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JP7773981B2 - 新型ポリペプチド複合物 - Google Patents

新型ポリペプチド複合物

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JP7773981B2
JP7773981B2 JP2022542256A JP2022542256A JP7773981B2 JP 7773981 B2 JP7773981 B2 JP 7773981B2 JP 2022542256 A JP2022542256 A JP 2022542256A JP 2022542256 A JP2022542256 A JP 2022542256A JP 7773981 B2 JP7773981 B2 JP 7773981B2
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Description

本願は2020年01月09日付けで提出された中国特許出願（出願番号CN202010020878.7）の優先権を主張する。
本開示は抗体薬物分野に関する。具体的には、CH1とCL構造が取り替えられた新型抗体及びその使用を含む。
ここでの記載は、必ずしも従来技術を構成するものではなく、本開示に関連する背景情報のみを提供する。
近年、抗体のヒト化技術の改善に伴い、モノクローナル抗体が素早く進展している。複数のモノクローナル抗体が悪性腫瘍、自己免疫疾患などの重大疾患の治療に利用されている。しかしながら、腫瘍の免疫回避に常に複数の異なるメカニズムが伴うが、単一のモノクローナル抗体が1つの特定のターゲットにしか結合できないため、モノクローナル抗体の治療効果が大幅に低減される。
二重特異性抗体（Bispecific antibody、BsAb）は遺伝子工学手段により異なる2つの抗原又は異なる2つの抗原エピトープをターゲティングする抗体を組合せることで形成される人工抗体である。二重特異性抗体は、モノクローナル抗体と異なり、異なる2つのエピトープを同時にターゲティングする能力を有すると共に、例えば、免疫細胞の募集、受容体の共刺激又は共抑制、多価ウィルスの中和などの特別な生物学的機能を果たすことができるため、単一のモノクローナル抗体よりも、更に抗体併用よりも優れた臨床的治療効果が望まれる。
例えば、IgG抗体形態及び単鎖ドメインと融合することで形成された四価二重特異性抗体などの、様々な組換え二重特異性抗体形態が開発された（Coloma，M.J. et al.、Nature Biotech. 15（1997）159-163；Morrison，S.L.，Nature Biotech. 25（2007）1233-1234を参照）。その他の二重特異性形態は、例えば、DVD-Ig、CrossMab、BiTEなどである（Spiess et al.、Molecular Immunology，67（2），pp.95-106（2015））。
二重特異性抗体に関する様々な構造モデルも開示された。例えば、Fc領域への変異の導入「knobs-into-holes」（Ridgway et al.、Protein Engineering，9（7），pp.617-21（1996））；静電の導入（Gunasekaran et al.、Journal of Biological Chemistry，285（25），pp.19637-19646（2010））又はマイナス状態の導入（Kreudenstein et al.、mAbs，5（5），pp.646-654（2013）；Leaver-Fay et al.、Structure，24（4），pp.641-651（2016））；CH1とCLドメインの交換（CrossMab）（Schaefer et al.、Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America，108（27），pp.11187-11192（2011））；TCR定常領域との融合（WO2019057122A1）などである。
しかしながら、二重特異性抗体の調製過程において、異なるポリペプチド鎖のランダムな組合せにより異なる複数の生成物が生成されるが、1種の生成物だけが必要とされるものである。これらの副生物は1本の軽鎖が欠失された抗体、不完全抗体、重鎖重合体、軽鎖と重鎖とのミスマッチなどを含むが、下流工程にとって大きな課題である。そのため、本開示は新規なドメインが改造されたポリペプチド複合物を提供する。
幾つかの実施形態において、本開示は、第1抗原結合部分を含み、前記第1抗原結合部分が、
A）N末端からC末端までの第1重鎖可変ドメイン（VH1）を含み、前記VH1が第1ドメインに操作可能に連結され、前記第1ドメインがTitin-T鎖を含む第1ポリペプチドと、
N末端からC末端までの第1軽鎖可変ドメイン（VL1）を含み、前記VL1が第2ドメインに操作可能に連結され、前記第2ドメインがTitin-T鎖と互いに作用できるドメインを含む第2ポリペプチドと、を含み、
或いは
B）N末端からC末端までのVH1を含み、前記VH1が第1ドメインに操作可能に連結され、前記第1ドメインがTitin-T鎖と互いに作用できるドメインを含む第1ポリペプチドと、
N末端からC末端までのVL1を含み、前記VL1が第2ドメインに操作可能に連結され、前記第2ドメインがTitin-T鎖を含む第2ポリペプチドと、を含み、
或いは
C）N末端からC末端までのVH1を含み、前記VH1が第1ドメインに操作可能に連結され、前記第1ドメインがObscurin-O鎖又はObscurin-Like-O鎖を含む第1ポリペプチドと、
N末端からC末端までのVL1を含み、前記VL1が第2ドメインに操作可能に連結され、前記第2ドメインがObscurin-O鎖又はObscurin-Like-O鎖と互いに作用できるドメインを含む第2ポリペプチドと、を含み、
或いは
D）N末端からC末端までのVH1を含み、前記VH1が第1ドメインに操作可能に連結され、前記第1ドメインがObscurin-O鎖又はObscurin-Like-O鎖と互いに作用できるドメインを含む第1ポリペプチドと、
N末端からC末端までのVL1を含み、前記VL1が第2ドメインに操作可能に連結され、前記第2ドメインがObscurin-O鎖或Obscurin-Like-O鎖を含む第2ポリペプチドと、を含み、
前記第1抗原結合部分が第1抗原に特異的に結合し、前記第1ドメインが第2ドメインと二量体を形成できる、ポリペプチド複合物を提供する。
幾つかの実施形態において、前記ポリペプチド複合物は、前記Obscurin-O鎖又はObscurin-Like-O鎖と互いに作用できるドメインがTitin-T鎖であり、前記Titin-T鎖と互いに作用できるドメインがObscurin-O鎖又はObscurin-Like-O鎖である。
幾つかの実施形態において、前記ポリペプチド複合物は、前記第1抗原結合部分のVH1とVL1が第1抗原に特異的に結合する第1抗原結合部位を形成する。
幾つかの実施形態において、前記VH1のC末端が第1ドメインのN末端に操作可能に連結される。
幾つかの実施形態において、前記VL1のC末端が第2ドメインのN末端に操作可能に連結される。
幾つかの実施形態において、前記ポリペプチド複合物は、前記第1ドメインが第2ドメインと天然鎖間結合及び/又は非天然鎖間結合により二量体を形成する。
幾つかの実施形態において、前記第1ドメインが第2ドメインと天然鎖間結合により二量体を形成する。幾つかの実施形態において、前記Titin-T鎖における7～15、19～24、26、55、59及び60番目から選ばれる1つ又は複数の残基がObscurin-O鎖における3～6、9、41、73、75及び80～90番目から選ばれる1つ又は複数の残基と互いに結合し、或いは前記Titin-T鎖における1、7～10、13～16、19～26、59～60及び96番目から選ばれる1つ又は複数の残基がObscurin-Like-O鎖における4～5、10、12～13、74、76、78及び82～91番目から選ばれる1つ又は複数の残基と互いに結合し、前記Titin-T鎖における残基部位が配列番号32の配列に対する自然順番号部位であり、Obscurin-O鎖における残基部位が配列番号33の配列に対する自然順番号部位であり、Obscurin-Like-O鎖残基部位が配列番号34の配列に対する自然順番号部位である。
幾つかの実施形態において、前記何れか1項に記載のポリペプチド複合物は、前記第1ドメインが第2ドメインと少なくとも1つの非天然鎖間結合により二量体を形成する。
幾つかの実施形態において、前記非天然鎖間結合が第1ドメインにおける特定変異残基と第2ドメインにおける特定変異残基との間に形成される。幾つかの実施形態において、第1ドメインにおける特定変異残基と第2ドメインにおける特定変異残基のうちの少なくとも1つがシステイン残基である。
幾つかの実施形態において、前記非天然鎖間結合がジスルフィド結合である。幾つかの実施形態において、前記二量体が1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10個の非天然鎖間結合を含む。
幾つかの実施形態において、前記ポリペプチド複合物は、前記第1ドメインにおける特定変異残基と第2ドメインにおける特定変異残基が第1ドメインと第2ドメインとの接触界面に位置する。
幾つかの実施形態において、前記第1ドメインにおける特定変異残基と第2ドメインにおける特定変異残基が下記から選ばれる変異を有し、即ち、前記Titin-T鎖が8、20、22、25、26及び39番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖が3、9、25、76及び88番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、或いはTitin-T鎖が8、20、22、25、26及び39番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、及び/又は前記Obscurin-Like-O鎖が6、26、74、77、84及び86番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有する。前記Titin-T鎖変異部位が配列番号32の配列に対する自然順番号部位であり、Obscurin-O鎖変異部位が配列番号33の配列に対する自然順番号部位であり、Obscurin-Like-O鎖変異部位が配列番号34の配列に対する自然順番号部位である。
幾つかの具体的な実施形態において、前記第1変異残基と第2変異残基が下記から選ばれる変異を有し、即ち、Titin-T鎖が8C、20C、22C、25S、26C及び39Tから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖が3C、9C、25S、76S及び88Cから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、或いは前記Titin-T鎖が8C、20C、22C、25S、26C及び39Tから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、及び/又は前記Obscurin-Like-O鎖が6E、26S、74C、77S、84C及び86Cから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有する。幾つかの実施形態において、Titin-T鎖が25S、39T及び8C変異を有し、且つObscurin-O鎖が88C変異を有し、
Titin-T鎖が25S、39T及び20C変異を有し、且つObscurin-O鎖が3C変異を有し、
Titin-T鎖が25S、39T及び26C変異を有し、且つObscurin-O鎖が9C変異を有し、
Titin-T鎖が25S、39T及び8C変異を有し、且つObscurin-O鎖が25S、76S及び88C変異を有し、
Titin-T鎖が25S、39T及び20C変異を有し、且つObscurin-O鎖が25S、76S及び3C変異を有し、
Titin-T鎖が25S、39T及び26C変異を有し、且つObscurin-O鎖が25S、76S及び9C変異を有し、
Titin-T鎖が25S、39T及び8C変異を有し、且つObscurin-Like-O鎖が6E及び74C変異を有し、
Titin-T鎖が25S、39T及び20C変異を有し、且つObscurin-Like-O鎖が6E及び84C変異を有し、
Titin-T鎖が25S、39T及び22C変異を有し、且つObscurin-Like-O鎖が6E及び86C変異を有し、
Titin-T鎖が25S、39T及び8C変異を有し、且つObscurin-Like-O鎖が6E、26S、77S及び74C変異を有し、
Titin-T鎖が25S、39T及び20C変異を有し、且つObscurin-Like-O鎖が6E、26S、77S及び84C変異を有し、或いは
Titin-T鎖が25S、39T及び22C変異を有し、且つObscurin-Like-O鎖が6E、26S、77S及び86C変異を有し、
Titin-T鎖変異部位が配列番号32の配列に対する自然順番号部位であり、Obscurin-O鎖変異部位が配列番号33の配列に対する自然順番号部位であり、Obscurin-Like-O鎖変異部位が配列番号34の配列に対する自然順番号部位である。
幾つかの具体的な実施形態において、前記第1変異残基と第2変異残基が下記から選ばれる変異を有し、即ち、前記Titin-T鎖がA8C、V20C、T22C、C25S、A26C及びC39Tから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖がA3C、R9C、C25S、C76S及びA88Cから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、或いは前記Titin-T鎖がA8C、V20C、T22C、C25S、A26C及びC39Tから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、及び/又は前記Obscurin-Like-O鎖がC6E、C26S、C77S、V74C、G84C及びA86Cから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有する。前記Titin-T鎖変異部位が配列番号32の配列に対する自然順番号部位であり、Obscurin-O鎖変異部位が配列番号33の配列に対する自然順番号部位であり、Obscurin-Like-O鎖変異部位が配列番号34の配列に対する自然順番号部位である。
幾つかの実施形態において、前記第1ドメインにおける特定変異残基と第2ドメインにおける特定変異残基が下記から選ばれる変異を有し、即ち、Titin-T鎖がC25S、C39T及びA8C変異を有し、Obscurin-O鎖がA88C変異を有し、Titin-T鎖がC25S、C39T及びV20C変異を有し、Obscurin-O鎖がA3C変異を有し、Titin-T鎖がC25S、C39T及びA26C変異を有し、Obscurin-O鎖がR9C変異を有し、Titin-T鎖がC25S、C39T及びA8C変異を有し、Obscurin-O鎖がC25S、C76S及びA88C変異を有し、Titin-T鎖がC25S、C39T及びV20C変異を有し、Obscurin-O鎖がC25S、C76S及びA3C変異を有し、Titin-T鎖がC25S、C39T及びA26C変異を有し、Obscurin-O鎖がC25S、C76S及びR9C変異を有し、Titin-T鎖がC25S、C39T及びA8C変異を有し、Obscurin-Like-O鎖がC6E及びV74C変異を有し、Titin-T鎖がC25S、C39T及びV20C変異を有し、Obscurin-Like-O鎖がC6E及びG84C変異を有し、Titin-T鎖がC25S、C39T及びT22C変異を有し、Obscurin-Like-O鎖がC6E及びA86C変異を有し、Titin-T鎖がC25S、C39T及びA8C変異を有し、Obscurin-Like-O鎖がC6E、C26S、C77S及びV74C変異を有し、Titin-T鎖がC25S、C39T及びV20C変異を有し、Obscurin-Like-O鎖がC6E、C26S、C77S及びG84C変異を有し、Titin-T鎖がC25S、C39T及びT22C変異を有し、Obscurin-Like-O鎖がC6E、C26S、C77S及びA86C変異を有する。前記Titin-T鎖変異部位が配列番号32の配列に対する自然順番号に対応する部位であり、Obscurin-O鎖変異部位が配列番号33の配列に対する自然順番号に対応する部位であり、Obscurin-Like-O鎖変異部位が配列番号34の配列に対する自然順番号に対応する部位である。
幾つかの実施形態において、前記第1ドメインと第2ドメインが下記Titin-T鎖/Obscurin-O鎖、或いはTitin-T鎖/Obscurin-Like-O鎖から選ばれ、即ち、前記Titin-T鎖が配列番号32の配列を基に8、20、22、25、26及び39番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有するポリペプチドであり、及び/又は前記Obscurin-O鎖が配列番号33の配列を基に3、9、25、76及び88番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有するポリペプチドであり、或いは前記Titin-T鎖が配列番号32の配列を基に8、20、22、25、26及び39番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有するポリペプチドであり、及び/又は前記Obscurin-Like-O鎖が配列番号34の配列を基に6、26、74、77、84及び86番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有するポリペプチドである。
幾つかの実施形態において、前記第1ドメインと第2ドメインが下記から選ばれ、即ち、Titin-T鎖/Obscurin-O鎖、或いはTitin-T鎖/Obscurin-Like-O鎖から選ばれる。前記Titin-T鎖が配列番号32の配列を基にA8C、V20C、T22C、C25S、A26C及びC39Tから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖が配列番号33の配列を基にA3C、R9C、C25S、C76S及びA88Cから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、或いは前記Titin-T鎖が配列番号32の配列を基にA8C、V20C、T22C、C25S、A26C及びC39Tから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、及び/又は前記Obscurin-Like-O鎖が配列番号34の配列を基にC6E、C26S、C77S、V74C、G84C及びA86Cから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有する。前記Titin-T鎖変異部位が配列番号32の配列の自然順番号部位であり、Obscurin-O鎖変異部位が配列番号33の配列の自然順番号部位であり、Obscurin-Like-O鎖変異部位が配列番号34の配列の自然順番号部位である。
幾つかの実施形態において、前記第1ドメインと第2ドメインが下記から選ばれ、即ち、Titin-T鎖/Obscurin-O鎖、或いはTitin-T鎖/Obscurin-Like-O鎖から選ばれる。前記Titin-T鎖が配列番号32の配列を基にC25S、C39T及びA8C変異を有し、Obscurin-O鎖が配列番号33の配列を基にA88C変異を有し、前記Titin-T鎖が配列番号32の配列を基にC25S、C39T及びV20C変異を有し、前記Obscurin-O鎖が配列番号33の配列を基にA3C変異を有し、前記Titin-T鎖が配列番号32の配列を基にC25S、C39T及びA26C変異を有し、前記Obscurin-O鎖が配列番号33の配列を基にR9C変異を有し、前記Titin-T鎖が配列番号32の配列を基にC25S、C39T及びA8C変異を有し、前記Obscurin-O鎖が配列番号33の配列を基にC25S、C76S及びA88C変異を有し、前記Titin-T鎖が配列番号32の配列を基にC25S、C39T及びV20C変異を有し、前記Obscurin-O鎖が配列番号33の配列を基にC25S、C76S及びA3C変異を有し、前記Titin-T鎖が配列番号32の配列を基にC25S、C39T及びA26C変異を有し、前記Obscurin-O鎖が配列番号33の配列を基にC25S、C76S及びR9C変異を有し、前記Titin-T鎖が配列番号32の配列を基にC25S、C39T及びA8C変異を有し、前記Obscurin-Like-O鎖が配列番号34の配列を基にC6E及びV74C変異を有し、前記Titin-T鎖が配列番号32の配列を基にC25S、C39T及びV20C変異を有し、前記Obscurin-Like-O鎖が配列番号34の配列を基にC6E及びG84C変異を有し、前記Titin-T鎖が配列番号32の配列を基にC25S、C39T及びT22C変異を有し、前記Obscurin-Like-O鎖が配列番号34の配列を基にC6E及びA86C変異を有し、前記Titin-T鎖が配列番号32の配列を基にC25S、C39T及びA8C変異を有し、前記Obscurin-Like-O鎖が配列番号34の配列を基にC6E、C26S、C77S及びV74C変異を有し、前記Titin-T鎖が配列番号32の配列を基にC25S、C39T及びV20C変異を有し、前記Obscurin-Like-O鎖が配列番号34の配列を基にC6E、C26S、C77S及びG84C変異を有し、前記Titin-T鎖が配列番号32の配列を基にC25S、C39T及びT22C変異を有し、前記Obscurin-Like-O鎖が配列番号34の配列を基にC6E、C26S、C77S及びA86C変異を有する。前記Titin-T鎖変異部位が配列番号32の配列の自然順番号に対応する部位であり、Obscurin-O鎖変異部位が配列番号33の配列の自然順番号に対応する部位であり、Obscurin-Like-O鎖変異部位が配列番号34の配列の自然順番号に対応する部位である。
幾つかの実施形態において、前記ポリペプチド複合物は、前記Obscurin-O鎖が7、11、62番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有する。幾つかの実施形態において、前記Obscurin-O鎖が7R又は7K、62K又は62H、及び11Lから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、最も好ましくは、前記Titin-T鎖が25S、39T及び8C変異を有し、且つObscurin-O鎖が25S、76S、88C、7K及び62K変異を有し、Titin-T鎖が25S、39T及び8C変異を有し、且つObscurin-O鎖が25S、76S、88C、7K及び62H変異を有し、Titin-T鎖が25S、39T及び8C変異を有し、且つObscurin-O鎖が25S、76S、88C、11L及び62K変異を有し、或いはTitin-T鎖が25S、39T及び8C変異を有し、且つObscurin-O鎖が25S、76S、88C、11L及び62Hを有し、Titin-T鎖変異部位が配列番号32の配列に対する自然順番号部位であり、Obscurin-O鎖変異部位が配列番号33の配列に対する自然順番号部位である。
幾つかの実施形態において、前記Obscurin-O鎖がL7K又はL7R、K11L、T62K又はT62Hから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有する。幾つかの実施形態において、Titin-T鎖がC25S、C39T及びA8C変異を有し、且つObscurin-O鎖がC25S、C76S、A88C、L7K及びT62K変異を有し、Titin-T鎖がC25S、C39T及びA8C変異を有し、且つObscurin-O鎖がC25S、C76S、A88C、L7K及びT62H変異を有し、Titin-T鎖がC25S、C39T及びA8C変異を有し、且つObscurin-O鎖がC25S、C76S、A88C、K11L及びT62K変異を有し、Titin-T鎖がC25S、C39T及びA8C変異を有し、且つObscurin-O鎖がC25S、C76S、A88C、K11L及びT62Hを有する。前記Titin-T鎖変異部位が配列番号32の配列に対する自然順番号に対応する部位であり、Obscurin-O鎖変異部位が配列番号33の配列に対する自然順番号に対応する部位である。
幾つかの実施形態において、前記ポリペプチド複合物は、前記Obscurin-O鎖が配列番号45を基に7、11、62番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有するObscurin-O鎖である。幾つかの実施形態において、前記Obscurin-O鎖が配列番号45を基にL7K又はL7R、K11L及びT62K又はT62Hから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有する。幾つかの実施形態において、前記Titin-T鎖が配列番号32を基にC25S、C39T及びA8C変異を有し、且つObscurin-O鎖が配列番号45を基にC25S、C76S、A88C、L7K及びT62K変異を有し、Titin-T鎖が配列番号32を基にC25S、C39T及びA8C変異を有し、且つObscurin-O鎖が配列番号45を基にC25S、C76S、A88C、L7K及びT62H変異を有し、Titin-T鎖が配列番号32を基にC25S、C39T及びA8C変異を有し、且つObscurin-O鎖が配列番号45を基にC25S、C76S、A88C、K11L及びT62K変異を有し、Titin-T鎖が配列番号32を基にC25S、C39T及びA8C変異を有し、且つObscurin-O鎖が配列番号45を基にC25S、C76S、A88C、K11L及びT62H変異を有する。前記Titin-T鎖変異部位が配列番号32の配列の自然順番号に対応する部位であり、Obscurin-O鎖変異部位が配列番号33の配列の自然順番号に対応する部位である。
幾つかの実施形態において、前記ポリペプチド複合物は、前記第1ドメインと第2ドメインが下記から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、即ち、Titin-T鎖が3、11、13、22、40、42、45、47、49、56、58、66、70、75、77、79、81、82、83及び84番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸変異を有し、及び/又はObscurin-O鎖が2、11、12、13、14、17、20、22、30、32、34、36、41、42、44、45、53、58、62、67、69、89、92、94及び97番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸変異を有する。前記Titin-T鎖変異部位が配列番号35の配列に対する自然順番号部位であり、Obscurin-O鎖変異部位が配列番号50の配列に対する自然順番号部位である。
幾つかの実施形態において、前記ポリペプチド複合物は、前記第1ドメインと第2ドメインが下記Titin-T鎖/Obscurin-O鎖から選ばれ、即ち、前記Titin-T鎖が配列番号35を基に3、11、13、22、40、42、45、47、49、56、58、66、70、75、77、79、81、82、83及び84番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸変異を有するポリペプチドであり、前記Obscurin-O鎖が配列番号50を基に2、11、12、13、14、17、20、22、30、32、34、36、41、42、44、45、53、58、62、67、69、89、92、94及び97番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸変異を有するポリペプチドである。前記Titin-T鎖変異部位が配列番号35の配列に対する自然順番号部位であり、Obscurin-O鎖変異部位が配列番号50の配列に対する自然順番号部位である。
幾つかの実施形態において、前記第1ドメインと第2ドメインが下記から選ばれる1つ又は複数の残基変異を有し、即ち、Titin-T鎖が3W、11I、13L、22M、40S、42K、45S、47E、49G、56S、58E、66S又は66K、70R、75V、77S、79T、81R、82M、83D及び84Lから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸変異を有し、及び/又はObscurin-O鎖が2E、11K、12S、13Y、14T、17E、20L、22M又は22S、30D、32P、34E、36T、41K、42L、44I、45T、53L、58V、62E、67Q又は67T、69S、89L、92E、94G及び97Gから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸変異を有する。幾つかの実施形態において、前記Titin-T鎖が66S及び77Sアミノ酸変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖が11K、12S、13Y、14T及び22Sアミノ酸変異を有し、前記Titin-T鎖が66K、70R、79T及び81Rアミノ酸変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖が2E、17E、30D、32P、34E、36T、44I、45T、58V、62E、67Q、69S及び97Gアミノ酸変異を有し、前記Titin-T鎖が3W、11I、13L、22M及び82Mアミノ酸変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖が20L、22M及び53Lアミノ酸変異を有し、前記Titin-T鎖が11I、66K、79T及び81Rアミノ酸変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖が41K、45T、67Q、69S及び89Lアミノ酸変異を有し、前記Titin-T鎖が40S、42K、45S、47E、49G、56S、58E、75V、83D及び84Lアミノ酸変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖が42L、45T、67T、69S、92E及び94Gアミノ酸変異を有し、前記Titin-T鎖が47E、49G、56S、58E及び75Vアミノ酸変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖が42L、45T、67T、69S、92E及び94Gアミノ酸変異を有し、前記Titin-T鎖が56S、58E及び75Vアミノ酸変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖が42L、45T、67T、69S、92E及び94Gアミノ酸変異を有し、或いは前記Titin-T鎖が56S、58E、66S及び77Sアミノ酸変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖が12S、13Y、22S、42L、45T、67Q、69S、92E及び94Gアミノ酸変異を有し、前記Titin-T鎖変異部位が配列番号35の配列に対する自然順番号部位であり、Obscurin-O鎖変異部位が配列番号50の配列に対する自然順番号部位である。
幾つかの実施形態において、前記第1ドメインと第2ドメインが下記から選ばれる1つ又は複数の残基変異を有し、即ち、Titin-T鎖がP3W、S11I、I13L、T22M、G40S、R42K、H45S、Q47E、Q49G、N56S、D58E、M66S、M66K、K70R、L75V、T77S、S79T、G81R、N82M、E83D及びF84Lから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸変異を有し、及び/又はObscurin-O鎖がG2E、L11K、A12S、F13Y、V14T、V17E、D20L、T22M又はT22S、N30D、T32P、Q34E、S36T、Q41K、Q42L、V44I、A45T、A53L、L58V、K62E、A67Q又はA67T、G69S、V89L、Q92E、D94G及びA97Gから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸変異を有する。前記Titin-T鎖変異部位が配列番号35の配列に対する自然順番号部位であり、Obscurin-O鎖変異部位が配列番号50の配列に対する自然順番号部位である。
幾つかの実施形態において、前記第1ドメインと第2ドメインが下記Titin-T鎖/Obscurin-O鎖から選ばれ、即ち、前記Titin-T鎖が配列番号35の配列を基にP3W、S11I、I13L、T22M、G40S、R42K、H45S、Q47E、Q49G、N56S、D58E、M66S、M66K、K70R、L75V、T77S、S79T、G81R、N82M、E83D及びF84Lから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸変異を有し、及び/又はObscurin-O鎖が配列番号35の配列を基にG2E、L11K、A12S、F13Y、V14T、V17E、D20L、T22M又はT22S、N30D、T32P、Q34E、S36T、Q41K、Q42L、V44I、A45T、A53L、L58V、K62E、A67Q又はA67T、G69S、V89L、Q92E、D94G及びA97Gから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸変異を有する。前記Titin-T鎖変異部位が配列番号35の配列の自然順番号部位であり、Obscurin-O鎖変異部位が配列番号50の配列の自然順番号部位である。
幾つかの実施形態において、前記Titin-T鎖がM66S及びT77Sアミノ酸変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖がL11K、A12S、F13Y、V14T及びT22Sアミノ酸変異を有し、前記Titin-T鎖がM66K、K70R、S79T及びG81Rアミノ酸変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖がG2E、V17E、N30D、T32P、Q34E、S36T、V44I、A45T、L58V、K62E、A67Q、G69S及びA97Gアミノ酸変異を有し、前記Titin-T鎖がP3W、S11I、I13L、T22M及びN82Mアミノ酸変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖がD20L、T22M及びA53Lアミノ酸変異を有し、前記Titin-T鎖がS11I、M66K、S79T及びG81Rアミノ酸変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖がQ41K、A45T、A67Q、G69S及びV89Lアミノ酸変異を有し、前記Titin-T鎖がG40S、R42K、H45S、Q47E、Q49G、N56S、D58E、L75V、E83D及びF84Lアミノ酸変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖がQ42L、A45T、A67T、G69S、Q92E及びD94Gアミノ酸変異を有し、前記Titin-T鎖がQ47E、Q49G、N56S、D58E及びL75Vアミノ酸変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖がQ42L、A45T、A67T、G69S、Q92E及びD94Gアミノ酸変異を有し、前記Titin-T鎖がN56S、D58E及びL75Vアミノ酸変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖がQ42L、A45T、A67T、G69S、Q92E及びD94Gアミノ酸変異を有し、或いは前記Titin-T鎖がN56S、D58E、M66S及びT77Sアミノ酸変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖がA12S、F13Y、T22S、Q42L、A45T、A67Q、G69S、Q92E及びD94Gアミノ酸変異を有する。前記Titin-T鎖変異部位が配列番号35の配列に対する自然順番号部位であり、Obscurin-O鎖変異部位が配列番号50の配列に対する自然順番号部位である。
幾つかの実施形態において、前記第1ドメインと第2ドメインが下記Titin-T鎖/Obscurin-O鎖から選ばれ、即ち、前記Titin-T鎖が配列番号35の配列を基にM66S及びT77Sアミノ酸変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖が配列番号50の配列を基にL11K、A12S、F13Y、V14T及びT22Sアミノ酸変異を有し、前記Titin-T鎖が配列番号35の配列を基にM66K、K70R、S79T及びG81Rアミノ酸変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖が配列番号50の配列を基にG2E、V17E、N30D、T32P、Q34E、S36T、V44I、A45T、L58V、K62E、A67Q、G69S及びA97Gアミノ酸変異を有し、前記Titin-T鎖が配列番号35の配列を基にP3W、S11I、I13L、T22M及びN82Mアミノ酸変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖が配列番号50の配列を基にD20L、T22M及びA53Lアミノ酸変異を有し、前記Titin-T鎖が配列番号35の配列を基にS11I、M66K、S79T及びG81Rアミノ酸変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖が配列番号50の配列を基にQ41K、A45T、A67Q、G69S及びV89Lアミノ酸変異を有し、前記Titin-T鎖が配列番号35の配列を基にG40S、R42K、H45S、Q47E、Q49G、N56S、D58E、L75V、E83D及びF84Lアミノ酸変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖が配列番号50の配列を基にQ42L、A45T、A67T、G69S、Q92E及びD94Gアミノ酸変異を有し、前記Titin-T鎖が配列番号35の配列を基にQ47E、Q49G、N56S、D58E及びL75Vアミノ酸変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖が配列番号50の配列を基にQ42L、A45T、A67T、G69S、Q92E及びD94Gアミノ酸変異を有し、前記Titin-T鎖が配列番号35の配列を基にN56S、D58E及びL75Vアミノ酸変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖が配列番号50の配列を基にQ42L、A45T、A67T、G69S、Q92E及びD94Gアミノ酸変異を有し、或いは前記Titin-T鎖が配列番号35の配列を基にN56S、D58E、M66S及びT77Sアミノ酸変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖が配列番号50の配列を基にA12S、F13Y、T22S、Q42L、A45T、A67Q、G69S、Q92E及びD94Gアミノ酸変異を有する。前記Titin-T鎖変異部位が配列番号35の配列の自然順番号部位であり、Obscurin-O鎖変異部位が配列番号50の配列の自然順番号部位である。
幾つかの実施形態において、前記ポリペプチド複合物は、前記VH1が第1連結ドメインにより第1ドメインに操作可能に連結され、VL1が第2連結ドメインにより第2ドメインに操作可能に連結される。
幾つかの実施形態において、前記第1及び/又は第2連結ドメインが下記から選ばれ、即ち、Titin-T鎖のN末端断片、Obscurin-O鎖のN末端断片又はObscurin-Like-O鎖のN末端断片、及び（GxS）yコネクソン（但し、Xが1～5の整数（例示的に1、2、3、4、5）から選ばれ、Yが1～6の整数（例示的に1、2、3、4、5、6）から選ばれる）から選ばれる。
幾つかの実施形態において、前記第1及び/又は第2連結ドメインが下記から選ばれ、即ち、「KAGIR」、「DQPQF」、（G4S）1及び（G4S）2から選ばれる。
幾つかの実施形態において、前記ポリペプチド複合物は、前記第1ドメインがTitin-T鎖である場合、前記第1連結ドメインがKAGIRポリペプチドであり、前記第2ドメインがObscurin-O鎖である場合、前記第2連結ドメインがDQPQFポリペプチドである。別の幾つかの実施形態において、前記第2ドメインがTitin-T鎖である場合、前記第2連結ドメインがKAGIRポリペプチドであり、前記第1ドメインがObscurin-O鎖である場合、前記第1連結ドメインがDQPQFポリペプチドである。
幾つかのポリペプチド複合物の実施形態において、
（A）前記Titin-T鎖の配列が、配列番号32に示される通りであり、若しくは配列番号32の配列を基に8、20、22、25、26、39、3、11、13、40、42、45、47、49、56、58、66、70、75、77、79、81、82、83及び84から選ばれる1つ又は複数の部位のアミノ酸変異を更に有し、及び/又はN末端に5つのアミノ酸残基KAGIRを付加する配列であり、好ましくは、A8C、V20C、T22C、C25S、A26C、C39T、P3W、S11I、I13L、T22M、G40S、R42K、H45S、Q47E、Q49G、N56S、D58E、M66S又はM66K、K70R、L75V、T77S、S79T、G81R、N82M、E83D及びF84Lから選ばれる1つ又は複数の部位のアミノ酸変異を有し、及び/又はN末端にKAGIRアミノ酸残基を付加する配列であり、及び/又は
（B）前記Obscurin-O鎖の配列が、配列番号33に示される通りであり、若しくは配列番号33の配列を基に3、9、25、76、88、7、11、62、2、12、13、14、17、20、22、30、32、34、36、41、42、44、45、53、58、67、69、89、92、94及び97から選ばれる1つ又は複数の部位のアミノ酸変異を更に有し、及び/又はN末端にKAGIRアミノ酸残基を付加する配列であり、好ましくは、A3C、R9C、C25S、C76S、A88C、L7K又はL7R、T62K又はT62H、G2E、L11K、A12S、F13Y、V14T、V17E、D20L、T22M又はT22S、N30D、T32P、Q34E、S36T、Q41K、Q42L、V44I、A45T、A53L、L58V、T62E、A67Q又はA67T、G69S、V89L、Q92E、D94G及びA97Gから選ばれる1つ又は複数の部位のアミノ酸変異を有し、及び/又はN末端にDQPQFアミノ酸残基を付加する配列であり、或いは
前記Obscurin-Like-O鎖の配列が、配列番号34に示される通りであり、若しくは配列番号34の配列を基に6、26、74、77、84及び86から選ばれる1つ又は複数の部位のアミノ酸変異を更に有する配列であり、好ましくは、C6E、C26S、C77S、V74C、G84C及びA86Cから選ばれる1つ又は複数の部位のアミノ酸変異を有する配列であり、
前記Titin-T鎖変異部位が配列番号32の配列の自然順番号部位であり、Obscurin-O鎖変異部位が配列番号33の配列の自然順番号部位であり、Obscurin-Like-O鎖変異部位が配列番号34の配列の自然順番号部位である。
幾つかのポリペプチド複合物の実施形態において、（A）前記Titin-T鎖が配列番号32の配列を基に8、20、22、25、26及び39番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、好ましくは、A8C、V20C、T22C、C25S、A26C及びC39Tから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、前記Titin-T鎖変異部位が配列番号32の配列の自然順番号部位であり、更に好ましくは、前記Titin-T鎖が配列番号35の配列を基に3、11、13、22、40、42、45、47、49、56、58、66、70、75、77、79、81、82、83及び84番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸変異を有し、好ましくは、P3W、S11I、I13L、T22M、G40S、R42K、H45S、Q47E、Q49G、N56S、D58E、M66S、M66K、K70R、L75V、T77S、S79T、G81R、N82M、E83D及びF84Lから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸変異を有し、前記Titin-T鎖変異部位が配列番号35の配列の自然順番号部位であり、及び/又は
（B）前記Obscurin-O鎖が配列番号33の配列を基に3、9、25、76及び88番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、好ましくは、A3C、R9C、C25S、C76S及びA88Cから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、前記Obscurin-O鎖変異部位が配列番号33の配列の自然順番号部位であり、好ましくは、前記Obscurin-O鎖が配列番号45の配列を基に7、11、62番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を更に有し、好ましくは、L7K又はL7R、T62K又はT62H、及びK11Lから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、前記Obscurin-O鎖変異部位が配列番号45の配列の自然順番号部位であり、更に好ましくは、前記Obscurin-O鎖が配列番号50の配列を基に2、11、12、13、14、17、20、22、30、32、34、36、41、42、44、45、53、58、62、67、69、89、92、94及び97番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸変異を有し、好ましくは、G2E、L11K、A12S、F13Y、V14T、V17E、D20L、T22M又はT22S、N30D、T32P、Q34E、S36T、Q41K、Q42L、V44I、A45T、A53L、L58V、K62E、A67Q又はA67T、G69S、V89L、Q92E、D94G及びA97Gから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸変異を有し、前記Obscurin-O鎖変異部位が配列番号50の配列の自然順番号部位であり、或いは
前記Obscurin-Like-O鎖が配列番号34の配列を基に6、26、74、77、84及び86番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、好ましくは、C6E、C26S、C77S、V74C、G84C及びA86Cから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、前記Obscurin-Like-O鎖変異部位が配列番号34の配列の自然順番号部位である。
幾つかのポリペプチド複合物の実施形態において、前記Titin-T鎖が配列番号32、35～41、65～76の何れか1つに示される配列、又は配列番号32、35～41、65～76の何れか1つの配列と少なくとも80%の同一性を有する配列のポリペプチドを含み、及び/又は前記Obscurin-O鎖が配列番号33、42～58、77～86の何れか1つに示される配列、又は配列番号33、42～58、77～86の何れか1つの配列と少なくとも80%の同一性を有する配列のポリペプチドを含み、或いは前記Titin-T鎖が配列番号32、35～41、65～76の何れか1つに示される配列、又は配列番号32、35～41、65～76の何れか1つの配列と少なくとも80%の同一性を有する配列のポリペプチドを含み、及び/又は前記Obscurin-Like-O鎖が配列番号34、59～64の何れか1つに示される配列、又は配列番号34、59～64の何れか1つに示される配列と少なくとも80%の同一性を有する配列のポリペプチドを含む。前記少なくとも80%の同一性を有することは、例えば、少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%の同一性を有することである。
幾つかの実施形態において、前記Titin-T鎖が配列番号68に示されるポリペプチドを含み、Obscurin-O鎖が配列番号80に示されるポリペプチドを含む。
別の幾つかの実施形態において、Titin-T鎖が配列番号73に示されるポリペプチドを含み、Obscurin-O鎖が配列番号83に示されるポリペプチドを含む。
別の幾つかの実施形態において、Titin-T鎖が配列番号76に示されるポリペプチドを含み、Obscurin-O鎖が配列番号84に示されるポリペプチドを含む。
別の幾つかの実施形態において、Titin-T鎖が配列番号76に示されるポリペプチドを含み、Obscurin-O鎖が配列番号86に示されるポリペプチドを含む。
別の幾つかの実施形態において、Titin-T鎖が配列番号76に示されるポリペプチドを含み、Obscurin-O鎖が配列番号86に示されるポリペプチドを含む。
別の幾つかの実施形態において、Titin-T鎖が配列番号75に示されるポリペプチドを含み、Obscurin-O鎖が配列番号86に示されるポリペプチドを含む。
幾つかの実施形態において、前記Titin-T鎖が配列番号68に示されるポリペプチドであり、Obscurin-O鎖が配列番号80に示されるポリペプチドであり、Titin-T鎖が配列番号73に示されるポリペプチドであり、Obscurin-O鎖が配列番号83に示されるポリペプチドであり、Titin-T鎖が配列番号76に示されるポリペプチドであり、Obscurin-O鎖が配列番号84に示されるポリペプチドであり、Titin-T鎖が配列番号76に示されるポリペプチドであり、Obscurin-O鎖が配列番号86に示されるポリペプチドであり、Titin-T鎖が配列番号76に示されるポリペプチドであり、Obscurin-O鎖が配列番号86に示されるポリペプチドであり、或いはTitin-T鎖が配列番号75に示されるポリペプチドであり、Obscurin-O鎖が配列番号86に示されるポリペプチドである。
幾つかの実施形態において、前記ポリペプチド複合物は、第1抗原が外因性抗原、内因性抗原、自己抗原、新生抗原、ウイルス抗原及び腫瘍抗原から選ばれる。
幾つかの実施形態において、
前記何れか1項に記載のポリペプチド複合物であり、第1抗原に特異的に結合する第1ポリペプチド複合物と、
第2抗原結合部分を含み、第2抗原に特異的に結合する第2ポリペプチド複合物と、を含む多重特異性ポリペプチド複合物が開示された。
幾つかの実施形態において、前記第1ポリペプチド複合物と第2ポリペプチド複合物が異なる2つの抗原に結合する。
幾つかの実施形態において、前記第1ポリペプチド複合物と第2ポリペプチド複合物が同じ抗原における異なる2つのエピトープに結合する。
幾つかの実施形態において、前記多重特異性ポリペプチド複合物が多重特異性ポリペプチド複合物であり、更に好ましくは、前記多重特異性ポリペプチド複合物が二重特異性抗体である。
幾つかの実施形態において、前記多重特異性ポリペプチド複合物の第2ポリペプチド複合物が第2重鎖可変ドメイン（VH2）と第2軽鎖可変ドメイン（VL2）を含む。第1ポリペプチド複合物のVH1と第2ポリペプチド複合物のVL2との間、及び/又は第2ポリペプチド複合物のVH2と第1ポリペプチド複合物のVL1との間に、ミスマッチが起きにくい。幾つかの実施形態において、前記第2抗原結合部分のVH2とVL2が第2抗原に特異的に結合する第2抗原結合部位を形成する。
幾つかの実施形態において、前記多重特異性ポリペプチド複合物は、前記第2ポリペプチド複合物の第2抗原結合部分が、
N末端からC末端までのVH2を含み、第3ドメインに操作可能に連結され、前記第3ドメインがCH1を含む第3ポリペプチドと、
N末端からC末端までのVL2を含み、第4ドメインに操作可能に連結され、前記第4ドメインがCLを含む第4ポリペプチドと、を含む。
幾つかの実施形態において、前記VH2のC末端がCH1のN末端に結合し、前記VL2のC末端がCLのN末端に結合する。
幾つかの実施形態において、前記多重特異性ポリペプチド複合物は、前記第1ポリペプチド複合物が操作可能に連結される第1二量化ドメインを更に含み、前記第2ポリペプチド複合物が操作可能に連結される第2二量化ドメインを更に含み、前記第1二量化ドメインが第2二量化ドメインに結合する。
幾つかの実施形態において、前記第1ポリペプチド複合物の第1ドメインのC末端が第1二量化ドメインのN末端に操作可能に連結され、前記第2ポリペプチド複合物の第3ドメインのC末端が第2二量化ドメインのN末端に操作可能に連結される。
幾つかの実施形態において、前記第1二量化ドメインが抗体ヒンジ領域又はその一部、コネクソン、ジスルフィド結合、水素結合、静電相互作用、塩橋、疎水-親水相互作用、又はこれらの組合せの結合方式により第2二量化ドメインに結合し、二量体を形成する。
幾つかの実施形態において、前記前記第1二量化ドメインが抗体ヒンジ領域又はその一部により第2二量化ドメインに結合し、二量体を形成し、好ましくは、IgG1、IgG2又はIgG4のヒンジ領域又はその一部により結合し、二量体を形成する。幾つかの実施形態において、好ましくは、IgG1、IgG2、IgG3又はIgG4のヒンジ領域又はその一部により結合し、二量体を形成する。
幾つかの実施形態において、前記多重特異性ポリペプチド複合物は、前記第1二量化ドメイン及び/又は第2二量化ドメインが抗体CH2ドメイン及び/又は抗体CH3ドメインを更に含む。
幾つかの実施形態において、前記多重特異性ポリペプチド複合物は、抗体CH2ドメイン及び/又は抗体CH3ドメインがIgG1、IgG2又はIgG4に由来する。幾つかの実施形態において、前記抗体CH2ドメイン及び/又は抗体CH3ドメインがIgG1、IgG2、IgG3又はIgG4に由来する。
幾つかの実施形態において、前記多重特異性ポリペプチド複合物は、前記第1ポリペプチドは、N末端からC末端までの順で、VH1-L1-T鎖-L2-CH2-CH3であり、前記第2ポリペプチドは、N末端からC末端までの順で、VL1-L3-O鎖又はVL1-L4-OL鎖であり、前記第3ポリペプチドは、N末端からC末端までの順で、VH2-CH1-CH2-CH3であり、前記第4ポリペプチドは、N末端からC末端までの順で、VL1-CLであり、或いは、前記第1ポリペプチドは、N末端からC末端までの順で、VH1-L2-O鎖-L3-CH2-CH3、又はVH1-L4-OL鎖-L5-CH2-CH3であり、前記第2ポリペプチドは、N末端からC末端までの順で、VL1-L1-T鎖であり、前記第3ポリペプチドは、N末端からC末端までの順で、VH2-CH1-CH2-CH3であり、前記第4ポリペプチドは、N末端からC末端までの順で、VL2-CLであり、前記L1-L5はスペーサー領域（連結ドメインとも呼ぶ）であり、スペーサー領域が存在してもよく、又は存在しなくてもよい。好ましくは、前記スペーサー領域が下記から選ばれ、即ち、Titin-T鎖のN末端断片、又はObscurin-O鎖のN末端断片、又はObscurin-Like-O鎖のN末端断片、又はコネクソン（例えば（GxS）yコネクソン（但し、Xが1～5の整数から選ばれ、Yが1～6の整数から選ばれる））から選ばれる。最も好ましくは、前記スペーサー領域が下記から選ばれ、即ち、「KAGIR」、「DQPQF」、（G4S）1及び（G4S）2から選ばれる。
