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JP7744391B2 - 抗ｖｅｇｆタンパク質組成物及びその製造方法 - Google Patents

抗ｖｅｇｆタンパク質組成物及びその製造方法

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JP7744391B2
JP7744391B2 JP2023145749A JP2023145749A JP7744391B2 JP 7744391 B2 JP7744391 B2 JP 7744391B2 JP 2023145749 A JP2023145749 A JP 2023145749A JP 2023145749 A JP2023145749 A JP 2023145749A JP 7744391 B2 JP7744391 B2 JP 7744391B2
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ニシャ パラッカル
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Regeneron Pharmaceuticals Inc
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Description

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含有し、その全体が参照として本明細書に組み入れられる。当該ＡＳＣＩＩコピーは２０２０年８月１３日に作成され、０７０８１６－０２３０１＿ＳＬ．ｔｘｔと明記され、サイズは１３４，３８５バイトである。
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年８月１３日に出願された米国仮特許出願番号第６３／０６５，０１２号に対する優先権及びその恩典を主張するものであり、その内容は全体が本明細書に参照として組み入れられる。
分野
本発明は概して、抗ＶＥＧＦ組成物及びその製造方法に関する。
背景
タンパク質をベースとするバイオ医薬組成物は、眼科疾患、がん、自己免疫疾患、感染症、並びに他の疾患及び障害の治療薬である、研究目的の重要な製品として台頭してきた。バイオ医薬品は、製薬産業の急速に成長している製品区分の１つである。
血管内皮細胞に対し選択性を有する細胞由来の二量体マイトジェンのクラスは、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）と同定され、かつこの名称で呼ばれている。
持続的な血管新生は、乾癬、関節リウマチ、血管腫、血管線維腫、糖尿病性網膜症、及び血管新生緑内障などの特定疾患を引き起こしたり、悪化させたりする可能性がある。ＶＥＧＦ活性の阻害薬は、こうした疾患、並びに他のＶＥＧＦ誘発性病理学的血管新生及び血管透過性状態、例えば腫瘍血管形成の治療薬として有用である。アンジオポエチン及び血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）ファミリーのメンバーは、血管内皮細胞に対して主に特異性があると考えられている唯一の成長因子である。
いくつかの眼障害は、病理学的血管新生に関連する。例えば、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）の発症は、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）と呼ばれるプロセスに関連する。ＣＮＶからの漏出により、黄斑浮腫、及び視力喪失の原因となる黄斑下の分泌液の集合を引き起こす。糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）は、血管新生成分を有する別の眼障害である。ＤＭＥは糖尿病患者における中程度の視力喪失の最も広く認められている原因であり、網膜の血管に悪影響を与える疾患である糖尿病性網膜症の一般的な合併症である。臨床的に重要なＤＭＥは、鮮明な直視に関係している網膜の感光部分である黄斑の中心へ分泌液が漏出する時に発生する。黄斑中に分泌液が存在することで、重症の視力喪失又は失明を引き起こす可能性がある。
例えばＶＥＧＦトラップのＥｙｌｅａ（アフリベルセプト）といった様々なＶＥＧＦ阻害薬は、こうした眼障害を処置するために承認されている。
概要
本発明は、融合タンパク質である、ＶＥＧＦトラップタンパク質であるアフリベルセプトを含む、抗ＶＥＧＦタンパク質に関する。本発明はまた、新規の抗ＶＥＧＦタンパク質、アフリベルセプトＭｉｎｉＴｒａｐ又はＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐ（特に明記しない限り、ＭｉｎｉＴｒａｐと総称される）に関する。本明細書では、関心対象のタンパク質を産生する効率的かつ効果的な手段を提供する製造様式を含む、これらの抗ＶＥＧＦタンパク質を作製する方法を開示する。一態様においては、本発明は抗ＶＥＧＦタンパク質を産生する合成培地（ＣＤＭ）の使用を目的に行われる。特定の態様においては、関心対象のＣＤＭは使用時、タンパク質試料を産生するＣＤＭであり、この試料は黄褐色であり、酸化種を含み得る。更に本出願では、アフリベルセプト及びＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐのタンパク質バリアントは、付随する製造方法と共に開示される。
アフリベルセプトの製造
本開示は、細胞培地を使用するアフリベルセプトの製造を説明する。一実施形態において、細胞培養培地は合成培地（「ＣＤＭ」）である。ＣＤＭは、これがタンパク質を含まず動物由来成分を使用しない合成製剤であり、培地の組成物に関して確実性が存在することから、多くの場合使用される。別の実施形態において、細胞培養培地はダイズ加水分解培地である。
一実施形態において、組換えタンパク質を産生する方法は、（ａ）関心対象の組換えタンパク質を発現させるために遺伝子改変された宿主細胞を提供する工程、（ｂ）この細胞が関心対象の組換えタンパク質を発現する好適な条件の下で、宿主細胞をＣＤＭ中で培養する工程、及び（ｃ）この細胞によって産生された関心対象の組換えタンパク質の調製物を回収する工程、を含む。一態様においては、関心対象の組換えタンパク質は抗ＶＥＧＦタンパク質である。特定の態様においては、抗ＶＥＧＦタンパク質は、アフリベルセプト及び組換えＭｉｎｉＴｒａｐ（その例は、米国特許第７，２７９，１５９号に開示される）、アフリベルセプトｓｃＦｖ及び他の抗ＶＥＧＦタンパク質からなる群から選択される。好ましい態様において、関心対象の組換えタンパク質はアフリベルセプトである。
本実施形態の一態様においては、アフリベルセプトは好適な宿主細胞内で発現される。こうした宿主細胞の非限定的な例としては、ＣＨＯ、ＣＨＯ Ｋ１、ＥＥＳＹＲ（登録商標）、ＮＩＣＥ（登録商標）、ＮＳ０、Ｓｐ２／０、胎児腎細胞、及びＢＨＫが挙げられるがこれらに限定されない。
好適なＣＤＭとしては、ダルベッコ改変イーグル（ＤＭＥ）培地、ハム栄養混合物、Ｅｘｃｅｌｌ培地、及びＩＳ ＣＨＯ－ＣＤ培地が挙げられる。当業者に公知である他のＣＤＭはまた、本発明の範囲内で企図されている。特定の態様においては、好適なＣＤＭはＣＤＭ１Ｂ（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ）又はＥｘｃｅｌｌ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＡＦＣ）である。
一実施形態において、アフリベルセプトを含むＣＤＭ培養物からの清澄化された回収試料は、捕捉クロマトグラフィー手順に供される。一態様においては、捕捉工程は、例えばプロテインＡを使用するアフィニティークロマトグラフィー手順である。更なる態様において、アフィニティー手順の溶出液は特定の色を呈する。例えばこの溶出液は黄褐色を呈し得る。以下でより詳細に説明するように、色は（ｉ）定性的な外観検査を行う欧州の色標準「ＢＹ」、又は（ｉｉ）ＢＹシステムよりも定量的である比色アッセイ（ＣＩＥ Ｌ＊、ａ＊、ｂ＊（又はＣＩＥＬＡＢ）を使用して評価することができる。ただしいずれの場合においても、複数の試料間での色評価は、意味ある調査であることを保証するために、タンパク質濃度に対して正規化されなければならない。例えば、以下の実施例９を参照すると、プロテインＡの溶出液は、およそ２．５２の「ｂ＊」値を有し、これはおよそＢＹ５のＢＹ値に対応する（プロテインＡ溶出液において、５ｇ／Ｌタンパク質濃度にて測定した場合）。プロテインＡ溶出液の色を別の試料と比較する場合には、続いてその比較は同じタンパク質濃度で行われなければならない。ＣＩＥＬＡＢ色空間におけるｂ＊値は試料の呈色を表すために使用され、青色（－）から黄色（＋）までカバーしている。別の試料と比較して試料のｂ＊値がより高くなることは、他の試料と比較して試料中の黄褐色の呈色がより濃くなることを示す。
一実施形態において、アフリベルセプトは、ＣＤＭを使用してアフリベルセプトを発現するために遺伝子改変された宿主細胞から産生される。一態様においては、アフリベルセプトの別の種又はバリアントもまた産生される。これらのバリアントには、オキソバリアントとして総称される、１つ以上の酸化アミノ酸残基を含む、アフリベルセプトアイソフォームが含まれる。アフリベルセプト及びそのオキソバリアントを含む、ＣＤＭを使用して製造された清澄化された回収試料は、捕捉クロマトグラフィー手順に供され得る。一態様においては、捕捉工程は、例えばプロテインＡカラムを使用するアフィニティークロマトグラフィー手順である。黄褐色を示し得る又は示すことがない、アフィニティー溶出液から抽出された試料を、例えば液体クロマトグラフィー－質量分析法（ＬＣ－ＭＳ）を使用して分析する場合、アフリベルセプトの１つ以上の酸化バリアントを検出することができる。ヒスチジン及び／又はトリプトファン残基を含むがこれらに限定されない変性アフリベルセプトの特定のアミノ酸残基は、酸化されることが示されている。一態様においては、バリアントは１つ以上のメチオニン残基及び他の残基の酸化を含むことができる。以下を参照されたい。
別の態様において、バリアントは、Ｎ－ホルミルキヌレニンを形成する、１つ以上のトリプトファン残基の酸化を含むことができる。更なる態様において、バリアントは、モノ－ヒドロキシルトリプトファンを形成する、１つ以上のトリプトファン残基の酸化を含むことができる。特定の態様においては、タンパク質バリアントは、ジ－ヒドロキシルトリプトファンを形成する、１つ以上のトリプトファン残基の酸化を含むことができる。特定の態様においては、タンパク質バリアントは、トリ－ヒドロキシルトリプトファンを形成する、１つ以上のトリプトファン残基の酸化を含むことができる。
別の態様において、バリアントは、以下からなる群から選択される、１つ以上の修飾を含むことができる：例えば１つ以上のアスパラギンの脱アミド化；１つ以上のアスパラギン酸のイソアスパルタート及び／又はＡｓｎへの変換；１つ以上のメチオニンの酸化；１つ以上のトリプトファンのＮ－ホルミルキヌレニンへの酸化；１つ以上のトリプトファンのモノ－ヒドロキシルトリプトファンへの酸化；１つ以上のトリプトファンのジ－ヒドロキシルトリプトファンへの酸化；１つ以上のトリプトファンのトリ－ヒドロキシルトリプトファンへの酸化；１つ以上のアルギニンのＡｒｇ３－デオキシグルコソン化；Ｃ末端グリシンの除去；及び１つ以上のグリコシル化されていないグリコサイトの存在。
別の実施形態において、本発明はアフリベルセプトの製造方法に関する。一態様においては、アフリベルセプト及びそのバリアントを含む、清澄化された回収試料は、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーといった捕捉工程に供される。アフィニティー工程に続き、アフィニティー溶出液は、イオン交換クロマトグラフィーに供することができる。イオン交換クロマトグラフィーは、陽イオン交換クロマトグラフィー又は陰イオン交換クロマトグラフィーのいずれかであり得る。以下で更に述べられる混合モード又はマルチモーダルクロマトグラフィー、及び他のクロマトグラフィー手順が、本実施形態の範囲内にあることもまた企図されている。特定の態様においては、イオン交換クロマトグラフィーは陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）である。ＡＥＸを使用するための好適な条件は、約８．３～約８．６のｐＨであるトリス塩酸塩を含むがこれに限定されない。例えば約８．３～約８．６のｐＨであるトリス塩酸塩を使用して平衡化した後、試料をＡＥＸカラムに負荷する。カラムの負荷後、カラムを例えば平衡化バッファを使用し、１回又は複数回洗浄することができる。特定の態様において、大部分のオキソバリアントがＡＥＸカラムの固定相に保持され、カラムをストリップした際に得ることができる一方で、大量のオキソバリアントが存在しないアフリベルセプトを含む画分はフロースルー画分中で収集され得るように、使用する条件が、アフリベルセプト及びその酸化バリアントの差動的なクロマトグラフィー挙動を促進させることができる。以下実施例２及び図１１を参照されたい。図１１及び実施例２を参照すると、オキソバリアントに関する変化は、異なる製造工程間で観察され得る。例えば、この変化は「トリプトファン酸化レベル（％）」セクション（特異的には「Ｗ１３８（＋１６）」カラム）にてデータにより例示され得る。ここで、オキソバリアント（特異的にはオキソ－トリプトファン）は、ＡＥＸクロマトグラフィー（ＡＥＸ分離２）後、負荷試料中の約０．１３１％からフロースルー試料中では約０．０７０％になったことが観察可能であり、これは、ＡＥＸを使用したアフリベルセプトのオキソバリアント中で減少があったことを示す。
色を軽減又は最小化するため、イオン交換が使用され得る。本実施形態の一態様においては、清澄化された回収試料は、例えばプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを使用する捕捉クロマトグラフィーに供される。アフィニティーカラムは溶出され、それに割り当てられた特定のＢＹ及び／又はｂ＊値を有する第１色を有する。続いて、このプロテインＡ溶出液は、陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）などのイオン交換クロマトグラフィーに供される。イオン交換カラムを洗浄し、フロースルーを収集し、それに割り当てられた特定のＢＹ及び／又はｂ＊値を有する第２色を有する。特定の態様において、第１色の色値（「ＢＹ」又は「ｂ＊」のいずれか）は第２色とは異なる。更なる態様において、プロテインＡ溶出液の第１色は、それぞれＢＹ及び／又はｂ＊値により反映されるように、ＡＥＸフロースルーの第２色と比較した場合、より黄褐色を有する。典型的には、プロテインＡ溶出液の第１色と比較したときには、ＡＥＸ後の第２色の黄褐色は減少している。例えば、陰イオン交換の使用により、ＡＥＸ後、ｂ＊値は約３．０６（第１色）から約０．９６（第２色）へと、プロテインＡ溶出液試料において観察される黄褐色は減少した。以下の実施例２、表２～３を参照されたい。
本実施形態の一態様において、ＡＥＸカラム用の平衡化バッファ及び洗浄バッファの両方のｐＨは、約８．３０～約８．６０であり得る。別の態様において、ＡＥＸカラム用の平衡化バッファ及び洗浄バッファの両方の伝導度は、約１．５０～約３．００ｍＳ／ｃｍであり得る。
本実施形態の一態様において、平衡化バッファ及び洗浄バッファは約５０ｍＭのトリス塩酸であり得る。一態様においては、ストリップバッファは、２Ｍの塩化ナトリウム又は１Ｎの水酸化ナトリウム、又はその両方を含む（表２－２を参照されたい）。
本実施形態は、特定の順序ではない、１つ以上の工程の追加、例えば疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、アフィニティークロマトグラフィー、マルチモーダルクロマトグラフィー、ウイルス不活化（例えば低ｐＨを使用）、ウイルスろ過、及び／又は限外ろ過／透析ろ過、並びに他の周知のクロマトグラフィー工程を含むことができる。
一実施形態において、抗ＶＥＧＦタンパク質は、以下のように１つ以上のアスパラギンにてグリコシル化される：Ｇ０－ＧｌｃＮＡｃグリコシル化、Ｇ１－ＧｌｃＮＡｃグリコシル化、Ｇ１Ｓ－ＧｌｃＮＡｃグリコシル化、Ｇ０グリコシル化、Ｇ１グリコシル化、Ｇ１Ｓグリコシル化、Ｇ２グリコシル化、Ｇ２Ｓグリコシル化、Ｇ２Ｓ２グリコシル化、Ｇ０Ｆグリコシル化、Ｇ２Ｆ２Ｓグリコシル化、Ｇ２Ｆ２Ｓ２グリコシル化、Ｇ１Ｆグリコシル化、Ｇ１ＦＳグリコシル化、Ｇ２Ｆグリコシル化、Ｇ２ＦＳグリコシル化、Ｇ２ＦＳ２グリコシル化、Ｇ３ＦＳグリコシル化、Ｇ３ＦＳ３グリコシル化、Ｇ０－２ＧｌｃＮＡｃグリコシル化、Ｍａｎ４グリコシル化、Ｍａｎ４＿Ａ１Ｇ１グリコシル化、Ｍａｎ４＿Ａ１Ｇ１Ｓ１グリコシル化、Ｍａｎ５グリコシル化、Ｍａｎ５＿Ａ１Ｇ１グリコシル化、Ｍａｎ５＿Ａ１Ｇ１Ｓ１グリコシル化、Ｍａｎ６グリコシル化、Ｍａｎ６＿Ｇ０＋リン酸グリコシル化、Ｍａｎ６＋リン酸グリコシル化、及び／又はＭａｎ７グリコシル化。一態様において、抗ＶＥＧＦタンパク質はアフリベルセプト、抗ＶＥＧＦ抗体又はＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐであり得る。
一態様において、抗ＶＥＧＦタンパク質の組成物のグリコシル化プロファイルは、以下である：約４０％～約５０％の総フコシル化グリカン、約３０％～約５５％の総シアリル化グリカン、約６％～約１５％のマンノース－５、及び約６０％～約７９％のガラクトシル化グリカン（実施例６を参照されたい）。一態様において、抗ＶＥＧＦタンパク質は約３２．４％のアスパラギン１２３残基、及び／又は約２７．１％のアスパラギン１９６残基にてＭａｎ５グリコシル化を有する。
一実施形態において、このプロセスは薬学的に許容される賦形剤を使用して原薬を製剤化することを更に含み得る。本実施形態の一態様において、薬学的に許容される賦形剤は、以下：水、緩衝剤、糖、塩、界面活性剤、アミノ酸、ポリオール、キレート剤、乳化剤、及び保存剤から選択され得る。当業者に周知の他の賦形剤は、本実施形態の範囲内である。
本実施形態の一態様において、製剤はヒト対象への投与に好適であり得る。特に、投与は、硝子体内注射により影響を受ける可能性がある。一態様において、この製剤は約４０～約２００ｍｇ／ｍＬの関心対象のタンパク質を有し得る。
製剤は、加齢黄斑変性症（例えば湿性又は乾性）、黄斑浮腫、網膜静脈閉塞症後の黄斑浮腫、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、網膜静脈分枝閉塞症（ＢＲＶＯ）、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）、虹彩新生血管、血管新生緑内障、緑内障の術後線維症、増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）、視神経円板血管新生、角膜血管新生、網膜血管新生、硝子体血管新生、パンヌス、翼状片、血管性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫に罹っている対象における糖尿病性網膜症、又は糖尿病性網膜症（例えば、非増殖性糖尿病性網膜症（例えば、約４７又は５３の糖尿病性網膜症の重症度スコア（ＤＲＳＳ）レベルによって特徴付けられる）又は増殖性糖尿病性網膜症（例えばＤＭＥに罹患していない対象における）を含み得る血管新生性眼障害を、処置又は予防する方法として使用され得る。
ＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐの製造
本開示は、アフリベルセプトの改変バージョンの製造を説明し、このＦｃ部分は、取り除かれるか又は存在しておらず、アフリベルセプトＭｉｎｉＴｒａｐ又はＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐと称される。このＭｉｎｉＴｒａｐは、合成培地（ＣＤＭ）又はダイズ加水分解培地を含む細胞培養培地にて産生され得る。
一実施形態において、ＭｉｎｉＴｒａｐはＣＤＭを使用して産生される。ＭｉｎｉＴｒａｐ製造の一態様において、全長アフリベルセプトは、好適な宿主を使用し及び好適な条件の下で産生され、更に処理され、それによりＦｃ部分が酵素的に除去され、結果ＭｉｎｉＴｒａｐが得られる。代替的には、ＭｉｎｉＴｒａｐをコードした遺伝子（例えば、そのＦｃ部分が存在しないアフリベルセプトをコードしたヌクレオチド配列）は、好適な宿主細胞を使用し、好適な条件の下で産生され得る。
一実施形態において、ＭｉｎｉＴｒａｐの製造方法は、全長アフリベルセプト融合タンパク質の産生、これに続くＦｃ領域の切断を含む。一態様において、この方法は、いわゆる全長アフリベルセプト融合タンパク質（その全体の教示が本明細書に参照として組み入れられる米国特許第７，２７９，１５９号を参照されたい）といった組換えタンパク質を産生することに関与し、これは（ａ）全長アフリベルセプトを発現させるために遺伝子改変された宿主細胞を提供する工程、（ｂ）細胞が全長アフリベルセプトを発現する好適な条件の下で、宿主細胞をＣＤＭ中で培養する工程、（ｃ）この細胞によって産生された全長アフリベルセプトの調製物を回収する工程、及び（ｄ）全長アフリベルセプトを、融合タンパク質のＦｃ部分の除去に特異的な酵素的切断に供する工程、を含む。別の態様において、アフリベルセプトをコードしたヌクレオチド配列からそのＦｃ部分を差し引いたものは、当業者に周知の好適な条件の下で、好適な宿主細胞から発現される（米国特許第７，２７９，１５９号を参照されたい）。
本実施形態の一態様においては、アフリベルセプトは好適な宿主細胞内で発現される。こうした宿主細胞の非限定的な例としては、ＣＨＯ、ＣＨＯ Ｋ１、ＥＥＳＹＲ（登録商標）、ＮＩＣＥ（登録商標）、ＮＳ０、Ｓｐ２／０、胎児腎細胞、及びＢＨＫが挙げられるがこれらに限定されない。
好適なＣＤＭとしては、ダルベッコ改変イーグル（ＤＭＥ）培地、ハム栄養混合物、ＥＸ－ＣＥＬＬ培地（ＳＡＦＣ）、及びＩＳ ＣＨＯ－ＣＤ培地（Ｉｒｖｉｎｅ）が挙げられる。当業者に公知である他のＣＤＭはまた、本発明の範囲内で企図されている。特定の態様においては、好適なＣＤＭは、ＣＤＭ１Ｂ（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ）又はＥｘｃｅｌｌ培地（ＳＡＦＣ）である。
一態様において、ＭｉｎｉＴｒａｐの製造中、関心対象のタンパク質（すなわち、アフリベルセプト融合タンパク質及び／又はＭｉｎｉＴｒａｐ）及びそのバリアント（オキソバリアントを含む）を含む試料は、特定の色特性、すなわち黄褐色を呈し得る。例えば、アフィニティークロマトグラフィー工程からの溶出液試料は、ＢＹ及び／又はｂ＊システムを使用して測定された特定の黄褐色を呈することができる（以下、実施例２及び９を参照されたい）。「試料」向けの例示的な供給源としては、例えばプロテインＡといったアフィニティークロマトグラフィーを含む；この試料はイオン交換クロマトグラフィー手順のフロースルー画分から得ることができる；また、この試料はイオン交換カラムのストリップから得ることができる。当業者に周知である製造プロセス中に、試料を分析可能である他の供給源が存在する。上述のように、及び以下に更に詳細に説明するように、色は、（ｉ）定性的な外観検査を行う欧州の色標準「ＢＹ」、又は（ｉｉ）ＢＹシステムよりも定量的である比色アッセイ（ＣＩＥＬＡＢ）を使用して、評価することができる。ただしいずれの場合においても、複数の試料間での色評価は、試料間で意味ある調査であることを保証するために、例えばタンパク質濃度を使用し、正規化されなければならない。
本実施形態の一態様において、全長アフリベルセプト融合タンパク質は、例えばプロテアーゼ又は酵素的に活性であるそれらのバリアントを使用したタンパク質分解性消化を使用してＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐを生み出すために、酵素処理（「切断動作」）に供され得る。本実施形態の一態様において、プロテアーゼは、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（ＩｄｅＳ）の免疫グロブリン分解酵素であり得る。別の態様において、プロテアーゼは、トロンビントリプシン、エンドプロテイナーゼＡｒｇ－Ｃ、エンドプロテイナーゼＡｓｐ－Ｎ、エンドプロテイナーゼＧｌｕ－Ｃ、外膜プロテアーゼＴ（ＯｍｐＴ）、ＩｄｅＳ、キモトリプシン、ペプシン、サーモリシン、パパイン、プロナーゼ、又は黒麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ Ｓａｉｔｏｉ）由来のプロテアーゼであり得る。一態様において、プロテアーゼはシステインプロテアーゼであり得る。本実施形態の特定の態様において、プロテアーゼはＩｄｅＳであり得る。別の態様において、プロテアーゼはＩｄｅＳのバリアントであり得る。ＩｄｅＳのバリアントの非限定的な例を以下にて説明する。このバリアントは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、及び配列番号１６からなる群に記載されるようなアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。一態様において、プロテアーゼはアガロース又は別の好適なマトリックス上に固定され得る。
一態様において、関心対象のタンパク質（そのバリアントも伴う）は、ＣＤＭを使用して産生される。特定の態様において、関心対象のタンパク質は、アフリベルセプト又はＭｉｎｉＴｒａｐを含む。バリアントは、１つ以上の酸化アミノ酸残基、総称してオキソバリアントを含む。酸化残基の例としては、１つ以上のヒスチジン及び／又はトリプトファン残基を含むがこれらに限定されず、ＬＣ－ＭＳを使用する他の酸化残基もまた検出され、これは酸化メチオニンなど以下で説明される。ＡＥＸなど、続くクロマトグラフィーを使用し、所与の試料中の関心対象のタンパク質からこれらのオキソバリアントを単離することができ、これは本明細書にて説明される。
一態様において、バリアントはＮ－ホルミルキヌレニンを形成する、１つ以上のトリプトファン残基の酸化を含むことができる。更なる態様において、バリアントは、モノ－ヒドロキシルトリプトファンを形成する、１つ以上のトリプトファン残基の酸化を含むことができる。特定の態様においては、タンパク質バリアントは、ジ－ヒドロキシルトリプトファンを形成する、１つ以上のトリプトファン残基の酸化を含むことができる。特定の態様においては、タンパク質バリアントは、トリ－ヒドロキシルトリプトファンを形成する、１つ以上のトリプトファン残基の酸化を含むことができる。
別の態様において、オキソバリアントは、以下からなる群から選択される、１つ以上の修飾を含むことができる：１つ以上のアスパラギン残基の脱アミド化；１つ以上のアスパラギン酸のイソアスパルタート及び／又はＡｓｎへの変換；１つ以上のメチオニン残基の酸化；１つ以上のトリプトファン残基を酸化することによるＮ－ホルミルキヌレニンの形成；１つ以上のトリプトファン残基を酸化することによるモノ－ヒドロキシルトリプトファンの形成；１つ以上のトリプトファン残基を酸化することによるジ－ヒドロキシルトリプトファンの形成；１つ以上のトリプトファン残基を酸化することによるトリ－ヒドロキシルトリプトファンの形成；１つ以上のアルギニン残基のＡｒｇ３－デオキシグルコソン化；Ｃ末端グリシンの除去；及び１つ以上のグリコシル化されていないグリコサイトの存在。
一実施形態において、ＭｉｎｉＴｒａｐタンパク質の製造方法は、（ａ）第１クロマトグラフィープラットフォーム上にて全長アフリベルセプト融合タンパク質を捕捉する工程、及び（ｂ）アフリベルセプトを切断し、それによりＭｉｎｉＴｒａｐタンパク質、すなわちそのＦｃドメインが存在しないアフリベルセプトを形成する工程、を含む。一態様において、第１クロマトグラフィー支持体は、アフィニティークロマトグラフィー媒体、イオン交換クロマトグラフィー媒体、又は疎水性相互作用クロマトグラフィー媒体を含む。特定の態様において、第１クロマトグラフィープラットフォームは、プロテインＡといったアフィニティークロマトグラフィープラットフォームを含む。更なる態様において、捕捉工程（ａ）のタンパク質は、切断工程（ｂ）の前に第１クロマトグラフィープラットフォームから溶出される。加えて更なる態様において、第２捕捉工程が切断工程（ｂ）の後に続く。特定の態様において、この第２捕捉工程は、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーなどのアフィニティークロマトグラフィーにより促進され得る。この第２捕捉工程のフロースルー（ＭｉｎｉＴｒａｐを含む）は、第１色、例えば黄褐色を有し、特定のＢＹ及び／又はｂ＊値を有すると測定される。例えば、以下の実施例９を参照されたい。加えて、この第２捕捉フロースルーのＬＣ－ＭＳ分析は、ＭｉｎｉＴｒａｐの１つ以上の残基が酸化されているオキソバリアントの存在を実証する（以下、実施例９を参照されたい）。
更なる態様において、第２捕捉フロースルーは、ＡＥＸなどのイオン交換クロマトグラフィーに供され得る。このＡＥＸカラムは好適なバッファを使用して洗浄され、本質的にＭｉｎｉＴｒａｐを含むＡＥＸフロースルー画分が収集され得る。このＡＥＸフロースルー画分は、特定のＢＹ及び／又はｂ＊値を有する黄褐色である第２色を有し得る。更なる態様において、第１色（第２捕捉工程からのフロースルー）及び第２色（イオン交換手順のフロースルー）は、ＢＹ及び／又はｂ＊システムのいずれかにより測定されるような異なる色を有する。一態様において、第２色は、ＡＥＸ後にＢＹ及び／又はｂ＊値のいずれかを使用して第１色と比較するときには、黄褐色の減少を実証する。
別の実施形態において、工程（ｂ）の切断動作は、クロマトグラフィーのカラムを使用して実施され得、この切断動作は例えば酵素活性であり、カラムマトリックスに付着又は固定化されている。工程（ｂ）にて使用されるカラムは、既に言及され、かつ以下にてより完全に説明されるプロテアーゼのうち１つ以上を含み得る。
一実施形態において、イオン交換クロマトグラフィー手順は、陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィー媒体を含み得る。別の態様において、イオン交換クロマトグラフィー媒体は、陽イオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィー媒体を含み得る。ＡＥＸを使用するための好適な条件は、約８．３～約８．６のｐＨであるトリス塩酸塩を含むがこれに限定されない。例えば約８．３～約８．６のｐＨであるトリス塩酸塩を使用して平衡化した後、試料をＡＥＸカラムに負荷する。カラムの負荷後、カラムを例えば平衡化バッファを使用し、１回又は複数回洗浄することができる。特定の態様において、オキソバリアントがＡＥＸカラムに実質的に保持され、カラムをストリップした際に収集され得る一方で、ＭｉｎｉＴｒａｐがフロースルー画分中に実質的に存在するように、使用する条件は、ＡＥＸを用いてＭｉｎｉＴｒａｐ及びそのオキソバリアントの差動的なクロマトグラフィー挙動を促進させることができる（以下の実施例９を参照されたい）。
一例において、製造の異なる段階からの試料を、色及びオキソバリアントの存在について分析した。実施例９を参照すると、アフィニティーフロースループール（第２プロテインＡアフィニティー工程からのフロースルー）は、約１．５８の第１ｂ＊値を有した（表９－３を参照されたい）。この第２アフィニティーフロースルーをＡＥＸに供した。ＡＥＸフロースルーは、約０．５０の第２ｂ＊値を有し、これは、ＡＥＸの使用後、黄褐色が著しく減少したことを示している。ＡＥＸカラムのストリップによりストリップ試料を得、約６．１０の第３ｂ＊値が観察され、これはこのストリップ試料が、負荷又はフロースルーのいずれかと比較したときに、より黄褐色を有することを示していた。
再び実施例９を参照すると、オキソバリアント分析もまた実施された。分析される試料はアフィニティーフロースループール（第２プロテインＡアフィニティー溶出液）、ＡＥＸフロースルー、及びＡＥＸストリップであった。表９－５及び表９－６を参照すると、オキソバリアントに関する変化は、異なる製造工程間で観察され得る。例えば、この変化は「トリプトファン酸化レベル（％）」セクション（特異的には「Ｗ５８（＋１６）」カラム）にてデータにより例示され得る。ここで、オキソバリアント（特異的にはオキソ－トリプトファン）は、ＡＥＸクロマトグラフィー後、負荷試料中の約０．０５５％からフロースルー試料中では約０．０３８％になったことが観察可能であり、これは、ＡＥＸ後のオキソバリアント中で減少があったことを示す。ＡＥＸストリップを分析し、オキソトリプトファン種の割合は約０．０８９％であることが見出された。このストリップ値を、負荷量（及びフロースルー）と比較すると、このオキソバリアントの大部分がＡＥＸカラム上に保持されていることが明らかであった。
本実施形態は、特定の順序ではない、１つ以上の工程の追加、例えば疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、マルチモーダルクロマトグラフィー、ウイルス不活化（例えば低ｐＨを使用）、ウイルスろ過、及び／又は限外ろ過／透析ろ過を含むことができる。
本発明の一実施形態は、樹脂を含むクロマトグラフィーカラムの再生方法に関する。本実施形態の一態様において、樹脂は固定化された加水分解剤を有する。本実施形態の更なる別の態様において、樹脂は固定化されたプロテアーゼ酵素を含む。本実施形態の更なる別の態様において、樹脂はＦａｂＲＩＣＡＴＯＲ（登録商標）樹脂又は樹脂の変異体である。本実施形態の一態様において、樹脂を含むカラムの再生方法により、樹脂の反応効率が向上する。
本実施形態の一態様において、樹脂を含むカラムの再生方法は、酢酸とカラム樹脂をインキュベートすることを含む。一態様において、使用される酢酸の濃度は約０．１Ｍ～約２Ｍである。一態様においては、酢酸の濃度は約０．５Ｍである。一態様において、樹脂は少なくとも約１０分間インキュベートされる。別の態様において、樹脂は少なくとも約３０分間インキュベートされる。本実施形態の更に別の態様において、樹脂は少なくとも約５０分間インキュベートされる。本実施形態の更に別の態様において、樹脂は少なくとも約１００分間インキュベートされる。本実施形態の更に別の態様において、樹脂は少なくとも約２００分間インキュベートされる。本実施形態の更に別の態様において、樹脂は少なくとも約３００分間インキュベートされる。
任意選択で、カラム樹脂は塩酸グアニジン（Ｇｕ－ＨＣｌ）で更にインキュベートされる。一態様において、酢酸を含まないＧｕ－ＨＣｌを使用してカラム樹脂を再生する。使用されるＧｕ－ＨＣｌの濃度は約１Ｎ～約１０Ｎである。別の態様において、Ｇｕ－ＨＣｌの濃度は約６Ｎである。更なる態様において、カラム樹脂は、再生剤（酢酸、Ｇｕ－ＨＣｌ）と少なくとも約１０分間インキュベートされ得る。更に別の態様において、樹脂は少なくとも約３０分間インキュベートされる。更に別の態様において、樹脂は少なくとも約５０分間インキュベートされる。更に別の態様において、当該樹脂は少なくとも約１００分間インキュベートされる。
一実施形態において、樹脂を含むカラムはエタノール中で保管される。一態様において、カラムはエタノール中に保管され、このエタノールの割合は約５％ｖ／ｖ～約２０％ｖ／ｖである。特定の態様において、カラムは２０％ｖ／ｖエタノールを使用して保管される。
一実施形態において、このプロセスは、薬学的に許容される賦形剤を使用して、ＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐを製剤化することを更に含み得る。一態様において、薬学的に許容される賦形剤は、以下：水、緩衝剤、糖、塩、界面活性剤、アミノ酸、ポリオール、キレート剤、乳化剤、及び保存剤から選択され得る。当業者に周知の他の賦形剤は、本実施形態の範囲内である。
本発明の製剤は、ヒト対象への投与に好適である。本実施形態の一態様において、投与は、硝子体内注射により行うことができる。一態様において、この製剤は、約４０～約２００ｍｇ／ｍＬの関心対象のタンパク質を有し得る。特定の態様において、関心対象のタンパク質は、アフリベルセプト又はアフリベルセプトＭｉｎｉＴｒａｐのいずれかである。
製剤は、加齢黄斑変性症（例えば湿性又は乾性）、黄斑浮腫、網膜静脈閉塞症後の黄斑浮腫、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、網膜静脈分枝閉塞症（ＢＲＶＯ）、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）、虹彩新生血管、血管新生緑内障、緑内障の術後線維症、増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）、視神経円板血管新生、角膜血管新生、網膜血管新生、硝子体血管新生、パンヌス、翼状片、血管性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫に罹っている対象における糖尿病性網膜症、又は糖尿病性網膜症（例えば、非増殖性糖尿病性網膜症（例えば、約４７又は５３の糖尿病性網膜症の重症度スコア（ＤＲＳＳ）レベルによって特徴付けられる）又は増殖性糖尿病性網膜症（例えばＤＭＥに罹患していない対象における）を含み得る血管新生性眼障害を処置又は予防する方法で使用され得る。
ＩｄｅＳのバリアント
本開示は、ＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐを産生するための、ＩｄｅＳ（ＦａｂＲＩＣＡＴＯＲ）（配列番号１）又はＩｄｅＳバリアントである他のポリペプチド（配列番号２～１６）の使用を説明する。ＩｄｅＳ（配列番号１）は、８７位、１３０位、１８２位、及び／又は２７４位におけるアスパラギン残基を含む（以下の配列番号１では太字かつイタリック体にて「Ｎ＊」と示される）。これらの位置のアスパラギンは、アスパラギン以外のアミノ酸に変異され、ＩｄｅＳバリアントを形成することができる（変異した（１つ以上の）アミノ酸は、イタリック体かつ下線で強調された（１つ以上の）アミノ酸として示されている）：
一実施形態において、ポリペプチドは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５及び配列番号１６からなる群に記載されるような単離されたアミノ酸配列の全長にわたり、少なくとも７０％の配列同一性を含む単離されたアミノ酸配列を有する。一態様において、単離されたアミノ酸配列は、単離されたアミノ酸配列の全長にわたり少なくとも約８０％の配列同一性を有する。別の態様において、単離されたアミノ酸配列は、単離されたアミノ酸配列の全長にわたり少なくとも約９０％の配列同一性を有する。別の態様において、単離されたアミノ酸配列は、単離されたアミノ酸配列の全長にわたり約１００％の配列同一性を有する。一態様において、ポリペプチドは、標的タンパク質を断片へと切断することが可能であり得る。特定の態様において、標的タンパク質はＩｇＧである。別の態様において、標的タンパク質は融合タンパク質である。更に別の態様において、断片はＦａｂ断片及び／又はＦｃ断片を含み得る。
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５及び配列番号１６。
