JP7714465B2

JP7714465B2 - 弱毒化サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）を使用する良性神経系腫瘍の処置

Info

Publication number: JP7714465B2
Application number: JP2021550170A
Authority: JP
Inventors: ジェイ．ブレナー，ギャリー; アハメド，シェリフ
Original assignee: ザジェネラルホスピタルコーポレイション
Priority date: 2019-02-27
Filing date: 2020-02-27
Publication date: 2025-07-29
Anticipated expiration: 2040-02-27
Also published as: CA3131699A1; JP2025165969A; US20220125906A1; EP3930745A1; EP3930745A4; CN113766927A; WO2020176764A1; JP2022522350A

Description

優先権の主張
本出願は、２０１９年２月２７日出願の米国特許出願第６２／８１１，０６６号の利益を主張する。前述の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

本明細書で提供されるのは、弱毒化サルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）および任意選択で１つまたは複数のチェックポイント阻害剤を使用する、神経鞘腫を含む良性神経系腫瘍の処置のための組成物および方法である。

神経鞘腫は、シュワン系列細胞^１、２に由来する増殖の遅い良性腫瘍である。場所およびサイズに応じて、これらの腫瘍は、難聴、不均衡、耳鳴り、運動障害、および重度の疼痛を含む、さまざまな機能獲得および機能喪失の神経学的欠損を引き起こす可能性があり^３、４、場合によっては、脳幹の圧迫により死に至る可能性がある^５。神経鞘腫は散発的に発生する場合があり（したがって、「散発性神経鞘腫」と称される）、または衰弱性遺伝的症候群の一部である神経線維腫症２型（ＮＦ２）およびシュワノマトーシスとして発生する場合がある^６。神経鞘腫の処置は、主に手術による切除および疼痛の対症的管理に限定されている。多くの患者にとって治癒的ではない切除は、多くの場合、追加の神経学的損傷を伴い、場所によりまたは腫瘍の数が多いために非現実的な場合がある^７。これらの良性病変の複製が遅いという性質のため、抗がん治療薬は神経鞘腫に対する有効性を実証していない^{８、９、１０}。ベバシズマブは現在、神経鞘腫に対して一般的に受け入れられている唯一の薬物療法であり、ベバシズマブは、これらの新生物のサブセットの高度に血管新生化された性質を標的とすることにより、腫瘍増殖を一時的に安定化させる^{８、９、１１}。残念ながら、疼痛管理のための現在の戦略は多くの場合に不適切であり、したがって疾患の負担がさらに増大している。神経鞘腫が複数の場所に現れ、生涯を通じて新しい病変が発生するという事実により、処置はさらに複雑になっている。したがって、神経鞘腫およびそれに関連する疾患によって、現在の処置選択肢では安定に制御することができない生涯にわたる苦痛がもたらされる。

神経鞘腫は、身体全体にわたって、例えば脊髄に沿って、頭蓋内に発生する、増殖の遅い良性新生物である。神経鞘腫は、多くの場合小児期または青年期に最初に現れ、生涯を通じて新しい腫瘍が発生する。これらの腫瘍は、末梢神経、脊髄、および／または脳の圧迫により、疼痛、感覚／運動機能不全、および死を引き起こす。治療選択肢の不足と相まって、神経鞘腫に関連する大きな苦痛および衰弱により、それらの処置が、主要なアンメットメディカルニーズとなっている。本明細書に記載されているのは、弱毒化サルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）（Ｓ．チフィムリウム（S. typhimurium））の腫瘍内（ｉ．ｔ．）注射を伴う神経鞘腫を含む良性新生物に対する治療アプローチである。現在の結果は、ヌードマウスにおける異種移植ヒトＮＦ２神経鞘腫モデルと免疫適格動物における同種移植遺伝子マウス－神経鞘腫モデルの両方で腫瘍増殖を制御する、このｉ．ｔ．Ｓ．チフィムリウム（S. typhimurium）の能力を示している。同種移植モデルにおける神経鞘腫の増殖制御は、腫瘍細胞のアポトーシス、腫瘍の血管新生の減少、および抗腫瘍適応免疫応答の誘導と関連していた。ｉ．ｔ．Ｓ．チフィムリウム（S. typhimurium）注射により、細菌注射腫瘍だけでなく、同時に発生する遠位神経鞘腫もまた、腫瘍制御された。さらに、ｉ．ｔ．Ｓ．チフィムリウム（S. typhimurium）によって、一次処置の１３日後に原発腫瘍の対側に移植された再チャレンジ神経鞘腫の増殖が制御された。同種移植神経鞘腫モデルでは、プログラム細胞死１受容体（ＰＤ－１）チェックポイント阻害剤の全身適用により、ｉ．ｔ．Ｓ．チフィムリウム（S. typhimurium）と同程度に腫瘍増殖が制御され、２つの治療法の組合せによって、細菌を注射したところの増殖制御に相加効果がもたらされ、Ｔ細胞サブセット集団に相乗効果がもたらされた。

現在のデータは、ｉ．ｔ．弱毒化Ｓ．チフィムリウム（S. typhimurium）を介した療法を、任意選択でＰＤ－１チェックポイント阻害と組み合わせて、細菌注射および非注射の、神経鞘腫を含む良性神経系腫瘍、ならびにＮＦ１関連腫瘍および髄膜腫を含む神経鞘腫関連新生物の増殖を制御することができる免疫療法として支持する。提示されたデータはさらに、初期処置後に発生する腫瘍の増殖を制御するための治療戦略の可能性を示唆している。重要なことに、弱毒化サルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）を腫瘍に直接注射すると、抗腫瘍適応免疫応答を誘導するワクチン様の作用があった。これらの結果は、良性新生物への細菌腫瘍療法の最初に報告された適用と、神経鞘腫免疫療法の最初の実証の両方を表している。

したがって、本明細書で提供されるのは、良性神経系腫瘍を有するかまたは有するリスクのある対象を処置するための方法である。方法は、任意選択で免疫チェックポイント阻害剤および／または血管新生阻害剤と組み合わせた、生弱毒化サルモネラ（Salmonella）細菌を含む治療有効量の組成物を対象に投与することを含む。良性神経系腫瘍を有するかまたは有するリスクのある対象を処置する方法における使用のための、任意選択でチェックポイント阻害剤および／または血管新生阻害剤と組み合わせた、生弱毒化サルモネラ（Salmonella）細菌を含む組成物も、本明細書で提供される。

いくつかの実施形態では、対象は、神経線維腫症１（ＮＦ１）；神経線維腫症２（ＮＦ２）；シュワノマトーシス；髄膜腫；神経鞘腫；前庭神経鞘腫；散発性神経鞘腫；神経線維腫；神経線維腫症（ＮＦ）；もしくはそれらの任意の組合せからなる群から選択される良性腫瘍または腫瘍関連状態を有するかまたは有すると診断された対象である。いくつかの実施形態では、対象は、悪性固形腫瘍を有していない（すなわち、悪性固形腫瘍と診断されていない）。いくつかの実施形態では、対象は、良性神経系腫瘍のリスクの増加に関連する状態、例えば、神経線維腫症１（ＮＦ１）；神経線維腫症２（ＮＦ２）；またはシュワノマトーシスを有する。

いくつかの実施形態では、弱毒化サルモネラ（Salmonella）は、腫瘍内または静脈内に投与される。

いくつかの実施形態では、弱毒化サルモネラ（Salmonella）は、Ｓ．チフィムリウム（S. typhimurium）の弱毒化菌株、例えば、修飾リピドＡ（ｍｓｂＢ－）およびプリン栄養要求性突然変異（ｐｕｒＩ－）を伴う、サルモネラ・エンテリカ血清型チフィムリウム（Salmonella enterica serovar typhimurium）菌株ＶＮＰ２０００９である。

いくつかの実施形態では、組成物は、クロストリジウム・ノビー（Clostridium novyi）を含まない。

いくつかの実施形態では、弱毒化サルモネラ（Salmonella）は、細胞内誘導性サルモネラ（Salmonella）プロモーターに作動可能に連結された溶菌遺伝子またはカセットを含まない。

いくつかの実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１またはＣＴＬＡ－４シグナル伝達の阻害剤、例えば、ＰＤ－１、ＣＤ４０、ＰＤ－Ｌ１、またはＣＴＬＡ－４に結合する抗体である。

いくつかの実施形態では、血管新生阻害剤は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）またはその受容体（ＶＥＧＦＲ）の阻害剤、例えば、ベバシズマブである。

さらに、本明細書で提供されるのは、哺乳動物における良性神経鞘腫瘍を処置する方法であって、前記哺乳動物に、病原性腸内細菌の弱毒化菌株の治療有効用量または力価を投与することを含む、方法である。いくつかの実施形態では、病原性腸内細菌の弱毒化菌株は、サルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）である。いくつかの実施形態では、サルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）の弱毒化菌株は、ｐｕｒｌおよびｍｓｂＢ遺伝子欠失を有し、前記菌株は、ＶＮＰ２０００９と名付けられている。いくつかの実施形態では、サルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）の弱毒化菌株は、グアノシン５’二リン酸－３’－二リン酸合成に欠失があり、前記菌株は８ｐｐＧｐｐと名付けられている。いくつかの実施形態では、投与は、静脈内注射または良性神経鞘腫瘍への直接注射によるものを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、神経鞘腫瘍は、神経線維腫または神経鞘腫を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、腫瘍は、神経線維腫症１型、神経線維腫症２型、シュワノマトーシス、または散発性神経鞘腫に関連するものを含むが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、方法は、治療有効用量の病原性腸内細菌の弱毒化菌株およびチェックポイント阻害剤を、前記哺乳動物に投与することを含む。いくつかの実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ペプチド、抗体、小分子、マイクロＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、または小分子干渉ＲＮＡを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、チェックポイント阻害剤は、抗原のエピトープに結合するモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体結合エピトープは、ＰＤ－１またはＣＴＬＡ－４抗原にある。

いくつかの実施形態では、哺乳動物はヒトである。

薬学的に許容される担体中の病原性腸内細菌の弱毒化菌株、および任意選択でチェックポイント阻害剤で構成される医薬組成物も、本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、病原性腸内細菌の弱毒化菌株は、サルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）である。

いくつかの実施形態では、チェックポイント阻害剤は、モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は、ＰＤ－１またはＣＴＬＡ－４抗原のエピトープに結合する。

他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本発明で使用するための方法および材料が本明細書に記載されており；当技術分野で知られている他の好適な方法および材料も使用することができる。材料、方法、および例は例示にすぎず、限定することを意図したものではない。本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリー、および他の参考文献は、それらの全体が参照により組み込まれる。抵触する場合には、定義を含めて、本明細書が優先する。

本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および図、ならびに特許請求の範囲から明らかになるであろう。

