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JP7763661B2 - 四官能性ケミカルプローブ、及び該プローブを用いた生細胞または生組織からの標的膜タンパク質の同定方法 - Google Patents

四官能性ケミカルプローブ、及び該プローブを用いた生細胞または生組織からの標的膜タンパク質の同定方法

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JP7763661B2 JP2021524938A JP2021524938A JP7763661B2 JP 7763661 B2 JP7763661 B2 JP 7763661B2 JP 2021524938 A JP2021524938 A JP 2021524938A JP 2021524938 A JP2021524938 A JP 2021524938A JP 7763661 B2 JP7763661 B2 JP 7763661B2
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Description

ケモプロテオミクス法を用いて、フェノタイプを反映する生細胞および生組織から、不偏かつ網羅的に特定リガンドの標的タンパク質を直接同定することができるプローブ、及びそのプローブを用いた同定方法に関する。特に、生細胞および生組織である脳スライスからイオンチャネルやGPCR、複数膜貫通型および多量体を形成する受容体を含む各種標的膜タンパク質を検出することができるプローブ、及びそれを用いた標的膜タンパク質の同定方法に関する。
近年、ケミカルバイオロジーという研究分野において、分子生物学的な手法に加えて有機化学的な手法を駆使して、タンパク質又は生理活性物質などの微量の生体内分子を検出・定量し、その生体内分子の機能又は反応を解明する研究が行われている。それらの一環として生体内分子の機能又は反応の解明のために、生体内分子に特異的に作用する化合物、すなわちケミカルプローブの開発が行われている。
この研究分野で、有機化学的手法を用いてタンパク質の構造と機能を解明する方法としてケモプロテオミクス法がある。
ケモプロテオミクス法は、フェノタイプを反映する生細胞または生組織から、不偏かつ網羅的に標的タンパク質を直接同定することを可能とする方法であり、表現型スクリーニングで見出された医薬品候補化合物の未知標的タンパク質の同定及び抗原未知抗体の抗原同定など、医薬品の開発に大きく寄与すると考えられている。
公知の膜タンパク質を検出するための従来技術としては、光親和性反応基を利用して生細胞をラベリングする方法（非特許文献１）、生細胞の細胞膜画分からプロテオミクスにより膜タンパク質を同定する方法（非特許文献２）、ケミカルプローブを用いた強制発現細胞からの標的膜タンパク質の検出法（非特許文献３及び４）、ケミカルプローブを用いた培養細胞および初代培養細胞からの標的膜タンパク質の検出法（非特許文献５）、ケミカルプローブを用いて培養細胞から細胞内および膜上の標的タンパク質を検出する方法（非特許文献６）、ケミカルプローブを用いた脳スライス上での標的膜タンパク質の蛍光イメージング方法（非特許文献７）、及び成長因子ＥＧＦやＦＧＦＲ抗体等のタンパク質を用いて標的とする膜タンパク質を同定する方法（非特許文献８）が知られている。
こうした標的タンパク質の同定には、標的タンパク質と特異的に結合する部位（リガンド部位）を有するプローブが用いられる。例えば、一方の末端にビオチンを、他方の末端に標的タンパク質と親和性のあるリガンドを結合させた化合物をプローブとして、標的タンパクを同定する方法が知られている（例えば、非特許文献１及び非特許文献９等）。このプローブによると、リガンドを介して標的タンパク質を結合させた後に、ビオチンを介してビオチン・アビジン複合体を形成することで、それを指標として、標的タンパク質を単離精製し、同定することが可能である。しかし、発現量が少ない膜タンパクを特定することは容易ではない。
具体的には、非特許文献１には、テトラゾールをリガンドの近くに配置したプローブを用いてリガンドと親和性のある標的タンパク質を検出する方法が開示されている。この方法では、リガンドに標的タンパク質が配位した後に、紫外線を照射することによりテトラゾールとタンパク質との間に共有結合を形成するため、精製等の工程においてリガンドに配位したタンパク質が脱離しないという特徴がある。
非特許文献９には、アビジンを含む非特異的タンパク質群を穏和な条件で除去するために、リガンドとビオチンの間の適切な場所に開裂部位を導入したプローブが開示されている。
また、特許文献１には、生細胞上または生体液中に存在する標的糖タンパク質を同定するためのプローブとして、（i）標的糖タンパク質受容体上に少なくとも１つの結合部位を有する目的のリガンドとのコンジュゲーションのためのリガンド反応性基、（ii）酸化された受容体－糖タンパク質の捕捉のためのヒドラゾン基、（iii）捕捉された糖タンパク質の検出、単離及び精製のためのアジド及びアルキンから選択された親和性基を担持する三官能性架橋試薬が開示されている。
しかしながら、上記の方法はいずれも、フェノタイプを正確に反映する生細胞または生組織から、再現性および実用性高く標的膜タンパク質を同定する技術ではない。その理由として、細胞膜上のタンパク質の多くは発現量が低く、また公知のケモプロテオミクス法において汎用される反応性基は標的膜タンパク質を捕捉する効率が低いため、真の標的膜タンパク質を特異的に高感度で検出することが難しいことを挙げることができる。さらにはアビジンビーズの熱処理若しくはビーズ上でのタンパク質消化に起因する非特異的タンパク質が精製後のサンプルに混入するという問題もある。これらの理由から、ケモプロテオミクスを利用した生組織からの標的膜タンパク質の同定例は報告されていない。
国際公開２０１７／０８１０６９号
J. Am. Chem. Soc., 138, 14609-14615 (2016) Cell Chemical Biology 2017, 24, 3－8 ChemBioChem 2017, 18, 1639－1649 Mol. Pharmacol. 2019, 95, 196－209 J. Am. Chem. Soc. 2018, 140, 6067－6075 J. Am. Chem. Soc. 2018, 140, 4259－4268 Nature Communications, 8, 14850 (2017) Nature Communications, 9, 1519 (2018) Chem Commun, 49, 5366 (2013)
本発明の目的は、生細胞または生組織において発現しているタンパク質を同定するためのプローブとして使用できる新規化合物を提供することである。より好ましくは、発現量の低い膜タンパク質でも同定が可能なプローブとして使用できる新規化合物を提供することである。さらに、本発明は、当該化合物をプローブとして用いた生細胞または生組織に存在する標的タンパク質、好ましくは標的膜タンパク質の同定方法を提供することである。
本発明では上記目的を達成する手段として４つの機能を有する四官能性化合物を設計した。具体的には、1）標的タンパク質に対して親和性（結合性）を有するリガンドをコンジュゲートさせるためのリガンド結合部位（Ligand binding moiety）、2） 標的タンパク質を捕捉するための反応性部位（Reactive moiety）、3)アビジンビーズに捕捉された標的タンパク質を選択的に溶出するための切断部分である切断可能部位（Cleavable moiety）、及び4）標的タンパク質を捕捉した後に濃縮または精製するために有用なビオチン部分（Biotin tag）である。当該四官能性化合物に、リガンドとして標的タンパク質に対して親和性（結合性）を有する低分子化合物または抗体を結合させて、それを四官能性ケミカルプローブとして用いることで、生細胞または生組織である脳スライスから標的膜タンパク質を検出することができることを見出した。
本発明は、こうした知見に基づいて、さらなる検討を重ねて完成したものであり、以下の態様を含む。
項１．リガンド結合部位（Ａ）、反応性部位（Ｄ）、切断可能部位（Ｅ）、及びビオチン部位（Ｂ）が、必要に応じてスペーサーを介して、連結してなる四官能性化合物であって、
前記リガンド結合部位（Ａ）は、アミン反応性基、ヒドロキシ反応性基、チオール反応性基、アルデヒドまたはケト反応性基、アルキルまたはアリールハライド反応性基、アルキルまたはアリールスルホナート反応性基、アミド反応性基、スルホンアミド反応性基、アリール反応性基、ジオール反応性基及びカルボキシ反応性基からなる群より選択される少なくとも１つの活性化官能基であるか、または、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ２、－ＯＨ、－ＳＨ、－ＣＨ＝ＣＨ－、－（Ｃ＝Ｏ）－ＣＨ＝ＣＨ－、アルキル、ビニルまたはアリールハライド、アルキル、ビニルまたはアリールスルホナート、アルキニル、アジド、エポキシ及びクリックタグからなる群から選択される少なくとも１つの反応性官能基であり、
前記反応性部位（Ｄ）は、2-アリール-5-カルボニルテトラゾール、フェニルアジド、ジアジリン、α－ケトアミド、４－ヒドロキシベンゼン、フタルヒドラジド及びベンゾフェノンからなる群より選択される少なくとも１つの化合物の構造を有する基であり、
前記切断可能部位（Ｅ）は、1-(4,4-ジメチル-2,6-ジオキソシクロヘキ-1-イリデン)エチル、レブリノイルエステル、ビシナルジオール、ジアゾベンゼン、ビスアリールヒドラゾン、ジアルコキシジフェニルシラン、ジスルフィド、ENLYFQG（配列番号１）の配列からなるペプチド、及びENLYFQS（配列番号２）の配列からなるペプチドからなる群より選択される少なくとも１つの化合物の構造を有する基であり、
前記ビオチン部位（Ｂ）は、下式（１）で示される基であり、
（式中、＊は、隣接する基との結合を意味する。）；
前記スペーサーが、直鎖若しくは分岐鎖状の炭素数１以上のアルキレン基、または直鎖若しくは分岐鎖状の炭素数３以上のアルキレン基において、隣接しない－ＣＨ２－基が互いに独立して、－Ｏ－、－ＯＣＨ２－、－ＣＨ２Ｏ－、－ＣＯ－、－ＮＲａ－［Ｒａは水素原子または炭素数１～６のアルキル基を意味する。以下同じ。］、－ＣＯ－ＮＲａ－、－ＮＲａ－ＣＯ－、下記式（１－１）で示される基、及び下記式（１－２）で示される基からなる群より選択される少なくとも１つの架橋基で置換されてなる基である、四官能性化合物。
（式中、ｍは０又は１を、ｎは１又は２を意味する。）
項２．前記反応性部位（Ｄ）が、下式（２）又は（２´）で示される基であり、
（式中、＊は、隣接する基との結合を意味し、ｎは０または１を意味する。）
または／および、
前記切断可能部位（Ｅ）が、下式（３）で示される基である、
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、各々独立して水素原子または炭素数１～６のアルキル基を意味し、＊は、隣接する基との結合を意味する。）
項１に記載する四官能性化合物。
項３．下式（Ｉ）または下式（ＩＩ）で示される化合物である、項１または２に記載する四官能性化合物：
（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥは項１に記載する部位を意味し、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５、Ｓ６及びＳ７は互いに独立してスペーサーを意味する。）
項４．前記リガンド結合部位（Ａ）が、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル基である項１～３のいずれかに記載する四官能性化合物。
項５．下式（i）、（ii）または（iii）で示される化合物である、項４に記載する四官能性化合物：
（式中、ｐは２を示す。）
項６．項１～５のいずれかに記載する四官能性化合物のリガンド結合部位（Ａ）に、リガンドが結合してなる四官能性ケミカルプローブ。
項７．前記リガンドが、生細胞または生組織に由来する膜タンパク質に親和性を有するタンパク質、ペプチド、脂質、糖及び低分子化合物からなる群より選択されるいずれかである、項６に記載する四官能性ケミカルプローブ。
項８．式（iv）で示される、項６または７に記載する四官能性ケミカルプローブ：
（式中、Ｓ１はスペーサーを意味し、ｐは２を意味する。）
項９．項６～８のいずれかに記載する四官能性ケミカルプローブを用いた、細胞または組織中の標的タンパク質の検出方法であって、
（１）細胞または組織に四官能性ケミカルプローブを反応させて、四官能性ケミカルプローブ中のリガンドと標的タンパクとを結合させる工程、
（２）四官能性ケミカルプローブ中の反応性部位（Ｄ）と標的タンパク質との間で共有結合を形成させる工程、
（３）四官能性ケミカルプローブが結合した標的タンパク質を含む画分を精製する工程、（４）四官能性ケミカルプローブ中のビオチン部位をアビジンと結合させて、四官能性ケミカルプローブ－アビジン複合体を形成する工程、
（５）形成した四官能性ケミカルプローブ－アビジン複合体を、四官能性ケミカルプローブ中の切断可能部位で開裂する工程、及び
（６）標的タンパク質を含有する画分を検出する工程
の工程を含む標的タンパク質の検出方法。
本発明の四官能性化合物は、リガンド結合部位（Ａ）、反応性部位（Ｄ）、切断可能部位（Ｅ）、及びビオチン部位（Ｂ）が、必要に応じてスペーサーを介して、連結してなる化合物であり、リガンド結合部位に、検出または同定する標的タンパク質に対して親和性（結合性）を有するリガンドを、前記リガンド結合部位に結合させることで、四官能性ケミカルプローブとして使用することができる。
本発明の四官能性ケミカルプローブは、前記四官能性化合物の構造に基づいて、高い反応性と高い選択性を示す反応性部位と、温和な条件で開裂する切断可能部位を有しており、この構造により、特に膜タンパク質の回収量、検出感度、及び再現性に優れることを特徴とする。このため、本発明の四官能性ケミカルプローブを用いることで、生細胞を対象とした標的膜タンパク質の同定が従来技術に比べてより高感度に実施することができる。さらには、より高度で複雑な生理環境である生組織を対象とした標的膜タンパク質の同定にも有用である。
化合物（CPP-127）を用いて生細胞からの標的分子を単離した試験例１の結果を示す図である。 化合物（CPF-224）を用いて生組織からの標的分子を単離した試験例２の結果を示す図である。 化合物（CPF-202）を用いて生組織からの標的分子を単離した試験例２の結果を示す図である。 化合物（CPF-242）を用いて生組織からの標的分子を単離した試験例２の結果を示す図である。 ラベル化抗体（CPA-321ラベル化抗CD71抗体）を用いて細胞表面抗原を捕捉した試験例３の結果を示す図である。 異なるリンカー長の化合物でラベル化された抗CD71抗体を用いてTHP-1細胞より抗原であるCD71の検出量の結果を示すグラフである。 架橋基の異なるプローブでラベルした抗CD71抗体を用い，A431細胞より抗原であるCD71の検出量の結果を示すグラフである。 異なるプローブでラベルしたHis-Tag EGFを用い，MDA-MB-231細胞より抗原であるEGF受容体の検出量の結果を示すグラフである。 異なる手法でラベル化された抗CD71抗体を用いてA431細胞より抗原であるCD71の検出量の結果を示すグラフである。 二次抗体法でラベル化された抗CD71抗体DF1513を用いてTHP-1細胞より抗原であるCD71の検出量の結果を示すグラフである。
（Ｉ）本明細書で使用する用語の説明
特に説明がない限り、本明細書で用いる用語及び語句は、以下に説明する意味で使用される。
「四官能性」とは、４種の機能的官能基を有することを意味する。前述するように、４種の機能的官能基のうち、１つはリガンド結合部位を構成する官能基または当該部位に形成されるリガンド部位、他の１つは反応性部位を構成する官能基、他の１つは切断可能部位を構成する官能基、残りの１つはアビジンと結合性を有するビオチン残基である。なお、ビオチンは、ビタミンＢ群に分類される水溶性ビタミンの一種（5-[(3aS,4S,6aR)-2-オキサヘキサヒドロ-1H-チエノ[3,4-d]イミダゾール-4-イル]ペンタン酸）である。
本明細書において「アルキレン」は、式「－（ＣＨＲ）ｎ－」（Ｒは水素原子または任意の置換基）で示される、炭素水素から誘導される二価ラジカルである。
好ましくは、アルキレン基は１～３０個程度（ｎ＝１～３０）、好ましくは１～１０個程度の炭素原子を有する。
本明細書において「アルキル」は、炭素数１～６（C1-6）の直鎖または分枝鎖状の低級アルキルを意味する。その具体例としては、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ－ヘキシル、イソヘキシル、3-メチルペンチル等である。好ましくは炭素数１～３の直鎖状の低級アルキルである。また、「C1-6アルキル」には、１～３個の水素原子が重水素原子に置換された低級アルキルも包含される。
本明細書において「タンパク質」および「ペプチド」は、同じ意味を有し、任意の長さを有するアミノ酸ポリマー（典型的にはペプチドはタンパク質の断片と呼ばれる）を指す。このポリマーは、直鎖、分枝鎖または環状鎖であってよい。アミノ酸は、天然もしくは非天然のアミノ酸、または変異アミノ酸であってよい。
本発明では、タンパク質は天然に存在するタンパク質であっても、また合成されたものであってもよい。また天然に存在するタンパク質において合成的に操作された配列を有するものであってもよい。タンパク質は、細胞内タンパク質、細胞表面タンパク質（すなわち、細胞の表面に結合したタンパク質）または溶液中のタンパク質（すなわち、培地中に分泌されるタンパク質）であってよい。またタンパク質は糖タンパク質であっても、また膜タンパク質であってもよい。本発明で対象とするタンパク質は、有用な生物学的または化学的活性を有する任意の医薬的、または商業的に関連するタンパク質、例えば、受容体、抗体、酵素、ホルモン、調節因子、抗原、結合剤であることができる。本発明の方法において使用され得る以下に列記するタンパク質は単なる例示であり、これらに限定されるものではない。当業者であれば、任意のタンパク質が本発明のプローブ及び方法における標的タンパク質になり得ることを理解することができる。
本明細書において「標的タンパク質」は、１または複数の特定の種類のリガンドが結合し得るタンパク質を指す。このような標的タンパク質は、制限されないものの、好ましくはヒトや非ヒト動物を含む哺乳動物に由来する生体液中、細胞上、または組織中に存在し得るものである。より好ましくは生細胞上、または生組織中で発現し存在するタンパク質である。このため、標的タンパク質が、例えば細胞表面上で発現している膜タンパク質である場合、これは、生細胞の細胞膜と会合し、時には細胞外空間に曝される少なくとも１つのアミノ酸を有し、１または複数のリガンドが結合可能な状態にあることができる。
本発明が対象とする標的タンパク質は、特に限定されないが、膜タンパク質が好ましい。膜タンパク質とは、脂質膜、特に脂質二重膜と直接的あるいは間接的に相互作用しうるタンパク質で、タンパク質を構成するアミノ酸分子が細胞外の環境に一つ以上存在するものを指す。例えば、Gタンパク質共役受容体，7回膜貫通型受容体，受容体型チロシンキナーゼ，免疫グロブリンスーパーファミリーとその関連タンパク質，スカベンジャー受容体，及びその他の受容体；輸送体，イオンチャンネル，溶液輸送体，能動輸送体，補助輸送体タンパク質，酵素，その他のものが挙げられる。
より具体的には、例えば、Gタンパク質共役受容体および7回膜貫通型受容体の例として、Frizzled受容体，核酸受容体，アデノシン受容体，アドレナリン受容体，アンジオテンシン受容体，アペリン受容体，バソプレシン受容体，ブラジキニン受容体，ボンベシン受容体，ケモカイン受容体，コレシストキニン受容体，ムスカリン性アセチルコリン受容体，カンナビノイド受容体，システイニルロイコトリエン受容体，ドパミン受容体，スフィンゴ脂質受容体，リゾホスファチジン受容体，スフィンゴシン一リン酸受容体，エンドセリン受容体，プロテアーゼ活性化受容体，遊離脂質受容体，ガラニン受容体，成長ホルモン分泌促進因子受容体，性腺刺激ホルモン受容体，胆汁酸受容体，ニコチン酸受容体，リゾホスファチジン酸受容体，アナフェラトキシン走化性受容体，ガストリン放出ペプチド受容体，オレキシン受容体，ヒスタミン受容体，セロトニン受容体，インターロイキン受容体，ロイシンリッチリピート含有Gタンパク質共役受容体，ロイコトリエン受容体，副腎皮質刺激ホルモン受容体，メラノコルチン受容体，メラニン凝集ホルモン受容体，メラトニン受容体，ニューロメジン受容体，神経ペプチド受容体，ニューロテンシン受容体，オピオイド受容体，ノシセプチン受容体，オキソグルタル酸受容体，オキシトシン受容体，P2Yプリン受容体，プロスタグランジン受容体，ロドプシン，リラキシン受容体，ソマトスタチン受容体，コハク酸受容体，サブスタンスP受容体，サブスタンスK受容体，トロンボキサン受容体，ウロテンシン受容体，カルシトニン受容体，味覚受容体， 代謝型グルタミン受容体，及び嗅覚受容体などを挙げることができる。
また受容体型チロシンキナーゼの例としては、アクチビン受容体，骨形成タンパク質受容体，TNF-β受容体，AXL受容体，上皮増殖因子受容体，エフリン受容体，インシュリン受容体，神経性成長因子受容体，ジスコイジンドメイン受容体，血管内皮増殖因子受容体，白血球受容体，肝細胞増殖因子受容体，マクロファージ刺激タンパク質受容体，血小板由来増殖因子受容体，及びエンテロトキシン受容体、並びにそれらの前駆体を挙げることができる。
免疫グロブリンスーパーファミリーとその関連タンパク質の例としては、免疫グロブリン受容体，キラー細胞免疫グロブリン様受容体，白血球免疫グロブリン様受容体，ネトリン受容体，T細胞受容体，各種サイトカイン受容体，T細胞表面糖タンパクCDの各種フラグメント，スーパファミリーおよびそれらの前駆体が挙げられる。その他の受容体には、例えば、アディポネクチン受容体，プロゲスチン受容体，コンタクチン関連タンパク質，デルリン，インテグリンおよびその前駆体，ニューレキシン，ニューロピリン，Notch受容体，プレキシンおよびその前駆体，受容体型チロシンホスファターゼ，セレクチンおよびその前駆体，シンデカン受容体，腫瘍壊死因子（TNF)受容体，Toll様受容体，トランスフェリン受容体，ソルチリンおよびその前駆体が含まれる。
また、輸送体としては、例えば、アクアポリン，塩素イオンチャンネル，ベストロフィン，リアノジン受容体，電位開口型カリウムチャンネル，環状ヌクレオチド依存性チャンネル，カルシウム活性化カリウムチャンネル，一過性受容器電位チャンネル（TRPチャンネル），電位開口型ナトリウムチャンネル，電位開口型カルシウムチャンネル，その他電位開口型チャンネル，セロトニン受容体，アセチルコリン受容体，γアミノ酪酸受容体，グリシン受容体，イオンチャンネル型グルタミン酸受容体，P2Xプリン受容体などが挙げられる。溶液輸送体の例としては、各種SLCファミリータンパク質が挙げられ、また能動輸送体としては、イオン輸送性ATP分解酵素およびABCトランスポーターが挙げられる。さらに酵素としては、NADH-ユビキノン酸化還元酵素，シトクロームc，フラビン含有モノオキシゲナーゼ，シトクロームP450，その他の酸化還元酵素；アシル転移酵素，グルコース転移酵素，硫酸転移酵素，その他の転移酵素；リガーゼ，チロシンホスファターゼ，リン酸ジエステル加水分解酵素，グリコシラーゼ，セリンペプチド内部加水分解酵素，金属エンドペプチダーゼ，ヌクレオシド2リン酸ホスファターゼ，その他の加水分解酵素が挙げられる。
本明細書において「試料」または「生体試料」は、任意の生きた細胞、または生物から得られる任意の固体または流体試料（生体試料）を指す。これらには、例えば、組織培養物、バイオリアクター、ヒトまたは非ヒト動物の組織、植物（果物や野菜を含む）、単細胞微生物（例えば、細菌および酵母）および多細胞生物が含まれる。また生体試料は、例えば、血液、血漿、血清、尿、胆汁、精液、脳脊髄液、眼房水もしくは硝子体液、または任意の身体分泌物、漏出液、滲出物（例えば、膿瘍または感染症もしくは炎症の任意の他の部位から得られる流体）または関節から得られる流体（例えば、正常な関節または関節リウマチ、変形性関節症、痛風または敗血症性関節炎などの疾患に侵された関節）から得られる生体液であってよい。生体試料は、また、例えば、任意の器官または組織（生検または剖検標本を含む）から得られた試料であってもよい。また細胞には、初代細胞、及び培養細胞が含まれる。
好ましくは、ヒトまたは非ヒト動物に由来する生細胞、及び生組織である。本発明で使用できる生細胞は、リガンドを用いて検出することができるタンパク質、好ましくは膜タンパク質が発現しているものであればよく、特に限定されない。制限されないものの、例えば、ＣＨＯ細胞、ＭＤＣＫ細胞、３Ｔ３-Ｌ１、２９３細胞、ＭＣＦ７細胞、Ａ４３１細胞、３Ｔ３細胞、ＣＶ-Ｉ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｌ細胞、ＢＨＫ２１細胞、ＨＬ-６０細胞、Ｕ９３７細胞、ＨａＫ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＴＨＰ-１細胞、その他の形質転換されて得られた細胞株、ならびに生体より単離された血球細胞、初代組織および初代移植片のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養物に由来する細胞株などが挙げられる。また、2次元的培養以外にも3次元培養システムにて培養されたもの，例えばオルガノイド培養なども含まれる。また、これらを宿主とし、特定のタンパク質をコードする遺伝子をベクター等によって導入した細胞等でもよく、制限されないものの、例えばドパミンD2受容体を安定に発現するCHO-K1細胞などを例示することができる。
本発明で使用できる組織も、リガンドを用いて検出することができるタンパク質、好ましくは膜タンパク質が発現しているものであればよく、特に限定されない。制限されないものの、例えば脳・肝・腎などの組織スライス切片や臓器スライス培養などを例示することができる。
本明細書において「生細胞」とは、細胞株として樹立された哺乳類（ヒトまたは非ヒト動物）由来、あるいは哺乳類以外を由来とする細胞を培養して変性処理を施していないものを指す。また、任意の器官または組織より非変性条件にて単離された細胞（例えば血球細胞や器官を構成する細胞，初代培養細胞など）も含まれる。これいは、2次元的培養以外にも3次元培養システムにて培養されたもの、例えばオルガノイド培養なども含まれる。また本明細書において「生組織」とは、哺乳類（ヒトまたは非ヒト動物）の任意の器官または組織より非変性条件にて単離された組織切片や組織培養試料（例えば脳、肝または腎などの組織スライス切片や臓器スライス培養物）を指す。
本発明において「リガンド」とは、標的タンパク質と親和性を有し、それに結合し得る化合物を意味する。制限されないものの、好ましくは、細胞膜に結合し、細胞表面上に発現し存在する標的膜タンパク質と相互作用または結合することができる任意の化合物を指す。リガンドの例としては、ペプチド、ポリペプチド、糖タンパク質またはリンタンパク質を含むタンパク質、炭水化物、糖脂質、リン脂質、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、アプタマー、ビタミン、抗原およびその断片、ハプテン、受容体アゴニスト、部分的アゴニスト、混合アゴニスト、拮抗薬、薬物、ケモカイン、ホルモン（例えば、ＬＨ、ＦＳＨ、ＴＲＨ、ＴＳＨ、ＡＣＴＨ、ＣＲＨ、ＰＲＨ、ＭＲＨ、ＭＳＨ、グルカゴンおよびプロラクチン；トランスフェリン；ラクトフェリン；アンジオテンシン；ヒスタミン；インスリン；レクチン）、伝達物質、オータコイド、成長因子（例えば、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦａ、ＴＢＦβ、ＧＭ-ＣＳＦ、Ｇ-ＣＳＦ、Ｍ-ＣＳＦ、ＦＧＦ、ＩＧＦ、ボンベシン、トロンボポエチン、エリスロポエチン、オンコスタチンおよびエンドセリン１）、インターロイキン（例えば、インターロイキン１～１５）、リンホカインおよび細胞シグナル伝達分子、サイトカイン（例えば、腫瘍壊死因子（腫瘍壊死因子αおよびβ）およびインターフェロン（例えばインターフェロンα、βおよびγ）を含む）、補欠分子族、補酵素、補因子、調節因子、及び、受容体に特異的に結合することができる天然または合成の有機分子、並びに同じ結合特性を維持するこれらの断片、類似体および他の誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
リガンドは抗体であってもよい。抗体は、特定の抗原に特異的に結合する能力を有する。抗体は、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよい。好ましい抗体はモノクローナル抗体であり、特に例えばトラスツズマブおよびベバシズマブなどで例示される治療用抗体であることができる。さらに抗体は、ヒト化抗体であることができる。
また、一次抗体法、二次抗体法のいずれであってもよい。一次抗体法とは、標的タンパク質と親和性を有する抗体（一次抗体）をリガンドとして用いる方法であり、二次抗体法とは、二次抗体がプローブのリガンド結合部位と一体化しており、リガンドである一次抗体がリガンド結合部位である二次抗体と複合体を形成させたものである。一次抗体法では標的タンパク質との親和性を感度よく検出できなかった抗体であっても、二次抗体法では感度よく検出できる場合がある。
またリガンドは、操作された親和性結合剤、例えばアンキリンリピート結合剤、特にＨｉｓタグ結合剤、ファージディスプレイによって生成された親和性結合剤、またはオリゴ核酸またはペプチドアプタマーなどであってもよい。またリガンドは、タンパク質受容体などのタンパク質であってもよいし、また細胞表面タンパク質受容体などの細胞表面タンパク質のドメインであってもよい。さらに、リガンドは微生物またはウイルスであってもよい。
本発明によれば、リガンドは、その標的タンパク質とその結合部位を介して相互作用する。結合部位は、標的タンパク質の特異的ペプチド断片、例えば標的タンパク質のその断片の特定のアミノ酸配列または３次元構造であり、結合部位と称される。その（細胞表面または分泌）標的タンパク質の結合部位に結合するリガンドに関する「相互作用」という用語は、細胞表面または分泌された標的タンパク質とリガンドとの間の一時的または永続的な直接的または間接的な接触を含み、その結合親和性、すなわち解離平衡定数Ｋｄによって特徴付けることができる。その標的タンパク質に対するリガンドの典型的な結合親和性は、少なくとも１０-５Ｍ、好ましくは１０-６Ｍ以上、例えば約１０-７Ｍ～約１０-１２Ｍであり得る。
このようにリガンドは、標的タンパク質と親和性のある化合物であれば特に限定されないが、好ましくはヒトまたは非ヒト動物の疾患の治療に供される医薬品の有効成分として使用される化合物（医薬化合物）である。当該医薬化合物は、低分子化合物、中分子化合物、天然物、及び抗体を含むタンパク質のいずれであってもよい。また当該医薬化合物は、本発明の四官能性化合物のリガンド結合部位と結合させるために、標的タンパク質との親和性に影響を与えない範囲で修飾してもよい。本発明の四官能性ケミカルプローブにおいて、リガンドと反応性部位はスペーサーを介して結合することができる。
本明細書において、アルキル化反応、加水分解反応、アミノ化反応、エステル化反応、アミド化反応、エーテル化反応、求核置換反応、付加反応、酸化反応、還元反応とは、自体公知の方法を意味する。このような方法としては、例えば、実験化学講座（第５版、日本化学会編、丸善株式会社）、オーガニック・ファンクショナル・グループ・プレパレーションズ（ORGANIC FUNCTIONAL GROUP PREPARATIONS）第２版、アカデミックプレス社（ACADEMIC PRESS, INC.）1989年刊；コンプリヘンシブ・オーガニック・トランスフォーメーションズ（Comprehensive Organic Transformations）VCH Publishers Inc.、1989年刊、ウッツ（P.G.M.Wuts)およびグリーン（T.W.Greene)著、「Greene's Protective Groups in Organic Synthesis」(第4版、2006年）等に記載の方法等が挙げられる。
