JP7731565B2 - Ｂ型肝炎ワクチンに対する免疫応答性の遺伝的要因を検出する方法及び試薬 - Google Patents

Description

本発明は、Ｂ型肝炎ワクチンに対する免疫応答性の遺伝的要因を検出する方法及び試薬に関する。

現在、世界１８０か国以上でＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に対してＢ型肝炎ワクチン（ＨＢワクチン）接種が行われている。ＨＢＶには複数の遺伝子型（Ｇｅｎｏｔｙｐｅ）が存在しており、本邦ではＧｅｎｏｔｙｐｅ Ｃ（ＨＢＶ／Ｃ）が最も多い。そのため、ＨＢＶ／Ｃに対応する組換え沈降ＨＢワクチン（酵母由来）であるビームゲン（登録商標）（以下、「登録商標」との記載を省略する）、及び、Ｇｅｎｏｔｙｐｅ Ａ（ＨＢＶ／Ａ）に対応する組換え沈降ＨＢワクチン（酵母由来）であるヘプタバックス（登録商標）（以下、「登録商標」との記載を省略する）－ＩＩが使用されている。しかしながら、ビームゲン接種者及びヘプタバックス－ＩＩ接種者のうち、約１０％はその中和抗体であるＨＢｓ抗体を獲得できないという問題があるが、その原因は未だ不明である。

発明者らは、日本人成人に対するビームゲン接種におけるワクチン低反応（ＨＢｓ抗体価が１０ｍＩＵ／ｍＬ以下）には、ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ遺伝子であるＨＬＡ－ＤＲＢ１^＊０４：０５－ＤＱＢ１^＊０４：０１及びＨＬＡ－ＤＲＢ１^＊１４：０６－ＤＱＢ１^＊０３：０１の２つのハプロタイプが強く寄与することを明らかにしている。一方でビームゲン応答性（ＨＢｓ抗体価が１０ｍＩＵ／ｍＬ超）には、ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ遺伝子であるＨＬＡ－ＤＲＢ１^＊０８：０３－ＤＱＢ１^＊０６：０１及びＨＬＡ－ＤＲＢ１^＊１５：０１－ＤＱＢ１^＊０６：０２の２つのハプロタイプ、並びに、ＢＴＮＬ２遺伝子が強く寄与することを明らかにしている（例えば、非特許文献１参照）。

Nishida N et al., "Key HLA-DRB1-DQB1 Haplotypes and Role of the BTNL2 Gene for Response to a Hepatitis B Vaccine.", Hepatology, Vol. 68, No. 3, pp. 848-858, 2018.

しかしながら、ＨＢワクチンに対する免疫応答性の遺伝的要因については未だ不明な点が多く、その検出方法は確立されていない。

本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、新規のＢ型肝炎ワクチンに対する免疫応答性の遺伝的要因を検出する方法及び試薬を提供する。

本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、ＨＬＡ（Ｈｕｍａｎ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ａｎｔｉｇｅｎ；ヒト白血球抗原） ｉｍｐｕｔａｔｉｏｎ法により、ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ遺伝子のハプロタイプとＢ型肝炎ワクチンの効果との関連解析を行なった結果、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４：０５－ＤＱＢ＊０４：０１を有するとビームゲン及びヘプタバックス－ＩＩのいずれのＢ型肝炎ワクチンを接種しても効果は低く（免疫応答性が低いままであり）、一方で、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１３：０２－ＤＱＢ１＊０６：０４を有するとヘプタバックス－ＩＩを接種することによる効果は得にくい（免疫応答性が低いままである）が、ビームゲンを接種することによる効果が得られる（免疫応答性が上昇する）ことを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
（１） Ｂ型肝炎ワクチンに対する免疫応答性の遺伝的要因を検出する方法であって、
前記Ｂ型肝炎ワクチンがビームゲン及びヘプタバックス－ＩＩであり、
被験者由来のＤＮＡ含有試料中のＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ遺伝子のハプロタイプを検出することと、
前記ハプロタイプとしてＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１３：０２－ＤＱＢ１＊０６：０４が検出された場合に、前記被験者は前記ビームゲンに対する免疫応答性を有し、前記ヘプタバックス－ＩＩに対する免疫応答性を有さない又は免疫応答性が低いと判定することと、
を含む、方法。
（２） 前記ハプロタイプとしてＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４：０５－ＤＱＢ＊０４：０１が検出された場合に、前記被験者は前記ビームゲン及び前記ヘプタバックス－ＩＩに対する免疫応答性を有さないと判定することを更に含む、（１）に記載の方法。
（３） Ｂ型肝炎ワクチンに対する免疫応答性の遺伝的要因を検出する試薬であって、
ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ遺伝子のハプロタイプであるＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１３：０２－ＤＱＢ１＊０６：０４を検出する１以上の核酸プローブ又はプライマーを含む、試薬。
（４） ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ遺伝子のハプロタイプであるＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４：０５－ＤＱＢ＊０４：０１を検出する１以上の核酸プローブ又はプライマーを更に含む、（３）に記載の試薬。

上記態様の方法及び試薬によれば、被験者におけるＢ型肝炎ワクチンに対する免疫応答性の遺伝的要因を簡便且つ確実に検出することができる。

本発明の一実施形態に係るＢ型肝炎ワクチンに対する免疫応答性の遺伝的要因を検出する方法及び試薬（以下、「本実施形態の方法」、「本実施形態の試薬」とそれぞれ略記する場合がある）の詳細を以下に説明する。

＜Ｂ型肝炎ワクチン（ＨＢワクチン）＞
本明細書において、Ｂ型肝炎ワクチンは、Ｂ型肝炎ウイルスの感染や再活性化を予防するために用いられるものであり、例えば、ヘプタバックス－ＩＩ等のＧｅｎｏｔｙｐｅ Ａ（ＨＢＶ／Ａ）由来のワクチン；Ｅｎｇｅｒｉｘ－Ｂ、Ｒｅｃｏｍｂｉｖａｘ ＨＢ等のＧｅｎｏｔｙｐｅ Ａ２（ＨＢＶ／Ａ２）由来のワクチン；ビームゲン等のＧｅｎｏｔｙｐｅ Ｃ（ＨＢＶ／Ｃ）由来のワクチン等が挙げられる。
中でも、本実施形態の方法で対象となるＨＢワクチンとしては、本邦にＨＢワクチンとしての使用実績のあるビームゲン及びヘプタバックス－ＩＩである。

＜Ｂ型肝炎ワクチンに対する免疫応答性の遺伝的要因を検出する方法＞
本実施形態の方法は、Ｂ型肝炎ワクチンに対する免疫応答性の遺伝的要因を検出する方法であって、前記Ｂ型肝炎ワクチンがビームゲン及びヘプタバックス－ＩＩであり、
被験者由来のＤＮＡ含有試料中のＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ遺伝子のハプロタイプを検出することと、
前記ハプロタイプとしてＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１３：０２－ＤＱＢ１＊０６：０４が検出された場合に、前記被験者は前記ビームゲンに対する免疫応答性を有し、前記ヘプタバックス－ＩＩに対する免疫応答性を有さない又は免疫応答性が低いと判定することと、
を含む。

