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JP7753355B2 - 改善特性を有する遺伝子改変メチロバチルス細菌 - Google Patents

改善特性を有する遺伝子改変メチロバチルス細菌

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Description

本発明は、概して、バイオテクノロジー工学、具体的には、大規模メタノール発酵に特に有用なものとなるように改善された特性を有するメチロバチルス属の遺伝子改変細菌に関する。より具体的には、本発明は、菌体外多糖（ＥＰＳ）の産生が、改変を有しないが、それ以外は同一の細菌と比較して減少するように改変されている、メチロバチルス属の細菌を提供する。本発明は、本発明の遺伝子改変細菌を用いて生化学化合物を生成する方法をさらに提供する。
発明の背景
メタノール発酵は、石油由来の化学物質の生成に取って代わる可能性を有する。これを実現するためには、効率的なメチロトローフ（メタノールもしくはメタン等の一炭素化合物、または炭素－炭素結合を有しない多炭素化合物を消費する）株を開発する必要がある。メタノールを唯一の炭素源として成長および産物形成に利用することができる幾つかの細菌が同定された。幾つかの例としては、バチルス・メタノリカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ）、メチロバクテリウム・エクストルケンス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ）、メチロバチルス・グリコゲネス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇｌｙｃｏｇｅｎｅｓ）およびメチロバチルス・フラゲラータス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｇｅｌｌａｔｕｓ）が挙げられる。メチロトローフ細菌は、メタノール同化経路に基づいて大きく２つの群に分けることができる。最初の工程は常に、メタノールデヒドロゲナーゼ酵素によって触媒されるメタノールからホルムアルデヒドの変換である。第１の群では、ホルムアルデヒドがリブロース一リン酸（ＲｕＭＰ）と反応してＣ６化合物を形成し、これが続いてさらに代謝される。この群のメンバーは、一般に「ＲｕＭＰサイクルメチロトローフ」と称される。Ｍ．エクストルケンス（Ｍ．ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ）を含む第２の群は、ホルムアルデヒドをグリシンと反応させ、セリンサイクルとして知られる経路でセリンを形成することによってホルムアルデヒドを同化する。どちらの群のメチロトローフ細菌も、メタノールからの様々な生化学物質の生成に使用されてきた。しかしながら、ＲｕＭＰサイクルは、セリンサイクルよりもエネルギー効率が高く、より速い成長およびバイオマス形成をもたらす。
メチロトローフ微生物は海洋、土壌、植物根圏、さらには下水等の極めて多様な環境に存在し得る。メチロトローフ細菌は、これらの多様で、多くの場合、過酷な環境で生き抜くことができなければならないため、最低限の栄養素で効率的に成長しながらも、非常に頑強であり、様々なタイプのストレスに対して耐性を示す傾向があることが多い。ＲｕＭＰサイクルを利用するメチロバチルス属の株は、最少ミネラル培地中で迅速かつ再現性よく成長し、温度およびメタノール濃度の変動に影響を受けにくいという、生化学物質生成系列に望ましい多数の特質を有する。さらに、これらの株は、遺伝子操作に非常に適しており、複雑な経路の代謝工学の可能性を引き出すものである。
メチロバチルスを含む多くのメチロトローフは、多量の菌体外多糖（ＥＰＳ）を産生し、その自然環境内の生物に乾燥からの保護、バイオフィルム足場形成、エネルギー貯蔵等の複数の利点を与える。流加発酵では、メチロバチルスのバイオマスは、最大３０％のＥＰＳからなることがある。
特にメチロバチルスにおけるＥＰＳ産生は、比較的研究されていない。メタノランと称される新規のＥＰＳを合成することが見出された、土壌から単離された偏性メチロトローフであるメチロバチルス属種１２Ｓ株の単一株のみに対して研究が行われている（Yoshida et al., 2000）。メチロバチルス属種１２Ｓ株におけるメタノラン合成に関与する遺伝子クラスターは、同定および特性化されているが（Yoshida et al., 2003）、他のメチロバチルスでは、そのような研究は行われていない。バイオインフォマティクス分析および配列相同性に基づいて、メチロバチルス・フラゲラータス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｇｅｌｌａｔｕｓ）のＫＴ株（Chistoserdova et al., 2007）およびメチロバチルス・グリコゲネス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇｌｙｃｏｇｅｎｅｓ）（Hattori et al., 2020）におけるＥＰＳ遺伝子クラスターが予測されているが、遺伝子自体は特性化されていない。
発明の概要
本発明の目的は、メタノールベースのバイオプロセスにおける或る特定の欠点を克服することである。これは、菌体外多糖（ＥＰＳ）の産生が減少しているメチロバチルス属の種々の遺伝子改変細菌を操作した本発明者らによって達成される。
本発明者らは、メチロバチルスにおける一般的なＥＰＳ産生について研究した。Ｍ．フラゲラータス（Ｍ．ｆｌａｇｅｌｌａｔｕｓ）およびＭ．グリコゲネス（Ｍ．ｇｌｙｃｏｇｅｎｅｓ）のゲノムのバイオインフォマティクス分析に基づいて、本発明者らは、２つの推定ＥＰＳ産生遺伝子クラスターを同定した。両方のＥＰＳクラスターを破壊すると、ＥＰＳ産生が完全に消失した。
改変されたＭ．フラゲラータス（Ｍ．ｆｌａｇｅｌｌａｔｕｓ）およびＭ．グリコゲネス（Ｍ．ｇｌｙｃｏｇｅｎｅｓ）株における予期せぬ驚くべき観察結果は、成長培養物におけるその挙動であった。メチロバチルス細菌における菌体外多糖（ＥＰＳ）の産生に関与する１つ以上の内在性ポリペプチドの発現を消失させると、培養物は、メタノールベースのバイオプロセスの開発に有益な多数の驚くべき予期せぬ特性を示した。予期せぬことに、振盪フラスコおよびバイオリアクターの両方における過剰な培養物の発泡が低減した。さらに、未改変の親株では細胞の凝集が観察されたが、改変メチロバチルスの培養物では、凝集が低減するか、あるいは見られなかった。ＥＰＳ産生を排除すると、バイオマスの遠心分離および濾過も改善された。これらの特性の組合せにより、バイオプロセス、株の取扱いおよび下流の処理が大幅に改善され、改変メチロバチルス細菌が大規模メタノール発酵に好適なものとなる。ＥＰＳ合成の除去は、予期せぬことに、Ｍ．フラゲラータス（Ｍ．ｆｌａｇｅｌｌａｔｕｓ）および他のメチロバチルス種のメタノール耐性も改善した。
以上の発見に基づき、本発明は、第１の態様において、菌体外多糖（ＥＰＳ）の産生が、改変を有しないが、それ以外は同一の細菌と比較して減少するように改変されている、メチロバチルス属の遺伝子組換え細菌を提供する。
本発明は、本発明の細菌を、メタノール等の還元一炭素化合物、またはジメチルアミン等の炭素－炭素結合を有しない多炭素化合物を含む培養培地中にて適切な培養条件下で培養することを含む、生化学化合物を生成する方法をさらに提供する。
本発明は、以下の項目によってまとめることができる：
１． 菌体外多糖（ＥＰＳ）の産生が、改変を有しないが、それ以外は同一の細菌と比較して減少するように改変されている、メチロバチルス属の遺伝子組換え細菌。
２． 上記細菌における菌体外多糖（ＥＰＳ）の産生に関与する少なくとも１つの内在性ポリペプチドの発現および／または機能（例えば活性）が、改変を有しないが、それ以外は同一の細菌（参照細菌）と比較して減少するように改変されている、項目１記載の細菌。
３． 上記細菌における菌体外多糖（ＥＰＳ）の産生に関与する少なくとも１つの内在性ポリペプチドの発現が、改変を有しないが、それ以外は同一の細菌（参照細菌）と比較して減少するように改変されている、項目１または２記載の細菌。
４． 上記細菌における菌体外多糖（ＥＰＳ）の産生に関与する少なくとも２つの内在性ポリペプチドの発現が、改変を有しないが、それ以外は同一の細菌（参照細菌）と比較して減少するように改変されている、項目１から３までのいずれか１つ記載の細菌。
５． 上記細菌における菌体外多糖（ＥＰＳ）の産生に関与する少なくとも３つの内在性ポリペプチドの発現が、改変を有しないが、それ以外は同一の細菌（参照細菌）と比較して減少するように改変されている、項目１から４までのいずれか１つ記載の細菌。
６． 上記細菌における菌体外多糖（ＥＰＳ）の産生に関与する少なくとも４つの内在性ポリペプチドの発現が、改変を有しないが、それ以外は同一の細菌（参照細菌）と比較して減少するように改変されている、項目１から５までのいずれか１つ記載の細菌。
７． 上記細菌における菌体外多糖（ＥＰＳ）の産生に関与する少なくとも５つの内在性ポリペプチドの発現が、改変を有しないが、それ以外は同一の細菌（参照細菌）と比較して減少するように改変されている、項目１から６までのいずれか１つ記載の細菌。
８． 上記細菌における菌体外多糖（ＥＰＳ）の産生に関与する少なくとも６つの内在性ポリペプチドの発現が、改変を有しないが、それ以外は同一の細菌（参照細菌）と比較して減少するように改変されている、項目１から７までのいずれか１つ記載の細菌。
９． 上記細菌における菌体外多糖（ＥＰＳ）の産生に関与する全ての内在性ポリペプチドの発現が、改変を有しないが、それ以外は同一の細菌（参照細菌）と比較して減少するように改変されている、項目１から８までのいずれか１つ記載の細菌。
１０． 上記細菌における菌体外多糖（ＥＰＳ）の産生に関与する少なくとも１つのポリペプチドが、ａ）配列番号１～３８のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、およびｂ）配列番号１～３８のいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、参照ポリペプチドと同じ機能特性を有するポリペプチドからなる群から選択される、項目２から９までのいずれか１つ記載の細菌。
１１． 上記細菌における菌体外多糖（ＥＰＳ）の産生に関与する少なくとも１つのポリペプチドが、ａ）配列番号１～２６のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、およびｂ）配列番号１～２６のいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、参照ポリペプチドと同じ機能特性を有するポリペプチドからなる群から選択される、項目２から１０までのいずれか１つ記載の細菌。
１２． 上記細菌における菌体外多糖（ＥＰＳ）の産生に関与する少なくとも１つのポリペプチドが、ａ）配列番号２７～３８のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、およびｂ）配列番号２７～３８のいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、参照ポリペプチドと同じ機能特性を有するポリペプチドからなる群から選択される、項目２から１０までのいずれか１つ記載の細菌。
１３． 上記細菌における菌体外多糖（ＥＰＳ）の産生に関与する少なくとも１つのポリペプチドが、ａ）配列番号３９～８６のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、およびｂ）配列番号３９～８６のいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、参照ポリペプチドと同じ機能特性を有するポリペプチドからなる群から選択される、項目２から１２までのいずれか１つ記載の細菌。
１４． 上記細菌における菌体外多糖（ＥＰＳ）の産生に関与する少なくとも１つのポリペプチドが、ａ）配列番号３９～６０のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、およびｂ）配列番号３９～６０のいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、参照ポリペプチドと同じ機能特性を有するポリペプチドからなる群から選択される、項目２から１３までのいずれか１つ記載の細菌。
１５． 上記細菌における菌体外多糖（ＥＰＳ）の産生に関与する少なくとも１つのポリペプチドが、ａ）配列番号６１～８６のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、およびｂ）配列番号６１～８６のいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、参照ポリペプチドと同じ機能特性を有するポリペプチドからなる群から選択される、項目２から１３までのいずれか１つ記載の細菌。
１６． 上記細菌における菌体外多糖（ＥＰＳ）の産生に関与する少なくとも１つのポリペプチドが、ペプチジルプロリルシス－トランスイソメラーゼ活性を有するポリペプチド、多糖排出輸送体として作用することが可能なポリペプチド；鎖長決定タンパク質として作用するポリペプチド；およびタンパク質チロシンキナーゼ活性を有するポリペプチドからなる群から選択される、項目２から１５までのいずれか１つ記載の細菌。
１７． ペプチジルプロリルシス－トランスイソメラーゼ活性を有するポリペプチドが、配列番号６に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、多糖排出輸送体として作用することが可能なポリペプチドが、配列番号７に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、鎖長決定タンパク質として作用するポリペプチドが、配列番号８に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、タンパク質チロシンキナーゼ活性を有するポリペプチドが、配列番号９に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目１６記載の細菌。
