JP7779905B2 - ホログラフィー装置及び細胞の評価方法 - Google Patents

Description

開示の技術は、ホログラフィー装置及びホログラフィー装置を用いた細胞の評価方法に関する。

デジタルホログラフィ技術を用いた細胞の評価方法に関する技術として、以下の技術が知られている。例えば、国際公開第２０１９／１７６４２７号には、複数の細胞の凝集体である細胞を撮像したホログラムから細胞の位相差画像を生成し、位相差画像と細胞の形状に応じた形状指標値とに基づいて、細胞の状態を判定する判定方法が記載されている。

また、物体光と参照光との干渉性の低下を回避する技術として、以下の技術が知られている。例えば、特開２００３－１５５０９号公報には、ホログラム用記録媒体に対してレーザ光を物体光及び参照光として照射して、ホログラム画像を露光記録する露光記録手段と、ホログラム用記録媒体を透過したレーザ光の偏光状態を検出する偏光状態検出手段と、 ホログラム用記録媒体における記録層上での物体光と参照光との干渉性が最も高くなるように、偏光状態検出手段による検出結果に基づいて、ホログラム用記録媒体に対して入射させるレーザ光の偏光状態を変化させる偏光状態可変手段とを備えることを特徴とする画像露光記録装置が記載されている。偏光状態検出手段として、光学素子である偏光板と、強度検出手段であるフォトディテクタとが用いられる。

デジタルホログラフィ技術を用いた細胞の評価においては、例えば、シャーレ等の光透過性を有する基板上に培養された細胞に物体光が照射される。細胞及び基板を透過した物体光と、物体光に対してコヒーレントな参照光との干渉によって生じる干渉像（ホログラム）が撮像装置によって撮像される。干渉像の画像データについて、光伝搬に基づく数値計算を実施することによって、細胞を透過した光波の波面が復元される。デジタルホログラフィ技術によれば、細胞の三次元情報を取得することができる。

本発明者は、ホログラフィー技術を用いて取得される干渉像のコントラストが、基板上の位置依存性を有して低下すること、すなわち、干渉像のコントラストのバラツキが大きくなることを発見した。なお干渉像においてコントラストが低いとは、干渉縞の明暗差が小さいことを意味する。コントラストの低下が光学系に起因するものである場合、干渉像は細胞の情報を正確に表しているとはいえず、このような干渉像に基づいて細胞の評価を行うのは適切ではないと考えられる。特に、胚細胞等の個別評価を行うことが必要となる細胞の評価においては、測定誤差の増大は大きな問題となる。

本発明者は、鋭意検討の結果、干渉像のコントラストのバラツキは、シャーレ等の細胞が培養される基板の複屈折に起因することを見出した。図１に示すように、干渉像は、細胞６０及び基板６１を透過した物体光Ｌ１と、物体光に対してコヒーレントな参照光Ｌ２とが合波されることにより形成される。物体光Ｌ１と参照光Ｌ２とを干渉させるためには、物体光Ｌ１及び参照光Ｌ２が、それぞれ直線偏光であり且つ偏光方向（偏光軸）が揃っている必要がある。しかしながら、物体光Ｌ１が基板６１を透過する際に、複屈折を生じ、物体光は楕円偏光となる。これにより、物体光Ｌ１の偏光軸が回転し、物体光Ｌ１の偏光方向と参照光Ｌ２の偏光方向とが揃わなくなる。その結果、物体光Ｌ１と参照光Ｌ２とのコヒーレンス性が低下して干渉像のコントラストが低下する。基板６１上の位置によって複屈折の大きさは異なるため、干渉像のコントラストは、基板６１上の物体光Ｌ１の照射位置に応じて変化する。

開示の技術は、上記の点に鑑みてなされたものであり、ホログラフィー技術を用いて取得される干渉像のコントラストのバラツキを抑制することを目的とする。

開示の技術に係るホログラフィー装置は、物体光と参照光との干渉による干渉像を形成する光学系であって、物体光又は参照光の光路上に配置された位相子と、物体光又は参照光の光軸を回転軸として位相子を回転させる回転機構とを含む光学系と、干渉像を撮像する撮像部と、撮像部によって撮像された干渉像について評価値を導出し、評価値に基づいて回転機構の回転位置を制御する制御部と、を含む。

