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JP7728181B2 - 半合成生物における複製、転写および翻訳のための試薬ならびに方法 - Google Patents

半合成生物における複製、転写および翻訳のための試薬ならびに方法

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Description

関連出願に対する相互参照
本出願は、２０１９年６月１４日に出願された米国仮出願第６２／８６１，９０１号に対する優先権を主張し、その開示は、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる。前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０２０年６月１０日に作成され、３６２７１－８０８＿６０１＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、１８，１６２バイトのサイズである。
連邦政府が後援する研究に関する陳述
本明細書に開示される発明は、少なくとも一部分において、国立衛生研究所（ＮＩＨ）による助成金番号５Ｒ３５ ＧＭ１１８１７８およびＧＭ１２８３７６およびＦ３１ ＧＭ１２８３７６、ならびに全米科学財団（ＮＳＦ）による助成金番号ＮＳＦ／ＤＧＥ－１３４６８３７の米国政府の支援により行われた。したがって、米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
生物学的多様性は、生命が異なる環境に適合するのを可能にし、時間とともに、新たな形態および機能を進化させる。この多様性の起源は、２０の天然アミノ酸によって提供されるタンパク質配列内のバリエーションであり、バリエーションは、４つの天然ＤＮＡヌクレオチドによる生物のゲノムにおいてコードされる。天然アミノ酸よって提供される機能的多様性は高いが、配列空間の広大さは、実際に探索される可能性がある対象を著しく限定し、また、一部の機能は、そもそも利用可能ですらない。ヒドリドの移動、酸化還元活性および求電子結合形成などのための補助因子を自然が使用していることは、これらの限定を証明している。さらにまた、治療薬としてのタンパク質の開発に対する注目の増加により、天然アミノ酸の物理化学的多様性が、化学者によって設計された低分子薬物のものと比較して、著しく制限されるので、これらの限定は問題がある。原理上は、所望の物理化学的性質を有する追加の非標準アミノ酸（ｎｃＡＡまたは「非天然アミノ酸」）を含むように遺伝コードを拡大することによってこれらの限定を回避することは可能であるはずである。
２０年近く前、大腸菌のｎｃＡＡをコードするアンバー終止コドン（ＵＡＧ）を使用して遺伝コードを拡大することによって、生命体が利用可能な多様性を増加させるための方法が作り出された。これは、メタノコッカス・ヤナシイ由来のｔＲＮＡ－アミノ酸ｔＲＮＡシンテターゼ（ａａＲＳ）の対を使用して達成され、ここで、ｔＲＮＡは、終止コドンを抑制するために再コードされ、ａａＲＳは、ｔＲＮＡをｎｃＡＡでチャージするように進化した。コドン抑制のこの方法は、その後、他の終止コドン、およびさらに四つ組コドンに拡張されただけでなく、いくつかの他の直交ｔＲＮＡ－ａａＲＳの対（最も顕著には、メタノサルシナ・バルケリ／マゼイ由来のＰｙｌ ｔＲＮＡシンテターゼの対）の使用にも拡張され、タンパク質に組み込まれるｎｃＡＡの範囲が広がった。これらの方法は、すでに、化学生物学およびタンパク質治療薬の両方に大改革をもたらし始めている。
これらの方法は、原核細胞および真核細胞の両方において最大で２つまでの異なるｎｃＡＡの組み込みを可能にするが、異種再コードｔＲＮＡは、内因性放出因子（ＲＦ）と、または四つ組コドンの場合では、正常な解読と競合してしまい、ｎｃＡＡの組み込みの効率および忠実度を限定する。アンバー終止コドンを認識し、翻訳を終結させるＲＦ１との競合を排除するために、宿主ゲノム中に出現するアンバー終止コドンの多くもしくはすべての除去、またはＲＦ１の欠失を可能にするためのＲＦ２の改変に努力が向けられてきた。しかしながら、真核生物は、放出因子を１つのみ有し、これは改変することはできるが欠失させることはできず、原核生物では、ＲＦ１の欠失は、他のｔＲＮＡによるアンバー終止コドンのより高い誤った抑制をもたらし、ｎｃＡＡの組み込みの忠実度を低減する。ｎｃＡＡへの再割当のために天然コドンを解放するためにさらにコドン冗長性を利用するための努力は、例えば、翻訳の速度およびタンパク質フォールディングに対するそれらの効果に起因して、コドンが真に冗長ではないので、多面的な効果によって複雑化する場合がある。加えて、コドン再充当は、特に真核生物では、大スケールのゲノム操作の課題によって限定される。
天然コドン再割当に対する代替アプローチは、任意の天然の機能または制約がない完全に新たなコドンの作出であり、リボソームにおけるその認識は、本質的により直交性である。これは、非天然塩基対（ＵＢＰ）を形成する第５および第６のヌクレオチドを持つ生物の作出により達成することができる。そのような半合成生物（ＳＳＯ）は、ＵＢＰを含有するＤＮＡを忠実に複製し、それを、非天然ヌクレオチドを含有するｍＲＮＡおよびｔＲＮＡに効率的に転写し、次いで、同族（ｃｏｇｎａｔｅ）の非天然アンチコドンで非天然コドンを効率的に解読することが必要であろう。そのようなＳＳＯは、ｎｃＡＡをコードする実質的に無制限の数の新たなコドンを有するだろう。
ある特定の実施形態において、非天然ヌクレオチドを含む核酸分子の増加した産生のための、方法、細胞、操作された微生物、プラスミドおよびキットを本明細書に記載する。
以下の実施形態が包含される。
実施形態Ａ１は、構造：
［式中、
それぞれのＸは、独立して、炭素または窒素であり；
Ｒ２は、Ｘが炭素である場合に存在し、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、メトキシ、メタンチオール、メタンセレノ、ハロゲン、シアノまたはアジド基であり；
Ｙは、硫黄、酸素、セレンまたは第二級アミンであり；
Ｅは、酸素、硫黄またはセレンであり；
波線は、リボシル、デオキシリボシルもしくはジデオキシリボシル部分、またはそれらのアナログとの結合点を示し、リボシル、デオキシリボシルもしくはジデオキシリボシル部分、またはそれらのアナログは、遊離形態であるか、モノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、α－チオトリホスフェート、β－チオトリホスフェートまたはγ－チオトリホスフェート基に接続されるか、あるいはＲＮＡもしくはＤＮＡ中、またはＲＮＡアナログもしくはＤＮＡアナログ中に含まれる］
の核酸塩基である。
実施形態Ａ２は、Ｘは、炭素である、実施形態Ａ１に記載の核酸塩基である。
実施形態Ａ３は、Ｅは、硫黄である、実施形態Ａ１またはＡ２に記載の核酸塩基である。
実施形態Ａ４は、Ｙは、硫黄である、実施形態Ａ１～Ａ３のいずれか１項に記載の核酸塩基である。
実施形態Ａ５は、構造
を有する、実施形態Ａ１に記載の核酸塩基である。
実施形態Ａ６は、相補的な塩基対形成核酸塩基に結合して、非天然塩基対（ＵＢＰ）を形成する、実施形態Ａ１～Ａ５のいずれか１項に記載の核酸塩基である。
実施形態Ａ７は、相補的な塩基対形成核酸塩基は、
から選択される、実施形態Ａ６に記載の核酸塩基である。
実施形態Ａ８は、二本鎖オリゴヌクレオチドの二本鎖であって、第１のオリゴヌクレオチド鎖は、実施形態Ａ１～Ａ５のいずれか１項に記載の核酸塩基を含み、第２の相補的なオリゴヌクレオチド鎖は、相補的な塩基対形成核酸塩基をその相補的な塩基対形成部位に含む、二本鎖オリゴヌクレオチドの二本鎖である。
実施形態Ａ９は、第１のオリゴヌクレオチド鎖は、
を含み、第２の鎖は、
から選択される相補的な塩基対形成核酸塩基をその相補的な塩基対形成部位に含む、実施形態Ａ８に記載の二本鎖オリゴヌクレオチドの二本鎖である。
実施形態Ａ１０は、第２の鎖は、相補的な塩基対形成核酸塩基
を含む、実施形態Ａ９に記載の二本鎖オリゴヌクレオチドの二本鎖である。
実施形態Ａ１１は、第２の鎖は、相補的な塩基対形成核酸塩基
を含む、実施形態Ａ９に記載の二本鎖オリゴヌクレオチドの二本鎖である。
実施形態Ａ１２は、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）をコードする遺伝子および／または目的のタンパク質をコードする遺伝子を含むプラスミドであって、遺伝子は、実施形態Ａ１～Ａ５のいずれか１項に記載の少なくとも１つの核酸塩基、またはＴＰＴ３（
）、および実施形態Ａ７に記載の少なくとも１つの相補的な塩基対形成核酸塩基、またはＮａＭ（
）を含み、相補的な塩基対形成核酸塩基は、相補的な塩基対形成部位にある、プラスミドである。
実施形態Ａ１３は、ｔＲＮＡをコードする実施形態Ａ１０に記載のプラスミドによってコードされるｍＲＮＡである。
実施形態Ａ１４は、タンパク質をコードする実施形態Ａ１０に記載のプラスミドによってコードされるｍＲＮＡである。
実施形態Ａ１５は、実施形態Ａ１～Ａ５のいずれか１項に記載の核酸塩基を含むトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）であって、
核酸塩基を含むアンチコドンであって、場合により核酸塩基は、アンチコドンの第１、第２または第３の位置にある、前記；および
アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼによる、ｔＲＮＡの非天然アミノ酸による選択的チャージを促進する認識エレメント；
を含むトランスファーＲＮＡである。
実施形態Ａ１６は、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼは、メタノサルシナ属もしくはそのバリアント、またはメタノコッカス属（メタノカルドコッカス属）もしくはそのバリアントに由来する、実施形態Ａ１５に記載のｔＲＮＡである。
実施形態Ａ１７は、非天然アミノ酸は、芳香族部分を含む、実施形態Ａ１５に記載のｔＲＮＡである。
実施形態Ａ１８は、非天然アミノ酸は、リジンまたはフェニルアラニンの誘導体である、実施形態Ａ１５に記載のｔＲＮＡである。
実施形態Ａ１９は、式：
Ｎ１－Ｚｘ－Ｎ２
［式中、
それぞれのＺは、独立して、実施形態Ａ１～Ａ７のいずれか１項に記載の核酸塩基であり、リボシルもしくはデオキシリボシル、またはそれらのアナログに結合しており；
Ｎ１は、Ｚのリボシルもしくはデオキシリボシル、またはそれらのアナログの５’末端で結合した、１つまたはそれ以上のヌクレオチドもしくはそのアナログ、または末端ホスフェート基であり；
Ｎ２は、Ｚのリボシルもしくはデオキシリボシル、またはそれらのアナログの３’末端に結合した、１つまたはそれ以上のヌクレオチドもしくはそのアナログ、または末端ヒドロキシル基であり；
ｘは、１～２０の整数である］
を含む構造である。
実施形態Ａ２０は、構造は、遺伝子をコードし、場合によりＺｘは、遺伝子の翻訳領域に位置するか、またはＺｘは、遺伝子の非翻訳領域に位置する、実施形態Ａ１９に記載の構造である。
実施形態Ａ２１は、ポリヌクレオチドライブラリーであって、ライブラリーは、少なくとも５０００の固有のポリヌクレオチドを含み、それぞれのポリヌクレオチドは、実施形態Ａ１～Ａ５のいずれか１項に記載の少なくとも１つの核酸塩基を含む、ポリヌクレオチドライブラリーである。
実施形態Ａ２２は、核酸塩基を含むヌクレオシド三リン酸であって、核酸塩基は、
から選択される、ヌクレオシド三リン酸である。
実施形態Ａ２３は、核酸塩基は、
である、実施形態Ａ２２に記載のヌクレオシド三リン酸である。
実施形態Ａ２４は、ヌクレオシドは、リボースまたはデオキシリボースを含む、実施形態Ａ２２またはＡ２３に記載のヌクレオシド三リン酸である。
実施形態Ａ２５は、構造
を有する核酸塩基、および構造
を有する相補的な塩基対形成核酸塩基を含むＤＮＡである。
実施形態Ａ２６は、構造
を有する核酸塩基、および構造
を有する相補的な塩基対形成核酸塩基を含むＤＮＡである。
実施形態Ａ２７は、ＤＮＡを、ｔＲＮＡまたはタンパク質をコードするｍＲＮＡに転写する方法であって、
ｔＲＮＡまたはタンパク質をコードする遺伝子を含むＤＮＡをリボヌクレオシド三リン酸およびＲＮＡポリメラーゼと接触させる工程を含み、ｔＲＮＡまたはタンパク質をコードする遺伝子は、第２の非天然塩基と対形成し、第２の非天然塩基と第１の非天然塩基対を形成する第１の非天然塩基対合を含み、リボヌクレオシド三リン酸は、第１の非天然塩基と第２の非天然塩基対を形成することができる第３の非天然塩基を含み、第１の非天然塩基対および第２の非天然塩基対は、同じではない、方法である。
実施形態Ａ２８は、リボヌクレオシド三リン酸は、第４の非天然塩基をさらに含み、第４の非天然塩基は、第３の非天然塩基と第２の非天然塩基対を形成することができる、実施形態Ａ２７に記載の方法である。
実施形態Ａ２９は、第１の非天然塩基対および第２の非天然塩基対は、同じではない、実施形態Ａ２８に記載の方法である。
実施形態Ａ３０は、ＤＮＡをリボヌクレオシド三リン酸およびＲＮＡポリメラーゼと接触させる工程の前に、ＤＮＡをデオキシリボヌクレオシド三リン酸およびＤＮＡポリメラーゼと接触させることによってＤＮＡを複製する工程をさらに含み、リボヌクレオシド三リン酸は、第１の非天然塩基と第５の非天然塩基対を形成することができる第５の非天然塩基を含み、第１の非天然塩基対および第５の非天然塩基対は、同じではない、実施形態Ａ２７～２９のいずれか１項に記載の方法である。
実施形態Ａ３０は、第１の非天然塩基は、ＴＰＴ３を含み、第２の非天然塩基は、ＣＮＭＯまたはＮａＭを含み、第３の非天然塩基は、ＴＡＴ１を含み、第４の非天然塩基は、ＮａＭまたは５ＦＭを含む、実施形態Ａ２７～Ａ３０のいずれか１項に記載の方法である。
実施形態Ａ３２は、方法は、半合成生物の使用を含み、場合により生物は、細菌であり、場合により細菌は、大腸菌である、実施形態Ａ２７～Ａ３１のいずれか１項に記載の方法である。
実施形態Ａ３３は、生物は、微生物を含む、実施形態Ａ３２に記載の方法である。
実施形態Ａ３４は、生物は、細菌を含む、実施形態Ａ３２に記載の方法である。
実施形態Ａ３５は、生物は、グラム陽性細菌を含む、実施形態Ａ３４に記載の方法である。
実施形態Ａ３６は、生物は、グラム陰性細菌を含む、実施形態Ａ３４に記載の方法である。
実施形態Ａ３７は、生物は、大腸菌を含む、実施形態Ａ２７～Ａ３４のいずれか１項に記載の方法である。
実施形態Ａ３８は、少なくとも１つの非天然塩基は、
（ｉ）２－チオウラシル、２－チオ－チミン、２’－デオキシウリジン、４－チオ－ウラシル、４－チオ－チミン、ウラシル－５－イル、ヒポキサンチン－９－イル（Ｉ）、５－ハロウラシル；５－プロピニル－ウラシル、６－アゾ－チミン、６－アゾ－ウラシル、５－メチルアミノメチルウラシル、５－メトキシアミノメチル－２－チオウラシル、シュードウラシル、ウラシル－５－オキサ酢酸メチルエステル、ウラシル－５－オキサ酢酸、５－メチル－２－チオウラシル、３－（３－アミノ－３－Ｎ－２－カルボキシプロピル）ウラシル、５－メチル－２－チオウラシル、４－チオウラシル、５－メチルウラシル、５’－メトキシカルボキシメチルウラシル、５－メトキシウラシル、ウラシル－５－オキシ酢酸、５－（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチルウラシルまたはジヒドロウラシル；
（ｉｉ）５－ヒドロキシメチルシトシン、５－トリフルオロメチルシトシン、５－ハロシトシン、５－プロピニルシトシン、５－ヒドロキシシトシン、シクロシトシン、シトシンアラビノシド、５，６－ジヒドロシトシン、５－ニトロシトシン、６－アゾシトシン、アザシトシン、Ｎ４－エチルシトシン、３－メチルシトシン、５－メチルシトシン、４－アセチルシトシン、２－チオシトシン、フェノキサジンシチジン（［５，４－ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン－２（３Ｈ）－オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ－ピリミド［５，４－ｂ］［１，４］ベンゾチアジン－２（３Ｈ）－オン）、フェノキサジンシチジン（９－（２－アミノエトキシ）－Ｈ－ピリミド［５，４－ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン－２（３Ｈ）－オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ－ピリミド［４，５－ｂ］インドール－２－オン）またはピリドインドールシチジン（Ｈ－ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３－ｄ］ピリミジン－２－オン）；
（ｉｉｉ）２－アミノアデニン、２－プロピルアデニン、２－アミノ－アデニン、２－Ｆ－アデニン、２－アミノ－プロピル－アデニン、２－アミノ－２’－デオキシアデノシン、３－デアザアデニン、７－メチルアデニン、７－デアザ－アデニン、８－アザアデニン、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキルおよび８－ヒドロキシルで置換されたアデニン、Ｎ６－イソペンテニルアデニン、２－メチルアデニン、２，６－ジアミノプリン、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニンまたは６－アザ－アデニン；
（ｉｖ）２－メチルグアニン、グアニンの２－プロピルおよびアルキル誘導体、３－デアザグアニン、６－チオ－グアニン、７－メチルグアニン、７－デアザグアニン、７－デアザグアノシン、７－デアザ－８－アザグアニン、８－アザグアニン、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキルおよび８－ヒドロキシルで置換されたグアニン、１－メチルグアニン、２，２－ジメチルグアニン、７－メチルグアニンまたは６－アザ－グアニン；ならびに
（ｖ）ヒポキサンチン、キサンチン、１－メチルイノシン、キュエオシン、ベータ－Ｄ－ガラクトシルキュエオシン、イノシン、ベータ－Ｄ－マンノシルキュエオシン、ワイブトキソシン、ヒドロキシウレア、（ａｃｐ３）ｗ、２－アミノピリジンまたは２－ピリドン
からなる群から選択される、実施形態Ａ２７～Ａ３７のいずれか１項に記載の方法である。
実施形態Ａ３９は、第１の非天然塩基、第２の非天然塩基、第３の非天然塩基または第４の非天然塩基のうちの少なくとも１つは、
を含む、実施形態Ａ２７～Ａ３７のいずれか１項に記載の方法である。
実施形態Ａ４０は、第１の非天然塩基、第２の非天然塩基、第３の非天然塩基または第４の非天然塩基のうちの少なくとも１つは、
からなる群から選択される、実施形態Ａ２７～Ａ３９のいずれか１項に記載の方法である。
実施形態Ａ４１は、第１の非天然塩基、第２の非天然塩基、第３の非天然塩基または第４の非天然塩基のうちの少なくとも１つは、
からなる群から選択される、実施形態Ａ４０に記載の方法である。
実施形態Ａ４２は、第１の非天然塩基、第２の非天然塩基、第３の非天然塩基または第４の非天然塩基のうちの少なくとも１つは、
からなる群から選択される、実施形態Ａ４０に記載の方法である。
実施形態Ａ４３は、第１の非天然塩基、第２の非天然塩基、第３の非天然塩基または第４の非天然塩基のうちの少なくとも１つは、
からなる群から選択される、実施形態Ａ４０に記載の方法である。
実施形態Ａ４４は、第１の非天然塩基、第２の非天然塩基、第３の非天然塩基または第４の非天然塩基のうちの少なくとも１つは、
を含む、実施形態Ａ４０に記載の方法である。
実施形態Ａ４５は、第１の非天然塩基、第２の非天然塩基、第３の非天然塩基または第４の非天然塩基のうちの少なくとも１つは、
を含む、実施形態Ａ４０に記載の方法である。
実施形態Ａ４６は、第１の非天然塩基、第２の非天然塩基、第３の非天然塩基または第４の非天然塩基のうちの少なくとも１つは、
を含む、実施形態Ａ４０に記載の方法である。
実施形態Ａ４７は、第１の非天然塩基、第２の非天然塩基、第３の非天然塩基または第４の非天然塩基のうちの少なくとも１つは、
からなる群から選択される、実施形態Ａ４０に記載の方法である。
実施形態Ａ４８は、第１の非天然塩基、第２の非天然塩基、第３の非天然塩基または第４の非天然塩基のうちの少なくとも１つは、
である、実施形態Ａ４０に記載の方法である。
実施形態Ａ４９は、第１の非天然塩基、第２の非天然塩基、第３の非天然塩基または第４の非天然塩基のうちの少なくとも１つは、
を含む、実施形態Ａ４０に記載の方法である。
実施形態Ａ５０は、第１または第２の非天然塩基は、
である、実施形態Ａ４０に記載の方法である。
実施形態Ａ５１は、第１または第２の非天然塩基は、
である、実施形態Ａ４０に記載の方法である。
実施形態Ａ５２は、第１の非天然塩基は、
であり、第２の非天然塩基は、
であるか、または第１の非天然塩基は、
であり、第２の非天然塩基は、
である、実施形態Ａ２７～Ａ４０のいずれか１項に記載の方法である。
実施形態Ａ５３は、第３または第４の非天然塩基は、
である、実施形態Ａ２７～Ａ４０およびＡ５２のいずれか１項に記載の方法である。
実施形態Ａ５４は、第３の非天然塩基は、
である、実施形態Ａ５３に記載の方法である。
実施形態Ａ５５は、第４の非天然塩基は、
である、実施形態Ａ５４に記載の方法である。
実施形態Ａ５６は、第３または第４の非天然塩基は、
である、実施形態Ａ２７～Ａ５２のいずれか１項に記載の方法である。
実施形態Ａ５７は、第３の非天然塩基は、
である、実施形態Ａ５６に記載の方法である。
実施形態Ａ５８は、第４の非天然塩基は、
である、実施形態Ａ５６に記載の方法である。
実施形態Ａ５９は、第１の非天然塩基は、
であり、第２の非天然塩基は、
であり、第３の非天然塩基は、
であり、第４の非天然塩基は、
である、実施形態Ａ２７～Ａ４０のいずれか１項に記載の方法である。
実施形態Ａ６０は、第１の非天然塩基は、
であり、第２の非天然塩基は、
であり、第３の非天然塩基は、
であり、第４の非天然塩基は、
である、実施形態Ａ２７～Ａ４０のいずれか１項に記載の方法である。
実施形態Ａ６１は、第１の非天然塩基は、
であり、第２の非天然塩基は、
であり、第３の非天然塩基は、
であり、第４の非天然塩基は、
である、実施形態Ａ２７～Ａ４０のいずれか１項に記載の方法である。
実施形態Ａ６２は、第３の非天然塩基は、
である、実施形態Ａ２７～Ａ４０のいずれか１項に記載の方法である。
実施形態Ａ６３は、第４の非天然塩基は、
である、実施形態Ａ２７～Ａ５１のいずれか１項に記載の方法である。
実施形態Ａ６４は、第１の非天然塩基は、
であり、第２の非天然塩基は、
であり、第３の非天然塩基は、
であり、第４の非天然塩基は、
である、実施形態Ａ２７～Ａ４０のいずれか１項に記載の方法である。
実施形態Ａ６５は、第３の非天然塩基および第４の非天然塩基は、リボースを含む、実施形態Ａ２７～Ａ６４のいずれか１項に記載の方法である。
実施形態Ａ６６は、第３の非天然塩基および第４の非天然塩基は、デオキシリボースを含む、実施形態Ａ２７～Ａ６４のいずれか１項に記載の方法である。
実施形態Ａ６７は、第１および第２の非天然塩基は、デオキシリボースを含む、実施形態Ａ２７～Ａ６６のいずれか１項に記載の方法である。
実施形態Ａ６８は、第１および第２の非天然塩基は、デオキシリボースを含み、第３の非天然塩基および第４の非天然塩基は、リボースを含む、実施形態Ａ２７～Ａ６４のいずれか１項に記載の方法である。
実施形態Ａ６９は、ＤＮＡは、
から選択される少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を含む、実施形態Ａ２７～Ａ４０のいずれか１項に記載の方法である。
実施形態Ａ７０は、ＤＮＡテンプレートは、ｄＮａＭ－ｄ５ＳＩＣＳである少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を含む、実施形態Ａ６９に記載の方法である。
実施形態Ａ７１は、ＤＮＡテンプレートは、ｄＣＮＭＯ－ｄＴＰＴ３である少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を含む、実施形態Ａ６９に記載の方法である。
実施形態Ａ７２は、ＤＮＡテンプレートは、ｄＮａＭ－ｄＴＰＴ３である少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を含む、実施形態Ａ６９に記載の方法である。
実施形態Ａ７３は、ＤＮＡテンプレートは、ｄＰＴＭＯ－ｄＴＰＴ３である少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を含む、実施形態Ａ６９に記載の方法である。
実施形態Ａ７４は、ＤＮＡテンプレートは、ｄＮａＭ－ｄＴＡＴ１である少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を含む、実施形態Ａ６９に記載の方法である。
実施形態Ａ７５は、ＤＮＡテンプレートは、ｄＣＮＭＯ－ｄＴＡＴ１である少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を含む、実施形態Ａ６９に記載の方法である。
実施形態Ａ７６は、ＤＮＡは、
から選択される少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を含み；
ｍＲＮＡおよび／またはｔＲＮＡは、
から選択される少なくとも１つの非天然塩基を含む、実施形態Ａ２７～Ａ４０のいずれか１項に記載の方法である。
実施形態Ａ７７は、ＤＮＡテンプレートは、ｄＮａＭ－ｄ５ＳＩＣＳである少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を含む、実施形態Ａ７６に記載の方法である。
実施形態Ａ７８は、ＤＮＡテンプレートは、ｄＣＮＭＯ－ｄＴＰＴ３である少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を含む、実施形態Ａ７６に記載の方法である。
実施形態Ａ７９は、ＤＮＡテンプレートは、ｄＮａＭ－ｄＴＰＴ３である少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を含む、実施形態Ａ７６に記載の方法である。
実施形態Ａ８０は、ＤＮＡテンプレートは、ｄＰＴＭＯ－ｄＴＰＴ３である少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を含む、実施形態Ａ７６に記載の方法である。
実施形態Ａ８１は、ＤＮＡテンプレートは、ｄＮａＭ－ｄＴＡＴ１である少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を含む、実施形態Ａ７６に記載の方法である。
実施形態Ａ８２は、ＤＮＡテンプレートは、ｄＣＮＭＯ－ｄＴＡＴ１である少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を含む、実施形態Ａ７６に記載の方法である。
実施形態Ａ８３は、ｍＲＮＡおよびｔＲＮＡは、
から選択される非天然塩基を含む、実施形態Ａ７６～Ａ８２のいずれか１項に記載の方法である。
実施形態Ａ８４は、ｍＲＮＡおよびｔＲＮＡは、
から選択される非天然塩基を含む、実施形態Ａ８３に記載の方法である。
実施形態Ａ８５は、ｍＲＮＡは、
である非天然塩基を含む、実施形態Ａ８３に記載の方法である。
実施形態Ａ８６は、ｍＲＮＡは、
である非天然塩基を含む、実施形態Ａ８３に記載の方法である。
実施形態Ａ８７は、ｍＲＮＡは、
である非天然塩基を含む、実施形態Ａ８３に記載の方法である。
実施形態Ａ８８は、ｔＲＮＡは、
から選択される非天然塩基を含む、実施形態Ａ７６～Ａ８７のいずれか１項に記載の方法である。
実施形態Ａ８９は、ｔＲＮＡは、
である非天然塩基を含む、実施形態Ａ８８に記載の方法である。
実施形態Ａ９０は、ｔＲＮＡは、
である非天然塩基を含む、実施形態Ａ８８に記載の方法である。
実施形態Ａ９１は、ｔＲＮＡは、
である非天然塩基を含む、実施形態Ａ７６～Ａ８７のいずれか１項に記載の方法である。
実施形態Ａ９２は、第１の非天然塩基は、ｄＣＮＭＯを含み、第２の非天然塩基は、ｄＴＰＴ３を含む、実施形態Ａ２７～Ａ４０のいずれか１項に記載の方法である。
実施形態Ａ９３は、第３の非天然塩基は、ＮａＭを含み、第２の非天然塩基は、ＴＡＴ１を含む、実施形態Ａ２７～Ａ４０およびＡ９２のいずれか１項に記載の方法である。
実施形態Ａ９４は、第１の非天然塩基または第２の非天然塩基は、ＤＮＡポリメラーゼによって認識される、実施形態Ａ２７～Ａ９３のいずれか１項に記載の方法である。
実施形態Ａ９５は、第３の非天然塩基または第４の非天然塩基は、ＲＮＡポリメラーゼによって認識される、実施形態Ａ２７～Ａ９４のいずれか１項の方法である。
実施形態Ａ９６は、ｍＲＮＡは、転写され、方法は、ｍＲＮＡをタンパク質に翻訳する工程をさらに含み、タンパク質は、第３の非天然塩基を含むｍＲＮＡのコドンに対応する位置に非天然アミノ酸を含む、実施形態Ａ２７～Ａ９５のいずれか１項に記載の方法である。
実施形態Ａ９７は、タンパク質は、少なくとも２つの非天然アミノ酸を含む、実施形態Ａ２７～Ａ９６のいずれか１項に記載の方法である。
実施形態Ａ９８は、タンパク質は、少なくとも３つの非天然アミノ酸を含む、実施形態Ａ２７～Ａ９６のいずれか１項に記載の方法である。
実施形態Ａ９９は、タンパク質は、少なくとも２つの異なる非天然アミノ酸を含む、実施形態Ａ２７～Ａ９８のいずれか１項に記載の方法である。
実施形態Ａ１００は、タンパク質は、少なくとも３つの異なる非天然アミノ酸を含む、実施形態Ａ２７～Ａ９８のいずれか１項に記載の方法である。
実施形態Ａ１０１は、少なくとも１つの非天然アミノ酸は、
リジンアナログである；
芳香族側鎖を含む；
アジド基を含む；
アルキン基を含む；または
アルデヒドもしくはケトン基を含む、
実施形態Ａ２７～Ａ１００のいずれか１項に記載の方法である。
実施形態Ａ１０２は、少なくとも１つの非天然アミノ酸は、芳香族側鎖を含まない、実施形態Ａ２７～Ａ１０１のいずれか１項に記載の方法である。
実施形態Ａ１０３は、少なくとも１つの非天然アミノ酸は、Ｎ６－アジドエトキシ－カルボニル－Ｌ－リジン（ＡｚＫ）、Ｎ６－プロパルギルエトキシ－カルボニル－Ｌ－リジン（ＰｒａＫ）、ＢＣＮ－Ｌ－リジン、ノルボルネンリジン、ＴＣＯ－リジン、メチルテトラジンリジン、アリルオキシカルボニルリジン、２－アミノ－８－オキソノナン酸、２－アミノ－８－オキソオクタン酸、ｐ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アジドメチル－Ｌ－フェニルアラニン（ｐＡＭＦ）、ｐ－ヨード－Ｌ－フェニルアラニン、ｍ－アセチルフェニルアラニン、２－アミノ－８－オキソノナン酸、ｐ－プロパルギルオキシフェニルアラニン、ｐ－プロパルギル－フェニルアラニン、３－メチル－フェニルアラニン、Ｌ－ドパ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アジド－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アシル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－ベンゾイル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－ブロモフェニルアラニン、ｐ－アミノ－Ｌ－フェニルアラニン、イソプロピル－Ｌ－フェニルアラニン、Ｏ－アリルチロシン、Ｏ－メチル－Ｌ－チロシン、Ｏ－４－アリル－Ｌ－チロシン、４－プロピル－Ｌ－チロシン、ホスホノチロシン、トリ－Ｏ－アセチル－ＧｌｃＮＡｃｐ－セリン、Ｌ－ホスホセリン、ホスホノセリン、Ｌ－３－（２－ナフチル）アラニン、２－アミノ－３－（（２－（（３－（ベンジルオキシ）－３－オキソプロピル）アミノ）エチル）セラニル）プロパン酸、２－アミノ－３－（フェニルセラニル）プロパン酸またはセレノシステインを含む、実施形態Ａ２７～Ａ１０２のいずれか１項に記載の方法である。
実施形態Ａ１０４は、少なくとも１つの非天然アミノ酸は、Ｎ６－アジドエトキシ－カルボニル－Ｌ－リジン（ＡｚＫ）またはＮ６－プロパルギルエトキシ－カルボニル－Ｌ－リジン（ＰｒａＫ）を含む、実施形態Ａ１０２またはＡ１０３に記載の方法である。
実施形態Ａ１０５は、少なくとも１つの非天然アミノ酸は、Ｎ６－アジドエトキシ－カルボニル－Ｌ－リジン（ＡｚＫ）を含む、実施形態Ａ１０４に記載の方法である。
実施形態Ａ１０６は、少なくとも１つの非天然アミノ酸は、Ｎ６－プロパルギルエトキシ－カルボニル－Ｌ－リジン（ＰｒａＫ）を含む、実施形態Ａ１０４に記載の方法である。
実施形態Ａ１０７は、実施形態Ａ２７～Ａ１０６のいずれか１項に記載の方法から生成するｍＲＮＡである。
実施形態Ａ１０８は、実施形態Ａ２７～Ａ１０６のいずれか１項に記載の方法から生成するｔＲＮＡである。
実施形態Ａ１０９は、第３の非天然塩基を含むｍＲＮＡのコドンに相当する位置に非天然アミノ酸を含む、実施形態Ａ１０７に記載のｍＲＮＡによってコードされるタンパク質である。
実施形態Ａ１１０は、拡張された遺伝子アルファベットを含む半合成生物であって、遺伝子アルファベットは、少なくとも３つの別個の非天然塩基を含む、半合成生物である。
実施形態Ａ１１１は、生物は、微生物を含み、場合により微生物は、大腸菌である、実施形態Ａ１１０に記載の半合成生物である。
実施形態Ａ１１２は、
から選択される少なくとも１つの非天然核酸塩基を含むＤＮＡを含む、実施形態Ａ１１０またはＡ１１１に記載の半合成生物である。
実施形態Ａ１１３は、ＤＮＡは、少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を含み、
非天然塩基対（ＵＢＰ）は、ｄＣＮＭＯ－ｄＴＰＴ３、ｄＮａＭ－ｄＴＰＴ３、ｄＣＮＭＯ－ｄＴＡＴ１、ｄ５ＦＭ－ｄＴＡＴ１またはｄＮａＭ－ｄＴＡＴ１である、実施形態Ａ１１０～Ａ１１３のいずれか１項に記載の半合成生物である。
実施形態Ａ１１４は、ＤＮＡは、
である少なくとも１つの非天然核酸塩基を含む、実施形態Ａ１１２に記載の半合成生物である。
実施形態Ａ１１５は、異種ヌクレオシド三リン酸輸送体を発現する、実施形態Ａ１１０～Ａ１１５のいずれか１項に記載の半合成生物である。
実施形態Ａ１１６は、異種ヌクレオシド三リン酸輸送体は、ＰｔＮＴＴ２である、実施形態Ａ１１５に記載の半合成生物である。
実施形態Ａ１１７は、異種ｔＲＮＡシンテターゼをさらに発現する、実施形態Ａ１１０～Ａ１１６のいずれか１項に記載の半合成生物である。
実施形態Ａ１１８は、異種ｔＲＮＡシンテターゼは、Ｍ．バルケリのピロリシル－ｔＲＮＡシンテターゼ（Ｍｂ ＰｙｌＲＳ）である、実施形態Ａ１１７に記載の半合成生物である。
実施形態Ａ１１９は、異種ＲＮＡポリメラーゼをさらに発現する、実施形態Ａ１１０～Ａ１１８のいずれか１項に記載の半合成生物である。
実施形態Ａ１２０は、異種ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７ ＲＮＡＰである、実施形態Ａ１１９に記載の半合成生物である。
実施形態Ａ１２１は、ＤＮＡ組換え修復の機能を有するタンパク質を発現しない、実施形態Ａ１１０～Ａ１２０のいずれか１項に記載の半合成生物である。
実施形態Ａ１２２は、ＲｅｃＡを発現しない、実施形態Ａ１２１に記載の半合成生物である。
実施形態Ａ１２３は、異種ｍＲＮＡをさらに含む、実施形態Ａ１１０～Ａ１２２のいずれか１項に記載の半合成生物である。
実施形態Ａ１２４は、異種ｍＲＮＡは、
から選択される少なくとも１つの非天然塩基を含む、実施形態Ａ１２３に記載の半合成生物である。
実施形態Ａ１２５は、異種ｔＲＮＡをさらに含む、実施形態Ａ１１０～Ａ１２５のいずれか１項に記載の半合成生物である。
実施形態Ａ１２６は、異種ｔＲＮＡは、
から選択される少なくとも１つの非天然塩基を含む、実施形態Ａ１２５に記載の半合成生物である。
実施形態Ａ１２７は、ＤＮＡを転写する方法であって、方法は、
（１）タンパク質をコードする遺伝子であって、タンパク質をコードする遺伝子のテンプレート鎖は、第１の非天然塩基を含む、タンパク質をコードする遺伝子、および（２）ｔＲＮＡをコードする遺伝子であって、ｔＲＮＡをコードする遺伝子のテンプレート鎖は、第１の非天然塩基と塩基対を形成することができる第２の非天然塩基を含む、ｔＲＮＡをコードする遺伝子を含む１つまたはそれ以上のＤＮＡを提供する工程；
タンパク質をコードする遺伝子を転写して、第３の非天然塩基をｍＲＮＡに組み込む工程であって、第３の非天然塩基は、第１の非天然塩基と第１の非天然塩基対を形成することができる、工程；
ｔＲＮＡをコードする遺伝子を転写して、第４の非天然塩基をｔＲＮＡに組み込む工程であって、第４の非天然塩基は、第２の非天然塩基と第２の非天然塩基対を形成することができる、工程
を含み、第１の非天然塩基対および第２の非天然塩基対は、同じではない、方法である。
実施形態Ａ１２８は、ｔＲＮＡを利用するｍＲＮＡからタンパク質を翻訳する工程をさらに含み、前記タンパク質は、ｍＲＮＡ中の第３の非天然塩基を含むコドンに対応する位置に非天然アミノ酸を含む、実施形態Ａ１２７に記載の方法である。
実施形態Ａ１２９は、ＤＮＡを複製する方法であって、方法は、
（１）タンパク質をコードする遺伝子であって、タンパク質をコードする遺伝子のテンプレート鎖は、第１の非天然塩基を含む、タンパク質をコードする遺伝子、および（２）ｔＲＮＡをコードする遺伝子であって、ｔＲＮＡをコードする遺伝子のテンプレート鎖は、第１の非天然塩基と塩基対を形成することができる第２の非天然塩基を含む、ｔＲＮＡをコードする遺伝子を含むＤＮＡを提供する工程；ならびに
ＤＮＡを複製して、第１の非天然塩基の代わりに第１の代替非天然塩基を組み込むか、および／または第２の非天然塩基の代わりに第２の代替非天然塩基を組み込む工程
を含み；
方法は、場合により、
タンパク質をコードする遺伝子を転写して、第３の非天然塩基をｍＲＮＡに組み込む工程であって、第３の非天然塩基は、第１の非天然塩基および／もしくは第１の代替非天然塩基と第１の非天然塩基対を形成することができる、工程；ならびに／または
ｔＲＮＡをコードする遺伝子を転写して、第４の非天然塩基をｔＲＮＡに組み込む工程であって、第４の非天然塩基は、第２の非天然塩基および／もしくは第２の代替非天然塩基と第２の非天然塩基対を形成することができる、工程
をさらに含み、第１の非天然塩基対および第２の非天然塩基対は、同じではない、方法である。
実施形態Ａ１３０は、タンパク質をコードする遺伝子を転写して、第３の非天然塩基をｍＲＮＡに組み込む工程であって、第３の非天然塩基は、第１の非天然塩基および／または第１の代替非天然塩基と第１の非天然塩基対を形成することができる、工程をさらに含む、実施形態Ａ１２９に記載の方法である。
実施形態Ａ１３１は、ｔＲＮＡをコードする遺伝子を転写して、第４の非天然塩基をｔＲＮＡに組み込む工程であって、第４の非天然塩基は、第２の非天然塩基および／または第２の代替非天然塩基と第２の非天然塩基対を形成することができる、工程をさらに含み、第１の非天然塩基対および第２の非天然塩基対は、同じではない、実施形態Ａ１２９またはＡ１３０に記載の方法である。
実施形態Ａ１３２は、方法は、半合成生物の使用を含む、実施形態Ａ１２７～Ａ１３１のいずれか１項に記載の方法である。
実施形態Ａ１３３は、生物は、微生物を含む、実施形態Ａ１３２に記載の方法である。
実施形態Ａ１３４は、方法は、細菌である半合成生物の使用を含むインビボの方法である、実施形態Ａ１３２またはＡ１３３に記載の方法である。
実施形態Ａ１３５は、生物は、グラム陽性細菌を含む、実施形態Ａ１３４に記載の方法である。
実施形態Ａ１３６は、生物は、グラム陰性細菌を含む、実施形態Ａ１３４に記載の方法である。
実施形態Ａ１３７は、生物は、大腸菌を含む、実施形態Ａ１３２～Ａ１３４のいずれか１項に記載の方法である。
実施形態Ａ１３８は、第１の非天然塩基、第２の非天然塩基、第３の非天然塩基または第４の非天然塩基のうちの少なくとも１つは、
を含む、実施形態Ａ１２７～Ａ１３７のいずれか１項に記載の方法である。
実施形態Ａ１３９は、第１の非天然塩基、第２の非天然塩基、第３の非天然塩基または第４の非天然塩基のうちの少なくとも１つは、
を含む、実施形態Ａ１３８に記載の方法である。
実施形態Ａ１４０は、第１の非天然塩基、第２の非天然塩基、第３の非天然塩基または第４の非天然塩基のうちの少なくとも１つは、
を含む、実施形態Ａ１３８に記載の方法である。
実施形態Ａ１４１は、第１の非天然塩基、第２の非天然塩基、第３の非天然塩基または第４の非天然塩基のうちの少なくとも１つは、
を含む、実施形態Ａ１３８に記載の方法である。
実施形態Ａ１４２は、第１の非天然塩基、第２の非天然塩基、第３の非天然塩基または第４の非天然塩基のうちの少なくとも１つは、
である、実施形態Ａ１３８に記載の方法である。
実施形態Ａ１４３は、第１の非天然塩基、第２の非天然塩基、第３の非天然塩基または第４の非天然塩基のうちの少なくとも１つは、
を含む、実施形態Ａ１３８に記載の方法である。
実施形態Ａ１４４は、第１または第２の非天然塩基は、
である、実施形態Ａ１３８に記載の方法である。
実施形態Ａ１４５は、第１または第２の非天然塩基は、
である、実施形態Ａ１３８に記載の方法である。
実施形態Ａ１４６は、第１の非天然塩基は、
であり、第２の非天然塩基は、
である、実施形態Ａ１３８に記載の方法である。
実施形態Ａ１４７は、第１の非天然塩基は、
であり、第２の非天然塩基は、
である、実施形態Ａ１３８に記載の方法である。
実施形態Ａ１４８は、第３または第４の非天然塩基は、
である、実施形態Ａ１３８、Ａ１４６およびＡ１４７のいずれか１項に記載の方法である。
実施形態Ａ１４９は、第３の非天然塩基は、
である、実施形態Ａ１４８に記載の方法である。
実施形態Ａ１５０は、第４の非天然塩基は、
である、実施形態Ａ１４８に記載の方法である。
実施形態Ａ１５１は、第３または第４の非天然塩基は、
である、実施形態Ａ１３８、Ａ１４６およびＡ１４７のいずれか１項に記載の方法である。
実施形態Ａ１５２は、第３の非天然塩基は、
である、実施形態Ａ１５１に記載の方法である。
実施形態Ａ１５３は、第４の非天然塩基は、
である、実施形態Ａ１５１に記載の方法である。
実施形態Ａ１５４は、第１の非天然塩基は、
であり、第２の非天然塩基は、
であり、第３の非天然塩基は、
であり、第４の非天然塩基は、
である、実施形態Ａ１３８に記載の方法である。
実施形態Ａ１５５は、第１の非天然塩基は、
であり、第２の非天然塩基は、
であり、第３の非天然塩基は、
であり、第４の非天然塩基は、
である、実施形態Ａ１３８に記載の方法である。
実施形態Ａ１５６は、第１の非天然塩基は、
であり、第２の非天然塩基は、
であり、第３の非天然塩基は、
であり、第４の非天然塩基は、
である、実施形態Ａ１３８に記載の方法である。
実施形態Ａ１５７は、第３の非天然塩基は、
である、実施形態Ａ１３８に記載の方法である。
実施形態Ａ１５８は、第４の非天然塩基は、
である、実施形態Ａ１３８に記載の方法である。
実施形態Ａ１５９は、第１の非天然塩基は、
であり、第２の非天然塩基は、
であり、第３の非天然塩基は、
であり、第４の非天然塩基は、
である、実施形態Ａ１３８に記載の方法である。
実施形態Ａ１６０は、第３の非天然塩基および第４の非天然塩基は、リボースを含む、実施形態Ａ１２７～Ａ１５９のいずれか１項に記載の方法である。
実施形態Ａ１６１は、第３の非天然塩基および第４の非天然塩基は、デオキシリボースを含む、実施形態Ａ１２７～Ａ１５９のいずれか１項に記載の方法である。
実施形態Ａ１６２は、第１および第２の非天然塩基は、デオキシリボースを含む、実施形態Ａ１２７～Ａ１６１のいずれか１項に記載の方法である。
実施形態Ａ１６３は、第１および第２の非天然塩基は、デオキシリボースを含み、第３の非天然塩基および第４の非天然塩基は、リボースを含む、実施形態Ａ１２７～Ａ１５９のいずれか１項に記載の方法である。
実施形態Ａ１６４は、ＤＮＡテンプレートは、
からなる群から選択される少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を含む、実施形態Ａ１２７～Ａ１３７のいずれか１項に記載の方法である。
実施形態Ａ１６５は、ＤＮＡテンプレートは、ｄＮａＭ－ｄ５ＳＩＣＳである少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を含む、実施形態Ａ１６４に記載の方法である。
実施形態Ａ１６６は、ＤＮＡテンプレートは、ｄＣＮＭＯ－ｄＴＰＴ３である少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を含む、実施形態Ａ１６４に記載の方法である。
実施形態Ａ１６７は、ＤＮＡテンプレートは、ｄＮａＭ－ｄＴＰＴ３である少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を含む、実施形態Ａ１６４に記載の方法である。
実施形態Ａ１６８は、ＤＮＡテンプレートは、ｄＮａＭ－ｄＴＡＴ１である少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を含む、実施形態Ａ１６４に記載の方法である。
実施形態Ａ１６９は、ＤＮＡテンプレートは、ｄＣＮＭＯ－ｄＴＡＴ１である少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を含む、実施形態Ａ１６４に記載の方法である。
実施形態Ａ１７０は、ＤＮＡテンプレートは、
からなる群から選択される少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を含み；
ｍＲＮＡおよびｔＲＮＡは、
から選択される少なくとも１つの非天然塩基を含む、実施形態Ａ１２７～Ａ１３７のいずれか１項に記載の方法である。
実施形態Ａ１７１は、ＤＮＡテンプレートは、ｄＮａＭ－ｄ５ＳＩＣＳである少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を含む、実施形態Ａ１７０に記載の方法である。
実施形態Ａ１７２は、ＤＮＡテンプレートは、ｄＣＮＭＯ－ｄＴＰＴ３である少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を含む、実施形態Ａ１７０に記載の方法である。
実施形態Ａ１７３は、ＤＮＡテンプレートは、ｄＮａＭ－ｄＴＰＴ３である少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を含む、実施形態Ａ１７０に記載の方法である。
実施形態Ａ１７４は、ＤＮＡテンプレートは、ｄＮａＭ－ｄＴＡＴ１である少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を含む、実施形態Ａ１７０に記載の方法である。
実施形態Ａ１７５は、ＤＮＡテンプレートは、ｄＣＮＭＯ－ｄＴＡＴ１である少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を含む、実施形態Ａ１７０に記載の方法である。
実施形態Ａ１７６は、ｍＲＮＡおよびｔＲＮＡは、
から選択される非天然塩基を含む、実施形態Ａ１２７～Ａ１７５のいずれか１項に記載の方法である。
実施形態Ａ１７７は、ｍＲＮＡおよびｔＲＮＡは、
から選択される非天然塩基を含む、実施形態Ａ１７６に記載の方法である。
実施形態Ａ１７８は、ｍＲＮＡは、
である非天然塩基を含む、実施形態Ａ１７６に記載の方法である。
実施形態Ａ１７９は、ｍＲＮＡは、
である非天然塩基を含む、実施形態Ａ１７６に記載の方法である。
実施形態Ａ１８０は、ｍＲＮＡは、
である非天然塩基を含む、実施形態Ａ１７６に記載の方法である。
実施形態Ａ１８１は、ｔＲＮＡは、
から選択される非天然塩基を含む、実施形態Ａ１７６に記載の方法である。
実施形態Ａ１８２は、ｔＲＮＡは、
である非天然塩基を含む、実施形態Ａ１７６に記載の方法である。
実施形態Ａ１８３は、ｔＲＮＡは、
である非天然塩基を含む、実施形態Ａ１７６に記載の方法である。
実施形態Ａ１８４は、ｔＲＮＡは、
である非天然塩基を含む、実施形態Ａ１７６に記載の方法である。
実施形態Ａ１８５は、第１の非天然塩基は、ｄＣＮＭＯを含み、第２の非天然塩基は、ｄＴＰＴ３を含む、実施形態Ａ１２７～Ａ１３７のいずれか１項に記載の方法である。
実施形態Ａ１８６は、第３の非天然塩基は、ＮａＭを含み、第２の非天然塩基は、ＴＡＴ１を含む、実施形態Ａ１２７～Ａ１３７のいずれか１項に記載の方法である。
実施形態Ａ１８７は、タンパク質は、少なくとも２つの非天然アミノ酸を含む、実施形態Ａ１２７～Ａ１８６のいずれか１項に記載の方法である。
実施形態Ａ１８８は、タンパク質は、少なくとも３つの非天然アミノ酸を含む、実施形態Ａ１２７～Ａ１８６のいずれか１項に記載の方法である。
実施形態Ａ１８９は、タンパク質は、少なくとも２つの異なる非天然アミノ酸を含む、実施形態Ａ１２７～Ａ１８６のいずれか１項に記載の方法である。
実施形態Ａ１９０は、タンパク質は、少なくとも３つの異なる非天然アミノ酸を含む、実施形態Ａ１２７～Ａ１８６のいずれか１項に記載の方法である。
実施形態Ａ１９１は、少なくとも１つの非天然アミノ酸は、
リジンアナログである；
芳香族側鎖を含む；
アジド基を含む；
アルキン基を含む；または
アルデヒドもしくはケトン基を含む
実施形態Ａ１２７～Ａ１９０のいずれか１項に記載の方法である。
実施形態Ａ１９２は、少なくとも１つの非天然アミノ酸は、芳香族側鎖を含まない、実施形態Ａ１２７～Ａ１９１のいずれか１項に記載の方法である。
実施形態Ａ１９３は、少なくとも１つの非天然アミノ酸は、Ｎ６－アジドエトキシ－カルボニル－Ｌ－リジン（ＡｚＫ）またはＮ６－プロパルギルエトキシ－カルボニル－Ｌ－リジン（ＰｒａＫ）を含む、実施形態Ａ１９１またはＡ１９２に記載の方法である。
実施形態Ａ１９４は、少なくとも１つの非天然アミノ酸は、Ｎ６－アジドエトキシ－カルボニル－Ｌ－リジン（ＡｚＫ）を含む、実施形態Ａ１９３に記載の方法である。
実施形態Ａ１９５は、少なくとも１つの非天然アミノ酸は、Ｎ６－プロパルギルエトキシ－カルボニル－Ｌ－リジン（ＰｒａＫ）を含む、実施形態Ａ１９３に記載の方法である。
本発明の様々な態様は、添付の特許請求の範囲に具体的に記載されている。本発明の特徴および利点のより良い理解は、本発明の原理が利用される例示的な実施形態を説明する以下の詳細な説明、およびその添付の図面を参照することによって得られる。
非天然塩基対（ＵＢＰ）を使用して、非天然Ｘ－Ｙ塩基対を使用して非標準アミノ酸（ｎｃＡＡ）をタンパク質に部位特異的に組み込むワークフローを示している。タンパク質への３つのｎｃＡＡの組み込みは、例として示すに過ぎない。多数のｎｃＡＡを組み込み得る。 非天然塩基対（ＵＢＰ）を示している。 ｄＸＴＰアナログを示している。明確にするために、リボースおよびリン酸塩は省略している。 様々なｄＸＴＰを使用して、ＳｆＧＦＰへのＡｚＫの取り込みを最適化するための、ｓｆＧＦＰ遺伝子におけるＵＢＰ保持（％）のプロットを示している。各バーは平均を表し、エラーバーは標準誤差を示す（ｎ＝３）。白丸は、各独立した試行のデータを表す。星印は、示された条件下で細胞が増殖し得なかったことを示す。 様々なｄＸＴＰを使用して、ｓｆＧＦＰへのＡｚＫの取り込みを最適化するための、ｔＲＮＡＰｙｌ遺伝子におけるＵＢＰ保持（％）のプロットを示している。各バーは平均を表し、エラーバーは標準誤差を示す（ｎ＝３）。白丸は、各独立した試行のデータを表す。星印は、示された条件下で細胞が増殖できなかったことを示す。 様々なｄＸＴＰを使用してＳｆＧＦＰへのＡｚＫの取り込みを最適化するために、ＡｚＫの存在下または非存在下での細胞増殖（ＯＤ６００あたりの相対蛍光単位（ＲＦＵ））に対して正規化された、観察された相対的なｓｆＧＦＰ蛍光のプロットを示す。各バーは平均を表し、エラーバーは標準誤差を示す（ｎ＝３）。白丸は、各独立した試行のデータを表す。星印は、示された条件下で細胞が増殖できなかったことを示す。 様々なｄＸＴＰを使用してｓｆＧＦＰへのＡｚＫの取り込みを最適化するためにウエスタンブロットによって測定された相対タンパク質シフト（％）のプロットを示している。各バーは平均を表し、エラーバーは標準誤差を示す（ｎ＝３）。白丸は、各独立した試行のデータを表す。星印は、示された条件下で細胞が増殖できなかったことを示す。 リボヌクレオチドＸＴＰアナログを示す。明確にするために、リボースおよびリン酸塩は省略されている。 リボヌクレオチドＹＴＰアナログを示す。明確にするために、リボースおよびリン酸塩は省略されている。 ＡｚＫをｓｆＧＦＰに組み込むために様々な非天然リボヌクレオチドを使用する翻訳のＳＡＲ分析のプロットを、ｙ軸上のＸＴＰアナログについてＡｚＫの存在下で観察された全ｓｆＧＦＰ蛍光（ＲＦＵ）と共に示す。各バーは平均を表し、エラーバーは標準誤差を示す（ｎ＝４）。白丸は、各独立した試行のデータを表す。 ＡｚＫをｓｆＧＦＰに組み込むために様々な非天然リボヌクレオチドを使用する翻訳のＳＡＲ分析のプロットを示し、タンパク質シフト（％）は、ｙ軸上のＸＴＰアナログのウエスタンブロットによって測定された。各バーは平均を表し、エラーバーは標準誤差を示す（ｎ＝４）。白丸は、各独立した試行のデータを表す。 ＡｚＫをｓｆＧＦＰに組み込むために様々な非天然リボヌクレオチドを使用する翻訳のＳＡＲ分析のプロットを、ｙ軸上のＹＴＰアナログについてＡｚＫの存在下で観察された全ｓｆＧＦＰ蛍光（ＲＦＵ）と共に示す。各バーは平均を表し、エラーバーは標準誤差を示す（ｎ＝４）。白丸は、各独立した試行のデータを表す。 ＡｚＫをｓｆＧＦＰに組み込むために様々な非天然リボヌクレオチドを使用する翻訳のＳＡＲ分析のプロットを示し、ここで、タンパク質シフト（％）は、ｙ軸上のＹＴＰアナログのウエスタンブロットによって測定された。各バーは平均を表し、エラーバーは標準誤差を示す（ｎ＝４）。白丸は、各独立した試行のデータを表す。 ＮａＭＴＰおよびＴＡＴ１ＴＰの濃度（μＭ）の関数としての総ｓｆＧＦＰ蛍光（ＲＦＵ）に対する非天然リボヌクレオチド三リン酸濃度の最適化のプロットを示している。エラーバーは、各値の標準誤差を示す（ｎ＝３）。 ５ＦＭＴＰおよびＴＡＴ１ＴＰ（μＭ）の濃度の関数としての総ｓｆＧＦＰ蛍光（ＲＦＵ）に対する非天然リボヌクレオチド三リン酸濃度の最適化のプロットを示す。エラーバーは、各値の標準誤差を示す（ｎ＝３）。 ＮａＭＴＰおよびＴＡＴ１ＴＰの濃度（μＭ）の関数としてのタンパク質シフト（％）に対する非天然リボヌクレオチド三リン酸濃度の最適化のプロットを示している。エラーバーは、各値の標準誤差を示す（ｎ＝３）。 ５ＦＭＴＰおよびＴＡＴ１ＴＰの濃度（μＭ）の関数としてのタンパク質シフト（％）に対する非天然リボヌクレオチド三リン酸濃度の最適化のプロットを示している。エラーバーは、各値の標準誤差を示す（ｎ＝３）。 ＡｚＫの存在下で観察された様々な非天然塩基対、コドン位置、および総ｓｆＧＦＰ蛍光（ＲＦＵ）についての高密度の非天然の情報の記憶および読出しのプロットである。ストリップチャートの場合、各バーは平均を表し、エラーバーは標準誤差（ｎ＝４）を示し、白丸は各独立した試行のデータを表す。 ＡｚＫの存在下で観察されたウエスタンブロットによって測定された、様々な非天然塩基対、コドン位置、およびタンパク質シフト（％）についての高密度の非天然の情報の記憶および読出しのプロットである。ストリップチャートの場合、各バーは平均を表し、エラーバーは標準誤差（ｎ＝４）を示し、白丸は各独立した試行のデータを表す。 ｄＣＮＭＯｄＴＰＴ３／ＮａＭＴＰ、ＴＡＴ１ＴＰを使用して生成された三重標識タンパク質の定量的ＨＲＭＳ分析の代表的なスペクトルを示している。ピークラベルは、インタクトタンパク質のデコンボリューションされた分子量を示し、１４９、１５１、および１５３の位置のアミノ酸残基が示され、各ピークの定量化（％、ｎ＝３）が以下に示されている。 例示的な非天然アミノ酸を示す。この図は、Ｙｏｕｎｇら、「Ｂｅｙｏｎｄ ｔｈｅ ｃａｎｏｎｉｃａｌ ２０ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ： ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｌｅｘｉｃｏｎ」、Ｊ．ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８５（１５）：１１０３９－１１０４４（２０１０）の図２から適合させたものである。 例示的な非天然アミノ酸リジン誘導体を示す。 例示的な非天然アミノ酸フェニルアラニン誘導体を示す。 図８Ｄ～８Ｇは、例示的な非天然アミノ酸を示している。これらの非天然アミノ酸（ＵＡＡ）は、タンパク質に遺伝的にコードされている（図８Ｄ－ＵＡＡ＃１－４２；図８Ｅ－ＵＡＡ＃４３－８９；図８Ｆ－ＵＡＡ＃９０－１２８；図８Ｇ－ＵＡＡ＃１２９－１６７）。図８Ｄ－図８Ｇは、Ｄｕｍａｓら、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１５，６，５０－６９の表１から採用されている。 図８Ｄ～８Ｇは、例示的な非天然アミノ酸を示している。これらの非天然アミノ酸（ＵＡＡ）は、タンパク質に遺伝的にコードされている（図８Ｄ－ＵＡＡ＃１－４２；図８Ｅ－ＵＡＡ＃４３－８９；図８Ｆ－ＵＡＡ＃９０－１２８；図８Ｇ－ＵＡＡ＃１２９－１６７）。図８Ｄ－図８Ｇは、Ｄｕｍａｓら、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１５，６，５０－６９の表１から採用されている。 図８Ｄ～８Ｇは、例示的な非天然アミノ酸を示している。これらの非天然アミノ酸（ＵＡＡ）は、タンパク質に遺伝的にコードされている（図８Ｄ－ＵＡＡ＃１－４２；図８Ｅ－ＵＡＡ＃４３－８９；図８Ｆ－ＵＡＡ＃９０－１２８；図８Ｇ－ＵＡＡ＃１２９－１６７）。図８Ｄ－図８Ｇは、Ｄｕｍａｓら、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１５，６，５０－６９の表１から採用されている。 図８Ｄ～８Ｇは、例示的な非天然アミノ酸を示している。これらの非天然アミノ酸（ＵＡＡ）は、タンパク質に遺伝的にコードされている（図８Ｄ－ＵＡＡ＃１－４２；図８Ｅ－ＵＡＡ＃４３－８９；図８Ｆ－ＵＡＡ＃９０－１２８；図８Ｇ－ＵＡＡ＃１２９－１６７）。図８Ｄ－図８Ｇは、Ｄｕｍａｓら、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１５，６，５０－６９の表１から採用されている。
特定の用語
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、特許請求される主題が属する当技術分野の技術者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。前述の一般的な説明および以下の詳細な説明は、例示的かつ説明的なものに過ぎず、請求された主題を限定するものではないことを理解されたい。参照により本明細書に組み込まれる資料が、本開示の明示的な内容と矛盾する場合、明示的な内容が支配する。本出願では、特に明記されていない限り、単数形の使用には複数形を含む。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「ａ（不定冠詞）」、「ａｎ（不定冠詞）」および「ｔｈｅ（定冠詞）」は、文脈が明らかに他のことを示さない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。本出願において、「または」の使用は、特に明記しない限り、「および／または」を意味する。さらに、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語、ならびに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、および「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」などの他の形式の使用は、限定的ではない。
本明細書で使用される場合、範囲および量は、特定の値または範囲の「約」として表されてもよい。約には正確な量も含まれる。したがって、「約５μＬ」とは「約５μＬ」を意味し、また「５μＬ」の説明にもなる。一般に、「約」という用語には、実験誤差の範囲内であると予想される量が含まれる。
本明細書で使用される、合成方法の文脈における「提供するのに適した条件下で」または「生成するのに十分な条件下で」などのようなフレーズは、反応産物の有用な量または収率を提供する、実験者が変化させる通常の技術の範囲内である、時間、温度、溶媒、反応物濃度などの反応条件を指す。所望の反応産物が唯一の反応産物である必要もなく、または出発物質が完全に消費される必要もないが、ただし、これは所望の反応産物が単離され得るか、さもなければさらに使用され得るという条件である。
「化学的に実現可能」とは、一般的に理解されている有機構造の規則に違反しない結合配置または化合物を意味する。例えば、特定の状況において、自然界には存在しない五価の炭素原子を含む特許請求の範囲の定義内の構造は、特許請求の範囲内にないことが理解される。本明細書に開示される構造は、それらの全ての実施形態では、「化学的に実現可能な」構造のみを含むことを意図し、例えば、可変の原子または基で示される構造において、化学的に実現可能ではない、任意の列挙された構造は、本明細書で開示されることも特許請求されることも意図されない。
化学構造の「アナログ」は、本明細書で使用される用語として、親構造から合成的に容易に導き出されない場合があるが、親構造との実質的な類似性を保持する化学構造を指す。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドアナログは、非天然ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ヌクレオシドアナログは、非天然ヌクレオシドである。親の化学構造から合成的に容易に導き出される関連する化学構造は、「誘導体」と呼ばれる。
本明細書で使用される場合、「塩基」または「核酸塩基」とは、少なくともヌクレオシドまたはヌクレオチドの核酸塩基部分を指し（ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、リボまたはデオキシリボバリアントを包含する）、場合によっては、ヌクレオシドまたはヌクレオチドの糖部分へのさらなる修飾を含み得る。場合によっては、「塩基」は、ヌクレオシドまたはヌクレオチドの全体を表すためにも使用される（例えば、「塩基」はＤＮＡポリメラーゼによってＤＮＡに組み込まれ得るか、ＲＮＡポリメラーゼによってＲＮＡに組み込まれ得る）。ただし、「塩基」という用語は、文脈上必要とされない限り、必ずしもヌクレオシド全体またはヌクレオチド全体を表すと解釈されるべきではない。本明細書で提供される塩基または核酸塩基の化学構造では、ヌクレオシドまたはヌクレオチドの塩基のみが示され、糖部分、および任意選択で、明確にするために任意のリン酸残基が省略されている。塩基または核酸塩基の本明細書で提供される化学構造で使用される場合、波線は、ヌクレオシドまたはヌクレオチドへの接続を表し、ヌクレオシドまたはヌクレオチドの糖部分はさらに修飾され得る。いくつかの実施形態では、波線は、ヌクレオシドまたはヌクレオチドのペントースなどの糖部分への塩基または核酸塩基の付着を表す。いくつかの実施形態では、ペントースは、リボースまたはデオキシリボースである。
いくつかの実施形態では、核酸塩基は、一般に、ヌクレオシドの複素環式塩基部分である。核酸塩基は、天然に存在してもよく、修飾されてもよく、天然塩基との類似性を有さなくてもよく、および／または、例えば、有機合成によって合成されてもよい。特定の実施形態では、核酸塩基は、ヌクレオシドまたはヌクレオチド中の任意の原子または原子群を含み、この原子または原子群は、水素結合の使用の有無にかかわらず、別の核酸の塩基と相互作用し得る。特定の実施形態では、非天然核酸塩基は、天然核酸塩基に由来しない。非天然核酸塩基は必ずしも塩基性の特性を保有しているわけではないが、簡単にするために核酸塩基と呼ばれることに注意すべきである。いくつかの実施形態では、核酸塩基に言及する場合、「（ｄ）」とは、核酸塩基がデオキシリボースまたはリボースに付着し得ることを示し、括弧なしの「ｄ」は、核酸塩基がデオキシリボースに付着することを示す。
いくつかの実施形態では、ヌクレオシドは、核酸塩基部分および糖部分を含む化合物である。ヌクレオシドとしては、限定するものではないが、天然に存在するヌクレオシド（ＤＮＡおよびＲＮＡに見られる）、脱塩基ヌクレオシド、修飾ヌクレオシド、ならびに模倣塩基および／または糖基を有するヌクレオシドが挙げられる。ヌクレオシドとしては、任意の多様な置換基を含むヌクレオシドが挙げられる。ヌクレオシドは、核酸塩基と糖の還元基との間のグリコシド連結によって形成されるグリコシド化合物であり得る。
本明細書で使用される場合、「ヌクレオチド」は、ヌクレオシド部分およびリン酸部分を含む化合物を指す。例示的な天然ヌクレオチドとしては、限定するものではないが、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、およびグアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシアデノシン二リン酸（ｄＡＤＰ）、チミジン二リン酸（ｄＴＤＰ）、デオキシシチジン二リン酸（ｄＣＤＰ）、デオキシグアノシン二リン酸（ｄＧＤＰ）、デオキシアデノシン一リン酸（ｄＡＭＰ）、デオキシチミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）、デオキシシチジン一リン酸（ｄＣＭＰ）、およびデオキシグアノシン一リン酸（ｄＧＭＰ）が挙げられる。糖部分としてデオキシリボースを含む例示的な天然デオキシリボヌクレオチドとしては、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＤＰ、ｄＴＤＰ、ｄＣＤＰ、ｄＧＤＰ、ｄＡＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＣＭＰ、およびｄＧＭＰが挙げられる。糖部分としてリボースを含む例示的な天然リボヌクレオチドとしては、ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＡＤＰ、ＵＤＰ、ＣＤＰ、ＧＤＰ、ＡＭＰ、ＵＭＰ、ＣＭＰ、およびＧＭＰが挙げられる。
本明細書で使用されるポリヌクレオチドは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ホスホロチオエートなどのＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはＲＮＡ様ポリマーを指し、これらの例は、当技術分野で周知であり、非天然塩基を含む場合がある。ポリヌクレオチドは、例えば、ホスホロアミダイト化学反応またはシンセサイザーの使用に適合した他の化学的アプローチを使用して、自動シンセサイザーで合成され得る。
ＤＮＡとしては、限定するものではないが、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）およびゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）が挙げられる。ＤＮＡは、共有または非共有手段によって、ＲＮＡおよびペプチドを含むがこれらに限定されない別の分子に付着され得る。ＲＮＡとしては、コーディングＲＮＡ、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）が挙げられる。ＲＮＡとしてはまた、非コードＲＮＡ、例えば、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）も挙げられる。ＲＮＡとしてはまた、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、低分子核ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）（短鎖干渉ＲＮＡとも呼ばれる）、低分子核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、細胞外ＲＮＡ（ｅｘＲＮＡ）、ＰＩＷＩ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、および長い非コードＲＮＡ（長いｎｃＲＮＡ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｎｏＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｅｘＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、長鎖ｎｃＲＮＡ、またはそれらの任意の組み合わせもしくはハイブリッドである。場合によっては、ＲＮＡはリボザイムの構成要素である。ＤＮＡおよびＲＮＡは、線状、環状、超らせん、一本鎖、および二本鎖を含むがこれらに限定されない任意の形態であり得る。
ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、合成ＤＮＡ／ＲＮＡアナログであり、ペプチド様骨格がＤＮＡまたはＲＮＡの糖リン酸骨格に置き換わっている。ＰＮＡオリゴマーは、相補的ＤＮＡへの結合においてより高い結合強度およびより大きな特異性を示し、ＰＮＡ／ＤＮＡ塩基のミスマッチは、ＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖における同様のミスマッチよりも不安定である。この結合強度および特異性はまた、ＰＮＡ／ＲＮＡ二重鎖にも当てはまる。ＰＮＡは、ヌクレアーゼまたはプロテアーゼのいずれによっても容易に認識されないので、酵素分解に対して耐性になる。ＰＮＡはまた、広いｐＨ範囲でも安定している。Ｎｉｅｌｓｅｎ ＰＥ、Ｅｇｈｏｌｍ Ｍ、Ｂｅｒｇ ＲＨ、Ｂｕｃｈａｒｄｔ Ｏ（１９９１年１２月）も参照のこと。「チミン置換ポリアミドを用いた鎖置換によるＤＮＡの配列選択的認識（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｂｙ ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ａ ｔｈｙｍｉｎｅ－ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ ｐｏｌｙａｍｉｄｅ）」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４（５０３７）：１４９７－５００．ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１９６２２１０．ＰＭＩＤ １９６２２１０；ならびにＥｇｈｏｌｍ Ｍ、Ｂｕｃｈａｒｄｔ Ｏ、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ Ｌ、Ｂｅｈｒｅｎｓ Ｃ、Ｆｒｅｉｅｒ ＳＭ、Ｄｒｉｖｅｒ ＤＡ、Ｂｅｒｇ ＲＨ、Ｋｉｍ ＳＫ、Ｎｏｒｄｅｎ Ｂ、およびＮｉｅｌｓｅｎ ＰＥ（１９９３）、「ＰＮＡはワトソンクリック水素結合規則に従い相補的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする（ＰＮＡ Ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｓ ｔｏ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ｏｂｅｙｉｎｇ ｔｈｅ Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ Ｈｙｄｒｏｇｅｎ Ｂｏｎｄｉｎｇ Ｒｕｌｅｓ）」。Ｎａｔｕｒｅ ３６５（６４４６）：５６６－８。ｄｏｉ：１０．１０３８／３６５５６６ａ０。ＰＭＩＤ ７６９２３０４；それぞれの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ロックド核酸（ＬＮＡ）は、改変されたＲＮＡヌクレオチドであり、ＬＮＡヌクレオチドのリボース部分は、２’酸素および４’炭素を接続する追加の架橋で修飾されている。この架橋は、３’－エンド（Ｎｏｒｔｈ）コンフォメーションでリボースを「ロック」し、これは、Ａ型二重鎖でよく見られる。ＬＮＡヌクレオチドは、必要に応じてオリゴヌクレオチドのＤＮＡまたはＲＮＡ残基と混合され得る。そのようなオリゴマーは化学的に合成されてもよく、市販されている。ロックされたリボースコンフォメーションは、塩基のスタッキングおよび骨格の事前組織化を強化する。例えば、Ｋａｕｒ、Ｈ；Ａｒｏｒａ，Ａ；Ｗｅｎｇｅｌ，Ｊ；Ｍａｉｔｉ、Ｓ（２００６），「ＤＮＡ二重鎖へのロックド核酸ヌクレオチドの取り込みのための熱力学的、対イオン、および水和効果（Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ，Ｃｏｕｎｔｅｒｉｏｎ，ａｎｄ Ｈｙｄｒａｔｉｏｎ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｉｎｔｏ ＤＮＡ Ｄｕｐｌｅｘｅｓ）」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４５（２３）：７３４７－５５．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｂｉ０６０３０７ｗ．ＰＭＩＤ １６７５２９２４；Ｏｗｃｚａｒｚｙ Ｒ．；Ｙｏｕ Ｙ．、Ｇｒｏｔｈ Ｃ．Ｌ．、Ｔａｔａｕｒｏｖ Ａ．Ｖ．（２０１１）、「ロックド核酸－ＤＮＡ二重鎖の安定性およびミスマッチの識別（Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｍｉｓｍａｔｃｈ ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ－ＤＮＡ ｄｕｐｌｅｘｅｓ）」、Ｂｉｏｃｈｅｍ．５０（４３）：９３５２－９３６７．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｂｉ２００９０４ｅ．ＰＭＣ３２０１６７６．ＰＭＩＤ２１９２８７９５；Ａｌｅｘｅｉ Ａ．Ｋｏｓｈｋｉｎ；Ｓａｎｊａｙ Ｋ．Ｓｉｎｇｈ、Ｐｏｕｌ Ｎｉｅｌｓｅｎ、Ｖｉｖｅｋ Ｋ．Ｒａｊｗａｎｓｈｉ、Ｒａｖｉｎｄｒａ Ｋｕｍａｒ、Ｍｉｃｈａｅｌ Ｍｅｌｄｇａａｒｄ、Ｃａｒｌ Ｅｒｉｋ Ｏｌｓｅｎ、Ｊｅｓｐｅｒ Ｗｅｎｇｅｌ（１９９８）、「ＬＮＡ（ロックド核酸）：アデニン、シトシン、グアニン、５－メチルシトシン、チミンおよびウラシルビシクロヌクレオシドモノマーの合成、オリゴマー化、ならびに前例のない核酸認識（ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ）：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ａｄｅｎｉｎｅ，ｃｙｔｏｓｉｎｅ，ｇｕａｎｉｎｅ，５－ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ，ｔｈｙｍｉｎｅ ａｎｄ ｕｒａｃｉｌ ｂｉｃｙｃｌｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｍｏｎｏｍｅｒｓ，ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｓａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｕｎｐｒｅｃｅｄｅｎｔｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ）」、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５４（１４）：３６０７－３０．ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｓ００４０－４０２０（９８）０００９４－５；ならびに、Ｓａｔｏｓｈｉ Ｏｂｉｋａ；Ｄａｉｓｈｕ Ｎａｎｂｕ、Ｙｏｓｈｉｙｕｋｉ Ｈａｒｉ、Ｋｅｎ－ｉｃｈｉｒｏ Ｍｏｒｉｏ，Ｙａｓｕｋｏ Ｉｎ、Ｔｏｓｈｉｍａｓａ Ｉｓｈｉｄａ、Ｔａｋｅｓｈｉ Ｉｍａｎｉｓｈｉ（１９９７）、「２’－Ｏ，４’－Ｃ－メチレンウリジンおよび－シチジンの合成。固定されたＣ３’－エンド糖パッカリングを有する新規二環式ヌクレオシド（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ２’－Ｏ，４’－Ｃ－ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｕｒｉｄｉｎｅ ａｎｄ －ｃｙｔｉｄｉｎｅ． Ｎｏｖｅｌ ｂｉｃｙｃｌｉｃ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ｈａｖｉｎｇ ａ ｆｉｘｅｄ Ｃ３’－ｅｎｄｏ ｓｕｇａｒ ｐｕｃｋｅｒｉｎｇ）」、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３８（５０）：８７３５－８．ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｓ００４０－４０３９（９７）１０３２２－７（それぞれの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