弱毒化Ｓ．チフィムリウム（S. typhimurium）の腫瘍内注射によって、ヒトＨＥＩ－１９３異種移植神経鞘腫モデルおよびマウス０８０３１－９同種移植神経鞘腫モデルにおける神経鞘腫の発症が制御される。Ａ）腫瘍細胞移植後２週目のｉ．ｔ．注射の後、ＶＮＰ２０００９およびΔｐｐＧｐｐによって、有意な腫瘍退縮がもたらされた（ｎ＝８マウス／群）。Ｂ）腫瘍細胞移植の１週間後、ΔｐｐＧｐｐではなくＶＮＰ２０００９の注射によって、増殖制御がもたらされた（ｎ＝８マウス／群）。ｉ．ｔ．ＶＮＰ２０００９およびΔｐｐＧｐｐ注射によって、ＰＢＳ注射対照と比較してＨＥＩ－１９３異種移植モデル（Ｃ）および０８０３１－９同種移植モデル（Ｄ）の両方でアポトーシスが増加した（ｎ＝３マウス／群、黄色の矢印は代表的なアポトーシス小体を示す）。反復測定ＡＮＯＶＡを使用して群間の腫瘍シグナルを比較し、一元配置ＡＮＯＶＡをアポトーシス小体分析に使用した。データを、平均±ＳＥＭとして示す。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１。^＊＊＊ｐ＜０．００１。坐骨神経内同種移植神経鞘腫のＳ．チフィムリウム（S. typhimurium）注射により、炎症誘発性サイトカインが増加し、免疫細胞浸潤が変化した。（Ａ）マウス同種移植神経鞘腫モデルのＳ．チフィムリウム（S. typhimurium）注射神経では、ＰＢＳ注射腫瘍と比較して免疫細胞浸潤の増加（ＣＤ４５＋共通白血球（common leukocytes）およびＣＤ６８＋汎マクロファージ）を示し、（黄色の矢じり）は陽性染色を示す（ｎ＝３マウス／群）。（Ｂ）ＣＤ４５＋細胞（左）およびＣＤ６８＋細胞（右）の定量化では、ＰＢＳ対照と比較して、ＶＮＰ２０００９およびΔｐｐＧｐｐ注射マウスの腫瘍における白血球およびマクロファージの有意な上昇を示した。（Ｃ）ＣＤ４５＋Ｆ４／８０＋サブセットとして同定された腫瘍関連マクロファージのフローサイトメトリー分析。ＣＤ８６発現を使用してＭ１マクロファージを同定し、一方では、ＣＤ２０６発現を使用してＭ２マクロファージを同定した。Ｍ１のＭ２に対する比（Ｍ１／Ｍ２）を、ＣＤ４５＋Ｆ４／８０＋におけるＭ１（ＣＤ６８＋）集団％をＣＤ４５＋Ｆ４／８０＋におけるＭ２（ＣＤ２０６＋）集団％で割ったものとして計算した。３日目（左）および７日目（右）におけるＴＡＭのＭ１／Ｍ２比。（Ｄ）注射腫瘍の適応免疫細胞浸潤を、細菌注射の７日後にフローサイトメトリーによって分析した。示されたパーセンテージは、ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４＋）、ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ８＋）、およびＣＤ２５＋Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋）を表す。フローサイトメトリープロファイルを図１０に示す。Ｓ．チフィムリウム（S. typhimurium）注射後３日目の腫瘍微小環境におけるサイトカインおよびインフラマソームの定量的ＲＴ－ＰＣＲ（Ｅ）およびＥＬＩＳＡ（Ｆ）。一元配置ＡＮＯＶＡを使用して、異なる処置間を比較した。データを、平均±ＳＥＭとして示す。Ｎ＝３／群。アスタリスク（^＊）は、ＰＢＳ対照と比較した差を示し；ハッシュ記号（^＃）は、ΔｐｐＧｐｐと比較した差を示す。^＊／^＃ｐ＜０．０５、^＊＊／^＃＃ｐ＜０．０１。^＊＊＊／^＃＃＃ｐ＜０．００１。ｉ．ｔ．ＶＮＰ２０００９注射によって、原発性処置および非注射遠位神経鞘腫の腫瘍増殖が阻害され、全身性抗ＰＤ－１ｍＡｂの添加によって原発腫瘍の死滅が増強される。Ａ）ＶＮＰ２０００９と抗ＰＤ－１ｍＡｂとの併用療法の実験プロトコル。Ｂ）０８０３１－９細胞を、ＦＶＢ／ｎマウス（ｎ＝６マウス／群）の両側腹部に皮下移植した。ＰＢＳと比較して、抗ＰＤ－１ｍＡｂまたはＶＮＰ２０００９の単剤療法を注射したマウス腫瘍において、有意な腫瘍退縮が観察された。併用療法によって、ＶＮＰ２０００９または抗ＰＤ－１ｍＡｂのいずれかの単剤療法よりも有意に、腫瘍が退縮した。Ｃ）注射された腫瘍部位を、研究の終了時に採取し、細胞傷害性ＣＤ８＋、ヘルパーＣＤ４＋および制御性ＣＤ２５＋Ｔ細胞（Ｎ＝３／群）についてフローサイトメトリーによって分析した。Ｄ）抗ＰＤ－１ｍＡｂにより、ＰＢＳと比較して非注射部位の腫瘍増殖が有意に減少したが、ＶＮＰ２０００９単剤療法とＶＮＰ２０００９／抗ＰＤ－１ｍＡｂの組合せにより、抗ＰＤ－１ｍＡｂまたはＰＢＳ処置群と比較して、非注射部位の腫瘍増殖制御が有意に増強した。Ｅ）非注射腫瘍部位を、移植後２６日目に採取し、細胞傷害性ＣＤ８＋、ヘルパーＣＤ４＋および制御性ＣＤ２５＋Ｔ細胞（Ｎ＝３／群）についてフローサイトメトリーによって分析した。フローサイトメトリープロファイルを図９に示す。反復測定ＡＮＯＶＡを利用して、異なる群間で腫瘍の体積および／またはシグナルを比較した。一元配置ＡＮＯＶＡを使用して、異なる群間でフローサイトメトリーデータを比較した。データを、平均±ＳＥＭとして示す。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１。ｉ．ｔ．ＶＮＰ２０００９注射によって、注射された後に移植された実験的神経鞘腫の腫瘍増殖が阻害され、全身性抗ＰＤ－１ｍＡｂの添加によって注射された腫瘍の死滅が増強された。Ａ）ＶＮＰ２０００９と抗ＰＤ－１ｍＡｂとの併用療法の実験プロトコル。Ｂ）０８０３１－９細胞を、ＦＶＢ／ｎマウス（ｎ＝６／群）の左側腹部に皮下移植した。ＰＢＳと比較して、抗ＰＤ－１ｍＡｂまたはＶＮＰ２０００９の単剤療法を注射したマウス腫瘍において、有意な腫瘍退縮が観察された。併用療法によって、ＶＮＰ２０００９または抗ＰＤ－１ｍＡｂのいずれかの単剤療法よりも有意に、腫瘍が退縮した。Ｃ）注射された腫瘍部位を、研究の終了時に採取し、細胞傷害性ＣＤ８＋、ヘルパーＣＤ４＋および制御性ＣＤ２５＋Ｔ細胞についてフローサイトメトリーによって分析した。Ｄ）ホタルルシフェラーゼを発現する０８０３１－９ＦＣ腫瘍細胞を、移植後２０日目に原発注射マウスの遠位坐骨神経に移植し（ｎ＝５／群）、腫瘍を生物発光によって監視した。Ｅ）二次腫瘍部位を、移植後１６日目に採取し、細胞傷害性ＣＤ８＋、ヘルパーＣＤ４＋および制御性ＣＤ２５＋Ｔ細胞についてフローサイトメトリーによって分析した。フローサイトメトリープロファイルを図１０に示す。反復測定ＡＮＯＶＡを、腫瘍体積および生物発光シグナルの分析に利用した。一元配置ＡＮＯＶＡを、フローサイトメトリーデータの分析に使用した。データを、平均±ＳＥＭとして示す。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１。腫瘍内Ｓ．チフィムリウム（S. typhimurium）注射により、坐骨神経内同種移植マウス神経鞘腫の血管新生が阻害される。細菌注射の２週間後に採取されたＶＮＰ２０００９およびΔｐｐＧｐｐ注射腫瘍は、ＣＤ３１＋染色によっても、直接視覚化によっても決定されるように、ＰＢＳ対照と比較して血管新生化の減少を示した。免疫組織化学は３つの腫瘍／群に基づいており、代表的な染色が示され、赤色の矢じりは内皮細胞が陽性であることを示している。ＣＤ３１＋細胞プロファイルを、Ｉｍａｇｅ－Ｊを使用して定量化し、一元配置ＡＮＯＶＡを、データ分析に使用した。データを、平均±ＳＥＭとして示す。^＊＊＊ｐ＜０．００１。ｉ．ｔ．Ｓ．チフィムリウム（S. typhimurium）注射により、異種移植ヒトＮＦ１、ヒト散発性ＭＰＮＳＴ、およびヒト髄膜腫皮下腫瘍の増殖が抑制される。ＶＮＰ２０００９またはΔｐｐＧｐｐいずれかの腫瘍内注射により、ＰＢＳ注射腫瘍と比較して、ＮＦ－１関連（Ｓ４６２ＴＹ、Ａ）の退縮および散発性（ＳＴＳ２６Ｔ、Ｂ）悪性末梢神経鞘腫瘍（ＭＰＮＳＴ）の増殖制御がもたらされた。同様に、ＶＮＰ２０００９またはΔｐｐＧｐｐのｉ．ｔ．注射により、ＰＢＳ注射腫瘍と比較して、良性Ｂｅｎ－Ｍｅｎ－１髄膜腫（Ｃ）の退縮および悪性髄膜腫ＣＨ－１５７（Ｄ）腫瘍増殖の増殖制御がもたらされた。矢印は細菌／ＰＢＳ注射の時期を示す。反復測定ＡＮＯＶＡを使用して群間の腫瘍サイズを比較した。Ｎ＝５マウス／群。データを、平均±ＳＥＭとして示す。^＊＊＊ｐ＜０．００１（ＰＢＳをいずれかのサルモネラ（Salmonella）菌株と比較した）。弱毒化Ｓ．チフィムリウム（S. typhimurium）（ＶＮＰ２０００９）の腫瘍内注射によって、ヒトＨＥＩ－１９３異種移植モデルおよびマウス０８０３１－９同種移植神経鞘腫モデルにおける神経鞘腫の発症が制御される。Ａ）ＶＮＰ２０００９によって、腫瘍細胞移植後２週間目の腫瘍内（ｉ．ｔ．）注射後に、異種移植神経鞘腫モデルにおいて有意な腫瘍退縮がもたらされた（ｎ＝８マウス／群）。Ｂ）腫瘍細胞移植の１週間後の同種移植神経鞘腫モデルへのＶＮＰ２０００９注射によって、増殖制御がもたらされた（ｎ＝８マウス／群）。反復測定ＡＮＯＶＡを使用して群間の腫瘍シグナルを比較した。データを、平均±ＳＥＭとして示す。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１。^＊＊＊ｐ＜０．００１。サルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）を注射した神経鞘腫を有する神経は、免疫細胞浸潤の増加した変化を示した。ヒト異種移植モデルのＳ．チフィムリウム（S. typhimurium）注射神経では、ＰＢＳ注射腫瘍と比較して免疫細胞浸潤の増加（ＣＤ４５＋共通白血球およびＣＤ６８＋汎マクロファージ）を示し、（黄色の矢印）は陽性染色を示す（ｎ＝３マウス／群）。Ｓ．チフィムリウム（S. typhimurium）またはＰＢＳを注射したマウスにおける脾臓マクロファージのフローサイトメトリー分析。細菌注射免疫適格神経鞘腫マウスでは、注射後３日目に、注射マウスの脾臓におけるマクロファージ集団の増加を示した。ＣＤ４５＋Ｆ４／８０＋マクロファージのフローサイトメトリー分析は、ＰＢＳ（１５．４％）と比較して、ＶＮＰ２０００９（３８．８％）、ΔｐｐＧｐｐ（３２．４％）を注射したマウスの脾臓における増加を示した。Ｓ．チフィムリウム（S. typhimurium）またはＰＢＳを注射したマウスの腫瘍における腫瘍浸潤免疫細胞のフローサイトメトリー分析を示すグラフである。細菌またはＰＢＳ注射後の３日目（Ａ）または７日目（Ｂ）に採取された腫瘍におけるＭ－１型マクロファージ（Ｆ４／８０＋ＣＤ８６＋）およびＭ－２型マクロファージ（Ｆ４／８０＋ＣＤ２０６＋）の分析。（Ｃ）処置マウスにおけるＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４＋）、ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ８＋）、およびＣＤ２５＋Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋）分析を、細菌株またはＰＢＳのいずれかの注射後７日目に実施した。ＶＮＰ２０００９、ＰＤ－１ｍＡｂ、ＶＮＰ２０００９／ＰＤ－１ｍＡｂまたはＰＢＳを注射したマウスの腫瘍における腫瘍浸潤免疫細胞のフローサイトメトリープロファイル。注射部位（Ａ）および非注射部位（Ｂ）の腫瘍へのＴリンパ球浸潤の分析。腫瘍を採取し、ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４＋）、ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ８＋）、およびＣＤ２５＋Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋）染色を、注射後２６日目に実施した。ＶＮＰ２０００９、ＰＤ－１ｍＡｂ、ＶＮＰ２０００９／ＰＤ－１ｍＡｂまたはＰＢＳを注射したマウスの腫瘍における腫瘍浸潤免疫細胞のフローサイトメトリープロファイル。注射部位（Ａ）および二次腫瘍部位（Ｂ）の腫瘍へのＴリンパ球浸潤の分析。腫瘍を採取し、ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４＋）、ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ８＋）、およびＣＤ２５＋Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋）染色を、原発腫瘍部位の移植後２０日目に、および二次腫瘍部位の移植後１６日目に実施した。培養マクロファージおよび神経鞘腫細胞株における弱毒化Ｓ．チフィムリウム（S. typhimurium）の侵襲性アッセイ。（Ａ）寒天プレート上に１６時間画線した後のＨＥＩ－１９３内在化サルモネラ（Salmonella）菌株の代表的な写真。（Ｂ）感染力の％としての侵襲性の定量化は、ＶＮＰ２０００９がΔｐｐＧｐｐよりも侵襲性が高いが、野生型Ｓ．チフィムリウム（S. typhimurium）よりも侵襲性が低いことを示した。マウスマクロファージ、ヒトＨＥＩ－１９３およびマウス０８０３１－９における野生型Ｓ．チフィムリウム（S. typhimurium）の得られた侵入効率は、それぞれおよそ１００％、９６％および５８％であった。ＶＮＰ２０００９およびΔｐｐＧｐｐの侵入効率は、野生型細菌と比較して著しく低かった。マウスマクロファージ、ヒトＨＥＩ－１９３およびマウス０８０３１－９におけるＶＮＰ２０００９の感染力パーセンテージは、それぞれおよそ３８％、２３％、および１５％であったが、ΔｐｐＧｐｐは、感染力パーセンテージがマウスマクロファージの場合は１８％、ＨＥＩ－１９３の場合は１０％、および０８０３１－９細胞の場合は５％で、より低い侵襲性を示していた。培養ヒト神経鞘腫（ＨＥＩ－１９３、Ａ）またはマウス神経鞘腫（０８０３１－９、Ｂ）細胞株をＳ．チフィムリウム（S. typhimurium）に曝露した後のサイトカインのＥＬＩＳＡ。ＶＮＰ２０００９またはΔｐｐＧｐｐとのインキュベーション後のＥＬＩＳＡによるＩＬ－１β、ＩＬ－１８、およびＴＮＦ－αの定量化では、ＰＢＳ処置細胞と比較して、放出されたサイトカインにおけるいずれの差も示さなかった。一元配置ＡＮＯＶＡを、群間の比較に使用した。Ｎ＝３回の独立した実験。データを、平均±ＳＥＭとして示す。培養ヒト（ＴＨＰ－１分化マクロファージ、Ａ）細胞株またはマウス（ＲＡＷ２６４．７マクロファージ、Ｂ）細胞株をＳ．チフィムリウム（S. typhimurium）に曝露した後のサイトカインのＥＬＩＳＡ。ＶＮＰ２０００９またはΔｐｐＧｐｐとのインキュベーション後のＥＬＩＳＡによるＩＬ－１β、ＩＬ－１８、およびＴＮＦ－αの定量化では、ＰＢＳ処置細胞と比較して、放出されたサイトカインに有意差が見られた。一元配置ＡＮＯＶＡを、群間の比較に使用した。データを、平均±ＳＥＭとして示す。Ｎ＝３回の独立した実験；^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１。Ｓ．チフィムリウム（S. typhimurium）は、同種移植免疫適格神経鞘腫マウスモデルの腫瘍に直接注射されたマウスの血清中にサイトカイン放出を誘導しなかった。注射マウスの血清中のサイトカインのＥＬＩＳＡを、細菌の３日後に測定した。一元配置ＡＮＯＶＡを、群間の比較に使用した。データを、平均±ＳＥＭとして示す。Ｎ＝３回の独立した実験。

グラム陰性生物を利用する細菌媒介がん治療（ＢＣＴ）は、１９世紀半ばにＷｉｌｌｉａｍＣｏｌｅｙが生化膿レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）を利用して固形腫瘍を処置したときに導入された^１２。細菌がん療法（bacterial cancer therapy）の理論的根拠は、グラム陰性細菌サルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）（Ｓ．チフィムリウム（S. typhimurium））^{１３～２１}を含むいくつかの細菌株が、血管新生腫瘍の低酸素領域に特異的に生息し、その領域内で増殖し、腫瘍細胞の直接溶解と、抗腫瘍免疫応答の確立の両方を誘導することである^２２。さらに、腫瘍への細菌注射は抗血管新生性であることが示されている^{２３，２４}。したがって、細菌は、がん細胞死を直接誘導することに加えて、高度に血管新生化された腫瘍を標的とし、新しい腫瘍の発生を予防する免疫制御を確立する免疫腫瘍学および抗血管新生剤として作用することができる。

免疫療法戦略としてＢＣＴを支持する前臨床および臨床データの実体があり^{２０、２５、３２、５７、５８}、４０年間、マイコバクテリウム・ボビス（Mycobacterium bovis）の生弱毒化菌株の膀胱内適用は、インサイチュにおける膀胱癌の唯一のＦＤＡ承認処置であった^２９。Ｓ．チフィムリウム（S. typhimurium）の弱毒化菌株を利用したＢＣＴは、いくつかの前臨床がんモデルにおいて明確な有効性を実証している^{１６、１８～２０}。静脈内、直接腫瘍内または経口送達を利用した弱毒化Ｓ．チフィムリウム（S. typhimurium）系ＢＣＴの初期段階の臨床試験では安全性が実証されたが、有効性を示すことはできなかった^{２５、２６、２７、２８}。この有効性の欠如は、がん細胞の急速な分裂、および静脈内送達の使用によるものであり得る。細菌接種は全身送達による毒性によって制限されており、これらの試験では有効性の欠如が用量に関連している場合がある。現在、米国食品医薬品局によって承認されたＢＣＴが１つある：すなわち、過去４０年間、高リスクの非筋肉浸潤性膀胱がんの標準治療であったマイコバクテリウム・ボビス（Mycobacterium bovis）の生弱毒化菌株である^２９。

しかし、おそらく良性腫瘍は免疫学的に低温である傾向があるため、ＢＣＴが良性新生物に対する可能性として示唆されたことはない^{６６、６７}。したがって、細菌療法は、主に高度に複製する細胞を標的とする従来のがん療法が効果的ではない神経鞘腫などの増殖の遅い良性腫瘍との関係において試験されたことはなかった。本明細書で提供されるのは、末梢神経系の良性新生物である神経鞘腫の細菌療法を支持する前臨床研究である。弱毒化Ｓ．チフィムリウム（S. typhimurium）の腫瘍内注射は、神経鞘腫細胞を直接殺傷し、血管新生を阻害し、免疫学的腫瘍の微小環境を比較的「低温」から「高温」に変換する可能性があるとの仮説が立てられた。さらに、免疫学的細胞死（発生した場合）、免疫原性促進（pro-immunogenic）腫瘍環境の生成、およびＶＥＧＦ／血管新生阻害の組合せが相乗作用して、抗腫瘍適応免疫応答を生成する可能性があるとの仮説が立てられた。