評価値は、干渉像の画素値の標準偏差又は分散であってもよく、制御部は、評価値が最大となるように回転機構の回転位置を制御してもよい。位相子は半波長板であってもよい。

光学系は、物体光の光路上に配置された偏光子と、参照光の光路上に配置され、参照光の光量を減衰させる減衰器と、を更に含んでいてもよい。制御部は、撮像部によって撮像された物体光による像の輝度と参照光による像の輝度との差が所定範囲内となるように、減衰器における減衰量を制御してもよい。

開示の技術に係る細胞の評価方法は、上記のホログラフィー装置を用いた細胞の評価方法であって、物体光に対して透過性を有する基板上に培養された細胞を、物体光の光路上に配して、基板及び細胞を透過した物体光と、参照光との干渉による干渉像を取得し、干渉像から位相画像を生成し、位相画像を用いて細胞を評価することを含む。

位相画像は、基板及び細胞を透過した物体光と参照光との干渉による干渉像であって、干渉像の画素値の標準偏差又は分散が最大となるように回転機構の回転位置を制御した状態で撮像された干渉像から生成されることが好ましい。

開示の技術によれば、ホログラフィー技術を用いて取得される干渉像のコントラストのバラツキを抑制することが可能となる。

ホログラフィー技術を用いて取得される干渉像が生成される過程の一例を示す図である。 開示の技術の実施形態に係るホログラフィー装置の構成の一例を示す図である。 開示の技術の実施形態に係る制御部が実行する処理の流れの一例を示すフローチャートである。 開示の技術の実施形態に係る位相子の回転位置と、干渉像の画像データの画素値の標準偏差との関係の一例を示すグラフである。 開示の技術の実施形態に係るホログラフィー装置の構成の一例を示す図である。 開示の技術の実施形態に係るホログラフィー装置の構成の一例を示す図である。 開示の技術の実施形態に係るホログラフィー装置の構成の一例を示す図である。 開示の技術の実施形態に係る制御部が実行する処理の流れの一例を示すフローチャートである。 干渉像の撮像位置に対応するウェルナンバー毎の標準偏差を、装置間で比較した結果を示すグラフである。 基板の３６か所について取得された画素値の標準偏差の平均値、最大値、最小値を装置間で比較した結果を示すグラフである。 凝集体の干渉像の一例を示す図である。 凝集体のフーリエ変換画像の一例を示す図である。 凝集体のアンラッピング前の位相差画像の一例を示す図である。 凝集体のアンラッピング後の位相差画像の一例を示す図である。 開示の技術の実施形態に係る位相差画像の概念を示す図である。 凝集体の体積と総位相量の相関特性を取得した結果示すグラフである。

以下、本発明の実施形態の一例を、図面を参照しつつ説明する。なお、各図面において同一または等価な構成要素及び部分には同一の参照符号を付与し、重複する説明は適宜省略する。

［第１の実施形態］
図２は、開示の技術の第１の実施形態に係るホログラフィー装置１０の構成の一例を示す図である。ホログラフィー装置１０は、レーザ光源２０、光学系２００、撮像部４０及び制御部５０を含んで構成されている。光学系２００は、物体光Ｌ１と参照光Ｌ２との干渉による干渉像を形成するように構成されており、分波器２１、反射ミラー２２、２４、対物レンズ２３、結像レンズ２５、合波器２６、位相子３０及び回転機構３１を含んでいる。本実施形態に係るホログラフィー装置１０は細胞の評価に用いることが可能である。評価対象の細胞６０は、基板６１上で培養され、基板６１に接着又は基板６１から浮遊した状態で反射ミラー２２と対物レンズ２３との間に配置される。細胞６０の種類は特に限定されないが、例えば、細胞毎の個別評価を行うことが要求され得る胚細胞であってもよい。

レーザ光源２０には、例えば波長６３２．８ｎｍのＨｅＮｅレーザを用いることが可能である。レーザ光源２０から出射された直線偏光であるレーザ光Ｌ０は、分波器２１によって２つのレーザ光に分割される。２つのレーザ光の一方は物体光Ｌ１とされ、他方は参照光Ｌ２とされる。分波器２１としてビームスプリッタを用いることができる。物体光Ｌ１は、回転機構３１に保持された位相子３０を経由して反射ミラー２２に入射する。反射ミラー２２によって進行方向が曲げられた物体光Ｌ１は、基板６１上の細胞６０に照射される。