本明細書で使用される場合、「遺伝子」という用語は、ＲＮＡまたはタンパク質などの遺伝子産物の合成をコードするポリヌクレオチドを指す。
分子ビーコンまたは分子ビーコンプローブは、均質な溶液中の特定の核酸配列の存在を検出し得るオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブである。分子ビーコンは、内部でクエンチされたフルオロフォアを備えたヘアピン型の分子であり、標的の核酸配列に結合すると蛍光が回復する。例えば、Ｔｙａｇｉ Ｓ、Ｋｒａｍｅｒ ＦＲ（１９９６）、「分子ビーコン：ハイブリダイゼーション時に蛍光を発するプローブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎｓ： ｐｒｏｂｅｓ ｔｈａｔ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅ ｕｐｏｎ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）」、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４（３）：３０３－８．ＰＭＩＤ ９６３０８９０；Ｔａｐｐ Ｉ、Ｍａｌｍｂｅｒｇ Ｌ、Ｒｅｎｎｅｌ Ｅ、Ｗｉｋ Ｍ、Ｓｙｖａｎｅｎ ＡＣ（２０００年４月）、「一塩基多型の均一スコアリング：５’－ヌクレアーゼＴａｑＭａｎアッセイおよび分子ビーコンプローブの比較（Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ ｓｃｏｒｉｎｇ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ－ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ： ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ５’－ｎｕｃｌｅａｓｅ ＴａｑＭａｎ ａｓｓａｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ ｐｒｏｂｅｓ）」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２８（４）：７３２－８．ＰＭＩＤ １０７６９７５２；ならびにＡｋｉｍｉｔｓｕ Ｏｋａｍｏｔｏ（２０１１）、「ＥＣＨＯプローブ：実用的な核酸センシングのための蛍光制御の概念」、Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．４０：５８１５－５８２８（それぞれの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
本明細書で使用される場合、「非天然塩基」という用語は、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ｕ、および他の天然に存在する塩基（例えば、５－メチルシトシン、シュードウリジン、およびイノシン）以外の塩基を指す。
本明細書で使用される場合、「非天然塩基対」という用語は、互いに結合し、二本鎖ポリヌクレオチドの対向する鎖（例えば、少なくとも部分的に自己ハイブリダイズされた分子であっても、または部分的もしくは完全に混成された分子の対であってもよい）上にある２つの塩基を指し、ここで２つの塩基のうちの少なくとも１つは非天然塩基である。
本明細書で使用される場合、「半合成生物」とは、非天然の構成要素、例えば、１つまたはそれ以上の非天然塩基を含む拡張された遺伝的アルファベットを含む生物である。
本明細書で使用されるセクション見出しは、組織的な目的のためだけであり、記載された主題を限定するものとして解釈されるべきではない。
非天然塩基対を含む方法および組成物
ある特定の実施形態において、拡張された遺伝子アルファベットを用いて核酸を生成するためのインビトロおよびインビボの方法ならびに組成物を本明細書において開示する（図１）。いくつかの例において、核酸は、非天然タンパク質をコードし、ここで、非天然タンパク質は、非天然アミノ酸を含む。いくつかの場合において、本明細書に記載のインビボの方法または組成物は、半合成生物を利用するか、または含む。いくつかの例において、方法は、少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を、１つまたはそれ以上の核酸に組み込む工程を含む。そのような塩基対は、２つのヌクレオシドの核酸塩基の間の対形成によって形成される。例示的なワークフローにおいて、タンパク質および相補的である非天然核酸塩基（Ｘ、Ｙ）を含むｔＲＮＡのための領域をコードするテンプレート鎖であるタンパク質１０２およびｔＲＮＡ１０３をコードするＤＮＡ１０１は、塩基対を形成することができ、ならびに／または塩基対を形成するように構成されたものは、転写１０４されて、ｔＲＮＡ１０６およびｍＲＮＡ１０７が生じる。ｔＲＮＡを非天然アミノ酸１０５でチャージした後、ｍＲＮＡ１０７は、翻訳１０８されて、１つまたはそれ以上の非天然アミノ酸１０９を含むタンパク質１１０が生じる。本明細書に記載の方法および組成物は、いくつかの例において、高い忠実度および収率で、非天然アミノ酸の部位特異的組み込みを可能にする。拡張された遺伝子アルファベットを含む半合成生物、および少なくとも１つの非天然アミノ酸残基を含むものを含むタンパク質産物を生成するための半合成生物を使用するための方法も本明細書に記載する。
非天然核酸塩基の選択は、本明細書に記載の方法における１つまたはそれ以上の工程の最適化を可能にする。例えば、核酸塩基は、高効率の複製、転写および／または翻訳のために選択される。いくつかの例において、１つ以上の非天然核酸塩基対は、本明細書に記載の方法のために利用される。例えば、デオキシリボ部分を含む核酸塩基の第１のセットは、ＤＮＡ複製のために使用され（例えば、第１の塩基対を形成するように構成されている第１の核酸塩基および第２の核酸塩基）、核酸塩基の第２のセット（例えば、第３および第４の核酸塩基はリボースに結合し、第２の塩基対を形成するように構成されている第３の核酸塩基および第４の核酸塩基）は、転写／翻訳のために使用される。いくつかの実施形態において、核酸塩基の第１のセットは、プラスミドを構築するために使用され（例えば、第１の塩基対を形成するように構成されている第１の核酸塩基および第２の核酸塩基）、核酸塩基の第２のセットは複製のために使用され（例えば、第２の塩基対を形成するように構成されている第３の核酸塩基および第４の核酸塩基）、塩基の第３のセットは、転写／翻訳のために使用される（例えば、第３の塩基対を形成するように構成されている第５および第６の核酸塩基）。第１のセットの核酸塩基および第２のセットの核酸塩基の間の相補的な対形成は、いくつかの例において、第１のセットからの核酸塩基を含むＤＮＡテンプレートからｔＲＮＡまたはタンパク質を生じさせるための遺伝子の転写を可能にする。第２のセットの核酸塩基の間の相補的な対形成（第２の塩基対）は、いくつかの例において、非天然核酸を含むｔＲＮＡおよびｍＲＮＡをマッチさせることによって、翻訳を可能にする。いくつかの場合において、第１のセット中の核酸塩基は、デオキシリボース部分に結合する。いくつかの場合において、第１のセット中の核酸塩基は、リボース部分に結合する。いくつかの例において、両方のセットの核酸塩基は、固有である。いくつかの例において、少なくとも１つの核酸塩基は、両方のセット中で同じである。いくつかの例において、第１の核酸塩基および第３の核酸塩基は、同じである。いくつかの実施形態において、第１の塩基対および第２の塩基対は、同じではない。いくつかの場合において、第１の塩基対、第２の塩基対および第３の塩基対は、同じではない。
一態様において、非天然アミノ酸を含むタンパク質を産生するためのインビボの方法であって、方法は、
第１の非天然塩基、および第１の非天然塩基と相補的であるか、第１の非天然塩基と塩基対を形成することができるか、および／または第１の非天然塩基と塩基対を形成して、第３の非天然塩基をｍＲＮＡに組み込むように構成されている第２の非天然塩基を含むＤＡＮテンプレートを転写する工程であって、第３の非天然塩基は、第１の非天然塩基と相補的であるか、第１の非天然塩基と塩基対を形成することができるか、および／または第１の非天然塩基と第１の非天然塩基対を形成するように構成されている、工程；
ＤＮＡテンプレートを転写して、第４の非天然塩基をｔＲＮＡに組み込む工程であって、第４の非天然塩基は、第２の非天然塩基と相補的であるか、第２の非天然塩基と塩基対を形成することができるか、および／または第２の非天然塩基と第２の非天然塩基対を形成するように構成され、第１の非天然塩基対および第２の非天然塩基対は同じではない、工程；ならびに
ｍＲＮＡおよびｔＲＡＮからタンパク質を翻訳する工程であって、前記タンパク質は、非天然アミノ酸を含む、工程
を含む方法を本明細書において提供する。
核酸分子
いくつかの実施形態において、核酸（例えば、本明細書において、目的の核酸分子とも称する）は、任意の起源または組成物由来、例えば、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｇＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ（短い阻害性ＲＮＡ）、ＲＮＡｉ、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡまたはｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）由来であり、例えば、任意の形態（例えば、線状、環状、高次コイル状、一本鎖、二本鎖など）である。いくつかの実施形態において、核酸は、ヌクレオチド、ヌクレオシドまたはポリヌクレオチドを含む。いくつかの場合において、核酸は、天然核酸および非天然核酸を含む。いくつかの場合において、核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡアナログ（例えば、塩基アナログ、糖アナログおよび／または非ネイティブ骨格などを含有する）などの非天然核酸も含む。「核酸」という用語は、特定の長さのポリヌクレオチド鎖を指さないこと、またはそれを推測しないことが理解され、したがって、ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドも、その定義内に含まれる。例示的な天然ヌクレオチドとしては、限定されないが、ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＡＤＰ、ＵＤＰ、ＣＤＰ、ＧＤＰ、ＡＭＰ、ＵＭＰ、ＣＭＰ、ＧＭＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＤＰ、ｄＴＤＰ、ｄＣＤＰ、ｄＧＤＰ、ｄＡＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＣＭＰおよびｄＧＭＰが挙げられる。例示的な天然デオキシリボヌクレオチドとしては、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＤＰ、ｄＴＤＰ、ｄＣＤＰ、ｄＧＤＰ、ｄＡＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＣＭＰおよびｄＧＭＰが挙げられる。例示的な天然リボヌクレオチドとしては、ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＡＤＰ、ＵＤＰ、ＣＤＰ、ＧＤＰ、ＡＭＰ、ＵＭＰ、ＣＭＰおよびＧＭＰが挙げられる。天然ＲＮＡについて、ウラシル含有ヌクレオシドは、ウリジンである。核酸は、ベクター、プラスミド、ファージミド、自己複製配列（ＡＲＳ）、セントロメア、人工染色体、酵母人工染色体（例えば、ＹＡＣ）、または宿主細胞中で複製可能であるか、もしくは宿主細胞中で複製される他の核酸である場合がある。いくつかの場合において、非天然核酸は、核酸アナログである。追加の場合において、非天然核酸は、細胞外起源由来である。他の場合において、非天然核酸は、本明細書に提供される生物、例えば、遺伝子改変生物の細胞内空間において利用可能である。いくつかの実施形態において、非天然ヌクレオチドは、天然ヌクレオチドではない。いくつかの実施形態において、天然塩基を含まないヌクレオチドは、非天然核酸塩基を含む。
非天然核酸
ヌクレオチドアナログまたは非天然ヌクレオチドは、塩基、糖またはホスフェート部分のいずれかにいくつかの種類の修飾を含有するヌクレオチドを含む。「修飾」という用語（および「修飾された」などの関連する文法形式）は、ヌクレオチドアナログまたは非天然ヌクレオチドが天然ヌクレオチドの直接的な変更によって製造されることを必ずしも意味せず、むしろ、ヌクレオチドアナログまたは非天然ヌクレオチドが天然ヌクレオチドと異なることを意味する。いくつかの実施形態において、修飾は、化学的修飾を含む。いくつかの場合において、修飾は、３’ＯＨもしくは５’ＯＨ基、主鎖、糖構成成分またはヌクレオチド塩基において起こる。いくつかの例において、修飾は、場合により、天然に存在しないリンカー分子および／または鎖間もしくは鎖内架橋を含む。一態様において、修飾された核酸は、３’ＯＨもしくは５’ＯＨ基、主鎖、糖構成成分もしくはヌクレオチド塩基の１つまたはそれ以上の修飾、および／あるいは天然に存在しないリンカー分子の付加を含む。一態様において、修飾された主鎖は、ホスホジエステル主鎖以外の主鎖を含む。一態様において、修飾された糖は、デオキシリボース以外（修飾されたＤＮＡにおいて）、またはリボース以外（修飾されたＲＮＡ）の糖を含む。一態様において、修飾された塩基は、アデニン、グアニン、シトシンもしくはチミン以外の塩基（修飾されたＤＮＡにおいて）、またはアデニン、グアニン、シトシンもしくはウラシル以外の塩基（修飾されたＲＮＡにおいて）を含む。いくつかの実施形態において、非天然ヌクレオチドは、非天然塩基を含む。いくつかの実施形態において、非天然塩基は、プリンもしくはピリミジン（プリンおよびピリミジンは、環外置換基を有するプリンおよびピリミジンを包含する）以外の環または環系を有する塩基であり、あるいは１つもしくはそれ以上の非窒素ヘテロ原子を含有するか、および／または窒素を含有しない環または環系を含む。
いくつかの実施形態において、核酸は、少なくとも１つの修飾された塩基を含む。いくつかの例において、核酸は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０またはそれ以上の修飾された塩基を含む。いくつかの場合において、塩基部分への修飾は、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）およびチミン（Ｔ）／ウラシル（Ｕ）の天然ならびに合成修飾だけでなく、異なるプリンまたはピリミジン塩基も含む。いくつかの実施形態において、修飾は、アデニン、グアニン、シトシンもしくはチミンの修飾された形態（修飾されたＤＮＡにおいて）、またはアデニン、グアニン、シトシンもしくはウラシルの修飾された形態（修飾されたＲＮＡ）である。
非天然核酸の修飾された塩基としては、限定されるものではないが、ウラシル－５－イル、ヒポキサンチン－９－イル（Ｉ）、２－アミノアデニン－９－イル、５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６－メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２－プロピルおよび他のアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミンおよび２－チオシトシン、５－ハロウラシルおよびシトシン、５－プロピニルウラシルおよびシトシン、６－アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５－ウラシル（シュードウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシルおよび他の８－置換アデニンおよびグアニン、５－ハロ、特に、５－ブロモ、５－トリフルオロメチルおよび他の５－置換ウラシルおよびシトシン、７－メチルグアニンおよび７－メチルアデニン、８－アザグアニンおよび８－アザアデニン、７－デアザグアニンおよび７－デアザアデニン、ならびに３－デアザグアニンおよび３－デアザアデニンが挙げられる。ある特定の非天然核酸、例えば、５－置換ピリミジン、６－アザピリミジンおよびＮ－２置換プリン、Ｎ－６置換プリン、Ｏ－６置換プリン、２－アミノプロピルアデニン、５－プロピニルウラシル、５－プロピニルシトシン、５－メチルシトシン、二本鎖形成の安定性を増加させるもの、ユニバーサル核酸、疎水性核酸、乱雑な核酸、サイズが拡大された核酸、フッ素化核酸、５－置換ピリミジン、６－アザピリミジン、ならびにＮ－２、Ｎ－６およびＯ－６置換プリンは、２－アミノプロピルアデニン、５－プロピニルウラシルおよび５－プロピニルシトシン、５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６－メチル、他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２－プロピルおよび他のアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミンおよび２－チオシトシン、５－ハロウラシル、５－ハロシトシン、５－プロピニル（－Ｃ≡Ｃ－ＣＨ３）ウラシル、５－プロピニルシトシン、ピリミジン核酸の他のアルキニル誘導体、６－アゾウラシル、６－アゾシトシン、６－アゾチミン、５－ウラシル（シュードウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシルおよび他の８－置換アデニンおよびグアニン、５－ハロ、特に、５－ブロモ、５－トリフルオロメチル、他の５－置換ウラシルおよびシトシン、７－メチルグアニン、７－メチルアデニン、２－Ｆ－アデニン、２－アミノ－アデニン、８－アザグアニン、８－アザアデニン、７－デアザグアニン、７－デアザアデニン、３－デアザグアニン、３－デアザアデニン、三環式ピリミジン、フェノキサジンシチジン（［５，４－ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン－２（３Ｈ）－オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ－ピリミド［５，４－ｂ］［１，４］ベンゾチアジン－２（３Ｈ）－オン）、Ｇ－ｃｌａｍｐｓ、フェノキサジンシチジン（例えば、９－（２－アミノエトキシ）－Ｈ－ピリミド［５，４－ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン－２（３Ｈ）－オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ－ピリミド［４，５－ｂ］インドール－２－オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ－ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３－ｄ］ピリミジン－２－オン）、プリンまたはピリミジン塩基が他の複素環で置き換えられたもの、７－デアザ－アデニン、７－デアザグアノシン、２－アミノピリジン、２－ピリドン、アザシトシン、５－ブロモシトシン、ブロモウラシル、５－クロロシトシン、塩素化シトシン、シクロシトシン、シトシンアラビノシド、５－フルオロシトシン、フルオロピリミジン、フルオロウラシル、５，６－ジヒドロシトシン、５－ヨードシトシン、ヒドロキシウレア、ヨードウラシル、５－ニトロシトシン、５－ブロモウラシル、５－クロロウラシル、５－フルオロウラシルおよび５－ヨードウラシル、２－アミノ－アデニン、６－チオ－グアニン、２－チオ－チミン、４－チオ－チミン、５－プロピニル－ウラシル、４－チオ－ウラシル、Ｎ４－エチルシトシン、７－デアザグアニン、７－デアザ－８－アザグアニン、５－ヒドロキシシトシン、２’－デオキシウリジン、２－アミノ－２’－デオキシアデノシン、ならびに米国特許第３，６８７，８０８号；同第４，８４５，２０５号；同第４，９１０，３００号；同第４，９４８，８８２号；同第５，０９３，２３２号；同第５，１３０，３０２号；同第５，１３４，０６６号；同第５，１７５，２７３号；同第５，３６７，０６６号；同第５，４３２，２７２号；同第５，４５７，１８７号；同第５，４５９，２５５号；同第５，４８４，９０８号；同第５，５０２，１７７号；同第５，５２５，７１１号；同第５，５５２，５４０号；同第５，５８７，４６９号；同第５，５９４，１２１号；同第５，５９６，０９１号；同第５，６１４，６１７号；同第５，６４５，９８５号；同第５，６８１，９４１号；同第５，７５０，６９２号；同第５，７６３，５８８号；同第５，８３０，６５３号および同第６，００５，０９６号；国際公開第９９／６２９２３号；Ｋａｎｄｉｍａｌｌａら、（２００１）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．９巻：８０７～８１３頁；Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ、Ｊ．Ｉ．編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、１９９０、８５８～８５９頁；Ｅｎｇｌｉｓｃｈら、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９１、３０巻、６１３頁；およびＳａｎｇｈｖｉ、第１５章、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ＣｒｏｏｋｅおよびＬｅｂｌｅｕ編、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、１９９３、２７３～２８８頁に記載のものを含む。追加の塩基修飾は、例えば、米国特許第３，６８７，８０８号；Ｅｎｇｌｉｓｃｈら、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９１、３０巻、６１３頁に見ることができる。いくつかの例において、非天然核酸は、図２の核酸塩基を含む。いくつかの例において、非天然核酸は、図４Ａの核酸塩基を含む。いくつかの例において、非天然核酸は、図４Ｂの核酸塩基を含む。
様々な複素環塩基および様々な糖部分（および糖アナログ）を含む非天然核酸は、当技術分野において利用可能であり、いくつかの場合において、核酸は、天然に存在する核酸の主要な５つの塩基構成成分以外の１つまたはいくつかの複素環塩基を含む。例えば、複素環塩基としては、いくつかの場合において、ウラシル－５－イル、シトシン－５－イル、アデニン－７－イル、アデニン－８－イル、グアニン－７－イル、グアニン－８－イル、４－アミノピロロ［２．３－ｄ］ピリミジン－５－イル、２－アミノ－４－オキソピロロ［２、３－ｄ］ピリミジン－５－イル、２－アミノ－４－オキソピロロ［２．３－ｄ］ピリミジン－３－イル基が挙げられ、ここで、プリンは、９位を介して核酸の糖部分に、１位を介してピリミジンに、７位を介してピロロピリミジンに、および１位を介してピラゾロピリミジンに結合する。
いくつかの実施形態において、非天然核酸の修飾された塩基を下記に表し、ここで、波線は、ヌクレオシドまたはヌクレオチドの糖（例えば、デオキシリボースまたはリボース）への結合点を特定する。
いくつかの実施形態において、非天然塩基（例えば、本明細書に記載の非天然アミノ酸を含むタンパク質を産生する方法の第１の非天然塩基、第２の非天然塩基、第３の非天然塩基または第４の非天然塩基のうちの少なくとも１つ）は、
からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、非天然塩基は、
からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、非天然塩基は、
からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、非天然塩基は、
からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、非天然塩基は、
である。いくつかの実施形態において、非天然塩基は、
から選択される。
いくつかの実施形態において、非天然塩基（例えば、本明細書に記載の非天然アミノ酸を含むタンパク質を産生する方法の第１または第２の非天然塩基）は、
である。いくつかの実施形態において、非天然塩基（例えば、本明細書に記載の非天然アミノ酸を含むタンパク質を産生する方法の第１または第２の非天然塩基）は、
である。いくつかの実施形態において、第１の非天然塩基は、
であり、第２の非天然塩基は、
である。
いくつかの実施形態において、非天然塩基（例えば、本明細書に記載の非天然アミノ酸を含むタンパク質を産生する方法の第３または第４の非天然塩基）は、
である。いくつかの実施形態において、第３の非天然塩基は、
である。いくつかの実施形態において、第４の非天然塩基は、
である。いくつかの実施形態において、非天然塩基（例えば、本明細書に記載の非天然アミノ酸を含むタンパク質を産生する方法の第３または第４の非天然塩基）は、
である。いくつかの実施形態において、第３の非天然塩基は、
である。いくつかの実施形態において、第４の非天然塩基は、
である。
いくつかの実施形態において、第１の非天然塩基は、
であり、第２の非天然塩基は、
であり、第３の非天然塩基は、
であり、第４の非天然塩基は、
である。いくつかの実施形態において、第１の非天然塩基は、
であり、第２の非天然塩基は、
であり、第３の非天然塩基は、
であり、第４の非天然塩基は、
である。いくつかの実施形態において、第１の非天然塩基は、
であり、第２の非天然塩基は、
であり、第３の非天然塩基は、
であり、第４の非天然塩基は、
である。いくつかの実施形態において、第３の非天然塩基は、
である。いくつかの実施形態において、第４の非天然塩基は、
である。いくつかの実施形態において、第１の非天然塩基は、
であり、第２の非天然塩基は、
であり、第３の非天然塩基は、
であり、第４の非天然塩基は、
である。
いくつかの実施形態において、第３の非天然塩基および第４の非天然塩基は、リボースを含む。いくつかの実施形態において、第３の非天然塩基および第４の非天然塩基は、デオキシリボースを含む。いくつかの実施形態において、第１および第２の非天然塩基は、デオキシリボースを含む。いくつかの実施形態において、第１および第２の非天然塩基は、デオキシリボースを含み、第３の非天然塩基および第４の非天然塩基は、リボースを含む。
本明細書に記載の非天然アミノ酸を含むタンパク質を産生する方法のいくつかの実施形態において、ＤＮＡは、
から選択される少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を含み、ここで、それぞれの糖部分は、独立して、本明細書に記載の任意の実施形態またはバリエーションである。いくつかの実施形態において、塩基対における両方の塩基の糖部分は、リボースを含む。いくつかの実施形態において、塩基対における両方の塩基の糖部分は、デオキシリボースを含む。いくつかの実施形態において、塩基対における一方の塩基の糖部分は、シリボースを含み、塩基対における他方の塩基の糖部分は、デオキシリボースを含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡテンプレートは、ＮａＭ－５ＳＩＣＳである少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡは、ＣＮＭＯ－ＴＰＴ３である少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡは、ＮａＭ－ＴＰＴ３である少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡは、ＮａＭ－ＴＡＴ１である少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡは、ＣＮＭＯ－ＴＡＴ１である少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を含む。
本明細書に記載の非天然アミノ酸を含むタンパク質を産生する方法のいくつかの実施形態において、ＤＮＡは、
からなる群から選択される少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡは、ｄＮａＭ－ｄ５ＳＩＣＳである少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡは、ｄＣＮＭＯ－ｄＴＰＴ３である少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡは、ｄＮａＭ－ｄＴＰＴ３である少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡは、ｄＮａＭ－ｄＴＡＴ１である少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡは、ｄＣＮＭＯ－ｄＴＡＴ１である少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を含む。
本明細書に記載の非天然アミノ酸を含むタンパク質を産生する方法のいくつかの実施形態において、ＤＮＡは、
から選択される少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を含み、ここで、それぞれの糖部分は、独立して、本明細書に記載の任意の実施形態またはバリエーションであり、ｍＲＮＡおよびｔＲＮＡは、
から選択される少なくとも１つの非天然塩基を含む。いくつかの実施形態において、塩基対における両方の塩基の糖部分は、リボースを含む。いくつかの実施形態において、塩基対における両方の塩基の糖部分は、デオキシリボースを含む。いくつかの実施形態において、塩基対における一方の塩基の糖部分は、リボースを含み、塩基対における他方の塩基の糖部分は、デオキシリボースを含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡは、ｄＮａＭ－ｄ５ＳＩＣＳである少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡは、ｄＣＮＭＯ－ｄＴＰＴ３である少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡは、ｄＮａＭ－ｄＴＰＴ３である少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡは、ｄＮａＭ－ｄＴＡＴ１である少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡは、ｄＣＮＭＯ－ｄＴＡＴ１である少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を含む。
本明細書に記載の非天然アミノ酸を含むタンパク質を産生する方法のいくつかの実施形態において、ＤＮＡは、
からなる群から選択される少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を含み、ここで、ｍＲＮＡおよびｔＲＮＡは、
から選択される少なくとも１つの非天然塩基を含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡは、ｄＮａＭ－ｄ５ＳＩＣＳである少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡは、ｄＣＮＭＯ－ｄＴＰＴ３である少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡは、ｄＮａＭ－ｄＴＰＴ３である少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡは、ｄＮａＭ－ｄＴＡＴ１である少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡは、ｄＣＮＭＯ－ｄＴＡＴ１である少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を含む。
いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡおよびｔＲＮＡは、
から選択される非天然塩基を含む。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡおよびｔＲＮＡは、
から選択される非天然塩基を含む。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、
である非天然塩基を含む。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、
である非天然塩基を含む。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、
である非天然塩基を含む。いくつかの実施形態において、ｔＲＮＡは、
から選択される非天然塩基を含む。いくつかの実施形態において、ｔＲＮＡは、
である非天然塩基を含む。いくつかの実施形態において、ｔＲＮＡは、
である非天然塩基を含む。いくつかの実施形態において、ｔＲＮＡは、
である非天然塩基を含む。
本明細書に記載の非天然アミノ酸を含むタンパク質を産生する方法のいくつかの実施形態において、第１の非天然塩基は、ｄＣＮＭＯを含み、第２の非天然塩基は、ｄＴＰＴ３を含む。いくつかの実施形態において、第３の非天然塩基は、ＮａＭを含み、第２の非天然塩基は、ＴＡＴ１を含む。
少なくとも１つの非天然アミノ酸を含むタンパク質であって、本明細書に開示される方法のいずれかに従って産生するタンパク質も本明細書において提供する。いくつかの実施形態において、タンパク質は、少なくとも１つの非天然アミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、タンパク質は、１つの非天然アミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、タンパク質は、２つまたはそれ以上の非天然アミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、タンパク質は、２つの非天然アミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、タンパク質は、３つまたはそれ以上の非天然アミノ酸を含む。
いくつかの実施形態において、ヌクレオチドアナログはまた、ホスフェート部分において修飾される。修飾されたホスフェート部分としては、限定されるものではないが、２つのヌクレオチド間の連結における修飾を有するものが挙げられ、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’－アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含むメチルおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’－アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデートを含むホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステルならびにボラノホスフェートを含む。２つのヌクレオチド間のこれらのホスフェートまたは修飾されたホスフェートの連結は、３’－５’連結または２’－５’連結によってであり、連結は、３’－５’から５’－３’または２’－５’から５’－２’などの逆の方向性を含むことが理解される。さまざまな塩、混合塩および遊離酸形態も含まれる。多数の米国特許が、修飾されたホスフェートを含有するヌクレオチドの作製方法および使用方法を教示しており、限定されるものではないが、第３，６８７，８０８号；第４，４６９，８６３号；第４，４７６，３０１号；第５，０２３，２４３号；第５，１７７，１９６号；第５，１８８，８９７号；第５，２６４，４２３号；第５，２７６，０１９号；第５，２７８，３０２号；第５，２８６，７１７号；第５，３２１，１３１号；第５，３９９，６７６号；第５，４０５，９３９号；第５，４５３，４９６号；第５，４５５，２３３号；第５，４６６，６７７号；第５，４７６，９２５号；第５，５１９，１２６号；第５，５３６，８２１号；第５，５４１，３０６号；第５，５５０，１１１号；第５，５６３，２５３号；第５，５７１，７９９号；第５，５８７，３６１号；および第５，６２５，０５０号が挙げられ、これらのそれぞれの開示は、それらの全体が参照によって本明細書に組み入れられる。
いくつかの実施形態において、非天然核酸は、２’，３’－ジデオキシ－２’，３’－ジデヒドロ－ヌクレオシド（ＰＣＴ／ＵＳ２００２／００６４６０号）、５’－置換ＤＮＡおよびＲＮＡ誘導体（ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３３９６１号；Ｓａｈａら、Ｊ．Ｏｒｇ Ｃｈｅｍ．、１９９５、６０巻、７８８～７８９頁；Ｗａｎｇら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ、１９９９、９巻、８８５～８９０頁；およびＭｉｋｈａｉｌｏｖら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、１９９１、１０巻（１～３号）、３３９～３４３頁；Ｌｅｏｎｉｄら、１９９５、１４巻（３～５号）、９０１～９０５頁；およびＥｐｐａｃｈｅｒら、Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ、２００４、８７巻、３００４～３０２０頁；ＰＣＴ／ＪＰ２０００／００４７２０号；ＰＣＴ／ＪＰ２００３／００２３４２号；ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１３２１６号；ＰＣＴ／ＪＰ２００５／０２０４３５号；ＰＣＴ／ＪＰ２００６／３１５４７９号；ＰＣＴ／ＪＰ２００６／３２４４８４号；ＰＣＴ／ＪＰ２００９／０５６７１８号；ＰＣＴ／ＪＰ２０１０／０６７５６０号）、または修飾された塩基を用いてモノホスフェートとして作製された５’－置換モノマー（Ｗａｎｇら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ、２００４、２３巻（１および２号）、３１７～３３７頁）を含み、これらのそれぞれの開示は、それらの全体が参照によって本明細書に組み入れられる。
いくつかの実施形態において、非天然核酸は、糖の環の５’位および２’位における修飾（ＰＣＴ／ＵＳ９４／０２９９３号）、例えば、５’－ＣＨ２置換２’－Ｏ－保護ヌクレオシド（Ｗｕら、Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ、２０００、８３巻、１１２７～１１４３頁およびＷｕら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１９９９、１０巻、９２１～９２４）を含む。いくつかの場合において、非天然核酸は、オリゴヌクレオチドへの組み込みのために製造されたアミド連結ヌクレオシドダイマーを含み、ここで、ダイマー中の３’連結ヌクレオシド（５’から３’）は、２’－ＯＣＨ３および５’－（Ｓ）－ＣＨ３（Ｍｅｓｍａｅｋｅｒら、Ｓｙｎｌｅｔｔ、１９９７、１２８７～１２９０頁）を含む。非天然核酸は、２’－置換５’－ＣＨ２（またはＯ）修飾ヌクレオシド（ＰＣＴ／ＵＳ９２／０１０２０号）を含むことができる。非天然核酸は、５’－メチレンホスホネートＤＮＡおよびＲＮＡモノマーおよびダイマー（Ｂｏｈｒｉｎｇｅｒら、Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．、１９９３、３４巻、２７２３～２７２６頁；Ｃｏｌｌｉｎｇｗｏｏｄら、Ｓｙｎｌｅｔｔ、１９９５、７巻、７０３～７０５頁；およびＨｕｔｔｅｒら、Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ、２００２、８５巻、２７７７～２８０６頁）を含むことができる。非天然核酸は、２’－置換を有する５’－ホスホネートモノマー（米国特許出願公開第２００６／００７４０３５号）および他の修飾された５’－ホスホネートモノマー（国際公開第１９９７／３５８６９号）を含むことができる。非天然核酸は、５’－修飾されたメチレンホスホネートモノマー（欧州特許出願公開第６１４９０７号および欧州特許出願公開第６２９６３３号）を含むことができる。非天然核酸は、５’および／もしくは６’位にヒドロキシル基を含む５’または６’－ホスホネートリボヌクレオシドのアナログ（Ｃｈｅｎら、Ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ，Ｓｕｌｆｕｒ ａｎｄ Ｓｉｌｉｃｏｎ、２００２、７７７巻、１７８３～１７８６頁；Ｊｕｎｇら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、２０００、８巻、２５０１～２５０９頁；Ｇａｌｌｉｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、２００７、９２５～９３３頁；およびＨａｍｐｔｏｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、１９７６、１９巻（８号）、１０２９～１０３３頁）を含むことができる。非天然核酸は、５’－ホスフェート基を有する５’－ホスホネートデオキシリボヌクレオシドモノマーおよびダイマー（Ｎａｗｒｏｔら、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、２００６、１６巻（１号）、６８～８２頁）を含むことができる。非天然核酸は、６’－ホスホネート基を有するヌクレオシドを含むことができ、ここで、５’または／および６’位は、無置換、またはチオ－ｔｅｒｔ－ブチル基（ＳＣ（ＣＨ３）３）（およびそのアナログ）；メチレンアミノ基（ＣＨ２ＮＨ２）（およびそのアナログ）またはシアノ基（ＣＮ）（およびそのアナログ）（Ｆａｉｒｈｕｒｓｔら、Ｓｙｎｌｅｔｔ、２００１、４巻、４６７～４７２頁；Ｋａｐｐｌｅｒら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、１９８６、２９巻、１０３０～１０３８頁；Ｋａｐｐｌｅｒら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、１９８２、２５巻、１１７９～１１８４頁；Ｖｒｕｄｈｕｌａら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、１９８７、３０巻、８８８～８９４頁；Ｈａｍｐｔｏｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、１９７６、１９巻、１３７１～１３７７頁；Ｇｅｚｅら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ、１９８３、１０５巻（２６号）、７６３８～７６４０頁；およびＨａｍｐｔｏｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ、１９７３、９５巻（１３号）、４４０４～４４１４頁）で置換される。本段落において列挙した参考文献のそれぞれの開示は、それらの全体が参照によって本明細書に組み入れられる。
いくつかの実施形態において、非天然核酸は、糖部分の修飾も含む。いくつかの場合において、核酸は、糖基が修飾された１つまたはそれ以上のヌクレオシドを含有する。そのような糖が修飾されたヌクレオシドは、増強されたヌクレアーゼ安定性、増加した結合親和性、またはいくつかの他の有利な生物学的性質が付与される場合がある。ある特定の実施形態において、核酸は、化学修飾されたリボフラノース環部分を含む。化学修飾されたリボフラノース環の例としては、限定されないが、置換基の付加（５’および／または２’置換基；二環式核酸（ＢＮＡ）を形成する２つの環原子の架橋；リボシル環の酸素原子のＳ、Ｎ（Ｒ）もしくはＣ（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ＝Ｈ、Ｃ１～Ｃ１２アルキルまたは保護基）による置き換え；ならびにそれらの組み合わせを含む）が挙げられる。化学修飾された糖の例は、国際公開第２００８／１０１１５７号、米国特許出願公開第２００５／０１３０９２３号および国際公開第２００７／１３４１８１号に見ることができ、それらのそれぞれの開示は、それらの全体が参照によって本明細書に組み入れられる。
いくつかの例において、修飾された核酸は、修飾された糖または糖アナログを含む。したがって、リボースおよびデオキシリボースに加えて、糖部分は、ペントース、デオキシペントース、ヘキソース、デオキシヘキソース、グルコース、アラビノース、キシロース、リキソース、または糖の「アナログ」のシクロペンチル基であることができる。糖は、ピラノシルまたはフラノシルの形態であることができる。糖部分は、リボース、デオキシリボース、アラビノースまたは２’－Ｏ－アルキルリボースのフラノシドであることができ、糖は、［アルファ］または［ベータ］アノマー配置のいずれかのそれぞれの複素環塩基に結合することができる。糖修飾としては、限定されるものではないが、２’－アルコキシ－ＲＮＡアナログ、２’－アミノ－ＲＮＡアナログ、２’－フルオロ－ＤＮＡおよび２’－アルコキシ－またはアミノ－ＲＮＡ／ＤＮＡキメラが挙げられる。例えば、糖修飾としては、２’－Ｏ－メチル－ウリジンまたは２’－Ｏ－メチル－シチジンを挙げることができる。糖修飾としては、２’－Ｏ－アルキル置換デオキシリボヌクレオシドおよび２’－Ｏ－エチレングリコール様リボヌクレオシドが挙げられる。そのような糖または糖アナログが複素環塩基（核酸塩基）に結合する、これらの糖または糖アナログおよびそれぞれの「ヌクレオシド」の製造は、公知である。糖修飾はまた、他の修飾を用いて作製し、それと組み合わせることができる。
糖部分への修飾は、リボースおよびデオキシリボースの天然修飾、ならびに非天然修飾を含む。糖修飾としては、限定されるものではないが、以下の２位における修飾：ＯＨ；Ｆ；Ｏ－、Ｓ－もしくはＮ－アルキル；Ｏ－、Ｓ－もしくはＮ－アルケニル；Ｏ－、Ｓ－もしくはＮ－アルキニル；またはＯ－アルキル－Ｏ－アルキルが挙げられ、ここで、アルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換または無置換のＣ１～Ｃ１０アルキルもしくはＣ２～Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルであってもよい。２’糖修飾としては、限定されるものではないが、－Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２および－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２（式中、ｎおよびｍは、１～約１０である）も挙げられる。
２’位における他の修飾としては、限定されるものではないが、Ｃ１～Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ－アルカリル、Ｏ－アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、干渉物質、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的性質を改善するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的性質を改善するための基、および類似の性質を有する他の置換基が挙げられる。類似の修飾はまた、糖の他の位置、特に、３’末端ヌクレオチドまたは２’－５’連結オリゴヌクレオチドにおける糖の３’位、および５’末端ヌクレオチドの５’位において行うことができる。修飾された糖は、ＣＨ２およびＳなどの架橋している環の酸素において修飾を含有するものも含む。ヌクレオチドの糖アナログは、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖ミメティックを有することもできる。米国特許第４，９８１，９５７号；同第５，１１８，８００号；同第５，３１９，０８０号；同第５，３５９，０４４号；同第５，３９３，８７８号；同第５，４４６，１３７号；同第５，４６６，７８６号；同第５，５１４，７８５号；同第５，５１９，１３４号；同第５，５６７，８１１号；同第５，５７６，４２７号；同第５，５９１，７２２号；同第５，５９７，９０９号；同第５，６１０，３００号；同第５，６２７，０５３号；同第５，６３９，８７３号；同第５，６４６，２６５号；同第５，６５８，８７３号；同第５，６７０，６３３号；同第４，８４５，２０５号；同第５，１３０，３０２号；同第５，１３４，０６６号；同第５，１７５，２７３号；同第５，３６７，０６６号；同第５，４３２，２７２号；同第５，４５７，１８７号；同第５，４５９，２５５号；同第５，４８４，９０８号；同第５，５０２，１７７号；同第５，５２５，７１１号；同第５，５５２，５４０号；同第５，５８７，４６９号；同第５，５９４，１２１号、同第５，５９６，０９１号；同第５，６１４，６１７号；同第５，６８１，９４１号；および同第５，７００，９２０号などの、そのような修飾された糖構造の製造を教示し、塩基修飾の範囲を詳述および記載する多数の米国特許があり、それらのそれぞれの開示は、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる。
修飾された糖部分を有する核酸の例としては、限定されないが、５’－ビニル、５’－メチル（ＲまたはＳ）、４’－Ｓ、２’－Ｆ、２’－ＯＣＨ３および２’－Ｏ（ＣＨ２）２ＯＣＨ３置換基を含む核酸が挙げられる。２’位における置換基は、アリル、アミノ、アジド、チオ、Ｏ－アリル、Ｏ－（Ｃ１～Ｃ１Ｏアルキル）、ＯＣＦ３、Ｏ（ＣＨ２）２ＳＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）２－Ｏ－Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）およびＯ－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）（式中、それぞれのＲｍおよびＲｎは、独立して、Ｈ、または置換もしくは無置換のＣ１～Ｃ１０アルキルである）から選択することもできる。
ある特定の実施形態において、本明細書に記載の核酸は、１つまたはそれ以上の二環式核酸を含む。ある特定のそのような実施形態において、二環式核酸は、４’および２’リボシル環原子の間の架橋を含む。ある特定の実施形態において、本明細書に提供される核酸は、１つまたはそれ以上の二環式核酸を含み、ここで、架橋は、４’－２’二環式核酸を含む。そのような４’－２’二環式核酸の例としては、限定されるものではないが、式：４’－（ＣＨ２）－Ｏ－２’（ＬＮＡ）；４’－（ＣＨ２）－Ｓ－２’；４’－（ＣＨ２）２－Ｏ－２’（ＥＮＡ）；４’－ＣＨ（ＣＨ３）－Ｏ－２’および４’－ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ３）－Ｏ－２’、ならびにそれらのアナログ（米国特許第７，３９９，８４５号を参照されたい）；４’－Ｃ（ＣＨ３）（ＣＨ３）－Ｏ－２’およびそのアナログ（国際公開第２００９／００６４７８号、国際公開第２００８／１５０７２９号、米国特許出願公開第２００４／０１７１５７０号、米国特許第７，４２７，６７２号、Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙａら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、２０９巻、７４号、１１８～１３４頁および国際公開第２００８／１５４４０１号を参照されたい）の１つが挙げられる。例えば、Ｓｉｎｇｈら、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１９９８、４巻、４５５～４５６頁；Ｋｏｓｈｋｉｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、１９９８、５４巻、３６０７～３６３０頁；Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、２０００、９７巻、５６３３～５６３８頁；Ｋｕｍａｒら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．、１９９８、８巻、２２１９～２２２２頁；Ｓｉｎｇｈら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、１９９８、６３巻、１００３５～１００３９頁；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、２００７、１２９巻（２６号）８３６２～８３７９頁；Ｅｌａｙａｄｉら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｉｎｖｅｎｓ．Ｄｒｕｇｓ、２００１、２巻、５５８～５６１頁；Ｂｒａａｓｃｈら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ、２００１、８巻、１～７頁；Ｏｒａｍら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、２００１、３巻、２３９～２４３頁；米国特許第４，８４９，５１３号：同第５，０１５，７３３号：同第５，１１８，８００号：同第５，１１８，８０２号：同第７，０５３，２０７号：同第６，２６８，４９０号：同第６，７７０，７４８号：同第６，７９４，４９９号：同第７，０３４，１３３号：同第６，５２５，１９１号：同第６，６７０，４６１号：および同第７，３９９，８４５号；国際公開第２００４／１０６３５６号、国際公開第１９９４／１４２２６号、国際公開第２００５／０２１５７０号、国際公開第２００７／０９００７１および国際公開第２００７／１３４１８１号；米国特許出願公開第２００４／０１７１５７０号、同第２００７／０２８７８３１号および同第２００８／００３９６１８号；米国仮出願第６０／９８９，５７４号、同第６１／０２６，９９５号、同第６１／０２６，９９８号、同第６１／０５６，５６４号、同第６１／０８６，２３１号、同第６１／０９７，７８７号および同第６１／０９９，８４４号；ならびに国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６４５９１号、同第ＰＣＴ ＵＳ２００８／０６６１５４号、同第ＰＣＴ ＵＳ２００８／０６８９２２号および同第ＰＣＴ／ＤＫ９８／００３９３号も参照されたい、これらのそれぞれの開示は、それらの全体が参照によって本明細書に組み入れられる。
ある特定の実施形態において、核酸は、連結された核酸を含む。核酸は、任意の核酸間の連結を使用して、一緒に連結することができる。核酸間連結基の２つの主なクラスは、リン原子の存在または非存在によって定義される。代表的なリン含有核酸間連結としては、限定されるものではないが、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、ホスホルアミデートおよびホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）が挙げられる。代表的なリン不含有核酸間連結基としては、限定されるものではないが、メチレンメチルイミノ（－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）－Ｏ－ＣＨ２－）、チオジエステル（－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－Ｓ－）、チオノカルバメート（－Ｏ－Ｃ（Ｏ）（ＮＨ）－Ｓ－）；シロキサン（－Ｏ－Ｓｉ（Ｈ）２－Ｏ－）；およびＮ，Ｎ＊－ジメチルヒドラジン（－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）－Ｎ（ＣＨ３））が挙げられる。ある特定の実施形態において、キラル原子を有する核酸間連結は、ラセミ混合物として、または別々のエナンチオマー、例えば、アルキルホスホネートおよびホスホロチオエートとして、製造することができる。非天然核酸は、単一の修飾を含有することができる。非天然核酸は、１つの部分内に、または異なる部分の間に、複数の修飾を含有することができる。
核酸に対する主鎖のホスフェートの修飾としては、限定されるものではないが、メチルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート（架橋または非架橋）、ホスホトリエステル、ホスホロジチオエート、ホスホジチオエートおよびボラノホスフェートが挙げられ、任意の組み合わせで使用することができる。他の非ホスフェート連結を使用することもできる。
いくつかの実施形態において、主鎖の修飾（例えば、メチルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロアミデートおよびホスホロジチオエートのヌクレオチド間連結）は、修飾された核酸における免疫調節活性を付与することができ、および／またはインビボでのそれらの安定性を増強することができる。
いくつかの例において、リン誘導体（または修飾されたホスフェート基）は、糖または糖アナログ部分に結合し、モノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、アルキルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミデートなどであることができる。修飾されたホスフェート連結または非ホスフェート連結を含有する例示的なポリヌクレオチドは、Ｐｅｙｒｏｔｔｅｓら、１９９６、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４巻：１８４１～１８４８頁；Ｃｈａｔｕｒｖｅｄｉら、１９９６、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４巻：２３１８～２３２３頁；およびＳｃｈｕｌｔｚら、（１９９６） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４巻：２９６６～２９７３頁；Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ、１９９７、「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｎａｌｏｇｓ：ａｎ Ｏｖｅｒｖｉｅｗ」ｉｎ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｇｅｎｔｓ、（ＣｈａｄｗｉｃｋおよびＣａｒｄｅｗ編）Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｚｏｎ、１９９３、「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅｓ」ｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｓ、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、１６５～１９０頁；Ｍｉｌｌｅｒら、１９７１、ＪＡＣＳ ９３巻：６６５７～６６６５頁；Ｊａｇｅｒら、１９８８、Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７巻：７２４７～７２４６頁；Ｎｅｌｓｏｎら、１９９７、ＪＯＣ ６２巻：７２７８～７２８７頁；米国特許第５，４５３，４９６号；ならびにＭｉｃｋｌｅｆｉｅｌｄ、２００１、Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．８巻：１１５７～１１７９頁に見ることができ、これらのそれぞれの開示は、それらの全体が参照によって本明細書に組み入れられる。
いくつかの場合において、主鎖の修飾は、アニオン性、中性またはカチオン性基などの代替部分でホスホジエステル連結を置き換えることを含む。そのような修飾の例としては、アニオン性ヌクレオシド間連結；Ｎ３’－Ｐ５’ホスホルアミデート修飾；ボラノホスフェートＤＮＡ；プロオリゴヌクレオチド；中性ヌクレオシド間連結、例えば、メチルホスホネート；アミド連結ＤＮＡ；メチレン（メチルイミノ）連結；ホルムアセタールおよびチオホルムアセタール連結；スルホニル基を含有する主鎖；モルホリノオリゴ；ペプチド核酸（ＰＮＡ）；ならびに正に荷電したデオキシリボ核酸グアニジン（ＤＮＧ）オリゴ（Ｍｉｃｋｌｅｆｉｅｌｄ、２００１、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ８巻：１１５７～１１７９頁）が挙げられ、その開示はその全体が参照によって本明細書に組み入れられる。修飾された核酸は、１つまたはそれ以上の修飾、例えば、ホスホジエステルおよびホスホロチオエート連結の組み合わせなどのホスフェート連結の組み合わせを含むキメラまたは混合主鎖を含むことができる。
ホスフェートについての代替物としては、例えば、短鎖アルキルまたはシクロアルキルのヌクレオシド間連結、混合ヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルのヌクレオシド間連結、または１つもしくはそれ以上の短鎖ヘテロ原子または複素環のヌクレオシド間連結が挙げられる。これらとしては、モルホリノ連結を有するもの（一部分において、ヌクレオシドの糖部分から形成される）；シロキサン主鎖；スルフィド、スルホキシドおよびスルホン主鎖；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖；アルケン含有主鎖；スルファメート主鎖；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ主鎖；スルホネートおよびスルホンアミド主鎖；アミド主鎖；ならびに混合Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２構成部分を有する他のものが挙げられる。多数の米国特許が、これらの種類のホスフェート置き換えの作製方法および使用方法を開示しており、限定されるものではないが、米国特許第５，０３４，５０６号；同第５，１６６，３１５号；同第５，１８５，４４４号；同第５，２１４，１３４号；同第５，２１６，１４１号；同第５，２３５，０３３号；同第５，２６４，５６２号；同第５，２６４，５６４号；同第５，４０５，９３８号；同第５，４３４，２５７号；同第５，４６６，６７７号；同第５，４７０，９６７号；同第５，４８９，６７７号；同第５，５４１，３０７号；同第５，５６１，２２５号；同第５，５９６，０８６号；同第５，６０２，２４０号；同第５，６１０，２８９号；同第５，６０２，２４０号；同第５，６０８，０４６号；同第５，６１０，２８９号；同第５，６１８，７０４号；同第５，６２３，０７０号；同第５，６６３，３１２号；同第５，６３３，３６０号；同第５，６７７，４３７号；および同第５，６７７，４３９号が挙げられ、これらのそれぞれの開示は、それらの全体が参照によって本明細書に組み入れられる。ヌクレオチド代替物において、ヌクレオチドの糖およびホスフェート部分の両方を、例えば、アミド型連結（アミノエチルグリシン）（ＰＮＡ）によって置き換えることができることも理解される。米国特許第５，５３９，０８２号；同第５，７１４，３３１号；および同第５，７１９，２６２号は、ＰＮＡ分子の作製方法および使用方法を教示しており、そのそれぞれは、参照によって本明細書に組み入れられる。Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９１、２５４巻、１４９７～１５００頁も参照されたい。例えば、細胞の取り込みを増強するために、ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログに他の種類の分子を連結する（コンジュゲートする）ことも可能である。コンジュゲートは、ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログに化学的に連結することができる。そのようなコンジュゲートとしては、限定されるものではないが、脂質部分、例えば、コレステロール部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８９、８６巻、６５５３～６５５６頁）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．、１９９４、４巻、１０５３～１０６０頁）、チオエーテル、例えば、ヘキシル－Ｓ－トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ａｎｎ．ＫＹ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１９９２、６６０巻、３０６～３０９頁；Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．、１９９３、３巻、２７６５～２７７０頁）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９９２、２０巻、５３３～５３８頁）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ－Ｂｅｈｍｏａｒａｓら、ＥＭ５ＯＪ、１９９１、１０巻、１１１１～１１１８頁；Ｋａｂａｎｏｖら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、１９９０、２５９巻、３２７～３３０頁；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ、１９９３、７５巻、４９～５４頁）、リン脂質、例えば、ジ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロールもしくはトリエチルアンモニウムｌ－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－Ｓ－Ｈ－ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．、１９９５、３６巻、３６５１～３６５４頁；Ｓｈｅａら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９９０、１８巻、３７７７～３７８３頁）、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、１９９５、１４巻、９６９～９７３頁）、またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．、１９９５、３６巻、３６５１～３６５４頁）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１９９５、１２６４巻、２２９～２３７頁）、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ－カルボニル－オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．、１９９６、２７７巻、９２３～９３７）が挙げられ、これらのそれぞれの開示は、それらの全体が参照によって本明細書に組み入れられる。多数の米国特許が、そのようなコンジュゲートの製造を教示しており、限定されるものではないが、米国特許第４，８２８，９７９号；同第４，９４８，８８２号；同第５，２１８，１０５号；同第５，５２５，４６５号；同第５，５４１，３１３号；同第５，５４５，７３０号；同第５，５５２，５３８号；同第５，５７８，７１７号、同第５，５８０，７３１号；同第５，５９１，５８４号；同第５，１０９，１２４号；同第５，１１８，８０２号；同第５，１３８，０４５号；同第５，４１４，０７７号；同第５，４８６，６０３号；同第５，５１２，４３９号；同第５，５７８，７１８号；同第５，６０８，０４６号；同第４，５８７，０４４号；同第４，６０５，７３５号；同第４，６６７，０２５号；同第４，７６２，７７９号；同第４，７８９，７３７号；同第４，８２４，９４１号；同第４，８３５，２６３号；同第４，８７６，３３５号；同第４，９０４，５８２号；同第４，９５８，０１３号；同第５，０８２，８３０号；同第５，１１２，９６３号；同第５，２１４，１３６号；同第５，２４５，０２２号；同第５，２５４，４６９号；同第５，２５８，５０６号；同第５，２６２，５３６号；同第５，２７２，２５０号；同第５，２９２，８７３号；同第５，３１７，０９８号；同第５，３７１，２４１号、同第５，３９１，７２３号；同第５，４１６，２０３号、同第５，４５１，４６３号；同第５，５１０，４７５号；同第５，５１２，６６７号；同第５，５１４，７８５号；同第５，５６５，５５２号；同第５，５６７，８１０号；同第５，５７４，１４２号；同第５，５８５，４８１号；同第５，５８７，３７１号；同第５，５９５，７２６号；同第５，５９７，６９６号；同第５，５９９，９２３号；同第５，５９９，９２８号および同第５，６８８，９４１号が挙げられ、これらのそれぞれの開示は、それらの全体が参照によって本明細書に組み入れられる。
非天然アミノ酸のタンパク質への複製、転写、翻訳および組み込みのための組成物ならびに方法において使用される核酸塩基を本明細書に記載する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の核酸塩基は、構造：
［式中、
それぞれのＸは、独立して、炭素または窒素であり；
Ｒ２は、Ｘが炭素である場合に存在し、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、メトキシ、メタンチオール、メタンセレノ、ハロゲン、シアノまたはアジド基であり；
それぞれのＹは、独立して、硫黄、酸素、セレンまたは第二級アミンであり；
それぞれのＥは、独立して、酸素、硫黄またはセレンであり；
波線は、リボシル、デオキシリボシルもしくはジデオキシリボシル部分、またはそれらのアナログとの結合点を示し、リボシル、デオキシリボシルもしくはジデオキシリボシル部分、またはそれらのアナログは、遊離形態であるか、場合によりα－チオトリホスフェート、β－チオトリホスフェートもしくはγ－チオトリホスフェート基を含むモノホスフェート、ジホスフェートまたはトリホスフェート基に接続されるか、あるいはＲＮＡもしくはＤＮＡ中、またはＲＮＡアナログもしくはＤＮＡアナログ中に含まれる］
を含む。
いくつかの実施形態において、Ｒ２は、低級アルキル（例えば、Ｃ１～Ｃ６）、水素またはハロゲンである。本明細書に記載の核酸塩基のいくつかの実施形態において、Ｒ２は、フルオロである。本明細書に記載の核酸塩基のいくつかの実施形態において、Ｘは、炭素である。本明細書に記載の核酸塩基のいくつかの実施形態において、Ｅは、硫黄である。本明細書に記載の核酸塩基のいくつかの実施形態において、Ｙは、硫黄である。
本明細書に記載の核酸塩基のいくつかの実施形態において、核酸塩基は、構造：
を有する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の核酸塩基は、構造：
を有する。本明細書に記載の核酸塩基のいくつかの実施形態において、Ｅは、硫黄であり、Ｙは、硫黄である。いくつかの実施形態において、波線は、リボシル、デオキシリボシルもしくはジデオキシリボシル部分、またはそれらのアナログとの結合点を示し、リボシル、デオキシリボシルもしくはジデオキシリボシル部分、またはそれらのアナログは、遊離形態であるか、モノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、α－チオトリホスフェート、β－チオトリホスフェートまたはγ－チオトリホスフェート基に接続されるか、あるいはＲＮＡもしくはＤＮＡ中、またはＲＮＡアナログもしくはＤＮＡアナログ中に含まれる。本明細書に記載の核酸塩基のいくつかの実施形態において、波線は、リボシルまたはデオキシリボシル部分との結合点を示す。本明細書に記載の核酸塩基のいくつかの実施形態において、波線は、トリホスフェート基に接続されるリボシルまたはデオキシリボシル部分との結合点を示す。本明細書に記載の核酸塩基のいくつかの実施形態において、核酸ポリマーの構成成分である。本明細書に記載の核酸塩基のいくつかの実施形態において、核酸塩基は、ｔＲＮＡの構成成分である。本明細書に記載の核酸塩基のいくつかの実施形態において、核酸塩基は、ｔＲＮＡ中のアンチコドンの構成成分である。本明細書に記載の核酸塩基のいくつかの実施形態において、核酸塩基は、ｍＲＮＡの構成成分である。本明細書に記載の核酸塩基のいくつかの実施形態において、核酸塩基は、ｍＲＮＡのコドンの構成成分である。本明細書に記載の核酸塩基のいくつかの実施形態において、核酸塩基は、ＲＮＡまたはＤＮＡの構成成分である。本明細書に記載の核酸塩基のいくつかの実施形態において、核酸塩基は、ＤＮＡ中のコドンの構成成分である。本明細書に記載の核酸塩基のいくつかの実施形態において、核酸塩基は、別の（例えば、相補的な）核酸塩基との核酸塩基対を形成し、それを形成することができ、またはそれを形成するように構成されている。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の核酸塩基は、構造：
［式中、
それぞれのＸは、独立して、炭素または窒素であり；
Ｒ２は、Ｘが窒素である場合に存在せず、Ｘが炭素である場合に存在し、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、メトキシ、メタンチオール、メタンセレノ、ハロゲン、シアノまたはアジドであり；
Ｙは、硫黄、酸素、セレンまたは第二級アミンであり；
Ｅは、酸素、硫黄またはセレンであり；
波線は、リボシル、デオキシリボシルもしくはジデオキシリボシル部分、またはそれらのアナログとの結合点を示し、リボシル、デオキシリボシルもしくはジデオキシリボシル部分、またはそれらのアナログは、遊離形態であるか、モノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、α－チオトリホスフェート、β－チオトリホスフェートまたはγ－チオトリホスフェート基に接続されるか、あるいはＲＮＡもしくはＤＮＡ中、またはＲＮＡアナログもしくはＤＮＡアナログ中に含まれる］
を有する。
いくつかの実施形態において、それぞれのＸは、炭素である。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＸは、炭素である。いくつかの実施形態において、１つのＸは、炭素である。いくつかの実施形態において、少なくとも２つのＸは、炭素である。いくつかの実施形態において、２つのＸは、炭素である。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＸは、窒素である。いくつかの実施形態において、１つのＸは、窒素である。いくつかの実施形態において、少なくとも２つのＸは、窒素である。いくつかの実施形態において、２つのＸは、窒素である。
いくつかの実施形態において、Ｙは、硫黄である。いくつかの実施形態において、Ｙは、酸素である。いくつかの実施形態において、Ｙは、セレンである。いくつかの実施形態において、Ｙは、第二級アミンである。
