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JP7766605B2 - 非アルコール性脂肪性肝炎（ｎａｓｈ）のバイオマーカー及びその使用 - Google Patents

非アルコール性脂肪性肝炎（ｎａｓｈ）のバイオマーカー及びその使用

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JP7766605B2 JP2022547788A JP2022547788A JP7766605B2 JP 7766605 B2 JP7766605 B2 JP 7766605B2 JP 2022547788 A JP2022547788 A JP 2022547788A JP 2022547788 A JP2022547788 A JP 2022547788A JP 7766605 B2 JP7766605 B2 JP 7766605B2
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Description

関連出願への相互参照
本出願は、２０２０年２月１０日に出願した米国仮出願第６２／９７２，４１８号の優先権の利益を主張するものであり、この出願を、あらゆる目的で、その全内容を、参照により、本明細書で援用する。
発明の分野
本出願は、一般的に、バイオマーカーの検出、及び肝疾患の特徴決定に関連しており、例えば、脂肪肝、肝炎、肝線維症、または肝細胞バルーニングを有する対象を特定する。様々な実施形態では、当該肝疾患は、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を含む。様々な実施形態では、本発明は、個体の肝疾患の特徴決定を行うための１つ以上のバイオマーカー、方法、機器、試薬、システム、及びキットに関する。
背景
以下の説明は、情報の概要を提供するものであって、提供したあらゆる情報、または本明細書で参照したあらゆる刊行物が、本出願の先行技術であることを自認するものではない。
非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）とは、炎症及び線維症の有無に関係なく、アルコール歴が無くとも、脂肪肝が存在するものとして定義する。ＮＡＦＬＤは、非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬ）と、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）に細分される。ＮＡＦＬでは、脂肪肝は、顕著な炎症の証拠が無くとも存在するのに対して、ＮＡＳＨでは、脂肪肝は、組織学的にアルコール性脂肪性肝炎と区別し得ない肝炎と関連している。
ＮＡＦＬＤは、世界規模で認められており、また、肥満の有病率が急速に高まった結果、北米では、肝疾患の主要原因となっている。しかしながら、診断には組織病理学的証拠が必要であるので、それが一因となり、ＮＡＦＬ及びＮＡＳＨの発生率に関する人口をベースとした正確なデータは僅かしかない。ＮＡＦＬＤの主なリスク因子として、中心性肥満、２型糖尿病、高レベルの血中トリグリセリド（脂肪）、及び高血圧がある。米国では、人口の２０～４０％がＮＡＦＬＤに罹患しており、また、肥満人口の約２５％がＮＡＳＨに罹患している。ＮＡＳＨ患者の１０～２９％が肝硬変を発症しており、また、４～２７％が肝癌を発症している。
ＮＡＳＨを有する大抵の方々は無症状である。一部の方々は、右上腹部痛、肝腫大、または非特異的症状、例えば、腹部不快感、脱力感、疲労、もしくは倦怠感などを訴える。医師または看護師は、定期的な血液検査の結果からＮＡＳＨの存在を疑い得る。ＮＡＦＬＤでは、肝酵素のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）及びアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）が高くなることがよくある。
ＮＡＳＨを確認するための現在の絶対的基準は、肝生検の組織学的評価であるが、これは、高額であり、侵襲的である上に、痛み及び出血を引き起こし、さらには死亡に至る場合もある。
ＮＡＳＨなどの肝疾患の様々なステージを同定及び識別する（そして、それにより、肝生検の必要性を小さくする）簡便な血液検査が待望されている。
概要
一部の実施形態では、対象での肝疾患の有無を決定する方法を提供する。一部の実施形態では、脂肪肝、肝炎、肝線維症、または肝細胞バルーニングを有する対象を同定する方法を提供する。様々な実施形態では、当該肝疾患として、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）がある。
一部の実施形態では、対象での非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の有無を決定する方法を提供する。一部の実施形態では、ＮＡＳＨを有する対象を同定する方法を提供する。一部の実施形態では、ＮＡＳＨを有する対象と、脂肪肝、肝炎、肝線維症、または肝細胞バルーニングを有する対象とを識別する方法を提供する。一部の実施形態では、ＮＡＳＨの重症度を決定する方法を提供する。
一部の実施形態では、本明細書の方法は、対象での脂肪肝の有無を決定するためのものであり、Ｎ個のバイオマーカータンパク質を有するバイオマーカーパネルを形成する、及び当該対象から得た試料でのＮ個のバイオマーカータンパク質のそれぞれのレベルを検出することを含む、また、Ｎは少なくとも１である、そして、Ｎ個のバイオマーカータンパク質の少なくとも１つを、ＰＴＧＲ１、ＩＮＨＢＣ、及びＢＰＩＢ１から選択する。一部の実施形態では、Ｎは１～１２である、またはＮは２～１２である、またはＮは３～１２である、またはＮは４～１２である、またはＮは５～１２である、またはＮは１～５である、またはＮは２～５である、またはＮは３～５である、またはＮは４～５である。一部の実施形態では、Ｎは１である、またはＮは２である、またはＮは３である、またはＮは４である、またはＮは５である、またはＮは６である、またはＮは７である、またはＮは８である、またはＮは９である、またはＮは１０である、またはＮは１１である、またはＮは１２である。一部の実施形態では、当該方法は、対象でのＮＡＳＨの有無を決定することを含む。
一部の実施形態では、対象での脂肪肝の有無を決定する方法を提供しており、Ｎ個のバイオマーカータンパク質を有するバイオマーカーパネルを形成する、及び当該対象から得た試料でのＮ個のバイオマーカータンパク質のそれぞれのレベルを検出することを含む、また、Ｎは少なくとも１である、そして、Ｎ個のバイオマーカータンパク質の少なくとも１つを、ＰＴＧＲ１、ＩＮＨＢＣ、及びＢＰＩＢ１から選択する。一部の実施形態では、Ｎ個のバイオマーカータンパク質の少なくとも１つを、ＰＴＧＲ１及びＩＮＨＢＣから選択する。一部の実施形態では、Ｎは少なくとも２である、そして、Ｎ個のバイオマーカータンパク質の少なくとも１つを、ＰＴＧＲ１、ＩＮＨＢＣ、及びＢＰＩＢ１から選択する、そして、Ｎ個のバイオマーカータンパク質の少なくとも１つを、ＦＢＰ１２、ＲＥＣＱ１、ＢＧＬＲ、ＣＮＤＰ１、ＳＯＭ２、及びＧＲＩＤ２から選択する。一部の実施形態では、Ｎは少なくとも２である、Ｎ個のバイオマーカータンパク質の少なくとも１つを、ＰＴＧＲ１、ＩＮＨＢＣ、及びＢＰＩＢ１から選択する、そして、Ｎ個のバイオマーカータンパク質の少なくとも１つを、ＩＮＳＬ５、ＨＥＸＢ、及びＥＲＮ１から選択する。一部のそのような実施形態では、Ｎ個のバイオマーカータンパク質のそれぞれを、ＰＴＧＲ１、ＩＮＨＢＣ、ＢＰＩＢ１、ＦＢＰ１２、ＲＥＣＱ１、ＢＧＬＲ、ＣＮＤＰ１、ＳＯＭ２、ＧＲＩＤ２、ＩＮＳＬ５、ＨＥＸＢ、及びＥＲＮ１から選択する。
一部の実施形態では、Ｎは少なくとも２である、Ｎ個のバイオマーカータンパク質の少なくとも２つを、ＰＴＧＲ１、ＣＮＤＰ１、及びＥＲＮ１；ＰＴＧＲ１、ＩＮＳＬ５、及びＨＥＸＢ；ＩＮＨＢＣ、ＨＥＸＢ、及びＣＮＤＰ１；または、ＢＰＩＢ１、ＣＮＤＰ１、ＩＮＳＬ５、ＨＥＸＢ、及びＥＲＮ１から選択する。
一部の実施形態では、本明細書の方法は、対象での肝炎の有無を決定するためのものであり、Ｎ個のバイオマーカータンパク質を有するバイオマーカーパネルを形成する、及び当該対象から得た試料でのＮ個のバイオマーカータンパク質のそれぞれのレベルを検出することを含む、また、Ｎは少なくとも１である、そして、Ｎ個のバイオマーカータンパク質の少なくとも１つを、ＭＡＡＩ、ＳＡＡ２、ＲＰＮ１、及びＰＣＯＣ２から選択する。一部の実施形態では、Ｎは少なくとも２である、そして、Ｎ個のバイオマーカータンパク質の少なくとも１つを、ＭＡＡＩ、ＳＡＡ２、ＲＰＮ１、ＰＣＯＣ２、ＣＡ１９８、ＣＴＣＦ、及びＴＡＣＤ２から選択する。一部の実施形態では、Ｎは１～１４である、またはＮは２～１４である、またはＮは３～１４である、またはＮは４～１４である、またはＮは５～１４である、またはＮは６～１４である、またはＮは７～１４である、またはＮは８～１４である、またはＮは１～８である、またはＮは２～８である、またはＮは３～８である、またはＮは４～８である、またはＮは５～８である。一部の実施形態では、Ｎは１である、またはＮは２である、またはＮは３である、またはＮは４である、またはＮは５である、またはＮは６である、またはＮは７である、またはＮは８である、またはＮは９である、またはＮは１０である、またはＮは１１である、またはＮは１２である、またはＮは１３である、またはＮは１４である。一部の実施形態では、当該方法は、対象でのＮＡＳＨの有無を決定することを含む。
一部の実施形態では、対象での肝炎の有無を決定する方法を提供しており、Ｎ個のバイオマーカータンパク質を有するバイオマーカーパネルを形成する、及び当該対象から得た試料でのＮ個のバイオマーカータンパク質のそれぞれのレベルを検出することを含む、また、Ｎは少なくとも２である、そして、Ｎ個のバイオマーカータンパク質の少なくとも１つを、ＣＡ１９８、ＣＴＣＦ、及びＴＡＣＤ２；または、ＰＰＡＣ、ＡＤＩＰＯ、ＰＹＹ、ＦＣＧ３Ｂ、ＴＲＸＲ１、ＡＣＹ１、及びＣＣＬ２３から選択する。一部のそのような実施形態では、Ｎ個のバイオマーカータンパク質のそれぞれを、ＭＡＡＩ、ＳＡＡ２、ＲＰＮ１、ＰＣＯＣ２、ＣＡ１９８、ＣＴＣＦ、ＴＡＣＤ２、ＰＰＡＣ、ＡＤＩＰＯ、ＰＹＹ、ＦＣＧ３Ｂ、ＴＲＸＲ１、ＡＣＹ１、及びＣＣＬ２３から選択する。
一部の実施形態では、Ｎは少なくとも２である、そしてＮ個のバイオマーカータンパク質の少なくとも２つを、ＰＣＯＣ２、ＰＹＹ、及びＴＲＸＲ１；ＴＡＣＤ２、ＴＲＸＲ１、及びＡＣＹ１；ＣＡ１９８及びＴＲＸＲ１；ＣＡ１９８、ＦＣＧ３Ｂ、及びＡＣＹ１；ＲＰＮ１、ＰＹＹ、及びＡＣＹ１；ＴＡＣＤ２、ＰＰＡＣ、及びＴＲＸＲ１；ＣＴＣＦ、ＡＤＩＰＯ、及びＴＲＸＲ１；またはＳＡＡ２、ＰＰＡＣ、及びＡＣＹ１から選択する
一部の実施形態では、本明細書の方法は、対象での肝細胞バルーニングの有無を決定するためのものであり、Ｎ個のバイオマーカータンパク質を有するバイオマーカーパネルを形成する、及び当該対象から得た試料でのＮ個のバイオマーカータンパク質のそれぞれのレベルを検出することを含む、また、Ｎは少なくとも１である、そして、Ｎ個のバイオマーカータンパク質の少なくとも１つを、ＰＴＧＲ１、ＡＴＬ２、及びＣＮＮ２から選択する。一部の実施形態では、Ｎは１～５である、またはＮは２～５である、またはＮは３～５である、またはＮは４～５である、またはＮは１～２である、またはＮは１～３、またはＮは１～４である。一部の実施形態では、Ｎは１である、またはＮは２である、またはＮは３である、またはＮは４である、またはＮは５である。一部の実施形態では、当該方法は、対象でのＮＡＳＨの有無を決定することを含む。
一部の実施形態では、対象での肝細胞バルーニングの有無を決定する方法を提供しており、Ｎ個のバイオマーカータンパク質を有するバイオマーカーパネルを形成する、及び当該対象から得た試料でのＮ個のバイオマーカータンパク質のそれぞれのレベルを検出することを含む、また、Ｎは少なくとも２である、そして、Ｎ個のバイオマーカータンパク質の少なくとも１つを、ＡＫ１ＢＡ及びＣＴＬＡ４から選択する。一部のそのような実施形態では、Ｎ個のバイオマーカータンパク質のそれぞれを、ＰＴＧＲ１、ＡＴＬ２、ＣＮＮ２、ＡＫ１ＢＡ、及びＣＴＬＡ４から選択する。
一部の実施形態では、Ｎは少なくとも３である、そして、Ｎ個のバイオマーカータンパク質の少なくとも３つを、ＡＫ１ＢＡ、ＰＴＧＲ１、及びＡＴＬ２から選択する。
一部の実施形態では、対象での肝線維症の有無を決定する方法を提供しており、Ｎ個のバイオマーカータンパク質を有するバイオマーカーパネルを形成する、及び当該対象から得た試料でのＮ個のバイオマーカータンパク質のそれぞれのレベルを検出することを含む、また、Ｎは少なくとも１である、そして、Ｎ個のバイオマーカータンパク質の少なくとも１つを、ＡＴＬ２、ＮＦＡＳＣ、及びＦＣＲＬ３から選択する。一部の実施形態では、Ｎは１～８である、またはＮは２～８である、またはＮは３～８である、またはＮは４～８である、またはＮは５～８である、またはＮは６～８である、またはＮは７～８である、またはＮは１～２である、またはＮは１～３である、またはＮは１～４である、またはＮは１～５である、またはＮは１～６である、またはＮは１～７である。一部の実施形態では、Ｎは１である、またはＮは２である、またはＮは３である、またはＮは４である、またはＮは５である、またはＮは６である、またはＮは７である、またはＮは８である。一部の実施形態では、当該方法は、対象でのＮＡＳＨの有無を決定することを含む。
一部の実施形態では、対象での肝線維症の有無を決定する方法を提供しており、Ｎ個のバイオマーカータンパク質を有するバイオマーカーパネルを形成する、及び当該対象から得た試料でのＮ個のバイオマーカータンパク質のそれぞれのレベルを検出することを含む、また、Ｎは少なくとも２である、そして、Ｎ個のバイオマーカータンパク質の少なくとも１つを、ＣＯ７、ＣＯＬ１１、ＶＧＦＲ２、ＷＮＴ５Ａ、及びＰＬＯＤ３から選択する。一部のそのような実施形態では、Ｎ個のバイオマーカータンパク質のそれぞれを、ＡＴＬ２、ＮＦＡＳＣ、ＦＣＲＬ３、ＣＯ７、ＣＯＬ１１、ＶＧＦＲ２、ＷＮＴ５Ａ、及びＰＬＯＤ３から選択する。
一部の実施形態では、Ｎは少なくとも２である、そして、Ｎ個のバイオマーカータンパク質の少なくとも２つは、ＡＴＬ２及びＶＧＦＲ２である；または、ＡＴＬ２、ＣＯＬ１１、及びＷＮＴ５Ａ；または、ＡＴＬ２、ＣＯ７、及びＷＮＴ５Ａから選択する。
本明細書に記載した実施形態のいずれでも、当該対象は、脂肪肝、肝炎、肝細胞バルーニング、及び／または肝線維症を発症するリスクがある。
本明細書に記載した実施形態のいずれでも、当該対象は、ＮＡＳＨを発症するリスクがあり得る。本明細書に記載した実施形態のいずれでも、当該対象は、肥満、腹部肥満、メタボリックシンドローム、心血管疾患、及び糖尿病から選択するＮＡＳＨ併存疾患を有し得る。本明細書に記載した実施形態のいずれでも、当該対象は、肥満であり得る。
本明細書に記載した実施形態のいずれでも、方法は、対象から得た試料のタンパク質バイオマーカーをバイオマーカー捕捉試薬のセットと接触させることを含み、当該バイオマーカー捕捉試薬のセットのそれぞれのバイオマーカー捕捉試薬は、検出する異なるバイオマーカーに対して特異的に結合する。一部の実施形態では、それぞれのバイオマーカー捕捉試薬は、抗体またはアプタマーである。一部の実施形態では、それぞれのバイオマーカー捕捉試薬は、アプタマーである。一部の実施形態では、少なくとも１つのアプタマーは、低速オフレートのアプタマーである。一部の実施形態では、低速オフレートを示す少なくとも１つのアプタマーでは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または、少なくとも１０個のヌクレオチドが修飾を受けている。一部の実施形態では、低速オフレートを示すそれぞれのアプタマーが、≧３０分、≧６０分、≧９０分、≧１２０分、≧１５０分、≧１８０分、≧２１０分、または≧２４０分のオフレート（ｔ１／２）で、その標的タンパク質に結合する。
本明細書に記載した実施形態のいずれでも、当該試料を、血液試料とし得る。本明細書に記載した実施形態のいずれでも、当該試料を、血清試料及び血漿試料から選択し得る。
本明細書に記載した実施形態のいずれでも、当該対象が、脂肪肝、肝炎、肝細胞バルーニング、肝線維症、及び／またはＮＡＳＨを有していれば、当該対象に対して、減量、血糖コントロール、アルコール回避、当該対象に糖尿病及び／または心血管疾患に関する試験を行う、当該対象に胃バイパス手術を実施する、及び当該対象に薬物を投与する、ことを推奨し得る。
一部の実施形態では、本明細書に記載した方法は、医療保険料または生命保険料を決定することを目的としている。一部の実施形態では、方法は、医療保険料または生命保険料を決定することをさらに含む。一部の実施形態では、本明細書に記載した方法は、当該方法から得た情報を使用して、医療資源の利用を予測及び／または管理することをさらに含む。
一部の実施形態では、キットを提供する。一部の実施形態では、キットは、表１、３、５または７から選択するＮ個のバイオマーカータンパク質に結合するＮ個のバイオマーカータンパク質捕捉試薬を含む、また、Ｎは、少なくとも１である。一部の実施形態では、Ｎ個のバイオマーカー捕捉試薬のそれぞれは、異なるバイオマーカータンパク質に対して特異的に結合する。一部の実施形態では、それぞれの捕捉試薬は、抗体またはアプタマーである。
本明細書に記載した実施形態のいずれでも、少なくとも１つのアプタマーを、低速オフレートのアプタマーとし得る。本明細書に記載した実施形態のいずれでも、それぞれのアプタマーを、低速オフレートのアプタマーとし得る。一部の実施形態では、少なくとも１つの低速オフレートアプタマーでは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または、少なくとも１０個のヌクレオチドが疎水性修飾を受けている。
一部の実施形態では、それぞれの低速オフレートアプタマーは、低速オフレートを示すそれぞれのアプタマーが、≧３０分、≧６０分、≧９０分、≧１２０分、≧１５０分、≧１８０分、≧２１０分、または≧２４０分のオフレート（ｔ１／２）で、その標的タンパク質に結合する。
本明細書に記載した実施形態のいずれでも、当該方法は、対象から得た試料のタンパク質バイオマーカーをバイオマーカー捕捉試薬のセットと接触させることを含み得る、当該バイオマーカー捕捉試薬のセットのそれぞれのバイオマーカー捕捉試薬は、検出する異なるバイオマーカーに対して特異的に結合する。一部の実施形態では、当該バイオマーカー捕捉試薬のセットのそれぞれのバイオマーカー捕捉試薬は、検出する異なるバイオマーカーに対して特異的に結合する。本明細書に記載した実施形態のいずれでも、それぞれのバイオマーカー捕捉試薬を、抗体またはアプタマーとし得る。本明細書に記載した実施形態のいずれでも、それぞれのバイオマーカー捕捉試薬を、アプタマーとし得る。本明細書に記載した実施形態のいずれでも、少なくとも１つのアプタマーを、低速オフレートのアプタマーとし得る。本明細書に記載した実施形態のいずれでも、低速オフレートを示す少なくとも１つのアプタマーは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または、少なくとも１０個のヌクレオチドが修飾を受け得る。一部の実施形態では、当該修飾は、疎水性修飾である。一部の実施形態では、当該修飾は、疎水性塩基修飾である。一部の実施形態では、当該修飾の１つ以上を、図１に示す修飾から選択し得る。一部の実施形態では、それぞれの低速オフレートアプタマーは、≧３０分、≧６０分、≧９０分、≧１２０分、≧１５０分、≧１８０分、≧２１０分、または≧２４０分のオフレート（ｔ１／２）で、その標的タンパク質に結合する。
本明細書に記載した実施形態のいずれでも、当該試料を、血液試料とし得る。一部の実施形態では、当該血液試料を、血清試料及び血漿試料から選択する。
アプタマーで使用することができる特定の核酸塩基修飾を示す。 本明細書に記載したコンピューターで実施する様々な方法での使用に供する例示的なコンピューターシステムを示しているが、これに限定されない。
詳細な説明
本発明を、代表的な特定の実施形態と併せて説明をするが、本発明は、特許請求の範囲によって定義されており、それらの実施形態に限定するものでない、ことを理解されたい。
当業者であれば、本明細書に記載したものと類似または同等の数多くの方法及び材料が、本発明を実施するにあたって使用し得ることを認識する。本発明は、本明細書に記載した方法及び材料に限定することは、決してない。
特記しない限り、本明細書で使用する技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が、一般的に理解する意味を有する。本明細書に記載したものと類似または同等のあらゆる方法、装置、及び材料を、本発明を実施するにあたって使用することができるが、特定の方法、装置、及び材料を、本明細書に記載している。
本明細書で引用するすべての刊行物、公開特許公報、及び特許出願は、それぞれの個別の刊行物、公開特許公報、または特許出願を、参照により、あたかも具体的かつ個別に示したものと同然に、参照により、それらの内容を本明細書で援用する。
本明細書に添付した許請求の範囲を含めて、本出願で使用する単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈で明確にその他の事項を指していない限り、複数形を含む、また、「少なくとも１つ（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」及び「１つ以上（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」と互換可能に使用し得る。したがって、「アプタマー」とは、アプタマーの混合物を含み、「プローブ」とは、プローブの混合物などを含む。
本明細書で使用する用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、及び、それらのあらゆる変形は、プロセス、方法、プロダクト－バイ－プロセス、または、要素を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）、含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）、または含む（ｃｏｎｔａｉｎｓ）組成物などを排他的に含むことは意図していない、そして、要素の一覧は、その一覧に明示されていないその他の要素を含み得る。
本出願は、対象での脂肪肝、肝炎、肝線維症、及び／または肝細胞バルーニングの有無を決定するためのバイオマーカー、方法、機器、試薬、システム、及びキットを含む。また、本出願は、対象でのＮＡＳＨの有無を決定するためのバイオマーカー、方法、機器、試薬、システム、及びキットを含む。一部の実施形態では、脂肪肝、肝炎、肝線維症、及び／または肝細胞バルーニングに罹患した対象でのＮＡＳＨの有無を決定するためのバイオマーカー、方法、機器、試薬、システム、及びキットを提供する。
一部の実施形態では、単独でまたは様々な組み合わせで使用する１つ以上のバイオマーカーを提供して、対象での脂肪肝、肝炎、肝線維症、肝細胞バルーニング、及び／またはＮＡＳＨの有無を決定する。以下に詳述するように、例示的実施形態として、表１、３、５、または７に提供するバイオマーカーがある。
一部の実施形態では、単独でまたは様々な組み合わせで使用する１つ以上のバイオマーカーを提供して、対象での脂肪肝、肝炎、肝線維症、肝細胞バルーニング、及び／またはあらゆるステージのＮＡＳＨの有無を決定する。一部の実施形態では、単独でまたは様々な組み合わせで使用する１つ以上のバイオマーカーを提供して、対象でのステージ２、３、または４のＮＡＳＨの有無を決定する。一部の実施形態では、対象は、脂肪肝に罹患していることがすでに判明している。以下に詳述するように、例示的実施形態として、表１、３、５、または７に提供するバイオマーカーがあり、それらは、多重アプタマーをベースとしたアッセイを使用して同定した。一部の実施形態では、パネルでのバイオマーカーの個数及び同一性は、バイオマーカー値の特定の組み合わせに対する感受性と特異性に基づいて選択する。用語「感受性」及び「特異性」は、生物学的試料で検出した１つ以上のバイオマーカーレベルに基づいて、疾患を有する個体、または疾患を持たない個体を正しく見分ける能力に関して本明細書で使用する。一部の実施形態では、用語「感受性」及び「特異性」は、生物学的試料で検出した１つ以上のバイオマーカーレベルに基づいて、脂肪肝、肝炎、肝線維症、及び／または肝細胞バルーニングを有する個体、または脂肪肝、肝炎、肝線維症、及び／または肝細胞バルーニングを持たない個体を正しく見分ける能力に関して本明細書で使用する。そのような実施形態では、「感受性」は、これらの肝疾患の１つを有する個体を正しく見分けるバイオマーカー（複数可）の性能を示す。「特異性」は、これらの肝疾患の１つを持たない個体を正しく見分けるバイオマーカー（複数可）の性能を示す。例えば、バイオマーカーのパネルに対して、８５％の特異性と９０％の感受性を試験するために使用した、一連のコントロール試料（健康な個体、または肝疾患を持っていないことが明らかである対象から得た試料など）、及び試験試料（肝疾患を有する個体から得た試料など）は、コントロール試料の８５％が、パネルではコントロール試料として正しく分類されており、かつ、試験試料の９０％が、パネルでは試験試料として正しく分類されている。