幾つかの実施形態において、前記多重特異性ポリペプチド複合物は、前記第1二量化ドメインが第2二量化ドメインと異なり、ホモ二量化を阻止する方式及び/又はヘテロ二量化を促進する方式により結合する。
幾つかの実施形態において、前記第1二量化ドメインがknob-into-hole、疎水相互作用、静電相互作用、親水相互作用又は柔軟性を向上させる方式により第2二量化ドメインに結合し、二量体を形成する。
幾つかの実施形態において、前記第1二量化ドメインが配列番号2に示される配列の104～330番目のアミノ酸残基を有し、前記第2二量化ドメインが配列番号3に示される配列の104～330番目のアミノ酸残基を有し、或いは前記第1二量化ドメインが配列番号3に示される配列の104～330番目のアミノ酸残基を有し、前記第2二量化ドメインが配列番号2に示される配列の104～330番目のアミノ酸残基を有する。
幾つかの実施形態において、本開示は、少なくとも1つの定常領域ドメインCH1と少なくとも1つの定常領域ドメインCLが取り替えられ、
前記ドメインCH1がTitin-T鎖で取り替えられ、前記ドメインCLがTitin-T鎖とタンパク質間相互作用を有することができるドメインで取り替えられ、
前記ドメインCLがTitin-T鎖で取り替えられ、前記ドメインCH1がTitin-T鎖とタンパク質間相互作用を有することができるドメインで取り替えられ、
前記ドメインCH1がObscurin-O鎖で取り替えられ、前記ドメインCLがObscurin-O鎖とタンパク質間相互作用を有することができるドメインで取り替えられ、
前記ドメインCLがObscurin-O鎖で取り替えられ、前記ドメインCH1がObscurin-O鎖とタンパク質間相互作用を有することができるドメインで取り替えられ、
前記ドメインCH1がObscurin-Like-O鎖で取り替えられ、前記ドメインCLがObscurin-Like-O鎖とタンパク質間相互作用を有することができるドメインで取り替えられ、或いは
前記ドメインCLがObscurin-Like-O鎖で取り替えられ、前記ドメインCH1がObscurin-Like-O鎖とタンパク質間相互作用を有することができるドメインで取り替えられる、ドメイン改造抗体を提供する。
幾つかの実施形態において、前記ドメイン改造抗体は、前記Obscurin-O鎖又はObscurin-Like-O鎖と互いに作用できるドメインがTitin-T鎖であり、前記Titin-T鎖と互いに作用できるドメインがObscurin-O鎖又はObscurin-Like-O鎖である。
幾つかの実施形態において、前記抗体が重鎖可変領域VH1と軽鎖可変領域VL1を含み、前記VH1とVL1がその抗原に特異的に結合する原結合部位を形成し、前記VH1のC末端がTitin-T鎖のN末端に操作可能に連結され、前記VL1のC末端がObscurin-O鎖又はObscurin-Like-O鎖のN末端に操作可能に連結され、或いは前記VL1のC末端がTitin-T鎖のN末端に操作可能に連結され、前記VH1のC末端がObscurin-O鎖又はObscurin-Like-O鎖のN末端に操作可能に連結される。
幾つかの実施形態において、本開示は、定常領域ドメインCH1と定常領域ドメインCLが取り替えられ、
前記ドメインCH1がTitin-T鎖で取り替えられ、前記ドメインCLがTitin-T鎖とタンパク質間相互作用を有することができるドメインで取り替えられ、或いは
前記ドメインCLがTitin-T鎖で取り替えられ、前記ドメインCH1がTitin-T鎖とタンパク質間相互作用を有することができるドメインで取り替えられ、或いは
前記ドメインCH1がObscurin-O鎖で取り替えられ、前記ドメインCLがObscurin-O鎖とタンパク質間相互作用を有することができるドメインで取り替えられ、或いは
前記ドメインCLがObscurin-O鎖で取り替えられ、前記ドメインCH1がObscurin-O鎖とタンパク質間相互作用を有することができるドメインで取り替えられ、或いは
前記ドメインCH1がObscurin-Like-O鎖で取り替えられ、前記ドメインCLがObscurin-Like-O鎖とタンパク質間相互作用を有することができるドメインで取り替えられ、或いは
前記ドメインCLがObscurin-Like-O鎖で取り替えられ、前記ドメインCH1がObscurin-Like-O鎖とタンパク質間相互作用を有することができるドメインで取り替えられる、ドメイン改造抗体のFab断片を提供する。
幾つかの実施形態において、前記Fab断片は、前記Titin-T鎖とタンパク質間相互作用を有するドメインがObscurin-O鎖又はObscurin-Like-O鎖であり、前記Obscurin-O鎖又はObscurin-Like-O鎖とタンパク質間相互作用を有するドメインがTitin-T鎖である。
幾つかの実施形態において、前記Fabが重鎖可変領域VH1と軽鎖可変領域VL1を含み、前記VH1とVL1がその抗原に特異的に結合する原結合部位を形成し、前記VH1のC末端がTitin-T鎖のN末端に操作可能に連結され、前記VL1のC末端がObscurin-O鎖又はObscurin-Like-O鎖のN末端に操作可能に連結され、或いは前記VL1のC末端がTitin-T鎖のN末端に操作可能に連結され、前記VH1のC末端がObscurin-O鎖又はObscurin-Like-O鎖のN末端に操作可能に連結される。
幾つかの実施形態において、本開示は、前記Fab断片を含むドメイン改造抗体を提供する。
幾つかの実施形態において、本開示は、第1抗原に特異的に結合する第1重鎖と第1軽鎖を含み、第2抗原に特異的に結合する第2重鎖と第2軽鎖を更に含み、
前記第1重鎖のCH1ドメインがTitin-T鎖で取り替えられ、第1軽鎖のCLドメインがTitin-T鎖とタンパク質間相互作用を有することができるドメインで取り替えられ、或いは
前記第1軽鎖のCLドメインがTitin-T鎖で取り替えられ、前記第1重鎖のCH1ドメインがTitin-T鎖とタンパク質間相互作用を有することができるドメインで取り替えられ、或いは
前記第1重鎖のドメインCH1がObscurin-O鎖で取り替えられ、前記第1軽鎖のドメインCLがObscurin-O鎖とタンパク質間相互作用を有することができるドメインで取り替えられ、或いは
前記第1軽鎖のドメインCLがObscurin-O鎖で取り替えられ、前記第1重鎖のドメインCH1がObscurin-O鎖とタンパク質間相互作用を有することができるドメインで取り替えられ、或いは
前記第1重鎖のドメインCH1がObscurin-Like-O鎖で取り替えられ、前記第1軽鎖のドメインCLがObscurin-Like-O鎖とタンパク質間相互作用を有することができるドメインで取り替えられ、或いは
前記第1軽鎖のドメインCLがObscurin-Like-O鎖で取り替えられ、前記第1重鎖のドメインCH1がObscurin-Like-O鎖とタンパク質間相互作用を有することができるドメインで取り替えられる、二重特異性抗体を提供する。
前記二重特異性抗体が異なる第1抗原と第2抗原に結合し、又は同じ抗原における異なる2つのエピトープに結合する。
具体的な実施形態において、第1重鎖と第2軽鎖との間、第1軽鎖と第2重鎖との間にミスマッチが起きにくい。
幾つかの実施形態において、前記二重特異性抗体は、前記Titin-T鎖とタンパク質間相互作用を有するドメインがObscurin-O鎖又はObscurin-Like-O鎖であり、前記Obscurin-O鎖又はObscurin-Like-O鎖とタンパク質間相互作用を有するドメインがTitin-T鎖である。
幾つかの実施形態において、前記第1重鎖が第1重鎖可変領域（VH1）を含み、前記第1軽鎖が第1軽鎖可変領域（VL1）を含み、前記VH1とVL1が第1抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、且つ前記VH1のC末端がTitin-T鎖のN末端に操作可能に連結され、前記VL1のC末端がObscurin-O鎖又はObscurin-Like-O鎖のN末端に操作可能に連結され、或いは前記VL1のC末端がTitin-T鎖のN末端に操作可能に連結され、前記VH1のC末端がObscurin-O鎖又はObscurin-Like-O鎖のN末端に操作可能に連結される。
幾つかの実施形態において、前記二重特異性抗体は、前記第2重鎖がN末端からC末端までの第2重鎖可変領域（VH2）を含み、CH1に操作可能に連結され、前記第2軽鎖がN末端からC末端までの第2軽鎖可変領域（VL2）を含み、CLに操作可能に連結される。
幾つかの実施形態において、前記二重特異性抗体は、前記VH2とVL2が第2抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、前記VH2のC末端がCH1のN末端に操作可能に連結され、前記VL2のC末端がCLのN末端に操作可能に連結される。
幾つかの実施形態において、前記二重特異性抗体は、前記二重特異性抗体の構造モデルがF（ab）2、scFv-Fab、（scFv）2-Fab、KiH、CrossMAb、Triomab quadroma、FcΔAdp、ART-Ig、BiMAb、Biclonics、BEAT、DuoBody、Azymetric、XmAb、2：1 TCBs、1Fab-IgG TDB、FynomAb、two-in-one/DAF、scFv-Fab-IgG、DART-Fc、LP-DART、CODV-Fab-TL、HLE-BiTE、F（ab）2-CrossMAb、IgG-（scFv）2、Bs4Ab、DVD-Ig、Tetravalent-DART-Fc、（scFv）4-Fc、CODV-Ig、mAb2、F（ab）4-CrossMAb、IgG及びFab-IgGなどから選ばれる。
幾つかの実施形態において、前記二重特異性抗体は、前記第1重鎖と第2重鎖のC末端がCH2及び/又はCH3ドメインを含む。
幾つかの実施形態において、前記CH1、CH2及びCH3ドメインがIgG1、IgG2又はIgG4に由来する。幾つかの実施形態において、前記CH1、CH2及びCH3ドメインがIgG1、IgG2、IgG3又はIgG4に由来する。幾つかの実施形態において、前記第1重鎖が抗体ヒンジ領域又はその一部、コネクソン、ジスルフィド結合、水素結合、静電相互作用、塩橋、疎水-親水相互作用又はこれらの組合せの結合方式により第2重鎖に結合し、二量体を形成する。
幾つかの実施形態において、前記二重特異性抗体は、前記第1重鎖は、N末端からC末端までの順で、VH1-L1-T鎖-L2-CH2-CH3であり、前記第1軽鎖は、N末端からC末端までの順で、VL1-L3-O鎖又はVL1-L4-OL鎖であり、前記第2重鎖は、N末端からC末端までの順で、VH2-CH1-CH2-CH3であり、前記第2軽鎖は、N末端からC末端までの順で、VL2-CLであり、或いは
前記第1軽鎖は、N末端からC末端までの順で、VL1-L1-T鎖であり、前記第1重鎖は、N末端からC末端までの順で、VH1-L2-O鎖-L3-CH2-CH3、又はVH1-L4-OL鎖-L5-CH2-CH3であり、前記第2重鎖は、N末端からC末端までの順で、VH2-CH1-CH2-CH3であり、前記第2軽鎖は、N末端からC末端までの順で、VL2-CLであり、
前記L1-L5がスペーサー領域であり、スペーサー領域が存在してもよく、又は存在しなくてもよく、好ましくは、前記スペーサー領域がTitin-T鎖のN末端断片、又はObscurin-O鎖のN末端断片、又はObscurin-Like-O鎖のN末端断片、又はコネクソン（例えば、（GxS）yコネクソン（但し、Xが1～5の整数から選ばれ、Yが1～6の整数から選ばれる））であり、好ましくは、前記スペーサー領域が「KAGIR」、「DQPQF」、（G4S）1及び（G4S）2から選ばれる。
幾つかの実施形態において、前記二重特異性抗体は、前記第1重鎖のCH2及びCH3と第2重鎖のCH2及びCH3が異なり、ホモ二量化を阻止する方式及び/又はヘテロ二量化を促進する方式により結合する。
幾つかの実施形態において、前記第1重鎖がknob-into-hole、疎水相互作用、静電相互作用、親水相互作用又は柔軟性を向上させる方式により第2重鎖に結合し、二量体を形成する。
幾つかの実施形態において、前記第1重鎖がknob-into-hole方式により第2重鎖に結合し、二量体を形成する。幾つかの実施形態において、前記第1重鎖CH2-CH3ドメインが配列番号2に示される配列の104～330番目のアミノ酸残基を有し、前記第2重鎖CH2-CH3ドメインが配列番号3に示される配列の104～330番目のアミノ酸残基を有し、或いは前記第1重鎖CH2-CH3ドメインが配列番号3に示される配列の104～330番目のアミノ酸残基を有し、前記第2重鎖CH2-CH3ドメインが配列番号2に示される配列の104～330番目のアミノ酸残基を有する。
幾つかの実施形態において、前記二重特異性抗体は、前記第1重鎖は、N末端からC末端までの順で、VH1-L1-T鎖-L2-knob-Fcであり、前記第1軽鎖は、N末端からC末端までの順で、VL1-L3-O鎖又はVL1-L4-OL鎖であり、前記第2重鎖は、N末端からC末端までの順で、VH2-CH1-hole-Fcであり、前記第2軽鎖は、N末端からC末端までの順で、VL1-CLであり、或いは前記第1重鎖は、N末端からC末端までの順で、VH1-L1-T鎖-L2-hole-Fcであり、前記第1軽鎖は、N末端からC末端までの順で、VL1-L3-O鎖又はVL1-L4-OL鎖であり、前記第2重鎖は、N末端からC末端までの順で、VH2-CH1-knob-Fcであり、前記第2軽鎖は、N末端からC末端までの順で、VL2-CLであり、或いは
前記第1軽鎖は、N末端からC末端までの順で、VL1-L1-T鎖であり、前記第1重鎖は、N末端からC末端までの順で、VH1-L2-O鎖-L3-knob-Fc、又はVH1-L4-OL鎖-L5-knob-Fcであり、前記第2重鎖は、N末端からC末端までの順で、VH2-CH1-hole-Fcであり、前記第2軽鎖は、N末端からC末端までの順で、VL2-CLであり、前記第1軽鎖は、N末端からC末端までの順で、VL1-L1-T鎖であり、前記第1重鎖は、N末端からC末端までの順で、VH1-L2-O鎖-L3-hole-Fc、又はVH1-L4-OL鎖-L5-hole-Fcであり、前記第2重鎖は、N末端からC末端までの順で、VH2-CH1-knob-Fcであり、前記第2軽鎖は、N末端からC末端までの順で、VL2-CLであり、
前記L1-L5がスペーサー領域であり、スペーサー領域が存在してもよく、又は存在しなくてもよく、好ましくは、前記スペーサー領域がTitin-T鎖のN末端断片、又はObscurin-O鎖のN末端断片、又はObscurin-Like-O鎖のN末端断片、又はコネクソン（例えば、（GxS）yコネクソン（但し、Xが1～5の整数から選ばれ、Yが1～6の整数から選ばれる））であり、好ましくは、前記スペーサー領域が「KAGIR」、「DQPQF」、（G4S）1及び（G4S）2から選ばれる。
幾つかの実施形態において、前記何れか1項に記載のドメイン改造抗体、又はドメイン改造抗体のFab断片、又は二重特異性抗体は、前記Titin-T鎖とタンパク質間相互作用を有するドメインがObscurin-O鎖又はObscurin-Like-O鎖であり、前記Obscurin-O鎖又はObscurin-Like-O鎖とタンパク質間相互作用を有するドメインがTitin-T鎖である。前記何れか1項に記載のドメイン改造抗体、又はドメイン改造抗体のFab断片、又は二重特異性抗体は、前記操作可能に連結されることは、2本のポリペプチド配列がスペーサー領域により連結されること、又は2本のポリペプチドが直接的に連結されることである。
幾つかの実施形態において、前記ドメイン改造抗体、又は二重特異性抗体、又はドメイン改造抗体のFab断片は、前記Titin-T鎖がObscurin-O鎖と、又はTitin-T鎖がObscurin-Like-O鎖と、天然鎖間結合及び/又は非天然鎖間結合により結合し、二量体を形成する。
幾つかの実施形態において、前記第1ドメインが第2ドメインと天然鎖間結合により二量体を形成し、前記Titin-T鎖における7～15、19～24、26、55、59及び60番目から選ばれる1つ又は複数の残基がObscurin-O鎖における3～6、9、41、73、75及び80～90番目から選ばれる1つ又は複数の残基と互いに結合し、或いは
前記Titin-T鎖における1、7～10、13～16、19～26、59～60及び96番目から選ばれる1つ又は複数の残基がObscurin-Like-O鎖における4～5、10、12～13、74、76、78及び82～91番目から選ばれる1つ又は複数の残基と互いに結合する。前記Titin-T鎖残基部位が配列番号32の配列に対する自然順番号部位であり、Obscurin-O鎖残基部位が配列番号33の配列に対する自然順番号部位であり、Obscurin-Like-O鎖残基部位が配列番号34の配列に対する自然順番号部位である。
幾つかの実施形態において、前記ドメイン改造抗体、二重特異性抗体、又はドメイン改造抗体のFab断片は、前記Titin-T鎖がObscurin-O鎖、又はTitin-T鎖がObscurin-Like-O鎖と、少なくとも1つの非天然鎖間結合により二量体を形成する。幾つかの実施形態において、前記非天然鎖間結合がジスルフィド結合である。幾つかの実施形態において、前記二量体が1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10個の非天然鎖間結合を含む。
幾つかの実施形態において、前記ドメイン改造抗体、二重特異性抗体又はドメイン改造抗体のFab断片は、
前記Titin-T鎖が8、20、22、25、26及び39番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖が3、9、25、76及び88番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、或いは
Titin-T鎖が8、20、22、25、26及び39番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、及び/又は前記Obscurin-Like-O鎖が6、26、74、77、84及び86番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有する。
幾つかの実施形態において、前記Titin-T鎖/Obscurin-O鎖、或いはTitin-T鎖/Obscurin-Like-O鎖は、
前記Titin-T鎖が配列番号32の配列を基に8、20、22、25、26及び39番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有するポリペプチドであり、及び/又は前記Obscurin-O鎖が配列番号33の配列を基に3、9、25、76及び88番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有するポリペプチドであり、或いは
前記Titin-T鎖が配列番号32の配列を基に8、20、22、25、26及び39番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有するポリペプチドであり、及び/又は前記Obscurin-Like-O鎖が配列番号34の配列を基に6、26、74、77、84及び86番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有するポリペプチドである。
幾つかの実施形態において、前記ドメイン改造抗体、二重特異性抗体又はドメイン改造抗体のFab断片は、
前記Titin-T鎖が8C、20C、22C、25S、26C及び39Tから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖が3C、9C、25S、76S及び88Cから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、或いは
前記Titin-T鎖が8C、20C、22C、25S、26C及び39Tから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、及び/又は前記Obscurin-Like-O鎖が6E、26S、74C、77S、84C及び86Cから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、
更に好ましくは、前記非天然鎖間結合が下記から選ばれる変異部位に位置し、即ち、
Titin-T鎖が25S、39T及び8C変異を有し、且つObscurin-O鎖が88C変異を有し、
Titin-T鎖が25S、39T及び20C変異を有し、且つObscurin-O鎖が3C変異を有し、
Titin-T鎖が25S、39T及び26C変異を有し、且つObscurin-O鎖が9C変異を有し、
Titin-T鎖が25S、39T及び8C変異を有し、且つObscurin-O鎖が25S、76S及び88C変異を有し、
Titin-T鎖が25S、39T及び20C変異を有し、且つObscurin-O鎖が25S、76S及び3C変異を有し、
Titin-T鎖が25S、39T及び26C変異を有し、且つObscurin-O鎖が25S、76S及び9C変異を有し、
Titin-T鎖が25S、39T及び8C変異を有し、且つObscurin-Like-O鎖が6E及び74C変異を有し、
Titin-T鎖が25S、39T及び20C変異を有し、且つObscurin-Like-O鎖が6E及び84C変異を有し、
Titin-T鎖が25S、39T及び22C変異を有し、且つObscurin-Like-O鎖が6E及び86C変異を有し、
Titin-T鎖が25S、39T及び8C変異を有し、且つObscurin-Like-O鎖が6E、26S、77S及び74C変異を有し、
Titin-T鎖が25S、39T及び20C変異を有し、且つObscurin-Like-O鎖が6E、26S、77S及び84C変異を有し、或いは
Titin-T鎖が25S、39T及び22C変異を有し、且つObscurin-Like-O鎖が6E、26S、77S及び86C変異を有し、
Titin-T鎖変異部位が配列番号32の配列に対する自然順番号部位であり、Obscurin-O鎖変異部位が配列番号33の配列に対する自然順番号部位であり、Obscurin-Like-O鎖変異部位が配列番号34の配列に対する自然順番号部位である。
幾つかの実施形態において、前記ドメイン改造抗体、二重特異性抗体又はドメイン改造抗体のFab断片は、
前記Titin-T鎖がA8C、V20C、T22C、C25S、A26C及びC39Tから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖がA3C、R9C、C25S、C76S及びA88Cから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、或いは
前記Titin-T鎖がA8C、V20C、T22C、C25S、A26C及びC39Tから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、及び/又は前記Obscurin-Like-O鎖がC6E、C26S、C77S、V74C、G84C及びA86Cから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、前記Titin-T鎖変異部位が配列番号32の配列に対する自然順部位であり、Obscurin-O鎖変異部位が配列番号33の配列に対する自然順部位であり、Obscurin-Like-O鎖変異部位が配列番号34の配列に対する自然順部位である。
幾つかの実施形態において、前記Titin-T鎖が配列番号32の配列を基にA8C、V20C、T22C、C25S、A26C及びC39Tから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖が配列番号33の配列を基にA3C、R9C、C25S、C76S及びA88Cから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、或いは前記Titin-T鎖が配列番号32の配列を基にA8C、V20C、T22C、C25S、A26C及びC39Tから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、及び/又は前記Obscurin-Like-O鎖が配列番号34の配列を基にC6E、C26S、C77S、V74C、G84C及びA86Cから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有する。前記Titin-T鎖変異部位が配列番号32の配列の自然順番号部位であり、Obscurin-O鎖変異部位が配列番号33の配列の自然順番号部位であり、Obscurin-Like-O鎖変異部位が配列番号34の配列の自然順番号部位である。
幾つかの実施形態において、前記ドメイン改造抗体、二重特異性抗体又はドメイン改造抗体のFab断片は、
前記Titin-T鎖がC25S、C39T及びA8C変異を有し、Obscurin-O鎖がA88C変異を有し、
Titin-T鎖がC25S、C39T及びV20C変異を有し、Obscurin-O鎖がA3C変異を有し、
Titin-T鎖がC25S、C39T及びA26C変異を有し、Obscurin-O鎖がR9C変異を有し、
Titin-T鎖がC25S、C39T及びA8C変異を有し、Obscurin-O鎖がC25S、C76S及びA88C変異を有し、
Titin-T鎖がC25S、C39T及びV20C変異を有し、Obscurin-O鎖がC25S、C76S及びA3C変異を有し、
Titin-T鎖がC25S、C39T及びA26C変異を有し、Obscurin-O鎖がC25S、C76S及びR9C変異を有し、
Titin-T鎖がC25S、C39T及びA8C変異を有し、Obscurin-Like-O鎖がC6E及びV74C変異を有し、
Titin-T鎖がC25S、C39T及びV20C変異を有し、Obscurin-Like-O鎖がC6E及びG84C変異を有し、
Titin-T鎖がC25S、C39T及びT22C変異を有し、Obscurin-Like-O鎖がC6E及びA86C変異を有し、
Titin-T鎖がC25S、C39T及びA8C変異を有し、Obscurin-Like-O鎖がC6E、C26S、C77S及びV74C変異を有し、
Titin-T鎖がC25S、C39T及びV20C変異を有し、Obscurin-Like-O鎖がC6E、C26S、C77S及びG84C変異を有し、
Titin-T鎖がC25S、C39T及びT22C変異を有し、Obscurin-Like-O鎖がC6E、C26S、C77S及びA86C変異を有し、
前記Titin-T鎖変異部位が配列番号32の配列に対する自然順部位であり、Obscurin-O鎖変異部位が配列番号33の配列に対する自然順部位であり、Obscurin-Like-O鎖変異部位が配列番号34の配列に対する自然順部位である。
幾つかの実施形態において、幾つかの実施形態において、前記ドメイン改造抗体、二重特異性抗体又はドメイン改造抗体のFab断片は、前記Titin-T鎖が配列番号32の配列を基にC25S、C39T及びA8C変異を有し、Obscurin-O鎖が配列番号33の配列を基にA88C変異を有し、前記Titin-T鎖が配列番号32の配列を基にC25S、C39T及びV20C変異を有し、前記Obscurin-O鎖が配列番号33の配列を基にA3C変異を有し、前記Titin-T鎖が配列番号32の配列を基にC25S、C39T及びA26C変異を有し、前記Obscurin-O鎖が配列番号33の配列を基にR9C変異を有し、前記Titin-T鎖が配列番号32の配列を基にC25S、C39T及びA8C変異を有し、前記Obscurin-O鎖が配列番号33の配列を基にC25S、C76S及びA88C変異を有し、前記Titin-T鎖が配列番号32の配列を基にC25S、C39T及びV20C変異を有し、前記Obscurin-O鎖が配列番号33の配列を基にC25S、C76S及びA3C変異を有し、前記Titin-T鎖が配列番号32の配列を基にC25S、C39T及びA26C変異を有し、前記Obscurin-O鎖が配列番号33の配列を基にC25S、C76S及びR9C変異を有し、前記Titin-T鎖が配列番号32の配列を基にC25S、C39T及びA8C変異を有し、前記Obscurin-Like-O鎖が配列番号34の配列を基にC6E及びV74C変異を有し、前記Titin-T鎖が配列番号32の配列を基にC25S、C39T及びV20C変異を有し、前記Obscurin-Like-O鎖が配列番号34の配列を基にC6E及びG84C変異を有し、前記Titin-T鎖が配列番号32の配列を基にC25S、C39T及びT22C変異を有し、前記Obscurin-Like-O鎖が配列番号34の配列を基にC6E及びA86C変異を有し、前記Titin-T鎖が配列番号32の配列を基にC25S、C39T及びA8C変異を有し、前記Obscurin-Like-O鎖が配列番号34の配列を基にC6E、C26S、C77S及びV74C変異を有し、前記Titin-T鎖が配列番号32の配列を基にC25S、C39T及びV20C変異を有し、前記Obscurin-Like-O鎖が配列番号34の配列を基にC6E、C26S、C77S及びG84C変異を有し、前記Titin-T鎖が配列番号32の配列を基にC25S、C39T及びT22C変異を有し、前記Obscurin-Like-O鎖が配列番号34の配列を基にC6E、C26S、C77S及びA86C変異を有する。前記Titin-T鎖変異部位が配列番号32の配列の自然順番号に対応する部位であり、Obscurin-O鎖変異部位が配列番号33の配列の自然順番号に対応する部位であり、Obscurin-Like-O鎖変異部位が配列番号34の配列の自然順番号に対応する部位である。
幾つかの実施形態において、前記ドメイン改造抗体、二重特異性抗体又はドメイン改造抗体のFab断片は、前記Obscurin-O鎖が7、11、62番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を更に有する。幾つかの実施形態において、前記Obscurin-O鎖が7R又は7K、62K又は62H、及び11Lから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、最も好ましくは、前記Titin-T鎖が25S、39T及び8C変異を有し、且つObscurin-O鎖が25S、76S、88C、7K及び62K変異を有し、Titin-T鎖が25S、39T及び8C変異を有し、且つObscurin-O鎖が25S、76S、88C、7K及び62H変異を有し、Titin-T鎖が25S、39T及び8C変異を有し、且つObscurin-O鎖が25S、76S、88C、11L及び62K変異を有し、或いはTitin-T鎖が25S、39T及び8C変異を有し、且つObscurin-O鎖が25S、76S、88C、11L及び62Hを有する。幾つかの実施形態において、前記Obscurin-O鎖がL7K又はL7R、K11L、T62K又はT62Hから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有する。幾つかの実施形態において、Titin-T鎖がC25S、C39T及びA8C変異を有し、Obscurin-O鎖がC25S、C76S、A88C、L7K及びT62K変異を有し、Titin-T鎖がC25S、C39T及びA8C変異を有し、Obscurin-O鎖がC25S、C76S、A88C、L7K及びT62H変異を有し、Titin-T鎖がC25S、C39T及びA8C変異を有し、Obscurin-O鎖がC25S、C76S、A88C、K11L及びT62K変異を有し、或いはTitin-T鎖がC25S、C39T及びA8C変異を有し、Obscurin-O鎖がC25S、C76S、A88C、K11L及びT62Hを有する。前記Titin-T鎖変異部位が配列番号32の配列に対する自然順部位であり、Obscurin-O鎖変異部位が配列番号33の配列に対する自然順部位である。
幾つかの実施形態において、前記ドメイン改造抗体、二重特異性抗体又はドメイン改造抗体のFab断片は、前記Obscurin-O鎖が配列番号45を基に7、11、62番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有するObscurin-O鎖である。幾つかの実施形態において、前記Obscurin-O鎖が配列番号45を基にL7K又はL7R、K11L及びT62K又はT62Hから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有する。幾つかの実施形態において、前記Titin-T鎖が配列番号32を基にC25S、C39T及びA8C変異を有し、且つObscurin-O鎖が配列番号45を基にC25S、C76S、A88C、L7K及びT62K変異を有し、Titin-T鎖が配列番号32を基にC25S、C39T及びA8C変異を有し、且つObscurin-O鎖が配列番号45を基にC25S、C76S、A88C、L7K及びT62H変異を有し、Titin-T鎖が配列番号32を基にC25S、C39T及びA8C変異を有し、且つObscurin-O鎖が配列番号45を基にC25S、C76S、A88C、K11L及びT62K変異を有し、Titin-T鎖が配列番号32を基にC25S、C39T及びA8C変異を有し、且つObscurin-O鎖が配列番号45を基にC25S、C76S、A88C、K11L及びT62H変異を有する。前記Titin-T鎖変異部位が配列番号32の配列の自然順番号に対応する部位であり、Obscurin-O鎖変異部位が配列番号33の配列の自然順番号に対応する部位である。
幾つかの実施形態において、前記ドメイン改造抗体、二重特異性抗体又はドメイン改造抗体のFab断片は、前記Titin-T鎖が3、11、13、22、40、42、45、47、49、56、58、66、70、75、77、79、81、82、83及び84番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸変異を有し、及び/又はObscurin-O鎖が2、11、12、13、14、17、20、22、30、32、34、36、41、42、44、45、53、58、62、67、69、89、92、94及び97番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸変異を有する。幾つかの実施形態において、Titin-T鎖が3W、11I、13L、22M、40S、42K、45S、47E、49G、56S、58E、66S又は66K、70R、75V、77S、79T、81R、82M、83D及び84Lから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸変異を有し、及び/又はObscurin-O鎖が2E、11K、12S、13Y、14T、17E、20L、22M又は22S、30D、32P、34E、36T、41K、42L、44I、45T、53L、58V、62E、67Q又は67T、69S、89L、92E、94G及び97Gから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸変異を有する。更に好ましくは、前記Titin-T鎖が66S及び77Sアミノ酸変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖が11K、12S、13Y、14T及び22Sアミノ酸変異を有し、前記Titin-T鎖が66K、70R、79T及び81Rアミノ酸変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖が2E、17E、30D、32P、34E、36T、44I、45T、58V、62E、67Q、69S及び97Gアミノ酸変異を有し、前記Titin-T鎖が3W、11I、13L、22M及び82Mアミノ酸変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖が20L、22M及び53Lアミノ酸変異を有し、前記Titin-T鎖が11I、66K、79T及び81Rアミノ酸変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖が41K、45T、67Q、69S及び89Lアミノ酸変異を有し、前記Titin-T鎖が40S、42K、45S、47E、49G、56S、58E、75V、83D及び84Lアミノ酸変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖が42L、45T、67T、69S、92E及び94Gアミノ酸変異を有し、前記Titin-T鎖が47E、49G、56S、58E及び75Vアミノ酸変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖が42L、45T、67T、69S、92E及び94Gアミノ酸変異を有し、前記Titin-T鎖が56S、58E及び75Vアミノ酸変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖が42L、45T、67T、69S、92E及び94Gアミノ酸変異を有し、或いは前記Titin-T鎖が56S、58E、66S及び77Sアミノ酸変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖が12S、13Y、22S、42L、45T、67Q、69S、92E及び94Gアミノ酸変異を有する。前記Titin-T鎖変異部位が配列番号35の配列に対する自然順番号部位であり、Obscurin-O鎖変異部位が配列番号50の配列に対する自然順番号部位である。幾つかの実施形態において、前記Titin-T鎖がP3W、S11I、I13L、T22M、G40S、R42K、H45S、Q47E、Q49G、N56S、D58E、M66S、M66K、K70R、L75V、T77S、S79T、G81R、N82M、E83D及びF84Lから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸変異を有し、及び/又はObscurin-O鎖がG2E、L11K、A12S、F13Y、V14T、V17E、D20L、T22M又はT22S、N30D、T32P、Q34E、S36T、Q41K、Q42L、V44I、A45T、A53L、L58V、K62E、A67Q又はA67T、G69S、V89L、Q92E、D94G及びA97Gから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸変異を有する。幾つかの実施形態において、前記Titin-T鎖がM66S及びT77Sアミノ酸変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖がL11K、A12S、F13Y、V14T及びT22Sアミノ酸変異を有し、前記Titin-T鎖がM66K、K70R、S79T及びG81Rアミノ酸変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖がG2E、V17E、N30D、T32P、Q34E、S36T、V44I、A45T、L58V、K62E、A67Q、G69S及びA97Gアミノ酸変異を有し、前記Titin-T鎖がP3W、S11I、I13L、T22M及びN82Mアミノ酸変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖がD20L、T22M及びA53Lアミノ酸変異を有し、前記Titin-T鎖がS11I、M66K、S79T及びG81Rアミノ酸変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖がQ41K、A45T、A67Q、G69S及びV89Lアミノ酸変異を有し、前記Titin-T鎖がG40S、R42K、H45S、Q47E、Q49G、N56S、D58E、L75V、E83D及びF84Lアミノ酸変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖がQ42L、A45T、A67T、G69S、Q92E及びD94Gアミノ酸変異を有し、前記Titin-T鎖がQ47E、Q49G、N56S、D58E及びL75Vアミノ酸変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖がQ42L、A45T、A67T、G69S、Q92E及びD94Gアミノ酸変異を有し、前記Titin-T鎖がN56S、D58E及びL75Vアミノ酸変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖がQ42L、A45T、A67T、G69S、Q92E及びD94Gアミノ酸変異を有し、或いは前記Titin-T鎖がN56S、D58E、M66S及びT77Sアミノ酸変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖がA12S、F13Y、T22S、Q42L、A45T、A67Q、G69S、Q92E及びD94Gアミノ酸変異を有する。前記Titin-T鎖変異部位が配列番号35の配列に対する自然順番号部位であり、Obscurin-O鎖変異部位が配列番号50の配列に対する自然順番号部位である。
幾つかの実施形態において、前記ドメイン改造抗体、二重特異性抗体又はドメイン改造抗体のFab断片は、前記Titin-T鎖が配列番号35を基に3、11、13、22、40、42、45、47、49、56、58、66、70、75、77、79、81、82、83及び84番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸変異を有するポリペプチドであり、前記Obscurin-O鎖が配列番号50を基に2、11、12、13、14、17、20、22、30、32、34、36、41、42、44、45、53、58、62、67、69、89、92、94及び97番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸変異を有するポリペプチドである。前記Titin-T鎖変異部位が配列番号35の配列の自然順番号部位であり、Obscurin-O鎖変異部位が配列番号50の配列の自然順番号部位である。幾つかの実施形態において、前記Titin-T鎖が配列番号35の配列を基にP3W、S11I、I13L、T22M、G40S、R42K、H45S、Q47E、Q49G、N56S、D58E、M66S、M66K、K70R、L75V、T77S、S79T、G81R、N82M、E83D及びF84Lから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸変異を有し、及び/又はObscurin-O鎖が配列番号35の配列を基にG2E、L11K、A12S、F13Y、V14T、V17E、D20L、T22M又はT22S、N30D、T32P、Q34E、S36T、Q41K、Q42L、V44I、A45T、A53L、L58V、K62E、A67Q又はA67T、G69S、V89L、Q92E、D94G及びA97Gから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸変異を有する。幾つかの実施形態において、前記Titin-T鎖が配列番号35の配列を基にM66S及びT77Sアミノ酸変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖が配列番号50の配列を基にL11K、A12S、F13Y、V14T及びT22Sアミノ酸変異を有し、前記Titin-T鎖が配列番号35の配列を基にM66K、K70R、S79T及びG81Rアミノ酸変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖が配列番号50の配列を基にG2E、V17E、N30D、T32P、Q34E、S36T、V44I、A45T、L58V、K62E、A67Q、G69S及びA97Gアミノ酸変異を有し、前記Titin-T鎖が配列番号35の配列を基にP3W、S11I、I13L、T22M及びN82Mアミノ酸変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖が配列番号50の配列を基にD20L、T22M及びA53Lアミノ酸変異を有し、前記Titin-T鎖が配列番号35の配列を基にS11I、M66K、S79T及びG81Rアミノ酸変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖が配列番号50の配列を基にQ41K、A45T、A67Q、G69S及びV89Lアミノ酸変異を有し、前記Titin-T鎖が配列番号35の配列を基にG40S、R42K、H45S、Q47E、Q49G、N56S、D58E、L75V、E83D及びF84Lアミノ酸変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖が配列番号50の配列を基にQ42L、A45T、A67T、G69S、Q92E及びD94Gアミノ酸変異を有し、前記Titin-T鎖が配列番号35の配列を基にQ47E、Q49G、N56S、D58E及びL75Vアミノ酸変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖が配列番号50の配列を基にQ42L、A45T、A67T、G69S、Q92E及びD94Gアミノ酸変異を有し、前記Titin-T鎖が配列番号35の配列を基にN56S、D58E及びL75Vアミノ酸変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖が配列番号50の配列を基にQ42L、A45T、A67T、G69S、Q92E及びD94Gアミノ酸変異を有し、或いは前記Titin-T鎖が配列番号35の配列を基にN56S、D58E、M66S及びT77Sアミノ酸変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖が配列番号50の配列を基にA12S、F13Y、T22S、Q42L、A45T、A67Q、G69S、Q92E及びD94Gアミノ酸変異を有し、前記Titin-T鎖変異部位が配列番号35の配列の自然順番号部位であり、Obscurin-O鎖変異部位が配列番号50の配列の自然順番号部位である。
幾つかの実施形態において、前記ドメイン改造抗体、二重特異性抗体又はドメイン改造抗体のFab断片は、前記Titin-T鎖、Obscurin-O鎖又はObscurin-Like-O鎖のN末端が連結ドメインによりVH又はVLに操作可能に連結される。幾つかの実施形態において、前記連結ドメインが下記から選ばれ、即ち、Titin-T鎖のN末端断片、Obscurin-O鎖のN末端断片又はObscurin-Like-O鎖のN末端断片、及び（GxS）yコネクソン（但し、Xが1～5の整数から選ばれ、Yが1～6の整数から選ばれる）から選ばれる。幾つかの実施形態において、前記連結ドメインが「KAGIR」、「DQPQF」、（G4S）1及び（G4S）2から選ばれる。
幾つかの実施形態において、前記Titin-T鎖がKAGIRポリペプチドによりVH又はVLに連結し、及び/又は前記Obscurin-O鎖がDQPQFポリペプチドによりVL又はVHに連結する。
幾つかの実施形態において、前記ポリペプチド複合物は、
（A）前記Titin-T鎖の配列が、配列番号32に示される通りであり、若しくは配列番号32の配列を基に8、20、22、25、26、39、3、11、13、40、42、45、47、49、56、58、66、70、75、77、79、81、82、83及び84から選ばれる1つ又は複数の部位のアミノ酸変異を更に有し、及び/又はN末端にKAGIRアミノ酸残基を付加する配列であり、好ましくは、A8C、V20C、T22C、C25S、A26C、C39T、P3W、S11I、I13L、T22M、G40S、R42K、H45S、Q47E、Q49G、N56S、D58E、M66S又はM66K、K70R、L75V、T77S、S79T、G81R、N82M、E83D及びF84Lから選ばれる1つ又は複数の部位のアミノ酸変異を有し、及び/又はN末端にKAGIRアミノ酸残基を付加する配列であり、及び/又は
（B）前記Obscurin-O鎖の配列が、配列番号33に示される通りであり、若しくは配列番号33の配列を基に3、9、25、76、88、7、11、62、2、12、13、14、17、20、22、30、32、34、36、41、42、44、45、53、58、67、69、89、92、94及び97から選ばれる1つ又は複数の部位のアミノ酸変異を更に有し、及び/又はN末端にDQPQFアミノ酸残基を付加する配列であり、好ましくは、A3C、R9C、C25S、C76S、A88C、L7K又はL7R、T62K又はT62H、G2E、L11K、A12S、F13Y、V14T、V17E、D20L、T22M又はT22S、N30D、T32P、Q34E、S36T、Q41K、Q42L、V44I、A45T、A53L、L58V、T62E、A67Q又はA67T、G69S、V89L、Q92E、D94G及びA97Gから選ばれる1つ又は複数の部位のアミノ酸変異を有し、及び/又はN末端にDQPQFアミノ酸残基を付加する配列であり、或いは
前記Obscurin-Like-O鎖の配列が、配列番号34に示される通りであり、若しくは配列番号34の配列を基に6、26、74、77、84及び86から選ばれる1つ又は複数の部位のアミノ酸変異を更に有する配列であり、好ましくは、C6E、C26S、C77S、V74C、G84C及びA86Cから選ばれる1つ又は複数の部位のアミノ酸変異を有する配列であり、
前記Titin-T鎖変異部位が配列番号32の配列の自然順番号部位であり、Obscurin-O鎖変異部位が配列番号33の配列の自然順番号部位であり、Obscurin-Like-O鎖変異部位が配列番号34の配列の自然順番号部位であり、
好ましくは、
（A）前記Titin-T鎖が配列番号32の配列を基に8、20、22、25、26及び39番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、好ましくは、A8C、V20C、T22C、C25S、A26C及びC39Tから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、前記Titin-T鎖変異部位が配列番号32の配列の自然順番号部位であり、更に好ましくは、前記Titin-T鎖が配列番号35の配列を基に3、11、13、22、40、42、45、47、49、56、58、66、70、75、77、79、81、82、83及び84番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸変異を有し、好ましくは、P3W、S11I、I13L、T22M、G40S、R42K、H45S、Q47E、Q49G、N56S、D58E、M66S、M66K、K70R、L75V、T77S、S79T、G81R、N82M、E83D及びF84Lから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸変異を有し、前記Titin-T鎖変異部位が配列番号35の配列の自然順番号部位であり、及び/又は
（B）前記Obscurin-O鎖が配列番号33の配列を基に3、9、25、76及び88番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、好ましくは、A3C、R9C、C25S、C76S及びA88Cから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、前記Obscurin-O鎖変異部位が配列番号33の配列の自然順番号部位であり、好ましくは、前記Obscurin-O鎖が配列番号45の配列を基に7、11、62番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を更に有し、好ましくは、L7K又はL7R、T62K又はT62H、及びK11Lから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、前記Obscurin-O鎖変異部位が配列番号45の配列の自然順番号部位であり、更に好ましくは、前記Obscurin-O鎖が配列番号50の配列を基に2、11、12、13、14、17、20、22、30、32、34、36、41、42、44、45、53、58、62、67、69、89、92、94及び97番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸変異を有し、好ましくは、G2E、L11K、A12S、F13Y、V14T、V17E、D20L、T22M又はT22S、N30D、T32P、Q34E、S36T、Q41K、Q42L、V44I、A45T、A53L、L58V、K62E、A67Q又はA67T、G69S、V89L、Q92E、D94G及びA97Gから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸変異を有し、前記Obscurin-O鎖変異部位が配列番号50の配列の自然順番号部位であり、或いは
前記Obscurin-Like-O鎖が配列番号34の配列を基に6、26、74、77、84及び86番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、好ましくは、C6E、C26S、C77S、V74C、G84C及びA86Cから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、前記Obscurin-Like-O鎖変異部位が配列番号34の配列の自然順番号部位である。
幾つかの実施形態において、前記ドメイン改造抗体、二重特異性抗体又はドメイン改造抗体のFab断片は、前記Titin-T鎖が配列番号32、35～41、65～76の何れか1つに示される配列、又は配列番号32、35～41、65～76の何れか1つの配列と少なくとも80%の同一性を有するポリペプチドを含み、及び/又は前記Obscurin-O鎖が配列番号33、42～58、77～86の何れか1つに示される配列、又は配列番号33、42～58、77～86の何れか1つの配列と少なくとも80%の同一性を有するポリペプチドを含み、或いは前記Titin-T鎖が配列番号32、35～41、65～76の何れか1つに示される配列、又は配列番号32、35～41、65～76の何れか1つの配列と少なくとも80%の同一性を有するポリペプチドを含み、及び/又は前記Obscurin-Like-O鎖が配列番号34、59～64の何れか1つに示される配列、又は配列番号34、59～64の何れか1つに示される配列と少なくとも80%の同一性を有するポリペプチドを含む。前記少なくとも80%の同一性を有することは、例えば、少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%の同一性を有することである。
幾つかの実施形態において、Titin-T鎖が配列番号68に示されるポリペプチドを含み、且つObscurin-O鎖が配列番号80に示されるポリペプチドを含み、Titin-T鎖が配列番号73に示されるポリペプチドを含み、且つObscurin-O鎖が配列番号83に示されるポリペプチドを含み、Titin-T鎖が配列番号76に示されるポリペプチドを含み、且つObscurin-O鎖が配列番号84に示されるポリペプチドを含み、Titin-T鎖が配列番号76に示されるポリペプチドを含み、且つObscurin-O鎖が配列番号86に示されるポリペプチドを含み、Titin-T鎖が配列番号76に示されるポリペプチドを含み、且つObscurin-O鎖が配列番号86に示されるポリペプチドを含み、Titin-T鎖が配列番号75に示されるポリペプチドを含み、且つObscurin-O鎖が配列番号86に示されるポリペプチドを含む。
幾つかの実施形態において、前記二重特異性抗体は、下記A～Gの何れか1項に記載の二重特異性抗体から選ばれ、即ち、