これらの仮説を試験するために、２つの弱毒化Ｓ．チフィムリウム（S. typhimurium）菌株（ＶＮＰ２０００９およびΔｐｐＧｐｐ）の効果を、ヌードマウスにおける異種移植ヒトＮＦ２モデルと同系免疫適格ＦＶＢ／Ｎマウスにおける同種移植マウス－神経鞘腫モデルの両方において評価した。データは、弱毒化Ｓ．チフィムリウム（S. typhimurium）の腫瘍内注射によって両方のモデルで神経鞘腫の増殖が制御されることを示した。神経鞘腫のｉ．ｔ．Ｓ．チフィムリウム（S. typhimurium）注射によって、腫瘍細胞の死滅がもたらされ、免疫適格マウスでは、全身性の抗腫瘍適応免疫応答が誘導される。この抗腫瘍免疫応答は、細菌処置時に存在していた非細菌注射腫瘍の増殖を制御し、処置後の「再チャレンジ」腫瘍の発生を予防した。Ｓ．チフィムリウム（S. typhimurium）は、細菌注射および対側非注射および再チャレンジ（ＣＤ４＋細胞に対する効果を除く）同種移植神経鞘腫において腫瘍浸潤ＣＤ４＋ヘルパーおよびＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞を増加させ、ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇを減少させ、このことは、抗腫瘍適応免疫応答の存在をさらに支持する。全身性ＰＤ－１免疫チェックポイント阻害をｉ．ｔ．Ｓ．チフィムリウム（S. typhimurium）注射に加えると、細菌注射および対側非注射腫瘍の神経鞘腫制御が強化されたが、再チャレンジ腫瘍の神経鞘腫制御は強化されなかった。腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の調査により、弱毒化Ｓ．チフィムリウム（S. typhimurium）を注射した神経鞘腫におけるＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞およびＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞の数の増加およびＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞の数の減少が実証された。

本研究では、神経鞘腫の増殖を抑制する２つの弱毒化Ｓ．チフィムリウム（S. typhimurium）菌株、すなわちＶＮＰ２０００９およびΔｐｐＧｐｐの能力を試験した。弱毒化によって、両方の菌株に、敗血症性ショックを含む病原性の可能性が低下する。インビトロ評価は、ＶＮＰ２０００９が、培養マクロファージおよび神経鞘腫細胞株の両方においてΔｐｐＧｐｐよりも侵襲性が高いが、野生型Ｓ．チフィムリウム（S. typhimurium）よりも侵襲性が低いことを明らかにした（図１３ＡおよびＢ）。培養マクロファージを両方のＳ．チフィムリウム（S. typhimurium）菌株に曝露すると炎症性サイトカインが放出されたが、ＶＮＰ２０００９もΔｐｐＧｐｐも神経鞘腫細胞株と共培養するといずれのサイトカイン放出も誘導しなかった（図１４ＡおよびＢならびに１５ＡおよびＢ）。このことは、細菌－マクロファージの相互作用が、観察されたＳ．チフィムリウム（S. typhimurium）の抗腫瘍効果において重要な役割を果たす場合があることを示唆している。

インビボデータは、ＶＮＰ２０００９またはΔｐｐＧｐｐ単剤療法のいずれかの腫瘍内（ｉ．ｔ．）注射によって、ヒトＮＦ２異種移植モデルにおいて腫瘍増殖が退縮し、２つの試験菌株間で退縮の規模に差がなかったことを示した。さらに、免疫適格マウスの同種移植神経鞘腫モデルでは、ｉ．ｔＶＮＰ２０００９の注射によって腫瘍増殖が制御された。ＶＮＰ２０００９の治療効果は、ΔｐｐＧｐｐまたはＰＢＳと比較して、腫瘍微小環境におけるアポトーシス小体の増加（図１Ｄ）およびＩＬ－１８、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γなどの炎症性サイトカインの放出の増加（図２ＥおよびＦ）によって反映された。Ｓ．チフィムリウム（S. typhimurium）を注射したマウスでは、全身性サイトカインレベルの上昇は観察されなかった（図１６）。さらなる研究では、ＶＮＰ２０００９の細菌ｉ．ｔ．注射またはＰＢＳｉ．ｔ．注射の後の、免疫適格神経鞘腫モデルの腫瘍微小環境における免疫プロファイルの変化の分析に焦点を合わせた。

Ｍ２型マクロファージおよび骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）は、前庭神経鞘腫に浸潤することが示されており、進行性の腫瘍増殖に関連している^{４２、５９}。腫瘍を促進するＭ２型マクロファージとは異なり、Ｍ１型マクロファージは免疫刺激性であり、腫瘍増殖を阻害し、少なくとも部分的に食作用および抗原提示を介して適応免疫応答を形成する^{６０～６５}。同種移植神経鞘腫モデルでは、腫瘍増殖を制御するｉ．ｔ．ＶＮＰ２０００９注射によって、細菌注射後３日目までにＣＤ４５＋Ｆ４／８０＋腫瘍活性化マクロファージ（ＴＡＭ）の中でＭ１マクロファージのＭ２マクロファージに対する比率が増加した。

処置方法
本明細書に示されるように、転移性黒色腫および腎細胞癌を有する患者に、安全に投与された弱毒化サルモネラ（Salmonella）の菌株、例えば、Ｓ．チフィムリウム（S. typhimurium）^{２５、３０、３１}は、マウスの神経鞘腫モデルにおける処置に有効であった。神経鞘腫は遺伝的に安定であり、増殖が遅く、大きな低酸素領域で高度に血管新生化している。これらの特徴によって、神経鞘腫は細菌の理想的なホーミング環境となり、細菌の細胞毒性および抗血管新生特徴にとって場合により完璧な標的となる可能性がある。加えて、細菌が免疫応答を誘導する能力により、複数の遠位病変の処置、およびこれらの腫瘍に典型的な特徴である、患者の生涯にわたる新しい神経鞘腫の発生を予防する制御メカニズムの確立が可能になる。

本明細書に記載の方法は、良性神経系腫瘍の処置のための方法を含む。いくつかの実施形態では、腫瘍は神経鞘腫である。神経鞘腫腫瘍はシュワン系列細胞で構成され、末梢神経、脊髄神経、および脳神経に沿って形成される。これらの腫瘍は、末梢神経、脊髄、および／または脳幹の圧迫により、疼痛、感覚／運動機能不全、および死を引き起こす可能性がある。末梢遠位神経および頭蓋内神経における複数の神経鞘腫は、３つのタイプの神経鞘腫瘍である、神経線維腫症１および２（ＮＦ１およびＮＦ２）、ならびにシュワノマトーシスの特徴である。神経鞘腫は、腫瘍性の脱分化したシュワン細胞で構成される良性腫瘍である。典型的には非悪性であり増殖が遅いが、これらの腫瘍は患者に壊滅的な結果をもたらす可能性がある。それらは極度の疼痛を引き起こし、聴覚および視覚を含む感覚／運動機能を損なう可能性がある。ＮＦ２における神経鞘腫は、多くの場合、知覚異常、脱力感、または難聴などの神経学的欠損に関連しており、シュワノマトーシスにおける同様の腫瘍は、多くの場合耐え難い疼痛を引き起す。一部の神経鞘腫は非常に大きくなり、隣接する臓器または構造の圧迫を引き起こし、進行性の脊髄または脳幹圧迫により麻痺または死に至る可能性がある。神経鞘腫は、ＮＦ１、ＮＦ２、およびシュワノマトーシスのいずれの遺伝的特徴も示すことなく、散発的に発生する場合がある。ほとんどの前庭神経鞘腫は散発性神経鞘腫であるため、その発生率は非常に重要である。前庭神経鞘腫は通常、全身の複数の腫瘍としてではなく、単一の腫瘍として発生する。態様のいずれかのいくつかの実施形態では、神経鞘腫の処置を必要とする対象は、神経線維腫症１（ＮＦ１）；神経線維腫症２（ＮＦ２）；シュワノマトーシス；髄膜腫；神経鞘腫瘍；神経鞘腫；前庭神経鞘腫；散発性神経鞘腫；神経線維肉腫；神経線維腫；神経線維腫症（ＮＦ）；悪性末梢神経鞘腫瘍；およびそれらの組合せからなる群から選択される状態を有するかまたは有すると診断された対象であり得る。本発明の方法を使用して処置することができる対象としては、哺乳動物、例えば、ヒトおよび非ヒト動物対象、例えば、ネコ、イヌ、ウマ、ヤギ、ウシなどが挙げられる。

ＮＦ２およびシュワノマトーシスを有する患者に対する現在の標準治療は、腫瘍サイズを縮小するための症候性腫瘍の外科的切除または放射線手術である。典型的には、単一の腫瘍のみが存在し、病変が切除のためにアクセス可能である限り、手術が一般的に有効な処置戦略である散発性神経鞘腫の場合とは異なり、複数の腫瘍を呈するシュワノマトーシスおよびＮＦ２では、切除は、多くの腫瘍にアクセスできないことと、主要な運動機能障害、重大な感覚喪失（ＮＦ２前庭神経鞘腫の場合の難聴を含む）、神経因性疼痛などの神経損傷のリスクとの両方によって厄介なものとなる。したがって、ほとんどの個体に対し、ＮＦ２とシュワノマトーシスとの両方における神経鞘腫、および現在の治療法に関連する実質的な罹患率が存在する。治療選択肢の不足と相まって、この苦痛および衰弱により、神経鞘腫の処置が、主要なアンメットメディカルニーズとなっている。

一般に、方法は、治療有効量の弱毒化サルモネラ（Salmonella）、例えば、本明細書に記載のＳ．チフィムリウム（S. typhimurium）を、任意選択でチェックポイント阻害剤と組み合わせて、そのような処置が必要な、または必要と判断された対象に投与することを含む。投与経路の例としては、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、および腫瘍内（ｉ．ｔ．）投与が挙げられる。好ましい実施形態では、ｉ．ｔ．経路を使用して、細菌の用量を最大化し、潜在的な用量制限毒性（ＤＬＴ）を最小化する。当業者は、良性神経系腫瘍を有するものとして対象に同定することができるであろう。いくつかの実施形態では、対象は、神経線維腫症１（ＮＦ１）；神経線維腫症２（ＮＦ２）；シュワノマトーシス；髄膜腫；神経鞘腫；前庭神経鞘腫；散発性神経鞘腫；神経線維腫；神経線維腫症（ＮＦ）；もしくはそれらの任意の組合せからなる群から選択される良性腫瘍または腫瘍関連状態を有するかまたは有すると診断された対象である。いくつかの実施形態では、対象は、悪性固形腫瘍を有していない、例えば、がんを有していない。いくつかの実施形態では、対象は、良性神経系腫瘍のリスクの増加に関連する状態、例えば、神経線維腫症１（ＮＦ１）；神経線維腫症２（ＮＦ２）；またはシュワノマトーシスを有する。

本明細書で使用される「有効量」という用語は、疾患または障害の少なくとも１つまたは複数の症状を緩和するために必要な組成物の量を指し、所望の効果を提供するのに十分な量の薬理学的組成物に関する。したがって、「治療有効量」という用語は、典型的な対象に投与されたときに特定の抗腫瘍効果を提供するのに十分な組成物の量を指す。本明細書で使用される有効量は、種々の状況において、疾患の症状の発症を遅延させる、疾患の症状の経過を変える（例えば、これに限定されないが、疾患の症状の進行を緩徐させる）、または疾患の症状を逆転させるのに十分な量も含む。したがって、正確な「有効量」を指定することは一般的に実行性がない。しかしながら、任意の所与の場合について、適切な「有効量」は、定型的実験のみを使用して当業者が決定することができる。良性神経系腫瘍の処置のための治療有効量の本明細書に記載の化合物の投与によって、例えば、本明細書に記載の方法での処置後、腫瘍サイズ、腫瘍数、腫瘍増殖速度、または再発の可能性の低下をもたらすことができる。

したがって、本発明の方法は、腫瘍増殖を抑制するための弱毒化Ｓ．チフィムリウム（S. typhimurium）菌株の投与を含む。本明細書に示されるように、治療の有効性を高めるために、好ましい実施形態において、本方法は、静脈内送達ではなく、腫瘍内の細菌濃度を増加させ、全身毒性を最小化する細菌の腫瘍内注射を利用することができる。本明細書に示されるように、弱毒化Ｓ．チフィムリウム（S. typhimurium）を神経鞘腫に直接注射すると、ワクチン様の作用があり、抗腫瘍適応免疫応答が誘導された。

弱毒化Ｓ．チフィムリウム（S. typhimurium）
本明細書で使用される場合、「弱毒化された」という用語は、天然の菌株と比較してビルレンスが低くなるようにされた、したがって無害になり、またはビルレンスが低くなった菌株を指す。弱毒化は非活性化を意味するものではない。弱毒化によって、両方の菌株において、敗血症性ショックを含む病原性の可能性が低下する。現在のデータは主にＶＮＰ２０００９およびΔｐｐＧｐｐに関するが、他の弱毒化菌株も使用することができる。弱毒化サルモネラ（Salmonella）菌株を生成する方法は、例えば定方向またはランダム突然変異誘発とそれに続くビルレンス低下のスクリーニングなど、当技術分野で知られている。例えば、ａｒｏＡ遺伝子（ａｒｏＡは解糖を芳香族アミノ酸の合成に接続するシキミ酸経路の一部である；ａｒｏＡ欠損サルモネラ（Salmonella）菌株は、例えばFeigner et al, mBio, 2016, 7: e01220-16に記載されている）；遺伝子ｐｕｒｌ（プリン合成に欠陥がある）；またはａｓｄ遺伝子（細胞壁合成に必要なアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼに欠陥がある）の定方向突然変異を使用することができる。サルモネラ（Salmonella）の弱毒化菌株は、国際公開第２０１４／００５６８３号パンフレット；国際公開第２０１６／２０２４５９号パンフレット；国際公開第２０１３／０９１８９号パンフレット；および米国特許出願公開第２０２０００３８４９６号明細書（弱毒化Ｓ．チフィ（S. typhi）Ｔｙ２１ａ）に開示されている。現在の方法で使用できる菌株としては、サルモネラ・エンテリカ血清型チフィムリウム（Salmonella enterica serovar typhimurium）（「Ｓ．チフィムリウム（S. typhimurium）」）、サルモネラ・モンテビデオ（Salmonella montevideo）、サルモネラ・エンテリカ血清型チフィ（Salmonella enterica serovar Typhi）（「Ｓ．チフィ（S. typhi）」）、サルモネラ・エンテリカ血清型パラチフィＢ（Salmonella enterica serovar Paratyphi B）（「Ｓ．パラチフィＢ（S. paratyphi B）」）、サルモネラ・エンテリカ血清型パラチフィＣ（Salmonella enterica serovar Paratyphi C）（「Ｓ．パラチフィＣ（S. paratyphi C）」）、サルモネラ・エンテリカ血清型ハダー（Salmonella enterica serovar Hadar）（「Ｓ．ハダー（S. hadar）」）、サルモネラ・エンテリカ血清型エンテリティディス（Salmonella enterica serovar Enteriditis）（「Ｓ．エンテリティディス（S. enteriditis）」）、サルモネラ・エンテリカ血清型ケンタッキー（Salmonella enterica serovar Kentucky）（「Ｓ．ケンタッキー（S. kentucky）」）、サルモネラ・エンテリカ血清型インファンティス（Salmonella enterica serovar Infantis）（「Ｓ．インファンティス（S. infantis）」）、サルモネラ・エンテリカ血清型プロルム（Salmonella enterica serovar Pullorurn）（「Ｓ．プロルム（S. pullorum）」）、サルモネラ・エンテリカ血清型ガリナルム（Salmonella enterica serovar Gallinarum）（「Ｓ．ガリナルム（S. gallinarum）」）、サルモネラ・エンテリカ血清型ミュンヘン（Salmonella enterica serovar Muenchen）（「Ｓ．ミュンヘン（S. muenchen）」）、サルモネラ・エンテリカ血清型アナタム（Salmonella enterica serovar Anaturn）（「Ｓ．アナタム（S. anatum）」）、サルモネラ・エンテリカ血清型ダブリン（Salmonella enterica serovar Dublin）（「Ｓ．ダブリン（S. dublin）」）、サルモネラ・エンテリカ血清型ダービー（Salmonella enterica serovar Derby）（「Ｓ．ダービー（S. derby）」）、サルモネラ・エンテリカ血清型コレラスイス変種クンツェンドルフ（Salmonella enterica serovar Choleraesuis var. kunzendorf）（「Ｓ．コレラ・クンツェンドルフ（S. cholerae kunzendorf）」）、およびサルモネラ・エンテリカ血清型ミネソタ（Salmonella enterica serovar minnesota）（「Ｓ．ミネソタ（S. minnesota）」）、の弱毒化バージョンを挙げることができる。例えば、国際公開第２００８／０３９４０８号パンフレットおよび米国特許出願公開第２０２０００２３０５３号明細書；米国特許出願公開第２０１９０１５３４５２号明細書；米国特許出願公開第２０１７０３３３４９０号明細書および米国特許出願公開第２０１８０３３９０３２号明細書；Grant et al., PLoS Pathog. 2012 Dec; 8(12): e1003070;Tennant and Levine, Vaccine. 2015 Jun 19; 33(0 3): C36-C41を参照。

