JPH06100599B2 - 体液成分の測定方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 この発明は、抗原抗体反応を利用した体液成分の測定方
法に関するものである。

従来の技術 粒状担体に抗体または抗原を付着させ抗原抗体反応を行
わせて体液成分を光学的に測定する方法としては、比濁
法と計数法とが知られている。前者は抗体（または抗
原）を付着（感作）させた担体を含有した溶液に抗原
（または抗体）を含む試料を加えて特異的な抗原抗体反
応に基づく免疫学的凝集作用によって粒子が凝集すると
きの溶液の濁度変化を透過および（または）散乱光の変
化で捉える方法であり、凝集が進むにつれて溶液の濁度
は減少する。一方、後者の方法は本出願人の出願になる
特願昭58−219753号，同59−100090号にみられる方法で
あり、前記と同様にして凝集反応を行わせた反応液をフ
ローセルに流して粒子検出曲線により凝集粒子数を凝集
していない粒子等と弁別しそれぞれの計数比率から試料
の測定値を得るものである。また、これら以外に免疫学
的な沈降反応を利用した一元放射状免疫拡散法（SRID
法），エンザイムイムノアッセイ法（EIA法）,RIA法な
どが従来よりよく知られている。

発明が解決しようとする問題点 上記比濁法や計数法のように粒子の凝集作用を利用する
方法では、必要とする抗原抗体反応が起きても、次に粒
子の凝集にまで至らなければ検知することができないた
め、感度が悪く、また他の要因で凝集が起こり測定誤差
を生じるおそれがあった。

また、その他の測定方法の場合は、測定に長時間を要す
るうえに、放射性物質，酵素などを使用するため測定前
後の処理に特別の注意を要するという問題があった。

この発明の主たる目的は、叙上の問題を排除し短時間に
かつ高精度で体液成分を定量することができる体液成分
の測定方法を提供することである。この発明の他の目的
は、同時に複数項目の体液成分を定量することができる
体液成分の測定方法を提供することである。

問題点を解決するための手段 第１の発明の体液成分の測定方法は、担体に抗体を付着
させた試薬を試料体液に加え試料体液中に含有される未
知濃度の抗原と第１の抗原抗体反応を行わせる工程と、
反応後，反応液に標識抗原を加え未反応抗体と第２の抗
原抗体反応を行わせる工程と、第２の抗原抗体反応で得
た反応液から前記標識抗原の前記試薬との反応量を求め
る工程と、得られた反応量を，前記標識抗原のみを前記
試薬と反応させて得られた基準反応量と比較してその変
化量から試料体液中の抗原濃度を定量する工程とを含
み、担体は粒子であり、前記担体に付着させた抗体はモ
ノクローナル抗体であり、前記標識抗原は前記担体に付
着させた抗体と特異的に反応する抗原に蛍光色素を付着
させたものであり、前記標識抗原の反応量は、反応液に
含まれる担体個々に散乱光強度と蛍光強度を検出して求
めた積算蛍光強度より算出されることを特徴とする。

また、第２の発明の体液成分の測定方法は、粒径が異な
る複数種の担体にそれぞれ異なる抗原に対する抗体を付
着させた試薬を試料体液に加え試料体液中に含有される
未知濃度の複数種の抗原とそれぞれ第１の抗原抗体反応
を行わせる工程と、反応後，反応液に前記複数種の抗原
にそれぞれ対応する標識抗原を加え未反応抗体と第２の
抗原抗体反応を行わせる工程と、第２の抗原抗体反応で
得た反応液から前記各標識抗原の前記試薬との反応量を
求める工程と、得られた反応量を，前記標識抗原のみを
前記試薬と反応させて得られた基準反応量と比較してそ
の変化量から試料体液中の複数種の抗原濃度を定量する
工程とを含み、担体は粒子であり、前記担体に付着させ
た抗体はモノクローナル抗体であり、前記標識抗原は前
記担体に付着させた抗体と特異的に反応する抗原に蛍光
色素を付着させたものであり、前記標識抗原の反応量
は、反応液に含まれる担体個々に散乱光強度と蛍光強度
を検出して求めた積算蛍光強度より算出されることを特
徴とする。