本開示はまた、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５及び配列番号１６からなる群に記載されるような単離されたアミノ酸配列の全長にわたり、少なくとも７０％の配列同一性を含む単離されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、単離された核酸分子を含む。一態様において、単離されたアミノ酸配列は、単離されたアミノ酸配列の全長にわたり少なくとも約８０％の配列同一性を有する。別の態様において、単離されたアミノ酸配列は、単離されたアミノ酸配列の全長にわたり少なくとも約９０％の配列同一性を有する。別の態様において、単離されたアミノ酸配列は、単離されたアミノ酸配列の全長にわたり約１００％の配列同一性を有する。一態様において、ポリペプチドは、標的タンパク質を断片へと切断することが可能であり得る。特定の態様において、標的タンパク質はＩｇＧである。別の特定の態様において、標的タンパク質は融合タンパク質である。更に別の特定の態様において、断片はＦａｂ断片及び／又はＦｃ断片を含み得る。
本開示はまた、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５及び配列番号１６からなる群に記載されるような単離されたアミノ酸配列の全長にわたり、少なくとも７０％の配列同一性を含む単離されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸を含むベクターを含む。一態様において、核酸分子は宿主細胞内でその発現を指示することが可能である発現制御配列に作動可能に連結される。一態様において、ベクターはプラスミドである。一態様において、単離されたアミノ酸配列は、単離されたアミノ酸配列の全長にわたり少なくとも約８０％の配列同一性を有する。別の態様において、単離されたアミノ酸配列は、単離されたアミノ酸配列の全長にわたり少なくとも約９０％の配列同一性を有する。別の態様において、単離されたアミノ酸配列は、単離されたアミノ酸配列の全長にわたり約１００％の配列同一性を有する。一態様において、ポリペプチドは、標的タンパク質を断片へと切断することが可能であり得る。特定の態様において、標的タンパク質はＩｇＧである。別の態様において、標的タンパク質は融合タンパク質である。更に別の態様において、断片はＦａｂ断片及び／又はＦｃ断片を含み得る。
一実施形態において、単離されたアミノ酸は、アスパラギン以外のアミノ酸に変異した８７位、１３０位、１８２位及び／又は２７４位のアスパラギン残基を有する、配列番号１により定義される親アミノ酸配列を含み得る。一態様において、変異は親アミノ酸配列と比較すると、アルカリｐＨ値での化学的安定性の増加をもたらし得る。別の態様において、変異は親アミノ酸配列と比較すると、アルカリｐＨ値での化学的安定性の５０％の増加をもたらし得る。一態様において、アミノ酸はアスパラギン酸、ロイシン、及びアルギニンから選択され得る。特定の態様において、８７位のアスパラギン残基はアスパラギン酸残基に変異される。別の態様において、１３０位のアスパラギン残基はアルギニン残基に変異される。更なる別の態様において、１８２位のアスパラギン残基はロイシン残基に変異される。更なる別の態様において、２７４位のアスパラギン残基はアスパラギン酸残基に変異される。更なる別の態様において、８７位及び１３０位のアスパラギン残基は変異される。更なる別の態様において、８７位及び１８２位のアスパラギン残基は変異される。更なる別の態様において、８７位及び２７４位のアスパラギン残基は変異される。更なる別の態様において、１３０位及び１８２位のアスパラギン残基は変異される。更なる別の態様において、１３０位及び２７４位のアスパラギン残基は変異される。更なる別の態様において、１８２位及び２７４位のアスパラギン残基は変異される。更なる別の態様において、８７位、１３０位及び１８２位のアスパラギン残基は変異される。更なる別の態様において、８７、１８２位及び２７４位のアスパラギン残基は変異される。更なる別の態様において、１３０位、１８２位及び２７４位のアスパラギン残基は変異される。更なる別の態様において、８７位、１３０位、１８２位及び２７４位のアスパラギン残基は変異される。
関連する実施形態において、本開示は、アスパラギン以外のアミノ酸へと変異した８７位、１３０位、１８２位及び／又は２７４位でのアスパラギン残基を有する、配列番号１により定義される親アミノ酸配列を含む単離されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、単離された核酸分子を含む。上記を参照されたい。変異は親アミノ酸配列と比較すると、アルカリｐＨ値での化学的安定性の増加をもたらし得る。
更に関連する実施形態において、本開示はベクターを含む。このベクターは、アスパラギン以外のアミノ酸へと変異した８７位、１３０位、１８２位及び／又は２７４位でのアスパラギン残基を有する、配列番号１により定義される親アミノ酸配列を含む単離されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸分子を含む。上記を参照されたい。変異は親アミノ酸配列と比較すると、アルカリｐＨ値での化学的安定性の増加をもたらし得る。一態様において、核酸分子は宿主細胞内でその発現を指示することが可能である発現制御配列に作動可能に連結される。一態様において、ベクターはプラスミドであり得る。
アフィニティーベースの産生
本開示はまた、アフィニティークロマトグラフィーを使用して抗ＶＥＧＦタンパク質を産生する間、宿主細胞タンパク質並びに望ましくない他のタンパク質及び核酸を減少させる方法を提供する。
一実施形態において、組換えタンパク質を産生する方法は、（ａ）関心対象の組換えタンパク質を発現させるために遺伝子改変された宿主細胞を提供する工程、（ｂ）この細胞が関心対象の組換えタンパク質を発現する好適な条件下で、宿主細胞を培養する工程、及び（ｃ）この細胞によって産生された関心対象の組換えタンパク質の調製物を回収する工程、を含む。一態様においては、関心対象の組換えタンパク質は抗ＶＥＧＦタンパク質である。特定の態様においては、抗ＶＥＧＦタンパク質は、アフリベルセプト、ＭｉｎｉＴｒａｐ、組換えＭｉｎｉＴｒａｐ（その例は、米国特許第７，２７９，１５９号に開示される）、ｓｃＦｖ及び他の抗ＶＥＧＦタンパク質からなる群から選択される。
本実施形態の一態様においては、関心対象の組換えタンパク質は好適な宿主細胞内で発現される。好適な宿主細胞の非限定的な例としては、ＣＨＯ、ＣＨＯＫ１、ＥＥＳＹＲ（登録商標）、ＮＩＣＥ（登録商標）、ＮＳ０、Ｓｐ２／０、胎児腎細胞及びＢＨＫが挙げられるがこれらに限定されない。
本実施形態の一態様において、関心対象の組換えタンパク質はＣＤＭ中で培養される。好適なＣＤＭとしては、ダルベッコ改変イーグル（ＤＭＥ）培地、ハム栄養混合物、Ｅｘｃｅｌｌ培地、及びＩＳ ＣＨＯ－ＣＤ培地、及びＣＤＭ１Ｂが挙げられる。当業者に公知である他のＣＤＭはまた、本発明の範囲内であることが企図されている。
産生調製物は、関心対象の組換えタンパク質に加えて１つ以上の宿主細胞タンパク質を含む、少なくとも１種類の夾雑物を含み得る。少なくとも１種の夾雑物は、細胞基質、細胞培養、又は下流プロセスに由来し得る。
一実施形態において、本発明は、アフィニティークロマトグラフィーを使用して生物学的試料から抗ＶＥＧＦタンパク質を製造する方法に関する。特定の態様において、本明細書に開示される方法は、少なくとも部分的には、抗ＶＥＧＦタンパク質の培養物産生プロセス中に形成される１つ以上の宿主細胞タンパク質及び核酸（例えばＤＮＡ）から、抗ＶＥＧＦタンパク質を分離するために使用され得る。
一態様において、この方法は、抗ＶＥＧＦタンパク質を含む生物学的試料を、付随する夾雑物と共に、好適な条件の下でアフィニティークロマトグラフィーに供する工程を含み得る。特定の態様において、アフィニティークロマトグラフィーは抗ＶＥＧＦタンパク質に選択的又は特異的に結合（「捕捉」）可能である材料を含み得る。そのようなクロマトグラフィー材料の非限定的な例としては、プロテインＡ、プロテインＧ、例えば抗ＶＥＧＦタンパク質に結合可能なタンパク質を含むクロマトグラフィー材料、及びＦｃ結合タンパク質を含むクロマトグラフィー材料が挙げられる。特定の態様において、抗ＶＥＧＦタンパク質に結合可能であるか又はこれと相互作用可能であるタンパク質は、抗体、融合タンパク質、又はそれらの断片であり得る。抗ＶＥＧＦタンパク質に選択的又は特異的に結合可能であるこうした材料の非限定的な例は、実施例７にて説明される。
本実施形態の一態様において、この方法は、抗ＶＥＧＦタンパク質及び１つ以上の宿主細胞タンパク質／夾雑物を含む生物学的試料を、好適な条件の下でアフィニティークロマトグラフィーに供する工程を含むことができ、このアフィニティークロマトグラフィーの固定相は、抗ＶＥＧＦタンパク質に選択的又は特異的に結合可能であるタンパク質を含む。特定の態様において、タンパク質は抗体、融合タンパク質、ｓｃＦｖ又は抗体断片であり得る。特定の態様において、タンパク質はＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１２１、例えばウサギといった他の種由来のＶＥＧＦフォームであり得る。例えば、表７－１及び表７－１０に例示されるように、抗ＶＥＧＦタンパク質に選択的又は特異的に結合可能であるか又はこれと相互作用可能であるタンパク質としてＶＥＧＦ１６５を使用することで、ＭＴ５（抗ＶＥＧＦタンパク質）、アフリベルセプト及び抗ＶＥＧＦ ｓｃＦｖ断片の首尾よい生成につながった。別の特定の態様において、タンパク質は配列番号７３～８０に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質のうち１つ以上であり得る。表７－１はまた、抗ＶＥＧＦタンパク質（ＭＴ５）に選択的又は特異的に結合可能なタンパク質として、配列番号７３～８０に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を使用するＭＴ５の首尾よい生成も開示する。
本実施形態の一態様において、この方法は、抗ＶＥＧＦタンパク質及び１つ以上の宿主細胞タンパク質／夾雑物を含む生物学的試料を、好適な条件の下でアフィニティークロマトグラフィーに供する工程を含むことができ、このアフィニティークロマトグラフィーの固定相は、抗ＶＥＧＦタンパク質に選択的又は特異的に結合可能であるか又はこれと相互作用可能であるタンパク質を含み、この抗ＶＥＧＦタンパク質は、アフリベルセプト、ＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐ、又は抗ＶＥＧＦ抗体から選択され得る。特定の態様において、ＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐはＶＥＧＦ受容体成分から更に得ることができ、これは宿主細胞中のＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐの組換え発現により形成され得る。この方法を実施することで、試料中の１つ以上の宿主細胞タンパク質の量を減少させることができる。例えば、図３５Ａ及び図３５Ｂは、５種類の異なるアフィニティークロマトグラフィーカラムを使用した際、ＭＴ５（抗ＶＥＧＦタンパク質）を含む試料中のすべての宿主細胞タンパク質で著しい減少を示している。この５種類の異なるアフィニティークロマトグラフィーカラムは、ＭＴ５に選択的又は特異的に結合可能である異なるタンパク質として、（ｉ）ＶＥＧＦ１６５（配列番号７２）、（ｉｉ）ｍＡｂ１（配列番号７３は重鎖であり、配列番号７４は軽鎖である、マウスの抗－ＶＥＧＦＲ１ ｍＡｂヒトＩｇＧ１）、（ｉｉｉ）ｍＡｂ２（配列番号７５は重鎖であり、配列番号７６は軽鎖である、マウスの抗－ＶＥＧＦＲ１ ｍＡｂヒトＩｇＧ１）、（ｉｖ）ｍＡｂ３（配列番号７７は重鎖であり、配列番号７８は軽鎖である、マウスの抗－ＶＥＧＦＲ１ ｍＡｂマウスＩｇＧ１）、及び（ｖ）ｍＡｂ４（配列番号７９は重鎖であり、配列番号８０は軽鎖である、マウスの抗－ＶＥＧＦＲ１ ｍＡｂマウスＩｇＧ１）を含む。図３５Ａ及び図３５Ｂに見られるように、アフィニティーベースの製造プロセスのそれぞれからの溶出液はそれぞれ、７０００ｐｐｍ超から約２５ｐｐｍまで及び約５５ｐｐｍまで、宿主細胞タンパク質を減少させた。
アフィニティークロマトグラフィーを使用するための好適な条件としては、平衡化バッファを使用する、アフィニティークロマトグラフィーカラムの平衡化が挙げられるがこれに限定されない。例えば約８．３～約８．６のｐＨであるトリス塩酸塩を使用して平衡化した後、生物学的試料をアフィニティークロマトグラフィーカラムに負荷する。カラムの負荷後、カラムを例えばダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）などの平衡化バッファを使用し、１回又は複数回洗浄することができる。異なるバッファを使用する洗浄を含む他の洗浄は、カラムを溶出する前に使用され得る。カラムの溶出は、バッファの種類及びｐＨ及び伝導度により影響を受ける可能性があり、当業者に周知の他の溶出条件を適用することができる。例えば約２．０～約３．０のｐＨであるグリシンといった１種以上の溶出バッファを使用して溶出した後、溶出画分は、例えばｐＨ７．５の１Ｍトリスといった中和バッファの添加により中和され得る。
本実施形態の一態様において、洗浄バッファ及び平衡化バッファの両方のｐＨは、約７．０～約８．６であり得る。本実施形態の一態様において、洗浄バッファはＤＰＢＳであり得る。一態様において、溶出バッファは約２．５のｐＨを有する１００ｍＭのグリシンバッファを含み得る。別の態様において、溶出バッファは約２．０～約３．０のｐＨを有するバッファであり得る。一態様において、中和バッファは約７．５のｐＨを有する１Ｍトリスを含み得る。
本実施形態の一態様において、本方法は洗浄バッファでカラムを洗浄する工程を更に含み得る。本実施形態の一態様において、本方法は、溶出画分を得るために溶出バッファでカラムを溶出する工程を更に含み得る。特定の態様において、溶出画分中の宿主細胞タンパク質の量は、生物学的試料中の宿主細胞タンパク質の量と比較して、例えば約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％、又は約９９％だけ著しく減少する。
本実施形態は、特定の順序ではない、１つ以上の工程の追加を含むことができ、例えば疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティーベースのクロマトグラフィー、マルチモーダルクロマトグラフィー、ウイルス不活化（例えば低ｐＨを使用）、ウイルスろ過、及び／又は限外ろ過／透析ろ過を含むことができる。
一態様において、抗ＶＥＧＦタンパク質の組成物のグリコシル化特性は、以下である：約４０％～約５０％の総フコシル化グリカン、約３０％～約５５％の総シアリル化グリカン、約６％～約１５％のマンノース－５、及び約６０％～約７９％のガラクトシル化グリカン。
本実施形態の一態様において、抗ＶＥＧＦタンパク質は約３２．４％のアスパラギン１２３残基、及び／又は約２７．１％のアスパラギン１９６残基にてＭａｎ５グリコシル化を有する。特定の実施形態において、抗ＶＥＧＦタンパク質は、アフリベルセプト、抗ＶＥＧＦ抗体、又はＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐであり得る。
一実施形態において、この方法は薬学的に許容される賦形剤を使用して原薬を製剤化する工程を更に含み得る。一態様において、薬学的に許容される賦形剤は、以下：水、緩衝剤、糖、塩、界面活性剤、アミノ酸、ポリオール、キレート剤、乳化剤及び保存剤から選択され得る。当業者に周知の他の賦形剤は、本実施形態の範囲内である。
本実施形態の一態様において、製剤はヒト対象への投与に好適であり得る。本実施形態の一態様において、投与は、硝子体内注射により行うことができる。一態様において、この製剤は約４０～約２００ｍｇ／ｍＬの関心対象のタンパク質を有し得る。特定の態様において、関心対象のタンパク質は、アフリベルセプト、抗ＶＥＧＦ抗体、又はＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐであり得る。
製剤は、加齢黄斑変性症（例えば湿性又は乾性）、黄斑浮腫、網膜静脈閉塞症後の黄斑浮腫、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、網膜静脈分枝閉塞症（ＢＲＶＯ）、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）、虹彩新生血管、血管新生緑内障、緑内障の術後線維症、増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）、視神経円板血管新生、角膜血管新生、網膜血管新生、硝子体血管新生、パンヌス、翼状片、血管性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫に罹っている対象における糖尿病性網膜症、又は糖尿病性網膜症（例えば、非増殖性糖尿病性網膜症（例えば、約４７又は５３の糖尿病性網膜症の重症度スコア（ＤＲＳＳ）レベルによって特徴付けられる）又は増殖性糖尿病性網膜症（例えばＤＭＥに罹患していない対象における）を含み得る血管新生性眼障害を処置又は予防する方法で使用され得る。
オキソ種の合成
本発明の一実施形態は、光を使用して酸化タンパク質種を合成する１つ以上の方法に関する。本実施形態の一態様において、関心対象のタンパク質は抗ＶＥＧＦタンパク質である。特定の態様において、抗ＶＥＧＦタンパク質はアフリベルセプトである。別の態様において、抗ＶＥＧＦタンパク質は組換えＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐを含むＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐである。本実施形態の更なる別の態様において、抗ＶＥＧＦタンパク質は一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。
本実施形態の一態様において、試料は例えば、最小限のオキソバリアントを有するか又はオキソバリアントを有さないアフリベルセプト融合タンパク質といった、関心対象のタンパク質を含む。試料に光ストレスをかけ、アフリベルセプトの酸化種を合成する。特定の態様において、試料は冷白色光を使用することにより光ストレスをかけられる。別の特定の態様において、試料は紫外線を使用することにより光ストレスをかけられる。
本実施形態の特定の態様において、アフリベルセプト又は別の抗ＶＥＧＦタンパク質を含む試料は、約３０時間～約３００時間冷白色光に曝露され、修飾オリゴペプチドの約１．５～約５０倍の増加を生じる。これらのペプチドは、酵素的に消化され、かつ分析され、
ＤＫＴＨ＊ＴＣ＊ＰＰＣ＊ＰＡＰＥＬＬＧ（配列番号１７）、ＥＩＧＬＬＴＣ＊ＥＡＴＶＮＧＨ＊ＬＹＫ（配列番号１８）、ＱＴＮＴＩＩＤＶＶＬＳＰＳＨ＊ＧＩＥＬＳＶＧＥＫ（配列番号１９）、ＴＥＬＮＶＧＩＤＦＮＷＥＹＰＳＳＫＨ＊ＱＨＫ（配列番号２０）、ＴＮＹＬＴＨ＊Ｒ（配列番号２１）、ＳＤＴＧＲＰＦＶＥＭＹＳＥＩＰＥＩＩＨ＊ＭＴＥＧＲ（配列番号２２）、ＶＨ＊ＥＫＤＫ（配列番号２３）、ＳＤＴＧＲＰＦＶＥＭ＊ＹＳＥＩＰＥＩＩＨＭＴＥＧＲ（配列番号６４）、ＳＤＴＧＲＰＦＶＥＭＹＳＥＩＰＥＩＩＨＭ＊ＴＥＧＲ（配列番号６５）、ＴＱＳＧＳＥＭ＊Ｋ（配列番号６６）、ＳＤＱＧＬＹＴＣ＊ＡＡＳＳＧＬＭ＊ＴＫ（配列番号６７）、ＩＩＷ＊ＤＳＲ（配列番号２８）、ＲＩＩＷ＊ＤＳＲ（配列番号１１５）、ＩＩＷ＊ＤＳＲＫ（配列番号１１４）、ＴＥＬＮＶＧＩＤＦＮＷ＊ＥＹＰＳＳＫ（配列番号２９）、ＧＦＩＩＳＮＡＴＹ＊Ｋ（配列番号６９）、ＫＦ＊ＰＬＤＴＬＩＰＤＧＫ（配列番号７０）Ｆ＊ＬＳＴＬＴＩＤＧＶＴＲ（配列番号３２）
からなる群から１つ以上を含み、この場合、Ｈ＊はヒスチジンであり２－オキソ－ヒスチジンに酸化され、Ｃ＊はシステインでありカルボキシメチル化され、Ｍ＊は酸化メチオニンであり、Ｗ＊は酸化トリプトファンであり、Ｙ＊は酸化チロシンであり、Ｆ＊は酸化フェニルアラニンである。消化は、ここまでに言及されたプロテアーゼにより、例えばトリプシンにより実施され得る。オリゴペプチドは質量分析法を使用して分析され得る。
本実施形態の特定の態様において、アフリベルセプト又は別の抗ＶＥＧＦタンパク質を含む試料は、約４時間～約４０時間紫外線に曝露され、修飾オリゴペプチド産物（消化を行った際に取得）の約１．５～約２５倍の増加を生じ、この場合、試料は、
ＤＫＴＨ＊ＴＣ＊ＰＰＣ＊ＰＡＰＥＬＬＧ（配列番号１７）、ＥＩＧＬＬＴＣ＊ＥＡＴＶＮＧＨ＊ＬＹＫ（配列番号１８）、ＱＴＮＴＩＩＤＶＶＬＳＰＳＨ＊ＧＩＥＬＳＶＧＥＫ（配列番号１９）、ＴＥＬＮＶＧＩＤＦＮＷＥＹＰＳＳＫＨ＊ＱＨＫ（配列番号２０）、ＴＮＹＬＴＨ＊Ｒ（配列番号２１）、ＳＤＴＧＲＰＦＶＥＭＹＳＥＩＰＥＩＩＨ＊ＭＴＥＧＲ（配列番号２２）、ＶＨ＊ＥＫＤＫ（配列番号２３）、ＳＤＴＧＲＰＦＶＥＭ＊ＹＳＥＩＰＥＩＩＨＭＴＥＧＲ（配列番号６４）、ＳＤＴＧＲＰＦＶＥＭＹＳＥＩＰＥＩＩＨＭ＊ＴＥＧＲ（配列番号６５）、ＴＱＳＧＳＥＭ＊Ｋ（配列番号６６）、ＳＤＱＧＬＹＴＣ＊ＡＡＳＳＧＬＭ＊ＴＫ（配列番号６７）、ＩＩＷ＊ＤＳＲ（配列番号２８）、ＲＩＩＷ＊ＤＳＲ（配列番号１１５）、ＩＩＷ＊ＤＳＲＫ（配列番号１１４）、ＴＥＬＮＶＧＩＤＦＮＷ＊ＥＹＰＳＳＫ（配列番号２９）、ＧＦＩＩＳＮＡＴＹ＊Ｋ（配列番号６９）、ＫＦ＊ＰＬＤＴＬＩＰＤＧＫ（配列番号７０）Ｆ＊ＬＳＴＬＴＩＤＧＶＴＲ（配列番号３２）
からなる群から選択される１つ以上の修飾オリゴペプチドを含み、この場合、Ｈ＊はヒスチジンであり２－オキソ－ヒスチジンに酸化され、Ｃ＊はシステインでありカルボキシメチル化され、Ｍ＊は酸化メチオニンであり、Ｗ＊は酸化トリプトファンであり、Ｙ＊は酸化チロシンであり、Ｆ＊は酸化フェニルアラニンである。消化は、ここまでに言及されたプロテアーゼにより、例えばトリプシンにより実施され得る。オリゴペプチドは質量分析法を使用して分析され得る。
黄褐色を最小化する方法
本開示は、ＣＤＭ中に産生されるアフリベルセプト、ＭｉｎｉＴｒａｐ又はその同等物の産生中、黄褐色の呈色を低減させる方法を提供する。
一実施形態において、この方法は、好適な条件の下で、関心対象の組換えタンパク質を発現する宿主細胞をＣＤＭ中で培養する工程、続いて関心対象の組換えタンパク質を含む調製物を回収する工程を含む。一態様において、関心対象の組換えタンパク質は抗ＶＥＧＦタンパク質である。特定の態様においては、抗ＶＥＧＦタンパク質は、アフリベルセプト、ＭｉｎｉＴｒａｐ、組換えＭｉｎｉＴｒａｐ（その全体が参照として本明細書に組み入れられる米国特許第７，２７９，１５９号に、その例が開示される）、ｓｃＦｖ、及び他の抗ＶＥＧＦタンパク質からなる群から選択される。一態様において、この方法は関心対象の組換えタンパク質の調製物を産生し、この調製物の色はＥｕｒｏｐｅａｎ ＢＹ法又はＣＩＥＬＡＢ法（ｂ＊）を使用して特徴付けられる。加えて、オキソバリアントの存在は例えばＬＣ－ＭＳを使用して分析され得る。
本実施形態の一態様において、軽減条件には、例えば塩及び前駆体を含む、アミノ酸、金属又は抗酸化剤といった１つ以上の培地成分の累積濃度を増加又は減少させることを含む。これは色並びにアフリベルセプト及びＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐのタンパク質バリアントにおける低減に対応している。アミノ酸の非限定的な例としては、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリンが挙げられる。特定の態様において、システインの低下は、調製物の黄褐色を低下させる上で効果的であり得る。システイン濃度はまた、オキソバリアントにも影響を与える可能性がある。
一実施形態において、この方法は、好適な条件の下でアフリベルセプトといった関心対象の組換えタンパク質を発現する宿主細胞をＣＤＭ中で培養する工程、細胞により産生された関心対象のタンパク質の調製物を回収する工程を含み、好適な条件は、ＣＤＭ中のシステインの累積濃度を約１０ｍＭ以下にまで低下させることにより部分的に得られる。好適な培地の例としては、ＣＤＭ１Ｂ、Ｅｘｃｅｌｌ又はその同等物が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書にて使用される場合、用語「累積量」は、ＣＤＭを形成する細胞培養の過程を通じてバイオリアクタに加えられる特定成分の総量を指し、これは培養の開始時（０日目のＣＤＭ）で加えられた量及び順次加えられた成分の量を含む。成分の累積量を計算するときには、バイオリアクタでの産生前（すなわち、０日目のＣＤＭ前）にシードトレイン培養又は種菌に加えられる成分の量もまた含まれる。累積量は、培養中の経時的な成分の損失（例えば、代謝又は化学分解による）により影響を受けることはない。したがって、例えば、成分が異なる時期に２つの培養物に加えられる場合（例えば、ある培養物においてはそのすべての成分が最初に加えられ、別の培養物においては、成分が経時的に加えられる場合）、成分について同じ累積量を有する２つの培養物であったとしても、異なる絶対レベルを有する場合がある。累積量はまた、培養中に経時的に成分をその場で合成させることで（例えば、代謝又は化学的変換による）影響を受けることはない。したがって、例えば成分が、生物変換プロセスの途中、２つの培養物のうち一方の中でその場で合成される場合には、所与の成分の同じ累積量を有する２つの培養物であったとしても異なる絶対レベルを有する場合がある。累積量は、例えば成分のグラム又はモルといった単位で表され得る。
本明細書にて使用される場合、用語「累積濃度」は、培養物中で使用される任意の種菌由来の開始体積への追加を含む、製造バッチの開始時のバイオリアクタ内の液体の体積で割った、成分の累積量を指す。例えば、バイオリアクタが製造バッチの開始時に２リットルの細胞培養培地を含有し、１グラムの成分Ｘが、０日目、１日目、２日目、及び３日目に加えられる場合には、３日目以降の累積濃度は２ｇ／Ｌである（すなわち、４グラムを２リットルで割る）。仮に４日目に、成分Ｘを含有しない１リットルの追加の液体をバイオリアクタに加えても、累積濃度は２ｇ／Ｌのままである。仮に５日目に、いくらかの量の液体がバイオリアクタから失われる（例えば蒸発による）としても、累積濃度は２ｇ／Ｌのままである。累積濃度は例えば、グラム／リットル、又はモル／リットルといった単位で表され得る。
本実施形態の一態様において、この方法は、好適な条件の下で、関心対象の組換えタンパク質を発現する宿主細胞をＣＤＭ中で培養する工程、細胞により産生されたタンパク質の調製物を回収する工程を含み、好適な条件は、約１：５０～約１：３０の累積総アミノ酸濃度に対する、約１：１０～１：２９の累積システイン濃度の比率を低下させることにより得られる。
一実施形態において、この方法は、（ｉ）好適な条件の下で、例えばアフリベルセプトなどの関心対象の組換えタンパク質を発現する宿主細胞をＣＤＭ中で培養する工程、（ｉｉ）細胞により産生された関心対象の組換えタンパク質の調製物を回収する工程を含み、好適な条件は、ＣＤＭ中の鉄の累積濃度を約５５．０μＭ未満にまで低下させることにより得られる。本実施形態の一態様において、この方法により得られた調製物は、ＣＤＭ中の鉄の累積濃度が約５５．０μＭ超までの方法によって得られた調製物よりも黄褐色が低減していることを示す。
一実施形態において、この方法は、好適な条件の下で、アフリベルセプトなどの関心対象の組換えタンパク質を発現する宿主細胞をＣＤＭ中で培養する工程を含む。この方法は、細胞によって産生された関心対象の組換えタンパク質の調製物を回収する工程を更に含み、好適な条件は、ＣＤＭ中の銅の累積濃度を約０．８μＭ以下にまで低下させることにより得られる。本実施形態の一態様において、この方法により得られた調製物は、ＣＤＭ中の銅の累積濃度が約０．８μＭ超までの方法によって得られた調製物よりも黄褐色が低減していることを示す。
一実施形態において、この方法は、好適な条件の下で、例えばアフリベルセプトなどの関心対象の組換えタンパク質を発現する宿主細胞をＣＤＭ中で培養する工程、細胞により産生された関心対象の組換えタンパク質の調製物を回収する工程を含み、好適な条件は、ＣＤＭ中のニッケルの累積濃度を約０．４０μＭ以下にまで低下させることにより得られる。本実施形態の一態様において、この方法により得られた調製物は、ＣＤＭ中のニッケルの累積濃度が約０．４０μＭ超までの方法によって得られた調製物よりも黄褐色が低減していることを示す。
一実施形態において、この方法は、好適な条件の下で、アフリベルセプトなどの関心対象の組換えタンパク質を発現する宿主細胞をＣＤＭ中で培養する工程を含む。この方法は、細胞により産生された関心対象の組換えタンパク質の調製物を回収する工程を更に含み、好適な条件は、ＣＤＭ中の亜鉛の累積濃度を約５６μＭ以下にまで低下させることにより得られる。本実施形態の一態様において、この方法により得られた調製物は、ＣＤＭ中の亜鉛の累積濃度が約５６μＭ超までの方法によって得られた調製物よりも黄褐色が低減していることを示す。
一実施形態において、この方法は、好適な条件の下で、アフリベルセプトなどの関心対象の組換えタンパク質を発現する宿主細胞をＣＤＭ中で培養する工程を含む。この方法は、細胞により産生された関心対象の組換えタンパク質の調製物を回収する工程を更に含み、好適な条件は、単一の抗酸化剤については約０．００１ｍＭ～約１０ｍＭの累積濃度でＣＤＭ中に抗酸化剤が存在することで得られ、複数の抗酸化剤が当該ＣＤＭ中に加えられる場合には、約３０ｍＭ以下の累積濃度で存在することで得られる。本実施形態の一態様において、この方法により得られた調製物は、およそ約０．０１ｍＭ未満又は約１００ｍＭ超の累積濃度でＣＤＭ中に抗酸化剤が存在しない方法により得られた調製物よりも黄褐色が低減していることを示す。抗酸化剤の非限定的な例としては、タウリン、ヒポタウリン、グリシン、チオクト酸、グルタチオン、塩化コリン、ヒドロコルチゾン、ビタミンＣ、ビタミンＥ、キレート剤、カタラーゼ、Ｓ－カルボキシメチル－Ｌ－システイン、及びこれらの組合せであり得る。キレート剤の非限定的な例としては、アウリントリカルボン酸（ＡＴＡ）、デフェロキサミン（ＤＦＯ）、ＥＤＴＡ及びクエン酸を含む。
一実施形態において、この方法は、好適な条件の下で、アフリベルセプトなどの関心対象の組換えタンパク質を発現する宿主細胞をＣＤＭ中で培養する工程を含む。この方法は、細胞により産生された関心対象の組換えタンパク質の調製物を回収する工程を更に含み、好適な条件は、約５５μＭ未満である当該ＣＤＭ中の鉄の累積濃度、約０．８μＭ以下である当該ＣＤＭ中の銅の累積濃度、約０．４０μＭ以下である当該ＣＤＭ中のニッケルの累積濃度、約５６μＭ以下である当該ＣＤＭ中の亜鉛の累積濃度、１０ｍＭ未満である当該ＣＤＭ中のシステインの累積濃度、及び／又は単一の抗酸化剤に対する約０．００１ｍＭ～約１０ｍＭの濃度である、当該ＣＤＭ中の抗酸化剤、及び複数の抗酸化剤が当該ＣＤＭに加えられる場合、約３０ｍＭ以下である累積濃度を有するＣＤＭを含む。
本実施形態の一態様において、好適な条件を使用することで得られた調製物は、アフリベルセプト及びＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐのタンパク質バリアントの望ましい量（アフリベルセプト及びＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐのタンパク質バリアントの「目標値」と称される）まで、アフリベルセプト及びＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐのタンパク質バリアントの減少をもたらす。本実施形態の更なる態様において、好適な条件を使用することで得られた調製物は、アフリベルセプト及びＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐのバリアントを含むタンパク質の調製物を５ｇ／Ｌ又は１０ｇ／Ｌの濃度に正規化するときには、所望のｂ＊値又はＢＹ値（それぞれ「目標ｂ＊値」、「目標ＢＹ値」と称される）まで調製物の色の低減をもたらす。本実施形態の更なる態様において、目標ｂ＊値（又は目標ＢＹ値）及び／又はバリアントの目標値は、力価が増加するか又は著しく減少しない場合には調製物において得ることが可能である。
[本発明1001]
アフリベルセプトを産生する方法であって、
（ａ）合成培地（ＣＤＭ）中で培養された細胞の清澄化された回収物を産生する工程と、
（ｂ）前記アフリベルセプトと結合又は相互作用可能なポリペプチドを含むアフィニティークロマトグラフィーカラムを使用して、前記清澄化された回収物からのアフリベルセプトを結合させる工程であって、前記ポリペプチドが、抗体、融合タンパク質、ＳｃＦｖ、又はこれらの断片である、結合させる工程と、
（ｃ）アフィニティー溶出液を形成する、工程（ｂ）の前記アフリベルセプトを溶出する工程と、
任意選択で、
（ｄ）（ｃ）の前記溶出したアフリベルセプトを第2クロマトグラフィー捕捉工程に供する工程と、
（ｅ）フロースルー画分を収集する工程であって、前記フロースルー画分がアフリベルセプトを有する、収集する工程と
を含む、方法。
[本発明1002]
前記アフリベルセプトと結合又は相互作用可能な前記ポリペプチドが、配列番号72、配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、及び配列番号80から選択される単離されたアミノ酸配列を含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
平衡化バッファを使用して（ｂ）の前記アフィニティークロマトグラフィーカラムを平衡化する工程を更に含む、本発明1001の方法。
[本発明1004]
前記平衡化バッファが、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水又はトリス塩酸である、本発明1003の方法。
[本発明1005]
前記平衡化バッファが約8．3～約8．6のｐＨを有する、本発明1004の方法。
[本発明1006]
1つ以上のフロースルー画分を得るために、平衡化バッファを用いてカラム（ｄ）を洗浄する工程を更に含む、本発明1001の方法。
[本発明1007]
前記平衡化バッファがダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水であり、約7．0～約8．6のｐＨを有する、本発明1006の方法。
[本発明1008]
1つ以上の溶出画分を得るために、（ｂ）のカラムを溶出バッファに供する工程を更に含む、本発明1001の方法。
[本発明1009]
前記溶出バッファが、約2．5のｐＨを有する100ｍＭのグリシンバッファを含む、本発明1008の方法。
[本発明1010]
前記溶出バッファのｐＨが、約2．0～約3．5である、本発明1008の方法。
[本発明1011]
中和バッファの追加により、前記溶出画分を中和する工程を更に含む、本発明1008の方法。
[本発明1012]
前記中和バッファがトリス塩酸である、本発明1011の方法。
[本発明1013]
（ｃ）における宿主細胞タンパク質の量が、前記清澄化された回収物中の宿主細胞タンパク質の量と比較して約90％、約95％、約98％、又は約99％だけ著しく減少する、本発明1001の方法。
[本発明1014]
（ｄ）の前記第2捕捉クロマトグラフィーが、陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）を含む、本発明1001の方法。
[本発明1015]
前記ＡＥＸカラム用の前記平衡化バッファ及び洗浄バッファの両方の伝導度が、約1．50～約3．0ｍＳ／ｃｍであり得る、本発明1014の方法。
[本発明1016]
（ｅ）の前記1つ以上のフロースルー画分からのアフリベルセプトが、20％未満のアフリベルセプトの総酸性種を含み、酸性種が、アフリベルセプトの陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）クロマトグラムにおけるメインピークよりも早く溶出するピークに対応しており、クロマトグラムが、20ｍＭの2－（Ｎ－モルフォリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）（ｐＨ5．7）の第1移動相、及び40ｍＭのリン酸ナトリウム、100ｍＭの塩化ナトリウム（ｐＨ9．0）（移動相Ｂ）の第2移動相を使用して生成され、クロマトグラムが280ｎｍでの検出を使用して生成される、本発明1014の方法。
[本発明1017]
アフリベルセプトを産生する方法であって、
（ａ）アフリベルセプトを発現するように遺伝子改変された宿主細胞を提供する工程と、
（ｂ）前記アフリベルセプトを発現する好適な条件の下で、前記宿主細胞を培養する工程と、
（ｃ）アフリベルセプトと前記宿主細胞により産生された少なくとも1つの不純物とを含む調製物を回収する工程と、
（ｄ）好適な条件の下で、前記調製物をアフィニティークロマトグラフィーに供する工程であって、前記アフィニティークロマトグラフィーが、前記アフリベルセプトと結合又は相互作用可能なポリペプチドを含む、供する工程と
を含む、方法。
[本発明1018]
前記アフリベルセプトと結合可能な前記ポリペプチドが、抗体、融合タンパク質、ＳｃＦｖ、又はこれらの断片である、本発明1017の方法。
[本発明1019]
前記アフリベルセプトと結合又は相互作用可能な前記ポリペプチドが、配列番号72、配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、及び配列番号80から選択される単離されたアミノ酸配列を含む、本発明1017の方法。
[本発明1020]
前記アフリベルセプトと結合又は相互作用可能な前記ポリペプチドが、配列番号72から選択される単離されたアミノ酸配列を含む、本発明1019の方法。
[本発明1021]
前記アフリベルセプトと結合又は相互作用可能な前記ポリペプチドが、配列番号73から選択される単離されたアミノ酸配列を含む、本発明1019の方法。
[本発明1022]
前記アフリベルセプトと結合又は相互作用可能な前記ポリペプチドが、配列番号74から選択される単離されたアミノ酸配列を含む、本発明1019の方法。
[本発明1023]
前記アフリベルセプトと結合又は相互作用可能な前記ポリペプチドが、配列番号75から選択される単離されたアミノ酸配列を含む、本発明1019の方法。
[本発明1024]
前記アフリベルセプトと結合又は相互作用可能な前記ポリペプチドが、配列番号76から選択される単離されたアミノ酸配列を含む、本発明1019の方法。
[本発明1025]
前記アフリベルセプトと結合又は相互作用可能な前記ポリペプチドが、配列番号77から選択される単離されたアミノ酸配列を含む、本発明1019の方法。
[本発明1026]
前記アフリベルセプトと結合又は相互作用可能な前記ポリペプチドが、配列番号78から選択される単離されたアミノ酸配列を含む、本発明1019の方法。
[本発明1027]
前記アフリベルセプトと結合又は相互作用可能な前記ポリペプチドが、配列番号79から選択される単離されたアミノ酸配列を含む、本発明1019の方法。
[本発明1028]
前記アフリベルセプトと結合又は相互作用可能な前記ポリペプチドが、配列番号80から選択される単離されたアミノ酸配列を含む、本発明1019の方法。
[本発明1029]
前記溶出画分中の宿主細胞タンパク質の量が、（ｃ）における宿主細胞タンパク質の量と比較して約90％、約95％、約98％、又は約99％だけ著しく減少する、本発明1017の方法。
本発明のこれらの態様及び他の態様は、以下の説明及び添付の図面と合わせて考えると、よりよく認識され、かつよりよく理解されるであろう。以下の説明は、様々な実施形態及びそれらの多数の特定の詳細部分を示すが、例示として与えられており限定するものではない。本発明の範囲内で、多くの置換、修正、追加、又は再配置を行うことができる。
