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JPH07301628A - 容量測定細管血球計算のための装置及び方法 - Google Patents

容量測定細管血球計算のための装置及び方法

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JPH07301628A
JPH07301628A JP7107182A JP10718295A JPH07301628A JP H07301628 A JPH07301628 A JP H07301628A JP 7107182 A JP7107182 A JP 7107182A JP 10718295 A JP10718295 A JP 10718295A JP H07301628 A JPH07301628 A JP H07301628A
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capillary
sample
scanning
fluorescence
hemocytometer
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JP7107182A
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Paul G Hayter
ジー ヘイター ポール
Michael Hodges
ホッジス マイケル
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エス マニアン ベイラ
Robert J Shartle
ジェイ シャートル ロバート
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Biometric Imaging Inc
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Publication date
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    • G—PHYSICS
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 生物学的流体における特定の細胞サブセット
の数を、容量測定の態様で直接得るための、少ない容量
の試料及び試薬しか要しない迅速で、使用が簡単で、費
用がより少なく、より安全で、自動化された装置及び方
法の提供。 【構成】 本発明の装置及び方法は、未処理の生物学的
流体試料を蛍光標識した結合剤と反応させる走査結像血
球計算器を開示している。反応した試料は、細管に仕込
まれる前に最小限の処理を受けるだけである。試料は、
光学的に走査され、細管の複数のカラム状領域からの蛍
光励起が記録される。各カラム状領域は、通常、励起ビ
ームのスポットサイズ及び細管の深さ寸法により規定さ
れる。十分なピンホールの空間フィルターが、各カラム
状領域における全ての蛍光性の標的の同時の容量測定的
検知を可能にするよう選択される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【技術分野】本発明は、自動化した血球計算装置及び手
法に関し、生物学的流体の細胞成分の確認及び計数に関
するものである。
【０００２】
【背景技術】生物学的流体の種々の成分の迅速な確認及
び計数が重要な研究及び診断の目的である。試料の最小
限の処置及び取り扱いが、斯かる技術の広範な用途に貢
献するであろう。人間の血液の白血球サブクラスの計数
の場合には、改良された技術の要求が特に強い。例え
ば、HIV 陽性状態からエイズへの進行の注視におけるCD
4 ＋リンパ球レベルを監視することの有用性は、患者の
血液試料を分析するための速やかで、低廉で、信頼性の
ある方法の必要性を強めてきた。AIDS 4、479 〜497 頁
(1990 年) のLanday等の「流動血球計算のHIV 感染の研
究への応用(Application of flow cytometry to the st
udy of HIV infection)」は、HIV 感染の生物学の理解
における技術の実用を記載している。種々のモノクロー
ナル抗体を用いて血液試料の表現分析を行なうことによ
って、複数色流動血球計算分析を、HIV 疾患の研究に応
用することができる。この技術は、器官移植又は白血病
の患者の状態評価におけるように、他の免疫系の測定に
も有用である。
【０００３】流動血球計算は、細胞を、蛍光放射に基づ
いて特徴付けて分離することのできる周知の技術であ
る。標識した単分散(mono-dispersed)細胞懸濁液が、細
い流体の流れになって管を通って進行し、励起ビームに
露呈される。各細胞の放射された蛍光は、適当な検知器
によって測定され、細胞は、小滴に分けられ、電気的及
び機械的手段によって所定のパラメータにしたがって種
別される。流動血球計算は、血液細胞の特定のサブクラ
スを確認し、計数するのに用いることができる。例え
ば、Hansen等の米国特許第4,284,412 号では、蛍光標識
したノモクローナル抗体と反応させたリンパ球が赤血球
から分離され、一つ一つ流動血球計算システムの固定し
た検知器にかけられる。各細胞は、前方光散乱、直角散
乱(right angle scatter) 、及び蛍光の分析によって特
徴付けされる。この方法は、複雑な試料調製及び計測を
必要とする。流動血球計算は、この用途におけるアッセ
イの信頼性及び再現性を向上させたが、一般には、リン
パ球サブセットの絶対細胞数を直接もたらすことができ
ない。独立白血球数(independent whiteblood counts)
及び差分白血球数(differential white counts) が、単
