JPH07243971A - 蛍光偏光法によるｄｎａまたはｒｎａの測定方法 - Google Patents
蛍光偏光法によるｄｎａまたはｒｎａの測定方法Info
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-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
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Abstract
(57)【要約】
【目的】蛍光偏光法を利用して迅速にＤＮＡまたはＲＮ
Ａ測定を行なう方法を提供する。 【構成】試料に蛍光標識試薬を加えて混合し、試料中の
ＤＮＡまたはＲＮＡと蛍光標識試薬とのハイブリダイゼ
ーション反応を行った後、蛍光標識に起因して発生する
信号による蛍光偏光度を計測することによる、ＤＮＡま
たはＲＮＡを測定する方法において、試料中のＤＮＡま
たはＲＮＡと蛍光標識試薬とのハイブリダイゼーション
反応を行わせるに際し、蛍光標識試薬の混合前あるいは
混合後に、塩化ナトリウム等の無機酸塩またはクエン酸
ナトリウム等の有機酸塩を添加する。
Ａ測定を行なう方法を提供する。 【構成】試料に蛍光標識試薬を加えて混合し、試料中の
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信号による蛍光偏光度を計測することによる、ＤＮＡま
たはＲＮＡを測定する方法において、試料中のＤＮＡま
たはＲＮＡと蛍光標識試薬とのハイブリダイゼーション
反応を行わせるに際し、蛍光標識試薬の混合前あるいは
混合後に、塩化ナトリウム等の無機酸塩またはクエン酸
ナトリウム等の有機酸塩を添加する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、試料中のＤＮＡまたは
ＲＮＡの測定において、蛍光偏光法を利用して迅速な測
定を行なう方法に関する。
ＲＮＡの測定において、蛍光偏光法を利用して迅速な測
定を行なう方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、遺伝子の本体であるＤＮＡやＲＮ
Ａを測定する必要性が高まっており、従来の免疫測定法
をモデルとして、放射性標識や酵素標識を用いる測定法
が研究され一部実用化されている。これらに代表される
従来のＤＮＡやＲＮＡの測定法はほとんどの場合、不均
一系の測定系として構成されている。すなわち測定物質
（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を含む試料と測定に用いる試薬
（測定試薬）とを混合し反応させた後、未反応の測定物
質または測定試薬を既反応のそれらと分離した上で、標
識に起因して発生する信号を計測する方法である。上述
の分離操作は通常、Ｂ／Ｆ分離とよばれる。このような
Ｂ／Ｆ分離の方法としては、反応容器やフィルム等に固
定化されたＤＮＡ試薬を用いる方法、磁性微粒子を用い
る方法または電気泳動を用いる方法などがあるが、いず
れの場合も煩雑なあるいは長時間の操作を必要とする。
Ａを測定する必要性が高まっており、従来の免疫測定法
をモデルとして、放射性標識や酵素標識を用いる測定法
が研究され一部実用化されている。これらに代表される
従来のＤＮＡやＲＮＡの測定法はほとんどの場合、不均
一系の測定系として構成されている。すなわち測定物質
（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を含む試料と測定に用いる試薬
（測定試薬）とを混合し反応させた後、未反応の測定物
質または測定試薬を既反応のそれらと分離した上で、標
識に起因して発生する信号を計測する方法である。上述
の分離操作は通常、Ｂ／Ｆ分離とよばれる。このような
Ｂ／Ｆ分離の方法としては、反応容器やフィルム等に固
定化されたＤＮＡ試薬を用いる方法、磁性微粒子を用い
る方法または電気泳動を用いる方法などがあるが、いず
れの場合も煩雑なあるいは長時間の操作を必要とする。
【０００３】このようなＢ／Ｆ分離が不要な測定法とし
て、均一系の測定系に適用できる蛍光偏光法が知られて
いる。該方法は、従来から試料中の薬物等の簡便かつ迅
速な測定法として知られているが、また同様に、ＤＮＡ
またはＲＮＡの測定法として応用可能であると考えられ
ている（特開平 5-123196 号公報など) 。
て、均一系の測定系に適用できる蛍光偏光法が知られて
いる。該方法は、従来から試料中の薬物等の簡便かつ迅
速な測定法として知られているが、また同様に、ＤＮＡ
またはＲＮＡの測定法として応用可能であると考えられ
ている（特開平 5-123196 号公報など) 。
【０００４】該方法によりＤＮＡまたはＲＮＡを測定す
るためには、検出すべきＤＮＡまたはＲＮＡの塩基配列
と相補的な塩基配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡに蛍光物
質を標識し、これを試薬として用いる。ここで上記試薬
を蛍光標識試薬（標識プローブ）とよぶ。通常、該試薬