一部の実施形態では、１つ以上のバイオマーカーのパネルの全体的な性能を、曲線下面積（ＡＵＣ）値で表す。このＡＵＣ値は、本明細書で例示する受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線から導き出す。このＲＯＣ曲線は、試験の偽陽性率（１－特異度）に対する試験の真正陽性率（感受性）のプロットである。用語「曲線下面積」または「ＡＵＣ」は、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線の曲線下面積のことを指しており、これらは、両方ともに、当該技術分野で周知である。ＡＵＣの測定は、完全なデータ範囲にわたって分類器の精度を比較する上で役立つ。ＡＵＣが大きい分類器は、２つの関心グループ（例えば、正常な個体と、肝疾患を有する個体）の間で未知数を正しく分類する能力を高める。ＲＯＣ曲線は、２つの母集団を区別する際に、特定の機能（例えば、本明細書で説明するバイオマーカーのいずれか、及び／またはさらなる生物医学情報のあらゆる特徴）のパフォーマンスをプロットする上で役立つ。一般的には、母集団全体の機能データを、単一の機能の値に基づいて昇順で並べ替える。次に、その機能に関するそれぞれの数値に関して、データの真陽性率と偽陽性率を計算する。真陽性率は、その機能の数値を超える事例の数を計数して、事例の総数で割って決定する。偽陽性率は、その機能の数値を超えるコントロールの数を計数して、コントロールの総数で割って決定する。この定義は、コントロールと比較して機能が改善している状況を指しているが、この定義は、コントロールと比較して機能が改善していない状況にも使える（そのような状況では、その機能の数値を下回る試料を計数する）。ＲＯＣ曲線は、単一の機能、及びその他の単一の出力に対して生成することができる、例えば、２つ以上の機能の組み合わせを数学的に（例えば、加算、減算、乗算などで）組み合わせて、単一の合計値を提供することができ、この単一の合計値は、ＲＯＣ曲線にプロットすることができる。加えて、複数の機能のあらゆる組み合わせ、すなわち、単一の出力値を導出する組み合わせを、ＲＯＣ曲線にプロットすることができる。
一部の実施形態では、方法は、当該対象から得た試料でのＮ個のバイオマーカータンパク質のそれぞれのレベルを検出することを含む、また、Ｎは少なくとも１である、そして、Ｎ個のバイオマーカータンパク質の少なくとも１つを、対象から得た試料でのＰＴＧＲ１、ＩＮＨＢＣ、及びＢＰＩＢ１；ＭＡＡＩ、ＳＡＡ２、ＲＰＮ１、及びＰＣＯＣ２；ＰＴＧＲ１、ＡＴＬ２、及びＣＮＮ２；または、ＡＴＬ２、ＮＦＡＳＣ、及びＦＣＲＬ３から選択する。一部の実施形態では、当該方法は、対象での脂肪肝、肝炎、肝細胞バルーニング、または肝線維症のそれぞれの有無を決定するためのものである。一部のそのような実施形態では、当該方法は、当該対象から得た試料または当該試料の一部を、少なくとも１つの捕捉試薬と接触させることを含む、また、それぞれの捕捉試薬は、Ｎ個のバイオマーカータンパク質の１つに対して、当該バイオマーカータンパク質の検出レベルで特異的に結合する。一部の実施形態では、当該方法は、当該対象から得た試料、または当該試料に由来するタンパク質を、少なくとも１つのアプタマーと接触させることを含む、また、それぞれのアプタマーは、Ｎ個のバイオマーカータンパク質の少なくとも１つに対して、当該バイオマーカータンパク質の検出レベルで特異的に結合する。一部の実施形態では、当該方法は、当該対象でのＮＡＳＨの有無を決定することを含む。
本明細書で使用する「非アルコール性脂肪肝疾患」または「ＮＡＦＬＤ」とは、過度のアルコール摂取が無く、炎症及び線維症の有無に関係なく、脂肪が肝臓に沈着する状態（脂肪肝）のことを指す。
本明細書で使用する「脂肪肝」とは、過度のアルコール摂取の非存在下での軽度、中等度、及び重度の脂肪肝を含む。
本明細書で使用する「非アルコール性脂肪性肝炎」または「ＮＡＳＨ」とは、肝臓に炎症及び／または線維症があるＮＡＦＬＤのことを指す。ＮＡＳＨは、４つのステージに分け得る。ＮＡＳＨのステージを決定する例示的方法は、例えば、Ｋｌｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，４１（６）：１３１３－１３２１、及びＢｒｕｎｔ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｍｏｄｅｒｎ Ｐａｔｈｏｌ．，２０：Ｓ４０－Ｓ４８に記載されている。
本明細書で使用する対象に関する「肥満」とは、ＢＭＩが３０以上の対象のことを指す。
「生物学的試料」、「試料」、及び「試験試料」は、本明細書では互換可能に使用しており、個体から得た、またはその他の方法で得たあらゆる材料、体液、組織、または細胞のことを指す。このものとして、血液（全血、白血球、末梢血単核細胞、バフィーコート、血漿、及び血清など）、喀痰、涙液、粘液、鼻洗浄液、鼻吸引液、尿、唾液、腹腔洗浄液、腹水、嚢胞液、腺液、リンパ液、気管支吸引物、滑液関節吸引物、臓器分泌物、細胞、細胞抽出物、及び脳脊髄液がある。これには、上記したすべての実験的に分離した画分も含む。例えば、血液試料は、血清、血漿、または、赤血球や白血球（ｗｈｉｔｅ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌｓ）（白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ））などの特定の種類の血液細胞を含む画分に分画することができる。一部の実施形態では、試料は、組織及び液体試料の組み合わせなど、個体由来の試料の組み合わせとし得る。また、用語「生物学的試料」は、例えば、糞便試料、組織試料、または組織生検など、均質化した固体材料を含む材料も含む。用語「生物学的試料」は、組織培養または細胞培養に由来する材料も含む。生物学的試料を得るためのあらゆる適切な方法を使用することができる；例示的な方法として、例えば、瀉血、綿棒拭い（例えば、口腔内綿棒拭い）、及び細針吸引生検方法がある。細針吸引の影響を受けやすい例示的な組織として、リンパ節、肺、甲状腺、乳房、膵臓、及び肝臓がある。試料は、例えば、顕微解剖（例えば、レーザーキャプチャーマイクロ解剖（ＬＣＭ）、またはレーザーマイクロ解剖（ＬＭＤ））、膀胱洗浄、塗抹標本（例えば、ＰＡＰ塗抹標本）、または管洗浄で回収することもできる。個体から得た、または個体に由来する「生物学的試料」として、個体から得た後にあらゆる適切な方法で処理をした試料がある。
さらに、一部の実施形態では、生物学的試料は、数多くの個体から生物学的試料を採取する、それらをプールする、または、それぞれの個体から得た生物学的試料のアリコートをプールすることによって誘導し得る。プールしたこれらの試料は、単一の個体に由来する試料に関して本明細書で記載したようにして処理し得る、そして、例えば、プールした試料に予後不良が確立すれば、次に、それぞれの生物学的試料を改めて試験をして、いずれの個体（複数可）が、脂肪症及び／またはＮＡＳＨを有しているのかを決定することができる。
「標的」、「標的分子」、及び「分析物」とは、本明細書では互換可能に使用しており、試料に存在し得るあらゆる関心分子のことを指す。「関心分子」とは、特定の分子の小さなあらゆる変化を含んでおり、例えば、タンパク質の事例では、アミノ酸配列のわずかな変化、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、またはその他のあらゆる操作または修飾、例えば、分子の同一性を実質的に変化させない標識成分とのコンジュケーションがある。「標的分子」、「標的」、または「分析物」とは、分子または多分子構造の１つのタイプまたは種のコピーのセットのことを指す。「標的分子」、「標的」、及び「分析物」とは、分子または多分子構造の２つ以上のタイプまたは種のことを指す。例示的な標的分子として、タンパク質、ポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質、多糖類、糖タンパク質、ホルモン、受容体、抗原、抗体、アフィボディ、抗体模倣体、ウイルス、病原体、毒性物質、基質、代謝産物、遷移状態類似体、補因子、阻害剤、薬物、色素、栄養素、成長因子、細胞、組織、及び上記したいずれかのあらゆるフラグメントまたは部分がある。一部の実施形態では、標的分子は、タンパク質であり、この事例では、標的分子は「標的タンパク質」と称し得る。
本明細書で使用する「捕捉剤」または「捕捉試薬」とは、バイオマーカーに対して特異的に結合することができる分子のことを指す。「標的タンパク質捕捉試薬」とは、標的タンパク質に対して特異的に結合することができる分子のことを指す。捕捉試薬の例として、アプタマー、抗体、アドネクチン、アンキリン、その他の抗体模倣体、及びその他のタンパク質スキャホールド、自己抗体、キメラ、小分子、核酸、レクチン、リガンド結合受容体、インプリントポリマー、アビマー、ペプチド模倣体、ホルモン受容体、サイトカイン受容体、合成受容体、及び、上記した捕捉試薬のいずれかの修飾体またはフラグメントがあるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、捕捉試薬は、アプタマー、及び抗体から選択する。
用語「抗体」は、あらゆる種の完全長抗体、及びそのような抗体のフラグメント、及び誘導体、例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、一本鎖抗体、Ｆｖフラグメント、及び一本鎖Ｆｖフラグメントのことを指す。また、用語「抗体」は、合成抗体のことも指しており、例えば、ファージディスプレイ由来の抗体、及びフラグメント、アフィボディ、及びナノボディがある。
本明細書で使用する「マーカー」及び「バイオマーカー」は互換可能に使用しており、個体での正常または異常なプロセスの徴候、または、個体での疾患またはその他の病態を示す標的分子のことを指す。より具体的には、「マーカー」または「バイオマーカー」は、正常または異常に関係なく、また異常であるならば、慢性または急性に関係なく、特定の生理学的状態またはプロセスの存在に関連する解剖学的、生理学的、生化学的、または分子的パラメーターである。バイオマーカーは、実験室アッセイ、及び医療イメージングを含めた様々な方法によって検出可能かつ測定可能である。一部の実施形態では、バイオマーカーは、標的タンパク質である。
本明細書で使用する「バイオマーカーレベル」及び「レベル」は、生物学的試料でのバイオマーカーを検出するあらゆる分析方法を使用して得た測定値のことを指しており、このものは、当該生物学的試料でのバイオマーカーに応じて、存在、不存在、絶対量または濃度、相対量または濃度、力価、レベル、発現レベル、測定したレベルの比率などを示す。「レベル」の正確な内容は、バイオマーカーを検出するために採用した特定の分析方法の特定のデザインと要素が関係している。
標的分子の「コントロールレベル」とは、疾患または病態が認められない個体、または疾患または病態を有する疑いのない個体から得た同じ試料タイプでの標的分子のレベルのことを指す。標的分子の「コントロールレベル」は、本発明の方法を行う度に決定する必要はなく、特定の試料のレベルが、通常のレベルより高い、または低いことを決定するためのリファレンスまたは閾値として使用する従前に決定したレベルとし得る。
本明細書で使用する「個体」及び「対象」は、試験対象または患者のことを指すために互換可能に使用する。個体は、哺乳動物または非哺乳動物とし得る。様々な実施形態では、個体は、哺乳動物である。哺乳動物の個体は、ヒトまたは非ヒトとし得る。様々な実施形態では、個体は、ヒトである。健康または正常な個体は、関心疾患または病態（ＮＡＳＨなど）が、従来の診断方法では検出できない個体のことである。
「診断する（Ｄｉａｇｎｏｓｅ）」、「診断する（ｄｉａｇｎｏｓｉｎｇ）」、「診断（ｄｉａｇｎｏｓｉｓ）」、及びこれらの変形は、個体に関連する１つ以上の徴候、症状、データ、またはその他の情報に基づいて、その個体の健康状態または病態を検出、定量、または認識することを指す。個体の健康状態は、健康／正常（すなわち、疾患または病態が存在しないことの診断）、または病気／異常（すなわち、疾患または病態の存在の診断または特徴の評価）として診断することができる。「診断する（Ｄｉａｇｎｏｓｅ）」、「診断する（ｄｉａｇｎｏｓｉｎｇ）」、「診断（ｄｉａｇｎｏｓｉｓ）」などの用語は、特定の疾患または病態に関して、疾患の初期検出、疾患の特徴決定または分類、疾患の進行、寛解、または再発の検出、及び個体に対して治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）または治療（ｔｈｅｒａｐｙ）を行った後の疾患応答の検出を含む。
「予後（Ｐｒｏｇｎｏｓｅ）」、「予後（ｐｒｏｇｎｏｓｉｎｇ）」、「予後（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）」、及びこれらの変形は、疾患または病態を有する個体での疾患または病態の将来の経過の予測（例えば、患者の生存予測）のことを指しており、そして、そのような用語は、個体に治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）または治療（ｔｈｅｒａｐｙ）を施した後の疾患反応の予測能のことを指す。
「評価する（Ｅｖａｌｕａｔｅ）」、「評価する（ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ）」、「評価（ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ）」、及びこれらの変形は、「診断」及び「予後」の両方を含み、また、疾患を有していない個体での疾患または病態の将来の経過についての判断または予測、ならびに、疾患が治癒したことが明白な個体において、疾患または病態が生じる尤度に関する判断及び予測を含む。また、用語「評価する（ｅｖａｌｕａｔｅ）」は、治療法に対する個体の応答を評価すること、例えば、個体が治療剤に対して好ましい応答を示し得る、または治療剤に対して応答し得ない（または、例えば、毒性またはその他の望ましくない副作用を被る）ことについて予測すること、個体に投与するための治療剤を選択すること、または、個体に対して行っている治療法に対する個体の応答をモニタリングまたは判定することも含む。したがって、ＮＡＳＨを「評価する（ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ）」ことは、例えば：個体におけるＮＡＳＨの将来の経過を予測すること；脂肪肝、肝炎、肝線維症、及び／または肝細胞バルーニングが、ＮＡＳＨにまで進行するか否かを予測すること；ＮＡＳＨの特定のステージが、ＮＡＳＨのさらに高いステージにまで進行するか否かを予測する、などのいずれかを含むことができる。
本明細書で使用するバイオマーカーレベルに関する「検出する」または「決定する」には、バイオマーカーレベルに対応するシグナルを検知及び記録するために使用する機器と、そのシグナルを生成するために必要な材料の両方の使用がある。様々な実施形態では、レベルは、蛍光、化学発光、表面プラズモン共鳴、表面音響波、質量分析、赤外線分光法、ラマン分光法、原子間力顕微鏡法、走査型トンネル顕微鏡法、電気化学検出法、核磁気共鳴検出、量子ドットなどのあらゆる適切な方法を使用して検出する。
本明細書で使用する「脂肪肝を有する対象」は、脂肪肝の診断を受けた対象のことを指す。一部の実施形態では、脂肪肝は、一般的に、ＮＡＦＬＤまたはＮＡＳＨに関して上記した方法で診断をする。
本明細書で使用する「ＮＡＳＨを有する対象」は、ＮＡＳＨの診断を受けた対象のことを指す。一部の実施形態では、ＮＡＳＨは、一般的に、ＮＡＦＬＤに関して上記した方法で診断をする。一部の実施形態では、進行性肝線維症は、ＮＡＦＬＤに罹患した患者において診断する、例えば、Ｇａｍｂｉｎｏ Ｒ，ｅｔ．ａｌ．Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１１；４３（８）：６１７－４９に従って診断を行う。
本明細書で使用する「脂肪肝を発症するリスクのある対象」とは、脂肪肝の診断を受けてはいないが、１つ以上のＮＡＳＨ併存疾患、例えば、肥満、腹部肥満、メタボリックシンドローム、心血管疾患、及び糖尿病などを有する対象のことを指す。
本明細書で使用する「ＮＡＳＨを発症するリスクのある対象」とは、脂肪肝を有する対象であって、１つ以上のＮＡＳＨ併存疾患、例えば、肥満、腹部肥満、メタボリックシンドローム、心血管疾患、及び糖尿病などが解消されていない対象のことを指す。
本明細書では、「固体支持体」は、分子が、共有結合または非共有結合のいずれかを介して直接的または間接的に付着し得る表面を有するあらゆる基板のことを指す。「固体支持体」は、様々な物理的形式、例えば、膜；チップ（例えば、タンパク質チップ）；スライド（例えば、スライドガラス、またはカバーガラス）；カラム；例えば、ビーズなどの中空、中実、半中実、細孔または空洞を含む粒子；ゲル；光ファイバー材料を含むファイバー；マトリックス；及び、試料レセプタクルを持つことができる。試料レセプタクルの例として、試料ウェル、チューブ、キャピラリー、バイアル、及び試料を保持することができるその他のあらゆる容器、溝、または、窪みがある。試料レセプタクルは、マイクロタイタープレート、スライド、マイクロフルイディクス機器などのマルチ試料プラットフォームに収容することができる。支持体は、天然または合成の材料、有機または無機の材料で構成することができる。捕捉試薬が付着する固体支持体の組成は、一般的には、付着の方法（例えば、共有結合）に依存する。その他のレセプタクルの例として、微小液滴、及びマイクロ流体制御、またはバルク油／水性エマルジョンがあり、その内部で、アッセイ及び関連する操作をし得る。適切な固体支持体として、例えば、プラスチック、樹脂、多糖類、シリカまたはシリカをベースとした材料、機能性ガラス、変性シリコン、炭素、金属、無機ガラス、膜、ナイロン、天然繊維（例えば、絹、羊毛、及び綿など）、ポリマーなどがある。固体支持体を構成する材料として、捕捉試薬の付着に使用する、例えば、カルボキシ、アミノ、またはヒドロキシル基などの反応性基を含むことができる。高分子固体支持体として、例えば、ポリスチレン、ポリエチレングリコールテトラフタレート、ポリ酢酸ビニル、ポリ塩化ビニル、ポリビニルピロリドン、ポリアクリロニトリル、ポリメチルメタクリレート、ポリテトラフルオロエチレン、ブチルゴム、スチレンブタジエンゴム、天然ゴム、ポリエチレン、ポリプロピレン、（ポリ）テトラフルオロエチレン、（ポリ）ビニリデンフルオリド、ポリカーボネート、及びポリメチルペンテンがある。使用可能な適切な固体支持体粒子として、例えば、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）タイプのコード化粒子、磁性粒子、及びガラス粒子などのコード化粒子がある。
バイオマーカーの例示的使用
様々な例示的実施形態では、対象での脂肪肝、肝炎、肝線維症、及び／または肝細胞バルーニングの有無を決定する方法を提供する、当該脂肪肝、肝炎、肝線維症、及び／または肝細胞バルーニングは、軽度、中等度、または重度のものとし得る。様々な実施形態では、対象での脂肪肝、肝炎、肝線維症、及び／または肝細胞バルーニングの有無を決定する方法を提供する、当該脂肪肝、肝炎、肝線維症、及び／または肝細胞バルーニングは、軽度、中等度、または重度のものとし得る、当該方法は、表１、３、５、または７に記載したバイオマーカータンパク質から得たＮ個のバイオマーカータンパク質を有するバイオマーカーパネルを形成する、及び、対象から得た試料での当該パネルのＮ個のバイオマーカータンパク質のそれぞれのレベルを検出することを含む、また、Ｎは、少なくとも１である。様々な実施形態では、対象での脂肪肝、肝炎、肝線維症、及び／または肝細胞バルーニングの有無を決定する方法を提供する、当該脂肪肝、肝炎、肝線維症、及び／または肝細胞バルーニングは、軽度、中等度、または重度のものとし得る、当該方法は、対象から得た試料での表１、３、５、または７に記載した少なくとも１つのバイオマーカーのレベルを検出して、対象でのＮＡＳＨの有無を決定する。
様々な実施形態では、対象での脂肪肝、肝炎、肝線維症、及び／または肝細胞バルーニングの有無を決定する方法を提供する、当該脂肪肝、肝炎、肝線維症、及び／または肝細胞バルーニングは、軽度、中等度、または重度のものとし得る。様々な実施形態では、対象でのＮＡＳＨの有無を決定する方法を提供する、当該ＮＡＳＨは、ステージ１、２、３、または４のＮＡＳＨとし得る、またはステージ２、３、または４のＮＡＳＨとし得る。一部の実施形態では、脂肪肝、肝炎、肝線維症、及び／または肝細胞バルーニングを有する対象でのＮＡＳＨの有無を決定する方法を提供する、当該ＮＡＳＨは、ステージ１、２、３、または４のＮＡＳＨとし得る、またはステージ２、３、または４のＮＡＳＨとし得る。一部の実施形態では、ＮＡＳＨの組織学的ステージを特徴決定する方法を提供する。これらの方法は、血清または血漿などの個体の血液循環に存在する１つ以上のバイオマーカーに対応する１つ以上のバイオマーカーレベルを、幾つもの分析方法、例えば、本明細書に記載した分析方法のいずれかで検出することを含む。これらのバイオマーカーは、例えば、健康な個体（健康な個体を、肥満の個体とし得る）と比較して、肝炎、肝線維症、肝細胞バルーニング、及び／またはＮＡＳＨを有する個体と異なるレベルで存在する。一部の実施形態では、バイオマーカーは、正常な個体（正常な個体を、肥満の個体とし得る）と比較して、ＮＡＳＨに罹患した個体（例えば、ステージ１、２、３、または４のＮＡＳＨ、またはステージ２、３、または４のＮＡＳＨ）と異なるレベルで存在する。一部の実施形態では、バイオマーカーは、脂肪肝、肝炎、肝線維症、及び／または肝細胞バルーニングに罹患した対象と比較して、ＮＡＳＨに罹患した個体（例えば、ステージ１、２、３、または４のＮＡＳＨ、またはステージ２、３、または４のＮＡＳＨ）と異なるレベルで存在する、当該脂肪肝、肝炎、肝線維症、及び／または肝細胞バルーニングは、軽度、中等度、または重度のものとし得る。
一部の実施形態では、バイオマーカーは、健康な個体（健康な個体を、肥満の個体とし得る）と比較して、脂肪肝を有する個体と異なるレベルで存在する。一部の実施形態では、バイオマーカーは、健康な個体（健康な個体を、肥満の個体とし得る）と比較して、肝炎を有する個体と異なるレベルで存在する。一部の実施形態では、バイオマーカーは、健康な個体（健康な個体を、肥満の個体とし得る）と比較して、肝細胞バルーニングを有する個体と異なるレベルで存在する。一部の実施形態では、バイオマーカーは、健康な個体（健康な個体を、肥満の個体とし得る）と比較して、肝繊維症を有する個体と異なるレベルで存在する。
個体でのバイオマーカーの異なるレベルの検出を使用することで、例えば、個体での脂肪肝、肝炎、肝線維症、肝細胞バルーニング、及び／またはＮＡＳＨの有無、または脂肪肝、肝炎、肝線維症、肝細胞バルーニングに罹患した個体でのＮＡＳＨの発症の有無の決定が可能になる。一部の実施形態では、本明細書に記載したバイオマーカーのいずれかを使用することで、脂肪肝、肝炎、肝線維症、肝細胞バルーニング、及び／またはＮＡＳＨの発症に関する個体（肥満の個体など）のモニタリング、または肝炎、肝線維症、及び／または肝細胞バルーニングに罹患している個体でのＮＡＳＨの発症に関するモニタリングを行い得る。
本明細書に記載したバイオマーカーのいずれかを使用して、対象での脂肪肝、肝炎、肝線維症、肝細胞バルーニング、及び／またはＮＡＳＨの有無を決定する方法の例として、脂肪肝、肝炎、肝線維症、肝細胞バルーニング、及び／またはＮＡＳＨの診断を受けていないが、脂肪肝、肝炎、肝線維症、肝細胞バルーニング、及び／またはＮＡＳＨ併存疾患の１つ以上を有する個体での１つ以上の説明をしたバイオマーカーのレベルは、肝生検などの侵襲的検査を使用して決定するよりも迅速に、脂肪肝、肝炎、肝線維症、肝細胞バルーニング、及び／またはＮＡＳＨを個体が発症していることを示し得る。本方法は非侵襲的であるので、脂肪肝、肝炎、肝線維症、肝細胞バルーニング、及び／またはＮＡＳＨを発症するリスクのある個体（例えば、肥満の個体など）をモニタリングするために使用し得る。脂肪肝、肝炎、肝線維症、肝細胞バルーニング、及び／またはＮＡＳＨを早期に検出することで、医学的介入がより効果的になり得る。このような医学的介入として、減量、血糖コントロール、アルコール回避、当該対象に糖尿病及び／または心血管疾患に関する試験を行う、当該対象に胃バイパス手術を実施する、及び当該対象への薬物の投与などがある、しかしながら、これらに限定されない。一部のそのような実施形態では、当該薬物は、ピオグリタゾン、ビタミンＥ、及び／またはメトホルミンである。例えば、Ｓａｎｙａｌ ｅｔ ａｌ．，２０１０，ＮＥＪＭ，３６２：１６７５－１６８５を参照されたい。一部の事例では、そのような早期介入は、肝不全になること、及び肝移植が必要になることを遅延させ得る、または、予防し得る。
