JP7766040B2 - 環状ペプチド - Google Patents

Description

本発明は、環状化ペプチド、並びに神経変性性疾患、例えばアルツハイマー病の防止及び治療のためのワクチンとしてのその使用に関する。

アルツハイマー病（ＡＤ）は、アミロイドβ（Ａβ）タンパク質で構成される細胞外沈着物の存在によって特徴づけられる、進行性肺変性疾患である。全長Ａβ１－４２（配列番号１８）及びＡβ１－４０（配列番号１９）、Ｎ切除ピログルタメートＡβｐＥ３－４２（配列番号２０）及びＡβ４－４２（配列番号２１）が、アミロイドβタンパク質の主な変異体である。

アミロイドβタンパク質は、凝集し、アミロイド原線維を形成する傾向がある。アミロイド原線維は、老人斑に見られるＡβの巨大な不溶性ポリマーであり、アルツハイマー病に典型的なニューロン損失及び認知症の主要な誘発要因である。しかし、アルツハイマー病の進行において、斑中に沈降しているＡβではなく可溶性Ａβオリゴマーの役割に関する証拠もまた増えつつある。可溶性オリゴマーは、非原線維構造を持ち、水溶液中で安定であり、高速遠心分離後であってさえ可溶性のままである。Ａβ斑は、ＡＤ患者における臨床的症状に関しては相関が乏しいことが示されてきている一方、可溶性オリゴマーは、シナプス損失（非特許文献１）、神経原線維タングル（非特許文献２）及び臨床表現型（非特許文献３）に関する優れた予測因子であることが示唆されている。さらに、多くのＡＤマウスモデルにおける記憶障害及び病的変化は、斑沈着開始のかなり前に生じる（非特許文献４）。特に、Ａβ三量体又は四量体は、ＡＤ病理開始時に最も有害なＡβペプチドであることが知られている。こうしたものとして、Ａβの低分子量（ＬＭＷ）オリゴマーは、ＡＤ等のアミロイドβ関連疾患の治療のターゲットと見られてきている。

低分子量オリゴマーを中和することを目的としてこれらのオリゴマーをターゲットとする抗体が開発されてきている。低分子量（ＬＭＷ）ＡβｐＥ３－４２を検出する抗体９Ｄ５に関して受動免疫が立証されている（非特許文献５、及び特許文献１）。ネズミ抗アミロイドβ（Ａβ）抗体ＮＴ４Ｘ－１６７が、Ａβ４－４０アミロイドペプチドに対して最初に作製され、Ｎ切除アミロイドペプチドＡβｐＥ３－４２及びＡβ４－４２に特異的に結合するが、アミロイドペプチドＡβ１－４２には結合しないことが報告されている（非特許文献６）。ＮＴ４Ｘ－１６７を使用した受動免疫は、アルツハイマーマウスモデルにおいて療法的に有益であることが示されている（非特許文献７、特許文献２）。臨床適用に関して、例えばアルツハイマー病（ＡＤ）の治療において有用であるＮＴ４Ｘのヒト化型もまた、開発されてきている（特許文献３）。

アルツハイマー病に関する能動免疫アプローチもまた提唱されてきている。例えば、頭尾（head-to-tail）環状化を通じて形成された環状ペプチドを含むＡβ由来ペプチドを開示する特許文献４に記載される通りである。Ａβの異なる領域に基づく直鎖ペプチドの使用もまた提唱されてきており、例えば特許文献５に記載されるものがある。特許文献５は、免疫原性構築物の一部として、Ａβに基づく直鎖ペプチドを使用する、ＡβのＮ末端エピトープをターゲットとする能動免疫アプローチを記載している。しかし、こうしたアプローチは、低分子量オリゴマーに対する抗体を特異的に生成することはない。

したがって、能動免疫のために使用され得る化合物は、アルツハイマー病の治療において、特にＡＤ進行の初期段階をターゲットとする治療において、有用であろう。

国際公開第２０１１／１５１０７６号 国際公開第２０１３／１６７６８１号 国際公開第２０２０／０７０２２５号 国際公開第２００６／０６０９７１８号 国際公開第２０１４／１４３０８７号

Lue LF et al, Am J Pathol 1999, 155:853-862 McLean CA, et al, Ann Neurol 1999, 46:860-866 Snowdon DA: Aging and Alzheimer's disease: lessons from the Nun Study. Gerontologist 1997, 37:150-156 Bayer TA and, Wirths O. Front Aging Neurosci 2010, 2:1-10 Wirths et al. (2010) J. Biol. Chem. 285, 41517-41524 Antonios et al Acta Neuropathol. Commun. (2013) 6 1 56 Antonios et al Scientific Reports 5 17338; 2015

本発明は、一般的に、アミロイドβ（Ａβ）タンパク質のアミノ酸残基１～１４に基づく特定の環状ペプチドであって、Ａβタンパク質の低分子量オリゴマーに特異的に結合する抗体に、好ましくは特異的に結合する、環状ペプチドに関する。

したがって、第１の態様において、本発明は、式（Ｉ）（配列番号１）：
Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３ＦＸ_４ＨＤＳＧＸ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８Ｈ （Ｉ）
の配列を有するアミノ酸配列又はその変異体を含む環状ペプチドであって、
式中、
Ｘ_１は存在しないか又は任意のアミノ酸であり、
Ｘ_２はアラニン又はシステインであり、
Ｘ_３はグルタミン酸又はシステインであり、
Ｘ_４はアルギニン又はシステインであり、
Ｘ_５はチロシン又はシステインであり、
Ｘ_６はグルタミン酸又はシステインであり、
Ｘ_７はバリン又はシステインであり、
Ｘ_８はヒスチジン又はシステインであり、
Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３及びＸ_４のうちの１つのみがシステインであり、Ｘ_５、Ｘ_６、Ｘ_７及びＸ_８のうちの１つのみがシステインであり、ペプチドが１位、２位、３位、又は５位のシステイン残基及び１０位、１１位、１２位又は１３位のシステイン残基を通じて環状化されている、環状ペプチドに関する。好ましくは、Ｘ_１は存在し、より好ましくは、Ｘ_１はプロリン、アスパラギン酸、又はシステインであり、より好ましくはシステイン又はアスパラギン酸である。好ましくは、配列中に存在する２つのシステイン残基間には少なくとも７つのアミノ酸があり、より好ましくは、配列中に存在する２つのシステイン残基間には、７～１１、更により好ましくは８又は１１のアミノ酸残基がある。

１つの実施の形態において、本発明は、上述のような式（Ｉ）の配列を含む環状ペプチドであって、このペプチドが、５位及び１２位の両方又は３位及び１０位の両方にはシステイン残基を含まない、環状ペプチドに関する。

１つの実施の形態において、Ｘ_１は存在しないか又は任意のアミノ酸であり、
ａ）Ｘ_１はシステインであり、Ｘ_２はアラニンであり、Ｘ_３はグルタミン酸であり、Ｘ_４はアルギニンであり、Ｘ_５はチロシンであり、Ｘ_６はグルタミン酸であり、Ｘ_７はバリンであり、Ｘ_８はシステインであるか、
ｂ）Ｘ_２はアラニンであり、Ｘ_３はシステインであり、Ｘ_４はアルギニンであり、Ｘ_５はチロシンであり、Ｘ_６はグルタミン酸であり、Ｘ_７はシステインであり、Ｘ_８はヒスチジンであるか、
ｃ）Ｘ_２はシステインであり、Ｘ_３はグルタミン酸であり、Ｘ_４はアルギニンであり、Ｘ_５はチロシンであり、Ｘ_６はグルタミン酸であり、Ｘ_７はシステインであり、Ｘ_８はヒスチジンであるか、
ｄ）Ｘ_２はシステインであり、Ｘ_３はグルタミン酸であり、Ｘ_４はアルギニンであり、Ｘ_５はシステインであり、Ｘ_６はグルタミン酸であり、Ｘ_７はバリンであり、Ｘ_８はヒスチジンであるか、
ｅ）Ｘ_２はシステインであり、Ｘ_３はグルタミン酸であり、Ｘ_４はアルギニンであり、Ｘ_５はチロシンであり、Ｘ_６はグルタミン酸であり、Ｘ_７はバリンであり、Ｘ_８はシステインであるか、
ｆ）Ｘ_２はシステインであり、Ｘ_３はグルタミン酸であり、Ｘ_４はアルギニンであり、Ｘ_５はチロシンであり、Ｘ_６はシステインであり、Ｘ_７はバリンであり、Ｘ_８はヒスチジンであるか、
ｇ）Ｘ_２はアラニンであり、Ｘ_３はシステインであり、Ｘ_４はアルギニンであり、Ｘ_５はチロシンであり、Ｘ_６はシステインであり、Ｘ_７はバリンであり、Ｘ_８はヒスチジンであるか、
ｈ）Ｘ_２はアラニンであり、Ｘ_３はグルタミン酸であり、Ｘ_４はシステインであり、Ｘ_５はチロシンであり、Ｘ_６はグルタミン酸であり、Ｘ_７はシステインであり、Ｘ_８はヒスチジンであるか、
ｉ）Ｘ_２はアラニンであり、Ｘ_３はシステインであり、Ｘ_４はアルギニンであり、Ｘ_５はシステインであり、Ｘ_６はグルタミン酸であり、Ｘ_７はヒバリンであり、Ｘ_８はヒスチジンであるか、又は、
ｊ）Ｘ_２はアラニンであり、Ｘ_３はシステインであり、Ｘ_４はアルギニンであり、Ｘ_５はチロシンであり、Ｘ_６はグルタミン酸であり、Ｘ_７はバリンであり、Ｘ_８はシステインであり、
ペプチドが、２つのシステイン残基を介して環状化されている。

１つの実施の形態において、環状ペプチドは、式（ＩＩ）（配列番号２）：
Ｘ_１ＡＣＦＲＨＤＳＧＹＥＣＨＨ （ＩＩ）
の配列を有するアミノ酸配列又はその変異体を含み、
式中、ペプチドは３位及び１２位に位置するシステイン残基を介して環状化され、Ｘ_１は上に定義される通りである。好ましくは、Ｘ_１はアスパラギン酸である。

更なる実施の形態において、環状ペプチドは、
ａ）ペプチドが１位及び１３位に位置するシステイン残基を通じて環状化されている、ＣＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＣＨ（配列番号１４）、
ｂ）ペプチドが３位及び１２位に位置するシステイン残基を通じて環状化されている、ＤＡＣＦＲＨＤＳＧＹＥＣＨＨ（配列番号４）、
ｃ）ペプチドが２位及び１２位に位置するシステイン残基を通じて環状化されている、ＤＣＥＦＲＨＤＳＧＹＥＣＨＨ（配列番号５）、
ｄ）ペプチドが２位及び１０位に位置するシステイン残基を通じて環状化されている、ＤＣＥＦＲＨＤＳＧＣＥＶＨＨ（配列番号１０）、
ｅ）ペプチドが２位及び１３位に位置するシステイン残基を通じて環状化されている、ＤＣＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＣＨ（配列番号１２）、
ｆ）ペプチドが２位及び１１位に位置するシステイン残基を通じて環状化されている、ＤＣＥＦＲＨＤＳＧＹＣＶＨＨ（配列番号９）、
ｇ）ペプチドが３位及び１１位に位置するシステイン残基を通じて環状化されている、ＤＡＣＦＲＨＤＳＧＹＣＶＨＨ（配列番号８）、
ｈ）ペプチドが５位及び１２位に位置するシステイン残基を通じて環状化されている、ＤＡＥＦＣＨＤＳＧＹＥＣＨＨ（配列番号７）、
ｉ）ペプチドが３位及び１０位に位置するシステイン残基を通じて環状化されている、ＤＡＣＦＲＨＤＳＧＣＥＶＨＨ（配列番号１１）、並びに、
ｊ）ペプチドが３位及び１３位に位置するシステイン残基を通じて環状化されている、ＤＡＣＦＲＨＤＳＧＹＥＶＣＨ（配列番号１３）、
より選択されるアミノ酸配列又はその変異体を含む。

好ましくは、環状ペプチドは、
ａ）ペプチドが３位及び１２位に位置するシステイン残基を通じて環状化されている、ＤＡＣＦＲＨＤＳＧＹＥＣＨＨ（配列番号４）、
ｂ）ペプチドが２位及び１２位に位置するシステイン残基を通じて環状化されている、ＤＣＥＦＲＨＤＳＧＹＥＣＨＨ（配列番号５）、
ｃ）ペプチドが２位及び１０位に位置するシステイン残基を通じて環状化されている、ＤＣＥＦＲＨＤＳＧＣＥＶＨＨ（配列番号１０）、
ｄ）ペプチドが２位及び１３位に位置するシステイン残基を通じて環状化されている、ＤＣＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＣＨ（配列番号１２）、
ｅ）ペプチドが２位及び１１位に位置するシステイン残基を通じて環状化されている、ＤＣＥＦＲＨＤＳＧＹＣＶＨＨ（配列番号９）、
ｆ）ペプチドが３位及び１１位に位置するシステイン残基を通じて環状化されている、ＤＡＣＦＲＨＤＳＧＹＣＶＨＨ（配列番号８）、並びに、
ｇ）ペプチドが３位及び１３位に位置するシステイン残基を通じて環状化されている、ＤＡＣＦＲＨＤＳＧＹＥＶＣＨ（配列番号１３）、
より選択されるアミノ酸配列又はその変異体を含む。

１つの実施の形態において、環状ペプチドは、アミノ酸配列ＣＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＣＨ（配列番号１４）又はその変異体を含み、ペプチドは１位及び１３位に位置するシステイン残基を通じて環状化されている。

１つの実施の形態において、環状ペプチドは、２つのシステイン残基を通じて環状化されている。好ましくは、ペプチドは、２つのシステイン残基間で、式－Ｓ－Ｓ－又は－Ｓ－ＣＨ_２－Ｓ－を有する架橋を通じて環状化されている。より好ましくは、ペプチドは、２つのシステイン残基間で、式－Ｓ－ＣＨ_２－Ｓ－を有する架橋を通じて環状化されている。

好ましくは、環状ペプチドは、アミノ酸配列ＣＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＣＨ（配列番号１４）又はその変異体を含み、ペプチドは１位及び１３位に位置するシステイン残基を通じて環状化されている。より好ましくは、環状ペプチドは、アミノ酸配列ＣＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＣＨ又はその変異体を含み、ペプチドは１位及び１３位の２つのシステイン残基間で、式－Ｓ－ＣＨ_２－Ｓ－を有する架橋を通じて環状化されている。

好ましくは、環状ペプチドは、アミノ酸配列ＤＡＣＦＲＨＤＳＧＹＥＣＨＨ（配列番号４）又はその変異体を含み、ペプチドは３位及び１２位に位置するシステイン残基を通じて環状化されている。より好ましくは、環状ペプチドは、アミノ酸配列ＤＡＣＦＲＨＤＳＧＹＥＣＨＨ又はその変異体を含み、ペプチドは３位及び１２位の２つのシステイン残基間で、式－Ｓ－ＣＨ_２－Ｓ－を有する架橋を通じて環状化されている。

好ましくは、環状ペプチドは、アミノ酸配列ＤＡＣＦＲＨＤＳＧＹＥＶＣＨ（配列番号１３）又はその変異体を含み、ペプチドは３位及び１３位に位置するシステイン残基を通じて環状化されている。より好ましくは、環状ペプチドは、アミノ酸配列ＤＡＣＦＲＨＤＳＧＹＥＶＣＨ又はその変異体を含み、ペプチドは３位及び１３位の２つのシステイン残基間で、式－Ｓ－ＣＨ_２－Ｓ－を有する架橋を通じて環状化されている。

更なる実施の形態において、環状ペプチドは、アミノ酸配列ＣＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＣＨ（配列番号１４）又はその変異体からなり、ペプチドは１位及び１３位の２つのシステイン残基間で、式－Ｓ－ＣＨ_２－Ｓ－を有する架橋を通じて環状化されている。

更なる実施の形態において、環状ペプチドは、アミノ酸配列ＤＡＣＦＲＨＤＳＧＹＥＣＨＨ（配列番号４）又はその変異体からなり、ペプチドは３位及び１２位の２つのシステイン残基間で、式－Ｓ－ＣＨ_２－Ｓ－を有する架橋を通じて環状化されている。

１つの実施の形態において、環状ペプチドは、アミノ酸配列ＤＡＣＦＲＨＤＳＧＹＥＶＣＨ（配列番号１３）又はその変異体からなり、ペプチドは３位及び１３位の２つのシステイン残基間で、式－Ｓ－ＣＨ_２－Ｓ－を有する架橋を通じて環状化されている。

本発明の更なる態様は、アミノ酸配列ＣＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＣＨ（配列番号１４）又はその変異体と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む環状ペプチドであって、ペプチドが１位及び１３位のシステイン残基並びに４位のフェニルアラニン残基を含み、ペプチドが１位及び１３位のシステイン残基を通じて環状化されている、環状ペプチドに関する。

本発明の更なる態様において、環状ペプチドは、アミノ酸配列ＤＡＣＦＲＨＤＳＧＹＥＣＨＨ（配列番号４）又はその変異体と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ペプチドは３位及び１２位のシステイン残基並びに４位のフェニルアラニン残基を含み、ペプチドは３位及び１２位のシステイン残基を通じて環状化されている。

本発明の更なる態様において、環状ペプチドは、アミノ酸配列ＤＡＣＦＲＨＤＳＧＹＥＶＣＨ（配列番号１３）又はその変異体と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ペプチドは３位及び１３位のシステイン残基並びに４位のフェニルアラニン残基を含み、ペプチドは３位及び１３位のシステイン残基を通じて環状化されている。

