JP7732991B2 - 標的化された核酸捕捉のためのシステムおよび方法 - Google Patents

Description

相互参照
本出願は、２０２０年１月３１日出願の米国仮出願第６２／９６８，８４７号、２０２０年３月９日出願の米国仮出願第６２／９８７，２３２号および２０２０年３月１２日出願の米国仮出願第６２／９８８，８５９号の利益を主張し、これらの出願は、参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、参照により本明細書に組み込まれる、２０１９年１１月２０日出願の以下の同時係属中の特許出願：国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０６２５０８号に関する。

背景
核酸標的捕捉法により、目的の特定の遺伝子、エクソン、および他のゲノム領域を、例えば標的化配列決定のために富化させることを可能にすることができる。しかし、標的捕捉に基づく配列決定方法には、煩わしい非常に長いプロトコールおよびコストがかかるプロセスが伴い得るだけでなく、小さな捕捉パネル（例えば、５００未満のプローブ）に対するオンターゲット率が低い。さらに、現行の核酸標的捕捉法は、低インプットおよび損傷ＤＮＡに対しては、回収率が低いことが原因で不適当であり得る。
バイサルファイト変換は、核酸分子のメチル化パターンを研究するための有用な技法であり得る。しかし、バイサルファイト変換は、例えば短縮を作り出すことによって核酸に損傷を与える恐れがある。次世代シーケンシング（ＮＧＳ）ＤＮＡライブラリーをバイサルファイトで処理すると、実質的な量の核酸が損傷を受け、その後の増幅ステップにおいて回収できなくなり、それにより、回収率が低くなる恐れがある。さらに、バイサルファイト変換により一本鎖または断片化ＤＮＡおよび配列の複雑さの低減が生じ得るので、変換されたＤＮＡは、従来のアダプター－ライゲーションに基づくライブラリー構築にインプットすることが難しいものになり得る。バイサルファイト処理された無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）または循環腫瘍細胞ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）は一般には最初のインプットが小さく、回収率が低いこと（例えば、バイサルファイト処理されたｃｆＤＮＡの５％またはそれ未満）を考慮すると、より大きな課題を提示し得る。メチル化感受性酵素処理を、メチル化シトシンに変換するために実施することもできる。しかし、酵素に基づく手法は、長い多重ステップのプロセス中のメチル化状態の喪失になお悩まされ、低い回収率をもたらし得る。

無細胞ＤＮＡにおけるメチル化分析は、早期がん検出のための大きな潜在性を持つ。早期がん患者の血漿中では、腫瘍内容物は、０．１％未満であり、多くの場合０．０１％またはそれよりも低くにまで低下していると推定され、したがって、感度の高いアッセイを必要とする。現在、がんのスクリーニングのために使用される２つの主な手法：全ゲノムバイサルファイトシーケンシング（ＷＧＢＳ）、縮小表示バイサルファイトシーケンシング（ＲＲＢＳ）または親和性に基づく富化を含む包括的手法、および１０，０００またはそれよりも多くの潜在的なメチル化マーカーを含有する大きな標的化パネルがある。標的メチル化シーケンシング（ＴＭＳ）は、メチル化マーカーの最も感度が高く特異的な分析を提供する。しかし、従来のＴＭＳの感度および特異度は、標的富化の低効率および低回収によって損なわれ、大きなパネルに関連するバックグラウンドノイズによってさらに妨害される。小さく集中したがん特異的メチル化バイオマーカーパネルを使用する徹底分析のための方法が必要とされている。

したがって、より効率的であり、使用しやすく、高速であり、柔軟であり、実用的な標的核酸捕捉法、および、特にｃｆＤＮＡなどの低インプット試料に対する、バイサルファイト処理された核酸を解析するための改善された方法が必要とされている。本明細書に開示される方法は、非常に低いＤＮＡインプット試料に対する増幅前かつバイサルファイト変換前のハイブリダイゼーションに基づく捕捉のために使用することができる。

概要
本明細書に開示されるのは、鋳型核酸分子の５’末端または３’末端にアダプターを含む鋳型核酸分子を得るステップと、第１の架橋プローブの第１の標的特異的領域を、鋳型核酸分子の第１の標的配列にハイブリダイズさせるステップであって、第１の架橋プローブの第１のアダプターランディング配列が、アダプターアンカープローブの第１の架橋結合配列に結合する、ステップと、第２の架橋プローブの第２の標的特異的領域を、鋳型核酸分子の第２の標的配列にハイブリダイズさせるステップであって、第２の架橋プローブの第２のアダプターランディング配列が、アダプターアンカープローブの第２の架橋結合配列に結合する、ステップとを含む方法である。この方法は、アダプターを試料核酸分子の５’末端または３’末端に結合させ、それにより、アダプターを含む鋳型核酸分子を生成するステップをさらに含み得る。この方法は、アダプターを試料核酸分子の５’末端または３’末端に結合させ、アダプターをアダプターを含む鋳型核酸分子の３’末端または５’末端にそれぞれ結合させ、それにより、各末端においてアダプターを含む鋳型核酸分子を生成するステップをさらに含み得る。この方法は、アダプタープライマーを、第１の架橋プローブおよび第２の架橋プローブにハイブリダイズさせた鋳型核酸分子の３’末端に結合したアダプターにハイブリダイズさせるステップと、アダプタープライマーの３’末端を伸長させ、それにより、伸長産物を生成するステップとをさらに含み得る。この方法は、伸長産物の配列決定を行うステップをさらに含み得る。

第１の標的特異的領域にハイブリダイズさせるステップの前に、第１の架橋プローブの第１のアダプターランディング配列は、アダプターアンカープローブの第１の架橋結合配列に結合され得る。第１の標的特異的領域にハイブリダイズさせるステップの後に、第１の架橋プローブの第１のアダプターランディング配列は、アダプターアンカープローブの第１の架橋結合配列に結合され得る。第２の標的特異的領域にハイブリダイズさせるステップの前に、第２の架橋プローブの第２のアダプターランディング配列は、アダプターアンカープローブの第２の架橋結合配列に結合され得る。第２の標的特異的領域にハイブリダイズさせるステップの後に、第２の架橋プローブの第２のアダプターランディング配列は、アダプターアンカープローブの第２の架橋結合配列に結合され得る。

この方法は、第１の架橋プローブの第１のランディング配列をアダプターアンカープローブの第１の架橋結合配列にハイブリダイズさせるステップをさらに含み得る。この方法は、第２の架橋プローブの第２のランディング配列をアダプターアンカープローブの第２の架橋結合配列にハイブリダイズさせるステップをさらに含み得る。アダプターアンカープローブは、第１の架橋結合配列と第２の架橋結合配列との間に位置するスペーサーをさらに含み得る。アダプターは、分子バーコードを含み得る。

アダプターアンカープローブは、結合部分を含み得る。結合部分は、支持体に結合され得る。支持体はビーズであり得る。ビーズはストレプトアビジンビーズであり得る。結合部分はビオチンであり得る。

第１の架橋プローブは、結合部分を含み得る。結合部分は、支持体に結合され得る。支持体はビーズであり得る。ビーズはストレプトアビジンビーズであり得る。結合部分はビオチンであり得る。

鋳型核酸分子は一本鎖ＤＮＡを含み得る。鋳型核酸分子は、生体試料由来の無細胞核酸を含み得る。無細胞核酸は無細胞ＤＮＡを含み得る。無細胞ＤＮＡは循環腫瘍ＤＮＡを含み得る。鋳型核酸分子は損傷ＤＮＡを含み得る。

本明細書に開示されるのは、第１の架橋プローブの第１の標的特異的領域を、鋳型核酸分子の第１の標的配列にハイブリダイズさせるステップであって、第１の架橋プローブの第１のアダプターランディング配列が、アダプターアンカープローブの第１の架橋結合配列に結合する、ステップと、第２の架橋プローブの第２の標的特異的領域を、鋳型核酸分子の第２の標的配列にハイブリダイズさせるステップであって、第２の架橋プローブの第２のアダプターランディング配列が、アダプターアンカープローブの第２の架橋結合配列に結合し、それにより、第１の架橋プローブおよび第２の架橋プローブにハイブリダイズさせた鋳型核酸分子を生成するステップと、第１の標的特異的領域のハイブリダイズさせるステップおよび第２の標的特異的領域のハイブリダイズさせるステップの後に、鋳型核酸分子をメチル化アッセイ試薬で処理するステップとを含む方法である。メチル化アッセイ試薬は、二硫化物、またはメチル化シトシンを修飾する酵素であり得る。この方法は、第３の架橋プローブの第３の標的特異的領域を、鋳型核酸分子の第３の標的配列にハイブリダイズさせるステップであって、第３の架橋プローブの第３のアダプターランディング配列が、アダプターアンカープローブの第３の架橋結合配列に結合する、ステップをさらに含み得る。この方法は、第４の架橋プローブの第４の標的特異的領域を、鋳型核酸分子の第４の標的配列にハイブリダイズさせるステップであって、第４の架橋プローブの第４のアダプターランディング配列が、アダプターアンカープローブの第４の架橋結合配列に結合する、ステップをさらに含み得る。

この方法は、第１の架橋プローブをハイブリダイズさせるステップの前および第２の架橋プローブをハイブリダイズさせるステップの前に、アダプターを鋳型核酸分子の５’末端または３’末端に結合させるステップをさらに含み得る。この方法は、アダプタープライマーを、第１の架橋プローブおよび第２の架橋プローブにハイブリダイズさせた鋳型核酸分子の３’末端に結合したアダプターにハイブリダイズさせるステップと、アダプタープライマーの３’末端を伸長させ、それにより、伸長産物を生成するステップとをさらに含み得る。この方法は、伸長産物の配列決定を行うステップをさらに含み得る。

アダプタープライマーのハイブリダイズさせるステップは、バイサルファイトでの処理前に実施され得る。アダプタープライマーのハイブリダイズさせるステップは、バイサルファイトでの処理後に実施され得る。アダプタープライマーは、バイサルファイトでの処理後にアダプターに基づいて設計され、アダプター内の非メチル化シトシンが、処理の間にウラシルに変換され得る。第１の標的特異的領域にハイブリダイズさせるステップの前に、第１の架橋プローブの第１のアダプターランディング配列は、アダプターアンカープローブの第１の架橋結合配列に結合され得る。第１の標的特異的領域にハイブリダイズさせるステップの後に、第１の架橋プローブの第１のアダプターランディング配列は、アダプターアンカープローブの第１の架橋結合配列に結合され得る。第２の標的特異的領域にハイブリダイズさせるステップの前に、第２の架橋プローブの第２のアダプターランディング配列は、アダプターアンカープローブの第２の架橋結合配列に結合され得る。第２の標的特異的領域にハイブリダイズさせるステップの後に、第２の架橋プローブの第２のアダプターランディング配列は、アダプターアンカープローブの第２の架橋結合配列に結合され得る。

この方法は、第１の架橋プローブの第１のランディング配列をアダプターアンカープローブの第１の架橋結合配列にハイブリダイズさせるステップをさらに含み得る。この方法は、第２の架橋プローブの第２のランディング配列をアダプターアンカープローブの第２の架橋結合配列にハイブリダイズさせるステップをさらに含み得る。アダプターアンカープローブは、第１の架橋結合配列と第２の架橋結合配列との間に位置するスペーサーをさらに含み得る。アダプターは、分子バーコードを含み得る。

アダプターアンカープローブは、結合部分を含み得る。結合部分は、支持体に結合され得る。支持体はビーズであり得る。ビーズはストレプトアビジンビーズであり得る。結合部分はビオチンであり得る。第１の架橋プローブは、結合部分を含み得る。結合部分は、支持体に結合され得る。支持体はビーズであり得る。ビーズはストレプトアビジンビーズであり得る。結合部分はビオチンであり得る。鋳型核酸分子は一本鎖ＤＮＡを含み得る。鋳型核酸分子は、生体試料由来の無細胞核酸を含み得る。無細胞核酸は無細胞ＤＮＡを含み得る。無細胞ＤＮＡは循環腫瘍ＤＮＡを含み得る。鋳型核酸分子は損傷ＤＮＡを含み得る。

本明細書に開示されるのは、鋳型核酸分子の標的配列にハイブリダイズするように構成された標的特異的領域を含む架橋プローブと、架橋プローブのアダプターランディング配列にハイブリダイズするように構成された架橋結合配列を含むアダプターアンカープローブと、鋳型核酸分子の５’末端または３’末端に結合するように構成されたアダプターとを含むキットである。

本明細書に開示されるのは、鋳型核酸分子であって、鋳型核酸分子の５’末端または３’末端がアダプターに結合する、鋳型核酸分子と、第１の架橋プローブであって、第１の架橋プローブの第１の標的特異的領域が鋳型核酸分子の第１の標的配列にハイブリダイズされる、第１の架橋プローブと、第２の架橋プローブであって、第２の架橋プローブの第２の標的特異的領域が鋳型核酸分子の第２の標的配列にハイブリダイズされる、第２の架橋プローブと、アダプターアンカープローブであって、アダプターアンカープローブの第１の架橋結合配列が第１の架橋プローブの第１のアダプターランディング配列に結合し、アダプターアンカープローブの第２の架橋結合配列が第２の架橋プローブの第２のアダプターランディング配列に結合する、アダプターアンカープローブとを含む組成物である。

本明細書に開示されるのは、鋳型核酸分子であって、鋳型核酸分子の５’末端または３’末端がアダプターに結合し、鋳型核酸分子の第１の標的配列が第１の架橋プローブの第１の標的特異的領域にハイブリダイズされ、鋳型核酸分子の第２の標的配列が第２の架橋プローブの第２の標的特異的領域にハイブリダイズされ、第１の架橋プローブの第１のアダプターランディング配列が、アダプターアンカープローブの第１の架橋結合配列に結合し、第２の架橋プローブの第２のアダプターランディング配列が、アダプターアンカープローブの第２の架橋結合配列に結合する、鋳型核酸分子を含む核酸複合体である。本明細書に開示されるのは、核酸複合体を含む組成物である。

本明細書に開示されるのは、逐次的富化の方法であって、複数の核酸分子を含む試料を得るステップと、第１の標的富化を実施して、１つまたは複数のゲノム領域の第１のパネルに対応する配列を含む核酸分子について富化させ、それにより、１つまたは複数のゲノム領域の第１のパネルに対応する配列について富化された核酸を含む第１の富化された試料、および１つまたは複数のゲノム領域の第１のパネルに対応する配列について枯渇した核酸を含む残留試料を生成するステップと、残留試料において第２の標的富化を実施して、１つまたは複数のゲノム領域の第２のパネルに対応する配列を含む核酸分子について富化させ、それにより、１つまたは複数のゲノム領域の第２のパネルに対応する配列について富化された核酸を含む第２の富化された試料を生成するステップであって、１つまたは複数のゲノム領域の第１のパネルおよび１つまたは複数のゲノム領域の第２のパネルが異なる、ステップとを含む方法である。