発明者らは、ビームゲンワクチンを接種した日本人成人１１９３検体及びヘプタバックス－ＩＩを接種した日本人成人５５５検体について、ゲノムワイド関連解析（ＧＷＡＳ）を行ない、Ｂ型肝炎ワクチンに対する免疫応答性に関連するＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ遺伝子のハプロタイプとしてＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４：０５－ＤＱＢ＊０４：０１及びＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１３：０２－ＤＱＢ１＊０６：０４を同定した。

よって、本実施形態の方法は、ハプロタイプとしてＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４：０５－ＤＱＢ＊０４：０１が検出された場合に、前記被験者は前記ビームゲン及び前記ヘプタバックス－ＩＩに対する免疫応答性を有さないと判定することを更に含むことが好ましい。

本実施形態の方法によれば、被験者におけるＢ型肝炎ワクチンに対する免疫応答性の遺伝的要因を簡便且つ確実に検出することができる。

ＨＬＡはヒトの主要組織適合性複合体（ＭＨＣ；Ｍａｊｏｒ Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｃｏｍｐｌｅｘ）であり、移植片や細菌、ウイルス等の外来抗原ペプチドと結合してＴ細胞に提示する膜タンパク質である。ＨＬＡには多くのアリルが存在することが知られており、これらの情報についてはＨＬＡ ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ（http://hla.alleles.org/announcement.html)等に記載がある。なお、本明細書のアリルや多型の表記は、ＨＬＡ ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる表記方法に基づく。

上記ハプロタイプに関するシークエンスデータは、例えばＧｅｎＢａｎｋ（ＮＩＨ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａ ｂａｓｅ）や、ＤＤＢＪ（ＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ）等のデータベースに登録されているデータを用いてよい。ここで、例えば、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４：０５－ＤＱＢ１＊０４：０１のうち、ＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子のｇＤＮＡは１１０７４ｂｐであり、ＧｅｎＢａｎｋにＨＬＡ－ＤＲＢ１（配列番号１、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００２１２４．４）と、アミノ酸は２６６残基でＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ ａｎｔｉｇｅｎ（配列番号２、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＢ４２０７２．１）と登録されている。
ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４：０５－ＤＱＢ１＊０４：０１のうち、ＨＬＡ－ＤＱＢ１遺伝子のｇＤＮＡは７１９１ｂｐであり、ＧｅｎＢａｎｋにＨＬＡ－ＤＱＢ１（配列番号３、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００２１２３．５）と、アミノ酸は２２９残基でＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ ＨＬＡ－ＤＱ－ｂｅｔａ－１（配列番号４、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ４１９６７．１）と登録されている。
ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１３：０２－ＤＱＢ１＊０６：０４のうち、ＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子のｇＤＮＡは１１７０４ｂｐであり、ＧｅｎＢａｎｋにＨＬＡ－ＤＲＢ１（配列番号１、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００２１２４．４）と、アミノ酸は８９残基でＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ ａｎｔｉｇｅｎ ＨＬＡ－ＤＲＢＩ， ｐａｒｔｉａｌ（配列番号５、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＤ５０９７１．１）と登録されている。 ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１３：０２－ＤＱＢ１＊０６：０４のうち、ＨＬＡ－ＤＱＢ１遺伝子のｇＤＮＡは７１９１ｂｐであり、ＧｅｎＢａｎｋにＨＬＡ－ＤＱＢ１（配列番号３、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００２１２３．５）と、アミノ酸は１８３残基でＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ ａｎｔｉｇｅｎ， ｐａｒｔｉａｌ（配列番号６、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＢＦ３５７３６．１）と登録されている。
なお、以降において、上記ハプロタイプＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４：０５－ＤＱＢ＊０４：０１及びＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１３：０２－ＤＱＢ１＊０６：０４を「Ｂ型肝炎ワクチンに対する免疫応答性に関連のあるアリル」、「本実施系に係るアリル」と称する場合がある。また、アリルに変えて多型やＳＮＰという場合がある。

アリルは、一本鎖及び二本鎖のＤＮＡのほか、そのＲＮＡ相補体も含み、天然由来のものであっても、人工的に作製したものであってもよい。ＤＮＡには、例えば、ゲノムＤＮＡや、前記ゲノムＤＮＡに対応するｃＤＮＡ、化学的に合成されたＤＮＡ、ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ、及びそれらの組み合わせや、ＤＮＡとＲＮＡのハイブリッド等が挙げられるが、これらに限定されない。なお、本明細書においてポリヌクレオチドとは、ヌクレオチドが２以上結合しているものをいい、一般にオリゴヌクレオチドと言われる長さのものを含む。また、本明細書におけるポリヌクレオチドは、ＤＮＡでもよく、ＲＮＡでもよい。

これらの塩基配列は、当業者に公知の方法で適当な断片を用いてプローブを作製し、このプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法により、ｃＤＮＡライブラリー及びゲノムライブラリー等から得ることができる。

被験者由来のＤＮＡ含有試料としては、被験者の生体から採取されたものであれば特別な限定はないが、例えば、血液、血清、血漿、尿、パフィーコート、唾液、精液、胸部滲出液、脳脊髄液、涙液、痰、粘液、リンパ液、腹水、胸水、羊水、膀胱洗浄液、気管支肺胞洗浄液、毛髪、便、生体から直接採取された細胞又は組織等が挙げられ、これらに限定されない。これら試料からＤＮＡを抽出して、後述する検出に用いられる試料とすることが好ましい。

ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ遺伝子のハプロタイプの検出は、遺伝子レベル又はタンパク質レベルで行うことができる。例えば、検体からゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡを調製し、塩基配列に基づいて、ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡにおけるＢ型肝炎ワクチンに対する免疫応答性に関連のあるアリルを検出することができる。また、検体からヒトＨＬＡ－ＤＰ分子タンパク質を調製し、例えば抗体等を用いてＤＰ分子におけるＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４：０５－ＤＱＢ＊０４：０１及びＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１３：０２－ＤＱＢ１＊０６：０４を検出することができる。これらの方法について、以下簡単に説明する。

［ＤＮＡ含有試料からのゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡ調製］
ＤＮＡの抽出方法としては、特別な限定はなく、公知の方法を用いて抽出することができる。例えば、フェノール／クロロホルム法、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）法等が挙げられる。ＤＮＡの抽出には、市販のキットを用いてもよい。当該キットとしては、例えば、Ｗｉｚａｒｄ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ製）等が挙げられる。

また、ＤＮＡは、ｍＲＮＡを抽出し、当該ｍＲＮＡを鋳型として合成されたｃＤＮＡであってもよい。ｍＲＮＡの抽出方法としては、特別な限定はなく、公知の方法を用いて抽出することができる。例えば、グアニジンイソチオシアネート法等が挙げられる。ｍＲＮＡの抽出には、市販のキットを用いてもよい。当該キットとしては、例えば、ＮｕｃｌｅｏＴｒａｐ（登録商標） ｍＲＮＡ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）等が挙げられる。ｃＤＮＡの合成方法についても、特別な限定はなく、公知の方法を用いて合成することができる。例えば、ランダムプライマー又はポリＴプライマーを用いて、ＲＮＡから逆転写酵素－ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）によりｃＤＮＡを合成することができる。