本発明の更なる態様において、環状ペプチドは、アミノ酸配列ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨ（配列番号３）又はその変異体を含み、ペプチドが２つのシステイン残基を含み、この２つのシステイン残基間でペプチドが環状化されるように、１位、２位、３位又は５位のアミノ酸残基の１つがシステイン残基で置換され、１０位、１１位、１２位又は１３位のアミノ酸残基の１つがシステイン残基で置換されている。

好ましくは、１つの実施の形態において、環状ペプチドは、アミノ酸配列ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨ（配列番号３）又はその変異体を含み、１位のアミノ酸残基がシステイン残基で置換され、１０位、１１位、１２位又は１３位のアミノ酸残基の１つがシステインで置換されている。好ましくは、１３位のアミノ酸残基がシステイン残基で置換されている。

或いは、１つの実施の形態において、環状ペプチドは、アミノ酸配列ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨ（配列番号３）又はその変異体を含み、２位、３位又は５位のアミノ酸残基の１つがシステイン残基で置換され、１０位、１１位、１２位又は１３位のアミノ酸残基の１つがシステインで置換されている。好ましくは、配列中に存在する２つのシステイン残基間には少なくとも７つのアミノ酸があり、より好ましくは、配列中に存在する２つのシステイン残基間には７～１０の間のアミノ酸残基があり、更により好ましくは、８つ又は９つのアミノ酸残基がある。１つの実施の形態において、ペプチドは、５位及び１２位又は３位及び１０位の両方にはシステイン残基を含まない。

本発明の更なる態様は、上記の環状ペプチドと薬学的に許容され得るキャリアーとを含む医薬組成物に関する。好ましくは、組成物は更にアジュバントを含む。組成物は免疫原性組成物であり得る。１つの実施の形態において、これらの組成物はワクチン組成物であり得る。

本発明の態様はまた、薬剤として使用される環状ペプチドにも関する。１つの実施の形態は、神経変性疾患を治療する方法であって、その必要がある個体に上述のような環状ペプチド又は組成物を投与することを含む、方法に関する。好ましくは、神経変性疾患はアルツハイマー病である。

本発明の更なる実施の形態は、被験体において免疫反応を誘導する方法であって、上述のような環状ペプチド又は組成物、すなわちアミロイドβのヘアピン構造を採用する環状ペプチド又はこのペプチドを含む組成物を、被験体に投与することを含む、方法に関する。好ましくは、免疫反応はアミロイドβに対する抗体を生成し、より好ましくは、アミロイドβは低分子量アミロイドβオリゴマーの形であり、方法は、低分子量アミロイドβオリゴマーに対する免疫反応を誘導するものである。

本発明の１つの実施の形態は、神経変性疾患を治療する際に使用される上述のような環状ペプチドに関する。好ましくは、神経変性疾患はアルツハイマー病である。

本発明の更なる実施の形態は、被験体において免疫反応を誘導する際に使用される上述のような環状ペプチドに関する。好ましくは、免疫反応はアミロイドβに対する抗体を生成し、より好ましくは、アミロイドβは低分子量アミロイドβオリゴマーの形であり、使用は、低分子量アミロイドβオリゴマーに対する免疫反応を誘導するものである。

本発明の更なる実施の形態は、神経変性疾患、例えばアルツハイマー病を治療するための、及び／又は、好ましくはアミロイドβオリゴマー、好ましくは低分子量アミロイドβオリゴマーに対する抗体を産生する免疫反応を誘導するための、薬剤製造のための環状ペプチド、すなわちアミロイドβのヘアピン構造を採用する環状ペプチドに関する。

本発明の更なる態様は、上述のような環状ペプチドを産生する方法であって、
（ａ）こうしたペプチドの配列を含む直鎖ペプチドを合成する工程と、
（ｂ）システイン残基を通じて直鎖ペプチドを環状化して、式（Ｉ）による環状ペプチドを得る工程と、
を含む、方法に関する。

本発明の更なる態様は、アミロイドβの低分子量オリゴマーを認識する抗体を生成する方法であって、
（ａ）上述のような環状ペプチド又はその変異体で動物を免疫することと、
（ｂ）工程（ａ）における免疫によって生成された抗体を得ることと、
を含む、方法に関する。この方法は更に、アミロイドβの低分子量オリゴマーの認識に関して、工程（ｂ）において得られた抗体をスクリーニングすることを含む工程（ｃ）を含み得る。好ましくは、抗体はまた、Ａβ１－４２、Ａβ１－４０及び／又はＡβ１－３８と結合しない能力、又はこれらと有意には結合しない能力に関してスクリーニングされる。好ましくは、抗体は、アミロイドβの低分子量オリゴマー、好ましくは低分子量ＡβｐＥ３－ｘ及びＡβ４－ｘ、より好ましくはＡβｐＥ３－４２及びＡβ４－４２を特異的に認識する能力に関してスクリーニングされる。好ましくは、方法は、配列番号４、１３又は１４の配列を有する環状ペプチドで動物を免疫することを含む。

本発明の更なる態様は、上記方法によって得られ得る抗体を含む。得られる抗体は、組成物、例えばワクチン組成物中で使用され得る。抗体は、アルツハイマー病の治療に使用され得る。

本発明の他の態様及び実施形態は、以下により詳細に記載される。

ＴＡＰ０１ Ｆａｂの構造を示す図である。 ＴＡＰ０１－ｐＥ３－１４ Ｆａｂの構造を示す図である。 （ａ）ｐＧｌｕ３－１４の構造及び（ｂ）ＴＡＰ０１－ｐＧｌｕ３－１４アミロイドペプチド構造を示す図である。 ＴＡＰ０１－ｐＥ３－１４及びＴＡＰ０１＿０１－ｐＥ３－１４の構造の比較を示す図である。 ＴＡＰ０１－１－１４環状化ペプチドの構造を示す図である。 （Ａ）１－１４（システイン３，１２）及び（Ｂ）ｐＧｌｕ３－１４環状アミロイドペプチドの構造の比較を示す図である。 ジスルフィド架橋１－１４環状ペプチド３，１２への、比較基準抗体（バピネウズマブ、ソラネズマブ、ＢＡＮ２４０１、ＰｒｏＢｉｏＤｒｕｇ ６＿１＿６、ＰｒｏＢｉｏＤｒｕｇ ２４＿２＿３）及びＴａｐ０１の結合に関する結合ＥＬＩＳＡデータを示す図である。 ジスルフィド架橋１－１４環状ペプチド３，１２への動物血清の結合に関する結合ＥＬＩＳＡデータを示す図である。 Ａβ１－４２ペプチドへの動物血清の結合に関する結合ＥＬＩＳＡデータを示す図である。 ＡβｐＥ３－４２ペプチドへの動物血清の結合に関する結合ＥＬＩＳＡデータを示す図である。 Ａβ４－４２ペプチドへの動物血清の結合に関する結合ＥＬＩＳＡデータを示す図である。 ＫＬＨ抗原への動物血清の結合に関する結合ＥＬＩＳＡデータを示す図である。 チオアセタール架橋１－１４環状ペプチド３，１２への動物血清の結合に関する結合ＥＬＩＳＡデータを示す図である。 Ａβ１－４２ペプチドへの動物血清の結合に関する結合ＥＬＩＳＡデータを示す図である。 ＡβｐＥ３－４２ペプチドへの動物血清の結合に関する結合ＥＬＩＳＡデータを示す図である。 Ａβ４－４２ペプチドへの動物血清の結合に関する結合ＥＬＩＳＡデータを示す図である。 Ｍ２抗血清でのＡＤマウスモデル脳切片の免疫染色を示す図である。ＳＸＦＡＤは大部分、Ａβ１－４２及び斑であり、Ｔｇ４－４２はＡβ４－４２のみであり、ＴＢＡ４２はピログルタメートＡβ３－４２のみである。 Ｍ４抗血清でのＡＤマウスモデル脳切片の免疫染色を示す図である。ＳＸＦＡＤは大部分、Ａβ１－４２及び斑であり、Ｔｇ４－４２はＡβ４－４２のみであり、ＴＢＡ４２はピログルタメートＡβ３－４２のみである。 若年及び加齢Ｔｇ４－４２マウスにおける１８Ｆ－ＦＤＧ取り込みに対するＴＡＰ０１＿０４（ＭｏＧ１Ｋとしてクローニング）の効果を示す図である。 チオアセタール架橋環状ペプチド変異体への（ａ）ＴＡＰ０１（ＭｏＧ１Ｋ）抗体及び（ｂ）ＭＲＣＴ対照ＩｇＧ１抗体（ＭｏＧ１Ｋとしてクローニング）の結合に関する結合ＥＬＩＳＡデータを示す図である。 チオアセタール架橋環状ペプチド変異体への（ａ）ＴＡＰ０１（ＭｏＧ１Ｋ）抗体及び（ｂ）ＭＲＣＴ対照ＩｇＧ１抗体（ＭｏＧ１Ｋとしてクローニング）の結合に関する結合ＥＬＩＳＡデータを示す図である。 チオアセタール架橋環状ペプチド変異体への比較基準抗体（バピネウズマブ、ソラネズマブ、ＢＡＮ２４０１、ＰｒｏＢｉｏＤｒｕｇ ６＿１＿６、ＰｒｏＢｉｏＤｒｕｇ ２４＿２＿３）及びＴＡＰ０１ ＨｕＧ４Ｋの結合に関する結合ＥＬＩＳＡデータを示す図である。 Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００を使用した、ＴＡＰ０１抗体へのプロリン突然変異ペプチド結合を示す図である。 ＴＡＰ０１抗体での受動免疫後、免疫された５ＸＦＡＤマウスにおける皮質斑負荷減少を示す図である。ＩｇＧ１を注射された５ＸＦＡＤマウスと比較したＴＡＰ０１＿４（ＭｏＧ１Ｋ）免疫５ＸＦＡＤマウスの斑負荷分析。（ａ）ＩｇＧ対照、ＴＡＰ０１＿０１及びＴＡＰ０１＿０２処置マウスと比較した際のＴＡＰ０１＿０４免疫マウスにおける有意な斑負荷減少を示す、全Ａβに対する抗体での免疫染色。（ｂ）ＩｇＧ対照と比較した際のＴＡＰ０１＿０４免疫マウスにおける有意な斑負荷減少を示す、ピログルタメートＡβ３－ｘに対する抗体での免疫染色。ＴＡＰ０１＿０１及びＴＡＰ０１＿０２で免疫したマウスに対して、有意な相違は観察されなかった。（ｃ）チオフラビンＳでの染色。（ｄ）ＴＡＰ０１（ＮＴ４Ｘ）での免疫染色を示し、ＩｇＧ対照と比較した際のＴＡＰ０１＿０４免疫マウスにおける有意な斑負荷減少を示す。ＴＡＰ０１＿０１及びＴＡＰ０１＿０２で免疫したマウスに対して、有意な相違は観察されなかった。 チオアセタール架橋環状ペプチド変異体への、（ａ）ＴＡＰ０１（ＭｏＧ１Ｋ）抗体、（ｂ）ＭＲＣＴ対照ＩｇＧ１抗体（ＭｏＧ１Ｋとしてクローニング）の結合に関する結合ＥＬＩＳＡデータを示す図である。 （ｂ）ＭＲＣＴ対照ＩｇＧ１抗体（ＨｕＧ１Ｋとしてクローニング）と比較した、（ａ）チオアセタール架橋環状ペプチド変異体へのバピネウズマブの結合に関する結合ＥＬＩＳＡデータを示す図である。 マウス脳の横断面の、トレーサーであるフロルベタベン（fluorbetaben）でのｉｎ ｖｉｖｏアミロイド斑イメージングを示す図である。（Ａ）フロルベタベン保持シグナルを伴わない、未処置野生型対照マウス脳。（Ｂ）脳における高いアミロイド斑負荷を示す、強いフロルベタベン保持シグナルを伴う未処置５ＸＦＡＤ。（Ｃ）能動免疫後の５ＸＦＡＤマウスは、フロルベタベン保持シグナルを示さず、脳における有意なアミロイド斑負荷減少を示す。 マウス脳におけるアミロイド斑負荷に関するマーカーとしてのフロルベタベン保持シグナルの統計分析を示す図である。群間のＡＮＯＶＡ（ｐ＜０．０００１、Ｆ＝２１．３９）及びボンフェローニ補正比較での統計評価。野生型（ＷＴ）皮質対５ＸＦＡＤ皮質（ｐ＜０．００１）、ＷＴ海馬対５ＸＦＡＤ海馬（ｐ＜０．００１）、ＷＴ扁桃体対５ＸＦＡＤ扁桃体（ｐ＜０．００１）。ＷＴ皮質対処置した５ＸＦＡＤ皮質（有意でない）、ＷＴ海馬対処置した５ＸＦＡＤ海馬（有意でない）、ＷＴ扁桃体対処置した５ＸＦＡＤ扁桃体（有意でない）。５ＸＦＡＤ皮質対処置した５ＸＦＡＤ皮質（ｐ＜０．０１）、５ＸＦＡＤ海馬対処置した５ＸＦＡＤ海馬（ｐ＜０．００１）、５ＸＦＡＤ扁桃体対処置した５ＸＦＡＤ扁桃体（ｐ＜０．００１）。処置した５ＸＦＡＤ＝環状ペプチドで免疫した５ＸＦＡＤ。 ＴＡＰ０１＿０４（ＭｏＧ１Ｋ）での受動免疫と環状ペプチドでの能動免疫とを比較する、５ＸＦＡＤマウス大脳皮質における斑負荷の免疫染色及び定量的評価を示す図である。ＩｇＧ１での処置、ＴＡＰ０１＿０４での受動免疫、及び環状化Ａβペプチドでの能動免疫後の５ＸＦＡＤマウスに関して、全Ａβ抗体での例示的染色（Ａ）を示す。全Ａβ、ピログルタメートＡβ３－Ｘ、チオフラビンＳ及びＮ切除Ａβに対する抗体を使用して、斑負荷の定量化（Ｂ）を評価し、能動免疫によって処置された５ＸＦＡＤマウスにおける斑の強い減少が立証された。ＴＡＰ０１＿０４及び能動免疫によって処置されたマウスは、全てのＡβ抗体及びチオフラビンＳで染色された斑に対して、類似の減少効果を示した。全Ａβ（Ｆ＝６５．２０、ｐ＜０．０００１、Ｒ二乗０．６２８７）、ピログルタメートＡβ３－Ｘ（Ｆ＝２３．３２、ｐ＜０．０００１、Ｒ二乗０．３５７０）、チオフラビンＳ（Ｆ＝１７．１７、ｐ＜０．０００１、Ｒ二乗０．３２９１）及びＮ切除Ａβ（Ｆ＝８９．１７、ｐ＜０．０００１、Ｒ二乗０．６３１６）に対する斑染色に関する、ボンフェローニの多重比較検定を伴うＡＮＯＶＡを示す（平均＋ＳＥＭ）。 環状化Ａβペプチドでの能動免疫の、５ＸＦＡＤマウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏ脳グルコース代謝に対する影響を示す図である。（Ａ）１８Ｆ－ＦＤＧ－ＰＥＴ／ＭＲＩイメージングによるグルコース取り込みの例示的冠状図、横断図、矢状図。（Ｂ）定量的分析。能動免疫された５ＸＦＡＤ（ｎ＝５）、２匹の５ＸＦＡＤマウス対照及び２匹の野生型マウス（全て雌、年齢４．５ヶ月齢～５．５ヶ月齢）における１８Ｆ－ＦＤＧ－ＰＥＴ／ＭＲＩイメージングによってグルコース取り込みを評価した。シグナル強度の定量的分析によって、免疫された５ＸＦＡＤマウスが、分析した大部分の脳領域において、脳グルコース代謝の有意なレスキューを示し、シナプス及びニューロン活性において療法的効果が立証された。ＡＮＯＶＡ比較試験（Ｆ＝１０．３７、ｐ＜０．０００１、Ｒ二乗＝０．７３５２）。ｔ検定を使用した有意差を示す（平均＋ＳＥＭ）。Ａ、扁桃体；Ｂｓ、脳幹；Ｃ、皮質；Ｃｂ、小脳；Ｈ、視床下部；Ｈｃ、海馬；Ｈｇ、ハーダー腺；Ｍ、中脳；Ｏ、嗅球；Ｓ、中隔／前脳基底部；Ｓｔ、線条体；Ｔ、視床。 Ｔｇ４－４２マウスにおける、ＴＡＰ０１＿０４（ＭｏＧ１Ｋ）での受動免疫と比較した、環状化Ａβペプチドでの能動免疫の効果を示す図である。（Ａ）加齢Ｔｇ４－４２における海馬依存性学習及び記憶喪失を、モリス水迷路試験のプローブ試験によって示す。ＴＡＰ０１＿０４での受動免疫及び環状化Ａβペプチドでの能動免疫はどちらも、Ｔｇ４－４２マウスにおける記憶欠損をレスキューした。ボンフェローニの多重比較検定を伴うＡＮＯＶＡ（Ｆ＝１３．２７、ｐ＜０．０００１、Ｒ二乗＝０．６４６）。平均＋ＳＥＭでＴ検定を示す。（Ｂ）加齢Ｔｇ４－４２マウスは、海馬のＣＡ１層において有意なニューロン損失を生じさせる。ＩｇＧ１処置マウス上のニューロンの平均数（＋ＳＥＭ）は１２８６８７＋１３０３５である一方、ＴＡＰ０１＿０４処置マウスにおけるニューロンの平均数（＋ＳＥＭ）は１９４３１０＋２２５７２で有意により高く、能動免疫マウスにおけるニューロンの平均数（＋ＳＥＭ）は、１８５８５８＋３９１８０で、やはり有意により高い。示すボンフェローニの多重比較検定を伴うＡＮＯＶＡ（Ｆ＝８．１２５、ｐ＜０．００１、Ｒ二乗＝０．５５５６）。^＊＝ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊＝ｐ＜０．００１。 環状化Ａβペプチドへの５ＸＦＡＤマウス血清の結合に関する結合ＥＬＩＳＡデータを示す図である。 環状化ＡβペプチドへのＴｇ４－４２マウス血清の結合に関する結合ＥＬＩＳＡデータを示す図である。 環状ペプチド３，１３への、対照抗体ＨｕＭＲＣＴ ＭｏＧ１Ｋ及びＭｏＭＲＣＴ ＨＵＧ１Ｋ、比較基準抗体バピネウズマブ並びにＴａｐ０１ ＭｏＧ１Ｋの結合に関する結合ＥＬＩＳＡデータを示す図である。

