JP7756391B2 - 改変光受容クロライドチャネル - Google Patents

Description

本開示は、改変光受容クロライドチャネルに関する。

視細胞は、網膜外層に存在する光受容細胞であり、受容した光を電気信号に変換して網膜神経細胞へと伝達する。視細胞が何らかに理由により変性または消失すると光情報伝達が阻害され、視力の低下や失明に至る。視細胞の光受容には光受容タンパク質が関与しており、光受容タンパク質の遺伝子導入により視機能の回復を図る研究が進められている。例えば、緑藻の一種であるグィラルディア・セータ（Ｇｕｉｌｌａｒｄｉａ ｔｈｅｔａ）の光受容クロライドチャネルであるグィラルディア・セータ アニオンチャネルロドプシン－１（Ｇｕｉｌｌａｒｄｉａ ｔｈｅｔａ ａｎｉｏｎ ｃｈａｎｎｅｌ ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ １，本明細書中ＧｔＡＣＲ１とも記載する）（非特許文献１）が注目されており、ＧｔＡＣＲ１のＡｒｇ８３およびＡｓｎ２３９をＧｌｕに置換した改変光受容クロライドチャネルも報告されている（非特許文献２）。このように、光遺伝学（オプトジェネティクス）による視機能回復のため、優れた光反応特性を有する改変光受容クロライドチャネルが望まれている。

Ｇｏｖｏｒｕｎｏｖａ，Ｅ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒａｌ ｌｉｇｈｔ－ｇａｔｅｄ ａｎｉｏｎ ｃｈａｎｎｅｌｓ：ａ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｒｈｏｄｏｐｓｉｎｓ ｆｏｒ ａｄｖａｎｃｅｄ ｏｐｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３４９，６４７－６５０（２０１５） Ｈｉｄｅａｋｉ Ｅ．Ｋａｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｇａｔｉｎｇ ｉｎ ａｎｉｏｎ ｃｈａｎｎｅｌｒｈｏｄｏｐｓｉｎｓ．，Ｎａｔｕｒｅ，５６１，３４９－３５４（２０１８）

本開示は、光反応特性に優れる改変光受容クロライドチャネルを提供することを目的とする。本開示はまた、かかる改変光受容クロライドチャネルをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、およびかかる改変光受容クロライドチャネルを発現する細胞を提供することを目的とする。本開示はまた、網膜外層の障害を患う被検体を治療するための医薬組成物および方法を提供することを目的とする。

一態様において、本開示は、ＧｔＡＣＲ１のアミノ酸配列において少なくとも３番目の膜貫通ドメインから６番目の膜貫通ドメインまでの領域がＧｔＡＣＲ２の対応する領域で置換されたアミノ酸配列を含む改変光受容クロライドチャネルに関する。

一態様において、本開示は、前記改変光受容クロライドチャネルをコードするポリヌクレオチドに関する。

一態様において、本開示は、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターに関する。

一態様において、本開示は、前記改変光受容クロライドチャネルを発現する細胞に関する。

一態様において、本開示は、網膜外層の障害を患う被検体を治療するための、前記改変光受容クロライドチャネル、前記ポリヌクレオチド、前記発現ベクター、または前記細胞を含む医薬組成物に関する。

一態様において、本開示は、網膜外層の障害を患う被検体を治療する方法であって、前記改変光受容クロライドチャネル、前記ポリヌクレオチド、前記発現ベクター、または前記細胞を前記被検体に投与することを含む方法に関する。

本開示により、光反応特性に優れる改変光受容クロライドチャネル、かかる改変光受容クロライドチャネルをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、およびかかる改変光受容クロライドチャネルを発現する細胞が提供される。また、本開示により、前記改変光受容クロライドチャネル、ポリヌクレオチド、発現ベクター、または細胞を含む網膜外層の障害を患う被検体を治療するための医薬組成物、および前記改変光受容クロライドチャネル、ポリヌクレオチド、発現ベクター、または細胞を網膜外層の障害の患う被検体に投与することを含む網膜外層の障害の治療方法が提供される。

図１は、野生型（ＧｔＡＣＲ１およびＧｔＡＣＲ２）および改変型（６０１、６０２、６０３、６０５、６０６）の光受容クロライドチャネルの構造を示す。黒ボックスおよび実線の領域はＧｔＡＣＲ１に由来し、白ボックスおよび破線の領域はＧｔＡＣＲ２に由来する。 図２は、組換え体６０５の発現のためのベクターマップを示す。 図３は、ＧｔＡＣＲ１およびＧｔＡＣＲ２、並びに組換え体６０５および６０６の光誘発電流を示す。 図４は、ＧｔＡＣＲ２、並びに組換え体６０５および６０６のτｏｎ（開速度：光照射を始めてからチャネルが開くまでの時間）を示す。 図５は、ＧｔＡＣＲ２、並びに組換え体６０５および６０６のτｏｆｆ（閉速度：光照射を止めてからチャネルが閉じるまでの時間）を示す。

特に具体的な定めのない限り、本明細書で使用される用語は、有機化学、医学、薬学、分子生物学、微生物学等の分野における当業者に一般に理解されるとおりの意味を有する。以下にいくつかの本明細書で使用される用語についての定義を記載するが、これらの定義は、本明細書において、一般的な理解に優先する。

本明細書において、アミノ酸残基は、通常のように、以下の略号で表される。

ＡｌａまたはＡ：アラニン
ＡｒｇまたはＲ：アルギニン
ＡｓｎまたはＮ：アスパラギン
ＡｓｐまたはＤ：アスパラギン酸
ＣｙｓまたはＣ：システイン
ＧｌｎまたはＱ：グルタミン
ＧｌｕまたはＥ：グルタミン酸
ＧｌｙまたはＧ：グリシン
ＨｉｓまたはＨ：ヒスチジン
ＩｌｅまたはＩ：イソロイシン
ＬｅｕまたはＬ：ロイシン
ＬｙｓまたはＫ：リジン
ＭｅｔまたはＭ：メチオニン
ＰｈｅまたはＦ：フェニルアラニン
ＰｒｏまたはＰ：プロリン
ＳｅｒまたはＳ：セリン
ＴｈｒまたはＴ：スレオニン
ＴｒｐまたはＷ：トリプトファン
ＴｙｒまたはＹ：チロシン
ＶａｌまたはＶ：バリン

本明細書において、あるアミノ酸配列におけるアミノ酸残基は、そのアミノ残基を表す略号と位置を表す数字とで（例えば、９２番目のトリプトファン残基を「Ｔｒｐ９２」として）示されることがある。