本明細書において、「パラジウム化合物」とは、特に限定するものではないが、例えば、ヘキサクロロパラジウム(IV)酸ナトリウム四水和物、ヘキサクロロパラジウム(IV)酸カリウム等の４価パラジウム触媒類；[1,1'-ビス(ジフェニルホスフィノ)フェロセン]パラジウム(II)ジクロリド ジクロロメタン付加物（Pd(dppf)Cl2・CH2Cl2）、(2-ジシクロヘキシルホスフィノ-2',4',6'-トリイソプロピル-1,1'-ビフェニル)[2-(2'-アミノ-1,1'-ビフェニル)]パラジウム(II) メタンスルホナート（XPhos Pd G3）、塩化パラジウム(II)、臭化パラジウム(II)、酢酸パラジウム(II)、パラジウムアセチルアセトナート(II)、ジクロロビス（ベンゾニトリル）パラジウム(II)、ジクロロビス（アセトニトリル）パラジウム(II)、ジクロロビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム(II)、ジクロロテトラアンミンパラジウム(II)、ジクロロ（シクロオクタ-1,5-ジエン）パラジウム(II)、パラジウムトリフルオロアセテート(II)、1,1'-ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセンジクロロパラジウム(II)-ジクロロメタン錯体等の２価パラジウム触媒類；トリス（ジベンジリデンアセトン）二パラジウム(0)（Pd2(dba)3）、トリス（ジベンジリデンアセトン）二パラジウムクロロホルム錯体(0)、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム(0)（Pd(PPh3)4）等の０価パラジウム触媒類等が挙げられる。これらのパラジウム化合物は、１種単独でまたは２種以上混合して使用される。
本明細書において、「カルボジイミド」としては、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）、ジイソプロピルカルボジイミド（DIC）、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩（EDAC）、3-エチル-1-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド (WSC)、N-[3-(Dimethylamino)propyl]-N'-ethylcarbodiimide、N-[3-(Dimethylamino)propyl]-N'-ethylcarbodiimide methiodide、N-tert-Butyl-N'-ethylcarbodiimide、N-Cyclohexyl-N'-(2-morpholinoethyl)carbodiimide metho-p-toluenesulfonate、N,N'-Di-tert-butylcarbodiimide、N,N'-Di-p-tolylcarbodiimide等が挙げられる。
本明細書において「保護基」とは、例えば、t-ブトキシカルボニル（BOC）基、9-フルオレニルメチルオキシカルボニル（Fmoc）基、2,2,2-トリクロロエトキシカルボニル（Troc）基、ベンジルオキシカルボニル（Z）基、アリルオキシカルボニル（Alloc）基、トリフルオロアセチル基、フタロイル基、パラトルエンスルホニル（Ts)基、2-ニトロベンゼンスルホニル（Ns)基が挙げられる。
本明細書において「溶媒」とは、反応に不活性な溶媒を意味し、例えば、水、エーテル（例えば、ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、1,2-ジメトキシエタン、ジエチレングリコールジメチルエーテル、エチレングリコールジメチルエーテル）、ハロ炭化水素（例えば、塩化メチレン、クロロホルム、1,2-ジクロロエタン、四塩化炭素）、芳香族炭化水素（例えば、ベンゼン、トルエン、キシレン）、低級アルコール（例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール）、極性溶剤（例えば、N,N-ジメチルホルムアミド（DMF）、N-メチルピロリドン（NMP）、ジメチルスルホキシド（DMSO）、ヘキサメチルリン酸トリアミド、アセトニトリル）が挙げられる。これらの溶媒は、１種単独で又は２種以上混合して使用される。
本明細書において「アミン」とは、トリアルキルアミン（例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン、N,N-ジイソプロピルエチルアミン）、ジアルキルアミン（例えば、ジエチルアミン、ジイソプロピルアミン）等が挙げられる。
本明細書において「塩基」としては、例えば、無機塩基、有機塩基等が挙げられる。「無機塩基」としては、アルカリ金属水酸化物（例えば、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム）、アルカリ土類金属水酸化物（例えば、水酸化マグネシウム、水酸化カルシウム、水酸化バリウム）、アルカリ金属炭酸塩（例えば、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸セシウム）、アルカリ土類金属炭酸塩（例えば、炭酸マグネシウム、炭酸カルシウム、炭酸バリウム）、アルカリ金属炭酸水素塩（例えば、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム）、アルカリ金属リン酸塩（例えば、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸セシウム）、アルカリ土類金属リン酸塩（例えば、リン酸マグネシウム、リン酸カルシウム）、アルカリ金属アルコキシド（例えば、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、カリウムtert-ブトキシド）、アルカリ金属ヒドリド（例えば、ナトリウムヒドリド、カリウムヒドリド）等が挙げられる。「有機塩基」としては、トリアルキルアミン（例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン（TEA）、N,N-ジイソプロピルエチルアミン（DIPEA））、ジアルキルアミン（例えば、ジエチルアミン、ジイソプロピルアミン）、4-ジメチルアミノピリジン（DMAP）、N-メチルモルホリン、ピコリン、1,5-ジアザビシクロ[4.3.0]ノン-5-エン、1,4-ジアザビシクロ[2.2.2]オクタン及び1,8-ジアザビシクロ[5.4.0] -7-ウンデセン（DBU）等が挙げられる。これらから１種または２種以上を適宜選択、混合して使用することができる。
本明細書において「縮合剤」としては、例えば、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、３－ヒドロキシ－３，４－ジヒドロ－１，２，３－ベンゾトリアジン－４－オン（ＨＯＯＢｔ）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド（ＥＤＡＣ）、２－（１Ｈ－７－アザベンズトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＡＴＵ）、２－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＢＴＵ）、３，４－ジヒドロ－１，２，３－ベンゾトリアジン－４－オン－３－オキシテトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＤＴＵ）、ベンゾトリアゾール－１－イルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスファート（ＢＯＰ）、ベンゾトリアゾール－１－イルオキシトリス－（ピロリジノ）－ホスホニウムヘキサフルオロホスファート（ＰｙＢｏｐ）、（３，４－ジヒドロ－１，２，３－ベンゾトリアジン－４－オン－３－オキシ）ジエチルホスファート（ＤＥＰＢｔ）、３，４－ジヒドロ－１，２，３－ベンゾトリアジン－４－オン－３－オキシトリス－（ピロリジノ）－ホスホニウムヘキサフルオロホスファート（ＰＤＯＰ）、２－（ベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）－１，３－ジメチル－２－ピロリジン－１－イル－１，３，２－ジアザホスホリジニウムヘキサフルオロホスファート（ＢＯＭＰ）、５－（１Ｈ－７－アザベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）－３，４－ジヒドロ－１－メチル２Ｈ－ピロリウムヘキサクロロアンチモナート（ＡＯＭＰ）、（１Ｈ－７－アザベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスファート（ＡＯＰ）、５－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－３，４－ジヒドロ－１－メチル２Ｈ－ピロリウムヘキサクロロアンチモナート：Ｎ－オキシド（ＢＤＭＰ）、２－ブロモ－３－エチル－４－メチルチアゾリウムテトラフルオロボラート（ＢＥＭＴ）、２－ブロモ－１－エチルピリジニウムテトラフルオロボラート（ＢＥＰ）、２－ブロモ－１－エチルピリジニウムヘキサクロロアンチモナート（ＢＥＰＨ）、ベンゾトリアゾール－１－イルオキシ－Ｎ,Ｎ－ジメチルメタンイミニウムヘキサクロロアンチモナート（ＢＯＭＩ）、Ｎ、Ｎ’ －ビス（２－オキソ－３－オキサゾリジニル）ホスフィン酸クロリド（ＢＯＰ－Ｃｌ）、１－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）フェニルメチレンピロリジニウムヘキサクロロ－アンチモナート（ＢＰＭＰ）、１，１，３，３－ビス（テトラメチレン）フルオロウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＢＴＦＦＨ）、４－（クロロ―４－モルホリニルメチレン）モルホリニウムヘキサフルオロホスファート（ＣＭＭＭ）、２－クロロ－１，３－ジメチル－１Ｈ－ベンズイミダゾリウムヘキサフルオロホスファート（ＣＭＢＩ）、２－フルオロ－１－エチルピリジニウムテトラフルオロボラート（ＦＥＰ）、２－フルオロ－１－エチルピリジニウムヘキサクロロアンチモナート（ＦＥＰＨ）、１－（１－ピロリジニル－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジン－１－イルメチレン）ピロリジニウムヘキサフルオロ－ホスファートＮ－オキシド（ＨＡＰｙＵ）、Ｏ－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－ビス－（ペンタメチレン）ウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＢＰｉｐＵ）、Ｏ－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）Ｎ，Ｎ，Ｎ０，Ｎ０－ビス（テトラメチレン）ウリニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＢＰｙＵ）、（１Ｈ－７－アザベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）トリス（ピロリジノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスファート（ＰｙＡＯＰ）、ブロモ－トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファート（ＰｙＢｒＯｐ）、クロロ－トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファート（ＰｙＣｌＯＰ）、１，１，３，３－ビス（テトラメチレン）クロロウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＰｙＣｌＵ）、テトラメチルフルオロ－マミジニウムヘキサフルオロホスファート（ＴＦＦＨ）、トリホスゲン、トリアジン系試薬［塩化シアヌル、フッ化シアヌル、４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）、２－クロロ－４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン（ＣＤＭＴ）］、ビス（２－クロロフェニル）ホスホロクロリダート、ジフェニルホスホロクロリダート、ジフェニルホスホロアジド（ＤＰＰＡ）、N－[1－(シアノ－2－エトキシ－2－オキソエチリデンアミノオキシ)ジメチルアミノ(モルホリノ)]ウロニウム ヘキサフルオロリン酸（COMU)、N,N,N',N'-テトラメチル-O-(N-スクシンイミジル)ウロニウムテトラフルオロボラート(TSTU)等を挙げられる。
本明細書において「脱保護剤」とは、保護基を脱離させることができれば特に限定されないが、例えば、ピペリジンやリチウムジイソプロピルアミドなどの塩基、亜鉛、TFAなどの酸、０価パラジウム触媒を共存させた求核剤、塩基性水溶液、メチルアミン、ヒドラジン、一電子還元剤、チオール類が挙げられる。
（ＩＩ）四官能性化合物、及び四官能性ケミカルプローブ
本発明の四官能性化合物は、リガンド結合部位（Ａ：ligand binding moiety）、反応性部位（Ｄ：Reactive moiety）、切断可能部位（Ｅ：Cleavable moiety）、及びビオチン部位（Ｂ：Biotin tag）が、必要に応じてスペーサーを介して、連結してなる構造を有する化合物である。この化合物によれば、そのリガンド結合部位に、標的タンパク質と親和性（結合性）を有するリガンドを結合させることで、当該標的タンパク質の検出、同定または精製に有用な四官能性ケミカルプローブを調製することができる。つまり、四官能性ケミカルプローブは、リガンド部位（ligand moiety）、反応性部位（Ｄ）、切断可能部位（Ｅ）、及びビオチン部位（Ｂ）が、スペーサーを介するか／または介することなく、連結してなる構造を有する化合物である。
以下、本発明の四官能性化合物及び四官能性ケミカルプローブが有する４つの機能性官能基部位、及びそれらを連結するスペーサーについて説明する。
（リガンド結合部位）
本発明の四官能性化合物において、リガンド結合部位（Ａ）は、四官能性化合物にリガンドを結合させるための部位（カップリング部位）である。このため、リガンド上に存在する反応性カウンターパート基と反応する反応性官能基または活性化官能基（これらを総称して「リガンド反応性基」と称する）であり得る。
「活性化官能基」は、対応する活性化官能基を得るために標準的な化学技術によって活性化された反応性官能基を指す。特定の実施形態において、活性化官能基は、アミン反応性基、ヒドロキシル反応性基、チオール反応性基、アルデヒドまたはケト反応性基、アルキルまたはアリールハライド反応性基、アルキルまたはアリールスルホナート反応性基、アミド反応性基、スルホンアミド反応性基、アリール反応性基、ジオール反応性基およびカルボキシ反応性基からなる群から選択される。
「アミン反応性基」は、第１級または第２級アミンと反応する活性化官能基である。典型的なアミン反応性基としては、アリールまたはアルキル活性化カルボン酸エステル－ＣＯＯＲ、例えばＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステルまたはこれらの誘導体（例えば、スルホ－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル）、フェノールエステルまたはこれらの誘導体（例えば、Ｒはフェノール、ｐ－ニトロフェノール、テトラフルオロフェノールである）が挙げられる。他のアミン反応性基としては、塩化アシル（－ＣＯＣｌ）、アリールまたはアルキルイミダート－Ｃ（ＮＨ）ＯＭｅ）、アルキルまたはアリールイソシアナート（－ＮＣＯ）、イソチオシアナート（－ＮＣＳ）、アルデヒド、特に２－ピリジンカルボキシアルデヒド、カルボニル、エポキシ、α,β不飽和カルボニル、アルキルまたはアリールハライド、アルキルまたはアリールスルホナートが含まれる。
「ヒドロキシル反応性基」は、ヒドロキシルと反応する活性化官能基である。典型的なヒドロキシル反応性基としては、例えばアルキルまたはアリールイソシアナート－ＮＣＯ、アリールまたはアルキル活性化カルボン酸エステル－ＣＯＯＲ、エポキシ、α,β不飽和カルボニル、アルキルまたはアリールハライド、アルキルまたはアリールスルホナートが挙げられる。
「チオール反応性基」は、チオールと反応する活性化官能基である。典型的なチオール反応性基としては、例えばマレイミド、α－ハロアミド（－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ２－Ｈａｌ）、エポキシ、α,β不飽和カルボニル、アルキルまたはアリールハライド、アルキルまたはアリールスルホナートが挙げられる。
「アルデヒドまたはケト反応性基」は、アルデヒドまたはケトンと反応する活性化官能基である。典型的なアルデヒドまたはケト反応性基としては、例えばアリールまたはアルキルアミン、アリールまたはアルキルヒドラジン（－ＮＨＮＨ２）、アリールまたはアルキルアシルヒドラジン（－ＣＯ－ＮＨＮＨ２）、アルキルまたはアリールヒドロキシルアミン（－ＯＮＨ２）、アルキルまたはアリールマグネシウムハライドが挙げられる。
「アルキルまたはアリールハライド反応性基」は、アルキルまたはアリールハライドと反応する活性化反応性基である。典型的なアルキルまたはアリールハライド活性化反応性基としては、アミン、アルコール、メルカプト、アミド、スルホンアミド、カルボン酸、アルケン、アルキン、ボロン酸、ボロン酸エステル、及びアルキルスズが挙げられる。
「アルキルまたはアリールスルホナート反応性基」は、アルキルまたはアリールスルホナートと反応する活性化反応性基である。典型的なアルキルまたはアリールスルホナート活性化反応性基としては、アミン、アルコール、メルカプト、アミド、スルホンアミド、カルボン酸、アルケン、アルキン、ボロン酸、ボロン酸エステル、及びアルキルスズが挙げられる。
「アミド反応性基」は、無置換または置換アミドと反応する活性化反応性基である。典型的なアミド反応性基は、エポキシ、α,β不飽和カルボニル、アルキルまたはアリールハライド、及びアルキルまたはアリールスルホナートが挙げられる。
「スルホンアミド反応性基」は、無置換または置換スルホンアミドと反応する活性化反応性基である。典型的なスルホンアミド反応性基は、エポキシ、α,β不飽和カルボニル、アルキルまたはアリールハライド、及びアルキルまたはアリールスルホナートが挙げられる。
「アリール反応性基」は、アリール基と反応する活性化官能基である。典型的なアリール反応性基としては、例えば、４－ヒドロキシベンゼンおよびフタルヒドラジドが挙げられる。
「ジオール反応性基」は、ジオール基と反応する活性化官能基である。典型的なジオール反応性基としては、例えば、ボロン酸が挙げられる。
「カルボキシ反応性基」は、カルボキシル基と反応する活性化官能基である。典型的なカルボキシ反応性基としては、例えばハロゲン、アルキルまたはアリールスルホナート、ヒドロキシル、エポキシ、メルカプト、アミノ、イソシアナトおよびカルボジイミドが挙げられる。
「反応性官能基」は、特に言及がない限り、保護されていない遊離官能基を指す。具体的には、反応性官能基は、―ＣＯＯＨ、－ＮＨ２、－ＯＨ、－ＳＨ、－ＣＨ＝ＣＨ－，－（Ｃ＝Ｏ）－ＣＨ＝ＣＨ－、アルキル、ビニルまたはアリールハライド、アルキル，ビニルまたはアリールスルホナート、アルキニル、アジド、エポキシおよびクリックタグからなる群から選択することができる。
反応性官能基を活性化するために使用される活性化試薬の例としては、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、３－ヒドロキシ－３，４－ジヒドロ－１，２，３－ベンゾトリアジン－４－オン（ＨＯＯＢｔ）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド（ＥＤＡＣ）、２－（１Ｈ－７－アザベンズトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＡＴＵ）、２－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＢＴＵ）、３，４－ジヒドロ－１，２，３－ベンゾトリアジン－４－オン－３－オキシテトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＤＴＵ）、ベンゾトリアゾール－１－イルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスファート（ＢＯＰ）、ベンゾトリアゾール－１－イルオキシトリス－（ピロリジノ）－ホスホニウムヘキサフルオロホスファート（ＰｙＢｏｐ）、（３，４－ジヒドロ－１，２，３－ベンゾトリアジン－４－オン－３－オキシ）ジエチルホスファート（ＤＥＰＢｔ）、３，４－ジヒドロ－１，２，３－ベンゾトリアジン－４－オン－３－オキシトリス－（ピロリジノ）－ホスホニウムヘキサフルオロホスファート（ＰＤＯＰ）、２－（ベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）－１，３－ジメチル－２－ピロリジン－１－イル－１，３，２－ジアザホスホリジニウムヘキサフルオロホスファート（ＢＯＭＰ）、５－（１Ｈ－７－アザベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）－３，４－ジヒドロ－１－メチル２Ｈ－ピロリウムヘキサクロロアンチモナート（ＡＯＭＰ）、（１Ｈ－７－アザベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスファート（ＡＯＰ）、５－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－３，４－ジヒドロ－１－メチル２Ｈ－ピロリウムヘキサクロロアンチモナート：Ｎ－オキシド（ＢＤＭＰ）、２－ブロモ－３－エチル－４－メチルチアゾリウムテトラフルオロボラート（ＢＥＭＴ）、２－ブロモ－１－エチルピリジニウムテトラフルオロボラート（ＢＥＰ）、２－ブロモ－１－エチルピリジニウムヘキサクロロアンチモナート（ＢＥＰＨ）、ベンゾトリアゾール－１－イルオキシ－Ｎ,Ｎ－ジメチルメタンイミニウムヘキサクロロアンチモナート（ＢＯＭＩ）、Ｎ、Ｎ’ －ビス（２－オキソ－３－オキサゾリジニル）ホスフィン酸クロリド（ＢＯＰ－Ｃｌ）、１－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）フェニルメチレンピロリジニウムヘキサクロロ－アンチモナート（ＢＰＭＰ）、１，１，３，３－ビス（テトラメチレン）フルオロウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＢＴＦＦＨ）、４－（クロロ―４－モルホリニルメチレン）モルホリニウムヘキサフルオロホスファート（ＣＭＭＭ）、２－クロロ－１，３－ジメチル－１Ｈ－ベンズイミダゾリウムヘキサフルオロホスファート（ＣＭＢＩ）、２－フルオロ－１－エチルピリジニウムテトラフルオロボラート（ＦＥＰ）、２－フルオロ－１－エチルピリジニウムヘキサクロロアンチモナート（ＦＥＰＨ）、１－（１－ピロリジニル－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジン－１－イルメチレン）ピロリジニウムヘキサフルオロ－ホスファートＮ－オキシド（ＨＡＰｙＵ）、Ｏ－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－ビス－（ペンタメチレン）ウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＢＰｉｐＵ）、Ｏ－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）Ｎ，Ｎ，Ｎ０，Ｎ０－ビス（テトラメチレン）ウリニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＢＰｙＵ）、（１Ｈ－７－アザベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）トリス（ピロリジノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスファート（ＰｙＡＯＰ）、ブロモ－トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファート（ＰｙＢｒＯｐ）、クロロ－トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファート（ＰｙＣｌＯＰ）、１，１，３，３－ビス（テトラメチレン）クロロウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＰｙＣｌＵ）、テトラメチルフルオロ－マミジニウムヘキサフルオロホスファート（ＴＦＦＨ）、トリホスゲン、トリアジン系試薬［塩化シアヌル、フッ化シアヌル、４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）、２－クロロ－４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン（ＣＤＭＴ）］、ビス（２－クロロフェニル）ホスホロクロリダート、ジフェニルホスホロクロリダート、ジフェニルホスホロアジド（ＤＰＰＡ）、N－[1－(シアノ－2－エトキシ－2－オキソエチリデンアミノオキシ)ジメチルアミノ(モルホリノ)]ウロニウム ヘキサフルオロリン酸（COMU)、 塩基、ルイス酸、酢酸パラジウム、1,1'-ビス(ジフェニルホスフィノ)フェロセン，硫酸銅、(トリス(2－カルボキシエチル)ホスフィン（TCEP)、アスコルビン酸ナトリウム、トリス[(1－ベンジル－1H－1,2,3－トリアゾール－4－イル)メチル]アミン（TBTA)、トリス(2-ベンゾイミダゾリルメチル)アミン、3,3′,3′′－(4,4′,4′′－(ニトリロトリス(メチレン))トリス(1H－1,2,3－トリアゾール－4,1-ジイル))トリス(プロパン-1-オール)およびこれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
当業者であれば、選択されたリガンドとのカップリングのためにどのリガンド反応性基を選択すべきかは容易に理解することができ、前述するなかから適宜選択して使用することができる。
好ましい態様において、リガンド結合部位（Ａ）は、アミン反応性基、ヒドロキシル反応性基、チオール反応性基、アルデヒドまたはケト反応性基、アルキルまたはアリールハライド反応性基、アルキルまたはアリールスルホナート反応性基、アミド反応性基、スルホンアミド反応性基、アリール反応性基、ジオール反応性基及びカルボキシ反応性基からなる群から選択される活性化官能基である。特に好ましくは、アリール－またはアルキル－活性化カルボン酸エステル－ＣＯＯＲ、例えば下式で示されるＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステルである。
（式中、＊は隣接する基との結合部位を意味する。）
また、他の好ましい態様において、リガンド結合部位（Ａ）は、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ２、－ＯＨ、－ＳＨ、－ＣＨ＝ＣＨ－、－（Ｃ＝Ｏ）－ＣＨ＝ＣＨ－、アルキル、ビニルまたはアリールハライド、アルキル、ビニルまたはアリールスルホナート、アルキニル、アジド、エポキシおよびクリックタグからなる群から選択される反応性官能基である。クリックタグとは、生体直交型反応に用いられる官能基であり、例えばジフェニルホスフィニルフェニル、１，２，４，５－テトラジンー３－イル、trans-シクロオクテニル、ノルボルネニル、シクロプロペニル、ボロノビニル、ボロノアリール、ハロゲン化アリール、及びが挙げられる。
（反応性部位：Ｄ）
本発明の四官能性化合物におけるもう1つの機能性部位である反応性部位（Ｄ）は、標的タンパク質と共有結合を形成することができる基である。かかる基としては、上記作用を有する基であれば特に制限されないが、好ましくは簡便な反応条件下で共有結合を形成する基である。かかる基として、例えば、2-アリール-5-カルボニルテトラゾール（ACT）、フェニルアジド、ジアジリン、α－ケトアミド、４－ヒドロキシベンゼン、フタルヒドラジド及びベンゾフェノンからなる群より選択される少なくとも１つの化合物の構造（moiety）を有する基を挙げることができる。なお、ACTはタンパク質の主にカルボキシル基と、またフェニルアジドはタンパク質の主にアミノ基と共有結合することができる。４－ヒドロキシベンゼンおよびフタルヒドラジドはタンパク質の主に４－ヒドロキシフェニル基と共有結合することができる。またジアジリン、α－ケトアミドおよびベンゾフェノンはタンパク質と非特異的に共有結合を形成することができる。
好ましい基は、下式（２）で示されるACTの構造を有する基である：
（式中、＊は隣接する基との結合部位であることを意味する。ｎは０または１を意味する。ｎが０とはベンゼン環に配位する基がないこと、つまり、ＡＣＴが本発明の四官能性化合物の末端に位置することを意味する。ｎが１である場合、隣接する基との結合は、ベンゼン環に配位するテトラゾール基に対して、オルト位、メタ位またはパラ位のいずれでもよいが、好ましくはパラ位である。）
前記において、簡便な反応としては紫外線照射を挙げることができる。照射する紫外線の波長および照射時間は、本発明の四官能性化合物の反応性部位と標的タンパク質とが共有結合を形成する条件であれば特に限定されない。好ましい波長は254～365nmであり、より好ましくは302nmである。好ましい照射時間は1秒から10分であり、より好ましくは30秒から5分であり、さらに好ましくは1分である。
別の好ましい基は、下式（２´）で示されるジアジリンの構造を有する基である：
（式中、＊は隣接する基との結合部位であることを意味する。）
前記において、簡便な反応としては紫外線照射を挙げることができる。照射する紫外線の波長および照射時間は、本発明の四官能性化合物の反応性部位と標的タンパク質とが共有結合を形成する条件であれば特に限定されない。好ましい波長は254～380nmであり、より好ましくは365nmである。好ましい照射時間は5分から30分であり、より好ましくは10分から20分であり、さらに好ましくは15分である。
（切断可能部位：Ｅ）
本発明の四官能性化合物におけるもう1つの機能性部位である切断可能部位（Ｅ）は、特定の条件下にて開裂することができる基である。かかる基としては、上記作用を有する基であれば特に制限されないが、好ましくは緩和な反応条件下で開裂する基である。かかる基として、例えば、1-(4,4-ジメチル-2,6-ジオキソシクロヘキ-1-イリデン)エチル（Dde）、レブリノイルエステル、ビシナルジオール（vicinal diol）、ジアゾベンゼン、ビスアリールヒドラゾン、ジアルコキシジフェニルシラン、ジスルフィド、ENLYFQG（配列番号１）の配列からなるペプチド、及びENLYFQS（配列番号２）の配列からなるペプチドよりなる群から選択される少なくとも１つの化合物の構造（moiety）を有する基、またはジスルフィド基を挙げることができる。好ましくは、下式（３）で示されるDdeの構造を有する基である：
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、各々独立して水素原子または炭素数１～６のアルキル基を意味する。好ましくはＲ１及びＲ２がアルキル基であり、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６が水素原子である態様である。ここでアルキル基として、好ましくは炭素数１～３のアルキル基であり、より好ましくはメチル基である。＊は、隣接する基との結合を意味する。）
前記において穏和な反応条件とは、その処理によって捕捉したタンパク質が分解せず、またアビジンビーズに非特異的に結合した夾雑タンパク質が溶出しない条件である。具体的には切断可能部位（Ｅ）を化学的あるいは生化学的に切断する条件を挙げることができ、例えば希薄ヒドラジン水溶液，希薄過ヨウ素酸ナトリウム水溶液，希薄亜ジチオン酸ナトリウム水溶液，希薄ギ酸溶液、tabacco etch virus（TEV）プロテアーゼ溶液、希薄(トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン水溶液及び希薄ジチオトレイトール水溶液による処理を挙げることができる。より好ましくは希薄ヒドラジン水溶液である。なお、ここで希薄とは、制限されないものの、５質量％以下、好ましくは３質量％以下の濃度を意味する。
（ビオチン部位：Ｂ）
本発明の四官能性化合物におけるもう1つの機能性部位であるビオチン部位（Ｅ）は、下式（１）で示されるビオチンの構造を有する基である：
（式中、＊は、隣接する基との結合を意味する。）
当該ビオチン部位は、アビジンまたはストレプトアビジンが結合した固体支持体（例えば、磁性粒子、ビーズ、プレート、フィルター、膜、クロマトグラフィー用樹脂など）に特異的に結合することができるタグである。当該ビオチン部位は、標的タンパク質を、検出、同定または精製をする場面において有効に機能する。
（スペーサー）
前述する４つの機能性官能基部位が、互いに各々独立したスペーサーを介して連結することで、本発明の四官能性化合物は形成されている。ここで４つの機能性官能基部位を連結するスペーサーとしては、直鎖または分岐鎖状の炭素数１以上のアルキレン基、並びに、直鎖または分岐鎖状の炭素数３以上のアルキレン基からなるアルキレン鎖において、隣接しない－ＣＨ２－基が互いに独立して、－Ｏ－、－ＯＣＨ２－、－ＣＨ２Ｏ－、－ＣＯ－、－ＮＲａ－［Ｒａは水素原子または炭素数１～６のアルキル基を意味する。以下同じ。］、－ＣＯ－ＮＲａ－、－ＮＲａ－ＣＯ－、下記式（１－１）で示される基、及び下記式（１－２）で示される基からなる群より選択される少なくとも１つの架橋基で置換されてなる基を挙げることができる。当該架橋基は、アルキレン鎖内の－ＣＨ２－基またはアルキレン鎖の末端の－ＣＨ２－基を置換することができる。Ｒａは、好ましくは水素原子である。
