JPH0716100A - 血清鉄の測定法および測定用組成物 - Google Patents
血清鉄の測定法および測定用組成物Info
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- JPH0716100A JPH0716100A JP17373092A JP17373092A JPH0716100A JP H0716100 A JPH0716100 A JP H0716100A JP 17373092 A JP17373092 A JP 17373092A JP 17373092 A JP17373092 A JP 17373092A JP H0716100 A JPH0716100 A JP H0716100A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 酸性雰囲気にして血清中のトランスフェリン
から鉄を遊離させた後、アコニターゼ、還元剤、クエン
酸、イソクエン酸脱水素酵素、（チオ）ＮＡＤ（Ｐ）を
少なくとも含有する反応系と被検試料とを接触せしめ
て、血清鉄を測定する。 【効果】 微量の鉄であっても正確且つ効率的に血清中
の鉄を測定することができる。
から鉄を遊離させた後、アコニターゼ、還元剤、クエン
酸、イソクエン酸脱水素酵素、（チオ）ＮＡＤ（Ｐ）を
少なくとも含有する反応系と被検試料とを接触せしめ
て、血清鉄を測定する。 【効果】 微量の鉄であっても正確且つ効率的に血清中
の鉄を測定することができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は血清鉄の定量方法に関
し、さらに詳しくは、トランスフェリンに結合している
鉄を遊離させ、鉄を加えないと活性を発現しないアポ型
アコニターゼ（ＥＣ ４．２．１．３）を接触せしめて
活性型としクエン酸から生じるイソクエン酸をイソクエ
ン酸脱水素酵素（ＥＣ １．１．１．４１，ＥＣ １．
１．１．４２）の反応によって血清鉄量を定量する高感
度な酵素定量方法および測定用試薬に関する。
し、さらに詳しくは、トランスフェリンに結合している
鉄を遊離させ、鉄を加えないと活性を発現しないアポ型
アコニターゼ（ＥＣ ４．２．１．３）を接触せしめて
活性型としクエン酸から生じるイソクエン酸をイソクエ
ン酸脱水素酵素（ＥＣ １．１．１．４１，ＥＣ １．
１．１．４２）の反応によって血清鉄量を定量する高感
度な酵素定量方法および測定用試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術及びその課題】体内鉄の総量は４ｇ前後
で、その２／３は赤血球ヘモグロビン中に、残りの１／
３は貯蔵鉄として肝・脾・骨髄その他の組織に存在す
る。血清鉄の総量は３〜４ｍｇであり、すべて血清のβ
−グロブリンに属するトランスフェリンに結合（その１
分子は鉄２原子を結合）して存在する。血清鉄濃度は、
赤血球の生成と崩壊の程度によって左右され、骨髄にお
ける造血が減退すれば血清鉄の流れは停滞して、血清鉄
濃度は上昇し、逆の場合は低下する。このことより血清
鉄濃度は造血器の機能を反映すると考えられている。ま
た貯蔵鉄の動態も血清鉄に関係があり、肝炎などでは肝
から貯蔵鉄が動員されて他の組織に移動するため、血清
鉄は上昇する。上述のように血清鉄は血液疾患（鉄欠乏
性貧血、再生不良性貧血、悪性貧血、溶血性貧血、白血
病、真性多血症など）のみでなく、多種の疾患（感染
症、急性肝炎、肝硬変症、ヘモクロマトーシス、ネフロ
ーゼなど）と関係があり、その測定は臨床検査上重要視
されている。
で、その２／３は赤血球ヘモグロビン中に、残りの１／
３は貯蔵鉄として肝・脾・骨髄その他の組織に存在す
る。血清鉄の総量は３〜４ｍｇであり、すべて血清のβ
−グロブリンに属するトランスフェリンに結合（その１
分子は鉄２原子を結合）して存在する。血清鉄濃度は、
赤血球の生成と崩壊の程度によって左右され、骨髄にお
ける造血が減退すれば血清鉄の流れは停滞して、血清鉄
濃度は上昇し、逆の場合は低下する。このことより血清
鉄濃度は造血器の機能を反映すると考えられている。ま
た貯蔵鉄の動態も血清鉄に関係があり、肝炎などでは肝
から貯蔵鉄が動員されて他の組織に移動するため、血清
鉄は上昇する。上述のように血清鉄は血液疾患（鉄欠乏
性貧血、再生不良性貧血、悪性貧血、溶血性貧血、白血
病、真性多血症など）のみでなく、多種の疾患（感染
症、急性肝炎、肝硬変症、ヘモクロマトーシス、ネフロ
ーゼなど）と関係があり、その測定は臨床検査上重要視
されている。
【０００３】血清鉄の定量方法としては、松原法、国際
標準法、オートアナライザー法、原子吸光法などがあ
る。松原法、国際標準法の原理は、酸で鉄を遊離後、除
タンパクし、還元剤で鉄を還元した後、発色剤で発色さ
せる方法であるが、ＢＰＴのモル吸光係数が小さく、感
度が低いため多量の血清を必要とし、干渉を受けやす