には１本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡが用いられる。
るためには、検出すべきＤＮＡまたはＲＮＡの塩基配列
と相補的な塩基配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡに蛍光物
質を標識し、これを試薬として用いる。ここで上記試薬
を蛍光標識試薬（標識プローブ）とよぶ。通常、該試薬
には１本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡが用いられる。
【０００５】蛍光偏光法によるＤＮＡまたはＲＮＡの測
定法のプロセスの例を以下に示す。まず、測定すべき試
料に蛍光標識試薬を加える。該試料中に標的とする塩基
配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡが存在する場合、該試薬
はある反応時間で標的とする塩基配列を有する部位と、
互いに相補的な配列同士が会合し結合する。この反応を
ハイブリダイゼーションとよぶ。ここで試料中のＤＮＡ
またはＲＮＡは温度あるいは薬品等の処理によって１本
鎖の状態に前処理されているものとする。ハイブリダイ
ゼーションにより、蛍光標識試薬が標的とするＤＮＡま
たはＲＮＡと結合すると該試薬の見かけ上の分子量は結
合前より増大する。一般に溶液中での分子運動は分子量
が大きいほど緩慢である。そこで反応前後の蛍光偏光度
をモニターすると、ハイブリダイゼーションによる結合
後の値は結合前より大きくなる。これは標的ＤＮＡまた
はＲＮＡとのハイブリダイゼーションにより、蛍光標識
試薬の見かけ上の分子量が増大するからである。蛍光標
識試薬の量を一定とすれば、この変化の程度は標的とす
るＤＮＡまたはＲＮＡの量に対応する。そこで反応前後
の蛍光偏光度の変化により、標的とするＤＮＡまたはＲ
ＮＡの量を測定することができる。
定法のプロセスの例を以下に示す。まず、測定すべき試
料に蛍光標識試薬を加える。該試料中に標的とする塩基
配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡが存在する場合、該試薬
はある反応時間で標的とする塩基配列を有する部位と、
互いに相補的な配列同士が会合し結合する。この反応を
ハイブリダイゼーションとよぶ。ここで試料中のＤＮＡ
またはＲＮＡは温度あるいは薬品等の処理によって１本
鎖の状態に前処理されているものとする。ハイブリダイ
ゼーションにより、蛍光標識試薬が標的とするＤＮＡま
たはＲＮＡと結合すると該試薬の見かけ上の分子量は結
合前より増大する。一般に溶液中での分子運動は分子量
が大きいほど緩慢である。そこで反応前後の蛍光偏光度
をモニターすると、ハイブリダイゼーションによる結合
後の値は結合前より大きくなる。これは標的ＤＮＡまた
はＲＮＡとのハイブリダイゼーションにより、蛍光標識
試薬の見かけ上の分子量が増大するからである。蛍光標
識試薬の量を一定とすれば、この変化の程度は標的とす
るＤＮＡまたはＲＮＡの量に対応する。そこで反応前後
の蛍光偏光度の変化により、標的とするＤＮＡまたはＲ
ＮＡの量を測定することができる。
【０００６】なお通常、蛍光偏光度は、励起側、蛍光側
ともに偏光素子をセットし、蛍光側の偏光素子を回転さ
せ励起光の偏光面と平行および垂直の偏光面を有する蛍
光を測定することによって得られるので、１分以内の短
時間で１回の測定を終了することができる。
ともに偏光素子をセットし、蛍光側の偏光素子を回転さ
せ励起光の偏光面と平行および垂直の偏光面を有する蛍
光を測定することによって得られるので、１分以内の短
時間で１回の測定を終了することができる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】一般に１本鎖ＤＮＡま
たはＲＮＡとそれらとのハイブリダイゼーションの速度
は非常に緩慢であるため、試料に蛍光標識試薬を加えた
後、長い反応時間を必要とする。ところが、蛍光偏光法
はすでに記したように短時間で測定できることが特徴で
あるため、長い反応時間を必要とする場合、測定に必要
な時間が必然的に長くなるので、この特徴が有効に発揮
されないという問題があった。すなわち蛍光偏光度の測
定は短時間で済むが、測定を行うまでの反応の待ち時間
が長いという問題があった。本発明の目的は、上記従来
の測定法が有する問題点を解消し、蛍光偏光法によりＤ
ＮＡまたはＲＮＡを短時間で測定する方法を提供するこ
とである。
たはＲＮＡとそれらとのハイブリダイゼーションの速度
は非常に緩慢であるため、試料に蛍光標識試薬を加えた
後、長い反応時間を必要とする。ところが、蛍光偏光法
はすでに記したように短時間で測定できることが特徴で
あるため、長い反応時間を必要とする場合、測定に必要
な時間が必然的に長くなるので、この特徴が有効に発揮
されないという問題があった。すなわち蛍光偏光度の測
定は短時間で済むが、測定を行うまでの反応の待ち時間
が長いという問題があった。本発明の目的は、上記従来
の測定法が有する問題点を解消し、蛍光偏光法によりＤ