基板６１は、シャーレ及びウェルプレート等の細胞培養において一般的に用いられる容器を構成するものであってもよい。基板６１は、例えばポリスチレン等の物体光Ｌ１に対して透過性を有する材料によって構成されている。基板６１はポリスチレン以外のプラスチック又はガラスによって構成されていてもよい。細胞６０及び基板６１を透過した物体光Ｌ１による像は、対物レンズ２３によって拡大される。対物レンズ２３を透過した物体光Ｌ１は、反射ミラー２４によって進行方向が曲げられて、結像レンズ２５を介して合波器２６に入射する。一方、参照光Ｌ２も合波器２６に入射する。物体光Ｌ１及び参照光Ｌ２は合波器２６によって合波され、撮像部４０の撮像面に結像される。合波器２６としてビームスプリッタを用いることができる。

物体光Ｌ１と参照光Ｌ２との干渉によって生じる干渉像（ホログラム）が撮像部４０によって撮像される。撮像部４０は、ＣＭＯＳ（Complementary Metal-Oxide-Semiconductor）イメージセンサ等の撮像素子を備え、干渉像の画像データを生成する。干渉像の画像データは制御部５０に供給される。

位相子３０は、物体光Ｌ１の光路上の分波器２１と反射ミラー２２の間に配置されている。位相子３０は、物体光Ｌ１の偏光方向を変化させる機能を有する。すなわち、位相子３０は、入射光の偏光方向を、位相子３０の回転位置に応じた方向に変化させて出射する。位相子３０は、例えば１／２波長板（λ/２板）であってもよい。回転機構３１は、制御部５０から供給される制御信号に基づいて、物体光Ｌ１の光軸を回転軸として位相子３０を回転させる。位相子３０を回転させることで、位相子３０を透過した物体光Ｌ１の偏光方向を任意の方向に定めることが可能である。

物体光Ｌ１と参照光Ｌ２とによる干渉像は、細胞６０及び基板６１を透過した物体光Ｌ１と参照光Ｌ２とが合波されることにより形成される。物体光Ｌ１と参照光Ｌ２とを干渉させるためには、物体光Ｌ１及び参照光Ｌ２が、それぞれ直線偏光であり且つ偏光方向（偏光軸）が揃っている必要がある。しかしながら、基板６１が複屈折を生じさせる材料で構成されている場合、物体光Ｌ１が基板６１を透過する際に複屈折を生じ、物体光Ｌ１は楕円偏光となる。これにより、物体光Ｌ１の偏光軸が回転し、物体光Ｌ１の偏光方向と参照光Ｌ２の偏光方向とが揃わなくなる。その結果、物体光Ｌ１と参照光Ｌ２とのコヒーレンス性が低下して干渉像のコントラストが低下する。しかしながら、位相子３０を回転させることによって物体光Ｌ１の偏光方向を変化させることで、物体光Ｌ１の偏光方向を参照光Ｌ２の偏光方向に一致させることが可能であり、これによって干渉像のコントラストの低下を抑制することが可能である。

制御部５０は、撮像部４０によって撮像された干渉像について評価値を導出し、評価値に基づいて回転機構３１（及び位相子３０）の回転位置を制御する。評価値は、干渉像のコントラストを示す指標値であり、例えば、干渉像の画像データにおける画素値の標準偏差又は分散であってもよい。画素値とは、当該画素の輝度を示す数値を意味する。物体光Ｌ１と参照光Ｌ２とのコヒーレンス性が高い程、干渉像のコントラストが高くなり、評価値としての標準偏差又は分散は大きくなる。評価値は、物体光Ｌ１と参照光Ｌ２とのコヒーレンス性を示す指標値であるともいえる。制御部５０は、評価値が最大となるように回転機構３１（及び位相子３０）の回転位置を制御する。具体的には、制御部５０は、プロセッサ（図示せず）を備えたコンピュータを含んで構成されており、下記の処理を行う。

図３は、制御部５０が実行する処理の流れの一例を示すフローチャートである。ステップＳ１において制御部５０は、回転機構３１（及び位相子３０）の回転位置を初期位置に設定する。ステップＳ２において制御部５０は、撮像部４０から干渉像の画像データを取得する。ステップＳ３において制御部５０は、ステップＳ２において取得した干渉像の画像データについて評価値を導出する。制御部５０は、評価値として例えば画素値の標準偏差を導出し、これをメモリ（図示せず）に記憶する。

ステップＳ４において制御部５０は、予め定められた全ての回転位置について評価値の導出が完了したか否かを判定する。制御部５０は、全ての回転位置について評価値の導出が完了していないと判定した場合、処理をステップＳ５に移行し、完了したと判定した場合、処理をステップＳ６に移行する。