本開示は、改変光受容クロライドチャネルに関する。光受容クロライドチャネルとは、光に反応して開閉するクロライドチャネルを意味する。本開示において、改変光受容クロライドチャネルとは、天然に存在する光受容クロライドチャネルとは異なるアミノ酸配列からなる光受容クロライドチャネルを意味する。本開示の改変光受容クロライドチャネルは、グィラルディア・セータ（Ｇｕｉｌｌａｒｄｉａ ｔｈｅｔａ）の光受容クロライドチャネルであるグィラルディア・セータ アニオンチャネルロドプシン－１（Ｇｕｉｌｌａｒｄｉａ ｔｈｅｔａ ａｎｉｏｎ ｃｈａｎｎｅｌ ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ １，本明細書中ＧｔＡＣＲ１とも記載する）およびグィラルディア・セータ アニオンチャネルロドプシン－２（Ｇｕｉｌｌａｒｄｉａ ｔｈｅｔａ ａｎｉｏｎ ｃｈａｎｎｅｌ ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ ２，本明細書中ＧｔＡＣＲ２とも記載する）それぞれのアミノ酸配列の一部を含む。ＧｔＡＣＲ１およびＧｔＡＣＲ２の代表的アミノ酸配列を配列番号１および２にそれぞれ示す。

ＧｔＡＣＲ１およびＧｔＡＣＲ２は、７回膜貫通タンパク質であり、７つの膜貫通ドメインを有する。本明細書において、タンパク質のあるドメインについて「ｎ番目」というとき、Ｎ末端側から数えてｎ番目のドメインを意味する。具体的には、「ｎ番目の膜貫通ドメイン」とは、Ｎ末端側から数えてｎ番目の膜貫通ドメインを意味する。ＧｔＡＣＲ１およびＧｔＡＣＲ２において、そのＮ末端から１番目の膜貫通ドメインまで、２番目の膜貫通ドメインと３番目の膜貫通ドメインの間、４番目の膜貫通ドメインと５番目の膜貫通ドメインの間、６番目の膜貫通ドメインと７番目の膜貫通ドメインの間の領域は、細胞外ドメインであり、１番目の膜貫通ドメインと２番目の膜貫通ドメインの間、３番目の膜貫通ドメインと４番目の膜貫通ドメインの間、５番目の膜貫通ドメインと６番目の膜貫通ドメインの間、および７番目の膜貫通ドメインからＣ末端までの領域は、細胞内ドメインである。

本開示の改変光受容クロライドチャネルは、ＧｔＡＣＲ１のアミノ酸配列において少なくとも３番目の膜貫通ドメインから６番目の膜貫通ドメインまでの領域がＧｔＡＣＲ２の対応する領域で置換されたアミノ酸配列を含む。改変光受容クロライドチャネルは、ＧｔＡＣＲ１のアミノ酸配列において３番目の膜貫通ドメインから６番目の膜貫通ドメインまでの領域がＧｔＡＣＲ２の対応する領域で置換されていることに加え、ＧｔＡＣＲ１のアミノ酸配列における他のドメインまたは領域が改変されていてもよい。例えば、改変光受容クロライドチャネルは、ＧｔＡＣＲ１のアミノ酸配列において３番目の膜貫通ドメインから６番目の膜貫通ドメインまでの領域に加え、２番目の膜貫通ドメインと３番目の膜貫通ドメインの間の細胞外ドメイン、および／または、６番目の膜貫通ドメインと７番目の膜貫通ドメインの間の細胞外ドメインが、ＧｔＡＣＲ２の対応する領域でさらに置換されたアミノ酸配列を含んでもよい。例えば、改変光受容クロライドチャネルは、ＧｔＡＣＲ１のアミノ酸配列において３番目の膜貫通ドメインから６番目の膜貫通ドメインまでの領域に加え、６番目の膜貫通ドメインと７番目の膜貫通ドメインの間の細胞外ドメインが、ＧｔＡＣＲ２の対応する領域で置換されたアミノ酸配列を含みうる。

一実施形態において、改変光受容クロライドチャネルは、ＧｔＡＣＲ１のアミノ酸配列において少なくとも２番目の膜貫通ドメインから６番目の膜貫通ドメインまでの領域がＧｔＡＣＲ２の対応するドメインで置換されたアミノ酸配列を含む。改変光受容クロライドチャネルは、ＧｔＡＣＲ１のアミノ酸配列において２番目の膜貫通ドメインから６番目の膜貫通ドメインまでの領域に加え、１番目の膜貫通ドメインと２番目の膜貫通ドメインの間の細胞内ドメイン、および／または、６番目の膜貫通ドメインと７番目の膜貫通ドメインの間の細胞外ドメインが、ＧｔＡＣＲ２の対応するドメインでさらに置換されたアミノ酸配列を含んでもよい。例えば、改変光受容クロライドチャネルは、ＧｔＡＣＲ１のアミノ酸配列において２番目の膜貫通ドメインから６番目の膜貫通ドメインまでの領域に加え、６番目の膜貫通ドメインと７番目の膜貫通ドメインの間の細胞外ドメインが、ＧｔＡＣＲ２の対応するドメインでさらに置換されたアミノ酸配列を含みうる。

配列番号１および２における７つの膜貫通ドメイン（TM1～7）を以下に示す。配列番号１において、３番目の膜貫通ドメインから６番目の膜貫通ドメインまでの領域はＴｒｐ９２～Ｐｈｅ２１３であり、２番目の膜貫通ドメインから６番目の膜貫通ドメインまでの領域はＧｌｕ６０～Ｐｈｅ２１３である。配列番号２において、３番目の膜貫通ドメインから６番目の膜貫通ドメインまでの領域はＴｒｐ８８～Ｉｌｅ２０９であり、２番目の膜貫通ドメインから６番目の膜貫通ドメインまでの領域はＧｌｕ５６～Ｉｌｅ２０９である。

一実施形態において、改変光受容クロライドチャネルは、ＧｔＡＣＲ１のアミノ酸配列において３番目の膜貫通ドメインから６番目の膜貫通ドメインまでの領域、および、６番目の膜貫通ドメインと７番目の膜貫通ドメインの間の細胞外ドメインが、ＧｔＡＣＲ２の対応する領域で置換されたアミノ酸配列を含む。かかる改変光受容クロライドチャネルの代表的アミノ酸配列を配列番号６に示す。以下において、ＧｔＡＣＲ２に由来する配列を太字で示す。

一実施形態において、改変光受容クロライドチャネルは、ＧｔＡＣＲ１のアミノ酸配列において２番目の膜貫通ドメインから６番目の膜貫通ドメインまでの領域、および、６番目の膜貫通ドメインと７番目の膜貫通ドメインの間の細胞外ドメインが、ＧｔＡＣＲ２の対応する領域で置換されたアミノ酸配列を含む。かかる改変光受容クロライドチャネルの代表的アミノ酸配列を配列番号７に示す。以下において、ＧｔＡＣＲ２に由来する配列を太字で示す。