ＮＡまたはＲＮＡを短時間で測定する方法を提供するこ
とである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】すなわち本発明は試料に
蛍光標識試薬を加えて混合し、試料中のＤＮＡまたはＲ
ＮＡと蛍光標識試薬とのハイブリダイゼーション反応を
行った後、蛍光標識に起因して発生する信号による蛍光
偏光度を計測することによる、ＤＮＡまたはＲＮＡを測
定する方法において、試料中のＤＮＡまたはＲＮＡと蛍
光標識試薬とのハイブリダイゼーション反応を行わせる
に際し、蛍光標識試薬の混合前あるいは混合後に、無機
酸塩または有機酸塩を添加することを特徴とする蛍光偏
光法によるＤＮＡまたはＲＮＡの測定方法である。
蛍光標識試薬を加えて混合し、試料中のＤＮＡまたはＲ
ＮＡと蛍光標識試薬とのハイブリダイゼーション反応を
行った後、蛍光標識に起因して発生する信号による蛍光
偏光度を計測することによる、ＤＮＡまたはＲＮＡを測
定する方法において、試料中のＤＮＡまたはＲＮＡと蛍
光標識試薬とのハイブリダイゼーション反応を行わせる
に際し、蛍光標識試薬の混合前あるいは混合後に、無機
酸塩または有機酸塩を添加することを特徴とする蛍光偏
光法によるＤＮＡまたはＲＮＡの測定方法である。
【０００９】ＤＮＡまたはＲＮＡを測定する方法として
は、下記具体例がある。 Ａ．（１）蛍光標識された１本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡプ
ローブを（２）試料と混合し、２本鎖形成前の蛍光偏光
度と該２本鎖形成後の蛍光偏光度との変化を測定するこ
とにより、試料中のＤＮＡまたはＲＮＡに存在する、上
記１本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡプローブに相補的に対応す
る塩基配列を測定する方法。
は、下記具体例がある。 Ａ．（１）蛍光標識された１本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡプ
ローブを（２）試料と混合し、２本鎖形成前の蛍光偏光
度と該２本鎖形成後の蛍光偏光度との変化を測定するこ
とにより、試料中のＤＮＡまたはＲＮＡに存在する、上
記１本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡプローブに相補的に対応す
る塩基配列を測定する方法。
【００１０】Ｂ．（１）蛍光標識された１本鎖ＤＮＡま
たはＲＮＡプローブおよび（２）試料中のＤＮＡまたは
ＲＮＡを、（３）該１本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡと相補的
な塩基配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡを固定化担体に結
合させた固定化試薬と競合させて、２本鎖ＤＮＡまたは
ＤＮＡ−ＲＮＡを形成させ、該２本鎖形成前の蛍光偏光
度と該２本鎖形成後の蛍光偏光度との変化を測定するこ
とにより、試料中のＤＮＡまたはＲＮＡに存在する、上
記１本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡプローブに対応する塩基配
列を測定する方法。
たはＲＮＡプローブおよび（２）試料中のＤＮＡまたは
ＲＮＡを、（３）該１本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡと相補的
な塩基配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡを固定化担体に結
合させた固定化試薬と競合させて、２本鎖ＤＮＡまたは
ＤＮＡ−ＲＮＡを形成させ、該２本鎖形成前の蛍光偏光
度と該２本鎖形成後の蛍光偏光度との変化を測定するこ
とにより、試料中のＤＮＡまたはＲＮＡに存在する、上
記１本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡプローブに対応する塩基配
列を測定する方法。
【００１１】Ｃ．（１）試料中のＤＮＡまたはＲＮＡお
よび（２）試料中のＤＮＡまたはＲＮＡと相同な塩基配
列を有するＤＮＡまたはＲＮＡを固定化担体に結合させ
た固定化試薬を、（３）検体中のＤＮＡまたはＲＮＡと
相補的な塩基配列を有する蛍光標識されたＤＮＡまたは
ＲＮＡプローブと競合させて、２本鎖ＤＮＡまたはＲＮ
Ａ−ＤＮＡを形成させ、２本鎖形成前の蛍光偏光度と２
本鎖形成後の蛍光偏光度の変化を測定して、試料中のＤ
ＮＡまたはＲＮＡに存在する、該ＤＮＡまたはＲＮＡプ
ローブに相補的に対応する塩基配列を測定する方法。
よび（２）試料中のＤＮＡまたはＲＮＡと相同な塩基配
列を有するＤＮＡまたはＲＮＡを固定化担体に結合させ
た固定化試薬を、（３）検体中のＤＮＡまたはＲＮＡと
相補的な塩基配列を有する蛍光標識されたＤＮＡまたは
ＲＮＡプローブと競合させて、２本鎖ＤＮＡまたはＲＮ
Ａ−ＤＮＡを形成させ、２本鎖形成前の蛍光偏光度と２
本鎖形成後の蛍光偏光度の変化を測定して、試料中のＤ
ＮＡまたはＲＮＡに存在する、該ＤＮＡまたはＲＮＡプ