例示的な実施形態を使用して生成されたＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐを示す。このＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐは、ＶＥＧＦＲ１（配列番号３４）、ＶＥＧＦＲ２（配列番号３６、ヒンジドメイン断片（配列番号６０））及びアフリベルセプト（配列番号５５）から切断されたＦｃ断片（配列番号１１３）を含む。 ２－オキソ－ヒスチジン（１４Ｄａ）へのヒスチジン酸化のために提案された機構を示す。 ２－オキソ－ヒスチジン（１６Ｄａ）へのヒスチジン酸化のために提案された機構を示す。 Ｎ－ホルミルキヌレニン及びキヌレニンへのトリプトファンの酸化のための提案された機構を示す。 アフリベルセプトの産生のための例示的な実施形態を示す。 ＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐの産生のための例示的な実施形態を示す。 アフリベルセプトの産生のための例示的な実施形態を示す。 ＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐの産生のための例示的な実施形態を示す。 例示的な実施形態として計算されたｂ＊値に対する計算されたＢＹ標準のチャートを示す。 それぞれ出現順に、配列番号１１４、１１５、２１、１１５、２８、２８、２０、１８、１７、１１６、１１７、及び１９を含む、還元されかつアルキル化されたアフリベルセプト（配列番号５５）の断片を含む、プロテアーゼ消化されたＡＥＸ負荷及びフロースルーからのオリゴペプチド中の２－オキソ－ヒスチジン及びトリプトファン酸化（下線部分は残基の酸化を表す）の割合を評価するために実施した実験の結果を示す。 それぞれ出現順に、配列番号２２、１８、２１、１９、２０、１１８、１１９、２８、及び２９を含む、アフリベルセプト（配列番号５５）の断片を含む、プロテアーゼ消化されたＡＥＸ負荷及びフロースルー（下線部分はペプチド配列中の残基の酸化を表す）からのオリゴペプチドを使用して実施されるペプチドマッピング分析から同定されたペプチドの相対的な存在量を示す。 ３５０ｎｍでのＭＴ４及びＭＴ１について、時間（分）に対する吸光度のクロマトグラムチャートの全体図を示す。 それぞれ出現順に、配列番号２１、２８、及び２８を含む、３５０ｎｍでのＭＴ４及びＭＴ１について、時間（１６～３０分）に対する吸光度のクロマトグラムチャートの拡大図を示す。 それぞれ出現順に、配列番号１７、２０、１８、及び１９を含む、３５０ｎｍでのＭＴ４及びＭＴ１について、時間（３０～７５分）に対する吸光度のクロマトグラムチャートの拡大図を示す。 それぞれ出現順に、配列番号２１、２８、１７、２０、１８、及び１９を含む、ＡＥＸクロマトグラフィーにより処理されたプロテアーゼ消化されたＭＴ１からのオリゴペプチド及びＡＥＸクロマトグラフィーからストリップされたプロテアーゼ消化されたＭＴ１からのオリゴペプチド中の、２－オキソ－ヒスチジン（及びトリプトファン二酸化）の割合を評価するために実施した実験の結果を示す。 それぞれ出現順に、配列番号２１、２８、２８、１７、２０、１８、及び１９を含む、ＭＴ１の異なる産生ロット中に存在する酸性種と、強陽イオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィーを実施する際に得られる酸性酸画分を比較するために実施される実験の結果を示す。 強陽イオン交換クロマトグラフィーを使用し、細胞培養回収試料中に存在する酸性種及び他のバリアントを濃縮する例示的な方法を示す。 例示的な実施形態に従う、強陽イオン交換クロマトグラフィーの実施からの画分を示す。 ＣＥＸに供されるＭＴ１産生（任意の産生手順前、ＢＹ３以下）について、及び塩－ｐＨのデュアルグラジエントを使用した脱シアリル化ＭｉｎｉＴｒａｐ（ｄｓＭＴ１）の濃縮されたバリアントについて、例示的な実施形態に従い実施された強陽イオン交換クロマトグラムを示す。 例示的な実施形態に従い、強陽イオン交換クロマトグラフィーにより実施される、分画されていない親対照についての３Ｄクロマトグラムを示す。 例示的な実施形態に従い、強陽イオン交換クロマトグラフィーにより実施される実験について、テーリング特徴の一部を表すＭＴ１、画分１についての３Ｄクロマトグラムを示す。 例示的な実施形態に従い、強陽イオン交換クロマトグラフィーにより実施される、ＭＴ１、画分２の特徴についての３Ｄクロマトグラムを示す。 例示的な実施形態に従い、強陽イオン交換クロマトグラフィーにより実施される、ＭＴ１、画分３の特徴についての３Ｄクロマトグラムを示す。 例示的な実施形態に従い、強陽イオン交換クロマトグラフィーにより実施される、ＭＴ１、画分４の特徴についての３Ｄクロマトグラムを示す。 例示的な実施形態に従い、強陽イオン交換クロマトグラフィーにより実施される、ＭＴ１、画分５の特徴についての３Ｄクロマトグラムを示す。 例示的な実施形態に従い、強陽イオン交換クロマトグラフィーにより実施される、ＭＴ１、画分６の特徴についての３Ｄクロマトグラムを示す。 例示的な実施形態に従い、強陽イオン交換クロマトグラフィーにより実施される、ＭＴ１、画分７の特徴についての３Ｄクロマトグラムを示す。 ＭＴ１産生について、例示的な実施形態に従い実施された画像キャピラリー等電点電気泳動（ｉｃＩＥＦ）の電気泳動図を示す。 それぞれ出現順に、配列番号１１４、１１４、１１５、２１、１１５、２８、２８、２８、１７、８３、２０、１８、２９、２９、１９、及び２２を含む、酸化アミノ酸残基の出現と、ＭＴ１の冷白色光又はＵＶＡ光への曝露とを相関させている調査の結果を示す。 例示的な実施形態に従い、約３５０ｎｍ（例えば、約３５０ｎｍを強調している円を参照されたい）での吸光度を有するＣＷＬストレスＭＴ１における３Ｄ ＳＥＣ－ＰＤＡ（フォトダイオードアレイ検出と連結されたサイズ排除クロマトグラフィー）クロマトグラムを示す。この場合、ＡはＴ＝０でのクロマトグラムを示し、Ｂは０．５×ＩＣＨでのクロマトグラムを示し、Ｃは２．０×ＩＣＨでのクロマトグラムを示し、Ｄは、異なる時間間隔でＣＷＬによりストレスを与えたバイアル（８０ｍｇ／ｍＬに正規化）中のＭＴ１を描写している。 例示的な実施形態に従い、約３５０ｎｍ（例えば、約３５０ｎｍを強調している円を参照されたい）での吸光度を有するＵＶＡストレスＭＴ１における３Ｄ ＳＥＣ－ＰＤＡクロマトグラムを示す。この場合、ＡはＴ＝０でのクロマトグラムを示し、Ｂは０．５×ＩＣＨでのクロマトグラムを示し、Ｃは２．０×ＩＣＨでのクロマトグラムを示し、Ｄは、異なる時間間隔でＵＶＡによりストレスを与えたバイアル（８０ｍｇ／ｍＬに正規化）中のＭＴ１を描写している。 ＣＷＬ（上パネル）を使用してストレスを与えた試料についてのＳＥＣ－ＰＤＡクロマトグラムから定量化されたＡ３２０／２８０吸光度比を示す。 ＣＷＬ（下パネル）を使用してストレスを与えた試料におけるサイズバリアントについてのＡ３２０／２８０吸光度比のチャートであり、この試料は例示的な実施形態に従いストレスが与えられている。 ＵＶＡ（上パネル）を使用してストレスを与えた試料についてのＳＥＣ－ＰＤＡクロマトグラムから定量化されたＡ３２０／２８０吸光度比を示す。 ＵＶＡ（下パネル）を使用してストレスを与えた試料におけるサイズバリアントについてのＡ３２０／２８０吸光度比のチャートであり、この試料は例示的な実施形態に従いストレスが与えられている。 アフリベルセプトを有する様々な成分のインキュベーションが色（ＣＩＥのＬ＊、ａ＊、ｂ値で予測されるｂ＊）の生成時に有している効果の見積もり推定値を示す。 予測ｂ値に対する実測値のプロットを示す。 アフリベルセプトの力価（Ａ）、生存細胞濃度（Ｂ）、生存率（Ｃ）、アンモニア（Ｄ）及び浸透圧（Ｅ）に関する、低システイン及び低金属を含むＣＤＭの効果を示す。 アフリベルセプトの力価（Ａ）、生存細胞濃度（Ｂ）、生存率（Ｃ）、アンモニア（Ｄ）及び浸透圧（Ｅ）に関する、低システイン及び低金属を含むＣＤＭの効果を示す。 アフリベルセプトの力価（Ａ）、生存細胞濃度（Ｂ）、生存率（Ｃ）、アンモニア（Ｄ）及び浸透圧（Ｅ）に関する、低システイン及び低金属を含むＣＤＭの効果を示す。 アフリベルセプトの力価（Ａ）、生存細胞濃度（Ｂ）、生存率（Ｃ）、アンモニア（Ｄ）及び浸透圧（Ｅ）に関する、低システイン及び低金属を含むＣＤＭの効果を示す。 アフリベルセプトの力価（Ａ）、生存細胞濃度（Ｂ）、生存率（Ｃ）、アンモニア（Ｄ）及び浸透圧（Ｅ）に関する、低システイン及び低金属を含むＣＤＭの効果を示す。 例示的な実施形態に従った、金属及びシステインの増加／減少濃度に関する回収物の色（１３日目のｂ＊値として確認される）の予測プロファイルを示すチャートである。 色（ＣＩＥのＬ＊、ａ＊、ｂ値で予測されるｂ＊）の生成時に消費されたＣＤＭにおける、アフリベルセプトを有する様々な成分のインキュベーションの効果を示す。 ｂ値における見積もられた予測される影響のプロットを示す。 振盪フラスコ培養における色（ＣＩＥのＬ＊、ａ＊、ｂ値で予測されるｂ＊）の生成時にＣＤＭ中のアフリベルセプトを有する様々な成分のインキュベーションの見積もり推定効果を示す。 色（ＣＩＥのＬ＊、ａ＊、「ｂ」値で予測されるｂ＊）の生成時に消費されたＣＤＭにおける、アフリベルセプトを有するヒポタウリン及びメシル酸デフェロキサミン塩（ＤＦＯ）のインキュベーションの効果を示す。 色（ＣＩＥのＬ＊、ａ＊、「ｂ」値で予測されるｂ＊）の生成時に振盪フラスコ培養からのアフリベルセプトを有する様々な成分それぞれのインキュベーションの効果を示す。 産生されるアフリベルセプトの産生の力価に関する、ＣＤＭ中のウリジン、マンガン、ガラクトース及びデキサメタゾンの添加の効果を示すチャートである。 産生されるアフリベルセプトを発現している細胞の生存率に関して、ＣＤＭ中のウリジン、マンガン、ガラクトース及びデキサメタゾンの添加の効果を示すチャートである。 産生されるアフリベルセプトを発現している細胞の生存細胞数に関して、ＣＤＭ中のウリジン、マンガン、ガラクトース及びデキサメタゾンの添加の効果を示すチャートである。 Ｃｙｇｎｕｓ ３Ｇ（Ｆ５５０）からの標準的な宿主細胞タンパク質溶液を使用して調製された宿主細胞タンパク質濃度（ｎｇ／ｍＬ）に対する、吸光度の標準曲線を示すチャートである。 非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥの試料バッファを使用して実施されたＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析の画像である。 還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥの試料バッファを使用して実施されたＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析の画像である。 負荷溶液、ＶＥＧＦ１６５、ｍＡｂ１及びｍＡｂ２を含むアフィニティークロマトグラフィーカラム１～３それぞれからの溶出画分中で検出された総宿主細胞タンパク質のチャートである。 負荷溶液、ＶＥＧＦ１６５、ｍＡｂ１、ｍＡｂ３及びｍＡｂ４を含むアフィニティークロマトグラフィーカラム１、２、４及び５それぞれからの溶出画分中で検出された総宿主細胞タンパク質のチャートである。 アフィニティークロマトグラフィー生成を実施する前のＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐのＳＥＣプロファイルを示す。 アフィニティークロマトグラフィー生成を実施した後のＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐのＳＥＣプロファイルを示す。 ＶＥＧＦ１６５に対するＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐの動態検査を表す略画表示を示す。この場合、検査されるＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐ構築物は、いくつかの例示的な実施形態に従ってアフィニティークロマトグラフィー生成を実施する前及び実施した後に由来するものであった。 ＶＥＧＦ１６５に対するＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐの動態検査からのＳＰＲセンサグラムを示す。この場合、検査されるＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐ構築物は、いくつかの例示的な実施形態に従ってアフィニティークロマトグラフィー生成を実施する前及び実施した後に由来するものであった。 負荷溶液、ＶＥＧＦ１６５、ｍＡｂ１及びｍＡｂ２を含むカラム用に繰り返し使用されるアフィニティークロマトグラフィーカラムからの溶出画分中で検出された総宿主細胞タンパク質のチャートである。 例示的な実施形態に従った、ＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐ ＭＴ１（配列番号４６）の構造を示す。 例示的な実施形態に従った、ＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐ ＭＴ６（配列番号５１）の構造を示す。 ＭＴ１、ＭＴ５及びＭＴ６のネイティブＳＥＣ－ＭＳ分析の、時間（分）に対する相対吸光度の総イオンクロマトグラム（ＴＩＣ）、並びにＴＩＣからの低分子量領域の拡大図を示す。 Ｎ末端アミノ酸（配列番号１２０）が示されている、一部のＰＴＭの解明と共にＭｉｎｉＴｒａｐ二量体の同一性を確認するための、ＭＴ１及びＭＴ５に対するメインピークのデコンボリューションされたマススペクトルを示す。 一部のＰＴＭの解明と共に一本鎖ＭｉｎｉＴｒａｐの同一性を確認するための、ＭＴ６に対するメインピークのデコンボリューションされたマススペクトルを示す。 ＭＴ１中の低分子量不純物について、時間（分）に対する相対吸光度のチャートを示す。 ＭＴ１中の低分子量不純物についてのマススペクトルを示す。 アフリベルセプトをＭＴ１へと切断するために使用されたＦａｂＲＩＣＡＴＯＲ酵素が存在しないことを示す、ＭＴ１についての時間（分）に対する相対吸光度を示す。 ＭＴ５中の低分子量不純物について、時間（分）に対する相対吸光度を示す。 ＭＴ６中の低分子量不純物について、時間（分）に対する相対吸光度を示す。 ＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐ ＭＴ６について、ＨＩＬＩＣ－ＵＶ／ＭＳを実施することで得られた時間（分）に対する吸光度のチャートを示す。このチャートは、２１分でメインピークの溶出及びおよそ２１．５分でＯ－グリカンを示す。 ４７９８５．８Ｄａでメインピークを示すＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐ ＭＴ６について、ＨＩＬＩＣ－ＵＶ／ＭＳを実施することで得られたマススペクトルを示す。 ＨＩＬＩＣ－ＵＶ／ＭＳを実施することで得られたＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐ ＭＴ６のＯ－グリカンのマススペクトルを示す。 ＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐ二量体の画像であり、ＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐのヒンジ領域（配列番号８３、１２３、８３、及び１２３）のジスルフィド架橋は平行であるか又は交差し得る。 ＭＴ１、ＭＴ５及びＭＴ６中、Ａｓｎ３６にて観察されるグリカンの分布の相対的な存在量を示す。図は、配列番号１２１を開示する。 ＭＴ１、ＭＴ５及びＭＴ６中、Ａｓｎ６８にて観察されるグリカンの分布の相対的な存在量を示す。図は、それぞれ出現順に、配列番号１０１及び３０を開示する。 ＭＴ１、ＭＴ５及びＭＴ６中、Ａｓｎ１２３にて観察されるグリカンの分布の相対的な存在量を示す。図は、配列番号８２を開示する。 ＭＴ１、ＭＴ５及びＭＴ６中、Ａｓｎ１９６にて観察されるグリカンの分布の相対的な存在量を示す。図は、それぞれ出現順に、配列番号１０３及び１２２を開示する。 蛍光検出に連結された親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）及び質量分析法分析（最大測定限界及び積み重ね）による、放出されたＮ結合グリカン分析を示す。 ＭＴ１、ＭＴ５及びＭＴ６についてのＨＩＬＩＣ－ＦＬＲクロマトグラムを示す。 蛍光検出に連結されたＨＩＬＩＣ及び質量分析法分析（最大測定限界、積み重ね、及び正規化）による、放出されたＮ結合グリカン分析を示す。 ＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐ試料ＭＴ１、ＭＴ５及びＭＴ６からの詳細なグリカン同定及び定量化の表である。 ＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐ試料ＭＴ１、ＭＴ５及びＭＴ６からの詳細なグリカン同定及び定量化の表である。 ＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐ試料ＭＴ１、ＭＴ５及びＭＴ６からの詳細なグリカン同定及び定量化の表である。 例示的な実施形態に従い、ＭｉｎｉＴｒａｐを製造する例示的な産生手順を示す。
詳細な説明
既存の血管系からの新しい血管の増殖である血管新生は、適切な胎児性血管発生及び出生後の血管発生にとって重要である、高度な組織化プロセスである。異常血管新生又は病理学的血管新生は、がん及び複数の網膜疾患の特徴である。この場合、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）といった血管新生促進因子の上方制御により、内皮増殖の増加、血管形態の変化、及び血管透過性の増加が引き起こされる。様々な眼疾患の患者の硝子体液及び網膜血管では、高レベルのＶＥＧＦが見出されている。ＶＥＧＦ活性を遮断することもまた、ＤＭＥ、湿性ＡＭＤ、ＣＮＶ、網膜静脈閉塞症ｎ及び異常血管新生が病因の根底にある他の眼疾患を処置する最適な治療となる。
本明細書にて使用される場合、アフリベルセプトは、ヒトＩｇＧ１の（Ｆｃ）とのインライン融合体（ｉｎｌｉｎｅ ｆｕｓｉｏｎ）として発現されるヒトＶＥＧＦＲ１の第２Ｉｇドメイン及びヒトＶＥＧＦＲ２の第３Ｉｇドメインを含む、すべてのヒトアミノ酸配列を含むこうした抗ＶＥＧＦタンパク質の１つである。アフリベルセプトは、すべての形態のＶＥＧＦ－Ａ（ＶＥＧＦ）と結合するが、更にはＰｌＧＦ及びＶＥＧＦ－Ｂとも結合する。いくつかの他のホモ二量体であるＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐは、アフリベルセプトから酵素的切断された産物、又は宿主細胞株から直接組換え発現されたものとして、生成される。こうしたＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐの一例を図１に示す。この図では、末端リジンが示されており（ｋ）、一部の培養プロセスはこの末端リジンを除去するが、一方で他の培養プロセスでは除去を行わない。図１は、末端リジンが残存するプロセスを例示している。一般には、アフリベルセプトは末端リジンが存在する場合及び末端リジンを含まない場合の両方を包含する。
本明細書にて示される場合、本発明は、ＣＤＭを使用する、抗ＶＥＧＦタンパク質の産生（実施例１）を部分的に開示する。特定のＣＤＭを使用して産生されたアフリベルセプトを含む溶液の分析は、強い黄褐色といったある特定の色特性を示した。溶液の色の強度は使用されるＣＤＭに応じて異なった。調査されたＣＤＭのすべてが、溶液を５ｇ／Ｌの濃度に正規化した後に明確な黄褐色を有する試料を生成したわけではなかった。
注射可能な治療薬溶液において、黄褐色といった色は、望ましくない特徴であり得る。これは、薬物製品が、特定の治療にとっての所定の精製レベル及び品質レベルを充足しているかどうかを判定するために使用される重要なパラメータであり得る。バイオ医薬品の製造経路に伴って観察される黄褐色といった色は、そのバイオ医薬品の化学修飾、製剤賦形剤の分解生成物、又はバイオ医薬品と製剤賦形剤の反応により形成される分解生成物により生じ得る。ただし、こうした情報は色変化の原因を理解するために役立ち得る。これはまた、こうした色変化を促進させる修飾を防ぐため、短期保管条件及び長期保管条件の設計を支援することができる。
本発明者らは、抗ＶＥＧＦタンパク質溶液の生成中にＡＥＸを使用することが、黄褐色への呈色を最小化させることを観察した。加えて、本発明者らは、アフリベルセプト又はＭｉｎｉＴｒａｐなどの修飾アフリベルセプトといった組換えタンパク質を産生するために使用される細胞培養物を改変することにより黄褐色への呈色が減少され得ることを発見した。
本発明は、抗ＶＥＧＦタンパク質及びＣＤＭを使用するそれらの産生を包含する。加えて、本発明は、タンパク質産生のため上流プロセス技術及び下流プロセス技術を同定及び最適化することに基づいている。
本明細書にて示される場合、以下に記載される実施例のいくつかは、抗ＶＥＧＦタンパク質の産生（実施例１）、抗ＶＥＧＦタンパク質の酸化種の産生（実施例４）、培養培地を最適化することによる抗ＶＥＧＦタンパク質の酸化種を減少させる方法（実施例５）、及び製造方法を最適化することによる抗ＶＥＧＦタンパク質の酸化種を減少させる方法（実施例２）を説明する。
近年のいくつかの特許出願及び取得済み特許は、様々なアフリベルセプト種及びそれらを製造する方法の説明を意図しているが、本明細書に説明される抗ＶＥＧＦ組成物及びそれらの製造方法を説明又は提案しているものは存在しない。例えば、Ｃｏｈｅｒｕｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．の米国特許出願第１６／５６６，８４７号、Ｓａｍ Ｃｈｕｎ Ｄａｎｇ Ｐｈａｒｍ．Ｃｏ．，Ｌｔｄ．の米国特許第１０，６４６，５４６号、Ｆｏｒｍｙｃｏｎ ＡＧの米国特許第１０，５７６，１２８号、Ａｍｇｅｎ Ｉｎｃ．の国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０１５６５９号、及びＭｏｍｅｎｔａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃの米国特許第８，９５６，８３０号、同第９，２１７，１６８号、同第９，４８７，８１０号、同第９，６６３，８１０号、同第９，９２６，５８３号、及び同第１０，１４４，９４４号を参照されたい。
Ｉ．選択された用語の説明
特に説明されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。当業者に公知の本明細書に説明される方法及び材料と類似するか又は同等の方法及び材料は、本明細書に説明される特定の実施形態の実施に使用することができる。言及されたすべての刊行物は、その全体が参照として本明細書に組み入れられる。
「１つの（ａ）」という用語は「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきであり、「約」及び「およそ」という用語は、当業者によって理解されるように標準的な変動を許容すると理解されるべきであり、範囲が提供される場合、終点が含まれる。
本明細書にて使用される場合、「血管新生性眼障害」という用語は、血管の成長若しくは増殖又は血管漏出によって引き起こされる、又はそれに関連する眼の任意の疾患を意味する。
本明細書にて使用される場合、「合成培地（ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ）」又は「合成培地（ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ｍｅｄｉａ）」（両方とも「ＣＤＭ」と略記される）という用語は、すべての成分の同定及び濃度が定義されている合成増殖培地を指す。合成培地は、微生物、酵母、動物又は植物抽出物、動物血清又は血漿を含有しないが、個別の植物又は動物由来成分（例えばタンパク質、ポリペプチドなど）は加えられてもよい。合成培地は、リン酸塩、硫酸塩、及び増殖を支援するために必要とされる同等物といった無機塩を含有してもよい。炭素源は定義され、通常は、グルコース、ラクトース、ガラクトース、及びそれらの同等物といった糖、又はグリセロール、乳酸塩、酢酸塩、及びそれらの同等物といった他の化合物である。ある特定の合成培地はまた、バッファとしてリン酸塩を使用する一方、例えば炭酸水素ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、クエン酸、トリエタノールアミン、及びそれらの同等物といった他のバッファを使用してもよい。市販の合成培地の例としては、様々なダルベッコ改変イーグル（ＤＭＥ）培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ；ＳＡＦＣ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）、ハムの栄養混合物（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ；ＳＡＦＣ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）、様々なＥＸ－ＣＥＬＬ培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ；ＳＡＦＣ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）、様々なＩＳ ＣＨＯ－ＣＤ培地（ＦＵＪＩＦＩＬＭ Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、これらの組合せ、及びこれらの同等物が挙げられるが、これらに限定されない。合成培地を調製する方法は当技術分野において、例えば、米国特許第６，１７１，８２５号及び同第６，９３６，４４１号、国際公開第２００７／０７７２１７号、及び米国特許出願公開第２００８／０００９０４０号及び同第２００７／０２１２７７０号にて公知であり、その全体の教示が参照として本明細書に組み入れられる。
本明細書にて使用される場合、用語「累積量」は、ＣＤＭを形成する細胞培養の過程を通じてバイオリアクタに加えられる特定成分の総量を指し、これは培養の開始時（０日目のＣＤＭ）で加えられた量及び順次加えられた成分の量を含む。成分の累積量を計算するときには、バイオリアクタでの産生前（すなわち、０日目のＣＤＭ前）にシードトレイン培養又は種菌に加えられる成分の量もまた含まれる。累積量は、培養中の経時的な成分の損失（例えば、代謝又は化学分解による）により影響を受けることはない。したがって、例えば、成分が異なる時期に２つの培養物に加えられる場合（例えば、ある培養物においてはそのすべての成分が最初に加えられ、別の培養物においては、成分が経時的に加えられる場合）、成分について同じ累積量を有する２つの培養物であったとしても、異なる絶対レベルを有する場合がある。累積量はまた、培養中に経時的に成分をその場で合成させることで（例えば、代謝又は化学的変換による）影響を受けることはない。したがって、例えば成分が、生物変換プロセスの途中、２つの培養物のうち一方の中でその場で合成される場合には、所与の成分の同じ累積量を有する２つの培養物であったとしても異なる絶対レベルを有する場合がある。累積量は、例えば成分のグラム又はモルといった単位で表すことができる。
本明細書にて使用される場合、用語「累積濃度」は、培養物中で使用される任意の種菌由来の開始体積への追加を含む、製造バッチの開始時にバイオリアクタ内の液体の体積で割った成分の累積量を指す。例えば、バイオリアクタが製造バッチの開始時に２リットルの細胞培養培地を含有し、１グラムの成分Ｘが、０日目、１日目、２日目、及び３日目に加えられる場合には、３日目以降の累積濃度は２ｇ／Ｌである（すなわち、４グラムを２リットルで割る）。仮に４日目に、成分Ｘを含有しない１リットルの追加の液体をバイオリアクタに加えても、累積濃度は２ｇ／Ｌのままである。仮に５日目に、いくらかの量の液体がバイオリアクタから失われる（例えば蒸発による）としても、累積濃度は２ｇ／Ｌのままである。累積濃度は例えば、グラム／リットル、又はモル／リットルといった単位で表され得る。
本明細書にて使用される場合、用語「製剤」は、１種以上の薬学的に許容されるビヒクルと共に製剤化される関心対象のタンパク質を指す。一態様において、関心対象のタンパク質はアフリベルセプト及び／又はＭｉｎｉＴｒａｐである。いくつかの例示的な実施形態において、製剤中の関心対象のタンパク質の量は、約０．０１ｍｇ／ｍＬ～約６００ｍｇ／ｍＬの範囲であり得る。いくつかの特定の実施形態において、製剤中の関心対象のタンパク質の量は、約０．０１ｍｇ／ｍＬ、約０．０２ｍｇ／ｍＬ、約０．０３ｍｇ／ｍＬ、約０．０４ｍｇ／ｍＬ、約０．０５ｍｇ／ｍＬ、約０．０６ｍｇ／ｍＬ、約０．０７ｍｇ／ｍＬ、約０．０８ｍｇ／ｍＬ、約０．０９ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ、約０．２ｍｇ／ｍＬ、約０．３ｍｇ／ｍＬ、約０．４ｍｇ／ｍＬ、約０．５ｍｇ／ｍＬ、約０．６ｍｇ／ｍＬ、約０．７ｍｇ／ｍＬ、約０．８ｍｇ／ｍＬ、約０．９ｍｇ／ｍＬ、約１ｍｇ／ｍＬ、約２ｍｇ／ｍＬ、約３ｍｇ／ｍＬ、約４ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬ、約６ｍｇ／ｍＬ、約７ｍｇ／ｍＬ、約８ｍｇ／ｍＬ、約９ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ、約１５ｍｇ／ｍＬ、約２０ｍｇ／ｍＬ、約２５ｍｇ／ｍＬ、約３０ｍｇ／ｍＬ、約３５ｍｇ／ｍＬ、約４０ｍｇ／ｍＬ、約４５ｍｇ／ｍＬ、約５０ｍｇ／ｍＬ、約５５ｍｇ／ｍＬ、約６０ｍｇ／ｍＬ、約６５ｍｇ／ｍＬ、約７０ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬ、約８０ｍｇ／ｍＬ、約８５ｍｇ／ｍＬ、約９０ｍｇ／ｍＬ、約１００ｍｇ／ｍＬ、約１１０ｍｇ／ｍＬ、約１２０ｍｇ／ｍＬ、約１３０ｍｇ／ｍＬ、約１４０ｍｇ／ｍＬ、約１５０ｍｇ／ｍＬ、約１６０ｍｇ／ｍＬ、約１７０ｍｇ／ｍＬ、約１８０ｍｇ／ｍＬ、約１９０ｍｇ／ｍＬ、約２００ｍｇ／ｍＬ、約２２５ｍｇ／ｍＬ、約２５０ｍｇ／ｍＬ、約２７５ｍｇ／ｍＬ、約３００ｍｇ／ｍＬ、約３２５ｍｇ／ｍＬ、約３５０ｍｇ／ｍＬ、約３７５ｍｇ／ｍＬ、約４００ｍｇ／ｍＬ、約４２５ｍｇ／ｍＬ、約４５０ｍｇ／ｍＬ、約４７５ｍｇ／ｍＬ、約５００ｍｇ／ｍＬ、約５２５ｍｇ／ｍＬ、約５５０ｍｇ／ｍＬ、約５７５ｍｇ／ｍＬ、又は約６００ｍｇ／ｍＬであり得る。いくつかの例示的な実施形態において、組成物のｐＨは約５．０超であり得る。例示的な一実施形態において、ｐＨは約５．０超、約５．５超、約６超、約６．５超、約７超、約７．５超、約８超、又は約８．５超であり得る。
本明細書にて使用される場合、用語「データベース」は、バイオインフォマティクスツールを指し、これは、（１つ以上の）データベース中、すべてのあり得る配列に対して解釈されていないＭＳ－ＭＳスペクトルを検索する可能性を提供するものである。このようなツールの非限定的な例としては、Ｍａｓｃｏｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍａｔｒｉｘｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ）、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｍｉｌｌ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈｅｍ．ａｇｉｌｅｎｔ．ｃｏｍ）、ＰＬＧＳ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗａｔｅｒｓ．ｃｏｍ）、ＰＥＡＫＳ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓｓｏｌｕｔｉｏｎｓ．ｃｏｍ）、Ｐｒｏｔｅｉｎｐｉｌｏｔ（ｈｔｔｐ：／／ｄｏｗｎｌｏａｄ．ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ／／ｐｒｏｔｅｉｎｐｉｌｏｔ）、Ｐｈｅｎｙｘ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｈｅｎｙｘ－ｍｓ．ｃｏｍ）、Ｓｏｒｃｅｒｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｇｅｎｒｅｓｅａｒｃｈ．ｃｏｍ）、ＯＭＳＳＡ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｕｂｃｈｅｍ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｏｍｓｓａ／）、Ｘ！Ｔａｎｄｅｍ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｈｅｇｐｍ．ｏｒｇ／ＴＡＮＤＥＭ／）、ＰｒｏｔｅｉｎＰｒｏｓｐｅｃｔｏｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ．ｕｃｓｆ．ｅｄｕ／ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ／ｍｓｈｏｍｅ．ｈｔｍ）、Ｂｙｏｎｉｃ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｔｅｉｎｍｅｔｒｉｃｓ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｂｙｏｎｉｃ）、又はＳｅｑｕｅｓｔ（ｈｔｔｐ：／／ｆｉｅｌｄｓ．ｓｃｒｉｐｐｓ．ｅｄｕ／ｓｅｑｕｅｓｔ）がある。
本明細書にて使用される場合、用語「限外ろ過」又は「ＵＦ」は、水を半透膜に強制的に通すために静水圧を使用する、逆浸透と類似の膜ろ過プロセスを含み得る。限外ろ過は、Ｌｅｏｓ Ｊ．Ｚｅｍａｎ＆Ａｎｄｒｅｗ Ｌ．Ｚｙｄｎｅｙ，Ｍｉｃｒｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（１９９６）に詳細に説明されており、その全体の教示が本明細書に組み入れられる。０．１μｍより小さい細孔径を有するフィルタを限外ろ過に使用することができる。こうした小さい細孔径を有するフィルタを使用することにより、タンパク質をフィルタの後ろに保持させつつ、フィルタを通して試料バッファを浸透させることで試料の体積を減少させることができる。
本明細書にて使用される場合、「透析ろ過」又は「ＤＦ」は、塩、糖、及び非水性溶媒を除去及び交換し、結合種から分離させ、低分子量材料を除去し、並びに／又はイオン環境及び／若しくはｐＨ環境の迅速な変化を引き起こすために、限外フィルタを使用する方法を含み得る。微小溶質は、限外ろ過速度とほぼ同等の速度で限外ろ過されている溶液に溶媒を加えることで最も効率的に除去される。こうすることで、微小種は一定量で溶液から洗浄される。本発明のある特定の例示的な実施形態において、透析ろ過工程を使用し、例えばクロマトグラフィー若しくは他の製造工程の前に本発明に関連して使用される様々なバッファを交換し、不純物をタンパク質調製物から除去することができる。本明細書にて使用される場合、用語「下流プロセス技術」は、タンパク質を産生する上流プロセス技術後に使用される１つ以上の技法を指す。下流プロセス技術には、例えばプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーと、ＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦ Ｒ）などその同族と相互作用可能であるＶＥＧＦなどの明確に定義された分子を有する固相を使用するアフィニティークロマトグラフィーとを含む、アフィニティークロマトグラフィー；陰イオン交換クロマトグラフィー又は陽イオンクロマトグラフィーなどのイオン交換クロマトグラフィー；疎水性相互作用クロマトグラフィー；又は置換クロマトグラフィーを使用する、例えばタンパク質産物の生成を含む。