１８． ペプチジルプロリルシス－トランスイソメラーゼ活性を有するポリペプチドが、配列番号４２に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、多糖排出輸送体として作用することが可能なポリペプチドが、配列番号４３に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、鎖長決定タンパク質として作用するポリペプチドが、配列番号４４に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、タンパク質チロシンキナーゼ活性を有するポリペプチドが、配列番号４５に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目１６記載の細菌。
１９． 上記細菌における菌体外多糖（ＥＰＳ）の産生に関与する少なくとも１つのポリペプチドの発現が、それ以外は同一の細菌と比較して少なくとも５０％、例えば少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも１００％減少している、項目２から１８までのいずれか１つ記載の細菌。
２０． 上記細菌における菌体外多糖（ＥＰＳ）の産生に関与する少なくとも１つのポリペプチドの発現が、それ以外は同一の細菌と比較して消失している、項目２から１９までのいずれか１つ記載の細菌。
２１． 上記細菌における菌体外多糖（ＥＰＳ）の産生に関与する上記ポリペプチドをコードする内在性遺伝子が不活性化されている、項目２から２０までのいずれか１つ記載の細菌。
２２． 上記細菌における菌体外多糖（ＥＰＳ）の産生に関与する上記ポリペプチドをコードする内在性遺伝子が、遺伝子配列の一部または全体の欠失によって不活性化されている、項目２から２１までのいずれか１つ記載の細菌。
２３． 上記細菌における菌体外多糖（ＥＰＳ）の産生に関与する上記ポリペプチドをコードする内在性遺伝子が、上記ポリペプチドをコードする内在性遺伝子をＤＮＡ切断により選択的に不活性化することが可能なそれぞれのレアカットエンドヌクレアーゼを細菌に導入または発現させることによって不活性化されている、項目２から２２までのいずれか１つ記載の細菌。
２４． 上記レアカットエンドヌクレアーゼが転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）ヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）およびＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼからなる群から選択される、項目２３記載の細菌。
２５． ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが、触媒的に不活性なＣａｓ９タンパク質である、項目２４記載の細菌。
２６． 上記酵素をコードするゲノムＤＮＡと細胞条件下で特異的にハイブリダイズする（例えば結合する）少なくとも１つのシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含む（例えば発現する）、項目２５記載の細菌。
２７． 上記細菌における菌体外多糖（ＥＰＳ）の産生に関与するポリペプチドの発現が、上記ポリペプチドをコードする内在性遺伝子の転写抑制および／または翻訳抑制によって減少する（例えば阻害される）、項目２から２１までのいずれか１つ記載の細菌。
２８． 上記細菌における菌体外多糖（ＥＰＳ）の産生に関与するポリペプチドの発現が、上記ポリペプチドをコードする細胞ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡと細胞条件下で特異的にハイブリダイズする（例えば結合する）少なくとも１つの阻害性核酸分子を細菌に導入または発現させることによって減少する（例えば阻害される）、項目２から２１までのいずれか１つ記載の細菌。
２９． 阻害性核酸分子がアンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイムまたは干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）分子である、項目２８記載の細菌。
３０． 干渉ＲＮＡ分子がマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である、項目２９記載の細菌。
３１． 上記細菌における菌体外多糖（ＥＰＳ）の産生に関与する内在性ポリペプチド（単数または複数）が、第１のＥＰＳ遺伝子クラスターおよび／または第２のＥＰＳ遺伝子クラスターに含まれる遺伝子（単数または複数）によってコードされる、項目２から３０までのいずれか１つ記載の細菌。
３２． 第１のＥＰＳ遺伝子クラスターが、配列番号１７４または１７７に見られるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）によって定義されるか、またはそれにオーソロガスな遺伝子を含む、項目３１記載の細菌。
３３． 第１のＥＰＳ遺伝子クラスターが遺伝子ｅｐｓＤ、ｅｐｓＥ、ｅｐｓＦ、ｅｐｓＧ、ｅｐｓＢ、ｅｐｓＬ、ｅｐｓＨ、ｅｐｓＩ、ｅｐｓＪおよびｅｐｓＳ、またはそれらのオーソログを含む、項目３１または３２記載の細菌。
３４． 第１のＥＰＳ遺伝子クラスターが遺伝子ｅｐｓＤ、ｅｐｓＥ、ｅｐｓＦおよびｅｐｓＧ、またはそれらのオーソログを含む、項目３１から３３までのいずれか１つ記載の細菌。
３５． 第１のＥＰＳ遺伝子クラスターが、配列番号１７４または１７７のヌクレオチド配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、項目３１から３４までのいずれか１つ記載の細菌。
３６． 第１のＥＰＳ遺伝子クラスターが、配列番号１７４のヌクレオチド配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、項目３１から３４までのいずれか１つ記載の細菌。
３７． 上記第１のＥＰＳ遺伝子クラスター中の少なくとも１つの遺伝子が、例えば遺伝子配列の一部または全体の欠失によって不活性化されている、項目３１から３６までのいずれか１つ記載の細菌。
３８． ｅｐｓＤ、ｅｐｓＥ、ｅｐｓＦ、ｅｐｓＧ、ｅｐｓＢ、ｅｐｓＬ、ｅｐｓＨ、ｅｐｓＩ、ｅｐｓＪおよびｅｐｓＳ、またはそれらのオーソログから選択される少なくとも１つの遺伝子が、例えば遺伝子配列の一部または全体の欠失によって不活性化されている、項目３１から３７までのいずれか１つ記載の細菌。
３９． ｅｐｓＤ、ｅｐｓＥ、ｅｐｓＦおよびｅｐｓＧ、またはそれらのオーソログから選択される少なくとも１つの遺伝子が、例えば遺伝子配列の一部または全体の欠失によって不活性化されている、項目３１から３８までのいずれか１つ記載の細菌。
４０． 遺伝子ｅｐｓＤ、ｅｐｓＥ、ｅｐｓＦおよびｅｐｓＧ、またはそれらのオーソログが、例えば遺伝子配列の一部または全体の欠失によって不活性化されている、項目３１から３９までのいずれか１つ記載の細菌。
４１． 遺伝子ｅｐｓＤが、配列番号６に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、遺伝子ｅｐｓＥが、配列番号７に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、遺伝子ｅｐｓＦが、配列番号８に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、遺伝子ｅｐｓＧが、配列番号９に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、項目３９または４０記載の細菌。
４２． 遺伝子ｅｐｓＤが、配列番号９２と少なくとも７０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、遺伝子ｅｐｓＥが、配列番号９３と少なくとも７０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、遺伝子ｅｐｓＦが、配列番号９４と少なくとも７０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、遺伝子ｅｐｓＧが、配列番号９５と少なくとも７０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、項目４１記載の細菌。
４３． 遺伝子ｅｐｓＤが、配列番号４２に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、遺伝子ｅｐｓＥが、配列番号４３に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、遺伝子ｅｐｓＦが、配列番号４４に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、遺伝子ｅｐｓＧが、配列番号４５に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、項目３９または４０記載の細菌。
４４． ｅｐｓＤ遺伝子が、配列番号１２８と少なくとも７０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、遺伝子ｅｐｓＥが、配列番号１２９と少なくとも７０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、遺伝子ｅｐｓＦが、配列番号１３０と少なくとも７０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、遺伝子ｅｐｓＧが、配列番号１３１と少なくとも７０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、項目４３記載の細菌。
４５． 第１のＥＰＳ遺伝子クラスターが不活性化されている、項目３１から４４までのいずれか１つ記載の細菌。
４６． 第１のＥＰＳ遺伝子クラスターが、上記クラスターの配列の一部または全体の欠失によって不活性化されている、項目３１から４５までのいずれか１つ記載の細菌。
４７． 第１のＥＰＳ遺伝子クラスターが、遺伝子発現の欠如を引き起こすプロモーターおよび／またはリボソーム結合部位領域の改変（例えば、その領域への少なくとも１つの突然変異の導入）によって不活性化されている、項目３１から４５までのいずれか１つ記載の細菌。
４８． 第２のＥＰＳ遺伝子クラスターが、配列番号１７５または１７９に見られるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）によって定義されるか、またはそれにオーソロガスな遺伝子を含む、項目３１から４７までのいずれか１つ記載の細菌。
４９． 第２のＥＰＳ遺伝子クラスターが、配列番号１７５または１７９のヌクレオチド配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、項目３１から４８までのいずれか１つ記載の細菌。
５０． 第２のＥＰＳ遺伝子クラスターが、配列番号１７５のヌクレオチド配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、項目３１から４８までのいずれか１つ記載の細菌。
５１． 上記第２のＥＰＳ遺伝子クラスター中の少なくとも１つの遺伝子が、例えば遺伝子配列の一部または全体の欠失によって不活性化されている、項目３１から５０までのいずれか１つ記載の細菌。
５２． 第２のＥＰＳ遺伝子クラスターが不活性化されている、項目３１から５１までのいずれか１つ記載の細菌。
５３． 第２のＥＰＳ遺伝子クラスターが、上記クラスターの配列の一部または全体の欠失によって不活性化されている、項目３１から５２までのいずれか１つ記載の細菌。
５４． 第２のＥＰＳ遺伝子クラスターが、遺伝子発現の欠如を引き起こすプロモーターおよび／またはリボソーム結合部位領域の改変（例えば、少なくとも１つの突然変異の導入）によって不活性化されている、項目３１から５２までのいずれか１つ記載の細菌。
５５． 上記細菌における菌体外多糖（ＥＰＳ）の産生に関与する酵素をコードする全ての内在性遺伝子が不活性化、例えば欠失している、項目１から５２までのいずれか１つ記載の細菌。
５６． 細菌がメチロバチルス・フラゲラータス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｇｅｌｌａｔｕｓ）、メチロバチルス・グリコゲネス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇｌｙｃｏｇｅｎｅｓ）、メチロバチルス・プラテンシス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｒａｔｅｎｓｉｓ）、メチロバチルス・リゾスファエラエ（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈｉｚｏｓｐｈａｅｒａｅ）、メチロバチルス・グラミネウス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇｒａｍｉｎｅｕｓ）、メチロバチルス・アルボレウス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｒｂｏｒｅｕｓ）、メチロバチルス・カリシス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｒｉｃｉｃｓ）、メチロバチルス・メチロボランス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｔｈｉｌｏｖｏｒａｎｓ）およびメチロバチルス属種から選択される、項目１から５５までのいずれか１つ記載の細菌。
５７． 細菌がメチロバチルス・フラゲラータス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｇｅｌｌａｔｕｓ）およびメチロバチルス・グリコゲネス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇｌｙｃｏｇｅｎｅｓ）から選択される、項目１から５６までのいずれか１つ記載の細菌。