好ましい実施形態では、本方法で使用される弱毒化菌株は、クロストリジウム・ノビー（Clostridium novyi）を含まない（例えば、国際公開第２０１４１６０９５０号パンフレットを参照）。好ましい実施形態では、本方法で使用される弱毒化菌株は、細胞内誘導性サルモネラ（Salmonella）プロモーターに作動可能に連結された溶菌遺伝子またはカセットを含まない（例えば、米国特許出願第２０１７０３３３４９０号明細書を参照）。

併用療法
本発明の方法は、１つまたは複数の他の処置と組み合わせた弱毒化サルモネラ（Salmonella）菌株の投与を含むことができる。例えば、現在の研究は、免疫適格マウスにおける神経鞘腫のｉ．ｔ．ＶＮＰ２０００９によって、腫瘍ヘルパーＣＤ４＋および細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージの増加、およびそれに伴うＣＤ２５＋Ｔｒｅｇのパーセンテージの低下がもたらされたことを実証した。Ｍ１殺腫瘍性マクロファージへのシフトに関連した腫瘍浸潤Ｔ細胞集団のこれらの変化は、Ｓ．チフィムリウム（S. typhimurium）が誘導する抗腫瘍適応免疫応答を示唆している。神経鞘腫における報告された高いＰＤ－Ｌ１発現は、腫瘍媒介性免疫微小環境における細胞性免疫への耐性を示す^４９。これを考慮に入れて、ＰＤ－１免疫チェックポイント阻害を添加した場合の、ｉ．ｔ．Ｓ．チフィムリウム（S. typhimurium）（ＶＮＰ２０００９）関連神経鞘腫増殖制御および宿主の抗腫瘍適応免疫の発生に対する効果を評価した。データは、この組合せが、細菌注射腫瘍および非注射腫瘍の両方に浸潤するＣＤ４＋ヘルパーおよびＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞の数の増加、ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞の数の減少に関連する、細菌注射された神経鞘腫の腫瘍退縮の増強をもたらしたことを示した（図３および４）。細菌注射腫瘍と比較して、対側非細菌注射神経鞘腫（図３Ｄ、Ｅ）および再チャレンジ神経鞘腫（図４Ｄ、Ｅ）では、ＶＮＰ２０００９と抗ＰＤ－１ｍＡｂの組合せにより、Ｔ細胞集団に対して同じ増強効果が得られた（ＣＤ４＋およびＣＤ８＋の増加、ＣＤ２５＋の減少）が、ＶＮＰ２０００９／抗ＰＤ－１ｍＡｂとＶＮＰ２０００９単独との間の増殖抑制に差はなかった。他方、神経鞘腫増殖制御に対するｉ．ｔ．ＶＮＰ２０００９とＶＮＰ２０００９／抗ＰＤ－１ｍＡｂの組合せの両方の効果は、原発性の細菌注射腫瘍（図４Ｂ）よりも再チャレンジ腫瘍（図４Ｄ）の方が大きいようである。これらの観察結果を説明する、細菌注射および非注射の対側神経鞘腫および再チャレンジ神経鞘腫の生物学における差は、まだ解明されていない。

したがって、本発明の方法は、チェックポイント阻害剤、例えば、ＰＤ－１シグナル伝達の阻害剤、例えば、ＰＤ－１、ＣＤ４０、もしくはＰＤ－Ｌ１に結合する抗体、またはＴｉｍ３もしくはＬａｇ３の阻害剤、例えば、Ｔｉｍ３もしくはＬａｇ３に結合する抗体、またはＣＴＬＡ－４に結合する抗体と細菌との組合せを（一緒にまたは別々に）投与することを含み得る。

本明細書に記載の方法において使用することができる例示的な抗ＰＤ－１抗体には、ヒトＰＤ－１に結合するものが含まれており；例示的なＰＤ－１タンパク質配列は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００５００９．２で提供されている。例示的な抗体としては、米国特許第８００８４４９号明細書；米国特許第９０７３９９４号明細書；および米国特許出願公開第２０１１０２７１３５８号明細書に記載されており、ＰＦ－０６８０１５９１、ＡＭＰ－２２４、ＢＧＢ－Ａ３１７、ＢＩ７５４０９１、ＪＳ００１、ＭＥＤＩ０６８０、ＰＤＲ００１、ＲＥＧＮ２８１０、ＳＨＲ－１２１０、ＴＳＲ－０４２、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、アベルマブ、ピジリズマブ、およびアテゾリズマブが含まれる。

本明細書に記載の方法において使用することができる例示的な抗ＣＤ４０抗体には、ヒトＣＤ４０に結合するものが含まれており；例示的なＣＤ４０タンパク質前駆体配列は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００１２４１．１、ＮＰ＿６９０５９３．１、ＮＰ＿００１３０９３５１．１、ＮＰ＿００１３０９３５０．１およびＮＰ＿００１２８９６８２．１で提供されている。例示的な抗体としては、国際公開第２００２／０８８１８６号パンフレット；国際公開第２００７／１２４２９９号パンフレット；国際公開第２０１１／１２３４８９号パンフレット；国際公開第２０１２／１４９３５６号パンフレット；国際公開第２０１２／１１１７６２号パンフレット；国際公開第２０１４／０７０９３４号明細書；米国特許出願公開第２０１３００１１４０５号明細書；米国特許出願公開第２００７０１４８１６３号明細書；米国特許出願公開第２００４０１２０９４８号明細書；米国特許出願公開第２００３０１６５４９９号明細書；および米国特許第８５９１９００号明細書に記載されているものが挙げられ、ダセツズマブ、ルカツムマブ、ブレセルマブ、テネリキシマブ、ＡＤＣ－１０１３、ＣＰ－８７０，８９３、ＣｈｉＬｏｂ７／４、ＨＣＤ１２２、ＳＧＮ－４、ＳＥＡ－ＣＤ４０、ＢＭＳ－９８６００４、およびＡＰＸ００５Ｍが含まれる。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ４０抗体は、ＣＤ４０アゴニストであり、ＣＤ４０アンタゴニストではない。

本明細書に記載の方法において使用することができる例示的な抗ＣＴＬＡ－４抗体には、ヒトＣＴＬＡ－４に結合するものが含まれており；例示的なＣＴＬＡ－４タンパク質配列は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００５２０５．２で提供されている。例示的な抗体としては、Tarhini and Iqbal, Onco Targets Ther. 3:15-25 (2010);Storz, MAbs. 2016 Jan; 8(1): 10-26；米国特許出願公開第２００９０２５２７４号明細書；米国特許第７６０５２３８号明細書；米国特許第６９８４７２０号明細書；欧州特許第１２１２４２２号明細書；米国特許第５８１１０９７号明細書；米国特許第５８５５８８７号明細書；米国特許仮出願第６０５１２２７号明細書；米国特許第６６８２７３６号明細書；欧州特許第１１４１０２８号明細書；および米国特許第７７４１３４５号明細書；に記載されているものが挙げられ、イピリムマブ、トレメリムマブ、およびＥＰＲ１４７６が含まれる。

本明細書に記載の方法において使用することができる例示的な抗ＰＤ－Ｌ１抗体には、ヒトＰＤ－Ｌ１に結合するものが含まれており；例示的なＰＤ－Ｌ１タンパク質配列は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００１２５４６３５．１、ＮＰ＿００１３００９５８．１、およびＮＰ＿０５４８６２．１で提供されている。例示的な抗体としては、米国特許出願公開第２０１７００５８０３３号明細書；国際公開第２０１６／０６１１４２号パンフレット；国際公開第２０１６／００７２３５号パンフレット；国際公開第２０１４／１９５８５２号パンフレット；および国際公開第２０１３／０７９１７４号パンフレットに記載されており、ＢＭＳ－９３６５５９（ＭＤＸ－１１０５）、ＦＡＺ０５３、ＫＮ０３５、アテゾリズマブ（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ、ＭＰＤＬ３２８０Ａ）、アベルマブ（Ｂａｖｅｎｃｉｏ）、およびデュルバルマブ（Ｉｍｆｉｎｚｉ、ＭＥＤＩ－４７３６）が含まれる。

本明細書に記載の方法において使用することができる例示的な抗Ｔｉｍ３（Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体２またはＨＡＶＣＲ２としても知られる）抗体には、ヒトＴｉｍ３に結合するものが含まれており；例示的なＴｉｍ３配列は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿１１６１７１．３で提供されている。例示的な抗体としては、国際公開第２０１６０７１４４８号パンフレット；米国特許第８５５２１５６号明細書；および米国特許出願公開第２０１８０２９８０９７号明細書；米国特許出願公開第２０１８０２５１５４９号明細書；米国特許出願公開第２０１８０２３０４３１号明細書；米国特許出願公開第２０１８００７２８０４号明細書；米国特許出願公開第２０１８００１６３３６号明細書；米国特許出願公開第２０１７０３１３７８３号明細書；米国特許出願公開第２０１７０１１４１３５号明細書；米国特許出願公開第２０１６０２５７７５８号明細書；米国特許出願公開第２０１６０２５７７４９号明細書；米国特許出願公開第２０１５００８６５７４号明細書；および米国特許出願公開第２０１３００２２６２３号明細書に記載されており、ＬＹ３３２１３６７、ＤＣＢ－８、ＭＢＧ４５３およびＴＳＲ－０２２が含まれる。

本明細書に記載の方法において使用することができる例示的な抗Ｌａｇ３抗体には、ヒトＬａｇ３に結合するものが含まれており；例示的なＬａｇ３配列は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００２２７７．４で提供されている。例示的な抗体としては、Andrews et al., Immunol Rev. 2017 Mar;276(1):80-96;Antoni et al., Am Soc Clin Oncol Educ Book. 2016;35:e450-8；米国特許出願公開第２０１８０３２６０５４号明細書；米国特許出願公開第２０１８０２５１７６７号明細書；米国特許出願公開第２０１８０２３０４３１；米国特許出願公開第２０１７０３３４９９５号明細書；米国特許出願公開第２０１７０２９０９１４号明細書；米国特許出願公開第２０１７０１０１４７２号明細書；米国特許出願公開第２０１７００２２２７３号明細書；米国特許出願公開第２０１６０３０３１２４号に記載されており、ＢＭＳ－９８６０１６が含まれる。

本発明の方法はまた、血管新生阻害剤と細菌との組合せを（一緒にまたは別々に）投与することを含み得る。血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、その受容体（ＶＥＧＦＲ）、または血管新生に関与する他の分子を標的とするものを含む、多くの血管新生阻害剤が知られている。具体的な例としては、アキシチニブ（ＩＮＬＹＴＡ）；ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ）；カボザンチニブ（ＣＯＭＥＴＲＩＱ）；エベロリムス（ＡＦＩＮＩＴＯＲ）；レナリドミド（ＲＥＶＬＩＭＩＤ）；レンバチニブメシル酸塩（ＬＥＮＶＩＭＡ）；パゾパニブ（ＶＯＴＲＩＥＮＴ）；ラムシルマブ（ＣＹＲＡＭＺＡ）；レゴラフェニブ（ＳＴＩＶＡＲＧＡ）；ソラフェニブ（ＮＥＸＡＶＡＲ）；スニチニブ（ＳＵＴＥＮＴ）；サリドマイド（ＳＹＮＯＶＩＲ、ＴＨＡＬＯＭＩＤ）；バンデタニブ（ＣＡＰＲＥＬＳＡ）；またはアフリベルセプト（Ziv-aflibercept）（ＺＡＬＴＲＡＰ）、が挙げられる。例えば、Zhang et al., Exp Neurol. 2018 Jan;299(Pt B):326-333; de Vries et al., Otol Neurotol. 2015 Aug;36(7):1128-36； Lim et al., Cancer Treat Rev. 2014 Aug;40(7):857-61； Blakeley, Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 2012 Oct;20(5):372-9； Goel et al., Cold Spring Harb Perspect Med. 2012 Mar;2(3):a006486を参照。

あるいはまたは加えて、本発明の方法は、外科的切除と組み合わせて使用することができ、例えば、態様のいずれかのいくつかの実施形態では、本明細書に記載の弱毒化サルモネラ（Salmonella）菌株を、新生物または腫瘍、例えば神経鞘腫の外科的除去または部分的除去の前、それと同時、または後に投与することができる。本発明の種々の処置方法は、外科手術、放射線療法、もしくは化学療法、またはそれらの組合せで対象を処置することをさらに含み得る。

医薬組成物および投与の方法
本明細書に記載の方法は、活性成分として弱毒化サルモネラ（Salmonella）を含む医薬組成物の使用を含む。医薬組成物は、典型的には、薬学的に許容される担体を含む。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、医薬投与と適合する生理食塩水、溶媒、分散媒体などを含む。補助的活性化合物はまた、例えば、当技術分野で知られているような、および／または本明細書で論じられているような、例えば、チェックポイント阻害剤および／または血管新生阻害剤などの組成物に組み込むことができる。

医薬組成物は、典型的には、その意図された投与経路と適合性があるように製剤化される。投与経路の例としては、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、および腫瘍内投与が挙げられる。