前記担体としては、均一な粒径を有する高分子ラテック
スがあげられ、このものは安定な分散媒に浮遊させて互
いに凝集しないようにする。ラテックスの粒径が不均一
なときは、後述のように蛍光強度と散乱光強度とから積
算蛍光強度を求める場合に粒子の径を示す前方散乱強度
がばらつき、データの解析が困難となる。これは、粒径
で項目情報を解析するためである。前記高分子ラテック
スとしては、ポリスチレン，カルボキシル化ポリスチレ
ン，アミノ基を有するカルボキシル化ポリスチテン，ポ
リビニルトルエン，スチレン−ブタジエン共重合体，カ
ルボキシル化スチレン−プタジエン共重合体，スチレン
−ジビニルベンゼン共重合体，ビニルトルエン−第三ブ
チルスチレン共重合体，ポリエステル，ポリアクリル
酸，ポリメタクリル酸，ポリアクリロニトリル，アクリ
ロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体，ポリ酢酸
ビニルアクリレート，ポリビニルピロリドン，塩化ビニ
ル−アクリレート共重合体等の合成高分子ラテックス粒
子からなるラテックスがあげられ、さらにこれらの合成
高分子ラテックス粒子の表面を非イオン界面活性剤等で
処理したものも使用可能である。また、ラテックスのほ
かに、類似の合成高分子物質（たとえばベントナイト，
カオリン，コロジオン等）も使用可能である。

担体粒子の表面に付着される抗体としては、特定の抗原
に対してのみ反応する抗体を使用する。かかる抗体とし
ては、モノクローナル抗体が好適に採用可能であり、こ
のものは抗体産生細胞と腫瘍細胞との細胞融合によって
得られた細胞を培養して得られる。このモノクローナル
抗体は単一の抗原決定基にのみ結合するので、ある抗体
が表面にその抗体と結合しうる決定基が１つしかない場
合には、すでにある抗原と結合した抗体はもはや他の抗
原と結合しない。そのため、担体の粒子表面にモノクロ
ーナル抗体を結合させたものは抗原を仲立ちとして粒子
同士が凝集することはない。

担体表面の抗体が試料体液中の抗原と反応したのち、未
反応の抗体と結合する標識抗原としては、たとえばFITC
（フルオレッセインイソチオシアネート）などの蛍光色
素を付着させた抗原があげられる。ただし、標識の操作
においては、抗原性が失われないように注意することが
必要である。

作用 この発明によれは、担体に付着した抗体に試料体液に含
まれる抗原を反応させる第１の抗原抗体反応を行い、つ
いで試料中の抗原と反応せずに残った未反応抗体に標識
抗原を反応させる第２の抗原抗体反応を行わせるので、
この場合の標識抗原の抗体との反応量を測定し、標識抗
原のみを反応させたときの基準反応量との変化量（減少
量）を求めると、これが試料体液に含まれる抗原量と対
応しており、容易にかつ高精度に抗原濃度の定量を行う
ことができる。

反応量の測定は蛍光色素を付着させた標識抗原に基づく
蛍光強度と粒子の散乱光強度とから積算蛍光強度を求め
る。この積算蛍光強度は標識抗原の反応量に対応してお
り、これから試料中に抗原量を知ることができる。粒子
の散乱光強度と蛍光強度はたとえばフローサイトメータ
ーに反応液を流して測定することができる。フローサイ
トメータとしては、たとえば米国特許4325706号明細書
に記載のものが使用可能である。

