JP7770341B2 - システインプロテアーゼ - Google Patents

Description

本発明は、ＩｇＧシステインプロテアーゼ活性を示す新規ポリペプチド、並びにインビボ及びエクスビボにおけるその使用に関する。ポリペプチドの用途は、ＩｇＧによって媒介される疾患及び病態を予防又は治療する方法、並びにＩｇＧの分析及びインビトロにおけるＦ（ａｂ’）_２断片の作製の方法を含む。

ＩｄｅＳ（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ－ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ｏｆ Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、化膿性連鎖球菌の免疫グロブリンＧ分解酵素、イムリフィダーゼとしても知られている）は、ヒト病原体化膿性連鎖球菌によって産生される細胞外システインプロテアーゼである。ＩｄｅＳは元々Ａ群連鎖球菌株の血清型Ｍ１から単離されたが、現在では試験した全てのＡ群連鎖球菌株においてｉｄｅｓ遺伝子が同定されている。ＩｄｅＳは、並外れて高い程度の基質特異性を有しており、その唯一同定されている基質がＩｇＧである。ＩｄｅＳは、ヒトＩｇＧの全てのサブクラスの重鎖の下部ヒンジ領域において、単一のタンパク質分解切断を触媒する。ＩｄｅＳはまた、様々な動物におけるＩｇＧの幾つかのサブクラスの重鎖の対応する切断も触媒する。ＩｄｅＳは、２段階機序を介してＩｇＧをＦｃ及びＦ（ａｂ’）_２の断片に効率的に切断する。第１段階では、ＩｇＧの１本（第１の）重鎖が切断されて、単一の非共有結合的に結合したＦｃ鎖を有する単一の切断されたＩｇＧ（ｓｃＩｇＧ）分子が作製される。ｓｃＩｇＧ分子は、事実上、元のＩｇＧ分子の残りの（第２の）重鎖を保持する中間生成物である。機序の第２段階では、この第２の重鎖がＩｄｅＳによって切断されて、Ｆ（ａｂ’）_２断片及びホモ二量体Ｆｃ断片が遊離する。これらは、生理学的条件下で一般的に観察される生成物である。ホモ二量体Ｆｃは、その構成モノマーに解離する場合がある。還元条件下では、Ｆ（ａｂ’）_２断片が２つのＦａｂ断片に解離する場合がある。ＩｄｅＳのＩｇＧを切断する能力は、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、及びＦｃの断片を生成する方法においてエクスビボで有用であることが示されており、例えばＩｇＧの分析及びインビトロにおけるＦ（ａｂ’）_２断片の生成のために使用することができる。例えば、国際公開第２００３０５１９１４号及び同第２００９０３３６７０号を参照。ＩｄｅＳはまた、疾患を媒介するか又はその他の理由で望ましくないＩｇＧ分子をインビボで切断することができるので、治療剤としてインビボで有用であることも示されている。例えば、国際公開第２００６１３１３４７号及び同第２０１３１１０９４６号を参照。ＩｄｅＳは、ＩｇＧによって全体的又は部分的に媒介される任意の疾患又は病態の療法として使用することができる。ＩｇＧは、多くの自己免疫病態の病状に加えて、移植された臓器の急性拒絶反応の一因となる。

しかし、ＩｄｅＳは、免疫原性のタンパク質である。すなわち、ＩｄｅＳを治療剤として使用する場合、ＩｄｅＳを投与された被験者の免疫系がそれに対して応答することが多い。ＩｄｅＳに対する免疫系の反応は、通常、ＩｄｅＳに特異的な抗体の産生を伴う。これら抗体は、本明細書において、ＩｄｅＳに特異的な抗薬物抗体（ＡＤＡ）又は「ＩｄｅＳ特異的ＡＤＡ」と称されることもある。一般にはＩｄｅＳに対する免疫応答、具体的にはＩｄｅＳ特異的ＡＤＡの産生は、関連する２種類の問題を引き起こす可能性がある。第一に、例えばＡＤＡの結合に起因してＩｄｅＳの有効性が低下する恐れがあるので、同じ効果を得るためにより高用量又は反復投与が必要になる可能性がある。この効果を有するＡＤＡは、「中和ＡＤＡ」と称されることがある。第二に、ＡＤＡとＩｄｅＳとの免疫複合体によって誘発される過剰な炎症応答等の望ましくない又は更には有害な合併症が生じる恐れがある。所与の被験体におけるＩｄｅＳに特異的なＡＤＡの量が多いほど、これら問題が生じる可能性が高くなる。患者におけるＩｄｅＳ特異的ＡＤＡ分子の存在及び量は、剤特異的ＣＡＰ ＦＥＩＡ（ＩｍｍｕｎｏＣＡＰ）試験又は患者からの血清サンプルに対して行われるタイターアッセイ等の任意の好適な方法によって求めることができる。臨床医が定めた閾値を超えると、患者におけるＩｄｅＳ特異的ＡＤＡ分子の量は、ＩｄｅＳの投与を不可能にしたり、より高用量のＩｄｅＳが必要であることを示したりし得る。このようなより高用量の結果、次に、患者におけるＩｄｅＳ特異的ＡＤＡ分子の量が増加し、それにより、ＩｄｅＳの更なる投与が不可能になる可能性がある。

ＩｄｅＳは、扁桃炎及び連鎖球菌性咽頭炎のような一般的な感染症の原因となる化膿性連鎖球菌の病原因子である。従って、ほとんどのヒト被験体は、この状況でＩｄｅＳに遭遇しており、血中に抗ＩｄｅＳ抗体を有している可能性が高い。通常、ヒト被験体からの血清サンプル（連鎖球菌感染歴があるためである可能性が高い）に加えて、数千人のドナーのプール血清から抽出されたＩｇＧの調製物であるＩＶＩｇ（Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ、静注用免疫グロブリン）調製物では、様々なレベルのＩｄｅＳ特異的ＡＤＡを検出することができる。ＩｄｅＳ特異的ＡＤＡを検出する技術は、当技術分野において公知である。被験体がＩｄｅＳの初回投与前にＩｄｅＳ特異的ＡＤＡを保有していないとしても、その後、そのような分子が産生される可能性が高い。従って、任意の所与の被験体にとって、ＩｄｅＳの免疫原性に関連する問題は、治療としてＩｄｅＳを使用する際の障壁となる可能性が高い。これら問題により、特に反復投与が必要な場合、ＩｄｅＳの用量を増やすことが必要になる及び／又はＩｄｅＳによる治療が完全に不可能になる可能性がある。この種の問題に対する既存のアプローチは、例えば、免疫原性を低下させるために治療剤をＰＥＧ化したり、治療剤を免疫抑制剤と共投与したりすることを伴う。

ＩｄｅＺは、主にウマでみられる細菌であるストレプトコッカス・エクイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）の亜種ズーエピデミカス（ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）によって産生されるＩｇＧシステインプロテアーゼである。ＩｄｅＺは、ＩｄｅＳと約６６％の同一性を有する。ストレプトコッカス・エクイの亜種ズーエピデミカスはヒトの病原体ではないため、ヒトはＩｄｅＺに対する抗体（抗薬物抗体、ＡＤＡ）をより僅かしか又は全く有していない可能性があるので、ＩｄｅＺはＩｄｅＳベースの療法の代替になると考えられた。しかし、特にＩｇＧ２を切断する場合、ＩｄｅＺのヒトＩｇＧに対するＩｇＧシステインプロテアーゼ活性のレベルはＩｄｅＳよりもかなり低い。

従って、ヒトＩｇＧに対して高い活性（好ましくは、野生型ＩｄｅＺよりも高く、更により好ましくはＩｄｅＳよりも高い）を有するＩｄｅＺ由来のシステインプロテアーゼが依然として必要とされている。具体的には、ヒトのＩｇＧ１及びＩｇＧ２に対して高い活性（好ましくは野生型ＩｄｅＺよりも高く、更に好ましくはＩｄｅＳよりも高い）を有するＩｄｅＺ由来のシステインプロテアーゼが依然として必要とされている。

ＩｄｅＳの全配列は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＷＰ＿０１０９２２１６０．１として公的に入手可能であり、本明細書では配列番号６として提供される。この配列は、Ｎ末端のメチオニンに続いて、２８アミノ酸の分泌シグナル配列を含む。Ｎ末端のメチオニン及びシグナル配列（Ｎ末端の合計２９アミノ酸）は、典型的には、成熟ＩｄｅＳタンパク質を形成するために除去され、該タンパク質の配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＤＦ１３９４９．１として公的に入手可能であり、本明細書では配列番号４として提供される。

ＩｄｅＺの全配列は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＷＰ＿０１４６２２７８０．１として公的に入手可能であり、本明細書では配列番号５として提供される。この配列は、Ｎ末端のメチオニンに続いて、３３アミノ酸の分泌シグナル配列を含む。Ｎ末端のメチオニン及びシグナル配列（Ｎ末端の合計３４アミノ酸）は、典型的には、成熟ＩｄｅＺタンパク質を形成するために除去され、該タンパク質の配列は、本明細書では配列番号３として提供される。

本発明者らは、本明細書に記載の通り改変したときにＩｄｅＺと比べてヒトＩｇＧに対するＩｇＧシステインプロテアーゼ活性が増加した新規ポリペプチドをもたらす、ＩｄｅＺの配列内の特定の位置を同定することができた。本発明のポリペプチドの（例えば、ヒトＩｇＧの切断における）ヒトＩｇＧに対するＩｇＧシステインプロテアーゼ活性は、好ましくは、ＩｄｅＳのヒトＩｇＧに対するＩｇＧシステインプロテアーゼ活性と少なくとも同程度高い。本発明のポリペプチドは、特にＩｇＧがＩｇＧ１又はＩｇＧ２のアイソタイプである場合、ＩｄｅＳのＩｇＧシステインプロテアーゼよりもヒトＩｇＧの切断により有効であり得る。本発明のポリペプチドは、特にＩｇＧ１の第２の鎖の切断で測定したとき、ＩｇＧシステインプロテアーゼＩｄｅＳよりもヒトＩｇＧの切断により有効であり得る。本発明のポリペプチドは、ＩｇＧ２よりもＩｇＧ１の切断により有効であり得る。本発明のポリペプチドは、典型的には、ＩｄｅＳよりも免疫原性が低く、好ましくは、免疫原性がＩｄｅＺ程度であってよい。

特に断らない限り、本明細書に開示されるポリペプチドにおけるアミノ酸位置の付番に対する全ての言及は、Ｎ末端から始まる配列番号５における対応する位置の付番に基づく。従って、配列番号１は、配列番号５のＮ末端のメチオニン及び３３アミノ酸のシグナル配列を欠いているので、配列番号１のＮ末端のアスパラギン酸（Ｄ）残基は３５位と称されるが、その理由は、これが配列番号５における対応位置であるためである。この付番スキームを適用すると、ＩｄｅＳのＩｇＧシステインプロテアーゼ活性に最も重要な残基は、配列番号５に対応する１０２位のシステイン（Ｃ）である。ＩｇＧシステインプロテアーゼ活性に重要である可能性が高い他の残基は、配列番号５に対応する９２位のリジン（Ｋ）、２７２位のヒスチジン（Ｈ）、並びに２９４位及び２９６位の２つのアスパラギン酸（Ｄ）である。また、配列番号１のＮ末端の最初の２０残基を欠失させると、この変化が組み込まれたポリペプチドの効力を増強することができる及び／又は効力に悪影響を及ぼすことなく免疫原性を低下させることができることも見出されている。配列番号１のＮ末端の最初の２０残基は、連続配列ＤＤＹＱＲＮＡＴＥＡＹＡＫＥＶＰＨＱＩＴからなる。従って、本発明に係るポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列（連続配列ＤＤＹＱＲＮＡＴＥＡＹＡＫＥＶＰＨＱＩＴを含まない）を含み得る。配列番号１の最初の２０残基は、配列番号５の３５～５４位に対応する。この特定の改変は、本明細書では「Ｄ３５＿Ｔ５４ｄｅｌ」という用語によって特定することができる。従って、配列番号２は、配列番号５のＮ末端のメチオニン、３３アミノ酸シグナル配列を欠いており、更に配列番号５の３５～５４位に対応する配列ＤＤＹＱＲＮＡＴＥＡＹＡＫＥＶＰＨＱＩＴが欠失しているので、配列番号２のＮ末端のセリン（Ｓ）残基は５５位と称されるが、その理由は、これが配列番号５における対応位置であるためである。

従って、一態様では、本発明は、ＩｇＧシステインプロテアーゼ活性を有し、
（ｉ）配列番号１；又は
（ｉｉ）配列番号２；又は
（ｉｉｉ）それぞれ配列番号１若しくは配列番号２に対して１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、若しくは１０個のアミノ酸改変（複数可）を有する配列番号１若しくは配列番号２のバリアント
であるアミノ酸配列を含むか又はからなるポリペプチド、但し、該配列が、（ａ）配列番号５の９５位に対応する位置のアスパラギン（Ｎ）、（ｂ）配列番号５の９９位に対応する位置のアスパラギン酸（Ｄ）、及び（ｃ）配列番号５の２２６位に対応する位置のアスパラギン（Ｎ）を保持しており、かつ同じアッセイで測定したときに、前記ポリペプチドが、それぞれ配列番号１又は２のアミノ酸配列からなるポリペプチドと少なくとも同程度ヒトＩｇＧの切断に有効である、ポリペプチドを提供する。

本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードしているか又は発現しているポリヌクレオチド、発現ベクター、又は宿主細胞を提供する。

本発明はまた、被験体におけるＩｇＧ抗体によって媒介される疾患又は病態を治療又は予防する方法であって、治療的又は予防的に有効な量の本発明のポリペプチドを被験体に投与することを含む方法を提供する。方法は、典型的には、該ポリペプチドを被験体に複数回投与することを含んでいてよい。

本発明はまた、患者、典型的には、ＩｇＧ抗体によって媒介される疾患又は病態に罹患している患者から採取した血液をエクスビボで処理する方法であって、該血液を本発明のポリペプチドと接触させることを含む方法を提供する。

本発明はまた、被験体に対する療法又は治療剤の利益を改善する方法であって、（ａ）本発明のポリペプチドを被験体に投与すること；及び（ｂ）その後、該療法又は該治療剤を被験体に投与することを含み；
－ 該療法が、臓器移植であるか、あるいは該治療剤が、抗体、ウイルスベクター等の遺伝子療法、酵素等の欠陥のある内因性因子の代替物、成長若しくは凝固因子、又は細胞療法であり；
－ 投与される該ポリペプチドの量が、被験体の血漿中に存在する実質的に全てのＩｇＧ分子を切断するのに十分であり；かつ
－ 工程（ａ）及び（ｂ）が、被験体の血漿中に存在する実質的に全てのＩｇＧ分子を切断するのに十分な時間間隔で隔てられている、方法を提供する。

本発明はまた、ＩｇＧを本発明のポリペプチドと、好ましくはエクスビボで接触させることを含む、ＩｇＧのＦｃ、Ｆａｂ、又はＦ（ａｂ’）_２の断片を作製する方法を提供する。