同様に、本明細書に記載したバイオマーカーを使用して、脂肪症を有する対象でのＮＡＳＨの発症の有無を決定することができる方法のさらなる例として、脂肪症を有する個体での１つ以上の説明をしたバイオマーカーのレベルは、当該個体がＮＡＳＨを発症していることを示し得る。本方法は非侵襲的であるので、脂肪症のある個体は、ＮＡＳＨの発症をモニタリングし得る。ＮＡＳＨをより早期に検出することで、医学的介入がより効果的になり得る。このような医学的介入として、減量、血糖コントロール、アルコール回避、当該対象に糖尿病及び／または心血管疾患に関する試験を行う、当該対象に胃バイパス手術を実施する、及び当該対象への薬物の投与などがある、しかしながら、これらに限定されない。一部のそのような実施形態では、当該薬物は、ピオグリタゾン、ビタミンＥ、及び／またはメトホルミンである。例えば、Ｓａｎｙａｌ ｅｔ ａｌ．，２０１０，ＮＥＪＭ，３６２：１６７５－１６８５を参照されたい。一部の事例では、そのような早期介入は、肝不全になること、及び肝移植が必要になることを遅延させ得る、または、予防し得る。
加えて、一部の実施形態では、個体での１つ以上のバイオマーカーの経時的な差次的発現レベルは、特定の治療レジメンに対する個体の応答を示し得る。一部の実施形態では、フォローアップモニタリングリングの間での１つ以上のバイオマーカーの発現の変化は、特定の治療が効果的であることを示す、または治療レジメンを何らかの方法で変更する、例えば、さらに積極的に血糖をコントロールする、もっと積極的に減量に取り組むべきである、ことを示唆し得る。一部の実施形態では、個体での１つ以上のバイオマーカーの経時的な一定の発現レベルは、個体の脂肪症が悪化していない、またはＮＡＳＨを発症していない、ことを示し得る。
スタンドアロンの診断試験としてバイオマーカーレベルを試験することに加えて、バイオマーカーレベルを、疾患の感受性のリスクの高まりを示す一塩基多型（ＳＮＰ）、または、その他の遺伝領域、または変動性と組み合わせて決定することもできる。（例えば、Ａｍｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ４０，６１６－６２２（２００９）を参照されたい）。
スタンドアロンの診断試験としてバイオマーカーレベルを試験することに加えて、バイオマーカーレベルを、脂肪肝、肝炎、肝線維症、肝細胞バルーニング、及び／またはＮＡＳＨのその他のスクリーニング法、例えば、肝腫大の検出、血液検査（例えば、ＡＬＴ及び／またはＡＳＴなどの特定の肝酵素の上昇を検出する）、腹部超音波検査、及び肝生検と組み合わせることもできる。一部の事例では、本明細書に記載したバイオマーカーを使用する方法は、脂肪肝、肝炎、肝線維症、肝細胞バルーニング、及び／またはＮＡＳＨに対して、さらに積極的な治療、さらに頻繁な追跡スクリーニングなどを実施することの医学的及び経済的妥当性を高め得る。脂肪肝、肝炎、肝線維症、肝細胞バルーニング、及び／またはＮＡＳＨを発症するリスクがあるが、これらの肝疾患であるとの診断を受けていない個体に関して、これら個体が当該疾患を発症し得ることを診断試験が示している場合でも、これらのバイオマーカーを使用して治療を開始し得る。
その他のＮＡＦＬＤ診断法と組み合わせてバイオマーカーレベルを試験することに加えて、バイオマーカーに関する情報は、その他のタイプのデータ、特に、ＮＡＦＬＤの個体のリスクを示すデータと組み合わせて評価することもできる。これらの様々なデータは、コンピューター、またはその他の装置／機器で具体化することができるコンピュータープログラム／ソフトウェアなどの自動化した方法で評価することができる。
バイオマーカーとバイオマーカーレベルの検出及び決定
本明細書に記載したバイオマーカーのバイオマーカーレベルは、公知の様々な分析方法のいずれかを使用して検出することができる。ある実施形態では、バイオマーカーレベルは、捕捉試薬を使用して検出する。様々な実施形態では、捕捉試薬を、溶液でのバイオマーカーに触れさせる、または捕捉試薬が固体支持体に固定化している間にバイオマーカーに触れさせることができる。その他の実施形態では、捕捉試薬は、固体支持体の二次的特徴を受けて反応する性質を含む。これらの実施形態では、捕捉試薬は、溶液でのバイオマーカーに触れさせる、次いで、捕捉試薬の特徴を、固体支持体の二次的特徴と組み合わせて使用することで、固体支持体にバイオマーカーを固定化することができる。捕捉試薬は、実施する分析の種類に基づいて選択する。捕捉試薬として、アプタマー、抗体、アドネクチン、アンキリン、その他の抗体模倣体、及びその他のタンパク質スキャホールド、自己抗体、キメラ、小分子、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、一本鎖抗体フラグメント、Ｆｖフラグメント、一本鎖Ｆｖフラグメント、核酸、レクチン、リガンド結合受容体、抗体、ナノボディ、インプリントポリマー、アビマー、ペプチド模倣体、ホルモン受容体、サイトカイン受容体、合成受容体、及びこれらの修飾物とフラグメントがあるが、これらに限定しない。
一部の実施形態では、バイオマーカーレベルは、バイオマーカー／捕捉試薬複合体を使用して検出する。
一部の実施形態では、バイオマーカーレベルは、バイオマーカー／捕捉試薬複合体に由来しており、そして、例えば、バイオマーカー／捕捉試薬の相互作用の結果として間接的に検出されるが、バイオマーカー／捕捉試薬複合体の形成に依存している。
一部の実施形態では、バイオマーカーレベルは、生物学的試料でのバイオマーカーから直接に検出する。
一部の実施形態では、バイオマーカーは、生物学的試料での２つ以上のバイオマーカーの同時検出を可能にする多重化フォーマットを使用して検出する。多重化フォーマットの一部の実施形態では、捕捉試薬は、直接的または間接的に、共有結合または非共有結合で、固体支持体での別個の位置に固定化する。一部の実施形態では、多重化フォーマットは、個別の固体支持体を使用しており、それぞれの固体支持体は、例えば、量子ドットなど、その固体支持体に関連する固有の捕捉試薬を有する。一部の実施形態では、個々の機器は、生物学的試料において検出する複数のバイオマーカーのそれぞれの検出のために使用する。個々の機器は、生物学的試料のそれぞれのバイオマーカーを同時に処理するように構成することができる。例えば、マイクロタイタープレートを使用して、プレート内のそれぞれのウェルで、生物学的試料で検出する複数のバイオマーカーの１つ以上を分析することができる。
上記した実施形態の１つ以上では、蛍光タグを使用して、バイオマーカー／捕捉試薬複合体の成分を標識して、バイオマーカーレベルを検出することができる。様々な実施形態では、蛍光標識は、公知の技術を使用して、本明細書に記載したバイオマーカーのいずれかに特異的な捕捉試薬にコンジュゲートすることができる、次いで、蛍光標識を使用して、対応するバイオマーカーレベルを検出することができる。適切な蛍光標識として、希土類キレート、フルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、アロフィコシアニン、ＰＢＸＬ－３、Ｑｄｏｔ ６０５、Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ、フィコエリトリン、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、及びその他のかような化合物がある。
一部の実施形態では、蛍光標識は、蛍光色素分子である。一部の実施形態では、蛍光色素分子は、少なくとも１つの置換したインドリウム環系を含み、インドリウム環の３つの炭素にある置換基は、化学的に反応性を示す基または共役物質を含む。一部の実施形態では、色素分子は、例えば、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ５３２、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６４７、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６８０、またはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ７００などのＡｌｅｘＦｌｕｏｒ分子を含む。一部の実施形態では、色素分子は、例えば、２つの異なるＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ分子など、第１のタイプ及び第２のタイプの色素分子を含む。一部の実施形態では、色素分子は、第１のタイプ及び第２のタイプの色素分子を含み、そして、２つの色素分子は、異なる発光スペクトルを有する。
蛍光は、様々なアッセイ形式と互換可能である様々な機器で測定することができる。例えば、分光蛍光光度計は、マイクロタイタープレート、顕微鏡スライド、プリントアレイ、キュベットなどを分析するようにデザインしている。Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，ｂｙ Ｊ．Ｒ．Ｌａｋｏｗｉｃｚ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＋ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｍｅｄｉａ，Ｉｎｃ．，２００４を参照されたい。Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ＆ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ：Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ＆ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ；Ｐｈｉｌｉｐ Ｅ．Ｓｔａｎｌｅｙ ａｎｄ Ｌａｒｒｙ Ｊ．Ｋｒｉｃｋａ ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｗｏｒｌｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｊａｎｕａｒｙ ２００２を参照されたい。
１つ以上の実施形態では、化学発光タグを任意に使用して、バイオマーカー／捕捉複合体の成分を標識して、バイオマーカーレベルを検出することができる。適切な化学発光材料として、塩化オキサリル、ローダミン６Ｇ、Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３ ２＋、ＴＭＡＥ（テトラキス（ジメチルアミノ）エチレン）、Ｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ（１，２，３－トリヒドロキシベンゼン）、Ｌｕｃｉｇｅｎｉｎ、ペルオキシシュウ酸塩、シュウ酸アリール、アクリジニウムエステル、ジオキセタンなどがある。
一部の実施形態では、検出方法は、バイオマーカーレベルに対応する検出可能なシグナルを生成する酵素／基質の組み合わせを含む。一般的に、この酵素は、分光光度法、蛍光、化学発光などの様々な手法を使用して測定できる発色基質の化学的変化を触媒する。適切な酵素として、例えば、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、尿素、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）、アルカリホスファターゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ、ウリカーゼ、キサンチンオキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼなどがある。
一部の実施形態では、検出方法は、測定可能なシグナルを生成する蛍光、化学発光、放射性核種の組み合わせ、または酵素／基質の組み合わせとすることができる。一部の実施形態では、マルチモーダルシグナリングは、バイオマーカーアッセイフォーマットにおいて、独特で有利な特性を有する。
一部の実施形態では、本明細書に記載したバイオマーカーのバイオマーカーレベルは、後述するような、シングルプレックスアプタマーアッセイ、マルチプレックスアプタマーアッセイ、シングルプレックスまたはマルチプレックス免疫アッセイ、ｍＲＮＡ発現プロファイリング、ｍｉＲＮＡ発現プロファイリング、質量分光分析、組織学的／細胞学的方法などのあらゆる分析方法を使用して検出することができる。
アプタマーをベースとしたアッセイを使用したバイオマーカーレベルの決定
生物学的試料及びその他の試料での生理学的に重要な分子の検出及び定量に関するアッセイは、科学研究及びヘルスケア分野での重要なツールである。そのようなアッセイの１種は、固体支持体に固定化した１つ以上のアプタマーを含むマイクロアレイの使用を含む。アプタマーはそれぞれ、非常に特異的な方法で、かつ、非常に高い親和性で標的分子に結合することができる。例えば、米国特許第５，４７５，０９６号、「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ」を参照されたい；また、例えば、それぞれの発明の名称が、「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｂｉｏｃｈｉｐ」である米国特許第６，２４２，２４６号、米国特許第６，４５８，５４３号、及び米国特許第６，５０３，７１５号を参照されたい。マイクロアレイが試料と接触すると、アプタマーは、試料に存在するそれぞれの標的分子に結合する、それによって、バイオマーカーに対応するバイオマーカーレベルの決定が可能となる。
本明細書で使用する「アプタマー」は、標的分子、例えば、バイオマーカータンパク質に対して特異的な結合親和性を有する核酸のことを指す。親和性の相互作用は、程度の問題であると認識されているが、このことに関して、その標的に対するアプタマーの「特異的結合親和性」とは、そのアプタマーが、一般的には、試験試料でのその他の成分に結合するよりも遙かに高レベルの親和性で、その標的に対して結合することを意味する。「アプタマー」は、特定のヌクレオチド配列を有する核酸分子の１つのタイプまたは１種のコピーのセットである。アプタマーは、あらゆる個数の化学的に修飾したヌクレオチドを含んだ、あらゆる適切な個数のヌクレオチドを含むことができる。「アプタマー」は、そのような分子の複数のセットのことを指す。異なるアプタマーは、同数または異なる個数のヌクレオチドを持つことができる。アプタマーは、ＤＮＡまたはＲＮＡまたは化学的に修飾した核酸とすることができる、また、一本鎖、二本鎖、または二本鎖領域を含むことができる、そして、さらに高次の構造を含むことができる。また、アプタマーが、光反応性または化学反応性官能基を含んだアプタマーであれば、対応する標的に共有結合する光アプタマーとすることができる。本明細書に開示したアプタマー方法のいずれでも、同じ標的分子に対して特異的に結合する２つ以上のアプタマーの使用を含むことができる。後述するように、アプタマーは、タグを含み得る。アプタマーがタグを含んでいると、アプタマーのすべてのコピーに、同じタグを付ける必要がない。さらに、異なるアプタマーが、それぞれタグを含んでいると、これらの異なるアプタマーは、同じタグまたは異なるタグのいずれかを持つことができる。
アプタマーは、ＳＥＬＥＸプロセスを含むあらゆる公知の方法を使用して識別することができる。同定が行われると、アプタマーは、化学的合成法、及び酵素的合成法を含むあらゆる公知の方法に従って調製または合成することができる。
用語「ＳＥＬＥＸ」及び「ＳＥＬＥＸプロセス」は、本明細書では互換可能に使用しており、一般的には、（１）所望の方法で標的分子と相互作用するアプタマーの選択、例えば、タンパク質に対する高度の親和性での結合と、（２）選択したそれらの核酸の増幅との組み合わせのことを指す。このＳＥＬＥＸプロセスは、特定の標的またはバイオマーカーに対して高度の親和性を有するアプタマーを同定するために使用することができる。
ＳＥＬＥＸは、一般的には、核酸の候補混合物を調製すること、当該候補混合物と所望の標的分子とを結合させて親和性複合体を形成すること、当該親和性複合体を非結合候補核酸から分離すること、当該核酸を当該親和性複合体から分離及び単離すること、当該核酸を精製すること、及び、特異的アプタマー配列を同定すること、を含む。このプロセスは、選択したアプタマーの親和性をさらに改良するために複数回行い得る。このプロセスは、プロセスでの１回以上の時点において、増幅ステップを含み得る。例えば、発明の名称が「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ」である米国特許第５，４７５，０９６号を参照されたい。ＳＥＬＥＸプロセスは、その標的と非共有結合するアプタマーに加えて、その標的と共有結合するアプタマーを生成するために使用することができる。例えば、発明の名称が「Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：Ｃｈｅｍｉ－ＳＥＬＥＸ」である米国特許第５，７０５，３３７号を参照されたい。
ＳＥＬＥＸプロセスは、改善した特性、例えば、改善したインビボ安定性、または、改善した送達特性などをアプタマーに付与する修飾ヌクレオチドを含有する親和性の大きなアプタマーを同定するために使用することができる。このような修飾の例として、リボース位置、及び／またはリン酸位置、及び／または塩基位置での化学的置換がある。ＳＥＬＥＸプロセスで同定する修飾ヌクレオチドを含有するアプタマーは、発明の名称が「Ｈｉｇｈ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」である米国特許第５，６６０，９８５号に記載されており、そこでは、ピリミジンの５’位、及び、２’位で化学的に修飾したヌクレオチド誘導体を含有するオリゴヌクレオチドについて記載がされている。前出の米国特許第５，５８０，７３７号は、２’－アミノ（２’－ＮＨ２）、２’－フルオロ（２’－Ｆ）、及び／または、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）で修飾した１つ以上のヌクレオチドを含有する優れた特異性を有するアプタマーについて記載している。広範な物理的及び化学的特質を有する核酸ライブラリー、ならびに、ＳＥＬＥＸ、及び、ｐｈｏｔｏＳＥＬＥＸでのそれらの使用について記載している、発明の名称が「ＳＥＬＥＸ ａｎｄ ＰＨＯＴＯＳＥＬＥＸ」である米国特許出願公開第２００９／００９８５４９号も参照されたい。
また、ＳＥＬＥＸは、所望の低速特性を有するアプタマーを同定するために使用することができる。発明の名称が「Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ Ａｐｔａｍｅｒｓ ｗｉｔｈ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｏｆｆ－Ｒａｔｅｓ」であり、標的分子に結合することができるアプタマーを生成する改善したＳＥＬＥＸ方法を記載している米国特許出願公開第２００９／０００４６６７号を参照されたい。解離速度がさらに低速であり、それぞれの標的分子由来のアプタマー及び光アプタマーを製造するための方法を説明している。この方法は、候補混合物を標的分子と接触させ、核酸－標的複合体の形成を可能ならしめ、そして、低速オフレートの核酸－標的複合体に富んだプロセスを行う、そこでは、高速解離速度の核酸－標的複合体は解離してしまい、再形成することはなく、一方で、低速解離速度を示す複合体はそのまま残存する。加えて、この方法は、候補核酸混合物の生産において修飾ヌクレオチドを使用して、改善したオフレート性能を有するアプタマーを生成することを含む。例示的な修飾ヌクレオチドとして、例えば、図１に示す修飾ピリミジンがあるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、アプタマーは、塩基修飾などの修飾を有する少なくとも１つのヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、アプタマーは、標的タンパク質との疎水性接触を可能にする、疎水性塩基修飾などの疎水性修飾を有する少なくとも１つのヌクレオチドを含む。そのような疎水性接触は、一部の実施形態では、アプタマーよりも大きな親和性、及び／または低速のオフレートを示す結合に寄与する。疎水性修飾を有する例示的なヌクレオチドを図１に示すが、これらに限定されない。一部の実施形態では、アプタマーは、疎水性修飾を有する少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでおり、当該疎水性修飾は、その他のものと同じものとし得る、または、違うものとし得る。一部の実施形態では、アプタマーでの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０個の疎水性修飾を、図１に示す疎水性修飾から独立して選択する。
一部の実施形態では、低速オフレートを示すアプタマー（疎水性修飾を有する少なくとも１つのヌクレオチドを含むアプタマーを含む）は、≧３０分、≧６０分、≧９０分、≧１２０分、≧１５０分、≧１８０分、≧２１０分、または≧２４０分のオフレート（ｔ１／２）を有する。
一部の実施形態では、このアッセイは、アプタマーが、それらの標的分子と共有結合する、または、「光架橋する」ことを可能にする光反応性官能基を含むアプタマーを使用する。例えば、発明の名称が、「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｂｉｏｃｈｉｐ」である米国特許第６，５４４，７７６号を参照されたい。これらの光反応性アプタマーは、光アプタマーとも称する。例えば、発明の名称がいずれも「Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：Ｐｈｏｔｏｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ ａｎｄ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ＳＥＬＥＸ」である米国特許第５，７６３，１７７号、米国特許第６，００１，５７７号、及び、米国特許第６，２９１，１８４号を参照されたい；また、例えば、発明の名称が「Ｐｈｏｔｏｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ」である米国特許第６，４５８，５３９号も参照されたい。マイクロアレイを試料と接触させ、光アプタマーが、それらの標的分子と結合する機会を得た後に、光アプタマーを光活性化し、そして、固体支持体を洗浄してあらゆる非特異的結合分子を除去する。光アプタマーに結合する標的分子は、光アプタマーでの光活性化官能基（複数可）が作り出す共有結合であるため、通常は除去されないので、徹底した洗浄条件を使用し得る。このアッセイは、このようにして、試験試料でのバイオマーカーに対応するバイオマーカーレベルの検出を可能にする。
一部のアッセイ形式では、アプタマーを、試料と接触させる前に、固体支持体に固定化する。しかしながら、特定の状況下では、試料と接触させる前のアプタマーの固定は、最適なアッセイを提供し得ない。例えば、アプタマーを予め固定化すると、固体支持体表面でのアプタマーと標的分子との混合が非効率的になりかねず、おそらくは、このことが、反応時間の長期化を招き、それ故に、アプタマーと、それらの標的分子との効率的な結合を可能にするためのインキュベーション時間を長くする。さらに、光アプタマーを、アッセイにおいて、かつ、固体支持体として利用する材料に応じて使用する場合、固体支持体は、光アプタマーと、それらの標的分子との間に共有結合を形成するために使用する光を散乱させる、または、吸収する傾向を示し得る。さらに、使用する方法に応じて、標的分子を、それらのアプタマーに結合させて検出することは、固体支持体の表面が、使用するあらゆる標識薬剤にも曝露されて、これらの影響を受ける場合もあり得るので、対象を不正確なものにしかねない。最後に、固体支持体でのアプタマーの固定化は、一般的には、試料に対してアプタマーを曝露する前に、アプタマー調製ステップ（すなわち、固定化）を含んでおり、そして、この調製ステップは、アプタマーの活性または機能性に影響を及ぼし得る。
アプタマーが、溶液において、その標的を捕捉し、次いで、アプタマー－標的混合物の特定の成分を検出前に除去することが可能になるようにデザインした分離ステップを用いるアプタマーアッセイも記載されている（発明の名称が、「Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ Ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ Ｔｅｓｔ Ｓａｍｐｌｅｓ」である米国特許出願公開第２００９／００４２２０６号を参照されたい）。ここに記載されているアプタマーアッセイ方法は、核酸（すなわち、アプタマー）を検出及び定量することで、試験試料での非核酸標的（例えば、タンパク質標的）の検出及び定量を可能にする。ここに記載されている方法は、非核酸標的を検出及び定量する核酸代用物（すなわち、アプタマー）を作り出し、それにより、増幅を含む多種多様な核酸技術を、タンパク質標的など、より広範囲な所望の標的に適用することを可能にする。