（式中、ｍは０又は１を、ｎは１又は２を意味する。）
上記式（１－１）で示される基又は式（１－２）で示される基の具体例として、下記式（１－３）～式（１－１６）を例示することができる。
スペーサーは、立体的な混雑が最小限に抑えられ、前述する４つの機能性官能基の作用が損なわれないように、その種類及び長さを選択することができる。この限りにおいて、アルキレン基の炭素数（アルキレン鎖長）は制限されないものの、好ましくは炭素数１～２０であり、より好ましくは炭素数２～１０を例示することができる。
本発明の四官能性化合物には、下式（Ｉ）で示される直鎖状の化合物、及び下式（ＩＩ）で示される分岐鎖状の化合物が含まれる。
（ＩＩ－１）直鎖状の四官能性化合物、及び四官能性ケミカルプローブ
式（Ｉ）において、Ａで示されるリガンド結合部位、Ｄで示される反応性部位、Ｅで示される切断可能部位、及びＢで示されるビオチン部位は、前述した通りである。式（Ｉ）において、Ｓ１、Ｓ２及びＳ３で示される部位はお互いに独立したスペーサー基である。
Ｓ１で示されるスペーサー基としては、下式（５）で示される基を挙げることができる。
（式中、ａは０～１０の整数、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ及びｈは、各々独立して、０～６から選択される整数である。）
Ｓ１の１つの態様として、炭素数１以上の直鎖状のアルキレン基を挙げることができる。これは、式（５）において、ｇ、ｃ及びｈが０であり、ａが１以上の整数である場合に該当する。ａは１以上の整数であればよいが、好ましくは１～３０であり、より好ましくは１～１０である。
Ｓ１の別の態様として、直鎖状の炭素数３以上のアルキレン基からなるアルキレン鎖において、隣接しない－ＣＨ２－基が互いに独立して、－Ｏ－、－ＯＣＨ２－、－ＣＨ２Ｏ－、－ＣＯ－、－ＮＲａ－［Ｒａは水素原子または炭素数１～６のアルキル基を意味する。以下同じ。］、－ＣＯ－ＮＲａ－、及び－ＮＲａ－ＣＯ－からなる群より選択される少なくとも１つの架橋基、好ましくは－Ｏ－、－ＣＯ－及び－ＮＨ－ＣＯ－からなる群より選択される少なくとも１つの架橋基で置換されてなる基を挙げることができる。炭素数としては３～４０、好ましくは１０～３５を、制限なく例示することができる。具体的には、例えば、式（５）において、ｇが０、ａ、ｂ、ｄ及びｅが２、ｃ及びｆが４、ｈが１である場合、並びにｇ、ｃ及びｆが０、ａが３、ｄが４、ｈが１である場合を例示することができる。
Ｓ２及びＳ３で示されるスペーサー基としては、互いに独立して、下式（６）で示される基を挙げることができる。
（式中、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ及びｈは、各々独立して、０～６から選択される整数である。また、ｉは、０または１である。但し、ａとｃとｈとｉが同時に０になることはない。）
Ｓ２の１つの態様として、直鎖状の炭素数１以上のアルキレン基からなるアルキレン鎖において、隣接しない－ＣＨ２－基が互いに独立して、－Ｏ－、－ＯＣＨ２－、－ＣＨ２Ｏ－、－ＣＯ－、－ＮＲａ－［Ｒａは水素原子または炭素数１～６のアルキル基を意味する。以下同じ。］、－ＣＯ－ＮＲａ－、及び－ＮＲａ－ＣＯ－からなる群より選択される少なくとも１つの架橋基、好ましくは－Ｏ－、－ＮＨ－、及び－ＮＨ－ＣＯ－からなる群より選択される少なくとも１つの架橋基で置換されてなる基を挙げることができる。炭素数としては１～２０、好ましくは１～５を、制限なく例示することができる。具体的には、例えば、式（６）において、例えばａ及びｃが０、ｄが３、ｆ及びｇが０、ｉが１である場合を例示することができる。
Ｓ３の１つの態様として、直鎖状の炭素数３以上のアルキレン基からなるアルキレン鎖において、隣接しない－ＣＨ２－基が互いに独立して、－Ｏ－、－ＯＣＨ２－、－ＣＨ２Ｏ－、－ＣＯ－、－ＮＲａ－［Ｒａは水素原子または炭素数１～６のアルキル基を意味する。以下同じ。］、－ＣＯ－ＮＲａ－、及び－ＮＲａ－ＣＯ－からなる群より選択される少なくとも１つの架橋基、好ましくは－Ｏ－、及び－ＮＨ－からなる群より選択される少なくとも１つの架橋基で置換されてなる基を挙げることができる。炭素数としては３～２０、好ましくは５～１５を、制限なく例示することができる。具体的には、例えば、式（６）において、例えばａ及びｂが２，ｃが４、及びｈとｉが０である場合を例示することができる。
直鎖状の四官能性化合物の分子量は、リガンド結合部位にリガンドを結合した状態（つまり、四官能性ケミカルプローブ）として、当該リガンドと親和性の高いタンパク質を適切に配位できるものであればよく、制限されないものの、通常５００～３０００である。好ましくは８００～２０００であり、より好ましくは１０００～１５００である。このような分子量を有することで、膜透過性を抑えることができる。また各種リガンドの細胞膜透過性について論じた文献（Methods Mol Biol. 2015 ; 1266: 29－53）によると、膜透過性を抑えるためには、水素結合供与基数は6以上、水素結合受容基数は15以上、または極性表面積は140Å2以上、さらに好ましくは300Å2以上であることが望ましいと考えられる。後述する本発明の四官能性化合物及び四官能性ケミカルプローブは、水素結合供与基数６～９、水素結合受容基数１５～２８、極性表面積300Å2以上である。また、近年では分子量よりは分子サイズに膜透過性が依存するとされている。中分子では環状ペプチドで実測されている例があり、分子サイズ800Å以上で膜透過性が減弱し、1000Å以下で極端に減弱することが知られている。後述する本発明の四官能性化合物及び四官能性ケミカルプローブは、分子サイズが900Å以上である。また前記の文献では回転可能結合数が10以下で膜透過性がよいとされている。つまり、膜透過性を抑えるための回転可能な結合数は10以上、さらに好ましくは30以上が望ましいと考えられる。本発明の四官能性化合物及び四官能性ケミカルプローブの回転可能結合数は３３～６０である。このようにデザインされた本発明の四官能性ケミカルプローブは細胞膜の透過性が抑制されており膜透過ができないため、膜タンパクと効率的に配位することができる。
以下に直鎖状の四官能性化合物のうち、リガンド結合部位がＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル基（NHSエステル基）である化合物の製造方法を、化合物（CPA-306）（製造例１５参照）を一例として説明する。なお、リガンド結合部位がNHSエステル基である化合物によれば、当該リガンド結合部位に抗体を結合させることで、標的タンパク質として特定の抗原を認識結合することができる抗体プローブを調製することができる。
［リガンド結合部位がＮＨＳエステル基である直鎖状四官能性化合物の製造方法］（例）
（式中、ｑは、それぞれ独立して０～６の整数を意味する。）
（第一工程）
本工程は、PEG-NH2およびアリルアルコールを、塩化チオニル存在下、無溶媒または反応に不活性な反応溶媒中で、通常、0.1時間から５日間にわたり、0℃から加熱還流に至る範囲の温度条件で撹拌することによって実行することができる。
（第二工程）
本工程は、第一工程で得られた化合物および2-アリール-5-カルボキシテトラゾール（ACT）を、N-[1-(Cyano-2-ethoxy-2-oxoethylideneaminooxy)dimethylamino(morpholino)]uronium hexafluorophosphate （COMU）およびアミンの存在下、反応に不活性な反応溶媒中で、通常、0.1時間から５日間にわたり、0℃から加熱還流に至る範囲の温度条件で撹拌することによって実行することができる。
（第三工程）脱保護
本工程は、第二工程で得られた化合物をモルホリンおよびパラジウム化合物存在下、反応に不活性な反応溶媒中で、通常、0.1時間から５日間にわたり、0℃から加熱還流に至る範囲の温度条件で撹拌することによって実行される。
（第四工程）側鎖延長
本工程は、第一工程及び第三工程で得られた化合物を、COMUおよびアミン存在下、反応に不活性な反応溶媒中で、通常、0.1時間から５日間にわたり、0℃から加熱還流に至る範囲の温度条件で撹拌することによって実行することができる。
（第五工程）脱保護
本工程は、第四工程で得られた化合物および脱保護剤を、反応に不活性な反応溶媒中で通常、0.1時間から５日間にわたり、0℃から加熱還流に至る範囲の温度条件で撹拌することによって実行することができる。
（第六工程）
本工程は、第五工程で得られた化合物と脱保護化合物とをアミン存在下、反応に不活性な反応溶媒中で通常、0.1時間から５日間にわたり、0℃から加熱還流に至る範囲の温度条件で撹拌することによって実行することができる。
（第七工程）脱保護
本工程は、第六工程で得られた化合物を1,3-ジメチルバルビツル酸およびパラジウム化合物存在下、反応に不活性な反応溶媒中で通常、0.1時間から５日間にわたり、0℃から加熱還流に至る範囲の温度条件で撹拌することによって実行することができる。
（第八工程）
本工程は、第七工程で得られた化合物およびN-ヒドロキシスクシンイミドをカルボジイミド（WSC）存在下、反応に不活性な反応溶媒中で通常、0.1時間から５日間にわたり、0℃から加熱還流に至る範囲の温度条件で撹拌することによって実行することができる。
このようにして調製される直鎖状四官能性化合物のリガンド結合部位（NHSエステル基）に、所望の抗体を結合させる方法は、公知の方法に従って行うことができ、斯くして、本発明の直鎖状四官能性ケミカルプローブを製造することができる。制限されないものの、所望の抗体をNHSエステル基に結合させる方法としては、下記の方法を例示することができる。
（四官能性化合物の抗体ラベル化方法）
標的タンパク質に親和性を有する所望の抗体を、慣用のNHSラベリングバッファーで濃度を調製した後に、本発明の四官能性化合物を加え、0～37℃の温度条件で5～60分間程度反応させる。次に、リジン溶液を加え、0～37℃で5～60分間程度反応させる。斯くして、本発明の四官能性化合物のリガンド結合部位（NHSエステル基）に所望の抗体が結合した直鎖状四官能性ケミカルプローブ（ラベル化抗体）を得ることができる。
一方、直鎖状の四官能性化合物のうち、リガンド結合部位がNHSエステル基以外のリガンド反応性基である化合物は、直接、リガンド結合部位に所望のリガンドを結合させた状態に、つまり四官能性ケミカルプローブとして、製造することができる。以下に、その製造方法の一例を説明する。
［直鎖状四官能性ケミカルプローブの製造方法］（例）
［第一工程］
（式中、ｒは１～６の整数を意味する。Ｒ１及びＲ２は前述の通り。）
本工程は、化合物1-1、カルボジイミドおよびシクロヘキサン-1,3-ジオンを、N,N-ジメチル-4-アミノピリジン（DMAP）の存在下、反応に不活性な反応溶媒中で、通常、0.1時間から５日間にわたり、0℃から加熱還流に至る範囲の温度条件で撹拌することによって実行することができる。
［第二及び三工程］
（式中、ｍは１～６の整数を意味する。）
（第二工程）
本工程は、化合物1-3および化合物1-4を、COMUおよびアミンの存在下、反応に不活性な反応溶媒中で、通常、0.1時間から５日間にわたり、0℃から加熱還流に至る範囲の温度条件で撹拌することによって実行することができる。
（第三工程）
本工程は、化合物1-5を塩基の存在下、反応に不活性な反応溶媒中で、通常、0.1時間から５日間にわたり、0℃から加熱還流に至る範囲の温度条件で撹拌することによって実行することができる。
（第四工程）
（式中、ｓは１～１０の整数を意味する。ｍは前記と同じ）
本工程は、化合物１－７および第三工程で得られた化合物１－６を、ＨＡＴＵおよびアミン存在下、反応に不活性な反応溶媒中で、通常、０．１時間から５日間にわたり、０℃から加熱還流に至る範囲の温度条件で撹拌することによって実行することができる。
（第五工程）
（式中、ｍ、ｒ、ｓ、Ｒ１及びＲ２は前記と同じ）
本工程は、第四工程で得られた化合物１－８を、弱酸存在下、反応に不活性な反応溶媒中で、通常、０．１時間から５日間にわたり、０℃から加熱還流に至る範囲の温度条件で撹拌して濃縮操作を行った後、第一工程で得られた化合物１－２とアミン存在下、反応に不活性な反応溶媒中で、通常、０．１時間から５日間にわたり、０℃から加熱還流に至る範囲の温度条件で撹拌することによって実行することができる。この反応に使用できる「弱酸」は、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、クエン酸、シュウ酸等が挙げられる。また、この反応に使用できる「アミン」としては、ジイソプロピルエチルアミン、及びトリエチルアミン等が挙げられる。
斯くして製造される化合物1-9は、本発明の四官能性化合物のリガンド結合部位に所望のリガンドが結合されており、四官能性ケミカルプローブとして使用することができる。なお、ここでリガンドとしては、抗体を除く、前述のものを制限なく例示することができる。
（ＩＩ－２）分岐鎖状の四官能性化合物、及び四官能性ケミカルプローブ
前述する式（ＩＩ）において、Ａで示されるリガンド結合部位、Ｄで示される反応性部位、Ｅで示される切断可能部位、及びＢで示されるビオチン部位は、前述した通りである。また式（ＩＩ）において、Ｓ４、Ｓ５、Ｓ６及びＳ７で示される部位はお互いに独立したスペーサー基である。
Ｓ４で示されるスペーサー基としては、下式（７）で示される基を挙げることができる。
式中、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ及びｉは、各々独立して、０～６から選択される整数である。但し、ａとｃとｉが同時に０になることはなく、またｄとｆとｇが同時に０になることはない。
Ｓ４の１つの態様として、直鎖状の炭素数３以上のアルキレン基からなるアルキレン鎖において、隣接しない－ＣＨ２－基が互いに独立して、－Ｏ－、－ＯＣＨ２－、－ＣＨ２Ｏ－、－ＣＯ－、－ＮＲａ－［Ｒａは水素原子または炭素数１～６のアルキル基を意味する。以下同じ。］、－ＣＯ－ＮＲａ－、及び－ＮＲａ－ＣＯ－からなる群より選択される少なくとも１つの架橋基、好ましくは－Ｏ－、及び－ＮＨ－からなる群より選択される少なくとも１つの架橋基で置換されてなる基を挙げることができる。炭素数としては１～２０、好ましくは１～１５、より好ましくは３～１０を、制限なく例示することができる。具体的には、例えば、上記式において、例えばａが２、ｂが２，ｃが２、ｈが０、及びｉが０である場合を例示することができる。
Ｓ５で示されるスペーサー基としては、下式（８）～（１０）で示される基を挙げることができる。
（式中、ｗ、ｘ、ｙ、及びｚは、各々独立して、０～６から選択される整数である。但し、ｘ及びｙが同時に０になることはない。）
Ｓ５の１つの態様として、直鎖状の炭素数３以上の（置換基を有する）アルキレン基からなるアルキレン鎖において、隣接しない－ＣＨ２－基が互いに独立して、－Ｏ－、－ＯＣＨ２－、－ＣＨ２Ｏ－、－ＣＯ－、－ＮＲａ－［Ｒａは水素原子または炭素数１～６のアルキル基を意味する。以下同じ。］、－ＣＯ－ＮＲａ－、及び－ＮＲａ－ＣＯ－からなる群より選択される少なくとも１つの架橋基、好ましくは－ＣＯ－、－ＮＨ－、－ＣＯ－ＮＨ－、及び－ＮＨ－ＣＯ－からなる群より選択される少なくとも１つの架橋基で置換されてなる基を挙げることができる。炭素数としては３～２０、好ましくは３～１５、より好ましくは５～１５を、制限なく例示することができる。具体的には、例えば、上記式（８）において、例えばx及びyが４である場合を例示することができる。
Ｓ６で示されるスペーサー基としては、下式で示される基を挙げることができる。
（式中、ａ、ｂ、ｃ及びｄは、各々独立して、０～６から選択される整数である。但し、ａとｃが同時に０になることはない。）
Ｓ６の１つの態様として、直鎖状の炭素数３以上のアルキレン基からなるアルキレン鎖において、隣接しない－ＣＨ２－基が互いに独立して、－Ｏ－、－ＯＣＨ２－、－ＣＨ２Ｏ－、－ＣＯ－、－ＮＲａ－［Ｒａは水素原子または炭素数１～６のアルキル基を意味する。以下同じ。］、－ＣＯ－ＮＲａ－、及び－ＮＲａ－ＣＯ－からなる群より選択される少なくとも１つの架橋基、好ましくは－Ｏ－、及び－ＮＨ－からなる群より選択される少なくとも１つの架橋基で置換されてなる基を挙げることができる。炭素数としては３～２０、好ましくは５～１５を、制限なく例示することができる。具体的には、例えば、上記式（１１）において、例えばａが３、ｂが２，ｃが３、及びｄが１である場合を例示することができる。
Ｓ７で示されるスペーサー基としては、下式で示される基を挙げることができる。
（式中、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ及びｈは、各々独立して、０～６から選択される整数である。但し、ａとｃが同時に０になることはなく、またａとｃとｇとｈが同時に０になることはない。）
Ｓ７の１つの態様として、直鎖状の炭素数３以上のアルキレン基からなるアルキレン鎖において、隣接しない－ＣＨ２－基が互いに独立して、－Ｏ－、－ＯＣＨ２－、－ＣＨ２Ｏ－、－ＣＯ－、－ＮＲａ－［Ｒａは水素原子または炭素数１～６のアルキル基を意味する。以下同じ。］、－ＣＯ－ＮＲａ－、及び－ＮＲａ－ＣＯ－からなる群より選択される少なくとも１つの架橋基、好ましくは－Ｏ－、－ＣＯ－及び－ＮＨ－ＣＯ－からなる群より選択される少なくとも１つの架橋基で置換されてなる基を挙げることができる。炭素数としては３～４０、好ましくは３～３０、より好ましくは３～２０を、制限なく例示することができる。具体的には、例えば、上記式において、例えばｇが０、ａが５、ｃが０、ｄが２、ｆが０、ｈが１である場合 を例示することができる。
Ｓ７で示されるスペーサー基の別の態様としては、下式で示される基を挙げることができる。
（式中、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ及びｇは、各々独立して、０～６から選択される整数である。但し、ａとｃが同時に０になることはなく、またａとｃとｈが同時に０になることはない。）
Ｓ７の１つの態様として、直鎖状の炭素数３以上のアルキレン基からなるアルキレン鎖において、隣接しない－ＣＨ２－基が互いに独立して、－Ｏ－、－ＯＣＨ２－、－ＣＨ２Ｏ－、－ＣＯ－、－ＮＲａ－［Ｒａは水素原子または炭素数１～６のアルキル基を意味する。以下同じ。］、－ＣＯ－ＮＲａ－、－ＮＲａ－ＣＯ－、下記式（１－１）で示される基、及び下記式（１－２）で示される基からなる群より選択される少なくとも１つの架橋基、好ましくは－Ｏ－、－ＣＯ－、－ＮＨ－ＣＯ－、下記式（１－３）で示される基、下記式（１－７）で示される基、及び下記式（１－１５）で示される基からなる群より選択される少なくとも１つの架橋基で置換されてなる基を挙げることができる。炭素数としては３～４０、好ましくは３～３０、より好ましくは３～２０を、制限なく例示することができる。具体的には、例えば、上記式（１３）において、例えばｇが０、ａが５、ｃが０、ｄが２、ｆが０、ｈが１である場合を例示することができる。
（式中、ｍは０又は１を、ｎは１又は２を意味する。）
分岐鎖状の四官能性化合物の分子量は、リガンド結合部位にリガンドを結合した状態（つまり、四官能性ケミカルプローブ）として、当該リガンドと親和性の高いタンパク質を適切に配位できるものであればよく、制限されないものの、通常５００～３０００である。好ましくは８００～２０００であり、より好ましくは１０００～１５００である。このような分子量を有することで、膜透過性を抑えることができる。また各種リガンドの細胞膜透過性について論じた文献（Methods Mol Biol. 2015 ; 1266: 29－53）によると、膜透過性を抑えるためには、水素結合供与基数は6以上、水素結合受容基数は15以上、または極性表面積は140Å2以上、さらに好ましくは300Å2以上であることが望ましいと考えられる。後述する本発明の四官能性化合物及び四官能性ケミカルプローブは、水素結合供与基数６～９、水素結合受容基数１５～２８、極性表面積300Å以上である。また、近年では分子量よりは分子サイズに膜透過性が依存するとされている。中分子では環状ペプチドで実測されている例があり、分子サイズ800Å以上で膜透過性が減弱し、1000Å以下で極端に減弱することが知られている。後述する本発明の四官能性化合物及び四官能性ケミカルプローブは、分子サイズが900Å以上である。また前記の文献では回転可能結合数が10以下で膜透過性がよいとされている。つまり、膜透過性を抑えるための回転可能な結合数は10以上、さらに好ましくは30以上が望ましいと考えられる。本発明の四官能性化合物及び四官能性ケミカルプローブの回転可能結合数は３３～６０である。このようにデザインされた本発明の四官能性ケミカルプローブは細胞膜の透過性が抑制されており膜透過ができないため、膜タンパクと効率的に配位することができる。
以下に分岐鎖状の四官能性化合物のうち、リガンド結合部位がＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル基（NHSエステル基）である化合物の製造方法を、化合物（CPA-306）（製造例１５参照）を一例として説明する。なお、リガンド結合部位がNHSエステル基である化合物によれば、当該リガンド結合部位に抗体を結合させることで、標的タンパク質として特定の抗原を認識結合することができる抗体プローブを調製することができる。
［リガンド結合部位がNHSエステル基である分岐鎖状四官能性化合物の製造方法］（例）
以下、説明の都合、反応工程を大きく５つに分けて説明する：
［反応工程Ｉ］
（式中、ｔは０～６の整数、ｖは１～５の整数を意味する。）
（第一工程）
本工程は、ジアミンおよび酸クロライドを、反応に不活性な反応溶媒中で通常、0.1時間から５日間にわたり、0℃から加熱還流に至る範囲の温度条件で撹拌することによって実行することができる。
（第二工程）
本工程は、第一工程で保護基が付されたジアミンおよび分岐アミンを有するリンカーを、カルボジイミド（WSC）および1-ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBt）存在下、反応に不活性な反応溶媒中で、通常、0.1時間から５日間にわたり、0℃から加熱還流に至る範囲の温度条件で撹拌することによって実行することができる。
（第三工程）
本工程は、第二工程で得られた化合物を、1,3-ジメチルバルビツル酸およびパラジウム化合物の存在下、反応に不活性な反応溶媒中で、通常、0.1時間から５日間にわたり、0℃から加熱還流に至る範囲の温度条件で撹拌することによって実行することができる。
（第四工程）
本工程は、第三工程で得られた化合物およびビオチン化合物を、アミン存在下、反応に不活性な反応溶媒中で通常、0.1時間から５日間にわたり、0℃から加熱還流に至る範囲の温度条件で撹拌することによって実行することができる。
（第五工程）
本工程は、第三工程で得られた化合物を、ピペリジンの存在下、反応に不活性な反応溶媒中で、通常、0.1時間から５日間にわたり、0℃から加熱還流に至る範囲の温度条件で撹拌することによって実行することができる。
［反応工程II］
（式中、ｗは０～６の整数を意味する。）
（第一工程）
本工程は、1-アミノアルキルカルボン酸およびアリルアルコールを塩化チオニルの存在下、反応に不活性な反応溶媒中で、通常、0.1時間から５日間にわたり、0℃から加熱還流に至る範囲の温度条件で撹拌することによって実行することができる。
（第二工程）
本工程は、第一工程で得られた1-アミノアルキルカルボン酸、およびアルキルジカルボン酸無水物を、アミンの存在下、反応に不活性な反応溶媒中で、通常、0.1時間から５日間にわたり、0℃から加熱還流に至る範囲の温度条件で撹拌することによって実行することができる。上記反応に使用するアルキルジカルボン酸無水物は、制限されないものの、例えば、無水コハク酸、グルタル酸無水物、アジピン酸無水物等が挙げられる。
［反応工程III］
（式中、ｃ及びｄは各々０～６の整数を意味する。）
（第一工程）
本工程は、BOC保護されたジアミンおよびテトラゾールを含むカルボン酸を、アミンおよびHATUの存在下、反応に不活性な反応溶媒中で、通常、0.1時間から５日間にわたり、0℃から加熱還流に至る範囲の温度条件で撹拌することによって実行することができる。
（第二工程）
本工程は、第一工程で得られた化合物及び脱保護剤を、反応に不活性な反応溶媒中で、通常、0.1時間から５日間にわたり、0℃から加熱還流に至る範囲の温度条件で撹拌することによって実行することができる。
（第三工程）
本工程および第四工程は、リンカー長をさらに延長させる場合の任意の工程である。第二工程で得られた化合物およびアミノ基がBOC保護されたアミノカルボン酸をアミンおよびCOMUの存在下、反応に不活性な反応溶媒中で、通常、0.1時間から５日間にわたり、0℃から加熱還流に至る範囲の温度条件で撹拌することによって実行することができる。
（第四工程）
本工程は、第三工程で得られた化合物及び脱保護剤を、反応に不活性な反応溶媒中で、通常、0.1時間から５日間にわたり、0℃から加熱還流に至る範囲の温度条件で撹拌することによって実行することができる。
［反応工程ＩＶ］
（式中、ｔ及びｕはそれぞれ独立して０～６の整数、ｖ、ｗ、Ｒ１、及びＲ２は前述の通り。）
（第一工程）
本工程は、反応工程II及びIIIで得られた化合物を、水溶性カルボジイミド（WSC）および1-ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBt）の存在下、反応に不活性な反応溶媒中で、通常、0.1時間から５日間にわたり、0℃から加熱還流に至る範囲の温度条件で撹拌することによって実行することができる。
（第二工程）
本工程は、第一工程で得られた化合物及び脱保護剤を、反応に不活性な反応溶媒中で、通常、0.1時間から５日間にわたり、0℃から加熱還流に至る範囲の温度条件で撹拌することによって実行することができる。
（第三工程）
本工程は、第二工程で得られた化合物およびアルキルジカルボン酸無水物をアミンの存在下、反応に不活性な反応溶媒中で、通常、0.1時間から５日間にわたり、0℃から加熱還流に至る範囲の温度条件で撹拌することによって実行することができる。
（第四工程）
本工程は、第三工程で得られた化合物およびシクロヘキサンジオンを水溶性カルボジイミド（WSC）およびN,N-ジメチル-4-アミノピリジン（DMAP）の存在下、反応に不活性な反応溶媒中で、通常、0.1時間から５日間にわたり、0℃から加熱還流に至る範囲の温度条件で撹拌することによって実行することができる。
［反応工程Ｖ］
（式中、Ｃ、ｕ、ｖ、ｗ、ｔ、Ｒ１、及びＲ２は前述の通り。）
（第一工程）
本工程は、反応工程ＩＩＩ及びＩＶでそれぞれ得られた化合物を、アミンの存在下、反応に不活性な反応溶媒中で、通常、０．１時間から５日間にわたり、０℃から加熱還流に至る範囲の温度条件で撹拌することによって実行することができる。
（第二工程）
本工程は、第一工程で得られた化合物を、パラジウム化合物および1,3-ジメチルバルビツル酸の存在下、反応に不活性な反応溶媒中で、通常、0.1時間から５日間にわたり、0℃から加熱還流に至る範囲の温度条件で撹拌することによって実行することができる。
（第三工程）
本工程は、第二工程で得られた化合物およびＮ－ヒドロキシスクシンイミドを、カルボジイミド（WSC）の存在下、反応に不活性な反応溶媒中で、通常、0.1時間から５日間にわたり、0℃から加熱還流に至る範囲の温度条件で撹拌することによって実行することができる。
（第四工程）
本工程は任意の工程であり、リガンド結合部位を変換する工程である。本工程は、第三工程で得られた化合物および6-(ピペラジン-1-イルメチル)ピコリンアルデヒドを、アミン（DIPEA）の存在下、反応に不活性な反応溶媒中で、通常、0.1時間から５日間にわたり、0℃から加熱還流に至る範囲の温度条件で撹拌することによって実行することができる。
このようにして調製される分岐鎖状四官能性化合物のリガンド結合部位（NHSエステル基）に、所望の抗体を結合させる方法は、公知の方法に従って行うことができ、斯くして、本発明の分岐鎖状四官能性ケミカルプローブを製造することができる。制限されないものの、所望の抗体をNHSエステル基に結合させる方法としては、前述する四官能性化合物の抗体ラベル化方法を例示することができる。
なお、前述する各反応式における各反応において、生成物は反応液のまま、または粗生成物として次反応に用いることもできるが、常法に従って反応混合物から単離することもでき、通常の分離手段により容易に精製することもできる。通常の分離手段としては、例えば、再結晶、蒸留、クロマトグラフィーが挙げられる。
また各工程における出発原料化合物、中間体化合物および目的化合物（本発明の四官能性化合物、四官能性ケミカルプローブ）には、幾何異性体、立体異性体、光学異性体および互変異性体が含まれる。各種異性体は一般的な光学分割法により分離できる。また、適当な光学活性な原料化合物より製造することもできる。
なお、本発明の四官能性化合物、及び四官能性ケミカルプローブは、上記の各反応式にて示された合成方法に拘束されるものではなく、それに準ずる方法また別の方法により製造することもできる。また、製造における原料化合物は特に言及していない場合、市販のものを用いてもよく、自体公知の方法またはそれに準ずる方法に従って製造したものを用いてもよい。
また各工程における出発原料化合物および目的化合物は、適切な塩形態で使用することができる。制限されないものの、これらの塩には、酸付加塩または置換基の種類によっては塩基との塩が含まれる。かかる酸付加塩を形成する酸の例としては、無機酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸等）；および有機酸（例えば、メタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸，クエン酸、酒石酸、マレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、乳酸等）等が挙げられる。また塩を形成する塩基の例としては、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム等）；および有機塩基（例えば、メチルアミン、ジエチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、エチレンジアミン、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、N,N’-ジベンジルエチレンジアミン、グアニジン、ピリジン、ピコリン、コリン等）；およびアンモニウム塩等が挙げられる。また、例えばリジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸等のアミノ酸と塩を形成してもよい。
（ＩＩ）標的タンパク質の検出方法
前述する本発明の四官能性ケミカルプローブを用いることで、試料中の標的タンパク質を検出することが可能である。本発明の四官能性ケミカルプローブを用いた標的タンパク質の検出は、制限されないものの、下記の工程を有する方法で実施することができる。
（１）試料中の細胞または組織に四官能性ケミカルプローブを反応させて、四官能性ケミカルプローブ中のリガンドと標的タンパク質とを結合させる工程、
（２）四官能性ケミカルプローブ中の反応性部位（Ｄ）と標的タンパク質との間で共有結合を形成させる工程、
（３）四官能性ケミカルプローブが結合した標的タンパク質を含む画分を精製する工程、（４）四官能性ケミカルプローブ中のビオチン部位をアビジンと結合させて、四官能性ケミカルプローブ－アビジン複合体を形成する工程、
（５）形成した四官能性ケミカルプローブ－アビジン複合体を、四官能性ケミカルプローブ中の切断可能部位で開裂する工程、
（６）標的タンパク質を検出または同定する工程。
以下、これらの各工程について説明する：
（１）リガンドとタンパク質とを結合する工程
本工程は、制限されないものの、標的タンパク質が発現している細胞を5％CO2雰囲気下37℃にて培養して、細胞がコンフルエントになったことを確認した後に、DMSOにて所望の濃度に調製した本発明の四官能性ケミカルプローブを添加し、30～60分間程度、5％CO2雰囲気下37℃にて静置することで実施することができる。
（２）四官能性ケミカルプローブ中の反応性部位（Ｄ）と標的タンパク質との間で共有結合を形成させる工程
本工程は、制限されないものの、ＵＶクロスリンカーを用いて、波長254～365nm、好ましくは302nmで、1秒～10分間、好ましくは30秒～5分間、さらに好ましくは1分間照射することで実施することができる。