語句「組換え宿主細胞」（又は単純に「宿主細胞」）は、関心対象のタンパク質をコードする組換え発現ベクターが導入される細胞を含む。こうした用語は、特定の対象の細胞だけでなく、こうした細胞の子孫もまた指すことを意図していることを理解されたい。ある特定の改変は、変異又は環境の影響のいずれかが原因で世代を継ぐ際に発生する可能性があることから、こうした子孫は実際のところは親細胞と同一ではない可能性があるが、これは本明細書にて使用される場合、用語「宿主細胞」の範囲内に依然として含まれる。一実施形態において、宿主細胞は生命の各界のいずれかから選択される原核細胞及び真核細胞を含む。一態様において、真核細胞は原生生物細胞、真菌細胞、植物細胞及び動物細胞を含む。更なる態様において、宿主細胞は植物細胞及び／又は動物細胞といった真核細胞を含む。細胞は哺乳動物細胞、魚類細胞、昆虫細胞、両生類細胞又は鳥類細胞であり得る。特定の態様において、宿主細胞は哺乳動物細胞である。培養での増殖に好適な様々な哺乳動物細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．）及び他の寄託機関、並びに商業的な供給業者から入手可能である。本発明のプロセスにて使用され得る細胞としては、ＭＫ２．７細胞；ＰＥＲ－Ｃ６細胞；例えばＣＨＯ－Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－６１）、ＤＧ４４（Ｃｈａｓｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｓｏｍ．ＣｅｌｌＭｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．，１２：５５５－５５６；Ｋｏｌｋｅｋａｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３６：１０９０１－１０９０９；及び国際公開第０１／９２３３７号Ａ２）、ジヒドロ葉酸還元酵素ネガティブＣＨＯ細胞（ＣＨＯ／－ＤＨＦＲ、Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ，１９８０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６）、及びｄｐ１２．ＣＨＯ細胞（米国特許第５，７２１，１２１号）などのチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）；サル腎細胞（ＣＶ１、ＡＴＣＣ ＣＣＬ－７０）；ＳＶ４０（ＣＯＳ細胞、ＣＯＳ－７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６５１）により形質転換されるサル腎臓ＣＶ１細胞；ＨＥＫ２９３細胞、及びＳｐ２／０細胞、５Ｌ８ハイブリドーマ細胞、Ｄａｕｄｉ細胞、ＥＬ４細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＬ－６０細胞、Ｋ５６２細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＴＨＰ－１細胞、Ｓｐ２／０細胞、初代上皮細胞（例えば、ケラチノサイト、子宮頸部上皮細胞、気管支上皮細胞、気管上皮細胞、腎臓上皮細胞及び網膜上皮細胞）、並びに樹立細胞株及びそれらの株細胞（例えば、ヒト胎児腎細胞（例えば、２９３細胞、又は懸濁培養で増殖するようにサブクローニングされた２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，１９７７，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，３６：５９）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ－１０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ、１９８０、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，２３：２４３－２５１）；ヒト子宮頸がん細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ－２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ－３４）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ－７５）；ヒト肝臓がん細胞（ＨＥＰ－Ｇ２、ＨＢ８０６５）；マウス乳がん細胞（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ－５１）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１４４２）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ，１９８２，Ａｎｎａｌｓ ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，３８３：４４－６８）；ＭＣＲ５細胞；ＦＳ４細胞；ＰＥＲ－Ｃ６網膜細胞、ＭＤＢＫ（ＮＢＬ－１）細胞、９１１細胞、ＣＲＦＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＢｅＷｏ細胞、Ｃｈａｎｇ細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５６２細胞、ＨｅＬａ２２９細胞、ＨｅＬａ Ｓ３細胞、Ｈｅｐ－２細胞、ＫＢ細胞、ＬＳ１８０細胞、ＬＳ１７４Ｔ細胞、ＮＣＩ－Ｈ－５４８細胞、ＲＰＭＩ２６５０細胞、ＳＷ－１３細胞、Ｔ２４細胞、ＷＩ－２８ＶＡ１３、２ＲＡ細胞、ＷＩＳＨ細胞、ＢＳ－Ｃ－Ｉ細胞、ＬＬＣ－ＭＫ２細胞、クローンＭ－３細胞、１－１０細胞、ＲＡＧ細胞、ＴＣＭＫ－１細胞、Ｙ－１細胞、ＬＬＣ－ＰＫ１細胞、ＰＫ（１５）細胞、ＧＨ１細胞、ＧＨ３細胞、Ｌ２細胞、ＬＬＣ－ＲＣ２５６細胞、ＭＨ１Ｃ１細胞、ＸＣ細胞、ＭＤＯＫ細胞、ＶＳＷ細胞、及びＴＨ－Ｉ、Ｂ１細胞、又はそれらの誘導体）、任意の組織又は器官からの線維芽細胞（心臓、肝臓、腎臓、結腸、腸、食道、胃、神経組織（脳、脊髄）、肺、血管組織（動脈、静脈、毛細血管）、リンパ組織（リンパ腺、咽頭扁桃、扁桃腺、骨髄及び血液）、脾臓及び線維芽細胞及び線維芽細胞様細胞株（例えば、ＴＲＧ－２細胞、ＩＭＲ－３３細胞、Ｄｏｎ細胞、ＧＨＫ－２１細胞、シトルリン血症細胞、Ｄｅｍｐｓｅｙ細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５５１細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５１０細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５２５細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５２９細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５３２細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５３９細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５４８細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５７３細胞、ＨＥＬ２９９細胞、ＩＭＲ－９０細胞、ＭＲＣ－５細胞、ＷＩ－３８細胞、ＷＩ－２６細胞、ＭｉＣｌ１細胞、ＣＶ－１細胞、ＣＯＳ－１細胞、ＣＯＳ－３細胞、ＣＯＳ－７細胞、アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ－７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８７；ＶＥＲＯ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ－８１）；ＤＢＳ－ＦｒｈＬ－２細胞、ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、Ｆ９細胞、ＳＶ－Ｔ２細胞、Ｍ－ＭＳＶ－ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、Ｋ－ＢＡＬＢ細胞、ＢＬＯ－１１細胞、ＮＯＲ－１０細胞、Ｃ３Ｈ／ＩＯＴＩ／２細胞、ＨＳＤＭ１Ｃ３細胞、ＫＬＮ２０５細胞、ＭｃＣｏｙ細胞、マウスＬ細胞、株２０７１（マウスＬ）細胞、Ｌ－Ｍ株（マウスＬ）細胞、Ｌ－ＭＴＫ（マウスＬ）細胞、ＮＣＴＣクローン２４７２及び２５５５、ＳＣＣ－ＰＳＡ１細胞、Ｓｗｉｓｓ／３Ｔ３細胞、インドキョン（Ｉｎｄｉａｎ ｍｕｎｔａｃ）細胞、ＳＩＲＣ細胞、ＣＩＩ細胞、及びＪｅｎｓｅｎ細胞、若しくはそれらの誘導体）細胞株を含むがこれらに限定されない）又は当業者に公知の任意の他の細胞タイプが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書にて使用される場合、用語「宿主細胞タンパク質」（ＨＣＰ）は、宿主細胞に由来するタンパク質を含み、所望の関心対象のタンパク質とは無関係であり得る。宿主細胞タンパク質は、製造プロセスに由来し得るプロセスに関連する不純物であり得、これは、細胞基質由来、細胞培養由来、及び下流由来の３つの主要なカテゴリを含み得る。細胞基質由来の不純物としては、宿主器官及び核酸（宿主細胞のゲノム、ベクター、又は全ＤＮＡ）由来のタンパク質が挙げられるがこれらに限定されない。細胞培養由来の不純物としては、誘導物質、抗菌薬、血清及び他の培地成分が挙げられるがこれらに限定されない。下流由来の不純物としては、酵素、化学処理試薬、及び生物学的処理試薬（例えば、臭化シアン、グアニジン、酸化剤及び還元剤）、無機塩（例えば、重金属、ヒ素、非金属イオン）、溶媒、担体、リガンド（例えば、モノクローナル抗体）、及び他の浸出可能な物質が挙げられるがこれらに限定されない。
いくつかの例示的な実施形態において、宿主細胞タンパク質は、約４．５～約９．０の範囲でｐＩを有し得る。例示的な実施形態において、ｐＩは、約４．５、約５．０、約５．５、約５．６、約５．７、約５．８、約５．９、約６．０、約６．１、約６．２、約６．３、約６．４、約６．５、約６．６、約６．７、約６．８、約６．９、約７．０、約７．１、約７．２、約７．３、約７．４、約７．５、約７．６、約７．７、約７．８、約７．９、約８．０、約８．１、約８．２、約８．３、約８．４、約８．５、約８．６、約８．７、約８．８、約８．９、又は約９．０であり得る。
本明細書にて使用される場合、用語「加水分解剤」は、タンパク質の消化を実施可能である多数の異なる薬剤のいずれか１つ又はその組合せを指す。酵素消化を実施可能である加水分解剤の非限定的な例としては、黒麹菌由来のプロテアーゼ、エラスターゼ、スブチリシン、プロテアーゼＸＩＩＩ、ペプシン、トリプシン、Ｔｒｙｐ－Ｎ、キモトリプシン、アスペルギロペプシンＩ、ＬｙｓＮプロテアーゼ（Ｌｙｓ－Ｎ）、ＬｙｓＣエンドプロテイナーゼ（Ｌｙｓ－Ｃ）、エンドプロテイナーゼＡｓｐ－Ｎ（Ａｓｐ－Ｎ）、エンドプロテイナーゼＡｒｇ－Ｃ（Ａｒｇ－Ｃ）、エンドプロテイナーゼＧｌｕ－Ｃ（Ｇｌｕ－Ｃ）又は外膜タンパク質Ｔ（ＯｍｐＴ）、化膿性連鎖球菌の免疫グロブリン分解酵素（ＩｄｅＳ）、サーモリシン、パパイン、プロナーゼ、Ｖ８プロテアーゼ、又は生物学的に活性である断片、又はそれらの相同体、又はこれらの組合せが挙げられる。非酵素的消化を実行することができる加水分解剤の非限定的な例としては、高温、マイクロ波、超音波、高圧、赤外線、溶媒（非限定的な例はエタノール及びアセトニトリル）、固定化酵素消化（ＩＭＥＲ）、磁性粒子固定化酵素、及びオンチップ固定化酵素の使用が挙げられる。タンパク質消化に利用可能な技術を述べている近年の総説としては、Ｓｗｉｔｚａｒ ｅｔ ａｌ．，「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ：Ａｎ Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ Ａｖａｉｌａｂｌｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ｒｅｃｅｎｔ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ」（Ｌｉｎｄａ Ｓｗｉｔｚａｒ，Ｍａｒｔｉｎ Ｇｉｅｒａ＆Ｗｉｌｆｒｉｅｄ Ｍ．Ａ．Ｎｉｅｓｓｅｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ：Ａｎ Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ Ａｖａｉｌａｂｌｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ｒｅｃｅｎｔ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ，１２ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １０６７－１０７７（２０１３）、その全体の教示が本明細書に組み入れられる）を参照されたい。加水分解剤の１つ又は組合せは、配列特異的な方法でタンパク質又はポリペプチドのペプチド結合を切断し、より短いペプチドの予測可能な収集物を生成することができる。タンパク質に対する加水分解剤の比率及び消化に必要とされる時間は、タンパク質の最適な消化を得るために適切に選択され得る。基質に対する酵素の比率が不適切に高い場合、それに対応して消化速度が速くなり、質量分析計でペプチドを分析する時間が十分な確保されず、配列網羅性が損なわれる可能性がある。一方で、Ｅ／Ｓ比が低いことで消化に長い時間が必要となり、これによりデータ取得時間が長くなる。酵素と基質の比は、約１：０．５～約１：２００の範囲であり得る。本明細書にて使用される場合、用語「消化」は、タンパク質の１つ以上のペプチド結合の加水分解を指す。適切な加水分解剤を使用して生物学的試料中のタンパク質の消化を実行するいくつかのアプローチが存在し、これは例えば、酵素消化又は非酵素的消化である。試料中のタンパク質の消化にとって広範に受け入れられている方法の１つは、プロテアーゼの使用に関与している。多くのプロテアーゼが利用可能であり、それらのそれぞれは特異性、効率及び最適な消化条件といった点で独自の特性を有している。プロテアーゼは、エンドペプチダーゼ及びエキソペプチダーゼの両方を指し、ペプチド内部の非末端又は末端アミノ酸で切断するというプロテアーゼの能力に基づいて分類される。代替的には、プロテアーゼはまた、触媒作用の機構に基づいて分類されるように、アスパラギン酸プロテアーゼ、グルタミンプロテアーゼ、及びメタロプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、及びスレオニンプロテアーゼといった６種類の異なるクラスを指す。用語「プロテアーゼ」及び「ペプチダーゼ」は、ペプチド結合を加水分解する酵素を指すために互換的に使用される。
用語「に伴い」は、抗ＡＮＧ２といった別の薬剤と共に、本発明の抗ＶＥＧＦ組成物といった成分を、同時送達用の単一組成物へと製剤化、又は２つ以上の組成物（例えば、各成分を含むキット）へと別々に製剤化することができることを示している。互いに伴って投与される成分は、他の成分を投与するとき以外の異なる時間に、対象へ投与することができる。例えば、各投与は所与の期間にわたり間隔をあけて非同時に（例えば、別々に又は順次）与えられ得る。互いに伴って投与される別個の成分はまた、同じ投与セッション中、本質的には同時に（例えば、正確に同じ時間で、又は非臨床的に有意な期間により分けられて）投与され得る。更には、互いに伴って投与される別個の成分は、同じ経路又は異なる経路により対象へ投与され得、例えば、アフリベルセプトの組成物は抗ＡＮＧ２といった別の薬剤と共に投与され、このアフリベルセプトの組成物は約１５％未満のそのバリアントを含む。
本明細書にて使用される場合、用語「液体クロマトグラフィー」は、流体により運搬される生物学的／化学的混合物を、静止流体相又は固相を通って（又はその中へ）流れながら、成分を差次的に分配した結果としての成分へと分離可能であるプロセスを指す。液体クロマトグラフィーの非限定的な例としては、逆相液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、又は混合モードクロマトグラフィーが挙げられる。
本明細書にて使用される場合、「アフィニティークロマトグラフィー」は、２つの物質を、クロマトグラフィー材料へのそれらの親和性に基づき分離する任意の方法を含む分離を含み得る。これは、好適なアフィニティークロマトグラフィーの媒体を含むカラムに物質を供することを含み得る。このようなクロマトグラフィー媒体の非限定的な例としては、プロテインＡ樹脂、プロテインＧ樹脂、それに対する結合分子（例えば抗体）を産生した抗原を含むアフィニティー支持体、関心対象のタンパク質に結合可能なタンパク質、及びＦｃ結合タンパク質を含むアフィニティー支持体が挙げられるが、これらに限定されない。一態様において、アフィニティーカラムは、試料の負荷前に好適なバッファで平衡化され得る。好適なバッファの一例は、トリス／ＮａＣｌバッファ（ｐＨはおよそ７．０～８．０）であり得る。当業者は過度の負担なく、好適なバッファを開発することができる。この平衡化の後、試料をカラムに負荷することができる。カラムの負荷後、カラムを例えば平衡化バッファを使用し、１回又は複数回洗浄することができる。異なるバッファを使用する洗浄を含む他の洗浄を、カラムを溶出する前に使用することができる。次いで、適切な溶出バッファを使用してアフィニティーカラムを溶出させることができる。好適な溶出バッファの一例は、酢酸／ＮａＣｌバッファ（ｐＨはおよそ２．０～３．５）であり得る。更に、当業者は過度の負担なく適切な溶出バッファを開発することができる。溶出液は、紫外線を含む当業者に周知の技術を使用してモニタリングされ、例えば、２８０ｎｍでの吸光度が、関心対象の試料が芳香環（例えば、トリプトファンなどの芳香族アミノ酸を有するタンパク質）を含む場合には特に使用可能である。
本明細書にて使用される場合、「イオン交換クロマトグラフィー」は、２つの物質を、関心対象の分子上及び／又はクロマトグラフィー材料上のいずれかで、関心対象の分子及び／又はクロマトグラフィー材料の特定領域上にまとめて又は局所的に、それらのそれぞれのイオン電荷における差異に基づいて分離する任意の方法を含む分離を指し得る。したがって、これは陽イオン交換材料又は陰イオン交換材料のいずれかを使用可能である。イオン交換クロマトグラフィーは、関心対象の分子の局所電荷とクロマトグラフィー材料の局所電荷との間の差異に基づき、分子を分離する。イオン交換クロマトグラフィーのパックドカラム又はイオン交換膜デバイスは、結合－溶出モード、フロースルーモード、又はハイブリッドモードで操作され得る。平衡化バッファ又は別のバッファを用いてカラム又は膜デバイスを洗浄した後、イオン交換マトリックスの荷電部位に対して溶質と競合する溶出バッファのイオン強度（すなわち伝導度）を増加させることにより、生成物の回収を行うことができる。ｐＨを変化させ、それにより溶質の電荷を変えることは、溶質の溶出を達成する別の方法であり得る。伝導度又はｐＨにおける変化は、段階的（グラジエント溶出）又は段階的（ステップ溶出）であってもよい。クロマトグラフィー用の陰イオン支持体又は陽イオン支持体を形成するために、陰イオン置換基又は陽イオン置換基をマトリックスへと結合させてもよい。陰イオン交換置換基の非限定的な例としては、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、第四級アミノエチル（ＱＡＥ）、及び第四級アミン（Ｑ）基が挙げられる。陽イオン置換基は、カルボキシメチル（ＣＭ）、スルホエチル（ＳＥ）、スルホプロピル（ＳＰ）、リン酸塩（Ｐ）、及びスルホン酸塩（Ｓ）を含む。セルロースイオン交換媒体又は支持体は、ＤＥ２３（商標）、ＤＥ３２（商標）、ＤＥ５２（商標）、ＣＭ－２３（商標）、ＣＭ－３２（商標）、及びＣＭ－５２（商標）を含むことができ、これらはＷｈａｔｍａｎ Ｌｔｄ．Ｍａｉｄｓｔｏｎｅ，Ｋｅｎｔ，Ｕ．Ｋ．から入手可能である。ＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標）ベースのイオン交換体及びＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標）架橋イオン交換体もまた公知である。例えば、ＤＥＡＥ－ＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標）、ＱＡＥ－ＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標）、ＣＭ－ＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標）、及びＳＰ－ＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標）、及びＤＥＡＥ－ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）、Ｑ－ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）、ＣＭ－ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）、Ｓ－ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）、及びＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、及びＣａｐｔｏ（商標）Ｓはすべて、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから入手可能である。更には、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（商標）ＤＥＡＥ－６５０Ｓ又はＭ、及びＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（商標）ＣＭ－６５０Ｓ又はＭといった、ＤＥＡＥ及びＣＭ誘導体化（ｄｅｒｉｖｉｔｉｚｅｄ）エチレングリコール－メタクリラートコポリマーの両方は、Ｔｏｓｏ Ｈａａｓ Ｃｏ．（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．）から、Ｎｕｖｉａ Ｓ及びＵＮＯＳｐｈｅｒｅ（商標）Ｓは、ＢｉｏＲａｄ，（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆ．）から、Ｅｓｈｍｕｎｏ（登録商標）ＳはＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（ＭＡ）から入手可能である。
本明細書にて使用される場合、用語「疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂」は、フェニル、オクチル、ブチル、又はその同等物で共有結合的に修飾され得る固相を含むことができる。疎水性相互作用クロマトグラフィーは、疎水性といった特性を使用し、分子を互いに分離させることができる。このタイプのクロマトグラフィーでは、フェニル、オクチル、ヘキシル、又はブチルといった疎水基がカラムの固定相を形成することができる。タンパク質、ペプチド、及びその同等物といった分子は、その表面上に１種以上の疎水性領域を有するか又は疎水性ポケットを有するＨＩＣ（疎水性相互作用クロマトグラフィー）カラムを通過し、ＨＩＣの固定相を構成する疎水基と相互作用することができる。ＨＩＣ樹脂又は支持体の例としては、Ｐｈｅｎｙｌ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、Ｃａｐｔｏ Ｐｈｅｎｙｌ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、Ｐｈｅｎｙｌ ６５０－Ｍ（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）及びＳａｒｔｏｂｉｎｄ Ｐｈｅｎｙｌ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ）が挙げられる。
本明細書にて使用される場合、用語「混合モードのクロマトグラフィー」又は「マルチモーダルクロマトグラフィー」（両方とも「ＭＭＣ」）には、複数の相互作用モード又は機構を通じて溶質が固定相と相互作用するクロマトグラフィー方法が含まれる。ＭＭＣは、従来の逆相（ＲＰ）クロマトグラフィー、イオン交換（ＩＥＸ）クロマトグラフィー、及び順相（ＮＰ）クロマトグラフィーの代替ツール又は補完ツールとして使用され得る。疎水性相互作用、親水性相互作用、及びイオン性相互作用のそれぞれが支配的な相互作用モードである、ＲＰ、ＮＰ、及びＩＥＸクロマトグラフィーとは異なり、混合モードのクロマトグラフィーは、これらの相互作用モードのうち２つ以上の組合せを使用することができる。混合モードのクロマトグラフィー媒体は、単一モードのクロマトグラフィーが再現できない、独自の選択性を提供することができる。混合モードのクロマトグラフィーはまた、アフィニティーベースの方法と比較すると、潜在的なコスト削減、カラム寿命の長期化、及び操作の柔軟性も提供することができる。いくつかの例示的な実施形態において、混合モードのクロマトグラフィー媒体は、時にベースマトリックスと表示され、直接又はスペーサを介して有機支持体又は無機支持体に結合される、混合モードの配位子から構成され得る。支持体は、本質的には球形粒子といった粒子、モノリス、フィルタ、膜、表面、キャピラリーなどの形態であってもよい。いくつかの例示的な実施形態において、支持体は、架橋された炭水化物材料といった天然ポリマーから調製され得る。例えばこれは、アガロース、ａｇＰＶ、セルロース、デキストラン、キトサン、コンニャク、カラギーナン、ゲラン、アルギナートなどである。高い吸着能力を得るには、支持体は多孔質であり得、次いで配位子は外面及び細孔表面に結合される。このような天然ポリマー支持体は、標準的な方法、例えば逆懸濁ゲル化（Ｓ Ｈｊｅｒｔｅｎ：Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ７９（２），３９３－３９８（１９６４）、その全体の教示が本明細書に組み入れられる）に従い調製され得る。代替的には、支持体は架橋された合成ポリマーなどの合成ポリマー、例えば、スチレン又はスチレン誘導体、ジビニルベンゼン、アクリルアミド、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル、ビニルエステル、ビニルアミド、及びそれらの同等物から調製され得る。このような合成ポリマーは、標準的な方法、例えば「Ｓｔｙｒｅｎｅ ｂａｓｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒ ｓｕｐｐｏｒｔｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｂｙ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ」（Ｒ Ａｒｓｈａｄｙ：Ｃｈｉｍｉｃａ ｅ Ｌ’Ｉｎｄｕｓｔｒｉａ ７０（９），７０－７５（１９８８）、その全体の教示が本明細書に組み入れられる）に従い調製され得る。多孔質天然又は合成ポリマー支持体はまた、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）といった製造元からも入手可能である。
本明細書にて使用される場合、用語「質量分析計」は、特異的な分子種を同定しかつそれらの正確な質量を測定することができる装置を含む。この用語は、その中でポリペプチド又はペプチドを特徴付けられ得る任意の分子検出器を含むことを意味する。質量分析計には３つの主要部分である、イオン源、質量分析器、及び検出器が含まれ得る。イオン源の役割は、気相のイオンを作り出すことである。分析物の原子、分子、又はクラスタを気相へと移行させ、同時に（エレクトロスプレーイオン化法にて）又は分離プロセスを通じてのいずれかでイオン化させることができる。イオン源の選択は用途に応じて異なる。いくつかの例示的な実施形態において、質量分析計はタンデム質量分析計であり得る。本明細書にて使用される場合、用語「タンデム質量分析法」は、質量選択及び質量分離といった複数の段階を使用することにより試料分子上の構造情報を得る技術を含む。必要条件としては、試料分子を気相へと移行させこれをイオン化することで、最初の質量選択工程後に予測可能かつ制御可能な方法でフラグメントを形成することである。多段階ＭＳ／ＭＳ又はＭＳｎは、最初にプリカーサイオン（ＭＳ２）を選択及び分離し、これをフラグメンテーションして第１フラグメントイオン（ＭＳ３）を分離し、これをフラグメンテーションして第２フラグメント（ＭＳ４）を分離するなどによって、重要な情報を得ることができるか又はフラグメントイオン信号が検出可能である限り、実施される。タンデムＭＳは、多くの種類の分析器を組み合わせて首尾よく実施される。特定のアプリケーション向けにどの分析器を組み合わせるかは、多くの異なる要因、例えば感度、選択性、及び速さだけでなく、サイズ、コスト、及び有効性などにもよって、決定される。タンデムＭＳ法の主要な２つのカテゴリは、空間的タンデム及び時間的タンデムであるが、時間的タンデム分析器を空間的に連結させた、又は空間的タンデム分析器と連結させたハイブリッドもまた存在する。空間的タンデム質量分析計は、イオン源、プリカーサイオン活性化装置、及び少なくとも２つの非トラップ型質量分析器を備える。特定のｍ／ｚによる分離機能は、機器の１セクションにてイオンを選択して中間領域でこれを解離させ、生成イオンを次いでｍ／ｚによる分離及びデータ取得のために別の分析器に送るように設計され得る。時間的タンデムでは、イオン源で生成された質量分析計イオンは、同じ物理装置内に閉じ込められ、単離され、フラグメンテーションされ、かつｍ／ｚで分離され得る。質量分析計により同定されたペプチドは、無処置のタンパク質及びそれらの翻訳後修飾の代用の代表物として使用され得る。これらは、実験的及び理論的ＭＳ／ＭＳデータ（後者は、タンパク質配列データベース中の可能性があるペプチドから生成される）を相関させることによりタンパク質特性評価のために使用され得る。特性評価としては、タンパク質断片のアミノ酸のシークエンシング、タンパク質シークエンシングの決定、タンパク質のｄｅ ｎｏｖｏシークエンシングの決定、翻訳後修飾の位置決定、又は翻訳後修飾の同定、又は比較分析、又はこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書にて使用される場合、「Ｍｉｎｉ－Ｔｒａｐ」又は「ＭｉｎｉＴｒａｐ」又は「ＭｉｎｉＴｒａｐ結合分子」は、ＶＥＧＦ分子に結合可能である。このようなＭｉｎｉＴｒａｐとしては、（ｉ）キメラポリペプチド、及び（ｉｉ）非共有結合的に、例えば１つ以上のジスルフィド架橋により結合される２つ以上のポリペプチドを含む多量体（例えば二量体）分子が挙げられ得る。ＭｉｎｉＴｒａｐは、化学修飾、酵素活性、又は組換え製造により産生され得る。
本明細書にて使用される場合、「ＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐ」又は「ＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐ結合分子」は、ＶＥＧＦに結合する分子又は分子の複合体であり得、これはＶＥＧＦ受容体であるＩｇ様ドメイン（又はそれらのバリアント）（例えば、ＶＥＧＦＲ１ Ｉｇドメイン２及び／又はＶＥＧＦＲ２ Ｉｇドメイン３及び／４）及び改変された多量体化成分（ＭＣ）の１つ以上のセットを有するか、又はこの改変された多量体化成分を含まず、このＭＣは改変された免疫グロブリンＦｃである。この改変は、ＶＥＧＦ ｔｒａｐ（例えばアフリベルセプト又はコンベルセプト）のタンパク質分解性消化の結果、又は短縮されたＭＣ配列を有する得られたポリペプチド鎖の直接発現の結果であり得る。（図１に示される分子構造を参照されたい。）図１は、化膿性連鎖球菌ＩｄｅＳでアフリベルセプトをタンパク質分解した産物である、ＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐ分子を示している。ホモ二量体分子は、２つの平行なジスルフィド結合により接続されるＩｇヒンジドメイン断片を有するものとして示されている。ＶＥＧＦＲ１ドメイン、ＶＥＧＦＲ２ドメイン、及びヒンジドメイン断片（ＭＣ）を示している。ＩｄｅＳ切断が生じるアフリベルセプト中の点は、「／／」で示されている。アフリベルセプトから切断されたＦｃ断片もまた示されている。二量体化されていないこうした単一のキメラポリペプチドはまた、これがＶＥＧＦ結合活性を有する場合にはＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐであり得る。用語「ＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐ」は、１つ以上のＶＥＧＦ受容体Ｉｇドメイン（又はそれらのバリアント）の第１のセットを含む単一のポリペプチドを含み、ＭＣを欠いているが、１つ以上のＶＥＧＦ受容体Ｉｇドメイン（又はそれらのバリアント）の１つ以上の更なるセットに対するリンカー（例えばペプチドリンカー）と融合される。本発明のＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐ中のＶＥＧＦ結合ドメインは、同一であってもよく、又は別のものとは異なっていてもよい（その全体の教示が本明細書に組み入れられる、国際公開第２００５／００８９５号を参照されたい）。
例えば、本発明の一実施形態において、未修飾免疫グロブリンＦｃドメインは、アミノ酸配列又はそれらのアミノ酸１～２２６を含む：
（配列番号３３、この中でＸ１はＬ又はＰであり、Ｘ２はＡ又はＴである）。
ＶＥＧＦの阻害としては、例えばＶＥＧＦ（例えば、ＶＥＧＦ１１０、ＶＥＧＦ１２１、及び／又はＶＥＧＦ１６５）結合に対するＶＥＧＦ受容体と競合することによる、例えばＶＥＧＦ受容体に結合するＶＥＧＦの拮抗作用が挙げられる。こうした阻害により、例えば、細胞表面上のＩＬ１８Ｒα及び／又はＩＬ１８Ｒβ細胞内ドメインに融合するＶＥＧＦＲ細胞外ドメインを有しかつＮＦｋＢ－ルシフェラーゼ－ＩＲＥＳ－ｅＧＦＰレポーター遺伝子、例えば本明細書に記載されるような細胞株ＨＥＫ２９３／Ｄ９／Ｆｌｔ－ＩＬ１８Ｒα／Ｆｌｔ－ＩＬ１８Ｒβを有するキメラＶＥＧＦ受容体（例えば、それらのホモ二量体）を発現している細胞株（例えばＨＥＫ２９３）においてルシフェラーゼ発現が阻害されるなど、ＶＥＧＦＲのＶＥＧＦによる活性化が阻害され得る。
本発明のＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐのＶＥＧＦ受容体Ｉｇドメイン成分は、
（ｉ）１つ以上のＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ１）の免疫グロブリン様（Ｉｇ）ドメイン２（Ｒ１Ｄ２）、
（ｉｉ）１つ以上のＶＥＧＦＲ２（Ｆｌｋ１又はＫＤＲ）のＩｇドメイン３（Ｆｌｋ１Ｄ３）（Ｒ２Ｄ３）、
（ｉｉｉ）１つ以上のＶＥＧＦＲ２（Ｆｌｔ１又はＫＤＲ）のＩｇドメイン４（Ｆｌｋ１Ｄ４）（Ｒ２Ｄ４）、及び／又は
（ｉｖ）１つ以上のＶＥＧＦＲ３（Ｆｌｔ４）のＩｇドメイン３（ＦｌｔＤ３又はＲ３Ｄ３）
を含むことができる。
ＶＥＧＦ受容体の免疫グロブリン様ドメインは、本明細書ではＶＥＧＦＲ「Ｉｇ」ドメインと称され得る。例えば、Ｒ１Ｄ２（ＶＥＧＦＲ１（ｄ２）と本明細書では称され得る））、Ｒ２Ｄ３（ＶＥＧＦＲ２（ｄ３）と本明細書では称され得る））、Ｒ２Ｄ４（ＶＥＧＦＲ２（ｄ４）と本明細書では称され得る））及びＲ３Ｄ３（ＶＥＧＦＲ３（ｄ３）と本明細書では称され得る））といった本明細書にて参照されるＶＥＧＦＲ Ｉｇドメインは、完全な野生型Ｉｇドメインだけでなく、例えばＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐへ組み入れられるときには機能ＶＥＧＦ結合ドメインを形成する能力を保持する、野生型ドメインの機能特性を実質的に保持するそれらのバリアントも包含するように意図されている。野生型ドメインと同様の機能特性を実質的に保持する上記Ｉｇドメインの多数のバリアントを得ることができることは、当業者には容易に明らかであるであろう。
本発明は、以下のドメイン構造を含むＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐポリペプチドを提供する：
・（（Ｒ１Ｄ２）－（Ｒ２Ｄ３））ａ－リンカー－（（Ｒ１Ｄ２）－（Ｒ２Ｄ３））ｂ；
・（（Ｒ１Ｄ２）－（Ｒ２Ｄ３）－（Ｒ２Ｄ４））ｃ－リンカー－（（Ｒ１Ｄ２）－（Ｒ２Ｄ３）－（Ｒ２Ｄ４））ｄ；
・（（Ｒ１Ｄ２）－（Ｒ２Ｄ３））ｅ－（ＭＣ）ｇ；
・（（Ｒ１Ｄ２）－（Ｒ２Ｄ３）－（Ｒ２Ｄ４））ｆ－（ＭＣ）ｇ；
式中、
－ Ｒ１Ｄ２は、ＶＥＧＦ受容体１（ＶＥＧＦＲ１）Ｉｇドメイン２（Ｄ２）であり；
－ Ｒ２Ｄ３は、ＶＥＧＦＲ２ Ｉｇドメイン３であり；
－ Ｒ２Ｄ４は、ＶＥＧＦＲ２ Ｉｇドメイン４であり；
－ ＭＣは多量体化成分（例えばＩｇＧ１に由来する、例えばＩｇＧヒンジドメイン又はそれらの断片）であり；
－ リンカーは、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又は１６アミノ酸を含むペプチドであり、例えば（ＧＧＧＳ）ｇ（配列番号１０４）であり；
並びに、
独立して、
ａ＝１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５；
ｂ＝１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５；
ｃ＝１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５；
ｄ＝１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５；
ｅ＝１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５；
ｆ＝１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５；及び
ｇ＝１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５。
本発明の一実施形態において、Ｒ１Ｄ２は、アミノ酸配列：
（配列番号３４）を含む。一態様において、Ｒ１Ｄ２はＮ末端ＳＤＴを欠いている。
本発明の一実施形態において、Ｒ１Ｄ２は、アミノ酸配列：
（配列番号３５）を含む。
本発明の一実施形態において、Ｒ２Ｄ３は、アミノ酸配列：
（配列番号３６）を含む。
本発明の一実施形態において、Ｒ２Ｄ４は、アミノ酸配列：
（配列番号３７）を含む。
本発明の一実施形態において、Ｒ２Ｄ４は、アミノ酸配列：
（配列番号３８）を含む。
本発明の一実施形態において、ＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐにて使用するための多量体化成分（ＭＣ）はペプチドであり、例えば別の多量体化成分に結合可能である改変されたＦｃ免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ１由来）である。一態様において、ＭＣは免疫グロブリンヒンジ領域を含む、改変されたＦｃ免疫グロブリンである。例えば、本発明の一実施形態において、ＭＣは別のＭＣ中のシステインを有する１つ以上のシステイン架橋を形成可能である、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５又は６）のシステインを含むペプチドであり、例えば、ＤＫＴＨＴＣＰＰＣ（配列番号３９）、ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＰＣ（配列番号４０）、ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＰＣＰＰＣ（配列番号４１）、ＤＫＴＨＴＣ（ＰＰＣ）ｈ（式中、ｈは１、２、３、４、又は５）（配列番号１０５）、ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧ（配列番号６０）、ＤＫＴＨＴＣＰＬＣＰＡＰＥＬＬＧ（配列番号．：４３）、ＤＫＴＨＴＣ（配列番号４４）、又はＤＫＴＨＴＣＰＬＣＰＡＰ（配列番号４５）である。
本発明はまた、以下のドメイン構造を含むＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐポリペプチドも提供する：
（ｉ）（Ｒ１Ｄ２）ａ－（Ｒ２Ｄ３）ｂ－（ＭＣ）ｃ；又は
（ｉｉ）（Ｒ１Ｄ２）ａ－（Ｒ２Ｄ３）ｂ－（Ｒ２Ｄ４）ｃ－（ＭＣ）ｄ；
これらは、例えば各ポリペプチドのＭＣ間で結合することにより、当該第２のポリペプチドとホモ二量体化することができる。
この場合、
（ｉ）当該Ｒ１Ｄ２ドメイン同士が整列して、
（ｉｉ）当該Ｒ２Ｄ３ドメイン同士が整列して、及び／又は
（ｉｉｉ）当該Ｒ２Ｄ４ドメイン同士が整列して、
二量体ＶＥＧＦ結合ドメインを形成する。
本発明の一実施形態において、ＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐポリペプチドは、アミノ酸配列：
を含む。述べられるように、こうしたポリペプチドは多量体化されることができ（例えば、二量体化（例えば、ホモ二量体化））、この場合、ポリペプチド間の結合は多量体化成分を介して媒介される。
本発明の一実施形態において、本発明の単量体ＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐのＶＥＧＦＲ１ Ｉｇ様ドメイン２は、Ｎ３６及び／若しくはＮ６８にＮ－結合グリコシル化；及び／若しくはＣ３０とＣ７９の間の鎖内ジスルフィド架橋を有し；並びに／又は本発明の単量体ＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐのＶＥＧＦＲ２ Ｉｇ様ドメイン３は、Ｎ１２３及び／若しくはＮ１９６にＮ－結合グリコシル化；及び／若しくはＣ１２４とＣ１８５の間の鎖内ジスルフィド架橋を有する。
本発明の一実施形態において、ＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐは構造：
・（Ｒ１Ｄ２）１－（Ｒ２Ｄ３）１－（Ｇ４Ｓ）３－（Ｒ１Ｄ２）１－（Ｒ２Ｄ３）１（「（Ｇ４Ｓ）３」：配列番号１０７として開示される）；
・（Ｒ１Ｄ２）１－（Ｒ２Ｄ３）１－（Ｇ４Ｓ）６－（Ｒ１Ｄ２）１－（Ｒ２Ｄ３）１（「（Ｇ４Ｓ）６」：配列番号１０８として開示される）；
・（Ｒ１Ｄ２）１－（Ｒ２Ｄ３）１－（Ｇ４Ｓ）９－（Ｒ１Ｄ２）１－（Ｒ２Ｄ３）１（「（Ｇ４Ｓ）９」：配列番号１０９として開示される）；又は
・（Ｒ１Ｄ２）１－（Ｒ２Ｄ３）１－（Ｇ４Ｓ）１２－（Ｒ１Ｄ２）１－（Ｒ２Ｄ３）１（「（Ｇ４Ｓ）１２」：配列番号１１０として開示される）
を含む。Ｇ４Ｓは、－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－（配列番号１１１）である。
本発明の一実施形態において、ＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐはアミノ酸配列：