この方法は、第１の富化された試料の第１の分析および第２の富化された試料の第２の分析を実施するステップをさらに含み得る。

第１の分析は配列分析であり得、第２の分析はメチル化分析であり得る。

一部の場合では、第１の分析は第１の配列分析であり、第２の分析は第２の配列分析であり、第１の配列分析は、第２の配列分析と異なる配列決定の深さで実施される。

一部の場合では、試料はｃｆＤＮＡ試料である。

一部の場合では、１つまたは複数のゲノム領域のパネルのゲノム領域についての標的富化は、ハイブリダイゼーションによる標的富化を含む。

一部の場合では、１つまたは複数のゲノム領域のパネルのゲノム領域についての標的富化は、第１の架橋プローブの第１の標的特異的領域を、ゲノム領域に対応する配列を有する分子の第１の標的配列にハイブリダイズさせるステップであって、第１の架橋プローブの第１のアダプターランディング配列が、アダプターアンカープローブの第１の架橋結合配列に結合する、ステップと、第２の架橋プローブの第２の標的特異的領域を、ゲノム領域に対応する配列を有する分子の第２の標的配列にハイブリダイズさせるステップであって、第２の架橋プローブの第２のアダプターランディング配列が、アダプターアンカープローブの第２の架橋結合配列に結合する、ステップ。

一部の場合では、アダプターアンカープローブは、結合部分を含む。

結合部分を支持体に結合させるステップと、結合した結合部分を有する支持体を未結合の核酸から分離するステップとをさらに含む、請求項７３に記載の方法。

一部の場合では、ゲノム領域の または第２のパネルはプロモーター領域を含む。

一部の場合では、ゲノム領域の第１または第２のパネルはイントロン領域を含む。

ゲノム領域の第１または第２のパネルがエクソン領域を含む、請求項６６、７５または７６に記載の方法。

一部の場合では、この方法は、アダプターを複数の核酸分子の核酸分子の５’末端または３’末端に結合させ、それにより、アダプターを含む核酸分子のライブラリーを生成するステップをさらに含む。

一部の場合では、第２の富化された試料は、バイサルファイト処理され、配列決定反応に供される。

一部の場合では、配列決定反応の情報提供リードの数は、１つまたは複数のゲノム領域の第２のパネルに対応する配列を含む核酸分子について富化するために単一標的富化に供された場合に試料から得られ得る情報提供リードの数の少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％である。

一部の場合では、この方法は、１つまたは複数のゲノム領域の第１のパネルおよび第２のパネルに対応する配列について枯渇した核酸を含む第２の残留試料において第３の標的富化を実施して、１つまたは複数のゲノム領域の第３のパネルに対応する配列を含む核酸分子について富化させ、それにより、１つまたは複数のゲノム領域の第３のパネルに対応する配列について富化された核酸を含む第３の富化された試料を生成するステップであって、１つまたは複数のゲノム領域の第１のパネル、１つまたは複数のゲノム領域の第２のパネルおよび１つまたは複数のゲノム領域の第３のパネルが異なる、ステップをさらに含む。

一部の場合では、この方法は、第３の架橋プローブの第３の標的特異的領域を、ゲノム領域に対応する配列を有する分子の第３の標的配列にハイブリダイズさせるステップであって、第３の架橋プローブの第３のアダプターランディング配列が、アダプターアンカープローブの第３の架橋結合配列に結合する、ステップをさらに含む。

一部の場合では、この方法は、第４の架橋プローブの第４の標的特異的領域を、ゲノム領域に対応する配列を有する分子の第４の標的配列にハイブリダイズさせるステップであって、第４の架橋プローブの第４のアダプターランディング配列が、アダプターアンカープローブの第４の架橋結合配列に結合する、ステップをさらに含む。

参照による組込み
本明細書において言及されている全ての刊行物、特許および特許出願は、個々の刊行物、特許、または特許出願が、具体的にかつ個別に参照により組み込まれることが示されたものと同程度に参照により本明細書に組み込まれる。

本発明の新規の特徴は、添付の特許請求の範囲において詳細に記載されている。本発明の原理が利用されている例示的な実施形態が記載されている以下の詳細な説明および以下の付属図を参照することにより、本発明の特徴および利点のよりよい理解が得られよう。

図１は、鋳型核酸分子の相乗的な間接的ハイブリダイゼーション捕捉の一実施形態を例示する。この実施形態では、鋳型核酸分子のライブラリーは、間接的ハイブリダイゼーションの前に構築される。

図２Ａ～２Ｂは、メチル化シーケンシングのための鋳型核酸分子の相乗的な間接的ハイブリダイゼーション捕捉の一実施形態を例示する。図２Ａは鋳型核酸分子の相乗的な間接的ハイブリダイゼーション捕捉を示し、図２Ｂは捕捉された鋳型にされた核酸分子のその後のバイサルファイト変換を示す。

図３は、鋳型核酸分子の相乗的な間接的ハイブリダイゼーション捕捉および標的メチル化シーケンシング（ＳＩＣＯＮ－ＴＭＳ）のためのワークフローを示す。

図４は、相乗的な間接的ハイブリダイゼーションの概略図を示す。

図５Ａ～５Ｄは、異なるハイブリダイゼーションシステムの概略図を示す。図５Ａは、非相乗的な直接的ハイブリダイゼーションを例示する。図５Ｂは、相乗的な直接的ハイブリダイゼーションを例示する。図５Ｃは、相乗的な間接的ハイブリダイゼーションを例示する。図５Ｄは、非相乗的な間接的ハイブリダイゼーションを例示する。

図６Ａ～６Ｂは、アダプターアンカープローブの架橋結合配列の中間にスペーサーありまたはなしのアダプターアンカープローブを使用した相乗的な間接的ハイブリダイゼーションの概略図を例示する。図６Ａは、スペーサーを含むアダプターアンカープローブを用いる相乗的な間接的ハイブリダイゼーションの概略図を示す。図６Ｂは、スペーサーを欠いたアダプターアンカープローブを用いる相乗的な間接的ハイブリダイゼーションを示す。

図７は、相乗的な間接的捕捉法を使用する１５標的パネルの配列決定カバレッジを示す。

図８Ａ～８Ｂは、２つの異なるハイブリダイゼーション法を使用する７６のヒト遺伝子標的（ヒトＩＤ）のパネルの配列決定カバレッジを示す。図８Ａは、相乗的な間接的ハイブリダイゼーションによる増幅前捕捉によるカバレッジを示す。図８Ｂは、直接的ハイブリダイゼーションによる増幅後捕捉によるカバレッジを示す。

図９は、非がん性個体から抽出されたｃｆＤＮＡの相乗的な間接的捕捉後の標的メチル化シーケンシングアッセイの結果を示す。

図１０は、スパイクインメチル化ＤＮＡの予測される量と測定値との間の直線関係を示す標的メチル化シーケンシングアッセイの結果を例示する。

図１１Ａおよび１１Ｂは、正常な結腸組織および結腸がん組織のゲノムＤＮＡ内のＤＭＲ１の分子メチル化分散パターンをそれぞれ示す。

図１２Ａおよび１２Ｂは、正常な結腸組織および結腸がん組織のゲノムＤＮＡ内のＤＭＲ２の分子メチル化分散パターンをそれぞれ示す。

図１３Ａおよび１３Ｂは、健康な個体の血漿ｃｆＤＮＡおよび結腸がん患者の血漿ｃｆＤＮＡ内のＤＭＲ１およびＤＭＲ２の分子メチル化分散パターンをそれぞれ示す。

図１４は、試料からの逐次的標的富化のための概略図を例示する。

図１５は、実施例１１におけるＣＲＣ ｃｆＤＮＡ試料において同定された変異を例示する。

図１６は、スタンドアロンおよび二重分析ＴＭＳからのメチル化スコアを例示する。

図１７は、スタンドアロンおよび二重分析ＴＭＳからの情報提供分子カウントを例示する。

図１８は、個別化パネル分析におけるバリアント対立遺伝子検出の感度を例示する。

図１９は、Ｐｏｉｎｔ－ｎ－Ｓｅｑ（商標）技術のインプリメンテーションを例示する。

詳細な説明
メチル化を使用したＣｆＤＮＡに基づくリキッドバイオプシーおよび変異分析を、がんの早期検出および管理のために使用することができる。限定的な量の核酸試料からの複合分析のためのシステムおよび方法が本明細書に提示される。例えば、限定的なＤＮＡ試料からの組み合わせた標的メチル化シーケンシング（ＴＭＳ）および変異分析のためのシステムおよび方法が本明細書に提示される。これらのシステムおよび方法は、量が少ない可能性のあるｃｆＤＮＡ試料について特に有用であり得る。

がんゲノムにおける広範であるが組織特異的なメチル化変化は、早期のまたは再発したがん患者由来の血漿中の循環腫瘍（ｃｔＤＮＡ）の高感度検出のために使用することができる。しかし、メチル化分析の感度は、プロセスにおけるメチル化マーカーの回収の低効率によって損なわれ得、特異性は、低検出感度を補うノイズの多い非特異的マーカーを含む手法によってさらに妨害される場合がある。さらに、メチル化分析は、早期がん検出のための利点を持ち得、アクショナブル変異は、処置の選択をガイドし、アッセイの特異性をさらに増加させるための情報を直接的に提供することができる。限られた臨床血液試料由来のｃｆＤＮＡの収量は、少量である可能性があり、これは、一試料から複数の分析を実施するための主な問題であり得、したがって、メチル化および変異の両方を検出することができるアッセイは、臨床研究および診断アッセイのために改善を提供することができる。

本開示は、ｃｆＤＮＡにおける標的メチル化と変異の複合分析のために設計された改善された技術：Ｐｏｉｎｔ－ｎ－Ｓｅｑを提供し、これは、シトシン変換および増幅前のｃｆＤＮＡからの直接的な標的分子の富化を特徴とする。この技術は、少なくとも１０、１００、１０００、または１０００よりも多くのマーカーのメチル化または変異の状態を調べる小さく集中したパネルを可能にすることができる。１００のメチル化マーカーおよび２２の遺伝子からの３５０より多くのホットスポット変異をカバーするように設計された結腸直腸がん（ＣＲＣ）パネルが本明細書に提示される。Ｐｏｉｎｔ－ｎ－Ｓｅｑ ＴＭＳは、ｃｆＤＮＡを使用した小さく集中したメチル化および変異の複合パネル配列決定のために使用することができる。Ｐｏｉｎｔ－ｎ－Ｓｅｑ ＴＭＳは、研究および臨床使用のための実用的でコスト効率が良いメチル化アッセイの開発において使用することができる。

超効率の変換前／増幅前捕捉Ｐｏｉｎｔ－ｎ－Ｓｅｑの利用を、疾患に集中したメチル化および変異パネル富化のために使用することができる。Ｐｏｉｎｔ－ｎ－Ｓｅｑ ＴＭＳは、ｃｆＤＮＡを使用した小さな集中的なメチル化および変異パネルの分析を可能にする。Ｐｏｉｎｔ－ｎ－Ｓｅｑ ＴＭＳは、研究および臨床使用のための実用的でコスト効率が良いメチル化アッセイにおいて使用することができる。

配列決定のための核酸の相乗的な間接的捕捉（ＳＩＣＯＮ－ＳＥＱ、Ｐｏｉｎｔ－ｎ－ＳＥＱとも称される）のためのシステムおよび方法も本明細書に提示される。本明細書に開示されるシステムおよび方法は、核酸材料の効率的な捕捉および富化を可能にする。ＳＩＣＯＮ－ＳＥＱ／Ｐｏｉｎｔ－ｎ－ＳＥＱは、アダプターの鋳型核酸材料への結合によるライブラリー構築後に捕捉富化のために実施することができる。一部の実施形態では、ＳＩＣＯＮ－ＳＥＱは、ライブラリー構築前に実施することができる。ＳＩＣＯＮ－ＳＥＱは、アダプター結合によるライブラリー構築なしで実施することができる。本明細書に開示されるＳＩＣＯＮ－ＳＥＱ法は、短いターンアラウンドタイムおよびシンプルなワークフローを可能にすることができる。ＳＩＣＯＮ－ＳＥＱは、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）などの低インプット試料を取り扱うために使用することができ、したがって、メチル化シーケンシング分析のために好適であり得る。

１つまたは複数の架橋プローブの鋳型核酸へのハイブリダイゼーションを通した鋳型核酸分子とアダプターアンカープローブとの間接的ハイブリダイゼーションを含む方法が本明細書に開示される。１つまたは複数の架橋プローブは、鋳型核酸分子内の特定の標的配列にハイブリダイズし、それにより、標的鋳型にハイブリダイズすることができるように設計することができる。次に、アダプターアンカープローブを１つまたは複数の架橋プローブにハイブリダイズすることができるように設計することができ、それにより、３つまたはそれよりも多くのハイブリダイズした核酸分子のアセンブリを作り出すことができる。多重構造ハイブリダイゼーションアセンブリは、アセンブリにより大きな安定性をもたらすように相乗的に作用することができる。その後、ハイブリダイズした鋳型核酸分子を、メチル化シーケンシングのためにバイサルファイトで処理することができる。

鋳型核酸分子の標的配列にハイブリダイズする標的特異的領域を含む架橋プローブと、架橋プローブのアダプターランディング配列にハイブリダイズする架橋結合配列を含むアダプターアンカープローブと、鋳型核酸分子の５’末端または３’末端に結合するように構成されたアダプターとを含むキットが本明細書に開示される。

Ｉ．ハイブリダイゼーションによる間接的捕捉
ハイブリダイゼーションアセンブリを形成する鋳型核酸と２つまたはそれよりも多くのプローブとの相乗的な相互作用により、標的プローブハイブリダイゼーションを容易にすることができる。多重複合アセンブリにより、鋳型と架橋プローブなどの標的プローブとの間のハイブリダイゼーション相互作用を安定化することができる。架橋プローブは、鋳型の標的領域とハイブリダイズする標的特異的領域およびアダプターアンカープローブの架橋結合配列（ＢＢＳ）にハイブリダイズするアダプターランディング配列（ＡＬＳ）を含み得る。鋳型と架橋プローブとの間のハイブリダイゼーションおよび架橋プローブとアダプターアンカープローブとの間のハイブリダイゼーションにより、多重複合アセンブリを形成することができる。