（３）四官能性ケミカルプローブが結合した標的タンパク質を含む画分を精製する工程 本工程は、制限されないものの、一例を挙げると、下記の方法を用いることができる。まず、細胞にTris Homogenate Bufferを加えてホモジナイズした後に、遠心分離する。沈殿物を分離し、Sodium Carbonate Bufferを加えホモジナイズした後に、インキュベートする。遠心分離して、沈殿物を分離することで、四官能性ケミカルプローブが結合した標的タンパク質を含む画分（例えば、膜画分）を精製し、回収することができる。
（４）四官能性ケミカルプローブ中のビオチン部位をアビジンと結合させて、四官能性ケミカルプローブ－アビジン複合体を形成する工程
本工程は、制限されないものの、例えば、上記で回収した画分に、例えば8M Urea含有RIPA bufferを加え、超音波粉砕機を用いて当該画分をバッファーに溶解させる。遠心分離して上清を分離し、例えばストレプトアビジン磁気粒子を加える。斯くして、ケミカルプローブ中のビオチン部位がアビジンと結合して、四官能性ケミカルプローブ－アビジン複合体が形成される。さらに、定法に従って磁気分離を行い、上清を廃棄することで、四官能性ケミカルプローブ－アビジン複合体を精製し回収することできる。
（５）形成した四官能性ケミカルプローブ－アビジン複合体を、四官能性ケミカルプローブ中の切断可能部位で開裂する工程
本工程は、制限されないものの、例えば、前記工程で回収した四官能性ケミカルプローブ－アビジン複合体（磁気粒子複合体）に、SDS (sodium dodecyl sulfate)およびヒドラジン水溶液を加え、室温（1～30℃）で30分静置することで実施することができる。この反応により、四官能性ケミカルプローブ中の切断可能部位が開裂し、四官能性ケミカルプローブ－アビジン複合体を、標的タンパク質の結合領域とビオチン・アビジン結合領域とに分断することができる。反応液を磁気分離して、上清を得ることで、標的タンパク質の結合領域断片を回収することができる。
（６）標的タンパク質を検出または同定する工程
標的タンパク質を検出または同定するにあたり、必要に応じて、事前に回収した標的タンパク質の結合領域断片を精製処理や加水分解処理に供してもよい。制限されないものの、具体的には、例えば、得られた上清にジチオトレイオールを加え、15分間70℃で撹拌する。次にヨードアセトアミドを加え、30分間室温で静置する。斯くして得られた溶液にSP3ビーズを添加し、MeCNを加え、18分間インキュベーションする。インキュベーション終了後、磁気分離を行い、上清を廃棄する。ペプチド分解処理は、例えば、上記で回収した残渣にトリプシン溶液を添加し、37℃で12～16時間インキュベーションする。MeCNを添加し、18分間インキュベーションし、磁気分離を行い、上清を廃棄する。残渣にTFA水溶液を添加し、3分間インキュベーションする。磁気分離して、上清を得る。
斯くして調製したペプチドは脱塩され、高質量精度質量分析計を用いた分析のための適切な緩衝溶液中に再懸濁される。質量分析計は、所定の閾値を超えるイオン信号が、ペプチドの衝突誘起解離（ＣＩＤ）スペクトルまたは高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）スペクトルを生成するためにＭＳからＭＳ／ＭＳモードに切り替えるように装置を自動的に始動させる、データ依存的取得モードで操作される。全てのＭＳ／ＭＳスペクトルを標準タンパク質データベースに対して検索する。
このようにして得られたペプチドを分析する。この分野で利用可能なこのような化合物を分析するための任意の方法を使用することができ、好ましい方法は質量分析法である。質量分析法の方法は、当業者に周知である（例えば、Ｙａｔｅｓ、Ｊ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔ．３３：１－１９（１９９８）；ＫｉｎｔｅｒおよびＳｈｅｒｍａｎ、タンデム質量分析法を用いたタンパク質配列決定および同定（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ Ｔａｎｄｅｍ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０００）；ＡｅｂｅｒｓｏｌｄおよびＧｏｏｄｌｅｔｔ、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１０１：２６９－２９５（２００１）を参照）。高分解能ポリペプチド断片分離のために、分離法としてキャピラリー逆相クロマトグラフィーを使用する液体クロマトグラフィーＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳまたは自動ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用することができる（Ｙａｔｅｓら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１２：５５３－５６９（１９９９））。好ましくは、動的除外を伴うデータ依存性衝突誘起解離（ＣＩＤ）または高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）が、選択される質量分析法として使用される（Ｇｏｏｄｌｅｔｔら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７２：１１１２－１１１８（２０００）））。このような分析のために、質量分析計は、典型的には、所定の閾値を超えるイオン信号が、ペプチドの衝突誘起解離（ＣＩＤ）スペクトルまたは高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）スペクトルを生成するためにＭＳからＭＳ／ＭＳモードに切り替えるように装置を自動的に始動させる、データ依存的取得モードで操作される。
タンパク質同定においては，標準アルゴリズム（ＳＥＱＵＥＳＴ、Ｍａｓｃｏｔ、Ｘ！ｔａｎｄｅｍ、MS Aandaなど）を使用して、全てのＭＳ／ＭＳスペクトルを標準タンパク質データベースに対して検索し、偽陽性タンパク質識別率を１％未満に制限するために典型的なフィルタリングを行う。
１つの実施形態において、試料中の膜タンパク質の濃度を対照試料と定量的に比較してもよい。これは、標的膜ンパク質受容体の特異的濃縮を検出可能にする。この非標識質量分析のために、質量分析の直前の逆相クロマトグラフィーを、質量／電荷比に対して保持時間の特徴をプロットしたＭＳ特徴マップとして表示することができる。質量分析計によって検出されるように、このようなマップ中のペプチドは、所定の時間にわたって明確な同位体パターンで現れ、試料中の存在量に応じて規定されたイオン電流強度で現れる。ペプチドが断片化およびＭＳ／ＭＳ分析によって同定されると、この情報をＭＳマップの特定のペプチドの特徴に割り当てることができ、MaxQuant（Coxら、Nature Biotechnology（２００８）ｖｏｌ．２６ ｐｐ．１３６７－１３７２頁）またはProteome Discoverer（Thermo Fischer scientific）のようなオープンソースまたは商用アルゴリズムを用いた半定量的データ解析と組み合わせることができる。次いで、ペプチド存在量の比率を得るために、異なる試料のＭＳ特徴マップ（例えば、試料対対照）を重ね合わせて比較することができる。膜タンパク質由来の確率論的に標識されたペプチドについては、これらの比は約１のはずであり、リガンドに基づいて特異的に捕捉される膜タンパク質ペプチドは、対照試料に比してより高い値を得る。
他の実施形態において、代わりの質量分析に基づく定量方法、例えば単一反応モニタリング（ＳＲＭ）、細胞培養物におけるアミノ酸による安定同位体標識（ＳＩＬＡＣ；例えば、Ｎｉｌｓｓｏｎら、Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ（２０１０）ｖｏｌ．７（９）ｐｐ．６８１－５頁）、質量スペクトルのデータ非依存的取得（ＳＷＡＴＨ ＭＳ；例えば、Ｇｉｌｌｅｔら、（Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｄａｔａ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＭＳ／ＭＳ Ｓｐｅｃｔｒａ Ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｂｙ Ｄａｔａ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ：Ａ Ｎｅｗ Ｃｏｎｃｅｐｔ ｆｏｒ Ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ ａｎｄ Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ）を参照）、タンデム質量タグ（ＴＭＴ；例えば、Ｄａｙｏｎら、（Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ Ｆｌｕｉｄｓ ｂｙ ＭＳ／ＭＳ ｕｓｉｎｇ ６－Ｐｌｅｘ Ｉｓｏｂａｒｉｃ Ｔａｇｓ）を参照）、などを使用することができる。
ＭＳ分析は、他の分析方法に置き換えることができると考えられる。このような他の方法は、本方法の一部として含まれる。
本発明のケミカルプローブを用いてプローブ構造の一部が付加されたペプチド配列を質量分析法によって同定することにより、標的タンパク質とリガンドの結合位置を決定することができる。これにより、リガンドとの結合位置を認識することができるため、標的タンパク質の同定をより正確なものにすることができる。さらに、標的タンパク質の検出力を高めたプローブをデザインすることができる。
本明細書において引用されるすべての特許文献および非特許文献の開示は、全体として本明細書に参照により組み込まれる。
本発明は、更に以下の試験例および製造例によって詳しく説明されるが、これらは本発明を限定するものではなく、また本発明の範囲を逸脱しない範囲で変化させてもよい。
本明細書において、以下の略語を用いることがある。
以下の実施例中の「室温」は、通常、約10℃～約35℃を示す。混合溶媒において示した比は、特に断らない限り容量比を示す。％は、特に断らない限り質量％を示す。
1HNMR（プロトン核磁気共鳴スペクトル）は、フーリエ変換型NMR（Bruker AVANCE III 400（400MHz）およびBruker AVANCE III HD（500MHz）の何れか）で測定し、テトラメチルシランを標準物質として用いて測定しスペクトル分裂パターンを一重項(ｓ)、二重項(ｄ)、三重項(ｔ)、四重項(ｑ)、多重項またはより重複したシグナル(ｍ)、幅広シグナル(ｂｒ)として記載し、溶媒を括弧内に示した。
またマススペクトルは、Waters社製ACQUITY H-Classと SQD Mass分光計を組み合わせて使用し、エレクトロスプレーイオン化法（ESI)にて測定した。高分解能質量分析（HRMS）はWaters社製 Xevo G2-XS QTof 分光計を用い，エレクトロスプレーイオン化法（ESI)にて測定した。[Ｍ＋Ｈ]＋はモノアイソトピック分子量を意味する。
実施例のシリカゲルカラムクロマトグラフィーには山善株式会社ハイフラッシュカラムもしくはバイオタージ社SNAP Ultra HP-Sphere 25 μmを使用した。 ODSカラムクロマトグラフィーには山善株式会社オクタデシルC18もしくはバイオタージ社SNAP Ultra C18を使用した。
試験例で用いた抗CD71抗体OKT9はThermo Fisher Scientific社製（Cat # 16-0719-85)、抗CD71抗体DF1513はAbcam社製（ab212863)、His-Tag EGFはオリエンタル酵母工業株式会社製（47061000)、Goat anti-mouse IgGはSouthernBiotech社製（Cat.1030-01）を使用した。
製造例１：化合物(CPI-003)の製造
下式に示す方法に従って、化合物（CPI-003）を製造した。
（1）化合物（CPI-002）の製造
N-(tert-ブトキシカルボニル)-4-アミノ酪酸 (0.24 g)、上記式に示す化合物(CPI-001) (0.31 g)、COMU (0.55 g)、およびDIPEA (0.44 ml)をDMF (2 mL)を溶解して室温で17時間撹拌したのち、反応液を濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN, 0.1%AcOH含有）で精製して、目的物（CPI-002）（0.45 g）を得た。 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ10.31(s, 1H), 8.08 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 7.89 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 6.86 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.47 (q, J = 7.0 Hz, 2H), 2.98 (q, J = 6.5 Hz, 2H), 2.36 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.71 (m, J = 7.2 Hz, 2H), 1.38 (t, J = 7.1 Hz, 12H) ;
HRMS (ESI) calcd for C19H27N6O5 419.2043 [M+H] +, found 419.2054.
（2）化合物（CPI-003）の製造
前記で合成したCPI-002(0.45 g)のMeOH (15 ml)溶液、0.2 M LiOH水溶液 (5.9 mL)を氷冷下添加し、30分間撹拌を行った。反応液にAcOH (0.30μL)を添加後、溶媒を除去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN, 0.1%AcOH含有）で精製して、目的物（0.45g）を得た。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 10.30 (s, 1H), 8.06 (d, J = 9.1 Hz, 2H), 7.89 (d, J = 9.1 Hz, 2H), 6.86 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 2.98 (q, J = 6.6 Hz, 2H), 2.36 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.71 (m, J = 7.2 Hz, 2H), 1.38 (s, 9H) ; HRMS (ESI) calcd for C17H23N6O5 391.1730 [M+H] +, found 391.1724.
製造例２：化合物(CPI-005)の製造
下式に示す方法に従って、化合物（CPI-005）を製造した。
ジメドン(63 mg) 、上記に示す化合物（CPI-004）(0.20 g)、WSC塩酸塩(82 mg)、DMAP(50 mg)、DMF(3 mL)の混合物を室温で14時間攪拌した後、反応液を濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN, 0.1%AcOH含有）で精製して、目的物（0.14 g）を得た。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 7.82 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 6.41 (br, 1H), 6.35 (br, 1H ), 4.30 (dd, J = 7.9, 5.0 Hz, 1H), 4.14－4.11 (m, 1H), 3.68 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 3.52－3.49 (m, 12H), 3.39 (t, J = 5.9 Hz, 2H), 3.23 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 3.18 (q, J = 5.7 Hz, 2H), 3.11－3.07 (m, 1H), 2.82 (dd, J = 12.5, 5.1 Hz, 1H), 2.63 (s, 2H), 2.57 (d, J = 12.5 Hz, 1H), 2.33 (s, 2H), 2.06 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.64－1.57 (m, 1H), 1.54－1.42 (m, 3H), 1.36－1.24 (m, 2H), 1.00 (s, 6H) ; HRMS (ESI) calcd for C29H48N3O9S 614.3111 [M+H] +, found 614.3112.
製造例３：化合物(CPI-104)の製造
下式に示す方法に従って、化合物（CPI-104）を製造した。
（1）化合物(CPI-102)の製造
上記に示す化合物（CPI-101）(0.21 g)、1-ブロモ-3-クロロプロパン(5.0 mL)、NMP(5 mL)の混合液をマイクロウェーブ反応装置を使用して、120℃にて6時間反応を行った。反応液に水を加え、AcOEtで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄後、Na2SO4で乾燥して溶媒を留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー (シリカゲル, ヘキサン/AcOEt)で精製し、中間体 (0.18 g)を得た。中間体 (0.18 g) 、フタルイミド (0.20 g), 炭酸カリウム (0.19 g)、ヨウ化ナトリウム (14 mg)のDMF (9 mL)懸濁液を70 ℃にて10時間撹拌した。溶媒を留去したのち水を加え、AcOEtで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄後、Na2SO4で乾燥して、溶媒を留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー (シリカゲル, ヘキサン/AcOEt)で精製し、化合物(0.24 g)を得た。得られた化合物(0.24 g)をDCM (9 mL)に溶解し、クロロアセチルクロリド(0.15 mL)およびトリエチルアミン (0.25 mL)を加えて室温にて2時間撹拌した。反応液に水を加え、DCMで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄後、Na2SO4で乾燥して、溶媒を留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー(シリカゲル, ヘキサン/AcOEt)で精製して目的物 (0.18 g）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.83-7.69 (m, 6H), 7.63-7.59 (m, 2H), 7.55 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.49-7.45 (m, 3H), 4.15-4.05 (m, 1H), 3.99 (d, J = 13.0 Hz, 1H), 3.87 (d, J = 13.0 Hz, 1H), 3.64 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 3.02-2.95 (m, 1H), 1.82-1.75 (m, 2H) ;
LC-MS: [M+H] + = 495.04.
（2）化合物(CPI-103)の製造
前記で合成した化合物（CPI-102）(0.18 g)をEtOH (5 mL)に溶解し、ヘキサメチレンテトラミン(0.10 g)およびAcONH4 (56 mg)を加えて、9時間加熱還流した。ヘキサメチレンテトラミン(51 mg)およびAcONH4 (28 mg)を追加し、9時間加熱還流した。反応液に水を加え、AcOEtで抽出して有機層を飽和食塩水で洗浄後、Na2SO4で乾燥して、溶媒を留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー (シリカゲル, ヘキサン/AcOEt)で精製して目的物(0.14 g)を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.83-7.79 (m, 2H), 7.73-7.68 (m, 2H), 7.67-7.64 (m, 2H), 7.50-7.40 (m, 4H), 7.31-7.29 (m, 2H), 4.80 (d, J = 10.6 Hz, 1H), 4.38 (dt, J = 14.4, 7.9 Hz, 1H), 3.74 (d, J = 10.6 Hz, 1H), 3.71-3.52 (m, 3H), 1.93 (tt, J = 7.2, 7.2 Hz, 2H) ;
LC-MS: [M+2H] 2+ = 458.08.
（3）化合物(CPI-104)の製造
前記で合成した化合物（CPI-103）(10 mg）のMeOH溶液 (0.5 mL)に、メチルアミン、40% MeOH溶液(22μL)を加え、室温にて2時間撹拌した。メチルアミン、40% MeOH溶液 (22μL)を追加し、室温にて2時間撹拌した。反応液に水を加え、AcOEtで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄後、Na2SO4で乾燥して、溶媒を留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー (ODS, 水/MeCN)で精製して目的物(1.6 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 7.66 (d, J = 1.4 Hz, 2H), 7.58-7.45 (m, 6H), 7.24 (t, J = 1.4 Hz, 1H), 4.64 (d, J = 10.6 Hz, 1H), 4.53-4.43 (m, 1H), 3.86 (d, J = 10.7 Hz, 1H), 3.82-3.76 (m, 1H), 2.46-2.43 (m, 2H), 1.73-1.53 (m, 2H) ; LC-MS: [M+H] + = 328.17.
製造例４：化合物(CPP-112)の製造
下式に示す方法に従って、化合物（CPP-112）を製造した。
上記式に示す化合物（CPP-111）(0.44 g)、 塩酸ヒドロキシルアミン(0.18 g)、ピリジン(1.0 ml)、EtOH(20 mL)の混合物を、2時間加熱還流した。溶媒を留去し、残渣を2M塩酸で酸性にして、DCMで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄後、Na2SO4で乾燥した。溶媒を留去して、無色油状の粗生成物 (0.51 g)を得た。DMAP(0.26 g)のDCM(15 mL)溶液に氷冷下、塩化チオニル(0.31 ml)を加え、30分撹拌した。氷冷下、前工程で得られた粗生成物(0.51 g)のDCM溶液(5 mL)とDMAP(0.39 g)を加え、室温に昇温して3日間撹拌した。反応液に水を加え、DCMで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄後、Na2SO4で乾燥して溶媒を留去した。カラムクロマトグラフィー(シリカゲル, ヘキサン/AcOEt)で精製して目的物 (0.30 g)を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ 7.94-7.89 (m, 1H), 7.87 (s, 1H), 7.42-7.37 (m, 2H), 3.92 (s, 3H), 2.84 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 2.34 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 2.02 (tt, J = 7.3, 7.3 Hz, 2H) ;
LC-MS: [M+H] + = 204.02.
製造例５：化合物（ＣＰＰ－１１７）の製造
下式に示す方法に従って、化合物（ＣＰＰ－１１７）を製造した。
（1）CPP-114の製造
上記式に示す化合物（CPP-113）(100 mg)、THF (3 mL)の混合物に-78℃にて1.6M n-ブチルリチウム、n-ヘキサン溶液(0.53 mL)を加えて1時間撹拌した。製造例４で製造した化合物（CPP-112）(84 mg)のTHF溶液(2 mL)を加え、－78℃にて5時間撹拌した。3時間かけて室温に昇温し、室温にて13時間撹拌した。反応液に水を加え、AcOEtで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄後、Na2SO4で乾燥して、溶媒を留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー(シリカゲル, ヘキサン/AcOEt)で精製して目的物 (48 mg)を得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.66-7.36 (m, 6H), 7.31-7.13 (brm, 1H), 3.14-2.92 (brm, 3H), 2.90-2.77 (brs, 2H), 2.34 (t, J = 6.9 Hz, 2H), 2.00 (tt, J = 6.9, 6.9 Hz, 2H), 1.26 (s, 9H) ;
LC-MS: [M+Na] + = 434.94.
（2）CPP-115の製造
前記で製造した化合物（CPP-114）(48 mg)のDCM(2mL)溶液に、TFA(0.45ml)を加え、室温にて2時間撹拌し、溶媒を留去した。残渣をDCM(2 mL)で希釈し、TEA(49μL)、クロロアセチルクロリド(28μL)を加えて、室温にて3時間撹拌した。反応液に水を加え、AcOEtで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄後、Na2SO4で乾燥して、溶媒を留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー(シリカゲル, ヘキサン/AcOEt)で精製した。精製物(38 mg)、ヘキサメチレンテトラミン (33 mg)、AcONH4 (18 mg)、EtOH(2 mL)の混合物を、6時間加熱還流した。溶媒を留去し、カラムクロマトグラフィー(シリカゲル, ヘキサン/AcOEt)で精製して目的物 (28 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.53 (dd, J = 8.8, 2.5 Hz, 1H), 7.50 (s, 1H), 7.41-7.30 (m, 4H), 7.27 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 4.84 (d, J = 10.8 Hz, 1H), 3.77 (d, J = 10.8 Hz, 1H), 3.40 (s, 3H), 2.88-2.77 (m, 2H), 2.36 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 2.05-1.97 (m, 2H) ;
LC-MS: [M+H] + = 352.08.
（3）CPP-116の製造
前記で製造した化合物（CPP-115）(28 mg)、30%過酸化水素水(0.16 mL)、 K2CO3(11 mg)、DMSO(1 mL)の混合物を、室温にて2時間撹拌した。チオ硫酸ナトリウム水溶液を加えて撹拌した後、AcOEtで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄後、Na2SO4で乾燥して、溶媒を留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー (シリカゲル, AcOEt/MeOH)で精製して目的物 (28 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.52 (dd, J = 8.8, 2.5 Hz, 1H), 7.50-7.46 (brm, 1H), 7.37-7.28 (m, 5H), 5.60-5.18 (brm, 2H), 4.82 (d, J = 10.8 Hz, 1H), 3.77 (d, J = 10.8 Hz, 1H), 3.40 (s, 3H), 2.79-2.65 (m, 2H), 2.23 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.08-1.91 (m, 2H) ;
LC-MS: [M+H] + = 370.00.
（4）CPP-117の製造
前記で製造した化合物（CPP-116）(28 mg)、四酢酸鉛(40 mg)、t-BuOH (0.72 mL)の混合物を、80℃にて3時間撹拌した。四酢酸鉛(40 mg)を追加し、80℃にて3時間撹拌後、水/AcOEtを加えてセライトろ過した。ろ液をAcOEtで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄後、Na2SO4で乾燥して、溶媒を留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー(シリカゲル, ヘキサン/AcOEt)で精製して目的物 (19 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.53-7.49 (m, 2H), 7.33-7.28 (m, 5H), 4.83 (d, J = 10.8 Hz, 1H), 4.62-4.47 (brs, 1H), 3.77 (d, J = 10.8 Hz, 1H), 3.40 (s, 3H), 3.22-3.10 (brm, 2H), 2.68 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 1.82 (tt, J = 7.6, 7.6 Hz, 2H), 1.44 (s, 9H) ;
LC-MS: [M+H] + = 442.11.
製造例６：化合物(CPP-124)の製造
下式に示す方法に従って、化合物（CPP-124）を製造した。
（1）化合物（CPP-122）の製造
前記式に示す化合物（CPP-121）(0.51 g)、60%NaH(72 mg)、DMF(50 mL)の混合物を、室温にて30分撹拌した。反応液に1-ブロモ-3-クロロプロパン(0.18 mL)を加え、室温にて60時間撹拌した。反応液に水を加えた後、濃縮した。残渣にAcOEtを加え、水で洗浄後、Na2SO4で乾燥して、溶媒を留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー(シリカゲル, AcOEt/MeOH)で精製して、目的物（0.45 g）を得た。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.61 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 7.55 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.42 (d, J = 5.5 Hz, 1H), 7.38 (d, J = 5.5 Hz, 1H), 7.27 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 7.09 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 6.99 (dd, J = 8.3, 2.7 Hz, 1H), 6.90 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 4.11 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 3.70 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 3.63 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 3.59 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 3.20 (br, 4H), 2.94 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 2.73 (br, 4H), 2.64 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 2.15 (m, J = 6.7 Hz, 2H), 2.04 (m, J = 6.5 Hz, 2H) ; HRMS (ESI) calcd for C27H33N3O2S 498.1982 [M+H] +, found 498.1979.
