JP7755321B2 - エクソソーム産生促進剤およびエクソソーム産生促進剤含有組成物 - Google Patents

Description

本発明は、エクソソーム産生促進剤およびエクソソーム産生促進剤含有組成物に関する。

細胞が分泌する膜小胞（細胞外小胞）には、生成機構やサイズ、構成分子の違いにより、さまざまな粒子が存在することが知られている。

中でも、エンドソーム由来のエクソソームは、近年化粧品等にも配合される美容成分としても認知されている。

エクソソームは、線維芽細胞に取り込まれることで、細胞増殖促進効果や創傷治癒効果等、様々な美容効果を発揮する。

このように肌への有用な効果が期待されるエクソソーム、特に、幹細胞由来のエクソソームを含む皮膚再生用化粧料組成物が提案されている（例えば、特許文献１参照）。

しかしながら、エクソソーム自体を単離精製することは技術的に難しく、また、一度に生産できる量が極めて少ないため、非常に高価である。さらに、幹細胞由来のエクソソームを、精製して配合した組成物は、安全性の観点からも懸念が持たれている。

このような問題を解決する目的で、エクソソームそのものを付与しなくても、生体内でエクソソームの産生を促進させる機能を有するエクソソーム産生促進剤の開発が進められているが、エクソソームの産生を十分に促進させることができるものは得られていない。

特開２０１８－１８４４４６号公報

本発明の目的は、生体内でのエクソソームの産生促進能が高く、安全性の高いエクソソーム産生促進剤を提供すること、また、前記エクソソーム産生促進剤を含有するエクソソーム産生促進剤含有組成物を提供することにある。

このような目的は、下記（１）～（６）に記載の本発明により達成される。
（１） 大豆エキスと脱脂米糠と酵母エキスとを含む組成物を枯草菌によって発酵させることで得られる発酵物を含有し、
全固形分中に占める前記発酵物の固形分の割合が、０．１質量％以上２．０質量％以下であることを特徴とするエクソソーム産生促進剤。

（２） 前記枯草菌が納豆菌である上記（１）に記載のエクソソーム産生促進剤。

（３） 前記組成物中における前記酵母エキスの固形分の含有量が０．１質量％以上１．０質量％以下である上記（１）または（２）に記載のエクソソーム産生促進剤。

（４） 上記（１）ないし（３）のいずれかに記載のエクソソーム産生促進剤を含有することを特徴とするエクソソーム産生促進剤含有組成物。

（５） エクソソーム産生促進剤含有組成物は、液状をなすものである上記（４）に記載のエクソソーム産生促進剤含有組成物。

（６） エクソソーム産生促進剤含有組成物は、外用剤である上記（４）または（５）に記載のエクソソーム産生促進剤含有組成物。

本発明によれば、生体内でのエクソソームの産生促進能が高く、安全性の高いエクソソーム産生促進剤を提供すること、また、前記エクソソーム産生促進剤を含有するエクソソーム産生促進剤含有組成物を提供することができる。

図１は、ｃｏｎｔｒｏｌ（対照）に対する各実施例および各比較例でのＣＤ６３の発現量の相対値を示す図である。 図２は、ｃｏｎｔｒｏｌ（対照）に対する各実施例および各比較例でのＣＤ９の発現量の相対値を示す図である。

以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
［１］エクソソーム産生促進剤
まず、本発明のエクソソーム産生促進剤について説明する。

本発明のエクソソーム産生促進剤は、大豆エキスと脱脂米糠と酵母エキスとを含む組成物を、枯草菌によって発酵させることで得られる発酵物を含有することを特徴とする。

これにより、生体内でのエクソソームの産生促進能が高く、安全性の高いエクソソーム産生促進剤を提供することができる。

［１－１］発酵物
本発明のエクソソーム産生促進剤は、少なくとも、前記発酵物、すなわち、大豆エキスと脱脂米糠と酵母エキスとを含む組成物を、枯草菌によって発酵させることで得られる発酵物を含有する。

［１－１－１］発酵に供される組成物
以下、枯草菌による発酵に供される組成物、すなわち、大豆エキスと脱脂米糠と酵母エキスとを含む組成物について説明する。

［１－１－１－１］大豆エキス
枯草菌による発酵に供される組成物は、大豆エキスを含む。

大豆エキスは、大豆の抽出物である。より具体的には、大豆エキスとしては、例えば、大豆を溶媒（水、熱水、アルコール（エタノール等）の有機溶媒または水－有機溶媒混合溶媒）で抽出することにより得られる抽出物を用いることができる。

