JPH069693A - アルツハイマー病関連蛋白 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】本発明はアルツハイマー病（ＡＤ）に関連する
新規な蛋白の提供を目的としている。 【構成】本発明は、還元条件下の２次元電気泳動により
分子量約２０kD（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、等電点約５〜７
（９M尿素含有ゲル中）を持つ単一のスポットとして検
出される新規なＡＤ関連蛋白である。このＡＤ関連蛋白
はＡＤ患者の血清中に存在する蛋白である。 【効果】本発明のＡＤ関連蛋白は患者血清中に存在する
ため、ＡＤの血清診断の可能性をもたらすものである。
またＡＤと密接に関連するアミロイド繊維の研究を進め
るうえでも重要な物質となる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、アルツハイマー病（以
下ＡＤと省略する）に関連する新規な蛋白に関するもの
である。ＡＤは高齢期に発症し、緩徐にしかし確実に進
行し、脳神経細胞死をきたす初老期から老年期にかけて
の痴呆性疾患の一つである。神経原繊維の変化、老人
班、βアミロイドの脳血管組織等への沈着、神経細胞の
脱落等の病理的変化を伴う。疫学的には年齢にともなっ
て発症率が対数的に増加するので、高齢化社会をむかえ
大きな問題となりつつある。本発明によるＡＤ関連蛋白
は、ＡＤの患者血清中に見いだされた新規な物質で、Ａ
Ｄとの関連が注目される蛋白である。

【０００２】

【従来の技術】ＡＤの発症機序等については未解明の部
分が多く、現在も様々な研究が進められている。ＡＤの
診断も例外ではなく、簡便で確実な診断法は実現してい
ない。痴呆症状の診断は、一般的にはＮＩＮＣＤＳ−Ａ
ＤＲＳの診断基準に基づいて行われているが、この方法
では痴呆症状がＡＤに起因するものかどうかについての
判定はできない。ＡＤの診断にあたっては、脳のＸ線Ｃ
Ｔ検査が大きな助けになっているが、大規模な設備が必
要なため一部の検査施設でしか実施することができな
い。またＸ線ＣＴ検査によっても、ＡＤを他の痴呆性疾
患と明瞭に識別することはできないのが現状である。

【０００３】一方、患者の組織、髄液、血液に出現する
物質をＡＤと関連づけることによって診断を行う方法が
試みられている。ＡＤ関連物質としてはβ蛋白(Bioche
m.Biophys.Res.Comun.120:885-890,1984)が知られてい
る。β蛋白は患者脳老人班アミロイドから分離された分
子量約４０００の物質で、その後の研究により膜蛋白質
の性質を持つβ蛋白質前駆体（以下ＡＰＰと省略する）
の膜貫通領域に相当していることが明らかにされた(Nat
ure 325:733-736,1987)。更にＡＰＰ遺伝子はダウン症
と関連する２１番染色体上に存在すること、３とおりの
発現によりアミノ酸残基６９５個のＡＰＰ６９５、同じ
く７５１個のＡＰＰ７５１、そして７７０個のＡＰＰ７
７０が存在すること、ＡＰＰ７５１とＡＰＰ７７０はKu
nitz-typeserine protease inhibitor活性を持つこと(N
ature 331:530-532,1988)等が明らかにされている。

