JPH05501961A - Ｄｎａプローブを用いる新規病原体検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＤＮＡプローブを用いる新規病原体検出方法本発明の概要 開示された新規方法により、人血検体を含む生物学的液体中の病原体例え１セ熱 帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｆａｌｃｉｐａｒｓ）寄生虫の迅速な 多検体用の非放射性検出方法が達成される。その検出は寄生虫特異的ＤＮＡプロ ーブおよびマククロタイタープレートを用いたサンドイッチ・ハイブリダイゼー ション法の使用に基づいている。これらのアッセイは感度および特異性が高くま た実施が容易なために、を椎動物および無を椎動物の多くの血液その他の着色組 織一体めルーチン分析に用いることができる。

特に、これらのアッセイは熱帯熱マラリア原虫の有無の検出に用いることができ る。記述される方法は非放射性ＤＡＮプローブを用いた多岐にわたる様々なりＡ Ｎ検出分析への応用に適している。熱帯熱マラリア原虫の検出に関し、本発明は さらに新規ＤＡＮ断片およびかかる断片に基づくハイブリダイゼーション・プロ ーブにも関する。

本発明は、前記新規方法に基づく診断キットを提供する。

本発明の背景 マラリアはプラスモジウム（Ｐｌａｓ■ｏｄｉｕｍ）属に属する原生動物寄生虫 に起因している。この寄生虫のライフサイクルは工期、すなわち、を椎動物体内 における無性生殖期および蚊（通常はアノフエレス（＾ｎｏｐｈｅｌｅｓ）属の ）の体内における有性生殖期に分かれる。ヒトマラリアに関係するプラスモジウ ムの四種は熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫（Ｐ、ｖｉｖａｘ）　、四 日熱原虫（Ｐ。

ｍａｌａｒｉａｅ）および卵形マラリア原虫（Ｐ、　ｏｖａｌｅ）である。

これらの中では、最初の二つが最も普遍的である。熱帯熱マラリア原虫は場合に よっては致命的な最も重い形のマラリアを引き起こす。さらに、この寄生虫は通 常用いられる抗マラリア薬に対する耐性をも生じる。

現在のマラリア診断方法は血液塗抹標本検査によっている。この方法は面倒であ りまた専門性を必要とする。

さらに−人の熟達した鏡検技士でも１日に最高で６０枚のスライドを検査できる に過ぎない。血清学による診断もなし得るが、抗体が存続するため、現在の感染 を過去の感染と区別できない（１）。そのため、新世代の診断テストの探究には 、寄生虫有無の指標として寄生虫核酸を検出する可能性が含められている。理論 上は、かかるテストは指を針で刺すこと（ｆｉｎｇｅｒ　ｐｒｉｃｋ）により得 られる極少量の血液（５〜５０１１Ｉｌ）シか必要としないはずであり、また鋭 敏かつ迅速なはずである。血液ｌｈｌ中わずか５０体の寄生虫も核酸ハイブリダ イゼーションにより検出できる（２）。最初に若干の訓練を受けただけで１日に 数百の検体を分析することができる。このアッセイの感度は血液銀行が輸血に使 用する血液のスクリーニングに用いることを可能にしている。

核酸ハイブリダイゼーションは、キャリアーとしての媒介生物種を同定するため に、昆虫組織検体に対して行うこともできる。かかる情報は、マラリアの地理的 伝播を制限するための媒介コントロール措置の強化に役立つであろう。あるいは また、化学的予防をかかる領域において採用し得るがこの手法の評価を核酸ハイ ブリダイゼーションを用いて行うことができる。本特許出願に記載の方法は、核 酸ハイブリダイゼーション法を用いた効率的な寄生虫検出実施手段を提供する。

本発明による検出方法は、一般に、ヒト、およびを椎動物および無を椎動物一般 例えば家畜および昆虫などの血液、組織、サンプルおよび体液中の病原体特に血 中病原体の有無の検出に用いることができる。

