JP7766303B2 - 足場、足場の製造方法、細胞培養物、細胞培養方法 - Google Patents

Description

本発明は、細胞を培養するための足場、足場の製造方法、当該足場を含む細胞培養物、及び当該足場を利用した細胞培養方法に関する。

現在、発生生物学、創薬、再生医学など様々な分野において、種々の細胞を培養することが試みられている。これらの細胞は、典型的には、組織培養用プラスチック容器の表面上で２次元的に培養される（２次元培養）。近年、多孔質膜やハイドロゲルなどの足場を利用して３次元的な培養環境下で細胞を培養する技術が注目されている（３次元培養）。以下の特許文献１～６は、管状のハイドロゲルの内部で細胞を培養することを開示している。

ここで、細胞が効率的に培養されるかどうかについては、細胞の種類や培養条件に大きく依存することが知られている。培地中で浮遊した状態で増殖する培養細胞は「浮遊細胞」と呼ばれている。一方、足場に付着しながら増殖する細胞は、「接着性細胞」と呼ばれている。

国際公開第２０１１／０４６１０５号 特開２０１７－９９３０３号 国際公開第２０１７／０９１６６２号 国際公開第２０１８／０９８２９５号 国際公開第２０１９／１７８５４９号 国際公開第２０２０／０３２２２１号

細胞が効率的に培養されるかどうかについては、細胞の種類や培養条件に大きく依存することが知られている。特に、接着性細胞は、培養するための足場に応じて培養の効率が大きく変わり得る。本願の発明者は、ハイドロゲルを足場として利用し接着性細胞を培養する場合に、条件によっては接着性細胞が培養し難く、未だ改善の余地があるということを見出した。

したがって、接着性細胞の培養に適した足場、当該足場を含む細胞培養物、当該足場を利用した接着性細胞の培養方法が望まれる。

一態様に係る細胞を培養するための足場は、ハイドロゲルと、前記ハイドロゲルに付着した血漿由来もしくは血小板由来の成分又はフィブリン含有物と、を有する。

好ましい一態様において、前記ハイドロゲルは、紐状、管状、球状、又は球殻状である。

好ましい一態様において、前記血漿由来もしくは前記血小板由来の成分又は前記フィブリン含有物は、前記ハイドロゲルの内側又は外側に設けられている。

好ましい一態様において、前記血漿由来もしくは前記血小板由来の成分又は前記フィブリン含有物は、ヒト血小板溶解物由来の成分を含む。

好ましい一態様において、前記ハイドロゲルは、アルギン酸ゲルを含む。

好ましい一態様において、前記ハイドロゲルは、アルギン酸ゲルと、前記アルギン酸ゲルに混合されたゼラチンと、を含む。

一態様に係る細胞培養物は、上記の足場と、前記足場に接着した細胞と、を有する。

好ましい一態様において、前記細胞は、接着性細胞である。

好ましい一態様において、前記細胞は、間葉系幹細胞である。

一態様に係る細胞培養方法は、ハイドロゲルと、前記ハイドロゲルに付着した血漿由来もしくは血小板由来の成分又はフィブリン含有物と、を有する足場を形成し、前記足場に細胞を接着させて前記細胞を培養することを含む。

一態様に係る細胞を培養するための足場の製造方法は、血漿由来もしくは血小板由来の成分又はフィブリノゲン、フィブリン、又はこれらの混合物を含む懸濁液を、ハイドロゲルに接触させることを含む。

好ましい一態様において、前記足場の製造方法は、ハイドロゲル前駆体をゲル化して前記ハイドロゲルを形成することと、前記懸濁液中に前記ハイドロゲルを漬けることと、を含む。

好ましい一態様において、前記足場の製造方法は、前記懸濁液を流しつつ、前記懸濁液のまわりでハイドロゲル前駆体を流すことと、前記ハイドロゲル前駆体をゲル化し、前記懸濁液を覆う管状の前記ハイドロゲルを形成することと、を含む。

好ましい一態様において、前記懸濁液は、ヒト血小板溶解物を含む。

好ましい一態様において、前記ハイドロゲル前駆体は、アルギン酸溶液を含む。

上記態様によれば、接着性細胞の培養に適した足場、当該足場の製造方法、当該足場を含む細胞培養物、当該足場を利用した接着性細胞の培養方法を提供することができる。

第１実施形態に係る細胞培養用の足場の構造を示す写真である。 第１実施形態に係る細胞培養用の足場の断面を示す模式図である。 第１実施形態に係る細胞培養用の足場と、当該足場に接着した細胞と、を有する細胞培養物の構造の一例を示す写真である。 第２実施形態に係る細胞培養用の足場の構造を示す模式図である。 第２実施形態に係る細胞培養用の足場の断面を示す模式図である。 第２実施形態に係る細胞培養用の足場と、当該足場に接着した細胞と、を有する細胞培養物の構造の一例を示す写真である。 第２実施形態に係る細胞培養用の足場を製造するための装置の一例を示す模式図である。 実施例１３～１６及び参考例７において培養した細胞の増殖率を示すグラフである。

本発明者らは、鋭意研究の結果、接着性細胞の培養に適した足場及び当該足場を用いた細胞培養方法を見出した。

細胞を培養するための足場は、ハイドロゲルと、ハイドロゲルに付着した成分と、を有する。ハイドロゲルに付着した成分は、細胞接着性を有する成分であることが好ましい。ハイドロゲルに付着した成分は、血漿由来もしくは血小板由来の成分、又はフィブリン含有物であってよい。

ハイドロゲルは、紐状、管状、球状、又は球殻状であってよい。足場の表面積の確保、及び足場の取り扱い易さという観点からは、ハイドロゲルは、紐状又は管状であることがより好ましい。

図１は、第１実施形態に係る細胞培養用の足場の構造を示す写真である。図２は、第１実施形態に係る細胞培養用の足場の断面を示す模式図である。図１に示す写真中の容器内の紐状の構造物が、足場１０である。図１及び図２に示す形態では、足場は、連続的に延びた紐状のハイドロゲル１２を有している。血漿由来もしくは血小板由来の成分、又はフィブリン含有物１４は、このハイドロゲル１２の外面に設けられている（図２参照）。この場合、接着性細胞は、ハイドロゲル１２の外面の成分１４に付着しつつ培養される（図３参照）。図３は、細胞培養用の足場に間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を接着して培養させた細胞培養物の一部を拡大して示している。なお、細胞の培養を継続することによって図３に示す状態から更に多くの数にまで細胞を培養することも可能である。

図４は、第２実施形態に係る細胞培養用の足場の構造を示す模式図である。図５は、第２実施形態に係る細胞培養用の足場の断面を示す模式図である。図４及び図５に示す形態では、足場２０は、連続的に延びた管状のハイドロゲル２２を有している。血漿由来もしくは血小板由来の成分、又はフィブリン含有物２４は、このハイドロゲル２２の内面に設けられている。この場合、接着性細胞２８は、ハイドロゲル２２の内面の成分２４に付着しつつ培養される。すなわち、接着性細胞２８は、管状の足場の内部で培養される（図６参照）。図６は、細胞培養用の足場の内側に間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を接着して培養させた細胞培養物の一部を拡大して示している。なお、細胞の培養を継続することによって、管状の足場の内部が密になるまで細胞を培養することも可能である。

接着性細胞の種類は、特に限定されない。接着性細胞は、分化多能性を有する各種の幹細胞、分化万能性を有するヒトＥＳ細胞やヒトｉＰＳ細胞、分化単一性を有する幹細胞などであってよい。分化多能性を有する各種の幹細胞としては、例えばｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、間葉系幹細胞、神経幹細胞等が挙げられる。分化単一性を有する幹細胞としては、例えば肝幹細胞、生殖幹細胞、呼吸器前駆細胞、消化器前駆細胞等が挙げられる。また、接着性細胞は、分化した各種の細胞、例えば骨格筋細胞や心筋細胞などの筋細胞、大脳皮質細胞などの神経細胞、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、脂肪細胞、骨芽細胞、マクロファージ、樹状細胞、肝細胞、膵β細胞、ケラチノサイト、腎細胞、尿細管細胞などであってもよい。