位容積あたりの絶対細胞数を計算するのに必要である。
通常の流動血球計算の実践においては、リンパ球を、単
球及び顆粒球と識別するためには、前方及び側方光散乱
パターンに基づくリンパ球ゲートを、各試料毎に得なけ
ればならない。
【０００４】Recktenwald の米国特許第4,727,020 号
は、反対の例を提供しているが、流動血球計算は、赤血
球の存在下でのリンパ球サブクラスの確認及び計数に
は、通常は用いられない。赤血球の除去は、密度勾配分
離又は溶解によると、アッセイあたりの時間、費用及び
血液処理工程がふえる。追加の血液処理工程は、血液媒
介の感染に晒す可能性を増すものである。先に述べたよ
うに、流動血球計算法によって得られたデータは、或る
目的には不十分である。単位容積あたりの絶対細胞数を
計算するためには、流動血球計算データを、他の方法か
ら得られた追加のデータと組み合わせなければならない
のが一般的である。更に、流動血球計算は、小さなノズ
ルを通過する流体の流れを従来利用するため、研究所の
職員に生物学的有害物質の追加の源をもたらすエーロゾ
ルを発生させることがある。他には、試料の位置を励起
ビームに対して固定することがある。例えば、Tomei 等
の米国特許第4,758,727 号及びその分割の米国特許第4,
877,966 号には、低レベルレーザー誘発蛍光の測定方法
及び装置が記載されている。この発明では、コヒーレン
トレーザービームが三次元スキャナーを通過し、静止し
た標的に合焦される。標的は、単層培養細胞又は組織片
等の対象物である。1 ミクロンといった小さなサイズを
有するビームスポットが、経路及び運動速度がコンピュ
ータ制御されたスキャナーによって標的を越えて行き来
する。蛍光が、バイアスカットした光ファイバーベース
プレートによって集められ、ビームからは標的の反対側
に位置する検知器に中継される。
【０００５】やはりTomei 等に許与された米国特許第5,
037,207 号が、支援コンピュータシステムのデータ検索
及び記憶限界によっては、いろいろなサイズの標的のデ
ジタル結像を可能にする高められた空間解像度及び集光
効率を有するレーザー結像システムを開示している。こ
のシステムは、各レーザースポットから全ての光を集め
て標的の表面に関する画像の定量的デジタル再生をなす
ため、新規な光ファイバー検知器アセンブリ及び迅速な
走査を利用している。Kamentsky の米国特許第5,072,38
2 号及びKamentsky 等の米国特許第5,107,422 号が、ビ
ームを用いて細胞個体数を走査し、各細胞の特定の位置
に基づいて複数パラメータ光学データを作成するための
装置及び方法を開示している。この走査は、細胞を付着
させた面についてなされる。バックグラウンドレベル
が、デジタルデータに基づいて各細胞を取り囲む近隣域
に関して推定され、バックグラウンドレベルに関して補
正がなされる。Cytometry 9 、101 〜110 ページ(1988
年) のBurger及びGershmanの「音響光学的レーザー走査
血球計算器(Acousto-Optic Laser-Scanning Cytomete
r)」及びGershman等の米国特許第4,665,553 号には、レ
ーザー走査血球計算器が開示されている。光学的走査
が、ブラッグ細胞制御スキャナー(Bragg cell-controll
ed scanner) によって、キュベット内の溶解及び洗浄を
行なった試料に対して行なわれる。キュベットは、スキ
ャナーに対して一方向に段階的態様で移送される。スキ
ャナーは、キュベット移送の方向と垂直の方向に作用
し、走査は、キュベットの側部に沿って行なわれる。細
胞が配置されると、ビーム最適化アルゴリズムが働いて
ビームを細胞に固定し、前方光散乱、垂直光散乱、及び
蛍光の測定が行なわれる。次いで、この過程が繰り返さ
れる。
【０００６】Buican等の米国特許第5,117,466 号には、
流動血球計算器からのデータが、試料の細胞成分を実質
上種分けするため共焦レーザー顕微鏡によって用いられ
る確認基準を確立する蛍光分析システムが記載されてい
る。複屈折光学及びフーリエ変換技術が、所望のスペク
トル特性を有する細胞又は亜細胞(subcellular) 構造体
を視覚的に選択及び表示するのに用いられている。Anal
ytical Biochemistry 102 、90〜96頁(1980 年) の「ピ
コリットル試料の蛍光分析(Fluorescence Analysis of
Picoliter Samples)」で、Mroz及びLechene は、蛍光デ
ータを集めるためのピコリットル容積の試料の処理方法
を教示している。試料が、シリンジによって、単一のシ
リコン処理した細管内に試料の間に油がある状態に採取
される。ピンホールダイヤフラム、顕微鏡の対物レン
ズ、及び細管の直径によって画定される光学的蛍光チャ
ンバーに対して測定がなされる。Mathies 等に許与され
た米国特許も本発明の分野に関連するものである。米国
特許第4,979,824 号には、高感度検知装置が記載されて
いる。この装置は、流動血球計算システムに基づいてお
り、空間フィルターを利用して個々の蛍光性の粒子及び
分子の検知を可能にする小さなプローブ容積を規定して
いる。最も良い信号対ノイズ比が得られるよう、レーザ
ー出力及び試料の曝露時間が選択される。蛍光粒子から
の光子バースト(photon bursts) のリアルタイムの検知
が、粒子の数、位置又は濃度をバックグラウンドエネル
ギーから識別するのに用いられている。
【０００７】Mathies 等の米国特許第5,091,652 号に
は、共焦顕微鏡を用いて分離した試料を走査するための
レーザー励起蛍光スキャナーが開示されている。この試
料は、電気泳動したどろどろの(slab)ゲルによって分離
され、斯かるゲルから検知されるのが好ましいが、膜、