５８． 細菌がメチロバチルス・フラゲラータス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｇｅｌｌａｔｕｓ）である、項目１から５５までのいずれか１つ記載の細菌。
５９． 細菌がメチロバチルス・グリコゲネス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇｌｙｃｏｇｅｎｅｓ）である、項目１から５５までのいずれか１つ記載の細菌。
６０． 項目１から５９までのいずれか１つ記載の細菌を、メタノール等の還元一炭素化合物、またはジメチルアミン等の炭素－炭素結合を有しない多炭素化合物を含む培養培地中にて適切な培養条件下で培養することを含む、生化学化合物を生成する方法。
６１． 培養培地がメタノールを含む、項目６０記載の方法。
６２． 培養をバイオリアクター内で行う、項目６０または６１記載の方法。
６３． 生化学化合物が有機酸、アミノ酸、脂肪酸およびそれらの誘導体から選択される、項目６０から６２までのいずれか１つ記載の方法。
加水分解したＭ．フラゲラータス（Ｍ．ｆｌａｇｅｌｌａｔｕｓ）振盪フラスコ上清の糖含量を示す図である。濃い灰色のバーは、ｍｇ／Ｌ単位の全グルコースを表し、薄い灰色のバーは、全単量体糖を表す。エラーバーは、技術的反復試験の標準偏差である。 メチロバチルス・フラゲラータス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｇｅｌｌａｔｕｓ）の様々な株によって産生されたバイオリアクターブロスの測定された粘度を示す図である。 ２４時間のインキュベーション後の野生型Ｍ．フラゲラータス（Ｍ．ｆｌａｇｅｌｌａｔｕｓ）およびＭ．グリコゲネス（Ｍ．ｇｌｙｃｏｇｅｎｅｓ）の培養物の写真である。左側が野生型ＡＢＭＥ ５および６、続いてＭ．フラゲラータス（Ｍ．ｆｌａｇｅｌｌａｔｕｓ）における単一クラスター破壊、最後が二重破壊である。 発酵時間（ｘ軸）に対するＡＢＭＥ ６およびＡＢＭＥ １３１の２回の代表的なバイオリアクター発酵中の消泡剤添加（ｙ軸）のプロットを示す図である。 野生型メチロバチルス・フラゲラータス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｇｅｌｌａｔｕｓ）（左）対二重破壊株ＡＢＭＥ １３１（右）のバイオリアクター発酵ブロスの位相差顕微鏡画像である。 親株と比較した、ＥＰＳを含まないＡＢＭＥ １３１の成長の改善を示す図である。
ここで、本発明を以下により詳細に説明する。
発明の詳細な説明
本明細書で特に定義されない限り、使用される全ての技術用語および科学用語は、生化学、遺伝学および微生物学の分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
本明細書に記載のものと同様または同等の全ての方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができ、好適な方法および材料が本明細書に記載される。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許および他の参照文献は、その全体が参照により援用される。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が優先される。さらに、材料、方法および実施例は、特に指定のない限り、例示に過ぎず、限定を意図していない。
本発明の実施には、特に記載のない限り、当業者の技能の範囲内の細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学および組換えＤＮＡの従来の手法が用いられる。かかる手法は、文献中で十分に説明される。例えば、Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA)；Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, (Sambrook et al, 2001, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984)；Mullis et al.の米国特許第４，６８３，１９５号明細書；Nucleic Acid Hybridization (B. D. Harries & S. J. Higgins eds. 1984)；Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984)；Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987)；Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986)；B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984)；Methods In ENZYMOLOGY (J. Abelson and M. Simon, eds.-in-chief, Academic Press, Inc., New York)のシリーズ、特にVols.154および155 (Wu et al. eds.)ならびにVol. 185, “Gene Expression Technology” (D. Goeddel, ed.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory)を参照されたい。
本発明の細菌
上述のように、本発明は、メタノールベースのバイオプロセスにおける或る特定の欠点が、メチロバチルス属の細菌において菌体外多糖（ＥＰＳ）の産生を下方調節することによって克服され得るという予期せぬ驚くべき発見に基づく。
本発明は、このように、第１の態様において、菌体外多糖（ＥＰＳ）の産生が、改変を有しないが、それ以外は同一の細菌と比較して減少するように改変されている、メチロバチルス属の遺伝子組換え細菌を提供する。
より具体的には、本発明は、上記細菌における菌体外多糖（ＥＰＳ）の産生に関与する少なくとも１つの内在性ポリペプチドの発現および／または活性が、改変を有しないが、それ以外は同一の細菌（参照細菌）と比較して減少するように改変されている、メチロバチルス属の遺伝子組換え細菌を提供する。
幾つかの実施形態によると、本発明の遺伝子組換え細菌は、上記細菌における菌体外多糖（ＥＰＳ）の産生に関与する少なくとも１つ、例えば少なくとも２つの内在性ポリペプチドの発現が、改変を有しないが、それ以外は同一の細菌（参照細菌）と比較して減少するように改変されている。
幾つかの実施形態によると、本発明の遺伝子組換え細菌は、上記細菌における菌体外多糖（ＥＰＳ）の産生に関与する少なくとも３つ、例えば少なくとも４つの内在性ポリペプチドの発現が、改変を有しないが、それ以外は同一の細菌（参照細菌）と比較して減少するように改変されている。
幾つかの実施形態によると、本発明の遺伝子組換え細菌は、上記細菌における菌体外多糖（ＥＰＳ）の産生に関与する少なくとも５つ、例えば少なくとも６つの内在性ポリペプチドの発現が、改変を有しないが、それ以外は同一の細菌（参照細菌）と比較して減少するように改変されている。
幾つかの実施形態によると、本発明の遺伝子組換え細菌は、上記細菌における菌体外多糖（ＥＰＳ）の産生に関与する少なくとも７つ、例えば少なくとも８つの内在性ポリペプチドの発現が、改変を有しないが、それ以外は同一の細菌（参照細菌）と比較して減少するように改変されている。
幾つかの実施形態によると、本発明の遺伝子組換え細菌は、上記細菌における菌体外多糖（ＥＰＳ）の産生に関与する少なくとも９つ、例えば少なくとも１０個の内在性ポリペプチドの発現が、改変を有しないが、それ以外は同一の細菌（参照細菌）と比較して減少するように改変されている。
幾つかの実施形態によると、本発明の遺伝子組換え細菌は、上記細菌における菌体外多糖（ＥＰＳ）の産生に関与する少なくとも１１個、例えば少なくとも１２個の内在性ポリペプチドの発現が、改変を有しないが、それ以外は同一の細菌（参照細菌）と比較して減少するように改変されている。
幾つかの実施形態によると、本発明の遺伝子組換え細菌は、上記細菌における菌体外多糖（ＥＰＳ）の産生に関与する少なくとも１３個、例えば少なくとも１４個の内在性ポリペプチドの発現が、改変を有しないが、それ以外は同一の細菌（参照細菌）と比較して減少するように改変されている。
幾つかの実施形態によると、本発明の遺伝子組換え細菌は、上記細菌における菌体外多糖（ＥＰＳ）の産生に関与する少なくとも１５個、例えば少なくとも１６個の内在性ポリペプチドの発現が、改変を有しないが、それ以外は同一の細菌（参照細菌）と比較して減少するように改変されている。
幾つかの実施形態によると、本発明の遺伝子組換え細菌は、上記細菌における菌体外多糖（ＥＰＳ）の産生に関与する全ての内在性ポリペプチドの発現が、改変を有しないが、それ以外は同一の細菌（参照細菌）と比較して減少するように改変されている。
幾つかの実施形態によると、上記細菌における菌体外多糖（ＥＰＳ）の産生に関与する少なくとも１つのポリペプチドは、ａ）配列番号１～３８のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、およびｂ）配列番号１～３８のいずれか１つと少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、参照ポリペプチドと同じ機能特性を有するポリペプチドからなる群から選択される。
幾つかの実施形態によると、上記細菌における菌体外多糖（ＥＰＳ）の産生に関与する少なくとも１つのポリペプチドは、ａ）配列番号１～２６のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、およびｂ）配列番号１～２６のいずれか１つと少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、参照ポリペプチドと同じ機能特性を有するポリペプチドからなる群から選択される。
幾つかの実施形態によると、上記細菌における菌体外多糖（ＥＰＳ）の産生に関与する少なくとも１つのポリペプチドは、ａ）配列番号２７～３８のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、およびｂ）配列番号２７～３８のいずれか１つと少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、参照ポリペプチドと同じ機能特性を有するポリペプチドからなる群から選択される。
幾つかの実施形態によると、上記細菌における菌体外多糖（ＥＰＳ）の産生に関与する少なくとも１つのポリペプチドは、ａ）配列番号３９～８６のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、およびｂ）配列番号３９～８６のいずれか１つと少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、参照ポリペプチドと同じ機能特性を有するポリペプチドからなる群から選択される。
幾つかの実施形態によると、上記細菌における菌体外多糖（ＥＰＳ）の産生に関与する少なくとも１つのポリペプチドは、ａ）配列番号３９～６０のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、およびｂ）配列番号３９～６０のいずれか１つと少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、参照ポリペプチドと同じ機能特性を有するポリペプチドからなる群から選択される。
幾つかの実施形態によると、上記細菌における菌体外多糖（ＥＰＳ）の産生に関与する少なくとも１つの酵素は、ａ）配列番号６１～８６のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、およびｂ）配列番号６１～８６のいずれか１つと少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、参照ポリペプチドと同じ機能特性を有するポリペプチドからなる群から選択される。
幾つかの実施形態によると、上記細菌における菌体外多糖（ＥＰＳ）の産生に関与する少なくとも１つのポリペプチドは、ペプチジルプロリルシス－トランスイソメラーゼ活性を有するポリペプチド、多糖排出輸送体として作用することが可能なポリペプチド；鎖長決定タンパク質として作用するポリペプチド；およびタンパク質チロシンキナーゼ活性を有するポリペプチドからなる群から選択される。
幾つかの実施形態によると、ペプチジルプロリルシス－トランスイソメラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号６に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
幾つかの実施形態によると、多糖排出輸送体として作用することが可能なポリペプチドは、配列番号７に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
幾つかの実施形態によると、鎖長決定タンパク質として作用するポリペプチドは、配列番号８に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
幾つかの実施形態によると、タンパク質チロシンキナーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号９に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
幾つかの実施形態によると、ペプチジルプロリルシス－トランスイソメラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号４２に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
幾つかの実施形態によると、多糖排出輸送体として作用することが可能なポリペプチドは、配列番号４３に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