改変光受容クロライドチャネルは、クラミドモナス・レインハルトチイ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）の光受容タンパク質であるクラミドモナス・レインハルトチイ チャネルロドプシン－１（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ ｃｈａｎｎｅｌ ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ １）（本明細書中ＣｈＲ１とも記載する）のＮ末端領域の全体または一部のアミノ酸配列をＮ末端に含んでもよい。ＣｈＲ１のＮ末端領域は、細胞膜上、特に哺乳類細胞膜上での局在発現に関与することが知られている。本明細書において「ＣｈＲ１のＮ末端領域」とは、ＣｈＲ１のＮ末端から１番目の膜貫通ドメインまでの領域を意味する。ＣｈＲ１のＮ末端領域は、改変光受容クロライドチャネルにおいて、ＧｔＡＣＲ１のアミノ酸配列のＮ末端に付加されてもよく、ＧｔＡＣＲ１のＮ末端から１番目の膜貫通ドメインまでの領域の全体または一部と置換されてもよい。一実施形態において、ＣｈＲ１のＮ末端領域は、ＧｔＡＣＲ１のアミノ酸配列のＮ末端に付加されている。

一実施形態において、改変光受容クロライドチャネルは、下記（ａ－１）～（ｃ－１）から選択されるいずれかのアミノ酸配列を含む、または前記アミノ酸配列からなる。
（ａ－１）配列番号６のアミノ酸配列、
（ｂ－１）配列番号６のアミノ酸配列において１個または複数個のアミノ酸が改変されたアミノ酸配列、および
（ｃ－１）配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列。
一実施形態において、改変光受容クロライドチャネルは、配列番号６のアミノ酸配列を含む、または前記アミノ酸配列からなる。

一実施形態において、改変光受容クロライドチャネルは、下記（ａ－２）～（ｃ－２）から選択されるいずれかのアミノ酸配列を含む、または前記アミノ酸配列からなる。
（ａ－２）配列番号７のアミノ酸配列、
（ｂ－２）配列番号７のアミノ酸配列において１個または複数個のアミノ酸が改変されたアミノ酸配列、および
（ｃ－２）配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列。
一実施形態において、改変光受容クロライドチャネルは、配列番号７のアミノ酸配列を含む、または前記アミノ酸配列からなる。

アミノ酸の改変には、欠失、置換、付加、および挿入が含まれる。アミノ酸配列が複数個のアミノ酸の改変を含む場合、各アミノ酸の改変は欠失、置換、付加、および挿入から独立に選択される。アミノ酸の改変は、１～３０個、１～２０個、１～１０個、１～９個、１～８個、１～７個、１～６個、１～５個、１～４個、１～３個、１個または２個でありうる。

本明細書において、アミノ酸配列または塩基配列についての「配列同一性」とは、比較対象の配列と、その配列の全領域にわたって最適な状態に（一致が最大となる状態に）アラインメントされた配列の、２つの配列間で一致するアミノ酸残基または塩基の割合を意味する。２つの配列の最適なアラインメントにおいて、付加または欠失（例えばギャップ等）が存在してもよい。配列同一性は、公共のデータベース（例えば、DDBJ（http://www.ddbj.nig.ac.jp））で提供されるＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ等のプログラムを用いて算出することができる。あるいは、市販の配列解析ソフトウェア（例えば、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（登録商標）ソフトウェア、ＧＥＮＥＴＹＸ（登録商標）ｖｅｒ．１２）を用いて求めることもできる。配列同一性は、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％でありうる。

改変光受容クロライドチャネルのアミノ酸長は、例えば、２６０、２７０、２８０、または２９０アミノ酸以上、４００、３９０、３８０、３７０、３６０、３５０、３４０、３３０、３２０、３１０、または３００アミノ酸以下でありうる。

一実施形態において、改変光受容クロライドチャネルは、配列番号６または７のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等の生物学的活性を有する。生物学的活性には、光誘発電流、波長感受域、τｏｎ、およびτｏｆｆが含まれる。改変光受容クロライドチャネルが参照ポリペプチドと「同等の生物学的活性を有する」という場合、少なくとも１つの生物学的活性が参照ポリペプチドと同等であることを意味する。生物学的活性は、実施例に記載のように測定することができる。一実施形態において、改変光受容クロライドチャネルは、参照ポリペプチドの光誘発電流、τｏｎ、またはτｏｆｆの、７０％、８０％、または９０％以上、１３０％、１２０％、または１１０％以下の光誘発電流、τｏｎ、またはτｏｆｆを有する。一実施形態において、改変光受容クロライドチャネルは、４００ｎｍ～５６０ｎｍの波長感受域を有する。

本開示の改変光受容クロライドチャネルは、遺伝子工学的手法により製造することができる。例えば、改変光受容クロライドチャネルは、改変光受容クロライドチャネルをコードするポリヌクレオチド（以下、本開示のポリヌクレオチドともいう）を用いて、調製することができる。配列番号６および７のアミノ酸配列をコードする塩基配列の例をそれぞれ配列番号１３および１４に示す。

配列番号１３：
ATGAGCAGCATCACCTGTGATCCCGCCATCTACGGCGAGTGGTCCCGCGAGAATCAGTTCTGCGTGGAAAAGAGCCTGATCACCCTGGACGGCATCAAATACGTGCAGCTGGTCATGGCCGTGGTGTCCGCTTGCCAGGTGTTCTTCATGGTCACACGGGCCCCTAAGGTGCCCTGGGAAGCTATCTACCTGCCTACCACCGAGATGATCACCTACAGCCTGGCCTTCACCGGCAACGGCTATATCAGAGTGGCCAACGGCAAGTACCTGCCTTGGAGCCGAATGGCCTCCTGGCTGTGCACCTGTCCAATCATGCTGGGACAGATTTCTAACATGGCTCTGGTGAAGTACAAAAGTATCCCACTGAACCCTATCGCTCAGGCCGCCAGCATCATCAGAGTCGTGATGGGCATCACCGCCACCATCTCTCCAGCCGAGTATATGAAGTGGCTGTTCTTCTTCTTCGGCGCCACCTGTCTGGTGTTCGAGTACAGCGTGGTGTTCACCATCTTCCAAGTGGGCCTGTACGGCTTCGAGAGCGTGGGAACACCTCTGGCTCAGAAAGTGGTCGTGCGGATCAAGATGCTGCGGCTGATCTTCTTTATCGCCTGGACCATGTTTCCCATCGTGTGGCTGATTAGCCCCACCGGCGTGTGTGTGATCCACGAGAATACCAGCAGCGTGCTGTACCTGCTGGGAGATGCCCTGTGCAAGAATACCTACGGCATCCTGCTGTGGGCCACCACATGGGGACTGCTGAATGGCAAGTGGGACAGAGACTACGTGAAGGGCAGAAACGTGGACGGCACCCTGATGCCTGAGTACGAGCAGGATCTGGAAAAGGGCAACACCGAGAGATACGAGGATGCCAGAGCTGGCGAAACG