A、第1重鎖の配列が配列番号89に示される通りであり、若しくは配列番号89と少なくとも85%の配列同一性を有し、第1軽鎖の配列が配列番号90に示される通りであり、若しくは配列番号90と少なくとも85%の配列同一性を有し、第2重鎖の配列が配列番号87に示される通りであり、若しくは配列番号87と少なくとも85%の配列同一性を有し、第2軽鎖の配列が配列番号88に示される通りであり、若しくは配列番号88と少なくとも85%の配列同一性を有する二重特異性抗体と、
B、第1重鎖の配列が配列番号93に示される通りであり、若しくは配列番号93と少なくとも85%の配列同一性を有し、第1軽鎖の配列が配列番号94に示される通りであり、若しくは配列番号94と少なくとも85%の配列同一性を有し、第2重鎖の配列が配列番号91に示される通りであり、若しくは配列番号91と少なくとも85%の配列同一性を有し、第2軽鎖の配列が配列番号92に示される通りであり、若しくは配列番号92と少なくとも85%の配列同一性を有する二重特異性抗体と、
C、第1重鎖の配列が配列番号97に示される通りであり、若しくは配列番号97と少なくとも85%の配列同一性を有し、第1軽鎖の配列が配列番号98に示される通りであり、若しくは配列番号98と少なくとも85%の配列同一性を有し、第2重鎖の配列が配列番号95に示される通りであり、若しくは配列番号95と少なくとも85%の配列同一性を有し、第2軽鎖の配列が配列番号96に示される通りであり、若しくは配列番号96と少なくとも85%の配列同一性を有する二重特異性抗体と、
D、第1重鎖の配列が配列番号99に示される通りであり、若しくは配列番号99と少なくとも85%の配列同一性を有し、第1軽鎖の配列が配列番号100に示される通りであり、若しくは配列番号100と少なくとも85%の配列同一性を有し、第2重鎖の配列が配列番号101に示される通りであり、若しくは配列番号101と少なくとも85%の配列同一性を有し、第2軽鎖の配列が配列番号96に示される通りであり、若しくは配列番号96と少なくとも85%の配列同一性を有する二重特異性抗体と、
E、第1重鎖の配列が配列番号102に示される通りであり、若しくは配列番号102と少なくとも85%の配列同一性を有し、第1軽鎖の配列が配列番号100に示される通りであり、若しくは配列番号100と少なくとも85%の配列同一性を有し、第2重鎖の配列が配列番号95に示される通りであり、若しくは配列番号95と少なくとも85%の配列同一性を有し、第2軽鎖の配列が配列番号96に示される通りであり、若しくは配列番号96と少なくとも85%の配列同一性を有する二重特異性抗体と、
F、第1重鎖の配列が配列番号103に示される通りであり、若しくは配列番号103と少なくとも85%の配列同一性を有し、第1軽鎖の配列が配列番号104に示される通りであり、若しくは配列番号104と少なくとも85%の配列同一性を有し、第2重鎖の配列が配列番号95に示される通りであり、若しくは配列番号95と少なくとも85%の配列同一性を有し、第2軽鎖の配列が配列番号96に示される通りであり、若しくは配列番号96と少なくとも85%の配列同一性を有する二重特異性抗体と、
G、第1重鎖の配列が配列番号107に示される通りであり、若しくは配列番号107と少なくとも85%の配列同一性を有し、第1軽鎖の配列が配列番号108に示される通りであり、若しくは配列番号108と少なくとも85%の配列同一性を有し、第2重鎖の配列が配列番号109に示される通りであり、若しくは配列番号109と少なくとも85%の配列同一性を有し、第2軽鎖の配列が配列番号110に示される通りであり、若しくは配列番号110と少なくとも85%の配列同一性を有する二重特異性抗体と、
H、第1重鎖の配列が配列番号122に示される通りであり、若しくは配列番号122と少なくとも85%の配列同一性を有し、第1軽鎖の配列が配列番号123に示される通りであり、若しくは配列番号123と少なくとも85%の配列同一性を有し、第2重鎖の配列が配列番号116に示される通りであり、若しくは配列番号116と少なくとも85%の配列同一性を有し、第2軽鎖の配列が配列番号117に示される通りであり、若しくは配列番号117と少なくとも85%の配列同一性を有する二重特異性抗体と、
I、第1重鎖の配列が配列番号118に示される通りであり、若しくは配列番号118と少なくとも85%の配列同一性を有し、第1軽鎖の配列が配列番号119に示される通りであり、若しくは配列番号119と少なくとも85%の配列同一性を有し、第2重鎖の配列が配列番号124に示される通りであり、若しくは配列番号124と少なくとも85%の配列同一性を有し、第2軽鎖の配列が配列番号125に示される通りであり、若しくは配列番号125と少なくとも85%の配列同一性を有する二重特異性抗体と、から選ばれ、
前記少なくとも85%の同一性を有することは、例えば、少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%の同一性を有することである。
幾つかの実施形態において、本開示は、Titin-T鎖とObscurin-O鎖、又はTitin-T鎖とObscurin-Like-O鎖で抗体のCH1/CLを取り替えることを含む、多重特異性抗体の調製方法を提供する。幾つかの多重特異性抗体の調製方法の実施形態において、CH1/CLがTitin-T鎖/Obscurin-O鎖、又はTitin-T鎖/Obscurin-Like-O鎖で取り替えられていない野生型よりも、本開示に係る多重特異性抗体の軽鎖と重鎖のミスマッチが低減された。
幾つかの実施形態において、本開示は、前記多重特異性抗体の調製方法により調製することで得られた多重特異性抗体を更に提供する。幾つかの実施形態において、前記多重特異性抗体が第1重鎖可変領域（VH1）と第1軽鎖可変領域（VL1）を含み、前記VH1とVL1が第1抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、且つ前記VH1のC末端がTitin-T鎖のN末端に操作可能に連結され、前記VL1のC末端がObscurin-O鎖又はObscurin-Like-O鎖のN末端に操作可能に連結され、或いは前記VL1のC末端がTitin-T鎖のN末端に操作可能に連結され、前記VH1のC末端がObscurin-O鎖又はObscurin-Like-O鎖のN末端に操作可能に連結される。
幾つかの実施形態において、前記多重特異性抗体の調製方法は、前記Titin-T鎖が配列番号32、35～41、65～76の何れか1つに示される配列、又は配列番号32、35～41、65～76の何れか1つの配列と少なくとも80%の同一性を有するポリペプチドを含み、及び/又は前記Obscurin-O鎖が配列番号33、42～58、77～86の何れか1つに示される配列、又は配列番号33、42～58、77～86の何れか1つの配列と少なくとも80%の同一性を有するポリペプチドを含み、或いは前記Titin-T鎖が配列番号32、35～41、65～76の何れか1つに示される配列、又は配列番号32、35～41、65～76の何れか1つの配列と少なくとも80%の同一性を有するポリペプチドを含み、及び/又は前記Obscurin-Like-O鎖が配列番号34、59～64の何れか1つに示される配列、又は配列番号34、59～64の何れか1つの配列と少なくとも80%の同一性を有するポリペプチドを含む。
幾つかの実施形態において、Titin-T鎖が配列番号68に示されるポリペプチドを含み、且つObscurin-O鎖が配列番号80に示されるポリペプチドを含む。幾つかの実施形態において、Titin-T鎖が配列番号73に示されるポリペプチドを含み、且つObscurin-O鎖が配列番号83に示されるポリペプチドを含む。幾つかの実施形態において、Titin-T鎖が配列番号76に示されるポリペプチドを含み、且つObscurin-O鎖が配列番号84に示されるポリペプチドを含む。幾つかの実施形態において、Titin-T鎖が配列番号76に示されるポリペプチドを含み、且つObscurin-O鎖が配列番号86に示されるポリペプチドを含む。幾つかの実施形態において、Titin-T鎖が配列番号75に示されるポリペプチドを含み、且つObscurin-O鎖が配列番号86に示されるポリペプチドを含む。
幾つかの実施形態において、
（A）前記Titin-T鎖の配列が配列番号32に示される通りであり、若しくは配列番号32の配列を基に8、20、22、25、26、39、3、11、13、40、42、45、47、49、56、58、66、70、75、77、79、81、82、83及び84から選ばれる1つ又は複数の部位のアミノ酸変異を更に有し、及び/又はN末端に5つのアミノ酸残基KAGIRを付加する配列であり、好ましくは、A8C、V20C、T22C、C25S、A26C、C39T、P3W、S11I、I13L、T22M、G40S、R42K、H45S、Q47E、Q49G、N56S、D58E、M66S又はM66K、K70R、L75V、T77S、S79T、G81R、N82M、E83D及びF84Lから選ばれる1つ又は複数の部位のアミノ酸変異を有し、及び/又はN末端に5つのアミノ酸残基KAGIRを付加する配列であり、及び/又は
（B）前記Obscurin-O鎖の配列が、配列番号33に示される通りであり、若しくは配列番号33の配列を基に3、9、25、76、88、7、11、62、2、12、13、14、17、20、22、30、32、34、36、41、42、44、45、53、58、67、69、89、92、94及び97から選ばれる1つ又は複数の部位のアミノ酸変異を更に有し、及び/又はN末端にDQPQFアミノ酸残基を付加する配列であり、好ましくは、A3C、R9C、C25S、C76S、A88C、L7K又はL7R、T62K又はT62H、G2E、L11K、A12S、F13Y、V14T、V17E、D20L、T22M又はT22S、N30D、T32P、Q34E、S36T、Q41K、Q42L、V44I、A45T、A53L、L58V、T62E、A67Q又はA67T、G69S、V89L、Q92E、D94G及びA97Gから選ばれる1つ又は複数の部位のアミノ酸変異を有し、及び/又はN末端にDQPQFアミノ酸残基を付加する配列であり、或いは
前記Obscurin-Like-O鎖の配列が、配列番号34に示される通りであり、若しくは配列番号34の配列を基に6、26、74、77、84及び86から選ばれる1つ又は複数の部位のアミノ酸変異を更に有する配列であり、好ましくは、C6E、C26S、C77S、V74C、G84C及びA86Cから選ばれる1つ又は複数の部位のアミノ酸変異を有する配列であり、
前記Titin-T鎖変異部位が配列番号32の配列の自然順番号部位であり、Obscurin-O鎖変異部位が配列番号33の配列の自然順番号部位であり、Obscurin-Like-O鎖変異部位が配列番号34の配列の自然順番号部位であり、
好ましくは、
（A）前記Titin-T鎖が配列番号32の配列を基に8、20、22、25、26及び39番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、好ましくは、A8C、V20C、T22C、C25S、A26C及びC39Tから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、前記Titin-T鎖変異部位が配列番号32の配列の自然順番号部位であり、更に好ましくは、前記Titin-T鎖が配列番号35の配列を基に3、11、13、22、40、42、45、47、49、56、58、66、70、75、77、79、81、82、83及び84番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸変異を有し、好ましくは、P3W、S11I、I13L、T22M、G40S、R42K、H45S、Q47E、Q49G、N56S、D58E、M66S、M66K、K70R、L75V、T77S、S79T、G81R、N82M、E83D及びF84Lから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸変異を有し、前記Titin-T鎖変異部位が配列番号35の配列の自然順番号部位であり、及び/又は
（B）前記Obscurin-O鎖が配列番号33の配列を基に3、9、25、76及び88番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、好ましくは、A3C、R9C、C25S、C76S及びA88Cから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、前記Obscurin-O鎖変異部位が配列番号33の配列の自然順番号部位であり、好ましくは、前記Obscurin-O鎖が配列番号45の配列を基に7、11、62番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を更に有し、好ましくは、L7K又はL7R、T62K又はT62H、及びK11Lから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、前記Obscurin-O鎖変異部位が配列番号45の配列の自然順番号部位であり、更に好ましくは、前記Obscurin-O鎖が配列番号50の配列を基に2、11、12、13、14、17、20、22、30、32、34、36、41、42、44、45、53、58、62、67、69、89、92、94及び97番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸変異を有し、好ましくは、G2E、L11K、A12S、F13Y、V14T、V17E、D20L、T22M又はT22S、N30D、T32P、Q34E、S36T、Q41K、Q42L、V44I、A45T、A53L、L58V、K62E、A67Q又はA67T、G69S、V89L、Q92E、D94G及びA97Gから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸変異を有し、前記Obscurin-O鎖変異部位が配列番号50の配列の自然順番号部位であり、或いは
前記Obscurin-Like-O鎖が配列番号34の配列を基に6、26、74、77、84及び86番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、好ましくは、C6E、C26S、C77S、V74C、G84C及びA86Cから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、前記Obscurin-Like-O鎖変異部位が配列番号34の配列の自然順番号部位である。
幾つかの実施形態において、本開示は、前記何れか1項に記載のポリペプチド複合物、多重特異性ポリペプチド複合物、ドメイン改造抗体、ドメイン改造抗体のFab断片又は二重特異性抗体、又は多重特異性抗体を含む、複合体を提供する。
幾つかの実施形態において、本開示は、配列が配列番号32、35～41、65～76の何れか1つに示される通りであり、又は配列番号32、35～41、65～76の何れか1つの配列と少なくとも80%の同一性を有し、或いは配列が配列番号33、42～58、77～86の何れか1つに示される通りであり、又は配列番号33、42～58、77～86の何れか1つの配列と少なくとも80%の同一性を有し、或いは配列が配列番号34、59～64の何れか1つに示される通りであり、又は配列番号34、59～64の何れか1つに示される配列と少なくとも80%の同一性を有し、好ましくは、前記ポリペプチドが抗体CH1及び/又はCLを取り替えるために利用できる、ポリペプチドを提供する。更に好ましくは、前記ポリペプチドがTitin-T鎖とObscurin-O鎖、又はTitin-T鎖とObscurin-Like-O鎖であり、二重特異性抗体の片側のCH1とCLがTitin-T鎖とObscurin-O鎖で取り替えられ、又はTitin-T鎖とObscurin-Like-O鎖で取り替えられた後に、第1重鎖と第2軽鎖との間、第1軽鎖と第2重鎖との間にミスマッチが起きにくい。
幾つかの実施形態において、前記Titin-T鎖の配列が、配列番号32に示される通りであり、若しくは配列番号32の配列を基に8、20、22、25、26、39、3、11、13、40、42、45、47、49、56、58、66、70、75、77、79、81、82、83及び84から選ばれる1つ又は複数の部位のアミノ酸変異配列を更に有し、好ましくは、A8C、V20C、T22C、C25S、A26C、C39T、P3W、S11I、I13L、T22M、G40S、R42K、H45S、Q47E、Q49G、N56S、D58E、M66S又はM66K、K70R、L75V、T77S、S79T、G81R、N82M、E83D及びF84Lから選ばれる1つ又は複数の部位のアミノ酸変異を有し、及び/又はN末端に5つのアミノ酸残基KAGIRを付加する配列であり、前記Obscurin-O鎖の配列が、配列番号33に示される通りであり、若しくは配列番号33の配列を基に3、9、25、76、88、7、11、62、2、12、13、14、17、20、22、30、32、34、36、41、42、44、45、53、58、67、69、89、92、94及び97から選ばれる1つ又は複数の部位のアミノ酸変異を更に有し、及び/又はN末端にDQPQFアミノ酸残基を付加する配列であり、好ましくは、A3C、R9C、C25S、C76S、A88C、L7K又はL7R、T62K又はT62H、G2E、L11K、A12S、F13Y、V14T、V17E、D20L、T22M又はT22S、N30D、T32P、Q34E、S36T、Q41K、Q42L、V44I、A45T、A53L、L58V、T62E、A67Q又はA67T、G69S、V89L、Q92E、D94G及びA97Gから選ばれる1つ又は複数の部位のアミノ酸変異を有し、及び/又はN末端にDQPQFアミノ酸残基を付加する配列であり、前記Obscurin-Like-O鎖の配列が配列番号34に示される通りであり、又は配列番号34の配列を基に6、26、74、77、84及び86から選ばれる1つ又は複数の部位のアミノ酸変異配列を更に有し、好ましくは、C6E、C26S、C77S、V74C、G84C及びA86Cから選ばれる1つ又は複数の部位のアミノ酸変異配列を有する。
抗体のCH1及び/又はCLを、抗原結合断片のCH1及び/又はCLを、又はポリペプチド複合物のCH1及び/又はCLを取り替えるために利用されるポリペプチドであって、前記ポリペプチドの配列が配列番号32、35～41、65～76の何れか1つに示される通りであり、又は配列番号32、35～41、65～76の何れか1つの配列と少なくとも80%の同一性を有し、或いは配列が配列番号33、42～58、77～86の何れか1つに示される通りであり、又は配列番号33、42～58、77～86の何れか1つの配列と少なくとも80%の同一性を有し、或いは配列が配列番号34、59～64の何れか1つに示される通りであり、又は配列番号34、59～64の何れか1つに示される配列と少なくとも80%の同一性を有し、好ましくは、前記ポリペプチドがTitin-T鎖とObscurin-O鎖、又はTitin-T鎖とObscurin-Like-O鎖である。更に好ましくは、前記ポリペプチドで二重特異性抗体の片側CH1とCLを取り替た後、二重特異性抗体の第1重鎖と第2軽鎖との間、第1軽鎖と第2重鎖との間にミスマッチが起きにくい。
幾つかの実施形態において、本開示は、Titin-T鎖の配列が配列番号32、35～41、65～76の何れか1つに示される通りであり、又は配列番号32、35～41、65～76の何れか1つの配列と少なくとも80%の同一性を有し、Obscurin-O鎖の配列が配列番号33、42～58、77～86の何れか1つに示される通りであり、又は配列番号33、42～58、77～86の何れか1つの配列と少なくとも80%の同一性を有し、Obscurin-Like-O鎖の配列が配列番号34、59～64の何れか1つに示される通りであり、又は配列番号34、59～64の何れか1つに示される配列と少なくとも80%の同一性を有する、Titin-T鎖、Obscurin-O鎖及び/又はObscurin-Like-O鎖を提供する。幾つかの実施形態において、前記Titin-T鎖/Obscurin-O鎖、又はTitin-T鎖/Obscurin-Like-O鎖が抗体CH1及び/又はCLを取り替えるために利用できる。
幾つかの実施形態において、前記Titin-T鎖の配列が配列番号32に示される通りであり、若しくは配列番号32の配列が8、20、22、25、26、39、3、11、13、40、42、45、47、49、56、58、66、70、75、77、79、81、82、83及び84から選ばれる1つ又は複数の部位のアミノ酸変異配列を更に有し、好ましくは、A8C、V20C、T22C、C25S、A26C、C39T、P3W、S11I、I13L、T22M、G40S、R42K、H45S、Q47E、Q49G、N56S、D58E、M66S又はM66K、K70R、L75V、T77S、S79T、G81R、N82M、E83D及びF84Lから選ばれる1つ又は複数の部位のアミノ酸変異配列を有し、前記Obscurin-O鎖の配列が配列番号33に示される通りであり、若しくは配列番号33の配列が3、9、25、76、88、7、11、62、2、12、13、14、17、20、22、30、32、34、36、41、42、44、45、53、58、67、69、89、92、94及び97から選ばれる1つ又は複数の部位のアミノ酸変異配列を更に有し、好ましくは、A3C、R9C、C25S、C76S、A88C、L7K又はL7R、T62K又はT62H、G2E、L11K、A12S、F13Y、V14T、V17E、D20L、T22M又はT22S、N30D、T32P、Q34E、S36T、Q41K、Q42L、V44I、A45T、A53L、L58V、T62E、A67Q又はA67T、G69S、V89L、Q92E、D94G及びA97Gから選ばれる1つ又は複数の部位のアミノ酸変異配列を有し、前記Obscurin-Like-O鎖の配列が配列番号34に示される通りであり、又は配列番号34の配列が6、26、74、77、84及び86から選ばれる1つ又は複数の部位のアミノ酸変異配列を更に有し、好ましくは、C6E、C26S、C77S、V74C、G84C及びA86Cから選ばれる1つ又は複数の部位のアミノ酸変異配列を有する。
幾つかの実施形態において、本開示は、Titin-T鎖とObscurin-O鎖、或いはTitin-T鎖とObscurin-Like-O鎖の、多重特異性抗体軽鎖/重鎖ミスマッチの低減における使用を更に開示する。幾つかの実施形態において、前記Titin-T鎖が配列番号32、35～41、65～76の何れか1つの配列に示される通りであり、又は配列番号32、35～41、65～76の何れか1つの配列と少なくとも80%の同一性を有するポリペプチドを含み、及び/又は前記Obscurin-O鎖が配列番号33、42～58、77～86の何れか1つの配列に示される通りであり、又は配列番号33、42～58、77～86の何れか1つの配列と少なくとも80%の同一性を有するポリペプチドを含み、或いは前記Titin-T鎖が配列番号32、35～41、65～76の何れか1つの配列に示される通りであり、又は配列番号32、35～41、65～76の何れか1つの配列と少なくとも80%の同一性を有するポリペプチドを含み、及び/又は前記Obscurin-Like-O鎖が配列番号34、59～64の何れか1つの配列に示される通りであり、又は配列番号34、59～64の何れか1つの配列と少なくとも80%の同一性を有するポリペプチドを含む。
幾つかの実施形態において、前記Titin-T鎖とObscurin-O鎖、或いはTitin-T鎖とObscurin-Like-O鎖の、多重特異性抗体軽鎖/重鎖ミスマッチの低減における使用は、前記Titin-T鎖の配列が配列番号32に示される通りであり、若しくは配列番号32の配列が8、20、22、25、26、39、3、11、13、40、42、45、47、49、56、58、66、70、75、77、79、81、82、83及び84から選ばれる1つ又は複数の部位のアミノ酸変異を更に有し、及び/又はN末端に5つのアミノ酸残基KAGIRを付加する配列であり、好ましくは、A8C、V20C、T22C、C25S、A26C、C39T、P3W、S11I、I13L、T22M、G40S、R42K、H45S、Q47E、Q49G、N56S、D58E、M66S又はM66K、K70R、L75V、T77S、S79T、G81R、N82M、E83D及びF84Lから選ばれる1つ又は複数の部位のアミノ酸変異を有し、及び/又はN末端に5つのアミノ酸残基KAGIRを付加する配列であり、前記Obscurin-O鎖の配列が配列番号33に示される通りであり、若しくは配列番号33の配列が3、9、25、76、88、7、11、62、2、12、13、14、17、20、22、30、32、34、36、41、42、44、45、53、58、67、69、89、92、94及び97から選ばれる1つ又は複数の部位のアミノ酸変異配列を更に有し、及び/又はN末端にDQPQFアミノ酸残基を付加する配列であり、好ましくは、A3C、R9C、C25S、C76S、A88C、L7K又はL7R、T62K又はT62H、G2E、L11K、A12S、F13Y、V14T、V17E、D20L、T22M又はT22S、N30D、T32P、Q34E、S36T、Q41K、Q42L、V44I、A45T、A53L、L58V、T62E、A67Q又はA67T、G69S、V89L、Q92E、D94G及びA97Gから選ばれる1つ又は複数の部位のアミノ酸変異配列を有し、及び/又はN末端にDQPQFアミノ酸残基を付加する配列であり、前記Obscurin-Like-O鎖の配列が配列番号34に示される通りであり、又は配列番号34の配列が6、26、74、77、84及び86から選ばれる1つ又は複数の部位のアミノ酸変異配列を更に有し、好ましくは、C6E、C26S、C77S、V74C、G84C及びA86Cから選ばれる1つ又は複数の部位のアミノ酸変異配列を有する。
幾つかの実施形態において、前記多重特異性抗体が第1重鎖可変領域（VH1）と第1軽鎖可変領域（VL1）を含み、前記VH1とVL1が第1抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、且つ前記VH1のC末端がTitin-T鎖のN末端に操作可能に連結され、前記VL1のC末端がObscurin-O鎖又はObscurin-Like-O鎖のN末端に操作可能に連結され、或いは前記VL1のC末端がTitin-T鎖のN末端に操作可能に連結され、前記VH1のC末端がObscurin-O鎖又はObscurin-Like-O鎖のN末端に操作可能に連結される。
幾つかの実施形態において、本開示は、前記何れか1項に記載のポリペプチド複合物、又は多重特異性ポリペプチド複合物、又はドメイン改造抗体、又はドメイン改造抗体のFab断片、又は二重特異性抗体、又はポリペプチド、又は多重特異性抗体をコードする、核酸分子を提供する。
幾つかの実施形態において、本開示は、前記核酸分子を含む、ベクターを提供する。
幾つかの実施形態において、本開示は、前記ベクターの変換（又は伝達、トランスフェクション）により得られ、原核細胞及び真核細胞から選ばれ、好ましくは、真核細胞であり、更に好ましくは、哺乳動物細胞である、宿主細胞を提供する。幾つかの実施形態において、前記宿主細胞が、例えば、ヒト胚性幹細胞、受精卵、生殖細胞などの完全な個体に発育できる動物又は植物細胞の何れかも含まない。
幾つかの実施形態において、前記宿主細胞が真核細胞であり、更に好ましくは、哺乳動物細胞であり、前記哺乳動物細胞がCHO、293、NSO、及び、例えば、哺乳動物細胞でゲノム編集を行うことで、抗体又はその抗原結合断片のグリコシル化修飾を変えることができ、更に抗体又はその抗原結合断片のADCC機能を変えることができ、例えば、FUT8又はGnT-IIIなどの遺伝子のノックアウトを行うことができる細胞を含むが、これらに限定されない。幾つかの実施形態において、前記哺乳動物細胞がヒト細胞を含まない。
幾つかの実施形態において、本開示は、下記工程を含み、即ち、
前記宿主細胞を培養してから、ポリペプチド複合物、多重特異性ポリペプチド複合物、ドメイン改造抗体、ドメイン改造抗体のFab断片、二重特異性抗体又はポリペプチド、又は多重特異性抗体を精製・回収する工程を含む、前記何れか1項に記載のポリペプチド複合物、多重特異性ポリペプチド複合物、ドメイン改造抗体、ドメイン改造抗体のFab断片、二重特異性抗体、又はポリペプチド、又は多重特異性抗体の調製方法を提供する。
幾つかの実施形態において、本開示は、前記何れか1項に記載のポリペプチド複合物、又は多重特異性ポリペプチド複合物、又はドメイン改造抗体、又はドメイン改造抗体のFab断片、又は二重特異性抗体、又は核酸、又は多重特異性抗体、又は複合体と、1種又は複数種の薬学的に許容可能な担体、賦形剤又は希釈剤と、を含む、医薬組成物を提供する。好ましくは、単位用量の前記医薬組成物に0.01～99重量%の前記ポリペプチド複合物、又は多重特異性ポリペプチド複合物、又はドメイン改造抗体、又はドメイン改造抗体のFab断片、又は二重特異性抗体、又は多重特異性抗体、又は複合体を含んでもよく、或いは単位用量の医薬組成物に含まれる前記ポリペプチド複合物、又は多重特異性ポリペプチド複合物、又はドメイン改造抗体、又はドメイン改造抗体のFab断片、又は二重特異性抗体、又は多重特異性抗体、又は複合体の量は、好ましくは、0.1～2000mgであり、更に好ましくは、1～1000mgである。
幾つかの実施形態において、本開示は、前記何れか1項に記載のポリペプチド複合物、多重特異性ポリペプチド複合物、ドメイン改造抗体、ドメイン改造抗体のFab断片、二重特異性抗体、医薬組成物、又は核酸分子、又は多重特異性抗体の、疾患又は障害を治療又は予防するための薬剤の調製における使用を提供する。幾つかの実施形態において、前記疾患又は障害は腫瘍、炎症性疾患、自己免疫性疾患又は感染症である。幾つかの実施形態において、前記疾患又は障害は骨系統疾患であり、骨粗鬆症、骨減少症又は骨関節炎、関節リウマチ、歯周病又は多発性骨髄腫の疾患又は障害である。幾つかの実施形態において、前記腫瘍は癌腫瘍、リンパ腫、芽腫、肉腫及び白血病又はリンパ球様悪性腫瘍から選ばれる。幾つかの実施形態において、前記腫瘍は扁平上皮癌、骨髄腫、小細胞肺癌、非小細胞肺癌（NSCLC）、頭頸部扁平上皮癌（HNSCC）、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫（DLBCL）、濾胞性リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病（ALL）、急性骨髄性白血病（AML）、慢性リンパ球性白血病（CLL）、慢性骨髄性白血病（CML）、縦隔原発大細胞型B細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫（MCL）、小リンパ球性リンパ腫（SLL）、T細胞/組織球に富む大細胞型B細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄細胞白血病-1タンパク質（Mcl-1）、骨髄異形成症候群（MDS）、胃腸癌（消化管癌）、腎臓癌、卵巣癌、肝臓癌、リンパ芽球性白血病、リンパ性白血病、結腸直腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌、前立腺癌、甲状腺癌、黒色腫、軟骨肉腫、神経芽細胞腫、膵臓癌、多形性膠芽腫、胃癌、骨癌、ユーイング肉腫、子宮頸癌、脳癌、胃癌、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌、結腸癌、肝細胞癌（HCC）、淡明細胞腎細胞癌（RCC）、頭頸部癌、咽頭癌、肝胆嚢癌（hepatobiliary cancer）、中枢神経系癌、食道癌、悪性胸膜中皮腫、全身性軽鎖アミロイド症、リンパ形質細胞性リンパ腫（lymphoplasmacytic lymphoma）、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性腫瘍、神経内分泌腫瘍、メルケル細胞癌、精巣癌及び皮膚癌から選ばれる。幾つかの実施形態において、前記炎症性疾患が関節リウマチ、乾癬、クローン病、強直性脊椎炎、多発性硬化症、1型糖尿病、肝炎（例えば、B型肝炎、A型肝炎、C型肝炎）、心筋炎、Sjogren症候群、移植片拒絶後の自己免疫性溶血性貧血、水疱性類天疱瘡、グレーブス病、橋本甲状腺炎、全身性エリテマトーデス（SLE）、重症筋無力症、天疱瘡、悪性貧血から選ばれる。幾つかの実施形態において、前記免疫性疾患が関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、皮膚炎、全身性強皮症及び硬化症、炎症性腸疾患（IBD）、Crohn病、潰瘍性結腸炎、呼吸窮迫症候群、髄膜炎、脳炎、ブドウ膜炎、糸球体腎炎、湿疹、喘息、動脈硬化、白血球接着不全症、多発性硬化症、Raynaud症候群、Sjogren症候群、若年性糖尿病、Reiter病、Behcet病、免疫複合体型腎炎、IgA腎疾患、IgM多発性神経症、免疫により仲介される血小板減少症（例えば、急性特発性血小板減少性紫斑病、慢性特発性血小板減少性紫斑病）、溶血性貧血、重症筋無力症、ループス腎炎、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ（RA）、アトピー性皮膚炎、天疱瘡、Graves病、橋本甲状腺炎、Wegener肉芽腫、Omenn症候群、慢性腎不全、急性伝染性単球増加症、HIV及び疱疹ウィルスに関連する疾患、重症急性呼吸器症候群、網脈絡膜炎（choreoretinitis）、及びウィルス感染により引き起こされる免疫性疾患（例えば、B細胞がエボラウィルス（EBV）で感染されることで引き起こされ、又は仲介される疾患）から選ばれる。
幾つかの実施形態において、本開示は、前記何れか1項に記載のポリペプチド複合物、多重特異性ポリペプチド複合物、ドメイン改造抗体、ドメイン改造抗体のFab断片、二重特異性抗体、医薬組成物、又は核酸分子、又は多重特異性抗体を、予防有効量又は治療有効量で被験者に投与することを含む、疾患又は障害を治療又は予防するための方法を提供する。幾つかの実施形態において、前記疾患又は障害は腫瘍、炎症性疾患、自己免疫性疾患又は感染症である。幾つかの実施形態において、前記疾患又は障害は骨系統疾患であり、骨粗鬆症、骨減少症又は骨関節炎、関節リウマチ、歯周病又は多発性骨髄腫の疾患又は障害である。幾つかの実施形態において、前記腫瘍は癌腫瘍、リンパ腫、芽腫、肉腫及び白血病又はリンパ球様悪性腫瘍から選ばれる。幾つかの実施形態において、前記腫瘍は扁平上皮癌、骨髄腫、小細胞肺癌、非小細胞肺癌（NSCLC）、頭頸部扁平上皮癌（HNSCC）、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫（DLBCL）、濾胞性リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病（ALL）、急性骨髄性白血病（AML）、慢性リンパ球性白血病（CLL）、慢性骨髄性白血病（CML）、縦隔原発大細胞型B細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫（MCL）、小リンパ球性リンパ腫（SLL）、T細胞/組織球に富む大細胞型B細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄細胞白血病-1タンパク質（Mcl-1）、骨髄異形成症候群（MDS）、胃腸癌（消化管癌）、腎臓癌、卵巣癌、肝臓癌、リンパ芽球性白血病、リンパ性白血病、結腸直腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌、前立腺癌、甲状腺癌、黒色腫、軟骨肉腫、神経芽細胞腫、膵臓癌、多形性膠芽腫、胃癌、骨癌、ユーイング肉腫、子宮頸癌、脳癌、胃癌、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌、結腸癌、肝細胞癌（HCC）、淡明細胞腎細胞癌（RCC）、頭頸部癌、咽頭癌、肝胆嚢癌（hepatobiliary cancer）、中枢神経系癌、食道癌、悪性胸膜中皮腫、全身性軽鎖アミロイド症、リンパ形質細胞性リンパ腫（lymphoplasmacytic lymphoma）、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性腫瘍、神経内分泌腫瘍、メルケル細胞癌、精巣癌及び皮膚癌から選ばれる。幾つかの実施形態において、前記炎症性疾患が関節リウマチ、乾癬、クローン病、強直性脊椎炎、多発性硬化症、1型糖尿病、肝炎（例えば、B型肝炎、A型肝炎、C型肝炎）、心筋炎、Sjogren症候群、移植片拒絶後の自己免疫性溶血性貧血、水疱性類天疱瘡、グレーブス病、橋本甲状腺炎、全身性エリテマトーデス（SLE）、重症筋無力症、天疱瘡、悪性貧血から選ばれる。幾つかの実施形態において、前記免疫性疾患が関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、皮膚炎、全身性強皮症及び硬化症、炎症性腸疾患（IBD）、Crohn病、潰瘍性結腸炎、呼吸窮迫症候群、髄膜炎、脳炎、ブドウ膜炎、糸球体腎炎、湿疹、喘息、動脈硬化、白血球接着不全症、多発性硬化症、Raynaud症候群、Sjogren症候群、若年性糖尿病、Reiter病、Behcet病、免疫複合体型腎炎、IgA腎疾患、IgM多発性神経症、免疫により仲介される血小板減少症（例えば、急性特発性血小板減少性紫斑病、慢性特発性血小板減少性紫斑病）、溶血性貧血、重症筋無力症、ループス腎炎、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ（RA）、アトピー性皮膚炎、天疱瘡、Graves病、橋本甲状腺炎、Wegener肉芽腫、Omenn症候群、慢性腎不全、急性伝染性単球増加症、HIV及び疱疹ウィルスに関連する疾患、重症急性呼吸器症候群、網脈絡膜炎（choreoretinitis）、及びウィルス感染により引き起こされる免疫性疾患（例えば、B細胞がエボラウィルス（EBV）で感染されることで引き起こされ、又は仲介される疾患）から選ばれる。
幾つかの実施形態において、本開示は、薬剤として使用される、前記何れか1項に記載のポリペプチド複合物、多重特異性ポリペプチド複合物、ドメイン改造抗体、ドメイン改造抗体のFab断片、二重特異性抗体、医薬組成物、又は核酸分子、又は多重特異性抗体を提供する。幾つかの実施形態において、前記薬剤が疾患又は障害を治療又は予防するために使用される。幾つかの実施形態において、前記疾患又は障害は腫瘍、炎症性疾患、自己免疫性疾患又は感染症である。幾つかの実施形態において、前記疾患又は障害は骨系統疾患であり、骨粗鬆症、骨減少症又は骨関節炎、関節リウマチ、歯周病又は多発性骨髄腫の疾患又は障害である。幾つかの実施形態において、前記腫瘍は癌腫瘍、リンパ腫、芽腫、肉腫及び白血病又はリンパ球様悪性腫瘍から選ばれる。幾つかの実施形態において、前記腫瘍は扁平上皮癌、骨髄腫、小細胞肺癌、非小細胞肺癌（NSCLC）、頭頸部扁平上皮癌（HNSCC）、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫（DLBCL）、濾胞性リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病（ALL）、急性骨髄性白血病（AML）、慢性リンパ球性白血病（CLL）、慢性骨髄性白血病（CML）、縦隔原発大細胞型B細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫（MCL）、小リンパ球性リンパ腫（SLL）、T細胞/組織球に富む大細胞型B細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄細胞白血病-1タンパク質（Mcl-1）、骨髄異形成症候群（MDS）、胃腸癌（消化管癌）、腎臓癌、卵巣癌、肝臓癌、リンパ芽球性白血病、リンパ性白血病、結腸直腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌、前立腺癌、甲状腺癌、黒色腫、軟骨肉腫、神経芽細胞腫、膵臓癌、多形性膠芽腫、胃癌、骨癌、ユーイング肉腫、子宮頸癌、脳癌、胃癌、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌、結腸癌、肝細胞癌（HCC）、淡明細胞腎細胞癌（RCC）、頭頸部癌、咽頭癌、肝胆嚢癌（hepatobiliary cancer）、中枢神経系癌、食道癌、悪性胸膜中皮腫、全身性軽鎖アミロイド症、リンパ形質細胞性リンパ腫（lymphoplasmacytic lymphoma）、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性腫瘍、神経内分泌腫瘍、メルケル細胞癌、精巣癌及び皮膚癌から選ばれる。幾つかの実施形態において、前記炎症性疾患が関節リウマチ、乾癬、クローン病、強直性脊椎炎、多発性硬化症、1型糖尿病、肝炎（例えば、B型肝炎、A型肝炎、C型肝炎）、心筋炎、Sjogren症候群、移植片拒絶後の自己免疫性溶血性貧血、水疱性類天疱瘡、グレーブス病、橋本甲状腺炎、全身性エリテマトーデス（SLE）、重症筋無力症、天疱瘡、悪性貧血から選ばれる。幾つかの実施形態において、前記免疫性疾患が関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、皮膚炎、全身性強皮症及び硬化症、炎症性腸疾患（IBD）、Crohn病、潰瘍性結腸炎、呼吸窮迫症候群、髄膜炎、脳炎、ブドウ膜炎、糸球体腎炎、湿疹、喘息、動脈硬化、白血球接着不全症、多発性硬化症、Raynaud症候群、Sjogren症候群、若年性糖尿病、Reiter病、Behcet病、免疫複合体型腎炎、IgA腎疾患、IgM多発性神経症、免疫により仲介される血小板減少症（例えば、急性特発性血小板減少性紫斑病、慢性特発性血小板減少性紫斑病）、溶血性貧血、重症筋無力症、ループス腎炎、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ（RA）、アトピー性皮膚炎、天疱瘡、Graves病、橋本甲状腺炎、Wegener肉芽腫、Omenn症候群、慢性腎不全、急性伝染性単球増加症、HIV及び疱疹ウィルスに関連する疾患、重症急性呼吸器症候群、網脈絡膜炎（choreoretinitis）、及びウィルス感染により引き起こされる免疫性疾患（例えば、B細胞がエボラウィルス（EBV）で感染されることで引き起こされ、又は仲介される疾患）から選ばれる。
幾つかの実施形態において、本開示は、前記何れか1項に記載のポリペプチド複合物、又は多重特異性ポリペプチド複合物、又はドメイン改造抗体、又はドメイン改造抗体のFab断片、又は二重特異性抗体、又は多重特異性抗体を、検出待ちサンプルに接触させる工程を含む、検出方法を提供する。
幾つかの実施形態において、本開示は、前記何れか1項に記載のポリペプチド複合物、又は多重特異性ポリペプチド複合物、又はドメイン改造抗体、又はドメイン改造抗体のFab断片、又は二重特異性抗体、又は多重特異性抗体を含む、検出又は測定に使用される試薬を提供する。
Titin-TとObscurin-O、又はTitin-TとObscurin-Like-O鎖ドメインとの間の相互作用界面の構造図である。 CH1とCLが取り替えられたFabの模式図である。 両側のCH1とCLが取り替えられたIgG単一特異性抗体構造の模式図である。 片側のCH1とCLが取り替えられたIgG二重特異性抗体構造の模式図である。 DI-1二重特異性抗体構造の模式図である。 DI-1マススペクトル分析図である。図6AはLC1/LC2マススペクトル図である。図6BはHC1/HC2マススペクトル図である。図6CはLC1+LC2+HC1+HC2マススペクトル図である。 DI-1マススペクトル分析図である。図6AはLC1/LC2マススペクトル図である。図6BはHC1/HC2マススペクトル図である。図6CはLC1+LC2+HC1+HC2マススペクトル図である。 DI-1マススペクトル分析図である。図6AはLC1/LC2マススペクトル図である。図6BはHC1/HC2マススペクトル図である。図6CはLC1+LC2+HC1+HC2マススペクトル図である。 抗体軽鎖/重鎖交差ミスマッチ分子構造の模式図である。 BU5二重特異性抗体構造の模式図である。 BU5マススペクトル分析図である。 DI-1二重特異性抗体の破骨細胞の分化実験結果図である。 DI-1二重特異性抗体のTF1細胞の増殖実験結果図である。 二重特異性抗体HJ-1、HJ-2、HJ-3及びHJ-4の構造の模式図である。 二重特異性抗体HJ-1、HJ-2、HJ-3、HJ-4の4本鎖共発現のマススペクトル分析図である。 二重特異性抗体HJ-1、HJ-2、HJ-3、HJ-4の4本鎖共発現のマススペクトル分析図である。 二重特異性抗体HJ-1、HJ-2、HJ-3、HJ-4の4本鎖共発現のマススペクトル分析図である。 二重特異性抗体HJ-1、HJ-2、HJ-3、HJ-4の4本鎖共発現のマススペクトル分析図である。 二重特異性抗体HJ-1のHJ-1-H1、HJ-1-H2、HJ-1-L2の3本鎖共発現のマススペクトル分析図である。 二重特異性抗体HJ-3のHJ-3-H1、HJ-3-H2、HJ-3-L2の3本鎖共発現のマススペクトル分析図である。 残基間の相互作用である。 残基間の相互作用である。
本開示が更に容易に理解されるように、以下、幾つかの技術・科学用語を具体的に定義する。本明細書で特に明らかに定義しない限り、本明細書に使用される他の技術・科学用語の全ては、当業者に通常理解されている意味を持っている。
本開示に用いられるアミノ酸の3文字符号と1文字符号は、J.biol．chem、243、p3558（1968）に記載される通りである。
通常、「抗体（antibody、Ab）」は免疫グロブリン（immunoglobulin、Ig）であり、1つの天然完全抗体は2本の同じ重鎖と2本の同じ軽鎖が鎖間ジスルフィド結合により連結されてなるテトラペプチド鎖構造である。免疫グロブリンは、重鎖定常領域のアミノ酸組成と配列順序が異なるので、その抗原性も異なる。これにより、免疫グロブリンは5種類（class）、即ち、IgM、IgD、IgG、IgA及びIgEに分けられ、その対応する重鎖がそれぞれμ鎖、δ鎖、γ鎖、α鎖、及びε鎖である。同一種類のIgは、そのヒンジ領域のアミノ酸組成及び重鎖ジスルフィド結合の数と位置の差によって、異なるサブクラスに更に分けられ、例えば、IgGがIgG1、IgG2、IgG3、IgG4に分けられてもよい。軽鎖は定常領域の違いによってκ鎖又はλ鎖に分けられ、これにより、抗体が2つのタイプ（type）に分けられる。5種類のIgにおけるそれぞれの種類は、κ鎖又はλ鎖を有してもよい。λ鎖定常領域の個別のアミノ酸の差によって、λ1、λ2、λ3及びλ4の4つのサブタイプ（subtype）に更に分けられる。
本開示に係る抗体は、抗体又はその抗原結合断片を含み、免疫グロブリンを基に改造されると共に、抗原に結合する能力が保持される抗体又はその抗原結合断片を含み、単一特異性抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）を含み、一価抗体、又は多価抗体（例えば、二価抗体）を更に含む。抗体の抗原結合断片は、例えば、少なくとも1つのVH-CH1と少なくとも1つのVL-CL構造を含み、VHとVL構造が鎖間の相互作用により近づくことができると共に、抗原に結合する能力が保持される抗原結合断片であってもよい。幾つかの実施形態において、前記抗体の抗原結合断片が一価Fab断片（Fab1断片）、二価Fab断片（F（ab）2）、三価Fab断片（F（ab）3）、多価（2つ以上）Fab断片であり、少なくとも1つのFab断片を含むその他の単一特異性、二重特異性又は多重特異性抗原結合断片であってもよい。
本開示に係る「ドメイン改造抗体」は抗体のCH1及び/又はCLがその他のドメイン又はペプチド断片で取り替えられて形成される抗体であり、抗体を取り替えるために利用できるCH1/CLドメインのドメイン又はペプチド断片が通常分子間相互作用を有し、選択できるドメインの組合せが、IL13RA1 Fibronectin type-III3ドメイン/IL4R Fibronectin type-IIIドメイン、IL6ST Fibronectin型-III2ドメイン/IL6R Fibronectin型-III2ドメイン、HFE Ig-Like C1-型ドメイン/B2M Ig-Like C1-型ドメイン、CD1B Ig-Likeドメイン/B2M Ig-Like C1-型ドメイン、Obscurin Ig-Like 1ドメイン/Titin Ig-Like 152ドメイン又はObscurin-Like Ig-Like 1/Titin Ig-Like 152ドメインを含むが、これらに限定されない。幾つかの実施形態において、前記構造改造抗体は単一特異性抗体、二重特異性抗体又は多重特異性抗体である。幾つかの実施形態において、前記構造改造抗体が一価抗体、二価抗体又は多価抗体である。幾つかの実施形態において、前記構造改造抗体が完全抗体又はその抗原結合断片である。幾つかの実施形態において、前記抗体抗原結合断片がFab断片であり、一価Fab断片（Fab1断片）、二価Fab断片（F（ab）2）、三価Fab断片（F（ab）3）又は多価（2つ以上）Fab断片であってもよい。例示的に、抗体Fab断片のCH1とCLがTitin-T鎖/Obscurin-O鎖又はTitin-T鎖/Obscurin-Like-O鎖で取り替えられた構造の模式図は図2に示される。抗体のCH1とCLがTitin-T鎖/Obscurin-O鎖、又はTitin-T鎖/Obscurin-Like-O鎖で取り替えられた構造の模式図は図3に示される。二重特異性抗体の片側のCH1とCLがTitin-T鎖/Obscurin-O鎖、又はTitin-T鎖/Obscurin-Like-O鎖で取り替えられた構造の模式図は図4に示される。少なくとも1つのCH1と少なくとも1つのCLがTitin-T鎖/Obscurin-O鎖、又はTitin-T鎖/Obscurin-Like-O鎖で取り替えられたその他の抗体は、例えば、二価抗体の片側のCH1とCLがTitin-T鎖/Obscurin-O鎖又はTitin-T鎖/Obscurin-Like-O鎖で取り替えられ、二重特異性抗体の両側のCH1とCLがTitin-T鎖/Obscurin-O鎖、又はTitin-T鎖/Obscurin-Like-O鎖で取り替えられ、F（ab）2断片の2つのCH1/CLがTitin-T鎖/Obscurin-O鎖、又はTitin-T鎖/Obscurin-Like-O鎖で取り替えられ、F（ab）3断片の1つ又は2つ又は3つのCH1/CLがTitin-T鎖/Obscurin-O鎖、又はTitin-T鎖/Obscurin-Like-O鎖で取り替えられた。
「Titin」（タイチン）は大きなサルコメリックタンパク質であり、複雑な分子折畳み構造を有する。太いミオフィラメントとZ-ディスクを連結することで、筋原線維の完全性及び安定性などを維持する機能を持つと知られている。タイチンは骨格筋線維の第3類リッチタンパク質であり、その分子量が2700 kDa（25000個以上のアミノ酸）であり、長さがほぼ筋節の半分の1 μmである。
「Titin Ig-Like 152ドメイン」はTitinタンパク質におけるTitin Ig-Like 152と名付けられたIg-Likeドメインであり、該ドメインが分子間相互作用によりObscurin Ig-Like 1又はObscurin-Like Ig-Like 1ドメインに結合し、二量体複合物を形成できる（RCSB PDBデータベースから入手できる）。
「Titin-T鎖」、「T鎖」はTitinタンパク質における長さが78～118個のアミノ酸であり、Titin Ig-Like 152ドメインを含むペプチド断片又はその機能変異体であり、前記Titin-T鎖が分子間相互作用によりObscurin Ig-Like 1又はObscurin-Like Ig-Like 1ドメインに結合し、複合物を形成できる。前記T鎖の機能変異体は、野生型T鎖の一部のアミノ酸に変異が起こされているが、分子間相互作用によりObscurin Ig-Like 1又はObscurin-Like Ig-Like 1に結合し、複合物を形成するペプチド断片を有するものである。本開示において、Titin-T鎖は抗体のCH1又はCLドメインを取り替えるために利用できるが、抗体VHとVLの結合及び抗体と抗原エピトープの結合に影響を与えない。Obscurin Ig-Like 1ドメインと互いに締結し、複合物を形成できるのであれば、Titin-T鎖の一部のアミノ酸に変異を起こさせることができる。例えば、Titin Ig-Like 152ドメインのC末端及び/又はN末端に適切な長さのアミノ酸を付加又は切断する。例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10個のアミノ酸残基を付加又は切断してもよい。例えば、Titin Ig-Like 152ドメインのN末端に5つのTitinタンパク質のうちのTitin Ig-Like 152ドメインのN末端と隣接する「KAGIR」アミノ酸を付加する。Titin Ig-Like 152ドメインのN末端及び/又はC末端に適切な長さの連結配列（例えば、（GxS）yコネクソン（但し、Xが1～5の整数から選ばれ、Yが1～6の整数から選ばれる）、例えば、「G4S」、「（G4S）2」）を付加し、Titin Ig-Like 152ドメインのN末端を連結配列により抗体のVH/又はVLと連結させる。Titin Ig-Like 152ドメインのアミノ酸にその他の変異を起こさせてもよい。例えば、鎖間ジスルフィド結合を付加して、複合物の安定性を向上させるために、あるアミノ酸に変異を起こさせる。本開示の幾つかの実施形態において、前記Titin-T鎖が配列番号32、35～41、65～76の何れか1つに示される配列であり、又は配列番号32、35～41、65～76の何れか1つの配列と少なくとも80%の同一性を有するポリペプチドであり、前記ポリペプチドがObscurin-O鎖又はObscurin-Like-O鎖と互いに締結し、複合物を形成できる。
「Obscurin」（オブスキュリン）は、OBSCN遺伝子によりコードされるタンパク質であり、ジャイアントサルコシンシグナルタンパク質ファミリーに属する。Obscurinは、心筋及び骨格筋において発現すると共に、筋節アセンブリ過程において筋原線維の組織に重要な働きを果たしている。Obscurinは、筋形質クラスリンsANK1の主な細胞質リガンドであり、sANK1の分解を阻止することができる（Lange S et al.、Molecular Biology of the Cell. 23（13）： 2490-504）。Obscurinは、筋形質網状ドメインと筋形質網状ドメインとの間にシグナル連絡の働きを果たしている（Bagnato P et al.、The Journal of Cell Biology. 160（2）： 245-53.）。Obscurinは、筋原線維アセンブリ過程において新しい筋節の形成に関与する（Borisov AB et al.、Biochemical and Biophysical Research Communications. 310（3）： 910-918）。
「Obscurin Ig-Like 1ドメイン」はObscurinタンパク質におけるObscurin Ig-Like 1と名付けられたIg-Likeドメインであり、該ドメインが分子間相互作用によりTitin Ig-Like 152ドメインと複合物を形成できる（RCSB PDBデータベースから入手できる）。