ハイドロゲルは、液状のハイドロゲル前駆体をゲル化することによって得られる。ハイドロゲルは、接着性細胞の足場として機能し得る強度を有していれば十分であり、好ましくは細胞培養培地成分に対して十分な透過性を有し得るものである。具体例では、ハイドロゲルは、アルギン酸ゲルを主成分とするゲルであってよい。この場合、ハイドロゲル前駆体は、アルギン酸溶液を主成分とする溶液であってよい。

ハイドロゲルは、アルギン酸ゲルに混合された別の材料を含んでいても良い。例えば、ゼラチン又はコラーゲンがアルギン酸ゲルに混合されていてもよい。ゼラチン又はコラーゲンは、架橋剤によって架橋されてもよい。架橋剤は、特に限定されないが、例えばゲニピンであってよい。

アルギン酸ゲルは、アルギン酸溶液を２価金属イオンにより架橋することによって形成できる。アルギン酸溶液は、例えば、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カリウム、アルギン酸アンモニウム、又はこれらの組み合わせであってよい。アルギン酸溶液は、常温又は常温付近において、２価金属イオンにより容易かつ短時間で架橋され、アルギン酸ゲルになり易い。また、アルギン酸ゲルは、細胞毒性もない。したがって、細胞を培養する足場を構成するハイドロゲルは、アルギン酸ゲルを主成分として含むことが好ましい。

アルギン酸は、天然抽出物であってもよく、化学修飾されたものであってもよい。化学修飾されたアルギン酸としては、例えばメタクリレート修飾アルギン酸等がある。また、ハイドロゲルは、前述したアルギン酸塩と、寒天（Agar）、アガロース（Agarose）、ポリエチレングリコール（PEG）、ポリ乳酸（PLA）又はナノセルロース等と、の混合系であってもよい。アルギン酸溶液の溶媒の重量に対するアルギン酸塩の重量は、例えば０．１～１０．０重量％、好ましくは０．２５～７．０重量％、より好ましくは０．５～５．０重量％である。

アルギン酸ゲルを得るために用いられる２価金属イオンは、例えば、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、バリウムイオン、ストロンチウムイオン、亜鉛イオン、鉄イオン等が挙げられる。好ましくは、２価金属イオンは、カルシウムイオン又はバリウムイオンである。

２価金属イオンは、溶液の形態でアルギン酸に与えられることが好ましい。２価金属イオンを含む溶液としては、例えば、カルシウムイオンを含む溶液が挙げられる。そのような溶液は、例えば、塩化カルシウム水溶液、炭酸カルシウム水溶液、グルコン酸カルシウム水溶液等の水溶液が挙げられる。そのような溶液は、好ましくは、塩化カルシウム水溶液又は塩化バリウム水溶液であってよい。

２価金属イオンを含む溶液の２価金属イオンの濃度は、例えば１ｍＭ～１Ｍ、好ましくは２０～５００ｍＭ、より好ましくは１００ｍＭである。

アルギン酸ゲルの原料は、好ましくはアルギン酸ナトリウムであってよい。この場合、アルギン酸ナトリウムのＭ／Ｇ比は、足場としての強度と培地成分の透過性の観点から、好ましくは０．４～１．８であり、より好ましくは０．１～０．４である。なお、Ｍ／Ｇ比は、アルギン酸類のＤ－マンヌロン酸とＬ－グルロン酸の構成比によって規定される。

前述した血漿由来もしくは血小板由来の成分は、ヒト血小板溶解物（ｈＰＬ）由来の成分を含んでいてよい。そのような成分は、例えばヒト血小板溶解物中の不溶成分であってもよく、フィブリン含有物であってもよい。ここで、フィブリン含有物は、血漿由来、血小板由来、もしくはヒト血小板溶解物由来の不溶成分を含むものであってよい。

なお、「フィブリン含有物」は、フィブリンそのものであってもよく、フィブリンを主成分に含むものであってよく、フィブリン以外の成分を含んでいてもよい。フィブリン以外の成分として、例えばアルブミンやフィブロネクチンのようなタンパク質が挙げられる。一例として、フィブリン含有物は、フィブリンとアルブミンの両方を含んでいてもよい。また、ヒト血小板溶解物（ｈＰＬ）を含む液状培地は、例えば、血漿もしくはｈＰＬ由来の成分、フィブリン、フィブリノゲン、又はこれらの混合物を含んでいてよい。フィブリノゲンは、トロンビンの作用によりフィブリンに変化する。フィブリンは、不溶成分であり、ハイドロゲルの内面又は外面に付着させることができる。なお、アルブミンやフィブロネクチンのようなタンパク質によって、フィブリンをハイドロゲルの内面又は外面に付着させやすくすることも期待できる。

血漿由来もしくは血小板由来の成分又はフィブリン含有物は、任意の方法によってハイドロゲルに付着させればよい。例えば、血漿由来もしくは血小板由来の成分又はフィブリンノゲンを含む懸濁液をハイドロゲルに接触させることによって、ハイドロゲルに、血漿由来もしくは血小板由来の成分又はフィブリン含有物を付着させることができる。

血漿由来もしくは血小板由来の成分、フィブリン、又はフィブリンノゲンは、例えば血小板溶解物を含む液状培地に含まれる。したがって、血小板溶解物、例えばヒト血小板溶解物（ｈＰＬ）を含む液状培地を含む懸濁液を、ハイドロゲルに接触させることによって、足場を形成することができる。ここで、この懸濁液は、足場に接着させて培養する細胞を含む細胞懸濁液であってもよい。この代わりに、フィブリンノゲンを含む溶液をハイドロゲルに接触させた状態で、トロンビンの作用によりハイドロゲルにフィブリンを付着させることもできる。なお、フィブリンを析出可能であれば、トロンビンの使用は必須ではないことに留意されたい。

好ましくは、ハイドロゲルの内面又は外面は、血漿由来もしくは血小板由来の成分、又はフィブリン含有物によってコーティングされている。

足場が紐状又は管状である場合、ハイドロゲルの長さは、例えば、好ましくは５ｃｍ以上、より好ましくは１０ｃｍ以上、さらに好ましくは２０ｃｍ以上であってよい。ハイドロゲルの長さが長いほど、多くの細胞を培養し得る。

足場が図１及び図２に示すように連続的に延びた紐形状を有する場合、足場の外径（図２の符号Ｒ１）は、特に限定されない。足場の外径は、接着性細胞の接着性という観点から、例えば１０μｍ～５０００μｍの範囲、好ましくは４０μｍ～２０００μｍの範囲、より好ましくは８０μｍ～１０００μｍであってよい。ここで、外径は、複数の位置、例えば１０か所で測定した外径の平均値によって規定されていてよい。

足場が図４及び図５に示すように連続的に延びた管形状を有する場合、足場の外径（図５の符号Ｒ２）は特に限定されない。足場の外径は、例えば１０μｍ～４０００μｍの範囲、好ましくは４０μｍ～１０００μｍの範囲であり、より好ましくは８０μｍ～５００μｍの範囲であってよい。ここで、外径は、複数の位置、例えば１０か所で測定した外径の平均値によって規定されていてよい。

足場を構成するハイドロゲルの厚み（図５のＲ２とＲ３の差分）は、実質的に均一であることが好ましい。ここで、「実質的に均一」とは、複数か所、例えば１０か所で測定した外径と内径との差（厚み）がその平均値から±１０％の範囲内であることを意味する。なお、前述した内径、外径、厚みは、例えば位相差光学顕微鏡により測定することができる。

足場を構成するハイドロゲルが管状の場合、ハイドロゲルの延在方向の両端は、ハイドロゲルによって閉じられていることが好ましい。これにより、ハイドロゲルの内部の細胞が、ハイドロゲルから外側に漏れ出ることを抑制することができる。

