JP7713221B2 - マルチウェルプレート、ウェルプレートキット、及び、タンパク質の結晶化方法 - Google Patents

Description

本発明は、マルチウェルプレート、ウェルプレートキット、及び、タンパク質の結晶化方法に関する。

タンパク質の機能の発現の研究には、タンパク質の結晶構造の解析がますます重要になってきている。このようなタンパク質の結晶構造の解析には、良質なタンパク質結晶を得ることが不可欠であるものの、結晶化条件に関する情報が乏しいタンパク質では、その条件の探索だけでも非常に煩雑となることもあり、探索の自動化や、多様な条件を短時間のうちに試行できる方法や装置の開発が進められている。

従来から、タンパク質の結晶化方法は複数知られているが、少ない量のタンパク質から多数の結晶化条件を試行できる点で、蒸気拡散法が多く用いられている。蒸気拡散法に用いる器具としては、操作が簡単で、自動化にも親和性が高いマルチウェルプレートが用いられる場合がある。

このようなウェルプレートとして、特許文献１には、「複数のウェルが内部に形成されたフレームを有するマルチウェルプレートであって、それぞれのウェルが、相対的に大きい容積を有する第一のウェル、および相対的に小さい容積を有し、前記第一のウェルの少なくとも一部の上方に位置するように配置される第二のウェル、を有してなることを特徴とするマルチウェルプレート。」が記載されている。

また、特許文献２には、「結晶化の実験を行う際に使用するためのキットにおいて、それぞれ結晶化溶液を受け入れるために上端が開口している複数のくぼみを有する事前充填された結晶化プレートと、前記くぼみの中の前記結晶化溶液を一時的に気密密封して、前記事前充填された結晶化プレートを利用前に安全に移送し取り扱うことができるようにするための、前記各くぼみにその上端から或る距離だけ下方に窪ませた個別のシールを含んでいる第１ 水準のシールと、前記個別のシールが破られた後で蒸気拡散が起きるようにすることを目的に、前記くぼみの前記第１水準のシールの上方を密封できるようにするための、前記プレート上の前記第１水準のシールの上方の密封面を含んでいる第２ 水準のシールと、を備えているキット。」が記載されている。

特表２００６－５１４５８０号公報 特表２００６－５２５８６４号公報

タンパク質の結晶構造の解析においては、結晶内の環境を生体内の環境と大きく異ならない様に調整し、タンパク質の活性を維持することが重要と考えられている。タンパク質の中には、酸化によって活性を速やかに失うようなものも知られており、このようなタンパク質の良質な結晶を得るためには還元状態での結晶化条件の探索が不可欠だった。

従来、上記のような還元状態の結晶化条件の探索には、嫌気グローブボックス内に必要な器具、及び、装置を載置して実験を行う必要があり、装置が大掛かりで、かつ、作業効率も悪く、多数の条件を迅速に試行するには、改善の余地があった。

そこで、本発明は、還元状態におけるタンパク質の結晶化条件の探索、及び、その結晶化を容易に実施できるマルチウェルプレートを提供することを課題とする。
また、本発明は、ウェルプレートキット、及び、タンパク質の結晶化方法を提供することも課題とする。

本発明者らは、上記課題を達成すべく鋭意検討した結果、以下の構成により上記課題を達成することができることを見出した。

［１］ 複数のウェルが内部に形成されたフレームを有するマルチウェルプレートであって、隣接する一対の上記ウェル間での蒸気拡散を可能にするための連通部と、隣接する上記一対のウェルの一方の底部に電極と、を有する、マルチウェルプレート。
［２］ 上記電極を有するウェルの断面積が、上記底部から、上記ウェルの開口部へと向かう深さ方向に沿って漸増する、［１］に記載のマルチウェルプレート。
［３］ タンパク質の結晶化用である、［１］又は［２］に記載のマルチウェルプレート。
［４］ ［１］～［３］のいずれかに記載のマルチウェルプレートと、上記ウェルを密封するためのシールとを備える、ウェルプレートキット。
［５］ 上記シール、及び、上記フレームからなる群より選択される少なくとも一方が透光性を有する、［４］に記載のウェルプレートキット。
［６］ 複数のウェルが内部に形成されたフレーム、隣接する一対の上記ウェル間での蒸気拡散を可能にするための連通部、及び、隣接する上記一対のウェルの一方の底部に電極と、を有する、マルチウェルプレートの一対のウェルの一方にタンパク質溶液を収容し、他方に試薬液を収容し、上記ウェルを密封することと、
上記電極の電位を負に調整することと、上記一対のウェル間での蒸気拡散によって、上記タンパク質の結晶を形成することと、を含む、タンパク質の結晶化方法。

本発明によれば、還元状態におけるタンパク質の結晶化条件の探索、及び、その結晶化を容易に実施できるマルチウェルプレートが提供できる。また、本発明によれば、タンパク質の結晶化方法も提供できる。