ローブに相補的に対応する塩基配列を測定する方法。
【００１２】本発明では試料中のＤＮＡまたはＲＮＡと
蛍光標識試薬とのハイブリダイゼーション反応を行わせ
るに際し、蛍光標識試薬の混合前あるいは混合後に、無
機酸塩または有機酸塩を添加し、ハイブリダイゼーショ
ンを、０．０１〜５ mol/l以上、好ましくは０．０５〜
３mol/l の濃度の無機酸塩または有機酸塩を含む溶液中
で行なう。０．０１ mol/l未満であると、ハイブリダイ
ゼーションが飽和に達するのにおよそ３０分以上必要と
し、実用に適さない。また無機酸塩または有機酸塩は５
mol/l を越えて溶解させることは難しい。
蛍光標識試薬とのハイブリダイゼーション反応を行わせ
るに際し、蛍光標識試薬の混合前あるいは混合後に、無
機酸塩または有機酸塩を添加し、ハイブリダイゼーショ
ンを、０．０１〜５ mol/l以上、好ましくは０．０５〜
３mol/l の濃度の無機酸塩または有機酸塩を含む溶液中
で行なう。０．０１ mol/l未満であると、ハイブリダイ
ゼーションが飽和に達するのにおよそ３０分以上必要と
し、実用に適さない。また無機酸塩または有機酸塩は５
mol/l を越えて溶解させることは難しい。
【００１３】本発明における無機酸塩としては、塩酸、
炭酸またはリン酸のアルカリ金属塩、アルカリ土類金属
塩またはアンモニウム塩などがあり、例えば塩化ナトリ
ウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化亜鉛等の
塩化物または炭酸ナトリウム、炭酸カルシウムまたはリ
ン酸ナトリウム等が挙げられる。
炭酸またはリン酸のアルカリ金属塩、アルカリ土類金属
塩またはアンモニウム塩などがあり、例えば塩化ナトリ
ウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化亜鉛等の
塩化物または炭酸ナトリウム、炭酸カルシウムまたはリ
ン酸ナトリウム等が挙げられる。
【００１４】本発明における有機酸塩としては、酢酸、
クエン酸、安息香酸またはフェノールのアルカリ金属
塩、アルカリ金土類金属塩又はアンモニウム塩などがあ
る。
クエン酸、安息香酸またはフェノールのアルカリ金属
塩、アルカリ金土類金属塩又はアンモニウム塩などがあ
る。
【００１５】上記塩は溶液中の塩濃度が０．０１〜５mo
l/l となるように添加する。そのためには、測定試薬ま
たは測定試料のいずれかあるいは両方に予め上記塩を添
加してもよい。また測定試薬または測定試料を塩を含む
緩衝液等によって希釈して用いてもよい。また測定試薬
と測定試料を混合した後、塩を含む溶液等を添加しても
よい。なお一般に塩の解離定数は非常に大きいので、こ
れらの塩を溶液に添加した場合、ほとんどが陽イオン、
陰イオンに解離した状態で存在する。
l/l となるように添加する。そのためには、測定試薬ま
たは測定試料のいずれかあるいは両方に予め上記塩を添
加してもよい。また測定試薬または測定試料を塩を含む
緩衝液等によって希釈して用いてもよい。また測定試薬
と測定試料を混合した後、塩を含む溶液等を添加しても
よい。なお一般に塩の解離定数は非常に大きいので、こ
れらの塩を溶液に添加した場合、ほとんどが陽イオン、
陰イオンに解離した状態で存在する。
【００１６】本発明において使用する蛍光標識として
は、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネー
ト、テトラメチルローダミンイソチオシアネートなどが
ある。ＤＮＡまたはＲＮＡに蛍光物質を結合させる方法
としては、例えばチオカルバミド結合などの共有結合に
よるものがある。例えばＤＮＡ（24塩基）をホスホアミ
ダイト法によって合成し、蛍光標識、例えばフルオレセ
インを標識する。
は、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネー
ト、テトラメチルローダミンイソチオシアネートなどが
ある。ＤＮＡまたはＲＮＡに蛍光物質を結合させる方法
としては、例えばチオカルバミド結合などの共有結合に
よるものがある。例えばＤＮＡ（24塩基）をホスホアミ
ダイト法によって合成し、蛍光標識、例えばフルオレセ
インを標識する。
【００１７】本発明に使用する蛍光標識試薬としては、
塩基数は２０ないし３０塩基程度あれば、ある特定の遺
伝子を特異的に検出できる（たとえば、Eur. J. Clin.
Microbiol. Infect. Dis., 10 (1991) 1048-1055参
照）。
塩基数は２０ないし３０塩基程度あれば、ある特定の遺
伝子を特異的に検出できる（たとえば、Eur. J. Clin.
Microbiol. Infect. Dis., 10 (1991) 1048-1055参
照）。
【００１８】本発明における試料中のＤＮＡまたはＲＮ
Ａとしては、例えば血清、尿、各種培養液などの測定試
料における細菌、ウイスルなどのＤＮＡまたはＲＮＡ、
または組織細胞やそれらの遊離ＤＮＡまたはＲＮＡなど
がある。
Ａとしては、例えば血清、尿、各種培養液などの測定試
