JP7727551B2

JP7727551B2 - 構造的に安定化されたペプチドによるユビキチンおよびユビキチン様ｅ１活性化酵素の選択的標的化

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Publication number: JP7727551B2
Application number: JP2021561702A
Authority: JP
Inventors: ローレンディー．ワレンスキー，; アンモーガンカスカート，; グレゴリーエイチ．バード，
Original assignee: デイナファーバーキャンサーインスティチュート，インコーポレイテッド
Priority date: 2019-04-18
Filing date: 2020-04-17
Publication date: 2025-08-21
Anticipated expiration: 2040-04-17
Also published as: JP2022530853A; CN114026113A; AU2020258482A1; US20250368694A1; US20220169688A1; CA3135115A1; JP2025108647A; WO2020215005A1; EP3962933A1; US12358960B2

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年４月１８日に出願した米国仮特許出願第６２／８３５，７２１号の優先権の利益を主張し、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
連邦政府から資金提供を受けた研究に関する記載

本発明は、国立衛生研究所から授与された助成金番号Ｒ３５ＣＡ１９７５８３およびＦ３０ＣＡ２２１０８７の下で、政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
配列表への言及

本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含有し、ここに参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０２０年４月１７日に作成され、００５３０－０３４８ＷＯ１＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、７２０，８９６バイトのサイズである。
技術分野

本開示は、ユビキチンおよびユビキチン様Ｅ１活性化酵素を標的とする構造的に安定化されたペプチド、ならびにがんおよび病的細胞の生存に関わる他の疾患の処置において、このようなペプチドを使用するための方法に関する。

ユビキチン－プロテアソームシステム（ＵＰＳ）は、細胞内タンパク質分解を担う高度に調節された酵素ネットワークである。ユビキチン活性化酵素（Ｅ１）は、ユビキチン結合酵素（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇｅｎｚｙｍｅ）（Ｅ２）へのユビキチン（Ｕｂ）の受け渡しを触媒する。Ｅ１は、最初に、ＵｂのＣ末端のアデニル化を触媒し、次いで、ＵｂのＣ末端とＥ１の触媒システインとの間の高エネルギーチオエステル結合を形成することによって、Ｕｂを活性化する。次いで、Ｅ１は、Ｅ２に結合し、ＵｂをＥ１の触媒システインからＥ２の触媒システインに転移することによって、Ｅ２への受け渡しを行う。Ｅ２は、次に、ユビキチンリガーゼ（Ｅ３）および基質タンパク質と複合体を形成し、ＵｂのＣ末端のカルボキシル基を共有結合により基質タンパク質に転移する。標的タンパク質に対する単一および複数のＵｂ結合の多様な構成は、タンパク質の機能を調節しタンパク質をプロテアソーム分解の標的とする複雑なコードを表す。Ｅ３活性をリダイレクトする免疫調節イミド薬（ＩＭｉＤ）およびプロテアソーム阻害剤（例えば、多発性骨髄腫に関するボルテゾミブ）を含む、ＵＰＳを標的とするいくつかの薬物が、多発性骨髄腫およびマントル細胞リンパ腫において臨床的に成功している。

ヒトゲノムは、６００種類を超えるユビキチンＥ３酵素、おおまかに４０種のユビキチンＥ２酵素、および２種のみのユビキチンＥ１酵素、すなわちＵＢＡ１およびＵＢＡ６を含有する。ＵＢＡ６は、１つのユビキチンＥ２（ＵＳＥ１）のみに対するＥ１であるが、ＵＢＡ１は、他のユビキチンＥ２すべてに対するＥ１であり、それに対応して細胞ユビキチンの９９％より多くを活性化する（Jin et al., Nature, 447: 1135-1138 (2007)）。ＵＰＳシステム全体は、ほぼ完全にＵＢＡ１に依拠するため、ＵＢＡ１の阻害によって、通常分解される基質の安定化、小胞体ストレス、および細胞周期停止がもたらされる（Hyer et al., Nature Medicine, 24(2):186-193 (2018)）。臨床グレードのＵＢＡ１阻害剤であるＴＡＫ２４３／ＭＬＮ７２４３が開発され、固形腫瘍および多発性骨髄腫の前臨床マウスモデルにおいて高度に有効であることが示されており（Hyer et al., Nature Medicine, 24(2):186-193 (2018)）、進行性固形腫瘍に関する第１相臨床試験を最近になって完了させた（ＮＣＴ０２０４５０９５）。しかし、ごく最近の研究によって、薬物の作用機序に対する点変異に基づく耐性機序が特定され（Barghout et al., Leukemia, 2018 Jun 8. doi: 10.1038/s41375-018-0167-0）、Ｅ１酵素の標的化阻害に関する潜在的な代替様式に対する必要性およびその新規性が強調されている。

ユビキチンシステムと並行して、いくつかの他のユビキチン様タンパク質（ＵＢＬ）は、基質タンパク質に共有結合し、種々の運命に向けてのシグナルとなる。これらのＵＢＬは、それら自体の活性化酵素および結合酵素を有する。ユビキチン結合システムに対して最も高い相同性を示すＵＢＬには、ＮＥＤＤ８およびＳＵＭＯが含まれる（Hochstrasser, Nature, 458: 422-429 (2009)）。ＮＥＤＤ８およびＳＵＭＯに対するＥ１は、それぞれ、ヘテロ二量体複合体であるＵＢＡ３－ＮＡＥ１およびＵＢＡ２－ＳＡＥ１である。ＭＬＮ７２４３に類似する機序を有するＵＢＡ３－ＮＡＥ１（ＭＬＮ４９２４／ペボネジスタット）およびＵＢＡ２－ＳＡＥ１（ＭＬ－７９２）の阻害剤が開発されている（Soucy et al., Nature, 458(7239):732-736 (2009)；He et al., Nat Chem Biol., 13(11):1164-1171 (2017)）。ＮＥＤＤ８は、カリン－ＲＩＮＧユビキチンＥ３リガーゼの活性を制御し、それに対応して、ＭＬＮ４９２４は、カリン－ＲＩＮＧ媒介性タンパク質代謝回転の阻害によって、その治療効果を発揮する。ＳＵＭＯは、有糸分裂の調節を含む複数の細胞の役割を有し、実際に、ＭＬ－７９２は、有糸分裂の混乱を引き起こす。両分子は、ｉｎｖｉｔｒｏで、強力な抗がん活性を示し、ＭＬＮ４９２４は、現在、固形腫瘍および血液悪性腫瘍に関する複数の第２相および第３相試験中である（ＮＣＴ０３２６８９５４、ＮＣＴ０２６１０７７７、ＮＣＴ０３２２８１８６、ＮＣＴ０３２３８２４８、ＮＣＴ０３３３０８２１、ＮＣＴ０３３１９５３７）。
ＭＬＮ７２４３、ＭＬＮ４９２４、およびＭＬ－７９２は、それぞれ、ＵＢＡ１、ＵＢＡ３、およびＵＢＡ２のＡＴＰ結合部位に結合するアデノシルスルファメート（ａｄｅｎｏｓｙｌｓｕｌｆａｍａｔｅ）である。ＡＴＰ競合阻害剤に対するがん細胞耐性は、標的酵素ＡＴＰ結合部位での、またはその周辺での変異によって発生することが多く（Krishnamurty and Maly, ACS Chem Biol., 5(1):121-138 (2010)）；実際に、がん細胞における選択圧によって、ＵＢＡ３^{Ａ１７１Ｔ}、ＵＢＡ３^{Ａ１７１Ｄ}、ＵＢＡ３^{Ｉ３１０Ｎ}、およびＵＢＡ３^{Ｙ３５２Ｈ}を含むＵＢＡ３の変異体バージョンを発現するクローン集団の正の選択を介して、経時的にＭＬＮ４９２４感度の低下をもたらす（Milhollen et al., Cancer Cell, 21(3):388-401 (2012）；Toth et al., Cell Rep., 1(4):309-316 (2012)；Xu et al., PLoS One, 9(4):e93530 (2014)）。ＵＢＡ１^{Ａ５８０Ｔ}、ＵＢＡ１^{Ａ５８０Ｓ}、およびＵＢＡ１^{Ｙ５８３Ｃ}は、同様に、ＭＬＮ７２４３に耐性であり（Misra et al., Structure, 25(7): 1120-1129 (2017)、Barghout et al., Leukemia, 2018 Jun 8. doi: 10.1038/s41375-018-0167-0）、ＵＢＡ２^{Ｓ９５Ｎ，Ｍ９７Ｔ}は、ＭＬ－７９２に耐性である（He et al., Nat Chem Biol., 13(11):1164-1171 (2017)）。よって、これらの阻害剤の初期の成功にも関わらず、活性部位変異による耐性の明らかな脅威によって、血液悪性腫瘍および固形腫瘍の処置に関するこれらの酵素の代替の阻害様式の開発が必要とされる。今日までに、ユビキチンＥ１活性化酵素阻害の代替様式を示す他の薬物リード化合物は開発されていない。

Jin et al., Nature, 447: 1135-1138 (2007) Hyer et al., Nature Medicine, 24(2):186-193 (2018) Barghout et al., Leukemia, 2018 Jun 8. doi: 10.1038/s41375-018-0167-0 Soucy et al., Nature, 458(7239):732-736 (2009) He et al., Nat Chem Biol., 13(11):1164-1171 (2017) Krishnamurty and Maly, ACS Chem Biol., 5(1):121-138 (2010)

したがって、これらのユビキチンおよびユビキチン様活性化酵素の新たな阻害剤に対する需要が存在する。

Ｅ１は、最初に、ＵｂのＣ末端のアデニル化を触媒し、次いで、ＵｂのＣ末端とＥ１の触媒システインとの間の高エネルギーチオエステル結合を形成することによって、Ｕｂを活性化する。次いで、Ｅ１は、Ｅ２に結合し、ＵｂをＥ１の触媒システインからＥ２の触媒システインに転移することによって、Ｅ２への受け渡しを行う。Ｅ２は、次に、ユビキチンリガーゼ（Ｅ３）および基質タンパク質と複合体を形成し、ＵｂのＣ末端のカルボキシル基を共有結合により基質タンパク質に転移する。Ｅ１とＥ２との間の相互作用は、タンパク質表面積の３０００Å^２を埋め、そのうちの１０００Å^２は、Ｅ２のヘリックスＡ（Ｅ２ｈＡ）とＥ１ユビキチンフォールドドメイン（Ｅ１ＵＦＤ）との間の界面に埋もれている。Ｅ１とＥ２ｈＡとの間の相互作用は、Ｅ１－Ｅ２遭遇複合体（ｅｎｃｏｕｎｔｅｒｃｏｍｐｌｅｘ）の形成において重要である。本開示は、例えば、Ｅ１－Ｅ２相互作用の競合的阻害によって（例えば、表１～５のＥ１およびＥ２を参照されたい）、Ｅ１の直接的阻害剤として作用し得る、Ｅ２ｈＡを模倣する、構造的に安定化された（例えば、ステープル化（stapled））アルファ－ヘリックスペプチド（例えば、配列番号１～３７、３９、５５～６３、または７９２～８０６のステープル化バージョン（stapled version））を提供する。ある特定の態様では、構造的に安定化された（例えば、ステープル化）Ｅ２ｈＡペプチドは、Ｅ１ＵＦＤ（例えば、配列番号８４５のアミノ酸９５０～１０５８；配列番号８４６のアミノ酸４４４～５５２；配列番号８４７のアミノ酸４４５～５６１；配列番号８４８のアミノ酸９５０～１０５２；または配列番号８４９のアミノ酸９１１～１０１２）に結合する。一部の場合には、構造的に安定化された（例えば、ステープル化）Ｅ２ｈＡペプチドは、配列番号１～３７、３９、５５～６３、または７９２～８０６のいずれか１つの中に１～１０（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０）個のアミノ酸置換を有する。ある特定の例では、ペプチドまたは構造的に安定化されたペプチド内にメチオニンが存在する場合、メチオニンはノルロイシンで置換されている。一部の場合には、構造的に安定化された（例えば、ステープル化）ペプチドは、Ｎ末端またはＣ末端に１～５個の欠失を有する。これらの構造的に安定化されたバリアントＥ２ｈＡペプチドは、Ｅ１－Ｅ２相互作用を阻害する。一部の場合には、これらのペプチドは、用量依存的に、Ｅ２へのＥ１媒介性チオエステル転移を阻害する。本開示は、同族Ｅ１に共有結合により結合し得る、本明細書に記載の安定化された（例えば、ステープル化）Ｅ２ｈＡペプチドの弾頭部（ｗａｒｈｅａｄ）を有するバージョンも提供する。本開示は、Ｅ１に依存するがんおよび／またはＥ１を発現するがん（例えば、血液悪性腫瘍、固形腫瘍、または以下の本明細書に記載の他の特定のがん）ならびに病的細胞の生存に関わる他の疾患（例えば、抗体媒介性移植拒絶、自己免疫障害、または炎症性障害）の処置において、単独で、または他の治療剤と組み合わせて、このような安定化されたペプチド（またはその弾頭部を有するバージョン）を使用するための方法も特徴とする。

構造的安定化（例えば、内部架橋、例えば、ステープリング）を本明細書に記載のＥ２ｈＡペプチドに導入するための修飾は、（ｉ）Ｅ２ｈＡの同族Ｅ１酵素との直接相互作用に関与しないＥ２ｈＡの面、（ｉｉ）Ｅ２ｈＡの極性面と非極性面の界面、および／または（ｉｉｉ）Ｅ２ｈＡの同族Ｅ１酵素と直接相互作用するＥ２ｈＡの面に位置し得る。ある特定の例では、本明細書に記載の構造的に安定化された（例えば、内部で架橋した、例えば、ステープル化）Ｅ２ｈＡペプチドは、１個または複数（例えば、１、２、３、４、５個）の追加のアミノ酸置換（野生型Ｅ２ｈＡペプチド配列と比較して）、例えば、１個または複数（例えば、１、２、３、４、５個）の保存的および／または非保存的アミノ酸置換（すなわち、Ｅ２ｈＡに構造的安定化を付与するためになされるアミノ酸置換に加えて、１個または複数のアミノ酸置換）も含有し得る。ある特定の例では、ペプチドまたは構造的に安定化されたペプチド内にメチオニンが存在する場合、メチオニンはノルロイシンで置換されている。ある特定の例では、これらの追加の置換は、Ｅ２ｈＡの同族Ｅ１酵素と直接相互作用するアミノ酸置換である。ある特定の例では、これらの追加の置換は、Ｅ２ｈＡの同族Ｅ１酵素との直接相互作用に関与しないアミノ酸置換である。ある特定の例では、これらの追加の置換は、Ｅ２ｈＡの同族Ｅ１酵素と直接相互作用するアミノ酸と、Ｅ２ｈＡの同族Ｅ１酵素との直接相互作用に関与しないアミノ酸の両方の置換である。ある特定の例では、本明細書に記載の構造的に安定化された（例えば、内部で架橋した、例えば、ステープル化）Ｅ２ｈＡペプチドは、Ｅ２ｈＡのＮ末端および／またはＣ末端からの１個または複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個）の欠失を含有し得る。例えば、構造的に安定化された（例えば、内部で架橋した、例えば、ステープル化）Ｅ２ｈＡペプチドは、５またはそれより多い（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４１５、１６）アミノ酸長であり得る。ある特定の例では、構造的に安定化された（例えば、内部で架橋した、例えば、ステープル化）Ｅ２ｈＡペプチドは、５～１１アミノ酸長である。ある特定の例では、構造的に安定化された（例えば、内部で架橋した、例えば、ステープル化）Ｅ２ｈＡペプチドは、５～１６アミノ酸長である。ある特定の例では、構造的に安定化された（例えば、内部で架橋した、例えば、ステープル化）Ｅ２ｈＡペプチドは、１１～１６アミノ酸長である。

よって、０～１０（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０）個のアミノ酸置換を有する配列番号１３２の配列の少なくとも８個の連続アミノ酸のアミノ酸配列を含むペプチドが、本明細書において提供される。ある特定の実施形態では、置換は、存在する場合、配列番号１３２の５および１２位にはない。ある特定の実施形態では、ペプチドは、ヒトＥ１－ヒトＥ２相互作用を阻害する。ある特定の実施形態では、ペプチドは、ヒトＥ２へのヒトＥ１媒介性チオエステル転移を阻害する。ある特定の実施形態では、５位はＲ－オクテニルアラニンであり、１２位はＳ－ペンテニルアラニンである。ペプチドの塩も本明細書において提供される。一部の例では、塩は、酢酸塩、硫酸塩、または塩化物である。

ある特定の実施形態では、ペプチドは、１～１０（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０）個のアミノ酸置換を有し、置換は、配列番号１３２の７および９位、または７もしくは９位にはない。ある特定の実施形態では、ペプチドは、１～１０個のアミノ酸置換を有し、置換は、配列番号１３２の７、９、１０、１３、および１６位の１個または複数（例えば、１、２、３、４、５個）にはない。ある特定の実施形態では、ペプチドは、１～１０個のアミノ酸置換を有し、置換は、配列番号１３２の７、９、１０、１３、および１６位の１個または複数にあり、置換は、これらの位置の１個または複数におけるアラニンへの置換である。ある特定の実施形態では、ペプチドは、１～１０個のアミノ酸置換を有し、置換は、配列番号１３２の１、２、３、４、６、８、１１、１３、１４、１５、１６、または１７位の１個または複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個）にある。一部の場合には、これらの位置は、アラニンに置換されている。一部の場合には、配列番号１３２の６および８位、または６もしくは８位は、グルタミン酸に置換されている。ある特定の実施形態では、ペプチドは、１～１０個のアミノ酸置換を有し、置換は、配列番号１３２の６または８位の１個または複数を含む。一部の場合には、これらの位置は、グルタミン酸に置換されている。ある特定の実施形態では、ペプチドは、ヒトＥ１内のシステイン残基と共有結合を形成することができる反応性基をさらに含み、必要に応じて、反応性基は、Ｎ末端に求電子性基または求電子性化学的キャップを有する非天然アミノ酸である。反応性基は、配列番号１３２のＮ～Ｃまたはその中に存在し得る（すなわち、Ｎ末端とＣ末端との間のアミノ酸は、Ｎ末端の求電子性基または求電子性化学的キャップを有する非天然アミノ酸で置換され得る）。

ある特定の実施形態では、ペプチドは、８～５０、８～４０、８～３０、８～２５、８～２０、８～１７、１０～５０、１０～４０、１０～３０、１０～２５、１０～２０、１０～１７、１５～５０、１５～４０、１５～３０、１５～２５、１５～２０、１５～１７、１７～５０、１７～４０、１７～３０、１７～２５、１７～２０、または８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５アミノ酸長である。ある特定の実施形態では、ペプチドまたはその塩は、内部で架橋している。一部の場合には、オレフィン側鎖を含む非天然アミノ酸の側鎖は、連結している。

ペプチドまたはその塩であって、ペプチドが、Ｎ末端からＣ末端に、以下の残基：
Ｘａａ１＝Ｂ、Ａ（Ｂは、ノルロイシンであるか、または存在しない）；
Ｘａａ２＝Ｓ、Ａ、または存在しない；
Ｘａａ３＝Ｔ、Ａ、または存在しない；
Ｘａａ４＝Ｐ、Ａ、または存在しない；
Ｘａａ５＝ステープリングアミノ酸
Ｘａａ６＝Ｒ、Ｅ、またはＡ；
Ｘａａ７＝ＲまたはＡ；
Ｘａａ８＝Ｒ、Ｅ、またはＡ；
Ｘａａ９＝Ｌ、Ａ、またはヒトＥ１内のシステイン残基と共有結合を形成することができる反応性基（必要に応じて、反応性基はＮ末端に求電子性基または求電子性化学的キャップを有する非天然アミノ酸である）；
Ｘａａ１０＝ＢまたはＡ（Ｂは、ノルロイシンである）；
Ｘａａ１１＝ＲまたはＡ；
Ｘａａ１２＝ステープリングアミノ酸；
Ｘａａ１３＝Ｆ、Ａ、ヒトＥ１内のシステイン残基と共有結合を形成することができる反応性基（必要に応じて、反応性基はＮ末端に求電子性基または求電子性化学的キャップを有する非天然アミノ酸である）、または存在しない；
Ｘａａ１４＝Ｋ、Ｒ、Ａ、または存在しない；
Ｘａａ１５＝Ｒ、Ａ、または存在しない
Ｘａａ１６＝Ｌ、Ａ、または存在しない；および
Ｘａａ１７＝Ｑ、Ａ、または存在しない
を有する配列の少なくとも８個の連続するアミノ酸を含み、
ペプチドがヒトＥ１とヒトＥ２との間の相互作用を阻害する、ペプチドまたはその塩も、本明細書に開示される。一部の場合には、ペプチドは、ヒトＥ２へのヒトＥ１媒介性チオエステル転移を阻害する。

別の態様では、本開示は、１～１０（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）個のアミノ酸置換を有する配列番号６８０、７２７、７５２、８４１、８４２、または８４４のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドであって、これらのペプチドのステープル化位置（stapled position）（すなわち、オレフィン側鎖を含む非天然アミノ酸を有する位置）が置換されていない、ペプチドを特徴とする。一部の場合には、Ｅ１と直接相互作用することが予測される残基は、置換されていないか、またはアラニンもしくは保存的アミノ酸で置換されている。すべての他の残基は置換され得る。ある特定の例では、ペプチドまたは構造的に安定化されたペプチド内にメチオニンが存在する場合、メチオニンはノルロイシンで置換されている。これらのペプチドは、Ｅ１－Ｅ２相互作用を阻害する。一部の例では、これらは、用量依存的にＥ２へのＥ１媒介性チオエステル転移を阻害する。

構造的に安定化されたペプチドを作製する方法も本明細書において提供される。一部の例では、本方法は、本明細書に記載されているペプチドを得るステップと、ペプチドを架橋させるステップとを含む。一部の例では、架橋は、ＲＣＭ反応による。一部の例では、本方法は、架橋したペプチドを医薬組成物として製剤化するステップをさらに含む。

本明細書に開示されるいずれかのペプチドまたはその塩、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物も、本明細書において提供される。

それを必要とするヒト対象において、Ｅ１を発現する疾患またはＥ１に依存する疾患を処置する方法であって、ヒト対象に、本明細書に開示されるいずれかのペプチド、その塩、または医薬組成物の治療有効量を投与するステップを含む、方法も本明細書において提供される。一部の例では、Ｅ１を発現する疾患またはＥ１に依存する疾患は、がんである。一部の例では、Ｅ１を発現する疾患またはＥ１に依存する疾患は、血液悪性腫瘍、固形腫瘍、抗体媒介性移植拒絶、自己免疫障害、または炎症性障害である。一部の例では、ヒト対象は、Ｅ１を発現する疾患またはＥ１に依存する疾患を処置するための治療に対して、応答性でなかったか、または耐性を生じたことがある。

別の態様では、配列番号１～３３のいずれか１つのアミノ酸Ａ１～Ａ１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含むペプチドであって、Ａ１～Ａ１１アミノ酸の１個または複数が、別のアミノ酸によって置換されており、修飾されたアミノ酸配列が、少なくとも１個のペプチド構造を安定化させる修飾を含み、ペプチドが、ユビキチン活性化酵素１（ＵＢＡ１）に結合し、それを阻害する、ペプチドが、本明細書において提供される。

ある特定の実施形態では、ペプチド構造を安定化させる修飾は、配列番号１～３３のいずれか１つのアミノ酸Ａ_１～Ａ_１１に示される配列の少なくとも２個のアミノ酸の、非天然アミノ酸による置換を含み、非天然アミノ酸は、オレフィン側鎖を含む。

ある特定の実施形態では、ペプチド構造を安定化させる修飾は、炭化水素ステープル／ステッチ、ラクタムステープル／ステッチ；ＵＶ環化付加ステープル／ステッチ；オキシムステープル／ステッチ；チオエーテルステープル／ステッチ；ダブルクリックステープル／ステッチ；ビス－ラクタムステープル／ステッチ；ビス－アリール化ステープル／ステッチ；またはこれらのいずれか２つもしくはそれより多くの組合せである。ある特定の実施形態では、ペプチド構造を安定化させる修飾は、ステッチである。

ある特定の実施形態では、ペプチド構造を安定化させる修飾は、ステープルである。ある特定の実施形態では、ステープルは、アミノ酸配列における２個の位置の１個または複数に存在し、２個の位置は、ｉおよびｉ＋３、ｉおよびｉ＋４、ｉおよびｉ＋６、またはｉおよびｉ＋７である。ある特定の実施形態では、ステープルは、アミノ酸配列における２個の位置の１個または複数に存在し、２個の位置は、Ａ_２およびＡ_９、Ａ_５およびＡ_９、Ａ_８およびＡ_１２、Ａ_９およびＡ_１３、Ａ_１およびＡ_８、Ａ_４およびＡ_１１、ならびにＡ_５およびＡ_１２からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、ステープルは、２個の位置に存在し、２個の位置は、Ａ_２およびＡ_９である。ある特定の実施形態では、ステープルは、２個の位置のそれぞれにおいてアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換のそれぞれは、非天然アミノによる置換であり、非天然アミノ酸は、オレフィン側鎖（複数可）を含む。

第１の態様のペプチドが、オレフィン側鎖を含む非天然アミノ酸を含むある特定の実施形態では、オレフィン側鎖を含む非天然アミノ酸は、Ｓ－ペンテニルアラニン、Ｒ－オクテニルアラニン；Ｒ－プロペニルアラニン、Ｓ－ペンテニルアラニン；Ｒ－ペンテニルアラニン、Ｓ－ペンテニルアラニン；Ｂｉｓ－ペンテニルグリシン、Ｓ－ペンテニルアラニン、Ｒ－オクテニルアラニン；ならびにＢｉｓ－ペンテニルグリシン、Ｓ－オクテニルアラニン、およびＲ－オクテニルアラニンからなる群から選択される。

ある特定の実施形態では、（ａ）修飾されたアミノ酸配列は、配列番号４のアミノ酸Ａ_１～Ａ_１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号４のＡ_１、Ａ_２、Ａ_３、Ａ_５、Ａ_８、Ａ_９、およびＡ_１１からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸置換を含むか；（ｂ）修飾されたアミノ酸配列は、配列番号６のアミノ酸Ａ_１～Ａ_１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号６のＡ_１、Ａ_２、Ａ_３、Ａ_５、Ａ_８、Ａ_９、およびＡ_１１からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸置換を含むか；（ｃ）修飾されたアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸Ａ_１～Ａ_１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号１のＡ_１、Ａ_２、Ａ_３、Ａ_５、Ａ_８、Ａ_９、およびＡ_１１からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸置換を含むか；（ｄ）修飾されたアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸Ａ_１～Ａ_１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号２のＡ_１、Ａ_２、Ａ_３、Ａ_５、Ａ_８、Ａ_９、およびＡ_１１からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸置換を含むか；（ｅ）修飾されたアミノ酸配列は、配列番号３のアミノ酸Ａ_１～Ａ_１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号３のＡ_１、Ａ_２、Ａ_３、Ａ_５、Ａ_８、Ａ_９、およびＡ_１１からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸置換を含むか；（ｆ）修飾されたアミノ酸配列は、配列番号５のアミノ酸Ａ_１～Ａ_１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号５のＡ_１、Ａ_２、Ａ_３、Ａ_５、Ａ_８、Ａ_９、およびＡ_１１からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸置換を含むか；（ｇ）修飾されたアミノ酸配列は、配列番号７のアミノ酸Ａ_１～Ａ_１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号７のＡ_１、Ａ_２、Ａ_３、Ａ_５、Ａ_８、Ａ_９、およびＡ_１１からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸置換を含むか；（ｈ）修飾されたアミノ酸配列は、配列番号８のアミノ酸Ａ_１～Ａ_１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号８のＡ_１、Ａ_２、Ａ_３、Ａ_５、Ａ_８、Ａ_９、およびＡ_１１からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸置換を含むか；（ｉ）修飾されたアミノ酸配列は、配列番号９のアミノ酸Ａ_１～Ａ_１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号９のＡ_１、Ａ_２、Ａ_３、Ａ_５、Ａ_８、Ａ_９、およびＡ_１１からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸置換を含むか；（ｊ）修飾されたアミノ酸配列は、配列番号１０のアミノ酸Ａ_１～Ａ_１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号１０のＡ_１、Ａ_２、Ａ_３、Ａ_５、Ａ_８、Ａ_９、およびＡ_１１からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸置換を含むか；（ｋ）修飾されたアミノ酸配列は、配列番号１１のアミノ酸Ａ_１～Ａ_１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号１１のＡ_１、Ａ_２、Ａ_３、Ａ_５、Ａ_８、Ａ_９、およびＡ_１１からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸置換を含むか；（ｌ）修飾されたアミノ酸配列は、配列番号１２のアミノ酸Ａ_１～Ａ_１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号１２のＡ_１、Ａ_２、Ａ_３、Ａ_５、Ａ_８、Ａ_９、およびＡ_１１からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸置換を含むか；（ｍ）修飾されたアミノ酸配列は、配列番号１３のアミノ酸Ａ_１～Ａ_１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号１３のＡ_１、Ａ_２、Ａ_３、Ａ_５、Ａ_８、Ａ_９、およびＡ_１１からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸置換を含むか；（ｎ）修飾されたアミノ酸配列は、配列番号１４のアミノ酸Ａ_１～Ａ_１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号１４のＡ_１、Ａ_２、Ａ_３、Ａ_５、Ａ_８、Ａ_９、およびＡ_１１からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸置換を含むか；（ｏ）修飾されたアミノ酸配列は、配列番号１５のアミノ酸Ａ_１～Ａ_１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号１５のＡ_１、Ａ_２、Ａ_３、Ａ_５、Ａ_８、Ａ_９、およびＡ_１１からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸置換を含むか；（ｐ）修飾されたアミノ酸配列は、配列番号１６のアミノ酸Ａ_１～Ａ_１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号１６のＡ_１、Ａ_２、Ａ_３、Ａ_５、Ａ_８、Ａ_９、およびＡ_１１からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸置換を含むか；（ｑ）修飾されたアミノ酸配列は、配列番号１７のアミノ酸Ａ_１～Ａ_１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号１７のＡ_１、Ａ_２、Ａ_３、Ａ_５、Ａ_８、Ａ_９、およびＡ_１１からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸置換を含むか；（ｒ）修飾されたアミノ酸配列は、配列番号１８のアミノ酸Ａ_１～Ａ_１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号１８のＡ_１、Ａ_２、Ａ_３、Ａ_５、Ａ_８、Ａ_９、およびＡ_１１からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸置換を含むか；（ｓ）修飾されたアミノ酸配列は、配列番号１９のアミノ酸Ａ_１～Ａ_１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号１９のＡ_１、Ａ_２、Ａ_３、Ａ_５、Ａ_８、Ａ_９、およびＡ_１１からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸置換を含むか；（ｔ）修飾されたアミノ酸配列は、配列番号２０のアミノ酸Ａ_１～Ａ_１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号２０のＡ_１、Ａ_２、Ａ_３、Ａ_５、Ａ_８、Ａ_９、およびＡ_１１からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸置換を含むか；（ｕ）修飾されたアミノ酸配列は、配列番号２１のアミノ酸Ａ_１～Ａ_１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号２１のＡ_１、Ａ_２、Ａ_３、Ａ_５、Ａ_８、Ａ_９、およびＡ_１１からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸置換を含むか；（ｖ）修飾されたアミノ酸配列は、配列番号２２のアミノ酸Ａ_１～Ａ_１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号２２のＡ_１、Ａ_２、Ａ_３、Ａ_５、Ａ_８、Ａ_９、およびＡ_１１からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸置換を含むか；（ｗ）修飾されたアミノ酸配列は、配列番号２３のアミノ酸Ａ_１～Ａ_１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号２３のＡ_１、Ａ_２、Ａ_３、Ａ_５、Ａ_８、Ａ_９、およびＡ_１１からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸置換を含むか；（ｘ）修飾されたアミノ酸配列は、配列番号２４のアミノ酸Ａ_１～Ａ_１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号２４のＡ_１、Ａ_２、Ａ_３、Ａ_５、Ａ_８、Ａ_９、およびＡ_１１からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸置換を含むか；（ｙ）修飾されたアミノ酸配列は、配列番号２５のアミノ酸Ａ_１～Ａ_１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号２５のＡ_１、Ａ_２、Ａ_３、Ａ_５、Ａ_８、Ａ_９、およびＡ_１１からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸置換を含むか；（ｚ）修飾されたアミノ酸配列は、配列番号２６のアミノ酸Ａ_１～Ａ_１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号２６のＡ_１、Ａ_２、Ａ_３、Ａ_５、Ａ_８、Ａ_９、およびＡ_１１からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、２、３、４、もしくは５個のアミ
ノ酸置換を含むか；（ａａ）修飾されたアミノ酸配列は、配列番号２７のアミノ酸Ａ_１～Ａ_１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号２７のＡ_１、Ａ_２、Ａ_３、Ａ_５、Ａ_８、Ａ_９、およびＡ_１１からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸置換を含むか；（ｂｂ）修飾されたアミノ酸配列は、配列番号２８のアミノ酸Ａ_１～Ａ_１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号２８のＡ_１、Ａ_２、Ａ_３、Ａ_５、Ａ_８、Ａ_９、およびＡ_１１からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸置換を含むか；（ｃｃ）修飾されたアミノ酸配列は、配列番号２９のアミノ酸Ａ_１～Ａ_１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号２９のＡ_１、Ａ_２、Ａ_３、Ａ_５、Ａ_８、Ａ_９、およびＡ_１１からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸置換を含むか；（ｄｄ）修飾されたアミノ酸配列は、配列番号３０のアミノ酸Ａ_１～Ａ_１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号３０のＡ_１、Ａ_２、Ａ_３、Ａ_５、Ａ_８、Ａ_９、およびＡ_１１からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸置換を含むか；（ｅｅ）修飾されたアミノ酸配列は、配列番号３１のアミノ酸Ａ_１～Ａ_１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号３１のＡ_１、Ａ_２、Ａ_３、Ａ_５、Ａ_８、Ａ_９、およびＡ_１１からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸置換を含むか；（ｆｆ）修飾されたアミノ酸配列は、配列番号３２のアミノ酸Ａ_１～Ａ_１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号３２のＡ_１、Ａ_２、Ａ_３、Ａ_５、Ａ_８、Ａ_９、およびＡ_１１からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸置換を含むか；または（ｇｇ）修飾されたアミノ酸配列は、配列番号３３のアミノ酸Ａ_１～Ａ_１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号３３のＡ_１、Ａ_２、Ａ_３、Ａ_５、Ａ_８、Ａ_９、およびＡ_１１からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸置換を含む。

ある特定の実施形態では、（ａ）修飾されたアミノ酸配列は、配列番号４のアミノ酸Ａ_１～Ａ_１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号４のＡ_４、Ａ_６、Ａ_７、およびＡ_１０からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、もしくは２個の保存的アミノ酸置換を含むか；（ｂ）修飾されたアミノ酸配列は、配列番号６のアミノ酸Ａ_１～Ａ_１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号６のＡ_４、Ａ_６、Ａ_７、およびＡ_１０からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、もしくは２個の保存的アミノ酸置換を含むか；（ｃ）修飾されたアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸Ａ_１～Ａ_１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号１のＡ_４、Ａ_６、Ａ_７、およびＡ_１０からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、もしくは２個の保存的アミノ酸置換を含むか；（ｄ）修飾されたアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸Ａ_１～Ａ_１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号２のＡ_４、Ａ_６、Ａ_７、およびＡ_１０からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、もしくは２個の保存的アミノ酸置換を含むか；（ｅ）修飾されたアミノ酸配列は、配列番号３のアミノ酸Ａ_１～Ａ_１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号３のＡ_４、Ａ_６、Ａ_７、およびＡ_１０からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、もしくは２個の保存的アミノ酸置換を含むか；（ｆ）修飾されたアミノ酸配列は、配列番号５のアミノ酸Ａ_１～Ａ_１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号５のＡ_４、Ａ_６、Ａ_７、およびＡ_１０からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、もしくは２個の保存的アミノ酸置換を含むか；（ｇ）修飾されたアミノ酸配列は、配列番号７のアミノ酸Ａ_１～Ａ_１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号７のＡ_４、Ａ_６、Ａ_７、およびＡ_１０からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、もしくは２個の保存的アミノ酸置換を含むか；（ｈ）修飾されたアミノ酸配列は、配列番号８のアミノ酸Ａ_１～Ａ_１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号８のＡ_４、Ａ_６、Ａ_７、およびＡ_１０からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、もしくは２個の保存的アミノ酸置換を含むか；（ｉ）修飾されたアミノ酸配列は、配列番号９のアミノ酸Ａ_１～Ａ_１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号９のＡ_４、Ａ_６、Ａ_７、およびＡ_１０からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、もしくは２個の保存的アミノ酸置換を含むか；（ｊ）修飾されたアミノ酸配列は、配列番号１０のアミノ酸Ａ_１～Ａ_１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号１０のＡ_４、Ａ_６、Ａ_７、およびＡ_１０からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、もしくは２個の保存的アミノ酸置換を含むか；（ｋ）修飾されたアミノ酸配列は、配列番号１１のアミノ酸Ａ_１～Ａ_１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号１１のＡ_４、Ａ_６、Ａ_７、およびＡ_１０からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、もしくは２個の保存的アミノ酸置換を含むか；（ｌ）修飾されたアミノ酸配列は、配列番号１２のアミノ酸Ａ_１～Ａ_１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号１２のＡ_４、Ａ_６、Ａ_７、およびＡ_１０からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、もしくは２個の保存的アミノ酸置換を含むか；（ｍ）修飾されたアミノ酸配列は、配列番号１３のアミノ酸Ａ_１～Ａ_１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号１３のＡ_４、Ａ_６、Ａ_７、およびＡ_１０からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、もしくは２個の保存的アミノ酸置換を含むか；（ｎ）修飾されたアミノ酸配列は、配列番号１４のアミノ酸Ａ_１～Ａ_１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号１４のＡ_４、Ａ_６、Ａ_７、およびＡ_１０からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、もしくは２個の保存的アミノ酸置換を含むか；（ｏ）修飾されたアミノ酸配列は、配列番号１５のアミノ酸Ａ_１～Ａ_１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号１５のＡ_４、Ａ_６、Ａ_７、およびＡ_１０からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、もしくは２個の保存的アミノ酸置換を含むか；（ｐ）修飾されたアミノ酸配列は、配列番号１６のアミノ酸Ａ_１～Ａ_１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号１６のＡ_４、Ａ_６、Ａ_７、およびＡ_１０からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、もしくは２個の保存的アミノ酸置換を含むか；（ｑ）修飾されたアミノ酸配列は、配列番号１７のアミノ酸Ａ_１～Ａ_１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号１７のＡ_４、Ａ_６、Ａ_７、およびＡ_１０からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、もしくは２個の保存的アミノ酸置換を含むか；（ｒ）修飾されたアミノ酸配列は、配列番号１８のアミノ酸Ａ_１～Ａ_１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号１８のＡ_４、Ａ_６、Ａ_７、およびＡ_１０からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、もしくは２個の保存的アミノ酸置換を含むか；（ｓ）修飾されたアミノ酸配列は、配列番号１９のアミノ酸Ａ_１～Ａ_１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号１９のＡ_４、Ａ_６、Ａ_７、およびＡ_１０からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、もしくは２個の保存的アミノ酸置換を含むか；（ｔ）修飾されたアミノ酸配列は、配列番号２０のアミノ酸Ａ_１～Ａ_１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号２０のＡ_４、Ａ_６、Ａ_７、およびＡ_１０からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、もしくは２個の保存的アミノ酸置換を含むか；（ｕ）修飾されたアミノ酸配列は、配列番号２１のアミノ酸Ａ_１～Ａ_１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号２１のＡ_４、Ａ_６、Ａ_７、およびＡ_１０からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、もしくは２個の保存的アミノ酸置換を含むか；（ｖ）修飾されたアミノ酸配列は、配列番号２２のアミノ酸Ａ_１～Ａ_１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号２２のＡ_４、Ａ_６、Ａ_７、およびＡ_１０からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、もしくは２個の保存的アミノ酸置換を含むか；（ｗ）修飾されたアミノ酸配列は、配列番号２３のアミノ酸Ａ_１～Ａ_１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号２３のＡ_４、Ａ_６、Ａ_７、およびＡ_１０からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、もしくは２個の保存的アミノ酸置換を含むか；（ｘ）修飾されたアミノ酸配列は、配列番号２４のアミノ酸Ａ_１～Ａ_１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号２４のＡ_４、Ａ_６、Ａ_７、およびＡ_１０からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、もしくは２個の保存的アミノ酸置換を含むか；（ｙ）修飾されたアミノ酸配列は、配列番号２５のアミノ酸Ａ_１～Ａ_１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号２５のＡ_４、Ａ_６、Ａ_７、およびＡ_１０からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、もしくは２個の保存的アミノ酸置換を含むか；（ｚ）修飾されたアミノ酸配列は、配列番号２６のアミノ酸Ａ_１～Ａ_１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号２６のＡ_４、Ａ_６、Ａ_７、およびＡ_１０からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、もしくは２個の保存的アミノ酸置換を含むか；（ａａ）修飾されたアミノ酸配列は、配列番号２７のアミノ酸Ａ_１～Ａ_１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号２７のＡ_４、Ａ_６、Ａ_７、およびＡ_１０からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、もしくは２個の保存的アミノ酸置換を含むか；（ｂｂ）修飾されたアミノ酸配列は、配列番号２８のアミノ酸Ａ_１～Ａ_１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号２８のＡ_４、Ａ_６、Ａ_７、およびＡ_１０からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、もしくは２個の保存的アミノ酸置換を含むか；（ｃｃ）修飾されたアミノ酸配列は、配列番号２９のアミノ酸Ａ_１～Ａ_１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号２９のＡ_４、Ａ_６、Ａ_７、およびＡ_１０からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、もしくは２個の保存的アミノ酸置換を含むか；（ｄｄ）修飾されたアミノ酸配列は、配列番号３０のアミノ酸Ａ_１～Ａ_１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号３０のＡ_４、Ａ_６、Ａ_７、およびＡ_１０からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、もしくは２個の保存的アミノ酸置換を含むか；（ｅｅ）修飾されたアミノ酸配列は、配列番号３１のアミノ酸Ａ_１～Ａ_１１に示される配列
の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号３１のＡ_４、Ａ_６、Ａ_７、およびＡ_１０からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、もしくは２個の保存的アミノ酸置換を含むか；（ｆｆ）修飾されたアミノ酸配列は、配列番号３２のアミノ酸Ａ_１～Ａ_１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号３２のＡ_４、Ａ_６、Ａ_７、およびＡ_１０からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、もしくは２個の保存的アミノ酸置換を含むか；または（ｇｇ）修飾されたアミノ酸配列は、配列番号３３のアミノ酸Ａ_１～Ａ_１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号３３のＡ_４、Ａ_６、Ａ_７、およびＡ_１０からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、もしくは２個の保存的アミノ酸置換を含む。

ある特定の実施形態では、別のアミノ酸で置換されたアミノ酸Ａ_１～Ａ_１１の１つまたは複数は、配列番号１～３３のアミノ酸Ａ_１～Ａ_１１のＥ１と相互作用しない面に存在する。ある特定の実施形態では、配列番号１～３３の相互作用しない面は、アミノ酸Ａ_１、Ａ_２、Ａ_５、Ａ_８、Ａ_９、およびＡ_１２を含む。

ある特定の実施形態では、配列番号１～３３のいずれか１つのアミノ酸Ａ_１～Ａ_１１の相互作用しない面における０～６個のアミノ酸は、アラニン、Ｄ－アラニン、α－アミノイソ酪酸、Ｎ－メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている。

ある特定の実施形態では、アミノ酸Ａ_４、Ａ_６、Ａ_７、およびＡ_１０の１つまたは複数は、アルファ－メチル化またはアルファ－エチル化された天然アミノ酸で置換されている。ある特定の実施形態では、アミノ酸Ａ_４、Ａ_６、Ａ_７、およびＡ_１０の１つまたは複数は、Ｌ－アラニン、Ｄ－アラニン、α－アミノイソ酪酸、Ｎ－メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている。

ある特定の実施形態では、アミノ酸Ａ_１、Ａ_２、Ａ_３、Ａ_５、Ａ_８、Ａ_９、およびＡ_１１の１つまたは複数は、アルファ－メチル化またはアルファ－エチル化された天然アミノ酸で置換されている。ある特定の実施形態では、アミノ酸Ａ_１、Ａ_２、Ａ_３、Ａ_５、Ａ_８、Ａ_９、およびＡ_１１の１つまたは複数は、Ｌ－アラニン、Ｄ－アラニン、α－アミノイソ酪酸、Ｎ－メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている。

ある特定の実施形態では、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号４のアミノ酸Ａ_１～Ａ_１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含む。

ある特定の実施形態では、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号６のアミノ酸Ａ_１～Ａ_１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含む。

ある特定の実施形態では、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号１～３３のいずれか１つに示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、配列番号１～３３の１個または複数のアミノ酸は、Ｌ－アラニン、Ｄ－アラニン、α－アミノイソ酪酸、Ｎ－メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸（１個または複数）で置換されている。ある特定の実施形態では、配列番号１～３３の０～５個のアミノ酸は、Ｃ末端から除去されているか、または除去されて、アラニン、Ｄ－アラニン、α－アミノイソ酪酸、Ｎ－メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群からの１～６個のアミノ酸で置き換えられている。ある特定の実施形態では、別のアミノ酸で置換された配列番号１～３３の１個または複数のアミノ酸は、配列番号１～３３のアミノ酸のＥ１と相互作用しない面に存在する。ある特定の実施形態では、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号４に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号６に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含む。

ある特定の実施形態では、（ｉ）ペプチドの全体的な疎水性は、配列番号１～３３のペプチドと比較して低下しているか；（ｉｉ）ペプチドの全体的な正荷電は、配列番号１～３３のペプチドと比較して低下しているか；または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の組合せである。

ある特定の実施形態では、ペプチドは、配列番号１３２に示される配列を含む。ある特定の実施形態では、ペプチドは、配列番号１３３に示される配列を含む。ある特定の実施形態では、ペプチドは、配列番号１０７に示される配列を含む。ある特定の実施形態では、ペプチドは、配列番号５０に示される配列を含む。

さらに別の態様では、配列番号３５または３６に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含むペプチドであって、配列番号３５または３６の１個または複数のアミノ酸が、別のアミノ酸で置換されており、修飾されたアミノ酸配列が、少なくとも１個のペプチド構造を安定化させる修飾を含み、ペプチドが、ユビキチン活性化酵素３（ＵＢＡ３）に結合し、それを阻害する、ペプチドが、本明細書において提供される。

ある特定の実施形態では、ペプチド構造を安定化させる修飾は、配列番号３５または３６の配列の少なくとも２個のアミノ酸の、非天然アミノ酸による置換を含み、非天然アミノ酸は、オレフィン側鎖を含む。ある特定の実施形態では、ペプチド構造を安定化させる修飾は、炭化水素ステープル／ステッチ、ラクタムステープル／ステッチ；ＵＶ環化付加ステープル／ステッチ；オキシムステープル／ステッチ；チオエーテルステープル／ステッチ；ダブルクリックステープル／ステッチ；ビス－ラクタムステープル／ステッチ；ビス－アリール化ステープル／ステッチ；またはこれらのいずれか２つもしくはそれより多くの組合せである。ある特定の実施形態では、ペプチド構造を安定化させる修飾は、ステッチである。