前記病原体は、例えば細菌、ウィルスおよび、例えばプラスモジウム属の寄生虫 、特に熱帯熱マラリア原虫および三日熱マラリア原虫などであってよい。更なる 病原体例としてはシゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、例えばフレキシナ−菌（Ｓｈｉ ｇｅｌｌａ　ｆｌｅｘｎｅｒｉ）　、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ　ｄｙｓｅｎｔ ｅｒｉａｅ）、ゾンネ菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ　５ｏｎｎｅｉ）および結核菌（ｉ ｌｙｃｏ−ｂａｃｔｅｒｉｕＩＩｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）などが挙げられる 。

本出願中の特定例は熱帯熱マラリア原虫に関するものであるが、その検出法が以 上概説した如く一般的に用いることができることは理解されよう。

従来技術 核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）をベースにしたハイブリダイゼーションは現在多く の臨床診断に用いられている。当初この技術は放射性標識プローブを用いた。放 射性方式による診断の感度は十分であるが、この方法は、放射性物質取扱いに必 要な注意および規制のために臨床ラボラトリ−において人気がない。そこで、核 酸ハイブリダイゼーションによる病原体検出の分野においては非放射性検出が重 要のこととなっている。最も人気のある非アイソトープ検出方法の一つは、核酸 プローブへのビオチンの酵素的（３）または光化学的（４）取込みに基づいてい る。ビオチン標識プローブを結合するハイブリッドは次いでアビジンまたはスト レプトアビジンおよび適当な酵素例えばホスファターゼまたはペルオキシダーゼ などの複合体を用いて容易に検出することができる。前述の非アイソトープ法は 魅力的にみえるが、未だ人気はない。

い（つか重要な課題の解決が残っている。主な課題は着色バックグランドおよび 標的ＤＮＡの純度状態に関するものである。大抵のＤＮＡをベースとした診断剤 は膜フィルターにトロセルロースまたはナイロン）上に置かれる。

病原体有無の検査対象体液例えば血液は、膜フィルターに直接スポットしてＤＮ Ａを固定すると消し得ない着色マークを残してしまいそのために以後のハイブリ ダイゼーション後の発色がほとんど不可能となる。従って残された唯一の選択肢 は組織または体液中に存在する病原体から得られる純粋ＤＮＡをスポットするこ とである。ＤＮＡの単離は遠心分離および沈殿を含む手順を伴うので、迅速な多 検体診断のフィーシビリテイ−は激減してしまう。核酸ハイブリダイゼーション に基づく好ましい診断法には次の条件が不可欠である： 良いＤＮＡベースの多検体診断手順の必須条件１、　非放射性検出に基づくべき である。

２、　少量の血液（指を針で刺して得られる一滴）を用いるべきである。

３、　診断キットに用いられる成分の大部分は室温で安定であるべきである。

４、　個々の成分を厳密にマイクロピペッティングすることは避けられるべきで ある。

５　遠心分離および沈殿段階は避けられるべきである。

６、　うまく操作するのに最小の訓練ですむべきである。

本発明によりこれらすべての基準を満たす検出方法が提供される。

本発明は以下のとおり要約される： １、　下記配列： ＡＧＧＴＣＴＴＡＡＣＡＴＧＡＣＴＡＡＣＴ＾＾ＧＧＴＣＴＴ＾＾ＣＴＴＡＡＣ Ｔ＾＾ＣＴＴＡＧＧＴＣＴＴＡＣＴＴＴ＾＾ＣＴＡＡＡＣＴ を有する一本鎖ＤＮＡ断片（ｆ６３）またはその相補鎖、またはｆ６３またはそ の相補鎖に対して／％イブリダイズできるそれらの変種、または相当する二本鎖 配列。−重鎖ＤＮＡを用いるのが好ましい。

２、　少くとも２０塩基または塩基対長よりも大きい第１項に定義されたＤＮＡ 断片またはその隣接セグメント（ｃｏｎ−ｔｉｇｕｏｕｓ　ｓｅｇｍｅｎｔ）　 、特にＡＧＧＴＣＴＴＡＡＣＡＴＧＡＣＴＡＡＣＴ＾。