本明細書に開示される方法では２種よりも多くの架橋プローブのプレ標的領域を使用することができる。例えば、鋳型とアダプターアンカープローブとを架橋するために、少なくとも２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、２５種、５０種、７５種、１００種、またはそれよりも多くの架橋プローブを使用することができる。配列決定のための核酸の相乗的な間接的捕捉（ＳＩＣＯＮ－ＳＥＱ）法は、第２の架橋プローブの第２の標的特異的領域を、鋳型核酸分子の第２の標的配列にハイブリダイズさせるステップであって、第２の架橋プローブの第２のアダプターランディング配列が、アダプターアンカープローブの第２の架橋結合配列に結合し得る、ステップをさらに含み得る（図１）。一部の場合では、ＳＩＣＯＮ－ＳＥＱは、ライブラリーを生成するためのアダプターの鋳型核酸分子への結合後に実行することができる（図１）。ライブラリーは、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）ライブラリーであり得る。

架橋プローブは、標的特異的領域とアダプターランディング配列とを接続するリンカーをさらに含み得る。アダプターアンカーは、架橋結合配列の中間に１つまたは複数のスペーサーを含み得る。１つまたは複数のスペーサーの存在は、ハイブリダイゼーション捕捉の効率を改善し、捕捉の特異性を増加させることができる。

無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）および循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）などの低インプット試料から鋳型核酸を捕捉し、富化することができる。捕捉および富化は、架橋プローブへのハイブリダイゼーションを通じたアダプターアンカープローブとの間接的会合によって行うことができる。架橋プローブおよび／またはアダプターアンカープローブは、１つまたは複数の結合性部分を含み得る。結合性部分はビオチンであり得る。結合性部分は、支持体に結合され得る。支持体はビーズであり得る。ビーズはストレプトアビジンビーズであり得る。

鋳型核酸分子の標的配列にハイブリダイズする標的特異的領域を含む架橋プローブと、架橋プローブのアダプターランディング配列にハイブリダイズする架橋結合配列を含むアダプターアンカープローブと、鋳型核酸分子の５’末端または３’末端に結合するように構成されたアダプターとを含むキットが本明細書に開示される。

ＩＩ．メチル化分析のためのワークフロー
核酸のメチル化分析のための方法が本明細書に提示される。メチル化分析は、バイサルファイト処理によって行うことができる。バイサルファイト処理された核酸を使用して、核酸のメチル化を研究することができる。バイサルファイト処理により、メチル化されていないシトシンをウラシルに変換することができる。シトシンのメチル化（例えば、５’－メチルシトシン（5’-methylctyosine））により、バイサルファイトによりメチル化されたシトシンがウラシルに変換されるのを防止することができる。

捕捉プローブまたは架橋プローブ／アダプターアンカープローブを使用して、ハイブリダイゼーション捕捉の前または後のいずれかで、鋳型核酸分子をバイサルファイトで処理することができる。一部の場合では、ハイブリダイズさせた鋳型核酸分子をバイサルファイトで処理することができる。二本鎖配列の形成（例えば、鋳型のＴＳと捕捉プローブのＴＳＲとの間での）により、バイサルファイト処理中、ハイブリダイズした領域内のシトシンをウラシルへの変換から保護することができる。捕捉プローブを鋳型にまたは架橋プローブを鋳型に、アダプターアンカープローブにハイブリダイズさせることによって形成された二本鎖配列により、ハイブリダイズした領域内のシトシンをウラシルへのバイサルファイトによる変換から保護することができる。さらに、バイサルファイト処理によりメチル化されていないシトシンをウラシルに変換することができるので、ＴＳ領域におけるシトシンのウラシルへの変換から保護することにより、バイサルファイト変換されていないＤＮＡにアニーリングするように設計された増幅プライマーの使用が可能になり得る。バイサルファイト変換前捕捉のために、変換されていない配列に対してプローブを設計することもできる。変換されていないシトシンにアニーリングするプローブおよびプライマーは、設計がより簡単であり得、また、より良好なハイブリダイゼーションをもたらす。
一部の場合では、メチル化分析のために、酵素処理を実施することができる。酵素は、メチル化感受性酵素またはメチル化依存性酵素であり得る。酵素は制限酵素であり得る。酵素はメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼであり得る。他の場合では、メチル化核酸を富化するために、メチル化部位に特異的に結合する特異的抗体またはタンパク質を使用することによって、メチル化分析を行うことができる。

ａ．鋳型核酸のハイブリダイゼーション捕捉後のメチル化処理または富化
本明細書に記載の通り、鋳型核酸（例えば、ＤＮＡ）を、相乗的な間接的ハイブリダイゼーションおよびその後の配列決定（ＳＩＣＯＮ－ＳＥＱ）のために使用することができる（例えば、図３を参照されたい）。鋳型核酸（例えば、ＤＮＡ）は、例えば、ゲノムＤＮＡ、またはｃｆＤＮＡであり得る。例えば、本明細書に記載の通り、例えば、図１および２Ａに例示されている通り、鋳型核酸（例えば、ＤＮＡ）を、捕捉プローブに直接的にハイブリダイズさせることができ、または架橋プローブハイブリダイゼーションによってアダプターアンカープローブ（または汎用アンカープローブ）に間接的に結合させることができる。ハイブリダイゼーション捕捉された鋳型核酸（例えば、ＤＮＡ）をバイサルファイトで処理し、伸長させ、その後、例えば、標的メチル化シーケンシング（ＳＩＣＯＮ－ＴＭＳ）のために増幅することができる（図２Ｂ）。一部の場合では、捕捉された鋳型核酸をメチル化感受性酵素で処理することができる。別の場合では、捕捉された鋳型核酸分子のメチル化核酸を、鋳型核酸分子内のメチル化ＣｐＧ部位を標的にする抗体またはタンパク質への特異的な結合によって富化することができる。ＳＩＣＯＮ－ＴＭＳは、広範囲におよぶ核酸材料の量（nucleic material amount）を有する臨床試料と適合し得る。一部の場合では、ＳＩＣＯＮ－ＴＭＳは、５ｎｇ未満、４ｎｇ未満、３ｎｇ未満、２ｎｇ未満、または１ｎｇ未満の核酸分子を有する配列試料を使用することができる。

捕捉プローブまたは架橋プローブの標的特異的配列もしくは標的特異的領域（ＴＳＲ）は、鋳型核酸分子の標的配列に基づいて設計することができ、鋳型核酸分子の標的配列は、バイサルファイト処理後にメチル化されていないシトシンを保持し得る。

一部の場合では、架橋プローブの標的特異的配列を脱離させる前にバイサルファイト処理を行うことができる。ＴＳおよびＴＳＲ部位内のメチル化されていないシトシンを、鋳型への捕捉プローブまたは架橋プローブのＴＳおよびＴＳＲのハイブリダイゼーション後に行われるバイサルファイト処理中のウラシルへの変換から保護することができる。その後、ハイブリダイズさせた鋳型をバイサルファイトで処理することができ、その間、ハイブリダイズしたＴＳＲ－ＴＳ領域内のメチル化されていないシトシンはウラシルに変換されないが、一方、一本鎖領域内のメチル化されていないシトシンはウラシルに変換される。ＴＳ領域においてシトシンのウラシルへの変換から保護されることにより、バイサルファイト変換されていないＤＮＡにアニーリングするように設計されたプローブの使用が可能になり得る。

一部の場合では、捕捉プローブまたは架橋プローブを鋳型核酸配列から脱離させた後にバイサルファイト処理を実施することができる。プライマー結合性部位（例えば、アダプターおよび／または鋳型内）の１つまたは複数のシトシン残基はバイサルファイト変換から保護され得ない。バイサルファイト変換後、アダプター内のプライマー結合性部位は、１つまたは複数のウラシルを含み得る。プライマーは、１つまたは複数のウラシルを含むアダプター配列と相補的になるように設計することができる。プライマーは、１つもしくは複数のウラシルを含むアダプター配列に対して１００％相補的、または１つもしくは複数のウラシルを含むアダプター配列に対して１００％未満相補的であり得る。

鋳型は、バイサルファイト処理後に１つまたは複数のウラシルを含み得る。アダプターにアニーリングしたプライマーは、鎖の伸長のために１つまたは複数のウラシルを含む鋳型を使用することができる。伸長した鎖は、１つまたは複数のウラシルに対合する塩基である１つまたは複数のアデニンを含み得る。伸長産物を鋳型から変性させることができる。プライマーを伸長産物に、１つまたは複数のアデニンを含む領域内でアニーリングさせ、伸長させることができる。プライマーを、例えば、アダプタープライマーを用いた鋳型の増幅に使用することができる。

アダプターの結合前に、メチル化処理または富化を鋳型核酸分子に適用することができる。アダプターの結合後に、メチル化処理または富化を鋳型核酸分子に適用することができる。第１のアダプターの鋳型への結合後に、メチル化処理または富化を鋳型核酸分子に適用することができる。第２のアダプターの鋳型への結合後に、メチル化処理または富化を鋳型核酸分子に適用することができる。

ｂ．鋳型核酸のハイブリダイゼーション捕捉前のメチル化処理または富化
鋳型核酸分子を、捕捉プローブまたは架橋プローブへのハイブリダイゼーションの前に、バイサルファイト処理することができる。ＤＮＡをバイサルファイトで処理して、メチル化されていないシトシンをウラシルに変換することができる。バイサルファイト処理されたＤＮＡを、相乗的な間接的ハイブリダイゼーションおよびその後の配列決定（ＳＩＣＯＮ－ＳＥＱ）のためのインプットとして使用することができる。プローブのＴＳＲは、既存のメチル化されていないシトシンがウラシルに変換されている鋳型にアニーリングするように設計することができる。ハイブリダイゼーション捕捉後、伸長を実施し、その後、標的増幅を行うことができる。一部の場合では、捕捉された鋳型核酸をメチル化感受性酵素で処理することができる。別の場合では、捕捉された鋳型核酸分子のメチル化核酸を、鋳型核酸分子内のメチル化ＣｐＧ部位を標的にする抗体またはタンパク質への特異的な結合によって富化することができる。

アダプターの結合前に、メチル化処理または富化を鋳型核酸分子に実施することができる。アダプターの結合後に、メチル化処理または富化を鋳型核酸分子に適用することができる。第１のアダプターの鋳型への結合後に、メチル化処理または富化を鋳型核酸分子に適用することができる。第２のアダプターの鋳型への結合後に、メチル化処理または富化を鋳型核酸分子に適用することができる。

ＩＩＩ．固相抽出
例えば、アダプターアンカープローブを鋳型にライゲーションする前に、架橋プローブにハイブリダイズした鋳型（またはアダプターアンカープローブが架橋プローブを介して会合した鋳型）を選択するための方法が本明細書に提示される。本方法では、固相抽出を用いることができる。架橋プローブまたはアダプターアンカープローブを固体支持体に結合させるための方法が本明細書に提示される。アダプターアンカープローブが架橋プローブと無関係に鋳型に結合する（例えば、ライゲーションする）可能性があることにより、最適以下の特異性が導入され得る。そのような非特異的ライゲーション産物ならびに結合していないプローブを低減するために、標識（例えば、ビオチン）および捕捉部分（例えば、ストレプトアビジンビーズ）を利用することができる。

架橋プローブまたはアダプターアンカープローブは、標識を含み得る。開示されている方法は、架橋プローブ、アダプターアンカープローブ、または鋳型核酸分子を含むハイブリダイゼーション複合体、架橋プローブ、およびアダプターアンカープローブを標識によって捕捉するステップをさらに含み得る。標識は、ビオチンであり得る。標識は、ポリＡもしくはポリＴ、または特定の配列などの核酸配列であり得る。核酸配列は、約５～３０塩基の長さであり得る。核酸配列は、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含み得る。標識は、捕捉プローブ、架橋プローブ、またはアダプターアンカープローブの３’末端に存在し得る。標識は、５－ブロモウリジン、およびビオチンなどの、抗体が認識することができるペプチド、または修飾された核酸であり得る。標識と捕捉プローブ、架橋プローブ、またはアダプターアンカープローブのコンジュゲートは「クリック」化学などの反応によって行うことができる。「クリック」化学により、蛍光色素のようなレポーター分子をＤＮＡのような生体分子にコンジュゲートすることが可能になり得る。クリックケミストリーは、共有結合産物（例えば、１，５－二置換１，２，３－トリアゾール）をもたらすことができる、アジドとアルキンとの間の反応であり得る。銅が触媒としての機能を果し得る。

標識は、固体支持体上に捕捉され得る。固体支持体は磁気であり得る。固体支持体は、ビーズ、フローセル、ガラス、プレート、１つもしくは複数のマイクロ流体チャネルを含むデバイス、またはカラムを含み得る。固体支持体は磁気ビーズであり得る。

固体支持体（例えば、ビーズ）は、標識に結合することができる１つまたは複数の捕捉部分を含み得る（例えば、それでコーティングすることにより）。捕捉用部分はストレプトアビジンであり得、ストレプトアビジンはビオチンに結合することができる。捕捉用部分は抗体であり得る。抗体は標識に結合することができる。捕捉用部分は、核酸、例えば、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含む核酸であり得る。核酸である捕捉用部分は、例えば、アダプターアンカープローブまたは架橋プローブ上の配列に結合することができる。一部の場合では、固体表面に結合させた抗ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド抗体を捕捉用部分として使用することができる。

標識と捕捉用部分とは、１つもしくは複数の共有結合または非共有結合を通じて結合させることができる。架橋プローブ、アダプターアンカープローブ、またはハイブリダイゼーション複合体を固体支持体上に捕捉した後、例えば、結合していない鋳型を試料から除去するために、固体支持体を洗浄することができる。一部の場合では、洗浄ステップは行わない。洗浄はストリンジェントまたは穏やかであり得る。鋳型核酸分子にハイブリダイズされる捕捉された架橋プローブまたはアダプターアンカープローブを、例えば標識がビオチンであり、捕捉用部分がストレプトアビジンである場合には、遊離のビオチンを試料に添加することによって溶出することができる。

伸長ステップ（例えば、アダプターにアニーリングするアダプタープライマーの伸長）は、架橋プローブまたはアダプターアンカープローブが固体支持体上に捕捉されている間、または固体支持体からの架橋プローブ（およびハイブリダイズさせた鋳型）の溶出後もしくはアダプターアンカープローブ（および間接的にハイブリダイズさせた鋳型）の固体支持体からの溶出後に実施することができる。

鋳型、架橋プローブ、およびアダプターアンカープローブのハイブリダイゼーション後のストレプトアビジンビーズを使用してクリーンアップを実施することができ、アダプターアンカープローブの３’末端はビオチン化されている。ハイブリダイゼーション複合体および遊離のアダプターアンカーアダプター（free adaptor anchor adaptor）の両方がビーズに結合し得る。結合していない鋳型および架橋プローブを洗い流すことができる。第１の架橋プローブおよび／または第２の架橋プローブの５’末端または３’末端は、ビオチン化され得る。ハイブリダイズしていないアダプターアンカーアダプターおよび鋳型を除去するために、ストレプトアビジンビーズを使用することができ、それにより、アダプターアンカープローブと鋳型とのランダムなライゲーションを防止することができる。