本発明のマルチウェルプレートは、蒸気拡散が可能な一対のウェルの一方の底部に電極を有する点に特徴点の一つがある。このように構成されたマルチウェルプレートでは、電極を有するウェルにタンパク質溶液を収容し、他方のウェルに試薬液（典型的には高濃度の塩溶液）を収容し、電極に負の電位を印加することで、タンパク質を還元状態としながら蒸気拡散法による結晶化実験が実施できる。

また、上記電極を有するウェルの断面積が、上記底部から、上記ウェルの開口部へと向かう深さ方向に沿って漸増する場合、収容されたタンパク質溶液が底部へと集まりやすく、電極と接触しやすい点で好ましい。タンパク質の結晶化条件の探索や結晶化の実験において、使用できるタンパク質溶液の量には制限がある場合が多い。そのような、少ない量のタンパク質溶液であっても、上記構成によって、確実に電極に接触させることができ、より優れた本発明の効果が得られる。

本発明のウェルプレートキットは、上記マルチウェルプレートと、上記ウェルプレートが有するウェルを密封するためのシールとを備える。このように構成されたマルチウェルプレートによれば、従来、嫌気グローブボックス内で行われていた還元状態のタンパク質の結晶化条件の探索、及び、結晶化を、より簡易な装置、及び、より操作のしやすい環境で行うことができる。

また、シール、及び／又は、フレームが透光性を有する場合、結晶化の進捗を観察できる点で好ましい。

本発明のタンパク質結晶化方法は、複数のウェルが内部に形成されたフレーム、隣接する一対の上記ウェル間での蒸気拡散を可能にするための連通部、及び、隣接する上記一対のウェルの一方の底部に電極と、を有する、マルチウェルプレートの一対のウェルの一方にタンパク質溶液を収容し、他方に試薬液を収容し、ウェルを密封することと、電極の電位を負に調整することと、一対のウェル間での蒸気拡散によって、タンパク質の結晶を形成することと、を含む。

上記方法によれば、タンパク質溶液に対して常に負の電位を印加しながら結晶化条件の探索、及び、結晶化をより簡単に行うことができる。

本発明の実施形態に係るマルチウェルプレートの平面図である。 本発明の実施形態に係るマルチウェルプレートのＡ－Ａ′部分の拡大図である。 本発明の実施形態に係るマルチウェルプレートのＡ－Ａ′部分の底面である。 本発明の実施形態に係るマルチウェルプレートのＢ－Ｂ′断面図である。

以下、本発明について詳細に説明する。
以下に記載する構成要件の説明は、本発明の代表的な実施形態に基づいてなされることがあるが、本発明はそのような実施形態に制限されるものではない。
なお、本明細書において、「～」を用いて表される数値範囲は、「～」の前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む範囲を意味する。

図１は、本発明の実施形態に係るマルチウェルプレートの平面図であり、図２は、Ａ－Ａ′部分の拡大図であり、図３は、Ａ－Ａ′部分の底面図であり、図４はＢ－Ｂ′断面図である。

マルチウェルプレート１０には、試料を収容するためのウェル１１の配列を有する。マルチウェルプレート１０は通常、フレーム１２内で互いに垂直な行と列のマトリクスで配置される。
マルチウェルプレート１０のウェル１１は、８×１２の９６ウェルのマトリクスで配置されているが、ウェルの配置は上記に制限されない。
上記外にも、例えば、４×６（２４ウェル）、１６×２４（３８４ウェル）、及び、３２×４８（１５３６ウェル）の配置等が挙げられる。

マルチウェルプレート１０のそれぞれのウェル１１は、隣り合う２つのウェル１１が対を成しており、平面視で左側方がタンパク質ウェル１３、右側方がリザーバウェル１４となっている。
なお、マルチウェルプレート１０においては平面視で左右の隣り合うウェル１１が対になっているが、本発明のマルチウェルプレートとしては上記に制限されず、平面視で上下のウェル１１が対を成していてもよい。

タンパク質ウェル１３は、底部から開口へと向かう厚み方向に沿って断面積が漸増するテーパー状の側壁を有しており、底部には電極セット１８が配置されている。
なお、タンパク質ウェル１３は底部から開口へと向かう厚み方向に沿って、断面積が漸増する部分と、断面積が略同一な部分とを有しているが、本発明のマルチウェルプレート１０が有するタンパク質ウェル１３の側壁の形態としては上記に制限されず、側壁の全体がテーパーを有する、つまり、底部から開口へと向かう厚み方向の全体にわたって厚みが増大する形態（例えば、すり鉢状の形態）であってもよい。

このように開口から底部へと向かって順次、断面積が絞られていく形態のタンパク質ウェル１３によれば、タンパク質溶液４３の量が少ない場合であっても、ピペッティングされたタンパク質溶液４３が、電極セット１８と接触しやすい。

リザーバウェル１４は、垂直な側壁と底により区画されているが、リザーバウェル１４の形状としては上記に制限されない。

なお、タンパク質ウェル１３の底部とリザーバウェル１４の底部とは断面視でマルチウェルプレート１０の厚み方向に関して略同一の高さに形成されているが、上記に制限されず、タンパク質ウェル１３の底部が、リザーバウェル１４の底部より高い（断面視で上方）位置に配置されていてもよい。