料における細菌、ウイスルなどのＤＮＡまたはＲＮＡ、
または組織細胞やそれらの遊離ＤＮＡまたはＲＮＡなど
がある。
【００１９】試料中のＤＮＡまたはＲＮＡと蛍光標識試
薬とのハイブリダイゼーション反応を行う緩衝液として
は、Ｔｒｉｓ緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液な
どがある。該緩衝液には無機酸塩または有機酸塩のほか
に、アジ化ナトリウムやＥＤＴＡ等を含んでいてもよ
い。
薬とのハイブリダイゼーション反応を行う緩衝液として
は、Ｔｒｉｓ緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液な
どがある。該緩衝液には無機酸塩または有機酸塩のほか
に、アジ化ナトリウムやＥＤＴＡ等を含んでいてもよ
い。
【００２０】本発明に使用する担体としては、ポリスチ
レン、ナイロンなどの合成樹脂のビーズ、ラテックス粒
子、ガラスビーズやＡｕ、Ａｇなどの金属粒子などが挙
げられる。またタンパク質などの高分子物質を用いるこ
ともできる。固体担体の分子量は、蛍光偏光法の原理に
基づき、相補ＤＮＡまたはＲＮＡの分子量が蛍光標識Ｄ
ＮＡまたはＲＮＡの分子量に対して十分に大きくなるよ
うに選択される。固定化担体の分子量は蛍光標識ＤＮＡ
またはＲＮＡの分子量よりも５倍以上であることが好ま
しい。
レン、ナイロンなどの合成樹脂のビーズ、ラテックス粒
子、ガラスビーズやＡｕ、Ａｇなどの金属粒子などが挙
げられる。またタンパク質などの高分子物質を用いるこ
ともできる。固体担体の分子量は、蛍光偏光法の原理に
基づき、相補ＤＮＡまたはＲＮＡの分子量が蛍光標識Ｄ
ＮＡまたはＲＮＡの分子量に対して十分に大きくなるよ
うに選択される。固定化担体の分子量は蛍光標識ＤＮＡ
またはＲＮＡの分子量よりも５倍以上であることが好ま
しい。
【００２１】ＤＮＡまたはＲＮＡを固定化担体に結合さ
せる方法としては、吸着法、共有結合法、アビジンとビ
オチンとの特異的結合を利用する方法などがある。
せる方法としては、吸着法、共有結合法、アビジンとビ
オチンとの特異的結合を利用する方法などがある。
【００２２】以下に蛍光偏光測定の原理について簡単に
説明すると、光源から出る光はフィルターによって試薬
に含まれる蛍光物質の励起波長に濾過され、偏光板によ
って偏光される。この励起波長の偏光は測定物質（サン
プル）を入れたセルに投射され、サンプル中の蛍光物質
を励起する。励起された蛍光物質は、物質に応じた波長
の蛍光を発するが、この際ブラウン運動の激しさに対応
して、該蛍光は偏光の分散を起こす。該蛍光はその波長
を透過するフィルターを透過し、偏光板を透過し、光検
知器によって電気信号に変換される。偏光板を回転する
ことにより、サンプルの蛍光に対して励起偏光と同じ向
きの偏光成分Ｉａとこれと垂直の偏光成分Ｉｂを求め
る。これらの値を用いて、次に示す測定物質の蛍光偏光
度Ｐが求められる。
説明すると、光源から出る光はフィルターによって試薬
に含まれる蛍光物質の励起波長に濾過され、偏光板によ
って偏光される。この励起波長の偏光は測定物質（サン
プル）を入れたセルに投射され、サンプル中の蛍光物質
を励起する。励起された蛍光物質は、物質に応じた波長
の蛍光を発するが、この際ブラウン運動の激しさに対応
して、該蛍光は偏光の分散を起こす。該蛍光はその波長
を透過するフィルターを透過し、偏光板を透過し、光検
知器によって電気信号に変換される。偏光板を回転する
ことにより、サンプルの蛍光に対して励起偏光と同じ向
きの偏光成分Ｉａとこれと垂直の偏光成分Ｉｂを求め
る。これらの値を用いて、次に示す測定物質の蛍光偏光
度Ｐが求められる。
【００２３】
【数１】 Ｉａは励起偏光と同じ向きの偏光を示す。Ｉｂは上記Ｉ
ａに垂直な偏光成分を示す。
ａに垂直な偏光成分を示す。
【００２４】この場合、蛍光物質または蛍光物質を結合
する物質のブラウン運動が激しいほど、励起偏光と垂直
な向きの偏光成分Ｉｂは、これと平行の偏光成分Ｉａに
比べて大きくなり、すなわちＰは小さくなる。
する物質のブラウン運動が激しいほど、励起偏光と垂直
な向きの偏光成分Ｉｂは、これと平行の偏光成分Ｉａに
比べて大きくなり、すなわちＰは小さくなる。
【００２５】本発明では、サンプルセルに蛍光標識（蛍
光標識相補）ＤＮＡまたはＲＮＡを含む溶液を入れ、測
定対象ＤＮＡまたはＲＮＡを含む溶液を加え、続いて固
定化相補（固定化）ＤＮＡまたはＲＮＡ断片を含む溶液
を加える。ただし、これらの３種の溶液を加える順序は
限定しない。しかし試料中のＤＮＡまたはＲＮＡと蛍光
標識試薬とのハイブリダイゼーション反応を行わせるに
際し、蛍光標識試薬の混合前あるいは混合後に、無機酸
塩または有機酸塩を添加する。加える蛍光標識ＤＮＡま
たはＲＮＡおよび固定化相補ＤＮＡまたはＲＮＡの濃度
は、測定対象ＤＮＡまたはＲＮＡの測定濃度範囲に応じ
て適切に選択される。
光標識相補）ＤＮＡまたはＲＮＡを含む溶液を入れ、測
定対象ＤＮＡまたはＲＮＡを含む溶液を加え、続いて固
定化相補（固定化）ＤＮＡまたはＲＮＡ断片を含む溶液
を加える。ただし、これらの３種の溶液を加える順序は