ＩＶ．鋳型核酸分子
鋳型核酸はＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、ミトコンドリアＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｃｆＤＮＡ、または合成ＤＮＡであり得る。ＤＮＡは、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、断片化ＤＮＡ、または損傷ＤＮＡであり得る。ＲＮＡは、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、低分子非コードＲＮＡ、ポリソームＲＮＡ、イントロンＲＮＡ、プレｍＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、または無細胞ＲＮＡであり得る。

鋳型核酸は、天然に存在する核酸または合成核酸であり得る。鋳型核酸は、修飾された複素環式塩基を有し得る。修飾は、メチル化プリンまたはピリミジン、アシル化プリンまたはピリミジン、アルキル化リボース、または他の複素環であり得る。鋳型核酸は、修飾された糖部分を有し得る。修飾された糖部分は、ペプチド核酸を含み得る。鋳型核酸は、ペプチド核酸を含み得る。鋳型核酸は、トレオース核酸を含み得る。鋳型核酸は、ロックド核酸を含み得る。鋳型核酸は、ヘキシトール核酸を含み得る。鋳型核酸は、フレキシブルな核酸であり得る。鋳型核酸は、グリセロール核酸を含み得る。

鋳型核酸分子を無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）および循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）などの低インプット（例えば、核酸材料１ｎｇ）試料から捕捉し、富化することができる。低インプット試料は、１ｎｇ、２ｎｇ、３ｎｇ、４ｎｇ、５ｎｇ、６ｎｇ、７ｎｇ、８ｎｇ、９ｎｇ、１０ｎｇ、またはそれよりも多くの核酸材料を有し得る。低インプット試料は、１０ｎｇ未満、９ｎｇ未満、８ｎｇ未満、７ｎｇ未満、６ｎｇ未満、５ｎｇ未満、４ｎｇ未満、３ｎｇ未満、２ｎｇ未満、１ｎｇ未満、またはそれ未満の核酸材料を有し得る。低インプット試料は、２００ｐｇから１０ｎｇまでの核酸材料を有し得る。低インプット試料は、１０ｎｇ未満の核酸材料を有し得る。低インプット試料は、１０ｎｇ未満、５ｎｇ未満、１ｎｇ未満、１００ｐｇ未満、５０ｐｇ未満、２５ｐｇ未満、またはそれ未満の核酸材料であり得る。一部の場合では、インプット試料は、１ｎｇ、１０ｎｇ、２０ｎｇ、３０ｎｇ、４０ｎｇ、５０ｎｇ、またはそれよりも多くの核酸分子を有し得る。インプット試料は、５０ｎｇ未満、４０ｎｇ未満、３０ｎｇ未満、２０ｎｇ未満、１０ｎｇ未満、１ｎｇ未満、またはそれ未満の核酸材料を有し得る。捕捉および富化は、標的プローブハイブリダイゼーションによって行うことができる。標的プローブは、捕捉プローブ、架橋プローブ、および／またはアダプターアンカープローブであり得る。標的プローブは、１つまたは複数の結合性部分を含み得る。結合性部分はビオチンであり得る。結合性部分は、支持体に結合され得る。支持体はビーズであり得る。ビーズはストレプトアビジンビーズであり得る。

鋳型核酸は損傷を受け得る。損傷核酸は、塩基の変更もしくは欠損、および／または骨格の修飾を含み得る。鋳型核酸は、酸化、放射線、またはランダム変異によって損傷を受け得る。鋳型核酸は、バイサルファイト処理によって損傷を受け得る。

損傷ＤＮＡに関しては、本開示では、二本鎖ＤＮＡ修復ステップを排除することができ、プロセスのステップが少ないことからＤＮＡ喪失が少なくなることに起因して、より高い変換率および改善された感度がもたらされる。

損傷ｄｓＤＮＡ（ニックを有する）またはｓｓＤＮＡは、ライブラリー構築のための鋳型として使用され得る。損傷ｄｓＤＮＡに関しては、ｄｓＤＮＡを変性させることができ、したがって、少なくとも１つの損傷を受けていない鎖を鋳型として使用することができる。次いで、鋳型を捕捉プローブにハイブリダイズおよび結合させ、種々のプライマーを使用して増幅することができる。

鋳型は、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）または循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）に由来し得る。ｃｆＤＮＡは、供給源が胎児または腫瘍であり得る。鋳型は、対象のリキッドバイオプシー、固体生検、または固定組織に由来し得る。鋳型は、ｃＤＮＡであり得、逆転写によって生成することができる。鋳型核酸は、これだけに限定されないが、血漿、血清、喀痰、唾液、尿、または汗を含めた体液試料に由来し得る。鋳型核酸のメチル化パターンを調査するため、および／または鋳型核酸の組織起源を決定するために、体液試料をバイサルファイト処理することができる。鋳型核酸は、肝臓、食道、腎臓、心臓、肺、脾臓、膀胱、結腸、または脳に由来し得る。鋳型核酸が由来する器官におけるメチル化パターンを分析するために、鋳型核酸をバイサルファイトで処理することができる。対象は、自己免疫疾患、心血管疾患、アテローム性動脈硬化症、神経障害、およびがんなどのメチル化関連疾患に罹患し得る。

鋳型核酸は、男性対象または女性対象に由来し得る。対象は乳児であり得る。対象はティーンエイジャーであり得る。対象は若年成人であり得る。対象は高齢者であり得る。

鋳型核酸は、ヒト、ラット、マウス、他の動物、または特定の植物、細菌、藻類、ウイルスなどを起源とし得る。鋳型核酸は、霊長類を起源とし得る。霊長類は、チンパンジーまたはゴリラであり得る。他の動物はアカゲザルであり得る。鋳型はまた、宿主－病原体、細菌集団などを含めた異なる種のゲノムの混合物に由来し得る。鋳型は、２つまたはそれよりも多くの種のゲノムから発現されたＲＮＡから作製されたｃＤＮＡであり得る。

鋳型核酸は、標的配列を含み得る。標的配列はエクソンである。標的配列はイントロンであり得る。標的配列は、プロモーターを含み得る。標的配列は、以前に知られているものであり得る。標的配列は、以前に部分的に知られているものであり得る。標的配列は、以前に知られていないものであり得る。標的配列は、染色体、染色体の腕、または遺伝子を含み得る。遺伝子は、状態、例えば、がんに関連付けられる遺伝子であり得る。例えば自己ライゲーションの率を低下させるために、ハイブリダイゼーション前に鋳型核酸分子を脱リン酸化することができる。

Ｖ．架橋プローブ
標的配列を有する鋳型核酸分子とアダプターアンカープローブをハイブリダイズさせるために、架橋プローブを使用することができる。架橋プローブにより、さらに、アダプターアンカープローブと鋳型の間接的会合が可能になり、それにより、それらの結合が容易になる。遊離のアダプターアンカープローブと鋳型のライゲーション率は、相互作用のランダム性に起因して非常に低い可能性がある。しかし、ハイブリダイズした架橋プローブにより、鋳型とアダプターアンカープローブのライゲーションの確率が、遊離のアダプターアンカープローブとのライゲーションの確率と比較して増加し得る。架橋プローブは、ＤＮＡを含み得る。架橋プローブは、ＲＮＡを含み得る。架橋プローブは、ウラシルおよびメチル化シトシンを含み得る。架橋プローブは、ウラシルを含み得ない。

架橋プローブは、標的配列にハイブリダイズする標的特異的領域（ＴＳＲ）を含み得る。架橋プローブは、アダプターアンカープローブの架橋結合配列にハイブリダイズするアダプターランディング配列（ＡＬＳ）を含み得る。架橋プローブは、ＴＳＲとＡＬＳを接続するリンカーを含み得る。ＴＳＲは、架橋プローブの３’部位に位置し得る。ＴＳＲは、架橋プローブの５’部位に位置し得る。

架橋プローブは、１つまたは複数の分子バーコードを含み得る。架橋プローブは、１つまたは複数の結合性部分を含み得る。結合性部分はビオチンであり得る。結合性部分は、支持体に結合され得る。支持体はビーズであり得る。ビーズはストレプトアビジンビーズであり得る。

架橋プローブは、約４００ヌクレオチド、約３００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド、約１２０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約９０ヌクレオチド、約８０ヌクレオチド、約７０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、または約１０ヌクレオチドを含み得る。

試料中の多数の標的配列にアニーリングさせるために多数の架橋プローブを使用することができる。架橋プローブは、同様の融解温度を有するように設計することができる。架橋プローブのセットの融解温度は、約１５℃以内、約１０℃以内、約５℃以内、または約２℃以内であり得る。１つまたは複数の架橋プローブの融解温度は、約７５℃、約７０℃、約６５℃、約６０℃、約５５℃、約５０℃、約４５℃、または約４０℃であり得る。架橋プローブの融解温度は、約４０℃～約７５℃、約４５℃～約７０℃、４５℃～約６０℃、または約５２℃～約５８℃であり得る。

アダプターアンカープローブを特定の架橋プローブの周囲の１つまたは複数の架橋プローブと一緒に使用することが、相乗効果を通じて、特定の架橋プローブのその標的配列へのハイブリダイゼーションの安定化に役立ち得る。多数の架橋プローブアセンブリを形成するためのハイブリダイゼーション温度は、単一の架橋プローブの融解温度よりも高くなり得る。温度が高いことにより、低い温度で起こる可能性がある非特異的ハイブリダイゼーションが低減することにより、より良好な捕捉の特異性がもたらされ得る。ハイブリダイゼーション温度は、個々の架橋プローブの融解温度よりも約５℃、約１０℃、約１５℃、または約２０℃高い温度であり得る。ハイブリダイゼーション温度は、架橋プローブの融解温度よりも約５℃～約２０℃高い温度、または複数の架橋プローブの平均融解温度よりも約５℃～約２０℃高い温度であり得る。

多数の架橋プローブのハイブリダイゼーション温度は、約７５℃、約７０℃、約６５℃、約６０℃、約５５℃、または約５０℃であり得る。多数の架橋プローブのハイブリダイゼーション温度は、約５０℃～約７５℃、５５℃～約７５℃、６０℃～約７５℃、または６５℃～約７５℃であり得る。

架橋プローブは、標識をさらに含み得る。標識は、蛍光であり得る。蛍光標識は、有機蛍光色素、金属キレート、カーボンナノチューブ、量子ドット、金粒子、または蛍光無機物であり得る。標識は、放射性であり得る。標識は、ビオチンであり得る。架橋プローブは、標識された核酸結合分子に結合し得る。核酸結合分子は、抗体、抗生物質、ヒストン、抗体、またはヌクレアーゼであり得る。

架橋プローブは、リンカーを含み得る。リンカーは、約３０ヌクレオチド、約２５ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約１５ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド、または約５ヌクレオチドを含み得る。リンカーは、約５～約２０ヌクレオチドを含み得る。

リンカーは、非核酸ポリマー（例えば、炭素の一続き）を含み得る。リンカー非ヌクレオチドポリマーは、約３０単位、約２５単位、約２０単位、約１５単位、約１０単位、または約５単位を含み得る。

架橋プローブを３’末端および／または５’末端において遮断することができる。架橋プローブは、５’リン酸を欠き得る。架橋プローブは、３’ＯＨを欠き得る。架橋プローブは、３’ｄｄＣ、３’逆ｄＴ、３’Ｃ３スペーサー、３’アミノ、または３’リン酸化を含み得る。

ＶＩ．アダプターアンカープローブ
アダプターアンカープローブまたは汎用アンカープローブは、１つまたは複数の架橋プローブのアダプターランディング配列にハイブリダイズする１つまたは複数の架橋結合配列を含み得る。

アダプターアンカープローブはＢＢＳの中間にスペーサーを含み得る。１つまたは複数のスペーサーの存在は、ハイブリダイゼーション捕捉の効率を改善し、捕捉の特異性を増加させることができる。

アダプターアンカープローブは、分子バーコード（ＭＢ）を含み得る。アダプターアンカープローブは、１つまたは複数の架橋プローブがハイブリダイズされ得る架橋結合配列（ＢＢＳ）を含み得る。アダプターアンカープローブは、１から１００までのＢＢＳを含み得る。アダプターアンカープローブは、試料を識別するためのインデックスを含み得る。分子バーコードまたはインデックスは、アダプター配列の５’およびＢＢＳの５’に存在し得る。

アダプターアンカープローブは、約４００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド、約１２０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約９０ヌクレオチド、約８０ヌクレオチド、約７０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、または約１０ヌクレオチドを含み得る。アダプターアンカープローブは、約２０～約７０ヌクレオチドであり得る。

架橋プローブに対するアダプターアンカープローブの融解温度は、約６５℃、約６０℃、約５５℃、約５０℃、約４５℃、または約４５℃～約７０℃であり得る。

アダプターアンカープローブは、標識を含み得る。標識は、蛍光であり得る。蛍光標識は、有機蛍光色素、金属キレート、カーボンナノチューブ、量子ドット、金粒子、または蛍光無機物であり得る。標識は、放射性であり得る。標識は、ビオチンであり得る。アダプターアンカープローブは、標識された核酸結合分子に結合し得る。核酸結合分子は、抗体、抗生物質、ヒストン、抗体、またはヌクレアーゼであり得る。

ＶＩＩ．アダプター／アダプタープライマー
ライブラリーの構築のために、１つまたは複数のアダプターを複数の鋳型核酸に結合させることができる。ライブラリーは、新世代シーケンシング（ＮＧＳ）ライブラリーであり得る。１つのアダプターを鋳型核酸分子の５’末端または３’末端に結合させることができる。２つのアダプターを鋳型核酸分子の５’末端および３’末端に結合させることができる。１つまたは複数のアダプターをライゲーションによって鋳型核酸に結合させることができる。鋳型核酸および標的プローブのハイブリダイゼーションの前に、１つまたは複数のアダプターの結合を実施することができる。一部の場合では、ハイブリダイゼーション後に、アダプターを捕捉された鋳型核酸に付加することができる。１つまたは複数のアダプターは、分子バーコード（ＭＢ）を含み得る。

１つまたは複数のアダプタープライマーを、鋳型核酸分子に結合した１つまたは複数のアダプターにハイブリダイズすることができる。一部の場合では、アダプターは、アダプターアンカープローブまたは捕捉プローブに組み入れられる。ある特定の場合では、結合した、付加された、または組み入れられたアダプターにより、増幅のためのプライマーハイブリダイゼーションの部位をもたらすことができる。第１のアダプター（ＡＤ１）を鋳型に捕捉プローブまたはアダプターアンカープローブを介して結合させることができる。ＡＤ１に対するプライマーを利用して、鋳型と相補的な鎖を合成することができる。鋳型のさらなる増幅のために第２のアダプター（ＡＤ２）を鋳型の５’末端および／または相補鎖の３’末端に結合させることができる。ＡＤ１プライマーおよびＡＤ２プライマーを使用してライブラリーを構築することができる。ＡＤ１プライマーおよびＴＳＲまたはそれに隣接する領域に対するプライマーを使用して選択的な増幅を実施することができる。