本発明は、ｐＥ３－Ｘアミロイドペプチド中に天然に見られるコンホメーションエピトープを模倣し、ｐＥ３－Ｘアミロイドペプチドのエピトープに結合する抗体に特異的に結合する非天然存在ペプチド、すなわち合成ペプチドに関する。この環状ペプチドは、アミロイドβ、特にアミロイドβの低分子量オリゴマーに特異的な抗体の生成のため、被験体の能動免疫に使用され得る。ヘアピン構造は、ｐＥ３－ＸアミロイドペプチドのＮ末端領域に見られる。この領域は、アミロイドβの低分子量オリゴマーに結合する抗体のエピトープであることが見出されてきている。

本発明による環状ペプチドは、アミロイドβタンパク質のアミノ酸残基１～１４であって、この配列中に見られる残基の２つがシステイン残基で置換されており、このシステイン残基を通じてペプチドが環状化される、アミノ酸残基に基づく。本発明の環状ペプチドは、アミロイドβに見られるヘアピン構造を模倣する。

環状ペプチドは、ｐＥ３－Ｘアミロイドβ中に同定され、マウスＴＡＰ０１抗体（ＮＴ４Ｘとしても知られる）、並びにヒト化ＴＡＰ０１＿０１、ＴＡＰ０１＿０２、ＴＡＰ０１＿０３、及びＴＡＰ０１＿０４抗体（それぞれＮＴ４Ｘ＿ＳＡ、ＮＴ４Ｘ＿Ｓ７Ａ、ＮＴ４Ｘ＿Ｓ７１Ａ及びＮＴ４Ｘ＿Ｓ７１Ｈとしても知られ、特許文献１及び特許文献３に記載されるようなもの）等の抗体の結合部位として同定されてきている、ヘアピン構造を模倣する。これらの抗アミロイドβ抗体は、Ｎ末端切除アミロイドペプチド（ＡβｐＥ３－ｘ又はＡβ４－ｘ）に特異的に結合することが示されてきている。これらの抗体は、全長アミロイドペプチド又はアミロイドＡβ１－４２に有意な結合を示さない。

本明細書に記載されるような環状ペプチドは、アミロイドβのアミノ酸１～１４、ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨ（配列番号３）に基づく変異体ペプチドであって、天然存在配列の２つのアミノ酸がシステイン残基で置換され、このシステイン残基を通じてペプチドが環状化されている、変異体ペプチドである。好ましくは、システイン残基の一方は、１位、２位、３位、又は５位のアミノ酸を置換し、他方のシステイン残基は、１０位、１１位、１２位又は１３位の残基でアミノ酸を置換する。

１つの実施形態において、本明細書に記載される環状ペプチドは、式（Ｉ）（配列番号１）：
Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３ＦＸ_４ＨＤＳＧＸ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８Ｈ （Ｉ）
の配列を有するアミノ酸配列又はその変異体を含み、
式中、
Ｘ_１は存在しないか又は任意のアミノ酸であり、
Ｘ_２はアラニン又はシステインであり、
Ｘ_３はグルタミン酸又はシステインであり、
Ｘ_４はアルギニン又はシステインであり、
Ｘ_５はチロシン又はシステインであり、
Ｘ_６はグルタミン酸又はシステインであり、
Ｘ_７はバリン又はシステインであり、
Ｘ_８はヒスチジン又はシステインであり、
Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３及びＸ_４のうちの１つのみがシステインであり、Ｘ_５、Ｘ_６、Ｘ_７及びＸ_８のうちの１つのみがシステインであり、ペプチドが１位、２位、３位、又は５位のシステイン残基及び１０位、１１位、１２位又は１３位のシステイン残基を通じて環状化されている。環状ペプチドは、２つのみのシステイン残基を含むことができ、このシステイン残基を通じてペプチドが環状化される。

好ましくは、配列中に存在する２つのシステイン残基間には少なくとも７つのアミノ酸があり、より好ましくは、環状ペプチド中に存在する２つのシステイン残基間には、７～１１のアミノ酸残基、更により好ましくは８～１１のアミノ酸残基がある。

環状ペプチドは、好ましくは、ペプチド配列の末端アミノ酸両方を通じては環状化されない。好ましくは、Ｘ_１は存在する。好ましくは、環状ペプチドは、Ｃ末端アミノ酸を通じては環状化されない。１つの実施形態において、Ｘ_１はシステインであり、好ましくは、ペプチドは、１位のシステイン及び１３位のシステインを通じて環状化される。更なる実施形態において、好ましくは、Ｘ_１はプロリン又はアスパラギン酸であり、好ましくはアスパラギン酸であり、ペプチドは、ペプチド残基の末端アミノ酸のいずれを通じても環状化されない。少なくとも１つの内部システイン残基を通じたペプチドの環状化、特に１位、２位、３位、又は５位及び１０位、１１位、１２位又は１３位での環状化は、ｐＥ３－Ｘアミロイドβに見られるヘアピン構造を模倣し得る安定なペプチドの提供を補助する。

１つの実施形態において、ペプチドは、１位のシステイン残基（すなわちＸ_１はシステインであり、Ｘ_２はアラニンである）及び１０位、１１位、１２位又は１３位、好ましくは１３位のシステイン残基を通じて環状化される。

好ましくは、環状アミノ酸は、Ｘ_１がシステインであり、Ｘ_２がアラニンであり、Ｘ_３がグルタミン酸であり、Ｘ_４がアルギニンであり、Ｘ_５がチロシンであり、Ｘ_６がグルタミン酸であり、Ｘ_７がバリンであり、Ｘ_８がシステインであり、ペプチドが２つのシステイン残基を通じて環状化されている配列を含む。例えば、ペプチドはＸ_１及びＸ_８のシステインを通じて環状化されている。例えば、環状ペプチドは、アミノ酸配列ＣＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＣＨ（配列番号１４）を含むか又はこうした配列からなることができ、ペプチドは、１位及び１３位のシステイン残基を通じて環状化されている。

或いは、１つの実施形態において、好ましくは、環状アミノ酸は、Ｘ_１が存在しないか又は任意のアミノ酸である配列を含み、
ａ）Ｘ_２はアラニンであり、Ｘ_３はシステインであり、Ｘ_４はアルギニンであり、Ｘ_５はチロシンであり、Ｘ_６はグルタミン酸であり、Ｘ_７はシステインであり、Ｘ_８はヒスチジンであるか、
ｂ）Ｘ_２はシステインであり、Ｘ_３はグルタミン酸であり、Ｘ_４はアルギニンであり、Ｘ_５はチロシンであり、Ｘ_６はグルタミン酸であり、Ｘ_７はシステインであり、Ｘ_８はヒスチジンであるか、
ｃ）Ｘ_２はシステインであり、Ｘ_３はグルタミン酸であり、Ｘ_４はアルギニンであり、Ｘ_５はシステインであり、Ｘ_６はグルタミン酸であり、Ｘ_７はバリンであり、Ｘ_８はヒスチジンであるか、
ｄ）Ｘ_２はシステインであり、Ｘ_３はグルタミン酸であり、Ｘ_４はアルギニンであり、Ｘ_５はチロシンであり、Ｘ_６はグルタミン酸であり、Ｘ_７はバリンであり、Ｘ_８はシステインであるか、
ｅ）Ｘ_２はシステインであり、Ｘ_３はグルタミン酸であり、Ｘ_４はアルギニンであり、Ｘ_５はチロシンであり、Ｘ_６はシステインであり、Ｘ_７はバリンであり、Ｘ_８はヒスチジンであるか、
ｆ）Ｘ_２はアラニンであり、Ｘ_３はシステインであり、Ｘ_４はアルギニンであり、Ｘ_５はチロシンであり、Ｘ_６はシステインであり、Ｘ_７はバリンであり、Ｘ_８はヒスチジンであるか、
ｇ）Ｘ_２はアラニンであり、Ｘ_３はグルタミン酸であり、Ｘ_４はシステインであり、Ｘ_５はチロシンであり、Ｘ_６はグルタミン酸であり、Ｘ_７はシステインであり、Ｘ_８はヒスチジンであるか、
ｈ）Ｘ_２はアラニンであり、Ｘ_３はシステインであり、Ｘ_４はアルギニンであり、Ｘ_５はシステインであり、Ｘ_６はグルタミン酸であり、Ｘ_７はヒバリンであり、Ｘ_８はヒスチジンであるか、又は、
ｉ）Ｘ_２はアラニンであり、Ｘ_３はシステインであり、Ｘ_４はアルギニンであり、Ｘ_５はチロシンであり、Ｘ_６はグルタミン酸であり、Ｘ_７はバリンであり、Ｘ_８はシステインであり、
ペプチドが、２つのシステイン残基を介して環状化されている。例えば、ペプチド（ａ）に関して、配列は、Ｘ_３及びＸ_７のシステインを通じて環状化されており、ペプチド（ｂ）に関して、配列は、Ｘ_２及びＸ_７のシステインを通じて環状化されており、ペプチド（ｃ）に関して、配列は、Ｘ_２及びＸ_５のシステインを通じて環状化されており、ペプチド（ｄ）に関して、配列は、Ｘ_２及びＸ_８のシステインを通じて環状化されており、ペプチド（ｅ）に関して、配列は、Ｘ_２及びＸ_６のシステインを通じて環状化されており、ペプチド（ｆ）に関して、配列は、Ｘ_３及びＸ_６のシステインを通じて環状化されており、ペプチド（ｇ）に関して、配列は、Ｘ_４及びＸ_７のシステインを通じて環状化されており、ペプチドｈ）に関して、配列は、Ｘ_３及びＸ_５のシステインを通じて環状化されており、ペプチドｉ）に関して、配列は、Ｘ_３及びＸ_８のシステインを通じて環状化されている。好ましくは、１つの実施形態において、Ｘ_１は存在し、プロリン又はアスパラギン酸より選択される。より好ましくは、Ｘ_１はアスパラギン酸である。

例えば環状ペプチドは、アミノ酸配列：
ａ）ＤＡＣＦＲＨＤＳＧＹＥＣＨＨ（配列番号４）、
ｂ）ＤＣＥＦＲＨＤＳＧＹＥＣＨＨ（配列番号５）、
ｃ）ＤＣＥＦＲＨＤＳＧＣＥＶＨＨ（配列番号１０）、
ｄ）ＤＣＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＣＨ（配列番号１２）、
ｅ）ＤＣＥＦＲＨＤＳＧＹＣＶＨＨ（配列番号９）、
ｆ）ＤＡＣＦＲＨＤＳＧＹＣＶＨＨ（配列番号８）、
ｇ）ＤＡＥＦＣＨＤＳＧＹＥＣＨＨ（配列番号７）、
ｈ）ＤＡＣＦＲＨＤＳＧＣＥＶＨＨ（配列番号１１）、又は、
ｉ）ＤＡＣＦＲＨＤＳＧＹＥＶＣＨ（配列番号１３）、
を含み得るか又はこれらからなり得る。ペプチドは、２位、３位又は５位、及び１０位、１１位、１２位、又は１３位に位置する２つのシステイン残基を通じて環状化される。好ましくは、環状ペプチドは、配列ＤＡＣＦＲＨＤＳＧＹＥＣＨＨ（配列番号４）であって、ペプチドが３位及び１２位のシステイン残基を通じて環状化されている配列、又はＤＡＣＦＲＨＤＳＧＹＥＶＣＨ（配列番号１３）であって、ペプチドが３位及び１３位のシステイン残基を通じて環状化されている配列を含む。

本発明はまた、上述のような式（Ｉ）の配列を含む環状ペプチドであって、環状ペプチドが５位及び１２位の両方又は３位及び１０位の両方にはシステイン残基を含まない、環状ペプチドに関する。特に、環状ペプチドは、配列番号７又は配列番号１１の配列を有するペプチドを含まず、又はこうしたペプチドからならない。

変異体環状ペプチドもまた提供される。変異体環状ペプチドは、その参照ペプチドと同じか又は類似の機能を有し、すなわち機能的に同等の環状ペプチドであり、アミロイドβのヘアピン構造を採用する。参照配列、例えば上述の参照配列の変異体である、本明細書に記載するような環状ペプチドは、参照配列に対して改変されている１つ以上のアミノ酸残基を有し得る。例えば、３つ以下のアミノ酸残基が参照配列に対して改変されていてもよく、好ましくは２つ以下、又は１つのアミノ酸残基が参照配列に対して改変されていてもよい。参照配列中のアミノ酸残基は、挿入、欠失又は置換、好ましくは異なるアミノ酸残基に関する置換によって改変又は突然変異され得る。好ましくは、置換は保存的アミノ酸置換である。保存的アミノ酸配列修飾は、環状ペプチドの特性に影響を及ぼさないか又はこれを改変しない、例えば環状ペプチドのコンホメーションを維持し、好ましくはペプチドの免疫原性を維持し、好ましくは抗アミロイドβ抗体、好ましくは低分子量ＡＢオリゴマーに特異的に結合するものを生成し得る免疫反応を誘導する能力を維持する修飾である。

保存的アミノ酸置換には、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されているものが含まれる。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で定義されてきている。置換には、２０の天然存在（又は「標準」）アミノ酸又はその変異体のいずれか、例えばＤ－アミノ酸等、又はタンパク質中に天然には見られない任意の変異体での置換が含まれる。非天然アミノ酸が当該技術分野において定義されてきている。

参照配列の変異体である、本明細書に記載されるような環状ペプチドは、参照配列、例えば配列番号４、５、７、９、１０、１１、１２、１３又は１４と、少なくとも８５％の配列同一性、参照配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を共有し得る。参照配列の変異体である、本明細書に記載されるような環状ペプチドは、少なくとも１つの内部システイン残基を維持し、すなわちそれを通じてペプチドが環状化される少なくとも１つの非末端システイン残基を含む。システイン残基の一方はペプチドのＮ末端領域に、もう一方はペプチドのＣ末端領域に配置されてもよく、システイン残基の両方が配列の末端に配置されることはなく、すなわち環状ペプチドは、ペプチドが頭尾型で環状化されないように、少なくとも１つの未結合（free）Ｎ及びＣ末端残基を含む。１つの実施形態において、システイン残基は配列のＣ末端残基として存在しない。参照配列、すなわち配列番号４、５、７、９、１０、１１、１２、１３又は１４の変異体である、本明細書に記載されるような環状ペプチドは、２つのシステイン残基を維持し、システイン残基のうち１つは配列の末端に存在せず、すなわちそれを通じてペプチドが環状化される少なくとも１つの非末端システイン残基を含む。１つの実施形態において、どちらのシステイン残基も配列の末端に配置されない。参照配列、すなわち配列番号４、５、７、９、１０、１１、１２、又は１３の変異体である、本明細書に記載されるような環状ペプチドは、２つの内部システイン残基を維持し、すなわちそれを通じてペプチドが環状化される２つの非末端システイン残基を含む。

好ましくは、システイン残基は、１位、２位、３位又は５位及び１０位、１１位、１２位又は１３位、好ましくは１位及び１３位、３位及び１２位、又は３位及び１３位で維持される。好ましくは、参照配列の４位のフェニルアラニン残基もまた維持される。例えば、本明細書に記載される環状ペプチドは、配列ＣＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＣＨ（配列番号１４）、配列ＤＡＣＦＲＨＤＳＧＹＥＣＨＨ（配列番号４）、又は配列ＤＡＣＦＲＨＤＳＧＹＥＶＣＨ（配列番号１３）と少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、ペプチドは、１位及び１３位、３位及び１２位、又は３位及び１３位のシステイン残基、並びに４位のフェニルアラニン残基を含み、ペプチドは１位及び１３位、３位及び１２位、又は３位及び１３位のシステイン残基を通じて環状化されている。こうした変異体環状ペプチドにおいて、１位及び１３位、３位及び１２位、又は３位及び１３位のシステイン残基、並びに４位のフェニルアラニン残基は維持される一方、他の位置では、配列内に保存的アミノ酸置換が導入される。１つの実施形態において、１位及び１３位のシステイン残基が変異体配列中で維持される。別の実施形態において、３位のシステイン残基及び１２位又は１３位のシステイン残基が変異体配列中で維持される。

配列同一性は、一般的に、アルゴリズムＧＡＰ（ウィスコンシンＧＣＧパッケージ、Accelerys Inc、米国サンディエゴ）を参照して定義される。ＧＡＰは、Needleman及びWunschのアルゴリズムを使用して、マッチ数を最大にし、ギャップ数を最小限にするように、２つの完全配列を整列させる。一般的に、デフォルトパラメータを使用し、ギャップ生成ペナルティ＝１２、ギャップ伸長ペナルティ＝４である。ＧＡＰの使用が好ましい可能性もあるが、一般的にデフォルトパラメータを使用して、他のアルゴリズム、例えばＢＬＡＳＴ（Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 405-410の方法を使用する）、ＦＡＳＴＡ（Pearson and Lipman (1988) PNAS USA 85: 2444-2448の方法を使用する)、又はSmith-Watermanアルゴリズム（Smith and Waterman (1981) J. Mol Biol. 147: 195-197）又はAltschul et al. (1990)上記のＴＢＬＡＳＴＮプログラムを使用してもよい。特に、ｐｓｉ－Ｂｌａｓｔアルゴリズム（Nucl. Acids Res. (1997) 25 3389-3402）を使用してもよい。配列同一性及び類似性はまた、Ｇｅｎｏｍｅｑｕｅｓｔ（商標）ソフトウェア（Gene-IT、米国マサチューセッツ州ウースター）を使用して決定され得る。配列比較は、好ましくは、本明細書に記載の関連配列の全長に渡って行われる。