いくつかの実施形態において、Ｅは、硫黄である。いくつかの実施形態において、Ｅは、酸素である。いくつかの実施形態において、Ｅは、セレンである。
いくつかの実施形態において、Ｒ２は、Ｘが炭素である場合に存在する。いくつかの実施形態において、Ｒ２は、Ｘが窒素の場合に存在しない。いくつかの実施形態において、それぞれのＲ２は、存在する場合、水素である。いくつかの実施形態において、Ｒ２は、メチル、エチルまたはプロピルなどのアルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ２は、－ＣＨ＝ＣＨ２などのアルケニルである。いくつかの実施形態において、Ｒ２は、エチニルなどのアルキニルである。いくつかの実施形態において、Ｒ２は、メトキシである。いくつかの実施形態において、Ｒ２は、メタンチオールである。いくつかの実施形態において、Ｒ２は、メタンセレノである。いくつかの実施形態において、Ｒ２は、クロロ、ブロモまたはフルオロなどのハロゲンである。いくつかの実施形態において、Ｒ２は、シアノである。いくつかの実施形態において、Ｒ２は、アジドである。
いくつかの実施形態において、Ｅは、硫黄であり、Ｙは、硫黄であり、それぞれのＸは、独立して、炭素または窒素である。いくつかの実施形態において、Ｅは、硫黄であり、Ｙは、硫黄であり、それぞれのＸは、炭素である。
いくつかの実施形態において、核酸塩基は、構造
を有する。いくつかの実施形態において、核酸塩基は、構造
を有する。
いくつかの実施形態において、核酸塩基は、構造
を有する。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される核酸塩基は、相補的な塩基対形成核酸塩基に（例えば、非共有結合的に）結合して、核酸塩基と非天然塩基対（ＵＢＰ）を形成するか、核酸塩基と塩基対形成することができるか、または核酸塩基と塩基対形成するように構成されている。いくつかの実施形態において、相補的な塩基対形成核酸塩基は、
から選択される。
一態様において、二本鎖オリゴヌクレオチドの二本鎖であって、第１のオリゴヌクレオチド鎖は、本明細書に開示される核酸塩基を含み、第２の相補的なオリゴヌクレオチド鎖は、相補的な塩基対形成核酸塩基をその相補的な塩基対形成部位に含む、二本鎖オリゴヌクレオチドの二本鎖を本明細書において提供する。いくつかの実施形態において、第１のオリゴヌクレオチド鎖は、
を含み、第２の鎖は、
からなる群から選択される相補的な塩基対形成核酸塩基をその相補的な塩基対形成部位に含む。
さらなる態様において、本明細書に記載の核酸塩基を含むトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）であって、核酸塩基を含むアンチコドン；および、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼによる、ｔＲＮＡの非天然アミノ酸による選択的チャージを促進する認識エレメント；を含むトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）を本明細書において提供する。いくつかの実施形態において、核酸塩基は、ｔＲＮＡのアンチコドン領域に位置する。いくつかの実施形態において、核酸塩基は、アンチコドンの第１の位置に位置する。いくつかの実施形態において、核酸塩基は、アンチコドンの第２の位置に位置する。いくつかの実施形態において、核酸塩基は、アンチコドンの第３の位置に位置する。いくつかの実施形態において、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼは、メタノサルシナ属またはそのバリアントに由来する。いくつかの実施形態において、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼは、メタノコッカス属（メタノカルドコッカス属）またはそのバリアントに由来する。いくつかの実施形態において、非天然アミノ酸は、芳香族部分を含む。いくつかの実施形態において、非天然アミノ酸は、リジン誘導体である。いくつかの実施形態において、非天然アミノ酸は、フェニルアラニン誘導体である。
式：
Ｎ１－Ｚｘ－Ｎ２
［式中、
Ｚは、本明細書に記載の核酸塩基であり、リボシルもしくはデオキシリボシル、またはそれらのアナログに結合しており；
Ｎ１は、Ｚのリボシルもしくはデオキシリボシル、またはそれらのアナログの５’末端で結合した、１つまたはそれ以上のヌクレオチドもしくはそのアナログ、または末端ホスフェート基であり；
Ｎ２は、Ｚのリボシルもしくはデオキシリボシル、またはそれらのアナログの３’末端に結合した、１つまたはそれ以上のヌクレオチドもしくはそのアナログ、または末端ヒドロキシル基であり；
ｘは、１～２０の整数である］
を含む構造も本明細書において提供する。
いくつかの実施形態において、Ｎ１は、Ｚのリボシルもしくはデオキシリボシル部分、またはそれらのアナログの５’末端で結合した、１つまたはそれ以上のヌクレオチドもしくはそのアナログである。リボシルもしくはデオキシリボシル部分の５’末端への結合は、ホスホジエステルによってである。いくつかの実施形態において、Ｎ１は、Ｚのリボシルもしくはデオキシリボシル部分、またはそれらのアナログの５’末端で結合した末端ホスフェート基である。いくつかの実施形態において、Ｎ２は、Ｚのリボシルもしくはデオキシリボシル部分、またはそれらのアナログの３’末端に結合した、１つまたはそれ以上のヌクレオチドもしくはそのアナログである。リボシルもしくはデオキシリボシル部分の３’末端への結合は、ホスホジエステルによってである。いくつかの実施形態において、Ｎ２は、Ｚのリボシルもしくはデオキシリボシル部分、またはそれらのアナログの３’末端に結合した末端ヒドロキシル基である。
いくつかの実施形態において、ｘは、１～２０の整数である。いくつかの実施形態において、ｘは、１～１５の整数である。いくつかの実施形態において、ｘは、１～１０の整数である。いくつかの実施形態において、ｘは、１～５の整数である。いくつかの実施形態において、ｘは、１である。いくつかの実施形態において、ｘは、２である。いくつかの実施形態において、ｘは、３である。いくつかの実施形態において、ｘは、４である。いくつかの実施形態において、ｘは、５である。いくつかの実施形態において、ｘは、６である。いくつかの実施形態において、ｘは、７である。いくつかの実施形態において、ｘは、８である。いくつかの実施形態において、ｘは、９である。いくつかの実施形態において、ｘは、１０である。いくつかの実施形態において、ｘは、１１である。いくつかの実施形態において、ｘは、１２である。いくつかの実施形態において、ｘは、１３である。いくつかの実施形態において、ｘは、１４である。いくつかの実施形態において、ｘは、１５である。いくつかの実施形態において、ｘは、１６である。いくつかの実施形態において、ｘは、１７である。いくつかの実施形態において、ｘは、１８である。いくつかの実施形態において、ｘは、１９である。いくつかの実施形態において、ｘは、２０である。
いくつかの実施形態において、Ｚは、本明細書において詳述される構造
を有する。いくつかの実施形態において、Ｚは、構造
を有する。
いくつかの実施形態において、式Ｎ１－Ｚｘ－Ｎ２の構造は、遺伝子をコードする。いくつかの実施形態において、Ｚｘは、遺伝子の翻訳領域に位置する。いくつかの実施形態において、Ｚｘは、遺伝子の非翻訳領域に位置する。いくつかの実施形態において、構造は、５’または３’非翻訳領域（ＵＴＲ）をさらに含む。いくつかの実施形態において、構造は、ターミネーター領域をさらに含む。いくつかの実施形態において、構造は、プロモーター領域をさらに含む。
さらなる態様において、ポリヌクレオチドライブラリーであって、ライブラリーは、少なくとも５０００の固有のポリヌクレオチドを含み、それぞれのポリヌクレオチドは、本明細書に開示される少なくとも１つの核酸塩基を含む、ポリヌクレオチドライブラリーを本明細書において提供する。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドライブラリーは、少なくとも１つの遺伝子をコードする。
さらに別の態様において、ヌクレオシド三リン酸であって、核酸塩基は、
から選択される、ヌクレオシド三リン酸を本明細書において提供する。いくつかの実施形態において、核酸塩基は、
である。いくつかの実施形態において、核酸塩基は、
である。いくつかの実施形態において、核酸塩基は、
である。いくつかの実施形態において、核酸塩基は、
である。いくつかの実施形態において、ヌクレオシドは、リボースを含む。いくつかの実施形態において、ヌクレオシドは、デオキシリボースを含む。
核酸の塩基対形成性；例示的な塩基対
いくつかの実施形態において、非天然ヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡへの組み込みの間またはその後に、別の非天然ヌクレオチドと塩基対（非天然塩基対；ＵＢＰ）を形成する。いくつかの実施形態において、安定に組み込まれた非天然核酸は、別の核酸、例えば、天然または非天然核酸と塩基対を形成することができる非天然核酸である。いくつかの実施形態において、安定に組み込まれた非天然核酸は、別の非天然核酸と塩基対（非天然核酸塩基対（ＵＢＰ））を形成することができる非天然核酸である。例えば、第１の非天然核酸は、第２の非天然核酸と塩基対を形成することができる。例えば、核酸への組み込みの間、またはその後に塩基対形成することができる非天然ヌクレオシド三リン酸の１つの対としては、（ｄ）５ＳＩＣＳのトリホスフェート（（ｄ）５ＳＩＣＳＴＰ）および（ｄ）ＮａＭのトリホスフェート（（ｄ）ＮａＭＴＰ）が挙げられる。他の例としては、限定されるものではないが、（ｄ）ＣＮＭＯのトリホスフェート（（ｄ）ＣＮＭＯＴＰ）および（ｄ）ＴＰＴ３のトリホスフェート（（ｄ）ＴＰＴ３ＴＰ）が挙げられる。そのような非天然ヌクレオチドは、リボースまたはデオキシリボース糖部分（「（ｄ）」によって示される）を有することができる。例えば、核酸に組み込まれる場合に塩基対形成することができる非天然ヌクレオシド三リン酸の１つの対としては、ＴＡＴ１のトリホスフェート（（ｄ）ＴＡＴ１ＴＰ）およびＮａＭのトリホスフェート（（ｄ）ＮａＭＴＰ）が挙げられる。いくつかの実施形態において、核酸に組み込まれる場合に塩基対形成することができる非天然ヌクレオシド三リン酸の１つの対としては、ｄＣＮＭＯのトリホスフェート（ｄＣＮＭＯＴＰ）およびＴＡＴ１のトリホスフェート（ＴＡＴ１ＴＰ）が挙げられる。いくつかの実施形態において、核酸に組み込まれる場合に塩基対形成することができる非天然ヌクレオシド三リン酸の１つの対としては、ｄＴＰＴ３のトリホスフェート（ｄＴＰＴ３ＴＰ）およびＮａＭのトリホスフェート（ＮａＭＴＰ）が挙げられる。いくつかの実施形態において、非天然核酸は、実質的に、天然核酸（Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）と塩基対を形成しない。いくつかの実施形態において、安定に組み込まれた非天然核酸は、天然核酸と塩基対を形成することができる。
いくつかの実施形態において、安定に組み込まれた非天然（デオキシ）リボヌクレオチドは、ＵＢＰを形成することができる非天然（デオキシ）リボヌクレオチドであるが、実質的に、それぞれの天然（デオキシ）リボヌクレオチドのいずれかと塩基対を形成しない。いくつかの実施形態において、安定に組み込まれた非天然（デオキシ）リボヌクレオチドは、ＵＢＰを形成することができる非天然（デオキシ）リボヌクレオチドであるが、実質的に、１つまたはそれ以上の天然核酸と塩基対を形成しない。例えば、安定に組み込まれた非天然核酸は、実質的に、Ａ、ＴおよびＣと塩基対を形成することができないが、Ｇと塩基対を形成することができる。例えば、安定に組み込まれた非天然核酸は、実質的に、Ａ、ＴおよびＧと塩基対を形成することができないが、Ｃと塩基対を形成することができる。例えば、安定に組み込まれた非天然核酸は、実質的に、Ｃ、ＧおよびＡと塩基対を形成することができないが、Ｔと塩基対を形成することができる。例えば、安定に組み込まれた非天然核酸は、実質的に、Ｃ、ＧおよびＴと塩基対を形成することができないが、Ａと塩基対を形成することができる。例えば、安定に組み込まれた非天然核酸は、実質的に、ＡおよびＴと塩基対を形成することができないが、ＣおよびＧと塩基対を形成することができる。例えば、安定に組み込まれた非天然核酸は、実質的に、ＡおよびＣと塩基対を形成することができないが、ＴおよびＧと塩基対を形成することができる。例えば、安定に組み込まれた非天然核酸は、実質的に、ＡおよびＧと塩基対を形成することができないが、ＣおよびＴと塩基対を形成することができる。例えば、安定に組み込まれた非天然核酸は、実質的に、ＣおよびＴと塩基対を形成することができないが、ＡおよびＧと塩基対を形成することができる。例えば、安定に組み込まれた非天然核酸は、実質的に、ＣおよびＧと塩基対を形成することができないが、ＴおよびＧと塩基対を形成することができる。例えば、安定に組み込まれた非天然核酸は、実質的に、ＴおよびＧと塩基対を形成することができないが、ＡおよびＧと塩基対を形成することができる。例えば、安定に組み込まれた非天然核酸は、実質的に、Ｇと塩基対を形成することができないが、Ａ、ＴおよびＣと塩基対を形成することができる。例えば、安定に組み込まれた非天然核酸は、実質的に、Ａと塩基対を形成することができないが、Ｇ、ＴおよびＣと塩基対を形成することができる。例えば、安定に組み込まれた非天然核酸は、実質的に、Ｔと塩基対を形成することができないが、Ｇ、ＡおよびＣと塩基対を形成することができる。例えば、安定に組み込まれた非天然核酸は、実質的に、Ｃと塩基対を形成することができないが、Ｇ、ＴおよびＡと塩基対を形成することができる。
例示的には、インビボでの条件下で、非天然ＤＮＡまたはＲＮＡ塩基対（ＵＢＰ）を形成することができる非天然ヌクレオチドとしては、限定されるものではないが、５ＳＩＣＳ、ｄ５ＳＩＣＳ、ＮａＭ、ｄＮａＭ、ｄＴＰＴ３、ｄＭＴＭＯ、ｄＣＮＭＯ、ＴＡＴ１、およびそれらの組み合わせが挙げられる。いくつかの実施形態において、インビボでの条件下で、非天然ＤＮＡまたはＲＮＡ塩基対（ＵＢＰ）を形成することができる非天然ヌクレオチドとしては、限定されるものではないが、５ＳＩＣＳ、ＮａＭ、ＴＰＴ３、ＭＴＭＯ、ＣＮＭＯ、ＴＡＴ１、およびそれらの組み合わせが挙げられ、ここで、ヌクレオチドの糖部分は、デオキシリボース糖である。いくつかの実施形態において、インビボでの条件下で、非天然ＤＮＡまたはＲＮＡ塩基対（ＵＢＰ）を形成することができる非天然ヌクレオチドとしては、限定されるものではないが、５ＳＩＣＳ、ＮａＭ、ＴＰＴ３、ＭＴＭＯ、ＣＮＭＯ、ＴＡＴ１、およびそれらの組み合わせが挙げられ、ここで、ヌクレオチドの糖部分は、リボース糖である。いくつかの実施形態において、インビボでの条件下で、非天然ＤＮＡまたはＲＮＡ塩基対（ＵＢＰ）を形成することができる非天然ヌクレオチドとしては、限定されるものではないが、（ｄ）５ＳＩＣＳ、（ｄ）ＮａＭ、（ｄ）ＴＰＴ３、（ｄ）ＭＴＭＯ、（ｄ）ＣＮＭＯ、（ｄ）ＴＡＴ１、およびそれらの組み合わせが挙げられる。いくつかの実施形態において、非天然ヌクレオチド塩基対としては、限定されるものではないが、
が挙げられ、ここで、糖部分は、本明細書に記載の任意の実施形態またはバリエーションである。いくつかの実施形態において、非天然ヌクレオチド塩基対としては、限定されるものではないが、
が挙げられる。任意のそのような実施形態において、非天然塩基に結合した１つまたは両方のデオキシリボースは、リボースで置換することができる。
操作された生物
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法およびプラスミドは、操作された生物、例えば、非天然ヌクレオチドまたは非天然核酸塩基対（ＵＢＰ）を組み込み、複製する生物を生じさせるためにさらに使用され、非天然アミノ酸残基を含有するタンパク質を翻訳するために使用されるｍＲＮＡおよびｔＲＡＮを転写するために、非天然ヌクレオチドを含有する核酸を使用することもできる。いくつかの例において、生物は、非ヒト半合成生物（ＳＳＯ）である。いくつかの例において、生物は、半合成生物（ＳＳＯ）である。いくつかの例において、ＳＳＯは、細胞である。いくつかの例において、インビボの方法は、半合成生物（ＳＳＯ）を含む。いくつかの例において、半合成生物は、微生物を含む。いくつかの例において、生物は、細菌を含む。いくつかの例において、生物は、グラム陰性細菌を含む。いくつかの例において、生物は、グラム陽性細菌を含む。いくつかの例において、生物は、大腸菌を含む。そのような改変された生物は、ＤＮＡ修復機構、改変されたポリメラーゼ、ヌクレオチド輸送体、または他の構成成分などの追加の構成成分を、さまざまに含む。いくつかの例において、ＳＳＯは、大腸菌株ＹＺ３を含む。いくつかの例において、ＳＳＯは、大腸菌株ＭＬ１またはＭＬ２、例えば、その開示が、その全体が参照によって本明細書に組み入れられるＬｅｄｂｅｔｔｅｒら、Ｊ．Ａｍ Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１８、１４０巻（２号）、７５８頁の図１（Ｂ～Ｄ）に記載の株を含む。
いくつかの例において、用いられる細胞は、異種タンパク質、例えば、非天然ヌクレオシド三リン酸を細胞に輸送することができるヌクレオシド三リン酸輸送体、および場合により非天然ヌクレオチドを欠くＤＮＡを排除するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系をコードする発現カセットで遺伝的に形質転換される（例えば、大腸菌株ＹＺ３、ＭＬ１またはＭＬ２）。いくつかの例において、細胞は、非天然核酸の取り込みのための増強された活性をさらに含む。いくつかの場合において、細胞は、非天然核酸の移入のための増強された活性をさらに含む。
いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９および適切なガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、別々のプラスミド上でコードされる。いくつかの例において、ＣＡＳ９およびｓｇＲＮＡは、同じプラスミド上でコードされる。いくつかの場合において、Ｃａｓ９、ｓｇＲＮＡをコードする核酸分子、または非天然ヌクレオチドを含む核酸分子は、１つまたはそれ以上のプラスミド上に位置する。いくつかの例において、Ｃａｓ９は、第１のプラスミド上でコードされ、ｓｇＲＮＡ、および非天然ヌクレオチドを含む核酸分子は、第２のプラスミド上でコードされる。いくつかの例において、Ｃａｓ９、ｓｇＲＮＡ、および非天然ヌクレオチドを含む核酸分子は、同じプラスミド上でコードされる。いくつかの例において、核酸分子は、２つまたはそれ以上の非天然ヌクレオチドを含む。いくつかの例において、Ｃａｓ９は、宿主生物のゲノムに組み込まれ、ｓｇＲＮＡは、プラスミド上、または生物のゲノム中でコードされる。
いくつかの例において、Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡをコードする第１のプラスミド、ならびに非天然ヌクレオチドを含む核酸分子をコードする第２のプラスミドは、操作された微生物に導入される。いくつかの例において、Ｃａｓ９をコードする第１のプラスミド、ならびにｓｇＲＮＡ、および非天然ヌクレオチドを含む核酸分子をコードする第２のプラスミドは、操作された微生物に導入される。いくつかの例において、Ｃａｓ９、ｓｇＲＮＡ、および非天然ヌクレオチドを含む核酸分子をコードするプラスミドは、操作された微生物に導入される。いくつかの例において、核酸分子は、２つまたはそれ以上の非天然ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態において、そのＤＮＡ（プラスミドまたはゲノム）内に少なくとも１つの非天然ヌクレオチドおよび／または少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）が組み込まれた生細胞が、作製される。いくつかの例において、非天然塩基対は、それらのそれぞれのトリホスフェートとしての非天然相互塩基対形成ヌクレオチドが、ヌクレオチド三リン酸輸送体の作用によって細胞に取り込まれる場合、インビボの条件下で非天然塩基対を形成することができる非天然相互塩基対形成ヌクレオチドの対を含む。いくつかの例において、非天然塩基対は、それらのそれぞれのトリホスフェートとしての非天然相互塩基対形成ヌクレオチドが、ヌクレオチド三リン酸輸送体の作用によって細胞に取り込まれる場合、インビボの条件下で非天然塩基対を形成するように構成された非天然相互塩基対形成ヌクレオチドの対を含む。細胞は、ヌクレオチド三リン酸輸送体が発現し、非天然ヌクレオチドの細胞への輸送が利用可能であるように、ヌクレオチド三リン酸輸送体をコードする発現カセットによって、遺伝的に形質転換することができる。細胞は、原核細胞または真核細胞であり、非天然相互塩基対形成ヌクレオチドの対は、それらのそれぞれのトリホスフェートとして、ｄＴＰＴ３のトリホスフェート（ｄＴＰ３ＴＰ）およびｄＮａＭのトリホスフェート（ｄＮａＭＴＰ）またはｄＣＮＭＯのトリホスフェート（ｄＣＮＭＯＴＰ）であることができる。
いくつかの実施形態において、細胞は、核酸、例えば、そのような非天然ヌクレオチドを細胞に輸送することができるヌクレオチド三リン酸輸送体をコードする発現カセットで、遺伝的に形質転換される細胞である。細胞は、異種ヌクレオシド三リン酸輸送体を含むことができ、ここで、異種ヌクレオシド三リン酸輸送体は、天然および非天然ヌクレオシド三リン酸を細胞に輸送することができる。
いくつかの場合において、本明細書に記載の方法は、遺伝的に形質転換された細胞を、リン酸カリウムおよび／またはホスファターゼもしくはヌクレオチダーゼの阻害剤の存在下でそれぞれのトリホスフェートと接触させる工程も含む。そのような接触の間、またはその後、細胞は、細胞の増殖および複製に好適な生命維持培地内に置くことができる。細胞は、非天然ヌクレオチドのそれぞれのトリホスフェート形態が、細胞の少なくとも１つの複製サイクルを通して細胞内の核酸に組み込まれるように、生命維持培地中で維持することができる。非天然相互塩基対形成ヌクレオチドの対は、それぞれのトリホスフェートとして、ｄＴＰＴ３のトリホスフェート（ｄＴＰＴ３ＴＰ）およびｄＣＮＭＯまたはｄＮａＭのトリホスフェート（ｄＣＮＯＭまたはｄＮａＭＴＰ）を含むことができ、細胞は、大腸菌であり、ｄＴＰＴ３ＴＰおよびｄＮａＭＴＰは、輸送体ＰｔＮＴＴ２によって大腸菌に移入することができ、Ｐｏｌ ＩＩＩまたはＰｏｌ ＩＩなどの大腸菌ポリメラーゼは、非天然トリホスフェートを使用して、ＵＢＰを含有するＤＮＡを複製し、それにより非天然ヌクレオチドおよび／または非天然塩基対を細胞環境内の細胞の核酸に組み込むことができる。加えて、ＮａＭＴＰおよびＴＡＴ１ＴＰ、５ＦＭＴＰ、ならびにＴＰＴ３ＴＰなどのリボヌクレオチドは、いくつかの例において、輸送体ＰｔＮＴＴ２によって大腸菌に移入される。
３つまたはそれ以上の非天然塩基対形成ヌクレオチドの使用を含む組成物および方法を本明細書に記載する。そのような塩基対形成ヌクレオチドは、いくつかの場合において、ヌクレオチド輸送体の使用により、または当技術分野において公知の標準的な核酸形質転換法（例えば、エレクトロポレーション、化学的形質転換または他の方法）により、細胞に入る。いくつかの場合において、塩基対形成非天然ヌクレオチドは、プラスミドなどのポリヌクレオチドの一部として、細胞に入る。ポリヌクレオチド（ＲＮＡまたはＤＮＡ）の一部として細胞に入る１つまたはそれ以上の塩基対形成非天然ヌクレオチドは、それ自身がインビボで複製される必要はない。例えば、第１の非天然塩基対を形成するように構成された塩基を有する第１の非天然デオキシリボヌクレオチドおよび第２の非天然デオキシリボヌクレオチドを含む二本鎖ＤＮＡプラスミドまたは他の核酸は、細胞にエレクトロポレーションされる。細胞培地は、互いに第２の非天然塩基対を形成するように構成された塩基を有する第３の非天然デオキシリボヌクレオチド、第４の非天然デオキシリボヌクレオチドで処理され、ここで、第１の非天然デオキシリボヌクレオチドの塩基および第３の非天然デオキシリボヌクレオチドの塩基は、第２の非天然塩基対を形成し、第２の非天然デオキシリボヌクレオチドの塩基および第４の非天然デオキシリボヌクレオチドの塩基は、第３の非天然塩基対を形成する。いくつかの例において、当初に形質転換された二本鎖ＤＮＡプラスミドのインビボ複製は、その後、第３の非天然デオキシリボヌクレオチドおよび第４の非天然デオキシリボヌクレオチドを含む複製されたプラスミドをもたらす。あるいは、または組み合わせて、第３の非天然デオキシリボヌクレオチドおよび第４の非天然デオキシリボヌクレオチドのリボヌクレオチドのバリアントは、細胞培地に添加される。これらのリボヌクレオチドは、いくつかの例において、ｍＲＮＡまたはｔＲＮＡなどのＲＮＡに組み込まれる。いくつかの例において、第１、第２、第３および第４のデオキシヌクレオチドは、異なる塩基を含む。いくつかの例において、第１、第３および第４のデオキシヌクレオチドは、異なる塩基を含む。いくつかの例において、第１および第３のデオキシヌクレオチドは、同じ塩基を含む。
本発明の方法の実施によって、当業者は、個々の細胞の少なくともいくつかの内で維持される少なくとも１つの核酸内に、少なくとも１つの非天然ヌクレオチドおよび／または少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を有する、生きており、増殖する細胞の集団を得ることができ、ここで、少なくとも１つの核酸は、細胞内で安定に伝播され、細胞は、生物の増殖および複製に好適な生命維持培地中で非天然ヌクレオチドと接触させた（例えば、その存在下で増殖させた）場合に、１つまたはそれ以上の非天然ヌクレオチドのトリホスフェート形態の細胞取り込みを提供するために好適なヌクレオチド三リン酸輸送体を発現する。
ヌクレオチド三リン酸輸送体による細胞への輸送後、非天然塩基対形成ヌクレオチドは、細胞機構、例えば、細胞自身のＤＮＡおよび／もしくはＲＮＡポリメラーゼ、異種ポリメラーゼ、または指向進化を使用して進化したポリメラーゼにより細胞内の核酸に組み込まれる（Ｃｈｅｎ Ｔ、Ｒｏｍｅｓｂｅｒｇ ＦＥ、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２０１４年１月２１日；５８８巻（２号）：２１９～２９頁；Ｂｅｔｚ Ｋら、Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．２０１３年１２月１１日；１３５巻（４９号）：１８６３７～４３頁；これらのそれぞれの開示は、それらの全体が、参照によって本明細書に組み入れられる）。非天然ヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、構造ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、および自己複製核酸（例えば、プラスミド、ウイルスまたはベクター）などの細胞核酸に組み込むことができる。
いくつかの場合において、遺伝子操作された細胞は、細胞への核酸、例えば異種核酸の導入によって作製される。本明細書に記載の任意の細胞は、宿主細胞であり、発現ベクターを含むことができる。一実施形態において、宿主細胞は、原核細胞である。別の実施形態において、宿主細胞は、大腸菌である。いくつかの実施形態において、細胞は、１つまたはそれ以上の異種ポリヌクレオチドを含む。核酸試薬は、さまざまな技法を使用して、微生物に導入することができる。さまざまな生物に異種核酸を導入するために使用される方法の非限定的な例としては、形質転換、トランスフェクション、形質導入、エレクトロポレーション、超音波媒介形質転換、コンジュゲーション、微粒子銃などが挙げられる。いくつかの例において、担体分子の付加（例えば、ビス－ベンゾイミダゾリル化合物、例えば、米国特許第５，５９５，８９９号を参照されたい）は、典型的には、従来の方法によって形質転換することが困難であると考えられる細胞におけるＤＮＡの取り込みを増加させることができる。形質転換の従来の方法は、当業者には容易に利用可能であり、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．、Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈおよびＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．において見ることができ、この開示は、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる。
いくつかの例において、遺伝的形質転換は、限定されるものではないが、プラスミド、ウイルスベクター、ウイルス核酸、ファージ核酸、ファージ、コスミドおよび人工染色体における発現カセットの直接導入を使用して、または細胞中の遺伝子材料もしくはカチオン性リポソームなどの担体の導入を介して、得られる。そのような方法は、当技術分野において利用可能であり、本明細書に記載の方法における使用のために容易に適合可能である。導入ベクターは、遺伝子を細胞に送達するために使用される任意のヌクレオチド構築物（例えばプラスミド）であるか、または遺伝子を送達する一般的戦略の一部として、例えば、組換えレトロウイルスもしくはアデノウイルスの一部としてである（Ｒａｍら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３巻：８３～８８頁、（１９９３））。ウイルスベクター、化学的トランスフェクタント、またはエレクトロポレーションおよびＤＮＡの直接拡散などの物理機械的方法を含む、トランスフェクションのための適切な手段は、例えば、Ｗｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４７巻、１４６５～１４６８頁、（１９９０）；および、Ｗｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．、Ｎａｔｕｒｅ、３５２巻、８１５～８１８頁、（１９９１）に記載されており、これらのそれぞれの開示は、それらの全体が参照によって本明細書に組み入れられる。
例えば、ヌクレオシド三リン酸輸送体もしくはポリメラーゼ発現カセットをコードするＤＮＡ、および／またはベクターは、限定されるものではないが、カルシウム媒介形質転換、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、微粒子銃などを含む任意の方法によって、細胞に導入することができる。
いくつかの場合において、細胞は、細胞内の１つまたはそれ以上の核酸に組み込まれた非天然ヌクレオシド三リン酸を含む。例えば、細胞は、細胞内に維持されたＤＮＡまたはＲＮＡ内の少なくとも１つの非天然ヌクレオチドを組み込むことができる生細胞である。細胞は、非天然相互塩基対形成ヌクレオチドの対を含む少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を、インビボ条件下で細胞内の核酸に組み込むこともでき、ここで、非天然相互塩基対形成ヌクレオチド、例えば、それらのそれぞれのトリホスフェートは、ヌクレオシド三リン酸輸送体の作用によって細胞に取り込まれ、遺伝子は、遺伝的形質転換によって細胞に存在する（例えば、導入された）。例えば、細胞内に維持された核酸への組み込みの際に、ｄＴＰＴ３およびｄＣＮＭＯは、例えば、ｄＴＰＴ３ＴＰおよびｄＣＮＭＯＴＰを含む生命維持培地中で増殖する場合に、生物のＤＮＡ複製機構によって安定に伝播される安定な非天然塩基対を形成することができる。
いくつかの場合において、細胞は、非天然ヌクレオチドを含有する核酸を複製することができる。そのような方法としては、インビボ条件下で、それぞれのトリホスフェートとして、１つまたはそれ以上の非天然ヌクレオチドを細胞に輸送することができるヌクレオシド三リン酸輸送体をコードする発現カセットで細胞を遺伝的に形質転換することを含むことができる。あるいは、コードされたヌクレオシド三リン酸輸送体を発現することができる発現カセットで、以前に遺伝的に形質転換された細胞を利用することができる。方法はまた、細胞の増殖および複製のために好適な生命維持培地中で、遺伝的に形質転換された細胞を、リン酸カリウムおよび少なくとも１つの非天然ヌクレオチド（例えば、非天然塩基対（ＵＢＰ）を形成することができる２つの相互塩基対形成ヌクレオチド）のそれぞれのトリホスフェート形態に接触または曝露する工程、ならびにインビボ条件下、細胞の少なくとも１つの複製サイクルにより、少なくとも１つの非天然ヌクレオチド（例えば、非天然塩基対（ＵＢＰ）を形成することができる２つの相互塩基対形成ヌクレオチド）のそれぞれのトリホスフェート形態の存在下、生命維持培地中で形質転換された細胞を維持する工程を含むことができる。方法はまた、細胞の増殖および複製のために好適な生命維持培地中で、遺伝的に形質転換された細胞を、リン酸カリウムおよび少なくとも１つの非天然ヌクレオチド（例えば、非天然塩基対（ＵＢＰ）を形成するように構成された２つの相互塩基対形成ヌクレオチド）のそれぞれのトリホスフェート形態に接触または曝露する工程、ならびにインビボ条件下、細胞の少なくとも１つの複製サイクルにより、少なくとも１つの非天然ヌクレオチド（例えば、非天然塩基対（ＵＢＰ）を形成するように構成された２つの相互塩基対形成ヌクレオチド）のそれぞれのトリホスフェート形態の存在下、生命維持培地中で形質転換された細胞を維持する工程を含むことができる。
いくつかの実施形態において、細胞は、安定に組み込まれた非天然核酸を含む。いくつかの実施形態は、細胞内で維持された核酸内のＡ、Ｇ、ＴおよびＣ以外のヌクレオチドを安定に組み込む細胞（例えば大腸菌として）を含む。例えば、Ａ、Ｇ、ＴおよびＣ以外のヌクレオチドは、ｄ５ＳＩＣＳ、ｄＣＮＭＯ、ｄＮａＭおよび／またはｄＴＰＴ３であり、細胞の核酸への組み込みの際に、核酸内で安定な非天然塩基対を形成することができる。一態様において、非天然ヌクレオチドおよび非天然塩基対は、三リン酸輸送体についての遺伝子で形質転換された生物が、リン酸カリウム、ならびにｄ５ＳＩＣＳ、ｄＮａＭ、ｄＣＮＭＯおよび／またはｄＴＰＴ３のトリホスフェート形態を含む、生命維持培地中で増殖する場合に、生物の複製装置によって安定に伝播される。
いくつかの場合において、細胞は、拡張された遺伝子アルファベットを含む。細胞は、安定に組み込まれた非天然核酸を含むことができる。いくつかの実施形態において、拡張された遺伝子アルファベットを有する細胞は、別の非天然ヌクレオチドと対形成することができる非天然ヌクレオチドを含有する非天然核酸を含む。いくつかの実施形態において、拡張された遺伝子アルファベットを有する細胞は、別の核酸に水素結合する非天然核酸を含む。いくつかの実施形態において、拡張された遺伝子アルファベットを有する細胞は、塩基対形成された別の核酸に水素結合していない非天然核酸を含む。いくつかの実施形態において、拡張された遺伝子アルファベットを有する細胞は、疎水性および／またはパッキング相互作用を介して、核酸塩基または別の非天然ヌクレオチドと塩基対形成する核酸塩基を有する非天然ヌクレオチドを含有する非天然核酸を含む。いくつかの実施形態において、拡張された遺伝子アルファベットを有する細胞は、非水素結合相互作用を介して、別の核酸と塩基対形成する非天然核酸を含む。拡張された遺伝子アルファベットを有する細胞は、相同核酸をコピーして、非天然核酸を含む核酸を形成することができる細胞である。拡張された遺伝子アルファベットを有する細胞は、別の非天然核酸（非天然核酸塩基対（ＵＢＰ））と塩基対形成された非天然核酸を含む細胞である。
いくつかの実施形態において、細胞は、インビボ条件下、移入された非天然ヌクレオチドから非天然ＤＮＡ塩基対（ＵＢＰ）を形成する。いくつかの実施形態において、リン酸カリウムならびに／またはホスファターゼおよび／もしくはヌクレオチダーゼの阻害剤の活性は、非天然ヌクレオチドの輸送を促進することができる。方法は、異種ヌクレオシド三リン酸輸送体を発現する細胞の使用を含む。そのような細胞が１つまたはそれ以上のヌクレオシド三リン酸と接触する場合、ヌクレオシド三リン酸は、細胞に輸送される。細胞は、リン酸カリウムならびに／またはホスファターゼおよびヌクレオチダーゼの阻害剤の存在下である。非天然ヌクレオシド三リン酸は、細胞の自然機構（すなわち、ポリメラーゼ）によって、細胞内の核酸に組み込むことができ、例えば、相互塩基対形成して細胞の核酸内の非天然塩基対を形成することができる。いくつかの実施形態において、ＵＢＰは、非天然塩基を持つＤＮＡおよびＲＮＡヌクレオチドの間で形成される。
いくつかの実施形態において、ＵＢＰは、非天然トリホスフェートに曝露された場合に、細胞または細胞の集団に組み込まれる。いくつかの実施形態において、ＵＢＰは、実質的に常に、非天然トリホスフェートに曝露された場合に、細胞または細胞の集団に組み込まれる。
いくつかの実施形態において、細胞における異種遺伝子、例えば、ヌクレオシド三リン酸輸送体（ＮＴＴ）の発現の誘導は、異種遺伝子の発現の誘導なしの細胞における１つまたはそれ以上の非天然トリホスフェートの増殖および取り込みと比較して、より遅い細胞増殖、および増加した非天然トリホスフェートの取り込みをもたらすことができる。取り込みは、拡散、浸透により、または輸送体の作用を介してなどの、細胞へのヌクレオチドの輸送を様々に含む。いくつかの実施形態において、細胞における異種遺伝子、例えば、ＮＴＴの発現の誘導は、異種遺伝子の発現の誘導なしの細胞の増殖および取り込みと比較して、増加した細胞増殖、および増加した非天然核酸の取り込みをもたらすことができる。
いくつかの実施形態において、ＵＢＰは、対数増殖期の間に組み込まれる。いくつかの実施形態において、ＵＢＰは、非対数増殖期の間に組み込まれる。いくつかの実施形態において、ＵＢＰは、実質的に線形増殖期の間に組み込まれる。いくつかの実施形態において、ＵＢＰは、期間にわたって増殖した後、細胞または細胞の集団に安定に組み込まれる。例えば、ＵＢＰは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５もしくは５０、またはそれ以上の複製にわたって増殖した後、細胞または細胞の集団に安定に組み込むことができる。例えば、ＵＢＰは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４時間の増殖にわって増殖した後、細胞または細胞の集団に安定に組み込むことができる。例えば、ＵＢＰは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０または３１日の増殖にわたって増殖した後、細胞または細胞の集団に安定に組み込むことができる。例えば、ＵＢＰは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２か月の増殖にわたって増殖した後、細胞または細胞の集団に安定に組み込むことができる。例えば、ＵＢＰは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５または５０年の増殖にわたって増殖した後、細胞または細胞の集団に安定に組み込むことができる。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される半合成生物は、
からなる群から選択される少なくとも１つの非天然核酸塩基を含むＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、非天然塩基のうちの少なくとも１つを含む半合成生物のＤＮＡは、非天然塩基対（ＵＢＰ）を形成する。いくつかの実施形態において、非天然塩基対（ＵＢＰ）は、ｄＣＮＭＯ－ｄＴＰＴ３、ｄＮａＭ－ｄＴＰＴ３、ｄＣＮＭＯ－ｄＴＡＴ１またはｄＮａＭ－ｄＴＡＴ１である。いくつかの実施形態において、ＤＮＡは、
からなる群から選択される少なくとも１つの非天然核酸塩基を含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡは、
からなる群から選択される少なくとも１つの非天然核酸塩基を含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡは、
からなる群から選択される少なくとも１つの非天然核酸塩基を含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡは、
からなる群から選択される少なくとも１つの非天然核酸塩基を含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡは、
から選択される少なくとも１つの非天然核酸塩基を含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡは、
から選択される少なくとも２つの非天然核酸塩基を含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡは、２つの鎖を含み、第１の鎖は、
である少なくとも１つの核酸塩基を含み、第２の鎖は、
である少なくとも１つの核酸塩基を含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡは、
である少なくとも１つの非天然核酸塩基を含む。
いくつかの実施形態において、細胞は、ＲＮＡポリメラーゼをさらに利用して、１つまたはそれ以上の非天然ヌクレオチドを含有するｍＲＮＡを生じさせる。いくつかの実施形態において、ＲＮＡポリメラーゼは、異種ＲＮＡポリメラーゼである。いくつかの例において、細胞は、ポリメラーゼをさらに利用して、１つまたはそれ以上の非天然ヌクレオチドを含むアンチコドンを含有するｔＲＮＡを生じさせる。いくつかの実施形態において、ｔＲＮＡは、異種ｔＲＮＡである。いくつかの例において、ｔＲＮＡは、非天然アミノ酸でチャージされる。いくつかの例において、ｔＲＮＡの非天然アンチコドンは、非天然アミノ酸を含有するタンパク質を合成するための翻訳の間にｍＲＮＡの非天然コドンと対形成する。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される半合成生物は、異種ヌクレオシド三リン酸輸送体を発現する。いくつかの実施形態において、異種ヌクレオシド三リン酸輸送体は、ＰｔＮＴＴ２である。いくつかの実施形態において、半合成生物は、異種ｔＲＮＡシンテターゼをさらに発現する。いくつかの実施形態において、異種ｔＲＮＡシンテターゼは、Ｍ．バルケリのピロリシル－ｔＲＮＡシンテターゼ（Ｍｂ ＰｙｌＲＳ）である。いくつかの実施形態において、半合成生物は、ヌクレオシド三リン酸輸送体ＰｔＮＴＴ２を発現し、ｔＲＮＡシンテターゼのＭ．バルケリのピロリシル－ｔＲＮＡシンテターゼ（Ｍｂ ＰｙｌＲＳ）をさらに発現する。いくつかの実施形態において、半合成生物は、異種ＲＮＡポリメラーゼをさらに発現する。いくつかの実施形態において、異種ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７ ＲＮＡＰである。いくつかの実施形態において、半合成生物は、ＤＮＡ組換え修復の機能を有するタンパク質を発現しない。いくつかの実施形態において、半合成生物は、大腸菌であり、生物は、ＲｅｃＡを発現しない。
いくつかの実施形態において、半合成生物は、異種ｍＲＮＡをさらに含む。いくつかの実施形態において、異種ｍＲＮＡは、
から選択される少なくとも１つの非天然塩基を含む。いくつかの実施形態において、異種ｍＲＮＡは、
である少なくとも１つの非天然塩基を含む。いくつかの実施形態において、異種ｍＲＮＡは、
である少なくとも１つの非天然塩基を含む。いくつかの実施形態において、異種ｍＲＮＡは、
である少なくとも１つの非天然塩基を含む。
いくつかの実施形態において、半合成生物は、異種ｔＲＮＡをさらに含む。いくつかの実施形態において、異種ｔＲＮＡは、
から選択される少なくとも１つの非天然塩基を含む。いくつかの実施形態において、異種ｔＲＮＡは、
である少なくとも１つの非天然塩基を含む。いくつかの実施形態において、異種ｔＲＮＡは、
である少なくとも１つの非天然塩基を含む。いくつかの実施形態において、異種ｔＲＮＡは、
である少なくとも１つの非天然塩基を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される半合成生物は、異種ｍＲＮＡおよび異種ｔＲＮＡをさらに含む。いくつかの実施形態において、半合成生物は、（ａ）異種ヌクレオシド三リン酸輸送体、（ｂ）異種ｍＲＮＡ、（ｃ）異種ｔＲＮＡ、（ｄ）異種ｔＲＮＡシンテターゼおよび（ｅ）異種ＲＮＡポリメラーゼをさらに含み、生物は、ＤＮＡ組換え修復の機能を有するタンパク質を発現しない。いくつかの実施形態において、ヌクレオシド三リン酸輸送体は、ＰｔＮＴＴ２であり、ｔＲＮＡシンテターゼは、Ｍ．バルケリのピロリシル－ｔＲＮＡシンテターゼ（Ｍｂ ＰｙｌＲＳ）であり、ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７ ＲＮＡＰである。いくつかの実施形態において、半合成生物は、大腸菌であり、生物は、ＲｅｃＡを発現しない。いくつかの実施形態において、半合成生物は、１つまたはそれ以上のＤＮＡポリメラーゼを過剰発現する。いくつかの実施形態において、生物は、ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩを過剰発現する。
天然および非天然アミノ酸
本明細書で使用される場合、アミノ酸残基とは、アミノ基およびカルボキシル基の両方を含む分子を指してもよい。適切なアミノ酸としては、限定するものではないが、天然に存在するアミノ酸のＤ異性体およびＬ異性体の両方、ならびに有機合成または任意の他の方法によって調製された天然には存在しないアミノ酸が挙げられる。本明細書で使用される用語アミノ酸としては、限定するものではないが、α－アミノ酸、β－アミノ酸、天然に存在するアミノ酸、非標準アミノ酸、非天然アミノ酸、およびアミノ酸アナログが挙げられる。
「α－アミノ酸」という用語は、α－炭素と呼ばれる、炭素に結合したアミノ基およびカルボキシル基の両方を含む分子を指してもよい。例えば：
「β－アミノ酸」という用語は、β配置のアミノ基とカルボキシル基の両方を含む分子を指すことができる。
「天然に存在するアミノ酸」とは、自然界で合成されたペプチドに一般的に見出される２０のアミノ酸のうちのいずれか１つを指し得、一文字の略語Ａ、Ｒ、Ｎ、Ｃ、Ｄ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、およびＶとして知られる。
次の表は、天然に存在するアミノ酸の特性の要約を示している。
「疎水性アミノ酸」としては、小さい疎水性アミノ酸および大きい疎水性アミノ酸が挙げられる。「小さい疎水性アミノ酸」とは、グリシン、アラニン、プロリン、およびそれらのアナログであってもよい。「大きい疎水性アミノ酸」とは、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、およびそれらのアナログであってもよい。「極性アミノ酸」とは、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、チロシン、およびそれらのアナログであってもよい。「荷電アミノ酸」は、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタメート、およびそれらのアナログであってもよい。
「アミノ酸アナログ」とは、アミノ酸に構造的に類似しており、ペプチド模倣大環状分子の形成においてアミノ酸の代わりになり得る分子であり得る。アミノ酸アナログとしては、限定するものではないが、βアミノ酸およびアミノ酸であって、アミノ基またはカルボキシ基が同様に反応性の基で置換されているもの（例えば、第一級アミンの第二級もしくは第三級アミンによる置換、またはカルボキシ基のエステルによる置換）が挙げられる。
「非標準アミノ酸（ｎｃＡＡ）」または「非天然アミノ酸」または「非天然アミノ酸」とは、自然界で合成されたペプチドに一般的に見られる２０個のアミノ酸のうちの１つではないアミノ酸であり得、１文字の略語Ａ、Ｒ、Ｎ、Ｃ、Ｄ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、およびＶで知られている。ある場合には、非天然アミノ酸は、非標準アミノ酸のサブセットである。
アミノ酸アナログは、β－アミノ酸アナログを含み得る。β－アミノ酸アナログの例としては、限定するものではないが、以下が挙げられる：環状βアミノ酸アナログ；β－アラニン；（Ｒ）－β－フェニルアラニン；（Ｒ）－１，２，３，４－テトラヒドロ－イソキノリン－３－酢酸；（Ｒ）－３－アミノ－４－（１－ナフチル）－酪酸；（Ｒ）－３－アミノ－４－（２，４－ジクロロフェニル）酪酸；（Ｒ）－３－アミノ－４－（２－クロロフェニル）－酪酸；（Ｒ）－３－アミノ－４－（２－シアノフェニル）－酪酸；（Ｒ）－３－アミノ－４－（２－フルオロフェニル）－酪酸；（Ｒ）－３－アミノ－４－（２－フリル）－酪酸；（Ｒ）－３－アミノ－４－（２－メチルフェニル）－酪酸；（Ｒ）－３－アミノ－４－（２－ナフチル）－酪酸；（Ｒ）－３－アミノ－４－（２－チエニル）－酪酸；（Ｒ）－３－アミノ－４－（２－トリフルオロメチルフェニル）－酪酸；（Ｒ）－３－アミノ－４－（３，４－ジクロロフェニル）酪酸；（Ｒ）－３－アミノ－４－（３，４－ジフルオロフェニル）酪酸；（Ｒ）－３－アミノ－４－（３－ベンゾチエニル）－酪酸；（Ｒ）－３－アミノ－４－（３－クロロフェニル）－酪酸；（Ｒ）－３－アミノ－４－（３－シアノフェニル）－酪酸；（Ｒ）－３－アミノ－４－（３－フルオロフェニル）－酪酸；（Ｒ）－３－アミノ－４－（３－メチルフェニル）－酪酸；（Ｒ）－３－アミノ－４－（３－ピリジル）－酪酸；（Ｒ）－３－アミノ－４－（３－チエニル）－酪酸；（Ｒ）－３－アミノ－４－（３－トリフルオロメチルフェニル）－酪酸；（Ｒ）－３－アミノ－４－（４－ブロモフェニル）－酪酸；（Ｒ）－３－アミノ－４－（４－クロロフェニル）－酪酸；（Ｒ）－３－アミノ－４－（４－シアノフェニル）－酪酸；（Ｒ）－３－アミノ－４－（４－フルオロフェニル）－酪酸；（Ｒ）－３－アミノ－４－（４－ヨードフェニル）－酪酸；（Ｒ）－３－アミノ－４－（４－メチルフェニル）－酪酸；（Ｒ）－３－アミノ－４－（４－ニトロフェニル）－酪酸；（Ｒ）－３－アミノ－４－（４－ピリジル）－酪酸；（Ｒ）－３－アミノ－４－（４－トリフルオロメチルフェニル）－酪酸；（Ｒ）－３－アミノ－４－ペンタフルオロ－フェニル酪酸；（Ｒ）－３－アミノ－５－ヘキセン酸；（Ｒ）－３－アミノ－５－ヘキシン酸；（Ｒ）－３－アミノ－５－フェニルペンタン酸；（Ｒ）－３－アミノ－６－フェニル－５－ヘキセン酸；（Ｓ）－１，２，３，４－テトラヒドロ－イソキノリン－３－酢酸；（Ｓ）－３－アミノ－４－（１－ナフチル）－酪酸；（Ｓ）－３－アミノ－４－（２，４－ジクロロフェニル）酪酸；（Ｓ）－３－アミノ－４－（２－クロロフェニル）－酪酸；（Ｓ）－３－アミノ－４－（２－シアノフェニル）－酪酸；（Ｓ）－３－アミノ－４－（２－フルオロフェニル）－酪酸；（Ｓ）－３－アミノ－４－（２－フリル）－酪酸；（Ｓ）－３－アミノ－４－（２－メチルフェニル）－酪酸；（Ｓ）－３－アミノ－４－（２－ナフチル）－酪酸；（Ｓ）－３－アミノ－４－（２－チエニル）－酪酸；（Ｓ）－３－アミノ－４－（２－トリフルオロメチルフェニル）－酪酸；（Ｓ）－３－アミノ－４－（３，４－ジクロロフェニル）酪酸；（Ｓ）－３－アミノ－４－（３，４－ジフルオロフェニル）酪酸；（Ｓ）－３－アミノ－４－（３－ベンゾチエニル）－酪酸；（Ｓ）－３－アミノ－４－（３－クロロフェニル）－酪酸；（Ｓ）－３－アミノ－４－（３－シアノフェニル）－酪酸；（Ｓ）－３－アミノ－４－（３－フルオロフェニル）－酪酸；（Ｓ）－３－アミノ－４－（３－メチルフェニル）－酪酸；（Ｓ）－３－アミノ－４－（３－ピリジル）－酪酸；（Ｓ）－３－アミノ－４－（３－チエニル）－酪酸；（Ｓ）－３－アミノ－４－（３－トリフルオロメチルフェニル）－酪酸；（Ｓ）－３－アミノ－４－（４－ブロモフェニル）－酪酸；（Ｓ）－３－アミノ－４－（４－クロロフェニル）酪酸；（Ｓ）－３－アミノ－４－（４－シアノフェニル）－酪酸；（Ｓ）－３－アミノ－４－（４－フルオロフェニル）酪酸；（Ｓ）－３－アミノ－４－（４－ヨードフェニル）－酪酸；（Ｓ）－３－アミノ－４－（４－メチルフェニル）－酪酸；（Ｓ）－３－アミノ－４－（４－ニトロフェニル）－酪酸；（Ｓ）－３－アミノ－４－（４－ピリジル）－酪酸；（Ｓ）－３－アミノ－４－（４－トリフルオロメチルフェニル）－酪酸；（Ｓ）－３－アミノ－４－ペンタフルオロ－フェニル酪酸；（Ｓ）－３－アミノ－５－ヘキセン酸；（Ｓ）－３－アミノ－５－ヘキシン酸；（Ｓ）－３－アミノ－５－フェニルペンタン酸；（Ｓ）－３－アミノ－６－フェニル－５－ヘキセン酸；１，２，５，６－テトラヒドロピリジン－３－カルボン酸；１，２，５，６－テトラヒドロピリジン－４－カルボン酸；３－アミノ－３－（２－クロロフェニル）－プロピオン酸；３－アミノ－３－（２－チエニル）－プロピオン酸；３－アミノ－３－（３－ブロモフェニル）－プロピオン酸；３－アミノ－３－（４－クロロフェニル）－プロピオン酸；３－アミノ－３－（４－メトキシフェニル）－プロピオン酸；３－アミノ－４，４，４－トリフルオロ－酪酸；３－アミノアジピン酸；Ｄ－β－フェニルアラニン；β－ロイシン；Ｌ－β－ホモアラニン；Ｌ－β－ホモアスパラギン酸γ－ベンジルエステル；Ｌ－β－ホモグルタミン酸δ－ベンジルエステル；Ｌ－β－ホモイソロイシン；Ｌ－β－ホモロイシン；Ｌ－β－ホモメチオニン；Ｌ－β－ホモフェニルアラニン；Ｌ－β－ホモプロリン；Ｌ－β－ホモトリプトファン；Ｌ－β－ホモバリン；Ｌ－Ｎω－ベンジルオキシカルボニル－β－ホモリジン；Ｎω－Ｌ－β－ホモアルギニン；Ｏ－ベンジル－Ｌ－β－ホモヒドロキシプロリン；Ｏ－ベンジル－Ｌ－β－ホモセリン；Ｏ－ベンジル－Ｌ－β－ホモトレオニン；Ｏ－ベンジル－Ｌ－β－ホモチロシン；γ－トリチル－Ｌ－β－ホモアスパラギン；（Ｒ）－β－フェニルアラニン；Ｌ－β－ホモアスパラギン酸γ－ｔ－ブチルエステル；Ｌ－β－ホモグルタミン酸δ－ｔ－ブチルエステル；Ｌ－Ｎω－β－ホモリジン；Ｎδ－トリチル－Ｌ－β－ホモグルタミン；Ｎω－２，２，４，６，７－ペンタメチル－ジヒドロベンゾフラン－５－スルホニル－Ｌ－β－ホモアルギニン；Ｏ－ｔ－ブチル－Ｌ－β－ホモヒドロキシ－プロリン；Ｏ－ｔ－ブチル－Ｌ－β－ホモセリン；Ｏ－ｔ－ブチル－Ｌ－β－ホモトレオニン；Ｏ－ｔ－ブチル－Ｌ－β－ホモチロシン；２－アミノシクロペンタンカルボン酸；および２－アミノシクロヘキサンカルボン酸。
アミノ酸アナログとしては、アラニン、バリン、グリシンまたはロイシンのアナログが挙げられ得る。アラニン、バリン、グリシン、およびロイシンのアミノ酸アナログの例としては、限定するものではないが、以下が挙げられる：α－メトキシグリシン；α－アリル－Ｌ－アラニン；α－アミノイソ酪酸；α－メチル－ロイシン；β－（１－ナフチル）－Ｄ－アラニン；β－（１－ナフチル）－Ｌ－アラニン；β－（２－ナフチル）－Ｄ－アラニン；β－（２－ナフチル）－Ｌ－アラニン；β－（２－ピリジル）－Ｄ－アラニン；β－（２－ピリジル）－Ｌ－アラニン；β－（２－チエニル）－Ｄ－アラニン；β－（２－チエニル）－Ｌ－アラニン；β－（３－ベンゾチエニル）－Ｄ－アラニン；β－（３－ベンゾチエニル）－Ｌ－アラニン；β－（３－ピリジル）－Ｄ－アラニン；β－（３－ピリジル）－Ｌ－アラニン；β－（４－ピリジル）－Ｄ－アラニン；β－（４－ピリジル）－Ｌ－アラニン；β－クロロ－Ｌ－アラニン；β－シアノ－Ｌ－アラニン；β－シクロヘキシル－Ｄ－アラニン；β－シクロヘキシル－Ｌ－アラニン；β－シクロペンテン－１－イル－アラニン；β－シクロペンチル－アラニン；β－シクロプロピル－Ｌ－Ａｌａ－ＯＨ．ジシクロヘキシルアンモニウム塩；β－ｔ－ブチル－Ｄ－アラニン；β－ｔ－ブチル－Ｌ－アラニン；γ－アミノ酪酸；Ｌ－α，β－ジアミノプロピオン酸；２，４－ジニトロフェニルグリシン；２，５－ジヒドロ－Ｄ－フェニルグリシン；２－アミノ－４，４，４－トリフルオロ酪酸；２－フルオロ－フェニルグリシン；３－アミノ－４，４，４－トリフルオロ－酪酸；３－フルオロバリン；４，４，４－トリフルオロバリン；４，５－デヒドロ－Ｌ－ｌｅｕ－ＯＨ．ジシクロヘキシルアンモニウム塩；４－フルオロ－Ｄ－フェニルグリシン；４－フルオロ－Ｌ－フェニルグリシン；４－ヒドロキシ－Ｄ－フェニルグリシン；５，５，５－トリフルオロロイシン；６－アミノヘキサン酸；シクロペンチル－Ｄ－Ｇｌｙ－ＯＨ．ジシクロヘキシルアンモニウム塩；シクロペンチル－Ｇｌｙ－ＯＨ．ジシクロヘキシルアンモニウム塩；Ｄ－α，β－ジアミノプロピオン酸；Ｄ－α－アミノ酪酸；Ｄ－α－ｔ－ブチルグリシン；Ｄ－（２－チエニル）グリシン；Ｄ－（３－チエニル）グリシン；Ｄ－２－アミノカプロン酸；Ｄ－２－インダニルグリシン；Ｄ－アリルグリシン－ジシクロヘキシルアンモニウム塩；Ｄ－シクロヘキシルグリシン；Ｄ－ノルバリン；Ｄ－フェニルグリシン；β－アミノ酪酸；β－アミノイソ酪酸；（２－ブロモフェニル）グリシン；（２－メトキシフェニル）グリシン；（２－メチルフェニル）グリシン；（２－チアゾイル）グリシン；（２－チエニル）グリシン；２－アミノ－３－（ジメチルアミノ）－プロピオン酸；Ｌ－α，β－ジアミノプロピオン酸；Ｌ－α－アミノ酪酸；Ｌ－α－ｔ－ブチルグリシン；Ｌ－（３－チエニル）グリシン；Ｌ－２－アミノ－３－（ジメチルアミノ）－プロピオン酸；Ｌ－２－アミノカプロン酸ジシクロヘキシル－アンモニウム塩；Ｌ－２－インダニルグリシン；Ｌ－アリルグリシンジシクロヘキシルアンモニウム塩；Ｌ－シクロヘキシルグリシン；Ｌ－フェニルグリシン；Ｌ－プロパルギルグリシン；Ｌ－ノルバリン；Ｎ－α－アミノメチル－Ｌ－アラニン；Ｄ－α，γ－ジアミノ酪酸；Ｌ－α，γ－ジアミノ酪酸；β－シクロプロピル－Ｌ－アラニン；（Ｎ－β－（２，４－ジニトロフェニル））－Ｌ－α，β－ジアミノプロピオン酸；（Ｎ－β－１－（４，４－ジメチル－２，６－ジオキソシクロヘキサ－１－イリデン）エチル）－Ｄ－α，β－ジアミノプロピオン酸；（Ｎ－β－１－（４，４－ジメチル－２，６－ジオキソシクロヘキサ－１－イリデン）エチル）－Ｌ－α，β－ジアミノプロピオン酸；（Ｎ－β－４－メチルトリチル）－Ｌ－α，β－ジアミノプロピオン酸；（Ｎ－β－アリルオキシカルボニル）－Ｌ－α，β－ジアミノプロピオン酸；（Ｎ－γ－１－（４，４－ジメチル－２，６－ジオキソシクロヘキサ－１－イリデン）エチル）－Ｄ－α，γ－ジアミノ酪酸；（Ｎ－γ－１－（４，４－ジメチル－２，６－ジオキソシクロヘキサ－１－イリデン）エチル）－Ｌ－α，γ－ジアミノ酪酸；（Ｎ－γ－４－メチルトリチル）－Ｄ－α，γ－ジアミノ酪酸；（Ｎ－γ－４－メチルトリチル）－Ｌ－α，γ－ジアミノ酪酸；（Ｎ－γ－アリルオキシカルボニル）－Ｌ－α，γ－ジアミノ酪酸；Ｄ－α，γ－ジアミノ酪酸；４，５－デヒドロ－Ｌ－ロイシン；シクロペンチル－Ｄ－Ｇｌｙ－ＯＨ；シクロペンチル－Ｇｌｙ－ＯＨ；Ｄ－アリルグリシン；Ｄ－ホモシクロヘキシルアラニン；Ｌ－１－ピレニルアラニン；Ｌ－２－アミノカプロン酸；Ｌ－アリルグリシン；Ｌ－ホモシクロヘキシルアラニン；およびＮ－（２－ヒドロキシ－４－メトキシ－Ｂｚｌ）－Ｇｌｙ－ＯＨ。
アミノ酸アナログとしては、アルギニンまたはリジンのアナログが挙げられ得る。アルギニンおよびリジンのアミノ酸アナログの例としては、限定するものではないが、以下が挙げられる：シトルリン；Ｌ－２－アミノ－３－グアニジノプロピオン酸；Ｌ－２－アミノ－３－ウレイドプロピオン酸；Ｌ－シトルリン；Ｌｙｓ（Ｍｅ）２－ＯＨ；Ｌｙｓ（Ｎ３）－ＯＨ；Ｎδ－ベンジルオキシカルボニル－Ｌ－オルニチン；Ｎω－ニトロ－Ｄ－アルギニン；Ｎω－ニトロ－Ｌ－アルギニン；α－メチルオルニチン；２，６－ジアミノヘプタンジオン酸；Ｌ－オルニチン；（Ｎδ－１－（４，４－ジメチル－２，６－ジオキソ－シクロヘキサ－１－イリデン）エチル）－Ｄ－オルニチン；（Ｎδ－１－（４，４－ジメチル－２，６－ジオキソ－シクロヘキセン－１－イリデン）エチル）－Ｌ－オルニチン；（Ｎδ－４－メチルトリチル）－Ｄ－オルニチン；（Ｎδ－４－メチルトリチル）－Ｌ－オルニチン；Ｄ－オルニチン；Ｌ－オルニチン；Ａｒｇ（Ｍｅ）（Ｐｂｆ）－ＯＨ；Ａｒｇ（Ｍｅ）２－ＯＨ（非対称）；Ａｒｇ（Ｍｅ）２－ＯＨ（対称）；Ｌｙｓ（ｉｖＤｄｅ）－ＯＨ；Ｌｙｓ（Ｍｅ）２－ＯＨ．ＨＣｌ；Ｌｙｓ（Ｍｅ３）－ＯＨクロリド；Ｎω－ニトロ－Ｄ－アルギニン；およびＮω－ニトロ－Ｌ－アルギニン。
アミノ酸アナログとしては、アスパラギン酸またはグルタミン酸のアナログが挙げられ得る。アスパラギン酸およびグルタミン酸のアミノ酸アナログの例としては、限定するものではないが、以下が挙げられる：α－メチル－Ｄ－アスパラギン酸；α－メチル－グルタミン酸；α－メチル－Ｌ－アスパラギン酸；γ－メチレン－グルタミン酸；（Ｎ－γ－エチル）－Ｌ－グルタミン；［Ｎ－α－（４－アミノベンゾイル）］－Ｌ－グルタミン酸；２，６－ジアミノピメリン酸；Ｌ－α－アミノスベリン酸；Ｄ－２－アミノアジピン酸；Ｄ－α－アミノスベリン酸；α－アミノピメリン酸；イミノ二酢酸；Ｌ－２－アミノアジピン酸；スレオ－β－メチル－アスパラギン酸；γ－カルボキシ－Ｄ－グルタミン酸γ，γ－ジ－ｔ－ブチルエステル；γ－カルボキシ－Ｌ－グルタミン酸γ，γ－ジ－ｔ－ブチルエステル；Ｇｌｕ（ＯＡｌｌ）－ＯＨ；Ｌ－Ａｓｕ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ；およびピログルタミン酸。
アミノ酸アナログは、システインおよびメチオニンのアナログを含み得る。システインおよびメチオニンのアミノ酸アナログの例としては、限定するものではないが、以下が挙げられる：Ｃｙｓ（ファルネシル）－ＯＨ、Ｃｙｓ（ファルネシル）－ＯＭｅ、α－メチル－メチオニン、Ｃｙｓ（２－ヒドロキシエチル）－ＯＨ、Ｃｙｓ（３－アミノプロピル）－ＯＨ、２－アミノ－４－（エチルチオ）酪酸、ブチオニン、ブチオニンスルホキシミン、エチオニン、メチオニンメチルスルホニウムクロリド、セレノメチオニン、システイン酸、［２－（４－ピリジル）エチル］－ＤＬ－ペニシラミン、［２－（４－ピリジル）エチル］－Ｌ－システイン、４－メトキシベンジル－Ｄ－ペニシラミン、４－メトキシベンジル－Ｌ－ペニシラミン、４－メチルベンジル－Ｄ－ペニシラミン、４－メチルベンジル－Ｌ－ペニシラミン、ベンジル－Ｄ－システイン、ベンジル－Ｌ－システイン、ベンジル－ＤＬ－ホモシステイン、カルバモイル－Ｌ－システイン、カルボキシエチル－Ｌ－システイン、カルボキシメチル－Ｌ－システイン、ジフェニルメチル－Ｌ－システイン、エチル－Ｌ－システイン、メチル－Ｌ－システイン、ｔ－ブチル－Ｄ－システイン、トリチル－Ｌ－ホモシステイン、トリチル－Ｄ－ペニシラミン、シスタチオニン、ホモシスチン、Ｌ－ホモシスチン、（２－アミノエチル）－Ｌ－システイン、セレノ－Ｌ－シスチン、シスタチオニン、Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）－ＯＨ、およびアセトアミドメチル－Ｄ－ペニシラミン。
アミノ酸アナログとしては、フェニルアラニンおよびチロシンのアナログが挙げられ得る。フェニルアラニンおよびチロシンのアミノ酸アナログの例としては、限定するものではないが、以下が挙げられる：β－メチル－フェニルアラニン、β－ヒドロキシフェニルアラニン、α－メチル－３－メトキシ－ＤＬ－フェニルアラニン、α－メチル－Ｄ－フェニルアラニン、α－メチル－Ｌ－フェニルアラニン、１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－３－カルボン酸、２，４－ジクロロ－フェニルアラニン、２－（トリフルオロメチル）－Ｄ－フェニルアラニン、２－（トリフルオロメチル）－Ｌ－フェニルアラニン、２－ブロモ－Ｄ－フェニルアラニン、２－ブロモ－Ｌ－フェニルアラニン、２－クロロ－Ｄ－フェニルアラニン、２－クロロ－Ｌ－フェニルアラニン、２－シアノ－Ｄ－フェニルアラニン、２－シアノ－Ｌ－フェニルアラニン、２－フルオロ－Ｄ－フェニルアラニン、２－フルオロ－Ｌ－フェニルアラニン、２－メチル－Ｄ－フェニルアラニン、２－メチル－Ｌ－フェニルアラニン、２－ニトロ－Ｄ－フェニルアラニン、２－ニトロ－Ｌ－フェニルアラニン、２，４，５－トリヒドロキシ－フェニルアラニン、３，４，５－トリフルオロ－Ｄ－フェニルアラニン、３，４，５－トリフルオロ－Ｌ－フェニルアラニン、３，４－ジクロロ－Ｄ－フェニルアラニン、３，４－ジクロロ－Ｌ－フェニルアラニン、３，４－ジフルオロ－Ｄ－フェニルアラニン、３，４－ジフルオロ－Ｌ－フェニルアラニン、３，４－ジヒドロキシ－Ｌ－フェニルアラニン、３，４－ジメトキシ－Ｌ－フェニルアラニン、３，５，３’－トリヨード－Ｌ－チロニン、３，５－ジヨード－Ｄ－チロシン、３，５－ジヨード－Ｌ－チロシン、３，５－ジヨード－Ｌ－チロニン、３－（トリフルオロメチル）－Ｄ－フェニルアラニン、３－（トリフルオロメチル）－Ｌ－フェニルアラニン、３－アミノ－Ｌ－チロシン、３－ブロモ－Ｄ－フェニルアラニン、３－ブロモ－Ｌ－フェニルアラニン、３－クロロ－Ｄ－フェニルアラニン、３－クロロ－Ｌ－フェニルアラニン、３－クロロ－Ｌ－チロシン、３－シアノ－Ｄ－フェニルアラニン、３－シアノ－Ｌ－フェニルアラニン、３－フルオロ－Ｄ－フェニルアラニン、３－フルオロ－Ｌ－フェニルアラニン、３－フルオロ－チロシン、３－ヨード－Ｄ－フェニルアラニン、３－ヨード－Ｌ－フェニルアラニン、３－ヨード－Ｌ－チロシン、３－メトキシ－Ｌ－チロシン、３－メチル－Ｄ－フェニルアラニン、３－メチル－Ｌ－フェニルアラニン、３－ニトロ－Ｄ－フェニルアラニン、３－ニトロ－Ｌ－フェニルアラニン、３－ニトロ－Ｌ－チロシン、４－（トリフルオロメチル）－Ｄ－フェニルアラニン、４－（トリフルオロメチル）－Ｌ－フェニルアラニン、４－アミノ－Ｄ－フェニルアラニン、４－アミノ－Ｌ－フェニルアラニン、４－ベンゾイル－Ｄ－フェニルアラニン、４－ベンゾイル－Ｌ－フェニルアラニン、４－ビス（２－クロロエチル）アミノ－Ｌ－フェニルアラニン、４－ブロモ－Ｄ－フェニルアラニン、４－ブロモ－Ｌ－フェニルアラニン、４－クロロ－Ｄ－フェニルアラニン、４－クロロ－Ｌ－フェニルアラニン、４－シアノ－Ｄ－フェニルアラニン、４－シアノ－Ｌ－フェニルアラニン、４－フルオロ－Ｄ－フェニルアラニン、４－フルオロ－Ｌ－フェニルアラニン、４－ヨード－Ｄ－フェニルアラニン、４－ヨード－Ｌ－フェニルアラニン、ホモフェニルアラニン、チロキシン、３，３－ジフェニルアラニン、チロニン、エチル－チロシン、およびメチルチロシン。
アミノ酸アナログとしては、プロリンのアナログが挙げられ得る。プロリンのアミノ酸アナログの例としては、限定するものではないが、以下が挙げられる：３，４－デヒドロ－プロリン、４－フルオロ－プロリン、シス－４－ヒドロキシ－プロリン、チアゾリジン－２－カルボン酸、およびトランス－４－フルオロ－プロリン。
アミノ酸アナログとしては、セリンおよびトレオニンのアナログが挙げられ得る。セリンおよびトレオニンのアミノ酸アナログの例としては、限定するものではないが、以下が挙げられる：３－アミノ－２－ヒドロキシ－５－メチルヘキサン酸、２－アミノ－３－ヒドロキシ－４－メチルペンタン酸、２－アミノ－３－エトキシブタン酸、２－アミノ－３－メトキシブタン酸、４－アミノ－３－ヒドロキシ－６－メチルヘプタン酸、２－アミノ－３－ベンジルオキシプロピオン酸、２－アミノ－３－ベンジルオキシプロピオン酸、２－アミノ－３－エトキシプロピオン酸、４－アミノ－３－ヒドロキシブタン酸、およびα－メチルセリン。
アミノ酸アナログとしては、トリプトファンのアナログが挙げられ得る。トリプトファンのアミノ酸アナログの例としては、限定するものではないが、以下が挙げられる：α－メチル－トリプトファン；β－（３－ベンゾチエニル）－Ｄ－アラニン；β－（３－ベンゾチエニル）－Ｌ－アラニン；１－メチル－トリプトファン；４－メチル－トリプトファン；５－ベンジルオキシ－トリプトファン；５－ブロモ－トリプトファン；５－クロロ－トリプトファン；５－フルオロ－トリプトファン；５－ヒドロキシトリプトファン；５－ヒドロキシ－Ｌ－トリプトファン；５－メトキシ－トリプトファン；５－メトキシ－Ｌ－トリプトファン；５－メチル－トリプトファン；６－ブロモ－トリプトファン；６－クロロ－Ｄ－トリプトファン；６－クロロ－トリプトファン；６－フルオロ－トリプトファン；６－メチル－トリプトファン；７－ベンジルオキシ－トリプトファン；７－ブロモ－トリプトファン；７－メチル－トリプトファン；Ｄ－１，２，３，４－テトラヒドロ－ノルハルマン－３－カルボン酸；６－メトキシ－１，２，３，４－テトラヒドロノルハルマン－１－カルボン酸；７－アザトリプトファン；Ｌ－１，２，３，４－テトラヒドロ－ノルハルマン－３－カルボン酸；５－メトキシ－２－メチル－トリプトファン；および６－クロロ－Ｌ－トリプトファン。
アミノ酸アナログはラセミ体であってもよい。場合によっては、アミノ酸アナログのＤ異性体が使用される。場合によっては、アミノ酸アナログのＬ異性体が用いられる。場合によっては、アミノ酸アナログは、ＲまたはＳ配置にあるキラル中心を含む。時には、β－アミノ酸アナログのアミノ基は、保護基、例えば、ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ基）、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル（ＦＭＯＣ）、トシルなどで置換される。時には、β－アミノ酸アナログのカルボン酸官能基は、例えば、そのエステル誘導体として保護されている。場合によっては、アミノ酸アナログの塩が使用される。
いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は、Ｌｉｕ Ｃ．Ｃ．，Ｓｃｈｕｌｔｚ、Ｐ．Ｇ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０１０，７９，４１３（その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載される非天然アミノ酸である。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は、Ｎ６（２－アジドエトキシ）－カルボニル－Ｌ－リジンを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のアミノ酸残基（例えば、タンパク質内）は、コンジュゲート部分に結合する前に、非天然アミノ酸に変異される。場合によっては、非天然アミノ酸への変異は、免疫系の自己抗原応答を防止または最小化する。本明細書で使用される場合、「非天然アミノ酸」という用語は、タンパク質中に天然に存在する２０個のアミノ酸以外のアミノ酸を指す。非天然アミノ酸の非限定的な例としては、以下が挙げられる：ｐ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－ヨード－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－メトキシフェニルアラニン、Ｏ－メチル－Ｌ－チロシン、ｐ－プロパルギルオキシフェニルアラニン、ｐ－プロパルギル－フェニルアラニン、Ｌ－３－（２－ナフチル）アラニン、３－メチル－フェニルアラニン、Ｏ－４－アリル－Ｌ－チロシン、４－プロピル－Ｌ－チロシン、トリ－Ｏ－アセチル－ＧｌｃＮＡｃｐ－セリン、Ｌ－ドーパ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アジド－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アシル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－ベンゾイル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－ボロノフェニルアラニン、Ｏ－プロパルギルチロシン、Ｌ－ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ－ブロモフェニルアラニン、セレノシステイン、ｐ－アミノ－Ｌ－フェニルアラニン、イソプロピル－Ｌ－フェニルアラニン、アジド－リジン（Ｎ６－アジドエトキシ－カルボニル－Ｌ－リジン、ＡｚＫ）、チロシンアミノ酸の非天然アナログ；グルタミンアミノ酸の非天然アナログ；フェニルアラニンアミノ酸の非天然アナログ；セリンアミノ酸の非天然アナログ；トレオニンアミノ酸の非天然アナログ；アルキル、アリール、アシル、アジド、シアノ、ハロ、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシル、アルケニル、アルキニル、エーテル、チオール、スルホニル、セレノ、エステル、チオ酸、ホウ酸塩、ボロネート、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、複素環式、エノン、イミン、アルデヒド、ヒドロキシルアミン、ケト、もしくはアミノ置換アミノ酸、またはそれらの組み合わせ；光活性化可能な架橋剤を有するアミノ酸；スピン標識アミノ酸；蛍光アミノ酸；金属結合アミノ酸；金属含有アミノ酸；放射性アミノ酸；光ケージおよび／または光異性化可能なアミノ酸；アミノ酸を含むビオチンまたはビオチンアナログ；アミノ酸を含むケト；ポリエチレングリコールまたはポリエーテルを含むアミノ酸；重原子置換アミノ酸；化学的に切断可能なまたは光切断可能なアミノ酸；細長い側鎖を有するアミノ酸；毒性基を含むアミノ酸；糖置換アミノ酸；炭素結合糖含有アミノ酸；酸化還元活性アミノ酸；α－ヒドロキシ含有酸；アミノチオ酸；α，α二置換アミノ酸；β－アミノ酸；プロリンまたはヒスチジン以外の環状アミノ酸、およびフェニルアラニン、チロシンまたはトリプトファン以外の芳香族アミノ酸。
いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は、選択的反応性基、または標的タンパク質もしくはポリペプチドの部位選択的標識のための反応性基を含む。場合によっては、化学反応は、双直交反応（例えば、生体適合性および選択的反応）である。場合によっては、化学反応は、Ｃｕ（Ｉ）触媒または「銅を含まない」アルキンアジドトリアゾール形成反応、Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒライゲーション、逆電子要求Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ（ＩＥＤＤＡ）反応、「フォトクリック」化学、またはオレフィンメタセシスおよび鈴木－宮浦または薗頭クロスカップリングなどの金属媒介プロセスである。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は、例えば、ＵＶでの照射時に架橋する光反応性基を含む。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は、光ケージアミノ酸を含む。場合によっては、非天然アミノ酸は、パラ置換、メタ置換、またはオルト置換アミノ酸誘導体である。
場合によっては、非天然アミノ酸は、ｐ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アジドメチル－Ｌ－フェニルアラニン（ｐＡＭＦ）、ｐ－ヨード－Ｌ－フェニルアラニン、Ｏ－メチル－Ｌ－チロシン、ｐ－メトキシフェニルアラニン、ｐ－プロパルギルオキシフェニルアラニン、ｐ－プロパルギル－フェニルアラニン、Ｌ－３－（２－ナフチル）アラニン、３－メチル－フェニルアラニン、Ｏ－４－アリル－Ｌ－チロシン、４－プロピル－Ｌ－チロシン、トリ－Ｏ－アセチル－ＧｌｃＮＡｃｐ－セリン、Ｌ－ドーパ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アジド－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アシル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－ベンゾイル－Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ－ブロモフェニルアラニン、ｐ－アミノ－Ｌ－フェニルアラニン、またはイソプロピル－Ｌ－フェニルアラニンを含む。