大豆エキスを得るための抽出方法、抽出条件については特に限定はない。例えば、抽出原料である大豆は未粉砕でも、粉砕したものでもよい。また、抽出物の品質を維持できる限り、不純物除去等の前処理をしてもよい。また、抽出溶媒としては、水または熱水の他、メタノールおよびエタノール等のアルコール、酢酸エチル等のエステル、ｎ－ヘキサン等の有機溶媒、並びにこれらの有機溶媒と水または熱水との混合溶媒等を用いることができる。前記抽出溶媒としては、水または熱水、アルコール（メタノールおよびエタノール等）、および水または熱水とアルコールとの混合溶媒が好ましい。

前記熱水の温度は、例えば、４０℃以上１００℃以下であり、５０℃以上８０℃以下であるのが好ましく、５０℃以上７０℃以下であるのがより好ましい。

また、抽出の際の抽出溶媒のｐＨは、例えば、３以上７以下であり、４以上６以下であるのが好ましく、４以上５以下であるのがより好ましい。
これにより、抽出原料に含まれている各種成分の安定性を保つことができる。

抽出温度は、特に限定されないが、常温または加熱抽出が好ましい。加熱抽出の場合、加熱温度としては、例えば、４０℃以上１００℃以下であり、５０℃以上８０℃以下であるのが好ましく、５０℃以上７０℃以下であるのがより好ましい。
これにより、抽出を効率的に行うことができる。

大豆エキスは、Brix値が、１０．０以上２０．０以下のものであるのが好ましく、１２．０以上１８．０以下のものであるのがより好ましく、１３．０以上１７．０以下のものであるのがさらに好ましい。

これにより、前記組成物中における大豆エキスの固形分の含有率を好適に高いものとすることができるとともに、大豆エキスの調製時に過剰に濃縮等の処理を施す必要がなく、生産性、コスト等の観点からも有利である。また、濃縮時等における構成成分の不本意な劣化、変性等をより効果的に防止することができる。
なお、前記Brix値は、大豆エキス中の固形分濃度の目安となる。

大豆エキスは、大豆特有のオリゴ糖であるラフィノースおよびスタキオースを含むものであるのが好ましい。
これにより、菌の生育が促進され、さらに発酵代謝物の生産量がさらに向上する。
以下、ラフィノースおよびスタキオースを総称して、「大豆オリゴ糖」と言う。

大豆エキスが大豆オリゴ糖を含むものである場合、前記組成物中における大豆オリゴ糖の含有量は、０．５質量％以上１０．０質量％以下であるのが好ましく、１．５質量％以上４．０質量％以下であるのがより好ましい。

これにより、菌の誘導期を短くすることができ、その結果、より短時間で発酵工程を終了させることができる。

前記組成物中における大豆エキスの固形分の含有量は、１０質量％以上２５質量％以下であるのが好ましく、１３質量％以上２０質量％以下であるのがより好ましい。
これにより、発酵代謝物の生産量が大幅に向上し、コスト削減効果が得られる。

［１－１－１－２］脱脂米糠
枯草菌による発酵に供される組成物は、脱脂米糠を含む。
米糠には、通常２０質量％程度の油分が含まれているが、脱脂米糠は、米糠に脱脂処理を施すことにより得られるものである。

このような脱脂米糠を用いることにより、菌の生育を促す良質な窒素やビタミン類の供給源となる他、酸化した油の菌に対する生育阻害効果を排除できる。

脱脂米糠としては、油分が１５質量％以下のものであるのが好ましく、１３質量％以下のものであるのがより好ましい。
これにより、前述した効果がより顕著に発揮される。

脱脂米糠の原料となる米のコメ種は、特に限定されず、例えば、コシヒカリ、ヒノヒカリ、ユメヒカリ、ほしのゆめ、ひとめぼれ、あきたこまち、ゆきひかり、ななつぼし、はくちょう等のほか、きたのむらさき、芽生さくらむらさき、朝紫、おくのむらさき等の黒米（紫黒米）、ベニロマン、紅衣、ゆうやけもち、紅染めもち等の赤米等の色素米が挙げられる。

前記組成物中における脱脂米糠の含有量は、０．００３質量％以上０．０８０質量％以下であるのが好ましく、０．００５質量％以上０．０７０質量％以下であるのがより好ましく、０．０１０質量％以上０．０５０質量％以下であるのがさらに好ましい。

これにより、菌の誘導期を短くすることができ、その結果、より短時間で発酵工程を終了させることができる。

大豆エキスが大豆オリゴ糖を含むものである場合、前記組成物中における大豆オリゴ糖の含有率をＸＰ［質量％］、当該組成物中における脱脂米糠の含有率をＸＢ［質量％］としたとき、３０≦ＸＰ／ＸＢ≦４００の関係を満たすのが好ましく、１３０≦ＸＰ／ＸＢ≦２００の関係を満たすのがより好ましい。