（2）化合物（CPP-123）の製造
前記で製造した化合物（CPP-122）（0.45 g）、フタルイミド(0.16 mg)、 K2CO3(0.15 g)、およびNaI(41 mg)のDMF(10 mL)懸濁液を、70℃にて17時間撹拌した。反応液を濃縮し、残渣に水を加えた後、EtOAcで抽出し、有機層をNa2SO4で乾燥して、溶媒を留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー(シリカゲル, AcOEt/MeOH)で精製して、目的物（0.43 g）を得た。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.84 (d, J = 3.0 Hz, 1H) 7.83 (d, J = 3.0 Hz, 1H), 7.60 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 7.54 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.41 (dd, J = 5.5, 0.6 Hz, 1H), 7.38 (d, J = 5.5 Hz, 1H), 7.27 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 7.09 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 6.98 (dd, J = 8.3, 2.8 Hz, 1H), 6.90 (dd, J = 7.7, 0.6 Hz, 1H), 4.10 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 3.77 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 3.66 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 3.57 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 3.20 (br, 4H), 2.96 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 2.75 (br, 4H), 2.65 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.07－ 2.01 (m, 4H) ;
HRMS (ESI) calcd for C35H37N4O4S 609.2535 [M+H] +, found 609.2538.
（3）化合物（CPP-124）の製造
前記で製造した化合物（CPP-123（0.43 g））、ヒドラジン一水和物(0.069 mL)、EtOH(12 mL)の混合物を、8時間加熱還流した。反応液を濃縮し、残渣に1M NaOH水溶液（50 mL）を加えた後、AcOEtで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄後、Na2SO4で乾燥して、溶媒を留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー (シリカゲル, DCM/MeOH)で精製した。精製物をMeOH (10 mL)に溶解し、2M HCl 水溶液(2.1 mL)を滴下して、室温にて15時間撹拌後、溶媒を留去した。残渣にAcOEtを加え、撹拌した後、生じた固体をろ取して、目的物（0.35 g）を得た。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 11.4 (br, 1H), 7.98 (br, 3H), 7.78 (d, J = 5.5 Hz, 1H), 7.71 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.50 (d, J = 5.5 Hz, 1H), 7.43 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 7.33 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 7.26 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.10 (dd, J = 8.3 , 2.7 Hz, 1H), 6.98 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 4.13 (t, J = 5.9 Hz, 2H), 3.66 (br, 2H), 3.57－3.53 (m, 6H), 3.37 (br, under the water signal), 3.27 (t, J = 11.9 Hz, 2H), 2.92 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.82－2.76 (m, 2H), 2.30－2.25 (m, 2H), 1.88 (m, J = 7.3 Hz, 2H) ;
HRMS (ESI) calcd for C27H35N4O2S 479.2481 [M+H] +, found 479.2482.
製造例７：化合物(CPP-125)の製造
下式に示す方法に従って、化合物（CPP-125）を製造した。
製造例６で製造した化合物（CPP-124）(20 mg), Boc-5-アミノ-n-吉草酸 (7.9 mg), COMU (17 mg) 、DIPEA (27μL)、DMF (1 ml)の混合物を，室温で5時間攪拌し、反応液を濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN, 0.1%AcOH含有）で精製して、目的物（15 mg）を得た。
1H NMR (500 MH, DMSO-d6) δ 7.78 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 7.69 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 7.61 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.40 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 7.39 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 7.27 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 7.20 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.05 (dd, J = 8.3, 2.6 Hz, 1H), 6.90 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 6.77 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 4.06 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 3.50 (t, J = 7.0 Hz, under the water signal), 3.46 (t, J = 6.6 Hz, under the water signal), 3.08－3.03 (m, 6H), 2.91－2.87 (m, 4H), 2.64 (br, 4H), 2.54 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 2.04 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 1.93 (m, J = 6.7 Hz, 2H), 1.82 (s, 3H), 1.67 (m, J = 7.0 Hz, 2H), 1.46 (m, J = 7.5 Hz, 2H), 1.36－1.31 (m, 11H) ;HRMS (ESI) calcd for C37H52N5O5S 678.3689 [M+H] +, found 678.3693.
製造例８：化合物(CPF-202)の製造
下式に示す方法に従って、化合物（CPF-202）を製造した。
（1）CPF-201の製造
製造例３で製造した化合物（CPI-104）(9.0 mg)、製造例１で製造した化合物（CPI-003）(11 mg) 、COMU (13 mg)、DIPEA(11μL)、DMF(1 mL)の混合物を、室温にて2時間撹拌した。溶媒を留去し、カラムクロマトグラフィー(ODS, 水/MeCN, 0.1% AcOH含有)で精製して、目的物 (10 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.57 (s, 1H), 8.13 (dt, J = 9.1, 2.4 Hz, 2H), 7.87 (d, J = 8.9 Hz, 2H), 7.64-7.59 (m, 3H), 7.54-7.47 (m, 2H), 7.45-7.39 (m, 3H), 7.30 (d, J = 2.4 Hz), 4.88-4.83 (m, 2H), 4.54-4.47 (m, 1H), 3.81-3.71 (m, 2H), 3.64-3.56 (m, 1H), 3.29 (dt, J = 6.1, 6.1 Hz, 2H), 3.11-3.03 (m, 1H), 2.44-2.41 (m, 2H), 2.00-1.86 (m, 3H), 1.77-1.65 (m, 1H), 1.50 (s, 9H) ; LC-MS: [M+H] + = 700.29.
（2）CPF-202の製造
前記で製造した化合物（CPF-201）(10 mg)、TFA(0.11 mL)、DCM(1 mL)の混合物を室温で2時間撹拌した後、溶媒を留去した。残渣、製造例２で製造した化合物（CPI-005） (10 mg) 、DIPEA (10μL)、及びDMF (1 mL)の混合物を、60 ℃にて3時間撹拌した後、溶媒を留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー(ODS, 水/MeCN)で精製して、目的物 (11 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 13.69-13.66 (m, 1H), 9.41 (s, 1H), 8.09 (dt, J = 9.0, 2.4 Hz, 2H), 7.88-7.86 (m, 3H), 7.61-7.59 (m, 2H), 7.54-7.48 (m, 2H), 7.45-7.39 (m, 3H), 7.30 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 6.44-6.39 (m, 1H), 5.61-5.58 (m, 1H), 4.85 (d, J = 10.5 Hz, 1H), 4.68 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 4.53-4.46 (m, 2H), 4.35-4.32 (m, 1H), 3.81-3.48 (m, 20H), 3.37-3.29 (m, 4H), 3.17-3.05 (m, 2H), 2.95-2.90 (m, 1H), 2.72 (dd, J = 12.8, 4.0 Hz, 1H), 2.57 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 2.34 (s, 4H), 2.14 (dd, J = 7.1, 7.1 Hz, 4H), 1.99-1.91 (m, 1H), 1.77-1.52 (m, 6H), 1.47-1.41 (m, 2H), 1.00 (s, 6H) ;
LC-MS: [M+H] + = 1195.3.
製造例９：化合物（ＣＰＦ－２１２）の製造
（1）CPF-211の製造
製造例５で製造した化合物（CPP-117）(19 mg)のDCM(1 mL)溶液にTFA(0.17 mL)を滴下し、室温にて2時間撹拌した後、溶媒を留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー(ODS, 水/MeCN)で精製して、中間体化合物 (13 mg)を得た。中間体化合物(13 mg)および製造例１で製造した化合物（CPI-003）(16.78 mg)をDMF(1 mL)に溶解し、COMU(18 mg)、およびDIPEA(0.23 mL)を加えて、室温にて3時間撹拌した後、溶媒を留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー(ODS, 水/MeCN)で精製して，目的物 (18 mg)を得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.62 (s, 1H), 8.14 (dt, J = 9.1, 2.4 Hz, 2H), 7.90-7.87 (m, 2H), 7.53-7.50 (m, 2H), 7.38-7.33 (m, 3H), 7.30 (dd, J = 5.6, 3.1 Hz, 2H), 7.26-7.22 (m, 1H), 4.84-4.82 (m, 2H), 3.77 (d, J = 10.8 Hz, 1H), 3.60 (dt, J = 6.8, 6.8 Hz, 2H), 3.40 (s, 3H), 3.29 (dt, J = 6.1, 6.1 Hz, 2H), 2.79 (t, J = 7.7 Hz, 2H), 2.44-2.41 (m, 2H), 2.07-2.00 (m, 2H), 1.92-1.86 (m, 2H), 1.50 (s, 9H) ;
LC-MS: [M+H] + = 714.08.
（2）CPF-212の製造
前記で製造した化合物(CPF-211)(18 mg)のDCM(1 mL)溶液にTFA(97μL)を滴下して室温にて1.5時間撹拌した後、溶媒を留去した。残渣および製造例２で製造した化合物（CPI-005）(22 mg)のDMF(1 mL)溶液に、DIPEA(18μL)を加えて、60℃にて3時間撹拌した。DIPEA(18μL)を追加し、60℃にてさらに3時間撹拌した後、溶媒を留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー(ODS, 水/MeCN)で精製して、目的物 (13 mg)を得た。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.53 (t, J = 5.1 Hz, 1H), 10.37 (s, 1H), 9.19 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 8.06 (dt, J = 9.1, 2.3 Hz, 2H), 7.89 (dt, J = 9.1, 2.3 Hz, 2H), 7.81 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 7.70 (dd, J = 8.9, 2.5 Hz, 1H), 7.60 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 7.49 (s, 1H), 7.42-7.36 (m, 2H), 7.30 (dt, J = 7.4, 1.6 Hz, 1H), 7.22 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 6.40 (s, 1H), 6.35 (s, 1H), 4.57 (d, J = 10.7 Hz, 1H), 4.31-4.28 (m, 1H), 4.13-4.10 (m, 1H), 3.78 (d, J = 10.7 Hz, 1H), 3.63-3.58 (m, 3H), 3.47-3.46 (m, 9H), 3.38-3.05 (m, under the water signal), 2.80 (dd, J = 12.4, 5.1 Hz, 1H), 2.71-2.66 (m, 3H), 2.58-2.49 (m, overlapped with the DMSO signal), 2.28 (s, 4H), 2.05 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.97-1.84 (m, 4H), 1.64-1.55 (m, 1H), 1.52-1.40 (m, 3H), 1.32-1.24 (m, 2H), 0.94 (s, 6H) ; LC-MS: [M+H] + = 1209.12.
製造例１０：化合物(CPF-224)の製造
下式に示す方法に従って、化合物（CPF-224）を製造した。
（1）化合物（CPF-222）の製造
製造例１で製造した化合物（CPI-003, 20 mg）および上記式で示した化合物（CPF-221, 23 mg）をDMF（2 mL）に溶解し、COMU(24 mg)およびDIPEA (0.020 mL)を加えて1時間攪拌した後、溶媒を留去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN, 0.1%AcOH含有）で精製して目的物（33 mg）を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.46 (br, 1H), 10.30 (s, 1H), 9.43 (t, J = 6.1 Hz, 1H), 8.06 (d, J = 9.2 Hz, 2H), 7.89 (d, J = 9.1 Hz, 2H), 7.60 (s, 1H), 7.52 (br, 1H), 6.88－6.83 (m, 3H), 6.28 (dd, J = 2.9, 1.7 Hz, 1H), 5.00 (s, 2H), 4.41 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 4.13 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 2.98 (q, J = 6.6 Hz, 2H), 2.36 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 1.71 (m, J = 7.3 Hz, 2H), 1.38 (s, 9H), 1.17 (t, J = 7.1 Hz, 3H) ;
LC-MS: [M+H] + = 783.31.
（2）化合物（CPF-223）の製造
前記で合成した化合物（CPF-222）(33 mg)のMeOH(2 ml)溶液に、1M LiOH水溶液 (0.13 mL)、水(0.36 mL) を加え，21時間撹拌を行った。0.1% AcOH水溶液で反応液を中和し、溶液を濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN, 0.1%AcOH含有）で精製して目的物（30 mg）を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.46 (s, 1H), 10.30 (s, 1H), 9.43 (t, J = 5.9 Hz, 1H), 8.06 (d, J = 9.1 Hz, 2H), 7.88 (d, J = 9.1 Hz, 2H), 7.61 (s, 1H), 7.47 (br, 1H), 6.90－6.83 (m, 3H), 6.28 (dd, J = 2.9, 1.7 Hz, 1H), 4.92 (s, 2H), 4.41 (d, J = 5.9 Hz, 2H), 2.98 (q, J = 6.5 Hz, 2H), 2.36 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.71 (m, J = 7.2 Hz, 2H), 1.38 (s, 9H) ;
LC-MS: [M+H] + = 754.99.
（3）化合物（CPF-224）の製造
前記で合成した化合物（CPF-223）(29 mg)をDCM (3 ml)に溶解し、TFA(0.29 mL)を滴下して室温で2時間攪拌した後、溶液を濃縮した。残渣にDIPEA (27μL)、製造例２で製造した化合物（CBI-455）(39 mg)、DMF(2 mL)を加え、60℃で5時間撹拌した後、反応液を濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN, 0.1%TFA含有）にて精製して、目的物（17 mg）を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.53 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 12.47 (s, 1H), 10.38 (s, 1H), 9.44 (t, J = 6.2 Hz, 1H), 8.07 (d, J = 9.1 Hz, 2H), 7.89 (d, J = 9.1 Hz, 2H), 7.82 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 7.61 (s, 1H), 7.49 (br, 1H), 6.90 (br, 1H), 6.84 (t, J = 2.4 Hz, 1H), 6.41 (br, 1H), 6.35 (br, 1H), 6.28 (dd, J = 2.8, 1.7 Hz, 1H), 4.95 (s, 2H), 4.41 (d, J = 5.9 Hz, 2H), 4.30 (dd, J = 7.8, 4.4 Hz, 1H), 4.12 (dd, J = 7.6, 4.4 Hz, 1H), 3.61 (t, J = 6.3 Hz, 4H), 3.49－3.46 (m, under the water signal), 3.30 －3.25 (m, 4H), 3.17 (q, J = 5.7 Hz, 2H), 3.10－3.06 (m, 1H), 2.81 (dd, J = 12.5, 5.1 Hz, 1H), 2.57 (d, J = 12.5 Hz, 1H), 2.47 (t, overlapped with the DMSO signal), 2.28 (s, 4H), 2.05 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.93 (m, J = 6.9 Hz, 2H), 1.60－1.55 (m, 1H), 1.53－1.40 (m, 3H), 1.33－1.23 (m, 2H)), 0.94 (s, 6H) ;
HRMS (ESI) calcd for C57H71N13O14F3S 1250.4916 [M+H] +, found 1250.4919..
製造例１１：化合物(CPF-232)の製造
下式に示す方法に従って、化合物（CPF-232）を製造した。
（1）化合物（CPF-231）の製造
製造例６で製造した化合物（CPP-124，40 mg）および製造例１で製造した化合物（CPI-003, 26 mg）をDMF(2 ml)で希釈し、HATU (26 mg) およびDIPEA (0.036 ml)を加えて5時間撹拌した後、反応液を濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN, 0.1%TFA含有）で精製して、目的物（50 mg）を得た。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 11.96 (br, 1H), 10.30 (s, 1H), 9.16 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 8.06 (d, J = 9.1 Hz, 2H), 7.89 (d, J = 9.1 Hz, 2H), 7.74 (d, J = 5.1 Hz, 1H), 7.67 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 7.46 (d, J = 4.1 Hz, 1H), 7.43 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 7.30 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 7.23 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.07 (dd, J = 8.3, 2.7 Hz, 1H), 6.95 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 6.86 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 4.10 (t, J = 5.4 Hz, 2H), 3.62－3.51 (m, 6H), 3.38－3.35 (m, under the water signal), 3.10 (br, 2H), 2.98 (q, J = 6.5 Hz, 2H), 2.92 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.36 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.08 (br, 2H), 1.91 (s, 3H), 1.86 (m, J = 7.0 Hz, 2H), 1.72 (m, J = 7.2 Hz, 2H) ; LC-MS: [M+H] + = 609.52
（2）化合物（CPF-232）の製造
前記で製造した化合物（CPF-231）(19 mg)をDCM (2 mL) に溶解し、TFA(0.16 mL)を滴下して室温で1時間撹拌した後、反応液を濃縮した。残渣に製造例２で製造した化合物(CPI-005(15 mg))、DIPEA(17μL)、およびDMF(2 ml)を加え、60℃で2時間撹拌した後、反応液を濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィーODS，水/MeCN, 0.1%TFA含有）で精製して（8.7 mg）を得た。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 13.53 (t, J = 5.3 Hz, 1H), 10.38 (s, 1H), 9.51 (br, 1H ), 9.17 (t, J = 5.9 Hz, 1H), 8.06 (d, J = 9.1 Hz, 2H), 7.89 (d, J = 9.1 Hz, 2H), 7.81 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 7.78 (d, J = 5.5 Hz, 1H), 7.72 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.51 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 7.45 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 7.33 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 7.25 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.08 (dd, J = 8.3, 2.7 Hz, 1H), 6.99 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 6.41 (br, 1H), 6.36 (br, 1H ), 4.29 (dd, J = 7.8, 4.9 Hz, 1H), 4.14－4.10 (m, 3H), 3.70 (br, 2H), 3.62－3.55 (m, under the water signal), 3.41－3.34 (m, under the water signal), 3.27 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 3.16 (q, J = 5.8 Hz, 2H), 3.10－3.06 (m, 3H), 2.92 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 2.80 (dd, J = 12.3, 5.1 Hz, 1H), 2.57 (d, J = 12.4 Hz, 1H), 2.28 (s, 4H), 2.22－2.17 (m, 2H), 2.05 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.93 (m, J = 7.1 Hz, 2H), 1.86 (m, J = 6.8 Hz, 2H), 1.63－1.56 (m, 1H), 1.51－1.40 (m, 3H), 1.33－1.22 (m, 2H), 0.94 (s, 6H) ; HRMS (ESI) calcd for C68H92N13O12S2 1346.6429 [M+H] +, found 1346.6445.
製造例１２：化合物(CPP-127)の製造
下式に示す方法に従って、化合物（CPP-127）を製造した。
（1）化合物(CPP-126)の製造
製造例７で製造した化合物（CPP-125, 15 mg）をDCM (3 mL)に溶解し、TFA (0.15μL)、を滴下して室温で2時間撹拌後、反応液を濃縮した。残渣を製造例１で製造した化合物(CPI-003(9.1 mg))、DMF(2 ml)で希釈し、COMU(9.35 mg)、およびDIPEA (15μL) を加え、1時間室温にて撹拌した後、反応液を濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN, 0.1%AcOH含有）で精製して、目的物（16 mg）を得た。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 11.94 (br, 1H), 10.29 (s, 1H), 9.14 (t, J = 5.9 Hz, 1H), 8.04 (d, J = 9.1 Hz, 2H), 7.87 (d, J = 9.1 Hz, 2H), 7.81 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 7.69 (br, 1H), 7.61 (br, 1H ), 7.41－7.38 (m, 2H), 7.28 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 7.19 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.04 (dd, J = 8.5, 2.7 Hz, 1H), 6.90 (br, 1H), 6.86 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 4.05 (br, 2H), 3.50 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 3.46 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 3.09－3.04 (m, 6H), 2.98 (q, J = 6.5 Hz, 2H), 2.87 (ｔ, J = 6.7 Hz, 2H), 2.64（br，4H），2.36 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.10 (br, 2H), 1.94 (br, 2H), 1.91 (s, 3H), 1.71 (m, J = 7.2 Hz, 2H), 1.67 (m, J = 7.0 Hz, 2H), 1.55 (br, 4H), 1.37 (s, 9H) ;
HRMS (ESI) calcd for C49H64N11O7S 950.4711 [M+H] +, found 950.4713.
（2）化合物(CPP-127)の製造
前記で製造した化合物（CPP-126）(14 mg)をDCM (5 ml)に溶解し、TFA(0.23 mL)を滴下して室温で12時間撹拌した後、反応液を濃縮した。残渣に製造例２で製造した化合物(CPI-005(9.2 mg))、DIPEA (12μL)、DMF (2 mL)を加え、60℃で2時間撹拌した後、反応液を濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN, 0.1%TFA含有）で精製して、目的物（13 mg）を得た。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 13.53 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 10.38 (s, 1H), 9.63 (br, 1H), 9.15 (t, J = 5.9 Hz, 1H), 8.05 (d, J = 9.1 Hz, 2H), 7.88 (d, J = 9.1 Hz, 2H), 7.84－7.81 (m, 2H), 7.78 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 7.72 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.51 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 7.43 (d, J = 2.8 Hz, 1H), 7.33 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 7.22 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.06 (dd, J = 8.4, 2.8 Hz, 1H), 6.99 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 6.41 (br, 1H), 6.36 (br, 1H), 4.29 (dd, J = 7.9, 4.9 Hz, 1H), 4.13－4.10 (m, under the water signal), 3.70 (br, 2H), 3.62－3.58 (m, 6H), 3.52－3.49 (m, 4H), 3.47－3.46 (m, 12H), 3.41 (br, 4H), 3.37 (t, J = 5.9 Hz, 2H), 3.32 (br, 2H), 3.27 (t, J = 6.1 Hz, 2H), 3.17 (q, J = 5.8 Hz, 2H), 3.11－3.04 (m, 5H), 2.88 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.81 (dd, J = 12.4, 5.1 Hz, 1H), 2.57 (d, J = 12.3 Hz, 1H), 2.48 (d, overlapped with the DMSO signal), 2.28 (s, 4H), 2.22－2.17 (m, 2H), 2.11 (br, 2H), 2.05 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 1.93 (m, J = 7.0 Hz, 2H), 1.68 (m, J = 6.9 Hz, 2H), 1.62－1.41 (m, 8H), 1.33－1.23 (m, 2H), 0.94 (s, 6H) ; HRMS (ESI) calcd for C73H101N14O13S2 1445.7114 [M+H] +, found 1445.7126.
製造例１３：化合物(CPP-133)の製造
下式に示す方法に従って、化合物（CPP-133）を製造した。
（1）CPP-132の製造
化合物（CPP-131）(15 mg)および製造例１で製造した化合物（CPI-003）(16 mg) をDMF溶液(1 mL)に溶解し、COMU(19 mg)およびDIPEA(15μL)を加えて、室温にて20時間撹拌した後、溶媒を留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー (ODS, 水/MeCN)で精製し、目的物(22 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.30 (s, 1H), 9.11 (s, 1H), 8.10 (dt, J = 9.1, 2.4 Hz, 2H), 7.85 (d, J = 9.1 Hz, 2H), 7.31-7.25 (m, 2H), 7.05 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.01 (td, J = 7.5, 0.9 Hz, 1H), 6.86 (dd, J = 7.7, 0.7 Hz, 1H), 6.82 (dd, J = 8.3, 2.4 Hz, 1H), 6.65 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 5.21 (s, 1H), 4.87-4.78 (brm, 1H), 3.70 (dt, J = 5.6, 5.6 Hz, 2H), 3.66-3.50 (brs, 4H), 3.28 (dt, J = 6.0, 6.0 Hz, 2H), 2.67-2.64 (m, 6H), 2.43-2.40 (m, 2H), 1.93-1.84 (m, 4H), 1.48 (s, 9H); LC-MS: [M+H] + = 742.29.
（2）CPP-133の製造
上記で製造した化合物（CPP-132）(22 mg)をDCM(1 mL)に希釈し、TFA(0.11 mL)を滴下して室温にて20時間撹拌した後、溶媒を留去した。残渣に製造例２で製造した化合物（CPI-005）(18 mg)、DIPEA (21μL)およびDMF(1.5 mL)を加え、60℃にて3時間撹拌した。DIPEA(26μL)を追加し、60℃にてさらに1時間撹拌した。溶媒を留去し、残渣をカラムクロマトグラフィー(ODS, 水/MeCN, 0.1% AcOHを含む)で精製して目的物 (16 mg)を得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 13.73-13.66 (brm, 1H), 9.28-9.16 (brm, 2H), 8.06 (dt, J = 9.1, 2.4 Hz, 2H), 7.86 (d, J = 9.1 Hz, 2H), 7.31-7.26 (m, 2H), 7.04 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.00 (td, J = 7.5, 0.9 Hz, 1H), 6.87 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 6.81 (dd, J = 8.3, 2.4 Hz, 1H), 6.68 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 6.49-6.39 (brs, 1H), 5.58 (s, 1H), 5.39 (s, 1H), 4.65 (s, 1H), 4.52-4.49 (m, 1H), 4.34-4.31 (m, 1H), 3.77 (t, J = 11.4 Hz, 2H), 3.72-3.48 (m, 23H), 3.38-3.28 (m, 4H), 3.16-3.12 (m, 1H), 2.92 (dd, J = 12.9, 5.0 Hz, 1H), 2.72-2.54 (m, 8H), 2.35 (s, 4H), 2.19-2.09 (m, 4H), 1.90-1.82 (m, 2H), 1.73-1.41 (m, 6H), 1.01 (s, 6H); LC-MS: [M+H] + = 1237.14.
製造例１４：化合物（ＣＰＡ－３０２）の製造
下式に示す方法に従って、化合物（ＣＰＡ－３０２）を製造した。
（1）CPA-301の製造
3-[2-[2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオン酸 (22 mg)およびアリルアルコール (78μL)の混合物に塩化チオニル(0.17 mL)を加え、室温にて1時間撹拌した。水を加えたのちに減圧濃縮した。残渣および製造例１で製造した化合物（CPI-003）(30 mg)をDMF（2 mL)に溶解しDIPEA (40μL)およびCOMU (36 mg)を加え、室温にて3時間撹拌した後、溶媒を留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー(ODS, 水/MeCN)で精製して、目的物(37 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.60 (s, 1H), 8.14 (dt, J = 9.0, 2.5 Hz, 2H), 7.88 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 7.71 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 5.95-5.86 (m, 1H), 5.31 (ddt, J = 17.2, 1.4, 1.4 Hz, 1H), 5.22 (ddt, J = 10.4, 1.4, 1.4 Hz, 1H), 4.86-4.82 (m, 1H), 4.59 (dt, J = 5.6, 1.4 Hz, 2H), 3.78-3.60 (m, 18H), 3.32-3.27 (m, 2H), 2.63 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.44-2.41 (m, 2H), 1.92-1.86 (m, 2H), 1.50 (s, 9H); LC-MS: [M+H] + = 678.27.
（2）CPA-302の製造
上記で製造した化合物（CPA-301）(36 mg)、モルホリン(9.3μL)、Pd(PPh3)4 (3.1 mg)およびTHF(1 mL)の混合物を室温にて6時間撹拌した。モルホリン (4.6μL)および Pd(PPh3)4(3.1 mg)を追加し、室温にて1時間撹拌した後、溶媒を留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー (ODS, 水/MeCN)で精製して、目的物 (27 mg)を得た。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.54 (s, 1H), 9.09 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 8.05 (dt, J = 9.2, 2.4 Hz, 2H), 7.91 (dt, J = 9.2, 2.3 Hz, 2H), 6.91 (t, J = 5.2 Hz, 1H), 3.60-3.42 (m, 18H), 2.98 (dt, J = 6.4, 6.4 Hz, 2H), 2.66 (t, J = 6.4 Hz, 1H), 2.37 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.29 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 1.71 (tt, J = 6.4, 6.4 Hz, 2H), 1.37 (s, 9H);
LC-MS: [M+H] + = 638.23.
製造例１５：化合物（ＣＰＡ－３０６）の製造
下式に示す方法に従って、化合物（ＣＰＡ－３０６）を製造した。
（1）CPA-303の製造
3-[2-[2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロピオン酸(11 mg)、塩化チオニル(8.8μL)、アリルアルコール(35μL)の混合物を室温にて1時間撹拌した。水を加た後、減圧濃縮した。残渣と製造例１４で製造した化合物（CPA-302）(22 mg)をDMF(1 mL)に溶解し、COMU(16 mg)およびDIPEA(18 μL)を加え、室温にて5時間撹拌した後、溶媒を留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー(ODS, 水/MeCN)で精製して、目的化合物 (17 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.63 (s, 1H), 8.13 (dt, J = 9.0, 2.3 Hz, 2H), 7.89 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 7.78 (t, J = 5.3 Hz, 1H), 6.72 (s, 1H), 5.96-5.86 (m, 1H), 5.31 (ddt, J = 17.2, 1.4, 1.4 Hz, 1H), 5.23 (ddt, J = 10.4, 1.4 , 1.4 Hz, 1H), 4.89 (s, 1H), 4.59 (dt, J = 5.7, 1.4 Hz, 2H), 3.78-3.60 (m, 32H), 3.54 (t, J = 5.3 Hz, 2H), 3.43 (dt, J = 5.3, 5.3 Hz, 2H), 3.28 (dt, J = 5.9 Hz, 2H), 2.62 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.48-2.42 (m, 4H), 1.93-1.87 (m, 2H), 1.49 (s, 9H) ; LC-MS: [M+H] + = 925.27.
（2）CPA-304の製造
上記で製造した化合物（CPA-303）(17 mg)をDCM(1 mL)に溶解し、TFA(0.14 mL)を滴下して室温で2時間撹拌した後、溶媒を留去した。残渣と製造例２で製造した化合物（CPI-005）(17 mg)のDMF溶液(1 mL)にDIPEA(13μL)を加え、60℃にて4時間撹拌した後、溶媒を留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー(ODS, 水/MeCN)で精製して、目的物 (22 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 13.68 (t, J = 5.0 Hz, 1H), 9.50 (s, 1H), 8.10 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 7.89-7.87 (m, 3H), 6.79-6.76 (m, 1H), 6.66-6.63 (m, 1H), 5.96-5.86 (m, 2H), 5.31 (ddt, J = 17.2, 1.4, 1.4 Hz, 1H), 5.23 (ddt, J = 10.4, 1.4, 1.4 Hz, 1H), 5.11-5.06 (m, 1H), 4.59 (dt, J = 5.6, 1.4 Hz, 2H), 4.54-4.51 (m, 1H), 4.34-4.31 (m, 1H), 3.78-3.50 (m, 50H), 3.43 (dt, J = 5.4, 5.4 Hz, 2H), 3.38 (dt, J = 5.3, 5.3 Hz, 2H), 3.33 (dt, J = 5.5, 5.5 Hz, 2H), 3.17-3.12 (m, 1H), 2.92 (dd, J = 12.8, 4.9 Hz, 1H), 2.74 (d, J = 12.8 Hz, 1H), 2.63 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.58 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 2.47 (t, J = 6.1 Hz, 2H), 2.34 (s, 4H), 2.18 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.12 (t, J = 6.9 Hz, 2H), 1.82-1.60 (m, 6H), 1.47-1.40 (m, 2H), 1.01 (s, 6H);
LC-MS: [M+H] + = 1420.69.