本発明は、以下の実施例においてさらに記載されるが、これらの実施例は、特許請求の範囲に記載された本発明の範囲を限定するものではない。

材料および方法
以下に記載の実施例では、以下の材料および方法を使用した。

細胞培養
ＨＥＩ－１９３ヒト神経鞘腫細胞株（ＨｏｕｓｅＥａｒＩｎｓｔｉｔｕｔｅ、ＬｏｓＡｎｇｅｌｅｓ、ＣＡのＤ．Ｊ．Ｌｉｍから）は、ＮＦ２患者の神経鞘腫から樹立され、ヒトパピローマウイルスＥ６／Ｅ７遺伝子で不死化され、記載されているように増殖させた^{６８、６９}。マウス０８０３１－９神経鞘腫細胞（Ｕｎｉｖ．ｏｆＣａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＬｏｓＡｎｇｅｌｅｓ（Las Angeles）、ＣＡのＭａｒｃｏＧｉｏｖａｎｎｉｎｉ博士から）を、記載されているように増殖させた^５０。細胞株を、生物発光イメージングおよびＩＨＣのためにそれぞれ、Ｆｌｕｃ（ホタルルシフェラーゼ）およびｍＣｈｅｒｒｙをコードするレンチウイルスに感染させた^７０。ヒトＭＰＮＳＴ（ＳＴＳ．２６Ｔ）細胞は、ＤａｖｉｄＬａｒｇａｅｓｐａｄａ博士（ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＭｉｎｎｅｓｏｔａのＭａｓｏｎｉｃＣａｎｃｅｒＣｅｎｔｅｒ）から好意により提供され、記載されているように増殖させた^５６。ヒトＮＦ－１関連ＭＰＮＳＴ（Ｓ４６２ＴＹ）細胞は、ＴｉｍｏｔｈｙＰ．Ｃｒｉｐｅ博士（ＮａｔｉｏｎｗｉｄｅＣｈｉｌｄｒｅｎ’ｓＨｏｓｐｉｔａｌの小児がんセンター）から好意により提供された。ヒトＢｅｎ－Ｍｅｎ－１およびＣＨ－１５７細胞は、それぞれＬｏｎｇ－ＳｈｅｎｇＣｈａｎｇ博士（ＮａｔｉｏｎｗｉｄｅＣｈｉｌｄｒｅｎ’ｓＨｏｓｐｉｔａｌの小児がんセンター）およびＧ．ＹａｎｃｅｙＧｉｌｌｅｓｐｉｅ博士（ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＡｌａｂａｍａＢｉｒｍｉｎｇｈａｍ校）から好意により提供された。ヒトマクロファージを分化させるために、ホルボール－１２－ミリステート１３－アセテート（ＰＭＡ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）を最終濃度１００μＭでヒト単球に加えた。２４時間後、ＰＭＡ補充培地を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄し、マクロファージの表現型特性を得るために、未処理ＰＭＡ非含有培地中でさらに２４時間静置した^７１。マウスＲＡＷマクロファージを入手した（ＡＴＣＣ、ＵＳＡから）。マクロファージを、製造元の指示に従ってＲＰＭＩ培地中で培養した。実験に使用する前に、すべての細胞株にマイコプラズマを含む汚染がないことを確認した。

細菌培養
弱毒化サルモネラ・エンテリカ血清型チフィムリウム菌株ＶＮＰ２０００９（修飾リピドＡ（ｍｓｂＢ－）、プリン栄養要求性突然変異（ｐｕｒＩ－）を伴う）を購入し（ＡＴＣＣ、ＵＳＡから、カタログ番号１４０２８）、ΔｐｐＧｐｐ菌株（欠失ｐｐＧｐｐ合成（ＲｅｌＡ：：ｃａｔ、ＳｐｏＴ：：ｋａｎ））が好意により提供された（ＫａｒｓｔｅｎＴｅｄｉｎ博士、ＩｎｓｔｉｔｕｔｆｏｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＥｐｉｚｏｏｔｉｃｓ、ＣｅｎｔｒｅｆｏｒＩｎｆｅｃｔｉｏｎＭｅｄｉｃｉｎｅ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。細菌細胞を、前述のように、好気性条件下で、低ナトリウムを含むルリア－ベルターニ（ＬＢ）ブロス培地（ＤｉｆｃｏＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＵＳＡ）中で、３７℃、３００ｒｐｍにて、一晩培養した^{３１、４７}。要約すると、細胞を対数期後期まで増殖させ（ＯＤ６００ｎｍ＝０．８）、５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して採取し、滅菌１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄した後、腫瘍への注射または培養細胞の感染を行った。

動物
すべての動物実験は、ＭａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓＧｅｎｅｒａｌＨｏｓｐｉｔａｌ（ＭＧＨ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）の施設内動物管理使用委員会（ＩＡＣＵＣプロトコル番号２０１４Ｎ０００２１１）によって承認され、その監督下で実施された。５～７週齢の雄型マウス、ｎｕ／ｎｕおよびＦＶＢ／Ｎ（ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、食料、水への自由なアクセスを伴い、１２：１２の明暗サイクルで飼育し、ＭＧＨのＣｅｎｔｅｒｆｏｒＣｏｍｐａｒａｔｉｖｅＭｅｄｉｃｉｎｅのスタッフ／獣医による毎日の健康診断を行った。

動物モデルおよび腫瘍内細菌注射
坐骨神経鞘腫を、記載されているように、イソフルラン麻酔マウスの左坐骨神経にＨＥＩ－１９３ＦＣヒトまたは０８０３１－８ＦＣマウス神経鞘腫細胞を直接注射することによって生成した^７２。ＨＥＩ－１９３ＦＣまたは０８０３１－９ＦＣ細胞をトリプシン処理し、冷ＰＢＳですすぎ、０．５μｌのＰＢＳ中の３０，０００（または０８０３１－９ＦＣの場合は１０，０００）細胞を、ガラス製マイクロピペットおよびガス式マイクロインジェクタ（ＩＭ－３００；Ｎａｒｉｓｈｉｇｅ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を使用して、それぞれ無胸腺ヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ、５～７週齢雄型、ＮａｔｉｏｎａｌＣａｎｃｅｒＩｎｓｔｉｔｕｔｅ［ＮＣＩ］）、または同系ＦＶＢ／Ｎマウス（５～７週齢雄型、ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の坐骨神経に注射した。ＨＥＩ－１９３腫瘍細胞移植後２週目または０８０３１－９腫瘍細胞移植後１週目に、腫瘍細胞が移植された坐骨神経の位置を標的化して、腫瘍に、２μｌのＰＢＳ［９、１３］中の１０^４ＣＦＵ弱毒化Ｓ．チフィムリウム（S. typhimurium）（ＶＮＰ２０００９またはΔｐｐＧｐｐ）を注射した。腫瘍増殖を、記載されているように、ＨＥＩ－１９３の場合は週間隔で、０８０３１－９の場合は週２回、インビボで生物発光イメージングによって監視した^７２。要約すると、マウスに、Ｆｌｕｃ基質ｄ－ルシフェリンを腹腔内注射し、１０分後、高効率ＩＶＩＳスペクトル（ＣａｌｉｐｅｒＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡ）によりシグナルを取得した。免疫適格皮下モデルの場合；０８０３１－９をＤＭＥＭ中に再懸濁し、マトリゲル（ＢＤｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）と混合した（１：１）後、ＦＶＢ／Ｎ同系マウスの皮下（ｓ．ｃ．）に移植した。ＮＦ－１または髄膜腫異種移植モデルの場合、ヒトＳ４６２ＴＹ、ＳＴＳ．２６Ｔ、Ｂｅｎ－Ｍｅｎ－１またはＣＨ－１５７細胞をマトリゲルと混合し（１：１）、記載されているようにｎｕ／ｎｕマウスの皮下に移植した^５６。腫瘍体積を、式（Ｗ×Ｌ×Ｌ×π／６）（式中、幅（Ｗ）、長さ（Ｌ）は、２つの最大直径である）を使用して推定した^５０。腫瘍が１５０ｍｍ^３に達したら、腹腔内（ｉ．ｐ．）ＰＤ－１ｍＡｂ（２５０ｕｇ／注射、ＢｉｏＸＣｅｌｌ、ＵＳＡ）による処置を開始し、前述のように３日ごとに繰り返した^５１。ＶＮＰ２０００９注射（１０^４ＣＦＵ／１００μｌＰＢＳ）を、インスリン注射器を使用して腫瘍内に実施した。対照群のマウスを、同じスケジュールでＰＢＳビヒクルまたはアイソタイプ抗体で処置した。

組織学的および免疫組織化学的分析
動物をイソフルラン（３％）で最終的に麻酔し、断頭術により屠殺した。記載されているように、腫瘍組織を除去し、ヘマトキシリンおよびエオジン（Ｈ＆Ｅ）ならびに免疫組織化学的染色のために急速凍結した^７３。腫瘍を、－８０℃でＯＣＴブロックに保持した。切片を、定型的プロトコルに従ってＨ＆Ｅにより染色した。増殖マーカー染色を、Ｋｉ６７（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）に対する抗体を使用して実行した。ＣＤ４５、ＣＤ６８およびＣＤ３１に対する抗体を、それぞれ白血球、マクロファージおよび血管新生化の染色に利用した。すべての抗体を（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）から購入した。要約すると、切片を室温（ＲＴ）で一晩乾燥させた。切片を、４℃で１０分間予冷したアセトンで固定し、乾燥させた後、すぐに染色した。切片をＰＢＳで洗浄し、無血清タンパク質ブロック（Ｄａｋｏ、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、ＣＡ）によりブロックし、二重内因性酵素ブロック（Ｄａｋｏ）でペルオキシダーゼをクエンチした。切片をＰＢＳで洗浄した後、一次抗体とともに室温で１時間インキュベートし、次にＰＢＳで洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体とともに室温（ＲＴ）で３０分間インキュベートした。切片をＰＢＳで洗浄し、ＤＡＢ溶液（Ｄａｋｏ）とともにインキュベートした。対比染色を、切片をエタノールおよびキシレンに浸した後、Ｃｙｔｏｓｅａｌ（ＲｉｃｈａｒｄＡｌｌａｎＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）でマウントし、顕微鏡で視覚化するためにカバーガラスで覆うことによって達成した。インビボアポトーシス染色を、ＴＡＣＳ２ＴｄＴ－ＤＡＢインサイチュアポトーシス検出キット（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を使用して評価した。製造元の指示に従って、スライド上にマウントした後、３．７％ホルムアルデヒドで固定した未処理凍結神経の１５μｍ切片（クリオスタット）を染色し、光学顕微鏡下でジアミノベンジジン（ＤＡＢ）により視覚化した。利用した抗体を表１に提供する。

リアルタイム定量（ｑＲＴ－ＰＣＲ）を使用した腫瘍内のサイトカインＲＮＡの測定
細菌注射後３日目に腫瘍組織を切除し、ＴｒｉｚｏｌでＲＮＡを抽出した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＶＶＩＬＯ（商標）ｗｉｔｈｅｚＤＮａｓｅｅｎｚｙｍｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、全ＲＮＡをｃＤＮＡに転写した。次に、試料を３７℃で１０分間インキュベートしてＤＮＡを消化し、続いて（ＰｒｏＦｌｅｘＰＣＲシステム、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）にて２５℃で１０分間、５０℃および８５℃で５分間インキュベートした。ｑＰＣＲ反応では、２０ｎｇのｃＤＮＡ／ウェルをインプットとして使用し、Ｔａｑ－ｍａｎプローブを使用して標的遺伝子の発現を判定した。ｑＰＣＲアッセイを、Ｍｘ３０００ＰｑＰＣＲシステム（ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）で標準サイクリングモード条件を使用して実行した。ＭｘＰｒｏｑＰＣＲソフトウェアを使用して融解曲線分析を実行し、各プレートのプライマー効率を検証し、非特異的増幅を除外した。目的の遺伝子と参照遺伝子１８Ｓ（ΔＣｔ）との間のサイクル閾値（Ｃｔ）値の差を、２－ΔΔＣＴ法を使用して相対発現に変換し、試料を比較することによって倍率変化を計算した。すべての反応を、３回行った。

ＥＬＩＳＡを使用した腫瘍内のサイトカインタンパク質の測定
細菌注射後３日目に腫瘍組織を切除し、プロテイナーゼ阻害剤を含むＮＰ４０溶解緩衝液で均質化し、１３，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離により上清を回収した。製造元の指示に従って、サイトカインレベルを、ヒトおよびマウスに対し個々のＱｕａｎｔｉｋｉｎｅＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ）を使用して測定した：インターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）（ＢＤｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＴＮＦ－α（ＢＤｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＩＬ－１β／ＩＬ－１Ｆ２（ＢＤｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）およびＩＬ－１８（ＢＤｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）。マイクロプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ）を使用して、補正波長を５４０ｎｍまたは５７０ｎｍに設定して４５０ｎｍで基質の呈色反応を測定した後、検量線で結果を定量化した。

インビトロ侵襲性アッセイ
マクロファージ（ヒトＴＨＰ－１およびマウスＲＡＷ２６４．７マクロファージ）および神経鞘腫（ヒトＨＥＩ－１９３およびマウス０８０３１－９）細胞を、２４ウェル組織培養プレートでウェルあたり１０^４細胞の密度まで増殖させた。細胞を温ＰＢＳで洗浄し、抗生物質非含有１０％ＦＢＳ培地を補充した。並行して、細菌細胞を前述のように対数増殖期後期まで増殖させ、細胞培養培地で希釈して、５０：１細菌／細胞の感染多重度（ＭＯＩ）を表した。培養マクロファージおよび神経鞘腫細胞に細菌を含む培地を加え、３７℃のインキュベーターに６０分間置いた。細菌株の侵襲性を決定するために、培養細胞をＰＢＳで洗浄し、ゲンタマイシン硫酸塩（５０ｕｇ／ｍＬ）を含有する培地中で３０分間インキュベートして、細胞表面に付着した細胞外細菌を死滅させた。次に、細胞を１～２ｍＬのＰＢＳで５回すすいだ後、０．２ｍＬの０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を１０分間加えて細胞を溶解し、付着した細菌を分離させた。次に、ＬＢブロス（０．８ｍＬ）を加え、各試料を激しく混合して、段階希釈用の均質な懸濁液を調製した。１０倍希釈液を調製し、ＬＢ寒天培地にプレートし、３７℃で一晩インキュベートしてコロニー形成単位（ＣＦＵ）を計数した。