ろ紙、ペトリ皿又はガラス基板に載っていてもよい。共
焦顕微鏡は、ゲルに照明容積を形成し、ビームは、バッ
クグラウンド散乱が散乱光の偏光特性によって最小限に
なるように方向付けされる。やはりMathies 等に許与さ
れ、上記特許の一部継続である米国特許第5,274,240 号
が、レーザー励起細管列スキャナーを教示している。こ
の発明は、細管電気泳動によって分離した試料を収容す
る細管の列からの蛍光の検知を主として意図するもので
ある。この蛍光検知アセンブリは、各細管の内部容積か
らの蛍光を検知するのに共焦システムを用いている。現
在の血球計算技術は、時間がかかり、潜在的に有害な試
料の処理及び成分の分離工程を要するのが一般的であ
る。斯かる技術は、混合個体群中に存在する細胞懸濁液
の下位(sub) 個体群の迅速な容量測定による確認及び計
数をすることができない。この先行技術のテクニック
は、訓練した職員を必要とすることがしばしばである。
【０００８】したがって、本発明の目的は、生物学的流
体における特定の細胞サブセットの数を、容量測定の態
様で直接得るための、少ない容量の試料及び試薬しか要
しない迅速で、使用が簡単で、費用がより少なく、より
安全で、自動化された装置及び方法を提供することであ
る。
【０００９】
【発明の概要】上記の目的は、生物学的流体の細胞成分
を、蛍光性複合体の形成と、静止した最小限の処理をし
た状態の試料を容れた細管の光学的走査とに基づいて、
容量測定の態様で確認し、計数するための装置及び方法
を用いて達成された。非流動細胞懸濁液全体から蛍光が
検知され、絶対細胞数を得る目的で、正確な容積におい
て計数を行なうことができる。本明細書で定義される
「絶対」とは、走査した容積によって表わされる容積あ
たりの細胞の絶対数を意味する。本明細書で定義する
「細胞」とは、細胞全体又は細胞の一部を意味する。複
合体は、蛍光標識した結合剤と流体の細胞成分に存在す
る対応する結合部位との反応の結果である。励起レーザ
ービームが、光学スキャナーによって細管のカラム状領
域に送られる。カラム状領域は、通常、細管の内側深さ
寸法とレーザーのビームスポットとによって画定され
る。カラム状領域全体から放射された蛍光を選択的に検
知するため、十分なピンホール孔部が選択され、細管と
検知手段との間に配置されている。試料における結合し
た蛍光標識した結合剤と未結合の蛍光標識した結合剤と
の分離が必要でないため、どちらも蛍光として検知手段
によって観察される。しかしながら、標識した結合剤が
集合する、即ち試料の細胞成分に存在する結合部位に集
合する、蛍光強度が高くなった領域が現れる。したがっ
て、検知手段は、単一の細胞に対応するバックグラウン
ド蛍光の所定の閾値を越える高くなった蛍光強度の信号
を記録する。
【００１０】好ましい実施態様では、レーザーは、600
〜1000nmの波長の励起ビームを発生させ、励起ビーム
は、長方形断面の細管の真上の位置から細管に合焦され
る。レーザービームが細管と交差する箇所におけるレー
ザービームのスポットサイズは、予期される細胞の大き
さによるが、直径が5 〜15ミクロンであり、細管の照さ
れる深さ寸法は、25〜225 ミクロンである。以下に説明
するように、スポットサイズと細管の深さ寸法との間に
は関係がある。本発明では、励起ビームを、二方向に走
査させ、固定位置にある透明な細管の外壁に当てる。第
一の走査方向は、細管の長手方向軸に対して横断方向の
経路、即ち、細管の長方形断面の巾部分を辿り、細管の
側方の境界を越える点に始まって終る。第二の走査方向
は、細管の長手方向軸に沿う経路を辿る。細管の断面積
が既知なので、第二の走査方向における始点及び終点を
測定することによって、又は規定した位置で走査を開始
し、終了することによって、達成される既知容積の走査
を、単位容積あたりの細胞成分の特定の下位個体群の存
在を計算するのに用いることができる。本発明の装置
は、血球のサブクラスの検知の特に好適である。典型的
なアッセイでは、凝固していない全血を取得し、血球サ
ブクラスに存在する種々の細胞表面マーカーに向けられ
る過剰量の蛍光標識した抗体を用いて培養する。発蛍光
団は、それらが、励起ビームの波長の範囲で活性である
ように選択される。この波長範囲も、意図しない血液成
分からの自発蛍光(autofluorescence)に起因する干渉を
最小限にするよう選択される。複合及び遊離の両形態の
蛍光標識した抗体を含む試料は、通常、希釈した後、細
管内に仕込む。次いで、細管を、発蛍光団を励起するの
に必要な波長で光学的に走査する。特定の抗体を標識す
るのに用いた特定の発蛍光団からの蛍光放射に基づき、
血液又は他の生物学的流体試料に存在する細胞種の比を
速やかに決定することができるように、或る種類の細胞
の単位容積あたりの数を、速やかに決定することができ
る。
【００１１】本発明の機器及び技術は、正確な容積の生
物学的流体の細胞成分を速やかに検知し、試料の最小限
の処理しか必要でない。本発明は、アッセイ時間及び費
用を削減し、試料の処理、特に重要なのは血液試料の検
査中の予防措置、が最小限でよい。試料を処理するのに
特別の機器が必要ではなく、必要な試薬の数が最小限に
保たれるので、臨床の状況に用いるのに非常に適してい
る。
【００１２】
【実施例】図１を参照すると、レーザー１０が、パワー
モニター１１と光学的に連絡しているガラスプレート１
２を先ず通過し、次いで、レーザーラインフィルター１
３及び選択したレーザービーム波長に対して鏡として作
用するスペクトル分散手段１４を通過する励起ビーム８
０を発生させる。スペクトル分散装置は、例えば、二色
ビームスプリッター、プリズム、又は格子でよい。励起
ビームは、次いで、鏡１５に送られ、直角プリズム１６
を通り、走査アセンブリ３４に送られる。図１では、走
査アセンブリ３４は、ガルボミラー１８、レンズ２６及
び２７、並びにレンズ１９が取り付けられた検流計１７