本出願全体で使用される際、環状ペプチドに関するアミノ酸位置は、ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨ（配列番号３）の配列を有するペプチドの配列に関して提供される。したがって、環状ペプチドの「「ｘ」位のアミノ酸」という表現又は類似の表現は、配列番号３を有する好ましい環状ペプチドにおける「ｘ」位のアミノ酸に対応するアミノ酸を意味する。全長アミロイドβペプチド、並びにＮ切除変異体を含む変異体、例えば１－４０、ｐ３－４２、及び４－４２に関するアミノ酸位置はＡβ１－４２（配列番号１８）の配列を有する全長ペプチドの配列に関連して提供される。したがって、Ｎ末端切除ｐ３－４２ペプチドの「「ｘ」位のアミノ酸」という表現又は類似の表現は、配列番号１８を有する好ましい全長ペプチドにおける「ｘ」位のアミノ酸に対応するアミノ酸を意味する。本出願全体で使用される番号づけ系は、Ｎ末端アミノ酸から出発することに注目されたい。

本明細書に記載の環状ペプチドは、本明細書に記載のペプチド又はその変異体の変異体アミノ酸配列を含み得るか、こうした配列から本質的になり得るか、又はこうした配列からなり得る。好ましい実施形態において、環状ペプチドは、１６以下のアミノ酸、好ましくは１５以下のアミノ酸を含む。より好ましくは、ペプチドは１４以下のアミノ酸を含む。好ましい実施形態において、環状ペプチドは、本明細書に記載のアミノ酸配列からなるか又はこうした配列から本質的になり、すなわち環状ペプチドは、式（Ｉ）、式（ＩＩ）、若しくは配列番号４、５、７、８、９、１０、１１、１２、１３若しくは１４に示される配列、又はその変異体からなるか又はこうした配列から本質的になる。

環状化又は「環状化される」又は類似の表現は、ペプチドが環状型であるか又は環状型に作製されることを意味する。用語「環状」は、ペプチドの構成要素残基の少なくともいくつかが環を形成することを意味する。本発明の環状ペプチドは、少なくとも１つの内部アミノ酸を通じて環状化され、すなわち頭尾型では環状化されない。好ましくは、本発明のペプチドは、内部アミノ酸を通じて環状化される。システイン残基を通じたペプチドの環状化は、ペプチドを、ｐＥ３－Ｘアミロイドβで同定されるヘアピン構造を模倣する構造に拘束する。

ペプチドの環状化は、配列内に２つのシステイン残基を取り込むことを通じた架橋の形成を通じて得られる。システイン残基は、天然存在配列中の対応するアミノ酸を置換する。好ましくは、環状化は、側鎖から側鎖への環状化によって形成され得る。本発明のペプチドは、直接、又はシステイン残基のチオール側鎖を通じて間接的に、環状化され得る。例えば、側鎖から側鎖への環状化は、式－Ｓ－（－ＣＨ_２－）ｎ－Ｓ－（式中、ｎ＝０、１又は２）の架橋の形成を通じて得られ得る。好ましくは、架橋は、式－Ｓ－Ｓ－又は－Ｓ－ＣＨ_２－Ｓ－（式中、Ｓは連結されたシステイン残基のチオール残基である）を有する。より好ましくは、架橋は式－Ｓ－ＣＨ_２－Ｓ－を有し、好ましくはペプチドの１位及び１３位に位置するシステイン残基間、ペプチドの３位及び１２位に位置するシステイン残基間、又はペプチドの３位及び１３位に位置するシステイン残基間である。システイン残基を通じてペプチドを環状化するために適した方法は、当該技術分野において知られており、例えばチオール酸化を使用し、任意選択でメチレン架橋を含む導入を伴う。例えば、Kourra C and Cramer N, Chem. Sci., 2016,7, 7007-7012もまた参照されたい。他の架橋、例えばチオエーテル架橋（－ＣＨ_２－Ｓ－）もまた本発明に含まれる。

環状ペプチドは、ＴＡＰ０１及びＴＡＰ０１＿０１抗体（特許文献２及び特許文献３に記載される通り）への結合特異性を示す。環状ペプチドは、これらの抗体が結合するヘアピン構造を有する、ｐ３－４２アミロイドβ上に見られるＮ末端エピトープを模倣する。

好ましい実施形態において、環状ペプチドは、可溶性低分子量ＡβρＥ３－Ｘオリゴマーを特異的に認識する抗体分子に特異的に結合し、すなわちＡβρＥ３ペプチドの高分子量オリゴマーに特異的に結合する抗体に結合しない。本明細書で使用される際、用語「低分子量オリゴマー」は、３つ～６つのＡβρＥ３－Ｘで構成される可溶性オリゴマー、好ましくは三量体及び四量体Ａβρ３－ｘ又はＡβ４－ｘオリゴマーを指し、式中、Ｘは３８、４０、４２である。好ましくは、Ａβρ３－ｘ又はＡβ４－ｘの低分子量オリゴマーは、少なくとも三量体オリゴマーであり、１５ｋＤＡ未満のサイズを有する。

抗体は、Ｎ末端切除アミロイドペプチド、例えばピログルタメート（ｐＥ）修飾アミロイドペプチド（ＡβｐＥ３－ｘ、ＡβｐＧｌｕ３－ｘ、２５ Ａβ（Ｇｌｐ３）３－ｘ、及びｐ３－ｘとも称される）、例えばＡβｐＥ３－３８、ＡβｐＥ３－４０、ＡβｐＥ３－１４及びＡβｐＥ３－４２、並びに非ピログルタメート修飾アミロイドペプチド、例えばＡβ４－３８、Ａβ４－４０、Ａβ４－１４及びＡβ４－４０に特異的に結合し得る。抗体、例えばＴＡＰ０１及びＴＡＰ０１＿０１は、全長アミロイドペプチド又はＮ末端切除を伴わないアミロイドペプチド（Ａβ１－ｘ）、例えばＡβ１－４２、Ａβ１－３８、Ａβ１－４０又はＡβ１－１４に特異的結合を示さないことも可能である。

好ましい実施形態において、本明細書に記載の環状ペプチドが結合する抗体は、アミロイドペプチドＡβｐＥ３－４２及びＡβ４－４２に特異的に結合し得る。この抗体は、Ａβ１－４２の単量体及び二量体に特異的結合を示さないか又は特異的結合を実質的に示さないことも可能である。

特異的結合又は「特異的認識」は、抗体が、抗原上の特定のエピトープ以外の分子にいかなる有意な結合も示さない状況を指す。

例えば、用語「特異的認識」又は同様の用語は、本明細書で使用される際、結合分子、すなわち抗体が、Ｎ末端切除アミロイドペプチド、すなわちＡβρ３－ｘ又はＡβ４－ｘ（式中、Ｘは４２、４０又は３８である）、例えばＡβρ３－４２又はＡβ４－４２の可溶性低分子量オリゴマーに特異的に結合する及び／又はこれらを検出する（すなわち認識する）ことを意味するよう意図される。抗体は、Ａβ１－４０の単量体若しくは二量体、又は高分子量オリゴマーを認識せず、又はこれらに結合しない。したがって、抗体は、好ましくは、三量体又は四量体Ａβρ３－４２オリゴマーにおいて形成されるコンホメーションエピトープを認識する。アミロイドβの低分子量オリゴマーを特異的に認識し、全長アミロイドペプチドに全く又はほとんど結合を示さない抗体には、限定されるわけではないが、ＴＡＰ０１及びＴＡＰ０１＿０１が含まれる。

本明細書に記載の抗体のアフィニティは、本明細書に定義される環状ペプチドへの抗体結合を含む、エピトープ又は抗原への抗体結合の度合い又は強度である。解離定数Ｋｄ及びアフィニティ定数Ｋａは、アフィニティの定量的測定値である。Ｋｄは、抗体がどれだけ迅速にその抗原に結合するかを示す抗体の抗体会合速度（ｋ_ｏｎ）に対する、抗体がどれだけ迅速にその抗原から解離するかを示す抗体解離速度（ｋ_ｏｆｆ）の比である。抗体のその抗原への結合は可逆的プロセスであり、結合反応の速度は、反応物の濃度に比例する。平衡状態では、［抗体］［抗原］複合体形成の比は、その構成要素［抗体］＋［抗原］への解離速度に等しい。反応速度定数の測定値を使用して、平衡又はアフィニティ定数Ｋａ（Ｋａ＝１／Ｋｄ）を定義し得る。Ｋｄ値が小さければ小さいほど、そのターゲットに関する抗体のアフィニティは大きい。大部分の抗体は、低マイクロモル（１０^－６）からナノモル（１０^－７～１０^－９）範囲のＫｄ値を有する。高アフィニティ抗体は、一般的に、低ナノモル範囲（１０^－９）にあると考えられ、非常に高アフィニティの抗体は、ピコモル（１０^－１２）範囲にある。

いくつかの実施形態において、抗Ａβ抗体（環状ペプチドが結合するもの）は、少なくとも２×１０^２Ｍ^－１、少なくとも５×１０^２Ｍ^－１、少なくとも１０^３Ｍ^－１、少なくとも５×１０^３Ｍ^－１、少なくとも１０^４Ｍ^－１、少なくとも５×１０^４Ｍ^－１、少なくとも１０^５Ｍ^－１、少なくとも５×１０^５Ｍ^－１、少なくとも１０^６Ｍ^－１、少なくとも５×１０^６Ｍ^－１、又は少なくとも１０^７Ｍ^－１のアフィニティ定数、すなわちＫａでアミロイドペプチドＡβｐＥ３－４２及びＡβ４－４２に結合する（例えば特異的に結合する）。

いくつかの実施形態において、抗Ａβ抗体（環状ペプチドが結合するもの）は、５×１０^２Ｍ未満、１０^－２Ｍ未満、５×１０^－３Ｍ未満、１０^－３Ｍ未満、５×１０^－４Ｍ未満、１０^－４Ｍ未満、５×１０^－５Ｍ^－１未満、５×１０^－５Ｍ未満、５×１０^－６Ｍ未満、１０^－６Ｍ未満、又は５×１０^－７Ｍ未満の、アミロイドペプチドＡβｐＥ３－４２及びＡβ４－４２からの解離定数、すなわちＫｄを有し得る。

抗体の特異的結合は、抗体が特定の抗原又はエピトープに関する認識可能なアフィニティを示し、一般的に、有意な交差反応性を示さないことを意味する。「有意な交差反応性を示さない」抗体は、望ましくない実体（例えば望ましくないタンパク質性実体）に認識可能に結合しないであろうものである。特定のエピトープに特異的な抗体は、例えば、同じタンパク質又はペプチド上の遠隔エピトープに有意に交差反応しないであろう。本明細書に記載の抗体の特異的結合、すなわちｋ_ｏｆｆ、ｋ_ｏｎ、Ｋａ及びＫｄは、こうした結合を決定するための、当該技術分野に認識される任意の手段に従って決定され得る。

抗Ａβ抗体の結合は、標準技術、例えばＥＬＩＳＡ又は表面プラズモン共鳴を使用して決定され得る。適切なＥＬＩＳＡ技術は当該技術分野に既知である。例えば、固定されたアミロイドペプチドを、ＩｇＧ１形式の抗体と接触させ、０．１％非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ２０）で１回以上洗浄して、未結合抗体を除去してもよい。次いで、任意の慣用的技術を使用して、例えば検出可能標識、例えばＨＲＰに結合した二次抗体を使用して、固定されたペプチドに結合した抗体を検出してもよい。

本発明は、キャリアー、好ましくはキャリアータンパク質に連結された、本明細書に記載の環状ペプチドを更に提供する。好ましくは、ペプチドは、化学的架橋によってキャリアーに連結される。環状ペプチドは、限定されるわけではないが、キーホールリンペット（keyhole limpet）ヘモシアニン（ＫＬＨ）、血清アルブミン（例えばウシ血清アルブミン、ＢＳＡ）又はオボアルブミン、免疫グロブリンＦＣドメイン、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド又はその組み合わせを含む、キャリアータンパク質にコンジュゲート化され得る。キャリアーペプチドは、環状ペプチドに直接又はリンカーを通じて連結され得る。ペプチドは、当該技術分野において標準的な技術を通じて、キャリアータンパク質に連結され得る。

本明細書に記載されるような環状ペプチドは、療法において有用であり得る。例えば、環状ペプチドタンパク質は、神経学的疾患の治療のために、個体に投与され得る。環状ペプチドは、通常、環状ペプチドに加えて少なくとも１つの更なる構成要素を含み得る、医薬組成物の形で投与されるであろう。

本明細書に記載の環状ペプチド及び組成物は、本明細書に記載されるように、非経口、局所、静脈内、経口、胃、皮下、動脈内、頭蓋内、腹腔内、鼻内又は筋内法によって、療法的及び／又は予防的治療のために投与され得る。環状ペプチドの投与には、筋内注射又は静脈内注入が好ましい。

医薬組成物は、本明細書に記載の環状ペプチドに加えて、医薬的に許容され得る賦形剤、キャリアー、緩衝剤、安定化剤、及び／又は当業者に既知の他の物質を含み得る。用語「医薬的に許容され得る」は、本明細書において使用される場合、正当な医学的判断の範囲内で、被験体（例えばヒト）への投与に適切であり、被験体にいかなる望ましくない又は有害な影響も引き起こさないであろう、化合物、物質、組成物、及び／又は剤形に関する。各キャリアー、賦形剤等はまた、配合物の他の成分と適合するという意味でも「許容され得る」ものでなければならない。キャリアー又は他の物質の正確な性質は、投与経路に応じ、これは、ボーラス、注入、注射、又は以下に論じられ、当該技術分野に既知である、任意の他の適切な経路によってもよい。

環状ペプチドを適切な送達ビヒクル内に配合してもよい。例えば注射による、非経口投与のため、本明細書に記載の環状ペプチドを含む医薬組成物は、適切な医薬キャリアーと共に、生理学的に許容され得る希釈剤中、非経口的に許容され得る水性溶液又は懸濁物の形であり得る。当業者は、適切なキャリアー、保存剤、安定化剤、緩衝剤、酸化防止剤及び／又は他の添加剤を使用して適切な溶液を十分に調製可能であり、これらは、必要に応じて使用され得る。適切なキャリアー、賦形剤等は、標準的な医薬教科書、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1990に見出され得る。

非経口という用語には、本明細書において使用される場合、本明細書に記載の環状ペプチド又は組成物の皮下、静脈内、皮内、筋内、腹腔内、及びクモ膜下腔内投与が含まれる。本明細書に記載の環状ペプチド又は組成物はまた、鼻又は胃への方法によって投与され得る。

本明細書に記載の環状ペプチドは、好ましくは、無菌溶液として配合され、投与されるが、場合によっては、凍結乾燥調製物を使用することもまた可能であり得る。無菌溶液は、無菌濾過によって、又は当該技術分野に知られる他の方法によって調製される。溶液を次いで、凍結乾燥するか、又は医薬投薬容器内に充填する。

医薬組成物は、ワクチンとして使用するためのものであり得る。ワクチン組成物は、アジュバントを更に含み得る。アジュバントは適用される抗原決定基に対する免疫反応を更に増加させることが当該技術分野に知られる。アジュバントは、免疫系の刺激を引き起こす１つ以上の物質として定義される。この背景において、アジュバントは本発明の環状ペプチドに対する免疫反応を増進させるために使用される。適切なアジュバントの例には、限定されるわけではないが、水酸化アルミニウム及び／又はリン酸アルミニウム等のアルミニウム塩、スクワラン－水エマルジョン、例えばＭＦ５９を含む油エマルジョン組成物（又は水中油（oil-in-water）組成物）、サポニン配合物、例えばＱＳ２１及び免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、細菌又は微生物派生物、例えばモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、３－０－脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）、ＣｐＧモチーフ含有オリゴヌクレオチド、ＡＤＰリボシル化細菌毒素又はその突然変異体、例えば大腸菌（E. coli）熱不安定性エンテロトキシンＬＴ、コレラ毒素ＣＴ等、レシピエント細胞と相互作用した際に免疫反応を刺激する真核タンパク質（例えば抗体又はその断片）が含まれる。或る特定の実施形態において、本発明の組成物は、アジュバントとして、例えば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、リン酸カリウムアルミニウム（aluminium potassium phosphate）、又はその組み合わせを含む。

本発明は、アミロイド関連疾患に対するワクチン接種に適したものにする、ＡβρＥ３－ｘ又はＡβ４－ｘ上のエピトープを模倣する環状ペプチドを提供する。本明細書に記載されるような環状ペプチドは免疫原性である。免疫原性は、環状ペプチドが免疫反応を誘発する能力を有することを意味する。本明細書に記載されるような環状ペプチドを含む免疫原性組成物は、環状ペプチドに対する免疫反応を誘導することができ、抗アミロイド抗体、特にＡβρＥ３－ｘ又はＡβ４－ｘの低分子量オリゴマーに特異的に結合する抗アミロイド抗体の生成を促進し得る。