「Obscurin-O鎖」、「O鎖」は、Obscurinタンパク質における長さが87～117個のアミノ酸であり、Obscurin Ig-Like 1ドメインを含むペプチド断片又はその機能変異体であり、前記Obscurin-O鎖が分子間相互作用によりTitin Ig-Like 152ドメインと複合物を形成できる。前記Obscurin-O鎖の機能変異体は、野生型O鎖の一部のアミノ酸に変異が起こされているが、分子間相互作用によりTitin Ig-Like 152ドメインと複合物を形成するペプチド断片を有するものである。本開示において、Obscurin-O鎖は抗体のCH1又はCLドメインを取り替えることができるが、抗体VHとVLの結合及び抗体と抗原エピトープの結合に影響を与えない。Titin Ig-Like 152ドメインと互いに締結し、複合物を形成できるのであれば、Obscurin-O鎖の一部のアミノ酸に変異を起こさせることができる。例えば、Obscurin-OドメインのC末端及び/又はN末端に適切な長さのアミノ酸を付加し、又は切断し、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10個のアミノ酸を付加し、又は切断する。例えば、Obscurin-OドメインのN末端に5つの野生型Obscurinタンパク質のうちのObscurin Ig-Like 1ドメインのN末端と隣接する「DQPQF」アミノ酸を付加する。Obscurin-OドメインのN末端及び/又はC末端に適切な長さの連結配列（例えば、（GxS）yコネクソン（但し、Xが1～5の整数から選ばれ、Yが1～6の整数から選ばれる）、例えば、「G4S」、「（G4S）2」）を付加し、Obscurin-OドメインのN末端を連結配列により抗体のVH/又はVLと連結させる。Obscurin Ig-Like 1ドメインの一部のアミノ酸にその他の変異を起こさせてもよい。例えば、鎖間ジスルフィド結合を付加して、抗体の安定性などを向上させるために、あるアミノ酸に変異を起こさせる。本開示の幾つかの実施形態において、前記Obscurin-O鎖が配列番号33、42～58、77～86の何れか1つに示される配列であり、又は配列番号33、42～58、77～86の何れか1つの配列と少なくとも80%の同一性を有するポリペプチドであり、前記ポリペプチドがTitin-T鎖と互いに締結し、複合物を形成できる。
「Obscurin-Like 1」、「オブスキュリンライク1」は、ヒト染色体2q35のSPEG内に位置するOBSL1遺伝子によりコードされるタンパク質であり、該タンパク質がObscurinと緊密に関連する。その選択的スプライシングにより複数のアイソフォームが発生され、予測分子量範囲が130 kD～230 kDである（Geisler SB et al.、（2007）. Genomics. 89（4）： 521-31）。
「Obscurin-Like Ig-Like 1ドメイン」はObscurin-Like 1タンパク質におけるObscurin-LikeIg-Like 1と名付けられたIg-Likeドメインであり、該ドメインが分子間天然相互作用によりTitin Ig-Like 152ドメインと複合物を形成できる（RCSB PDBデータベースから入手できる）。
「Obscurin-Like-O鎖」、「OL鎖」は、Obscurin-Like 1タンパク質における長さが78～118個のアミノ酸であり、Obscurin-Like Ig-Like 1ドメインを含むペプチド断片又はその機能変異体である。前記Obscurin-Like-O鎖が分子間相互作用によりTitin Ig-Like 152ドメインと複合物を形成できる。前記Obscurin-Like-O鎖の機能変異体は、野生型OL鎖の一部のアミノ酸に変異が起こされているが、Titin Ig-Like 152ドメインと互いに作用して複合物を形成するペプチドを有するものである。本開示において、Obscurin-Like-O鎖は抗体のCH1又はCLドメインを取り替えることができるが、抗体VHとVLの結合及び抗体と抗原エピトープの結合に影響を与えない。Titin Ig-Like 152ドメインと互いに締結し、複合物を形成できるのであれば、Obscurin-Like-O鎖の一部のアミノ酸に変異を起こさせることができる。幾つかの実施形態において、例えば、Obscurin-OドメインのC末端及び/又はN末端に適切な長さのアミノ酸を付加し、又は切断し、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10個のアミノ酸を付加し、又は切断する。Obscurin-Like-OドメインのN末端及び/又はC末端に適切な長さの連結配列（例えば、（GxS）yコネクソン（但し、Xが1～5の整数から選ばれ、Yが1～6の整数から選ばれる）、例えば「G4S」、「（G4S）2」）を付加し、Obscurin-Like-OドメインのN末端を連結配列により抗体のVH又はVLと連結させる。Obscurin-Like Ig-Like 1ドメインの一部のアミノ酸にその他の変異を起こさせてもよい。例えば、鎖間ジスルフィド結合を付加して、抗体の安定性などを向上させるために、あるアミノ酸に変異を起こさせる。本開示の幾つかの実施形態において、前記Obscurin-Like-O鎖が配列番号34、59～64の何れか1つに示される配列であり、又は配列番号34、59～64の何れか1つに示される配列と少なくとも80%の同一性を有するポリペプチドであり、前記ポリペプチドがTitin-T鎖と互いに締結して、複合物を形成できる。
また、Titin Ig-Like 152ドメインとObscurin Ig-Like 1ドメイン、又はTitin Ig-Like 152ドメインとObscurin-Like Ig-Like 1ドメインとを互いに締結して、複合物を形成できるのであれば、Titin Ig-Like 152ドメイン、Obscurin Ig-Like 1ドメイン又はObscurin-Like Ig-Like 1ドメインにおける一部のアミノ酸に変異を起こさせてもよい。幾つかの実施形態において、Titin Ig-Like 152ドメインとObscurin Ig-Like 1ドメイン、又はTitin Ig-Like 152ドメインとObscurin-Like Ig-Like 1ドメインを互いに締結して、複合物を形成できるのであれば、Titin Ig-Like 152ドメイン、Obscurin Ig-Like 1ドメイン又はObscurin-Like Ig-Like 1ドメインのC末端及び/又はN末端に適切な長さのアミノ酸（例えば、ドメインと隣接する野生型タンパク質の1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10個のアミノ酸）を付加し、又は切断してもよい。例えば、Titin Ig-Like 152ドメインのN末端に5つの野生型Titinタンパク質のうちのTitin Ig-Like 152ドメインのN末端と隣接する「KAGIR」アミノ酸を付加し、又はObscurin Ig-Like 1ドメインのN末端に5つの野生型Obscurinタンパク質のうちのObscurin Ig-Like 1ドメインのN末端と隣接する「DQPQF」アミノ酸を付加する。幾つかの実施形態において、Titin Ig-Like 152ドメイン、Obscurin Ig-Like 1ドメイン又はObscurin-Like Ig-Like 1ドメインのN末端及び/又はC末端に適切な長さの連結配列（例えば、（GxS）yコネクソン（但し、Xが1～5の整数から選ばれ、Yが1～6の整数から選ばれる）、例えば、「G4S」、「（G4S）2」）を付加して、Titin Ig-Like 152ドメイン、Obscurin Ig-Like 1ドメイン、Obscurin-Like Ig-Like 1ドメインのN末端を連結配列により抗体のVH又はVLと連結させる。幾つかの実施形態において、Titin Ig-Like 152ドメインとObscurin Ig-Like 1ドメイン、又はTitin Ig-Like 152ドメインとObscurin-Like Ig-Like 1ドメインとを互いに作用して複合物を形成できるのであれば、Titin Ig-Like 152ドメイン、Obscurin Ig-Like 1ドメイン又はObscurin-Like Ig-Like 1ドメインにおける一部のアミノ酸にその他の変異を起こさせてもよい。例えば、鎖間ジスルフィド結合を付加して、抗体の安定性などを向上させるために、一部のアミノ酸に変異を起こさせる。
「Fab断片」は酵素によりモノクローナル抗体を処理して得られた抗原に結合できる断片であり、該断片が軽鎖（VL-CL）と重鎖のVH-CH1構造を含む。
「ドメインが改造されたFab断片」は抗体Fab断片におけるCL及び/又はCH1がその他のドメイン又はペプチド断片で取り替えられて形成されたポリペプチド断片であり、ドメインが改造されたFab断片がVHとVLとの間の相互作用及び抗体と抗原との結合能力を保持している。幾つかの実施形態において、ドメインが改造されたFab断片が多価抗体又は多価ポリペプチド複合物の一部として利用できる。別の幾つかの実施形態において、ドメインが改造されたFab断片が1つの単一タンパク質分子として利用される。Fab断片が一価Fab断片（Fab断片1）、二価Fab断片（F（ab）2）、三価Fab断片（F（ab）3）又は多価（2つ以上）Fab断片であってもよい。例示的に、Fab断片のCH1とCLが取り替えられた模式図は図2に示される。
用語「特異性抗体」又は「特異性ポリペプチド複合物」は目標抗原又は抗原エピトープに特異的に結合できる抗体又はポリペプチド複合物である。抗体が結合する異なる目標抗原又は異なる抗原エピトープの数によって、単一特異性抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体……、多重特異性（2つ以上の異なる目標抗原又は異なる抗原エピトープに結合する）抗体に分けられる。ポリペプチド複合物が結合する異なる目標抗原又は異なる抗原エピトープの数によって、単一特異性ポリペプチド複合物、二重特異性ポリペプチド複合物、三重特異性ポリペプチド複合物、四重特異性ポリペプチド複合物……、多重特異性（2つ以上の異なる目標抗原又は異なる抗原エピトープに結合する）ポリペプチド複合物に分けられる。例えば、「二重特異性抗体」は2つの異なる抗原又は同じ抗原における2つの異なる抗原エピトープに特異的に結合できる抗体（抗体又はその抗原結合断片を含み、例えば、単鎖抗体）である。従来技術には様々な構造の二重特異性抗体が開示された。IgG分子の完全性によって、IgG-Like二重特異性抗体と抗体断片型二重特異性抗体に分けられる。抗原結合ドメインの数や立体配置によって、二価、三価、四価又はそれ以上の多価の二重特異性抗体に分けられる。構造が左右対称であるかによって、対称構造二重特異性抗体と非対称構造二重特異性抗体に分けられる。抗体断片に基づく二重特異性抗体は、例えば、Fc断片欠如のFab断片であり、2つ又は複数のFab断片を1つの分子に結合することで二重特異性抗体形成を形成し、低い免疫原性を有し、且つ分子量が小さく、高い腫瘍組織浸透性を有し、該タイプの典型的な抗体構造が、例えば、F（ab）2、scFv-Fab、（scFv）2-Fabなどの二重特異性抗体である。IgG-Like二重特異性抗体（例えば、Fc断片を有する）であり、該抗体は相対分子量が大きく、Fc断片が抗体の後期精製に繋がり、溶解性、安定性を向上させ、Fc部分が受容体FcRnに結合して、抗体血清の半減期を増加し、典型的な二重特異性抗体の構造モデルが、例えば、KiH、CrossMAb、Triomab quadroma、FcΔAdp、ART-Ig、BiMAb、Biclonics、BEAT、DuoBody、Azymetric、XmAb、2：1 TCBs、1Fab-IgG TDB、FynomAb、two-in-one/DAF、scFv-Fab-IgG、DART-Fc、LP-DART、CODV-Fab-TL、HLE-BiTE、F（ab）2-CrossMAb、IgG-（scFv）2、Bs4Ab、DVD-Ig、Tetravalent- DART-Fc、（scFv）4-Fc、CODV-Ig、mAb2、F（ab）4-CrossMAbなどの二重特異性抗体である（Aran F. Labrijn et al.、Nature Reviews Drug Discovery volume 18，pages585-608（2019）；Chen S1 et al.、J Immunol Res. 2019 Feb 11；2019：4516041を参照）。
用語「一価」、「二価」、「三価」又は「多価」は抗体又はポリペプチド複合物に所定数の抗原結合部位が存在することである。例えば、「一価抗体」は抗体に1つの抗原結合部位が存在することを示し、「一価ポリペプチド複合物」はポリペプチド複合物に1つの抗原結合部位が存在することを示す。「二価抗体」は抗体に2つの抗原結合部位が存在することを示し、「二価ポリペプチド複合物」はポリペプチド複合物に2つの抗原結合部位が存在することを示す。「三価抗体」は抗体に3つの抗原結合部位が存在することを示し、「三価ポリペプチド複合物」はポリペプチド複合物に3つの抗原結合部位が存在することを示す。「多価抗体」は抗体に複数の抗原結合部位が存在すること（例えば、3つ以上の抗原結合部位が存在すること）を示し、「多価ポリペプチド複合物」はポリペプチド複合物に複数の抗原結合部位が存在すること（例えば、2つ以上の抗原結合部位が存在すること）を示す。
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」又は「タンパク質」は本開示において互いに交換して利用してもよく、アミノ酸残基重合体、又は複数のアミノ酸残基重合体の集合体である。これらの用語はそのうちの1つ又は複数のアミノ酸残基が対応する天然存在アミノ酸である人工化学模倣物のアミノ酸重合体、天然存在アミノ酸重合体及び非天然存在アミノ酸重合体に使用される。通常、ポリペプチド配列は、ポリペプチド配列の左手端がアミノ基末端（N末端、N端）であり、ポリペプチド配列の右手端がカルボキシ基末端（C末端、C端）であると、記述される。本開示の「ポリペプチド複合物」はある機能の実現に関連する1つ又は複数のポリペプチドを含む複合物である。幾つかの実施形態において、前記ポリペプチド複合物は、抗原に特異的に結合できる抗体又はその抗原結合断片である。
抗原に対する「結合領域」又は「結合部位」、「結合ドメイン」という用語は特異性タンパク質分子（例えば、抗体分子）において、抗原に特異的に結合できる領域又は部分であり、抗原結合領域が抗原に直接的に結合できるリガンド結合ドメイン部分であってもよく、抗原に直接的に結合できる抗体可変領域を含むドメインであってもよい。
用語「操作可能に連結する」又は「操作可能な連結」又は「操作可能連結」は、スペーサー領域（リンカー、コネクソン、連結配列とも呼ばれる）の存在にも関わらず、2つ以上の生物学的配列が目的方式で作用する方式により連結されることである。ポリペプチドに利用される場合、該用語は、ポリペプチド配列が連結される生成物が目的生物学的機能を有する方式により連結され、2本の配列の間にスペーサー領域が存在してもよく、又は存在しなくてもよいことを示す。例えば、抗原結合活性を有する安定的な生成物を形成するように、抗体の可変領域を定常領域に操作可能に連結する。前記用語はポリヌクレオチドにも利用できる。例えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー配列など）に操作可能に連結される場合、該用語は、前記ポリヌクレオチド配列が前記ポリペプチドが前記ポリヌクレオチドにより発現調節できる方式により連結されることを示す。
用語「二量化ドメイン」は互いに締結して二量体を形成するように促進できるポリペプチドドメインである。幾つかの実施形態において、第1二量化ドメインが第2二量化ドメインと締結できる。該締結は、例えば、コネクソン、ジスルフィド結合、水素結合、静電相互作用、塩橋、又は疎水-親水相互作用、或いはこれらの組合せなどの何れか適切な方式により結合又は連結又は結合できる。例示的な二量化ドメインは、抗体ヒンジ領域、抗体CH2ドメイン、抗体CH3ドメイン、並びに互いに二量化できる、及び互いに作用できるその他の適切なタンパク質単量体又はポリペプチドを含むが、これらに限定されない。ヒンジ領域、CH2、CH3は、例えば、IgG1、IgG2、IgG3及びIgG4などの何れかの抗体アイソタイプにより誘導されてもよい。
用語「相互作用ドメイン」は、2つ以上のホモ又はヘテロポリペプチドの相互作用又は締結を促進できるポリペプチドのドメインである。例えば、相互作用ドメインは互いに締結して二量体を形成するように促進できる二量化ドメインである。タンパク質間相互作用のドメインは2つ以上のタンパク質間で互いに作用し、又は締結するポリペプチドのドメインである。例えば、Obscurin-Likeタンパク質におけるObscurin-Like Ig-Like 1ドメインは分子間相互作用によりTitinタンパク質のTitin Ig-Like 152ドメインと複合物を形成できる。幾つかの実施形態において、Titin-T鎖と互いに作用するドメインがObscurin-O鎖又はObscurin-Like-O鎖である。
用語「二量体」は2つの分子（例えば、ポリペプチド又はタンパク質）が共有又は非共有相互作用により形成される構造である。ホモ二量体又はホモ二量化は同じ2つの分子により形成され、ヘテロ二量体又はヘテロ二量化は異なる2つの分子により形成される。2つの分子が天然鎖間結合により二量体を形成してもよく、非天然鎖間結合により二量体を形成してもよい。本開示の幾つかの実施形態において、Titin-T鎖とObscurin-O鎖又はTitin-T鎖とObscurin-Like-O鎖が天然鎖間結合により二量体を形成してもよい。当業者が周知する通り、互いに締結して二量体を形成する2つのドメインは、第1ドメインと第2ドメインとの間隔6オングストローム以内の接触界面残基（特に、4.5オングストローム以内の残基）が2つのドメインの締結の維持にとって肝心な働きを果たしている（Yan, Changhui et al. “Characterization of protein-protein interfaces.” The protein journal vol. 27,1 (2008)： 59-70）。MOE（Molecular Operating Environment）システムによりTitin-T鎖とObscurin-O鎖又はTitin-T鎖とObscurin-Like-O鎖が締結して形成される複合物（図1A及び図1Bを参照）を分析したところ、Titin-T鎖における7～15、19～24、26、55、59及び60番目のうちの1つ又は複数の残基がObscurin-O鎖における3～6、9、41、73、75及び80～90番目の1つ又は複数の残基と互いに作用し、Titin-T鎖における1、7～10、13～16、19～26、59～60及び96番目の1つ又は複数の残基がObscurin-Like-O鎖における4～5、10、12～13、74、76、78及び82～91番目の1つ又は複数の残基と互いに作用し（図16A及び図16Bを参照）、前記部位の接触界面残基間隔が4.5オングストローム以内であり、2つのドメインの締結の維持にとって重要な働きを果たしていることが発現された。また、別の幾つかの実施形態において、Titin-T鎖とObscurin-O鎖又はTitin-T鎖とObscurin-Like-O鎖が非天然鎖間結合により二量体を形成してもよく、前記二量体が1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個以上の非天然鎖間結合を含む。Titin-T鎖、Obscurin-O鎖又はObscurin-Like-O鎖における幾つかのアミノ酸に変異を起こさせることで、Titin-T鎖とObscurin-O鎖又はTitin-T鎖とObscurin-Like-O鎖の間にジスルフィド結合を形成して、二量体を安定化させることができる。幾つかの実施形態において、前記Titin-T鎖が8、20、22、25、26及び39番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖が3、9、25、76及び88番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、或いはTitin-T鎖が8、20、22、25、26及び39番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、及び/又は前記Obscurin-Like-O鎖が6、26、74、77、84及び86番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有する。幾つかの実施形態において、前記Titin-T鎖がA8C、V20C、T22C、C25S、A26C及びC39Tから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖がA3C、R9C、C25S、C76S及びA88Cから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、或いは前記Titin-T鎖がA8C、V20C、T22C、C25S、A26C及びC39Tから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、及び/又は前記Obscurin-Like-O鎖がC6E、C26S、C77S、V74C、G84C及びA86Cから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有する。幾つかの実施形態において、前記Titin-T鎖がC25S、C39T及びA8C変異を有し、Obscurin-O鎖がA88C変異を有し、Titin-T鎖がC25S、C39T及びV20C変異を有し、Obscurin-O鎖がA3C変異を有し、Titin-T鎖がC25S、C39T及びA26C変異を有し、Obscurin-O鎖がR9C変異を有し、Titin-T鎖がC25S、C39T及びA8C変異を有し、Obscurin-O鎖がC25S、C76S及びA88C変異を有し、Titin-T鎖がC25S、C39T及びV20C変異を有し、Obscurin-O鎖がC25S、C76S及びA3C変異を有し、Titin-T鎖がC25S、C39T及びA26C変異を有し、Obscurin-O鎖がC25S、C76S及びR9C変異を有し、Titin-T鎖がC25S、C39T及びA8C変異を有し、Obscurin-Like-O鎖がC6E及びV74C変異を有し、Titin-T鎖がC25S、C39T及びV20C変異を有し、Obscurin-Like-O鎖がC6E及びG84C変異を有し、Titin-T鎖がC25S、C39T及びT22C変異を有し、Obscurin-Like-O鎖がC6E及びA86C変異を有し、Titin-T鎖がC25S、C39T及びA8C変異を有し、Obscurin-Like-O鎖がC6E、C26S、C77S及びV74C変異を有し、Titin-T鎖がC25S、C39T及びV20C変異を有し、Obscurin-Like-O鎖がC6E、C26S、C77S及びG84C変異を有し、Titin-T鎖がC25S、C39T及びT22C変異を有し、Obscurin-Like-O鎖がC6E、C26S、C77S及びA86C変異を有する。幾つかの実施形態において、前記Obscurin-O鎖が7、11、62番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を更に有し、好ましくは、前記Obscurin-O鎖がL7K又はL7R、K11L、T62K又はT62Hから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、最も好ましくは、前記Titin-T鎖がC25S、C39T及びA8C変異を有し、Obscurin-O鎖がC25S、C76S、A88C、L7K及びT62K変異を有し、Titin-T鎖がC25S、C39T及びA8C変異を有し、Obscurin-O鎖がC25S、C76S、A88C、L7K及びT62H変異を有し、Titin-T鎖がC25S、C39T及びA8C変異を有し、Obscurin-O鎖がC25S、C76S、A88C、K11L及びT62K変異を有し、或いはTitin-T鎖がC25S、C39T及びA8C変異を有し、Obscurin-O鎖がC25S、C76S、A88C、K11L及びT62Hを有する。前記Titin-T鎖変異部位がT.0鎖（配列番号32の配列）に対する自然順部位であり、Obscurin-O鎖変異部位がO.0鎖（配列番号33の配列）に対する自然順部位であり、Obscurin-Like-O鎖変異部位がOL.0鎖（配列番号34の配列）に対する自然順部位である。
本開示において、「ミスマッチ」は2つ以上のホモ又はヘテロポリペプチドが互いに作用し、又は締結し、希望外の二量体又は多量体を形成してペアリングすることである。「ミスマッチが起きにくい」とは、例えば、ポリペプチドA1、B1及びB2が共発現する場合、希望のA1-B1二量体の発現量がA1-B2二量体の量より大きければ、A1-B1間に優先的にペアリングし、即ち、A1-B2間にミスマッチが起きにくいことを意味する。本開示において、幾つかの実施例において、多重特異性ポリペプチド複合物のうち、第1ポリペプチド複合物のVH1と第2ポリペプチド複合物のVL2との間にミスマッチが起きにくく、及び/又は第1ポリペプチド複合物のVL1と第2ポリペプチド複合物のVH2との間にミスマッチが起きにくく、VH1-VL1間に優先的にペアリングし、VH2-VL2間に優先的にペアリングする。
「ジスルフィド結合」は構造R-S-S-R'における硫黄原子間に形成される共有結合である。システインであるアミノ酸は、チオール基を含み、2つ目のチオール基とジスルフィド結合を形成してもよく、例えば、もう1つのシステイン残基のチオール基とジスルフィド結合を形成する。ジスルフィド結合がそれぞれ2本のポリペプチド鎖に位置する2つのシステイン残基のチオール基の間に形成してもよく、鎖間架橋又は鎖間結合を形成する。
静電相互作用は非共有相互作用であり、且つタンパク質折畳み、安定性、柔軟性及び機能において重要な働きを果たしており、イオン相互作用、水素結合及びハロゲン結合を含む。静電相互作用はポリペプチドにおいて形成してもよく、例えば、LysとAspの間に、LysとGluの間に、GluとArgの間に、又は第1鎖におけるGlu、Trpと第2鎖におけるArg、Val又はThrの間に形成してもよい。
塩橋は近距離の静電相互作用であり、主にAsp又はGluのカルボキシレートアニオン及びLysのアンモニウムカチオン又はArgのグアニジノ基に由来し、天然タンパク質構造において空間的に近寄り、且つ異なる電荷を帯びた残基対である。疎水界面における帯電及び極性残基が結合に利用するためのホットスポットとされる。イオン化可能な側鎖を有する残基は、例えば、His、Tyr及びSerであり、塩橋の形成に関与することができる。
親水相互作用であり、極性基を有する分子は、水に対して大きな親和力を有し、分子が水素結合及び水により短時間の結合を形成できる。疎水相互作用は非極性分子間の非共有相互作用である。これらの非極性分子（例えば、幾つかの中性アミノ酸残基であり、疎水残基とも呼ばれる）は、水相環境において水を避けて互いに凝集する傾向がある。例えば、第1鎖における1つ又は複数のVal、Tyr及びAlaと第2鎖における1つ又は複数のVal、Leu及びTrpとの間に疎水相互作用を形成し、或いは第1鎖にHis及びAlaを形成し、第2鎖にThr及びPheを形成する（Brinkmann et al.、2017を参照）。
用語「水素結合」は、水素原子が例えば、窒素、酸素又はフッ素原子などの電気陰性度が高い原子と共有結合する場合、2つの極性基の間における静電吸引力により水素結合が形成される。ポリペプチドの2つの残基の骨格酸素（例えば、酸素族元素基）とアミド水素（窒素基）との間に水素結合が形成でき、例えば、Asnにおける窒素基とHisにおける酸素基との間、或いはAsnにおける酸素基とLysにおける窒素基との間に水素結合を形成する。水素結合はファンデルワールス相互作用より強く、共有結合又はイオン結合より弱く、且つ二次構造及び三次構造の維持にとって肝心である。例えば、アミノ酸残基の間隔が位置iとi+4との間に規律的に発生する場合にαヘリックスが形成され、2本のペプチドが少なくともの2つ又は3つの骨格水素結合により連結される場合に形成される3～10個アミノ酸長さのペプチド断片には、形成される捻じ曲がった皺のあるシートがβプリーツシートである。
本明細書で使用される「ノブイントゥホール」、「knob-into-hole」は2本のポリペプチドの間の相互作用である。1本のポリペプチドは巨大な側鎖を有するアミノ酸残基（例えば、チロシン又はトリプトファン）が存在するために、突起（即ち、「ノブ」、knob）を有する。もう1本のポリペプチドは空洞（即ち、「ホール」、hole）を有し、小さい側鎖を有するアミノ酸残基（例えば、アラニン又はスレオニン）が存在し、且つ突起が空洞に位置し、2つのポリペプチドの相互作用を促進して、ヘテロ二量体又は複合物を形成できる。ノブイントゥホールを有するポリペプチドの発生方法は本分野において知られているものであり、特許US5731169、WO1996027011などを参照できる。
「非天然鎖間結合」は野生型ポリペプチド重合体において発見されていない鎖間結合である。例えば、非天然鎖間結合が1本のポリペプチドの変異アミノ酸残基ともう1本のポリペプチドの野生型アミノ酸残基又は変異アミノ酸残基との間に形成できる。特定の実施形態において、少なくとも1つの非天然鎖間結合はアミノ酸変異が起こった場合に形成された「ジスルフィド結合」である。本開示の幾つかの実施形態において、Titin-T鎖とObscurin-O鎖との間、又はTitin-T鎖とObscurin-Like-O鎖との間の非天然鎖間結合は、Titin-T鎖における8、20、22、25、26及び39番目、及び/又はObscurin-O鎖における3、9、25、76及び88番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基に変異を起こさせることで形成され、或いはTitin-T鎖の8、20、22、25、26及び39番目、及び/又はObscurin-Like-O鎖における6、26、74、77、84及び86番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基に変異を起こさせることで形成される。
用語「接触界面」はポリペプチドにおける特定領域であり、ポリペプチドが互いに接触し又は互いに作用する。接触界面が1つ又は複数のアミノ酸残基を含み、相互作用が発生した場合、あるポリペプチドにおける接触界面アミノ酸残基がそれと接触する対応するアミノ酸残基と互いに作用できる。接触界面におけるアミノ酸残基が連続的に又は非連続的な配列であってもよい。例えば、界面が3次元構造である場合、界面内にあるアミノ酸残基が線形配列における異なる位置に間隔を空けて存在する。
「連結ドメイン」又は「連結ドメイン」又は「スペーサー領域」は2本のポリペプチド配列が融合し、又は組合せる境界又は境界領域である。例えば、連結ドメインは第1融合ポリペプチドに由来する少なくとも一部のC末端断片を含んでもよく、第2融合ポリペプチドに由来するN末端断片の少なくとも一部と融合し、その間にその他のスペーサー領域を有してもよく、又は有さなくてもよい。例えば、スペーサー領域がグリシン及びプロリン残基を大量に含んでもよい。例えば、スレオニン/セリン及びグリシンからなる単一又は反復配列を有するスペーサー領域であり、GGGGS、TGGGG、SGGGG、又はその直列反復配列（例えば、2、3、4、5以上の反復）である。特定の実施形態において、スペーサー領域がGGGGS又はその2つ以上の直列反復配列を含む。
天然完全抗体が2本の重鎖と2本の軽鎖を含む。各重鎖は可変領域（「HCVR」、VH）と、第1、第2及び第3定常領域（CH1、CH2及びCH3）からなり、「Fc」が抗体第2（CH2）と第3（CH3）定常領域により構成され、CH2のN末端が抗体ヒンジ領域部分を含んでもよく、又は含まなくてもよく、ヒンジ領域部分がプロリンを大量に含み、鎖間ジスルフィド結合を含む。各軽鎖は可変領域（「LCVR」、VL）と、定常領域（CL）からなる。重鎖及び軽鎖のN末端に近い約110個のアミノ酸の配列の変化が大きく、可変領域（Fv領域）であり、C末端に近い残りのアミノ酸配列が比較的に安定的で、定常領域である。可変領域は、3つの高変領域（HVR）と、4つの配列が比較的に保存的な骨格領域（FR）とを含む。3つの高変領域は、抗体の特異性を決定し、相補決定領域（CDR）とも呼ばれる。各軽鎖可変領域（VL）及び重鎖可変領域（VH）は、3つのCDR領域と、4つのFR領域からなり、アミノ基末端からカルボキシル基末端までFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順で配列される。軽鎖の3つのCDR領域はLCDR1、LCDR2及びLCDR3を指し、重鎖の3つのCDR領域はHCDR1、HCDR2及びHCDR3を指す。
本開示の抗体は、例えば、動物由来の抗体（例えば、マウス、トリ、ウサギ、ラクダ、サルなどに由来する抗体）、キメラ抗体、ヒト化抗体及び完全ヒト化抗体であってもよい。本開示の抗体は、全長抗体の他に、抗原に結合可能な抗原結合断片を含む。
用語「マウス抗体」は本開示において本分野の知識と技術により調製された抗原に対するモノクローナル抗体である。調製時に抗原を試験対象に注射した後、所望の配列又は機能特性を有する抗体を発現したハイブリドーマを分離する。本開示の好ましい一実施形態において、前記マウス抗体又はその抗原結合断片は、マウスκ、λ鎖又はその変異体の軽鎖定常領域を更に含み、又は、マウスIgG1、IgG2、IgG3又はその変異体の重鎖定常領域を更に含んでもよい。
用語「キメラ抗体（chimeric antibody）」は、その他の第1種抗体の可変領域と第2種抗体の定常領域を融合してなる抗体である。例えば、ヒトマウスキメラ抗体を作成するには、まず、マウス特異的モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを作成してから、マウスハイブリドーマ細胞から可変領域遺伝子をクローニングし、更に必要に応じてヒト抗体の定常領域遺伝子をクローニングし、マウス可変領域遺伝子とヒト定常領域遺伝子とをキメラ遺伝子になるように連結した後、発現ベクターに挿入し、最後に真核細胞系又は原核細胞系においてキメラ抗体分子を発現する。本開示の好ましい一実施形態において、前記キメラ抗体の抗体軽鎖がヒトκ、λ鎖又はその変異体の軽鎖定常領域を更に含む。前記抗原キメラ抗体の抗体重鎖は、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、IgG4又はその変異体の重鎖定常領域を更に含み、好ましくはヒトIgG1、IgG2又はIgG4重鎖定常領域を含み、又はアミノ酸変異（例えばL234A及び/又はL235A変異、及び/又はS228P変異）のIgG1、IgG2又はIgG4変異体を使用する。
用語「ヒト化抗体（humanized antibody）」は、CDR移植抗体（CDR-grafted antibody）とも呼ばれ、マウスのCDR配列をヒトの抗体可変領域フレームワーク、即ち、異なる種類のヒト生殖細胞系の抗体フレームワーク配列に移植して発生された抗体を指す。キメラ抗体が大量のマウスタンパク質成分をもつことにより誘導された異種反応性を克服することができる。このようなフレームワーク配列は、生殖細胞系抗体遺伝子配列を含む共通DNAデータベース又は開示された参考文献から取得することができる。例えば、ヒト重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子の生殖細胞系DNA配列は、「VBase」ヒト生殖細胞系配列データベースにより取得し、及びKabat，E.A. et al.によって発表された1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版で発見することができる。免疫原性の低下に伴う活性の低下を回避するために、前記ヒト抗体可変領域フレームワーク配列に対して最も少ない逆変異又は復帰変異を行うことにより、活性を保つことができる。本開示のヒト化抗体は、更に酵母菌で提示される、CDRに対して親和性成熟変異を行ったヒト化抗体も含む。
本開示の一実施形態において、前記抗体又はその抗原結合断片は、ヒト又はマウスκ、λ鎖又はその変異体の軽鎖定常領域を更に含み、又はヒト又はマウスIgG1、IgG2、IgG3、IgG4又はその変異体の重鎖定常領域を更に含んでもよく、好ましくは、ヒトIgG1、IgG2又はIgG4重鎖定常領域を含み、又は、アミノ酸変異（例えばL234A及び/又はL235A変異、及び/又はS228P変異）のIgG1、IgG2又はIgG4変異体を使用する。
本開示に記載されるヒト抗体の重鎖定常領域及びヒト抗体の軽鎖定常領域を含む「通常の変異体」は、従来技術に開示された抗体可変領域の構造と機能を変更しないヒト由来の重鎖定常領域又は軽鎖定常領域の変異体である。例示的な変異体は、重鎖定常領域に対して部位特異的に改造とアミノ酸置換を行ったIgG1、IgG2、IgG3又はIgG4重鎖定常領域変異体を含み、具体的な置換は、例えば、従来技術における既知のYTE変異、L234A及び/又はL235A変異、S228P変異、及び/又はknob-into-hole構造を得た変異（抗体重鎖にknob-Fcとhole-Fcの組合せを付与する）であり、これらの変異は、抗体可変領域の機能を変更せずに、抗体に新しい性能を付与することが確認された。
「ヒト抗体」（HuMAb）、「ヒト化抗体」、「全ヒト抗体」、「完全なヒト抗体」は互いに交換して使用してもよく、ヒト由来の抗体であってもよく、1種のトランスジェニック生体から得た抗体であってもよく、該トランスジェニック生体は、「改造」により抗原の刺激に応答して特異性ヒト抗体が生成され、且つ本分野で知られている任意の方法で生成することができる。トランスジェニック生物は、ヒト抗体を合成することができ、且つ該生物はヒト抗体の産生、即ちハイブリドーマの分泌に利用されてもよい。ヒト抗体は、重鎖と軽鎖が1人以上のヒトDNA由来のヌクレオチド配列によりコードされる抗体であってもよい。完全なヒト抗体は、遺伝子又は染色体トランスフェクション方法及びファージ提示技術により構築されてもよく、体外で活性化したB細胞で構築されてもよく、これらは全て本分野で知られているものである。
用語「全長抗体」、「完全抗体」、「完全な抗体」及び「全抗体」は本明細書で互いに交換して用いられてもよく、実質的に完全な形式の抗体を指し、以下定義される抗原結合断片と区別するものである。該用語は、特に、軽鎖及び重鎖が定常領域を含む抗体を指す。本開示の「抗体」は、「全長抗体」及びその抗原結合断片を含む。
幾つかの実施形態において、本開示の全長抗体は、軽鎖可変領域と軽鎖定常領域が接続した軽鎖と、重鎖可変領域と重鎖定常領域が接続した重鎖により形成される全長抗体を含む。当業者は、実際の必要に応じて、ヒト抗体由来の軽鎖定常領域と重鎖定常領域などの、異なる抗体由来の軽鎖定常領域、重鎖定常領域を選択することができる。
用語抗体の「抗原結合断片」は、抗体における抗原（例えば、抗原）結合能力を保つ1つ以上の断片である。全長抗体の断片により抗体の抗原結合機能を果たすことができることが示されている。用語である抗体の「抗原結合断片」に含まれる結合断片の実例としては、（ｉ）VL、VH、CL及びCH1ドメインからなる1価断片であるFab断片、（ｉｉ）ヒンジ領域でのジスルフィド架橋により接続された2つのFab断片を含む二価断片であるF（ab'）2断片、（ｉｉｉ）VHとCH1ドメインからなるFd断片、（ｉｖ）抗体の単アームのVHとVLドメインからなるFv断片、（ｖ）VHとVLにより鎖間ジスルフィド結合で形成された安定的な抗原結合断片であるdsFv、（ｖｉ）scFv、dsFv、Fabなどの断片を含む二重抗体、二重特異性抗体及び多重特異性抗体が含まれる。また、Fv断片の2つのドメインVL及びVHは、分離した遺伝子でコードされるが、その中のVL及びVH領域のためにペアリングして1価分子を形成する単一のタンパク質鎖（単鎖Fv（scFv）と呼ばれ、例えば、Bird et al.（1988）Science242：423-426、及びHuston et al.（1988）Proc．Natl．Acad．Sci USA85：5879-5883を参照）を生成することができるように、組換え法により、合成するリンカーでそれらを接続することができる。このような単鎖抗体も、用語である抗体の「抗原結合断片」に含まれる。当業者に知られている通常の技術により、このような抗体断片が得られ、且つ完全な抗体と同じような方式により機能性によって断片が選別される。抗原結合部分は、組換えDNA技術により、完全な免疫グロブリンを酵素的又は化学的に切断することで生成することができる。抗体は、例えば、IgG（例えば、IgG1、IgG2、IgG3又はIgG4亜型）、IgA1、IgA2、IgD、IgE又はIgM抗体のような異なるアイソタイプの抗体であってもよい。
F（ab'）2は、酵素によりIgGヒンジ領域における2つのジスルフィド結合の下方部分を消化することで得られ、分子量が約100,000であり、抗原結合活性を有すると共に、ヒンジの位置で接続された2つのFab領域に含まれる抗体断片である。
Fab'は、前記F（ab'）2のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断することで得られ、分子量が約50,000であり、抗原結合活性を有する抗体断片である。本開示のFab'は、例えば、ジチオスレイトールなどの還元剤を利用して本開示の抗原を特異的に認識するF（ab'）2を処理することで製造することができる。
また、抗体のFab'断片をコードするDNAを原核生物発現ベクター又は真核生物発現ベクターに挿入して、ベクターを原核生物又は真核生物に導入してFab'を発現することで前記Fab'を製造することができる。
用語「単鎖抗体」、「単鎖Fv」又は「scFv」とは、リンカーにより接続された抗体重鎖可変ドメイン（又は領域、VH）と抗体軽鎖可変ドメイン（又は領域、VL）の分子を含む。このようなscFv分子は、NH2-VL-リンカー-VH-COOH又はNH2-VH-リンカー-VL-COOHという一般的な構造を有してもよい。好適な従来技術のリンカーは、反復のGGGGSアミノ酸配列又はその変異体からなり、例えば、1～4個の反復変異体（Holliger et al.（1993）, Proc. Natl. Acad. Sci. USA90: 6444-6448）が用いられる。本開示に利用されるその他のリンカーは、Alfthan et al.（1995）、Protein Eng．8：725-731，Choi et al.（2001）、Eur．J．Immuno l．31：94-106，Hu et al.（1996）、Cancer Res．56：3055-3061，Kipriyanov et al.（1999）、J．Mol．Biol．293：41-56及びRoovers et al.（2001）、Cancer Immunol．で記載されている。
二重抗体は、その中のscFv又はFabが二量体化された抗体断片であり、二価抗原結合活性を有する抗体断片である。二価抗原結合活性では、2つの抗原が相同又は相異であってもよい。
本開示の二重抗体は、本開示の抗体のVH及びVLのコードcDNAを取得し、scFvをコードするDNAを構築し、前記DNAを発現ベクターに挿入してから、前記発現ベクターを原核生物又は真核生物に導入して二重抗体を発現する工程により製造することができる。
dsFvは、その中の各VHとVLにおける1つのアミノ酸残基がシステイン残基で置換されたポリペプチドを、システイン残基間のジスルフィド結合で接続することにより得られる。既知の方法（Protein Engineering, 7, 697（1994））により、抗体の3次元構造予測に基づき、システイン残基で置換されるアミノ酸残基を選択することができる。
本開示の全長抗体又は抗原結合断片又は二重特異性抗体又は多重特異性抗体、ポリペプチド、ポリペプチド複合物、多重特異性ポリペプチド複合物は、本開示の抗体のコードcDNAを取得し、dsFvをコードするDNAを構築し、前記DNAを発現ベクターに挿入してから、前記発現ベクターを原核生物又は真核生物に導入してdsFvを発現する工程により製造することができる。
用語「アミノ酸差異」又は「アミノ酸変異」とは、元のタンパク質又はポリペプチドを基にして発生された1つ、2つ、3つ又はそれ以上のアミノ酸の挿入、欠失又は置換を含む、元のタンパク質又はポリペプチドと比べて、変異体タンパク質又はポリペプチドにアミノ酸の変異又は変異があることである。
用語「抗体フレームワーク」又は「FR領域」は、該可変ドメインの抗原結合環（CDR）のステントとして用いられる可変ドメインVL又はVHの一部である。本質的に、それは、CDRを有しない可変ドメインである。用語「相補性決定領域」、「CDR」又は「高変領域」は、抗体の可変ドメインにおいて抗原結合を促進する主な6つ高変領域の1つである。通常、それぞれの重鎖可変領域には3つのCDR（HCDR1、HCDR2、HCDR3）があり、それぞれの軽鎖可変領域には3つのCDR（LCDR1、LCDR2、LCDR3）がある。「Kabat」番号付け規則（Kabat et al.（1991），「Sequences of Proteins of Immunological Interest」，5th edition，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MDを参照）、「Chothia」番号付け規則（Al-Lazikani et al.，（1997）JMB 273：927-948を参照）及びImMunoGenTics（IMGT）番号付け規則（Lefranc M．P．，Immunologist，7，132-136（1999）；Lefranc、M．P．et al.，Dev．Comp．Immunol．，27，55-77（2003）などを含む種々の公知方法の何れか1つによって、CDRのアミノ酸配列境界を決定することができる。
用語「エピトープ」又は「抗原決定基」は、抗原における免疫グロブリン又は抗体に特異的に結合する部位（例えば、抗原分子における特定部位）である。エピトープは、通常、特別な空間的配座で、少なくとも3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14又は15個の連続的又は非連続的なアミノ酸を含む。例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular B iology，第66巻，G．E．Morris，Ed．（1996）を参照する。
用語「特異的結合」、「選択的結合」、「選択的に結合」又は「特異的に結合」は、予め決定された抗原におけるエピトープに対する抗体の結合である。通常、抗体は、約10-7 Mよりも小さく、例えば、約10-8 M、10-9 M、10-10 M、10-11 M、10-12 Mよりも小さく、又はそれ以上に小さい親和力（KD）で結合する。
用語「KD」は、特定の抗体ー抗原が互いに作用する解離平衡定数である。通常、本開示の抗体は、約10-7 Mよりも小さく、例えば、約10-8 M又は10-9 Mよりも小さい解離平衡定数（KD）で抗原に結合し、例えば、本開示において、抗体と抗原との親和力は、FACS法によりKD値が測定される。
用語「競合」は、同じエピトープの抗原結合タンパク質の競合（例えば、抗原結合タンパク質の中和又は抗体の中和）に用いられる場合に、抗原結合タンパク質間での競合を指し、下記の測定法により測定される。前記測定法において、検出待ちの抗原結合タンパク質（例えば、抗体又はその免疫学的機能断片）により、参照抗原結合タンパク質（例えば、リガンド又は参照抗体）と共通抗原との特異的結合を防止又は阻害（例えば、低減）する。様々な競合的結合測定は、1つの抗原結合タンパク質が別の抗原結合タンパク質と競合しているか否かを確定することに用いることができ、これらの測定は、例えば、固相直接又は間接放射免疫検出（RIA）、固相直接又は間接酵素免疫検出（EIA）、サンドイッチ競合測定（例えば、Stahli et al.，1983，Methodsin Enzymology 9：242-253を参照）、固相直接ビオチンーアビジンEIA（例えば、Kirkland et al.，1986，J．Immunol．137：3614-3619を参照）、固相直接標識測定、固相直接標識サンドイッチ測定（例えば、HarlowとLane，1988，Antibodies，A Laboratory Manual（抗体、実習マニュアル）、Cold Spring Harbor Pressを参照）、I-125マーカーを用いる固相直接標識RIA（例えば、Morel et al.，1988，Molec．Immunol．25：7-15を参照）、固相直接ビオチン-アビジンEIA（例えば、Cheung et al.，1990，Virology176：546-552を参照）、及び直接標識するRIA（Moldenhauer et al.，1990，Scand．J．Immunol．32：77-82）である。通常、前記測定法は、未標識の検出抗原結合タンパク質及び標識した参照抗原結合タンパク質の何れか1つを担持した固相表面又は細胞に結合する精製した抗原を使用する必要がある。測定される抗原結合タンパク質の存在下で固相表面又は細胞に結合する標識量を測定することによって、競合的阻害を測定する。通常、測定される抗原結合タンパク質は過剰に存在する。競合的測定（競合的抗原結合タンパク質）により同定される抗原結合タンパク質は、参照抗原結合タンパク質と同一のエピトープに結合する抗原結合タンパク質と、参照抗原結合タンパク質の結合エピトープに十分に近い隣接エピトープに結合する抗原結合タンパク質とを含み、前記2つのエピトープは空間的に互いに干渉し合いながら結合を行う。本明細書の実施例には、競合的結合を測定するための方法の他の詳細な資料が提供される。通常、競合的抗原結合タンパク質が過剰に存在する場合に、参照抗原結合タンパク質と共通抗原との特異的結合は、少なくとも40～45%、45～50%、50～55%、55～60%、60～65%、65～70%、70～75%又は75%以上阻害（例えば、低減）される。ある場合に、結合は、少なくとも80～85%、85～90%、90～95%、95～97%又は97%以上阻害される。本明細書に使用される用語「核酸分子」はDNA分子及びRNA分子である。核酸分子は、単鎖又は二重鎖であってもよく、好ましくは、二重鎖DNA又は単鎖mRNA又は修飾されたmRNAである。核酸を別の核酸配列と共に機能的関係に置く場合に、核酸は「効果的に接続」である。例えば、プロモーター又はエンハンサーがコード配列の転写に影響を与えると、プロモーター又はエンハンサーは、前記コード配列に効果的に接続されている。
用語「発現ベクター」は、それに接続された別の核酸を輸送可能な核酸分子である。一実施形態において、ベクターは「プラスミド」であり、他のDNAセグメントをその中に接続する環状二重鎖DNA環である。別の実施形態において、ベクターはウイルスベクターであり、その中に、他のDNAセグメントをウイルスゲノムに接続することができる。本明細書に開示されるベクターは、それらを導入した宿主細胞において自己複製することができ（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーマル哺乳動物ベクター）、又は、宿主細胞に導入された後、宿主細胞のゲノムに整合されることで、宿主ゲノムと共に複製することができる（例えば、非エピソーマル哺乳動物ベクター）。
従来の技術でよく知られている抗体及び抗原結合断片を製造・精製する方法は、冷泉港（The Cold Spring Harbor Laboratory）の抗体実験技術マニュアル，5-8章及び15章の通りである。例えば、マウスは抗原により免疫可能であり、得られた抗体は復元、精製されることができると共に、通常の方法によりアミノ酸シークエンシングを行うことができる。抗原結合断片は同じく、通常の方法により調製することができる。発明に記載の抗体又は抗原結合断片は、遺伝子工学的方法により、非ヒトのCDR領域に1つ又は複数のヒトFR領域が加えられる。ヒトFR生殖細胞系配列は、IMGTヒト抗体可変領域生殖細胞系遺伝子データベースとMOEソフトウエアをアラインメントすることにより、ImMunoGeneTics（IMGT）のホームページから取得し、又は免疫グロブリン雑誌である2001ISBN012441351から得ることができる。
用語「宿主細胞」は、その中に発現ベクターを導入した細胞である。宿主細胞は、細菌、微生物、植物又は動物の細胞を含むことができる。形質転換しやすい細菌は、大腸菌（Escherichia coli）やサルモネラ菌（Salmonella）の菌株などの腸内細菌科（enterobacteriaceae）のメンバー、枯草菌（Bacillus subtilis）などのバシラス科（Bacillaceae）、肺炎球菌（Pneumococcus）、連鎖球菌（Streptococcus）及びインフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）を含む。好適な微生物は、サッカロミセス酵母（Saccharomyces cerevisiae）及びピキア酵母（Pichia pastoris）を含む。適切な動物宿主細胞系は、CHO（中国ハムスター卵巣細胞系）、293細胞及びNS0細胞を含む。
本開示の工学的な抗体又は抗原結合断片は、通常の方法により、調製と精製することができる。例えば、重鎖及び軽鎖をコードcDNA配列は、クローニングして発現ベクターに組換えることができる。組換えた発現ベクターは、CHO細胞を安定的にトランスフェクションすることができる。更に好ましい従来技術の一つとして、哺乳動物発現系は、特にFc領域の高度に保存的なN末端部位において、抗体のグリコシル化を引き起こすことになる。抗原に特異的に結合する抗体を発現することにより、安定的なクローンが得られる。陽性クローンは、バイオリアクターの無血清培地において培養を拡大することで、抗体を産生する。抗体を分泌した培養液は、通常の技術により精製することができる。例えば、A又はG Sepharose FFカラムで精製する。非特異的結合の成分を洗い流す。そして、pH勾配法により結合する抗体を溶出し、SDS-PAGEで抗体断片を検出し、収集する。抗体は、通常の方法によりろ過し濃縮することができる。可溶性の混合物及び多量体は、分子ふるい、イオン交換などの通常の方法により除去されてもよい。得られた生成物は、直ちに-70℃などで冷凍し、又は冷凍乾燥する。
「投与」、「与える」及び「処理」は動物、ヒト、実験被験者、細胞、組織、器官や生物流体に適用される場合に、外因性薬剤、治療剤、診断薬又は組成物の、動物、ヒト、被験者、細胞、組織、器官や生物流体との接触を意味する。「投与」、「与える」及び「処理」は例えば、治療、薬物動態、診断、研究と実験方法を意味してもよい。細胞の処理は、試薬の細胞との接触、及び試薬の流体との接触を含み、そのうち、前記流体は細胞と接触する。「投与」、「与える」及び「処理」は、また、試薬、診断、結合組成物により、又は別種の細胞を通じて、体外及びインビトロで例えば細胞を処理することを意味する。「処理」はヒト、獣医学又は研究被験者に適用される場合に、治療的処理、予防又は予防的措置、研究と診断的応用を意味する。
「治療」は、例えば、本開示の何れか1つの結合化合物の組成物を含む経口又は外用治療剤を被験者に与えることを意味し、前記被験者は1種又は複数種の疾患症状を有するが、既知の前記治療剤は、これらの症状に対して治療作用を有する。通常、治療を受ける被験者又はグループには、1種又は複数種の疾患症状を効果的に緩和する量で治療剤を与えることにより、これらの症状の解消を誘導し、又は臨床的に測定可能な任意の程度まで進行しないようにこれらの症状を抑制する。任意の具体的な疾患症状を効果的に緩和する治療剤の量（「治療有効量」とも呼ばれる）は、被験者の疾患状態、年齢と体重、及び薬剤の被験者で必要な治療効果を発生させる能力などの複数の要因によって、変化することができる。医者や他のプロのヘルスケアプロバイダによる該症状の重症度又は進行状況への評価によく用いられる何れの臨床的検出方法によっても、疾患症状が低減されたか否かを評価することができる。本開示の実施形態（例えば、治療方法又は製品）は、それぞれの目標疾患症状の緩和において無効な可能性があるが、該分野で知られている任意の統計学的検定方法、例えばStudent t検定、カイ二乗検定、Mann及びWhitneyによるU検定、Kruskal-Wallis検定（H検定）、Jonckheere-Terpstra検定とWilcoxon検定により、統計学的に有意な数の被験者において目標疾患症状を低減可能なことが確認される。