また、本発明に係る方法を実施するためのキットも提供される。

図１は、ｐＣＡＲＴ２３９（Ｎ末端Ｍｅｔ及びＣ末端Ｈｉｓタグを有する配列番号１）の発現及び精製のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。（Ａ）ｐＣＡＲＴ２３９の過剰発現－レーン１及び２は、ＩＰＴＧによる誘導の１時間後に収集した細胞から得られた溶解物を示す；レーン３はプールされた溶解物を示す。（Ｂ）ｐＣＡＲＴ２３９の精製－レーン１は、溶解物中にみられた不純物の除去を示す、ＮｉＮＴＡ精製プロセスからのフロースルーを示し、レーン２及び３は、精製ｐＣＡＲＴ２３９（それぞれ約０．５μｇ及び約３．０μｇのタンパク質をロード）を表す。 図２は、図示する通りＩｇＧ１（ヒュミラ）をＩｄｅＳ及び被験ＩｄｅＺバリアントと共にインキュベートすることによって生成された切断産物を可視化するために使用した代表的なＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの結果を示す。レーンの上方の濃度は、試験したＩｄｅＳ／ＩｄｅＺバリアントの濃度を示す。パネルＡ及びＢは、２つの別々の実験を表す。 図３は、図示する通りＩｇＧ２（ＸＧＥＶＡ）をＩｄｅＳ及び被験ＩｄｅＺバリアントと共にインキュベートすることによって生成された切断産物を可視化するために使用した代表的なＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの結果を示す。レーンの上方の濃度は、試験したＩｄｅＳ／ＩｄｅＺバリアントの濃度を示す。パネルＡ及びＢは、２つの別々の実験を表す。 図４は、図示する通り、（Ａ）ＩｇＧ１（ヒュミラ）、（Ｂ）ＩｇＧ２（ＸＧＥＶＡ）、（Ｃ）ＩｇＧ３、（Ｄ）ＩｇＧ４をＩｄｅＳ及びＮ２４０と共にインキュベートすることによって生成された切断産物を可視化するために使用した代表的なＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの結果を示す。レーンの上方の濃度は、試験したＩｄｅＳ／ＩｄｅＺバリアントの濃度を示す。 図５は、ＩｄｅＳと比較したときのＮ２４０の効力（ＩｇＧ１切断の有効性）を求めるためのアッセイにおける、トリプリケートサンプルからの平均電気化学発光（ＥＣＬ）値の近似タイトレーション曲線を示す。エラーバーは、ＳＤを表す。 図６は、デコイ（ｐＣＡＲＴ２３９の不活性バージョン）の有り無し両方での、ｐＣＡＲＴ２３９による血清ＩｇＧの消化を示す。デコイを使用することで、血清中に存在するＡＤＡの阻害作用を低減することができる。レーンの上方の濃度は、試験したＩｄｅＺバリアントの濃度を示す。 図７は、血清中のＮ２４０及びＩｄｅＳの効力（ＩｇＧ切断の有効性）を求めるためのアッセイにおける、トリプリケートサンプル及び２つの別々の希釈系列からの平均電気化学発光（ＥＣＬ）値の近似タイトレーション曲線を示す。エラーバーは、ＳＤを表す。 図８は、４０人の健常個体からの血清及び１つの正常血清プール（ｎ＝１００）における既存のＮ２４０及びＩｄｅＳ ＡＤＡのレベルに対応する平均ＥＣＬ値を示す。 図９は、本発明のポリペプチドによるＩｇＧの段階的切断を示す概略図を示す。

配列の簡単な説明
配列番号１は、本発明のポリペプチドの塩基配列である。

配列番号２は、配列番号１に関連し、連続配列ＤＤＹＱＲＮＡＴＥＡＹＡＫＥＶＰＨＱＩＴに対応する配列番号１のＮ末端の最初の２０アミノ酸が欠失していることを除いて配列番号１と同一である、本発明の更なるポリペプチドの配列である。

配列番号３は、Ｎ末端メチオニン及びシグナル配列を欠く、ＩｄｅＺの成熟配列である。

配列番号４は、Ｎ末端メチオニン及びシグナル配列を欠く、ＩｄｅＳの成熟配列である。Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＤＦ１３９４９．１としても開示されている。

配列番号５は、Ｎ末端メチオニン及びシグナル配列を含む、ＩｄｅＺの全配列である。ＮＣＢＩ参照配列番号ＷＰ＿０１４６２２７８０．１としても開示されている。

配列番号６は、Ｎ末端メチオニン及びシグナル配列を含む、ＩｄｅＳの全配列である。ＮＣＢＩ参照配列番号ＷＰ＿０１０９２２１６０．１としても開示されている。

配列番号７は、バリアントＩｄｅＺポリペプチドであるｐＣＡＲＴ２０７の配列である。

配列番号８は、バリアントＩｄｅＺポリペプチドであるｐＣＡＲＴ２２９の配列である。

配列番号９は、（グリシンリンカーと共に）追加のＮ末端メチオニン及び追加のＣ末端ヒスチジンタグの存在によって配列番号１に関連する本発明のバリアントＩｄｅＺポリペプチドである、ｐＣＡＲＴ２３９の配列である。

配列番号１０は、追加のＮ末端メチオニンの存在によって配列番号１と関連する本発明のバリアントＩｄｅＺポリペプチドである、Ｎ２４０の配列である。

配列番号１１は、（グリシンリンカーと共に）追加のＮ末端メチオニン及び追加のＣ末端ヒスチジンタグの存在によって配列番号２に関連する本発明のバリアントＩｄｅＺポリペプチドである、ｐＣＡＲＴ２４２の配列である。

配列番号１２は、不活性バリアントＩｄｅＺポリペプチドであるｐＣＡＲＴ２４３の配列である。

配列番号１３は、対照ＩｄｅＳポリペプチドの配列である。（グリシンリンカーと共に）追加のＮ末端メチオニン及びヒスチジンタグを有する配列番号４の配列を含む（内部参照ｐＣＡＲＴ１２４）。

配列番号１４は、対照ＩｄｅＺポリペプチドの配列である。（グリシンリンカーと共に）追加のＮ末端メチオニン及びヒスチジンタグを有する配列番号３の配列を含む（内部参照ｐＣＡＲＴ１４４）。

配列番号１５は、配列番号５の３５～５４位に対応する連続配列ＤＤＹＱＲＮＡＴＥＡＹＡＫＥＶＰＨＱＩＴである。

配列番号１６～２３は、本明細書に開示される特定のポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列である。

発明を実施するための形態
開示される生成物及び方法の様々な用途は、当技術分野における具体的なニーズに応じて調整できることを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は、本発明の特定の実施形態を説明することのみを目的とし、限定を意図するものではないことも理解されたい。

更に、本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用するとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、特に明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。従って、例えば、「ポリペプチド（ａ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」に対する言及は、「複数のポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ）」等を含む。

「ポリペプチド」は、本明細書では、２つ以上のサブユニットアミノ酸、アミノ酸アナログ、又は他のペプチドミメティックの化合物を指すために、その最も広い意味で使用される。従って、用語「ポリペプチド」は、短いペプチド配列を含み、より長いポリペプチド及びタンパク質も含む。本明細書で使用するとき、用語「アミノ酸」とは、Ｄ型又はＬ型の光学異性体の両方を含む天然及び／又は非天然、すなわち合成のアミノ酸、並びにアミノ酸アナログ及びペプチドミメティックを指す。

「患者」及び「被験体」という用語は、互換的に使用され、典型的には、ヒトを指す。ＩｇＧに対する言及は、特に断りのない限り、典型的にはヒトＩｇＧを指す。

上記であろうと下記であろうと、本明細書に引用される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

ポリペプチドの機能的特徴
本発明は、ＩｇＧシステインプロテアーゼ活性を有する新規ポリペプチドであって、ＩｄｅＺよりもヒトＩｇＧの切断により有効であるポリペプチドに関する。本発明のポリペプチドのヒトＩｇＧに対するＩｇＧシステインプロテアーゼ活性は、好ましくは、ＩｄｅＳのヒトＩｇＧに対するＩｇＧシステインプロテアーゼ活性と少なくとも同程度高い。更に、本発明のポリペプチドは、典型的には、ＩｄｅＳよりも免疫原性が低く、好ましくは、免疫原性がＩｄｅＺ程度であってよい。本発明のポリペプチドに対する対照又は比較の文脈において、「ＩｄｅＳ」及び「ＩｄｅＺ」は、それぞれ配列番号４及び３のアミノ酸配列からなるポリペプチドを指す。あるいは又は更に、対照又は比較として使用するとき、「ＩｄｅＳ」及び「ＩｄｅＺ」は、それぞれ配列番号４及び３のアミノ酸配列を含み、標準的な細菌発現系での発現及びそれからの単離を支援するためにＮ末端に追加のメチオニン（Ｍ）残基及び／又はＣ末端にタグを有するポリペプチドを指し得る。好適なタグとしては、ポリペプチドのＣ末端に直接連結されてもよく、任意の好適なリンカー配列、例えば、３つ、４つ、又は５つのグリシン残基によって間接的に連結されてもよいヒスチジンタグが挙げられる。ヒスチジンタグは、典型的には６つのヒスチジン残基からなるが、これよりも典型的には最大７アミノ酸、最大８アミノ酸、最大９アミノ酸、最大１０アミノ酸、又は最大２０アミノ酸長くてもよく、例えば５アミノ酸、４アミノ酸、３アミノ酸、２アミノ酸、又は１アミノ酸短くてもよい。本明細書で対照として使用される例示的なＩｄｅＳポリペプチドの配列を、配列番号１３として提供する。このポリペプチドは、追加のＮ末端メチオニン及びヒスチジンタグを有する配列番号４の配列を含み、本明細書ではｐＣＡＲＴ１２４と称されることもある。本明細書で対照として使用される例示的なＩｄｅＺポリペプチドの配列を、配列番号１４として提供する。このポリペプチドは、追加のＮ末端メチオニン及びヒスチジンタグを有する配列番号３の配列を含み、本明細書ではｐＣＡＲＴ１４４と称されることもある。

ＩｇＧシステインプロテアーゼ活性は、任意の好適な方法によって、例えば、ＩｇＧを含有するサンプルと共にポリペプチドをインキュベートし、ＩｇＧ切断産物の存在を判定することによって評価することができる。有効性は、中和抗体等の阻害剤の存在下又は非存在下で評価することができる。ただし、本明細書における有効性は、典型的には、特に断らない限り、そのような阻害剤の非存在下で評価したときの有効性を意味する。好適な方法については、実施例に記載する。ＩｇＧの切断におけるポリペプチドの有効性は、本明細書ではポリペプチドの「効力」と称されることもある。本発明のポリペプチドの効力は、好ましくは、同じアッセイで測定したＩｄｅＺの効力よりも少なくとも２．０倍高い。本発明のポリペプチドの効力は、同じアッセイで測定したＩｄｅＺの効力よりも少なくとも１．５倍、少なくとも２．０倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３．０倍、少なくとも４．０倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５．０倍、少なくとも６．０倍、少なくとも７．０倍、少なくとも７．５倍、又は少なくとも８．０倍高くてよい。あるいは又は更に、本発明のポリペプチドの効力は、好ましくは、同じアッセイで測定したＩｄｅＳの効力と少なくとも等価である。あるいは又は更に、本発明のポリペプチドの効力は、好ましくは、同じアッセイで測定したＩｄｅＳの効力よりも高い。本発明のポリペプチドの効力は、同じアッセイで測定したＩｄｅＳの効力よりも少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２．０倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３．０倍、少なくとも４．０倍高くてよい。本発明のポリペプチドの効力は、好ましくは、同じアッセイで測定したＩｄｅＳの効力よりも少なくとも２．０倍、より好ましくは少なくとも３．０倍、又は少なくとも４．０倍高い。

本発明のポリペプチドは、典型的には、ＩｄｅＳよりも免疫原性が低く、従って、ＩｄｅＺと比べて増大した効力及び／又はＩｄｅＳと等価な効力が、ヒトＩｇＧに対するシステインプロテアーゼ活性の許容可能な最低水準である。しかし、ＩｄｅＳと比べた効力の増大が望ましい改善である。このような効力の増大により、典型的には、より高用量のＩｄｅＳと同じ治療効果のために、より低用量の本発明のポリペプチドを使用することが可能になるであろう。また、より低用量であることにより、ＩｄｅＳと比べて、本発明のポリペプチドの反復投与回数をより多くすることも可能になる。これは、より低濃度で存在する剤に対しては免疫系が応答する可能性が低いか又は応答が鈍いので、より低用量の使用により、治療剤の免疫原性に関連する問題が低減されるからである。

ＩｇＧの切断におけるポリペプチドの効力を評価するためのアッセイ、すなわち、ポリペプチドの効力を評価するためのアッセイは、当技術分野で周知であり、任意の好適なアッセイを使用してよい。好適なアッセイとしては、実施例に記載されるもの等のＥＬＩＳＡベースのアッセイが挙げられる。このようなアッセイでは、典型的には、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等の抗体標的でアッセイプレートのウェルをコーティングする。次いで、試験するポリペプチドのサンプルをウェルに添加し、続いて、この例ではＢＳＡに特異的な抗体である（そして、ＩｄｅＳによる切断に対して感受性である）標的特異的抗体のサンプルを添加する。ポリペプチド及び抗体を、ＩｇＧシステインプロテアーゼ活性に好適な条件下で相互作用させる。好適な間隔後にアッセイプレートを洗浄し、標的特異的抗体のＦｃ領域に特異的に結合する検出抗体を、標的特異的抗体への結合に好適な条件下で添加する。検出抗体は、各ウェル中の標的に結合している任意のインタクトな標的特異的抗体のＦｃ領域に結合する。洗浄後、ウェル中に存在する検出抗体の量は、そのウェルに結合した標的特異的抗体の量に比例する。検出抗体は、標識又は別のレポーター系（酵素等）に直接又は間接的にコンジュゲートすることができ、その結果、各ウェルに残存する検出抗体の量を求めることができる。ウェル中に存在していた被験ポリペプチドの効力が高いほど、残存するインタクトな標的特異的抗体が少なく、従って、存在する検出抗体も少ない。典型的には、所与のアッセイプレートの少なくとも１つのウェルには、被験ポリペプチドの代わりにＩｄｅＳが含まれており、その結果、被験ポリペプチドの効力をＩｄｅＳの効力と直接比較することができる。また、比較のためにＩｄｅＺ又はＩｄｅＺの公知のバリアントが含まれていてもよい。

他のアッセイでは、被験ポリペプチドによるＩｇＧの切断によって生じるＩｇＧの断片を直接可視化及び／又は定量化することにより、被験ポリペプチドの効力を求めることができる。この種のアッセイについては実施例にも記載する。このようなアッセイでは、典型的には、タイトレーション系列における異なる濃度の試験ポリペプチド（又は対照としてのＩｄｅＳ、ＩｄｅＺ、及びＩｄｅＺの公知のバリアントのうちの１つ以上）と共にＩｇＧのサンプルをインキュベートする。次いで、各濃度でインキュベートの結果生じた生成物を、例えばＳＤＳ－ＰＡＧＥによってゲル電気泳動を用いて分離する。次いで、ＩｇＧ全体及びＩｇＧの切断によって生じた断片をサイズによって識別し、好適な色素による染色の強度によって定量することができる。切断断片の量が多いほど、所与の濃度における被験ポリペプチドの効力が高い。本発明のポリペプチドは、典型的には、ＩｄｅＺ及び／又はＩｄｅＳよりも低い濃度（タイトレーション系列におけるより低い点）で検出可能な量の切断断片を生成する。この種のアッセイは、各切断事象から生じた異なる断片の量を求めることもできるので、ＩｇＧ分子の第１又は第２の重鎖の切断により有効である被験ポリペプチドの同定も可能にし得る。本明細書に記載される効力アッセイに好適なＩｇＧのサンプルは、様々な供給源からのものであってよい。例えば、市販の抗体調製物を使用してよい。市販の抗体調製物は、一般に純粋であり、アイソタイプ及びサブクラス特異的である。あるいは、ヒト血清等のＩｇＧの混合集団を含むサンプルを用いてもよい。血清を含むＩｇＧのサンプルは、ＩｄｅＳ及び／又はＩｄｅＺに対するＡＤＡを含んでいてもよい。このように、本明細書に記載の効力アッセイに好適なＩｇＧのサンプルは、ＡＤＡを含んでいてもよい。本発明のポリペプチドは、特にＩｇＧがＩｇＧ２アイソタイプである場合、ＩｇＧ分子の第２の鎖よりも第１の鎖の切断に（ＩｄｅＳ及び／又はＩｄｅＺと比較したとき）より有効であり得る（図９の概略図を参照）。あるいは、本発明のポリペプチドは、特にＩｇＧがＩｇＧ１アイソタイプである場合、ＩｇＧ分子の第２の鎖よりも第２の鎖の切断に（ＩｄｅＳ及び／又はＩｄｅＺと比較したとき）より有効であり得る（図９の概略図を参照）。本発明のポリペプチドは、（ＩｄｅＳ及び／又はＩｄｅＺと比較したとき）ＩｇＧ２よりもＩｇＧ１の切断により有効であり得る。