限定しない。しかし試料中のＤＮＡまたはＲＮＡと蛍光
標識試薬とのハイブリダイゼーション反応を行わせるに
際し、蛍光標識試薬の混合前あるいは混合後に、無機酸
塩または有機酸塩を添加する。加える蛍光標識ＤＮＡま
たはＲＮＡおよび固定化相補ＤＮＡまたはＲＮＡの濃度
は、測定対象ＤＮＡまたはＲＮＡの測定濃度範囲に応じ
て適切に選択される。
【００２６】本発明では蛍光標識ＤＮＡまたはＲＮＡ
は、無機塩または有機塩の存在下に測定対象ＤＮＡまた
はＲＮＡと競合しつつ、相補的結合反応により固定化酵
素ＤＮＡまたはＲＮＡと結合する。蛍光標識ＤＮＡまた
はＲＮＡが固定化相補ＤＮＡまたはＲＮＡと結合する
際、見掛け上大きな分子量変化が生じるので、結合した
量に対応して上述した蛍光偏光度Ｐの値が求められる。
測定対象ＤＮＡの濃度に対応して固定化ＤＮＡまたはＲ
ＮＡと結合する蛍光標識ＤＮＡまたはＲＮＡの量が決定
される。したがって、偏光度Ｐが求められれば、測定対
象ＤＮＡまたはＲＮＡの濃度が求められる。
は、無機塩または有機塩の存在下に測定対象ＤＮＡまた
はＲＮＡと競合しつつ、相補的結合反応により固定化酵
素ＤＮＡまたはＲＮＡと結合する。蛍光標識ＤＮＡまた
はＲＮＡが固定化相補ＤＮＡまたはＲＮＡと結合する
際、見掛け上大きな分子量変化が生じるので、結合した
量に対応して上述した蛍光偏光度Ｐの値が求められる。
測定対象ＤＮＡの濃度に対応して固定化ＤＮＡまたはＲ
ＮＡと結合する蛍光標識ＤＮＡまたはＲＮＡの量が決定
される。したがって、偏光度Ｐが求められれば、測定対
象ＤＮＡまたはＲＮＡの濃度が求められる。
【００２７】
【実施例】以下に本発明を実施例を用いて説明する。 参考例１ 以下に示すＤＮＡ（24塩基）をホスホアミダイト法によ
って合成し、フルオレセインで標識して測定試薬とし
た。これは上記文献(Eur. J. Clin. Microbiol.Infect.
Dis., 10 (1991) 1048-1055 ）で報告されている毒素
原性大腸菌の易熱性腸管毒素の遺伝子を構成するＤＮＡ
の塩基配列の一部である。さらに、これと相補的なＤＮ
Ａ（24塩基）を同様にして合成した。また対照実験用と
して、ランダム配列ＤＮＡ（30塩基）を同様に合成し
た。ランダムな配列は乱数表を用いて決定した。これら
のＤＮＡの塩基配列をそれぞれ順に示す（便宜的にこれ
らを順にＤＮＡ１、ＤＮＡ２、ＤＮＡ３とよぶ）。なお
A, C, G, T はそれぞれアデニン、シトシン、グアニ
ン、チミンを表す。F は標識として用いたフルオレセイ
ンを示す。数字はＤＮＡ末端の符号を示す。
って合成し、フルオレセインで標識して測定試薬とし
た。これは上記文献(Eur. J. Clin. Microbiol.Infect.
Dis., 10 (1991) 1048-1055 ）で報告されている毒素
原性大腸菌の易熱性腸管毒素の遺伝子を構成するＤＮＡ
の塩基配列の一部である。さらに、これと相補的なＤＮ
Ａ（24塩基）を同様にして合成した。また対照実験用と
して、ランダム配列ＤＮＡ（30塩基）を同様に合成し
た。ランダムな配列は乱数表を用いて決定した。これら
のＤＮＡの塩基配列をそれぞれ順に示す（便宜的にこれ
らを順にＤＮＡ１、ＤＮＡ２、ＤＮＡ３とよぶ）。なお
A, C, G, T はそれぞれアデニン、シトシン、グアニ
ン、チミンを表す。F は標識として用いたフルオレセイ
ンを示す。数字はＤＮＡ末端の符号を示す。
【００２８】 5'-F AAC AGG GAA TAC AGA GAC CGG TAT -3' （ＤＮＡ１） 3'-TTG TCC CTT ATG TCT CTG GCC ATA -5' （ＤＮＡ２） 3'-GGA TTA CGT ATC TAC GCG ATG ACG GCC ACC-5' （ＤＮＡ３）
【００２９】実施例１ ＤＮＡ１を含む溶液にＤＮＡ２を加え、加えた直後から
１分または２分間隔で蛍光偏光度を測定した。光検出器
として光電子増倍管を使用して測定した。その結果を図
１に示す。ここでＤＮＡ２は標的ＤＮＡのモデルとして
用いられる。なお溶液は３６℃に維持した。ＤＮＡ１、
ＤＮＡ２、ＤＮＡ３の混合後の溶液中の濃度はそれぞ
れ、９×10-9、７×10-8、６×10-8 mol/lである。希釈
用緩衝液としてはＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）を用いた。図
１より、ＤＮＡ１とＤＮＡ２とは互いに相補的なのでハ
イブリダイゼーションにより会合し、蛍光偏光度が徐々
に大きくなっていることが分かる。しかし、反応は４時
間程度経過しても飽和に達していない。すなわち溶液中
に無機酸塩あるいは有機酸塩を含まない条件では上記Ｄ
ＮＡのハイブリダイゼーションの速度は非常に小さい。
ここで図１中に、ＤＮＡ１とＤＮＡ３とを混合し同様に
測定した結果を示す。ＤＮＡ１とＤＮＡ３とは互いに相
補的でないので会合反応は起こらず、蛍光偏光度は増加
しない。
１分または２分間隔で蛍光偏光度を測定した。光検出器
として光電子増倍管を使用して測定した。その結果を図
１に示す。ここでＤＮＡ２は標的ＤＮＡのモデルとして
用いられる。なお溶液は３６℃に維持した。ＤＮＡ１、