く、用手法であるため多検体処理は困難である。オート
アナライザー法は、松原法、国際標準法の原理を単に自
動化したものであるので、感度的問題はまったく解決さ
れておらずヘモグロビン、ビリルビンなどの干渉がみら
れる。原子吸光法は、前処理が必要なうえ処理方法の違
いにより測定値にかなりのばらつきがみられ、感度が悪
いなどの問題の他に、高価な特殊機器が必要であるなど
の多くの問題点をかかえている。
標準法、オートアナライザー法、原子吸光法などがあ
る。松原法、国際標準法の原理は、酸で鉄を遊離後、除
タンパクし、還元剤で鉄を還元した後、発色剤で発色さ
せる方法であるが、ＢＰＴのモル吸光係数が小さく、感
度が低いため多量の血清を必要とし、干渉を受けやす
く、用手法であるため多検体処理は困難である。オート
アナライザー法は、松原法、国際標準法の原理を単に自
動化したものであるので、感度的問題はまったく解決さ
れておらずヘモグロビン、ビリルビンなどの干渉がみら
れる。原子吸光法は、前処理が必要なうえ処理方法の違
いにより測定値にかなりのばらつきがみられ、感度が悪
いなどの問題の他に、高価な特殊機器が必要であるなど
の多くの問題点をかかえている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記した従
来法の欠点を一挙に解決して、生体内の、特に血清中の
鉄の量を正確に且つ熟練を要することなく簡便、迅速に
測定することができ、自動化ないし多検体処理を可能と
する、血清鉄の高感度分析システムを新規に開発するこ
とを、目的とするものである。
来法の欠点を一挙に解決して、生体内の、特に血清中の
鉄の量を正確に且つ熟練を要することなく簡便、迅速に
測定することができ、自動化ないし多検体処理を可能と
する、血清鉄の高感度分析システムを新規に開発するこ
とを、目的とするものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明は、上記目的を達
成するためになされたものであって、本発明者らは、血
清鉄量をすみやかに、かつ、正確に定量するために、鉄
と各種酵素活性との関係を詳細に検討した結果、アコニ
ターゼがその酵素活性を発現するために、鉄を要求し、
血清鉄濃度の増加に応じてアコニターゼの活性が変化す
ることを知り、そしてその変化を測定することによって
血清鉄量が測定できることを確認し、本発明を完成する
に至った。
成するためになされたものであって、本発明者らは、血
清鉄量をすみやかに、かつ、正確に定量するために、鉄
と各種酵素活性との関係を詳細に検討した結果、アコニ
ターゼがその酵素活性を発現するために、鉄を要求し、
血清鉄濃度の増加に応じてアコニターゼの活性が変化す
ることを知り、そしてその変化を測定することによって
血清鉄量が測定できることを確認し、本発明を完成する
に至った。
【０００６】アコニターゼがその活性発現に鉄を要求す
ることは良く知られている〔蛋白質核酸 酵素Ｖｏｌ．
２２ Ｎｏ．１２ １２９３−１３０２（１９７７）；
ＴＨＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ
ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ Ｖｏｌ．２３６，Ｎｏ．１２，
Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １９６１；ＴＨＥ ＪＯＵＲＮＡＬ
ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ
Ｖｏｌ．２４２，Ｎｏ．８，Ｉｓｓｕｅ ｏｆ Ａｐｒ
ｉｌ ２５，ｐｐ．１８７０−１８７９，１９６７；Ｔ
ＨＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ
ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ Ｖｏｌ．２４６，Ｎｏ．３，Ｉｓ
ｓｕｅ ｏｆ Ｆｅｂｒｕａｒｙ １０，ｐｐ．７７２
−７７９，１９７１；Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．６４，８８１
−８８３，Ｍａｒｃｈ ８，１９９１〕。しかしながら
いずれの文献も、例えば、血清鉄のような低濃度な鉄
（正常値；血清 男性１１．６〜３４．９μＭ、女性；
７．２９〜２９．５μＭ）を測定できるものはなく、臨
床検査で日常使用されているような直線的なスタンダー
ドカーブも得られてはいない。本発明の方法は、上記の
ような低濃度な血清鉄を直線性の良好なスタンダードカ
ーブによって、再現性よく高感度に測定することを可能
にした。
ることは良く知られている〔蛋白質核酸 酵素Ｖｏｌ．
２２ Ｎｏ．１２ １２９３−１３０２（１９７７）；
ＴＨＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ
ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ Ｖｏｌ．２３６，Ｎｏ．１２，
Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １９６１；ＴＨＥ ＪＯＵＲＮＡＬ
ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ
Ｖｏｌ．２４２，Ｎｏ．８，Ｉｓｓｕｅ ｏｆ Ａｐｒ
ｉｌ ２５，ｐｐ．１８７０−１８７９，１９６７；Ｔ
ＨＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ
ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ Ｖｏｌ．２４６，Ｎｏ．３，Ｉｓ
ｓｕｅ ｏｆ Ｆｅｂｒｕａｒｙ １０，ｐｐ．７７２
−７７９，１９７１；Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．６４，８８１
−８８３，Ｍａｒｃｈ ８，１９９１〕。しかしながら
いずれの文献も、例えば、血清鉄のような低濃度な鉄
（正常値；血清 男性１１．６〜３４．９μＭ、女性；
７．２９〜２９．５μＭ）を測定できるものはなく、臨
床検査で日常使用されているような直線的なスタンダー
ドカーブも得られてはいない。本発明の方法は、上記の
ような低濃度な血清鉄を直線性の良好なスタンダードカ
ーブによって、再現性よく高感度に測定することを可能
にした。
【０００７】本発明は、血清鉄の定量を行うに際し、ト
ランスフェリンに結合している血清鉄を遊離させ、活性
型アコニターゼを形成せしめ、アコニターゼの反応より
生じるイソクエン酸をイソクエン酸脱水素酵素によって
酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類（以降
ＮＡＤ類という）または／および、酸化型ニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチドリン酸類（以降ＮＡＤＰ類と
いう）から、還元型ＮＡＤ類（以降ＮＡＤＨ類という）
または／および、還元型ＮＡＤＰ類（以降ＮＡＤＰＨ類
という）への変化量として血清鉄濃度に依存して変化す
るアコニターゼ活性を検出することによって血清鉄量を
測定することを基本的測定原理とするものである。具体
的には、トランスフェリンと結合している鉄を酸性ｐＨ
の溶液で遊離させ、少なくともアポ型アコニターゼを溶
解した緩衝液に加え、アポ型アコニターゼをホロ型アコ
ニターゼとし、クエン酸を少なくとも含む適当な緩衝液
で、ＮＡＤＨ類または／およびＮＡＤＰＨ類の生成量あ
るいは生成速度を測定することによって血清鉄量を測定
するものである。
ランスフェリンに結合している血清鉄を遊離させ、活性
型アコニターゼを形成せしめ、アコニターゼの反応より
生じるイソクエン酸をイソクエン酸脱水素酵素によって
酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類（以降
ＮＡＤ類という）または／および、酸化型ニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチドリン酸類（以降ＮＡＤＰ類と
いう）から、還元型ＮＡＤ類（以降ＮＡＤＨ類という）
または／および、還元型ＮＡＤＰ類（以降ＮＡＤＰＨ類
という）への変化量として血清鉄濃度に依存して変化す
るアコニターゼ活性を検出することによって血清鉄量を
測定することを基本的測定原理とするものである。具体
的には、トランスフェリンと結合している鉄を酸性ｐＨ
の溶液で遊離させ、少なくともアポ型アコニターゼを溶
解した緩衝液に加え、アポ型アコニターゼをホロ型アコ
ニターゼとし、クエン酸を少なくとも含む適当な緩衝液
で、ＮＡＤＨ類または／およびＮＡＤＰＨ類の生成量あ
るいは生成速度を測定することによって血清鉄量を測定
するものである。
【０００８】松原法、国際標準法、オートアナライザー
法、原子吸光法は１個の鉄に対して１個の応答しか得ら
れないのに対して、本発明の酵素的定量法は、酵素が増
幅作用を示すことにより１個の鉄に対して多数の応答が
得られるという点で高感度化、精密性につながる。また
鉄への特異性が高いという点で現行の測定法より優れて
いる。
法、原子吸光法は１個の鉄に対して１個の応答しか得ら
れないのに対して、本発明の酵素的定量法は、酵素が増
幅作用を示すことにより１個の鉄に対して多数の応答が
得られるという点で高感度化、精密性につながる。また
鉄への特異性が高いという点で現行の測定法より優れて
いる。
【０００９】血清中の鉄は、すべてがトランスフェリン
と結合している。そこで本発明においては、血清中のト
ランスフェリンから鉄を遊離せしめ、遊離した鉄を測定
することとした。
と結合している。そこで本発明においては、血清中のト