上記のように調製したゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡにおけるＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４：０５－ＤＱＢ＊０４：０１及びＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１３：０２－ＤＱＢ１＊０６：０４の検出は、当技術分野で公知の遺伝子多型検出法を用いて検出することができる。例えば、直接配列決定法、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）法、ハイブリダイゼーション法、ＴａｑＭａｎ（登録商標） ＰＣＲ法（以下、「登録商標」との記載を省略する）、質量分析法等を用いる方法が挙げられる。ただし、ＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子では、特に第２エクソン内に多型部位が多数あるため、これらのアリルを検出するために、多数の多型を判別する必要がある。以下に当該方法について説明する。

直接配列決定法は、上記被験者由来のＤＮＡ含有試料中の検出対象であるＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４：０５－ＤＱＢ＊０４：０１及びＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１３：０２－ＤＱＢ１＊０６：０４を含む領域を、ベクターにクローニングするか又はＰＣＲで増幅し、当該領域の塩基配列を決定することにより行う。クローニングの方法としては、適切なプローブを用いてｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングすることにより、クローニングすることができる。また、適切なプライマーを用いてＰＣＲ反応により増幅し、適切なベクターに連結することによりクローニングすることができる。さらに、別のベクターにサブクローニングすることもできるが、これらに限定されない。ベクターとしては、例えば、ｐＢｌｕｅ－Ｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製）、ｐＧＥＭ－Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ製）、ｐＡｍｐ（Ｇｉｂｃｏ－ＢＲＬ製）、ｐ－Ｄｉｒｅｃｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）、ｐＣＲ２．１－ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ製）等の市販のプラスミドベクター、ウイルスベクター、人口染色体ベクターやコスミドベクターを用いることができる。塩基配列の決定としては、公知の方法を用いることができ、例えば、放射性マーカーヌクレオチドを使用する手動式配列決定法や、ダイターミネーターを使用する自動配列決定法が挙げられるが、これらに限定されない。このようにして得られた塩基配列に基づき、検体がＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４：０５－ＤＱＢ＊０４：０１及びＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１３：０２－ＤＱＢ１＊０６：０４に相当する配列を有するか否かを決定する。

ＰＣＲ法は、本実施形態に係るアリルを有する配列又は他のアリルを有する配列にのみハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマー（以下、「本実施形態に係るアリル検出用プライマー」と称する場合がある）を用いて行う。上述のとおりＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子には複数のＳＮＰが存在本実施形態に係るアリル検出用プライマーは、全てのＳＮＰを検出し得るプライマーを１種単独で用いてもよく、各ＳＮＰを検出し得るプライマーを２種以上組み合わせて用いてもよい。このプライマーを使用して検体のＤＮＡを増幅する。本実施形態に係るアリル検出用プライマーのみがＰＣＲ産物を生成した場合には、検体は本実施形態に係るアリルを有することになる。他のアリル用プライマーのみがＰＣＲ産物を生成した場合には、検体には本実施形態に係るアリルがないことが示される。

ＲＦＬＰ法は、まず、検出対象の本実施形態に係るアリルを含む領域をＰＣＲで増幅する。続いてこのＰＣＲ産物を、本実施形態に係るアリルを含む領域に適する制限酵素で切断する。制限酵素により消化されたＰＣＲ産物は、ゲル電気泳動で分離し、エチジウムブロマイド染色で可視化する。当該断片長を、分子量マーカー、並びに、対照として、制限酵素処理していない上記ＰＣＲ産物等と比較して、検体における本実施形態に係るアリルの存在を検出することができる。

ハイブリダイゼーション法は、検体由来のＤＮＡが、それに対し相補的なＤＮＡ分子（例えば、オリゴヌクレオチドプローブ）とハイブリダイズする性質に基づき、検体における本実施形態に係るアリルの有無を決定する方法である。コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション等のハイブリダイゼーション及び検出のための種々の技術を利用してこのハイブリダイゼーション法を行うことができる。ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ３ｒｄ ｅｄ．」（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（２００１）；特にＳｅｃｔｉｏｎ６－７）、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７－１９９７）；特にＳｅｃｔｉｏｎ６．３－６．４)、「ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １：Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ２ｎｄ ｅｄ．」（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９５）；ハイブリダイゼーション条件については特にＳｅｃｔｉｏｎ２．１０）等を参照することができる。さらに、ハイブリダイゼーションはＤＮＡチップを利用して検出することもできる。当該方法としては、本実施形態に係るアリルに特異的なオリゴヌクレオチドプローブを設計し、それを固相支持体に貼りつけたものを用いる。そして、検体由来のＤＮＡサンプルを当該ＤＮＡチップと接触させて、ハイブリダイゼーションを検出する。

ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法は、本実施形態に係るアリルに特異的なＴａｑＭａｎプローブとＴａｑポリメラーゼを用い、ＳＮＰの検出とＳＮＰを含む領域の増幅とを同時並行で行う方法である。ＴａｑＭａｎプローブは、５’末端が蛍光物質、３’末端がクエンチャーで標識されている約２０塩基前後のオリゴヌクレオチドであり、目的のＳＮＰ部位にハイブリダイズするよう設計されている。Ｔａｑポリメラーゼは５’→３’ヌクレアーゼ活性がある。これらのＴａｑＭａｎプローブ及びＴａｑポリメラーゼ存在下で目的のＳＮＰ部位を含む領域を増幅するよう設計されたＰＣＲプライマーを用いて該ＳＮＰ部位を含む領域を増幅すると、増幅と並行して、ＴａｑＭａｎプローブが鋳型ＤＮＡの目的のＳＮＰ部位にハイブリダイズする。フォワードプライマー側からの伸長反応が、鋳型にハイブリダイズした、ＴａｑＭａｎプローブに到達すると、Ｔａｑポリメラーゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性により、ＴａｑＭａｎプローブの５’末端に結合していた蛍光物質が切断される。その結果、遊離した蛍光物質はクエンチャーの影響を受けなくなり、蛍光を発生する。蛍光強度の測定により、ＳＮＰ検出が可能となる。

質量分析法を用いた方法としては、例えば、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳ法を応用したＳＮＰタイピング方法として、プライマー伸長法と組み合わせた方法もあげられる。この方法はハイスループットな解析が可能であり、１）ＰＣＲ、２）ＰＣＲ産物の精製、３）プライマー伸長反応、４）伸長産物の精製、５）質量分析、６）ジェノタイプ決定、のステップにより解析する。まずＰＣＲによって、目的とするＳＮＰ部位を含む領域をゲノムＤＮＡから増幅する。ＰＣＲプライマーは、ＳＮＰ部位塩基と重複しないように設計する。そして、エキソヌクレアーゼとエビのアルカリホスファターゼを用いて酵素的除去方法により精製するかエタノール沈殿法を用いて精製する。次に、３’末端がＳＮＰ部位に直接隣接するように設計したジェノタイピングプライマーを用いて、プライマー伸長反応を行う。ＰＣＲ産物を高温で変性し、過剰のジェノタイピングプライマーを加えて、アニールさせる。ｄｄＮＴＰとＤＮＡポリメラーゼを反応系に添加し、サーマルサイクル反応させると、ジェノタイピングプライマーよりも１塩基長いオリゴマーが生じる。この伸長反応で生じる１塩基長いオリゴマーは、ジェノタイピングプライマーの上記設計により、アリルに応じて異なる。精製した伸長反応産物について質量分析を行い、マススペクトルから解析する。