細胞を保護するという観点から、管状のハイドロゲルは、ハイドロゲルの内部に設けられる基材の強度よりも高い機械的強度を有することが好ましい。ハイドロゲルの機械的強度については、当業者に周知の方法に従って、引っ張り試験機を水中で用いる方法などにより引っ張り強度や荷重強度などを測定することができる。

管状のハイドロゲルの内部は、細胞懸濁液を含んでいてよい。細胞懸濁液は、培養すべき前述の細胞と、ハイドロゲルに付着させるべき血漿由来もしくは血小板由来の成分又はフィブリン含有物の元となる成分と、基材を含んでいてよい。細胞懸濁液は、前述した血漿由来もしくは血小板由来の成分、又はフィブリン含有物を付着させるために使用したものであってよい。基材は、例えば、細胞外基質、キトサンゲル、コラーゲン溶液、マトリゲル、コラーゲンゲル、ゼラチン、アルギン酸溶液、アルギン酸ゲル、ペプチドゲル、ラミニン、アガロース、ナノセルロース、メチルセルロース、ヒアルロン酸、プロテオグリカン、エラスチン、プルラン、デキストラン、ペクチン、ジェランガム、キサンタンガム、グァーガム、カラギーナン、グルコマンナンからなる群から選択される群、又はこれらの混合物を含んでいてもよい。さらに、細胞懸濁液は、培地、培養上清、緩衝液、ヒト血小板溶解物、多血小板血漿（ＰＲＰ）、血清又はそれらの混合物を含んでいてよい。好ましくは、細胞懸濁液は、ヒト血小板溶解物を含む。

基材は、細胞の培養、細胞の維持や増殖、又は細胞の機能発現などに適した各種の成長因子、例えば上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）などを含んでいてもよい。

（足場の製造方法１）
細胞を培養するための足場が図１及び図２に示すように連続的に延びた紐形状を有する場合、足場は、例えば以下のように製造できる。まず、ハイドロゲル前駆体をゲル化してハイドロゲルを形成する。ハイドロゲル前駆体は、ゲル化可能な前駆体であればよい。そのような前駆体として、例えばアルギン酸溶液を主成分とする溶液が挙げられる。アルギン酸溶液は、例えばアルギン酸ナトリウム水溶液であってよい。必要に応じて、アルギン酸溶液中にゼラチン溶液又はコラーゲン溶液のような溶液を混合してもよい。

次に、ハイドロゲル前駆体をシリンジに充填し、シリンジの吐出口から所定の速度で、ハイドロゲル前駆体を、ゲル化剤を含む溶液中に吐出する。ハイドロゲル前駆体がアルギン酸溶液である場合、ゲル化剤を含む溶液は、前述した２価の陽イオンを含む溶液であってよい。２価の陽イオンを含む溶液は、例えば、所望の液状培地に、塩化カルシウム又は塩化バリウムを溶解させた溶液であってよい。なお、ハイドロゲル前駆体がゼラチン溶液又はコラーゲン溶液を含む場合、ゲル化剤を含む溶液は、ゲニピンのような架橋剤を含んでいてもよい。

ゲル化剤を含む溶液中に吐出されたハイドロゲル前駆体は、ゲル化することによってハイドロゲルを形成する。シリンジの吐出口からハイドロゲル前駆体を連続的に吐出することによって、連続的に延びた紐状のハイドロゲルが形成される。

次に、血漿由来もしくは血小板由来の成分、フィブリン、フィブリノゲン、又はこれらの混合物を含む懸濁液中に、前述のように得られた紐状のハイドロゲルを漬ける。この懸濁液の成分は、前述したとおりである。この懸濁液は、例えば血漿もしくはｈＰＬ由来の不溶成分を含む液状培地、より好ましくはヒト血小板溶解物を含む培地であってよい。

以上のプロセスにより、紐状のハイドロゲルの外面に、血漿由来もしくは血小板由来の成分、及び／又はフィブリノゲンから変化したフィブリン含有物が付着する。これにより、前述した足場が形成される。なお、前述したシリンジの吐出口からハイドロゲル前駆体を断続的に吐出すれば、多数の球状のハイドロゲルが形成される。これらの多数の球状のハイドロゲルに前述したようにフィブリン含有物を付着させれば、球状の足場が形成される。

このような足場を利用して接着性細胞を培養する場合、所望の液状培地中に足場を投入するとともに、接着性細胞を播種すればよい。これにより、接着性細胞は、ハイドロゲルの外面上の血漿由来もしくは血小板由来の成分又はフィブリン含有物に接着しつつ、培養される。

（足場の製造方法２）
細胞を培養するための足場が図４及び図５に示すように連続的に延びた管状を有する場合、足場は、例えば以下のように製造できる。ここで、図７は、管状の足場を形成するための用いられる装置の概略図である。

まず、血漿由来もしくは血小板由来の成分、フィブリン、フィブリノゲン、又はこれらの混合物を含む懸濁液１を流しつつ、懸濁液１のまわりでハイドロゲル前駆体３を流す。ここで、懸濁液１は、培養すべき細胞と、フィブリン及び／又はフィブリノゲンを含む基材と、を含む細胞懸濁液である。基材の材料は前述したとおりである。好ましくは、基材は、細胞外基質及び／又はヒト血小板溶解物を含む。この場合、細胞懸濁液中に血漿もしくはｈＰＬ由来の成分、フィブリン、フィブリノゲン又はこれらの混合物が含まれる。ハイドロゲル前駆体３の材料は前述したとおりである。

好ましくは、懸濁液１は、層流として流される。この層流は、第１導入管２内で形成される。ハイドロゲル前駆体３は、懸濁液１の流れの外周を覆うように流される。すなわち、ハイドロゲル前駆体３は、懸濁液１と同軸状で、同方向に流れる。好ましくは、ハイドロゲル前駆体３は、層流として流される。これにより、第２導入管４のところで、細胞懸濁液１の流れを取り囲むハイドロゲル前駆体３の流れが形成される。

ハイドロゲル前駆体をゲル化し、懸濁液１を覆う管状のハイドロゲルを形成する。これは、ハイドロゲル前駆体３の流れの外周に、ハイドロゲル前駆体をゲル化させるゲル化剤を含む溶液５を接触させることにより実現できる。図７に示す態様では、溶液５は、第３導入管６のところでハイドロゲル前駆体（第２層流）３の周囲を取り囲む。すなわち、溶液５は、懸濁液１及びハイドロゲル前駆体３と同軸状で、同方向に流れる。

細胞懸濁液１、ハイドロゲル前駆体３、及びゲル化剤を含む溶液５は、開始時にどの順に流し始めてもよく、停止時にどの順に停止してもよい。ただし、細胞を漏れなく閉じ込めるという観点からは、細胞懸濁液１は、製造開始時には最後に流し始めることが好ましく、製造停止時には最初に停止することが望ましい。細胞懸濁液１、ハイドロゲル前駆体３、及びゲル化剤を含む溶液５のそれぞれの流速は、足場を形成できれば、特に限定されない。

細胞懸濁液１、ハイドロゲル前駆体３、及びゲル化剤を含む溶液５は、第３導入管６から流出し、たとえば生理食塩水又は液状培地のような液体又は懸濁液中に漬けられる。ここで、ハイドロゲル前駆体３は、ゲル化剤の付与によりゲル化されながら、第３導入管６から流出する。これにより、懸濁液を覆う管状のハイドロゲルが形成される。管状のハイドロゲルの内部に形成された不溶成分、すなわち血漿由来もしくは血小板由来の成分、及び／又はフィブリン含有物は、時間経過とともに管状のハイドロゲルの内面に付着する。