この種のアッセイは、ＩｄｅＳ特異的ＡＤＡの存在が本発明のポリペプチドの効力を低下させ得る程度を求めるするために適応させることもできる。適応したアッセイでは、ＩｇＧのサンプルを試験ポリペプチド（又は対照としてのＩｄｅＳ）と共にインキュベートするとき、ＩｄｅＳ特異的ＡＤＡを含有する血清又はＩＶＩｇ調製物を反応媒体に含める。好ましくは、本発明のポリペプチドの効力は、ＡＤＡの存在によって影響を受けないか、又は同じアッセイにおけるＩｄｅＳの効力よりもＡＤＡの存在による低下が少ない。すなわち、好ましくは、本発明のポリペプチドに対するＩｄｅＳ特異的ＡＤＡの中和効果は、同じアッセイで測定したＩｄｅＳに対するＩｄｅＳ特異的ＡＤＡの中和効果と同等であるか又はそれよりも低い。

上に示したように、本発明のポリペプチドは、典型的には、ＩｄｅＳよりも免疫原性が低い。すなわち、本発明のポリペプチドは、等価な用量又は濃度で存在しかつ同じアッセイで測定したとき、生じ得る免疫応答がＩｄｅＳと同等であるか又は好ましくはより少ない。本発明のポリペプチドの免疫原性は、典型的には、同じアッセイで測定したＩｄｅＳの免疫原性の５０％以下、４５％以下、４０％以下、３５％以下、３０％以下、又は２５％以下である。好ましくは、本発明のポリペプチドの免疫原性は、同じアッセイで測定したＩｄｅＳの免疫原性の２５％以下である。

ポリペプチドの免疫原性を評価するためのアッセイも当技術分野で周知であり、任意の好適なアッセイを使用してよい。ＩｄｅＳの免疫原性と比べてポリペプチドの免疫原性を評価するための好ましいアッセイは、ＩｄｅＳに特異的なＡＤＡが、本発明のポリペプチドにも結合する程度を評価することを含む。この種のアッセイについては、実施例に記載する。患者におけるＩｄｅＳ特異的ＡＤＡ分子の存在及び量は、剤特異的ＣＡＰ ＦＥＩＡ（ＩｍｍｕｎｏＣＡＰ）試験又は患者からの血清サンプルに対して行われるタイターアッセイ等の任意の好適な方法によって求めることができる。

そのようなアッセイの１つは、ＩｄｅＳと試験ポリペプチドとの間のＩｄｅＳ特異的ＡＤＡに対する結合についての競合を試験することを含む。典型的には、アッセイプレートのウェルにＩｄｅＳをコーティングし、続いて、ＩｄｅＳ特異的ＡＤＡを含有する溶液、例えばＩＶＩｇ調製物と試験ポリペプチド（又は対照としてのＩｄｅＳ）とのプレインキュベーションされた混合物を投与する。プレインキュベーションは、タンパク質とＡＤＡとの間の高親和性結合のみが許容されるように、ＩｇＧシステインプロテアーゼ活性の阻害剤、例えばヨード酢酸（ＩＨＡｃ）の存在下かつ高塩濃度で行われる。プレインキュベーションされた混合物を、ＩｄｅＳでコーティングされたウェルと相互作用させる。試験ポリペプチドに結合していない任意のＩｄｅＳ特異的ＡＤＡは、ウェル上のＩｄｅＳに結合する。好適な間隔後にアッセイプレートを洗浄し、ＩｇＧに特異的に結合する検出抗体を、結合に好適な条件下で添加する。検出抗体は、各ウェル中のＩｄｅＳに結合している任意のＡＤＡに結合する。洗浄後、ウェル中に存在する検出抗体の量は、試験ポリペプチドに結合したＡＤＡの量に反比例する。検出抗体は、標識又は別のレポーター系（酵素等）に直接又は間接的にコンジュゲートすることができ、その結果、各ウェルに残存する検出抗体の量を求めることができる。典型的には、所与のアッセイプレートの少なくとも１つのウェルを、被験ポリペプチドの代わりにＩＶＩｇ及びＩｄｅＳのプレインキュベーションされた混合物を用いて試験し、その結果、ＡＤＡの被験ポリペプチドへの結合をＩｄｅＳへの結合と直接比較することができる。また、更なる対照としてＩｄｅＺを含めてもよい。

別の好適なアッセイは、対照としてのＩｄｅＳ及び／又はＩｄｅＺと比較したときの、異なる濃度のＩｄｅＳ特異的ＡＤＡ、例えばＩＶＩｇ調製物のタイトレーション系列が試験ポリペプチドに結合する程度を試験することを含む。好ましくは、本発明のポリペプチドは、ＩｄｅＳへの結合が検出可能になるＡＤＡの濃度に比べて、結合が検出可能になるにはより高濃度のＡＤＡを必要とする。このようなアッセイについては、実施例に記載する。このようなアッセイは、典型的には、アッセイプレートのウェルに試験ポリペプチド又は対照をコーティングし、続いて、各ウェルをタイトレーション系列からの異なる濃度のＩｄｅＳ特異的ＡＤＡと共にインキュベートすることを含む。インキュベーションは、タンパク質とＡＤＡとの間の高親和性結合のみが許容されるように、ＩｇＧシステインプロテアーゼ活性の阻害剤、例えばヨード酢酸（ＩＨＡｃ）の存在下かつ高塩濃度で実施される。好適な間隔後にアッセイプレートを洗浄し、ＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）_２に特異的に結合する検出抗体を、結合に好適な条件下で添加する。検出抗体は、各ウェルにコーティングされた試験ポリペプチド又はＩｄｅＳに結合している任意のＡＤＡに結合する。洗浄後、ウェル中に存在する検出抗体の量は、試験ポリペプチド又は対照に結合したＡＤＡの量に正比例する。検出抗体は、標識又は別のレポーター系（酵素等）に直接又は間接的にコンジュゲートすることができ、その結果、各ウェルに残存する検出抗体の量を求めることができる。試験ウェルにおける結合の検出についての閾値レベルを確立するために、所与のアッセイプレート上の少なくとも１つのウェルを、ブランクとしてＡＤＡを含まないバッファと共にインキュベートする。

ポリペプチドの構造的特徴
この章は、本発明のポリペプチドの構造的特徴について記載し、これは、上の章に概説した機能的特徴に加えて適用される。

本発明のポリペプチドは、典型的には、少なくとも１００アミノ酸長、少なくとも１５０アミノ酸長、少なくとも２００アミノ酸長、少なくとも２５０アミノ酸長、少なくとも２６０アミノ酸長、少なくとも２７０アミノ酸長、少なくとも２８０アミノ酸長、少なくとも２９０アミノ酸長、少なくとも３００アミノ酸長、又は少なくとも３１０アミノ酸長である。本発明のポリペプチドは、典型的には、４００アミノ酸長以下、３５０アミノ酸長以下、３４０アミノ酸長以下、３３０アミノ酸長以下、３２０アミノ酸長以下、又は３１５アミノ酸長以下である。上記下限のいずれかを上記上限のいずれかと組み合わせて、本発明のポリペプチドの長さについての範囲を提供できることが理解されるであろう。例えば、ポリペプチドは、１００～４００アミノ酸長又は２５０～３５０アミノ酸長であってよい。ポリペプチドは、好ましくは、２９０～３２０アミノ酸長、最も好ましくは３００～３１５アミノ酸長である。

本発明のポリペプチドの一次構造（アミノ酸配列）は、野生型成熟ＩｄｅＺ配列（配列番号３）に基づく特定のバリアントである配列番号１である。言い換えれば、配列番号１は、ヒトＩｇＧに対する効力の増大に関与する（配列番号３と比較したとき）一次ポリペプチド配列における特定の点変異のセットを通じて配列番号３と関連している。

本発明の別のポリペプチドは、配列番号１に関連する配列番号２である。配列番号２は、連続配列ＤＤＹＱＲＮＡＴＥＡＹＡＫＥＶＰＨＱＩＴに対応する配列番号１のＮ末端の最初の２０アミノ酸が欠失していることを除いて配列番号１と同一である。言い換えれば、配列番号２は、野生型ＩｄｅＺ配列（配列番号３）に対する一次ポリペプチド配列の点変異に関しても配列番号１と同一である。

本発明はまた、それぞれ配列番号１又は配列番号２に比べて１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、又は１０個のアミノ酸改変を有するが、但し、配列が、（ａ）配列番号５の９５位に対応する位置のアスパラギン（Ｎ）、（ｂ）配列番号５の９９位に対応する位置のアスパラギン酸（Ｄ）、及び（ｃ）配列番号５の２２６位に対応する位置のアスパラギン（Ｎ）を保持しており、かつ同じアッセイで測定したときに、ポリペプチドが、それぞれ配列番号１又は２のアミノ酸配列からなるポリペプチドと少なくとも同程度ヒトＩｇＧの切断に有効である、配列番号１若しくは配列番号２のバリアントにも関する。任意で、配列番号１又は配列番号２のバリアントにおける１つ以上のアミノ酸改変によって、配列番号３のポリペプチド配列の対応する位置に存在するのと同じアミノ酸は生じず、好ましくは、いずれの改変によっても、配列番号３のポリペプチド配列の対応する位置に存在するのと同じアミノ酸は生じない。

本発明のポリペプチドの配列が、配列番号１又は配列番号２の配列と比べて１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、又は１０個のアミノ酸改変、例えば、アミノ酸の付加、欠失、又は置換が行われた配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列のバリアントを含む場合、該配列は、（ａ）配列番号５の９５位に対応する位置のアスパラギン（Ｎ）、（ｂ）配列番号５の９９位に対応する位置のアスパラギン酸（Ｄ）、及び（ｃ）配列番号５の２２６位に対応する位置のアスパラギン（Ｎ）を保持していなければならない。そうでなければ、改変は、好ましくは、保存的アミノ酸置換である。配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列のバリアントは、配列番号３のポリペプチド配列の対応する位置に存在するのと同じアミノ酸を生じさせない１つ以上の改変（それぞれ配列番号１又は配列番号２に対してなされる）を含んでいてよい。好ましくは、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列のバリアントでは、（それぞれ配列番号１又は配列番号２に対してなされた）改変は全て、配列番号３のポリペプチド配列の対応する位置に存在するのと同じアミノ酸を生じさせない。

保存的置換は、アミノ酸を類似の化学的構造、類似の化学的特性、及び／又は類似の側鎖体積の他のアミノ酸に置き換える。導入されるアミノ酸は、置き換えられるアミノ酸と類似の極性、親水性、疎水性、塩基性、酸性、中性、又は電荷を有していてよい。あるいは、保存的置換は、既存の芳香族又は脂肪族のアミノ酸の代わりに芳香族又は脂肪族の別のアミノ酸を導入してもよい。保存的アミノ酸変化は当技術分野において周知であり、以下の表Ａ１に定義する２０種の主なアミノ酸の特性に従って選択してよい。アミノ酸が類似の極性を有する場合、これは、表Ａ２中のアミノ酸側鎖のヒドロパシースケールを参照することによって決定することができる。

配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列における特定の残基（配列番号５に対応する９５位、９９位、及び２２６位以外）は、好ましくは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、又は１０個のアミノ酸改変を含むバリアント配列内に保持される。例えば、該バリアント配列は、典型的には、ＩｇＧシステインプロテアーゼ活性に必要であることが知られている特定の残基を保持する。従って、配列番号５の１０２位に対応するシステインは、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列において保持されていなければならない。任意で、配列番号５の９２位に対応するリジン（Ｋ）、配列番号５の２７２位に対応するヒスチジン（Ｈ）、並びに配列番号５の２９４位及び２９６位の各々に対応するアスパラギン酸（Ｄ）も保持される。従って、本発明に係る配列番号１又は配列番号２のポリペプチドバリアントは、典型的には、配列番号５の１０２位に対応する位置にシステイン（Ｃ）を有し；任意で、それぞれ配列番号５の９２位、２７２位、２９４位、及び２９６位に対応する位置に、リジン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ）、アスパラギン酸（Ｄ）、及びアスパラギン酸（Ｄ）を有する。

本発明者らはまた、配列番号１又は配列番号２の配列に対する特定の他の改変が、本発明のポリペプチドの効力を増大させ得る及び／又はＩｄｅＳ特異的ＡＤＡによる本発明のポリペプチドの認識を低下させ得ることを見出した。従って、本発明に係る配列番号１又は配列番号２のポリペプチドバリアントは、配列番号５の８４位、９３位、９７位、１３７位、１３９位、１４０位、１４７位、１５０位、１６２位、１６５位、１６６位、１７１位、１７４位、２０５位、２２６位、２３７位、２３９位、２４３位、２５０位、２５１位、２５４位、２５５位、２８２位、２８８位、３１２位、３１５位、３４７位、３４９位に対応する位置のうちの１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、又は１０個でなされるアミノ酸置換を含んでいてよい。

置換は、典型的には、既存のアミノ酸を、異なる性質を有する別のアミノ酸に置き換える。例えば、非荷電アミノ酸を荷電アミノ酸に置き換えてもよく、逆もまた同様である。これら位置における好ましい置換基を、１文字コードを用いて以下の表Ｂに示す。

各置換は、本明細書では、左から右へ各行の１列目、２列目、及び３列目の記入事項を組み合わせることによって得られる用語を用いて参照することができる。例えば、本明細書では、表Ｂの１行目の置換を「Ｈ８４Ｎ」と称する場合があり、２行目の置換を「Ａ９３Ｔ」と称する場合があり、以下同様である。７

以下の表Ｃに、本明細書に記載される特定のポリペプチドのアミノ酸配列を生成するために、野生型ＩｄｅＺ配列（配列番号３）に対してなされた変更をまとめる。

本明細書で言及する特定のポリペプチドのアミノ酸配列を以下に完全に再現する。

配列番号１
DDYQRNATEAYAKEVPHQITSVWTKGVTPPEQFTQGEDVIHAPYLAHQGWYDITKAFNGKDDLLCGAATAGNMLHWWFDQNKTEIEAYLSKHPEKQKIIFRNQELFDLKAAIDTKDSQTNSQLFNYFRDKAFPNLSARQLGVMPDLVLDMFINGYYLNVFKTQSTDVNRPYQDKDKRGGIFDAVFTRGNQTTLLTARHDLKNKGLNDISTIIKQELTEGRALALSHTYANVSISHVINLWGADFNAEGNLEAIYVTDSDANASIGMKKYFVGINAHGHVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSSGKDIWQKLS

配列番号２
SVWTKGVTPPEQFTQGEDVIHAPYLAHQGWYDITKAFNGKDDLLCGAATAGNMLHWWFDQNKTEIEAYLSKHPEKQKIIFRNQELFDLKAAIDTKDSQTNSQLFNYFRDKAFPNLSARQLGVMPDLVLDMFINGYYLNVFKTQSTDVNRPYQDKDKRGGIFDAVFTRGNQTTLLTARHDLKNKGLNDISTIIKQELTEGRALALSHTYANVSISHVINLWGADFNAEGNLEAIYVTDSDANASIGMKKYFVGINAHGHVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSSGKDIWQKLS

配列番号３（ＩｄｅＺ成熟配列）
DDYQRNATEAYAKEVPHQITSVWTKGVTPLTPEQFRYNNEDVIHAPYLAHQGWYDITKAFDGKDNLLCGAATAGNMLHWWFDQNKTEIEAYLSKHPEKQKIIFNNQELFDLKAAIDTKDSQTNSQLFNYFRDKAFPNLSARQLGVMPDLVLDMFINGYYLNVFKTQSTDVNRPYQDKDKRGGIFDAVFTRGDQTTLLTARHDLKNKGLNDISTIIKQELTEGRALALSHTYANVSISHVINLWGADFNAEGNLEAIYVTDSDANASIGMKKYFVGINAHGHVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSSGKDIWQKLS

配列番号４（ＩｄｅＳ成熟配列）
DSFSANQEIRYSEVTPYHVTSVWTKGVTPPANFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTFNGKDDLLCGAATA
GNMLHWWFDQNKDQIKRYLEEHPEKQKINFNGEQMFDVKEAIDTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPYLSTKHL
GVFPDHVIDMFINGYRLSLTNHGPTPVKEGSKDPRGGIFDAVFTRGDQSKLLTSRHDFKEKNLKEISDLI
KKELTEGKALGLSHTYANVRINHVINLWGADFDSNGNLKAIYVTDSDSNASIGMKKYFVGVNSAGKVAIS
AKEIKEDNIGAQVLGLFTLSTGQDSWNQTN