その他の検出方法としては、ハイスループットが可能なＳＮＰタイピング法として、１分子蛍光分析法を応用した方法等が挙げられる。例えば、ＭＦ２０／１０Ｓ（オリンパス製）は、当該方法を採用したシステムである。具体的には、共焦点レーザー光学系と高感度光検出器を用いて、約１フェムトリットル（１０００兆分の１リットル）の超微小領域中で、相補的及び非相補的なプライマーを用いたＰＣＲ法によって増幅した蛍光ラベルプライマーの１分子レベルの並進拡散時間を計測及び解析するものである。

また、ＤＮＡチップによる方法も、ハイスループットが可能なタイピングの１つである。ＤＮＡチップは、基板上に多種類のＤＮＡプローブを整列して固定したもので、標識したＤＮＡ試料をチップ上でハイブリダイゼーションし、プローブによる蛍光シグナルを検出する。

ＰＣＲ法以外の遺伝子増幅法を利用したＳＮＰタイピング方法の例として、Ｓｎｉｐｐｅｒ法が挙げられる。当該方法は、環状一本鎖ＤＮＡを鋳型としてＤＮＡポリメラーゼがその上を移動しながら相補鎖ＤＮＡを合成するＤＮＡ増幅方法であるＲＣＡ（ｒｏｌｌｉｎｇ ｃｉｒｃｌｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法を応用したＳＮＰタイピング法である。プローブは８０塩基長以上９０塩基長以下のオリゴＤＮＡで、標的ＳＮＰ部位の５’末端及び３’末端近傍のそれぞれに相補的な１０塩基長２０塩基長以下の配列を両末端に含んでおり、標的ＤＮＡにアニールして環状になるように設計されている。また、プローブの３’末端が標的ＳＮＰ部位に相補的配列となるよう設計されている。プローブの３’末端が標的ＳＮＰ部位と完全に相補的であれば、プローブは環状化されるが、プローブの３’末端がミスマッチであるとプローブは環状化されない。またプローブには、４０塩基長以上５０塩基長以下のバックボーン配列があり、２種類のＲＣＡ増幅プライマーと相補的な配列が含まれる。

ＰＣＲ法以外の遺伝子増幅法を利用したＳＮＰタイピング方法の他の例としては、例えば、ＵＣＡＮ法やＬＡＭＰ法を利用したタイピング方法が挙げられる。

ＵＣＡＮ法は、タカラバイオが開発した遺伝子等温増幅法であるＩＣＡＮ法を応用した方法である。ＵＣＡＮ法では、プライマー前駆体としてＤＮＡ－ＲＮＡ－ＤＮＡキメラオリゴヌクレオチド（ＤＲＤ）を用いる。このＤＲＤプライマー前駆体は、ＤＮＡポリメラーゼによる鋳型ＤＮＡの複製が起こらないように、３’末端のＤＮＡが修飾されており、ＳＮＰサイトにＲＮＡ部分が結合するように設計されている。このＤＲＤプライマー前駆体を鋳型とインキュベートすると、ＤＲＤプライマーと鋳型が完全にマッチしている場合のみ、共存するＲＮａｓｅ Ｈが対合したＤＲＤプライマーのＲＮＡ部分を切断する。これにより、プライマー３’末端は修飾ＤＮＡが外れて新しくなるため、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応が進み、鋳型ＤＮＡが増幅される。一方、ＤＲＤプライマーと鋳型ＤＮＡがマッチしない場合、ＲＮａｓｅ ＨはＤＲＤプライマーを切断せず、ＤＮＡ増幅も起こらない。パーフェクトマッチしたＤＲＤプライマー前駆体がＲＮａｓｅ Ｈによって切断された後の増幅反応は、ＩＣＡＮ反応メカニズムによって進行する。

ＬＡＭＰ法は、栄研化学によって開発された遺伝子等温増幅法で、標的遺伝子の６箇所の領域（３’末端側からＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃ、５’末端側からＢ３、Ｂ２、Ｂ１）を規定し、当該６領域に対する４種類のプライマー（ＦＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、ＢＩＰプライマー、Ｂ３プライマー）を用いて増幅する。タイピングを目的とする場合は、Ｆ１－Ｂ１間は標的ＳＮＰ部位（１塩基）のみでよく、ＦＩＰプライマー及びＢＩＰプライマーを、その５’末端にＳＮＰの１塩基がくるように設計する。ＳＮＰがない場合、ＬＡＭＰ法の起点構造であるダンベル構造からＤＮＡの合成反応が起こり、増幅反応が連続的に進行する。ＳＮＰがある場合は、ダンベル構造からのＤＮＡ合成反応が起こらず、増幅反応は進行しない。

インベーダー（Ｉｎｖａｄｅｒ）法は、核酸増幅法を用いず、２種類の非蛍光標識プローブ（アレルプローブ、インベーダープローブ） と１種類の蛍光標識プローブ（ＦＲＥＴプローブ）及びエンドヌクレアーゼであるＣｌｅａｖａｓｅを用いる方法である。アレルプローブは、鋳型ＤＮＡに対しＳＮＰ部位から３’末端側に相補的な配列があり、プローブの５’末端側にフラップという鋳型ＤＮＡと無関係な配列がある。インベーダープローブは、鋳型ＤＮＡのＳＮＰ部位から５’末端側に相補的な配列があり、ＳＮＰ部位に相当する部分の塩基は任意の塩基がある。ＦＲＥＴプローブは、３’末端側にフラップ配列に相補的な配列がある。一方の５’末端側は蛍光色素及びクエンチャーで標識されているが、ＦＲＥＴプローブは分子内で２本鎖を形成するよう設計されており、通常は消光されている。これらを鋳型ＤＮＡと反応させると、アレルプローブが鋳型ＤＮＡと２本鎖を形成したときに、ＳＮＰ部位にインベーダープローブの３’末端（任意塩基部分）が侵入する。Ｃｌｅａｖａｓｅは、当該塩基が侵入した構造を認識して、アレルプローブのフラップ部分を切断する。次に、この遊離したフラップがＦＲＥＴプローブの相補配列と結合すると、フラップの３’末端がＦＲＥＴプローブの分子内二本鎖部分に侵入する。Ｃｌｅａｖａｓｅは、上記アレルプローブとインベーダープローブの場合と同様に、このＦＲＥＴプローブにフラップの塩基が侵入した構造を認識し、ＦＲＥＴプローブの蛍光色素を切断する。蛍光色素はクエンチャーから離れるため、蛍光が発生する。アレルプローブが鋳型ＤＮＡとマッチしない場合は、Ｃｌｅａｖａｓｅが認識する、上記特異的な構造が形成されないため、フラップは切断されない。