３、−重鎖形態の第１または２項記載のＤＮＡ断片。

４、　第１および２項記載のＤＮＡ断片より成るハイブリダイゼーションプロー ブ。

５、　比色検出可能な基により標識される第４項記載のハイブリダイゼーション プローブ。この基の性質は本発明にとって臨界的ではない。

６、　比色検出用に標識された基がビオチンである第５項記載のハイブリダイゼ ーションプローブ。ビオチンは一つの好ましいレポーター基である。

７、　比色検出用に標識された基が発色団（ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｉｃ）レポー ター基である第５項記載のハイブリダイゼーションプローブ。

８、　以下の諸段階より成る血液またはその他の体液に存在する病原体の検出方 法： ａ）塩酸グアニジン（ＧｕＨＣＡ’）　、ナトリウムラウリルサルコシン（ＳＬ Ｓ）およびＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００を含む溶液中で血液検体を溶解（ｌｙｓｉ ｎｇ）する。

ｂ）適切には加熱により前記血液検体中に存在するＤＮＡを変性させ、そして前 記病原体のＤＮＡとハイブリダイズするハイブリダイゼーションプローブの存在 下に溶液ハイブリダイゼーションを行う。

ｃ）　８ｂ）段階に用いたハイブリダイゼーションプローブが結合する同じゲノ ムＤＮＡ鎖にハイブリダイズできるヌクレオチド配列を有するハイブリダイゼー シコンプローブで被覆されたマイクロタイタープレートで８ｂ）段階で形成され たハイブリッドを捕獲（ｃａｐｔｕｒｅ）する。（特に熱帯熱マラリア原虫を検 出するための）好ましい一態様においては、マイクロタイタープレートの被覆に 用いるヌクレオチド配列は、８ｂ）段階で用いられるハイブリダイゼーションプ ローブの配列と同じである。

ｄ）前記マイクロタイタープレートを標準食塩−クエン酸緩衝液（ＳＳＣ）、ド デシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）およびＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００より成る溶液 を用いて洗浄する。

ｅ）比色法によりハイブリッドの有無を検出する。

９、　ハイブリダイゼーションプローブが第２および第３項に記載のとおりであ る第８項記載の方法。好ましい一側面において、本発明はプラスモジウム属に属 す種の検出に用いられる。

１０、８　ａ）段階の試薬の最終濃度が次のとおりである第８および９項記載の 方法： ａ）塩酸グアニジン：　１．ＯＭ　〜３．０Ｍｂ）ナトリウムラウリルサルコシ ン：ｏ、２％〜０．５％ｆ／Ｖ　Ｎ／Ｖ ｃ）　Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００：　０．２％〜０．５％Ｖ／Ｖ　Ｖ／Ｖ以上は 好ましい範囲を示している。

１１、８　ｅ）段階の最終濃度が次のとおりである第８および９項記載の方法・ ａ）標準食塩−クエン酸緩衝液　−０，５ｘ〜２．５ｘｓｓｃｂ）　Ｔｒｉｔｏ ｎ−Ｘ−１００−０，２％〜０．５％　’ｉ／ＶＣ）　ドデシル硫酸ナトリウム 　−０，２％〜０．５％１／Ｖ以上は好ましい範囲を示している。

１２　溶解溶液が可溶化剤としてもハイブリダイゼーション溶液としても用いら れる第８〜１１項記載の方法。

１３、　２ＸＳＳＣが非特異的ハイブリッドの除去に用いられる第８〜１２項記 載の方法。

１４、　Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００およびＳＯ３が血液超厚の着色物質の除去に 用いられる第８および１４項記載の方法。