「保存的修飾」又は「保存的置換又は置換」は、類似の特徴（例えば、電荷、側鎖の大きさ、疎水性/親水性、主鎖の立体配座や剛性など）を有する他のアミノ酸でタンパク質中のアミノ酸を置換することで、タンパク質の生物学的活性を変えずに頻繁に変化可能にすることを意味する。当業者は、一般的に、ポリペプチドの非必須領域中の単一のアミノ酸置換が実質的に生物学的活性を変えないと分かる（例えば、Watson et al.（1987）Molecular Biology of the Gene、The Benjamin/Cummings Pub．Co．，p224，（4th edition）を参照）。また、構造又は機能が類似したアミノ酸の置換は、生物学的活性を破壊する可能性が低い。例示的な保存的置換は、下表「例示的なアミノ酸保存的置換」に記載される。例示的なアミノ酸保存的置換、即ち、
オリジナル残基 保存的置換
Ala（A） Gly；Ser
Arg（R） Lys；His
Asn（N） Gln；His；Asp
Asp（D） Glu；Asn
Cys（C） Ser；Ala；Val
Gln（Q） Asn；Glu
Glu（E） Asp；Gln
Gly（G） Ala
His（H） Asn；Gln；Lys; Arg
Ile（I） Leu；Val
Leu（L） Ile；Val
Lys（K） Arg；His
Met（M） Leu；Ile；Tyr
Phe（F） Tyr；Met；Leu
Pro（P） Ala
Ser（S） Thr
Thr（T） Ser
Trp（W） Tyr；Phe
Tyr（Y） Trp；Phe
Val（V） Ile；Leu。
「有効量」又は「有効投与量」は、何れか1種又は複数種の有益な又は必要な治療結果を得るために必要な薬剤、化合物又は医薬組成物の量である。予防使用として、有益又は必要な結果はリスクの解消や低減、重症度の低減又は病症の発作の遅延を含み、病症、その合併症と病症の進行中に現れる中間病理学的表現型の生化学・組織学的、及び/又は行動症状を含む。治療的応用として、有益又は必要な結果は、種々の本開示のターゲット抗原関連病症の罹患率の低減又は前記病症の1つ又は複数の症状の改善、病症の治療に必要な他の薬剤の投与量の低減、別の薬剤の治療効果の向上、及び/又は、受験者の本開示のターゲット抗原関連病症の進行の遅延などの臨床的結果を含む。
「外因性」は、場合によって生物、細胞やヒトの体外で発生された物質を意味する。
「内因性」は、場合によって生物、細胞やヒトの体内で発生された物質を意味する。
「相同性」、「同一性」は、2つのポリヌクレオチド配列間又は2つのポリペプチド間の配列の類似性である。2つの比較される配列における位置が同じ塩基又はアミノ酸モノマーサブユニットに占められる場合、例えば、2つのDNA分子のそれぞれの位置がアデニンに占められる場合、前記分子が該位置で相同である。2つの配列間の相同性百分率は、2つの配列の共有するマッチング又は相同位置数を比較される位置数で割って100をかける関数である。例えば、配列の最適アラインメントを行う際に、2つの配列中の10個の位置に6個がマッチングし、又は相同である場合は、2つの配列が60%相同であり、2つの配列中の100個の位置に95個がマッチングし、又は相同である場合は、2つの配列が95%相同である。通常、2つの配列をアライメントする際に、最大百分率の相同性が得られるように、比較が行われる。例えば、各参照配列の全長にわたって各配列間の最大マッチングが得られるようにアルゴリズムのパラメータを選択するBLASTアルゴリズムにより、比較を実行することができる。下記の参考文献は、配列分析によく用いられるBLASTアルゴリズムに関し、即ち、BLASTアルゴリズム（BLAST ALGORITHMS）： Altschul，S.F. et al.、（1990）J. Mol. Biol. 215：403-410；Gish，W. et al.、（1993）Nature Genet. 3：266-272；Madden，T.L. et al.、（1996）Meth. Enzymol. 266：131-141；Altschul，S.F. et al.、（1997）Nucleic Acids Res. 25：3389-3402；Zhang，J. et al.、（1997）Genome Res. 7：649-656である。その他、例えば、NCBI BLASTにより提供される通常のBLASTアルゴリズムも、当業者によく知られている。本開示において、例えば、「XX配列に対する自然順番号部位」は、XX配列における自然順番号に対応する部位を含む他に、XX配列の変異配列におけるXX配列同等位置の部位も含む。同等部位について、XX配列の変異配列とXX配列をアラインメントすることで、最大百分率の同一性を取得した場合、XX配列の変異配列におけるXX配列に対応する部位が同等部位である。
本明細書に用いられる表現である「細胞」、「細胞系」及び「細胞培養物」は互いに交換して用いられてもよく、これらの名称は何れも子孫を含む。従って、単語「形質転換体」及び「形質転換細胞」は、移転数を考慮せずに、初代被検細胞及びそれより誘導された培養物を含む。また、意図する又は意図しない変異のために、あらゆる子孫はDNA含有量で精確に同じであることがあり得ないと理解すべきである。最初の形質転換細胞から選別されたものと同様の機能又は生物学的活性を有する変異子孫が含まれる。異なる名称を指す場合は、文脈から明らかに分かる。
本明細書に用いられる「ポリメラーゼ連鎖反応」又は「PCR」は、その中の微量の特定部分の核酸、RNA及び/又はDNAが、例えばアメリカ特許US4683195に記載されるように増幅するプログラム又は技術である。一般的に、オリゴヌクレオチドプライマーの設計が可能になるように、目標領域末端からの配列情報又はそれ以外の配列情報を取得する必要があり、これらのプライマーは配列において、増幅すべきテンプレートの対応する鎖と同様又は類似である。2つのプライマーの5’末端ヌクレオチドは、増幅すべき材料の末端に一致してもよい。PCRは、特定のRNA配列、全ゲノムDNAからの特定DNA配列、及び全細胞RNAから転写されたcDNA、ファージ又はプラスミド配列などの増幅に用いることができる。一般的に、Mullis et al.（1987）Cold Spring Harbor Symp. Ouant. Biol. 51：263；Erlich編集、（1989）PCR TECHNOLOGY（Stockton Press，N.Y.）を参照する。本明細書に用いられるPCRは、核酸試験試料を増幅するための核酸ポリメラーゼ反応法の一実例とされるが、唯一の実例ではなく、前記方法は、核酸の特定部分を増幅又は産生するために、プライマーとなる既知の核酸及び核酸ポリメラーゼを用いることを含む。
用語「複合体」、「薬物複合体」は、リガンドが安定的な連結ユニットにより生物学的活性を有する薬物と連結してなる新型薬物である。例えば、「抗体薬物複合体」（antibody drug conjugate、ADC）は、抗体又は抗体断片を連結ユニットにより生物学的活性を有する薬物と連結させるものである。抗体が直接的に又はリンカーにより薬物に連結してもよい。各抗体の平均薬物モジュール数の範囲は、例えば、各抗体に約0～約20個の薬物モジュールである。幾つかの実施形態において、各抗体に1個～約10個の薬物モジュールである。特定の実施形態において、各抗体に1個～約8個の薬物モジュールである。本開示の複合体において、各抗体の平均薬物負荷が約2個～約5個又は約3個～約4個である。
「単離した」は、精製状態を指し、この場合、該分子に核酸、タンパク質、脂質、炭水化物などのその他の生物分子、又は、細胞破片や成長培地などのその他の材料を実質的に含まないことを意味する。通常、用語「単離した」は、本明細書に記載の化合物の実験や治療使用を顕著に干渉する量で存在しない限り、これらの材料が全然存在しない、又は水、緩衝液や塩が存在しないことを意味する意図はない。
「選択的」又は「選択的に」は、その後記載されるイベントや環境が発生されてもよいが、必ずしもその必要がないことを意味し、この説明は、該イベントや環境が発生され、又は発生されない場合を含む。
「医薬組成物」は、本明細書に記載される1種又は複数種の化合物又はその生理学的/薬学的に使用可能な塩又はプロドラッグと、生理学的/薬学的に使用可能な担体や賦形剤などの他の化学成分とを含む混合物を示す。医薬組成物は、生体への投与を促進し、活性成分の吸収に寄与して更に生物学的活性を発揮するためのものである。
用語「薬学的に許容される担体」は、抗体又は抗原結合断片を送達するために製剤に適用される任意の不活性物質である。担体は、粘着防止剤、結合剤、コーティング、崩壊剤、充填剤や希釈剤、防腐剤（例えば、酸化防止剤、抗菌剤や抗真菌剤）、甘味剤、吸収遅延剤、湿潤剤、乳化剤、緩衝剤などであってもよい。好適な薬学的に許容される担体の例は、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）デキストロース、植物油（例えば、オリーブオイル）、塩水、緩衝液、緩衝塩水、及び糖、ポリオール、ソルビトールや塩化ナトリウムなどの等張剤を含む。
また、本開示は、例えば、目標抗原陽性細胞に関わる疾患を治療するための薬剤などの、疾患又は障害を治療するための薬物製剤を含み、前記製剤が本開示のポリペプチド複合物、多重特異性ポリペプチド複合物、ドメイン改造抗体、ドメイン改造抗体のFab断片、二重特異性抗体、医薬組成物、又は核酸分子、又は多重特異性抗体を活性成分としてを含む。
本開示において、疾患には制限がないが、例えば、本開示の分子により誘導される治療反応は、ヒト抗原と結合することで、抗原とその受容体/リガンドとの結合を阻害し、又は抗原を過剰発現した腫瘍細胞を殺す。
また、本開示は、目標抗原の免疫検出又は測定に使用される方法、目標抗原の免疫検出又は測定に使用される試薬、目標抗原を発現した細胞の免疫検出又は測定に使用される方法、及び目標抗原陽性細胞に関連する疾患の診断に使用される診断剤に関し、これらは、本開示のポリペプチド複合物、多重特異性ポリペプチド複合物、ドメイン改造抗体、ドメイン改造抗体のFab断片、二重特異性抗体、医薬組成物、又は核酸分子、又は多重特異性抗体を活性成分として含む。
本開示において、目標抗原の量の検出又は測定に使用される方法は任意の既知方法であってもよい。例えば、免疫検出又は測定方法が含まれる。
免疫検出又は測定方法は、標識された抗原又は抗体を用いて抗体量又は抗原量を検出又は測定する方法である。免疫検出又は測定方法の実例としては、放射性物質で標識する免疫抗体方法（RIA）、酵素免疫測定法（EIA又はELISA）、蛍光免疫測定法（FIA）、発光免疫測定法、ウエスタンブロット法、物理化学的方法などが含まれる。
前記抗原陽性細胞に関連する疾患は、本開示の抗体により抗原を発現した細胞を検出又は測定することで診断することができる。
ポリペプチドを発現した細胞を検出するために、既知の免疫検出方法、好ましくは、免疫沈降法、蛍光細胞染色法、免疫組織染色法などを利用することができる。更に、FMAT8100HTSシステム（Applied Biosystem）による蛍光抗体染色法などを利用することができる。
本開示において、目標抗原を検出又は測定するための生体試料には特に制限がないが、目標抗原を発現した細胞を含む可能性があるものであればよく、例えば、組織球、血液、血漿、血清、膵液、尿液、糞便、組織液又は培養液である。
必要な診断方法に応じて、本開示の抗体又はその抗原結合断片を含む診断剤は、抗原-抗体反応を実行するための試薬、又は反応を検出するための試薬を含んでもよい。抗原ー抗体反応を実行するための試薬は、緩衝剤、塩などを含む。検出するための試薬は、前記モノクローナル抗体、その抗原結合断片又はその結合物の標識を認識する第2抗体と前記標識に対応する基質などの、一般的に免疫検出又は測定方法に使用される試薬を含む。
上記の明細書には、本開示の1つ又は複数種の実施形態の詳細が提出されている。本開示は、本明細書の記載と類似又は同様の任意の方法と材料により実施又は試験することができるが、以下、好ましい方法と材料を説明する。明細書と特許請求の範囲により、本開示の他の特徴、目的及び利点は明らかになる。明細書と特許請求の範囲において、文脈で特に明記しない限り、単数形は複数の指示対象を含む。特に定義しない限り、本明細書に用いられる技術・科学用語の全ては、本開示の属する分野の当業者により理解されている一般的な意味をもっている。明細書に引用される特許と出版物の全ては、引用により組み込まれている。下記の実施例は、本開示の好ましい実施形態を更に全面的に説明するために提出される。これらの実施例は決して本開示の範囲を限定するものと理解してはならない。
以下、実施例と合わせて本発明を更に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。本発明の実施例において、具体的な条件が明記されていない実験方法は一般的に、冷泉港（The Cold Spring Harbor Laboratory）の抗体技術実験マニュアル、分子クローンマニュアルのような通常の条件に従い、又は原料又は商品メーカーにより勧められた条件に従う。特定の供給元が明記されていない試薬は、市販されている一般的な試薬である。
実施例に使用される抗体が特定の抗原をターゲティングするが、当業者は本開示の示唆を基に下記のことと理解できる。即ち、技術効果は、特定のCDR配列によって実現されるものではなく、特定の抗原配列によって実現されるものでもなく、CH1/CLがTitin T鎖/Obscurin-O鎖、又はTitin T鎖/Obscurin-Like-O鎖で取り替えられることで、重鎖/軽鎖の間のミスマッチが改善されるために実現されるものである。
実施例1、抗体又はポリペプチドタンパク質の調製方法
プライマーPCRを設計し、遺伝子断片（例えば、抗体VH/VK遺伝子断片）を組立て、更に発現ベクター（例えば、pHr（シグナルペプチド及び定常領域付きの遺伝子（例えば、CH1-Fc/CL）断片））と相同組換えを行い、発現ベクター（例えば、VH-CH1-Fc-pHr/VK-CL-pHr）を構築してから、構築された発現ベクターを原核生物又は真核生物に導入して発現し、最後に生成物を精製して、所望の抗体又はポリペプチドタンパク質を得た。非限定的に、抗体定常領域がヒトκ、λ鎖軽鎖定常領域から選ばれ、及びIgG1、IgG2、IgG3又はIgG4の重鎖定常領域から選ばれてもよい。非制限的な実施例は、例えば、重鎖定常領域のL234A/L235A又はL234F/L235Eなどの部位に変異を起こさせることなど、ヒト抗体定常領域に対して最適化設計を行うことを更に含む。例示的に、抗体軽/重鎖定常領域配列は下記の通りである。
>IgG1重鎖定常領域（略称hIgG1）
備考：配列において、一重線部分がCH1であり、点線部分がCH2であり、イタリック体部分がCH3である。
>knob-IgG1重鎖定常領域（略称knob-IgG1）：
備考：配列において、一重線部分がCH1であり、点線部分がCH2であり、イタリック体部分がCH3である。
>hole-IgG1重鎖定常領域（略称hole-IgG1）：
備考：配列において、一重線部分がCH1であり、点線部分がCH2であり、イタリック体部分がCH3である。
>kappa軽鎖定常領域（略称kappa又はhκ）
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（配列番号4）。
>lambda軽鎖定常領域（略称lambda又はhλ）
GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS（配列番号5）。
本開示の実施例又は試験例に係るB7H3、CD3などの複数種抗原に対する抗体の軽鎖及び重鎖可変領域のアミノ酸配列は下記の通りである。
>F0抗体VHアミノ酸配列：
QVQLVQSGGGVVQPGTSLRLSCAASGFIFSSSAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYVDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSARLYASFDYWGQGALVTVSS（配列番号6）；
>F0抗体VLアミノ酸配列
DTVVTQEPSFSVSPGGTVTLTCGLSSGSVSTSHYPSWYQQTPGQAPRMLIYNTNTRSSGVPDRFSGSILGNKAALTITGAQADDESDYYCAIHVDRDIWVFGGGTKLTVL（配列番号7）；
>N0抗体VHアミノ酸配列
DVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAGSGFTSSLSWMSWLRQAPGKGLEWVANINQDGSEKNYVDSVKGRFTISRDNAQNSLYLQMSSLRAEDTAVYYCARGLWTFDSWGQGTLLTVSP（配列番号8）；
>N0抗体VLアミノ酸配列
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQNINNRFLAWYQQRPGQAPRLLIYAASSRATGVPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEAEDFAMYHCQQYGSFPRTFGQGTMVDIK（配列番号9）；
>S0抗体VHアミノ酸配列
EVQLQESGPGLVKPGGSLSLSCAASGFVFSSYDMSWVRQTPERGLEWVAYISSGGGITYAPSTVKGRFTVSRDNAKNTLYLQMNSLTSEDTAVYYCAAHYFGSSGPFAYWGQGTLVTVSS（配列番号10）；
>S0抗体VLアミノ酸配列
DIQMTQSPASLSASVGDRVTITCRASENIFSYLAWYQQKPGKSPKLLVYNTRTLAEGVPSRFSGSGSGTDFSLTISSLQPEDFATYYCQHHYGTPFTFGSGTKLEIK（配列番号11）；
>V0抗体VHアミノ酸配列
QVQLQQSAAELARPGASVKMSCKASGYSFTSYTIHWVKQRPGQGLEWIGYINPNSRNTDYNQKFKDETTLTADRSSSTAYMQLISLTSEDSAVYYCARYSGSTPYWYFDVWGAGTTVTVSS（配列番号12）；
>V0抗体VLアミノ酸配列
QIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSVSVSGTSHSLTISRVEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELK（配列番号13）；
>J0抗体VHアミノ酸配列
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYWMHWVRQAPGKGLEWVGHIKSKTDAGTTDYAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCAREIYYYAFDSWGQGTLVTVSS（配列番号14）；
>J0抗体VLアミノ酸配列
SYELTQPLSVSVALGQTARITCSGDNIGSKYVHWYQQKPGQAPVLVIYGDNERPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRAQAGDEADYYCQAADWVDFYVFGGGTKLTVL（配列番号15）；
>H0抗体VHアミノ酸配列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYYMAWVRQAPGKGLEWVTSISYEGDITYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCASQTLRESFDYWGQGTLVTVSS（配列番号16）；
>H0抗体VLアミノ酸配列
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDIANYLSWYQQKPGKSPKLLIYGTSNLEVGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQDKEFPRTFGGGTKVEIK（配列番号17）；
>R0抗体VHアミノ酸配列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGLSLTSNSVNWIRQAPGKGLEWVGLIWSNGDTDYNSAIKSRFTISRDTSKSTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAREYYGYFDYWGQGTLVTVSS（配列番号18）；
>R0抗体VLアミノ酸配列
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCLASEGISSYLAWYQQKPGKAPKLLIYGANSLQTGVPSRFSGSGSATDYTLTISSLQPEDFATYYCQQSYKFPNTFGQGTKVEVK（配列番号19）；
>Bmab（略称B0）抗体VHアミノ酸配列
QVQLQQSGAEVKKPGSSVRVSCKASGGTFNNNAINWVRQAPGQGLEWMGGIIPMFGTAKYSQNFQGRVAITADESTGTASMELSSLRSEDTAVYYCARSRDLLLFPHHALSPWGRGTMVTVSS（配列番号20）；
>Bmab（略称B0）抗体VLアミノ酸配列
SSELTQDPAVSVALGQTVRVTCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCSSRDSSGNHWVFGGGTELTVL（配列番号21）；
>Umab（略称U0）抗体VHアミノ酸配列
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTTYWLGWVRQMPGKGLDWIGIMSPVDSDIRYSPSFQGQVTMSVDKSITTAYLQWNSLKASDTAMYYCARRRPGQGYFDFWGQGTLVTVSS（配列番号22）；
>Umab（略称U0）抗体VLアミノ酸配列
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPEKAPKSLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNIYPYTFGQGTKLEIK（配列番号23）；
>Dmab（略称D0）抗体VHアミノ酸配列
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSGITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPGTTVIMSWFDPWGQGTLVTVSS（配列番号24）；
>Dmab（略称D0）抗体VLアミノ酸配列
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVRGRYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVFYCQQYGSSPRTFGQGTKVEIK（配列番号25）；
>Tmab（略称I0）抗体VHアミノ酸配列
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLIGYDLNWIRQPPGKGLEWIGIIWGDGTTDYNSAVKSRVTISKDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGGYWYATSYYFDYWGQGTLVTVSS（配列番号26）；
>Tmab（略称I0）抗体VLアミノ酸配列
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNNLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRFHSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQEHTLPYTFGQGTKLEIK（配列番号27）；
>C0抗体VHアミノ酸配列
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYHMNWVRQAPGQRLEWMGDINPDIGGTSYNQNFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARWDFDSFANWGQGTLVTVSS（配列番号28）；
>C0抗体VLアミノ酸配列
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVSIIGTNLIHWYQQKPGQPPKLLIYHASNLETGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCLQSRKIPYTFGGGTKVEIK（配列番号29）；
>A0抗体VHアミノ酸配列
EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNEYISYWAYWGQGTLVTVSS（配列番号105）；
>A0抗体VLアミノ酸配列
QTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL（配列番号106）；
前記抗体F0、N0、S0、V0、J0、H0、R0、B0、U0、D0、I0、C0、A0抗体の重鎖定常領域配列がIgG1重鎖定常領域（配列番号1）であり、N0、S0、H0、R0、U0、I0、C0抗体軽鎖定常領域配列がkappa軽鎖定常領域（配列番号4）であり、F0、V0、J0、B0、D0、A0抗体軽鎖定常領域配列がlambda軽鎖定常領域（配列番号5）である。
また、hB7H3抗原タンパク質の配列は下記の通りである。
LEVQVPEDPVVALVGTDATLCCSFSPEPGFSLAQLNLIWQLTDTKQLVHSFAEGQDQGSAYANRTALFPDLLAQGNASLRLQRVRVADEGSFTCFVSIRDFGSAAVSLQVAAPYSKPSMTLEPNKDLRPGDTVTITCSSYQGYPEAEVFWQDGQGVPLTGNVTTSQMANEQGLFDVHSILRVVLGANGTYSCLVRNPVLQQDAHSSVTITPQRSPTGAVEVQVPEDPVVALVGTDATLRCSFSPEPGFSLAQLNLIWQLTDTKQLVHSFTEGRDQGSAYANRTALFPDLLAQGNASLRLQRVRVADEGSFTCFVSIRDFGSAAVSLQVAAPYSKPSMTLEPNKDLRPGDTVTITCSSYRGYPEAEVFWQDGQGVPLTGNVTTSQMANEQGLFDVHSVLRVVLGANGTYSCLVRNPVLQQDAHGSVTITGQPMT DYKDDDDKHHHHHH（配列番号111）；
hCD3抗原タンパク質がhCD3抗原のδサブユニットとεサブユニットからなるヘテロ二量体であり、hCD3抗原のδサブユニット配列が下記の通りである。
FKIPIEELEDRVFVNCNTSITWVEGTVGTLLSDITRLDLGKRILDPRGIYRCNGTDIYKDKESTVQVHYRMCQSCVELDPATVASAENAQCEKELQALEKENAQLEWELQALEKELAQDYKDDDDK（配列番号112）；
hCD3抗原のεサブユニット配列が下記の通りである。
DGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILTCPQYPGSEILWQHNDKNIGGDEDDKNIGSDEDHLSLKEFSELEQSGYYVCYPRGSKPEDANFYLYLRARVCENCMEMDAKNAQCKKKLQALKKKNAQLKWKLQALKKKLAQHHHHHH（配列番号113）。
実施例2、抗体CH1/CLドメインの取り替え
天然Titin/Obscurin複合物、Titin/Obscurin-Like O複合物とIL6Ra/IL6Rb複合物における天然の分子間相互作用を有するIg-Likeドメインをそれぞれ利用し、抗体のCH1/CLドメインを取り替えて、CH1/CLドメインが改造された抗体を得た。
IL6Ra/IL6Rb複合物において、抗体CH1又はCLを取り替えるためのIL6Raタンパク質におけるIg-LikeドメインがIL6Ra.0鎖であり、抗体CL又はCH1を取り替えるためのIL6Rbタンパク質におけるIg-LikeドメインがIL6Rb.0鎖である。Titin/Obscurin複合物において、抗体CH1又はCLを取り替えるためのTitinタンパク質におけるIg-Likeドメイン（Titin Ig-Like 152ドメイン）がT.0鎖であり、抗体CL又はCH1を取り替えるためのObscurinタンパク質におけるIg-Likeドメイン（Obscurin Ig-Like-1ドメイン）がO.0鎖である。Titin/Obscurin-Like O複合物において、抗体CH1又はCLを取り替えるためのObscurin-Likeタンパク質におけるIg-Likeドメイン（Obscurin-Like-Ig-Like-1ドメイン）がOL.0鎖であり、抗体CL又はCH1を取り替えるためのTitinタンパク質におけるIg-Likeドメイン（Titin Ig-Like 152ドメイン）がT.0鎖である。そのうち、
>IL6Ra.0鎖配列は下記の通りである。
GILQPDPPANITVTAVARNPRWLSVTWQDPHSWNSSFYRLRFELRYRAERSKTFTTWMVKDLQHHCVIHDAWSGLRHVVQLRAQEEFGQGEWSEWSPEAMGTPW（配列番号30）；
>IL6Rb.0鎖配列は下記の通りである。
FDPVYKVKPNPPHNLSVINSEELSSILKLTWTNPSIKSVIILKYNIQYRTKDASTWSQIPPEDTASTRSSFTVQDLKPFTEYVFRIRCMKEDGKGYWSDWSEEASGIT（配列番号31）；
>T.0鎖配列は下記の通りである。
GIPPKIEALPSDISIDEGKVLTVACAFTGEPTPEVTWSCGGRKIHSQEQGRFHIENTDDLTTLIIMDVQKQDGGLYTLSLGNEFGSDSATVNIHIRSI（配列番号32）；
>O.0鎖配列は下記の通りである。
SGAPRFLTRPKAFVVSVGKDATLSCQIVGNPTPQVSWEKDQQPVAAGARFRLAQDGDLYRLTILDLALGDSGQYVCRARNAIGEAFAAVGLQVDAEA（配列番号33）；
>OL.0鎖配列は下記の通りである。
QGSPPCFLRFPRPVRVVSGAEAELKCVVLGEPPPVVVWEKGGQQLAASERLSFPADGAEHGLLLTAALPTDAGVYVCRARNAAGEAYAAAAVTVLEPP（配列番号34）；
CH1/CLが取り替えられた複数種の抗体を構築し、試験例2及び4の方法により、検出待ちの抗体の純度及び対応する抗原との結合活性を検出した。実験結果が下表1に示される。実験結果によれば、F0、V0、S0、N0、J0、H0、R0及びC0など異なる抗原と結合する抗体において、CH1/CLがT.0鎖/O.0鎖又はT.0鎖/OL.0鎖で同時に取り替えられた後でも、抗体は良好な結合活性を保持し、且つ抗体純度が高い。
備考：例えば、F1は、F0抗体の重鎖CH1がIL6Rb.0鎖（配列番号31）で取り替えられ、軽鎖CLがIL6Ra.0鎖（配列番号30）で取り替えられ、その他の部分がF0と同じになるように保持して得られた抗体である。その他はこれと同様である。表の「-」が未検出を示し、SECがサイズ排除クロマトグラフィーにより検出された抗体の純度結果である（NAは発現量が低いため未検出であることを示す）。
実施例3、CH1/CLドメイン改造抗体の最適化設計
Titin Ig-Like 152ドメイン（T.0鎖）、Obscurin Ig-Like 1ドメイン（O.0鎖）、Obscurin-Like Ig-Like 1ドメイン（OL.0鎖）の個別のアミノ酸にアミノ酸の挿入、欠失又は取り替えを含む変異を起こさせ、ドメイン改造抗体の活性を検証する。
例示的に、まず、T.0鎖、O.0鎖及びOL.0鎖における少量のアミノ酸に変異を起こさせることで、鎖間ジスルフィド結合を付加し、次に、ドメインにおけるその他の個別のアミノ酸に変異を更に起こさせ、例えば、Obscurin Ig-Like 1ドメインの7、62、11番目のアミノ酸に変異を起こさせ、Titin Ig-Like 152ドメインのN末端にアミノ酸を付加又は削減し（例えば、5つの野生型Titinタンパク質のうちのTitin Ig-Like 152ドメインのN末端と隣接する5つのアミノ酸「KAGIR」を付加し）、Obscurin Ig-Like 1ドメインのN末端にアミノ酸を付加又は削減し（例えば、5つの野生型Obscurinタンパク質のうちのObscurin Ig-Like 1ドメインのN末端と隣接する5つのアミノ酸「DQPQF」を付加し）、また、Titin Ig-Like 152ドメイン、Obscurin Ig-Like 1ドメイン又はObscurin-Like Ig-Like 1ドメインのN末端又はC末端に連結配列を更に付加し（例えば、N末端に「G4S」、「（G4S）2」連結配列を付加し）、抗体VH又はVLのC末端が連結配列によりTitin Ig-Like 152ドメイン、Obscurin Ig-Like 1ドメイン又はObscurin-Like Ig-Like 1ドメインと連結される。具体的なドメインの最適化設計は表2を参照する。
備考：表のObscurin-O鎖におけるO.1変異方式「A88C」は、O.0（配列番号33）配列の88番目アミノ酸残基をAからCに変異させることを示す。O.11変異方式「C25S、C76S、A88C+Obscurin_DQPQF」は、O.0（配列番号33）配列のC25S、C76S、A88Cアミノ酸に変異を起こさせ、且つN末端に「DQPQF」5つのアミノ酸を付加することを示す。その他はこれと同様である。
一部のアミノ酸を変異させた後のTitin-T鎖、Obscurin-O鎖、Obscurin-Like-O鎖配列は下記の通りである。
>T.1（T.0がC25S、C39T、A8Cの変異を有する）
GIPPKIECLPSDISIDEGKVLTVASAFTGEPTPEVTWSTGGRKIHSQEQGRFHIENTDDLTTLIIMDVQKQDGGLYTLSLGNEFGSDSATVNIHIRSI（配列番号35）；
>T.2（T.0がC25S、C39T、V20Cの変異を有する）
GIPPKIEALPSDISIDEGKCLTVASAFTGEPTPEVTWSTGGRKIHSQEQGRFHIENTDDLTTLIIMDVQKQDGGLYTLSLGNEFGSDSATVNIHIRSI（配列番号36）；
>T.3（T.0がC25S、C39T、A26Cの変異を有する）
GIPPKIEALPSDISIDEGKVLTVASCFTGEPTPEVTWSTGGRKIHSQEQGRFHIENTDDLTTLIIMDVQKQDGGLYTLSLGNEFGSDSATVNIHIRSI（配列番号37）；
>T.4（T.0がC25S、C39T、T22Cの変異を有する）
GIPPKIEALPSDISIDEGKVLCVASAFTGEPTPEVTWSTGGRKIHSQEQGRFHIENTDDLTTLIIMDVQKQDGGLYTLSLGNEFGSDSATVNIHIRSI（配列番号38）；
>T.5（T.0がC25S、C39T、A8Cの変異を有し、N末端にKAGIRを付加する）
KAGIRGIPPKIECLPSDISIDEGKVLTVASAFTGEPTPEVTWSTGGRKIHSQEQGRFHIENTDDLTTLIIMDVQKQDGGLYTLSLGNEFGSDSATVNIHIRSI（配列番号39）；
>T.6（T.0がC25S、C39T、A8Cの変異を有し、N末端に（G4S）1コネクソンを付加する）
GGGGSGIPPKIECLPSDISIDEGKVLTVASAFTGEPTPEVTWSTGGRKIHSQEQGRFHIENTDDLTTLIIMDVQKQDGGLYTLSLGNEFGSDSATVNIHIRSI（配列番号40）；
>T.7（T.0がC25S、C39T、A8Cの変異を有し、N末端に（G4S）2コネクソンを付加する）
GGGGSGGGGSGIPPKIECLPSDISIDEGKVLTVASAFTGEPTPEVTWSTGGRKIHSQEQGRFHIENTDDLTTLIIMDVQKQDGGLYTLSLGNEFGSDSATVNIHIRSI（配列番号41）；
>O.1（O.0がA88C変異を有する）
SGAPRFLTRPKAFVVSVGKDATLSCQIVGNPTPQVSWEKDQQPVAAGARFRLAQDGDLYRLTILDLALGDSGQYVCRARNAIGEAFACVGLQVDAEA（配列番号42）；
>O.2（O.0がA3C変異を有する）
SGCPRFLTRPKAFVVSVGKDATLSCQIVGNPTPQVSWEKDQQPVAAGARFRLAQDGDLYRLTILDLALGDSGQYVCRARNAIGEAFAAVGLQVDAEA（配列番号43）；
>O.3（O.0がR9C変異を有する）
SGAPRFLTCPKAFVVSVGKDATLSCQIVGNPTPQVSWEKDQQPVAAGARFRLAQDGDLYRLTILDLALGDSGQYVCRARNAIGEAFAAVGLQVDAEA（配列番号44）；
>O.4（O.0がC25S、C76S、A88C変異を有する）
SGAPRFLTRPKAFVVSVGKDATLSSQIVGNPTPQVSWEKDQQPVAAGARFRLAQDGDLYRLTILDLALGDSGQYVSRARNAIGEAFACVGLQVDAEA（配列番号45）；
>O.5（O.0がC25S、C76S、A3C変異を有する）
SGCPRFLTRPKAFVVSVGKDATLSSQIVGNPTPQVSWEKDQQPVAAGARFRLAQDGDLYRLTILDLALGDSGQYVSRARNAIGEAFAAVGLQVDAEA（配列番号46）；
>O.6（O.0がC25S、C76S、R9C変異を有する）
SGAPRFLTCPKAFVVSVGKDATLSSQIVGNPTPQVSWEKDQQPVAAGARFRLAQDGDLYRLTILDLALGDSGQYVSRARNAIGEAFAAVGLQVDAEA（配列番号47）；
> O.7（O.0がC25S、C76S、A88C、L7K、T62K変異を有する）
SGAPRFKTRPKAFVVSVGKDATLSSQIVGNPTPQVSWEKDQQPVAAGARFRLAQDGDLYRLKILDLALGDSGQYVSRARNAIGEAFACVGLQVDAEA（配列番号48）；
>O.8（O.0がC25S、C76S、A88C、L7K、T62H変異を有する）
SGAPRFKTRPKAFVVSVGKDATLSSQIVGNPTPQVSWEKDQQPVAAGARFRLAQDGDLYRLHILDLALGDSGQYVSRARNAIGEAFACVGLQVDAEA（配列番号49）；
>O.9（O.0がC25S、C76S、A88C、K11L、T62K変異を有する）
SGAPRFLTRPLAFVVSVGKDATLSSQIVGNPTPQVSWEKDQQPVAAGARFRLAQDGDLYRLKILDLALGDSGQYVSRARNAIGEAFACVGLQVDAEA（配列番号50）；
>O.10（O.0がC25S、C76S、A88C、K11L、T62H変異を有する）
SGAPRFLTRPLAFVVSVGKDATLSSQIVGNPTPQVSWEKDQQPVAAGARFRLAQDGDLYRLHILDLALGDSGQYVSRARNAIGEAFACVGLQVDAEA（配列番号51）；
>O.11（O.0がC25S、C76S、A88C変異を有し、N末端にDQPQFを付加する）
DQPQFSGAPRFLTRPKAFVVSVGKDATLSSQIVGNPTPQVSWEKDQQPVAAGARFRLAQDGDLYRLTILDLALGDSGQYVSRARNAIGEAFACVGLQVDAEA（配列番号52）；
>O.12（O.0がC25S、C76S、A88C、L7K、T62K変異を有し、N末端にDQPQFを付加する）
DQPQFSGAPRFKTRPKAFVVSVGKDATLSSQIVGNPTPQVSWEKDQQPVAAGARFRLAQDGDLYRLKILDLALGDSGQYVSRARNAIGEAFACVGLQVDAEA（配列番号53）；
>O.13（O.0がC25S、C76S、A88C、L7K、T62H変異を有し、N末端にDQPQFを付加する）
DQPQFSGAPRFKTRPKAFVVSVGKDATLSSQIVGNPTPQVSWEKDQQPVAAGARFRLAQDGDLYRLHILDLALGDSGQYVSRARNAIGEAFACVGLQVDAEA（配列番号54）；
>O.14（O.0がC25S、C76S、A88C、L7R、T62K変異を有し、N末端にDQPQFを付加する）
DQPQFSGAPRFRTRPKAFVVSVGKDATLSSQIVGNPTPQVSWEKDQQPVAAGARFRLAQDGDLYRLKILDLALGDSGQYVSRARNAIGEAFACVGLQVDAEA（配列番号55）；
>O.15（O.0がC25S、C76S、A88C、L7R、T62H変異を有し、N末端にDQPQFを付加する）
DQPQFSGAPRFRTRPKAFVVSVGKDATLSSQIVGNPTPQVSWEKDQQPVAAGARFRLAQDGDLYRLHILDLALGDSGQYVSRARNAIGEAFACVGLQVDAEA（配列番号56）；
>O.16（O.0がC25S、C76S、A88C変異を有し、N末端に（G4S）1コネクソンを付加する）
GGGGSSGAPRFLTRPKAFVVSVGKDATLSSQIVGNPTPQVSWEKDQQPVAAGARFRLAQDGDLYRLTILDLALGDSGQYVSRARNAIGEAFACVGLQVDAEA（配列番号57）；
>O.17（O.0がC25S、C76S、A88C変異を有し、N末端に（G4S）2コネクソンを付加する）
GGGGSGGGGSSGAPRFLTRPKAFVVSVGKDATLSSQIVGNPTPQVSWEKDQQPVAAGARFRLAQDGDLYRLTILDLALGDSGQYVSRARNAIGEAFACVGLQVDAEA（配列番号58）；
>OL.1（OL.0がC6E、V74C変異を有する）
QGSPPEFLRFPRPVRVVSGAEAELKCVVLGEPPPVVVWEKGGQQLAASERLSFPADGAEHGLLLTAALPTDAGCYVCRARNAAGEAYAAAAVTVLEPP（配列番号59）；
>OL.2（OL.0がC6E、G84C変異を有する）
QGSPPEFLRFPRPVRVVSGAEAELKCVVLGEPPPVVVWEKGGQQLAASERLSFPADGAEHGLLLTAALPTDAGVYVCRARNAACEAYAAAAVTVLEPP（配列番号60）；
>OL.3（OL.0がC6E、A86C変異を有する）
QGSPPEFLRFPRPVRVVSGAEAELKCVVLGEPPPVVVWEKGGQQLAASERLSFPADGAEHGLLLTAALPTDAGVYVCRARNAAGECYAAAAVTVLEPP（配列番号61）；
>OL.4（OL.0がC6E、C26S、C77S、V74C変異を有する）
QGSPPEFLRFPRPVRVVSGAEAELKSVVLGEPPPVVVWEKGGQQLAASERLSFPADGAEHGLLLTAALPTDAGCYVSRARNAAGEAYAAAAVTVLEPP（配列番号62）；
>OL.5（OL.0がC6E、C26S、C77S、G84C変異を有する）
QGSPPEFLRFPRPVRVVSGAEAELKSVVLGEPPPVVVWEKGGQQLAASERLSFPADGAEHGLLLTAALPTDAGVYVSRARNAACEAYAAAAVTVLEPP（配列番号63）；
>OL.6（OL.0がC6E、C26S、C77S、A86C変異を有する）
QGSPPEFLRFPRPVRVVSGAEAELKSVVLGEPPPVVVWEKGGQQLAASERLSFPADGAEHGLLLTAALPTDAGVYVSRARNAAGECYAAAAVTVLEPP（配列番号64）。
前記変異又は構造改造のTitin-T鎖、Obscurin-O鎖、Obscurin-Like-O鎖を利用し、CH1/CLが取り替えられた複数種の抗体を構築し、本開示の試験例4の方法により最適化された各変異抗体と対応する抗原と結合する結合活性を検出した。実験結果は表3に示される。結果によれば、ジスルフィド結合が改造された抗体が良好な抗原結合活性を保持している。
備考：例えば、表の抗体「F5」は、F0抗体の重鎖CH1がT.1鎖（配列番号35）で取り替えられ、且つ軽鎖CLがO.1鎖（配列番号42）で取り替えられ、その他の部分がF0と同じになるように保持して得られた抗体である。その他はこれと同様である。
また、前記変異又は構造改造のTitin-T鎖、Obscurin-O鎖を利用し、CH1/CLが取り替えられた抗体を構築し、本開示の試験例2及び試験例4の方法によりその他のCH1/CLが取り替えられた抗体の機能活性を検出した。実験結果は表4に示される。実験結果によれば、CH1/CLが取り替えられた後でも、抗体は良好な抗原結合活性を有し、抗体純度SEC（%）が高い。
備考：例えば、表の抗体「F16」は、F0抗体の重鎖CH1がT.5鎖（配列番号39）で取り替えられ、軽鎖CLがO.4鎖（配列番号45）で取り替えられ、で取り替えられ、その他の部分がF0と同じになるように保持して得られた抗体である。その他はこれと同様である。
また、Titin Ig-Like 152ドメイン、Obscurin Ig-Like 1ドメインのその他のアミノ酸に変異を起こさせる。具体的なアミノ酸変異の設計は表5に示される。
備考：表において、例えば、T.8はT.1（配列番号35）配列にM66S、T77Sアミノ酸変異を起こさせて得られたTitin-T鎖を示し、O.24はO.9（配列番号50）に先ずA12S、F13Y、T22S、Q42L、A45T、A67Q、G69S、Q92E及びD94Gアミノ酸変異を起こさせ、次にN末端に「DQPQF」配列を付加し、最後にN末端に「GGGGS」連結配列を付加して得られたObscurin-O鎖を示す。その他はこれと同様である。
T.1鎖及びO.9鎖の変異体配列は下記の通りである。
>T.8（T.1がM66S、T77S変異を有する）
GIPPKIECLPSDISIDEGKVLTVASAFTGEPTPEVTWSTGGRKIHSQEQGRFHIENTDDLTTLIISDVQKQDGGLYSLSLGNEFGSDSATVNIHIRSI（配列番号65）；
>T.9（T.1がM66K、K70R、S79T、G81R変異を有する）
GIPPKIECLPSDISIDEGKVLTVASAFTGEPTPEVTWSTGGRKIHSQEQGRFHIENTDDLTTLIIKDVQRQDGGLYTLTLRNEFGSDSATVNIHIRSI（配列番号66）；
>T.10（T.1がP3W、S11I、I13L、T22M、N82M変異を有する）
GIWPKIECLPIDLSIDEGKVLMVASAFTGEPTPEVTWSTGGRKIHSQEQGRFHIENTDDLTTLIIMDVQKQDGGLYTLSLGMEFGSDSATVNIHIRSI（配列番号67）；
>T.11（T.1がS11I、M66K、S79T、G81R変異を有する）
GIPPKIECLPIDISIDEGKVLTVASAFTGEPTPEVTWSTGGRKIHSQEQGRFHIENTDDLTTLIIKDVQKQDGGLYTLTLRNEFGSDSATVNIHIRSI（配列番号68）；
>T.12（T.1がG40S、R42K、H45S、Q47E、Q49G、N56S、D58E、L75V、E83D、F84L変異を有する）
GIPPKIECLPSDISIDEGKVLTVASAFTGEPTPEVTWSTSGKKISSEEGGRFHIESTEDLTTLIIMDVQKQDGGVYTLSLGNDLGSDSATVNIHIRSI（配列番号69）；
>T.13（T.1がQ47E、Q49G、N56S、D58E、L75V変異を有する）
GIPPKIECLPSDISIDEGKVLTVASAFTGEPTPEVTWSTGGRKIHSEEGGRFHIESTEDLTTLIIMDVQKQDGGVYTLSLGNEFGSDSATVNIHIRSI（配列番号70）；
>T.14（T.1がN56S、D58E、L75V変異を有する）
GIPPKIECLPSDISIDEGKVLTVASAFTGEPTPEVTWSTGGRKIHSQEQGRFHIESTEDLTTLIIMDVQKQDGGVYTLSLGNEFGSDSATVNIHIRSI（配列番号71）；
>T.15（T.1がN56S、D58E、M66S、T77S変異を有する）
GIPPKIECLPSDISIDEGKVLTVASAFTGEPTPEVTWSTGGRKIHSQEQGRFHIESTEDLTTLIISDVQKQDGGLYSLSLGNEFGSDSATVNIHIRSI（配列番号72）；
>T.16（T.1がS11I、M66K、S79T、G81R変異+（G4S）1連結配列を有する）
GGGGSGIPPKIECLPIDISIDEGKVLTVASAFTGEPTPEVTWSTGGRKIHSQEQGRFHIENTDDLTTLIIKDVQKQDGGLYTLTLRNEFGSDSATVNIHIRSI（配列番号73）；
>T.17（T.1がN56S、D58E、M66S、T77S変異+KAGIRを有する）
KAGIRGIPPKIECLPSDISIDEGKVLTVASAFTGEPTPEVTWSTGGRKIHSQEQGRFHIESTEDLTTLIISDVQKQDGGLYSLSLGNEFGSDSATVNIHIRSI（配列番号74）；
>T.18（T.1がN56S、D58E、M66S、T77S変異+KAGIR+（G4S）1連結配列を有する）
GGGGSKAGIRGIPPKIECLPSDISIDEGKVLTVASAFTGEPTPEVTWSTGGRKIHSQEQGRFHIESTEDLTTLIISDVQKQDGGLYSLSLGNEFGSDSATVNIHIRSI（配列番号75）；
>T.19（T.1がN56S、D58E、M66S、T77S変異+（G4S）1連結配列を有する）
GGGGSGIPPKIECLPSDISIDEGKVLTVASAFTGEPTPEVTWSTGGRKIHSQEQGRFHIESTEDLTTLIISDVQKQDGGLYSLSLGNEFGSDSATVNIHIRSI（配列番号76）；
>O.18（O.9がL11K、A12S、F13Y、V14T、T22S変異を有する）
SGAPRFLTRPKSYTVSVGKDASLSSQIVGNPTPQVSWEKDQQPVAAGARFRLAQDGDLYRLKILDLALGDSGQYVSRARNAIGEAFACVGLQVDAEA（配列番号77）；
>O.19（O.9がG2E、V17E、N30D、T32P、Q34E、S36T、V44I、A45T、L58V、K62E、A67Q、G69S、A97G変異を有する）
SEAPRFLTRPLAFVVSEGKDATLSSQIVGDPPPEVTWEKDQQPITAGARFRLAQDGDVYRLEILDLQLSDSGQYVSRARNAIGEAFACVGLQVDAEG（配列番号78）；
>O.20（O.9がD20L、T22M、A53L変異を有する）
SGAPRFLTRPLAFVVSVGKLAMLSSQIVGNPTPQVSWEKDQQPVAAGARFRLLQDGDLYRLKILDLALGDSGQYVSRARNAIGEAFACVGLQVDAEA（配列番号79）；
>O.21（O.9がQ41K、A45T、A67Q、G69S、V89L変異を有する）
SGAPRFLTRPLAFVVSVGKDATLSSQIVGNPTPQVSWEKDKQPVTAGARFRLAQDGDLYRLKILDLQLSDSGQYVSRARNAIGEAFACLGLQVDAEA（配列番号80）；
>O.22（O.9がQ42L、A45T、A67T、G69S、Q92E、D94G変異を有する）
SGAPRFLTRPLAFVVSVGKDATLSSQIVGNPTPQVSWEKDQLPVTAGARFRLAQDGDLYRLKILDLTLSDSGQYVSRARNAIGEAFACVGLEVGAEA（配列番号81）；
>O.23（O.9がA12S、F13Y、T22S、Q42L、A45T、A67Q、G69S、Q92E、D94G変異を有する）
SGAPRFLTRPLSYVVSVGKDASLSSQIVGNPTPQVSWEKDQLPVTAGARFRLAQDGDLYRLKILDLQLSDSGQYVSRARNAIGEAFACVGLEVGAEA（配列番号82）；
>O.24（O.9がQ41K、A45T、A67Q、G69S、V89L変異+（G4S）1連結配列を有する）
GGGGSSGAPRFLTRPLAFVVSVGKDATLSSQIVGNPTPQVSWEKDKQPVTAGARFRLAQDGDLYRLKILDLQLSDSGQYVSRARNAIGEAFACLGLQVDAEA（配列番号83）；
>O.25（O.9がA12S、F13Y、T22S、Q42L、A45T、A67Q、G69S、Q92E、D94G変異+（G4S）1連結配列を有する）
GGGGSSGAPRFLTRPLSYVVSVGKDASLSSQIVGNPTPQVSWEKDQLPVTAGARFRLAQDGDLYRLKILDLQLSDSGQYVSRARNAIGEAFACVGLEVGAEA（配列番号84）；
>O.26（O.9がA12S、F13Y、T22S、Q42L、A45T、A67Q、G69S、Q92E、D94G変異+ DQPQFを有する）
DQPQFSGAPRFLTRPLSYVVSVGKDASLSSQIVGNPTPQVSWEKDQLPVTAGARFRLAQDGDLYRLKILDLQLSDSGQYVSRARNAIGEAFACVGLEVGAEA（配列番号85）；
>O.27（O.9がA12S、F13Y、T22S、Q42L、A45T、A67Q、G69S、Q92E、D94G変異+DQPQF+（G4S）1連結配列を有する）
GGGGSDQPQFSGAPRFLTRPLSYVVSVGKDASLSSQIVGNPTPQVSWEKDQLPVTAGARFRLAQDGDLYRLKILDLQLSDSGQYVSRARNAIGEAFACVGLEVGAEA（配列番号86）。
前記変異又は構造改造のTitin-T鎖、Obscurin-O鎖を利用して、CH1/CLが取り替えられた抗体を構築し、本開示の試験例4の方法によりCH1/CLが取り替えられた抗体を検出した。実験結果は表6に示される。結果によれば、CH1/CLが最適化されたTitin-T鎖、Obscurin-O鎖で取り替えられた後でも、抗体は良好な抗原結合活性を保持する。
備考：表において、例えば、抗体「B1」はB0抗体の重鎖CH1がT.1鎖（配列番号35）で取り替えられ、軽鎖CLがO.9鎖（配列番号50）で取り替えられ、その他の部分がB0と同じになるようにして得られた抗体を示す。その他はこれと同様である。
また、本開示の試験例1の方法によりCH1/CLが取り替えられた後の抗体のタンパク質発現量を検出した。実験結果は表7に示される。結果によれば、Titin Ig-Like 152ドメイン及びObscurin Ig-Like 1ドメインの幾つかのアミノ酸が変異した後、抗体の発現量は大幅に向上された。
実施例4、CH1/CLドメインが改造された後の抗体の半減期
抗体のCH1/CLがTitin-T鎖/Obscurin-O鎖又はTitin-T鎖/ Obscurin-Like-O鎖で取り替えられた後に、動物体内における抗体の安定性が影響を受けたかについて評価するために、取り替え前後の抗体の、ラット体内における半減期を検出した。例示的に、F0抗体のCH1/CLがT.1/O.9で取り替えられた抗体F20、及びC0抗体のCH1/CLがT.1/O.9で取り替えられた抗体C3の、ラット体内における半減期を検出した。具体的な方法は下記の通りである。