ＳＮＰの検出にプライマーを用いる場合は、増幅する領域及びタイピング方法に即したプライマーとなるように設計する。例えば、上記領域を完全に増幅できることが好ましく、上記領域の両端付近の配列に基づいて配列を設計できる。プライマーの設計手法は当技術分野で周知であり、本実施形態の方法において使用可能なプライマーは、特異的なアニーリングが可能な条件を満たす、例えば特異的なアニーリングが可能な長さ及び塩基組成（融解温度）を有するように設計される。増幅する領域の長さは、タイピングに支障がない限り制限はないし、検出方法により適宜増減してよい。また、増幅される領域の一部にはＳＮＰ部位が含まれるが、増幅される領域内における当該部位の位置に制限はなく、検出方法（タイピング方法）にしたがって適切な位置に配置してよい。そのためプライマーの設計にあたり、プライマーとＳＮＰ部位との位置関係は、検出方法にあわせて自由に設計でき、検出しようとするＳＮＰを含む領域（例えば、連続した５０塩基長以上５００塩基長以下）にハイブリダイズする限り、タイピング方法の特性を考慮しながら、プライマーを設計できる。プライマーとしての機能を発揮する長さとしては、１０塩基以上１００塩基以下が好ましく、１５塩基以上５０塩基以下がより好ましく、１５塩基以上３０塩基以下がさらに好ましい。また設計の際には、任意の核酸鎖の５０％がその相補鎖とハイブリッドを形成する温度であるプライマーの融解温度（Ｔｍ）を確認することが好ましい。鋳型となるＤＮＡとプライマーとが二本鎖を形成してアニーリングするためには、アニーリングの温度を最適化する必要があるが、その一方で、この温度をより低すぎると非特異的な反応がおこるため、好ましくないからである。Ｔｍの確認には、公知のプライマー設計用ソフトウェアを利用することができる。

ＳＮＰの検出にプローブを用いる場合は、プローブがＳＮＰ部位を認識するように設計する。プローブ設計において、ＳＮＰ部位は、タイピング方法にあわせて、プローブ内のいずれかの場所で認識されればよく、タイピング方法によっては、プローブの末端で認識されてもよい。ＳＮＰ検出用ポリヌクレオチドをプローブとする場合、ゲノムＤＮＡに相補的な塩基配列の長さは、通常１５塩基以上２００塩基以下であり、１５塩基以上１００塩基以下が好ましく、１５塩基以上５０塩基以下がより好ましいが、タイピング方法によってはこれより長くても短くてもよい。

本実施形態の方法において、ハプロタイプとしてＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１３：０２－ＤＱＢ１＊０６：０４が検出された場合に、前記被験者は前記ビームゲンに対する免疫応答性を有し、前記ヘプタバックス－ＩＩに対する免疫応答性を有さない又は免疫応答性が低いと判定する。すなわち、当該被験者がビームゲンを接種した後である場合には、当該被験者がＨＢｓ抗体を有する可能性があることを示す。
また、本実施形態の方法において、ハプロタイプとしてＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４：０５－ＤＱＢ＊０４：０１が検出された場合に、前記被験者は前記ビームゲン及び前記ヘプタバックス－ＩＩに対する免疫応答性を有さないと判定する。

また、診断実用性の計算に用いて、ビームゲンに対する免疫応答性の陽性率を解析することもできる。ここでいう陽性率とは、検体全体のうち、ハプロタイプとしてＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１３：０２－ＤＱＢ１＊０６：０４を有する検体の割合を意味する。例えば、本明細の実施例に記載した日本人成人１１９３人については、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１３：０２－ＤＱＢ１＊０６：０４を有する検体は１２３人であり、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１３：０２－ＤＱＢ１を有さない検体は１０７０人であり、陽性率は約１０．３％となる。

ＨＢワクチンに対する免疫応答性の有無は、ＨＢワクチンをこれから接種する健常者やＨＢワクチンを接種した健常者だけでなく、ＨＢＶ感染者にとっても重要な情報であり、例えば、Ｂ型肝炎の治療方法や治療薬の選定及びＢ型肝炎の予防及び発症防止に関する重要な情報となる。特に、ＨＢＶ感染者においては、免疫力が低下等することでＨＢＶが再活性化して肝炎が劇症化することを予防するために重要な情報となり得る。

本実施形態の方法において、上記ハプロタイプの検出に加えて、他のＢ型肝炎ワクチンに対する免疫応答性の有無に関連するＳＮＰやハプロタイプを検出してもよい。上記ハプロタイプの検出と組み合わせてこれら他のＳＮＰやハプロタイプを検出することで、Ｂ型肝炎ワクチンに対する免疫応答性の有無をより精度が高く判断することができ、診断の信頼度がより高まる。

他のＢ型肝炎ワクチンに対する免疫応答性の有無に関連するＳＮＰとしては、例えば、ＢＴＮＬ２遺伝子座におけるＳＮＰ（ＮＣＢＩ ＳＮＰ Ｄａｔａｂａｓｅにおける登録番号ｒｓ４２４８１６６等）、ＩＬ１ＲＬ１遺伝子座におけるＳＮＰ（ＮＣＢＩ ＳＮＰ Ｄａｔａｂａｓｅにおける登録番号ｒｓ９６４６９４４等）、ＳＴＯＸ２遺伝子座におけるＳＮＰ（ＮＣＢＩ ＳＮＰ Ｄａｔａｂａｓｅにおける登録番号ｒｓ２８７１３８５等）、ＭＣＰＨ１遺伝子座におけるＳＮＰ（ＮＣＢＩ ＳＮＰ Ｄａｔａｂａｓｅにおける登録番号ｒｓ２７３２９７７等）、ＯＸＡ１Ｌ遺伝子座におけるＳＮＰ（ＮＣＢＩ ＳＮＰ Ｄａｔａｂａｓｅにおける登録番号ｒｓ３１３２９６９等）、ＢＣＬ１１Ｂ遺伝子座におけるＳＮＰ（ＮＣＢＩ ＳＮＰ Ｄａｔａｂａｓｅにおける登録番号ｒｓ１９５１１２２等）が挙げられる。これらのＳＮＰを１種単独で検出対象としてもよく、２種以上組み合わせて検出対象としてもよい。検体中にこれらのＳＮＰが検出された場合に、当該検体がＨＢワクチンに対する免疫応答性を有すると判定することができる。