ランスフェリンから鉄を遊離せしめ、遊離した鉄を測定
することとした。
【００１０】そこで、血清中のトランスフェリンから鉄
を定量的に遊離することができ、しかも該遊離処理がそ
の後に行う鉄の測定にはいささかも悪影響を及ぼすこと
がなく、そのうえ処理が簡便な方法について各方面から
鋭意研究した結果、酸性雰囲気にすることによりこの目
的が達成できるとの新知見を得た。したがって、本発明
においては測定系を酸性ｐＨ域にもっていけばよく、そ
のためにはすべての方法が利用可能であるが、例えば酸
性の緩衝液を利用することができる。
を定量的に遊離することができ、しかも該遊離処理がそ
の後に行う鉄の測定にはいささかも悪影響を及ぼすこと
がなく、そのうえ処理が簡便な方法について各方面から
鋭意研究した結果、酸性雰囲気にすることによりこの目
的が達成できるとの新知見を得た。したがって、本発明
においては測定系を酸性ｐＨ域にもっていけばよく、そ
のためにはすべての方法が利用可能であるが、例えば酸
性の緩衝液を利用することができる。
【００１１】トランスフェリンに結合している血清鉄を
遊離させる工程に使用できる緩衝液は、酢酸バッファ
ー、ＧＴＡバッファー、シュウ酸バッファー、リン酸バ
ッファー、グリシンバッファー、ＨＣｌ−ＫＣｌバッフ
ァー、重フタル酸カリウムバッファー、コハク酸バッフ
ァーなどがあげられるが、緩衝液の最適ｐＨが、１〜
５、好ましくは２〜４の範囲のものであれば良く、試薬
濃度は、１〜１，０００ｍＭ、好ましくは１０〜５００
ｍＭを用い、特に規定されることはない。また、効果的
な場合には、界面活性剤、還元剤などを添加しても構わ
ない。界面活性剤としては、陰イオン性界面活性剤、陽
イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン性界面
活性剤、ステロイド骨格を持つ界面活性剤などがあげら
れる。
遊離させる工程に使用できる緩衝液は、酢酸バッファ
ー、ＧＴＡバッファー、シュウ酸バッファー、リン酸バ
ッファー、グリシンバッファー、ＨＣｌ−ＫＣｌバッフ
ァー、重フタル酸カリウムバッファー、コハク酸バッフ
ァーなどがあげられるが、緩衝液の最適ｐＨが、１〜
５、好ましくは２〜４の範囲のものであれば良く、試薬
濃度は、１〜１，０００ｍＭ、好ましくは１０〜５００
ｍＭを用い、特に規定されることはない。また、効果的
な場合には、界面活性剤、還元剤などを添加しても構わ
ない。界面活性剤としては、陰イオン性界面活性剤、陽
イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン性界面
活性剤、ステロイド骨格を持つ界面活性剤などがあげら
れる。
【００１２】本発明に使用できる還元剤としては、アス
コルビン酸、チオ−グリコール酸、チオ−マレート、シ
ステイン、Ｎ−アセチルシステイン、ヒドロキシルアミ
ン、２−メルカプトエタノール、還元型グルタチオン、
ジチオトレイトール、ジチオエリトリオール、臭化２−
アミノエチルイソチオウロニウム及びチオ−グリセロー
ルなどのほかに、アコニターゼへの鉄の結合を促進する
ものであれば何を使っても構わない。試薬濃度は、０〜
１，０００ｍＭ、好ましくは０．１〜５００ｍＭを用い
る。
コルビン酸、チオ−グリコール酸、チオ−マレート、シ
ステイン、Ｎ−アセチルシステイン、ヒドロキシルアミ
ン、２−メルカプトエタノール、還元型グルタチオン、
ジチオトレイトール、ジチオエリトリオール、臭化２−
アミノエチルイソチオウロニウム及びチオ−グリセロー
ルなどのほかに、アコニターゼへの鉄の結合を促進する
ものであれば何を使っても構わない。試薬濃度は、０〜
１，０００ｍＭ、好ましくは０．１〜５００ｍＭを用い
る。
【００１３】本発明に使用できるアコニターゼとしては
鉄の添加無添加によって活性が変化するものであればよ
く、特に規定されることはない。また、アポ型アコニタ
ーゼの調整法としては、キレート剤処理があげられる。
キレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸類（ＥＤ
ＴＡ類）、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸
（ＥＤＴＡ−ＯＨ）、シクロヘキサンジアミン四酢酸
（ＣｙＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰ
Ａ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＧＥＤＴ
Ａ）、トリエチレンテトラミン六酢酸（ＴＴＨＡ）、ジ
アミノプロパノール四酢酸（ＤＰＴＡ−ＯＨ）、ｏ−フ
ェナントロリンなどが有効であり、鉄を加えていない状
況でのバックグランドができるだけ小さなものが好まし
い。また、エチレンジアミン四酢酸類（ＥＤＴＡ類）
は、遊離酸型、アルカリ、ナトリウム、アンモニウムな