アプタマーは、アプタマーバイオマーカー複合体（または、光アプタマーバイオマーカー共有結合複合体）由来のアッセイ成分の分離を容易にし、そして、検出及び／または定量のためのアプタマーの単離を許容するように構築することができる。ある実施形態では、このような構築物は、アプタマー配列に切断可能な要素、または放出可能な要素を含むことができる。その他の実施形態では、さらなる機能性をアプタマーに導入することができる、例えば、標識または検出可能成分、スペーサー成分、または特異的結合タグ、または固定化要素を導入することができる。例えば、アプタマーは、切断可能部分を介して、アプタマーに接続したタグ、標識、その標識を分離するスペーサー成分、及び切断可能部分を含むことができる。ある実施形態では、切断可能要素は、光切断可能リンカーである。光切断可能リンカーは、ビオチン部分、及びスペーサー部分に結合可能であり、アミンの誘導体化のためのＮＨＳ基を含むことが可能であり、ビオチン基をアプタマーに導入するために使用することができる、それにより、その後にアッセイ法でアプタマーの放出が可能になる。
均質アッセイは、溶液に含まれるすべてのアッセイ成分を使用して実施するが、シグナルの検出前に試料及び試薬の分離を必要としない。これらの方法は、迅速かつ容易に使用できる。これらの方法は、その特定の標的と反応する分子捕捉試薬または結合試薬に基づいてシグナルを生成する。本明細書に記載した方法の一部の実施形態では、分子捕捉試薬は、アプタマーまたは抗体などを含んでおり、当該特定の標的は、表１、３、５、及び／または７に示すバイオマーカーとし得る。
一部の実施形態では、シグナル生成のための方法は、フルオロフォア標識捕捉試薬と、その特異的バイオマーカー標的との相互作用による異方性シグナル変化を利用する。標識した捕捉物質がその標的と反応すると、分子量の増加によって、複合体に結合しているフルオロフォアの回転運動が生じて、異方性値の変化が非常に遅くなる。異方性変化をモニタリングすることで、結合事象を使用して、溶液でのバイオマーカーを定量的に測定することができる。その他の方法として、蛍光偏光アッセイ、分子ビーコン法、時間分解蛍光消光、化学発光、蛍光共鳴エネルギー移動などがある。
生物学的試料でのバイオマーカーレベルを検出するために使用し得る例示的な溶液をベースとしたアプタマーアッセイは：（ａ）生物学的試料を、第１のタグを含み、かつ、バイオマーカーに対して特異的親和性を有するアプタマーに接触させる、また、バイオマーカーが試料に存在する場合、アプタマー親和性複合体を形成する；（ｂ）混合物を、第１の捕捉要素を含む第１の固体支持体に曝露し、そして、第１のタグを、第１の捕捉要素と関連付ける；（ｃ）第１の固体支持体に関連しない混合物の成分を除去する；（ｄ）アプタマー親和性複合体のバイオマーカー成分に、第２のタグを結合させる；（ｅ）第１の固体支持体からアプタマー親和性複合体を放出させる；（ｆ）放出したアプタマー親和性複合体を、第２の捕捉要素を含む第２の固体支持体に曝露する、そして、第２のタグを、第２の捕捉要素と会合させる；（ｇ）複合体を形成していないアプタマーを、アプタマー親和性複合体から分配して、複合体を形成していないアプタマーを混合物から除去する；（ｈ）固体支持体からアプタマーを溶出させる；及び、（ｉ）アプタマー親和性複合体のアプタマー成分を検出して、分析物を検出すること、を含む。
アプタマーを使用して生物学的試料でのバイオマーカーを検出する例示的な方法を、実施例７に記載しているが、これに限定されない。Ｋｒａｅｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ６（１０）：ｅ２６３３２も参照されたい。
イムノアッセイを使用するバイオマーカーレベルの定量
イムノアッセイ法は、対応する標的または分析物に対する抗体の反応に基づいており、そして、特定のアッセイ形式に応じて試料に含まれる分析物を検出することができる。特異的なエピトープ認識を備えているが故に、免疫反応性に基づいたアッセイ法の特異性及び感受性を改善するために、モノクローナル抗体、及びそのフラグメントを使用することが多い。ポリクローナル抗体も、モノクローナル抗体と比較して標的に対する親和性が高いので、様々なイムノアッセイで首尾よく使用されている。イムノアッセイは、広範囲の生物学的試料マトリックスと共に使用するようにデザインされている。イムノアッセイ形式は、定性的、半定量的、及び定量的な結果が得られるようにデザインされている。
定量的な結果は、公知の濃度の検出すべき特定の分析物で作り出した標準曲線を使用して得る。未知の試料からの応答またはシグナルを標準曲線にプロットし、そして、未知の試料での標的に対応する量またはレベルを確立させる。
数多くのイムノアッセイ形式がデザインされている。ＥＬＩＳＡまたはＥＩＡは、分析物の検出を定量的なものにし得る。この方法は、分析物または抗体のいずれかに対する標識の結合に依存しており、そして、標識成分は、直接的または間接的に酵素を含む。ＥＬＩＳＡ試験は、分析物の直接的、間接的、競合的、またはサンドイッチ検出のためにフォーマットを作成し得る。その他の方法は、例えば、放射性同位体（Ｉ１２５）または蛍光などの標識に依存している。さらなる技術として、例えば、凝集、比濁法、濁度法、ウェスタンブロット、免疫沈降、免疫細胞化学、免疫組織化学、フローサイトメトリー、Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイなどがある（ＩｍｍｕｎｏＡｓｓａｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ（Ｂｒｉａｎ Ｌａｗ編、Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｌｔｄ．発行、２００５年版）を参照されたい）。
例示的なアッセイ形式として、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ、蛍光、化学発光、及び蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、または時間分解ＦＲＥＴ（ＴＲ－ＦＲＥＴ）イムノアッセイがある。バイオマーカーを検出するための手順の例として、バイオマーカー免疫沈降、それに続いて、サイズ及びペプチドレベルの識別を可能にする定量的方法（例えば、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、平面電気クロマトグラフィーなど）がある。
検出可能な標識またはシグナル生成材料を検出及び／または定量する方法は、標識の性質に依存している。適切な酵素が触媒した反応の産物（検出可能な標識が酵素である場合；上記を参照されたい）は、限定を意図するものではないが、蛍光性、発光性、または放射性のものとし得る、または、このような産物は、可視光または紫外光を吸収することができる。このような検出可能な標識を検出する上で好適な検出器の例として、Ｘ線フィルム、放射能カウンター、シンチレーションカウンター、分光光度計、比色計、蛍光光度計、照度計、及び濃度計があるが、これらに限定されない。
検出のための方法はいずれも、反応に向けたあらゆる好適な調製、処理、及び分析を可能にするあらゆる形式で実施することができる。この形式として、例えば、マルチウェルアッセイプレート（例えば、９６ウェルまたは３８６ウェル）や、あらゆる好適なアレイまたはマイクロアレイを用いる形式もある。様々な作用物質の原液は、手動またはロボットで作り出すことができる、そして、それに続くピペッティング、希釈、混合、分配、洗浄、インキュベーション、試料読み出し、データ収集、及び分析のすべてを、検出可能な標識を検出できる市販の分析ソフトウェア、ロボット工学、及び検出計測器を使用して、ロボットが行い得る。
遺伝子発現プロファイリングを使用するバイオマーカーレベルの決定
生物学的試料でのｍＲＮＡの測定は、一部の実施形態では、当該生物学的試料での対応するタンパク質のレベルの検出のための代替物として使用し得る。したがって、一部の実施形態では、本明細書に記載したバイオマーカーまたはバイオマーカーパネルは、適切なＲＮＡを検出することで検出し得る。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ発現レベルは、逆転写定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲと、それに続くｑＰＣＲ）で測定する。ＲＴ－ＰＣＲ法を使用して、ｍＲＮＡからｃＤＮＡを作り出す。このｃＤＮＡを、ｑＰＣＲアッセイに使用すると、ＤＮＡ増幅プロセスが進行するにつれて蛍光を生成し得る。標準曲線と比較することで、ｑＰＣＲは、絶対的測定値、例えば、ｍＲＮＡのコピー数／細胞などを示し得る。ノーザンブロット、マイクロアレイ、インベーダーアッセイ、及びキャピラリー電気泳動と組み合わせたＲＴ－ＰＣＲは、すべて、試料に含まれるｍＲＮＡの発現レベルを測定するために使用する。Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｒｉｃｈａｒｄ Ａ．Ｓｈｉｍｋｅｔｓ，ｅｄｉｔｏｒ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，２００４を参照されたい。
インビボ分子イメージング技術を使用するバイオマーカーの検出
一部の実施形態では、本明細書に記載したバイオマーカーは、分子イメージング試験で使用することができる。例えば、造影剤を、捕捉試薬にカップリングしたものを使用してインビボでバイオマーカーを検出することができる。
インビボでのイメージング技術は、個体の体内の特定の疾患の病態を決定する非侵襲的方法を提供する。例えば、身体の全部分、または全身をも三次元画像として見ることができ、これにより、体内の形態及び構造に関する有用な情報を提供し得る。このような技術は、本明細書に記載したバイオマーカーの検出と組み合わせて、インビボでのバイオマーカーに関する情報を提供し得る。
インビボでの分子イメージング技術は、様々な技術進歩を受けて発展しつつある。これらの進歩として、体内で強力なシグナルを発生させることができる放射標識、及び／または蛍光標識などの新しい造影剤または標識の開発；及び、身体の外部からこれらのシグナルを十分な感受性ならびに精度で検出して分析を行って、有用な情報を提供することができる強力で新規のイメージング技術の開発がある。造影剤は、適切なイメージングシステムで可視化することができる、それにより、体内の造影剤が存在する部分（複数可）の画像を得ることができる。造影剤は、例えば、アプタマーまたは抗体などの捕捉試薬、及び／またはペプチドもしくはタンパク質、またはオリゴヌクレオチド（例えば、遺伝子発現の検出のためのもの）、またはこれらのいずれかと１つ以上の巨大分子及び／またはその他の粒子型とを備えた複合体と結合または連結し得る。
また、造影剤は、イメージングにおいて有用な放射性原子を特徴とするものとし得る。適切な放射性原子として、シンチグラフ検査のためのテクネチウム－９９ｍまたはヨウ素－１２３がある。その他の容易に検出可能な部分として、例えば、磁気共鳴像（ＭＲＩ）用のスピン標識があり、例えば、ヨウ素－１２３の他に、ヨウ素－１３１、インジウム－１１１、フッ素－１９、炭素－１３、窒素－１５、酸素－１７、ガドリニウム、マンガン、または鉄がある。このような標識は、当該技術分野において周知であり、当業者であれば容易に選択することができる。
標準的なイメージング技術として、磁気共鳴撮像、コンピューター断層撮影スキャン、陽電子射出断層撮影法（ＰＥＴ）、単光子放射型コンピューター断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）などがあるが、これらに限定されない。インビボでの診断イメージングについては、所定の造影剤、例えば、所定の放射性核種と、それを使用して標的化する具体的なバイオマーカー（タンパク質、ｍＲＮＡなど）との選択に際して利用可能な検出機器のタイプが重要な要素となる。一般的に選択されている放射性核種は、所定のタイプの機器で検出できるある種の減衰を示す。また、インビボでの診断のために放射性核種を選択する場合、その半減期は、標的組織の取り込み時間が最長であるが、宿主に対する有害な放射線を最小化する上で十分な程度の短さにすべきである。
例示的なイメージング技術として、個体に対して放射性核種を合成的または局所的に照射するイメージング技術であるＰＥＴ及びＳＰＥＣＴがあるが、これらに限定されない。その後の放射性トレーサーの取り込みを経時的に測定して、標的組織及びバイオマーカーに関する情報を得るために使用する。使用する特定の同位体からの高エネルギー（ガンマ線）放射と、それを検出するために使用する機器の感受性及び精巧さが故に、身体の外部から放射活性の二次元分布を推定し得る。
ＰＥＴにおいて一般的に使用されている陽電子放出核種として、例えば、炭素－１１、窒素－１３、酸素－１５、及びフッ素－１８がある。ＳＰＥＣＴでは、電子捕捉、及び／またはガンマ放射によって減衰する同位体を使用しており、例えば、ヨウ素－１２３、及びテクネチウム－９９ｍがある。アミノ酸を、テクネチウム－９９ｍで標識する例示的な方法では、キレート前駆体の存在下で過テクネチウム酸イオンを還元し、次いで、不安定なテクネチウム－９９ｍ前駆体複合体を形成し、続いて、このものを二官能性修飾下走化性ペプチドの金属結合基と反応させて、テクネチウム－９９ｍ－走化性ペプチドコンジュケートを形成する。
このようなインビボでのイメージング診断方法では、抗体が、頻繁に使用されている。インビボでの診断用抗体の調製及び使用は、当該技術分野において周知である。同様に、アプタマーは、このようなインビボイメージング診断法に使用し得る。例えば、本明細書に記載した特定のバイオマーカーを同定するために使用したアプタマーを、適切に標識し、個体に注射し、そして、インビボでバイオマーカーを検出し得る。使用する標識は、上記したようにして使用するイメージング様式に従って選択する。アプタマー特異的造影剤は、その他の造影剤と比べて、組織透過性、組織分布、速度論、除去、効力、及び選択性に関して、特有かつ有利な特性を有する。
また、そのような技術は、任意に、アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用するイメージングで遺伝子発現を検出するために、例えば、標識したオリゴヌクレオチドも使用し得る。これらの方法は、例えば、標識として蛍光分子または放射性核種を使用するインサイチュハイブリダイゼーションで利用する。遺伝子発現の検出のためのその他の方法として、例えば、レポーター遺伝子活性の検出がある。
別の一般的なタイプのイメージング技術として、光学イメージングがあり、このものは、対象の身体内の蛍光シグナルを、対象の外部にある光学装置が検出する。これらのシグナルは、実際の蛍光、及び／または生物発光に起因し得る。光学検出装置の感受性を改善することで、インビボでの診断アッセイのための光学イメージングの有用性を改善し得る。
その他の技術の総論については、Ｎ．Ｂｌｏｗ、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ、６、４６５－４６９、２００９を参照されたい。
組織学／細胞学的方法を使用するバイオマーカーの決定
一部の実施形態では、本明細書に記載したバイオマーカーは、組織学的または細胞学的方法を使用して、様々な組織試料において検出し得る。例えば、気管支内生検、及び経気管支生検、穿刺吸引生検、切断針、及びコア生検を組織学に使用することができる。気管支洗浄、及び擦過、胸膜吸引、及び喀痰は、細胞診に使用することができる。本明細書で同定したいずれのバイオマーカーも、疾患の兆候として、標本を染色するために使用することができる。
一部の実施形態では、対応するバイオマーカー（複数可）に特異的な１つ以上の捕捉試薬を、試料の細胞学的評価に使用する、そして：細胞試料の回収、細胞試料の固定、脱水、清浄、顕微鏡スライドでの細胞試料の固定化、細胞試料の透過処理、分析物の回収処理、染色、脱色、洗浄、ブロッキング、及び緩衝剤での１つ以上の捕捉試薬との反応の１つ以上を含み得る。別の実施形態では、細胞試料は、細胞ブロックから生成する。
一部の実施形態では、対応するバイオマーカーに特異的な１つ以上の捕捉試薬を、組織試料の組織学的評価に使用する、そして：組織標本の回収、組織試料の固定、脱水、清浄、組織試料の顕微鏡スライドへの固定化、組織試料の透過処理、分析物の回収、染色、脱色、洗浄、ブロッキング、再水和、及び緩衝剤での捕捉試薬（複数可）との反応の１つ以上を含み得る。別の実施形態では、固定化及び脱水を、凍結と置き換える。
別の実施形態では、対応するバイオマーカー（複数可）に特異的な１つ以上のアプタマー（複数可）は、組織学的または細胞学的試料と反応して、核酸増幅法において核酸標的として機能することができる。適切な核酸増幅法として、例えば、ＰＣＲ、ｑ－ベータレプリカーゼ、ローリングサークル増幅、鎖置換、ヘリカーゼ依存的増幅、ループ媒介等温増幅、リガーゼ連鎖反応、そして、制限及び環状化支援ローリングサークル増幅がある。
ある実施形態では、組織学的または細胞学的評価で使用するための対応するバイオマーカーに特異的な１つ以上の捕捉試薬を：ブロッキング物質、競合物質、界面活性剤、安定剤、担体核酸、ポリアニオン性材料などのいずれかを含むことができる緩衝剤溶液において混合する。
「細胞診プロトコール」は、一般的には、試料の回収、試料の固定、試料の固定化、及び染色を含む。「細胞調製」は、調製した細胞の染色のための１つ以上のアプタマーの使用を含んでいる、試料回収後の幾つかの処理ステップを含むことができる。
質量分析法を使用するバイオマーカーレベルの決定
様々な構成の質量分析計を使用して、バイオマーカーレベルを検出することができる。幾つかのタイプの質量分析計が利用可能であり、または様々な構成で製造することができる。一般的に、質量分析計は：試料注入口、イオン源、質量分析器、検出器、真空系、及び計測器制御系、及びデータ系という主要な構成要素を備えている。一般的に、試料注入口、イオン源、及び質量分析器での差異は、計測器のタイプと、その能力を表している。例えば、注入口は、キャピラリーカラム液体クロマトグラフィー源や、マトリックス支援レーザー脱離で使用するような、直接プローブまたはステージとすることができる。一般的なイオン源は、例えば、エレクトロスプレー、例えば、ナノスプレーやマイクロスプレーなど、またはマトリックス支援レーザー脱離である。一般的な質量分析器として、四重極質量フィルター、イオントラップ質量分析器、及び飛行時間型質量分析器がある。さらなる質量分析法は、当該技術分野で周知である（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７０：６４７ Ｒ－７１６Ｒ（１９９８）；Ｋｉｎｔｅｒ ａｎｄ Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０００）を参照されたい）。
タンパク質バイオマーカー、及びバイオマーカーレベルは：エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）、ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ、ＥＳＩ－ＭＳ／（ＭＳ）ｎ、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ）、表面増強レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析（ＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ）、シリコンでの脱離／イオン化（ＤＩＯＳ）、二次イオン質量分析（ＳＩＭＳ）、四重極飛行時間型（Ｑ－ＴＯＦ）、ｕｌｔｒａｆｌｅｘ ＩＩＩ ＴＯＦ／ＴＯＦと称するタンデム飛行時間型（ＴＯＦ／ＴＯＦ）技術、大気圧化学イオン化質量分析（ＡＰＣＩ－ＭＳ）、ＡＰＣＩ－ＭＳ／ＭＳ、ＡＰＣＩ－（ＭＳ）Ｎ、大気圧光イオン化質量分析（ＡＰＰＩ－ＭＳ）、ＡＰＰＩ－ＭＳ／ＭＳ及びＡＰＰＩ－（ＭＳ）Ｎ、四重極質量分析、フーリエ変換質量分析（ＦＴＭＳ）、定量的質量分析、及びイオントラップ質量分析のいずれかで、検出及び測定することができる。
試料調製戦略は、タンパク質バイオマーカーの質量分析による特徴決定と、バイオマーカーレベルの定量の前に、試料を標識及び濃縮するために使用する。標識方法として、相対的及び絶対的定量のための等圧性タグ（ｉＴＲＡＱ）、及び細胞培養物でのアミノ酸を含む安定同位体標識（ＳＩＬＡＣ）があるが、これらに限定されない。質量分析の前に候補バイオマーカータンパク質のための試料を選択的に濃縮するために使用する捕捉試薬として、アプタマー、抗体、核酸プローブ、キメラ、小分子、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、一本鎖抗体フラグメント、Ｆｖフラグメント、一本鎖Ｆｖフラグメント、核酸、レクチン、リガンド結合受容体、アフィボディ、ナノボディ、アンキリン、ドメイン抗体、代替的抗体スキャホールド（例えば、ダイアボディなど）インプリントポリマー、アビマー、ペプチド模倣体、ペプトイド、ペプチド核酸、トレオース核酸、ホルモン受容体、サイトカイン受容体、及び合成受容体、そして、これらの修飾物及びフラグメントがあるが、これらに限定されない。
上記したアッセイは、本明細書に記載した方法において有用なバイオマーカーレベルの検出を可能にしており、当該方法は、個体由来の生物学的試料において、表１、３、５、または７に記載したバイオマーカーから選択した少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つを検出することを含む。様々な実施形態では、当該方法は、本明細書に記載したバイオマーカーのグループのいずれかから選択する１つ以上のバイオマーカーのレベルを検出することを含む。したがって、説明をしたバイオマーカーの一部は、それ単独で、脂肪肝、肝炎、肝線維症、肝細胞バルーニング、及び／またはＮＡＳＨを検出する上で有用であり得る一方で、複数のバイオマーカー、及び当該バイオマーカーの一部をグループ化して、２つ以上のバイオマーカーのパネルを形成する方法も本明細書に記載している。本明細書に記載した方法のいずれかに従って、バイオマーカーレベルを、個別に検出及び分類することができる、あるいは、例えば、マルチプレックスアッセイ形式など、それらを集合的に検出及び分類することができる。
バイオマーカーの分類、及び疾患スコアの計算
一部の実施形態では、所定の診断試験に関するバイオマーカーの「シグネチャー」は、一連のバイオマーカーを含んでおり、それぞれのバイオマーカーは、関心集団において特徴的なレベルを有する。特徴的なレベルとは、一部の実施形態では、特定のグループ内の個体に関するバイオマーカーの平均または平均値のことを指し得る。一部の実施形態では、本明細書に記載した診断方法を用いて、個体由来の未知の試料を、２つのグループの内の一方、例えば、脂肪肝または正常の内の一方に割り当てることができる。一部の実施形態では、本明細書に記載した診断方法を使用して、個体から得た未知の試料を、２つのグループ、例えば、脂肪肝または肝線維症のいずれかに割り当てることができる。一部の実施形態では、本明細書に記載した診断方法を使用して、個体から得た未知の試料を、３つのグループ、例えば、正常、ＮＡＳＨが認められない肺線維症、及びＮＡＳＨのいずれか１つに割り当てることができる。
試料を２つ以上のグループの１つに割り当てることは、分類として知られており、また、この割り当てを達成するための手法は、分類器または分類方法として知られている。分類方法は、スコア付け法とも称し得る。バイオマーカーレベルのセットから診断分類器を構築するために使用することができる数多くの分類方法がある。一部の事例では、分類方法は、監視型ラーニング技術を使用して行われており、そこでは、区別しようとする２つ（または、多変量状態の場合では、それより多く）の別個のグループの個体から得た試料を使用してデータセットを回収する。それぞれの試料が属するクラス（グループまたは集団）が、それぞれの試料について予め分かっているので、分類方法をトレーニングして、望ましい分類応答を得ることができる。監視型ラーニング技術を使用しなくとも、診断分類器を作り出すことは可能である。
診断分類器を開発するための一般的な手法として、決定木；バギング＋ブースティング＋フォレスト；推論ルールに基づく学習；パルザン窓（Ｐａｒｚｅｎ Ｗｉｎｄｏｗｓ）；線形モデル；記号論理学；ニューラルネットワーク法；非監視型クラスタリング；Ｋ平均法；階層上昇／下降；半管理学習法；プロトタイプ法；最近傍法；カーネル密度推定；サポーティブベクターマシーン；隠れマルコフ（Ｍａｒｋｏｖ）モデル；ボルツマン（Ｂｏｌｔｚｍａｎｎ）学習があり、そして、分類器は、単純に組み合わせ得る、あるいは特定の目的関数を最小化する方法で組み合わせ得る。総論に関して、例えば、Ｐａｔｔｅｒｎ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｒ．Ｏ．Ｄｕｄａ，ｅｔ ａｌ．、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、２００１を参照されたい。また、Ｔｈｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｌｅａｒｎｉｎｇ－Ｄａｔａ Ｍｉｎｉｎｇ，Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ，ａｎｄ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ、Ｔ．Ｈａｓｔｉｅ，ｅｔ ａｌ．、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ＋Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｍｅｄｉａ，ＬＬＣ、２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、２００９も参照されたい。