幾つかの実施形態によると、鎖長決定タンパク質として作用するポリペプチドは、配列番号４４に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
幾つかの実施形態によると、タンパク質チロシンキナーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号４５に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
内在性ポリペプチドの発現レベルは例えば、それ以外は同一の細菌と比較して少なくとも５０％、例えば少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも１００％減少し得る。
内在性ポリペプチドの発現の減少は、当該技術分野で既知の任意の好適な手段によって達成することができる。例えば、発現は、例えば遺伝子配列の一部または全体の欠失により、細菌における菌体外多糖（ＥＰＳ）の産生に関与する上記ポリペプチドをコードする内在性遺伝子を不活性化することによって減少させることができる。
幾つかの実施形態によると、上記細菌における菌体外多糖（ＥＰＳ）の産生に関与する少なくとも１つのポリペプチドの発現が、それ以外は同一の細菌と比較して消失している。
幾つかの実施形態によると、細菌における菌体外多糖（ＥＰＳ）の産生に関与する上記ポリペプチドをコードする内在性遺伝子は、例えば遺伝子配列の一部または全体の欠失によって不活性化されている。
幾つかの実施形態によると、上記細菌における菌体外多糖（ＥＰＳ）の産生に関与する上記ポリペプチドをコードする内在性遺伝子は、上記酵素をコードする内在性遺伝子をＤＮＡ切断により選択的に不活性化することが可能なレアカットエンドヌクレアーゼを細菌に導入または発現させることによって不活性化されている。内在性遺伝子を不活性化するために本発明に従って使用されるレアカットエンドヌクレアーゼは、例えば転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）ヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）またはＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼであり得る。
細菌における菌体外多糖（ＥＰＳ）の産生に関与するポリペプチドをコードする内在性遺伝子を不活性化する方法の１つは、ＣＲＩＳＰＲｉシステムを使用することである。ＣＲＩＳＰＲｉシステムは、遺伝子発現の標的抑制またはゲノム上の標的位置のブロックのためのツールとして開発された。ＣＲＩＳＰＲｉシステムは、触媒的に不活性な「死んだ」Ｃａｓ９タンパク質（ｄＣａｓ９）と、ＤＮＡに対するｄＣａｓ９の結合部位を画定するガイドＲＮＡとからなる。
幾つかの実施形態によると、細菌における菌体外多糖（ＥＰＳ）の産生に関与する内在性ポリペプチドの発現は、阻害によって減少する。
上記ポリペプチドの発現の阻害は、当該技術分野で既知の任意の好適な手段によって達成することができる。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイムまたは干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）分子、例えばマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）等の阻害性核酸分子の使用を伴う遺伝子サイレンシング技術によって発現を阻害することができる。
幾つかの実施形態によると、細菌における菌体外多糖（ＥＰＳ）の産生に関与する内在性ポリペプチドの発現は、上記ポリペプチドをコードする内在性遺伝子の転写抑制および／または翻訳抑制によって減少する（例えば阻害される）。
幾つかの実施形態によると、細菌における菌体外多糖（ＥＰＳ）の産生に関与する内在性ポリペプチドの発現は、阻害性核酸分子を細菌に導入または発現させることによって阻害される。例えば、阻害性核酸分子は、細菌において上記阻害性核酸分子の産生を引き起こすように機能するプロモーター、例えば誘導性プロモーターに操作可能に連結した、上記阻害性核酸分子をコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸分子によって導入することができる。好適には、阻害性核酸分子は、問題の内在性ポリペプチドをコードする細胞ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡと細胞条件下で特異的にハイブリダイズする（例えば結合する）ものである。標的に応じて、コードゲノムＤＮＡの転写および／またはコードｍＲＮＡの翻訳を阻害する。
幾つかの実施形態によると、阻害性核酸分子はアンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイムまたは干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）分子である。好ましくは、かかる核酸分子は、問題のポリペプチドをコードする細胞ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡの相補体の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドを含む。
幾つかの実施形態によると、阻害性核酸はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。かかるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、問題の酵素をコードする細胞ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡと細胞条件下で特異的にハイブリダイズする（例えば結合する）核酸分子（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）である。
幾つかの実施形態によると、阻害性核酸分子は、ハンマーヘッド型リボザイム等のリボザイムである。リボザイム分子は、問題のポリペプチドの翻訳を防ぐためにｍＲＮＡ転写産物を触媒的に切断するように設計されている。
幾つかの実施形態によると、阻害性核酸分子は干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）分子である。ＲＮＡ干渉は、ＲＮＡ分子が発現を阻害する生物学的プロセスであり、通例、特定のｍＲＮＡの破壊を引き起こす。ＲＮＡｉ分子の例示的なタイプとしては、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）および短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が挙げられる。幾つかの実施形態によると、ＲＮＡｉ分子はｍｉＲＮＡである。幾つかの実施形態によると、ＲＮＡｉ分子はｓｉＲＮＡである。幾つかの実施形態によると、ＲＮＡｉ分子はｓｈＲＮＡである。
幾つかの実施形態によると、本発明の細菌は、細菌における菌体外多糖（ＥＰＳ）の産生に関与する少なくとも１つのポリペプチドの機能（例えば活性）が、改変を有しないが、それ以外は同一の微生物（参照細菌）と比較して減少するように改変されている。
少なくとも１つの内在性ポリペプチドの機能（例えば活性）の減少は、当該技術分野で既知の任意の好適な手段によって達成することができる。例えば、ポリペプチドが酵素である場合、活性の低下または喪失をもたらす１つ以上の突然変異を酵素の活性部位に導入することによって活性を減少させることができる。このように、幾つかの実施形態によると、細菌における菌体外多糖（ＥＰＳ）の産生に関与する少なくとも１つの内在性酵素の活性が、活性の低下または喪失をもたらす少なくとも１つの活性部位突然変異によって減少する。少なくとも１つの活性部位突然変異は、例えば少なくとも１つの非保存的アミノ酸置換であり得る。
上述のように、本発明者らは、メチロバチルスのゲノムにおいて２つの推定ＥＰＳ遺伝子クラスターを同定した。菌体外多糖（ＥＰＳ）の産生に関与する内在性ポリペプチド（単数または複数）は、このように第１のＥＰＳ遺伝子クラスターおよび／または第２のＥＰＳ遺伝子クラスターに含まれる遺伝子（単数または複数）によってコードされる。
幾つかの実施形態によると、上記細菌における菌体外多糖（ＥＰＳ）の産生に関与する内在性ポリペプチド（単数または複数）は、第１のＥＰＳ遺伝子クラスターおよび／または第２のＥＰＳ遺伝子クラスターに含まれる遺伝子（単数または複数）によってコードされる。
幾つかの実施形態によると、第１のＥＰＳ遺伝子クラスターは、配列番号１７４または１７７に見られるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）によって定義されるか、またはそれにオーソロガスな遺伝子を含む。
幾つかの実施形態によると、第１のＥＰＳ遺伝子クラスターは、遺伝子ｅｐｓＤ、ｅｐｓＥ、ｅｐｓＦ、ｅｐｓＧ、ｅｐｓＢ、ｅｐｓＬ、ｅｐｓＨ、ｅｐｓＩ、ｅｐｓＪおよびｅｐｓＳ、またはそれらのオーソログを含む。
幾つかの実施形態によると、第１のＥＰＳ遺伝子クラスターは、遺伝子ｅｐｓＤ、ｅｐｓＥ、ｅｐｓＦおよびｅｐｓＧ、またはそれらのオーソログを含む。
幾つかの実施形態によると、第１のＥＰＳ遺伝子クラスターは、配列番号１７４または１７７のヌクレオチド配列と少なくとも５０％、例えば少なくとも５５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
幾つかの実施形態によると、第１のＥＰＳ遺伝子クラスターは、配列番号１７４または１７７のヌクレオチド配列と少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
幾つかの実施形態によると、第１のＥＰＳ遺伝子クラスターは、配列番号１７４または１７７のヌクレオチド配列と少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
幾つかの実施形態によると、第１のＥＰＳ遺伝子クラスターは、配列番号１７４または１７７のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
幾つかの実施形態によると、第１のＥＰＳ遺伝子クラスターは、配列番号１７４または１７７のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、例えば少なくとも９３％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
幾つかの実施形態によると、第１のＥＰＳ遺伝子クラスターは、配列番号１７４または１７７のヌクレオチド配列と少なくとも９５％、例えば少なくとも９７％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
幾つかの実施形態によると、第１のＥＰＳ遺伝子クラスターは、配列番号１７４のヌクレオチド配列と少なくとも５０％、例えば少なくとも５１％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５７％、少なくとも５８％、少なくとも５９％、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
幾つかの実施形態によると、第１のＥＰＳ遺伝子クラスターは、配列番号１７７のヌクレオチド配列と少なくとも５０％、例えば少なくとも５１％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５７％、少なくとも５８％、少なくとも５９％、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
幾つかの実施形態によると、第２のＥＰＳ遺伝子クラスターは、配列番号１７５または１７９に見られるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）によって定義されるか、またはそれにオーソロガスな遺伝子を含む。
幾つかの実施形態によると、第２のＥＰＳ遺伝子クラスターは、配列番号１７５または１７９のヌクレオチド配列と少なくとも５０％、例えば少なくとも５５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
幾つかの実施形態によると、第２のＥＰＳ遺伝子クラスターは、配列番号１７５または１７９のヌクレオチド配列と少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
幾つかの実施形態によると、第２のＥＰＳ遺伝子クラスターは、配列番号１７５または１７９のヌクレオチド配列と少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
幾つかの実施形態によると、第２のＥＰＳ遺伝子クラスターは、配列番号１７５または１７９のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
幾つかの実施形態によると、第２のＥＰＳ遺伝子クラスターは、配列番号１７５または１７９のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、例えば少なくとも８５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
幾つかの実施形態によると、第２のＥＰＳ遺伝子クラスターは、配列番号１７５のヌクレオチド配列と少なくとも５０％、例えば少なくとも５１％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５７％、少なくとも５８％、少なくとも５９％、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
幾つかの実施形態によると、第２のＥＰＳ遺伝子クラスターは、配列番号１７９のヌクレオチド配列と少なくとも５０％、例えば少なくとも５１％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５７％、少なくとも５８％、少なくとも５９％、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