以上のプロセスにより、管状のハイドロゲルの内面に、血漿由来もしくは血小板由来の成分、及び／又はフィブリン含有物が付着する。これにより、前述した足場が形成される。

図７で示す態様では、細胞懸濁液１の流れ、ハイドロゲル前駆体３の流れ及びゲル化剤を含む溶液５の流れを形成し、第３導入管６から流出することで足場を形成した。この代わりに、細胞懸濁液１の流れを形成し、第１層流の外周を覆うハイドロゲル前駆体３の流れを形成し、これらの流れを、ゲル化剤を含む溶液５を収容する容器内に吐出することによっても、同様の構造の足場を形成することができる。この場合、細胞懸濁液１の流れとハイドロゲル前駆体３の流れを断続的に吐出すれば、多数の球殻状のハイドロゲルが形成される。これらの球殻状のハイドロゲルの内面には、前述したように血漿由来もしくは血小板由来の成分、及び／又はフィブリン含有物が付着する。この場合、細胞を包む球殻状の足場を形成することができる。

このような足場を利用して接着性細胞を培養する場合、ハイドロゲルの内側に培養すべき接着性細胞を含ませておけばよい。これにより、接着性細胞は、ハイドロゲルの内面の血漿由来もしくは血小板由来の成分、及び／又はフィブリン含有物に接着しつつ、培養される。

細胞を培養する足場を構成するハイドロゲルは、好ましくはアルギン酸ゲルである。アルギン酸ゲルは、アルギン酸溶液から、常温又は常温付近で２価の陽イオンを含む溶液によって容易かつ即座にゲル化できるというメリットを有する。また、アルギン酸ゲルは、細胞毒性が弱いというメリットも有する。

しかしながら、アルギン酸ゲルは細胞非接着性であるため、接着性細胞の足場として必ずしも適してはいない。本願の発明者は、ハイドロゲル、特にアルギン酸ゲルの外面又は内面に、血漿由来もしくは血小板由来の成分、及び／又はフィブリン含有物を付着させることによって、接着性細胞を接着させて培養させ易い足場を見出した。

また、本願の発明者は、前述したような紐状、管状、球状、又は球殻状のハイドロゲル、特にアルギン酸ゲルに、血漿由来もしくは血小板由来の成分、及び／又はフィブリン含有物を効果的に付着又はコーティングするため、ヒト血小板溶解物を含む液状培地（懸濁液）が好適に利用可能であることを見出した。ただし、ハイドロゲルの外面又は内面に、血漿由来もしくは血小板由来の成分、及び／又はフィブリン含有物を付着させることが可能であれば、付着又はコーティングの方法は、上記で説明した方法に制限されない。

また、血漿由来もしくは血小板由来の成分、及び／又はフィブリン含有物をハイドロゲルに付着させ易くするため、血漿由来もしくは血小板由来の成分又はフィブリンノゲンを含む溶液を培地と混合した懸濁液を生成した後に、当該懸濁液を室温（例えば２２～３７℃の温度）で１０～１２０分の間静置してもよい。静置した後に、上記懸濁液をハイドロゲルに接触させればよい。さらに、細胞を培養するための足場が図４及び図５に示すように連続的に延びた管状である場合、血漿由来もしくは血小板由来の成分又はフィブリンノゲンを含む溶液を培地と混合した懸濁液を生成した後に、当該懸濁液を室温（例えば２２～３７℃の温度）で１０～１２０分の間静置してから、懸濁液１に培養すべき細胞を導入することが好ましい。このようにして得られた細胞懸濁液１を用いて、前述したように図７に示す装置を利用し、管状の足場を製造すればよい。

さらに、本願の発明者は、必要に応じてアルギン酸ゲル中にコラーゲンゲル又はゼラチンゲルを混入させることにより、接着性細胞をより接着させて培養させ易くすることができることを見出した。コラーゲンゲル又はゼラチンゲルは、アルギン酸ゲルよりも細胞接着性が高いため、細胞接着性が低いというアルギン酸ゲルのデメリットを補うことができる。この場合、アルギン酸ゲルに対するコラーゲンゲル又はゼラチンゲルの割合は、例えば０．１～２０質量パーセント、好ましくは１．０～２０質量パーセントであってよい。

［実施例１］
（足場の製造）
次に、実施例について、詳細に説明する。まず、試薬として以下のものを準備した。
・アルギン酸ナトリウム（株式会社キミカ製「I-3G」）
・ゼラチン（新田ゼラチン株式会社製「beMatrix gelatin LS-H」）
・ダルベッコ改変イーグル培地：DMEM（シグマアルドリッチ製「D6429」）
・ゲニピン（富士フイルム和光純薬株式会社製「製品コード：078-03021」）
・ＭＳＣ用培地（間葉系幹細胞増殖培地2：Mesenchymal Stem Cell Growth Medium 2 (Ready-to-use)：C-28009）
・ｈＰＬ液（AventaCell, UltraGRO-PURE:HPCHXCRL50)）

まず、生理食塩水に上記のゼラチンを加えた溶液をオートクレーブし、ゼラチン溶液を作成した。生理食塩水に対するゼラチンの濃度は、３７℃の温度で２０体積パーセントに相当する濃度であった。

また、生理食塩水に上記のアルギン酸ナトリウムを加え、攪拌することによってアルギン酸溶液を作成した。生理食塩水に対するアルギン酸ナトリウムの濃度は、１．９６質量パーセント濃度であった。

前述したゼラチン溶液とアルギン酸溶液を３７℃の温度で１：１の体積比となるように混合した混合液を作成した。

また、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に塩化カルシウムと上記のゲニピンを溶解させた。培地（ＤＭＥＭ）に対するゲニピンの濃度は、３７℃の温度で１ｍＭとなる濃度であった。また、培地（ＤＭＥＭ）に対する塩化カルシウムの濃度は、３７℃の温度で１００ｍＭとなる濃度であった。ここで、「Ｍ」は、モル濃度（ｍоｌ／Ｌ）を意味する（以下、同様。）。これにより、塩化カルシウムを含有する液状培地が作成された。

次に、ゼラチン溶液とアルギン酸溶液との混合液をガラス製のシリンジに充填した。この混合液を、シリンジに取り付けられた注射針から、上記の塩化カルシウムを含有する液状培地に吐出した。

ここで、混合液中のアルギン酸溶液は、液状培地中のカルシウムイオンによって架橋され、ゲル化する。一方、混合液中のゼラチンは、液状培地中のゲニピンにより架橋されることになる。これにより、紐状のハイドロゲル（足場）が、液状培地中に形成される（図１も参照）。

シリンジから混合液を吐出した後、紐状のハイドロゲルを含む液状培地は、３７℃に維持された状態で所望の時間静置した。

静置後紐状のハイドロゲルを洗浄し、それから、紐状のハイドロゲルを、上記のｈＰＬ液と上記のＭＳＣ用培地との混合物にうつした。ハイドロゲルを収容した培地は、３７℃に維持した状態で所望の時間静置した。ここで、ＭＳＣ用培地に対するｈＰＬ液の濃度は、３７℃の温度で体積比で１：１となるような濃度であった。ここで、上記のｈＰＬ液は、血漿由来もしくは血小板由来の成分、フィブリンノゲン、フィブリン、又はこれらの混合物を含む。

以上の手順により、紐状のハイドロゲルの外面に、血漿由来もしくは血小板由来の成分及び／又はフィブリン含有物が付着した足場が形成される。なお、血漿由来もしくは血小板由来の成分及び／又はフィブリン含有物は、ｈＰＬ液中の成分由来のものである。なお、紐状の足場の直径は、およそ４２０μｍであった。

（細胞の培養）
次に、実施例１にて製造した足場を利用した細胞の培養方法について説明する。まず、以下の細胞、材料、試薬を準備した。
・前述のように製造された紐状の足場
・ヒト骨髄由来間葉系幹細胞：Human Mesenchymal Stem Cells from Bone Marrow (hMSC-BM) （Promo Cell社製「C-12974」）
・培地（間葉系幹細胞増殖培地2：Mesenchymal Stem Cell Growth Medium 2 (Ready-to-use)：C-28009）

前述した紐状の足場を、上記のＭＳＣ用培地にうつした。この培地中に分散したヒト骨髄由来間葉系幹細胞を播種した。播種した細胞の数は、４．０×１０^５ｃｅｌｌｓである。なお、培地を収容する容器は、細胞非接着性のものである。