管理学習技術を使用して分類器を作るために、トレーニングデータと称する試料のセットを入手する。診断テストに関連して、トレーニングデータは、後から、未知試料が割り当てられる別個のグループ（クラス）に由来する試料を含むことになる。例えば、コントロール集団の個体から回収した試料と、特定の疾患を有する集団の個体から回収した試料とで、未知試料（または、より具体的には、試料を提供した個体）を、疾患の有無のいずれかに分類することができる分類器を開発するためのトレーニングデータを構成することができる。トレーニングデータに由来する分類器の開発は、分類器のトレーニングとして知られている。分類器のトレーニングに関する具体的な詳細は、管理学習技術の性質に依存している。単純ベイズ分類器は、このような管理学習技術の一例である（例えば、Ｐａｔｔｅｒｎ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｒ．Ｏ．Ｄｕｄａ，ｅｔ ａｌ．、ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、２００１を参照されたい；また、Ｔｈｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｌｅａｒｎｉｎｇ－Ｄａｔａ Ｍｉｎｉｎｇ，Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ，ａｎｄ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ、Ｔ．Ｈａｓｔｉｅ，ｅｔ ａｌ．、ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ＋Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｍｅｄｉａ，ＬＬＣ、２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、２００９も参照されたい）。単純ベイズ分類器のトレーニングは、例えば、米国特許公開第２０１２／０１０１００２号、及び同第２０１２／００７７６９５号に記載されている。
一般的には、トレーニングセットの試料よりも数多くの潜在的なバイオマーカーレベルがあるので、過剰適合を回避する配慮が必要である。過剰適合は、統計モデルが、基礎的な関係性の代わりに、ランダムエラーまたはノイズを表現する場合に発生する。過剰適合は、様々な方法で回避することができ、そのような方法として、例えば、分類器開発に使用するバイオマーカーの数を制限すること、バイオマーカーの応答が互いに独立していると仮定すること、使用する基本とする統計モデルの複雑度を制限すること、そして、基本とする統計モデルを確実にデータに一致させる、ことがある。
バイオマーカーのセットを使用する診断試験の開発の具体的な例として、単純ベイズ分類器の利用、すなわち、バイオマーカーの厳密な独立した処理を行うベイズの定理に基づいた単純な確率的分類器の利用がある。それぞれのバイオマーカーは、それぞれのクラスでのＲＦＵ測定値または対数ＲＦＵ（相対蛍光単位）測定値に関するクラス依存性確率密度関数（ｐｄｆ）で説明される。１つのクラスでのバイオマーカーのセットに関する結合ｐｄｆは、それぞれのバイオマーカーに関する個々のクラス依存性ｐｄｆの積であると推定される。このことに関連して、単純ベイズ分類器をトレーニングすることは、クラス依存性ｐｄｆを特性化するために、パラメーターを割り当てること（「パラメーター化」）に等しい。クラス依存性ｐｄｆのために、あらゆる基本モデルを使用し得るが、このモデルは、一般的には、トレーニングセットで認められたデータと一致している必要がある。
単純ベイズ分類器の性能は、分類器を構築及びトレーニングするために使用するバイオマーカーの個数及び品質に依存している。単一のバイオマーカーは、ＫＳ－距離（コルモボロフ－スミルノフ（Ｋｏｌｍｏｇｏｒｏｖ－Ｓｍｉｒｎｏｖ）に従う。良好なＫＳ距離（例えば、＞０．３）を有するバイオマーカーを続けて加えると、続けて加えたバイオマーカーが第１のバイオマーカーから独立している場合には、一般的には、分類性能を高める。分類器スコアとして感受性に加えて特異性を使用して、高いスコアを付ける数多くの分類器を、グリーディアルゴリズムの変動を利用して作り出すことができる。（グリーディアルゴリズムとは、大域的最適解を見出すという目的で、それぞれの段階において局所的に最適な選択を行って、問題解決を図るメタヒューリスティック手法に従うあらゆるアルゴリズムのことである）。
分類器性能を説明する別の方法は、受信者動作特性（ＲＯＣ）、または単純にＲＯＣ曲線、もしくはＲＯＣプロットによる。ＲＯＣとは、２項分類器系の識別閾値の変化に応じた、その２項分類器系に関する、感受性、または真陽性率の偽陽性率に対する（１－特異性、または１－真陽性率）グラフィカルプロットである。また、このＲＯＣは、陽性の内の真陽性の割合（ＴＰＲ＝真陽性率）を、陰性の内の偽陽性の割合（ＦＰＲ＝偽陽性率）に対してプロットして同等に表すことができる。このことは、基準の変化が、２つの動作特性（ＴＰＲ ＆ ＦＰＲ）の比較であるので、相対的動作特性曲線としても知られている。ＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）は、診断精度の集約尺度として一般的に使用されている。これは、０．０～１．０の値になり得る。ＡＵＣは、重要な統計的性質：すなわち、分類器のＡＵＣが、分類器が無作為に選択した正事例を、無作為に選択した負事例よりも上にランク付けする確率と同等である（Ｆａｗｃｅｔｔ Ｔ、２００６．Ａｎ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ ＲＯＣ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｐａｔｔｅｒｎ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ．２７：８６１－８７４）。このものは、ウィルコクソン順位検定（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ ｔｅｓｔ ｏｆ ｒａｎｋｓ）に相当する（Ｈａｎｌｅｙ，Ｊ．Ａ．、ＭｃＮｅｉｌ，Ｂ．Ｊ、１９８２．Ｔｈｅ ｍｅａｎｉｎｇ ａｎｄ ｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ａ ｒｅｃｅｉｖｅｒ ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ（ＲＯＣ） ｃｕｒｖｅ．Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ １４３、２９－３６．）。
例示的な実施形態は、表１、３、５、または７に記載したあらゆる個数のバイオマーカーの様々な組み合わせを使用して、様々な実施形態では、脂肪肝、肝炎、肝線維症、肝細胞バルーニング、及び／またはＮＡＳＨを有する個体を同定する診断試験を作り出す。表１、３、５、または７に記載したバイオマーカーを様々な方法で組み合わせて、分類器を作り出すことができる。一部の実施形態では、バイオマーカーのパネルは、選択した特定の診断性能基準に応じて、異なるセットのバイオマーカーから構成する。例えば、バイオマーカーの特定の組み合わせは、その他の組み合わせよりも感受性が高い（または、特異性が高い）試験を構成し得る。一部の実施形態では、脂肪肝を有する個体を同定するためのバイオマーカーのパネルは、表１のバイオマーカーから選択する。一部の実施形態では、肝炎を有する個体を同定するためのバイオマーカーのパネルは、表３のバイオマーカーから選択する。一部の実施形態では、肝細胞バルーニングを有する個体を同定するためのバイオマーカーのパネルは、表５のバイオマーカーから選択する。一部の実施形態では、肝線維症を有する個体を同定するためのバイオマーカーのパネルは、表７のバイオマーカーから選択する。
一部の実施形態では、１つ以上のさらなるバイオマーカーの有無に関係なく、表１、３、５、及び／または７から得た特定のバイオマーカーのセットを含むようにパネルを定義しており、また、分類器をトレーニングデータのセットから構築すると、診断試験パラメーターが完了する。一部の実施形態では、生物学的試料に対して１つ以上のアッセイを行って、分類のための関連する定量的バイオマーカーレベルを決める。測定したバイオマーカーレベルを、分類を決める分類方法の入力値として、また、クラス割り当ての信頼性を反映する試料の任意のスコアとして使用する。
一部の実施形態では、生物学的試料を、任意に希釈して、多重化アプタマーアッセイを行って、データを、次のように評価する。まず、アッセイから得たデータを、任意に、正規化及び標準化する、そして、得られたバイオマーカーレベルの結果を、ベイズ分類スキームの入力値として使用する。次に、測定した個別のバイオマーカーごとに対数尤度比を計算し、合計して最終的な分類スコア、別名、診断スコアを生成する。結果の割り当てと、全体的な分類スコアを報告することができる。一部の実施形態では、それぞれのバイオマーカーレベルについて計算した個々の対数尤度リスク因子も報告することができる。
キット
例えば、本明細書に開示した方法を実行するための使用において、適切なキットを利用して、本明細書に記載したバイオマーカーのあらゆる組み合わせを検出することができる。さらに、いずれのキットも、本明細書に記載したような１つ以上の検出可能な標識、例えば、蛍光部分などを含むことができる。
一部の実施形態では、キットは、（ａ）生体試料での１つ以上のバイオマーカーを検出するための１つ以上の捕捉試薬（例えば、少なくとも１つのアプタマーまたは抗体）、及び、任意に、（ｂ）生体試料を提供した個体が、脂肪肝、肝炎、肝線維症、肝細胞バルーニング、及び／またはＮＡＳＨ（ステージ１、２、３、または４のＮＡＳＨ、またはステージ２、３、または４のＮＡＳＨなど）を有するか否かを予測するための１つ以上のソフトウェアまたはコンピュータープログラム製品とを含む。あるいは、１つ以上のコンピュータープログラム製品よりもむしろ、上記した工程を、ヒトが手動で行うための１つ以上の説明書を提供し得る。
一部の実施形態では、キットは、固体支持体、捕捉試薬、及びシグナルを生成する材料を含む。また、キットは、機器と試薬の使用、試料の取り扱い、及びデータ解析に関する説明書を含むことができる。さらに、キットは、生体試料の分析結果を解析して報告するためのコンピューターシステムまたはソフトウェアと共に使用し得る。
さらに、キットは、生物学的試料を処理するための１つ以上の試薬（例えば、可溶化緩衝剤、洗浄剤、洗浄液、または緩衝剤）を含むことができる。本明細書に記載したいずれのキットも、例えば、緩衝剤、ブロッキング剤、質量分析用マトリックス材料、抗体捕捉剤、陽性コントロール試料、陰性コントロール試料、プロトコール、ガイダンス、及びリファレンスデータなどのソフトウェアならびに情報を含むことができる。
一部の実施形態では、キットを、脂肪肝、肝炎、肝線維症、肝細胞バルーニング、及び／またはＮＡＳＨを分析するために提供する、そして、キットは、本明細書に記載したバイオマーカーに特異的な１つ以上のアプタマーのためのＰＣＲプライマーを含む。一部の実施形態では、キットは、バイオマーカーの使用に関する説明書と、バイマーカーと、脂肪肝、肝炎、肝線維症、肝細胞バルーニング、及び／またはＮＡＳＨの予後との相関に関する説明書をさらに含み得る。一部の実施形態では、キットは、試料ＤＮＡを増幅または単離するために、本明細書に記載した１つ以上のバイオマーカーの補体を含むＤＮＡアレイ、試薬、及び／または酵素を含み得る。キットは、リアルタイムＰＣＲのための試薬、例えば、ＴａｑＭａｎプローブ、及び／またはプライマー、及び酵素を含み得る。
例えば、キットは、（ａ）試験試料での１つ以上のバイオマーカーのレベルを決定するための少なくとも１つの捕捉試薬を含む試薬、及び、任意に、（ｂ）試験試料に関して定量したそれぞれのバイオマーカーの量を、１つ以上の所定のカットオフと比較する工程を行うための１つ以上のアルゴリズムまたはコンピュータープログラムとを含むことができる。一部の実施形態では、アルゴリズムまたはコンピュータープログラムは、当該比較に基づいて定量したそれぞれのバイオマーカーに関するスコアを割り当てる、一部の実施形態では、バイオマーカーごとに割り当てられたスコアを足し合わせて総スコアを得る。さらに、一部の実施形態では、アルゴリズムまたはコンピュータープログラムは、総スコアと所定のスコアとを比較して、この比較を利用して、個体での脂肪肝、肝炎、肝線維症、肝細胞バルーニング、及び／またはＮＡＳＨの有無を決定する。あるいは、１つ以上のアルゴリズムまたはコンピュータープログラムよりはむしろ、上記した工程を、ヒトが手動で行うための１つ以上の説明書を提供することができる。
コンピューターによる方法、及びソフトウェア
バイオマーカーまたはバイオマーカーパネルを選択したら、個体での脂肪肝、肝炎、肝線維症、肝細胞バルーニング、及び／またはＮＡＳＨの有無を決定する方法は：１）当該個体から生体試料を回収する、または得る；２）分析方法を行って、生体試料においてパネルでの１つ以上のバイオマーカーを検出して測定する；及び、３）バイオマーカーレベルの結果を報告する、ことを含み得る。一部の実施形態では、バイオマーカーレベルの結果を、例えば、下された診断（「脂肪肝」、「肝炎」、「肝線維症」、「肝細胞バルーニング」、「ＮＡＳＨ」、「ステージ２、３、または４のＮＡＳＨ」など）として、または「陽性」及び「陰性」と定義される陽性／陰性として簡略して報告する。一部の実施形態では、個体での脂肪肝、肝炎、肝線維症、肝細胞バルーニング、及び／またはＮＡＳＨの有無を決定する方法は：１）生体試料を回収する、または得る；２）分析方法を行って、生体試料のパネルでの１つ以上のバイオマーカーを検出して測定する；３）あらゆるデータの正規化または標準化を行う；４）それぞれのバイオマーカーレベルを決定する；及び、５）これらの結果を報告することを含み得る。一部の実施形態では、バイオマーカーレベルは、何らかの方法で組み合わせる、そして、組み合わせたバイオマーカーレベルに関する単一の値を報告する。この手法において、一部の実施形態では、報告を受ける数値を、疾患の有無を示す予め設定された閾値と比較する数である、すべてのバイオマーカーの計算値を合計して決定した単一の数とし得る。あるいは、診断スコアは、それぞれを、バイオマーカー値を示す一連の棒で示し、そして、応答パターンは、疾患の有無の決定について予め設定したパターンと比較し得る。
本明細書に記載した方法の少なくとも一部の実施態様は、コンピューターを使用して実施することができる。図２に、コンピューターシステム１００の例を示す。図２を参照すると、システム１００は、プロセッサ１０１、入力装置１０２、出力装置１０３、記憶装置１０４、コンピューターで読取り可能な記憶媒体リーダー１０５ａ、通信システム１０６、加速処理装置（例えば、ＤＳＰ、または特殊用途のプロセッサ）１０７、及び記憶装置１０９を含む、バス１０８を介して電気的に接続したハードウェア要素から構成されている。コンピューターで読取り可能な記憶媒体リーダー１０５ａは、コンピューターで読取り可能な記憶媒体１０５ｂにさらに接続しており、この組み合わせは、コンピューターで読取り可能な情報を、一時的な格納、及び／または長期間の格納、遠隔利用、ローカル接続、固定、及び／または取り外しが可能な記憶装置と記憶媒体、メモリなどを総合的に示しており、この組み合わせは、記憶装置１０４、記憶装置１０９、及び／または、そのようなその他のあらゆるアクセス可能なシステム１００リソースを含む。また、システム１００は、オペレーティングシステム１９２、及びその他のコード１９３、例えば、プログラム、データなどを含むソフトウェア要素（作業メモリ１９１内に配置したものとして示す）も含む。
図２を参照すると、システム１００は、広範な適応性と構成可能性とを備えている。したがって、例えば、単一のアーキテクチャーを利用して１つ以上のサーバーを実施することが可能であり、このようなサーバーは、現在のところ、所望のプロトコール、プロトコール変更、拡張などにしたがって再構成することもできる。しかしながら、当業者であれば、ある特定のアプリケーション要求に従って実施形態を利用できることは自明の事項である。例えば、１つ以上のシステム要素が、システム１００の構成要素（例えば、通信システム１０６）の下位要素として実施し得る。また、カスタマイズしたハードウェアを利用することもできる、及び／またはハードウェア、ソフトウェア、またはその両方において特定の要素を実施し得る。さらに、ネットワーク入力／出力装置（図示せず）などのその他の演算装置に接続し得るが、その他の演算装置への有線、無線、モデム、及び／またはその他の接続（複数可）も利用し得る、ことを理解されたい。
ある態様では、システムは、脂肪肝、肝炎、肝線維症、肝細胞バルーニング、及び／またはＮＡＳＨに特徴的なバイオマーカーの特徴を含むデータベースを含むことができる。このバイオマーカーデータ（または、バイオマーカー情報）を、コンピューターに入力して、コンピューターに実装した方法の一部として使用することができる。バイオマーカーデータは、本明細書に記載したようなデータを含むことができる。
ある態様では、システムは、入力データを１つ以上のプロセッサに提供するための１つ以上の装置をさらに含む。
システムは、ランク付けしたデータ要素のデータセットを格納する記憶装置をさらに含む。
別の態様では、入力データを提供するための装置は、例えば、質量分析計または遺伝子チップリーダーなどのデータ要素の特徴を検出するための検出器を含む。
システムは、データベース管理システムをさらに含み得る。ユーザーの要求または質問は、質問を処理するトレーニングセットのデータベースから関連情報を抽出するデータベース管理システムが理解する適切な言語でフォーマットし得る。
システムは、ネットワークサーバーと１つ以上のクライエントとを接続するネットワークに接続可能とし得る。ネットワークは、当該技術分野で公知のように、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）またはワイドエリアネットワーク（ＷＡＮ）とし得る。好ましくは、サーバーは、コンピュータープログラム製品（例えば、ソフトウェア）を作動させてユーザーの要求を処理するためのデータベースのデータにアクセスする上で必要なハードウェアを含む。
システムは、データベース管理システムからの命令を実行するオペレーティングシステム（例えば、ＵＮＩＸ（登録商標）またはＬｉｎｕｘ）を含み得る。ある態様では、オペレーティングシステムは、インターネットなどのグローバル通信ネットワークで作動する、そして、そのようなネットワークに接続するために、グローバル通信ネットワークサーバーを利用することができる。
システムは、当該技術分野で公知のグラフィカルユーザーインターフェースで日常的に認められるボタン、プルダウンメニュー、スクロールバー、テキスト入力用フィールドなどのインターフェース要素を含むグラフィカルディスプレイインターフェースを含む１つ以上の装置を含み得る。ユーザーインターフェイスで入力される要求事項は、システム内のアプリケーションプログラムに送信して、１つ以上のシステムデータベースにおいて関連情報を検索するようにフォーマットすることができる。ユーザーが入力した要求または質問は、あらゆる適切なデータベース言語で構築することができる。
グラフィカルユーザーインターフェースは、オペレーティングシステムの一部としてグラフィカルユーザーインターフェースコードで作製し得る、そして、データを入力したり、及び／または入力したデータを表示したりするために利用することができる。処理したデータの結果は、インターフェースで表示する、システムと接続した印刷機で印刷する、記憶装置デバイスに保存する、及び／またはネットワークに送信し得る、あるいはコンピューターで読取り可能な媒体の形態で提供することができる。
システムは、システムにデータ要素に関するデータ（例えば、発現値）を提供する入力装置と接続することができる。ある態様では、この入力装置は、例えば、質量分析装置、遺伝子チップ、またはアレイリーダーなどの遺伝子発現プロファイリングシステムを含むことができる。
様々な実施態様に従ってバイオマーカー情報を解析する方法及び装置は、あらゆる適切な方式で、例えば、コンピューターシステムで作動するコンピュータープログラムを使用して実施することができる。リモートアクセス可能なアプリケーションサーバー、ネットワークサーバー、パーソナルコンピューター、またはワークステーションなどのプロセッサ、及びランダムアクセス記憶装置を含む従来のコンピューターシステムを利用し得る。さらなるコンピューターシステム要素は、例えば、大規模記憶システム、及びユーザーインターフェイス、例えば、従来型のモニター、キーボード、及びトラッキング装置などの記憶装置デバイスまたは情報保存システムを含み得る。コンピューターシステムは、スタンドアロンシステムとし得る、またはサーバーと１つ以上のデータベースとを含むコンピューターのネットワークの一部とし得る。
バイオマーカー解析システムは、データ収集、処理、解析、報告、及び／または診断などのデータ解析を完了するための機能及び操作を提供することができる。例えば、ある実施態様では、コンピューターシステムは、バイオマーカーに関する情報を受け取る、保存する、検索する、解析する、及び報告することができるコンピュータープログラムを実行することができる。コンピュータープログラムは、様々な機能または操作を実行する複数のモジュールを含み得る、例えば、生データを処理して補充データを生成するための処理モジュール、及び生データと補足データを解析して、疾患の病態及び／または診断を提供する解析モジュールなどがある。脂肪肝、肝炎、肝線維症、肝細胞バルーニング、及び／またはＮＡＳＨを特定することは、疾患に関連する個体の病態に関するさらなる生物医学情報を含むあらゆるその他の情報を生成または回収すること、さらなる検査が望ましいか否かを決定すること、または、その他の方法で個体の健康状態を評価することを含み得る。
本明細書に記載した一部の実施形態は、コンピュータープログラム製品の形態で実施することができる。コンピュータープログラム製品は、アプリケーションプログラムを生成する媒体内にあり、コンピューターで読取り可能なプログラムコードを有しているコンピューターで読取り可能な媒体を含み、データベースを備えたコンピューターを作動させ得る。
本明細書で使用する「コンピュータープログラム製品」とは、あらゆるタイプの物理的媒体（例えば、文書、電子、磁気、光学、またはその他の様式）を含んでおり、また、コンピューターまたはその他の自動データ処理システムで使用することができる自然言語またはプログラミング言語ステートメントの形態で組織化した一連の指示のことを指している。このようなプログラミング言語ステートメントを、コンピューターまたはデータ処理システムで実行すると、コンピューターまたはデータ処理システムが、ステートメントの特定の内容に従って作動する。コンピュータープログラム製品として：ソース及びオブジェクトコードでのプログラム、及び／またはコンピューターで読取り可能な媒体に埋め込まれたテストライブラリーまたはデータライブラリーがあるが、これらに限定されない。さらに、コンピューターシステムまたはデータ処理装置を予め選択した方式で作動可能にしているコンピュータープログラム製品を、数多くの形態で提供することができる、例えば、オリジナルソースコード、アセンブリコード、オブジェクトコード、機械言語、上記コードの暗号化または圧縮したバージョン、そして、ありとあらゆる等価物があるが、これらに限定されない。
ある態様では、個体での脂肪肝、肝炎、肝線維症、肝細胞バルーニング、及び／またはＮＡＳＨ（ステージ１、２、３、または４のＮＡＳＨ、またはステージ２、３、または４のＮＡＳＨなど）の有無を示すコンピュータープログラム製品を提供する。このコンピュータープログラム製品は、演算装置またはシステムのプロセッサが実行可能なプログラムコードを具体化するコンピューターで読取り可能な媒体を含んでおり、このプログラムコードは：個体由来の生体試料に起因するデータを検索するコードを含んでおり、このデータは、本明細書に記載した１つ以上のバイオマーカーに対応するバイオマーカーレベルと、これらのバイオマーカーレベルに応じて個体での脂肪肝、肝炎、肝線維症、肝細胞バルーニング、及び／またはＮＡＳＨ状態を示す分類方法を実行するコードを含む。