Ｂ型肝炎ワクチンに対する免疫応答性の有無に関連するハプロタイプとしては、ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ遺伝子のハプロタイプ（ＨＬＡ－ＤＲＢ１^＊０８：０３－ＤＱＢ１^＊０６：０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１^＊１４：０６－ＤＱＢ１^＊０３：０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１^＊１５：０１－ＤＱＢ１^＊０６：０２、ＨＬＡ－ＤＲＢ１^＊０１：０１－ＤＱＢ１^＊０５：０１等）等が挙げられる。これらのハプロタイプを１種単独で検出対象としてもよく、２種以上組み合わせて検出対象としてもよい。検体中にＨＬＡ－ＤＲＢ１^＊０８：０３－ＤＱＢ１^＊０６：０１及びＨＬＡ－ＤＲＢ１^＊１５：０１－ＤＱＢ１^＊０６：０２のうち少なくともいずれか一方のハプロタイプが検出された場合に、当該検体がＨＢワクチンに対する免疫応答性を有すると判定することができる。一方で、検体中にＨＬＡ－ＤＲＢ１^＊０４：０５－ＤＱＢ１^＊０４：０１及びＨＬＡ－ＤＲＢ１^＊１４：０６－ＤＱＢ１^＊０３：０１のうち少なくともいずれか一方のハプロタイプが検出された場合に、当該検体がＨＢワクチンに対する免疫応答性を有さない、又は免疫応答性が低いと判定することができる。
また、検体中に、ＨＬＡ－ＤＲＢ１^＊０８：０３－ＤＱＢ１^＊０６：０１及びＨＬＡ－ＤＲＢ１^＊１５：０１－ＤＱＢ１^＊０６：０２のうち少なくともいずれか一方のハプロタイプ、及び、ＨＬＡ－ＤＲＢ１^＊０４：０５－ＤＱＢ１^＊０４：０１及びＨＬＡ－ＤＲＢ１^＊１４：０６－ＤＱＢ１^＊０３：０１のうち少なくともいずれか一方のハプロタイプ、の両方が検出された場合には、ワクチンへの高反応性が有意となることから、当該検体がＨＢワクチンに対する免疫応答性を有すると判定することができる。

これら他のＳＮＰやハプロタイプの検出方法としては、上述したハプロタイプの検出方法と同様の方法が挙げられる。

＜Ｂ型肝炎ワクチンに対する免疫応答性の遺伝的要因を検出する試薬＞
本実施形態の試薬は、ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ遺伝子のハプロタイプであるＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１３：０２－ＤＱＢ１＊０６：０４を検出する核酸プローブ又はプライマーを含む。本実施形態の試薬は、Ｂ型肝炎ワクチンに対する免疫応答性の有無の検査用試薬として有用である。ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１３：０２－ＤＱＢ１＊０６：０４としては、上記「Ｂ型肝炎ワクチンに対する免疫応答性の遺伝的要因を検出する方法」において例示されたものと同様のものが挙げられる。また、核酸プローブ又はプライマーについては、当業者であれば、上記「Ｂ型肝炎ワクチンに対する免疫応答性の遺伝的要因を検出する方法」において、ハプロタイプの検出方法として記載した方法を用いて適宜作製することができる。

本実施形態の試薬は、ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ遺伝子のハプロタイプであるＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４：０５－ＤＱＢ＊０４：０１を検出する１以上の核酸プローブ又はプライマーを更に含むことが好ましい。当該核酸プローブ又はプライマーを更に含むことで、ビームゲン及びヘプタバックス－ＩＩに対する免疫応答性を有さない又は免疫応答性が低い被験者の検出をより効率良く行うことができる。

本実施形態の試薬は、上記核酸プローブ又はプライマーに加えて、ＳＮＰタイピングに通常用いられる試薬、陽性コントロール、溶媒及び溶質を更に含むことができる。当該試薬としては、例えば、デオキシヌクレオチド３リン酸（ｄＮＴＰｓ）やＤＮＡポリメラーゼ等が挙げられる。溶媒及び溶質としては、例えば、蒸留水、ｐＨ緩衝試薬、塩、タンパク質、界面活性剤等が挙げられる。

上記核酸プローブ又はプライマーは、上述した２種類のハプロタイプとは無関係な配列が含まれていてもよい。また、上記核酸プローブ又はプライマーは、ＤＮＡとＲＮＡのキメラであってもよい。また、上記核酸プローブ又はプライマーは、蛍光物質や、ビオチン又はジゴキシンのような結合親和性物質、酵素、放射性同位元素、発光物質等で標識されていてもよい。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセインイソチオシアネート等が挙げられる。酵素としては、例えば、パーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、リンゴ酸脱水酵素、α－グルコシダーゼ、α－ガラクトシダーゼ等が挙げられる。放射性同位元素としては、例えば、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^３Ｈ、^１４Ｃ等が挙げられる。発光物質としては、例えば、ルシフェリン、ルシゲニン、ルミノール、ルミノール誘導体等が挙げられる。

本実施形態の試薬は、上記核酸プローブ又はプライマーに加えて、比較基準とするためのあるいは検量線を作成するための照合サンプル、検出器等も含んでもよい。検出器としては、例えば、分光器、放射線検出器、光散乱検出器等の上記核酸プローブ又はプライマーの標識を検出可能なものが挙げられる。

本実施形態の試薬は、上述した２種類のハプロタイプを検出する核酸プローブ又はプライマーに加えて、他のＢ型肝炎ワクチンに対する免疫応答性の有無に関連するＳＮＰやハプロタイプを検出する核酸プローブ又はプライマーを含むことができる。当該ＳＮＰやハプロタイプとしては、上記「Ｂ型肝炎ワクチンに対する免疫応答性の遺伝的要因を検出する方法」において例示されたものと同様のものが挙げられる。また、これらＳＮＰやハプロタイプを検出する核酸プローブ又はプライマーについては、当業者であれば、上記「Ｂ型肝炎ワクチンに対する免疫応答性の遺伝的要因を検出する方法」において、ハプロタイプの検出方法として記載した方法を用いて適宜作製することができる。

以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

＜材料及び測定方法＞
［試料及び臨床データ］
本研究でビームゲンに対する免疫応答性の遺伝的要因の検出に使用された日本人成人１１９３例のゲノムＤＮＡサンプルは、全て組換え沈降ＨＢワクチン（ビームゲン、化学及血清療法研究所製）で、０、１及び６か月に３回（０．５ｍＬ）のワクチン接種を行った健康な成人ボランティア（１８歳以上）から得られたものである。ヘプタバックス－ＩＩワクチン（ＭＳＤ ＫＫ製）の予防接種を受けた個人は上記１１９３例のゲノムＤＮＡサンプルには含まれない。
一方、本研究でヘプタバックス－ＩＩに対する免疫応答性の遺伝的要因の検出に使用された日本人成人５５５例のゲノムＤＮＡサンプルは、全て全て組換え沈降ＨＢワクチン（ヘプタバックス－ＩＩ、ＭＳＤ ＫＫ製）で、０、１及び６か月に３回（０．５ｍＬ）のワクチン接種を行った健康な成人ボランティア（１８歳以上）から得られたものである。ビームゲンワクチン（化学及血清療法研究所製）の予防接種を受けた個人は上記５５５例のゲノムＤＮＡサンプルには含まれない。