幾つかの実施形態によると、上記第１のＥＰＳ遺伝子クラスター中の少なくとも１つの遺伝子が、例えば遺伝子配列の一部または全体の欠失によって不活性化されている。
幾つかの実施形態によると、少なくとも１つの遺伝子はｅｐｓＤ、ｅｐｓＥ、ｅｐｓＦ、ｅｐｓＧ、ｅｐｓＢ、ｅｐｓＬ、ｅｐｓＨ、ｅｐｓＩ、ｅｐｓＪおよびｅｐｓＳ、またはそれらのオーソログから選択される。
幾つかの実施形態によると、少なくとも１つの遺伝子はｅｐｓＤ、ｅｐｓＥ、ｅｐｓＦおよびｅｐｓＧ、またはそれらのオーソログから選択される。
幾つかの実施形態によると、遺伝子ｅｐｓＤ、ｅｐｓＥ、ｅｐｓＦおよびｅｐｓＧ、またはそれらのオーソログが、例えば遺伝子配列の一部または全体の欠失によって不活性化されている。
幾つかの実施形態によると、遺伝子ｅｐｓＤは、配列番号６に対して少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、遺伝子ｅｐｓＥは、配列番号７に対して少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、遺伝子ｅｐｓＦは、配列番号８に対して少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、遺伝子ｅｐｓＧは、配列番号９に対して少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする。
幾つかの実施形態によると、遺伝子ｅｐｓＤは、配列番号６に対して少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、遺伝子ｅｐｓＥは、配列番号７に対して少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、遺伝子ｅｐｓＦは、配列番号８に対して少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、遺伝子ｅｐｓＧは、配列番号９に対して少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする。
幾つかの実施形態によると、遺伝子ｅｐｓＤは、配列番号６に対して少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、遺伝子ｅｐｓＥは、配列番号７に対して少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、遺伝子ｅｐｓＦは、配列番号８に対して少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、遺伝子ｅｐｓＧは、配列番号９に対して少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする。
幾つかの実施形態によると、ｅｐｓＤ遺伝子は、配列番号９２と少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、遺伝子ｅｐｓＥは、配列番号９３と少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、遺伝子ｅｐｓＦは、配列番号９４と少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、遺伝子ｅｐｓＧは、配列番号９５と少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
幾つかの実施形態によると、ｅｐｓＤ遺伝子は、配列番号９２と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、遺伝子ｅｐｓＥは、配列番号９３と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、遺伝子ｅｐｓＦは、配列番号９４と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、遺伝子ｅｐｓＧは、配列番号９５と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
幾つかの実施形態によると、ｅｐｓＤ遺伝子は、配列番号９２と少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、遺伝子ｅｐｓＥは、配列番号９３と少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、遺伝子ｅｐｓＦは、配列番号９４と少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、遺伝子ｅｐｓＧは、配列番号９５と少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
幾つかの実施形態によると、遺伝子ｅｐｓＤは、配列番号４２に対して少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、遺伝子ｅｐｓＥは、配列番号４３に対して少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、遺伝子ｅｐｓＦは、配列番号４４に対して少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、遺伝子ｅｐｓＧは、配列番号４５に対して少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする。
幾つかの実施形態によると、遺伝子ｅｐｓＤは、配列番号４２に対して少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、遺伝子ｅｐｓＥは、配列番号４３に対して少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、遺伝子ｅｐｓＦは、配列番号４４に対して少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、遺伝子ｅｐｓＧは、配列番号４５に対して少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする。
幾つかの実施形態によると、遺伝子ｅｐｓＤは、配列番号４２に対して少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、遺伝子ｅｐｓＥは、配列番号４３に対して少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、遺伝子ｅｐｓＦは、配列番号４４に対して少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、遺伝子ｅｐｓＧは、配列番号４５に対して少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする。
幾つかの実施形態によると、遺伝子ｅｐｓＤは、配列番号１２８と少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、遺伝子ｅｐｓＥは、配列番号１２９と少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、遺伝子ｅｐｓＦは、配列番号１３０と少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、遺伝子ｅｐｓＧは、配列番号１３１と少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
幾つかの実施形態によると、遺伝子ｅｐｓＤは、配列番号１２８と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、遺伝子ｅｐｓＥは、配列番号１２９と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、遺伝子ｅｐｓＦは、配列番号１３０と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、遺伝子ｅｐｓＧは、配列番号１３１と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
幾つかの実施形態によると、遺伝子ｅｐｓＤは、配列番号１２８と少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、遺伝子ｅｐｓＥは、配列番号１２９と少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、遺伝子ｅｐｓＦは、配列番号１３０と少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、遺伝子ｅｐｓＧは、配列番号１３１と少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
幾つかの実施形態によると、本発明の遺伝子組換え細菌は、第１のＥＰＳ遺伝子クラスターを不活性化するように改変されている。
幾つかの実施形態によると、本発明の遺伝子組換え細菌は、第２のＥＰＳ遺伝子クラスターを不活性化するように（さらに）改変されている。
幾つかの実施形態によると、本発明の遺伝子組換え細菌は、第１のＥＰＳ遺伝子クラスターおよび第２のＥＰＳ遺伝子クラスターを不活性化するように改変されている。
幾つかの実施形態によると、第１のＥＰＳ遺伝子クラスターは、上記クラスターの配列の一部または全体の欠失によって不活性化されている。
幾つかの実施形態によると、第１のＥＰＳ遺伝子クラスターは、上記クラスターのコード配列全体の欠失によって不活性化されている。
幾つかの実施形態によると、第１のＥＰＳ遺伝子クラスターは、上記クラスターの配列全体の欠失によって不活性化されている。
幾つかの実施形態によると、第１のＥＰＳ遺伝子クラスターは、遺伝子発現の欠如を引き起こすプロモーターおよび／またはリボソーム結合部位領域の改変（例えば、少なくとも１つの突然変異の導入）によって不活性化されている。
幾つかの実施形態によると、第２のＥＰＳ遺伝子クラスターは、上記クラスターの配列の一部または全体の欠失によって不活性化されている。
幾つかの実施形態によると、第２のＥＰＳ遺伝子クラスターは、上記クラスターのコード配列全体の欠失によって不活性化されている。
幾つかの実施形態によると、第２のＥＰＳ遺伝子クラスターは、上記クラスターの配列全体の欠失によって不活性化されている。
幾つかの実施形態によると、第２のＥＰＳ遺伝子クラスターは、遺伝子発現の欠如を引き起こすプロモーターおよび／またはリボソーム結合部位領域の改変（例えば、少なくとも１つの突然変異の導入）によって不活性化されている。
幾つかの実施形態によると、本発明の遺伝子組換え細菌は、配列番号１８１または１８３と少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列が欠失するように改変されている。幾つかの実施形態によると、本発明の遺伝子組換え細菌は、配列番号１８１または１８３と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列が欠失するように改変されている。幾つかの実施形態によると、本発明の遺伝子組換え細菌は、配列番号１８１または１８３と少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列が欠失するように改変されている。
幾つかの実施形態によると、本発明の遺伝子組換え細菌は、配列番号１８２または１８４と少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列が欠失するように改変されている。幾つかの実施形態によると、本発明の遺伝子組換え細菌は、配列番号１８２または１８４と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列が欠失するように改変されている。幾つかの実施形態によると、本発明の遺伝子組換え細菌は、配列番号１８２または１８４と少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列が欠失するように改変されている。
幾つかの実施形態によると、本発明の遺伝子組換え細菌は、配列番号１８１と少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列が欠失し、配列番号１８２と少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列が欠失するように改変されている。幾つかの実施形態によると、本発明の遺伝子組換え細菌は、配列番号１８１と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列が欠失し、配列番号１８２と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列が欠失するように改変されている。幾つかの実施形態によると、本発明の遺伝子組換え細菌は、配列番号１８１と少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列が欠失し、配列番号１８２と少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列が欠失するように改変されている。
幾つかの実施形態によると、本発明の遺伝子組換え細菌は、配列番号１８３と少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列が欠失し、配列番号１８４と少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列が欠失するように改変されている。幾つかの実施形態によると、本発明の遺伝子組換え細菌は、配列番号１８３と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列が欠失し、配列番号１８４と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列が欠失するように改変されている。幾つかの実施形態によると、本発明の遺伝子組換え細菌は、配列番号１８３と少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列が欠失し、配列番号１８４と少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列が欠失するように改変されている。