3mpk抗体を静脈内注射の方式によりラットに投与し、それぞれ投与後5 min、8 h、1 d、2 d、4 d、7 d、10 d、14 d、21 d、28 dに全血0.3 mLを採集し、抗凝固薬を加えず、採血した後、4℃で30 min置き、1000 g、15 min遠心分離し、上澄（血清）を取り、EP管に置き、-80℃で保存した。各時点における抗体薬物濃度の検出方法はサンドイッチELISAを採用した。即ち、対応する抗原をELISAプレートに被覆し、一晩で4回インキュベートした後に、洗浄液で洗浄した。次に、ブロック緩衝液を加え、室温で1～3時間インキュベートし、洗浄液で洗浄した。その後、100 μL標準品又は検出待ち血清サンプルを加え、37℃で3時間インキュベートし、洗浄液で洗浄した。二次抗体Anti-Human IgG FC （HRP）mouse preadsorbed（Abcam、品番ab98624、1：10000で希釈）を加え、37℃で1～1.5 hインキュベートし、wash緩衝液で洗浄した。次に、TMBを加え、暗所に置き室温で10分間インキュベートした。その後、停止溶液を加え、OD450値を読取った。
実験結果は表8に示される。結果によれば、抗体のCH1/CLがTitin-T鎖/Obscurin-O鎖に取り替えられた後、抗体がラット体内で元抗体の半減期を保っているため、CH1/CL取り替え後の抗体が元抗体と同様に体内で良好な安定性を有すると提示されている。
実施例5、二重特異性抗体の構築と検出
第1抗原に結合する抗体と第2抗原に結合する抗体を利用し、ブリッジPCRにより、二重特異性抗体を構築した。例示的に、複数種の二重特異性抗体を構築した。
一、二重特異性抗体の構築
まず、DI-1二重特異性抗体を構築した。DI-1二重特異性抗体は、D0抗体の1本の重鎖（Fc領域にknob修飾を行う）及び1本の軽鎖と、I0抗体のCH1/CLがTitin-T鎖/Obscurin-O鎖で取り替えられた改造抗体の1本の重鎖（Fc領域にhole修飾を行う）及び1本の軽鎖から構成されるIgG-Like二重特異性抗体である。その構造模式図は図5を参照する。その配列は下記に示される。
DI-1鎖1（DI-1-H1）のアミノ酸配列：
備考：配列において、ボールド体部分がD0のVHであり、一重線部分がCH1であり、点線部分がCH2であり、イタリック体部分がCH3である。
DI-1鎖2（DI-1-L1）のアミノ酸配列：
備考：配列において、ボールド体部分がD0のVLであり、一重線部分がD0軽鎖定常領域CLである。
DI-1鎖3（DI-1-H2）のアミノ酸配列：
備考：配列において、ボールド体部分がI0のVHであり、一重線部分がT.16であり、点線部分がCH2であり、イタリック体部分がCH3である。
DI-1鎖4（DI-1-L2）のアミノ酸配列：
備考：配列において、ボールド体部分がI0のVLであり、一重線部分がO.24である。
また、B0又はB0のCH1/CL構造改造抗体とU0又はU0のCH1/CL構造改造抗体により構築されたIgG-Like二重特異性抗体（例示的に、BU5構造模式図は図8を参照）を構築した。得られた二重特異性抗体の4本鎖配列は表9に示される。
備考：配列において、ボールド体部分が可変領域配列であり、一重線部分がCH1又はTitin-T鎖であり、点線部分がCH2であり、イタリック体部分がCH3であり、二重線部分がCL又はObscurin-O鎖である。
また、FA-1二重特異性抗体を更に構築した。FA-1二重特異性抗体は、A0抗体の1本の重鎖（Fc領域にknob修飾を行う）及び1本の軽鎖と、F0抗体の1本の重鎖（Fc領域にhole修飾を行い、CH1がT.16で取り替えられた）及び1本の軽鎖（CLがO.24で取り替えられた）から構成されるIgG-Like二重特異性抗体である。FA-1の4本鎖配列は表10に示される。
備考：配列において、ボールド体部分が可変領域配列であり、一重線部分がCH1又はTitin-T鎖であり、点線部分がCH2であり、イタリック体部分がCH3であり、二重線部分がCL又はObscurin-O鎖である。
二、二重特異性抗体の検出
本開示の試験例3の方法によりDI-1を検出し、DI-1の4本鎖を細胞にコトランスフェクションして発現してから、マススペクトル分析を行った。実験結果は表11及び図6A～図6Cを参照する。マススペクトル分析結果によれば、ホモ二量体及びミスマッチ分子が検出されておらず、DI-1が正確に組み立てられた。
また、本開示の試験例3及び試験例2の方法によりBU5発現を検出した。まず、BU5の4本鎖を細胞にコトランスフェクションして、二重特異性抗体を発現した。また、B0、U0を対照とする。その後、発現生成物に対して純度及びマススペクトル分析を行った。実験結果は表12及び図9A～図9Cを参照する。実験結果によれば、二重特異性抗体BU5が正確に発現され、BU5の4本鎖が目標分子となるように正確に組み立てられ、且つミスマッチが現れなかった。且つ二重特異性分子BU5は純度が高く、SEC%が88%に達した。
また、本開示の試験例2と試験例4の方法により、構築されたBU1-BU4二重特異性抗体の抗体純度及び抗原結合活性を検出した。実験結果は表13に示される。実験結果によれば、CH1/CLが取り替えられた後の二重特異性抗体は、良好な抗原結合活性を保持し、且つ抗体純度が高い。
試験例
試験例1、抗体の発現量試験方法
モノクローナル抗体又は二重特異性抗体の発現プラスミドを利用してHEK293E細胞にトランスフェクションし、6日間後に発現上澄を収集し、高速遠心分離により不純物を除去した。上澄をProtein Aカラム（GE Healthcare）により精製した。A280読取値が基線に低減されるまで、PBSによりカラムを洗浄し、更に100mM酢酸緩衝液（pH3.5）によりクロマトグラフィーカラムを洗浄し、1M Tris-HClによりpH8.0となるように中和した。抗体の発現量が最終的に精製して得られた抗体量/発現体積によって定量された。
試験例2、抗体の純度検出方法
SEC-HPLCにより抗体純度を監視した。機器取扱説明書に従って検出を行い、Waters e2695クロマトグラフィーを使用するが、クロマトグラフィーカラムがWaters Xbridge BEH 200A SECであり、流動相がPBS（希塩酸でpH値が6.8となるように調整）であり、100 μgタンパク質を注入し、イソクラティック溶離を行い、流速が0.5 mL/minである。抗体純度は、主ピークのピーク面積がピーク総面積に占める百分率（SEC（%））である。
試験例3、抗体マススペクトル検出方法
（一）サンプルの準備：
1. 脱グリコシル完全分子量の測定：発現された抗体30 μgを取り、冷凍乾燥してから、10 μLの8M Gua-HClを加え、70℃水浴で10 min変性させた。90 μLの蒸留水を加え、30 μLを取り、0.8 μLのPNG酵素F（ペプチドN-グリコシダーゼF）を加え、37℃水浴に置き、2 hインキュベートし、0.5 μgを取り、脱グリコシル完全分子量を測定した。
2. 脱グリコシル還元分子量の測定：発現された抗体30 μgを取り、冷凍乾燥してから、10 μLの8 M Gua-HClを加え、70℃水浴で10 min変性させた。90 μL蒸留水を加え、30 μLを取り、0.8 μLのPNG酵素F（ペプチドN-グリコシダーゼF）を加え、37℃水浴に置き、2 hrインキュベートした。更に2 μLの0.025M DTTを加え、70℃水浴で10 min還元させ、0.5 μgを取り、脱グリコシル還元分子量を測定した。
（二）クロマトグラフィー-マススペクトル条件：
クロマトグラフィー条件：
クロマトグラフィーカラム：Poroshell 300SB-C8 5um 2.1*75mm
流動相：A：0.1%HCOOH/H2O B： 0.1% HCOOH/CAN
カラム温度：75℃
勾配：
マススペクトル条件：
マススペクトル：Agilent 6530 Q-TOF LC-MS
イオン化モード ESI
採集モード：1 GHz（質量範囲 500～5000 m/z）
乾燥ガス温度：325℃
乾燥ガス流量：10 L/min
アトマイザー：40psi
シースガス温度：350℃
シースガス流速：12 L/min
スプレー電圧：500 V
キャピラリー電圧：3,500 V
解離電圧：200 V
Skimmer電圧：65 V
Rf電圧：7500 V
検出待ち抗体に対してマススペクトル分析を行った。実験結果によれば、CH1/CLがTitin-T/Obscurin-Oで取り替えられた後、抗体は正確な組立てを保持する。
試験例4、抗体結合活性検出方法
膜タンパク質をターゲットとする抗体と抗原との結合活性検出はFACSの方法を採用してもよい。例えば、C0、N0、F0、V0、S0、及びそのCH1/CL構造が改造された抗体は、FACSの方法により検出できる。96ウェルU型底板（corning、3795）にFACS緩衝液（98% PBS、2% FBS）で再懸濁させた細胞（2×106細胞/mL、90 μL）を加え、勾配希釈された抗体10 μLを加え、4℃で1 hインキュベートし、FACS緩衝液で2回洗浄した。その後、各ウェルにAlexa Fluor 488ヒツジ 抗-ヒトIgG（H+L）（invitrogen、Cat# 2015982、1：1000で希釈）を加え、4℃で1時間インキュベートし、2回洗浄した。次に、FACS緩衝液で細胞を再懸濁させ、最後にFACS CantoII（BD）で蛍光シグナル値を読取った。最後にFlowJo 7.6及びGraphpad Prism 5でデータを処理して分析した。
可溶性タンパク質をターゲットとする抗体に対して、ELISAの方法により抗体と可溶性タンパク質との結合活性を検出した。例えば、D0、I0、B0、U0、H0、R0、J0、及びそのCH1/CL構造が改造された抗体は、ELISAの方法により検出できる。方法は下記の通りである。pH7.4のPBS（源培生物、B320）緩衝液でタンパク質を1 μg/mLとなるように希釈し、100 μL/ウェルの体積で96ウェルマイクロプレート（Corning、9018）に入れ、4℃で一晩インキュベートした。液体を捨ててから、各ウェルにPBSで希釈された5%脱脂乳（BD、232100）300 μLを入れてブロックし、37℃で2時間インキュベートした。ブロック終了後、ブロック液を捨て、PBST緩衝液（PH7.4 PBS含有0.1% tween-20）でプレートを3回洗った。その後、各ウェルに勾配希釈された抗体溶液100 μLを入れ、37℃で1時間インキュベートした。インキュベート終了後、PBSTでプレートを3回洗った。各ウェルに100 μLマウス 抗-ヒトIgG（H+L）（Jackson ImmunoResearch、209-035-088、1：8000で希釈）を入れ、37℃で1時間インキュベートした。PBSTでプレートを3回洗った。その後、各ウェルに100 μLのTMB顕色基質（KPL、5120-0077）を入れ、室温で10～15 minインキュベートした。各ウェルに50 μLの1 M H2SO4を入れて反応を終了させ、マイクロプレートリーダーで450 nmにおける吸収値を読み取り、ソフトウエアで抗体と抗原との結合曲線をフィッティングして、EC50値を算出した。
本試験例において、抗体に対応する抗原は下記の通りである。D0及びそのCH1/CL構造が改造された抗体に結合する抗原はhRANKL（Sino biologicalより購入し、11682-HNCH）であり、I0及びそのCH1/CL構造が改造された抗体に結合する抗原はhNGF（Sino biologicalより購入し、11050-HNAC）であり、B0及びそのCH1/CL構造が改造された抗体に結合する抗原はhBAFF（Sino biologicalより購入し、10056-HNCH）であり、U0及びそのCH1/CL構造が改造された抗体に結合する抗原はhP40（Sino biologicalより購入し、10052-H08H）であり、H0、R0、及びそのCH1/CL構造が改造された抗体に結合する抗原はhIL-5（R&D systemsより購入し、205-IL-025/CF）であり、J0及びそのCH1/CL構造が改造された抗体に結合する抗原はhTSLP（Sino biologicalより購入し、16135-H08H）であり、C0、N0、及びそのCH1/CL構造が改造された抗体に結合する抗原はCEA（CEAを過剰発現させた細胞MKN45（南京科佰より購入し、CBP60488））であり、F0、V0、S0、及びそのCH1/CL構造が改造された抗体に結合する抗原はB7H3（B7H3を過剰発現させた組換え細胞系CT26-B7H3（CT26が中国科学院細胞バンクに由来し、B7H3配列がID：XP_005254757.1を参照）である。
試験例5、CH1/CL構造が改造された抗体のミスマッチ低減の実験方法
一、異なる抗体軽/重鎖交差ミスマッチ分子発現の検出方法
本実験は、異なる軽/重鎖抗体のペアリング発現を分析することで、CH1/CLがTitin-T鎖/Obscurin-O鎖又はTitin-T鎖/Obscurin-Like-O鎖で取り替えられた後に重/軽鎖ミスマッチの発生が効果的に低減できることを検証した。具体的に、細胞にトランスフェクションして抗体を発現した場合、D0及びI0の重/軽鎖をそれぞれ交換した（即ち、I/D-1（D0重鎖+I0軽鎖）。I/D-2（I0重鎖+D0軽鎖）で野生型CH1とCLが交差ミスマッチ分子を形成できるか検出した。同時に、D0及びI0のCH1/CLがTitin-T鎖/Obscurin-O鎖で取り替えられた後の構造改造抗体D3（D0の重鎖CH1がT.11で取り替えられ、軽鎖CLがO.21で取り替えられた）、I3（I0の重鎖CH1がT.11で取り替えられ、軽鎖CLがO.21で取り替えられた）の重軽鎖をそれぞれ交換して、I/D-3（D0重鎖+I3軽鎖）、I/D-4（D3重鎖+I0軽鎖）、I/D-5（I0重鎖+I3軽鎖）、I/D-6（I3重鎖+D0軽鎖）のミスマッチ分子を構築した。構築された抗体の構造模式図は図7を参照する。
試験例1の方法により抗体発現量を検出し、試験例3の方法により発現生成物に対してマススペクトル分析を行い、ミスマッチ分子が形成できるか検出した。実験結果は表14に示される。実験結果によれば、D0重鎖+I0軽鎖、又はI0重鎖+D0軽鎖は、共発現した場合に、完全なIgG分子（150kDa）を形成でき、発現量が高く、それぞれ74.4 mg/Lと73.8 mg/Lに達した。且つLC-MS結果によれば、得られたタンパク質がミスマッチした後のIgG分子であると証明された。これにより、CH1-CLを改造せず、又はCH1-CLを取り替えない場合、二重特異性抗体の異なる4本の重軽鎖が共発現して、大量な軽/重鎖ミスマッチ分子を形成する。Titin-T鎖/Obscurin-O鎖でCH1/CLを取り替えた後に、I/D-3（D0重鎖+I3軽鎖）、I/D-4（D3重鎖+I0軽鎖）、I/D-5（I0重鎖+I3軽鎖）、I/D-6（I3重鎖+D0軽鎖）の4形態の交差ミスマッチ発現は、どちらも目標分子の発生（150kDa）がなかった。D3重鎖+I0軽鎖の組合せは少量の2本重鎖のミスマッチ分子を形成した（分子量が100kDa）が、その他の3形態はミスマッチ分子の発生がなかった。これにより、改造された後の非相同ペアリングは、IgG構造形態のミスマッチ分子を形成できない。従って、Titin-T鎖/Obscurin-O鎖でCH1-CLを取り替えた後に、IgG-Like二重特異性抗体の軽/重鎖間の非相同交叉ペアリング分子の形成を効果的に回避、又は低減した。
二、二重特異性抗体軽/重鎖ミスマッチ発現の検出方法
CH1/CLがTitin-T鎖/Obscurin-O鎖で取り替えられた後にミスマッチの発生がないこと又はミスマッチが低減されることを検証するために、本試験例は3形態の軽/重鎖交叉ペアリング発現を設計した。即ち、異なる2本の重鎖と同じ1本のVL-CL軽鎖を二重特異性抗体の発現とし、又は異なる2本の重鎖と同じ1本のObscurin-O鎖でCLの軽鎖を取り替えて発現とし、又は異なる2本の重鎖と異なる2本の軽鎖の通常の発現を対照とする（具体的なペアリングは表15を参照）。
その後、発現生成物に対してマススペクトル分析を行い（方法は本開示の試験例3を参照）、抗体純度SECを検出した（方法は本開示の試験例2を参照）。実験結果は表15に示される。結果によれば、Obscurin-O鎖で取り替えた軽鎖及びCLを取り替えていない軽鎖を同時に加えた場合だけ、正確な分子を形成するが、CLを取り替えていない軽鎖を1本だけ加え、又はObscurin-O鎖でCLを取り替えた軽鎖を1本だけ加えた交叉ペアリングにおいて、正確な目標分子がなかった。これにより、Obscurin-O鎖でCLを取り替えられた軽鎖は、CH1がTitin-T鎖で取り替えられた重鎖とより容易にペアリングして結合し、分子を形成できるが、CH1がTitin-T鎖で取り替えられていない重鎖と交差ミスマッチを行わない。CLがObscurin-O鎖で取り替えられていない軽鎖は、CH1がTitin-T鎖で取り替えられていない重鎖とより容易にペアリングして結合するが、CH1がTitin-T鎖で取り替えられた重鎖と結合しない。
試験例6、二重特異性抗体と抗原の親和力検出
Biacore T200（GE）機器により検出待ち抗体と抗原タンパク質との親和力を測定した。ヒト捕捉防止試薬キット（GE、Cat# BR-1008-39）の取扱書における方法により、Protein Aバイオセンサチップ（Cat. # 29127556、Ge）により検出待ち抗体を親和的に捕捉した後、チップの表面で一連の濃度勾配の可溶性抗原を流し、Biacore T200機器によりリアルタイムで反応シグナルを検出することにより、結合と解離曲線を得た。各実験のサイクル解離が完了した後、グリシン-塩酸再生溶液（pH 1.5 Cat. # BR-1003-54、GE）でバイオセンサチップを洗浄して再生した。実験で得られたデータをBIAevaluation version 4.1、GEソフトウエアにより（1：1）Langmuirモデルでフィッティングし、親和力の数値を得た。実験結果は表16に示される。
実験結果によれば、本開示の構造が改造された二重特異性抗体は、2つの母体モノクローナル抗体とその抗原との親和力を完全に保留した。本実験において、抗原hRANKL（Sino biologicalより購入し、11682-HNCH）、hNGF（Sino biologicalより購入し、11050-HNAC）、hBAFF（Sino biologicalより購入し、10056-HNCH）、hP40（Sino biologicalより購入し、10052-H08H）、hB7H3（ラボで調製し、配列が配列番号111を参照）、hCD3抗原（ラボで調製し、hCD3のδサブユニット（配列が配列番号112を参照）とεサブユニット（配列が配列番号113を参照）からなるヘテロ二量体）である。
試験例7、CH1-CL構造が改造された後の二重特異性抗体と2つのターゲット抗原との同時結合実験
Biacore T200（GE）機器により検出待ち抗体と抗原タンパク質との親和力を測定し、本開示のCH1-CL構造が改造された二重特異性抗体と2つのターゲット抗原との同時結合を検証した。具体的な実験工程は下記の通りである。Protein Aバイオセンサチップ（Cat. # 29127556、GE）により抗体BU5を親和的に捕捉した後、チップの表面で二重特異性抗体の第1抗原分子hP40（Sino biologicalより購入し、10052-H08H）を飽和になるまで流し、更に所定濃度の第2抗原分子hBAFF（Sino biologicalより購入し、10056-HNCH）を注入し、Biacore T200機器によりリアルタイムで反応シグナルを検出し、結合と解離曲線を得た。各実験のサイクル解離が完了した後、グリシン-塩酸再生溶液（pH 1.5 Cat. # BR-1003-54、GE）でバイオセンサチップを洗浄して再生し、データフィッティングモデルはBIAevaluation version 4.1、GEソフトウエアにより（1：1）Langmuirモデルでフィッティングした。その後、更にProtein Aバイオセンサチップ（Cat. # 29127556、GE）により抗体BU5を親和的に捕捉した後、チップの表面で二重特異性抗体の第1抗原分子hP40（Sino biologicalより購入し、10052-H08H）を飽和になるまで流し、更に所定濃度の第2抗原分子hBAFF（Sino biologicalより購入し、10056-HNCH）を注入し、Biacore T200機器によりリアルタイムで反応シグナルを検出し、結合と解離曲線を得た。各実験のサイクル解離が完了した後、グリシン-塩酸再生溶液（pH 1.5 Cat. # BR-1003-54、GE）でバイオセンサチップを洗浄して再生し、データフィッティングモデルはBIAevaluation version 4.1、GEソフトウエアにより（1：1）Langmuirモデルでフィッティングした。
実験結果は表17に示される。実験結果によれば、二重特異性抗体BU5は抗原hP40と飽和になるまで結合した後、抗原hBAFFと引続き結合でき、且つhBaFFと更に結合する能力についてモノクローナル抗体B0と同様である。同様に、二重特異性抗体BU5は抗原hBAFFと飽和になるまで結合した後、抗原hP40と引続き結合でき、且つhP40と更に結合する能力についてU0と同様である。これにより、本開示のCH1/CLがTitin-T鎖/Obscurin-O鎖で取り替えられた二重特異性抗体は、ダブルターゲットの特徴を有し、2つのターゲット抗原と同時に結合できる。
試験例8、DI-1二重特異性抗体の破骨細胞の分化実験
Raw264.7細胞（中科院細胞バンク、SCSP-5036）を消化し、再懸濁させてカウントし、24ウェル細胞培養プレート（Corning、3524）に敷き、37℃セルインキュベーターで一晩培養した。翌日、抗体溶液を異なる濃度で希釈し、RANKL（Sino biological、11682-HNCH）と均一に混合させて、細胞培養プレートに入れ、RANKL最終濃度が50 ng/mLであり、37℃で引続き培養した。96 h後に24ウェルプレートにおける溶液を除去し、各ウェルに100 μL細胞解離液（Beyotime、P0013J）を加え、均一に吹き込み、解離液をEP管に移動して、12000 gで5 min遠心分離し、上澄を取り、酒石酸耐性酸性ホスファターゼ検出試薬キット（Beyotime、P0332）により取扱書の方法で検出し、マイクロプレートリーダーにより405 nmにおける吸収値を読取った。検出値をソフトウエアにより曲線にフィッティングし、IC50値を算出した。実験結果は図10に示される。実験結果によれば、CH1/CLが取り替えられた後の二重特異性抗体DI-1は良好な活性を保持し、破骨細胞の分化を効果的に抑制する。
試験例9、DI-1二重特異性抗体TF1細胞の増殖実験
NGFにより誘導されたTF-1細胞（ATCC、CRL-2003）増殖実験によって、抗体の細胞レベルにおける活性を評価した。実験方法は下記の通りである。TF1細胞を消化して収集し、再懸濁させてカウントし、96ウェルプレート（Corning、3903）に敷き、37℃インキュベーターで一晩培養した。翌日、抗体溶液を異なる濃度で希釈し、NGF（Sino biological、11050-HNAC）と均一に混合させて、細胞培養プレートに入れ、NGFの最終濃度が10 ng/mLであり、細胞をインキュベーターに置いて引続き培養した。72 h後に細胞培養プレートを取り出し、各ウェルに50 μL Cell-titer Glo（Promega、G755B）検出液を入れ、オービタルシェーカーに設置し、10 minインキュベートし、室温で10 min静置した。マイクロプレートリーダー（PerkinElmer、Victor3）により発光シグナルを検出した。検出されたシグナル値をソフトウエアによりグラフにフィッティングし、IC50値を算出した。実験結果は図11に示される。実験結果によれば、CH1/CLが取り替えられた後の二重特異性抗体DI-1は良好な活性を有する。
試験例10、二重特異性抗体CH1/CLが異なるドメインで取り替えられた軽重鎖ミスマッチの検出
下記のように、実験によりCH1/CLがTitin-T鎖/Obscurin-O鎖で取り替えられ、又はTCRα/TCRβで取り替えられる場合の二重特異性抗体軽重鎖ミスマッチの状況を分析した。具体的な実験は下記の通りである。
一、二重特異性抗体4本鎖が共発現した場合の軽重鎖ミスマッチ実験
TCRα/TCRβでH0又はJ1のCH1/CLを取り替え、4本鎖からなる二重特異性抗体HJ-1とHJ-2を構築した。Titin-T鎖/Obscurin-O鎖でH0又はJ1のCH1/CLを取り替え、4本鎖からなる二重特異性抗体HJ-3とHJ-4を構築した。二重特異性抗体の構造模式図は図12を参照する。二重特異性抗体の全長配列は表18を参照する。
備考：配列において、ボールド体部分は取り替えられた部分であり、点線部分は定常領域部分であり、一重線部分は可変領域である。
J1重鎖：
J1軽鎖：
HJ-1、HJ-2、HJ-3、HJ-4の4本鎖をコトランスフェクションして発現した後、発現生成物に対してマススペクトル分析を行い（方法は本開示の試験例3を参照）、軽重鎖ミスマッチ分子があるか検出した。実験結果は図13A～図13D及び表19に示される。
実験結果によれば、TCRβ/TCRαでCH1/CLを取り替えた二重特異性抗体は、その4本鎖がコトランスフェクションして発現した場合、その軽重鎖にミスマッチが発生した。Titin-T鎖/Obscurin-O鎖でCH1/CLを取り替えた二重特異性抗体は、軽重鎖のミスマッチが発生しなかった。これにより、本開示のTitin-T鎖/Obscurin-O鎖でCH1/CLを取り替えた二重特異性抗体は、軽重鎖ミスマッチを低減させる優れた能力を有する。
二、3本鎖で共発現した二重特異性抗体の実験
本試験において、3本鎖（1本のCH1がTCRβ又はTitin-T鎖で取り替えられた重鎖、1本のCH1が取り替えられていない重鎖、1本のCLが取り替えられていない野生型軽鎖（VL-CL）、具体的な配列は表18を参照）でコトランスフェクションして発現した後、発現生成物に対してマススペクトル分析を行い（方法は本開示の試験例3を参照）、抗体純度SECを検出し（方法は本開示の試験例2を参照）、野生型軽鎖（VL-CL）とCH1がTCRβ又はTitin-T鎖で取り替えられた重鎖と組合せてミスマッチ分子を形成するか検証した。実験結果は図14A、図14B、図15A、図15B及び表20に示される。
実験結果によれば、VL-CLはCH1がTCRβで取り替えられた重鎖と容易に結合することで、同じ2本の軽鎖を有するミスマッチ分子を発現した。ところが、VL-CL軽鎖はCH1がTitin-T鎖で取り替えられた重鎖と結合して同じ2本の軽鎖のミスマッチ分子を形成していない。これにより、重鎖CH1がTCRβで取り替えられた二重特異性抗体によりも、本開示のTitin-T鎖で重鎖CH1を取り替えた二重特異性抗体が軽重鎖ミスマッチを低減させる更に優れた能力を有することは、間接的に証明された。
本開示は、例えば、以下に関する。
［１］
第1抗原結合部分を含み、前記第1抗原結合部分が、
A）N末端からC末端までの第1重鎖可変ドメイン（VH1）を含み、前記VH1が第1ドメインに操作可能に連結され、前記第1ドメインがTitin-T鎖を含む第1ポリペプチドと、
N末端からC末端までの第1軽鎖可変ドメイン（VL1）を含み、前記VL1が第2ドメインに操作可能に連結され、前記第2ドメインがTitin-T鎖と互いに作用できるドメインを含む第2ポリペプチドと、を含み、
或いは
B）N末端からC末端までのVH1を含み、前記VH1が第1ドメインに操作可能に連結され、前記第1ドメインがTitin-T鎖と互いに作用できるドメインを含む第1ポリペプチドと、
N末端からC末端までのVL1を含み、前記VL1が第2ドメインに操作可能に連結され、前記第2ドメインがTitin-T鎖を含む第2ポリペプチドと、を含み、
或いは
C）N末端からC末端までのVH1を含み、前記VH1が第1ドメインに操作可能に連結され、前記第1ドメインがObscurin-O鎖又はObscurin-Like-O鎖を含む第1ポリペプチドと、
N末端からC末端までのVL1を含み、前記VL1が第2ドメインに操作可能に連結され、前記第2ドメインがObscurin-O鎖又はObscurin-Like-O鎖と互いに作用できるドメインを含む第2ポリペプチドと、を含み、
或いは
D）N末端からC末端までのVH1を含み、前記VH1が第1ドメインに操作可能に連結され、前記第1ドメインがObscurin-O鎖又はObscurin-Like-O鎖と互いに作用できるドメインを含む第1ポリペプチドと、
N末端からC末端までのVL1を含み、前記VL1が第2ドメインに操作可能に連結され、前記第2ドメインがObscurin-O鎖或Obscurin-Like-O鎖を含む第2ポリペプチドと、を含み、
前記第1抗原結合部分が第1抗原に特異的に結合し、前記第1ドメインが第2ドメインと二量体を形成できる、ポリペプチド複合物。
［２］
前記Obscurin-O鎖又はObscurin-Like-O鎖と互いに作用できるドメインがTitin-T鎖であり、
前記Titin-T鎖と互いに作用できるドメインがObscurin-O鎖又はObscurin-Like-O鎖である、前記［1］に記載のポリペプチド複合物。
［３］
前記第1抗原結合部分のVH1とVL1が第1抗原に特異的に結合する第1抗原結合部位を形成し、前記VH1のC末端が第1ドメインのN末端に操作可能に連結され、前記VL1のC末端が第2ドメインのN末端に操作可能に連結される、前記［1］又は［2］に記載のポリペプチド複合物。
［４］
前記第1ドメインが第2ドメインと天然鎖間結合及び/又は非天然鎖間結合により二量体を形成し、
好ましくは、前記第1ドメインが第2ドメインと天然鎖間結合により二量体を形成し、
更に好ましくは、前記Titin-T鎖における7～15、19～24、26、55、59及び60番目から選ばれる1つ又は複数の残基がObscurin-O鎖における3～6、9、41、73、75及び80～90番目から選ばれる1つ又は複数の残基と互いに結合し、或いは
前記Titin-T鎖における1、7～10、13～16、19～26、59～60及び96番目から選ばれる1つ又は複数の残基がObscurin-Like-O鎖における4～5、10、12～13、74、76、78及び82～91番目から選ばれる1つ又は複数の残基と互いに結合し、
前記Titin-T鎖における残基部位が配列番号32の配列に対する自然順番号部位であり、前記Obscurin-O鎖における残基部位が配列番号33の配列に対する自然順番号部位であり、前記Obscurin-Like-O鎖における残基部位が配列番号34の配列に対する自然順番号部位である、前記［1］～［3］の何れか1項に記載のポリペプチド複合物。
［５］
前記第1ドメインが第2ドメインと少なくとも1つの非天然鎖間結合により二量体を形成し、
好ましくは、前記非天然鎖間結合が第1ドメインの特定変異残基と第2ドメインの特定変異残基との間に形成され、
更に好ましくは、前記変異残基における少なくとも一対がシステイン残基であり、
最も好ましくは、前記非天然鎖間結合がジスルフィド結合であり、
更に好ましくは、前記二量体が1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10個の非天然鎖間結合を含む、前記［1］～［4］の何れか1項に記載のポリペプチド複合物。
［６］
前記第1ドメインの特定変異残基と第2ドメインの特定変異残基が下記変異から選ばれ、即ち、
（A）前記Titin-T鎖が8、20、22、25、26及び39番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖が3、9、25、76及び88番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、或いは、
（B）前記Titin-T鎖が8、20、22、25、26及び39番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、及び/又は前記Obscurin-Like-O鎖が6、26、74、77、84及び86番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、
好ましくは、前記Titin-T鎖がA8C、V20C、T22C、C25S、A26C及びC39Tから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖がA3C、R9C、C25S、C76S及びA88Cから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、或いは
前記Titin-T鎖がA8C、V20C、T22C、C25S、A26C及びC39Tから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、及び/又は前記Obscurin-Like-O鎖がC6E、C26S、C77S、V74C、G84C及びA86Cから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、
更に好ましくは、前記第1ドメインの変異残基と第2ドメインの変異残基が下記変異から選ばれ、即ち、
Titin-T鎖がC25S、C39T及びA8C変異を有し、且つObscurin-O鎖がA88C変異を有し、
Titin-T鎖がC25S、C39T及びV20C変異を有し、且つObscurin-O鎖がA3C変異を有し、
Titin-T鎖がC25S、C39T及びA26C変異を有し、且つObscurin-O鎖がR9C変異を有し、
Titin-T鎖がC25S、C39T及びA8C変異を有し、且つObscurin-O鎖がC25S、C76S及びA88C変異を有し、
Titin-T鎖がC25S、C39T及びV20C変異を有し、且つObscurin-O鎖がC25S、C76S及びA3C変異を有し、
Titin-T鎖がC25S、C39T及びA26C変異を有し、且つObscurin-O鎖がC25S、C76S及びR9C変異を有し、
Titin-T鎖がC25S、C39T及びA8C変異を有し、且つObscurin-Like-O鎖がC6E及びV74C変異を有し、
Titin-T鎖がC25S、C39T及びV20C変異を有し、且つObscurin-Like-O鎖がC6E及びG84C変異を有し、
Titin-T鎖がC25S、C39T及びT22C変異を有し、且つObscurin-Like-O鎖がC6E及びA86C変異を有し、
Titin-T鎖がC25S、C39T及びA8C変異を有し、且つObscurin-Like-O鎖がC6E、C26S、C77S及びV74C変異を有し、
Titin-T鎖がC25S、C39T及びV20C変異を有し、且つObscurin-Like-O鎖がC6E、C26S、C77S及びG84C変異を有し、或いは
Titin-T鎖がC25S、C39T及びT22C変異を有し、且つObscurin-Like-O鎖がC6E、C26S、C77S及びA86C変異を有し、
Titin-T鎖変異部位が配列番号32の配列に対する自然順番号部位であり、Obscurin-O鎖変異部位が配列番号33の配列に対する自然順番号部位であり、Obscurin-Like-O鎖変異部位が配列番号34の配列に対する自然順番号部位である、前記［5］に記載のポリペプチド複合物。
［７］
前記Obscurin-O鎖が7、11、62番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を更に有し、
好ましくは、前記Obscurin-O鎖がL7R又はL7K、T62K又はT62H、及びK11Lから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、
最も好ましくは、前記Titin-T鎖がC25S、C39T及びA8C変異を有し、且つObscurin-O鎖がC25S、C76S、A88C、L7K及びT62K変異を有し、
Titin-T鎖がC25S、C39T及びA8C変異を有し、且つObscurin-O鎖がC25S、C76S、A88C、L7K及びT62H変異を有し、
Titin-T鎖がC25S、C39T及びA8C変異を有し、且つObscurin-O鎖がC25S、C76S、A88C、K11L及びT62K変異を有し、或いは
Titin-T鎖がC25S、C39T及びA8C変異を有し、且つObscurin-O鎖がC25S、C76S、A88C、K11L及びT62Hを有し、
Titin-T鎖変異部位が配列番号32の配列に対する自然順番号部位であり、Obscurin-O鎖変異部位が配列番号33の配列に対する自然順番号部位である、前記［6］に記載のポリペプチド複合物。
［８］
前記第1ドメインと第2ドメインが下記から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、即ち、
Titin-T鎖が3、11、13、22、40、42、45、47、49、56、58、66、70、75、77、79、81、82、83及び84番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸変異を有し、及び/又はObscurin-O鎖が2、11、12、13、14、17、20、22、30、32、34、36、41、42、44、45、53、58、62、67、69、89、92、94及び97番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸変異を有し、
好ましくは、前記第1ドメインと第2ドメインが下記から選ばれる1つ又は複数の残基変異を有し、即ち、
Titin-T鎖がP3W、S11I、I13L、T22M、G40S、R42K、H45S、Q47E、Q49G、N56S、D58E、M66S又はM66K、K70R、L75V、T77S、S79T、G81R、N82M、E83D及びF84Lから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸変異を有し、及び/又はObscurin-O鎖がG2E、L11K、A12S、F13Y、V14T、V17E、D20L、T22M又はT22S、N30D、T32P、Q34E、S36T、Q41K、Q42L、V44I、A45T、A53L、L58V、K62E、A67Q又はA67T、G69S、V89L、Q92E、D94G及びA97Gから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸変異を有し、
更に好ましくは、前記Titin-T鎖がM66S及びT77Sアミノ酸変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖がL11K、A12S、F13Y、V14T及びT22Sアミノ酸変異を有し、
前記Titin-T鎖がM66K、K70R、S79T及びG81Rアミノ酸変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖がG2E、V17E、N30D、T32P、Q34E、S36T、V44I、A45T、L58V、K62E、A67Q、G69S及びA97Gアミノ酸変異を有し、
前記Titin-T鎖がP3W、S11I、I13L、T22M及びN82Mアミノ酸変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖がD20L、T22M及びA53Lアミノ酸変異を有し、
前記Titin-T鎖がS11I、M66K、S79T及びG81Rアミノ酸変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖がQ41K、A45T、A67Q、G69S及びV89Lアミノ酸変異を有し、
前記Titin-T鎖がG40S、R42K、H45S、Q47E、Q49G、N56S、D58E、L75V、E83D及びF84Lアミノ酸変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖がQ42L、A45T、A67T、G69S、Q92E及びD94Gアミノ酸変異を有し、
前記Titin-T鎖がQ47E、Q49G、N56S、D58E及びL75Vアミノ酸変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖がQ42L、A45T、A67T、G69S、Q92E及びD94Gアミノ酸変異を有し、
前記Titin-T鎖がN56S、D58E及びL75Vアミノ酸変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖がQ42L、A45T、A67T、G69S、Q92E及びD94Gアミノ酸変異を有し、或いは
前記Titin-T鎖がN56S、D58E、M66S及びT77Sアミノ酸変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖がA12S、F13Y、T22S、Q42L、A45T、A67Q、G69S、Q92E及びD94Gアミノ酸変異を有し、
前記Titin-T鎖変異部位が配列番号35の配列に対する自然順番号部位であり、Obscurin-O鎖変異部位が配列番号50の配列に対する自然順番号部位である、前記［1］～［7］の何れか1項に記載のポリペプチド複合物。
［９］
前記VH1が第1連結ドメインにより第1ドメインに操作可能に連結され、前記VL1が第2連結ドメインにより第2ドメインに操作可能に連結され、
好ましくは、前記第1連結ドメイン及び/又は前記第2連結ドメインが下記から選ばれ、即ち、Titin-T鎖のN末端断片、Obscurin-O鎖のN末端断片、Obscurin-Like-O鎖のN末端断片、及び（G x S） y コネクソン（但し、Xが1～5の整数から選ばれ、Yが1～6の整数から選ばれる）から選ばれ、
更に好ましくは、前記第1連結ドメイン及び/又は前記第2連結ドメインが下記ポリペプチド断片、即ち、「KAGIR」、「DQPQF」、（G 4 S） 1 及び（G 4 S） 2 から選ばれ、
最も好ましくは、前記第1ドメインがTitin-T鎖であり、前記第1連結ドメインがKAGIRポリペプチドであり、前記第2ドメインがObscurin-O鎖であり、前記第2連結ドメインがDQPQFポリペプチドであり、或いは
前記第2ドメインがTitin-T鎖であり、前記第2連結ドメインがKAGIRポリペプチドであり、前記第1ドメインがObscurin-O鎖であり、前記第1連結ドメインがDQPQFポリペプチドである、前記［1］～［8］の何れか1項に記載のポリペプチド複合物。
［１０］
（A）前記Titin-T鎖の配列が、配列番号32に示される通りであり、若しくは配列番号32の配列を基に3、8、11、13、20、22、25、26、39、40、42、45、47、49、56、58、66、70、75、77、79、81、82、83及び84から選ばれる1つ又は複数の部位のアミノ酸変異を更に有し、及び/又はN末端にKAGIRアミノ酸残基を付加する配列であり、
好ましくは、A8C、V20C、T22C、C25S、A26C、C39T、P3W、S11I、I13L、T22M、G40S、R42K、H45S、Q47E、Q49G、N56S、D58E、M66S又はM66K、K70R、L75V、T77S、S79T、G81R、N82M、E83D及びF84Lから選ばれる1つ又は複数の部位のアミノ酸変異を有し、及び/又はN末端にKAGIRアミノ酸残基を付加する配列であり、及び/又は
（B）前記Obscurin-O鎖の配列が、配列番号33に示される通りであり、若しくは配列番号33の配列を基に2、3、7、9、11、12、13、14、17、20、22、25、30、32、34、36、41、42、44、45、53、58、62、67、69、76、88、89、92、94及び97から選ばれる1つ又は複数の部位のアミノ酸変異を更に有し、及び/又はN末端にDQPQFアミノ酸残基を付加する配列であり、好ましくは、A3C、R9C、C25S、C76S、A88C、L7K、T62K又はT62H、G2E、L11K、A12S、F13Y、V14T、V17E、D20L、T22M又はT22S、N30D、T32P、Q34E、S36T、Q41K、Q42L、V44I、A45T、A53L、L58V、T62E、A67Q又はA67T、G69S、V89L、Q92E、D94G及びA97Gから選ばれる1つ又は複数の部位のアミノ酸変異を有し、及び/又はN末端にDQPQFアミノ酸残基を付加する配列であり、或いは
前記Obscurin-Like-O鎖の配列が、配列番号34に示される通りであり、若しくは配列番号34の配列を基に6、26、74、77、84及び86から選ばれる1つ又は複数の部位のアミノ酸変異を更に有する配列であり、好ましくは、C6E、C26S、C77S、V74C、G84C及びA86Cから選ばれる1つ又は複数の部位のアミノ酸変異を有する配列であり、
前記Titin-T鎖変異部位が配列番号32の配列の自然順番号部位であり、Obscurin-O鎖変異部位が配列番号33の配列の自然順番号部位であり、Obscurin-Like-O鎖変異部位が配列番号34の配列の自然順番号部位であり、
好ましくは、
A）前記Titin-T鎖が、配列番号32の配列を基に8、20、22、25、26及び39番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、好ましくは、A8C、V20C、T22C、C25S、A26C及びC39Tから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、前記Titin-T鎖変異部位が配列番号32の配列の自然順番号部位であり、
更に好ましくは、前記Titin-T鎖が、配列番号35の配列を基に3、11、13、22、40、42、45、47、49、56、58、66、70、75、77、79、81、82、83及び84番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸変異を有し、好ましくは、P3W、S11I、I13L、T22M、G40S、R42K、H45S、Q47E、Q49G、N56S、D58E、M66S、M66K、K70R、L75V、T77S、S79T、G81R、N82M、E83D及びF84Lから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸変異を有し、前記Titin-T鎖変異部位が配列番号35の配列の自然順番号部位であり、及び/又は
B）前記Obscurin-O鎖が、配列番号33の配列を基に3、9、25、76及び88番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、好ましくは、A3C、R9C、C25S、C76S及びA88Cから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、前記Obscurin-O鎖変異部位が配列番号33の配列の自然順番号部位であり、
更に好ましくは、前記Obscurin-O鎖が、配列番号45の配列を基に7、11、62番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を更に有し、好ましくは、L7K又はL7R、T62K又はT62H、及びK11Lから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、前記Obscurin-O鎖変異部位が配列番号45の配列の自然順番号部位であり、
最も好ましくは、前記Obscurin-O鎖が、配列番号50の配列を基に2、11、12、13、14、17、20、22、30、32、34、36、41、42、44、45、53、58、62、67、69、89、92、94及び97番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸変異を有し、好ましくは、G2E、L11K、A12S、F13Y、V14T、V17E、D20L、T22M又はT22S、N30D、T32P、Q34E、S36T、Q41K、Q42L、V44I、A45T、A53L、L58V、K62E、A67Q又はA67T、G69S、V89L、Q92E、D94G及びA97Gから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸変異を有し、前記Obscurin-O鎖変異部位が配列番号50の配列の自然順番号部位であり、
或いは
A）前記Titin-T鎖が、配列番号32の配列を基に8、20、22、25、26及び39番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、好ましくは、A8C、V20C、T22C、C25S、A26C及びC39Tから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、前記Titin-T鎖変異部位が配列番号32の配列の自然順番号部位であり、
更に好ましくは、前記Titin-T鎖が、配列番号35の配列を基に3、11、13、22、40、42、45、47、49、56、58、66、70、75、77、79、81、82、83及び84番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸変異を有し、好ましくは、P3W、S11I、I13L、T22M、G40S、R42K、H45S、Q47E、Q49G、N56S、D58E、M66S、M66K、K70R、L75V、T77S、S79T、G81R、N82M、E83D及びF84Lから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸変異を有し、前記Titin-T鎖変異部位が配列番号35の配列の自然順番号部位であり、及び/又は
B）前記Obscurin-Like-O鎖が、配列番号34の配列を基に6、26、74、77、84及び86番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、好ましくは、C6E、C26S、C77S、V74C、G84C及びA86Cから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、前記Obscurin-Like-O鎖変異部位が配列番号34の配列の自然順番号部位である、前記［1］～［9］の何れか1項に記載のポリペプチド複合物。
［１１］
前記Titin-T鎖が配列番号32、35～41、65～76の何れか1つに示される配列、又は配列番号32、35～41、65～76の何れか1つの配列と少なくとも80%の同一性を有する配列を含み、及び/又は前記Obscurin-O鎖が配列番号33、42～58、77～86の何れか1つに示される配列又は配列番号33、42～58、77～86の何れか1つの配列と少なくとも80%の同一性を有する配列を含み、或いは
前記Titin-T鎖が配列番号32、35～41、65～76の何れか1つに示される配列、又は配列番号32、35～41、65～76の何れか1つの配列と少なくとも80%の同一性を有する配列を含み、及び/又は前記Obscurin-Like-O鎖が配列番号34、59～64の何れか1つに示される配列、又は配列番号34、59～64の何れか1つの配列と少なくとも80%の同一性を有する配列を含み、
更に好ましくは、前記Titin-T鎖が配列番号68に示される配列を含み、且つ前記Obscurin-O鎖が配列番号80に示される配列を含み、
前記Titin-T鎖が配列番号73に示される配列を含み、且つ前記Obscurin-O鎖が配列番号83に示される配列を含み、
前記Titin-T鎖が配列番号76に示される配列を含み、且つ前記Obscurin-O鎖が配列番号84に示される配列を含み、
前記Titin-T鎖が配列番号76に示される配列を含み、且つ前記Obscurin-O鎖が配列番号86に示される配列を含み、或いは
前記Titin-T鎖が配列番号75に示される配列を含み、且つ前記Obscurin-O鎖が配列番号86に示される配列を含む、前記［1］～［10］の何れか1項に記載のポリペプチド複合物。
［１２］
前記第1抗原が外因性抗原、内因性抗原、自己抗原、新生抗原、ウイルス抗原及び腫瘍抗原から選ばれる、前記［1］～［11］の何れか1項に記載のポリペプチド複合物。
［１３］
前記［1］～［12］の何れか1項に記載のポリペプチド複合物であり、第1抗原に特異的に結合する第1ポリペプチド複合物と、
第2抗原結合部分を含み、第2抗原に特異的に結合する第2ポリペプチド複合物と、を含み、
前記第1ポリペプチド複合物と第2ポリペプチド複合物が異なる2つの抗原に結合し、又は同じ抗原における異なる2つのエピトープに結合し、
好ましくは、前記第2ポリペプチド複合物が第2重鎖可変ドメイン（VH2）と第2軽鎖可変ドメイン（VL2）とを含み、前記第1ポリペプチド複合物のVH1と第2ポリペプチド複合物のVL2との間、及び/又は第2ポリペプチド複合物のVH2と第1ポリペプチド複合物のVL1との間にミスマッチが起きにくく、更に好ましくは、二重特異性ポリペプチド複合物であり、最も好ましくは、前記第2抗原結合部分のVH2とVL2が第2抗原に特異的に結合する第2抗原結合部位を形成する、多重特異性ポリペプチド複合物。
［１４］
前記第2ポリペプチド複合物の第2抗原結合部分が、
N末端からC末端までのVH2を含み、第3ドメインに操作可能に連結され、前記第3ドメインがCH1を含む第3ポリペプチドと、
N末端からC末端までのVL2を含み、第4ドメインに操作可能に連結され、前記第4ドメインがCLを含む第4ポリペプチドと、を含み、
好ましくは、前記VH2のC末端がCH1のN末端に操作可能に連結され、前記VL2のC末端がCLのN末端に操作可能に連結される、前記［13］に記載の多重特異性ポリペプチド複合物。
［１５］
前記第1ポリペプチド複合物が第1二量化ドメインを更に含み、前記第2ポリペプチド複合物が第2二量化ドメインを更に含み、前記第1二量化ドメインが第2二量化ドメインに結合し、
好ましくは、前記第1ポリペプチド複合物の第1ドメインのC末端が第1二量化ドメインのN末端に操作可能に連結され、前記第2ポリペプチド複合物の第3ドメインのC末端が第2二量化ドメインのN末端に操作可能に連結され、
更に好ましくは、前記第1二量化ドメインが下記から選ばれる方式により、即ち、抗体ヒンジ領域又はその一部、コネクソン、ジスルフィド結合、水素結合、静電相互作用、塩橋、疎水-親水相互作用、又はこれらの組合せから選ばれる方式により、第2二量化ドメインに結合し、
最も好ましくは、前記第1二量化ドメインが下記から選ばれる方式により、即ち、抗体ヒンジ領域又はその一部の結合から選ばれる方式により、好ましくは、IgG1、IgG2、IgG3又はIgG4のヒンジ領域又はその一部から選ばれる方式により、第2二量化ドメインに結合する、前記［13］又は［14］に記載の多重特異性ポリペプチド複合物。
［１６］
前記第1二量化ドメインが抗体CH2ドメイン及び/又は抗体CH3ドメインを含み、及び/又は前記第2二量化ドメインが抗体CH2ドメイン及び/又は抗体CH3ドメインを含み、
好ましくは、前記抗体CH2ドメイン及び/又は抗体CH3ドメインがIgG1、IgG2、IgG3又はIgG4に由来する、前記［15］に記載の多重特異性ポリペプチド複合物。
［１７］
前記第1二量化ドメインが第2二量化ドメインと異なり、ホモ二量化を阻止する方式及び/又はヘテロ二量化を促進する方式により結合し、
好ましくは、前記第1二量化ドメインが下記から選ばれる方式により、即ち、knob-into-hole、疎水相互作用、静電相互作用、親水相互作用、又は柔軟性を向上させる方式から選ばれる方式により、第2二量化ドメインに結合し、
更に好ましくは、前記第1二量化ドメインが配列番号2に示される配列における104～330番目のアミノ酸残基を有し、且つ前記第2二量化ドメインが配列番号3に示される配列における104～330番目のアミノ酸残基を有し、或いは
前記第1二量化ドメインが配列番号3に示される配列における104～330番目のアミノ酸残基を有し、且つ前記第2二量化ドメインが配列番号2に示される配列における104～330番目のアミノ酸残基を有する、前記［15］又は［16］に記載の多重特異性ポリペプチド複合物。
［１８］
前記抗体の少なくとも1つの重鎖定常領域ドメインCH1と少なくとも1つの軽鎖定常領域ドメインCLが取り替えられ、
A）前記ドメインCH1がTitin-T鎖で取り替えられ、前記ドメインCLがTitin-T鎖とタンパク質間相互作用を有することができるドメインで取り替えられ、
B）前記ドメインCLがTitin-T鎖で取り替えられ、前記ドメインCH1がTitin-T鎖とタンパク質間相互作用を有することができるドメインで取り替えられ、
C）前記ドメインCH1がObscurin-O鎖で取り替えられ、前記ドメインCLがObscurin-O鎖とタンパク質間相互作用を有することができるドメインで取り替えられ、