（3）CPA-305の製造
上記で製造した化合物（CPA-304）(10 mg)、1,3-ジメチルバルビツル酸(2.2 mg)、Pd(PPh3)4 (0.81 mg)およびAcOEt/DCM (1:1, 0.5 mL)の混合物を室温にて1時間撹拌した後、溶媒を留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー(ODS, 水/MeCN)で精製して目的物 (9.5 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.53 (t, J = 10.4 Hz, 1H), 10.57 (s, 1H), 9.10 (t, J = 5.2 Hz, 1H), 8.06 (d, J = 9.1 Hz, 2H), 7.95 (s, 1H), 7.91 (d, J = 9.1 Hz, 2H), 7.84 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 6.42 (s, 1H), 6.36 (s, 1H), 4.29 (dd, J = 5.6, 5.2 Hz, 1H), 4.13-4.10 (m, 1H), 3.63-3.25 (m, under the water signal), 3.17 (tt, J = 5.8, 5.8 Hz, 4H), 3.10-3.06 (m, 1H), 2.81 (dd, J = 12.4, 5.1 Hz, 1H), 2.58-2.49 (m, overlapped with the DMSO signal), 2.35-2.28 (m, 8H), 2.05 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.93 (tt, J = 7.0 Hz, 2H), 1.64-1.40 (m, 4H), 1.34-1.23 (m, 2H), 0.94 (s, 6H) ;
LC-MS: [M+H] + = 1380.38.
（4）CPA-306の製造
上記で製造した化合物（CPA-305）(8.5 mg)、NHS(1.4 mg), WSC・HCl(2.4 mg)およびDMF(0.5 mL)の混合物を室温にて4時間撹拌した。NHS(1.4 mg)および WSC・HCl(2.4 mg)を追加し、2時間撹拌した後、溶媒を留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー(ODS, 水/MeCN)で精製し、目的物 (7.7 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.55-13.52 (m, 1H), 10.38 (s, 1H), 9.12-9.07 (m, 1H), 8.08-7.80 (m, 6H), 6.41 (s, 1H), 6.35 (s, 1H), 4.31-4.28 (m, 1H), 4.13-4.10 (m, 1H), 3.71 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 3.63-3.25 (m, under the water signal), 3.17 (tt, J = 6.0, 6.0 Hz, 4H), 3.10-3.06 (m, 1H), 2.92 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.83-2.79 (m, 4H), 2.58-2.44 (m, overlapped with the DMSO signal), 2.34-2.28 (m, 8H), 2.05 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.97-1.90 (m, 2H), 1.64-1.40 (m, 4H), 1.32-1.23 (m, 2H), 0.94 (s, 6H) ;
LC-MS: [M+2H] 2+ = 1478.07
製造例１６：化合物(CPA-310)の製造
下式に示す方法に従って、化合物（CPA-310）を製造した。
(1) CPA-307の製造
ジエチレングリコールビス(3-アミノプロピル)エーテル(2.1 mL)をDCM(200 mL)に溶解し、クロロぎ酸アリル(1.0 mL)を氷冷下で滴下した後、4時間撹拌した。室温に昇温して14時間撹拌した後、溶媒を留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー(ODS, 水/MeCN)で精製して、目的物 (0.50 g)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.26-7.37 (brs, 2H), 7.19 (t, J = 5.4, 1H), 5.95-5.85 (m, 1H), 5.26 (ddt, J = 13.8, 1.6, 1.6 Hz, 1H), 5.17 (ddt, J = 6.2, 1.6, 1.6 Hz, 1H), 4.45 (d, J = 5.3 Hz, 2H), 3.54-3.36 (m, 12H), 3.03 (dt, J = 6.6, 6.6 Hz, 2H), 2.83 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 1.78 (tt, J = 6.6, 6.6 Hz, 2H), 1.62 (tt, J = 7.0, 7.0 Hz, 2H);
LC-MS: [M+H] + = 305.16.
(2) CPA-308の製造
前記で製造した化合物（CPA-307）(0.50 g)のDMF溶液(20 mL)にFmoc-Lys(Boc)-OH (0.77 g)、WSC・HCl (0.38 g)およびHOBt・H2O (0.30 g) を室温にて加えて15時間撹拌した後、溶媒を留去した。飽和NaHCO3水溶液を加え、AcOEtで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄した後、Na2SO4で乾燥させた。溶媒を留去し、カラムクロマトグラフィー(シリカゲル, AcOEt/MeOH)で精製し、目的物 (0.80 g)を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.76 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 7.60 (d, J = 7.4 Hz, 2H), 7.40 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 7.31 (td, J = 7.4, 1.0 Hz, 2H), 6.83-6.73 (brs, 1H), 5.92-5.84 (m, 1H), 5.72-5.62 (brs, 1H), 5.44-5.34 (brs, 1H), 5.26 (d, J = 17.4 Hz, 1H), 5.17 (d, J = 10.6 hz, 2H), 4.75-4.63 (brs, 1H), 4.52 (d, J = 5.3 Hz, 2H), 4.42 (d, J = 7.0 Hz, 2H), 4.21 (t, J = 6.9 Hz, 1H), 4.14-4.10 (m, 1H), 3.59-3.43 (m, 13H), 3.35-3.25 (m, 3H), 3.11-3.08 (brm, 2H), 1.85-1.73 (m, 4H), 1.66-1.60 (m, 1H), 1.50-1.35 (m, 13H);
LC-MS: [M+H] + = 755.21.
(3) CPA-309の製造
前記で製造した化合物（CPA-308）(0.80 g)および1,3-ジメチルバルビツル酸 (0.33 g)のDCM(10 mL)溶液に、Pd(PPh3)4 (0.12 g)を加え、室温にて2時間撹拌した後、溶媒を留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー(シリカゲル, AcOEt/MeOH)で精製して、中間体(0.41 g)を得た。先の中間体(0.41 g)にビオチン-NHS (0.31 g)、DIPEA (0.16 mL)およびDMF (10 mL)を加え、室温にて2時間撹拌した後、溶媒を留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー(ODS, 水/MeCN)で精製して、目的物 (0.15 g)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.89 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.85 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 7.74-7.72 (m, 3H), 7.44-7.40 (m, 3H), 7.33 (td, J = 7.4, 0.9 Hz, 2H), 6.76 (t, J = 5.3 Hz, 1H), 6.42 (s, 1H), 6.35 (s, 1H), 4.31-4.19 (m, 4H), 4.13-4.10 (m, 1H), 3.91-3.86 (m, 1H), 3.50-3.44 (m, 8H), 3.39-3.33 (m, 4H), 3.14-3.03 (m, 5H), 2.91-2.85 (m, 2H), 2.81 (dd, J = 12.4, 5.1 Hz, 1H), 2.57 (d, J = 12.4 Hz, 1H), 2.04 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.64-1.43 (m, 10H), 1.36-1.21 (m, 15H) ; LC-MS: [M+H] + = 897.11.
(4) CPA-310の製造
前記で製造した化合物（CPA-309）(0.15 g)、ピペリジン(24μL)、DMF(3 mL)の混合物を室温にて2時間撹拌した後、溶媒を留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー(ODS, 水/MeCN)で精製して、目的物(0.11 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.81 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 7.75 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 6.75 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 6.42 (s, 1H), 6.35 (s, 1H), 4.32-4.29 (m, 1H), 4.14-4.11 (m, 1H), 3.53-3.45 (m, 8H), 3.41-3.33 (m, 4H), 3.13-3.03 (m, 6H), 2.90-2.80 (m, 3H), 2.57 (d, J = 12.4 Hz, 1H), 2.04 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.66-1.57 (m, 5H), 1.54-1.43 (m, 4H), 1.37-1.20 (m, 16H) ; LC-MS: [M+H] + = 675.21.
製造例１７：化合物(CPA-311)の製造
6-アミノカプロン酸(0.20 g)およびアリルアルコール(1.0 mL)に塩化チオニル(0.33 mL)を滴下し、室温にて1時間撹拌した後、溶媒を留去した。残渣に無水コハク酸 (0.18 g)、DIPEA (0.80 mL)およびDMF (5 mL)を加え、室温にて20時間撹拌した。無水コハク酸(0.15 g)およびDIPEA (0.4 mL)を追加し、室温にて1時間撹拌した後、溶媒を留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー(ODS, 水/MeCN)で精製して、目的物 (0.40 g)を得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.02 (s, 1H), 5.97-5.87 (m, 1H), 5.32 (ddt, J = 14.1, 1.4, 1.4 Hz, 1H), 5.24 (ddt, J = 10.4, 1.4, 1.4 Hz, 1H), 4.58 (dt, J = 5.8, 1.4 Hz, 2H), 3.27 (dt, J = 6.6, 6.6 Hz, 2H), 2.71-2.68 (m, 2H), 2.52-2.49 (m, 2H), 2.36 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 1.65 (tt, J = 7.5, 7.5 Hz, 2H), 1.53 (tt, J = 7.3, 7.3 Hz, 2H), 1.40-1.32 (m, 2H) ;
LC-MS: [M+H] + = 272.21.
製造例１８：化合物（ＣＰＡ－３１４）の製造
(1) CPA-312の製造
製造例１６で製造した化合物（CPA-310）(0.11 g)および製造例１７で製造した化合物（CPA-311）(43 mg)をDMF(4 mL)に溶解し、WSC・HCl(37 mg)およびHOBt・H2O (29 mg)を加えて、室温にて14時間撹拌した後、溶媒を留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー(ODS, 水/MeCN)で精製して，目的物 (0.13 g)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.95 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.86-7.82 (m, 2H), 7.74 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 6.74 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 6.42 (s, 1H), 6.35 (s, 1H), 5.96-5.86 (m, 1H), 5.28 (ddt, J = 17.3, 1.5, 1.5 Hz, 1H), 5.20 (ddt, J = 10.5, 1.5, 1.5 Hz, 1H), 4.54 (dt, J = 5.4, 1.4 Hz, 2H), 4.32-4.29 (m, 1H), 4.14-4.06 (m, 2H), 3.52-3.45 (m, 8H), 3.40-3.33 (m, 4H), 3.12-2.98 (m, 7H), 2.89-2.80 (m, 3H), 2.57 (d, J = 12.4 Hz, 1H), 2.37-2.25 (m, 6H), 2.04 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.65-1.19 (m, 31H) ; LC-MS: [M+H] + = 928.30.
(2) CPA-313の製造
前記で製造した化合物（CPA-312）(0.13 g)の DCM(3 mL)溶液に、TFA(1.1 mL)を滴下し、室温にて1時間撹拌した後、溶媒を留去した。残渣をDMF(2 mL)で希釈したのち、DIPEA(0.12 mL)およびアジピン酸無水物(36 mg)を加え、室温にて2時間撹拌した。撹拌を停止し、4日間静置した後、溶媒を留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー(ODS, 水/MeCN)で精製して目的物 (75 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.02-7.95 (m, 1H), 7.89-7.84 (m, 2H), 7.78-7.75 (m, 2H), 6.43 (s, 1H), 6.36 (s, 1H), 5.96-5.86 (m, 1H), 5.28 (ddt, J = 17.2, 1.5, 1.5 Hz, 1H), 5.20 (ddt, J = 10.5, 1.5 1.5 Hz, 1H), 4.53 (dt, J = 5.5, 1.5, 2H), 4.32-4.29 (m, 1H), 4.14-4.06 (m, 2H), 3.52-3.33 (m, 12H), 3.12-2.96 (m, 9H), 2.82 (dd, J = 12.5, 5.2 Hz, 1H), 2.57 (d, J = 12.5 Hz, 1H), 2.38-2.27 (m, 6H), 2.21-2.16 (m, 2H), 2.06-2.02 (m, 4H), 1.65-1.21 (m, 26H) ; LC-MS: [M+H] + = 956.19.
(3) CPA-314の製造
前記で製造した化合物（CPA-313）(75 mg)をDMF(2 mL)に溶解し、ジメドン (12 mg)、WSC・HCl (16 mg)およびDMAP(9.6 mg) を加え、室温にて14時間撹拌した後、溶媒を留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー(ODS, 水/MeCN)で精製して目的物(31 mg)を得た。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.99 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.89-7.82 (m, 2H), 7.74 (t, J = 10.6 Hz, 2H), 6.61 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 6.42 (s, 1H), 6.35 (s, 1H), 5.96-5.86 (m, 1H), 5.28 (ddt, J = 17.2, 1.6, 1.6 Hz, 1H), 5.20 (ddt, J = 10.5, 1.5, 1.5 Hz, 1H), 4.53 (dt, J = 5.4, 1.4 Hz, 2H), 4.32-4.28 (m, 1H), 4.14-4.06 (m, 2H), 3.52-3.43 (m, 8H), 3.40-3.33 (m, 4H), 3.12-2.96 (m, 11H), 2.86-2.79 (m, 3H), 2.57 (d, J = 12.5 Hz, 1H), 2.36-2.30 (m, 8H), 2.06-1.96 (m, 4H), 1.65-1.21 (m, 26H), 0.97 (s, 6H) ;
LC-MS: [M+2H] 2+ = 1079.50.
製造例１９：化合物(CPA-318)の製造
(1) CPA-317の製造
上記式で示される化合物（CPA-315）(0.11g)および化合物（CPA-316）(0.087g)をDMF(5 mL)に溶解し、HATU(0.209 g)とDIPEA(0.160 ml) を室温にて加え20時間撹拌した後、溶媒を留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー(シリカゲル, ヘキサン/AcOEt)で精製して，目的物 (0.11 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.22-8.19 (m, 2H), 7.74-7.64 (brs, 1H), 7.61-7.52 (m, 3H), 5.15-5.02 (brs, 1H), 3.80-3.71 (m, 4H), 3.69-3.64 (m,4H), 3.58 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 3.36-3.33 (m, 2H), 1.43 (s, 9H) ; LC-MS: [M+H] + = 421.08.
(2) CPA-318の製造
前記で製造した化合物（CPA-317）(0.11 mg)をDCM(2 mL)に溶解し、TFA (0.97 mL)を滴下して、室温にて1時間撹拌した後に、溶媒を留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー(ODS, 水/MeCN)で精製して、目的物(89 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.15 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 8.15-8.12 (m, 2H), 7.74-7.64 (m, 6H), 3.61-3.58 (m, 8H), 3.54-3.49 (m, 2H), 2.97 (t, J = 5.2 Hz, 2H) ; LC-MS: [M+H] + = 321.06.
製造例２０：化合物（ＣＰＡ－３２１）の製造
(1) CPA-319の製造
製造例１９で製造した化合物（CPA-318）(12 mg)および製造例１８で製造した化合物（CPA-314）(30 mg)をDMF (1 mL)に溶解し、DIPEA (19μL)との混合物を60 ℃にて2時間撹拌した。カラムクロマトグラフィー(ODS, 水/MeCN) で精製して，目的物 (30 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.35 (t, J = 4.5, 1H), 9.08 (t, J = 5.9 Hz, 1H), 8.13-8.10 (m, 2H), 7.96 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.86-7.82 (m, 2H), 7.75-7.63 (m, 5H), 6.42 (s, 1H), 6.35 (s, 1H), 5.95-5.85 (m, 1H), 5.28 (ddt, J = 17.2, 1.5, 1.5 Hz, 1H), 5.20 (ddt, J = 10.4, 1.5, 1.5 Hz, 1H), 4.53 (dt, J = 5.5, 1.5 Hz, 2H), 4.32-4.28 (m, 1H), 4.13-4.05 (m, 2H), 3.63-3.60 (m, 8H), 3.50-3.43 (m, 10H), 3.39-3.33 (m, 4H), 3.11-2.90 (m, 11H), 2.81 (dd, J = 12.4, 5.1 Hz, 1H), 2.57 (d, J = 12.4 Hz., 1H), 2.36-2.27 (m, 8H), 2.23 (s, 4H), 2.11-2.02 (m, 4H), 1.65-1.21 (m, 26H), 0.91 (s, 6H) ;
LC-MS: [M+H] + = 1380.98.
(2) CPA-320の製造
前記で製造した化合物（CPA-319）(29 mg)、1,3-ジメチルバルビツル酸(6.6 mg)、Pd(PPh3)4 (2.4 mg)およびDCM (1 mL)の混合物を室温にて1時間撹拌した後、溶媒を留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー(ODS, 水/MeCN) で精製して，目的物(26 mg)を得た。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.35 (t, J = 4.3 Hz, 1H), 9.09 (t, J = 5.5, 1H), 8.13-8.10 (m, 3H), 7.99-7.89 (brs, 1H), 7.85 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 7.78-7.75 (m, 2H), 7.72-7.63 (m, 3H), 6.43 (s, 1H), 6.36 (s, 1H), 4.32-4.28 (m, 1H), 4.14-4.05 (m, 2H), 3.63-3.60 (m, 8H), 3.50-3.45 (m, 10H), 3.39-3.33 (m, 4H), 3.11-2.90 (m, 11H), 2.82 (dd, J = 12.4, 5.1 Hz, 1H), 2.57 (d, J = 12.4 Hz, 1H), 2.36-2.27 (m, 6H), 2.23 (s, 4H), 2.16-2.02 (m, 6H), 1.65-1.21 (m, 26H), 0.91 (s, 6H); LC-MS: [M+H] + = 1339.89.
(3) CPA-321の製造
前記で製造した化合物（CPA-320）(25 mg)、NHS(4.3 mg)、WSC・HCl(7.2 mg)、およびDMF(0.4 mL)の混合物を室温にて3時間撹拌した。NHS(4.3 mg)、およびWSC・HCl(7.2 mg)を追加し、室温にてさらに3時間撹拌した。カラムクロマトグラフィー(ODS, 水/MeCN) で精製して、目的物(21 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.35 (t, J = 4.4 Hz, 1H), 9.08 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 8.13-8.10 (m, 2H), 7.96 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.87-7.83 (m, 2H), 7.75-7.63 (m, 5H), 6.42 (s, 1H), 6.35 (s, 1H), 4.32-4.28 (m, 1H), 4.14-4.05 (m, 2H), 3.63-3.60 (m, 8H), 3.50-3.43 (m, 10H), 3.39-3.33 (m, 4H), 3.11-2.90 (m, 11H), 2.84-2.79 (m, 5H), 2.65 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.57 (d, J = 12.4 Hz, 1H), 2.38-2.28 (m, 6H), 2.23 (s, 4H), 2.09-2.02 (m, 4H), 1.65-1.21 (m, 26H), 0.91 (s, 6H); LC-MS: [M+H] + = 1437.12.
製造例２１：CPF-242の合成
(1) CPF-241の合成
CPI-104 (14 mg)およびDMF (1 mL)の混合物にCPI-006 (6.6 mg)，WSC・HCl (6.8 mg)およびHOBt・H2O (5.4 mg)を加え，室温にて3時間撹拌した。溶媒を留去し，残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN）で精製した。精製物 (8.9 mg)およびDMF (1 mL)の混合物にN-Boc-1,5-ジアミノペンタン (12 μL)，WSC・HCl (11 mg)およびHOBt・H2O (9.0 mg)を加え，室温にて16時間撹拌した。溶媒を留去し，残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN）で精製して，目的物 (7.4 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.77 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 7.72-7.65 (m, 3H), 7.57-7.50 (m, 3H), 7.47-7.43 (m, 2H), 7.20 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.75 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.55 (d, J = 10.5 Hz, 1H), 4.25-4.18 (m, 1H), 3.77 (d, J = 10.5 Hz, 1H), 3.70-3.63 (m, 1H), 2.98 (dt, J = 6.5, 6.5 Hz, 2H), 2.90-2.80 (m, 4H), 1.86-1.77 (m, 4H), 1.58-1.31 (m, 19H), 1.24-1.18 (m, 2H);
LC-MS: [M+H]+ = 680.53.
(2) CPF-242の合成
前記で製造した化合物 (CPF-241)(6.6 mg)およびDCM (1 mL)の混合物にTFA (149 μL)を加え，室温にて2時間撹拌した。溶媒を留去し，残渣にDMF (1 mL)，CPI-005 (6.0 mg)およびDIPEA (17 μL)を加え，60 ℃にて3時間撹拌した。溶媒を留去し，残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN）で精製して，目的物 (7.9 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.46 (t, J = 4.9 Hz, 1H), 7.84-7.79 (m, 2H), 7.72-7.65 (m, 3H), 7.57-7.50 (m, 3H), 7.47-7.43 (m, 2H), 7.20 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 6.41 (s, 1H), 6.35 (s, 1H), 4.55 (d, J = 10.5 Hz, 1H), 4.31-4.28 (m, 1H), 4.25-4.18 (m, 1H), 4.14-4.10 (m, 1H), 3.76 (d, J = 10.5 Hz, 1H), 3.70-3.58 (m, 3H), 3.52-3.48 (m, 14H), 3.42-2.99 (m, overlapped with water signal), 2.85-2.79 (m, 3H), 2.59-2.49 (m, overlapped with DMSO signal), 2.28 (s, 4H), 2.06 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.87-1.77 (m, 4H), 1.65-1.23 (m, 18H), 0.94 (s, 6H);
LC-MS: [M+H]+ = 1175.70.
製造例２２：CPA-325の製造
(1) CPA-322の製造
前記式に示す化合物(CPA-316)(40 mg)，N-Boc-1,3-ジアミノプロパン (61 μL)およびCOMU (99 mg)をDMF (1 mL)に溶解し，DIPEA (121 μL)を加え，室温にて26時間撹拌した。溶媒を留去し，残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN）で精製して，目的物 (53 mg)を得た。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 9.15 (br, 1H), 8.13 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 7.72-7.64 (m, 3H), 6.84 (br, 1H), 3.30 (br, overlapped with water signal), 2.99 (br, 2H), 1.67 (quin, J = 6.5 Hz, 2H), 1.38 (s, 9H);
LC-MS: [M+Na]+ = 369.41.
(2) CPA-323の製造
前記で製造した化合物(CPA-322)(51 mg)をDCM (1 mL)に溶解し，氷冷下TFA (113 μL)を加え，室温にて1時間撹拌した。溶媒を留去し，残渣に15-(Boc-アミノ)-4,7,10,13-テトラオキサペンタデカン酸 (56 mg)，COMU (76 mg)，DIPEA (85 μL)，DMF (1 mL)を加え，室温にて12時間撹拌した。溶媒を留去し，残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN）で精製して，目的物 (76 mg)を得た。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 9.15 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 8.13 (d, J = 7.7 Hz, 2H), 7.89 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 7.72-7.69 (m, 2H), 7.66 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 6.74 (t, J = 5.2 Hz, 1H), 3.60 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 3.49-3.46 (m, 12H), 3.37-3.36 (m, overlapped with water signal), 3.12 (q, J = 6.4 Hz, 2H), 3.05 (q, J = 5.9 Hz, 2H), 2.32 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 1.68 (quin, J = 7.0 Hz, 2H), 1.36 (s, 9H);
LC-MS: [M+H]+ = 594.60.
(3) CPA-324の製造
前記で製造した化合物(CPA-323)(67 mg)をDCM (1 mL)に溶解し，TFA (130 μL)を加え，室温にて2時間撹拌した。溶媒を留去し，目的物 (68 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.16 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 8.15-8.11 (m, 2H), 7.92 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 7.75-7.64 (m, 6H), 3.62-3.48 (m, 16H), 3.34 (dt, J = 6.7, 6.7 Hz, 2H), 3.12 (dt, J = 6.7, 6.7 Hz, 2H), 3.01-2.94 (m, 2H), 2.33 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 1.69 (tt, J = 6.7, 6.7 Hz, 2H);
LC-MS: [M+H]+ = 494.38.
(4) CPA-325の製造
CPA-318を前記で製造した化合物(CPA-324)に変更した以外は製造例２０と同様にして製造した。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.35 (s, 1H), 9.15 (t, J = 5.9 Hz, 1H), 8.14-8.11 (m, 2H), 7.97 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.91-7.83 (m, 3H), 7.76-7.63 (m, 5H), 6.42 (s, 1H), 6.35 (s, 1H), 4.30 (dd, J = 7.6, 5.2 Hz, 1H), 4.14-4.05 (m, 2H), 3.61-3.34 (m, 32 H), 3.17-2.91 (m, 13 H), 2.84-2.79 (m, 5H), 2.65 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.57 (d, J = 12.4 Hz, 2H), 2.37-2.26 (m, 10H), 2.09-2.02 (m, 4H), 1.71-1.19 (m, 28H), 0.93 (s, 6H);
LC-MS: [M+2H]2+ = 1611.63.
製造例２３：CPA-326の製造
N-Boc-1,3-ジアミノプロパンをN-Boc-3,3’-((オキシビス(エタン-2,1-ジイル))ビス(オキシ))ビス(プロパン-1-アミン)に変更した以外は製造例２１と同様にして製造した。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.35 (s, 1H), 9.14 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 8.14-8.11 (m, 2H), 7.96 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.85 (dd, J = 9.9, 5.4 Hz, 2H), 7.79 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 7.87-7.63 (m, 5H), 6.42 (s, 1H), 6.35 (s, 1H), 4.30 (dd, J = 7.6, 5.2 Hz, 1H), 4.14-4.05 (m, 2H), 3.61-3.34 (m, 40H), 3.11-2.92 (m, 15H), 2.84-2.79 (m, 5H), 2.65 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.57 (d, J = 12.4, 1H), 2.37-2.26 (m, 12H), 2.09-2.02 (m, 4H), 1.83-1.77 (m, 2H), 1.65-1.19 (m, 28H), 0.93 (s, 6H);
LC-MS: [M+2H]2+ = 1757.83.
製造例２４：CPA-332の製造
(1) CPA-328の製造
前記式に示す化合物(CPA-327)(60 mg)および Nα,Nε-ジ-Boc-L-リシン (87 mg)をDMF (2 mL)に溶解し，COMU (108 mg)およびDIPEA (109 μL)を加え，室温にて1時間撹拌した。溶媒を留去し，残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN）で精製して，目的物 (129 mg)を得た。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 8.13 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 6.77-6.39 (m, 3H), 5.88 (ddt, J = 17.3, 10.5, 5.3 Hz, 1H), 5.30 (dd, J = 17.3, 1.6 Hz, 1H), 5.20 (dd, J = 10.5, 1.5 Hz, 1H), 4.59-4.52 (m, 2H), 4.22 (br, 1H), 3.91 (br, 1H), 2.92-2.82 (m, 4H), 1.72-1.66 (m, 1H), 1.64-1.52 (m, 2H), 1.49-1.42 (m, 1H), 1.37-1.24 (m, 35H);
LC-MS: [M+H]+ = 615.68.
(2) CPA-329の製造
前記で合成した化合物(CPA-328)(126 mg)をDCM (2 mL)に溶解し，TFA (474 μL)を加え，室温にて1時間撹拌した。溶媒を留去し，残渣に上記式に示す化合物 (CPA-316)(128 mg)，DMF (2 mL)，COMU (288 mg)およびDIPEA (235 μL)を加え，室温にて1時間撹拌した。溶媒を留去し，残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN）で精製して，目的物 (132 mg)を得た。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 9.18 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 9.15 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 8.92 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.52 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 8.12-8.09 (m, 6H), 7.70-7.62 (m, 9H), 5.87 (ddt, J = 17.3, 10.5, 5.3 Hz, 1H), 5.29 (dq, J = 17.2, 1.6 Hz, 1H), 5.17 (dq, J = 10.5, 1.5 Hz, 1H), 4.60 (q, J = 7.3 Hz, 1H), 4.56 (dq, J = 5.4, 1.6 Hz, 2H), 4.32-4.27 (m, 1H), 3.32-3.30 (m, overlapped with water signal), 1.86-1.77 (m, 3H), 1.73-1.66 (m, 1H), 1.64-1.55 (m, 4H), 1.49-1.36 (m, 4H);
LC-MS: [M+H]+ = 831.77.
(3) CPA-330の製造
前記で製造した化合物(CPA-329)(42 mg)をDCM (3 mL)に溶解し，Pd(PPh3)4 (5.8 mg)およびN-メチルアニリン (27 μL)を加え，室温にて1時間撹拌した。溶媒を留去し，残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN）で精製して，目的物 (31 mg)を得た。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 12.60 (br, 1H), 9.18 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 9.15 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 8.92 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.36 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 8.12-8.07 (m, 5H), 7.80-7.77 (m, 1H), 7.71-7.62 (m, 9H), 4.60 (q, J = 7.5 Hz, 1H), 4.24-4.19 (m, 1H), 3.34-3.29 (m, overlapped with water signal), 1.87-1.76 (m, 3H), 1.70-1.54 (m, 5H), 1.49-1.35 (m, 4H);
LC-MS: [M+H]+ = 791.46.