この条件で表１に示す日数、細胞を培養した。なお、２日ごとに全量の培地を交換した。交換後に使用する培地は、交換前に使用する培地と同じである。なお、足場に接着していない細胞が存在する場合、培地の上清を遠心することによって接着していない細胞を回収した。回収した細胞は、培地交換後に、再び培地中に播種した。

（細胞の回収）
前述の足場を利用して培養した細胞の回収方法について説明する。まず、細胞が付着した紐状のハイドロゲル（足場）を、培地中から取り出し、EDTA/PBS溶液と細胞分散用酵素溶液（Tryple）とを混合した回収液に入れる。回収液に足場を投入した状態で、３７℃で５分間インキュベートし、足場を溶解させるとともに細胞を分散させた。

次に、３７℃で３分間さらにインキュベートし、足場の形状が視認できなくなったら、回収液を５分間遠心する。その後、回収液の上清を捨て、培地で懸濁し、回収した細胞をトリパンブルー染色し、生細胞の数をカウントした。

［実施例２］
実施例２に係る足場及びその製造方法は、次に記載した点を除き実施例１と同じである。実施例２では、細胞の培養中に、ＭＳＣ用培地中に、上記のｈＰＬ液（AventaCell, UltraGRO-PURE:HPCHXCRL50)）を導入した。ＭＳＣ用培地に対するｈＰＬ液の濃度は、３７℃の温度で１０体積パーセントに相当する濃度である。その他の事項については、実施例１と同様である。

［参考例１］
参考例１に係る足場は、紐状のハイドロゲルの外面に血漿由来もしくは血小板由来の成分及び／又はフィブリン含有物を付着させないことを除き、実施例１とほぼ同様である。したがって、参考例１では、実施例１と同様に紐状のハイドロゲルを作成した後に、紐状のハイドロゲルをｈＰＬ液には投入しない。その他の事項については、実施例１と同様である。

［参考例２］
参考例２に係る足場及びその製造方法は、次に記載した点を除き参考例１と同じである。参考例２では、細胞の培養中に、ＭＳＣ用培地中に、上記のｈＰＬ液（AventaCell, UltraGRO-PURE:HPCHXCRL50)）を導入した。ＭＳＣ用培地に対するｈＰＬ液の濃度は、３７℃の温度で１０体積パーセントに相当する濃度である。その他の事項については、参考例１と同様である。

実施例１、実施例２、参考例１及び参考例２に関する細胞の培養の結果が、以下の表１に示されている。

実施例１、実施例２及び参考例１における細胞の増殖率は、９倍以上であり、参考例１における細胞の増殖率よりも大きかった。また、実施例１及び実施例２おける細胞の増殖率は、参考例２における細胞の増殖率よりもわずかに大きかった。同様に、実施例１及び実施例２における細胞培養の倍加時間は、参考例１及び参考例２の倍加時間よりも改善されている。これは、紐状のハイドロゲルの外面に血漿由来もしくは血小板由来の成分及び／又はフィブリン含有物を付着させた足場が、細胞の培養により適していることを示している。

また、実施例１と実施例２の比較、又は実施例１と参考例２の比較により、細胞培養中の培地にヒト血小板溶解物（ｈＰＬ）を導入しなくても、紐状のハイドロゲルの外面に血漿由来もしくは血小板由来の成分及び／又はフィブリン含有物を付着させた足場を利用することによって、細胞の増殖率を十分に高めることができることがわかる。すなわち、紐状のハイドロゲルの外面に血漿由来もしくは血小板由来の成分及び／又はフィブリン含有物を付着させた足場を利用すれば、細胞の培養中の培地にヒト血小板溶解物を導入する必要がなくなる。これにより、比較的高価なヒト血小板溶解物の使用量を削減することが可能になる。

［実施例３］
実施例３は、実施例１で回収された細胞の継代培養に相当する。具体的には、次の説明を除き、実施例１と同様に足場を製造し、実施例１と同様に細胞を培養する。ただし、実施例３において播種した細胞は、実施例１において回収した細胞である。実施例３において播種した細胞の数は、４．０×１０^５ｃｅｌｌｓである。

［実施例４］
実施例４は、実施例２で回収された細胞の継代培養に相当する。具体的には、次の説明を除き、実施例２と同様に足場を製造し、実施例２と同様に細胞を培養する。すなわち、実施例４では、細胞の培養中に、ＭＳＣ用培地にヒト血小板溶解物が導入される。ただし、実施例４において播種した細胞は、実施例２において回収した細胞である。実施例４において播種した細胞の数は、４．０×１０^５ｃｅｌｌｓである。

［参考例３］
参考例３は、参考例１で回収された細胞の継代培養に相当する。具体的には、次の説明を除き、参考例１と同様に足場を製造し、参考例１と同様に細胞を培養する。ただし、参考例３において播種した細胞は、参考例１において回収した細胞である。参考例３において播種した細胞の数は、４．０×１０^５ｃｅｌｌｓである。

［参考例４］
参考例４は、参考例２で回収された細胞の継代培養に相当する。具体的には、次の説明を除き、参考例２と同様に足場を製造し、参考例２と同様に細胞を培養する。すなわち、参考例４では、細胞の培養中に、ＭＳＣ用培地にヒト血小板溶解物が導入される。ただし、参考例４において播種した細胞は、参考例２において回収した細胞である。参考例４において播種した細胞の数は、４．０×１０^５ｃｅｌｌｓである。

実施例３、実施例４、参考例３及び参考例４に関する細胞の培養の結果が、以下の表２に示されている。

実施例３及び実施例４のように、血漿由来もしくは血小板由来の成分及び／又はフィブリン含有物が付着したハイドロゲルの足場を利用した場合、細胞の継代培養においても３倍以上の増殖率が維持された。一方、比較例３及び比較例４では、回収された細胞の数が減っていた。これは、実施例３及び実施例４の足場が、細胞の培養により適していることを示している。

［実施例５］
実施例５は、実施例３で回収された細胞の再継代培養に相当する。具体的には、次の説明を除き、実施例１と同様に足場を製造し、実施例１と同様に細胞を培養する。ただし、実施例５において播種した細胞は、実施例３において回収した細胞である。実施例５において播種した細胞の数は、４．０×１０^５ｃｅｌｌｓである。

実施例５において、細胞を５日間培養した後に、回収された細胞の数は、１．６×１０^６ｃｅｌｌｓであり、約４倍の増殖率が維持されていた。このように、血漿由来もしくは血小板由来の成分及び／又はフィブリン含有物が付着したハイドロゲルの足場を利用した場合、細胞の再継代培養においても高い増殖率が維持された。

間葉系幹細胞は、接着性細胞であり、実施例１～５の足場に接着しやすいことがわかった。したがって、ハイドロゲルの外面に血漿由来もしくは血小板由来の成分及び／又はフィブリン含有物を付着させた足場を利用することによって接着性細胞の培養の効果を改善させることができる。

また、前述したように、足場を紐形状にすることにより、培養中の足場の取り扱いが容易になり、かつ液状培地中での３次元培養が容易になる。ただし、接着性細胞の培養の効果という観点では、足場は、紐状に限定されず、例えば球状であってもよい。

［実施例６］
（足場の製造）
次に、実施例６について、詳細に説明する。実施例６において製造される足場は、図４及び図５で示すような管状の足場である。まず、試薬として以下のものを準備した。
・アルギン酸ナトリウム（株式会社キミカ製「I-3G」）
・ヒト骨髄由来間葉系幹細胞：Human Mesenchymal Stem Cells from Bone Marrow (hMSC-BM) （Promo Cell社製「C-12974」）
・ダルベッコ改変イーグル培地：DMEM（シグマアルドリッチ製「D6046」）
・ヒト血小板溶解物：Human Platelet Lysate (STEMCELL TECHNOLOGIES,06960)

まず、細胞懸濁液、アルギン酸ナトリウム溶液、塩化カルシウム水溶液を準備した。アルギン酸ナトリウム溶液は、生理食塩水に上記のアルギン酸ナトリウムを加え、攪拌することによって生成された。生理食塩水に対するアルギン酸ナトリウムの濃度は、１．４４質量パーセント濃度であった。