ステップＳ５において制御部５０は、回転機構３１（及び位相子３０）の回転位置を１ステップだけ回転させる。これにより、位相子３０は、物体光Ｌ１の光軸を回転軸として１ステップ分（例えば５°）回転する。その後、制御部５０は処理をステップＳ２に戻す。すなわち、制御部５０は、位相子３０の回転位置が１ステップ分回転した状態における干渉像の画像データを取得し、その画像データについて評価値を導出する。制御部５０は、位相子３０による偏光方向の初期位置からの変化量が、例えば１８０°に達するまで、ステップＳ２からステップＳ５までの処理を繰り返す。位相子３０が１／２波長板（λ／２板）である場合、位相子を初期位置から９０°変化させることで、物体光Ｌ１の偏光方向は１８０°変化する。

ステップＳ６において制御部５０は、回転機構３１に制御信号を供給することにより、メモリに記憶した評価値が最大となる回転位置に回転機構３１（及び位相子３０）を位置決めする。

以上のように、開示の技術の実施形態に係るホログラフィー装置１０は、物体光Ｌ１と参照光Ｌ２との干渉による干渉像を形成する光学系２００を有する。光学系２００は、物体光Ｌ１の光路上に配置された位相子３０と、物体光Ｌ１の光軸を回転軸として位相子３０を回転させる回転機構３１とを含む。ホログラフィー装置１０は、干渉像を撮像する撮像部４０と、撮像部４０によって撮像された干渉像について評価値を導出し、評価値に基づいて回転機構３１（及び位相子３０）の回転位置を制御する制御部５０と、を備える。上記の評価値として、干渉像の画像データにおける画素値の標準偏差又は分散等の干渉像のコントラストの状態を示す指標値が用いられる。制御部５０は、評価値が最大となるように回転機構３１（及び位相子３０）の回転位置を制御する。

開示の技術の実施形態に係るホログラフィー装置１０によれば、基板６１における複屈折に起因して干渉像のコントラストが低下する状況においても、上記の評価値が最大となるように回転機構３１（及び位相子３０）の回転位置を制御することで、物体光Ｌ１の偏光方向を参照光Ｌ２の偏光方向に一致させ、干渉像のコントラストの低下を抑制することできる。すなわち、ホログラフィー装置１０によれば、基板６１における複屈折の影響を抑制することができる。基板６１上の各位置に存在する細胞について干渉像を取得する場合に、回転機構３１（及び位相子３０）の回転位置の制御を都度行うことで、干渉像のコントラストのバラツキを抑制することが可能となる。

図４は、位相子３０の回転位置と、干渉像の画像データの画素値の標準偏差との関係の一例を示すグラフである。図４には、物体光Ｌ１の光路上に基板６１を配置した場合（基板有り）及び基板６１を配置しない場合（基板無し）のそれぞれについての関係が示されている。図４に示すように、物体光Ｌ１の光路上に複屈折を生じる基板６１を配置することで、位相子３０の回転位置が０°における標準偏差は、基板６１を配置しない場合と比較して低下する。しかしながら、位相子３０の回転位置を変化させることで、標準偏差が大きくなり、特定の回転位置（３５°付近）において最大値をとることが確認された。また、標準偏差の最大値は、基板６１を配置した場合と基板６１を配置しない場合とで同等であった。このことは、位相子３０の回転位置の制御によって、基板６１の複屈折の影響を相殺できる程度に干渉像のコントラストを改善できることを示している。

図５及び図６は、それぞれ、変形例に係るホログラフィー装置１０の構成の一例を示す図である。図５に示すように、位相子３０及び回転機構３１を、細胞６０及び基板６１に対して、物体光Ｌ１の進行方向後方側に配置することも可能である。図５に示す例では、位相子３０及び回転機構３１は、反射ミラー２４と結像レンズ２５との間に配置されている。この場合においても、干渉像のコントラストのバラツキを抑制することができる。また、図６に示すように、位相子３０及び回転機構３１を、参照光Ｌ２の光路上に配置してもよい。この場合においても、干渉像のコントラストのバラツキを抑制することができる。

［第２の実施形態］
図７は、開示の技術の第２の実施形態に係るホログラフィー装置１０Ａの構成の一例を示す図である。本実施形態に係るホログラフィー装置１０Ａは、偏光子２７、減衰器２８、第１のシャッター２９Ａ及び第２のシャッター２９Ｂを更に含む点が、第１の実施形態に係るホログラフィー装置１０（図２参照）と異なる。偏光子２７は、物体光Ｌ１の光路上に配置される。図７に示す例では、偏光子２７は、反射ミラー２４と結像レンズ２５との間に配置されている。偏光子２７は、物体光Ｌ１が基板６１を透過することによって生じる楕円偏光に含まれる、干渉像の形成に不要な偏光成分を除去する機能を有する偏光フィルタである。