配列番号５（ＩｄｅＺ全配列）
MKTIAYPNKPHSLSAGLLTAIAIFSLASSNITYADDYQRNATEAYAKEVPHQITSVWTKGVTPLTPEQFRYNNEDVIHAPYLAHQGWYDITKAFDGKDNLLCGAATAGNMLHWWFDQNKTEIEAYLSKHPEKQKIIFNNQELFDLKAAIDTKDSQTNSQLFNYFRDKAFPNLSARQLGVMPDLVLDMFINGYYLNVFKTQSTDVNRPYQDKDKRGGIFDAVFTRGDQTTLLTARHDLKNKGLNDISTIIKQELTEGRALALSHTYANVSISHVINLWGADFNAEGNLEAIYVTDSDANASIGMKKYFVGINAHGHVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSSGKDIWQKLS

配列番号６（ＩｄｅＳ全配列）
MRKRCYSTSAAVLAAVTLFVLSVDRGVIADSFSANQEIRYSEVTPYHVTSVWTKGVTPPANFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTFNGKDDLLCGAATAGNMLHWWFDQNKDQIKRYLEEHPEKQKINFNGEQMFDVKEAIDTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPYLSTKHLGVFPDHVIDMFINGYRLSLTNHGPTPVKEGSKDPRGGIFDAVFTRGDQSKLLTSRHDFKEKNLKEISDLIKKELTEGKALGLSHTYANVRINHVINLWGADFDSNGNLKAIYVTDSDSNASIGMKKYFVGV
NSAGKVAISAKEIKEDNIGAQVLGLFTLSTGQDSWNQTN

配列番号７（ｐＣＡＲＴ２０７）
MDDYQRNATEAYAKEVPHQITSVWTKGVTPPEQFTQGEDVIHAPYLAHQGWYDITKAFDGKDNLLCGAATAGNMLHWWFDQNKTEIEAYLSKHPEKQKIIFRNQELFDLKAAIDTKDSQTNSQLFNYFRDKAFPNLSARQLGVMPDLVLDMFINGYYLNVFKTQSTDVNRPYQDKDKRGGIFDAVFTRGDQTTLLTARHDLKNKGLNDISTIIKQELTEGRALALSHTYANVSISHVINLWGADFNAEGNLEAIYVTDSDANASIGMKKYFVGINAHGHVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSSGKDIWQKLS

配列番号８（ｐＣＡＲＴ２２９）
MDDYQRNATEAYAKEVPHQITSVWTKGVTPPEQFTQGEDVIHAPYLAHQGWYDITKAFDGKDNLLCGAATAGNMLHWWFDQNKTEIEAYLSKHPEKQKIIFRNQELFDLKAAIDTKDSQTNSQLFNYFRDKAFPNLSARQLGVMPDLVLDMFINGYYLNVFKTQSTDVNRPYQDKDKRGGIFDAVFTRGNQTTLLTARHDLKNKGLNDISTIIKQELTEGRALALSHTYANVSISHVINLWGADFNAEGNLEAIYVTDSDANASIGMKKYFVGINAHGHVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSSGKDIWQKLS

配列番号９（ｐＣＡＲＴ２３９）
MDDYQRNATEAYAKEVPHQITSVWTKGVTPPEQFTQGEDVIHAPYLAHQGWYDITKAFNGKDDLLCGAATAGNMLHWWFDQNKTEIEAYLSKHPEKQKIIFRNQELFDLKAAIDTKDSQTNSQLFNYFRDKAFPNLSARQLGVMPDLVLDMFINGYYLNVFKTQSTDVNRPYQDKDKRGGIFDAVFTRGNQTTLLTARHDLKNKGLNDISTIIKQELTEGRALALSHTYANVSISHVINLWGADFNAEGNLEAIYVTDSDANASIGMKKYFVGINAHGHVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSSGKDIWQKLSGGGHHHHHH

配列番号１０（Ｎ２４０）
MDDYQRNATEAYAKEVPHQITSVWTKGVTPPEQFTQGEDVIHAPYLAHQGWYDITKAFNGKDDLLCGAATAGNMLHWWFDQNKTEIEAYLSKHPEKQKIIFRNQELFDLKAAIDTKDSQTNSQLFNYFRDKAFPNLSARQLGVMPDLVLDMFINGYYLNVFKTQSTDVNRPYQDKDKRGGIFDAVFTRGNQTTLLTARHDLKNKGLNDISTIIKQELTEGRALALSHTYANVSISHVINLWGADFNAEGNLEAIYVTDSDANASIGMKKYFVGINAHGHVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSSGKDIWQKLS

配列番号１１（ｐＣＡＲＴ２４２）
MSVWTKGVTPPEQFTQGEDVIHAPYLAHQGWYDITKAFNGKDDLLCGAATAGNMLHWWFDQNKTEIEAYLSKHPEKQKIIFRNQELFDLKAAIDTKDSQTNSQLFNYFRDKAFPNLSARQLGVMPDLVLDMFINGYYLNVFKTQSTDVNRPYQDKDKRGGIFDAVFTRGNQTTLLTARHDLKNKGLNDISTIIKQELTEGRALALSHTYANVSISHVINLWGADFNAEGNLEAIYVTDSDANASIGMKKYFVGINAHGHVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSSGKDIWQKLSGGGHHHHHH

配列番号１２（ｐＣＡＲＴ２４３－不活性ＩｄｅＺバリアント）
MDDYQRNATEAYAKEVPHQITSVWTKGVTPPEQFTQGEDVIHAPYLAHQGWYDITKAFNGKDDLLGGAATAGNMLHWWFDQNKTEIEAYLSKHPEKQKIIFRNQELFDLKAAIDTKDSQTNSQLFNYFRDKAFPNLSARQLGVMPDLVLDMFINGYYLNVFKTQSTDVNRPYQDKDKRGGIFDAVFTRGNQTTLLTARHDLKNKGLNDISTIIKQELTEGRALALSHTYANVSISHVINLWGADFNAEGNLEAIYVTDSDANASIGMKKYFVGINAHGHVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSSGKDIWQKLSGGGHHHHHH

本発明のポリペプチドは、配列番号１又は配列番号２の配列を含んでいてもよく、から本質的になっていてもよく、からなっていてもよい。配列番号１又は配列番号２はそれぞれ、任意で、Ｎ末端における追加のメチオニン及び／又はＣ末端におけるヒスチジンタグを含んでいてもよい。ヒスチジンタグは、好ましくは、６個のヒスチジン残基からなる。ヒスチジンタグは、好ましくは、３×グリシン残基又は５×グリシン残基のリンカーによってＣ末端に連結される。

関連している場合、任意の好適なアルゴリズムを使用してアミノ酸の同一性を計算することができる。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ．（１９９３）Ｊ Ｍｏｌ Ｅｖｏｌ ３６：２９０－３００；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ，Ｆ ｅｔ ａｌ（１９９０）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５：４０３－１０に記載の通り、ＰＩＬＥＵＰ及びＢＬＡＳＴのアルゴリズムを使用して、同一性を計算したり、配列を並べたりすることができる（典型的には、そのデフォルト設定で）等価な又は対応する配列を同定する等）。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通して公的に入手可能である。このアルゴリズムは、まず、データベース配列における同じ長さのワードとアラインメントしたときに幾つかの正の値の閾値スコアＴに一致するか又は満たす、クエリー配列における長さＷの短いワードを同定することによって、高スコア配列対（ＨＳＰ）を同定することを含む。Ｔは、近傍ワードスコア閾値（ｎｅｉｇｈｂｏｕｒｈｏｏｄ ｗｏｒｄ ｓｃｏｒｅ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）と称される（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、上掲）。これら初期近傍ワードヒットは、それを含有するＨＳＰを見つけるための検索を始めるためのシードとして作用する。累積アラインメントスコアが増加し得る限り、ワードヒットを各配列に沿って両方向に拡張する。各方向におけるワードヒットの拡張は、累積アラインメントスコアがその最大達成値から量Ｘだけ減少したとき；１つ以上の負のスコアの残基アラインメントの累積に起因して累積スコアがゼロ以下になったとき；又はいずれかの配列の末端に達したときに停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、及びＸが、アラインメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）１１、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５－１０９１９を参照されたい）アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４、及び両鎖の比較を使用する。

ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計的解析を実施する；例えば、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－５７８７を参照されたい。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は最小和確率（ｔｈｅ ｓｍａｌｌｅｓｔ ｓｕｍ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのポリヌクレオチド又はアミノ酸の配列間の一致が偶然生じる確率の指標を提供する。例えば、第１の配列の第２の配列に対する比較における最小和確率が約１未満、好ましくは約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合、ある配列が別の配列と類似しているとみなされる。あるいは、ＵＷＧＣＧパッケージは、同一性を計算するために使用することができる（例えば、そのデフォルト設定で使用される）ＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供する（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２，３８７－３９５）。

ポリペプチドの生成
本明細書に開示されるポリペプチドは、任意の好適な手段によって生成することができる。例えば、ポリペプチドは、Ｆｍｏｃ固相化学、Ｂｏｃ固相化学、又は液相ペプチド合成等の当技術分野において公知の標準的な方法を使用して直接合成することができる。あるいは、ポリペプチドは、細胞、典型的には細菌細胞を、該ポリペプチドをコードしている核酸分子又はベクターで形質転換することによって生成することもできる。細菌宿主細胞における発現によるポリペプチドの生成については、以下に記載し、実施例に例示する。本発明は、本発明のポリペプチドをコードしている核酸分子及びベクターを提供する。本発明はまた、このような核酸又はベクターを含む宿主細胞を提供する。本発明のポリペプチド及び本明細書に開示されるその他をコードしている例示的なポリヌクレオチド分子を配列番号１６～２３として提供する。これら配列はそれぞれ、５’末端にＮ末端メチオニン（ＡＴＧ）のコドンを、そして、３’末端の終止コドン（ＴＡＡ）の前に３×Ｇｌｙリンカー及び６×Ｈｉｓヒスチジンタグのコドンを含むが、これらは任意で除外されてもよい。

用語「核酸分子」及び「ポリヌクレオチド」は、本明細書では互換的に使用され、デオキシリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチドのいずれか又はこれらのアナログである、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドの非限定的な例は、遺伝子、遺伝子断片、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ｃＤＮＡ、組み換えポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、及びプライマーを含む。本発明のポリヌクレオチドは、単離又は実質的に単離された形態で提供され得る。実質的に単離されたとは、任意の周囲媒体からポリペプチドが完全にではないがかなり単離され得ることを意味する。ポリヌクレオチドは、その意図する用途に干渉しない担体又は希釈剤と混合されてもよく、それでもなお実質的に単離されたとみなされ得る。選択されたポリペプチドを「コードしている」核酸配列は、例えば発現ベクターにおいて適切な調節配列の制御下におかれたときにインビボでポリペプチドに転写（ＤＮＡの場合）及び翻訳（ｍＲＮＡの場合）される核酸分子である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端における開始コドン及び３’（カルボキシ）末端における翻訳終止コドンによって決定される。本発明の目的のために、このような核酸配列は、ウイルス由来のｃＤＮＡ、原核生物又は真核生物のｍＲＮＡ、ウイルス又は原核生物のＤＮＡ又はＲＮＡ由来のゲノム配列、及び更には合成ＤＮＡ配列を含み得るが、これらに限定されない。転写終結配列は、コード配列の３’側に位置していてよい。

ポリヌクレオチドは、一例としてＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ－ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）に記載されている通り、当技術分野において周知の方法に従って合成することができる。本発明の核酸分子は、挿入された配列に動作可能に連結された制御配列を含む発現カセットの形態で提供され得、従って、インビボで本発明のポリペプチドを発現させることができる。次に、これら発現カセットは、典型的には、ベクター（例えば、プラスミド又は組み換えウイルスベクター）内に提供される。このような発現カセットを宿主被験体に直接投与してもよい。あるいは、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを宿主被験体に投与してもよい。好ましくは、遺伝子ベクターを使用してポリヌクレオチドを調製及び／又は投与する。好適なベクターは、十分な量の遺伝情報を保有し、本発明のポリペプチドを発現させることができる任意のベクターであってよい。

従って、本発明は、このようなポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む。このような発現ベクターは、分子生物学の分野においてルーチン的に構築され、例えば、本発明のペプチドを発現させるために、プラスミドＤＮＡ、並びに適切なイニシエータ、プロモータ、エンハンサ、及び他のエレメント、例えば、必要になる場合がありかつ正確な配向で配置されたポリアデニル化シグナルの使用を伴っていてよい。他の好適なベクターは、当業者には明らかであろう。これに関する更なる例として、Ｓａｍｂｒｏｏｋらを参照する。

また、本発明は、本発明のポリペプチドを発現するように改変された細胞を含む。このような細胞は、典型的には、原核細胞、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）等の細菌細胞を含む。このような細胞は、本発明のポリペプチドを生成するための常法を使用して培養してよい。

ポリペプチドの生成、単離、又は精製を支援するために、該ポリペプチドを誘導体化又は改変してもよい。例えば、本発明のポリペプチドが細菌宿主細胞における組み換え発現によって生成される場合、ポリペプチドの配列は、発現を改善するためにＮ末端に追加のメチオニン（Ｍ）残基を含んでいてよい。別の例として、分離手段に直接かつ特異的に結合することができるリガンドを付加することによって、本発明のポリペプチドを誘導体化又は改変してもよい。あるいは、結合対の一方のメンバーを付加することによってポリペプチドを誘導体化又は改変してもよく、分離手段は、結合対の他方のメンバーを付加することによって誘導体化又は改変された試薬を含む。任意の好適な結合対を使用してよい。本発明において使用するためのポリペプチドが結合対の一方のメンバーの付加によって誘導体化又は改変される好ましい実施形態では、ポリペプチドは、好ましくは、ヒスチジンでタグ付けされるか又はビオチンでタグ付けされる。典型的には、ヒスチジン又はビオチンのタグのアミノ酸コード配列は遺伝子レベルで含まれ、ポリペプチドは大腸菌において組み換え的に発現する。ヒスチジン又はビオチンのタグは、典型的には、ポリペプチドのいずれかの末端、好ましくはＣ末端に存在する。該タグは、ポリペプチドに直接連結されてもよく、任意の好適なリンカー配列、例えば、３つ、４つ、又は５つのグリシン残基によって間接的に連結されてもよい。ヒスチジンタグは、典型的には６つのヒスチジン残基からなるが、これよりも典型的には最大７アミノ酸、最大８アミノ酸、最大９アミノ酸、最大１０アミノ酸、又は最大２０アミノ酸長くてもよく、例えば５アミノ酸、４アミノ酸、３アミノ酸、２アミノ酸、又は１アミノ酸短くてもよい。

ポリペプチドのアミノ酸配列は、例えば安定性を高めるために、天然には存在しないアミノ酸を含むように修飾してもよい。ポリペプチドが合成手段によって生成される場合、そのようなアミノ酸を生成中に導入してもよい。また、合成又は組換えの生成のいずれかの後にポリペプチドを修飾してもよい。また、Ｄ－アミノ酸を使用してポリペプチドを生成してもよい。そのような場合、アミノ酸は、Ｃ→Ｎの配向で逆順に連結されるであろう。これは、このようなポリペプチドを生成するために当技術分野では従来から行われている。

多くの側鎖修飾が当技術分野において公知であり、本明細書で指定し得る通り、任意の更なる必要な活性又は特徴をポリペプチドが保持していることを条件として、ポリペプチドの側鎖に対してなされ得る。また、ポリペプチドは化学的に修飾されてもよく、例えば翻訳後修飾されてもよいことが理解されるであろう。例えば、グリコシル化されてもよく、リン酸化されてもよく、又は修飾されたアミノ酸残基を含んでもよい。

ポリペプチドは、ＰＥＧ化されてもよい。本発明のポリペプチドは、実質的に単離された形態であってよい。該ポリヌクレオチドは、（以下で論じる通り）その意図する用途に干渉しない担体又は希釈剤と混合されてもよく、それでもなお実質的に単離されたとみなされ得る。また、実質的に精製された形態であってもよく、その場合、一般に、調製物中に少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％のタンパク質が含まれる。

ポリペプチドを含む組成物及び製剤
別の態様では、本発明は、本発明のポリペプチドを含む組成物を提供する。例えば、本発明は、１つ以上の本発明のポリペプチドと、少なくとも１つの薬学的に許容し得る担体又は希釈剤とを含む組成物を提供する。担体（複数可）は、組成物の他の成分と適合し、かつ投与される被験体にとって有害ではないという意味で「許容可能」でなければならない。典型的には、担体及び最終組成物は、無菌かつパイロジェンフリーである。