を備えている。その他、走査アセンブリは、多面を有す
る多面体鏡でもよい。本発明の励起ビーム８０は、ガル
ボミラー１８に当り、ガルボミラー１８は、検流計１７
と連絡しているため、絶えず位置を変化させ、それによ
り、励起ビームの位置の変化を生じさせる。走査アセン
ブリ３４内で、励起ビームは、ガルボミラー１８から、
レンズ２７を通り、次いでレンズ２６を通って進行す
る。レンズ２６から、励起ビームは、ビームの焦点が、
透明な細管２０の外壁に当ることができるよう、レンズ
１９を通して送られる。
【００１３】外壁に当る励起ビームは、外壁を横切って
試料のカラム状領域を照らし、試料から蛍光放射を生じ
させる。集光が、エピイルミネーション(epi-illuminat
ion)の態様で生じる。放射された蛍光は、レンズ１９に
よって集められ、レトロビーム８３として、走査アセン
ブリ３４を通って送り戻される。レンズ１９は、図２で
分るように、入射ビーム８０を通過させ、細管２０を通
る入射ビーム８０の一様な焦点深度を得るするための中
央部を有している。蛍光放射は、光線３２ａ及び３２ｂ
によって表わすような非常に広い角度にわたっているた
め、蛍光の集光が、対物レンズ１９のより広い部分にわ
たって行なわれる。図１に戻ると、レトロビーム８３
は、走査アセンブリ３４から直角プリズム１６へと進行
し、鏡１５及びスペクトル分散装置１４へと進行する。
レトロビーム８３は、その蛍光放射の波長のため、スペ
クトル分散装置１４を通り、帯域通過フィルター２１を
通って鏡２２へと伝播され、鏡２２で、レトロビーム８
３は、視準レンズ２３へと送られてこれを通過する。レ
トロビーム８３は、次いで、空間フィルター２４を選択
的に通過し、検知手段３５に進入する。空間フィルター
２４は、細管内の照らされたセグメントによって規定さ
れる領域からの蛍光放射のみを通過させる直径の所定の
ピンホール孔部を有している。
【００１４】検知手段３５は、レトロビーム８３の蛍光
信号を読み取る検知要素３０のような検知チャンネルを
備えており、蛍光信号をアナログからデジタル形式に変
換するデータリーダー５０と連絡している。検知要素
は、光電子増倍管又は光ダイオード等の光測定装置であ
る。信号は、データリーダー５０によって、蛍光強度の
単位として記録される。検知手段３５は、如何なる数の
検知チャンネルを含んでいてもよい。例えば、図１にお
いて、スペクトル分散装置２５が、空間フィルター２４
と検知要素３０及び３１との間に配置され、試料の蛍光
放射の波長を分け、一方の波長の光を一方の検知要素
へ、第二の波長の光を第二の検知要素へと選択的に送
る。このようにして、複数の発蛍光団からのいろいろな
波長において蛍光を検知するため、複数のスペクトル分
散装置及び複数の検知要素を検知手段に組み込むことが
できる。同様にして、いろいろな波長で試料を励起する
ため、複数のレーザーを利用することができる。本発明
の重要な特徴が、図２に示されている。大きな開口数に
わたっって集光するが、検知の深さを細管の内部の深さ
寸法に限定するピンホール孔部を有する空間フィルター
２４が選択される。励起レーザービーム８０の細管２０
の外壁へのスポットサイズは、ほぼ一定の直径のもので
あり、細管の深さ寸法に沿って一様な照明を提供するよ
う選択されている。そのため、本発明は、励起ビームの
スポットサイズ、細管の深さ寸法、及び空間フィルター
のピンホール孔部の従属関係に依存するものである。
【００１５】細管２０は、既知寸法の透明な試料ホルダ
ーである。細管は、25〜225 μm の内部深さを規定する
短い方の寸法と1mm の巾を規定する長い方の寸法とを有
する長方形の断面を有しているのが好ましい。細管の長
さは、決定的なものではなく、細管の長さに沿う方向に
おける走査の始点及び終点が、走査するセグメントの正
確な体積を規定する。本発明では、40mmの細管長さを一
般的に用いている。細管は、細管の走査がトップダウン
方式(top-down manner) で行なわれるよう、励起ビーム
の真下に固定して配置される。励起ビームと細管との交
差部は、図２及び図３に示すように、カラム状領域５１
によって全体が画定される。カラム状領域の上部寸法
は、5 〜15μm の円状ビームスポット３３である。ビー
ムスポットのサイズは、細管の深さ寸法全体が照らされ
るように選択される。細管のカラム状領域が照らされ、
その内容物から放射された蛍光が検知及び記録された
後、光学走査手段は、新しいカラム状領域を照すため、
新しい位置へと移動される。移動は、ビームスポットの
サイズの一部分にすぎない量のものであるため、各々の
照明されるカラム状領域５１は、図３におけるような他
の領域４４と部分的に重複する。光学走査手段は、蛍光
放射が検知及び記録される領域をこの態様で照明及び蛍
光性励起を継続し、次いで若干移動されて新しい領域を
照明し、この過程を繰り返す。好ましい実施態様では、
光学走査手段は、細管の長手方向軸を横断する方向であ
る矢印５２によって示される、即ち、細管の巾に沿う一
方の方向、及び矢印５３によって示される細管の長さに
沿うもう一方の方向に走査経路を辿り、ビームスポット
の二次元の配列を形成する。図１において、点線部１３
４が、走査アセンブリ３４の位置の変化を示しており、
したがって、点線の検流計１１７及び点線のガルボミラ
ー１１８が、変更位置にある検流計１７及びガルボミラ
ー１８を表わしている。同様にして、点線１２６、１２
７及び１１９が、変更位置にあるレンズ２６、２７及び
１９を表わしている。図３及び図４に示すように、横断
方向の走査は、細管の側方の境界を越えて箇所５４に始
まって箇所５４に終る。この余分目の走査(overscan)
は、細管の縁の特異性を特定するのに効果的である。
【００１６】図５は、本発明の好ましい実施態様による
走査経路４８の細管２０上方からの模式図を示してい
る。励起ビームのスポットは、横断方向の走査経路に沿