これにより、菌の誘導期が短くなることで発酵工程を短縮化でき、さらに発酵代謝物の生産量も増やすことができる。

［１－１－１－３］酵母エキス
枯草菌による発酵に供される組成物は、酵母エキスを含む。

酵母エキスは、酵母の抽出物である。例えば、酵母エキスは、培養された酵母の自己消化により抽出することで得ることができる。

酵母の自己消化は、公知の方法により行うことができる。例えば、培養終了後に回収された酵母を水や緩衝液に懸濁させて得られた酵母懸濁液を自己消化液とし、この自己消化液を３０℃以上５５℃以下に保持することにより、酵母菌体内に元々存在していた酵素によって酵母を分解し、抽出することができる。

自己消化は、酵母懸濁液のｐＨを制御した条件で行ってもよく、制御していない条件で行ってもよい。ｐＨ制御下で行う場合、当該酵母懸濁液のｐＨは、４以上７以下の範囲の値であるのが好ましい。

前記酵母としては、例えば、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属菌、シゾサッカロマイセス（Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属菌、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属菌、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属菌、クリベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属菌、ウィリオプシス（Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ）属菌、デバリオマイセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）属菌、ガラクトマイセス（Ｇａｌａｃｔｏｍｙｃｅｓ）属菌、トルラスポラ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ）属菌、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属菌、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属菌、ジゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属菌等が挙げられる。

これらの中でも、キャンディダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、キャンディダ・リポリティカ（Ｃａｎｄｉｄａ ｌｙｐｏｌｉｔｉｃａ）、キャンディダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）、キャンディダ・サケ（Ｃａｎｄｉｄａ ｓａｋｅ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が好ましく、より好ましくはサッカロマイセス・セレビシエ、キャンディダ・ユティリスである。

なお、酵母としては、天然型の酵母（遺伝子が人為的に改変処理されていない酵母）であってもよく、変異株であってもよい。

培養形式は、特に限定されず、例えば、培養スケール、得られた培養物の使用用途等に応じて、適宜決定することができる。

前記組成物中における前記酵母エキスの固形分の含有量は、０．１質量％以上１．０質量％以下であるのが好ましく、０．２質量％以上０．９質量％以下であるのがより好ましく、０．３質量％以上０．８質量％以下であるのがさらに好ましい。

これにより、菌の生育を促すビタミンやミネラル、アミノ酸等の微量成分をより好適に供給することができ、代謝産物の生産量をさらに増大させることができる。

前記組成物中における前記酵母エキス由来のアミノ態窒素の含有量は、０．００５質量％以上０．０７０質量％以下であるのが好ましく、０．０１０質量％以上０．０６３質量％以下であるのがより好ましく、０．０１５質量％以上０．０２１質量％以下であるのがさらに好ましい。
これにより、代謝産物の生産量をより好適に増大させることができる。

なお、アミノ態窒素の含有量は、Ｐｏｐｅ－Ｓｔｅｖｅｎｓ加銅法により求めることができる。

［１－１－１－４］その他の成分
枯草菌による発酵に供される組成物は、上記以外の成分を含んでいてもよい。
このような成分としては、例えば、コーンスティープリカー、廃糖蜜、小麦ふすま、おから、カゼインペプトン、獣肉ペプトン、ソイペプトン、カザミノ酸、ビタミン類、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、シリコーン樹脂等が挙げられる。

［１－１－２］枯草菌
以下、前記組成物の発酵に用いられる枯草菌について説明する。

前記枯草菌［バチルス・ズブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）］は、好気性胞子形成細菌の代表的な種類である。

前記枯草菌としては、特に限定されないが、例えば、納豆菌［バチルス・ナットウ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｎａｔｔｏ）］を好適に用いることができる。
これにより、代謝産物の生産量をより好適に増大させることができる。

前記枯草菌としては、入手が容易であり、かつ安価である納豆菌が好ましい。なお、前記枯草菌としては、市販されている一般的な枯草菌を用いることができる。また、前記枯草菌としては、変異株を用いてもよい。

［１－１－３］発酵条件
前記発酵物は、大豆エキスと脱脂米糠と酵母エキスとを含む組成物を枯草菌によって発酵させることで得られる。前記発酵物は、通常、大豆エキスと脱脂米糠と酵母エキスとを含む培地に枯草菌を摂取し、適切な条件で発酵培養することにより得られる。前記発酵物を得るための発酵培養条件は、特に限定されない。発酵培養は、通常、通気攪拌を行うことにより行われる。