細胞懸濁液は、前記のヒト骨髄由来間葉系幹細胞と、前記のダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）と前記のウシ胎児血清（ＦＢＳ）の混合物と、前記のヒト血小板溶解物と、を含む。具体的には、ＤＭＥＭとＦＢＳとを、３７℃の温度で体積比で９：１の割合となるように混合した。それから、ＤＭＥＭとＦＢＳとの混合物に対して上記のヒト血小板溶解物を、３７℃の温度で体積比で７：３の割合となるように混合した。それから、室温で１０～１２０分の間静置した。次に、ＤＭＥＭとＦＢＳとヒト血小板溶解物との混合物に、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞を導入することによって細胞懸濁液を生成した。懸濁液中のヒト骨髄由来間葉系幹細胞の密度は、２×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬであった。なお、ＦＢＳは、アルブミンを豊富に含んでいる。

これらの材料を用いて図７及びそれに伴う説明で示した足場の作成方法に従い、細胞懸濁液を覆う管状のハイドロゲル足場を作成した。すなわち、細胞懸濁液の流れと、細胞懸濁液の流れの周囲のアルギン酸ナトリウム溶液の流れと、アルギン酸ナトリウム溶液の流れの周囲の塩化カルシウム水溶液の流れとを形成し、これらの流れを生理食塩水中に吐出した（図７も参照）。アルギン酸ナトリウム溶液は、塩化カルシウム水溶液と接触することによって架橋され、アルギン酸ゲルを形成する。これにより、細胞懸濁液を包んだ細長い管状のハイドロゲルが生理食塩水中に生成された。管状のハイドロゲル中の細胞の数は、おおむね２×１０^４ｃｅｌｌｓであった。生成された管状のハイドロゲルの断面の直径は４００～５００μｍであった。

細胞懸濁液を包んだ細長い管状のハイドロゲルは、生理食塩水中で所望の時間静置された。次に、細胞懸濁液を包んだ筒状のハイドロゲルを液体培地中に移し、管状のハイドロゲル内で細胞を培養した。これらの過程において、ヒト血小板溶解物由来の不溶成分、具体的には血漿由来もしくは血小板由来の成分及び／又はフィブリン含有物が、ハイドロゲルの内側に付着したと考えられる。このようにして、細胞培養用の足場が製造された。

足場内でのヒト骨髄由来間葉系幹細胞の培養は、液体培地中で、３７℃で表３に示される日数行われた。この液体培地は、前述のダルベッコ改変イーグル培地：DMEM（シグマアルドリッチ製「D6046」）である。なお、この液体培地は、２日ごとに交換された。交換後に使用する培地は、交換前に使用する培地と同じである。

（細胞の回収）
前述の足場を利用して培養した細胞の回収方法について説明する。まず、細胞を内包した管状のハイドロゲル（足場）を、EDTA/PBS溶液によって除去し、遠心分離によって細胞を回収した。それから、回収した細胞の数をトリパンブルー染色し、生細胞をカウントした。なお、細胞の培養開始から４日目に、本方法にて細胞を回収し、回収した細胞の継代培養を行った。継代培養では、回収した細胞を用いて上記方法と同様に管状の足場内で培養した。

［実施例７］
実施例７に係る足場の製造方法及び細胞の培養方法は、次の説明を除き、実施例６と同様である。ただし、実施例７では、細胞懸濁液の調製時に、ＤＭＥＭとＦＢＳとの混合物に対してヒト血小板溶解物を、３７℃の温度で体積比で４：６の割合となるように混合した。それ以外の工程は、実施例６と同じである。

［実施例８］
実施例８に係る足場の製造方法及び細胞の培養方法は、次の説明を除き実施例６と同様である。ただし、実施例８では、細胞懸濁液の調製時に、ＤＭＥＭとＦＢＳとの混合物を使用することなくヒト血小板溶解物を用いた。それ以外の工程は、実施例６と同じである。

［参考例５］
参考例５に係る足場の製造方法及び細胞の培養方法は、次の説明を除き実施例６と同様である。ただし、参考例５では、細胞懸濁液の調製時に、ＤＭＥＭとＦＢＳとの混合物にヒト血小板溶解物を混合しなかった。すなわち、細胞懸濁液は、ＤＭＥＭとＦＢＳとの混合物にヒト骨髄由来間葉系幹細胞を導入することによって形成された。その他の工程については、実施例６と同じである。

実施例６、実施例７、実施例８及び参考例５に関する細胞の培養の結果が、以下の表３に示されている。

実施例６～８における細胞の増殖率は、参考例５における細胞の増殖率よりも高かった。したがって、細胞懸濁液にヒト血小板溶解物を混合した方が細胞の増殖率が高いことがわかった。言い換えると、管状のハイドロゲルの内側に血漿由来もしくは血小板由来の成分又はフィブリン含有物を付着させた足場は、接着性細胞の培養により適していることがわかった。

また、実施例６～８を参照すると、足場を製造する際に細胞懸濁液中のヒト血小板溶解物の濃度を高くするほど、細胞の増殖率が高くなり、培化時間が短くなることがわかる。

［実施例９］
実施例９に係る足場の製造方法及び細胞の培養方法は、次の説明を除き実施例６と同様である。ただし、実施例９では、細胞懸濁液の調製時に、ＤＭＥＭとＦＢＳとの混合物に対してヒト血小板溶解物を、３７℃の温度で体積比で９：１の割合となるように混合した。さらに、細胞の培養時に用いられる液体培地を、前述のＤＭＥＭとＦＢＳとの混合物に対してｈＰＬ液（AventaCell, UltraGRO-PURE: HPCHXCRL50)）に混合した物とした。ここで、ＤＭＥＭとＦＢＳとの混合物に対してｈＰＬ液を、３７℃の温度で体積比で９：１の割合となるように混合した。それ以外の工程は、実施例６と同じである。なお、ｈＰＬ液は、フィブリノゲン低減処理を施されたものであるものの、フィブリノゲンを含有する溶液である。

［実施例１０］
実施例１０に係る足場の製造方法及び細胞の培養方法は、次の説明を除き実施例９と同様である。ただし、実施例１０では、細胞懸濁液の調製時に、ＤＭＥＭとＦＢＳとの混合物に対してヒト血小板溶解物を、３７℃の温度で体積比で７：３の割合となるように混合した。それ以外の工程は、実施例９と同じである。

［実施例１１］
実施例１１に係る足場の製造方法及び細胞の培養方法は、次の説明を除き実施例９と同様である。ただし、実施例１１では、細胞懸濁液の調製時に、ＤＭＥＭとＦＢＳとの混合物に対してヒト血小板溶解物を、３７℃の温度で体積比で４：６の割合となるように混合した。それ以外の工程は、実施例９と同じである。

［実施例１２］
実施例１２に係る足場の製造方法及び細胞の培養方法は、次の説明を除き実施例９と同様である。ただし、実施例１２では、細胞懸濁液の調製時に、ＤＭＥＭとＦＢＳとを使用することなくヒト血小板溶解物を用いた。それ以外の工程は、実施例９と同じである。

［参考例６］
参考例６に係る足場の製造方法及び細胞の培養方法は、次の説明を除き実施例９と同様である。ただし、参考例６では、細胞懸濁液の調製時に、ＤＭＥＭとＦＢＳとの混合物にヒト血小板溶解物を混合しなかった。すなわち、細胞懸濁液は、ＤＭＥＭとＦＢＳとの混合物に対してヒト骨髄由来間葉系幹細胞を導入することによって形成された。その他の工程については、実施例９と同じである。

実施例９～１２及び参考例６に関する細胞の培養の結果が、以下の表４に示されている。

実施例９～１２における細胞の増殖率は、参考例６における細胞の増殖率よりも大きかった。したがって、細胞懸濁液にヒト血小板溶解物を混合した方が細胞の増殖率が高いことがわかった。言い換えると、管状のハイドロゲルの内側に血漿由来もしくは血小板由来の成分又はフィブリン含有物を付着させた足場は、接着性細胞の培養により適していることがわかった。