理論によって束縛されることなく、ワクチンとしての本明細書に記載されるような環状ペプチドの投与は、低分子量ＡβρＥ３－ｘ又はＡβ４－ｘオリゴマーに特異的に結合する抗Ａβ抗体の生成を導く免疫反応を誘導するであろうと考えられる。これらの抗Ａβ抗体は、アルツハイマー病の病理において初期に生成される毒性Ａβオリゴマーを中和し、続く斑形成を防止し得る。

したがって、本発明は、被験体においてアミロイドβに対する免疫反応を誘導する方法であって、療法的有効量の本発明による環状ペプチドを被験体に投与することを含む、方法を提供する。被験体において免疫反応を誘導する際に使用される、特にワクチンとして使用される、本発明による組成物もまた提供する。被験体において免疫反応タンパク質を誘導する際に使用するための薬剤製造用の本発明による本明細書に記載の環状ペプチドの使用を更に提供する。好ましくは、誘導される免疫反応は、アミロイドβの低分子量オリゴマーに特異的に結合可能な抗体の産生によって特徴づけられる。

本発明はまた、アルツハイマー病の治療の方法を提供し、特に、アルツハイマー病は、孤発性アルツハイマー病又は家族性アルツハイマー病、並びに他のＡβ関連疾患及び障害及び可溶性アミロイドによって特徴づけられる他の神経学的疾患である。したがって、本発明はまた、アルツハイマー病を治療する方法であって、療法的有効量の本明細書に記載されるような環状ペプチドを被験体に投与することを含む、方法に関する。

治療には、予防的治療及び療法的治療の両方が含まれる。用語「治療する（treat）」、「治療している（treating）」又は「治療（treatment）」（又は同等の用語）は、個体の病態の重症度が減少するか、又は少なくとも部分的に改善されるか若しくは寛解すること、及び／又は少なくとも１つの臨床症状において、或る程度の寛解、軽減若しくは減少が達成されること、及び／又は病態の進行の阻害若しくは遅延及び／又は疾患若しくは疾病の開始の防止若しくは遅延があることを意味する。

特に、アルツハイマー病の治療には、被験体におけるアルツハイマー病及び／又はアルツハイマー病と関連する１つ以上の症状の開始の防止又は遅延が含まれる。治療は、被験体におけるアミロイドβオリゴマーの集積の阻害又は減少を含む。

上述の治療法は、例えばアルツハイマー病の防止又は治療のため、個体において有益な療法反応を生じる条件下で、個体に、本明細書に記載の抗体又は組成物（例えば本明細書に記載の環状ペプチド、医薬的に許容され得る賦形剤及び任意選択で更なる療法剤を含む組成物）を投与することを含み得る。こうした個体は、アルツハイマー病を患っている場合がある。本明細書に記載の治療法は、無症候性患者、及びアルツハイマー病の症状を現在示している患者の両方に対して使用され得る。本明細書に記載の環状ペプチドは、アルツハイマー病に罹患していない個体に、予防的に投与され得る。本明細書に記載の環状ペプチドは、アルツハイマー病に罹患していない又はアルツハイマー病の症状を示していない個体に投与され得る。本明細書に記載の環状ペプチドは、アルツハイマー病に罹患している、又は罹患しているようである個体に投与され得る。治療に適した個体には、アルツハイマー病のリスクがあるか又はアルツハイマー病に感受性であるが、症状を示していない個体、及びアルツハイマー病を有すると推測される個体、並びに現在症状を示している個体が含まれる。本明細書に記載の環状ペプチドは、一般集団に、予防的に投与され得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるような治療に適している個体には、早発型アルツハイマー病又はその１つ以上の症状を伴う個体、及びそのアミロイドペプチドが、体液、例えばＣＳＦ試料中で検出されている個体が含まれ得る。

用語「患者」、「個体」又は「被験体」には、本明細書に記載の１つ以上の環状ペプチドでの予防的治療又は療法的治療のいずれかを受けているヒト及び他の哺乳動物被験体が含まれる。哺乳動物被験体には、霊長類、例えば非ヒト霊長類が含まれる。哺乳動物被験体にはまた、研究に一般的に使用される実験動物、例えば限定されるわけではないが、ウサギ並びに齧歯類、例えばラット及びマウスが含まれる。

本明細書に記載の環状ペプチドは、有効投薬量の本明細書に記載するような環状ペプチドを患者に投与することを含む、アルツハイマー病を防止するか又は治療する方法において使用され得る。本明細書で使用される際、本明細書に記載の環状ペプチドの「有効量」又は「有効投薬量」又は「十分な量」（又は文法的に同等の用語）は、望ましい効果、任意選択で療法的効果を生じる（すなわち療法的又は予防的有効量の投与により）ために有効である、本明細書に記載の環状ペプチド又は組成物の量を指す。例えば、「有効量」又は「有効投薬量」又は「十分な量」は、個体の病態、例えばアルツハイマー病の重症度が減少しているか又は少なくとも部分的に改善されているか若しくは寛解している、及び／又は少なくとも１つの臨床症状において、或る程度の寛解、軽減又は減少が達成されている、及び／又はアルツハイマー病の進行の阻害又は遅延及び／又はアルツハイマー病の開始の防止又は遅延があるような量であり得る。

予防的及び療法的治療措置の両方において、十分な免疫反応が達成されるまで、何回かの投薬量で、試薬を投与してもよい。用語「免疫反応」又は「免疫学的反応」には、レシピエント被験体において、抗原に対して向けられる体液性（抗体仲介性）及び／又は細胞性（抗原特異的Ｔ細胞又はその分泌産物によって仲介される）反応の発展が含まれる。典型的には、免疫反応を監視し、免疫反応が減弱し始めたら反復投薬量を投与する。

上述の病態の治療のための本明細書に記載の組成物の有効用量は、投与手段、ターゲット部位、患者の生理学的状態、患者がヒトであるか又は動物であるか、投与されている他の薬剤、及び治療が予防的であるか又は療法的であるかを含む多くの異なる要因に応じて多様である。

本明細書に記載の環状ペプチドでの能動免疫のため、投薬量は、約０．１ｍｇ／宿主体重ｋｇ～１００ｍｇ／宿主体重ｋｇ、より一般的には０．１ｍｇ／宿主体重ｋｇ～５０ｍｇ／宿主体重ｋｇの範囲である。例えば、投薬量は、少なくとも１ｍｇ／体重ｋｇ又は少なくとも１０ｍｇ／体重ｋｇ、又は１ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇの範囲内であり得る。別の例において、投薬量は、少なくとも０．５ｍｇ／体重ｋｇ又は少なくとも５０ｍｇ／体重ｋｇ、又は０．５ｍｇ／体重～５０ｍｇ／体重の範囲内、好ましくは少なくとも５ｍｇ／ｋｇである。好ましい例において、投薬量は約５０ｍｇ／ｋｇであり得る。

本明細書に記載の治療は、単回用量、２回用量、又は多数回用量として、被験体への環状ペプチドの投与を含み得る。本明細書に記載の環状ペプチドは、多数の機会に投与され得る。単一の投薬量間の間隔は、毎日、毎週、毎月又は毎年であり得る。間隔はまた、患者において誘導される抗Ａβ抗体の血液レベルを測定することによって示されるように、不定期であってもよい。いくつかの方法において、投薬量は、望ましい血漿抗体濃度を達成するように調節される。投薬量及び頻度は、患者に応じて多様である。

投薬量及び投与頻度は、治療が予防的であるか又は療法的であるかに応じて多様であり得る。予防的適用では、本明細書に記載の環状ペプチドを含有する組成物を、既に疾患状態にあるわけではない患者に投与して、患者の耐性を増進させる。こうした量は、「予防的有効用量」と定義される。この使用においても、正確な量は、患者の健康状態及び全身免疫状態に応じるが、一般的に、用量あたり０．１ｍｇ～２５ｍｇ、特に用量あたり０．５ｍｇ～２．５ｍｇの範囲である。長い期間に渡っては、相対的により頻繁でない間隔で、相対的に低い投薬量が投与される。

本発明による組成物は、アミロイドβタンパク質によって引き起こされる疾患又は病態、すなわち神経変性疾患、例えばアルツハイマー病の独立した治療及び／又は予防において、又は他の予防的及び／又は療法的治療、例えば他のワクチン、及び／又は抗体、及び／又は他の活性剤と組み合わせて、使用され得る。或る特定の実施形態において、ワクチンは、例えばアルツハイマー病と関連する他のタンパク質に対する免疫反応を誘導する、及び／又はアミロイドβの他の型に向けられる抗体を誘導する、他の構成要素を更に含む、混合ワクチンであり得る。更なる活性構成要素の投与は、例えば、別個の投与によって、又は本発明のワクチン及び更なる活性構成要素の組み合わせ産物を投与することによって、行われ得る。

本明細書に記載の環状ペプチドは、キットの形で提供され得る。キットは、少なくとも１つの本明細書に記載の環状ペプチドを含有し得る。キットは、任意選択で、アルツハイマー病（ＡＤ）の防止、管理又は治療に有用な１つ以上の他の予防剤又は療法剤と共に、１つ以上の容器中に、本明細書に記載の組成物を含み得る。投与のための構成要素を含有する組成物が、消化管を通じた送達、例えば経口送達用に配合されていない場合、何らかの他の経路を通じてキット構成要素を送達可能なデバイス、例えばシリンジが含まれ得る。キットは、他の疾患又は病態のための他の療法剤を含む組成物を更に含み得る。キットは、ＡＤを防止するか、治療するか、管理するか、又は寛解させるための指示、並びに副作用及び投与法のための投薬情報を更に含み得る。

本発明はまた、本明細書に記載されるような環状ペプチドを産生する方法にも関する。本明細書に記載されるような環状ペプチドは、当該技術分野に知られる方法によって調製され得る。１つの実施形態において、方法は、望ましいペプチドの配列を含む直鎖ペプチドを生成することと、システイン残基を通じて直鎖ペプチドを環状化して、環状ペプチドを得ることとを含む。生成される直鎖ペプチドは、当該技術分野に知られる方法、例えばチオール酸化によって、任意選択でメチレン架橋を含む導入を伴い、環状化され得る。Kourra C and Cramer N, Chem. Sci., 2016,7, 7007-7012もまた参照されたい。

本発明はまた、アミロイドβの低分子量オリゴマーを認識する抗体を産生する方法であって、
（ａ）動物を、上述のような環状ペプチド又は変異体、式（Ｉ）の配列、好ましくは配列番号１４、配列番号４又は配列番号１３の配列を含む環状ペプチドで免疫することと、
（ｂ）工程（ａ）における免疫によって生成された抗体を得ることと、
を含む、方法にも関する。方法は更に、工程（ｂ）で得られた抗体をスクリーニングすることを含む、工程（ｃ）を更に含み得る。好ましくは、抗体は、アミロイドβの低分子量オリゴマーの特異的認識に関してスクリーニングされる。好ましい抗体を、Ｎ末端切除アミロイドペプチド、すなわちＡβｐＥ３－４２及びＡβ４－４２を特異的に認識し、Ａβ１－４２に有意には結合せず、好ましくはＡβｐＥ３－４２及びＡβ４－４２を特異的に認識する能力に関してスクリーニングする。

抗体は、アミロイドβの低分子量オリゴマー、好ましくはＡβｐＥ３－ｘ及びＡβ４－ｘの低分子量オリゴマーに対するその結合及び／又は特異性に関して、当該技術分野に知られる標準法、例えばＥＬＩＳＡを使用してスクリーニングされ得る。例えば、特許文献１及び特許文献３に記載されるようなアッセイを使用する。低分子量オリゴマーに特異的に結合するが、アミロイドβタンパク質の他の型、例えば、アミロイドβの高分子量オリゴマー及び／又は単量体型及び二量体型に特異的には結合しない抗体の選択は、アミロイドβの低分子量オリゴマーへの陽性結合、及びアミロイドβの高分子量オリゴマー及び／又は単量体及び二量体型への結合の欠如に基づいて行われ得る。ＡβｐＥ３－４２及びＡβ４－４２に特異的に結合するが、Ａβ１－４２に特異的には結合しない抗体の選択は、ＡβｐＥ３－４２及びＡβ４－４２への陽性結合、並びにＡβ１－４２への結合の欠如に基づいて行われ得る。

本明細書に記載の他の態様及び実施形態は、用語「を含む」が用語「からなる」によって置き換えられた上記態様及び実施形態、並びに用語「を含む」が用語「から本質的になる」によって置き換えられた上記態様及び実施形態を提供する。

本出願は、文脈が別に要求しない限り、上述の上記態様及び実施形態のいずれかの互いとの全ての組み合わせを開示することが理解されるものとする。同様に、本出願は、文脈が別に要求しない限り、単一の又は他の態様いずれかと一緒のいずれかで、好ましい及び／又は任意選択の特徴の全ての組み合わせを開示する。

上記実施形態の変更形態、更なる実施形態及びその変更形態は、本開示を読めば当業者には明らかであり、したがって、これらは本明細書に記載の範囲内である。

本明細書に言及される全ての文書及び配列データベースエントリーは、全ての目的のため、その全体が引用することにより本明細書の一部をなす。

実験法
１． 環状化ペプチドの産生
要約すると、当該技術分野の標準的技術を使用して、望ましい配列を含み、２つのシステイン残基を含む直鎖ペプチドを生成する。ペプチド中に存在するシステイン残基を通じて、ペプチドを環状化する。

当該技術分野で標準的な方法、例えばチオール酸化によって、任意選択でメチレン架橋を含む導入を伴い、ペプチドを環状化した。例えば、Kourra C and Cramer N, Chem. Sci., 2016,7, 7007-7012もまた参照されたい。

以下の配列を有するペプチドが生成された。

ペプチドは、式－Ｓ－Ｓを有するジスルフィド架橋又は式－Ｓ－ＣＨ_２－Ｓ－を有するチオアセタール架橋のいずれかで、システイン残基を通じて環状化された。

２． １－１４ジスルフィド架橋環状ペプチド結合ＥＬＩＳＡ
１． ＰＢＳ（Thermo Fisher １００１０－０１５）中で希釈された２．５μｇ／ｍｌのストレプトアビジン（Thermo Scientific ２１１２２）３０μＬ／ウェルで３８４ウェルプレートをコーティングする
２． ４℃で一晩インキュベーションする
３． プレートを洗浄する（NUNC ３８４プログラム）
４． ＰＢＳ中で希釈された２μｇ／ｍｌのジスルフィド架橋された環状ペプチド３０μＬ／ウェルで３８４ウェルプレートをコーティングする
５． 室温で１時間インキュベーションする
６． プレートを洗浄する（NUNC ３８４プログラム）
７． アッセイ緩衝液８０μＬ／ウェルでプレートをブロッキングする
８． ４℃で一晩インキュベーションする
９． プレートを洗浄する（NUNC ３８４プログラム）
１０． 血清に関して、血清試料（アッセイ緩衝液中１／１００で希釈）７０μＬ／ウェルを非粘着性（non-sticky）プレート上に分配し、アッセイ緩衝液中、２倍シリーズで（３５μＬを３５μＬアッセイ緩衝液に）希釈する
競合剤抗体に関して、対照抗体（アッセイ緩衝液中、１００．０μｇ／ｍｌに希釈）６０μＬ／ウェルを非粘着性プレート上に分配し、アッセイ緩衝液中、３倍シリーズで（２０μＬを４０μＬアッセイ緩衝液に）希釈する
１１． 対照抗体（アッセイ緩衝液中、３６０．０μｇ／ｍｌに希釈）６０μＬ／ウェルを非粘着性プレート上に分配し、アッセイ緩衝液中、３倍シリーズで（２０μＬを４０μＬアッセイ緩衝液に）希釈する
１２． ３０μＬ／ウェルをアッセイプレート上に移す
１３． ３７℃で１時間インキュベーションする
１４． プレートを洗浄する（NUNC ３８４プログラム）
１５． アッセイ緩衝液中、二次抗体を適切に希釈し、３０μＬ／ウェルを添加する
１６． ３７℃で１時間インキュベーションする
１７． プレートを洗浄する（NUNC ３８４プログラム）
１８． ２０μＬ／ウェルのＫ－ＢＬＵＥ基質（Neogen ３０８１７６）を添加する
１９． 暗所中、室温で１０分間インキュベーションする
２０． １０μＬ／ウェルのＲＥＤ ＳＴＯＰ溶液（Neogen ３０８１７６）を添加することによって反応を停止する
２１． ＰｈｅｒａＳｔａｒ Ｐｌｕｓ（BMG LabTech）を使用して、６５０ｎｍで光学密度を読み取る