ある特定の実施形態では、ペプチド構造を安定化させる修飾は、ステープルである。ある特定の実施形態では、ステープルは、アミノ酸配列における２個の位置の１個または複数に存在し、２個の位置は、ｉおよびｉ＋３、ｉおよびｉ＋４、またはｉおよびｉ＋７である。ある特定の実施形態では、ステープルは、２個の位置のそれぞれにおいてアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換のそれぞれは、非天然アミノによる置換であり、非天然アミノ酸は、オレフィン側鎖を含む。

ペプチドが、オレフィン側鎖を含む非天然アミノ酸を含むある特定の実施形態では、オレフィン側鎖を含む非天然アミノ酸は、Ｓ－ペンテニルアラニン、Ｒ－オクテニルアラニン；Ｒ－プロペニルアラニン、Ｓ－ペンテニルアラニン；Ｒ－ペンテニルアラニン、Ｓ－ペンテニルアラニン；Ｂｉｓ－ペンテニルグリシン、Ｓ－ペンテニルアラニン、Ｒ－オクテニルアラニン；ならびにＢｉｓ－ペンテニルグリシン、Ｓ－オクテニルアラニン、およびＲ－オクテニルアラニンからなる群から選択される。

ある特定の実施形態では、（ａ）修飾されたアミノ酸配列は、配列番号３５の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号３５のＡｒｇ－１、Ａｒｇ－２、Ｓｅｒ－４、Ｖａｌ－５、Ａｒｇ－６、Ａｓｐ－７、Ｌｅｕ－９、Ｌｅｕ－１０、Ｇｌｕ－１３、Ａｌａ－１５、およびＧｌｕ－１６からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸置換を含むか、または（ｂ）修飾されたアミノ酸配列は、配列番号３６の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号３６のＬｙｓ－１、Ｓｅｒ－４、Ａｌａ－５、Ａｌａ－６、Ａｒｇ－９、Ｉｌｅ－１０、およびＡｓｐ－１３_４からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸置換を含む。

ある特定の実施形態では、（ａ）修飾されたアミノ酸配列は、配列番号３５の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号３５のＶａｌ－３、Ｌｙｓ－８、Ｖａｌ－１１、Ｌｙｓ－１２、およびＶａｌ－１４からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、もしくは２個の保存的アミノ酸置換を含むか、または（ｂ）修飾されたアミノ酸配列は、配列番号３６の修飾されたアミノ酸配列を含み、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号３６のＬｙｓ－２、Ａｌａ－３、Ｇｌｎ－７、Ｌｅｕ－８、Ｇｌｎ－１１、Ｌｙｓ－１２、Ｉｌｅ－１４、Ａｓｎ－１５、およびＧｌｕ－１６からなる群から選択される０、１、もしくは２個の保存的アミノ酸位置を含む。

ある特定の実施形態では、別のアミノ酸で置換された１個または複数のアミノ酸は、配列番号３５または３６のＥ１と相互作用しない面に存在する。ある特定の実施形態では、配列番号３５の相互作用しない面は、配列番号２５のアミノ酸Ａｒｇ－１、Ａｒｇ－２、Ｓｅｒ－４、Ｖａｌ－５、Ａｒｇ－６、Ａｓｐ－７、Ｌｅｕ－９、Ｌｅｕ－１０、Ｇｌｕ－１３、Ａｌａ－１５、およびＧｌｕ－１６を含み、配列番号３６の相互作用しない面は、配列番号３６のアミノ酸Ｌｙｓ－１、Ｓｅｒ－４、Ａｌａ－５、Ａｌａ－６、Ａｒｇ－９、Ｉｌｅ－１０、およびＡｓｐ－１３を含む。

ある特定の実施形態では、配列番号３５または３６の相互作用しない面における０～６個のアミノ酸は、アラニン、Ｄ－アラニン、α－アミノイソ酪酸、Ｎ－メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている。

ある特定の実施形態では、アミノ酸Ｂ_７、Ｂ_８、Ｂ_１１、Ｂ_１２、Ｂ_１５、およびＢ_１６の１つまたは複数は、アルファ－メチル化またはアルファ－エチル化された天然アミノ酸で置換されている。ある特定の実施形態では、アミノ酸Ｂ_７、Ｂ_８、Ｂ_１１、Ｂ_１２、Ｂ_１５、およびＢ_１６の１つまたは複数は、Ｌ－アラニン、Ｄ－アラニン、α－アミノイソ酪酸、Ｎ－メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている。

ある特定の実施形態では、アミノ酸Ｂ_１、Ｂ_２、Ｂ_３、Ｂ_４、Ｂ_５、Ｂ_６、Ｂ_９、Ｂ_１０、Ｂ_１３、およびＢ_１４の１つまたは複数は、アルファ－メチル化またはアルファ－エチル化された天然アミノ酸で置換されている。ある特定の実施形態では、アミノ酸Ｂ_１、Ｂ_２、Ｂ_３、Ｂ_４、Ｂ_５、Ｂ_６、Ｂ_９、Ｂ_１０、Ｂ_１３、およびＢ_１４の１つまたは複数は、Ｌ－アラニン、Ｄ－アラニン、α－アミノイソ酪酸、Ｎ－メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている。

ある特定の実施形態では、配列番号３５または３６の０～５個のアミノ酸は、Ｃ末端から除去されているか、または除去されて、アラニン、Ｄ－アラニン、α－アミノイソ酪酸、Ｎ－メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群からの１～６個のアミノ酸で置き換えられている。

ある特定の実施形態では、（ｉ）ペプチドの全体的な疎水性は、配列番号３５もしくは３６のペプチドと比較して低下しているか；（ｉｉ）ペプチドの全体的な正荷電は、配列番号３５もしくは３６のペプチドと比較して低下しているか；または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の組合せである。

第３の態様では、配列番号３７に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含むペプチドであって、配列番号３７の１個または複数のアミノ酸が、別のアミノ酸で置換されており、修飾されたアミノ酸配列が、少なくとも１個のペプチド構造を安定化させる修飾を含み、ペプチドが、ユビキチン活性化酵素２（ＵＢＡ２）に結合し、それを阻害する、ペプチドが、本明細書において提供される。

ある特定の実施形態では、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号３７のＡｌａ－１、Ａｒｇ－４、Ｌｅｕ－５、Ｇｌｕ－８、Ａｌａ－１１、Ｔｒｐ－１２、およびＡｓｐ－１５からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、２、３、４、または５個のアミノ酸置換を含む。

ある特定の実施形態では、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号３７のＬｅｕ－２、Ｓｅｒ－３、Ａｌａ－６、Ｇｌｎ－７、Ａｒｇ－９、Ｌｙｓ－１０、Ａｒｇ－１３、およびＬｙｓ－１４からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、または２個の保存的アミノ酸置換を含む。

ある特定の実施形態では、別のアミノ酸で置換された１個または複数のアミノ酸は、配列番号３７のＥ１と相互作用しない面に存在する。ある特定の実施形態では、配列番号３７の相互作用しない面は、配列番号３７のアミノ酸Ａｌａ－１、Ａｒｇ－４、Ｌｅｕ－５、Ｇｌｕ－８、Ａｌａ－１１、Ｔｒｐ－１２、およびＡｓｐ－１５を含む。

ある特定の実施形態では、配列番号３７の相互作用しない面における０～６個のアミノ酸は、アラニン、Ｄ－アラニン、α－アミノイソ酪酸、Ｎ－メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている。

ある特定の実施形態では、配列番号３７のアミノ酸Ｌｅｕ－２、Ｓｅｒ－３、Ａｌａ－６、Ｇｌｎ－７、Ａｒｇ－９、Ｌｙｓ－１０、Ａｒｇ－１３、およびＬｙｓ－１４の１つまたは複数は、アルファ－メチル化またはアルファ－エチル化された天然アミノ酸で置換されている。ある特定の実施形態では、配列番号３７のアミノ酸Ｌｅｕ－２、Ｓｅｒ－３、Ａｌａ－６、Ｇｌｎ－７、Ａｒｇ－９、Ｌｙｓ－１０、Ａｒｇ－１３、およびＬｙｓ－１４の１つまたは複数は、Ｌ－アラニン、Ｄ－アラニン、α－アミノイソ酪酸、Ｎ－メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている。

ある特定の実施形態では、配列番号３７のアミノ酸Ａｌａ－１、Ａｒｇ－４、Ｌｅｕ－５、Ｇｌｕ－８、Ａｌａ－１１、Ｔｒｐ－１２、およびＡｓｐ－１５の１つまたは複数は、アルファ－メチル化またはアルファ－エチル化された天然アミノ酸で置換されている。ある特定の実施形態では、配列番号３７のアミノ酸Ａｌａ－１、Ａｒｇ－４、Ｌｅｕ－５、Ｇｌｕ－８、Ａｌａ－１１、Ｔｒｐ－１２、およびＡｓｐ－１５の１つまたは複数は、Ｌ－アラニン、Ｄ－アラニン、α－アミノイソ酪酸、Ｎ－メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている。

ある特定の実施形態では、配列番号３７の０～５個のアミノ酸は、Ｃ末端から除去されているか、または除去されて、アラニン、Ｄ－アラニン、α－アミノイソ酪酸、Ｎ－メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群からの１～６個のアミノ酸で置き換えられている。

ある特定の実施形態では、（ｉ）ペプチドの全体的な疎水性は、配列番号３７のペプチドと比較して低下しているか；（ｉｉ）ペプチドの全体的な正荷電は、配列番号３７のペプチドと比較して低下しているか；または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の組合せである。

第４の態様では、配列番号３８に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含むペプチドであって、配列番号３８の１個または複数のアミノ酸が、別のアミノ酸で置換されており、修飾されたアミノ酸配列が、少なくとも１個のペプチド構造を安定化させる修飾を含み、ペプチドが、ユビキチン活性化酵素６（ＵＢＡ６）に結合し、それを阻害する、ペプチドが、本明細書において提供される。

ある特定の実施形態では、ペプチド構造を安定化させる修飾は、配列番号３８の配列の少なくとも２個のアミノ酸の、非天然アミノ酸による置換を含み、非天然アミノ酸は、オレフィン側鎖を含む。ある特定の実施形態では、ペプチド構造を安定化させる修飾は、炭化水素ステープル／ステッチ、ラクタムステープル／ステッチ；ＵＶ環化付加ステープル／ステッチ；オキシムステープル／ステッチ；チオエーテルステープル／ステッチ；ダブルクリックステープル／ステッチ；ビス－ラクタムステープル／ステッチ；ビス－アリール化ステープル／ステッチ；またはこれらのいずれか２つもしくはそれより多くの組合せである。ある特定の実施形態では、ペプチド構造を安定化させる修飾は、ステッチである。

ある特定の実施形態では、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号３８のＭｅｔ－１、Ａｌａ－２、Ａｌａ－３、Ｓｅｒ－４、Ｌｅｕ－６、Ａｓｎ－９、Ｌｅｕ－１０、Ａｒｇ－１２、Ｌｅｕ－１３、Ｓｅｒ－１５、Ａｒｇ－１６、およびＣｙｓ－１７からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、２、３、４、または５個のアミノ酸置換を含む。

ある特定の実施形態では、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号３８のＡｒｇ－５、Ｇｌｕ－７、Ｌｅｕ－８、Ｖａｌ－１１、およびＬｅｕ－１４からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、または２個の保存的アミノ酸置換を含む。

ある特定の実施形態では、別のアミノ酸で置換された１個または複数のアミノ酸は、配列番号３８のＥ１と相互作用しない面に存在する。ある特定の実施形態では、配列番号３８の相互作用しない面は、配列番号３８のアミノ酸Ｍｅｔ－１、Ａｌａ－２、Ａｌａ－３、Ｓｅｒ－４、Ｌｅｕ－６、Ａｓｎ－９、Ｌｅｕ－１０、Ａｒｇ－１２、Ｌｅｕ－１３、Ｓｅｒ－１５、Ａｒｇ－１６、およびＣｙｓ－１７を含む。

ある特定の実施形態では、配列番号３８の相互作用しない面における０～６個のアミノ酸は、アラニン、Ｄ－アラニン、α－アミノイソ酪酸、Ｎ－メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている。

ある特定の実施形態では、配列番号３８のアミノ酸Ａｒｇ－５、Ｇｌｕ－７、Ｌｅｕ－８、Ｖａｌ－１１、およびＬｅｕ－１４の１つまたは複数は、アルファ－メチル化またはアルファ－エチル化された天然アミノ酸で置換されている。ある特定の実施形態では、配列番号３８のアミノ酸Ａｒｇ－５、Ｇｌｕ－７、Ｌｅｕ－８、Ｖａｌ－１１、およびＬｅｕ－１４の１つまたは複数は、Ｌ－アラニン、Ｄ－アラニン、α－アミノイソ酪酸、Ｎ－メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている。

ある特定の実施形態では、配列番号３８のアミノ酸Ｍｅｔ－１、Ａｌａ－２、Ａｌａ－３、Ｓｅｒ－４、Ｌｅｕ－６、Ａｓｎ－９、Ｌｅｕ－１０、Ａｒｇ－１２、Ｌｅｕ－１３、Ｓｅｒ－１５、Ａｒｇ－１６、およびＣｙｓ－１７の１つまたは複数は、アルファ－メチル化またはアルファ－エチル化された天然アミノ酸で置換されている。ある特定の実施形態では、配列番号３８のアミノ酸Ｍｅｔ－１、Ａｌａ－２、Ａｌａ－３、Ｓｅｒ－４、Ｌｅｕ－６、Ａｓｎ－９、Ｌｅｕ－１０、Ａｒｇ－１２、Ｌｅｕ－１３、Ｓｅｒ－１５、Ａｒｇ－１６、およびＣｙｓ－１７の１つまたは複数は、Ｌ－アラニン、Ｄ－アラニン、α－アミノイソ酪酸、Ｎ－メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている。

ある特定の実施形態では、配列番号３８の０～５個のアミノ酸は、Ｃ末端から除去されているか、または除去されて、アラニン、Ｄ－アラニン、α－アミノイソ酪酸、Ｎ－メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群からの１～６個のアミノ酸で置き換えられている。

ある特定の実施形態では、（ｉ）ペプチドの全体的な疎水性は、配列番号３８のペプチドと比較して低下しているか；（ｉｉ）ペプチドの全体的な正荷電は、配列番号３８のペプチドと比較して低下しているか；または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の組合せである。

第５の態様では、第１の態様のペプチドの誘導体であって、求電子性弾頭部を含む、ペプチド誘導体が、本明細書において提供される。ある特定の実施形態では、求電子性弾頭部は、アミノ酸位置Ａ_７、Ａ_８、またはＡ_１１に存在する。ある特定の実施形態では、求電子性弾頭部は、ペプチドのＮ末端に存在する。ある特定の実施形態では、求電子性弾頭部は、ペプチドのＮ末端に存在しない。

ある特定の実施形態では、求電子性弾頭部は、求電子性基を有する非天然アミノ酸である。ある特定の実施形態では、求電子性基を有する非天然アミノ酸は、ポリペプチド骨格に連結した求電子性アクリルアミドまたは置換されたアクリルアミドを有する。ある特定の実施形態では、求電子性基を有する非天然アミノ酸は、（Ｓ）－１－アクリロイルピロリジン－３－カルボキサミド；１－アクリロピぺリジン－４－カルボキサミド、（Ｒ）－１アクリロイルピぺリジン－３－カルボキサミド；（Ｓ）－１－アクリロイルピぺリジン－３－カルボキサミド；（Ｓ）－１－アクリロイルピロリジン（acryloylpyyrolidine）－２－カルボキサミド；（Ｒ）－１－アクリロイルピロリジン－２－カルボキサミド；（Ｅ）－４－（ジメチルアミノ）ブタ－２－エナミド；アクリルアミド；アジリジン、ジアジリジン、アゼチジン、ピロリジン、イミダゾリジン、ピラゾリジン、オキサゾリジン、イソキサゾリジン、チアゾリジン、イソチアゾリジン、ピぺリジン、ピペラジン、モルホリン、チオモルホリン、アゼパネアジリン（ａｚｅｐａｎｅａｚｉｒｉｎｅ）、ジアジリン、アゼト、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、チアゾール、イソチアゾール、ピリジン、ジアジン、オキサジン、チアジン、アゼピンフェニル（アニリン）；ナフタレン、アントラセン、フェナントレン、インドール、イソインドール、インドリジン、キノロン、イソキノリン、キノキサリン、フタルジン（phthalzine）、キナゾリン、プリン、カルバゾール、インダゾール、ベンズイミダゾール、アザインドール、α－シアノアクリルアミド、プロピオルアミド、ｔｒａｎｓ４－ジメチルアミノ－２－ブテンアミド、ｔｒａｎｓ４－ピペリジニル－２－ブテンアミド、置換アクリルアミド、およびビニル－スルホンアミドからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、求電子性弾頭部は、末端がブロモアセチルであるジアミノブタン酸または末端がアクリルアミドであるジアミノブタン酸である。ある特定の実施形態では、求電子性弾頭部は、システイン反応性Ｄ－ニペコチン酸部分である。ある特定の実施形態では、求電子性弾頭部は、システイン反応性部分である。

ある特定の実施形態では、誘導体は、配列番号３９２、４２８、４６４、５００、６８０、７１６、７５２、および７８８のいずれか１つに示される配列を含む。ある特定の実施形態では、誘導体は、配列番号６８０に示される配列を含む。ある特定の実施形態では、誘導体は、配列番号７５２に示される配列を含む。ある特定の実施形態では、誘導体は、配列番号３９３、４２９、４６５、５０１、６８１、７１７、７５３、および７８９のいずれか１つに示される配列を含む。ある特定の実施形態では、誘導体は、配列番号３６７、４０３、４３９、６５５、７２７、および７５７のいずれか１つに示される配列を含む。ある特定の実施形態では、誘導体は、配列番号７２７に示される配列を含む。ある特定の実施形態では、誘導体は、配列番号８３３～８３６および８４１～８４４のいずれか１つに示される配列を含む。ある特定の実施形態では、誘導体は、配列番号８４１に示される配列を含む。ある特定の実施形態では、誘導体は、配列番号８４２に示される配列を含む。ある特定の実施形態では、誘導体は、配列番号８４４に示される配列を含む。

ある特定の実施形態では、誘導体は、ＵＢＡ１に共有結合により結合する。

第６の態様では、第１から第４の態様のいずれか１つに記載のペプチドまたは第５の態様に記載の誘導体ペプチド、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物が、本明細書において提供される。

第７の態様では、それを必要とするヒト対象において、Ｅ１を発現する疾患またはＥ１に依存する疾患を処置する方法であって、ヒト対象に、第１から第４の態様のいずれか１つに記載のペプチド、第５の態様に記載の誘導体ペプチド、または第６の態様に記載の医薬組成物の治療有効量を投与するステップを含む、方法が本明細書において提供される。ある特定の実施形態では、Ｅ１を発現する疾患またはＥ１に依存する疾患は、がんである。ある特定の実施形態では、Ｅ１を発現する疾患またはＥ１に依存する疾患は、血液悪性腫瘍、固形腫瘍、抗体媒介性移植拒絶、自己免疫障害、または炎症性障害である。

第８の態様では、本開示は、ユビキチン活性化酵素（Ｅ１）とユビキチン結合酵素（Ｅ２）との間の相互作用を阻害するための手段を含む組成物を特徴とする。一部の例では、相互作用を阻害する手段は、Ｅ１とＥ２との間の相互作用を阻害する安定化された（例えば、ステープル化（stapled）、ステッチ化（stitched））ペプチドである。ある特定の場合には、相互作用を阻害するための手段は、Ｅ２ｈＡを模倣する安定化されたペプチドである（例えば、表１～６を参照されたい）。一部の例では、相互作用を阻害するための手段は、表７、８、もしくは９のペプチド、またはそのバリアントである。１つの場合には、相互作用を阻害するための手段は、ＵＢＥ２Ａ／ＵＢＥ２ＢＥ２ｈＡ（すなわち、配列番号４）に基づくステープルペプチド（stapled peptide）である安定化されたペプチドである。１つの場合には、相互作用を阻害するための手段は、ＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａ－１１（配列番号１３２）である安定化されたペプチドまたはそのバリアントである。１つの場合には、相互作用を阻害するための手段は、配列番号６５、９６、または１０１に示される配列を含む安定化されたペプチドまたはそのバリアントである。一部の例では、組成物は、医薬組成物であり、薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤を含む。

第９の態様では、本開示は、それを必要とするヒト対象において、Ｅ１を発現する疾患またはＥ１に依存する疾患を処置する方法を提供する。本方法は、ヒト対象に、ユビキチン活性化酵素（Ｅ１）とユビキチン結合酵素（Ｅ２）との間の相互作用を阻害するための手段を含む組成物の治療有効量を投与するステップを含む。一部の例では、相互作用を阻害するための手段は、Ｅ１とＥ２との間の相互作用を阻害する安定化された（例えば、ステープル化、ステッチ化）ペプチドである。ある特定の場合には、相互作用を阻害するための手段は、Ｅ２ｈＡを模倣する安定化されたペプチドである（例えば、表１～６を参照されたい）。一部の例では、相互作用を阻害するための手段は、表７、８、もしくは９のペプチド、またはそのバリアントである。１つの場合には、相互作用を阻害するための手段は、ＵＢＥ２Ａ／ＵＢＥ２ＢＥ２ｈＡ（すなわち、配列番号４）に基づくステープルペプチドである安定化されたペプチドである。１つの場合には、相互作用を阻害するための手段は、ＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａ－１１（配列番号１３２）である安定化されたペプチド、またはそのバリアントである。１つの場合には、相互作用を阻害するための手段は、配列番号６５、９６、または１０１に示される配列を含む安定化されたペプチド、またはそのバリアントである。一部の例では、組成物は、医薬組成物であり、薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤を含む。ある特定の例では、Ｅ１を発現する疾患またはＥ１に依存する疾患は、がんである。ある特定の例では、Ｅ１を発現する疾患またはＥ１に依存する疾患は、血液悪性腫瘍、固形腫瘍、抗体媒介性移植拒絶、自己免疫障害、炎症性障害、または病的細胞の生存に関わる疾患である。

図１Ａ～１Ｃは、ＵＢＡ１に結合するステープルペプチドの設計を示す図である。図１Ａは、ＵＢＡ１阻害剤ペプチド設計の構造基礎を図示する。Ｓ．ｐｏｍｂｅのＥ１酵素Ｕｂｅ１（ＰＤＢＩＤ：５ＫＮＬ）に結合するＥ２酵素Ｕｂｃ１５の結晶構造が示される。Ｕｂｃ１５はリボン図として示され、Ｕｂｅｌは表面図として示される。破線のボックスは、阻害剤ペプチドを設計するための基礎を形成するＥ２のアルファヘリックスを示す。図１Ｂ～１Ｃは、配列番号４０のアミノ酸５～１８に沿って、「ｉ＋４」ステープルウォーク（図１Ｂ；ステープル位置２～９）および「ｉ＋７」ステープルウォーク（図１Ｃ；ステープル位置１０～１５）を図示する。ホイール図は、アルファ－ヘリックスであることが予期されるペプチド部分を表し、Ｅ２ヘリックスＡ（ｈＡ）ペプチド残基は、１文字アミノ酸コードおよびその配列番号４０における位置によって示される。同上。

図２は、選択したＥ２ｈＡステープルペプチド（それぞれ、配列番号４０～５４に対応する１～１５）による、Ｅ２へのＥ１媒介性ユビキチン転移の阻害を示す図である。上のパネルは、３つの独立したバンドシフト実験の定量である。１つの代表的なバンドシフト実験を下のパネルに示す。

図３は、ステープルペプチドＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａ－１１（左のパネル）、ＳＡＨ－ＵＢＥ２Ｇ２－１１（真ん中のパネル）、およびＳＡＨ－ＵＢＥ２Ｄ２－１１（右のパネル）を含む、ヒトＥ２ｈＡのヘリックス部分における例示的なステープル位置を示す図である。

図４Ａおよび４Ｂは、ステープルペプチドＳＡＨ－Ｕｂｃ１５－１１（配列番号５０）、ＳＡＨ－ＵＢＥ２Ｇ２－１１（配列番号１３３）、ＳＡＨ－ＵＢＥ２Ｄ２－１１（配列番号１０７）およびＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａ－１１（配列番号１３２）が、示された効力の範囲で、Ｅ２へのＥ１媒介性チオエステル転移を用量依存的に阻害することを示す図である。図４Ａは、３つの独立した阻害実験を定量するグラフである。図４Ｂは、１つの代表的実験を示す。

図５は、非還元条件でＢｉｓ－Ｔｒｉｓタンパク質ゲルで泳動したｉｎｖｉｔｒｏチオエステル転移阻害アッセイ試料の銀染色を示す図である。多種多様な組換えヒトＥ１活性化タンパク質ＵＢＡ１、Ｅ２酵素、ユビキチン、Ｍｇ－ＡＴＰ、およびステープルペプチドＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａ－１１（配列番号１３２）またはＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａ－１１－Ｒ７Ｅ変異体対照ステープルペプチド（ＢＳＴＰＸ_１ＲＥＲＬＢＲＸ_２ＦＫＲＬＱ（配列番号１３３８）、「Ｘ_１」は、Ｓ－ペンテニルアラニンであり、「Ｘ_２」は、Ｒ－オクテニルアラニンである）に関して、ｉｎｖｉｔｒｏチオエステル転移阻害アッセイを実施した。遊離Ｅ２は１７ｋＤａで可視化され、Ｅ２～ユビキチンコンジュゲートは約２６ｋＤａで可視化される。各場合において、ＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａ－１１は、Ｅ１チオエステル転移活性を阻害し、これは、単一の点変異（Ｒ７Ｅ）によって軽減され、Ｅ１阻害活性の配列特異性を強調する。

図６Ａ～６Ｄは、どの残基が、アラニンスキャニング変異誘発によって決定される標的結合にとって重要であり、それに寄与しているかを特定する図である。図６Ａは、配列番号４のアミノ酸１～１７に対応するアミノ酸配列；ＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａ（配列番号１３２）；およびＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａ（配列番号１３２）の１番目（Ｂ１Ａ）、２番目（Ｓ２Ａ）、３番目（Ｔ３Ａ）、４番目（Ｐ４Ａ）、６番目（Ｒ６Ａ）、７番目（Ｒ７Ａ）、８番目（Ｒ８Ａ）、９番目（Ｌ９Ａ）、１０番目（Ｂ１０Ａ）、１１番目（Ｒ１１Ａ）、１３番目（Ｆ１３Ａ）、１４番目（Ｋ１４Ａ）、１５番目（Ｒ１５Ａ）、１６番目（Ｌ１６Ａ）、または１７番目（Ｑ１７Ａ）のアミノ酸に変異を有するバリアントＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａステープルペプチドの配列を示す。図６Ａは、出現順に、それぞれ、配列番号１３２１、１３２、および１３２２～１３３６を開示する。図６Ｂは、非還元条件でＢｉｓ－Ｔｒｉｓタンパク質ゲルで泳動したｉｎｖｉｔｒｏチオエステル転移阻害アッセイ試料の銀染色を示す。組換えヒトＥ１活性化タンパク質ＵＢＡ１、Ｅ２酵素、ユビキチン、Ｍｇ－ＡＴＰ、およびＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａ－１１ステープルペプチド変異体に関して、ｉｎｖｉｔｒｏチオエステル転移阻害アッセイを実施した。遊離Ｅ２は１７ｋＤａで可視化され、Ｅ２～ユビキチンコンジュゲートは約２６ｋＤａで可視化される。上のパネルは、下のパネルのバンドの定量である。図６Ｃは、アラニン変異誘発に基づいて、ペプチド阻害活性にとって特に重要であると特定されたアミノ酸位置の場所を示す。寄与アミノ酸の位置を黒色の星でマークする。図６Ｄは、予測したＵＢＡ１結合表面と比較した、重要なアミノ酸位置の場所を示す。ＵＢＡ１と直接相互作用することが予測されるアミノ酸位置を、ＵＢＡ１にドッキングしたＵＢＥ２Ａヘリックス１のモデル（ＰＤＢＩＤ：６ＤＣ６）に標識および黒色の星でマークする。同上。

図７Ａ～７Ｄは、荷電したＮ末端残基のどれが、電荷反転変異誘発によって決定される標的結合にとって重要であり、それに寄与するかを特定する図である。図７Ａは、配列番号４のアミノ酸１～１７に対応するアミノ酸配列；ＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａ－１１（配列番号１３２）、およびＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａ－１１（配列番号１３２）の６番目（Ｒ６Ｅ）、７番目（Ｒ７Ｅ）、または８番目（Ｒ８Ｅ）のアミノ酸にＲからＥへの置換を有するバリアントＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａ－１１ステープルペプチドの配列を示す。図７Ａは、出現順に、それぞれ、配列番号１３２１、１３２、および１３３７～１３３９を開示する。図７Ｂは、非還元条件でＢｉｓ－Ｔｒｉｓタンパク質ゲルで泳動したｉｎｖｉｔｒｏチオエステル転移阻害アッセイ試料の銀染色を示す。組換えヒトＥ１活性化タンパク質ＵＢＡ１、Ｅ２酵素、ユビキチン、Ｍｇ－ＡＴＰ、およびＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａ－１１ステープルペプチド変異体に関して、ｉｎｖｉｔｒｏチオエステル転移阻害アッセイを実施した。遊離Ｅ２は１７ｋＤａで可視化され、Ｅ２～ユビキチンコンジュゲートは約２６ｋＤａで可視化される。上のパネルは、下のパネルのバンドの定量である。図７Ｃは、ペプチド阻害活性にとって重要であると特定されたカチオン性アミノ酸位置の場所を示す（黒色の星でマークされる）。図７Ｄは、ＵＢＡ１にドッキングしたＵＢＥ２Ａヘリックス１のモデル（ＰＤＢＩＤ：６ＤＣ６）に標識および黒色の星でマークした、予測したＵＢＡ１結合表面と比較して、鍵となるカチオン性アミノ酸位置の場所を示す。同上。

図８は、ビオチン化ＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａおよび組換えＵＢＡ１を利用する、ストレプトアビジン－ビオチンプルダウン実験の銀染色されたタンパク質ゲルであり、ビオチン化ＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａの組換えＵＢＡ１への直接結合を示している。

図９Ａおよび図９Ｂは、蛍光偏光アッセイによって測定した、ＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａの組換えＵＢＡ１への直接結合を示すグラフである。図９Ａに示した実験は、ユビキチンおよびＡＴＰの非存在下で実施した。図９Ｂに示した実験は、ユビキチンおよびＡＴＰの存在下で実施した。

図１０は、ＳＡＨ－ＵＢＥ２ＡのＥ１への用量応答性結合（Ｅ２へは用量応答的に結合しない）の水素－重水素交換質量分光分析を示すグラフである。

図１１は、ビオチン化ＳＡＨ－ＵＢＥ２ＡおよびＨｅＬａ細胞溶解産物を利用し、ＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａの天然ＵＢＡ１への直接結合を示す、ストレプトアビジン－ビオチンプルダウン実験のウエスタンブロットである。

図１２は、ＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａによる細胞溶解産物中のユビキチン経路の阻害を示すウエスタンブロットである。ＨｅＬａ細胞の細胞質画分を、過剰なユビキチンおよびＡＴＰ再生溶液の存在下で、ＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａまたはビヒクル対照とインキュベートし、次いで、非還元ゲル電気泳動およびユビキチンに対するウエスタンブロッティングに供した。ＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａは、ビヒクル対照と比較して、ポリユビキチン鎖の形成を用量依存的に阻害した。

図１３は、アルファヘリックスであることが予期される配列番号３６（左のパネル）および配列番号３５（右のパネル）のペプチド部分のホイール図である。

図１４は、アルファヘリックスであることが予期される配列番号３７のペプチド部分のホイール図である。

図１５は、アルファヘリックスであることが予期される配列番号３８のペプチド部分のホイール図である。

図１６は、ｉｎｖｉｔｒｏ組換えユビキチン経路再構成アッセイのウエスタンブロットを示す図である。Ｅ１：ＵＢＡ１；Ｅ２：ＵＢＥ２ＡＥ３：ＨＤＭ２Ｕｂ：ユビキチン；ＤＵＢ：脱ユビキチン化酵素ＵＳＰ７；およびＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａ：配列番号１３２。ＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａは、Ｅ１（ＵＢＡ１）、Ｅ２（ＵＢＥ２Ａ）、Ｅ３（ＨＤＭ２）、ＵｂおよびＡＴＰと同時にインキュベートした場合に、ｐ５３のユビキチン化を阻害する。ｐ５３のユビキチン化は、ウエスタンブロットが抗ｐ５３抗体により展開される場合、タンパク質ラダーとして検出される。活性化されていないＥ２およびＵｂの代わりに予め活性化されたＥ２で置換することにより、ＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａの阻害活性が回避され、Ｅ２の活性化に対するＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａ阻害の特異性が実証される。脱ユビキチン化酵素（ＤＵＢ）ＵＳＰ７を反応混合物に添加することにより、ＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａの存在にかかわらず、タンパク質ラダーの喪失として検出されるｐ５３の脱ユビキチン化が生じ、これは、Ｅ２の活性化を阻害し、ユビキチンカスケードの他のステップでは見られないＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａの特異性をさらに実証する。

図１７は、ユビキチンコンジュゲートＵＢＡ１（ＵＢＡ１～Ｕｂ）からＵＢＡ１を解離させるために最適化された泳動時間で、非還元条件でＢｉｓ－Ｔｒｉｓタンパク質ゲルで泳動したｉｎｖｉｔｒｏチオエステル転移阻害アッセイ試料の銀染色を示す図である。ＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａ（配列番号１３２）は、ＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａの全濃度にわたり、チオエステル転移酵素アッセイの終了点でのＵＢＡ１、ＵＢＡ１～Ｕｂの二重線の存在によって実証されるように、Ｅ２へのチオエステル転移に先立つＵＢＡ１触媒サイクルにおける酵素ステップである、共有結合によるＵＢＡ１～Ｕｂチオエステル付加物を形成するＵＢＡ１の能力に影響を及ぼさない。

図１８は、非イオン性界面活性剤（０．０１％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００）の非存在下または存在下で、非還元条件でＢｉｓ－Ｔｒｉｓタンパク質ゲルで泳動したｉｎｖｉｔｒｏチオエステル転移阻害アッセイ試料の銀染色を示す図である。ＴｒｉｔｏｎＸ－１００のアッセイ緩衝液への添加は、ＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａ（配列番号１３２）の阻害活性に影響を及ぼさない。

図１９は、Ｎｉ－ＮＴＡアガロースビーズ（上の段）、Ｎｉ－ＮＴＡアガロースビーズおよびＨｉｓ－ＵＢＥ１（真ん中の段）、ならびにＮｉ－ＮＴＡアガロースビーズおよびＨｉｓ－ｐ５３（下の段）の存在下で、ＦＩＴＣ－ＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａ（配列番号１３２にコンジュゲートしたＦＩＴＣ）の、組換えＵＢＡ１への特異的直接結合を示す明視野および蛍光顕微鏡法による画像である。Ｎｉ－ＮＴＡアガロースビーズを使用して、関連しないタンパク質対照としてのＨｉｓタグ付きＵＢＥ１またはＨｉｓタグ付きｐ５３を捕捉し、その後、ＦＩＴＣ－ＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａとインキュベートした。ＦＩＴＣ－ＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａは、Ｈｉｓ－ＵＢＥ１の存在下でビーズに結合しただけであり（真ん中の段）、ビーズ（上の段）またはＨｉｓ－ｐ５３（下の段）には非特異的に結合しなかった。

図２０は、円二色性によって測定した場合、ペプチドＵＢＥ２Ａ（ＢＳＴＰＡＲＲＲＬＢＲＤＦＫＲＬＱ；配列番号１３４３）、ＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａ（配列番号１３２）、Ｕｂｃ１５－１（ＢＰＳＳＡＳＲＱＬＬＲＫＱＬＫＥＩＱＫ；配列番号１３４０）、およびＳＡＨ－Ｕｂｃ１５－１１（配列番号５０）のα－ヘリシティを示すグラフである。ペプチドのステープリングによって、そうでなければ溶液中でランダムコイルである、Ｕｂｃ１５およびＵＢＥ２Ａペプチドのα－ヘリックスフォールディングを誘導する。

図２１は、円二色性によって測定した場合、ペプチドＳＡＨ－Ｕｂｃ１５－１１（配列番号５０）、ＳＡＨ－ＵＢＥ２Ｄ２（配列番号１０７）、ＳＡＨ－ＵＢＥ２Ｇ２（配列番号１３３）、およびＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａ（配列番号１３２）のα－ヘリシティを示すグラフである。ペプチドステープリングによって、α－ヘリックスフォールディングが誘導されるが、アミノ酸配列自体が、Ｅ１阻害活性の存在または非存在を規定する。

図２２は、円二色性によって測定した場合、ペプチドＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａ（配列番号１３２）、ＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａ－Ｒ６Ａ（配列番号１３２６）、ＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａ－Ｒ７Ａ（配列番号１３２７）、ＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａ－Ｒ８Ａ（配列番号１３２８）、ＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａ－Ｒ６Ｅ（配列番号１３３７）、ＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａ－Ｒ７Ｅ（配列番号１３３８）、およびＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａ－Ｒ８Ｅ（配列番号１３３９）のα－ヘリシティを示すグラフである。ペプチドステープリングによって、α－ヘリックスフォールディングが誘導されるが、アミノ酸配列自体が、Ｅ１阻害活性の存在または非存在を規定する。

図２３は、プロテイナーゼＫの消化条件下で、ＵＢＥ２Ａ（配列番号４）およびＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａ（配列番号１３２）の相対的プロテアーゼ安定性を示すグラフである。ＵＢＥ２ＡおよびＳＡＨ－ＵＢＥ２ＡをプロテイナーゼＫとインキュベートし、インタクトなペプチドの量を液体クロマトグラフィー／質量分析に基づくアッセイによって経時的に定量した。ペプチドステープリングは、非ステープル（unstapled）ＵＢＥ２Ａに対して２３倍、ＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａのプロテアーゼ安定性を増加させた。

図２４は、ＵＢＥ２Ａ（ＢＳＴＰＡＲＲＲＬＢＲＤＦＫＲＬＱ配列番号１３４３）、ＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａ（配列番号１３２）、ＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａ－Ｒ７Ｅ（配列番号１３３８）、およびＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａ－ＡＡＡ（ＢＳＴＰＸ_１ＲＡＲＡＡＲＸ_２ＦＫＲＬＱ；配列番号１３５４）による、Ｅ２へのＥ１媒介性ユビキチン転移の比較阻害を示す図である。上のパネルは、下のパネルに示されるバンドシフト実験の定量である。ステープルされていないＵＢＥ２Ａ（配列番号４）および三重点変異体ＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａ－ＡＡＡ（ＢＳＴＰＸ_１ＲＡＲＡＡＲＸ_２ＦＫＲＬＱ；配列番号１３５３）は、チオエステル転移アッセイによって評価した場合、ＵＢＥ１酵素機能に対する阻害活性を示さない。単一点変異体ＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａ－Ｒ７Ｅ（配列番号１３３８）は、ＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａと比較した場合、低下した阻害活性を有する。

図２５は、水素－重水素交換質量分光分析によって測定した場合、ＵＢＡ１とＵＢＥ２Ａ（ＢＳＴＰＡＲＲＲＬＢＲＤＦＫＲＬＱ配列番号１３４３）、ＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａ（配列番号１３２）、ＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａ－Ｒ７Ｅ（配列番号１３３８）、およびＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａ－ＡＡＡ（ＢＳＴＰＸ_１ＲＡＲＡＡＲＸ_２ＦＫＲＬＱ；配列番号１３５４）のパネルとの間の直接相互作用を定量するグラフである。

図２６は、様々な種類のステープルを生成するために使用した例示の不自然な（unnatural）アミノ酸の化学構造を示す図である（上）。真ん中のパネルは、様々な長さのステープルを有するペプチドを図示する。下のパネルは、ペプチド配列に沿ったステープルウォークを図示する。

図２７は、例示的なステープルウォークと一緒に、様々な種類の二重および三重ステープリング戦略の代表例を示す概略図である。

図２８は、様々な長さの分岐二重ステープルまたは「ステッチ化」部分を使用する例示的ステープルウォークを示す概略図である。

図２９は、ステープルペプチド誘導体を生成するために用いられる例示的な化学的変更を示す概略図である。

Ｅ１酵素は、最初に、ＵｂのＣ末端のアデニル化を触媒し、次いで、ＵｂのＣ末端とＥ１の触媒システインとの間の高エネルギーチオエステル結合を形成することによって、Ｕｂを活性化する。次いで、Ｅ１は、Ｅ２に結合し、ＵｂをＥ１の触媒システインからＥ２の触媒システインに転移することによって、Ｅ２への受け渡しを行う。Ｅ２は、次に、ユビキチンリガーゼ（Ｅ３）および基質タンパク質と複合体を形成し、ＵｂのＣ末端のカルボキシル基を共有結合により基質タンパク質に転移する。Ｅ１とＥ２との間の相互作用は、タンパク質表面積の３０００Å^２を埋め、そのうちの１０００Å^２は、Ｅ２のヘリックスＡ（Ｅ２ｈＡ）とＥ１ユビキチンフォールドドメイン（Ｅ１ＵＦＤ）との間の界面に埋もれている。よって、Ｅ１とＥ２との間の相互作用は、Ｅ１－Ｅ２遭遇複合体の形成において重要である。本開示は、例えば、Ｅ１－Ｅ２相互作用の競合的阻害によって、Ｅ１の直接的阻害剤として作用し得る、Ｅ２ｈＡを模倣する、構造的に安定化された（例えば、ステープル化）アルファ－ヘリックスペプチドを提供する。ある特定の態様では、構造的に安定化された（例えば、ステープル化）Ｅ２ｈＡペプチドは、Ｅ１ＵＦＤに結合する。本開示は、同族Ｅ１に共有結合により結合し得る、本明細書に記載の安定化された（例えば、ステープル化）Ｅ２ｈＡペプチドの弾頭部を有するバージョンも提供する。いかなる理論にも拘束されないが、本明細書において提供される安定化されたＥ２ｈＡは、Ｅ１がＥ２への受け渡しを行うのを妨げ、よって、Ｅ１を阻害する機序を表す。本開示は、Ｅ１に依存するがんおよび／またはＥ１を発現するがん（例えば、血液悪性腫瘍、固形腫瘍、または本明細書に記載の他の特定のがん）ならびに病的細胞の生存に関わる他の疾患（例えば、抗体媒介性移植拒絶、自己免疫障害、または炎症性障害）の処置において、単独で、または他の治療剤と組み合わせて、このような安定化されたペプチド（またはその弾頭部を有するバージョン）を使用するための方法も特徴とする。
Ｅ１タンパク質
ヒトＵＢＡ１のアミノ酸配列を以下に提供する（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿６９５０１２）：

ヒトＵＢＡ１のＵＦＤは、配列番号８４５のアミノ酸残基９５０～１０５８からなる。

ヒトＵＢＡ２のアミノ酸配列を以下に提供する（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００５４９０）：

ヒトＵＢＡ２のＵＦＤは、配列番号８４６のアミノ酸残基４４４～５５２からなる。

ヒトＵＢＡ３のアミノ酸配列を以下に提供する（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００３９５９）：

ヒトＵＢＡ３のＵＦＤは、配列番号８４７のアミノ酸残基４４５～５６１からなる。

ヒトＵＢＡ６のアミノ酸配列を以下に提供する（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０６０６９７）：

ヒトＵＢＡ６のＵＦＤは、配列番号８４８のアミノ酸残基９５０～１０５２からなる。

Ｓ．ｐｏｍｂｅＵＢＡ１のアミノ酸配列を以下に提供する（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＡＡ２２３５４．２）：

Ｓ．ｐｏｍｂｅＵＢＡ１のＵＦＤは、配列番号８４９のアミノ酸残基９１１～１０１２からなる。
Ｅ２ヘリックスＡペプチド

本開示の例示的なＥ２ｈＡペプチドは、表１～５のペプチドである。Ｅ２ｈＡペプチドの相互作用する面におけるアミノ酸は、Ｅ２ｈＡペプチドとＥ１、例えば、ＵＢＡ１、ＵＢＡ６、ＵＢＡ２、またはＵＢＡ３との間の相互作用に寄与する。対照的に、Ｅ２ｈＡペプチドの相互作用しない面におけるアミノ酸は、Ｅ２ｈＡペプチドとＥ１、例えば、ＵＢＡ１、ＵＢＡ６、ＵＢＡ２、またはＵＢＡ３との間の直接相互作用に関与しない。Ｅ２ｈＡペプチドのその同族Ｅ１酵素（例えば、配列番号１～３４に関するＵＢＡ１、配列番号３８に関するＵＢＡ６、配列番号３７に関するＵＢＡ２、ならびに配列番号３５および３６に関するＵＢＡ３）に対する直接相互作用に関与する残基は、表１～５の太字であり、他のアミノ酸はすべて、その同族Ｅ１酵素に対する直接相互作用に関与しない（または直接相互作用に関与しないことが予測される）。

本開示は、ＵＢＡ１Ｅ１に結合し、それを阻害するＥ２ｈＡペプチドを提供する。ある特定の実施形態では、Ｅ２ｈＡペプチドは、ＵＢＡ１Ｅ１ＵＦＤに結合する。本開示の例示的なＵＢＡ１に結合するＥ２ｈＡペプチドは、表１（Ｓ．ｐｏｍｂｅ由来）および表２（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ由来）に提供される。ＵＢＡ１に結合するペプチドについて使用されるコンセンサス位置の番号付け（Ａ_＃）は、以下の表１および表２に提供される。ペプチドのＵＢＡ１阻害を評価するための方法は、当技術分野において公知であり、本明細書に記載される。

表1. S. pombe由来のUBA1に結合するペプチド。UBA1と直接相互作用する残基は太字である。

ＵＢＡ１と直接相互作用する、例えば、ＵＢＡ１に結合するＵｂｃ４Ｅ２ｈＡ（配列番号１）の残基は、アミノ酸コンセンサス位置Ａ_１、Ａ_３、Ａ_４、Ａ_７、Ａ_１０、およびＡ_１１である。例えば、配列番号１に関する位置番号付けとの関係で、ＵＢＡ１と直接相互作用するＵｂｃ４Ｅ２ｈＡの残基は、Ｍｅｔ－１（すなわち、Ａ_１）、Ｌｅｕ－３（すなわち、Ａ_３）、Ｌｙｓ－４（すなわち、Ａ_４）、Ａｓｎ－７（すなわち、Ａ_７）、Ｌｅｕ－１０（すなわち、Ａ_１０）、およびＡｌａ－１１（すなわち、Ａ_１１）である（Lv et al., 2017, Mol. Cell, 65(4):699-714を参照されたい）。

ＵＢＡ１との直接相互作用、例えば、ＵＢＡ１への結合に関与しないＵｂｃ４Ｅ２ｈＡ（すなわち、配列番号１）の残基は、Ａ_２、Ａ_５、Ａ_６、Ａ_８、Ａ_９、Ａ_１２、Ａ_１３、Ａ_１４、Ａ_１５、およびＡ_１６である。例えば、配列番号１に関する位置番号付けとの関係で、ＵＢＡ１との直接相互作用に関与しないＵｂｃ４Ｅ２ｈＡの残基は、Ａｌａ－２（すなわち、Ａ_２）、Ａｒｇ－５（すなわち、Ａ_５）、Ｉｌｅ－６（すなわち、Ａ_６）、Ａｒｇ－８（すなわち、Ａ_８）、Ｇｌｕ－９（すなわち、Ａ_９）、Ａｓｐ－１２（すなわち、Ａ_１２）、Ｌｅｕ－１３（すなわち、Ａ_１３）、Ｇｌｙ－１４（すなわち、Ａ_１４）、Ｌｙｓ－１５（すなわち、Ａ_１５）、およびＡｓｐ－１６（すなわち、Ａ_１６）である。