１５、病原体が熱帯熱マラリア原虫である第８〜１４項記載の方法。

１６、病原体か三日熱マラリア原虫である第８〜１４項記載の方法。

１７、病原体がシゲラである第８〜１４項記載の方法。

１８、病原体が結核菌である第８〜１４項記載の方法。

１９　第８〜１８項記載の方法に基づく標的ポリヌクレオチド配列に存在する所 与のヌクレオチド配列の検出のための診断キット。

ＤＮＡをベースとするサンドイッチハイブリダイゼーションの原理 背景： 非放射性方式における最終検出様式は、アルカリ性ホスファターゼまたは西洋ワ サビペルオキシダーゼにより触媒される反応に用いられる基質の性質に応じて可 溶性または不溶性の色の発色である。したがって、残留着色物質を標的ＤＮＡか ら除去しそして内生酵素を不活化させることが必須である。これによって（放射 性ハイブリダイゼーション方式の場合に行われているような）膜フィルターへの 血液の直接スポットは無用となる。何故ならばフィルターから残留する血液の染 み（ｂｌｏｏｄ　５ｔａｉｎ）を除去することはほとんど不可能だからである。

この問題を避けるために、我々は、マイクロタイタープレート方式とサンドイッ チハイブリダイゼーションを組み合わせて用いた。その基本原理を以下に記載す る。

熱帯熱マラリアゲノムの特徴の一つがそれが該ゲノムの大領域にタンデムに存在 する２１塩基対リピートを含んでいることであることはすでに示されている（５ 〜６）。

この反復配列により表わされるゲノムの割合は約１％である。このリピート配列 を含むいくつかのクローンを比較した結果、コンセンサス２１塩基対リピート配 列が示された。このコンセンサス配列に基づき、我々は６３マーオリゴヌクレオ チドプローブ（以下ｆ６３と記す）を設計し構築した。それは熱帯熱マラリア原 虫ＤＮＡの反復配列において最大に示されるタンデムに並ぶ３つの２１７−で構 成されている（第１図）。プローブとして一本鎖ＤＮＡおよび前述のその鎖長を 用いることが好ましいのは以下の理由に基づ（。−重鎖ＤＮＡは標的ＤＮＡに対 してのみハイブリダイズするので、プローブとして二本鎖よりも優れている。

二本鎖ＤＮＡの場合には、自己ハイブリダイゼーションの確立が高まり、そのた めに標的ＤＮＡの結合に必要となるプローブの有効濃度が減少する。このことは 費用対効果において一本鎖プローブの方が優れている二七は明確に確立するもの である。何故なら一重鎖ブローブはハイブリダイゼーシヨンに対してはるかに少 量しか要求されないからである。−重鎖ＤＮＡ製造にはいくつかの方法を利用で きるが、それらのうちでもオリゴヌクレオチド合成が最も便利である。

熱帯熱マラリア原虫以外の病原体の検出には、その病原体ＤＮＡにおいて反復さ れる至適ＤＮＡプローブを設計する必要がある。このハイブリダイゼーションプ ローブは次いで以下熱帯熱マラリア原虫について特定的に記載するサンドイッチ ・ハイブリダイゼーションの検出プロトコールと同様にして用いることができる 。

サンドイッチ・ハイブリダイゼーションの基本的プロトコールを以下に記す（第 ２図に図説もされている）。

サンドイッチ・ハイブリダイゼーションによる人血中熱帯熱マラリア原虫感染の 非放射性診断フローチャート 指に針を突いて得た一滴の血液検体（５０μ／）を溶解溶液とｂｉｏ−ｆ６３プ ローブを含む小プラスチック管に添加する。

フェーズ１１　（Ｄよく混合する。

寄生虫ＤＮＡ− ｂｉｏ−ｆ６３プローブハイブリッド 第２図プレートＡ参照 １　ブで予め被覆されたマイクロタ 捕獲ハイブリ、ド 第２図プレートＣ参照 ル フェーズ３　（ｉ）フェーズ２からのマイクロタイタープレートのウェルを０． ２ １　（ｉｉｉ）各ウェルにおいてＡＰＢ−１溶液（ｘｉｉ）マイクロタイタープ レート リーダーで４１０ｎｍの吸光度を読 む。