どの塩型のアルコール沈殿物でも結晶物でもよく、特に
規定されることはない。添加する酵素濃度は、０．０１
〜１００ｕ／ｍｌ、好ましくは０．１〜３０ｕ／ｍｌを
用いる。
鉄の添加無添加によって活性が変化するものであればよ
く、特に規定されることはない。また、アポ型アコニタ
ーゼの調整法としては、キレート剤処理があげられる。
キレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸類（ＥＤ
ＴＡ類）、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸
（ＥＤＴＡ−ＯＨ）、シクロヘキサンジアミン四酢酸
（ＣｙＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰ
Ａ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＧＥＤＴ
Ａ）、トリエチレンテトラミン六酢酸（ＴＴＨＡ）、ジ
アミノプロパノール四酢酸（ＤＰＴＡ−ＯＨ）、ｏ−フ
ェナントロリンなどが有効であり、鉄を加えていない状
況でのバックグランドができるだけ小さなものが好まし
い。また、エチレンジアミン四酢酸類（ＥＤＴＡ類）
は、遊離酸型、アルカリ、ナトリウム、アンモニウムな
どの塩型のアルコール沈殿物でも結晶物でもよく、特に
規定されることはない。添加する酵素濃度は、０．０１
〜１００ｕ／ｍｌ、好ましくは０．１〜３０ｕ／ｍｌを
用いる。
【００１４】本発明に使用できるイソクエン酸脱水素酵
素としては、イソクエン酸へのＫｍ値が小さいものが好
まれるが本反応によって生成されるイソクエン酸と反応
でき得るものであれば、特に規定されることはない。Ｎ
ＡＤ類に特異的なものでも、ＮＡＤＰ類に特異的なもの
でも差し支えない。添加する酵素濃度は、０．０１〜２
００ｕ／ｍｌ、好ましくは０．１〜２０ｕ／ｍｌを用い
る。また、イソクエン酸脱水素酵素およびアコニターゼ
が、その酵素活性を発現するために、マグネシウムイオ
ンあるいはマンガンイオンを要求するが、その試薬濃度
は、０．５μＭ〜１００ｍＭ、好ましくは５μＭ〜１０
ｍＭを用いる。
素としては、イソクエン酸へのＫｍ値が小さいものが好
まれるが本反応によって生成されるイソクエン酸と反応
でき得るものであれば、特に規定されることはない。Ｎ
ＡＤ類に特異的なものでも、ＮＡＤＰ類に特異的なもの
でも差し支えない。添加する酵素濃度は、０．０１〜２
００ｕ／ｍｌ、好ましくは０．１〜２０ｕ／ｍｌを用い
る。また、イソクエン酸脱水素酵素およびアコニターゼ
が、その酵素活性を発現するために、マグネシウムイオ
ンあるいはマンガンイオンを要求するが、その試薬濃度
は、０．５μＭ〜１００ｍＭ、好ましくは５μＭ〜１０
ｍＭを用いる。
【００１５】本発明に使用できるＮＡＤ類または／およ
びＮＡＤＰ類は、遊離酸型またはアルカリ金属やアンモ
ニウムなどの塩型のアルコール沈殿物でも結晶物でもよ
く、純度の高いものほど望まれるが、一般に市販されて
いるＮＡＤ類、ＮＡＤＰ類は十分に本発明に使用でき
る。ＮＡＤ類、ＮＡＤＰ類としてＮＡＤ、ＮＡＤＰは言
うまでもなく、チオ−ＮＡＤ、チエ−ＮＡＤＰも本発明
の方法に使用できる。他のＮＡＤ類、ＮＡＤＰ類もイソ
クエン酸脱水素酵素と反応できうるものは本発明の方法
を応用できる。試薬濃度は、０．０１〜１００ｍＭ、好
ましくは０．１〜１０ｍＭを用いる。
びＮＡＤＰ類は、遊離酸型またはアルカリ金属やアンモ
ニウムなどの塩型のアルコール沈殿物でも結晶物でもよ
く、純度の高いものほど望まれるが、一般に市販されて
いるＮＡＤ類、ＮＡＤＰ類は十分に本発明に使用でき
る。ＮＡＤ類、ＮＡＤＰ類としてＮＡＤ、ＮＡＤＰは言
うまでもなく、チオ−ＮＡＤ、チエ−ＮＡＤＰも本発明
の方法に使用できる。他のＮＡＤ類、ＮＡＤＰ類もイソ
クエン酸脱水素酵素と反応できうるものは本発明の方法
を応用できる。試薬濃度は、０．０１〜１００ｍＭ、好
ましくは０．１〜１０ｍＭを用いる。
【００１６】アコニターゼに鉄を結合させる工程、アコ
ニターゼ活性を測定する工程に使用できる緩衝液は、特
に規定されることはなく、ＰＩＰＥＳバッファー、トリ
スバッファー、トリエタノールアミンバッファー、グリ
シンバッファー、ＧＴＡバッファー、リン酸バッファ
ー、ホウ酸バッファーなどがあげられるが、緩衝液の最
適ｐＨが、５〜９、好ましくは６〜８の範囲のものであ
れば良く、試薬濃度としては、１〜１，０００ｍＭ、好
ましくは１０〜５００ｍＭを用いる。
ニターゼ活性を測定する工程に使用できる緩衝液は、特
に規定されることはなく、ＰＩＰＥＳバッファー、トリ
スバッファー、トリエタノールアミンバッファー、グリ
シンバッファー、ＧＴＡバッファー、リン酸バッファ
ー、ホウ酸バッファーなどがあげられるが、緩衝液の最
適ｐＨが、５〜９、好ましくは６〜８の範囲のものであ
れば良く、試薬濃度としては、１〜１，０００ｍＭ、好