ＵＢＡ１と直接相互作用する、例えば、ＵＢＡ１に結合するＵｂｃ１５Ｅ２ｈＡ（配列番号２）の残基は、アミノ酸コンセンサス位置Ａ_－４、Ａ_－３、Ａ_－２、Ａ_－１、Ａ_３、Ａ_７、Ａ_８、Ａ_１０、Ａ_１１、およびＡ_１４である。例えば、配列番号２に関する位置番号付けとの関係で、ＵＢＡ１と直接相互作用するＵｂｃ１５Ｅ２ｈＡの残基は、Ｍｅｔ－１（すなわち、Ａ_－４）、Ｐｒｏ－２（すなわち、Ａ_－３）、Ｓｅｒ－３（すなわち、Ａ_－２）、Ｓｅｒ－４（すなわち、Ａ_－１）、Ｇｌｕ－７（すなわち、Ａ_３）、Ａｒｇ－１１（すなわち、Ａ_７）、Ｌｙｓ－１２（すなわち、Ａ_８）、Ｌｅｕ－１４（すなわち、Ａ_１０）、Ｌｙｓ－１５（すなわち、Ａ_１１）、およびＧｌｎ－１８（すなわち、Ａ_１４）である（Lv et al., 2017, Mol. Cell, 65(4):699-714を参照されたい）。

ＵＢＡ１との直接相互作用、例えば、ＵＢＡ１への結合に関与しないＵｂｃ１５Ｅ２ｈＡ（すなわち、配列番号２）の残基は、Ａ_１、Ａ_２、Ａ_４、Ａ_５、Ａ_６、Ａ_９、Ａ_１２、Ａ_１３、Ａ_１５、およびＡ_１６である。例えば、配列番号２に関する位置番号付けとの関係で、ＵＢＡ１との直接相互作用に関与しないＵｂｃ４Ｅ２ｈＡの残基は、Ａｌａ－５（すなわち、Ａ_１）、Ｓｅｒ－６（すなわち、Ａ_２）、Ｇｌｎ－８（すなわち、Ａ_４）、Ｌｅｕ－９（すなわち、Ａ_５）、Ｌｅｕ－１０（すなわち、Ａ_６）、Ｇｌｎ－１３（すなわち、Ａ_９）、Ｇｌｕ－１６（すなわち、Ａ_１２）、Ｉｌｅ－１７（すなわち、Ａ_１３）、Ｌｙｓ－１９（すなわち、Ａ_１５）、およびＡｓｎ－２０（すなわち、Ａ_１６）である。

ＵＢＡ１と直接相互作用する、例えば、ＵＢＡ１に結合することが予測される配列番号３～２０および２２～３４のＥ２ｈＡペプチドの残基は、アミノ酸コンセンサス位置Ａ_４、Ａ_６、Ａ_７、Ａ_１０、および必要に応じてＡ_１３である。例えば、配列番号４に関する位置番号付けとの関係で、ＵＢＡ１と直接相互作用することが予測されるＵＢＥ２ＡＥ２ｈＡ（配列番号４）の残基は、Ａｒｇ－７（すなわち、Ａ_４）、Ｌｅｕ－９（すなわち、Ａ_６）、Ｍｅｔ－１０（すなわち、Ａ_７）、Ｐｈｅ－１３（すなわち、Ａ_１０）、および必要に応じてＬｅｕ－１６（すなわち、Ａ_１３）である。別の例において、配列番号６に関する位置番号付けとの関係で、ＵＢＡ１と直接相互作用することが予測されるＵＢＥ２Ｇ２Ｅ２ｈＡ（配列番号６）の残基は、Ｌｙｓ－７（すなわち、Ａ_４）、Ｌｅｕ－９（すなわち、Ａ_６）、Ｍｅｔ－１０（すなわち、Ａ_７）、Ｔｙｒ－１３（すなわち、Ａ_１０）、および必要に応じてＬｅｕ－１６（すなわち、Ａ_１３）である。さらに別の例において、配列番号１０に関する位置番号付けとの関係で、ＵＢＡ１と直接相互作用することが予測されるＵＢＥ２Ｄ２Ｅ２ｈＡ（配列番号１０）の残基は、Ｌｙｓ－４（すなわち、Ａ_４）、Ｉｌｅ－６（すなわち、Ａ_６）、Ｈｉｓ－７（すなわち、Ａ_７）、Ｌｅｕ－１０（すなわち、Ａ_１０）、および必要に応じてＬｅｕ－１３（すなわち、Ａ_１３）である。

ＵＢＡ１との直接相互作用、例えば、ＵＢＡ１への結合に関与しないことが予測される配列番号３～２０および２２～３４のＥ２ｈＡペプチドの残基は、Ａ_１、Ａ_２、Ａ_３、Ａ_５、Ａ_８、Ａ_９、Ａ_１１、Ａ_１２、Ａ_１４、Ａ_１５、Ａ_１６、およびＡ_１に対してＮ末端側の位置である。例えば、配列番号４に関する位置番号付けとの関係で、ＵＢＡ１との直接相互作用に関与しないことが予測されるＵＢＥ２ＡＥ２ｈＡの残基は、Ｍｅｔ－１（すなわち、Ａ_－３）、Ｓｅｒ－２（すなわち、Ａ_－２）、Ｔｈｒ－３（すなわち、Ａ_－１）、Ｐｒｏ－４（すなわち、Ａ_１）、Ａｌａ－５（すなわち、Ａ_２）、Ａｒｇ－６（すなわち、Ａ_３）、Ａｒｇ－８（すなわち、Ａ_５）、Ａｒｇ－１１（すなわち、Ａ_８）、Ａｓｐ－１２（すなわち、Ａ_９）、Ｌｙｓ－１４（すなわち、Ａ_１１）、Ａｒｇ－１５（すなわち、Ａ_１２）、Ｇｌｎ－１７（すなわち、Ａ_１４）、Ｇｌｕ－１８（すなわち、Ａ_１５）、およびＡｓｐ－１９（すなわち、Ａ_１６）である。別の例において、配列番号６に関する位置番号付けとの関係で、ＵＢＡ１との直接相互作用に関与しないことが予測されるＵＢＥ２Ｇ２Ｅ２ｈＡの残基は、Ｍｅｔ－１（すなわち、Ａ_－３）、Ａｌａ－２（すなわち、Ａ_－２）、Ｇｌｙ－３（すなわち、Ａ_－１）、Ｔｈｒ－４（すなわち、Ａ_１）、Ａｌａ－５（すなわち、Ａ_２）、Ｌｅｕ－６（すなわち、Ａ_３）、Ａｒｇ－７（すなわち、Ａ_５）、Ａｌａ－１０（すなわち、Ａ_８）、Ｇｌｕ－１１（すなわち、Ａ_９）、Ｌｙｓ－１３（すなわち、Ａ_１１）、Ｇｌｎ－１４（すなわち、Ａ_１２）、Ｔｈｒ－１６（すなわち、Ａ_１４）、Ｌｅｕ－１７（すなわち、Ａ_１５）、およびＡｓｎ－１８（すなわち、Ａ_１６）である。さらに別の例において、配列番号１０に関する位置番号付けとの関係で、ＵＢＡ１との直接相互作用に関与しないことが予測されるＵＢＥ２Ｄ２Ｅ２の残基は、Ｍｅｔ－１（すなわち、Ａ_１）、Ａｌａ－２（すなわち、Ａ_２）、Ｌｅｕ－３（すなわち、Ａ_３）、Ａｒｇ－５（すなわち、Ａ_５）、Ｌｙｓ－８（すなわち、Ａ_８）、Ｇｌｕ－９（すなわち、Ａ_９）、Ａｓｎ－１１（すなわち、Ａ_１１）、Ａｓｐ－１２（すなわち、Ａ_１２）、Ａｌａ－１４（すなわち、Ａ_１４）、Ａｒｇ－１５（すなわち、Ａ_１５）、およびＡｓｐ－１６（すなわち、Ａ_１６）である。

一例では、本開示は、配列ＢＰＳＳＡＳＲＱＬＬＲＫＱＬＫＥＩＱＺ（配列番号１３４０）を有するペプチドであって、Ｂがノルロイシンであり、Ｚがビオチン化したリシン（Ｌｙｓ（ビオチン））である、ペプチドを特徴とする。一部の場合には、ペプチドは、少なくとも２個（例えば、２、３、４、５個）のアミノ酸置換を含み、アミノ酸は、オレフィン側鎖を有する非天然アミノ酸に置換されている。一部の場合には、少なくとも２個の置換されたアミノ酸は、２、３、または６個のアミノ酸によって分離されている。これらのペプチドは、Ｅ１－Ｅ２相互作用を阻害する。

一例では、本開示は、配列ＢＰＳＳＡＳＲＱＬＬＲＫＱＬＫＥＩＱ（配列番号１３４１）を有するペプチドであって、Ｂがノルロイシンである、ペプチドを特徴とする。一部の場合には、ペプチドは、少なくとも２個（例えば、２、３、４、５個）のアミノ酸置換を含み、アミノ酸は、オレフィン側鎖を有する非天然アミノ酸に置換されている。一部の場合には、少なくとも２個の置換されたアミノ酸は、２、３、または６個のアミノ酸によって分離されている。これらのペプチドは、Ｅ１－Ｅ２相互作用を阻害する。

表2. H. sapiens由来のUBA1に結合するペプチド。UBA1と直接相互作用することが予測される残基は太字である(配列番号3～20および22～34に関するアミノ酸コンセンサス位置A₄、A₆、A₇、およびA₁₀、ならびに必要に応じてA₁₃;配列番号21に関するアミノ酸コンセンサス位置A_-1、A₂、A₃、A₄、A₆、A₇、A₈、A₁₀、A₁₁、およびA₁₄)。

ＵＢＡ１と直接相互作用する、例えば、ＵＢＡ１に結合するＵＢＥ２ＴＥ２ｈＡ（配列番号２１）の残基は、アミノ酸コンセンサス位置Ａ_－１、Ａ_２、Ａ_３、Ａ_４、Ａ_６、Ａ_７、Ａ_８、Ａ_１０、Ａ_１１、およびＡ_１４である。例えば、配列番号２１に関する位置番号付けとの関係で、ＵＢＡ１と直接相互作用するＵＢＥ２ＴＥ２ｈＡの残基は、Ｍｅｔ－１（すなわち、Ａ_－１）、Ａｒｇ－３（すなわち、Ａ_２）、Ａｌａ－４（すなわち、Ａ_３）、Ｓｅｒ－５（すなわち、Ａ_４）、Ｌｅｕ－７（すなわち、Ａ_６）、Ｌｙｓ－８（すなわち、Ａ_７）、Ａｒｇ－９（すなわち、Ａ_８）、Ｌｅｕ－１１（すなわち、Ａ_１０）、Ｈｉｓ－１２（すなわち、Ａ_１１）、およびＡｌａ－１５（すなわち、Ａ_１４）である（Lv et al., 2018, JBC, 293(47):18337-18352を参照されたい）。

ＵＢＡ１との直接相互作用、例えば、ＵＢＡ１への結合に関与しないＵＢＥ２ＴＥ２ｈＡ（配列番号２１）の残基は、Ａ_１、Ａ_５、Ａ_９、Ａ_１２、Ａ_１３、Ａ_１５、およびＡ_１６である。例えば、配列番号２１に関する位置番号付けとの関係で、ＵＢＡ１との直接相互作用に関与しないＵＢＥ２ＴＥ２ｈＡの残基は、Ｇｌｎ－２（すなわち、Ａ_１）、Ａｒｇ－６（すなわち、Ａ_５）、Ｇｌｕ－１０（すなわち、Ａ_９）、Ｍｅｔ－１３（すなわち、Ａ_１２）、Ｌｅｕ－１４（すなわち、Ａ_１３）、Ｔｙｒ－１６（すなわち、Ａ_１５）、およびＧｌｕ－１７（すなわち、Ａ_１６）である。

本開示は、Ｅ１ＵＢＡ６に結合し、Ｅ１ＵＢＡ６を阻害するＥ２ｈＡペプチドも提供する。ある特定の実施形態では、Ｅ２ｈＡペプチドは、ＵＢＡ６Ｅ１ＵＦＤに結合する。本開示の例示的なＵＢＡ６に結合するＥ２ｈＡペプチドを、表３に提供する（すなわち、配列番号３８）。ペプチドのＵＢＡ６阻害を評価するための方法は、当技術分野において公知であり、本明細書に記載される。

一例では、本開示は、配列ＢＳＴＰＡＲＲＲＬＢＲＤＦＫＲＬＱＺ（配列番号１３４２）を有するペプチドであって、Ｂがノルロイシンであり、Ｚがビオチン化したリシン（Ｌｙｓ（ビオチン））である、ペプチドを特徴とする。一部の場合には、ペプチドは、少なくとも２個（例えば、２、３、４、５個）のアミノ酸置換を含み、アミノ酸は、オレフィン側鎖を有する非天然アミノ酸に置換されている。一部の場合には、少なくとも２個の置換されたアミノ酸は、２、３、または６個のアミノ酸によって分離されている。これらのペプチドは、Ｅ１－Ｅ２相互作用を阻害する。

一例では、本開示は、配列ＢＳＴＰＡＲＲＲＬＢＲＤＦＫＲＬＱ（配列番号１３４３）を有するペプチドであって、Ｂがノルロイシンである、ペプチドを特徴とする。一部の場合には、ペプチドは、少なくとも２個（例えば、２、３、４、５個）のアミノ酸置換を含み、アミノ酸は、オレフィン側鎖を有する非天然アミノ酸に置換されている。一部の場合には、少なくとも２個の置換されたアミノ酸は、２、３、または６個のアミノ酸によって分離されている。これらのペプチドは、Ｅ１－Ｅ２相互作用を阻害する。

表3. UBA6に結合するペプチド。UBA6と直接相互作用することが予測される残基は太字である(アミノ酸Arg-5、Glu-7、Leu-8、Val-11、およびLeu-14)。

配列番号３８に関する位置番号付けとの関係で、ＵＢＡ６と直接相互作用する、例えば、ＵＢＡ６に結合することが予測されるＵＳＥ１Ｅ２ｈＡ（配列番号３８）の残基は、Ａｒｇ－５、Ｇｌｕ－７、Ｌｅｕ－８、Ｖａｌ－１１、およびＬｅｕ－１４である。

配列番号３８に関する位置番号付けとの関係で、ＵＢＡ６との直接相互作用、例えば、ＵＢＡ６への結合に関与しないことが予測されるＵＳＥ１Ｅ２ｈＡ（配列番号３８）の残基は、Ｍｅｔ－１、Ａｌａ－２、Ａｌａ－３、Ｓｅｒ－４、Ｌｅｕ－６、Ａｓｎ－９、Ｌｅｕ－１０、Ａｒｇ－１２、Ｌｅｕ－１３、Ｓｅｒ－１５、Ａｒｇ－１６、およびＣｙｓ－１７である。

本開示は、Ｅ１ＵＢＡ３に結合し、Ｅ１ＵＢＡ３を阻害するＥ２ｈＡペプチドも提供する。ある特定の実施形態では、Ｅ２ｈＡペプチドは、ＵＢＡ３Ｅ１ＵＦＤに結合する。ＵＢＡ３と結合することが可能な本開示の例示的なヒトＥ２ｈＡペプチドを、表４に提供する。ペプチドのＵＢＡ３阻害を評価するための方法は、当技術分野において公知であり、本明細書に記載される

表4. UBA3に結合するペプチド。UBA3と直接相互作用する残基は太字である。

配列番号３５に関する位置番号付けとの関係で、ＵＢＡ３と直接相互作用する、例えば、ＵＢＡ３に結合するＵＢＥ２ＦＥ２ｈＡ（配列番号３５）の残基は、Ｖａｌ－３、Ｌｙｓ－８、Ｖａｌ－１１、Ｌｙｓ－１２、およびＶａｌ－１４である（Huang et al., 2009, Mol. Cell, 33(4):483-95を参照されたい）。

配列番号３５に関する位置番号付けとの関係で、ＵＢＡ３との直接相互作用に関与しないＵＢＥ２ＦＥ２ｈＡ（配列番号３５）の残基は、Ａｒｇ－１、Ａｒｇ－２、Ｓｅｒ－４、Ｖａｌ－５、Ａｒｇ－６、Ａｓｐ－７、Ｌｅｕ－９、Ｌｅｕ－１０、Ｇｌｕ－１３、Ａｌａ－１５、およびＧｌｕ－１６である。

配列番号３６に関する位置番号付けとの関係で、ＵＢＡ３と直接相互作用する、例えば、ＵＢＡ３に結合するＵＢＥ２ＭＥ２ｈＡ（配列番号３６）の残基は、Ｌｙｓ－２、Ａｌａ－３、Ｇｌｎ－７、Ｌｅｕ－８、Ｇｌｎ－１１、Ｌｙｓ－１２、Ｉｌｅ－１４、Ａｓｎ－１５、およびＧｌｕ－１６である（Huang et al., 2005, Mol. Cell, 17(3):341-350を参照されたい）。

配列番号３６に関する位置番号付けとの関係で、ＵＢＡ３との直接相互作用に関与しないＵＢＥ２ＭＥ２ｈＡ（配列番号３６）の残基は、Ｌｙｓ－１、Ｓｅｒ－４、Ａｌａ－５、Ａｌａ－６、Ａｒｇ－９、Ｉｌｅ－１０、およびＡｓｐ－１３である。

本開示は、ＵＢＡ２に結合し、それを阻害するＥ２ｈＡペプチドも提供する。ある特定の実施形態では、Ｅ２ｈＡペプチドは、ＵＢＡ２Ｅ１ＵＦＤに結合する。ＵＢＡ２と結合することが可能な本開示の例示的なヒトＥ２ｈＡペプチドを、表５に提供する（すなわち、配列番号３７）。ペプチドのＵＢＡ２阻害を評価するための方法は、当技術分野において公知であり、本明細書に記載される。

表5. UBA2に結合するペプチド。UBA2と直接相互作用する残基は太字である(アミノ酸Leu-2、Ser-3、Ala-6、Gln-7、Arg-9、Lys-10、Arg-13、およびLys-14)。

配列番号３７に関する位置番号付けとの関係で、ＵＢＡ２と直接相互作用する、例えば、ＵＢＡ２に結合するＵＢＥ２ＩＥ２ｈＡ（配列番号３７）の残基は、Ｌｅｕ－２、Ｓｅｒ－３、Ａｌａ－６、Ｇｌｎ－７、Ａｒｇ－９、Ｌｙｓ－１０、Ａｒｇ－１３、およびＬｙｓ－１４である（Wang et al., 2010, PLoS ONE, 5(12):e15805を参照されたい）。

配列番号３７に関する位置番号付けとの関係で、ＵＢＡ２との直接相互作用に関与しないＵＢＥ２ＩＥ２ｈＡ（配列番号３７）の残基は、Ａｌａ－１、Ａｒｇ－４、Ｌｅｕ－５、Ｇｌｕ－８、Ａｌａ－１１、Ｔｒｐ－１２、およびＡｓｐ－１５である。

ある特定の実施形態では、本明細書に記載のＥ２ｈＡペプチドの修飾されたアミノ酸配列を含むペプチドも、本明細書において提供される。一部の場合には、ペプチドは、修飾されて、構造的安定化をペプチドに導入する（例えば、ペプチドのアルファ－ヘリシティを維持する）。構造的安定化は、例えば、ペプチドの「ステープリング」または「ステッチング」によるものであってもよい。一部の場合には、ステープルまたはステッチは、炭化水素ステープルまたはステッチである。構造的安定化（例えば、内部架橋、例えば、ステープリング、ステッチング）を本明細書に記載のＥ２ｈＡペプチド中に導入する修飾は、（ｉ）Ｅ２ｈＡの同族Ｅ１酵素との直接相互作用に関与しないＥ２ｈＡの面、（ｉｉ）Ｅ２ｈＡの極性面と非極性面の界面、および／または（ｉｉｉ）Ｅ２ｈＡの同族Ｅ１酵素と直接相互作用するＥ２ｈＡの面に位置し得る。一部の場合には、Ｅ２ｈＡペプチドは、Ｅ２ｈＡの極性面と非極性面の界面に、ステープルまたはステッチ（例えば、炭化水素ステープルまたはステッチ）を導入することによって安定化される。一部の場合には、Ｅ２ｈＡペプチドは、Ｅ２ｈＡの同族Ｅ１酵素と直接相互作用するＥ２ｈＡの面にステープルまたはステッチを導入することによって安定化される、例えば、ステープルは、ヘリックスの相互作用面の相互作用面において疎水性パッチを「模倣」し得る。ある特定の例では、本明細書に記載の構造的に安定化された（例えば、内部で架橋した、例えば、ステープル化）Ｅ２ｈＡペプチドは、１個または複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７個）の追加のアミノ酸置換（野生型Ｅ２ｈＡペプチド配列と比較して）、例えば、１個または複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７個）の保存的および／または非保存的アミノ酸置換（すなわち、Ｅ２ｈＡに構造的安定化を付与するためになされるアミノ酸置換に加えて、１個または複数のアミノ酸置換）を含有してもよい。ある特定の例では、これらの追加の置換は、Ｅ２ｈＡの同族Ｅ１酵素と直接相互作用するアミノ酸置換である。ある特定の例では、これらの追加の置換は、Ｅ２ｈＡの同族Ｅ１酵素との直接相互作用に関与しないアミノ酸置換である。ある特定の例では、これらの追加の置換は、Ｅ２ｈＡの同族Ｅ１酵素と直接相互作用するアミノ酸と、Ｅ２ｈＡの同族Ｅ１酵素との直接相互作用に関与しないアミノ酸の両方の置換である。ある特定の例では、本明細書に記載の構造的に安定化された（例えば、内部で架橋した、例えば、ステープル化）Ｅ２ｈＡペプチドは、Ｅ２ｈＡのＮ末端および／またはＣ末端からの１個または複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個）の欠失を含有し得る。例えば、構造的に安定化された（例えば、内部で架橋した、例えば、ステープル化）Ｅ２ｈＡペプチドは、５またはそれより長い（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２３、２７）アミノ酸長であり得る。ある特定の例では、構造的に安定化された（例えば、内部で架橋した、例えば、ステープル化）Ｅ２ｈＡペプチドは、５～１１アミノ酸長である。ある特定の例では、構造的に安定化された（例えば、内部で架橋した、例えば、ステープル化）Ｅ２ｈＡペプチドは、５～１７アミノ酸長である。ある特定の例では、構造的に安定化された（例えば、内部で架橋した、例えば、ステープル化）Ｅ２ｈＡペプチドは、１１～１７アミノ酸長である。ある特定の例では、構造的に安定化された（例えば、内部で架橋した、例えば、ステープル化）Ｅ２ｈＡペプチドは、５～２７アミノ酸長である。ある特定の例では、構造的に安定化された（例えば、内部で架橋した、例えば、ステープル化）Ｅ２ｈＡペプチドは、１１～２７アミノ酸長である。ある特定の例では、構造的に安定化された（例えば、内部で架橋した、例えば、ステープル化）Ｅ２ｈＡペプチドは、１７～２７アミノ酸長である。

ある特定の実施形態では、本開示のＥ２ｈＡペプチドは、配列番号１～３８のいずれか１つにおいて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３個のアミノ酸置換を有し得る（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３個のアミノ酸が保存的にまたは非保存的に置換されている）。例えば、ある特定の実施形態では、本開示のＥ２ｈＡペプチドは、配列番号４に示される配列の修飾されたアミノ酸配列であって、配列番号４の配列において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３個のアミノ酸置換を有する配列番号４を含む、修飾されたアミノ酸配列を含む（例えば、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号４の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３個のアミノ酸が、保存的または非保存的に置換されているアミノ酸であることを除いて、配列番号４を含む）。別の例において、ある特定の実施形態では、本開示のＥ２ｈＡペプチドは、配列番号６に示される配列の修飾されたアミノ酸配列であって、配列番号６の配列において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３個のアミノ酸置換を有する配列番号６を含む、修飾されたアミノ酸配列を含む（例えば、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号６の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３個のアミノ酸が、保存的または非保存的に置換されているアミノ酸であることを除いて、配列番号６を含む）。別の例において、ある特定の実施形態では、本開示のＥ２ｈＡペプチドは、配列番号１０に示される配列の修飾されたアミノ酸配列であって、配列番号１０の配列において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３個のアミノ酸置換を有する配列番号１０を含む、修飾されたアミノ酸配列を含む（例えば、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号１０の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３個のアミノ酸が、保存的または非保存的に置換されているアミノ酸であることを除いて、配列番号１０を含む）。「保存的アミノ酸置換」は、この置換によって、１個のアミノ酸が、類似する側鎖を有する別のアミノ酸残基で置き換えられていることを意味する。類似する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。一部の例では、配列番号１～３８のいずれか１つの１～３個のアミノ酸が置換されている。配列番号１～３８のいずれか１つにおけるアミノ酸置換は、Ｅ２ｈＡの同族Ｅ１酵素と直接相互作用する（または直接相互作用することが予測される）か、またはＥ２ｈＡの同族Ｅ１酵素との直接相互作用に関与しない（または直接相互作用に関与しないことが予測される）アミノ酸置換であり得る。さらにより多くの変動性は、Ｅ２ｈＡの同族Ｅ１酵素と直接相互作用する（または直接相互作用することが予測される）Ｅ２ｈＡのアミノ酸においてよりも、Ｅ２ｈＡの同族Ｅ１酵素との直接相互作用に関与しない（または直接相互作用に関与しないことが予測される）Ｅ２ｈＡのアミノ酸において許容される。実際に、Ｅ２ｈＡの同族Ｅ１酵素との直接相互作用に関与しない（または直接相互作用に関与しないことが予測される）アミノ酸のほぼすべては、置換され得る（例えば、保存的もしくは非保存的アミノ酸置換またはアラニンでの置換）。ある特定の実施形態では、Ｅ２ｈＡの同族Ｅ１酵素と直接相互作用する（または直接相互作用することが予測される）１、２、または３個のＥ２ｈＡのアミノ酸は、別のアミノ酸で置換されている。一部の例では、置換（複数可）は、保存的アミノ酸置換である。他の例では、置換（複数可）は、非保存的アミノ酸置換である。一部の例では、１個より多くのアミノ酸置換が存在する場合、置換は、保存的アミノ酸置換と非保存的アミノ酸置換の両方である。一部の例では、１個より多くのアミノ酸置換が存在する場合、置換のそれぞれは、保存的アミノ酸置換である。一部の場合には、配列番号１～３８のいずれか１つの１～３個のアミノ酸（例えば、１、２、または３個）が置換されている場合、置換は、すべて、Ｅ２ｈＡの同族Ｅ１酵素との直接相互作用に関与しない（または直接相互作用に関与しないことが予測される）Ｅ２ｈＡのアミノ酸置換である。一部の場合には、配列番号１～３８のいずれか１つの１～３個のアミノ酸（例えば、１、２、または３個）が置換されている場合、置換は、すべて、Ｅ２ｈＡの同族Ｅ１酵素と直接相互作用する（または直接相互作用することが予測される）Ｅ２ｈＡのアミノ酸置換である。一部の場合には、配列番号１～３８のいずれか１つの１～３個のアミノ酸（例えば、１、２、または３個）が置換されている場合、置換は、Ｅ２ｈＡの同族Ｅ１酵素と直接相互作用する（または直接相互作用することが予測される）Ｅ２ｈＡのアミノ酸置換およびＥ２ｈＡの同族Ｅ１酵素との直接相互作用に関与しない（または直接相互作用に関与しないことが予測される）Ｅ２ｈＡのアミノ酸置換の両方である。ある特定の実施形態では、配列番号１３２のアミノ酸位置８および１１位のそれぞれ、もしくは配列番号４の安定化されたバージョン、またはそのトランケートされたバージョン（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個のアミノ酸は、Ｎ末端および／またはＣ末端から除去されている）は、別のアミノ酸で置換されている。ある特定の実施形態では、配列番号１３２のアミノ酸位置８および１１位のそれぞれ、もしくは配列番号４の安定化されたバージョン、またはそのトランケートされたバージョン（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個のアミノ酸は、Ｎ末端および／またはＣ末端から除去されている）は、グルタミン酸で置換されている。ある特定の実施形態では、配列番号１３２のアミノ酸位置４、６、１１、１４、および１５位のそれぞれ、もしくは配列番号４の安定化されたバージョン、またはそのトランケートされたバージョン（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個のアミノ酸は、Ｎ末端および／またはＣ末端から除去されている）は、アラニンで置換されている。ある特定の実施形態では、配列番号１３２のアミノ酸位置４、１４、および１５位のそれぞれ、もしくは配列番号４の安定化されたバージョン、またはそのトランケートされたバージョン（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個のアミノ酸は、Ｎ末端および／またはＣ末端から除去されている）は、アラニンで置換されており、配列番号１３２のアミノ酸位置６、８、および１１位のそれぞれ、もしくは配列番号４の安定化されたバージョン、またはそのトランケートされたバージョン（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個のアミノ酸は、Ｎ末端および／またはＣ末端から除去されている）は、グルタミン酸で置換されている。

ある特定の例では、置換されたアミノ酸（複数可）は、Ｌ－Ａｌａ、Ｄ－Ａｌａ、Ａｉｂ、Ｓａｒ、Ｓｅｒ、置換されたアラニン、または置換されたグリシン誘導体からなる群から選択される。ある特定の例では、修飾されたＵｂｃ１５Ｅ２ｈＡペプチドは、アルギニンで置換されたＥ７残基（配列番号２に従う番号付け）を含む。

ある特定の実施形態では、本開示のＥ２ｈＡペプチドは、配列番号１～３８のいずれか１つに示される配列のＣ末端から除去された／欠失した１、２、３、４、または５個のアミノ酸を有し得る。例えば、ある特定の実施形態では、本開示のＥ２ｈＡペプチドは、配列番号４に示されるアミノ酸配列の修飾されたアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、ここで、２個のアミノ酸は、配列番号４の配列のＣ末端から除去されている／欠失している（すなわち、Ｅ２ｈＡペプチドは、配列番号３９のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる）。別の例において、ある特定の実施形態では、本開示のＥ２ｈＡペプチドは、配列番号６に示されるアミノ酸配列の修飾されたアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、ここで、５個のアミノ酸は、配列番号６の配列のＣ末端から除去されている／欠失している（すなわち、Ｅ２ｈＡペプチドは、配列番号５５のアミノ酸を含むかまたはそれからなる）。ある特定の実施形態では、本開示のＥ２ｈＡペプチドは、配列番号１～３８のいずれか１つに示される配列のＮ末端から除去された／欠失した１、２、３、４、または５個のアミノ酸を有し得る。ある特定の実施形態では、本開示のＵＢＡ１と相互作用するＥ２ｈＡペプチドは、配列番号１～３４のいずれか１つに示される配列のＣ末端から除去された／欠失したアミノ酸位置Ａ_１２～Ａ_１６を有し得る。例えば、ある特定の実施形態では、本開示のＥ２ｈＡペプチドは、配列番号６に示されるアミノ酸配列の修飾されたアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、ここで、アミノ酸位置Ａ_１２～Ａ_１６は、配列番号６の配列のＣ末端から除去されている／欠失している（すなわち、Ｅ２ｈＡペプチドは、配列番号５５のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる）。ある特定の実施形態では、本開示のＵＢＡ１に結合するＥ２ｈＡペプチドは、配列番号１～３４のいずれか１つに示される配列のＮ末端から除去された／欠失したアミノ酸位置Ａ_１に対してＮ末端側のアミノ酸位置の１、２、３個、またはすべてを有し得る。ある特定の実施形態では、本開示のＥ２ｈＡペプチドは、配列番号１～３８のいずれか１つに示される配列のＮ末端とＣ末端の両方から除去された／欠失した１、２、３、４、または５個のアミノ酸を有し得る。ある特定の実施形態では、本開示のＵＢＡ１に結合するＥ２ｈＡペプチドは、配列番号１～３４のいずれか１つに示される配列のＣ末端から除去された／欠失した１、２、３、４、または５個のアミノ酸、およびその配列のＮ末端から除去された／欠失したアミノ酸位置Ａ_１に対してＮ末端側のアミノ酸の１、２、３個、またはすべてを有し得る。例えば、ある特定の実施形態では、本開示のＵＢＡ１に結合するＥ２ｈＡペプチドは、配列番号６に示されるアミノ酸配列の修飾されたアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、ここで、アミノ酸Ａ_－３～Ａ_－１およびＡ_１２～Ａ_１６は、配列番号６から除去されている／欠失している（すなわち、ペプチドは、配列番号６のアミノ酸Ａ_１～Ａ_１１を含むかまたはそれからなる）。別の例では、ある特定の実施形態では、本開示のＵＢＡ１に結合するＥ２ｈＡペプチドは、配列番号６に示されるアミノ酸配列の修飾されたアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、ここで、アミノ酸Ａ_－３～Ａ_－１およびＡ_１２～Ａ_１６は、配列番号４から除去されている／欠失している（すなわち、ペプチドは、配列番号４のアミノ酸Ａ_１～Ａ_１１を含むかまたはそれからなる）。さらに別の例において、ある特定の実施形態では、本開示のＵＢＡ１に結合するＥ２ｈＡペプチドは、配列番号６に示されるアミノ酸配列の修飾されたアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、ここで、アミノ酸Ａ_１２～Ａ_１６は、配列番号１０から除去されている／欠失している（すなわち、ペプチドは、配列番号１０のアミノ酸Ａ_１～Ａ_１１を含むかまたはそれからなる）。ある特定の例では、これらの除去されたアミノ酸は、Ｌ－Ａｌａ、Ｄ－Ａｌａ、Ａｉｂ、Ｓａｒ、Ｓｅｒ、置換されたアラニン、または置換されたグリシン誘導体からなる群から選択される１～６（例えば、１、２、３、４、５、または６）個のアミノ酸で置き換えられ得る。

本開示は、配列番号１～３８のいずれか１つに対して、少なくとも１４％（例えば、少なくとも１４～５０％、少なくとも１４～４５％、少なくとも１４～４０％、少なくとも１４～３５％、少なくとも１４～３０％、少なくとも１４～２５％、少なくとも１４～２０％、少なくとも２０％～５０％、少なくとも２０％～４５％、少なくとも２０％～４０％、少なくとも２０％～３５％、少なくとも２０％～３０％、少なくとも２０％～２５％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２７％、少なくとも３４％、少なくとも４０％少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるＥ２ｈＡペプチドも包含する。配列番号１～３８のいずれか１つのアミノ酸配列における変動性は、アルファヘリックスの直接相互作用する側と直接相互作用しない側の一方または両方に存在し得る。Ｅ２ｈＡの同族Ｅ１酵素との直接相互作用に関与しない（または直接相互作用に関与しないことが予測される）Ｅ２ｈＡのアミノ酸のほぼすべては、変更され得る。Ｅ２ｈＡの同族Ｅ１酵素と直接相互作用する（または直接相互作用することが予測される）Ｅ２ｈＡのアミノ酸も変更され得る。具体的な実施形態では、Ｅ２ｈＡペプチドは、配列番号１～３８のいずれか１つに対して、少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。具体的な実施形態では、Ｅ２ｈＡペプチドは、配列番号１～３８のいずれか１つに対して、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。具体的な実施形態では、Ｅ２ｈＡペプチドは、配列番号１～３８、９９、および５５のいずれか１つのアミノ酸配列からなる。アミノ酸配列間の同一性パーセントを決定するための方法は、当技術分野において公知である。例えば、配列は、最適な比較のためにアラインされる（例えば、最適なアライメントのために、第１および第２のアミノ酸または核酸配列の一方または両方にギャップが導入されてもよく、比較のために非相同配列が無視されてもよい）。好ましい実施形態では、比較のためにアラインされた参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、８０％、９０％、または１００％である。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列における位置が、第２の配列における対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占められる場合には、分子はその位置において同一である。２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントの決定は、ＢＬＡＳＴ２．０プログラムを使用して達成される。配列比較は、ギャップなしのアライメントを使用し、デフォルトパラメーターを使用して実施される（Ｂｌｏｓｓｏｍ６２マトリックス、ギャップ存在コスト１１、残基当たりギャップコスト１、およびラムダ比０．８５）。ＢＬＡＳＴプログラムで使用した数学アルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997）に記載されている。

一部の実施形態では、本開示は、配列番号１～３８のいずれか１つのバリアントを特徴とし、ここで、ペプチドのバリアントは、Ｅ１に非共有結合により結合する（例えば、配列番号１～３４に関するＵＢＡ１、配列番号３８に関するＵＢＡ６、配列番号３７に関するＵＢＡ２、ならびに配列番号３５および３６に関するＵＢＡ３）。

ある特定の例では、Ｅ２ｈＡペプチドは、以下の表６に示されるアミノ酸配列を有する。本開示は、これらのバリアントＥ２ｈＡペプチドの安定化されたバージョン（例えば、内部で架橋したバージョン）も特徴とする。例えば、例えば、３または６個のアミノ酸によって分離されたこれらのバリアントの２個の（またはそれより多い）残基は、オレフィンのメタセシスによって架橋を形成することができる非天然アミノ酸で置き換えられている。架橋は、Ｅ２ｈＡペプチドのその同族Ｅ１酵素への結合を破壊しない場所で、これらのバリアント内に配置される。一部の例では、バリアントＥ２ｈＡペプチドは、炭化水素ステープルもしくはステッチ、ラクタムステープルもしくはステッチ；ＵＶ－環化付加ステープルもしくはステッチ；オキシムステープルもしくはステッチ；チオエーテルステープルもしくはステッチ；ダブルクリックステープルもしくはステッチ；ビス－ラクタムステープルもしくはステッチ；ビス－アリール化ステープルもしくはステッチ；またはこれらのいずれか２つもしくはそれより多くの組合せによって安定化される。
表6. 例示的なバリアントE2 hAペプチド

本明細書に記載のＥ２ｈＡペプチドは、治療使用のために最適化され得る。例えば、上記Ｅ２ｈＡペプチドのいずれかが膜破壊（細胞溶解）を引き起こす場合、全体的なペプチドの疎水性を低下させることによってペプチドを最適化することができる。例えば、これは、特に、疎水性残基を、より低い疎水性を有するアミノ酸（例えば、アラニン）で置換することによって達成され得る。膜破壊は、ペプチドの全体的な正荷電を低下させることによって低下させることもできる。これは、塩基性残基を荷電していないかまたは酸性の残基で置換することによって達成することもできる。ある特定の例では、全体的なペプチドの疎水性とペプチドの全体的な正荷電の両方が低下される。

ある特定の実施形態では、本明細書に記載のＥ２ｈＡペプチドは、５から３５の間のアミノ酸長、５から２５の間のアミノ酸長、５から２０の間のアミノ酸長、５から１８の間のアミノ酸長、１０から３５の間のアミノ酸長、１０から２５の間のアミノ酸長、１０から２０の間のアミノ酸長、１０から１８の間のアミノ酸長、１５から２６の間のアミノ酸長、１５から１８の間のアミノ酸長、または１０から２８の間のアミノ酸長である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載のＥ２ｈＡペプチドは、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、または２７アミノ酸長である。

ある特定の例では、本明細書に記載のＥ２ｈＡペプチドは、構造的に安定化されている。これらのＥ２ｈＡペプチドを安定化させるために、ペプチドは、ペプチドがステープル化および／またはステッチ化され得るように、例えば、Ｅ２ｈＡペプチドのアミノ酸を非天然アミノ酸で置き換える２個またはそれより多い置換を含み得る。
安定化されたペプチド

ペプチドヘリックスは、アポトーシスなどの多くの重要な生物学的プロセスを調節する鍵となるタンパク質－タンパク質相互作用の重要な媒介物であるが、このようなヘリックスがタンパク質内でその環境（context）から取り除かれ、単離して調製されると、通常ランダムコイル立体構造をとり、生物活性の大幅な低下、よって、治療ポテンシャルの減少をもたらす。本開示は、Ｅ２ｈＡの構造的に安定化されたペプチドを提供する。本開示は、内部（分子内）架橋（またはステープル）によって接合した少なくとも２個の修飾されたアミノ酸を含み、ある特定の例では、構造的に安定化されたペプチドが結合する標的タンパク質（例えば、Ｅ１）内のシステイン（Ｃｙｓ）残基と共有結合を形成することができる反応性基（求電子性基を有する非天然アミノ酸などの「弾頭部」）を有する、構造的に安定化されたＥ２ｈＡペプチド（上記のものなど）を含む。本明細書に記載されている安定化されたペプチドは、ステープルペプチドおよびステッチペプチド（stitched peptide）、ならびに複数のステッチ、複数のステープルもしくはステープルとステッチの混合物を含有するペプチド、または構造強化のための他の化学的戦略を含む（例えば、Balaram P. Cur. Opin. Struct. Biol. 1992;2:845；Kemp DS, et al., J. Am. Chem. Soc. 1996;118:4240；Orner BP, et al., J. Am. Chem. Soc. 2001;123:5382；Chin JW, et al., Int. Ed. 2001;40:3806；Chapman RN, et al., J. Am. Chem. Soc. 2004;126:12252；Horne WS, et al., Chem., Int. Ed. 2008;47:2853；Madden et al., Chem Commun (Camb). 2009 Oct 7; (37): 5588-5590；Lau et al., Chem. Soc. Rev., 2015,44:91-102；およびGunnoo et al., Org. Biomol. Chem., 2016,14:8002-8013を参照されたい；これらのすべては参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。

ある特定の実施形態では、本明細書に記載のＥ２ｈＡペプチドの１つまたは複数は、ペプチドステープリングによって安定化され得る（例えば、Walensky, J. Med. Chem., 57:6275-6288 (2014)を参照されたい（その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。ペプチドは、それが、その天然の二次構造を維持するという点で「安定化」される。例えば、ステープリングは、α－ヘリックス二次構造を有しやすくなったポリペプチドが、その天然のα－ヘリックス立体構造を維持するのを可能にする。この二次構造は、ポリペプチドのタンパク質切断および熱に対する耐性を増加させ、標的結合親和性、疎水性、および細胞透過性も増加させることができる。したがって、本明細書に記載のステープル化（架橋した）ポリペプチドは、対応するステープル無し（non-stapled）（架橋していない）ポリペプチドと比較して、改善された生物活性を有する。

「ペプチドステープリング」は、合成方法論からの造語であり、ポリペプチド鎖に存在する２つのオレフィン含有側鎖（例えば、架橋可能な側鎖）が、閉環メタセシス（ＲＣＭ）反応を使用して共有結合により接合され（例えば、「一緒にステープルされる（stapled together）」）、架橋環を形成する（例えば、Blackwell et al., J. Org. Chem., 66: 5291-5302, 2001；Angew et al., Chem. Int. Ed. 37:3281, 1994を参照されたい）。本明細書で使用される場合、用語「ペプチドステープリング」は、このような反応を促進するいくつもの反応条件および／または触媒を使用して、ポリペプチド鎖に存在し得る２つの二重結合含有側鎖、２つの三重結合含有側鎖、または二重結合含有側鎖と三重結合含有側鎖（例えば、それらの少なくとも１つの対）を接合して、単独で「ステープル化された」ポリペプチドを得ることを含む。用語「複合ステープル化」ポリペプチドは、１つより多くの個々のステープルを含有するこれらのポリペプチドを指し、様々な間隔の２、３、またはそれより多い独立したステープルを含有し得る。さらに、用語「ペプチドステッチング」は、本明細書で使用される場合、単一のポリペプチド鎖における複数かつタンデムな「ステープリング」事象を指し、例えば、２つのステープルが共通の残基に連結した「ステッチ化」（例えば、タンデムまたは複合ステープル化）ポリペプチドを提供する。ペプチドステッチングは、例えば、ＷＯ２００８／１２１７６７およびＷＯ２０１０／０６８６８４に開示されており、これらはいずれも参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。一部の例では、ステープルは、本明細書において使用される場合、不飽和結合を保持することができ、または低減され得る。

ある特定の実施形態では、本明細書に記載のペプチドの１つまたは複数は、安定化され得る。一部の例では、本開示のＥ２ｈＡペプチドは、炭化水素ステープルもしくはステッチ、ラクタムステープルもしくはステッチ；ＵＶ－環化付加ステープルもしくはステッチ；オキシムステープルもしくはステッチ；チオエーテルステープルもしくはステッチ；ダブルクリックステープルもしくはステッチ；ビス－ラクタムステープルもしくはステッチ；ビス－アリール化ステープルもしくはステッチ；またはこれらのいずれか２つもしくはそれより多くの組合せによって安定化される。一例では、本明細書に記載のペプチドは、炭化水素ステープリングによって安定化される。一部の実施形態では、ステープルペプチドは、配列番号１～３９、５５～６３、または７９２～８０６のアミノ酸配列のいずれか１つを含むかまたはそれからなるポリペプチドの架橋バージョンである。一部の例では、ステープルペプチドは、配列番号１～３９、５５～６３、または７９２～８０６のアミノ酸配列のいずれか１つを含むかまたはそれからなるポリペプチドの炭化水素ステープル化バージョンである。一部の例では、ステープルペプチドは、配列番号１～３９、５５～６３、または７９２～８０６の少なくとも２（例えば、２、３、４、５、６）個のアミノ酸が非天然アミノ酸（例えば、Ｓ５、Ｒ８）で置き換えられていることを除き、配列番号１～３９、５５～６３、または７９２～８０６のアミノ酸配列のいずれか１つを含むかまたはそれからなるポリペプチドである。一部の実施形態では、ステープルペプチドは、配列番号１～３８のアミノ酸配列のいずれか１つを含むかもしくはそれからなる、またはこの中に、１～１３（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３）個のアミノ酸の置換、欠失および／もしくは挿入を含む（例えば、上記および以下の実施例に記載されるように、例えば、配列番号３９、５５、または４７）ポリペプチドである。ある特定の例では、ステープルペプチドは、少なくとも２（例えば、２、３、４、５、６）個のアミノ酸置換を含み、ここで、置換されたアミノ酸は、２、３、または６個のアミノ酸で分離され、かつオレフィン側鎖を有する非天然アミノ酸である。そのいずれかが本開示のペプチドに含まれ得る多くの公知の非天然（ｎｏｎ－ｎａｔｕｒａｌ）または不自然な（ｕｎｎａｔｕｒａｌ）アミノ酸が存在する。不自然なアミノ酸のいくつかの例は、４－ヒドロキシプロリン、デスモシン、ガンマ－アミノ酪酸、ベータ－シアノアラニン、ノルバリン、４－（Ｅ）－ブテニル－４（Ｒ）－メチル－Ｎ－メチル－Ｌ－トレオニン、Ｎ－メチル－Ｌ－ロイシン、１－アミノ－シクロプロパンカルボン酸、１－アミノ－２－フェニル－シクロプロパンカルボン酸、１－アミノ－シクロブタンカルボン酸、４－アミノ－シクロペンテンカルボン酸、３－アミノ－シクロヘキサンカルボン酸、４－ピペリジル酢酸、４－アミノ－ｌ－メチルピロール－２－カルボン酸、２，４－ジアミノ酪酸、２，３－ジアミノプロピオン酸、２，４－ジアミノ酪酸、２－アミノヘプタン二酸、４－（アミノメチル）安息香酸、４－アミノ安息香酸、オルト－、メタ－および／パラ置換フェニルアラニン（例えば、－Ｃ（＝Ｏ）Ｃ_６Ｈ_５；－ＣＦ_３；－ＣＮ；－ハロ；－ＮＯ_２；ＣＨ_３で置換された）、二置換フェニルアラニン、置換チロシン（例えば、－Ｃ＝Ｏ）Ｃ_６Ｈ_５；－ＣＦ_３；－ＣＮ；－ハロ；－ＮＯ_２；ＣＨ_３でさらに置換された）、ならびにスタチンである。さらに、アミノ酸は誘導体化され、ヒドロキシル化、リン酸化、スルホン化、アシル化、またはグリコシル化されたアミノ酸残基を含み得る。