また、前記培地についても、前記枯草菌が増殖できる限り、特に限定はない。前記培地は、通常、液体培地であるが、固形培地でもかまわない。

また、前記培地のｐＨ（特に発酵時のｐＨ）は、５．５以上８．５以下であるのが好ましく、６．０以上８．０以下であるのがより好ましく、６．５以上７．５以下であるのがさらに好ましい。
これにより、抽出原料に含まれている各種成分の安定性を好適に保つことができる。

培養温度は、１５℃以上５０℃以下であるのが好ましく、２０℃以上４５℃以下であるのがより好ましく、３０℃以上４５℃以下であるのがさらに好ましく、３５℃以上４３℃以下であるのがもっとも好ましい。

培養時間は、２４時間以上６０時間以下であるのが好ましく、２７時間以上５４時間以下であるのがより好ましく、３０時間以上４８時間以下であるのがさらに好ましい。

また、糖等の各種の栄養素やｐＨ調製のための酸、アルカリ等を培地に添加してもよい。さらに、前記発酵は、混合発酵でも連続発酵でもよい。

［１－１－４］その他の条件
前記発酵物の形態は、特に限定されない。例えば、前記発酵物は、発酵培養により得られた発酵液または該発酵液をろ過したままの液でもよい。また、前記発酵物は、前記発酵液に対し、必要に応じて滅菌処理若しくはｐＨ調整をしたり、イオン交換樹脂、活性炭カラムや透析膜等を利用し、脱臭、脱色、精製等の後処理をしたものであってもよい。さらに、前記発酵物は、該発酵液を濃縮した濃縮液またはペースト状物でもよい。その他にも、前記発酵物は、該発酵液を凍結乾燥等の公知の方法により液状成分を除去した粉末等の固形物でもよい。

本発明のエクソソーム産生促進剤中における前記発酵物の含有量は、特に限定されないが、エクソソーム産生促進剤を構成する全固形分中に占める前記発酵物の固形分の割合が、０．１質量％以上２．０質量％以下であるのが好ましく、０．５質量％以上１．２質量％以下であるのがより好ましい。

これにより、エクソソーム産生促進剤によるエクソソームの産生促進能をより高いものとすることができる。

［１－２］その他の成分
本発明のエクソソーム産生促進剤は、少なくとも、前記発酵物を含んでいればよいが、前記発酵物以外の成分を含んでいてもよい。以下、この項目内において、このような成分を「その他の成分」と言う。

その他の成分としては、例えば、前記発酵物以外の成分であって、エクソソームの産生を促進する機能を有する成分等が挙げられる。このような成分が前記発酵物とともに含まれることにより、例えば、これらが相乗的に作用しあい、エクソソーム産生促進剤全体としてのエクソソームの産生促進能をより優れたものとすることができる。

本発明のエクソソーム産生促進剤中におけるその他の成分の含有量は、特に限定されないが、５質量％以下であるのが好ましく、１質量％以下であるのがより好ましい。

［２］エクソソーム産生促進剤含有組成物
次に、本発明のエクソソーム産生促進剤含有組成物について説明する。

本発明のエクソソーム産生促進剤含有組成物は、前述したエクソソーム産生促進剤を含有することを特徴とする。言い換えると、本発明のエクソソーム産生促進剤含有組成物は、前述したエクソソーム産生促進剤に加えて、エクソソーム産生促進を有さない成分をさらに含有するものである。

これにより、生体内でのエクソソームの産生促進能が高く、安全性の高いエクソソーム産生促進剤を含有するエクソソーム産生促進剤含有組成物を提供することができる。特に、生体内でのエクソソームの産生促進能を確保しつつ、エクソソーム産生促進剤以外の成分による効果を得ることができる。例えば、エクソソームの産生促進能以外の美容に係る効果を有する成分を含むことにより、エクソソーム産生促進剤との相乗効果が得られ、エクソソーム産生促進剤含有組成物全体としての美容効果を特に優れたものとすることができる。また、エクソソーム産生促進剤含有組成物全体としての取扱いのし易さが向上する。

［２－１］エクソソーム産生促進剤
本発明のエクソソーム産生促進剤含有組成物は、本発明のエクソソーム産生促進剤を含むものである。

本発明のエクソソーム産生促進剤含有組成物中における前記発酵物の固形分の含有率は、０．０１質量％以上であるのが好ましく、０．０３質量％以上であるのがより好ましい。

これにより、エクソソーム産生促進剤によるエクソソームの産生促進能をより高いものとすることができる。

特に、本発明のエクソソーム産生促進剤含有組成物が液状のものである場合、当該エクソソーム産生促進剤含有組成物中における前記発酵物の固形分の含有率は、０．０１質量％以上１．０質量％以下であるのが好ましく、０．０３質量％以上０．４質量％以下であるのがより好ましい。