比色法による検出の用意の整った捕獲ハ第２図プレートＤ より低い吸光度値を与えるはず である。

この方法の成功は、熱帯熱マラリア原虫ＤＮＡが処理の間はとんど分解されずに いるという事実に依存している。

溶液ハイブリダイゼーション段階において、ビオチン化ｆ６３は熱帯熱ＤＮＡに 結合し、そしてほとんど完全に進行するが、溶液ハイブリダイゼーション速度は 、固定標的ＤＮＡに比べはるかに速い。捕獲ハイブリダイゼーションの効率は、 熱帯熱マラリア原虫は熱帯熱マラリア原虫ＤＮＡ長に正比例する。極端な場合、 熱帯熱マラリア原虫ＤＮＡが全く分解されなければ、わずか０．０３％という捕 獲ハイブリダイゼーションでさえすべてのハイブリッドコンブレンクスを生じさ せることができる。

その他の病原体の場合、捕獲ハイブリダイゼーションの効率は病原体ゲノムにお けるプローブの反復回数に依存することとなろう。

血液検体中熱熱帯マラリア原虫ＤＮＡの非アイソトープ検出プロトコール １、　プローブの調製： マイクロタイタープレート被覆用プローブ、６３マーオリゴヌクレオチド（ｆ６ ３）を自動ＤＮＡンンセサイザ−（＾ｐｐｌｉｅｄ　ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３ ４０Ａ）を用いて合成した。

ハイブリッド検出用標識プローブ・公表された手順に従ってフォトビオチンアセ テートを用いたフォトビオチン化によりｆ６３のビオチン化を行った。

２、　マイクロタイタープレートの被覆：マイクロタイタープレート（Ｄｙｎａ ｔｅｃｈ、ポリ塩化ビニル）のすべてのウェルを０．ＩＭ　ＭｇＣ６を含む５０ μｌ量中の様々な量（１μ９〜１０ｎｇ）のｆ６３で被覆する。被覆を一夜行っ た後、マイクロタイタープレートを１０ｃ厘の距離をおいて５分間殺菌ＵＶラン プ（４０ワツト）下に曝露してＤＮＡを固定する。次にウェルの内容物を捨て、 そしてそれらウェルを２ＸＳＳＣ緩衝液で洗浄する。それらウェルの各々におけ る未占有部位を２ＸＳＳＣ，５ＸＤｅｎｈａｒｄｔｓ１０．５％Ｔｒｉｔｏｎ− Ｘ−１００．０．５％ＳＤＳおよび５０ＩＩｇ／１１１！サケ精子ＤＮＡを含む 緩衝液（２００μｌ／ウエル）中でプレハイブリダイゼーションを行うことによ りブロックする。このプレハイブリダイゼーションは、室温で４〜６時間行われ る。被覆されたプレートはこの段階で室温で保存することができる。

３、　血液検体収集および溶液ハイブリダイゼーション：血液検体（５０ｔｔｌ アリコート）を指に針を刺すことにより集めて、４Ｍ塩酸グアニジン（Ｇｕ　Ｈ ＣＩ）　、０．５％ナトリウムラウリルサルコシン（ＳＬＳ）および０．５％Ｔ ｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００を含む溶液５０μｌに直接式れる。この溶液はさらに５ ｒ＋ｇのオリゴヌクレオチドプローブ（ビオチン化ｆ−６３）をも含有する。こ の混合物を９５℃で５分間加熱した後室温に４〜６時間保って溶液ハイブリダイ ゼーションを行わせる。

４、　捕獲ハイブリダイゼーション： 溶液ハイブリダイゼーション終了後、エッペンドルフ管の内容物を未標識ｆ−６ ３で予め被覆されたマイクロタイタープレートのウェルに移す。このサンドイン チ・ハイブリダイゼーション（捕獲）を２４時時間待させる。このフェーズにお いて、プレートに被覆されたｆ−６３とハイブリッドにおいて利用可能な残りの 相補部位との間にハイブリダイゼーションが生じる。そのハイブリッドはある場 所にビオチン化ｆ−６３を担持し他の相補部位を残す標的ＤＮＡの長片である（ 第２図参照）。