３． １－４２ペプチド結合ＥＬＩＳＡ
１． 炭酸／重炭酸緩衝液中で希釈された１００ｎｇ／ｍｌのＰＳＬアミロイド１－４２ペプチド（ヒト－Peptide Speciality Laboratories－ＣＥＭ１９０４１６１）３０μＬ／ウェルで３８４ウェルプレートをコーティングする
２． ３７℃で１時間インキュベーションする
３． プレートを洗浄する（NUNC ３８４プログラム）
４． アッセイ緩衝液８０μＬ／ウェルでプレートをブロッキングする
５． ４℃で一晩インキュベーションする
６． プレートを洗浄する（NUNC ３８４プログラム）
７． ジスルフィド架橋免疫血清に関して、
試料（アッセイ緩衝液中１／１００で希釈）７０μＬ／ウェルを非粘着性プレート上に分配し、アッセイ緩衝液中、２倍シリーズで（３５μＬを３５μＬアッセイ緩衝液に）希釈する
チオアセタール架橋免疫血清に関して、
血清試料（アッセイ緩衝液中１／１００で希釈）及び対照抗体（アッセイ緩衝液中、３６０．０μｇ／ｍｌに希釈）６０μＬ／ウェルを非粘着性プレート上に分配し、アッセイ緩衝液中、３倍シリーズで（２０μＬを４０μＬアッセイ緩衝液に）希釈する
８． 対照抗体に関して、対照抗体（アッセイ緩衝液中、３６０．０μｇ／ｍｌに希釈）６０μＬ／ウェルを非粘着性プレート上に分配し、アッセイ緩衝液中、２倍又は３倍シリーズで（免疫血清の希釈に応じて）（２０μＬを４０μＬアッセイ緩衝液に）希釈する
９． ３０μＬ／ウェルをアッセイプレート上に移す
１０． ３７℃で１時間インキュベーションする
１１． プレートを洗浄する（NUNC ３８４プログラム）
１２． アッセイ緩衝液中、二次抗体を適切に希釈し、３０μＬ／ウェルを添加する
１３． ３７℃で１時間インキュベーションする
１４． プレートを洗浄する（NUNC ３８４プログラム）
１５． ２０μＬ／ウェルのＫ－ＢＬＵＥ基質（Neogen ３０８１７６）を添加する
１６． 暗所中、室温で１０分間インキュベーションする
１７． １０μＬ／ウェルのＲＥＤ ＳＴＯＰ溶液（Neogen ３０８１７６）を添加することによって反応を停止する
１８． ＰｈｅｒａＳｔａｒ Ｐｌｕｓ（BMG LabTech）を使用して、６５０ｎｍで光学密度を読み取る

４． ｐＥ３－４２ペプチド結合ＥＬＩＳＡ
１． 炭酸／重炭酸緩衝液中で希釈された１００ｎｇ／ｍｌ ＰＳＬアミロイドｐＥ３－４２ペプチド（ヒト－Peptide Speciality Laboratories－ＣＥＭ０６２２１０Ｐｙｒ）３０μＬ／ウェルで、３８４ウェルプレートをコーティングする
２． ３７℃で１時間インキュベーションする
３． プレートを洗浄する（NUNC ３８４プログラム）
４． アッセイ緩衝液８０μＬ／ウェルでプレートをブロッキングする
５． ４℃で一晩インキュベーションする
６． プレートを洗浄する（NUNC ３８４プログラム）
７． ジスルフィド架橋免疫血清に関して、
血清試料（アッセイ緩衝液中１／１００で希釈）７０μＬ／ウェルを非粘着性プレート上に分配し、アッセイ緩衝液中、２倍シリーズで（３５μＬを３５μＬアッセイ緩衝液に）希釈する
チオアセタール架橋免疫血清に関して、
血清試料（アッセイ緩衝液中１／１００で希釈）及び対照抗体（アッセイ緩衝液中、３６０．０μｇ／ｍｌに希釈）６０μＬ／ウェルを非粘着性プレート上に分配し、アッセイ緩衝液中、３倍シリーズで（２０μＬを４０μＬアッセイ緩衝液に）希釈する
８． 対照抗体に関して、対照抗体（アッセイ緩衝液中、３６０．０μｇ／ｍｌに希釈）６０μＬ／ウェルを非粘着性プレート上に分配し、アッセイ緩衝液中、２倍又は３倍シリーズで（免疫血清の希釈に応じて）（２０μＬを４０μＬアッセイ緩衝液に）希釈する
９． ３０μＬ／ウェルをアッセイプレート上に移す
１０． ３７℃で１時間インキュベーションする
１１． プレートを洗浄する（NUNC ３８４プログラム）
１２． アッセイ緩衝液中、二次抗体を適切に希釈し、３０μＬ／ウェルを添加する
１３． ３７℃で１時間インキュベーションする
１４． プレートを洗浄する（NUNC ３８４プログラム）
１５． ２０μＬ／ウェルのＫ－ＢＬＵＥ基質（Neogen ３０８１７６）を添加する
１６． 暗所中、室温で１０分間インキュベーションする
１７． １０μＬ／ウェルのＲＥＤ ＳＴＯＰ溶液（Neogen ３０８１７６）を添加することによって反応を停止する
１８． ＰｈｅｒａＳｔａｒ Ｐｌｕｓ（BMG LabTech）を使用して、６５０ｎｍで光学密度を読み取る

５． ４－４２ペプチド結合ＥＬＩＳＡ
１． 炭酸／重炭酸緩衝液中で希釈された２００ｎｇ／ｍｌ Anaspec ４－４２ペプチド（Eurogentec ＡＳ－２９９０８－１）３０μＬ／ウェルで、３８４ウェルプレートをコーティングする
２． ３７℃で１時間インキュベーションする
３． プレートを洗浄する（NUNC ３８４プログラム）
４． アッセイ緩衝液８０μＬ／ウェルでプレートをブロッキングする
５． ４℃で一晩インキュベーションする
６． プレートを洗浄する（NUNC ３８４プログラム）
７． ジスルフィド架橋免疫血清に関して、
血清試料（アッセイ緩衝液中１／１００で希釈）７０μＬ／ウェルを非粘着性プレート上に分配し、アッセイ緩衝液中、２倍シリーズで（３５μＬを３５μＬアッセイ緩衝液に）希釈する
チオアセタール架橋免疫血清に関して、
対照抗体（アッセイ緩衝液中、３６０．０μｇ／ｍｌに希釈）６０μＬ／ウェルを非粘着性プレート上に分配し、アッセイ緩衝液中、３倍シリーズで（２０μＬを４０μＬアッセイ緩衝液に）希釈する
８． ３０μＬ／ウェルをアッセイプレート上に移す
９． ３７℃で１時間インキュベーションする
１０． プレートを洗浄する（NUNC ３８４プログラム）
１１． アッセイ緩衝液中、二次抗体を適切に希釈し、３０μＬ／ウェルを添加する
１２． ３７℃で１時間インキュベーションする
１３． プレートを洗浄する（NUNC ３８４プログラム）
１４． ２０μＬ／ウェルのＫ－ＢＬＵＥ基質（Neogen ３０８１７６）を添加する
１５． 暗所中、室温で１０分間インキュベーションする
１６． １０μＬ／ウェルのＲＥＤ ＳＴＯＰ溶液（Neogen ３０８１７６）を添加することによって反応を停止する
１７． ＰｈｅｒａＳｔａｒ Ｐｌｕｓ（BMG LabTech）を使用して、６５０ｎｍで光学密度を読み取る

６． ８．５．ＫＬＨ抗原結合ＥＬＩＳＡ
１． ＰＢＳ（Thermo Fisher １００１０－０１５）中で希釈された２μｇ／ｍｌ ＫＬＨ（Sigma Ｈ８２８３）３０μＬ／ウェルで、３８４ウェルプレートをコーティングする
２． ４℃で一晩インキュベーションする
３． プレートを洗浄する（NUNC ３８４プログラム）
４． アッセイ緩衝液８０μＬ／ウェルでプレートをブロッキングする
５． 室温で１時間インキュベーションする
６． プレートを洗浄する（NUNC ３８４プログラム）
７． 血清試料（アッセイ緩衝液中１／１０００で希釈）及び対照抗体（アッセイ緩衝液中、２０．０μｇ／ｍｌに希釈）６０μＬ／ウェルを非粘着性プレート上に分配し、アッセイ緩衝液中、３倍シリーズで（２０μＬを４０μＬアッセイ緩衝液に）希釈する
８． ３０μＬ／ウェルをアッセイプレート上に移す
９． ３７℃で１時間インキュベーションする
１０． プレートを洗浄する（NUNC ３８４プログラム）
１１． アッセイ緩衝液中、二次抗体を適切に希釈し、３０μＬ／ウェルを添加する
１２． ３７℃で１時間インキュベーションする
１３． プレートを洗浄する（NUNC ３８４プログラム）
１４． ２０μＬ／ウェルのＫ－ＢＬＵＥ基質（Neogen ３０８１７６）を添加する
１５． 暗所中、室温で５分間インキュベーションする
１６． １０μＬ／ウェルのＲＥＤ ＳＴＯＰ溶液（Neogen ３０８１７６）を添加することによって反応を停止する
１７． ＰｈｅｒａＳｔａｒ Ｐｌｕｓ（BMG LabTech）を使用して、６５０ｎｍで光学密度を読み取る

７． チオアセタール架橋環状ペプチド結合ＥＬＩＳＡ
１． ＰＢＳ（Thermo Fisher １００１０－０１５）中で希釈された２．５μｇ／ｍｌのストレプトアビジン（Thermo Scientific ２１１２２）３０μＬ／ウェルで３８４ウェルプレートをコーティングする
２． ４℃で一晩インキュベーションする
３． プレートを洗浄する（NUNC ３８４プログラム）
４． ＰＢＳ中で希釈された２μｇ／ｍｌのチオアセタール架橋環状ペプチド３０μＬ／ウェルで３８４ウェルプレートをコーティングする
５． 室温で１時間インキュベーションする
６． プレートを洗浄する（NUNC ３８４プログラム）
７． アッセイ緩衝液８０μＬ／ウェルでプレートをブロッキングする
８． ４℃で一晩インキュベーションする
９． プレートを洗浄する（NUNC ３８４プログラム）
１０． 血清試料（アッセイ緩衝液中１／１００で希釈）及び対照抗体（アッセイ緩衝液中、３６０．０μｇ／ｍｌに希釈）６０μＬ／ウェルを非粘着性プレート上に分配し、アッセイ緩衝液中、３倍シリーズで（２０μＬを４０μＬアッセイ緩衝液に）希釈する
１１． ３０μＬ／ウェルをアッセイプレート上に移す
１２． ３７℃で１時間インキュベーションする
１３． プレートを洗浄する（NUNC ３８４プログラム）
１４． アッセイ緩衝液中、二次抗体を適切に希釈し、３０μＬ／ウェルを添加する
１５． ３７℃で１時間インキュベーションする
１６． プレートを洗浄する（NUNC ３８４プログラム）
１７． ２０μＬ／ウェルのＫ－ＢＬＵＥ基質（Neogen ３０８１７６）を添加する
１８． 暗所中、室温で１０分間インキュベーションする
１９． １０μＬ／ウェルのＲＥＤ ＳＴＯＰ溶液（Neogen ３０８１７６）を添加することによって反応を停止する
２０． ＰｈｅｒａＳｔａｒ Ｐｌｕｓ（BMG LabTech）を使用して、６５０ｎｍで光学密度を読み取る

８． 結晶学研究のためのタンパク質発現及び精製
抗βアミロイドＦａｂ ＴＡＰ０１及びＴＡＰ０１＿０１のＦａｂ断片をＥｘｐｉ２９３細胞において発現した。ｐＥ３－１４及び環状化３－１４ペプチドを２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）及び５０ｍＭ ＮａＣｌ中、１ｍＭで可溶化した。Ｆａｂ／ペプチド複合体を、典型的には、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）及び５０ｍＭ ＮａＣｌ中、１：１．５のモル比で混合した。結晶化のため、全てのＦａｂ／ペプチド複合体試料を約１４ｍｇ／ｍｌに濃縮した。

９． 結晶化、構造決定、及び精密化（Refinement）
等体積のタンパク質に加えてウェル溶液を混合することによって、１９℃で蒸気拡散法によって、全ての結晶を得た。

ＴＡＰ０１－ｐＥ３－１４結晶は、２０％ ＰＥＧ３３５０及び０．２Ｍクエン酸アンモニウム中で成長した。ＴＡＰ０１＿０１－ｐＥ３－１４結晶は、１０％ＰＥＧ ２０Ｋ、２０％ＰＥＧ５５０ＭＭＥ、０．１Ｍ ＭＯＰＳ／ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、並びに各０．０３Ｍの硝酸ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム及び硫酸アンモニウム中で成長した。

ＴＡＰ０１環状化３－１４共結晶は、２０％ ＰＥＧ ６Ｋ、０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、及び０．０１Ｍ塩化亜鉛中で成長した。凍結保護のため、結晶は一般的に、２２％エチレングリコールを加えた母液溶液に移した。

European Synchrotron Radiation Facility（ビームラインＩＤ３０Ｂ（ＴＡＰ０１＋ｐＥ３－１４））又はDiamond Light Source（ビームラインＩ０４（ＴＡＰ０１＿０１＋ｐＥ３－１４及びＴＡＰ０１＋環状化３－１４））でデータセットを収集した。ＴＡＰ０１及びＴＡＰ０１＿０１とｐＥ３－１４ペプチドとの共結晶を、それぞれ、１．４Å解像度及び２．５Å解像度に精密化する一方、ＴＡＰ０１と環状化３－１４ペプチドは、２．１Åで回折した。ＸＤＳ（Kabsch, W. (2010a/b) Acta Cryst D66, 125-132）及びＣＣＰ４ ＳｕｉｔｅのＡＩＭＬＥＳＳ（Winn, M., et al. (2011) Acta Cryst D67, 235-242）を使用して、データをプロセシングした。

全ての結晶構造を、Ｐｈａｓｅｒ（McCoy et al., (2005) Acta Cryst D 61, 458-64）を使用した分子置換によって解析した。それぞれ重鎖及び軽鎖をモデリングするために使用される、寄託された抗体構造４Ｆ３３（Ma, J., et al. (2012) JBC, 287: 33123-33131）及び１Ｉ７Ｚ（Larsen N.A., et al. (2001) JMB, 311: 9-15）で、ＳＷＩＳＳＭＯＤＥＬ（Waterhouse, A., et al. (2018) Nucleic Acids res. 46 W296-W303）を使用して生成される相同性モデルを使用し、ＴＡＰ０１構造を解析した。ＴＡＰ０１構造の精密化座標は、続くＴＡＰ０１＿０１構造の検索モデルとして働いた。Ｃｏｏｔ（Emsley, P. & Cowtan, K. Coot, (2004) Acta Cryst D60, 2126-32）を使用して原子モデルを構築し、Ｒｅｆｍａｃ（Murshudov, et al., (1997) Acta Cryst D53, 240-255）で精密化した。全ての構造を分子置換によって解析し、優れた立体化学を伴い、２０／２５％未満の最終Ｒワーク／Ｒフリー値と共に報告する（表１）。

結果及び考察
１． 新規エピトープの同定及び「拘束」環状ペプチドの生成
ＴＡＰ０１抗体、ＴＡＰ０１及びＴＡＰ０１＿０１（ＮＴ４Ｘ及びＮＴ４Ｘ＿ＳＡとしても知られる）に関するアミロイドペプチドの新規エピトープが同定されてきている。ｐＥ３－１４ペプチドの存在下又は非存在下で、マウスＴＡＰ０１抗体及びヒト化ＴＡＰ０１＿０１抗体を使用して、Ｘ線結晶研究を行った（表１）。

ＴＡＰ０１ Ｆａｂ単独（図１）及びｐＥ３－１４ペプチドの存在下（図２）の構造を決定した。これらの研究は、ＴＡＰ０１抗体がアミロイドペプチドのヘアピン構造（図３）に結合することを示した。抗体に対するこの結合部位は以前同定されていなかった。

結果はまた、アポ構造が、抗体－ペプチド構造と同じであることも示し、それによって、アミロイドペプチドが結合している際、コンホメーション変化が起こらないことを立証する。さらに、ＴＡＰ０１抗体及びエピトープの構造は、ＴＡＰ０１抗体のヒト化プロセス中に維持される（図４）。

環状ペプチドの「拘束された」型を形成する３位及び１２位のシステイン残基を含む１－１４アミロイドペプチド（表２）を生成した。

環状ペプチドを拘束するための２つの異なる構造、すなわちジスルフィド架橋ペプチド及びチオアセタール架橋ペプチドを生成した。ペプチドの配列及び構造を、以下の表２に示す。チオアセタール架橋ペプチドは、ジスルフィド架橋環状ペプチドのより化学的に安定な類似体を提供する。配列ＤＡＣＦＲＨＤＳＧＹＥＣＨＨを有する環状ペプチドの分析は、環状ペプチドが、構造研究で同定されたヘアピン構造を模倣することを示した。

Ｘ線結晶研究は、この「環状」コンホメーションを生成することができ、ＴＡＰ０１抗体がｐＥ３－４２ペプチドと類似の方式で、環状ペプチドに結合することを確認した。

両方の環状ペプチド構造は、元来の構造と類似の結合モード及びコンホメーションを明らかにした（図４）。環状ペプチドが、天然ｐＥ３－１４ペプチドのエピトープと同じヘアピンコンホメーションを採用することもまた示された（図５及び図６）。

いくつかの比較基準抗体は、ｐＥ３－４２アミロイドペプチドに結合可能であるが、結果は、ＴＡＰ０１がこの新規ヘアピンエピトープに結合可能な唯一の抗体であることを示す（図７）。同定されるエピトープへの比較基準抗体（バピネウズマブ、ソラネズマブ、ＢＡＮ２４０１、ＰｒｏＢｉｏＤｒｕｇ ６＿１＿６、ＰｒｏＢｉｏＤｒｕｇ ２４＿２＿３）の結合を、エピトープコンホメーションに拘束された１－１４チオアセタール架橋環状ペプチドを使用したＥＬＩＳＡによって調べた。ＰｒｏＢｉｏＤｒｕｇ ６＿１＿６（寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ ２９２４）及びＰｒｏＢｉｏＤｒｕｇ ２４＿２＿３（寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ ２９２６）は、国際公開第２０１０／００９９８７号に記載される。試験した比較基準抗体はいずれも、この「環状」ペプチドコンホメーションに結合不能であった。