配列番号１４：
ATGAGCAGCATCACCTGTGATCCCGCCATCTACGGCGAGTGGTCCCGCGAGAATCAGTTCTGCGTGGAAAAGAGCCTGATCACCCTGGACGGCATCAAATACGTGCAGCTGGTCATGGCCGTGGTGTCCGCTTGCCAGGTGTTCTTCATGGTCACACGGGCCCCTAAGGTGCCCTGGGAGTCCGTGTACCTGCCCTTTGTCGAATCTATCACTTATGCACTGGCCAGTACTGGCAACGGAACCCTGCAGATGAGGGACGGCAGATTCTTTCCTTGGAGCCGAATGGCCTCCTGGCTGTGCACCTGTCCAATCATGCTGGGACAGATTTCTAACATGGCTCTGGTGAAGTACAAAAGTATCCCACTGAACCCTATCGCTCAGGCCGCCAGCATCATCAGAGTCGTGATGGGCATCACCGCCACCATCTCTCCAGCCGAGTATATGAAGTGGCTGTTCTTCTTCTTCGGCGCCACCTGTCTGGTGTTCGAGTACAGCGTGGTGTTCACCATCTTCCAAGTGGGCCTGTACGGCTTCGAGAGCGTGGGAACACCTCTGGCTCAGAAAGTGGTCGTGCGGATCAAGATGCTGCGGCTGATCTTCTTTATCGCCTGGACCATGTTTCCCATCGTGTGGCTGATTAGCCCCACCGGCGTGTGTGTGATCCACGAGAATACCAGCAGCGTGCTGTACCTGCTGGGAGATGCCCTGTGCAAGAATACCTACGGCATCCTGCTGTGGGCCACCACATGGGGACTGCTGAATGGCAAGTGGGACAGAGACTACGTGAAGGGCAGAAACGTGGACGGCACCCTGATGCCTGAGTACGAGCAGGATCTGGAAAAGGGCAACACCGAGAGATACGAGGATGCCAGAGCTGGCGAAACG

一実施形態において、改変光受容クロライドチャネルをコードするポリヌクレオチドは、下記（ｄ－１）～（ｆ－１）から選択される：
（ｄ－１）配列番号６のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、または前記塩基配列からなる、ポリヌクレオチド、
（ｅ－１）配列番号６のアミノ酸配列において１個または複数個のアミノ酸が改変されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、または前記塩基配列からなる、ポリヌクレオチド、および
（ｆ－１）配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、または前記塩基配列からなる、ポリヌクレオチド。
一実施形態において、改変光受容クロライドチャネルをコードするポリヌクレオチドは、配列番号６のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、または前記塩基配列からなる。

一実施形態において、改変光受容クロライドチャネルをコードするポリヌクレオチドは、下記（ｄ－２）～（ｆ－２）から選択される：
（ｄ－２）配列番号７のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、または前記塩基配列からなる、ポリヌクレオチド、
（ｅ－２）配列番号７のアミノ酸配列において１個または複数個のアミノ酸が改変されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、または前記塩基配列からなる、ポリヌクレオチド、および
（ｆ－２）配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、または前記塩基配列からなる、ポリヌクレオチド。
一実施形態において、改変光受容クロライドチャネルをコードするポリヌクレオチドは、配列番号７のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、または前記塩基配列からなる。

一実施形態において、改変光受容クロライドチャネルをコードするポリヌクレオチドは、下記（ｇ－１）～（ｉ－１）から選択される：
（ｇ－１）配列番号１３の塩基配列を含む、または前記塩基配列からなる、ポリヌクレオチド、
（ｈ－１）配列番号１３の塩基配列を含む、または前記塩基配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、および
（ｉ－１）配列番号１３の塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する塩基配列を含む、または前記塩基配列からなる、ポリヌクレオチド。
一実施形態において、改変光受容クロライドチャネルをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１３の塩基配列を含む、または前記塩基配列からなる。

一実施形態において、改変光受容クロライドチャネルをコードするポリヌクレオチドは、下記（ｇ－２）～（ｉ－２）から選択される：
（ｇ－２）配列番号１４の塩基配列を含む、または前記塩基配列からなる、ポリヌクレオチド、
（ｈ－２）配列番号１４の塩基配列を含む、または前記塩基配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、および
（ｉ－２）配列番号１４の塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する塩基配列を含む、または前記塩基配列からなる、ポリヌクレオチド。
一実施形態において、改変光受容クロライドチャネルをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１４の塩基配列を含む、または前記塩基配列からなる。

本明細書において、ストリンジェントな条件でのハイブリダイゼーションとは、例えば、３０～５０℃、３～４×ＳＳＣ（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．２）、０．１～０．５％ＳＤＳ中で１～２４時間のハイブリダイゼーション、好ましくは４０～４５℃、３．４×ＳＳＣ、０．３％ＳＤＳ中で１～２４時間のハイブリダイゼーション、そしてその後の洗浄を含む。洗浄条件としては、例えば、２×ＳＳＣと０．１％ＳＤＳとを含む溶液、および１×ＳＳＣ溶液および／または０．２×ＳＳＣ溶液による室温での連続した洗浄などの条件が挙げられる。上記条件の組み合わせは例示であり、当業者であればハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記の要素や他の要素（例えば、ハイブリダーゼーションプローブの濃度、長さおよびＧＣ含量、ハイブリダイゼーションの反応時間など）を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することができる。

改変光受容クロライドチャネルをコードするポリヌクレオチドの塩基長は、例えば、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、または８８０塩基以上、１２００、１１００、１０００、９９０、９８０、９７０、９６０、９５０、９４０、９３０、９２０、９１０、９００、または８９０塩基以下でありうる。

本開示の改変光受容クロライドチャネルは、例えば、以下のように製造することができる。まず、改変光受容クロライドチャネルをコードするポリヌクレオチドを調製する。前記ポリヌクレオチドは、当業者に公知の手法によって調製することができる。例えば、改変光受容クロライドチャネルをコードするポリヌクレオチドは、ＧｔＡＣＲ１およびＧｔＡＣＲ２をそれぞれコードするポリヌクレオチドの配列情報に基づいて化学合成することで調製することができる。あるいは、改変光受容クロライドチャネルをコードするポリヌクレオチドは、ＧｔＡＣＲ１およびＧｔＡＣＲ２をそれぞれコードするポリヌクレオチドの配列情報に基づき、各ポリヌクレオチドの所望領域を増幅するＰＣＲプライマーを用いて当該領域を増幅し、例えばＧｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙシステム（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）等を用いて連結することによって調製することもできる。次に、プロモーターと機能的に連結された前記ポリヌクレオチドを、宿主内で複製維持が可能であり、コードされるポリペプチドを安定に発現させることができ、このポリヌクレオチドを安定に保持できる発現ベクターに組み込み、得られた組換え発現ベクターを用いて宿主を形質転換し、宿主において改変光受容クロライドチャネルを生産させることができる。組換え技術については、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，１９８４ ８１：５６６２や、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８９）Ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓなどを参照することができる。