ましくは１０〜５００ｍＭを用いる。
【００１７】本発明の血清鉄測定用組成物は、ｐＨ１〜
５、好ましくはｐＨ２〜４の第一試薬と、少なくとも
０．０１〜３００ｕ／ｍｌ、好ましくは０．１〜３０ｕ
／ｍｌのアコニターゼを含む第二試薬と、少なくとも
０．０１〜１，０００ｍＭ、好ましくは０．１〜１００
ｍＭのクエン酸を含む第三試薬からなり、還元剤、イソ
クエン酸脱水素酵素、ＮＡＤ類または／およびＮＡＤＰ
類、マグネシウムイオンまたはマンガンイオンは、第一
〜第三試薬のいずれか、または、第一〜第三試薬の複数
にまたがって添加使用される。還元剤を第一・第二試薬
に、イソクエン酸脱水素酵素、ＮＡＤ類または／および
ＮＡＤＰ類、マグネシウムイオンまたはマンガンイオン
を第三試薬に添加することが、推奨される。
５、好ましくはｐＨ２〜４の第一試薬と、少なくとも
０．０１〜３００ｕ／ｍｌ、好ましくは０．１〜３０ｕ
／ｍｌのアコニターゼを含む第二試薬と、少なくとも
０．０１〜１，０００ｍＭ、好ましくは０．１〜１００
ｍＭのクエン酸を含む第三試薬からなり、還元剤、イソ
クエン酸脱水素酵素、ＮＡＤ類または／およびＮＡＤＰ
類、マグネシウムイオンまたはマンガンイオンは、第一
〜第三試薬のいずれか、または、第一〜第三試薬の複数
にまたがって添加使用される。還元剤を第一・第二試薬
に、イソクエン酸脱水素酵素、ＮＡＤ類または／および
ＮＡＤＰ類、マグネシウムイオンまたはマンガンイオン
を第三試薬に添加することが、推奨される。
【００１８】以上のように、本発明は、反応系に酵素を
用いることを特徴とする血清鉄の定量方法である。また
本発明は、それに用いるための試薬ないし測定キットに
関するものである。
用いることを特徴とする血清鉄の定量方法である。また
本発明は、それに用いるための試薬ないし測定キットに
関するものである。
【００１９】
【発明の効果】本発明は、酵素を用いることによって
血清鉄の高感度測定が可能である、測定精度が上が
る、酵素を用いることによって温和な条件での測定が
可能である、レートアッセイもできる、操作が簡便
であるという大きな効果がある。
血清鉄の高感度測定が可能である、測定精度が上が
る、酵素を用いることによって温和な条件での測定が
可能である、レートアッセイもできる、操作が簡便
であるという大きな効果がある。
【００２０】
【実施例】以下に本発明の実施例を挙げてさらに具体的
に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定さ
れるものではない。
に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定さ
れるものではない。
【００２１】
【実施例１】下記表１に示す組成にしたがって、試薬Ｒ
−１、試薬Ｒ−２、試薬Ｒ−３を調製した。
−１、試薬Ｒ−２、試薬Ｒ−３を調製した。
【００２２】
【表１】
【００２３】
【測定方法】鉄標準液は、０〜５０μＭ硫酸第一鉄アン
モニウム液を用いた。検体（トランスフェリン）および
鉄標準液に等量の試薬Ｒ−１を加え、攪拌し、サンプル
カップに入れた。この混合液２０μｌに、試薬Ｒ−２
１００μｌを加え攪拌し、３７℃にて５分間インキュベ
ーション後、試薬Ｒ−３ ９０μｌを加え同温度にて攪
拌し、２分間放置後１分間の吸光度変化量を日立７１５
０型自動分析器で測定した。
モニウム液を用いた。検体（トランスフェリン）および
鉄標準液に等量の試薬Ｒ−１を加え、攪拌し、サンプル
カップに入れた。この混合液２０μｌに、試薬Ｒ−２
１００μｌを加え攪拌し、３７℃にて５分間インキュベ
ーション後、試薬Ｒ−３ ９０μｌを加え同温度にて攪
拌し、２分間放置後１分間の吸光度変化量を日立７１５
０型自動分析器で測定した。
【００２４】その結果を図１に示す。図１を見て分かる
ように本発明の方法を用いると、ｐＨ３前後で、トラン
スフェリンに結合している鉄を測定できることが分か
る。つまり、Ｒ−１のｐＨを２〜３．５にすることによ
ってＮｉｔｒｏｓｏ−ＰＳＡＰ法とほぼ相関的に血清鉄
を測定できることが分かる。
ように本発明の方法を用いると、ｐＨ３前後で、トラン
スフェリンに結合している鉄を測定できることが分か
る。つまり、Ｒ−１のｐＨを２〜３．５にすることによ
ってＮｉｔｒｏｓｏ−ＰＳＡＰ法とほぼ相関的に血清鉄
を測定できることが分かる。
【００２５】
【実施例２】下記表２に示す組成にしたがって、試薬Ｒ
−１、試薬Ｒ−２、試薬Ｒ−３を調製した。
−１、試薬Ｒ−２、試薬Ｒ−３を調製した。
【００２６】
【表２】
【００２７】
【測定方法】鉄標準液は、０〜５０μＭ硫酸第一鉄アン
モニウム液を用いた。血清検体および鉄標準液に等量の
試薬Ｒ−１を加え、攪拌し、サンプルカップに入れた。
この混合液２０μｌに、試薬Ｒ−２ １００μｌを加え
攪拌し、３７℃にて５分間インキュベーション後、試薬
Ｒ−３ ９０μｌを加え同温度にて攪拌し、２分間放置
後１分間の吸光度変化量を日立７１５０型自動分析器で