これにより、エクソソーム産生促進剤含有組成物の取扱いのし易さが向上し、例えば、エクソソーム産生促進剤含有組成物の皮膚への塗布性や噴霧器による噴霧のしやすさ等をより優れたものとしつつ、エクソソーム産生促進剤によるエクソソームの産生促進能をより高いものとすることができる。

［２－２］液状成分
本発明のエクソソーム産生促進剤含有組成物は、本発明のエクソソーム産生促進剤以外の成分として、例えば、本発明のエクソソーム産生促進剤の構成成分の少なくとも一部を溶解または分散する液状成分をさらに含んでいてもよい。

このような液状成分としては、例えば、水、エタノール等の１価アルコール、１，３－ブチレングリコール、１，３－プロパンジオール、グリセリン、エチルへキシルグリセリン等の多価アルコール等が挙げられる。特に、上記の多価アルコール成分は、溶媒、分散媒としての機能を発揮することができるとともに、保湿成分としての機能も発揮することができる。また、これらの多価アルコール成分を含むことにより、使用時に、粉体組成物と混合されることで、レチノールが有する、皮膚の表皮細胞のターンオーバーを促進させる効果との相乗効果により、上述したような保湿効果をより顕著に発揮させることができる。

本発明のエクソソーム産生促進剤含有組成物が液状組成物である場合、当該エクソソーム産生促進剤含有組成物中における前記液状成分（エクソソーム産生促進剤由来の液状成分（前記発酵物由来の液状成分等）を含む）の含有率は、６０．０質量％以上９９．０質量％以下であるのが好ましく、７０．０質量％以上９８．０質量％以下であるのがより好ましく、８０．０質量％以上９７．０質量％以下であるのがさらに好ましい。

これにより、エクソソーム産生促進剤含有組成物全体としてのエクソソームの産生促進能を十分に高いものとしつつ、エクソソーム産生促進剤含有組成物の取扱いのし易さが向上し、例えば、エクソソーム産生促進剤含有組成物の皮膚への塗布性や噴霧器による噴霧のしやすさ等をより優れたものとすることができる。

前記液状成分は、少なくとも水を含んでいるのが好ましく、エクソソーム産生促進剤含有組成物中における水（エクソソーム産生促進剤由来の水（前記発酵物由来の水等）を含む）の含有率は、５０．０質量％以上９３．０質量％以下であるのが好ましく、６０．０質量％以上９０．０質量％以下であるのがより好ましく、６５．０質量％以上８７．０質量％以下であるのがさらに好ましい。

これにより、エクソソーム産生促進剤含有組成物全体としてのエクソソームの産生促進能を十分に高いものとしつつ、エクソソーム産生促進剤含有組成物の取扱いのし易さが向上し、例えば、エクソソーム産生促進剤含有組成物の皮膚への塗布性や噴霧器による噴霧のしやすさ等をより優れたものとすることができる。

［２－３］その他の成分
本発明のエクソソーム産生促進剤含有組成物は、少なくとも、前記エクソソーム産生促進剤を含んでいればよいが、前記エクソソーム産生促進剤以外の成分を含んでいてもよい。以下、この項目内において、このような成分を「その他の成分」と言う。

その他の成分としては、例えば、賦形剤、エクソソーム産生促進剤以外の美容成分、植物エキス、ビタミン、ビタミン様物質、ミネラル、油脂類、増粘剤、ゲル化剤、界面活性剤、ｐＨ調整剤、酸化防止剤、着色剤、ラクトース等の安定化剤、グルタミン酸、アスパラギン酸等の溶解補助剤、防腐剤、ｐＨ調整剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、エリキシル剤、芳香剤、香料、他の有効成分（薬効成分）等が挙げられる。

増粘剤としては、例えば、キサンタンガム等が挙げられる。
ｐＨ調整剤としては、例えば、クエン酸、クエン酸Ｎａ等が挙げられる。

防腐剤としては、例えば、フェノキシエタノール等が挙げられる。
界面活性剤としては、例えば、水添ヒマシ油（ＰＥＧ－４）等が挙げられる。

ただし、エクソソーム産生促進剤含有組成物中におけるその他の成分の含有率は、５質量％以下であるのが好ましく、１質量％以下であるのがより好ましい。

［２－４］その他の条件
本発明のエクソソーム産生促進剤含有組成物は、例えば、液状、固体状、半固体状等、いかなる状態のものであってもよい。また、本発明のエクソソーム産生促進剤含有組成物は、基体に担持されたものであってもよい。この場合、基体は、例えば、綿状やシート状等、いかなる形態のものであってもよい。