炭化水素ステープルポリペプチド（hydrocarbon stapled polypeptide）は、２個の非天然アミノ酸間に１つまたは複数のテザー（結合）を含み、このテザーによって、ポリペプチドのα－ヘリックス二次構造がかなり増強される。一般的に、テザーは、１つまたは２つのヘリックスターン（すなわち、約３．４または約７個のアミノ酸）の長さを横切って伸長する。したがって、ｉおよびｉ＋３、ｉおよびｉ＋４、またはｉおよびｉ＋７に配置されたアミノ酸は、化学的修飾および架橋の理想的な候補物質である。よって、例えば、ペプチドが配列．．．Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９．．．を有する場合、Ｘ１とＸ４との間、またはＸ１とＸ５との間、またはＸ１とＸ８との間の架橋は、Ｘ２とＸ５との間、またはＸ２とＸ６との間、またはＸ２とＸ９との間の架橋などがそうであるように、そのペプチドの有用な炭化水素ステープル化形態（hydrocarbon stapled form）である。複数の架橋（例えば、２、３、４、またはそれより多い）の使用も企図される。複数の架橋の使用は、特にペプチド長が増加したペプチドの安定化および最適化に非常に有効である。よって、本開示は、配列をさらに安定化させるか、または構造的安定化、タンパク質分解耐性、酸安定性、熱安定性、細胞透過性、および／もしくはより長いポリペプチドストレッチの生物活性の増強を促進するために、ポリペプチド配列内に１つより多くの架橋を組み込むことを包含する。炭化水素ステープルポリペプチドの作製および使用に関するさらなる説明は、例えば、米国特許出願公開第２０１２／０１７２２８５号、同第２０１０／０２８６０５７号、および同第２００５／０２５０６８０号に見出すことができ、これらのすべての内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

ある特定の実施形態では、ステープルがｉおよびｉ＋３残基に存在する場合、Ｒ－プロペニルアラニンおよびＳ－ペンテニルアラニン；またはＲ－ペンテニルアラニンおよびＳ－ペンテニルアラニンは、それらの位置のアミノ酸の代わりとなる。ある特定の実施形態では、ステープルがｉおよびｉ＋４残基に存在する場合、Ｓ－ペンテニルアラニンは、それらの位置のアミノ酸の代わりとなる。ある特定の実施形態では、ステープルがｉおよびｉ＋７残基に存在する場合、Ｓ－ペンテニルアラニンおよびＲ－オクテニルアラニンは、それらの位置のアミノ酸の代わりとなる。一部の例では、ペプチドがステッチ化されている場合、「ステッチ」に関与するペプチドのアミノ酸は、ビス－ペンテニルグリシン、Ｓ－ペンテニルアラニン、およびＲ－オクテニルアラニン；またはビス－ペンテニルグリシン、Ｓ－オクテニルアラニン、およびＲ－オクテニルアラニンで置換されている。

ステープル化されるペプチドでは、ステープリング反応を妨げる（例えば、それを阻害するかまたはその効率を低下させる）アミノ酸は、ステープリング反応を妨げない（例えば、それを阻害しないかまたはその効率を実質的に低下させない）アミノ酸で置換されているべきである。例えば、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）は、ステープリング反応を妨げる場合があり、よって、ある特定の実施形態では、ステープル化されるペプチド内のメチオニン（複数可）は、例えば、ノルロイシン（複数可）で置き換えられている。

ペプチドがＵＢＡ１に結合するＥ２ｈＡ（例えば、配列番号１～３４のいずれか１つまたはその修飾されたバージョン（例えば、配列番号３９、５５、または５７））である、ある特定の実施形態では、ステープルおよび／またはステッチは、位置Ａ_２およびＡ_９、Ａ_５およびＡ_９、Ａ_８およびＡ_１２、Ａ_９およびＡ_１３、Ａ_１およびＡ_８、Ａ_４およびＡ_１１、またはＡ_５およびＡ_１２において作製される。ペプチドがＵＢＡ１に結合するＥ２ｈＡ（例えば、配列番号１～３４のいずれか１つまたはその修飾されたバージョン（例えば、配列番号３９、５５、もしくは５７、またはその修飾されたバージョン））である、ある特定の実施形態では、ステープルおよび／またはステッチは、位置Ａ_２およびＡ_９において作製される（例示的なステープルペプチドに関する表７を参照されたい）。ペプチドがＵＢＡ１に結合するＥ２ｈＡ（例えば、配列番号１～３４のいずれか１つまたはその修飾されたバージョン（例えば、配列番号３９、５５、もしくは５７、またはその修飾されたバージョン））である、ある特定の実施形態では、ステープルおよび／またはステッチは、位置Ａ_１およびＡ_８において作製される。ステープル位置は、ステープルウォークにおいて異なるステープルの場所を試験することによって変更され得る。

ペプチドが配列番号３５またはその修飾されたバージョンを含むかまたはそれからなる、ある特定の実施形態では、ステープルおよび／またはステッチは、位置Ａｒｇ－６およびＧｌｕ－１３において作製される。ペプチドが配列番号３６またはその修飾されたバージョンを含むかまたはそれからなる、ある特定の実施形態では、ステープルおよび／またはステッチは、位置Ａｌａ－６およびＡｓｐ－１３において作製される。ペプチドが配列番号３７またはその修飾されたバージョンを含むかまたはそれからなる、ある特定の実施形態では、ステープルおよび／またはステッチは、位置Ｌｅｕ－５およびＴｒｐ－１２において作製される。ペプチドが配列番号３８またはその修飾されたバージョンを含むかまたはそれからなる、ある特定の実施形態では、ステープルおよび／またはステッチは、位置Ａｌａ－３およびＬｅｕ－１０において作製される。例示的なステープルペプチドに関しては、表７および８を参照されたい。

表7. 例示的なステープルペプチド。配列番号64～99および850(それぞれ、上から下へ):「B」はノルロイシンであり、「X₁」および「X₂」は、架橋環を形成するために閉環メタセシス(RCM)反応を使用して共有結合により接合され得る(「一緒にステープルされる」)非天然アミノ酸である。配列番号100～135および851(それぞれ、上から下へ):「B」はノルロイシンであり、「X₁」はR-オクテニルアラニンであり、「X₂」はS-ペンテニルアラニンである。「tr」=トランケート;「m」=変異体

表8. 例示的なステープルペプチド。配列番号136～139(それぞれ、上から下へ):「B」はノルロイシンであり、「X₁」および「X₂」は、架橋環を形成するために閉環メタセシス(RCM)反応を使用して共有結合により接合され得る(「一緒にステープルされる」)非天然アミノ酸である。配列番号140～143(それぞれ、上から下へ):「B」はノルロイシンであり、「X₁」はR-オクテニルアラニンであり、「X₂」はS-ペンテニルアラニンである。

図２６の上のパネルは、様々な架橋した化合物を生成するために使用することができる非天然アミノ酸の例示的な化学構造を示す。図２６の真ん中のパネルは、位置ｉおよびｉ＋３、ｉおよびｉ＋４、ならびにｉおよびｉ＋７の残基の間の炭化水素架橋を有するペプチドを図示する。図２６の下のパネルは、ペプチド配列に沿ったステープルウォークを図示する。図２７は、二重および三重ステープリング戦略、ならびに例示的なステープルウォークを有する様々なペプチド配列を示す。図２８は、様々な長さの分岐ステッチ化部分（branched stitched moieties）を使用する例示的なステープルウォークを図示する。図２９は、点変異体およびステープルスキャン、ならびにＮおよびＣ末端の欠失、付加、および／または誘導体化に基づくペプチドのバリアントを図示する。

一態様では、安定化されたＥ２ｈＡペプチドは、式（Ｉ）、
（式中、
各Ｒ_１およびＲ_２は、独立して、Ｈ、またはＣ_１～Ｃ_１０アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアリールアルキル、もしくはヘテロシクリルアルキルであり；
Ｒ_３は、アルキル、アルケニル、アルキニル；［Ｒ_４－Ｋ－Ｒ_４］_ｎであり；そのそれぞれは、０～６個のＲ_５で置換されており；
Ｒ_４は、アルキル、アルケニル、またはアルキニルであり；
Ｒ_５は、ハロ、アルキル、ＯＲ_６、Ｎ（Ｒ_６）_２、ＳＲ_６、ＳＯＲ_６、ＳＯ_２Ｒ_６、ＣＯ_２Ｒ_６、Ｒ_６、蛍光部分、または放射性同位体であり；
Ｋは、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ_２、ＣＯ、ＣＯ_２、ＣＯＮＲ_６、または
であり、
Ｒ_６は、Ｈ、アルキル、または治療剤であり；
ｎは、１～４の整数であり；
ｘは、２～１０の整数であり；
各ｙは、独立して、０～１００の整数であり；
ｚは、１～１０の整数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０）であり；
各Ｘａａは、独立して、アミノ酸である）
を有する。一部の実施形態では、式（Ｉ）のＮ末端の［Ｘａａ］_ｙ、式（Ｉ）の［Ｘａａ］_ｘ、および式（Ｉ）のＣ末端の［Ｘａａ］_ｙのそれぞれは、表９の構築物１～２２５のいずれか１つについて記載された通りである。例えば、表９の構築物７のＮ末端の［Ｘａａ］_ｙ、［Ｘａａ］_ｘ、およびＣ末端の［Ｘａａ］_ｙを含む安定化されたペプチドに関して、Ｎ末端の［Ｘａａ］_ｙ、［Ｘａａ］_ｘ、およびＣ末端の［Ｘａａ］_ｙは、（ｉ）それぞれ、配列番号８７１、配列番号８７２、および配列番号８７３、（ｉｉ）それぞれ、Ｐ、配列番号８７２、および配列番号８７３、（ｉｉｉ）それぞれ、Ｐ、配列番号８７２、およびＦＫ、または（ｉｖ）それぞれ、配列番号８７１、配列番号８７２、およびＦＫであり得る。

表9. 式(I)の構築物1～225に関するN末端の[Xaa]_y、[Xaa]_x、およびC末端の[Xaa]_y配列。

ある特定の例では、表９において上記に示される配列のメチオニン（Ｍ）は、ノルロイシン（Ｂ）で置き換えられている。ある特定の例では、表９において上記で示される配列は、少なくとも１個（例えば、１、２、３、４、５、６個）のアミノ酸の置換または欠失を有し得る。Ｅ２ｈＡペプチドは、本明細書に記載の任意のアミノ酸配列を含み得る。

テザーは、アルキル、アルケニル、またはアルキニル部分（例えば、Ｃ_５、Ｃ_８、もしくはＣ_１１アルキル、Ｃ_５、Ｃ_８、もしくはＣ_１１アルケニル、またはＣ_５、Ｃ_８、もしくはＣ_１１アルキニル）を含み得る。テザーアミノ酸（ｔｅｔｈｅｒｅｄａｍｉｎｏａｃｉｄ）は、アルファ二置換されていてもよい（例えば、Ｃ_１～Ｃ_３またはメチル）。

一部の例では、ｘは、２、３、または６である。一部の例では、各ｙは、独立して、０から１５の間、または３から１５の間の整数である。一部の例では、Ｒ_１およびＲ_２は、それぞれ独立して、ＨまたはＣ_１～Ｃ_６アルキルである。一部の例では、Ｒ_１およびＲ_２は、それぞれ独立して、Ｃ_１～Ｃ_３アルキルである。一部の例では、Ｒ_１およびＲ_２のうちの少なくとも１つは、メチルである。例えば、Ｒ_１およびＲ_２は、いずれもメチルであってもよい。一部の例では、Ｒ_３はアルキル（例えば、Ｃ_８アルキル）であり、ｘは３である。一部の例では、Ｒ_３はＣ_１１アルキルであり、ｘは６である。一部の例では、Ｒ_３はアルケニル（例えば、Ｃ_８アルケニル）であり、ｘは３である。一部の例では、ｘは６であり、Ｒ_３はＣ_１１アルケニルである。一部の例では、Ｒ_３は、直鎖アルキル、アルケニル、またはアルキニルである。一部の例では、Ｒ_３は、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ＝ＣＨ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－である。

別の態様では、２つのアルファ、アルファ二置換立体中心は、いずれもＲ配置もしくはＳ配置（例えば、ｉ、ｉ＋４架橋）であるか、または一方の立体中心がＲであり、他方がＳである（例えば、ｉ、ｉ＋７架橋）。よって、ここで、式（Ｉ）は以下のように示され：

Ｃ’およびＣ’’の二置換立体中心は、いずれもＲ配置であってもよく、または、これらは、いずれもＳ配置であってもよい（例えば、ｘが３の場合）。ｘが６である場合、Ｃ’の二置換立体中心は、Ｒ配置にあり、Ｃ’’の二置換立体中心は、Ｓ配置にある。Ｒ_３の二重結合は、ＥまたはＺ立体化学配置にあってもよい。

一部の例では、Ｒ_３は［Ｒ_４－Ｋ－Ｒ_４］_ｎであり、Ｒ_４は直鎖アルキル、アルケニル、またはアルキニルである。

一部の実施形態では、本開示は、配列番号１～３８のいずれか１つ（またはその修飾されたバージョン（例えば、配列番号３９、５５、もしくは５７、またはその修飾されたバージョン）のアミノ酸配列を含む内部で架橋した（「ステープル化」または「ステッチ化」）ペプチドであって、２、３、または６個のアミノ酸によって分離された２個のアミノ酸の側鎖が、内部ステープルによって置き換えられているか；３個のアミノ酸の側鎖が、内部ステッチによって置き換えられているか；４個のアミノ酸の側鎖が、２つの内部ステープルによって置き換えられているか；または５個のアミノ酸の側鎖が、内部ステープルと内部ステッチの組合せによって置き換えられている、ペプチドを特徴とする。ある特定の例では、配列番号１の位置Ｍｅｔ－１、Ｌｅｕ－３、Ｌｙｓ－４、Ａｓｎ－７、Ｌｅｕ－１０、およびＡｌａ－１１の１個または複数におけるアミノ酸は、ステープルやステッチで置き換えられていない。ある特定の例では、配列番号２の位置Ｍｅｔ－１、Ｐｒｏ－２、Ｓｅｒ－３、Ｓｅｒ－４、Ｇｌｕ－７、Ａｒｇ－１１、Ｌｙｓ－１２、Ｌｅｕ－１４、Ｌｙｓ－１５、およびＧｌｎ－１８の１個または複数におけるアミノ酸は、ステープルやステッチで置き換えられていない。ある特定の例では、配列番号３～２０および２２～３４のいずれか１個の位置Ａ_４、Ａ_６、Ａ_７、Ａ_１０、および必要に応じてＡ_１３の１個または複数におけるアミノ酸は、ステープルやステッチで置き換えられていない。ある特定の例では、配列番号２１の位置Ｍｅｔ－１、Ａｒｇ－３、Ａｌａ－４、Ｓｅｒ－５、Ｌｅｕ－７、Ｌｙｓ－８、Ａｒｇ－９、Ｌｅｕ－１１、Ｈｉｓ－１２、およびＡｌａ－１５の１個または複数におけるアミノ酸は、ステープルやステッチで置き換えられていない。ある特定の例では、配列番号３５の位置Ｖａｌ－３、Ｌｙｓ－８、Ｖａｌ－１１、Ｌｙｓ－１２、およびＶａｌ－１４の１個または複数におけるアミノ酸は、ステープルやステッチで置き換えられていない。ある特定の例では、配列番号３６のいずれか１個の位置Ｌｙｓ－２、Ａｌａ－３、Ｇｌｎ－７、Ｌｅｕ－８、Ｇｌｎ－１１、Ｌｙｓ－１２、Ｉｌｅ－１４、Ａｓｎ－１５、およびＧｌｕ－１６の１個または複数におけるアミノ酸は、ステープルやステッチで置き換えられていない。ある特定の例では、配列番号３７の位置Ｌｅｕ－２、Ｓｅｒ－３、Ａｌａ－６、Ｇｌｎ－７、Ａｒｇ－９、Ｌｙｓ－１０、Ａｒｇ－１３、およびＬｙｓ－１４の１個または複数におけるアミノ酸は、ステープルやステッチで置き換えられていない。ある特定の例では、配列番号３８の位置Ａｒｇ－５、Ｇｌｕ－７、Ｌｅｕ－８、Ｖａｌ－１１、およびＬｅｕ－１４の１個または複数におけるアミノ酸は、ステープルやステッチで置き換えられていない。ステープル化／ステッチ化ペプチドは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０アミノ酸長であり得る。具体的な実施形態では、ステープル化／ステッチ化ペプチドは、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５アミノ酸長である。具体的な実施形態では、ステープル化／ステッチ化ペプチドは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８アミノ酸長である。具体的な実施形態では、ステープル化／ステッチ化ペプチドは、１１アミノ酸長である。具体的な実施形態では、ステープル化／ステッチ化ペプチドは、１２アミノ酸長である。例示的なＥ２ｈＡステープルペプチドは、表７、８、および１１～１５に示される。一実施形態では、Ｅ２ｈＡステープルペプチドは、配列番号６５、９６、１０１、および１３２に示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。一実施形態では、Ｅ２ｈＡステープルペプチドは、配列番号１３２に示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。一実施形態では、Ｅ２ｈＡステープルペプチドは、配列番号６７、９７、１０３、および１３３に示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。一実施形態では、Ｅ２ｈＡステープルペプチドは、配列番号７１および１０７に示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。ある特定の実施形態では、ステープルポリペプチド（stapled polypeptide）は、配列番号１～３９、５５～６３、７９２～８０６のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、ここで、２、３または６個のアミノ酸によって分離された少なくとも２個のアミノ酸が、ペプチドを構造的に安定させるために修飾される（例えば、それらを非天然アミノ酸で置換し、炭化水素ステープリングを可能にすることによって）。ある特定の実施形態では、ステープルポリペプチドは、配列番号１～３９、５５～６３、７９２～８０６のいずれか１つに示されるアミノ酸配列のバリアントを含むかまたはそれからなり、ここで、２、３または６個のアミノ酸によって分離された少なくとも２個のアミノ酸が、ペプチドを構造的に安定させるために修飾される（例えば、それらを非天然アミノ酸で置換し、炭化水素ステープリングを可能にすることによって）。ある特定の実施形態では、ステープルポリペプチドは、配列番号４（またはその修飾されたバージョン）に示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、ここで、２、３または６個のアミノ酸によって分離された少なくとも２個のアミノ酸が、ペプチドを構造的に安定させるために修飾される（例えば、それらを非天然アミノ酸で置換し、炭化水素ステープリングを可能にすることによって）。ある特定の実施形態では、ステープルポリペプチドは、配列番号３９（またはその修飾されたバージョン）に示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、ここで、２、３または６個のアミノ酸によって分離された少なくとも２個のアミノ酸が、ペプチドを構造的に安定させるために修飾される（例えば、それらを非天然アミノ酸で置換し、炭化水素ステープリングを可能にすることによって）。ある特定の実施形態では、ステープルポリペプチドは、配列番号６（またはその修飾されたバージョン）に示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、ここで、２、３または６個のアミノ酸によって分離された少なくとも２個のアミノ酸が、ペプチドを構造的に安定させるために修飾される（例えば、それらを非天然アミノ酸で置換し、炭化水素ステープリングを可能にすることによって）。ある特定の実施形態では、ステープルポリペプチドは、配列番号５５（またはその修飾されたバージョン）に示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、ここで、２、３または６個のアミノ酸によって分離された少なくとも２個のアミノ酸が、ペプチドを構造的に安定させるために修飾される（例えば、それらを非天然アミノ酸で置換し、炭化水素ステープリングを可能にすることによって）。ある特定の実施形態では、ステープルポリペプチドは、配列番号１０（またはその修飾されたバージョン）に示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、ここで、２、３または６個のアミノ酸によって分離された少なくとも２個のアミノ酸が、ペプチドを構造的に安定させるために修飾される（例えば、それらを非天然アミノ酸で置換し、炭化水素ステープリングを可能にすることによって）。ある特定の実施形態では、ステープルポリペプチドは、配列番号５７（またはその修飾されたバージョン）に示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、ここで、２、３または６個のアミノ酸によって分離された少なくとも２個のアミノ酸が、ペプチドを構造的に安定させるために修飾される（例えば、それらを非天然アミノ酸で置換し、炭化水素ステープリングを可能にすることによって）。

炭化水素テザーは一般的であるが、本明細書に記載のＥ２ｈＡペプチドにおいては、他のテザーを用いることもできる。例えば、テザーは、エーテル、チオエーテル、エステル、アミン、またはアミド、またはトリアゾール部分の１つまたは複数を含んでもよい。一部の場合には、天然に存在するアミノ酸側鎖は、テザーに組み込まれてもよい。例えば、テザーは、セリンのヒドロキシル、システインのチオール、リシンの第一級アミン、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸の酸、またはアスパラギンもしくはグルタミンのアミドなどの官能基と連結されてもよい。したがって、２個の天然に存在しないアミノ酸を連結させることによって作製されるテザーを使用するよりもむしろ、天然に存在するアミノ酸を使用するテザーを作製することが可能である。単一の天然に存在しないアミノ酸を天然に存在するアミノ酸と一緒に使用することも可能である。トリアゾールを含有する（例えば、１，４トリアゾールまたは１，５トリアゾール）架橋を使用することができる（例えば、Kawamoto et al. 2012 Journal of Medicinal Chemistry 55:1137；ＷＯ２０１０／０６０１１２を参照されたい）。さらに、様々なタイプのステープリングを実施する他の方法が、当技術分野において周知であり、本明細書に記載のＥ２ｈＡペプチドと共に用いられ得る（例えば、ラクタムステープリング：Shepherd et al., J. Am. Chem. Soc., 127:2974-2983 (2005)；ＵＶ－環化付加ステープリング：Madden et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 21:1472-1475 (2011)；ジスルフィドステープリング：Jackson et al., Am. Chem. Soc., 113:9391-9392 (1991)；オキシムステープリング：Haney et al., Chem. Commun., 47:10915-10917 (2011)；チオエーテルステープリング：Brunel and Dawson, Chem. Commun., 552-2554 (2005)；光スイッチ可能ステープリング：J. R. Kumita et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 97:3803-3808 (2000)；ダブルクリックステープリング：Lau et al., Chem. Sci., 5:1804-1809 (2014)；ビス－ラクタムステープリング：J. C. Phelan et al., J. Am. Chem. Soc., 119:455-460 (1997)；およびビス－アリール化ステープリング：A. M. Spokoyny et al., J. Am. Chem. Soc., 135:5946-5949 (2013)を参照されたい）。

テザーの長さが変更され得ることが、さらに想起される。例えば、二次アルファ－ヘリックス構造に関して比較的高い度合いの拘束をもたらすのが望ましい場合には、より短い長さのテザーを使用することができ、一方、一部の例では、二次アルファ－ヘリックス構造に関してそれほど拘束性をもたらさないのが望ましいため、より長いテザーが望ましい場合がある。

さらに、アミノ酸ｉ～ｉ＋３、ｉ～ｉ＋４、およびｉ～ｉ＋７に及ぶテザーは、アルファヘリックスの単一の面に主に存在するテザーを提供するために一般的であるが、テザーを合成して多数のアミノ酸の任意の組合せに広げてもよく、テザーを組み合わせて使用して複数のテザーを取り付けてもよい。

一部の例では、本明細書に記載の炭化水素テザー（すなわち、架橋）は、さらに操作されてもよい。一例では、炭化水素アルケニルテザー（例えば、ルテニウムに触媒される閉環メタセシス（ＲＣＭ）を使用して合成される）の二重結合を酸化させて（例えば、エポキシ化、アミノヒドロキシル化またはジヒドロキシル化によって）、以下の化合物のうちの１つをもたらすことができる。

エポキシド部分または遊離ヒドロキシル部分の１つのいずれかは、さらに官能化されてもよい。例えば、エポキシドを求核剤で処置して、例えば、治療剤を結合させるために使用することができるさらなる官能性を与えてもよい。あるいは、このような誘導体化は、ポリペプチドのアミノ末端もしくはカルボキシ末端の合成操作によって、またはアミノ酸側鎖によって達成されてもよい。他の作用物質（agent）、例えば、ポリペプチドの細胞への侵入を促進する作用物質を、官能化テザーに結合させてもよい。

一部の例では、アルファ二置換アミノ酸をポリペプチドにおいて使用し、アルファヘリックス二次構造の安定性を改善する。しかし、アルファ二置換アミノ酸が必要とされず、モノアルファ置換基（例えば、テザーアミノ酸において）を使用する例も想起される。

ステープルポリペプチドは、薬物、毒素、ポリエチレングリコールの誘導体、第２のポリペプチド、炭水化物などを含んでもよい。ポリマーまたは他の作用物質がステープルポリペプチドに連結される場合が、実質的に均質である組成物にとっては望ましい場合がある。

ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子の付加によって、ポリペプチドの薬物動態および薬力学特性が改善され得る。例えば、ＰＥＧ化によって、腎クリアランスが低下する場合があり、より安定した血漿中濃度がもたらされ得る。ＰＥＧは水溶性ポリマーであり、以下の式のようなポリペプチドに連結されて表されてもよい：

ＸＯ－－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ－－ＣＨ_２ＣＨ_２－－Ｙ（式中、ｎは２～１０，０００であり、ＸはＨであるかまたは末端修飾、例えば、Ｃ_１～_４アルキルであり；Ｙはポリペプチドのアミン基（リシンのイプシロンアミンまたはＮ末端を含むがこれらに限定されない）へのアミド、カルバメートまたは尿素の結合である。Ｙは、チオール基（システインのチオール基を含むがこれらに限定されない）へのマレイミド結合であってもよい）。ＰＥＧをポリペプチドに直接または間接的に連結させるための他の方法は、当業者に公知である。ＰＥＧは直鎖状であっても分岐状であってもよい。様々な官能化誘導体を含むＰＥＧの様々な形態が市販されている。

主鎖に分解可能な結合を有するＰＥＧを使用してもよい。例えば、ＰＥＧは、加水分解の対象であるエステル結合により調製されてもよい。分解可能なＰＥＧ結合を有するコンジュゲートが、ＷＯ９９／３４８３３；ＷＯ９９／１４２５９、および米国特許第６，３４８，５５８号に記載されている。

ある特定の実施形態では、高分子ポリマー（例えば、ＰＥＧ）は、中間体リンカーを介して本明細書に記載の作用物質に結合される。ある特定の実施形態では、リンカーは、ペプチド結合によって連結された１～２０個のアミノ酸から構成され、ここで、アミノ酸は、２０種の天然に存在するアミノ酸から選択される。これらのアミノ酸の一部は、当業者によって十分に理解されているように、グリコシル化されてもよい。他の実施形態では、１～２０個のアミノ酸は、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、およびリシンから選択される。他の実施形態では、リンカーは、立体障害のない主要なアミノ酸、例えば、グリシンおよびアラニンから構成される。非ペプチドリンカーも可能である。例えば、－ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎＣ（Ｏ）－（式中、ｎ＝２～２０）などのアルキルリンカーを使用してもよい。これらのアルキルリンカーは、例えば、低級アルキル（例えば、Ｃ_１～Ｃ_６）低級アシル、ハロゲン（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ）、ＣＮ、ＮＨ_２、フェニルなどの、任意の非立体障害基によってさらに置換されてもよい。米国特許第５，４４６，０９０号は、二官能性ＰＥＧリンカーおよび各ＰＥＧリンカー末端にペプチドを有するコンジュゲートを形成する際のその使用について記載する。

ステープルペプチドはまた、例えば、一部の実施形態では、細胞取込みをさらに促進するか、またはｉｎｖｉｖｏ安定性をさらに増加させるために、修飾されてもよい。例えば、ペプチド模倣大環状分子をアシル化またはＰＥＧ化することによって、細胞取込みを促進させる、バイオアベイラビリティーを増加させる、血液循環を増加させる、薬物動態を変更させる、免疫原性を低下させる、および／または必要とされる投与頻度を減少させる。

一部の実施形態では、本明細書に開示されるステープルペプチドは、細胞膜を貫通する増強された能力を有する（例えば、ステープル無しペプチドと比較して）。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１７／１４７２８３号を参照されたい。

本明細書に記載の安定化されたペプチドを合成する方法は、当技術分野において公知である。それにもかかわらず、以下の例示的な方法を使用してもよい。所望の化合物を得るために、代替の配列または順序で様々なステップが実施され得ることが認識される。本明細書に記載の化合物を合成するのに有用な合成化学変換（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃｃｈｅｍｉｓｔｒｙｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）および保護基方法論（保護および脱保護）は当技術分野で公知であり、例えばR. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers (1989)；T.W. Greene and P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3d. Ed., John Wiley and Sons (1999)；L. Fieser and M. Fieser, Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1994)；およびL. Paquette, ed., Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1995)、ならびにそれらの改版に記載される方法を含む。

本発明のペプチドは、当業者に周知である化学合成方法によって作製され得る。例えば、Fields et al., Chapter 3 in Synthetic Peptides: A User's Guide, ed. Grant, W. H. Freeman & Co., New York, N.Y., 1992, p. 77を参照されたい。それゆえに、例えば、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒＭｏｄｅｌ４３０Ａまたは４３１上で、側鎖保護されたアミノ酸を使用するｔ－ＢｏｃまたはＦｍｏｃ化学のいずれかにより保護されたα－ＮＨ_２を用いた固相合成の自動化されたメリフィールド技法を使用してペプチドが合成される。

本明細書に記載のペプチドを作製する１つの方式は、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を使用することである。Ｃ末端アミノ酸は、リンカー分子との酸不安定結合を介して架橋したポリスチレン樹脂に結合している。この樹脂は合成のために使用される溶媒に不溶性であり、これによって、過剰な試薬および副産物が比較的簡単に、素早く洗い流される。Ｎ末端はＦｍｏｃ基で保護されており、Ｆｍｏｃ基は、酸性で安定しているが、塩基で除去可能である。すべての側鎖官能基は、塩基安定基、酸不安定基を用いて保護される。

より長いペプチドは、天然の化学的ライゲーションを使用して、個々の合成ペプチドをつなぎ合わせることによって作製することができる。あるいは、より長い合成ペプチドは、周知の組換えＤＮＡ技法によって合成することができる。このような技法は、詳細なプロトコールを有する周知の標準的マニュアルにおいて提供される。本発明のペプチドをコードする遺伝子を構築するために、アミノ酸配列は、逆翻訳されて、好ましくは、遺伝子が発現されることになる生物に対して最適なコドンを有する、アミノ酸配列をコードする核酸配列が得られる。次に、合成遺伝子は、典型的には、ペプチドおよび必要であれば、任意の調節エレメントをコードするオリゴヌクレオチドを合成することによって作製される。合成遺伝子を好適なクローニングベクターに挿入し、宿主細胞にトランスフェクトする。次いで、選択された発現系および宿主に対して適切である、好適な条件下で、ペプチドを発現させる。ペプチドを精製し、標準的方法で特徴付ける。

ペプチドは、例えば、ＡｄｖａｎｃｅｄＣｈｅｍｔｅｃｈから入手可能なハイスループットマルチチャネルコンビナトリアルシンセサイザーを使用して、ハイスループットコンビナトリアル様式で作製され得る。ペプチド結合は、例えば、ペプチドの生理学的安定性を増加させるために、レトロインベルソ結合（Ｃ（Ｏ）－ＮＨ）；還元アミド結合（ＮＨ－ＣＨ_２）；チオメチレン結合（Ｓ－ＣＨ_２またはＣＨ_２－Ｓ）；オキソメチレン結合（Ｏ－ＣＨ_２またはＣＨ_２－Ｏ）；エチレン結合（ＣＨ_２－ＣＨ_２）；チオアミド結合（Ｃ（Ｓ）－ＮＨ）；ｔｒａｎｓ－オレフィン結合（ＣＨ＝ＣＨ）；フルオロ置換ｔｒａｎｓ－オレフィン結合（ＣＦ＝ＣＨ）；ケトメチレン結合（Ｃ（Ｏ）－ＣＨＲ）またはＣＨＲ－Ｃ（Ｏ）（ここで、ＲはＨまたはＣＨ_３である）；およびフルオロ－ケトメチレン結合（Ｃ（Ｏ）－ＣＦＲまたはＣＦＲ－Ｃ（Ｏ）（ここで、ＲはＨまたはＦまたはＣＨ_３である））によって置き換えることができる。

アセチル化、アミド化、ビオチン化、シンナモイル化、ファルネシル化、フルオレセイン化、ホルミル化、ミリストイル化、パルミトイル化、リン酸化（Ｓｅｒ、ＴｙｒまたはＴｈｒ）、ステアロイル化、スクシニル化およびスルフリル化によって、ポリペプチドをさらに修飾することができる。上記したように、ペプチドを、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；アルキル基（例えば、Ｃ１～Ｃ２０直鎖または分岐鎖アルキル基）；脂肪酸ラジカル；およびそれらの組合せとコンジュゲートすることができる。さまざまな長さのオレフィン側鎖を含有するα，α－二置換非天然アミノ酸は、公知の方法によって合成することができる（Williams et al. J. Am. Chem. Soc., 113:9276, 1991；Schafmeister et al., J. Am. Chem Soc., 122:5891, 2000；およびBird et al., Methods Enzymol., 446:369, 2008；Bird et al, Current Protocols in Chemical Biology, 2011）。ペプチドについて、ｉとｉ＋７を連結するステープルが使用される場合（安定化されたヘリックスの２ターン）、ａ）１つのＳ５アミノ酸および１つのＲ８が使用されるか、またはｂ）１つのＳ８アミノ酸および１つのＲ５アミノ酸が使用される。Ｒ８は、出発キラル補助剤（starting chiral auxillary）がＲ－アルキル－立体異性体を与えることを除けば、同じ経路を使用して合成される。また、５－ヨードペンテンに代えて８－ヨードオクテンが使用される。阻害剤は、ＭＢＨＡ樹脂において固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を使用して、固体支持体上で合成される（例えば、ＷＯ２０１０／１４８３３５を参照されたい）。

Ｆｍｏｃ保護α－アミノ酸（オレフィン系アミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｓ_５－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｒ_８－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｒ_８－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｓ_８－ＯＨおよびＦｍｏｃ－Ｒ_５－ＯＨ以外）、２－（６－クロロ－１－Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルアミニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＣＴＵ）、およびＲｉｎｋＡｍｉｄｅＭＢＨＡは、例えば、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）から市販されている。ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ－メチル－２－ピロリジノン（ＮＭＰ）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、１，２－ジクロロエタン（ＤＣＥ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、およびピペリジンは、例えば、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから市販されている。オレフィン系アミノ酸合成は、当技術分野において報告されている（Williams et al., Org. Synth., 80:31, 2003）。

やはり、本明細書に開示されるペプチドを得る（例えば、合成する）、ステープリングする、および精製するために好適な方法も、当技術分野において公知である（例えば、Bird et. al., Methods in Enzymol., 446:369-386 (2008)；Bird et al, Current Protocols in Chemical Biology, 2011；Walensky et al., Science, 305:1466-1470 (2004)；Schafmeister et al., J. Am. Chem. Soc., 122:5891-5892 (2000)；２０１０年３月１８日に出願された米国特許出願第１２／５２５，１２３号；および２０１０年５月２５日に発行された米国特許第７，７２３，４６８号（これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。

一部の実施形態では、ペプチドは、ステープル無しペプチド夾雑物を実質的に含まないか、または単離されている。ペプチドを精製するための方法としては、例えば、固相支持体上でペプチドを合成することが挙げられる。環化後に、固相支持体を単離し、ＤＭＳＯ、ＤＭＳＯ／ジクロロメタン混合物、またはＤＭＳＯ／ＮＭＰ混合物などの溶媒の溶液中に懸濁してもよい。ＤＭＳＯ／ジクロロメタンまたはＤＭＳＯ／ＮＭＰ混合物は、約３０％、４０％、５０％または６０％のＤＭＳＯを含んでもよい。具体的な実施形態では、５０％／５０％のＤＭＳＯ／ＮＭＰ溶液が使用される。溶液は、１、６、１２または２４時間の期間インキュベートされてもよく、その後、例えば、ジクロロメタンまたはＮＭＰで樹脂が洗浄されてもよい。一実施形態では、樹脂は、ＮＭＰで洗浄される。振盪および不活性ガスの溶液中へのバブリングが実施されてもよい。

安定化されたペプチドを生成する方法であって、（ａ）Ｅ２ｈＡペプチドをステープリングまたはステッチングするステップと、（ｂ）ステープルペプチドまたはステッチペプチドを単離するステップとを含む、方法も本明細書において提供される。

本発明のステープル化（架橋した）ポリペプチドの特性は、例えば、以下および実施例に記載の方法を使用して、アッセイされ得る。

α－ヘリシティを決定するためのアッセイ：化合物を水溶液に溶解させる（例えば、５ｍＭのリン酸カリウム溶液（ｐＨ７）、または蒸留したＨ_２Ｏ、２５～５０μＭの濃度まで）。標準的な測定パラメーター（例えば、温度、２０℃；波長、１９０～２６０ｎｍ；ステップ解像度（ｓｔｅｐｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）、０．５ｎｍ；速度、２０ｎｍ／秒；アキュムレーション、１０；応答、１秒；帯域幅、１ｎｍ；光路長、０．１ｃｍ）を使用して、分光偏光計（例えば、ＪａｓｃｏＪ－７１０、Ａｖｉｖ）上で円二色性（ＣＤ）スペクトルを得る。平均残基楕円率をモデルヘリックスデカペプチドについて報告された値（Yang et al., Methods Enzymol. 130:208 (1986)）で割ることによって、各ペプチドのα－ヘリックス含量を算出する。

融解温度（Ｔｍ）を決定するためのアッセイ：架橋または非修飾テンプレートペプチドを、蒸留したＨ_２Ｏまたは他の緩衝液もしくは溶媒に溶解させ（例えば、５０μＭの最終濃度で）、分光偏光計（例えば、ＪａｓｃｏＪ－７１０、Ａｖｉｖ）において標準的なパラメーター（例えば、波長２２２ｎｍ；ステップ解像度、０．５ｎｍ；速度、２０ｎｍ／秒；アキュムレーション、１０；応答、１秒；帯域幅、１ｎｍ；温度上昇率：１℃／分；光路長、０．１ｃｍ）を使用して、ある温度範囲（例えば、４～９５℃）にわたって楕円率の変化を測定することによってＴｍを決定する。

ｉｎｖｉｔｒｏプロテアーゼ耐性アッセイ：ペプチド骨格のアミド結合は、プロテアーゼによる加水分解を受けやすく、それによって、ペプチド系化合物はｉｎｖｉｖｏで急速に分解しやすくなる。しかしながら、ペプチドヘリックス形成は、典型的には、アミド骨格を埋め、および／またはひずませ、および／または保護し、したがって、タンパク質切断を防止するかまたは実質的に遅らせることができる。本発明のペプチド模倣大環状分子をｉｎｖｉｔｒｏ酵素タンパク質分解（例えば、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン）させて、対応する非架橋ポリペプチドまたは或いはステープルポリペプチドと比較した分解速度の何らかの変化について評価することができる。例えば、ペプチド模倣大環状分子および対応する非架橋ポリペプチドを、トリプシンアガロースと共にインキュベートし、遠心分離によって様々な時点で反応をクエンチし、その後ＨＰＬＣ注入して２８０ｎｍでの紫外線吸収により残存基質を定量する。簡潔に述べると、ペプチド模倣大環状分子およびペプチド模倣前駆体（５ｍｃｇ）を、トリプシンアガロース（Ｐｉｅｒｃｅ）（Ｓ／Ｅ約１２５）と共に、０、１０、２０、９０、および１８０分間インキュベートする。高速での卓上遠心分離によって反応をクエンチし、単離した上清中に残存している基質を２８０ｎｍでのＨＰＬＣによるピーク検出によって定量する。タンパク質分解反応は、一次速度則を示し、ｌｎ［Ｓ］対時間のプロットから速度定数、ｋを決定する。

ペプチド模倣大環状分子および／または対応する非架橋ポリペプチドを、各々、マウス、ラットおよび／またはヒトの新鮮な血清（例えば、１～２ｍＬ）と共に、３７℃で、例えば、０、１、２、４、８、および２４時間インキュベートすることができる。大環状分子濃度が異なる試料を、血清による段階希釈によって調製することができる。インタクトな化合物のレベルを決定するために、以下の手順を使用することができる：例えば、血清１００μＬを２ｍｌ遠心チューブに移し、その後、５０％のギ酸１０μＬおよびアセトニトリル５００μＬを添加し、４＋／－２℃で１０分間、１４，０００ＲＰＭで遠心分離することにより、試料を抽出する。次いで、上清を新しい２ｍｌチューブに移し、ＴｕｒｂｏｖａｐにおいてＮ_２＜１０ｐｓｉにて３７℃で蒸発させる。試料を５０：５０のアセトニトリル：水１００μＬで再構成し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を行う。ｅｘｖｉｖｏ安定性を試験するための同等または同様の手順は公知であり、血清における大環状分子の安定性を決定するために使用することができる。

ｉｎｖｉｖｏプロテアーゼ耐性アッセイ：ペプチドステープリングの鍵となる利益は、ｉｎｖｉｔｒｏプロテアーゼ耐性を、顕著に向上したｉｎｖｉｖｏでの薬物動態への移行である。

ｉｎｖｉｔｒｏ結合アッセイ：アクセプタータンパク質に対するペプチド模倣大環状分子およびペプチド模倣性前駆体の結合および親和性を評価するために、例えば、蛍光偏光アッセイ（ＦＰＡ）を使用することができる。ＦＰＡ技法は、偏光および蛍光トレーサーを使用して、分子配向および運動を測定する。偏光で励起されると、見掛けの分子量が高い分子と結合した蛍光トレーサー（例えば、ＦＩＴＣ）（例えば、大きいタンパク質と結合したＦＩＴＣ標識ペプチド）は、小分子と結合した蛍光トレーサー（例えば、溶液中にて遊離しているＦＩＴＣ標識ペプチド）と比較して、より遅いそれらの回転速度に起因して、より高レベルの偏光蛍光を発光する。

ｉｎｖｉｔｒｏ酵素阻害アッセイ：Ｅ２ｈＡペプチドによるＥ１酵素の阻害を評価するために、例えば、ｉｎｖｉｔｒｏ酵素阻害アッセイを使用することができる。ｉｎｖｉｔｒｏ酵素阻害アッセイは、Ｅ１による、ユビキチンのＥ２へのコンジュゲーションを阻害するＥ２ｈＡペプチドの能力を測定する。簡潔に述べると、例えば、５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）を含有する緩衝液中、室温で一定時間（例えば、３０分）、Ｅ２ｈＡペプチドまたはビヒクル対照（例えば、１％のＤＭＳＯ）の存在下で、組換えＥ１（例えば、ＵＢＡ１）、組換えＥ２（例えば、ＵＢＥ２Ａ）、ユビキチン、およびＭｇ－ＡＴＰを組み合わせる。対照反応はＥ１を含まない。ＳＤＳを含有するローディングダイの添加によって反応をクエンチし、非還元条件下で、試料をゲル（例えば、４～１２％のＢｉｓ－Ｔｒｉｓタンパク質ゲル）上で分離する。ゲル上のタンパク質は、例えば、銀染色によって可視化する。Ｅ１によるユビキチンのＥ２へのコンジュゲーションを、遊離Ｅ２（約１７ｋＤａ）のＥ２～ユビキチンコンジュゲート（約２６ｋＤａ）への変換によってモニターする。
安定化されたＥ２ｈＡペプチドのバリアント

一部の実施形態では、配列番号１～３８またはその修飾されたバージョン（すなわち、そのバリアント（例えば、配列番号３９、５５、または５７））のいずれか１つのペプチドを修飾することによって（例えば、アミノ酸置換によって）、内部で架橋したペプチドを作製することができる。一部の実施形態では、内部ステープルは、２個のアミノ酸の側鎖を置き換える、すなわち、各ステープルは、例えば、２、３、または６個のアミノ酸によって分離された２個のアミノ酸の間にある。一部の実施形態では、内部ステッチは、３個のアミノ酸の側鎖を置き換える、すなわち、ステッチは、例えば、３および６個のアミノ酸によって分離された３個のアミノ酸の間の一対の架橋である。一部の実施形態では、内部ステープルおよび／または内部ステッチは、少なくとも２つの内部ステープルを含む（４個のアミノ酸の側鎖を置き換える、すなわち、各ステープルは、例えば、３個のアミノ酸によって分離された２個のアミノ酸の間にある）。一部の実施形態では、内部ステープルおよび／または内部ステッチは、少なくとも１つの内部ステープルと内部ステッチの組合せを含む。一部の実施形態では、内部ステッチは、第１のアミノ酸ならびに第２および第３のアミノ酸の側鎖を置き換え、それによって、内部架橋によって、第１のアミノ酸（第２および第３のアミノ酸の間にある）を第２および第３のアミノ酸に架橋させ、ここで、第１および第２のアミノ酸は、２、３、または６個のアミノ酸によって分離され、第１および第３のアミノ酸は、２、３、または６個のアミノ酸によって分離され、かつ第２および第３のアミノ酸は別個のアミノ酸である。一部の実施形態では、本開示の内部で架橋したポリペプチドの４個のアミノ酸の側鎖は、２つの別個の内部ステープルによって置き換えられている。一部の実施形態では、２つの別個の内部ステープルの１つ目は、２、３、または６個のアミノ酸によって分離された第１のアミノ酸の対を架橋させ、少なくとも２つの別個の内部ステープルの２つ目は、２、３、または６個のアミノ酸によって分離された第２のアミノ酸の対を架橋させる。

ステープルポリペプチドは、内部の分子内架橋（または「ステープル」）によって接合された少なくとも２個の修飾されたアミノ酸を含み、この少なくとも２個のアミノ酸は、２、３、または６個のアミノ酸によって分離されている。本明細書において、安定化されたペプチドは、２つのステープルおよび／またはステッチペプチドを有するペプチドを含む、ステープルペプチドを含む。少なくとも２個の修飾されたアミノ酸は、不自然なアルファ－アミノ酸（α，α－二置換アミノ酸およびＮ－アルキル化アミノ酸を含むがこれらに限定されない）であってもよい。多くの公知の不自然なアミノ酸が存在し、これらはいずれも、本発明のペプチドに含まれ得る。不自然なアミノ酸のいくつかの例は、４－ヒドロキシプロリン、デスモシン、ガンマ－アミノ酪酸、ベータ－シアノアラニン、ノルバリン、４－（Ｅ）－ブテニル－４（Ｒ）－メチル－Ｎ－メチル－Ｌ－トレオニン、Ｎ－メチル－Ｌ－ロイシン、１－アミノ－シクロプロパンカルボン酸、１－アミノ－２－フェニル－シクロプロパンカルボン酸、１－アミノ－シクロブタンカルボン酸、４－アミノ－シクロペンテンカルボン酸、３－アミノ－シクロヘキサンカルボン酸、４－ピペリジル酢酸、４－アミノ－ｌ－メチルピロール－２－カルボン酸、２，４－ジアミノ酪酸、２，３－ジアミノプロピオン酸、２，４－ジアミノ酪酸、２－アミノヘプタン二酸、４－（アミノメチル）安息香酸、４－アミノ安息香酸、オルト－、メタ－および／パラ置換フェニルアラニン（例えば、－Ｃ（＝Ｏ）Ｃ_６Ｈ_５；－ＣＦ_３；－ＣＮ；－ハロ；－ＮＯ２；ＣＨ_３で置換された）、二置換フェニルアラニン、置換チロシン（例えば、－Ｑ＝Ｏ）Ｃ_６Ｈ_５；－ＣＦ_３；－ＣＮ；－ハロ；－ＮＯ_２；ＣＨ_３でさらに置換された）、ならびにスタチンである。