減衰器２８は、参照光Ｌ２の光路上に配置される。減衰器２８は、制御部５０から供給される制御信号に応じた減衰量で参照光Ｌ２を減衰させる機能を有する。物体光Ｌ１が偏光子２７を透過することで物体光Ｌ１の光量が低下する。参照光Ｌ２の光量を減衰させない場合には、物体光Ｌ１と参照光Ｌ２の光量が不均一となる。そこで、制御部５０は、撮像部４０において撮像される物体光Ｌ１のみによる像の画像データの平均画素値（平均輝度値）と、参照光Ｌ２のみによる画像データの平均画素値（平均輝度値）が同じになるように減衰器２８における減衰量を制御する。

第１のシャッター２９Ａは、物体光Ｌ１の光路上に配置される。図７に示す例では、第１のシャッター２９Ａは結像レンズ２５と合波器２６との間に配置されているが、物体光Ｌ１の光路上であればどこに配置されていてもよい。第１のシャッター２９Ａは、制御部５０から供給される制御信号に応じて物体光Ｌ１の通過及び遮断を切り替える。

第２のシャッター２９Ｂは、参照光Ｌ２の光路上に配置される。図７に示す例では、第２のシャッター２９Ｂは減衰器２８と合波器２６との間に配置されているが、参照光Ｌ２の光路上であればどこに配置されていてもよい。第２のシャッター２９Ｂは、制御部５０から供給される制御信号に応じて参照光Ｌ２の通過及び遮断を切り替える。

図８は、本実施形態に係る制御部５０が実行する処理の流れの一例を示すフローチャートである。図８に示す各処理は、図３に示す処理が終了した後に実行される。

ステップＳ１１において制御部５０は、第１のシャッター２９Ａを開状態に制御するとともに、第２のシャッター２９Ｂを閉状態に制御する。これにより、物体光Ｌ１のみによる像が撮像部４０によって撮像される。ステップＳ１２において制御部５０は、撮像部４０から物体光Ｌ１のみによる像の画像データを取得する。ステップＳ１３において制御部５０は、ステップＳ１２において取得した画像データによって示される物体光画像の平均画素値（平均輝度値）を導出し、これをメモリ（図示せず）に記憶する。

ステップＳ１４において制御部５０は、第１のシャッター２９Ａを閉状態に制御するとともに、第２のシャッター２９Ｂを開状態に制御する。これにより、参照光Ｌ２のみによる像が撮像部４０によって撮像される。ステップＳ１５において制御部５０は、撮像部４０から参照光Ｌ２のみによる像の画像データを取得する。ステップＳ１６において制御部５０は、ステップＳ１５において取得した画像データによって示される参照光画像の平均画素値（平均輝度値）を導出し、これをメモリ（図示せず）に記憶する。

ステップＳ１７において制御部５０は、メモリに記憶された物体光画像の平均画素値（平均輝度値）と参照光画像の平均画素値（平均輝度値）が一致しているか否かを判定する。制御部５０は、平均画素値（平均輝度値）が一致していないと判定した場合、処理をステップＳ１８に移行し、平均画素値（平均輝度値）が一致していると判定した場合、処理をステップＳ１９に移行する。

ステップＳ１８において制御部５０は、減衰器２８の減衰量を１ステップ分だけ増加させ、処理をステップＳ１５に戻す。すなわち、制御部５０は、減衰器２８における減衰量が１ステップ分増加した状態における参照光画像について、画像データの取得、メモリへの記憶及び平均画素値（平均輝度値）の導出を行う。制御部５０は、メモリに記憶された物体光画像の平均画素値（平均輝度値）と参照光画像の平均画素値（平均輝度値）とが一致するまで、ステップＳ１５からステップＳ１８までの処理を繰り返し行う。ステップＳ１９において制御部５０は、第１のシャッター２９Ａを開状態に制御するとともに、第２のシャッター２９Ｂを開状態に制御する。

本実施形態に係るホログラフィー装置１０Ａによれば、物体光Ｌ１が基板６１を透過することによって生じる楕円偏光に含まれる、干渉像の形成に不要な偏光成分が偏光子２７によって除去される。また、物体光Ｌ１の光量と参照光Ｌ２の光量とが同じになるように、減衰器２８の減衰量が制御される。これにより、干渉像のコントラストの低下を抑制する効果及び干渉像のコントラストのバラツキを抑制する効果が促進される。