幾つかの実施形態によると、本発明の遺伝子組換え細菌は、上記細菌における菌体外多糖（ＥＰＳ）の産生に関与するポリペプチドをコードする全ての内在性遺伝子が欠失するように改変されている。
本発明による細菌は、メチロバチルス属の任意の好適な細菌から生成することができる。メチロバチルスは、グラム陰性メチロトローフ細菌の一属である。
幾つかの実施形態によると、本発明の細菌は、メチロバチルス・フラゲラータス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｇｅｌｌａｔｕｓ）、メチロバチルス・グリコゲネス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇｌｙｃｏｇｅｎｅｓ）、メチロバチルス・プラテンシス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｒａｔｅｎｓｉｓ）およびメチロバチルス・リゾスファエラエ（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈｉｚｏｓｐｈａｅｒａｅ）から選択される。
幾つかの実施形態によると、本発明の細菌は、メチロバチルス・フラゲラータス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｇｅｌｌａｔｅｓ）およびメチロバチルス・グリコゲネス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇｌｙｃｏｇｅｎｅｓ）から選択される。
幾つかの実施形態によると、本発明の細菌は、メチロバチルス・フラゲラータス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｇｅｌｌａｔｕｓ）である。
幾つかの実施形態によると、本発明の細菌は、メチロバチルス・グリコゲネス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇｌｙｃｏｇｅｎｅｓ）である。
本発明の方法
本発明は、本発明による細菌を、メタノール等の還元一炭素化合物、またはジメチルアミン等の炭素－炭素結合を有しない多炭素化合物を含む培養培地中にて適切な培養条件下で培養することを含む、生化学化合物を生成する方法も提供する。
用いられる培養培地は、問題の細菌細胞の培養に適した任意の従来の培地とすることができ、従来技術の原理に従って構成され得る。培地は通常、それぞれの細菌の成長および生存に必要とされる全ての栄養素、例えば炭素源および窒素源、ならびに他の無機塩を含有する。好適な培地、例えば最少培地または複合培地は、商業的供給業者から入手可能であるか、または公表されているレセプト、例えばアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）の菌株カタログに従って調製することができる。当業者に既知の非限定的な標準培地としては、ルリアベルターニ（ＬＢ）ブロス、サブローデキストロース（ＳＤ）ブロス、ＭＳブロス、酵母ペプトンデキストロース、ＢＭＭＹ、ＧＭＭＹまたは酵母麦芽エキス（ＹＭ）ブロスが挙げられ、全て市販されている。Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞等の細菌細胞の培養に適した培地の非限定的な例としては、最少培地および富栄養培地、例えばルリアブロス（ＬＢ）、Ｍ９培地、Ｍ１７培地、ＳＡ培地、ＭＯＰＳ培地、テリフィックブロス、ＹＴ等が挙げられる。
炭素源は、当該技術分野で既知の任意の好適な炭素基質、特にメチロトローフ細菌の培養および／または発酵に一般に使用される任意の炭素基質とすることができる。特に関心が持たれる炭素源は、メタノール等の還元一炭素化合物、またはメチルアミン、またはジメチルアミン等の炭素－炭素結合を有しない多炭素化合物である。このように、幾つかの実施形態によると、培養培地は、炭素源としてメタノールを含む。培養培地中のメタノールの濃度は、一般に約０．５％（ｗ／ｖ）～約４％（ｗ／ｖ）、例えば約２％（ｗ／ｖ）～約４％（ｗ／ｖ）の範囲であり得る。幾つかの実施形態によると、培養培地中のメタノールの濃度は、約２．５％（ｗ／ｖ）～約３．５％（ｗ／ｖ）の範囲である。
窒素源として、アンモニアおよび硫酸アンモニウム等の様々なアンモニウム塩、アミン等の他の窒素化合物、ペプトン、大豆加水分解物および発酵微生物の消化物等の天然窒素源を使用することができる。ミネラルとして、一リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩化カルシウム等を使用することができる。
好ましくは、培養は好気条件下で、例えば振盪培養により、撹拌培養により、または通気したバイオリアクター内にて約２０～約４５℃、例えば約３０～３８℃、好ましくは約３７℃の温度で行うことができる。培養物のｐＨは、通常は５超、例えば約６～約８、好ましくは約６．５～約７．５、より好ましくは約６．８～約７．２の範囲である。培養物のｐＨはアンモニア、炭酸カルシウム、様々な酸、様々な塩基および緩衝剤で調整することができる。培養は、１０～７０時間の範囲、好ましくは２４～６０時間の範囲、より好ましくは３６～５０時間の範囲の期間にわたって行うことができる。
培養後に、細胞等の固形物を遠心分離または膜濾過によって培養培地から除去することができる。生化学化合物は、化学化合物を培地から単離および精製する従来の方法によって回収することができる。よく知られた精製手順としては、遠心分離または濾過、沈殿、イオン交換、クロマトグラフィー法、例えばイオン交換クロマトグラフィーまたはゲル濾過クロマトグラフィー、および結晶化法が挙げられるが、これらに限定されない。方法は、生化学化合物を培養培地から回収することをさらに含み得る。
本発明の方法によって生成される生化学化合物は、本発明の細菌の培養によって得られる任意の所望の化合物であり得る。非限定的な例としては、有機酸、アミノ酸、脂肪酸およびそれらの誘導体が挙げられる。有機酸の非限定的な例としては、フマレート、グリコレート、スクシネート、マレート、マロネート、ラクテートおよびそれらの誘導体が挙げられる。アミノ酸の非限定的な例としては、グルタメート、リジン、メチオニン、トリプトファン、フェニルアラニンおよびそれらの誘導体が挙げられる。
本発明は、このように、本明細書で詳述される方法によって得ることができる生化学化合物を提供する。
或る特定の他の定義
「ポリペプチド」および「タンパク質」は、長さまたは翻訳後修飾（例えばグリコシル化、リン酸化、脂質化、ミリスチル化、ユビキチン化等）にかかわらず、アミド結合によって共有結合した少なくとも２つのアミノ酸のポリマーを表すために本明細書で区別なく使用される。Ｄ－およびＬ－アミノ酸、ならびにＤ－およびＬ－アミノ酸の混合物がこの定義に含まれる。
「核酸」または「ポリヌクレオチド」は、長さまたは塩基修飾にかかわらず、ホスホジエステル結合によって共有結合した少なくとも２つの核酸モノマー単位または塩基（例えばアデニン、シトシン、グアニン、チミン）のポリマーを表すために本明細書で区別なく使用される。
例えば宿主細胞、核酸またはポリペプチドに関連して使用される「組換え」または「非自然発生」は、そうでなければ自然界には存在しない様式で修飾された、またはそれと同一であるが、合成物質から、かつ／または組換え技術を用いた操作によって生成または誘導された、物質またはその物質の自然もしくは天然形態に対応する物質を指す。非限定的な例としては、特に、細胞の天然（非組換え）形態に見られない遺伝子を発現するか、またはそうでなければ異なるレベルで発現される天然遺伝子を発現する組換え細菌細胞が挙げられる。
本明細書で遺伝子または核酸分子の文脈において使用される「異種」または「外因性」は、それが存在する細菌のゲノムの一部として天然に存在しない、または天然に存在する場合とは異なるゲノム内の位置（単数または複数）に見られる遺伝子または核酸分子（すなわちＤＮＡまたはＲＮＡ分子）を指す。このように、「異種」または「外因性」の遺伝子または核酸分子は、細菌に対して内因性ではなく、微生物に外因的に導入されたものである。「異種」遺伝子または核酸分子のＤＮＡ分子は、宿主ＤＮＡとして異なる生物、異なる種、異なる属または異なる界に由来し得る。
本明細書でポリペプチドの文脈において使用される「異種」は、ポリペプチドが通常は宿主微生物に見られず、または宿主微生物によって作製（すなわち発現）されず、異なる生物、異なる種、異なる属または異なる界に由来することを意味する。
本明細書で使用される場合、「オーソログ」という用語は、共通の祖先遺伝子に由来するが、異なる種に存在する遺伝子、それによりコードされる核酸分子、すなわちｍＲＮＡ、またはそれによりコードされるタンパク質を指す。
遺伝子の「発現の減少」とは、改変細菌が産生する転写産物の量、それぞれ上記遺伝子によってコードされるポリペプチド（例えば酵素）の量が、改変を有しないが、それ以外は同一の細菌と比較して減少することを意味する。より詳細には、遺伝子の「発現の減少」とは、改変細菌が産生する転写産物の量、それぞれ上記遺伝子によってコードされるポリペプチド（例えば酵素）の量が、改変を有しないが、それ以外は同一の細菌と比較して少なくとも１０％、例えば少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも１００％減少することを意味する。遺伝子発現のレベルは、ＰＣＲ、サザンブロッティング等を含む既知の方法によって決定することができる。加えて、遺伝子発現のレベルは、ノーザンブロッティング、定量ＲＴ－ＰＣＲ等を含む様々な既知の方法を用いて、遺伝子から転写されるｍＲＮＡの量を測定することで推定することができる。遺伝子によってコードされるポリペプチドの量は、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学またはウエスタンブロッティング等を含む既知の方法によって測定することができる。
遺伝子の発現は、遺伝子によってコードされるポリペプチドの細胞内活性が、該突然変異を有しないが、それ以外は同一の細菌と比較して減少するように、細菌のゲノム内の遺伝子に突然変異を導入することによって減少させることができる。遺伝子の発現の減少をもたらす突然変異としては、遺伝子によってコードされるポリペプチドにおいてアミノ酸置換を引き起こす１ヌクレオチド以上の置換（ミスセンス突然変異）、終止コドンの導入（ナンセンス突然変異）、フレームシフトを引き起こすヌクレオチドの欠失もしくは挿入、薬剤耐性遺伝子の挿入、または遺伝子の一部もしくは遺伝子全体の欠失が挙げられる（Qiu and Goodman, 1997；Kwon et al., 2000）。プロモーター、シャイン－ダルガノ（ＳＤ）配列等の発現調節配列の改変等によっても発現を減少させることができる。遺伝子の発現は、「λ－レッド媒介遺伝子置換」等の遺伝子置換によって減少させることもできる（Datsenko and Wanner, 2000）。λ－レッド媒介遺伝子置換は、本明細書に記載される１つ以上の遺伝子を不活性化する特に好適な方法である。
「不活性化する」、「不活性化」および「不活性化した」は、遺伝子または遺伝子クラスターの文脈において使用される場合、問題の遺伝子または遺伝子クラスターがもはや機能性タンパク質を発現しないことを意味する。遺伝子もしくは遺伝子クラスターの配列の一部もしくは全体の欠失、遺伝子もしくは遺伝子クラスターのリーディングフレームの移動、ミスセンス／ナンセンス突然変異の導入、または遺伝子発現を制御する配列、例えばプロモーター、エンハンサー、アテニュエーター、リボソーム結合部位等を含む遺伝子もしくは遺伝子クラスターの調節領域の改変のために改変ＤＮＡ領域が遺伝子または遺伝子クラスターを天然に発現することができない可能性がある。好ましくは、対象の遺伝子または遺伝子クラスターは、遺伝子置換等による遺伝子または遺伝子クラスターの配列の一部または全体の欠失によって不活性化される。不活性化は、対象の遺伝子または遺伝子クラスターをＤＮＡ切断、好ましくは二本鎖切断により選択的に不活性化することが可能なレアカットエンドヌクレアーゼを導入または発現させることによっても達成され得る。本発明の文脈における「レアカットエンドヌクレアーゼ」としては、転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）ヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）およびＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが挙げられる。
細菌のゲノム内の遺伝子または遺伝子クラスターの有無は、ＰＣＲ、サザンブロッティング等を含む既知の方法によって検出することができる。加えて、遺伝子発現のレベルは、ノーザンブロッティング、定量ＲＴ－ＰＣＲ等を含む様々な既知の方法を用いて、遺伝子または遺伝子クラスターから転写されるｍＲＮＡの量を測定することで推定することができる。遺伝子または遺伝子クラスターによってコードされるポリペプチドの量は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥに続くイムノブロッティングアッセイ（ウエスタンブロッティング分析）等を含む既知の方法によって測定することができる。