血清抗ＨＢＶ表面抗体（ＨＢｓＡｂ）及び血清抗ＨＢＶコア抗体（ＨＢｃＡｂ）は、それぞれ、抗ＨＢｓキット及び抗ＨＢｃ ＩＩ キットを使用し、且つ、Ａｒｃｈｉｔｅｃｔ ｉ２０００ＳＲアナライザー（Ａｂｂｏｔｔ Ｊａｐａｎ製）を使用した完全自動化学発光酵素免疫測定システムで、ワクチン接種前及び最終接種の１か月後に確認した。ＨＢｃＡｂ陽性（＞１．０ Ｓ／ＣＯ）の個人は、本研究には含まれない。
本研究では、上記ビームゲンに対する免疫応答性の遺伝的要因の検出に使用された日本人成人１１９３例を以下に示す３つのグループに分類した：
ｇｒｏｕｐ＿０、低反応群、ＨＢｓＡｂ≦１０ｍＩＵ／ｍＬ、ｎ＝１０７。
ｇｒｏｕｐ＿１、中反応群、１０ｍＩＵ／ｍＬ＜ＨＢｓＡｂ≦１００ｍＩＵ／ｍＬ、ｎ＝３５１。
ｇｒｏｕｐ＿２、高応応群、１００ｍＩＵ／ｍＬ＜ＨＢｓＡｂ≦１０００ｍＩＵ／ｍＬ、ｎ＝７３５。
１１９３例の個人の臨床情報は、グループ毎に以下のＵＲＬにまとめられている（http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/hep.29876/suppinfo）。
また、上記ヘプタバックス－ＩＩに対する免疫応答性の遺伝的要因の検出に使用された日本人成人５５５例についても同様に、以下に示す３つのグループに分類した：
ｇｒｏｕｐ＿０、低反応群、ＨＢｓＡｂ≦１０ｍＩＵ／ｍＬ、ｎ＝６６。
ｇｒｏｕｐ＿１、中反応群、１０ｍＩＵ／ｍＬ＜ＨＢｓＡｂ≦１００ｍＩＵ／ｍＬ、ｎ＝１２４。
ｇｒｏｕｐ＿２、高反応群、１００ｍＩＵ／ｍＬ＜ＨＢｓＡｂ、ｎ＝３０５。

［ゲノムワイド関連解析（ＧＷＡＳ）］
上記ゲノムＤＮＡサンプルについて、製造元の指示に従い、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ａｘｉｏｍ Ｇｅｎｏｍｅ－Ｗｉｄｅ ＡＳＩ １ Ａｒｒａｙを使用して、ゲノムワイドＳＮＰ解析を実施した。

［ＨＬＡ ｉｍｕｐｕｔａｔｉｏｎ法］
上記５５５例のＳＮＰデータは、ｈｇ１９の位置に基づいて、２５，７５９，２４２ｂｐ以上３３，５３４，８２７ｂｐ以下の範囲の拡張ＭＨＣ（ｘＭＨＣ）領域から抽出した。以前の報告（非特許文献１）と同じ方法を用いて、ＨＩＢＡＧ Ｒパッケージを使用して、３つのＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ遺伝子に対して、２－ｆｉｅｌｄ ＨＬＡ ｇｅｎｏｔｙｐｅ ｉｍｐｕｔａｔｉｏｎを実施した。ＨＬＡ－ＤＲＢ１、ＤＱＢ１、及びＤＰＢ１の場合には、ＨＬＡ遺伝子型ｉｍｐｕｔａｔｉｏｎには、当所が所有する日本語参照ｉｍｐｕｔａｔｉｏｎが使用された。呼び出した閾値（ＣＴ＞０．５）を使用して、ｉｍｐｕｔａｔｉｏｎ後の品質管理を適用した。Ｇｒｏｕｐ＿０の６３例、Ｇｒｏｕｐ＿１の１７４例、及びＧｒｏｕｐ＿２の２７８例からなる合計５１５例のサンプルは、３つの推定ＨＬＡ遺伝子型を示し、すべてが閾値を満たしていた 合計で、２２個のＨＬＡ―ＤＲＢ１、１４個のＨＬＡ－ＤＱＢ１、及び１１個のＨＬＡ－ＤＰＢ１遺伝子型をＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ遺伝子に代入した。

［実施例１］
上記５５５例のゲノムＤＮＡサンプルを用いて、上記ゲノムワイドＳＮＰ解析を実施し、下記に示すＳｔａｔｕｓ－１及びＳｔａｔｕｓ－２中の２群をそれぞれ比較するゲノムワイド関連解析（ＧＷＡＳ）を行なった。

Ｓｔａｔｕｓ－１：ｇｒｏｕｐ＿０（低反応群、ＨＢｓＡｂ≦１０ｍＩＵ／ｍＬ、ｎ＝６６）に対する、ｇｒｏｕｐ＿１＋ｇｒｏｕｐ＿２（中反応群＋高反応群、ＨＢｓＡｂ＞１０ｍＩＵ／ｍＬ、ｎ＝４８９）
Ｓｔａｔｕｓ－２：ｇｒｏｕｐ＿０（低反応群、ＨＢｓＡｂ≦１０ｍＩＵ／ｍＬ、ｎ＝６６）に対する、ｇｒｏｕｐ＿２（高反応群、ＨＢｓＡｂ＞１００ｍＩＵ／ｍＬ、ｎ＝３０５）

以前の研究により、ビームゲンを対象としたＧＷＡＳにおいてビームゲン応答性との関連が有意（Ｐ値＜０．０００１）となったＳＮＰの中で、ヘプタバックス－ＩＩを対象としたＧＷＡＳでも応答性が有意（Ｐ値＜０．０５）となった７２個のＳＮＰのオッズ比は非常に高い相関を示した（Ｒ２＝０．８８５６）。一方で、ヘプタバックス－ＩＩ接種者とビームゲン接種者を３群ごとに比較した結果、ゲノムワイドで有意となるＳＮＰが存在しなかった。
これらのことから、ＧＷＡＳでは、２種類のＢ型肝炎ワクチンに対する免疫応答性に関わる遺伝子に有意な違いを検出できないことが分かった。

続いて、ＨＬＡ関連解析を実施した。
具体的には、ＨＬＡ関連解析においても、まずはヘプタバックス－ＩＩに対する免疫応答性の遺伝的要因の検出に使用された日本人成人５５５例を同様に、以下に示す３つのグループに分類した：
ｇｒｏｕｐ＿０、低反応群、ＨＢｓＡｂ≦１０ｍＩＵ／ｍＬ、ｎ＝６６。
ｇｒｏｕｐ＿１、中反応群、１０ｍＩＵ／ｍＬ＜ＨＢｓＡｂ≦１００ｍＩＵ／ｍＬ、ｎ＝１２４。
ｇｒｏｕｐ＿２、高反応群、１００ｍＩＵ／ｍＬ＜ＨＢｓＡｂ、ｎ＝３０５。

次いで、それぞれの応答群におけるハプロタイプ及びアリルとの関連をＨＬＡ ｉｍｕｐｕｔａｔｉｏｎ法により解析した。

まず、各反応群とＨＬＡハプロタイプとの関係性について検討した。結果を表１（ｇｒｏｕｐ＿０とｇｒｏｕｐ＿２の比較）及び表２（ｇｒｏｕｐ＿０とｇｒｏｕｐ＿１＋ｇｒｏｕｐ＿２の比較）に示す。