２． 環状ペプチドでのマウス及びウサギの免疫
２．１． ジスルフィド架橋ペプチドでの免疫及びアミロイドペプチドへの結合
３位及び１２位のシステイン残基を含み、ジスルフィド架橋を有する１－１４アミロイドペプチド配列を使用して、ウサギ及びマウスにおいて免疫研究を行い、ＡＤの治療のためのワクチンアプローチの潜在能力を調べた。動物（５匹のマウス、２匹のウサギ）をジスルフィド架橋環状ペプチドで免疫し、表３に示すように、免疫前（第１日）、中間時点（第３５日）及び最終時点（第６３日）で血清を収集した。

ビオチン化環状、１－４２、ｐＥ３－４２及び４－４２アミロイドペプチドへの結合に関して血清をスクリーニングした。結果を図８～図１２に示す。

結果は、マウス５が最適な免疫反応を生じ、ジスルフィド架橋環状ペプチドに対して１／３２００の力価を生じることを示した（図８）。ジスルフィド架橋環状ペプチドに対して、ウサギによって、より高いレベルのバックグラウンド結合（免疫前）が生じた（図８）。「環状」ペプチド、並びに１－４２、４－４２及びｐＥ３－４２アミロイドペプチドへの、生じた血清の結合を調べた。４－４２及びｐＥ３－４２アミロイドペプチドへの結合が最小であることが、ＥＬＩＳＡによって観察された（図９～図１１）。

２．２． チオアセタール架橋ペプチドでの免疫及びアミロイドペプチドへの結合
３位及び１２位のシステイン残基を含み、チオアセタール架橋を有する１－１４アミロイドペプチド配列を使用して、ウサギ及びマウスにおいて免疫研究を行い、ＡＤの治療のためのワクチンアプローチの潜在能力を調べた。動物をチオアセタール架橋環状ペプチドで免疫し、表３に示すように、免疫前（第１日）、中間時点（第３５日）及び最終時点（第６３日）で血清を収集した。

チオアセタール架橋環状ペプチドでの免疫後（表３）、ウサギ及びマウスの両方で免疫反応が生じ、マウスにおいてより高い力価が得られた（図１３）。

「環状」ペプチドへの、並びに１－４２、４－４２及びｐＥ３－４２アミロイドペプチドへの、生じた血清の結合を調べた（図１３～図１６）。結果は、マウス２、３及び４が最適な免疫反応を生じることを示し、チオアセタール架橋環状ペプチドに対して、それぞれ１／７２９００（マウス２）及び１／２４３００（マウス３及び４）の力価であった（図１３）。ジスルフィド架橋環状ペプチドでの免疫後に生じた結果と一致して、ウサギにおいて、より高いレベルのバックグラウンド結合が観察された。

「拘束」された環状ペプチドの両方の型を試験した結果、チオアセタール架橋ペプチドは、より安定であり、かつマウスにおいてより高い力価で反応を生じることが示された。したがって、チオアセタール架橋ペプチドを下流実験に使用した。

３． ヒトＡＤ脳、並びに５Ｘ ＦＡＤ及びＴｇ４－４２脳切片における、血清のスクリーニング
マウス免疫由来の血清（Ｍ２及びＭ４血清）を、ヒトＡＤ脳切片、並びに５Ｘ ＦＡＤ及びＴｇ４－４２マウスモデル由来の脳切片を染色するために使用した（図１７及び図１８）。

４． バイオマーカー同定、及びグルコース代謝に対するＴＡＰ０１抗体の影響
若年及び加齢Ｔｇ４－４２マウスにおける１８Ｆ－ＦＤＧ取り込みのイメージングは、Ｔｇ４－４２加齢マウスにおける大脳グルコース代謝の減少を示した（図１９）。結果は、大脳グルコース代謝におけるこの減少が、ＴＡＰ０１ヒト化抗体でレスキューされ得ることを示す。

５． １－１４環状ペプチド（チオアセタール架橋）変異体へのＴＡＰ０１＿０４抗体の結合の生成及び評価
上記実験で評価された１－１４チオアセタール架橋環状ペプチドは、チオアセタール架橋のため３位及び１２位にシステイン残基を有し、ペプチドを拘束する。ＴＡＰ０１抗体の結合に関して、３位及び１２位へのシステイン残基の配置が有する役割を評価するため、ペプチド配列内の異なる位置にシステイン残基を持つ更なるペプチドを生成した（表４）。

ＴＡＰ０１抗体のこれらのチオアセタール架橋環状ペプチド変異体への結合は、ＥＬＩＳＡによって評価されてきている（図２０～図２２及び表５）。比較基準抗体への結合もまた評価した。

結果は、ＴＡＰ０１（ＭｏＧ１Ｋ）抗体のアフィニティが、環状ペプチド３，１２と比較して、環状ペプチド２，１０、２，１２及び２，１３に関してより高いことを示し（図２２及び図２３）、計算されるＥＣ５０値は、３，１２に関する１３．３３ｎＭと比較して、それぞれ、１．３３ｎＭ、０．２４ｎＭ及び１．５６ｎＭであった。しかし、比較基準抗体であるバピネウズマブもまた、２，１０、２，１２及び２，１３環状ペプチド変異体に結合可能である（図２２）。さらに、ＢＡＮ２４０１及びソラネズマブもまた、低アフィニティで、２，１０ペプチド変異体に結合可能である（図２２）。したがって、これは、ＴＡＰ０１抗体によって認識される新規ヘアピンエピトープが、主に、３，１２コンホメーションであることを示唆する。

ＴＡＰ０１抗体の結合に関して、位置の異なる組み合わせでのシステイン残基の配置が有する、特にシステインを１位で提供した際の役割を評価するため、ペプチド配列内の異なる位置にシステイン残基を持つ更なるペプチドを生成した（表６）。

ＴＡＰ０１抗体のこれらのチオアセタール架橋環状ペプチド変異体への結合、並びに環状ペプチド３，１２、環状ペプチド２，１０、環状ペプチド２，１２、及び環状ペプチド２，１３への結合は、ＥＬＩＳＡによって評価されてきている（図２５、表７）。比較基準抗体への結合もまた評価した（図２６）。

結果は、ＴＡＰ０１（ＭｏＧ１Ｋ）抗体のアフィニティが、環状ペプチド１，１０、環状ペプチド１，１１、及び環状ペプチド１，１２と比較して、環状ペプチド１，１３に関して最も高いことを示し（図２５）、計算されるＥＣ５０値は、それぞれ１２、１１１、及び９．５と比較して、３．５であった。

比較基準抗体バピネウズマブへの環状ペプチド３，１２の結合は全く見られなかった（図２６）。さらに、比較基準抗体バピネウズマブへの環状ペプチド３，１３の結合は全く見られなかった（図３４）。比較基準抗体バピネウズマブへの結合は、環状ペプチド２，１０、環状ペプチド２，１２、環状ペプチド２，１３、環状ペプチド１，１０、環状ペプチド１，１１、環状ペプチド１，１２及び環状ペプチド１，１３に関して見られた（図２６Ａ）。しかし、このデータは更に、ＴＡＰ０１抗体によって認識される新規ヘアピンエピトープが主に、３，１２コンホメーションであることを示唆し、また、３，１３コンホメーションにある環状ペプチドがこのヘアピンエピトープを模倣することを示唆する。

６． １－１４突然変異体ペプチド変異体の生成及びこの変異体へのＴＡＰ０１抗体の結合の評価
ＴＡＰ０１抗体へのアミロイドペプチドの作用機構を決定するため、プロリン残基がペプチド中に見られる実際のアミノ酸を置換する５つのペプチド（表８）を生成し、ＴＡＰ０１抗体へのこれらのペプチドの結合を調べた（図２３）。

ＤＰＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨ及びＤＡＰＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨペプチドとの結合は全く観察されず、残基２（Ａ）及び３（Ｅ）が結合に重要であることが示唆された。ペプチドＰＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨ、ＰＰＰＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨ及びＰＰＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨは、用量依存方式で結合し、残基１（Ｄ）、残基１、２及び３の組み合わせ（ＤＡＥ）、並びに残基１及び２の組み合わせ（ＤＡ）は、結合に必須ではないことが示唆された。

７． ＴＡＰ０１＿０１、ＴＡＰ０１＿０２及びＴＡＰ０１＿４でのマウスの免疫、並びに５ＸＦＡＤマウスにおける斑負荷に対する影響
５ＸＦＡＤマウスを、６週齢～１８週齢の間に、１０ｍｇ／ｋｇの抗体（ＴＡＰ０１＿０１、ＴＡＰ０１＿０２及びＴＡＰ０１＿４）でｉ．ｐ．処置した。ＴＡＰ０１＿４（ＭｏＧ１Ｋとしてクローニング）（ＮＴ４Ｘ＿Ｓ７１Ｈとしても知られる）抗体での受動免疫は、アイソタイプ対照ＩｇＧ１抗体と比較して、明確なＡβ種に関する斑負荷を低下させた。ＴＡＰ０１＿４（ＭｏＧ１Ｋ）は、全Ａβ、ピログルタメートＡβ３－ｘ、チオフラビン及びＴＡＰ０１に対して染色される斑を有意に減少させた。

全Ａβ陽性斑において、ＴＡＰ０１＿０１（ＭｏＧ１Ｋ）の効果は全く検出されず、ＴＡＰ０１＿０２（ＭｏＧ１Ｋ）ではＩｇＧ対照と比較して弱い効果が検出された。ＴＡＰ０１＿０２（ＭｏＧ１Ｋ）は、ピログルタメートＡβ３－ｘに対して染色された斑を有意に減少させた。ＴＡＰ０１＿０１（ＭｏＧ１Ｋ）及びＴＡＰ０１＿０２（ＭｏＧ１Ｋ）処置群は、チオフラビン染色によって示される原線維Ａβ沈着を有意に減少させることが示された（図２４）。

８． 拘束された環状ペプチドでのマウスの能動免疫
６週齢の５ＸＦＡＤマウスを、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中で乳化された抗原［チオアセタール架橋アミロイドβペプチド１－１４－ＫＬＨコンジュゲート、ＤＡＣ^＊ＦＲＨＤＳＧＹＥＣ^＊ＨＨ［Ｃｙｓ］－アミド（^＊Ｓ－ＣＨ－Ｓ架橋、３位及び１２位を通じて環状化）］で１２週間免疫した後、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）中で乳化されたタンパク質をブースター用量で免疫した。免疫前に、本発明者らの施設でマウスを少なくとも７日間順化させた。マウスの背中２部位で、ＣＦＡ中で乳化された抗原を皮下注射し、各部位に０．０５ｍＬ～０．１ｍＬ注射した（マウスあたり、総量０．１ｍＬ～０．２ｍＬ）。

抗原／ＣＦＡエマルジョンでの免疫の１４日後、２８日後、４２日後、及び１０週間後に、ＩＦＡ中で乳化された抗原のブースター注射を投与した。背中の１部位で、ＩＦＡエマルジョン０．１ｍＬの単回皮下注射としてブースターを投与する。マウスを屠殺（１８週齢）した後、マウスから血清試料を単離し、抗体濃度を試験した。

１８Ｆ－ＦＤＧ－ＰＥＴ／ＭＲＩイメージング
５ｘＦＡＤマウス及び年齢をマッチさせたＣ５７Ｂｌ／６Ｊ野生型マウスに対して、１８Ｆ－ＦＤＧ－ＰＥＴ／ＭＲＩを行った。マウスを一晩絶食させ、トレーサー注射の前に血中グルコースレベルを測定した。１１．４６ＭＢｑ～２０．５３ＭＢｑ（平均１６．８１ＭＢｑ）の１８Ｆ－ＦＤＧを、最大体積２００μｌで尾静脈内に静脈内注射した後、４５分間の取り込み期間を置いた。取り込みプロセス中、マウスは覚醒していた。小動物１ Ｔｅｓｌａ ｎａｎｏＳｃａｎ ＰＥＴ／ＭＲＩ（Mediso、ハンガリー）を使用して、２０分間、ＰＥＴスキャンを行った。スキャン中、酸素を補充したイソフルランでマウスを麻酔し、加熱ベッド（３７℃）上に維持した。イメージングプロセス全体で呼吸速度を測定した。マテリアルマップ（material map）（マトリックス１４４×１４４×１６３、ボクセルサイズ０．５×０．５×０．６ｍｍ^３、ＴＲ：１５ｍｓ、ＴＥ ２．０３２ｍｓ及びフリップ角２５度）で、ＭＲＩに基づく減衰補正を行い、以下のパラメータ：マトリックス１３６×１３１×３１５、ボクセルサイズ０．２３×０．３×０．３ｍｍ^３を使用して、ＰＥＴ画像を再構築した。

アミロイド斑負荷に関する１８Ｆ－フロルベタベン－ＰＥＴ／ＭＲＩ
７．５ＭＢｑ～２４ＭＢｑ（平均１４ＭＢｑ）の１８Ｆ－フロルベタベンを、最大体積２００μｌで尾静脈内に静脈内投与した。４０分間の取り込み期間後、上述のようにマウスを麻酔し、スキャンした。ＰＥＴ獲得時間は３０分間であった。マテリアルマップ（マトリックス１４４×１４４×１６３、ボクセルサイズ０．５×０．５×０．６ｍｍ^３、ＴＲ：１５ｍｓ、ＴＥ ２．０３２ｍｓ及びフリップ角２５度）で、ＭＲＩに基づく減衰補正を行い、以下のパラメータ：マトリックス１３６×１３１×３１５、ボクセルサイズ０．２３×０．３×０．３ｍｍ^３を使用して、ＰＥＴ画像を再構築した（Bouter et al, (2019), Frontiers in Aging Neuroscience vol. 10:425）。

画像分析
ＰＭＯＤ ｖ３．９（PMOD Technologies、スイス）を使用して、以前記載されるように（Bouter et al）全ての画像を分析した。簡潔には、あらかじめ定義されたＭＲＩに基づくマウス脳アトラステンプレートを使用して、全脳体積、並びに扁桃体、脳幹、小脳、皮質、海馬、視床下部、中脳、嗅球、中隔／前脳基底部、線条体及び視床を含む、異なる関心体積（ＶＯＩ）を定義した。全ての脳領域に関して、ＰＥＴ ＶＯＩ統計（ｋＢｑ／ｃｃ）を生成し、半定量的分析のため標準化取り込み値（ＳＵＶ）を計算した［ＳＵＶ＝組織活性濃度平均（ｋＢｑ／ｃｃ）×体重（ｇ）／注入用量（ｋＢｑ）］。１８Ｆ－ＦＤＧ－ＰＥＴスキャンのＳＵＶを、測定血中グルコースレベルに関して補正した［ＳＵＶＧｌｃ＝ＳＵＶ×血中グルコースレベル（ｍｇ／ｄｌ）］。１８Ｆ－フロルベタベンスキャンのＳＵＶを、小脳ＶＯＩ内のＳＵＶによって更に正規化し、得られた比（ＳＵＶｒ）を更なる分析に使用した。

結果
免疫された５ＸＦＡＤ（ｎ＝５）、２匹の５ＸＦＡＤマウス対照及び２匹の野生型マウス（全て雌、年齢４．５ヶ月齢～５．５ヶ月齢）において、アミロイド斑トレーサーであるフロルベタベンを用いたアミロイド斑イメージングを行った。結果を図２７及び図２８に示す。免疫された５ＸＦＡＤマウスは、皮質、海馬及び扁桃体におけるフロルベタベン保持を示さず、これは明らかにアミロイド斑シグナルが劇的に減少したことを立証する。免疫に使用される環状ペプチドは、Ｎ切除アミロイドβオリゴマーに特異的であり、この環状ペプチドによって誘導される抗体は、全長アミロイドβ１－４２と反応しない。免疫に使用された環状ペプチド（抗体が作製される切除ペプチドのヘアピン構造の模倣体）は、５ＸＦＡＤ脳において、大部分、全長アミロイドβ１－４２で構成され、わずかな割合のみがＮ切除アミロイドβである、アミロイド斑のクリアランスを生じた。したがって、これは、環状ペプチドが、切除アミロイドβに結合する抗体を作製し、これらが斑を溶解することを示す。ヘアピン構造は、アルツハイマー斑のシーディング因子であり、これらは、環状ペプチド能動免疫によって除去され得る。

要約
ＴＡＰ０１及びＴＡＰ０１＿０１抗体が結合する新規ペプチドが同定されている。これらの抗体は、やはり斑に結合するいくつかの比較基準抗体と比較して、低分子量オリゴマーのみに結合し、斑には結合しない。いくつかの抗体は、アミロイドペプチド配列の異なる領域に結合可能であるが、ＴＡＰ０１のみがアミロイドペプチドの環状／ヘアピンコンホメーションに結合可能である。したがって、Ａβｐ３－４２のヘアピンエピトープを模倣する、生成された環状ペプチドを能動免疫に使用して、被験体において、低分子量オリゴマーに特異的な抗体の生成を誘導し得る。

９． ５ＸＦＡＤマウスにおける環状化Ａβペプチドの能動免疫：脳切片における免疫組織化学によるアミロイド負荷、及び１８Ｆ－ＦＤＧ－ＰＥＴ／ＭＲＩイメージングによるｉｎ ｖｉｖｏグルコース代謝
以前記載されるように、５ＸＦＡＤマウスを抗原［チオアセタール架橋アミロイドβペプチド１－１４－ＫＬＨコンジュゲート、ＤＡＣ^＊ＦＲＨＤＳＧＹＥＣ^＊ＨＨ［Ｃｙｓ］－アミド（^＊Ｓ－ＣＨ－Ｓ架橋、３位及び１２位を通じて環状化）］で免疫した。

ｉｎ ｖｉｖｏイメージング
上述のように、アルツハイマーマウス（５ＸＦＡＤ）及び年齢をマッチさせたＣ５７Ｂｌ／６Ｊ野生型マウス上のｉｎ ｖｉｖｏグルコース代謝を１８Ｆ－ＦＤＧ－ＰＥＴ／ＭＲＩイメージングによって分析した。