５、　発色・ サンドイッチ・ハイブリダイゼーション終了後、マイクロタイタープレートのウ ェルの内容物を捨て、そしてウェルを２ｘＳＳＣ，０，２％　ＳＤＳおよび０， ２％Ｔｒｉ　ｔｏｎ−Ｘ−１００を含む溶液を用いて４回にわたり、各々室温で ５分間洗浄する。このハイブリダイゼーション後洗浄の間に、すべての着色物質 が除去され後にサンドインチ・ハイブリッドが残る。それらのウェルを次にＩ　 Ｍ　ＮａＣ１，ｌｏｏｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＣＡ’　（ｐＨ７，５）　、２　ｎＭ　 ＭｇＣ１ｚ、口、０５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００および３％ＢＳ＾を含む溶液 である＾、Ｐ’７．５を用いて室温で３０分間ブロックする。

次にそれらサンドイッチ・ハイブリッドを、例えばストレプトアビジン−アルカ リ性ホスファターゼ接合体を用いることにより検出する。ストレプトアビジンア ルカリ性ホスファターゼ接合体（１ａｇ／　ｗｌ）をＡ、Ｐ７．５緩衝液に添加 する。この溶液（ストレプトアビジンアルカリ性ホスファターゼ含有＾、Ｐ７． ５緩衝液）５０ＩＩＮを各ウェルに添加し、そしてインキュベーションを室温で さらに３０分間続ける。過剰の未結合接合体をＢＳ＾不含Ａ、Ｐ７．５緩衝液を 用いて４回、各々室温で５分間洗浄することにより除去する。

最後ニソれらウェルをＡ、Ｐ９．５　（１００ＩＩＭ　Ｔｒｉｓ−ＣＡ！（ｐＨ ９，５）、１００＋Ｍ　ＮａＣ１および５ｏ１ＭＭｇｃ１１ヲ含ム基質インキュ ベーション緩衝液）ですすぐ。５０ａｌの基質ｐ−ニトロフェニルホスフェート を＾、Ｐ　９．５に１１１９／ＩＩ／濃度で添加しそしてこの溶液５０ａｌを各 ウェルに添加する。発色は６〜１２時間行わせる。適当なプレートリーダー（例 えばＤｙｎａｔｅｃｈプレートリーダー）を用いて（４１０ｒｖにおける）吸光 度を記録する。

テスト結果を次表に示す。

結果： １μ９　５００ｎｇ１００ｎｇ１．Ｏｎｇ５００ｎｇ　超過　超過　超過　超過 ７．５ｎｇ１．５１１　１．２４２　１．３７３　０．９２９１μ９　０．２９ １　０．２９５　０．２６３　０．２１４注：ヒト検体では、感染が約１％の場 合５０μｍの血液は約５０ｎｇの寄生虫（熱帯熱マラリア原虫）　ＤＮＡを有す る。

「超過」という用語は２．０を超える光学密度を示す。

図の説明： 第１図は、熱帯熱マラリア原虫のコンセンサス反復配列（２１塩基リピート）か ら設計されたオリゴｆ６３を示す。

第２図の説明 Ａ：溶液ハイブリダイゼーション Ｂニブローブｆ６３で被覆されたマイクロタイターウェルを表わす。

Ｃ捕獲ハイブリダイゼーション Ｄ：洗浄後で発色用意の整った捕獲ハイブリッド第３図は次を表わす・ Ａ、ビオチン化ｆ６３　ＤＮＡ Ｂニゲツム熱帯熱マラリア原虫ＤＮＡ Ｃ：　ｆ６３　ＤＮＡ 参考文献： １．　Ｓｅｒｏｅｐｉｄｉｍｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｍａｌａｒｉａ 　：　Ａ　ｍｕｌｔｉｃｅｎ−ｔｒｉｃ　５ｔｕｄｙ、　Ｍａｌａｒｆａ　Ｒｅ ５ｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｒｅ　（丁ＣＭ［１）（１９８７）。