様々な実施態様を、方法または機器に関して説明をしてきたが、これらの実施形態は、コンピューターと接続したコード、例えば、コンピューターに内蔵した、またはコンピューターに接続可能なコードを介して実施することができる、ことを理解されたい。例えば、ソフトウェア及びデータベースを利用して、上記した本方法の数多くのことが実施可能である。したがって、ハードウェアが達成する実施態様に加えて、これらの実施態様は、コンピューターで読取り可能なプログラムコードを具体化させるコンピューターが使用可能な媒体で構成されている製造品を使用して、本明細書の説明で開示した機能が達成できる、ことも留意されたい。それ故に、それらのプログラムコード手段においても、これらの実施態様が、本特許によって同様に保護されたものとみなすことが望ましい。さらに、これらの実施形態は、実質的にあらゆる種類のコンピューターで読取り可能な記憶装置に保存したコードとして具体化することができ、当該記憶装置として、ＲＡＭ、ＲＯＭ、磁気媒体、光学媒体、または磁気光学媒体があるが、これらに限定されない。なおもさらに一般的には、このような実施形態は、ソフトウェア、またはハードウェア、あるいはそれらのあらゆる組み合わせにおいて実施することができ、例えば、汎用プロセッサで作動するソフトウェア、マイクロコード、プログラマブルロジックアレイ（ＰＬＡ）、または特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）などで実施可能であるが、これらに限定されない。
搬送波で具体化するコンピューターシグナル、及び伝送媒体を介して伝播するシグナル（例えば、電気、及び光学）で、実施形態が達成し得ることも想定される。したがって、上記した様々な種類の情報を、データ構造などの構造でフォーマットして、伝送媒体を介して電気シグナルとして伝送する、またはコンピューターで読取り可能な媒体に保存することができる。
治療の方法
一部の実施形態では、対象での脂肪肝、肝炎、肝線維症、肝細胞バルーニング、及び／またはＮＡＳＨの有無の決定に続いて、当該対象は、疾患の悪化を遅延または予防するための治療レジメンを受ける。脂肪肝、肝炎、肝線維症、肝細胞バルーニング、及び／またはＮＡＳＨの例示的治療レジメンとして、減量、血糖コントロール、アルコール回避、当該対象に糖尿病及び／または心血管疾患に関する試験を行う、当該対象に胃バイパス手術を実施する、及び当該対象への薬物の投与などがある、しかしながら、これらに限定されない。一部のそのような実施形態では、当該薬物は、ピオグリタゾン、ビタミンＥ、及び／またはメトホルミンである。例えば、Ｓａｎｙａｌ ｅｔ ａｌ．，２０１０、ＮＥＪＭ、３６２：１６７５－１６８５を参照されたい。
一部の実施形態では、ＮＡＦＬＤをモニタリングする方法を提供する。一部の実施形態では、対象でのＮＡＦＬＤの有無を決定する本発明の方法は、時間０で行う。一部の実施形態では、この方法は、対象のＮＡＦＬＤの進行をモニタリングするために、時間１、そして、任意に時間２、及び、任意に時間３などで改めて行う。一部の実施形態では、個体の疾患の現在の状態に応じて、及び／または疾患が疑われる、または、進行すると考えられる際に予測される速度に応じて、異なる時点で、異なるバイオマーカーを使用する。
その他の方法
一部の実施形態では、本明細書に記載したバイオマーカー及び方法は、医療保険料及び／または生命保険料を決定するために使用する。一部の実施形態では、本明細書に記載した方法の結果は、医療保険料及び／または生命保険料を決定するために使用する。一部のそのような事例では、医療保険または生命保険を提供する組織は、医療保険または生命保険の申請に応じる、そうでなければ、対象のＮＡＳＨ状態に関する情報を得る、そして、その情報を使用して、当該対象に関する適切な医療保険料または生命保険料を決定する。一部の実施形態では、この審査は、医療保険または生命保険を提供する組織が要求し、そして、その審査経費は当該組織が負担する。
一部の実施形態では、本明細書に記載したバイオマーカー及び方法は、医療資源の利用を予測、及び／または管理するために使用する。一部のそのような実施形態では、本方法は、そのような予測目的のために行われることはないが、本方法から得た情報を、そのような医療資源の利用の予測及び／または管理のために使用する。例えば、検査施設または病院は、特定の施設、または特定の地理的領域での医療資源の利用を予測及び／または管理するために、数多くの対象に関する情報を、本方法で回収し得る。
本発明は、下記の実施形態であり得る。
項１．
対象での脂肪肝の有無を決定する方法であって、Ｎ個のバイオマーカータンパク質を有するバイオマーカーパネルを形成する、及び、前記対象から得た試料でのＮ個の前記バイオマーカータンパク質のそれぞれのレベルを検出することを含む、また、Ｎは、少なくとも１であり、かつ、Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質の少なくとも１つを、ＰＴＧＲ１、ＩＮＨＢＣ、及びＢＰＩＢ１から選択する、前記方法。
項２．
前記対象が、脂肪肝と共にＮＡＳＨを有するか否かを決定することを含む、項１に記載の方法。
項３．
Ｎが１～１２である、またはＮが２～１２である、またはＮが３～１２である、またはＮが４～１２である、またはＮが５～１２である、またはＮが１～５である、またはＮが２～５である、またはＮが３～５である、またはＮが４～５である、項１または２に記載の方法。
項４．
Ｎが１である、またはＮが２である、またはＮが３である、またはＮが４である、またはＮが５である、またはＮが６である、またはＮが７である、またはＮが８である、またはＮが９である、またはＮが１０である、またはＮが１１である、またはＮが１２である、先行項のいずれか１項に記載の方法。
項５．
Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質の少なくとも１つを、ＰＴＧＲ１及びＩＮＨＢＣから選択する、先行項のいずれか１項に記載の方法。
項６．
Ｎは少なくとも２である、かつ、Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質の少なくとも１つを、ＦＢＰ１２、ＲＥＣＱ１、ＢＧＬＲ、ＣＮＤＰ１、ＳＯＭ２、及びＧＲＩＤ２から選択する、先行項のいずれか１項に記載の方法。
項７．
Ｎは少なくとも２である、かつ、Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質の少なくとも１つを、ＩＮＳＬ５、ＨＥＸＢ、及びＥＲＮ１から選択する、先行項のいずれか１項に記載の方法。
項８．
Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質のそれぞれを、ＰＴＧＲ１、ＩＮＨＢＣ、ＢＰＩＢ１、ＦＢＰ１２、ＲＥＣＱ１、ＢＧＬＲ、ＣＮＤＰ１、ＳＯＭ２、ＧＲＩＤ２、ＩＮＳＬ５、ＨＥＸＢ、及びＥＲＮ１から選択する、先行項のいずれか１項に記載の方法。
項９．
Ｎは少なくとも２である、かつ、Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質の少なくとも２つを、ＰＴＧＲ１、ＣＮＤＰ１、及びＥＲＮ１から選択する、先行項のいずれか１項に記載の方法。
項１０．
Ｎは少なくとも２である、かつ、Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質の少なくとも２つを、ＰＴＧＲ１、ＩＮＳＬ５、及びＨＥＸＢから選択する、先行項のいずれか１項に記載の方法。
項１１．
Ｎは少なくとも２である、かつ、Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質の少なくとも２つを、ＩＮＨＢＣ、ＨＥＸＢ、及びＣＮＤＰ１から選択する、項１～８のいずれか１項に記載の方法。
項１２．
Ｎは少なくとも２である、かつ、Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質の少なくとも２つを、ＢＰＩＢ１、ＣＮＤＰ１、ＩＮＳＬ５、ＨＥＸＢ、及びＥＲＮ１から選択する、項１～８のいずれか１項に記載の方法。
項１３．
前記対象が、脂肪肝を有する、先行項のいずれか１項に記載の方法。
項１４．
前記脂肪肝が、軽度、中等度、または重度の脂肪肝である、項１３に記載の方法。
項１５．
前記対象が、ＮＡＳＨを有する、項２～１４のいずれか１項に記載の方法。
項１６．
前記ＮＡＳＨが、ステージ１、２、３、または４のＮＡＳＨである、項１５に記載の方法。
項１７．
対象での肝炎の有無を決定する方法であって、Ｎ個のバイオマーカータンパク質を有するバイオマーカーパネルを形成する、及び、前記対象から得た試料でのＮ個の前記バイオマーカータンパク質のそれぞれのレベルを検出することを含む、また、Ｎは、少なくとも１であり、かつ、Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質の少なくとも１つを、ＭＡＡＩ、ＳＡＡ２、ＲＰＮ１、及びＰＣＯＣ２から選択する、前記方法。
項１８．
対象での肝炎の有無を決定する方法であって、Ｎ個のバイオマーカータンパク質を有するバイオマーカーパネルを形成する、及び、前記対象から得た試料でのＮ個の前記バイオマーカータンパク質のそれぞれのレベルを検出することを含む、また、Ｎは、少なくとも２であり、かつ、Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質の少なくとも１つを、ＭＡＡＩ、ＳＡＡ２、ＲＰＮ１、ＰＣＯＣ２、ＣＡ１９８、ＣＴＣＦ、及びＴＡＣＤ２から選択する、前記方法。
項１９．
前記対象が、肝炎と共にＮＡＳＨを有するか否かを決定することを含む、項１７または１８に記載の方法。
項２０．
Ｎが１～１４である、またはＮが２～１４である、またはＮが３～１４である、またはＮが４～１４である、またはＮが５～１４である、またはＮが６～１４である、またはＮが７～１４である、またはＮが８～１４である、またはＮが１～８である、またはＮが２～８である、またはＮが３～８である、またはＮが４～８である、またはＮが５～８である、項１７～１９のいずれか１項に記載の方法。
項２１．
Ｎが１である、またはＮが２である、またはＮが３である、またはＮが４である、またはＮが５である、またはＮが６である、またはＮが７である、またはＮが８である、またはＮが９である、またはＮが１０である、またはＮが１１である、またはＮが１２である、またはＮが１３である、またはＮが１４である、項１７～２０のいずれか１項に記載の方法。
項２２．
Ｎは少なくとも２である、かつ、N個の前記バイオマーカータンパク質の少なくとも１つを、ＣＡ１９８、ＣＴＣＦ、及びＴＡＣＤ２から選択する、項１７～２１のいずれか１項に記載の方法。
項２３．
Ｎは少なくとも２である、かつ、Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質の少なくとも１つを、ＰＰＡＣ、ＡＤＩＰＯ、ＰＹＹ、ＦＣＧ３Ｂ、ＴＲＸＲ１、ＡＣＹ１、及びＣＣＬ２３から選択する、項１７～２２のいずれか１項に記載の方法。
項２４．
Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質のそれぞれを、ＭＡＡＩ、ＳＡＡ２、ＲＰＮ１、ＰＣＯＣ２、ＣＡ１９８、ＣＴＣＦ、ＴＡＣＤ２、ＰＰＡＣ、ＡＤＩＰＯ、ＰＹＹ、ＦＣＧ３Ｂ、ＴＲＸＲ１、ＡＣＹ１、及びＣＣＬ２３から選択する、項１７～２３のいずれか１項に記載の方法。
項２５．
Ｎは少なくとも２である、かつ、Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質の少なくとも２つを、ＰＣＯＣ２、ＰＹＹ、及びＴＲＸＲ１から選択する、項１７～２４のいずれか１項に記載の方法。
項２６．
Ｎは少なくとも２である、かつ、Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質の少なくとも２つを、ＴＡＣＤ２、ＴＲＸＲ１、及びＡＣＹ１から選択する、項１８～２４のいずれか１項に記載の方法。
項２７．
Ｎは少なくとも２である、かつ、Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質の少なくとも２つは、ＣＡ１９８及びＴＲＸＲ１である、項１８～２４のいずれか１項に記載の方法。
項２８．
Ｎは少なくとも２である、かつ、Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質の少なくとも２つを、ＣＡ１９８、ＦＣＧ３Ｂ、及びＡＣＹ１から選択する、項１８～２４のいずれか１項に記載の方法。
項２９．
Ｎは少なくとも２である、かつ、Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質の少なくとも２つを、ＲＰＮ１、ＰＹＹ、及びＡＣＹ１から選択する、項１７～２４のいずれか１項に記載の方法。
項３０．
Ｎは少なくとも２である、かつ、Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質の少なくとも２つを、ＴＡＣＤ２、ＰＰＡＣ、及びＴＲＸＲ１から選択する、項１８～２４のいずれか１項に記載の方法。
項３１．
Ｎは少なくとも２である、かつ、Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質の少なくとも２つを、ＣＴＣＦ、ＡＤＩＰＯ、及びＴＲＸＲ１から選択する、項１８～２４のいずれか１項に記載の方法。
項３２．
Ｎは少なくとも２である、かつ、Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質の少なくとも２つを、ＳＡＡ２、ＰＰＡＣ、及びＡＣＹ１から選択する、項１７～２４のいずれか１項に記載の方法。
項３３．
前記対象が、肝炎を有する、項１７～３２のいずれか１項に記載の方法。
項３４．
前記肝炎が、軽度、中等度、または重度の肝炎である、項３３に記載の方法。
項３５．
前記対象が、ＮＡＳＨを有する、項１９～３４のいずれか１項に記載の方法。
項３６．
前記ＮＡＳＨが、ステージ１、２、３、または４のＮＡＳＨである、項３５に記載の方法。
項３７．
対象での肝細胞バルーニングの有無を決定する方法であって、Ｎ個のバイオマーカータンパク質を有するバイオマーカーパネルを形成する、及び、前記対象から得た試料でのＮ個の前記バイオマーカータンパク質のそれぞれのレベルを検出することを含む、また、Ｎは、少なくとも１であり、かつ、Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質の少なくとも１つを、ＰＴＧＲ１、ＡＴＬ２、及びＣＮＮ２から選択する、前記方法。
項３８．
前記対象が、肝細胞バルーニングと共にＮＡＳＨを有するか否かを決定することを含む、項３７に記載の方法。
項３９．
Ｎが１～５である、またはＮが２～５である、またはＮが３～５である、またはＮが４～５である、またはＮが１～２である、またはＮが１～３である、またはＮは１～４である、項３７または３８に記載の方法。
項４０．
Ｎが１である、またはＮが２である、またはＮが３である、またはＮが４である、またはＮが５である、項３７～３９のいずれか１項に記載の方法。
項４１．
Ｎは少なくとも２である、かつ、Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質の少なくとも１つを、ＡＫ１ＢＡ、及びＣＴＬＡ４から選択する、項３７～４０のいずれか１項に記載の方法。
項４２．
Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質のそれぞれを、ＰＴＧＲ１、ＡＴＬ２、ＣＮＮ２、ＡＫ１ＢＡ、及びＣＴＬＡ４から選択する、項３７～４１のいずれか１項に記載の方法。
項４３．
Ｎは少なくとも３である、かつＮ個の前記バイオマーカータンパク質の少なくとも３つが、ＡＫ１ＢＡ、ＰＴＧＲ１、及びＡＴＬ２である、項１７～４２のいずれか１項に記載の方法。
項４４．
前記対象が、肝細胞バルーニングを有する、項３７～４３のいずれか１項に記載の方法。
項４５．
前記肝細胞バルーニングが、軽度、中等度、または重度の肝細胞バルーニングである、項４４に記載の方法。
項４６．
前記対象が、ＮＡＳＨを有する、項３８～４５のいずれか１項に記載の方法。
項４７．
前記ＮＡＳＨが、ステージ１、２、３、または４のＮＡＳＨである、項４６に記載の方法。
項４８．
対象での肝線維症の有無を決定する方法であって、Ｎ個のバイオマーカータンパク質を有するバイオマーカーパネルを形成する、及び、前記対象から得た試料でのＮ個の前記バイオマーカータンパク質のそれぞれのレベルを検出することを含む、また、Ｎは、少なくとも１であり、かつ、Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質の少なくとも１つを、ＡＴＬ２、ＮＦＡＳＣ、及びＦＣＲＬ３から選択する、前記方法。
項４９．
前記対象が、肝線維症と共にＮＡＳＨを有するか否かを決定することを含む、項４８に記載の方法。
項５０．
Ｎが１～８である、またはＮが２～８である、またはＮが３～８である、またはＮが４～８である、またはＮが５～８である、またはＮが６～８である、またはＮが７～８である、またはＮが１～２である、またはＮが１～３である、またはＮが１～４である、またはＮが１～５である、またはＮが１～６である、またはＮが１～７である、項４８または４９に記載の方法。
項５１．
Ｎが１である、またはＮが２である、またはＮが３である、またはＮが４である、またはＮが５である、またはＮが６である、またはＮが７である、またはＮが８である、項４８～５０のいずれか１項に記載の方法。
項５２．
Ｎは少なくとも２である、かつ、Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質の少なくとも１つを、ＣＯ７、ＣＯＬ１１、ＶＧＦＲ２、ＷＮＴ５Ａ、及びＰＬＯＤ３から選択する、項４８～５１に記載の方法。
項５３．
Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質のそれぞれを、ＡＴＬ２、ＮＦＡＳＣ、ＦＣＲＬ３、ＣＯ７、ＣＯＬ１１、ＶＧＦＲ２、ＷＮＴ５Ａ、及びＰＬＯＤ３から選択する、項４８～４１のいずれか１項に記載の方法。
項５４．
Ｎは少なくとも２である、かつ、Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質の少なくとも２つが、ＡＴＬ２及びＶＧＦＲ２である、項４８～５３のいずれか１項に記載の方法。
項５５．
Ｎは少なくとも２である、かつ、Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質の少なくとも２つを、ＡＴＬ２、ＣＯＬ１１、及びＷＮＴ５Ａから選択する、項４８～５３のいずれか１項に記載の方法。
項５６．
Ｎは少なくとも２である、かつ、Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質の少なくとも２つを、ＡＴＬ２、ＣＯ７、及びＷＮＴ５Ａから選択する、項４８～５３のいずれか１項に記載の方法。
項５７．
前記対象が、肝線維症を有する、項４８～５６のいずれか１項に記載の方法。
項５８．
前記肝線維症が、軽度、中等度、または重度の肝線維症である、項５７に記載の方法。
項５９．
前記対象が、ＮＡＳＨを有する、項４９～５８のいずれか１項に記載の方法。
項６０．
前記ＮＡＳＨが、ステージ１、２、３、または４のＮＡＳＨである、項５９に記載の方法。
項６１．
前記試料が、血液試料、血漿試料、または血清試料である、先行項のいずれか１項に記載の方法。
項６２．
前記対象が、肝疾患のリスクに曝されている、先行項のいずれか１項に記載の方法。
項６３．
前記対象が、脂肪肝、肝炎、肝細胞バルーニング、及び／または肝線維症を発症する、または有するリスクがある、先行項のいずれか１項に記載の方法。
項６４．
前記対象が、肥満である、先行項のいずれか１項に記載の方法。
項６５．
１つ以上の前記試料のＮ個のバイオマーカータンパク質を、一組のＮ個のバイオマーカー捕捉試薬と接触させることを含み、また、一組の前記バイオマーカー捕捉試薬のそれぞれのバイオマーカー捕捉試薬が、検出した異なるバイオマーカータンパク質に対して特異的に結合する、先行項のいずれか１項に記載の方法。
項６６．
それぞれのバイオマーカー捕捉試薬が、抗体またはアプタマーである、項６５に記載の方法。
項６７．
それぞれのバイオマーカー捕捉試薬が、アプタマーである、項６６に記載の方法。
項６８．
少なくとも１つのアプタマーが、低速オフレートを示すアプタマーである、項６７に記載の方法。
項６９．
低速オフレートを示す少なくとも１つのアプタマーでは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または、少なくとも１０個のヌクレオチドが修飾を受けている、項６８に記載の方法。
項７０．
低速オフレートを示すそれぞれのアプタマーが、≧３０分、≧６０分、≧９０分、≧１２０分、≧１５０分、≧１８０分、≧２１０分、または≧２４０分のオフレート（ｔ １／２ ）で、その標的タンパク質に結合する、項６８または項６９に記載の方法。
項７１．
前記対象が、脂肪肝、肝炎、肝細胞バルーニング、肝線維症、及び／またはＮＡＳＨである、または、その可能性が高い、先行項のいずれか１項に記載の方法。
項７２．
前記決定が、分類モデルまたはエラスティックネットロジスティック回帰モデルを使用して、Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質レベルのレベルを解析することを含む、先行項のいずれか１項に記載の方法。
項７３．
医療保険料、または、生命保険料を決定する目的で、前記対象が、脂肪肝、肝炎、肝細胞バルーニング、肝線維症、及び／またはＮＡＳＨを有する、または、有する可能性が高いか否かを決定することを含む、先行項のいずれか１項に記載の方法。
項７４．
前記方法が、医療保険料または生命保険料を決定することをさらに含む、先行項のいずれか１項に記載の方法。
項７５．
前記方法が、前記方法から得た情報を使用して、医療資源の利用を予測及び／または管理することをさらに含む、先行項のいずれか１項に記載の方法。
項７６．
Ｎ個のバイオマーカータンパク質捕捉試薬を含むキットであって、Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質捕捉試薬が、項１、３～１２、１７、１９、２０～３２、３７、３９～４３、４８、及び５０～５６のいずれか１項に記載のＮ個の前記バイオマーカータンパク質に対して結合する、前記キット。
項７７．
Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質捕捉試薬のそれぞれが、異なるバイオマーカータンパク質に対して特異的に結合する、項７６に記載のキット。
項７８．
Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質捕捉試薬のそれぞれが、抗体またはアプタマーである、項７６または７７に記載のキット。
項７９．
それぞれのバイオマーカー捕捉試薬が、アプタマーである、項７８に記載のキット。
項８０．
少なくとも１つのアプタマーが、低速オフレートを示すアプタマーである、項７９に記載のキット。
項８１．
低速オフレートを示す少なくとも１つのアプタマーでは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０個のヌクレオチドが修飾を受けている、項８０に記載のキット。
項８２．
低速オフレートを示すそれぞれのアプタマーが、≧３０分、≧６０分、≧９０分、≧１２０分、≧１５０分、≧１８０分、≧２１０分、または≧２４０分のオフレート（ｔ １／２ ）で、その標的タンパク質に結合する、項８０または項８１に記載のキット。
項８３．
対象から得た試料でのＮ個の前記バイオマーカータンパク質の検出において使用する項７６～８２のいずれか１項に記載のキット。
項８４．
前記対象が、脂肪肝、肝炎、肝細胞バルーニング、肝線維症、及び／またはＮＡＳＨである、または、その可能性が高いか否かを決定するために使用する項８３に記載のキット。
項８５．
前記対象に対して、ＮＡＳＨの治療を実施するべきか否かを決定することを含み、前記治療は：前記対象に対して糖尿病及び／または心血管疾患に関する試験を実施する、前記対象に対して薬物を投与する、前記薬物は、脂肪肝及び／またはＮＡＳＨの治療のためのものである、及び／または、前記対象に対して胃バイパス手術を実施することを含む、項１～１６のいずれか１項に記載の方法。
項８６．
前記方法が、ＮＡＳＨの治療に対して前記対象が応答するか否かを決定することを含み：
ａ）前記対象から得た第１の試料でのＮ個の前記バイオマーカータンパク質のそれぞれのレベルを検出する、また、前記第１の試料は、前記対象がＮＡＳＨの治療を受ける前に前記対象から得る、それにより、前記対象の治療前の状態を決定する；
ｂ）前記対象に対してＮＡＳＨの治療を実施する、また、前記治療は：前記対象に対して糖尿病及び／または心血管疾患に関する試験を実施する、前記対象に対して薬物を投与する、前記薬物は、脂肪肝及び／またはＮＡＳＨの治療のためのものである、及び／または、前記対象に対して胃バイパス手術を実施することを含む；
ｃ）前記対象から得た第２の試料でのパート（ａ）で検出したものと同じＮ個の前記バイオマーカータンパク質のそれぞれのレベルを検出する、また、前記第２の試料は、前記対象が前記ＮＡＳＨの治療を受けた後に前記対象から得る、それにより、前記対象の治療状態を決定する；及び