中でも、エクソソーム産生促進剤含有組成物は、液状をなすものであるのが好ましい。
これにより、エクソソーム産生促進剤の取扱いのし易さがさらに向上し、例えば、エクソソーム産生促進剤の皮膚への塗布性や噴霧器による噴霧のしやすさ等をさらに優れたものとすることができる。

エクソソーム産生促進剤含有組成物は、例えば、経口剤等であってもよいが、外用剤であるのが好ましい。

これにより、線維芽細胞からのコラーゲン産生をより好適に促進させ、また、表皮角化細胞におけるバリア機能をより好適に増強させることができる。

本発明のエクソソーム産生促進剤含有組成物は、動物（ヒトを含む）の皮膚（爪を含む）や粘膜に接触して用いるものとすることができるが、例えば、医薬品；医薬部外品；化粧水、クリーム、乳液、美容液、美白剤、洗顔料（洗顔用クレンザーを含む）等のスキンケア製品；リップクリーム、口紅等のリップ用製品；化粧下地、チーク、ファンデーションクリーム等の化粧品；ポリッシュ、ポリッシュリムーバー、ストレンスナー、レングスナー、ハードナー、キューティクルリムーバー、ソフナー等のネイルケア製品；シェービングクリームおよびローション、脱毛剤、髭剃り後のスキンコンディショナー等の脱毛関連製品；ヘアトリートメント、シャンプー等のヘアケア用品；その他、石鹸、ボディーソープ、手洗い用洗剤（ハンドソープ）、アンチエイジング剤、制汗剤、日焼け止め剤、日焼け促進剤、香水、冷却用スプレー、入浴剤等が挙げられる。中でも、本発明のエクソソーム産生促進剤含有組成物は化粧水、クリーム、乳液および美容液よりなる群から選択されるものであるのが好ましい。

以上、本発明の好適な実施形態について説明したが、本発明は、これらに限定されない。

次に、本発明の具体的実施例について説明する。
なお、本発明はこれらの実施例の記載に何ら限定されるものではない。

［３］エクソソーム産生促進剤の製造
（実施例１）
まず、大豆エキス、脱脂米糠および酵母エキスを用意した。

大豆エキスとしては、大豆の煮汁の濃縮物を用いた。大豆エキスは、Brix値が１５．０であり、大豆オリゴ糖を含むものであった。

脱脂米糠としては、米糠に脱脂処理を施すことにより得られたものであり、油分が１３質量％のものを用いた。

酵母エキスとしては、粉末状のアサヒグループ食品社製のミーストＰ１Ｇを用いた。当該酵母エキス中に占めるアミノ態窒素の割合は、６．０±１．０質量％である。

これらの大豆エキス、脱脂米糠および酵母エキスを所定の割合で混合した後、１２１℃で２１分間の滅菌処理を施し、その後、４５℃まで冷却した。このようにして得られた組成物は、大豆エキスの固形分の含有量が１７．５質量％であり、大豆オリゴ糖の含有量が２．７質量％であり、脱脂米糠の含有量が０．０１６質量％であり、酵母エキスの固形分の含有量が０．５８質量％であった。

そこに、所定の条件で培養した納豆菌、すなわち、上記と同様にして用意した大豆エキス：１００質量部に対して上記と同様の酵母エキス：０．５質量部を加えた培地で３７℃、２８時間培養した納豆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｎａｔｔｏ）を添加して、３７℃で４０時間発酵し、その後、精製処理を施すことにより、液状の発酵物を得た。得られた発酵物中の固形分の割合は、１．０質量％であった。

（実施例２）
納豆菌の代わりに枯草菌Ａ（ＮＢＲＣ３１３４）を用いた以外は、前記実施例１と同様にしてエクソソーム産生促進剤を製造した。

（実施例３）
納豆菌の代わりに枯草菌Ｂ（ＮＢＲＣ１３７１９）を用いた以外は、前記実施例１と同様にしてエクソソーム産生促進剤を製造した。

（実施例４）
発酵に用いる組成物中における酵母エキスの含有量が０．１質量％となるように、酵母エキスおよび大豆エキスの使用量を変更して組成物を調製した以外は、前記実施例１と同様にしてエクソソーム産生促進剤を製造した。

（実施例５）
発酵に用いる組成物中における酵母エキスの含有量が１．０質量％となるように、酵母エキスおよび大豆エキスの使用量を変更して組成物を調製した以外は、前記実施例１と同様にしてエクソソーム産生促進剤を製造した。