２、Ｂａｒｋｅｒ、Ｒ，Ｈ，Ｊｒ、、５ｕｅｂｓａｅｎｓ、Ｌ、、Ｒｏｏｎｅｙ 、ＩＦ、。

＾１ｅｃｒｉｎ、Ｇ、Ｃ，、Ｄａｕｒａｄｏ、Ｈ，Ｖ、および１ｌｉｒｔｈ、Ｄ 、Ｆ。

（１９８６）　５ｃｉｅｎｃｅ　２３１．１４３４゜３、Ｌａｎｇｅｒ　Ｐ、Ｒ ，、ｆａｌｄｒｏｐ　＾、Ａ、およびＷａｒｄ、Ｄ、Ｃ。

（１９８１）、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳ＾７８．　６６ ３３゜４、Ｆｏｒｓｔｅｒ、　Ａ、Ｃ，、ＭｃＩｒ＋ｒ＋ｅｓ、　Ｊ、Ｌ、、　 Ｓｋｉｎｇｌｅ、　Ｄ、Ｃ。

ａｎｄ　Ｓｙｍｏｎｓ、　Ｒ−Ｈ，（１９８５）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ 　Ｒｅｓ、１３゜７４５゜ ５、　＾５Ｉｕｎｄ、　Ｌ、　Ｆｒａｎｚｅｎ、　Ｌ、、　ｆｅｓｔｊｎ、　Ｇ 、、　Ｐｅｒｓｓｏｎ。

Ｔ、、Ｈｇｚｅｌｌ、１１．およびＰｅｔｔｅｒｓｓｏｎ、Ｕ、（１，９８５） 　Ｊ。

Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１８５．５０９゜６、Ｆｒａｎｃｉｓ、Ｖ、Ｓ、、＾ｙ ｙａｎａｔｈａｎ、Ｋ、、Ｂｈａｔ、Ｐ、。

５ｒｉｎｉｖａｓａ、　Ｈ，およびＰａｄｍａｎａｂａｎ、　Ｇ、（１９８ｇ） 、　ＩｎｄｉａｎＪ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ　２５．５３７゜Ａ　 ビオチン化ｆ６３を表わす。

Ｂ　ゲノム熱帯熱マラニア原虫ＤＮＡを表わす。

Ｃｆ６３ＤＮＡを表わす。

要　約　書 開示された新規方法により、人血検体を含む生物学的液体中の病原体例えば熱帯 熱マラリア原虫寄生虫の迅速な多検体用の非放射性検出方法が達成される。その 検出は寄生虫特異的ＤＮＡプローブおよびマイクロタイタープレートを用いたサ ンドイッチ・ハイブリダイゼーション法の使用に基づいている。これらのアッセ イは感度および特異性が高くまた実施が容易なために、を推動物および無を推動 物の多くの血液その他の着色組織検体のルーチン分析に用いることができる。特 に、これらのアッセイは熱帯熱マラリア原虫の有無の検出に用いることができる 。記述される方法は非放射性ＤＮＡプローブを用いた多岐にわたる様々なりＮＡ 検出分析への応用に適している。