ＤＮＡ２、ＤＮＡ３の混合後の溶液中の濃度はそれぞ
れ、９×10-9、７×10-8、６×10-8 mol/lである。希釈
用緩衝液としてはＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）を用いた。図
１より、ＤＮＡ１とＤＮＡ２とは互いに相補的なのでハ
イブリダイゼーションにより会合し、蛍光偏光度が徐々
に大きくなっていることが分かる。しかし、反応は４時
間程度経過しても飽和に達していない。すなわち溶液中
に無機酸塩あるいは有機酸塩を含まない条件では上記Ｄ
ＮＡのハイブリダイゼーションの速度は非常に小さい。
ここで図１中に、ＤＮＡ１とＤＮＡ３とを混合し同様に
測定した結果を示す。ＤＮＡ１とＤＮＡ３とは互いに相
補的でないので会合反応は起こらず、蛍光偏光度は増加
しない。
【００３０】これに対して、ＤＮＡ１とＤＮＡ２または
ＤＮＡ３を予め0.8mol/lの塩化ナトリウムを含むＴｒｉ
ｓ緩衝液に溶解し、図１の場合と同様の実験を行った。
実験条件は、溶液中に該濃度の塩を含む以外は、すべて
図１の場合と同じである。その結果を図２に示す。ＤＮ
Ａ１またはＤＮＡ２とのハイブリダイゼーションは非常
に早く進行し、およそ１０分未満で飽和に達することが
分かる。すなわちハイブリダイゼーションの速度は、溶
液中の塩イオンの存在によって大きく変化することが分
かる。
ＤＮＡ３を予め0.8mol/lの塩化ナトリウムを含むＴｒｉ
ｓ緩衝液に溶解し、図１の場合と同様の実験を行った。
実験条件は、溶液中に該濃度の塩を含む以外は、すべて
図１の場合と同じである。その結果を図２に示す。ＤＮ
Ａ１またはＤＮＡ２とのハイブリダイゼーションは非常
に早く進行し、およそ１０分未満で飽和に達することが
分かる。すなわちハイブリダイゼーションの速度は、溶
液中の塩イオンの存在によって大きく変化することが分
かる。
【００３１】同様に、溶液中に0.05mol/l の塩化ナトリ
ウムを含む場合の実験例を図３に示す。実験条件は、溶
液中の塩濃度以外はすべて図２の場合と同じである。図
２の場合と同様に、溶液中に塩化ナトリウムを含まない
場合（図１の場合）に比べてハイブリダイゼーションは
非常に早く進行し飽和に達することが分かる。
ウムを含む場合の実験例を図３に示す。実験条件は、溶
液中の塩濃度以外はすべて図２の場合と同じである。図
２の場合と同様に、溶液中に塩化ナトリウムを含まない
場合（図１の場合）に比べてハイブリダイゼーションは
非常に早く進行し飽和に達することが分かる。
【００３２】なお、実施例で用いた易熱性腸管毒素の遺
伝子の塩基配列はモデルとして用いたにすぎないのであ
り、本発明の測定法を限定するものではない。また実施
例ではＤＮＡの測定を例として示すが、用いたＤＮＡそ
れぞれについてＲＮＡと置き換えても基本的に同様であ
る。
伝子の塩基配列はモデルとして用いたにすぎないのであ
り、本発明の測定法を限定するものではない。また実施
例ではＤＮＡの測定を例として示すが、用いたＤＮＡそ
れぞれについてＲＮＡと置き換えても基本的に同様であ
る。
【００３３】
【発明の効果】本発明では、溶液中に０．０１〜５mol/
l の無機酸塩または有機酸塩を含むことにより、ハイブ
リダイゼーションは充分に早く進行し飽和に達する。該
条件においてはハイブリダイゼーションは１０〜２０分
未満で飽和に達する。したがってハイブリダイズした蛍
光標識試薬を蛍光偏光法によってモニターすれば、ハイ
ブリダイゼーションの反応時間を含めて２０〜３０分以
内に測定を完了することが可能である。本発明に基づく
測定法によれば、ＤＮＡまたはＲＮＡを短時間で測定す
ることが可能となり、遺伝子の診断やウイルス、細菌の
検出等の作業の短時間化およびコストの低減等が可能と
なる。
l の無機酸塩または有機酸塩を含むことにより、ハイブ
リダイゼーションは充分に早く進行し飽和に達する。該
条件においてはハイブリダイゼーションは１０〜２０分
未満で飽和に達する。したがってハイブリダイズした蛍
光標識試薬を蛍光偏光法によってモニターすれば、ハイ
ブリダイゼーションの反応時間を含めて２０〜３０分以
内に測定を完了することが可能である。本発明に基づく
測定法によれば、ＤＮＡまたはＲＮＡを短時間で測定す
ることが可能となり、遺伝子の診断やウイルス、細菌の
検出等の作業の短時間化およびコストの低減等が可能と
なる。
【００３４】
【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 他の特徴：毒素原性大腸菌の易熱性腸管毒素の遺伝子を
構成するＤＮＡの塩基配列の一部 配列 AACAGGGAAT ACAGAGACCG GTAT 24
構成するＤＮＡの塩基配列の一部 配列 AACAGGGAAT ACAGAGACCG GTAT 24
【００３５】配列番号：２ 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 他の特徴：毒素原性大腸菌の易熱性腸管毒素の遺伝子を
構成するＤＮＡの塩基配列の一部 配列 ATACCGGTCT CTGTATTCCC TGTT 24