（比較例１）
納豆菌を用いなかった以外は前記実施例１と同様にしてエクソソーム産生促進剤を製造した。

（比較例２）
酵母エキスを用いなかった以外は前記実施例１と同様にしてエクソソーム産生促進剤を製造した。

（比較例３）
脱脂米糠の代わりにし赤糠を用いた以外は前記実施例１と同様にしてエクソソーム産生促進剤を製造した。

（比較例４）
納豆菌の代わりに乳酸菌（ＮＢＲＣ３０７０：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）を用いた以外は、前記実施例１と同様にしてエクソソーム産生促進剤を製造した。

（比較例５）
納豆菌の代わりに酵母（ＮＢＲＣ０５５５：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を用いた以外は、前記実施例１と同様にしてエクソソーム産生促進剤を製造した。

［４］評価
上記のようにして得られたエクソソーム産生促進剤について、以下の評価を行った。

［４－１］エクソソーム産生促進効果の評価
細胞として、ヒト脂肪由来間葉系幹細胞（Ｌｉｆｅｌｉｎｅ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製のＨｕｍａｎ ａｄｉｐｏｓｅ ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ：ＨＭＳＣ－ＡＤ）を用い、培養液として、ＳｔｅｍＬｉｆｅ ＢＭ基礎培地にＳｔｅｍＬｉｆｅ ＭＳＣ ＬｉｆｅＦａｃｔｏｒｓ増殖用添加剤セット（クラボウ社製）を加えた培地を用いた。

凍結細胞の解凍および植込みはマニュアルの通りに実施した。クリーンベンチにて解凍した細胞浮遊液より細胞数を数えたのち、推奨密度２，５００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２になるようにＴ７５細胞培養フラスコ（ＢＭ機器社製）に播種し、３７℃、５％ＣＯ_２下で２４時間培養した後に培地の交換を行った。その後、細胞の被覆率が４０％以下である場合には１日おきに培地交換し、細胞の被覆率が４０％を超えた後は毎日培地を交換した。細胞の被覆率が７０％になった時点で培養を終了させて、トリプシン処理により細胞を集めた。

集めた細胞を用いて、６ウェルプレート（ＢＭ機器社製）に１００，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌを播種し、３７℃、５％ＣＯ_２下で細胞がサブコンフルエントになるまで培養した後、培養上清を吸い取り、前記各実施例および各比較例で製造した液状のエクソソーム産生促進剤を滅菌水で１０分の１に希釈した後に各ウェルに２ｍＬずつ添加し、さらに４８時間培養した。培養終了後、各ウェル中の培養上清を回収し、培養上清中のエクソソームの特異的なマーカーＣＤ６３、ＣＤ９量を後に詳述するＥＬＩＳＡ法により測定した。また、ウェル中の細胞はＰＢＳ（－）で洗浄後、ＲＩＰＡ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ ＷＡＫＯ純薬社製）で細胞を溶解し、セルライセートとしてサンプル保存した。セルライセートサンプルはＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ ｋｉｔ（ｐｉｅｒｃｅ社製）にて全タンパク質を定量した。なお、試料添加してない培地をｃｏｎｔｒｏｌとした。なお、ＣＤ９およびＣＤ６３は、エクソソーム特有のマーカーであり、これらを測定することでエクソソームを定量することが可能である。

［４－１－１］ＣＤ６３の産生促進効果による評価
市販のヒト由来エクソソーム定量用ＣＤ６３／ＣＤ６３ Ｅｘｏｓｏｍｅ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ，Ｈｕｍａｎ（コスモバイオ社製）を用いて測定を行った。具体的には、ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに上記のようにして回収した培養上清およびＣＤ６３スタンダードビーズ溶液を１００μＬずつ加えて室温にて２時間反応させた。抗原－抗体反応終了後、各ウェル中の反応液を完全に除去し、洗浄バッファー３００μＬを用いて３回洗浄した。希釈したＨＲＰ標識抗ＣＤ６３抗体を各ウェルに１００μＬずつ加えて室温にて２時間反応した。反応終了後、洗浄バッファー３００μＬを用いて３回洗浄した。発色の基質液１００μＬずつを各ウェルに加えて室温で遮光２０分間の静置反応をさせた後、５０μＬずつの停止液を加えた。測定は、波長４５０ｎｍをマイクロプレートリーダー（ＴａｋａｒａＢｉｏ社製）にて読み取ることにより行い、スタンダード検量線よりＣＤ６３の量を算出した。

併せて、別途の透明プレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、上記のようにして保存したセルライセート中の蛋白質量を、ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ ｋｉｔ（ｐｉｅｒｃｅ社製）にて測定した。