好適な組成物の製剤化は、標準的な医薬製剤化の化学及び方法論を用いて実施することができ、それらは全て、適当な技能を有する当業者が容易に利用可能なものである。例えば、剤を１つ以上の薬学的に許容し得る賦形剤又はビヒクルと合わせてよい。湿潤又は乳化剤、ｐＨ緩衝物質、還元剤等の補助物質が、賦形剤又はビヒクル中に存在していてもよい。好適な還元剤としては、システイン、チオグリセロール、チオレドキシン、グルタチオン等が挙げられる。賦形剤、ビヒクル、及び補助物質は、一般に、組成物を受け取る個体において免疫応答を誘導せず、過度の毒性なしに投与することができる医薬品である。薬学的に許容し得る賦形剤としては、水、生理食塩水、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、グリセロール、チオグリセロール、及びエタノール等の液体が挙げられるが、これらに限定されない。その中に薬学的に許容し得る塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩等の鉱酸塩；並びに酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩等の有機酸の塩を含めてもよい。薬学的に許容し得る賦形剤、ビヒクル、及び補助物質に関する綿密な考察は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｎ．Ｊ．１９９１）において入手可能である。

このような組成物は、ボーラス投与又は連続投与に好適な形態で調製、包装、又は販売され得る。注射可能な組成物は、アンプル又は保存剤を含む多回投与用容器等の単位剤形で調製、包装、又は販売され得る。組成物は、懸濁剤、液剤、油性又は水性のビヒクル中乳剤、ペースト剤、及び移植可能な持続放出性又は生分解性の製剤を含むが、これらに限定されない。このような組成物は、懸濁化剤、安定剤、又は分散剤を含むがこれらに限定されない１つ以上の追加成分を更に含んでいてもよい。非経口投与用の組成物の一実施態様では、好適なビヒクル（例えば、無菌パイロジェンフリー水）で再構成するための（例えば、散剤又は顆粒剤用の）乾燥形態で活性成分が提供された後、再構成された組成物が非経口投与される。組成物は、無菌の注射可能な水性又は油性の懸濁剤又は液剤の形態で調製、包装、又は販売され得る。この懸濁剤又は液剤は、公知の分野に従って製剤化され得、そして、活性成分に加えて、本明細書に記載される分散剤、湿潤剤、又は懸濁化剤等の追加成分を含んでいてもよい。このような無菌の注射可能な製剤は、非毒性の非経口的に許容し得る希釈剤又は溶媒、例えば水又は１，３－ブタンジオールを使用して調製され得る。他の許容し得る希釈剤及び溶媒としては、リンゲル液、等張塩化ナトリウム溶液、及び固定油、例えば合成のモノグリセリド又はジグリセリドが挙げられるが、これらに限定されない。

有用である他の非経口的に投与可能な組成物は、微結晶性形態で、リポソーム調製品で、又は生分解性ポリマー系の成分として活性成分を含むものを含む。制御放出又は移植のための組成物は、薬学的に許容し得る高分子又は疎水性の材料、例えば、エマルション、イオン交換樹脂、難溶性ポリマー、又は難溶性塩を含んでいてよい。組成物は、例えば、皮内、皮下、経皮、筋肉内、動脈内、腹腔内、関節内、骨内、髄腔内、又は他の適切な投与経路を含む任意の好適な経路による投与に好適であり得る。好ましい組成物は、静脈内注入による投与に好適である。

ポリペプチドの使用方法
本発明は、様々な方法における本発明のポリペプチドの使用を提供する。例えば、本ポリペプチドは、バイオテクノロジーに有用なツールを提供することができる。ポリペプチドは、ＩｇＧ、特にヒトＩｇＧの特異的なエクスビボ切断に使用することができる。このような方法では、特異的システインプロテアーゼ活性を生じさせる条件下で、ＩｇＧを含有するサンプルと共にポリペプチドをインキュベートしてよい。特異的な切断は、国際公開第２００３０５１９１４号及び同第２００９０３３６７０号に記載されているもの等の任意の好適な方法を用いて確認し、切断生成物を単離することができる。従って、この方法は、特にＦｃ及びＦ（ａｂ’）_２の断片を作製するために使用することができる。次いで、本発明のポリペプチドでＩｇＧを切断することによって生じるＦ（ａｂ’）_２断片に対して（例えば、２－メルカプトエタノールアミン又はシステアミン中で）還元工程を実施することにより、Ｆａｂ断片を生成することができる。

また、方法は、サンプル中のＩｇＧを検出又は分析したり、サンプルからＩｇＧを除去したりするために使用することもできる。サンプル中のＩｇＧを検出する方法は、典型的には、ＩｇＧ特異的な結合及び切断を可能にする条件下でポリペプチドをサンプルと共にインキュベートすることを含む。ＩｇＧの存在は、特異的ＩｇＧ切断産物の検出により確認することができ、その後、これを分析することができる。

また、本発明に係るポリペプチドは、治療又は予防に用いることもできる。治療用途では、既に障害又は病態に罹患している被験体に、病態又はその症状のうちの１つ以上を治癒、緩和、又は部分的に停止させるのに十分な量のポリペプチド又は組成物を投与する。このような治療的処置の結果、疾患の症状の重症度が低下し得る又は無症状期間の頻度若しくは持続時間が増加し得る。これを達成するのに適切な量を「治療上有効な量」と定義する。予防用途では、未だ障害又は病態の症状を呈していない被験体に、症状の発生を防止又は遅延させるのに十分な量のポリペプチド又は組成物を投与する。このような量を「予防上有効な量」と定義する。被験体は、任意の好適な手段により、疾患又は病態を発症するリスクがあると同定されたことがある場合がある。従って、本発明はまた、ヒト又は動物の身体の治療に使用するための本発明のポリペプチドを提供する。また、被験体における疾患又は病態を予防又は治療する方法であって、予防上又は治療上有効な量の本発明のポリペプチドを被験体に投与することを含む方法が、本明細書に提供される。ポリペプチドは、免疫抑制剤と共投与してもよい。ポリペプチドは、好ましくは静脈内注入により投与されるが、例えば、皮内、皮下、経皮、筋肉内、動脈内、腹腔内、関節内、骨内、髄腔内、又は他の適切な投与経路を含む任意の好適な経路によって投与されてもよい。投与されるポリペプチドの量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ ＢＷ～２ｍｇ／ｋｇ ＢＷ、０．０５～１．５ｍｇ／ｋｇ ＢＷ、０．１ｍｇ／ｋｇ ＢＷ～１ｍｇ／ｋｇ ＢＷ、好ましくは、０．１５ｍｇ／ｋｇ～０．７ｍｇ／ｋｇ ＢＷ、最も好ましくは、０．２ｍｇ／ｋｇ～０．３ｍｇ／ｋｇ ＢＷ、特に０．２５ｍｇ／ｋｇ ＢＷであってよい。ポリペプチドを同一の被験体に複数回投与してもよいが、但し、ポリペプチドと結合することができる被験体の血清中のＡＤＡの量は、臨床医によって決定された閾値を超えない。ポリペプチドに結合することができる被験体の血清中のＡＤＡの量は、剤特異的ＣＡＰ ＦＥＩＡ（ＩｍｍｕｎｏＣＡＰ）試験又はタイターアッセイ等の任意の好適な方法によって求めることができる。

本発明のポリペプチドは、病原性ＩｇＧ抗体によって媒介される疾患又は病態の治療又は予防において特に有用であり得る。従って、本発明は、病原性ＩｇＧ抗体によって媒介される疾患又は病態の治療又は予防において使用するための本発明ポリペプチドを提供する。本発明はまた、病原ＩｇＧ抗体によって媒介される疾患又は病態を治療又は予防する方法であって、本発明のポリペプチドを個体に投与することを含む方法を提供する。方法は、該ポリペプチドの反復投与を含んでいてもよい。本発明はまた、病原性ＩｇＧ抗体によって媒介される疾患又は病態、特に病原性ＩｇＧ抗体によって全体的又は部分的に媒介される自己免疫疾患を治療又は予防するための医薬の製造に使用するための本発明のポリペプチドを提供する。

病原性抗体は、典型的には、抗体によって全体的又は部分的に媒介される自己免疫疾患又は他の病態において標的とされる抗原に特異的であり得る。表Ｄは、そのような疾患及び関連する抗原のリストを示す。本発明のポリペプチドは、これら疾患又は病態のいずれかを治療するために使用することができる。ポリペプチドは、病原性ＩｇＧ抗体によって全体的又は部分的に媒介される自己免疫疾患の治療又は予防に特に有効である。

別の実施形態では、本発明のポリペプチドは、療法又は治療剤が被験体に与える利益を改善する方法に使用され得る。方法は、本明細書では工程（ａ）及び（ｂ）と称される２つの工程を含む。

工程（ａ）は、被験体に本発明のポリペプチドを投与することを含む。投与される該ポリペプチドの量は、好ましくは、被験体の血漿中に存在する実質的に全てのＩｇＧ分子を切断するのに十分である。工程（ｂ）は、その後、被験体に該療法又は治療剤を投与することを含む。工程（ａ）及び（ｂ）は、好ましくは被験体の血漿中に存在する実質的に全てのＩｇＧ分子が切断されるのに十分な時間間隔で隔てられている。該間隔は、典型的には、少なくとも３０分間、最長２１日間であってよい。

その利益が改善される治療剤は、典型的には、がん又は別の疾患の治療のために投与される抗体である。治療剤は、ＩＶＩｇであってよい。この実施形態の状況では、本発明は、代替的に、被験体におけるがん又は別の疾患を治療する方法であって、（ａ）該被験体に本発明のポリペプチドを投与すること；及び（ｂ）その後、該がん又は該別の疾患の治療である治療上有効な量の抗体を該被験体に投与することを含み、
－ 投与される該ポリペプチドの量が、該被験体の血漿中に存在する実質的に全てのＩｇＧ分子を切断するのに十分であり；かつ
－ 工程（ａ）及び（ｂ）が、少なくとも３０分間、最長２１日間の時間間隔で隔てられている方法を提供すると説明することもできる。

言い換えれば、本発明はまた、がん又は別の疾患を治療するためのそのような方法において使用するためのポリペプチドも提供する。本発明はまた、そのような方法によるがん又は別の疾患を治療のための医薬の製造における剤の使用も提供する。がんは、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質がん腫、ＡＩＤＳ関連がん、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、肛門がん、虫垂がん、星状細胞腫、小児小脳又は大脳、基底細胞がん腫、胆管がん、肝外、膀胱がん、骨がん、骨肉腫／悪性線維性組織球腫、脳幹神経膠腫、脳がん、脳腫瘍、小脳星状細胞腫、脳腫瘍、大脳星状細胞腫／悪性神経膠腫、脳腫瘍、上衣腫、脳腫瘍、髄芽腫、脳腫瘍、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、脳腫瘍、視覚路及び視床下部神経膠腫、乳がん、気管支腺腫／カルチノイド、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、カルチノイド腫瘍、消化器系、原発不明がん腫、中枢神経系リンパ腫、小脳星状細胞腫、大脳星状細胞腫／悪性神経膠腫、子宮頸がん、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病慢性骨髄増殖性障害、結腸がん、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、子宮内膜がん、上衣腫、食道がん、ユーイングファミリー腫瘍におけるユーイング肉腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、小児、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管がん、眼球がん、眼内黒色腫、眼球がん、網膜芽腫、胆嚢がん、胃（胃）がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、胚細胞腫瘍：頭蓋外、性腺外、又は卵巣、妊娠性絨毛性腫瘍、脳幹の神経膠腫、神経膠腫、小児大脳星状細胞腫、神経膠腫、小児視覚路及び視床下部、胃カルチノイド、ヘアリーセル白血病、頭頸部がん、心臓がん、肝細胞（肝臓）がん、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、視床下部及び視覚路神経膠腫、眼内黒色腫、膵島細胞がん腫（膵内分泌部）、カポジ肉腫、腎臓がん（腎細胞がん）、喉頭がん、白血病、白血病、急性リンパ芽球性（急性リンパ性白血病とも呼ばれる）、白血病、急性骨髄（急性骨髄性白血病とも呼ばれる）、白血病、慢性リンパ性（慢性リンパ性白血病とも呼ばれる）、白血病、慢性骨髄性（慢性骨髄白血病とも呼ばれる）、白血病、ヘアリーセル、唇及び口腔がん、脂肪肉腫、肝がん（原発）、肺がん、非小細胞肺がん、小細胞、リンパ腫、リンパ腫、ＡＩＤＳ関連、リンパ腫、バーキット、リンパ腫、皮膚Ｔ細胞、リンパ腫、ホジキン、リンパ腫、非ホジキン（ホジキンを除く全てのリンパ腫の古い分類）、リンパ腫、原発性中枢神経系、マクログロブリン血症、ワルデンストーム、骨の悪性線維性組織球腫／骨肉腫、髄芽腫、黒色腫、黒色腫、眼内（眼）、メルケル細胞がん腫、中皮腫、成人悪性、中皮腫、潜在性原発性転移性扁平上皮頚部がん、口腔がん、多発性内分泌新生物症候群、多発性骨髄腫／形質細胞新生物、菌状息肉症、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性疾患、骨髄性白血病、慢性、骨髄白血病、成人急性、骨髄白血病、小児急性、骨髄腫、多発性（骨髄のがん）、骨髄増殖性障害、鼻腔及び副鼻腔がん、鼻咽頭がん腫、神経芽腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺がん、口腔がん、中咽頭がん、骨肉腫／骨の悪性線維性組織球腫、卵巣がん、卵巣上皮がん（表面上皮－間質腫瘍）、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、膵がん、膵がん、膵島細胞、副鼻腔及び鼻腔がん、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭がん、褐色細胞腫、松果体星状細胞腫、松果体胚細胞腫、松果体芽細胞腫及びテント上原始神経外胚葉腫瘍、下垂体腺腫、形質細胞新生物／多発性骨髄腫、胸膜肺芽球腫、中枢神経系原発リンパ腫、前立腺がん、直腸がん、腎細胞がん腫（腎臓がん）、腎盂及び尿管、移行細胞がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、肉腫、ユーイングファミリー腫瘍、カポジ肉腫、肉腫、軟部組織、肉腫、子宮、セザリー症候群、皮膚がん（非黒色腫）、皮膚がん（黒色腫）、皮膚がん腫、メルケル細胞、小細胞肺がん、小腸がん、軟部組織肉腫、扁平上皮がん腫、潜在性原発性扁平上皮頚部がん、転移性、胃がん、テント上原始神経外胚葉腫瘍、Ｔ細胞リンパ腫、皮膚－菌状息肉症及びセザリー症候群を参照、精巣がん、咽頭がん、胸腺腫、胸腺腫及び胸腺がん腫、甲状腺がん、甲状腺がん、腎盂及び尿管の移行細胞がん、絨毛腫瘍、尿管及び腎盂、移行細胞がん尿道がん、子宮体がん、子宮内膜、子宮肉腫、膣がん、視覚路及び視床下部神経膠腫、外陰がん、ワルデンストレームマクログロブリン血症及びウィルムス腫瘍（腎がん）であってよい。

がんは、好ましくは、前立腺がん、乳がん、膀胱がん、結腸がん、直腸がん、膵臓がん、卵巣がん、肺がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、腎臓（腎細胞）がん、食道がん、甲状腺がん、皮膚がん、リンパ腫、メラノーマ、又は白血病である。