また、実施例９～１２を参照すると、足場を製造する際に細胞懸濁液中のヒト血小板溶解物の濃度を高くするほど、細胞の増殖率が高くなり、培化時間が短くなることがわかる。

さらに、実施例６～８と実施例１０～１２を比較すると、細胞の培養時に使用する液体培地中のフィブリノゲンの濃度を高めることによって、細胞の増殖率がより高くなり、培化時間がより短くなることがわかる。

なお、管状のハイドロゲルを有する足場を製造する際、及び当該足場を用いて間葉系幹細胞を培養する際に、フィブリンを特異的に分解するナットウキナーゼで処理した場合、間葉系幹細胞が管状の足場の内面に接着して増殖する様子は確認できなかった。すなわち、前述の実施例において、少なくともフィブリンが、細胞の接着及び増殖に寄与していることがわかる。

［実施例１３］
（足場の製造）
次に、実施例１３について、詳細に説明する。実施例１３において製造される足場は、図４及び図５で示すような管状の足場である。まず、試薬として以下のものを準備した。
・アルギン酸ナトリウム（株式会社キミカ製「I-1G」）
・ヒト骨髄由来間葉系幹細胞：Human Mesenchymal Stem Cells from Bone Marrow (hMSC-BM) （Promo Cell社製「C-12974」）
・ＭＳＣ用培地（間葉系幹細胞増殖培地2：Mesenchymal Stem Cell Growth Medium 2 (Ready-to-use)：C-28009）
・フィブリノゲン：ヒト血漿由来（富士フイルム和光純薬社製：JAN 4987481365186）
・リン酸緩衝食塩水：ＰＢＳ（富士フイルム和光純薬社製：JAN 4987481628489）

まず、細胞懸濁液、アルギン酸ナトリウム溶液、塩化カルシウム水溶液を準備した。アルギン酸ナトリウム溶液は、生理食塩水に上記のアルギン酸ナトリウムを加え、攪拌することによって生成された。生理食塩水に対するアルギン酸ナトリウムの濃度は、０．９９質量パーセント濃度であった。

細胞懸濁液は、以下のように調整した。まず、上記のフィブリノゲンを溶解させた上記のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を準備した。ここで、リン酸緩衝食塩水に対するフィブリノゲンの濃度は、３７℃の温度で５ｍｇ／ｍＬとなる濃度であった。次に、フィブリノゲン含有リン酸緩衝食塩水に１０^５～１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの密度でヒト骨髄由来間葉系幹細胞を導入することによって、細胞懸濁液を生産した。

次に、図７及びそれに伴う説明で示した足場の作成方法に従い、細胞懸濁液を覆う管状のハイドロゲル足場を作成した。すなわち、前述の細胞懸濁液の流れと、細胞懸濁液の流れの周囲のアルギン酸ナトリウム溶液の流れと、アルギン酸ナトリウム溶液の流れの周囲の塩化カルシウム水溶液の流れとを形成し、これらの流れを生理食塩水中に吐出した（図７も参照）。アルギン酸ナトリウム溶液は、塩化カルシウム水溶液と接触することによって架橋され、アルギン酸ゲルを形成する。これにより、前述のように生産された細胞懸濁液を包んだ細長い管状のハイドロゲルが生理食塩水中に生成された。

次に、生成された細長い管状のハイドロゲルを、トロンビンを添加した生理食塩水中に移し、３７℃で３０分間静置した。ここで、生理食塩水に対するトロンビンの濃度は、管状のハイドロゲルの内側のフィブリノゲンを十分にフィブリンに変化させられる程度あればよい。

上記の工程により、管状のハイドロゲルの内側にフィブリンを有する足場が形成された。なお、管状のハイドロゲルの内側のフィブリンの濃度は、管状のハイドロゲルの内側に導入したフィブリノゲンの濃度に概ね対応すると考えられる。

次に、管状のハイドロゲルの内側にフィブリンを有する足場を上記のＭＳＣ用培地に漬けて、足場の内部に封入した上記のヒト骨髄由来間葉系幹細胞を７日間培養した。なお、培養中、ＭＳＣ用培地を、２～３日ごとに交換した。

（細胞の回収）
前述の足場を利用して培養した細胞の回収方法について説明する。まず、ナットウキナーゼを添加したEDTA/PBS溶液によって管状のハイドロゲルとともにフィブリンを溶解する。それから、足場の形状が十分に崩れたのを確認した後、遠心分離によって細胞を回収した。それから、回収した細胞の数を血球計算盤で計測した。

［実施例１４］
実施例１４に係る足場の製造方法及び細胞の培養方法は、次の説明を除き実施例１３と同様である。実施例１４では、細胞懸濁液の調整時に、リン酸緩衝食塩水に対するフィブリノゲンの濃度を、３７℃の温度で１０ｍｇ／ｍＬとなる濃度にした。それ以外の点については、実施例１３と同じである。実施例１４において、管状のハイドロゲルの内側のフィブリンの濃度は、管状のハイドロゲルの内側に導入したフィブリノゲンの濃度に概ね対応すると考えられる。

［実施例１５］
実施例１５に係る足場の製造方法及び細胞の培養方法は、次の説明を除き実施例１３と同様である。実施例１５では、細胞懸濁液の調整時に、リン酸緩衝食塩水に対するフィブリノゲンの濃度を、３７℃の温度で２５ｍｇ／ｍＬとなる濃度にした。それ以外の点については、実施例１３と同じである。実施例１５において、管状のハイドロゲルの内側のフィブリンの濃度は、管状のハイドロゲルの内側に導入したフィブリノゲンの濃度に概ね対応すると考えられる。

［実施例１６］
実施例１６に係る足場の製造方法及び細胞の培養方法は、次の説明を除き実施例１３と同様である。実施例１６では、細胞懸濁液の調整時に、リン酸緩衝食塩水に対するフィブリノゲンの濃度を、３７℃の温度で５０ｍｇ／ｍＬとなる濃度にした。それ以外の点については、実施例１３と同じである。実施例１６において、管状のハイドロゲルの内側のフィブリンの濃度は、管状のハイドロゲルの内側に導入したフィブリノゲンの濃度に概ね対応すると考えられる。

［参考例７］
参考例７に係る足場の製造方法及び細胞の培養方法は、次の説明を除き実施例１３と同様である。参考例７では、細胞懸濁液の調整時に、リン酸緩衝食塩水にフィブリノゲンを添加しなかった。それ以外の点については、実施例１３と同じである。そのため、参考例７では、管状のハイドロゲルの内側にフィブリンは析出しなかった。

図８は、実施例１３～１６及び参考例７において培養した細胞の増殖率を示すグラフである。なお、図８のグラフにおいて、フィブリン濃度が０というケースは、参考例７に相当する。また、図８に示す増殖率は、７日後に回収した細胞の数を、足場を製造した時点での細胞数で割ることによって算出された値である。

参考例７では、管状のハイドロゲル内の細胞は丸く凝集し、細胞数は減少した。一方で、実施例１３～１６では、参考例７に比べて、細胞が増殖した。したがって、管状のハイドロゲルの内側にフィブリンを付着させた足場は、細胞の培養にとってより適していることがわかった。また、管状のハイドロゲルの内側のフィブリンの濃度、言い換えると細胞懸濁液調整時のフィブリノゲンの濃度が少なくとも５～５０ｍｇ／ｍＬである場合、フィブリノゲンを含まない管状のハイドロゲルよりも著しく優れていることがわかった。

なお、実施例９～１２で説明したように、フィブリノゲン含有リン酸緩衝食塩水をトロンビンで処理することによって管状のハイドロゲルの内側にフィブリンを析出させる場合、条件によってはフィブリンが均一にコーティングされにくくなることがあった。これに対して、実施例６～１２で説明したように、ヒト血小板溶解物（ｈＰＬ）を利用して管状のハイドロゲルの内側に血漿由来もしくは血小板由来の成分又はフィブリン含有物を付着させる場合、コーティングが容易であり、細胞の培養により適していた。