【０００４】これらβ蛋白やＡＰＰに対する抗体を用
い、ＡＤ診断を目的とした患者組織や脳脊髄液等を試料
とする免疫学的な分析も提案されている。(NEUROLOGY 4
0:1028-1034,1990、生物物理化学 35/6:417-420,1991)
しかしＡＰＰはＡＤのみならず健常人の脳以外の組織に
おいても発現している物質であり、ＡＤのマーカーとし
て十分なものとは言い難い。脳老人班アミロイドを特異
的に染色することができる抗体が知られているが、脳の
生検試料を必要とする検査は現実的な診断法とは言えな
い。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、ＡＤに関連
する新規な蛋白の提供を主な課題とするものである。Ａ
Ｄに関連する新規な蛋白の提供により、ＡＤの診断はも
とより、その研究を更に進めることが本発明の課題であ
る。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は、次のような物
理化学的性状によって特徴付けられるアルツハイマー病
関連蛋白を提供するものである。 1)次の条件によるＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した分子量が
約２０kD ・ゲル条件： ０．３７５M Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．９） ０．１% ＳＤＳ ０．０５% N,N,N',N'−テトラメチルエチレンジアミン ０．０５% 過硫酸アンモニウム ５%〜２０% アクリルアミド・リニアグラディエント （アクリルアミド:ビスアクリルアミド＝３０：０．
８） ・サンプル処理条件： ６２．５mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８） ４% ＳＤＳ ５% βメルカプトエタノール ０．００２% ブロムフェノールブルー １０% グリセロール の終濃度溶液中で１００℃５分処理後にゲルにアプライ ・泳動条件： 泳動緩衝液：５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０） ０．３８M グリシン ０．１% ＳＤＳ １５０Ｖで２〜３時間 2)次の条件による２次元電気泳動で分子量が約２０kD、
等電点が約５〜７の単一のスポットとして分離される ・１次元目ゲル条件： ２% アンフォライン３．５−１０ ０．５% アンフォライン３．５−５ ０．０５% N,N,N',N'−テトラメチルエチレンジアミン ０．０５% 過硫酸アンモニウム １% ノニデットＰ４０ ９M 尿素 ４% アクリルアミド（アクリルアミド：ビスアクリル
アミド＝２０：１） ・サンプル処理条件： ８M 尿素 ２% ノニデットＰ４０ ５% βメルカプトエタノール ２０% ショ糖 の終濃度溶液中で室温で１時間反応後にゲルへアプライ ・１次元目泳動条件： 陽極液 １０mM リン酸 陰極液 ４０mM 水酸化ナトリウム １５０Ｖで３〜５時間 ・２次元目ゲル条件： 1)に同じ ・２次元目泳動条件： 1)に同じ 3)アルツハイマー病の患者血清中に高い頻度で認められ
る 4)β蛋白に由来する次のアミノ酸配列を持つ合成ペプチ
ドを免疫原として得られたモノクローナル抗体と反応す
る アミノ酸配列：Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly
Tyr Gln Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Gl
u Asp Val

【０００７】なお各アミノ酸の略号は、各々次のアミノ
酸を示すものである。 Ala:アラニン Leu:ロイシン Arg:アルギニン Lys:リジン Asn:アスパラギン Met:メチオニン Asp:アスパラギン酸 Phe:フェニルアラニ
ン Cys:システイン Pro:プロリン Glu:グルタミン酸 Ser:セリン Gln:グルタミン Thr:トレオニン Gly:グリシン Trp:トリプトファン His:ヒスチジン Tyr:チロシン Ile:イソロイシン Val:バリン

【０００８】本発明によるＡＤ関連蛋白は、ＡＤ患者の
血清中から２次元電気泳動法により単一のスポットとし
て分離され、β蛋白に対するモノクローナル抗体によっ
て確認することができる。すなわち前記のような２次元
電気泳動により、分子量約２０kD（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ）、等電点約５〜７（９M尿素含有ゲル中）を持つ単
一のスポットとして検出される。

【０００９】β蛋白に対するモノクローナル抗体とは、
次のようなβ蛋白に由来するアミノ酸配列を持つ合成ペ
プチドを免疫原として用い、常法によって得ることがで
きる。 アミノ酸配列：Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly
Tyr Gln Val His HisGln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu
Asp Val

【００１０】更に本発明のＡＤ関連蛋白は、ＡＰＰのＮ
末端およびＣ末端に由来する合成ペプチドを免疫原とし
て調製したラット・ポリクローナル抗体によって、公知
のＡＰＰと識別することができる。例えば脳脊髄液中等
に存在する分泌型のＡＰＰは、ＡＰＰのＮ末端に対する
ポリクローナル抗体との反応性を持つが、本発明のＡＤ
関連蛋白はこの抗体との反応性を示さない。ＡＰＰのア
ミノ酸配列は前に引用した文献などで既に知られてお
り、そのＮ末端、Ｃ末端に由来する合成ペプチドは常法
によって得ることができる。