工程（ｂ）で投与される抗体は、好ましくは、上記がんの種類のうちの１つ以上に関連する腫瘍抗原に特異的である。方法で使用するための抗体の関心対象の標的としては、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ６４、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１０５、ＣＤ１３８、ＣＤ１７４、ＣＤ２０５、ＣＤ２２７、ＣＤ３２６、ＣＤ３４０、ＭＵＣ１６、ＧＰＮＭＢ、ＰＳＭＡ、Ｃｒｉｐｔｏ、ＥＤ－Ｂ、ＴＭＥＦＦ２、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＢ２、ＦＡＰ、αｖインテグリン、メソテリン、ＥＧＦＲ、ＴＡＧ－７２、ＧＤ２、ＣＡ１Ｘ、５Ｔ４、α４β７インテグリン、Ｈｅｒ２が挙げられる。他の標的は、インターロイキンＩＬ－１～ＩＬ－１３、腫瘍壊死因子α及びβ、インターフェロンα、β、及びγ、腫瘍増殖因子β（ＴＧＦ－β）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、並びに顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）等のサイトカインである。Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ：Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｆｏｒ Ｂａｓｉｃ ＆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ａｇｇｒａｗａｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ １９９１）を参照。他の標的は、ホルモン、酵素、並びに細胞内及び細胞間メッセンジャー、例えば、アデニリルシクラーゼ、グアニルシクラーゼ、及びホスホリパーゼＣである。関心対象の他の標的は、白血球抗原、例えば、ＣＤ２０及びＣＤ３３である。また、薬物が関心対象の標的であってもよい。標的分子は、ヒト、哺乳類、又は細菌であってよい。他の標的は、抗原、例えば、ウイルス及び細菌の両方の微生物病原体のタンパク質、糖タンパク質、及び炭化水素、並びに腫瘍である。更に他の標的は、米国特許第４，３６６，２４１号に記載されている。

抗体は、細胞傷害性部分又は検出可能な標識に直接又は間接的に結合し得る。抗体は、当技術分野において公知の様々な方法のうちの１つ以上を用い、１つ以上の投与経路を介して投与してよい。投与の経路及び／又はモードは、所望の結果に応じて変化する。抗体の好ましい投与経路としては、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄、又は他の非経口的な投与経路、例えば、注射又は注入が挙げられる。「非経口投与」という表現は、本明細書で使用するとき、経腸投与及び局所投与以外の投与モードを意味し、通常注射による。あるいは、抗体は、非経口的な経路、例えば、局所、表皮、又は粘膜の投与経路を介して投与してもよい。また、腫瘍周囲、腫瘍近傍、腫瘍内、病変内、病変周囲、腔内注入、膀胱内投与、及び吸入を含む、局所投与も好ましい。

本発明の抗体の好適な投与量は、熟練の医師によって決定され得る。抗体の実際の投与レベルは、患者にとって毒性であることなく、特定の患者、組成物、及び投与モードについて所望の治療応答を達成するのに有効な活性成分の量が得られるように変化させてよい。選択される投与量レベルは、使用される具体的な抗体の活性、投与経路、投与時間、抗体の排泄速度、治療の持続時間、使用される特定の組成物と併用される他の薬物、化合物、及び／又は材料、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、全身健康、及び前病歴、並びに医学分野で周知である同様の要因を含む様々な薬物動態学的要因に依存する。

抗体の好適な用量は、例えば、約０．１μｇ／ｋｇ（治療される患者の体重）～約１００ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。例えば、好適な投与量は、１日あたり約１μｇ／ｋｇ（体重）～約１０ｍｇ／ｋｇ又は１日あたり約１０μｇ／ｋｇ（体重）～約５ｍｇ／ｋｇ体重であってよい。

投与レジメンは、最適な所望の応答（例えば、治療応答）を提供するように調整してよい。例えば、単一ボーラスを投与してもよく、又は方法の工程（ｂ）が経時的に投与される幾つかの分割用量を含んでいてもよく、又は工程（ａ）と（ｂ）の間の必要な間隔が超えない限り、治療状況の緊急性により適応があれば用量を比例的に減少又は増加させてもよい。投与の容易さ及び投与量の均一性のために、非経口組成物を単位剤形に製剤化することが特に有利である。単位剤形とは、本明細書で使用するとき、治療される被験体のための単位投薬量として適している物理的に別々の単位を指し、各単位は、必要な医薬担体と共同して所望の治療効果を生じさせるように計算された所定の量の活性化合物を含有する。

工程（ｂ）の抗体は、化学療法又は放射線療法と併用して投与してもよい。方法は、追加の抗がん抗体又は他の治療剤の投与を更に含んでいてもよく、これは、工程（ｂ）の抗体と共に単一の組成物で又は併用療法の一部として別々の組成物で投与してよい。例えば、工程（ｂ）の抗体を、他の剤の前に、後に、又は同時に投与してよい。

抗体は、アバゴボマブ、アブシキシマブ、アクトクスマブ、アダリムマブ、アデカツムマブ、アフェリモマブ、アフツズマブ、アラシズマブペゴール、ＡＬＤ５１８、アレムツズマブ、アリロクマブ、アルツモマブペンテト酸、アマツキシマブ、アナツモマブマフェナトクス、アンルキンズマブ、アポリズマブ、アルシツモマブ、アセリズマブ、アチヌマブ、アツリズマブ（＝トシリズマブ）、アトロリムマブ、バピネウズマブ、バシリキシマブ、バビツキシマブ、ベクツモマブ、ベリムマブ、ベンラリズマブ、ベルチリムマブ、ベシレソマブ、ベバシズマブ、ベズロトクスマブ、ビシロマブ、ビマグルマブ、ビバツズマブメルタンシン、ブリナツモマブ、ブロソズマブ、ブレンツキシマブベドチン、ブリアキヌマブ、ブロダルマブ、カナキヌマブ、カンツズマブメルタンシン、カンツズマブラブタンシン、カプラシズマブ、カプロマブペンデチド、カルルマブ、カツマキソマブ、ＣＣ４９、セデリズマブ、セルトリズマブペゴール、セツキシマブ、Ｃｈ．１４．１８、シタツズマブボガトクス、シクスツムマブ、クラザキズマブ、クレノリキシマブ、クリバツズマブテトラキセタン、コナツムマブ、コンシズマブ、クレネズマブ、ＣＲ６２６１、ダセツズマブ、ダクリズマブ、ダロツズマブ、ダラツムマブ、デムシズマブ、デノスマブ、デツモマブ、ドルリモマブアリトクス、ドロジツマブ、デュリゴツマブ、デュピルマブ、デュシギツマブ、エクロメキシマブ、エクリズマブ、エドバコマブ、エドレコロマブ、エファリズマブ、エフングマブ、エロツズマブ、エルシリモマブ、エナバツズマブ、エンリモマブペゴール、エノキズマブ、エノチクマブ、エンシツキシマブ、エピツモマブシツキセタン、エプラツズマブ、エルリズマブ、エルツマキソマブ、エタラシズマブ、エトロリズマブ、エボロクマブ、エキスビビルマブ、ファノレソマブ、ファラリモマブ、ファルレツズマブ、ファシヌマブ、ＦＢＴＡ０５、フェルビズマブ、フェザキヌマブ、フィクラツズマブ、フィギツムマブ、フランボツマブ、フォントリズマブ、フォラルマブ、フォラビルマブ、フレソリムマブ、フルラヌマブ、フツキシマブ、ガリキシマブ、ガニツマブ、ガンテネルマブ、ガビリモマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、ゲボキズマブ、ギレンツキシマブ、グレムバツムマブベドチン、ゴリムマブ、ゴミリキシマブ、ＧＳ６６２４、イバリズマブ、イブリツモマブチウキセタン、イクルクマブ、イゴボマブ、イムシロマブ、イムガツズマブ、インクラクマブ、インダツキシマブラブタンシン、インフリキシマブ、インテツムマブ、イノリモマブ、イノツズマブオゾガマイシン、イピリムマブ、イラツムマブ、イトリズマブ、イキセキズマブ、ケリキシマブ、ラベツズマブ、ラムパリズマブ、レブリキズマブ、レマレソマブ、レルデリムマブ、レキサツムマブ、リビビルマブ、リゲリズマブ、リンツズマブ、リリルマブ、ロデルシズマブ、ロルボツズマブメルタンシン、ルカツムマブ、ルミリキシマブ、マパツムマブ、マスリモマブ、マブリリムマブ、マツズマブ、メポリズマブ、メテリムマブ、ミラツズマブ、ミンレツモマブ、ミツモマブ、モガムリズマブ、モロリムマブ、モタビズマブ、モキセツモマブパスドトクス、ムロモナブＣＤ－３、ナコロマブタフェナトクス、ナミルマブ、ナプツモマブエスタフェナトクス、ナルナツマブ、ナタリズマブ、ネバクマブ、ネシツムマブ、ネレリモマブ、ネスバクマブ、ニモツズマブ、ニボルマブ、ノフェツモマブメルペンタン、オビヌツズマブ、オカラツズマブ、オクレリズマブ、オデュリモマブ、オファツムマブ、オララツマブ、オロキズマブ、オマリズマブ、オナルツズマブ、オポルツズマブモナトクス、オレゴボマブ、オルチクマブ、オテリキシズマブ、オキセルマブ、オザネズマブ、オゾラリズマブ、パギバキシマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、パノバクマブ、パルサツズマブ、パスコリズマブ、パテクリズマブ、パトリツマブ、ペムツモマブ、ペラキズマブ、ペルツズマブ、ペキセリズマブ、ピジリズマブ、ピナツズマブベドチン、ピンツモマブ、プラクルマブ、ポラツズマブベドチン、ポネズマブ、プリリキシマブ、プリトキサキシマブ、プリツムマブ、ＰＲＯ１４０、クイリズマブ、ラコツモマブ、ラドレツマブ、ラフィビルマブ、ラムシルマブ、ラニビズマブ、ラキシバクマブ、レガビルマブ、レスリズマブ、リロツムマブ、リツキシマブ、ロバツムマブ、ロレデュマブ、ロモソズマブ、ロンタリズマブ、ロベリズマブ、ルプリズマブ、サマリズマブ、サリルマブ、サツモマブペンデチド、セクキヌマブ、セリバンツマブ、セトキサキシマブ、セビルマブ、シブロツズマブ、シファリムマブ、シルツキシマブ、シムツズマブ、シプリズマブ、シルクマブ、ソラネズマブ、ソリトマブ、ソネプシズマブ、ソンツズマブ、スタムルマブ、スレソマブ、スビズマブ、タバルマブ、タカツズマブテトラキセタン、タドシズマブ、タリズマブ、タネズマブ、タプリツモマブパプトクス、テフィバズマブ、テリモマブアリトクス、テナツモマブ、テネリキシマブ、テプリズマブ、テプロツムマブ、ＴＧＮ１４１２、チシリムマブ（＝トレメリムマブ）、チルドラキズマブ、チガツズマブ、ＴＮＸ－６５０、トシリズマブ（＝アツリズマブ）、トラリズマブ、トシツモマブ、トラロキヌマブ、トラスツズマブ、ＴＲＢＳ０７、トレガリズマブ、トレメリムマブ、ツコツズマブセルモロイキン、ツビルマブ、ウブリツキシマブ、ウレルマブ、ウルトキサズマブ、ウステキヌマブ、バパリキシマブ、バテリズマブ、ベドリズマブ、ベルツズマブ、ベパリモマブ、ベセンクマブ、ビシリズマブ、ボロシキシマブ、ボルセツズマブマフォドチン、ボツムマブ、ザルツムマブ、ザノリムマブ、ザツキシマブ、ジラリムマブ、又はゾリモマブアリトクスであってよい。

好ましい抗体としては、ナタリズマブ、ベドリズマブ、ベリムマブ、アタシセプト、アレファセプト、オテリキシズマブ、テプリズマブ、リツキシマブ、オファツムマブ、オクレリズマブ、エプラツズマブ、アレムツズマブ、アバタセプト、エクリズマブ、オマリズマブ、カナキヌマブ、メプリズマブ、レスリズマブ、トシリズマブ、ウステキヌマブ、ブリアキヌマブ、エタネルセプト、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴール、ゴリムマブ、トラスツズマブ、ゲムツズマブ、オゾガマイシン、イブリツモマブ、チウキセタン、トスチツモマブ、セツキシマブ、ベバシズマブ、パニツムマブ、デノスマブ、イピリムマブ、ブレンツキシマブ、及びベドチンが挙げられる。

その利益が改善される療法は、典型的には、臓器移植である。臓器は、腎臓、肝臓、心臓、膵臓、肺、又は小腸から選択してよい。治療される被験体は、好ましくは、感作されていてもよく、高度に感作されていてもよい。「感作」とは、被験体でヒト主要組織適合性（ＭＨＣ）抗原（ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）とも称される）に対する抗体を発生していることを意味する。抗ＨＬＡ抗体は、同種感作されたＢ細胞を起源とし、通常、輸血、過去の移植、又は妊娠によって既に感作されている患者に存在する（Ｊｏｒｄａｎ ｅｔ ａｌ．，２００３）。

有望な移植レシピエントが感作されているかどうかは、任意の好適な方法によって判定することができる。例えば、パネル反応性抗体（ＰＲＡ）試験を使用して、レシピエントが感作されているかどうかを判定することができる。ＰＲＡスコアが＞３０％であれば、典型的には、患者が「免疫学的リスクが高い」又は「感作されている」ことを意味すると解釈される。あるいは、有望な移植ドナーの血液サンプルと意図されるレシピエントの血液サンプルとを混合する交差適合試験を実施してもよい。交差適合が陽性であるとは、レシピエントがドナーのサンプルと反応する抗体を有していることを意味し、これは、レシピエントが感作されており、移植を行うべきでないことを示す。交差適合試験は、典型的には、移植直前の最終チェックとして実施される。

有望なドナーのＭＨＣ抗原に対する高力価抗体（すなわち、ドナー特異的抗体（ＤＳＡ））の存在は、急性抗体媒介性拒絶反応のリスクがあるため、移植の直接の禁忌となる。つまり、ドナーのＭＨＣ抗原に対する感作は、好適なドナーの同定の妨げとなる。交差適合試験が陽性であることは、移植の明白な障害となる。腎移植待機患者の約３分の１が感作されており、高度に感作されているのは１５％にものぼるため、これは移植待機患者の蓄積につながる。米国では、２００１～２００２年における腎移植の待機者リストの中央時間は、パネル反応性抗体（ＰＲＡ）スコアが０～９％の人で１３２９日、ＰＲＡが１０～７９％の人で１９２０日、ＰＲＡが８０％以上の人では３６４９日であった（ＯＰＴＮ－データベース、２０１１年）。

ＤＳＡの障壁を克服するための１つの許容されている戦略は、移植を考慮することができるレベルまでＤＳＡのレベルを下げるために、血漿交換又は免疫吸着を、多くの場合、例えば静注ガンマグロブリン（ＩＶＩｇ）又はリツキシマブと組み合わせて適用することである（Ｊｏｒｄａｎ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｖｏ ｅｔ ａｌ．，２００８ａ；Ｖｏ ｅｔ ａｌ．，２００８ｂ）。しかし、血漿交換、免疫吸着、及びＩＶＩｇ処理は、長期間にわたって繰り返し処理することを含むので、非効率であり、綿密な計画が必要になるという問題点がある。死亡したドナーからの臓器が利用可能になった場合、数時間以内に移植しなければならないが、その理由は、長時間にわたる冷阻血時間が腎移植における臓器移植後臓器機能障害及び同種移植片機能損失の最も重大なリスク要因のうちの１つであるためである（Ｏｊｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６３：９６８－７４）。

対照的に、本発明の方法では、有望な移植レシピエントにおけるＤＳＡを迅速、一時的、かつ安全に除去することができる。本発明のポリペプチドを移植直前に投与することは、高度に感作された患者を有効に脱感作する能力を有し、それにより、移植が可能になり、急性抗体媒介性拒絶反応が回避される。移植前にポリペプチドを単回投与することで、ドナー特異的ＩｇＧ抗体を有する数千人の患者への移植が可能になる。

この実施形態の状況では、方法は、代替的に、被験体における臓器不全を治療する方法であって、（ａ）被験体に本発明のポリペプチドを投与すること；及び（ｂ）その後、移植用臓器を該被験体に移植することを含み、
－ 投与される該ポリペプチドの量が、該被験体の血漿中に存在する実質的に全てのＩｇＧ分子を切断するのに十分であり；かつ
－ 工程（ａ）及び（ｂ）が、少なくとも３０分間、最長２１日間の時間間隔で隔てられている方法であると説明することもできる。