アダプターは、一本鎖核酸であり得る。アダプターは、二本鎖核酸であり得る。アダプターは、部分的な２重鎖であり得、短鎖とそれよりも長い長鎖を有する、または長さが等しい２本の鎖を有する。

ＶＩＩＩ．酵素
本明細書に記載の方法およびキットに使用することができるＤＮＡポリメラーゼの例としては、クレノウポリメラーゼ、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｃａポリメラーゼ、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔ４ポリメラーゼ、Ｔ７ポリメラーゼ、またはＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ１が挙げられる。

本明細書に記載の方法およびキットに使用することができるリガーゼの例としては、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ ＩＩ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ３ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７ ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡリガーゼＩ、ＤＮＡリガーゼＩＩ、ＤＮＡリガーゼＩＩＩ、ＤＮＡリガーゼＩＶ、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ、またはＴｔｈ ＤＮＡリガーゼが挙げられる。

本明細書に記載の方法およびキットに使用することができるメチル化感受性制限酵素またはメチル化依存性制限酵素の例としては、Ａａｔ ＩＩ、Ａｃｃ ＩＩ、Ａｏｒ１３Ｈ Ｉ、Ａｏｒ５１Ｈ Ｉ、ＢｓｐＴ１０４ Ｉ、ＢｓｓＨ ＩＩ、Ｃｆｒ１０ Ｉ、Ｃｌａ Ｉ、Ｃｐｏ Ｉ、Ｅｃｏ５２ Ｉ、Ｈａｅ ＩＩ、Ｈａｐ ＩＩ、Ｈｈａ Ｉ、Ｍｌｕ Ｉ、Ｎａｅ Ｉ、Ｎｏｔ Ｉ、Ｎｒｕ Ｉ、Ｎｓｂ Ｉ、ＰｍａＣ Ｉ、Ｐｓｐ１４０６ Ｉ、Ｐｖｕ Ｉ、Ｓａｃ ＩＩ、Ｓａｌ Ｉ、Ｓｍａ Ｉ、およびＳｎａＢ Ｉが挙げられる。

ＩＸ．増幅産物の下流の分析
本明細書に記載の方法を使用して生成された増幅産物を、サザンブロット法、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）、デジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）、ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）、定量的ＰＣＲ（Ｑ－ＰＣＲ）、ｎＣｏｕｎｔｅｒ分析（Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ゲル電気泳動、ＤＮＡマイクロアレイ、質量分析（例えば、タンデム質量分析、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ）、連鎖停止反応シーケンシング（サンガーシーケンシング）、または次世代シーケンシングを含めた様々な方法を使用してさらに分析することができる。

次世代シーケンシングは、４５４シーケンシング（ＲＯＣＨＥ）（パイロシーケンシングを使用する）、可逆的ターミネーター色素を使用したシーケンシング（ＩＬＬＵＭＩＮＡシーケンシング）、半導体シーケンシング（ＴＨＥＲＭＯＦＩＳＨＥＲ ＩＯＮ ＴＯＲＲＥＮＴ）、単一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）シーケンシング（ＰＡＣＩＦＩＣ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ）、ナノポアシーケンシング（例えば、ＯＸＦＯＲＤ ＮＡＮＯＰＯＲＥまたはＧＥＮＩＡの技術を使用する）、ピロリン酸溶解を使用した微小滴単一分子シーケンシング（ＢＡＳＥ４）、単一分子電子検出シーケンシング、例えば、核酸（ＤＮＡ／ＲＮＡ）がナノギャップを通過する際のナノ電極を通るトンネル電流を測定し、電流の差異を算出すること（ＱＵＡＮＴＵＭ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳのＱＵＡＮＴＵＭ ＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ）、ＧｅｎａｐＳｙｓ Ｇｅｎｅ Ｅｌｅｃｔｏｒｎｉｃ Ｎａｎｏ－Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｕｌｔｒａ－Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ（ＧＥＮＩＵＳ）技術（ＧＥＮＡＰＹＳ）、ＱＩＡＧＥＮのＧＥＮＥＲＥＡＤＥＲ、特定のフルオロフォアによって同定された部分的にランダムなオリゴヌクレオチドと中央決定塩基（central determined base）（または塩基の対）との逐次的ハイブリダイゼーションおよびライゲーションを用いるシーケンシング（ＳＯＬｉＤシーケンシング）を含み得る。シーケンシングは、ペアエンドシーケンシングであり得る。

本明細書に記載の方法を使用して配列決定することができる、試料由来の標的配列の数は、約５、１０、１５、２５、５０、１００、１０００、１０，０００、１００，０００、もしくは１，０００，０００、または約５～約１００、約１００～約１０００、約１０００～約１０，０００、約１０，０００～約１００，０００、もしくは約１００，０００～約１，０００，０００であり得る。

本明細書に記載の方法を使用して生成された核酸ライブラリーは、１つよりも多くの試料から生成されたものであり得る。各ライブラリーは、試料に関連付けられる異なるインデックスを有し得る。例えば、捕捉プローブまたはアダプターアンカープローブは、核酸を同じ試料に由来するものであると同定するために使用することができるインデックスを含み得る（例えば、同じ第１のインデックスを含む捕捉プローブまたはアダプターアンカープローブの第１のセットを使用して、第１の対象由来の第１の試料に由来する第１のライブラリーを生成することができ、同じ第２のインデックスを含む捕捉プローブまたはアダプターアンカープローブの第２のセットを使用して、第２の対象由来の第２の試料に由来する第２のライブラリーを生成することができ、第１のライブラリーおよび第２のライブラリーをプールし、配列決定を行うことができ、インデックスを使用して、配列決定された核酸が由来する試料を見分けることができる）。本明細書に記載の方法を使用して生成された増幅産物を使用して、少なくとも２、５、１０、２５、５０、１００、１０００、または１０，０００試料から、それぞれが異なるインデックスを有するライブラリーを生成することができ、ライブラリーをプールし、例えば次世代シーケンシング技術を使用して配列決定を行うことができる。

配列決定により、少なくとも１００、１０００、５０００、１０，０００、１００，０００、１，０００，０００、または１０，０００，０００配列リードを生成することができる。配列決定により、約１００配列リードから約１０００配列リードの間、約１０００配列リードから約１０，０００配列リードの間、約１０，０００配列リードから約１００，０００配列リードの間、約１００，０００配列リードから約１，０００，０００配列リードの間、または約１，０００，０００配列リードから約１０，０００，０００配列リードの間を生成することができる。

配列決定の深さは、約１×、５×、１０×、５０×、１００×、１０００×、または１０，０００×であり得る。配列決定の深さは、約１×から約１０×の間、約１０×から約１００×の間、約１００×から約１０００×の間、または約１０００×から約１００００×の間であり得る。
Ｘ．バイオインフォマティクス分析
配列決定データのバイオインフォマティク分析のための方法が本明細書に提示される。例えば、不完全にバイサルファイト変換された分子を排除する方法、および非常に低い疾患分子含有量を有する試料におけるメチル化パターンを分析する方法。

ａ．不完全にバイサルファイト変換された分子の排除
不完全にＣ＞Ｔ変換された分子を排除するためのフィルタリング技法を使用して、分子カウントおよびメチル化割合のデータの頑強性を増強する。

ゲノム内のリードの開始および終了のヌクレオチド位置および固有分子識別子情報を使用して、各差次的にメチル化された領域（ＤＭＲ）にマッピングされた配列決定リードを重複排除することができる。重複排除は、より低い精度で、開始および終了位置の情報だけを用いて行うこともできる。

重複排除されたリードは、ＣＨ環境内の変換されていないＣの数に従ってフィルターをかけ、ここで、Ｃはシトシンを表し、Ｈは３つのヌクレオチド：Ｃ（シトシン）、Ａ（アデニン）またはＴ（チミン）のいずれかを表す。Ｔに変換されていないＣＨ環境内のＣの存在は、分子の不完全なバイサルファイト処理または酵素処理の高い尤度を示す。ＣＨ環境内の変換されていないＣの数がプリセットした閾値よりも大きい場合、リードは廃棄される。一部の場合では、ＣＨ環境内の変換されていないＣの閾値数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。一部の場合では、リードは、ＣＨ環境内の変換されていないＣのパーセンテージ（ＣＨ環境内のＣの総数のパーセントとして）が１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１２％、１４％、１６％、１８％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、または５０％よりも大きい場合、廃棄され得る。
ｂ．ＳＩＣＯＮ ＴＭＳ分析

メチル化シーケンシングデータの分析のための現在の方法は、下流の分析のための２つの測定基準：（１）個々のＣｐＧ部位のメチル化割合、（２）目的のゲノム領域のメチル化密度のいずれかまたは両方を算出することを含み得る。（１）のために、ＣｐＧ部位においてメチル化されたＣの数は、ＣｐＧ部位をカバーする分子の総数で割られ得る。（２）のために、定義されたゲノム領域内のＣｐＧ部位の全メチル化割合の平均が算出され得る。上記の概念に対するわずかな改変として、領域の分子におけるメチル化パターンの相違を考慮に入れるために、メチル化ハプロタイプロード（ＭＨＬ）が導入され得る。本質的には、ＭＨＬは、分子の混合物にわたる平均尺度を表し、ブロックの長さを考慮して重みが加えられる。これらの方法は、疾患由来材料および健康な正常由来材料の両方を含む配列決定される分子の全てにおけるＤＮＡ分子にわたる平均尺度を取る。

組織の配列決定データでは、全ての分子にわたる平均を取ることは、通常、適正かつ必要な手法である。例えば、腫瘍生検組織のケースでは、腫瘍内容物は、中程度に高い場合がある（例えば、２０％またはそれよりも高い）。腫瘍と正常組織との間のメチル化レベルの有意な差は、腫瘍－正常混合組織の平均および純粋な正常組織の平均を反映し得る。ほとんどのバイサルファイトシーケンシングデータが各ゲノム領域で低い複雑さを有するので、平均は、多くの場合、必要に迫られて実施される。例えば、３０×は、全ゲノムバイサルファイトシーケンシングにおけるディープカバレッジを考慮し得、多くの研究ははるかに低いカバレッジを有する。領域内の多くのＣｐＧ部位にわたる平均は、低カバレッジに起因するばらつきをならし、測定の頑強性を増強し得る。腫瘍患者由来の血漿ｃｆＤＮＡを使用するリキッドバイオプシーなどの非常に低い疾患分子含有量の試料の状況では、腫瘍内容物は、多くの場合、０．１％を下回り、健康な正常分子および疾患由来分子の混合物にわたる平均は、正常分子が優勢であり得る。言い換えれば、腫瘍由来メチル化情報は、平均を取る行為において、正常由来分子に圧倒される。

メチル化シーケンシングデータを分析するための方法は、本明細書で「ＳＩＣＯＮ ＴＭＳ分析」と記載する。簡潔には、配列決定される各分子上のＣｐＧ部位の数をカウントし、これらの部位のメチル化割合を算出する。ＣｐＧカウントおよびメチル化割合からなるデータ対は、下流の分類モデルにおける１つのデータポイントを表す。平均に基づく方法と比較して、疾患由来分子および正常由来分子からのメチル化情報の平均は実施されない。したがって、疾患由来分子および正常細胞由来分子のメチル化プロファイルは別々に保たれ得る。得られるリードのそれぞれは、アッセイによって捕捉された固有のＤＮＡ分子からのＣｐＧメチル化情報を含有し得る。２つの測定基準が各リードから収集される：
１）Ｎ：リード内のＣｐＧの総数；
２）Ｍ：リード内のメチル化ＣｐＧの数。
１）および２）から、第３の測定基準が、
３）ｆ＝Ｍ／Ｎ、現在のリード内でメチル化されるＣｐＧの割合
として算出される。

データ対（Ｎ、ｆ）は、アッセイにおいて全てのＤＭＲにおける分子のそれぞれについて収集される。ｆ（ｙ軸）対Ｎ（ｘ軸）を示す散布図を、ＤＭＲについて生成することができ、ＤＭＲの全てのリードはプロット内のドットとして示される。例えば、図１１は、正常な結腸組織（図１１Ａ）および結腸がん組織のゲノムＤＮＡ（図１１Ｂ）内のＤＭＲ１の分子メチル化分散パターンを示す。これは、正常結腸組織中に過剰メチル化ＤＮＡ分子が存在せず、結腸がん組織中に多量の過剰メチル化分子が存在するＤＭＲを実証する。図１２Ａおよび１２Ｂは、正常な結腸組織および結腸がん組織のゲノムＤＮＡ内のＤＭＲ２の分子メチル化分散パターンをそれぞれ示す。これは、正常結腸組織中に一部の過剰メチル化ＤＮＡ分子が存在し（図１２Ａ）、結腸がん組織中に多量の過剰メチル化分子が存在する（図１２Ｂ）ＤＭＲを実証する。図１３は、健康な個体（図１３Ａ）および結腸がん患者（図１３Ｂ）由来の血漿ｃｆＤＮＡ内のＤＭＲ１およびＤＭＲ２の分子メチル化分散パターンを示す。各ＤＭＲからの図１３Ｂの上部分に例示される過剰メチル化分子のカウントは、リキッドバイオプシーからの疾患検出のための基準である。

いくつかのさらなる分析を実行することができる。例えば、フィルターを適用して、過剰メチル化分子をカウントすることができる。過剰メチル化分子のためのフィルター：閾値ｆ０を選択して、ｆ＞ｆ０の全ての分子をカウントし得る（すなわち、散布図の上部分）。これらのリードは、疾患組織（結腸がんなど）の徴候である過剰メチル化リードである。過剰メチル化フィルター閾値（ｆ０）は、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、または０．９に設定され得る。一部の場合では、過剰メチル化フィルター閾値（ｆ０）は、正常組織または健康な対象由来の試料におけるメチル化の分析に基づいて設定され得る。例えば、過剰メチル化フィルター閾値（ｆ０）は、正常組織試料または健康な対象由来の試料における平均メチル化割合からの０．５、１、１．５、２、２．５、または３標準偏差として設定され得る。

分子はまた、頑強なシグナルについてフィルターをかけることもできる。頑強なシグナルを有する分子のためのフィルター：追加閾値Ｎ０を選択して、Ｎ＞Ｎ０のリードのみを保持して、分子カウントの頑強性を増強することができる。閾値Ｎ０は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または３０に設定され得る。