【００１１】本発明のＡＤ関連蛋白は、ＡＤ患者の血清
中には健常人の血清と比較して高い頻度で確認される。
また分泌型のＡＰＰと異なり髄液中ではほとんど確認さ
れない。

【００１２】

【作用】本発明のＡＤ関連蛋白は新規な物質であり、Ａ
Ｄの新しい血清診断の可能性をもたらす。またＡＤと密
接に関連するアミロイド繊維の発現、代謝、沈着等の研
究を進めるうえで有用な新たな物質を提供する。以下実
施例によって本発明を更に詳細に説明する。

【００１３】

【実施例】

１．本発明のＡＤ関連蛋白の確認 ＡＤ患者血清中の本発明によるＡＤ関連蛋白を、ＳＤＳ
−ＰＡＧＥと２次元電気泳動により種々の抗体を利用し
たイムノブロット法によって確認した。

【００１４】ＳＤＳ−ＰＡＧＥの条件は次のとおりであ
る。ＡＤ患者血清としては、ＮＩＮＣＤＳ−ＡＤＲＤＳ
の診断基準等によってＡＤの可能性が高いと診断された
患者の血清（ＡＤ−１、ＡＤ−２、およびＡＤ−３の３
例）を用いた。 ・ゲル条件： ０．３７５M Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．９） ０．１% ＳＤＳ ０．０５% N,N,N',N'−テトラメチルエチレンジアミン ０．０５% 過硫酸アンモニウム ５%〜２０% アクリルアミド・リニアグラディエント （アクリルアミド:ビスアクリルアミド＝３０：０．
８） ・サンプル処理条件： ６２．５mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８） ４% ＳＤＳ ５% βメルカプトエタノール ０．００２% ブロムフェノールブルー １０% グリセロール の終濃度溶液１０μlに血清試料１μlを加え、１００℃
５分処理後にゲルに反応液の全量をアプライ ・泳動条件： 泳動緩衝液：５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０） ０．３８M グリシン ０．１% ＳＤＳ １５０Ｖで２〜３時間

【００１５】またイムノブロット法に用いた抗体は次の
３種である。 ・抗体１：β蛋白に対するモノクローナル抗体 β蛋白Ｎ末端の２４アミノ酸残基に相当する次に示すア
ミノ酸配列を持つ合成ペプチドとキーホール・リンペッ
ト・ヘモシアニン（以下ＫＬＨと省略する）との結合物
を免疫原として得られたマウス・モノクローナル抗体
（以下ＴＢ−１と省略する）。精製後、過ヨウ素酸法に
よりホース・ラディッシュ・ペルオキシダーゼ（以下Ｐ
ＯＤと省略する）で直接標識し、２００倍希釈して用い
た。 アミノ酸配列：Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly
Tyr Gln Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Gl
u Asp Val

【００１６】・抗体２：ＡＰＰのＮ末端に対するポリク
ローナル抗体 ＡＰＰのＮ末端の１８アミノ酸残基（ＡＰＰ７５１の４
５−６２）に相当する、次に示すアミノ酸配列を持つ合
成ペプチドとＫＬＨとの結合物を免疫原として得られた
ラット・ポリクローナル抗体（以下ＡＰＰ−Ｎと省略す
る）。２５００倍に希釈して用い、検出には２次抗体と
して市販のＰＯＤ標識抗ラットＩｇＧ山羊抗体を用い
た。 アミノ酸配列：Met Asn Val Gln Asn Gly Lys Trp Asp
Ser Asp Pro Ser Gly Thr Lys Thr Cys

【００１７】・抗体３：ＡＰＰのＣ末端に対するポリク
ローナル抗体 ＡＰＰのＣ末端の１５アミノ酸残基（ＡＰＰ７５１の７
３６−７５１）に相当する、次に示すアミノ酸配列を持
つ合成ペプチドとＫＬＨとの結合物を免疫原として得ら
れたラット・ポリクローナル抗体（以下ＡＰＰ−Ｃと省
略する）。２５００倍に希釈して用い、検出には２次抗
体として市販のＰＯＤ標識抗ラットＩｇＧ山羊抗体を用
いた。 アミノ酸配列：Gly Tyr Glu Asn Pro Thr Tyr Lys Phe
Phe Glu Gln Met Gln Asn