って移動され、次いで、迅速に戻り、やはり横断方向の
近接して間隔をおいて位置する平行な経路を辿る。この
過程は、走査が、細管の長手方向軸に沿うセグメントも
網羅するような頻繁さで反復される。このようにして、
蛍光放射が生じ、任意の選択した長さの細管から検知さ
れる。本発明において開示された方法は、生物学的流体
の試料の分析を、最小限度の準備で可能にするものであ
る。本発明によれば、生物学的流体が、既知の光学特性
の発蛍光団を含む過剰量の結合剤を用いて培養される。
蛍光標識された結合剤は、試料に存在する結合部位と反
応するように選択される。例えば、生物学的流体の何等
かの細胞成分に存在する抗原に向けられた蛍光標識され
た抗体を、試料に加えることができる。標識された結合
剤と結合部位とは、本発明の装置に用いると信号を発す
る蛍光性複合体を形成する。試料を標識した結合剤で培
養した後、必要であれば希釈し、次いで、細管２０内に
直接仕込む。生物学的流体の成分の溶解も、結合した結
合剤と未結合の結合体の分離も、本発明方法の実施の如
何なる時点においても必要がない。光学的走査が、容量
測定の態様で試料になされ、照された各カラム状領域か
ら、蛍光放射が順に記録される。
【００１７】所望の用途によっては、細管の長手方向の
走査の始点及び終点をノッチでしるし、走査した距離を
測定することにより、又は、細管に付した特定の識別マ
ークの間を走査することにより、絶対容積の計数を行な
ってもよい。この決定した正確な容積における全ての蛍
光性の標的の定量は、詳細な個体群(population)データ
を迅速に得る有力な方法である。この容積は、一定の断
面積の細管を用いることにより、又は特定の識別マーク
間の細管の容積を独立に測定することにより、決定され
る。その他、正確な容積の算出は行なわないが、試料の
異なる成分の相対数を比較することにより、比率を得る
ことができる。図１のデータリーダー５０が、図６に示
すように、事象、即ち、或る閾値を越える蛍光のバック
グラウンドレベルより上への増加を記録する。この事象
は、試料中に特定の種類の細胞が存在することに対応す
る。蛍光の放射は、結合剤−結合部位複合体４５からも
遊離の結合剤４０からも生じるが、バックグラウンドレ
ベル８０に対するより強い信号８５が、結合剤がクラス
ターになった領域、即ち、結合剤が向けられる結合部位
を露呈している細胞から生じる。したがって、強くなっ
た蛍光８５の信号が、図６に点線でつながりを示す細胞
に対応し、そのように記録される。
【００１８】本発明の方法は、未反応の蛍光標識した結
合剤の除去を必要としない。光学的走査に先立つ試料の
希釈が、信号対ノイズ比を向上させる役割をするので、
本発明による蛍光の結像が、最小限の処理工程で迅速な
態様で行なわれる。希釈は、試料中で細胞の重複が生じ
ることを最小限度にする役割もする。本発明の実施にお
いては、試料の細胞が10ミクロン程度の大きさで、細胞
の密度がマイクロリッターあたり5000未満である時に、
最適の結果が得られる。本方法の有用性の例が、血液試
料中に存在する白血球のサブクラスの決定のためのアッ
セイによって例示される。典型的なアッセイでは、凝固
していない全血の試料が、特定の細胞表面マーカーに向
けられる蛍光標識された抗体を用いて培養される。例え
ば、異なる光学特性を有する発蛍光団で標識された抗CD
4 及び抗CD8 を、全血とともに培養することができる。
試料内で、CD4 又はCD8 の何れか、或いは両方の細胞表
面マーカーを帯びた白血球は、標識した抗体と反応して
蛍光性複合体を形成する。十分な反応時間の後、全血試
料を希釈し、細管に入れる。次いで、本発明に従って細
管を光学的に走査する。使用する発蛍光団を活性化し、
意図しない血液成分からの自発蛍光(autofluorescence)
に起因する干渉を最小限にするよう、光学的走査の波長
範囲を選択する。抗CD4 及び抗CD8 を標識するのに用い
た発蛍光団に対応する蛍光放射が検知され、記録され
る。次いで、これらの抗体を向ける細胞表面マーカーの
何れか又は両方を帯びた白血球の存在を計数する。走査
の長さ及び細管の断面積によって決定される所定の容積
内に存在する或るサブクラスの細胞の数を計算すること
によって、結果を、単位容積当りの絶対細胞数として表
わすことができる。結果を、比、例えばCD4/CD8 白血球
比として表わすことも、これらの細胞表面マーカー各々
を帯びた細胞の数を計算して両方を比較することによ
り、可能である。この最も後の例示の有用性は、この比
がエイズの進行の測定において重要なため、非常に明ら
かである。
【００１９】凝固していない全血における白血球サブク
ラスの測定を行なうため、本発明の技術を用いてアッセ
イを行なう場合、反応した試料の細管内への仕込みと光
学的走査との間の二、三分間の待機が、試料中に存在す
る多数の赤血球の自然密度ための余裕を与え、赤血球の
細管の底への沈殿と後続する白血球の変位を生じさせ
る。この自然の浮力効果が、細管の上部付近の白血球の
帰結位置を生じさせ、本発明のトップダウン走査形態の
ため、蛍光検知に役立つ。上記の例におけるように、異
なる光学特性を有する発蛍光団を、異なる結合部位に向
けられる結合剤と結合させることができるため、試料中
の複数の反応成分の存在を検知することができる。走査
した細管の正確に分っている容積から、迅速な読み取り
が、試料中に存在する単位容積あたりの特定のサブクラ
スの細胞の数を確認する。光学系は、単に、各発蛍光団
を、その重要な波長で励起するように設定され、各発蛍
光団の放射波長に対応するよう検知チャンネルが形成さ
れる。本発明の装置及び方法は、既知容量内の絶対数を
必要とする用途を含む多くの用途に適している。例え
ば、細胞運動学の研究、介在染料(intercalating dye)
を用いる細胞毒性の研究、及び原位置ハイブリッド形成
を、本発明に従う分析に適合させることができる。加え