過剰メチル化分子および頑強なシグナルのためのフィルタリングは、頑強な過剰メチル化分子のみを各ＤＭＲについてカウントすることを確実にし得る。これにより、分析の品質および／または感度を改善し得る。

一部の場合では、閾値ｆ０およびＮ０は、全てのＤＭＲを通して同じである。一部の場合では、閾値ｆ０およびＮ０は、個々のＤＭＲそれぞれについてカスタマイズされ得る。一部の場合では、閾値ｆ０は、全てのＤＭＲを通して同じであり得、閾値Ｎ０は、個々のＤＭＲそれぞれについてカスタマイズされ得る。一部の場合では、閾値Ｎ０は、全てのＤＭＲを通して同じであり得、閾値ｆ０は、個々のＤＭＲそれぞれについてカスタマイズされ得る。一部の場合では、閾値ｆ０およびＮ０はどちらも、個々のＤＭＲそれぞれについてカスタマイズされ得る。

アッセイにおける全てのＤＭＲにわたる頑強な過剰メチル化分子カウントは、機械学習分類法を使用して試料の疾患状態を決定するためのモデルに送り込まれ得る。
ＸＩ．逐次的標的富化
本開示は、分割しない同じＤＮＡインプットからの配列の２つまたはそれよりも多くのパネルについて富化するために使用され得る逐次的ハイブリダイゼーションに基づく富化の方法を提供する。図１４は、逐次的富化を実施する方法を例示する。一部の場合では、逐次的富化の方法は、複数の核酸分子を含む試料を得るステップと、第１の標的富化を実施して、１つまたは複数のゲノム領域の第１のパネルに対応する配列を含む核酸分子について富化させ、それにより、１つまたは複数のゲノム領域の第１のパネルに対応する配列について富化された核酸を含む第１の富化された試料を生成するステップとを含み得る。第１の標的富化は、１つまたは複数のゲノム領域の第１のパネルに対応する配列について枯渇した核酸を含む残留試料（または第１の残留試料）も生成し得る。この残留試料は、残留試料において第２の標的富化を実施して、１つまたは複数のゲノム領域の第２のパネルに対応する配列を含む核酸分子について富化させ、それにより、１つまたは複数のゲノム領域の第２のパネルに対応する配列について富化された核酸を含む第２の富化された試料を生成するために使用され得る。１つまたは複数のゲノム領域の第１のパネルおよび１つまたは複数のゲノム領域の第２のパネルは、通常、異なる。一部の場合では、標的富化の第３、第４の、またはさらなるラウンドを、ゲノム領域の第３、第４の、またはさらなるパネルを用いて実施し得る。

例えば、１つまたは複数のゲノム領域のパネルは、変異ホットスポット、がん遺伝子、腫瘍抑制因子の遺伝子、がん遺伝子のエクソン、腫瘍抑制因子のエクソン、または調節領域に関連する、１～５０，０００、５～１００００、または５～５０００のゲノム領域のパネルを含み得る。別の例では、１つまたは複数のゲノム領域のパネルは、差次的にメチル化された領域に、エピジェネティック修飾に、イントロンに、プロモーターに、または他の調節配列に関連する５～５０００のゲノム領域のパネルを含み得る。一部の例では、パネルは、がんにおける過剰メチル化に関連する５０～５００のゲノム領域を含む。

Ｐｏｉｎｔ－ｎ－Ｓｅｑは、事前増幅および事前変換富化技術であるので、富化された試料が配列決定によって分析され得るか、またはメチル化を評価するために配列決定する前に二硫化物（bisulfide）処理（または酵素処理）され得る。一部の場合では、第１の富化された試料は、配列決定によって分析されて、変異が評価され得る一方、第２の富化された試料は、配列決定の前に二硫化物（または酵素）処理されて、メチル化が評価される。一部の場合では、第１の富化された試料および第２の富化された試料はどちらも、簡単な配列決定によって評価されて、ゲノム変更が評価されるが、しかし試料は、異なる深さで配列決定され得る。一部の場合では、第１の富化された試料の分析は、第２の標的富化ステップを実施する前に実施され得る。第１の富化された試料の分析の結果は、第２の富化ステップについての第２のパネルを選択するために使用され得る。

標的富化は、本明細書に開示されるか、または当技術分野において公知の任意の方法を含み得る。一部の場合では、標的富化は、第１の架橋プローブの第１の標的特異的領域を、ゲノム領域に対応する配列を有する分子の第１の標的配列にハイブリダイズさせるステップであって、第１の架橋プローブの第１のアダプターランディング配列が、アダプターアンカープローブの第１の架橋結合配列に結合する、ステップと、第２の架橋プローブの第２の標的特異的領域を、ゲノム領域に対応する配列を有する分子の第２の標的配列にハイブリダイズさせるステップであって、第２の架橋プローブの第２のアダプターランディング配列が、アダプターアンカープローブの第２の架橋結合配列に結合する、ステップとを含む。本明細書に記載の通り、アンカープローブは結合部分を含み得る。方法は、通常、アダプターを複数の核酸分子の核酸分子の５’末端または３’末端に結合させ、それにより、アダプターを含む核酸分子のライブラリーを生成するステップを含む。

本明細書に記載の逐次的標的富化は、非常に効率的であり得る。例えば、第２の富化された試料がバイサルファイト処理され、配列決定反応に供される場合、配列決定反応の情報提供リードの数は、１つまたは複数のゲノム領域の第２のパネルに対応する配列を含む核酸分子について富化するために単一標的富化に供された場合に試料から得られ得る情報提供リードの数の少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、または８５％であり得る。

本明細書に記載の逐次的標的富化方法は、任意の核酸試料（nucleic sample）に一般化され得る。方法は、限られた核酸試料の分析のために特に有用であり得る。

ＸＩＩ．適用
ａ．核酸の特徴の検出
本明細書に記載の方法およびキットを使用して生成された増幅核酸産物を、１つまたは複数の核酸の特徴について分析することができる。１つまたは複数の核酸の特徴は、１つまたは複数のメチル化事象であり得る。メチル化は、ＣｐＧジヌクレオチド内のシトシンのメチル化であり得る。メチル化塩基は、５－メチルシトシンであり得る。ＣｐＧの状態にないシトシンもメチル化され得る。メチル化されたまたはメチル化されていないシトシンは、ＣｐＧアイランド内のものであり得る。ＣｐＧアイランドは、ゲノムの、ＣｐＧ部位の頻度が高い領域であり得る。ＣｐＧアイランドは、少なくとも２００ｂｐ、または約
３００～約３０００ｂｐであり得る。ＣｐＧアイランドのＣｐＧジヌクレオチド含有量は少なくとも６０％であり得る。ＣｐＧアイランドは、遺伝子のプロモーター領域内に存在し得る。メチル化は、５－ｈｍＣ（５－ヒドロキシメチルシトシン）、５－ｆＣ（５－ホルミルシトシン）、または５－ｃａＣ（５－カルボキシルシトシン）であり得る。本明細書に記載の方法およびキットを使用して、例えば、固形組織由来のＤＮＡまたは、例えば、無細胞ＤＮＡを含む生体液、例えば、血漿、血清、尿、もしくは唾液由来のＤＮＡのメチル化パターンを検出することができる。

１つまたは複数の核酸の特徴は、新規の変異、ナンセンス変異、ミスセンス変異、サイレント変異、フレームシフト変異、挿入、置換、点変異、一塩基多型（ＳＮＰ）、一塩基バリアント（ＳＮＶ）、新規の一塩基バリアント、欠失、再構成、増幅、染色体転座、中間部欠失、染色体逆位、ヘテロ接合性の喪失、機能喪失、機能獲得、ドミナントネガティブ、または致死的な変異であり得る。増幅核酸産物を分析して、生殖細胞系列変異または体細胞変異を検出することができる。１つまたは複数の核酸の特徴を状態、例えば、がん、自己免疫疾患、神経疾患、感染（例えば、ウイルス感染）、または代謝性疾患に関連付けることができる。

ｂ．診断／検出／モニタリング
開示されている方法およびキットを使用して、疾患または状態を診断または検出することもできる。疾患または状態は、メチル化異常と関係があり得る。状態は、心理学的障害であり得る。状態は、老化であり得る。状態は、疾患であり得る。状態（例えば、疾患）は、がん、神経疾患（例えば、アルツハイマー病、自閉症スペクトラム障害、レット症候群、統合失調症）、免疫不全、皮膚疾患、自己免疫疾患（例えば、眼のベーチェット病、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ（ＲＡ）、多発性硬化症、感染（例えば、ウイルス感染）、または代謝性疾患（例えば、高血糖症、高脂血症、２型糖尿病）であり得る。がんは、例えば、結腸がん、乳がん、肝がん、膀胱がん、ウィルムスがん、卵巣がん、食道がん、前立腺がん、骨がん、または肝細胞癌、神経膠芽腫、乳がん、肺扁平上皮がん、甲状腺癌、または白血病であり得る（例えば、Jin and Liu (2018) DNA methylation in human disease. Genes & Diseases, 5:1-8を参照されたい）。状態は、ベックウィズ・ヴィーデマン症候群、プラダー・ウィリー症候群、またはアンジェルマン症候群であり得る。

本明細書に提示される方法およびキットを使用して生成された無細胞ＤＮＡのメチル化パターンを、がんのマーカーとして使用することができる（例えば、Hao et al., DNA methylation markers for diagnosis and prognosis of common cancers. Proc. Natl. Acad. Sci. 2017；国際ＰＣＴ出願公開ＷＯ２０１５１１６８３７号を参照されたい）。無細胞ＤＮＡのメチル化パターンを、ＤＮＡの起源組織を決定するために使用ことができる（例えば、国際ＰＣＴ出願公開ＷＯ２００５０１９４７７号を参照されたい）。本明細書に記載の方法およびキットを、メチル化ハプロタイプ情報を決定するために使用することができ、無細胞ＤＮＡの組織または細胞の起源を決定するために使用することができる（例えば、Seioighe et al, (2018) DNA methylation haplotypes as cancer markers. Nature Genetics 50, 1062-1063；国際ＰＣＴ出願公開ＷＯ２０１５１１６８３７号；米国特許出願公開第２０１７０１２１７６７号を参照されたい）。本明細書に記載の方法およびキットを、がんを有する対象およびがんを有さない対象における、例えば無細胞ＤＮＡのメチル化レベルを検出するために使用することができる（例えば、Vidal et al. A DNA methylation map of human cancer at single base-pair resolution. Oncogenomics 36, 5648-5657；国際ＰＣＴ出願公開ＷＯ２０１４０４３７６３号を参照されたい）。本明細書に記載の方法およびキットを、メチル化レベルを決定するため、または無細胞ＤＮＡ混合物への異なる組織のわずかな寄与を決定するために使用することができる（例えば、国際ＰＣＴ出願公開ＷＯ２０１６００８４５１号を参照されたい）。本明細書に記載の方法およびキットを、例えば血漿中の無細胞ＤＮＡの起源組織に関して、例えば、メチル化ハプロタイプのパターンおよび存在量を比較することに基づいて使用することができる（例えば、Tang et al., (2018) Tumor origin detection with tissue-specific miRNA and DNA methylation markers. Bioinformatics 34, 398-406；国際ＰＣＴ出願公開ＷＯ２０１８１１９２１６号を参照されたい）。本明細書に記載の方法およびキットを、がん細胞を正常な細胞と区別するため、および異なるがんの型をそれらの起源組織に従って分類するために使用することができる（例えば、米国特許出願公開第２０１７０１７５２０５号Ａ１を参照されたい）。本明細書に提示される方法およびキットを、母体試料を使用して胎児のＤＮＡまたは胎児の異常を検出するために使用することができる（例えば、Poon et al. (2002) Differential DNA Methylation between Fetus and Mother as a Strategy for Detecting Fetal DNA in Maternal Plasma. Clinical Chemistry, 48: 35-41を参照されたい）。

開示されている方法を、状態をモニタリングするために使用することができる。状態は、疾患であり得る。疾患は、がん、神経疾患（例えば、アルツハイマー病）、免疫不全、皮膚疾患、自己免疫疾患（例えば、眼のベーチェット病）、感染（例えば、ウイルス感染）、または代謝性疾患であり得る。がんは、寛解したものであり得る。開示されている方法では、ｃｆＤＮＡおよびｃｔＤＮＡを使用して低レベルの異常を検出することができるので、本開示により、疾患をモニタリングする比較的非侵襲的な方法を提供することができる。開示されている方法を、処置または治療をモニタリングために使用することができる。処置または治療は、状態、例えば疾患、例えばがんに対して、または本明細書に開示される任意の状態に対して使用することができる。
本明細書に記載の方法は、バイサルファイト変換および増幅の前に、ｃｆＤＮＡからの直接的な標的分子の富化を可能にし得る。方法は、所与の疾患に対する１～約１０００のマーカーのメチル化状態を調べる小さな集中的なパネルの開発も可能にし得る。一部の場合では、キットは、所与の疾患のための１～約１００００の差次的にメチル化された領域のメチル化状態を調べるパネルのために作製され得る。

（実施例１）
相乗的な間接的ハイブリダイゼーションによる捕捉
配列決定のための核酸の相乗的な間接的捕捉（ＳＩＣＯＮ－ＳＥＱ）実験を、異なる配列を有する２つの架橋プローブおよびアダプターアンカープローブ／汎用アンカープローブ（ＵＰ、配列番号１）を用いて行った。２つの架橋プローブ（ＥＧＦＲ－ＢＰ２、配列番号２、およびＥＧＦＲ－ＢＰ３、配列番号３）を、ＥＧＦＲゲノム配列を標的にするように設計した。各架橋プローブは、約２５ｂｐの標的化配列（ＴＳ１またはＴＳ２）領域、少なくとも１５個のチミンを含むリンカー、およびアダプターアンカープローブ上の架橋結合配列に相補的になるように設計した２０ｂｐを有するランディング配列（ＬＳ１またはＬＳ１、イタリック体）を含んだ。アダプターアンカープローブは、架橋プローブのランディング配列のいずれかにハイブリダイズするように設計した２つの架橋結合配列（ＢＢＳ１またはＢＢＳ２）を含んだ。アダプターアンカープローブは、核酸配列の５’でさらにビオチン化された。図４は、相乗的な間接的ハイブリダイゼーションの概略図を提示する。