フローサイトメトリー
マウス（ｎ＝３／群）から組織を採取し、新たに調製した溶解緩衝液（２０ｍＭＨｅｐｅｓを含有するＰＢＳ中１２５Ｕ／ｍＬコラゲナーゼＸＩ型、６０Ｕ／ｍＬのヒアルロニダーゼＩ－ｓ型、６０Ｕ／ｍＬ、ＤＮａｓｅ１、および４５０Ｕ／ＬのコラゲナーゼＩ型（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ））を使用して、水浴にて３７℃で１時間、適切な均質化および細胞解離のために１０分ごとに穏やかにフリックしながら、細胞を解離させた。細胞懸濁液を、予め湿らせたストレーナー、７０μｍセルストレーナー（ＢＤ－Ｆａｌｃｏｎ）に通した。１０ｕＬの懸濁液を１０ｕＬのトリパンブルーと混合することにより、細胞を定量した後、血球計にロードした。細胞懸濁液を２０００ｒｐｍで１０分間４℃で遠心分離して溶解緩衝液を除去し、洗浄して１×ＰＢＳに再懸濁し、１０^６細胞／１００ｕＬを維持した。細胞を、２ｕＬのＦＣブロッキング剤（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で室温にて１５分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、次に細胞表面マーカーまたはさまざまな免疫マーカーに対する蛍光標識抗体とともに暗所で１時間インキュベートし、次にＰＢＳによる洗浄工程を経て、２％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ溶液）で一晩透過させた。以下のマウス免疫マーカーに対する抗体を表面染色に使用した：ＣＤ４５、Ｆ４／８０、ＣＤ２０６、ＣＤ８６、ＬＹ６Ｇ、ＮＫ１．１、ＮＫｐ４６、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３、ＣＤ２５。ＦＡＣＳおよび分析を、ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）およびＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して、ＦＡＣＳＡｒｉａおよびＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａを使用して実行した。利用した抗体を補足表１に提供する。

データ分析
すべてのデータは、群平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表される。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍおよびＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌを使用してデータを分析した。反復測定分散分析（ＡＮＯＶＡ）を利用して、記載されているように腫瘍の体積および／またはシグナルを比較した^７４。一元配置ＡＮＯＶＡを使用して、サイトカインの発現およびフローサイトメトリーデータを分析した。Ｐ＜０．０５が有意であると認められた。

[実施例１]
腫瘍内弱毒化Ｓ．チフィムリウム（S. typhimurium）注射により、異種移植ヒトおよび同種移植マウス神経鞘腫モデルにおいて腫瘍増殖が抑制される
Ｓ．チフィムリウム（S. typhimurium）の腫瘍内（ｉｔ）注射により、ｎｕ／ｎｕ免疫不全およびＦＶＢ／Ｎ免疫適格マウスの坐骨神経において発生するヒト（ＨＥＩ－１９３細胞株）およびマウス（０８０３１－９細胞株）神経鞘腫の増殖を制御することができるかどうかをそれぞれ評価した。Ｓ．チフィムリウム（S. typhimurium）の２つの異なる菌株、すなわちＶＮＰ２０００９およびΔｐｐＧｐｐを評価した。両菌株は、前臨床研究^{１９、３２、３３}で、ＶＮＰ２０００９については臨床試験^{２５、３４}でもより高い腫瘍指向性および向上した安全性プロファイルを示した野生型細菌の突然変異弱毒化形態である。

腫瘍量を、ＨＥＩ－１９３ＦＣ（ヒトＮＦ２神経鞘腫）および０８０３１－９ＦＣ（マウスＮＦ２欠損神経鞘腫）細胞によって発現するホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）のインビボ生物発光イメージングを介して評価した。腫瘍シグナルが安定したら（ＨＥＩ－１９３ＦＣまたは０８０３１－９ＦＣ細胞の腫瘍移植のそれぞれ約２週間後または１週間後；図１ＡおよびＢ）、直接視覚化して、担腫瘍坐骨神経に、弱毒化Ｓ．チフィムリウム（S. typhimurium）（ＶＮＰ２０００９もしくはΔｐｐＧｐｐ）またはＰＢＳ（対照）を注射した（ｎ＝８マウス／群）。腫瘍増殖を、担ヒトＮＦ２神経鞘腫ヌードマウスでさらに５週間、担マウスＮＦ２神経鞘腫免疫適格ＦＶＢ／Ｎマウスで２週間追跡した。異種移植神経鞘腫モデルでは、腫瘍細胞の移植の７週間後に研究が終了した－この時点で、細菌注射腫瘍のほとんどは生物発光シグナルを有していない。坐骨神経内同種移植モデルにおける研究の終了は、対照マウスの担腫瘍後肢の運動機能不全の発症によって決定された（我々のグループと動物飼育技術者の両方によって評価され、その全員が研究群に対し盲検化されていた）。この研究の２つの追加の複製を、異種移植モデルで実行し、１つの複製を同種移植モデルで実行した。（すべての研究についてｎ＝８マウス／群；図７ＡおよびＢ）。

弱毒化Ｓ．チフィムリウム（S. typhimurium）のＶＮＰ２０００９菌株の腫瘍内注射によって、異種移植ヒトＮＦ２神経鞘腫モデルにおける３つの複製すべて（ｐ＜０．０１、図１Ａ；図７Ａ）および同種移植マウス神経鞘腫モデルにおける両方の複製（ｐ＜０．０５、図１Ｂ；図７Ｂ）において、ＰＢＳ対照と比較して生物発光腫瘍シグナルの減少がもたらされた。細菌およびＰＢＳ注射マウスの増殖曲線は、ＶＮＰ２０００９注射後早くも１週間で両方の腫瘍モデルにおいて分岐し始める。細菌処置によって、細菌注射後２週目までに８匹中５匹のマウスでＨＥＩ－１９３ＦＣ腫瘍シグナルが検出不可能なレベルに退縮した（図１Ａ）。この実験の３つの複製全体で、ＶＮＰ２０００９注射動物の７５％（１８／２４マウス）は、実験の終了までに検出可能な腫瘍シグナルを有していなかった（図１Ａ、図７Ａ）。

同種移植マウス－神経鞘腫モデルで細菌注射後の腫瘍シグナルの完全な退縮は観察されなかったが、腫瘍増殖制御は、屠殺の時まで続き、その時には、ＰＢＳ対照と比較してＶＮＰ２０００９注射マウスでは、生物発光シグナルはおよそ８分の１であった（図１Ｂ、図７Ｂ）。

次に、Ｓ．チフィムリウム（S. typhimurium）のΔｐｐＧｐｐ菌株がＶＮＰ２０００９と同様の治療効果を有するかどうかを試験した。異種移植モデルでは、腫瘍シグナルに対するＶＮＰ２０００９とΔｐｐＧｐｐの効果は互いに区別できなかったが、同種移植マウス神経鞘腫モデルでは、Ｓ．チフィムリウム（S. typhimurium）のΔｐｐＧｐｐ菌株ではなくＶＮＰ２０００９が腫瘍増殖を制御しており（ｐ＜０．０５ＶＮＰ２０００９対ＰＢＳ、図１Ｂ）、実際、２つの菌株の間には有意差があった（ｐ＜０．０５ＶＮＰ２０００９対ΔｐｐＧｐｐ、図１Ｂ）。

実験の終了時（すなわち、異種移植ヒト神経鞘腫モデルでは細菌注射の５週間後、同種移植マウス神経鞘腫モデルでは細菌注射の２週間後）に採取された担腫瘍神経（ｎ＝３マウス／群）の組織学的分析では、ＰＢＳ注射腫瘍と比較して、ＶＮＰ２０００９およびΔｐｐＧｐｐ注射腫瘍の両方で豊富なアポトーシス小体が示された（図１ＣおよびＤ）。異種移植モデルからの組織の定量化により、ＶＮＰ２０００９注射神経鞘腫（５７０±７７；ｐ＜０．０００５）およびΔｐｐＧｐｐ注射神経鞘腫（２３０±６８、ｐ＜０．００５）の両方で、ＰＢＳ注射腫瘍（４±１）よりアポトーシス小体の数が多いことが明らかになった（図１Ｃ）。２つの細菌株によって誘導されたアポトーシス小体を比較すると、ＨＥＩ－１９３神経鞘腫のΔｐｐＧｐｐ処置腫瘍と比較して、ＶＮＰ２０００９処置腫瘍のアポトーシス細胞の数がより多いことを示した（ｐ＜０．０１、図１Ｃ）。異種移植ヒトＮＦ－２神経鞘腫では、ΔｐｐＧｐｐ注射後よりもＶＮＰ２００９注射後のアポトーシス細胞がおよそ３倍多かった。同種移植マウス神経鞘腫モデルでは、群間の一致した違いが観察され；ΔｐｐＧｐｐ注射腫瘍（１１０±２７、ｐ＜０．０１）およびＰＢＳ注射腫瘍（６±０．３、ｐ＜０．００１）と比較して、ＶＮＰ２０００９注射腫瘍（３４０±６３、）にはより多くのアポトーシス細胞が存在していた。ΔｐｐＧｐｐ注射腫瘍は、ＰＢＳ対照よりもアポトーシス細胞の数が有意により多い（ｐ＜０．０１、図１Ｄ）。このモデルでは、ｉ．ｔ．ＶＮＰ２０００９注射によって、ΔｐｐＧｐｐ注射のおよそ３倍のアポトーシス細胞がよりもたらされた（ｐ＜０．０１、図１Ｄ）。

[実施例２]
ｉ．ｔ．弱毒化Ｓ．チフィムリウム（S. typhimurium）注射によって、同種移植マウス－神経鞘腫モデルにおいて免疫原性促進サイトカインの上昇および免疫細胞浸潤の変化がもたらされる
ＢＣＴの最も刺激的な特性の１つは、抗腫瘍適応免疫を誘導する能力である^{３５～３７}。この発見に基づいて、我々は、弱毒化Ｓ．チフィムリウム（S. typhimurium）による神経鞘腫の感染が、宿主の抗腫瘍適応免疫を誘導するワクチン接種効果を有するであろうと仮定した。神経鞘腫の免疫療法は、罹患した個体が典型的には複数の腫瘍を有し、生涯を通じて新しい腫瘍を発症し、主要な神経損傷の実質的なリスクなしに外科的に除去することができない場所に腫瘍を有し、完全切除が多くの場合実現可能ではなく、また前述のように、腫瘍は生涯を通じて発症するために複数の手術を必要とすることを考えると、特に価値がある。

異種移植および同種移植の神経鞘腫モデルに細菌をｉ．ｔ．注射すると、アポトーシス細胞死が引き起こされる（図１）が、我々は、パイロトーシスおよび／または免疫原性細胞死のエビデンスがあるかどうかも調査したいと考えた。したがって、ＶＮＰ２０００９およびΔｐｐＧｐｐを、それぞれヌードマウスおよび免疫適格マウスの坐骨神経内で増殖している、ヒトＨＥＩ－１９３およびマウス０８０３１－９神経鞘腫にｉ．ｔ．注射すると、宿主の自然免疫応答および適応免疫応答の幅広い指標を誘導する可能性がある。リンパ球共通抗原マーカーＣＤ４５^３８と単球および組織マクロファージマーカーＣＤ６８^３９の分析を通じて、腫瘍内免疫細胞浸潤を評価した。免疫細胞浸潤を、異種移植ヒトＮＦ２モデルでは細菌注射後５週目に、同種移植マウス神経鞘腫モデルでは細菌注射後２週目に収集された腫瘍の免疫細胞化学的染色（ｎ＝３腫瘍／処置／モデル）によって評価した。屠殺の時期は、前述の理由、すなわち、ほとんどのマウス（異種移植モデル）における腫瘍シグナルの消散または対照マウス（同種移植モデル）における深刻な病態の手前という理由のために選択された。

異種移植モデルにおいて、担腫瘍神経の組織学的分析によって、どちらのクラスの細胞の表示もなかったＰＢＳ注射腫瘍と比較して、ＣＤ４５＋白血球およびＣＤ６８＋マクロファージの豊富な腫瘍浸潤が明らかになった（図８）。坐骨神経内同種移植マウス神経鞘腫の同じ分析は、ＶＮＰ２０００９またはΔｐｐＧｐｐのいずれかのｉ．ｔ．注射によって、ＰＢＳ注射腫瘍と比較して、ＣＤ４５＋白血球およびＣＤ６８＋マクロファージ浸潤の増加をもたらしたことを示した（図２Ａ）。同種移植モデルの腫瘍微小環境におけるＣＤ４５＋およびＣＤ６８＋細胞の定量化によって、この細菌注射により、ＰＢＳ注射対照と比較して腫瘍浸潤白血球およびマクロファージが増加したことが示された（図２Ｂ）。

これらの腫瘍が免疫適格宿主マウスで発生する同種移植モデルのみを利用して、Ｓ．チフィムリウム（S. typhimurium）による神経鞘腫死滅を特徴付けることに焦点を当てて、免疫原性細胞応答および免疫原性細胞死の指標があるかどうかを調査した。マクロファージは、Ｍ１殺腫瘍性とＭ２腫瘍形成性に分類することができ、（Ｍ１）^４０宿主の抗腫瘍適応免疫の促進または（Ｍ２）^４１宿主の抗腫瘍適応免疫の阻害を差次的に行うことができるようであり、宿主の抗腫瘍免疫の重要な決定要因は、Ｍ１マクロファージとＭ２マクロファージの均衡である。ヒト神経鞘腫は、細胞数により最大５０％のマクロファージで構成されていると報告されており^４２、マクロファージの含有量が多いほど、腫瘍増殖率が高くなる^４３。弱毒化Ｓ．チフィムリウム（S. typhimurium）のｉ．ｔ．注射の３日後および７日後に坐骨神経内同種移植マウス神経鞘腫から収集したＣＤ４５＋Ｆ４／８０＋細胞におけるＣＤ８６＋（Ｍ１型に対する、殺腫瘍性）およびＣＤ２０６＋（Ｍ２型に対する、腫瘍形成性）発現のフローサイトメトリーによって、マクロファージ集団を評価した。ＶＮＰ２０００９およびΔｐｐＧｐｐの両方のｉ．ｔ．注射によって、細菌注射後３日目にマクロファージの均衡がＭ１型にシフトし、ＰＢＳ注射と比較してＭ１マクロファージのＭ２マクロファージに対する比率（Ｍ１／Ｍ２）が増加した（ｐ＜０．０５、図２Ｃ）。ｉ．ｔ．細菌注射から７日後に、Ｍ１／Ｍ２比は、ＰＢＳ処置腫瘍と比較して、ＶＮＰ２０００９注射腫瘍ではさらにＭ１へシフトし（ｐ＜０．０１、図２Ｃ）、一方、ΔｐｐＧｐｐ注射腫瘍では、Ｍ１／Ｍ２比は３日目の時点と比較して低下し、ＰＢＳとの差はもはやなかった（図２Ｃ）。興味深いことに、マクロファージ数に対するｉ．ｔ．弱毒化Ｓ．チフィムリウム（S. typhimurium）注射の全身的効果があった。ｉ．ｔ．細菌注射後の３日間で、脾臓マクロファージ（ＣＤ４５＋Ｆ４／８０＋）は、ＰＢＳ（１５．４％）と比較してＶＮＰ２０００９群（３８．８％、ｐ＜０．０１）およびΔｐｐＧｐｐ群（３２．４％、ｐ＜０．０１）で増加した（図９）。

細菌注射同種移植神経鞘腫における腫瘍浸潤リンパ球の増加が観察されたことおよびＭ１型マクロファージへのシフトを考えて、腫瘍内Ｔ細胞組成が、弱毒化Ｓ．チフィムリウム（S. typhimurium）のｉ．ｔ．注射によって変化するかどうかを調査した。腫瘍浸潤ヘルパーＴ細胞（ＣＤ３／ＣＤ４）、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ３／ＣＤ８）および制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ、ＣＤ４／ＣＤ２５）を、ｉ．ｔ．細菌注射の７日後にマルチカラーフローサイトメトリーを使用して評価した（ｎ＝３／群）。ｉ．ｔ．細菌注射のＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞に対する効果は観察されなかったが、ＶＮＰ２０００９またはΔｐｐＧｐｐのいずれかのｉ．ｔ．注射によって、ＰＢＳ注射と比較してＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞のパーセンテージが増加した（それぞれ７．５６％、７．５６％および２．７９％、図２Ｄ）。さらに、ＶＮＰ２００９またはΔｐｐＧｐｐｉ．ｔ．注射によって、ＰＢＳと比較して、腫瘍浸潤性ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇの数が減少した（それぞれ４．１５％、３．２４％および８．３２％、図２Ｄ）。すべての場合において、これらのパーセンテージはＣＤ４５＋細胞の割合を表している。