熱帯熱マラリア原虫の検出に関し、本発明はさらに新規ＤＮＡ断片およびかかる 断片に基づ（ハイブリダイゼーション・プローブにも関する。

本発明は、前記新規方法に基づく診断キットを提供する。

国際調査報告 喝−ｎ＊＋Ｉｌ＋ｌａ＊＋１ｌｌＩｔｌ’ｅａｌ＋６ｇＨａρＣＴ／５Ｅ９１１ ００５３３国際調査報告 ＰＣＴ／ＳＥ　９１１００５３３

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．下記配列： ＡＧＧＴＣＴＴＡＡＣＡＴＧＡＣＴＡＡＣＴＡＡＧＣＴＣＴＴＡＡＣＴＴＡＡＣ ＴＡＡＣＴＴＡＧＧＴＣＴＴＡＣＴＴＴＡＡＣＴＡＡＡＣＴ を有する一本鎖ＤＮＡ断片（ｆ６３）またはその相補鎖、またはｆ６３またはそ の相補鎖に対してハイブリダイズできるそれらの変種、または相当する二本鎖配 列。 ２．少くとも２０塩基または塩基対長よりも大きい請求項１記載のＤＮＡ断片ま たはその隣接セグメント、特にＡＧＧＴＣＴＴＡＡＣＡＴＧＡＣＴＡＡＣＴＡ。 ３．一本鎖形態の請求項１または２記載のＤＭ断片。 ４．請求項１または２記載のＤＮＡ断片より成るハイブリダイゼーションプロー ブ。 ５．比色検出可能な基により標識される請求項４記載のハイブリダイゼーション プローブ。 ６．比色検出用に標識された基がビオチンである請求項５記載のハイブリダイゼ ーションプローブ。 ７．比色検出用に標識された基が発色団レポーター基である請求項５記載のハイ ブリダイゼーションプローブ。 ８．以下の諸段階より成る血液またはその他の体液に存在する病原体の検出方法 ： ａ）ＧｕＨＣｌ、ＳＬＳおよびＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００を含む溶液中で血液検 体を溶解する、 ｂ）前記血液検体中に存在するＤＮＡを変性させ、そして前記病原体のＤＮＡと ハイブリダイズするハイブリダイゼーションプローブの存在下に溶液ハイブリダ イゼーションを行う、 ｃ）８ｂ）段階に用いたハイブリダイゼーションプローブが結合する同じゲノム ＤＨＡ鎖にハイブリダイズできるヌクレオチド配列を有するハイブリダイゼーシ ョンプローブで被覆されたマイクロタイタープレートで８ｂ）段階で形成された ハイブリッドを捕獲する、 ｄ）そのマイクロタイタープレートをＳＳＣ、ＳＤＳおよびＴｒｉｔｏｎ−Ｘ− １００より成る溶液を用いて洗浄する、ｅ）比色法によりハイブリッドの有無を 検出する。 ９．変性段階８ｂ）が加熱により行われる請求項８記載の方法。 １０．マイクロタイタープレートの被覆に用いられるハイブリダイゼーションプ ローブが８ｂ）段階で用いたハイブリダイゼーションプローブと同じヌクレオチ ド配列を有する請求項８または９記載の方法。 １１．ハイブリダイゼーションプローブが請求項２または３に記載のとおりであ る請求項８記載の方法。 １２．８ａ）段階の試薬最濃度が次のとおりである請求項８〜１１のいずれかに 記載の方法： ａ）塩酸グアニジン：１．１Ｍ〜３．０Ｍｂ）ナトリウムラウリルサルコシン： ０．２％〜０．５％Ｖ／Ｖ ｃ）Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００：０．２％〜０．５％Ｖ／Ｖ。 １３．８ｅ）段階の最終濃度が次のとおりである請求項８および１２記載の方法 ： ａ）標準食塩ークエン酸緩衝液−０．５×〜２．５×ＳＳＣｂ）Ｔｒｉｔｏｎ− Ｘ−１００−０．２％〜０．５％Ｖ／Ｖｃ）ドデシル硫酸ナトリウム−０．２％ 〜０．５％Ｖ／Ｖ。 １４．溶解溶液が可溶化剤としてもハイブリダイゼーション溶液としても用いら れる請求項８〜１３のいずれかに記載の方法。 １５．２×ＳＳＣが非特異的ハイブリッドの除去に用いられる請求項８〜１４の いずれかに記載の方法。 １６．Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００およびＳＤＳが血液起原の着色物質の除去に用 いられる請求項８〜１５のいずれかに記載の方法。 １７．病原体が熱帯熱マラリア原虫である請求項８〜１６のいずれかに記載の方 法。 １８．病原体が三日熱マラリア原虫である請求項８〜１６のいずれかに記載の方 法。 １９．病原体がシゲラである請求項８〜１６のいずれかに記載の方法。 ２０．病原体が結核菌である請求項８〜１６のいずれかに記載の方法。 ２１．病原体が血液病原体である請求項８〜１６のいずれかに記載の方法。 ２２．請求項８〜２１のいずれかに記載の方法に基づく標的ポリヌクレオチド配 列における所与のヌクレオチド配列の検出のための診断キット。