すなわち、この実施形態は、被験体における移植臓器の拒絶反応、特に、急性抗体媒介性移植拒絶反応を予防する方法であって、該臓器の移植の少なくとも３０分、最長２１日前に、本発明のポリペプチドを被験体に投与することを含み、投与される該ポリペプチドの量が、該被験体の血漿中に存在する実質的に全てのＩｇＧ分子を切断するのに十分である方法として説明することができる。本発明はまた、臓器不全を治療するか又は移植拒絶反応、特に急性抗体媒介性移植拒絶反応を予防するこのような方法における本発明のポリペプチドの使用も提供する。本発明はまた、そのような方法による臓器不全の治療又は移植拒絶反応の予防のための医薬の製造における、本発明のポリペプチドの使用も提供する。この実施形態では、本発明の方法は、移植時又は移植直前に実施される工程を更に含んでいてもよく、該工程は、患者におけるＴ細胞及び／又はＢ細胞の誘導抑制を含む。該誘導抑制は、典型的には、有効量の、Ｔ細胞を殺傷又は阻害する剤の投与、及び／又は有効量の、Ｂ細胞を殺傷又は阻害する剤の投与を含み得る。Ｔ細胞を殺傷又は阻害する剤としては、ムロモナブ、バシリキシマブ、ダクリズマブ、抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）抗体、及びリンパ球免疫グロブリン、抗胸腺細胞グロブリン調製物（ＡＴＧＡＭ）が挙げられる。リツキシマブは、Ｂ細胞を殺傷又は阻害することが知られている。

本発明のポリペプチド等のＩｇＧシステインプロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、例えば造血幹／前駆細胞（ＨＳＰＣ）の被験体への移植の状況において、被験体における造血キメラ化を誘導する方法においても有用であり得る。このように本発明のポリペプチドは、被験体における造血キメラ化を誘導する方法であって、本発明のコンディショニングレジメンを実施し、その後、該被験体における造血キメラ化を誘導するのに十分な量及び好適な条件下でＨＳＰＣを該被験体に投与することを含む方法に使用することができる。あるいは、方法は、ＨＳＰＣを安定的に移植する方法として説明することもできる。ＨＳＰＣは、自己（被験体／患者自身の細胞が使用される）又は同系（細胞が遺伝的に同一の双子由来である）であってもよく、同種（細胞が別個の同一ではないドナーに由来する）であってもよい。レシピエントにおけるＨＳＰＣの生着が成功する可能性を低下させる免疫合併症は、同種細胞において最も顕著であり、従って、造血キメラ化を誘導する方法は、このような細胞において利益が最も大きい。しかし、自己細胞であっても、レシピエントが過去に曝露されたことのない生成物が発現している場合には、免疫合併症が起こる可能性がある。自己細胞が遺伝子療法を発現するように遺伝的に改変されている場合、その細胞は免疫応答を惹起するのに十分な程度変化している可能性がある。例えば、発現した遺伝子療法産物に対する免疫応答が存在する可能性がある。レシピエントのＨＬＡと適合しない異なるＨＬＡ型を発現するようにＨＳＰＣが遺伝的に改変されている場合も同様である。

また、本発明のポリペプチド等のＩｇＧシステインプロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、養子細胞移入免疫療法と併用することもできる。ＣＡＲ－Ｔ細胞等の移植された細胞の生存期間が限定されること及び活性の持続性が限定されることにより、養子細胞移入免疫療法の有効性が低下する可能性がある。ＩｇＧシステインプロテアーゼを有するタンパク質は、移入された細胞を保護することができる。具体的には、既存の抗体及び移入された細胞を投与した後に作製された抗体は、移入された細胞の潜在力を短くする可能性があり、移入された細胞の治療効果は、レシピエントのコンディショニングを通して抗体のエフェクター機能を除去することから利益を得られる。従って、ＩｇＧシステインプロテアーゼ活性を有するタンパク質を投与することにより、移入された細胞の生存率及び活性を高めることができ、その結果、養子細胞移入免疫療法の患者への利益が改善され、例えばがん治療等の状況において療法及び予後が改善される。この状況では、がんを治療する方法は、１用量以上の養子細胞移入免疫療法を投与する前及び／又は後に、ＩｇＧシステインプロテアーゼ活性を有する本発明のポリペプチドを投与することを含んでいてもよい。また、本発明のポリペプチド等のＩｇＧシステインプロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、自己免疫病態、感染症、及び有害な抗体によって媒介される病態を治療する方法の状況において、養子細胞移入免疫療法と併用することもできる。このような方法によって、既存の抗薬物抗体（ＡＤＡ）及び養子細胞移入免疫療法によって惹起された抗体の両方を不活性化することが可能になる。

特に断りのない限り、使用した方法は、標準的な生化学的及び分子生物学的技術である。好適な方法論の教科書の例としては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８９）及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．が挙げられる。

実施例１－ｐＣＡＲＴ２３９の発現及び精製
成熟ＩｄｅＺ分子及び配列を分析し、変異に好適な領域を同定した。場合によっては、変異によってもたらされる可能性の高い結果を評価するために、インシリコ評価を使用した。ｐＣＡＲＴ２３９の配列を決定し、導入される変異の数に応じて出発配列の部位特異的変異又は合成によって、各ポリペプチドをコードしているｃＤＮＡをＧｅｎｅＣｕｓｔ（Ｌｕｘｅｍｂｏｕｒｇ）において作製した。ｃＤＮＡの配列を決定し、短いグリシンリンカー（３×Ｇｌｙ）によってＣ末端に連結されたＣ末端の６×ＨｉｓタグとインフレームになるようにｐＥＴ９ａ発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）に移入した。細菌発現のために、Ｎ末端にメチオニンを付加した。従って、ｐＣＡＲＴ２３９ポリペプチドは、追加の（１）Ｎ末端メチオニン及び（２）短いグリシンリンカー（３×Ｇｌｙ）によってＣ末端に連結されたＣ末端６×Ｈｉｓタグを有する配列番号１と等価である。

ｐＣＡＲＴ２３９発現プラスミドを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔ７Ｅ２（ＳＯＵＲＣＥ）に形質転換し、５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含有するＬＢアガロースプレートに播種した。シングルコロニーをピッキングし、３７℃、２５０ｒｐｍで一晩培養（１０ｍＬ ＬＢ培地）を開始した。翌日、１２５ｍＬのＬＢ培地＋５０μｇ／ｍＬカナマイシン＋１：１００，０００希釈した消泡剤の入ったフラスコ２本に、一晩培養物５ｍＬを接種した。培養フラスコは接種時に既に３７℃であり、ＯＤが０．６～０．７になるまで培養物を成長させた（３７℃、３００ｒｐｍ）。この時点で、ＩＰＴＧ（最終濃度１ｍＭ）を添加して発現を誘導し、培養物を少なくとも２時間更にインキュベートした。インキュベートした後、遠心分離（１０分、４０００×ｇ、４℃）によって細菌懸濁液を収集し、上清を廃棄した。ペレットをＰＢＳ（３０ｍＬ）で１回洗浄し、再度遠心分離して上清を廃棄し、最終ペレットを－２０℃で凍結させ、一晩冷凍庫で保存した。細菌の溶解には、製造業者の指示書に従ってＰａｎｄａ Ｐｌｕｓ ２０００ホモジナイザー（ＧＥＡ）を使用したか、又は凍結融解プロトコルを使用した（１０ｍＬ ＰＢＳ中凍結／融解を３サイクル、滅菌ガラスビーズを使用）。凍結融解サイクルの後、チューブを遠心分離（２０分、２５０００×ｇ、４℃）して細菌溶解物（上清）を単離し、次いで、氷上で保存した。最終的な細菌溶解物をプールし、０．２μｍのナイロンフィルター（ＨＰＦ Ｍｉｌｌｅｘ（登録商標）－Ｎｙｌｏｎ）で滅菌濾過し、Ｎｉ－ＮＴＡプレパックスピンカラム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いてタンパク質を精製した。精製後、ＤＴＴ（最終濃度５ｍＭ）及びＥＤＴＡ（最終濃度５ｍＭ）を溶出液に添加した後、バッファ交換した（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－４ １０Ｋ）。ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、タンパク質濃度を測定した。ステンレスの１２％ Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標）ＴＧＸ（商標）プレキャストゲル（Ｂｉｏｒａｄ）を用いたドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）で、発現精製プロセス中の精製タンパク質の純度及び安定性を評価した（図１）。図１Ａは、ＩＰＴＧ誘導とその後のｐＣＡＲＴ２３９の過剰発現が成功したことを示す。図１Ｂは、精製プロセスも成功し、高い純度及び安定性のｐＣＡＲＴ２３９サンプルが得られたことを示す。

実施例２－ヒュミラ（ＩｇＧ１）及びＸＧＥＶＡ（ＩｇＧ２）に対するｐＣＡＲＴ２０７、ｐＣＡＲＴ２２９、Ｎ２４０、ｐＣＡＲＴ２４２の有効性
この実施例では、ヒトＩｇＧ１はＨｕｍｉｒａ（Ａｂｂｖｉｅ）によって、ＩｇＧ２はＸＧＥＶＡ（Ａｍｇｅｎ）によって表される。これらは、モノクローナルヒトＩｇＧの切断におけるＩｄｅＺバリアント及びＩｄｅＳポジティブコントロールの活性を比較するために使用される。ＩｄｅＺバリアント酵素（及びＩｄｅＳ）を、３．３μｇ／ｍＬの出発濃度から１：３希釈段階でＰＢＳ中０．０５％ＢＳＡにおいてタイトレーションし、切断産物をＳＤＳ－ＰＡＧＥ（４→２０％勾配ゲル）によって分析した。試験したｐＣＡＲＴ２４２ポリペプチドは、追加の（１）Ｎ末端メチオニン及び（２）短いグリシンリンカー（３×Ｇｌｙ）によってＣ末端に連結されたＣ末端６×Ｈｉｓ－ｔａｇを有する配列番号２と等価である。

方法：
１．酵素及び対照（バッファ）の希釈液２５μＬをマルチタイタープレートに移した。
２．各ウェルにヒュミラ又はＸＧＥＶＡの２ｍｇ／ｍＬ溶液を２５μＬ添加することによって反応を開始させた。この結果、反応中の各抗体は１ｍｇ／ｍＬとなった。連続希釈を考慮すると、試験したＩｄｅＺ（又はＩｄｅＳ）の最高濃度は３．３μｇ／ｍＬであり、最低０．０５７ｎｇ／ｍＬまで低下した。
３．プレートをゆっくり回転させながら３７℃で２時間インキュベートする。
４．インキュベーション後、マイクロタイタープレートにおいて各サンプル１０μＬを２×ＳＤＳローディングバッファー３０μＬと混合した。一晩保存（４～８℃）した後、これを１．５ｍＬのチューブに移し、９２℃で５分間インキュベートし、サンプル１０μＬを１５ウェル４→２０％ Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標）ＴＧＸ（商標）プレキャストゲルにロードし、サンプルを非還元条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥにおいて分析した。

ＩｄｅＺバリアントによるＩｇＧ１（ヒュミラ）及びＩｇＧ２（ＸＧＥＶＡ）の消化を示すゲルを、それぞれ図２、図３に示す。異なるパネルは、異なる実験セットを表す（ただし、プロトコルはいずれの場合も同一であった）。

ＩｇＧ１／ＩｇＧ２の第１及び第２の重鎖を切断するためのおおよその濃度を、ゲルに示された切断パターンから以下の通り推定した。

概要：
ＩｇＧ１（ヒュミラ）切断に関するＩｄｅＳ、ｐＣＡＲＴ２０７、ｐＣＡＲＴ２２９の有効性は非常に類似している。ｐＣＡＲＴ２３９及びＮ２４０では、ＩｄｅＳ及び非常に類似するバリアントであるｐＣＡＲＴ２２９の両方と比較して高い有効性がみられる。Ｎ２４０及びｐＣＡＲＴ２４２は、第２のＩｇＧ１重鎖の切断においてＩｄｅＳよりも強力であると考えられる。Ｎ２４０及びｐＣＡＲＴ２４２は、主にＩｇＧ２（Ｘｇｅｖａ）の第２の切断に対してｐＣＡＲＴ２２９及びｐＣＡＲＴ２０７よりも高い効力を有するだけでなく、ＩｇＧ２の第１の重鎖の切断においてもより効力が高い。

実施例３－ヒトＩｇＧサブクラスに対するＮ２４０の有効性
この報告では、様々なＩｇＧサブクラスの消化によるインビトロにおけるＮ２４０活性の特性評価について説明する。ＩｇＧサブクラスの場合、２種の異なる自社製Ｎ２４０バッチを比較し、使用した参照物質はＩｄｅＳである。

方法：
１．Ｎ２４０又はＩｄｅＳの酵素及び対照（バッファ）の希釈液２５μＬをマルチタイタープレートに移した。連続する各ウェル間で、酵素をＰＢＳ中０．０５％ ＢＳＡで１：３連続希釈した。
２．各ウェルにヒトＩｇＧの２ｍｇ／ｍＬ溶液を２５μＬ添加することによって反応を開始させた。この結果、反応中の各抗体は１ｍｇ／ｍＬとなった。使用したＩｇＧ１はヒュミラ（Ａｂｂｖｉｅ）であり、使用したＩｇＧ２はＸＧＥＶＡ（Ａｍｇｅｎ）であり、使用したＩｇＧ３はＳｉｇｍａ製（Ｉ５６５４ ロット番号ＳＬＢＷ０８９９）であり、使用したＩｇＧ４はＡｂｃａｍ製（ａｂ９０２８６ ロット番号ＧＲ３１８０４６９）であった。
３．プレートをゆっくり回転させながら３７℃で２時間インキュベートする。
４．インキュベーション後、マイクロタイタープレートにおいて各サンプル１０μＬを２×ＳＤＳローディングバッファー３０μＬと混合した。一晩保存後（４～８℃）、これを１．５ｍＬチューブに移し、９２℃で５分間インキュベートし、サンプル１０μＬを１５ウェル４→２０％ Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標）ＴＧＸ（商標）プレキャストゲルにロードした。

Ｎ２４０及びＩｄｅＳによるＩｇＧサブクラスの消化を示すゲルを図４に示す。

ゲルの目視から得られた推定ＥＣ_５０値を以下の表３に列挙する。

概要：
１．４つのヒトのサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４を全てＮ２４０によって切断する。
２．Ｎ２４０、特に第２の鎖の切断について、（ＩｄｅＳに対して）より高い活性が明らかにみられる。ＩｇＧ１についてのＥＣ_５０ Ｆ（ａｂ’）_２は、Ｎ２４０と比較してＩｄｅＳではおよそ５倍高かった。
３．ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４の場合、Ｎ２４０は、ＩｄｅＳと同等であるか又はわずかに低い効力を有していた。

実施例４－Ｎ２４０とＩｄｅＳとのＭＳＤ効力アッセイの比較
方法：
ＭＳＤ力価アッセイの背後にある原理のより詳細な概要については、実施例５で後述する。

簡潔に述べると、ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）_２断片特異的を、９６ウェルＭＳＤプレートにコーティングした。ブロッキング後、プレートを洗浄し、一連の濃度で希釈したＮ２４０参照物質及びＩｄｅＳ試験サンプルをプレートに添加した。一定濃度のヒトＩｇＧを添加し、プレートを３７℃でインキュベートした。インキュベート及び洗浄した後、ビオチン化マウス抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）及びＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ標識ストレプトアビジンを含有する検出ミックスをプレートに添加した。最後のインキュベート及び洗浄の後、Ｒｅａｄ Ｂｕｆｆｅｒを添加した。ＭＳＤ機器を用いて、ＳＵＬＦＯ－ＴＡＧからの発光強度を測定して、サンプル中の非切断型及び単一切断型のＩｇＧの定量的測定値を提供した。Ｎ２４０参照物質及びＩｄｅＳ試験サンプルをデュープリケートのウェル及びトリプリケートのプレートで分析した。結果を５パラメータ曲線に当てはめることによって、各参照サンプル及び試験サンプルのＥＣ_５０を得た。ＥＣ_５０参照／ＥＣ_５０試験を除して１００％を乗じることにより、各試験サンプルの相対効力（％）を求めた。報告する値は、３枚の異なるプレートからの平均である。