て、本発明の容量測定法は、細胞懸濁液中でなく表面に
位置する細胞における免疫的及び生化学的応答を研究す
る場合に存在することのある人為要素の回避を可能にす
るものである。細胞は、細管内から検知されるが、本発
明は、比較的静止した局在細胞に対する流動細胞光度測
定的な分析を可能にする態様で試料を呈示するものであ
る。したがって、細胞を、位置特異的な態様で検知する
こと又は後続の目視試験のために確認することができ
る。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係る装置の平面図である。
【図２】本発明の試料を充填した細管の側面図であり、
カラム状領域、並びに励起ビーム及び放射ビームの両方
を示す図である。
【図３】本発明による重複するビームスポット及び照さ
れたカラム状領域を示す試料を充填した細管の斜視図で
ある。
【図４】本発明による重複するビームスポットを示す試
料を充填した細管の平面図である。
【図５】本発明の好ましい実施態様による光学的走査経
路の模式図である。
【図６】標識した細胞懸濁液及び対応する検知器の信号
の模式図である。
【符号の説明】
１９…レンズ ２０…細管 ２４…空間フィルター ３５…検知要素 ８０…励起ビーム ８３…レトロビーム
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ルイス ジェイ ディーツ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94041 マウンテン ヴィュー シー ヴ ィラ ストリート 759 (72)発明者 ロバート エス デュブロウ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94070 サン カーロス フェイ アベニ ュー 37 (72)発明者 ポール ジー ヘイター アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94024 ロス アルトス コンコード ア ベニュー 1340 (72)発明者 マイケル ホッジス アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94306 パロ アルト ガスパー コート 2778 (72)発明者 ベイラ エス マニアン アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94022 ロス アルトス ベリー ヒル コート 14240 (72)発明者 ロバート ジェイ シャートル アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94550 リヴァーモア マドローン ウェ イ 982

Claims (44)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 細管内の非流動流体用の走査結像血球計
    算器であって、 細胞と蛍光標識した結合剤との複合体を有する遊離の蛍
    光標識した結合剤を含む懸濁状態の非流動流体を収容
    し、外壁及び内壁を有する透明な細管と、 細管の長手方向軸に対して横断方向に、流体のカラム状
    領域を照す第一の直径を有するビームスポットとなっ
    て、細管の外壁に当る光のビームであって、光は、複合
    体及び遊離の結合剤からの蛍光放射を刺激する励起波長
    を有しているビームと、 細管から間隔をおいて位置し、蛍光放射に反応する光検
    知要素と、 照されたカラムからの蛍光放射を集め、集めた光をレト
    ロビームとして検知要素に向けて送る細管に近接した広
    角集光要素と、 ピンホール孔部を有し、集光要素と検知要素との間に間
    隔をおいて位置する空間フィルターであって、ピンホー
    ル孔部は、レトロビームを遮るように配置され、レトロ
    ビームの一部だけを検知要素へと通す第二の直径を有
    し、第二の直径は、ビームスポットの第一の直径よりも
    かなり大きい空間フィルターと、 ビームを細管に複数のスポットとして逐次当て、合計容
    積を測定することのできる複数のカラム状領域を照すた
    めの細管とビームとの相対運動を与える手段とを、備え
    ていることを特徴とする走査結像血球計算器。
  2. 【請求項２】 蛍光標識した結合剤は、600 〜1000nmの
    範囲で働く発蛍光団を含んでいることを特徴とする請求
    項１記載の走査結像血球計算器。
  3. 【請求項３】 結合剤は、抗体であることを特徴とする
    請求項１記載の走査結像血球計算器。
  4. 【請求項４】 結合剤は、細胞の膜に対して特異性であ
    ることを特徴とする請求項１記載の走査結像血球計算
    器。
  5. 【請求項５】 結合剤は、介在染料であることを特徴と
    する請求項１記載の走査結像血球計算器。
  6. 【請求項６】 結合剤は、核酸プローブであることを特
    徴とする請求項１記載の走査結像血球計算器。
  7. 【請求項７】 結合剤は、特定の受容体に向けられるこ
    とを特徴とする請求項１記載の走査結像血球計算器。
  8. 【請求項８】 細管の外壁に当る光は、広角集光要素の
    中央部を通過した後、細管の外壁に当り、細管の内部に
    合焦されていることを特徴とする請求項１記載の走査結
    像血球計算器。
  9. 【請求項９】 遊離の結合剤に関連するバックグラウン
    ド蛍光と複合体に関連する蛍光とを識別するため、検知
    要素と連携する粒子計数手段を更に備えていることを特
    徴とする請求項１記載の走査結像血球計算器。
  10. 【請求項１０】 相対運動を与えるための手段は、複数
    のスポットを互いに部分的に重複させることを特徴とす
    る請求項１記載の走査結像血球計算器。