（この場合、ｘは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５である）を含む。本明細書にて述べられるように、これらのポリペプチドは二次構造を含むことができ、この場合、同様のＶＥＧＥＲ Ｉｇドメインは鎖内ＶＥＧＦ結合ドメインを形成するように結合する（例えば、図２）。本発明の一実施形態において、こうしたポリペプチドの２つ以上は多量体化し（例えば、二量体化（例えば、ホモ二量体化））し、この場合、各鎖のＶＥＧＦＲ Ｉｇドメインは、鎖内ＶＥＧＦ結合ドメインを形成するために別の鎖の同様のＩｇドメインと結合する。
本発明のある特定の実施形態において、本発明のＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐは、ＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐポリペプチドのアミノ酸残基の任意の有意な修飾（例えばＮ末端及び／又はＣ末端での、例えばＰＥＧ化又はヨードアセトアミド化といった指向性の化学修飾）を欠いている。
本発明の一実施形態において、ポリペプチドは二次構造を含み、この場合、単一のキメラポリペプチド（例えば、（Ｒ１Ｄ２）ａ－（Ｒ２Ｄ３）ｂ－リンカー－（Ｒ１Ｄ２）ｃ－（Ｒ２Ｄ３）ｄ；又は（Ｒ１Ｄ２）ａ－（Ｒ２Ｄ３）ｂ－（Ｒ２Ｄ４）ｃ－リンカー－（Ｒ１Ｄ２）ｄ－（Ｒ２Ｄ３）ｅ－（Ｒ２Ｄ４）ｆ）又は別個のキメラポリペプチド（例えばホモ二量体）中の同様のＶＥＧＦＲ Ｉｇドメインは、ＶＥＧＦ結合ドメインを形成するために整列する。例えばこの場合、
（ｉ）当該Ｒ１Ｄ２ドメイン同士が整列して、
（ｉｉ）当該Ｒ２Ｄ３ドメイン同士が整列して、及び／又は
（ｉｉｉ）当該Ｒ２Ｄ４ドメイン同士が整列して、
ＶＥＧＦ結合ドメインを形成する。図２は、そのようなドメイン配置を示す一本鎖ＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐを示す。ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、及びリンカードメインが示される。示されるリンカーは（Ｇ４Ｓ）６（配列番号１０８）である。本発明は、（Ｇ４Ｓ）３（配列番号１０７）；（Ｇ４Ｓ）９（配列番号１０９）；又は（Ｇ４Ｓ）１２（配列番号１１０）リンカーを有する一本鎖ＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐを含む。
加えて、本発明はまた、ＶＥＧＦポリペプチド又はその断片又はその融合物と複合体を形成する、本明細書にて述べられるＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐを含む複合体も提供する。本発明の一実施形態において、ＶＥＧＦ（例えば、ＶＥＧＦ１６５）はホモ二量体化され、及び／又はＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐは２：２複合体（２ＶＥＧＦ：２ＭｉｎｉＴｒａｐ）でホモ二量体化され、及び／又はＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐは１：１複合体でホモ二量体化される。複合体としては、ホモ二量体化されたＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐポリペプチドに結合されるホモ二量体化ＶＥＧＦ分子が挙げられる。本発明の一実施形態において、複合体はインビトロである（例えば、固体基質に固定化）、又は対象の身体内に存在する。本発明はまた、ＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐで複合体を形成したＶＥＧＦ二量体（例えば、ＶＥＧＦ１６５）の複合体の組成物も含む。
本明細書にて使用される場合、用語「タンパク質」又は「関心対象のタンパク質」としては、共有結合されたアミド結合を有する、任意のアミノ酸ポリマーが挙げられ得る。関心対象のタンパク質の例としては、アフリベルセプト及びＭｉｎｉＴｒａｐが挙げられるがこれらに限定されない。タンパク質は、当技術分野にて一般には「ポリペプチド」として公知である１種以上のアミノ酸ポリマー鎖を含む。「ポリペプチド」は、アミノ酸残基から構成されるポリマー、関連する天然に存在する構造バリアント、及びペプチド結合を介して結合される天然に存在しないそれらの合成アナログ、関連する天然に存在する構造バリアント、及び天然に存在しないそれらの合成アナログを指す。「合成ペプチド又はポリペプチド」は、天然に存在しないペプチド又はポリペプチドを指す。合成ペプチド又はポリペプチドは、例えば自動ポリペプチドシンセサイザーを使用して合成され得る。様々な固相ペプチド合成法が当業者に知られている。タンパク質は１種又は複数種のポリペプチドを含み、単一の機能性生体分子を形成することができる。別の例示的な態様では、タンパク質には抗体断片、ナノボディ、組換え抗体キメラ、サイトカイン、ケモカイン、ペプチドホルモン、及びそれらの同等物が含まれ得る。関心対象のタンパク質には、バイオ治療タンパク質、研究又は治療に使用される組換えタンパク質、トラップタンパク質及び他のキメラ受容体Ｆｃ融合タンパク質、キメラタンパク質、抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、及び二重特異性抗体のいずれかが含まれ得る。特定の態様において、関心対象のタンパク質は抗ＶＥＧＦ融合タンパク質（例えば、アフリベルセプト又はＭｉｎｉＴｒａｐ）である。タンパク質は、例えば昆虫バキュロウイルス（ｂａｃｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）系、酵母系（例えば、ピキア種（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．））、哺乳動物系（例えば、ＣＨＯ細胞及びＣＨＯ－Ｋ１細胞などのＣＨＯ誘導体）といった組換え細胞ベースの産生システムを使用して産生され得る。バイオ治療タンパク質及びそれらの産生について述べた近年の総説としては、Ｇｈａｄｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｐｌａｔｆｏｒｍｓ ｆｏｒ ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ，ｉｍｐａｃｔ，ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｏｆ ｎｏｎ－ｈｕｍａｎ ｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎ」（Ｄａｒｉｕｓ Ｇｈａｄｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｐｌａｔｆｏｒｍｓ ｆｏｒ ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ，ｉｍｐａｃｔ，ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｏｆ ｎｏｎ－ｈｕｍａｎ ｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎ，２８ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＧＥＮＥＴＩＣ ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ ＲＥＶＩＥＷＳ １４７－１７６（２０１２）、その全体の教示が本明細書に組み入れられる）を参照されたい。いくつかの例示的な実施形態において、タンパク質は修飾物、付加物、及び他の共有結合された部分を含む。こうした修飾、付加物、及び部分としては例えば、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、グリカン（例えば、Ｎ－アセチルガラクトサミン、ガラクトース、ノイラミン酸、Ｎ－アセチルグルコサミン、フコース、マンノース、及び他の単糖類）、ＰＥＧ、ポリヒスチジン、ＦＬＡＧタグ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）ｍｙｃ－エピトープ、蛍光標識、及び他の色素、及びそれらの同等物が挙げられる。タンパク質は、組成及び溶解度に基づいて分類可能であり、したがって、タンパク質としては、球状タンパク質及び繊維状タンパク質といった単純タンパク質、核タンパク質、糖タンパク質、ムコタンパク質、色素タンパク質、リンタンパク質、金属タンパク質、及びリポタンパク質といった複合タンパク質、並びに一次誘導タンパク質及び二次誘導タンパク質といった誘導タンパク質が挙げられる。
いくつかの例示的な実施形態において、関心対象のタンパク質は組換えタンパク質、抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、抗体断片、モノクローナル抗体、融合タンパク質、ｓｃＦｖ、及びこれらの組合せであり得る。
本明細書にて使用される場合、用語「組換えタンパク質」は、好適な宿主細胞へと組み入れられる組換え発現ベクターにて運ばれる遺伝子の転写及び翻訳の結果として産生されるタンパク質を指す。特定の例示的な実施形態において、組換えタンパク質は融合タンパク質であり得る。特定の態様において、組換えタンパク質は抗ＶＥＧＦ融合タンパク質（例えば、アフリベルセプト又はＭｉｎｉＴｒａｐ）である。特定の例示的な実施形態において、組換えタンパク質は、例えばキメラ抗体、ヒト化抗体、又は完全ヒト抗体といった抗体であり得る。特定の例示的な実施形態において、組換えタンパク質は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、又はＩｇＥからなる群から選択されるアイソタイプの抗体であり得る。特定の例示的な実施形態において、抗体分子は全長抗体（例えばＩｇＧ１）、又は代替的には抗体は断片（例えば、Ｆｃ断片又はＦａｂ断片）であり得る。
本明細書にて使用される場合、用語「抗体」は、４つのポリペプチド鎖（ジスルフィド結合により相互接続される２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖）を含む免疫グロブリン分子、並びにそれらの多量体（例えばＩｇＭ）を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲ又はＶＨと略される）及び重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３といった３つのドメインを含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲ又はＶＬと略される）及び軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は１つのドメイン（ＣＬ１）を含む。ＶＨ領域及びＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域へと更に細分され、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存されている領域に点在している。各ＶＨ及びＶＬは、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成され、アミノ末端からカルボキシル末端までＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４の順で配列される。本発明の異なる実施形態において、抗ｂｉｇ－ＥＴ－１抗体のＦＲ（又はその抗原結合部分）は、ヒト生殖系列配列と同一であり得、又は自然に若しくは人工的に改変され得る。アミノ酸コンセンサス配列は、２つ以上のＣＤＲのサイドバイサイド分析に基づいて定義され得る。本明細書にて使用される場合、用語「抗体」はまた、完全抗体分子の抗原結合断片も含む。本明細書にて使用される場合、抗体の用語「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合断片」、及びそれらの同等物は、抗原に特異的に結合して複合体を形成する、任意の天然に存在するポリペプチド又は糖タンパク質、酵素的に得ることができるポリペプチド又は糖タンパク質、合成ポリペプチド又は糖タンパク質、あるいは遺伝子的に改変されたポリペプチド又は糖タンパク質を含む。抗体の抗原結合断片は、例えばタンパク質分解性消化又は可変ドメイン及び任意で定常ドメインをコードするＤＮＡの操作及び発現に関与する組換え遺伝子改変技術といった、任意の好適な標準技術を使用し、完全抗体分子から誘導され得る。このようなＤＮＡは公知であり、及び／又は例えば製造元、ＤＮＡライブラリ（例えば、ファージ－抗体ライブラリを含む）から容易に入手可能であり、又は合成することができる。ＤＮＡは、例えば、１つ以上の可変ドメイン及び／若しくは定常ドメインを好適な構成へと配置させるため、又はコドンを導入し、システイン残基を生成し、アミノ酸を修飾、添加、若しくは欠失させるために、化学的に又は分子生物学的技術を使用することで、配列決定及び操作され得る。
本明細書にて使用される場合、「抗体断片」としては、例えば抗体の抗原結合領域又は可変領域といった無処置抗体の一部が挙げられる。抗体断片の例としては、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ断片、Ｆｖ断片、ｄｓＦｖ二重特異性抗体、ｄＡｂ断片、Ｆｄ’断片、Ｆｄ断片、及び単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）領域、並びにトリアボディ、テトラボディ、線形抗体、一本鎖抗体分子、及び抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。Ｆｖ断片は、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の可変領域の組合せであり、ｓｃＦｖタンパク質は、免疫グロブリン軽鎖可変領域及び重鎖可変領域がペプチドリンカーにより接続されている組換え一本鎖ポリペプチド分子である。いくつかの例示的な実施形態において、抗体断片は、親抗体が結合するのと同じ抗原に結合する断片である親抗体の十分なアミノ酸配列を含み、いくつかの例示的な実施形態において、断片は親抗体と同等の親和性で抗原に結合し、抗原への結合について親抗体と競合する。抗体断片は、任意の手段により産生され得る。例えば、抗体断片は無処置抗体の断片化により酵素的若しくは化学的に産生され得、及び／又は部分的な抗体配列をコードする遺伝子から組換え産生され得る。代替的に又は加えて、抗体断片は全体的に又は部分的に合成によって産生され得る。抗体断片は、任意で一本鎖抗体断片を含み得る。代替的に又は加えて、抗体断片は、例えばジスルフィド結合により共に結合されている複数の鎖を含み得る。抗体断片は、任意で複数分子の複合体を含み得る。機能的抗体断片は典型的には少なくとも約５０アミノ酸、より典型的には少なくとも約２００アミノ酸を含む。
用語「二重特異性抗体」は、２つ以上のエピトープを選択的に結合可能である抗体を含む。二重特異性抗体は一般には、２つの異なる分子（例えば複数の抗原）又は同じ分子（例えば同じ抗原）のいずれかの上で、異なるエピトープに特異的に結合する各重鎖を有する２つの異なる重鎖を含む。二重特異性抗体が２つの異なるエピトープ（第１エピトープ及び第２エピトープ）に選択的に結合可能である場合、第１エピトープの第１重鎖の親和性は、一般には、第２エピトープの第１重鎖の親和性よりも少なくとも１～２桁又は１～３桁又は１～４桁低くなることがあり、またこの逆もあり得る。二重特異性抗体により認識されるエピトープは、同じ標的又は異なる標的（例えば、同じタンパク質又は異なるタンパク質）上であり得る。二重特異性抗体は例えば、同じ抗原の異なるエピトープを認識する重鎖を組み合わせることにより作製され得る。例えば、同じ抗原の異なるエピトープを認識する重鎖可変配列をコードする核酸配列は、異なる重鎖定常領域をコードする核酸配列に融合され得、こうした配列は、免疫グロブリン軽鎖を発現する細胞内で発現され得る。
典型的な二重特異性抗体は、３つの重鎖ＣＤＲをそれぞれ有する２つの重鎖、続いてＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン、どれもが抗原結合特異性をもたらさないがそれぞれの重鎖と結合可能である免疫グロブリン軽鎖、又は各重鎖と結合可能でありかつ重鎖抗原結合領域により結合された１つ以上のエピトープに結合可能である免疫グロブリン軽鎖、又は各重鎖と結合可能でありかつ１つ若しくは両方のエピトープに１つ若しくは両方の重鎖の結合が可能であり得る免疫グロブリン軽鎖を有する。ＢｓＡｂは、２つの主要クラスへと分けることができ、これらはＦｃ領域（ＩｇＧ様）を有するものと、Ｆｃ領域を欠いているものであり、後者は通常、ＩｇＧ及びＦｃを含むＩｇＧ様二重特異的分子よりも小さいものである。ＩｇＧ様ｂｓＡｂは例えば、トリオマブ、ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂｓ ｉｎｔｏ ｈｏｌｅｓ）ＩｇＧ（ｋｉｈ ＩｇＧ）、クロスマブ、ｏｒｔｈ－Ｆａｂ ＩｇＧ、デュアル可変ドメインＩｇ（ＤＶＤ－Ｉｇ）、トゥー・イン・ワン又はデュアルアクションＦａｂ（ＤＡＦ）、ＩｇＧ一本鎖Ｆｖ（ＩｇＧ－ｓｃＦｖ）、又はκλ－ボディといった異なるフォーマットを有し得るがこれらに限定されない。非ＩｇＧ様の異なるフォーマットとしては、タンデムｓｃＦｖ、ダイアボディフォーマット、一本鎖ダイアボディ、タンデムダイアボディ（ＴａｎｄＡｂ）、デュアルアフィニティー再標的分子（ＤＡＲＴ）、ＤＡＲＴ－Ｆｃ、ナノボディ、又はドック・アンド・ロック（ＤＮＬ）法（Ｇａｏｗｅｉ Ｆａｎ，Ｚｕｊｉａｎ Ｗａｎｇ＆Ｍｉｎｇｊｕ Ｈａｏ，Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，８ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＨＥＭＡＴＯＬＯＧＹ＆ＯＮＣＯＬＯＧＹ １３０；Ｄａｆｎｅ Ｍｕｌｌｅｒ＆Ｒｏｌａｎｄ Ｅ．Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ２６５－３１０（２０１４）、その全体の教示が本明細書に組み入れられる）により産生された抗体が挙げられる。ｂｓＡｂを産生する方法は、２つの異なるハイブリドーマ細胞株の体細胞融合物に基づくクアドローマ技術、化学的架橋リンカーを含む化学的コンジュゲーション、組換えＤＮＡ技術を利用する遺伝子的アプローチに限定されない。ｂｓＡｂの例としては、以下：２０１０年６月２５日に提出された米国特許番号第１２／８２３８３８号、２０１２年６月５日に提出された米国特許番号第１３／４８８６２８号、２０１３年９月１９日に提出された米国特許番号第１４／０３１０７５号、２０１５年７月２４日に提出された米国特許番号第１４／８０８１７１号、２０１７年９月２２日に提出された米国特許番号第１５／７１３５７４号、２０１７年９月２２日に提出された米国特許番号第１５／７１３５６９号、２０１６年１２月２１日に提出された米国特許番号第１５／３８６４５３号、２０１６年１２月２１日に提出された米国特許番号第１５／３８６４４３号、２０１６年７月２９年に提出された米国特許番号第１５／２２３４３号、及び２０１７年１１月１５日に提出された米国特許番号１５８１４０９５号といった特許出願に開示されるものが挙げられ、これらは参照として本明細書に組み入れられる。低レベルのホモ二量体不純物は、二重特異性抗体を製造する間の複数の工程に存在し得る。ホモ二量体不純物の存在量が低く、通常の液体クロマトグラフィー法を使用して実行されるときには、これらの不純物は主要種と共溶出されることから、このようなホモ二量体不純物の検出は、インタクト質量分析を使用して実施されるときには困難なものとなる可能性がある。
本明細書にて使用される場合、「多重特異性抗体」は、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有する抗体を指す。このような分子は通常、２つの抗原にのみ結合する（すなわち、二重特異性抗体、ｂｓＡｂ）が、三重特異性抗体及びＫＩＨ三重特異性といった追加の特異性を有する抗体はまた、本明細書に開示されるシステム及び方法により処理され得る。
本明細書にて使用される場合、用語「モノクローナル抗体」はハイブリドーマ技術により産生された抗体に限定されない。モノクローナル抗体は、当技術分野にて入手可能であり公知である任意の手段により、任意の真核細胞クローン、原核細胞クローン、又はファージクローンを含む単一クローンから誘導され得る。本開示に有用なモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術、組換え技術、及びファージディスプレイ技術、又はこれらの組合せの使用を含む、当技術分野にて公知の様々な技術を使用して調製され得る。
いくつかの例示的な実施形態において、関心対象のタンパク質は約４．５～約９．０の範囲でｐＩを有し得る。例示的な特定の一実施形態において、ｐＩは、約４．５、約５．０、約５．５、約５．６、約５．７、約５．８、約５．９、約６．０、約６．１、約６．２、約６．３、約６．４、約６．５、約６．６、約６．７、約６．８、約６．９、約７．０、約７．１、約７．２、約７．３、約７．４、約７．５、約７．６、約７．７、約７．８、約７．９、約８．０、約８．１、約８．２、約８．３、約８．４、約８．５、約８．６、約８．７、約８．８、約８．９、又は約９．０であり得る。いくつかの例示的な実施形態において、組成物中の関心対象のタンパク質の種類は２種以上であり得る。
いくつかの例示的な実施形態において、関心対象のタンパク質は哺乳動物細胞から産生され得る。哺乳動物細胞はヒト起源であり得、又は非ヒト起源は、初代上皮細胞（例えば、ケラチノサイト、頸部上皮細胞、気管支上皮細胞、気管上皮細胞、腎臓上皮細胞及び網膜上皮細胞）、樹立された細胞系統及びそれらの株（例えば、２９３胎児腎細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ子宮頸部上皮細胞及びＰＥＲ－Ｃ６網膜細胞、ＭＤＢＫ（ＮＢＬ－１）細胞、９１１細胞、ＣＲＦＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＢｅＷｏ細胞、Ｃｈａｎｇ細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５６２細胞、ＨｅＬａ２２９細胞、ＨｅＬａＳ３細胞、Ｈｅｐ－２細胞、ＫＢ細胞、ＬＳＩ８０細胞、ＬＳ１７４Ｔ細胞、ＮＣＩ－Ｈ－５４８細胞、ＲＰＭＩ２６５０細胞、ＳＷ－１３細胞、Ｔ２４細胞、ＷＩ－２８ ＶＡ１３、２ＲＡ細胞、ＷＩＳＨ細胞、ＢＳ－Ｃ－Ｉ細胞、ＬＬＣ－ＭＫ２細胞、クローンＭ－３細胞、１－１０細胞、ＲＡＧ細胞、ＴＣＭＫ－１細胞、Ｙ－ｌ細胞、ＬＬＣ－ＰＫｉ細胞、ＰＫ（１５）細胞、ＧＨｉ細胞、ＧＨ３細胞、Ｌ２細胞、ＬＬＣ－ＲＣ２５６細胞、ＭＨｉＣｉ細胞、ＸＣ細胞、ＭＤＯＫ細胞、ＶＳＷ細胞、及びＴＨ－Ｉ、Ｂ１細胞、ＢＳＣ－１細胞、ＲＡｆ細胞、ＲＫ－細胞、ＰＫ－１５細胞又はそれらの誘導体）、任意の組織又は器官からの線維芽細胞（心臓、肝臓、腎臓、結腸、腸、食道、胃、神経組織（脳、脊髄）、肺、血管組織（動脈、静脈、毛細血管）、リンパ組織（リンパ腺、咽頭扁桃、扁桃腺、骨髄及び血液）、脾臓及び線維芽細胞及び線維芽細胞様細胞株（例えば、ＣＨＯ細胞、ＴＲＧ－２細胞、ＩＭＲ－３３細胞、Ｄｏｎ細胞、ＧＨＫ－２１細胞、シトルリン血症細胞、Ｄｅｍｐｓｅｙ細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５５１細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５１０細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５２５細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５２９細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５３２細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５３９細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５４８細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５７３細胞、ＨＥＬ２９９細胞、ＩＭＲ－９０細胞、ＭＲＣ－５細胞、ＷＩ－３８細胞、ＷＩ－２６細胞、Ｍｉｄｉ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＶ－１細胞、ＣＯＳ－１細胞、ＣＯＳ－３細胞、ＣＯＳ－７細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＤＢＳ－ＦｒｈＬ－２細胞、ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、Ｆ９細胞、ＳＶ－Ｔ２細胞、Ｍ－ＭＳＶ－ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、Ｋ－ＢＡＬＢ細胞、ＢＬＯ－１１細胞、ＮＯＲ－１０細胞、Ｃ３Ｈ／ＩＯＴＩ／２細胞、ＨＳＤＭｉＣ３細胞、ＫＬＮ２０５細胞、ＭｃＣｏｙ細胞、マウスＬ細胞、株２０７１（マウスＬ）細胞、Ｌ－Ｍ株（マウスＬ）細胞、Ｌ－ＭＴＫ’（マウスＬ）細胞、ＮＣＴＣクローン２４７２及び２５５５、ＳＣＣ－ＰＳＡ１細胞、Ｓｗｉｓｓ／３Ｔ３細胞、インドキョン（Ｉｎｄｉａｎ ｍｕｎｔａｃ）細胞、ＳＩＲＣ細胞、Ｃｎ細胞、及びＪｅｎｓｅｎ細胞、Ｓｐ２／０、ＮＳ０、ＮＳ１細胞若しくはそれらの誘導体）を含むがこれらに限定されない）を含み得る。
本明細書にて使用される場合、用語「タンパク質アルキル化剤」は、タンパク質中の特定の遊離アミノ酸残基をアルキル化するために使用される薬剤を指す。タンパク質アルキル化剤の非限定的な例としては、ヨードアセトアミド（ＩＯＡ）、クロロアセトアミド（ＣＡＡ）、アクリルアミド（ＡＡ）、Ｎ－エチルマレイミド（ＮＥＭ）、メチルメタンチオスルホナート（ＭＭＴＳ）、及び４－ビニルピリジン又はこれらの組合せである。
本明細書にて使用される場合、「タンパク質変性」は、分子の３次元形状をその天然状態から変化させるプロセスを指し得る。タンパク質の変性は、タンパク質変性剤を使用して実行され得る。タンパク質変性剤の非限定的な例としては、熱、高ｐＨ又は低ｐＨ、ＤＴＴなどの還元剤（以下を参照されたい）又はカオトロピック剤への曝露が挙げられる。いくつかのカオトロピック剤はタンパク質変性剤として使用され得る。カオトロピック溶質は、水素結合、ファンデルワールス力、及び疎水作用などの非共有結合力により媒介される分子内相互作用に干渉することで、系のエントロピーを増加させる。カオトロピック剤の非限定的な例としては、ブタノール、エタノール、塩化グアニジニウム、過塩素酸リチウム、酢酸リチウム、塩化マグネシウム、フェノール、プロパノール、ドデシル硫酸ナトリウム、チオ尿素、Ｎ－ラウロイルサルコシン、尿素、及びそれらの塩が挙げられる。
本明細書にて使用される場合、用語「タンパク質還元剤」は、タンパク質中のジスルフィド架橋を還元するために使用される薬剤を指す。タンパク質を還元するために使用されるタンパク質還元剤の非限定的な例としては、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、β－メルカプトエタノール、エルマン試薬、ヒドロキシルアミン塩酸塩、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ－ＨＣｌ）、又はこれらの組合せである。
本明細書にて使用される場合、ポリペプチドの用語「バリアント」（例えば、ＶＥＧＦＲ Ｉｇドメインのバリアント）は、関心対象のタンパク質の参照アミノ酸配列又は天然アミノ酸配列と少なくとも約７０～９９．９％（例えば、７０、７１、７２、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５、９９．９％）同一又は類似するアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。配列比較は、例えばＢＬＡＳＴアルゴリズムにより実施され得、この場合、このアルゴリズムのパラメータは、それぞれの参照配列の全長にわたるそれぞれの配列間で、最大の一致をもたらすように選択される（例えば、しきい値：１０、ワードサイズ３、クエリ幅：０での最大一致、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス、ギャップコスト：存在１１、伸長１、条件付き構成スコアマトリックスの調整を想定する）。ポリペプチドのバリアント（例えば、ＶＥＧＦＲ Ｉｇドメインのバリアント）はまた、例えば、ミスセンス置換（例えば、保存的置換）、ナンセンス変異、欠失又は挿入といった、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０）の変異を除いた参照アミノ酸配列を含むポリペプチドも指す。以下の参照は、配列分析に多くの場合使用されるＢＬＡＳＴアルゴリズムに関するものである：ＢＬＡＳＴ ＡＬＧＯＲＩＴＨＭＳ：Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（２００５）ＦＥＢＳ Ｊ．２７２（２０）：５１０１－５１０９；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０；Ｇｉｓｈ，Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３：２６６－２７２；Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｍｅｔｈ．ＥｎｚｙＭｏｌ．２６６：１３１－１４１；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．７：６４９－６５６；Ｗｏｏｔｔｏｎ，Ｊ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．１７：１４９－１６３；Ｈａｎｃｏｃｋ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．１０：６７－７０；ＡＬＩＧＮＭＥＮＴ ＳＣＯＲＩＮＧ ＳＹＳＴＥＭＳ：Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．，ｅｔ ａｌ．，「Ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｃｈａｎｇｅ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．」Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ中，（１９７８）ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐｌ．３．Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ（ｅｄ．），ｐｐ．３４５－３５２，Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．；Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｒ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，「Ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｄｉｓｔａｎｔ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ」 Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ中，（１９７８）ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐｌ．３．Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ（ｅｄ．），ｐｐ．３５３－３５８，Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１９：５５５－５６５；Ｓｔａｔｅｓ，Ｄ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ３：６６－７０；Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０９１５－１０９１９；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３６：２９０－３００；ＡＬＩＧＮＭＥＮＴ ＳＴＡＴＩＳＴＩＣＳ：Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：２２６４－２２６８；Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：５８７３－５８７７；Ｄｅｍｂｏ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ａｎｎ．Ｐｒｏｂ．２２：２０２２－２０３９；ａｎｄＡｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．「Ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ．」Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓ．Ｓｕｈａｉ，ｅｄ．）中，（１９９７）ｐｐ．１－１４，Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎ．Ｙ．；これらの全体の教示は本明細書に組み入れられる。
いくつかのバリアントは、ポリペプチドがそれらのリボソーム合成（同時翻訳修飾）中又はそれらのリボソーム合成（翻訳後修飾「ＰＴＭ」）後のいずれかにて受ける共有結合修飾であり得る。ＰＴＭは一般には、特異的な酵素又は酵素経路により導入される。多くは、タンパク質バックボーン内の特定の特徴的なタンパク質配列（例えば、シグネチャー配列）の部位にて生じる。数百ものＰＴＭが記録されており、これらの修飾はタンパク質の構造又は機能のいくつかの態様に一定して影響を及ぼす（Ｗａｌｓｈ，Ｇ．「Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」（２０１４）第２版，Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ．から発行，ＩＳＢＮ：９７８０４７０６６９８５３、その全体の教示が本明細書に組み入れられる）。特定の例示的な実施形態において、タンパク質組成物は、関心対象のタンパク質の２タイプ以上のタンパク質バリアントを含み得る。
アフリベルセプトの場合におけるタンパク質バリアント（及びアフリベルセプトの構造特性、例えば、アフリベルセプトの１つ以上の重鎖領域又は軽鎖領域を共有するタンパク質）としては、例えば、ヒスチジン、システイン、メチオニン、トリプトファン、フェニルアラニン及び／又はチロシン残基で生じる１種以上のアミノ酸残基の酸化から生じ得る酸化バリアント、アスパラギン残基及び／又はデオキシグルコソン化アルギニン残基での脱アミド化から生じ得る脱アミド化バリアントを含み得るが、これらに限定されない。
アフリベルセプト（及びアフリベルセプトの構造特性、例えば、アフリベルセプトの１つ以上の重鎖領域又は軽鎖領域を共有するタンパク質）に関して、酸化バリアントは、Ｈｉｓ８６、Ｈｉｓ１１０、Ｈｉｓ１４５、Ｈｉｓ２０９、Ｈｉｓ９５、Ｈｉｓ１９及び／若しくはＨｉｓ２０３（又はアフリベルセプトのある特定の構造特性を共有するタンパク質上の同等の残基位置）でのヒスチジン残基の酸化；Ｔｒｐ５８及び／若しくはＴｒｐ１３８（又はアフリベルセプトのある特定の構造特性を共有するタンパク質上の同等の残基位置）でのトリプトファン残基の酸化；Ｔｙｒ６４（又はアフリベルセプトのある特定の構造特性を共有するタンパク質上の同等の位置）でのチロシン残基の酸化；Ｐｈｅ４４及び／若しくはＰｈｅ１６６（又はアフリベルセプトのある特定の構造特性を共有するタンパク質上の同等の残基位置）でのフェニルアラニン残基の酸化；並びに／又はＭｅｔ１０、Ｍｅｔ２０、Ｍｅｔ１６３及び／若しくはＭｅｔ１９２（又はアフリベルセプトのある特定の構造特性を共有するタンパク質上の同等の残基位置）でのメチオニン残基での酸化を含み得る。
アフリベルセプト（及びアフリベルセプトの構造特性、例えば、アフリベルセプトの１つ以上の重鎖領域又は軽鎖領域を共有するタンパク質）に関して、脱アミド化バリアントは、Ａｓｎ８４及び／又はＡｓｎ９９（又はアフリベルセプトのある特定の構造特性を共有するタンパク質上の同等の残基位置）でのアスパラギン残基の脱アミド化を含み得る。
アフリベルセプト（及びアフリベルセプトの構造特性、例えば、アフリベルセプトの１つ以上の重鎖領域又は軽鎖領域を共有するタンパク質）に関して、デオキシグルコソン化バリアントは、Ａｒｇ５（又はアフリベルセプトのある特定の構造特性を共有するタンパク質上の同等の残基位置）でのアルギニン残基の３－デオキシグルコソン化を含み得る。
タンパク質バリアントは、酸性種及び塩基性種の両方を含み得る。酸性種は、典型的には、ＣＥＸからはメインピークより早く溶出する又はＡＥＸからはメインピークより遅く溶出するバリアントであり、一方で塩基性種は、ＣＥＸからはメインピークより遅く溶出する又はＡＥＸからはメインピークより早く溶出するバリアントである。
本明細書にて使用される場合、用語「酸性種」、「ＡＳ」、「酸性領域」、「及びＡＲ」は、全体的な酸性電荷により特徴付けられるタンパク質のバリアントを指す。例えば、組換えタンパク質の調製においてこうした酸性種は、例えばＷＣＸ－１０ ＨＰＬＣ（弱陽イオン交換クロマトグラフィー）といったイオン交換、又はＩＥＦ（等電点電気泳動）といった様々な方法により検出され得る。抗体の酸性種としては、バリアント、構造バリアント、及び／又は断片化バリアントが挙げられてもよい。例示的なバリアントとしては、脱アミド化バリアント、脱フコシル化バリアント、酸化バリアント、メチルグリオキサル（ＭＧＯ）バリアント、糖化バリアント、及びクエン酸バリアントが挙げられ得るがこれらに限定されない。例示的な構造バリアントとしては、グリコシル化バリアント及びアセトン化バリアントが挙げられるがこれらに限定されない。例示的な断片化バリアントとしては、Ｆｃ断片及びＦａｂ断片、Ｆａｂを欠損している断片、重鎖可変ドメインを欠損している断片を含むがこれらに限定されない、ペプチド鎖の解離、酵素的及び／又は化学的修飾による標的分子からの任意の改変タンパク質種；Ｃ末端切断型バリアント；軽鎖中のＮ末端Ａｓｐを切除したバリアント；及び軽鎖のＮ末端切断を有するバリアントが挙げられる。他の酸性種バリアントとしては、不対ジスルフィド、宿主細胞タンパク質、及び宿主の核酸、クロマトグラフィー材料、及び培地成分を含むバリアントが挙げられる。一般に、酸性種はＣＥＸ中にメインピークよりも早く溶出し、又はＡＥＸ分析中にメインピークよりも遅く溶出する（図１６及び図１７を参照されたい）。
特定の実施形態において、タンパク質組成物は、２タイプ以上の酸性種バリアントを含み得る。例えば、限定するものではないが、総酸性種はピークが出現しているクロマトグラフィーの保持時間に基づき分類され得る。総酸性種が分類され得る別の例は、バリアントのタイプ（バリアント、構造バリアント、又は断片化バリアント）に基づき得る。