(4) CPA-331の製造
製造例２２と同様にして製造した。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.18-9.14 (m, 2H), 8.99 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.17-8.07 (m, 7H), 7.97 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 7.71-7.62 (m, 12H), 4.56 (dt, J = 7.2, 7.2 Hz, 2H), 4.26 (dt, J = 7.2, 7.2 Hz, 2H), 3.59-3.53 (m, 6H), 3.42-3.16 (m, 8H), 3.00-2.96 (m, 2H), 1.86-1.80 (m, 2H), 1.70-1.28 (m, 10H);
LC-MS: [M+H]+ = 921.30.
(5) CPA-332の製造
CPA-318をCPA-331に変更した以外は製造例２１と同様にして製造した。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.34 (s, 1H), 9.17-9.12 (m, 2H), 8.98 (d, J = 8.4 Hz. 1H), 8.17 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 8.12-8.06 (m, 6H), 8.06-7.96 (m, 2H), 7.87-7.83 (m, 2H), 7.76-7.74 (m, 2H), 7.70-7.53 (m, 9H), 6.42 (s, 1H), 6.36 (s, 1H), 4.57 (dt, J = 7.5, 7.5 Hz, 1H), 4.32-4.24 (m, 2H), 4.14-4.05 (m, 2H), 3.60-2.90 (m, 37H), 2.84-2.79 (m, 5H), 2.66-2.50 (m, 3H), 2.36-2.25 (m, 10H), 2.09-2.02 (m, 4H), 1.86-1.80 (m, 2H), 1.68-1.20 (m, 36H), 0.91 (s. 6H);
LC-MS: [M+2H]2+ = 2039.42.
製造例２５：CPA-403の製造
(1) CPA-401の製造
4-ベンゾイル安息香酸 (50 mg)，N-Boc-2,2'-(エチレンジオキシ)ジエチルアミン (55 mg)およびDMF (3 mL)の混合物に，WSC・HCl (42 mg)およびHOBt・H2O（34 mg）を加え，室温にて15時間撹拌した。溶媒を留去し，残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル，ヘキサン/AcOEt）で精製して，目的物 (61 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.07-7.88 (brm, 2H), 7.86-7.79 (m, 4H), 7.62 (tt, J = 7.4, 1.2 Hz, 1H), 7.50 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 6.99-6.88 (brs, 1H), 5.03-4.91 (brs, 1H), 3.71-3.56 (m, 10H), 3.36-3.23 (brm, 2H), 1.42 (s, 9H);
LC-MS: [M+H]+ = 457.45.
(2) CPA-402の製造
前記で製造した化合物(CBI-712)(61 mg)およびDCM (2 mL)の混合物に，TFA (515 μL)を加え，室温にて14時間撹拌した。溶媒を留去し，目的物 (63 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.73 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 8.01-7.98 (m, 2H), 7.82-7.69 (m, 8H), 7.61-7.57 (m, 2H), 3.60-3.56 (m, 8H), 3.49-3.38 (m, 2H), 3.00-2.93 (m, 2H);
LC-MS: [M+H]+ = 357.36.
(3) CPA-403の製造
CPA-316をCPA-402に変更した以外は、製造例２２と同様にして製造した。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.38-13.32 (brm, 1H), 8.72 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 8.00-7.96 (m, 3H), 7.87-7.83 (m, 2H), 7.80-7.68 (m, 7H), 7.60-7.56 (m, 2H), 6.42 (s, 1H), 6.35 (s, 1H), 4.30 (dd, J = 7.6, 5.1 Hz, 1H), 4.14-4.05 (m, 3H), 3.62-3.36 (m, 22H), 3.11-2.91 (m, 11H), 2.84-2.79 (m, 5H), 2.65 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.57 (d, J = 12.6 Hz, 1H), 2.37-2.24 (m, 10H), 1.68-1.19 (m, 26H), 0.91 (s, 6H);
LC-MS: [M+2H]2+ = 1474.68.
製造例２６：CPA-503の製造
(1) CPA-502の製造
上記式に示す化合物 (CPA-501)(40 mg)をDCM (2 mL)に溶解し，TFA (258 μL)を加え，室温にて1時間撹拌した。溶媒を留去し，目的物 (41 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.93 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 7.87-7.66 (brs, 3H), 3.60-3.52 (m, 6H), 3.41 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.20 (dt, J = 5.9, 5.9 Hz, 2H), 2.97 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 1.97 (m, 2H), 1.56 (m, 2H), 0.98 (s, 3H);
LC-MS: [M+H]+ = 259.28.
(2) CPA-503の製造
CPA-316をCPA-502に変更した以外は、製造例２２と同様にして製造した。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.35 (s, 1H), 7.98-7.84 (m, 4H), 7.77-7.74 (m, 2H), 6.42 (s, 1H), 6.36 (s, 1H), 4.30 (dd, J = 7.6, 5.2 Hz, 1H), 4.14-4.06 (m, 2H), 3.61-3.16 (m, 22H), 3.12-2.92 (m, 11H), 2.84-2.80 (m, 5H), 2.65 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 2.59-2.56 (m, 1H), 2.37-2.27 (m, 10H), 2.10-2.02 (m, 4H), 1.97 (t, J = 7.7 Hz), 1.65-1.23 (m, 28H), 0.97 (s, 3H), 0.94 (s, 6H);
LC-MS: [M+2H]2+ = 1376.31.
製造例２７：CPA-334の製造
上記式に示す化合物 (CPA-333)およびDCM (1 mL)の混合物にTFA (80 μL)を加え，室温にて1時間撹拌した。溶媒を留去し，残渣に上記式に示す化合物 (CPA-321)(15 mg)，DMF (1 mL)およびDIPEA (5.5 μL)を加え，室温にて8時間撹拌した。DIPEA (1.8 μL)を追加し，室温にて14時間撹拌した。溶媒を留去し，残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN）で精製して，目的物 (12 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.34 (t, J = 4.5 Hz, 1H), 9.96 (d, J = 0.7 Hz, 1H), 9.08 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 8.13-8.10 (m, 2H), 8.04 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 7.96 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.87-7.82 (m, 3H), 7.78-7.63 (m, 6H), 6.42 (s, 1H), 6.35 (s, 1H), 4.30 (dd, J = 7.5, 5.3 Hz, 1H), 4.14-4.05 (m, 2H), 3.63-3.60 (m, 8H), 3.50-3.29 (m, overlapped with water signal), 3.11-2.89 (m, 11H), 2.83-2.79 (m, 1H), 2.59-2.23 (m, overlapped with DMSO signal), 2.09-2.02 (m, 4H), 1.65-1.24 (m, 26H), 0.91 (s, 6H);
LC-MS: [M+H]+ = 1528.03.
製造例２８：CPI-007の製造
アジピン酸無水物 (100 mg)およびDCM (5 mL)の混合物に，氷冷下，アリルアルコール (96 μL)，DMAP (9.5 mg)およびピリジン (170 μL)を加え，氷冷下1時間撹拌した。室温に昇温し15時間撹拌した。反応液を2 M HCl水溶液および飽和食塩水で洗浄後，Na2SO4で乾燥した。溶媒を留去し，目的物 (101 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.97-5.87 (m, 1H), 5.34-5.29 (m, 1H), 5.26-5.22 (m, 1H), 4.58 (ddt, J = 5.7, 1.3, 1.3 Hz, 2H), 2.42-2.34 (m, 4H), 1.75-1.64 (m, 4H);
LC-MS: [M+H]+ = 187.20.
製造例２９：CPA-338の製造
(1) CPA-335の製造
上記式に示す化合物 (CPA-310)(139 mg)およびDCM (5 mL)の混合物に，TEA (43 μL)およびクロロぎ酸2,2,2-トリクロロエチル (33 μL)を加え，氷冷下1時間撹拌した。溶媒を留去し，残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN）で精製して，目的物 (172 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.89 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 7.78-7.73 (m, 2H), 6.75 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 6.42 (s, 1H), 6.35 (s, 1H), 4.82 (d, J = 12.4 Hz, 1H), 4.75 (d, J = 12.4 Hz, 1H), 4.30 (dd, J = 7.6, 5.2 Hz, 1H), 4.14-4.12 (m, 1H), 3.93-3.87 (m, 1H), 3.52-3.54 (m, 8H), 3.40-3.34 (m, 4H), 3.12-3.04 (m, 5H), 2.88-2.80 (m, 3H), 2.57 (d, J = 12.4 Hz, 1H), 2.04 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.65-1.41 (m, 10H), 1.37-1.21 (m, 15H);
LC-MS: [M+H]+ = 849.56.
(2) CPA-336の製造
前記で製造した化合物 (CPA-335)(172 mg)およびDCM (3 mL)の混合物に，TFA (468 μL)を加え，室温にて1時間撹拌した。溶媒を留去し，残渣にDMF (3 mL)，CBI-741 (41 mg)，WSC・HCl (47 mg)，HOBt・H2O (37 mg)およびDIPEA (141 μL)を加え，室温にて13時間撹拌した。溶媒を留去し，残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN）で精製して，目的物 (134 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.89 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 7.80-7.73 (m, 3H), 6.42 (s, 1H), 6.35 (s, 1H), 5.96-5.86 (m, 1H), 5.28 (ddt, J = 17.2, 1.5, 1.5 Hz, 1H), 5.20 (ddt, J = 10.5, 1.5, 1.5 Hz, 1H), 4.82 (d, J = 12.4 Hz, 1H), 4.75 (d, J = 12.4 Hz, 1H), 4.53 (dt, J = 5.4, 1.5 Hz, 2H), 4.30 (dd, J = 7.6, 5.2 Hz, 1H), 4.14-4.11 (m, 1H), 3.93-3.87 (m, 1H), 3.52-3.44 (m, 8H), 3.39-3.30 (m, 4H), 3.15-3.04 (m, 5H), 3.01-2.96 (m, 2H), 2.82 (dd, J = 12.4, 5.1 Hz, 1H), 2.57 (d, J = 12.4 Hz, 1H), 2.35-2.31 (m, 2H), 2.06-2.02 (m, 4H), 1.64-1.21 (m, 20H);
LC-MS: [M+H]+ = 917.63.
(3) CPA-337の製造
前記で製造した化合物 CPA-336)(134 mg)およびDCM (3 mL)の混合物に，Pd(PPh3)4 (17 mg)および1,3-ジメチルバルビツル酸 (47 mg)を加え，室温にて1時間撹拌した。溶媒を留去し，残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN）で精製して，目的物 (96 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.91 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 7.80-7.74 (m, 3H), 6.42 (s, 1H), 6.36 (s, 1H), 4.82 (d, J = 12.4 Hz, 1H), 4.75 (d, J = 12.4 Hz), 4.30 (dd, J = 7.6, 5.2 Hz, 1H), 4.14-4.11 (m, 1H), 3.93-3.87 (m, 1H), 3.52-3.35 (m, 12H), 3.12-3.04 (m, 5H), 3.01-2.96 (m, 2H), 2.82 (dd, J = 12.4, 5.1 Hz, 1H), 2.57 (d, J = 12.4 Hz, 1H), 2.18 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.06-2.01 (m, 4H), 1.64-1.21 (m, 20H);
LC-MS: [M+H]+ = 877.54.
(4) CPA-338の製造
前記で製造した化合物 (CPA-337)(96 mg)およびDMF (2 mL)の混合物に，ジメドン (31 mg)，WSC・HCl (42 mg)およびDMAP (27 mg)を加え，60 ℃にて2時間撹拌した。溶媒を留去し，残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN，0.1%AcOH含有）で精製して，目的物 (69 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.12-11.83 (brs, 1H), 7.90 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 7.78-7.74 (m, 3H), 6.42 (s, 1H), 6.35 (s, 1H), 4.82 (d, J = 12.4 Hz, 1H), 4.75 (d, J = 12.4 Hz, 1H), 4.30 (dd, J = 7.6, 5.2 Hz, 1H), 4.14-4.11 (m, 1H), 3.93-3.87 (m, 1H), 3.52-3.30 (m, 12H), 3.12-3.04 (m, 5H), 3.01-2.96 (m, 2H), 2.93-2.90 (m, 2H), 2.82 (dd, J = 12.4, 5.1 Hz, 1H), 2.59-2.43 (m, 5H), 2.04 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 1.64-1.21 (m, 20H), 0.99 (s, 6H);
LC-MS: [M+H]+ = 999.69.
製造例３０：CPI-009の製造
上記式に示す化合物 (CPI-008)(80 mg)，DMF (3 mL)およびDIPEA (166 μL)の混合物に，TSTU (105 mg)を加え，室温にて5分撹拌した。6-アミノヘキサン酸 (41 mg)を加え，室温にて1時間撹拌した。50 ℃に昇温し5時間撹拌した。溶媒を留去し，残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN）で精製して，目的物 (102 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 8.53 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 8.37 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 7.99 (dd, J = 8.8, 2.3 Hz, 1H), 6.70 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 3.39-3.32 (m, 2H), 2.31 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 1.70-1.58 (m, 4H), 1.53-1.33 (m, 11H);
LC-MS: [M+H]+ = 367.30.
製造例３１：CPA-342の製造
(1) CPA-339の製造
上記式に示す化合物 (CPA-338)(29 mg)，製造例１９で製造した化合物 (CPA-318) (13 mg)およびDMF (1 mL)の混合物にDIPEA (25 μL)を加え，60 ℃にて1時間撹拌した。溶媒を留去し，残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN）で精製して，目的物 (31 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.36-13.34 (m, 1H), 9.06 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 8.14-8.11 (m, 2H), 7.89 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 7.78-7.63 (m, 6H), 6.42 (s, 1H), 6.35 (s, 1H), 4.82 (d, J = 12.3 Hz, 1H), 4.75 (d, J = 12.3 Hz, 1H), 4.32-4.29 (m, 1H), 4.14-4.11 (m, 1H), 3.93-3.87 (m, 1H), 3.63-3.60 (m, 10H), 3.52-3.30 (m, 14H), 3.11-3.04 (m, 5H), 3.00-2.96 (m, 2H), 2.93-2.90 (m, 2H), 2.82 (dd, J = 12.4, 5.1 Hz, 1H), 2.57 (d, J = 12.4 Hz, 1H), 2.23 (s, 4H), 2.09-2.02 (m, 4H), 1.63-1.21 (m, 20H), 0.91 (s, 6H);
LC-MS: [M+H]+ = 1301.83.
(2) CPA-340の製造
前記で製造した化合物 (CPA-339)(31 mg)および1,4-ジオキサン (1 mL)の混合物に，亜鉛 (16 mg)および酢酸 (68 μL)を加え，60 ℃にて2時間撹拌した。反応液をカラムクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN，0.1%AcOH含有）で精製して，目的物 (21 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.34 (t, J = 4.2 Hz, 1H), 9.09 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 8.14-8.11 (m, 2H), 7.84 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 7.77-7.63 (m, 5H), 6.42 (s, 1H), 6.36 (s, 1H), 4.32-4.29 (m, 1H), 4.14-4.11 (m, 1H), 3.63-3.04 (m, 32H), 3.01-2.96 (m, 2H), 2.94-2.90 (m, 2H), 2.82 (dd, J = 12.5, 5.1 Hz, 1H), 2.57 (d, J = 12.5 Hz, 1H), 2.24 (s, 4H), 2.09-2.02 (m, 4H), 1.65-1.21 (m, 20H), 0.91 (s, 6H);
LC-MS: [M+H]+ = 1127.92.
(3) CPA-341の製造
前記で製造した化合物 (CPA-340)(10 mg)，製造例２８（１）で製造した化合物 (CPI-009)(4.7 mg)およびDMF (1 mL)の混合物に，WSC・HCl (3.4 mg)，HOBt・H2O (2.7 mg)およびDIPEA (6.2 μL)を加え，室温にて12時間撹拌した。溶媒を留去し，残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN）で精製して，目的物 (5.1 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.34 (t, J = 4.7 Hz, 1H), 9.09 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 8.91 (s, 1H), 8.63 (s, 1H), 8.52 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 8.24 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 8.13-8.10 (m, 2H), 7.93 (dd, J = 8.9, 1.7 Hz, 1H), 7.86-7.84 (m, 2H), 7.77-7.63 (m, 5H), 6.43 (s, 1H), 6.36 (s, 1H), 4.32-4.29 (m, 1H), 4.17-4.11 (m, 2H), 3.62-2.89 (m, 35H), 2.81 (dd, J = 12.5, 5.1 Hz, 1H), 2.57 (d, J = 12.5 Hz, 1H), 2.23 (s, 4H), 2.13-2.02 (m, 6H), 1.67-1.24 (m, 35H), 0.90 (s, 6H);
LC-MS: [M+H]+ = 1476.01.
(4) CPA-342の製造
前記で製造した化合物 (CPA-341)(4.7 mg)およびMeOH (50 μL)の混合物に4M HCl、 1,4-ジオキサン溶液を加え，室温にて1時間撹拌した。MeOH (100 μL)，アセトン (100 μL)およびDIPEA (70 μL)を加え，室温にて1時間撹拌した。反応液をカラムクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN）で精製して，目的物 (2.9 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.34 (t, J = 4.6 Hz, 1H), 9.62 (s, 1H), 9.08 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 8.57 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 8.26 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 8.14-8.11 (m, 2H), 7.99 (dd, J = 8.8, 2.3 Hz, 1H), 7.86-7.84 (m, 2H), 7.7607.63 (m, 5H), 7.04 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.43 (s, 1H), 6.36 (s, 1H), 4.31-4.28 (m, 1H), 4.17-4.10 (m, 2H), 3.62-3.59 (m, 10H), 3.50-2.89 (m, 25H), 2.81 (dd, J = 12.6, 5.1 Hz, 1H), 2.57 (d, J = 12.6 Hz, 1H), 2.23 (s, 4H), 2.14-2.02 (m, 6H), 1.96 (s, 3H), 1.92 (s, 3H), 1.63-1.15 (m, 26H), 0.90 (s, 6H);
LC-MS: [M+H]+ = 1415.76.
製造例３２：CPA-344の製造
CPA-321をCPA-343に変更した以外は製造例３１と同様にして製造した。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.35 (s, 1H), 9.62 (s, 1H), 9.14 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 8.57 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 8.26 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 8.14-8.12 (m, 2H), 7.99 (dd, J = 8.8, 2.4 Hz, 1H), 7.86-7.84 (m, 2H), 7.81-7.63 (m, 6H), 7.04 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.43 (s, 1H), 6.36 (s, 1H), 4.32-4.28 (m, 1H), 4.17-4.10 (m, 2H), 3.60-2.91 (m, overlapped with water signal), 2.81 (dd, J = 12.4, 5.1 Hz, 1H), 2.61-2.45 (m, overlapped with DMSO signal), 2.29-2.26 (m, 6H), 2.14-2.02 (m, 8H), 1.96 (s, 3H), 1.93 (s, 3H), 1.80 (tt, J = 6.6, 6.6 Hz, 2H), 1.68-1.24 (m, 28H), 0.93 (s, 6H);
LC-MS: [M+H]+ = 1735.36.
製造例３３：CPI-016の製造
(1) CPI-012の製造
上記式に示す化合物 (CPI-011)(97 mg)およびDCM (2 mL)の混合物に，TFA (683 μL)を加え，室温にて1時間撹拌した。溶媒を留去し，残渣にDMF (2 mL)，N-[(9H-フルオレン-9-イルメトキシ)カルボニル]-L-グルタミン酸5-tert-ブチル水和物 (75 mg)，HATU (81 mg)およびDIPEA (155 μL)を加え，室温にて1時間撹拌した。N-[(9H-フルオレン-9-イルメトキシ)カルボニル]-L-グルタミン酸5-tert-ブチル水和物 (75 mg)およびHATU (68 mg)を追加し，室温にて1時間撹拌した。溶媒を留去し，残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN）で精製して，目的物 (136 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.76 (d, J = 7.4 Hz, 2H), 7.66-7.60 (m, 2H), 7.40 (dd, J = 7.4, 7.4 Hz, 2H), 7.32 (ddd, J = 7.4, 7.4, 1.0 Hz, 2H), 7.28-7.25 (m, 1H), 6.68 (s, 1H), 6.55 (s, 1H), 6.13-6.05 (brm, 1H), 4.89-4.78 (brm, 1H), 4.50-4.47 (m, 1H), 4.38-4.17 (m, 5H), 3.65-3.51 (m, 12H), 3.43-3.28 (m, 4H), 3.16-3.11 (m, 1H), 2.89 (dd, J = 12.8, 4.9 Hz, 1H), 2.68 (d, J = 12.8 Hz, 1H), 2.42-2.28 (m, 2H), 2.19-2.05 (m, 3H), 1.98-1.89 (m, 1H), 1.81-1.57 (m, 8H), 1.49-1.39 (m, 11H);
LC-MS: [M+H]+ = 854.39.
(2) CPI-013の製造
前記で製造した化合物 (CPI-012)(136 mg)およびDMF (2 mL)の混合物に，ピペリジン (24 μL)を加え，室温にて5時間撹拌した。溶媒を留去し，残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN）で精製して，目的物 (87 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.83 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 7.75 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 6.42 (s, 1H), 6.35 (s, 1H), 4.32-4.29 (m, 1H), 4.14-4.11 (m, 1H), 3.53-3.45 (m, 8H), 3.41-3.33 (m, 6H), 3.13-3.04 (m, 6H), 2.82 (dd, J = 12.5, 5.1 Hz, 1H), 2.57 (d, J = 12.5 Hz, 1H), 2.24-2.20 (m, 2H), 2.04 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.80-1.71 (m, 1H), 1.66-1.43 (m, 9H), 1.39 (s, 9H), 1.35-1.23 (m, 2H);
LC-MS: [M+H]+ = 632.38.
(3) CPI-015の製造
前記で製造した化合物 (CPI-013)(87 mg)，上記式に示す化合物 (CPI-014)(22 mg)およびDMF (2 mL)の混合物に，WSC・HCl (32 mg)およびHOBt・H2O (25 mg)を加え，室温にて5時間撹拌した。溶媒を留去し，残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN）で精製して，目的物 (92 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.80-7.71 (brm, 1H), 7.22 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 6.85 (t, J = 5.3 Hz, 1H), 6.61 (s, 1H), 5.95-5.85 (m, 1H), 5.31 (dd, J = 15.8, 1.4 Hz, 1H), 5.22 (dd, J = 9.2, 1.4 Hz, 1H), 5.01-4.79 (brs, 1H), 4.57 (d, J = 5.7 Hz, 2H), 4.53-4.50 (m, 1H), 4.39-4.34 (m, 2H), 3.70-3.49 (m, 12H), 3.43-3.34 (m, 3H), 3.28-3.14 (m, 2H), 2.92 (dd, J = 12.8, 4.8 Hz, 1H), 2.72 (d, J = 12.8 Hz, 1H), 2.69-2.65 (m, 2H), 2.61-2.57 (m, 2H), 2.39-2.26 (m, 2H), 2.15-2.03 (m, 3H), 1.98-1.36 (m, 20H);
LC-MS: [M+H]+ = 772.45.
(4) CPI-016の製造
前記で製造した化合物 (CPI-015)(92 mg)およびDCM (1 mL)の混合物に，TFA (200 μL)を加え，室温にて20時間撹拌した。溶媒を留去し，残渣にDMF (2 mL)，ジメドン (33 mg)，WSC・HCl (46 mg)およびDMAP (29 mg)を加え，60 ℃にて4時間撹拌した。溶媒を留去し，残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN，0.1%AcOH含有）で精製して，目的物 (45 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.06 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.84 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 7.74 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 6.42 (s, 1H), 6.35 (s, 1H), 5.94-5.84 (m, 1H), 5.29 (ddt, J = 17.2, 1.5, 1.5 Hz, 1H), 5.19 (ddt, J = 10.5, 1.5, 1.5 Hz, 2H), 4.52 (dt, J = 5.3, 1.5 Hz, 2H), 4.32-4.29 (m, 1H), 4.22-4.16 (m, 1H), 4.14-4.11 (m, 1H), 3.52-2.45 (m, 8H), 3.40-3.30 (m, 4H), 3.14-3.02 (m, 5H), 3.01-2.91 (brs, 2H), 2.82 (dd, J = 12.4, 5.1 Hz, 1H), 2.59-2.41 (m, 9H), 2.04 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.95-1.87 (m, 1H), 1.80-1.71 (m, 1H), 1.65-1.57 (m, 5H), 1.54-1.41 (m, 3H), 1.35-1.24 (m, 2H), 0.99 (s, 6H);
LC-MS: [M+H]+ = 838.42.
製造例３４：CPA-346の製造
(1) CPA-345の製造
上記式に示す化合物 (CPA-316)(8.8 mg)およびDMF (1 mL)の混合物に，N-Boc-1,2-ジアミノエタン (7.3 μL)，COMU (22 mg)およびDIPEA (24 μL)を加え，室温にて5時間撹拌した。溶媒を留去し，残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN）で精製して，目的物 (8.3 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.22-8.19 (m, 2H), 7.81-7.70 (brs, 1H), 7.61-7.52 (m, 3H), 4.99-4.87 (brs, 1H), 3.68 (dt, J = 5.7, 5.7 Hz, 2H), 3.45 (dt, J = 5.7, 5.7 Hz, 2H), 1.44 (s, 9H);
LC-MS: [M+H]+ = 333.16.
(2) CPA-346の製造
CPA-345およびCPI-016を用いて、製造例20と同様にして製造した。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.31 (t, J = 5.9 Hz, 1H), 9.43 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 8.15-8.12 (m, 2H), 7.85 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 7.75-7.65 (m, 4H), 6.41 (s, 1H), 6.35 (s, 1H), 4.48 (dd, J = 10.8, 3.5 Hz, 1H), 4.32-4.28 (m, 1H), 4.14-4.10 (m, 1H), 3.70-3.67 (m, 2H), 3.58-3.29 (m, 14H), 3.12-2.89 (m, 7H), 2.84-2.66 (m, 5H), 2.59-2.49 (m, 5H), 2.26-2.19 (m, 5H), 2.04 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.65-1.41 (m, 8H), 1.35-1.24 (m, 2H), 0.91 (s, 6H);
LC-MS: [M+H]+ = 1109.51.
製造例３５：CPA-347の製造
(1) CPI-018HCLの製造
上記式に示す化合物 (CPI-017，異性体比4:3)(63 mg)およびTHF (2 mL)の混合物に，トリフェニルホスフィン (78 mg)およびH2O (0.40 mL)を加え，室温にて一晩撹拌した。1 M HCl水溶液 (0.10 mL)を加え，室温にて1時間撹拌した。1M HCl水溶液 (0.30 mL)を追加し，室温にて1時間撹拌した。60 ℃に昇温し，6時間撹拌した後，室温にて4日間撹拌した。溶媒を留去し，残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN）で精製して，目的物 (39 mg，異性体比10:9)を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 8.20 (dd, J = 8.4, 0.8 Hz, 1H), 7.99 (d, J = 8.8 Hz, 0.9H), 7.69 (d, J = 2.6 Hz, 0.9H), 7.45-7.37 (m, 2 + 0.9H), 4.21-4.15 (m, 2 + 0.9 × 2H), 3.67 (s, 0.9 × 3H), 3.65 (s, 3H), 2.95 (t, J = 7.6 Hz, 2 + 0.9 × 2H), 1.94-1.85 (m, 2 + 0.9 × 2H), 1.76-1.66 (m, 2 + 0.9 × 2H), 1.65-1.45 (m, 4 + 0.9 × 4H);
LC-MS: [M+H]+ = 292.23.
(2) CPI-019の製造
前記で製造した化合物 (CPI-018HCL)(39 mg)，DMF (2 mL)およびDIPEA (93 μL)の混合物に，無水コハク酸 (13 mg)を加え，室温にて一晩撹拌した。溶媒を留去し，残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN）で精製して，目的物 (32 mg，異性体比2:1)を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 8.19 (dd, J = 7.6, 2.0 Hz, 1H), 7.98 (d, J = 8.8 Hz, 0.5H), 7.69 (d, J = 2.6 Hz, 0.5H), 7.45-7.37 (m, 2 + 0.5H), 4.19-4.12 (m, 2 + 0.5 × 2H), 3.66 (s, 0.5 × 3H), 3.64 (s, 3H), 3.19 (t, J = 6.9 Hz, 2 + 0.5 × 2H), 2.60-2.55 (m, 2 + 0.5 × 2H), 2.45 (t, J = 6.8 Hz, 2 + 0.5 × 2H), 1.91-1.82 (m, 2 + 0.5 × 2H), 1.60-1.50 (m, 4 + 0.5 × 4H), 1.48-1.39 (m, 2 + 0.5 × 2H);
LC-MS: [M+H]+ = 392.33.
(3)CPA-347の製造
製造例１８および製造例２０と同様にして製造した（異性体比2:1）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.34 (t, J = 4.9 Hz, 1H), 9.10 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 8.13-9.10 (m, 2.3H), 8.00 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.89-7.63 (m, 8.3H), 7.52 (s, 0.7H), 7.36 (s, 0.7H), 6.43 (s, 1H), 6.36 (s, 1H), 4.31-4.28 (m, 1H), 4.13-4.06 (m, 4H), 3.62-2.89 (m, 36H), 2.81 (dd, J = 12.5, 5.2 Hz, 1H), 2.60-2.49 (m, 3H), 2.37-2.28 (m, 4H), 2.23 (s, 4H), 2.09-2.02 (m, 4H), 1.78-1.71 (m, 2H), 1.65-1.23 (m, 26H), 0.90 (s, 6H);
LC-MS: [M+H]+ = 1500.96.