測定した。ｎ数は１５．０μＭの硫酸第一鉄アンモニウ
ム液の吸光度変化量を差し引きして、作図した。
モニウム液を用いた。血清検体および鉄標準液に等量の
試薬Ｒ−１を加え、攪拌し、サンプルカップに入れた。
この混合液２０μｌに、試薬Ｒ−２ １００μｌを加え
攪拌し、３７℃にて５分間インキュベーション後、試薬
Ｒ−３ ９０μｌを加え同温度にて攪拌し、２分間放置
後１分間の吸光度変化量を日立７１５０型自動分析器で
測定した。ｎ数は１５．０μＭの硫酸第一鉄アンモニウ
ム液の吸光度変化量を差し引きして、作図した。
【００２８】その結果を図２に示す。図２を見て分かる
ように本発明の方法を用いると、原点を通る良好な直線
性が得られた。また、血清検体及び各鉄標準液の変動係
数を下記の表３に示す。表３にあるように、血清検体お
よび鉄標準液のＣＶ値は、３％以下と良好であった。
ように本発明の方法を用いると、原点を通る良好な直線
性が得られた。また、血清検体及び各鉄標準液の変動係
数を下記の表３に示す。表３にあるように、血清検体お
よび鉄標準液のＣＶ値は、３％以下と良好であった。
【００２９】
【表３】
【図１】実施例１に記載した方法で測定した鉄の測定カ
ーブである。
ーブである。
【図２】実施例２に記載した方法で測定した鉄の測定カ
ーブである。
ーブである。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成５年７月５日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１に記載した方法で測定した鉄の測定カ
ーブである。
ーブである。
【図２】実施例２に記載した方法で測定した鉄の測定カ
ーブである。
ーブである。
Claims (19)
- 【請求項１】 血清鉄の定量を行うに際し、鉄を活性化
因子とするアコニターゼを用いて血清鉄量を測定するこ
とを特徴とする血清鉄の酵素的定量方法。 - 【請求項２】 血清中のトランスフェリンから鉄を遊離
させる工程と、遊離した鉄をアコニターゼに結合させる
工程と、アコニターゼ活性を測定する工程とからなるこ
とを特徴とする請求項１に記載の血清鉄の酵素的定量方
法。 - 【請求項３】 酸性ｐＨ下で、血清中の鉄と結合してい
るトランスフェリンから鉄を遊離させることを特徴とす
る、請求項２に記載の血清鉄の酵素的定量方法。 - 【請求項４】 還元剤を用い、アコニターゼにトランス
フェリンから遊離した鉄を結合させることを特徴とする
請求項２に記載の血清鉄の酵素的定量方法。 - 【請求項５】 還元剤が、アスコルビン酸、チオ−グリ
コール酸、チオ−マレート、システイン、Ｎ−アセチル
システイン、ヒドロキシルアミン、２−メルカプトエタ
ノール、還元型グルタチオン、ジチオトレイトール、ジ
チオエリトリオール、臭化２−アミノエチルイソチオウ
ロニウム及びチオ−グリセロールからなる群から選ばれ
たものであることを特徴とする請求項４に記載の血清鉄
の酵素的定量方法。 - 【請求項６】 アコニターゼ活性をイソクエン酸脱水素
酵素によって検出することにより血清鉄量を測定するこ
とを特徴とする請求項２に記載の血清鉄の酵素的定量方
法。 - 【請求項７】 イソクエン酸脱水素酵素の補酵素とし
て、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類または／
および、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸
類、を用いることを特徴とする請求項２に記載の血清鉄
の酵素的定量方法。 - 【請求項８】 血清鉄の定量を行うに際し、鉄を活性化
因子とするアコニターゼを用いて血清鉄量を測定するこ
とを特徴とする血清鉄の酵素的測定用試薬。 - 【請求項９】 血清中のトランスフェリンから鉄を遊離
させる工程と、遊離した鉄をアコニターゼに結合させる
工程と、アコニターゼ活性を測定する工程からなること
を特徴とする請求項８に記載の血清鉄の酵素的測定用試
薬。 - 【請求項１０】 酸性ｐＨ下で、血清中の鉄と結合して
いるトランスフェリンから鉄を遊離させることを特徴と
する請求項９に記載の血清鉄の酵素的測定用試薬。 - 【請求項１１】 酸性ｐＨとしては、ｐＨ１〜５、好ま
しくは２〜４を用いる請求項１０に記載の血清鉄の酵素
的測定用試薬。 - 【請求項１２】 還元剤を用い、アコニターゼにトラン
スフェリンから遊離した鉄を結合させることを特徴とす
る請求項９に記載の血清鉄の酵素的測定用試薬。 - 【請求項１３】 還元剤が、アスコルビン酸、チオ−グ
リコール酸、チオ−マレート、システイン、Ｎ−アセチ
ルシステイン、ヒドロキシルアミン、２−メルカプトエ
タノール、還元型グルタチオン、ジチオトレイトール、
ジチオエリトリオール、臭化２−アミノエチルイソチオ
ウロニウム及びチオ−グリセロールからなる群から選ば
れたものであることを特徴とする請求項１２に記載の血