D）前記ドメインCLがObscurin-O鎖で取り替えられ、前記ドメインCH1がObscurin-O鎖とタンパク質間相互作用を有することができるドメインで取り替えられ、
E）前記ドメインCH1がObscurin-Like-O鎖で取り替えられ、前記ドメインCLがObscurin-Like-O鎖とタンパク質間相互作用を有することができるドメインで取り替えられ、或いは
F）前記ドメインCLがObscurin-Like-O鎖で取り替えられ、前記ドメインCH1がObscurin-Like-O鎖とタンパク質間相互作用を有することができるドメインで取り替えられ、
好ましくは、前記Obscurin-O鎖又はObscurin-Like-O鎖とタンパク質間相互作用を有することができるドメインはTitin-T鎖であり、
前記Titin-T鎖とタンパク質間相互作用を有することができるドメインはObscurin-O鎖又はObscurin-Like-O鎖であり、
更に好ましくは、前記抗体が重鎖可変領域VH1と軽鎖可変領域VL1とを含み、前記VH1のC末端がTitin-T鎖のN末端に操作可能に連結され、前記VL1のC末端がObscurin-O鎖又はObscurin-Like-O鎖のN末端に操作可能に連結され、或いは
前記VL1のC末端がTitin-T鎖のN末端に操作可能に連結され、前記VH1のC末端がObscurin-O鎖又はObscurin-Like-O鎖のN末端に操作可能に連結される、ドメイン改造抗体。
［１９］
ドメイン改造抗体のFab断片であって、前記Fab断片の定常領域ドメインCH1と定常領域ドメインCLが取り替えられ、
前記ドメインCH1がTitin-T鎖で取り替えられ、前記ドメインCLがTitin-T鎖とタンパク質間相互作用を有することができるドメインで取り替えられ、
前記ドメインCLがTitin-T鎖で取り替えられ、前記ドメインCH1がTitin-T鎖とタンパク質間相互作用を有することができるドメインで取り替えられ、
前記ドメインCH1がObscurin-O鎖で取り替えられ、前記ドメインCLがObscurin-O鎖とタンパク質間相互作用を有することができるドメインで取り替えられ、
前記ドメインCLがObscurin-O鎖で取り替えられ、前記ドメインCH1がObscurin-O鎖とタンパク質間相互作用を有することができるドメインで取り替えられ、
前記ドメインCH1がObscurin-Like-O鎖で取り替えられ、前記ドメインCLがObscurin-Like-O鎖とタンパク質間相互作用を有することができるドメインで取り替えられ、或いは
前記ドメインCLがObscurin-Like-O鎖で取り替えられ、前記ドメインCH1がObscurin-Like-O鎖とタンパク質間相互作用を有することができるドメインで取り替えられ、
好ましくは、前記Titin-T鎖とタンパク質間相互作用を有するドメインはObscurin-O鎖又はObscurin-Like-O鎖であり、
前記Obscurin-O鎖又はObscurin-Like-O鎖とタンパク質間相互作用を有するドメインはTitin-T鎖であり、
更に好ましくは、前記Fabが重鎖可変領域VH1と軽鎖可変領域VL1とを含み、前記VH1とVL1が抗原結合部位を形成し、前記VH1のC末端がTitin-T鎖のN末端に操作可能に連結され、前記VL1のC末端がObscurin-O鎖又はObscurin-Like-O鎖のN末端に操作可能に連結され、或いは
前記VL1のC末端がTitin-T鎖のN末端に操作可能に連結され、前記VH1のC末端がObscurin-O鎖又はObscurin-Like-O鎖のN末端に操作可能に連結される、ドメイン改造抗体のFab断片。
［２０］
前記［19］に記載のFab断片を含む、ドメイン改造抗体。
［２１］
第1抗原に特異的に結合する第1重鎖と第1軽鎖を含み、第2抗原に特異的に結合する第2重鎖と第2軽鎖を更に含み、
前記第1重鎖のCH1ドメインがTitin-T鎖で取り替えられ、第1軽鎖のCLドメインがTitin-T鎖とタンパク質間相互作用を有することができるドメインで取り替えられ、
前記第1軽鎖のCLドメインがTitin-T鎖で取り替えられ、前記第1重鎖のCH1ドメインがTitin-T鎖とタンパク質間相互作用を有することができるドメインで取り替えられ、
前記第1重鎖のCH1ドメインがObscurin-O鎖で取り替えられ、前記第1軽鎖のCLドメインがObscurin-O鎖とタンパク質間相互作用を有することができるドメインで取り替えられ、
前記第1軽鎖のCLドメインがObscurin-O鎖で取り替えられ、前記第1重鎖のCH1ドメインがObscurin-O鎖とタンパク質間相互作用を有することができるドメインで取り替えられ、
前記第1重鎖のCH1ドメインがObscurin-Like-O鎖で取り替えられ、前記第1軽鎖のCLドメインがObscurin-Like-O鎖とタンパク質間相互作用を有することができるドメインで取り替えられ、或いは
前記第1軽鎖のCLドメインがObscurin-Like-O鎖で取り替えられ、前記第1重鎖のCH1ドメインがObscurin-Like-O鎖とタンパク質間相互作用を有することができるドメインで取り替えられ、
前記第1抗原が第2抗原と異なり、又は前記第1抗原と第2抗原が同じ抗原における異なる2つのエピトープであり、
好ましくは、前記第1重鎖と第2軽鎖との間、第1軽鎖と第2重鎖との間にミスマッチが起きにくく、更に好ましくは、前記Titin-T鎖とタンパク質間相互作用を有するドメインがObscurin-O鎖又はObscurin-Like-O鎖であり、
前記Obscurin-O鎖又はObscurin-Like-O鎖とタンパク質間相互作用を有するドメインがTitin-T鎖である、二重特異性抗体。
［２２］
前記第1重鎖が第1重鎖可変領域（VH1）を含み、前記第1軽鎖が第1軽鎖可変領域（VL1）を含み、前記VH1とVL1が第1抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、且つ
前記VH1のC末端がTitin-T鎖のN末端に操作可能に連結され、前記VL1のC末端がObscurin-O鎖又はObscurin-Like-O鎖のN末端に操作可能に連結され、或いは
前記VL1のC末端がTitin-T鎖のN末端に操作可能に連結され、前記VH1のC末端がObscurin-O鎖又はObscurin-Like-O鎖のN末端に操作可能に連結される、前記［21］に記載の二重特異性抗体。
［２３］
前記第2重鎖がN末端からC末端までの第2重鎖可変領域（VH2）を含み、CH1に操作可能に連結され、前記第2軽鎖がN末端からC末端までの第2軽鎖可変領域（VL2）を含み、CLに操作可能に連結され、
好ましくは、前記VH2とVL2が第2抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、前記VH2のC末端がCH1のN末端に操作可能に連結され、前記VL2のC末端がCLのN末端に操作可能に連結される、前記［21］又は［22］に記載の二重特異性抗体。
［２４］
前記第1重鎖と第2重鎖のC末端がCH2及び/又はCH3ドメインを含み、
好ましくは、前記CH1、CH2及びCH3ドメインがIgG1、IgG2、IgG3又はIgG4に由来し、
更に好ましくは、前記第1重鎖が下記から選ばれる方式により、即ち、抗体ヒンジ領域又はその一部、コネクソン、ジスルフィド結合、水素結合、静電相互作用、塩橋、疎水-親水相互作用、又はこれらの組合せから選ばれる方式により、第2重鎖に結合する、前記［21］～［23］の何れか1項に記載の二重特異性抗体。
［２５］
前記第1重鎖は、N末端からC末端までの順で、VH1-L1-Titin-T鎖-L2-CH2-CH3であり、
前記第1軽鎖は、N末端からC末端までの順で、VL1-L3-Obscurin-O鎖又はVL1-L4-Obscurin-Like-O鎖であり、
前記第2重鎖は、N末端からC末端までの順で、VH2-CH1-CH2-CH3であり、
前記第2軽鎖は、N末端からC末端までの順で、VL2-CLであり、
或いは、
前記第1軽鎖は、N末端からC末端までの順で、VL1-L1-Titin-T鎖であり、
前記第1重鎖は、N末端からC末端までの順で、VH1-L2-Obscurin-O鎖-L3-CH2-CH3、又はVH1-L4-Obscurin-Like-O鎖-L5-CH2-CH3であり、
前記第2重鎖は、N末端からC末端までの順で、VH2-CH1-CH2-CH3であり、
前記第2軽鎖は、N末端からC末端までの順で、VL2-CLであり、
前記L1～L5がスペーサー領域であり、スペーサー領域が存在してもよく、又は存在しなくてもよく、
好ましくは、前記スペーサー領域が下記から選ばれ、即ち、Titin-T鎖のN末端断片、Obscurin-O鎖のN末端断片、Obscurin-Like-O鎖のN末端断片、又は（G x S） y コネクソン（但し、Xが1～5の整数から選ばれ、Yが1～6の整数から選ばれる）から選ばれ、
最も好ましくは、前記スペーサー領域が下記から選ばれ、即ち、「KAGIR」、「DQPQF」、（G 4 S） 1 及び（G 4 S） 2 から選ばれる、前記［24］に記載の二重特異性抗体。
［２６］
前記第1重鎖のCH2及びCH3と第2重鎖のCH2及びCH3が異なり、ホモ二量化を阻止する方式及び/又はヘテロ二量化を促進する方式により結合し、
好ましくは、前記第1重鎖が下記から選ばれる方式により、即ち、knob-into-hole、疎水相互作用、静電相互作用、親水相互作用、又は柔軟性を向上させる方式から選ばれる方式により、第2重鎖に結合し、
更に好ましくは、前記第1重鎖がknob-into-holeを含む方式により第2重鎖に結合し、
最も好ましくは、前記第1重鎖CH2-CH3ドメインが配列番号2に示される配列における104～330番目のアミノ酸残基を有し、前記第2重鎖CH2-CH3ドメインが配列番号3に示される配列における104～330番目のアミノ酸残基を有し、或いは
前記第1重鎖CH2-CH3ドメインが配列番号3に示される配列における104～330番目のアミノ酸残基を有し、前記第2重鎖CH2-CH3ドメインが配列番号2に示される配列における104～330番目のアミノ酸残基を有する、前記［25］に記載の二重特異性抗体。
［２７］
前記操作可能に連結されることは、2本のポリペプチド配列が連結ドメインにより連結されること、又は2本のポリペプチドが直接的に連結されることである、前記［18］又は［20］に記載のドメイン改造抗体、或いは前記［19］に記載のドメイン改造抗体のFab断片、或いは前記［21］～［26］の何れか1項に記載の二重特異性抗体。
［２８］
前記Titin-T鎖がObscurin-O鎖に、又はTitin-T鎖がObscurin-Like-O鎖に、天然鎖間結合により結合し、及び/又は非天然鎖間結合により二量体を形成し、
好ましくは、前記Titin-T鎖がObscurin-O鎖又はObscurin-Like-O鎖と天然鎖間結合により二量体を形成し、前記Titin-T鎖における7～15、19～24、26、55、59及び60番目から選ばれる1つ又は複数の残基がObscurin-O鎖における3～6、9、41、73、75及び80～90番目から選ばれる1つ又は複数の残基と互いに結合し、或いは
前記Titin-T鎖における1、7～10、13～16、19～26、59～60及び96番目から選ばれる1つ又は複数の残基がObscurin-Like-O鎖における4～5、10、12～13、74、76、78及び82～91番目から選ばれる1つ又は複数の残基と互いに結合し、
前記Titin-T鎖残基部位が配列番号32の配列に対する自然順番号部位であり、Obscurin-O鎖残基部位が配列番号33の配列に対する自然順番号部位であり、Obscurin-Like-O鎖残基部位が配列番号34の配列に対する自然順番号部位である、前記［27］に記載のドメイン改造抗体、或いは二重特異性抗体、或いはドメイン改造抗体のFab断片。
［２９］
前記Titin-T鎖がObscurin-O鎖と、又はTitin-T鎖がObscurin-Like-O鎖と、少なくとも1つの非天然鎖間結合により二量体を形成し、
好ましくは、前記非天然鎖間結合がジスルフィド結合であり、
更に好ましくは、前記二量体が1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10個の非天然鎖間結合を含む、前記［27］又は［28］に記載のドメイン改造抗体、二重特異性抗体或いはドメイン改造抗体のFab断片。
［３０］
前記Titin-T鎖が8、20、22、25、26及び39番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖が3、9、25、76及び88番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、或いは
前記Titin-T鎖が8、20、22、25、26及び39番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、及び/又は前記Obscurin-Like-O鎖が6、26、74、77、84及び86番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、
好ましくは、前記Titin-T鎖がA8C、V20C、T22C、C25S、A26C及びC39Tから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、及び/又は
前記Obscurin-O鎖がA3C、R9C、C25S、C76S及びA88Cから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、或いは
前記Titin-T鎖がA8C、V20C、T22C、C25S、A26C及びC39Tから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、及び/又は
前記Obscurin-Like-O鎖がC6E、C26S、C77S、V74C、G84C及びA86Cから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、
更に好ましくは、前記Titin-T鎖がC25S、C39T及びA8C変異を有し、且つObscurin-O鎖がA88C変異を有し、
Titin-T鎖がC25S、C39T及びV20C変異を有し、且つObscurin-O鎖がA3C変異を有し、
Titin-T鎖がC25S、C39T及びA26C変異を有し、且つObscurin-O鎖がR9C変異を有し、
Titin-T鎖がC25S、C39T及びA8C変異を有し、且つObscurin-O鎖がC25S、C76S及びA88C変異を有し、
Titin-T鎖がC25S、C39T及びV20C変異を有し、且つObscurin-O鎖がC25S、C76S及びA3C変異を有し、
Titin-T鎖がC25S、C39T及びA26C変異を有し、且つObscurin-O鎖がC25S、C76S及びR9C変異を有し、
Titin-T鎖がC25S、C39T及びA8C変異を有し、且つObscurin-Like-O鎖がC6E及びV74C変異を有し、
Titin-T鎖がC25S、C39T及びV20C変異を有し、且つObscurin-Like-O鎖がC6E及びG84C変異を有し、
Titin-T鎖がC25S、C39T及びT22C変異を有し、且つObscurin-Like-O鎖がC6E及びA86C変異を有し、
Titin-T鎖がC25S、C39T及びA8C変異を有し、且つObscurin-Like-O鎖がC6E、C26S、C77S及びV74C変異を有し、
Titin-T鎖がC25S、C39T及びV20C変異を有し、且つObscurin-Like-O鎖がC6E、C26S、C77S及びG84C変異を有し、或いは
Titin-T鎖がC25S、C39T及びT22C変異を有し、且つObscurin-Like-O鎖がC6E、C26S、C77S及びA86C変異を有し、
前記Titin-T鎖変異部位が配列番号32の配列に対する自然順部位であり、Obscurin-O鎖変異部位が配列番号33の配列に対する自然順部位であり、Obscurin-Like-O鎖変異部位が配列番号34の配列に対する自然順部位である、前記［27］～［29］の何れか1項に記載のドメイン改造抗体、二重特異性抗体或いはドメイン改造抗体のFab断片。
［３１］
前記Obscurin-O鎖が7、11及び62番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を更に有し、
好ましくは、前記Obscurin-O鎖がL7K又はL7R、K11L、及びT62K又はT62Hから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、
最も好ましくは、前記Titin-T鎖がC25S、C39T及びA8C変異を有し、且つObscurin-O鎖がC25S、C76S、A88C、L7K及びT62K変異を有し、
Titin-T鎖がC25S、C39T及びA8C変異を有し、且つObscurin-O鎖がC25S、C76S、A88C、L7K及びT62H変異を有し、
Titin-T鎖がC25S、C39T及びA8C変異を有し、且つObscurin-O鎖がC25S、C76S、A88C、K11L及びT62K変異を有し、或いは
Titin-T鎖がC25S、C39T及びA8C変異を有し、且つObscurin-O鎖がC25S、C76S、A88C、K11L及びT62Hを有し、
前記Titin-T鎖変異部位が配列番号32の配列に対する自然順番号部位であり、Obscurin-O鎖変異部位が配列番号33の配列に対する自然順番号部位である、前記［29］又は［30］に記載のドメイン改造抗体、二重特異性抗体或いはドメイン改造抗体のFab断片。
［３２］
前記Titin-T鎖が3、11、13、22、40、42、45、47、49、56、58、66、70、75、77、79、81、82、83及び84番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸変異を有し、及び/又は
Obscurin-O鎖が2、11、12、13、14、17、20、22、30、32、34、36、41、42、44、45、53、58、62、67、69、89、92、94及び97番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸変異を有し、
好ましくは、前記Titin-T鎖がP3W、S11I、I13L、T22M、G40S、R42K、H45S、Q47E、Q49G、N56S、D58E、M66S又はM66K、K70R、L75V、T77S、S79T、G81R、N82M、E83D及びF84Lから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸変異を有し、及び/又は
Obscurin-O鎖がG2E、L11K、A12S、F13Y、V14T、V17E、D20L、T22M又はT22S、N30D、T32P、Q34E、S36T、Q41K、Q42L、V44I、A45T、A53L、L58V、K62E、A67Q又はA67T、G69S、V89L、Q92E、D94G及びA97Gから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸変異を有し、
更に好ましくは、前記Titin-T鎖がM66S及びT77Sアミノ酸変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖がL11K、A12S、F13Y、V14T及びT22Sアミノ酸変異を有し、
前記Titin-T鎖がM66K、K70R、S79T及びG81Rアミノ酸変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖がG2E、V17E、N30D、T32P、Q34E、S36T、V44I、A45T、L58V、K62E、A67Q、G69S及びA97Gアミノ酸変異を有し、
前記Titin-T鎖がP3W、S11I、I13L、T22M及びN82Mアミノ酸変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖がD20L、T22M及びA53Lアミノ酸変異を有し、
前記Titin-T鎖がS11I、M66K、S79T及びG81Rアミノ酸変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖がQ41K、A45T、A67Q、G69S及びV89Lアミノ酸変異を有し、
前記Titin-T鎖がG40S、R42K、H45S、Q47E、Q49G、N56S、D58E、L75V、E83D及びF84Lアミノ酸変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖がQ42L、A45T、A67T、G69S、Q92E及びD94Gアミノ酸変異を有し、
前記Titin-T鎖がQ47E、Q49G、N56S、D58E及びL75Vアミノ酸変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖がQ42L、A45T、A67T、G69S、Q92E及びD94Gアミノ酸変異を有し、
前記Titin-T鎖がN56S、D58E及びL75Vアミノ酸変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖がQ42L、A45T、A67T、G69S、Q92E及びD94Gアミノ酸変異を有し、或いは
前記Titin-T鎖がN56S、D58E、M66S及びT77Sアミノ酸変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖がA12S、F13Y、T22S、Q42L、A45T、A67Q、G69S、Q92E及びD94Gアミノ酸変異を有し、
前記Titin-T鎖変異部位が配列番号35の配列に対する自然順番号部位であり、Obscurin-O鎖変異部位が配列番号50の配列に対する自然順番号部位である、前記［27］～［31］の何れか1項に記載のドメイン改造抗体、二重特異性抗体或いはドメイン改造抗体のFab断片。
［３３］
前記Titin-T鎖、Obscurin-O鎖又はObscurin-Like-O鎖のN末端が連結ドメインによりVH1又はVL1に操作可能に連結され、
好ましくは、前記連結ドメインが下記から選ばれ、即ち、Titin-T鎖のN末端断片、Obscurin-O鎖のN末端断片、Obscurin-Like-O鎖のN末端断片、及び（G x S） y コネクソン（但し、Xが1～5の整数から選ばれ、Yが1～6の整数から選ばれる）から選ばれ、
更に好ましくは、前記連結ドメインが下記から選ばれ、即ち、「KAGIR」、「DQPQF」、（G 4 S） 1 及び（G 4 S） 2 から選ばれ、
最も好ましくは、前記Titin-T鎖がKAGIRポリペプチドによりVH1又はVL1に連結し、及び/又は前記Obscurin-O鎖がDQPQFポリペプチドによりVL1又はVH1に連結する、前記［27］～［32］の何れか1項に記載のドメイン改造抗体、二重特異性抗体或いはドメイン改造抗体のFab断片。
［３４］
A）前記Titin-T鎖の配列が、配列番号32に示される通りであり、若しくは配列番号32の配列を基に3、8、11、13、20、22、25、26、39、40、42、45、47、49、56、58、66、70、75、77、79、81、82、83及び84から選ばれる1つ又は複数の部位のアミノ酸変異を更に有し、及び/又はN末端に5つのアミノ酸残基KAGIRを付加する配列であり、好ましくは、A8C、V20C、T22C、C25S、A26C、C39T、P3W、S11I、I13L、T22M、G40S、R42K、H45S、Q47E、Q49G、N56S、D58E、M66S又はM66K、K70R、L75V、T77S、S79T、G81R、N82M、E83D及びF84Lから選ばれる1つ又は複数の部位のアミノ酸変異を有し、及び/又はN末端にKAGIRアミノ酸残基を付加する配列であり、及び/又は
B）前記Obscurin-O鎖の配列が、配列番号33に示される通りであり、若しくは配列番号33の配列を基に2、3、7、9、11、12、13、14、17、20、22、25、30、32、34、36、41、42、44、45、53、58、62、67、69、76、88、89、92、94及び97から選ばれる1つ又は複数の部位のアミノ酸変異を更に有し、及び/又はN末端にDQPQFアミノ酸残基を付加する配列であり、好ましくは、A3C、R9C、C25S、C76S、A88C、L7K又はL7R、T62K又はT62H、G2E、L11K、A12S、F13Y、V14T、V17E、D20L、T22M又はT22S、N30D、T32P、Q34E、S36T、Q41K、Q42L、V44I、A45T、A53L、L58V、T62E、A67Q又はA67T、G69S、V89L、Q92E、D94G及びA97Gから選ばれる1つ又は複数の部位のアミノ酸変異を有し、及び/又はN末端にDQPQFアミノ酸残基を付加する配列であり、或いは
前記Obscurin-Like-O鎖の配列が、配列番号34に示される通りであり、若しくは配列番号34の配列を基に6、26、74、77、84及び86から選ばれる1つ又は複数の部位のアミノ酸変異を更に有する配列であり、好ましくは、C6E、C26S、C77S、V74C、G84C及びA86Cから選ばれる1つ又は複数の部位のアミノ酸変異を有する配列であり、
前記Titin-T鎖変異部位が配列番号32の配列の自然順番号部位であり、Obscurin-O鎖変異部位が配列番号33の配列の自然順番号部位であり、Obscurin-Like-O鎖変異部位が配列番号34の配列の自然順番号部位であり、
好ましくは、
A）前記Titin-T鎖が、配列番号32の配列を基に8、20、22、25、26及び39番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、好ましくは、A8C、V20C、T22C、C25S、A26C及びC39Tから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、前記Titin-T鎖変異部位が配列番号32の配列の自然順番号部位であり、
更に好ましくは、前記Titin-T鎖が、配列番号35の配列を基に3、11、13、22、40、42、45、47、49、56、58、66、70、75、77、79、81、82、83及び84番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸変異を有し、好ましくは、P3W、S11I、I13L、T22M、G40S、R42K、H45S、Q47E、Q49G、N56S、D58E、M66S、M66K、K70R、L75V、T77S、S79T、G81R、N82M、E83D及びF84Lから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸変異を有し、前記Titin-T鎖変異部位が配列番号35の配列の自然順番号部位であり、及び/又は
B）前記Obscurin-O鎖が、配列番号33の配列を基に3、9、25、76及び88番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、好ましくは、A3C、R9C、C25S、C76S及びA88Cから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、前記Obscurin-O鎖変異部位が配列番号33の配列の自然順番号部位であり、
好ましくは、前記Obscurin-O鎖が、配列番号45の配列を基に7、11、62番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を更に有し、好ましくは、L7K又はL7R、T62K又はT62H、及びK11Lから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、前記Obscurin-O鎖変異部位が配列番号45の配列の自然順番号部位であり、
更に好ましくは、前記Obscurin-O鎖が、配列番号50の配列を基に2、11、12、13、14、17、20、22、30、32、34、36、41、42、44、45、53、58、62、67、69、89、92、94及び97番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸変異を有し、好ましくは、G2E、L11K、A12S、F13Y、V14T、V17E、D20L、T22M又はT22S、N30D、T32P、Q34E、S36T、Q41K、Q42L、V44I、A45T、A53L、L58V、K62E、A67Q又はA67T、G69S、V89L、Q92E、D94G及びA97Gから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸変異を有し、前記Obscurin-O鎖変異部位が配列番号50の配列の自然順番号部位であり、
或いは
A）前記Titin-T鎖が、配列番号32の配列を基に8、20、22、25、26及び39番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、好ましくは、A8C、V20C、T22C、C25S、A26C及びC39Tから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、前記Titin-T鎖変異部位が配列番号32の配列の自然順番号部位であり、
更に好ましくは、前記Titin-T鎖が、配列番号35の配列を基に3、11、13、22、40、42、45、47、49、56、58、66、70、75、77、79、81、82、83及び84番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸変異を有し、好ましくは、P3W、S11I、I13L、T22M、G40S、R42K、H45S、Q47E、Q49G、N56S、D58E、M66S、M66K、K70R、L75V、T77S、S79T、G81R、N82M、E83D及びF84Lから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸変異を有し、前記Titin-T鎖変異部位が配列番号35の配列の自然順番号部位であり、及び/又は
B）前記Obscurin-Like-O鎖が、配列番号34の配列を基に6、26、74、77、84及び86番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、好ましくは、C6E、C26S、C77S、V74C、G84C及びA86Cから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、前記Obscurin-Like-O鎖変異部位が配列番号34の配列の自然順番号部位である、前記［27］～［33］の何れか1項に記載のドメイン改造抗体、二重特異性抗体或いはドメイン改造抗体のFab断片。
［３５］
前記Titin-T鎖が配列番号32、35～41、65～76の何れか1つに示される配列、又は配列番号32、35～41、65～76の何れか1つの配列と少なくとも80%の同一性を有する配列を含み、及び/又は
前記Obscurin-O鎖が配列番号33、42～58、77～86の何れか1つに示される配列、又は配列番号33、42～58、77～86の何れか1つの配列と少なくとも80%の同一性を有する配列を含み、或いは
前記Titin-T鎖が配列番号32、35～41、65～76の何れか1つに示される配列、又は配列番号32、35～41、65～76の何れか1つの配列と少なくとも80%の同一性を有する配列を含み、及び/又は
前記Obscurin-Like-O鎖が配列番号34、59～64の何れか1つに示される配列、又は配列番号34、59～64の何れか1つの配列と少なくとも80%の同一性を有する配列を含み、
更に好ましくは、
前記Titin-T鎖が配列番号68に示されるポリペプチドを含み、且つ前記Obscurin-O鎖が配列番号80に示されるポリペプチドを含み、
前記Titin-T鎖が配列番号73に示されるポリペプチドを含み、且つ前記Obscurin-O鎖が配列番号83に示されるポリペプチドを含み、
前記Titin-T鎖が配列番号76に示されるポリペプチドを含み、且つ前記Obscurin-O鎖が配列番号84に示されるポリペプチドを含み、
前記Titin-T鎖が配列番号76に示されるポリペプチドを含み、且つ前記Obscurin-O鎖が配列番号86に示されるポリペプチドを含み、
前記Titin-T鎖が配列番号75に示されるポリペプチドを含み、且つ前記Obscurin-O鎖が配列番号86に示されるポリペプチドを含む、前記［27］～［34］の何れか1項に記載のドメイン改造抗体、二重特異性抗体或いはドメイン改造抗体のFab断片。
［３６］
下記A～Gの何れか1項に記載の二重特異性抗体から選ばれ、即ち、
A）第1重鎖の配列が配列番号89に示される通りであり、若しくは配列番号89と少なくとも85%の配列同一性を有し、第1軽鎖の配列が配列番号90に示される通りであり、若しくは配列番号90と少なくとも85%の配列同一性を有し、第2重鎖の配列が配列番号87に示される通りであり、若しくは配列番号87と少なくとも85%の配列同一性を有し、第2軽鎖の配列が配列番号88に示される通りであり、若しくは配列番号88と少なくとも85%の配列同一性を有する二重特異性抗体と、
B）第1重鎖の配列が配列番号93に示される通りであり、若しくは配列番号93と少なくとも85%の配列同一性を有し、第1軽鎖の配列が配列番号94に示される通りであり、若しくは配列番号94と少なくとも85%の配列同一性を有し、第2重鎖の配列が配列番号91に示される通りであり、若しくは配列番号91と少なくとも85%の配列同一性を有し、第2軽鎖の配列が配列番号92に示される通りであり、若しくは配列番号92と少なくとも85%の配列同一性を有する二重特異性抗体と、
C）第1重鎖の配列が配列番号97に示される通りであり、若しくは配列番号97と少なくとも85%の配列同一性を有し、第1軽鎖の配列が配列番号98に示される通りであり、若しくは配列番号98と少なくとも85%の配列同一性を有し、第2重鎖の配列が配列番号95に示される通りであり、若しくは配列番号95と少なくとも85%の配列同一性を有し、第2軽鎖の配列が配列番号96に示される通りであり、若しくは配列番号96と少なくとも85%の配列同一性を有する二重特異性抗体と、
D）第1重鎖の配列が配列番号99に示される通りであり、若しくは配列番号99と少なくとも85%の配列同一性を有し、第1軽鎖の配列が配列番号100に示される通りであり、若しくは配列番号100と少なくとも85%の配列同一性を有し、第2重鎖の配列が配列番号101に示される通りであり、若しくは配列番号101と少なくとも85%の配列同一性を有し、第2軽鎖の配列が配列番号96に示される通りであり、若しくは配列番号96と少なくとも85%の配列同一性を有する二重特異性抗体と、
E）第1重鎖の配列が配列番号102に示される通りであり、若しくは配列番号102と少なくとも85%の配列同一性を有し、第1軽鎖の配列が配列番号100に示される通りであり、若しくは配列番号100と少なくとも85%の配列同一性を有し、第2重鎖の配列が配列番号95に示される通りであり、若しくは配列番号95と少なくとも85%の配列同一性を有し、第2軽鎖の配列が配列番号96に示される通りであり、若しくは配列番号96と少なくとも85%の配列同一性を有する二重特異性抗体と、
F）第1重鎖の配列が配列番号103に示される通りであり、若しくは配列番号103と少なくとも85%の配列同一性を有し、第1軽鎖の配列が配列番号104に示される通りであり、若しくは配列番号104と少なくとも85%の配列同一性を有し、第2重鎖の配列が配列番号95に示される通りであり、若しくは配列番号95と少なくとも85%の配列同一性を有し、第2軽鎖の配列が配列番号96に示される通りであり、若しくは配列番号96と少なくとも85%の配列同一性を有する二重特異性抗体と、
G）第1重鎖の配列が配列番号107に示される通りであり、若しくは配列番号107と少なくとも85%の配列同一性を有し、第1軽鎖の配列が配列番号108に示される通りであり、若しくは配列番号108と少なくとも85%の配列同一性を有し、第2重鎖の配列が配列番号109に示される通りであり、若しくは配列番号109と少なくとも85%の配列同一性を有し、第2軽鎖の配列が配列番号110に示される通りであり、若しくは配列番号110と少なくとも85%の配列同一性を有する二重特異性抗体と、
H）第1重鎖の配列が配列番号122に示される通りであり、若しくは配列番号122と少なくとも85%の配列同一性を有し、第1軽鎖の配列が配列番号123に示される通りであり、若しくは配列番号123と少なくとも85%の配列同一性を有し、第2重鎖の配列が配列番号116に示される通りであり、若しくは配列番号116と少なくとも85%の配列同一性を有し、第2軽鎖の配列が配列番号117に示される通りであり、若しくは配列番号117と少なくとも85%の配列同一性を有する二重特異性抗体と、
I）第1重鎖の配列が配列番号118に示される通りであり、若しくは配列番号118と少なくとも85%の配列同一性を有し、第1軽鎖の配列が配列番号119に示される通りであり、若しくは配列番号119と少なくとも85%の配列同一性を有し、第2重鎖の配列が配列番号124に示される通りであり、若しくは配列番号124と少なくとも85%の配列同一性を有し、第2軽鎖の配列が配列番号125に示される通りであり、若しくは配列番号125と少なくとも85%の配列同一性を有する二重特異性抗体と、
から選ばれる、前記［21］～［35］の何れか1項に記載の二重特異性抗体。
［３７］
Titin-T鎖とObscurin-O鎖、又はTitin-T鎖とObscurin-Like-O鎖で抗体のCH1/CLを取り替える工程を含み、
更に好ましくは、前記Titin-T鎖が配列番号32、35～41、65～76の何れか1つに示される配列、又は配列番号32、35～41、65～76の何れか1つの配列と少なくとも80%の同一性を有する配列を含み、及び/又は
前記Obscurin-O鎖が配列番号33、42～58、77～86の何れか1つに示される配列、又は配列番号33、42～58、77～86の何れか1つの配列と少なくとも80%の同一性を有する配列を含み、或いは
前記Titin-T鎖が配列番号32、35～41、65～76の何れか1つに示される配列、又は配列番号32、35～41、65～76の何れか1つの配列と少なくとも80%の同一性を有する配列を含み、及び/又は
前記Obscurin-Like-O鎖が配列番号34、59～64の何れか1つに示される配列、又は配列番号34、59～64の何れか1つの配列と少なくとも80%の同一性を有する配列を含み、
最も好ましくは、
Titin-T鎖が配列番号68に示される配列を含み、且つObscurin-O鎖が配列番号80に示される配列を含み、
Titin-T鎖が配列番号73に示される配列を含み、且つObscurin-O鎖が配列番号83に示される配列を含み、
Titin-T鎖が配列番号76に示される配列を含み、且つObscurin-O鎖が配列番号84に示される配列を含み、
Titin-T鎖が配列番号76に示される配列を含み、且つObscurin-O鎖が配列番号86に示される配列を含み、或いは
Titin-T鎖が配列番号75に示される配列を含み、且つObscurin-O鎖が配列番号86に示される配列を含む、多重特異性抗体の調製方法。
［３８］
前記［37］に記載の方法により調製され、
第1重鎖可変領域（VH1）と第1軽鎖可変領域（VL1）を含み、前記VH1とVL1が第1抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、且つ
前記VH1のC末端がTitin-T鎖のN末端に操作可能に連結され、前記VL1のC末端がObscurin-O鎖又はObscurin-Like-O鎖のN末端に操作可能に連結され、或いは
前記VL1のC末端がTitin-T鎖のN末端に操作可能に連結され、前記VH1のC末端がObscurin-O鎖又はObscurin-Like-O鎖のN末端に操作可能に連結される、多重特異性抗体。
［３９］
A）前記Titin-T鎖の配列が、配列番号32に示される通りであり、若しくは配列番号32の配列を基に8、20、22、25、26、39、3、11、13、40、42、45、47、49、56、58、66、70、75、77、79、81、82、83及び84から選ばれる1つ又は複数の部位のアミノ酸変異を更に有し、及び/又はN末端に5つのアミノ酸残基KAGIRを付加する配列であり、好ましくは、A8C、V20C、T22C、C25S、A26C、C39T、P3W、S11I、I13L、T22M、G40S、R42K、H45S、Q47E、Q49G、N56S、D58E、M66S又はM66K、K70R、L75V、T77S、S79T、G81R、N82M、E83D及びF84Lから選ばれる1つ又は複数の部位のアミノ酸変異を有し、及び/又はN末端にKAGIRアミノ酸残基を付加する配列であり、及び/又は
B）前記Obscurin-O鎖の配列が、配列番号33に示される通りであり、若しくは配列番号33の配列を基に3、9、25、76、88、7、11、62、2、12、13、14、17、20、22、30、32、34、36、41、42、44、45、53、58、67、69、89、92、94及び97から選ばれる1つ又は複数の部位のアミノ酸変異を更に有し、及び/又はN末端にDQPQFアミノ酸残基を付加する配列であり、好ましくは、A3C、R9C、C25S、C76S、A88C、L7K又はL7R、T62K又はT62H、G2E、L11K、A12S、F13Y、V14T、V17E、D20L、T22M又はT22S、N30D、T32P、Q34E、S36T、Q41K、Q42L、V44I、A45T、A53L、L58V、T62E、A67Q又はA67T、G69S、V89L、Q92E、D94G及びA97Gから選ばれる1つ又は複数の部位のアミノ酸変異を有し、及び/又はN末端にDQPQFアミノ酸残基を付加する配列であり、或いは
前記Obscurin-Like-O鎖の配列が、配列番号34に示される通りであり、若しくは配列番号34の配列を基に6、26、74、77、84及び86から選ばれる1つ又は複数の部位のアミノ酸変異を更に有する配列であり、好ましくは、C6E、C26S、C77S、V74C、G84C及びA86Cから選ばれる1つ又は複数の部位のアミノ酸変異を有する配列であり、
前記Titin-T鎖変異部位が配列番号32の配列の自然順番号部位であり、Obscurin-O鎖変異部位が配列番号33の配列の自然順番号部位であり、Obscurin-Like-O鎖変異部位が配列番号34の配列の自然順番号部位であり、
好ましくは、
A）前記Titin-T鎖が、配列番号32の配列を基に8、20、22、25、26及び39番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、好ましくは、A8C、V20C、T22C、C25S、A26C及びC39Tから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、前記Titin-T鎖変異部位が配列番号32の配列の自然順番号部位であり、
更に好ましくは、前記Titin-T鎖が、配列番号35の配列を基に3、11、13、22、40、42、45、47、49、56、58、66、70、75、77、79、81、82、83及び84番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸変異を有し、好ましくは、P3W、S11I、I13L、T22M、G40S、R42K、H45S、Q47E、Q49G、N56S、D58E、M66S、M66K、K70R、L75V、T77S、S79T、G81R、N82M、E83D及びF84Lから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸変異を有し、前記Titin-T鎖変異部位が配列番号35の配列の自然順番号部位であり、及び/又は
B）前記Obscurin-O鎖が、配列番号33の配列を基に3、9、25、76及び88番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、好ましくは、A3C、R9C、C25S、C76S及びA88Cから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、前記Obscurin-O鎖変異部位が配列番号33の配列の自然順番号部位であり、
好ましくは、前記Obscurin-O鎖が、配列番号45の配列を基に7、11、62番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を更に有し、好ましくは、L7K又はL7R、T62K又はT62H、及びK11Lから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、前記Obscurin-O鎖変異部位が配列番号45の配列の自然順番号部位であり、
更に好ましくは、前記Obscurin-O鎖が、配列番号50の配列を基に2、11、12、13、14、17、20、22、30、32、34、36、41、42、44、45、53、58、62、67、69、89、92、94及び97番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸変異を有し、好ましくは、G2E、L11K、A12S、F13Y、V14T、V17E、D20L、T22M又はT22S、N30D、T32P、Q34E、S36T、Q41K、Q42L、V44I、A45T、A53L、L58V、K62E、A67Q又はA67T、G69S、V89L、Q92E、D94G及びA97Gから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸変異を有し、前記Obscurin-O鎖変異部位が配列番号50の配列の自然順番号部位であり、
或いは
A）前記Titin-T鎖が、配列番号32の配列を基に8、20、22、25、26及び39番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、好ましくは、A8C、V20C、T22C、C25S、A26C及びC39Tから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、前記Titin-T鎖変異部位が配列番号32の配列の自然順番号部位であり、
更に好ましくは、前記Titin-T鎖が、配列番号35の配列を基に3、11、13、22、40、42、45、47、49、56、58、66、70、75、77、79、81、82、83及び84番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸変異を有し、好ましくは、P3W、S11I、I13L、T22M、G40S、R42K、H45S、Q47E、Q49G、N56S、D58E、M66S、M66K、K70R、L75V、T77S、S79T、G81R、N82M、E83D及びF84Lから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸変異を有し、前記Titin-T鎖変異部位が配列番号35の配列の自然順番号部位であり、及び/又は
B）前記Obscurin-Like-O鎖が、配列番号34の配列を基に6、26、74、77、84及び86番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、好ましくは、C6E、C26S、C77S、V74C、G84C及びA86Cから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、前記Obscurin-Like-O鎖変異部位が配列番号34の配列の自然順番号部位である、前記［38］に記載の多重特異性抗体。
［４０］
下記（A）～（F）から選ばれる何れかの物質を含み、即ち、
A）前記［1］～［12］の何れか1項に記載のポリペプチド複合物と、
B）前記［13］～［17］の何れか1項に記載の多重特異性ポリペプチド複合物と、
C）前記［18］、［20］、［27］～［35］の何れか1項に記載のドメイン改造抗体と、
D）前記［19］、［27］～［35］の何れか1項に記載のドメイン改造抗体のFab断片と、
E）前記［21］～［36］の何れか1項に記載の二重特異性抗体と、
F）前記［38］又は［39］に記載の多重特異性抗体と、から選ばれる何れかの物質を含む、複合体。
［４１］
配列が配列番号32、35～41、65～76の何れか1つの配列に示される通りであり、若しくは配列番号32、35～41、65～76の何れか1つの配列と少なくとも80%の同一性を有し、或いは
配列が配列番号33、42～58、77～86の何れか1つの配列に示される通りであり、若しくは配列番号33、42～58、77～86の何れか1つの配列と少なくとも80%の同一性を有し、或いは
配列が配列番号34、59～64の何れか1つの配列に示される通りであり、若しくは配列番号34、59～64の何れか1つの配列と少なくとも80%の同一性を有し、
好ましくは、抗体CH1及び/又はCLを取り替えるために利用できる、ポリペプチド。
［４２］
Titin-T鎖とObscurin-O鎖との組合せ、或いはTitin-T鎖とObscurin-Like-O鎖との組合せの、多重特異性抗体軽鎖/重鎖ミスマッチの低減における使用であって、
好ましくは、前記多重特異性抗体が第1重鎖可変領域（VH1）と第1軽鎖可変領域（VL1）を含み、前記VH1とVL1が第1抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、且つ
前記VH1のC末端がTitin-T鎖のN末端に操作可能に連結され、前記VL1のC末端がObscurin-O鎖又はObscurin-Like-O鎖のN末端に操作可能に連結され、或いは
前記VL1のC末端がTitin-T鎖のN末端に操作可能に連結され、前記VH1のC末端がObscurin-O鎖又はObscurin-Like-O鎖のN末端に操作可能に連結され、
更に好ましくは、前記Titin-T鎖が配列番号32、35～41、65～76の何れか1つに示される配列、又は配列番号32、35～41、65～76の何れか1つの配列と少なくとも80%の同一性を有する配列を含み、及び/又は前記Obscurin-O鎖が配列番号33、42～58、77～86の何れか1つに示される配列、又は配列番号33、42～58、77～86の何れか1つの配列と少なくとも80%の同一性を有する配列を含み、或いは
前記Titin-T鎖が配列番号32、35～41、65～76の何れか1つに示される配列、又は配列番号32、35～41、65～76の何れか1つの配列と少なくとも80%の同一性を有する配列を含み、及び/又は前記Obscurin-Like-O鎖が配列番号34、59～64の何れか1つに示される配列、又は配列番号34、59～64の何れか1つの配列と少なくとも80%の同一性を有する配列を含み、
最も好ましくは、
Titin-T鎖が配列番号68に示される配列を含み、且つObscurin-O鎖が配列番号80に示される配列を含み、
Titin-T鎖が配列番号73に示される配列を含み、且つObscurin-O鎖が配列番号83に示される配列を含み、
Titin-T鎖が配列番号76に示される配列を含み、且つObscurin-O鎖が配列番号84に示される配列を含み、Titin-T鎖が配列番号76に示される配列を含み、且つObscurin-O鎖が配列番号86に示される配列を含み、或いは
Titin-T鎖が配列番号75に示される配列を含み、且つObscurin-O鎖が配列番号86に示される配列を含む、使用。
［４３］
A）前記Titin-T鎖の配列が、配列番号32に示される通りであり、若しくは配列番号32の配列を基に8、20、22、25、26、39、3、11、13、40、42、45、47、49、56、58、66、70、75、77、79、81、82、83及び84から選ばれる1つ又は複数の部位のアミノ酸変異を更に有し、及び/又はN末端に5つのアミノ酸残基KAGIRを付加する配列であり、好ましくは、A8C、V20C、T22C、C25S、A26C、C39T、P3W、S11I、I13L、T22M、G40S、R42K、H45S、Q47E、Q49G、N56S、D58E、M66S又はM66K、K70R、L75V、T77S、S79T、G81R、N82M、E83D及びF84Lから選ばれる1つ又は複数の部位のアミノ酸変異を有し、及び/又はN末端にKAGIRアミノ酸残基を付加する配列であり、及び/又は
B）前記Obscurin-O鎖の配列が、配列番号33に示される通りであり、若しくは配列番号33の配列を基に3、9、25、76、88、7、11、62、2、12、13、14、17、20、22、30、32、34、36、41、42、44、45、53、58、67、69、89、92、94及び97から選ばれる1つ又は複数の部位のアミノ酸変異を更に有し、及び/又はN末端にDQPQFアミノ酸残基を付加する配列であり、好ましくは、A3C、R9C、C25S、C76S、A88C、L7K又はL7R、T62K又はT62H、G2E、L11K、A12S、F13Y、V14T、V17E、D20L、T22M又はT22S、N30D、T32P、Q34E、S36T、Q41K、Q42L、V44I、A45T、A53L、L58V、T62E、A67Q又はA67T、G69S、V89L、Q92E、D94G及びA97Gから選ばれる1つ又は複数の部位のアミノ酸変異を有し、及び/又はN末端にDQPQFアミノ酸残基を付加する配列であり、或いは
前記Obscurin-Like-O鎖の配列が、配列番号34に示される通りであり、若しくは配列番号34の配列を基に6、26、74、77、84及び86から選ばれる1つ又は複数の部位のアミノ酸変異を更に有する配列であり、好ましくは、C6E、C26S、C77S、V74C、G84C及びA86Cから選ばれる1つ又は複数の部位のアミノ酸変異を有する配列であり、
前記Titin-T鎖変異部位が配列番号32の配列の自然順番号部位であり、Obscurin-O鎖変異部位が配列番号33の配列の自然順番号部位であり、Obscurin-Like-O鎖変異部位が配列番号34の配列の自然順番号部位であり、
好ましくは、
A）前記Titin-T鎖が、配列番号32の配列を基に8、20、22、25、26及び39番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、好ましくは、A8C、V20C、T22C、C25S、A26C及びC39Tから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、前記Titin-T鎖変異部位が配列番号32の配列の自然順番号部位であり、
更に好ましくは、前記Titin-T鎖が、配列番号35の配列を基に3、11、13、22、40、42、45、47、49、56、58、66、70、75、77、79、81、82、83及び84番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸変異を有し、好ましくは、P3W、S11I、I13L、T22M、G40S、R42K、H45S、Q47E、Q49G、N56S、D58E、M66S、M66K、K70R、L75V、T77S、S79T、G81R、N82M、E83D及びF84Lから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸変異を有し、前記Titin-T鎖変異部位が配列番号35の配列の自然順番号部位であり、及び/又は
B）前記Obscurin-O鎖が、配列番号33の配列を基に3、9、25、76及び88番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、好ましくは、A3C、R9C、C25S、C76S及びA88Cから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、前記Obscurin-O鎖変異部位が配列番号33の配列の自然順番号部位であり、