表１及び表２に示すように、ハプロタイプ（ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４：０５－ＤＱＢ１＊０４：０１）及びアリル（ＤＰＢ＊０５：０１）が有意な関連を示した。それぞれにおけるオッズ比（ＯＲ）が１より大きいことから、これらハプロタイプ及びアリルを有すると、グループ０となる確率が有意に大きい、つまり低反応群となりやすいことが示唆された。

次に、ＨＬＡハプロタイプとヘプタバックス－ＩＩ応答性との関係性と、以前行った日本人成人１，１９３例を対象としたＨＬＡハプロタイプとビームゲン応答性との関係性（非特許文献１参照）とを比較した。表３は、ヘプタバックス－ＩＩ及びビームゲンそれぞれの高反応群（Ｇｒｏｕｐ＿２）におけるＨＬＡハプロタイプの比率を示したものである。表４は、ヘプタバックス－ＩＩ及びビームゲンそれぞれの中高反応群（Ｇｒｏｕｐ＿１＋Ｇｒｏｕｐ＿２）におけるＨＬＡハプロタイプの比率を示したものである。

表３及び表４に示したように、２種のハプロタイプ（ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４：０５－ＤＱＢ１＊０４：０１及びＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１３：０２－ＤＱＢ１＊０６：０４）が有意な関連を示した。それぞれのオッズ比（ＯＲ）から、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４：０５－ＤＱＢ１＊０４：０１を有すると、ヘプタバックス－ＩＩの群が有意に大きい、つまりヘプタバックス－ＩＩの群で高反応群及び中高反応群となりやすい。一方、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１３：０２－ＤＱＢ１＊０６：０４を有すると、ビームゲンの群が有意に大きい、つまりビームゲンの群で高反応群となりやすいことが示された。
なお、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４：０５－ＤＱＢ１＊０４：０１は、ヘプタバックス－ＩＩ及びビームゲンそれぞれにおける低反応群、中反、及び応群高反応群との比較により、本ハプロタイプを有すると、いずれのワクチンの場合も低反応群となりやすいことが既に示されているハプロタイプである。
他方、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１３：０２－ＤＱＢ１＊０６：０４はヘプタバックス－ＩＩ及びビームゲンそれぞれにおける中高反応群との比較で初めて有意な相関が認められた。

そこで、続いてＨＬＡハプロタイプと、ビームゲン及びヘプタバックス－ＩＩの高反応群それぞれと健常者群の関係性を比較した。結果を表５に示す。

表５に示すように、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１３：０２－ＤＱＢ１＊０６：０４がヘプタバックス－ＩＩ高反応群と健常者群との比較において有意な関連を示した。一方、健常者群とビームゲン高反応群では、同ハプロタイプにおいて有意な相関は得られなかった。なおヘプタバックス－ＩＩ高反応群と健常者群との比較におけるオッズ比（ＯＲ）が１より小さいことから、これらハプロタイプを有する確率は健常者の群が有意に大きい。つまり、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１３：０２－ＤＱＢ１＊０６：０４を有する群は、ヘプタバックス－ＩＩ高反応群よりも健常者の群において割合が有意に多いことを示しており、間接的に同ハプロタイプを有する群はヘプタバックス－ＩＩ接種において高反応群となりにくいことを示唆している。

また、ＩＥＤＢ（Ｉｍｍｕｎｅ Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｄａｔａｂａｓｅ）を用いて、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４：０５又はＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１３：０２と、ビームゲン又はヘプタバックス－ＩＩの抗原ペプチドの結合予測を行なった。

その結果、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４：０５では、ヘプタバックス－ＩＩの抗原ペプチドのほうが安定的な結合を示すものが多いことが明らかとなった。また、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１３：０２との結合において、ヘプタバックス－ＩＩでは不安定で、ビームゲンでは安定である抗原ペプチドの配列を探索したところ、ヘプタバックス－ＩＩに特有の配列であって、Ｎ末端から１３４番目のアミノ酸残基から１４８番目のアミノ酸残基までの１５アミノ酸残基からなる配列（FPSCCCTKP[T/S]DGNCT：配列番号７）であることが明らかとなった。

以上の結果から、検体がＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４：０５－ＤＱＢ１＊０４：０１を有する場合には、当該検体は、ビームゲン及びヘプタバックス－ＩＩに対する免疫応答性を有さない又は免疫応答性が低い傾向があり、一方で、検体がＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１３：０２－ＤＱＢ１＊０６：０４を有する場合には、当該検体は、ビームゲンに対する免疫応答性を有し、ヘプタバックス－ＩＩに対する免疫応答性を有さない又は免疫応答性が低い傾向があることが示唆された。

本実施形態の方法及び試薬によれば、被験者におけるＢ型肝炎ワクチンに対する免疫応答性の遺伝的要因を簡便且つ確実に検出することができる。

Claims (4)

1. Ｂ型肝炎ワクチンに対する免疫応答性の遺伝的要因を検出する方法であって、
   前記Ｂ型肝炎ワクチンがＧｅｎｏｔｙｐｅ Ａ（ＨＢＶ／Ａ）に対応する酵母由来の組換え沈降ＨＢワクチン及びＧｅｎｏｔｙｐｅ Ｃ（ＨＢＶ／Ｃ）に対応する酵母由来の組換え沈降ＨＢワクチンであり、
   被験者由来のＤＮＡ含有試料中のＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ遺伝子のハプロタイプを検出することと、
   前記ハプロタイプとしてＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１３：０２－ＤＱＢ１＊０６：０４が検出された場合に、前記被験者は前記Ｇｅｎｏｔｙｐｅ Ｃ（ＨＢＶ／Ｃ）に対応する酵母由来の組換え沈降ＨＢワクチンに対する免疫応答性を有し、前記Ｇｅｎｏｔｙｐｅ Ａ（ＨＢＶ／Ａ）に対応する酵母由来の組換え沈降ＨＢワクチンに対する免疫応答性を有さない又は免疫応答性が低いと判定することと、を含む、方法。
2. 前記ハプロタイプとしてＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４：０５－ＤＱＢ１＊０４：０１が検出された場合に、前記被験者は前記Ｇｅｎｏｔｙｐｅ Ａ（ＨＢＶ／Ａ）に対応する酵母由来の組換え沈降ＨＢワクチン及び前記Ｇｅｎｏｔｙｐｅ Ｃ（ＨＢＶ／Ｃ）に対応する酵母由来の組換え沈降ＨＢワクチンに対する免疫応答性を有さないと判定することを更に含む、請求項１に記載の方法。
3. Ｇｅｎｏｔｙｐｅ Ａ（ＨＢＶ／Ａ）に対応する酵母由来の組換え沈降ＨＢワクチン及びＧｅｎｏｔｙｐｅ Ｃ（ＨＢＶ／Ｃ）に対応する酵母由来の組換え沈降ＨＢワクチンに対する免疫応答性の遺伝的要因を検出する試薬であって、
   ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ遺伝子のハプロタイプであるＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１３：０２－ＤＱＢ１＊０６：０４を検出する１以上の核酸プローブ又はプライマーを含む、試薬。
4. ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ遺伝子のハプロタイプであるＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４：０５－ＤＱＢ１＊０４：０１を検出する１以上の核酸プローブ又はプライマーを更に含む、請求項３に記載の試薬。