ｄ）前記治療前の状態と前記治療状態とを比較することを含み、また、前記比較が、同じ対象での前記治療前の状態と比較して、脂肪肝の重症度が低下したことを示していれば、前記対象は、前記ＮＡＳＨ治療に応答している、項１～１６のいずれか１項に記載の方法。
項８７．
対象での肝生検の必要性の有無を決定することを含み、脂肪肝の存在は、前記対象が肝生検を必要としていることを示す、項１～１６のいずれか１項に記載の方法。
項８８．
前記対象での脂肪肝疾患の有無を決定することを含む、項１～１６のいずれか１項に記載の方法。
項８９．
前記対象に対して、ＮＡＳＨの治療を実施するべきか否かを決定することを含み、前記治療は：前記対象に対して糖尿病及び／または心血管疾患に関する試験を実施する、前記対象に対して薬物を投与する、前記薬物は、肝炎及び／またはＮＡＳＨの治療のためのものである、及び／または、前記対象に対して胃バイパス手術を実施することを含む、項１７～３６のいずれか１項に記載の方法。
項９０．
前記方法が、ＮＡＳＨの治療に対して前記対象が応答するか否かを決定することを含み：
ａ）前記対象から得た第１の試料でのＮ個の前記バイオマーカータンパク質のそれぞれのレベルを検出する、また、前記第１の試料は、前記対象がＮＡＳＨの治療を受ける前に前記対象から得る、それにより、前記対象の治療前の状態を決定する；
ｂ）前記対象に対してＮＡＳＨの治療を実施する、また、前記治療は：前記対象に対して糖尿病及び／または心血管疾患に関する試験を実施する、前記対象に対して薬物を投与する、前記薬物は、肝炎及び／またはＮＡＳＨの治療のためのものである、及び／または、前記対象に対して胃バイパス手術を実施することを含む；
ｃ）前記対象から得た第２の試料でのパート（ａ）で検出したものと同じＮ個の前記バイオマーカータンパク質のそれぞれのレベルを検出する、また、前記第２の試料は、前記対象が前記ＮＡＳＨの治療を受けた後に前記対象から得る、それにより、前記対象の治療状態を決定する；及び
ｄ）前記治療前の状態と前記治療状態とを比較することを含み、また、前記比較が、同じ対象での前記治療前の状態と比較して、肝炎の重症度が低下したことを示していれば、前記対象は、前記ＮＡＳＨ治療に応答している、項１７～３６のいずれか１項に記載の方法。
項９１．
対象での肝生検の必要性の有無を決定することを含み、肝炎の存在は、前記対象が肝生検を必要としていることを示す、項１７～３６のいずれか１項に記載の方法。
項９２．
前記対象での脂肪肝疾患の有無を決定することを含む、項１７～３６のいずれか１項に記載の方法。
項９３．
前記対象に対して、ＮＡＳＨの治療を実施するべきか否かを決定することを含み、前記治療は：前記対象に対して糖尿病及び／または心血管疾患に関する試験を実施する、前記対象に対して薬物を投与する、前記薬物は、肝細胞バルーニング及び／またはＮＡＳＨの治療のためのものである、及び／または、前記対象に対して胃バイパス手術を実施することを含む、項３７～４７のいずれか１項に記載の方法。
項９４．
前記方法が、ＮＡＳＨの治療に対して前記対象が応答するか否かを決定することを含み：
ａ）前記対象から得た第１の試料でのＮ個の前記バイオマーカータンパク質のそれぞれのレベルを検出する、また、前記第１の試料は、前記対象がＮＡＳＨの治療を受ける前に前記対象から得る、それにより、前記対象の治療前の状態を決定する；
ｂ）前記対象に対してＮＡＳＨの治療を実施する、また、前記治療は：前記対象に対して糖尿病及び／または心血管疾患に関する試験を実施する、前記対象に対して薬物を投与する、前記薬物は、肝細胞バルーニング及び／またはＮＡＳＨの治療のためのものである、及び／または、前記対象に対して胃バイパス手術を実施することを含む；
ｃ）前記対象から得た第２の試料でのパート（ａ）で検出したものと同じＮ個の前記バイオマーカータンパク質のそれぞれのレベルを検出する、また、前記第２の試料は、前記対象が前記ＮＡＳＨの治療を受けた後に前記対象から得る、それにより、前記対象の治療状態を決定する；及び
ｄ）前記治療前の状態と前記治療状態とを比較することを含み、また、前記比較が、同じ対象での前記治療前の状態と比較して、肝細胞バルーニングの重症度が低下したことを示していれば、前記対象は、前記ＮＡＳＨ治療に応答している、項３７～４７のいずれか１項に記載の方法。
項９５．
対象での肝生検の必要性の有無を決定することを含み、肝細胞バルーニングの存在は、前記対象が肝生検を必要としていることを示す、項３７～４７のいずれか１項に記載の方法。
項９６．
前記対象での脂肪肝疾患の有無を決定することを含む、項３７～４７のいずれか１項に記載の方法。
項９７．
前記対象に対して、ＮＡＳＨの治療を実施するべきか否かを決定することを含み、前記治療は：前記対象に対して糖尿病及び／または心血管疾患に関する試験を実施する、前記対象に対して薬物を投与する、前記薬物は、肝線維症及び／またはＮＡＳＨの治療のためのものである、及び／または、前記対象に対して胃バイパス手術を実施することを含む、項４８～６０のいずれか１項に記載の方法。
項９８．
前記方法が、ＮＡＳＨの治療に対して前記対象が応答するか否かを決定することを含み：
ａ）前記対象から得た第１の試料でのＮ個の前記バイオマーカータンパク質のそれぞれのレベルを検出する、また、前記第１の試料は、前記対象がＮＡＳＨの治療を受ける前に前記対象から得る、それにより、前記対象の治療前の状態を決定する；
ｂ）前記対象に対してＮＡＳＨの治療を実施する、また、前記治療は：前記対象に対して糖尿病及び／または心血管疾患に関する試験を実施する、前記対象に対して薬物を投与する、前記薬物は、肝線維症及び／またはＮＡＳＨの治療のためのものである、及び／または、前記対象に対して胃バイパス手術を実施することを含む；
ｃ）前記対象から得た第２の試料でのパート（ａ）で検出したものと同じＮ個の前記バイオマーカータンパク質のそれぞれのレベルを検出する、また、前記第２の試料は、前記対象が前記ＮＡＳＨの治療を受けた後に前記対象から得る、それにより、前記対象の治療状態を決定する；及び
ｄ）前記治療前の状態と前記治療状態とを比較することを含み、また、前記比較が、同じ対象での前記治療前の状態と比較して、肝線維症の重症度が低下したことを示していれば、前記対象は、前記ＮＡＳＨ治療に応答している、項４８～６０のいずれか１項に記載の方法。
項９９．
対象での肝生検の必要性の有無を決定することを含み、肝線維症の存在は、前記対象が肝生検を必要としていることを示す、項４８～６０のいずれか１項に記載の方法。
項１００．
前記対象での脂肪肝疾患の有無を決定することを含む、項４８～６０のいずれか１項に記載の方法。
項１０１．
前記対象に対してＮＡＳＨの治療を実施するべきか否かを決定することをさらに含む、項１～７２のいずれか１項に記載の方法。
項１０２．
前記治療は：前記対象に対して糖尿病及び／または心血管疾患に関する試験を実施する；前記対象に対して薬物を投与する、また、前記薬物は、脂肪肝、肝炎、肝細胞バルーニング、及び肝線維症から選択する少なくとも１つの病態を治療する、及び／または、前記薬物は、ＮＡＳＨを治療する；及び／または、前記対象に対して胃バイパス手術を実施することを含む、項１０１に記載の方法。
項１０３．
前記方法が、ＮＡＳＨの治療に対して前記対象が応答するか否かを決定することを含み：
ａ）前記対象から得た第１の試料でのＮ個の前記バイオマーカータンパク質のそれぞれのレベルを検出する、また、前記第１の試料は、前記対象がＮＡＳＨの治療を受ける前に前記対象から得る、それにより、前記対象の治療前の状態を決定する；
ｂ）前記対象に対してＮＡＳＨの治療を実施する、また、前記治療は：前記対象に対して糖尿病及び／または心血管疾患に関する試験を実施する；前記対象に対して薬物を投与する、前記薬物は、脂肪肝、肝炎、肝細胞バルーニング、及び肝線維症から選択する少なくとも１つの病態を治療する、及び／または、前記薬物は、ＮＡＳＨを治療する、及び／または、前記対象に対して胃バイパス手術を実施することを含む；
ｃ）前記対象から得た第２の試料でのパート（ａ）で検出したものと同じＮ個の前記バイオマーカータンパク質のそれぞれのレベルを検出する、また、前記第２の試料は、前記対象が前記ＮＡＳＨの治療を受けた後に前記対象から得る、それにより、前記対象の治療状態を決定する；及び
ｄ）前記治療前の状態と前記治療状態とを比較することを含み、また、前記比較が、同じ対象での前記治療前の状態と比較して、脂肪肝、肝炎、肝細胞バルーニング、及び肝線維症から選択する少なくとも１つの病態の重症度が低下したことを示していれば、前記対象は、前記ＮＡＳＨ治療に応答している、項１～７２のいずれか１項に記載の方法。
項１０４．
前記対象での肝生検の必要性の有無を決定することを含み、脂肪肝、肝炎、肝細胞バルーニング、及び肝線維症から選択する少なくとも１つの病態の存在は、前記対象が肝生検を必要としていることを示す、項１～７２のいずれか１項に記載の方法。
項１０５．
前記対象での脂肪肝疾患の有無を決定することを含む、項１０１～１０４のいずれか１項に記載の方法。
項１０６．
前記試料が、血液試料、血漿試料、または血清試料である、項８５、８７～８９、９１～９３、９５～９７、９９～１０２、１０４、及び１０５のいずれか１項に記載の方法。
項１０７．
前記第１の試料、及び前記第２の試料が、血液試料、血漿試料、及び血清試料である、かつ、前記第１の試料、及び前記第２の試料が、同じタイプの試料である、項８６、９０、９４、９８、及び１０３のいずれか１項に記載の方法。
項１０８．
前記対象が、肝疾患のリスクに曝されている、項８５～１０７のいずれか１項に記載の方法。
項１０９．
前記対象が、脂肪肝、肝炎、肝細胞バルーニング、及び／または肝線維症を発症するリスクがある、またはすでに罹患している、項８５～１０８のいずれか１項に記載の方法。
項１１０．
前記対象が、肥満である、項８５～１０９のいずれか１項に記載の方法。
項１１１．
１つ以上の前記試料のＮ個のバイオマーカータンパク質を、一組のＮ個のバイオマーカー捕捉試薬と接触させることを含み、また、一組の前記バイオマーカー捕捉試薬のそれぞれのバイオマーカー捕捉試薬が、検出した異なるバイオマーカータンパク質に対して特異的に結合する、項８５～１１０のいずれか１項に記載の方法。
項１１２．
それぞれのバイオマーカー捕捉試薬が、抗体またはアプタマーである、項１１１に記載の方法。
項１１３．
それぞれのバイオマーカー捕捉試薬が、アプタマーである、項１１２に記載の方法。
項１１４．
少なくとも１つのアプタマーが、低速オフレートを示すアプタマーである、項１１３に記載の方法。
項１１５．
低速オフレートを示す少なくとも１つのアプタマーでは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または、少なくとも１０個のヌクレオチドが修飾を受けている、項１１４に記載の方法。
項１１６．
低速オフレートを示すそれぞれのアプタマーが、≧３０分、≧６０分、≧９０分、≧１２０分、≧１５０分、≧１８０分、≧２１０分、または≧２４０分のオフレート（ｔ １／２ ）で、その標的タンパク質に結合する、項１１４または項１１５に記載の方法。
項１１７．
前記対象が、脂肪肝、肝炎、肝細胞バルーニング、肝線維症、及び／またはＮＡＳＨである、または、その可能性が高い、項８５～１１６のいずれか１項に記載の方法。
項１１８．
前記決定が、分類モデルまたはエラスティックネットロジスティック回帰モデルを使用して、Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質レベルのレベルを解析することを含む、項８５～１１７のいずれか１項に記載の方法。
項１１９．
医療保険料、または、生命保険料を決定する目的で、前記対象が、脂肪肝、肝炎、肝細胞バルーニング、肝線維症、及び／またはＮＡＳＨである、または、その可能性が高いか否かを決定することを含む、項８５～１１８のいずれか１項に記載の方法。
項１２０．
前記方法が、医療保険料または生命保険料を決定することをさらに含む、項８５～１１９のいずれか１項に記載の方法。
項１２１．
前記方法が、前記方法から得た情報を使用して、医療資源の利用を予測及び／または管理することをさらに含む、項８５～１２０のいずれか１項に記載の方法。
以下の実施例は、例示目的で提供しており、添付した特許請求の範囲が定義している本出願の範囲の限定を意図するものではない。以下の実施例で説明する所定の分子生物学技術は、標準的な実験マニュアル、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ．ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（２００１）に記載されているようにして行う。
実施例１．バイオマーカー同定のための多重化アプタマーアッセイ及び統計的手法
多重化アプタマーアッセイを使用して、試験試料とコントロール試料の分析を行って、脂肪肝、肝炎、肝細胞バルーニング、または肝線維症を予測するバイオマーカーを特定した。この多重分析では、少量の試料（約６５μｌの血清または血漿）から得た血液に含まれる約５，０００個のタンパク質を検出するアプタマーを使用しており、検出限界は低く（１ｐＭの中央値）、約７ ｌｏｇのダイナミックレンジ、そして、変動係数は、中央値で約５％であった。多重化アプタマーアッセイは、一般的には、例えば、Ｇｏｌｄ ｅｔ ａｌ．（２０１０） Ａｐｔａｍｅｒ－Ｂａｓｅｄ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ ５（１２）：ｅ１５００４；及び、米国公開：２０１２／０１０１００２及び２０１２／００７７６９５に記載されている。
脂肪肝分類器
安定性選択で選んだ表１に示す１２個のバイオマーカーのパネルを、ランダムフォレストアルゴリズムに提供してモデルを生成した。エラスティックネットロジスティック回帰モデルを使用して、ＲＯＣ曲線（ＡＵＣ）下面積など、様々なモデルのパフォーマンスを決定した。表１に記載した１～５個のバイオマーカーからなるモデルに関する結果を、表２に示した。表２での「Ｎ／Ａ」の記載は、そこに示したように、当該モデルが、１、２、３、または４個のバイオマーカーだけからなることを示している。
肝炎分類器
安定性選択で選んだ表３に示す１４個のバイオマーカーのパネルを、ランダムフォレストアルゴリズムに提供してモデルを生成した。エラスティックネットロジスティック回帰モデルを使用して、ＲＯＣ曲線（ＡＵＣ）下面積など、様々なモデルのパフォーマンスを決定した。表３に記載した１～８個のバイオマーカーからなるモデルに関する結果を、表４に示した。表４での空欄は、そこに示したように、当該モデルが、１、２、３、４、５、６、または７個のバイオマーカーだけからなることを示している。
肝細胞バルーニング分類器
安定性選択で選んだ表５に示す５個のバイオマーカーのパネルを、ランダムフォレストアルゴリズムに提供してモデルを生成した。エラスティックネットロジスティック回帰モデルを使用して、ＲＯＣ曲線（ＡＵＣ）下面積など、様々なモデルのパフォーマンスを決定した。表５に記載した１～５個のバイオマーカーからなるモデルに関する結果を、表６に示した。表６での空欄は、そこに示したように、当該モデルが、１、２、３、または４個のバイオマーカーだけからなることを示している。
肝線維症分類器
安定性選択で選んだ表７に示す８個のバイオマーカーのパネルを、ランダムフォレストアルゴリズムに提供してモデルを生成した。エラスティックネットロジスティック回帰モデルを使用して、ＲＯＣ曲線（ＡＵＣ）下面積など、様々なモデルのパフォーマンスを決定した。表７に記載した１～４個のバイオマーカーからなるモデルに関する結果を、表８に示した。表８での空欄は、そこに示したように、当該モデルが、１、２、または３個のバイオマーカーだけからなることを示している。
実施例２：アプタマーを使用する例示的なバイオマーカー検出
試料に含まれる１つ以上のバイオマーカーを検出する例示的な方法は、例えば、Ｋｒａｅｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳＯｎｅ６（１０）：ｅ２６３３２に記載されており、以下に記載する。３つの異なる定量方法：マイクロアレイをベースとしたハイブリダイゼーション、Ｌｕｍｉｎｅｘビーズをベースとした方法、及びｑＰＣＲが記載されている。
試薬
ＨＥＰＥＳ、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＭｇＣｌ２、及びＴｗｅｅｎ－２０は、例えば、Ｆｉｓｈｅｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入し得る。公称分子量８０００のデキストラン硫酸ナトリウム塩（ＤｘＳＯ４）は、例えば、ＡＩＣから購入し得る、そして、１回の交換で、少なくとも２０時間、脱イオン水に対して透析する。ＫＯＤ ＥＸ ＤＮＡポリメラーゼは、例えば、ＶＷＲから購入し得る。塩化テトラメチルアンモニウム、及びＣＡＰＳＯは、例えば、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入し得る、そして、ストレプトアビジン－フィコエリトリン（ＳＡＰＥ）は、例えば、Ｍｏｓｓ Ｉｎｃから購入し得る。４－（２－アミノエチル）－ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩（ＡＥＢＳＦ）は、例えば、Ｇｏｌｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入し得る。ストレプトアビジンでコーティングした９６ウェルプレートは、例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃｏａｔｅｄ Ｐｌａｔｅｓ ＨＢＣ、透明、９６ウェル、製品番号１５５００または１５５０１）から購入し得る。ＮＨＳ－ＰＥＯ４－ビオチンは、例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ＥＺ－Ｌｉｎｋ ＮＨＳ－ＰＥＯ４－Ｂｉｏｔｉｎ、製品番号２１３２９）から購入して、無水ＤＭＳＯに溶解し、そして、使い捨てのアリコートで凍結保存することができる。ＩＬ－８、ＭＩＰ－４、リポカリン－２、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＭＰ－７、及びＭＭＰ－９は、例えば、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入し得る。レジスチン及びＭＣＰ－１は、例えば、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈから購入し得る、また、ｔＰＡは、例えば、ＶＷＲから購入し得る。
核酸
従来のオリゴデオキシヌクレオチド（アミン及びビオチンで置換したものを含む）は、例えば、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）から購入し得る。Ｚ－Ｂｌｏｃｋとは、配列５’－（ＡＣ－ＢｎＢｎ）７－ＡＣ－３’の一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドであり、式中、Ｂｎは、ベンジル置換デオキシウリジン残基を示す。Ｚ－ブロックは、従来のホスホルアミダイト化学を使用して合成し得る。アプタマー捕捉試薬も、従来のホスホルアミダイト化学で合成し得る、そして、例えば、ｔｉｍｂｅｒｌｉｎｅ ＴＬ－６００またはＴＬ－１５０ヒーターと、重炭酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＢ）／ＡＣＮの勾配を使用するＷａｔｅｒｓ Ａｕｔｏｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ２７６７システム（または、Ｗａｔｅｒｓ ６００シリーズ半自動システム）で、８０℃で作動する、２１．５×７５ｍｍ ＰＲＰ－３カラムで精製して、生成物を溶出する。検出を２６０ｎｍで行い、最良のフラクションをプールする前に、メインピーク全体についてフラクションを回収する。
緩衝剤
緩衝剤ＳＢ１８は、４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０１ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、及びＮａＯＨでｐＨを７．５に調整した０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０からなる。緩衝剤ＳＢ１７は、ＳＢ１８に、１ｍＭ 三ナトリウムＥＤＴＡを加えたものである。緩衝剤ＰＢ１は、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０１ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ 三ナトリウムＥＤＴＡ、及びＮａＯＨでｐＨを７．５に調整した０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ－２０からなる。ＣＡＰＳＯ溶出緩衝剤は、１００ｍＭ ＣＡＰＳＯ ｐＨ１０．０と、１Ｍ ＮａＣｌとからなる。中和緩衝剤は、５００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５００ｍＭ ＨＣｌ、及び０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ－２０を含む。Ａｇｉｌｅｎｔハイブリダイゼーション緩衝剤は、キット（Ｏｌｉｇｏ ａＣＧＨ／ＣｈＩＰ－ｏｎ－ｃｈｉｐハイブリダイゼーションキット）の一部として提供する当社の製剤である。Ａｇｉｌｅｎｔ洗浄緩衝剤１は、当社の製剤である（Ｏｌｉｇｏ ａＣＧＨ／ＣｈＩＰ－ｏｎ－ｃｈｉｐ洗浄緩衝剤１、Ａｇｉｌｅｎｔ）。Ａｇｉｌｅｎｔ洗浄緩衝剤２は、当社の製剤である（Ｏｌｉｇｏ ａＣＧＨ／ＣｈＩＰ－ｏｎ－ｃｈｉｐ洗浄緩衝剤２、Ａｇｉｌｅｎｔ）。ＴＭＡＣハイブリダイゼーション溶液は、４．５Ｍ 塩化テトラメチルアンモニウム、６ｍＭ ＥＤＴＡ三ナトリウム、７５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、及び０．１５％（ｖ／ｖ）サルコシルからなる。ＫＯＤ緩衝剤（１０倍濃縮）は、１２００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＳＯ４、１００ｍＭ ＫＣｌ、６０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、１％ｖ／ｖ Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００、及び１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡからなる。
試料調製
血清（１００μＬのアリコートを－８０℃で保存したもの）を、２５℃の水浴で、１０分間かけて解凍し、試料を希釈する前に、氷上で保存する。試料は、８秒間、穏やかにボルテックスして混合する。６％血清試料溶液を、０．６ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＥＧＴＡ三ナトリウム、０．８ｍＭ ＡＥＢＳＦ、及び２μＭ Ｚ－Ｂｌｏｃｋを加えた０．９４×ＳＢ１７に希釈して調製する。６％血清原液の一部を、ＳＢ１７で１０倍に希釈して、０．６％血清原液を調製する。一部の実施形態では、６％及び０．６％の原液を、それぞれ、存在量の多い分析物と、存在量の少ない分析物を検出するために使用する。
捕捉試薬（アプタマー）とストレプトアビジンプレートの調製
アプタマーは、関連する分析物（または、バイオマーカー）の相対的な存在量に応じて、２つの混合物に分ける。原液濃度は、それぞれのアプタマーについて４ｎＭであり、それぞれのアプタマーの最終濃度は０．５ｎＭである。アプタマー原体混合物を、ＳＢ１７緩衝剤で４倍に希釈し、９５℃で５分間加熱し、そして、使用前に、１５分間で３７℃にまで冷却する。この変性－再生サイクルは、アプタマーのコンフォーマー分布を正常化して、様々な履歴にもかかわらず、再現性のあるアプタマー活性を確保することを目的としている。ストレプトアビジンプレートは、使用前に、１５０μＬの緩衝剤ＰＢ１で２回洗浄する。
インキュベーション及びプレート捕捉
熱冷却した２×アプタマーミックス（５５μＬ）を、等量の６％または０．６％血清希釈液と合わせて、３％及び０．３％血清を含むインキュベーションミックスを作る。これらのプレートを、Ｓｉｌｉｃｏｎｅ Ｓｅａｌｉｎｇ Ｍａｔ（Ａｘｙｍａｔ Ｓｉｌｉｃｏｎｅシーリングマット、ＶＷＲ）で密封し、３７℃で、１．５時間インキュベーションした。次に、インキュベーションミックスを、洗浄した９６ウェルストレプトアビジンプレートのウェルに移し、さらに、３７℃に設定したＥｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒで、８００ｒｐｍで、震盪しながら、２時間、インキュベーションする。
マニュアルアッセイ