次に、ＩＣＤに関与し、免疫細胞と腫瘍細胞の両方の生存、増殖、および分化を調節することが知られている、２つの重要な免疫刺激性サイトカインである腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）およびインターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）^{４４、４５}に対するＶＮＰ２００９またはΔｐｐＧｐｐｉ．ｔ．注射の効果を調査した。部分的には、ｉ．ｔ．弱毒化Ｓ．チフィムリウム（S. typhimurium）は、Ｍ１型マクロファージへのシフトをもたらすので、我々は、神経鞘腫の細菌感染がこれらのサイトカインの産生を誘導すると仮定した（図２Ｃ）。さらに、Ｓ．チフィムリウム（S. typhimurium）は、抗腫瘍活性を有することが知られている２つの炎症誘発性サイトカイン、すなわちＩＬ－１βおよびＩＬ－１８^{１９、４７、４８}のプロセシングおよび成熟化に関与するインフラマソーム（ＮＬＲＰ３およびＮＬＲＣ４を含む）^４６の既知の誘導因子である。ｉ．ｔ．細菌注射後３日目に、ＶＮＰ２０００９およびΔｐｐＧｐｐを媒介したＭ１／Ｍ２比の変化が明らかであり（図２Ｃ）、坐骨神経内同種移植神経鞘腫内の複数のサイトカインの上昇が観察された。ｍＲＮＡおよびタンパク質を腫瘍から抽出して、サイトカインプロファイルを、ＲＴ－ＰＣＲおよびＥＬＩＳＡを使用して評価した（Ｎ＝３／群）。炎症誘発性サイトカインＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１β、およびＩＬ－１８の転写レベルは、対照と比較して、ＶＮＰ２０００９およびΔｐｐＧｐｐＳ．チフィムリウム（S. typhimurium）注射腫瘍においてアップレギュレートされた（図２Ｅ）。注目すべきことに、ＶＮＰ２０００９注射腫瘍は、ΔｐｐＧｐｐと比較してより高いＴＮＦ－αおよびＩＦＮ－γ ｍＲＮＡ発現レベルを示した（それぞれｐ＜０．０１、ｐ＜０．００１）。転写レベルで観察されたように；ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１β、およびＩＬ－１８タンパク質レベルは、ＰＢＳ対照と比較してＶＮＰ２０００９およびΔｐｐＧｐｐ注射腫瘍で上昇した（図２Ｆ）。さらに、ｉ．ｔ．ＶＮＰ２０００９注射によって、ΔｐｐＧｐｐと比較した注射腫瘍において、より多くのＩＬ－１８、ＩＦＮ－γおよびＴＮＦ－αタンパク質がもたらされた（それぞれ、ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１、ｐ＜０．０５；図２Ｆ）。ＶＮＰ２００９処置によってまた、ΔｐｐＧｐｐまたはＰＢＳと比較して、ＮＬＲＣ４およびＮＬＲＰ３ｍＲＮＡがより大きく上昇した（ｐ＜０．０１、図２Ｅ）。

[実施例３]
ｉ．ｔ．Ｓ．チフィムリウム（S. typhimurium）ＶＮＰ２０００９注射により、細菌注射および対側非注射同種移植マウス神経鞘腫の増殖が制御される。
神経鞘腫のサブセットは、ＰＤ－１を発現するＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を含有することが示されており、これらの細胞における抗腫瘍免疫の低下を示している^４９。同種移植神経鞘腫のｉ．ｔ．ＶＮＰ２０００９注射は、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔの数の増加およびＣＤ２５＋Ｔｒｅｇの数の減少と関連しており、適応免疫応答の活性化を示唆していることが見出された。したがって、全身性抗ＰＤ－１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）とｉ．ｔ．ＶＮＰ２０００９注射との組合せによって、宿主の細菌誘導抗腫瘍適応免疫応答が増強する場合があると評価された。０８０３１－９マウス神経鞘腫細胞を、ＦＶＢ／Ｎマウスの両側腹部に皮下移植し、４群に分けた（図３Ａは実験計画を示す）：ｉ）ｉ．ｔ．ＶＮＰ２０００９（左側腹部腫瘍）、ｉｉ）ｉ．ｐ．抗ＰＤ－１－ｍＡｂＰ、ｉｉｉ）ｉ．ｔ．ＶＮＰ２０００９およびｉ．ｐ．抗ＰＤ－１－ｍＡｂ、ならびにｉｖ）ｉ．ｔ．ＰＢＳ（左腫瘍）。坐骨神経内移植ではなく皮下移植が利用され、これは、前者によって、より長い生存が可能になり、したがって適応免疫応答が起こるためのより大きな機会が可能になるためである。平均腫瘍サイズがおよそ１５０ｍｍ^３ ^５０（移植後１１日目）に達したら、ＶＮＰ２０００９（１００μｌ中１０^４ＣＦＵ）またはＰＢＳを、左側腹部に移植された腫瘍にのみ直接注射した。並行して、抗ＰＤ－１ｍＡｂ（２５０μｇ／注射）を、腫瘍細胞移植後１０、１３、１６、および１９日目にｉ．ｐ．注射した^５１。ｉ．ｔ．ＰＢＳ注射と比較して、ＶＮＰ２０００９または抗ＰＤ－１ｍＡｂのいずれかによる単剤療法は、両方の腫瘍の増殖を抑制し（図３Ｂ）、ｉ．ｔ．ＶＮＰ２００９によって、ＰＤ－１－ｍＡｂよりも非注射腫瘍のより大きな増殖制御がもたらされた（ｐ＜０．０５、図３Ｂ、Ｄ）ことが観察された。ｉ．ｔ．ＶＮＰ２０００９と抗ＰＤ－１ｍＡｂとの組合せにより、１）ＶＮＰ２０００９または抗ＰＤ－１ｍＡｂのいずれかの単独と比較して、細菌注射腫瘍の増殖制御が強化され（ｐ＜０．０５、図３Ｂ）、および２）抗ＰＤ－１ｍＡｂ処置と比較して、非注射対側腫瘍の腫瘍増殖制御が強化された（ｐ＜０．０５）が、ＶＮＰ２０００９処置マウスと比較して、差はなかった（図３Ｄ）。

神経鞘腫の増殖に対するこれらの効果は、ｉ．ｔ．ＶＮＰ２０００９によって、腫瘍増殖を制御することができる適応免疫応答が生成され、この効果は免疫チェックポイント阻害によって強化される可能性があることを示唆している。これを考慮して、フローサイトメトリーを介してこれらの腫瘍のＴ細胞サブセット、具体的には、ヘルパー（ＣＤ３／ＣＤ４）Ｔ細胞、細胞傷害性（ＣＤ３／ＣＤ８）Ｔ細胞、および制御性Ｔ（ＣＤ４／ＣＤ２５）Ｔ細胞を分析した（図３Ｃ）。左側腹部腫瘍（図３Ｂ、Ｃ）では、ｉ．ｔ．ＶＮＰ２０００９および全身性抗ＰＤ－１ｍＡｂによって、１）ＰＢＳ注射（１．０１％）と比較してＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞の増加（それぞれ１１．８％および１０．８％）、２）ＰＢＳ注射（０．７７％）と比較して、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の増加（ＶＮＰ２０００９（３．４３％）；抗ＰＤ－１ｍＡｂ（４．２１％））、および３）ＰＢＳ（３１．２％）と比較して、制御性Ｔ細胞の減少（ＶＮＰ２０００９（１５．５％）；抗ＰＤ－１ｍＡｂ（１９．３％））、がもたらされた。ＶＮＰ２０００９と抗ＰＤ－１ｍＡｂとの組合せにより、各単剤療法およびＰＢＳと比較してＣＤ８＋（２４．９％）およびＣＤ４＋（２９．６％）Ｔ細胞が相加的に増加した（図３Ｃ）。各単剤療法（ＶＮＰ２０００９（１５．５％）；抗ＰＤ－１ｍＡｂ（１９．３％）、およびＰＢＳ（３１．２％））と比較して、Ｔｒｅｇ低下（７．５９％）に対する細菌および免疫チェックポイント阻害の組合せの相加効果もあった。

これらの操作が全身性宿主抗腫瘍免疫応答を誘導したかどうかをさらに評価するために、細菌注射を受けなかった右側腹部腫瘍の同じＴ細胞集団を分析した。全身性抗ＰＤ－１ｍＡｂと組み合わせた（左側腹部腫瘍の）ｉ．ｔ．ＶＮＰ２０００９によって、ＶＮＰ２０００９（４．５５％）または抗ＰＤ－１ｍＡｂ（３．２６％）単独と比較して、浸潤性ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞（２３．４％）に対する非注射腫瘍における相乗効果がもたらされ；どちらの単剤療法もＰＢＳ（２．２４％）と異ならなかった（図３Ｅ）。右側腹部腫瘍におけるＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞のパーセンテージは、抗ＰＤ－１ｍＡｂ（６．０５％）とＰＢＳ処置（４．９２％）の両方と比較して、ＶＮＰ２０００９／抗ＰＤ－１ｍＡｂの組合せ（４７．５％）またはＶＮＰ２０００９（４１．９％）のいずれかによって増加し、ＶＮＰ２０００９／抗ＰＤ－１ｍＡｂの組合せでは、ＶＮＰ２０００９単独のものよりも高かった（図３Ｅ）。最後に、図３Ｅに示すように、各処置レジメンは、（対側左側腹部腫瘍の）ｉ．ｔ．ＰＢＳ注射と比較して以下の値で、腫瘍浸潤ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇのパーセンテージを減少させた：ＶＮＰ２０００９／抗ＰＤ－１ｍＡｂ（１４．２％）、ＶＮＰ２０００９（２２．２％）、抗ＰＤ－１ｍＡｂ（３１．４％）およびＰＢＳ（５０．５％）。注目すべきことに、Ｔｒｅｇ減少に対する効果は、ＶＮＰ２０００９／抗ＰＤ－１ｍＡｂマウスにおいて最大であり、ＶＮＰ２０００９は抗ＰＤ－１ｍＡｂよりも大きな効果を及ぼした。

[実施例４]
原発同種移植マウス神経鞘腫のｉ．ｔ．Ｓ．チフィムリウム（S. typhimurium）（ＶＮＰ２０００９）注射により、細菌非注射再チャレンジ神経鞘腫の増殖が抑制される。
神経鞘腫のｉ．ｔ．ＶＮＰ２０００９単独または抗ＰＤ－１ｍＡｂと組合せにより、持続的な抗腫瘍適応免疫応答が生成され得るかどうか調査するために、再チャレンジモデルを利用した。０８０３１－９マウス神経鞘腫細胞を、ＦＶＢ／Ｎマウスの左側腹部に移植し、図５Ａに概略的に示すよう以下の群に分けた：ｉ）ｉ．ｔ．ＶＮＰ２０００９、ｉｉ）ｉ．ｐ．抗ＰＤ－１－ｍＡｂＰ、ｉｉｉ）ｉ．ｔ．ＶＮＰ２０００９およびｉ．ｐ．抗ＰＤ－１ｍＡｂ、ならびにｉｖ）ｉ．ｔ．ＰＢＳ。平均腫瘍サイズが１５０ｍｍ^{３５０}に達したら（移植後８日目）、ｉ．ｔ．ＶＮＰ２０００９（１００μｌ中１０^４ＣＦＵ）を直接注射した。抗ＰＤ－１ｍＡｂ（２５０μｇ／注射）^５１を、腫瘍細胞移植後７、１０、１３、および１６日目にｉ．ｐ．投与した。図３に示される結果を複製すると、すべての処置レジメン、すなわちＶＮＰ２０００９／抗ＰＤ－１ｍＡｂ、ＶＮＰ２０００９、および抗ＰＤ－１ｍＡｂは、ＰＢＳと比較して腫瘍増殖を抑制し、ＶＮＰ２０００９と抗ＰＤ－１ｍＡｂを組み合わせることによる相加効果があった（図４Ｂ）。ｓ．ｃ．腫瘍の細菌注射から１２日後（および免疫チェックポイント阻害剤の最初の適用から１３日後）、動物を、対側坐骨神経に０８０３１－９ＦＣ神経鞘腫細胞を移植することによって再チャレンジさせた。同所性があり、効果を確認するのにバイアスがかかるため、これらの同種移植神経鞘腫は皮下よりも神経内でより急速に発生するため、坐骨神経内の場所が両方とも選択された。坐骨神経内腫瘍増殖を生物発光イメージングを介して監視し、ＰＢＳ対照と比較して、ＶＮＰ２０００９またはＶＮＰ２０００９／抗ＰＤ－１ｍＡｂで以前に処置したマウスにおいて腫瘍増殖が阻害され、これら２つの処置の間に差がないことが明らかになった（図４Ｄ）。抗ＰＤ－１ｍＡｂ単独での以前の処置では、ＰＢＳと比較して腫瘍増殖に変化がなかった（図４Ｄ）。特に、ｉ．ｔ．ＶＮＰ２０００９の抑制効果の規模は、原発性の細菌注射神経鞘腫（図４Ｂ）よりも再チャレンジ腫瘍（図４Ｄ）の方が大きいようである。

我々は、フローサイトメトリーによって、屠殺の時点で注射腫瘍および再チャレンジ腫瘍のＴ細胞組成を再び分析した。皮下原発腫瘍では、浸潤性ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞のパーセンテージが、ＰＢＳ注射対照（０．９９％）と比較して、ＶＮＰ２０００９（８．４７％）、抗ＰＤ－１ｍＡｂ（３．３９％）、および抗ＰＤ－１ｍＡｂとＶＮＰ２０００９との組合せ（９．３９％）によって増加しており；ＶＮＰ２０００９は抗ＰＤ１－ｍＡｂよりも大きな効果を及ぼしたが、チェックポイント阻害を細菌に加えた場合、細菌単独と比較して、影響の増加はなかった（図４Ｃ）。皮下腫瘍におけるＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞のパーセンテージも、ＰＢＳ注射（３．８３％）と比較して、ＶＮＰ２０００９（１１．２％）、抗ＰＤ－１ｍＡｂ（６．６９％）、およびＶＮＰ２０００９と抗ＰＤ－１ｍＡｂ（１５．５％）との組合せによって増加しており；この場合、免疫チェックポイント処置腫瘍よりも細菌注射腫瘍の方が増加が大きく、併用療法は細菌単独よりもＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導が大きかった（図４Ｃ）。対照的に、ＰＢＳ対照（１２．２％）と比較して、皮下腫瘍におけるＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞の割合は、全身性抗ＰＤ－１ｍＡｂ（１１．２％）によって変化しなかったが、ｉ．ｔ．ＶＮＰ２０００９注射（９．５２％）および細菌注射とチェックポイント阻害との組合せの両方により低下した（４．９０％；図４Ｃ）。腫瘍性Ｔｒｅｇに対する併用療法のこの抑制効果は、細菌処置単独の効果よりも大きかった（図４Ｃ）。