発現ベクターとしては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来のプラスミド（例えばｐＥＴ２８、ｐＧＥＸ４Ｔ、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、および他のプラスミドＤＮＡ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、および他のプラスミドＤＮＡ）、酵母由来のプラスミド（例えばＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０、および他のプラスミドＤＮＡ）、λファージ（例えばλｇｔ１１およびλＺＡＰ）、哺乳動物用プラスミド（例えばｐＣＭＶおよびｐＳＶ４０）、ウイルスベクター（例えばアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクターなどの動物ウイルスベクター、バキュロウイルスベクターなどの昆虫ウイルスベクター）、植物用ベクター（例えばバイナリベクターｐＢＩ系）、コスミドベクターなどを用いることができる。

本明細書において、プロモーターと機能的に連結されたポリヌクレオチドとは、そのポリヌクレオチドの転写を開始することができるようにプロモーターと結合しているポリヌクレオチドをいう。プロモーターは特に制限されず、宿主に応じて適するプロモーターを選択すればよく、公知の構成的プロモーターや誘導性プロモーターを用いることができるが、構成的プロモーターを用いることが好ましい。プロモーターの例としては、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＣＡＧプロモーター、シナプシンプロモーター、ロドプシンプロモーター、ＣａＭＶプロモーター、解糖系酵素プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔａｃプロモーター、ＧＡＰＤＨプロモーター、ＧＡＬ１プロモーター、ＰＨ０５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ｔｈｙ１プロモーター、ＧＲＫプロモーター、ＲＰＥＪプロモーターなどが挙げられる。改変光受容クロライドチャネルを特定の細胞で特異的に発現させることを目的として、プロモーターの上流にその細胞で特異的に発現しているポリペプチド遺伝子の転写調節領域（例えば視細胞で特異的に発現しているＩＲＢＰ（Ｉｎｔｅｒｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｒｅｔｉｎｏｉｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）の転写調節領域（Ｍａｒｊｏｒｉｅ Ｎｉｃｏｕｄ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌｕｍｅ ９，Ｉｓｓｕｅ１２，１０１３－１１０７，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２００７））を結合してもよい。

改変光受容クロライドチャネルをコードするポリヌクレオチドの発現ベクターへの挿入は、例えば、前記ポリヌクレオチドにフランキングする制限酵素部位を作製または連結し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入することにより行うことができる。発現ベクターは、プロモーターおよび本開示のポリヌクレオチドに加え、必要に応じてエンハンサーまたは他のシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー（アンピシリン耐性マーカー、テトラサイクリン耐性マーカーなどの薬剤耐性遺伝子マーカー、ＬＥＵ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３などの栄養要求性相補遺伝子マーカー、ＡＰＨ、ＤＨＦＲ、ＴＫなどの優性選択マーカーなど）、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）などを含んでもよい。

宿主の形質転換は、プロトプラスト法、スフェロプラスト法、コンピテントセル法、ウイルス法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、ジーンボンバートメント法、アグロバクテリウム法、エレクトロポレーションなどを用いて行うことができる。得られた形質転換体は、炭素源、窒素源、金属塩、ビタミンなどを含む培地を用いて適当な条件で培養する。形質転換体の培養は、例えば、好気的条件下、２５～３７℃で３～６時間行う。培養期間中、ｐＨは中性付近に保持する。ｐＨの調整は、無機または有機酸、アルカリ溶液などを用いて行う。培養中は、必要に応じて、組換え発現ベクターに挿入した選択マーカーに応じて、アンピシリンやテトラサイクリンなどの抗生物質を培地に添加してもよい。

形質転換に使用する宿主は、改変光受容クロライドチャネルを発現できるものであれば特に制限されず、例えば、細菌（大腸菌や枯草菌）、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなど）、動物細胞（ＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、３Ｔ３細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞など）、昆虫細胞などを用いることができる。

改変光受容クロライドチャネルは、形質転換体の培養により得られた培養物（培養上清、培養細胞、培養菌体、細胞や菌体のホモジェネートなど）から一般的な方法によって分取や精製を行い、限外濾過濃縮、凍結乾燥、噴霧乾燥、結晶化などの方法を適宜用いることによって、その活性を保持する形態で得ることができる。あるいは、改変光受容クロライドチャネルは、単離や精製を行うことなく、改変光受容クロライドチャネルを発現する細胞の形態で提供されてもよい。この場合、形質転換に使用する宿主細胞は、その後の用途に適した宿主細胞、例えば網膜を構成する細胞、具体的には神経細胞（視細胞、双極細胞、神経節細胞など）または網膜色素上皮細胞でありうるが、その他の細胞であってもよい。一実施形態において、宿主細胞は、ヒトの網膜を構成する細胞である。

本開示は、上記のとおり、本開示の改変光受容クロライドチャネルをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、本開示の改変光受容クロライドチャネルを発現する細胞を提供する。

本開示の改変光受容クロライドチャネルは、ＧｔＡＣＲ１よりも波長感受域が狭く、ＧｔＡＣＲ２と比較すると波長感受域は同等であるがτｏｎおよびτｏｆｆが短いという、優れた光反応特性を有する。波長感受域が狭いことは、神経細胞の興奮と抑制を制御するための波長の選択を容易にする点において有効であり、τｏｎおよびτｏｆｆのいずれもが短いことは、神経細胞を高い時間分解能で制御することを可能にする点において有効である。よって、本開示の改変光受容クロライドチャネル、これをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、および本開示の改変光受容クロライドチャネルを発現する細胞は、視細胞の変性または消失による視機能不全または視機能障害の発症の抑制、および発症した視機能不全または視機能障害の改善などに寄与することができ、網膜外層の障害を患う被検体の治療に有用である。また、本開示の改変光受容クロライドチャネル、これをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、および本開示の改変光受容クロライドチャネルを発現する細胞は、脳や中枢・末梢神経系の障害、脊髄損傷、自己免疫疾患など、光反応が関係する各種の障害に対しても有用である。