用語「酸性種」又は「ＡＳ」は、プロセス関連不純物を指すわけではない。本明細書にて使用される場合、用語「プロセス関連不純物」は、タンパク質を含む組成物中に存在するが、それ自体タンパク質由来ではない不純物を指す。プロセス関連不純物としては、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、宿主細胞の核酸、クロマトグラフィー材料、及び培地成分が挙げられるがこれらに限定されない。
例示的な一実施形態において、関心対象のタンパク質と比較した抗ＶＥＧＦ組成物中の酸性種の量は、最大で約２０％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４．５％、４％、３．５％、３％、２．５％、２％、１．９％、１．８％、１．７％、１．６％、１．５％、１．４％、１．３％、１．２％、１．１％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％又は０．０％であり得、上記のうち１つ以上の範囲内である。抗ＶＥＧＦ組成物の例は、以下のセクションＩＩＩにて述べられる。一態様において、抗ＶＥＧＦ組成物は、アフリベルセプト、組換えＭｉｎｉＴｒａｐ（その例は、米国特許第７，２７９，１５９号に開示される）、ｓｃＦｖ及び他の抗ＶＥＧＦタンパク質からなる群から選択される抗ＶＥＧＦタンパク質を含み得る。好ましい態様において、関心対象の組換えタンパク質はアフリベルセプトである。
酸性種又は塩基性種に関係している化学分解経路の中で、タンパク質及びペプチド中に生じる２つの最も一般的に観察される共有結合修飾は、脱アミノ化及び酸化である。メチオニン、システイン、ヒスチジン、トリプトファン、及びチロシンは、Ｍｅｔ及びＣｙｓはそれらの硫黄原子を理由として、Ｈｉｓ、Ｔｒｉｐ、及びＴｙｒはそれらの芳香環を理由として、酸化に対して最も感受性が高いアミノ酸である。
本明細書にて使用される場合、用語「酸化種」、「ＯＳ」又は「酸化バリアント」は、酸化により形成されたタンパク質のバリアントを指す。こうした酸性種はまた、例えばＷＣＸ－１０ ＨＰＬＣ（弱陽イオン交換クロマトグラフィー）といったイオン交換、又はＩＥＦ（等電点電気泳動）といった様々な方法により検出され得る。酸化バリアントは、ヒスチジン、システイン、メチオニン、トリプトファン、フェニルアラニン及び／又はチロシン残基で生じる酸化からもたらされ得る。特に、アフリベルセプト（及びアフリベルセプトの構造特性、例えば、アフリベルセプトの１つ以上の重鎖領域又は軽鎖領域を共有するタンパク質）に関して、酸化バリアントは、Ｈｉｓ８６、Ｈｉｓ１１０、Ｈｉｓ１４５、Ｈｉｓ２０９、Ｈｉｓ９５、Ｈｉｓ１９及び／若しくはＨｉｓ２０３（又はアフリベルセプトのある特定の構造特性を共有するタンパク質上の同等の残基位置）でのヒスチジン残基の酸化；Ｔｒｐ５８及び／若しくはＴｒｐ１３８（又はアフリベルセプトのある特定の構造特性を共有するタンパク質上の同等の残基位置）でのトリプトファン残基の酸化；Ｔｙｒ６４（又はアフリベルセプトのある特定の構造特性を共有するタンパク質上の同等の位置）でのチロシン残基の酸化；Ｐｈｅ４４及び／若しくはＰｈｅ１６６（又はアフリベルセプトのある特定の構造特性を共有するタンパク質上の同等の残基位置）でのフェニルアラニン残基の酸化；並びに／又はＭｅｔ１０、Ｍｅｔ２０、Ｍｅｔ１６３及び／若しくはＭｅｔ１９２（又はアフリベルセプトのある特定の構造特性を共有するタンパク質上の同等の残基位置）でのメチオニン残基での酸化を含み得る。
例示的な一実施形態において、関心対象のタンパク質と比較した抗ＶＥＧＦ組成物中の酸化種の量は、最大で約１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４．５％、４％、３．５％、３％、２．５％、２％、１．９％、１．８％、１．７％、１．６％、１．５％、１．４％、１．３％、１．２％、１．１％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％又は０．０％であり得、上記のうち１つ以上の範囲内である。抗ＶＥＧＦ組成物の例は、以下のセクションＩＩＩにて述べられる。一態様において、抗ＶＥＧＦ組成物は、アフリベルセプト、組換えＭｉｎｉＴｒａｐ（その例は、米国特許第７，２７９，１５９号に開示される）、ｓｃＦｖ及び他の抗ＶＥＧＦタンパク質からなる群から選択される抗ＶＥＧＦタンパク質を含み得る。好ましい態様において、関心対象の組換えタンパク質はアフリベルセプト又はＭｉｎｉＴｒａｐである。
システイン残基は自発的酸化を受け、分子内又は分子間ジスルフィド結合のいずれか、又はスルフェン酸といった単分子の副生成物を形成することができる。
ヒスチジン残基はまた、追加のヒドロキシル種を順次生成可能である、それらのイミダゾール環による反応を介した酸化に対し、高い感受性を有する（Ｌｉ，Ｓ，Ｃ Ｓｃｈｏｎｅｉｃｈ，ａｎｄ ＲＴ．Ｂｏｒｃｈａｒｄｔ．１９９５．Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ：Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．４８：４９０－５００，その全体の教示は本明細書に組み入れられる）。ヒスチジン酸化のための提案された機構は、図２及び図３に強調される。詳細な機構的研究は、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２０１４，８６，４９４０－４９４８及びＪ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｎａｌ．２１（２０００）１０９３－１０９７にて利用可能であり、その全体の教示が本明細書に組み入れられる。
メチオニンの酸化は、メチオニンスルホキシドの形成を引き起こし得る（Ｌｉ，Ｓ，Ｃ Ｓｃｈｏｎｅｉｃｈ，ａｎｄ ＲＴ．Ｂｏｒｃｈａｒｄｔ．１９９５．Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ：Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．４８：４９０－５００）。メチオニン残基の可能である様々な酸化機構は、文献中で述べられている（Ｂｒｏｔ，Ｎ．，Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ，Ｈ．１９８２．Ｔｈｅ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．７：１３７－１３９、その全体の教示が本明細書に組み入れられる）。
トリプトファンの酸化は、生成物の複雑な混合物をもたらし得る。一次生成物は、一酸化、二酸化及び／又は三酸化生成物を伴うＮ－ホルミルキヌレニン及びキヌレニンであり得る（図４）。酸化Ｔｒｐ修飾を有するペプチドは、一般には、キヌレニン（ＫＹＮ）、ヒドロキシトリプトファン（ＷＯＸ１）、及びＮ－ホルミルキヌレニン／ジヒドロキシトリプトファン（ＮＦＫ／ＷＯＸ２、「二重酸化Ｔｒｐ」とも称される）、トリヒドロキシトリプトファン（ＷＯＸ３、「三重酸化Ｔｒｐ」とも称される）、及び例えばヒドロキシキヌレニン（ＫＹＮＯＸ１、＋２０Ｄａ）といったこれらの組合せの形成に対応して、４Ｄａ、１６Ｄａ、３２Ｄａ、及び４８Ｄａの質量増加を呈する。ヒドロキシトリプトファン（ＷＯＸ１）の酸化（Ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｒｔｉｆａｃｔ ｏｒ ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ？ Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２０１０ Ｊｕｌ；２１（７）：１１１４－１１１７、その全体の教示が本明細書に組み入れられる）。メチオニン及びヒスチジン酸化ではなく、トリプトファン酸化がタンパク質産物における色変化を産生することが見出された（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ａ Ｃｏｌｏｒ－Ｃｈａｎｇｅｄ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ：Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅｓ．ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ａｃ４０４２１８ｔ｜Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２０１４，８６，６８５０－６８５７）。トリプトファン同様、チロシン酸化は最初に３，４－ジヒドロキシフェニルアラニン（ＤＯＰＡ）及びジチロシンを産生する（Ｌｉ，Ｓ，Ｃ Ｓｃｈｏｎｅｉｃｈ，ａｎｄ ＲＴ．Ｂｏｒｃｈａｒｄｔ．１９９５．Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ：Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．４８：４９０－５００）。
本明細書にて使用される場合、用語「塩基性種」、「塩基性領域」及び「ＢＲ」は、例えば、それらの抗体又は抗原結合部分といったタンパク質のバリアントを指し、これらは、タンパク質中に存在する一次電荷バリアント種と比較すると、全体的な塩基性電荷により特徴付けられる。例えば、組換えタンパク質の調製においてこうした塩基性種は、例えばＷＣＸ－１０ ＨＰＬＣ（弱陽イオン交換クロマトグラフィー）といったイオン交換、又はＩＥＦ（等電点電気泳動）といった様々な方法により検出され得る。例示的なバリアントとしては、リジンバリアント、アスパラギン酸の異性化、アスパラギンでのスクシンイミド形成、メチオニン酸化、アミド化、不完全なジスルフィド結合形成、セリンからアルギニンの変異、グリコシル化、断片化及び凝集が挙げられるがこれらに限定されない。一般に、塩基性種はＣＥＸ中にメインピークよりも遅く溶出し、又はＡＥＸ分析中にメインピークよりも早く溶出する。（Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ａｃｉｄｉｃ ａｎｄ ｂａｓｉｃ ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＭＡｂｓ．２０１２ Ｓｅｐ １；４（５）：５７８－５８５．ｄｏｉ：１０．４１６１／ｍａｂｓ．２１３２８，その全体の教示が本明細書に組み入れられる。）
特定の実施形態において、タンパク質組成物は、２タイプ以上の塩基性種バリアントを含み得る。例えば、限定するものではないが、総塩基性種はピークが出現しているクロマトグラフィーの保持時間に基づき分離され得る。総塩基性種が分離され得る別の例は、バリアントのタイプ（バリアント、構造バリアント、又は断片化バリアント）に基づき得る。
酸性種について述べたように、用語「塩基性種」は、プロセス関連不純物を含まず、塩基性種は生成物調製の結果（本明細書では「調製由来塩基性種」と称される）、又は保管の結果（本明細書では「保管由来塩基性種」と称される）であり得る。
例示的な一実施形態において、関心対象のタンパク質と比較した抗ＶＥＧＦ組成物中の塩基性種の量は、最大で約１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４．５％、４％、３．５％、３％、２．５％、２％、１．９％、１．８％、１．７％、１．６％、１．５％、１．４％、１．３％、１．２％、１．１％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％又は０．０％であり得、上記のうち１つ以上の範囲内である。抗ＶＥＧＦ組成物の例は、以下のセクションＩＩＩにて述べられる。一態様において、抗ＶＥＧＦ組成物は、アフリベルセプト、組換えＭｉｎｉＴｒａｐ（その例は、米国特許第７，２７９，１５９号に開示される）、ｓｃＦｖ及び他の抗ＶＥＧＦタンパク質からなる群から選択される抗ＶＥＧＦタンパク質を含み得る。好ましい態様において、関心対象の組換えタンパク質はアフリベルセプトである。
本明細書にて使用される場合、「試料マトリックス」又は「生物学的試料」は、細胞培養流体（ＣＣＦ）、回収された細胞培養流体（ＨＣＣＦ）といったバイオプロセスの任意の工程、下流処理における任意の工程（最終的に製剤化された製品を含む原薬（ＤＳ）又は薬物製品（ＤＰ））から得ることができる。いくつかの他の特定の例示的な実施形態において、生物学的試料は、清澄、クロマトグラフィー生成、ウイルス不活化、又はろ過といった下流プロセスの任意工程から選択され得る。いくつかの特定の例示的な実施形態において、薬物製品は、クリニック、輸送、保管又は取り扱いにおいて製造された薬物製品から選択され得る。
本明細書にて使用される場合、用語「対象」は、哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ヤギ、ウサギ）、好ましくはがん又は血管新生性眼障害の予防及び／又は処置の必要があるヒトを指す。対象は、がん若しくは血管新生性眼障害を有し得る、又はがん若しくは血管新生性眼障害を発症する素因を有し得る。
タンパク質の製剤化に関して、本明細書にて使用される場合、用語「安定した」は、本明細書にて定義される例示的条件の下で保管した後、化学的構造又は生物学的機能を許容できる程度に保持することができる、製剤中の関心対象のタンパク質を指す。製剤は、規定の時間にわたって保管した後、中に含有される関心対象のタンパク質が１００％の化学的構造又は生物学的機能を維持していない場合であったとしても、安定した状態であり得る。特定の状況下にて、規定の時間にわたる保管後の約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％のタンパク質構造又は機能の維持は、「安定している」と見なされ得る。
用語「処置する」又は「処置」は、例えば、任意の臨床的に測定可能な程度で、望ましくない疾患又は障害（例えば、血管新生性眼障害又はがん）を、こうした疾患又は障害の１つ以上の症状又は徴候の退行、安定化、又は除去を引き起こすことによって（例えば、血管新生性眼障害に関しては、糖尿病性網膜症の重症度スコア（ＤＲＳＳ）の低減又はこの維持を生じさせることによって、視覚を改善若しくは維持し（例えば、ＥＴＤＲＳ視力検査の文字についての増加により測定されるような、例えば最善に補正された視力に関して）、視野を増大させるか若しくはこれを維持し、及び／又は中心網膜の厚みを減少させるか若しくはこれを維持することによって、がんに関しては、対象内のがん細胞の増殖、生存時間、及び／又は転移を停止又は退行させることによって）、好転、安定化、又は除去する治療処置を指す。典型的には、治療的測定は、疾患又は障害を抱える対象に、治療有効量のＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐを、１回以上の用量で投与することである。
本明細書にて使用される場合、タンパク質調製の文脈における用語「上流プロセス技術」は、関心対象のタンパク質の細胞培養中、又はこの後に、細胞からタンパク質を産生及び収集することに関与する動作を指す。本明細書にて使用される場合、用語「細胞培養」は、関心対象の組換えタンパク質を産生可能な宿主細胞の集団を生成及び維持するための方法、並びに関心対象のタンパク質の産生及び収集を最適化するための方法及び技術を指す。例えば、発現ベクターが適切な宿主細胞へ組み入れられると、宿主細胞は、関連するヌクレオチドをコードする配列の発現並びに所望の組換えタンパク質の収集及び産生に好適な条件の下で、維持され得る。
本発明の細胞培養技術を使用するときには、関心対象のタンパク質は、細胞内部、細胞膜周辺腔で産生され得るか、又は培地に直接分泌される。関心対象のタンパク質が細胞内部で産生される実施形態において、宿主細胞又は溶解細胞のいずれかである粒状の細片（例えば均質化により生じる）は、遠心分離又は限外ろ過を含むがこれらに限定されない様々な手段により取り除かれ得る。関心対象のタンパク質が培地に分泌される場合、こうした発現系からの上清は、例えば、Ａｍｉｃｏｎ（商標）Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ（商標）限外ろ過ユニットを用いて、市販のタンパク質濃度フィルタを使用して、最初に濃縮することができる。一態様において、関心対象のタンパク質は遠心分離に続いて深層ろ過、次いでアフィニティー捕捉クロマトグラフィーにより回収され得る。
本明細書にて使用される場合、「ＶＥＧＦアンタゴニスト」は、ＶＥＧＦに結合するか又はこれに相互作用する任意のタンパク質又はペプチドである。典型的には、こうした結合又は相互作用は、ＶＥＧＦがその受容体（ＶＥＧＦＲ１及びＶＥＧＦＲ２）に結合することを阻害し、及び／又はＶＥＧＦの生物学的シグナル伝達及びその活性を阻害する。ＶＥＧＦアンタゴニストとしては、ＶＥＧＦと天然ＶＥＧＦ受容体との相互作用に干渉する分子が挙げられ、例えば、ＶＥＧＦ又はＶＥＧＦ受容体に結合する分子、及びＶＥＧＦとＶＥＧＦ受容体との相互作用を防止又は他の方法で妨害する分子である。特定の例示的なＶＥＧＦアンタゴニストとしては、抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、ラニビズマブ［ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標）］、抗ＶＥＧＦ受容体抗体（例えば、抗ＶＥＧＦＲ１抗体、抗ＶＥＧＦＲ２抗体、及びそれらの同等物）、並びに、例えばアフリベルセプト、ジブ－アフリベルセプト、及び配列番号６０を有するアミノ酸を有するタンパク質など、ＶＥＧＦ受容体ベースのキメラ分子又はＶＥＧＦ阻害融合タンパク質（「ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ」又は「ＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐ」と本明細書では呼ばれる）が挙げられる。ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐの別の例は、ＡＬＴ－Ｌ９、Ｍ７１０、ＦＹＢ２０３、及びＣＨＳ－２０２０である。ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐの追加例は、米国特許第７，０７０，９５９号、同第７，３０６，７９９号、同第７，３７４，７５７号、同第７，３７４，７５８号、同第７，５３１，１７３号、同第７，６０８，２６１号、同第５，９５２，１９９号、同第６，１００，０７１号、同第６，３８３，４８６号、同第６，８９７，２９４号＆同第７，７７１，７２１号に見出すことができ、その全体が参照として特異的に本明細書に特に組み入れられる。
ＶＥＧＦ受容体ベースのキメラ分子としては、ＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ１とも呼ばれる）及び／又はＶＥＧＦＲ２（Ｆｌｋ１又はＫＤＲとも呼ばれる）といったＶＥＧＦ受容体の２種以上の免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメインを含む、キメラポリペプチドが挙げられ、これはまた、多量体ドメイン（例えば、２種以上のキメラポリペプチドの多量体化［例えば、二量体化］を促進させるＦｃドメイン）も含むこともできる。例示的なＶＥＧＦ受容体ベースのキメラ分子は、ＶＥＧＦＲ１Ｒ２－ＦｃΔＣ１（ａ）と称される分子（アフリベルセプトとしても公知であり、商品名ＥＹＬＥＡ（登録商標）の下で販売される）である。特定の例示的な実施形態において、アフリベルセプトは
（配列番号５５）として記載されるアミノ酸配列を含む。
本明細書にて使用される場合、「ウイルスろ過」は、Ａｓａｈｉ Ｋａｓｅｉ Ｐｈａｒｍａ製のＰｌａｎｏｖａ ２０Ｎ（商標）、Ｐｌａｎｏｖａ ５０Ｎ又はＢｉｏＥｘ、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製のＶｉｒｅｓｏｌｖｅ（商標）フィルタ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ製のＶｉｒｏＳａｒｔ ＣＰＶ、Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製のＵｌｔｉｐｏｒ ＤＶ２０又はＵｌｔｉｐｏｒ ＤＶ５０（商標）を含むがこれらに限定されない好適なフィルタを使用するろ過が挙げられ得る。所望のろ過性能を得るための好適なフィルタを選択することは、当業者には明らかであろう。
ＩＩ．色判定
本明細書にて使用される場合、組換えタンパク質、特に抗ＶＥＧＦタンパク質の産生中に観察される色は、様々な方法により測定され得る。非限定的な例としては、ヨウ素色数、ハーゼン色数、ガードナー色数、ロビボンド色数、セーボルト色数、鉱油色数、欧州薬局方色数、米国薬局方色数、ＣＩＥ Ｌ＊、ａ＊、ｂ＊（又はＣＩＥＬＡＢ）、クレット色数、Ｈｅｓｓ－Ｉｖｅｓ色数、黄色度、ＡＤＭＩ色数、並びにＡＳＢＣ及びＥＢＣ醸造所色数の使用が挙げられる。こうしたスケールにおける詳細は、ＬａｎｇｅによるアプリケーションレポートＮｏ．３．９ｅに見出すことができ、その全体の教示は本明細書に組み入れられる。
欧州薬局方（Ｐｈ Ｅｕｒ）の基準に基づく視覚的なカラーマッチング（欧州の色標準、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ．Ｃｈａｐｔｅｒ ２．２．２．Ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ ｃｏｌｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｑｕｉｄｓ．８ｔｈ ｅｄ．ＥＰを参照されたい。この全体の教示は本明細書に組み入れられる）は、欧州薬局方（ＥＰ ２．２．２．Ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ Ｃｏｌｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｑｕｉｄｓ ２）に説明されるように、色参照液の調製を含み得、すなわち、赤（塩化コバルト（ＩＩ））、黄色（塩化鉄（ＩＩＩ））、及び青色（硫酸銅（ＩＩ））といった３つの親溶液及び１％の塩酸、黄色（Ｙ）、緑黄色（ＧＹ）、黄褐色（ＢＹ）、褐色（Ｂ）、及び赤色（Ｒ）色相の５色の参照液が調製される。これらの５種類の参照液を順番に用いて、全部で３７色の参照液を調製する（Ｙ１～Ｙ７、ＧＹ１～ＧＹ７、ＢＹ１～ＢＹ７、Ｂ１～Ｂ９、及びＲ１～Ｒ７）。各参照液は、例えば明度、色相、及び彩度によって、ＣＩＥ－Ｌａｂ色空間において明確に定義される。７つの黄褐色標準（ＢＹ標準）のうち、ＢＹ１は最も暗い標準であり、ＢＹ７は最も明るい暗色である。ＢＹ色標準の試料と所与の試料とのマッチングは、典型的には拡散状態の日光の下で実施される。欧州の黄褐色標準の組成を以下の表１に説明する。
（表１）欧州の黄褐色標準の組成
黄褐色標準溶液（ＢＹ）：１０．８ｇ／ＬのＦｅＣｌ３．６Ｈ２Ｏ、６．０ｇ／ＬのＣｏＣｌ２．６Ｈ２Ｏ及び２．５ｇ／ＬのＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ
液体の色の検査は、試験液と色標準液とを比較することにより実施される。色標準液の組成は、試験液の色の色相及び強度に応じて選択される。典型的には、内径及びすべての点で可能な限りほぼ一致している無色透明な中性ガラスの平底の試験管（例えば、約１２ｍｍ、１５ｍｍ、１６ｍｍ、又は２５ｍｍの径の試験管）で、比較が実施される。例えば、比較は２～１０ｍＬの試験液と色標準液との比較であり得る。液体の深さは例えば、約１５ｍｍ、２５ｍｍ、４０ｍｍ又は５０ｍｍであり得る。試験液に割り当てる色が、標準色よりも更に濃くなってはならない。色比較は典型的には、白色の背景に対し、拡散光（例えば日光）で実行される。色は試験管の縦軸又は横軸を下ることで比較され得る。
ＥＰ色測定とは対照的に、米国薬局方医薬品各条１０６１、Ｃｏｌｏｒ－Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｌ ＭｅａｓｕｒｅｍｅｎｔはＣＩＥ Ｌ＊、ａ＊、ｂ＊（又はＣＩＥＬＡＢ）色測定の使用を参照し、正確かつ客観的に色を定量化している。合計で２０色の参照液（文字Ａ～Ｔにより順次同定される）は、米国薬局方により定義される。測定された試料の色は、色参照液と自動的に相関される。これは、試料に最も近い色参照液（すなわち、試料の色に対して最も小さい色差ΔＥ＊を有する参照液）が表示されることを意味する。ΔＬ＊値、Δａ＊値及びΔｂ＊値は、試料のＬ＊値、ａ＊値、ｂ＊値と、表示される米国薬局方溶液のＬ＊値、ａ＊値、ｂ＊値との定量的な差を示す。ＣＩＥ Ｌ＊、ａ＊、ｂ＊座標系では、Ｌ＊は色の明度を０～１００のスケール（最も暗いものを０、最も明るいものを１００とする）で表し、ａ＊は色の赤色及び緑色を表し（ａ＊の正の値は赤色を表すが、一方でａ＊の負の値は緑色を表す）、ｂ＊は試料の黄色又は青色を表す（ｂ＊の正の値は黄色を表すが、ｂ＊の負の値は青色を表す）。標準又は評価時の最初の試料からの色差は、それぞれの色成分であるΔＬ＊、Δａ＊及びΔｂ＊における変化により表され得る。複合変化、又は色差は、式：
を使用し、空間内の単純ユークリッド距離として計算され得る。ＣＩＥ Ｌ＊、ａ＊、ｂ＊色座標は、例えば、Ｈｕｎｔｅｒ Ｌａｂｓ ＵｌｔｒａｓｃａｎＰｒｏ（Ｈｕｎｔｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｒｅｓｔｏｎ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ）を使用して、又はＢＹＫ Ｇａｒｄｎｅｒ ＬＣＳ ＩＶ（ＢＹＫ－Ｇａｒｄｎｅｒ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）上で生成され得る。Ｈｕｎｔｅｒ Ｌａｂｓ ＵｌｔｒａＳｃａｎＰｒｏに関しては、波長の較正のため、Ｄｉｄｙｍｉｕｍ Ｆｉｌｔｅｒ Ｔｅｓｔを実行することができる。この機器は、使用前に０．７８０インチのポートインサート及びＤＩＷを備えたＴＴＲＡＮにて標準化され得る。これにより、ライトトラップ及び黒色板を使用し、測光スケールの最上部（Ｌ＝１００）及び最下部（Ｌ＝０）を確立する。Ｐａｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｄｅｒｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ａｐｐｅａｒａｎｃｅ ａｎｄ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｏｌｏｒ Ｔｅｓｔｓ Ｕｓｉｎｇ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｔｒｉｓｔｉｍｕｌｕｓ Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｙ：Ａｄｖａｎｔａｇｅｓ，Ｈａｒｍｏｎｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉ．１０４：３２９９－３３１３（２０１５）を参照されたい。その全体の教示は本明細書に組み入れられる。ＢＹ標準の色はまた、ＣＩＥ Ｌ＊、ａ＊、ｂ＊色空間（「ＣＩＥＬＡＢ」又は「ＣＩＥＬａｂ」色空間）の下で発現され得る。表２を参照されたい。
（表２）ＣＩＥ Ｌ＊、ａ＊、ｂ＊色空間における欧州の黄褐色標準の特性評価
^Ｐａｃｋ ｅｔ ａｌにより報告。
~各ＢＹ色標準に関して、本明細書ではＬ＊値及びｂ＊値を実験的に測定。
色彩アッセイの高スループットスクリーニングを可能とするためには、分光測色アッセイ法（ＣＩＥＬＡＢ）は、ＢＹ色標準よりも好適で定量的な測定である。代用のアッセイは、実施例セクションに説明されるように更に最適化された。
色について評価されたいずれの試料についても、試験試料のタンパク質濃度は、比較のため、例えば５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ及びその同等物といった試料中のタンパク質濃度に対して標準化されなければならない。
ＩＩＩ．抗ＶＥＧＦ組成物
ＶＥＧＦシグナル伝達経路を制御するタンパク質のＶＥＧＦファミリーの少なくとも５つのメンバーが存在する。すなわち、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ、及び胎盤増殖因子（ＰlＧＦ）である。抗ＶＥＧＦ組成物は、ＶＥＧＦアンタゴニストを含むことができ、これは、タンパク質のＶＥＧＦファミリーの１つ以上のメンバーと特異的に相互作用し、例えば、分裂促進性活性、血管新生活性、及び／又は血管透過性活性といった１つ以上のその生物学的活性を阻害する。
一実施形態において、抗ＶＥＧＦタンパク質を産生する方法は、（ａ）抗ＶＥＧＦタンパク質を発現するよう遺伝子改変された宿主細胞を提供する工程、（ｂ）細胞が抗ＶＥＧＦタンパク質を発現するのに好適な条件の下で、ＣＤＭ中の宿主細胞を培養する工程、及び（ｃ）細胞により産生された抗ＶＥＧＦタンパク質の調製物を回収する工程、を含む。一態様において、抗ＶＥＧＦタンパク質はアフリベルセプト、組換えＭｉｎｉＴｒａｐ（その例は、米国特許第７，２７９，１５９号に開示される）、ｓｃＦｖ及び他の抗ＶＥＧＦタンパク質からなる群から選択される。好ましい態様において、関心対象の組換えタンパク質はアフリベルセプトである。
本発明者らは、ある特定のＣＤＭ中で抗ＶＥＧＦタンパク質（例えばアフリベルセプト）を製造することで、明確な色を呈する生物学的試料を生成したことを発見した。明確な色特性は、異なる製造工程中、更には抗ＶＥＧＦタンパク質を含む最終製剤中にて観察された。実施例９で観察されるように、ＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐの産生については、ＣＤＭ中で細胞を培養することで、強い黄褐色を有する抗ＶＥＧＦタンパク質（例えばアフリベルセプト）を産生した。回収後のアフィニティー捕捉工程はまた、黄褐色といった特定の色を呈する溶出液も産生した。ＡＥＸを使用しての更なる製造工程も黄褐色を呈したが、この強さは低減されていた。
以下に詳細に説明するように、色は（ｉ）定性的な外観検査を行う欧州の色標準「ＢＹ」、又は（ｉｉ）ＢＹシステムよりも定量的である、比色アッセイであるＣＩＥＬＡＢを使用して評価され得る。ただしいずれの場合においても、複数の試料間での色評価は、意味ある調査／比較であることを保証するためにタンパク質濃度に対して正規化された。例えば実施例９、特に表９－２を参照すると、プロテインＡの溶出液は、およそ２．５２の「ｂ＊」値を有すし、これはおよそのＢＹ値であるＢＹ５に対応する（プロテインＡ溶出液において、５ｇ／Ｌタンパク質濃度にて測定した場合）。プロテインＡ溶出液の色を別の試料と比較する場合には、続いてその比較は同じタンパク質濃度を用いて行われなければならない。したがって、プロテインＡ溶出液と、およそ０．７４のｂ＊値を有するＡＥＸプールとを比較すると（プロテインＡ溶出液中、５ｇ／Ｌのタンパク質濃度にて測定される場合）、この生成方法は、ＡＥＸクロマトグラフィー後のＡＥＸプールに対する、プロテインＡ溶出液からの試料の黄褐色については実質的な低減が認められる。
本発明の組成物は、本明細書にて述べられる黄褐色により特徴付けられ得、例えば、欧州の黄褐色標準（ＢＹ２～ＢＹ３、ＢＹ３～ＢＹ４、ＢＹ４～ＢＹ５、又はＢＹ５～ＢＹ６）と同等の暗さ／強さであり、１７～２３、１０～１７、５～１０、３～５、又は１～３のｂ＊値を有し、この組成物は、約５ｇ／Ｌの抗ＶＥＧＦタンパク質又は約１０ｇ／Ｌの抗ＶＥＧＦタンパク質を含み、この組成物は、清澄化された回収物からの試料、又は清澄化された回収物のプロテインＡ溶出液として得られる。
一実施形態において、ＣＤＭを使用して生成された本発明の組成物は、明確な黄褐色を有する生物学的試料を生成し、この試料は、
（ｉ）欧州の色標準ＢＹ２と同程度の黄褐色；
（ｉｉ）欧州の色標準ＢＹ３と同程度の黄褐色；
（ｉｉｉ）欧州の色標準ＢＹ４と同程度の黄褐色；
（ｉｖ）欧州の色標準ＢＹ５と同程度の黄褐色；
（ｖ）欧州の色標準でＢＹ２～ＢＹ３の間；
（ｖｉ）欧州の色標準でＢＹ３～ＢＹ４の間；
（ｖｉｉ）欧州の色標準でＢＹ４～ＢＹ５の間
で認識される標準色特性評価により特徴付けられ得る。この組成物は約５ｇ／Ｌ又は約１０ｇ／Ｌの抗ＶＥＧＦタンパク質を含み、この組成物は清澄化された回収物であるプロテインＡ溶出液からの試料として得られる。
別の実施形態において、ＣＤＭを使用して生成された本発明の組成物は、異なる黄褐色を有する生物学的試料を生成し、この組成物は、ＣＩＥＬＡＢスケール：
（ｉ）約２２～２３のｂ＊値と同程度の黄褐色；
（ｉｉ）約１６～１７のｂ＊値と同程度の黄褐色；
（ｉｉｉ）９～１０のｂ＊値と同程度の黄褐色；
（ｉｖ）４～５のｂ＊値と同程度の黄褐色；
（ｖ）２～３のｂ＊値と同程度の黄褐色；
（ｖｉ）１７～２３の間のｂ＊値；
（ｖｉｉ）１０～１７の間のｂ＊値；
（ｖｉｉｉ）５～１０の間のｂ＊値；
（ｉｘ）３～５の間のｂ＊値；又は
（ｘ）１～３の間のｂ＊値
で認識される標準色特性評価により特徴付けられ得る。この組成物は約５ｇ／Ｌ又は約１０ｇ／Ｌの抗ＶＥＧＦタンパク質を含み、この組成物は清澄化された回収物であるプロテインＡ溶出液からの試料として得られる。
一実施形態において、ＣＤＭを使用して生成された本発明の組成物は、抗ＶＥＧＦタンパク質の他の種又はバリアントを含み得る。これらのバリアントには、オキソバリアントとして総称される、１つ以上の酸化アミノ酸残基を含む、抗ＶＥＧＦタンパク質アイソフォームが含まれる。抗ＶＥＧＦタンパク質及びそのオキソバリアントを含むこうした組成物の酵素消化は、以下：
約０．００４～０．０１３％の２－オキソ－ヒスチジンを含む、ＥＩＧＬＬＴＣ＊ＥＡＴＶＮＧＨ＊ＬＹＫ（配列番号１８）、
約０．００６～０．０２８％の２－オキソ－ヒスチジンを含む、ＱＴＮＴＩＩＤＶＶＬＳＰＳＨ＊ＧＩＥＬＳＶＧＥＫ（配列番号１９）、
約０．０４９～０．０８５％の２－オキソ－ヒスチジンを含む、ＴＥＬＮＶＧＩＤＦＮＷＥＹＰＳＳＫＨ＊ＱＨＫ（配列番号２０）、
約０．０５７～０．０９２％の２－オキソ－ヒスチジンを含む、ＤＫＴＨ＊ＴＣ＊ＰＰＣ＊ＰＡＰＥＬＬＧ（配列番号１７）、
約０．００８～０．０２２％の２－オキソ－ヒスチジンを含む、ＴＮＹＬＴＨ＊Ｒ（配列番号２１）、及び／又は
約０．１８５～０．２９８％の二酸化トリプトファンを含む、ＩＩＷＤＳＲ（配列番号５６）、
又は
約０．００８％の２－オキソ－ヒスチジンを含む、ＥＩＧＬＬＴＣ＊ＥＡＴＶＮＧＨ＊ＬＹＫ（配列番号１８）、
約０．０２％の２－オキソ－ヒスチジンを含む、ＱＴＮＴＩＩＤＶＶＬＳＰＳＨ＊ＧＩＥＬＳＶＧＥＫ（配列番号１９）、
約０．０６％の２－オキソ－ヒスチジンを含む、ＴＥＬＮＶＧＩＤＦＮＷＥＹＰＳＳＫＨ＊ＱＨＫ（配列番号２０）、
約０．０７％の２－オキソ－ヒスチジンを含む、ＤＫＴＨ＊ＴＣ＊ＰＰＣ＊ＰＡＰＥＬＬＧ（配列番号１７）、
約０．０１％の２－オキソ－ヒスチジンを含む、ＴＮＹＬＴＨ＊Ｒ（配列番号２１）、及び／又は
約０．２３％のジ－オキソトリプトファンを含む、ＩＩＷＤＳＲ（配列番号５６）
のうち１つ以上を含むことができ、Ｈ＊は２－オキソ－ヒスチジンへと酸化され得るヒスチジンであり、Ｃ＊はカルボキシメチル化され得るシステインである。特定の実施形態において、抗ＶＥＧＦタンパク質はアフリベルセプトである。別の実施形態において、抗ＶＥＧＦタンパク質はＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐである。
本発明の例示的な一実施形態において、本発明の組成物は抗ＶＥＧＦタンパク質を含み、抗ＶＥＧＦタンパク質の約１％以下、約０．１％以下、又は約０．１～１％、約０．２～１％、約０．３～１％、約０．４～１％、約０．５～１％、約０．６～１％、約０．７～１％、約０．８～１％、又は約０．９～１％のヒスチジン残基は２－オキソ－ヒスチジンである。そのような組成物において、様々な量の２－オキソ－ヒスチジン残基及び非酸化ヒスチジン残基をそれぞれ有する抗ＶＥＧＦタンパク質バリアントの不均一な集団が存在し得る。したがって、組成物中の２－オキソ－ヒスチジン抗ＶＥＧＦタンパク質の割合は、抗ＶＥＧＦ分子中の部位特異的な２－オキソ－ヒスチジンを、抗ＶＥＧＦタンパク質（酸化したものに加えて非酸化状態のもの）の分子中の合計の部位特異的ヒスチジンで割り、１００をかけたものを指す。組成物中の２－オキソ－ヒスチジンのレベルを定量化する１つの方法は、プロテアーゼ（例えば、Ｌｙｓ－Ｃ及び／又はトリプシン）でポリペプチドを消化し、例えば質量分析法（ｍｓ）により、得られたペプチド中の２－オキソ－ヒスチジンの量を分析することである。
抗ＶＥＧＦタンパク質の消化前に、システインのスルフヒドリル基は、ヨードアセトアミド（ＩＡＭ）による反応により遮断され、以下の化学的構造：
により表される残基を生じる。このような修飾は、遊離チオールがジスルフィド架橋を再形成するのを防止し、ジスルフィド結合のスクランブルを防ぐ。本発明は抗ＶＥＧＦタンパク質及びそのバリアントを含む組成物（例えば、水性組成物）を含む。ＩＡＭで修飾され、プロテアーゼ（例えば、Ｌｙｓ－Ｃ及びトリプシン）で消化され、質量分析法により分析される場合に、これは以下のペプチド：
約０．００４～０．０１３％の２－オキソ－ヒスチジンを含む、ＥＩＧＬＬＴＣ＊ＥＡＴＶＮＧＨ＊ＬＹＫ（配列番号１８）、
約０．００６～０．０２８％の２－オキソ－ヒスチジンを含む、ＱＴＮＴＩＩＤＶＶＬＳＰＳＨ＊ＧＩＥＬＳＶＧＥＫ（配列番号１９）、
約０．０４９～０．０８５％の２－オキソ－ヒスチジンを含む、ＴＥＬＮＶＧＩＤＦＮＷＥＹＰＳＳＫＨ＊ＱＨＫ（配列番号２０）、
約０．０５７～０．０９２％の２－オキソ－ヒスチジンを含む、ＤＫＴＨ＊ＴＣ＊ＰＰＣ＊ＰＡＰＥＬＬＧ（配列番号１７）、
約０．００８～０．０２２％の２－オキソ－ヒスチジンを含む、ＴＮＹＬＴＨ＊Ｒ（配列番号２１）、及び／又は
約０．１８５～０．２９８％の二酸化トリプトファンを含む、ＩＩＷＤＳＲ（配列番号５６）、
又は
約０．００８％の２－オキソ－ヒスチジンを含む、ＥＩＧＬＬＴＣ＊ＥＡＴＶＮＧＨ＊ＬＹＫ（配列番号１８）、
約０．０２％の２－オキソ－ヒスチジンを含む、ＱＴＮＴＩＩＤＶＶＬＳＰＳＨ＊ＧＩＥＬＳＶＧＥＫ（配列番号１９）、
約０．０６％の２－オキソ－ヒスチジンを含む、ＴＥＬＮＶＧＩＤＦＮＷＥＹＰＳＳＫＨ＊ＱＨＫ（配列番号２０）、
約０．０７％の２－オキソ－ヒスチジンを含む、ＤＫＴＨ＊ＴＣ＊ＰＰＣ＊ＰＡＰＥＬＬＧ（配列番号１７）、
約０．０１％の２－オキソ－ヒスチジンを含む、ＴＮＹＬＴＨ＊Ｒ（配列番号２１）、及び／又は
約０．２３％のジ－オキソトリプトファンを含む、ＩＩＷＤＳＲ（配列番号５６）
を含み、ここでＨ＊は２－オキソ－ヒスチジンであり、Ｃ＊はカルボキシメチル化システインである。本発明の一実施形態において、ペプチドはＰＮＧａｓｅ Ｆで脱グリコシル化される。
本発明は、抗ＶＥＧＦタンパク質を含む組成物を含み、この抗ＶＥＧＦタンパク質のすべてのヒスチジンのうち、約０．１％～１０％は２－オキソ－ヒスチジンに改変される。更には、組成物の色は、例えば、欧州の黄褐色標準（ＢＹ２～ＢＹ３、ＢＹ３～ＢＹ４、ＢＹ４～ＢＹ５、又はＢＹ５～ＢＹ６）と同等の暗さ／強さであり、代替的には約１７～２３、１０～１７、５～１０、３～５、又は１～３のＣＩＥのＬ＊、ａ＊、ｂ＊を使用することを特徴とするｂ＊値を有し、この組成物は、約５ｇ／Ｌ又は約１０ｇ／Ｌの抗ＶＥＧＦタンパク質を含む。この組成物は、清澄化された回収物、又は清澄化された回収物のプロテインＡ溶出液に由来する試料のいずれかとして得られる。このような組成物は、回収材料が捕捉クロマトグラフィー手順に供されるときには清澄化された回収物から得ることができる。一態様において、捕捉工程は例えば、プロテインＡアフィニティーカラムを使用するアフィニティークロマトグラフィー手順である。アフィニティー試料が液体クロマトグラフィー－質量分析法（ＬＣ－ＭＳ）を使用して分析されるときには、１つ以上のバリアントが検出され得る。