次に第１図〜第３図に基づいてより詳細に説明する。第
１図は担体表面に結合した抗体に過剰量の標識抗原を作
用させて基準となる積算蛍光強度を求める説明図であ
る。同図において、６はこの発明における試薬であり、
このものはラテックスなどの担体１に抗体２を結合させ
たものである。抗体２は特定の抗原とのみ反応する。使
用する標識抗原３はあらかじめ蛍光色素４を結合させた
ものであり、それぞれが各抗体２と反応しすべての抗体
２と結合する。反応後、反応液をフローサイトメータに
流し蛍光強度，前方散乱光強度および側方散乱光強度を
それぞれ測定する。このとき、溶液は過剰の未反応標識
抗原３を含有しているので、背後蛍光の影響を無視でき
るほど反応液を希釈しなければならない。反応後は、担
体１表面の抗原３が遊離しないように、かつ担体１同士
が結合しないように注意する必要がある。測定された蛍
光強度および散乱光強度から蛍光強度の積算値を求め
る。この積算値は第１図に示す三次元のグラフのピーク
５で示され、このピーク５の体積が積算蛍光強度とな
る。この値は粒子のカウント数が一定ならば、ほぼ一定
である。すなわち、１個の担体１に結合する抗体２の量
は一定であり、これに結合する標識抗原３の量もほぼ一
定であるから、ある一定数の粒子をカウントすると、そ
の総蛍光量（総標識抗原量）もほぼ一定となり、個々の
担体１に結合する標識抗原３の量にばらつきがあって
も、充分に多い数をカウントすれば、総量としては一定
となるのである。なお、小ピーク９は抗体２と結合しな
い遊離の蛍光色素のピークである。

試料体液中の抗原濃度を求める場合、この試料体液に前
記試薬６を加え、第２図に示すように試料体液中に含有
される抗原７と第１の抗原抗体反応をおこさせる。つい
で、前記と同じ標識抗原３で第２の抗原抗体反応をおこ
させる。このため、標識抗原３の抗体２への結合量（反
応量，第２図に示すピーク８）は試料に含まれていた抗
原量だけ減少することになる。したがって、求められた
積算蛍光強度は試料中の抗原量に応じて変化し、その変
化量は抗原量と一定の関係にあるので、これから抗原濃
度を定量することができる。

また、第３図に示すように、粒径の異なる複数種の担体
1a,1b,1c…にそれぞれ異なる抗原に対する抗体を付着さ
せると、１つの試料体液に含まれる多数の抗原8a,8b,8c
…を同時に測定することができる。第３図のグラフに示
す各ピーク5a,5b,5c…はそれぞれの抗原の変化量を示し
ている。

なお、第１図〜第３図では、三次元のグラフで積算蛍光
強度を示したが、この場合、Ｘ方向の前方散乱光強度で
粒子の径を示しており、これとＺ方向の蛍光強度とで積
算蛍光強度を算出することもできるので、側方散乱強度
の測定は省略してもよい。側方散乱光強度は粒子の性
質，とくに粒子の表面状態と関係がある。

以上では、担体に抗体を付着させて試料体液中の抗原量
を測定する場合について説明した。

上記説明とは、抗原と抗体の関係が逆になっているが、
以下では担体に抗原が付着され試料体液中の抗体量を測
定する場合について説明する。

実施例 次に例をあげてこの発明の方法を詳細に説明する。

例：粒径が0.75μのポリスチレンラテックスにウサギの
イムノグロブリンＧ（ウサギIgG）を吸着させた。すな
わち、0.5％のラテックス溶液1ml当り40μｇのウサギIg
Gが吸着したものを調整した。ついで、これに検体中の
抗ウサギIgGを各濃度で反応させた後、蛍光色素（FIT
C）で標識した標識抗ウサギIgGを反応させた。ここで、
ウサギIgGは抗原となり、抗ウサギIgGは抗体となる。反
応後、反応液を第４図に示すフローサイトメーター（本
出願人の製造にかかるAR−II）によって蛍光強度を測定
し、抗ウサギIgG濃度に対する平均蛍光強度を求め、こ
れから第５図に示す検量線を作成した。平均蛍光強度と
はラテックス１個当りの蛍光強度であって、積算蛍光強
度÷カウント数で算出される。

フローサイトメーターは、第４図に示すように、Arイオ
ン・レーザ（50mW）の光Ａをフローセル10に導びき、ピ
ンホール板11を経た前方散乱光Ｂを光検出器12で受け、
電気信号に変換して増幅器13へ送る。一方、フローセル
10から放出される蛍光および側方散乱光Ｃは第１および
第２のカラーフィルター14,15を経てピンホール板16を
通り、青反射ダイクロイックミラー17,赤反射（580nm）
ダイクロイックミラー18および前反射ミラー19でそれぞ
れ側方散乱光，赤蛍光および緑蛍光を反射させる。各反
射光は受光フィルタ20,21を通ってそれぞれの受光部22,
23,24（光増倍管,RMT）で受けられる。緑蛍光信号（540
〜580nm）Ｄは増幅器13へ送られる。赤蛍光信号および
側方散乱光信号も同様に、増幅器13へ送られる。増幅器
13へ送られた各信号はデータ解析部25により各粒子の蛍
光強度が測定される。