なお、本実施形態では、撮像部４０によって撮像される物体光Ｌ１による像の輝度と、参照光Ｌ２による像の輝度とが一致するように、減衰器２８における減衰量を制御する場合を例示したが、物体光Ｌ１による像の輝度と、参照光Ｌ２による像の輝度との差が所定範囲内となるように減衰器２８における減衰量を制御してもよい。

［実施例］
上記した第１の実施形態に係るホログラフィー装置１０（図２参照）、第２の実施形態に係るホログラフィー装置１０Ａ（図７参照）及び比較例に係るホログラフィー装置（図示せず）のそれぞれを用いて干渉像を形成し、干渉像のコントラスト及びそのバラツキを比較した。

各ホログラフィー装置の構成部品を下記の表１に示す。第１の実施形態に係るホログラフィー装置１０は、表１に示す構成部品のうち、偏光子及び減衰器を備えていない構成である。比較例に係るホログラフィー装置は、表１に示す構成部品のうち、位相子、回転機構、偏光子及び減衰器を備えていない構成である。すなわち、比較例に係るホログラフィー装置は、基板６１の複屈折に起因する物体光の偏光方向の変動を補正する手段を有していない構成である。

基板が有する１２個のウェル内に胚細胞を培養した。各ホログラフィー装置において、１つの基板につき１２箇所、合計３つの基板について胚細胞の干渉像の画像データを取得した。すなわち、各ホログラフィー装置における干渉像の取得数は３６である。取得した干渉像の画像データの各々について画素値の標準偏差を導出した。

図９は、干渉像の撮像位置に対応するウェルナンバー毎の標準偏差を、装置間で比較した結果を示すグラフである。図１０は、標準偏差の３６箇所分の平均値、最大値、最小値を装置間で比較した結果を示すグラフである。図９及び図１０において、実施例１は第１の実施形態に係るホログラフィー装置１０に対応し、実施例２は第２の実施形態に係るホログラフィー装置１０Ａに対応し、比較例は比較例に係るホログラフィー装置に対応する。

図９及び図１０に示すように、ホログラフィー装置が、基板６１の複屈折に起因する物体光の偏光方向の変動を補正する手段としての位相子を備えることで、干渉像の画素値の標準偏差が大きくなること及び標準偏差のバラツキが小さくなることが確認された。このことは、位相子による偏光方向の補正により、基板６１の複屈折に起因する干渉像のコントラストの低下が抑制され、コントラストのバラツキが抑制されることを示している。

［細胞の評価方法］
以下に開示の技術の実施形態に係る細胞の評価方法について説明する。本実施形態に係る細胞の評価方法は、上記した第１の実施形態に係るホログラフィー装置１０又は第２の実施形態に係るホログラフィー装置１０Ａを用いるものである。

本実施形態に係る細胞の評価方法は、物体光Ｌ１に対して透過性を有する基板６１上に培養された細胞６０を物体光Ｌ１の光路上に配して、基板６１及び細胞６０を透過した物体光Ｌ１と、参照光Ｌ２とによる干渉像を取得し、干渉像から位相画像を生成し、位相画像を用いて細胞を評価することを含む。

以下に、干渉像から位相画像を取得する方法の一例について図１１Ａ～図１１Ｄを参照しつつ説明する。なお、図１１Ａ～１１Ｄは、ｉＰＳ細胞(induced pluripotent stem cells）の凝集体（スフェア）について取得されたものである。

はじめに、撮像部４０によって取得された図１１Ａに例示する細胞の干渉像(ホログラム)を、例えば、２０４８×２０４８のサイズとなるようにトリミングを行った後、二次元フーリエ変換する。図１１Ｂは、この処理によって得られる細胞のフーリエ変換画像の一例である。図１１Ｂには、直接光、物体光、共役光に基づく像が示されている。

次に、フーリエ変換画像における直接光に対する物体光のずれ量を特定することで物体光の位置を特定し、例えば、半径２５０ｐｉｘｅｌの円形開口のマスクを用いた周波数フィルタリング処理により、物体光のみの複素振幅成分を抜き出す。