細胞数の影響を除くために、全タンパク質との比でＣＤ６３発現量（ｎｇ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）を求めて、ｃｏｎｔｒｏｌに対する相対値を算出した。これらの結果を図１に示した。図１から、前記各実施例では、いずれも優れた結果が得られたのに対し、各比較例では満足のいく結果が得られなかったことがわかる。

［４－１－２］ＣＤ９の産生促進効果による評価
市販のヒト由来エクソソーム定量用ＣＤ９／ＣＤ９ Ｅｘｏｓｏｍｅ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ，Ｈｕｍａｎ（コスモバイオ社製）を用いて測定を行った。具体的には、ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに上記のようにして回収した培養上清およびＣＤ９スタンダードビーズ溶液を１００μＬずつ加えて室温にて２時間反応させた。抗原－抗体反応終了後、各ウェル中の反応液を完全に除去し、洗浄バッファー３００μＬを用いて３回洗浄した。希釈したＨＲＰ標識抗ＣＤ９抗体を各ウェルに１００μＬずつ加えて室温にて２時間反応した。反応終了後、洗浄バッファー３００μＬを用いて３回洗浄した。発色の基質液１００μＬずつを各ウェルに加えて室温で遮光２０分間の静置反応をさせた後、５０μＬずつの停止液を加えた。測定は、波長４５０ｎｍをマイクロプレートリーダー（ＴａｋａｒａＢｉｏ社製）にて読み取ることにより行い、スタンダード検量線よりＣＤ９の量を算出した。

併せて、別途の透明プレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、上記のようにして保存したセルライセート中の蛋白質量を、ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ ｋｉｔ（ｐｉｅｒｃｅ社製）にて測定した。

細胞数の影響を除くために、全タンパク質との比でＣＤ９発現量（ｎｇ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）を求めて、ｃｏｎｔｒｏｌに対する相対値を算出した。これらの結果を図２に示した。図２から、前記各実施例では、いずれも優れた結果が得られたのに対し、各比較例では満足のいく結果が得られなかったことがわかる。

［４－２］エクソソーム産生促進剤含有組成物の使用感
まず、前記各実施例および各比較例のエクソソーム産生促進剤を用いて、それぞれ、エクソソーム産生促進剤含有組成物としての化粧水を製造した。より詳しくは、エクソソーム産生促進剤：１０．０質量部、１，３－ブチレングリコール：５．０質量部、１，３－プロパンジオール：３．０質量部および精製水：８２．０質量部を混合することにより、エクソソーム産生促進剤含有組成物としての化粧水を製造した。

女性５名の被験者に、上記のようにして得られた各化粧水を使用してもらい、使用前後での肌状態について、アンケート形式で回答を得た。より具体的には、各化粧水の左頬部への塗布を、朝晩２回１４日間連用してもらい、試験開始前の肌状態に対する試験終了から１２時間後の肌状態を比較してもらった。そして、以下の評価基準に基づいて、各被験者に、肌の乾燥状態、肌のハリおよび化粧ノリの各項目について、スコア値を算出してもらった。

２：試験後の方が格段に良くなった。
１：試験後の方が良くなった。
０：試験前後で変化がなかった。
－１：試験後の方が悪くなった。
－２：試験後の方が格段に悪くなった。

各実施例および各比較例に係る化粧水について、被験者ごとに、肌の乾燥状態、肌のハリおよび化粧ノリについてのスコア値の合計値を求め、さらに、５名の被験者についての前記合計値の平均値を求めた。スコア値の合計値の平均値が大きいほど、使用感に優れていると言える。
上記［４－２］の結果を表１にまとめて示す。

表１から、前記各実施例では、いずれも優れた結果が得られたのに対し、各比較例では満足のいく結果が得られなかったことがわかる。

Claims (6)

1. 大豆エキスと脱脂米糠と酵母エキスとを含む組成物を枯草菌によって発酵させることで得られる発酵物を含有し、
   全固形分中に占める前記発酵物の固形分の割合が、０．１質量％以上２．０質量％以下であることを特徴とするエクソソーム産生促進剤。
2. 前記枯草菌が納豆菌である請求項１に記載のエクソソーム産生促進剤。
3. 前記組成物中における前記酵母エキスの固形分の含有量が０．１質量％以上１．０質量％以下である請求項１に記載のエクソソーム産生促進剤。
4. 請求項１ないし３のいずれか１項に記載のエクソソーム産生促進剤を含有することを特徴とするエクソソーム産生促進剤含有組成物。
5. エクソソーム産生促進剤含有組成物は、液状をなすものである請求項４に記載のエクソソーム産生促進剤含有組成物。
6. エクソソーム産生促進剤含有組成物は、外用剤である請求項４に記載のエクソソーム産生促進剤含有組成物。