一部の実施形態では、本開示の内部で架橋したＥ２ｈＡペプチドのバリアントは、配列番号１～３８のいずれか１つのポリペプチドから調製され、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、もしくは９個のアミノ酸置換を有する（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、または９個のアミノ酸が、保存的にまたは非保存的に置換されている）、ならびに／または例えば、Ｎ末端および／もしくはＣ末端から、１、２、３、４、５、６、７、８、もしくは９個のアミノ酸の欠失を有する（例えば、Ｎ末端および／またはＣ末端から１、２、３、４、５、６、７、８、または９個のアミノ酸が欠失している）。バリアントを含む例示的なＥ２ｈＡペプチドが、表１～６に提供される。例えば、ある特定の実施形態では、本開示の内部で架橋したＥ２ｈＡペプチドのバリアントは、配列番号１～３８のいずれか１つにおいて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３個のアミノ酸置換を有する（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３個のアミノ酸が、保存的にまたは非保存的に置換されている）。一部の例では、配列番号１～３８のいずれか１つの１～３個のアミノ酸が置換されている。配列番号１～３８のいずれか１つにおけるアミノ酸置換は、Ｅ２ｈＡの同族Ｅ１酵素と直接相互作用する（または直接相互作用することが予測される）か、またはそれとの直接相互作用に関与しない（または直接相互作用に関与しないことが予測される）アミノ酸の置換であり得る。さらにより多くの変動性は、Ｅ２ｈＡの同族Ｅ１酵素と直接相互作用する（または直接相互作用することが予測される）アミノ酸においてよりも、Ｅ２ｈＡの同族Ｅ１酵素との直接相互作用に関与しない（または直接相互作用に関与しないことが予測される）アミノ酸において許容される。実際に、Ｅ２ｈＡの同族Ｅ１酵素との直接相互作用に関与しない（または直接相互作用に関与しないことが予測される）アミノ酸のほぼすべて（例えば、直接相互作用しない（または直接相互作用しないことが予測される）アミノ酸のうちの５、４、３、２、または１個のアミノ酸）が、置換され得る（例えば、保存的もしくは非保存的アミノ酸置換またはアラニンでの置換）。ある特定の実施形態では、Ｅ２ｈＡの同族Ｅ１酵素と直接相互作用する（または直接相互作用することが予測される）１、２、または３個のアミノ酸は、別のアミノ酸で置換されている。一部の例では、置換（複数可）は、保存的アミノ酸置換である。他の例では、置換（複数可）は、非保存的アミノ酸置換である。一部の例では、１個より多くのアミノ酸置換が存在する場合、置換は、保存的アミノ酸置換と非保存的アミノ酸置換の両方である。一部の例では、１個より多くのアミノ酸置換が存在する場合、置換のそれぞれは、保存的アミノ酸置換である。一部の場合には、配列番号１～３８のいずれか１つの１～３個のアミノ酸（例えば、１、２、または３個）が置換されている場合、置換は、すべて、Ｅ２ｈＡの同族Ｅ１酵素との直接相互作用に関与しない（または直接相互作用に関与しないことが予測される）アミノ酸の置換である。一部の場合には、配列番号１～３８のいずれか１つの１～３個のアミノ酸（例えば、１、２、または３個）が置換されている場合、置換は、すべて、Ｅ２ｈＡの同族Ｅ１酵素と直接相互作用する（または直接相互作用することが予測される）アミノ酸の置換である。一部の場合には、配列番号１～３８のいずれか１つの１～３個のアミノ酸（例えば、１、２、または３個）が置換されている場合、置換は、Ｅ２ｈＡの同族Ｅ１酵素と直接相互作用する（または直接相互作用することが予測される）アミノ酸およびＥ２ｈＡの同族Ｅ１酵素との直接相互作用に関与しない（または直接相互作用に関与しないことが予測される）アミノ酸の置換の両方である。ある特定の例では、置換されたアミノ酸（複数可）は、Ｌ－Ａｌａ、Ｄ－Ａｌａ、Ａｉｂ、Ｓａｒ、Ｓｅｒ、置換されたアラニン、または置換されたグリシン誘導体からなる群から選択される。ある特定の例では、修飾されたＵｂｃ１５Ｅ２ｈＡペプチドは、アルギニンで置換されたＥ７残基（配列番号２に従う番号付け）を含む。

ある特定の実施形態では、本開示の内部で架橋したＥ２ｈＡペプチドのバリアントは、配列番号１～３８のいずれか１つに示される配列のＣ末端から除去された／欠失した１、２、３、４、または５個のアミノ酸を有し得る。例えば、ある特定の実施形態では、本開示の内部で架橋したＥ２ｈＡペプチドのバリアントは、配列番号４に示されるアミノ酸配列の修飾されたアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、ここで、２個のアミノ酸は、配列番号４の配列のＣ末端から除去されている／欠失している（例えば、内部で架橋したＥ２ｈＡペプチドのバリアントは、配列番号３９のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる）。別の例において、ある特定の実施形態では、本開示の内部で架橋したＥ２ｈＡペプチドのバリアントは、配列番号６に示されるアミノ酸配列の修飾されたアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、ここで、５個のアミノ酸は、配列番号６の配列のＣ末端から除去されている／欠失している（例えば、内部で架橋したＥ２ｈＡペプチドのバリアントは、配列番号５５のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる）。ある特定の実施形態では、本開示の内部で架橋したＥ２ｈＡペプチドのバリアントは、配列番号１～３８のいずれか１つに示される配列のＮ末端から除去された／欠失した１、２、３、４、または５個のアミノ酸を有し得る。ある特定の実施形態では、本開示のＵＢＡ１と結合するＥ２ｈＡペプチドは、配列番号１～３４のいずれか１つに示される配列のＣ末端から除去された／欠失したアミノ酸位置Ａ_１２～Ａ_１６を有し得る。ある特定の実施形態では、本開示のＵＢＡ１に結合する内部で架橋したＥ２ｈＡペプチドのバリアントは、配列番号１～３４のいずれか１つに示される配列のＮ末端から除去された／欠失したアミノ酸位置Ａ_１に対してＮ末端側のアミノ酸位置の１、２、３個、またはすべてを有し得る。ある特定の実施形態では、本開示の内部で架橋したＥ２ｈＡペプチドのバリアントは、配列番号１～３８のいずれか１つに示される配列のＮ末端とＣ末端の両方から除去された／欠失した１、２、３、４、または５個のアミノ酸を有し得る。ある特定の実施形態では、本開示のＵＢＡ１に結合する内部で架橋したＥ２ｈＡペプチドのバリアントは、配列番号１～３４のいずれか１つに示される配列のＣ末端から除去された／欠失した１、２、３、４、または５個のアミノ酸、およびその配列のＮ末端から除去された／欠失したアミノ酸位置Ａ_１に対してＮ末端側のアミノ酸の１、２、３個、またはすべてを有し得る。ある特定の例では、これらの除去されたアミノ酸は、Ｌ－Ａｌａ、Ｄ－Ａｌａ、Ａｉｂ、Ｓａｒ、Ｓｅｒ、置換されたアラニン、または置換されたグリシン誘導体からなる群から選択される１～６（例えば、１、２、３、４、５、または６）個のアミノ酸で置き換えられ得る。

ある特定の例では、内部で架橋したＥ２ｈＡペプチドまたはバリアントは、表７、８、および１１～１５のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有する。

本明細書に記載の内部で架橋したＥ２ｈＡペプチドのバリアントは、治療使用のために最適化され得る。例えば、上記内部で架橋したＥ２ｈＡペプチドのバリアントのいずれかが膜破壊（細胞溶解）を引き起こす場合、全体的なペプチドの疎水性を低下させることによってペプチドを最適化することができる。例えば、これは、特に、疎水性残基を、より低い疎水性を有するアミノ酸（例えば、アラニン）で置換することによって達成され得る。膜破壊は、ペプチドの全体的な正荷電を低下させることによって低下させることもできる。これは、塩基性残基を荷電していないかまたは酸性の残基で置換することによって達成することができる。ある特定の例では、全体的なペプチドの疎水性とペプチドの全体的な正荷電の両方が低下される。

ある特定の実施形態では、本明細書に記載の内部で架橋したＥ２ｈＡペプチドのバリアントは、５から３５の間のアミノ酸長、５から２５の間のアミノ酸長、５から２０の間のアミノ酸長、５から１８の間のアミノ酸長、１０から３５の間のアミノ酸長、１０から２５の間のアミノ酸長、１０から２０の間のアミノ酸長、１０から１８の間のアミノ酸長、１５から２６の間のアミノ酸長、または１５から１８の間のアミノ酸長である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の内部で架橋したＥ２ｈＡペプチドのバリアントは、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９アミノ酸長である。

ある特定の実施形態では、ステープル化Ｅ２ｈＡペプチドのバリアントは、表７、８、および１１～１５のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。これらのペプチドの構造的安定化の非限定的な例は、これらの配列において、２、３、または６個のアミノ酸によって分離された位置に非天然アミノ酸を導入することによる炭化水素ステープリングによって達成される。
弾頭部を有する安定化されたＥ２ｈＡペプチドのバリアント

本開示は、弾頭部、すなわち、求電子性基を有する非天然アミノ酸などの反応性基を含む、安定化されたＵＢＡ１に結合するＥ２ｈＡペプチドを特徴とする。重要なことに、これらの弾頭部を含有するペプチドによって、ＵＢＡ１に結合するＥ２ｈＡペプチドとＥ１との間の非共有結合による相互作用が、求電子剤とＵＢＡ１の位置Ｃｙｓ－１０３９のシステイン（すなわち、配列番号８４５の１０３９位）との間の共有結合によって接合されるため、関連するＥ２ｈＡペプチドのアミノ酸配列において有意な（弾頭部の非存在下におけるよりもはるかに大きな）変動性が可能になる。よって、Ｅ２ｈＡの同族Ｅ１酵素と直接相互作用する（または直接相互作用することが予測される）アミノ酸の置換を含む、配列番号１～３４のいずれか１つにおける置換および／または欠失が存在する場合であっても（例えば、配列番号３～２０および２２～３４に関する位置Ａ４、Ａ５、Ａ７、およびＡ１０）、これらの弾頭部を有するペプチドは、ＵＢＡ１に結合する際に効果的である傾向がある。さらに、弾頭部が存在すると、Ｅ２ｈＡペプチド（例えば、表１、２、６、および７の配列のいずれか１つ）のサイズは、長さが低減され得る（例えば、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、または５個のアミノ酸まで）。

求電子剤は、非天然アミノ酸との関係においてのみではなく、安定化された（例えば、架橋した）Ｅ２ｈＡペプチドのＮ末端またはＣ末端に対する化学的キャップとしても、導入され得る。一部の例では、求電子剤は、安定化されたペプチド内に導入され得る。このような弾頭部を有する安定化されたペプチドは、それらが相互作用するタンパク質の少なくとも一部と共有結合を形成することができる。例えば、このような弾頭部を有するＥ２ｈＡペプチドは、共有結合によってＵＢＡ１を修飾し得る（例えば、ＵＢＡ１のＣｙｓ１０３９との共有結合およびＵＢＡ１との非共有結合による相互作用によって）。

弾頭部は、ポリペプチド配列のＮ末端、Ｃ末端、またはその中に存在してもよい。ある特定の実施形態では、弾頭部は、位置Ａ_７に存在する。ある特定の実施形態では、弾頭部は、位置Ａ_８に存在する。ある特定の実施形態では、弾頭部は、位置Ａ_１１に存在する。一部の場合には、弾頭部は、非天然求電子剤を有するアミノ酸である。ある特定の実施形態では、弾頭部は、末端がブロモアセチルであるジアミノブタン酸、末端がアクリルアミドであるジアミノブタン酸；末端がアクリルアミドである３Ｓ－１－ピロリジン－３－カルボン酸；末端がアクリルアミドであるＤ－ホモプロリン；末端がアクリルアミドであるＬ－ホモプロリン；末端がアクリルアミドであるイソニペコチン酸；末端がアクリルアミドであるＤ－ニペコチン酸；末端がアクリルアミドであるＬ－ニペコチン酸；末端がアクリルアミドであるＤ－プロリン；末端がアクリルアミドであるＬ－プロリン；ｔｒａｎｓ－４－ジメチルアミノクロトン酸；およびアクリル酸からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、弾頭部は、末端がブロモアセチルであるジアミノブタン酸である。ある特定の実施形態では、弾頭部は、末端がアクリルアミドであるジアミノブタン酸である。

一部の実施形態では、求電子性弾頭部は、システイン反応性Ｄ－ニペコチン酸部分である。他の実施形態では、求電子性弾頭部は、システイン反応性部分である。

ある特定の実施形態では、弾頭部は、（Ｓ）－１－アクリロイルピロリジン－３－カルボキサミド；１－アクリロピペリジン－４－カルボキサミド、（Ｒ）－１アクリロイルピぺリジン－３－カルボキサミド；（Ｓ）－１－アクリロイルピぺリジン－３－カルボキサミド；（Ｓ）－１－アクリロイルピロリジン－２－カルボキサミド；（Ｒ）－１－アクリロイルピロリジン－２－カルボキサミド；（Ｅ）－４－（ジメチルアミノ）ブタ－２－エナミド；およびアクリルアミドからなる群から選択される求電子性基を有する非天然アミノ酸である。他の実施形態では、弾頭部は、アミノ酸ではない。例えば、求電子性部分およびペプチドは、飽和（アジリジン、ジアジリジン、アゼチジン、ピロリジン、イミダゾリジン、ピラゾリジン、オキサゾリジン、イソキサゾリジン、チアゾリジン、イソチアゾリジン、ピぺリジン、ピペラジン、モルホリン、チオモルホリン、アゼパン）、または不飽和（アジリン、ジアジリン、アゼト、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、イソキサゾール、チアゾール、イソチアゾール、ピリジン、ジアジン、オキサジン、チアジン、アゼピン）の窒素を含有する複素環によって連結される。ペプチドおよび求電子剤はまた、フェニル（アニリン）などの置換アミノ官能化環（例えば、Ｎ－アリールアクリルアミド）によって、またはより複雑な二環式もしくは多環式環、例えば、ナフタレン、アントラセン、フェナントレン、インドール、イソインドール、インドリジン、キノロン、イソキノリン、キノキサリン、フタルジン、キナゾリン、プリン、カルバゾール、インダゾール、ベンゾイミダゾール、アザインドールによって連結され得る。一部の実施態様では、求電子弾頭部は、アクリルアミドであるか、またはより一般的には、α，β－不飽和カルボニル、例えばα－シアノアクリルアミド、プロピオルアミド、ｔｒａｎｓ４－ジメチルアミノ－２－ブテンアミド、もしくはｔｒａｎｓ４－ピペリジニル－２－ブテンアミド、あるいはいずれかの他の置換アクリルアミド、またはＮ－官能化ビニルスルホニル、アルファ－フルオロアセチル、アルファ－クロロアセチル、アルファ－ブロモアセチル、およびアルファ－ヨードアセチルまたは他の求電子部分として定義される。求電子剤は、非天然アミノ酸との関係において導入され得るだけでなく、架橋（例えば、ステープル化、ステッチ化）ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に対する化学的キャップとしても導入され得る。

一態様では、ＵＢＡ１に結合し、弾頭部を有するＥ２ｈＡは、配列番号１～３４、または本明細書で上記されるかもしくは実施例に記載されるその修飾されたバージョン（例えば、配列番号３９、５５、または５７）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、弾頭部を含むよう修飾されている。別の態様では、ＵＢＡ１に結合し、弾頭部を有するＥ２ｈＡペプチドは、配列番号１～３４、またはその修飾されたバージョン（例えば、配列番号３９、５５、または５７）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、弾頭部を含むよう修飾されている。別の態様では、ＵＢＡ１に結合し、弾頭部を有するＥ２ｈＡペプチドは、配列番号１～３４のいずれか１つに示される配列の５個またはそれより多い（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４個の）アミノ酸を含有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、弾頭部を含むよう修飾されている。別の態様では、ＵＢＡ１に結合し、弾頭部を有するＥ２ｈＡペプチドは、配列番号１～３４のいずれか１つに示される配列のＣ末端またはＮ末端に１～８個の欠失（例えば、１、２、３、４、５、６、７、または８個）を含有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、弾頭部を含むよう修飾されている。別の態様では、ＵＢＡ１に結合し、弾頭部を有するＥ２ｈＡペプチドは、弾頭部を含むよう修飾された表１、２、６、および７のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。一部の例では、求電子性弾頭部は、ペプチドのＮ末端に存在する。他の例では、求電子性弾頭部は、ペプチド内、例えば、位置Ａ_７、Ａ_８、またはＡ_１１に存在する。

一実施形態では、ＵＢＡ１に結合し、弾頭部を有するＥ２ｈＡペプチドは、以下の表１０に示される配列から選択される配列を有する。

表10. 例示的な弾頭部を有するペプチド。配列番号144～251および827～829(それぞれ、上から下へ):「J」は、アミノ酸を含有する非天然求電子剤またはアミノ酸ではない部分との関係において提示される求電子性弾頭部である(求電子剤は、化学的キャップとして作用することができる)。配列番号252～359および830～832(それぞれ、上から下へ):「J」は、末端がアクリルアミドであるジアミノブタン酸または末端がブロモアセチルであるジアミノブタン酸である。「tr」=トランケート;「m」=変異体

ある特定の例では、上記弾頭部を有する配列は、当技術分野において公知の任意の方法または本明細書に記載の任意の方法によって、構造的に安定化され得る。例えば、２、３、または６個のアミノ酸によって分離された配列の少なくとも２個のアミノ酸（例えば、２、３、４、５個）は、ステープルおよび／またはステッチを形成することができる非天然アミノ酸で置き換えられてもよい。

一部の実施形態では、ステープル化された、弾頭部を有するポリペプチドは、表１１から選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。

表11. 例示的な弾頭部を有するステープルペプチド。配列番号360～503および833～836(それぞれ、上から下へ):「B」はノルロイシンであり、「X₁」および「X₂」は、架橋環を形成するために閉環メタセシス(RCM)反応を使用して共有結合により接合され得る(「一緒にステープルされる」)非天然アミノ酸である。「J」は、アミノ酸を含有する非天然求電子剤またはアミノ酸ではない部分との関係において提示される求電子性弾頭部である(求電子剤は、化学的キャップとして作用することができる)。配列番号504～647および837～840(それぞれ、上から下へ):「B」はノルロイシンであり、「X₁」はR-オクテニルアラニンであり、「X₂」はS-ペンテニルアラニンであり、「J」は、アミノ酸を含有する非天然求電子剤またはアミノ酸ではない部分との関係において提示される求電子性弾頭部である(求電子剤は、化学的キャップとして作用することができる)。配列番号648～791および841～844(それぞれ、上から下へ):「B」はノルロイシンであり、「X1」はR-オクテニルアラニンであり、「X2」はS-ペンテニルアラニンであり、「J」は、末端がアクリルアミドであるジアミノブタン酸または末端がブロモアセチルであるジアミノブタン酸である。「tr」=トランケート;「m」=変異体

一部の実施形態では、弾頭部を有するステープルペプチドは、表１１において上記で列挙したアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、Ｅ２ｈＡの同族Ｅ１酵素との直接相互作用に関与しない複数（例えば、１、２、３、４、５、６個）の残基は、Ａｌａ（アラニン）、Ｄ－Ａｌａ（Ｄ－アラニン）、Ａｉｂ（α－アミノイソ酪酸）、Ｓａｒ（Ｎ－メチルグリシン）、およびＳｅｒ（セリン）、他の置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択される残基で置き換えられている。さらに、これらの残基の１個または複数（例えば、１、２、３、４、５、６個）は、ペプチドのＣ末端に付加され得る。一部の例では、表１１の上記ペプチドのＣ末端の０～５個のアミノ酸は、Ａｌａ（アラニン）、Ｄ－Ａｌａ（Ｄ－アラニン）、Ａｉｂ（α－アミノイソ酪酸）、Ｓａｒ（Ｎ－メチルグリシン）、およびＳｅｒ（セリン）、他の置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択される残基（１個または複数）で置き換えられている。

一部の実施形態では、本開示は、表１０または１１に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２７％、少なくとも３４％、少なくとも４０％、少なくとも４７％、少なくとも５０％、少なくとも５３％、少なくとも６０％、少なくとも６５％少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である弾頭部を有するＥ２ｈＡステープルペプチドを特徴とし、修飾されたペプチドは、ＵＢＡ１に共有結合により結合する。一部の実施形態では、これらの修飾されたペプチドは、アミノ酸バリエーションの前に、ステープル化Ｅ２ｈＡペプチドと比較して、低下した疎水性および／または全体的な正荷電を有する。一部の実施形態では、疎水性または正荷電は、独立して増強され、細胞貫通性を最適化する。

ある特定の実施形態では、本開示は、表１０または１１に示されるアミノ酸配列と比較して、１～１０（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）個のアミノ酸置換を有する弾頭部を有するＥ２ｈＡステープルペプチドを特徴とし、修飾されたペプチドは、ＵＢＡ１に共有結合により結合する。一部の実施形態では、これらの修飾されたペプチドは、アミノ酸置換の前に、ステープル化Ｅ２ｈＡペプチドと比較して、低下した疎水性および／または全体的な正荷電を有する。一部の実施形態では、疎水性または正荷電は、独立して増強され、細胞貫通性を最適化する。
例示的な安定化されたＥ２ｈＡペプチドのバリアントおよび弾頭部を有する安定化されたＥ２ｈＡペプチドのバリアント

具体的な実施形態では、安定化されたペプチドは、０～６（すなわち、０、１、２、３、４、５、６）個のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を有する配列番号４のアミノ酸配列に基づく。具体的な実施形態では、安定化されたペプチドは、０～６（すなわち、０、１、２、３、４、５、６）個のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を有する配列番号３９のアミノ酸配列に基づく。具体的な実施形態では、安定化されたペプチドは、ＢＳＴＰＸ_１ＲＲＲＬＢＲＸ_２ＦＫＲＬＱのアミノ酸配列を含み、ここで、「Ｂ」はノルロイシンであり、「Ｘ_１」はＳ－ペンテニルアラニンであり、「Ｘ_２」は、Ｒ－オクテニルアラニンであり（配列番号１３２）、０～６（すなわち、０、１、２、３、４、５、６）個のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を有する。特定の実施形態では、ステープルペプチドは、上記「Ｅ２ｈＡペプチド」および「安定化されたペプチド」の項目に記載された修飾の１個または複数をさらに含む。別の実施形態では、安定化されたペプチドは、配列番号１３２のアミノ酸配列からなる。ある特定の実施形態では、別のアミノ酸で置換された配列番号１３２の０～６（すなわち、０、１、２、３、４、５、６）個のアミノ酸は、配列番号１３２のヘリックスのＥ１と相互作用しない面に存在する。一部の実施形態では、配列番号１３２の０～３個のアミノ酸は、Ｃ末端から除去されているか、または除去されて、アラニン、Ｄ－アラニン、α－アミノイソ酪酸、Ｎ－メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群からの１～６個のアミノ酸で置き換えられている。一部の実施形態では、配列番号１３２の相互作用しない面の０～６個のアミノ酸は、アラニン、Ｄ－アラニン、α－アミノイソ酪酸、Ｎ－メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている。一部の実施形態では、配列番号１３２の以下のアミノ酸、Ａｒｇ－７（すなわち、Ａ４）、Ｌｅｕ－９（すなわち、Ａ６）、ノルロイシン－１０（すなわち、Ａ７）、Ｐｈｅ－１３（すなわち、Ａ１０）、および必要に応じてＬｅｕ－１６（すなわち、Ａ１３）の１個または複数は、アルファ－メチル化またはアルファ－エチル化された天然アミノ酸で置換されている。一部の実施形態では、配列番号１３２の以下のアミノ酸、Ａｒｇ－７（すなわち、Ａ４）、Ｌｅｕ－９（すなわち、Ａ６）、ノルロイシン－１０（すなわち、Ａ７）、Ｐｈｅ－１３（すなわち、Ａ１０）、および必要に応じてＬｅｕ－１６（すなわち、Ａ１３）の１個または複数は、Ｌ－アラニン、Ｄ－アラニン、α－アミノイソ酪酸、Ｎ－メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている。一部の実施形態では、配列番号１３２の以下のアミノ酸、ノルロイシン－１（すなわち、Ａ－３）、Ｓｅｒ－２（すなわち、Ａ－２）、Ｔｈｒ－３（すなわち、Ａ－１）、Ｐｒｏ－４（すなわち、Ａ１）、Ａｌａ－５（すなわち、Ａ２）、Ａｒｇ－６（すなわち、Ａ３）、Ａｒｇ－８（すなわち、Ａ５）、Ａｒｇ－１１（すなわち、Ａ８）、Ａｓｐ－１２（すなわち、Ａ９）、Ｌｙｓ－１４（すなわち、Ａ１１）、Ａｒｇ－１５（すなわち、Ａ１２）、およびＧｌｎ－１７（すなわち、Ａ１４）の１個または複数は、アルファ－メチル化またはアルファ－エチル化された天然アミノ酸で置換されている。ある特定の実施形態では、配列番号１３２の以下のアミノ酸、ノルロイシン－１（すなわち、Ａ－３）、Ｓｅｒ－２（すなわち、Ａ－２）、Ｔｈｒ－３（すなわち、Ａ－１）、Ｐｒｏ－４（すなわち、Ａ１）、Ａｌａ－５（すなわち、Ａ２）、Ａｒｇ－６（すなわち、Ａ３）、Ａｒｇ－８（すなわち、Ａ５）、Ａｒｇ－１１（すなわち、Ａ８）、Ａｓｐ－１２（すなわち、Ａ９）、Ｌｙｓ－１４（すなわち、Ａ１１）、Ａｒｇ－１５（すなわち、Ａ１２）、およびＧｌｎ－１７（すなわち、Ａ１４）の１個または複数は、Ｌ－アラニン、Ｄ－アラニン、α－アミノイソ酪酸、Ｎ－メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている。ある特定の例では、別のアミノ酸で置換された配列番号１３２の１～６個のアミノ酸は、配列番号１３２のヘリックスのＥ１と相互作用する面に存在する。他の例では、別のアミノ酸により置換された配列番号１３２の１～６個のアミノ酸は、配列番号１３２のヘリックスのＥ１と相互作用しない面および相互作用する面に存在する。ある特定の実施形態では、配列番号１３２の１～６個のアミノ酸は、Ｌ－アラニン、Ｄ－アラニン、α－アミノイソ酪酸、Ｎ－メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸（１個または複数）によって置換されている。

具体的な実施形態では、安定化されたペプチドは、０～６（すなわち、０、１、２、３、４、５、６）個のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を有する配列番号６のアミノ酸配列に基づく。具体的な実施形態では、安定化されたペプチドは、０～６（すなわち、０、１、２、３、４、５、６）個のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を有する配列番号５５のアミノ酸配列に基づく。具体的な実施形態では、安定化されたペプチドは、ＢＡＧＴＸ_１ＬＫＲＬＢＡＸ_２ＹＫのアミノ酸配列を含み、ここで、「Ｂ」はノルロイシンであり、「Ｘ_１」はＳ－ペンテニルアラニンであり、「Ｘ_２」はＲ－オクテニルアラニンであり（配列番号１３３）、０～６（すなわち、０、１、２、３、４、５、６）個のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を有する。特定の実施形態では、ステープルペプチドは、上記「Ｅ２ｈＡペプチド」および「安定化されたペプチド」の項目に記載された修飾の１個または複数をさらに含む。別の実施形態では、安定化されたペプチドは、配列番号１３３のアミノ酸配列からなる。ある特定の実施形態では、別のアミノ酸により置換された配列番号１３３の０～６（すなわち、０、１、２、３、４、５、６）個のアミノ酸は、配列番号１３３のヘリックスのＥ１と相互作用しない面に存在する。一部の実施形態では、配列番号１３３の０～３個のアミノ酸は、Ｃ末端から除去されているか、または除去されて、アラニン、Ｄ－アラニン、α－アミノイソ酪酸、Ｎ－メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群からの１～６個のアミノ酸で置き換えられている。一部の実施形態では、配列番号１３３の相互作用しない面の０～６個のアミノ酸は、アラニン、Ｄ－アラニン、α－アミノイソ酪酸、Ｎ－メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている。一部の実施形態では、配列番号１３３の以下のアミノ酸、Ｌｙｓ－７（すなわち、Ａ４）、Ｌｅｕ－９（すなわち、Ａ６）、ノルロイシン－１０（すなわち、Ａ７）、Ｔｙｒ－１３（すなわち、Ａ１０）、および必要に応じてＬｅｕ－１６（すなわち、Ａ１３）の１個または複数は、アルファ－メチル化またはアルファ－エチル化された天然アミノ酸で置換されている。一部の実施形態では、配列番号１３３の以下のアミノ酸、Ｌｙｓ－７（すなわち、Ａ４）、Ｌｅｕ－９（すなわち、Ａ６）、ノルロイシン－１０（すなわち、Ａ７）、Ｔｙｒ－１３（すなわち、Ａ１０）、および必要に応じてＬｅｕ－１６（すなわち、Ａ１３）の１個または複数は、Ｌ－アラニン、Ｄ－アラニン、α－アミノイソ酪酸、Ｎ－メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている。一部の実施形態では、配列番号１３３の以下のアミノ酸、ノルロイシン－１（すなわち、Ａ－３）、Ａｌａ－２（すなわち、Ａ－２）、Ｇｌｙ－３（すなわち、Ａ－１）、Ｔｈｒ－４（すなわち、Ａ１）、Ａｌａ－５（すなわち、Ａ２）、Ｌｅｕ－６（すなわち、Ａ３）、Ａｒｇ－７（すなわち、Ａ５）、Ａｌａ－１０（すなわち、Ａ８）、Ｇｌｕ－１１（すなわち、Ａ９）、およびＬｙｓ－１３（すなわち、Ａ１１）の１個または複数は、アルファ－メチル化またはアルファ－エチル化された天然アミノ酸で置換されている。ある特定の実施形態では、配列番号１０７の以下のアミノ酸、ノルロイシン－１（すなわち、Ａ－３）、Ａｌａ－２（すなわち、Ａ－２）、Ｇｌｙ－３（すなわち、Ａ－１）、Ｔｈｒ－４（すなわち、Ａ１）、Ａｌａ－５（すなわち、Ａ２）、Ｌｅｕ－６（すなわち、Ａ３）、Ａｒｇ－７（すなわち、Ａ５）、Ａｌａ－１０（すなわち、Ａ８）、Ｇｌｕ－１１（すなわち、Ａ９）、およびＬｙｓ－１３（すなわち、Ａ１１）は、Ｌ－アラニン、Ｄ－アラニン、α－アミノイソ酪酸、Ｎ－メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている。ある特定の例では、別のアミノ酸により置換された配列番号１３３の１～６個のアミノ酸は、配列番号１３３のヘリックスのＥ１と相互作用する面に存在する。他の例では、別のアミノ酸により置換された配列番号１３３の１～６個のアミノ酸は、配列番号１３３のヘリックスのＥ１と相互作用しない面および相互作用する面に存在する。ある特定の実施形態では、配列番号１３３の１～６個のアミノ酸は、Ｌ－アラニン、Ｄ－アラニン、α－アミノイソ酪酸、Ｎ－メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸（１個または複数）によって置換されている。

具体的な実施形態では、安定化されたペプチドは、０～６（すなわち、０、１、２、３、４、５、６）個のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を有する配列番号１０のアミノ酸配列に基づく。具体的な実施形態では、安定化されたペプチドは、ＢＸ_１ＬＫＲＩＨＫＸ_２ＬＮＤＬＡＲＤのアミノ酸配列を含み、ここで、「Ｂ」はノルロイシンであり、「Ｘ_１」はＳ－ペンテニルアラニンであり、「Ｘ_２」はＲ－オクテニルアラニンであり（配列番号１０７）、０～６（すなわち、０、１、２、３、４、５、６）個のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を有する。特定の実施形態では、ステープルペプチドは、上記「Ｅ２ｈＡペプチド」および「安定化されたペプチド」の項目に記載された修飾の１個または複数をさらに含む。別の実施形態では、安定化されたペプチドは、配列番号１０７のアミノ酸配列からなる。ある特定の実施形態では、別のアミノ酸により置換された配列番号１０７の０～６（すなわち、０、１、２、３、４、５、６）個のアミノ酸は、配列番号１０７のヘリックスのＥ１と相互作用しない面に存在する。一部の実施形態では、配列番号１０７の０～３個のアミノ酸は、Ｃ末端から除去されているか、または除去されて、アラニン、Ｄ－アラニン、α－アミノイソ酪酸、Ｎ－メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群からの１～６個のアミノ酸で置き換えられている。一部の実施形態では、配列番号１０７の相互作用しない面の０～６個のアミノ酸は、アラニン、Ｄ－アラニン、α－アミノイソ酪酸、Ｎ－メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている。一部の実施形態では、配列番号１０７の以下のアミノ酸、Ｌｙｓ－４（すなわち、Ａ４）、Ｉｌｅ－６（すなわち、Ａ６）、Ｈｉｓ－７（すなわち、Ａ７）、Ｌｅｕ－１０（すなわち、Ａ１０）、および必要に応じてＬｅｕ－１３（すなわち、Ａ１３）の１個または複数は、アルファ－メチル化またはアルファ－エチル化された天然アミノ酸で置換されている。一部の実施形態では、配列番号１０７の以下のアミノ酸、Ｌｙｓ－４（すなわち、Ａ４）、Ｉｌｅ－６（すなわち、Ａ６）、Ｈｉｓ－７（すなわち、Ａ７）、Ｌｅｕ－１０（すなわち、Ａ１０）、および必要に応じてＬｅｕ－１３（すなわち、Ａ１３）の１個または複数は、Ｌ－アラニン、Ｄ－アラニン、α－アミノイソ酪酸、Ｎ－メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている。一部の実施形態では、配列番号１０７の以下のアミノ酸、ノルロイシン－１（すなわち、Ａ１）、Ａｌａ－２（すなわち、Ａ２）、Ｌｅｕ－３（すなわち、Ａ３）、Ａｒｇ－５（すなわち、Ａ５）、Ｌｙｓ－８（すなわち、Ａ８）、Ｇｌｕ－９（すなわち、Ａ９）、Ａｓｎ－１１（すなわち、Ａ１１）、Ａｓｐ－１２（すなわち、Ａ１２）、Ａｌａ－１４（すなわち、Ａ１４）、Ａｒｇ－１５（すなわち、Ａ１５）、およびＡｓｐ－１６（すなわち、Ａ１６）の１個または複数は、アルファ－メチル化またはアルファ－エチル化された天然アミノ酸で置換されている。ある特定の実施形態では、配列番号１０７の以下のアミノ酸、ノルロイシン－１（すなわち、Ａ１）、Ａｌａ－２（すなわち、Ａ２）、Ｌｅｕ－３（すなわち、Ａ３）、Ａｒｇ－５（すなわち、Ａ５）、Ｌｙｓ－８（すなわち、Ａ８）、Ｇｌｕ－９（すなわち、Ａ９）、Ａｓｎ－１１（すなわち、Ａ１１）、Ａｓｐ－１２（すなわち、Ａ１２）、Ａｌａ－１４（すなわち、Ａ１４）、Ａｒｇ－１５（すなわち、Ａ１５）、およびＡｓｐ－１６（すなわち、Ａ１６）の１個または複数は、Ｌ－アラニン、Ｄ－アラニン、α－アミノイソ酪酸、Ｎ－メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている。ある特定の例では、別のアミノ酸により置換された配列番号１０７の１～６個のアミノ酸は、配列番号１０７のヘリックスのＥ１と相互作用する面に存在する。他の例では、別のアミノ酸により置換された配列番号１０７の１～６個のアミノ酸は、配列番号１０７のヘリックスのＥ１と相互作用しない面および相互作用する面に存在する。ある特定の実施形態では、配列番号１０７の１～６個のアミノ酸は、Ｌ－アラニン、Ｄ－アラニン、α－アミノイソ酪酸、Ｎ－メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸（１個または複数）によって置換されている。

別の具体的な実施形態では、ペプチドは、本明細書に記載のＥ１に結合する、弾頭部を有するＥ２ｈＡペプチドである。例えば、上記配列番号４、６、１０、３９、５５のペプチド、またはそれらのバリアントは、アミノ酸を含有する非天然求電子剤またはアミノ酸ではない部分との関係において提示される求電子性弾頭部を含むよう修飾されている（求電子剤は化学的キャップとして作用する）（例えば、システイン反応性部分、例えば、末端がアクリルアミドであるジアミノブタン酸または末端がブロモアセチルであるジアミノブタン酸）。

具体的な実施形態では、Ｅ１に結合する、弾頭部を有するＥ２ｈＡペプチドは、（上記のように）０～６（すなわち、０、１、２、３、４、５、６）個のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を有する配列番号１７６の配列を含む。特定の実施形態では、Ｅ１に結合する、弾頭部を有するＥ２ｈＡペプチドは、（上記のように）０～６（すなわち、０、１、２、３、４、５、６）個のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を有する配列番号３９２の配列を含む。別の特定の実施形態では、Ｅ１に結合する、弾頭部を有するＥ２ｈＡペプチドは、（上記のように）０～６（すなわち、０、１、２、３、４、５、６）個のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を有する配列番号６８０の配列を含む。特定の実施形態では、Ｅ１に結合する、弾頭部を有するＥ２ｈＡペプチド（例えば、配列番号１７６、３９２、または６８０）は、上記「Ｅ２ｈＡペプチド」および「安定化されたペプチド」の項目に記載された１個または複数の修飾をさらに含む。

具体的な実施形態では、Ｅ１に結合する、弾頭部を有するＥ２ｈＡペプチドは、（上記のように）０～６（すなわち、０、１、２、３、４、５、６）個のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を有する配列番号２１２の配列を含む。特定の実施形態では、Ｅ１に結合する、弾頭部を有するＥ２ｈＡペプチドは、（上記のように）０～６（すなわち、０、１、２、３、４、５、６）個のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を有する配列番号４２８の配列を含む。別の特定の実施形態では、Ｅ１に結合する、弾頭部を有するＥ２ｈＡペプチドは、（上記のように）０～６（すなわち、０、１、２、３、４、５、６）個のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を有する配列番号７１６の配列を含む。特定の実施形態では、Ｅ１に結合する、弾頭部を有するＥ２ｈＡペプチド（例えば、配列番号２１２、４２８、または７１６）は、上記「Ｅ２ｈＡペプチド」および「安定化されたペプチド」の項目に記載された１個または複数の修飾をさらに含む。

具体的な実施形態では、Ｅ１に結合する、弾頭部を有するＥ２ｈＡペプチドは、（上記のように）０～６（すなわち、０、１、２、３、４、５、６）個のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を有する配列番号２４８の配列を含む。特定の実施形態では、Ｅ１に結合する、弾頭部を有するＥ２ｈＡペプチドは、（上記のように）０～６（すなわち、０、１、２、３、４、５、６）個のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を有する配列番号４６４の配列を含む。別の特定の実施形態では、Ｅ１に結合する、弾頭部を有するＥ２ｈＡペプチドは、（上記のように）０～６（すなわち、０、１、２、３、４、５、６）個のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を有する配列番号７５２の配列を含む。特定の実施形態では、Ｅ１に結合する、弾頭部を有するＥ２ｈＡペプチドは、（上記のように）０～６（すなわち、０、１、２、３、４、５、６）個のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を有する配列番号５００の配列を含む。別の特定の実施形態では、Ｅ１に結合する、弾頭部を有するＥ２ｈＡペプチドは、（上記のように）０～６（すなわち、０、１、２、３、４、５、６）個のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を有する配列番号７８８の配列を含む。特定の実施形態では、Ｅ１に結合する、弾頭部を有するＥ２ｈＡペプチド（例えば、配列番号２４８、４６４、５００、７５２、または７８８）は、上記「Ｅ２ｈＡペプチド」および「安定化されたペプチド」の項目に記載された修飾の１個または複数をさらに含む。

具体的な実施形態では、Ｅ１に結合する、弾頭部を有するＥ２ｈＡペプチドは、（上記のように）０～６（すなわち、０、１、２、３、４、５、６）個のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を有する配列番号１７７の配列を含む。特定の実施形態では、Ｅ１に結合する、弾頭部を有するＥ２ｈＡペプチドは、（上記のように）０～６（すなわち、０、１、２、３、４、５、６）個のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を有する配列番号３９３の配列を含む。別の特定の実施形態では、Ｅ１に結合する、弾頭部を有するＥ２ｈＡペプチドは、（上記のように）０～６（すなわち、０、１、２、３、４、５、６）個のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を有する配列番号６８１の配列を含む。特定の実施形態では、Ｅ１に結合する、弾頭部を有するＥ２ｈＡペプチド（例えば、配列番号１７７、３９３、または６８１）は、上記「Ｅ２ｈＡペプチド」および「安定化されたペプチド」の項目に記載された１個または複数の修飾をさらに含む。

具体的な実施形態では、Ｅ１に結合する、弾頭部を有するＥ２ｈＡペプチドは、（上記のように）０～６（すなわち、０、１、２、３、４、５、６）個のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を有する配列番号２１３の配列を含む。特定の実施形態では、Ｅ１に結合する、弾頭部を有するＥ２ｈＡペプチドは、（上記のように）０～６（すなわち、０、１、２、３、４、５、６）個のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を有する配列番号４２９の配列を含む。別の特定の実施形態では、Ｅ１に結合する、弾頭部を有するＥ２ｈＡペプチドは、（上記のように）０～６（すなわち、０、１、２、３、４、５、６）個のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を有する配列番号７１７の配列を含む。特定の実施形態では、Ｅ１に結合する、弾頭部を有するＥ２ｈＡペプチド（例えば、配列番号２１３、４２９、または７１７）は、上記「Ｅ２ｈＡペプチド」および「安定化されたペプチド」の項目に記載された１個または複数の修飾をさらに含む。

具体的な実施形態では、Ｅ１に結合する、弾頭部を有するＥ２ｈＡペプチドは、（上記のように）０～６（すなわち、０、１、２、３、４、５、６）個のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を有する配列番号２４９の配列を含む。特定の実施形態では、Ｅ１に結合する、弾頭部を有するＥ２ｈＡペプチドは、（上記のように）０～６（すなわち、０、１、２、３、４、５、６）個のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を有する配列番号４６５の配列を含む。別の特定の実施形態では、Ｅ１に結合する、弾頭部を有するＥ２ｈＡペプチドは、（上記のように）０～６（すなわち、０、１、２、３、４、５、６）個のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を有する配列番号７５３の配列を含む。特定の実施形態では、Ｅ１に結合する、弾頭部を有するＥ２ｈＡペプチドは、（上記のように）０～６（すなわち、０、１、２、３、４、５、６）個のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を有する配列番号５０１の配列を含む。別の特定の実施形態では、Ｅ１に結合する、弾頭部を有するＥ２ｈＡペプチドは、（上記のように）０～６（すなわち、０、１、２、３、４、５、６）個のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を有する配列番号７８９の配列を含む。特定の実施形態では、Ｅ１に結合する、弾頭部を有するＥ２ｈＡペプチド（例えば、配列番号２４９、４６５、５０１、７５３、または７８９）は、上記「Ｅ２ｈＡペプチド」および「安定化されたペプチド」の項目に記載された修飾の１個または複数をさらに含む。

具体的な実施形態では、Ｅ１に結合する、弾頭部を有するＥ２ｈＡペプチドは、（上記のように）０～６（すなわち、０、１、２、３、４、５、６）個のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を有する配列番号１５１の配列を含む。特定の実施形態では、Ｅ１に結合する、弾頭部を有するＥ２ｈＡペプチドは、（上記のように）０～６（すなわち、０、１、２、３、４、５、６）個のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を有する配列番号３６７の配列を含む。別の特定の実施形態では、Ｅ１に結合する、弾頭部を有するＥ２ｈＡペプチドは、（上記のように）０～６（すなわち、０、１、２、３、４、５、６）個のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を有する配列番号６５５の配列を含む。特定の実施形態では、Ｅ１に結合する、弾頭部を有するＥ２ｈＡペプチド（例えば、配列番号１５１、３６７、または６５５）は、上記「Ｅ２ｈＡペプチド」および「安定化されたペプチド」の項目に記載された１個または複数の修飾をさらに含む。

具体的な実施形態では、Ｅ１に結合する、弾頭部を有するＥ２ｈＡペプチドは、（上記のように）０～６（すなわち、０、１、２、３、４、５、６）個のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を有する配列番号１８７の配列を含む。特定の実施形態では、Ｅ１に結合する、弾頭部を有するＥ２ｈＡペプチドは、（上記のように）０～６（すなわち、０、１、２、３、４、５、６）個のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を有する配列番号４０３の配列を含む。別の特定の実施形態では、Ｅ１に結合する、弾頭部を有するＥ２ｈＡペプチドは、（上記のように）０～６（すなわち、０、１、２、３、４、５、６）個のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を有する配列番号６９１の配列を含む。特定の実施形態では、Ｅ１に結合する、弾頭部を有するＥ２ｈＡペプチド（例えば、配列番号１８７、４０３、または６９１）は、上記「Ｅ２ｈＡペプチド」および「安定化されたペプチド」の項目に記載された１個または複数の修飾をさらに含む。

具体的な実施形態では、Ｅ１に結合する、弾頭部を有するＥ２ｈＡペプチドは、（上記のように）０～６（すなわち、０、１、２、３、４、５、６）個のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を有する配列番号２２３の配列を含む。特定の実施形態では、Ｅ１に結合する、弾頭部を有するＥ２ｈＡペプチドは、（上記のように）０～６（すなわち、０、１、２、３、４、５、６）個のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を有する配列番号４３９の配列を含む。別の特定の実施形態では、Ｅ１に結合する、弾頭部を有するＥ２ｈＡペプチドは、（上記のように）０～６（すなわち、０、１、２、３、４、５、６）個のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を有する配列番号７２７の配列を含む。特定の実施形態では、Ｅ１に結合する、弾頭部を有するＥ２ｈＡペプチドは、（上記のように）０～６（すなわち、０、１、２、３、４、５、６）個のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を有する配列番号４７５の配列を含む。別の特定の実施形態では、Ｅ１に結合する、弾頭部を有するＥ２ｈＡペプチドは、（上記のように）０～６（すなわち、０、１、２、３、４、５、６）個のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を有する配列番号７６３の配列を含む。特定の実施形態では、Ｅ１に結合する、弾頭部を有するＥ２ｈＡペプチド（例えば、配列番号２２３、４３９、７２７、７５７、または７６３）は、上記「Ｅ２ｈＡペプチド」および「安定化されたペプチド」の項目に記載された修飾の１個または複数をさらに含む。

具体的な実施形態では、Ｅ１に結合する、弾頭部を有するＥ２ｈＡペプチドは、（上記のように）０～６（すなわち、０、１、２、３、４、５、６）個のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を有する配列番号８２７の配列を含む。特定の実施形態では、Ｅ１に結合する、弾頭部を有するＥ２ｈＡペプチドは、（上記のように）０～６（すなわち、０、１、２、３、４、５、６）個のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を有する配列番号８３５の配列を含む。別の特定の実施形態では、Ｅ１に結合する、弾頭部を有するＥ２ｈＡペプチドは、（上記のように）０～６（すなわち、０、１、２、３、４、５、６）個のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を有す配列番号８４３の配列を含む。特定の実施形態では、Ｅ１に結合する、弾頭部を有するＥ２ｈＡペプチド（例えば、配列番号８２７、８３５、または８４３）は、上記「Ｅ２ｈＡペプチド」および「安定化されたペプチド」の項目に記載された１個または複数の修飾をさらに含む。