前記検量線を作成することにより、抗ウサギIgG量が未
知の試料の蛍光強度を検量線に照らし合わせてその濃度
を決定することができる。

発明の効果 第１の発明によれば、抗原抗体反応による凝集作用を利
用することなく簡単に、しかもモノクローナル抗体を使
用したことにより、担体同士が凝集することがなく、き
わめて高精度に試料中の抗原の定量を行うことができる
という効果がある。

また、第２の発明によれば、さらに、粒径の異なる複数
種の担体にそれぞれ異なる抗原に対する抗体を付着させ
た試薬を用いることにより、同時に複数項目の体液成分
の測定が可能になり、しかもモノクローナル抗体を使用
したことにより、担体同士が凝集することがなく、ある
担体の凝集塊と別の未凝集の担体の分布がオーバーラッ
プするということが防止され、担体の種類に対応した各
抗原の濃度を正確に測定することができるという効果が
ある。

【図面の簡単な説明】

第１図および第２図はこの発明の方法を示す説明図、第
３図はこの発明における他の方法を示す説明図、第４図
はこの発明の例におけるフローサイトメーターの説明
図、第５図は検量線を示すグラフである。 １……担体、２……抗体、３……標識抗原、６……試
薬、７……抗原

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】担体に抗体を付着させた試薬を試料体液に
   加え試料体液中に含有される未知濃度の抗原と第１の抗
   原抗体反応を行わせる工程と、反応後，反応液に標識抗
   原を加え未反応抗体と第２の抗原抗体反応を行わせる工
   程と、第２の抗原抗体反応で得た反応液から前記標識抗
   原の前記試薬との反応量を求める工程と、得られた反応
   量を，前記標識抗原のみを前記試薬と反応させて得られ
   た基準反応量と比較してその変化量から試料体液中の抗
   原濃度を定量する工程とを含み、担体は粒子であり、前
   記担体に付着させた抗体はモノクローナル抗体であり、
   前記標識抗原は前記担体に付着させた抗体と特異的に反
   応する抗原に蛍光色素を付着させたものであり、前記標
   識抗原の反応量は、反応液に含まれる担体個々に散乱光
   強度と蛍光強度を検出して求めた積算蛍光強度より算出
   されることを特徴とする体液成分の測定方法。
2. 【請求項２】前記担体が均一な粒径を有するラテックス
   粒子である特許請求の範囲第（１）項記載の体液成分の
   測定方法。
3. 【請求項３】粒径が異なる複数種の担体にそれぞれ異な
   る抗原に対する抗体を付着させた試薬を試料体液に加え
   試料体液中に含有される未知濃度の複数種の抗原とそれ
   ぞれ第１の抗原抗体反応を行わせる工程と、反応後，反
   応液に前記複数種の抗原にそれぞれ対応する標識抗原を
   加え未反応抗体と第２の抗原抗原反応を行わせる工程
   と、第２の抗原抗体反応で得た反応液から前記各標識抗
   原の前記試薬との反応量を求める工程と、得られた反応
   量を，前記標識抗原のみを前記試薬と反応させて得られ
   た基準反応量と比較してその変化量から試料体液中の複
   数種の抗原濃度を定量する工程とを含み、担体は粒子で
   あり、前記担体に付着させた抗体はモノクローナル抗体
   であり、前記標識抗原は前記担体に付着させた抗体と特
   異的に反応する抗原に蛍光色素を付着させたものであ
   り、前記標識抗原の反応量は、反応液に含まれる担体個
   々に散乱光強度と蛍光強度を検出して求めた積算蛍光強
   度より算出されることを特徴とする体液成分の測定方
   法。