したがって、血漿由来もしくは血小板由来の成分、フィブリンノゲン、フィブリン、又はこれらの混合物を含むヒト血小板溶解物（ｈＰＬ）を利用することによって管状のハイドロゲルの内側に、血漿由来もしくは血小板由来の成分又はフィブリン含有物を付着させることがより好ましい。ただし、実施例９～１２で説明したように、フィブリノゲンを含有する溶液をトロンビンで処理することによって管状のハイドロゲルの内側にフィブリンを析出させる態様も本発明の範囲に含まれることに留意されたい。

前述した実施形態及び／又は実施例や、以下で追加する説明等により、少なくとも以下のような発明が本明細書に明示されていることが理解できる。

「付記１」
細胞を培養するための足場であって、
ハイドロゲルと、
前記ハイドロゲルに付着した血漿由来もしくは血小板由来の成分又はフィブリン含有物と、を有する、足場。
ここで、血漿由来もしくは血小板由来の成分は、前述したとおりである。フィブリン含有物は、前述したとおり、フィブリンそのもの、例えばフィブリンポリマーであってもよく、フィブリンとその他のポリマーの混合物であってもよい。

「付記２」
前記ハイドロゲルは、紐状、管状、球状、又は球殻状である、付記１に記載の足場。

「付記３」
前記血漿由来もしくは前記血小板由来の成分又は前記フィブリン含有物は、前記ハイドロゲルの内側又は外側に設けられている、付記２に記載の足場。

「付記４」
前記血漿由来もしくは前記血小板由来の成分又は前記フィブリン含有物は、ヒト血小板溶解物由来の成分を含む、付記１から３のいずれか１項に記載の足場。

「付記５」
前記ハイドロゲルは、アルギン酸ゲルを含む、付記１から４のいずれか１項に記載の足場。

「付記６」
前記ハイドロゲルは、アルギン酸ゲルと、前記アルギン酸ゲルに混合されたゼラチンと、を含む、付記１から５のいずれか１項に記載の足場。

「付記７」
細胞を培養するための足場であって、
ハイドロゲルと、
前記ハイドロゲル上に設けられたフィブリンポリマーと、を有する、足場。
ここで、ハイドロゲルは例えば紐状、管状、球状、又は球殻状であってよい。この場合、フィブリンポリマーは、紐状又は球状のハイドロゲルの外表面上、又は管状又は球殻状のハイドロゲルの内側に設けられていてよい。

「付記８」
前記ハイドロゲル上に設けられたフィブリンポリマー及びアルブミンを有する、付記７に記載の足場。
ここで、ハイドロゲルは例えば紐状、管状、球状、又は球殻状であってよい。この場合、フィブリンポリマー及びアルブミンは、紐状又は球状のハイドロゲルの外表面上、又は管状又は球殻状のハイドロゲルの内側に設けられていてよい。

「付記９」
付記１から８のいずれか１項に記載の足場と、
前記足場に接着した細胞と、を有する、細胞培養物。
ここで、足場に接着した細胞の種類については、既に列挙したとおりである。

「付記１０」
前記細胞は、接着性細胞である、付記９に記載の細胞培養物。

「付記１１」
前記細胞は、間葉系幹細胞である、付記１０に記載の細胞培養物。

「付記１２」
付記１から８のいずれか１項に記載の足場に細胞を接着させて前記細胞を培養することを含む、細胞培養方法。

「付記１３」
細胞を培養するための足場の製造方法であって、
血漿由来もしくは血小板由来の成分、フィブリンノゲン、フィブリン、又はこれらの混合物を含む懸濁液をハイドロゲルに接触させることを含む、足場の製造方法。
好ましくは、懸濁液は、フィブリノゲンを含む。この場合、懸濁液中のフィブリノゲンの導入量、例えばリン酸緩衝食塩水に対するフィブリノゲンの導入量は、例えば１ｍｇ／ｍＬ以上、好ましくは３ｍｇ／ｍＬ以上、より好ましくは５ｍｇ／ｍＬ以上であってよい。フィブリノゲンの導入量の上限は、特に制限されないが、例えば３００ｍｇ／ｍＬであってよい。なお、懸濁液中のフィブリノゲンにトロンビンを作用させるによってフィブリンポリマーを形成してもよい。

「付記１４」
前記懸濁液はフィブリノゲン及びアルブミンを含む、付記１３に記載の足場の製造方法。

「付記１５」
ハイドロゲル前駆体をゲル化して前記ハイドロゲルを形成することと、
前記懸濁液中に前記ハイドロゲルを漬けることと、を含む、付記１３又は１４に記載の足場の製造方法。

「付記１６」
前記懸濁液を流しつつ、前記懸濁液のまわりでハイドロゲル前駆体を流すことと、
前記ハイドロゲル前駆体をゲル化し、前記懸濁液を覆う管状の前記ハイドロゲルを形成することと、を含む、付記１３又は１４に記載の足場の製造方法。

「付記１７」
前記懸濁液は、ヒト血小板溶解物を含む、付記１３から１６のいずれか１項に記載の足場の製造方法。

「付記１８」
前記ハイドロゲル前駆体は、アルギン酸溶液を含む、付記１３から１７のいずれか１項に記載の足場の製造方法。

「付記１９」
付記９から１１のいずれか１項に記載の細胞培養物から前記足場を除去することによって得られた細胞集団。

「付記２０」
付記９から１１のいずれか１項に記載の細胞培養物における前記足場に接着された状態の前記細胞、付記９から１１のいずれか１項に記載の細胞培養物における前記足場から回収した細胞、及び付記１９に記載の細胞集団のうちの少なくとも１つによって生成された生体物質。
ここで、生体物質は、細胞によって生成される任意の物質であってよい。生体物質は、例えば核酸、タンパク質又は多糖のような高分子であってよい。このような生体物質は、前述した細胞培養物における細胞や細胞集団の培養中に生成され得る。

また、足場に接着された状態の細胞は、足場の外表面に付着した細胞だけでなく、足場を形成するハイドロゲルに封入された状態の細胞をも含む。ハイドロゲルが例えば管状又は球殻状である場合、生成物質は、管状又は球殻状のハイドロゲル内に封入された細胞によって生成された物質を含む。

上述したように、実施形態及び実施例を通じて本発明の内容を開示したが、この開示の一部をなす論述及び図面は、本発明を限定するものであると理解すべきではない。この開示から当業者には様々な代替の実施形態、実施例及び運用技術が明らかとなる。したがって、本発明の技術的範囲は、上述の説明から妥当な特許請求の範囲に係る発明特定事項によってのみ定められるものである。

Claims (6)

1. 接着性細胞を培養するための足場の製造方法であって、
   ヒト血小板溶解物を含む懸濁液を流しつつ、前記懸濁液のまわりにアルギン酸溶液を流すことと、
   前記アルギン酸溶液をゲル化することによってハイドロゲルを形成するとともに、前記ハイドロゲルの内面に、血漿由来もしくは血小板由来の成分又はフィブリン含有物を析出させることと、を含み、
   前記懸濁液中の前記ヒト血小板溶解物の割合は、３７℃の温度で１０体積％以上である、足場の製造方法。
2. 前記ヒト血小板溶解物を利用して前記ハイドロゲルの内面にフィブリンポリマーを析出させることを含む、請求項１に記載の足場の製造方法。
3. 前記懸濁液中の前記ヒト血小板溶解物の割合は、３７℃の温度で３０体積％以上である、請求項１又は２に記載の足場の製造方法。
4. 前記懸濁液は、接着性細胞を含む、請求項１から３のいずれか１項に記載の足場の製造方法。
5. 前記接着性細胞は間葉系幹細胞である、請求項４に記載の足場の製造方法。
6. 請求項１から５のいずれか１項に記載の足場の製造方法により製造された足場を用いて、前記ハイドロゲルの内側で接着性細胞を培養することを含む、培養方法。