具体的な実施形態では、Ｅ１に結合する、弾頭部を有するＥ２ｈＡペプチドは、（上記のように）０～６（すなわち、０、１、２、３、４、５、６）個のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を有する配列番号８２８の配列を含む。特定の実施形態では、Ｅ１に結合する、弾頭部を有するＥ２ｈＡペプチドは、（上記のように）０～６（すなわち、０、１、２、３、４、５、６）個のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を有する配列番号８３４の配列を含む。別の特定の実施形態では、Ｅ１に結合する、弾頭部を有するＥ２ｈＡペプチドは、（上記のように）０～６（すなわち、０、１、２、３、４、５、６）個のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を有する配列番号８４２の配列を含む。特定の実施形態では、Ｅ１に結合する、弾頭部を有するＥ２ｈＡペプチド（例えば、配列番号８２８、８３４、または８４２）は、上記「Ｅ２ｈＡペプチド」および「安定化されたペプチド」の項目に記載された１個または複数の修飾をさらに含む。

具体的な実施形態では、Ｅ１に結合する、弾頭部を有するＥ２ｈＡペプチドは、（上記のように）０～６（すなわち、０、１、２、３、４、５、６）個のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を有する配列番号８２９の配列を含む。特定の実施形態では、Ｅ１に結合する、弾頭部を有するＥ２ｈＡペプチドは、（上記のように）０～６（すなわち、０、１、２、３、４、５、６）個のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を有する配列番号８３６の配列を含む。別の特定の実施形態では、Ｅ１に結合する、弾頭部を有するＥ２ｈＡペプチドは、（上記のように）０～６（すなわち、０、１、２、３、４、５、６）個のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を有する配列番号８４４の配列を含む。特定の実施形態では、Ｅ１に結合する、弾頭部を有するＥ２ｈＡペプチドは、（上記のように）０～６（すなわち、０、１、２、３、４、５、６）個のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を有する配列番号８３３の配列を含む。別の特定の実施形態では、Ｅ１に結合する、弾頭部を有するＥ２ｈＡペプチドは、（上記のように）０～６（すなわち、０、１、２、３、４、５、６）個のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を有する配列番号８４１の配列を含む。特定の実施形態では、Ｅ１に結合する、弾頭部を有するＥ２ｈＡペプチド（例えば、配列番号８２９、８３３、８３６、８４１、または８４４）は、上記「Ｅ２ｈＡペプチド」および「安定化されたペプチド」の項目に記載された修飾の１個または複数をさらに含む。
処置の方法

本開示は、Ｅ１を発現する疾患またはＥ１に依存する疾患の予防および／または処置のために、本明細書に記載の安定化されたペプチド（または前記安定化されたペプチドを含む医薬組成物）のいずれかを使用する方法を特徴とする。Ｅ１を発現する疾患またはＥ１に依存する疾患の非限定的な例としては、がん、血液悪性腫瘍、固形腫瘍、抗体媒介性移植拒絶、自己免疫障害、炎症性障害、および病的細胞の生存に関わる他の疾患が挙げられる。用語「処置する」または「処置すること」は、本明細書で使用される場合、対象が患っている疾患または状態を緩和すること、阻害すること、または改善することを指す。

本明細書に記載のペプチド（またはペプチドを含む組成物）は、Ｅ１を発現するがんを有するヒト対象を処置するのに有用であり得る。本明細書に記載のペプチド（またはペプチドを含む組成物）はまた、Ｅ１に依存するがんを有するヒト対象を処置するのに有用であり得る。ある特定の実施形態では、がんは、固形腫瘍または液性腫瘍である。ある特定の実施形態では、固形腫瘍は、膀胱がん腫瘍、胆管がん腫瘍、骨がん腫瘍、軟部組織肉腫、脳腫瘍、脊髄腫瘍、乳がん腫瘍、膵がん腫瘍、結腸直腸がん腫瘍、直腸がん腫瘍、小腸がん腫瘍、前立腺がん腫瘍、腎臓がん腫瘍、肝細胞がん腫瘍、胆嚢がん腫瘍、肺がん腫瘍、気管支がん腫瘍、卵巣がん腫瘍、子宮頸がん腫瘍、膣がん腫瘍、子宮内膜がん腫瘍、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃｃａｎｃｅｒ）腫瘍、食道がん腫瘍、頭頚部がん（例えば、鼻咽頭がん、口腔咽頭がん、唾液腺がん、および甲状腺がん）腫瘍、黒色腫腫瘍、眼内黒色腫腫瘍、または神経内分泌腫瘍である。ある特定の実施形態では、がんは、黒色腫、白血病、リンパ腫、もしくは他の血液悪性腫瘍または固形腫瘍である。ある特定の実施形態では、血液悪性腫瘍は、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄単球性白血病、リンパ腫（例えば、ホジキン病、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、およびＴ細胞リンパ腫）、骨髄増殖性症候群、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症である。ある特定の実施形態では、がんは、乳がん、自律神経節のがん、膵臓がん、皮膚がん、ＣＮＳがん、造血器もしくはリンパ系のがん、肺がん、大腸がん、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈｃａｎｃｅｒ）、軟部組織肉腫、または骨がんである。ある特定の例では、固形腫瘍は、黒色腫、乳がんまたは肺がんである。ある特定の実施形態では、自己免疫障害または炎症性障害は、胃腸障害（例えば、セリアック病、クローン病、または潰瘍性大腸炎）、皮膚および筋骨格状態（例えば、円形脱毛症、強皮症、乾癬、類天疱瘡、関節リウマチ、骨関節炎、乾癬性関節炎、線維筋痛症、リウマチ性多発筋痛症、強直性脊椎炎、ベーチェット病、ＣＲＥＳＴ症候群、エリテマトーデス、または白斑）、気道および肺の疾患（例えば、喘息またはＣＯＰＤ）、自己免疫ニューロパチー（例えば、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、急性運動性軸索型ニューロパチー、多発性硬化症、または下肢静止不能症候群）、血管炎、腎炎、肝炎、胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、心筋炎、アディソン病、抗リン脂質症候群（antiphospholipid syndrome）、再生不良性貧血、脳炎、慢性疲労症候群、糖尿病、子宮内膜症、グレーブス病、ギランバレー症候群、サルコイドーシス、感染に関連する炎症、虚血に関連する炎症、または神経変性障害（例えば、アルツハイマー病）である。

ある特定の実施形態では、それを必要とするヒト対象は、表７、８、および１１～１５の配列からなる群から選択されるペプチドを投与される。ある特定の実施形態では、それを必要とするヒト対象は、配列番号４またはその修飾されたバージョンを含むかまたはそれからなるステープル化Ｅ２ｈＡペプチド、例えば、配列番号６５、９６、１０１、および１３２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるペプチドを投与される。ある特定の実施形態では、それを必要とするヒト対象は、配列番号６またはその修飾されたバージョンを含むかまたはそれからなるステープル化Ｅ２ｈＡペプチド、例えば、配列番号６７、９７、１０３、および１３３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるペプチドを投与される。ある特定の実施形態では、それを必要とするヒト対象は、配列番号１０を含むかまたはそれからなるステープル化Ｅ２ｈＡペプチド、またはその修飾されたバージョン、例えば、配列番号７１または配列番号１０７のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるペプチドを投与される。ある特定の実施形態では、それを必要とするヒト対象は、配列番号２を含むかまたはそれからなるステープル化Ｅ２ｈＡペプチド、またはその修飾されたバージョン、例えば、配列番号９９、１３５、８５０、および８５１のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるペプチドを投与される。

ある特定の実施形態では、それを必要とするヒト対象は、表１０および１４の配列からなる群から選択される弾頭部を有するペプチドを投与される。ある特定の実施形態では、それを必要とするヒト対象は、配列番号４に基づく、弾頭部を有するステープルペプチド、例えば、配列番号３６１、３９２、３９７、４２８、４３３、４６４、４６９、５００、５０５、５３６、５４１、５７２、５７７、６０８、６１３、６４４、６４９、６８０、６８５、７１６、７２１、７５２、７５７、および７８８のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるペプチドを投与される。ある特定の実施形態では、それを必要とするヒト対象は、配列番号６に基づく、弾頭部を有するステープルペプチド、例えば、配列番号３６３、３９３、３９９、４２９、４３５、４６５、４７１、５０１、５０７、５３７、５４３、５７３、５７９、６０９、６１５、６４５、６５１、６８１、６８７、７１７、７２３、７５３、７５９、および７８９のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるペプチドを投与される。ある特定の実施形態では、それを必要とするヒト対象は、配列番号１０に基づく弾頭部を有するステープルペプチド、例えば、配列番号３６７、４０３、４３９、４７５、５１１、５４７、５８３、６１９、６５５、６９１、７２７、および７６３のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるペプチドを投与される。ある特定の実施形態では、それを必要とするヒト対象は、配列番号２に基づく弾頭部を有するステープルペプチド、例えば、配列番号３９５、４３１、４６７、５０２、５０３、５３９、５７５、６１１、６４６、６４７、６８３、７１９、７５５、７９０、７９１、および８３３～８４４のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるペプチドを投与される。ある特定の実施形態では、それを必要とするヒト対象は、表１０および１４の配列からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２７％、少なくとも３４％、少なくとも４０％、少なくとも４７％、少なくとも５０％、少なくとも５３％、少なくとも６０％、少なくとも６５％少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるペプチドを投与される。

がん、自己免疫障害、または炎症性障害の処置のための一部の例では、それを必要とするヒト対象は、放射線療法、免疫療法、または化学療法を共投与される。化学療法の非限定的な例としては、アルキル化剤（例えば、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、ダカルバジン、イホスファミド、ロムスチン、メフェラン（ｍｅｐｈｅｌａｎ）、オキサリプラチン、プロカルバジン塩酸塩、テモゾロミド、またはチオテパ）、代謝拮抗剤（例えば、アザチオプリン、カペシチビン、クラドラビン（ｃｌａｄｒａｂｉｎｅ）、クロファラビン、シタラビン、デシタビン、フロクスウラジン（floxuradine）、フルオロウラシル、ヒドロジウレア（ｈｙｄｒｏｚｙｕｒｅａ）、メルカプトプリン、メトトレキサート、プララトレキサート、チオグアニン、ペントスタチン、またはビダラビン）、抗腫瘍抗生物質（例えば、ダクチノマイシン、ブレオマイシン、マイトマイシンＣ、アドリアマイシン、ダウノルビシン、イダルビシン、ドキソルビシン、またはミトキサントロン）、有糸分裂阻害剤（例えば、パクリタキセル、ドセタキセル、ビノレルビン、ビンクリスチン、ビンブラスチン）、白金剤（例えば、シスプラチン、カルボプラチン、またはオキサリプラチン）、プロテアソーム阻害剤（例えば、ボルテゾミブ）、トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、エトポシド、テニポシド、カンプトテシン、トポテカン、イリノテカン、ドキソルビシン、またはダウノルビシン）、サリドマイドおよび関連するアナログ、ステロイド（例えば、デキサメタゾンまたはプレドニゾン）、ならびに抗体（例えば、トラスツズマブ、リツキシマブ、セツキシマブ、およびベバシズマブ）が挙げられる。一部の例では、それを必要とするヒト対象は、免疫調節剤または抗炎症剤と共投与される。免疫調節剤の非限定的な例としては、メトトレキサート、レフルノミド、シクロホスファミド、シクロスポリンＡ、ミコフェノール酸モフェチル、ラパマイシン、ミゾリビン、デオキシスパガリン（deoxyspergualin）、およびブレキナルが挙げられる。抗炎症剤の非限定的な例としては、非ステロイド抗炎症薬（例えば、サリチル酸、アセチルサリチル酸、サリチル酸メチル、ジフルニサル、サルサレート、オルサラジン、スルファサラジン、アセトアミノフェン、インドメタシン、スリンダク、エトドラク、メフェナム酸、メクロフェナム酸ナトリウム、トルメチン、ケトロラク、ジクロフェナク、イブプロフェン、ナプロキセン、ナプロキセンナトリウム、フェノプロフェン、ケトプロフェン、フルルビプロフェン（flurbinprofen）、オキサプロジン、ピロキシカム、メロキシカム、アンピロキシカム、ドロキシカム、ピボキシカム（pivoxicam）、テノキシカム、ナブメトン（nabumetome）、フェニルブタゾン、オキシフェンブタゾン、アンチピリン、アミノピリン、アパゾンおよびニメスリド；ジロートン、アウロチオグルコース、金チオリンゴ酸ナトリウムまたはオーラノフィンを含むロイコトリエン拮抗薬）、ステロイド（例えば、アルクロメタゾンジプロピオネート（alclometasone diproprionate）、アムシノニド、ベクロメタゾンジプロピオネート、ベタメタゾン、安息香酸ベタメタゾン、ベタメタゾンジプロピオネート（betamethasone diproprionate）、リン酸ベタメタゾンナトリウム、吉草酸ベタメタゾン、プロピオン酸クロベタゾール（clobetasol proprionate）、クロコルトロンピバレート、ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾン誘導体、デソニド、デソキシマタゾン（desoximatasone）、デキサメタゾン、フルニソリド、フルコキシノリド（ｆｌｕｃｏｘｉｎｏｌｉｄｅ）、フルランドレノリド（flurandrenolide）、ハルシノシド（halcinocide）、メドリソン、メチルプレドニゾロン、酢酸メチルプレドニゾロン（methprednisolone acetate）、コハク酸メチルプレドニゾロンナトリウム、フロ酸モメタゾン、酢酸パラメタゾン、プレドニゾロン、酢酸プレドニゾロン、リン酸プレドニゾロンナトリウム、テブト酸プレドニゾロン（prednisolone tebuatate）、プレドニゾン、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、トリアムシノロンジアセテート、またはトリアムシノロンヘキサアセトニド）；および他の抗炎症剤（例えば、メトトレキサート、コルヒチン、アロプリノール、プロベネシド、スルフィンピラゾンまたはベンズブロマロン）が挙げられる。

一部の実施形態では、ヒト対象は、がん、血液悪性腫瘍、固形腫瘍、抗体媒介性移植拒絶、自己免疫障害、または炎症性障害を有する。

一般に、方法は、対象を選択するステップと、対象に、例えば、医薬組成物中のまたは医薬組成物として、本明細書のペプチドの１つまたは複数の有効量を投与するステップと、必要に応じて、がんの予防または処置のために必要とされる場合、投与を繰り返すステップとを含み、経口的、静脈内または局所的に投与することができる。例えば、対象がＥ１を発現するがんを有するという決定に基づいて、対象を処置のために選択することができる。本開示のペプチドを使用して、対象のがんがＥ１を発現するかどうか、または対象のがんがＥ１に依存するかどうかを決定することができる。

任意の特定の患者に対する特定の投薬量および処置レジメンは、用いられる特定の化合物の活性、年齢、体重、全般的健康状態、性別、食事、投与時間、排出速度、薬物の組合せ、疾患、状態または症状の重症度および経過、疾患、状態または症状への患者の素因、ならびに処置する医師の判断を含む種々の要因に依存することになる。

１回または複数の投与、適用または投薬量で、有効量を投与することができる。治療化合物の治療有効量（すなわち、有効投薬量）は、選択される治療化合物に依存する。組成物は、１日に１または複数回から１週間に１または複数回（１日おきに１回を含む）で投与することができる。当業者は、疾患または障害の重症度、以前の処置、対象の健康全般および／または年齢、ならびに存在する他の疾患を含むがこれらに限定されない、ある特定の因子が、対象を効果的に処置するために必要とされる投薬量およびタイミングに影響を及ぼし得ることを認識する。さらに、本明細書に記載の治療化合物の治療有効量による対象の処置は、単回の処置または一連の処置を含み得る。例えば、有効量は、少なくとも１回投与され得る。
医薬組成物

本明細書に記載の安定化されたペプチドのいずれかの１つまたは複数は、医薬組成物として、または医薬組成物中で使用するために製剤化され得る。医薬組成物は、本明細書に記載の処置方法（上記を参照されたい）において使用されてもよい。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、１～１０、１～９、１～８、１～７、１～６、１～５、１～４、１～３、１～２、または１個のアミノ酸の置換、挿入、または欠失を除いて、表７～１４のいずれか１つに示されるアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるペプチドを含む。アミノ酸配列に対するこれらの変更は、これらのペプチドのＥ１と相互作用しないアルファ－ヘリックス面に（すなわち、Ｅ１との直接相互作用に関与しない／関与しないことが予測されるアミノ酸に対して）、および／またはＥ１と相互作用するアルファ－ヘリックス面に（すなわち、Ｅ１と直接相互作用する／直接相互作用することが予測されるアミノ酸に対して）なされ得る。このような組成物は、任意の経路、例えば、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認された任意の経路によって、対象への投与のために製剤化または適用され得る。例示的な方法は、FDA's CDER Data Standards Manual, version number 004（fda.give/cder/dsm/DRG/drg00301.htmにおいて入手可能である）に記載されている。例えば、組成物は、吸入（例えば、経口および／または経鼻吸入（例えば、ネブライザーまたはスプレーによって））、注射（例えば、静脈内、動脈内、真皮下（ｓｕｂｄｅｒｍａｌｌｙ）、腹腔内、筋肉内、および／または皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ）に）によって投与するために；ならびに／または経口投与、経粘膜投与、および／もしくは局所投与（局所（例えば、経鼻）スプレーおよび／または液剤を含む）のために、製剤化または適用され得る。

一部の例では、医薬組成物は、１つまたは複数の安定化されたペプチドの有効量を含み得る。用語「有効量」および「処置するのに有効な」は、本明細書で使用される場合、その投与に関連して、意図された効果または生理学的帰結（例えば、感染症の処置）をもたらすのに有効である、一定期間（急性または慢性投与および定期的または連続投与を含む）利用される本明細書に記載の１種もしくは複数の化合物または医薬組成物の量または濃度を指す。

本発明の医薬組成物は、１つまたは複数のペプチドならびに任意の薬学的に許容される担体および／またはビヒクルを含み得る。一部の例では、医薬品は、疾患または疾患症状のモジュレーションを達成するのに有効な量で、１種または複数の追加の治療剤をさらに含み得る。例えば、医薬組成物は、放射線治療剤、免疫療法剤、化学療法剤、免疫調節剤、または抗炎症剤を含んでもよい。

用語「薬学的に許容される担体またはアジュバント」は、本発明の化合物と一緒に患者に投与することができ、化合物の治療量を送達するのに十分な用量で投与された場合に、その生理学的活性を破壊せず、非毒性である担体またはアジュバントを指す。

本発明の医薬組成物において使用することができる薬学的に許容される担体、アジュバントおよびビヒクルとしては、以下に限定されないが、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ｄ－α－トコフェロールポリエチレングリコール１０００スクシネートなどの自己乳化薬物送達系（ＳＥＤＤＳ）、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）または他の類似するポリマー送達マトリックスなどの医薬剤形において使用される界面活性剤、ヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質、リン酸塩などの緩衝物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分的グリセリド混合物、水、塩または電解質、例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイドシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン－ポリオキシプロピレン－ブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂肪が挙げられる。α－、β－、およびγ－シクロデキストリンなどのシクロデキストリンも、本明細書に記載の式の化合物の送達を増強するために有利に使用することができる。

本発明の医薬組成物は、任意の従来の非毒性の薬学的に許容される担体、アジュバントまたはビヒクルを含有してもよい。一部の場合には、製剤のｐＨは、製剤化された化合物またはその送達形態の安定性を増強するために、薬学的に許容される酸、塩基またはバッファで調整することができる。非経口という用語は、本明細書で使用される場合、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、滑液内、胸骨内、髄腔内（intra-thecal）、病変内および頭蓋内注射または注入の技法を含む。

医薬組成物は、吸入および／または経鼻投与のための液剤または粉剤・散剤（powder）の形態内に存在し得る。このような組成物は、好適な分散剤または湿潤剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０など）および懸濁化剤を使用して、当技術分野で公知の技法に従って製剤化されてもよい。滅菌注射用調製物もまた、非毒性の非経口的に許容される希釈液または溶媒中の滅菌注射用液剤または懸濁剤、例えば１，３－ブタンジオール中の液剤であってもよい。用いることができる許容されるビヒクルおよび溶媒の中には、マンニトール、水、リンガー溶液および等張塩化ナトリウム溶液がある。さらに、滅菌固定油は、溶媒または懸濁媒として従来より用いられる。このために、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む任意の無刺激の固定油を用いることができる。オレイン酸およびそのグリセリド誘導体などの脂肪酸は、天然の薬学的に許容される油、例えばオリーブ油またはヒマシ油（特にそれらのポリオキシエチレン化バージョン）がそうであるように、注射剤の調製において有用である。これらの油液剤または懸濁剤はまた、乳剤およびまたは懸濁剤などの薬学的に許容される剤形の製剤化において通常使用される長鎖アルコール希釈剤もしくは分散剤、またはカルボキシメチルセルロースもしくは類似する分散剤を含有することができる。Ｔｗｅｅｎ（登録商標）もしくはＳｐａｎ（登録商標）などの他の通常使用される界面活性剤および／または薬学的に許容される固体、液体、もしくは他の剤形の製造において通常使用される他の類似する乳化剤もしくはバイオアベイラビリティー増強剤も、製剤化のために使用されてもよい。

医薬組成物は、カプセル剤、錠剤、乳剤および水性懸濁剤、分散液剤および液剤を含むがこれらに限定されない、任意の経口的に許容される剤形で経口投与され得る。経口的使用のための錠剤の場合には、通常使用される担体としては、ラクトースおよびトウモロコシデンプンが挙げられる。ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤も典型的に添加される。カプセル形態での経口投与では、有用な希釈剤としては、ラクトースおよび乾燥トウモロコシデンプンが挙げられる。水性懸濁剤および／または乳剤が経口投与される場合、油層に懸濁または溶解することができる有効成分は、乳化剤および／または懸濁化剤と組み合わされる。所望の場合、ある種の甘味剤および／または風味剤および／または着色剤が添加されてもよい。

あるいはまたはさらに、医薬組成物は、経鼻エアロゾルまたは吸入によって投与することができる。このような組成物は、医薬製剤の技術分野で周知の技法に従って調製され、ベンジルアルコールまたは他の好適な防腐剤、バイオアベイラビリティーを増強するための吸収促進剤、フルオロカーボン、および／または当技術分野において公知の他の可溶化剤もしくは分散剤を用いて、食塩水中の液剤として調製され得る。

一部の例では、本明細書に開示される１つまたは複数のペプチドは、例えば、担体タンパク質にコンジュゲートされ得る。このようなコンジュゲートされた組成物は、一価であっても多価であってもよい。例えば、コンジュゲートされた組成物は、担体タンパク質にコンジュゲートされた本明細書に開示される１つのペプチドを含んでもよい。あるいは、コンジュゲートされた組成物は、担体にコンジュゲートされた本明細書に開示される２つまたはそれより多いペプチドを含んでもよい。

本明細書で使用される場合、２つの実体が互いに「コンジュゲート」される場合、これらは、直接的もしくは間接的共有結合または非共有結合による相互作用によって連結されている。ある特定の実施形態では、会合は共有結合によるものである。他の実施形態では、会合は非共有結合によるものである。非共有結合による相互作用には、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、磁気相互作用、静電相互作用などが含まれる。間接的共有結合による相互作用は、２つの実体が、必要に応じて、リンカー基を介して、共有結合により接続されている場合である。

担体タンパク質は、対象における免疫原性を増加させるかまたは増強する任意のタンパク質を含み得る。例示的な担体タンパク質は、当技術分野において説明されている（例えば、Fattom et al., Infect. Immun., 58:2309-2312, 1990；Devi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7175-7179, 1991；Li et al., Infect. Immun. 57:3823-3827, 1989；Szu et al., Infect. Immun. 59:4555-4561,1991；Szu et al., J. Exp. Med. 166:1510-1524, 1987；およびSzu et al., Infect. Immun. 62:4440-4444, 1994を参照されたい）。ポリマー担体は、１種または複数の第一級および／または第二級アミノ基、アジド基、またはカルボキシル基を含有する天然または合成の材料であってもよい。担体は、水溶性であってもよい。
安定化されたペプチドを作製する方法

本開示は、安定化された（例えば、単一ステープル化、二重ステープル化、またはステッチ化）ペプチドを作製する方法を特徴とする。本方法は、２種またはそれより多い非天然アミノ酸を含む本明細書に記載のペプチドのいずれかの架橋されていないバージョンを得るステップと、ペプチドを架橋させるステップを伴う。一例では、架橋は、閉環メタセシス（ＲＣＭ）反応によるものである。

ステープルペプチドの合成：Ｆｍｏｃに基づく固相ペプチド合成を使用して、すべての炭化水素ステープルペプチドを生成するための報告された方法に従って、ステープルペプチド融合阻害剤を合成することができる。例えば、様々なステープル長を達成するために、α－メチル、α－アルケニルアミノ酸を、例えば、２種のＳ－２－（４’－ペンテニル）アラニン（Ｓ５）残基；２種の（Ｒ）－２－（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニルアミノ）－２－メチル－デカ－９－エン酸（Ｒ８）残基；または１個のＳ５残基および１個のＳ８残基を使用して、ｉ、ｉ＋４（またはｉ、ｉ＋７）位置に導入した。一部の例では、様々なステープル長を達成するために、α－メチル、α－アルケニルアミノ酸を、例えば、Ｒ－オクテニルアラニン（例えば、（Ｒ）－α－（７’－オクテニル）アラニン）；Ｒ－ペンテニルアラニン（例えば、（Ｒ）－α－（４’－ペンテニル）アラニン）；１個のビス－ペンテニルグリシン（例えば、α，α－ビス（４’－ペンテニル）グリシン）；１個の１個の（one one）ビス－オクテニルグリシン（例えば、α，α－ビス（７’－オクテニル）グリシン）；またはＳ－オクテニルアラニン（例えば、（Ｓ）－α－（７’－オクテニル）アラニン）を使用して、ｉ、ｉ＋４（またはｉ、およびｉ＋７）位置に導入した。ステープリング反応のために、ジクロロエタン中に溶解させたＧｒｕｂｂｓ第一世代ルテニウム触媒を、樹脂に結合したペプチドに添加する。最大変換を確実にするために、３～５回のステープリングを実施する。次いで、トリフルオロ酢酸を使用してペプチドを樹脂から切り離し、ヘキサン：エーテル（１：１）混合物を使用して沈殿させ、空気乾燥させ、ＬＣ－ＭＳによって精製する。ペプチドは、アミノ酸分析によって定量することができる。

ステッチペプチドの合成：ステッチペプチドを合成する方法は、当技術分野において公知である。それにもかかわらず、以下の例示的な方法を使用してもよい。本明細書に記載の化合物を合成するのに有用な合成化学変換および保護基方法論（保護および脱保護）は当技術分野で公知であり、例えば、R. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers (1989)；T.W. Greene and P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3d. Ed., John Wiley and Sons (1999)；L. Fieser and M. Fieser, Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1994)；およびL. Paquette, ed., Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1995)、ならびにそれらの改版に記載されるような方法を含む。

本発明のペプチドは、当業者に周知である化学合成方法によって作製され得る。例えば、Fields et al., Chapter 3 in Synthetic Peptides: A User's Guide, ed. Grant, W. H. Freeman & Co., New York, N.Y., 1992, p. 77を参照されたい。それゆえに、例えば、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒＭｏｄｅｌ４３０Ａまたは４３１上で、側鎖保護されたアミノ酸を使用するｔ－ＢｏｃまたはＦｍｏｃ化学のいずれかにより保護されたα－ＮＨ２を用いた固相合成の自動化されたメリフィールド技法を使用してペプチドを合成することができる。

より長いペプチドは、天然の化学的ライゲーションを使用して、個々の合成ペプチドをつなぎ合わせることによって作製することができる。ステッチングアミノ酸の挿入は、例えば、Young and Schultz, J Biol Chem. 2010 Apr 9; 285(15): 11039-11044に記載される通りに実施されてもよい。あるいは、より長い合成ペプチドは、周知の組換えＤＮＡ技法によって合成することができる。このような技法は、詳細なプロトコールを有する周知の標準的マニュアルにおいて提供される。本発明のペプチドをコードする遺伝子を構築するために、アミノ酸配列は、逆翻訳されて、好ましくは、遺伝子が発現されることになる生物に対して最適なコドンを有する、アミノ酸配列をコードする核酸配列が得られる。次に、合成遺伝子は、典型的には、ペプチドおよび必要であれば、任意の調節エレメントをコードするオリゴヌクレオチドを合成することによって作製される。合成遺伝子を好適なクローニングベクターに挿入し、宿主細胞にトランスフェクトする。次いで、選択された発現系および宿主に対して適切である、好適な条件下で、ペプチドを発現させる。ペプチドを精製し、標準的方法で特徴付ける。

ペプチドは、例えば、例えば、ＡｄｖａｎｃｅｄＣｈｅｍｔｅｃｈまたはＳｙｍｐｈｏｎｙＸから入手可能なハイスループットマルチプルチャネルコンビナトリアルシンセサイザーを使用して、ハイスループットコンビナトリアル様式で作製することができる。ペプチド結合は、例えば、ペプチドの生理学的安定性を増加させるために、レトロインベルソ結合（Ｃ（Ｏ）－ＮＨ）；還元アミド結合（ＮＨ－ＣＨ２）；チオメチレン結合（Ｓ－ＣＨ２またはＣＨ２－Ｓ）；オキソメチレン結合（Ｏ－ＣＨ２またはＣＨ２－Ｏ）；エチレン結合（ＣＨ２－ＣＨ２）；チオアミド結合（Ｃ（Ｓ）－ＮＨ）；ｔｒａｎｓ－オレフィン結合（ＣＨ＝ＣＨ）；フルオロ置換ｔｒａｎｓ－オレフィン結合（ＣＦ＝ＣＨ）；ケトメチレン結合（Ｃ（Ｏ）－ＣＨＲ）またはＣＨＲ－Ｃ（Ｏ）（ここで、ＲはＨまたはＣＨ３である）；およびフルオロケトメチレン結合（Ｃ（Ｏ）－ＣＦＲまたはＣＦＲ－Ｃ（Ｏ）（ここで、ＲはＨまたはＦまたはＣＨ３である））によって置き換えられてもよい。

アセチル化、アミド化、ビオチン化、シンナモイル化、ファルネシル化、フルオレセイン化、ホルミル化、ミリストイル化、パルミトイル化、リン酸化（Ｓｅｒ、ＴｙｒまたはＴｈｒ）、ステアロイル化、スクシニル化およびスルフリル化によって、ペプチドをさらに修飾することができる。上記したように、ペプチドを、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；アルキル基（例えば、Ｃ１～Ｃ２０直鎖または分岐鎖アルキル基）；脂肪酸ラジカル；およびそれらの組合せとコンジュゲートすることができる。様々な長さのオレフィン側鎖を含有するα，α－二置換非天然アミノ酸は、公知の方法によって合成することができる（Williams et al. J. Am. Chem. Soc., 113:9276, 1991；Schafmeister et al., J. Am. Chem Soc., 122:5891, 2000；およびBird et al., Methods Enzymol., 446:369, 2008；Bird et al, Current Protocols in Chemical Biology, 2011）。ｉ＋７に連結したｉ、ｉ＋１４に連結したｉ＋７ステッチが使用される（安定化されたヘリックスの４ターン）ペプチドに関する一部の例では、１個のＲ－オクテニルアラニン（例えば、（Ｒ）－α－（７’－オクテニル）アラニン）、１個の１個のビス－ペンテニルグリシン（例えば、α，α－ビス（４’－ペンテニル）グリシン）、および１個のＲ－オクテニルアラニン（例えば、（Ｒ）－α－（７’－オクテニル）アラニン）が使用される。ｉ＋７に連結したｉ、ｉ＋１４に連結したｉ＋７ステッチが使用される（安定化されたヘリックスの４ターン）ペプチドに関する一部の例では、１個のＳ－オクテニルアラニン（例えば、（Ｓ）－α－（７’－オクテニル）アラニン）、１個の１個のビス－ペンテニルグリシン（例えば、α，α－ビス（４’－ペンテニル）グリシン）、および１個のＲ－オクテニルアラニン（例えば、（Ｒ）－α－（７’－オクテニル）アラニン）が使用される。ｉ＋７に連結したｉ、ｉ＋１４に連結したｉ＋７ステッチが使用される（安定化されたヘリックスの４ターン）ペプチドに関する一部の例では、１個のＳ－オクテニルアラニン（例えば、（Ｓ）－α－（７’－オクテニル）アラニン）、１個のビス－ペンテニルグリシン（例えば、α，α－ビス（４’－ペンテニル）グリシン）、および１個のＳ－オクテニルアラニン（例えば、（Ｓ）－α－（７’－オクテニル）アラニン）が使用される。ｉ＋７に連結したｉ、ｉ＋１４に連結したｉ＋７ステッチが使用される（安定化されたヘリックスの４ターン）ペプチドに関する一部の例では、１個のＲ－ペンテニルアラニン（例えば、（Ｒ）－α－（４’－ペンテニル）アラニン）、１個のビス－オクテニルグリシン（例えば、α，α－ビス（７’－オクテニル）グリシン）、および１個のＳ－ペンテニルアラニン（例えば、（Ｓ）－α－（４’－ペンテニル）アラニン）が使用される。ｉ＋７に連結したｉ、ｉ＋１４に連結したｉ＋７ステッチが使用される（安定化されたヘリックスの４ターン）ペプチドに関する一部の例では、１個のＲ－ペンテニルアラニン（例えば、（Ｒ）－α－（４’－ペンテニル）アラニン）、１個のビス－オクテニルグリシン（例えば、α，α－ビス（７’－オクテニル）グリシン）、および１個のＲ－ペンテニルアラニン（例えば、（Ｒ）－α－（４’－ペンテニル）アラニン）が使用される。ｉ＋７に連結したｉ、ｉ＋１４に連結したｉ＋７ステッチが使用される（安定化されたヘリックスの４ターン）ペプチドに関する一部の例では、１個のＳ－ペンテニルアラニン（例えば、（Ｓ）－α－（４’－ペンテニル）アラニン）、１個のビス－オクテニルグリシン（例えば、α，α－ビス（７’－オクテニル）グリシン）、および１個のＲ－ペンテニルアラニン（例えば、（Ｒ）－α－（４’－ペンテニル）アラニン）が使用される。ｉ＋７に連結したｉ、ｉ＋１４に連結したｉ＋７ステッチが使用される（安定化されたヘリックスの４ターン）ペプチドに関する一部の例では、１個のＳ－ペンテニルアラニン（例えば、（Ｓ）－α－（４’－ペンテニル）アラニン）、１個のビス－オクテニルグリシン（例えば、α，α－ビス（７’－オクテニル）グリシン）、および１個のＳ－ペンテニルアラニン（例えば、（Ｓ）－α－（４’－ペンテニル）アラニン）が使用される。Ｒ－オクテニルアラニンは、出発キラル補助剤がＲ－アルキル－立体異性体を与えることを除けば、同じ経路を使用して合成される。また、５－ヨードペンテンに代えて８－ヨードオクテンが使用される。阻害剤は、ＭＢＨＡ樹脂において固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を使用して、固体支持体上で合成される（例えば、ＷＯ２０１０／１４８３３５を参照されたい）。

Ｆｍｏｃ保護α－アミノ酸（オレフィン系アミノ酸Ｎ－Ｆｍｏｃ－α，α－ビス（４’－ペンテニル）グリシン、（Ｓ）－Ｎ－Ｆｍｏｃ－α－（４’－ペンテニル）アラニン、（Ｒ）－Ｎ－Ｆｍｏｃ－α－（７’－オクテニル）アラニン、（Ｒ）－Ｎ－Ｆｍｏｃ－α－（７’－オクテニル）アラニン、および（Ｒ）－Ｎ－Ｆｍｏｃ－α－（４’－ペンテニル）アラニン以外）、２－（６－クロロ－１－Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルアミニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＣＴＵ）、およびＲｉｎｋＡｍｉｄｅＭＢＨＡは、例えば、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）から市販されている。ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ－メチル－２－ピロリジノン（ＮＭＰ）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、１，２－ジクロロエタン（ＤＣＥ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、およびピペリジンは、例えば、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから市販されている。オレフィン系アミノ酸合成は、当技術分野において報告されている（Williams et al., Org. Synth., 80:31, 2003）。

やはり、本明細書に開示されるペプチドを得る（例えば、合成する）、ステッチングする、および精製するために好適な方法も、当技術分野において公知である（例えば、Bird et. al., Methods in Enzymol., 446:369-386 (2008)；Bird et al, Current Protocols in Chemical Biology, 2011；Walensky et al., Science, 305:1466-1470 (2004)；Schafmeister et al., J. Am. Chem. Soc., 122:5891-5892 (2000)；２０１０年３月１８日に出願された米国特許出願第１２／５２５，１２３号；および２０１０年５月２５日に発行された米国特許第７，７２３，４６８号（これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。

一部の例では、ペプチドは、ステッチ化されていないペプチド夾雑物を実質的に含まないか、または単離されている。ペプチドを精製するための方法は、例えば、固相支持体上でペプチドを合成するステップを含む。環化後に、固相支持体を単離し、ＤＭＳＯ、ＤＭＳＯ／ジクロロメタン混合物、またはＤＭＳＯ／ＮＭＰ混合物などの溶媒の溶液中に懸濁してもよい。ＤＭＳＯ／ジクロロメタンまたはＤＭＳＯ／ＮＭＰ混合物は、約３０％、４０％、５０％または６０％のＤＭＳＯを含んでもよい。具体的な例では、５０％／５０％のＤＭＳＯ／ＮＭＰ溶液が使用される。溶液は、１、６、１２または２４時間の期間インキュベートされてもよく、その後、例えば、ジクロロメタンまたはＮＭＰで樹脂が洗浄されてもよい。一例では、樹脂は、ＮＭＰで洗浄される。振盪および不活性ガスの溶液中へのバブリングが実施されてもよい。

本開示のステッチペプチドまたはステープルペプチドの特性は、例えば、以下および実施例に記載される方法を使用して、アッセイされ得る。

以下の実施例は、特許請求された発明をより十分に例証するために提供されるものであり、本発明の範囲の限定として解釈されるべきではない。具体的な材料が言及される程度に、これは、単に例証のためであって、本発明を限定することを意図するものではない。当業者は、本発明の能力を行使せず、かつ本発明の範囲を逸脱することなく、同等の手段または反応物を開発することができる。
（実施例１）
Ｓ．ｐｏｍｂｅのＥ２ｈＡステープルペプチドの調製

ユビキチンシステムでは、Ｅ１とＥ２との間の相互作用は、タンパク質表面積の３０００Å^２を埋め、そのうちの１０００Å^２は、Ｅ２のヘリックスＡ（Ｅ２ｈＡ）とＥ１ユビキチンフォールドドメイン（Ｅ１ＵＦＤ）との間の界面に埋もれている。Ｅ１－Ｅ２相互作用のＫｄは、ナノモル濃度未満から１桁のナノモル濃度（ｓｕｂ－ｔｏ－ｓｉｎｇｌｅ－ｄｉｇｉｔｎａｎｏｍｏｌａｒ）の範囲内にあり、Ｅ２ｈＡは、その相互作用の結合エネルギーの少なくとも４０％を占める。さらに、Ｅ１とＥ２ｈＡとの間の相互作用は、Ｅ１－Ｅ２遭遇複合体の形成において重要である。したがって、Ｅ１－Ｅ２相互作用の競合阻害剤として作用し得るＥ２ｈＡを模倣し、Ｅ１がＥ２への受け渡しを行うのを妨げ、よって、Ｅ１活性を阻害する新規機序を表す、安定化されたアルファ－ヘリックスペプチドを設計および調製した。

Ｓ．ｐｏｍｂｅのＵｂｅ１（ＰＤＢＩＤ：５ＫＮＬ）に対するＵｂｃ１５の結合の結晶構造は、ＵＢＡ１阻害剤ペプチド設計の構造的基礎を提供した（図１Ａ）。非天然アミノ酸を、Ｅ７Ｒアミノ酸置換を含む、Ｓ．ｐｏｍｂｅのＵｂｃ１５ヘリックスＡ（ｈＡ）の修飾された配列を有するペプチドの［ｉ、ｉ＋４］または［ｉ、ｉ＋７］位置のオレフィン側鎖で置換することによって、構造的に安定化されたアルファ－ヘリックスＥ２関連ペプチドを調製した。Ｅ７Ｒアミノ酸置換は、Ｋ_ｍの約８０倍の低下をもたらすことが示されている（Lv et al., 2017, Molecular Cell, 65(4):699-714）。表１２は、調製したペプチドの配列を提供する。図１Ｂおよび１Ｃは、アルファヘリックスであることが予期される配列番号４０のペプチド部分のホイール図を例示し、配列番号４１～５４のステープルペプチドを生成するために、配列番号４０に導入された［ｉ、ｉ＋４］（図１Ｂ）および［ｉ、ｉ＋７］（図１Ｃ）アミノ酸ステープル位置を示す（以下の表１２）。

表12. E2 hAペプチド。「B」はノルロイシンであり、「X₁」はR-オクテニルアラニンであり、「X₂」はS-ペンテニルアラニンである。

Ｅ２へのＥ１媒介性ユビキチン転移を阻害するＥ２ｈＡステープルペプチド（配列番号４１～５４）の能力を評価した。ヒトＥ１活性化酵素ＵＢＡ１（１０ｎＭ）、ＵｂｃＨ５ｂＥ２酵素（１５０ｎＭ）、ユビキチン（１μＭ）、およびＭｇ－ＡＴＰ（２０μＭ）を、５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｍＭのＴＣＥＰｐＨ７．５を含有する緩衝液中、１００μＭのＥ２ｈＡ非ステープル対照ペプチド（配列番号４０）、ステープルペプチド（配列番号４１～５４のいずれか１つ）、またはビヒクル対照（１％のＤＭＳＯ）の存在下で、室温で４５分間組み合わせた。対照反応物は、Ｅ１酵素を含まなかった。ＳＤＳを含有するローディングダイを添加することによって反応をクエンチし、非還元条件下で、試料を４～１２％のＢｉｓ－Ｔｒｉｓタンパク質ゲル上で分離した。銀染色によってタンパク質を可視化した。Ｅ１によるユビキチンのＥ２へのコンジュゲーションを、遊離Ｅ２（１７ｋＤａ）のＥ２～ユビキチンコンジュゲート（２６ｋＤａ）への変換によってモニターした。

アミノ酸位置Ａ_２およびＡ_９（配列番号５０）にステープルを含むペプチドが、Ｅ２へのＥ１媒介性ユビキチン転移を阻害するのに、このパネルで最も優れていた（図２）。アミノ酸位置Ａ_５およびＡ_９（配列番号４４）、Ａ_８およびＡ_１２（配列番号４６）、Ａ_９およびＡ_１３（配列番号４７）、Ａ_１およびＡ_８（配列番号４９）、Ａ_４およびＡ_１１（配列番号５２）、ならびにＡ_５およびＡ_１２（配列番号５３）にステープルを含むペプチドも、Ｅ１によるＥ２のＥ２～ユビキチンへの変換を阻害した（図２）。

この研究は、Ｓ．ｐｏｍｂｅのＵｂｃ１５Ｅ２ｈＡペプチドに導入されたステープル位置のすべてが、Ｅ２へのＥ１媒介性ユビキチン転移を阻害する訳ではないことを明らかにした。いかなる特定の理論にも拘束されないが、位置Ａ_１およびＡ_５（配列番号４１）、Ａ_２およびＡ_６（配列番号４２）、Ａ_４およびＡ_８（配列番号４３）、Ａ_６およびＡ_１０（配列番号４５）、Ａ_１０およびＡ_１４（配列番号４８）、Ａ_３およびＡ_１０（配列番号５１）、ならびにＡ_６およびＡ_１３（配列番号５４）にステープルを含むペプチドが、そのステープルの導入によってＥ２／Ｅ１結合界面が妨害されたか、またはＥ２ヘリックスＡペプチドの重要な残基がブロックされたために、Ｅ２へのＥ１媒介性ユビキチン転移を阻害することができなかったと仮定される。
（実施例２）
Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓのＥ２ｈＡステープルペプチドの調製

位置Ａ_２およびＡ_９（配列番号５０）にステープルを含むＳ．ｐｏｍｂｅのＵｂｃ１５Ｅ２ｈＡペプチドによる、Ｅ２へのＥ１媒介性ユビキチン転移の強力な阻害ならびにヒトのＥ１とＳ．ｐｏｍｂｅのＥ１との間の高い相同性を考慮して、Ｅ２ｈＡステープルペプチドを設計し、ヒトＥ２ｈＡ配列に基づいて生成した。上記表２は、３２種の異なるヒト遺伝子によってコードされるＥ２ｈＡに関する配列を提供する。位置Ａ_２およびＡ_９にステープルを有するＵＢＥ２Ｄ２のＥ２ｈＡまたはＵＢＥ２Ｇ２もしくはＵＢＥ２ＡのＥ２ｈＡのトランケートされた形態を含むペプチド（それぞれ、ペプチド「ＳＡＨ－ＵＢＥ２Ｇ２－１１」、「ＳＡＨ－ＵＢＥＤ２－１１」、および「ＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａ－１１」、表１３を参照されたい；これらのペプチドのヘリックスホイール部分の図を提供する図３も参照されたい）を生成した。

表13. ステープルE2 hAペプチド。「B」はノルロイシンであり、ここで、「X₁」はR-オクテニルアラニンであり、かつ「X₂」はS-ペンテニルアラニンである。

Ｅ２へのＥ１媒介性チオエステル転移を阻害するペプチドの能力を評価した。ヒトＥ１活性化酵素ＵＢＡ１（１０ｎＭ）、ＵｂｃＨ５ｂＥ２酵素（１５０ｎＭ）、ユビキチン（１μＭ）、およびＭｇ－ＡＴＰ（２０μＭ）を、５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｍＭのＴＣＥＰｐＨ７．５を含有する緩衝液中、一定範囲の濃度のステープルペプチドまたはビヒクル対照（１％のＤＭＳＯ）の存在下で、室温で４５分間組み合わせた。ＳＤＳを含有するローディングダイを添加することによって反応をクエンチし、非還元条件下で、試料を４～１２％のＢｉｓ－Ｔｒｉｓタンパク質ゲル上で分離した。銀染色によってタンパク質を可視化した。Ｅ１によるユビキチンのＥ２へのコンジュゲーションを、遊離Ｅ２（１７ｋＤａ）のＥ２～ユビキチンコンジュゲート（２６ｋＤａ）への変換によってモニターした。銀染色画像のデンシトメトリーから、阻害パーセンテージを計算した。ステープルペプチドＳＡＨ－Ｕｂｃ１５－１１（配列番号５０）、ＳＡＨ－ＵＢＥ２Ｇ２－１１（配列番号１３３）、ＳＡＨ－ＵＢＥ２Ｄ２－１１（配列番号１０７）、およびＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａ－１１（配列番号１３２）のそれぞれは、Ｅ２へのＥ１媒介性チオエステル転移を用量依存的に阻害し（図４）、ＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａ－１１は、最も強力な活性を有した。
（実施例３）
Ｅ２ｈＡステープルペプチドはユビキチン経路のＥ１－Ｅ２相互作用の汎活性阻害剤である

ＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａ－１１（配列番号１３２）の効力を考慮して、このペプチドをさらなる評価のために選択した。ヒトは、ヒトＥ１酵素ＵＢＡ１によって活性化される少なくとも３３種のヒトＥ２酵素をコードする。ＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａ－１１（配列番号１３２）の汎阻害活性を試験するために、ヒトＥ１活性化酵素ＵＢＡ１、ＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａ－１１または点変異体陰性対照ＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａ－１１－Ｒ７Ｅ（ＢＳＴＰＸ_１ＲＥＲＬＢＲＸ_２ＦＫＲＬＱ、「Ｘ_１」はＳ－ペンテニルアラニンであり、「Ｘ_２」はＲ－オクテニルアラニンである；配列番号８５２）、および様々な異なるヒトＥ２酵素（ＵＢＥ２Ａ、ＵＢＥ２Ｂ、ＵＢＥ２Ｃ、ＵＢＥ２Ｄ１、ＵＢＥ２Ｄ２、ＵＢＥ２Ｄ３、ＵＢＥ２Ｄ４、ＵＢＥ２Ｅ１、ＵＢＥ２Ｅ３、ＵＢＥ２Ｇ１、ＵＢＥ２Ｌ３、ＵＢＥ２Ｊ１、ＵＢＥ２Ｊ２、ＵＢＥ２Ｒ１、ＵＢＥ２Ｒ２、ＵＢＥ２Ｓ、ＵＢＥ２Ｔ、ＵＢＥ３Ｑ１、ＵＢＥ２Ｑ１、およびＵＢＥ２Ｗ２）を使用して、ｉｎｖｉｔｒｏ酵素阻害を実施した。ＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａ－１１は、試験したすべてのヒトＥ２酵素に対するＥ１媒介性チオエステル転移を阻害したが、一方、点変異体対照ＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａ－１１－Ｒ７Ｅは、阻害能を消失しており、作用の特異性が強調された（図５）。これらの研究は、ＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａ－１１が、Ｅ２へのＥ１媒介性チオエステル転移を阻害するその能力において汎活性であること：ＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａ－１１が、それが由来するＥ２への転移（すなわち、ＵＢＥ２Ａ）を阻害するだけでなく、多数の他のヒトＥ２酵素への転移も阻害することを明らかにした。
（実施例４）
ＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａ－１１における鍵となる結合残基の同定

アラニンスキャニング変異誘発（図６）および電荷反転（ＲからＥへのアミノ酸置換）（図７）変異誘発をＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａ－１１（配列番号１３２）ペプチドに関して実施し、機能的Ｅ２ｈＡステープルペプチドの活性に寄与する鍵となるアミノ酸残基を同定した（図６および７）。変異体ＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａ－１１ペプチドに関して実施したｉｎｖｉｔｒｏ酵素阻害アッセイは、アミノ酸Ｒ７、Ｌ９、Ｂ１０、Ｆ１３、およびＬ１６（位置Ａ_４、Ａ_６、Ａ_７、Ａ_１０、Ａ_１３）が、ペプチドの機能に対して特に重要であることを明らかにした（図６および７）。
（実施例５）
ＳＡＨ－ＵＢＥ２ＡのＵＢＡ１への直接結合

ＳＡＨ－ＵＢＥ２ＡのＵＢＡ１への直接結合を、ストレプトアビジン捕捉（図８）、蛍光偏光アッセイ（図９）、および水素－重水素交換質量分析（図１０）によって評価した。組換えタンパク質と混合したビオチン化ペプチドのストレプトアビジン捕捉、その後の洗浄、溶出、およびタンパク質ゲル電気泳動による検出は、ＳＡＨ－ＵＢＥ２ＡのＵＢＡ１への直接結合を実証した（図８）。ユビキチンおよびＡＴＰの存在下と非存在下の両方で実施した蛍光偏光アッセイは、ＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａが、ユビキチンおよびＡＴＰとは無関係にＵＢＡ１に結合することを実証した（図９）。水素－重水素交換質量分析は、組換えＵＢＡ１とのインキュベーションが、ペプチド単独のインキュベーションと比較して、ＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａを重水素取り込みから用量依存的に保護したことを示した。対照的に、ペプチドの組換えＥ２とのインキュベーションは、有意な保護をもたらさなかった（図１０）。
（実施例６）
ＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａは天然のＵＢＡ１に結合し、細胞溶解産物中のユビキチンカスケードを阻害する

ＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａの天然のＵＢＡ１への直接結合を、ＨｅＬａ細胞溶解産物と混合したビオチン化ペプチドのストレプトアビジン捕捉、その後の洗浄、溶出、タンパク質ゲル電気泳動およびＵＢＡ１に関するウエスタンブロッティングによって実証した（図１１）。がん細胞溶解産物中のユビキチンカスケードの阻害を、ユビキチン化アッセイによって実証した。ＨｅＬａ細胞の細胞質画分を、過剰なユビキチンおよびＡＴＰ再生溶液の存在下で、ＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａまたはビヒクル対照と共にインキュベートし、次いで、非還元ゲル電気泳動およびユビキチンに対するウエスタンブロッティングに供した。ＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａは、ビヒクル対照と比較して、ポリユビキチン鎖の形成を用量依存的に阻害した（図１２）。
（実施例７）
追加のＥ２ｈＡステープルペプチドの生成

追加のステープル化Ｅ２ｈＡペプチドを設計および生成した。表１４は、追加の生成されたＥ２ｈＡステープルペプチド（そのそれぞれは、Ｅ２へのＥ１媒介性チオエステル転移を阻害した）の配列を提供する。言い換えれば、表１４のＥ２ｈＡステープルペプチドのそれぞれは機能的であった。表１５は、追加の生成されたＥ２ｈＡステープルペプチド（そのそれぞれは、Ｅ２へのＥ１媒介性チオエステル転移を阻害する能力が損なわれていることが認められた）の配列を提供する。言い換えれば、表１５のＥ２ｈＡステープルペプチドは、顕著に損なわれた機能を示し、前臨床および臨床開発に関して最適に機能的なＥ２ｈＡステープルペプチドを達成するための設計、合成、試験、および反復の重要性を強調した。

表14. 生成した機能的なE2 hAステープルペプチド。「B」はノルロイシンであり、「X₁」はR-オクテニルアラニンであり、「X₂」はS-ペンテニルアラニンである。

表15. 生成した非機能的なE2 hAステープルペプチド。「B」はノルロイシンであり、「X₁」はR-オクテニルアラニンであり、「X₂」はS-ペンテニルアラニンである。
実施例１～７において使用した方法

ステープルペプチドの合成および精製：リンクアミドＡＭ樹脂にアミノ酸を連続的に付加して、ＳｙｍｐｈｏｎｙＸのペプチド合成器で固相Ｆｍｏｃ化学を使用して、ステープルペプチドを生成した。２個のＳ－ペンテニルアラニンまたは１個のＳ－ペンテニルアラニンおよび１個のＲ－オクテニルアラニン非天然アミノ酸は、それぞれ、ｉ、ｉ＋４またはｉ、ｉ＋７位置で２個のネイティブなアミノ酸を置き換えた。Ｇｒｕｂｂｓ第一世代ルテニウム触媒を使用して、オレフィンメタセシスによってすべての炭化水素ステープルを形成し、その後、ペプチドの脱保護および樹脂からの切断を行った。示したように、ペプチドをアセチルでＮ末端で誘導体化し、Ｃ末端をＦＩＴＣでアミド化または誘導体化した。ペプチドを、逆相高速液体クロマトグラフィーおよび質量分析（ＬＣ／ＭＳ）によって精製し、アミノ酸分析によって定量した。

ｉｎｖｉｔｒｏ結合アッセイ：アクセプタータンパク質に対するリガンドの結合および親和性を評価するために、例えば、蛍光偏光アッセイ（ＦＰＡ）を使用することができる。ＦＰＡ技法は、偏光および蛍光トレーサーを使用して、分子配向および運動を測定する。偏光で励起されると、見掛けの分子量が高い分子と結合した蛍光トレーサー（例えば、ＦＩＴＣ）（例えば、大きいタンパク質と結合したＦＩＴＣ標識ペプチド）は、小分子と結合した蛍光トレーサー（例えば、溶液中にて遊離しているＦＩＴＣ標識ペプチド）と比較して、より遅いそれらの回転速度に起因して、より高レベルの偏光蛍光を発光する。示したように、ユビキチン（１０μＭ）およびＡＴＰ（２０μＭ）を含有するかまたは含有していない結合緩衝液中で、ＦＰアッセイを実施した。

ストレプトアビジン－ビオチンプルダウンアッセイ：組換えタンパク質のプルダウンのために、１０ｐｍｏｌの組換えヒトＵＢＡ１を、総体積１ｍＬの結合緩衝液（５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、５ｍＭのＤＴＴ）中、５ｎｍｏｌのＣ末端をビオチン化したＳＡＨ－ＵＢＥ２ＡまたはＤＭＳＯビヒクル対照と共に、４℃で１．５時間インキュベートした。次いで、３０μＬの予め平衡化したストレプトアビジンアガロースビーズを添加し、４℃でさらに１．５時間インキュベートした。遠心分離によってビーズをペレット化し、ＮＰ－４０緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＤＴＴ、０．５％［ｖ／ｖ］のＮＰ－４０）で３回洗浄し、その後、３×ＳＤＳローディング緩衝液中で、７０℃で１０分間加熱することによって、タンパク質試料をビーズから溶出させた。試料を、電気泳動および銀染色（Ｐｉｅｒｃｅ２４６１２）に供した。細胞溶解産物からのプルダウンのために、０．７５ｍｇのＨｅＬａ細胞溶解産物を、プロテアーゼ－ホスファターゼ阻害剤カクテルを含有する総体積１ｍＬの結合緩衝液（５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、５ｍＭのＤＴＴ）中、５ｎｍｏｌのＣ末端をビオチン化したＳＡＨ－ＵＢＥ２ＡまたはＤＭＳＯビヒクル対照と共に、４℃で２時間インキュベートした。次いで、３０μＬの予め平衡化したストレプトアビジンアガロースビーズ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ２０３５７）を添加し、４℃でさらに１．５時間インキュベートした。遠心分離によってビーズをペレット化し、ＮＰ－４０緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＤＴＴ、０．５％［ｖ／ｖ］のＮＰ－４０）で３回洗浄し、その後、３×ＳＤＳローディング緩衝液中で、７０℃で１０分間加熱することによって、タンパク質試料をビーズから溶出させた。タンパク質を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル電気泳動によって分離し、ＵＢＥ１（Ａｂｃａｍａｂ３４７１１）に対するウエスタンブロットによって検出した。

ｉｎｖｉｔｒｏ酵素阻害アッセイ：５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＨＥＰＥＳｐＨ７．５を含有する緩衝液中、組換えヒトＥ１活性化酵素ＵＢＡ１（１０ｎＭ）、Ｅ２酵素（１５０ｎＭ）、ユビキチン（１μＭ）、およびＭｇ－ＡＴＰ（２０μＭ）を、ペプチドまたはビヒクル対照（１％のＤＭＳＯ）の存在下で、室温で４５分間組み合わせる。対照反応はＥ１酵素を含まない。ＳＤＳを含有するローディングダイの添加によって反応をクエンチし、非還元条件下で、試料を４～１２％のＢｉｓ－Ｔｒｉｓタンパク質ゲル上で分離する。銀染色によってタンパク質を可視化する。Ｅ１によるユビキチンのＥ２へのコンジュゲーションを、遊離Ｅ２（１７ｋＤａ）のＥ２～ユビキチンコンジュゲート（約２６ｋＤａ）への変換によってモニターする。銀染色画像のデンシトメトリーから、阻害パーセントの定量を計算した。エラーバーは、３回の独立した実験から計算した±１ＳＥＭを表す。

ＨＸＭＳ分析：水素－重水素交換質量分析（ＨＸＭＳ）実験を、記載された通りに実施した（Barclay, L. A. et al. Inhibition of Pro-apoptotic BAX by a noncanonical interaction mechanism. Molecular Cell 57, 873-886, doi: 10.1016/j.molcel.2015.01.014 (2015)）。ＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａを、５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ_２、５００ｎＭのユビキチン、２０ｍＭのＡＴＰ、５ｍＭのＤＴＴ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４を含有する緩衝液中、単独で、または示したモル比の組換えヒトＵＢＡ１、ＵＢＥ２Ｄ２、もしくはビヒクル対照と共に、氷上で１０分間インキュベートした。重水素標識化をＤ_２Ｏ緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＤ８）中への１８倍希釈で開始した。１０秒の標識化後に、等体積のクエンチング緩衝液（０．８Ｍの塩化グアニジウム、０．８％［ｖ／ｖ］のギ酸）を添加して標識化反応をクエンチした。次いで、試料を注入し、ペプチドを無傷で捕捉し、ＶａｎＧｕａｒｄＰｒｅ－Ｃｏｌｕｍｎトラップ（２．１ｍｍ×５ｍｍ、ＡＣＱＵＩＴＹＵＰＬＣＢＥＨＣ１８、１．７μｍ）上で３分間脱塩し、６５μＬ／分の流速で６分かけて、５％～３５％のアセトニトリル勾配を使用してトラップから溶出させ、次いで、ＷａｔｅｒｓｎａｎｏＡＣＱＵＩＴＹＬＣ上のＡＣＱＵＩＴＹＵＰＬＣＨＳＳＴ３、１．８μｍ、１．０ｍｍ×５０ｍｍカラムを使用して分離した。ＷａｔｅｒｓＳｙｎａｐｔＧ２Ｓｉの質量分析計をイオンモビリティーモードで操作し、データを分析した。すべての質量スペクトルは、ＤｙｎａｍＸ３．０（ＷａｔｅｒｓＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して処理した。重水素レベルは逆交換のために補正せず、よって、相対値として報告した。記載されたすべての変化は、少なくともｎ＝２の生物学的反復（bioreplicate）において一致した。

細胞溶解産物酵素阻害アッセイ：１×ＡＴＰ再生溶液、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのＤＴＴ、１００ｎＭユビキチンアルデヒド、およびプロテアーゼ－ホスファターゼ阻害剤カクテルを含有するアッセイ緩衝液（ｐＨ７．４）中で、細胞溶解産物アッセイを、１ｍｇ／ｍＬの最終濃度のＨｅＬａＳ１００溶解産物画分および示した濃度のペプチドまたはＤＭＳＯビヒクル対照を用いて実施した。反応を、１００μＭの最終濃度までユビキチンを添加することによって開始させ、室温で３０分間進行させ、その後、非還元ＬＤＳローディング緩衝液でクエンチした。タンパク質を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル電気泳動によって分離し、ポリユビキチン（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣＳＴ３９３６）に対するウエスタンブロットによって検出した。
（実施例８）
求電子性弾頭部を組み込むためのＳＡＨ－Ｅ２ペプチドの修飾

ＵＢＡ１のＣｙｓ１０３９との共有結合を形成する潜在性を有する追加のＥ２ｈＡステープルペプチドのバリアントを作製するために、位置Ａ_８またはＡ_１１を「弾頭部」で置き換えたいくつかのバリアントを生成した。バリアントは、Ｕｂｃ１５（配列番号２）、ＵＢＥ２Ｄ２（配列番号１０）、およびＵＢＥ２Ａ（配列番号４）のＥ２ｈＡ配列に基づいた。表１６および１７は、生成した様々なＥ２ｈＡステープルペプチドの弾頭部バリアントの配列を提供する。弾頭部の位置を、ヒトＥ１の結晶構造へのペプチドのドッキングに基づいて決定した（ＰＤＦ６ｄｃ６）。ペプチドのＥ１結合面またはそれに隣接する位置およびＵＢＡ１（配列番号８４５）のＣｙｓ１０３９の近傍を、弾頭部による置換のために選択した。アミノ酸コンセンサス位置Ａ_７のアルファ炭素は、ＵＢＡ１（配列番号８４５）のＣｙｓ１０３９の硫黄から５．４オングストロームであると推定される。アミノ酸コンセンサス位置Ａ_８のアルファ炭素は、ＵＢＡ１（配列番号８４５）のＣｙｓ１０３９の硫黄から６．６オングストロームであると推定される。アミノ酸コンセンサス位置Ａ_１１のアルファ炭素は、ＵＢＡ１（配列番号８４５）のＣｙｓ１０３９の硫黄から４．８オングストロームであると推定される。

表16. 生成したE2 hAの弾頭部を有するステープルペプチド。「J」は、ジアミノブタン酸(「Dab」)のアクリルアミドを有するバージョンであり、「B」はノルロイシンであり、「X₁」はR-オクテニルアラニンであり、「X₂」はS-ペンテニルアラニンである

表17. 生成したE2 hAの弾頭部を有するステープルペプチド。「J」は、ジアミノブタン酸(「Dab」)のアクリルアミドを有するバージョンであり、「B」はノルロイシンであり、「X₁」はR-オクテニルアラニンであり、「X₂」はS-ペンテニルアラニンである。

配列番号７２７、８４１、８４２、および８４４の弾頭部を有するＥ２ｈＡステープルペプチドは、Ｅ２へのＥ１媒介性チオエステル転移を阻害した。配列番号６８０および７５２の弾頭部を有するＥ２ｈＡステープルペプチドは、Ｅ２へのＥ１媒介性チオエステル転移を阻害した。配列番号６９１および７６３の弾頭部を有するＥ２ｈＡステープルペプチドは、Ｅ２へのＥ１媒介性チオエステル転移を阻害しなかった。
（実施例９）
生成したステープルペプチドおよび生成した弾頭部を有するステープルペプチド

表１８および１９に列挙したステープルペプチドおよび弾頭部を有するステープルペプチドを生成し、試験した。本開示は、末端が、Ｃ末端の「Ｚ」であるこれらのステープルペプチド（バリアントはＺを欠く）のバリアントも包含することに留意されたい。さらに、本開示は、非天然アミノ酸（Ｘ_１、Ｘ_２）が置換されていないことを除いて（except that that）、１～１０（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０）個のアミノ酸位置で、以下に列挙した配列と異なるステープルペプチドを特徴とする。一部の場合には、置換された残基は、Ｅ１との相互作用に関与することが予測されないものである。これらのバリアントは、Ｅ１－Ｅ２相互作用を阻害する。一部の場合には、これらのバリアントは、Ｅ２へのＥ１媒介性チオエステル転移を阻害する。本開示は、末端のＺやその塩（例えば、酢酸塩、硫酸塩、塩化物）を含まない表１８および１９に列挙したペプチドのいずれか、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物、ならびにがんまたは他のＥ１を発現する疾患もしくはＥ１に依存する疾患を処置する際のそれらの使用方法を特徴とする。
表18. 生成したステープルペプチド

表１８では、「Ｂ」はノルロイシンであり；「Ｘ_１」はＲ－オクテニルアラニンであり；「Ｘ_２」はＳ－ペンテニルアラニンであり；「ｔｒ」＝トランケートされた；「ｍ」＝変異体；Ｚ＝ｌｙｓ（ビオチン）（本開示は、存在する場合、末端の「Ｚ」を含まない以外は上記ペプチドのそれぞれも包含することに留意されたい）
表19: 生成した弾頭部を有するステープルペプチド

表１９では、「Ｂ」はノルロイシンであり、「Ｘ_１」はＲ－オクテニルアラニンであり、「Ｘ_２」はＳ－ペンテニルアラニンであり；「Ｊ」は末端がブロモアセチルであるジアミノブタン酸であり；「Ｕ」は非天然ベンゾフェノンを含有するアミノ酸であり；「ｔｒ」＝トランケートされた；「ｍ」＝変異体；Ｚ＝ｌｙｓ（ビオチン）。
（実施例１０）
Ｅ２ｈＡステープルペプチドは、Ｅ１チオエステル転移活性に対して高い特異的阻害活性を示す

ＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａ－１１（配列番号１３２）の阻害活性は、非Ｅ１タンパク質または活性への効果の欠如またはそれへの干渉によって例示されるように、Ｅ２へのＥ１媒介性チオエステル転移に対して非常に特異的である。ＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａ－１１（配列番号１３２）の作用機序の特異性を調査したところ、ＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａ－１１（配列番号１３２）は、Ｅ２へのチオエステル転移に先立つ酵素ステップである、ＵＢＡ１の共有結合によりそれ自体にユビキチンを受け渡しする能力に効果を示さなかった（図１７）。さらに、ユビキチンカスケード全体をｉｎｖｉｔｒｏで再構成し、ＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａ－１１（配列番号１３２）が、Ｅ２への受け渡しを阻害するレベルでしかカスケードに影響を及ぼさないことを実証した（図１６）。タンパク質基質ｐ５３ならびにユビキチンカスケードの構成成分であるＥ１（ＵＢＡ１）、Ｅ２（ＵＢＥ２Ａ）、Ｅ３（ＨＤＭ２）、Ｕｂ、およびＡＴＰと共にインキュベートした場合、ＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａ－１１（配列番号１３２）は、ｐ５３タンパク質のユビキチン化を阻害した。しかし、Ｕｂで予め活性化されたＥ２が、受け渡しされていないＥ２およびＵｂの代わりに、反応混合物中に含まれる場合、ＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａ－１１（配列番号１３２）は、ｐ５３のユビキチン化に影響を及ぼさず；予め受け渡しされたＥ２に関するＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａ－１１の阻害効果の回避によって、Ｅ２への受け渡しに対するＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａ－１１（配列番号１３２）の阻害効果の特異性が実証される。ＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａ－１１（配列番号１３２）は、ｐ５３に対する脱ユビキチン化酵素であるＵＳＰ７の活性にも影響を及ぼさなかった（図１６）。ＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａ－１１（配列番号１３２）の活性への潜在的なペプチド凝集のいかなる影響も排除するために、ＵＢＡ１に対するペプチドの阻害活性が、非イオン性界面活性剤（他の方法で、低分子またはペプチドの凝集物を可溶化することができる）の存在によって、全く影響を受けないことをさらに示した（図１８）。ＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａ－１１（配列番号１３２）のＵＢＡ１への直接的かつ特異的結合のさらなる調査において、蛍光顕微鏡法は、ＦＩＴＣで標識したＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａ－１１（配列番号１３２）が、Ｈｉｓ－ＵＢＡ１でタグ付けしたＮｉ－ＮＴＡビーズに特異的に結合し、タグ付けされていないビーズにも無関係なタンパク質（Ｈｉｓ－ｐ５３）でタグ付けされたビーズにも関与しなかったことを示し、ＵＢＡ１への特異的ペプチド結合を示した（図１９）。
（実施例１１）
Ｅ２ｈＡステープルペプチドは、ステープリングの際にα－ヘリックス構造の強化を受け、α－ヘリックスＥ２ｈＡペプチドの生物学的活性はペプチド配列に依存する。

ペプチドステープリングは、Ｅ２ｈＡペプチドにおけるα－ヘリックスフォールディングを誘導した。円二色性は、修飾されていないＵＢＥ２Ａペプチド（ＢＳＴＰＡＲＲＲＬＢＲＤＦＫＲＬＱ、ここで「Ｂ」はノルロイシンである；配列番号１３４３）が、ランダムコイル立体構造を優先的にとることに対応して、溶液中で２１％のヘリシティを示したことを示したが、一方、ＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａ－１１（配列番号１３２）は、５４％のヘリックス含量を有するアルファ－ヘリックス立体構造の安定化を示した（図２０）。同様に、ペプチドステープリングは、Ｕｂｃ１５ペプチド主鎖においてアルファ－ヘリックスフォールディングを誘導し、修飾されていないＵｂｃ１５－１ペプチド（Ｕｂｃ１５－ｔｒ－ｍ－ｚ＿１ｚ；ＢＰＳＳＡＳＲＱＬＬＲＫＱＬＫＥＩＱＺ、ここで、「Ｂ」はノルロイシンであり、「Ｚ」はビオチン化したリシン（Ｌｙｓ（ビオチン））である；配列番号１３４０）は、１９％のヘリックス含量しか示さず、ステープル化ＳＡＨ－Ｕｂｃ１５－１１ペプチド（配列番号５０）は、５１％のヘリックス含量を示した。一連のＥ２ｈＡペプチド（配列番号５０、１０７、１３２、１３３；１３２７～１３２９；および１３３７～１３３９）のヘリシティのパーセントがそれらの阻害活性と相関しなかったため、ヘリックス形状単独では、Ｅ２ｈＡペプチドに対して生物学的活性を付与するのに十分ではなく、アルファ－ヘリックスの強化に加えて、適合するアミノ酸配列を必要とした（図２０～２２）。
（実施例１２）
Ｅ２ｈＡステープルペプチドはプロテアーゼ耐性である

ペプチドのステープリングによって、Ｅ２ｈＡペプチドのタンパク質分解安定性が付与された。プロテイナーゼＫ溶液による消化の際のＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａ－１１（配列番号１３２）の半減期は６時間を超え、非ステープルペプチドＵＢＥ２Ａ（ＢＳＴＰＡＲＲＲＬＢＲＤＦＫＲＬＱ；配列番号１３４３）に対して２３倍延長された（図２３）。

（実施例１３）
ｈＡステープルペプチドは、明白な結合と、結合界面を破壊して、ＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａの阻害活性を漸次的に損なう特異的変異との生物学的構造－活性－関係を示す。

上記実施例４で実証したように、点変異Ｒ７Ａ、Ｌ９Ａ、およびＢ１０Ａはそれぞれ、ＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａ－１１の阻害活性を損なうことが判明した（図６Ｂを参照されたい）。ペプチドＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａ－ＡＡＡ（ＢＳＴＰＸ_１ＲＡＲＡＡＲＸ_２ＦＫＲＬＱ；配列番号１３５４）におけるように、３つの点変異の組合せによって、単一の点変異ペプチドＳＡＨ－ＵＢＥ２Ａ－Ｒ７Ｅと比較して、阻害活性が漸次的に損なわれることが判明した。三重の変異体ペプチドは、ヘリックス構造を欠く、非ステープルＵＢＥ２Ａペプチド（ＢＳＴＰＡＲＲＲＬＢＲＤＦＫＲＬＱ；配列番号１３４３）と同様に、無視できる程度の阻害活性しか示さなかった（図２４）。単一の点変異体ペプチドと三重の点変異体ペプチドの阻害活性が損なわれる度合いは、水素－重水素交換質量分析によって測定した場合、ＵＢＡ１に対する各ペプチドの結合度合と相関した（図２５）。
実施例１０～１３において使用した追加の方法

ｉｎｖｉｔｒｏユビキチン経路再構成アッセイ：示したように、ペプチド（３０μＭ）ＵＢＡ１（０．１μＭ）、ＵＢＥ２Ｄ（１μＭ）、ＨＤＭ２（１μＭ）、ユビキチン（１μＭ）およびＡＴＰ（１０ｍＭ）（すべてＢｏｓｔｏｎＢｉｏｃｈｅｍＫ－２００Ｂ）、予め活性化されたＵｂ－ＵＢＥＡ２（３μＭ）（ＢｏｓｔｏｎＢｉｏｃｈｅｍＥ２－８０２）、およびＵＳＰ７（１μＭ）（ＢｏｓｔｏｎＢｉｏｃｈｅｍＥ－５１９）の存在下または非存在下で、組換えＨｉｓ－ｐ５３（０．１μＭ）を含有する反応物を混合し、最終体積３０μｌで、３７℃で２時間インキュベートし、その後、ＳＤＳを含有するローディングダイ中で９０℃で１０分間ボイルすることによって変性させた。試料を、アガロースゲル電気泳動によって分離し、ニトロセルロース膜に転写した。膜を３％のミルクで１時間ブロッキングし、１：１０００の希釈で３％のＢＳＡとマウスｐ５３抗体（ＢｏｓｔｏｎＢｉｏｃｈｅｍＫ－２００Ｂ）を含有するＰＢＳ中で一晩インキュベートし、０．１％のＴｗｅｅｎ（登録商標）－２０を含有するＰＢＳ中で洗浄し、次いで、１：５０００希釈で３％のＢＳＡと抗マウス二次抗体（ＢｉｏＲａｄＡＡＣ１０Ｐ）を含有するＰＢＳ中で、室温で１時間インキュベートした。０．１％のＴｗｅｅｎ（登録商標）－２０を含有するＰＢＳ中で膜を再度洗浄し、ＡｍｅｒｓｈａｍＩｍａｇｅｒ６８０（ＧＥＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）上でＡｍｅｒｓｈａｍＥＣＬＰｒｉｍｅ（ＧＥＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して撮像した。

蛍光顕微鏡法：Ｈｉｓタグ付きＵＢＡ１（２５μｇ）を、ＰＢＳ中でＮｉ－ＮＴＡアガロースビーズ（１００μｌ）（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴＭＲ９０１１０）と共に３０分間インキュベートした。次いで、ビーズを、ＦＩＴＣで標識したペプチド（１０μＭ）と共に３０分間インキュベートした。ビーズを３８６ウェルプレート形式（１０μｌ／ウェル）（Ｃｏｒｎｉｎｇ３８４ウェルＨｉｇｈＣｏｎｔｅｎｔＩｍａｇｉｎｇＧｌａｓｓＢｏｔｔｏｍＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ）でプレーティングし、Ｏｌｙｍｐｕｓの広視野落射蛍光顕微鏡、６３×ＬＣＰｌａｎＦＬＮＡ０．７対物レンズ、およびＣｏｏｌＳＮＡＰＤＹＮＯカメラを用いて撮像した。

円二色性：報告されたように（Bird et. al., Methods in Enzymol., 446:369-386 (2008)を参照されたい）、ＡｖｉｖＢｉｏｍｅｄｉｃａｌの分光光度計で実施される円二色性分析のために、アセチル化ペプチドを水中１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のアセトニトリルに溶解させた。

ペプチドタンパク質分解アッセイ：ｉｎｖｉｔｒｏでのタンパク質分解は、以下のパラメーター：２０μｌの注射、０．６ｍＬの流速、水（０．１％のギ酸）から２０％～８０％のアセトニトリル（０．７５％のギ酸）への１５分にわたる勾配、出発勾配条件に戻すための４分の洗浄、および０．５分のポストタイムからなる２０分のランタイムを使用して、ＬＣ／ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ１２００）によって測定した。ＭＳＤは、（Ｍ＋２Ｈ）／２、±１質量単位の１チャネル、（Ｍ＋３Ｈ）／３、±１質量単位の１チャネル、および（Ｍ＋４Ｈ）／４、および±１質量単位の他のチャネルを有するスキャンモードに設定した。各ＭＳＤシグナルを統合して、１０８を超えるカウントの曲線下面積を得た。反応試料は、ＤＭＳＯ（１ｍＭのストック）中５μｌのペプチドおよび５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌからなる緩衝液１９５μｌ（ｐＨ７．４）から構成した。ゼロ時間の試料の注射の際に、２０ｎｇ／μＬのプロテイナーゼＫ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）６μｌを添加し、無傷のペプチドの量を経時的に連続注射によって定量した。時間に対するＭＳＤ面積のプロットによって指数減衰曲線が得られ、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して非線形回帰分析によって半減期を決定した。
（実施例１４）
ＵＢＡ２－、ＵＢＡ３－、およびＵＢＡ６－に結合するステープルペプチド

ＵＢＡ２、ＵＢＡ３、およびＵＢＡ６に結合するステープルペプチドは、上記のように生成される。ＵＢＥ２Ｆ、ＵＢＥ２ｍ、ＵＢＥ２Ｉ、およびＵＳＥ１Ｅ２ｈＡペプチド（配列番号３５～３８）のステープルスキャンは、ステープルペプチドのＵＢＡ２、ＵＢＡ３、またはＵＢＡ６を阻害する能力を評価するためのアッセイ（例えば、上記のｉｎｖｉｔｒｏ酵素阻害アッセイ）と併せて実施される。図１３は、アルファヘリックスであることが予期される配列番号３６（左のパネル）および配列番号３５（右のパネル）のペプチド部分のホイール図を例示する。図１４は、アルファヘリックスであることが予期される配列番号３７のペプチド部分のホイール図を例示する。図１５は、アルファヘリックスであることが予期される配列番号３８のペプチド部分のホイール図を例示する。
他の実施形態