場合によっては、非天然アミノ酸は、３－アミノチロシン、３－ニトロチロシン、３，４－ジヒドロキシ－フェニルアラニン、または３－ヨードチロシンである。場合によっては、非天然アミノ酸は、フェニルセレノシステインである。場合によっては、非天然アミノ酸は、ベンゾフェノン、ケトン、ヨウ化物、メトキシ、アセチル、ベンゾイル、またはアジド（フェニルアラニン誘導体を含む）である。場合によっては、非天然アミノ酸は、ベンゾフェノン、ケトン、ヨウ化物、メトキシ、アセチル、ベンゾイル、またはアジド含有リジン誘導体である。場合によっては、非天然アミノ酸は、芳香族側鎖を含む。場合によっては、非天然アミノ酸は、芳香族側鎖を含まない。場合によっては、非天然アミノ酸は、アジド基を含む。場合によっては、非天然アミノ酸は、マイケルアクセプター基を含む。場合によっては、マイケル受容体基は、１，２－付加反応を介して共有結合を形成し得る不飽和部分を含む。場合によっては、マイケルアクセプター基は、電子不足のアルケンまたはアルキンを含む。場合によっては、マイケルアクセプター基としては、限定するものではないが、アルファ、ベータ不飽和：ケトン、アルデヒド、スルホキシド、スルホン、ニトリル、イミン、または芳香族が挙げられる。場合によっては、非天然アミノ酸は、デヒドロアラニンである。場合によっては、非天然アミノ酸は、アルデヒドまたはケトン基を含む。場合によっては、非天然アミノ酸は、アルデヒドまたはケトン基を含むリジン誘導体である。場合によっては、非天然アミノ酸は、ベータ、ガンマ、またはデルタ位置に１つまたはそれ以上のＯ、Ｎ、Ｓｅ、またはＳ原子を含むリジン誘導体である。場合によっては、非天然アミノ酸は、ガンマ位置にＯ、Ｎ、Ｓｅ、またはＳ原子を含むリジン誘導体である。場合によっては、非天然アミノ酸は、イプシロンＮ原子が酸素原子で置き換えられているリジン誘導体である。場合によっては、非天然アミノ酸は、天然には存在しない翻訳後修飾されたリジンであるリジン誘導体である。
場合によっては、非天然アミノ酸は、側鎖を含むアミノ酸であり、アルファ位置から６番目の原子は、カルボニル基を含む。場合によっては、非天然アミノ酸は側鎖を含むアミノ酸であり、アルファ位置から６番目の原子はカルボニル基を含み、アルファ位置から５番目の原子は窒素である。場合によっては、非天然アミノ酸は側鎖を含むアミノ酸であり、アルファ位置から７番目の原子は酸素原子である。
場合によっては、非天然アミノ酸は、セレンを含むセリン誘導体である。場合によっては、非天然アミノ酸はセレノセリン（２－アミノ－３－ヒドロセレノプロパン酸）である。場合によっては、非天然アミノ酸は、２－アミノ－３－（（２－（（３－（ベンジルオキシ）－３－オキソプロピル）アミノ）エチル）セラニル）プロパン酸である。場合によっては、非天然アミノ酸は、２－アミノ－３－（フェニルセラニル）プロパン酸である。場合によっては、非天然アミノ酸はセレンを含み、セレンの酸化は、アルケンを含む非天然アミノ酸の形成をもたらす。
場合によっては、非天然アミノ酸はシクロオクチニル基を含む。場合によっては、非天然アミノ酸はトランスシクロクテニル基を含む。場合によっては、非天然アミノ酸はノルボルネニル基を含む。場合によっては、非天然アミノ酸は、シクロプロペニル基を含む。場合によっては、非天然アミノ酸は、ジアジリン基を含む。場合によっては、非天然アミノ酸は、テトラジン基を含む。
場合によっては、非天然アミノ酸は、側鎖窒素がカルバミル化されているリジン誘導体である。場合によっては、非天然アミノ酸はリジン誘導体であり、側鎖窒素がアシル化されている。場合によっては、非天然アミノ酸は、２－アミノ－６－｛［（ｔｅｒｔ－ブトキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸である。場合によっては、非天然アミノ酸は、２－アミノ－６－｛［（ｔｅｒｔ－ブトキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸である。場合によっては、非天然アミノ酸は、Ｎ６－Ｂｏｃ－Ｎ６－メチルリジンである。場合によっては、非天然アミノ酸は、Ｎ６－アセチルリジンである。場合によっては、非天然アミノ酸は、ピロリシンである。場合によっては、非天然アミノ酸は、Ｎ６－トリフルオロアセチルリジンである。場合によっては、非天然アミノ酸は、２－アミノ－６－｛［（ベンジルオキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸である。場合によっては、非天然アミノ酸は、２－アミノ－６－｛［（ｐ－ヨードベンジルオキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸である。場合によっては、非天然アミノ酸は、２－アミノ－６－｛［（ｐ－ニトロベンジルオキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸である。場合によっては、非天然アミノ酸は、Ｎ６－プロリルリジンである。場合によっては、非天然アミノ酸は、２－アミノ－６－｛［（シクロペンチルオキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸である。場合によっては、非天然アミノ酸は、Ｎ６－（シクロペンタンカルボニル）リジンである。場合によっては、非天然アミノ酸は、Ｎ６－（テトラヒドロフラン－２－カルボニル）リジンである。場合によっては、非天然アミノ酸は、Ｎ６－（３－エチニルテトラヒドロフラン－２－カルボニル）リジンである。場合によっては、非天然アミノ酸は、Ｎ６－（（プロパ－２－イン－１－イルオキシ）カルボニル）リジンである。場合によっては、非天然アミノ酸は、２－アミノ－６－｛［（２－アジドシクロペンチルオキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸である。場合によっては、非天然アミノ酸は、Ｎ６－（（２－アジドエトキシ）カルボニル）リジンである。場合によっては、非天然アミノ酸は、２－アミノ－６－｛［（２－ニトロベンジルオキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸である。場合によっては、非天然アミノ酸は、２－アミノ－６－｛［（２－シクロオクチニルオキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸である。場合によっては、非天然アミノ酸は、Ｎ６－（２－アミノブタ－３－イノイル）リジンである。場合によっては、非天然アミノ酸は、２－アミノ－６－（（２－アミノブタ－３－イノイル）オキシ）ヘキサン酸である。場合によっては、非天然アミノ酸は、Ｎ６－（アリルオキシカルボニル）リジンである。場合によっては、非天然アミノ酸は、Ｎ６－（ブテニル－４－オキシカルボニル）リジンである。場合によっては、非天然アミノ酸は、Ｎ６－（ペンテニル－５－オキシカルボニル）リジンである。場合によっては、非天然アミノ酸は、Ｎ６－（（ブタ－３－イン－１－イルオキシ）カルボニル）－リジンである。場合によっては、非天然アミノ酸は、Ｎ６－（（ペンタ－４－イン－１－イルオキシ）カルボニル）－リジンである。場合によっては、非天然アミノ酸は、Ｎ６－（チアゾリジン－４－カルボニル）リジンである。場合によっては、非天然アミノ酸は、２－アミノ－８－オキソノナン酸である。場合によっては、非天然アミノ酸は、２－アミノ－８－オキソオクタン酸である。場合によっては、非天然アミノ酸は、Ｎ６－（２－オキソアセチル）リジンである。
場合によっては、非天然アミノ酸は、Ｎ６－プロピオニルリジンである。場合によっては、非天然アミノ酸は、Ｎ６－ブチリルリジンである。場合によっては、非天然アミノ酸は、Ｎ６－（ブタ－２－エノイル）リジンである。場合によっては、非天然アミノ酸は、Ｎ６－（（ビシクロ［２．２．１］ヘプタ－５－エン－２－イルオキシ）カルボニル）リジンである。場合によっては、非天然アミノ酸は、Ｎ６－（（スピロ［２．３］ヘキサ－１－エン－５－イルメトキシ）カルボニル）リジンである。場合によっては、非天然アミノ酸は、Ｎ６－（（（４－（１－（トリフルオロメチル）シクロプロパ－２－エン－１－イル）ベンジル）オキシ）カルボニル）リジンである。場合によっては、非天然アミノ酸は、Ｎ６－（（ビシクロ［２．２．１］ヘプタ－５－エン－２－イルメトキシ）カルボニル）リジンである。場合によっては、非天然アミノ酸は、システイニルリジンである。場合によっては、非天然アミノ酸は、Ｎ６－（（１－（６－ニトロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－イル）エトキシ）カルボニル）リジンである。場合によっては、非天然アミノ酸は、Ｎ６－（（２－（３－メチル－３Ｈ－ジアジリン－３－イル）エトキシ）カルボニル）リジンである。場合によっては、非天然アミノ酸は、Ｎ６－（（３－（３－メチル－３Ｈ－ジアジリン－３－イル）プロポキシ）カルボニル）リジンである。場合によっては、非天然アミノ酸は、Ｎ６－（（メタニトロベニルオキシ）Ｎ６－メチルカルボニル）リジンである。場合によっては、非天然アミノ酸は、Ｎ６－（（ビシクロ［６．１．０］ノン－４－イン－９－イルメトキシ）カルボニル）－リジンである。場合によっては、非天然アミノ酸は、Ｎ６－（（シクロヘプタ－３－エン－１－イルオキシ）カルボニル）－Ｌ－リジンである。
場合によっては、非天然アミノ酸は、２－アミノ－３－（（（（（ベンジルオキシ）カルボニル）アミノ）メチル）セラニル）プロパン酸である。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は、再利用されたアンバー、オパール、またはオーカーの終止コドンによってタンパク質に組み込まれる。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は、４塩基コドンによってタンパク質に組み込まれる。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は、再利用された稀なセンスコドンによってタンパク質に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は、非天然ヌクレオチドを含む非天然コドンによってタンパク質に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、タンパク質は、少なくとも２つの非天然アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は、少なくとも３つの非天然アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は、少なくとも２つの異なる非天然アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は、少なくとも３つの異なる非天然アミノ酸を含む。少なくとも１つの非天然アミノ酸は：リジンアナログであるか；芳香族側鎖を含むか；アジド基を含むか；アルキン基を含むか；またはアルデヒドもしくはケトン基を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの非天然アミノ酸は、芳香族側鎖を含まない。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの非天然アミノ酸は、Ｎ６－アジドエトキシ－カルボニル－Ｌ－リジン（ＡｚＫ）またはＮ６－プロパルギルエトキシ－カルボニル－Ｌ－リジン（ＰｒａＫ）を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの非天然アミノ酸は、Ｎ６－アジドエトキシ－カルボニル－Ｌ－リジン（ＡｚＫ）を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの非天然アミノ酸は、Ｎ６－プロパルギルエトキシ－カルボニル－Ｌ－リジン（ＰｒａＫ）を含む。
場合によっては、タンパク質への非天然アミノ酸の取り込みは、直交する改変されたシンテターゼ／ｔＲＮＡの対によって媒介される。そのような直交性対は、非天然ｔＲＮＡに特定の非天然アミノ酸をチャージし得る天然または変異シンテターゼを含み、一方で、しばしばａ）他の内因性アミノ酸または代替の非天然アミノ酸の非天然ｔＲＮＡへのチャージおよびｂ）任意の他の（内因性を含む）ｔＲＮＡのチャージを最小限にする。このような直交性の対は、内因性シンテターゼによって他の内因性アミノ酸がチャージされるのを避けながら、シンテターゼによってチャージされ得るｔＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、そのような対は、細菌、酵母、古細菌、またはヒト源などの様々な生物から同定される。いくつかの実施形態では、直交性シンテターゼ／ｔＲＮＡの対は、単一の生物由来の構成要素を含む。いくつかの実施形態では、直交性シンテターゼ／ｔＲＮＡ対は、２つの異なる生物由来の構成要素を含む。いくつかの実施形態では、直交性シンテターゼ／ｔＲＮＡ対は、修飾の前に、異なるアミノ酸の翻訳を促進する構成要素を含む。いくつかの実施形態では、直交性シンテターゼは、改変されたアラニンシンテターゼである。いくつかの実施形態では、直交性シンテターゼは、改変されたアルギニンシンテターゼである。いくつかの実施形態では、直交性シンテターゼは、改変されたアスパラギンシンテターゼである。いくつかの実施形態では、直交性シンテターゼは、改変されたアスパラギン酸シンテターゼである。いくつかの実施形態では、直交性シンテターゼは、改変されたシステインシンテターゼである。いくつかの実施形態では、直交性シンテターゼは、改変されたグルタミンシンテターゼである。いくつかの実施形態では、直交性シンテターゼは、改変されたグルタミン酸シンテターゼである。いくつかの実施形態では、直交性シンテターゼは、改変されたアラニングリシンである。いくつかの実施形態では、直交性シンテターゼは、改変されたヒスチジンシンテターゼである。いくつかの実施形態では、直交性シンテターゼは、改変されたロイシンシンテターゼである。いくつかの実施形態では、直交性シンテターゼは、改変されたイソロイシンシンテターゼである。いくつかの実施形態では、直交性シンテターゼは、改変されたリジンシンテターゼである。いくつかの実施形態では、直交性シンテターゼは、改変されたメチオニンシンテターゼである。いくつかの実施形態では、直交性シンテターゼは、改変されたフェニルアラニンシンテターゼである。いくつかの実施形態では、直交性シンテターゼは、改変されたプロリンシンテターゼである。いくつかの実施形態では、直交性シンテターゼは、改変されたセリンシンテターゼである。いくつかの実施形態では、直交性シンテターゼは、改変されたトレオニンシンテターゼである。いくつかの実施形態では、直交性シンテターゼは、改変されたトリプトファンシンテターゼである。いくつかの実施形態では、直交性シンテターゼは、改変されたチロシンシンテターゼである。いくつかの実施形態では、直交性シンテターゼは、改変されたバリンシンテターゼである。いくつかの実施形態では、直交性シンテターゼは、改変されたホスホセリンシンテターゼである。いくつかの実施形態では、直交性ｔＲＮＡは、改変されたアラニンｔＲＮＡである。いくつかの実施形態では、直交性ｔＲＮＡは、改変されたアルギニンｔＲＮＡである。いくつかの実施形態では、直交性ｔＲＮＡは、改変されたアスパラギンｔＲＮＡである。いくつかの実施形態では、直交性ｔＲＮＡは、改変されたアスパラギン酸ｔＲＮＡである。いくつかの実施形態では、直交性ｔＲＮＡは、改変されたシステインｔＲＮＡである。いくつかの実施形態では、直交性ｔＲＮＡは、改変されたグルタミンｔＲＮＡである。いくつかの実施形態では、直交性ｔＲＮＡは、改変されたグルタミン酸ｔＲＮＡである。いくつかの実施形態では、直交性ｔＲＮＡは、改変されたアラニングリシンである。いくつかの実施形態では、直交性ｔＲＮＡは、改変されたヒスチジンｔＲＮＡである。いくつかの実施形態では、直交性ｔＲＮＡは、改変されたロイシンｔＲＮＡである。いくつかの実施形態では、直交性ｔＲＮＡは、改変されたイソロイシンｔＲＮＡである。いくつかの実施形態では、直交性ｔＲＮＡは、改変されたリジンｔＲＮＡである。いくつかの実施形態では、直交性ｔＲＮＡは、改変されたメチオニンｔＲＮＡである。いくつかの実施形態では、直交性ｔＲＮＡは、改変されたフェニルアラニンｔＲＮＡである。いくつかの実施形態では、直交性ｔＲＮＡは、改変されたプロリンｔＲＮＡである。いくつかの実施形態では、直交性ｔＲＮＡは、改変されたセリンｔＲＮＡである。いくつかの実施形態では、直交性ｔＲＮＡは、改変されたトレオニンｔＲＮＡである。いくつかの実施形態では、直交性ｔＲＮＡは、改変されたトリプトファンｔＲＮＡである。いくつかの実施形態では、直交性ｔＲＮＡは、改変されたチロシンｔＲＮＡである。いくつかの実施形態では、直交性ｔＲＮＡは、改変されたバリンｔＲＮＡである。いくつかの実施形態では、直交性ｔＲＮＡは、改変されたホスホセリンｔＲＮＡである。これらの実施形態のいずれにおいても、ｔＲＮＡは異種ｔＲＮＡであり得る。
いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は、アミノアシル（ａａＲＳまたはＲＳ）－ｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対によってタンパク質に組み込まれる。例示的なａａＲＳ－ｔＲＮＡ対としては、限定するものではないが、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（Ｍｊ－Ｔｙｒ）ａａＲＳ／ｔＲＮＡ対、Ｅ．ｃｏｌｉ ＴｙｒＲＳ（Ｅｃ－Ｔｙｒ）／Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ｔＲＮＡＣＵＡ対、Ｅ．ｃｏｌｉ ＬｅｕＲＳ（Ｅｃ－Ｌｅｕ）／Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ｔＲＮＡＣＵＡ対、およびピロリシル－ｔＲＮＡ対が挙げられる。場合によっては、非天然アミノ酸は、Ｍｊ－ＴｙｒＲＳ／ｔＲＮＡ対によってタンパク質に組み込まれる。Ｍｊ－ＴｙｒＲＳ／ｔＲＮＡ対によって組み込まれ得る例示的な非天然アミノ酸（ＵＡＡ）としては、限定するものではないが、パラ置換フェニルアラニン誘導体、例えば、ｐ－アミノフェニルアラニンおよびｐ－メトイフェニルアラニン；メタ置換チロシン誘導体、例えば、３－アミノチロシン、３－ニトロチロシン、３，４－ジヒドロキシフェニルアラニン、および３－ヨードチロシン；フェニルセレノシステイン；ｐ－ボロノフェニルアラニン；およびｏ－ニトロベンジルチロシンが挙げられる。
場合によっては、非天然アミノ酸は、Ｅｃ－Ｔｙｒ／ｔＲＮＡＣＵＡまたはＥｃ－Ｌｅｕ／ｔＲＮＡＣＵＡ対によってタンパク質に組み込まれる。Ｅｃ－Ｔｙｒ／ｔＲＮＡＣＵＡまたはＥｃ－Ｌｅｕ／ｔＲＮＡＣＵＡ対によって組み込まれ得る例示的なＵＡＡとしては、限定するものではないが、ベンゾフェノン、ケトン、ヨウ化物、またはアジド置換を含むフェニルアラニン誘導体；Ｏ－プロパルギルチロシン；α－アミノカプリル酸、Ｏ－メチルチロシン、Ｏ－ニトロベンジルシステイン；および３－（ナフタレン－２－イルアミノ）－２－アミノ－プロパン酸が挙げられる。
場合によっては、非天然アミノ酸は、ピロリシル－ｔＲＮＡ対によってタンパク質に組み込まれる。場合によっては、ＰｙｌＲＳは、メタン生成細菌などの古細菌種から得られる。場合によっては、ＰｙｌＲＳは、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｂａｒｋｅｒｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ、またはＭｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓから取得される。ピロリシル－ｔＲＮＡ対によって組み込むことができる例示的なＵＡＡとしては、限定するものではないが、アミドおよびカルバメート置換リジン、例えば、２－アミノ－６－（（Ｒ）－テトラヒドロフラン－２－カルボキサミド）ヘキサン酸、Ｎ－ε－Ｄ－プロリル－Ｌ－リジン、およびＮ－ε－シクロペンチルオキシカルボニル－Ｌ－リジン；Ｎ－ε－アクリロイル－Ｌ－リジン；Ｎ－ε－［（１－（６－ニトロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－イル）エトキシ）カルボニル］－Ｌ－リジン；およびＮ－ε－（１－メチルシクロプロ－２－エンカルボキサミド）リジンが挙げられる。
場合によっては、非天然アミノ酸は、米国特許第９，９８８，６１９号および米国特許第９，９３８，５１６号に開示されているシンテターゼによって本明細書に記載のタンパク質に組み込まれ、これらのそれぞれの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。そのようなシンテターゼによって組み込むことができる例示的なＵＡＡとしては、パラ－メチルアジド－Ｌ－フェニルアラニン、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロアラルキル非天然アミノ酸などが挙げられる。いくつかの実施形態では、そのようなＵＡＡは、ピリジル、ピラジニル、ピラゾリル、トリアゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、チオフェニル、または他の複素環を含む。いくつかの実施形態におけるそのようなアミノ酸は、アジド、テトラジン、または水溶性部分などのカップリングパートナーにコンジュゲーションし得る他の化学基を含む。いくつかの実施形態では、そのようなシンテターゼは、インビボでタンパク質にＵＡＡを組み込むために発現され、使用される。いくつかの実施形態では、そのようなシンテターゼは、無細胞翻訳システムを使用して、ＵＡＡをタンパク質に組み込むために使用される。
場合によっては、非天然アミノ酸は、天然に存在するシンテターゼによって本明細書に記載のタンパク質に組み込まれる。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は、１つまたはそれ以上のアミノ酸に対して栄養要求性である生物によってタンパク質に組み込まれる。いくつかの実施形態では、栄養要求性アミノ酸に対応するシンテターゼは、対応するｔＲＮＡに非天然アミノ酸をチャージし得る。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は、セレノシステインまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は、セレノメチオニンまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は、芳香族アミノ酸であり、芳香族アミノ酸は、ヨウ化物などのハロゲン化アリールを含む。実施形態では、非天然アミノ酸は、栄養要求性アミノ酸と構造的に類似している。
場合によっては、非天然アミノ酸は、図８Ａに示される非天然アミノ酸を含む。
場合によっては、非天然アミノ酸は、リジンまたはフェニルアラニン誘導体またはアナログを含む。場合によっては、非天然アミノ酸は、リジン誘導体またはリジンアナログを含む。場合によっては、非天然アミノ酸は、ピロリシン（Ｐｙｌ）を含む。場合によっては、非天然アミノ酸は、フェニルアラニン誘導体またはフェニルアラニンアナログを含む。場合によっては、非天然アミノ酸は、Ｗａｎらの「ピロリシル－ｔＲＮＡシンテターゼ：通常の酵素であるが、優れた遺伝子コード拡張ツール（Ｐｙｒｒｏｌｙｓｙｌ－ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ： ａｎ ｏｒｄｉｎａｒｙ ｅｎｚｙｍｅ ｂｕｔ ａｎ ｏｕｔｓｔａｎｄｉｎｇ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｔｏｏｌ）」，Ｂｉｏｃｈｅｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｅｔａ １８４４（６）：１０５９－４０７０（２０１４）に記載されている非天然アミノ酸である。場合によっては、非天然アミノ酸は、図８Ｂおよび図８Ｃに示される非天然アミノ酸を含む。
いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は、図８Ｄ～図８Ｇに示される非天然アミノ酸を含む。（Ｄｕｍａｓら、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１５，６，５０－６９の表１から採用）。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のタンパク質に組み込まれた非天然アミノ酸は、米国特許第９，８４０，４９３号；米国特許第９，６８２，９３４号；米国特許出願公開第２０１７／０２６０１３７号；米国特許第９，９３８，５１６号；または米国特許出願公開第２０１８／００８６７３４号（それぞれの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示されている。そのようなシンテターゼによって組み込まれ得る例示的なＵＡＡとしては、パラ－メチルアジド－Ｌ－フェニルアラニン、アラルキル、ヘテロシクリル、およびヘテロアラルキル、ならびにリジン誘導体の非天然アミノ酸が挙げられる。いくつかの実施形態では、そのようなＵＡＡは、ピリジル、ピラジニル、ピラゾリル、トリアゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、チオフェニル、または他の複素環を含む。いくつかの実施形態におけるそのようなアミノ酸は、アジド、テトラジン、または水溶性部分などのカップリングパートナーに結合し得る他の化学基を含む。いくつかの実施形態では、ＵＡＡは、アルキルリンカーを介して芳香族部分に結合されたアジドを含む。いくつかの実施形態では、アルキルリンカーは、Ｃ１－Ｃ１０リンカーである。いくつかの実施形態では、ＵＡＡは、アルキルリンカーを介して芳香族部分に結合されたテトラジンを含む。いくつかの実施形態では、ＵＡＡは、アミノ基を介して芳香族部分に結合されたテトラジンを含む。いくつかの実施形態では、ＵＡＡは、アルキルアミノ基を介して芳香族部分に結合されたテトラジンを含む。いくつかの実施形態では、ＵＡＡは、アルキル鎖を介してアミノ酸側鎖の末端窒素（例えば、リジン誘導体のＮ６、またはより短いアルキル側鎖を含む誘導体のＮ５、Ｎ４、もしくはＮ３）に結合したアジドを含む。いくつかの実施形態では、ＵＡＡは、アルキル鎖を介してアミノ酸側鎖の末端窒素に結合したテトラジンを含む。いくつかの実施形態では、ＵＡＡは、アルキルリンカーを介してアミドに結合されたアジドまたはテトラジンを含む。いくつかの実施形態では、ＵＡＡは、アジドまたはテトラジン含有カルバメートまたは３－アミノアラニン、セリン、リジン、またはそれらの誘導体のアミドである。いくつかの実施形態では、そのようなＵＡＡは、インビボでタンパク質に組み込まれる。いくつかの実施形態では、そのようなＵＡＡは、無細胞系のタンパク質に組み込まれる。
細胞型
いくつかの実施形態では、多くのタイプの細胞／微生物が、例えば、形質転換または遺伝子工学のために使用される。いくつかの実施形態では、細胞は、原核生物または真核生物の細胞である。いくつかの実施形態では、原核細胞は細菌細胞である。いくつかの実施形態では、真核細胞は、真菌細胞または単細胞原生動物である。いくつかの実施形態では、真菌細胞は酵母細胞である。他の場合では、真核細胞は、培養された動物、植物、またはヒトの細胞である。追加の場合には、真核細胞は、植物、多細胞真菌、または動物などの生物に存在する。
いくつかの実施形態では、操作された微生物は、単細胞生物であり、しばしば分裂および増殖し得る。本明細書で使用される場合、「操作された微生物」は、遺伝子操作技術（すなわち、組換えＤＮＡ技術）を使用して、その遺伝物質が変更された微生物である。微生物は、以下の特徴のうちの１つまたはそれ以上を含み得る：好気性、嫌気性、糸状、非糸状、一倍体、二倍体、栄養要求性および／または非栄養要求性。特定の実施形態では、操作された微生物は、原核生物の微生物（例えば、細菌）であり、特定の実施形態では、操作された微生物は、真核生物の微生物などの非原核生物の微生物である。いくつかの実施形態では、操作された微生物は、真核生物の微生物（例えば、酵母、他の真菌、アメーバ）である。いくつかの実施形態では、操作された微生物は真菌である。いくつかの実施形態では、操作された生物は酵母である。
任意の適切な酵母を、宿主微生物、操作された微生物、遺伝子改変生物、または異種もしくは改変ポリヌクレオチドの供給源として選択し得る。酵母としては、限定するものではないが、Ｙａｒｒｏｗｉａ酵母（例えば、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ（以前はＣａｎｄｉｄａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａとして分類されていた））、Ｃａｎｄｉｄａ酵母（例えば、Ｃ．ｒｅｖｋａｕｆｉ、Ｃ．ｖｉｓｗａｎａｔｈｉｉ、Ｃ．ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃ．ｕｔｉｌｉｓ）、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ酵母（例えば、Ｒ．ｇｌｕｔｉｎｕｓ、Ｒ．ｇｒａｍｉｎｉｓ）、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ酵母（例えば、Ｒ．ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ酵母（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ、Ｓ．ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ、Ｓ．ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ酵母、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ酵母（例えば、Ｔ．ｐｕｌｌａｎｓ、Ｔ．ｃｕｔａｎｅｕｍ）、Ｐｉｃｈｉａ酵母（例えば、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｋ．ｐｈａｆｆｉｉ）、およびＬｉｐｏｍｙｃｅｓ酵母（例えば、Ｌ．ｓｔａｒｋｅｙｉｉ、Ｌ．ｌｉｐｏｆｅｒｕｓ）。いくつかの実施形態では、適切な酵母は、Ａｒａｃｈｎｉｏｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ａｕｘａｒｔｈｒｏｎ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｕｉｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｄｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｇｙｍｎｏａｓｃｕｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ、Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ、Ｌｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ、Ｍｙｘｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｍｙｘｏｚｙｍａ、Ｏｉｄｉｏｄｅｎｄｒｏｎ、Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｏｐｕｌａｒｉｏｐｓｉｓ、Ｓｅｐｅｄｏｎｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ、またはＹａｒｒｏｗｉａの属の酵母である。いくつかの実施形態では、適切な酵母は、Ａｒａｃｈｎｉｏｔｕｓ ｆｌａｖｏｌｕｔｅｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ａｕｘａｒｔｈｒｏｎ ｔｈａｘｔｅｒｉ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｆａｍａｔａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｋｅｆｙｒ、Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｌａｍｂｉｃａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｌｕｓｔｉｔａｎｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｒｅｖｋａｕｆｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｖｉｓｗａｎａｔｈｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｘｅｓｔｏｂｉｉ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｕｉｍ ｋｅｒａｔｉｎｏｐｈｉｌｕｍ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｌｂｉｄｕｓ ｖａｒ． ｄｉｆｆｌｕｅｎｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｕｒｅｎｔｉｉ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｍａｎｓ、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ ｈａｎｓｅｎｉｉ、Ｇｙｍｎｏａｓｃｕｓ ｄｕｇｗａｙｅｎｓｉｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ａｎｏｍａｌａ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ、Ｉｓｓｔａｃｈｅｎｋｉａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｗａｌｔｉｉ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ ｌｉｐｏｆｅｒｕｓ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ ｓｔａｒｋｅｙｉｉ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｇｙｐｓｅｕｍ、Ｍｙｘｏｔｒｉｃｈｕｍ ｄｅｆｌｅｘｕｍ、Ｏｉｄｉｏｄｅｎｄｒｏｎ ｅｃｈｉｎｕｌａｔｕｍ、Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ ｔａｎｎｏｐｈｉｌｉｓ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｎｏｔａｔｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ ａｎｏｍａｌａ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｌｕｔｉｎｕｓ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｒａｍｉｎｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｋｌｕｙｖｅｒｉ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｓｃｏｐｕｌａｒｉｏｐｓｉｓ ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ｓｅｐｅｄｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｓｐｅｒｍｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｃｕｔａｎｅｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｐｕｌｌａｎｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、またはＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ（以前はＣａｎｄｉｄａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａとして分類されていた）の種の酵母である。いくつかの実施形態では、酵母は、限定するものではないが、ＡＴＣＣ２０３６２、ＡＴＣＣ８８６２、ＡＴＣＣ１８９４４、ＡＴＣＣ２０２２８、ＡＴＣＣ７６９８２およびＬＧＡＭ Ｓ（７）１株（Ｐａｐａｎｉｋｏｌａｏｕ Ｓ．およびＡｇｇｅｌｉｓ Ｇ．、Ｂｉｏｒｅｓｏｒ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．８２（１）：４３－９（２００２））を含むＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ株である。特定の実施形態では、酵母は、カンジダ種（すなわち、カンジダ属）酵母である。任意の適切なカンジダ種を使用してもよく、および／または脂肪性ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）の生成のために遺伝子改変してもよい。いくつかの実施形態では、適切なカンジダ種としては、限定するものではないが、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｆａｍａｔａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｋｅｆｙｒ、Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｌａｍｂｉｃａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｌｕｓｔｉｔａｎｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｒｅｖｋａｕｆｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｖｉｓｗａｎａｔｈｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｘｅｓｔｏｂｉｉ、および本明細書に記載の任意の他のカンジダ種酵母が挙げられる。カンジダ種の株の非限定的な例としては、限定するものではないが、ｓＡＡ００１（ＡＴＣＣ２０３３６）、ｓＡＡ００２（ＡＴＣＣ２０９１３）、ｓＡＡ００３（ＡＴＣＣ２０９６２）、ｓＡＡ４９６（米国特許出願公開第２０１２／００７７２５２号）、ｓＡＡ１０６（米国特許出願公開第２０１２／００７７２５２号）、ＳＵ－２（ｕｒａ３－／ｕｒａ３－）、Ｈ５３４３（ベータ酸化ブロック；米国特許第５６４８２４７号）という株が挙げられる。カンジダ種由来の任意の適切な株酵母は、遺伝子組換えのための親株として利用され得る。
酵母の属、種、および菌株は、遺伝的内容が非常に密接に関連していることが多いため、区別、分類、および／または名前を付けるのが難しい場合がある。場合によっては、Ｃ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａおよびＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの菌株を区別、分類、および／または命名することが困難であり得、場合によっては、同じ生物と見なされ得る。場合によっては、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓおよびＣ．ｖｉｓｗａｎａｔｈｉｉの様々な菌株を区別、分類、および／または命名することが難しい場合がある（例えば、Ａｒｉｅら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４６，２５７－２６２（２０００）を参照のこと。ＡＴＣＣおよび他の商業的または学術的供給源から得られたいくつかのＣ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓおよびＣ．ｖｉｓｗａｎａｔｈｉｉ株は、本明細書に記載の実施形態と同等かつ同等に適切であると見なされ得る。いくつかの実施形態では、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓおよびＣ．ｖｉｓｗａｎａｔｈｉｉのいくつかの親株は、名前のみが異なると見なされる。
任意の適切な真菌を、宿主微生物、操作された微生物、または異種ポリヌクレオチドの供給源として選択し得る。真菌の非限定的な例としては、限定するものではないが、アスペルギルス菌類（例えば、Ａ．ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）、Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｆｕｎｇｉ、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｆｕｎｇｉおよびＲｈｉｚｏｐｕｓ ｆｕｎｇｉ（例えば、Ｒ．ａｒｒｈｉｚｕｓ、Ｒ．ｏｒｙｚａｅ、Ｒ．ｎｉｇｒｉｃａｎｓ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、真菌類は、Ａ．ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ株であり、これには限定するものではないが、ＡＴＣＣ２４６９０株が挙げられ、および特定の実施形態では、真菌類は、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ株であり、これには、限定するものではないが、ＡＴＣＣ３８１６３株が挙げられる。
任意の適切な原核生物を、宿主微生物、操作された微生物、または異種ポリヌクレオチドの供給源として選択し得る。グラム陰性菌またはグラム陽性菌を選択し得る。菌の例としては、限定するものではないが、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）菌（例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）菌、ノルカルディア（Ｎｏｒｃａｒｄｉａ）菌、キサントバクター（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ）菌、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ（例えば、株ＤＨ１０Ｂ、Ｓｔｂｌ２、ＤＨ５－アルファ、ＤＢ３、ＤＢ３．１）、ＤＢ４、ＤＢ５、ＪＤＰ６８２およびｃｃｄＡ－ｏｖｅｒ（例えば、米国出願番号０９／５１８，１８８）））、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）菌、エルビニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）菌、クレブシェラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）菌、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）菌（例えば、Ｓ．ｍａｒｃｅｓｓａｎｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）菌（例えば、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）菌（例えば、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓ．ｔｙｐｈｉ）、メガスファエラ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ）菌（例えば、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｅｌｓｄｅｎｉｉ）が挙げられる。菌としては、また、限定するものではないが、光合成菌（例えば、緑色非硫黄菌（例えば、Ｃｈｏｒｏｆｌｅｘｕｓ菌（例えば、Ｃ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）、Ｃｈｌｏｒｏｎｅｍａ菌（例えば、Ｃ．ｇｉｇａｔｅｕｍ））、緑色硫黄菌（例えば、Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ菌（例えば、Ｃ．ｌｉｍｉｃｏｌａ）、Ｐｅｌｏｄｉｃｔｙｏｎ菌（例えば、Ｐ．ｌｕｔｅｏｌｕｍ）、紫色硫黄菌（例えば、クロマチウム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ）菌（例えば、Ｃ．ｏｋｅｎｉｉ））、および紫色非硫黄菌（例えば、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ菌（例えば、Ｒ．ｒｕｂｒｕｍ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）菌（例えば、Ｒ．ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｒ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）、およびロドミクロビウム（Ｒｈｏｄｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）菌（例えば、Ｒ．ｖａｎｅｌｌｉｉ））が挙げられる。
非微生物由来の細胞は、宿主微生物、操作された微生物、または異種ポリヌクレオチドの供給源として利用され得る。そのような細胞の例としては、限定するものではないが、昆虫細胞（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ（例えば、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ（例えば、Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ Ｓｆ９またはＳｆ２１細胞）およびＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓａ（例えば、ハイ－ファイブ（Ｈｉｇｈ－Ｆｉｖｅ）細胞）；線虫細胞（例えば、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ細胞）；鳥類細胞；両生類細胞（例えば、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ細胞）；爬虫類細胞；哺乳類細胞（例えば、ＮＩＨ３Ｔ３、２９３、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＶＥＲＯ、Ｃ１２７、ＢＨＫ、Ｐｅｒ－Ｃ６、Ｂｏｗｅｓ ｍｅｌａｎｏｍａおよびＨｅＬａ細胞）；ならびに植物細胞（例えば、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ、Ｎｉｃｏｔａｎｉａ ｔａｂａｃｕｍ、Ｃｕｐｈｅａ ａｃｉｎｉｆｏｌｉａ、Ｃｕｐｈｅａ ａｅｑｕｉｐｅｔａｌａ、Ｃｕｐｈｅａ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ、Ｃｕｐｈｅａ ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔａ、Ｃｕｐｈｅａ ａｖｉｇｅｒａ、Ｃｕｐｈｅａ ａｖｉｇｅｒａ ｖａｒ． ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ、Ｃｕｐｈｅａ ａｘｉｌｌｉｆｌｏｒａ、Ｃｕｐｈｅａ ｂａｈｉｅｎｓｉｓ、Ｃｕｐｈｅａ ｂａｉｌｌｏｎｉｓ、Ｃｕｐｈｅａ ｂｒａｃｈｙｐｏｄａ、Ｃｕｐｈｅａ ｂｕｓｔａｍａｎｔａ、Ｃｕｐｈｅａ ｃａｌｃａｒａｔａ、Ｃｕｐｈｅａ ｃａｌｏｐｈｙｌｌａ、Ｃｕｐｈｅａ ｃａｌｏｐｈｙｌｌａ ｓｕｂｓｐ． ｍｅｓｏｓｔｅｍｏｎ、Ｃｕｐｈｅａ ｃａｒｔｈａｇｅｎｅｎｓｉｓ、Ｃｕｐｈｅａ ｃｉｒｃａｅｏｉｄｅｓ、Ｃｕｐｈｅａ ｃｏｎｆｅｒｔｉｆｌｏｒａ、Ｃｕｐｈｅａ ｃｏｒｄａｔａ、Ｃｕｐｈｅａ ｃｒａｓｓｉｆｌｏｒａ、Ｃｕｐｈｅａ ｃｙａｎｅａ、Ｃｕｐｈｅａ ｄｅｃａｎｄｒａ、Ｃｕｐｈｅａ ｄｅｎｔｉｃｕｌａｔａ、Ｃｕｐｈｅａ ｄｉｓｐｅｒｍａ、Ｃｕｐｈｅａ ｅｐｉｌｏｂｉｉｆｏｌｉａ、Ｃｕｐｈｅａ ｅｒｉｃｏｉｄｅｓ、Ｃｕｐｈｅａ ｆｌａｖａ、Ｃｕｐｈｅａ ｆｌａｖｉｓｅｔｕｌａ、Ｃｕｐｈｅａ ｆｕｃｈｓｉｉｆｏｌｉａ、Ｃｕｐｈｅａ ｇａｕｍｅｒｉ、Ｃｕｐｈｅａ ｇｌｕｔｉｎｏｓａ、Ｃｕｐｈｅａ ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ、Ｃｕｐｈｅａ ｈｏｏｋｅｒｉａｎａ、Ｃｕｐｈｅａ ｈｙｓｓｏｐｉｆｏｌｉａ （Ｍｅｘｉｃａｎ－ｈｅａｔｈｅｒ）、Ｃｕｐｈｅａ ｈｙｓｓｏｐｏｉｄｅｓ、Ｃｕｐｈｅａ ｉｇｎｅａ、Ｃｕｐｈｅａ ｉｎｇｒａｔａ、Ｃｕｐｈｅａ ｊｏｒｕｌｌｅｎｓｉｓ、Ｃｕｐｈｅａ ｌａｎｃｅｏｌａｔａ、Ｃｕｐｈｅａ ｌｉｎａｒｉｏｉｄｅｓ、Ｃｕｐｈｅａ ｌｌａｖｅａ、Ｃｕｐｈｅａ ｌｏｐｈｏｓｔｏｍａ、Ｃｕｐｈｅａ ｌｕｔｅａ、Ｃｕｐｈｅａ ｌｕｔｅｓｃｅｎｓ、Ｃｕｐｈｅａ ｍｅｌａｎｉｕｍ、Ｃｕｐｈｅａ ｍｅｌｖｉｌｌａ、Ｃｕｐｈｅａ ｍｉｃｒａｎｔｈａ、Ｃｕｐｈｅａ ｍｉｃｒｏｐｅｔａｌａ、Ｃｕｐｈｅａ ｍｉｍｕｌｏｉｄｅｓ、Ｃｕｐｈｅａ ｎｉｔｉｄｕｌａ、Ｃｕｐｈｅａ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ、Ｃｕｐｈｅａ ｐａｒｓｏｎｓｉａ、Ｃｕｐｈｅａ ｐａｓｃｕｏｒｕｍ、Ｃｕｐｈｅａ ｐａｕｃｉｐｅｔａｌａ、Ｃｕｐｈｅａ ｐｒｏｃｕｍｂｅｎｓ、Ｃｕｐｈｅａ ｐｓｅｕｄｏｓｉｌｅｎｅ、Ｃｕｐｈｅａ ｐｓｅｕｄｏｖａｃｃｉｎｉｕｍ、Ｃｕｐｈｅａ ｐｕｌｃｈｒａ、Ｃｕｐｈｅａ ｒａｃｅｍｏｓａ、Ｃｕｐｈｅａ ｒｅｐｅｎｓ、Ｃｕｐｈｅａ ｓａｌｉｃｉｆｏｌｉａ、Ｃｕｐｈｅａ ｓａｌｖａｄｏｒｅｎｓｉｓ、Ｃｕｐｈｅａ ｓｃｈｕｍａｎｎｉｉ、Ｃｕｐｈｅａ ｓｅｓｓｉｌｉｆｌｏｒａ、Ｃｕｐｈｅａ ｓｅｓｓｉｌｉｆｏｌｉａ、Ｃｕｐｈｅａ ｓｅｔｏｓａ、Ｃｕｐｈｅａ ｓｐｅｃｔａｂｉｌｉｓ、Ｃｕｐｈｅａ ｓｐｅｒｍａｃｏｃｅ、Ｃｕｐｈｅａ ｓｐｌｅｎｄｉｄａ、Ｃｕｐｈｅａ ｓｐｌｅｎｄｉｄａ ｖａｒ． ｖｉｒｉｄｉｆｌａｖａ、Ｃｕｐｈｅａ ｓｔｒｉｇｕｌｏｓａ、Ｃｕｐｈｅａ ｓｕｂｕｌｉｇｅｒａ、Ｃｕｐｈｅａ ｔｅｌｅａｎｄｒａ、Ｃｕｐｈｅａ ｔｈｙｍｏｉｄｅｓ、Ｃｕｐｈｅａ ｔｏｌｕｃａｎａ、Ｃｕｐｈｅａ ｕｒｅｎｓ、Ｃｕｐｈｅａ ｕｔｒｉｃｕｌｏｓａ、Ｃｕｐｈｅａ ｖｉｓｃｏｓｉｓｓｉｍａ、Ｃｕｐｈｅａ ｗａｔｓｏｎｉａｎａ、Ｃｕｐｈｅａ ｗｒｉｇｈｔｉｉ、Ｃｕｐｈｅａ ｌａｎｃｅｏｌａｔａ）が挙げられる。
宿主生物または異種ポリヌクレオチドの供給源として使用される微生物または細胞は市販されている。本明細書に記載の微生物および細胞、ならびに他の適切な微生物および細胞は、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（Ｍａｎａｓｓａｓ， Ｖｉｒｇｉｎｉａ）、および農業研究文化コレクション（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＮＲＲＬ；Ｐｅｏｒｉａ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）から入手可能である。宿主微生物および操作された微生物は、任意の適切な形態で提供され得る。例えば、そのような微生物は、液体培養または固体培養（例えば、寒天ベースの培地）で提供され得、これは、初代培養物であってもよいし、または１回またはそれ以上継代されていてもよい（例えば、希釈および培養されていてもよい）。微生物はまた、凍結形態または乾燥形態（例えば、凍結乾燥）で提供されてもよい。微生物は、任意の適切な濃度で提供されてもよい。
ポリメラーゼ
ポリメラーゼの特に有用な機能は、既存の核酸をテンプレートとして使用して、核酸鎖の重合を触媒することである。有用な他の機能は、本明細書の他のいずれかで説明されている。有用なポリメラーゼの例としては、ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡポリメラーゼが挙げられる。
ポリメラーゼ非天然核酸の特異性、処理性、または他の特徴を改善する能力は、例えば、増幅、配列決定、標識、検出、クローニングなどを含む、非天然核酸の取り込みが望まれる様々な状況において非常に望ましい。
いくつかの例では、本明細書に開示されるのは、例えば、ＤＮＡ増幅中に、伸長するテンプレートコピーに非天然核酸を組み込むポリメラーゼを含む。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、ポリメラーゼの活性部位が、活性部位への非天然核酸の立体侵入阻害を低減するように改変されるように改変され得る。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、非天然核酸の１つまたはそれ以上の非天然特徴との相補性を提供するように改変され得る。このようなポリメラーゼは、ＵＢＰを細胞に安定して組み込むために細胞内で発現されても、または操作されてもよい。したがって、本発明は、異種または組換えポリメラーゼを含む組成物、およびその使用方法を含む。
ポリメラーゼは、タンパク質工学に関係する方法を使用して改変され得る。例えば、分子モデリングは、結晶構造に基づいて実行され、変異を生じて標的活性を改変し得るポリメラーゼの位置を特定し得る。置換の標的として同定された残基は、Ｂｏｒｄｏら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１７：７２１－７２９（１９９１）およびＨａｙｅｓら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，ＵＳＡ ９９：１５９２６－１５９３１（２００２）（これらのそれぞれの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているような、エネルギー最小化モデリング、ホモロジーモデリング、および／または保存的アミノ酸置換を使用して選択された残基で置換されてもよい。
任意の様々なポリメラーゼを、例えば、生物学的系から単離されたタンパク質ベースの酵素およびその機能的バリアントを含む、本明細書に記載の方法または組成物で使用し得る。以下に例示されるような特定のポリメラーゼへの言及は、他に示されない限り、その機能的バリアントを含むと理解されるであろう。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、野生型ポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、改変された、または変異体のポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、異種ポリメラーゼであり得る。
活性部位領域への非天然核酸の侵入の改善のための、および活性部位領域中の非天然ヌクレオチドと協調するための特徴を有するポリメラーゼも用いられ得る。いくつかの実施形態では、修飾されたポリメラーゼは、改変されたヌクレオチド結合部位を有する。
いくつかの実施形態では、修飾されたポリメラーゼは、非天然核酸に対する野生型ポリメラーゼの特異性の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９９％である非天然核酸に対する特異性を有する。いくつかの実施形態では、修飾または野生型ポリメラーゼは、天然核酸および／または修飾糖を含まない非天然核酸に対する野生型ポリメラーゼの特異性の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９９％である修飾糖を含む非天然核酸に対する特異性を有する。いくつかの実施形態では、修飾または野生型ポリメラーゼは、天然核酸および／または修飾された塩基を含まない非天然核酸に対する野生型ポリメラーゼの特異性の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９９％である修飾された塩基を含む非天然核酸に対する特異性を有する。いくつかの実施形態では、修飾または野生型ポリメラーゼは、三リン酸を含む核酸および／または三リン酸を含まない非天然核酸に対する野生型ポリメラーゼの特異性の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９９％である三リン酸を含む非天然核酸に特異性を有する。例えば、修飾または野生型ポリメラーゼは、二リン酸もしくは一リン酸を含むか、またはリン酸を含まないか、またはそれらの組み合わせを有する非天然核酸に対する野生型ポリメラーゼの特異性の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９９％である三リン酸を含む非天然核酸への特異性を有し得る。
いくつかの実施形態では、改変されたまたは野生型のポリメラーゼは、非天然核酸に対して緩和された特異性を有する。いくつかの実施形態では、修飾または野生型ポリメラーゼは、非天然核酸に対する特異性、および天然核酸に対する野生型ポリメラーゼの特異性の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９９％である天然核酸に対する特異性を有する。いくつかの実施形態では、修飾または野生型ポリメラーゼは、修飾糖を含む非天然核酸に対する特異性、および天然核酸に対する野生型ポリメラーゼの特異性の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９９％である天然核酸に対する特異性を有する。いくつかの実施形態では、修飾または野生型ポリメラーゼは、修飾された塩基を含む非天然核酸に対する特異性、および天然核酸に対する野生型ポリメラーゼの特異性の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９９％である天然核酸に対する特異性を有する。
エキソヌクレアーゼ活性の欠如は、野生型の特徴であるか、またはバリアントもしくは操作されたポリメラーゼによって付与される特徴であり得る。例えば、エキソマイナスクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）フラグメントは、３’から５’のプルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性を欠くクレノウフラグメントの変異バージョンである。
本発明の方法は、固有の３→５’のエキソヌクレアーゼプルーフリーディング活性を欠くか、または３→５’エキソヌクレアーゼプルーフリーディング活性が無効にされている（例えば、変異を通して）、任意のＤＮＡポリメラーゼの基質範囲を拡大するために使用され得る。ＤＮＡポリメラーゼの例としては、ｐｏｌＡ、ｐｏｌＢ（例えば、Ｐａｒｒｅｌ＆Ｌｏｅｂ、Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃ Ｂｉｏｌ ２００１を参照のこと）ｐｏｌＣ、ｐｏｌＤ、ｐｏｌＹ、ｐｏｌＸ、および逆転写酵素（ＲＴ）が挙げられるが、進化性で忠実度の高いポリメラーゼ（ＰＣＴ／ＧＢ２００４／００４６４３）が好ましい。いくつかの実施形態では、修飾または野生型ポリメラーゼは、３’→５’のプルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠いている。いくつかの実施形態では、改変されたまたは野生型のポリメラーゼは、非天然核酸に対する３’→５’のプルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠いている。いくつかの実施形態では、改変されたまたは野生型のポリメラーゼは、３’→５’のプルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性を有する。いくつかの実施形態では、修飾または野生型ポリメラーゼは、天然核酸に対して３’→５’のプルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性を有し、非天然核酸に対して３’→５’のプルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠いている。
いくつかの実施形態では、修飾されたポリメラーゼは、野生型ポリメラーゼのプルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性の少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または９９．９９％である３’→５’のプルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性を有する。いくつかの実施形態では、修飾されたポリメラーゼは、天然核酸に対する野性型ポリメラーゼのプルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性の少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９９％である非天然核酸に対する３’→５’プルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性を有する。いくつかの実施形態では、修飾されたポリメラーゼは、非天然核酸に対して３’→５’のプルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性を有し、天然核酸に対する野生型ポリメラーゼのプルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性の少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９９％である、天然核酸の３’→５’のプルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性を有する。いくつかの実施形態では、修飾されたポリメラーゼは、天然核酸に対して野生型ポリメラーゼのプルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性の少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９９％である天然核酸についての３’→５’のプルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性を有する。
いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、核酸からのそれらの解離速度に従って特徴付けられる。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、１つまたはそれ以上の天然および非天然核酸に対して比較的低い解離速度を有する。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、１つまたはそれ以上の天然および非天然核酸に対して比較的高い解離速度を有する。この解離速度は、ポリメラーゼの活性であって、本明細書に記載の方法において反応速度を調整するために調整され得る。
いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、特定の天然および／もしくは非天然核酸または天然および／もしくは非天然核酸のコレクションと共に使用されるとき、それらの忠実度に従って特徴付けられる。忠実度とは、一般に、核酸テンプレートのコピーを作製するときに、ポリメラーゼが伸長中の核酸鎖に正しい核酸を組み込む精度を指す。ＤＮＡポリメラーゼの忠実度は、天然および非天然核酸が、例えば、等濃度で存在して、ポリメラーゼ鎖－テンプレート核酸バイナリー複合体の同じ部位で鎖合成を競合する場合、天然および非天然核酸の取り込みが正しい場合の、正しくない場合に対する比率として測定され得る。ＤＮＡポリメラーゼの忠実度は、天然および非天然核酸の場合は（ｋｃａｔ／Ｋｍ）、および誤った天然および非天然核酸の場合は（ｋｃａｔ／Ｋｍ）という比率として算出され得る；ここで、ｋｃａｔおよびＫｍは、定常状態の酵素反応速度論におけるミカエリスメンテンパラメーターである（Ｆｅｒｓｈｔ，Ａ．Ｒ．（１９８５）Ｅｎｚｙｍｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ、２ｎｄ ｅｄ．，ｐ３５０，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．（参照により本明細書に組み込まれる））。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、プルーフリーディング活性の有無にかかわらず、少なくとも約１００、１０００、１０，０００、１００，０００、または１×１０６の忠実度値を有する。
いくつかの実施形態では、天然の供給源またはそのバリアント由来のポリメラーゼは、特定の構造を有する非天然核酸の取り込みを検出するアッセイを使用してスクリーニングされる。一例では、ポリメラーゼは、非天然核酸またはＵＢＰ（例えば、ｄ５ＳＩＣＳＴＰ、ｄＣＮＭＯＴＰ、ｄＴＰＴ３ＴＰ、ｄＮａＭＴＰ、ｄＣＮＭＯＴＰ－ｄＴＰＴ３ＴＰ、またはｄ５ＳＩＣＳＴＰ－ｄＮａＭＴＰ ＵＢＰ）を組み込む能力についてスクリーニングしてもよい。野生型ポリメラーゼと比較して、非天然核酸に対して改変された特性を示すポリメラーゼ、例えば、異種ポリメラーゼを使用してもよい。例えば、改変された特性は、例えば、Ｋｍ、ｋｃａｔ、Ｖｍａｘ、非天然核酸（または天然に存在するヌクレオチド）の存在下でのポリメラーゼ処理性、非天然核酸存在下でのポリメラーゼによる平均テンプレート読み取り長、非天然核酸に対するポリメラーゼの特異性、非天然核酸の結合速度、産物（ピロリン酸、三リン酸など）の放出速度、分岐速度、またはそれらの任意の組み合わせであってもよい。一実施形態では、改変された特性は、非天然核酸については減少したＫｍであり、および／または非天然核酸については増加したｋｃａｔ／ＫｍまたはＶｍａｘ／Ｋｍである。同様に、ポリメラーゼは、任意選択で、野生型ポリメラーゼと比較して、非天然核酸の結合速度の増加、産物放出の速度の増加、および／または分岐速度の減少を有する。
同時に、ポリメラーゼは、天然核酸、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴを、伸長する核酸コピーに組み込み得る。例えば、ポリメラーゼは、任意選択で、対応する野生型ポリメラーゼよりも少なくとも約５％高い（例えば、５％、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％以上）天然核酸に対する比活性、および天然核酸の存在下での野生型ポリメラーゼに対して少なくとも５％高い（例えば、５％、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％以上）テンプレートの存在下での天然核酸による処理性を示す。必要に応じて、ポリメラーゼは、野生型ポリメラーゼに対して、少なくとも約５％高い（例えば、約５％、１０％、２５％、５０％、７５％または１００％以上）天然に存在するヌクレオチドに対するｋｃａｔ／ＫｍまたはＶｍａｘ／Ｋｍを表す。
特定の構造の非天然核酸を組み込む能力を有し得る、本明細書で使用されるポリメラーゼはまた、指向進化アプローチを使用して生成されてもよい。核酸合成アッセイを使用して、様々な非天然核酸のいずれかに特異性を有するポリメラーゼバリアントをスクリーニングしてもよい。例えば、ポリメラーゼバリアントは、ＤＮＡテンプレートの非天然ヌクレオチドの反対側に非天然ヌクレオシド三リン酸を組み込む能力についてスクリーニングされ得る（例えば、ｄＣＮＭＯの反対側のｄＴＰＴ３ＴＰ、ｄＴＰＴ３の反対側のｄＣＮＭＯＴＰ、ｄＴＰＴ３の反対側のＮａＭＴＰ、またはｄＣＮＭＯもしくはｄＮａＭの反対側のＴＡＴ１ＴＰ）。いくつかの実施形態では、そのようなアッセイは、例えば、組換えポリメラーゼバリアントを使用するインビトロアッセイである。いくつかの実施形態では、そのようなアッセイは、例えば、細胞においてポリメラーゼバリアントを発現するインビボアッセイである。そのような指向進化技術を使用して、本明細書に記載の任意の非天然核酸に対する活性について、任意の適切なポリメラーゼのバリアントをスクリーニングし得る。場合によっては、本明細書で使用されるポリメラーゼは、非天然リボヌクレオチドをＲＮＡなどの核酸に組み込む能力を有する。例えば、ＮａＭまたはＴＡＴ１リボヌクレオチドは、本明細書に記載のポリメラーゼを使用して核酸に組み込まれる。
記載された組成物の修飾されたポリメラーゼは、任意選択で、改変されたか、および／または組換えのΦ２９型ＤＮＡポリメラーゼであり得る。任意選択で、ポリメラーゼは、改変および／または組換えΦ２９、Ｂ１０３、ＧＡ－１、ＰＺＡ、Φ１５、ＢＳ３２、Ｍ２Ｙ、Ｎｆ、Ｇ１、Ｃｐ－１、ＰＲＤ１、ＰＺＥ、ＳＦ５、Ｃｐ－５、Ｃｐ－７、ＰＲ４、ＰＲ５、ＰＲ７２２、またはＬ１７ポリメラーゼであり得る。
記載された組成物の修飾されたポリメラーゼは、任意選択で改変および／または組換え原核生物ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、ＤＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩ）、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩＩ）、ＤＮＡポリメラーゼＩＶ（Ｐｏｌ ＩＶ）、ＤＮＡポリメラーゼＶ（Ｐｏｌ Ｖ）であってもよい。いくつかの実施形態では、修飾されたポリメラーゼは、非指示的損傷ヌクレオチドにまたがってＤＮＡ合成を媒介するポリメラーゼを含む。いくつかの実施形態では、Ｐｏｌ Ｉ、Ｐｏｌ ＩＩ（ｐｏｌＢ）、Ｐｏｌｌ ＩＶ（ｄｉｎＢ）、および／またはＰｏｌ Ｖ（ｕｍｕＣＤ）をコードする遺伝子は、操作された細胞、またはＳＳＯにおいて構成的に発現または過剰発現される。いくつかの実施形態では、Ｐｏｌ ＩＩの発現または過剰発現の増大は、操作された細胞、またはＳＳＯにおける非天然塩基対（ＵＢＰ）の保持の増大に寄与する。
本発明において一般的に有用な核酸ポリメラーゼとしては、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、およびそれらの変異型または改変型が挙げられる。ＤＮＡポリメラーゼおよびそれらの特性は、とりわけ、ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ第２版、ＫｏｒｎｂｅｒｇおよびＢａｋｅｒ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９１）に詳細に記載されている。本発明において有用な公知の従来のＤＮＡポリメラーゼとしては、限定するものではないが、Ｐｙｒｏｃｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌｕｎｄｂｅｒｇら、１９９１、Ｇｅｎｅ，１０８：１，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、Ｐｙｒｏｃｏｃｏｃｃｕｓ ｗｏｅｓｅｉ（Ｐｗｏ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｈｉｎｎｉｓｄａｅｌｓら、１９９６，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２０：１８６－８，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍｙｅｒｓ ａｎｄ Ｇｅｌｆａｎｄ １９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：７６６１）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ（ＳｔｅｎｅｓｈおよびＭｃＧｏｗａｎ，１９７７，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ４７５：３２）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ（ＴＩｉ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ（商標）ＤＮＡポリメラーゼとも呼ばれる、Ｃａｒｉｅｌｌｏら、１９９１，Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ｒｅｓ，１９：４１９３，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、９°Ｎｍ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、Ｓｔｏｆｆｅｌフラグメント、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（登録商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＵＫ）、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ（Ｔｍａ）ＤＮＡポリメラーゼ（ＤｉａｚおよびＳａｂｉｎｏ，１９９８ Ｂｒａｚ Ｊ Ｍｅｄ．Ｒｅｓ，３１：１２３９）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｈｉｅｎら、１９７６，Ｊ．Ｂａｃｔｅｏｒｉｏｌ，１２７：１５５０）、ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｇｉら、１９９７，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：４５０４）、ＪＤＦ－３ ＤＮＡポリメラーゼ（ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＪＤＦ－３、特許出願ＷＯ０１３２８８７から）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ＧＢ－Ｄ（ＰＧＢ－Ｄ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（商標）ＤＮＡポリメラーゼとも呼ばれる、Ｊｕｎｃｏｓａ－Ｇｉｎｅｓｔａら、１９９４、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１６：８２０、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、ＵｌＴｍａ ＤＮＡポリメラーゼ（好熱菌Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａから；ＤｉａｚおよびＳａｂｉｎｏ，１９９８ Ｂｒａｚ Ｊ．Ｍｅｄ．Ｒｅｓ，３１：１２３９；ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｔｇｏ ＤＮＡポリメラーゼ（ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ、Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓから）、Ｅ．ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｌｅｃｏｍｔｅ ａｎｄ Ｄｏｕｂｌｅｄａｙ、１９８３，Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ｒｅｓ．１１：７５０５）、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｏｒｄｓｔｒｏｍら、１９８１、Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：３１１２）、および古細菌ＤＰ１Ｉ／ＤＰ２ ＤＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｃａｎｎら、１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：１４２５０）が挙げられる。中温性ポリメラーゼおよび好熱性ポリメラーゼの両方が企図されている。好熱性ＤＮＡポリメラーゼとしては、限定するものではないが、ＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ（登録商標）、９°Ｎｍ（商標）、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）、Ｔａｑ、Ｔｎｅ、Ｔｍａ、Ｐｆｕ、ＴｆＩ、Ｔｔｈ、ＴＩｉ、Ｓｔｏｆｆｅｌフラグメント、Ｖｅｎｔ（商標）およびＤｅｅｐＶｅｎｔ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｇｏ、ＪＤＦ－３、ならびにそれらの変異体、バリアントおよび誘導体が挙げられる。３’エキソヌクレアーゼ欠損変異体であるポリメラーゼも企図されている。本発明において有用な逆転写酵素としては、限定するものではないが、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ－Ｉ、ＨＴＬＶ－ＩＩ、ＦｅＬＶ、ＦＩＶ、ＳＩＶ、ＡＭＶ、ＭＭＴＶ、ＭｏＭｕＬＶおよび他のレトロウイルス由来の逆転写酵素が挙げられる（Ｌｅｖｉｎ，Ｃｅｌｌ ８８：５－８（１９９７）；Ｖｅｒｍａ，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．４７３：１－３８（１９７７）；Ｗｕら、ＣＲＣ Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ．３：２８９－３４７（１９７５）を参照のこと）。ポリメラーゼのさらなる例としては、限定するものではないが、９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＢ６９ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、およびＶｅｎｔＲ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。Ｇａｒｄｎｅｒら（２００４）「ベントＤＮＡポリメラーゼによるヌクレオチドアナログ取り込みの比較速度論（Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｎａｌｏｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｂｙ Ｖｅｎｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７９（１２），１１８３４－１１８４２；ＧａｒｄｎｅｒおよびＪａｃｋ「古細菌ＤＮＡポリメラーゼにおけるヌクレオチド糖認識の決定因子（Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｏｆ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｕｇａｒ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｉｎ ａｎ ａｒｃｈａｅｏｎ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）」Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２７（１２）２５４５－２５５３。）非好熱性生物から単離されたポリメラーゼは、熱不活性化され得る。例としては、ファージからのＤＮＡポリメラーゼがある。任意の様々な供給源由来のポリメラーゼを改変して、高温条件に対するそれらの耐性を増減し得ることが理解される。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、好熱性であり得る。いくつかの実施形態では、好熱性ポリメラーゼは、熱不活性化可能であり得る。好熱性ポリメラーゼは、典型的には、高温条件またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術に使用される条件などの熱サイクル条件に有用である。
いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、Φ２９、Ｂ１０３、ＧＡ－１、ＰＺＡ、Φ１５、ＢＳ３２、Ｍ２Ｙ、Ｎｆ、Ｇ１、Ｃｐ－１、ＰＲＤ１、ＰＺＥ、ＳＦ５、Ｃｐ－５、Ｃｐ－７、ＰＲ４、ＰＲ５、ＰＲ７２２、Ｌ１７、ＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ（登録商標）、９°Ｎｍ（商標）、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｎｅ、Ｔｍａ、ＴｆＩ、Ｔｔｈ、ＴＩｉ、Ｓｔｏｆｆｅｌフラグメント、Ｖｅｎｔ（商標）およびＤｅｅｐＶｅｎｔ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｇｏ、ＪＤＦ－３、Ｐｆｕ、Ｔａｑ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、ＰＧＢ－Ｄ、ＵｌＴｍａ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ、古細菌のＤＰ１Ｉ／ＤＰ２ ＤＮＡポリメラーゼＩＩ、９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＢ６９ ＤＮＡポリメラーゼ、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩ逆転写酵素、またはＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ逆転写酵素を含む。
いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼＩ（またはクレノウフラグメント）、ベントポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＰＯＬＢポリメラーゼ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩ逆転写酵素、またはＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ逆転写酵素である。
ヌクレオチド輸送体
ヌクレオチド輸送体（ＮＴ）は、細胞膜および小胞を横切るヌクレオチド基質の移動を促進する膜輸送タンパク質の群である。いくつかの実施形態では、２つのタイプのＮＴ、濃縮ヌクレオシド輸送体および平衡ヌクレオシド輸送体が存在する。場合によっては、ＮＴには、有機陰イオン輸送体（ＯΑΤ）および有機陽イオン輸送体（ＯＣＴ）も含まれる。場合によっては、ヌクレオチド輸送体は、ヌクレオシド三リン酸輸送体（ＮＴＴ）である。
いくつかの実施形態では、ヌクレオシド三リン酸輸送体（ＮＴＴ）は、細菌、植物、または藻類に由来する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドヌクレオシド三リン酸輸送体は、ＴｐＮＴＴ１、ＴｐＮＴＴ２、ＴｐＮＴＴ３、ＴｐＮＴＴ４、ＴｐＮＴＴ５、ＴｐＮＴＴ６、ＴｐＮＴＴ７、ＴｐＮＴＴ８（Ｔ．ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ）、ＰｔＮＴＴ１、ＰｔＮＴＴ２、ＰｔＮＴＴ３、ＰｔＮＴＴ４、ＰｔＮＴＴ５、ＰｔＮＴＴ６（Ｐ．ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）、ＧｓＮＴＴ（Ｇａｌｄｉｅｒｉａ ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ）、ＡｔＮＴＴ１、ＡｔＮＴＴ２（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、ＣｔＮＴＴ１、ＣｔＮＴＴ２（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、ＰａｍＮＴＴ１、ＰａｍＮＴＴ２（Ｐｒｏｔｏｃｈｌａｍｙｄｉａ ａｍｏｅｂｏｐｈｉｌａ）、ＣｃＮＴＴ（Ｃａｅｄｉｂａｃｔｅｒ ｃａｒｙｏｐｈｉｌｕｓ）、またはＲｐＮＴＴ１（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ）である。
いくつかの実施形態では、ＮＴＴは、ＣＮＴ１、ＣＮＴ２、ＣＮＴ３、ＥＮＴ１、ＥＮＴ２、ＯＡＴ１、ＯＡＴ３、またはＯＣＴ１である。
いくつかの実施形態では、ＮＴＴは、非天然核酸を生物、例えば、細胞に導入する。いくつかの実施形態では、ＮＴＴは、ＮＴＴのヌクレオチド結合部位が、ヌクレオチド結合部位への非天然核酸の立体侵入阻害を低減するために改変されるように、改変されてもよい。いくつかの実施形態では、ＮＴＴは、非天然核酸の１つまたはそれ以上の天然または非天然の特徴との相互作用の増大を提供するように改変されてもよい。このようなＮＴＴは、ＵＢＰを細胞に安定して導入するために、細胞内で発現されても、または操作されてもよい。したがって、本発明は、異種または組換えＮＴＴを含む組成物およびその使用方法を含む。
ＮＴＴは、タンパク質工学に関係する方法を使用して改変され得る。例えば、結晶構造に基づいて分子モデリングを実行して、標的活性または結合部位を変更するために変異が行われ得る、ＮＴＴの位置を特定し得る。置換の標的として同定された残基は、Ｂｏｒｄｏら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１７：７２１－７２９（１９９１）およびＨａｙｅｓら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，ＵＳＡ ９９：１５９２６－１５９３１（２００２）（これらのそれぞれの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているような、エネルギー最小化モデリング、ホモロジーモデリング、および／または保存的アミノ酸置換を使用して、選択された残基で置換されてもよい。
様々なＮＴＴのいずれかを、例えば、生物学的システムから単離されたタンパク質ベースの酵素およびその機能的バリアントを含む、本明細書に記載の方法または組成物で使用してもよい。以下に例示されるような特定のＮＴＴへの言及は、他に示されない限り、その機能的バリアントを含むと理解される。いくつかの実施形態では、ＮＴＴは、野生型ＮＴＴである。いくつかの実施形態では、ＮＴＴは、改変された、または変異体のＮＴＴである。
細胞への非天然核酸の侵入を改善し、およびヌクレオチド結合領域の非天然ヌクレオチドと協調するための特徴を備えたＮＴＴも使用してもよい。いくつかの実施形態では、改変されたＮＴＴは、改変されたヌクレオチド結合部位を有する。いくつかの実施形態では、改変されたまたは野生型のＮＴＴは、非天然核酸に対して特異性が緩和されている。例えば、ＮＴＴは、任意選択で、対応する野生型ＮＴＴに対して、少なくとも約０．１％高い（例えば、約０．１％、０．２％、０．５％、０．８％、１％、１．１％、１．２％、１．５％、１．８％、２％、３％、４％、５％、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％以上）非天然ヌクレオチドに対する導入の比活性を示す。任意選択で、ＮＴＴは、野生型ＮＴＴに対して、少なくとも約０．１％高い（例えば、約０．１％、０．２％、０．５％、０．８％、１％、１．１％、１．２％、１．５％、１．８％、２％、３％、４％、５％、１０％、２５％、５０％、７５％、または１００％以上）非天然ヌクレオチドに対するｋｃａｔ／ＫｍまたはＶｍａｘ／Ｋｍを示す。
ＮＴＴは、三リン酸（すなわち、Ｋｍ）に対するそれらの親和性、および／または導入速度（すなわち、Ｖｍａｘ）に従って特徴付けることができる。いくつかの実施形態では、ＮＴＴは、１つまたはそれ以上の天然および非天然三リン酸に対して相対的にＫｍまたはＶｍａｘを有する。いくつかの実施形態では、ＮＴＴは、１つまたはそれ以上の天然および非天然三リン酸に対して比較的高いＫｍまたはＶｍａｘを有する。
天然源またはそのバリアント由来のＮＴＴは、三リン酸の量を検出するアッセイを使用してスクリーニングされ得る（質量分析、または三リン酸が適切に標識されている場合は放射能のいずれかを使用する）。一例では、ＮＴＴは、非自然の三リン酸（例えば、ｄＴＰＴ３ＴＰ、ｄＣＮＭＯＴＰ、ｄ５ＳＩＣＳＴＰ、ｄＮａＭＴＰ、ＮａＭＴＰ、および／またはＴＰＴ１ＴＰ）を導入する能力についてスクリーニングされてもよい。ＮＴＴ、例えば、野生型ＮＴＴと比較して、非天然核酸に対して改変された特性を示す、異種ＮＴＴを用いてもよい。例えば、変更された特性とは、例えば、三リン酸の導入の場合、Ｋｍ、ｋｃａｔ、Ｖｍａｘであり得る。一実施形態では、改変された特性は、非天然三リン酸の場合は、減少したＫｍであり、および／または非天然三リン酸の場合は増大したｋｃａｔ／ＫｍもしくはＶｍａｘ／Ｋｍである。同様に、ＮＴＴは、野生型ＮＴＴと比較して、任意選択で、非天然三リン酸の結合速度の増大、細胞内放出の速度の増大、および／または細胞導入速度の増大を有する。
同時に、ＮＴＴは、天然三リン酸、例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、および／またはＴＴＰを細胞に導入し得る。場合によっては、ＮＴＴは、複製および転写をサポートし得る天然核酸の導入の比活性を任意選択で示す。いくつかの実施形態では、ＮＴＴは、複製および転写をサポートし得る天然核酸について、任意選択でｋｃａｔ／ＫｍまたはＶｍａｘ／Ｋｍを示す。
特定の構造の非天然三リン酸を導入する能力を有し得る本明細書で使用されるＮＴＴはまた、指向進化アプローチを使用して生成され得る。核酸合成アッセイを使用して、様々な非天然三リン酸のいずれかに特異性を有するＮＴＴバリアントをスクリーニングし得る。例えば、ＮＴＴバリアントは、非天然三リン酸（例えば、ｄ５ＳＩＣＳＴＰ、ｄＮａＭＴＰ、ｄＣＮＭＯＴＰ、ｄＴＰＴ３ＴＰ、ＮａＭＴＰ、および／またはＴＰＴ１ＴＰ）を導入する能力についてスクリーニングされ得る。いくつかの実施形態では、そのようなアッセイは、例えば、組換えＮＴＴバリアントを使用するインビトロアッセイである。いくつかの実施形態では、そのようなアッセイは、例えば、細胞においてＮＴＴバリアントを発現するインビボアッセイである。このような技術を使用して、本明細書に記載の非天然三リン酸のいずれかに対する活性について、任意の適切なＮＴＴのバリアントをスクリーニングし得る。
核酸試薬およびツール
本明細書に記載の方法、細胞、または操作された微生物と共に使用するためのヌクレオチドおよび／または核酸試薬（またはポリヌクレオチド）は、非天然ヌクレオチドを伴うかまたは伴わない１つまたはそれ以上のＯＲＦを含む。ＯＲＦは、任意の適切な供給源、時にはゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、逆転写ＲＮＡまたは相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、または前述の１つまたはそれ以上を含む核酸ライブラリーに由来し得、そして目的の核酸配列、目的のタンパク質、または目的の活性を含む任意の生物種に由来する。ＯＲＦを得ることができる生物の非限定的な例としては、例えば、細菌、酵母、真菌、ヒト、昆虫、線虫、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ラットまたはマウスが挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のヌクレオチドおよび／または核酸試薬または他の試薬は、単離または精製される。公開されているインビトロの方法により、非天然ヌクレオチドを含むＯＲＦを作製し得る。場合によっては、ヌクレオチドまたは核酸試薬は、非天然核酸塩基を含む。
核酸試薬は、ＯＲＦと併せて翻訳され、アミノ酸タグをコードする、ＯＲＦに隣接するヌクレオチド配列を含む場合がある。タグをコードするヌクレオチド配列は、核酸試薬中のＯＲＦの３’および／または５’に位置し、それにより、ＯＲＦによってコードされるタンパク質またはペプチドのＣ末端またはＮ末端でタグをコードしている。インビトロでの転写および／または翻訳を無効にしない任意のタグを利用してもよく、技術者によって適切に選択されてもよい。タグは、培養または発酵培地からの所望のＯＲＦ産物の単離および／または精製を容易にし得る。場合によっては、核酸試薬のライブラリーが、本明細書に記載の方法および組成物と共に使用される。例えば、少なくとも１００、１０００、２０００、５０００、１０，０００、または５０，０００超の固有のポリヌクレオチドのライブラリーが、ライブラリーに存在し、各ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの非天然核酸塩基を含む。
非天然ヌクレオチドを含むかまたは含まない、核酸または核酸試薬は、特定のエレメント、例えば、核酸の使用目的に従ってしばしば選択される調節エレメントを含み得る。以下のエレメントのいずれかを核酸試薬に含めてもよいし、除外してもよい。例えば、核酸試薬は、以下のヌクレオチドエレメントの１つまたはそれ以上または全てを含み得る：１つまたはそれ以上のプロモーターエレメント、１つまたはそれ以上の５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、標的ヌクレオチド配列が挿入され得る１つまたはそれ以上の領域（「挿入エレメント」）、１つまたはそれ以上の標的ヌクレオチド配列、１つまたはそれ以上の３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）、および１つまたはそれ以上の選択エレメント。核酸試薬は、そのようなエレメントの１つまたはそれ以上を提供されてもよく、核酸が所望の生物に導入される前に、他のエレメントを核酸に挿入してもよい。いくつかの実施形態では、提供される核酸試薬は、プロモーター、５’ＵＴＲ、任意の３’ＵＴＲ、および標的ヌクレオチド配列がヌクレオチド酸試薬に挿入される（すなわち、クローニングされる）挿入エレメントを含む。特定の実施形態では、提供される核酸試薬は、プロモーター、挿入エレメント、および任意の３’ＵＴＲを含み、そして５’ＵＴＲ／標的ヌクレオチド配列は、任意の３’ＵＴＲと共に挿入される。エレメントは、選択された発現系での発現（例えば、選択された生物での発現、または例えば、無細胞系での発現）に適した任意の順序で配置されてもよく、いくつかの実施形態では、核酸試薬は、５’→３’の方向で以下のエレメントを含む：（１）プロモーターエレメント、５’ＵＴＲ、および挿入エレメント；（２）プロモーターエレメント、５’ＵＴＲ、および標的ヌクレオチド配列；（３）プロモーターエレメント、５’ＵＴＲ、挿入エレメントおよび３’ＵＴＲ；ならびに（４）プロモーターエレメント、５’ＵＴＲ、標的ヌクレオチド配列および３’ＵＴＲ。いくつかの実施形態では、ＵＴＲは、完全に天然であるか、または非天然ヌクレオチドを含む、ＯＲＦの転写または翻訳を変更または増大させるように最適化され得る。
核酸試薬、例えば、発現カセットおよび／または発現ベクターは、プロモーター、エンハンサー、翻訳開始配列、転写終結配列および他のエレメントを含む様々な調節エレメントを含んでもよい。「プロモーター」とは、一般に、転写開始部位に関して比較的固定された位置にあるときに機能するＤＮＡの配列である。例えば、プロモーターは、ヌクレオチド三リン酸輸送体核酸セグメントの上流にあり得る。「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼおよび転写因子の基本的な相互作用に必要なコアエレメントを含み、かつ上流エレメントおよび応答エレメントを含んでもよい。「エンハンサー」とは、一般に、転写開始部位から固定でない距離で機能し、転写ユニットに対して５’または３’’のいずれかであり得るＤＮＡの配列を指す。さらに、エンハンサーは、イントロン内およびコード配列自体内に存在してもよい。それらは通常長さが１０～３００の間であり、シスで機能する。エンハンサーは、近くのプロモーターからの転写を増大するように機能する。プロモーターと同様、エンハンサーも、転写の調節を媒介する応答エレメントを含む場合が多い。エンハンサーはしばしば発現の調節を決定し、完全に天然であるかまたは非天然ヌクレオチドを含むＯＲＦなどの、ＯＲＦ発現を変更または最適化するために使用され得る。
上記のように、核酸試薬はまた、１つまたはそれ以上の５’ＵＴＲ、および１つまたはそれ以上の３’ＵＴＲを含んでもよい。例えば、真核生物の宿主細胞（例えば、酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒトまたは有核細胞）および原核生物の宿主細胞（例えば、ウイルス、細菌）で使用される発現ベクターは、ｍＲＮＡの発現に影響を与え得る、転写の終了についてシグナル伝達する配列を含んでもよい。これらの領域は、組織因子タンパク質をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分のポリアデニル化セグメントとして転写され得る。３’’の非翻訳領域には、転写終結部位も含まれる。いくつかの好ましい実施形態では、転写ユニットは、ポリアデニル化領域を含む。この領域の利点の１つは、転写されたユニットがｍＲＮＡのように処理および輸送される可能性が高くなるということである。発現構築物におけるポリアデニル化シグナルの同定および使用は、十分に確立されている。いくつかの好ましい実施形態では、相同なポリアデニル化シグナルは、導入遺伝子構築物において使用され得る。
５’ＵＴＲは、それが由来するヌクレオチド配列に内因性の１つまたはそれ以上のエレメントを含み得、時には１つまたはそれ以上の外因性エレメントを含む。５’ＵＴＲは、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ＲＮＡまたはｍＲＮＡなどの任意の適切な核酸から、例えば、任意の適切な生物（例えば、ウイルス、細菌、酵母、真菌、植物、昆虫または哺乳動物）から由来し得る。技術者は、選択された発現系（例えば、選択された生物での発現、または、例えば、無細胞系での発現）に基づいて、５’ＵＴＲにとって適切なエレメントを選択し得る。５’ＵＴＲは、技術者に公知の以下のエレメントの１つまたはそれ以上を含む場合がある：エンハンサー配列（例えば、転写または翻訳）、転写開始部位、転写因子結合部位、翻訳調節部位、翻訳開始部位、翻訳因子結合部位、アクセサリータンパク質結合部位、フィードバック調節剤結合部位、Ｐｒｉｂｎｏｗボックス、ＴＡＴＡボックス、－３５エレメント、Ｅ－ｂｏｘ（ヘリックス－ループ－ヘリックス結合エレメント）、リボソーム結合部位、レプリコン、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、サイレンサーエレメントなど。いくつかの実施形態では、プロモーターエレメントは、適切な条件付き調節に必要な全ての５’ＵＴＲエレメントが、プロモーターエレメントフラグメント内に、またはプロモーターエレメントフラグメントの機能的部分配列内に含まれるように分離されてもよい。
核酸試薬中の５’ＵＴＲは、翻訳エンハンサーヌクレオチド配列を含んでもよい。翻訳エンハンサーヌクレオチド配列は、多くの場合、核酸試薬のプロモーターと標的ヌクレオチド配列の間に位置している。翻訳エンハンサー配列は、しばしばリボソームに結合し、１８Ｓ ｒＲＮＡ結合リボヌクレオチド配列（すなわち、４０Ｓリボソーム結合配列）である場合もあり、内部リボソーム侵入配列（ＩＲＥＳ）である場合もある。ＩＲＥＳは一般に、多数の特定の分子間相互作用を介して４０Ｓリボソームサブユニットと接触する正確に配置されたＲＮＡ三次構造を有するＲＮＡ足場を形成する。リボソームエンハンサー配列の例は公知であり、技術者によって同定され得る（例えば、Ｍｉｇｎｏｎｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３３：Ｄ１４１－Ｄ１４６（２００５）；Ｐａｕｌｏｕｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３１：７２２－７３３（２００３）；Ａｋｂｅｒｇｅｎｏｖら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３２：２３９－２４７（２００４）；Ｍｉｇｎｏｎｅら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３（３）：ｒｅｖｉｅｗｓ０００４．１－０００１．１０（２００２）；Ｇａｌｌｉｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３０：３４０１－３４１１（２００２）；Ｓｈａｌｏｉｋｏら、ＤＯＩ：１０．１００２／ｂｉｔ．２０２６７；およびＧａｌｌｉｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １５：３２５７－３２７３（１９８７）；それぞれの開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
翻訳エンハンサー配列は、コザックコンセンサス配列または他の配列（例えば、ヒドロ虫ポリプ配列、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ０７１２８）などの真核生物配列である場合がある。翻訳エンハンサー配列は、シャイン・ダルガルノコンセンサス配列などの原核生物配列である場合がある。特定の実施形態では、翻訳エンハンサー配列は、ウイルスヌクレオチド配列である。翻訳エンハンサー配列は、例えば、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）、アルファルファモザイクウイルス（ＡＭＶ）；タバコエッチウイルス（ＥＴＶ）；ジャガイモウイルスＹ（ＰＶＹ）；カブモザイク（ポティ）ウイルスおよびエンドウ種子伝染モザイクウイルスなどの植物ウイルスの５’ＵＴＲに由来する場合がある。特定の実施形態では、ＴＭＶから約６７塩基の長さのオメガ配列は、翻訳エンハンサー配列として核酸試薬に含まれる（例えば、グアノシンヌクレオチドを欠き、２５ヌクレオチド長のポリ（ＣＡＡ）中央領域を含む）。
３’ＵＴＲは、それが由来するヌクレオチド配列に内因性の１つまたはそれ以上のエレメントを含んでもよく、１つまたはそれ以上の外因性エレメントを含む場合もある。３’ＵＴＲは、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ＲＮＡまたはｍＲＮＡなどの任意の適切な核酸から、例えば、任意の適切な生物（例えば、ウイルス、細菌、酵母、真菌、植物、昆虫または哺乳動物）から由来し得る。技術者は、選択された発現系に基づいて、３’ＵＴＲに適切なエレメントを選択し得る（例えば、選択された生物での発現など）。３’ＵＴＲは、技術者に公知の以下のエレメントの１つまたはそれ以上を含む場合がある：転写調節部位、転写開始部位、転写終結部位、転写因子結合部位、翻訳調節部位、翻訳終結部位、翻訳開始部位、翻訳因子結合部位、リボソーム結合部位、レプリコン、エンハンサーエレメント、サイレンサーエレメントおよびポリアデノシンテール。３’ＵＴＲにはポリアデノシンテールが含まれることが多く、含まれない場合もあり、ポリアデノシンテールが存在する場合は、１つまたはそれ以上のアデノシン部分が追加されても、またはそれから削除されてもよい（例えば、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５または約５０のアデノシン部分を追加してもまたは削除してもよい）。
いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲの改変を用いて、プロモーターの活性を変更する（例えば、増加、追加、減少、または実質的に排除する）。プロモーター活性の変更は、次いで、改変された５’または３’ＵＴＲを含む作動可能に連結されたプロモーターエレメントからの目的のヌクレオチド配列の転写の変化によって、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の活性（例えば、酵素活性）を変更し得る。例えば、微生物を、新規の活性（例えば、宿主生物には通常見られない活性）を加え得る、または特定の実施形態では、目的のヌクレオチド配列（例えば、目的の相同または異種ヌクレオチド配列）に作動可能に連結された同種または異種プロモーターからの転写を増大させることによって既存の活性の発現を増大し得る改変５’または３’ＵＴＲを含む核酸試薬を発現するように遺伝子改変によって操作してもよい。いくつかの実施形態では、微生物を、特定の実施形態では、目的のヌクレオチド配列に対して作動可能に連結された同種または異種プロモーターからの転写を減少または実質的に排除することによって、活性の発現を減少し得る改変５’または３’ＵＴＲを含む核酸試薬を発現するように遺伝子改変によって操作してもよい。
発現カセットまたは発現ベクターからのヌクレオチド三リン酸輸送体の発現は、原核細胞または真核細胞で発現し得る任意のプロモーターによって制御され得る。プロモーターエレメントは通常、ＤＮＡ合成および／またはＲＮＡ合成に必要である。プロモーターエレメントは、ある遺伝子に対応するＲＮＡの合成の開始部位を提供することにより、特定の遺伝子の転写を促進し得るＤＮＡの領域を含むことが多い。プロモーターは一般に、それらが調節する遺伝子の近くに位置し、遺伝子の上流（例えば、遺伝子の５’）に位置し、いくつかの実施形態では、遺伝子のセンス鎖と同じＤＮＡ鎖上にある。いくつかの実施形態では、プロモーターエレメントは、遺伝子または生物から単離されてもよく、ポリヌクレオチド配列と機能的に関連して挿入されて、変化されたおよび／または調節された発現を可能にし得る。核酸の発現に使用される非天然プロモーター（例えば、通常は所与の核酸配列に関連しないプロモーター）は、しばしば異種プロモーターと呼ばれる。特定の実施形態では、異種プロモーターおよび／または５’ＵＴＲは、本明細書に記載されるような所望の活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと機能的に関連して挿入され得る。プロモーターに関して本明細書で使用される「作動可能に連結された」および「機能的に関連して」という用語は、コード配列とプロモーターエレメントとの間の関係を指す。転写を介したコード配列からの発現がプロモーターエレメントによって調節または制御される場合、プロモーターは、コード配列と作動可能に連結されているか、または機能的に関連している。「作動可能に連結された」および「機能的に関連して」という用語は、プロモーターエレメントに関して本明細書で交換可能に使用される。
プロモーターはしばしばＲＮＡポリメラーゼと相互作用する。ポリメラーゼは、既存の核酸試薬を使用して核酸の合成を触媒する酵素である。テンプレートがＤＮＡテンプレートの場合、タンパク質が合成される前にＲＮＡ分子が転写される。本発明の方法での使用に適したポリメラーゼ活性を有する酵素としては、タンパク質を合成するために選択されたテンプレートを用いて、選択されたシステムで活性である任意のポリメラーゼが挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書においてプロモーターエレメントとも呼ばれるプロモーター（例えば、異種プロモーター）は、ヌクレオチド配列またはオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に作動可能に連結され得る。プロモーターエレメントからの転写は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列またはＯＲＦ配列に対応するＲＮＡの合成を触媒し得、これは次いで、所望のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の合成をもたらす。
プロモーターエレメントは、調節制御に対して応答性を示すことがある。プロモーターエレメントは、選択的薬剤によって調節され得る場合もある。すなわち、プロモーターエレメントからの転写は、環境、栄養、または内部条件またはシグナル（例えば、熱誘導性プロモーター、光調節プロモーター、フィードバック調節プロモーター、ホルモン影響性プロモーター、組織特異的プロモーター、酸素およびｐＨ影響性プロモーター、選択的薬剤（例えば、カナマイシン）に応答するプロモーターなど）の変化に応じて、オン、オフ、アップレギュレーションまたはダウンレギュレーションされ得る場合がある。環境、栄養、または内部シグナルの影響を受けるプロモーターは、そのプロモーターまたはその近くに結合し、特定の条件下で標的配列の発現を増加または減少させるシグナル（直接または間接）の影響を受けることがよくある。本明細書に開示される全ての方法と同様に、天然または改変プロモーターの包含を使用して、完全天然ＯＲＦ（例えば、ＮＴＴまたはａａＲＳ）または非天然ヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡまたはｔＲＮＡ）を含むＯＲＦの発現を変更または最適化し得る。
本明細書に記載の実施形態で使用されるプロモーターエレメントからの転写に影響を与える選択的薬剤または調節剤の非限定的な例としては、限定するものではないが、以下が挙げられる：（１）他の方法では毒性化合物（例えば、抗生物質）に対して耐性を提供する産物をコードする核酸セグメント；（２）他の方法ではレシピエント細胞に欠けている産物（例えば、必須産物、ｔＲＮＡ遺伝子、栄養要求性マーカー）をコードする核酸セグメント；（３）遺伝子産物の活性を抑制する産物をコードする核酸セグメント；（４）容易に同定され得る産物をコードする核酸セグメント（例えば、抗生物質（例えば、β－ラクタマーゼ）、β－ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、および細胞表面タンパク質などの表現型マーカー）；（５）細胞の生存および／または機能に、他の方法では有害である産物に結合する核酸セグメント；（６）上記の１～５番に記載されている核酸セグメントのいずれかの活性を、他の方法では阻害する核酸セグメント（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）；（７）基質を改変する産物（例えば、制限エンドヌクレアーゼ）に結合する核酸セグメント；（８）所望の分子（例えば、特定のタンパク質結合部位）を単離または同定するために使用され得る核酸セグメント；（９）他の方法では機能し得ない特定のヌクレオチド配列をコードする核酸セグメント（例えば、分子の亜集団のＰＣＲ増幅のために）；（１０）存在しない場合、特定の化合物に対する耐性または感受性を直接的または間接的に付与する核酸セグメント；（１１）レシピエント細胞において、毒性であるか、または相対的に非毒性の化合物を毒性化合物（例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ）に変換する産物をコードする核酸セグメント；（１２）それらを含む核酸分子の複製、分配または遺伝可能性を阻害する核酸セグメント；（１３）条件付き複製機能、例えば、特定の宿主もしくは宿主細胞株における、または特定の環境条件下（例えば、温度、栄養条件など）での複製をコードする核酸セグメント；および／または（１４）非天然ヌクレオチドを含む１つまたはそれ以上のｍＲＮＡまたはｔＲＮＡをコードする核酸。いくつかの実施形態では、調節剤または選択的薬剤を添加して、生物が供される既存の増殖条件を変更してもよい（例えば、液体培養での増殖、発酵槽での増殖、固体栄養プレートでの増殖など）。
いくつかの実施形態では、プロモーターエレメントの調節を使用して、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の活性（例えば、酵素活性など）を変更（例えば、増大、追加、減少、または実質的に排除）し得る。例えば、微生物を、新規の活性（例えば、宿主生物には通常見られない活性）を加え得る、または特定の実施形態では、目的のヌクレオチド配列（例えば、目的の相同または異種ヌクレオチド配列）に作動可能に連結された相同性プロモーターまたは異種プロモーターからの転写を増加させることによって既存の活性の発現を増大し得る核酸試薬を発現するように遺伝子改変によって操作してもよい。いくつかの実施形態では、微生物を、特定の実施形態では、目的のヌクレオチド配列に作動可能に連結された相同または異種プロモーターからの転写を減少または実質的に排除することによって活性の発現を減少し得る核酸試薬を発現するように遺伝子改変によって操作してもよい。
異種タンパク質、例えば、ヌクレオチド三リン酸輸送体をコードする核酸を、任意の適切な発現系に挿入してもよいし、または使用してもよい。いくつかの実施形態では、核酸試薬は、時には、宿主生物の染色体に安定して組み込まれるか、または核酸試薬は、特定の実施形態では、宿主染色体の一部の欠失であってもよい（例えば、遺伝子改変生物において、宿主ゲノムの変更は、遺伝子改変がある所望の生物を選択的または優先的に維持する能力を付与する）。そのような核酸試薬（例えば、変更されたゲノムが生物に選択可能な形質を与える核酸または遺伝子改変生物）は、所望のタンパク質または核酸分子の産生を誘導するそれらの能力について選択され得る。必要に応じて、核酸試薬は、コドンが（ｉ）ネイティブ配列で指定されたものとは異なるｔＲＮＡを使用して、同じアミノ酸をコードするように、または（ｉｉ）従来とは異なるかまたは非天然アミノ酸（検出可能な標識アミノ酸を含む）を含む、通常とは異なるアミノ酸をコードするように変更してもよい。
組換え発現は、プラスミドなどのベクターの一部であり得る発現カセットを使用して有用に達成される。ベクターは、ヌクレオチド三リン酸輸送体をコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含み得る。ベクターはまた、本明細書に記載されるように、転写および翻訳に必要な他のエレメントを含んでもよい。発現カセット、発現ベクター、およびカセットまたはベクター中の配列は、非天然ヌクレオチドが接触している細胞に対して異種であり得る。例えば、ヌクレオチド三リン酸輸送体配列は、細胞に対して異種であり得る。
ヌクレオチド三リン酸輸送体を保持するか、コードするか、および／または発現するのに適した様々な原核生物および真核生物の発現ベクターを生成し得る。そのような発現ベクターとしては、例えば、ｐＥＴ、ｐＥＴ３ｄ、ｐＣＲ２．１、ｐＢＡＤ、ｐＵＣ、および酵母ベクターが挙げられる。ベクターは、例えば、様々なインビボおよびインビトロの状況で使用し得る。使用され得る原核生物プロモーターの非限定的な例としては、ＳＰ６、Ｔ７、Ｔ５、ｔａｃ、ｂｌａ、ｔｒｐ、ｇａｌ、ｌａｃ、またはマルトースプロモーターが挙げられる。使用され得る真核生物プロモーターの非限定的な例としては、構成的プロモーター、例えば、ＣＭＶ、ＳＶ４０およびＲＳＶプロモーターなどのウイルスプロモーター、ならびに調節可能なプロモーター、例えば、ｔｅｔプロモーター、ｈｓｐ７０プロモーター、およびＣＲＥによって調節される合成プロモーターなどの誘導性または抑制性プロモーターが挙げられる。細菌発現用のベクターとしてはｐＧＥＸ－５Ｘ－３が含まれ、真核生物発現用のベクターとしては、ｐＣＩｎｅｏ－ＣＭＶが挙げられる。使用され得るウイルスベクターとしては、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、ＡＩＤＳウイルス、神経栄養ウイルス、シンドビスおよび他のウイルスに関連するものが挙げられる。これらのウイルスの特性を共有し、ベクターとしての使用に適した任意のウイルスファミリーも有用である。使用できるレトロウイルスベクターとしては、Ｖｅｒｍａ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｐ．２２９－２３２，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，（１９８５）に記載されているベクターが挙げられる。例えば、そのようなレトロウイルスベクターとしては、マウスマロニー白血病ウイルス、ＭＭＬＶ、および望ましい特性を発現する他のレトロウイルスが挙げられる。通常、ウイルスベクターには、非構造初期遺伝子、構造後期遺伝子、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写物、複製およびキャプシド形成に必要な逆末端リピート、ならびにウイルスゲノムの転写および複製を制御するプロモーターを含む。ベクターとして設計された場合、ウイルスは通常、１つまたはそれ以上の初期遺伝子が除去されており、除去されたウイルス核酸の代わりに遺伝子または遺伝子／プロモーターカセットがウイルスゲノムに挿入される。
クローニング
当技術分野で公知の任意の便利なクローニング戦略を利用して、ＯＲＦなどのエレメントを核酸試薬に組み込んでもよい。以下のような公知の方法を利用して、挿入エレメントとは独立してエレメントをテンプレートに挿入してもよい、例えば、（１）１つまたはそれ以上の既存の制限酵素部位でテンプレートを切断し、目的のエレメントをライゲーションすること、および（２）１つまたはそれ以上の適切な制限酵素部位を含むオリゴヌクレオチドプライマーをハイブリダイズし、ポリメラーゼ連鎖反応（本明細書でより詳細に記載される）によって増幅することによって、テンプレートに制限酵素部位を追加すること。他のクローニング戦略は、例えば、ＰＣＲのためのオリゴヌクレオチドプライマーハイブリダイゼーション部位、および本明細書に記載される他のものなど、核酸試薬に存在するかまたは挿入される１つまたはそれ以上の挿入部位を利用する。いくつかの実施形態では、クローニング戦略は、組換えなどの遺伝子操作と組み合わせてもよい（例えば、本明細書でさらに説明するように、改変される生物のゲノムへの目的の核酸配列を有する核酸試薬の組換え）。いくつかの実施形態では、クローニングされたＯＲＦは、目的の１つまたはそれ以上のＯＲＦを有する微生物を操作することによって、（直接的または間接的に）改変のまたは野生型のヌクレオチド三リン酸輸送体および／またはポリメラーゼを生成し得、その微生物はヌクレオチド三リン酸輸送体活性またはポリメラーゼ活性の変化した活性を含む。
核酸を１つまたはそれ以上の特異的切断剤と接触させることにより、その核酸を特異的に切断し得る。特定の切断剤は、特定の部位で特定のヌクレオチド配列に従って特異的に切断することが多い。酵素特異的切断剤の例としては、限定するものではないが、エンドヌクレアーゼ（例えば、ＤＮａｓｅ（例えば、ＤＮａｓｅ Ｉ、ＩＩ）；ＲＮａｓｅ（例えば、ＲＮａｓｅ Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｐ）；Ｃｌｅａｖａｓｅ（商標）酵素；ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ；Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩおよび真核生物構造特異的エンドヌクレアーゼ；マウスＦＥＮ－１エンドヌクレアーゼ；Ｉ型、ＩＩ型またはＩＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ、例えば、Ａｃｃ Ｉ、Ａｆｌ ＩＩＩ、Ａｌｕ Ｉ、Ａｌｗ４４ Ｉ、Ａｐａ Ｉ、Ａｓｎ Ｉ、Ａｖａ Ｉ、Ａｖａ ＩＩ、ＢａｍＨ Ｉ、Ｂａｎ ＩＩ、Ｂｃｌ Ｉ、Ｂｇｌ Ｉ．Ｂｇｌ ＩＩ、Ｂｌｎ Ｉ、ＢｓａＩ、Ｂｓｍ Ｉ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｓＨ ＩＩ、ＢｓｔＥ ＩＩ、Ｃｆｏ Ｉ、ＣＩａ Ｉ、Ｄｄｅ Ｉ、Ｄｐｎ Ｉ、Ｄｒａ Ｉ、ＥｃＩＸ Ｉ、ＥｃｏＲ Ｉ、ＥｃｏＲ Ｉ、ＥｃｏＲ ＩＩ、ＥｃｏＲ Ｖ、Ｈａｅ ＩＩ、Ｈａｅ ＩＩ、Ｈｉｎｄ ＩＩ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、Ｈｐａ Ｉ、Ｈｐａ ＩＩ、Ｋｐｎ Ｉ、Ｋｓｐ Ｉ、Ｍｌｕ Ｉ、ＭＩｕＮ Ｉ、Ｍｓｐ Ｉ、Ｎｃｉ Ｉ、Ｎｃｏ Ｉ、Ｎｄｅ Ｉ、Ｎｄｅ ＩＩ、Ｎｈｅ Ｉ、Ｎｏｔ Ｉ、Ｎｒｕ Ｉ、Ｎｓｉ Ｉ、Ｐｓｔ Ｉ、Ｐｖｕ Ｉ、Ｐｖｕ ＩＩ、Ｒｓａ Ｉ、Ｓａｃ Ｉ、Ｓａｌ Ｉ、Ｓａｕ３Ａ Ｉ、Ｓｃａ Ｉ、ＳｃｒＦ Ｉ、Ｓｆｉ Ｉ、Ｓｍａ Ｉ 、Ｓｐｅ Ｉ、Ｓｐｈ Ｉ、Ｓｓｐ Ｉ、Ｓｔｕ Ｉ、Ｓｔｙ Ｉ、Ｓｗａ Ｉ、Ｔａｑ Ｉ、Ｘｂａ Ｉ、Ｘｈｏ Ｉ）；グリコシラーゼ（例えば、ウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）、３－メチルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ、３－メチルアデニンＤＮＡグリコシラーゼＩＩ、ピリミジン水和物－ＤＮＡグリコシラーゼ、ＦａＰｙ－ＤＮＡグリコシラーゼ、チミンミスマッチ－ＤＮＡグリコシラーゼ、ヒポキサンチン－ＤＮＡグリコシラーゼ、５－ヒドロキシメチルウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＨｍＵＤＧ）、５－ヒドロキシメチルシトシンＤＮＡグリコシラーゼ、または１，Ｎ６－エテノ－アデニンＤＮＡグリコシラーゼ）；エキソヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼＩＩＩ）；リボザイム；およびＤＮＡｚｙｍｅｓが挙げられる。サンプル核酸は、化学薬品で処理されてもよいし、または修飾ヌクレオチドを使用して合成されてもよく、修飾核酸を切断してもよい。非限定的な例では、サンプル核酸は、（ｉ）アルキルプリンＤＮＡグリコシラーゼによって認識および切断される、Ｎ３－メチルアデニンおよびＮ３－メチルグアニンを含む、いくつかのアルキル化塩基を生成するメチルニトロソ尿素などのアルキル化剤；（ｉｉ）亜硫酸水素ナトリウムであって、これにより、ＤＮＡのシトシン残基が脱アミノ化され、ウラシルＮ－グリコシラーゼによって切断され得るウラシル残基が形成される、亜硫酸水素ナトリウム；ならびに（ｉｉｉ）グアニンをその酸化型である８－ヒドロキシグアニンに変換する化学薬品（これはホルムアミドピリミジンＤＮＡ Ｎ－グリコシラーゼによって切断され得る）、で処理され得る。化学的切断プロセスの例としては、限定するものではないが、アルキル化（例えば、ホスホロチオエート修飾核酸のアルキル化）；Ｐ３’－Ｎ５’－ホスホロアミデート含有核酸の酸不安定性の切断；ならびに核酸の四酸化オスミウムおよびピペリジン処理が挙げられる。
いくつかの実施形態では、核酸試薬は、１つまたはそれ以上のリコンビナーゼ挿入部位を含む。リコンビナーゼ挿入部位は、組換えタンパク質による組み込み／組換え反応に関与する核酸分子上の認識配列である。例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼの組換え部位は、ｌｏｘＰであり、これは、８塩基対のコア配列（例えば、Ｓａｕｅｒ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．５：５２１－５２７（１９９４））に隣接する２つの１３塩基対の逆方向反復配列（リコンビナーゼ結合部位として機能）で構成される３４塩基対の配列である。組換え部位の他の例としては、ａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬ、およびａｔｔＲ配列、ならびに組換えタンパク質λＩｎｔによって、および補助タンパク質組み込み宿主因子（ＩＨＦ）、ＦＩＳおよび切除酵素（Ｘｉｓ）によって認識される、それらの変異体、フラグメント、バリアントおよび誘導体が挙げられる（例えば、米国特許第５，８８８，７３２号；同第６，１４３，５５７号；同第６，１７１，８６１号；同第６，２７０，９６９号；同第６，２７７，６０８号；および同第６，７２０，１４０号；米国特許出願公開第０９／５１７，４６６号、および同第０９／７３２，９１４号；米国特許出願公開第２００２／０００７０５１号；ならびにＬａｎｄｙ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３：６９９－７０７（１９９３）（それぞれの開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。
リコンビナーゼクローニング核酸の例は、ゲートウェイ（Ｇａｔｅｗａｙ）（登録商標）システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）にあり、これは、インビボまたはインビトロで所望の核酸分子をクローニングするための少なくとも１つの組換え部位を含む。いくつかの実施形態では、この系は、しばしばバクテリオファージラムダ系（例えば、ａｔｔ１およびａｔｔ２）に基づいて、少なくとも２つの異なる部位特異的組換え部位を含み、野生型（ａｔｔ０）部位から変異しているベクターを利用する。各変異部位は、同じタイプの同族のパートナーａｔｔ部位（すなわち、その結合パートナー組換え部位）に対して固有の特異性を有し（例えば、ａｔｔＢ１とａｔｔＰ１、またはａｔｔＬ１とａｔｔＲ１）、他の変異型の組換え部位とも、または野生型ａｔｔ０部位とも交差反応しない。異なる部位特異性は、所望の分子の方向性のあるクローニングまたは連結を可能にし、したがって、クローニングされた分子の所望の配向を提供する。組換え部位に隣接する核酸フラグメントは、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）系を使用して、目的ベクター（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ）と呼ばれることもあるレシピエントプラスミド分子上のａｔｔ部位に隣接する選択可能なマーカー（例えば、ｃｃｄＢ）を置き換えることにより、クローニングおよびサブクローニングされる。次いで、ｃｃｄＢ感受性宿主株の形質転換およびレシピエント分子上のマーカーの陽性選択によって、所望のクローンが選択される。陰性選択（例えば、毒性遺伝子の使用）のための同様の戦略は、哺乳類および昆虫のチミジンキナーゼ（ＴＫ）のように他の生物で使用され得る。
核酸試薬は、１つまたはそれ以上の複製起点（ＯＲＩ）エレメントを含むことがある。いくつかの実施形態では、テンプレートは、２つまたはそれ以上のＯＲＩを含み、１つは１つの生物（例えば、細菌）において効率的に機能し、別の生物は別の生物（例えば、酵母のような真核生物）において効率的に機能する。いくつかの実施形態では、ＯＲＩは、１つの種（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなど）において効率的に機能し得、そして別のＯＲＩは、異なる種（例えば、Ｓ．ｐｏｍｂｅなど）において効率的に機能し得る。核酸試薬はまた、１つまたはそれ以上の転写調節部位を含む場合もある。
核酸試薬、例えば、発現カセットまたはベクターは、マーカー産物をコードする核酸配列を含み得る。マーカー産物は、ある遺伝子が細胞に送達され、送達された後は発現されているか否かを判断するために使用される。マーカー遺伝子の例としては、β－ガラクトシダーゼおよび緑色蛍光タンパク質をコードする大腸菌ｌａｃＺ遺伝子が挙げられる。いくつかの実施形態では、マーカーは、選択可能なマーカーであり得る。そのような選択可能なマーカーが宿主細胞に首尾よく移されるとき、その形質転換された宿主細胞は、選択圧下に置かれた場合に生き残り得る。選択的レジームには、広く使用されている２つの別個のカテゴリーがある。第１のカテゴリーは、細胞の代謝、および補充された培地から独立して増殖する能力を欠く変異細胞株の使用に基づいている。第２のカテゴリーは優性選択であり、これは任意の細胞型で使用される選択スキームを指し、変異細胞株の使用を必要としない。これらのスキームは通常、宿主細胞の増殖を阻止するために薬物を使用する。新規遺伝子を有するそれらの細胞は、薬剤耐性を運ぶタンパク質を発現し、選択を生き残る。そのような優勢な選択の例は、薬物ネオマイシン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７（１９８２））、ミコフェノール酸（Ｍｕｌｌｉｇａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０９：１４２２（１９８０））またはハイグロマイシン（Ｓｕｇｄｅｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：４１０～４１３（１９８５）；それらのそれぞれの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を使用する。
核酸試薬は、１つまたはそれ以上の選択エレメント（例えば、核酸試薬の存在を選択するためのエレメントであり、選択的に調節され得るプロモーターエレメントの活性化のためではないエレメント）を含み得る。選択エレメントは、核酸試薬が細胞に含まれるか否かを決定するために公知のプロセスを使用して利用されることが多い。いくつかの実施形態では、核酸試薬は、２つまたはそれ以上の選択エレメントを含み、１つのエレメントは１つの生物において効率的に機能し、別のエレメントは別の生物において効率的に機能する。選択エレメントの例としては、限定するものではないが、以下が挙げられる：（１）他の方法では毒性のある化合物（例えば、抗生物質）に対する耐性を提供する産物をコードする核酸セグメント；（２）他の方法ではレシピエント細胞に欠けている産物（例えば、必須産物、ｔＲＮＡ遺伝子、栄養要求性マーカー）をコードする核酸セグメント；（３）遺伝子産物の活性を抑制する産物をコードする核酸セグメント；（４）容易に同定され得る産物をコードする核酸セグメント（例えば、抗生物質（例えば、β－ラクタマーゼ）、β－ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、および細胞表面タンパク質などの表現型マーカー）；（５）細胞の生存および／または機能に対して他の方法では有害な産物に結合する核酸セグメント；（６）上記の１～５番に記載されている核酸セグメント（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）のいずれかの活性を他の方法では阻害する核酸セグメント；（７）基質を修飾する産物（例えば、制限エンドヌクレアーゼ）に結合する核酸セグメント；（８）所望の分子（例えば、特定のタンパク質結合部位）を単離または同定するために使用され得る核酸セグメント；（９）他の方法では機能しない場合がある特定のヌクレオチド配列をコードする核酸セグメント（例えば、分子の亜集団のＰＣＲ増幅のために）；（１０）存在しない場合、特定の化合物に対する耐性または感受性を直接的または間接的に付与する核酸セグメント；（１１）レシピエント細胞において、毒性であるか、または比較的非毒性の化合物を毒性化合物に変換する産物（例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ）をコードする核酸セグメント；（１２）それらを含む核酸分子の複製、分配または遺伝可能性を阻害する核酸セグメント；ならびに／あるいは（１３）条件付き複製機能、例えば、特定の宿主もしくは宿主細胞株における、または特定の環境条件下（例えば、温度、栄養状態など）での複製をコードする核酸セグメント。
核酸試薬は、インビボ転写および／または翻訳に有用な任意の形態であり得る。核酸は、スーパーコイルプラスミドなどのプラスミドである場合もあれば、酵母人工染色体（例えば、ＹＡＣ）である場合もあり、線状核酸（例えば、ＰＣＲまたは制限消化によって産生される線状核酸）である場合もあり、一本鎖である場合もあり、時には二本鎖でもある。核酸試薬は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プロセスまたは転写媒介増幅プロセス（ＴＭＡ）などの増幅プロセスによって調製される場合もある。ＴＭＡでは、２つの酵素が、等温反応で使用され、発光によって検出される増幅産物を生成する（例えば、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９６ Ｊｕｎ ２５；３５（２５）：８４２９－３８）。標準的なＰＣＲプロセスは公知であり（例えば、米国特許第４，６８３，２０２号；第４，６８３，１９５号；第４，９６５，１８８号；および第５，５６５，４９３号）、一般にサイクルで実施される。各サイクルとしては、熱変性（ここでハイブリッド核酸が解離する）、冷却（ここでプライマーオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする）；およびポリメラーゼ（すなわち、Ｔａｑポリメラーゼ）によるオリゴヌクレオチドの伸長が挙げられる。ＰＣＲ循環プロセスの例は、サンプルを９５℃で５分間処理すること；９５℃で１分間、５９℃で１分間、１０秒間、７２℃で１分３０秒間という４５サイクルを繰り返すこと；次いで、サンプルを７２℃で５分間処理すること。複数のサイクルは、市販のサーマルサイクラーを使用して頻繁に行われる。ＰＣＲ増幅産物は、低温で一時的に保存される場合もあり（例えば、４℃）、分析前に凍結される場合もある（例えば、－２０℃）。
上記のものと類似のクローニング戦略を使用して、非天然ヌクレオチドを含むＤＮＡを生成し得る。例えば、所望の位置に非天然ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドは、標準的な固相合成を使用して合成され、ＨＰＬＣによって精製される。次いで、オリゴヌクレオチドは、ＢｓａＩ部位などのクローニング部位を使用したクローニング方法（Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅアセンブリなど）を使用して（ただし、上記で説明した他のものを使用してもよい）、必要な配列コンテキスト（すなわち、ＵＴＲおよびコード配列）を含むプラスミドに挿入される。
キット／製造品
特定の実施形態では、本明細書に開示されるのは、本明細書に記載される１つまたはそれ以上の方法で使用するためのキットおよび製造品である。そのようなキットとしては、バイアル、チューブなどのような１つまたはそれ以上の容器を受け入れるように区画化された担体、パッケージ、または容器を含み、その容器のそれぞれは、本明細書に記載の方法で使用される別個のエレメントの１つを含んでいる。適切な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、注射器、および試験管が挙げられる。一実施形態では、容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成される。
いくつかの実施形態では、キットは、キットの内容物を収容するための適切な包装材料を備える。場合によっては、包装材料は、好ましくは無菌で夾雑物のない環境を提供するために、周知の方法によって構築される。本明細書で使用される包装材料としては、例えば、核酸配列決定システムで使用するために販売されている市販のキットで慣習的に利用されているものが挙げられる。例示的な包装材料としては、限定するものではないが、本明細書に記載の構成要素を一定の範囲内に保持し得るガラス、プラスチック、紙、ホイルなどが挙げられる。
包装材料は、構成要素の特定の用途を示すラベルを備えてもよい。このラベルで示されているキットの使用は、そのキットに存在する構成要素の特定の組み合わせに適切な、本明細書に記載されている方法の１つまたはそれ以上であり得る。例えば、ラベルは、キットがポリヌクレオチドを合成する方法にとって、または核酸の配列を決定する方法にとって有用であることを示し得る。
パッケージングされた試薬または構成要素の使用説明書もキットに含まれてもよい。この説明書には通常、混合されるキット成分およびサンプルの相対量、試薬／サンプル混合物のメンテナンス期間、温度、緩衝液条件などの反応パラメーターを説明する具体的な表現が含まれる。
特定の反応に必要な全ての構成要素が特定のキットに存在する必要があるわけではないことが理解される。そうではなく、１つまたはそれ以上の追加の構成要素を他の供給源から提供され得る。キットに付属の説明書で、提供される追加の構成要素、及びそれらを入手できる場所が特定され得る。
いくつかの実施形態では、例えば、遺伝子操作された細胞を調製するための本発明によって提供される方法を使用して、非天然核酸を細胞核酸に安定に組み込むために有用なキットが提供される。一実施形態では、本明細書に記載のキットは、遺伝子操作された細胞および１つまたはそれ以上の非天然核酸を含む。別の実施形態では、本明細書に記載のキットは、配列番号１～２から選択される配列を含む単離および精製されたプラスミドを含む。さらなる実施形態では、本明細書に記載のキットは、配列番号３～２０から選択される配列を含むプライマーを含む。
追加の実施形態では、本明細書に記載のキットは、細胞および細胞に導入するための異種遺伝子を含む核酸分子を提供し、それにより、この段落で説明されている上記の任意の実施形態の核酸を含む発現ベクターなどの遺伝子操作された細胞を提供する。
例示的な実施形態
本開示を、以下の実施形態によってさらに記載する。実施形態のそれぞれの構成は、適切および実用的である場合、他の実施形態のいずれかと組み合わされる。
実施形態１。非天然アミノ酸を含むタンパク質を産生するインビボの方法であって、方法は、
第１の非天然塩基および相補的な第２の非天然塩基を含むＤＡＮテンプレートを転写して、第３の非天然塩基をｍＲＮＡに組み込む工程であって、第３の非天然塩基は、第１の非天然塩基と第１の非天然塩基対を形成するように構成されている、工程；
ＤＮＡテンプレートを転写して、第４の非天然塩基をｔＲＮＡに組み込む工程であって、第４の非天然塩基は、第２の非天然塩基と第２の非天然塩基対を形成するように構成され、第１の非天然塩基対および第２の非天然塩基対は同じではない、工程；ならびに
ｍＲＮＡおよびｔＲＡＮからタンパク質を翻訳する工程であって、前記タンパク質は、非天然アミノ酸を含む、工程
を含む方法。
実施形態２。インビボの方法は、半合成生物の使用を含む、実施形態１に記載の方法。
実施形態３。生物は、微生物を含む、実施形態２に記載の方法。
実施形態４。生物は、細菌を含む、実施形態３に記載の方法。
実施形態５。生物は、グラム陽性細菌を含む、実施形態４に記載の方法。
実施形態６。生物は、グラム陰性細菌を含む、実施形態４に記載の方法。
実施形態７。生物は、大腸菌を含む、実施形態２～４のいずれか１項に記載の方法。
実施形態８。少なくとも１つの非天然塩基は、
（ｉ）２－チオウラシル、２－チオ－チミン、２’－デオキシウリジン、４－チオ－ウラシル、４－チオ－チミン、ウラシル－５－イル、ヒポキサンチン－９－イル（Ｉ）、５－ハロウラシル；５－プロピニル－ウラシル、６－アゾ－チミン、６－アゾ－ウラシル、５－メチルアミノメチルウラシル、５－メトキシアミノメチル－２－チオウラシル、シュードウラシル、ウラシル－５－オキサ酢酸メチルエステル、ウラシル－５－オキサ酢酸、５－メチル－２－チオウラシル、３－（３－アミノ－３－Ｎ－２－カルボキシプロピル）ウラシル、５－メチル－２－チオウラシル、４－チオウラシル、５－メチルウラシル、５’－メトキシカルボキシメチルウラシル、５－メトキシウラシル、ウラシル－５－オキシ酢酸、５－（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチルウラシルまたはジヒドロウラシル；
（ｉｉ）５－ヒドロキシメチルシトシン、５－トリフルオロメチルシトシン、５－ハロシトシン、５－プロピニルシトシン、５－ヒドロキシシトシン、シクロシトシン、シトシンアラビノシド、５，６－ジヒドロシトシン、５－ニトロシトシン、６－アゾシトシン、アザシトシン、Ｎ４－エチルシトシン、３－メチルシトシン、５－メチルシトシン、４－アセチルシトシン、２－チオシトシン、フェノキサジンシチジン（［５，４－ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン－２（３Ｈ）－オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ－ピリミド［５，４－ｂ］［１，４］ベンゾチアジン－２（３Ｈ）－オン）、フェノキサジンシチジン（９－（２－アミノエトキシ）－Ｈ－ピリミド［５，４－ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン－２（３Ｈ）－オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ－ピリミド［４，５－ｂ］インドール－２－オン）またはピリドインドールシチジン（Ｈ－ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３－ｄ］ピリミジン－２－オン）；
（ｉｉｉ）２－アミノアデニン、２－プロピルアデニン、２－アミノ－アデニン、２－Ｆ－アデニン、２－アミノ－プロピル－アデニン、２－アミノ－２’－デオキシアデノシン、３－デアザアデニン、７－メチルアデニン、７－デアザ－アデニン、８－アザアデニン、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキルおよび８－ヒドロキシルで置換されたアデニン、Ｎ６－イソペンテニルアデニン、２－メチルアデニン、２，６－ジアミノプリン、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニンまたは６－アザ－アデニン；
（ｉｖ）２－メチルグアニン、グアニンの２－プロピルおよびアルキル誘導体、３－デアザグアニン、６－チオ－グアニン、７－メチルグアニン、７－デアザグアニン、７－デアザグアノシン、７－デアザ－８－アザグアニン、８－アザグアニン、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキルおよび８－ヒドロキシルで置換されたグアニン、１－メチルグアニン、２，２－ジメチルグアニン、７－メチルグアニンまたは６－アザ－グアニン；ならびに
（ｖ）ヒポキサンチン、キサンチン、１－メチルイノシン、キュエオシン、ベータ－Ｄ－ガラクトシルキュエオシン、イノシン、ベータ－Ｄ－マンノシルキュエオシン、ワイブトキソシン、ヒドロキシウレア、（ａｃｐ３）ｗ、２－アミノピリジンまたは２－ピリドン
からなる群から選択される、実施形態１～７のいずれか１項に記載の方法。
実施形態９。第１の非天然塩基、第２の非天然塩基、第３の非天然塩基または第４の非天然塩基のうちの少なくとも１つは、
からなる群から選択される、実施形態１～７のいずれか１項に記載の方法。
実施形態１０。第１の非天然塩基、第２の非天然塩基、第３の非天然塩基または第４の非天然塩基のうちの少なくとも１つは、
からなる群から選択される、実施形態１～７のいずれか１項に記載の方法。
実施形態１１。第１の非天然塩基、第２の非天然塩基、第３の非天然塩基または第４の非天然塩基のうちの少なくとも１つは、
からなる群から選択される、実施形態９に記載の方法。
実施形態１２。第１の非天然塩基、第２の非天然塩基、第３の非天然塩基または第４の非天然塩基のうちの少なくとも１つは、
からなる群から選択される、実施形態９に記載の方法。
実施形態１３。第１の非天然塩基、第２の非天然塩基、第３の非天然塩基または第４の非天然塩基のうちの少なくとも１つは、
からなる群から選択される、実施形態９に記載の方法。
実施形態１４。第１の非天然塩基、第２の非天然塩基、第３の非天然塩基または第４の非天然塩基のうちの少なくとも１つは、
からなる群から選択される、実施形態９に記載の方法。
実施形態１５。第１の非天然塩基、第２の非天然塩基、第３の非天然塩基または第４の非天然塩基のうちの少なくとも１つは、
からなる群から選択される、実施形態９に記載の方法。
実施形態１６。第１の非天然塩基、第２の非天然塩基、第３の非天然塩基または第４の非天然塩基のうちの少なくとも１つは、
からなる群から選択される、実施形態９に記載の方法。
実施形態１７。第１の非天然塩基、第２の非天然塩基、第３の非天然塩基または第４の非天然塩基のうちの少なくとも１つは、
からなる群から選択される、実施形態９に記載の方法。
実施形態１８。第１の非天然塩基、第２の非天然塩基、第３の非天然塩基または第４の非天然塩基のうちの少なくとも１つは、
である、実施形態９に記載の方法。
実施形態１９。第１の非天然塩基、第２の非天然塩基、第３の非天然塩基または第４の非天然塩基のうちの少なくとも１つは、
から選択される、実施形態９に記載の方法。
実施形態２０。第１または第２の非天然塩基は、
である、実施形態９に記載の方法。
実施形態２１。第１または第２の非天然塩基は、
である、実施形態９に記載の方法。
実施形態２２。第１の非天然塩基は、
であり、第２の非天然塩基は、
である、実施形態９に記載の方法。
実施形態２３。第１の非天然塩基は、
であり、第２の非天然塩基は、
である、実施形態９に記載の方法。
実施形態２４。第３または第４の非天然塩基は、
である、実施形態９に記載の方法。
実施形態２５。第３の非天然塩基は、
である、実施形態９に記載の方法。
実施形態２６。第４の非天然塩基は、
である、実施形態９に記載の方法。
実施形態２７。第３または第４の非天然塩基は、
である、実施形態９に記載の方法。
実施形態２８。第３の非天然塩基は、
である、実施形態９に記載の方法。
実施形態２９。第４の非天然塩基は、
である、実施形態９に記載の方法。
実施形態３０。第１の非天然塩基は、
であり、第２の非天然塩基は、
であり、第３の非天然塩基は、
であり、第４の非天然塩基は、
である、実施形態９に記載の方法。
実施形態３１。第１の非天然塩基は、
であり、第２の非天然塩基は、
であり、第３の非天然塩基は、
であり、第４の非天然塩基は、
である、実施形態９に記載の方法。
実施形態３２。第１の非天然塩基は、
であり、第２の非天然塩基は、
であり、第３の非天然塩基は、
であり、第４の非天然塩基は、
である、実施形態９に記載の方法。
実施形態３３。第３の非天然塩基は、
である、実施形態９に記載の方法。
実施形態３４。第４の非天然塩基は、
である、実施形態９に記載の方法。
実施形態３５。第１の非天然塩基は、
であり、第２の非天然塩基は、
であり、第３の非天然塩基は、
であり、第４の非天然塩基は、
である、実施形態９に記載の方法。
実施形態３６。第３の非天然塩基および第４の非天然塩基は、リボースを含む、実施形態９～３５のいずれか１項に記載の方法。
実施形態３７。第３の非天然塩基および第４の非天然塩基は、デオキシリボースを含む、実施形態９～３５のいずれか１項に記載の方法。
実施形態３８。第１および第２の非天然塩基は、デオキシリボースを含む、実施形態９～３５のいずれか１項に記載の方法。
実施形態３９。第１および第２の非天然塩基は、デオキシリボースを含み、第３の非天然塩基および第４の非天然塩基は、リボースを含む、実施形態９～３５のいずれか１項に記載の方法。
実施形態４０。ＤＮＡテンプレートは、
からなる群から選択される少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を含む、実施形態９に記載の方法。
実施形態４１。ＤＮＡテンプレートは、ｄＮａＭ－ｄ５ＳＩＣＳである少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を含む、実施形態４０に記載の方法。
実施形態４２。ＤＮＡテンプレートは、ｄＣＮＭＯ－ｄＴＰＴ３である少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を含む、実施形態４０に記載の方法。
実施形態４３。ＤＮＡテンプレートは、ｄＮａＭ－ｄＴＰＴ３である少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を含む、実施形態４０に記載の方法。
実施形態４４。ＤＮＡテンプレートは、ｄＰＴＭＯ－ｄＴＰＴ３である少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を含む、実施形態４０に記載の方法。
実施形態４５。ＤＮＡテンプレートは、ｄＮａＭ－ｄＴＡＴ１である少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を含む、実施形態４０に記載の方法。
実施形態４６。ＤＮＡテンプレートは、ｄＣＮＭＯ－ｄＴＡＴ１である少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を含む、実施形態４０に記載の方法。
実施形態４７。ＤＮＡテンプレートは、
からなる群から選択される少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を含み；
ｍＲＮＡおよびｔＲＮＡは、
から選択される少なくとも１つの非天然塩基を含む、実施形態１に記載の方法。
実施形態４８。ＤＮＡテンプレートは、ｄＮａＭ－ｄ５ＳＩＣＳである少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を含む、実施形態４７に記載の方法。
実施形態４９。ＤＮＡテンプレートは、ｄＣＮＭＯ－ｄＴＰＴ３である少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を含む、実施形態４７に記載の方法。
実施形態５０。ＤＮＡテンプレートは、ｄＮａＭ－ｄＴＰＴ３である少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を含む、実施形態４７に記載の方法。
実施形態５１。ＤＮＡテンプレートは、ｄＰＴＭＯ－ｄＴＰＴ３である少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を含む、実施形態４７に記載の方法。
実施形態５２。ＤＮＡテンプレートは、ｄＮａＭ－ｄＴＡＴ１である少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を含む、実施形態４７に記載の方法。
実施形態５３。ＤＮＡテンプレートは、ｄＣＮＭＯ－ｄＴＡＴ１である少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を含む、実施形態４７に記載の方法。
実施形態５４。ｍＲＮＡおよびｔＲＮＡは、
から選択される非天然塩基を含む、実施形態４７～５３のいずれか１項に記載の方法。
実施形態５５。ｍＲＮＡおよびｔＲＮＡは、
から選択される非天然塩基を含む、実施形態５４に記載の方法。
実施形態５６。ｍＲＮＡは、
である非天然塩基を含む、実施形態５４に記載の方法。
実施形態５７。ｍＲＮＡは、
である非天然塩基を含む、実施形態５４に記載の方法。
実施形態５８。ｍＲＮＡは、
である非天然塩基を含む、実施形態５４に記載の方法。
実施形態５９。ｔＲＮＡは、
から選択される非天然塩基を含む、実施形態５４に記載の方法。
実施形態６０。ｔＲＮＡは、
である非天然塩基を含む、実施形態５４に記載の方法。
実施形態６１。ｔＲＮＡは、
である非天然塩基を含む、実施形態５４に記載の方法。
実施形態６２。ｔＲＮＡは、
である非天然塩基を含む、実施形態５４に記載の方法。
実施形態６３。第１の非天然塩基は、ｄＣＮＭＯを含み、第２の非天然塩基は、ｄＴＰＴ３を含む、実施形態１～７のいずれか１項に記載の方法。
実施形態６４。第３の非天然塩基は、ＮａＭを含み、第２の非天然塩基は、ＴＡＴ１を含む、実施形態１～７または４１のいずれか１項に記載の方法。
実施形態６５。第１の非天然塩基または第２の非天然塩基は、ＤＮＡポリメラーゼによって認識される、実施形態１～６４のいずれか１項に記載の方法。
実施形態６６。第３の非天然塩基または第４の非天然塩基は、ＲＮＡポリメラーゼによって認識される、実施形態１～６５のいずれか１項に記載の方法。
実施形態６７。タンパク質は、少なくとも２つの非天然アミノ酸を含む、実施形態１～６６のいずれか１項に記載の方法。
実施形態６８。タンパク質は、少なくとも３つの非天然アミノ酸を含む、実施形態１～６６のいずれか１項に記載の方法。
実施形態６９。タンパク質は、少なくとも２つの異なる非天然アミノ酸を含む、実施形態１～６６のいずれか１項に記載の方法。
実施形態７０。タンパク質は、少なくとも３つの異なる非天然アミノ酸を含む、実施形態１～６６のいずれか１項に記載の方法。
実施形態７１。少なくとも１つの非天然アミノ酸は、
リジンアナログである；
芳香族側鎖を含む；
アジド基を含む；
アルキン基を含む；または
アルデヒドもしくはケトン基を含む、