本発明は、抗ＶＥＧＦタンパク質を含む組成物を含み、この抗ＶＥＧＦタンパク質のすべてのトリプトファンのうち、約０．１％～１０％はキヌレニンに改変される。更には、組成物の色は、欧州の黄褐色標準（ＢＹ２～ＢＹ３、ＢＹ３～ＢＹ４、ＢＹ４～ＢＹ５、若しくはＢＹ５～ＢＹ６）と同等の暗さ／強さであり、並びに／又は約１７～２３、１０～１７、５～１０、３～５、若しくは１～３のＣＩＥのＬ＊、ａ＊、ｂ＊により特徴付けられるように、ｂ＊値を有し、この組成物は、約５ｇ／Ｌの抗ＶＥＧＦタンパク質又は約１０ｇ／Ｌの抗ＶＥＧＦタンパク質を含む。この組成物は、清澄化された回収物、又は清澄化された回収物のプロテインＡ溶出液に由来する試料として得られる。このような組成物は、捕捉クロマトグラフィー手順に供されるときには清澄化された回収物から得ることができる。この捕捉工程は例えば、プロテインＡアフィニティーカラムを使用するアフィニティークロマトグラフィー手順である。アフィニティー試料が液体クロマトグラフィー－質量分析法（ＬＣ－ＭＳ）を使用して分析されるときには、１つ以上のこれらのバリアントが検出され得る。
本発明は、抗ＶＥＧＦタンパク質を含む組成物を含み、この抗ＶＥＧＦタンパク質のすべてのトリプトファンのうち、約０．１％～１０％はモノ－ヒドロキシルトリプトファンに改変される。更には、組成物の色は、欧州の黄褐色標準（ＢＹ２～ＢＹ３、ＢＹ３～ＢＹ４、ＢＹ４～ＢＹ５、若しくはＢＹ５～ＢＹ６）と同等の暗さ／強さであり、並びに／又は約１７～２３、１０～１７、５～１０、３～５、若しくは１～３のＣＩＥのＬ＊、ａ＊、ｂ＊により特徴付けられるｂ＊値を有し、この組成物は、約５ｇ／Ｌの抗ＶＥＧＦタンパク質又は約１０ｇ／Ｌの抗ＶＥＧＦタンパク質を含む。この組成物は、清澄化された回収物、又は清澄化された回収物のプロテインＡ溶出液に由来する試料として得られる。このような組成物は、捕捉クロマトグラフィー手順に供されるときには清澄化された回収物から得ることができる。この捕捉工程は例えば、プロテインＡアフィニティーカラムを使用するアフィニティークロマトグラフィー手順である。アフィニティー工程から抽出された試料が液体クロマトグラフィー－質量分析法（ＬＣ－ＭＳ）を使用して分析されるときには、１つ以上のこれらのバリアントが検出され得る。
本発明は、抗ＶＥＧＦタンパク質を含む組成物を含み、この抗ＶＥＧＦタンパク質のすべてのトリプトファンのうち、約０．１％～１０％はジ－ヒドロキシルトリプトファンに改変される。更には、この色は、欧州の黄褐色標準（ＢＹ２～ＢＹ３、ＢＹ３～ＢＹ４、ＢＹ４～ＢＹ５、若しくはＢＹ５～ＢＹ６）と同等の暗さ／強さであり、並びに／又は約１７～２３、１０～１７、５～１０、３～５、若しくは１～３のＣＩＥのＬ＊、ａ＊、ｂ＊を使用することを特徴とするｂ＊値を有し、この組成物は、約５ｇ／Ｌの抗ＶＥＧＦタンパク質又は約１０ｇ／Ｌの抗ＶＥＧＦタンパク質を含む。この組成物は、清澄化された回収物、又は清澄化された回収物のプロテインＡ溶出液に由来する試料として得られる。そのような組成物は、捕捉クロマトグラフィー手順に供される抗ＶＥＧＦタンパク質及びそのオキソバリアントを含むＣＤＭを使用して作製された、清澄化された回収物から得ることができる。この捕捉工程は例えば、プロテインＡアフィニティーカラムを使用するアフィニティークロマトグラフィー手順である。アフィニティー工程から抽出された試料が液体クロマトグラフィー－質量分析法（ＬＣ－ＭＳ）を使用して分析されるときには、１つ以上のこれらのバリアントが検出され得る。
本発明は、抗ＶＥＧＦタンパク質を含む組成物を含み、この抗ＶＥＧＦタンパク質のすべてのトリプトファンのうち、約０．１％～１０％はトリ－ヒドロキシルトリプトファンに改変される。更には、組成物の色は、欧州の黄褐色標準（ＢＹ２～ＢＹ３、ＢＹ３～ＢＹ４、ＢＹ４～ＢＹ５、若しくはＢＹ５～ＢＹ６）と同等の暗さ／強さであり、並びに／又は約１７～２３、１０～１７、５～１０、３～５、若しくは１～３のＣＩＥのＬ＊、ａ＊、ｂ＊により特徴付けられるｂ＊値を有し、この組成物は、約５ｇ／Ｌの抗ＶＥＧＦタンパク質又は約１０ｇ／Ｌの抗ＶＥＧＦタンパク質を含む。この組成物は、清澄化された回収物、又は清澄化された回収物のプロテインＡ溶出液に由来する試料として得られる。このような組成物は、捕捉クロマトグラフィーを使用して得ることができる。この捕捉工程は例えば、プロテインＡアフィニティーカラムを使用するアフィニティークロマトグラフィー手順である。アフィニティーから抽出された試料が液体クロマトグラフィー－質量分析法（ＬＣ－ＭＳ）を使用して分析されるときには、１つ以上のこれらのバリアントが検出され得る。
一実施形態において、本発明の組成物は、抗ＶＥＧＦタンパクを含むことができ、この場合、抗ＶＥＧＦタンパク質は、以下のような１つ以上の残基の修飾を含み得る：１つ以上のアスパラギンが脱アミド化される；１つ以上のアスパラギン酸がイソアスパルタート及び／又はＡｓｎに変換される；１つ以上のメチオニンが酸化される；１つ以上のトリプトファンがＮ－ホルミルキヌレニンに変換される；１つ以上のトリプトファンがモノ－ヒドロキシルトリプトファンである；１つ以上のトリプトファンがジ－ヒドロキシルトリプトファンである；１つ以上のトリプトファンがトリ－ヒドロキシルトリプトファンである；１つ以上のアルギニンがＡｒｇ３－デオキシグルコソンに変換される；Ｃ末端グリシンが存在しない；並びに／又は１つ以上の非グリコシル化グリコサイトが存在する。
そのような組成物は、例えば、捕捉クロマトグラフィー手順に供される抗ＶＥＧＦタンパク質及びそのバリアントを含むＣＤＭを使用して作製された、清澄化された回収物から得ることができる。この捕捉工程は例えば、プロテインＡカラムを使用するアフィニティークロマトグラフィー手順である。アフィニティー工程から抽出された試料が、例えば液体クロマトグラフィー－質量分析法（ＬＣ－ＭＳ）を使用して分析されるときには、１つ以上のこれらのバリアントが検出され得る。
例示的な一実施形態において、本発明の組成物は、以下：Ｈｉｓ８６、Ｈｉｓ１１０、Ｈｉｓ１４５、Ｈｉｓ２０９、Ｈｉｓ９５、Ｈｉｓ１９、及び／若しくはＨｉｓ２０３（又はアフリベルセプトのある特定の構造特性を共有するタンパク質上の同等の残基位置）、Ｔｒｐ５８及び／若しくはＴｒｐ１３８（又はアフリベルセプトのある特定の構造特性を共有するタンパク質上の同等の残基位置）、Ｔｙｒ６４（又はアフリベルセプトのある特定の構造特性を共有するタンパク質上の同等の位置）、Ｐｈｅ４４及び／若しくはＰｈｅ１６６（又はアフリベルセプトのある特定の構造特性を共有するタンパク質上の同等の残基位置）、並びに／又はＭｅｔ１０、Ｍｅｔ２０、Ｍｅｔ１６３及び／若しくはＭｅｔ１９２（又はアフリベルセプトのある特定の構造特性を共有するタンパク質上の同等の残基位置）のうち１つ以上で酸化され得るアフリベルセプトの構造特性を共有する抗ＶＥＧＦタンパク質を含み得る。そのような組成物は、捕捉クロマトグラフィー手順に供されるアフリベルセプト及びそのオキソバリアントを含むＣＤＭを使用して作製された、清澄化された回収物から得ることができる。この捕捉工程は例えば、プロテインＡカラムを使用するアフィニティークロマトグラフィー手順であり得る。アフィニティー工程から抽出された試料が、例えば液体クロマトグラフィー－質量分析法（ＬＣ－ＭＳ）を使用して分析されるときには、１つ以上のこれらのバリアントが検出され得る。
一実施形態において、本発明の組成物は、配列番号４６のアミノ酸配列を有するＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐを含むことができる、これは、Ｈｉｓ８６、Ｈｉｓ１１０、Ｈｉｓ１４５、Ｈｉｓ２０９、Ｈｉｓ９５、Ｈｉｓ１９、及び／又はＨｉｓ２０３；Ｔｒｐ５８及び／又はＴｒｐ１３８；Ｔｙｒ６４；Ｐｈｅ４４及び／又はＰｈｅ１６６；及び／又はＭｅｔ１０、Ｍｅｔ２０、Ｍｅｔ１６３、及び／又はＭｅｔ１９２で酸化され得る。そのような組成物は、捕捉クロマトグラフィー手順に供されるＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐ及びそのオキソバリアントを含むＣＤＭを使用して作製された、清澄化された回収物から得ることができる。捕捉工程は、例えばプロテインＡカラムを使用するアフィニティークロマトグラフィー手順であり、液体クロマトグラフィー－質量分析法（ＬＣ－ＭＳ）を使用して分析されるときには、１つ以上のこれらのバリアントが検出され得る。
いくつかの例示的な実施形態において、本発明の組成物は、抗ＶＥＧＦタンパク質及びそのバリアント（オキソバリアントを含む）を含むことができ、この組成物中のタンパク質バリアントの量は、最大で約２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４．５％、４％、３．５％、３％、２．５％、２％、１．９％、１．８％、１．７％、１．６％、１．５％、１．４％、１．３％、１．２％、１．１％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％又は０．０％であり得、上記のうち１つ以上の範囲内である。そのような組成物は、捕捉クロマトグラフィー手順に供される抗ＶＥＧＦタンパク質及びそのバリアントを含むＣＤＭを使用して作製された、清澄化された回収物から得ることができる。捕捉工程は、例えばプロテインＡカラムを使用するアフィニティークロマトグラフィー手順であり、液体クロマトグラフィー－質量分析法（ＬＣ－ＭＳ）を使用して分析されるときには、１つ以上のこれらのバリアントが検出され得る。一態様において、こうした組成物の色は、例えば、欧州の黄褐色標準（ＢＹ２～ＢＹ３、ＢＹ３～ＢＹ４、ＢＹ４～ＢＹ５、若しくはＢＹ５～ＢＹ６）と同等の暗さ／強さであり、及び／又は約１７～２３、１０～１７、５～１０、３～５、若しくは１～３のＣＩＥのＬ＊、ａ＊、ｂ＊により特徴付けられるｂ＊値を有し、この組成物は、約５ｇ／Ｌ又は約１０ｇ／Ｌの抗ＶＥＧＦタンパク質を含む。
他の例示的な実施形態において、本発明の組成物は抗ＶＥＧＦタンパク質及びそのバリアントを含み、この組成物中のタンパク質バリアントの量は、約０％～約２０％であり得、例えば約０％～約２０％、約０．０５％～約２０％、約０．１％～約２０％、約０．２％～約２０％、約０．３％～約２０％、約０．４％～約２０％、約０．５％～約２０％、約０．６％～約２０％、約０．７％～約２０％、約０．８％～約２０％、約０．９％～約２０％、約１％～約２０％、約１．５％～約２０％、約２％～約２０％、約３％～約２０％、約４％～約２０％、約５％～約２０％、約６％～約２０％、約７％～約２０％、約８％～約２０％、約９％～約２０％、約１０％～約２０％、約０％～約１０％、約０．０５％～約１０％、約０．１％～約１０％、約０．２％～約１０％、約０．３％～約１０％、約０．４％～約１０％、約０．５％～約１０％、約０．６％～約１０％、約０．７％～約１０％、約０．８％～約１０％、約０．９％～約１０％、約１％～約１０％、約１．５％～約１０％、約２％～約１０％、約３％～約１０％、約４％～約１０％、約５％～約１０％、約６％～約１０％、約７％～約１０％、約８％～約１０％、約９％～約１０％、約０％～約７．５％、約０．０５％～約７．５％、約０．１％～約７．５％、約０．２％～約７．５％、約０．３％～約７．５％、約０．４％～約７．５％、約０．５％～約７．５％、約０．６％～約７．５％、約０．７％～約７．５％、約０．８％～約７．５％、約０．９％～約７．５％、約１％～約７．５％、約１．５％～約７．５％、約２％～約７．５％、約３％～約７．５％、約４％～約７．５％、約５％～約７．５％、約６％～約７．５％、約７％～約７．５％、約０％～約５％、約０．０５％～約５％、約０．１％～約５％、約０．２％～約５％、約０．３％～約５％、約０．４％～約５％、約０．５％～約５％、約０．６％～約５％、約０．７％～約５％、約０．８％～約５％、約０．９％～約５％、約１％～約５％、約１．５％～約５％、約２％～約５％、約３％～約５％、約４％～約５％であり得、上記のうち１つ以上の範囲内である。このような組成物は、回収試料上で捕捉クロマトグラフィーを実施して得ることができる。この捕捉工程は例えば、プロテインＡカラムを使用するアフィニティークロマトグラフィー手順である。試料が液体クロマトグラフィー－質量分析法（ＬＣ－ＭＳ）を使用して分析されるときには、１つ以上のこれらのバリアントが検出され得る。一態様において、こうした組成物の色は、例えば、欧州の黄褐色標準（ＢＹ２～ＢＹ３、ＢＹ３～ＢＹ４、ＢＹ４～ＢＹ５、若しくはＢＹ５～ＢＹ６）と同等の暗さ／強さであり、及び／又は約１７～２３、１０～１７、５～１０、３～５、若しくは１～３のＣＩＥのＬ＊、ａ＊、ｂ＊により特徴付けられるｂ＊値を有し、この組成物は、約５ｇ／Ｌ又は約１０ｇ／Ｌの抗ＶＥＧＦタンパク質を含む。
一実施形態において、本発明の組成物は、その酸性種を含む抗ＶＥＧＦタンパク質を含むことができ、この組成物中の酸性種の量は、約２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４．５％、４％、３．５％、３％、２．５％、２％、１．９％、１．８％、１．７％、１．６％、１．５％、１．４％、１．３％、１．２％、１．１％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％又は０．０％であり得、上記のうち１つ以上の範囲内である。上記で述べられるように、こうした酸性種は、例えばＷＣＸ（ＷＣＸ－１０ ＨＰＬＣ、弱陽イオン交換クロマトグラフィー）といったイオン交換、又はＩＥＦ（等電点電気泳動）といった様々な方法により検出され得る。一般に、酸性種はＣＥＸ中にメインピークよりも早く溶出し、又はＡＥＸ分析中にメインピークよりも遅く溶出する（図１６及び図１７を参照されたい）。酸性種を含む組成物は、回収物又はイオン交換クロマトグラフィーを使用したアフィニティー生成された材料といった生物学的材料から得ることができる。
一態様において、こうした組成物の色は、例えば、欧州の黄褐色標準（ＢＹ２～ＢＹ３、ＢＹ３～ＢＹ４、ＢＹ４～ＢＹ５、若しくはＢＹ５～ＢＹ６）と同等の暗さ／強さであり、及び／又は約１７～２３、１０～１７、５～１０、３～５、若しくは１～３のＣＩＥのＬ＊、ａ＊、ｂ＊により特徴付けられるｂ＊値を有し、この組成物は、約５ｇ／Ｌ又は約１０ｇ／Ｌを含む。一例としては、図１６及び図１７を参照すると、画分Ｆ１及びＦ２は、酸性種の大部分を含む酸性画分を表す。図１７におけるＭＴ１のピーク１及びピーク２は酸性種を含み、画分Ｆ１及びＦ２は、酸性画分の大部分を含む。このような酸性種（Ｆ１及びＦ２）を含む画分はまた、他の画分と比較すると黄褐色を示した（図１８Ｂ及び図１８Ｃ）。
別の実施形態において、本発明の組成物はその酸性種を含む抗ＶＥＧＦタンパク質を含み、この組成物中の酸性種の量は、約０％～約２０％であり得、例えば約０％～約２０％、約０．０５％～約２０％、約０．１％～約２０％、約０．２％～約２０％、約０．３％～約２０％、約０．４％～約２０％、約０．５％～約２０％、約０．６％～約２０％、約０．７％～約２０％、約０．８％～約２０％、約０．９％～約２０％、約１％～約２０％、約１．５％～約２０％、約２％～約２０％、約３％～約２０％、約４％～約２０％、約５％～約２０％、約６％～約２０％、約７％～約２０％、約８％～約２０％、約９％～約２０％、約１０％～約２０％、約０％～約１０％、約０．０５％～約１０％、約０．１％～約１０％、約０．２％～約１０％、約０．３％～約１０％、約０．４％～約１０％、約０．５％～約１０％、約０．６％～約１０％、約０．７％～約１０％、約０．８％～約１０％、約０．９％～約１０％、約１％～約１０％、約１．５％～約１０％、約２％～約１０％、約３％～約１０％、約４％～約１０％、約５％～約１０％、約６％～約１０％、約７％～約１０％、約８％～約１０％、約９％～約１０％、約０％～約７．５％、約０．０５％～約７．５％、約０．１％～約７．５％、約０．２％～約７．５％、約０．３％～約７．５％、約０．４％～約７．５％、約０．５％～約７．５％、約０．６％～約７．５％、約０．７％～約７．５％、約０．８％～約７．５％、約０．９％～約７．５％、約１％～約７．５％、約１．５％～約７．５％、約２％～約７．５％、約３％～約７．５％、約４％～約７．５％、約５％～約７．５％、約６％～約７．５％、約７％～約７．５％、約０％～約５％、約０．０５％～約５％、約０．１％～約５％、約０．２％～約５％、約０．３％～約５％、約０．４％～約５％、約０．５％～約５％、約０．６％～約５％、約０．７％～約５％、約０．８％～約５％、約０．９％～約５％、約１％～約５％、約１．５％～約５％、約２％～約５％、約３％～約５％、約４％～約５％であり得、上記のうち１つ以上の範囲内である。上で述べられるように、こうした酸性種は、例えばＷＣＸ（ＷＣＸ－１０ ＨＰＬＣ、弱陽イオン交換クロマトグラフィー）といったイオン交換、又はＩＥＦ（等電点電気泳動）といった様々な方法により検出され得る。典型的には、酸性種はＣＥＸ中にメインピークよりも早く溶出し、又はＡＥＸ分析中にメインピークよりも遅く溶出する（図１６及び図１７を参照されたい）。
陽イオン交換カラムを使用することで、関心対象のメインピーク前に溶出しているすべてのピークを酸性領域として合計し、関心対象のタンパク質後に溶出しているすべてのピークを塩基性領域として合計した。例示的な実施形態において、酸性種は２つ以上の酸性領域として溶出することができ、ピークの特定の保持時間及び使用されるイオン交換カラムに基づき、ＡＲ１、ＡＲ２、ＡＲ３などと番号付けされ得る。
一実施形態において、組成物は酸性種を含む抗ＶＥＧＦタンパク質を含むことができ、ＡＲ１は、２０％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４．５％、４％、３．５％、３％、２．５％、２％、１．９％、１．８％、１．７％、１．６％、１．５％、１．４％、１．３％、１．２％、１．１％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％又は０．０％であり、上記のうち１つ以上の範囲内である。一態様において、組成物はその酸性種を含む抗ＶＥＧＦタンパク質を含むことができ、ＡＲ１は、約０．０％～約１０％、約０．０％～約５％、約０．０％～約４％、約０．０％～約３％、約０．０％～約２％、約３％～約５％、約５％～約８％、又は約８％～約１０％、又は約１０％～約１５％であり、上記のうち１つ以上の範囲内である。上で述べられるように、こうした酸性領域は、例えばＷＣＸ（ＷＣＸ－１０ ＨＰＬＣ、弱陽イオン交換クロマトグラフィー）といったイオン交換、又はＩＥＦ（等電点電気泳動）といった様々な方法により検出され得る。一般に、酸性種はＣＥＸ中にメインピークよりも早く溶出し、又はＡＥＸ分析中にメインピークよりも遅く溶出する（図１６及び図１７を参照されたい）。
別の実施形態において、組成物は酸性種を含む抗ＶＥＧＦタンパク質を含むことができ、ＡＲ２は、２０％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４．５％、４％、３．５％、３％、２．５％、２％、１．９％、１．８％、１．７％、１．６％、１．５％、１．４％、１．３％、１．２％、１．１％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％又は０．０％であり、上記のうち１つ以上の範囲内である。一態様において、組成物は酸性種を含む抗ＶＥＧＦタンパク質を含むことができ、ＡＲ２は、約０．０％～約１０％、約０．０％～約５％、約０．０％～約４％、約０．０％～約３％、約０．０％～約２％、約３％～約５％、約５％～約８％、又は約８％～約１０％、又は約１０％～約１５％であり、上記のうち１つ以上の範囲内である。
一実施形態において、組成物は、その塩基性種を含む抗ＶＥＧＦタンパク質を含むことができ、この組成物中の塩基性種の量は、最大で約２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４．５％、４％、３．５％、３％、２．５％、２％、１．９％、１．８％、１．７％、１．６％、１．５％、１．４％、１．３％、１．２％、１．１％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％又は０．０％であり得、上記のうち１つ以上の範囲内である。一態様において、組成物は抗ＶＥＧＦタンパク質及びその塩基性種を含むことができ、抗ＶＥＧＦタンパク質と比較してこの組成物中の塩基性種の量は、約０％～約２０％であり得、例えば０％～約２０％、約０．０５％～約２０％、約０．１％～約２０％、約０．２％～約２０％、約０．３％～約２０％、約０．４％～約２０％、約０．５％～約２０％、約０．６％～約２０％、約０．７％～約２０％、約０．８％～約２０％、約０．９％～約２０％、約１％～約２０％、約１．５％～約２０％、約２％～約２０％、約３％～約２０％、約４％～約２０％、約５％～約２０％、約６％～約２０％、約７％～約２０％、約８％～約２０％、約９％～約２０％、約１０％～約２０％、約０％～約１０％、約０．０５％～約１０％、約０．１％～約１０％、約０．２％～約１０％、約０．３％～約１０％、約０．４％～約１０％、約０．５％～約１０％、約０．６％～約１０％、約０．７％～約１０％、約０．８％～約１０％、約０．９％～約１０％、約１％～約１０％、約１．５％～約１０％、約２％～約１０％、約３％～約１０％、約４％～約１０％、約５％～約１０％、約６％～約１０％、約７％～約１０％、約８％～約１０％、約９％～約１０％、約０％～約７．５％、約０．０５％～約７．５％、約０．１％～約７．５％、約０．２％～約７．５％、約０．３％～約７．５％、約０．４％～約７．５％、約０．５％～約７．５％、約０．６％～約７．５％、約０．７％～約７．５％、約０．８％～約７．５％、約０．９％～約７．５％、約１％～約７．５％、約１．５％～約７．５％、約２％～約７．５％、約３％～約７．５％、約４％～約７．５％、約５％～約７．５％、約６％～約７．５％、約７％～約７．５％、約０％～約５％、約０．０５％～約５％、約０．１％～約５％、約０．２％～約５％、約０．３％～約５％、約０．４％～約５％、約０．５％～約５％、約０．６％～約５％、約０．７％～約５％、約０．８％～約５％、約０．９％～約５％、約１％～約５％、約１．５％～約５％、約２％～約５％、約３％～約５％、約４％～約５％であり得、上記のうち１つ以上の範囲内である。
塩基性種は、２つ以上の塩基性領域として溶出することができ、ピークの特定の保持時間及び使用されるイオン交換に基づき、ＢＲ１、ＢＲ２、ＢＲ３などと番号付けされ得る。
一実施形態において、組成物は塩基性種を含む抗ＶＥＧＦタンパク質を含むことができ、ＢＲ１は、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４．５％、４％、３．５％、３％、２．５％、２％、１．９％、１．８％、１．７％、１．６％、１．５％、１．４％、１．３％、１．２％、１．１％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％又は０．０％であり、上記のうち１つ以上の範囲内である。一態様において、組成物は抗ＶＥＧＦタンパク質及びその塩基性種を含むことができ、ＢＲ１は、約０．０％～約１０％、約０．０％～約５％、約０．０％～約４％、約０．０％～約３％、約０．０％～約２％、約３％～約５％、約５％～約８％、又は約８％～約１０％、又は約１０％～約１５％であり、上記のうち１つ以上の範囲内である。
別の実施形態において、組成物は抗ＶＥＧＦタンパク質及びその塩基性種を含むことができ、ＢＲ２は、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４．５％、４％、３．５％、３％、２．５％、２％、１．９％、１．８％、１．７％、１．６％、１．５％、１．４％、１．３％、１．２％、１．１％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％又は０．０％であり、上記のうち１つ以上の範囲内である。一態様において、組成物は抗ＶＥＧＦタンパク質及び抗ＶＥＧＦタンパク質のその塩基性種を含むことができ、ＢＲ２は、約０．０％～約１０％、約０．０％～約５％、約０．０％～約４％、約０．０％～約３％、約０．０％～約２％、約３％～約５％、約５％～約８％、又は約８％～約１０％、又は約１０％～約１５％であり、上記のうち１つ以上の範囲内である。
別の実施形態において、組成物は抗ＶＥＧＦタンパク質及びその塩基性種を含むことができ、ＢＲ３は、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４．５％、４％、３．５％、３％、２．５％、２％、１．９％、１．８％、１．７％、１．６％、１．５％、１．４％、１．３％、１．２％、１．１％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％又は０．０％であり、上記のうち１つ以上の範囲内である。一態様において、組成物は抗ＶＥＧＦタンパク質及び抗ＶＥＧＦタンパク質のその塩基性種を含むことができ、ＢＲ３は、約０．０％～約１０％、約０．０％～約５％、約０．０％～約４％、約０．０％～約３％、約０．０％～約２％、約３％～約５％、約５％～約８％、又は約８％～約１０％、又は約１０％～約１５％であり、上記のうち１つ以上の範囲内である。
アフリベルセプトの光誘起酸化
ＣＤＭを使用して生成された抗ＶＥＧＦタンパク質組成物の異なる色特性又はそのバリアントの発見に加え、本発明者らはまた、光に曝露することで、実験室にてこうした組成物を人工的に生成することができることも発見した。
酸化を含む、改変された抗ＶＥＧＦ組成物のバリアントは、抗ＶＥＧＦタンパク質を冷白色光白色又は紫外線に曝露することで生成され得る。一態様において、抗ＶＥＧＦ組成物は、試料と比較すると１種以上の修飾オリゴペプチドにおいて約１．５～約５０倍の増加を含み、このオリゴペプチドは、
ＤＫＴＨ＊ＴＣ＊ＰＰＣ＊ＰＡＰＥＬＬＧ（配列番号１７）、ＥＩＧＬＬＴＣ＊ＥＡＴＶＮＧＨ＊ＬＹＫ（配列番号１８）、ＱＴＮＴＩＩＤＶＶＬＳＰＳＨ＊ＧＩＥＬＳＶＧＥＫ（配列番号１９）、ＴＥＬＮＶＧＩＤＦＮＷＥＹＰＳＳＫＨ＊ＱＨＫ（配列番号２０）、ＴＮＹＬＴＨ＊Ｒ（配列番号２１）、ＳＤＴＧＲＰＦＶＥＭＹＳＥＩＰＥＩＩＨ＊ＭＴＥＧＲ（配列番号２２）、ＶＨ＊ＥＫＤＫ（配列番号２３）、ＳＤＴＧＲＰＦＶＥＭ＊ＹＳＥＩＰＥＩＩＨＭＴＥＧＲ（配列番号６４）、ＳＤＴＧＲＰＦＶＥＭＹＳＥＩＰＥＩＩＨＭ＊ＴＥＧＲ（配列番号６５）、ＴＱＳＧＳＥＭ＊Ｋ（配列番号６６）、ＳＤＱＧＬＹＴＣ＊ＡＡＳＳＧＬＭ＊ＴＫ（配列番号６７）、ＩＩＷ＊ＤＳＲ（配列番号２８）、ＲＩＩＷ＊ＤＳＲ（配列番号１１５）、ＩＩＷ＊ＤＳＲＫ（配列番号１１４）、ＴＥＬＮＶＧＩＤＦＮＷ＊ＥＹＰＳＳＫ（配列番号２９）、ＧＦＩＩＳＮＡＴＹ＊Ｋ（配列番号６９）、ＫＦ＊ＰＬＤＴＬＩＰＤＧＫ（配列番号７０）Ｆ＊ＬＳＴＬＴＩＤＧＶＴＲ（配列番号３２）
からなる群から選択され、ここで、Ｈ＊はヒスチジンであり２－オキソ－ヒスチジンに酸化され、Ｃ＊はシステインでありカルボキシメチル化され、Ｍ＊は酸化メチオニンであり、Ｗ＊は酸化トリプトファンであり、Ｙ＊は酸化チロシンであり、Ｆ＊は酸化フェニルアラニンである。更なる態様において、抗ＶＥＧＦ組成物は、例えば約３０時間といった一定期間にわたり、抗ＶＥＧＦ組成物を冷白色光に曝露することにより１種以上の修飾オリゴペプチドにおいて約１．５～約１０倍の増加を含むことができる。別の態様において、抗ＶＥＧＦ組成物は、約７５時間にわたり、試料を冷白色光に曝露することにより１種以上の修飾オリゴペプチドにおいて約１．５～約１０倍の増加を含むことができる。更に別の態様において、抗ＶＥＧＦ組成物は、約１００時間にわたり、試料を冷白色光に曝露することにより、前に説明される１種以上のオリゴペプチドにおいて約１．５～約２０倍の増加を含むことができる。更に別の態様において、抗ＶＥＧＦ組成物は、約１５０時間にわたり、試料を冷白色光に曝露することにより、前に説明される１種以上のオリゴペプチドにおいて約１．５～約２０倍の増加を含むことができる。更に別の態様において、抗ＶＥＧＦ組成物は、約３００時間にわたり、試料を冷白色光に曝露することにより、１種以上のオリゴペプチドにおいて約１．５～約５０倍の増加を含むことができる（以下実施例４を参照されたい）。
抗ＶＥＧＦ組成物は、約４時間にわたり、抗ＶＥＧＦ組成物の試料を紫外線に曝露することにより、上で説明されるように、１種以上のオリゴペプチドにおいて約１．５～約３倍の増加を含むことができる。別の態様において、抗ＶＥＧＦ組成物は、約１０時間にわたり、試料を紫外線に曝露することにより１種以上のオリゴペプチドにおいて約１．５～約１０倍の増加を含むことができる。更に別の態様において、抗ＶＥＧＦ組成物は、約１６時間にわたり、試料を紫外線に曝露することにより、説明される１種以上のオリゴペプチドにおいて約１．５～約１０倍の増加を含むことができる。更に別の態様において、抗ＶＥＧＦ組成物は、約２０時間にわたり、試料を紫外線に曝露することにより１種以上のオリゴペプチドにおいて約１．５～約２５倍の増加を含むことができる。更に別の態様において、抗ＶＥＧＦ組成物は、約４０時間にわたり、試料マトリックスを紫外線に曝露することにより１種以上のオリゴペプチドにおいて約１．５～約２５倍の増加を含むことができる。実施例４を参照されたい。
糖質多様性－ＣＤＭを使用して生成された抗ＶＥＧＦタンパク質
本発明の組成物は抗ＶＥＧＦタンパク質を含み、ＣＤＭ中に生成された抗ＶＥＧＦタンパク質は様々な糖質多様性を有する。抗ＶＥＧＦタンパク質の異なるグリコシル化プロファイルは、本発明の範囲内である。
本発明のいくつかの例示的な実施形態において、この組成物は、以下のような１つ以上のアスパラギンにてグリコシル化された抗ＶＥＧＦタンパク質を含むことができる：Ｇ０－ＧｌｃＮＡｃグリコシル化、Ｇ１－ＧｌｃＮＡｃグリコシル化、Ｇ１Ｓ－ＧｌｃＮＡｃグリコシル化、Ｇ０グリコシル化、Ｇ１グリコシル化、Ｇ１Ｓグリコシル化、Ｇ２グリコシル化、Ｇ２Ｓグリコシル化、Ｇ２Ｓ２グリコシル化、Ｇ０Ｆグリコシル化、Ｇ２Ｆ２Ｓグリコシル化、Ｇ２Ｆ２Ｓ２グリコシル化、Ｇ１Ｆグリコシル化、Ｇ１ＦＳグリコシル化、Ｇ２Ｆグリコシル化、Ｇ２ＦＳグリコシル化、Ｇ２ＦＳ２グリコシル化、Ｇ３ＦＳグリコシル化、Ｇ３ＦＳ３グリコシル化、Ｇ０－２ＧｌｃＮＡｃグリコシル化、Ｍａｎ４グリコシル化、Ｍａｎ４＿Ａ１Ｇ１グリコシル化、Ｍａｎ４＿Ａ１Ｇ１Ｓ１グリコシル化、Ｍａｎ５グリコシル化、Ｍａｎ５＿Ａ１Ｇ１グリコシル化、Ｍａｎ５＿Ａ１Ｇ１Ｓ１グリコシル化、Ｍａｎ６グリコシル化、Ｍａｎ６＿Ｇ０＋リン酸グリコシル化、Ｍａｎ６＋リン酸グリコシル化、及び／又はＭａｎ７グリコシル化。一態様において、関心対象のタンパク質は、アフリベルセプト、抗ＶＥＧＦ抗体、又はＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐであり得る。
一実施形態において、この組成物は、以下のようなグリコシル化特性を有し得る：約４０％～約５０％の総フコシル化グリカン、約３０％～約５０％の総シアリル化グリカン、約６％～約１５％のマンノース－５、及び約６０％～約７９％のガラクトシル化グリカン。（実施例６）。
一実施形態において、組成物は、抗ＶＥＧＦタンパク質を含むことができ、関心対象のタンパク質は、アスパラギン１２３残基の約３２．４％、及び／又はアスパラギン１９６残基の約２７．１％で、Ｍａｎ５グリコシル化を有する。一態様において、関心対象のタンパク質は、アフリベルセプト、抗ＶＥＧＦ抗体、又はＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐであり得る。
別の実施形態において、この組成物は、約４０％、約４１％、約４２％、約４３％、約４４％、約４５％、約４６％、約４７％、約４８％、約４９％、又は約５０％の総フコシル化グリカンを有し得る。
更なる別の実施形態において、この組成物は、約３０％、約３１％、約３２％、約３３％、約３４％、約３５％、約３６％、約３７％、約３８％、約３９％、約４０％、約４１％、約４２％、約４３％、約４４％、約４５％、約４６％、約４７％、約４８％、約４９％、又は約５０％の総シアリル化グリカンを有し得る。
一実施形態において、組成物は、約６％、約７％、約８％、約８％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、又は約１５％のマンノース－５を含み得る。
別の実施形態において、この組成物は、約６０％、約６１％、約６２％、約６３％、約６４％、約６５％、約６６％、約６７％、約６８％、約６９％、約７０％、約７１％、約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、又は約７９％の総ガラクトシル化グリカンを有し得る。
一実施形態において、抗ＶＥＧＦタンパク質は、約１％、１．２％、１．５％、２％、２．２％、２．５％、３％、３．２％、３．５％、４％、４．２％、４．５％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％だけ減少したレベルのフコシル化グリカンを有し得る。ダイズ加水分解物を使用して産生された抗ＶＥＧＦタンパク質中のフコシル化グリカンのレベルと比較して、例えば１～１０％、１～１５％、１～２０％、１～２５％、１～３０％、１～３５％、１～４０％、１～４１％、１～４２％、１～４３％、１～４４％、１～４５％、１～４６％、１～４７％、１～４８％、１～４９％、１～５０％、２～１０％、２～１５％、２～２０％、２～２５％、２～３０％、２～３５％、２～４０％、２～４１％、２～４２％、２～４３％、２～４４％、２～４５％、２～４６％、２～４７％、２～４８％、２～４９％、２～５０％、３～１０％、３～１５％、３～２０％、３～２５％、３～３０％、３～３５％、３～４０％、３～４１％、３～４２％、３～４３％、３～４４％、３～４５％、３～４６％、３～４７％、３～４８％、３～４９％、３～５０％、４～１０％、４～１５％、４～２０％、４～２５％、４～３０％、４～３５％、４～４０％、４～４１％、４～４２％、４～４３％、４～４４％、４～４５％、４～４６％、４～４７％、４～４８％、４～４９％、４～５０％、又は１～９９％といった、上記の値のうち１つ以上の範囲内である。
一実施形態において、抗ＶＥＧＦタンパク質は、約１％、１．２％、１．５％、２％、２．２％、２．５％、３％、３．２％、３．５％、４％、４．２％、４．５％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％だけ減少したレベルのシアリル化グリカンを有し得る。ダイズ加水分解物を使用して産生された抗ＶＥＧＦタンパク質中のシアリル化グリカンのレベルと比較して、例えば１～１０％、１～１５％、１～２０％、１～２５％、１～３０％、１～３５％、１～４０％、１～４１％、１～４２％、１～４３％、１～４４％、１～４５％、１～４６％、１～４７％、１～４８％、１～４９％、１～５０％、２～１０％、２～１５％、２～２０％、２～２５％、２～３０％、２～３５％、２～４０％、２～４１％、２～４２％、２～４３％、２～４４％、２～４５％、２～４６％、２～４７％、２～４８％、２～４９％、２～５０％、３～１０％、３～１５％、３～２０％、３～２５％、３～３０％、３～３５％、３～４０％、３～４１％、３～４２％、３～４３％、３～４４％、３～４５％、３～４６％、３～４７％、３～４８％、３～４９％、３～５０％、４～１０％、４～１５％、４～２０％、４～２５％、４～３０％、４～３５％、４～４０％、４～４１％、４～４２％、４～４３％、４～４４％、４～４５％、４～４６％、４～４７％、４～４８％、４～４９％、４～５０％、又は１～９９％といった、上記の値のうち１つ以上の範囲内である。
別の実施形態において、抗ＶＥＧＦタンパク質は、約１％、１．２％、１．５％、２％、２．２％、２．５％、３％、３．２％、３．５％、４％、４．２％、４．５％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％だけ減少したレベルのガラクトシル化グリカンを有し得る。ダイズ加水分解物を使用して産生された抗ＶＥＧＦタンパク質中のガラクトシル化グリカンのレベルと比較して、例えば１～１０％、１～１５％、１～２０％、１～２５％、１～３０％、１～３５％、１～４０％、１～４１％、１～４２％、１～４３％、１～４４％、１～４５％、１～４６％、１～４７％、１～４８％、１～４９％、１～５０％、２～１０％、２～１５％、２～２０％、２～２５％、２～３０％、２～３５％、２～４０％、２～４１％、２～４２％、２～４３％、２～４４％、２～４５％、２～４６％、２～４７％、２～４８％、２～４９％、２～５０％、３～１０％、３～１５％、３～２０％、３～２５％、３～３０％、３～３５％、３～４０％、３～４１％、３～４２％、３～４３％、３～４４％、３～４５％、３～４６％、３～４７％、３～４８％、３～４９％、３～５０％、４～１０％、４～１５％、４～２０％、４～２５％、４～３０％、４～３５％、４～４０％、４～４１％、４～４２％、４～４３％、４～４４％、４～４５％、４～４６％、４～４７％、４～４８％、４～４９％、４～５０％、又は１～９９％といった、上記の値のうち１つ以上の範囲内である。
一実施形態において、抗ＶＥＧＦタンパク質は、約１％、１．２％、１．５％、２％、２．２％、２．５％、３％、３．２％、３．５％、４％、４．２％、４．５％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％だけ増加したレベルのマンノシル化グリカンを有し得る。ダイズ加水分解物を使用して産生された抗ＶＥＧＦタンパク質中のマンノシル化グリカンのレベルと比較して、例えば１～１０％、１～１５％、１～２０％、１～２５％、１～３０％、１～３５％、１～４０％、１～４１％、１～４２％、１～４３％、１～４４％、１～４５％、１～４６％、１～４７％、１～４８％、１～４９％、１～５０％、２～１０％、２～１５％、２～２０％、２～２５％、２～３０％、２～３５％、２～４０％、２～４１％、２～４２％、２～４３％、２～４４％、２～４５％、２～４６％、２～４７％、２～４８％、２～４９％、２～５０％、３～１０％、３～１５％、３～２０％、３～２５％、３～３０％、３～３５％、３～４０％、３～４１％、３～４２％、３～４３％、３～４４％、３～４５％、３～４６％、３～４７％、３～４８％、３～４９％、３～５０％、４～１０％、４～１５％、４～２０％、４～２５％、４～３０％、４～３５％、４～４０％、４～４１％、４～４２％、４～４３％、４～４４％、４～４５％、４～４６％、４～４７％、４～４８％、４～４９％、４～５０％、又は１～９９％といった、上記の値のうち１つ以上の範囲内である。
このセクションで説明される組成物は、以下のセクションＩＶ及びＶのそれぞれにおいて説明される、複数の上流パラメータ及び下流パラメータにより生成され得る。
ＩＶ．上流プロセス技術を使用した組成物の調製
バイオ医薬品の場合、頑強で柔軟性のある上流プロセスの実装が望ましい。効率的な上流プロセスは、関心対象のタンパク質の望ましい産生及びスケールアップにつながり得る。本発明者らは、抗ＶＥＧＦタンパク質を含む本発明の組成物は、ＣＤＭの培地成分の変更など、上流でのタンパク質産生中の条件を調整することで生成され得る。上流プロセスの各工程は、製造されるタンパク質の品質、純度及び量に影響を与え得る。
本開示は、ＣＤＭを使用して産生されたアフリベルセプト及び／又はＭｉｎｉＴｒａｐの特定のバリアントの存在を証明する。これらのバリアントは、１つ以上の酸化アミノ酸残基を含むアイソフォームを含む。酸化残基の例としては、１つ以上のヒスチジン残基、トリプトファン残基、メチオニン残基、フェニルアラニン残基、又はチロシン残基を含むがこれらに限定されない。改変ＣＤＭを使用することにより生成された組成物は、アフリベルセプト及び／又はＭｉｎｉＴｒａｐのタンパク質バリアントの所望の目標値を伴った、抗ＶＥＧＦタンパク質の調製物を産生することができる。上で言及したように、ＣＤＭを使用して産生された断片と関連する黄褐色もまた存在し得る。（上で言及したように、本発明者らにより検査されたＣＤＭのすべてが明確な変色を示したわけではない。）