本発明は、その詳細な説明と併せて説明されてきたが、前述の説明は、本発明を例証することを意図するものであり、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定するものではない。他の態様、利点、および修正は、以下の特許請求の範囲内である。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目１)
０～１０個のアミノ酸置換を有する配列番号１３２の配列の少なくとも８個の連続アミノ酸のアミノ酸配列を含むペプチドであって、前記置換が、存在する場合、配列番号１３２の５および１２位にはなく、前記ペプチドが、ヒトＥ２へのヒトＥ１媒介性チオエステル転移を阻害し、必要に応じて、５位がＳ－ペンテニルアラニンであり、１２位がＲ－オクテニルアラニンであるか、または５位がＲ－オクテニルアラニンであり、１２位がＳ－ペンテニルアラニンである、ペプチド、またはその塩。
(項目２)
前記ペプチドが、１～１０個のアミノ酸置換を有し、前記置換が、配列番号１３２の７および／または９位にはない、項目１に記載のペプチドまたはその塩。
(項目３)
前記ペプチドが、１～１０個のアミノ酸置換を有し、前記置換が、配列番号１３２の７、９、１０、１３、および１６位の１個または複数にはない、項目１に記載のペプチドまたはその塩。
(項目４)
前記ペプチドが、１～１０個のアミノ酸置換を有し、前記置換が、配列番号１３２の７、９、１０、１３、および１６位の１個または複数にあり、前記置換が、これらの位置の１個または複数におけるアラニンへの置換である、項目１に記載のペプチドまたはその塩。
(項目５)
前記ペプチドが、１～１０個のアミノ酸置換を有し、前記置換が、配列番号１３２の１、２、３、４、６、８、１１、１３、１４、１５、１６、または１７位の１個または複数にあり、必要に応じて、これらの位置が、アラニンに置換されており、６および／または８位が置換されている場合、これらの位置がまた、グルタミン酸に置換されていてもよい、項目１に記載のペプチドまたはその塩。
(項目６)
前記ペプチドが、１～１０個のアミノ酸置換を有し、前記置換が、配列番号１３２の６または８位の１個または複数を含み、必要に応じて、これらの位置が、グルタミン酸に置換されている、項目１に記載のペプチドまたはその塩。
(項目７)
ヒトＥ１内のシステイン残基と共有結合を形成することができる反応性基をさらに含み、必要に応じて、前記反応性基が、Ｎ末端に求電子性基または求電子性化学的キャップを有する非天然アミノ酸である、項目１から６のいずれか一項に記載のペプチドまたはその塩。
(項目８)
ペプチドまたはその塩であって、前記ペプチドが、Ｎ末端からＣ末端に以下の残基：
Ｘａａ１＝Ｂ、Ａ（Ｂは、ノルロイシンであるか、または存在しない）；
Ｘａａ２＝Ｓ、Ａ、または存在しない；
Ｘａａ３＝Ｔ、Ａ、または存在しない；
Ｘａａ４＝Ｐ、Ａ、または存在しない；
Ｘａａ５＝ステープリングアミノ酸
Ｘａａ６＝Ｒ、Ｅ、またはＡ；
Ｘａａ７＝ＲまたはＡ；
Ｘａａ８＝Ｒ、Ｅ、またはＡ；
Ｘａａ９＝Ｌ、Ａ、またはヒトＥ１内のシステイン残基と共有結合を形成することができる反応性基（必要に応じて、前記反応性基は前記Ｎ末端に求電子性基または求電子性化学的キャップを有する非天然アミノ酸である）；
Ｘａａ１０＝ＢまたはＡ（Ｂは、ノルロイシンである）；
Ｘａａ１１＝ＲまたはＡ；
Ｘａａ１２＝ステープリングアミノ酸；
Ｘａａ１３＝Ｆ、Ａ、ヒトＥ１内のシステイン残基と共有結合を形成することができる反応性基（必要に応じて、前記反応性基は前記Ｎ末端に求電子性基または求電子性化学的キャップを有する非天然アミノ酸である）、または存在しない；
Ｘａａ１４＝Ｋ、Ｒ、Ａ、または存在しない；
Ｘａａ１５＝Ｒ、Ａ、または存在しない
Ｘａａ１６＝Ｌ、Ａ、または存在しない；および
Ｘａａ１７＝Ｑ、Ａ、または存在しない
を有する配列の少なくとも８個の連続アミノ酸を含み、
前記ペプチドが、ヒトＥ１とヒトＥ２との間の相互作用を阻害し、必要に応じて、前記ペプチドが、ヒトＥ２へのヒトＥ１媒介性チオエステル転移を阻害する、ペプチドまたはその塩。
(項目９)
前記ペプチドが、８～５０、８～４０、８～３０、８～２５、８～２０、または８～１７アミノ酸長である、項目８に記載のペプチドまたはその塩。
(項目１０)
前記ペプチドが、内部で架橋している、項目１から９のいずれか一項に記載のペプチドまたはその塩。
(項目１１)
構造的に安定化されたペプチドを作製する方法であって、
（ａ）項目１から９のいずれか一項に記載のペプチドを得るステップと、
（ｂ）前記ペプチドを架橋させるステップであって、必要に応じて、前記架橋が、ＲＣＭ反応によるものである、ステップと
を含む、方法。
(項目１２)
前記架橋したペプチドを医薬組成物として製剤化するステップをさらに含む、項目１１に記載の方法。
(項目１３)
項目１から１０のいずれか一項に記載のペプチドまたはその塩、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
(項目１４)
それを必要とするヒト対象において、Ｅ１を発現する疾患またはＥ１に依存する疾患を処置する方法であって、前記ヒト対象に、項目１から１０のいずれか一項に記載のペプチドもしくはその塩、または項目１３に記載の医薬組成物の治療有効量を投与するステップを含む、方法。
(項目１５)
前記Ｅ１を発現する疾患またはＥ１に依存する疾患が、がんである、項目１４に記載の方法。
(項目１６)
前記Ｅ１を発現する疾患またはＥ１に依存する疾患が、血液悪性腫瘍、固形腫瘍、抗体媒介性移植拒絶、自己免疫障害、または炎症性障害である、項目１４に記載の方法。
(項目１７)
前記ヒト対象が、前記Ｅ１を発現する疾患またはＥ１に依存する疾患を処置するための以前の治療に対して、応答性でなかったか、または耐性を生じたことがある、項目１４から１６のいずれか一項に記載の方法。
(項目１８)
前記塩が、酢酸塩、硫酸塩、または塩化物である、項目１から１０のいずれか一項に記載のペプチドまたはその塩。
(項目１９)
配列番号１～３３のいずれか１つのアミノ酸Ａ _１～Ａ _１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含むペプチドであって、前記Ａ _１～Ａ _１１アミノ酸の１個または複数が、別のアミノ酸で置換されており、前記修飾されたアミノ酸配列が、少なくとも１個のペプチド構造を安定化させる修飾を含み、前記ペプチドが、ユビキチン活性化酵素１（ＵＢＡ１）に結合し、それを阻害する、ペプチド。
(項目２０)
前記ペプチド構造を安定化させる修飾が、配列番号１～３３のいずれか１つのアミノ酸Ａ _１～Ａ _１１に示される配列の少なくとも２個のアミノ酸の、非天然アミノ酸による置換を含み、前記非天然アミノ酸が、オレフィン側鎖を含む、項目１９に記載のペプチド。
(項目２１)
前記ペプチド構造を安定化させる修飾が、炭化水素ステープル／ステッチ、ラクタムステープル／ステッチ；ＵＶ環化付加ステープル／ステッチ；オキシムステープル／ステッチ；チオエーテルステープル／ステッチ；ダブルクリックステープル／ステッチ；ビス－ラクタムステープル／ステッチ；ビス－アリール化ステープル／ステッチ；またはこれらのいずれか２つもしくはそれより多くの組合せである、項目１９に記載のペプチド。
(項目２２)
前記ペプチド構造を安定化させる修飾が、ステッチである、項目１９に記載のペプチド。
(項目２３)
前記ペプチド構造を安定化させる修飾が、ステープルである、項目１９に記載のペプチド。
(項目２４)
前記ステープルが、前記アミノ酸配列における２個の位置の１個または複数に存在し、前記２個の位置が、ｉおよびｉ＋３、ｉおよびｉ＋４、ｉおよびｉ＋６、またはｉおよびｉ＋７である、項目２３に記載のペプチド。
(項目２５)
前記ステープルが、前記アミノ酸配列における２個の位置の１個または複数に存在し、前記２個の位置が、Ａ _２およびＡ _９、Ａ _５およびＡ _９、Ａ _８およびＡ _１２、Ａ _９およびＡ _１３、Ａ _１およびＡ _８、Ａ _４およびＡ _１１、ならびにＡ _５およびＡ _１２からなる群から選択される、項目２３に記載のペプチド。
(項目２６)
前記ステープルが、２個の位置に存在し、前記２個の位置が、Ａ _２およびＡ _９である、項目２３に記載のペプチド。
(項目２７)
前記ステープルが、前記２個の位置のそれぞれにおいてアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換のそれぞれが、非天然アミノによる置換であり、前記非天然アミノ酸が、オレフィン側鎖を含む、項目２３から２６のいずれか一項に記載のペプチド。
(項目２８)
オレフィン側鎖を含む前記非天然アミノ酸が、Ｓ－ペンテニルアラニン、Ｒ－オクテニルアラニン；Ｒ－プロペニルアラニン、Ｓ－ペンテニルアラニン；Ｒ－ペンテニルアラニン、Ｓ－ペンテニルアラニン；Ｂｉｓ－ペンテニルグリシン、Ｓ－ペンテニルアラニン、Ｒ－オクテニルアラニン；ならびにＢｉｓ－ペンテニルグリシン、Ｓ－オクテニルアラニン、およびＲ－オクテニルアラニンからなる群から選択される、項目２０または２７に記載のペプチド。
(項目２９)
（ａ）前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号４のアミノ酸Ａ _１～Ａ _１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号４のＡ _１、Ａ _２、Ａ _３、Ａ _５、Ａ _８、Ａ _９、およびＡ _１１からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸置換を含むか、
（ｂ）前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号６のアミノ酸Ａ _１～Ａ _１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号６のＡ _１、Ａ _２、Ａ _３、Ａ _５、Ａ _８、Ａ _９、およびＡ _１１からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸置換を含むか、
（ｃ）前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号１のアミノ酸Ａ _１～Ａ _１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号１のＡ _１、Ａ _２、Ａ _３、Ａ _５、Ａ _８、Ａ _９、およびＡ _１１からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸置換を含むか、
（ｄ）前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号２のアミノ酸Ａ _１～Ａ _１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号２のＡ _１、Ａ _２、Ａ _３、Ａ _５、Ａ _８、Ａ _９、およびＡ _１１からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸置換を含むか、
（ｅ）前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号３のアミノ酸Ａ _１～Ａ _１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号３のＡ _１、Ａ _２、Ａ _３、Ａ _５、Ａ _８、Ａ _９、およびＡ _１１からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸置換を含むか、
（ｆ）前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号５のアミノ酸Ａ _１～Ａ _１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号５のＡ _１、Ａ _２、Ａ _３、Ａ _５、Ａ _８、Ａ _９、およびＡ _１１からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸置換を含むか、
（ｇ）前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号７のアミノ酸Ａ _１～Ａ _１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号７のＡ _１、Ａ _２、Ａ _３、Ａ _５、Ａ _８、Ａ _９、およびＡ _１１からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸置換を含むか、
（ｈ）前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号８のアミノ酸Ａ _１～Ａ _１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号８のＡ _１、Ａ _２、Ａ _３、Ａ _５、Ａ _８、Ａ _９、およびＡ _１１からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸置換を含むか、
（ｉ）前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号９のアミノ酸Ａ _１～Ａ _１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号９のＡ _１、Ａ _２、Ａ _３、Ａ _５、Ａ _８、Ａ _９、およびＡ _１１からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸置換を含むか、
（ｊ）前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号１０のアミノ酸Ａ _１～Ａ _１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号１０のＡ _１、Ａ _２、Ａ _３、Ａ _５、Ａ _８、Ａ _９、およびＡ _１１からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸置換を含むか、
（ｋ）前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号１１のアミノ酸Ａ _１～Ａ _１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号１１のＡ _１、Ａ _２、Ａ _３、Ａ _５、Ａ _８、Ａ _９、およびＡ _１１からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸置換を含むか、
（ｌ）前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号１２のアミノ酸Ａ _１～Ａ _１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号１２のＡ _１、Ａ _２、Ａ _３、Ａ _５、Ａ _８、Ａ _９、およびＡ _１１からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸置換を含むか、
（ｍ）前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号１３のアミノ酸Ａ _１～Ａ _１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号１３のＡ _１、Ａ _２、Ａ _３、Ａ _５、Ａ _８、Ａ _９、およびＡ _１１からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸置換を含むか、
（ｎ）前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号１４のアミノ酸Ａ _１～Ａ _１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号１４のＡ _１、Ａ _２、Ａ _３、Ａ _５、Ａ _８、Ａ _９、およびＡ _１１からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸置換を含むか、
（ｏ）前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号１５のアミノ酸Ａ _１～Ａ _１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号１５のＡ _１、Ａ _２、Ａ _３、Ａ _５、Ａ _８、Ａ _９、およびＡ _１１からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸置換を含むか、
（ｐ）前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号１６のアミノ酸Ａ _１～Ａ _１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号１６のＡ _１、Ａ _２、Ａ _３、Ａ _５、Ａ _８、Ａ _９、およびＡ _１１からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸置換を含むか、
（ｑ）前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号１７のアミノ酸Ａ _１～Ａ _１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号１７のＡ _１、Ａ _２、Ａ _３、Ａ _５、Ａ _８、Ａ _９、およびＡ _１１からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸置換を含むか、
（ｒ）前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号１８のアミノ酸Ａ _１～Ａ _１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号１８のＡ _１、Ａ _２、Ａ _３、Ａ _５、Ａ _８、Ａ _９、およびＡ _１１からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸置換を含むか、
（ｓ）前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号１９のアミノ酸Ａ _１～Ａ _１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号１９のＡ _１、Ａ _２、Ａ _３、Ａ _５、Ａ _８、Ａ _９、およびＡ _１１からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸置換を含むか、
（ｔ）前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号２０のアミノ酸Ａ _１～Ａ _１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号２０のＡ _１、Ａ _２、Ａ _３、Ａ _５、Ａ _８、Ａ _９、およびＡ _１１からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸置換を含むか、
（ｕ）前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号２１のアミノ酸Ａ _１～Ａ _１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号２１のＡ _１、Ａ _２、Ａ _３、Ａ _５、Ａ _８、Ａ _９、およびＡ _１１からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸置換を含むか、
（ｖ）前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号２２のアミノ酸Ａ _１～Ａ _１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号２２のＡ _１、Ａ _２、Ａ _３、Ａ _５、Ａ _８、Ａ _９、およびＡ _１１からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸置換を含むか、
（ｗ）前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号２３のアミノ酸Ａ _１～Ａ _１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号２３のＡ _１、Ａ _２、Ａ _３、Ａ _５、Ａ _８、Ａ _９、およびＡ _１１からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸置換を含むか、
（ｘ）前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号２４のアミノ酸Ａ _１～Ａ _１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号２４のＡ _１、Ａ _２、Ａ _３、Ａ _５、Ａ _８、Ａ _９、およびＡ _１１からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸置換を含むか、
（ｙ）前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号２５のアミノ酸Ａ _１～Ａ _１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号２５のＡ _１、Ａ _２、Ａ _３、Ａ _５、Ａ _８、Ａ _９、およびＡ _１１からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸置換を含むか、
（ｚ）前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号２６のアミノ酸Ａ _１～Ａ _１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号２６のＡ _１、Ａ _２、Ａ _３、Ａ _５、Ａ _８、Ａ _９、およびＡ _１１からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸置換を含むか、
（ａａ）前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号２７のアミノ酸Ａ _１～Ａ _１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号２７のＡ _１、Ａ _２、Ａ _３、Ａ _５、Ａ _８、Ａ _９、およびＡ _１１からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸置換を含むか、
（ｂｂ）前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号２８のアミノ酸Ａ _１～Ａ _１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号２８のＡ _１、Ａ _２、Ａ _３、Ａ _５、Ａ _８、Ａ _９、およびＡ _１１からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸置換を含むか、
（ｃｃ）前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号２９のアミノ酸Ａ _１～Ａ _１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号２９のＡ _１、Ａ _２、Ａ _３、Ａ _５、Ａ _８、Ａ _９、およびＡ _１１からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸置換を含むか、
（ｄｄ）前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号３０のアミノ酸Ａ _１～Ａ _１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号３０のＡ _１、Ａ _２、Ａ _３、Ａ _５、Ａ _８、Ａ _９、およびＡ _１１からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸置換を含むか、
（ｅｅ）前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号３１のアミノ酸Ａ _１～Ａ _１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号３１のＡ _１、Ａ _２、Ａ _３、Ａ _５、Ａ _８、Ａ _９、およびＡ _１１からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸置換を含むか、
（ｆｆ）前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号３２のアミノ酸Ａ _１～Ａ _１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号３２のＡ _１、Ａ _２、Ａ _３、Ａ _５、Ａ _８、Ａ _９、およびＡ _１１からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸置換を含むか；または
（ｇｇ）前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号３３のアミノ酸Ａ _１～Ａ _１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号３３のＡ _１、Ａ _２、Ａ _３、Ａ _５、Ａ _８、Ａ _９、およびＡ _１１からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸置換を含む、項目１９から２８のいずれか一項に記載のペプチド。
(項目３０)
（ａ）前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号４のアミノ酸Ａ _１～Ａ _１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号４のＡ _４、Ａ _６、Ａ _７、およびＡ _１０からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、もしくは２個の保存的アミノ酸置換を含むか、
（ｂ）前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号６のアミノ酸Ａ _１～Ａ _１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号６のＡ _４、Ａ _６、Ａ _７、およびＡ _１０からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、もしくは２個の保存的アミノ酸置換を含むか、
（ｃ）前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号１のアミノ酸Ａ _１～Ａ _１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号１のＡ _４、Ａ _６、Ａ _７、およびＡ _１０からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、もしくは２個の保存的アミノ酸置換を含むか、
（ｄ）前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号２のアミノ酸Ａ _１～Ａ _１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号２のＡ _４、Ａ _６、Ａ _７、およびＡ _１０からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、もしくは２個の保存的アミノ酸置換を含むか、
（ｅ）前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号３のアミノ酸Ａ _１～Ａ _１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号３のＡ _４、Ａ _６、Ａ _７、およびＡ _１０からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、もしくは２個の保存的アミノ酸置換を含むか、
（ｆ）前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号５のアミノ酸Ａ _１～Ａ _１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号５のＡ _４、Ａ _６、Ａ _７、およびＡ _１０からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、もしくは２個の保存的アミノ酸置換を含むか、
（ｇ）前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号７のアミノ酸Ａ _１～Ａ _１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号７のＡ _４、Ａ _６、Ａ _７、およびＡ _１０からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、もしくは２個の保存的アミノ酸置換を含むか、
（ｈ）前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号８のアミノ酸Ａ _１～Ａ _１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号８のＡ _４、Ａ _６、Ａ _７、およびＡ _１０からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、もしくは２個の保存的アミノ酸置換を含むか、
（ｉ）前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号９のアミノ酸Ａ _１～Ａ _１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号９のＡ _４、Ａ _６、Ａ _７、およびＡ _１０からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、もしくは２個の保存的アミノ酸置換を含むか、
（ｊ）前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号１０のアミノ酸Ａ _１～Ａ _１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号１０のＡ _４、Ａ _６、Ａ _７、およびＡ _１０からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、もしくは２個の保存的アミノ酸置換を含むか、
（ｋ）前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号１１のアミノ酸Ａ _１～Ａ _１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号１１のＡ _４、Ａ _６、Ａ _７、およびＡ _１０からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、もしくは２個の保存的アミノ酸置換を含むか、
（ｌ）前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号１２のアミノ酸Ａ _１～Ａ _１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号１２のＡ _４、Ａ _６、Ａ _７、およびＡ _１０からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、もしくは２個の保存的アミノ酸置換を含むか、
（ｍ）前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号１３のアミノ酸Ａ _１～Ａ _１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号１３のＡ _４、Ａ _６、Ａ _７、およびＡ _１０からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、もしくは２個の保存的アミノ酸置換を含むか、
（ｎ）前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号１４のアミノ酸Ａ _１～Ａ _１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号１４のＡ _４、Ａ _６、Ａ _７、およびＡ _１０からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、もしくは２個の保存的アミノ酸置換を含むか、
（ｏ）前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号１５のアミノ酸Ａ _１～Ａ _１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号１５のＡ _４、Ａ _６、Ａ _７、およびＡ _１０からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、もしくは２個の保存的アミノ酸置換を含むか、
（ｐ）前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号１６のアミノ酸Ａ _１～Ａ _１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号１６のＡ _４、Ａ _６、Ａ _７、およびＡ _１０からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、もしくは２個の保存的アミノ酸置換を含むか、
（ｑ）前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号１７のアミノ酸Ａ _１～Ａ _１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号１７のＡ _４、Ａ _６、Ａ _７、およびＡ _１０からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、もしくは２個の保存的アミノ酸置換を含むか、
（ｒ）前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号１８のアミノ酸Ａ _１～Ａ _１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号１８のＡ _４、Ａ _６、Ａ _７、およびＡ _１０からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、もしくは２個の保存的アミノ酸置換を含むか、
（ｓ）前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号１９のアミノ酸Ａ _１～Ａ _１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号１９のＡ _４、Ａ _６、Ａ _７、およびＡ _１０からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、もしくは２個の保存的アミノ酸置換を含むか、
（ｔ）前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号２０のアミノ酸Ａ _１～Ａ _１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号２０のＡ _４、Ａ _６、Ａ _７、およびＡ _１０からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、もしくは２個の保存的アミノ酸置換を含むか、
（ｕ）前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号２１のアミノ酸Ａ _１～Ａ _１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号２１のＡ _４、Ａ _６、Ａ _７、およびＡ _１０からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、もしくは２個の保存的アミノ酸置換を含むか、
（ｖ）前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号２２のアミノ酸Ａ _１～Ａ _１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号２２のＡ _４、Ａ _６、Ａ _７、およびＡ _１０からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、もしくは２個の保存的アミノ酸置換を含むか、
（ｗ）前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号２３のアミノ酸Ａ _１～Ａ _１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号２３のＡ _４、Ａ _６、Ａ _７、およびＡ _１０からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、もしくは２個の保存的アミノ酸置換を含むか、
（ｘ）前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号２４のアミノ酸Ａ _１～Ａ _１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号２４のＡ _４、Ａ _６、Ａ _７、およびＡ _１０からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、もしくは２個の保存的アミノ酸置換を含むか、
（ｙ）前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号２５のアミノ酸Ａ _１～Ａ _１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号２５のＡ _４、Ａ _６、Ａ _７、およびＡ _１０からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、もしくは２個の保存的アミノ酸置換を含むか、
（ｚ）前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号２６のアミノ酸Ａ _１～Ａ _１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号２６のＡ _４、Ａ _６、Ａ _７、およびＡ _１０からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、もしくは２個の保存的アミノ酸置換を含むか、
（ａａ）前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号２７のアミノ酸Ａ _１～Ａ _１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号２７のＡ _４、Ａ _６、Ａ _７、およびＡ _１０からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、もしくは２個の保存的アミノ酸置換を含むか、
（ｂｂ）前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号２８のアミノ酸Ａ _１～Ａ _１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号２８のＡ _４、Ａ _６、Ａ _７、およびＡ _１０からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、もしくは２個の保存的アミノ酸置換を含むか、
（ｃｃ）前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号２９のアミノ酸Ａ _１～Ａ _１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号２９のＡ _４、Ａ _６、Ａ _７、およびＡ _１０からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、もしくは２個の保存的アミノ酸置換を含むか、
（ｄｄ）前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号３０のアミノ酸Ａ _１～Ａ _１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号３０のＡ _４、Ａ _６、Ａ _７、およびＡ _１０からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、もしくは２個の保存的アミノ酸置換を含むか、
（ｅｅ）前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号３１のアミノ酸Ａ _１～Ａ _１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号３１のＡ _４、Ａ _６、Ａ _７、およびＡ _１０からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、もしくは２個の保存的アミノ酸置換を含むか、
（ｆｆ）前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号３２のアミノ酸Ａ _１～Ａ _１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号３２のＡ _４、Ａ _６、Ａ _７、およびＡ _１０からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、もしくは２個の保存的アミノ酸置換を含むか、または
（ｇｇ）前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号３３のアミノ酸Ａ _１～Ａ _１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号３３のＡ _４、Ａ _６、Ａ _７、およびＡ _１０からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、もしくは２個の保存的アミノ酸置換を含む、項目１９から２９のいずれか一項に記載のペプチド。
(項目３１)
別のアミノ酸で置換されたアミノ酸Ａ _１～Ａ _１１の前記１つまたは複数が、配列番号１～３３のアミノ酸Ａ _１～Ａ _１１のＥ１と相互作用しない面に存在する、項目１９から３０のいずれか一項に記載のペプチド。
(項目３２)
配列番号１～３３の相互作用しない面が、アミノ酸Ａ _１、Ａ _２、Ａ _５、Ａ _８、Ａ _９、およびＡ _１２を含む、項目３１に記載のペプチド。
(項目３３)
配列番号１～３３のいずれか１つのアミノ酸Ａ _１～Ａ _１１の相互作用しない面における０～６個のアミノ酸が、アラニン、Ｄ－アラニン、α－アミノイソ酪酸、Ｎ－メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている、項目１９から３２のいずれか一項に記載のペプチド。
(項目３４)
アミノ酸Ａ _４、Ａ _６、Ａ _７、およびＡ _１０の１つまたは複数が、アルファ－メチル化またはアルファ－エチル化された天然アミノ酸で置換されている、項目１９から３３のいずれか一項に記載のペプチド。
(項目３５)
アミノ酸Ａ _４、Ａ _６、Ａ _７、およびＡ _１０の１つまたは複数が、Ｌ－アラニン、Ｄ－アラニン、α－アミノイソ酪酸、Ｎ－メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている、項目１９から３３のいずれか一項に記載のペプチド。
(項目３６)
アミノ酸Ａ _１、Ａ _２、Ａ _３、Ａ _５、Ａ _８、Ａ _９、およびＡ _１１の１つまたは複数が、アルファ－メチル化またはアルファ－エチル化された天然アミノ酸で置換されている、項目１９から３５のいずれか一項に記載のペプチド。
(項目３７)
アミノ酸Ａ _１、Ａ _２、Ａ _３、Ａ _５、Ａ _８、Ａ _９、およびＡ _１１の１つまたは複数が、Ｌ－アラニン、Ｄ－アラニン、α－アミノイソ酪酸、Ｎ－メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている、項目１９から３５のいずれか一項に記載のペプチド。
(項目３８)
前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号４のアミノ酸Ａ _１～Ａ _１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含む、項目１９から３７のいずれか一項に記載のペプチド。
(項目３９)
前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号６のアミノ酸Ａ _１～Ａ _１１に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含む、項目１９から３７のいずれか一項に記載のペプチド。
(項目４０)
前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号１～３３のいずれか１つに示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含む、項目１９から３７のいずれか一項に記載のペプチド。
(項目４１)
配列番号１～３３の１個または複数のアミノ酸が、Ｌ－アラニン、Ｄ－アラニン、α－アミノイソ酪酸、Ｎ－メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸（１つまたは複数）で置換されている、項目４０に記載のペプチド。
(項目４２)
配列番号１～３３の０～５個のアミノ酸が、Ｃ末端から除去されているか、または除去されて、アラニン、Ｄ－アラニン、α－アミノイソ酪酸、Ｎ－メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群からの１～６個のアミノ酸で置き換えられている、項目４０または４１に記載のペプチド。
(項目４３)
別のアミノ酸で置換された配列番号１～３３の１個または複数のアミノ酸が、配列番号１～３３のアミノ酸のＥ１と相互作用しない面に存在する、項目４０から４２のいずれか一項に記載のペプチド。
(項目４４)
前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号４に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含む、項目４０から４３のいずれか一項に記載のペプチド。
(項目４５)
前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号６に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含む、項目４０から４３のいずれか一項に記載のペプチド。
(項目４６)
（ｉ）前記ペプチドの全体的な疎水性が、配列番号１～３３のペプチドと比較して低下しているか；（ｉｉ）前記ペプチドの全体的な正荷電が、配列番号１～３３のペプチドと比較して低下しているか；または（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の組合せである、項目１９から４５のいずれか一項に記載のペプチド。
(項目４７)
配列番号１３２に示される配列を含む、項目１９に記載のペプチド。
(項目４８)
配列番号１３３に示される配列を含む、項目１９に記載のペプチド。
(項目４９)
配列番号１０７に示される配列を含む、項目１９に記載のペプチド。
(項目５０)
配列番号５０に示される配列を含む、項目１９に記載のペプチド。
(項目５１)
配列番号３５または３６に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含むペプチドであって、配列番号３５または３６の１個または複数のアミノ酸が、別のアミノ酸で置換されており、前記修飾されたアミノ酸配列が、少なくとも１個のペプチド構造を安定化させる修飾を含み、前記ペプチドが、ユビキチン活性化酵素３（ＵＢＡ３）に結合し、それを阻害する、ペプチド。
(項目５２)
前記ペプチド構造を安定化させる修飾が、配列番号３５または３６の配列の少なくとも２個のアミノ酸の、非天然アミノ酸による置換を含み、前記非天然アミノ酸が、オレフィン側鎖を含む、項目５１に記載のペプチド。
(項目５３)
前記ペプチド構造を安定化させる修飾が、炭化水素ステープル／ステッチ、ラクタムステープル／ステッチ；ＵＶ環化付加ステープル／ステッチ；オキシムステープル／ステッチ；チオエーテルステープル／ステッチ；ダブルクリックステープル／ステッチ；ビス－ラクタムステープル／ステッチ；ビス－アリール化ステープル／ステッチ；またはこれらのいずれか２つもしくはそれより多くの組合せである、項目５１に記載のペプチド。
(項目５４)
前記ペプチド構造を安定化させる修飾が、ステッチである、項目５１に記載のペプチド。
(項目５５)
前記ペプチド構造を安定化させる修飾が、ステープルである、項目５１に記載のペプチド。
(項目５６)
前記ステープルが、前記アミノ酸配列における２個の位置の１個または複数に存在し、前記２個の位置が、ｉおよびｉ＋３、ｉおよびｉ＋４、またはｉおよびｉ＋７である、項目５５に記載のペプチド。
(項目５７)
前記ステープルが、前記２個の位置のそれぞれにおいてアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換のそれぞれが、非天然アミノによる置換であり、前記非天然アミノ酸が、オレフィン側鎖を含む、項目５５または５６に記載のペプチド。
(項目５８)
オレフィン側鎖を含む前記非天然アミノ酸が、Ｓ－ペンテニルアラニン、Ｒ－オクテニルアラニン；Ｒ－プロペニルアラニン、Ｓ－ペンテニルアラニン；Ｒ－ペンテニルアラニン、Ｓ－ペンテニルアラニン；Ｂｉｓ－ペンテニルグリシン、Ｓ－ペンテニルアラニン、Ｒ－オクテニルアラニン；ならびにＢｉｓ－ペンテニルグリシン、Ｓ－オクテニルアラニン、およびＲ－オクテニルアラニンからなる群から選択される、項目５２または５７に記載のペプチド。
(項目５９)
（ａ）前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号３５の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号３５のＡｒｇ－１、Ａｒｇ－２、Ｓｅｒ－４、Ｖａｌ－５、Ａｒｇ－６、Ａｓｐ－７、Ｌｅｕ－９、Ｌｅｕ－１０、Ｇｌｕ－１３、Ａｌａ－１５、およびＧｌｕ－１６からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸置換を含むか、または
（ｂ）前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号３６の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号３６のＬｙｓ－１、Ｓｅｒ－４、Ａｌａ－５、Ａｌａ－６、Ａｒｇ－９、Ｉｌｅ－１０、およびＡｓｐ－１３ _４からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸置換を含む、項目５１から５８のいずれか一項に記載のペプチド。
(項目６０)
（ａ）前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号３５の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号３５のＶａｌ－３、Ｌｙｓ－８、Ｖａｌ－１１、Ｌｙｓ－１２、およびＶａｌ－１４からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、もしくは２個の保存的アミノ酸置換を含むか、または
（ｂ）前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号３６の修飾されたアミノ酸配列を含み、前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号３６のＬｙｓ－２、Ａｌａ－３、Ｇｌｎ－７、Ｌｅｕ－８、Ｇｌｎ－１１、Ｌｙｓ－１２、Ｉｌｅ－１４、Ａｓｎ－１５、およびＧｌｕ－１６からなる群から選択される０、１、もしくは２個の保存的アミノ酸位置を含む、項目５１から５９のいずれか一項に記載のペプチド。
(項目６１)
別のアミノ酸で置換された前記１個または複数のアミノ酸が、配列番号３５または３６のＥ１と相互作用しない面に存在する、項目５１から６０のいずれか一項に記載のペプチド。
(項目６２)
配列番号３５の相互作用しない面が、配列番号２５のアミノ酸Ａｒｇ－１、Ａｒｇ－２、Ｓｅｒ－４、Ｖａｌ－５、Ａｒｇ－６、Ａｓｐ－７、Ｌｅｕ－９、Ｌｅｕ－１０、Ｇｌｕ－１３、Ａｌａ－１５、およびＧｌｕ－１６を含み、配列番号３６の相互作用しない面が、配列番号３６のアミノ酸Ｌｙｓ－１、Ｓｅｒ－４、Ａｌａ－５、Ａｌａ－６、Ａｒｇ－９、Ｉｌｅ－１０、およびＡｓｐ－１３を含む、項目６１に記載のペプチド。
(項目６３)
項目３５または３６の相互作用しない面における０～６個のアミノ酸が、アラニン、Ｄ－アラニン、α－アミノイソ酪酸、Ｎ－メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている、項目５１から６２のいずれか一項に記載のペプチド。
(項目６４)
アミノ酸Ｂ _７、Ｂ _８、Ｂ _１１、Ｂ _１２、Ｂ _１５、およびＢ _１６の１つまたは複数が、アルファ－メチル化またはアルファ－エチル化された天然アミノ酸で置換されている、項目５１から６２のいずれか一項に記載のペプチド。
(項目６５)
アミノ酸Ｂ _７、Ｂ _８、Ｂ _１１、Ｂ _１２、Ｂ _１５、およびＢ _１６の１つまたは複数が、Ｌ－アラニン、Ｄ－アラニン、α－アミノイソ酪酸、Ｎ－メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている、項目５１から６２のいずれか一項に記載のペプチド。
(項目６６)
アミノ酸Ｂ _１、Ｂ _２、Ｂ _３、Ｂ _４、Ｂ _５、Ｂ _６、Ｂ _９、Ｂ _１０、Ｂ _１３、およびＢ _１４の１つまたは複数が、アルファ－メチル化またはアルファ－エチル化された天然アミノ酸で置換されている、項目５１から６５のいずれか一項に記載のペプチド。
(項目６７)
アミノ酸Ｂ _１、Ｂ _２、Ｂ _３、Ｂ _４、Ｂ _５、Ｂ _６、Ｂ _９、Ｂ _１０、Ｂ _１３、およびＢ _１４の１つまたは複数が、Ｌ－アラニン、Ｄ－アラニン、α－アミノイソ酪酸、Ｎ－メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている、項目５１から６５のいずれか一項に記載のペプチド。
(項目６８)
配列番号３５または３６の０～５個のアミノ酸が、Ｃ末端から除去されているか、または除去されて、アラニン、Ｄ－アラニン、α－アミノイソ酪酸、Ｎ－メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群からの１～６個のアミノ酸で置き換えられている、項目５１から６７のいずれか一項に記載のペプチド。
(項目６９)
（ｉ）前記ペプチドの全体的な疎水性が、配列番号３５もしくは３６のペプチドと比較して低下しているか；（ｉｉ）前記ペプチドの全体的な正荷電が、配列番号３５もしくは３６のペプチドと比較して低下しているか；または（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の組合せである、項目５１から６８のいずれか一項に記載のペプチド。
(項目７０)
配列番号３７に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含むペプチドであって、配列番号３７の１個または複数のアミノ酸が、別のアミノ酸で置換されており、前記修飾されたアミノ酸配列が、少なくとも１個のペプチド構造を安定化させる修飾を含み、前記ペプチドが、ユビキチン活性化酵素２（ＵＢＡ２）に結合し、それを阻害する、ペプチド。
(項目７１)
前記ペプチド構造を安定化させる修飾が、配列番号３５または３６の配列の少なくとも２個のアミノ酸の、非天然アミノ酸による置換を含み、前記非天然アミノ酸が、オレフィン側鎖を含む、項目７０に記載のペプチド。
(項目７２)
前記ペプチド構造を安定化させる修飾が、炭化水素ステープル／ステッチ、ラクタムステープル／ステッチ；ＵＶ環化付加ステープル／ステッチ；オキシムステープル／ステッチ；チオエーテルステープル／ステッチ；ダブルクリックステープル／ステッチ；ビス－ラクタムステープル／ステッチ；ビス－アリール化ステープル／ステッチ；またはこれらのいずれか２つもしくはそれより多くの組合せである、項目７０に記載のペプチド。
(項目７３)
前記ペプチド構造を安定化させる修飾が、ステッチである、項目７０に記載のペプチド。
(項目７４)
前記ペプチド構造を安定化させる修飾が、ステープルである、項目７０に記載のペプチド。
(項目７５)
前記ステープルが、前記アミノ酸配列における２個の位置の１個または複数に存在し、前記２個の位置が、ｉおよびｉ＋３、ｉおよびｉ＋４、またはｉおよびｉ＋７である、項目７４に記載のペプチド。
(項目７６)
前記ステープルが、前記２個の位置のそれぞれにおいてアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換のそれぞれが、非天然アミノによる置換であり、前記非天然アミノ酸が、オレフィン側鎖を含む、項目７４または７５に記載のペプチド。
(項目７７)
オレフィン側鎖を含む前記非天然アミノ酸が、Ｓ－ペンテニルアラニン、Ｒ－オクテニルアラニン；Ｒ－プロペニルアラニン、Ｓ－ペンテニルアラニン；Ｒ－ペンテニルアラニン、Ｓ－ペンテニルアラニン；Ｂｉｓ－ペンテニルグリシン、Ｓ－ペンテニルアラニン、Ｒ－オクテニルアラニン；ならびにＢｉｓ－ペンテニルグリシン、Ｓ－オクテニルアラニン、およびＲ－オクテニルアラニンからなる群から選択される、項目７１または７６に記載のペプチド。
(項目７８)
前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号３７のＡｌａ－１、Ａｒｇ－４、Ｌｅｕ－５、Ｇｌｕ－８、Ａｌａ－１１、Ｔｒｐ－１２、およびＡｓｐ－１５からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、２、３、４、または５個のアミノ酸置換を含む、項目７０から７７のいずれか一項に記載のペプチド。
(項目７９)
前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号３７のＬｅｕ－２、Ｓｅｒ－３、Ａｌａ－６、Ｇｌｎ－７、Ａｒｇ－９、Ｌｙｓ－１０、Ａｒｇ－１３、およびＬｙｓ－１４からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、または２個の保存的アミノ酸置換を含む、項目７０から７８のいずれか一項に記載のペプチド。
(項目８０)
別のアミノ酸で置換された前記１個または複数のアミノ酸が、配列番号３７のＥ１と相互作用しない面に存在する、項目７０から７９のいずれか一項に記載のペプチド。
(項目８１)
配列番号３７の相互作用しない面が、配列番号３７のアミノ酸Ａｌａ－１、Ａｒｇ－４、Ｌｅｕ－５、Ｇｌｕ－８、Ａｌａ－１１、Ｔｒｐ－１２、およびＡｓｐ－１５を含む、項目８０に記載のペプチド。
(項目８２)
配列番号３７の相互作用しない面における０～６個のアミノ酸が、アラニン、Ｄ－アラニン、α－アミノイソ酪酸、Ｎ－メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている、項目７０から８１のいずれか一項に記載のペプチド。
(項目８３)
配列番号３７のアミノ酸Ｌｅｕ－２、Ｓｅｒ－３、Ａｌａ－６、Ｇｌｎ－７、Ａｒｇ－９、Ｌｙｓ－１０、Ａｒｇ－１３、およびＬｙｓ－１４の１つまたは複数が、アルファ－メチル化またはアルファ－エチル化された天然アミノ酸で置換されている、項目７０から８２のいずれか一項に記載のペプチド。
(項目８４)
配列番号３７のアミノ酸Ｌｅｕ－２、Ｓｅｒ－３、Ａｌａ－６、Ｇｌｎ－７、Ａｒｇ－９、Ｌｙｓ－１０、Ａｒｇ－１３、およびＬｙｓ－１４の１つまたは複数が、Ｌ－アラニン、Ｄ－アラニン、α－アミノイソ酪酸、Ｎ－メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている、項目７０から８２のいずれか一項に記載のペプチド。
(項目８５)
配列番号３７のアミノ酸Ａｌａ－１、Ａｒｇ－４、Ｌｅｕ－５、Ｇｌｕ－８、Ａｌａ－１１、Ｔｒｐ－１２、およびＡｓｐ－１５の１つまたは複数が、アルファ－メチル化またはアルファ－エチル化された天然アミノ酸で置換されている、項目７０から８４のいずれか一項に記載のペプチド。
(項目８６)
配列番号３７のアミノ酸Ａｌａ－１、Ａｒｇ－４、Ｌｅｕ－５、Ｇｌｕ－８、Ａｌａ－１１、Ｔｒｐ－１２、およびＡｓｐ－１５の１つまたは複数が、Ｌ－アラニン、Ｄ－アラニン、α－アミノイソ酪酸、Ｎ－メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている、項目７０から８４のいずれか一項に記載のペプチド。
(項目８７)
配列番号３７の０～５個のアミノ酸が、Ｃ末端から除去されているか、または除去されて、アラニン、Ｄ－アラニン、α－アミノイソ酪酸、Ｎ－メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群からの１～６個のアミノ酸で置き換えられている、項目７０から８６のいずれか一項に記載のペプチド。
(項目８８)
（ｉ）前記ペプチドの全体的な疎水性が、配列番号３７のペプチドと比較して低下しているか；（ｉｉ）前記ペプチドの全体的な正荷電が、配列番号３７のペプチドと比較して低下しているか；または（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の組合せである、項目７０から８７のいずれか一項に記載のペプチド。
(項目８９)
配列番号３８に示される配列の修飾されたアミノ酸配列を含むペプチドであって、配列番号３８の１個または複数のアミノ酸が、別のアミノ酸で置換されており、前記修飾されたアミノ酸配列が、少なくとも１個のペプチド構造を安定化させる修飾を含み、前記ペプチドが、ユビキチン活性化酵素６（ＵＢＡ６）に結合し、それを阻害する、ペプチド。
(項目９０)
前記ペプチド構造を安定化させる修飾が、配列番号３８の配列の少なくとも２個のアミノ酸の、非天然アミノ酸による置換を含み、前記非天然アミノ酸が、オレフィン側鎖を含む、項目８９に記載のペプチド。
(項目９１)
前記ペプチド構造を安定化させる修飾が、炭化水素ステープル／ステッチ、ラクタムステープル／ステッチ；ＵＶ環化付加ステープル／ステッチ；オキシムステープル／ステッチ；チオエーテルステープル／ステッチ；ダブルクリックステープル／ステッチ；ビス－ラクタムステープル／ステッチ；ビス－アリール化ステープル／ステッチ；またはこれらのいずれか２つもしくはそれより多くの組合せである、項目８９に記載のペプチド。
(項目９２)
前記ペプチド構造を安定化させる修飾が、ステッチである、項目８９に記載のペプチド。
(項目９３)
前記ペプチド構造を安定化させる修飾が、ステープルである、項目８９に記載のペプチド。
(項目９４)
前記ステープルが、前記アミノ酸配列における２個の位置の１個または複数に存在し、前記２個の位置が、ｉおよびｉ＋３、ｉおよびｉ＋４、またはｉおよびｉ＋７である、項目９３に記載のペプチド。
(項目９５)
前記ステープルが、前記２個の位置のそれぞれにおいてアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換のそれぞれが、非天然アミノによる置換であり、前記非天然アミノ酸が、オレフィン側鎖を含む、項目９３または９４に記載のペプチド。
(項目９６)
オレフィン側鎖を含む前記非天然アミノ酸が、Ｓ－ペンテニルアラニン、Ｒ－オクテニルアラニン；Ｒ－プロペニルアラニン、Ｓ－ペンテニルアラニン；Ｒ－ペンテニルアラニン、Ｓ－ペンテニルアラニン；Ｂｉｓ－ペンテニルグリシン、Ｓ－ペンテニルアラニン、Ｒ－オクテニルアラニン；ならびにＢｉｓ－ペンテニルグリシン、Ｓ－オクテニルアラニン、およびＲ－オクテニルアラニンからなる群から選択される、項目９０または９５に記載のペプチド。
(項目９７)
前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号３８のＭｅｔ－１、Ａｌａ－２、Ａｌａ－３、Ｓｅｒ－４、Ｌｅｕ－６、Ａｓｎ－９、Ｌｅｕ－１０、Ａｒｇ－１２、Ｌｅｕ－１３、Ｓｅｒ－１５、Ａｒｇ－１６、およびＣｙｓ－１７からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、２、３、４、または５個のアミノ酸置換を含む、項目８９から９６のいずれか一項に記載のペプチド。
(項目９８)
前記修飾されたアミノ酸配列が、配列番号３８のＡｒｇ－５、Ｇｌｕ－７、Ｌｅｕ－８、Ｖａｌ－１１、およびＬｅｕ－１４からなる群から選択されるアミノ酸位置に、０、１、または２個の保存的アミノ酸置換を含む、項目８９から９７のいずれか一項に記載のペプチド。
(項目９９)
別のアミノ酸で置換された前記１個または複数のアミノ酸が、配列番号３８のＥ１と相互作用しない面に存在する、項目８９から９８のいずれか一項に記載のペプチド。
(項目１００)
配列番号３８の相互作用しない面が、配列番号３８のアミノ酸Ｍｅｔ－１、Ａｌａ－２、Ａｌａ－３、Ｓｅｒ－４、Ｌｅｕ－６、Ａｓｎ－９、Ｌｅｕ－１０、Ａｒｇ－１２、Ｌｅｕ－１３、Ｓｅｒ－１５、Ａｒｇ－１６、およびＣｙｓ－１７を含む、項目９９に記載のペプチド。
(項目１０１)
配列番号３８の相互作用しない面における０～６個のアミノ酸が、アラニン、Ｄ－アラニン、α－アミノイソ酪酸、Ｎ－メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている、項目８９から１００のいずれか一項に記載のペプチド。
(項目１０２)
配列番号３８のアミノ酸Ａｒｇ－５、Ｇｌｕ－７、Ｌｅｕ－８、Ｖａｌ－１１、およびＬｅｕ－１４の１つまたは複数が、アルファ－メチル化またはアルファ－エチル化された天然アミノ酸で置換されている、項目８９から１０１のいずれか一項に記載のペプチド。
(項目１０３)
配列番号３８のアミノ酸Ａｒｇ－５、Ｇｌｕ－７、Ｌｅｕ－８、Ｖａｌ－１１、およびＬｅｕ－１４の１つまたは複数が、Ｌ－アラニン、Ｄ－アラニン、α－アミノイソ酪酸、Ｎ－メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている、項目８９から１０１のいずれか一項に記載のペプチド。
(項目１０４)
配列番号３８のアミノ酸Ｍｅｔ－１、Ａｌａ－２、Ａｌａ－３、Ｓｅｒ－４、Ｌｅｕ－６、Ａｓｎ－９、Ｌｅｕ－１０、Ａｒｇ－１２、Ｌｅｕ－１３、Ｓｅｒ－１５、Ａｒｇ－１６、およびＣｙｓ－１７の１つまたは複数が、アルファ－メチル化またはアルファ－エチル化された天然アミノ酸で置換されている、項目８９から１０３のいずれか一項に記載のペプチド。
(項目１０５)
配列番号３８のアミノ酸Ｍｅｔ－１、Ａｌａ－２、Ａｌａ－３、Ｓｅｒ－４、Ｌｅｕ－６、Ａｓｎ－９、Ｌｅｕ－１０、Ａｒｇ－１２、Ｌｅｕ－１３、Ｓｅｒ－１５、Ａｒｇ－１６、およびＣｙｓ－１７の１つまたは複数が、Ｌ－アラニン、Ｄ－アラニン、α－アミノイソ酪酸、Ｎ－メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている、項目８９から１０３のいずれか一項に記載のペプチド。
(項目１０６)
配列番号３８の０～５個のアミノ酸が、Ｃ末端から除去されているか、または除去されて、アラニン、Ｄ－アラニン、α－アミノイソ酪酸、Ｎ－メチルグリシン、セリン、置換されたアラニン、およびグリシン誘導体からなる群からの１～６個のアミノ酸で置き換えられている、項目８９から１０５のいずれか一項に記載のペプチド。
(項目１０７)
（ｉ）前記ペプチドの全体的な疎水性が、配列番号３８のペプチドと比較して低下しているか；（ｉｉ）前記ペプチドの全体的な正荷電が、配列番号３８のペプチドと比較して低下しているか；または（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の組合せである、項目８９から１０６のいずれか一項に記載のペプチド。
(項目１０８)
求電子性弾頭部を含む、項目１９から５０のいずれか一項に記載のペプチドの誘導体。
(項目１０９)
前記求電子性弾頭部が、アミノ酸位置Ａ _７、Ａ _８、またはＡ _１１に存在する、項目１０８に記載のペプチド誘導体。
(項目１１０)
前記求電子性弾頭部が、前記ペプチドのＮ末端に存在する、項目１０８に記載のペプチド誘導体。
(項目１１１)
前記求電子性弾頭部が、前記ペプチドのＮ末端に存在しない、項目１０８に記載のペプチド誘導体。
(項目１１２)
前記求電子性弾頭部が、求電子性基を有する非天然アミノ酸である、項目１０８から１１１のいずれか一項に記載のペプチド誘導体。
(項目１１３)
求電子性基を有する前記非天然アミノ酸が、ポリペプチド骨格に連結した求電子性アクリルアミドまたは置換されたアクリルアミドを有する、項目１１２に記載のペプチド誘導体。
(項目１１４)
求電子性基を有する前記非天然アミノ酸が、（Ｓ）－１－アクリロイルピロリジン－３－カルボキサミド；１－アクリロピぺリジン－４－カルボキサミド、（Ｒ）－１アクリロイルピぺリジン－３－カルボキサミド；（Ｓ）－１－アクリロイルピぺリジン－３－カルボキサミド；（Ｓ）－１－アクリロイルピロリジン－２－カルボキサミド；（Ｒ）－１－アクリロイルピロリジン－２－カルボキサミド；（Ｅ）－４－（ジメチルアミノ）ブタ－２－エナミド；アクリルアミド；アジリジン、ジアジリジン、アゼチジン、ピロリジン、イミダゾリジン、ピラゾリジン、オキサゾリジン、イソキサゾリジン、チアゾリジン、イソチアゾリジン、ピぺリジン、ピペラジン、モルホリン、チオモルホリン、アゼパネアジリン、ジアジリン、アゼト、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、チアゾール、イソチアゾール、ピリジン、ジアジン、オキサジン、チアジン、アゼピンフェニル（アニリン）；ナフタレン、アントラセン、フェナントレン、インドール、イソインドール、インドリジン、キノロン、イソキノリン、キノキサリン、フタルジン、キナゾリン、プリン、カルバゾール、インダゾール、ベンズイミダゾール、アザインドール、α－シアノアクリルアミド、プロピオルアミド、ｔｒａｎｓ４－ジメチルアミノ－２－ブテンアミド、ｔｒａｎｓ４－ピペリジニル－２－ブテンアミド、置換アクリルアミド、およびビニル－スルホンアミドからなる群から選択される、項目１１３に記載のペプチド誘導体。
(項目１１５)
前記求電子性弾頭部が、末端がブロモアセチルであるジアミノブタン酸または末端がアクリルアミドであるジアミノブタン酸である、項目１１２に記載のペプチド誘導体。
(項目１１６)
前記求電子性弾頭部が、システイン反応性Ｄ－ニペコチン酸部分である、項目１１２に記載のペプチド誘導体。
(項目１１７)
前記求電子性弾頭部が、システイン反応性部分である、項目１１２に記載のペプチド誘導体。
(項目１１８)
配列番号３９２、４２８、４６４、５００、６８０、７１６、７５２、および７８８のいずれか１つに示される配列を含む、項目１０８に記載のペプチド誘導体。
(項目１１９)
配列番号６８０に示される配列を含む、項目１０８に記載のペプチド誘導体。
(項目１２０)
配列番号７５２に示される配列を含む、項目１０８に記載のペプチド誘導体。
(項目１２１)
配列番号３９３、４２９、４６５、５０１、６８１、７１７、７５３、および７８９のいずれか１つに示される配列を含む、項目１０８に記載のペプチド誘導体。
(項目１２２)
配列番号３６７、４０３、４３９、６５５、７２７、および７５７のいずれか１つに示される配列を含む、項目１０８に記載のペプチド誘導体。
(項目１２３)
配列番号７２７に示される配列を含む、項目１０８に記載のペプチド誘導体。
(項目１２４)
配列番号８３３～８３６および８４１～８４４のいずれか１つに示される配列を含む、項目１０８に記載のペプチド誘導体。
(項目１２５)
配列番号８４１に示される配列を含む、項目１０８に記載のペプチド誘導体。
(項目１２６)
配列番号８４２に示される配列を含む、項目１０８に記載のペプチド誘導体。
(項目１２７)
配列番号８４４に示される配列を含む、項目１０８に記載のペプチド誘導体。
(項目１２８)
ＵＢＡ１に共有結合により結合する、項目１０８から１２７のいずれか一項に記載のペプチド誘導体。
(項目１２９)
項目１９から１０７のいずれか一項に記載のペプチドまたは項目１０８から１２８のいずれか一項に記載の誘導体ペプチド、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
(項目１３０)
それを必要とするヒト対象において、Ｅ１を発現する疾患またはＥ１に依存する疾患を処置する方法であって、前記ヒト対象に、項目１９から１０７のいずれか一項に記載のペプチド、項目１０８から１２８のいずれか一項に記載の誘導体ペプチド、または項目１２９に記載の医薬組成物の治療有効量を投与するステップを含む、方法。
(項目１３１)
前記Ｅ１を発現する疾患またはＥ１に依存する疾患が、がんである、項目１３０に記載の方法。
(項目１３２)
前記Ｅ１を発現する疾患またはＥ１に依存する疾患が、血液悪性腫瘍、固形腫瘍、抗体媒介性移植拒絶、自己免疫障害、または炎症性障害である、項目１３０に記載の方法。
(項目１３３)
構造的に安定化されたペプチドを作製する方法であって、
（ａ）項目１９から１０７のいずれか一項に記載のペプチドまたは項目１０８から１２８のいずれか一項に記載の誘導体ペプチドを得るステップと、
（ｂ）前記ペプチドまたは前記ペプチド誘導体を架橋させるステップであって、必要に応じて、前記架橋が、ＲＣＭ反応によるものである、ステップと
を含む、方法。
(項目１３４)
前記架橋したペプチドを医薬組成物として製剤化するステップをさらに含む、項目１３３に記載の方法。
(項目１３５)
式：

を有する、内部で架橋した配列のアミノ酸配列を含む化合物、
または薬学的に許容されるその塩であって、
式中、
各Ｒ _１およびＲ _２は、独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアリールアルキルまたはヘテロシクリルアルキルであり、そのいずれかは、置換されているかまたは置換されておらず、
各Ｒ _３は、独立して、アルキレン、アルケニレンまたはアルキニレンであり、そのいずれかは、置換されているかまたは置換されておらず、
各ｘは、独立して、２、３、または６であり、
各ｗおよびｙは、独立して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０であり、
ｚは、１または２であり、
各Ｘａａは、独立して、アミノ酸であり、
前記架橋したアミノ酸配列が、配列番号４、６、または１０の配列と比較して、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸置換および０、１、２、４、または５個のアミノ酸の欠失を有し、
前記アミノ酸置換の少なくとも２個が、オレフィン側鎖を含む（ciomprising）非天然
アミノ酸への置換であり、前記置換されたアミノ酸が、配列番号４、６、または１０において、２、３、または６アミノ酸離れており、
前記架橋したアミノ酸配列が、アルファヘリックス立体構造を有し、
前記化合物がＥ１－Ｅ２相互作用を阻害し、および／または、用量依存的に、Ｅ２へのＥ１０媒介性チオエステル転移を阻害し、
必要に応じて、少なくとも１つのアミノ酸配列が、ヒトＥ１内のシステイン残基と共有結合を形成することができる反応性基で置換されており、必要に応じて、前記反応性基が、Ｎ末端に求電子性基または求電子性化学的キャップを有する非天然アミノ酸である、化合物または薬学的に許容されるその塩。
(項目１３６)
前記欠失が、Ｎ末端および／またはＣ末端に存在する、項目１３５に記載の化合物または薬学的に許容されるその塩。
(項目１３７)
前記アミノ酸置換が、Ｅ１との相互作用に関与しない配列番号４、６、または１０における位置を含む、項目１３５または１３６に記載の化合物または薬学的に許容されるその塩。
(項目１３８)
前記架橋したアミノ酸配列が、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸置換を有する配列番号１３２、１３３、１０７、６８０、７２７、７５２、８４１、８４２、または８４４のいずれか１つの配列を有し、これらのペプチドにおけるオレフィン側鎖を含む前記非天然アミノ酸を有する位置が、置換されていない、項目１３５に記載の化合物または薬学的に許容されるその塩。
(項目１３９)
前記Ｅ１と直接相互作用することが予測されるアミノ酸が、置換されていないか、またはアラニンもしくは保存的アミノ酸で置換されている、項目１３８に記載の化合物または薬学的に許容されるその塩。
(項目１４０)
前記Ｅ１と直接相互作用しないことが予測されるアミノ酸が、置換されている、項目１３８または１３９に記載の化合物または薬学的に許容されるその塩。
(項目１４１)
前記薬学的に許容される塩が、酢酸塩、硫酸塩、または塩化物である、項目１３５から１４０のいずれか一項に記載の化合物または薬学的に許容されるその塩。

Claims

配列番号１３２のアミノ酸配列に対して０～１個のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むペプチドまたは薬学的に許容されるその塩であって、ここで、前記アミノ酸置換は、存在する場合、配列番号１３２のアミノ酸配列の５、７、９、１２、１３、１５、または１６位にはなく、さらに
（ｉ）配列番号１３２のアミノ酸配列の１０位に存在する場合、前記アミノ酸置換は、配列番号１３２の１０位のアミノ酸の、メチオニン、もしくは求電子性基を有する非天然アミノ酸での置換を含み、前記求電子性基は、アクリルアミドもしくは置換されたアクリルアミドを含むか、
（ｉｉ）配列番号１３２のアミノ酸配列の１４位に存在する場合、前記アミノ酸置換は、配列番号１３２の１４位のアミノ酸の、求電子性基を有する非天然アミノ酸での置換を含み、前記求電子性基は、アクリルアミドもしくは置換されたアクリルアミドを含むか、または
（ｉｉｉ）存在する場合、前記アミノ酸置換は、配列番号１３２のアミノ酸配列の１、２、３、４、６、８、１１、１４もしくは１７位のアラニン、または６もしくは８位のグルタミン酸であり、
ここで、前記ペプチドまたは前記薬学的に許容されるその塩は、ヒトＥ２へのヒトＥ１媒介性チオエステル転移を阻害し、ここで、配列番号１３２のアミノ酸配列の５位および１２位は、内部で架橋し、そして、ここで、前記ペプチドまたは前記薬学的に許容されるその塩は、１７～２５アミノ酸長である、ペプチドまたは薬学的に許容されるその塩。
配列番号１３２のアミノ酸配列の５位がＳ－ペンテニルアラニンであり、配列番号１３２のアミノ酸配列の１２位がＲ－オクテニルアラニンであるか、または配列番号１３２のアミノ酸配列の５位がＲ－オクテニルアラニンであり、配列番号１３２のアミノ酸配列の１２位がＳ－ペンテニルアラニンである、請求項１に記載のペプチドまたは薬学的に許容されるその塩。
前記ペプチドまたは前記薬学的に許容されるその塩が、配列番号１３２のアミノ酸配列の１、２、３、４、６、８、１１、１４、もしくは１７位におけるアラニン、または、６もしくは８位におけるグルタミン酸の１個のアミノ酸置換を有する配列番号１３２のアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載のペプチドまたは薬学的に許容されるその塩。
前記ペプチドまたは前記薬学的に許容されるその塩が、１個のアミノ酸置換を有する配列番号１３２のアミノ酸配列を含み、前記１個のアミノ酸置換は、配列番号１３２のアミノ酸配列の６または８位に置換を含む、請求項１または２に記載のペプチドまたは薬学的に許容されるその塩。
１７アミノ酸長である、請求項１から４のいずれか一項に記載のペプチドまたは薬学的に許容されるその塩。
配列番号１３２のアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載のペプチドまたは薬学的に許容されるその塩。
配列番号１３２のアミノ酸配列からなる、請求項１または２に記載のペプチドまたは薬学的に許容されるその塩。
求電子性基を有する非天然アミノ酸を含み、前記求電子性基は、アクリルアミドまたは置換されたアクリルアミドを含む、請求項１に記載のペプチドまたは薬学的に許容されるその塩。
求電子性基を有する前記非天然アミノ酸が、末端がアクリルアミドであるジアミノブタン酸を含む、請求項１または８に記載のペプチドまたは薬学的に許容されるその塩。
配列番号６８０に示される配列を含む、請求項８に記載のペプチドまたは薬学的に許容されるその塩。
配列番号７５２に示される配列を含む、請求項８に記載のペプチドまたは薬学的に許容されるその塩。
前記薬学的に許容されるその塩が、酢酸塩、硫酸塩、または塩酸塩である、請求項１から１１のいずれか一項に記載のペプチドまたは薬学的に許容されるその塩。
請求項１から１２のいずれか一項に記載のペプチドまたは薬学的に許容されるその塩、および、薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
Ｅ１を発現する疾患またはＥ１に依存する疾患の処置を必要とするヒト対象における、Ｅ１を発現する疾患またはＥ１に依存する疾患の処置における使用のための、請求項１～１２のいずれか一項に記載のペプチドもしくは薬学的に許容されるその塩を含む組成物または請求項１３に記載の医薬組成物であって、前記組成物が前記ヒト対象に投与されることを特徴とする、組成物または医薬組成物。
前記Ｅ１を発現する疾患またはＥ１に依存する疾患が、がん、血液悪性腫瘍、固形腫瘍、抗体媒介性移植拒絶、自己免疫障害、または炎症性障害である、請求項１４に記載の組成物または医薬組成物。
構造的に安定化されたペプチドを作製する方法であって、
（ａ）請求項１～１２のいずれか一項に記載のペプチドの非架橋形態を得るステップと、
（ｂ）前記ペプチドを架橋させるステップと
を含む、
方法。
前記架橋が、閉環メタセシス（ＲＣＭ）反応によるものである、請求項１６に記載の方法。
前記方法が前記架橋したペプチドを医薬組成物として製剤化するステップをさらに含む、請求項１６に記載の方法。