ＩｄｅＳ及びＮ２４０についてのＩｇＧ切断を表す、得られた希釈曲線を図５に示す。

Ｎ２４０の平均相対効力は、ＩｄｅＳ比較しておよそ３００％であると算出された。

実施例５－ヒト血清中のＩｇＧに対するｐＣＡＲＴ２３９の有効性
ＩｄｅＺバリアントｐＣＡＲＴ２３９を、血清中での活性を測定することによって更に特性評価した。

ＩｇＧ基質として、１００人の個体からのヒト血清プールを使用した。

ＳＤＳ－ＰＡＧＥ
ｐＣＡＲＴ２３９に使用した希釈系列は、以下の通りであった：３０、１５、７．５、３．７５、１．９、０．９、０．２、０．２、０．１、０．０６、及び０．０３μｇ／ｍＬ、実施例２及び３に概説した活性アッセイ及びＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析プロトコルに従った。

ｐＣＡＲＴ２３９による血清ＩｇＧの消化を示すゲルを、図６に示す。この図は、ｐＣＡＲＴ２３９が血清プールにおいてＩｇＧ切断活性を有し、およそ０．９μｇ／ｍＬの酵素でＩｇＧからｓｃＩｇＧに切断されるとゲルから推定されることを示す（図６、上パネル）。ｓｃＩｇＧは、およそ１．９μｇ／ｍＬの酵素でＦ（ａｂ’）_２及びＦｃの断片に更に消化される。

血清中で得られた活性値は、バッファ中で得られたものよりも低く、これは血清中には阻害性抗薬物抗体（ＡＤＡ）が存在するためであり、以前の研究から公知の現象である。血清中に阻害性ＡＤＡ以外の特異的阻害因子が存在しないことを確認するために、ｐＣＡＲＴ２３９の不活性型バリアント（ｐＣＡＲＴ２４３）を０．１ｍｇ／ｍＬで添加した実験も行った。この添加は高モル過剰であり、血清中のｐＣＡＲＴ２３９の活性が回復する程度に不活化ＡＤＡと結合するはずである。その通りであることが示され（図６、下パネル）、ｐＣＡＲＴ２４３の存在により、はるかに低いｐＣＡＲＴ２３９濃度でＩｇＧの切断が生じた。インタクトなＩｇＧは０．０３μｇ／ｍＬですでに消化され始め、０．５μｇ／ｍＬで全てのＩｇＧがｓｃＩｇＧに変換された。

電気化学発光メソスケールディスカバリー（ＭＳＤ）プラットフォーム
血清中のＮ２４０活性について更に調べるために、血清マトリックスでＭＳＤ効力アッセイを行った。

このアッセイの原理は、Ｆａｂ領域に対して特異性を有するヒトＩｇＧ抗体に対するＦ（ａｂ）_２－断片でマルチタイタープレートのウェルをコーティングすることであった。次いで、タイトレーションされた濃度のＩｇＧシステインプロテアーゼポリペプチド（試験又は対照）を、ウェル中のヒト血清と共にインキュベートした。ウェルに結合したインタクトな又は単一切断型のヒトＩｇＧの量を、抗体のＦｃ部分に対して特異性を有するヒトＩｇＧに対する検出抗体を用いて測定した。ウェル中の所与のＩｇＧシステインプロテアーゼポリペプチドの濃度が高いほど、ウェルに結合するインタクトなヒトＩｇＧ抗体が少なくなるので、シグナルがより少なくなる。同様に、より強力なＩｇＧシステインプロテアーゼポリペプチドは、同じ濃度で存在する場合、それほど強力ではないＩｇＧシステインプロテアーゼポリペプチドよりも与えるシグナルが少なくなるであろう。ＩｄｅＳ対照（ｐＣＡＲＴ１２４）及びＮ２４０についてタイトレーション用量応答曲線を作成した。試験したシステインプロテアーゼのＥＣ_５０値を算出することによって、効力を推定した。ＥＣ_５０値が低いほど、より強力なＩｇＧシステインプロテアーゼであることを表す。このアッセイでは、ＩｇＧのＦｃ部分が未だ存在し、Ｆｃ特異的検出抗体によって検出することができるため、第１のＩｇＧ重鎖のＩｇＧからｓｃＩｇＧへの切断はみられない。

実験室プロトコルの簡単な概要：マルチタイタープレートのウェルにヤギ抗ヒトＦａｂ特異的Ｆ（ａｂ）_２－断片（０．５μｇ／ｍＬ）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＃１０９－００６－０９７）を一晩コーティングし（＋２～８℃）、次いで、ＰＢＳ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０（ＰＢＳ－Ｔ）で洗浄し、ＰＢＳ－Ｔ中０．４５％フィッシュゼラチン（ブロッキングバッファ）において室温で４５～１２０分ブロッキングした。対照ＩｄｅＳ（ｐＣＡＲＴ１２４）及び被験ＩｇＧシステインプロテアーゼポリペプチドは、出発濃度８０μｇ／ｍＬで、ブロッキングバッファによる１：４希釈段階のタイトレーション系列として調製した。等体積（２５μＬ）のヒト血清及びタイトレーションした量のＩｇＧシステインプロテアーゼポリペプチドをウェルに添加し、３７℃の制御された温度環境で振盪しながら２時間インキュベートし、次いで、ＰＢＳ－Ｔで洗浄した。ビオチン化マウス抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ特異的（ｍ－ａ－ｈＩｇＧ Ｂｉｏ ＩＩ、ロット：Ｃ００１３－ＺＣ４３Ｃ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）（６００ｎｇ／ｍＬ）抗体をＳｔｒｅｐ－ｓｕｌｆｏ（２００ｎｇ／ｍＬ）と混合し、マルチタイタープレートに添加した。プレートをアルミテープで密封し、＋２５℃で１時間振盪しながらインキュベートした。次いで、プレートをＰＢＳ－Ｔで洗浄し、２倍希釈したＲｅａｄ ｂｕｆｆｅｒ Ｔ（ＭＳＤ ｒｅａｄ ｂｕｆｆｅｒ Ｔ、カタログ番号Ｒ９２ＴＣ－２）１５０μＬを各ウェルに添加した。プレートを直ちにプレートリーダー、ＭＳＤ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）ＱｕｉｃｋＰｌｅｘ ＳＱ １２０ Ｍｏｄｅｌ １３００で読み取った。

ＩｄｅＳ及びＮ２４０についてのＩｇＧ切断を表す、得られた標準曲線を図７に示す。以下の表は、用量応答曲線から求めたＥＣ_５０値に基づく相対効力の推定値を示す。

概要
Ｎ２４０は、血清中で活性がある。緩衝溶液中でのＮ２４０の効力はイムリフィダーゼの効力よりもおよそ４倍高いことが前の実施例で示されているが、この差は、２つの酵素を血清中で比較したときにはより小さい。ＭＳＤ効力分析では、Ｎ２４０は、更に、ＩｄｅＳと比較したとき、血清中でヒトＩｇＧに対して活性の実質的な増加を示した（約１４２％）。

実施例６－健常個体におけるＮ２４０及びＩｄｅＳのＡＤＡレベル
以下を除いて、実施例５に記載した一般的なＭＳＤプロトコルに従った。

マルチアレイＭＳＤプレートに２０μｇ／ｍＬのＮ２４０又はＩｄｅＳをコーティングした。健常個体（ｎ＝４０）からの血清（１：１００希釈）及び１つのヒト血清プール（ｎ＝１００）と共にインキュベートする前に、プレートをフィッシュゼラチンでブロッキングした。検出試薬は、抗ヒトＦ（ａｂ’）_２特異的Ｆ（ａｂ’）_２－ｂｉｏ抗体（ＪＡＸ、１０９－０６６－０９７）をストレプトアビジン－スルホ（ＭＳＤ ＃Ｒ３２ＡＤ－１）と共に使用した。Ｒｅａｄ Ｂｕｆｆｅｒ（ＭＳＤ ＃Ｒ９２ＴＣ－２）を添加した後、ＭＳＤ ＱｕｉｃｋＰｌｅｘ ＳＱ １２０を使用してプレートを読み取った。

結果を図８に提示する。この結果は、Ｎ２４０に対するＡＤＡのレベルがＩｄｅＳに対するＡＤＡよりも低いことを示す。

Claims (29)

1. ＩｇＧシステインプロテアーゼ活性を有し、
   （ｉ）配列番号１；又は
   （ｉｉ）配列番号２；又は
   （ｉｉｉ）それぞれ配列番号１若しくは配列番号２に対して１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、若しくは１０個のアミノ酸改変を有する配列番号１若しくは配列番号２のバリアント
   であるアミノ酸配列を含むか又はからなるポリペプチド、但し、前記配列が、（ａ）配列番号５の９５位に対応する位置のアスパラギン（Ｎ）、（ｂ）配列番号５の９９位に対応する位置のアスパラギン酸（Ｄ）、及び（ｃ）配列番号５の２２６位に対応する位置のアスパラギン（Ｎ）を保持しており、かつ同じアッセイで測定したときに、前記ポリペプチドが、それぞれ配列番号１又は２のアミノ酸配列からなるポリペプチドと少なくとも同程度ヒトＩｇＧの切断に有効である、ポリペプチド。
2. （ｉｉｉ）における改変のうちの少なくとも１つによって、配列番号３のポリペプチド配列の対応する位置に存在するのと同じアミノ酸は生じない、請求項１に記載のポリペプチド。
3. （ｉｉｉ）におけるいずれの改変によっても、配列番号３のポリペプチド配列の対応する位置に存在するのと同じアミノ酸は生じない、請求項１または２に記載のポリペプチド。
4. Ｎ末端に追加のメチオニン及び／又はＣ末端に追加のヒスチジンタグを更に含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
5. 同じアッセイで測定したときに、ＩｄｅＺポリペプチドよりもヒトＩｇＧの切断に有効である、及び／又はＩｄｅＳポリペプチドと少なくとも同程度ヒトＩｇＧの切断に有効である、請求項１から４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
6. 同じアッセイで測定したときに、ＩｄｅＳポリペプチドよりもヒトＩｇＧの切断に有効であり、任意で、有効性が、ヒト被験体から採取した血液又は血清のサンプルにおいてインビトロで測定される、請求項１から５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
7. 同じアッセイで測定したときに、ＩｄｅＳポリペプチドよりも少なくとも１．２倍ヒトＩｇＧに切断に有効である、請求項６に記載のポリペプチド。
8. 同じアッセイで測定したときに、ＩｄｅＳポリペプチドよりも少なくとも１．３倍ヒトＩｇＧに切断に有効である、請求項６または７に記載のポリペプチド。
9. 同じアッセイで測定したときに、ＩｄｅＳポリペプチドよりも少なくとも１．４倍ヒトＩｇＧに切断に有効である、請求項６から８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
10. 同じアッセイで測定したときに、ＩｄｅＳポリペプチドよりも免疫原性が低い及び／又はＩｄｅＺポリペプチドの免疫原性を超えない、請求項１から９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
11. 同じアッセイで測定したときに、ＩｄｅＳポリペプチドよりも免疫原性が低い、請求項１から１０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
12. 同じアッセイで測定したときに、ポリペプチドの免疫原性がＩｄｅＳポリペプチドの免疫原性の８５％以下である、請求項１から１１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
13. 請求項１から１２のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド。
14. 請求項１３に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
15. 請求項１３に記載のポリヌクレオチド又は請求項１４に記載の発現ベクターを含む宿主細胞である、宿主細胞。
16. 前記宿主細胞が、細菌細胞である、請求項１５に記載の宿主細胞。
17. 前記宿主細胞が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の細胞である、請求項１４または１５に記載の細胞。
18. 請求項１～１２のいずれか一項に記載のポリペプチドと、少なくとも１つの薬学的に許容し得る担体又は希釈剤とを含む組成物。
19. ヒト又は動物の身体の治療において使用するための、請求項１～１２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
20. 被験体における疾患又は病態を予防又は治療するために使用される請求項１８に記載の組成物。
21. 前記疾患又は病態が、病原性ＩｇＧ抗体によって全体的又は部分的に媒介される疾患又は病態である、請求項２０に記載の組成物。
22. 前記疾患又は病態が、ＡＢＯ不適合移植、アジソン病、抗ＧＢＭ糸球体腎炎（グッドパスチャーに関連する）、抗好中球細胞質抗体関連血管炎（ＡＮＣＡ関連血管炎）（ウェゲナー肉芽腫症、チャーグ－ストラウス症候群、顕微鏡的多発性血管炎）、抗ＮＭＤＡＲ脳炎、抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）及び難治性ＡＰＳ、自己免疫性水疱性皮膚疾患（天疱瘡）、落葉状天疱瘡（ＰＦ）、ブラジル天疱瘡（ＦＳ）（風土病型）、尋常性天疱瘡（ＰＶ）、自己免疫性溶結性貧血（ＡＩＨＡ）、自己免疫性肝炎（ＡＩＨ）、自己免疫性好中球減少症（ＡＩＮ）、水疱性類天疱瘡（ＢＰ）、セリアック病、慢性蕁麻疹、完全先天性心ブロック（ＣＣＨＢ）、１Ａ型糖尿病（Ｔ１ＤＭ）、後天性表皮水泡症（ＥＰＣ）、本態性混合型クリオグロブリン血症、グッドパスチャー症候群（グッドパスチャー病及び抗糸球体基底膜疾患としても知られている）、グレーブス病（バセドウ病）（甲状腺腫及び甲状腺機能亢進症、浸潤性眼球突出、並びに浸潤性皮膚病を含む）、ギランバレー症候群（ＧＢＳ）、急性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＡＩＤＰ）、急性運動軸索性ニューロパチー（ＡＭＡＮ）、血友病－後天性ＦＶＩＩＩ欠損症、ＩｇＡ腎炎、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ランバート－イートン筋無力症候群（ＬＥＭＳ）、混合結合組織病（ＭＣＴＤ）、多発性骨髄腫、重症筋無力症、筋無力症クリーゼ、心筋炎、拡張型心筋症（ＤＣＭ）（うっ血性心筋症）、視神経脊髄炎（ＮＭＯ）、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）、原発性進行性多発性硬化症（ＰＰＭＳ）、リウマチ性心疾患（ＲＨＤ）、（リウマチ熱）、関節リウマチ（ＲＡ）、血清病、免疫複合体過敏症（ＩＩＩ型）、シェーグレン症候群（ＳＳ）、ループス腎炎を含むＳＬＥ、全身硬直症候群（ＳＰＳ）、全身性硬化症（強皮症）、移植拒絶反応、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、ウェゲナー肉芽腫症（多発血管炎性肉芽腫症）、抗薬物抗体（ＡＤＡ）から選択される、請求項２０または２１に記載の組成物。
23. ＩｇＧを切断するためのエクスビボにおける方法であって、ＩｇＧシステインプロテアーゼ活性を生じさせる条件下で、ＩｇＧを含有するサンプルを請求項１～１２のいずれか一項に記載のポリペプチドと接触させることを含む方法。
24. Ｆｃ、Ｆａｂ、及び／又はＦ（ａｂ’）_２の断片を作製するために実施される、請求項２３に記載の方法。
25. 前記サンプルが、請求項２１又は２２において定義された疾患又は病態に罹患している被験体から採取された血液サンプルである、請求項２３又は２４に記載の方法。
26. 療法に使用されるための請求項１８に記載の組成物であって、
    （ａ）前記組成物が前記被験体に投与され、（ｂ）その後、前記療法が前記被験体に投与され、
    前記組成物に投与される前記ポリペプチドの量は、前記被験体の血漿中に存在する実質的に全てのＩｇＧ分子を切断するのに十分であり、
    工程（ａ）及び（ｂ）が、前記被験体の血漿中に存在する実質的に全てのＩｇＧ分子を切断するのに十分な時間間隔で隔てられている、組成物。
27. 前記療法が、臓器移植である、請求項２６に記載の組成物。
28. 被験体に対する治療剤の利益を改善するために使用される請求項１８に記載の組成物であって、
    （ａ）前記組成物が前記被験体に投与され、（ｂ）その後、前記治療剤が前記被験体に投与され、
    前記組成物に投与される前記ポリペプチドの量は、前記被験体の血漿中に存在する実質的に全てのＩｇＧ分子を切断するのに十分であり、
    工程（ａ）及び（ｂ）が、前記被験体の血漿中に存在する実質的に全てのＩｇＧ分子を切断するのに十分な時間間隔で隔てられている、組成物。
29. 前記治療剤が、
    抗体であり；
    ウイルスベクター等の遺伝子療法であり；
    酵素等の欠陥のある内因性因子の代替物であり；
    成長若しくは凝固因子であり；または
    細胞療法である、請求項２８に記載の組成物。