特記しない限り、液体を流して除去し、続いて、層状のペーパータオルで、２回軽くたたく。洗浄量は１５０μＬであり、すべての震盪インキュベーションを、２５℃、８００ｒｐｍに設定したＥｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒで行う。インキュベーションミックスを、ピペッティングして除去し、そして、プレートを、１ｍＭ デキストラン硫酸、及び５００μＭ ビオチンを加えた緩衝剤ＰＢ１で、１分間、２回洗浄し、次に、緩衝剤ＰＢ１で、１５秒間、４回洗浄する。新たに調製した１ｍＭ ＮＨＳ－ＰＥＯ４－ビオチンを含む緩衝剤ＰＢ１（１５０μＬ／ウェル）溶液を加え、そして、プレートを震盪しながら５分間インキュベーションする。ＮＨＳ－ビオチン溶液を除去し、そして、プレートを、２０ｍＭ グリシンを加えた緩衝剤ＰＢ１で３回、そして、緩衝剤ＰＢ１で３回洗浄する。次に、１ｍＭ ＤｘＳＯ４を加えた８５μＬの緩衝剤ＰＢ１を、それぞれのウェルに加え、そして、プレートを、ＢｌａｃｋＲａｙ ＵＶランプ（公称波長３６５ｎｍ）の下で、５ｃｍの距離で、２０分間、震盪しながら照射する。改めて洗浄したストレプトアビジンコーティングプレート、または公知の洗浄を終えたストレプトアビジンプレートの未使用ウェルに試料を移し、希釈度の高い試料と希釈度の低い試料の混合物を、単一のウェルに合わせる。試料を、室温で、１０分間震盪しながらインキュベーションする。未吸着の物質を除去し、そして、プレートを、３０％グリセロールを加えた緩衝剤ＰＢ１で、それぞれ、１５秒間、８回洗浄する。次に、プレートを、緩衝剤ＰＢ１で１回洗浄する。アプタマーを、１００μＬ ＣＡＰＳＯ溶出緩衝剤を使用して、室温で、５分間溶出する。９０μＬの溶出液を、９６ウェルＨｙｂＡｉｄプレートに移し、そして、１０μＬの中和緩衝剤を加える。
半自動アッセイ
吸着したインキュベーションミックスを含むストレプトアビジンプレートを、ＢｉｏＴｅｋ ＥＬ４０６プレート洗浄機のデッキに置く。ＢｉｏＴｅｋ ＥＬ４０６プレート洗浄機は：未吸着物質を吸引して除去する、そして、ウェルを、１ｍＭ デキストラン硫酸、及び５００μＭ ビオチンを加えた３００μＬの緩衝剤ＰＢ１で、４回洗浄するステップを行うようにプログラムしている。次に、ウェルを、３００μＬの緩衝液ＰＢ１で、３回洗浄する。新たに調製した（１００ｍＭ 原液を含むＤＭＳＯ）１５０μＬの溶液、すなわち、１ｍＭ ＮＨＳ－ＰＥＯ４－ビオチンを含む緩衝剤ＰＢ１を加える。プレートを震盪しながら、５分間、インキュベーションする。液体を吸引し、そして、ウェルを、１０ｍＭ グリシンを加えた３００μＬの緩衝剤ＰＢ１で８回洗浄する。１ｍＭ デキストラン硫酸を加えた１００μＬの緩衝剤ＰＢ１を加える。これらの自動化したステップの後に、プレートを、プレート洗浄機から取り外し、そして、ＵＶ光源（ＢｌａｃｋＲａｙ、公称波長３６５ｎｍ）の下に取り付けたサーモシェーカーに対して、５ｃｍの距離をあけて、２０分間置く。サーモシェーカーは、８００ｒｐｍ、２５℃に設定している。２０分間の照射後に、改めて洗浄をしたストレプトアビジンプレート（または、洗浄を終えた公知のプレートの未使用ウェル）へ、試料を手動で移す。この時点で、十分量（３％血清＋３％アプタマーミックス）と、少量の反応ミックス（０．３％血清＋０．３％アプタマーミックス）が、１つのウェルで合わさる。この「Ｃａｔｃｈ－２」プレートを、ＢｉｏＴｅｋ ＥＬ４０６プレート洗浄機のデッキに配置する。このプレート洗浄機は：これらのプレートを、震盪しながら、１０分間インキュベートするステップを行うようにプログラムしている。液体を吸引し、そして、ウェルを、３０％グリセロールを加えた３００μＬの緩衝剤ＰＢ１で２１回洗浄する。ウェルを、３００μＬの緩衝剤ＰＢ１で５回洗浄し、そして、最後の洗浄液を吸引する。１００μＬのＣＡＰＳＯ溶出緩衝剤を加え、そして、アプタマーを、震盪しながら、５分間溶出する。これらの自動化ステップに続いて、プレートを、プレート洗浄機のデッキから取り外し、試料の９０μＬアリコートを、１０μＬ中和緩衝剤を含むＨｙｂＡｉｄ ９６ウェルプレートのウェルに手動で移す。
カスタムＡｇｉｌｅｎｔ８×１５ｋマイクロアレイに対するハイブリダイゼーション
中和した溶出液の２４μＬを、新たな９６ウェルプレートに移し、そして、１０Ｃｙ３アプタマーから構成されるハイブリダイゼーションコントロールのセットを含む、６μＬの１０×Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｌｏｃｋ（Ｏｌｉｇｏ ａＣＧＨ／ＣｈＩＰ－ｏｎ－ｃｈｉｐハイブリダイゼーションキット、大量、Ａｇｉｌｅｎｔ ５１８８－５３８０）を、それぞれのウェルに加える。３０μＬの２×Ａｇｉｌｅｎｔ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ緩衝剤を、それぞれの試料に加えて混合する。得られたハイブリダイゼーション溶液の４０μＬを、ハイブリダイゼーションガスケットスライド（Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｇａｓｋｅｔ Ｓｌｉｄｅ、８個のマイクロアレイ／スライドフォーマット、Ａｇｉｌｅｎｔ）のそれぞれの「ウェル」に対して、手動で、ピペットで移す。２０×ｄＴリンカーを備えたそれぞれのアプタマーの４０個のヌクレオチドランダム領域に相補的なアレイに対して１０個のプローブを備えているカスタムＡｇｉｌｅｎｔマイクロアレイスライドを、メーカーのプロトコールに従って、ガスケットスライドに配置する。このアセンブリ（Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｃｈａｍｂｅｒ Ｋｉｔ－ＳｕｒｅＨｙｂ対応可能、Ａｇｉｌｅｎｔ）を固定して、２０ｒｐｍで、回転させながら、６０℃で、１９時間、インキュベーションする。
ハイブリダイゼーション後の洗浄
約４００ｍＬのＡｇｉｌｅｎｔ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ １を、２つの別々のガラス染色ディシュのそれぞれに入れる。スライド（一度に２つ以下）を、Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ １に沈めた状態で分解及び分離させ、次いで、Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ １を含む第２の染色ディシュのスライドラックに移す。スライドを、Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ １で、さらに５分間撹拌しながらインキュベーションする。スライドを、３７℃で、事前に平衡化したＷａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ ２に移し、そして、撹拌しながら、５分間インキュベーションする。スライドを、アセトニトリルを含む第４の染色ディシュに移し、そして、撹拌しながら５分間インキュベーションする。
マイクロアレイイメージング
Ａｇｉｌｅｎｔ Ｇ２５６５ＣＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｓｃａｎｎｅｒ Ｓｙｓｔｅｍを、１００％ＰＭＴに設定して、５μｍの分解能で、Ｃｙ３チャネルを使用し、そして、０．０５でＸＲＤオプションを有効にして、マイクロアレイスライドを画像化する。得られるＴＩＦＦ画像は、ＧＥ１＿１０５＿Ｄｅｃ０８プロトコールを使用したＡｇｉｌｅｎｔ特徴抽出ソフトウェア バージョン１０．５．１．１を使用して処理する。
Ｌｕｍｉｎｅｘプローブのデザイン
ビーズに固定化したプローブは、標的アプタマーの４０個のヌクレオチドランダム領域の３’末端に相補的な４０ヌクレオチドを有する。このアプタマー相補領域は、５’アミノ末端を有するヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）リンカーを介して、Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓに結合する。ビオチン化検出デオキシオリゴヌクレオチドは、標的アプタマーの５’プライマー領域に相補的な１７－２１デオキシヌクレオチドを含む。ビオチン部分を、検出オリゴの３’末端に加える。
Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓに対するプローブの結合
プローブは、基本的にメーカーの指示に従って、Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｍｉｃｒｏｐｌｅｘ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓに結合させるが、次の変更：アミノ末端オリゴヌクレオチドの量は、０．０８ｎｍｏｌ／２．５×１０６ミクロスフェアである、そして、２回目のＥＤＣ添加は、１０ｍｇ／ｍＬで５μＬを添加する、ことが加えられている。カップリング反応は、２５℃、６００ｒｐｍに設定したＥｐｐｅｎｄｏｒｆ ＴｈｅｒｍｏＳｈａｋｅｒで行う。
ミクロスフェアハイブリダイゼーション
ミクロスフェア原液（約４００００ミクロスフェア／μＬ）を、ボルテックスし、そして、Ｈｅａｌｔｈ Ｓｏｎｉｃｓ超音波洗浄機（Ｍｏｄｅｌ：Ｔ１．９Ｃ）で、６０秒間、超音波処理して、ミクロスフェアを懸濁する。懸濁したミクロスフェアを、１．５×ＴＭＡＣハイブリダイゼーション溶液で、反応の度に、２０００個のミクロスフェアに希釈をし、そして、ボルテックスと超音波処理して混合する。ビーズ混合物の反応の度に、３３μＬを、９６ウェルＨｙｂＡｉｄプレートに移す。１５ｎＭ ビオチン化検出オリゴヌクレオチドストックを含む１×ＴＥ緩衝剤の７μＬを、それぞれの反応に加えて、混合する。中和したアッセイ試料の１０μＬを加え、そして、プレートを、シリコンキャップマットシールで密封する。まず、プレートを、９６℃で、５分間、インキュベーションする、そして、従来のハイブリダイゼーションオーブンで、５０℃で、一晩、撹拌せずに、インキュベーションする。フィルタープレート（Ｄｕｒａ ｐｏｒｅ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ部品番号ＭＳＢＶＮ１２５０、１．２μｍ孔径）を、０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを加えた７５μＬ １×ＴＭＡＣハイブリダイゼーション溶液で事前に湿らせておく。ハイブリダイゼーション反応で得た試料全量を、フィルタープレートに移す。ハイブリダイゼーションプレートを、０．５％ＢＳＡを含む７５μＬ １×ＴＭＡＣハイブリダイゼーション溶液で濯ぎ、そして、残余の物質を残らずフィルタープレートに移す。試料を、ゆっくりと真空下で濾過し、１５０μＬの緩衝剤を、約８秒間、脱気する。フィルタープレートを、０．５％ＢＳＡを含む７５μＬ １×ＴＭＡＣハイブリダイゼーション溶液で１回洗浄し、そして、フィルタープレート内のミクロスフェアを、０．５％ＢＳＡを含む７５μＬ １×ＴＭＡＣハイブリダイゼーション溶液に再懸濁する。フィルタープレートを光から保護し、そして、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍａｌｍｉｘｅｒ Ｒで、１０００ｒｐｍで、５分間、インキュベーションする。次に、フィルタープレートを、０．５％ＢＳＡを含む７５μＬ １×ＴＭＡＣハイブリダイゼーション溶液で、１回洗浄する。７５μＬの１０μｇ／ｍＬストレプトアビジンフィコエリトリン（ＳＡＰＥ－１００、ＭＯＳＳ，Ｉｎｃ．）を含む１×ＴＭＡＣハイブリダイゼーション溶液を、それぞれの反応に加え、そして、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍａｌｍｉｘｅｒ Ｒで、２５℃、１０００ｒｐｍで、６０分間インキュベーションする。このフィルタープレートを、０．５％ＢＳＡを含む７５μＬの１×ＴＭＡＣハイブリダイゼーション溶液で２回洗浄し、そして、フィルタープレート内のミクロスフェアを、０．５％ＢＳＡを含む７５μＬ １×ＴＭＡＣハイブリダイゼーション溶液に再懸濁する。次に、フィルタープレートを、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍａｌｍｉｘｅｒ Ｒで、光から保護しながら、５分間、１０００ｒｐｍで、インキュベーションする。次に、フィルタープレートを、０．５％ＢＳＡを含む７５μＬの１×ＴＭＡＣハイブリダイゼーション溶液で１回洗浄する。ミクロスフェアを、０．５％ＢＳＡを加えた７５μＬ １×ＴＭＡＣハイブリダイゼーション溶液に再懸濁し、そして、ＸＰｏｎｅｎｔ ３．０ソフトウェアで作動するＬｕｍｉｎｅｘ １００機器で分析する。ＰＭＴキャリブレーションが大きくし、かつ、７５００～１８０００のダブレット除去の設定下で、少なくとも１００個／ビーズタイプのミクロスフェアを計数する。
ＱＰＣＲ読み出し
ｑＰＣＲの標準曲線を、１０倍希釈、及びテンプレートを持たないコントロールを使用して、１０８～１０２コピーの範囲で、水中で作成する。中和したアッセイ試料を、ｄｉＨ２Ｏで、４０倍に希釈する。ｑＰＣＲマスターミックスを、２×最終濃度で調製する（２×ＫＯＤ緩衝剤、４００μＭ ｄＮＴＰミックス、４００ｎＭフォワード及びリバースプライマーミックス、２×ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ、及び０．５Ｕ ＫＯＤＥＸ）。１０μＬの２×ｑＰＣＲマスターミックスを、１０μＬの希釈アッセイ試料に加える。ｑＰＣＲを、ＢｉｏＲａｄ ＭｙＩＱ ｉＣｙｃｌｅｒで、９６℃で、２分間行った後に、９６℃で、５秒間、７２℃で、３０秒間のサイクルを、４０回行う。
上記した実施形態及び実施例は、例示を意図するものでしかない。特定の実施形態、実施例、または特定の実施形態または実施例の要素は、特許請求の範囲のいずれかの重要な、必要とする、または必須の要素または特徴事項として解釈すべきではない。添付した特許請求の範囲が定義する本出願の範囲から逸脱せずに、開示した実施形態に対して様々な変更、修正、置換、及びその他の変形を行うことができる。図面及び実施例を含む明細書は、限定を意図するものではなく、例示的な方法であるとみなすべきであり、そのようなすべての修正及び置換を、出願の範囲に含めることを意図している。方法またはプロセスの請求項のいずれかに記載したステップは、実行可能なあらゆる順序で行うことができ、実施形態、実施例、または請求項のいずれかに示した順序に限定されない。さらに、上記した方法のいずれかにおいて、１つ以上の具体的に記載したバイオマーカーは、個々のバイオマーカー、またはあらゆるパネルに由来するバイオマーカーとして、具体的に除外することができる。
１００・・・コンピューターシステム
１０１・・・プロセッサ
１０２・・・入力装置
１０３・・・出力装置
１０４、１０９・・・記憶装置
１０５ａ、１０５ｂ・・・記憶媒体リーダー
１０６・・・通信システム
１０７・・・加速処理装置
１０８・・・バス
１９１・・・作業メモリ
１９２・・・オペレーティングシステム
１９３・・・コード

Claims (36)

  1. 対象での肝線維症の有無を決定するための方法であって、Ｎ個のバイオマーカータンパク質を有するバイオマーカーパネルを形成する、及び、前記対象から得た試料でのＮ個の前記バイオマーカータンパク質のそれぞれのレベルを検出することを含む、また、Ｎは、少なくとも１であり、かつ、Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質の少なくとも１つがＡＴＬ２である、前記方法。
  2. 前記対象が、肝線維症と共にＮＡＳＨを有するか否かを決定するための、請求項１に記載の方法。
  3. Ｎが１～８である、またはＮが２～８である、またはＮが３～８である、またはＮが４～８である、またはＮが５～８である、またはＮが６～８である、またはＮが７～８である、またはＮが１～２である、またはＮが１～３である、またはＮが１～４である、またはＮが１～５である、またはＮが１～６である、またはＮが１～７である、請求項１または２に記載の方法。
  4. Ｎが１である、またはＮが２である、またはＮが３である、またはＮが４である、またはＮが５である、またはＮが６である、またはＮが７である、またはＮが８である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. Ｎは少なくとも２である、かつ、Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質の少なくとも１つを、ＮＦＡＳＣ、ＦＣＲＬ３、ＣＯ７、ＣＯＬ１１、ＶＧＦＲ２、ＷＮＴ５Ａ、及びＰＬＯＤ３から選択する、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. Ｎは少なくとも２である、かつ、Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質のそれぞれを、ＮＦＡＳＣ、ＦＣＲＬ３、ＣＯ７、ＣＯＬ１１、ＶＧＦＲ２、ＷＮＴ５Ａ、及びＰＬＯＤ３から選択する、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  7. Ｎは少なくとも２である、かつ、
    （ｉ）Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質の少なくとも２つが、ＡＴＬ２及びＶＧＦＲ２である、
    （ｉｉ）Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質の少なくとも２つが、（ａ）ＡＴＬ２、及び（ｂ）ＣＯＬ１１もしくはＷＮＴ５Ａである、または
    （ｉｉｉ）Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質の少なくとも２つが、（ａ）ＡＴＬ２、及び（ｂ）ＣＯ７もしくはＷＮＴ５Ａである、
    請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  8. 前記対象が、肝線維症を有する、あるいは軽度、中等度、または重度の肝線維症を有する、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 前記対象が、ＮＡＳＨを有する、あるいはステージ１、２、３、または４のＮＡＳＨを有する、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 前記試料が、血液試料、血漿試料、または血清試料である、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 前記対象が、肝疾患のリスクに曝されている、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 前記対象が、脂肪肝、肝炎、肝細胞バルーニング、及び／または肝線維症を発症する、または有するリスクがある、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 前記対象が、肥満である、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. １つ以上の前記試料のＮ個のバイオマーカータンパク質を、一組のＮ個のバイオマーカー捕捉試薬と接触させることを含み、また、一組の前記バイオマーカー捕捉試薬のそれぞれのバイオマーカー捕捉試薬が、検出した異なるバイオマーカータンパク質に対して特異的に結合する、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. それぞれのバイオマーカー捕捉試薬が、抗体またはアプタマーである、請求項１４に記載の方法。
  16. それぞれのバイオマーカー捕捉試薬が、アプタマーである、請求項１５に記載の方法。
  17. 少なくとも１つのアプタマーが、低速オフレートを示すアプタマーである、請求項１６に記載の方法。
  18. 低速オフレートを示す少なくとも１つのアプタマーでは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または、少なくとも１０個のヌクレオチドが修飾を受けている、請求項１７に記載の方法。
  19. 低速オフレートを示すそれぞれのアプタマーが、≧３０分、≧６０分、≧９０分、≧１２０分、≧１５０分、≧１８０分、≧２１０分、または≧２４０分のオフレート（ｔ１／２）で、その標的タンパク質に結合する、請求項１７または請求項１８に記載の方法。
  20. 前記対象が、脂肪肝、肝炎、肝細胞バルーニング、肝線維症、及び／またはＮＡＳＨである、または、その可能性が高い、請求項１～１９のいずれか１項に記載の方法。
  21. 前記決定が、分類モデルまたはエラスティックネットロジスティック回帰モデルを使用して、Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質レベルのレベルを解析することを含む、請求項１～２０のいずれか１項に記載の方法。
  22. 医療保険料、または、生命保険料を決定する目的で、前記対象が、脂肪肝、肝炎、肝細胞バルーニング、肝線維症、及び／またはＮＡＳＨを有する、または、有する可能性が高いか否かを決定することを含む、請求項１～２１のいずれか１項に記載の方法。
  23. 前記方法が、医療保険料または生命保険料を決定することをさらに含む、請求項１～２２のいずれか１項に記載の方法。
  24. 前記方法が、前記方法から得た情報を使用して、医療資源の利用を予測及び／または管理することをさらに含む、請求項１～２３のいずれか１項に記載の方法。
  25. 対象での肝線維症の有無を決定するためのキットであって、前記キットは、Ｎ個のバイオマーカータンパク質捕捉試薬を含み、Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質捕捉試薬が、各々、バイオマーカータンパク質に結合し、前記バイオマーカータンパク質の１つがＡＴＬ２である、前記キット。
  26. Ｎは少なくとも２である、かつ、Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質捕捉試薬の少なくとも１つが、ＮＦＡＳＣ、ＦＣＲＬ３、ＣＯ７、ＣＯＬ１１、ＶＧＦＲ２、ＷＮＴ５Ａ、及びＰＬＯＤ３から選択されるバイオマーカータンパク質に対して結合する、請求項２５に記載のキット。
  27. Ｎは少なくとも２である、かつ、Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質捕捉試薬のそれぞれが、ＮＦＡＳＣ、ＦＣＲＬ３、ＣＯ７、ＣＯＬ１１、ＶＧＦＲ２、ＷＮＴ５Ａ、及びＰＬＯＤ３から選択されるバイオマーカータンパク質に対して結合する、請求項２５又は２６に記載のキット。
  28. Ｎは少なくとも２である、かつ、
    （ｉ）Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質捕捉試薬の少なくとも２つが、バイオマーカータンパク質のＡＴＬ２及びＶＧＦＲ２に対して結合する、
    （ｉｉ）Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質捕捉試薬の少なくとも２つが、バイオマーカータンパク質の（ａ）ＡＴＬ２、及び（ｂ）ＣＯＬ１１もしくはＷＮＴ５Ａに対して結合する、または
    （ｉｉｉ）Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質捕捉試薬の少なくとも２つが、バイオマーカータンパク質の（ａ）ＡＴＬ２、及び（ｂ）ＣＯ７もしくはＷＮＴ５Ａに対して結合する、請求項２５又は２６に記載のキット。
  29. Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質捕捉試薬のそれぞれが、異なるバイオマーカータンパク質に対して特異的に結合する、請求項２５に記載のキット。
  30. Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質捕捉試薬のそれぞれが、抗体またはアプタマーである、請求項２５～２９のいずれか１項に記載のキット。
  31. それぞれのバイオマーカー捕捉試薬が、アプタマーである、請求項３０に記載のキット。
  32. 少なくとも１つのアプタマーが、低速オフレートを示すアプタマーである、請求項３１に記載のキット。
  33. 低速オフレートを示す少なくとも１つのアプタマーでは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０個のヌクレオチドが修飾を受けている、請求項３２に記載のキット。
  34. 低速オフレートを示すそれぞれのアプタマーが、≧３０分、≧６０分、≧９０分、≧１２０分、≧１５０分、≧１８０分、≧２１０分、または≧２４０分のオフレート（ｔ１／２）で、その標的タンパク質に結合する、請求項３２または請求項３３に記載のキット。
  35. 対象から得た試料での前記バイオマーカータンパク質の検出において使用する請求項２５～３４のいずれか１項に記載のキット。
  36. 前記対象が、脂肪肝、肝炎、肝細胞バルーニング、肝線維症、及び／またはＮＡＳＨである、または、その可能性が高いか否かを決定するために使用する請求項３５に記載のキット。
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