実施形態１～７０のいずれか１項に記載の方法。
実施形態７２。少なくとも１つの非天然アミノ酸は、芳香族側鎖を含まない、実施形態１～７０のいずれか１項に記載の方法。
実施形態７３。少なくとも１つの非天然アミノ酸は、Ｎ６－アジドエトキシ－カルボニル－Ｌ－リジン（ＡｚＫ）、Ｎ６－プロパルギルエトキシ－カルボニル－Ｌ－リジン（ＰｒａＫ）、ＢＣＮ－Ｌ－リジン、ノルボルネンリジン、ＴＣＯ－リジン、メチルテトラジンリジン、アリルオキシカルボニルリジン、２－アミノ－８－オキソノナン酸、２－アミノ－８－オキソオクタン酸、ｐ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アジドメチル－Ｌ－フェニルアラニン（ｐＡＭＦ）、ｐ－ヨード－Ｌ－フェニルアラニン、ｍ－アセチルフェニルアラニン、２－アミノ－８－オキソノナン酸、ｐ－プロパルギルオキシフェニルアラニン、ｐ－プロパルギル－フェニルアラニン、３－メチル－フェニルアラニン、Ｌ－ドパ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アジド－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アシル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－ベンゾイル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－ブロモフェニルアラニン、ｐ－アミノ－Ｌ－フェニルアラニン、イソプロピル－Ｌ－フェニルアラニン、Ｏ－アリルチロシン、Ｏ－メチル－Ｌ－チロシン、Ｏ－４－アリル－Ｌ－チロシン、４－プロピル－Ｌ－チロシン、ホスホノチロシン、トリ－Ｏ－アセチル－ＧｌｃＮＡｃｐ－セリン、Ｌ－ホスホセリン、ホスホノセリン、Ｌ－３－（２－ナフチル）アラニン、２－アミノ－３－（（２－（（３－（ベンジルオキシ）－３－オキソプロピル）アミノ）エチル）セラニル）プロパン酸、２－アミノ－３－（フェニルセラニル）プロパン酸またはセレノシステインを含む、実施形態１～７０のいずれか１項に記載の方法。
実施形態７４。少なくとも１つの非天然アミノ酸は、Ｎ６－アジドエトキシ－カルボニル－Ｌ－リジン（ＡｚＫ）およびＮ６－プロパルギルエトキシ－カルボニル－Ｌ－リジン（ＰｒａＫ）を含む、実施形態７３に記載の方法。
実施形態７５。少なくとも１つの非天然アミノ酸は、Ｎ６－アジドエトキシ－カルボニル－Ｌ－リジン（ＡｚＫ）を含む、実施形態７２に記載の方法。
実施形態７６。少なくとも１つの非天然アミノ酸は、Ｎ６－プロパルギルエトキシ－カルボニル－Ｌ－リジン（ＰｒａＫ）を含む、実施形態７２に記載の方法。
実施形態７７。拡大された遺伝子アルファベットを含む半合成生物であって、遺伝子アルファベットは、少なくとも２つの固有の非天然塩基を含む、半合成生物。
実施形態７８。生物は、微生物を含む、実施形態７７に記載の半合成生物。
実施形態７９。生物は、細菌を含む、実施形態７７～７８のいずれか１項に記載の半合成生物。
実施形態８０。生物は、グラム陽性細菌を含む、実施形態７９に記載の半合成生物。
実施形態８１。生物は、グラム陽性細菌を含む、実施形態７９に記載の半合成生物。
実施形態８２。生物は、大腸菌を含む、実施形態７７～７９のいずれか１項に記載の半合成生物。
実施形態８３。非天然塩基のうちの少なくとも１つは、２－アミノアデニン－９－イル、２－アミノアデニン、２－Ｆ－アデニン、２－チオウラシル、２－チオ－チミン、２－チオシトシン、アデニンおよびグアニンの２－プロピルおよびアルキル誘導体、２－アミノ－アデニン、２－アミノ－プロピル－アデニン、２－アミノピリジン、２－ピリドン、２’－デオキシウリジン、２－アミノ－２’－デオキシアデノシン、３－デアザグアニン、３－デアザアデニン、４－チオ－ウラシル、４－チオ－チミン、ウラシル－５－イル、ヒポキサンチン－９－イル（Ｉ）、５－メチル－シトシン、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、５－ブロモおよび５－トリフルオロメチルウラシルおよびシトシン；５－ハロウラシル、５－ハロシトシン、５－プロピニル－ウラシル、５－プロピニルシトシン、５－ウラシル、５－置換、５－ハロ、５－置換ピリミジン、５－ヒドロキシシトシン、５－ブロモシトシン、５－ブロモウラシル、５－クロロシトシン、塩素化シトシン、シクロシトシン、シトシンアラビノシド、５－フルオロシトシン、フルオロピリミジン、フルオロウラシル、５，６－ジヒドロシトシン、５－ヨードシトシン、ヒドロキシウレア、ヨードウラシル、５－ニトロシトシン、５－ブロモウラシル、５－クロロウラシル、５－フルオロウラシルおよび５－ヨードウラシル、アデニンおよびグアニンの６－アルキル誘導体、６－アザピリミジン、６－アゾ－ウラシル、６－アゾシトシン、アザシトシン、６－アゾ－チミン、６－チオ－グアニン、７－メチルグアニン、７－メチルアデニン、７－デアザグアニン、７－デアザグアノシン、７－デアザ－アデニン、７－デアザ－８－アザグアニン、８－アザグアニン、８－アザアデニン、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキルおよび８－ヒドロキシル置換アデニンおよびグアニン；Ｎ４－エチルシトシン、Ｎ－２置換プリン、Ｎ－６置換プリン、Ｏ－６置換プリン、二本鎖形成の安定性を増加させるもの、ユニバーサル核酸、疎水性核酸、乱雑な核酸、サイズが拡大された核酸、フッ素化核酸、三環式ピリミジン、フェノキサジンシチジン（［５，４－ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン－２（３Ｈ）－オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ－ピリミド［５，４－ｂ］［１，４］ベンゾチアジン－２（３Ｈ）－オン）、Ｇ－ｃｌａｍｐｓ、フェノキサジンシチジン（９－（２－アミノエトキシ）－Ｈ－ピリミド［５，４－ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン－２（３Ｈ）－オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ－ピリミド［４，５－ｂ］インドール－２－オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ－ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３－ｄ］ピリミジン－２－オン）、５－フルオロウラシル、５－ブロモウラシル、５－クロロウラシル、５－ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４－アセチルシトシン、５－（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ－Ｄ－ガラクトシルキュエオシン、イノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデニン、１－メチルグアニン、１－メチルイノシン、２，２－ジメチルグアニン、２－メチルアデニン、２－メチルグアニン、３－メチルシトシン、５－メチルシトシン、Ｎ６－アデニン、７－メチルグアニン、５－メチルアミノメチルウラシル、５－メトキシアミノメチル－２－チオウラシル、ベータ－Ｄ－マンノシルキュエオシン、５’－メトキシカルボキシメチルウラシル、５－メトキシウラシル、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン、ウラシル－５オキシ酢酸、ワイブトキソシン、シュードウラシル、キュエオシン、２－チオシトシン、５－メチル－２－チオウラシル、２－チオウラシル、４－チオウラシル、５－メチルウラシル、ウラシル－５－オキサ酢酸メチルエステル、ウラシル－５－オキサ酢酸、５－メチル－２－チオウラシル、３－（３－アミノ－３－Ｎ－２－カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６－ジアミノプリン、ならびにプリンまたはピリミジン塩基が複素環で置き換えられたものからなる群から選択される、実施形態７７～８２のいずれか１項に記載の半合成生物。
実施形態８４。
からなる群から選択される少なくとも１つの非天然核酸塩基を含むＤＮＡを含む、実施形態７７～８２のいずれか１項に記載の半合成生物。
実施形態８５。非天然塩基のうちの少なくとも１つを含むＤＮＡは、非天然塩基対（ＵＢＰ）を形成する、実施形態７７～８４のいずれか１項に記載の半合成生物。
実施形態８６。非天然塩基対（ＵＢＰ）は、ｄＣＮＭＯ－ｄＴＰＴ３、ｄＮａＭ－ｄＴＰＴ３、ｄＣＮＭＯ－ｄＴＡＴ１またはｄＮａＭ－ｄＴＡＴ１である、実施形態８５に記載の半合成生物。
実施形態８７。ＤＮＡは、
からなる群から選択される少なくとも１つの非天然核酸塩基を含む、実施形態８４に記載の半合成生物。
実施形態８８。ＤＮＡは、
からなる群から選択される少なくとも１つの非天然核酸塩基を含む、実施形態８７に記載の半合成生物。
実施形態８９。ＤＮＡは、
からなる群から選択される少なくとも１つの非天然核酸塩基を含む、実施形態８８に記載の半合成生物。
実施形態９０。ＤＮＡは、
からなる群から選択される少なくとも１つの非天然核酸塩基を含む、実施形態８８に記載の半合成生物。
実施形態９１。ＤＮＡは、
からなる群から選択される少なくとも１つの非天然核酸塩基を含む、実施形態８８に記載の半合成生物。
実施形態９２。ＤＮＡは、
からなる群から選択される少なくとも１つの非天然核酸塩基を含む、実施形態８８に記載の半合成生物。
実施形態９３。ＤＮＡは、
からなる群から選択される少なくとも１つの非天然核酸塩基を含む、実施形態８８に記載の半合成生物。
実施形態９４。ＤＮＡは、
からなる群から選択される少なくとも１つの非天然核酸塩基を含む、実施形態８８に記載の半合成生物。
実施形態９５。ＤＮＡは、
から選択される少なくとも１つの非天然核酸塩基を含む、実施形態８８に記載の半合成生物。
実施形態９６。ＤＮＡは、
から選択される少なくとも２つの非天然核酸塩基を含む、実施形態８８に記載の半合成生物。
実施形態９７。ＤＮＡは、２つの鎖を含み、第１の鎖は、
である少なくとも１つの核酸塩基を含み、第２の鎖は、
である少なくとも１つの核酸塩基を含む、実施形態８８に記載の半合成生物。
実施形態９８。ＤＮＡは、
である少なくとも１つの非天然核酸塩基を含む、実施形態８８に記載の半合成生物。
実施形態９９。生物は、ヌクレオシド三リン酸輸送体を発現する、実施形態７７～９８のいずれか１項に記載の半合成生物。
実施形態１００。生物は、ヌクレオシド三リン酸輸送体ＰｔＮＴＴ２を発現する、実施形態９９に記載の半合成生物。
実施形態１０１。生物は、ｔＲＮＡシンテターゼをさらに発現する、実施形態７７～１００のいずれか１項に記載の半合成生物。
実施形態１０２。ｔＲＮＡシンテターゼは、Ｍ．バルケリのピロリシル－ｔＲＮＡシンテターゼ（Ｍｂ ＰｙｌＲＳ）である、実施形態１０１の半合成生物。
実施形態１０３。生物は、ヌクレオシド三リン酸輸送体ＰｔＮＴＴ２を発現し、ｔＲＮＡシンテターゼのＭ．バルケリのピロリシル－ｔＲＮＡシンテターゼ（Ｍｂ ＰｙｌＲＳ）をさらに発現する、実施形態９９に記載の半合成生物。
実施形態１０４。生物は、ＲＮＡポリメラーゼをさらに発現する、実施形態７７～１０３のいずれか１項に記載の半合成生物。
実施形態１０５。ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７ ＲＮＡＰである、実施形態１０４に記載の半合成生物。
実施形態１０６。生物は、ＤＮＡ組換え修復の機能を有するタンパク質を発現しない、実施形態７７～１０５のいずれか１項に記載の半合成生物。
実施形態１０７。大腸菌であり、ＲｅｃＡを発現しない、実施形態７７～１０５のいずれか１項に記載の半合成生物。
実施形態１０８。ｍＲＮＡをさらに含む、実施形態７７～１０７のいずれか１項に記載の半合成生物。
実施形態１０９。ｍＲＮＡは、
から選択される少なくとも１つの非天然塩基を含む、実施形態１０８に記載の半合成生物。
実施形態１１０。ｍＲＮＡは、
である少なくとも１つの非天然塩基を含む、実施形態１０８に記載の半合成生物。
実施形態１１１。ｍＲＮＡは、
である少なくとも１つの非天然塩基を含む、実施形態１０８に記載の半合成生物。
実施形態１１２。ｍＲＮＡは、
である少なくとも１つの非天然塩基を含む、実施形態１０８に記載の半合成生物。
実施形態１１３。ｔＲＮＡをさらに含む、実施形態７７～１１２のいずれか１項に記載の半合成生物。
実施形態１１４。ｔＲＮＡは、
から選択される少なくとも１つの非天然塩基を含む、実施形態１１３に記載の半合成生物。
実施形態１１５。ｔＲＮＡは、
である少なくとも１つの非天然塩基を含む、実施形態１１３に記載の半合成生物。
実施形態１１６。ｔＲＮＡは、
である少なくとも１つの非天然塩基を含む、実施形態１１３に記載の半合成生物。
実施形態１１７。ｔＲＮＡは、
である少なくとも１つの非天然塩基を含む、実施形態１１３に記載の半合成生物。
実施形態１１８。ｍＲＮＡおよびｔＲＮＡをさらに含む、実施形態７７～１０７のいずれか１項に記載の半合成生物。
実施形態１１９。生物は、（ａ）ヌクレオシド三リン酸輸送体、（ｂ）ｍＲＮＡ、（ｃ）ｔＲＮＡ、（ｄ）ｔＲＮＡシンテターゼおよび（ｅ）ＲＮＡポリメラーゼをさらに含み、生物は、ＤＮＡ組換え修復の機能を有するタンパク質を発現しない、実施形態７７～９８のいずれか１項に記載の半合成生物。
実施形態１２０。ヌクレオシド三リン酸輸送体は、ＰｔＮＴＴ２であり、ｔＲＮＡシンテターゼは、Ｍ．バルケリのピロリシル－ｔＲＮＡシンテターゼ（Ｍｂ ＰｙｌＲＳ）であり、ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７ ＲＮＡＰである、実施形態１１９に記載の半合成生物。
実施形態１２１。大腸菌であり、ＲｅｃＡを発現しない、実施形態１１９に記載の半合成生物。
実施形態１２２。生物は、１つまたはそれ以上のＤＮＡポリメラーゼを過剰発現する、実施形態１１８または１１９に記載の半合成生物。
実施形態１２３。生物は、１つまたはそれ以上のＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩを過剰発現する、実施形態１２２に記載の半合成生物。
実施形態１２４。少なくとも１つの非天然塩基は、非天然糖部分をさらに含む、実施形態７７～１２３のいずれか１項に記載の半合成生物。
実施形態１２５。非天然糖部分は、
２’位における修飾：
ＯＨ、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ－アルカリルもしくはＯ－アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２Ｆ；
Ｏ－アルキル、Ｓ－アルキル、Ｎ－アルキル；
Ｏ－アルケニル、Ｓ－アルケニル、Ｎ－アルケニル；
Ｏ－アルキニル、Ｓ－アルキニル、Ｎ－アルキニル；
Ｏ－アルキル－Ｏ－アルキル、２’－Ｆ、２’－ＯＣＨ３、２’－Ｏ（ＣＨ２）２ＯＣＨ３、（ここで、アルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換もしくは無置換のＣ１～Ｃ１０アルキル、Ｃ２～Ｃ１０アルケニル、Ｃ２～Ｃ１０アルキニル、－Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、－Ｏ（ＣＨ２）ｎ－ＮＨ２および－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２であってもよく、ｎおよびｍは、１～約１０である）；
ならびに／または
５’位における修飾：
５’－ビニル、５’－メチル（ＲまたはＳ）；
４’位における修飾：
４’－Ｓ、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、干渉物質、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的性質を改善するための基、もしくはオリゴヌクレオチドの薬力学的性質を改善するための基、およびそれらの任意の組み合わせ
からなる群から選択される、実施形態１２４に記載の半合成生物。
実施形態１２６。少なくとも１つの非天然塩基は、ＤＮＡポリメラーゼによって認識される、実施形態７７～１２５のいずれか１項に記載の半合成生物。
実施形態１２７。少なくとも１つの非天然塩基は、ＲＮＡポリメラーゼによって認識される、実施形態７３～１２６のいずれか１項に記載の半合成生物。
実施形態１２８。構造：
［式中、
それぞれのＸは、独立して、炭素または窒素であり；
Ｒ２は、任意であり、存在する場合、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、メトキシ、メタンチオール、メタンセレノ、ハロゲン、シアノまたはアジド基であり；
それぞれのＹは、独立して、硫黄、酸素、セレンまたは第二級アミンであり；
それぞれのＥは、独立して、酸素、硫黄またはセレンであり；
波線は、リボシル、デオキシリボシルもしくはジデオキシリボシル部分、またはそれらのアナログとの結合点を示し、リボシル、デオキシリボシルもしくはジデオキシリボシル部分、またはそれらのアナログは、遊離形態であるか、場合によりα－チオトリホスフェート、β－チオトリホスフェートもしくはγ－チオトリホスフェート基を含むモノホスフェート、ジホスフェートまたはトリホスフェート基に接続されるか、あるいはＲＮＡもしくはＤＮＡ中、またはＲＮＡアナログもしくはＤＮＡアナログ中に含まれる］
の核酸塩基アナログを含む、組成物。
実施形態１２９。リボシルまたはデオキシリボシル部分は、それらの５’ヒドロキシルに結合したトリホスフェートまたはα－チオトリホスフェート基を有する、実施形態１２８に記載の化合物。
実施形態１３０。リボシルもしくはデオキシリボシル部分は、それぞれ、ＲＮＡもしくはＤＮＡオリゴヌクレオチド鎖に組み込まれるか、あるいはリボシルもしくはデオキシリボシル部分、またはそれらのアナログは、ポリヌクレオチドに組み込まれる、実施形態１２８または１２９に記載の化合物。
実施形態１３１。Ｘは、炭素である、実施形態１２８～１３０のいずれか１項に記載の化合物。
実施形態１３２。Ｅは、硫黄である、実施形態１２８～１３１のいずれか１項に記載の化合物。
実施形態１３３。Ｙは、硫黄である、実施形態１２８～１３２のいずれか１項に記載の化合物。
実施形態１３４。核酸塩基は、構造
を含む、実施形態１２８に記載の化合物。
実施形態１３５。核酸塩基は、相補的な塩基対形成核酸塩基に結合して、非天然塩基対（ＵＢＰ）を形成する、実施形態１２８～１３４のいずれか１項に記載の化合物。
実施形態１３６。相補的な塩基対形成核酸塩基は、
から選択される、実施形態１３５に記載の化合物。
実施形態１３７。二本鎖オリゴヌクレオチドの二本鎖であって、第１のオリゴヌクレオチド鎖は、実施形態１２８～１３４のいずれか１項に記載の化合物を含み、第２の相補的なオリゴヌクレオチド鎖は、相補的な塩基対形成核酸塩基をその相補的な塩基対形成部位に含む、二本鎖オリゴヌクレオチドの二本鎖。
実施形態１３８。第１のオリゴヌクレオチド鎖は、
を含み、第２の鎖は、
からなる群から選択される相補的な塩基対形成核酸塩基をその相補的な塩基対形成部位に含む、実施形態１３７に記載の二本鎖オリゴヌクレオチドの二本鎖。
実施形態１３９。実施形態１２８～１３６のいずれか１項に記載の核酸塩基アナログを含むトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）であって、
核酸塩基アナログを含むアンチコドン；および
アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼによる、ｔＲＮＡの非天然アミノ酸による選択的チャージを促進する認識エレメント；
を含むトランスファーＲＮＡ。
実施形態１４０。核酸塩基アナログは、ｔＲＮＡのアンチコドン領域に位置する、実施形態１３９に記載のｔＲＮＡ。
実施形態１４１。核酸塩基アナログは、アンチコドンの第１の位置に位置する、実施形態１４０に記載のｔＲＮＡ。
実施形態１４２。核酸塩基アナログは、アンチコドンの第２の位置に位置する、実施形態１４０に記載のｔＲＮＡ。
実施形態１４３。核酸塩基アナログは、アンチコドンの第３の位置に位置する、実施形態１４０に記載のｔＲＮＡ。
実施形態１４４。アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼは、好熱菌に由来する、実施形態１３９に記載のｔＲＮＡ。
実施形態１４５。アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼは、メタノサルシナ属またはそのバリアントに由来する、実施形態１３９に記載のｔＲＮＡ。
実施形態１４６。アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼは、メタノコッカス属（メタノカルドコッカス属）またはそのバリアントに由来する、実施形態１３９に記載のｔＲＮＡ。
実施形態１４７。非天然アミノ酸は、芳香族部分を含む、実施形態１３９に記載のｔＲＮＡ。
実施形態１４８。非天然アミノ酸は、リジン誘導体である、実施形態１３９に記載のｔＲＮＡ。
実施形態１４９。非天然アミノ酸は、フェニルアラニン誘導体である、実施形態１３９に記載のｔＲＮＡ。
実施形態１５０。非天然アミノ酸は、Ｎ６－アジドエトキシ－カルボニル－Ｌ－リジン（ＡｚＫ）、Ｎ６－プロパルギルエトキシ－カルボニル－Ｌ－リジン（ＰｒａＫ）、ＢＣＮ－Ｌ－リジン、ノルボルネンリジン、ＴＣＯ－リジン、メチルテトラジンリジン、アリルオキシカルボニルリジン、２－アミノ－８－オキソノナン酸、２－アミノ－８－オキソオクタン酸、ｐ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アジドメチル－Ｌ－フェニルアラニン（ｐＡＭＦ）、ｐ－ヨード－Ｌ－フェニルアラニン、ｍ－アセチルフェニルアラニン、２－アミノ－８－オキソノナン酸、ｐ－プロパルギルオキシフェニルアラニン、ｐ－プロパルギル－フェニルアラニン、３－メチル－フェニルアラニン、Ｌ－ドパ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アジド－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アシル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－ベンゾイル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－ブロモフェニルアラニン、ｐ－アミノ－Ｌ－フェニルアラニン、イソプロピル－Ｌ－フェニルアラニン、Ｏ－アリルチロシン、Ｏ－メチル－Ｌ－チロシン、Ｏ－４－アリル－Ｌ－チロシン、４－プロピル－Ｌ－チロシン、ホスホノチロシン、トリ－Ｏ－アセチル－ＧｌｃＮＡｃｐ－セリン、Ｌ－ホスホセリン、ホスホノセリン、Ｌ－３－（２－ナフチル）アラニン、２－アミノ－３－（（２－（（３－（ベンジルオキシ）－３－オキソプロピル）アミノ）エチル）セラニル）プロパン酸、２－アミノ－３－（フェニルセラニル）プロパン酸およびセレノシステインからなる群から選択される、実施形態１３９に記載のｔＲＮＡ。
実施形態１５１。式：
Ｎ１－Ｚｘ－Ｎ２
［式中、Ｎ１は、ヌクレオチドもしくはそのアナログ、または末端ホスフェート基であり；Ｎ２は、ヌクレオチドもしくはそのアナログ、または末端ヒドロキシル基であり；Ｚは、実施形態１２８～１３６のいずれか１項に記載の化合物であり、
ｘは、１～２０の整数である］
を含む構造。
実施形態１５２。構造は、遺伝子をコードする、実施形態１５１に記載の構造。
実施形態１５３。Ｚｘは、遺伝子の翻訳領域に位置する、実施形態１５１に記載の構造。
実施形態１５４。Ｚｘは、遺伝子の非翻訳領域に位置する、実施形態１５１に記載の構造。
実施形態１５５。構造は、５’または３’非翻訳領域（ＵＴＲ）をさらに含む、実施形態１５１に記載の構造。
実施形態１５６。構造は、ターミネーター領域をさらに含む、実施形態１５１に記載の構造。
実施形態１５７。構造は、プロモーター領域をさらに含む、実施形態１５１に記載の構造。
実施形態１５８。ポリヌクレオチドライブラリーであって、ライブラリーは、少なくとも５０００の固有のポリヌクレオチドを含み、それぞれのポリヌクレオチドは、実施形態１２８～１３６のいずれか１項に記載の少なくとも１つの化合物を含む、ポリヌクレオチドライブラリー。
実施形態１５９。ポリヌクレオチドライブラリーは、少なくとも１つの遺伝子をコードする、実施形態１５８に記載のライブラリー。
実施形態１６０。ヌクレオシド三リン酸であって、核酸塩基は、
から選択される、ヌクレオシド三リン酸。
実施形態１６１。ヌクレオシドは、リボースを含む、実施形態１６０に記載のヌクレオシド三リン酸。
実施形態１６２。ヌクレオシドは、デオキシリボースを含む、実施形態１６０に記載のヌクレオシド三リン酸。
実施形態１６３。核酸塩基は、
から選択される、実施形態１６０～１６２のいずれか１項に記載のヌクレオシド三リン酸。
実施形態１６４。核酸塩基は、
から選択される、実施形態１６３に記載のヌクレオシド三リン酸。
実施形態１６５。核酸塩基は、
から選択される、実施形態１６３に記載のヌクレオシド三リン酸。
実施形態１６６。核酸塩基は、
から選択される、実施形態１６３に記載のヌクレオシド三リン酸。
実施形態１６７。核酸塩基は、
である、実施形態１６５に記載のヌクレオシド三リン酸。
実施形態１６８。ヌクレオシドは、リボースを含む、実施形態１６７に記載のヌクレオシド三リン酸。
実施形態１６９。ヌクレオシドは、デオキシリボースを含む、実施形態１６７に記載のヌクレオシド三リン酸。
実施形態１７０。核酸塩基は、
である、実施形態１６５に記載のヌクレオシド三リン酸。
実施形態１７１。ヌクレオシドは、リボースを含む、実施形態１７０に記載のヌクレオシド三リン酸。
実施形態１７２。ヌクレオシドは、デオキシリボースを含む、実施形態１７０に記載のヌクレオシド三リン酸。
実施形態１７３。核酸塩基は、
である、実施形態１６５に記載のヌクレオシド三リン酸。
実施形態１７４。ヌクレオシドは、リボースを含む、実施形態１７３に記載のヌクレオシド三リン酸。
実施形態１７５。ヌクレオシドは、デオキシリボースを含む、実施形態１７３に記載のヌクレオシド三リン酸。
非天然アミノ酸を含むタンパク質を産生するインビボの方法であって、方法は、第１の非天然塩基および相補的な第２の非天然塩基を含むＤＡＮテンプレートを転写して、第３の非天然塩基をｍＲＮＡに組み込む工程であって、第３の非天然塩基は、第１の非天然塩基と第１の非天然塩基対を形成するように構成されている、工程；ＤＮＡテンプレートを転写して、第４の非天然塩基をｔＲＮＡに組み込む工程であって、第４の非天然塩基は、第２の非天然塩基と第２の非天然塩基対を形成するように構成され、第１の非天然塩基対および第２の非天然塩基対は同じではない、工程；ならびにｍＲＮＡおよびｔＲＡＮからタンパク質を翻訳する工程であって、前記タンパク質は、非天然アミノ酸を含む、工程を含む方法を本明細書に記載する。いくつかの実施形態において、インビボの方法は、半合成生物の使用を含む。いくつかの実施形態において、生物は、微生物を含む。いくつかの実施形態において、生物は、細菌を含む。いくつかの実施形態において、生物は、グラム陽性細菌を含む。いくつかの実施形態において、生物は、グラム陰性細菌を含む。いくつかの実施形態において、生物は、大腸菌を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの非天然塩基は、（ｉ）２－チオウラシル、２－チオ－チミン、２’－デオキシウリジン、４－チオ－ウラシル、４－チオ－チミン、ウラシル－５－イル、ヒポキサンチン－９－イル（Ｉ）、５－ハロウラシル；５－プロピニル－ウラシル、６－アゾ－チミン、６－アゾ－ウラシル、５－メチルアミノメチルウラシル、５－メトキシアミノメチル－２－チオウラシル、シュードウラシル、ウラシル－５－オキサ酢酸メチルエステル、ウラシル－５－オキサ酢酸、５－メチル－２－チオウラシル、３－（３－アミノ－３－Ｎ－２－カルボキシプロピル）ウラシル、５－メチル－２－チオウラシル、４－チオウラシル、５－メチルウラシル、５’－メトキシカルボキシメチルウラシル、５－メトキシウラシル、ウラシル－５－オキシ酢酸、５－（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチルウラシルまたはジヒドロウラシル；（ｉｉ）５－ヒドロキシメチルシトシン、５－トリフルオロメチルシトシン、５－ハロシトシン、５－プロピニルシトシン、５－ヒドロキシシトシン、シクロシトシン、シトシンアラビノシド、５，６－ジヒドロシトシン、５－ニトロシトシン、６－アゾシトシン、アザシトシン、Ｎ４－エチルシトシン、３－メチルシトシン、５－メチルシトシン、４－アセチルシトシン、２－チオシトシン、フェノキサジンシチジン（［５，４－ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン－２（３Ｈ）－オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ－ピリミド［５，４－ｂ］［１，４］ベンゾチアジン－２（３Ｈ）－オン）、フェノキサジンシチジン（９－（２－アミノエトキシ）－Ｈ－ピリミド［５，４－ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン－２（３Ｈ）－オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ－ピリミド［４，５－ｂ］インドール－２－オン）またはピリドインドールシチジン（Ｈ－ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３－ｄ］ピリミジン－２－オン）；（ｉｉｉ）２－アミノアデニン、２－プロピルアデニン、２－アミノ－アデニン、２－Ｆ－アデニン、２－アミノ－プロピル－アデニン、２－アミノ－２’－デオキシアデノシン、３－デアザアデニン、７－メチルアデニン、７－デアザ－アデニン、８－アザアデニン、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキルおよび８－ヒドロキシルで置換されたアデニン、Ｎ６－イソペンテニルアデニン、２－メチルアデニン、２，６－ジアミノプリン、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニンまたは６－アザ－アデニン；（ｉｖ）２－メチルグアニン、グアニンの２－プロピルおよびアルキル誘導体、３－デアザグアニン、６－チオ－グアニン、７－メチルグアニン、７－デアザグアニン、７－デアザグアノシン、７－デアザ－８－アザグアニン、８－アザグアニン、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキルおよび８－ヒドロキシルで置換されたグアニン、１－メチルグアニン、２，２－ジメチルグアニン、７－メチルグアニンまたは６－アザ－グアニン；ならびに（ｖ）ヒポキサンチン、キサンチン、１－メチルイノシン、キュエオシン、ベータ－Ｄ－ガラクトシルキュエオシン、イノシン、ベータ－Ｄ－マンノシルキュエオシン、ワイブトキソシン、ヒドロキシウレア、（ａｃｐ３）ｗ、２－アミノピリジンまたは２－ピリドンからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、第１の非天然塩基、第２の非天然塩基、第３の非天然塩基または第４の非天然塩基のうちの少なくとも１つは、
からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、第１の非天然塩基、第２の非天然塩基、第３の非天然塩基または第４の非天然塩基のうちの少なくとも１つは、
からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、第１の非天然塩基、第２の非天然塩基、第３の非天然塩基または第４の非天然塩基のうちの少なくとも１つは、
からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、第１の非天然塩基、第２の非天然塩基、第３の非天然塩基または第４の非天然塩基のうちの少なくとも１つは、
からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、第１の非天然塩基、第２の非天然塩基、第３の非天然塩基または第４の非天然塩基のうちの少なくとも１つは、
からなる群から選択される。ヌクレオシドまたはヌクレオチドの塩基のみを、糖部分とともに示し、場合により任意のホスフェート残基は、明確にするために、割愛する。ここで、全体にわたって、波線は、デオキシもしくはリボヌクレオシドまたはヌクレオチドとの接続を表し、ここで、ヌクレオチドの糖部分は、さらに修飾することができる。いくつかの実施形態において、第１の非天然塩基、第２の非天然塩基、第３の非天然塩基または第４の非天然塩基のうちの少なくとも１つは、
からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、第１の非天然塩基、第２の非天然塩基、第３の非天然塩基または第４の非天然塩基のうちの少なくとも１つは、
からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、第１の非天然塩基、第２の非天然塩基、第３の非天然塩基または第４の非天然塩基のうちの少なくとも１つは、
からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、第１の非天然塩基、第２の非天然塩基、第３の非天然塩基または第４の非天然塩基のうちの少なくとも１つは、
からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、第１の非天然塩基、第２の非天然塩基、第３の非天然塩基または第４の非天然塩基のうちの少なくとも１つは、
である。いくつかの実施形態において、第１の非天然塩基、第２の非天然塩基、第３の非天然塩基または第４の非天然塩基のうちの少なくとも１つは、
から選択される。いくつかの実施形態において、第１または第２の非天然塩基は、
である。いくつかの実施形態において、第１または第２の非天然塩基は、
である。いくつかの実施形態において、第１の非天然塩基は、
であり、第２の非天然塩基は、
である。いくつかの実施形態において、第１の非天然塩基は、
であり、第２の非天然塩基は、
である。いくつかの実施形態において、第３または第４の非天然塩基は、
である。いくつかの実施形態において、第３の非天然塩基は、
である。いくつかの実施形態において、第４の非天然塩基は、
である。いくつかの実施形態において、第３または第４の非天然塩基は、
である。いくつかの実施形態において、第３の非天然塩基は、
である。いくつかの実施形態において、第４の非天然塩基は、
である。いくつかの実施形態において、第１の非天然塩基は、
であり、第２の非天然塩基は、
であり、第３の非天然塩基は、
であり、第４の非天然塩基は、
である。いくつかの実施形態において、第１の非天然塩基は、
であり、第２の非天然塩基は、
であり、第３の非天然塩基は、
であり、第４の非天然塩基は、
である。いくつかの実施形態において、第１の非天然塩基は、
であり、第２の非天然塩基は、
であり、第３の非天然塩基は、
であり、第４の非天然塩基は、
である。いくつかの実施形態において、第３の非天然塩基は、
である。いくつかの実施形態において、第４の非天然塩基は、
である。いくつかの実施形態において、第１の非天然塩基は、
であり、第２の非天然塩基は、
であり、第３の非天然塩基は、
であり、第４の非天然塩基は、
である。いくつかの実施形態において、第３の非天然塩基および第４の非天然塩基は、リボースを含む。いくつかの実施形態において、第３の非天然塩基および第４の非天然塩基は、デオキシリボースを含む。いくつかの実施形態において、第１および第２の非天然塩基は、デオキシリボースを含む。いくつかの実施形態において、第１および第２の非天然塩基は、デオキシリボースを含み、第３の非天然塩基および第４の非天然塩基は、リボースを含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡテンプレートは、
からなる群から選択される少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡテンプレートは、ｄＮａＭ－ｄ５ＳＩＣＳである少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡテンプレートは、ｄＣＮＭＯ－ｄＴＰＴ３である少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡテンプレートは、ｄＮａＭ－ｄＴＰＴ３である少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡテンプレートは、ｄＰＴＭＯ－ｄＴＰＴ３である少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡテンプレートは、
からなる群から選択される少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を含み；ｍＲＮＡおよびｔＲＮＡは、
から選択される非天然塩基を有する少なくとも１つの非天然リボヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡテンプレートは、ｄＮａＭ－ｄ５ＳＩＣＳである少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡテンプレートは、ｄＣＮＭＯ－ｄＴＰＴ３である少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡテンプレートは、ｄＮａＭ－ｄＴＰＴ３である少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡテンプレートは、ｄＰＴＭＯ－ｄＴＰＴ３である少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を含む。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡおよびｔＲＮＡは、
から選択される非天然塩基を含む。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡおよびｔＲＮＡは、
から選択される非天然塩基を含む。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、
である非天然塩基を含む。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、
である非天然塩基を含む。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、
である非天然塩基を含む。いくつかの実施形態において、ｔＲＮＡは、
から選択される非天然塩基を含む。いくつかの実施形態において、ｔＲＮＡは、
である非天然塩基を含む。いくつかの実施形態において、ｔＲＮＡは、
である非天然塩基を含む。いくつかの実施形態において、ｔＲＮＡは、
である非天然塩基を含む。いくつかの実施形態において、第１の非天然塩基は、ｄＣＮＭＯを含み、第２の非天然塩基は、ｄＴＰＴ３を含む。いくつかの実施形態において、第３の非天然塩基は、ＮａＭを含み、第２の非天然塩基は、ＴＡＴ１を含む。いくつかの実施形態において、第１の非天然塩基または第２の非天然塩基は、ＤＮＡポリメラーゼによって認識される。いくつかの実施形態において、第３の非天然塩基または第４の非天然塩基は、ＲＮＡポリメラーゼによって認識される。いくつかの実施形態において、タンパク質は、少なくとも２つの非天然アミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、タンパク質は、少なくとも３つの非天然アミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの非天然アミノ酸は、リジンアナログである；芳香族側鎖を含む；アジド基を含む；アルキン基を含む；またはアルデヒドもしくはケトン基を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの非天然アミノ酸は、芳香族側鎖を含まない。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの非天然アミノ酸は、Ｎ６－アジドエトキシ－カルボニル－Ｌ－リジン（ＡｚＫ）、Ｎ６－プロパルギルエトキシ－カルボニル－Ｌ－リジン（ＰｒａＫ）、ＢＣＮ－Ｌ－リジン、ノルボルネンリジン、ＴＣＯ－リジン、メチルテトラジンリジン、アリルオキシカルボニルリジン、２－アミノ－８－オキソノナン酸、２－アミノ－８－オキソオクタン酸、ｐ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アジドメチル－Ｌ－フェニルアラニン（ｐＡＭＦ）、ｐ－ヨード－Ｌ－フェニルアラニン、ｍ－アセチルフェニルアラニン、２－アミノ－８－オキソノナン酸、ｐ－プロパルギルオキシフェニルアラニン、ｐ－プロパルギル－フェニルアラニン、３－メチル－フェニルアラニン、Ｌ－ドパ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アジド－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アシル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－ベンゾイル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－ブロモフェニルアラニン、ｐ－アミノ－Ｌ－フェニルアラニン、イソプロピル－Ｌ－フェニルアラニン、Ｏ－アリルチロシン、Ｏ－メチル－Ｌ－チロシン、Ｏ－４－アリル－Ｌ－チロシン、４－プロピル－Ｌ－チロシン、ホスホノチロシン、トリ－Ｏ－アセチル－ＧｌｃＮＡｃｐ－セリン、Ｌ－ホスホセリン、ホスホノセリン、Ｌ－３－（２－ナフチル）アラニン、２－アミノ－３－（（２－（（３－（ベンジルオキシ）－３－オキソプロピル）アミノ）エチル）セラニル）プロパン酸、２－アミノ－３－（フェニルセラニル）プロパン酸またはセレノシステインを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの非天然アミノ酸は、Ｎ６－アジドエトキシ－カルボニル－Ｌ－リジン（ＡｚＫ）およびＮ６－プロパルギルエトキシ－カルボニル－Ｌ－リジン（ＰｒａＫ）を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの非天然アミノ酸は、Ｎ６－アジドエトキシ－カルボニル－Ｌ－リジン（ＡｚＫ）を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの非天然アミノ酸は、Ｎ６－プロパルギルエトキシ－カルボニル－Ｌ－リジン（ＰｒａＫ）を含む。
拡大された遺伝子アルファベットを含む半合成生物であって、遺伝子アルファベットは、少なくとも３つの固有の非天然塩基を含む、半合成生物を本明細書に記載する。いくつかの実施形態において、生物は、微生物を含む。いくつかの実施形態において、生物は、細菌を含む。いくつかの実施形態において、生物は、グラム陽性細菌を含む。いくつかの実施形態において、生物は、グラム陽性細菌を含む。いくつかの例において、生物は、大腸菌を含む。いくつかの実施形態において、非天然塩基のうちの少なくとも１つは、２－アミノアデニン－９－イル、２－アミノアデニン、２－Ｆ－アデニン、２－チオウラシル、２－チオ－チミン、２－チオシトシン、アデニンおよびグアニンの２－プロピルおよびアルキル誘導体、２－アミノ－アデニン、２－アミノ－プロピル－アデニン、２－アミノピリジン、２－ピリドン、２’－デオキシウリジン、２－アミノ－２’－デオキシアデノシン、３－デアザグアニン、３－デアザアデニン、４－チオ－ウラシル、４－チオ－チミン、ウラシル－５－イル、ヒポキサンチン－９－イル（Ｉ）、５－メチル－シトシン、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、５－ブロモおよび５－トリフルオロメチルウラシルおよびシトシン；５－ハロウラシル、５－ハロシトシン、５－プロピニル－ウラシル、５－プロピニルシトシン、５－ウラシル、５－置換、５－ハロ、５－置換ピリミジン、５－ヒドロキシシトシン、５－ブロモシトシン、５－ブロモウラシル、５－クロロシトシン、塩素化シトシン、シクロシトシン、シトシンアラビノシド、５－フルオロシトシン、フルオロピリミジン、フルオロウラシル、５，６－ジヒドロシトシン、５－ヨードシトシン、ヒドロキシウレア、ヨードウラシル、５－ニトロシトシン、５－ブロモウラシル、５－クロロウラシル、５－フルオロウラシルおよび５－ヨードウラシル、アデニンおよびグアニンの６－アルキル誘導体、６－アザピリミジン、６－アゾ－ウラシル、６－アゾシトシン、アザシトシン、６－アゾ－チミン、６－チオ－グアニン、７－メチルグアニン、７－メチルアデニン、７－デアザグアニン、７－デアザグアノシン、７－デアザ－アデニン、７－デアザ－８－アザグアニン、８－アザグアニン、８－アザアデニン、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキルおよび８－ヒドロキシル置換アデニンおよびグアニン；Ｎ４－エチルシトシン、Ｎ－２置換プリン、Ｎ－６置換プリン、Ｏ－６置換プリン、二本鎖形成の安定性を増加させるもの、ユニバーサル核酸、疎水性核酸、乱雑な核酸、サイズが拡大された核酸、フッ素化核酸、三環式ピリミジン、フェノキサジンシチジン（［５，４－ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン－２（３Ｈ）－オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ－ピリミド［５，４－ｂ］［１，４］ベンゾチアジン－２（３Ｈ）－オン）、Ｇ－ｃｌａｍｐｓ、フェノキサジンシチジン（９－（２－アミノエトキシ）－Ｈ－ピリミド［５，４－ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン－２（３Ｈ）－オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ－ピリミド［４，５－ｂ］インドール－２－オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ－ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３－ｄ］ピリミジン－２－オン）、５－フルオロウラシル、５－ブロモウラシル、５－クロロウラシル、５－ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４－アセチルシトシン、５－（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ－Ｄ－ガラクトシルキュエオシン、イノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデニン、１－メチルグアニン、１－メチルイノシン、２，２－ジメチルグアニン、２－メチルアデニン、２－メチルグアニン、３－メチルシトシン、５－メチルシトシン、Ｎ６－アデニン、７－メチルグアニン、５－メチルアミノメチルウラシル、５－メトキシアミノメチル－２－チオウラシル、ベータ－Ｄ－マンノシルキュエオシン、５’－メトキシカルボキシメチルウラシル、５－メトキシウラシル、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン、ウラシル－５オキシ酢酸、ワイブトキソシン、シュードウラシル、キュエオシン、２－チオシトシン、５－メチル－２－チオウラシル、２－チオウラシル、４－チオウラシル、５－メチルウラシル、ウラシル－５－オキサ酢酸メチルエステル、ウラシル－５－オキサ酢酸、５－メチル－２－チオウラシル、３－（３－アミノ－３－Ｎ－２－カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６－ジアミノプリン、ならびにプリンまたはピリミジン塩基が複素環で置き換えられたものからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、生物は、
からなる群から選択される少なくとも１つの非天然核酸塩基を含むＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、非天然塩基のうちの少なくとも１つを含むＤＮＡは、非天然塩基対（ＵＢＰ）を形成する。いくつかの実施形態において、非天然塩基対（ＵＢＰ）は、ｄＣＮＭＯ－ｄＴＰＴ３、ｄＮａＭ－ｄＴＰＴ３、ｄＣＮＭＯ－ｄＴＡＴ１またはｄＮａＭ－ｄＴＡＴ１である。いくつかの実施形態において、ＤＮＡは、
からなる群から選択される少なくとも１つの非天然核酸塩基を含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡは、
からなる群から選択される少なくとも１つの非天然核酸塩基を含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡは、
からなる群から選択される少なくとも１つの非天然核酸塩基を含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡは、
からなる群から選択される少なくとも１つの非天然核酸塩基を含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡは、
からなる群から選択される少なくとも１つの非天然核酸塩基を含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡは、
からなる群から選択される少なくとも１つの非天然核酸塩基を含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡは、
からなる群から選択される少なくとも１つの非天然核酸塩基を含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡは、
からなる群から選択される少なくとも１つの非天然核酸塩基を含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡは、
から選択される少なくとも１つの非天然核酸塩基を含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡは、
から選択される少なくとも２つの非天然核酸塩基を含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡは、２つの鎖を含み、第１の鎖は、
である少なくとも１つの核酸塩基を含み、第２の鎖は、
である少なくとも１つの核酸塩基を含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡは、
である少なくとも１つの非天然核酸塩基を含む。いくつかの実施形態において、生物は、ヌクレオシド三リン酸輸送体を発現する。いくつかの実施形態において、生物は、ヌクレオシド三リン酸輸送体ＰｔＮＴＴ２を発現する。いくつかの実施形態において、生物は、ｔＲＮＡシンテターゼをさらに発現する。いくつかの実施形態において、ｔＲＮＡシンテターゼは、Ｍ．バルケリのピロリシル－ｔＲＮＡシンテターゼ（Ｍｂ ＰｙｌＲＳ）である。いくつかの実施形態において、生物は、ヌクレオシド三リン酸輸送体ＰｔＮＴＴ２を発現し、ｔＲＮＡシンテターゼのＭ．バルケリのピロリシル－ｔＲＮＡシンテターゼ（Ｍｂ ＰｙｌＲＳ）をさらに発現する。いくつかの実施形態において、生物は、ＲＮＡポリメラーゼをさらに発現する。いくつかの実施形態において、ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７ ＲＮＡＰである。いくつかの実施形態において、生物は、ＤＮＡ組換え修復の機能を有するタンパク質を発現しない。いくつかの実施形態において、生物は、大腸菌であり、生物は、ＲｅｃＡを発現しない。いくつかの実施形態において、生物は、ＤＮＡポリメラーゼを過剰発現する。いくつかの実施形態において、生物は、ＤＮＡポリメラーゼＩＩを過剰発現する。いくつかの実施形態において、半合成生物は、ｍＲＮＡをさらに含む。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、
から選択される少なくとも１つの非天然塩基を含む。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、
である少なくとも１つの非天然塩基を含む。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、
である少なくとも１つの非天然塩基を含む。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、
である少なくとも１つの非天然塩基を含む。いくつかの実施形態において、半合成生物は、ｔＲＮＡをさらに含む。いくつかの実施形態において、ｔＲＮＡは、
から選択される少なくとも１つの非天然塩基を含む。いくつかの実施形態において、ｔＲＮＡは、
である少なくとも１つの非天然塩基を含む。いくつかの実施形態において、ｔＲＮＡは、
である少なくとも１つの非天然塩基を含む。いくつかの実施形態において、ｔＲＮＡは、
である少なくとも１つの非天然塩基を含む。いくつかの実施形態において、半合成生物は、ｍＲＮＡおよび／またはｔＲＮＡをさらに含む。いくつかの実施形態において、生物は、（ａ）ヌクレオシド三リン酸輸送体、（ｂ）ｍＲＮＡ、（ｃ）ｔＲＮＡ、（ｄ）ｔＲＮＡシンテターゼおよび（ｅ）ＲＮＡポリメラーゼをさらに含み、生物は、ＤＮＡ組換え修復の機能を有するタンパク質を発現しない。いくつかの実施形態において、ヌクレオシド三リン酸輸送体は、ＰｔＮＴＴ２であり、ｔＲＮＡシンテターゼは、Ｍ．バルケリのピロリシル－ｔＲＮＡシンテターゼ（Ｍｂ ＰｙｌＲＳ）であり、ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７ ＲＮＡＰである。いくつかの実施形態において、生物は、大腸菌であり、生物は、ＲｅｃＡを発現しない。いくつかの実施形態において、生物は、１つまたはそれ以上のＤＮＡポリメラーゼを過剰発現する。いくつかの実施形態において、生物は、１つのＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩを過剰発現する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの非天然塩基は、非天然糖部分をさらに含む。いくつかの実施形態において、非天然糖部分は、２’位における修飾：ＯＨ、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ－アルカリルもしくはＯ－アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２Ｆ；Ｏ－アルキル、Ｓ－アルキル、Ｎ－アルキル；Ｏ－アルケニル、Ｓ－アルケニル、Ｎ－アルケニル；Ｏ－アルキニル、Ｓ－アルキニル、Ｎ－アルキニル；Ｏ－アルキル－Ｏ－アルキル、２’－Ｆ、２’－ＯＣＨ３、２’－Ｏ（ＣＨ２）２ＯＣＨ３（ここで、アルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換もしくは無置換のＣ１～Ｃ１０アルキル、Ｃ２～Ｃ１０アルケニル、Ｃ２～Ｃ１０アルキニル、－Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、－Ｏ（ＣＨ２）ｎ－ＮＨ２および－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２であってもよく、ｎおよびｍは、１～約１０である）；ならびに／または５’位における修飾：５’－ビニル、５’－メチル（ＲまたはＳ）；４’位における修飾：４’－Ｓ、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、干渉物質、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的性質を改善するための基、もしくはオリゴヌクレオチドの薬力学的性質を改善するための基、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの非天然塩基は、ＤＮＡポリメラーゼによって認識される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの非天然塩基は、ＲＮＡポリメラーゼによって認識される。
構造：
［式中、それぞれのＸは、独立して、炭素または窒素であり；Ｒ２は、任意であり、存在する場合、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、メトキシ、メタンチオール、メタンセレノ、ハロゲン、シアノまたはアジド基であり；それぞれのＹは、独立して、硫黄、酸素、セレンまたは第二級アミンであり；それぞれのＥは、独立して、酸素、硫黄またはセレンであり；波線は、リボシル、デオキシリボシルもしくはジデオキシリボシル部分、またはそれらのアナログとの結合点を示し、リボシル、デオキシリボシルもしくはジデオキシリボシル部分、またはそれらのアナログは、遊離形態であるか、場合によりα－チオトリホスフェート、β－チオトリホスフェートもしくはγ－チオトリホスフェート基を含むモノホスフェート、ジホスフェートまたはトリホスフェート基に接続されるか、あるいはＲＮＡもしくはＤＮＡ中、またはＲＮＡアナログもしくはＤＮＡアナログ中に含まれる］の核酸塩基アナログを含む、組成物を本明細書に記載する。いくつかの実施形態において、リボシルまたはデオキシリボシル部分は、それらの５’ヒドロキシルに結合したトリホスフェートまたはα－チオトリホスフェート基を有する。いくつかの実施形態において、リボシルもしくはデオキシリボシル部分は、それぞれ、ＲＮＡもしくはＤＮＡオリゴヌクレオチド鎖に組み込まれるか、あるいはリボシルもしくはデオキシリボシル部分、またはそれらのアナログは、ＲＮＡもしくはＤＮＡアナログに組み込まれる。いくつかの実施形態において、Ｘは、炭素である。いくつかの実施形態において、Ｅは、硫黄である。いくつかの実施形態において、Ｙは、硫黄である。いくつかの実施形態において、核酸塩基は、構造
を含む。いくつかの実施形態において、核酸塩基は、構造
を含む。いくつかの実施形態において、核酸塩基は、相補的な核酸塩基と対形成して、非天然塩基対（ＵＢＰ）を形成する。いくつかの実施形態において、相補的な塩基対形成核酸塩基は、
から選択される。
二本鎖オリゴヌクレオチドの二本鎖であって、第１のオリゴヌクレオチド鎖は、本明細書に記載の化合物を含み、第２の相補的なオリゴヌクレオチド鎖は、相補的な塩基対形成核酸塩基をその相補的な塩基対形成部位に含む、二本鎖オリゴヌクレオチドの二本鎖を本明細書に記載する。いくつかの実施形態において、第１のオリゴヌクレオチド鎖は、
を含み；第２の鎖は、
からなる群から選択される相補的な塩基対形成核酸塩基をその相補的な塩基対形成部位に含む。
本明細書に記載のリボ核酸塩基アナログを含むトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）であって、リボ核酸塩基アナログを含むアンチコドン；アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼによる、ｔＲＮＡの非天然アミノ酸による選択的チャージを促進する認識エレメント；を含むトランスファーＲＮＡを本明細書に記載する。ｔＲＮＡのいくつかの実施形態において、核酸塩基アナログは、ｔＲＮＡのアンチコドン領域に位置する。ｔＲＮＡのいくつかの実施形態において、核酸塩基アナログは、アンチコドンの第１の位置に位置する。ｔＲＮＡのいくつかの実施形態において、核酸塩基アナログは、アンチコドンの第２の位置に位置する。ｔＲＮＡのいくつかの実施形態において、核酸塩基アナログは、アンチコドンの第３の位置に位置する。ｔＲＮＡのいくつかの実施形態において、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼは、好熱菌に由来する。ｔＲＮＡのいくつかの実施形態において、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼは、メタノサルシナ属またはそのバリアントに由来する。ｔＲＮＡのいくつかの実施形態において、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼは、メタノコッカス属（メタノカルドコッカス属）またはそのバリアントに由来する。ｔＲＮＡのいくつかの実施形態において、非天然アミノ酸は、芳香族部分を含む。ｔＲＮＡのいくつかの実施形態において、非天然アミノ酸は、リジン誘導体である。ｔＲＮＡのいくつかの実施形態において、非天然アミノ酸は、フェニルアラニン誘導体である。ｔＲＮＡのいくつかの実施形態において、非天然アミノ酸は、Ｎ６－アジドエトキシ－カルボニル－Ｌ－リジン（ＡｚＫ）、Ｎ６－プロパルギルエトキシ－カルボニル－Ｌ－リジン（ＰｒａＫ）、ＢＣＮ－Ｌ－リジン、ノルボルネンリジン、ＴＣＯ－リジン、メチルテトラジンリジン、アリルオキシカルボニルリジン、２－アミノ－８－オキソノナン酸、２－アミノ－８－オキソオクタン酸、ｐ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アジドメチル－Ｌ－フェニルアラニン（ｐＡＭＦ）、ｐ－ヨード－Ｌ－フェニルアラニン、ｍ－アセチルフェニルアラニン、２－アミノ－８－オキソノナン酸、ｐ－プロパルギルオキシフェニルアラニン、ｐ－プロパルギル－フェニルアラニン、３－メチル－フェニルアラニン、Ｌ－ドパ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アジド－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アシル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－ベンゾイル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－ブロモフェニルアラニン、ｐ－アミノ－Ｌ－フェニルアラニン、イソプロピル－Ｌ－フェニルアラニン、Ｏ－アリルチロシン、Ｏ－メチル－Ｌ－チロシン、Ｏ－４－アリル－Ｌ－チロシン、４－プロピル－Ｌ－チロシン、ホスホノチロシン、トリ－Ｏ－アセチル－ＧｌｃＮＡｃｐ－セリン、Ｌ－ホスホセリン、ホスホノセリン、Ｌ－３－（２－ナフチル）アラニン、２－アミノ－３－（（２－（（３－（ベンジルオキシ）－３－オキソプロピル）アミノ）エチル）セラニル）プロパン酸、２－アミノ－３－（フェニルセラニル）プロパン酸およびセレノシステインからなる群から選択される。
式：Ｎ１－Ｚｘ－Ｎ２［式中、Ｎ１は、ヌクレオチドもしくはそのアナログ、または末端ホスフェート基であり；Ｎ２は、ヌクレオチドもしくはそのアナログ、または末端ヒドロキシル基であり；Ｚは、本明細書に記載の化合物であり、ｘは、１～２０の整数である］を含む構造を本明細書に記載する。いくつかの実施形態において、構造は、遺伝子をコードする。いくつかの実施形態において、Ｚｘは、遺伝子のコード領域に位置する。いくつかの実施形態において、Ｚｘは、コドンに位置する。いくつかの実施形態において、構造は、５’または３’非翻訳領域（ＵＴＲ）をさらに含む。いくつかの実施形態において、構造は、ターミネーター領域をさらに含む。いくつかの実施形態において、構造は、プロモーター領域をさらに含む。
ポリヌクレオチドライブラリーであって、ライブラリーは、少なくとも５０００の固有のポリヌクレオチドを含み、それぞれのポリヌクレオチドは、本明細書に記載の少なくとも１つの非天然核酸塩基を含む、ポリヌクレオチドライブラリーを本明細書に記載する。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドライブラリーは、少なくとも１つの遺伝子をコードする。
ヌクレオシド三リン酸であって、核酸塩基は、
から選択される、ヌクレオシド三リン酸を本明細書に記載する。いくつかの実施形態において、ヌクレオシドは、リボースを含む。いくつかの実施形態において、ヌクレオシドは、デオキシリボースを含む。いくつかの実施形態において、核酸塩基は、
から選択される。いくつかの実施形態において、核酸塩基は、
から選択される。いくつかの実施形態において、核酸塩基は、
から選択される。いくつかの実施形態において、核酸塩基は、
から選択される。いくつかの実施形態において、核酸塩基は、
である。いくつかの実施形態において、ヌクレオシドは、リボースを含む。いくつかの実施形態において、ヌクレオシドは、デオキシリボースを含む。いくつかの実施形態において、核酸塩基は、
である。いくつかの実施形態において、ヌクレオシドは、リボースを含む。いくつかの実施形態において、ヌクレオシドは、デオキシリボースを含む。いくつかの実施形態において、核酸塩基は、
である。いくつかの実施形態において、ヌクレオシドは、リボースを含む。いくつかの実施形態において、ヌクレオシドは、デオキシリボースを含む。
これらの実施例は、例示のみを目的として提供されており、本明細書で提供される特許請求の範囲を限定するものではない。
実施例１Ａ：複製および転写のテンプレート化の概要。
プラスミドは、２つのｄＮａＭ－ｄＴＰＴ３ ＵＢＰで構築され、その結果、配列ＡＸＣ（ここおよび全体を通してＸは（ｄ）ＮａＭまたは（ｄ）ＮａＭアナログを指す）がｓｆＧＦＰ ｍＲＮＡのテンプレートコドン１５１（ｓｆＧＦＰ１５１（ＡＸＣ））に位置し、配列ＧＹＴ（ここおよび全体を通じてＹは（ｄ）ＴＰＴ３または（ｄ）ＴＰＴ３アナログを指す）は、Ｍ．ｂａｒｋｅｒｉピロリシル－ｔＲＮＡシンテターゼ（Ｍｂ ＰｙｌＲＳ）によるｎｃＡＡ Ｎ６－（２－アジドエトキシ）－カルボニル－Ｌ－リジン（ＡｚＫ）で選択的に帯電されているＭ．ｍａｚｅｉ Ｐｙｌ ｔＲＮＡ（ｔＲＮＡＰｙｌ（ＧＹＴ））のアンチコドンをテンプレート化するように配置されている。これらのプラスミドを使用して、ヌクレオシド三リン酸輸送体ＰｔＮＴＴ２（ＹＺ３８株）を発現し、ＭｂＰｙｌＲＳをコードするプラスミドを保有するＥ．ｃｏｌｉを形質転換した。形質転換後、コロニーを選択し、ｄＴＰＴ３ＴＰ（１０μＭ）および様々な濃度（１５０μＭ、１０μＭ、または５μＭ）で添加された７つの異なるｄＸＴＰ（図２）の１つを補充された液体培地中でＯＤ６００約１．０まで増殖させた。次いで、細胞を、同じ非天然デオキシリボヌクレオチドならびにＮａＭＴＰ（２５０μＭ）、ＴＰＴ３ＴＰ（３０μＭ）、およびＡｚＫ（１０ｍＭ）を含む新鮮な発現培地で希釈した。短時間のインキュベーション後、イソプロピル－β－ｄ－チオガラクトシド（ＩＰＴＧ、１ｍＭ）の添加により、Ｔ７ ＲＮＡＰおよびｔＲＮＡＰｙｌ（ＧＹＴ）の発現が誘導された。さらに１時間インキュベートした後、アンヒドロテトラサイクリン（ａＴｃ、１００ｎｇ／ｍＬ）を添加して、ｓｆＧＦＰ１５１（ＡＸＣ）の発現を開始した。
ＰＣＲ産物の分析。２．５時間後、プラスミドを単離し、次いで、ｄ５ＳＩＣＳＴＰおよびｄＮａＭＴＰ７のビオチン化アナログを使用して、目的の遺伝子を独立してＰＣＲ増幅した。得られたＰＣＲ産物を、ストレプトアビジンを使用するゲル移動度シフトアッセイを介して分析し、全増幅産物のパーセントシフトとして保持されたＵＢＰを定量した（本明細書では以下、ストレプトアビジンゲルシフトアッセイと呼ぶ）（図３Ａおよび図３Ｂ）。調べた最高のｄＸＴＰ濃度（１５０μＭ）では、ｓｆＧＦＰ１５１（ＡＸＣ）遺伝子の保持は、各ｄＸＴＰアナログで類似しており、ｄＮａＭＴＰの９９％からｄＭＴＭＯＴＰの９２％まで変化した。ｔＲＮＡＰｙｌ（ＧＹＴ）遺伝子内の保持はわずかに低く、ｄＭＴＭＯＴＰの８２％からｄＭＭＯ２ＴＰの７４％の範囲であった。各ｄＸＴＰを１０μＭ添加すると、ｓｆＧＦＰ１５１（ＡＸＣ）遺伝子の保持は、ｄ５ＦＭＴＰの９６％からｄＮａＭＴＰの７３％の範囲であった。ｔＲＮＡＰｙｌ（ＧＹＴ）遺伝子を使用すると、保持は再び一般的にわずかに低くなり、ｄ５ＦＭＴＰおよびｄＰＴＭＯＴＰの８２％からｄＮａＭＴＰの７１％の範囲であった。最低濃度（５μＭ）では、保持は、ｓｆＧＦＰ１５１（ＡＸＣ）遺伝子のｄ５ＦＭＴＰの９４％からｄＭＴＭＯＴＰの６４％、およびｔＲＮＡＰｙｌ（ＧＹＴ）遺伝子のｄ５ＦＭＴＰの８３％からｄＭＴＭＯＴＰの７１％の範囲であった。一般に、最高濃度では、全てのｄＸＴＰは、ｓｆＧＦＰ遺伝子内のＵＢＰをほぼ定量的に保持して実行された。ただし、低濃度では、ｄＣＮＭＯ－ｄＴＰＴ３、ｄ５ＦＭ－ｄＴＰＴ３、およびｄＰＴＭＯ－ｄＴＰＴ３が大幅に高い保持率で複製された。ｔＲＮＡ遺伝子の保持は、ｄＸＴＰ濃度には有意には依存していなかった。
レポータータンパク質産生の分析。産生されたタンパク質の量を特徴付けるために、細胞増殖に対して正規化されたバルク培養蛍光を、タンパク質発現の誘導の２．５時間後に測定した（図３Ｃ）。ＡｚＫがない場合、わずかに高いように見える低濃度のｄＰＴＭＯＴＰおよびｄＭＴＭＯＴＰを除いて、蛍光は一般に低かった。ＡｚＫを培地に添加した場合、１５０または１０μＭの各ｄＸＴＰで増殖した細胞は、１５０μＭよりも１０μＭで有意に少ない蛍光を示したｄＮａＭＴＰを除いて、一般に有意かつ同様のレベルの蛍光を示した。最低濃度（５μＭ）では、ＡｚＫの添加により、ｄＭＴＭＯＴＰで観察される蛍光が少なくなったが、ｄＣＮＭＯＴＰ、ｄ５ＦＭＴＰ、ｄＣｌＭＯＴＰ、ｄＭＭＯ２ＴＰ、またはｄＰＴＭＯＴＰでは同じままであった。５μＭのｄＮａＭＴＰのみを供給した場合、細胞増殖は観察されなかった。高濃度では同様であるが、低濃度では、各ｄＸＴＰアナログを使用すると、ｄＮａＭＴＰを使用した場合よりもＡｚＫに依存した蛍光の増大が大きくなる。特に、ｄＣＮＭＯＴＰ、ｄ５ＦＭＴＰ、およびｄＣｌＭＯＴＰは、ＡｚＫ依存性の蛍光の最大の増大を示した。
レポータータンパク質の忠実度の分析。非天然タンパク質産生の忠実度を直接評価するために、タンパク質発現の誘導の２．５時間後に細胞を回収し、産生されたｓｆＧＦＰを精製し、４つのＰＥＧユニットによってＴＡＭＲＡ色素に連結したジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）とのひずみ促進アジド－アルキン付加環化反応に供した。ｎｃＡＡを含むタンパク質に検出可能なフルオロフォアをタグ付けすることに加えて、コンジュゲーションは、電気泳動移動のシフトを生成し、生成された総タンパク質のパーセンテージとしてＡｚＫを含むタンパク質の定量化を可能にする（すなわち、ｎｃＡＡ取り込みの忠実度；図３Ｄ）。ｄＮａＭと同様に、最高濃度（１５０μＭ）で各ｄＸＴＰを使用すると、ｎｃＡＡの忠実度の高い取り込みを反映して、精製タンパク質が実質的に完全にシフトする。１０μＭのｄＸＴＰの存在下で増殖させた場合、ｎｃＡＡ取り込みの忠実度は、ｄＣＮＭＯＴＰ、ｄ５ＦＭＴＰ、ｄＣｌＭＯＴＰ、ｄＭＭＯ２ＴＰ、ｄＰＴＭＯＴＰ、およびｄＭＴＭＯＴＰで高いままであったが、ｄＮａＭＴＰでは急激に低下した。最後に、５μＭのｄＸＴＰの濃度では、ｎｃＡＡの取り込みの忠実度は、ｄＣＮＭＯＴＰ、ｄ５ＦＭＴＰ、ｄＣｌＭＯＴＰ、ｄＭＭＯ２ＴＰ、およびｄＰＴＭＯＴＰの場合は１０μＭで観察されたものと同じままであったが、ｄＭＴＭＯＴＰの場合は低下した（これも実行可能性に起因して、ｄＮａＭＴＰの忠実度はこの濃度で測定できなかった）。
結果。特に低濃度で最も多くの純粋な非天然タンパク質を生成した非天然塩基は、ｄＣＮＭＯＴＰおよびｄ５ＦＭＴＰである。ただし、ｄ５ＦＭＴＰと比較して、ｄＣＮＭＯＴＰを使用すると、配列を複製することがより困難で、ＵＢＰの保持率が高くなることが以前に示されている。ｄＣＮＭＯ－ｄＴＰＴ３ ＵＢＰは、増加した情報の記憶および読出しに適している。以前に報告されたＳＳＯは、ＵＢＰ ｄＮａＭ－ｄＴＰＴ３、ｄＰＴＭＯ－ｄＴＰＴ３、またはｄＭＴＭＯ－ｄＴＰＴ３で情報を保存し、ＮａＭＴＰおよびＴＰＴ３ＴＰを使用してその情報を読み出した。ＳＳＯの最適化を検討するために、ＵＢＰの保持、ｓｆＧＦＰ ｍＲＮＡおよびｔＲＮＡＰｙｌへの転写、ならびにリボソームでのデコードを、以前および新たに報告されたデオキシおよびリボヌクレオチド三リン酸アナログのコレクションを使用して検討した。７つの異なるｄＸ－ｄＴＰＴ３ ＵＢＰで情報を保存する機能を調べた。いずれの場合も、ＵＢＰの鎖のコンテキストは同じであり、ｄＴＰＴ３およびｄＸはそれぞれｓｆＧＦＰおよびｔＲＮＡＰｙｌ遺伝子の対応するアンチセンス（テンプレート）鎖に配置されていた。高濃度の各ｄＸＴＰが提供されると、各ｄＸ－ｄＴＰＴ３ ＵＢＰは、ｍＲＮＡ遺伝子に高レベルで保持され、ｄＭＴＭＯＴＰでの９２％と、ｄＣＮＭＯＴＰ、ｄＰＴＭＯＴＰ、およびｄＮａＭＴＰでの９６％から９９％の間で変動がある。ｔＲＮＡ遺伝子の保持は、やや減少し、７４％から８２％の間で変動した。ｄＸＴＰの濃度が低下すると、保持は、ｔＲＮＡ遺伝子ではほぼ一定のままであったが、ｍＲＮＡ遺伝子ではｄＸＴＰ特異的に減少し、ｄＭＴＭＯＴＰでは６４％に減少したが、ｄＣＮＭＯＴＰおよびｄ５ＦＭＴＰでは約９４％と比較的高いままであった。理論に拘束されることなく、ｔＲＮＡおよびｍＲＮＡ遺伝子の保持に対する異なる濃度依存性は、ｍＲＮＡではヌクレオチド挿入を律速にし、ｔＲＮＡ遺伝子では継続的な伸長を律速にする配列コンテキスト効果に起因する可能性が高い。例外は、ｄＮａＭＴＰで観察され、１０μＭで保持が７３％に減少し、ｄＮａＭＴＰが５μＭで提供された場合、細胞は生存しなかった。さらに、ｄＣＮＭＯＴＰおよびｄ５ＦＭＴＰを使用した場合、調べた最低濃度でさえ、ｍＲＮＡの保持率は高いままであった（約９３％）。理論に縛られることなく、ｔＲＮＡ遺伝子の保持が失われると、非天然タンパク質の生成が少なくなり、おそらくもっと問題なのは、「同族に近い」天然ｔＲＮＡによる非天然コドンの解読の競争が激化することに起因して、ｎｃＡＡの取り込みの忠実度が低下し得ることである。ただし、ｎｃＡＡの取り込みの忠実度は、ｍＲＮＡ遺伝子の保持と相関していた（データは示さず）。したがって、このデータは、各ｄＸが、非天然タンパク質生成の忠実度を制限しないように十分な効率および忠実度でｔＲＮＡの転写をテンプレート化することを示している。これらの結果に基づくと、ｄ５ＦＭ－ｄＴＰＴ３およびｄＣＮＭＯ－ｄＴＰＴ３は、情報記憶を増やし得るＵＢＰであり、ｄＮａＭ－ｄＴＰＴ３と比較した場合の有用性は、主に、より低い非天然三リン酸濃度でのより高い保持とタンパク質生成に由来する。
実施例１Ｂ：転写の複製およびテンプレート化のための詳細な手順。
プラスミドのＧｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅアセンブリ。ＵＢＰ（および必要に応じてｓｆＧＦＰまたはｔＲＮＡＰｙｌをコードする遺伝子）を含む挿入物は、手動で合成（オリゴヌクレオチド合成を参照のこと）されるか、またはＳｙｎｔｈｏｒｘから提供された非天然含有オリゴヌクレオチドＯ３およびＯ６－１２（オリゴ配列については表Ｓ４を参照のこと）のＰＣＲによって、ｄＴＰＴ３ＴＰおよびｄＮａＭＴＰ、ならびにプライマーＰ１－２（Ｏ３またはＯ７－１２を増幅する場合）およびＰ３－４（Ｏ６を増幅する場合）を使用して、生成して（プライマー配列については表Ｓ１を参照）、一旦消化されると以下に示す配列（配列番号２）である、ｓｆＧＦＰ翻訳用の適切な目的プラスミドｐ［ｓｆＧＦＰ（ｇｇ）１５１ ｔＲＮＡＰｙｌ（ｇｇ）］ＧＧ目的プラスミドと適合するオーバーハングを導入する、末端ＢｓａＩ認識部位を作製する。ＰＣＲ増幅は、ＰＴＣ－２００ペルチェサーマルサイクラー（Ｐｅｌｔｉｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ）（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）で行った。テンプレートオリゴヌクレオチド（５０μＬ反応あたり０．０２５ｎｇ）は、次の試薬濃度を使用してＰＣＲ増幅した：ＯｎｅＴａｑ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（１×、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）、ｄＮＴＰ（０．２ｍＭ）、ｄＴＰＴ３ＴＰ（０．１ｍＭ）、ｄＮａＭＴＰ（０．１ｍＭ）、ＭｇＳＯ４（１．２ｍＭ）、プライマー（各１μＭ）、およびＯｎｅＴａｑポリメラーゼ（１．２５Ｕ）。天然オリゴヌクレオチドは、非天然三リン酸の非存在下で増幅された。これらは、以下のサーモサイクリング条件下で増幅された（時間は、ｍｍ：ｓｓとして示される）：［９４℃ ０：３０｜２０×（９４℃ ０：３０｜５４℃ ０：３０｜６８℃ ４：００）］。残りの溶液を、スピンカラム（ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ ａｎｄ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ－５；Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）で精製し、次いで、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００ Ｐｒｏマルチモードマイクロプレートリーダー（Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ）（Ｔｅｃａｎ）を使用して２８０ｎｍでの吸光度で定量した。