ハイブリダイゼーション捕捉のために、２０ｎｇの断片化（ピークサイズ１６０ｂｐ）ｇＤＮＡを、ＥＧＦＲに対する２つの架橋プローブ（それぞれ１ｆｍｏｌｅ）ならびに１つの汎用アンカープローブ（２００ｆｍｏｌｅ）を２０μｌの最終溶液体積で混合した。ＤＮＡインプットおよびハイブリダイゼーションプローブをハイブリダイゼーションバッファー中、９５℃で３０分間変性させ、６５℃まで徐々に冷やした。ハイブリダイゼーション複合体をサーモサイクラーにおいて６５℃で１時間インキュベートした。最終のハイブリダイゼーションバッファーは、１００ｎｇ／μｌのブロッキングＤＮＡ、１μｇ／μｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１μｇ／μｌのフィコール、１μｇ／μｌのポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム、０．７５ＭのＮａＣｌ、５×ＳＳＣ、および１×デンハート液を含んだ。

捕捉／クリーンアップのために、ハイブリダイゼーションアセンブリを、ストレプトアビジンビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ２７０ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）と一緒に室温で１０分間インキュベートした。３回の洗浄（洗浄１：５×ＳＳＰＥ、１％ＳＤＳ；洗浄２：２×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ；洗浄３：０．１×ＳＳＰＥ、０．０１％トリトン）を用いてクリーンアップを実行した。

富化されたＤＮＡを、ＥＧＦＲ標的化配列に対するプライマー（配列番号４および５）を使用するｑＰＣＲによって評価した。捕捉されたＥＧＦＲ ＤＮＡに対するｑＰＣＲの結果を、捕捉富化なしのｇＤＮＡの同じ部分と比較した。６５％～９０％超のＥＧＦＲを回収した。

（実施例２）
異なるハイブリダイゼーションスキームによる捕捉
種々のハイブリダイゼーションシステムの捕捉性能を決定するために、４種類のハイブリダイゼーションスキームを試験した：非相乗的なハイブリダイゼーション、直接的（図５Ａ）、相乗的な直接的ハイブリダイゼーション（図５Ｂ）、相乗的な間接的ハイブリダイゼーション（図５Ｃ）、および非相乗的な間接的ハイブリダイゼーション（図５Ｄ）。

非相乗的な直接的方法は、標的特異的配列を含むビオチン化捕捉プローブ（１２０ｂｐ、配列番号６）のハイブリダイゼーションを含んだ（斜線、図５Ａ）。相乗的な直接的方法は、４つの短いビオチン化捕捉プローブ（配列番号７～１０）のハイブリダイゼーションを含み、２５ｂｐの標的特異的配列をそれぞれ含有した（斜線、図５Ｂ）。相乗的な間接的方法は、ビオチンなしの４つの短い架橋プローブ（配列番号１２～１５）を利用し（図５Ｃ）、相乗的な直接的方法に使用した捕捉プローブの１つと同じ標的特異的配列をそれぞれ含んだ。架橋プローブ（ＢＰ）のそれぞれは、汎用アンカープローブ（配列番号１１）における架橋結合配列の１つに相補的になるように設計した２つの異なるランディング配列（点線および縦斜線）の１つを含んだ。非相乗的であるが間接的な方法（図５Ｄ）を、相乗的な直接的ハイブリダイゼーションに使用したものと同じ汎用アンカープローブと対をなす短い架橋プローブ（配列番号１６）を使用することによって試験した。実験に使用した捕捉プローブまたは汎用アンカープローブ（ＵＰ）は５’末端でビオチン化された。

ハイブリダイゼーション反応の前に、１０ｎｇのｃｆＤＮＡを使用して、添付されたプロトコール中のステップに従うことによりＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＩＩ ＤＮＡライブラリー調製キットを使用して、ＮＧＳライブラリーを構築した。ライブラリー構築後、ハイブリダイゼーションに基づく捕捉を、ビーズ精製なしでライゲーションミックスを用いて直接的に実行して、ライブラリーを富化させた。次いで、富化されたライブラリーをｑＰＣＲ分析に供した。

捕捉効率を、捕捉前および後のＥＧＦＲの存在のパーセンテージを比較することによって評価した。捕捉後のｃｔを、２．５ｎｇのヒトｇＤＮＡライブラリー（捕捉インプットの適切な画分）と比較した。捕捉有効性ＰＣＲを、ＥＧＦＲに対して設計したプライマー（配列番号１７）およびＮＧＳアダプターＰ７配列（配列番号１８）を使用することによって実行した。バックグラウンド（総ＤＮＡ存在）を、全てのＤＮＡライブラリーを増幅することができるプライマー（配列番号１８、１９）を使用したｑＰＣＲによって評価した。全てのバックグラウンドデルタｃｔを、「Ｃ」プローブ設計から得られた平均ＣＴに対して正規化した。

間接的な相乗的ハイブリダイゼーション捕捉は、非相乗的方法および直接的方法のいずれかよりも優れたハイブリダイゼーションの感度および特異度を実証した（表３）。相乗的な間接的プローブ設計は、最高の捕捉効率（平均で約９１％）および最低のバックグラウンドノイズを実証した。非相乗的な直接的ハイブリダイゼーションは、はるかに高い（３００×）架橋プローブ濃度で、なし～１４．８７％の回収を示したが、バックグラウンドの２００倍より高い増加を示した。ハイブリダイゼーション温度を下げることは、捕捉効率に役立たなかったが、代わりにバックグラウンドノイズが劇的な増加した。相乗的であるが間接的でない設計について、架橋プローブ濃度の増加とハイブリダイゼーションの低下はどちらも捕捉効率に役立たなかった。間接的な非相乗的方法について、捕捉富化は検出されなかった。

（実施例３）
スペーサーありまたはなしの汎用アンカープローブによる間接的捕捉
汎用アンカープローブ（ＵＰ）上の２つまたはそれよりも多くの架橋結合配列の中間のスペーサーの存在が間接的な相乗的ハイブリダイゼーション捕捉の捕捉性能に影響を及ぼすかを確かめるために研究を実行した。同じ架橋プローブを両方の場合に使用した。

表４は、使用した架橋プローブおよびＵＰの配列を列挙する。図６Ａは、スペーサーありのＵＰを使用した相乗的な間接的ハイブリダイゼーションの概略図を示す。図６Ｂは、スペーサーなしのＵＰを使用した相乗的な間接的ハイブリダイゼーションを示す。

捕捉効率およびバックグラウンドノイズを、いずれかのハイブリダイゼーション捕捉について決定した。バックグラウンドノイズを、ｑＰＣＲの結果を平均バックグラウンドシグナルに対して正規化することによって算出した。捕捉効率は、スペーサーの存在によって大きく影響を受けなかったが、スペーサーなしの捕捉ハイブリダイゼーションのバックグラウンドノイズは、スペーサーありの捕捉よりも約１００倍高かった（表５）。したがって、汎用アンカープローブ内のスペーサーは、高い特異的（低バックグラウンド）捕捉を可能にするのに重要な役割を果たしたことを示唆する。

（実施例４）
相乗的な間接的捕捉法を使用したＮＧＳ測定基準の決定
３、１５および７６標的パネルを使用した次世代シーケンシング（ＮＧＳ）の測定基準を決定した。マップ化率を、ヒトゲノムに整列された配列決定リードのパーセンテージとして算出した。３、１５および７６標的パネルについてのマップ化率は、それぞれ、９７％、９４％、９５％であった（表６）。オンターゲット率を、捕捉プローブおよび１００ｂｐの隣接によってカバーされた領域にわたって重複除外されたマップ化リードを使用して算出した。３、１５および７６標的などの小さなパネルのために、従来のハイブリダイゼーションに基づくＤＮＡ富化は実行可能ではなかった。しかし、研究は、５０ｋｂ超を有する標準的な標的パネルと比較して、１５および７６標的パネルについて同等の高さの８３．６％および８５．３％のオンターゲット率を示した。

さらに、パネルについての均一性は高かった（位置の＞９９％が平均カバレッジの０．２×よりも高いリードを有し、９５％超が０．５×カバレッジを有していた）。０．２または０．５×カバレッジは、３つの標的を有するマイクロパネルに対して好適ではなかった。１５標的パネルの高い均一性も、ＧＣ含有量が高い領域の均一なカバレッジを反映した（図７）。８０％のＧＣ含有量の領域のカバレッジは、平均カバレッジの０．５×よりも高かった。

（実施例５）
相乗的な間接的捕捉法を使用したヒトＳＮＰのＮＧＳ測定基準の決定
相乗的な間接的ハイブリダイゼーションアッセイを、７６のヒトＩＤ一塩基多型（ＳＮＰ）をカバーするように実行した。増殖前ハイブリダイゼーションを、２０ｎｇのヒト無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）において実行した。結果を、市販のＩＤＴ ｘＧｅｎハイブリダイゼーションおよび洗浄キットを使用した増幅後ハイブリダイゼーションの結果と比較した。同じ７６ＩＤのＳＮＰをカバーするｘＧｅｎヒトＩＤリサーチパネルＶ１．０を捕捉のために使用した。ｘＧｅｎヒトＩＤパネルを使用して、商業的プロトコールに従って２０ｎｇのｃｆＤＮＡをオリジナルインプットとして使用することによって構築されたＮＧＳライブラリーにおいてハイブリダイゼーションに基づく捕捉を実行した。

７６標的パネルを使用した次世代シーケンシング（ＮＧＳ）の測定基準を決定した（表７）。増幅後捕捉の標的率は、３０．７％のオンターゲット率と低かった。対照的に、同じゲノム領域をカバーするＳＩＣＯＮ－ＭＡＳパネルのオンターゲット率は８８％であった。

（実施例６）
ＳＩＣＯＮ－ＳＥＱと増幅後法との比較
配列決定のための核酸の相乗的な間接的捕捉（ＳＩＣＯＮ－ＳＥＱ）を、１時間のみの増幅前捕捉で、ｃｆＤＮＡインプット１０ｎｇからの１Ｍ リードに対して＞８０％のオンターゲット率を提供する７６のヒト遺伝子標的のパネルについて実行した。ｃｏｍｐａｎｙ「Ｉ」キットを用いる増幅後捕捉を同じパネルに対して使用して、１６時間の増幅後捕捉で、二倍の量のインプット（ｃｆＤＮＡ ２０ｎｇ）からの１Ｍのリードに対するわずか６～３０％のオンターゲット率を得た。ｃｏｍｐａｎｙ Ｉキットを使用した増幅前捕捉を実行したが、結果は少しも得られなかった。

図８Ａ～８Ｂは、異なるパーセンテージのＧＣ含有量の領域に対する、ＳＩＣＯＮ－ＳＥＱおよびＩＤＴ ｘＧＥＮハイブリダイゼーションおよび洗浄キットによるカバレッジを示す。低ＧＣ含有量（＜３０％）～高ＧＣ含有量（＞５０％）の領域からのカバレッジは、ＳＩＣＯＮ－ＳＥＱアッセイについて非常に均一であった（図８Ａ）。ライブラリー富化を生じなかったＩＤＴ ｘＧＥＮキットを使用した捕捉プロトコールについて（図８Ｂ）、ＣＧ含有量が異なる領域のカバレッジは体系的に偏りがあった。

（実施例７）
ＳＩＣＯＮ－ＴＭＳによるメチル化アッセイ
図２Ａおよび２Ｂに例示される通りに、ＳＩＣＯＮ標的メチル化シーケンシング（ＳＩＣＯＮ－ＴＭＳ）アッセイを実行した。試料ｃｆＤＮＡを、異なる非がん性個体由来の３～５ｍｌの血漿から抽出し、１２０の異なる差次的メチル化領域（ＤＭＲ）について調べた。リードアウトは、１ｎｇという低いｃｆＤＮＡインプットでさえ、インプットとのほぼ直線（Ｒ^２＝０．９４７４）関係を示した（図９）。

（実施例８）
ＳＩＣＯＮ－ＴＭＳによるｃｆＤＮＡ中のメチル化ＤＮＡの検出
ＳＩＣＯＮ－ＴＭＳアッセイを実施して、６０の異なる差次的メチル化領域（ＤＭＲ）を調べた。

ＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＩＩキットのマニュアルに従うことによって、ｃｆＤＮＡを使用して、新世代シーケンシング（ＮＧＳ）ライブラリーを最初に構築した。ライブラリーＤＮＡ（０．０１％、０．１％、１％、１０％または１００％の比でスパイクインメチル化ＤＮＡを有するｃｆＤＮＡ）をハイブリダイゼーション捕捉のためにインプットした。増幅なしの２０ｎｇのＤＮＡをプローブと混合し、ライブラリー／プローブ混合物をハイブリダイゼーションバッファー中、９５℃で３０分間変性させた。混合物を６０℃まで徐々に冷やした。ハイブリダイゼーション混合物をサーモサイクラーにおいて６０℃で１時間インキュベートした。最終のハイブリダイゼーションバッファーは、１００ｎｇ／μｌのサケ精子ＤＮＡ、１μｇ／μｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１μｇ／μｌのフィコール、１μｇ／μｌのポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム、０．７５ＭのＮａＣｌ、５×ＳＳＣ、および１×デンハート液を含有した。

クリーンアップのために、捕捉されたアセンブリを、ストレプトアビジンビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ２７０ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）と一緒に室温で１０分間インキュベートし、続いて３回洗浄した（洗浄１：５×ＳＳＰＥ、１％ＳＤＳ；洗浄２：２×ＳＳＰＥ、０．１％；洗浄３：０．１×ＳＳＰＥ、０．０１％トリトン）。クリーンアップアセンブリをメチル化分析のためにバイサルファイトで処理した。

図１０は、予測されるスパイクインと測定値との間の関係を示す。ＳＩＣＯＮ－ＴＭＳアッセイは、分析感度および０．０１％のメチル化まで直線性を実証した。メチル化パーセンテージは、Ｒ^２が０．９９で予測値と高度に相関し、アッセイの高い精度を示した。

（実施例９）
ＳＩＣＯＮ－ＴＭＳによるｃｆＤＮＡにおけるがんメチル化パターンの検出
正常な結腸組織および結腸がん組織由来の試料、ならびに健康な個体および結腸がん患者由来の血漿ｃｆＤＮＡの試料をバイサルファイト処理し、配列決定した。配列決定リードを、重複排除されるそれぞれの差次的にメチル化された領域（ＤＭＲ）にマッピングした。得られるリードのそれぞれは、アッセイによって捕捉された固有のＤＮＡ分子からのＣｐＧメチル化情報を含有した。次いで、２つの測定基準を各リードについて算出した：
１）Ｎ：リード内のＣｐＧの総数；
２）Ｍ：リード内のメチル化ＣｐＧの数。
１）および２）から、第３の測定基準を、
３）ｆ＝Ｍ／Ｎ、現在のリード内でメチル化されるＣｐＧの割合
として算出した。