本明細書で使用される場合、ポリペプチド（本明細書に記載される酵素等）の発現が「減少した」、「減少する」またはその「減少」とは、改変細菌における上記ポリペプチドの発現が、上記改変を有しないが、それ以外は同一の細菌（対照）における上記ポリペプチドの発現と比較して低下することを意味する。改変細菌におけるポリペプチドの発現は、上記改変を有しないが、それ以外は同一の細菌（対照）における上記ポリペプチドの発現と比較して少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％もしくは１００％、または１０％～１００％の整数の任意のパーセンテージ（例えば６％、７％、８％等）で低下し得る。より詳細には、ポリペプチドの発現が「減少した」、「減少する」またはその「減少」とは、改変細菌におけるポリペプチドの量が、上記改変を有しないが、それ以外は同一の細菌（対照）における上記ポリペプチドの量と比較して少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％もしくは１００％、または１０％～１００％の整数の任意のパーセンテージ（例えば６％、７％、８％等）で低下することを意味する。細菌におけるポリペプチドの発現または量は、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学、ウエスタンブロッティングまたはフローサイトメトリー等の手法を含む当該技術分野で既知の任意の好適な手段によって決定することができる。
本明細書で使用される場合、ポリペプチド（本明細書に記載される酵素等）の発現が「消失した」とは、改変細菌における上記ポリペプチドの発現が、上記改変を有しないが、それ以外は同一の細菌（対照）における上記ポリペプチドの発現と比較して検出可能でないことを意味する。
本明細書で使用される場合、ポリペプチド（本明細書に記載される酵素等）の活性が「減少した」、「減少する」またはその「減少」とは、改変細菌における上記ポリペプチドの触媒活性が、上記改変を有しないが、それ以外は同一の細菌（対照）における上記ポリペプチドの触媒活性と比較して低下することを意味する。細菌微生物におけるポリペプチドの活性は、上記改変を有しないが、それ以外は同一の細菌（対照）における上記ポリペプチドの発現と比較して少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％もしくは１００％、または１０％～１００％の整数の任意のパーセンテージ（例えば６％、７％、８％等）で低下し得る。細菌におけるポリペプチドの活性は、任意の好適なタンパク質および酵素活性アッセイによって決定することができる。
「発現」は、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾および分泌を含むが、これらに限定されない、ポリペプチド（例えば、コードされる酵素）の産生に関与する任意の工程を含む。
本明細書で使用される場合、遺伝子または遺伝子クラスターの「調節領域」は、コード配列の発現に影響を与える核酸配列を指す。調節領域は、当該技術分野で既知であり、プロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位、マトリックス付着領域、および／またはコード配列の発現を調節する他の要素が挙げられるが、これらに限定されない。
「置換」または「置換された」は、或るアミノ酸残基を別のアミノ酸残基に置き換えることによるポリペプチドの改変を指し、例えばポリペプチド配列中のセリン残基をグリシンまたはアラニン残基で置き換えることは、アミノ酸置換である。ポリヌクレオチドに関して使用される場合、「置換」または「置換された」は、或るヌクレオチドを別のヌクレオチドで置き換えることによるポリヌクレオチドの改変を指し、例えばポリヌクレオチド配列中のシトシンをチミンで置き換えることは、ヌクレオチド置換である。
「保存的置換」は、ポリペプチドに関連して使用される場合、アミノ酸残基を同様の側鎖を有する異なる残基で置換することを指し、したがって、通例、ポリペプチド中のアミノ酸を同じまたは同様のクラス内のアミノ酸で置換することを含む。例としては、限定されるものではないが、脂肪族側鎖を有するアミノ酸は、別の脂肪族アミノ酸、例えばアラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンで置換されてもよく、ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸は、ヒドロキシル側鎖を有する別のアミノ酸、例えばセリンおよびトレオニンで置換され、芳香族側鎖を有するアミノ酸は、芳香族側鎖を有する別のアミノ酸、例えばフェニルアラニン、チロシン、トリプトファンおよびヒスチジンで置換され、塩基性側鎖を有するアミノ酸は、塩基性側鎖を有する別のアミノ酸、例えばリジンおよびアルギニンで置換され、酸性側鎖を有するアミノ酸は、酸性側鎖を有する別のアミノ酸、例えばアスパラギン酸またはグルタミン酸で置換され、疎水性または親水性アミノ酸は、それぞれ別の疎水性または親水性アミノ酸で置き換えられる。
「非保存的置換」は、ポリペプチドに関して使用される場合、ポリペプチド中のアミノ酸を側鎖の特性が顕著に異なるアミノ酸で置換することを指す。非保存的置換では、定義された基の中ではなく、その間のアミノ酸を使用することができ、（ａ）置換（例えば、グリシンの代わりにセリン）の領域におけるペプチド骨格の構造、（ｂ）電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩高さに影響を与える。例として、限定されるものではないが、例示的な非保存的置換は、塩基性または脂肪族アミノ酸で置換された酸性アミノ酸；小型のアミノ酸で置換された芳香族アミノ酸；および疎水性アミノ酸で置換された親水性アミノ酸であり得る。
本明細書で使用される場合、「ベクター」は、それが連結した別の核酸分子を輸送することができる核酸分子を指す。ベクターの一種は、付加的な核酸セグメントがライゲートし得る環状二本鎖核酸ループを指す「プラスミド」である。或る特定のベクターは、それが操作可能に連結した遺伝子の発現を誘導することができる。かかるベクターは、本明細書で「発現ベクター」と称される。或る特定の他のベクターは、細菌のゲノムへの外因性核酸分子の挿入を促進することができる。かかるベクターは、本明細書で「形質転換ベクター」と称される。概して、組換え核酸技術に有用なベクターは、プラスミドの形態であることが多い。プラスミドがベクターの最も一般的に使用される形態であることから、本明細書では、「プラスミド」および「ベクター」は区別なく使用され得る。多数の好適なベクターが当業者に既知であり、市販されている。
本明細書で使用される場合、「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼおよび転写の開始に必要とされ得る他の因子の認識および結合部位を与えることによってコード領域の発現を制御する、通常は構造遺伝子のコード領域の上流（５’）にあるＤＮＡの配列を指す。プロモーターの選択は、関心の核酸配列によって決まる。好適な「プロモーター」は一般に、本発明の細菌における転写の開始を支持し、ｍＲＮＡ分子の産生を引き起こすことができるものである。
本明細書で使用される場合、「操作可能に連結した」とは、記載の構成要素が意図されるように機能することを可能にする関係にある並置を指す。コード配列に「操作可能に連結した」制御配列は、制御配列に適合する条件下でコード配列の発現が達成されるようにライゲートする。プロモーター配列は、遺伝子の転写開始部位に、遺伝子の転写を調節するのに十分に近接している場合に「操作可能に連結している」。
「配列同一性のパーセンテージ」、「％配列同一性」および「パーセント同一性」は、ヌクレオチド配列と参照ヌクレオチド配列との間またはアミノ酸配列と参照アミノ酸配列との間の配列同一性を指す。配列同一性は、比較を目的としてアラインメントされ得る各配列中の位置を比較することによって決定することができる。比較される配列中の位置が同じ塩基またはアミノ酸で占められる場合、分子はその位置で同一である。ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間の同一性の程度は、それぞれヌクレオチドまたはアミノ酸配列に共有される位置での同一または一致するヌクレオチドまたはアミノ酸の数の関数である。ＧＣＧ配列分析パッケージ（ウィスコンシン大学マディソン校、ウィスコンシン州）の一部として利用可能であり、デフォルト設定で使用することができるＦＡＳＴＡまたはＢＬＡＳＴを含む、様々なアラインメントアルゴリズムおよび／またはプログラムを用いて２つの配列間の同一性を計算することができる。
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、それが用いられる数の数値のプラスまたはマイナス１０％を意味する。
数値の限界または範囲が本明細書において定められる場合、端点が含まれる。また、数値の限界または範囲内の全ての値および部分範囲は、明示的に書き出されるかのように具体的に含まれる。
本明細書で使用される場合、不定冠詞「a」および「an」は、文脈上そうでないことが明らかに指示されない限り、「少なくとも１つ」または「１つ以上」を意味する。
本明細書で使用される場合、「含む（comprising）」、「含む（including）」、「有する」およびその文法的変形語は、記載される特徴、工程または構成要素を指定するとみなされるが、その１つ以上の付加的な特徴、工程、構成要素または群を加えることを排除するものではない。
本発明を一般的に説明したが、例示のみを目的として本明細書に提示され、特に指定のない限り、限定を意図するものではない或る特定の具体例を参照することによって更なる理解を得ることができる。
実施例
実施例１：メチロバチルス・フラゲラータス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｇｅｌｌａｔｕｓ）およびメチロバチルス・グリコゲネス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇｌｙｃｏｇｅｎｅｓ）におけるＥＰＳ産生遺伝子の同定
バイオインフォマティクス分析に基づき、幾つかのゲノム遺伝子座を破壊のために選択した。メチロバチルス・フラゲラータス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｇｅｌｌａｔｕｓ）における２つのＥＰＳ関連遺伝子クラスターの遺伝的位置は、以前に公表されている（Chistoserdova et al., 2007）。第１のメチロバチルス・フラゲラータス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｇｅｌｌａｔｕｓ）ＥＰＳ産生遺伝子クラスター（配列番号８７～１１２）における遺伝子をアノテーションするために、公表されたメチロバチルス属種１２Ｓメタノラン合成クラスター（Yoshida et al., 2000）からの遺伝子のホモログを、Ｐｙｔｈｏｎプログラミング言語の特注スクリプトを用いて、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴタンパク質検索によりメチロバチルス・フラゲラータス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｇｅｌｌａｔｕｓ）ゲノムと比較した。Ｅ値、クエリーカバレッジおよび配列同一性からなる計算された組合せスコアに基づいてトップヒットを選択した。次いで、各遺伝子の単一トップヒットを、ゲノム配列において手動で位置決めし、アノテーションした。これらのトップヒットの位置は、公表された第１のクラスターの位置と一致した。各遺伝子について明らかなホモログが見られなかったため、最も遠いホモログの間の全ての遺伝子をクラスターの一部とみなした。このようなアノテーションされなかった遺伝子の殆どが糖および多糖関連遺伝子をコードしていた。同じ手順を用いて、メチロバチルス・グリコゲネス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇｌｙｃｏｇｅｎｅｓ）における完全にアノテーションされなかったＥＰＳクラスターを同定した（配列番号１２５～１４６）。
メチロバチルス・フラゲラータス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｇｅｌｌａｔｕｓ）における第２のＥＰＳ関連クラスターを予測した（配列番号１１３～１２４）。これらの遺伝子をメタノランクラスターと比較するＢＬＡＳＴ検索を行ったが、明らかなホモログは見られなかった。このクラスター内の個々の遺伝子のタンパク質産物を、全ての非冗長タンパク質配列に対するＮＣＢＩタンパク質ＢＬＡＳＴ検索によって同定し、それぞれのトップヒットを上記のように選択した。このメチロバチルス・フラゲラータス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｇｅｌｌａｔｕｓ）タンパク質クラスターからの各遺伝子のタンパク質配列を、メチロバチルス・グリコゲネス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇｌｙｃｏｇｅｎｅｓ）ゲノムにおいてＮＣＢＩタンパク質ＢＬＡＳＴを用いて横断検索した。トップヒットは、メチロバチルス・グリコゲネス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇｌｙｃｏｇｅｎｅｓ）において同様のクラスターを形成することが見出された（配列番号１４７～１７２）。
各ＥＰＳ関連遺伝子クラスターにおいて同定されたオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を下記表１～４に示す。
ｅｐｓＤ、ｅｐｓＥ、ｅｐｓＦおよびｅｐｓＧとしてアノテーションされたＯＲＦ（Ｍ．フラゲラータス（Ｍ．ｆｌａｇｅｌｌａｔｕｓ）では配列番号６～９、Ｍ．グリコゲネス（Ｍ．ｇｌｙｃｏｇｅｎｅｓ）では配列番号４２～４５）を、メチロバチルス属種株１２におけるＥＰＳ産生必須遺伝子との類似性に基づいて欠失のために選択した（Yoshida et al., 2003）。第２のＥＰＳクラスターが他の特性化されたＥＰＳクラスターにおいて明らかなホモログを有しなかったため、Ｍ．フラゲラータス（Ｍ．ｆｌａｇｅｌｌａｔｕｓ）における１２個全てのＯＲＦ（配列番号２７～３８）およびメチロバチルス・グリコゲネス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇｌｙｃｏｇｅｎｅｓ）における２６個全てのＯＲＦ（配列番号６１～８６）を欠失のために選択した。
実施例２：ＤＮＡの欠失