本明細書において、「網膜外層の障害」とは、網膜外層に存在する視細胞の変性または消失により視機能不全または視機能障害を生じている疾患または状態をいう。網膜外層の障害を患う被検体において、視細胞以外の網膜の細胞は正常であるかその機能の一部を保持していてよい。網膜外層の障害としては、網膜色素変性症、加齢黄斑変性症、および網膜はく離が挙げられる。被検体としては、例えば、ヒトまたは他の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、サル、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ）が挙げられる。網膜外層の障害を患う被検体には、網膜外層の障害に起因して失明している被検体や、失明のリスクを有する被検体が含まれる。網膜外層の障害を患う被検体の「治療」とは、前記被検体の視機能を回復することを意味する。

医薬用途に用いる発現ベクターとしては、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどのウイルスベクター、（自立複製可能な）プラスミド、トランスポゾンなどが挙げられる。改変光受容クロライドチャネルの発現ベクター作製用プラスミドは、例えばＴｏｍｉｔａ Ｈ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ．２００７ Ａｕｇ；４８（８）：３８２１－６や、Ｓｕｇａｎｏ Ｅ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ．２００５ Ｓｅｐ；４６（９）：３３４１－８に記載される方法に従って調製することができる。

本開示の改変光受容クロライドチャネル、これをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、または本開示の改変光受容クロライドチャネルを発現する細胞が有効成分として被検体に投与される。その有効量は、所与の症状や用法について治療効果を与え得る量であり、動物を用いた試験、臨床試験の実施により当業者によって適宜決定されるが、投与対象とする被検体の年齢、体重、性別、疾患の状態や重篤度、投与方法などが考慮される。例えばウイルスベクターの場合、ウイルス量は、１０^１２～１０^１３ｃａｐｓｉｄｓ／ｍｌ（例えば、約１０^１３ｃａｐｓｉｄｓ／ｍｌ）でありうる。

医薬としての製剤化に際し、有効成分は、１以上の薬学的に許容される担体と共に製剤化されてよい。薬学的に許容される担体としては、各種緩衝液、例えば生理食塩水、リン酸塩、酢酸塩などの緩衝液が挙げられる。前記有効成分を含む医薬組成物は、例えば局所投与用の注射剤、点眼剤、洗眼剤などに製剤化することができる。注射用製剤は、保存剤を添加して、例えばアンプルや複数回投与容器中の単位投与剤形として提供することができる。医薬組成物は、好適なビヒクル、例えば発熱物質不含の滅菌水などで使用前に再構成される凍結乾燥剤としてもよい。医薬組成物は、好ましくは被検体の患部に投与される。例えば、医薬組成物は、網膜への直接的な注射、または硝子体への直接的な接触によって投与されうる。

本開示の改変光受容クロライドチャネル、これをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、または本開示の改変光受容クロライドチャネルを発現する細胞は、その他の治療成分、例えば、網膜色素変性症、加齢性黄斑変性症、網膜はく離などの治療薬として公知の薬剤と併用されてもよい。

一態様において、本開示は、網膜外層の障害を患う被検体を治療するための医薬の製造における、本開示の改変光受容クロライドチャネル、これをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、または本開示の改変光受容クロライドチャネルを発現する細胞の使用を提供する。
一態様において、本開示は、網膜外層の障害を患う被検体を治療する方法であって、本開示の改変光受容クロライドチャネル、これをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、または本開示の改変光受容クロライドチャネルを発現する細胞を前記被検体に投与することを含む方法を提供する。
一態様において、本開示は、網膜外層の障害を患う被検体を治療するため、本開示の改変光受容クロライドチャネル、これをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、または本開示の改変光受容クロライドチャネルを発現する細胞の使用を提供する。

本開示の例示的な実施形態を以下に記載する。

［１］
グィラルディア・セータ アニオンチャネルロドプシン－１（ＧｔＡＣＲ１）のアミノ酸配列において少なくとも３番目の膜貫通ドメインから６番目の膜貫通ドメインまでの領域がグィラルディア・セータ アニオンチャネルロドプシン－２（ＧｔＡＣＲ２）の対応する領域で置換されたアミノ酸配列を含む、改変光受容クロライドチャネル。
［２］
ＧｔＡＣＲ１のアミノ酸配列において２番目の膜貫通ドメインと３番目の膜貫通ドメインの間の細胞外ドメインおよび／または６番目の膜貫通ドメインと７番目の膜貫通ドメインの間の細胞外ドメインがＧｔＡＣＲ２の対応するドメインでさらに置換されたアミノ酸配列を含む、前記１に記載の改変光受容クロライドチャネル。
［３］
ＧｔＡＣＲ１のアミノ酸配列において３番目の膜貫通ドメインから６番目の膜貫通ドメインまでの領域および６番目の膜貫通ドメインと７番目の膜貫通ドメインの間の細胞外ドメインがＧｔＡＣＲ２の対応する領域で置換されたアミノ酸配列を含む、前記１または２に記載の改変光受容クロライドチャネル。
［４］
ＧｔＡＣＲ１のアミノ酸配列において少なくとも２番目の膜貫通ドメインから６番目の膜貫通ドメインまでの領域がＧｔＡＣＲ２の対応するドメインで置換されたアミノ酸配列を含む、前記１に記載の改変光受容クロライドチャネル。
［５］
ＧｔＡＣＲ１のアミノ酸配列において１番目の膜貫通ドメインと２番目の膜貫通ドメインの間の細胞内ドメインおよび／または６番目の膜貫通ドメインと７番目の膜貫通ドメインの間の細胞外ドメインがＧｔＡＣＲ２の対応するドメインでさらに置換されたアミノ酸配列を含む、前記４に記載の改変光受容クロライドチャネル。
［６］
ＧｔＡＣＲ１のアミノ酸配列において２番目の膜貫通ドメインから６番目の膜貫通ドメインまでの領域および６番目の膜貫通ドメインと７番目の膜貫通ドメインの間の細胞外ドメインがＧｔＡＣＲ２の対応する領域で置換されたアミノ酸配列を含む、前記５に記載の改変光受容クロライドチャネル。
［７］
ＧｔＡＣＲ１が配列番号１のアミノ酸配列からなる、前記１～６のいずれかに記載の改変光受容クロライドチャネル。
［８］
ＧｔＡＣＲ２が配列番号２のアミノ酸配列からなる、前記１～７のいずれかに記載の改変光受容クロライドチャネル。
［９］
下記（ａ－１）～（ｃ－１）から選択されるいずれかのアミノ酸配列を含む、前記１～８のいずれかに記載の改変光受容クロライドチャネル：
（ａ－１）配列番号６のアミノ酸配列、
（ｂ－１）配列番号６のアミノ酸配列において１個または複数個のアミノ酸が改変されたアミノ酸配列、および
（ｃ－１）配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列。
［１０］
下記（ａ－２）～（ｃ－２）から選択されるいずれかのアミノ酸配列を含む、前記１～８のいずれかに記載の改変光受容クロライドチャネル：
（ａ－２）配列番号７のアミノ酸配列、
（ｂ－２）配列番号７のアミノ酸配列において１個または複数個のアミノ酸が改変されたアミノ酸配列、および
（ｃ－２）配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列。