好ましくは、前記Obscurin-O鎖が、配列番号45の配列を基に7、11、62番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を更に有し、好ましくは、L7K又はL7R、T62K又はT62H、及びK11Lから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、前記Obscurin-O鎖変異部位が配列番号45の配列の自然順番号部位であり、
更に好ましくは、前記Obscurin-O鎖が、配列番号50の配列を基に2、11、12、13、14、17、20、22、30、32、34、36、41、42、44、45、53、58、62、67、69、89、92、94及び97番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸変異を有し、好ましくは、G2E、L11K、A12S、F13Y、V14T、V17E、D20L、T22M又はT22S、N30D、T32P、Q34E、S36T、Q41K、Q42L、V44I、A45T、A53L、L58V、K62E、A67Q又はA67T、G69S、V89L、Q92E、D94G及びA97Gから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸変異を有し、前記Obscurin-O鎖変異部位が配列番号50の配列の自然順番号部位であり、
或いは
A）前記Titin-T鎖が、配列番号32の配列を基に8、20、22、25、26及び39番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、好ましくは、A8C、V20C、T22C、C25S、A26C及びC39Tから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、前記Titin-T鎖変異部位が配列番号32の配列の自然順番号部位であり、
更に好ましくは、前記Titin-T鎖が、配列番号35の配列を基に3、11、13、22、40、42、45、47、49、56、58、66、70、75、77、79、81、82、83及び84番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸変異を有し、好ましくは、P3W、S11I、I13L、T22M、G40S、R42K、H45S、Q47E、Q49G、N56S、D58E、M66S、M66K、K70R、L75V、T77S、S79T、G81R、N82M、E83D及びF84Lから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸変異を有し、前記Titin-T鎖変異部位が配列番号35の配列の自然順番号部位であり、及び/又は
B）前記Obscurin-Like-O鎖が、配列番号34の配列を基に6、26、74、77、84及び86番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、好ましくは、C6E、C26S、C77S、V74C、G84C及びA86Cから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、前記Obscurin-Like-O鎖変異部位が配列番号34の配列の自然順番号部位である、前記［42］に記載の使用。
［４４］
下記（A）～（G）から選ばれ、即ち、
A）前記［1］～［12］の何れか1項に記載のポリペプチド複合物と、
B）前記［13］～［17］の何れか1項に記載の多重特異性ポリペプチド複合物と、
C）前期［18］、［20］、［27］～［35］の何れか1項に記載のドメイン改造抗体と、
D）前期［19］、［27］～［35］の何れか1項に記載のドメイン改造抗体のFab断片と、
E）前記［21］～［36］の何れか1項に記載の二重特異性抗体と、
F）前記［41］に記載のポリペプチドと、
G）前記［38］又は［39］に記載の多重特異性抗体と、から選ばれる何れかの物質をコードする、核酸分子。
［４５］
前記［44］に記載の核酸分子を含む、ベクター。
［４６］
前記［45］に記載のベクターの変換により得られ、原核細胞及び真核細胞から選ばれ、好ましくは、真核細胞であり、更に好ましくは、哺乳動物細胞である、宿主細胞。
［４７］
下記から選ばれ、即ち、
前記［1］～［12］の何れか1項に記載のポリペプチド複合物、或いは前記［13］～［17］の何れか1項に記載の多重特異性ポリペプチド複合物、或いは前期［18］、［20］、［27］～［35］の何れか1項に記載のドメイン改造抗体、或いは前期［19］、［27］～［35］の何れか1項に記載のドメイン改造抗体のFab断片、或いは前記［21］～［36］の何れか1項に記載の二重特異性抗体、或いは前記［41］に記載のポリペプチド、或いは前記［38］又は［39］に記載の多重特異性抗体、から選ばれる何れかの物質を調製し、
下記工程を含み、即ち、
前記［46］に記載の宿主細胞を培養してから、ポリペプチド複合物、多重特異性ポリペプチド複合物、ドメイン改造抗体、ドメイン改造抗体のFab断片、二重特異性抗体、ポリペプチド又は多重特異性抗体を精製・回収することを含む、調製方法。
［４８］
1種又は複数種の薬学的に許容可能な担体、賦形剤又は希釈剤、及び下記から選ばれ、即ち、
前記［1］～［12］の何れか1項に記載のポリペプチド複合物、或いは前記［13］～［17］の何れか1項に記載の多重特異性ポリペプチド複合物、或いは前期［18］、［20］、［27］～［35］の何れか1項に記載のドメイン改造抗体、或いは前期［19］、［27］～［35］の何れか1項に記載のドメイン改造抗体のFab断片、或いは前記［21］～［36］の何れか1項に記載の二重特異性抗体、或いは前記［38］又は［39］に記載の多重特異性抗体、或いは前記［40］に記載の複合体、から選ばれる何れかの物質を含む、医薬組成物。
［４９］
下記から選ばれ、即ち、前記［1］～［12］の何れか1項に記載のポリペプチド複合物、或いは前記［13］～［17］の何れか1項に記載の多重特異性ポリペプチド複合物、或いは前記［18］、［20］、［27］～［35］の何れか1項に記載のドメイン改造抗体、或いは前記［19］、［27］～［35］の何れか1項に記載のドメイン改造抗体のFab断片、或いは前記［21］～［36］の何れか1項に記載の二重特異性抗体、或いは前記［48］に記載の医薬組成物、或いは前記［38］又は［39］に記載の多重特異性抗体、或いは前記［40］に記載の複合体、から選ばれる何れかの物質の、疾患又は障害を治療又は予防するための薬剤の調製における使用。
［５０］
下記から選ばれ、即ち、
前記［1］～［12］の何れか1項に記載のポリペプチド複合物、或いは前記［13］～［17］の何れか1項に記載の多重特異性ポリペプチド複合物、或いは前記［18］、［20］、［27］～［35］の何れか1項に記載のドメイン改造抗体、或いは前記［19］、［27］～［35］の何れか1項に記載のドメイン改造抗体のFab断片、或いは前記［21］～［36］の何れか1項に記載の二重特異性抗体、或いは前記［38］又は［39］に記載の多重特異性抗体、から選ばれる何れかの物質を検出待ちサンプルに接触させることを含む、検出方法。

Claims (46)

  1. 第1抗原結合部分を含み、前記第1抗原結合部分が、
    A）N末端からC末端までの第1重鎖可変ドメイン（VH1）を含み、前記VH1が第1ドメインに操作可能に連結され、前記第1ドメインがTitin-T鎖を含む第1ポリペプチドと、
    N末端からC末端までの第1軽鎖可変ドメイン（VL1）を含み、前記VL1が第2ドメインに操作可能に連結され、前記第2ドメインがObscurin-O鎖又はObscurin-Like-O鎖を含む第2ポリペプチドと、を含み、
    或いは
    B）N末端からC末端までのVH1を含み、前記VH1が第1ドメインに操作可能に連結され、前記第1ドメインがObscurin-O鎖又はObscurin-Like-O鎖を含む第1ポリペプチドと、
    N末端からC末端までのVL1を含み、前記VL1が第2ドメインに操作可能に連結され、前記第2ドメインがTitin-T鎖を含む第2ポリペプチドと、を含み、
    前記第1抗原結合部分が第1抗原に特異的に結合し、前記第1ドメインが第2ドメインと二量体を形成でき、
    前記第1抗原結合部分のVH1とVL1が第1抗原に特異的に結合する第1抗原結合部位を形成し、前記VH1のC末端が第1ドメインのN末端に操作可能に連結され、前記VL1のC末端が第2ドメインのN末端に操作可能に連結され、
    前記第1ドメインが第2ドメインと天然鎖間結合及び/又は非天然鎖間結合により二量体を形成し、前記非天然鎖間結合が第1ドメインの特定変異残基と第2ドメインの特定変異残基との間に形成され、
    前記Titin-T鎖の配列が、配列番号32に示される通りであり、若しくは配列番号32の配列を基に3、8、11、13、20、22、25、26、39、40、42、45、47、49、56、58、66、70、75、77、79、81、82、83及び84から選ばれる1つ又は複数の部位のアミノ酸変異を更に有し、
    前記Obscurin-O鎖の配列が、配列番号33に示される通りであり、若しくは配列番号33の配列を基に2、3、7、9、11、12、13、14、17、20、22、25、30、32、34、36、41、42、44、45、53、58、62、67、69、76、88、89、92、94及び97から選ばれる1つ又は複数の部位のアミノ酸変異を更に有し、
    前記Obscurin-Like-O鎖の配列が、配列番号34に示される通りであり、若しくは配列番号34の配列を基に6、26、74、77、84及び86から選ばれる1つ又は複数の部位のアミノ酸変異を更に有する配列であり、
    前記Titin-T鎖残基部位が配列番号32の配列に対する自然順番号部位であり、Obscurin-O鎖残基部位が配列番号33の配列に対する自然順番号部位であり、Obscurin-Like-O鎖残基部位が配列番号34の配列に対する自然順番号部位である、
    ポリペプチド複合物。
  2. 前記第1ドメインが第2ドメインと天然鎖間結合により二量体を形成し、
    前記Titin-T鎖における7～15、19～24、26、55、59及び60番目から選ばれる1つ又は複数の残基がObscurin-O鎖における3～6、9、41、73、75及び80～90番目から選ばれる1つ又は複数の残基と互いに結合し、或いは
    前記Titin-T鎖における1、7～10、13～16、19～26、59～60及び96番目から選ばれる1つ又は複数の残基がObscurin-Like-O鎖における4～5、10、12～13、74、76、78及び82～91番目から選ばれる1つ又は複数の残基と互いに結合し、
    前記Titin-T鎖における残基部位が配列番号32の配列に対する自然順番号部位であり、前記Obscurin-O鎖における残基部位が配列番号33の配列に対する自然順番号部位であり、前記Obscurin-Like-O鎖における残基部位が配列番号34の配列に対する自然順番号部位である、請求項1に記載のポリペプチド複合物。
  3. 前記第1ドメインが第2ドメインと少なくとも1つの非天然鎖間結合により二量体を形成し、
    前記非天然鎖間結合が第1ドメインの特定変異残基と第2ドメインの特定変異残基との間に形成され、
    前記変異残基における少なくとも一対がシステイン残基であり、
    前記非天然鎖間結合がジスルフィド結合であり、
    前記二量体が1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10個の非天然鎖間結合を含む、請求項1又は2に記載のポリペプチド複合物。
  4. 前記第1ドメインの特定変異残基と第2ドメインの特定変異残基が下記変異から選ばれ、即ち、
    （A）前記Titin-T鎖が8、20、22、25、26及び39番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖が3、9、25、76及び88番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、或いは、
    （B）前記Titin-T鎖が8、20、22、25、26及び39番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、及び/又は前記Obscurin-Like-O鎖が6、26、74、77、84及び86番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、
    前記Titin-T鎖における変異部位が配列番号32の配列に対する自然順番号部位であり、前記Obscurin-O鎖における変異部位が配列番号33の配列に対する自然順番号部位であり、前記Obscurin-Like-O鎖における変異部位が配列番号34の配列に対する自然順番号部位である、請求項１～3の何れか1項に記載のポリペプチド複合物。
  5. 前記第1ドメインの特定変異残基と第2ドメインの特定変異残基が下記変異から選ばれ、即ち、
    （A）前記Titin-T鎖がA8C、V20C、T22C、C25S、A26C及びC39Tから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖がA3C、R9C、C25S、C76S及びA88Cから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、或いは
    （B）前記Titin-T鎖がA8C、V20C、T22C、C25S、A26C及びC39Tから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、及び/又は前記Obscurin-Like-O鎖がC6E、C26S、C77S、V74C、G84C及びA86Cから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、
    前記Titin-T鎖における変異部位が配列番号32の配列に対する自然順番号部位であり、前記Obscurin-O鎖における変異部位が配列番号33の配列に対する自然順番号部位であり、前記Obscurin-Like-O鎖における変異部位が配列番号34の配列に対する自然順番号部位である、請求項１～４の何れか1項に記載のポリペプチド複合物。
  6. 前記第1ドメインの変異残基と第2ドメインの変異残基が下記変異から選ばれ、即ち、
    Titin-T鎖がC25S、C39T及びA8C変異を有し、且つObscurin-O鎖がA88C変異を有し、
    Titin-T鎖がC25S、C39T及びV20C変異を有し、且つObscurin-O鎖がA3C変異を有し、
    Titin-T鎖がC25S、C39T及びA26C変異を有し、且つObscurin-O鎖がR9C変異を有し、
    Titin-T鎖がC25S、C39T及びA8C変異を有し、且つObscurin-O鎖がC25S、C76S及びA88C変異を有し、
    Titin-T鎖がC25S、C39T及びV20C変異を有し、且つObscurin-O鎖がC25S、C76S及びA3C変異を有し、
    Titin-T鎖がC25S、C39T及びA26C変異を有し、且つObscurin-O鎖がC25S、C76S及びR9C変異を有し、
    Titin-T鎖がC25S、C39T及びA8C変異を有し、且つObscurin-Like-O鎖がC6E及びV74C変異を有し、
    Titin-T鎖がC25S、C39T及びV20C変異を有し、且つObscurin-Like-O鎖がC6E及びG84C変異を有し、
    Titin-T鎖がC25S、C39T及びT22C変異を有し、且つObscurin-Like-O鎖がC6E及びA86C変異を有し、
    Titin-T鎖がC25S、C39T及びA8C変異を有し、且つObscurin-Like-O鎖がC6E、C26S、C77S及びV74C変異を有し、
    Titin-T鎖がC25S、C39T及びV20C変異を有し、且つObscurin-Like-O鎖がC6E、C26S、C77S及びG84C変異を有し、或いは
    Titin-T鎖がC25S、C39T及びT22C変異を有し、且つObscurin-Like-O鎖がC6E、C26S、C77S及びA86C変異を有し、
    Titin-T鎖変異部位が配列番号32の配列に対する自然順番号部位であり、Obscurin-O鎖変異部位が配列番号33の配列に対する自然順番号部位であり、Obscurin-Like-O鎖変異部位が配列番号34の配列に対する自然順番号部位である、請求項１～５の何れか1項に記載のポリペプチド複合物。
  7. 前記Obscurin-O鎖が7、11、62番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を更に有し、
    Obscurin-O鎖変異部位が配列番号33の配列に対する自然順番号部位である、請求項4～6の何れか1項に記載のポリペプチド複合物。
  8. 前記Obscurin-O鎖がL7R又はL7K、T62K又はT62H、及びK11Lから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、
    Obscurin-O鎖変異部位が配列番号33の配列に対する自然順番号部位である、請求項4～7の何れか1項に記載のポリペプチド複合物。
  9. 前記Titin-T鎖がC25S、C39T及びA8C変異を有し、且つObscurin-O鎖がC25S、C76S、A88C、L7K及びT62K変異を有し、
    Titin-T鎖がC25S、C39T及びA8C変異を有し、且つObscurin-O鎖がC25S、C76S、A88C、L7K及びT62H変異を有し、
    Titin-T鎖がC25S、C39T及びA8C変異を有し、且つObscurin-O鎖がC25S、C76S、A88C、K11L及びT62K変異を有し、或いは
    Titin-T鎖がC25S、C39T及びA8C変異を有し、且つObscurin-O鎖がC25S、C76S、A88C、K11L及びT62Hを有し、
    Titin-T鎖変異部位が配列番号32の配列に対する自然順番号部位であり、Obscurin-O鎖変異部位が配列番号33の配列に対する自然順番号部位である、請求項4～8の何れか1項に記載のポリペプチド複合物。
  10. 前記第1ドメインと第2ドメインが下記から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、即ち、
    Titin-T鎖が3、11、13、22、40、42、45、47、49、56、58、66、70、75、77、79、81、82、83及び84番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸変異を有し、及び/又はObscurin-O鎖が2、11、12、13、14、17、20、22、30、32、34、36、41、42、44、45、53、58、62、67、69、89、92、94及び97番目から選ばれる1つ又は複数のアミノ酸変異を有し、
    前記Titin-T鎖変異部位が配列番号35の配列に対する自然順番号部位であり、Obscurin-O鎖変異部位が配列番号50の配列に対する自然順番号部位である、請求項1～9の何れか1項に記載のポリペプチド複合物。
  11. 前記第1ドメインと第2ドメインが下記から選ばれる1つ又は複数の残基変異を有し、即ち、
    Titin-T鎖がP3W、S11I、I13L、T22M、G40S、R42K、H45S、Q47E、Q49G、N56S、D58E、M66S又はM66K、K70R、L75V、T77S、S79T、G81R、N82M、E83D及びF84Lから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸変異を有し、及び/又はObscurin-O鎖がG2E、L11K、A12S、F13Y、V14T、V17E、D20L、T22M又はT22S、N30D、T32P、Q34E、S36T、Q41K、Q42L、V44I、A45T、A53L、L58V、K62E、A67Q又はA67T、G69S、V89L、Q92E、D94G及びA97Gから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸変異を有し、
    前記Titin-T鎖変異部位が配列番号35の配列に対する自然順番号部位であり、Obscurin-O鎖変異部位が配列番号50の配列に対する自然順番号部位である、請求項1～10の何れか1項に記載のポリペプチド複合物。
  12. 前記Titin-T鎖がM66S及びT77Sアミノ酸変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖がL11K、A12S、F13Y、V14T及びT22Sアミノ酸変異を有し、
    前記Titin-T鎖がM66K、K70R、S79T及びG81Rアミノ酸変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖がG2E、V17E、N30D、T32P、Q34E、S36T、V44I、A45T、L58V、K62E、A67Q、G69S及びA97Gアミノ酸変異を有し、
    前記Titin-T鎖がP3W、S11I、I13L、T22M及びN82Mアミノ酸変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖がD20L、T22M及びA53Lアミノ酸変異を有し、
    前記Titin-T鎖がS11I、M66K、S79T及びG81Rアミノ酸変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖がQ41K、A45T、A67Q、G69S及びV89Lアミノ酸変異を有し、
    前記Titin-T鎖がG40S、R42K、H45S、Q47E、Q49G、N56S、D58E、L75V、E83D及びF84Lアミノ酸変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖がQ42L、A45T、A67T、G69S、Q92E及びD94Gアミノ酸変異を有し、
    前記Titin-T鎖がQ47E、Q49G、N56S、D58E及びL75Vアミノ酸変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖がQ42L、A45T、A67T、G69S、Q92E及びD94Gアミノ酸変異を有し、
    前記Titin-T鎖がN56S、D58E及びL75Vアミノ酸変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖がQ42L、A45T、A67T、G69S、Q92E及びD94Gアミノ酸変異を有し、或いは
    前記Titin-T鎖がN56S、D58E、M66S及びT77Sアミノ酸変異を有し、及び/又は前記Obscurin-O鎖がA12S、F13Y、T22S、Q42L、A45T、A67Q、G69S、Q92E及びD94Gアミノ酸変異を有し、
    前記Titin-T鎖変異部位が配列番号35の配列に対する自然順番号部位であり、Obscurin-O鎖変異部位が配列番号50の配列に対する自然順番号部位である、請求項1～11の何れか1項に記載のポリペプチド複合物。
  13. 前記VH1が第1連結ドメインにより第1ドメインに操作可能に連結され、前記VL1が第2連結ドメインにより第2ドメインに操作可能に連結され、
    前記第1連結ドメイン及び/又は前記第2連結ドメインが下記から選ばれ、即ち、Titin-T鎖のN末端断片、Obscurin-O鎖のN末端断片、Obscurin-Like-O鎖のN末端断片、及び（GxS）yコネクソン（但し、Xが1～5の整数から選ばれ、Yが1～6の整数から選ばれる）から選ばれる、請求項1～12の何れか1項に記載のポリペプチド複合物。
  14. 前記第1連結ドメイン及び/又は前記第2連結ドメインが下記ポリペプチド断片、即ち、「KAGIR」、「DQPQF」、（G4S）1及び（G4S）2から選ばれる、請求項13に記載のポリペプチド複合物。
  15. 前記第1ドメインがTitin-T鎖であり、前記第1連結ドメインがKAGIRポリペプチドであり、前記第2ドメインがObscurin-O鎖であり、前記第2連結ドメインがDQPQFポリペプチドであり、或いは
    前記第2ドメインがTitin-T鎖であり、前記第2連結ドメインがKAGIRポリペプチドであり、前記第1ドメインがObscurin-O鎖であり、前記第1連結ドメインがDQPQFポリペプチドである、請求項13又は14に記載のポリペプチド複合物。
  16. （A）前記Titin-T鎖の配列が、配列番号32に示される通りであり、若しくはA8C、V20C、T22C、C25S、A26C、C39T、P3W、S11I、I13L、T22M、G40S、R42K、H45S、Q47E、Q49G、N56S、D58E、M66S又はM66K、K70R、L75V、T77S、S79T、G81R、N82M、E83D及びF84Lから選ばれる1つ又は複数の部位のアミノ酸変異を有し、及び/又はN末端にKAGIRアミノ酸残基を付加する配列であり、及び/又は
    （B）前記Obscurin-O鎖の配列が、配列番号33に示される通りであり、若しくはA3C、R9C、C25S、C76S、A88C、L7K、T62K又はT62H、G2E、L11K、A12S、F13Y、V14T、V17E、D20L、T22M又はT22S、N30D、T32P、Q34E、S36T、Q41K、Q42L、V44I、A45T、A53L、L58V、T62E、A67Q又はA67T、G69S、V89L、Q92E、D94G及びA97Gから選ばれる1つ又は複数の部位のアミノ酸変異を有し、及び/又はN末端にDQPQFアミノ酸残基を付加する配列であり、或いは
    前記Obscurin-Like-O鎖の配列が、配列番号34に示される通りであり、若しくはC6E、C26S、C77S、V74C、G84C及びA86Cから選ばれる1つ又は複数の部位のアミノ酸変異を有する配列であり、
    前記Titin-T鎖変異部位が配列番号32の配列の自然順番号部位であり、Obscurin-O鎖変異部位が配列番号33の配列の自然順番号部位であり、Obscurin-Like-O鎖変異部位が配列番号34の配列の自然順番号部位である、請求項1～15の何れか1項に記載のポリペプチド複合物。
  17. A）前記Titin-T鎖が、配列番号32の配列を基にA8C、V20C、T22C、C25S、A26C及びC39Tから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、前記Titin-T鎖変異部位が配列番号32の配列の自然順番号部位であり、或いは
    前記Titin-T鎖が、配列番号35の配列を基にP3W、S11I、I13L、T22M、G40S、R42K、H45S、Q47E、Q49G、N56S、D58E、M66S、M66K、K70R、L75V、T77S、S79T、G81R、N82M、E83D及びF84Lから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸変異を有し、前記Titin-T鎖変異部位が配列番号35の配列の自然順番号部位であり、及び/又は
    B）前記Obscurin-O鎖が、配列番号33の配列を基にA3C、R9C、C25S、C76S及びA88Cから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、前記Obscurin-O鎖変異部位が配列番号33の配列の自然順番号部位であり、或いは
    前記Obscurin-O鎖が、配列番号45の配列を基にL7K又はL7R、T62K又はT62H、及びK11Lから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、前記Obscurin-O鎖変異部位が配列番号45の配列の自然順番号部位であり、或いは
    前記Obscurin-O鎖が、配列番号50の配列を基にG2E、L11K、A12S、F13Y、V14T、V17E、D20L、T22M又はT22S、N30D、T32P、Q34E、S36T、Q41K、Q42L、V44I、A45T、A53L、L58V、K62E、A67Q又はA67T、G69S、V89L、Q92E、D94G及びA97Gから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸変異を有し、前記Obscurin-O鎖変異部位が配列番号50の配列の自然順番号部位であり、
    或いは
    A）前記Titin-T鎖が、配列番号32の配列を基にA8C、V20C、T22C、C25S、A26C及びC39Tから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、前記Titin-T鎖変異部位が配列番号32の配列の自然順番号部位であり、或いは
    前記Titin-T鎖が、配列番号35の配列を基にP3W、S11I、I13L、T22M、G40S、R42K、H45S、Q47E、Q49G、N56S、D58E、M66S、M66K、K70R、L75V、T77S、S79T、G81R、N82M、E83D及びF84Lから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸変異を有し、前記Titin-T鎖変異部位が配列番号35の配列の自然順番号部位であり、及び/又は
    B）前記Obscurin-Like-O鎖が、配列番号34の配列を基にC6E、C26S、C77S、V74C、G84C及びA86Cから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、前記Obscurin-Like-O鎖変異部位が配列番号34の配列の自然順番号部位である、請求項1～16の何れか1項に記載のポリペプチド複合物。
  18. 前記Titin-T鎖が配列番号32、35～41、65～76の何れか1つに示される配列、又は配列番号32、35～41、65～76の何れか1つの配列と少なくとも90%の同一性を有する配列を含み、及び/又は前記Obscurin-O鎖が配列番号33、42～58、77～86の何れか1つに示される配列又は配列番号33、42～58、77～86の何れか1つの配列と少なくとも90%の同一性を有する配列を含み、或いは
    前記Titin-T鎖が配列番号32、35～41、65～76の何れか1つに示される配列、又は配列番号32、35～41、65～76の何れか1つの配列と少なくとも90%の同一性を有する配列を含み、及び/又は前記Obscurin-Like-O鎖が配列番号34、59～64の何れか1つに示される配列、又は配列番号34、59～64の何れか1つの配列と少なくとも90%の同一性を有する配列を含む、請求項1～17の何れか1項に記載のポリペプチド複合物。
  19. 前記Titin-T鎖が配列番号68に示される配列を含み、且つ前記Obscurin-O鎖が配列番号80に示される配列を含み、
    前記Titin-T鎖が配列番号73に示される配列を含み、且つ前記Obscurin-O鎖が配列番号83に示される配列を含み、
    前記Titin-T鎖が配列番号76に示される配列を含み、且つ前記Obscurin-O鎖が配列番号84に示される配列を含み、
    前記Titin-T鎖が配列番号76に示される配列を含み、且つ前記Obscurin-O鎖が配列番号86に示される配列を含み、或いは
    前記Titin-T鎖が配列番号75に示される配列を含み、且つ前記Obscurin-O鎖が配列番号86に示される配列を含む、請求項1～18の何れか1項に記載のポリペプチド複合物。
  20. 前記第1抗原が外因性抗原、内因性抗原、自己抗原、新生抗原、ウイルス抗原及び腫瘍抗原から選ばれる、請求項1～19の何れか1項に記載のポリペプチド複合物。
  21. 前記ポリペプチド複合物が、請求項1～20の何れか1項で定義される第1抗原結合部分を含む、ドメイン改造抗体、又はそのFab断片である、請求項1～20の何れか1項に記載のポリペプチド複合物。
  22. 請求項1～21の何れか1項に記載のポリペプチド複合物であり、第1抗原に特異的に結合する第1ポリペプチド複合物と、
    第2抗原結合部分を含み、第2抗原に特異的に結合する第2ポリペプチド複合物と、を含み、
    前記第1ポリペプチド複合物と第2ポリペプチド複合物が異なる2つの抗原に結合し、又は同じ抗原における異なる2つのエピトープに結合し、
    前記第2ポリペプチド複合物が第2重鎖可変ドメイン（VH2）と第2軽鎖可変ドメイン（VL2）とを含み、前記第1ポリペプチド複合物のVH1と第2ポリペプチド複合物のVL2との間、及び/又は第2ポリペプチド複合物のVH2と第1ポリペプチド複合物のVL1との間にミスマッチが起きにくい、多重特異性ポリペプチド複合物。
  23. 前記第2ポリペプチド複合物の第2抗原結合部分が、
    N末端からC末端までのVH2を含み、前記VH2が第3ドメインに操作可能に連結され、前記第3ドメインがCH1を含む第3ポリペプチドと、
    N末端からC末端までのVL2を含み、前記VL2が第4ドメインに操作可能に連結され、前記第4ドメインがCLを含む第4ポリペプチドと、を含み、
    前記VH2のC末端がCH1のN末端に操作可能に連結され、前記VL2のC末端がCLのN末端に操作可能に連結される、請求項22に記載のポリペプチド複合物。
  24. 前記第1ポリペプチド複合物が第1二量化ドメインを更に含み、前記第2ポリペプチド複合物が第2二量化ドメインを更に含み、前記第1二量化ドメインが第2二量化ドメインに結合し、
    前記第1ポリペプチド複合物の第1ドメインのC末端が第1二量化ドメインのN末端に操作可能に連結され、前記第2ポリペプチド複合物の第3ドメインのC末端が第2二量化ドメインのN末端に操作可能に連結する、請求項22又は23に記載のポリペプチド複合物。
  25. 前記第1二量化ドメインが下記から選ばれる方式により、即ち、抗体ヒンジ領域又はその一部、コネクソン、ジスルフィド結合、水素結合、静電相互作用、塩橋、疎水-親水相互作用、又はこれらの組合せから選ばれる方式により、第2二量化ドメインに結合し、
    抗体ヒンジ領域又はその一部が、IgG1、IgG2、IgG3又はIgG4のヒンジ領域又はその一部である、請求項24に記載のポリペプチド複合物。
  26. 前記第1二量化ドメインが抗体CH2ドメイン及び/又は抗体CH3ドメインを含み、及び/又は前記第2二量化ドメインが抗体CH2ドメイン及び/又は抗体CH3ドメインを含み、
    前記抗体CH2ドメイン及び/又は抗体CH3ドメインがIgG1、IgG2、IgG3又はIgG4に由来する、請求項24または25に記載のポリペプチド複合物。
  27. 前記第1二量化ドメインが第2二量化ドメインと異なり、ホモ二量化を阻止する方式及び/又はヘテロ二量化を促進する方式により結合し、
    前記第1二量化ドメインが下記から選ばれる方式により、即ち、knob-into-hole、疎水相互作用、静電相互作用、親水相互作用、又は柔軟性を向上させる方式から選ばれる方式により、第2二量化ドメインに結合する、請求項24～26の何れか1項に記載のポリペプチド複合物。
  28. 前記第1二量化ドメインが配列番号2に示される配列における104～330番目のアミノ酸残基を有し、且つ前記第2二量化ドメインが配列番号3に示される配列における104～330番目のアミノ酸残基を有し、或いは
    前記第1二量化ドメインが配列番号3に示される配列における104～330番目のアミノ酸残基を有し、且つ前記第2二量化ドメインが配列番号2に示される配列における104～330番目のアミノ酸残基を有する、請求項24～27の何れか1項に記載のポリペプチド複合物。
  29. 第1抗原に特異的に結合する第1重鎖と第1軽鎖を含み、第2抗原に特異的に結合する第2重鎖と第2軽鎖を更に含み、
    前記第1重鎖のCH1ドメインがObscurin-O鎖で取り替えられ、前記第1軽鎖のCLドメインがTitin-T鎖で取り替えられ、
    前記第1軽鎖のCLドメインがObscurin-O鎖で取り替えられ、前記第1重鎖のCH1ドメインがTitin-T鎖で取り替えられ、
    前記第1重鎖のCH1ドメインがObscurin-Like-O鎖で取り替えられ、前記第1軽鎖のCLドメインがTitin-T鎖で取り替えられ、或いは
    前記第1軽鎖のCLドメインがObscurin-Like-O鎖で取り替えられ、前記第1重鎖のCH1ドメインがTitin-T鎖で取り替えられ、
    前記第1抗原が第2抗原と異なり、又は前記第1抗原と第2抗原が同じ抗原における異なる2つのエピトープであり、
    前記第1重鎖が第1重鎖可変領域（VH1）を含み、前記第1軽鎖が第1軽鎖可変領域（VL1）を含み、前記VH1とVL1が第1抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、且つ
    前記VH1のC末端がTitin-T鎖のN末端に操作可能に連結され、前記VL1のC末端がObscurin-O鎖又はObscurin-Like-O鎖のN末端に操作可能に連結され、或いは
    前記VL1のC末端がTitin-T鎖のN末端に操作可能に連結され、前記VH1のC末端がObscurin-O鎖又はObscurin-Like-O鎖のN末端に操作可能に連結され、
    前記第1ドメインが第2ドメインと天然鎖間結合及び/又は少なくとも1つの非天然鎖間結合により二量体を形成し、
    前記非天然鎖間結合が第1ドメインの特定変異残基と第2ドメインの特定変異残基との間に形成され、前記変異残基における少なくとも一対がシステイン残基であり、
    前記非天然鎖間結合がジスルフィド結合であり、
    前記第1ドメインの特定変異残基と第2ドメインの特定変異残基が下記変異から選ばれ、即ち、
    （A）前記Titin-T鎖の配列が、配列番号32に示される通りであり、若しくは配列番号32の配列を基に3、8、11、13、20、22、25、26、39、40、42、45、47、49、56、58、66、70、75、77、79、81、82、83及び84から選ばれる1つ又は複数の部位のアミノ酸変異を更に有し、及び／又は
    （B）前記Obscurin-O鎖の配列が、配列番号33に示される通りであり、若しくは配列番号33の配列を基に2、3、7、9、11、12、13、14、17、20、22、25、30、32、34、36、41、42、44、45、53、58、62、67、69、76、88、89、92、94及び97から選ばれる1つ又は複数の部位のアミノ酸変異を更に有し、または
    前記Obscurin-Like-O鎖の配列が、配列番号34に示される通りであり、若しくは配列番号34の配列を基に6、26、74、77、84及び86から選ばれる1つ又は複数の部位のアミノ酸変異を更に有する配列であり、
    前記Titin-T鎖変異部位が配列番号32の配列の自然順番号部位であり、Obscurin-O鎖変異部位が配列番号33の配列に対する自然順番号部位であり、Obscurin-Like-O鎖変異部位が配列番号34の配列に対する自然順番号部位である、請求項1～21の何れか1項に定義される第1抗原結合部分を含む二重特異性抗体。
  30. （A）前記Titin-T鎖の配列が、配列番号32に示される通りであり、若しくは配列番号32の配列を基にA8C、V20C、T22C、C25S、A26C、C39T、P3W、S11I、I13L、T22M、G40S、R42K、H45S、Q47E、Q49G、N56S、D58E、M66S又はM66K、K70R、L75V、T77S、S79T、G81R、N82M、E83D及びF84Lから選ばれる1つ又は複数の部位のアミノ酸変異を有し、及び/又はN末端にKAGIRアミノ酸残基を付加する配列であり、及び/又は
    （B）前記Obscurin-O鎖の配列が、配列番号33に示される通りであり、若しくは配列番号33の配列を基にA3C、R9C、C25S、C76S、A88C、L7K、T62K又はT62H、G2E、L11K、A12S、F13Y、V14T、V17E、D20L、T22M又はT22S、N30D、T32P、Q34E、S36T、Q41K、Q42L、V44I、A45T、A53L、L58V、T62E、A67Q又はA67T、G69S、V89L、Q92E、D94G及びA97Gから選ばれる1つ又は複数の部位のアミノ酸変異を有し、及び/又はN末端にDQPQFアミノ酸残基を付加する配列であり、或いは
    前記Obscurin-Like-O鎖の配列が、配列番号34の配列を基にC6E、C26S、C77S、V74C、G84C及びA86Cから選ばれる1つ又は複数の部位のアミノ酸変異を有する配列であり、
    前記Titin-T鎖変異部位が配列番号32の配列の自然順番号部位であり、Obscurin-O鎖変異部位が配列番号33の配列の自然順番号部位であり、Obscurin-Like-O鎖変異部位が配列番号34の配列の自然順番号部位である、請求項２９に記載の二重特異性抗体。
  31. A）前記Titin-T鎖が、配列番号32の配列を基にA8C、V20C、T22C、C25S、A26C及びC39Tから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、前記Titin-T鎖変異部位が配列番号32の配列の自然順番号部位であり、或いは
    前記Titin-T鎖が、配列番号35の配列を基にP3W、S11I、I13L、T22M、G40S、R42K、H45S、Q47E、Q49G、N56S、D58E、M66S、M66K、K70R、L75V、T77S、S79T、G81R、N82M、E83D及びF84Lから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸変異を有し、前記Titin-T鎖変異部位が配列番号35の配列の自然順番号部位であり、及び/又は
    B）前記Obscurin-O鎖が、配列番号33の配列を基にA3C、R9C、C25S、C76S及びA88Cから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、前記Obscurin-O鎖変異部位が配列番号33の配列の自然順番号部位であり、或いは
    前記Obscurin-O鎖が、配列番号45の配列を基にL7K又はL7R、T62K又はT62H、及びK11Lから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、前記Obscurin-O鎖変異部位が配列番号45の配列の自然順番号部位であり、或いは
    前記Obscurin-O鎖が、配列番号50の配列を基にG2E、L11K、A12S、F13Y、V14T、V17E、D20L、T22M又はT22S、N30D、T32P、Q34E、S36T、Q41K、Q42L、V44I、A45T、A53L、L58V、K62E、A67Q又はA67T、G69S、V89L、Q92E、D94G及びA97Gから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸変異を有し、前記Obscurin-O鎖変異部位が配列番号50の配列の自然順番号部位であり、
    或いは
    A）前記Titin-T鎖が、配列番号32の配列を基にA8C、V20C、T22C、C25S、A26C及びC39Tから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、前記Titin-T鎖変異部位が配列番号32の配列の自然順番号部位であり、或いは
    前記Titin-T鎖が、配列番号35の配列を基にP3W、S11I、I13L、T22M、G40S、R42K、H45S、Q47E、Q49G、N56S、D58E、M66S、M66K、K70R、L75V、T77S、S79T、G81R、N82M、E83D及びF84Lから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸変異を有し、前記Titin-T鎖変異部位が配列番号35の配列の自然順番号部位であり、及び/又は
    B）前記Obscurin-Like-O鎖が、配列番号34の配列を基にC6E、C26S、C77S、V74C、G84C及びA86Cから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸残基変異を有し、前記Obscurin-Like-O鎖変異部位が配列番号34の配列の自然順番号部位である、請求項29に記載の二重特異性抗体。
  32. 前記Titin-T鎖が配列番号32、35～41、65～76の何れか1つに示される配列、又は配列番号32、35～41、65～76の何れか1つの配列と少なくとも90%の同一性を有する配列を含み、及び/又は前記Obscurin-O鎖が配列番号33、42～58、77～86の何れか1つに示される配列又は配列番号33、42～58、77～86の何れか1つの配列と少なくとも90%の同一性を有する配列を含み、或いは
    前記Titin-T鎖が配列番号32、35～41、65～76の何れか1つに示される配列、又は配列番号32、35～41、65～76の何れか1つの配列と少なくとも90%の同一性を有する配列を含み、及び/又は前記Obscurin-Like-O鎖が配列番号34、59～64の何れか1つに示される配列、又は配列番号34、59～64の何れか1つの配列と少なくとも90%の同一性を有する配列を含む、請求項29～31に記載の二重特異性抗体。
  33. 前記Titin-T鎖が配列番号68に示される配列を含み、且つ前記Obscurin-O鎖が配列番号80に示される配列を含み、
    前記Titin-T鎖が配列番号73に示される配列を含み、且つ前記Obscurin-O鎖が配列番号83に示される配列を含み、
    前記Titin-T鎖が配列番号76に示される配列を含み、且つ前記Obscurin-O鎖が配列番号84に示される配列を含み、
    前記Titin-T鎖が配列番号76に示される配列を含み、且つ前記Obscurin-O鎖が配列番号86に示される配列を含み、或いは
    前記Titin-T鎖が配列番号75に示される配列を含み、且つ前記Obscurin-O鎖が配列番号86に示される配列を含む、請求項29～32に記載の二重特異性抗体。
  34. 前記第2重鎖がN末端からC末端までの第2重鎖可変領域（VH2）を含み、前記VH2がCH1に操作可能に連結され、前記第2軽鎖がN末端からC末端までの第2軽鎖可変領域（VL2）を含み、前記VL2がCLに操作可能に連結され、
    前記VH2とVL2が第2抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、前記VH2のC末端がCH1のN末端に操作可能に連結され、前記VL2のC末端がCLのN末端に操作可能に連結される、請求項29～33の何れか1項に記載の二重特異性抗体。
  35. 前記第1重鎖と第2重鎖のC末端がCH2及び/又はCH3ドメインを含み、
    前記CH1、CH2及びCH3ドメインがIgG1、IgG2、IgG3又はIgG4に由来し、
    前記第1重鎖が下記から選ばれる方式により、即ち、抗体ヒンジ領域又はその一部、コネクソン、ジスルフィド結合、水素結合、静電相互作用、塩橋、疎水-親水相互作用、又はこれらの組合せから選ばれる方式により、第2重鎖に結合する、請求項34に記載の二重特異性抗体。
  36. 前記第1重鎖は、N末端からC末端までの順で、VH1-L1-Titin-T鎖-L2-CH2-CH3であり、
    前記第1軽鎖は、N末端からC末端までの順で、VL1-L3-Obscurin-O鎖又はVL1-L4-Obscurin-Like-O鎖であり、
    前記第2重鎖は、N末端からC末端までの順で、VH2-CH1-CH2-CH3であり、
    前記第2軽鎖は、N末端からC末端までの順で、VL2-CLであり、
    或いは、
    前記第1軽鎖は、N末端からC末端までの順で、VL1-L1-Titin-T鎖であり、
    前記第1重鎖は、N末端からC末端までの順で、VH1-L2-Obscurin-O鎖-L3-CH2-CH3、又はVH1-L4-Obscurin-Like-O鎖-L5-CH2-CH3であり、
    前記第2重鎖は、N末端からC末端までの順で、VH2-CH1-CH2-CH3であり、
    前記第2軽鎖は、N末端からC末端までの順で、VL2-CLであり、
    前記L1～L5がスペーサー領域であり、スペーサー領域が存在してもよく、又は存在しなくてもよく、
    前記スペーサー領域が下記から選ばれ、即ち、Titin-T鎖のN末端断片、Obscurin-O鎖のN末端断片、Obscurin-Like-O鎖のN末端断片、又は（GxS）yコネクソン（但し、Xが1～5の整数から選ばれ、Yが1～6の整数から選ばれる）から選ばれる、請求項35に記載の二重特異性抗体。
  37. 前記スペーサー領域が下記から選ばれ、即ち、「KAGIR」、「DQPQF」、（G4S）1及び（G4S）2から選ばれる、請求項36に記載の二重特異性抗体。
  38. 前記第1重鎖のCH2及びCH3と第2重鎖のCH2及びCH3が異なり、ホモ二量化を阻止する方式及び/又はヘテロ二量化を促進する方式により結合し、
    前記第1重鎖が下記から選ばれる方式により、即ち、knob-into-hole、疎水相互作用、静電相互作用、親水相互作用、又は柔軟性を向上させる方式から選ばれる方式により、第2重鎖に結合する、
    請求項36または37に記載の二重特異性抗体。
  39. 前記第1重鎖のCH2及びCH3が配列番号2に示される配列における104～330番目のアミノ酸残基を有し、前記第2重鎖のCH2及びCH3が配列番号3に示される配列における104～330番目のアミノ酸残基を有し、或いは
    前記第1重鎖のCH2及びCH3が配列番号3に示される配列における104～330番目のアミノ酸残基を有し、前記第2重鎖のCH2及びCH3が配列番号2に示される配列における104～330番目のアミノ酸残基を有する、請求項38に記載の二重特異性抗体。
  40. 下記A～Iの何れか1項に記載の二重特異性抗体から選ばれ、即ち、
    A）第1重鎖の配列が配列番号89に示される通りであり、若しくは配列番号89と少なくとも90%の配列同一性を有し、第1軽鎖の配列が配列番号90に示される通りであり、若しくは配列番号90と少なくとも90%の配列同一性を有し、第2重鎖の配列が配列番号87に示される通りであり、若しくは配列番号87と少なくとも90%の配列同一性を有し、第2軽鎖の配列が配列番号88に示される通りであり、若しくは配列番号88と少なくとも90%の配列同一性を有する二重特異性抗体と、
    B）第1重鎖の配列が配列番号93に示される通りであり、若しくは配列番号93と少なくとも90%の配列同一性を有し、第1軽鎖の配列が配列番号94に示される通りであり、若しくは配列番号94と少なくとも90%の配列同一性を有し、第2重鎖の配列が配列番号91に示される通りであり、若しくは配列番号91と少なくとも90%の配列同一性を有し、第2軽鎖の配列が配列番号92に示される通りであり、若しくは配列番号92と少なくとも90%の配列同一性を有する二重特異性抗体と、
    C）第1重鎖の配列が配列番号97に示される通りであり、若しくは配列番号97と少なくとも90%の配列同一性を有し、第1軽鎖の配列が配列番号98に示される通りであり、若しくは配列番号98と少なくとも90%の配列同一性を有し、第2重鎖の配列が配列番号95に示される通りであり、若しくは配列番号95と少なくとも90%の配列同一性を有し、第2軽鎖の配列が配列番号96に示される通りであり、若しくは配列番号96と少なくとも90%の配列同一性を有する二重特異性抗体と、
    D）第1重鎖の配列が配列番号99に示される通りであり、若しくは配列番号99と少なくとも90%の配列同一性を有し、第1軽鎖の配列が配列番号100に示される通りであり、若しくは配列番号100と少なくとも90%の配列同一性を有し、第2重鎖の配列が配列番号101に示される通りであり、若しくは配列番号101と少なくとも90%の配列同一性を有し、第2軽鎖の配列が配列番号96に示される通りであり、若しくは配列番号96と少なくとも90%の配列同一性を有する二重特異性抗体と、
    E）第1重鎖の配列が配列番号102に示される通りであり、若しくは配列番号102と少なくとも90%の配列同一性を有し、第1軽鎖の配列が配列番号100に示される通りであり、若しくは配列番号100と少なくとも90%の配列同一性を有し、第2重鎖の配列が配列番号95に示される通りであり、若しくは配列番号95と少なくとも90%の配列同一性を有し、第2軽鎖の配列が配列番号96に示される通りであり、若しくは配列番号96と少なくとも90%の配列同一性を有する二重特異性抗体と、
    F）第1重鎖の配列が配列番号103に示される通りであり、若しくは配列番号103と少なくとも90%の配列同一性を有し、第1軽鎖の配列が配列番号104に示される通りであり、若しくは配列番号104と少なくとも90%の配列同一性を有し、第2重鎖の配列が配列番号95に示される通りであり、若しくは配列番号95と少なくとも90%の配列同一性を有し、第2軽鎖の配列が配列番号96に示される通りであり、若しくは配列番号96と少なくとも90%の配列同一性を有する二重特異性抗体と、
    G）第1重鎖の配列が配列番号107に示される通りであり、若しくは配列番号107と少なくとも90%の配列同一性を有し、第1軽鎖の配列が配列番号108に示される通りであり、若しくは配列番号108と少なくとも90%の配列同一性を有し、第2重鎖の配列が配列番号109に示される通りであり、若しくは配列番号109と少なくとも90%の配列同一性を有し、第2軽鎖の配列が配列番号110に示される通りであり、若しくは配列番号110と少なくとも90%の配列同一性を有する二重特異性抗体と、
    H）第1重鎖の配列が配列番号122に示される通りであり、若しくは配列番号122と少なくとも90%の配列同一性を有し、第1軽鎖の配列が配列番号123に示される通りであり、若しくは配列番号123と少なくとも90%の配列同一性を有し、第2重鎖の配列が配列番号116に示される通りであり、若しくは配列番号116と少なくとも90%の配列同一性を有し、第2軽鎖の配列が配列番号117に示される通りであり、若しくは配列番号117と少なくとも90%の配列同一性を有する二重特異性抗体と、
    I）第1重鎖の配列が配列番号118に示される通りであり、若しくは配列番号118と少なくとも90%の配列同一性を有し、第1軽鎖の配列が配列番号119に示される通りであり、若しくは配列番号119と少なくとも90%の配列同一性を有し、第2重鎖の配列が配列番号124に示される通りであり、若しくは配列番号124と少なくとも90%の配列同一性を有し、第2軽鎖の配列が配列番号125に示される通りであり、若しくは配列番号125と少なくとも90%の配列同一性を有する二重特異性抗体と、
    から選ばれる、請求項29～39の何れか1項に記載の二重特異性抗体。
  41. 請求項1～21の何れか1項に記載のポリペプチド複合物、請求項22～28の何れか1項に記載の多重特異性ポリペプチド複合物、または請求項29～40の何れか1項に記載の二重特異性抗体を含む、複合体。
  42. 請求項1～27の何れか1項に記載のポリペプチド複合物、請求項22～28の何れか1項に記載の多重特異性ポリペプチド複合物、または請求項29～40の何れか1項に記載の二重特異性抗体をコードする、核酸分子。
  43. 請求項42に記載の核酸分子を含む、ベクター。
  44. 請求項43に記載のベクターの変換により得られ、原核細胞及び真核細胞から選ばれる、宿主細胞。
  45. 真核細胞が哺乳動物細胞である、請求項44に記載の宿主細胞。
  46. 1種又は複数種の薬学的に許容可能な担体、賦形剤又は希釈剤、及び下記から選ばれ、即ち、
    請求項1～21の何れか1項に記載のポリペプチド複合物、請求項22～28の何れか1項に記載の多重特異性ポリペプチド複合物、または請求項29～40の何れか1項に記載の二重特異性抗体、或いは請求項41に記載の複合体、から選ばれる何れかの物質を含む、医薬組成物。
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