坐骨神経内再チャレンジ腫瘍におけるＴリンパ球集団の定量化により、原発皮下腫瘍とは異なる処置効果のパターンが明らかになった。ＰＢＳ対照動物（５．５９％）と比較して、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞のパーセンテージは、ＶＮＰ２０００９と抗ＰＤ－１ｍＡｂ（１３％）との組合せに以前に曝露されたマウスの腫瘍でのみ増加しており；以前のＶＮＰ２０００９（７．４９％）または抗ＰＤ－１ｍＡｂ単剤療法（６．９３％）の効果はなかった（図４Ｅ）。これらの再チャレンジ腫瘍では、ＰＢＳ対照（１１．５％）と比較して、ＶＮＰ２０００９（１４．１％）またはＶＮＰ２０００９／抗ＰＤ－１ｍＡｂの組合せ（２３．１％）で以前に処置したマウスでＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞のパーセンテージが増加しており；以前のチェックポイント阻害単独の効果はなかった（抗ＰＤ－１ｍＡｂ、１２．２％；図４Ｅ）。同様に、再チャレンジ腫瘍におけるＣＤ２５＋Ｔｒｅｇのパーセンテージは、ＰＢＳ対照マウス（１０．４％）と比較して、以前のＶＮＰ２０００９（６．０１％）またはＶＮＰ２０００９／抗ＰＤ－１ｍＡｂの組合せ（３．８２％）処置によって低下したが、抗ＰＤ－１ｍＡｂ（８．１６％）では低下しなかった（図４Ｅ）。再チャレンジ神経鞘腫におけるＴｒｅｇパーセンテージに対する以前の免疫チェックポイント阻害単独の効果はなかったが、ＶＮＰ２０００９に抗ＰＤ－１ｍＡｂを加えると、以前の細菌処置単独の抑制効果が増強された（図４Ｅ）。

[実施例５]
ｉ．ｔ．Ｓ．チフィムリウム（S. typhimurium）注射によって、同種移植マウス神経鞘腫の血管新生が抑制される
Ｓ．チフィムリウム（S. typhimurium）は、重要な血管新生促進因子である血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の発現を低下させ^５２、前臨床がんモデルにおいて抗血管新生特性を有することが示されている^{２４、５３}。ＶＥＧＦ－Ａに対する抗血管新生モノクローナル抗体であるベバシズマブは、神経鞘腫を有する個体のサブセットにおける神経鞘腫増殖を制御することができる^５４。これらの観察結果を考えて、腫瘍血管分布に対する弱毒化Ｓ．チフィムリウム（S. typhimurium）のｉ．ｔ．注射の効果を調査した。

坐骨神経内マウス０８０３１－９神経鞘腫を、弱毒化Ｓ．チフィムリウム（S. typhimurium）のｉ．ｔ．注射の２週間後に評価し、これは、ＰＢＳ注射対照と比較して腫瘍血管新生の阻害を実証していた。腫瘍血管新生を、血管内皮マーカーＣＤ３１＋の直接可視化および免疫組織化学によって評価した^５５（図５）。腫瘍の肉眼的評価（Ｎ＝６／マウス群）は、色が淡く、外部血管新生化は最小限であるか、非存在であるＳ．チフィムリウム（S. typhimurium）注射腫瘍と比較して、鮮赤色で顕著な外部血管分布を有するすべてのＰＢＳ注射神経鞘腫間で容易に区別できる差を示していた（図５）。ＶＮＰ２０００９注射腫瘍およびΔｐｐＧｐｐ注射腫瘍の両方とも、ＰＢＳ注射腫瘍（４５．７１±４．７５；図５、Ｎ＝３／群）と比較して、ＣＤ３１＋細胞の数が減少した（それぞれ７．７１±１．８９、Ｐ＜０．００１および８．４１±１．６８、Ｐ＜０．００１）。

[実施例６]
ｉ．ｔ．Ｓ．チフィムリウム（S. typhimurium）注射により、異種移植ヒトＮＦ１、ヒト散発性ＭＰＮＳＴ、およびヒト髄膜腫皮下腫瘍の増殖が抑制される。
免疫不全ｎｕ／ｎｕマウスの左側腹部に、ヒトＮＦ１関連（Ｓ４６２ＴＹ、図６Ａ）または散発性（ＳＴＳ２６、図６Ｂ）の悪性末梢神経鞘腫瘍細胞（ＭＰＮＳＴ）を皮下移植した^５６ヒトＮＦ－１異種移植モデルの増殖に対する、ｉ．ｔ．Ｓ．チフィムリウム（S. typhimurium）（ＶＮＰ２０００９およびΔｐｐＧｐｐ）注射の効果もまた評価した。さらに、ｉ．ｔ．Ｓ．チフィムリウム（S. typhimurium）の有効性を、ｎｕ／ｎｕマウスに良性髄膜腫（Ｂｅｎ－Ｍｅｎ－１、図６Ｃ）または悪性髄膜腫（ＣＨ－１５７ＭＮ、図６Ｄ）細胞株を移植した皮下移植異種移植モデルで証明した。試験モデルでは、マウスを３群（ｎ＝５）に分けた：ＶＮＰ２０００９またはΔｐｐＧｐｐ（１００μｌ中１０^４ＣＦＵ）対ＰＢＳ注射対照。腫瘍塊が肉眼で見えるようになったら腫瘍内注射を実施して、腫瘍増殖をノギス測定によって監視した。

ＮＦ－１異種移植モデルでは、我々のデータは、ｉ．ｔ．ＰＢＳ注射と比較して、ＶＮＰ２０００９またはΔｐｐＧｐｐのいずれかを用いてｉ．ｔ．注射すると、ＮＦ－１関連Ｓ４６２ＴＹＭＰＮＳＴ細胞の腫瘍増殖が有意に抑制され（Ｐ＜０．００１、図６Ａ）、急速に増殖する散発性ＳＴＳ２６ＴＭＰＮＳＴ細胞の腫瘍増殖が制御された（Ｐ＜０．００１、図６Ｂ）ことを示した。屠殺の時点で（Ｓ４６２ＴＹの場合は３１日目およびＳＴＳ２６Ｔの場合は３０日目）、およびＰＢＳ対照と比較して、ＶＮＰ２０００９およびΔｐｐＧｐｐ注射マウスは、Ｓ４６２ＴＹおよびＳＴＳ２６Ｔモデルでそれぞれ、およそ７分の１および４分の１の腫瘍サイズを示した。

同様に、髄膜腫異種移植モデルでは、ＶＮＰ２０００９またはΔｐｐＧｐｐのいずれかのｉ．ｔ．注射によって、ＰＢＳ対照と比較して、良性（Ｂｅｎ－Ｍｅｎ－１、図６Ｃ）髄膜腫の腫瘍増殖が有意に退縮し、悪性（ＣＨ－１５７、図６Ｄ）髄膜腫の腫瘍増殖が制御された。良性モデルでは、ＶＮＰ２０００９Ｓ．チフィムリウム（S. typhimurium）またはΔｐｐＧｐｐＳ．チフィムリウム（S. typhimurium）のいずれかの注射を受けたマウスにおいて、屠殺の日（３８日目）に、５匹中２匹のマウスが完全な退縮を示した。悪性髄膜腫の屠殺の日に、ＰＢＳ対照と比較して、ＶＮＰ２０００９およびΔｐｐＧｐｐ注射マウスでは、腫瘍サイズがおよそ３分の１であった。対照群の腫瘍が潰瘍化／壊死した２３日目に、実験を停止した。

参考文献

その他の実施形態
本発明を、その詳細な説明と併せて説明してきたが、前述の説明は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を説明することを意図し、限定するものではないことを理解すべきである。その他の態様、利点、および改変は、以下の特許請求の範囲内にある。

本発明の様々な実施形態を以下に示す。
１．良性神経系腫瘍を有するかまたは有するリスクのある対象を処置する方法であって、任意選択で免疫チェックポイント阻害剤および／または血管新生阻害剤と組み合わせた、生弱毒化サルモネラ（Salmonella）細菌を含む治療有効量の組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
２．前記対象が、神経線維腫症１（ＮＦ１）；神経線維腫症２（ＮＦ２）；シュワノマトーシス；髄膜腫；神経鞘腫；前庭神経鞘腫；散発性神経鞘腫；神経線維腫；神経線維腫症（ＮＦ）；もしくはそれらの任意の組合せからなる群から選択される良性腫瘍または腫瘍関連状態を有するかまたは有すると診断された対象である、上記１に記載の方法。
３．前記対象が、悪性固形腫瘍を有していない、上記１に記載の方法。
４．前記対象が、良性神経系腫瘍のリスクの増加に関連する状態を有する、上記１に記載の方法。
５．良性神経系腫瘍のリスクの増加に関連する前記状態が、神経線維腫症１（ＮＦ１）；神経線維腫症２（ＮＦ２）；またはシュワノマトーシスである、上記４に記載の方法。
６．前記弱毒化サルモネラ（Salmonella）が、腫瘍内または静脈内に投与される、上記１に記載の方法。
７．前記弱毒化サルモネラ（Salmonella）が、Ｓ．チフィムリウム（S. typhimurium）の弱毒化菌株である、上記１から６のいずれかに記載の方法。
８．Ｓ．チフィムリウム（S. typhimurium）の前記弱毒化菌株が、修飾リピドＡ（ｍｓｂＢ－）およびプリン栄養要求性突然変異（ｐｕｒＩ－）を伴う、サルモネラ・エンテリカ血清型チフィムリウム（Salmonella enterica serovar typhimurium）菌株ＶＮＰ２０００９である、上記７に記載の方法。
９．前記組成物が、クロストリジウム・ノビー（Clostridium novyi）を含まない、上記１に記載の方法。
１０．前記弱毒化サルモネラ（Salmonella）が、細胞内誘導性サルモネラ（Salmonella）プロモーターに作動可能に連結された溶菌遺伝子またはカセットを含まない、上記１に記載の方法。
１１．前記チェックポイント阻害剤が、ＰＤ－１またはＣＴＬＡ－４シグナル伝達の阻害剤である、上記１に記載の方法。
１２．ＰＤ－１シグナル伝達の前記阻害剤が、ＰＤ－１、ＣＤ４０、ＰＤ－Ｌ１、またはＣＴＬＡ－４に結合する抗体である、上記１１に記載の方法。
１３．前記血管新生阻害剤が、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）またはその受容体（ＶＥＧＦＲ）の阻害剤である、上記１に記載の方法。
１４．ＶＥＧＦの前記阻害剤がベバシズマブである、上記１１に記載の方法。
１５．良性神経系腫瘍を有するかまたは有するリスクのある対象を処置する方法における使用のための、任意選択でチェックポイント阻害剤および／または血管新生阻害剤と組み合わせた、生弱毒化サルモネラ（Salmonella）細菌を含む組成物。
１６．前記対象が、神経線維腫症１（ＮＦ１）；神経線維腫症２（ＮＦ２）；シュワノマトーシス；髄膜腫；神経鞘腫；前庭神経鞘腫；散発性神経鞘腫；神経線維腫；神経線維腫症（ＮＦ）；もしくはそれらの任意の組合せからなる群から選択される良性腫瘍または腫瘍関連状態を有するかまたは有すると診断された対象である、上記１５に記載の使用のための組成物。
１７．前記対象が、悪性固形腫瘍を有していない、上記１５に記載の使用のための組成物。
１８．前記対象が、良性神経系腫瘍のリスクの増加に関連する状態を有する、上記１５に記載の使用のための組成物。
１９．良性神経系腫瘍のリスクの増加に関連する前記状態が、神経線維腫症１（ＮＦ１）；神経線維腫症２（ＮＦ２）；またはシュワノマトーシスである、上記１８に記載の使用のための組成物。
２０．前記弱毒化サルモネラ（Salmonella）が、腫瘍内または静脈内に投与されるように製剤化される、上記１５に記載の使用のための組成物。
２１．前記弱毒化サルモネラ（Salmonella）が、Ｓ．チフィムリウム（S. typhimurium）の弱毒化菌株である、上記１５から２０のいずれかに記載の使用のための組成物。
２２．Ｓ．チフィムリウム（S. typhimurium）の前記弱毒化菌株が、修飾リピドＡ（ｍｓｂＢ－）およびプリン栄養要求性突然変異（ｐｕｒＩ－）を伴う、サルモネラ・エンテリカ血清型チフィムリウム（Salmonella enterica serovar typhimurium）菌株ＶＮＰ２０００９である、上記２１に記載の使用のための組成物。
２３．前記組成物が、クロストリジウム・ノビー（Clostridium novyi）を含まない、上記１５に記載の使用のための組成物。
２４．前記弱毒化サルモネラ（Salmonella）が、細胞内誘導性サルモネラ（Salmonella）プロモーターに作動可能に連結された溶菌遺伝子またはカセットを含まない、上記１５に記載の使用のための組成物。
２５．前記チェックポイント阻害剤が、ＰＤ－１またはＣＴＬＡ－４シグナル伝達の阻害剤である、上記１５に記載の使用のための組成物。
２６．ＰＤ－１またはＣＴＬＡ－４シグナル伝達の前記阻害剤が、ＰＤ－１、ＣＤ４０、ＰＤ－Ｌ１、またはＣＴＬＡ－４に結合する抗体である、上記２５に記載の使用のための組成物。
２７．前記血管新生阻害剤が、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）またはその受容体（ＶＥＧＦＲ）の阻害剤である、上記１５に記載の前記使用のための組成物。
２８．ＶＥＧＦの前記阻害剤がベバシズマブである、上記１５に記載の使用のための組成物。

Claims

良性神経系腫瘍を有する対象を処置する方法における使用のための、生弱毒化サルモネラ（Salmonella）細菌を含む組成物であって、前記良性神経系腫瘍が、髄膜腫または神経鞘腫である、前記組成物。
前記対象が、悪性固形腫瘍を有していない、請求項１に記載の組成物。
前記弱毒化サルモネラ（Salmonella）が、腫瘍内または静脈内に投与されるように製剤化される、請求項１に記載の組成物。
前記弱毒化サルモネラ（Salmonella）が、Ｓ．チフィムリウム（S. typhimurium）の弱毒化菌株である、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
Ｓ．チフィムリウム（S. typhimurium）の前記弱毒化菌株が、修飾リピドＡ（ｍｓｂＢ－）およびプリン栄養要求性突然変異（ｐｕｒＩ－）を伴う、サルモネラ・エンテリカ血清型チフィムリウム（Salmonella enterica serovar typhimurium）菌株ＶＮＰ２０００９である、請求項４に記載の組成物。
前記組成物が、クロストリジウム・ノビー（Clostridium novyi）を含まない、請求項１に記載の組成物。
前記弱毒化サルモネラ（Salmonella）が、細胞内誘導性サルモネラ（Salmonella）プロモーターに作動可能に連結された溶菌遺伝子またはカセットを含まない、請求項１に記載の組成物。
前記組成物が、ＰＤ－１、ＣＤ４０、ＰＤ－Ｌ１、またはＣＴＬＡ－４に結合する抗体と組み合わせた、前記生弱毒化サルモネラ細菌を含むものである、請求項１に記載の組成物。
前記組成物が、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）またはその受容体（ＶＥＧＦＲ）の阻害剤と組み合わせた、前記生弱毒化サルモネラ細菌を含むものである、請求項１または８に記載の組成物。
前記ＶＥＧＦの阻害剤がベバシズマブである、請求項９に記載の組成物。