［１１］
前記１～１０のいずれかに記載の改変光受容クロライドチャネルをコードするポリヌクレオチド。
［１２］
下記（ｄ－１）～（ｆ－１）から選択されるいずれかのポリヌクレオチドである、前記１１に記載のポリヌクレオチド：
（ｄ－１）配列番号６のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｅ－１）配列番号６のアミノ酸配列において１個または複数個のアミノ酸が改変されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、および
（ｆ－１）配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
［１３］
下記（ｄ－２）～（ｆ－２）から選択されるいずれかのポリヌクレオチドである、前記１１に記載のポリヌクレオチド：
（ｄ－２）配列番号７のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｅ－２）配列番号７のアミノ酸配列において１個または複数個のアミノ酸が改変されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、および
（ｆ－２）配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
［１４］
下記（ｇ－１）～（ｉ－１）から選択されるいずれかのポリヌクレオチドである、前記１１に記載のポリヌクレオチド：
（ｇ－１）配列番号１３の塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｈ－１）配列番号１３の塩基配列を含むポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、および
（ｉ－１）配列番号１３の塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチド。
［１５］
下記（ｇ－２）～（ｉ－２）から選択されるいずれかのポリヌクレオチドである、前記１１に記載のポリヌクレオチド：
（ｇ－２）配列番号１４の塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｈ－２）配列番号１４の塩基配列を含むポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、および
（ｉ－２）配列番号１４の塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチド。

［１６］
前記１１～１５のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。

［１７］
前記１～１０のいずれかに記載の改変光受容クロライドチャネルを発現する細胞。
［１８］
細胞が、網膜を構成する細胞である、前記１７に記載の細胞。

［１９］
網膜外層の障害を患う被検体を治療するための、前記１～１０のいずれかに記載の改変光受容クロライドチャネル、前記１１～１５のいずれかに記載のポリヌクレオチド、前記１６に記載の発現ベクター、または前記１７または１８に記載の細胞を含む医薬組成物。
［２０］
前記１～１０のいずれかに記載の改変光受容クロライドチャネルを含む、前記１９に記載の医薬組成物。
［２１］
前記１７または１８に記載の細胞を含む、前記１９に記載の医薬組成物。
［２２］
網膜外層の障害が、網膜色素変性症、加齢黄斑変性症、または網膜はく離である、前記１９～２１のいずれかに記載の医薬組成物。

［２３］
網膜外層の障害を患う被検体を治療する方法であって、前記１～１０のいずれかに記載の改変光受容クロライドチャネル、前記１１～１５のいずれかに記載のポリヌクレオチド、前記１６に記載の発現ベクター、または前記１７または１８に記載の細胞を前記被検体に投与することを含む、方法。
［２４］
網膜外層の障害を患う被検体を治療するための医薬の製造における、前記１～１０のいずれかに記載の改変光受容クロライドチャネル、前記１１～１５のいずれかに記載のポリヌクレオチド、前記１６に記載の発現ベクター、または前記１７または１８に記載の細胞の使用。
［２５］
網膜外層の障害を患う被検体を治療するため、前記１～１０のいずれかに記載の改変光受容クロライドチャネル、前記１１～１５のいずれかに記載のポリヌクレオチド、前記１６に記載の発現ベクター、または前記１７または１８に記載の細胞の使用。

以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載に限定して解釈されるものではない。

実施例１：改変光受容クロライドチャネルの作製
ＧｔＡＣＲ１とＧｔＡＣＲ２の膜貫通ドメインと細胞内ドメインの望ましい組み合わせを検討する目的で、複数の組換え体を検討した。その中から、パッチクランプ法で評価すべき５種類の組換え体（６０１、６０２、６０３、６０５、６０６）を設定した。各組換え体の膜貫通ドメインと細胞内ドメインの組み合わせを図１に示す。これら５種類の組換え体とＧｔＡＣＲ１およびＧｔＡＣＲ２（図１参照）の７種について、ｃｏｄｏｎ ａｄａｐｔａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘ（Ｃ．Ａ．Ｉ）が高くなるようにヒトコドンに最適化したポリヌクレオチドを化学合成し、アデノ随伴ウイルスベクター作製用プラスミドのマルチクローニングサイトに挿入した。組換え体６０５または６０６を発現する細胞株の作製の詳細を以下に示す。他の組換え体、ＧｔＡＣＲ１およびＧｔＡＣＲ２もこれらと同様に作製した。ＧｔＡＣＲ１、ＧｔＡＣＲ２、組換え体６０１、６０２、６０３、６０５、および６０６のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１～７に示し、これらをコードするポリヌクレオチドの塩基配列をそれぞれ配列番号８～１４に示す。

実施例１－１：組換え体６０５（配列番号６）発現細胞株の作製
ＧｔＡＣＲ１のＮ末端から２番目の膜貫通ドメインと３番目の膜貫通ドメインの間の細胞外ドメインまでのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、ＧｔＡＣＲ２の３番目の膜貫通ドメインから６番目の膜貫通ドメインと７番目の膜貫通ドメインの間の細胞外ドメインまでのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、ＧｔＡＣＲ１の７番目の膜貫通ドメインからＣ末端までのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが連結されたポリヌクレオチド（配列番号１３）の５’末端と３’末端に制限酵素配列を付加したポリヌクレオチドを化学合成し、アデノ随伴ウイルスベクター作製用プラスミドのマルチクローニングサイトに挿入した。本プラスミドのベクターマップを図２に示す。本プラスミドではマルチクローニングサイトの３’領域に蛍光タンパク質遺伝子（ｖｅｎｕｓ）が配置されていることから、ｖｅｎｕｓを指標にして組換え体６０５を発現する細胞を特定した。なお、細胞は、Ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｋｉｄｎｅｙ（ＨＥＫ）２９３細胞を用い、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地で、５％ＣＯ２、３７℃で培養した。

実施例１－２：組換え体６０６（配列番号７）発現細胞株の作製
ＧｔＡＣＲ１のＮ末端から１番目の膜貫通ドメインと２番目の膜貫通ドメインの間の細胞内ドメインまでのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、ＧｔＡＣＲ２の２番目の膜貫通ドメインから６番目の膜貫通ドメインと７番目の膜貫通ドメインの間の細胞外ドメインまでのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、ＧｔＡＣＲ１の７番目の膜貫通ドメインからＣ末端までのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが連結されたポリヌクレオチド（配列番号１４）の５’末端と３’末端に制限酵素配列を付加したポリヌクレオチドを化学合成し、アデノ随伴ウイルスベクター作製用プラスミドのマルチクローニングサイトに挿入した。組換え配列以外の作製手順は実施例１－１に記載の方法と同様である。