【００１８】サンプル処理後のＡＤ患者血清試料をＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ後、常法によってニトロセルロース膜にブ
ロッティングした。この膜に上記３種の抗体を反応さ
せ、洗浄後に２次抗体を反応させ、再度洗浄して発色剤
を加えた。発色剤には４−クロロ−１−ナフトールと過
酸化水素を用いた。ＰＯＤで直接標識したＴＢ−１につ
いては、２次抗体は使わず発色剤との反応を行った。

【００１９】２次元電気泳動の条件は次のとおりであ
る。ＡＤ患者血清は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに使ったものと
同じものを用いた。 ・１次元目ゲル条件： ２% アンフォライン３．５−１０（ＬＫＢ社製、商品
名） ０．５% アンフォライン３．５−５（ＬＫＢ社製、商
品名） ０．０５% N,N,N',N'−テトラメチルエチレンジアミン ０．０５% 過硫酸アンモニウム １% ノニデットＰ４０（商品名） ９M 尿素 ４% アクリルアミド （アクリルアミド：ビスアクリルアミド＝２０：１） ・サンプル処理条件： ８M 尿素 ２% ノニデットＰ４０ ５% βメルカプトエタノール ２０% ショ糖 の終濃度溶液１０μlに血清試料２．５μlを加え、室温
で１時間反応後にゲルへ反応液の全量をアプライ ・１次元目泳動条件： 陽極液 １０mM リン酸 陰極液 ４０mM 水酸化ナトリウム １５０Ｖで３〜５時間 ・２次元目は、１次元目の泳動を完了したゲルをＳＤＳ
−ＰＡＧＥのサンプル処理に用いたのと同じ処理溶液中
で１５分間振とう後、２次元用ゲルに載せて電気泳動す
る他は、前記ＳＤＳ−ＰＡＧＥと同じ条件で行った。

【００２０】サンプル処理した同じＡＤ患者血清（３
例）を２次元電気泳動後、常法によってブロッティング
したニトロセルロース膜を３種類の抗体と反応させ、Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥの場合と同じ方法によって染色した

【００２１】イムノブロット法の結果の一部は図１〜５
に示した。図１はＳＤＳ−ＰＡＧＥのイムノブロット法
による結果を示すものである。分子量２０kDのＴＢ−１
によって染色されるバンドを確認できる。図２は患者血
清ＡＤ−３のＴＢ−１による染色結果を示すものであ
る。分子量２０kD、等電点５〜７に相当するスポットが
特異的に染色された。他方、同じＡＤ−３のＡＰＰ−
Ｎ、およびＡＰＰ−Ｃによる染色（図３〜４）ではこの
スポットは観察されない。これらの結果から、ＡＤ患者
血清中に存在する本発明によるＡＤ関連蛋白が確認され
た。

【００２２】２．血清中ＡＤ関連蛋白の検出 ＡＤ患者および健常人の血清を試料とし、２次元電気泳
動およびイムノブロット法によって本発明のＡＤ関連蛋
白の検出を試みた。１と同じ処理をした患者血清（１２
例）、および健常人血清（３２例）２．５μlについ
て、１と同じ条件の基で２次元電気泳動を行った。患者
血清としては、ＮＩＮＣＤＳ−ＡＤＲＤＳの診断基準等
によって各種の痴呆症と診断された患者の血清を用い
た。

【００２３】電気泳動後のゲルからニトロセルロース膜
に蛋白をブロットし、マウス・モノクローナル抗体ＴＢ
−１によって本発明によるＡＤ関連蛋白を検出した。ま
た同時にＴＢ−１と反応する１２５kD（ＡＰＰと思われ
る）、および１５kD（未知の蛋白と思われる）の蛋白も
検出し、ＡＤとの関連性を比較した。イムノブロット法
は、１と同じ操作によって行った。結果は表１（健常
人）、表２（患者）に示すとおりである。

【００２４】

【表１】

【００２５】

【表２】

【００２６】表１、表２から、本発明によるＡＤ関連蛋
白はＡＤ患者では比較的高い頻度で検出されるが、健常
人ではあまり検出されないことがわかる。またＡＰＰと
思われる１２５kDの蛋白と比較しても、より高い頻度で
痴呆症患者血清中に検出されている。更に本発明のＡＤ
関連蛋白は、ＡＤ以外の痴呆性疾患とも関連性を示す可
能性も示唆された。