オリゴヌクレオチド合成。修飾オリゴヌクレオチドは、Ｅｘｐｅｄｉｔｅ ８９０９遺伝子シンセサイザー、孔径１，０００Åのスクシニル連結ＬＣＡＡ－ＣＰＧ（長鎖アルキルアミン制御孔ガラス）カラム、ならびにｄＡＢｚ、ｄＣＢｚ、ｄＧｉＢｕおよびｄＴ ＤＮＡホスホルアミダイトの取り込みのための標準プロトコールを用いて０．２μｍｏｌスケールに合成した。モノマーｄＮａＭの取り込みには、以下のハンドカップリング条件を使用した（１５分；ＣＨ３ＣＮ中のテトラゾール；＞９５％）。変性ホスホルアミダイトを、無水ＣＨ３ＣＮ中で５０倍モル過剰および０．０５Ｍ濃度で使用した。固体支持体からの切断および保護基の除去は、約３０％のアンモニア水を使用して達成された（５５℃、１６時間）。ＤＭＴ－ｏｎ粗オリゴヌクレオチドの精製は、Ｈｙｐｅｒｓｉｌ Ｇｏｌｄ Ｃ１８カラム（５μｍ、４．６×１５０ｍｍ）を備えたＶａｎｑｕｉｓｈ ＵＨＰＬＣシステムを使用し、０～５０％Ｂを２５分間にわたって使用して行った（緩衝液Ａ＝０．０５ Ｍ ＴＥＡＡ、ｐＨ７；緩衝液Ｂ＝ＣＨ３ＣＮ中の２５％Ｈ２Ｏ；流量＝１．０ｍＬ／分）。適切な画分をプールし、蒸発乾固させた後、脱トリチル化（８０％ＡｃＯＨ水）および沈殿（ＮａＯＡｃ／ＮａＣｌＯ４／アセトン、－８０℃で３時間）させた。純度は、分析モード（＞９０％）で実行されるイオン対逆相ＨＰＬＣによって検証した。
プラスミドは、以下の条件下で、８０μＬの反応容量でアセンブルされた：目的のプラスミド（１μｇ）、ＰＣＲ挿入（４：１という挿入：プラスミドのモル比）、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（５３２Ｕ）、ＢｓａＩ－ＨＦ（５３．４Ｕ）およびＡＴＰ（１ｍＭ）を、ＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝液（１×、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）で組み合わせ、以下の条件（時間は、ｍｍ：ｓｓで表す）でサーモサイクルした：［３７℃ ２０：００｜４０×（３７℃ ５：００｜１６℃ １０：００｜２２℃ ５：００）｜３７℃２０：００｜５０℃１５：００｜７０℃３０：００］。
ゴールデンゲート反応後、Ｔ５エキソヌクレアーゼ（１３．３Ｕ）およびＢｓａＩ－ＨＦ（２６．６Ｕ）を添加し、その反応液を３７℃で１時間インキュベートして、残りのＤＮＡフラグメントおよび取り込まれなかった目的のプラスミドを消化した。アセンブルされたプラスミドは、Ｚｙｍｏ－Ｓｐｉｎ Ｉカラムで精製し、Ｑｕｂｉｔ ｄｓＤＮＡ ＨＳアッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して定量した。
ｐＧＥＸ－ＭｂＰｙｌＲＳ ＴｅｔＲによるＹＺ３／ＭＬ２の変換。ＳＳＯ株ＹＺ３またはＭＬ２の一晩培養物を、５０ｍＭリン酸カリウムおよび５μｇ／ｍＬクロラムフェニコール（本明細書においてこのセクションでは「培地」と呼ぶ）を補充した２×ＹＴ中で増殖させ、次いで、同じ培地中でＯＤ６００が０．０３になるように希釈し、ＯＤ６００が０．４から０．６まで増殖させた。次いで、培養物を氷水上で５分間振盪しながら冷却し、次に３，２００×ｇで１０分間の遠心分離によってペレット化した。次いで、細胞を再懸濁し、氷冷ｄｄＨ２Ｏで２回洗浄した後、氷冷ｄｄＨ２Ｏに再懸濁してＯＤ６００を５０～６０にした。エレクトロコンピテントセル（５０μＬ）および２ｎｇのｐＧＥＸ－ＭｂＰｙｌＲＳ ＴｅｔＲプラスミド（配列番号１）を、事前に冷却したエレクトロポレーションキュベット（０．２ｃｍギャップ）に移し、次いで、製造業者の推奨（電圧２５ｋＶ、コンデンサ２．５μＦ、抵抗２００Ω）に従ってエレクトロポレーションし（Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＩＩ；Ｂｉｏ－Ｒａｄ）、次いで９５０μＬの培地で直ちに希釈した。次いで、このエレクトロポレーション反応のアリコート（４０μＬ）を培地で５倍に希釈して最終容量を２００μＬにし、次いで、３７℃で１時間回復させた。回収率の２倍希釈液を、５０ｍＭリン酸カリウム、５μｇ／ｍＬクロラムフェニコール、１００μｇ／ｍＬカルベニシリン、および２％（ｗ／ｖ）寒天を補充した固体２×ＹＴ培地にプレートし、次いで３７℃で一晩増殖させた。単一コロニーを採取して、１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを補充した液体培地の培養物に接種し、－８０℃でグリセロール（２５％ｖ／ｖ）に保存した。
ｄＸＴＰのインビボ翻訳スクリーニング。ｐＧＥＸ－ＭｂＰｙｌＲＳ ＴｅｔＲプラスミドを保持するＳＳＯ株ＹＺ３の一晩培養物を、５０ｍＭリン酸カリウム、５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール、および１００μｇ／ｍＬのカルベニシリン（本明細書では、このセクションで「培地」と呼ぶ）を補充した２×ＹＴ中で増殖し、次いで、同じ培地中でＯＤ６００が０．０３になるまで希釈し、ＯＤ６００が０．４から０．６になるまで増殖させた。次いで、培養物を氷水上で１５分間振盪しながら冷却し、次に３，２００×ｇで１０分間の遠心分離によりペレット化した。次いで、細胞を再懸濁し、氷冷ｄｄＨ２Ｏで２回洗浄した後、氷冷ｄｄＨ２Ｏ中でＯＤ６００が５５～６５まで再懸濁した。エレクトロコンピテントセル（５０μＬ）、ならびにｓｆＧＦＰおよびｔＲＮＡＰｙｌ遺伝子（プラスミドのＧｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅアセンブリを参照のこと）内のＵＢＰを有するＧｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅアセンブルされたプラスミドの１ｎｇを、事前に冷却したエレクトロポレーションキュベット（０．２ｃｍギャップ）に移し、次いで、製造業者の推奨（電圧２５ｋＶ、コンデンサ２．５μＦ、抵抗器２００Ω）に従って、エレクトロポレーションし（Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＩＩ；Ｂｉｏ－Ｒａｄ）、次いで、９５０μＬの培地を用いて直ちに希釈した。次いで、形質転換体のアリコート（４０μＬ）をｄＮａＭＴＰ（１５０μＭ）およびｄＴＰＴ３ＴＰ（１０μＭ）を補充した培地中で５倍に希釈し、最終容量を２００μＬにし、次いで、３７℃で１時間振盪して回復させた。回収率の２倍希釈液を、ゼオシン（５０μｇ／ｍＬ）、ｄＮａＭＴＰ（１５０μＭ）、ｄＴＰＴ３ＴＰ（１０μＭ）、および寒天（２％ｗ／ｖ）を補充した固形培地にプレートし、３７℃で一晩増殖させた。単一コロニーを採取し、５０μｇ／ｍＬゼオシン（本明細書において、以下、このセクションでは「増殖培地」と呼ぶ）を補充した培地（３００μＬ）で増殖させ、ｄＮａＭＴＰ（１５０μＭ）およびｄＴＰＴ３ＴＰ（１０μＭ）を提供した。培養物の細胞増殖をモニターし（５９０／２０ｎｍフィルターを備えたＥｎｖｉｓｉｏｎ ２１０３ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ）、次いで、ＯＤ６００約１．０で収集した。アリコート（５０μＬ）を、ＺＲ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用してプラスミド単離に供した。次いで、単離されたプラスミドを、以下に記載されるストレプトアビジンゲルシフトアッセイ（プライマーＰ３－４およびＰ５－６、表Ｓ１を使用）に供して、ＵＢＰ保持を決定した。次いで、優れたＵＢＰ保持力を有するコロニーを、－８０℃でグリセロール（２５％ｖ／ｖ）に保存した。
グリセロールストックの１０倍希釈物を、ｄＮａＭＴＰ（１５０μＭ）、ｄＴＰＴ３ＴＰ（１０μＭ）、および２％ｗ／ｖ寒天を補充した固体増殖培地上に再プレートし、次いで３７℃で一晩増殖させた。単一コロニーを採取し、対応するｄＸＴＰ（様々な濃度）およびｄＴＰＴ３ＴＰ（１０μＭ）を補充した増殖培地（３００μＬ）で増殖させた後、細胞増殖をモニターし、ＯＤ６００約１．０で収集した。全てのサンプルが一旦、収集されたら、サンプルを氷上に一晩放置した。次いで、サンプルをＯＤ６００約０．１に再希釈し、最終容量を３００μＬにし、対応するｄＸＴＰ（様々な濃度）およびｄＴＰＴ３ＴＰ（１０μＭ）を提供した。使用しなかった残りの培養物を、ペレット化し、その後のプラスミド単離の間、－８０℃で、ＺＲ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して保存して、ＵＢＰの保持を確認した。培養物がＯＤ６００約０．４～０．６に達すると、ＮａＭＴＰ（２５０μＭ）およびＴＰＴ３ＴＰ（３０μＭ）、ならびにＡｚＫ（１０ｍＭ）（またはＡｚＫの非存在下で増殖された培養物の場合はｄｄＨ２Ｏ）が提供された。光分解を防ぐために、ＡｚＫの添加後にサンプルを遮光した。次いで、これらのサンプルを３７℃で２０分間増殖させた後、１ｍＭのＩＰＴＧを添加し、３７℃でさらに１時間増殖させて、Ｔ７ＲＮＡＰならびにｔＲＮＡＰｙｌおよびＰｙｌＲＳの転写を誘導した。この時点から、細胞の増殖および蛍光をモニターした。次いで、ｓｆＧＦＰの発現を、アンヒドロテトラサイクリン（１００ｎｇ／ｍＬ）で誘導した。３７℃でさらに２．５時間増殖させた後、細胞を収集し（ＵＢＰ保持を決定するためのプラスミド単離には５０μＬ、ｓｆＧＦＰのアフィニティー精製には２３０μＬ）、冷却し、次いでペレット化して－８０℃で保存した後に、ＵＢＰの保持およびタンパク質の精製を評価した。
ＸＴＰ／ＹＴＰのインビボ翻訳スクリーニング。ｐＧＥＸ－ＭｂＰｙｌＲＳ ＴｅｔＲプラスミドを保持するＳＳＯ株ＭＬ２の一晩培養物を、５０ｍＭリン酸カリウム、５μｇ／ｍＬクロラムフェニコール、および１００μｇ／ｍＬカルベニシリン（本明細書において、このセクションでは「培地」と呼ぶ）を補充した２×ＹＴ中で増殖させ、次いで同じ培地でＯＤ６００が０．０３になるまで希釈し、ＯＤ６００が０．４から０．６になるまで増殖させた。次いで、培養物を氷水上で１５分間振盪しながら冷却し、次に３，２００×ｇで１０分間の遠心分離によりペレット化した。次いで、細胞を再懸濁し、氷冷ｄｄＨ２Ｏで２回洗浄した後、氷冷ｄｄＨ２Ｏ中で５５～６５のＯＤ６００に再懸濁した。エレクトロコンピテントセル（５０μＬ）ならびにｓｆＧＦＰおよびｔＲＮＡＰｙｌ遺伝子内（プラスミドのＧｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅアセンブリを参照）にＵＢＰを有する１ｎｇのＧｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅアセンブルプラスミドを、事前に冷却したエレクトロポレーションキュベット（０．２ｃｍギャップ）に移し、次いで、製造業者の推奨（電圧２５ｋＶ、コンデンサ２．５μＦ、抵抗器２００Ω）に従ってエレクトロポレーションし（Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＩＩ；Ｂｉｏ－Ｒａｄ）、次いで、９５０μＬの培地で直ちに希釈した。次いで、形質転換体のアリコート（４０μＬ）を、ｄＣＮＭＯＴＰ（２５μＭ）およびｄＴＰＴ３ＴＰ（１０μＭ）を補充した培地で５倍に希釈して最終容量を２００μＬにし、次いで、３７℃で１時間振盪して回復させた。回収率の２倍希釈液を、ゼオシン（５０μｇ／ｍＬ）、ｄＣＮＭＯＴＰ（１０μＭ）、ｄＴＰＴ３ＴＰ（１０μＭ）、および寒天（２％ｗ／ｖ）を補充した固形培地にプレートし、３７℃で１８時間増殖させた。単一コロニーを採取し、５０μｇ／ｍＬゼオシンを補充した培地（３００μＬ）で増殖させ、ｄＣＮＭＯＴＰ（２５μＭ）およびｄＴＰＴ３ＴＰ（１０μＭ）を提供した（本明細書において、以下、このセクションでは「増殖培地」と呼ぶ）。培養物の細胞増殖をモニターし（５９０／２０ｎｍフィルターを備えたＥｎｖｉｓｉｏｎ ２１０３ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ）、次いで、ＯＤ６００約１．０で収集した。アリコート（５０μＬ）を、ＺＲ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用してプラスミド単離に供した。次いで、単離されたプラスミドを、以下に記載されるストレプトアビジンゲルシフトアッセイ（プライマーＰ３－４およびＰ５－６、表Ｓ１を使用）に供して、ＵＢＰ保持を決定した。
次いで、優れたＵＢＰ保持を有するコロニーを、増殖培地中ＯＤ６００約０．０１に希釈し、そしてＯＤ６００約０．４～０．６に増殖させた。次いで、この培養物を複数の３００μＬ培養物に分割し、ＸＴＰアナログのスクリーニングのために、それぞれに対応するＸＴＰ（２５μＭまたは２５０μＭのいずれか）または「－ＸＴＰ」サンプル用のｄｄＨ２Ｏ、ＴＰＴ３ＴＰ（３０μＭ）、およびＡｚＫ（１０ｍＭ）を提供した。ＹＴＰアナログのスクリーニングでは、各３００μＬの培養物に、対応するＹＴＰ（２５μＭまたは２５０μＭのいずれかで）または「－ＹＴＰ」サンプル用のｄｄＨ２Ｏ、ＮａＭＴＰ（２５０μＭ）、およびＡｚＫ（１０ｍＭ）が提供された。光分解を防ぐために、ＡｚＫの添加後にサンプルを遮光した。次いで、これらのサンプルを３７℃で２０分間増殖させた後、１ｍＭのＩＰＴＧを添加し、３７℃でさらに１時間増殖させて、Ｔ７ＲＮＡＰならびにｔＲＮＡＰｙｌおよびＰｙｌＲＳの転写を誘導した。この時点から、細胞の増殖および蛍光をモニターした。次いで、ｓｆＧＦＰの発現を、アンヒドロテトラサイクリン（１００ｎｇ／ｍＬ）で誘導した。３７℃でさらに３時間増殖させた後、細胞を回収し（ｓｆＧＦＰのアフィニティー精製用に２３０μＬ）、冷却し、次いでペレット化して－８０℃で保存した後、タンパク質を精製した。
ステプタビジンゲルシフトアッセイ。ＰＣＲ増幅は、ＣＦＸ ＣｏｎｎｅｃｔリアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で実行した。プラスミドミニプレップ、またはＧｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅアセンブルプラスミド（０．５μＬ～２μＬ、０．５ｎｇ／μＬ～５ｎｇ／μＬ）、またはｄＮａＭ含有オリゴヌクレオチド（０．０２５ｎｇ）を、以下の条件下で、総反応量１５μＬでＰＣＲ増幅した：ＯｎｅＴａｑ標準反応緩衝液（１×、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）、ｄＮＴＰ（４００μＭ）、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（１×、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＭｇＳＯ４（２．２ｍＭ）、プライマーＰ３－４またはＰ５－６（各１μＭ、プライマー配列については表Ｓ４を参照のこと）、ｄ５ＳＩＣＳＴＰ（６５μＭ）、ｄＭＭＯ２ＢＩＯＴＰ（６５μＭ；わかりやすくするために糖およびリン酸を省略した構造を以下に示す）、ＯｎｅＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（０．２７Ｕ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）、ＤｅｅｐＶｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ（０．１０５Ｕ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）。
翻訳実験から単離されたプラスミドは、以下のサーモサイクリング条件（時間はｍｍ：ｓｓとして示される）を使用して増幅された：［９６℃ ５：００｜２０×（９５℃ ００：１５｜５４℃ ００：１５｜６８℃ ４：００］。その後、ストレプトアビジン（２．５μＬ、２μｇ／μＬ；Ｐｒｏｍｅｇａ）を、各反応液（１μＬ）と混合し、室温で５分間インキュベートした。ストレプトアビジンを含むサンプル（３．５μＬ）および含まないサンプル（１μＬ）を、それぞれローディング緩衝液と混合し、６％（重量／容積）ポリアクリルアミド（２９：１アクリルアミド：ビス－アクリルアミド）トリス／ホウ酸塩／ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）ゲルで、１２０Ｖで約３０分間分離した。次いで、ゲルを、１×ＳＹＢＲゴールド色素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で染色し、５２０ＤＦ３０フィルター（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を装備したＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｅｒ Ｇｅｌ Ｄｏｃ ＸＲ＋（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して画像化した。次いで、ＵＢＰ保持は、入力プラスミド（開始形質転換で使用されるプラスミド）で得られたものと比較した、各レーンのシフトしたバンドの、シフトしていないバンドに対する比率を比較することによって決定され得る。このアッセイは、以前に定量的に実証されている。
ストレプトアビジンゲルシフトアッセイは、ミニプレップ純度などの様々な要因に高感度であり、ＵＢＰ保持の検出のためのＵＢＰ含有プラスミドの合理的な増幅を得るために、時にはより高いプラスミド濃度で複数回繰り返され得る。プラスミド濃度が低すぎる場合、ストレプトアビジンゲルシフトアッセイによるとＵＢＰ保持は低く見え、より多くのミニプレッププラスミドを使用して繰り返された。
ｓｆＧＦＰのアフィニティー精製。翻訳実験から収集した細胞ペレットを、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（１００μＬ １×、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に再懸濁し、室温で１５分間振盪した。次いで、細胞溶解物を、緩衝液Ｗ（３８０μＬ；５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）で希釈し、緩衝液Ｗで平衡化した磁気Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎビーズ（２０μＬ、ＭａｇＳｔｒｅｐ’ｔｙｐｅ３’ＸＴビーズの５％（ｖ／ｖ）懸濁液、ＩＢＡ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加した。その混合物を４℃で３０分間穏やかに反転させた。次いで、ビーズを、磁気ラックで引き下げ、緩衝液Ｗ（２×５００μＬ）で洗浄した後、２５μＬのＢＸＴ緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８、５０ｍＭ Ｄ－ビオチン）を添加し、その懸濁液を時々混合しながら、室温で１０分間インキュベートさせた。溶離液を集めるためにビーズを再び引き下げた。精製タンパク質は、Ｑｕｂｉｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して定量した。
ＴＡＭＲＡの銅を含まないクリックコンジュゲーション。精製タンパク質（３００ｎｇ）を、ＴＡＭＲＡ－ＤＢＣＯ（０．１ｍＭ、Ｃｌｉｃｋ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｔｏｏｌｓ；製品番号Ａ１３１）と混合し、最終反応容量が６μＬになるように水を加え、室温で一晩インキュベートし、遮光した。コンジュゲーション後、ＴＡＭＲＡの光退色を最小限に抑えるために、サンプル、ゲル、およびブロットの露光を最小限に抑えるための対策を講じた。
ｓｆＧＦＰのウエスタンブロッティング。ＴＡＭＲＡ－ＤＢＣＯにコンジュゲートした精製タンパク質（３００ｎｇ）を、ローディング緩衝液／色素（２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、３０％（ｖ／ｖ）グリセロール、２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、ｐＨ６．８）と混合（２：１ ｖ：ｖ）し、次いで、９５℃で５分間加熱する。タンパク質ラダー（Ｃｏｌｏｒ Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ、Ｂｒｏａｄ Ｒａｎｇｅ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）および各クリック反応の一部（約６０ｎｇのタンパク質）を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（スタッキングゲル：５％（ｗ／ｖ）アクリルアミド：ｂｉｓ－アクリルアミド２９：１（Ｆｉｓｈｅｒ）、０．１２５Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌおよび０．１％ＳＤＳ、ｐＨ６．８（ＰｒｏｔｏＧｅｌ Ｓｔａｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）；分離ゲル：１５％（ｗ／ｖ）アクリルアミド：ビス－アクリルアミド２９：１（Ｆｉｓｈｅｒ）、０．３７５Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌおよび０．１％ＳＤＳ、ｐＨ８．８（ＰｒｏｔｏＧｅｌ Ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ））にロードし、次いで、５０Ｖで１５分間、次いで１２０Ｖでさらに約４．５時間、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｂａｓｅ、２００ｍＭグリシン、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ）中で泳動する。次いで、適切な緩衝液（２０％（ｖ／ｖ）ＭｅＯＨ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｂａｓｅ、４００ｍＭグリシン、０．０３７３％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ）でのセミドライトランスファーにより、サンプルを、低蛍光ＰＶＤＦ（０．２μＭ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）に移し、１５Ｖで約３０～４５分間泳動する。次いで、メンブレンを、（ＰＢＳ－Ｔ（ＰＢＳ ｐＨ７．４、０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ－２０）中のブロッキング溶液５％（ｗ／ｖ）脱脂乳（Ｃａｒｎａｔｉｏｎ）中で４℃で一晩ロッキングして、３７℃で１時間可溶化した。次いで、そのメンブレンをＰＢＳ－Ｔで２回リンスし、ウサギ抗ＧＦＰ抗体（ＰＢＳ－Ｔで１：３０００、製品番号Ｇ１５４４、ロット０４６Ｍ４８７１Ｖ、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）で室温で１時間振盪した。次いで、そのメンブレンを、ＰＢＳ－Ｔで５分間洗浄した後、ヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７コンジュゲート抗体（ＰＢＳ－Ｔで１：２０，０００、製品番号Ａ３２７３３、ロット番号ＳＤ２５０２９８、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で、室温で４５分間、振盪した。次いで、そのメンブレンを、ＰＢＳ－Ｔで洗浄（３×５分）し、以下の優先で設定されたフラットベッドレーザースキャナー（Ｔｙｐｈｏｏｎ ９４１０、ＧＥ Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で画像化した：５０μＭの解像度、５３２ｎｍのレーザー励起、および５８０／３０ｎｍの発光フィルター（ＴＡＭＲＡ用の４００Ｖ ＰＭＴを使用）、ならびに６３３ｎｍレーザー励起および６７０／３０ｎｍ発光フィルター（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７用の５００Ｖ ＰＭＴを使用）。
ＡｚＫの取り込みを評価するために、精製されたタンパク質を、ＤＢＣＯ－ＴＡＭＲＡにコンジュゲートさせて、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによってゲルシフトを生じさせた。異なるバンドサイズは、ネイティブのｓｆＧＦＰおよびｓｆＧＦＰコンジュゲートＴＡＭＲＡに対応する。次いで、これらのバンドを、Ｉｍａｇｅ Ｓｔｕｄｉｏ Ｌｉｔｅ ５．２．５ソフトウェア（ＬＩ－ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、バンドの濃度測定定量化により定量し、シフト（コンジュゲート）バンドと非シフト（天然）ｓｆＧＦＰバンドの両方によって生成されたシグナル全体に対するシフト（コンジュゲート）バンドの比率を算出した。これは、ｎｃＡＡ ＡｚＫが組み込まれたサンプルのタンパク質シフトの割合またはｓｆＧＦＰの割合として解釈され得る。
インタクトなタンパク質の定量的高分解能質量分析。サンプルの準備およびデータの取得。精製したタンパク質（４μｇ）を、４５０μＬの質量分析グレードの水で希釈し、遠心分離フィルターデバイス（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５－Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にアプライして脱塩した。そのデバイスを１４，０００×ｇで１０分間遠心分離し、得られた濃縮溶液を、質量分析グレードの水で希釈して、総量を５００μＬに戻した。このプロセスを、合計４回の遠心分離について繰り返し、最後のスピンを１８分間続けた。最後のスピンに続いて、フィルターデバイスを新しいマイクロ遠心チューブに逆さにし、１，０００×ｇで２分間遠心分離することにより、サンプルを回収した。次いで、脱塩したタンパク質を、Ｗａｔｅｒｓ Ｇ２－ＸＳ ＴＯＦに接続されたＷａｔｅｒｓＩ－Ｃｌａｓｓ ＬＣに注入した（６μＬ、約２５０ｎｇ）。フロー条件は、０．４ｍＬ／分の５０：５０の水：アセトニトリルに加えて０．１％ギ酸であった。イオン化は、ＥＳＩ＋によるもので、データは、ｍ／ｚ５００～ｍ／ｚ２０００の間で収集された。スペクトル結合は、ピークの主要部分で実行され、結合されたスペクトルは、ＷａｔｅｒｓＭａｘＥｎｔ１を使用してデコンボリューションされた。
定量化の検証。ｓｆＧＦＰの１５１位にチロシン残基またはＡｚＫ残基のいずれかが含まれる真正のタンパク質サンプルを、上記と同一のプラスミド調製およびタンパク質発現条件を使用して、ただし、それぞれｓｆＧＦＰ１５１（ＴＡＣ）およびｓｆＧＦＰ１５１（ＴＡＧ）を使用して、非天然三リン酸を補充することなく調製した。これらの真正のタンパク質を使用して、Ｙ１５１およびＡｚＫ１５１ ｓｆＧＦＰの混合物を、１００：０～０：１００というＡｚＫ対Ｙの範囲におよぶ定義された比率で調製した。これらの混合物は、上記のようにＨＲＭＳによって調製および定量化された。観察されたデータは、サンプルの全範囲にわたって非常に直線的であり、期待される比率と正確に一致しており、この方法が非常に定量的であることが検証された。
リボヌクレオシド三リン酸の毒性を検討すること。ＭＬ２の一晩培養物は、このセクション全体で「培地」と呼ばれる、５０ｍＭのリン酸カリウムおよびクロラムフェニコール（５μｇ／ｍＬ）を補充した２×ＹＴ培地で増殖させた。この培養物を、希釈してＯＤ６００を０．０１に戻し、複数の３００μＬ培養物に分割し、それぞれに様々な濃度のＴＰＴ３ＴＰ、ＴＡＴ１ＴＰ、ＮａＭＴＰ、または５ＦＭＴＰを補充し、三リン酸対照は使わなかった。次いでこの培養物を２３０ｒｐｍで振盪しながら３７℃でインキュベートした。次いで、細胞の増殖を１時間ごとに合計８時間モニターした（５９０／２０ｎｍフィルターを備えたＥｎｖｉｓｉｏｎ ２１０３ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ）。次いで、ＯＤ６００を、各濃度の各ヌクレオチドの時間の関数としてプロットし、増殖速度の違いを視覚化した。
実施例２：リボヌクレオチド候補の合成および第１のＳＡＲ分析。
ＵＢＰによって利用可能にされた情報の読出しは、以前は、ＮａＭＴＰおよびＴＰＴ３ＴＰを使用してのみ調査されてきた。ＳＳＯにおける効率的な転写および翻訳を支配するＳＡＲの解明を開始するために、９つの新規ＮａＭＴＰアナログ（図４Ａ）および４つの新規ＴＰＴ３ＴＰアナログ（図４Ｂ）を設計および合成した。これらのアナログは、核酸塩基の形状、芳香族表面積、およびヘテロ原子誘導体化の役割を調査するために設計した。一般に、ＸＴＰアナログの合成は、対応するハロゲン化アリールのリチウム化と、それに続くベンジル化またはＴＢＳ保護リボラクトンへのリチウム化種のカップリングによって進行した。三フッ化ホウ素ジエチルエーテラートおよびトリエチルシランの存在下で得られたヘミアセタール中間体を還元すると、それぞれの場合に所望の保護されたヌクレオシドが得られた。脱保護後、得られたＸヌクレオシドアナログは、標準的なルートヴィヒ（Ｌｕｄｗｉｇ）リン酸化条件を使用して三リン酸に変換された。ＮａＭＴＰおよびＭＭＯ２ＴＰは、以前に報告されたように合成された。ＹＴＰアナログの合成は、一般に、対応するアシルアジドの分子内クルチウス転位と、それに続く１－Ｏアセチル－２，３，５－トリ－Ｏ－ベンゾイル－ｂ－Ｄ－リボフラノースへのルイス酸媒介カップリングを介して進行し、所望の保護されたヌクレオシドの純粋なβアノマーをもたらした。ピリジンを対応するチオピリドンに変換し、続いてベンゾイルを脱保護した後、標準的なルートヴィヒ・リン酸化条件を使用して、対応する遊離ヌクレオシドを三リン酸に変換した。５ＳＩＣＳＴＰは以前に報告されたように合成された。
ＳＡＲ分析は、ＮａＭＴＰおよび９つのＸＴＰアナログで開始された。上記のｄＸＴＰスクリーニングの能力に基づいて、複雑な要因としてＤＮＡレベルでの変動する損失を排除するために、天然ではない情報がｄＣＮＭＯ－ｄＴＰＴ３ＵＢＰでコードされた。さらに、ヌクレオシド三リン酸輸送体ＰｔＮＴＴ２を発現するが、ＲｅｃＡをコードする遺伝子の欠失（クローニング株で一般的）により、ＵＢＰのより忠実な複製およびＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩの過剰発現のために遺伝子操作もされているＥ．ｃｏｌｉ株ＭＬ２を使用した。ｓｆＧＦＰ１５１（ＡＸＣ）およびｔＲＮＡＰｙｌ（ＧＹＴ）を保持する、上記の実施例１Ａおよび１Ｂで説明した同じプラスミドを使用し、単一の非天然リボヌクレオチドにスクリーニングを集中させるために、Ｍ．ｍａｚｅｉ Ｐｙｌ ｔＲＮＡを３０μＭのＴＰＴ３ＴＰの存在下で転写した。様々なＸＴＰが発現培地において高濃度（２５０μＭ）または低濃度（２５μＭ）のいずれかで提供されたことを除いて、細胞を増殖させて、上記のようにタンパク質を産生するように誘導した（図５Ａ～図５Ｄ）。発現されたｓｆＧＦＰを誘導の３時間後に精製して、ｎｃＡＡ含有量は上記のＤＢＣＯ媒介ゲルシフトアッセイを使用して分析した（図５Ｂ）。２５０μＭで各ＸＴＰを使用すると、少なくとも６３％のｓｆＧＦＰゲルシフトが生じた。ＸＴＰがない場合に観察可能なシフトがないことに加えて、ＸＴＰは、ＰｔＮＴＴ２によって導入され、少なくとも妥当な効率でリボソームでの転写および翻訳に関与する。ＣＮＭＯＴＰおよび５Ｆ２ＯＭｅＴＰはそれぞれ良好に機能し、それぞれ９２％と９４％のゲルシフトをもたらしたが、ＮａＭＴＰ、ＭＭＯ２ＴＰ、および５ＦＭＴＰは、それぞれ９８％、９７％、および９８％のタンパク質ゲルシフトで最高の能力を示した。同様に高レベルのタンパク質純度で、これら３つのＸＴＰを使用して生成された相対蛍光を、有意なレベルの天然ｓｆＧＦＰ夾雑物に起因する複雑化を完全に排して比較した。２５０μＭのＭＭＯ２ＴＰまたは５ＦＭＴＰのいずれかで増殖した細胞は、同じ濃度のＮａＭＴＰで増殖した細胞と比較して、それぞれ６３％および９０％のバルク蛍光を生成した（図５Ａ）。
試験されたより低い濃度（２５μＭ）では、ＮａＭＴＰの使用は、８６％に低下したタンパク質シフトを伴う、ｎｃＡＡ取り込みの忠実度の低下をもたらした。９つのＮａＭＴＰアナログのうち７つも忠実度の大幅な低下を示したが、ＭＭＯ２ＴＰおよび５ＦＭＴＰを使用すると、それぞれ９４％のタンパク質シフトが得られた。これらのリボヌクレオチドで増殖した細胞の相対蛍光を比較すると（これも生成された非天然タンパク質の類似性および高忠実度に起因して可能）、５ＦＭＴＰは、この低濃度でＭＭＯ２ＴＰより３４％多くの蛍光を生成した。一定量のＮａＭＴＰ（２５０μＭ）と高濃度（２５０μＭ）または低濃度（２５μＭ）のＹＴＰアナログを供給した同様の実験を実施した。以前の報告と一致して、より高い濃度でのＴＰＴ３ＴＰの添加は、ＹＴＰを受けなかった対照サンプルと比較して、細胞増殖を有意に減少させ、蛍光をほとんど生じさせなかった（図５Ｃ）。対照的に、他の各々のＹＴＰアナログは、バックグラウンドを超える蛍光を生成し、タンパク質は少なくとも５１％シフトした（図５Ｄ）。ＴＡＴ１ＴＰを使用すると、９６％のタンパク質シフトを維持しながら、他のＹＴＰよりも少なくとも２．６倍多くの蛍光が得られた。この濃度でＴＡＴ１ＴＰを添加すると、適度なレベルの細胞増殖の低下が生じた（データは示していない）。ＴＰＴ３ＴＰは、低濃度で提供されると毒性がやや低くなり、それに対応して、２５μＭで提供されると、細胞は有意な量の純粋なタンパク質を生成する。これらの条件下で、ＴＰＴ３ＴＰは、それぞれ、ＳＩＣＳＴＰ、ＦＳＩＣＳＴＰ、および５ＳＩＣＳＴＰよりも２倍、５倍、および６倍大きい蛍光を生成した。高濃度のＴＡＴ１ＴＰで観察された毒性は、低濃度ではほぼ完全に排除され（データは示していない）、その使用により、高濃度よりも強い蛍光が得られた。２５μＭで提供された場合、ＴＡＴ１ＴＰは、２５０μＭで提供された場合よりも４１％多くの蛍光を生成し、興味深いことに、ＴＰＴ３ＴＰが２５μＭで提供された場合よりも５７％多くの蛍光を生成した。これらの濃度でＴＡＴ１ＴＰを使用すると、９８％のｎｃＡＡが組み込まれたタンパク質が生成された。
合成プロトコール
一般的な材料および方法。
合成手順では、全ての反応は、不活性雰囲気下でオーブン乾燥したガラス器具内で実行された。溶媒を蒸留および／または４Åモレキュラーシーブで乾燥させた。特に断りのない限り、他の全ての化学試薬をさらに精製することなく使用した。１Ｈ、１３Ｃ、および３１Ｐスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ ＮＭＲ分光計（ＡＶ－６００、ＤＲＸ－５００、またはＤＰＸ－４００）で取得した。質量分析データは、Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（スクリップス研究所）のコア施設から取得した。非天然デオキシリボヌクレオシド三リン酸は、以前に報告されたように合成された（Ｄｉｅｎ，Ｖ．Ｔ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１８，１４０，１６１１５－１６１２３；Ｌａｖｅｒｇｎｅ，Ｔ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１３，１３５，５４０８－５４１９；Ｍａｔｓｕｄａ，Ｓ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００７，１２９，５５５１－５５５７；Ｓｅｏ，Ｙ．Ｊら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００９，１３１、３２４６－３２５２（それぞれの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。ヌクレオシド三リン酸ｄＮａＭＴＰ、ｄＴＰＴ３ＴＰ、ｄＣＮＭＯＴＰ、およびＴＰＴ３ＴＰは、Ｓｙｎｔｈｏｒｘ Ｉｎｃから寄贈された。
核酸塩基１３ａの合成。ＴＡＴ１核酸塩基（化合物１３ａ）は、文献の方法に基づいて合成された（Ｎｅｗ，Ｊ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９８９，３２，１１４７－１１５６；Ａｓａｇａｒａｓｕ、Ａ．ら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２００９，５７，３４－４２（これらのそれぞれの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。簡単に説明すると、チアゾール－４－カルボキサルデヒド（１当量）とマロン酸を１００℃で溶媒としてピリジン、触媒としてピペリジン（２：１のピリジン対ピペリジン、最終反応濃度２．７５Ｍ）を使用して、１３時間縮合させた後、１時間還流すると、対応するアクリル酸中間体（化合物１１）が得られた。この酸（１当量）を、クロロホルム（１．３Ｍ反応濃度）中の塩化チオニル（１．１当量）を用いて、触媒ＤＭＦ（０．２当量）の存在下で塩素化すると、塩化アシルが得られた。さらに精製することなく、塩化アシルを、アジ化ナトリウム（２当量）を含む５℃で１，４－ジオキサンと水の１：１二相混合物中で、対応するアジド（化合物１２）に変換した。粗アシルアジドを、クロロホルムに溶解し、ジフェニルエーテルに０．２Ｍまで滴下して加えた。次いで、得られた混合物を、２３０℃に２時間加熱した。室温に冷却した際に、ヘキサンを加え、追加のヘキサンを使用して反応混合物を濾過して、洗浄した。得られた粗産物を、固定相としてシリカゲルを使用するフラッシュクロマトグラフィーによって精製して、所望の核酸塩基（化合物１３ａ）を得た。
スキームＳ１。（ｇ）ピペリジン、ピリジン、１００℃、１２時間、その後１時間還流、（ｈ）ＳＯＣｌ２、ＤＭＦ、ＣＨＣｌ３、還流、３時間、（ｉ）ＮａＮ３、１，４－ジオキサン、Ｈ２Ｏ、５℃、０．５時間、（ｊ）ジフェニルエーテル、２３０℃、１時間
ＴＢＳ保護リボラクトン２の核酸塩基カップリングおよび脱保護。ハロゲン化アリール（１．０当量）を無水ＴＨＦに溶解して０．１Ｍにし、－７８℃に冷却した。一旦、冷却したら、ｎ－ＢｕＬｉの溶液（１．６当量、ヘキサン中１．６Ｍ）を反応フラスコに滴下して加えた。この混合物を－７８℃で３０分間撹拌した後、約０．８Ｍの無水ＴＨＦ中のＴＢＳ保護リボラクトン（化合物２、１．６当量）の溶液を滴下して加えた。次いで、この反応物を－７８℃でさらに１時間撹拌した後、塩化アンモニウムの飽和水溶液でクエンチした。室温まで温めたら、揮発性物質を真空中で除去し、得られた残留物を酢酸エチルと水で抽出した。有機物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、揮発性物質を再び真空で除去した。
残留溶媒を室温で１時間、高真空で除去した後、無水ＤＣＭ中に０．１Ｍまで再溶解した。その溶液を－７８℃に冷却した後、トリエチルシラン（３当量）を滴下して加え、続いて、三フッ化ホウ素ジエチルエーテラートの４８％溶液（３当量）を滴下して加える。次いで、反応物を－７８℃で１５～２０分間撹拌した後、メタノールおよびトリエチルアミンの１：１溶液でクエンチした（反応液の３０％の容量を追加する）。この混合物を－７８℃で３分間撹拌させた後、飽和重炭酸ナトリウム（元の反応容量の５０％）を添加した。次いで、その混合物を、ＤＣＭで２倍に希釈し、有機層を分離した。その水層をＤＣＭでさらに２回抽出し、合わせた有機物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、そして真空中で濃縮した。
残留溶媒を、室温で１時間、高真空で残りの残留物から除去した。このとき、この残留物を、ＴＨＦに溶解して０．１Ｍにし、フッ化テトラブチルアンモニウムの溶液（３．３当量、ＴＨＦ中１．０Ｍ）を加えた。その反応物を１時間撹拌した後、酢酸エチルで希釈し、水で抽出した。合わせた有機物を、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、そして真空中で濃縮した。次いで、得られた残留物を、移動相としてＤＣＭ中の５～１０％エタノールを使用するシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。
ベンジル保護リボラクトン１０の核酸塩基カップリングおよび脱保護。ハロゲン化アリール（１．０当量）を、無水ＴＨＦに溶解して０．１Ｍにし、－７８℃に冷却した。一旦、冷却したら、ｎ－ＢｕＬｉの溶液（１．６当量、ヘキサン中１．６Ｍ）を、反応フラスコに滴下して加えた。この混合物を－７８℃で３０分間撹拌した後、約０．８Ｍの無水ＴＨＦ中のベンジル保護リボラクトン（化合物１０、１．６当量）の溶液を滴下して加えた。次いで、その反応物を－７８℃でさらに１時間撹拌した後、塩化アンモニウムの飽和水溶液でクエンチした。室温まで温めたら、揮発性物質を真空で除去し、得られた残留物を、酢酸エチルおよび水で抽出した。有機物を、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、揮発性物質を再び真空で除去した。
残留溶媒を室温で１時間高真空で除去した後、無水ＤＣＭに０．１Ｍに再溶解した。その溶液を－７８℃に冷却した後、トリエチルシラン（３当量）を滴下して加え、続いて三フッ化ホウ素ジエチルエーテラートの４８％溶液（３当量）を滴下して加える。次いで、その反応液を－７８℃で１５～２０分間撹拌させた後、メタノールおよびトリエチルアミンの１：１溶液でクエンチした（反応液の３０％の容量を追加する）。この混合物を、－７８℃で３分間撹拌した後、飽和重炭酸ナトリウム（元の反応容量の５０％）を添加した。次いで、その混合物を、ＤＣＭで２倍に希釈し、有機層を分離した。その水層をＤＣＭでさらに２回抽出し、合わせた有機物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、そして真空中で濃縮した。次いで、ベンジル保護されたヌクレオシド中間体を、移動相としてヘキサン中の０から８～１０％酢酸エチルの勾配を使用するシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。
精製したベンジル保護ヌクレオシドを、１０％パラジウム炭素（０．１当量）と共にメタノールで０．１Ｍに希釈した。溶液を液体窒素で凍結し、凍結しながら、反応フラスコを、水素で３回パージし、最後のパージの後にフラスコを水素のバルーンの下に置いた。次いで、その反応物を解凍させ、水素下で室温で３時間激しく撹拌した。次いで、反応物をシリカゲルのパッチで濾過し、酢酸エチルで洗浄した。次いで、揮発性物質を真空で除去し、得られた粗残留物を、移動相としてＤＣＭ中の５～１０％エタノールを使用するシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。
臭化アリールのシアン化。乾燥したマイクロ波バイアルに、ＣｕＣＮ（８当量）、Ｐｄ２（ｄｂａ）３（０．１当量）、およびＤＰＰＦ（０．１当量）を入れ、アルゴンで３回パージした。臭化アリール（１当量）を、脱気した無水ＤＭＦに溶解して０．０５～０．１Ｍにし、反応フラスコに移した。次いで、フラスコをアルゴン下で密封し、１５５℃で一晩（約１６時間）激しく撹拌した。次いで、その反応物を室温に冷却し、シリカゲルの短いパッチで濾過し、酢酸エチルで洗浄した。揮発性物質を真空で除去し、得られた粗残留物を、移動相としてヘキサン中の７０～９５％酢酸エチルの勾配を使用するシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。
ヌクレオシドの三リン酸化のための一般的なプロトコール。不活性ガス下で、乾燥マイクロ波バイアルに、プロトンスポンジ（１．３当量）および遊離ヌクレオシド（１当量）を入れた。無水リン酸トリメチル（４０当量）を、フラスコに加え、得られた混合物を、塩氷浴中で－１５℃に冷却した。新たに蒸留したオキシ塩化リン（１．３当量）を、冷却したフラスコに滴下して加え、その反応物を－１５℃で３時間撹拌した。このとき、ピロリン酸トリブチルアンモニウム（５当量）を、別の乾燥フラスコ内で０．５Ｍの無水ＤＭＦに溶解し、反応フラスコに滴下して加えた後、無水トリブチルアミン（６当量）を滴下して加えた。得られた混合物をゆっくりと０℃に温め、この温度でさらに３０分間撹拌させた。次いで、重炭酸トリエチルアンモニウム水溶液（０．５Ｍ、ｐＨ７．５、全反応容容積に対して１：１）を加えることにより反応をクエンチし、室温で１５分間撹拌した。次いで、このクエンチされた反応混合物を、固定相としてＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ－２５を使用し、移動相としてｐＨ７．５の０～１．２Ｍのゆるい勾配のＴＥＡＢを使用して、陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。ヌクレオシド三リン酸を含む画分を合わせて、ＳｐｅｅｄＶａｃで濃縮して、乾燥した所望の産物を得た。
ベンゾイル保護リボラクトン１４の核酸塩基カップリングおよび脱保護。０．１Ｍまでのアセトニトリル中の核酸塩基（１．０当量）およびＮ，Ｏ－ビス（トリメチルシリル）アセトアミド（１．２当量）の混合物を、アルゴン雰囲気下、室温で３０分間、撹拌した。このとき、１－Ｏ－アセチル－２，３，５－トリ－Ｏ－ベンゾイル－β－Ｄ－リボフラノース（化合物１４、１．２当量）を加え、得られた反応混合物を、０℃に冷却した。次いで、ＳｎＣｌ４（１当量）を、反応混合物に加え、その溶液を室温で一晩撹拌した。その反応物を、酢酸エチルおよび飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で抽出し、合わせた有機層を、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。濾過および蒸発後、その残留物をシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。
ピリドンのチオ－ピリドンへの変換。ピリドン（１当量）を、乾燥トルエンとの共蒸発を繰り返すことにより乾燥させた。ローソン試薬（３当量）をアルゴン下で添加し、その混合物を１２０℃で一晩加熱した。ワタで濾過した後、その濾液を濃縮し、粗産物をシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。
保護されたヌクレオシドのフッ素化。保護されたヌクレオシド（１当量）を、ＭｅＯＨ－ＣＨ３ＣＮ（１：１ ｖ／ｖ）に溶解して０．１Ｍにし、Ｓｅｌｅｃｔｆｌｕｏｒ（１．１当量）を加えた。その混合物を３時間加熱還流した。次いで、揮発性物質を真空中で除去し、得られた残留物を、酢酸エチルおよび水で抽出した。合わせた有機層を蒸発させ、得られた粗残留物を、無水トルエンとの同時蒸発により３回乾燥させた。その残留物を、ＴｆＯＨ－ＤＣＭ（１：１ ｖ／ｖ）に溶解して０．１Ｍにし、その混合物を室温で１時間撹拌した。このとき、その反応物を真空で濃縮し、得られた粗産物をシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。
化合物の特徴づけ
化合物１ｂ．（０．３８７ｍｍｏｌ、収率３８％、３ステップ）。1H NMR (600 MHz, Chloroform-d) 7.46 (dd, J = 8.2, 0.9 Hz, 1H), 7.01 (dd, J = 8.2, 1.9 Hz, 1H), 6.87 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 5.32 (d, J = 3.3 Hz, 1H), 4.43 (dd, J = 4.6, 3.3 Hz, 1H), 4.37 (dd, J = 8.1, 4.6 Hz, 1H), 4.05 - 4.01 (m, 1H), 3.97 (dd, J = 12.0, 3.2 Hz, 1H), 3.83 (s, 3H), 3.77 (dd, J = 11.9, 4.1 Hz, 1H). 13C NMR (151 MHz, CDCl3) 156.40, 134.51, 128.81, 124.00, 121.01, 111.03, 82.18, 78.55, 73.31, 72.25, 62.57, 55.85. HRMS (ESI-TOF+) calcd for C12H15ClO5 [M+Na]+ 297.0500; found 297.0501.
化合物３ｂ。（０．３３３ｍｍｏｌ、収率５２％、３ステップ）。1H NMR (600 MHz, Methanol-d4) 7.53 (d, J = 7.4, 1.5 Hz, 1H), 7.24 (td, J = 7.8, 1.8 Hz, 1H), 6.98- 6.92 (m, 2H), 5.33 (d, J = 2.9 Hz, 1H), 4.35 - 4.28 (m, 2H), 4.03 (ddd, J = 8.2, 4.7, 2.6 Hz, 1H), 3.89 (dd, J = 13.1, 3.8 Hz, 1H), 3.84 (s, 3H), 3.70 (dd, J = 12.0, 4.7 Hz, 1H). 13C NMR (151 MHz, MeOD) 157.46, 129.07, 129.03, 127.68, 121.09, 110.69, 83.00, 79.66, 74.04, 73.61, 63.32, 55.72. HRMS (ESI-TOF+) calcd for C12H16O5 [M+Na]+ 263.0890; 263.0888.
化合物４ｂ。（０．７６５ｍｍｏｌ、収率６２％、３ステップ）。1H NMR (600 MHz, Chloroform-d) 7.23 (dd, J = 9.2, 3.1 Hz, 1H), 6.94 (td, J = 8.4, 3.2 Hz, 1H), 6.77 (dd, J = 8.9, 4.2 Hz, 1H), 5.28 (d, J = 3.3 Hz, 1H), 4.43 - 4.38 (m, 1H), 4.30 (dd, J = 8.2, 4.6 Hz, 1H), 3.99 (dt, J = 7.8, 3.6 Hz, 1H), 3.90 (dd, J = 12.0, 3.2 Hz, 1H), 3.79 (s, 3H), 3.72 (dd, J = 12.0, 4.0 Hz, 1H). 13C NMR (151 MHz, CDCl3) 158.28, 156.69, 151.87, 151.86, 127.64, 127.59, 115.09, 114.92, 114.62, 114.46, 110.95, 110.90, 81.92, 78.51, 73.10, 72.30, 62.37, 56.02. HRMS (ESI-TOF+) calcd for C12H15FO5 [M+Na}+ 281.0796; 281.0799.
化合物５ｂ。（０．３６６ｍｍｏｌ、収率５０％、３ステップ）。1H NMR (600 MHz, Methanol-d4) δ 7.95 (s, 1H), 7.43 (s, 1H), 7.32 (d, J = 5.4 Hz, 1H), 7.26 (d, J = 5.4 Hz, 1H), 5.38 (d, J = 3.0 Hz, 1H), 4.40 - 4.35 (m, 1H), 4.32 (dd, J = 8.5, 4.4 Hz, 1H), 4.06 (ddd, J = 8.2, 4.6, 2.6 Hz, 1H), 3.92 (dd, J = 12.0, 2.5 Hz, 1H), 3.90 (s, 3H), 3.71 (dd, J = 12.0, 4.7 Hz, 1H). 13C NMR (151 MHz, Methanol-d4) δ 154.39, 139.73, 133.33, 124.79, 123.31, 122.99, 122.24, 102.01, 81.60, 78.62, 72.69, 72.23, 61.98, 54.69. HRMS (ESI-TOF+) calcd for C14H16O5S [M+Na]+ 319.0611; 319.0612.
化合物６ｂ。（０．１６０ｍｍｏｌ、収率５１％、３ステップ）。1H NMR (600 MHz, Methanol-d4) δ 7.98 (s, 1H), 7.48 (d, J = 5.4 Hz, 1H), 7.34 (s, 1H), 7.29 (d, J = 5.4 Hz, 1H), 5.39 (d, J = 3.7 Hz, 1H), 4.40 - 4.35 (m, 1H), 4.32 (dd, J = 8.5, 4.4 Hz, 1H), 4.05 (ddd, J = 8.4, 4.7, 2.6 Hz, 1H), 3.91 (dd, J = 11.9, 2.6 Hz, 1H), 3.89 (s, 3H), 3.71 (dd, J = 12.0, 4.7 Hz, 1H). 13C NMR (151 MHz, Methanol-d4) δ 154.41, 139.63, 131.85, 126.26, 125.11, 123.24, 120.94, 102.92, 81.60, 78.66, 72.68, 72.29, 61.95. HRMS (ESI-TOF+) calcd for C14H16O5S [M+Na]+ 319.0611; 319.0609.
化合物７ｂ。（１．２４８ｍｍｏｌ、収率６１％、３ステップ）。1H NMR (600 MHz, Chloroform-d) δ 7.41 (dd, J = 8.1, 0.9 Hz, 1H), 7.17 (dd, J = 8.1, 1.8 Hz, 1H), 7.02 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 5.32 (d, J = 3.3 Hz, 1H), 4.44 (dd, J = 4.6, 3.4 Hz, 1H), 4.38 (dd, J = 8.1, 4.6 Hz, 1H), 4.04 (dt, J = 7.7, 3.6 Hz, 1H), 3.98 (dd, J = 11.9, 3.2 Hz, 1H), 3.83 (s, 3H), 3.79 (dd, J = 11.9, 4.1 Hz, 1H). 13C NMR (151 MHz, CDCl3) δ155.82, 128.57, 123.94, 123.44, 121.77, 113.26, 81.62, 78.00, 72.72, 71.60, 61.99, 55.28. HRMS (ESI-TOF-) calcd for C12H15BrO5 [M+Cl]- 352.9797; found 352.9799.
化合物８ａ。（０．０６６ｍｍｏｌ、化合物６ｂから収率４２％）。1H NMR (600 MHz, Methanol-d4) δ 7.68 (dd, J = 7.8, 0.9 Hz, 1H), 7.34 (dd, J = 7.8, 1.5 Hz, 1H), 7.28 (d, J = 1.5 Hz, 1H), 5.32 (d, J = 3.1 Hz, 1H), 4.39 (dd, J = 4.5, 3.2 Hz, 1H), 4.30 (dd, J = 8.6, 4.5 Hz, 1H), 4.03 (ddd, J = 8.6, 4.6, 2.5 Hz, 1H), 3.93 - 3.89 (m, 4H), 3.70 (dd, J = 12.0, 4.6 Hz, 1H). 13C NMR (151 MHz, MeOD) δ 157.65, 134.76, 129.90, 125.39, 120.07, 113.77, 112.30, 83.14, 79.64, 73.80, 73.50, 63.17, 56.31, 50.87. HRMS (ESI-TOF-) calcd for C13H15NO5 [M-H]- 264.0877; found 264.0869.
化合物９ｂ。（０．２８８ｍｍｏｌ、収率２９％、３ステップ）。1H NMR (600 MHz, Chloroform-d) δ 7.12 (d, J = 9.9 Hz, 1H), 6.73 (d, J = 6.1 Hz, 1H), 5.02 (d, J = 6.1 Hz, 1H), 4.17 (dd, J = 5.9, 4.8 Hz, 1H), 4.13 - 4.09 (m, 1H), 4.08 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 3.98 (dd, J = 11.9, 3.3 Hz, 1H), 3.87 (s, 3H), 3.85, 3.81 (m, 1H), 2.29 (d, J = 2.0 Hz, 3H). 13C NMR (151 MHz, CDCl3) δ 156.19, 154.61, 151.45, 126.24, 124.08, 123.95, 113.10, 83.98, 80.69, 71.56, 62.65, 55.76, 14.22. HRMS (ESI-TOF+) calcd for C13H17FO5 [M+Na]+ 295.0952; 295.0952.
化合物１３ａ。（３．１８４ｍｍｏｌ、４ステップにわたって１１％）。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 11.87 (br, 1 H, N-H), 9.59 (s, 1H, Ar-H), 7.50 (d, J = 5.0 Hz, 1 H, Ar-H), 6.98 (d, J = 5.0 Hz, 1 H, Ar-H). 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.9, 150.3, 159.2, 133.1, 124.3, 102.5. HRMS (ESI-TOF+) calcd for C6H5N2OS+ [M+H]+ 153.0117; found 153.0115.
化合物１３ｂ。（０．５３０ｍｍｏｌ、収率５３％）。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 9.13 (s, 1 H, Ar-H), 7.36-8.16 (m, 16H, Ar-H), 6.87 (d, J = 5.0 Hz, 1 H, H-1’), 6.71 (d, J = 5.0 Hz, 1 H, Ar-H), 5.99-6.01 (m, 1 H, H-3’), 5.90-5.92 (m, 1 H, H-2’), 4.92 (dd, J1 = 15 Hz, J2 = 5 Hz, 1 H, H-5’a), 4.80-4.82 (m, 1 H, H-4’), 4.72 (dd, J1 = 15 Hz, J2 = 5 Hz, 1 H, H-5’b). 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 166.5. 165.7, 165.6, 160.7, 156.7, 134.1, 133.9, 130.9, 130.3, 130.2, 130.1, 130.1, 130.1, 129.8, 129.1, 129.0, 128.9, 128.8, 104.5, 89.2, 80.8, 75.3, 71.4, 64.0. HRMS (ESI-TOF+) calcd for C32H25N2O8S [M+H]+ 597.1326; found 597.1330.
化合物１３ｃ。（０．０５６ｍｍｏｌ、収率５６％）。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 9.16 (s, 1 H, Ar-H), 7.31-8.24 (m, 17 H, Ar-H), 7.12 (d, J = 5 Hz, 1H, H-1’), 5.95-5.96 (m, 1 H, H-2’ ), 5.87-5.90 (m, 1 H, H-3’), 4.99 (dd, J1 = 15 Hz, J2 = 5 Hz, 1 H, H-5’a), 4.89-4.91 (m, 1H, H-4’), 4.73 (dd, J1 = 15 Hz, J2 = 5 Hz, 1 H, H-5’b). 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 175.7, 166.4, 165.6, 165.3, 163.7, 151.8, 142.1, 134.2, 134.1, 134.0, 132.5, 130.5, 130.3, 130.1, 129.2, 129.2, 128.9, 128.9, 109.7, 92.2, 80.8, 75.9, 69.9, 63.0. HRMS (ESI-TOF+) calcd for C32H25N2O7S2 [M+H]+ 613.1098; found 613.1095.
化合物１３ｄ。（０．０４３ｍｍｏｌ、収率８９％）。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 9.58 (s, 1 H, Ar-H), 8.68 (d, J = 10 Hz, 1 H, Ar-H), 7.45 (d, J = 10 Hz, 1 H, Ar-H), 6.81 (d, J = 2.5 Hz, 1 H, H-1’), 5.48 (d, J = 5 Hz, 1 H, -OH), 5.39-5.41 (m, 1 H, -OH), 5.18 (d, J = 5 Hz, 1 H , -OH), 4.03-4.05 (m, 2 H, H-2’, H-3’), 3.98-4.00 (m, 1 H, H-4’), 3.78 (dd, J1 = 10Hz, J2 = 2.5 Hz, 1 H, H-5’a), 3.64 (dd, J1 = 10Hz, J2 = 2.5 Hz, 1 H, H-5’b). 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6) δ 174.2, 166.6, 152.2, 135.5, 109.4, 99.9, 95.1, 85.5, 76.6, 69.0, 60.2. HRMS (ESI-TOF+) calcd for C11H13N2O4S2 [M+H]+ 301.0311; found 301.0309.
化合物１５ｂ。（０．９３１ｍｍｏｌ、収率９３％）。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 9.05 (d, J = 10 Hz, 1 H, H-Ar), 7.30-8.16 (m, 20 H, Ar-H), 6.72 (d, J = 5 Hz, 1 H, H-1’), 5.97-5.99 (m, 1 H, H-2’), 5.85-5.88 (m, 1 H, H-3’), 4.98 (dd, J1 = 10 Hz, J2 = 5 Hz, 1 H, H-5’a), 4.89-4.90 (m, 1 H, H-4’), 4.72 (dd, J1 = 10 Hz, J2 = 5 Hz, 1 H, H-5’b). 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 182.1, 179.6, 166.6, 165.5, 165.5, 165.2, 151.1, 143.9, 134.0, 133.9, 133.6, 130.4, 130.3, 130.2, 130.1, 129.6, 129.4, 129.1, 128.9, 128.9, 128.8, 92.8, 80.4,75.7, 69.7, 62.8. HRMS (ESI-TOF+) calcd for C35H28NO8 [M+H]+ 590.1809; found 590.1811.
化合物１５ｃ。（０．０８８ｍｍｏｌ、収率８７％）。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 9.07 (d, J = 10 Hz, 1 H, Ar-H), 7.30-8.17 (m, 20 H, Ar-H, H-1’), 5.98-5.99 (m, 1 H, H-2’), 5.82-5.84 (m, 1 H, H-3’), 4.89-4.94 (m, 2 H, H-5’a, H-4’), 4.80 (dd, J1 = 15 Hz, J2 = 5 Hz, 1 H, H-5’b). 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 184.9, 166.5, 165.6, 165.3, 134.0, 133.9, 133.3, 132.7, 130.5, 130.3, 130.2, 129.8, 129.5, 129.1, 128.9, 128.9, 128.8, 127.3, 127.1, 112.8, 92.6, 80.3, 75.9, 70.1, 63.2. HRMS (ESI-TOF+) calcd for C35H28NO7S [M+H]+ 606.1581; found 606.1579.
化合物１５ｄ。（０．０４４ｍｍｏｌ、収率９２％）。1H NMR (500 MHz, MeOH-d4) δ 8.33 (d, J = 10 Hz, 1 H, Ar-H), 7.52-7.80 (m, 4 H, Ar-H), 6.71 (d, J = 5 Hz, 1 H, Ar-H), 6.36 (d, J = 2.5 Hz, 1 H, H-1’), 4.22-4.26 (m, 2 H, H-2’, H-3’), 4.10-4.11 (m, 1 H, H-4’), 3.94 (dd, J1 = 15 Hz, J2 = 5 Hz, 1 H, H-5’a), 3.82 (dd, J1 = 15 Hz, J2 = 5 Hz, 1 H, H- 5’b). 13C NMR (125 MHz, MeOH-d4) δ 163.0, 137.6, 133.0, 127.5, 127.4, 127.1, 126.3, 125.6, 106.9, 90.1, 85.1, 75.5, 70.3, 61.4. HRMS (ESI-TOF+) calcd for C14H16NO4S [M+H]+ 294.0795; found 294.0799.
化合物１６ａ。（０．０７７ｍｍｏｌ、収率７１％）。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.33-8.42 (m, 20 H, Ar-H), 6.82 (d, J = 5 Hz, 1 H, H-1’), 5.94-5.97 (m, 1 H, H-2’), 5.83-5.85 (m, 1 H, H-3’), 4.87 (d, J = 10 Hz, 1 H, H-5’a), 4.74-4.79 (m, 2 H, H-4’, H-5’b). 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 166.6, 165.7, 165.6, 162.9, 160.8, 134.0, 134.0, 133.9, 133.5, 130.3, 130.2, 130.1, 129.7, 129.1, 129.1, 129.1, 128.9, 128.8, 128.8, 120.3, 111.1, 88.9, 87.8, 85.3, 80.6, 80.4, 74.8, 71.4, 64.1. 19F NMR (376 MHz, CDCl3) δ -145.6. HRMS (ESI-TOF+) calcd for C35H27FNO8 [M+H]+ 608.1715; found 608.1717.
化合物１６ｂ。（０．０６６ｍｍｏｌ、収率６５％）。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 9.07 (d, J = 10 Hz,1 H, Ar-H), 7.32-8.18 (m, 20 H, Ar-H, H-1’), 5.96- 5.98 (m, 1 H, H-2’), 5.87-5.89 (m, 1 H, H-3’), 4.97 (dd, J1 = 15 Hz, J2 = 5 Hz, 1 H, H-5’a), 4.89-4.91 (m, 1H, H-4’), 4.76 (dd, J1 = 15 Hz, J2 = 5 Hz, 1 H, H-5’b). 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 184.3, 166.6, 165.6, 165.3, 134.7, 134.1, 134.0, 133.9, 133.9, 133.3, 133.2, 130.5, 130.3, 130.3, 129.8, 129.7, 129.3, 129.2, 128.9, 128.9, 128.9, 128.8, 128.3, 126.8, 108.4, 100.0, 92.3, 80.7, 75.8, 70.3, 63.2, 56.0. HRMS (ESI-TOF+) calcd for C35H27FNO7S [M+H]+ 624.1487; found 624.1490.
化合物１６ｃ。（０．０４２ｍｍｏｌ、収率９０％）。1H NMR (500 MHz, MeOH-d4) δ 9.04 (d, J = 10 Hz, 1 H, H-Ar), 8.73 (d, J = 10 Hz, 1 H, H-Ar), 7.83-7.87 (m, 2 H, Ar-H), 7.65-7.68 (m, 1 H, H-Ar), 6.96 (s, 1 H, H-1’), 4.23-4.29 (m, 2 H, H-2’, H-3’), 4.18-4.4.21 (m, 1 H, H-4’), 4.11 (dd, J1 = 10 Hz, J2 = 5 Hz, H-5’a), 3.91 (dd, J1 = 10 Hz, J2 = 5 Hz, H-5’b). 13C NMR (125 MHz, MeOH-d4) δ 180.5, 150.5, 148.6, 134.2, 134.1, 133.2, 132.0, 132.0, 129.2, 126.1, 125.9, 119.6, 119.6, 115.5, 115.1, 96.2, 84.4, 76.1, 68.1, 59.4. HRMS (ESI-TOF)+ calcd for C14H15FNO4S [M+H]+ 312.0700; found 312.0702.
化合物１ｃ。（０．０４８ｍｍｏｌ、収率２４％）。31P NMR (162 MHz, H2O) δ -8.79 - -10.99 (m), -21.21 - -21.58 (m), -21.77 - -23.23 (m). MS (MALDI-TOF-, matrix: 9-aminoacridine) (m/z) [M-H]- cald for C12H17ClO14P3-, 512.95; found, 512.7.
化合物３ｃ。（０．０３１ｍｍｏｌ、収率３１％）。31P NMR (162 MHz, H2O) δ -11.19 - -11.91 (m), -22.06 - -22.73 (m), -23.87 - -24.46 (m). MS (MALDI-TOF-, matrix: 9-aminoacridine) (m/z) [M-H]- cald for C12H18O14P3-, 479.00; found, 497.4.
化合物４ｃ。（０．０１４ｍｍｏｌ、収率１４％）。31P NMR (162 MHz, H2O) δ -7.31 (d), -11.47 (d), -22.79 - -23.21 (m). MS (MALDI-TOF-, matrix: 9-aminoacridine) (m/z): [M-H]- cald for C12H17FO14P3-, 496.97; found, 497.3.
化合物５ｃ。（０．０４２ｍｍｏｌ、収率２３％）。31P NMR (162 MHz, D2O) δ-8.48 (d, J = 17.8 Hz), -11.21 (d, J = 20.7 Hz), -22.96 (t, J = 21.6 Hz). MS (MALD-TOF-, matrix: 9-aminoacridine) (m/z): [M-H]- cald for C14H18O14P3S-, 534.97; found, 535.4.
化合物６ｃ。（０．０１７ｍｍｏｌ、収率２１％）。31P NMR (162 MHz, D2O) δ-9.25 (d, J = 21.0 Hz), -10.93 (d, J = 19.5 Hz), -22.94 (t, J = 20.5 Hz). MS (MALDI-TOF-, matrix: 9-aminoacridine) (m/z): [M-H]- cald for C14H18O14P3S-, 534.97; found, 535.4.
化合物７ｃ。（０．００９ｍｍｏｌ、収率１２％）。31P NMR (162 MHz, H2O) δ -10.07 - -11.45 (m), -21.8 - -22.21 (m), -24.06 - -24.60 (m). MS (MALDI-TOF-, matrix: 9-aminoacridine) (m/z) [M-H]- cald for C12H17BrO14P3-, 556.91; found, 556.6.
化合物８ｂ。（０．０２３ｍｍｏｌ、収率２２％）。31P NMR (162 MHz, H2O) δ -9.96 - -12.34 (m), -21.91 - -22.45 (m), -22.88 - -24.4 (m). MS (MALDI-TOF-, matrix: 9-aminoacridine) (m/z) [M-H]- cald for C13H17NO14P3-, 503.99; found, 504.3
化合物９ｃ。（０．０２１ｍｍｏｌ、収率２１％）。31P NMR (162 MHz, H2O) δ -9.77 - -10.37 (m), -10.8 - -11.17 (m), -22.0 - -22.2 (m). MS (MALDI-TOF-, matrix: 9-aminoacridine) (m/z) [M-H]- cald for C13H19FO14P3-, 511.0; found, 511.0.
化合物１３ｅ。（０．００７ｍｍｏｌ、収率２２％）。31P NMR (400 MHz, D2O): δ -10.82-10.94 (m), -11.68-11.74 (m), -23.21-23.45 (m). MS (MALDI-TOF, matrix: 9-aminoacridine) (m/z): [M-H]- calcd for C11H14N2O13P3S2-, 538.9, found, 538.3.
化合物１５ｅ。（０．０１２ｍｍｏｌ、収率３５％）。31P NMR (400 MHz, D2O): δ -10.74-10.84 (m), -11.55-11.67 (m), -23.17-23.42 (m). MS (MALDI-TOF, matrix: 9-aminoacridine) (m/z): [M-H]- calcd for C14H17NO13P3S-, 532.0, found, 532.5.
化合物１６ｄ。（０．００９ｍｍｏｌ、収率２９％）。31P NMR (400 MHz, D2O): δ -10.65-10.79 (m), -11.45-11.54 (m), -22.16-23.40 (m). MS (MALDI-TOF, matrix: 9-aminoacridine) (m/z): [M-H]- calcd for C14H16FNO13P3S-, 550.0, found, 550.6.