試験例１：パッチクランプ法による光誘発電流並びにτｏｎおよびτｏｆｆの測定
（測定方法）
顕微鏡下でｖｅｎｕｓの発現を確認した後、パッチクランプシステム（ＥＰＣ－１０、ＨＥＫＡ）を用いて、光誘発電流とτｏｎ（開速度：光照射を始めてからチャネルが開くまでの時間）およびτｏｆｆ（閉速度：光照射を止めてからチャネルが閉じるまでの時間）を測定した。細胞外液は、１３８ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、４ｍＭ ＮａＯＨ、１ｍＭ ＣａＣｌ_２、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２からなり、１Ｎ ＨＣｌでｐＨ７．４に調整したものを用いた。電極内液は、１３０ｍＭ ＣｓＣｌ、１．１ｍＭ ＥＧＴＡ、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．１ｍＭ ＣａＣｌ_２、１０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ Ｎａ_２ＡＴＰからなり、１Ｎ ＣｓＯＨでｐＨ７．２に調整したものを用いた。光照射（光源：ＬＥＤ）は１秒間、光強度は１μＷ／ｍｍ^２、刺激間隔は６０秒、固定電位は０ｍＶに設定した。波長は４０５、４５５、５０５、５６０、６１７、６５６ｎｍのそれぞれとした。

（測定結果）
光誘発電流の測定結果を図３に、τｏｎおよびτｏｆｆの測定結果を図４および図５に示す（ｎ＝８）。組換え体の特徴を明らかにする目的で、組換え体を発現する細胞の測定結果とＧｔＡＣＲ１またはＧｔＡＣＲ２を発現する細胞の測定結果とをあわせて示す。

組換え体６０１、６０２、または６０３を発現させた細胞では、光誘発イオン電流が認められなかった。図３に示すように、組換え体６０５または６０６を発現させた細胞では光誘発イオン電流が確認され、特に組換え体６０５においては高い光応答反応が認められた。組換え体６０５および６０６の波長感受域とＧｔＡＣＲ１の波長感受域とを比較すると、短波長側は同等であったが、長波長側はＧｔＡＣＲ１よりも組換え体６０５および６０６の方が短かった。組換え体６０５および６０６の波長感受域とＧｔＡＣＲ２の波長感受域とを比較すると、ほぼ同等の波長感受域であった。組換え体６０５はＧｔＡＣＲ２と比較してすべての波長感受域において高い光誘発イオン電流が認められた。組換え体６０６は高い光反応性が認められた。

図４および図５に示すように，組換え体６０５および６０６のτｏｎおよびτｏｆｆは、ＧｔＡＣＲ２のそれらと比較して、波長域全体として短かった。

以上の結果より、組換え体６０５および６０６、特に６０５は、優れた光反応特性を有する改変光受容クロライドチャネルであり、様々な状況においてオプトジェネティクスとして利用できる可能性を有する新規な光受容クロライドチャネルであることが示された。

Claims (14)

1. グィラルディア・セータ アニオンチャネルロドプシン－１（ＧｔＡＣＲ１）のアミノ酸配列において少なくとも３番目の膜貫通ドメインから６番目の膜貫通ドメインまでの領域がグィラルディア・セータ アニオンチャネルロドプシン－２（ＧｔＡＣＲ２）の対応する領域で置換され、かつＮ末端から１番目の膜貫通ドメインまでの細胞外ドメイン、１番目の膜貫通ドメイン、１番目の膜貫通ドメインと２番目の膜貫通ドメインの間の細胞内ドメイン、７番目の膜貫通ドメイン、および７番目の膜貫通ドメインからＣ末端までの細胞内ドメインは置換されていないアミノ酸配列を含む、改変光受容クロライドチャネル。
2. ＧｔＡＣＲ１のアミノ酸配列において２番目の膜貫通ドメインと３番目の膜貫通ドメインの間の細胞外ドメインおよび／または６番目の膜貫通ドメインと７番目の膜貫通ドメインの間の細胞外ドメインがＧｔＡＣＲ２の対応するドメインでさらに置換されたアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の改変光受容クロライドチャネル。
3. ＧｔＡＣＲ１のアミノ酸配列において３番目の膜貫通ドメインから６番目の膜貫通ドメインまでの領域および６番目の膜貫通ドメインと７番目の膜貫通ドメインの間の細胞外ドメインがＧｔＡＣＲ２の対応する領域で置換されたアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載の改変光受容クロライドチャネル。
4. ＧｔＡＣＲ１のアミノ酸配列において少なくとも２番目の膜貫通ドメインから６番目の膜貫通ドメインまでの領域がＧｔＡＣＲ２の対応するドメインで置換されたアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の改変光受容クロライドチャネル。
5. ＧｔＡＣＲ１のアミノ酸配列において２番目の膜貫通ドメインから６番目の膜貫通ドメインまでの領域および６番目の膜貫通ドメインと７番目の膜貫通ドメインの間の細胞外ドメインがＧｔＡＣＲ２の対応する領域で置換されたアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の改変光受容クロライドチャネル。
6. ＧｔＡＣＲ１が配列番号１のアミノ酸配列からなる、請求項１～５のいずれかに記載の改変光受容クロライドチャネル。
7. ＧｔＡＣＲ２が配列番号２のアミノ酸配列からなる、請求項１～６のいずれかに記載の改変光受容クロライドチャネル。
8. 下記（ａ－１）～（ｃ－１）から選択されるいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項１～７のいずれかに記載の改変光受容クロライドチャネル：
   （ａ－１）配列番号６のアミノ酸配列、
   （ｂ－１）配列番号６のアミノ酸配列において１個または複数個のアミノ酸が改変されたアミノ酸配列、および
   （ｃ－１）配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列。
9. 下記（ａ－２）～（ｃ－２）から選択されるいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項１～７のいずれかに記載の改変光受容クロライドチャネル：
   （ａ－２）配列番号７のアミノ酸配列、
   （ｂ－２）配列番号７のアミノ酸配列において１個または複数個のアミノ酸が改変されたアミノ酸配列、および
   （ｃ－２）配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列。
10. 請求項１～９のいずれかに記載の改変光受容クロライドチャネルをコードするポリヌクレオチド。
11. 請求項１～９のいずれかに記載の改変光受容クロライドチャネルを発現する細胞。
12. 細胞が、網膜を構成する細胞である、請求項１１に記載の細胞。
13. 網膜外層の障害を患う被検体を治療するための、請求項１～９のいずれかに記載の改変光受容クロライドチャネル、請求項１０に記載のポリヌクレオチド、または請求項１１または１２に記載の細胞を含む医薬組成物。
14. 網膜外層の障害が、網膜色素変性症、加齢黄斑変性症、または網膜はく離である、請求項１３に記載の医薬組成物。