【００２７】

【発明の効果】本発明によって新規なＡＤ関連蛋白が得
られる。本発明のＡＤ関連蛋白は患者血清中に見いださ
れるため、ＡＤの血清試料による検査の可能性をもたら
す。血清診断はＸ線ＣＴ検査のような特別な設備が不要
で、また脳組織の生検等に比べてはるかに容易に試料を
採取できるので非常に有利である。更に本発明によるＡ
Ｄ関連蛋白は新規な物質であり、ＡＤと密接に関連する
アミロイド繊維の発現、代謝、沈着等の研究を進めるう
えでも有用である。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１はＡＤ患者血清（ＡＤ−１〜３）のＳＤＳ
−ＰＡＧＥのイムノブロット法の結果を模式的に示した
図である。

【図２】図２はＡＤ患者血清（ＡＤ−３）の２次元電気
泳動のＴＢ−１によるイムノブロット法の結果を模式的
に示した図である。

【図３】図３はＡＤ患者血清（ＡＤ−３）の２次元電気
泳動のＡＰＰ−Ｎによるイムノブロット法の結果を模式
的に示した図である。

【図４】図４はＡＤ患者血清（ＡＤ−３）の２次元電気
泳動のＡＰＰ−Ｃによるイムノブロット法の結果を模式
的に示した図である。

【図５】図５はＡＤ患者血清（ＡＤ−３）の２次元電気
泳動の２次抗体（ＰＯＤ標識抗ラットＩｇＧ抗体）によ
るイムノブロット法の結果（バックグラウンド）を模式
的に示した図である。

【符号の説明】

図中「ＭＷ」で示したレーンは、分子量マーカーであ
る。

Claims (1)

【整理番号】 Ｐ−０００２５７ 【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】次のような物理化学的性状によって特徴付
   けられるアルツハイマー病関連蛋白 1)次の条件によるＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した分子量が
   約２０kD ・ゲル条件： ０．３７５M Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．９） ０．１% ＳＤＳ ０．０５% N,N,N',N'−テトラメチルエチレンジアミン ０．０５% 過硫酸アンモニウム ５%〜２０% アクリルアミド・リニアグラディエント （アクリルアミド:ビスアクリルアミド＝３０：０．
   ８） ・サンプル処理条件： ６２．５mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８） ４% ＳＤＳ ５% βメルカプトエタノール ０．００２% ブロムフェノールブルー １０% グリセロール の終濃度溶液中で１００℃５分処理後にゲルにアプライ ・泳動条件： 泳動緩衝液：５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０） ０．３８M グリシン ０．１% ＳＤＳ １５０Ｖで２〜３時間 2)次の条件による２次元電気泳動で分子量が約２０kD、
   等電点が約５〜７の単一のスポットとして分離される ・１次元目ゲル条件： ２% アンフォライン３．５−１０ ０．５% アンフォライン３．５−５ ０．０５% N,N,N',N'−テトラメチルエチレンジアミン ０．０５% 過硫酸アンモニウム １% ノニデットＰ４０ ９M 尿素 ４% アクリルアミド （アクリルアミド：ビスアクリルアミド＝２０：１） ・サンプル処理条件： ８M 尿素 ２% ノニデットＰ４０ ５% βメルカプトエタノール ２０% ショ糖 の終濃度溶液中で室温で１時間反応後にゲルへアプライ ・１次元目泳動条件： 陽極液 １０mM リン酸 陰極液 ４０mM 水酸化ナトリウム １５０Ｖで３〜５時間 ・２次元目ゲル条件： 1)に同じ ・２次元目泳動条件： 1)に同じ 3)アルツハイマー病の患者血清中に高い頻度で認められ
   る 4)β蛋白に由来する次のアミノ酸配列を持つ合成ペプチ
   ドを免疫原として得られたモノクローナル抗体と反応す
   る アミノ酸配列：Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly
   Tyr Gln Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Gl
   u Asp Val