構成するＤＮＡの塩基配列の一部 配列 ATACCGGTCT CTGTATTCCC TGTT 24
【００３６】配列番号：３ 配列の長さ：30 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 CCACCGGCAG TAGCGCATCT ATGCATTAGG 30
【図１】ＤＮＡ１とＤＮＡ２またはＤＮＡ３を無機塩が
存在しない条件下にハイブリダイズさせた結果を示す。
存在しない条件下にハイブリダイズさせた結果を示す。
【図２】ＤＮＡ１とＤＮＡ２またはＤＮＡ３を塩化ナト
リウムを含むＴｒｉｓ緩衝液中でハイブリダイズさせた
結果を示す。
リウムを含むＴｒｉｓ緩衝液中でハイブリダイズさせた
結果を示す。
【図３】ＤＮＡ１とＤＮＡ２またはＤＮＡ３を塩化ナト
リウムを含むＴｒｉｓ緩衝液中でハイブリダイズさせた
結果を示す。
リウムを含むＴｒｉｓ緩衝液中でハイブリダイズさせた
結果を示す。
Claims (7)
- 【請求項１】 試料に蛍光標識試薬を加えて混合し、試
料中のＤＮＡまたはＲＮＡと蛍光標識試薬とのハイブリ
ダイゼーション反応を行った後、蛍光標識に起因して発
生する信号による蛍光偏光度を計測することによる、Ｄ
ＮＡまたはＲＮＡを測定する方法において、試料中のＤ
ＮＡまたはＲＮＡと蛍光標識試薬とのハイブリダイゼー
ション反応を行わせるに際し、蛍光標識試薬の混合前あ
るいは混合後に、無機酸塩または有機酸塩を添加するこ
とを特徴とする蛍光偏光法によるＤＮＡまたはＲＮＡの
測定方法。 - 【請求項２】 試料中のＤＮＡまたはＲＮＡと蛍光標識
試薬とのハイブリダイゼーションを、０．０１〜５ mol
/lの濃度の無機酸塩または有機酸塩を含む溶液中で行な
うことを特徴とする請求項１に記載される蛍光偏光法に
よるＤＮＡまたはＲＮＡの測定方法。 - 【請求項３】 試料中のＤＮＡまたはＲＮＡと蛍光標識
試薬とのハイブリダイゼーションを、０．０５〜３ mol
/lの濃度の無機酸塩または有機酸塩を含む溶液中で行な
うことを特徴とする請求項１に記載される蛍光偏光法に
よるＤＮＡまたはＲＮＡの測定方法。 - 【請求項４】 無機酸塩が塩酸、炭酸またはリン酸のア
ルカリ金属塩、アルカリ土類金属またはアンモニウム塩
であることを特徴とする請求項１記載の蛍光偏光法によ
るＤＮＡまたはＲＮＡの測定方法。 - 【請求項５】 無機酸塩が塩化ナトリウムであることを
特徴とする請求項１記載の蛍光偏光法によるＤＮＡまた
はＲＮＡの測定方法。 - 【請求項６】 有機酸塩が酢酸、クエン酸、安息香酸ま
たはフェノールのアルカリ金属、アルカリ土類金属また
はアンモニウム塩であることを特徴とする請求項１記載
の蛍光偏光法によるＤＮＡまたはＲＮＡの測定方法。 - 【請求項７】 蛍光標識試薬が蛍光標識を結合したＤＮ
ＡまたはＲＮＡであることを特徴とする請求項１に記載
される蛍光偏光法によるＤＮＡまたはＲＮＡの測定方
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3471994A JPH07243971A (ja) | 1994-03-04 | 1994-03-04 | 蛍光偏光法によるｄｎａまたはｒｎａの測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3471994A JPH07243971A (ja) | 1994-03-04 | 1994-03-04 | 蛍光偏光法によるｄｎａまたはｒｎａの測定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07243971A true JPH07243971A (ja) | 1995-09-19 |
Family
ID=12422145
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3471994A Pending JPH07243971A (ja) | 1994-03-04 | 1994-03-04 | 蛍光偏光法によるｄｎａまたはｒｎａの測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07243971A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008505321A (ja) * | 2004-07-02 | 2008-02-21 | ブルーシフト・バイオテクノロジーズ・インコーポレーテッド | 蛍光体微小環境の探索 |
-
1994
- 1994-03-04 JP JP3471994A patent/JPH07243971A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008505321A (ja) * | 2004-07-02 | 2008-02-21 | ブルーシフト・バイオテクノロジーズ・インコーポレーテッド | 蛍光体微小環境の探索 |
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