清鉄の酵素的測定用試薬。 - 【請求項１４】 還元剤の試薬濃度は、０〜１，０００
ｍＭ、好ましくは０．１〜５００ｍＭを用いる請求項１
３に記載の血清鉄の酵素的測定用試薬。 - 【請求項１５】 アコニターゼの酵素濃度は、０．０１
〜３００ｕ／ｍｌ、好ましくは０．１〜３０ｕ／ｍｌを
用いる請求項９に記載の血清鉄の酵素的測定用試薬。 - 【請求項１６】 イソクエン酸脱水素酵素の酵素濃度
は、０．０１〜２００ｕ／ｍｌ、好ましくは０．１〜２
０ｕ／ｍｌを用いる請求項９に記載の血清鉄の酵素的測
定用試薬。 - 【請求項１７】 イソクエン酸脱水素酵素の補酵素とし
て、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類または／
および、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸
類、を用いることを特徴とする請求項１６に記載の血清
鉄の酵素的測定用試薬。 - 【請求項１８】 補酵素の試薬濃度は、０．０１〜１０
０ｍＭ、好ましくは０．１〜１０ｍＭを用いる請求項１
７に記載の血清鉄の酵素的測定用試薬。 - 【請求項１９】 ｐＨ１〜５、好ましくはｐＨ２〜４の
第一試薬、少なくとも０．０１〜３００ｕ／ｍｌ、好ま
しくは０．１〜３０ｕ／ｍｌのアコニターゼを含む第二
試薬と、少なくとも、０．０１〜１，０００ｍＭ、好ま
しくは０．１〜１００ｍＭのクエン酸を含む第三試薬か
らなる請求項９に記載の酵素的測定用試薬。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4173730A JP2983765B2 (ja) | 1992-06-09 | 1992-06-09 | 血清鉄の測定法および測定用組成物 |
| DE69226940T DE69226940T2 (de) | 1991-12-02 | 1992-11-30 | Verfahren und Reagenz zur Bestimmung von Serumeisen oder von der Bindungsfähigkeit des ungesättigten Eisens durch Verwendung von Akonitase |
| US08/094,188 US5420008A (en) | 1991-12-02 | 1992-11-30 | Assay method and assay reagent for serum iron or unsaturated iron binding capacity |
| PCT/JP1992/001566 WO1993011259A1 (fr) | 1991-12-02 | 1992-11-30 | Procede et reactif pour determiner le fer serique ou la capacite de fixation de fer sans saturation |
| EP92924031A EP0570588B1 (en) | 1991-12-02 | 1992-11-30 | Method and reagent for determination of serum iron or unsaturated iron binding capacity using aconitase |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4173730A JP2983765B2 (ja) | 1992-06-09 | 1992-06-09 | 血清鉄の測定法および測定用組成物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0716100A true JPH0716100A (ja) | 1995-01-20 |
| JP2983765B2 JP2983765B2 (ja) | 1999-11-29 |
Family
ID=15966079
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4173730A Expired - Fee Related JP2983765B2 (ja) | 1991-12-02 | 1992-06-09 | 血清鉄の測定法および測定用組成物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2983765B2 (ja) |
-
1992
- 1992-06-09 JP JP4173730A patent/JP2983765B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2983765B2 (ja) | 1999-11-29 |
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