パラフィン切片の免疫組織化学染色
ＣＯ_２麻酔後、頚椎脱臼によってマウスを屠殺した。脳試料を注意深く切除し、４％リン酸緩衝ホルマリン中、４℃で後固定した。ヒト及びマウス組織試料を以前記載されるようにプロセシングした^４。簡潔には、４μｍパラフィン切片をキシレン中で脱パラフィン処理した後、一連のエタノール中で再水和した。内因性ペルオキシダーゼをブロッキングするため、Ｈ_２Ｏ_２処理した後、抗原賦活化のため、０．０１Ｍクエン酸緩衝液中で切片を煮沸し、その後、８８％ギ酸中で３分間インキュベーションした。ＰＢＳ中のスキムミルク及びウシ胎児血清での処理によって非特異的結合部位をブロッキングした後、一次抗体を添加した。以下の抗体を用いた：全Ａβ５に対するポリクローナル抗体２４３１１、ピログルタメートＡβ３－Ｘに対するモノクローナル抗体１－５７（Synaptic Sytems、ドイツ、ゲッチンゲン、１ｍｇ／ｍｌ、１：５００）、及びＴＡＰ０１＿４（１：２００、２ｍｇ／ｍｌ）。対応するビオチン化二次抗ヒト及び抗マウス抗体（１：２００）をDAKO（デンマーク、グロストルプ）より購入した。Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎキット（Vector Laboratories、米国バーリンゲーム）及び色素原としてのジアミノベンジジン（ＤＡＢ）で、ＡＢＣ法を使用して染色を視覚化した。ヘマトキシリンで対比染色を行った。

Ａβ負荷の定量化
以前記載されるように（G. Antonios et al., Alzheimer therapy with an antibody against N-terminal Abeta 4-X and pyroglutamate Abeta 3-X. Scientific reports 5, 17338 (2015)）、斑負荷を定量化した。互いに少なくとも８０μｍ離れている５つ～６つのパラフィン包埋切片を、色素原としてのＤＡＢで同時に染色した。チオフラビンＳ蛍光染色のため、組織切片を脱パラフィン処理し、再水和し、脱イオン水で２回洗浄し、次いで水溶液中の１％（ｗ／ｖ）チオフラビンＳで処理し、４’６－ジアミジン－２－フェニルインドールの１％（ｗ／ｖ）水溶液中で対比染色した。OlympusのＤＰ－５０カメラ及びＩｍａｇｅＪソフトウェア（NIH、米国）を備えたOlympusのＢＸ－５１顕微鏡を使用して、相対Ａβ負荷を評価した。１００×倍率の代表的な写真を体系的に捕捉した。ＩｍａｇｅＪを使用して、写真を８ビット白黒写真にバイナリ化し、固定された強度閾値を適用して、ＤＡＢ染色を定義した。

ＤＡＢ染色によって含まれるパーセント領域、並びにｍｍ^２あたりの粒子数及び粒子の平均サイズに関して測定を行った。

結果
本発明者らは、脳切片中の斑負荷（図２９）及びＰＥＴ／ＭＲＩイメージングを使用したｉｎ ｖｉｖｏグルコース代謝（図３０）に対する、能動免疫の影響を評価した。

３－１２連結Ａβ１－１４環状ペプチドでのＡＤマウスモデル５ＸＦＡＤの能動免疫は、脳組織におけるアミロイド斑負荷の減少を生じた。

ＴＡＰ０１＿０４抗体又は環状化Ａβペプチドでの能動免疫で処置した５ＸＦＡＤマウスの皮質における斑負荷の免疫染色（図２９）は、図２８に示される皮質、海馬及び扁桃体に関して見られるフロルベタベン保持シグナルとよく一致した。５ＸＦＡＤマウス皮質切片を、全Ａβ、ピログルタメートＡβ３－Ｘ、チオフラビンＳ及びＡβ４－Ｘに対する抗体で染色した。能動免疫された５ＸＦＡＤマウスは、抗体染色及びチオフラビンＳ染色を伴う斑負荷の有意な減少を示した（図２９）。

ＷＴ及び５ＸＦＡＤマウスにおいて、１８Ｆ－ＦＤＧイメージングによって、グルコース取り込みを評価した。能動免疫を行った５ＸＦＡＤマウスの皮質、海馬、視床、前脳及び中脳において、グルコース取り込みシグナルのレスキューが見られた（図３０Ｂ）。

１０． Ｔｇ４－４２マウスにおける環状化Ａβペプチドの能動免疫及び海馬機能に対する治療効果
６週齢のＴｇ４－４２マウスを、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中で乳化された抗原［チオアセタール架橋Ａβペプチド１－１４－ＫＬＨコンジュゲート、ＤＡＣ^＊ＦＲＨＤＳＧＹＥＣ^＊ＨＨ［Ｃｙｓ］－アミド（^＊Ｓ－ＣＨ－Ｓ架橋）］で１２週間免疫した後、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）中で乳化されたタンパク質をブースター用量で免疫した。ＩＦＡ中で乳化された抗原のブースター注射を抗原／ＣＦＡエマルジョンでの免疫の１４日後、２８日後、４２日後に、その後は毎月（４ヶ月後、５ヶ月後、及び６ヶ月後の３回）投与した。免疫前に、本発明者らの施設でマウスを少なくとも７日間順化させた。マウスの背中２部位で、ＣＦＡ又はＩＦＡ中で乳化された抗原を皮下注射し、各部位に０．０５ｍＬ～０．１ｍＬ注射した（マウスあたり、総量０．１ｍＬ～０．２ｍＬ）。背中の１部位で、ＩＦＡエマルジョン０．１ｍＬの単回皮下注射としてブースターを投与した。力価決定のため、マウスを屠殺した後、マウスから血清試料を単離した。

モリス水迷路による空間参照記憶
以前記載されるように（Y. Bouter et al., N-truncated amyloid beta (Abeta) 4-42 forms stable aggregates and induces acute and long-lasting behavioral deficits. Acta Neuropathol 126, 189-205 (2013)）、モリス水迷路（R. Morris, Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat. J. Neurosci. Methods 11, 47-60 (1984)）を使用して、マウスにおける空間参照記憶を評価した。

不偏立体学を使用したニューロン数の定量化
以前記載されるように（G. Antonios et al., Alzheimer therapy with an antibody against N-terminal Abeta 4-X and pyroglutamate Abeta 3-X. Scientific reports 5, 17338 (2015)）、立体学的分析を行った。クレシルバイオレット染色切片上で、海馬細胞層ＣＡ１（ブレグマ －１．２２ｍｍ～－３．５２ｍｍ）を描出し（delineated）、立体学ワークステーション（自動サンプリング用の電動式標本ステージを備えたOlympusのＢＸ５１）、ＳｔｅｒｅｏＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ７（MicroBrightField、米国ウィリストン）及び１００×油浸レンズ（oil lens）（ＮＡ＝１．３５）で分析した。

結果
３－１２連結Ａβ１－１４環状ペプチドでのＡＤマウスモデルＴｇ４－４２の能動免疫は、有意に減少したニューロン損失を伴う、学習及び記憶欠損の実質的なレスキューを明らかにした。

モリス水迷路試験（図３１Ａ）により、かつ海馬におけるＣＡ１ニューロン総数の計数（図３１Ｂ）により、海馬依存性学習及び記憶に関して、６．５ヶ月齢のＴｇ４－４２マウスにおいて、能動免疫の治療効果を評価した。これをＴＡＰ０１＿０４及びＩｇＧ１対照抗体での受動免疫の効果と比較した。能動免疫及びＴＡＰ０１＿０４抗体での受動免疫は、能動免疫又はＴＡＰ０１＿０４免疫を受けた加齢Ｔｇ４－４２において、空間参照記憶欠損及びＣＡ１ニューロン数を有意に改善した。

１１． ＡＤの治療のための潜在的ワクチンアプローチとしての環状化Ａβペプチドの能動免疫
動物（５ＸＦＡＤ及びＴｇ４－４２マウス）をチオアセタール架橋環状ペプチド１－１４で免疫し、先に上述するように、ビオチン化環状化ペプチドへの結合に関して血清をスクリーニングした。全てのマウスは、優れた免疫反応を生じた（図３２及び図３３）。

要約
Ａβｐ３－４２のヘアピンエピトープを模倣する環状ペプチドを用いたアルツハイマー病の治療及び防止のための能動免疫の療法的潜在能力が、上記結果によって示されてきている。

Claims (18)

1. 式（Ｉ）：
   Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３ＦＸ_４ＨＤＳＧＸ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８Ｈ （Ｉ）
   の構造を有するアミノ酸配列を含む環状ペプチドであって、
   式中、
   Ｘ_１は存在しないか又は任意のアミノ酸であり、
   Ｘ_２はアラニン又はシステインであり、
   Ｘ_３はグルタミン酸又はシステインであり、
   Ｘ_４はアルギニンであり、
   Ｘ_５はチロシン又はシステインであり、
   Ｘ_６はグルタミン酸であり、
   Ｘ_７はバリン又はシステインであり、
   Ｘ_８はヒスチジン又はシステインであり、
   Ｘ_１、Ｘ_２、及びＸ _３ のうちの１つのみがシステインであり、Ｘ_５ 、Ｘ _７及びＸ_８のうちの１つのみがシステインであり、前記ペプチドが１位、２位、又は３位のシステイン残基及び１０位、１２位又は１３位のシステイン残基を通じて環状化されている、環状ペプチド。
2. Ｘ_１は存在しないか又は任意のアミノ酸であり、
   ａ）Ｘ_１はシステインであり、Ｘ_２はアラニンであり、Ｘ_３はグルタミン酸であり、Ｘ_４はアルギニンであり、Ｘ_５はチロシンであり、Ｘ_６はグルタミン酸であり、Ｘ_７はヒスチジンであり、Ｘ_８はシステインであるか、
   ｂ）Ｘ_２はアラニンであり、Ｘ_３はシステインであり、Ｘ_４はアルギニンであり、Ｘ_５はチロシンであり、Ｘ_６はグルタミン酸であり、Ｘ_７はシステインであり、Ｘ_８はヒスチジンであるか、
   ｃ）Ｘ_２はシステインであり、Ｘ_３はグルタミン酸であり、Ｘ_４はアルギニンであり、Ｘ_５はチロシンであり、Ｘ_６はグルタミン酸であり、Ｘ_７はシステインであり、Ｘ_８はヒスチジンであるか、
   ｄ）Ｘ_２はシステインであり、Ｘ_３はグルタミン酸であり、Ｘ_４はアルギニンであり、Ｘ_５はシステインであり、Ｘ_６はグルタミン酸であり、Ｘ_７はバリンであり、Ｘ_８はヒスチジンであるか、
   ｅ）Ｘ_２はシステインであり、Ｘ_３はグルタミン酸であり、Ｘ_４はアルギニンであり、Ｘ_５はチロシンであり、Ｘ_６はグルタミン酸であり、Ｘ_７はバリンであり、Ｘ_８はシステインであるか、
   ｆ）Ｘ_２はアラニンであり、Ｘ_３はシステインであり、Ｘ_４はアルギニンであり、Ｘ_５はシステインであり、Ｘ_６はグルタミン酸であり、Ｘ_７はヒスチジンであり、Ｘ_８はヒスチジンであるか、又は、
   ｇ）Ｘ_２はアラニンであり、Ｘ_３はシステインであり、Ｘ_４はアルギニンであり、Ｘ_５はチロシンであり、Ｘ_６はグルタミン酸であり、Ｘ_７はヒスチジンであり、Ｘ_８はシステインであり、
   前記ペプチドが、前記２つのシステイン残基を介して環状化されている、請求項１に記載の環状ペプチド。
3. ａ）前記ペプチドが３位及び１２位に位置するシステイン残基を通じて環状化されている、ＤＡＣＦＲＨＤＳＧＹＥＣＨＨ、
   ｂ）前記ペプチドが３位及び１３位に位置するシステイン残基を通じて環状化されている、ＤＡＣＦＲＨＤＳＧＹＥＶＣＨ、
   ｃ）前記ペプチドが１位及び１３位に位置するシステイン残基を通じて環状化されている、ＣＡＥＣＦＲＨＤＳＧＹＥＶＣＨ、
   ｄ）前記ペプチドが２位及び１２位に位置するシステイン残基を通じて環状化されている、ＤＣＥＦＲＨＤＳＧＹＥＣＨＨ、
   ｅ）前記ペプチドが２位及び１０位に位置するシステイン残基を通じて環状化されている、ＤＣＥＦＲＨＤＳＧＣＥＶＨＨ、
   ｆ）前記ペプチドが２位及び１３位に位置するシステイン残基を通じて環状化されている、ＤＣＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＣＨ、
   並びに、
   ｇ）前記ペプチドが３位及び１０位に位置するシステイン残基を通じて環状化されている、ＤＡＣＦＲＨＤＳＧＣＥＶＨＨ、
   より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載の環状ペプチド。
4. Ｘ_１がプロリン又はアスパラギン酸である、請求項１又は２に記載の環状ペプチド。
5. 前記ペプチドが、前記２つのシステイン残基を連結する架橋を通じて環状化されている、請求項１～４のいずれか一項に記載の環状ペプチド。
6. 前記ペプチドが、前記２つのシステイン残基間で、式－Ｓ－Ｓ－又は－Ｓ－ＣＨ_２－Ｓ－を有する架橋を通じて環状化されている、請求項１～５のいずれか一項に記載の環状ペプチド。
7. ａ）前記ペプチドが３位及び１２位に位置するシステイン残基を通じて環状化されている、前記アミノ酸配列ＤＡＣＦＲＨＤＳＧＹＥＣＨＨ、
   ｂ）前記ペプチドが３位及び１３位に位置するシステイン残基を通じて環状化されている、前記アミノ酸配列ＤＡＣＦＲＨＤＳＧＹＥＶＣＨ、又は、
   ｃ）前記ペプチドが１位及び１３位に位置するシステイン残基を通じて環状化されている、前記アミノ酸配列ＣＡＥＣＦＲＨＤＳＧＹＥＶＣＨ、
   を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の環状ペプチド。
8. ａ）前記ペプチドが、３位及び１２位の前記２つのシステイン残基間で、式－Ｓ－ＣＨ_２－Ｓ－を有する架橋によって形成される環状ペプチドである、前記アミノ酸配列ＤＡＣＦＲＨＤＳＧＹＥＣＨＨ、又は、
   ｂ）前記ペプチドが、３位及び１３位の前記２つのシステイン残基間で、式－Ｓ－ＣＨ_２－Ｓ－を有する架橋によって形成される環状ペプチドである、前記アミノ酸配列ＤＡＣＦＲＨＤＳＧＹＥＶＣＨ、又は、
   ｃ）前記ペプチドが、１位及び１３位の前記２つのシステイン残基間で、式－Ｓ－ＣＨ_２－Ｓ－を有する架橋によって形成される環状ペプチドである、前記アミノ酸配列ＣＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＣＨ、
   を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の環状ペプチド。
9. ａ）前記ペプチドが、３位及び１２位の前記２つのシステイン残基間で、式－Ｓ－ＣＨ_２－Ｓ－を有する架橋によって形成される環状ペプチドである、前記アミノ酸配列ＤＡＣＦＲＨＤＳＧＹＥＣＨＨ、又は、
   ｂ）前記ペプチドが、３位及び１３位の前記２つのシステイン残基間で、式－Ｓ－ＣＨ_２－Ｓ－を有する架橋によって形成される環状ペプチドである、前記アミノ酸配列ＤＡＣＦＲＨＤＳＧＹＥＶＣＨ、又は、
   ｃ）前記ペプチドが、１位及び１３位の前記２つのシステイン残基間で、式－Ｓ－ＣＨ_２－Ｓ－を有する架橋によって形成される環状ペプチドである、前記アミノ酸配列ＣＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＣＨ、
   からなる、請求項１～８のいずれか一項に記載の環状ペプチド。
10. 前記アミノ酸配列ＤＡＣＦＲＨＤＳＧＹＥＣＨＨを含み、前記ペプチドが３位及び１２位のシステイン残基間で、式－Ｓ－ＣＨ_２－Ｓ－を有する架橋によって形成される環状ペプチドである、請求項１～９のいずれか一項に記載の環状ペプチド。
11. 請求項１～１０のいずれか一項に記載の環状ペプチドと医薬的に許容され得るキャリアーとを含む医薬組成物。
12. アジュバントを更に含む、請求項１１に記載の医薬組成物。
13. その必要がある個体において神経変性疾患を治療するための、請求項１１又は１２に記載の医薬組成物。
14. 前記神経変性疾患がアルツハイマー病である、請求項１３に記載の医薬組成物。
15. 被験体において免疫反応を誘導するための、請求項１１又は１２に記載の医薬組成物。
16. 前記免疫反応が、低分子量アミロイドβオリゴマーの形のアミロイドβに対する抗体を産生する、請求項１５に記載の医薬組成物。
17. 請求項１～１０のいずれか一項に記載の環状ペプチドを産生する方法であって、
    （ａ）請求項１～１０のいずれか一項に定義されるような前記ペプチドの配列を含む直鎖ペプチドを合成する工程と、
    （ｂ）システイン残基を通じて前記直鎖ペプチドを環状化して、請求項１～１０のいずれか一項に記載の環状ペプチドを得る工程と、
    を含む、方法。
18. アミロイドβの低分子量オリゴマーを特異的に認識する抗体を生成する方法であって、
    （ａ）請求項１～１０のいずれかに記載の環状ペプチドで、動物を免疫することと、
    （ｂ）工程（ａ）における前記免疫によって生成された前記抗体を得ることと、
    を含み、
    前記動物は非ヒト動物である、方法。