一方のＥＰＳ産生クラスターまたは両方のＥＰＳ産生クラスターが欠失したＡＢＭＥ ５およびＡＢＭＥ ６の改変株を作製した。ゲノム編集は、組込み部位の上流および下流に２ｋｂ長の配列が隣接したカナマイシンまたはリファンピシン耐性カセットからなる線状ＤＮＡフラグメントを導入することによって達成した。ＤＮＡフラグメントをエレクトロポレーションによってＡＢＭＥ ５およびＡＢＭＥ ６に形質転換した。形質転換体を２０ｇ／Ｌ寒天、５０μｇ／ｍＬカナマイシンまたは５μｇ／ｍＬリファンピシンを含有する選択ＰＭ７プレートに２４～４８時間プレーティングした。ＡＢＭＥ ５由来株は３０℃でインキュベートした。ＡＢＭＥ ６由来株は３７℃で培養した。正確なクローンがコロニーＰＣＲによって確認された。ＤＮＡ欠失によって作製した株を表６に挙げる。
実施例３：メチロバチルス・フラゲラータス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｇｅｌｌａｔｕｓ）におけるＥＰＳ遺伝子破壊の前後の振盪フラスコ培養物中の全ＥＰＳの測定
ＡＢＭＥ ６におけるＥＰＳ産生遺伝子の欠失の影響を評価するために、３つの改変ＡＢＭＥ ６株（ＡＢＭＥ ８０、ＡＢＭＥ ８２およびＡＢＭＥ １３１）を実施例３に記載のように作製し、ＥＰＳ産生について試験した。
確認された形質転換体をＰＭ７＋５０μｇ／ｍＬカナマイシン寒天プレート上で一晩成長させた。単一コロニーをバッフル付き２５０ｍＬ振盪フラスコ内で２５ｍＬ ＰＭ７培地＋２５μｇ／ｍＬカナマイシンに再懸濁し、２００ｒｐｍで一晩インキュベートした。翌日、バッフル付き２５０ｍＬ振盪フラスコ内の５０ｍＬ ＰＭ７培地＋２５μｇ／ｍＬカナマイシンに２．５ｍＬの一晩培養物を接種した。全てのＡＢＭＥ ５由来株を３０℃で培養し、全てのＡＢＭＥ ６由来株を３７℃で培養した。次いで、培養物を氷上で冷却し、２ｍＬエッペンドルフチューブに分取し、４℃の標準卓上遠心機上にて１５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。細胞ペレット上にＥＰＳの層が見えた時点で、上清に戻して混合した。培養上清をＥＰＳ加水分解のために保存した。上清の半量の６Ｍ ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）を添加し、最終ＴＦＡ濃度を３Ｍとすることによって加水分解を行った。１２０℃に加熱したサーモブロックにチューブを入れ、６時間インキュベートした。加水分解後に、液体（ＴＦＡを含む）を完全に乾燥するまで８０℃で蒸発させた。乾燥した塊を０．５Ｍ ＮａＯＨ（元の培養物アリコートと同じ容量）に再懸濁し、単量体糖についてＨＰＬＣで分析した。
ＡＢＭＥ ６は、遠心分離後に細胞ペレットの上に目に見えるスライム層を生じ、加水分解後の全単量体糖は約１ｇ／Ｌに達した。単一クラスター破壊（ＡＢＭＥ ８０およびＡＢＭＥ ８２）は、目に見えるスライム層を有しなかったが、依然として約５００ｍｇ／Ｌの全糖を生じた。興味深いことに、グルコースと全糖との比率は、破壊された遺伝子クラスターに応じて逆転したが、これは産生される２つの異なるタイプのＥＰＳによる可能性が最も高い。両方のクラスターが破壊された場合（株ＡＢＭＥ １３１）、糖は検出限界未満であった。
実施例４：ＥＰＳ遺伝子破壊の前後のメチロバチルス・フラゲラータス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｇｅｌｌａｔｕｓ）のリアクター培養物における粘度の測定
ＥＰＳ産生の破壊の前後の発酵ブロス粘度の変化を評価するために、酸素制限下での５リットルバイオリアクター発酵において株を比較した。バイオリアクター種培養物は、常に以下のように調製した。２５０ｍＬバッフル付き振盪フラスコ内の２５ｍＬのＰＭ７培地に、ストックＯＤを５に調整した２５０ｕＬの株クライオストックを接種し、０．０５の開始ＯＤを生じさせた。培養物を２００ｒｐｍ、３７℃で一晩インキュベートした。朝に、２Ｌバッフル付き振盪フラスコ内の２００ｍＬのＰＭ７培地に１０％（２０ｍＬ）の一晩培養物を接種し、ＯＤ約１（±０．２）まで成長させた。次いで、培養物を用いて、２．５Ｌ開始容量の滅菌ＰＭ３培地を５Ｌバイオリアクター（８％の接種材料）に接種した。ＮＨ４ＯＨの自動添加によりｐＨを７に維持し、温度を３７℃に維持した。
酸素制限プロセスについては、メタノールを自動的に供給し、濃度を３～６ｇ／Ｌに維持した。リアクターの通気および撹拌を最大限に維持したが、プロセス中の酸素濃度は常に０％に低下した。ＯＤ、ミネラルおよび代謝産物の測定のためにブロスを定期的にサンプリングした。プロセスの最後に粘度を測定し、結果を図２にまとめる。野生型Ｍ．フラゲラータス（Ｍ．ｆｌａｇｅｌｌａｔｕｓ）発酵ブロスは、サンプリング時に４００センチポアズと高粘性であった。別の種のメチロバチルスであるＡＢＭＥ １４５を同様に測定したが、同様に４２２センチポアズの粘性のブロスを生じた。二重破壊により、明らかにより低粘性のブロスが得られ、先のサンプルでは可能でなかった標準卓上装置を用いた遠心分離および濾過が可能であった。粘度計でこの評価を確認したところ、３５ｃＰ、すなわちほぼ１０倍の粘度の低下が測定された。エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）発酵ブロスの代表的なサンプルも比較のために測定した。
実施例５：メチロバチルス・フラゲラータス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｇｅｌｌａｔｅｓ）におけるＥＰＳ遺伝子除去の前後の振盪フラスコでの発泡の低減の測定
ＥＰＳ欠損株が顕著に少ない発泡を示すことが観察された。ＡＢＭＥ ６とＥＰＳ欠損突然変異株（ＡＢＭＥ ８２およびＡＢＭＥ １３１）との泡の形成を比較するために、実施例３に記載のように株を培養した。
泡の形成を測定するために、フラスコをシェーカーから取り外し、液体を５分間沈降させた。液体の上の泡層を巻き尺で測定した（図３）。野生型培養物は、液体の上に０．５～１ｃｍの泡層を生じたが、単一クラスター破壊では、液体メニスカスに約１ｍｍの泡しか蓄積しなかった。二重破壊培養物では、泡は全く見られなかった。
実施例６：メチロバチルス・フラゲラータス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｇｅｌｌａｔｕｓ）におけるＥＰＳ遺伝子破壊の前後のバイオリアクター培養での発泡の低減の測定
ＥＰＳ産生の破壊の前後の発酵ブロスの発泡の変化を評価するために、５リットルバイオリアクター発酵において株を比較した。泡の形成量は、消泡剤（ＳＡＧ ５６９３）の添加量によって概算した。発酵は炭素制限下で行った。
実施例５に記載のようにリアクターに接種した。炭素制限を達成するために、５０％メタノールを、最高の通気および撹拌設定でｐＯ２値を約３０％に維持するように動的計算した速度でリアクターに自動的に供給した。添加したメタノールは即座に消費され、検出レベル未満に維持された。消泡剤は、発酵ブロスのメニスカス上に設置された検出器に泡が到達したときに自動的に添加された。ＡＢＭＥ ６およびＡＢＭＥ １３１をこの方法で試験した。ＡＢＭＥ １３１の場合、消泡剤の添加は５時間後に開始した。ＡＢＭＥ １３１の発酵では、発酵時間に応じて約６０％少ない消泡剤を添加した（図４）。
実施例７：ＥＰＳ遺伝子破壊の前後のメチロバチルス・フラゲラータス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｇｅｌｌａｔｕｓ）細胞集合体の顕微鏡画像
ＥＰＳ産生の破壊の前後の細胞凝集の変化を評価するために、実施例３に記載のように酸素制限下での５リットルバイオリアクター発酵において株を培養した。
ブロスのサンプルをＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｐｌａｎ ２顕微鏡でＺｅｉｓｓ Ｐｈ２ Ｐｌａｎ－ＮＥＯＦＬＵＡＲ ４０ｘ対物レンズ（ＮＡ ０．７５）を通した位相差顕微鏡法によって観察し、ｓＣＭＯＳカメラで記録した。ＡＢＭＥ ６の細胞は大きな凝集塊を形成し、ＥＰＳマトリックスに固定化されていた（図５）。二重破壊株ＡＢＭＥ １３１の場合、細胞は溶液中で個々に浮遊し、凝集は最小であった。
実施例８：ＥＰＳを含まないＭ．フラゲラータス（Ｍ．ｆｌａｇｅｌｌａｔｅｓ）のメタノール耐性の改善
高メタノール濃度に対する耐性は、効率的なバイオプロセスにとって重要なパラメーターである。ＥＰＳを産生することができない株においてメタノール耐性が低下していないことを確認するために、ＡＢＭＥ ６およびそのＥＰＳ産生派生株ＡＢＭＥ １３１においてメタノール濃度を上昇させた際の成長を試験した。
実施例４に記載のように振盪フラスコ内で株を試験した。メタノール耐性を試験するために、初期メタノール濃度を４．５％まで上昇させた。２４時間後にＯＤ６００を測定した。
驚くべきことに、ＡＢＭＥ １３１のメタノール耐性は、ＡＢＭＥ ６と比較して高かった。例えば、２．７５％の初期メタノール濃度では、ＥＰＳを含まないＡＢＭＥ １３１は、１．６のＯＤ６００まで成長したが、野生型ＡＢＭＥ ６は、０．３のＯＤ６００までしか成長しなかった。成長の差は、２．７５％で最も顕著であった。しかしながら、ＡＢＭＥ ６と比較したＡＢＭＥ １３１の成長の改善は、全てのメタノール濃度で明らかであった（図６）。
本明細書中に引用した参照文献のリスト
Chistoserdova, L. et al. (2007) ‘Genome of Methylobacillus flagellatus, Molecular Basis for Obligate Methylotrophy, and Polyphyletic Origin of Methylotrophy’, Journal of Bacteriology. American Society for Microbiology Journals, 189(11): 4020-4027.
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Claims (14)

  1. 配列番号１７５または１７９に見られるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）によって定義されるかまたはそれにオーソロガスな遺伝子を含むＥＰＳ遺伝子クラスターを不活性化するように改変されたメチロバチルス属の遺伝子組換え細菌。
  2. 付加的なＥＰＳ遺伝子クラスターが不活性化されており、前記付加的なＥＰＳ遺伝子クラスターが、配列番号１７４または１７７に見られるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）によって定義されるかまたはそれにオーソロガスな遺伝子を含む、請求項１記載の細菌。
  3. 前記付加的なＥＰＳ遺伝子クラスター中の少なくとも１つの遺伝子が、例えば遺伝子配列の一部または全体の欠失によって不活性化されている、請求項２記載の細菌。
  4. 前記付加的なＥＰＳ遺伝子クラスターが遺伝子ｅｐｓＤ、ｅｐｓＥ、ｅｐｓＦおよびｅｐｓＧ、またはそれらのオーソログを含む、請求項２または３記載の細菌。
  5. 前記遺伝子ｅｐｓＤ、ｅｐｓＥ、ｅｐｓＦおよびｅｐｓＧ、またはそれらのオーソログが、例えば遺伝子配列の一部または全体の欠失によって不活性化されている、請求項４記載の細菌。
  6. 前記遺伝子ｅｐｓＤが、配列番号６に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、前記遺伝子ｅｐｓＥが、配列番号７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、前記遺伝子ｅｐｓＦが、配列番号８に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、前記遺伝子ｅｐｓＧが、配列番号９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするか、または前記遺伝子ｅｐｓＤが、配列番号４２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、前記遺伝子ｅｐｓＥが、配列番号４３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、前記遺伝子ｅｐｓＦが、配列番号４４に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、前記遺伝子ｅｐｓＧが、配列番号４５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、請求項４または５記載の細菌。
  7. 付加的なＥＰＳ遺伝子クラスターが不活性化されている、請求項１から６までのいずれか１項記載の細菌。
  8. 前記ＥＰＳ遺伝子クラスターが不活性化されている、請求項１から７までのいずれか１項記載の細菌。
  9. 前記付加的なＥＰＳ遺伝子クラスターおよび／または前記ＥＰＳ遺伝子クラスターが、前記クラスターの配列の一部または全体の欠失によって、または遺伝子発現の欠如を引き起こすプロモーターおよび／またはリボソーム結合部位領域の改変、例えば、その領域への少なくとも１つの突然変異の導入によって不活性化されている、請求項７または８記載の細菌。
  10. 前記細菌がメチロバチルス・フラゲラータス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｇｅｌｌａｔｕｓ）である、請求項１から９までのいずれか１項記載の細菌。
  11. 前記細菌がメチロバチルス・グリコゲネス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇｌｙｃｏｇｅｎｅｓ）である、請求項１から９までのいずれか１項記載の細菌。
  12. 請求項１から１１までのいずれか１項記載の細菌を、還元一炭素化合物、または炭素－炭素結合を有しない多炭素化合物を含む培養培地中にて適切な培養条件下で培養することを含む、生化学化合物を生成する方法。
  13. 前記還元一炭素化合物がメタノールである、請求項１２記載の方法。
  14. 前記多炭素化合物がジメチルアミンである、請求項１２または１３記載の方法。
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