  11. 【請求項１１】 相対運動を与えるための手段は、ビー
    ムを細管の側方の縁を越えて走査させることを特徴とす
    る請求項１記載の走査結像血球計算器。
  12. 【請求項１２】 相対運動を与えるための手段は、ビー
    ムをスポットの二次元配列に細管に逐次当て、合計容積
    を測定することのできるカラム状領域の二次元配列を照
    すことを特徴とする請求項１記載の走査結像血球計算
    器。
  13. 【請求項１３】 光検知要素は、少なくとも一つのスペ
    クトル分散装置によって隔てられた複数の光電性部材を
    含み、それにより、複数の蛍光放射の波長を分離するこ
    とを特徴とする請求項１記載の走査結像血球計算器。
  14. 【請求項１４】 探査容積は、細管の既知の断面積と、
    細管に沿って走査した距離とによって決定されることを
    特徴とする請求項１記載の走査結像血球計算器。
  15. 【請求項１５】 容積は、細管の既知の断面積と、距離
    を規定するため、特定の識別マークを細管に付すことに
    よって決定されることを特徴とする請求項１記載の走査
    結像血球計算器。
  16. 【請求項１６】 ビームは、細管内の或る位置に合焦さ
    れることを特徴とする請求項１記載の走査結像血球計算
    器。
  17. 【請求項１７】 光のビームは、600 〜1000nmの範囲の
    波長を有していることを特徴とする請求項１記載の走査
    結像血球計算器。
  18. 【請求項１８】 細管内の非流動流体用の走査結像血球
    計算器であって、 細胞と蛍光標識した結合剤との複合体を有する非流動流
    体を収容し、外壁及び内壁を有する透明な細管と、 細管の長手方向軸に対して横断方向に、流体のカラム状
    領域を照す第一の直径を有するビームスポットとなっ
    て、細管の外壁に当る光のビームであって、光は、複合
    体からの蛍光放射を刺激する励起波長を有しているビー
    ムと、 細管から間隔をおいて位置し、蛍光放射に反応する光検
    知要素と、 照されたカラムからの蛍光放射を集め、集めた光をレト
    ロビームとして検知要素に向けて送る細管に近接した広
    角集光要素と、 ピンホール孔部を有し、集光要素と検知要素との間に間
    隔をおいて位置する空間フィルターであって、ピンホー
    ル孔部は、レトロビームを遮るように配置され、レトロ
    ビームの殆どを検知要素へと通す第二の直径を有し、第
    二の直径は、ビームスポットの第一の直径よりもかなり
    大きい空間フィルターと、 ビームを細管に複数のスポットとして逐次当て、合計容
    積を測定することのできる複数のカラム状領域を照すた
    めの細管とビームとの相対運動を与える手段とを、備え
    ていることを特徴とする走査結像血球計算器。
  19. 【請求項１９】 細胞懸濁液の容量蛍光測定を行なうた
    めの装置であって、 長方形断面の細管であって、細管の深さを画定する断面
    の短い方の寸法と、細管の巾を画定する断面の長い方の
    寸法とを有し、その中に細胞懸濁液を収容する細管と、 細管の内容物を蛍光的に励起するよう選択された波長の
    入射ビームを有する光学的走査手段であって、入射ビー
    ムは、複数のカラム状領域を照すため、特定した直径の
    複数のビームスポットとして細管と逐次交差する光学的
    走査手段と、 蛍光放射を検知するための光電性部材を有する検知手段
    と、 カラム状領域からの蛍光放射を集め、蛍光放射を検知手
    段へと送るための集光手段と、 カラム状領域全体から放射された蛍光の検知を可能にす
    るための特定したピンホール孔部を有し、集光手段と検
    知手段との間に配置された空間フィルターと、 蛍光放射信号の記録及び表示のため、検知手段と連絡し
    ているデータリーダーとを、備えていることを特徴とす
    る装置。
  20. 【請求項２０】 細管は、水平に配置されており、光学
    的走査手段のビームは、細管の真上の位置から細管と交
    差することを特徴とする請求項１９記載の装置。
  21. 【請求項２１】 入射ビームの波長は、600 〜1000nmで
    あることを特徴とする請求項１９記載の装置。
  22. 【請求項２２】 ビームスポットの直径は、5 〜15ミク
    ロンの範囲であることを特徴とする請求項１９記載の装
    置。
  23. 【請求項２３】 細管は、25〜225 ミクロンの範囲の深
    さを有していることを特徴とする請求項１９記載の装
    置。
  24. 【請求項２４】 光学的走査手段の入射ビームは、細管
    の巾に沿う第一の方向及び細管の長手方向軸に沿う第二
    の方向に経路を縦走することを特徴とする請求項１９記
    載の装置。
  25. 【請求項２５】 細管は、光学的走査手段の入射ビーム
    に対して固定された位置にあることを特徴とする請求項
    １９記載の装置。
  26. 【請求項２６】 光学的走査手段は、細管の巾に沿う方
    向の経路を進行し、経路は、細管の外側の境界を越える
    点に始まって終ることを特徴とする請求項１９記載の装
    置。
  27. 【請求項２７】 検知手段は、少なくとも一つのスペク
    トル分散装置によって隔てられた複数の光電性部材を含
    み、それにより、複数の蛍光放射の波長を分離すること
    を特徴とする請求項１９記載の装置。
  28. 【請求項２８】 更にレンズを備えており、レンズの中
    央部は、入射ビームが細管と交差する前にビームを通過
    させるため光学的走査手段によって用いられ、レンズ全
    体は、細管からの蛍光放射を集めるため集光手段によっ
    て用いられることを特徴とする請求項１９記載の装置。