電極セット１８は、３つの電極１５～１７からなり、それぞれ、検体に電位を印加するための作用電極１５、対電極１６、及び、参照電極１７からなる。
これらの各電極は、マルチウェルプレート１０の厚み方向に沿って設けられた図示しない貫通孔を介して、マルチウェルプレート１０裏面のコネクタ３３～３５とそれぞれ接続されている。なお、図３における領域３０は、タンパク質ウェル１３の位置に、領域３１は、リザーバウェル１４の位置に対応している。
各コネクタは、典型的には個別にポテンシオスタットに接続され、各ウェル１１毎に定められた条件に従って作用電極１５の電位を制御する。

なお、マルチウェルプレート１０が有する電極セット１８は３個の電極１５～１７を有しているが、本発明のマルチウェルプレート１０が有する電極セット１８は上記に制限されず、２個以上の電極から形成されていればよく、４個以上の電極から形成されていてもよい。電極の数は、一般に１０個以下が好ましい。

タンパク質ウェル１３とリザーバウェル１４とは、ウェル１１の深さ方向の中途に設けられ、タンパク質ウェル１３とリザーバウェル１４との間での蒸気拡散を可能にするための連通部１９が設けられている。連通部１９の形状、及び、位置は特に制限されず、タンパク質溶液４３と試薬液４４とが互いに混合せず、かつ、上記のやり取りが可能であればよい。

次に、マルチウェルプレート１０の使用方法について説明する。
まず、試薬液４４がリザーバウェル１４に収容される。典型的には、試薬液４４は高濃度の塩溶液である。次に、タンパク質溶液４３が１３タンパク質ウェルに収容される。次に、マルチウェルプレート１０の上部がシールされる。

次に、作用電極１５の電位が制御され、タンパク質溶液４３に負の電位が印加される。印加される電位は０Ｖ未満であれば特に制限されないが、例えば、銀／塩化銀電極を基準として、電位窓の下限値を超える電位であって、０Ｖ未満であることが好ましい。
作用電極１５の電位を、電位窓の下限値を超える電位に制御することによって、カソード反応で水素が発生するのが抑制され、タンパク質が還元状態に保持されやすく、より優れた本発明の効果が得られる。

このようにすると、蒸気拡散過程によって、タンパク質溶液４３は試薬液４４と相互作用してタンパク質結晶が得られる。この際も、作用電極１５の電位を負に維持することによって、還元状態でタンパク質の結晶化を行い、結晶化したタンパク質も還元状態に維持できる。

本発明のマルチウェルプレートによれば、還元状態におけるタンパク質の結晶化条件の探索を、グローブボックスを使用しなくても行うことができる。本発明のマルチウェルプレートによれば、多くの結晶化条件を同時並行的に試行できるため、特に、生体由来のタンパク質の機能研究のための優れた実験器具となる。

１０ ：マルチウェルプレート
１１ ：ウェル
１２ ：フレーム
１３ ：タンパク質ウェル
１４ ：リザーバウェル
１５ ：作用電極
１６ ：対電極
１７ ：参照電極
１８ ：電極セット
１９ ：連通部
３３、３４、３５ ：コネクタ
４３ ：タンパク質溶液
４４ ：試薬液

Claims (7)

1. 複数のウェルが内部に形成されたフレームを有するタンパク質の結晶化用マルチウェルプレートであって、
   隣接する一対の前記ウェル間での蒸気拡散を可能にするための連通部と、
   隣接する前記一対のウェルの一方の底部に設けられた電極と、
   前記底部に形成された貫通孔と、
   前記貫通孔を介して前記電極に接続されたコネクタと、
   前記コネクタが設けられた裏面と、を有する、マルチウェルプレート。
2. 平面視で前記底部の中央に前記電極が設けられ、
   断面視で前記中央の高さが前記底部の周縁よりも低い、
   請求項１に記載のマルチウェルプレート。
3. 前記電極は作用電極である、請求項１又は２に記載のマルチウェルプレート。
4. 請求項１～３のいずれか１項に記載のマルチウェルプレートと、前記ウェルを密封するためのシールとを備える、ウェルプレートキット。
5. 前記シール、及び、前記フレームからなる群より選択される少なくとも一方が透光性を有する、請求項４に記載のウェルプレートキット。
6. 複数のウェルが内部に形成されたフレーム、隣接する一対の前記ウェル間での蒸気拡散を可能にするための連通部、及び、隣接する前記一対のウェルの一方の底部に設けられた電極とを有するマルチウェルプレートの前記一対のウェルのうち、前記電極が設けられた一方のウェルにタンパク質溶液を収容し、他方に試薬液を収容し、前記ウェルを密封することと、
   前記底部に形成された貫通孔を介して前記電極に接続されたコネクタに対し負の電位を印加し、前記タンパク質溶液を還元状態にすることと、
   前記一対のウェル間での蒸気拡散によって、前記タンパク質の結晶を形成することと、を含む、タンパク質の結晶化方法。
7. 平面視で前記底部の中央に前記電極が設けられ、
   断面視で前記中央の高さが前記底部の周縁よりも低い、
   請求項６に記載のタンパク質の結晶化方法。