次に、例えば、角スペクトル法を適用して任意の空間位置の細胞の位相を示す画像を復元する。具体的には、撮像部４０の撮像面で捉えた波面ｕ（ｘ，ｙ；０）のフーリエ変換画像の角スペクトルＵ（ｆ_ｘ，ｆ_ｙ；０）を求める。次に、下記の（１）式に示すように、角スペクトルＵ（ｆ_ｘ，ｆ_ｙ；０）に伝達関数Ｈ（ｆ_ｘ，ｆ_ｙ；ｚ）を乗算することで、光軸方向（ｚ方向）の任意の位置ｚにおける波面を再生する。ここで、伝達関数Ｈ（ｆ_ｘ，ｆ_ｙ；ｚ）は、周波数応答関数（インパルス応答関数(グリーン関数)のフーリエ変換）である。

次に、下記の（２）式に示すように、光軸方向（ｚ方向）の位置ｚにおける波面Ｕ（ｆ_ｘ，ｆ_ｙ；ｚ）について逆フーリエ変換を実施することで、位置ｚにおける解ｕ（ｘ，ｙ；ｚ）を導出する。

次に、下記の（３）式に示すように、ｕ（ｘ，ｙ；ｚ）についての位相φを導出することで位相画像を生成する。図１１Ｃは、上記の各処理によって得られるアンラッピング前の位相画像の一例である。

図１１Ｃに示すアンラッピング前の位相差画像における位相は、０～２πの値に畳みこまれている。そこで、例えば、Unweighted Least Squares（重みなし最小２乗法）またはFlynn's Algorithm（フリンのアルゴリズム）などの位相接続（アンラッピング）手法を適用して２π以上の部分も接合していくことで、図１１Ｄに例示するような最終的な位相画像を得ることができる。なお、アンラッピングの手法は数多く提案されており、位相不整合を生じない適切なものを適宜選択すればよい。

以下において、位相画像について説明する。図１２は、位相画像Ｉ_Ｐの概念を示す図である。図１２下段は、位相画像Ｉ_Ｐの各画素ｋにおける位相量を三次元表示したものである。図１２上段は、位相画像Ｉ_Ｐの各画素ｋにおける位相量を平面上にグレースケールで示したものである。

ここで、位相画像Ｉ_Ｐの同一焦点面内に存在するバックグラウンド（細胞の存在しない領域）の位相をＰ_Ｂとし、細胞の存在する領域の位相をＰ_Ｓとしたとき、位相画像Ｉ_Ｐにおける位相量Ｐは、下記の（４）式によって表わされる。また、本明細書中における「位相」という用語は、光を電磁波とみなした場合の電場振幅の位相であり、より一般的な意味で使用される。

位相画像Ｉ_Ｐの各画素ｋにおける位相量Ｐ_ｋは、下記（５）式によって表わすことができる。但し、ｎ_ｋは位相画像Ｉ_Ｐの各画素ｋに対応する部位における細胞の屈折率であり、ｄ_ｋは位相画像Ｉ_Ｐの各画素ｋに対応する部位における細胞の厚さであり、λはホログラム光学系における物体光の波長である。

細胞の位相画像は、細胞を透過した物体光の光路長分布を示した画像である。細胞内における光路長は、細胞の屈折率と細胞の厚さの積に相当することから、細胞の位相画像は、（５）式にも示されているように、細胞の屈折率及び厚さ（形状）の情報を含んでいる。

位相画像を用いた細胞の評価方法の例としては、位相画像から導出される総位相量Ｐ_Ａを用いる方法が挙げられる。総位相量Ｐ_Ａは、下記の（６）式によって表わされる。但し、ｓは位相画像の各画素ｋの面積であり、ｖ_ｋは位相画像の各画素ｋに対応する部位における細胞の体積である。（６）式に示されるように、総位相量Ｐ_Ａは、細胞の位相画像の画素毎の位相量Ｐ_ｋを、全ての画素ｋについて積算したものに相当する。位相画像の画素値は位相量Ｐ_ｋに対応している。

図１３は、ｉＰＳ細胞の凝集体（スフェア）の体積と総位相量Ｐ_Ａの相関特性を取得した結果示すグラフである。図１３に示すように、総位相量Ｐ_Ａと凝集体の体積とは、比例関係であることが確認された。図１３には、凝集体の体積と総位相量Ｐ_Ａとの間の相関性の基準を示すトレンドラインＬ_Ｓが、プロットと共に示されている。図１３に示す各プロットから、導出した回帰線をトレンドラインＬ_Ｓとして適用した。