  29. 【請求項２９】 蛍光による生物学的流体の細胞成分の
    確認及び計数方法であって、 生物学的流体の試料を取
    得することと、 蛍光性複合体を生成するため、未処理の試料を、試料中
    の細胞成分に存在する結合部位に向けられる過剰量の蛍
    光標識した結合剤を用いて培養することと、 培養した試料を、特定した寸法を有する細管内に直接仕
    込むことと、 細管の内容物を蛍光的に励起するよう選択された波長の
    入射ビームであって、複数のカラム状領域を照すため、
    特定した直径の複数のビームスポットとして細管と逐次
    交差する入射ビームを用いて、試料を光学的に走査する
    ことと、 各カラム状領域の内部全体から放射された蛍光を逐次検
    知することと、 高くなった蛍光強度の領域として、細胞を記録すること
    と、 特定の励起波長において記録された蛍光強度から試料の
    細胞成分の計数をすること、を含んでいることを特徴と
    する方法。
  30. 【請求項３０】 試料を細管に仕込む前に、試料を希釈
    することを更に含んでいることを特徴とする請求項２９
    記載の方法。
  31. 【請求項３１】 試料を光学的に走査することは、細管
    の真上に位置する入射ビームを、水平に配置された細管
    に交差させることを含んでいることを特徴とする請求項
    ２９記載の方法。
  32. 【請求項３２】 試料を光学的に走査することは、600
    〜1000nmの波長の入射ビームで走査することを含んでい
    ることを特徴とする請求項２９記載の方法。
  33. 【請求項３３】 試料を蛍光標識した結合剤と反応させ
    ることは、600 〜1000nmの範囲で働く発蛍光団で標識し
    た結合剤を用いることを含んでいることを特徴とする請
    求項２９記載の方法。
  34. 【請求項３４】 試料を光学的に走査することは、ビー
    ムと細管との交差点での直径が5 〜15ミクロンの入射ビ
    ームで走査することを含んでいることを特徴とする請求
    項２９記載の方法。
  35. 【請求項３５】 試料を細管に仕込むことは、細管の深
    さを画定する断面の短い方の寸法と、細管の巾を画定す
    る断面の長い方の寸法とを有する長方形断面の細管に、
    試料を仕込むことを含んでいることを特徴とする請求項
    ２９記載の方法。
  36. 【請求項３６】 試料を細管に仕込むことは、25〜225
    ミクロンの深さ寸法を有する細管に、試料を仕込むこと
    を含んでいることを特徴とする請求項２９記載の方法。
  37. 【請求項３７】 試料を光学的に走査することは、細管
    の長手方向軸に対して横断方向の第一の方向及び細管の
    長手方向軸に沿う第二の方向に経路を縦走することを含
    んでいることを特徴とする請求項２９記載の方法。
  38. 【請求項３８】 試料を、細管の長手方向軸に対して横
    断方向の第一の方向に光学的に走査することは、細管の
    外側の境界を越える点に始まり終る走査経路を縦走する
    ことを含んでいることを特徴とする請求項２９記載の方
    法。
  39. 【請求項３９】 試料を光学的に走査することは、固定
    位置にある細管を走査することを含んでいることを特徴
    とする請求項２９記載の方法。
  40. 【請求項４０】 細管の長手方向軸に沿う方向における
    走査の始点及び終点と細管の断面積とによって決定され
    る細管の特定した容積当りの計数した成分の量を計算す
    ることによって、試料の細胞成分の濃度を決定すること
    を更に含んでいることを特徴とする請求項２９記載の方
    法。
  41. 【請求項４１】 試料の異なる細胞成分の比を、計数し
    た各成分の量を計算して計数した各成分の相対量を比較
    することによって決定することを更に含んでいることを
    特徴とする請求項２９記載の方法。
  42. 【請求項４２】 蛍光による全血における白血球サブク
    ラスを確認及び計数するためのアッセイであって、 凝固していない全血の試料を取得することと、 蛍光性複合体を生成するため、未処理の試料を、試料中
    の白血球サブクラスに存在する抗原に向けられる過剰量
    の蛍光標識した抗体を用いて培養することと、 培養した試料を、特定した寸法を有する細管内に直接仕
    込むことと、 細管の内容物を蛍光的に励起し、試料中に存在する赤血
    球からの干渉を最小限にするよう選択された波長の入射
    ビームであって、複数のカラム状領域を照すため、特定
    した直径の複数のビームスポットとして細管と逐次交差
    する入射ビームを用いて、試料を光学的に走査すること
    と、 各カラム状領域の内部全体から放射された蛍光を逐次検
    知することと、 高くなった強度の領域として、白血球を記録すること
    と、 白血球のサブクラスを、特定の励起波長において記録さ
    れたその蛍光強度から試料中のサブクラスの存在を計算
    することによって、計数すること、を含んでいることを
    特徴とする方法。
  43. 【請求項４３】 試料を細管に仕込む前に、試料を希釈
    することを更に含んでいることを特徴とする請求項４２
    記載のアッセイ。
  44. 【請求項４４】 試料を蛍光標識した抗体を用いて培養
    することは、複数の蛍光標識した抗体を用いて培養する
    ことを含んでおり、各抗体は、白血球サブクラスの表面
    に存在する異なる抗体に向けられ、異なる光学特性を有
    する異なる発蛍光団で標識されていることを特徴とする
    請求項１記載のアッセイ。
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