製造例３６：CPA-353の製造
(1) CPA-348の製造
上記式に示す化合物 (CPA-338)(11 mg)，N-Boc-2,2'-(エチレンジオキシ)ジエチルアミン (2.7 mg)およびDMF (1 mL)の混合物を，60 ℃にて2時間撹拌した。溶媒を留去し，残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN）で精製して，目的物 (10 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.35 (s, 1H), 7.89 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 7.78-7.74 (m, 3H), 6.77 (t, J = 5.3 Hz, 1H), 6.42 (s, 1H), 6.35 (s, 1H), 4.82 (d, J = 12.4 Hz, 1H), 4.75 (d, J = 12.4 Hz, 1H), 4.32-4.29 (m, 1H), 4.14-4.11 (m, 1H), 3.93-3.87 (m, 1H), 3.61-2.92 (m, 33H), 2.82 (dd, J = 12.4, 5.1 Hz, 1H), 2.59-2.49 (m, 1H), 2.27 (s, 4H), 2.10-2.02 (m, 4H), 1.73-1.21 (m, 29H), 0.94 (s, 6H);
LC-MS: [M+H]+ = 1229.65.
(2) CPA-349の製造
前記で製造した化合物 (CPA-348)(10 mg)および1,4-ジオキサン (1 mL)の混合物に，亜鉛 (11 mg)および酢酸 (47 μL)を加え，60 ℃にて30分間撹拌した。亜鉛 (11 mg)を追加し，60 ℃にて30分間撹拌した。溶媒を留去し，残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN，0.1%AcOH含有）で精製して，目的物 (8.6 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.35 (s, 1H), 7.98-7.92 (brs, 1H), 7.75 (t, J = 5.5 Hz, 2H), 6.77 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 6.42 (s, 1H), 6.35 (s, 1H), 6.32-6.29 (m, 1H), 4.14-4.11 (m, 1H), 3.61-3.28 (m, 27H), 3.14-2.92 (m, 9H), 2.82 (dd, J = 12.4, 5.1 Hz, 1H), 2.59-2.49 (m, 1H), 2.27 (s, 4H), 2.10-2.02 (m, 4H), 1.64-1.23 (m, 29H), 0.94 (s, 6H);
LC-MS: [M+H]+ = 1055.66.
(3) CPA-350の製造
前記で製造した化合物 (CPA-349)(8.6 mg)，CPA-311 (2.2 mg)およびDMF (1 mL)の混合物にWSC・HCl (3.1 mg)およびHOBt・H2O (2.5 mg)を加え，室温にて1時間撹拌した。溶媒を留去し，残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN）で精製して，目的物 (2.3 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.34 (s, 1H), 7.96 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.87-7.82 (m, 2H), 7.75-7.73 (m, 2H), 6.80-6.74 (brs, 1H), 6.42 (s, 1H), 6.35 (s, 1H), 5.96-5.86 (m, 1H), 5.32-5.26 (m, 1H), 5.22-5.19 (m, 1H), 4.54-4.53 (m, 2H), 4.32-4.28 (m, 1H), 4.14-4.04 (m, 2H), 3.61-3.16 (m, overlapped with water signal), 3.12-2.89 (m, 11H), 2.82 (dd, J = 12.4, 5.1 Hz, 1H), 2.61-2.49 (m, overlapped with DMSO signal), 2.33-2.22 (m, 10H), 2.10-2.02 (m, 4H), 1.85 (s, 2H), 1.65-1.21 (m, 33H), 0.94 (s, 6H);
LC-MS: [M+H]+ = 1309.01.
(4) CPA-351の製造
前記で製造した化合物 (CPA-350)(2.2 mg)およびDCM (0.50 mL)の混合物にTFA (130 μL)を加え，室温にて1時間撹拌した。溶媒を留去し，残渣にDMF (0.50 mL)，2-チオフェングリオキシル酸 (1.3 mg)，COMU (3.6 mg)およびDIPEA (15 μL)を加え，室温にて1時間撹拌した。溶媒を留去し，残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN）で精製して，目的物 (1.4 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.36-13.33 (m, 1H), 8.88 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 8.19-8.16 (m, 2H), 7.97 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.87-7.83 (m, 2H), 7.77-7.73 (m, 2H), 7.29 (dd, J = 4.8, 4.0 Hz, 1H), 6.42 (s, 1H), 6.35 (s, 1H), 5.96-5.86 (m, 1H), 5.31-5.26 (m, 1H), 5.22-5.19 (m, 1H), 4.53 (dd, J = 5.4, 1.2 Hz, 2H), 4.32-4.28 (m, 1H), 4.14-4.05 (m, 2H), 3.61-2.91 (m, overlapped with water signal), 2.82 (dd, J = 12.4, 5.1 Hz, 1H), 2.61-2.49 (m, overlapped with DMSO signal), 2.34-2.25 (m, 10H), 2.09-2.02 (m, 4H), 1.63-1.19 (m, 26H), 0.92 (s, 6H);
LC-MS: [M+H]+ = 1346.89.
(5) CPA-352の製造
前記で製造した化合物 (CPA-351)(1.4 mg)およびDCM (0.50 mL)の混合物にPd(PPh3)4 (0.1 mg)および1,3-ジメチルバルビツル酸 (0.3 mg)を加え，室温にて1時間撹拌した。溶媒を留去し，残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN）で精製して，目的物 (0.7 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.35-13.33 (m, 1H), 8.94-8.91 (m, 1H), 8.19-8.16 (m, 2H), 8.07-7.99 (m, 1H), 7.94-7.91 (m, 2H), 7.29 (dd, J = 4.8, 3.9 Hz, 1H), 6.47 (s, 1H), 6.37 (s, 1H), 4.31-4.28 (m, 1H), 4.14-4.04 (m, 2H), 3.62-2.94 (m, overlapped with water signal), 2.82 (dd, J = 12.4, 5.1 Hz, 1H), 2.61-2.49 (m, overlapped with DMSO signal), 2.34-2.25 (m, 10H), 2.11-2.03 (m, 4H), 1.94-1.88 (brm, 2H), 1.62-1.11 (m, 24H), 0.92 (s, 6H);
LC-MS: [M+H]+ = 1306.84.
(6) CPA-353の製造
前記で製造した化合物 (CPA-352)(0.7 mg)およびDMF (0.50 mL)の混合物にN-ヒドロキシスクシンイミド (0.6 mg)およびWSC・HCl (1.0 mg)を加え，室温にて16時間撹拌した。N-ヒドロキシスクシンイミド (0.6 mg)およびWSC・HCl (1.0 mg)を追加し，室温にて1時間撹拌した。溶媒を留去し，残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN）で精製して，目的物 (0.7 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.37-13.33 (m, 1H), 8.94-8.87 (m, 1H), 8.19-8.16 (m, 2H), 7.98-7.96 (m, 1H), 7.87-7.83 (m, 2H), 7.76-7.73 (m, 2H), 7.29 (dd, J = 4.9, 3.9 Hz, 1H), 6.42 (s, 1H), 6.36 (s, 1H), 4.31-4.28 (m, 1H), 4.14-4.04 (m, 2H), 3.62-2.79 (m, overlapped with water signal), 2.61-2.25 (m, overlapped with DMSO signal), 2.09-2.02 (m, 4H), 1.63-1.15 (m, 26H), 0.92 (s, 6H);
LC-MS: [M+2H]2+ = 1404.71.
製造例３７：CPI-018の合成
CPI-018の合成
上記式に示す化合物 (CPI-017) (20 mg)，DMF (0.5 mL) および DIPEA (14 μL) の混合物に，無水コハク酸 (2.4 mg) を加え，室温にて一晩撹拌した。反応溶液に AcOEt を加え，水および飽和食塩水で洗浄後，Na2SO4で乾燥した。溶媒を留去し，残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN）で精製して，目的物 (14 mg) を得た。
1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ 4.30-4.23 (m, 1H), 3.53-3.38 (m, 8H), 3.31-3.25 (m, 2H), 3.20-3.13 (m, 4H), 2.54-2.40 (m, 4H), 2.30-2.24 (m, 2H), 2.20-2.10 (m, 1H), 1.89-1.80 (m, 1H), 1.69-1.27 (m, 66H);
LC-MS: [M+H]+ = 1073.20.
製造例３８：CPA-354の製造
CPA-353の合成
前記で製造した化合物 (CPI-018) (5.3 mg)，製造例30 (2) で製造した化合物 (CPA-340) (5.6 mg) およびDMF (0.5 mL) の混合物に，HATU (2.3 mg) および DIPEA (2.6 μL)を加え，室温にて1時間撹拌した。溶媒を留去し，残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS，水/MeCN）で精製して，目的物 (5.8 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 8.20-8.15 (m, 2H), 7.69-7.59 (m, 3H), 4.52-4.47 (m, 1H), 4.33-4.19 (m, 3H), 3.78-3.38 (m, 34H), 3.29-3.10 (m, 11H), 3.00-2.89 (m, 3H), 2.70 (d, J = 12.7 Hz, 1H), 2.64-2.48 (m, 4H), 2.33-2.05 (m, 11H), 1.93-1.27 (m, 87H), 0.97 (s, 6H).
CPA-354の合成
前記で製造した化合物 (CPA-353) (5.8 mg) および DCM (1 mL) の混合物に，TFA (0.5 mL) を加え，室温にて9時間撹拌した。溶媒を留去し，目的物 (4.5 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 8.19-8.15 (m, 2H), 7.69-7.59 (m, 3H), 4.52-4.46 (m, 1H), 4.34-4.20 (m, 3H), 3.80-3.46 (m, 34H), 3.29-3.10 (m, 11H), 3.00-2.89 (m, 3H), 2.74-2.68 (m, 1H), 2.67-2.48 (m, 4H), 2.33-2.09 (m, 11H), 1.93-1.26 (m, 33H), 0.97 (s, 6H);
LC-MS: [M+H]2+ = 923.48.
製造例３９：ラベル化抗体（CPA-321ラベル化抗体）の製造
抗CD71抗体OKT9(#16-0719-85, Thermo Fisher Scientific)，あるいはコントロール抗体としてマウスIgG1アイソタイプコントロール抗体（＃553447，BD Biosciences)を20μLチューブにとり、NHS labeling buffer（25 mM HEPES-NaOH pH 8.2, 150 mM NaCl）で最終濃度約0.1 mg/mlとなるように希釈した。これに製造例２０で製造した化合物（CPA-321）のDMSO溶液（10 mg/ml in DMSO)約1.5μLを加え、室温で2時間反応させた。次いで、これにリジン溶液（100 mM)を約5μL加えて、室温で20分間反応させた。これを脱塩カラム（Zeba Spin, Thermo Sscientific, 89882）に供して脱塩し、CPA-321ラベル化抗体を含む溶液（CPA-321ラベル化抗体溶液）を回収した。
［試験例］
以下に、本発明の四官能性化合物および四官能性ケミカルプローブのうち代表的な化合物を用いた試験結果を示すことにより、本発明の化合物の作用を説明する。但し、本発明はこれらの試験例に限定されるものではない。
試験例１：化合物（CPP-127）を用いた、生細胞からの標的分子の単離と検出
１．細胞培養、及び本化合物による培養細胞の処理方法
ヒトドパミン受容体D2（DRD2）を安定的に発現するCHO-K1細胞を10cmプレート上でコンフルエントになるまで培養した。
細胞を培地にて洗浄後、DMSOもしくは未修飾リガンドを含んだ培地に交換して30分間反応させた。次に、培地を捨て、製造例１２で合成した化合物（CPP-127）を含む培地に交換し、30分間37℃にて静置した。培地を捨て、細胞をPBSにて洗浄し、プレート上の細胞に1 mlのPBSを加えた後、UVクロスリンカーを用いて302 nmのUV光を1分間細胞に照射した。UV照射後の細胞をセルスクレーパーにて回収し、回収した細胞ペレットを－80℃にて凍結保存した。
２．膜画分タンパク質の調製と精製
凍結保存された細胞を50 mM Tris Homogenate Buffer（pH 7.4, 2.5 mM EDTA, 5 mM MgCl2, 320 mMスクロース）で懸濁し、超音波破砕機にてホモジナイズした。ホモジナイズ後の懸濁液を遠心機にて遠心分離した(1,000g, 15分間, 4℃)。遠心後に得られた上清を別のチューブに移し、遠心分離（30,000 ×g, 30分間，4℃）した。遠心後に上清を捨て、沈殿に100mM Sodium Carbonate Buffer（Na2CO3）を加えて超音波破砕機にてホモジナイズし、氷上にて10分間インキュベートした。懸濁液を超遠心（45,2000×g，30分間, 4℃)にて遠心した後に上清を捨て、得られた沈殿をミリＱ水でリンスし、これを膜画分タンパク質とした。
３．膜タンパク質の溶出
上記方法で調製した膜画分タンパク質に膜溶解バッファー（50mM Tris-HCl(pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.1% SDS, 0.5% SDC, 1% Triton-X-100，8M Urea）を加え、超音波粉砕機にて膜画分タンパク質を溶解させた。可溶化した膜タンパク質の溶液にストレプトアビジンビーズ（#88816, Thermo Fisher Scientific)を加え、60分間撹拌混合することでビオチンラベル化タンパク質をビーズに吸着させた。ビーズを膜溶解バッファーにて洗浄後に、0.05％SDSを含む2％N2H4溶液を40μL添加し、室温で30分間静置した。磁気分離によりビーズを除き、溶液を回収した。回収した溶液に20％TFA溶液を加えて中和処理を行った後、遠心エバポレーターにて濃縮した。濃縮液にdithiothreitol及びIodoacetamideを加えて還元及びアルキル化し、トリプシン溶液を加えて37℃で一晩消化した。
４．LC-MS解析、及び標的タンパク質の同定
得られたトリプシン消化物を脱塩精製し、LC-MSにてタンパク質解析を行った。LC-MSは、nano-HPLC 装置（Ultimate 3000, Thermo Scientific）と質量分析装置（Q Exactive, Thermo Scientific)を組み合わせたLC-MSシステムにて行った。Nano-HPLC 装置においては、トラップカラム（C18 Acclaim PepMap, Thermo Scientific） とチップカラム(75μm i.d., 12 cm long, 3 μm C18 particles, 日京テクノス)にて構成されるカラム（固定相）と、移動相に0.1％ギ酸－アセトニトリル系を用いた逆相クロマトグラフィーによるグラジエント分析にて行った。流速は300 nl/minで行い、アセトニトリル濃度を48分かけて4％から35％ に増加させるリニアグラジエントでペプチドを溶出する。質量分析は、ナノエレクトロスプレーによるイオン化を正イオンモードで行った。フルスキャンMSスペクトルはm/z 380～1600で行い、データ依存的取得モードによりプロダクトイオンスペクトルを測定した。LC-MSにて得られたデータは、解析ソフトウェアProteome Discovere 2.2（PD 2.2, Thermo Fisher Scientific)にて解析した。タンパク質同定はPD2.2に備わるサーチエンジンSequestを用い、Uniprotよりダウンロードしたデータベースに対して検索を行った。False discovery rateによる計算を行い、偽陽性タンパク質識別率を１％未満となるようにフィルタリングを行った後，さらに確実な候補タンパク質を選別するため， PSM 値 5 以上のものを同定タンパク質とした。さらに、同定されたUnique peptideの数を用いてデータの絞り込みを行った。定量解析はPD2.2に備わる定量手法LFQにてタンパク質を定量し、未修飾リガンド処理群との定量的な比較解析を行うことで、特異的に回収されたタンパク質を判別した。分析は独立した2回の試験にて実施し、その結果は未修飾リガンド処理群に対する比にて表すことができる。
５．結果
結果を図１に示す。図１に示すように、本発明の四官能性ケミカルプローブ（化合物（CPP-127））を用いた際に，未修飾リガンド処理群でドパミン受容体D2が有意に抑制されることからドパミン受容体D2（DRD2)が特異的に回収されていることが確認された。
試験例２：化合物（CPF-224、CPF-202、CPF-242）を用いた生組織からの標的分子の単離と検出 DBA/2CrSlcマウスにイソフルラン吸入させて麻酔した後に断頭し、素早く脳を取出した。取り出した脳を、0℃の人工脳脊髄液（ACSF：artificial cerebrospinal fluid）に、混合ガス（95％O2，5％CO2）を連続的に通気した状態で60秒間浸漬した。メスで嗅球と小脳を取り除き、振動刃ミクロトーム（Leica，VT1200）のステージに瞬間接着剤を使用して脳を固定した。混合ガスを連続的に通気した状態の0℃ ACSF中で、線条体と海馬を含む脳のスライス切片（0.3 mmの厚さの薄切切片）を作製した。スライス切片を人工脳脊髄液の入ったディッシュに入れ、未修飾リガンドあるいはDMSOを添加し、5分間室温にて静置した。次に、製造例１０で製造した化合物（CPF-224）、もしくは製造例８で製造した化合物（CPF-202）を加え、室温にて30分間静置した。溶液を除去し、スライス切片に302nmのUV光を1分間（CPF-224およびCPF-202）、365nmのUV光を15分間（CPF242）照射した。スライス切片をPBSにて洗浄回収し、遠心分離（3000×g，4℃，5分間）にて上清を除去した。得られたペレットは、試験例１と同様の方法により解析した。分析は独立した2回の試験にて実施し，未修飾リガンド処理群に対する比にて表すことができる。
化合物（CPF-224）を用いた結果を図２に、化合物（CPF-202）を用いた結果を図３に、化合物（CPF-242）を用いた結果を図４にそれぞれ示す。これらの図に示すように、本発明の四官能性ケミカルプローブを用いた際に、未修飾リガンド処理群で脳組織に含まれるAMPA型グルタミン酸受容体（Gria1, Gria2, Gria3, Gria4)及びGABA受容体サブユニット（Gabra1, Gabra2, Gabra5, Gabrg2)がCPF-224、CPF-202及びCPF242を用いてそれぞれが有意に抑制されることから、各膜タンパク質が特異的に回収されていることが確認された。
試験例３：ラベル化抗体を用いた細胞表面抗原の捕捉
製造例２１で製造したCPA-321ラベル化抗CD71抗体あるいはCPA-321ラベル化抗マウスIgG1コントロール抗体を用い、THP-1細胞より抗原分子を取得した。具体的には、THP-1細胞を回収し、SB Buffer（2％FCSを含むPBS Buffer）にて洗浄した。洗浄後の細胞を0.1％ Fc block reagent (Invitrogen, 16-9161-73) を含むSB bufferに懸濁し、4℃にて15分間反応させた。遠心分離（600×g, 3 分間, 4℃）にて上清を除去し、抗体溶液（製造例２１で調製したCPA-321ラベル化抗体溶液（20μg）にSB Bufferを加えて1 mLにしたもの）を加え、4℃にて20分間反応させた。遠心分離にて抗体溶液を除去し、細胞をSB Bufferにて洗浄後に0.5 mlのSB Bufferに懸濁した。細胞懸濁液に302 nmのUV光を1分間照射し、遠心分離にてSB Bufferを除去する。得られた細胞を、試験例１で示した方法により解析した。分析は独立した2回の試験にて実施し、その結果を、抗CD71抗体で取得されたタンパク質の量をマウスIgG1アイソタイプコントロール抗体（抗マウスIgG抗体）に対する比にて表した［図５］。
図５に示すように、2回の分析においてTFRC（CD71）が有意に取得されることが確認された。
試験例４～１３：ラベル化抗体を用いた細胞表面抗原の捕捉（１）
表１に示したラベル化抗体を用い、表１に示した細胞より抗原分子を探索した。具体的には、表１に示した細胞をSB Buffer（2％FCSを含むPBS Buffer）にて洗浄し， 0.1％ Fc block reagent (Invitrogen, 16-9161-73) を含むSB bufferに懸濁後，4℃にて15分間反応させた。遠心分離（600×g, 3 分間, 4℃）にて上清を除去し、ラベル化抗体の製造に従い製造したラベル化抗体含有溶液を加え、4℃にて20分間反応させた。遠心分離にて抗体溶液を除去し、細胞をSB Bufferにて洗浄後に0.5 mlのSB Bufferに懸濁した。細胞懸濁液に表に示した波長の紫外線を表に示した時間照射し、遠心分離にてSB Bufferを除去した。回収した細胞を、試験例１で示した方法により解析した。試験は独立した2回の試験にて実施し、表に示した分析対象膜タンパクの検出量を比較した（図６～図８）。
ラベル化抗体の製造（試験例４～１２）
表１に示した抗体をチューブにとり、NHS labeling buffer（25 mM HEPES-NaOH pH 8.2, 150 mM NaCl）で最終濃度約0.05 mg/mlとなるように希釈した。これに表１に示したプローブのDMSO溶液（10 mg/ml in DMSO)約0.9 μLをそれぞれ加え、室温で2時間反応させた。次いで、これにリジン溶液（100 mM)を約5μL加えて、室温で20分間反応させ，使用時まで4℃にて保存した。
ラベル化リガンドの製造（試験例13）
His-Tag EGFを12.5 μgチューブにとり、NHS labeling bufferで最終濃度約0.25 mg/mlとなるように希釈した。この溶液48μLに，5 mM CPA-354を2 μL加えたものをラベル化リガンド溶液とした。この溶液は，使用時まで4℃にて保存した。
試験例14：ラベル化抗体を用いた細胞表面抗原の捕捉（２）
下表で製造したラベル化OKT9を用い、A431細胞より抗原分子を探索した。まず，細胞をSB Buffer（2％FCSを含むPBS Buffer）にて洗浄した後，0.1％ Fc block reagent (Invitrogen, 16-9161-73) を含むSB bufferを加え，4℃にて15分間反応させた。上清を除去し、SB Bufferで10倍希釈したリガンド溶液を250μL加え、4℃にて20分間反応させた。リガンド溶液を除去し、細胞をPBSにて洗浄後，302 nmのUV光を1.5分間照射した。1% NP-40を含む溶解バッファーにて細胞よりタンパク質を抽出し、試験例１で示した方法により解析した。また，プローブ化されていないOKT9抗体を陰性対照として用い（No Probe)，それぞれのプローブ化リガンドによるCD71の検出量を比較した（図９）。
ラベル化抗体の製造
(1) 抗CD71抗体OKT9 (Thermo Fisher Scientific, Cat # 16-0719-85)を10 μgチューブにとり、NHS labeling buffer（25 mM HEPES-NaOH pH 8.2, 150 mM NaCl）で最終濃度約0.1 mg/mlとなるように希釈した。これにCPA-321溶液（10 mg/ml in DMSO)を0.9 μL加え、室温で2時間反応させた。次いで、これにリジン溶液（100 mM)を約5μL加えて、室温で20分間反応させ，使用時まで4℃にて保存した。
(2) 抗CD71抗体OKT9 を10 μgチューブにとり，5μLの30 mM Sodium Periodate (in Phosphate Buffer pH 6.5)を加えた後，Phosphate buffer pH 6.5を加えて総液量を100 μLとした。室温にて15分間反応後に，ZabaSpinカラム（Thermo Scientific)を用いてPBSに溶媒交換した。得られた抗体溶液100 μLに対し，500 mM 5-MA水溶液を1 μL加え，続いて10 mg/ml のCPA-342あるいはCPA-344 DMSO溶液を1 μL加えた後，室温遮光条件下にて1.5時間反応させた。反応後，ZabaSpinカラムを用いてPBSに溶媒交換し，余剰試薬を除去した。
試験例１７：ラベル化抗体を用いた細胞表面抗原の補足（二次抗体法）
CBP-198ラベル化二次抗体の製造方法で製造したラベル化二次抗体を用い、THP-1細胞より抗原分子を探索した。具体的には、THP-1細胞をSB Buffer（2％FCSを含むPBS Buffer）にて洗浄し， 0.1％ Fc block reagent (Invitrogen, 16-9161-73) を含むSB bufferに懸濁後，4℃にて15分間反応させた。遠心分離（600×g, 3 分間, 4℃）にて上清を除去した。細胞に，SB Bufferで5 μg/ mLに希釈した抗CD71抗体DF1513溶液を加え，4℃にて20分間反応させた。遠心分離にて抗体溶液を除去し、細胞をSB Bufferにて洗浄した。次に，細胞をCPA-503ラベル化二次抗体の製造方法で製造したラベル化二次抗体にSB Bufferを加えて1 mLにしたもの）に懸濁し，4℃にて20分間反応させた。遠心分離にて抗体溶液を除去し、細胞をSB Bufferにて洗浄後に0.5 mlのSB Bufferに懸濁した。365 nmのUV光を15分間照射し、遠心分離にてSB Bufferを除去した。回収した細胞を、試験例１で示した方法により解析した。試験は独立した2回の試験にて実施し、CD71の検出量を比較した。
比較例として、抗CD71抗体OKT9を抗CD71抗体DF1513以外は試験例１１と同様にして、CD71の検出量を算出した（図１０）。
CPA-503ラベル化二次抗体の製造
Goat anti-mouse IgG (5μg)をチューブにとり、NHS labeling buffer（25 mM HEPES-NaOH pH 8.2, 150 mM NaCl）で表に示した最終濃度約0.05 mg/mとなるように希釈した。CPA-503のDMSO溶液（10 mg/ml in DMSO)約0.9 μLをそれぞれ加え、室温で2時間反応させた。次いで、これにリジン溶液（100 mM)を約5μL加えて、室温で20分間反応させ，使用時まで4℃にて保存した。
二次抗体法を用いることにより、一次抗体法では検出することができなかった膜タンパク質を検出することができる。
配列番号１及び２は、いずれも本発明の四官能性化合物または四官能性ケミカルプローブの切断可能部位（Ｅ）を構成する化合物の一態様であるペプチドのアミノ酸配列である。

Claims (5)

  1. リガンド結合部位（Ａ）、反応性部位（Ｄ）、切断可能部位（Ｅ）、及びビオチン部位（Ｂ）が、スペーサーを介して、連結してなる四官能性化合物であって、
    該四官能性化合物は、下記式（Ｉ）又は下記式（ＩＩ）で示され、
    （式中、Ａ、Ｄ、Ｅ及びＢは、それぞれリガンド結合部位（Ａ）、反応性部位（Ｄ）、切断可能部位（Ｅ）及びビオチン部位（Ｂ）を示し、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５、Ｓ６及びＳ７は互いに独立してスペーサーを意味する。）
    前記リガンド結合部位（Ａ）は、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル基であり、
    前記反応性部位（Ｄ）は、前記四官能性化合物が式（Ｉ）の構造を採用する場合には式（２）で示される基〔この時、式（２）におけるｎは１である。〕または（２´－１）で示される基であり、前記四官能性化合物が式（ＩＩ）の構造を採用する場合には式（２）で示される基〔この時、式（２）におけるｎは０である。〕、式（２´－２）で示される基、またはベンゾフェノン構造（moiety）を有する基であり、
    （式中、＊は、隣接する基との結合を意味する。）
    前記切断可能部位（Ｅ）は、下式（３）で表されるＤｄｅの構造を有する基であり、
    （式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、各々独立して水素原子または炭素数１～６のアルキル基を意味する。＊は、隣接する基との結合を意味する。）
    前記ビオチン部位（Ｂ）は、下式（１）で示される基であり、
    （式中、＊は、隣接する基との結合を意味する。）；
    前記スペーサーが、直鎖若しくは分岐鎖状の炭素数１以上２０以下のアルキレン基、または直鎖若しくは分岐鎖状の炭素数３以上２０以下のアルキレン基において、隣接しない－ＣＨ２－基が互いに独立して、－Ｏ－、－ＮＲａ－［Ｒａは水素原子または炭素数１～６のアルキル基を意味する。以下同じ。］、－ＣＯ－ＮＲａ－、－ＮＲａ－ＣＯ－からなる群より選択される少なくとも１つの架橋基で置換されてなる基である、
    又は、下記式（ＩＩＩ）～（Ｖ）の何れかで表される、四官能性化合物。
  2. 下式（i）、（ii）または（iii）で示される化合物である、請求項１に記載する四官能性化合物：
    （式中、ｐは２を示す。）
  3. 請求項１若しくは２に記載する四官能性化合物のリガンド結合部位（Ａ）に、該リガンド結合部位（Ａ）中の遊離官能基に置き替えてリガンドが結合してなる四官能性ケミカルプローブ、又は下記式（ＶＩ）～（ＩＸ）の何れかで表される四官能性ケミカルプローブ。
  4. 前記リガンドが、生細胞または生組織に由来する膜タンパク質に親和性を有するタンパク質、ペプチド、脂質、糖及び低分子化合物からなる群より選択されるいずれかである、請求項３に記載する四官能性ケミカルプローブ。
  5. 請求項３又は４に記載する四官能性ケミカルプローブを用いた、細胞または組織中の標的タンパク質の検出方法であって、
    （１）細胞または組織に四官能性ケミカルプローブを反応させて、四官能性ケミカルプローブ中のリガンドと標的タンパクとを結合させる工程、
    （２）四官能性ケミカルプローブ中の反応性部位（Ｄ）と標的タンパク質との間で共有結合を形成させる工程、
    （３）四官能性ケミカルプローブが結合した標的タンパク質を含む画分を精製する工程、（４）四官能性ケミカルプローブ中のビオチン部位をアビジンと結合させて、四官能性ケミカルプローブ－アビジン複合体を形成する工程、
    （５）形成した四官能性ケミカルプローブ－アビジン複合体を、四官能性ケミカルプローブ中の切断可能部位で開裂する工程、及び
    （６）標的タンパク質を含有する画分を検出する工程
    の工程を含む標的タンパク質の検出方法。
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