図１３には、トレンドラインＬ_Ｓ上に存在するプロットａ１及びａ２に対応する凝集体の位相画像、及びトレンドラインＬ_Ｓから乖離した位置に存在するプロットａ３、ａ４、ａ５に対応する凝集体の位相画像が示されている。トレンドラインＬ_Ｓ上に存在するプロットａ１及びａ２に対応する凝集体については、凝集体の全体に亘って輝度が均一な位相画像が得られた。このことは、凝集体を構成する複数の細胞が均質であること、及び凝集体内における細胞の密度が均一であること等を示している。一方、トレンドラインＬ_Ｓから乖離した位置に存在するプロットａ３及びａ４に対応する凝集体については、中心部の輝度が他の部位と比較して低下している位相画像が得られた。このことは、凝集体を構成する複数の細胞が不均質であること、及び凝集体内における細胞の密度が不均一であること等を示している。また、トレンドラインＬ_Ｓから乖離した位置に存在するプロットａ５に対応する凝集体については、凝集体の輪郭線の凹凸が顕著な位相差画像が得られた。このことは、凝集体を構成する細胞に異常が生じていること等を示している。

以上の結果から、総位相量Ｐ_Ａと、凝集体の体積との相関性を用いて凝集体の状態を判定することが可能であるといえる。また、総位相量Ｐ_Ａと凝集体の体積との相関性を示すトレンドラインＬ_Ｓと、判定対象の凝集体についての総位相量Ｐ_Ａと凝集体の体積との相関性とを比較し、判定対象の凝集体についての相関性の、トレンドラインＬ_Ｓからの乖離の程度に応じて当該凝集体の状態を判定することが可能であるといえる。具体的には、一方の軸に凝集体の体積をとり、他方の軸に総位相量Ｐ_Ａをとったグラフ上にプロットした、判定対象の凝集体についてのプロットの、トレンドラインＬ_Ｓからの乖離の程度に応じて、各凝集体の状態を判定することが可能であるといえる。従って、例えば、総位相量Ｐ_ＡのトレンドラインＬ_Ｓからのマイナス幅が閾値以上である凝集体については、当該凝集体に含まれる複数の細胞の密度、均質性、及びスフェアの外形形状のうちの少なくとも１つに異常があるものと判定することができる。

位相画像を用いた細胞の評価においては、高コントラストの干渉像から生成された位相画像を用いることが好ましい。すなわち、干渉像における画素値の標準偏差又は分散が最大となるように回転機構３１（及び位相子３０）の回転位置を制御した状態で撮像された干渉像から生成される位相画像を用いることが好ましい。

なお、２０２１年４月９日に出願された日本国特許出願２０２１－０６６７６９の開示は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。また、本明細書に記載された全ての文献、特許出願および技術規格は、個々の文献、特許出願、および技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。

Claims (7)

1. 物体光と参照光との干渉による干渉像を形成する光学系であって、前記物体光又は参照光の光路上に配置された位相子と、前記物体光又は参照光の光軸を回転軸として前記位相子を回転させる回転機構とを含む光学系と、
   前記干渉像を撮像する撮像部と、
   前記撮像部によって撮像された干渉像について評価値を導出し、前記評価値に基づいて前記回転機構の回転位置を制御する制御部と、
   を含むホログラフィー装置。
2. 前記評価値は、前記干渉像の画素値の標準偏差又は分散であり、
   前記制御部は、前記評価値が最大となるように前記回転機構の回転位置を制御する
   請求項１に記載のホログラフィー装置。
3. 前記位相子は半波長板である
   請求項１に記載のホログラフィー装置。
4. 前記光学系は、
   前記物体光の光路上に配置された偏光子と、
   前記参照光の光路上に配置され、前記参照光の光量を減衰させる減衰器と、
   を更に含む
   請求項１から請求項３のいずれか１項に記載のホログラフィー装置。
5. 前記制御部は、前記撮像部によって撮像された物体光による像の輝度と参照光による像の輝度との差が所定範囲内となるように、前記減衰器における減衰量を制御する
   請求項４に記載のホログラフィー装置。
6. 請求項１から請求項５のいずれか１項に記載のホログラフィー装置を用いた細胞の評価方法であって、
   前記物体光に対して透過性を有する基板上に培養された細胞を、前記物体光の光路上に配して、前記基板及び前記細胞を透過した物体光と、参照光との干渉による干渉像を取得し、
   前記干渉像から位相画像を生成し、
   前記位相画像を用いて前記細胞を評価する
   評価方法。
7. 前記位相画像は、前記基板及び前記細胞を透過した物体光と参照光との干渉による干渉像であって、干渉像の画素値の標準偏差又は分散が最大となるように前記回転機構の回転位置を制御した状態で撮像された干渉像から生成される
   請求項６に記載の評価方法。