結果を各ＤＭＲについてｆ（ｙ軸）対Ｎ（ｘ軸）を示す散布図として示し、ＤＭＲの全てのリードをプロット内のドットとして示す。図１１は、正常な結腸組織（図１１Ａ）および結腸がん組織のゲノムＤＮＡ（図１１Ｂ）内のＤＭＲ１の分子メチル化分散パターンを示す。これは、正常結腸組織中に過剰メチル化ＤＮＡ分子が存在せず、結腸がん組織中に多量の過剰メチル化分子が存在するＤＭＲを実証する。

図１２Ａおよび１２Ｂは、正常な結腸組織および結腸がん組織のゲノムＤＮＡ内のＤＭＲ２の分子メチル化分散パターンをそれぞれ示す。これらの図は、正常結腸組織中に一部の過剰メチル化ＤＮＡ分子が存在し、結腸がん組織中に多量の過剰メチル化分子が存在するＤＭＲを実証する。

図１３Ａおよび１３Ｂは、健康な個体の血漿ｃｆＤＮＡおよび結腸がん患者の血漿ｃｆＤＮＡ内のＤＭＲ１およびＤＭＲ２の分子メチル化分散パターンをそれぞれ示す。各ＤＭＲからの図１３Ｂの上部分に例示される過剰メチル化分子のカウントは、リキッドバイオプシーからの疾患検出のための基準として使用され得る。

（実施例１０）
ＳＩＣＯＮ－ＴＭＳによるｃｆＤＮＡ中のがんメチル化パターンの検出
１００のメチル化マーカーをカバーするＰｏｉｎｔ－ｎ－Ｓｅｑ結腸直腸がん（ＣＲＣ）パネルを３ステップで設計した。最初に、およそ１０００のＣＲＣ特異的マーカーを公開データベースから同定した。２番目に、健康な集団のベースラインｃｆＤＮＡ内で高いバックグラウンドシグナルを有するマーカーを除外した。最後に、リストを、患者と健康なｃｆＤＮＡとの間で最も識別されるマーカーを含有するように完結させた。ＳＩＣＯＮ ＣＲＣパネルの捕捉は、非常に効率的で、高い均一性（９４％＞０．５×、１００％＞０．２×）およびオンターゲット率（＞８０％）をもたらした。２０ｎｇのｃｆＤＮＡインプットについて、高いＧＣ含有量（＞８０％）にもかかわらず、１０００超の重複排除された情報提供リードが平均で各マーカーに対して得られた。情報提供リードのアウトプットは、１ｎｇ～４０ｎｇの範囲でｃｆＤＮＡインプットに対して線形であった。用量設定研究では、ｃｆＤＮＡ ２０ｎｇ中の０．６ｐｇ（０．２×ゲノム当量）のメチル化ＤＮＡ（０．００３％）は、ｃｆＤＮＡバックグラウンドを超えて確実に検出された。結腸直腸腺癌－早期（Ｉ、ｎ＝７；ＩＩ、ｎ＝７）、末期（ＩＩＩ、ｎ＝１１；ＩＶ、ｎ＝３）を有する患者、および対照個体（ｎ＝１０５）由来の血漿試料を使用したパイロット臨床研究では、メチル化シグナルの平均割合は、その結果、対照、ステージＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶについて、０．００３４％、０．０１３％、０．０９％、０．１７％、０．２９％であった。ステージＩ試料のメチル化割合は、対照群と有意差があった（Ｐ＜０．００１）。メチル化割合を使用する単純なカットオフにより、Ｐｏｉｎｔ－ｎ－Ｓｅｑ ＣＲＣパネルは、ＡＵＣ＝０．９６で、９１％の特異性で、ステージＩについて８６％、ステージＩＩ～ＩＶについて１００％の感度を達成した。

（実施例１１）
ＣＲＣ血漿試料におけるＰｏｉｎｔ－ｎ－Ｓｅｑ ＳＮＶ＋メチル二重捕捉分析
遺伝子変化およびエピジェネティック変化を、末期ＣＲＣ患者由来の血漿試料（１ｍｌ）における統合Ｐｏｉｎｔ－ｎ－Ｓｅｑアッセイによって検出した。メチル化マーカーおよび２２の遺伝子からの３５０より多くのホットスポット変異をカバーするＰｏｉｎｔ－ｎ－Ｓｅｑ結腸直腸がん（ＣＲＣ）パネルを設計した。

標的富化の２回の逐次的ラウンドを、メチル化マーカーパネルおよび変異ホットスポットパネルを使用して、本明細書に記載される通り、相乗的な間接的ハイブリダイゼーション捕捉によって実施した。簡潔には、２０μＬの各ｃｆＤＮＡ試料をＰＣＲ管に添加した。２０μＬ未満のＤＮＡ体積については、ＩＤＴＥまたはバッファーＥＢを２０μＬの最終体積まで添加した。各試料について、２．８μＬの最終調製バッファーおよび１．２μＬの最終調製酵素を添加した。管を、穏やかにボルテックスして十分に混合し、次いで簡潔に遠心分離した。管を、２０℃の温度で３０分間、続いて６５℃で３０分間、加熱蓋を有するサーマルサイクラーにおいて処理した。この２．５μＬのアダプター溶液を添加し、１３μＬのライゲーションミックスを添加した後、混合物を２０℃で３０分間インキュベートした。

試料結合ビーズを室温で少なくとも１５分間平衡化し、ボルテックスして再懸濁させた。４８μＬ（約１．２×体積）のライブラリー結合ビーズを、３９．５μＬのライゲーション反応物に添加した。これらを、少なくとも１０回のピペッティングによって完全に混合し、簡潔に遠心分離した。混合物を室温で１０分間インキュベートし、少なくとも２分間、または溶液が澄明になるまで、磁石上に置いた。上清を除去し、廃棄した。磁石上で、１５０μＬの試料洗浄バッファーを、ビーズを妨げることなくビーズに添加し、２分間インキュベートし、上清を廃棄した。

標的捕捉のために、変異捕捉パネルおよびプローブ結合混合物を含有するハイブリダイゼーション混合物を、添加し、穏やかにボルテックスすることまたは軽くはじくことによって十分に混合した。混合物を９８℃に２分間加熱し、次いで、２．５℃／秒の速度で６０℃に低下させ、６０℃で６０分間インキュベートした。６０分のハイブリダイゼーション後、試料を磁石上に３０秒間置き、上清を注意深くラベル付けした管に移し、第２のハイブリダイゼーションステップのために保存した。ビーズを３回洗浄し、再懸濁させ、ＤＮＡをビーズ上で増幅させた。

上記から保存した上清を、ＴＭＳ捕捉パネルを含有するハイブリダイゼーション混合物と混合し、捕捉ハイブリダイゼーションを、変異捕捉パネルに関して実施した。捕捉されたＴＭＳ ＤＮＡを二硫化物処理し、修復し、ビーズから溶出させ、続いてインデックスＰＣＲを行った。両方の増幅されたＤＮＡ試料を配列決定のために調製し、Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォームにおいて配列決定した。

図１４は逐次的標的富化を例示する。表８は、ＤＮＡインプット量、およびメチル化シグナルの割合、および各患者試料についての変異体シグナルの割合を列挙する。検出された変異の詳細を図１５に示す。表８によって示される通り、Ｐｏｉｎｔ－ｎ－Ｓｅｑ ＣＲＣ変異の捕捉およびメチル化パネルは、幅広い範囲のＤＮＡの出発量からの過剰メチル化および変異の検出を高効率でもたらした。さらに、ＣＲＣ患者由来の血漿ｃｆＤＮＡを使用したメチル化および変異の複合分析は、メチル化状態からの一致した腫瘍内容物の推定、およびドライバー変異対立遺伝子の頻度を示した。

（実施例１２）
二重分析からのメチル化シグナルはスタンドアロンメチル化（ＴＭＳ）分析と同等である
逐次的標的富化方法に由来するメチル化シグナルを評価するために、用量設定実験を、対照ｃｆＤＮＡにスパイクした細胞系ＨＣＴ１１６からのｇＤＮＡを用いて実施した。ＨＣＴ１１６ ｇＤＮＡを、０．００１％～１０％の範囲の濃度でスパイクした。図１４に概説される通り、同じＤＮＡインプットを、ＴＭＳ分析単独、または逐次的ＳＩＣＯＮによる変異－ＴＭＳ二重分析に供し、ここで、変異分析のための富化ステップを最初に実行し、ＴＭＳ分析のための富化ステップを２番目に実施した。図１６に示されている通り、スタンドアロンおよび二重分析からのメチル化スコアは同等であり、メチル化アッセイの感度が逐次的捕捉二重分析における第２の捕捉につれて損なわれなかったことを示した。図１７は、第２の捕捉ＴＭＳ回収（差次的にメチル化された領域（ＤＭＲ）あたりの配列決定からの情報提供分子カウント）が第１の捕捉ＴＭＳの約８５％であることを示す。

（実施例１３）
腫瘍の情報に基づく個別化パネル分析
ＣＲＣ腫瘍ｇＤＮＡを全エクソン配列決定に供し、１１４の一塩基バリアントを選択して、個別化パネルを作製した。ＣＲＣ腫瘍ｇＲＮＡを、０．００１％、０．００３％、０．０１％、０．０３％、および０．１％の濃度で用量設定実験において対照ｃｆＤＮＡに添加した。図１８に示されている通り、０．００３％で添加された試料は、０％から区別することができ、特定の個別化ハイブリダイゼーションに基づくアッセイについて、０．００３％の検出限界を示唆した。より大きなパネルがより低い検出限界をもたらすであろうことが予測される。

本発明の好ましい実施形態が本明細書において示され、記載されているが、そのような実施形態は単に例として提供されていることは当業者には明白である。当業者には、本発明から逸脱することなく多数の変形、変化および置換をすぐに想起される。本明細書に記載の発明の実施形態に対する種々の代替を本発明の実施に用いることができることが理解されるべきである。以下の特許請求の範囲により本発明の範囲が定義されること、ならびに、それにより、これらの特許請求の範囲内に入る方法および構造ならびにそれらの等価物が網羅されることが意図される。

Claims (15)

1. ５’アダプターまたは３’アダプターに結合された鋳型核酸分子を得る工程と、
   第１の架橋プローブの第１の標的特異的領域を、前記鋳型核酸分子の第１の標的配列にハイブリダイズさせる工程であって、前記第１の架橋プローブの第１のアダプターランディング配列が、汎用アンカープローブの第１の架橋結合配列にハイブリダイズするように構成されている、工程と、
   第２の架橋プローブの第２の標的特異的領域を、前記鋳型核酸分子の第２の標的配列にハイブリダイズさせる工程であって、前記第２の架橋プローブの第２のアダプターランディング配列が、前記汎用アンカープローブの第２の架橋結合配列にハイブリダイズするように構成されている、工程と、
   を含む方法。
2. 前記５’アダプターを前記鋳型核酸分子の５’末端に結合せる工程、または前記３’アダプターを前記鋳型核酸分子の３’末端に結合させる工程、をさらに含む請求項１に記載の方法。
3. 前記５’アダプターを前記鋳型核酸分子の５’末端に結合させる工程および前記３’アダプターを前記鋳型核酸分子の３’末端に結合させる工程、をさらに含み、それにより、前記５’末端および前記３’末端に結合された前記鋳型核酸分子を生成する、請求項１に記載の方法。
4. 第３の架橋プローブの第３の標的特異的領域を、前記鋳型核酸分子の第３の標的配列にハイブリダイズさせる工程をさらに含み、前記第３の架橋プローブの第３のアダプターランディング配列が、前記汎用アンカープローブの第３の架橋結合配列にハイブリダイズするように構成されている、請求項１に記載の方法。
5. 前記汎用アンカープローブが、前記第１の架橋結合配列と前記第２の架橋結合配列との間に位置するスペーサーをさらに含む、請求項１に記載の方法。
6. 前記５’アダプターまたは３’アダプターが、分子バーコードを含む、請求項１に記載の方法。
7. 前記汎用アンカープローブが、結合部分を含む、請求項６に記載の方法。
8. 前記結合部分が、支持体に結合する、請求項７に記載の方法。
9. （ａ）前記第１の架橋プローブの前記第１のランディング配列を、前記汎用アンカープローブの前記第１の架橋結合配列にハイブリダイズさせる工程と、
   （ｂ）前記第２の架橋プローブの前記第２のランディング配列を、前記汎用アンカープローブの前記第２の架橋結合配列にハイブリダイズさせる工程とをさらに含み、
   前記（ａ）および（ｂ）の工程中に、前記汎用アンカープローブは固体支持体に結合せず、
   （ｃ）前記（ａ）および前記（ｂ）の工程後に、前記汎用アンカープローブを前記固体支持体に結合させる工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
10. 前記固体支持体がビーズである、請求項９に記載の方法。
11. 前記第１の架橋プローブを前記鋳型核酸分子の第１の標的配列にハイブリダイズさせる工程および前記第２の架橋プローブを前記鋳型核酸分子の第２の標的配列にハイブリダイズさせる工程の後に、前記鋳型核酸分子をメチル化アッセイ試薬で処理する工程をさらに含み、これにより、処理された鋳型核酸分子を生成する、請求項１に記載の方法。
12. 前記メチル化試薬が、二硫化物であるか、またはメチル化シトシンを修飾する酵素である、請求項１１に記載の方法。
13. 前記処理された核酸分子を増幅する工程をさらに含み、それにより増幅された生成物
    を得る、請求項１２に記載の方法。
14. 鋳型核酸分子の第１の標的配列にハイブリダイズするように構成された第１の標的特異的領域を含む第１の架橋プローブと、
    前記鋳型核酸分子の第２の標的配列にハイブリダイズするように構成された第２の標的特異的領域を含む第２の架橋プローブと、
    前記第１の架橋プローブの第１のアダプターランディング配列にハイブリダイズするように構成された第１の架橋結合配列と、前記第２の架橋プローブの第２のアダプターランディング配列にハイブリダイズするように構成された第２の架橋結合配列とを含む汎用アンカープローブと、
    前記鋳型核酸分子の５’末端または３’末端に結合するように構成されたアダプターと、
    を含むキット。
15. 鋳型核酸分子であって、前記鋳型核酸分子の５’末端または３’末端がアダプターに結合する、鋳型核酸分子と、
    第１の架橋プローブであって、第１の架橋プローブの第１の標的特異的領域が前記鋳型核酸分子の第１の標的配列にハイブリダイズされる、第１の架橋プローブと、
    第２の架橋プローブであって、第２の架橋プローブの第２の標的特異的領域が前記鋳型核酸分子の第２の標的配列にハイブリダイズされる、第２の架橋プローブと、
    汎用アンカープローブであって、前記汎用アンカープローブの第１の架橋結合配列が前記第１の架橋プローブの第１のアダプターランディング配列に結合し、前記汎用アンカープローブの第２の架橋結合配列が前記第２の架橋プローブの第２のアダプターランディング配列に結合する、汎用アンカープローブと、
    を含む組成物。