スキームＳ２。（ａ）１．６Ｍ ｎ－ＢｕＬｉ、ＴＨＦ、－７８℃、１時間、（ｂ）トリエチルシラン、ＤＣＭ、ＢＦ３・ＯＥｔ２、－７８℃、１５～２０分、（ｃ）１．０Ｍ ＴＢＡＦ，ＴＨＦ、１時間、（ｄ）プロトン・スポンジ、ＰＯＣｌ３、Ｂｕ３Ｎ、Ｂｕ３ＮＰＰｉ、（ＭｅＯ）３Ｐ、ＤＭＦ、－１５℃，３時間。
スキームＳ３。（ａ）１．６Ｍ ｎ－ＢｕＬｉ、ＴＨＦ、－７８℃、１時間、（ｂ）トリエチルシラン、ＤＣＭ、ＢＦ３・ＯＥｔ２、－７８℃、１５～２０分、（ｃ）１．０Ｍ ＴＢＡＦ，ＴＨＦ、１時間、（ｄ）プロトン・スポンジ、ＰＯＣｌ３、Ｂｕ３Ｎ、Ｂｕ３ＮＰＰｉ、（ＭｅＯ）３Ｐ、ＤＭＦ、－１５℃、３時間。
スキームＳ４。（ａ）１．６Ｍ ｎ－ＢｕＬｉ、ＴＨＦ、－７８℃、１時間、（ｂ）トリエチルシラン、ＤＣＭ、ＢＦ３・ＯＥｔ２、－７８℃、１５～２０分、（ｃ）１．０Ｍ ＴＢＡＦ，ＴＨＦ、１時間、（ｄ）プロトン・スポンジ、ＰＯＣｌ３、Ｂｕ３Ｎ、Ｂｕ３ＮＰＰｉ、（ＭｅＯ）３Ｐ、ＤＭＦ、－１５℃、３時間。
スキームＳ５。（ａ）１．６Ｍ ｎ－ＢｕＬｉ、ＴＨＦ、－７８℃、１時間、（ｂ）トリエチルシラン、ＤＣＭ、ＢＦ３・ＯＥｔ２、－７８℃、１５～２０分、（ｃ）１．０Ｍ ＴＢＡＦ，ＴＨＦ、１時間、（ｄ）プロトン・スポンジ、ＰＯＣｌ３、Ｂｕ３Ｎ、Ｂｕ３ＮＰＰｉ、（ＭｅＯ）３Ｐ、ＤＭＦ、－１５℃、３時間。
スキームＳ６。（ａ）１．６Ｍ ｎ－ＢｕＬｉ、ＴＨＦ、－７８℃、１時間、（ｂ）トリエチルシラン、ＤＣＭ、ＢＦ３・ＯＥｔ２、－７８℃、１５～２０分、（ｃ）１．０Ｍ ＴＢＡＦ，ＴＨＦ、１時間、（ｄ）プロトン・スポンジ、ＰＯＣｌ３、Ｂｕ３Ｎ、Ｂｕ３ＮＰＰｉ、（ＭｅＯ）３Ｐ、ＤＭＦ、－１５℃、３時間。
スキームＳ７。（ａ）１．６Ｍ ｎ－ＢｕＬｉ、ＴＨＦ、－７８℃、１時間、（ｂ）トリエチルシラン、ＤＣＭ、ＢＦ３・ＯＥｔ２、－７８℃、１５～２０分、（ｃ）１．０Ｍ ＴＢＡＦ，ＴＨＦ、１時間、（ｄ）プロトン・スポンジ、ＰＯＣｌ３、Ｂｕ３Ｎ、Ｂｕ３ＮＰＰｉ、（ＭｅＯ）３Ｐ、ＤＭＦ、－１５℃、３時間。
スキームＳ８。（ｄ）プロトン・スポンジ、ＰＯＣｌ３、Ｂｕ３Ｎ、Ｂｕ３ＮＰＰｉ、（ＭｅＯ）３Ｐ、ＤＭＦ、－１５℃、３時間、（ｅ）ＣｕＣＮ，Ｐｄ２（ｄｂａ）３，ＤＰＰＦ、ＤＭＦ、１５５℃、１６時間
スキームＳ９。（ａ）１．６Ｍ ｎ－ＢｕＬｉ、ＴＨＦ、－７８℃、１時間、（ｂ）トリエチルシラン、ＤＣＭ、ＢＦ３・ＯＥｔ２、－７８℃、１５～２０分、（ｄ）プロトン・スポンジ、ＰＯＣｌ３、Ｂｕ３Ｎ、Ｂｕ３ＮＰＰｉ、（ＭｅＯ）３Ｐ、ＤＭＦ、－１５℃、３時間、（ｆ）Ｈ２（ｇ），Ｐｄ／Ｃ（１０％），ＭｅＯＨ，ｒｔ，３時間
スキームＳ１０。（ｋ）Ｎ，Ｏ－ビス（トリメチルシリル）アセトアミド，ＳｎＣｌ４，ＣＨ３ＣＮ，ＲＴ，一晩，（ｌ）ローソン試薬，１２０℃、一晩，（ｍ）３０％ ＮａＯＭｅ、ＤＣＭ、０℃、２時間、（ｄ）プロトン・スポンジ、ＰＯＣｌ３、Ｂｕ３Ｎ、Ｂｕ３ＮＰＰｉ、（ＭｅＯ）３Ｐ、ＤＭＦ、－１５℃、３時間
スキームＳ１１。（ｋ）Ｎ，Ｏ－ビス（トリメチルシリル）アセトアミド，ＳｎＣｌ４，ＣＨ３ＣＮ，ＲＴ，一晩，（ｌ）ローソン試薬，１２０℃、一晩，（ｍ）３０％ ＮａＯＭｅ、ＤＣＭ、０℃、２時間、（ｄ）プロトン・スポンジ、ＰＯＣｌ３、Ｂｕ３Ｎ、Ｂｕ３ＮＰＰｉ、（ＭｅＯ）３Ｐ、ＤＭＦ、－１５℃、３時間
スキームＳ１２。（ｎ）ｉ．セレクトフルオル，ＭｅＯＨ／ＣＨ３ＣＮ（１：１ ｖ／ｖ），還流，３時間；ｉｉ．ＴｆＯＨ／ＤＣＭ（１：１ ｖ／ｖ）、１時間、（ｌ）ローソン試薬，１２０℃、一晩，（ｍ）３０％ ＮａＯＭｅ、ＤＣＭ、０℃、２時間、（ｄ）プロトン・スポンジ、ＰＯＣｌ３、Ｂｕ３Ｎ、Ｂｕ３ＮＰＰｉ、（ＭｅＯ）３Ｐ、ＤＭＦ、－１５℃、３時間
実施例３：非天然タンパク質生成の最適化。
実施例１Ａ、１Ｂ、および２は、ｄＣＮＭＯ－ｄＴＰＴ３を情報の記憶のためのコンピテントなＵＢＰとして特定し、ＴＡＴ１ＴＰおよびＮａＭＴＰまたは５ＦＭＴＰを、その読出しのためのコンピテントなリボヌクレオシド三リン酸として特定した。上記で使用したのと同じプラスミドで形質転換すると、１０μＭのｄＴＰＴ３ＴＰおよび２５μＭのｄＣＮＭＯＴＰが増殖培地に供給され、次いで、１００μＭ～１２．５μＭの範囲の濃度のＴＡＴ１ＴＰ、および２００μＭ～１２．５μＭの範囲の濃度のＮａＭＴＰまたは５ＦＭＴＰのいずれかも補充され（全て一連の２倍希釈、および１ｍＭ ＡｚＫの添加後）、細胞はｓｆＧＦＰを発現するように誘導された。ＴＡＴ１ＴＰおよびＮａＭＴＰを備えた細胞で観察された総ｓｆＧＦＰ蛍光は、一般に、ＴＡＴ１ＴＰおよび５ＦＭＴＰを備えた細胞で観察された蛍光よりも高かった（図６Ａおよび図６Ｂ）。どちらの場合も、ＮａＭＴＰまたは５ＦＭＴＰの濃度が低いほど蛍光が高くなった（夾雑天然ｓｆＧＦＰの生成の増大に起因、以下を参照のこと）。さらに、細胞は一般に、ＴＡＴ１ＴＰの濃度が高いほど高い蛍光を発した。ただし、増殖がわずかに低下したため、１００μＭのＴＡＴ１ＴＰを与えられた細胞は、５０μＭのＴＡＴ１ＴＰを与えられた細胞よりも生成した蛍光が少なかった。タンパク質産生は、ゲルシフトアッセイを介して再び定量化された（図６Ｃおよび図６Ｄ）。一般に、ＮａＭＴＰの濃度が２００μＭ未満に低下すると、ｓｆＧＦＰへのＡｚＫの取り込みの忠実度が徐々に低下するのに対し、５ＦＭＴＰを使用すると、この忠実度の低下は、５０μＭの濃度未満でのみ観察された。明らかに、忠実度を損なうことなく低濃度の５ＦＭＴＰが使用され得る。高濃度の５ＦＭＴＰ（≧５０μＭ）を提供された細胞は、探索された全ての濃度のＴＡＴ１ＴＰ（１００μＭ、５０μＭ、２５μＭ、または１２．５μＭ）で高タンパク質シフトを生成した。ただし、５ＦＭＴＰの濃度が２５μＭ以下の場合、ＴＡＴ１ＴＰの濃度を下げるとタンパク質シフトが減少した。ＮａＭＴＰが２００μＭで提供された場合、調査した全ての濃度のＴＡＴ１ＴＰは、忠実度の高いｎｃＡＡ取り込みを伴うタンパク質の生成をもたらしたが、ＮａＭＴＰの濃度が低い場合、ＴＡＴ１ＴＰの濃度を下げると、タンパク質シフトが再び減少した。全体として、これらの研究により、タンパク質の純度および収量の複合された最適化は、それぞれ２００μＭおよび５０μＭの濃度で提供されるＮａＭＴＰおよびＴＡＴ１ＴＰ、または両方とも５０μＭの濃度で提供される５ＦＭＴＰおよびＴＡＴ１ＴＰで達成されることが明らかになった。タンパク質生成のみの観点からは、ＮａＭＴＰおよびＴＡＴ１ＴＰの使用が最適であるが、５ＦＭＴＰおよびＴＡＴ１ＴＰを使用すると、純粋なｎｃＡＡ標識タンパク質の収量がわずかに低下するが、有意により低い濃度のＸＴＰが要求される。
インビボ翻訳条件の最適化。ｐＧＥＸ－ＭｂＰｙｌＲＳ ＴｅｔＲプラスミドを保持するＳＳＯ株ＭＬ２の一晩培養物を、５０ｍＭリン酸カリウム、５μｇ／ｍＬクロラムフェニコール、および１００μｇ／ｍＬカルベニシリン（本明細書においてこのセクションでは「培地」と呼ぶ）を補充した２×ＹＴで増殖させ、次いで、同じ培地でＯＤ６００が０．０３になるまで希釈し、ＯＤ６００が０．４～０．６になるまで増殖させた。次いで、その培養物を氷水上で１５分間振盪しながら冷却し、次に３，２００×ｇで１０分間の遠心分離によりペレット化した。次いで、細胞を再懸濁し、氷冷ｄｄＨ２Ｏで２回洗浄した後、氷冷ｄｄＨ２Ｏに、ＯＤ６００が５５～６５まで再懸濁した。エレクトロコンピテントセル（５０μＬ）ならびにｓｆＧＦＰおよびｔＲＮＡＰｙｌ遺伝子（プラスミドのＧｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅアセンブリを参照）内のＵＢＰを有する約１ｎｇのＧｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅアセンブリプラスミドを、事前に冷却したエレクトロポレーションキュベット（０．２ｃｍギャップ）に移し、次いで、製造業者の推奨（電圧２５ｋＶ、コンデンサー２．５μＦ、抵抗器２００Ω）に従ってエレクトロポレーション（Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＩＩ；Ｂｉｏ－Ｒａｄ）し、次いで、９５０μＬの培地で直ちに希釈する。次いで、形質転換体のアリコート（４０μＬ）を、ｄＣＮＭＯＴＰ（２５μＭ）およびｄＴＰＴ３ＴＰ（１０μＭ）を補充した培地で５倍に希釈して、最終容積を２００μＬにし、次いで３７℃で１時間振盪して回復させた。回収率の２倍希釈液を、ゼオシン（５０μｇ／ｍＬ）、ｄＣＮＭＯＴＰ（１０μＭ）、ｄＴＰＴ３ＴＰ（１０μＭ）、および寒天（２％ｗ／ｖ）を補充した固形培地にプレートし、次いで３７℃で１８時間培養した。単一コロニーを採取し、５０μｇ／ｍＬゼオシンを補充した培地（３００μＬ）で増殖させ、ｄＣＮＭＯＴＰ（２５μＭ）およびｄＴＰＴ３ＴＰ（１０μＭ）を提供した（本明細書において、以下、このセクションでは「増殖培地」と呼ぶ）。培養物の細胞増殖をモニターし（５９０／２０ｎｍフィルターを備えたＥｎｖｉｓｉｏｎ ２１０３ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ）、次いでＯＤ６００約１．０で収集した。アリコート（５０μＬ）を、ＺＲ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用してプラスミド単離した。次いで、単離されたプラスミドを、以下に記載されるストレプトアビジンゲルシフトアッセイ（プライマーＰ３－４およびＰ５－６、表Ｓ１を使用）に供して、ＵＢＰ保持を決定した。
次いで、優れたＵＢＰ保持力を持つコロニーを、増殖培地でＯＤ６００約０．０１に希釈し、ＯＤ６００約０．４～０．６に増殖させた。次いで、この培養物を複数の３００μＬ培養物に分割し、それぞれに、各ＸＴＰ（１２．５μＭ、２５μＭ、５０μＭ、１００μＭ、または２００μＭ）の可変濃度の５ＦＭＴＰ、ＴＡＴ１ＴＰまたはＮａＭＴＰ、ＴＡＴ１ＴＰ、およびＴＡＴ１ＴＰ（１２．５μＭ、２５μＭ、５０μＭ、または１００μＭで）を提供した。Ａｚｋ（１０ｍＭ）もまた、この時点で、細胞に提供した。光分解を防ぐために、ＡｚＫの添加後にサンプルを遮光した。次いで、これらのサンプルを３７℃で２０分間増殖させた後、１ｍＭのＩＰＴＧを添加し、３７℃でさらに１時間増殖させて、Ｔ７ＲＮＡＰならびにｔＲＮＡＰｙｌおよびＰｙｌＲＳの転写を誘導した。この時点から、細胞の増殖および蛍光をモニターした。次いで、ｓｆＧＦＰの発現を、アンヒドロテトラサイクリン（１００ｎｇ／ｍＬ）で誘導した。３７℃でさらに３時間増殖させた後、細胞を収集し（ｓｆＧＦＰのアフィニティー精製用に２３０μＬ）、冷却し、次いでペレット化して－８０℃で保存した後、タンパク質を精製した。
高密度の非天然コドンのインビボ翻訳。ｐＧＥＸ－ＭｂＰｙｌＲＳ ＴｅｔＲプラスミドを保持するＳＳＯ株ＭＬ２の一晩培養物を、５０ｍＭリン酸カリウム、５μｇ／ｍＬクロラムフェニコール、および１００μｇ／ｍＬカルベニシリン（本明細書において、このセクションでは「培地」と呼ぶ）を補充した２×ＹＴで増殖させ、次いで同じ培地でＯＤ６００が０．０３になるまで希釈し、ＯＤ６００が０．４～０．６になるまで増殖させた。次いで、培養物を氷水上で１５分間振盪しながら冷却し、次いで３，２００×ｇで１０分間の遠心分離によりペレット化した。次いで、細胞を再懸濁し、氷冷ｄｄＨ２Ｏで２回洗浄した後、氷冷ｄｄＨ２Ｏ中で、５５～６５のＯＤ６００に再懸濁した。エレクトロコンピテントセル（５０μＬ）および約１ｎｇのＧｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅアセンブルプラスミドで、３つの確証されたコドン位置のうち２つであるｓｆＧＦＰの１４９もしくは１５３コドン位置、または３つ全ての位置（ｓｆＧＦＰ１４９（ＡＸＣ）、ｓｆＧＦＰ１５１（ＡＸＣ）、ｓｆＧＦＰ１４９、１５１（ＡＸＣ、ＡＸＣ）、ｓｆＧＦＰ１５１、１５３（ＡＸＣ、ＡＸＣ）、ｓｆＧＦＰ１４９、１５３（ＡＸＣ、ＡＸＣ）、および（ｓｆＧＦＰ１４９、１５１、１５３（ＡＸＣ、ＡＸＣ、ＡＸＣ））でＵＢＰを有するプラスミド（プラスミドのＧｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅアセンブリを参照）を、事前に冷却したエレクトロポレーションキュベット（０．２ｃｍギャップ）に移した。次いで、細胞を、製造業者の推奨（電圧２５ ｋＶ、コンデンサー２．５μＦ、抵抗器２００Ω）に従って、エレクトロポレーションし（Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＩＩ；Ｂｉｏ－Ｒａｄ）、次いで９５０μＬの培地で直ちに希釈した。次いで、形質転換体のアリコート（４０μＬ）を、ｄＮａＭＴＰ（１５０μＭ）およびｄＴＰＴ３ＴＰ（１０μＭ）（本明細書において、以下、このセクションでは「古い条件」と呼ぶ）またはｄＣＮＭＯＴＰ（１５０μＭ）およびｄＴＰＴ３ＴＰ（１０μＭ）（本明細書において、以下、このセクションでは「新しい条件」と呼ぶ）のいずれかを補充した培地で５倍希釈し、最終容量を２００μＬにして、次いで、３７℃で１時間振盪しながら回復させた。回収率の２倍希釈液を、ゼオシン（５０μｇ／ｍＬ）、対応する非天然三リン酸、および寒天（２％ｗ／ｖ）を補充した固体培地にプレートし、次いで、３７℃で約１８時間培養した。単一コロニーを採取し、５０μｇ／ｍＬゼオシンを補充した培地（３００μＬ）（本明細書において、以下、このセクションでは「増殖培地」と呼ぶ）で増殖させ、古い条件または新しい条件に対応する非天然三リン酸を提供した。培養物の細胞増殖をモニターし（５９０／２０ｎｍフィルターを備えたＥｎｖｉｓｉｏｎ２１０３Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ）、ＯＤ６００約１．０で収集した。収集した細胞を、氷上で一晩冷却した。
次いで、細胞を増殖培地でＯＤ６００約０．１に再希釈し、古い条件または新しい条件に対応する非天然三リン酸を提供し、次いでＯＤ６００約０．４～０．６に増殖させた。次いで、古い条件に対応する細胞に、ＮａＭＴＰ（２５０μＭ）およびＴＰＴ３ＴＰ（３０μＭ）を提供し、一方で、新しい条件に対応する細胞には、ＮａＭＴＰ（２００μＭ）およびＴＡＴ１ＴＰ（５０μＭ）を提供した。ＡｚＫ（１０ｍＭ）（またはＡｚＫの非存在下で増殖した培養物の場合はｄｄＨ２Ｏ）もこの時点で細胞に提供された。光分解を防ぐために、ＡｚＫの添加後にサンプルを遮光した。次いで、これらのサンプルを３７℃で２０分間増殖させた後、１ｍＭのＩＰＴＧを添加し、３７℃でさらに１時間増殖させて、Ｔ７ＲＮＡＰならびにｔＲＮＡＰｙｌおよびＰｙｌＲＳの転写を誘導した。この時点から、細胞の増殖および蛍光をモニターした。次いで、ｓｆＧＦＰの発現を、アンヒドロテトラサイクリン（１００ｎｇ／ｍＬ）で誘導した。３７℃でさらに３時間増殖させた後、細胞を冷却して、収集し（ＵＢＰ保持を決定するためのプラスミド単離には５０μＬ、ｓｆＧＦＰのアフィニティー精製には２３０μＬ）、ペレット化して－８０℃で保存した後にタンパク質精製およびＵＢＰ保持の評価をした。
結果。高濃度で探索された１０個のＸＴＰは全て、少なくとも中程度のｎｃＡＡ取り込み忠実度（９８％～６３％）でタンパク質の生成を媒介し得る。一般に、ＸＴＰ濃度が低下するにつれて、ｎｃＡＡ取り込みの忠実度が低下し、非天然ｍＲＮＡが転写される忠実度が低下したことが示される。これは、ＸＴＰが差し控えられたときに観察された有意な蛍光と一致している。
この実施例は、主に疎水性のリボヌクレオチドの転写および翻訳のためのＳＡＲを提供した。ＸＴＰでは、ＮａＭＴＰ、ＰＴＭＯＴＰ、およびＭＴＭＯＴＰを検討する場合、環縮小および／またはヘテロ原子誘導体化が有害な場合がある。ただし、単環式核酸塩基ＸＴＰでは、ＣｌＭＯＴＰを除いて、ＭＴＭＯＴＰおよびＰＴＭＯＴＰと比較して、より忠実性の高いタンパク質生成が観察される。場合によっては、非天然核酸塩基間またはポリメラーゼとの特定の相互作用が塩基対形成に有益である。例えば、単環式核酸塩基の４位と５位の両方での置換は、場合によっては、塩基対形成に影響を及ぼす。２ＯＭｅＴＰと比較して、４位のＣｌまたはＢｒ置換基（ＣｌＭＯＴＰおよびＢｒＭＯＴＰ）は場合によっては有害であるが、４位のメチル基（ＭＭＯ２ＴＰ）は、全体的な蛍光を低減するが、タンパク質の忠実度は向上する。４位のニトリル置換基（ＣＮＭＯＴＰ）は、最大量の非天然タンパク質の生成をもたらし、またｎｃＡＡが組み込まれる忠実度も適度に高める。５位（５Ｆ２ＯＭｅＴＰ）でのフルオロ置換基の追加も、２ＯＭｅＴＰと比較して、タンパク質生成および忠実度の両方を向上させる。５－フルオロおよび４－メチル置換基（５ＦＭＴＰ）を組み合わせると、他の非天然三リン酸と比較して低濃度で純粋な非天然タンパク質を高収率で生成できるので、４位および５位での置換の効果は、少なくともほぼ相加的である場合がある。ただし、ＮａＭＴＰはより高い濃度を必要とするが、調べたＸＴＰアナログの収量および純度のバランスの取れた組み合わせを提供する。場合によっては、ＸＴＰアナログ用に派生したＳＡＲは、ｄＸＴＰアナログの複製から派生したＳＡＲとは明らかに異なる。例えば、ｄＰＴＭＯＴＰ、ｄＣｌＭＯＴＰ、およびｄＣＮＭＯは、ｄＮａＭＴＰよりも最適な場合もあるが、ＣｌＭＯＴＰおよびＰＴＭＯＴＰは、ＮａＭＴＰよりも適度に、場合によっては大幅に最適ではない。さらに、ｄＣＮＭＯはこれまでに発見されたｄＴＰＴ３の最適なパートナーであるが、ＣＮＭＯＴＰを使用すると、ＮａＭＴＰと比較して、ｎｃＡＡの取り込みの忠実度がわずかに低下するが、使用すると最も非天然タンパク質が生成される。最高濃度では、探索された５つのＹＴＰ全てが、ｔＲＮＡＰｙｌのアンチコドンに効果的に組み込まれ、少なくとも中程度のｎｃＡＡ取り込み忠実度（９８％～５１％）でタンパク質の生成を媒介し得る。理論に拘束されることなく、ＵＢＰ保持データは、タンパク質生成の忠実度が、非天然ｔＲＮＡの若干の損失に敏感ではないことを示唆しており、タンパク質ゲルシフトの低下をもたらしたＹＴＰの場合、ｔＲＮＡの転写は非常に非効率的または低い忠実度であったことを意味する。ＴＰＴ３ＴＰ、ＳＩＣＳＴＰ、ＦＳＩＣＳＴＰ、およびＴＡＴ１ＴＰは全て、最高濃度で少なくともわずかに毒性があり（データは示さず）、バルク細胞の蛍光は濃度の低下と共に増大した。ＸＴＰおよびｍＲＮＡの転写とは異なり、非天然タンパク質の忠実度は低下せず、このことは、タンパク質産生の増大が単に細胞増殖の増大の結果であることを示唆している。対照的に、５ＳＩＣＳＴＰは、最小限の毒性を示し（データは示さず）、非天然タンパク質産生と忠実度の両方が濃度の低下と共に低下し、これもおそらく、非天然ｔＲＮＡ産生が有意に損なわれたことに起因する。このＹＴＰ ＳＡＲを検討し、ＳＩＣＳＴＰを参照として使用すると、７－フルオロ置換基（ＦＳＩＣＳＴＰ）が有害な場合があり、少量のタンパク質しか生成されず、忠実度が低くなる。５位にメチル基を追加すると（５ＳＩＣＳＴＰ）毒性が減少するが、場合によっては非天然ｔＲＮＡの生成も減少する。環縮小およびヘテロ原子誘導体化（ＴＰＴ３ＴＰ）は、タンパク質の生成および忠実度の両方を向上させる場合があるが、高濃度では、他のＹＴＰアナログと比較して毒性がある場合もよくある。ＴＰＴ３ＴＰのチオフェン環をさらにヘテロ原子誘導体化して、ＴＡＴ１ＴＰのチアゾールを生成すると、ＴＰＴ３ＴＰよりも多くの非天然タンパク質が生成され、毒性が低下する。生成されるタンパク質の量とｎｃＡＡの取り込みの忠実度の両方を考慮すると、ＴＡＴ１ＴＰがＹＴＰとして使用される場合がある。
実施例４：高密度の非天然の情報の記憶および読出し。
高密度のＵＢＰを含む遺伝子からの情報の記憶および読出しを評価した。この目標に向けて、単一の天然コドンによって、それぞれ上記のコドン（コドン１５１）から分離されているコドン１４９または１５３をコードするように配置されたＵＢＰを有するｓｆＧＦＰ遺伝子を含むＤＮＡを複製するＳＳＯの能力を検証した。したがって、発現プラスミドは、上記のように構築されたが、配列ＡＸＣは、コドン１４９または１５３（それぞれ、ｓｆＧＦＰ１４９（ＡＸＣ）またはｓｆＧＦＰ１５３（ＡＸＣ））のいずれかをコードするように配置された。ＭＬ２の形質転換時に、細胞を、本発明者らの以前に報告された系（デオキシリボヌクレオチドｄＮａＭＴＰおよびｄＴＰＴ３ＴＰおよびリボヌクレオチドＮａＭＴＰおよびＴＰＴ３ＴＰ、ｄＮａＭ－ｄＴＰＴ３／ＮａＭＴＰ、ＴＰＴ３ＴＰと表記）、または本研究で発見された最適化された系（ｄＣＮＭＯｄＴＰＴ３／ＮａＭＴＰ、ＴＡＴ１ＴＰ）のいずれかに対応する非天然ヌクレオシド三リン酸の存在下で増殖させた。次いで、ＵＢＰ保持は、上記のようにストレプトアビジンゲルシフトアッセイを使用して特徴付けられた。ｓｆＧＦＰ１４９（ＡＸＣ）およびｓｆＧＦＰ１５３（ＡＸＣ）遺伝子（≧９５％）ならびにｔＲＮＡ遺伝子（≧９１％）の両方における対応するＵＢＰの高い保持が、両方の条件下で観察された（データは示さず）。
誘導の３時間後に観察された全ｓｆＧＦＰ蛍光によって、両方のセットの条件下で、ＡｚＫの存在下で両方の構築物からの有意なタンパク質産生が明らかになった（図７Ａ）。
しかし、ｄＣＮＭＯｄＴＰＴ３／ＮａＭ、ＴＡＴ１を備えたｓｆＧＦＰ１４９（ＡＸＣ）構築物を発現する細胞からの蛍光は、ｄＮａＭ－ｄＴＰＴ３／ＮａＭ、ＴＰＴ３を備えた細胞よりも５８％高かった。ｓｆＧＦＰ１５３（ＡＸＣ）遺伝子の場合、ｄＮａＭｄＴＰＴ３／ＮａＭＴＰ、ＴＰＴ３ＴＰよりもｄＣＮＭＯｄＴＰＴ３／ＮａＭＴＰ、ＴＡＴ１ＴＰの方が４３％多くの蛍光が観察された。両方のセットの条件下で、ｓｆＧＦＰ１４９（ＡＸＣ）よりもｓｆＧＦＰ１５３（ＡＸＣ）の方が約２倍の蛍光が観察された。タンパク質を精製し、ＡｚＫの取り込みを上記のように分析した（図７Ｂ）。ｄＮａＭ－ｄＴＰＴ３／ＮａＭＴＰ、ＴＰＴ３ＴＰでは、ｓｆＧＦＰ１４９（ＡＸＣ）およびｓｆＧＦＰ１５３（ＡＸＣ）でそれぞれ８６％および９４％のタンパク質シフトが観察された。ただし、ｄＣＮＭＯｄＴＰＴ３／ＮａＭＴＰ、ＴＡＴ１ＴＰでは、いずれかの構築物から生成されたタンパク質で９６％のシフトが観察された。これらの結果は、２つの追加のコドン位置が両方とも効率的に転写および翻訳されることを明確に示しているが、新しく特定されたｄＣＮＭＯ－ｄＴＰＴ３／ＮａＭＴＰ、ＴＡＴ１ＴＰ系を使用するとやはり転写および翻訳が向上する。調べた位置の２つまたは３つ全てで同時にコードされた非天然コドンを持つ発現プラスミド（それぞれ、ｓｆＧＦＰ１４９，１５１（ＡＸＣ、ＡＸＣ）、ｓｆＧＦＰ１５１，１５３（ＡＸＣ、ＡＸＣ）、ｓｆＧＦＰ１４９，１５３（ＡＸＣ、ＡＸＣ）、およびｓｆＧＦＰ１４９，１５１，１５３（ＡＸＣ、ＡＸＣ、ＡＸＣ））が構築された。ＭＬ２細胞を形質転換し、ｄＮａＭｄＴＰＴ３／ＮａＭＴＰ、ＴＰＴ３ＴＰまたはｄＣＮＭＯｄＴＰＴ３／ＮａＭＴＰ、ＴＡＴ１ＴＰのいずれかの存在下で増殖させ、タンパク質発現を、上記のように誘導した。ｔＲＮＡＰｙｌ（ＧＹＴ）遺伝子のＵＢＰ保持率は全ての場合で高い（８８％以上）ままであったが（データは示さず）、ｍＲＮＡ遺伝子を使用したビオチンシフトアッセイでは、おそらく少なくとも部分的には、複数のストレプトアビジンに結合した単一のＰＣＲ産物との複合体の混合物の形成に起因して、複雑かつ解釈できないバンドパターンが生成された。上記のようにＤＢＣＯ－ＴＡＭＲＡへのコンジュゲーションを介して生成されたタンパク質（図７Ｂ）を調べた。喜ばしいことに、単一のｎｃＡＡで観察されたシフトと比較して、ｓｆＧＦＰ１４９，１５１（ＡＸＣ、ＡＸＣ）、ｓｆＧＦＰ１５１，１５３（ＡＸＣ、ＡＸＣ）、およびｓｆＧＦＰ１４９，１５３（ＡＸＣ、ＡＸＣ）構築物から発現されたタンパク質について、有意にさらにシフトしたバンドが観察され、２つのＡｚＫ残基を有するｓｆＧＦＰへの２つのＤＢＣＯ－ＴＡＭＲＡ分子のコンジュゲーションを示している。ｄＮａＭ－ｄＴＰＴ３／ＮａＭＴＰ、ＴＰＴ３ＴＰで発現した精製タンパク質を分析する場合、総ｓｆＧＦＰに対するこれらのダブルシフトバンドの定量化により、タンパク質の８０％、８７％、および８３％にそれぞれ２つのＡｚＫ残基があり、それぞれ、ｓｆＧＦＰ１４９，１５１（ＡＸＣ、ＡＸＣ）、ｓｆＧＦＰ１５１，１５３（ＡＸＣ、ＡＸＣ）、またはｓｆＧＦＰ１４９，１５３（ＡＸＣ、ＡＸＣ）構築物を使用した場合、それぞれ２０％、１３％または９％が単一のＡｚＫを有した。ｄＣＮＭＯｄＴＰＴ３／ＮａＭＴＰ、ＴＡＴ１ＴＰでは、タンパク質の８１％、８９％、および９３％に、それぞれ、ｓｆＧＦＰ１４９，１５１（ＡＸＣ、ＡＸＣ）、ｓｆＧＦＰ１５１，１５３（ＡＸＣ、ＡＸＣ）、およびｓｆＧＦＰ１４９，１５３（ＡＸＣ、ＡＸＣ）を有する２つのｎｃＡＡがあり、一方で、１９％、１１％、および６％が単一のｎｃＡＡを有したことが明らかになった。ｓｆＧＦＰ１４９，１５１，１５３（ＡＸＣ、ＡＸＣ、ＡＸＣ）構築物で形質転換された細胞は、さらにシフトしたバンドを生成するタンパク質を発現し、３つのＡｚＫ残基の取り込みを明確に示している。総ｓｆＧＦＰに対する各バンドの定量化により、ｄＮａＭ－ｄＴＰＴ３／ＮａＭＴＰ、ＴＰＴ３ＴＰを使用すると、タンパク質の３９％、２４％、３３％がそれぞれ３つ、２つ、および１つのｎｃＡＡを有し、蛍光およびタンパク質のシフトが非常に変動したタンパク質が生じたことが明らかになった（図７Ａおよび７Ｂ）。対照的に、ｄＣＮＭＯ－ｄＴＰＴ３／ＮａＭＴＰ、ＴＡＴ１ＴＰ系を使用すると、生成されたタンパク質の９０％が３つ全てのｎｃＡＡを有し、残りは２つを有する。
３つ全てのｎｃＡＡがｄＣＮＭＯ－ｄＴＰＴ３／ＮａＭＴＰ、ＴＡＴ１ＴＰ系に首尾よく組み込まれていることをさらに検証するために、単離されたｓｆＧＦＰを定量的なインタクトなタンパク質質量分析によって分析した。簡単に説明すると、精製タンパク質を、遠心フィルター装置（ＡｍｉｃｏｎＲ Ｕｌｔｒａ－０．５－Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して脱塩し、ＨＲＭＳ（ＥＳＩ－ＴＯＦ）で分析した。続いて、取得した質量スペクトルを、Ｗａｔｅｒｓ ＭａｘＥｎｔ １ソフトウェアを使用してデコンボリューションし、これは、ピーク積分時に定量的であることが証明された（データは示さず）。ゲルシフトアッセイと一致して、この分析によって、単離されたタンパク質の８８％が予想される３つのＡｚＫ残基を含み、一方で残りの１２％が２つのＡｚＫ残基および１つのＩｌｅまたはＬｅｕ残基を含むことが明らかになった（図７Ｃ）。
結果。全体として、ＳＡＲによって、ｄＣＮＭＯｄＴＰＴ３／ＮａＭＴＰ、ＴＡＴ１ＴＰ系が、ｎｃＡＡを高い忠実度で組み込んだ大量のタンパク質を生成することを確認した。ｄＣＮＭＯｄＴＰＴ３／５ＦＭＴＰ、ＴＡＴ１ＴＰを使用すると、同じ高忠実度のタンパク質が生成され、一方で、生成されるタンパク質はわずかに少なくなるが、使用が必要な非天然リボヌクレオチドは有意に少なくなる。ｄＣＮＭＯ－ｄＴＰＴ３／ＮａＭＴＰ、ＴＡＴ１ＴＰ系の有用性は、場合によっては、高密度の非天然の情報のエンコードおよび読出しに有用である。両方のシステムとも、忠実度の高い２つのｎｃＡＡを含むタンパク質を生成したが、ｄＣＮＭＯｄＴＰＴ３／ＮａＭＴＰ、ＴＡＴ１ＴＰ系は、通常、所望のタンパク質をより大量に生成した。さらに、３つのｎｃＡＡをコードする場合、ｄＮａＭ－ｄＴＰＴ３／ＮａＭＴＰ、ＴＰＴ３ＴＰ系は、忠実度および収量が有意に減少し、さらに変動する三重標識タンパク質を生成したが、ｄＣＮＭＯ－ｄＴＰＴ３／ＮａＭＴＰ、ＴＡＴ１ＴＰ系の忠実度および収量は、再現性が高いままであった。理論に拘束されることではないが、ＩｌｅまたはＬｅｕが単一のｎｃＡＡに取って代わった夾雑物が、非天然ｔＲＮＡ生成に起因する可能性は低い。これは、ｔＲＮＡ遺伝子のＵＢＰ保持が高く、両方のシステムで類似しており、またわずかな違いがあっても、単一のｎｃＡＡ取り込みデータは、それらが非天然タンパク質生成の忠実度を大幅に低下させるはずはないことを示唆しているためである。また、２つのシステムで同一であるはずのｍＲＮＡ転写に起因する可能性は低い（どちらの場合も、ｄＴＰＴ３は、ＮａＭのｍＲＮＡへの取り込みを指示する）。理論に縛られることなく、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ夾雑物の起源は、複製中のｍＲＮＡ遺伝子のＵＢＰの喪失である可能性が高い。これは、Ｉｌｅコドンを生成する、予想される最も一般的な変異（ｄＸからｄＴ）とも一致している。
識別引用によって本明細書で言及される全ての刊行物、特許、特許出願、および公開特許出願の開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
配列
配列番号１。ｐＧＥＸ－ＭｂＰｙｌＲＳ ＴｅｔＲ ＰｙｌＲＳ発現プラスミドの配列（５９２３ｂｐ）
GTAAATCACTGCATAATTCGTGTCGCTCAAGGCGCACTCCCGTTCTGGATAATGTTTTTTGCGCCGACAT
CATAACGGTTCTGGCAAATATTCTGAAATGAGCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGA
ATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGTATTCATGGATAAAAAACCGCTGGACGTTCTGATC
TCCGCTACGGGTCTGTGGATGAGCCGCACGGGTACGCTGCATAAAATTAAACACCACGAAGTGTCACGTT
CGAAAATCTATATCGAAATGGCGTGCGGTGATCATCTGGTGGTTAACAATAGCCGTTCTTGTCGCACCGC
GCGTGCCTTTCGCCATCACAAATACCGCAAAACGTGCAAACGTTGTCGCGTGTCAGATGAAGACATTAAC
AATTTCCTGACCCGTAGTACGGAATCCAAAAACTCAGTGAAAGTTCGCGTCGTGAGTGCTCCGAAAGTTA
AAAAAGCGATGCCGAAAAGTGTCTCCCGTGCCCCGAAACCGCTGGAAAACTCAGTGTCGGCAAAAGCTTC
CACCAATACGAGCCGCTCTGTTCCGTCGCCGGCAAAAAGCACCCCGAACAGCTCTGTCCCGGCAAGCGCA
CCGGCACCGTCTCTGACGCGTAGTCAGCTGGATCGCGTGGAAGCCCTGCTGTCCCCGGAAGACAAAATCT
CACTGAATATGGCAAAACCGTTTCGTGAACTGGAACCGGAACTGGTTACCCGTCGCAAAAACGATTTCCA
ACGTCTGTATACGAATGATCGCGAAGACTACCTGGGTAAACTGGAACGTGATATCACCAAATTTTTCGTG
GACCGCGGCTTTCTGGAAATCAAATCTCCGATTCTGATCCCGGCTGAATATGTTGAACGCATGGGTATTA
ACAATGATACCGAACTGAGTAAACAGATTTTTCGTGTGGATAAAAACCTGTGCCTGCGGCCGATGCTGGC
ACCGACGCTGTATAATTACCTGCGTAAACTGGATCGCATTCTGCCGGGTCCGATTAAAATCTTTGAAGTG
GGCCCGTGTTATCGTAAAGAATCGGATGGCAAAGAACACCTGGAAGAATTTACCATGGTTAACTTCTGCC
AAATGGGCAGCGGTTGTACGCGCGAAAATCTGGAAGCGCTGATCAAAGAATTCCTGGATTACCTGGAAAT
CGACTTCGAAATCGTCGGTGATTCTTGCATGGTGTATGGCGATACCCTGGACATCATGCATGGTGACCTG
GAACTGAGTTCCGCTGTTGTCGGTCCGGTCAGCCTGGATCGTGAATGGGGCATTGACAAACCGTGGATCG
GCGCGGGTTTTGGCCTGGAACGCCTGCTGAAAGTTATGCACGGCTTCAAAAACATCAAACGTGCGTCTCG
CTCGGAATCGTATTACAACGGCATCTCAACCAATCTGTAATAATGACTGACGATCTGCCTCGCGCGTTTC
GGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATG
CCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCGCAGCCATGACCCA
GTCACGTAGCGATAGCGGAGTGTATAATTCTTGAAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAG
GTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCC
CTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCT
TCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCG
GCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGG
GTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGA
ACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTGTTGACGCCGGG
CAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAA
AGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGC
GGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGAT
CATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCA
CGATGCCTGCAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCG
GCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCT
GGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGC
CAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAA
TAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATAT
ATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATC
TCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGG
ATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCG
GTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGA
TACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTAC
ATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTG
GACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCA
GCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCC
CGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTT
CCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTT
TGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGC
CTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCGAGCTCTTAGCGCGAATTGTCGAGG
GAAATTTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATA
ATATTAAATATGGCTGGTTCTCGCAGAAAGAAACATATCCATGAAATCCCGCCCCGAATTGATATGTCCA
GATTAGATAAAAGTAAAGTGATTAACAGCGCATTAGAGCTGCTTAATGAGGTCGGAATCGAAGGTTTAAC
AACCCGTAAACTCGCCCAGAAGCTAGGTGTAGAGCAGCCTACATTGTATTGGCATGTAAAAAATAAGCGG
GCTTTGCTCGACGCCTTAGCCATTGAGATGTTAGATAGGCACCATACTCACTTTTGCCCTTTAGAAGGGG
AAAGCTGGCAAGATTTTTTACGTAATAACGCTAAAAGTTTTAGATGTGCTTTACTAAGTCATCGCGATGG
AGCAAAAGTACATTTAGGTACACGGCCTACAGAAAAACAGTATGAAACTCTCGAAAATCAATTAGCCTTT
TTATGCCAACAAGGTTTTTCACTAGAGAATGCATTATATGCACTCAGCGCTGTGGGGCATTTTACTTTAG
GTTGCGTATTGGAAGATCAAGAGCATCAAGTCGCTAAAGAAGAAAGGGAAACACCTACTACTGATAGTAT
GCCGCCATTATTACGACAAGCTATCGAATTATTTGATCACCAAGGTGCAGAGCCAGCCTTCTTATTCGGC
CTTGAATTGATCATTTGCGGATTAGAAAAACAACTTAAATGTGAAAGTGGGTCTTAAGCACTAGGTCTAG
GGCGGCGGATTTGTCCTACTCAGGAGAGCGTTCACCGACAAACAACAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTT
TCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGATGCCTCTAGCACGCGTAGAGCTAGAGCCTTCAACCCAGTCAGCT
CCTTCCGGTGGGCGCGGGGCATGACTAACATGAGAATTACAACTTATATCGTATGGGGCTGACTTCAGGT
GCTACATTTGAAGAGATAAATTGCACTGAAATCTAGATGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGA
GTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAG
CGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATAAATTCCGACACCATCG
AATGGTGCAAAACCTTTCGCGGTATGGCATGATAGCGCCCGGAAGAGAGTCAATTCAGGGTGGTGAATGT
GAAACCAGTAACGTTATACGATGTCGCAGAGTATGCCGGTGTCTCTTATCAGACCGTTTCCCGCGTGGTG
AACCAGGCCAGCCACGTTTCTGCGAAAACGCGGGAAAAAGTGGAAGCGGCGATGGCGGAGCTGAATTACA
TTCCCAACCGCGTGGCACAACAACTGGCGGGCAAACAGTCGTTGCTGATTGGCGTTGCCACCTCCAGTCT
GGCCCTGCACGCGCCGTCGCAAATTGTCGCGGCGATTAAATCTCGCGCCGATCAACTGGGTGCCAGCGTG
GTGGTGTCGATGGTAGAACGAAGCGGCGTCGAAGCCTGTAAAGCGGCGGTGCACAATCTTCTCGCGCAAC
GCGTCAGTGGGCTGATCATTAACTATCCGCTGGATGACCAGGATGCCATTGCTGTGGAAGCTGCCTGCAC
TAATGTTCCGGCGTTATTTCTTGATGTCTCTGACCAGACACCCATCAACAGTATTATTTTCTCCCATGAA
GACGGTACGCGACTGGGCGTGGAGCATCTGGTCGCATTGGGTCACCAGCAAATCGCGCTGTTAGCGGGCC
CATTAAGTTCTGTCTCGGCGCGTCTGCGTCTGGCTGGCTGGCATAAATATCTCACTCGCAATCAAATTCA
GCCGATAGCGGAACGGGAAGGCGACTGGAGTGCCATGTCCGGTTTTCAACAAACCATGCAAATGCTGAAT
GAGGGCATCGTTCCCACTGCGATGCTGGTTGCCAACGATCAGATGGCGCTGGGCGCAATGCGCGCCATTA
CCGAGTCCGGGCTGCGCGTTGGTGCGGATATCTCGGTAGTGGGATACGACGATACCGAAGACAGCTCATG
TTATATCCCGCCGTTAACCACCATCAAACAGGATTTTCGCCTGCTGGGGCAAACCAGCGTGGACCGCTTG
CTGCAACTCTCTCAGGGCCAGGCGGTGAAGGGCAATCAGCTGTTGCCCGTCTCACTGGTGAAAAGAAAAA
CCACCCTGGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACG
ACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAAT
配列番号２．ｓｆＧＦＰおよびｔＲＮＡＰｙｌ発現のためのｐ［ｓｆＧＦＰ（ｇｇ）１５１；ｔＲＮＡＰｙｌ（ｇｇ）］ＧＧ目的プラスミドの配列（３１０１ｂｐ）
TAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGAACTATAT
CCGGATTGGTTAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGAAAAGCATT
GGAAACCGAGACCGGTACCGGTCTCTTAGATTCCCGGGGTTTCCGCCAAATTCGAAAAGCCTGCTCAACG
AGCAGGCTTTTTTGCATCTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCCTGA
ACGAGCAGGCTTTTTTGCATAAGCTTCCTAGTGGCAGCGGCTAACTAAGCGGCCTGCTGACTTTCTCGCC
GATCAAAAGGCATTTTGCTATTAAGGGATTGACGAGGGCGTATCTGCGCAGTAAGATGCGCCCCGCATTG
GAGACGCCATGGCGTCTCGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACT
TGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTAATTCGAAAAGCCTGCTCAACGAGCAGGCTTTTTTGGT
CGACAGTAGTGGCAGCGGCTAACTAAGCGGCCTGCTGACTTTCTCGCCGATCAAAAGGCATTTTGCTATT
AAGGGATTGACGAGGGCGTATCTGCGCAGTAAGATGCGCCCCGCATGAGACGGCATGCCGTCTCTAGAGC
TAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTT
TTTAATTCGAAAAGCCTGCTCAACGAGCAGGCTTTTTTGGTCGACAGTTCATAGGTGATTGCGGATCCCG
TCGTTGACAATTAATCATCGGCATAGTATATCGGCATAGTATAATACGACAAGGTGAGGAACTAAACCAT
GGCCAAGTTGACCAGTGCCGTTCCGGTGCTCACCGCGCGCGACGTCGCCGGAGCGGTCGAGTTCTGGACC
GACCGGCTCGGGTTCTCCCGCGACTTCGTGGAGGACGACTTCGCCGGTGTGGTCCGGGACGACGTGACCC
TGTTCATCAGCGCGGTCCAGGACCAGGTGGTGCCGGACAACACCCTGGCCTGGGTGTGGGTGCGCGGCCT
GGACGAGCTGTACGCCGAGTGGTCGGAGGTCGTGTCCACGAACTTCCGGGACGCCTCCGGGCCGGCCATG
ACCGAGATCGGCGAGCAGCCGTGGGGGCGGGAGTTCGCCCTGCGCGACCCGGCCGGCAACTGCGTGCACT
TCGTGGCCGAGGAGCAGGACTGAGAGCTCGCTTGGACTCCTGTTGATAGATCCAGTAATGACCTCAGAAC
TCCATCTGGATTTGTTCAGAACGCTCGGTTGCCGCCGGGCGTTTTTTATTGGTGAGAATCCAAGCACTAG
CTAGTAACAACTTATATCGTATGGGGCTGACTTCAGGTGCTACATTTGAAGAGATAAATTGCACTGAAAT
CTAGTAATATTTTATCTGATTAATAAGATGATCTTCTTGAGATCGTTTTGGTCTGCGCGTAATCTCTTGC
TCTGAAAACGAAAAAACCGCCTTGCAGGGCGGTTTTTCGAAGGTTCTCTGAGCTACCAACTCTTTGAACC
GAGGTAACTGGCTTGGAGGAGCGCAGTCACCAAAACTTGTCCTTTCAGTTTAGCCTTAACCGGCGCATGA
CTTCAAGACTAACTCCTCTAAATCAATTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGTGCTTTTGCATGTCTTTCCGG
GTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGACTGAACGGGGGGTTCGTGCATACAG
TCCAGCTTGGAGCGAACTGCCTACCCGGAACTGAGTGTCAGGCGTGGAATGAGACAAACGCGGCCATAAC
AGCGGAATGACACCGGTAAACCGAAAGGCAGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCCGCCAGGGGGAAACG
CCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCACTGATTTGAGCGTCAGATTTCGTGATGCTTGTC
AGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGGCTTTGCCGCGGCCCTCTCACTTCCCTGTTAAGTATCTTCCTGG
CATCTTCCAGGAAATCTCCGCCCCGTTCGTAAGCCATTTCCGCTCGCCGCAGTCGAACGACCGAGCGTAG
CGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAATATATCCCTTAATACGACTCACTATAGGGTCCCTATCAGTGATAG
AGAGGTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGTCGAAAGGCGAAGAACTGTT
TACGGGAGTGGTGCCTATCCTGGTAGAGCTCGACGGAGATGTAAACGGTCACAAATTTTCAGTCCGCGGG
GAAGGCGAAGGCGATGCGACCAACGGTAAATTAACTTTGAAGTTTATTTGCACCACCGGCAAATTACCGG
TGCCTTGGCCGACGCTTGTGACGACCCTGACTTACGGGGTGCAGTGTTTCAGTCGCTACCCAGATCACAT
GAAACGCCATGACTTCTTCAAATCTGCGATGCCGGAAGGCTATGTGCAGGAACGTACAATTAGCTTTAAA
GACGACGGCACGTATAAAACGCGGGCAGAGGTTAAATTTGAGGGAGATACCCTGGTAAACCGTATTGAAC
TGAAAGGCATCGATTTTAAAGAAGATGGGAACATCTTGGGCCACAAGAGACCGGTACCGGTCTCGGAATC
AAAGCAAATTTCAAGATCCGTCATAACGTGGAGGACGGTTCCGTGCAGCTTGCAGATCACTATCAGCAGA
ATACGCCGATTGGCGATGGCCCGGTGCTGCTGCCCGATAATCACTACCTCTCTACTCAGAGTGTTTTATC
GAAAGACCCGAACGAGAAGCGTGATCACATGGTGCTGCTTGAATTTGTTACCGCGGCAGGTATTACACAC
GGCATGGATGAGTTGTATAAGGGATCCGCTTGGAGCCACCCGCAGTTCGAGAAAGGTGGAGGTTCCGGAG
GTGGATCGGGAGGTTCGGCGTGGAGCCACCCGCAGTTCGAAAAATAAAAGCTTAATTAGCTGAGCTTGGA
CTCCCTGCCACCGCTGAGCAA

Claims (27)

  1. 構造：
    ［式中、波線は、リボシル、デオキシリボシルもしくはジデオキシリボシル部分への核酸塩基の付着を表し、該リボシル、デオキシリボシルもしくはジデオキシリボシル部分は、遊離形態であるか、モノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、α－チオトリホスフェート、β－チオトリホスフェートまたはγ－チオトリホスフェート基に接続されるか、あるいはポリヌクレオチド中に含まれる］
    の核酸塩基。
  2. 相補的な塩基対形成核酸塩基に結合して、非天然塩基対（ＵＢＰ）を形成する、請求項１に記載の核酸塩基。
  3. 相補的な塩基対形成核酸塩基は、
    から選択される、請求項２に記載の核酸塩基。
  4. 二本鎖オリゴヌクレオチドであって、請求項１に記載の核酸塩基を含む第１のオリゴヌクレオチド鎖、および第１のオリゴヌクレオチド鎖に相補的な第２のオリゴヌクレオチド鎖を含み、第２のオリゴヌクレオチド鎖は、相補的な塩基対形成核酸塩基をその相補的な塩基対形成部位に含む、前記二本鎖オリゴヌクレオチド。
  5. 第２のオリゴヌクレオチド鎖は、
    から選択される相補的な塩基対形成核酸塩基をその相補的な塩基対形成部位に含む、請求項４に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
  6. 第２のオリゴヌクレオチド鎖は、相補的な塩基対形成核酸塩基
    を含む、請求項５に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
  7. 第２のオリゴヌクレオチド鎖は、相補的な塩基対形成核酸塩基
    を含む、請求項５に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
  8. トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）をコードする遺伝子および／または目的のタンパク質をコードする遺伝子を含むプラスミドであって、該遺伝子は、請求項１に記載の少なくとも１つの核酸塩基、および請求項３に記載の少なくとも１つの相補的な塩基対形成核酸塩基を含み、該相補的な塩基対形成核酸塩基は、相補的な塩基対形成部位にある、前記プラスミド。
  9. 請求項１に記載の核酸塩基または請求項１に記載の核酸塩基を含むコドンを含む、ｍＲＮＡ。
  10. 請求項１に記載の核酸塩基を含む、ｔＲＮＡ。
  11. 請求項１に記載の核酸塩基を含むアンチコドンであって、非天然アミノ酸をコードする非天然コドンと対形成する、前記アンチコドン；および
    アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼによる、ｔＲＮＡの非天然アミノ酸による選択的チャージを促進する認識エレメント；
    を含む前記トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）。
  12. アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼは、メタノサルシナ属またはメタノコッカス属（メタノカルドコッカス属）に由来する、請求項１１に記載のｔＲＮＡ。
  13. 非天然アミノ酸は、芳香族部分を含む、請求項１１に記載のｔＲＮＡ。
  14. 非天然アミノ酸は、以下の構造式：
    から選択されるリジンの誘導体または以下の構造式：
    から選択されるフェニルアラニンの誘導体である、請求項１１に記載のｔＲＮＡ。
  15. 式：
    Ｎ１－Ｚｘ－Ｎ２
    ［式中、
    それぞれのＺは、請求項１に記載の核酸塩基であり、リボシルもしくはデオキシリボシルに結合しており；
    Ｎ１は、Ｚのリボシルもしくはデオキシリボシルの５’末端で結合した、１つまたはそれ以上のヌクレオチドまたは末端ホスフェート基であり；
    Ｎ２は、Ｚのリボシルもしくはデオキシリボシルの３’末端に結合した、１つまたはそれ以上のヌクレオチドまたは末端ヒドロキシル基であり；
    ｘは、１～２０の整数である］
    を含む構造を含む、核酸分子。
  16. 遺伝子をコードする、請求項１５に記載の核酸分子。
  17. Ｚｘは、遺伝子の翻訳領域に位置する、請求項１５に記載の核酸分子。
  18. Ｚｘは、遺伝子の非翻訳領域に位置する、請求項１５に記載の核酸分子。
  19. ｘは１である、請求項１５に記載の核酸分子。
  20. ポリヌクレオチドライブラリーであって、該ライブラリーは、少なくとも５０００の異なるポリヌクレオチドを含み、それぞれのポリヌクレオチドは、請求項１に記載の少なくとも１つの核酸塩基を含む、前記ポリヌクレオチドライブラリー。
  21. 請求項１に記載の核酸塩基を含むヌクレオシド三リン酸。
  22. ヌクレオシドは、リボースまたはデオキシリボースを含む、請求項２１に記載のヌクレ
    オシド三リン酸。
  23. 前記ポリヌクレオチドがＲＮＡである、請求項１に記載の核酸塩基。
  24. 前記ポリヌクレオチドがＤＮＡである、請求項１に記載の核酸塩基。
  25. 前記ポリヌクレオチドが二環式核酸、連結された核酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、またはホスホロチオエート含有核酸である、請求項１に記載の核酸塩基。
  26. 構造
    を有する核酸塩基、および構造
    を有する相補的な塩基対形成核酸塩基を含むＤＮＡ。
  27. 構造
    を有する核酸塩基、および構造
    を有する相補的な塩基対形成核酸塩基を含むＤＮＡ。
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Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015021432A1 (en) * 2013-08-08 2015-02-12 The Scripps Research Institute A method for the site-specific enzymatic labelling of nucleic acids in vitro by incorporation of unnatural nucleotides
US10513706B2 (en) 2014-04-09 2019-12-24 The Scripps Research Institute Import of unnatural or modified nucleoside triphosphates into cells via nucleic acid triphosphate transporters
US11761007B2 (en) 2015-12-18 2023-09-19 The Scripps Research Institute Production of unnatural nucleotides using a CRISPR/Cas9 system
DK3475295T3 (da) 2016-06-24 2022-10-24 Scripps Research Inst Hidtil ukendt nukleosidtriphosphat-transportør og anvendelser deraf
CA3069321A1 (en) 2017-07-11 2019-01-17 Synthorx, Inc. Incorporation of unnatural nucleotides and methods thereof
JP7429642B2 (ja) 2017-12-29 2024-02-08 ザ スクリプス リサーチ インスティテュート 非天然塩基対組成物および使用の方法
CN111690587B (zh) * 2019-03-13 2022-10-25 上海凯赛生物技术股份有限公司 一种离心筛选具有高含油率油脂酵母菌株的方法及其应用
WO2020252262A1 (en) 2019-06-14 2020-12-17 The Scripps Research Institute Reagents and methods for replication, transcription, and translation in semi-synthetic organisms
TW202128996A (zh) * 2019-10-10 2021-08-01 美商史基普研究協會 用於活體內合成非天然多肽的組合物及方法
CN114031648A (zh) * 2021-11-08 2022-02-11 河南师范大学 一类非天然碱基三磷酸及其合成方法和应用
WO2023164676A1 (en) * 2022-02-27 2023-08-31 The Regents Of The University Of California Methods to generate novel acyl-trna species
CN116425816B (zh) * 2023-03-20 2025-10-31 河南师范大学 一种isoTAT非天然碱基三磷酸及其制备方法和应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016531122A (ja) 2013-08-08 2016-10-06 ザ スクリップス リサーチ インスティテュートＴｈｅ Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ 非天然ヌクレオチドの取り込みによるインビトロの核酸の部位特異的な酵素標識のための方法
WO2019014267A1 (en) 2017-07-11 2019-01-17 Synthorx, Inc. INCORPORATION OF NON-NATURAL NUCLEOTIDES AND ASSOCIATED METHODS

Family Cites Families (202)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3687808A (en) 1969-08-14 1972-08-29 Univ Leland Stanford Junior Synthetic polynucleotides
US4469863A (en) 1980-11-12 1984-09-04 Ts O Paul O P Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof
US5023243A (en) 1981-10-23 1991-06-11 Molecular Biosystems, Inc. Oligonucleotide therapeutic agent and method of making same
US4476301A (en) 1982-04-29 1984-10-09 Centre National De La Recherche Scientifique Oligonucleotides, a process for preparing the same and their application as mediators of the action of interferon
JPS5927900A (ja) 1982-08-09 1984-02-14 Wakunaga Seiyaku Kk 固定化オリゴヌクレオチド
FR2540122B1 (fr) 1983-01-27 1985-11-29 Centre Nat Rech Scient Nouveaux composes comportant une sequence d'oligonucleotide liee a un agent d'intercalation, leur procede de synthese et leur application
US4605735A (en) 1983-02-14 1986-08-12 Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha Oligonucleotide derivatives
US4948882A (en) 1983-02-22 1990-08-14 Syngene, Inc. Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis
US4824941A (en) 1983-03-10 1989-04-25 Julian Gordon Specific antibody to the native form of 2'5'-oligonucleotides, the method of preparation and the use as reagents in immunoassays or for binding 2'5'-oligonucleotides in biological systems
US4587044A (en) 1983-09-01 1986-05-06 The Johns Hopkins University Linkage of proteins to nucleic acids
US4849513A (en) 1983-12-20 1989-07-18 California Institute Of Technology Deoxyribonucleoside phosphoramidites in which an aliphatic amino group is attached to the sugar ring and their use for the preparation of oligonucleotides containing aliphatic amino groups
US5015733A (en) 1983-12-20 1991-05-14 California Institute Of Technology Nucleosides possessing blocked aliphatic amino groups
US5118802A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology DNA-reporter conjugates linked via the 2' or 5'-primary amino group of the 5'-terminal nucleoside
US5118800A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology Oligonucleotides possessing a primary amino group in the terminal nucleotide
US5550111A (en) 1984-07-11 1996-08-27 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education Dual action 2',5'-oligoadenylate antiviral derivatives and uses thereof
FR2567892B1 (fr) 1984-07-19 1989-02-17 Centre Nat Rech Scient Nouveaux oligonucleotides, leur procede de preparation et leurs applications comme mediateurs dans le developpement des effets des interferons
US5430136A (en) 1984-10-16 1995-07-04 Chiron Corporation Oligonucleotides having selectably cleavable and/or abasic sites
US5367066A (en) 1984-10-16 1994-11-22 Chiron Corporation Oligonucleotides with selectably cleavable and/or abasic sites
US5258506A (en) 1984-10-16 1993-11-02 Chiron Corporation Photolabile reagents for incorporation into oligonucleotide chains
US4828979A (en) 1984-11-08 1989-05-09 Life Technologies, Inc. Nucleotide analogs for nucleic acid labeling and detection
FR2575751B1 (fr) 1985-01-08 1987-04-03 Pasteur Institut Nouveaux nucleosides de derives de l'adenosine, leur preparation et leurs applications biologiques
US5185444A (en) 1985-03-15 1993-02-09 Anti-Gene Deveopment Group Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US5166315A (en) 1989-12-20 1992-11-24 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5405938A (en) 1989-12-20 1995-04-11 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5235033A (en) 1985-03-15 1993-08-10 Anti-Gene Development Group Alpha-morpholino ribonucleoside derivatives and polymers thereof
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4965188A (en) 1986-08-22 1990-10-23 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme
US5656493A (en) 1985-03-28 1997-08-12 The Perkin-Elmer Corporation System for automated performance of the polymerase chain reaction
US4762779A (en) 1985-06-13 1988-08-09 Amgen Inc. Compositions and methods for functionalizing nucleic acids
US5093232A (en) 1985-12-11 1992-03-03 Chiron Corporation Nucleic acid probes
US4910300A (en) 1985-12-11 1990-03-20 Chiron Corporation Method for making nucleic acid probes
US5317098A (en) 1986-03-17 1994-05-31 Hiroaki Shizuya Non-radioisotope tagging of fragments
JPS638396A (ja) 1986-06-30 1988-01-14 Wakunaga Pharmaceut Co Ltd ポリ標識化オリゴヌクレオチド誘導体
US5264423A (en) 1987-03-25 1993-11-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US5276019A (en) 1987-03-25 1994-01-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US4904582A (en) 1987-06-11 1990-02-27 Synthetic Genetics Novel amphiphilic nucleic acid conjugates
DE3851889T2 (de) 1987-06-24 1995-04-13 Florey Howard Inst Nukleosid-derivate.
US5585481A (en) 1987-09-21 1996-12-17 Gen-Probe Incorporated Linking reagents for nucleotide probes
US4924624A (en) 1987-10-22 1990-05-15 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education 2,',5'-phosphorothioate oligoadenylates and plant antiviral uses thereof
US5188897A (en) 1987-10-22 1993-02-23 Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education Encapsulated 2',5'-phosphorothioate oligoadenylates
US5525465A (en) 1987-10-28 1996-06-11 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Oligonucleotide-polyamide conjugates and methods of production and applications of the same
DE3738460A1 (de) 1987-11-12 1989-05-24 Max Planck Gesellschaft Modifizierte oligonukleotide
US5082830A (en) 1988-02-26 1992-01-21 Enzo Biochem, Inc. End labeled nucleotide probe
WO1989009221A1 (en) 1988-03-25 1989-10-05 University Of Virginia Alumni Patents Foundation Oligonucleotide n-alkylphosphoramidates
US5278302A (en) 1988-05-26 1994-01-11 University Patents, Inc. Polynucleotide phosphorodithioates
US5109124A (en) 1988-06-01 1992-04-28 Biogen, Inc. Nucleic acid probe linked to a label having a terminal cysteine
US5216141A (en) 1988-06-06 1993-06-01 Benner Steven A Oligonucleotide analogs containing sulfur linkages
US5175273A (en) 1988-07-01 1992-12-29 Genentech, Inc. Nucleic acid intercalating agents
US5262536A (en) 1988-09-15 1993-11-16 E. I. Du Pont De Nemours And Company Reagents for the preparation of 5'-tagged oligonucleotides
US5512439A (en) 1988-11-21 1996-04-30 Dynal As Oligonucleotide-linked magnetic particles and uses thereof
US5599923A (en) 1989-03-06 1997-02-04 Board Of Regents, University Of Tx Texaphyrin metal complexes having improved functionalization
US5457183A (en) 1989-03-06 1995-10-10 Board Of Regents, The University Of Texas System Hydroxylated texaphyrins
US5391723A (en) 1989-05-31 1995-02-21 Neorx Corporation Oligonucleotide conjugates
US4958013A (en) 1989-06-06 1990-09-18 Northwestern University Cholesteryl modified oligonucleotides
US5451463A (en) 1989-08-28 1995-09-19 Clontech Laboratories, Inc. Non-nucleoside 1,3-diol reagents for labeling synthetic oligonucleotides
US5134066A (en) 1989-08-29 1992-07-28 Monsanto Company Improved probes using nucleosides containing 3-dezauracil analogs
US5254469A (en) 1989-09-12 1993-10-19 Eastman Kodak Company Oligonucleotide-enzyme conjugate that can be used as a probe in hybridization assays and polymerase chain reaction procedures
US5591722A (en) 1989-09-15 1997-01-07 Southern Research Institute 2'-deoxy-4'-thioribonucleosides and their antiviral activity
US5399676A (en) 1989-10-23 1995-03-21 Gilead Sciences Oligonucleotides with inverted polarity
DE69033495T2 (de) 1989-10-24 2000-07-20 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-modifizierte nukleotide
US5264564A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences Oligonucleotide analogs with novel linkages
US5264562A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs with novel linkages
US5292873A (en) 1989-11-29 1994-03-08 The Research Foundation Of State University Of New York Nucleic acids labeled with naphthoquinone probe
US5177198A (en) 1989-11-30 1993-01-05 University Of N.C. At Chapel Hill Process for preparing oligoribonucleoside and oligodeoxyribonucleoside boranophosphates
US5130302A (en) 1989-12-20 1992-07-14 Boron Bilogicals, Inc. Boronated nucleoside, nucleotide and oligonucleotide compounds, compositions and methods for using same
US5486603A (en) 1990-01-08 1996-01-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide having enhanced binding affinity
US5459255A (en) 1990-01-11 1995-10-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-2 substituted purines
US5578718A (en) 1990-01-11 1996-11-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Thiol-derivatized nucleosides
US5670633A (en) 1990-01-11 1997-09-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Sugar modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US5646265A (en) 1990-01-11 1997-07-08 Isis Pharmceuticals, Inc. Process for the preparation of 2'-O-alkyl purine phosphoramidites
US5587361A (en) 1991-10-15 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US5681941A (en) 1990-01-11 1997-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted purines and oligonucleotide cross-linking
US5587470A (en) 1990-01-11 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. 3-deazapurines
AU7579991A (en) 1990-02-20 1991-09-18 Gilead Sciences, Inc. Pseudonucleosides and pseudonucleotides and their polymers
US5214136A (en) 1990-02-20 1993-05-25 Gilead Sciences, Inc. Anthraquinone-derivatives oligonucleotides
US5321131A (en) 1990-03-08 1994-06-14 Hybridon, Inc. Site-specific functionalization of oligodeoxynucleotides for non-radioactive labelling
US5470967A (en) 1990-04-10 1995-11-28 The Dupont Merck Pharmaceutical Company Oligonucleotide analogs with sulfamate linkages
GB9009980D0 (en) 1990-05-03 1990-06-27 Amersham Int Plc Phosphoramidite derivatives,their preparation and the use thereof in the incorporation of reporter groups on synthetic oligonucleotides
EP0455905B1 (en) 1990-05-11 1998-06-17 Microprobe Corporation Dipsticks for nucleic acid hybridization assays and methods for covalently immobilizing oligonucleotides
US5138045A (en) 1990-07-27 1992-08-11 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5218105A (en) 1990-07-27 1993-06-08 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5688941A (en) 1990-07-27 1997-11-18 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods of making conjugated 4' desmethyl nucleoside analog compounds
US5610289A (en) 1990-07-27 1997-03-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogues
CA2088258C (en) 1990-07-27 2004-09-14 Phillip Dan Cook Nuclease resistant, pyrimidine modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US5623070A (en) 1990-07-27 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5489677A (en) 1990-07-27 1996-02-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleoside linkages containing adjacent oxygen and nitrogen atoms
US5541307A (en) 1990-07-27 1996-07-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs and solid phase synthesis thereof
US5677437A (en) 1990-07-27 1997-10-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5618704A (en) 1990-07-27 1997-04-08 Isis Pharmacueticals, Inc. Backbone-modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through radical coupling
US5608046A (en) 1990-07-27 1997-03-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated 4'-desmethyl nucleoside analog compounds
US5602240A (en) 1990-07-27 1997-02-11 Ciba Geigy Ag. Backbone modified oligonucleotide analogs
KR100211552B1 (ko) 1990-08-03 1999-08-02 디. 꼬쉬 유전자 발현 억제용 화합물 및 방법
US5245022A (en) 1990-08-03 1993-09-14 Sterling Drug, Inc. Exonuclease resistant terminally substituted oligonucleotides
US5177196A (en) 1990-08-16 1993-01-05 Microprobe Corporation Oligo (α-arabinofuranosyl nucleotides) and α-arabinofuranosyl precursors thereof
US5512667A (en) 1990-08-28 1996-04-30 Reed; Michael W. Trifunctional intermediates for preparing 3'-tailed oligonucleotides
US5214134A (en) 1990-09-12 1993-05-25 Sterling Winthrop Inc. Process of linking nucleosides with a siloxane bridge
US5561225A (en) 1990-09-19 1996-10-01 Southern Research Institute Polynucleotide analogs containing sulfonate and sulfonamide internucleoside linkages
JPH06505704A (ja) 1990-09-20 1994-06-30 ギリアド　サイエンシズ，インコーポレイテッド 改変ヌクレオシド間結合
NZ239893A (en) 1990-09-25 1993-11-25 Hoechst Japan A method for introducing a foreign dna into a cell
US5432272A (en) 1990-10-09 1995-07-11 Benner; Steven A. Method for incorporating into a DNA or RNA oligonucleotide using nucleotides bearing heterocyclic bases
KR930702373A (ko) 1990-11-08 1993-09-08 안토니 제이. 페이네 합성 올리고누클레오티드에 대한 다중 리포터(Reporter)그룹의 첨합
US5672697A (en) 1991-02-08 1997-09-30 Gilead Sciences, Inc. Nucleoside 5'-methylene phosphonates
US5539082A (en) 1993-04-26 1996-07-23 Nielsen; Peter E. Peptide nucleic acids
US5719262A (en) 1993-11-22 1998-02-17 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having amino acid side chains
US5714331A (en) 1991-05-24 1998-02-03 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility
US5371241A (en) 1991-07-19 1994-12-06 Pharmacia P-L Biochemicals Inc. Fluorescein labelled phosphoramidites
US5571799A (en) 1991-08-12 1996-11-05 Basco, Ltd. (2'-5') oligoadenylate analogues useful as inhibitors of host-v5.-graft response
DE59208572D1 (de) 1991-10-17 1997-07-10 Ciba Geigy Ag Bicyclische Nukleoside, Oligonukleotide, Verfahren zu deren Herstellung und Zwischenprodukte
US5594121A (en) 1991-11-07 1997-01-14 Gilead Sciences, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified purines
TW393513B (en) 1991-11-26 2000-06-11 Isis Pharmaceuticals Inc Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified pyrimidines
CA2122365C (en) 1991-11-26 2010-05-11 Brian Froehler Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified pyrimidines
US5484908A (en) 1991-11-26 1996-01-16 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotides containing 5-propynyl pyrimidines
US5359044A (en) 1991-12-13 1994-10-25 Isis Pharmaceuticals Cyclobutyl oligonucleotide surrogates
US5595726A (en) 1992-01-21 1997-01-21 Pharmacyclics, Inc. Chromophore probe for detection of nucleic acid
US5565552A (en) 1992-01-21 1996-10-15 Pharmacyclics, Inc. Method of expanded porphyrin-oligonucleotide conjugate synthesis
FR2687679B1 (fr) 1992-02-05 1994-10-28 Centre Nat Rech Scient Oligothionucleotides.
US5633360A (en) 1992-04-14 1997-05-27 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs capable of passive cell membrane permeation
US5434257A (en) 1992-06-01 1995-07-18 Gilead Sciences, Inc. Binding compentent oligomers containing unsaturated 3',5' and 2',5' linkages
EP0577558A2 (de) 1992-07-01 1994-01-05 Ciba-Geigy Ag Carbocyclische Nukleoside mit bicyclischen Ringen, Oligonukleotide daraus, Verfahren zu deren Herstellung, deren Verwendung und Zwischenproduckte
US5272250A (en) 1992-07-10 1993-12-21 Spielvogel Bernard F Boronated phosphoramidate compounds
US5574142A (en) 1992-12-15 1996-11-12 Microprobe Corporation Peptide linkers for improved oligonucleotide delivery
US5476925A (en) 1993-02-01 1995-12-19 Northwestern University Oligodeoxyribonucleotides including 3'-aminonucleoside-phosphoramidate linkages and terminal 3'-amino groups
GB9304618D0 (en) 1993-03-06 1993-04-21 Ciba Geigy Ag Chemical compounds
CA2159631A1 (en) 1993-03-30 1994-10-13 Sanofi Acyclic nucleoside analogs and oligonucleotide sequences containing them
WO1994022891A1 (en) 1993-03-31 1994-10-13 Sterling Winthrop Inc. Oligonucleotides with amide linkages replacing phosphodiester linkages
AU6449294A (en) 1993-03-31 1994-10-24 Sterling Winthrop Inc. Novel 5'-substituted nucleosides and oligomers produced therefrom
DE4311944A1 (de) 1993-04-10 1994-10-13 Degussa Umhüllte Natriumpercarbonatpartikel, Verfahren zu deren Herstellung und sie enthaltende Wasch-, Reinigungs- und Bleichmittelzusammensetzungen
GB9311682D0 (en) 1993-06-05 1993-07-21 Ciba Geigy Ag Chemical compounds
US5502177A (en) 1993-09-17 1996-03-26 Gilead Sciences, Inc. Pyrimidine derivatives for labeled binding partners
US5457187A (en) 1993-12-08 1995-10-10 Board Of Regents University Of Nebraska Oligonucleotides containing 5-fluorouracil
US5446137B1 (en) 1993-12-09 1998-10-06 Behringwerke Ag Oligonucleotides containing 4'-substituted nucleotides
US5519134A (en) 1994-01-11 1996-05-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Pyrrolidine-containing monomers and oligomers
US5596091A (en) 1994-03-18 1997-01-21 The Regents Of The University Of California Antisense oligonucleotides comprising 5-aminoalkyl pyrimidine nucleotides
US5627053A (en) 1994-03-29 1997-05-06 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. 2'deoxy-2'-alkylnucleotide containing nucleic acid
US5625050A (en) 1994-03-31 1997-04-29 Amgen Inc. Modified oligonucleotides and intermediates useful in nucleic acid therapeutics
US5525711A (en) 1994-05-18 1996-06-11 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Pteridine nucleotide analogs as fluorescent DNA probes
US5597696A (en) 1994-07-18 1997-01-28 Becton Dickinson And Company Covalent cyanine dye oligonucleotide conjugates
US5597909A (en) 1994-08-25 1997-01-28 Chiron Corporation Polynucleotide reagents containing modified deoxyribose moieties, and associated methods of synthesis and use
US5580731A (en) 1994-08-25 1996-12-03 Chiron Corporation N-4 modified pyrimidine deoxynucleotides and oligonucleotide probes synthesized therewith
US6720140B1 (en) 1995-06-07 2004-04-13 Invitrogen Corporation Recombinational cloning using engineered recombination sites
NZ500843A (en) 1995-06-07 2002-03-28 Invitrogen Corp A method of DNA recombination which is selectable to select for cells containing a product and against cells only harbouring the insert donor
US6143557A (en) 1995-06-07 2000-11-07 Life Technologies, Inc. Recombination cloning using engineered recombination sites
GB9606158D0 (en) 1996-03-23 1996-05-29 Ciba Geigy Ag Chemical compounds
US6770748B2 (en) 1997-03-07 2004-08-03 Takeshi Imanishi Bicyclonucleoside and oligonucleotide analogue
JP3756313B2 (ja) 1997-03-07 2006-03-15 武 今西 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体
US6794499B2 (en) 1997-09-12 2004-09-21 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
KR100414936B1 (ko) 1997-09-12 2004-01-13 엑시콘 에이/에스 이환 및 삼환 뉴클레오시드, 뉴클레오타이드 및올리고뉴클레오타이드 동족체
IL135776A0 (en) 1997-10-24 2001-05-20 Life Technologies Inc Recombinational cloning using nucleic acids having recombination sites
US6955807B1 (en) 1998-05-15 2005-10-18 Bayer Pharmaceuticals Corporation IL-2 selective agonists and antagonists
US6562798B1 (en) 1998-06-05 2003-05-13 Dynavax Technologies Corp. Immunostimulatory oligonucleotides with modified bases and methods of use thereof
PT1178999E (pt) 1999-05-04 2007-06-26 Santaris Pharma As Análogos de l-ribo-lna
US6525191B1 (en) 1999-05-11 2003-02-25 Kanda S. Ramasamy Conformationally constrained L-nucleosides
DE60045238D1 (de) 1999-07-15 2010-12-30 Japan Science & Tech Agency Nukleinsäurebasenpaar
DE60027040T2 (de) 1999-10-29 2006-11-23 Stratagene California, La Jolla Zusammensetzungen und methoden zur verwendung von dna polymerasen
CA2392753A1 (en) 1999-12-10 2001-06-14 Invitrogen Corporation Use of multiple recombination sites with unique specificity in recombinational cloning
RU2003129164A (ru) 2001-03-01 2005-03-20 Фармассет Лтд. (Bb) Способ синтеза 2`,3`-дидезокси-2`,3`-дидегидронуклеозидов
US20060074035A1 (en) 2002-04-17 2006-04-06 Zhi Hong Dinucleotide inhibitors of de novo RNA polymerases for treatment or prevention of viral infections
EP1544294B8 (en) 2002-07-17 2014-03-19 Riken Nucleosides or nucleotides having novel unnatural bases and use thereof
CA2504694C (en) 2002-11-05 2013-10-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Polycyclic sugar surrogate-containing oligomeric compounds and compositions for use in gene modulation
EP1560840B1 (en) 2002-11-05 2015-05-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions comprising alternating 2'-modified nucleosides for use in gene modulation
CN103289960B (zh) 2003-04-17 2017-04-26 斯克利普斯研究院 扩展真核生物遗传密码
WO2004106356A1 (en) 2003-05-27 2004-12-09 Syddansk Universitet Functionalized nucleotide derivatives
JP4731324B2 (ja) 2003-08-28 2011-07-20 武 今西 Ｎ−ｏ結合性架橋構造型新規人工核酸
WO2005026187A1 (ja) 2003-09-10 2005-03-24 Riken 非天然型塩基を有するヌクレオシド又はヌクレオチド及びその利用
WO2005027962A1 (en) 2003-09-18 2005-03-31 Isis Pharmaceuticals, Inc. 4’-thionucleosides and oligomeric compounds
ES2546945T3 (es) 2003-11-03 2015-09-30 Medical Research Council Polimerasa
BRPI0507159A (pt) 2004-02-02 2007-06-26 Ambrx Inc polipeptìdeos em feixe de quatro hélices humanos modificados e seus usos
US7960543B2 (en) 2004-11-08 2011-06-14 Riken Nucleoside or nucleotide derivative and use thereof
JP5649018B2 (ja) 2005-08-04 2015-01-07 タグシクス・バイオ株式会社 新規人工塩基対及びその利用
AU2006323745B2 (en) 2005-12-09 2012-11-22 Riken Method for replicating nucleic acids and novel unnatural base pairs
ES2516815T3 (es) 2006-01-27 2014-10-31 Isis Pharmaceuticals, Inc. Análogos de ácidos nucleicos bicíclicos modificados en la posición 6
CA2651453C (en) 2006-05-11 2014-10-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. 5'-modified bicyclic nucleic acid analogs
US20100190837A1 (en) 2007-02-15 2010-07-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. 5'-Substituted-2-F' Modified Nucleosides and Oligomeric Compounds Prepared Therefrom
WO2008150729A2 (en) 2007-05-30 2008-12-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-substituted-aminomethylene bridged bicyclic nucleic acid analogs
EP2173760B2 (en) 2007-06-08 2015-11-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Carbocyclic bicyclic nucleic acid analogs
AU2008272918B2 (en) 2007-07-05 2012-09-13 Isis Pharmaceuticals, Inc. 6-disubstituted bicyclic nucleic acid analogs
WO2009123216A1 (ja) 2008-03-31 2009-10-08 独立行政法人理化学研究所 高選択・高効率でｐｃｒ増幅が可能な新規ｄｎａ
WO2011043385A1 (ja) 2009-10-06 2011-04-14 独立行政法人理化学研究所 特異な塩基対を形成する人工塩基対
WO2011139699A2 (en) 2010-04-28 2011-11-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. 5' modified nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
KR20200070407A (ko) 2010-11-12 2020-06-17 넥타르 테라퓨틱스 Ｉｌ-2 부분 및 중합체의 접합체
LT3075745T (lt) 2011-02-10 2018-11-26 Roche Glycart Ag Mutavę interleukino-2 polipeptidai
ES2728864T3 (es) 2012-08-31 2019-10-29 Sutro Biopharma Inc Aminoácidos modificados que comprenden un grupo azido
JP6430481B2 (ja) 2013-03-13 2018-11-28 トラスティーズ オブ ボストン ユニバーシティ 合成および内因性の細菌システムにおけるタンパク質分解の調整可能な制御
ES2697778T3 (es) 2013-10-11 2019-01-28 Sutro Biopharma Inc ARNt sintetasas de aminoácidos no naturales para para-metilazido-L-fenilalanina
EP3055320B1 (en) 2013-10-11 2018-10-03 Sutro Biopharma, Inc. NON-NATURAL AMINO ACID tRNA SYNTHETASES FOR PYRIDYL TETRAZINE
EP3055298B1 (en) 2013-10-11 2020-04-29 Sutro Biopharma, Inc. Modified amino acids comprising tetrazine functional groups, methods of preparation, and methods of their use
EP3080256B1 (en) 2013-12-13 2018-06-13 Cellectis Cas9 nuclease platform for microalgae genome engineering
US10513706B2 (en) 2014-04-09 2019-12-24 The Scripps Research Institute Import of unnatural or modified nucleoside triphosphates into cells via nucleic acid triphosphate transporters
KR102424721B1 (ko) 2014-11-06 2022-07-25 이 아이 듀폰 디 네모아 앤드 캄파니 Rna-유도 엔도뉴클레아제의 세포 내로의 펩티드 매개성 전달
EP3889260A1 (en) 2014-12-12 2021-10-06 The Broad Institute, Inc. Protected guide rnas (pgrnas)
WO2016115168A1 (en) 2015-01-12 2016-07-21 Synthorx, Inc. Incorporation of unnatural nucleotides and methods thereof
EP3292208B1 (en) * 2015-05-06 2020-08-19 Trelys, Inc. Compositions and methods for biological production of methionine
WO2017093254A1 (en) * 2015-11-30 2017-06-08 European Molecular Biology Laboratory Means and methods for preparing engineered proteins by genetic code expansion in insect cells
US11761007B2 (en) 2015-12-18 2023-09-19 The Scripps Research Institute Production of unnatural nucleotides using a CRISPR/Cas9 system
DK3475295T3 (da) 2016-06-24 2022-10-24 Scripps Research Inst Hidtil ukendt nukleosidtriphosphat-transportør og anvendelser deraf
MA49716A (fr) 2017-07-11 2021-04-07 Scripps Research Inst Incorporation de nucléotides non naturels et procédés d'utilisationin vivo
JP7429642B2 (ja) 2017-12-29 2024-02-08 ザ スクリプス リサーチ インスティテュート 非天然塩基対組成物および使用の方法
WO2020252262A1 (en) 2019-06-14 2020-12-17 The Scripps Research Institute Reagents and methods for replication, transcription, and translation in semi-synthetic organisms
EP4041247A4 (en) 2019-09-30 2024-03-06 The Scripps Research Institute Eukaryotic semi-synthetic organisms
TW202128996A (zh) * 2019-10-10 2021-08-01 美商史基普研究協會 用於活體內合成非天然多肽的組合物及方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016531122A (ja) 2013-08-08 2016-10-06 ザ スクリップス リサーチ インスティテュートＴｈｅ Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ 非天然ヌクレオチドの取り込みによるインビトロの核酸の部位特異的な酵素標識のための方法
WO2019014267A1 (en) 2017-07-11 2019-01-17 Synthorx, Inc. INCORPORATION OF NON-NATURAL NUCLEOTIDES AND ASSOCIATED METHODS

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MOREAU, C. et al，CD38 Structure-Based Inhibitor Design Using the N1-Cyclic Inosine 5'-Diphosphate Ribose Template，PLOS ONE，2013年，Vol.8, Issue6，e66247

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