本発明は、細胞が関心対象の組換えタンパク質を発現する好適な条件の下で改変ＣＤＭ中の宿主細胞を培養することと、続いて細胞により産生された関心対象の組換えタンパク質の調製物を回収することと、を含む。こうした改変ＣＤＭは、上のセクションＩＩＩにて説明された組成物を生成するために使用され得る。（なお、ＣＤＭは、アフリベルセプトが発現されるときには黄褐色である培地であることに注意されたい。）
一実施形態において、この方法は、好適な条件の下で、アフリベルセプトなどの関心対象の組換えタンパク質を発現する宿主細胞をＣＤＭ中で培養する工程を含む。この方法は、細胞により産生された関心対象の組換えタンパク質の調製物を回収する工程を更に含み、好適な条件は、以下を有するＣＤＭを含む：約５５μＭ未満である当該ＣＤＭ中の鉄の累積濃度、約０．８μＭ以下である当該ＣＤＭ中の銅の累積濃度、約０．４０μＭ以下である当該ＣＤＭ中のニッケルの累積濃度、約５６μＭ以下である当該ＣＤＭ中の亜鉛の累積濃度、約１０ｍＭ未満である当該ＣＤＭ中のシステインの累積濃度、及び／又は単一の抗酸化剤に対して約０．００１ｍＭ～約１０ｍＭの濃度である当該ＣＤＭ中の抗酸化剤、及び複数の抗酸化剤が当該ＣＤＭに加えられる場合、約３０ｍＭ以下である累積濃度。
本実施形態の一態様において、好適な条件を使用することで得られた調製物は、アフリベルセプト及びＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐのタンパク質バリアントの望ましい量（アフリベルセプト及びＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐのタンパク質バリアントの「目標値」と称される）まで、アフリベルセプト及びＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐのタンパク質バリアントの減少をもたらす。本実施形態の更なる態様において、好適な条件を使用することで得られた調製物は、アフリベルセプト及びＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐのバリアントを含むタンパク質の調製物を５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ又はそれ以上の濃度に正規化するときには、所望のＢＹ値（「目標ＢＹ値」と称される）まで調製物の色の低減をもたらす。
本実施形態の更なる態様において、目標ＢＹ値及び／又はバリアントの目標値は、力価が増加するか又は著しく減少しない場合には調製物において得ることが可能である（例５を参照されたい）。
いくつかの実施形態において、改変ＣＤＭを使用することにより生成される組成物は、所望の目標のＢＹ値を伴う抗ＶＥＧＦタンパク質の調製物を生成することができる。この調製物の色は、以下：
（ｉ）欧州の色標準ＢＹ２と同程度の黄褐色；
（ｉｉ）欧州の色標準ＢＹ３と同程度の黄褐色；
（ｉｉｉ）欧州の色標準ＢＹ４と同程度の黄褐色；
（ｉｖ）欧州の色標準ＢＹ５と同程度の黄褐色；
（ｖ）欧州の色標準でＢＹ２～ＢＹ３の間；
（ｖｉ）欧州の色標準でＢＹ３～ＢＹ４の間；
（ｖｉｉ）欧州の色標準でＢＹ４～ＢＹ５の間
のように特徴付けられ、この組成物は約５ｇ／Ｌ又は約１０ｇ／Ｌの抗ＶＥＧＦタンパク質を含み、この組成物の試料は清澄化された回収物であるプロテインＡ溶出液からの試料として得ることができる。以下の実施例９、表９－３で確認されるように、５ｇ／Ｌのアフリベルセプトを含むプロテインＡ溶出液は、黄褐色を呈し、これは１．７７のｂ＊値を有すると測定される。ＡＥＸ後の下流で生成されたとき、こうした試料は、０．５０のｂ＊値を有した。これは、試料の黄褐色を低下させるＡＥＸの有用性を実証している（表９－３）。
改変ＣＤＭを使用することにより生成される組成物は、抗ＶＥＧＦタンパク質の調製物を生成することができ、この調製物の色は、ＣＩＥＬＡＢスケール：
（ｉ）約２２～２３のｂ＊値と同程度の黄褐色；
（ｉｉ）約１６～１７のｂ＊値と同程度の黄褐色；
（ｉｉｉ）９～１０のｂ＊値と同程度の黄褐色；
（ｉｖ）４～５のｂ＊値と同程度の黄褐色；
（ｖ）２～３のｂ＊値と同程度の黄褐色；
（ｖｉ）１７～２３のｂ＊値；
（ｖｉｉ）１０～１７のｂ＊値；
（ｖｉｉｉ）５～１０のｂ＊値；
（ｉｘ）３～５のｂ＊値；又は
（ｘ）１～３のｂ＊値
での認められた標準色特性評価により特徴付けられ、この場合、この組成物は約５ｇ／Ｌ又は約１０ｇ／Ｌの抗ＶＥＧＦタンパク質を含み、この組成物は清澄化された回収物であるプロテインＡ溶出液からの試料として得られる。実施例９、表９－３を参照されたい。
改変ＣＤＭを形成するために細胞培養物に加えられる成分に関して、用語「累積量」は、ＣＤＭを形成する細胞培養の過程を通じてバイオリアクタに加えられる特定成分の総量を指し、これは培養の開始時（０日目のＣＤＭ）で加えられた量及び順次加えられた成分の量を含む。成分の累積量を計算するときには、バイオリアクタでの産生前（すなわち、０日目のＣＤＭ前）にシードトレイン培養又は種菌に加えられる成分の量もまた含まれる。累積量は、培養中の経時的な成分の損失（例えば、代謝又は化学分解による）により影響を受けることはない。したがって、例えば、成分が異なる時期に２つの培養物に加えられる場合（例えば、ある培養物においてはそのすべての成分が最初に加えられ、別の培養物においては、成分が経時的に加えられる場合）、成分について同じ累積量を有する２つの培養物であったとしても、異なる絶対レベルを有する場合がある。累積量はまた、培養中に経時的に成分をその場で合成させることで（例えば、代謝又は化学的変換による）影響を受けることはない。したがって、例えば成分が、生物変換プロセスの途中、２つの培養物のうち一方の中でその場で合成される場合には、所与の成分の同じ累積量を有する２つの培養物であったとしても異なる絶対レベルを有する場合がある。累積量は、例えば成分のグラム又はモルといった単位で表すことができる。用語「累積濃度」は、培養物中で使用される任意の種菌由来の開始体積への追加を含む、製造バッチの開始時にバイオリアクタ内の液体の体積で割った成分の累積量を指す。例えば、バイオリアクタが製造バッチの開始時に２リットルの細胞培養培地を含有し、１グラムの成分Ｘが、０日目、１日目、２日目、及び３日目に加えられる場合には、３日目以降の累積濃度は２ｇ／Ｌである（すなわち、４グラムを２リットルで割る）。仮に４日目に、成分Ｘを含有しない１リットルの追加の液体をバイオリアクタに加えても、累積濃度は２ｇ／Ｌのままである。仮に５日目に、いくらかの量の液体がバイオリアクタから失われる（例えば蒸発による）としても、累積濃度は２ｇ／Ｌのままである。累積濃度は例えば、グラム／リットル、又はモル／リットルといった単位で表され得る。
Ａ．アミノ酸：
いくつかの実施形態において、改変ＣＤＭは、ＣＤＭ中のアミノ酸の累積濃度を減少又は増加させることにより得ることができる。こうしたアミノ酸の非限定的な例としては、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリン（又はこれらの塩）が挙げられる。改変ＣＤＭにおけるこれらのアミノ酸の累積量における増加又は減少は、出発ＣＤＭと比較すると、約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％であることができ、上記のうち１つ以上の範囲内である。代替的には、改変ＣＤＭ中の１種以上のアミノ酸の累積量の増加又は減少は、未改変ＣＤＭと比較すると、約５～約２０％、約１０～約３０％、約３０％～約４０％、約３０％～約５０％、約４０％～約６０％、約６０％～約７０％、約７０％～約８０％、約８０％～約９０％、又は約９０％～約１００％であることができ、上記のうち１つ以上の範囲内である（図２５～２７及び実施例５を参照されたい）。
いくつかの実施形態において、改変ＣＤＭは、ＣＤＭ中のシステインの累積濃度を減少させることにより得ることができる。改変ＣＤＭを形成するため、ＣＤＭ中のシステインの量における減少は、未改変ＣＤＭと比較すると、約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％であることができ、上記のうち１つ以上の範囲内である。代替的には、改変ＣＤＭ中のシステインの累積量の減少は、ＣＤＭと比較すると、約５～約２０％、約１０～約３０％、約３０％～約４０％、約３０％～約５０％、約４０％～約６０％、約６０％～約７０％、約７０％～約８０％、約８０％～約９０％、又は約９０％～約１００％であることができ、上記のうち１つ以上の範囲内である。一態様において、改変ＣＤＭ中の累積システインの量は、約１ｍＭ未満、約２ｍＭ未満、約３ｍＭ未満、約４ｍＭ未満、約５ｍＭ未満、約６ｍＭ未満、約７ｍＭ未満、約８ｍＭ未満、約９ｍＭ未満、又は約１０ｍＭ未満である（図２５～２７及び実施例５を参照されたい）。
いくつかの実施形態において、改変ＣＤＭは、ＣＤＭ中の累積システインの少なくともある特定の割合をシスチンで置換することにより得ることができる。置換は、未改変ＣＤＭと比較すると、約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％であることができ、上記のうち１つ以上の範囲内である。代替的には、置換は、未改変ＣＤＭと比較すると、約５％～約２０％、約１０％～約３０％、約３０％～約４０％、約３０％～約５０％、約４０％～約６０％、約６０％～約７０％、約７０％～約８０％、約８０％～約９０％、又は約９０％～約１００％であることができ、上記のうち１つ以上の範囲内である（図２５～２７及び実施例５を参照されたい）。
いくつかの実施形態において、改変ＣＤＭは、ＣＤＭ中の累積システインの少なくともある特定の割合を硫酸システインで置換することにより得ることができる。置換は、未改変ＣＤＭと比較すると、約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％であることができ、上記のうち１つ以上の範囲内である。代替的には、置換は、未改変ＣＤＭと比較すると、約５～約２０％、約１０～約３０％、約３０％～約４０％、約３０％～約５０％、約４０％～約６０％、約６０％～約７０％、約７０％～約８０％、約８０％～約９０％、又は約９０％～約１００％であることができ、上記のうち１つ以上の範囲内である。
Ｂ．金属：
いくつかの実施形態において、改変ＣＤＭは、ＣＤＭ中の金属の累積濃度を減少又は増加させることにより得ることができる。金属の非限定的な例としては、鉄、銅、マンガン、モリブデン、亜鉛、ニッケル、カルシウム、カリウム及びナトリウムが挙げられる。改変ＣＤＭにおける１種以上の金属の量における増加又は減少は、未改変ＣＤＭと比較すると、約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％であることができ、上記のうち１つ以上の範囲内である。代替的には、改変ＣＤＭ中の１種以上の金属の累積量の増加又は減少は、未改変ＣＤＭと比較すると、約５～約２０％、約１０～約３０％、約３０％～約４０％、約３０％～約５０％、約４０％～約６０％、約６０％～約７０％、約７０％～約８０％、約８０％～約９０％、又は約９０％～約１００％であることができ、上記のうち１つ以上の範囲内である（図２５～２７及び実施例５を参照されたい）。
Ｃ．抗酸化剤：
いくつかの実施形態において、改変ＣＤＭは１種以上の抗酸化剤を含む。抗酸化剤の非限定的な例としては、タウリン、ヒポタウリン、グリシン、チオクト酸、グルタチオン、塩化コリン、ヒドロコルチゾン、ビタミンＣ、ビタミンＥ、及びこれらの組合せであり得る（図２８Ａ～E及び実施例５を参照されたい）。
いくつかの実施形態において、改変ＣＤＭは、約０．０１ｍＭ～約２０ｍＭのタウリン、すなわち、０．０１ｍＭ～約１ｍＭ、約０．０１ｍＭ～約５ｍＭ、約０．０１ｍＭ～約１０ｍＭ、０．１ｍＭ～約１ｍＭ、約０．１ｍＭ～約５ｍＭ、約０．１ｍＭ～約１０ｍＭ、約１ｍＭ～約５ｍＭ、約１ｍＭ～約１０ｍＭを含み、及び上記のうち１つ以上の範囲内である。
いくつかの実施形態において、改変ＣＤＭは、約０．０１ｍＭ～約２０ｍＭのヒポタウリン、すなわち、０．０１ｍＭ～約１ｍＭ、約０．０１ｍＭ～約５ｍＭ、約０．０１ｍＭ～約１０ｍＭ、０．１ｍＭ～約１ｍＭ、約０．１ｍＭ～約５ｍＭ、約０．１ｍＭ～約１０ｍＭ、約１ｍＭ～約５ｍＭ、約１ｍＭ～約１０ｍＭを含み、及び上記のうち１つ以上の範囲内である。
いくつかの実施形態において、改変ＣＤＭは、約０．０１ｍＭ～約２０ｍＭのグリシン、すなわち、０．０１ｍＭ～約１ｍＭ、約０．０１ｍＭ～約５ｍＭ、約０．０１ｍＭ～約１０ｍＭ、０．１ｍＭ～約１ｍＭ、約０．１ｍＭ～約５ｍＭ、約０．１ｍＭ～約１０ｍＭ、約１ｍＭ～約５ｍＭ、約１ｍＭ～約１０ｍＭを含み、及び上記のうち１つ以上の範囲内である。
いくつかの実施形態において、改変ＣＤＭは、約０．０１μＭ～約５μＭのチオクト酸、すなわち、約０．０１μＭ～約０．１μＭ、約０．１μＭ～約１μＭ、約１μＭ～約２．５μＭ、約１μＭ～約３μＭ、約１μＭ～約５μＭを含み、及び上記のうち１つ以上の範囲内である。
いくつかの実施形態において、改変ＣＤＭは、約０．０１Ｍ～約５ｍＭのグルタチオン、すなわち、０．０１ｍＭ～約１ｍＭ、０．１ｍＭ～約１ｍＭ、約０．１ｍＭ～約５ｍＭ、約１ｍＭ～約５ｍＭを含み、及び上記のうち１つ以上の範囲内である。
いくつかの実施形態において、改変ＣＤＭは、約０．０１μＭ～約５μＭのヒドロコルチゾン、すなわち、約０．０１μＭ～約０．１μＭ、約０．１μＭ～約１μＭ、約１μＭ～約２．５μＭ、約１μＭ～約３μＭ、約１μＭ～約５μＭを含み、及び上記のうち１つ以上の範囲内である。
いくつかの実施形態において、改変ＣＤＭは、約１μＭ～約５０μＭのビタミンＣ、すなわち、約１μＭ～約５μＭ、約５μＭ～約２０μＭ、約１０μＭ～約３０μＭ、約５μＭ～約３０μＭ、約２０μＭ～約５０μＭ、約２５μＭ～約５０μＭを含み、及び上記のうち１つ以上の範囲内である。
Ｄ．グリコシル化を調整するための培地に対する変更：
本開示はまた、ＣＤＭ中のある特定の成分の累積濃度を変更することにより、抗ＶＥＧＦタンパク質のグリコシル化を調整する方法も含む。ＣＤＭに加えられる成分の累積量に基づき、フコシル化の合計％、ガラクトシル化の合計％、シアリル化の合計％及びマンノース－５を変更することができる。
例示的な実施形態において、抗ＶＥＧＦタンパク質のグリコシル化を調整する方法は、ウリジンを含むＣＤＭを追加することを含み得る。抗ＶＥＧＦタンパク質は、約４０％～約５５％の総フコシル化グリカン、約３０％～約５０％の総シアリル化グリカン、約２％～約１５％のマンノース－５、及び約６０％～約７９％のガラクトシル化グリカンを有し得る（以下の実施例６を参照されたい）。
いくつかの実施形態において、抗ＶＥＧＦタンパク質のグリコシル化を調整する方法は、マンガンをＣＤＭに追加することを含み得る。一態様において、ＣＤＭは追加前にはマンガンを欠いている。抗ＶＥＧＦタンパク質は、約４０％～約５０％の総フコシル化グリカン、約３０％～約５５％の総シアリル化グリカン、約２％～約１５％のマンノース－５、及び約６０％～約７９％のガラクトシル化グリカンを有し得る（以下の実施例６を参照されたい）。
いくつかの実施形態において、抗ＶＥＧＦタンパク質のグリコシル化を調整する方法は、ガラクトースをＣＤＭに追加することを含み得る。一態様において、ＣＤＭは追加前にはガラクトースを欠いている。抗ＶＥＧＦタンパク質は、約４０％～約５０％の総フコシル化グリカン、約３０％～約５５％の総シアリル化グリカン、約２％～約１５％のマンノース－５、及び約６０％～約７９％のガラクトシル化グリカンを有し得る（実施例６）。
いくつかの実施形態において、抗ＶＥＧＦタンパク質のグリコシル化を調整する方法は、デキサメタゾンをＣＤＭに追加することを含み得る。一態様において、ＣＤＭは追加前にはデキサメタゾンを欠いている。抗ＶＥＧＦタンパク質は、約４０％～約５０％の総フコシル化グリカン、約３０％～約５５％の総シアリル化グリカン、約２％～約１５％のマンノース－５、及び約６０％～約７９％のガラクトシル化グリカンを有し得る（以下の実施例６を参照されたい）。
いくつかの実施形態において、抗ＶＥＧＦタンパク質のグリコシル化を調整する方法は、ウリジン、マンガン、ガラクトース、及びデキサメタゾンのうち１つ以上をＣＤＭに追加することを含み得る。一態様において、ＣＤＭは追加前には、ウリジン、マンガン、ガラクトース及びデキサメタゾンのうち１つ以上を欠いている。抗ＶＥＧＦタンパク質は、約４０％～約５０％の総フコシル化グリカン、約３０％～約５５％の総シアリル化グリカン、約２％～約１５％のマンノース－５、及び約６０％～約７９％のガラクトシル化グリカンを有し得る（実施例６）。
Ｖ．下流プロセス技術を使用した組成物の調製
本発明の抗ＶＥＧＦタンパク質を含む組成物は、下流タンパク質産生中の条件を調整することにより産生され得る。本発明者らは、下流手順を最適化させることで、抗ＶＥＧＦタンパク質の特定のバリアントが最小化し、かつこれが変色することを発見した。下流プロセスの最適化により、オキソバリアントが減少し、かつ色特性が最適化された組成物を生成することができる。
下流プロセス技術は、単独で、又は上記セクションＩＶに説明される上流プロセス技術と組み合わせて使用されてもよい。
Ａ．陰イオン交換クロマトグラフィー：
いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、ＣＤＭ中の宿主細胞で抗ＶＥＧＦタンパク質を発現させることを含むプロセスに関与し得、この場合、抗ＶＥＧＦタンパク質は宿主細胞から培地へと分泌され、清澄化された回収物が得られる。この回収物は、以下：（ａ）回収物から得られた生物学的試料を、陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）に負荷する工程、（ｂ）好適な洗浄バッファでＡＥＸカラムを洗浄する工程、（ｃ）（１つ以上の）フロースルー画分を収集する工程、任意で（ｄ）好適なストリップバッファでカラムを洗浄する工程、及び（ｅ）ストリップされた画分を収集する工程に供される。
フロースルー画分は、陰イオン交換クロマトグラフィーカラムのストリップ画分中のオキソバリアントと比較すると、約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％の抗ＶＥＧＦタンパク質試料である抗ＶＥＧＦタンパク質のオキソバリアントを含み得る。例えば、表９－５及び表９－６を参照すると、フロースルー画分は、抗ＶＥＧＦタンパク質の酸化バリアントを含む。この場合、いくつかのヒスチジン及びトリプトファン残基は、ストリップ画分中の酸化バリアントと比較すると、約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％（及び上記のうち１つ以上の範囲内で）酸化される。
ＡＥＸカラム用の平衡化バッファ及び洗浄バッファの両方のｐＨは、約８．２０～約８．６０であり得る。別の態様において、ＡＥＸカラム用の平衡化バッファ及び洗浄バッファの両方の伝導度は、約１．５０～約３．０ｍＳ／ｃｍであり得る。一態様において、平衡化バッファ及び洗浄バッファは約５０ｍＭのトリス塩酸であり得る。一態様においては、ストリップバッファは２Ｍの塩化ナトリウム又は１Ｎ水酸化ナトリウム、又はその両方を含む（表２－２を参照されたい）。実施例２は、平衡化バッファ及び洗浄バッファの濃度及び伝導度の最適化を更に例示している。
タンパク質バリアントは、以下のような１つ以上の残基の修飾を含み得る：１つ以上のアスパラギンが脱アミド化される；１つ以上のアスパラギン酸がイソアスパルタート及び／又はＡｓｎに変換される；１つ以上のメチオニンが酸化される；１つ以上のトリプトファンがＮ－ホルミルキヌレニンに変換される；１つ以上のトリプトファンがモノ－ヒドロキシルトリプトファンである；１つ以上のトリプトファンがジ－ヒドロキシルトリプトファンである；１つ以上のトリプトファンがトリ－ヒドロキシルトリプトファンである；１つ以上のアルギニンがＡｒｇ３－デオキシグルコソンに変換される；Ｃ末端グリシンが存在しない；並びに／又は１つ以上の非グリコシル化グリコサイトが存在する。
関心対象のタンパク質は、アフリベルセプト、抗ＶＥＧＦ抗体、又はＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐであり得る。タンパク質バリアントは、以下のうち１つ以上によって形成され得る：（ｉ）Ｈｉｓ８６、Ｈｉｓ１１０、Ｈｉｓ１４５、Ｈｉｓ２０９、Ｈｉｓ９５、Ｈｉｓ１９、及び／若しくはＨｉｓ２０３（又はアフリベルセプトのある特定の構造特性を共有するタンパク質上の同等の残基位置）から選択されるヒスチジン残基からのヒスチジンの酸化、（ｉｉ）Ｔｒｐ５８及び／若しくはＴｒｐ１３８（又はアフリベルセプトのある特定の構造特性を共有するタンパク質上の同等の残基位置）でのトリプトファン残基から選択されるトリプトファン残基の酸化、（ｉｉｉ）Ｔｙｒ６４（又はアフリベルセプトのある特定の構造特性を共有するタンパク質上の同等の位置）でのチロシン残基の酸化、（ｉｖ）Ｐｈｅ４４及び／若しくはＰｈｅ１６６（又はアフリベルセプトのある特定の構造特性を共有するタンパク質上の同等の残基位置）から選択されるフェニルアラニン残基の酸化、並びに／又は（ｖ）Ｍｅｔ１０、Ｍｅｔ２０、Ｍｅｔ１６３、及び／若しくはＭｅｔ１９２（又はアフリベルセプトのある特定の構造特性を共有するタンパク質上の同等の残基位置）から選択されるメチオニン残基の酸化。
フロースルー画分は以下のうち１つ以上を含み得る：
（ａ）２－オキソ－ヒスチジンに酸化されているヒスチジン残基の割合であって、それらの色特性は以下：
（ｉ）欧州の色標準ＢＹ２と同程度の黄褐色；
（ｉｉ）欧州の色標準ＢＹ３と同程度の黄褐色；
（ｉｉｉ）欧州の色標準ＢＹ４と同程度の黄褐色；
（ｉｖ）欧州の色標準ＢＹ５と同程度の黄褐色；
（ｖ）欧州の色標準でＢＹ２～ＢＹ３の間；
（ｖｉ）欧州の色標準でＢＹ３～ＢＹ４の間；
（ｖｉｉ）欧州の色標準でＢＹ４～ＢＹ５の間
であり、この組成物は約５ｇ／Ｌ又は約１０ｇ／Ｌの抗ＶＥＧＦタンパク質を含み、この組成物はフロースルー画分からの試料として得られる。
（ｂ）２－オキソ－ヒスチジンに酸化されているヒスチジン残基の割合。更には、これらの色は、ＢＹ２、ＢＹ３、ＢＹ４、ＢＹ５、ＢＹ６、ＢＹ７の色に近く、又はＢＹ２よりも暗くなく／強くもなく、ＢＹ３よりも暗くなく、ＢＹ４よりも暗くなく、ＢＹ５よりも暗くなく、ＢＹ６よりも暗くなく、ＢＹ７よりも暗くなく、又はＢＹ２～ＢＹ３の間であり、ＢＹ２～ＢＹ４の間であり、ＢＹ３～ＢＹ４の間であり、又はＢＹ３～ＢＹ５の間である、黄褐色を有することで特徴付けられる。
（ｃ）２－オキソ－ヒスチジンに酸化されているヒスチジン残基の割合であり、それらの色は以下：
（ｉ）約２２～２３のｂ＊値と同程度の黄褐色；
（ｉｉ）約１６～１７のｂ＊値と同程度の黄褐色；
（ｉｉｉ）９～１０のｂ＊値と同程度の黄褐色；
（ｉｖ）４～５のｂ＊値と同程度の黄褐色；
（ｖ）２～３のｂ＊値と同程度の黄褐色；
（ｖｉ）１７～２３のｂ＊値；
（ｖｉｉ）１０～１７のｂ＊値；
（ｖｉｉｉ）５～１０のｂ＊値；
（ｉｘ）３～５のｂ＊値；又は
（ｘ）１～３のｂ＊値
のようなＣＩＥのＬ＊、ａ＊、ｂ＊色空間における色により特徴付けられ、この場合、この組成物は、約５ｇ／Ｌ又は約１０ｇ／Ｌの抗ＶＥＧＦタンパク質を含み、この組成物は、フロースルー画分からの試料として得られる。
（ｄ）組成物中、約１％以下、約０．１％以下、又は約０．１～１％、約０．２～１％、約０．３～１％、約０．４～１％、約０．５～１％、約０．６～１％、約０．７～１％、約０．８～１％、又は約０．９～１％のヒスチジン残基は２－オキソ－ヒスチジンに酸化される。割合の計算はセクションＩＩに説明される。
Ｂ．アフィニティークロマトグラフィー：
いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、宿主細胞で抗ＶＥＧＦタンパク質を発現させることを含むプロセスを使用して生成され得、この場合、抗ＶＥＧＦタンパク質は宿主細胞から培地へと分泌され、清澄化された回収物が得られる。この回収物は、以下を含む工程に供される：（ａ）清澄化された回収物から得られた生物学的試料を、アフィニティークロマトグラフィーカラムに負荷する工程であって、アフィニティークロマトグラフィーが抗ＶＥＧＦタンパク質に選択的又は特異的に結合可能なタンパク質を含む、工程、（ｂ）好適な溶出バッファでアフィニティークロマトグラフィーカラムを洗浄する工程、及び（ｃ）（１つ以上の）溶出画分を収集する工程。例えば、表７－１及び表７－７～７－１０に例示されるように、抗ＶＥＧＦタンパク質に選択的又は特異的に結合可能であるタンパク質としてＶＥＧＦ１６５を使用し、かつ上記方法に従い、溶出画分を収集することで、ＭＴ５（抗ＶＥＧＦタンパク質）、アフリベルセプト及び抗ＶＥＧＦ ｓｃＦｖ断片の首尾よい生成につながった。表７－１はまた、ＭＴ５に選択的又は特異的に結合可能である異なるタンパク質として、（ｉ）ｍＡｂ１（配列番号７３は重鎖であり、配列番号７４は軽鎖である、マウスの抗－ＶＥＧＦＲ１ ｍＡｂヒトＩｇＧ１）、（ｉｉ）ｍＡｂ２（配列番号７５は重鎖であり、配列番号７６は軽鎖である、マウスの抗ＶＥＧＦＲ１ ｍＡｂヒトＩｇＧ１）、（ｉｉｉ）ｍＡｂ３（配列番号７７は重鎖であり、配列番号７８は軽鎖である、マウスの抗－ＶＥＧＦＲ１ ｍＡｂマウスＩｇＧ１）、及び（ｉｖ）ｍＡｂ４（配列番号７９は重鎖であり、配列番号８０は軽鎖である、マウスの抗－ＶＥＧＦＲ１ ｍＡｂマウスＩｇＧ１）、を使用するＭＴ５の首尾よい生成を開示する。
上の工程（ａ）に関して、アフィニティーカラムへと負荷される生物学的試料は、イオン交換クロマトグラフィー（陰イオン又は陽イオンのいずれか）を含むがこれに限定されないアフィニティー前に、清澄化された回収物を生成に供することが可能である試料に由来し得る。当業者に周知である他のクロマトグラフィー手順もまた、アフィニティー工程の使用前に利用することができる。重要な点としては、抗ＶＥＧＦタンパク質を含む生物学的試料は、アフィニティークロマトグラフィーに供することができるという点である。
いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、宿主細胞でＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐタンパク質を発現させることを含むプロセスを使用して生成され得、この場合、ＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐは宿主細胞から培地へと分泌され、培地は清澄化された回収物を形成するために更に処理され得る。この回収物は、ＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐを含む生物学的試料を生産する、公知のクロマトグラフィー手順により更に処理され得る。この生物学的試料は、以下を含む工程を使用することで更に処理され得る：（ａ）生物学的試料を、アフィニティークロマトグラフィーカラムに負荷する工程であって、アフィニティークロマトグラフィーが、ＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐタンパク質と選択的若しくは特異的に結合可能又は相互作用可能なタンパク質を含む、工程、（ｂ）好適な溶出バッファでアフィニティークロマトグラフィーカラムを洗浄する工程、及び（ｃ）１つ以上の溶出画分を収集する工程。再び表７－１を参照すると、ＭＴ５と選択的又は特異的に結合可能又は相互作用可能である異なるタンパク質として、（ｉ）ＶＥＧＦ１６５、（ｉｉ）ｍＡｂ１（配列番号７３は重鎖であり、配列番号７４は軽鎖である、マウスの抗－ＶＥＧＦＲ１ ｍＡｂヒトＩｇＧ１）、（ｉｉｉ）ｍＡｂ２（配列番号７５は重鎖であり、配列番号７６は軽鎖である、マウスの抗ＶＥＧＦＲ１ ｍＡｂ ヒトＩｇＧ１）、（ｉｖ）ｍＡｂ３（配列番号７７は重鎖であり、配列番号７８は軽鎖である、マウスの抗－ＶＥＧＦＲ１ ｍＡｂマウスＩｇＧ１）、及び（ｖ）ｍＡｂ４（配列番号７９は重鎖であり、配列番号８０は軽鎖である、マウスの抗－ＶＥＧＦＲ１ ｍＡｂマウスＩｇＧ１）、を使用するＭＴ５（ＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐ）の首尾よい生成をこの表にて開示する。
一実施形態において、アフィニティークロマトグラフィーはまた、他のＭｉｎｉＴｒａｐタンパク質を単離するために使用され得る。アフリベルセプトの切断後、切断されたアフリベルセプトを含む試料は、切断アフリベルセプトに特異的な結合剤を使用してアフィニティークロマトグラフィーに供され得る。一態様において、結合剤は抗体又はその一部であり得る。
アフリベルセプトの切断は、ＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐを生成するために、例えばＩｄｅＳプロテアーゼ（ＦａｂＲＩＣＡＴＯＲ）又はそのバリアントを用いてアフリベルセプトのタンパク質分解性消化を使用して促進され得る。ＩｄｅＳプロテアーゼ又はそのバリアントを用いたアフリベルセプトの切断により、Ｆｃ断片及びＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐを含む生成物の混合物が生成され得る。ＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐは、本明細書にて説明される生成方針のうち１つ以上を使用することで更に処理される。
いくつかの例示的な実施形態において、例えばアフリベルセプト又はＭｉｎｉＴｒａｐといった、抗ＶＥＧＦタンパク質と選択的又は特異的に結合可能（「結合剤」）又は相互作用可能であるタンパク質は、ヒト又はマウスに起源を持ち得る。
アフィニティー生成プロセスは、生物学的試料に負荷する前に平衡化バッファを使用してアフィニティーカラムを平衡化することを更に含み得る。例示的な平衡化バッファは、２０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６～８、特にｐＨ７．２）、１０ｍＭのリン酸ナトリウム、５００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ６～８、特にｐＨ７．２）、５０ｍＭのトリス（ｐＨ７～８）、ＤＰＢＳ（ｐＨ７．４）であり得る。
生物学的試料は、ＤＰＢＳといった好適なバッファを使用して負荷され得る。
このアフィニティー生成プロセスは、１種以上の洗浄バッファでアフィニティーカラムを洗浄することを更に含み得る。カラムは１回又は複数回洗浄され得る。更には、洗浄物はまた、洗浄画分としても収集され得る。両方の洗浄バッファのｐＨは、約７．０～約８．６０であり得る。一態様において、洗浄バッファはＤＰＢＳであり得る。別の態様において、洗浄バッファは、２０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６～８、特にｐＨ７．２）、１０ｍＭのリン酸ナトリウム、５００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ６～８、特にｐＨ７．２）、５０ｍＭのトリス（ｐＨ７～８）、又はＤＰＢＳ（ｐＨ７．４）であり得る。
このアフィニティープロセスは、１種以上の好適な溶出バッファでアフィニティーカラムを洗浄すること、及び溶出画分を収集することを更に含み得る。カラムは１回又は複数回洗浄され得る。このような好適な溶出バッファの非限定的な例としては、酢酸アンモニウム（約２．０～約３．０のｐＨ）、酢酸（約２．０～約３．２のｐＨ）、グリシン－ＨＣｌ（約２．０～約３．０のｐＨ）、クエン酸ナトリウム（約２．０～約３．０のｐＨ）、クエン酸（約２．０～約３．０のｐＨ）、イソチオシアン酸カリウム（約２．０～約３．０のｐＨ）、又はこれらの組合せが挙げられる。
いくつかの態様において、溶出画分は中和バッファを使用して中和され得る。このような中和バッファの一例としては、トリス～トリス－ＨＣｌ（約７．０～約９．０のｐＨ）である。
Ｃ．ＩｄｅＳ変異体
アフリベルセプトといったＦｃ融合タンパク質の切断に使用されるＩｄｅＳプロテアーゼは、塩基性ｐＨ条件の下で酵素活性を急速に損失し、これはＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐの製造中、その使用を制限する可能性がある。したがってバリアントは、例えばＮａＯＨといった強塩基の存在下で、塩基性ｐＨで更に安定であるように開発されてきた。そのような塩基性条件は、０．０５ＮのＮａＯＨで１時間、又は０．１ＮのＮａＯＨで０．５時間であり得る。
いくつかの実施形態において、ＩｄｅＳ変異体は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５及び配列番号１６からなる群に記載されるアミノ酸配列に対してその全長にわたり、少なくとも約７０％の配列同一性を含むアミノ酸配列を有し得る。いくつかの態様において、アミノ酸配列は、上記にて直接言及されるアミノ酸配列に対してその全長にわたり、約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は約１００％の配列同一性を有する。
いくつかの実施形態において、ＩｄｅＳ変異体は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５及び配列番号１６からなる群に記載されるようなアミノ酸配列に対してその全長にわたり、少なくとも７０％の配列同一性を含むアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、単離された核酸分子を有し得る。いくつかの態様において、アミノ酸配列は、上記にて直接言及されるアミノ酸配列に対してその全長にわたり、約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は約１００％の配列同一性を有する。
いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５及び配列番号１６からなる群に記載されるアミノ酸配列に対してその全長にわたり、少なくとも７０％の配列同一性を含むアミノ酸配列を有し、同定されたペプチド用にコードする核酸を含む好適なベクターを有する宿主細胞によって発現され得る。一態様において、核酸分子は宿主細胞内でその発現を指示することが可能である発現制御配列に作動可能に連結される。一態様において、ベクターはプラスミドである。いくつかの態様において、アミノ酸配列は、上記にて直接言及されるアミノ酸配列に対してその全長にわたり、約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は約１００％の配列同一性を有する。いくつかの態様において、単離された核酸分子はポリペプチドをコードするために使用され得る。
いくつかの実施形態において、ＩｄｅＳ変異体は、アスパラギン以外のアミノ酸に変異した８７位、１３０位、１８２位及び／又は２７４位のアスパラギン残基を有する、配列番号１（ＩｄｅＳ）により定義される親アミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有し得る。一態様において、変異は親アミノ酸配列と比較すると、アルカリｐＨ値での化学的安定性の増加をもたらし得る。別の態様において、変異は親アミノ酸配列と比較すると、アルカリｐＨ値での化学的安定性の５０％の増加をもたらし得る。一態様において、アミノ酸はアスパラギン酸、ロイシン、及びアルギニンから選択され得る。特定の態様において、８７位のアスパラギン残基はアスパラギン酸残基に変異される。別の特定の態様において、１３０位のアスパラギン残基はアルギニン残基に変異される。更に別の特定の態様において、１８２位のアスパラギン残基はロイシン残基に変異される。更に別の特定の態様において、２７４位のアスパラギン残基はアスパラギン酸残基に変異される。更に別の特定の態様において、８７位及び１３０位のアスパラギン残基は変異される。更に別の特定の態様において、８７位及び１８２位のアスパラギン残基は変異される。更に別の特定の態様において、８７位及び２７４位のアスパラギン残基は変異される。更に別の特定の態様において、１３０位及び１８２位のアスパラギン残基は変異される。更に別の特定の態様において、１３０位及び２７４位のアスパラギン残基は変異される。更に別の特定の態様において、１８２位及び２７４位のアスパラギン残基は変異される。更に別の特定の態様において、８７位、１３０位及び１８２位のアスパラギン残基は変異される。更に別の特定の態様において、８７位、１８２位及び２７４位のアスパラギン残基は変異される。更に別の特定の態様において、１３０位、１８２位及び２７４位のアスパラギン残基は変異される。更に別の特定の態様において、８７位、１３０位、１８２位及び２７４位のアスパラギン残基は変異される。いくつかの態様において、アミノ酸配列は、上にて説明されるアミノ酸配列に対してその全長にわたり、約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は約１００％の配列同一性を有する。いくつかの態様において、単離された核酸分子はポリペプチドをコードするために使用され得る。
標準的な分子生物学的技術に精通している当業者は、過度の負担なく、本発明のＩｄｅＳ変異体を調製及び使用可能である。標準的な技術は、組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、組織培養、及び形質転換（例えば、電気穿孔法、リポフェクション）のために使用され得る。例えば、上記のＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌを参照されたく、これは任意の目的のため、本明細書に参照として組み入れられる。酵素反応及び生成技術は、製造業者の仕様に従い、又は本明細書に説明されるように実施され得る。
ＶＩ．一般的なタンパク質産生
アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、混合モードのクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、及び疎水性相互作用クロマトグラフィーを含むがこれらに限定されず、単独で又は組み合わせられる、様々な異なる生成技術は本発明の範囲内にあることが想定される。これらのクロマトグラフィー工程は、それらの電荷、疎水性度、又はサイズ、又はこれらの組合せに基づき、分離の特定の形式に応じて、生物学的試料であるタンパク質の混合物を分離する。異なる複数のクロマトグラフィー樹脂は、上記に示唆された技術のそれぞれについて利用可能であり、これにより関与する特定のタンパク質に対する生成スキームを正確に作ることができる。各分離方法により、タンパク質が異なる速度でカラムを通過することで、それらがカラムを更に通過するたびに増加する物理分離又は分離媒体への選択的な付着が実現する。次いでタンパク質は、（ｉ）適切な溶出バッファを使用して差次的に溶出され、及び／又は（ｉｉ）使用されるカラムから、任意選択で適切な平衡化バッファでカラムを洗浄することにより得られるフロースルー画分から収集される。場合によっては、不純物が優先的にカラムに付着し、関心対象のタンパク質がそれほど吸着しない、すなわち関心対象のタンパク質が特定のカラムの固相に吸着せず、したがってカラムを通過する場合、関心対象のタンパク質は、不純物（ＨＣＰ、タンパク質バリアントなどの）から分離される。場合によっては、不純物がカラムに吸着できず、したがってカラムを通過する場合、この不純物は、関心対象のタンパク質から分離される。
組換えタンパク質が上で説明される上流の生成方法を使用して産生された後、及び／又は当技術分野では通常の代替の生成方法により、生成プロセスが、分離工程にて開始されてもよい。例えば融合タンパク質といった関心対象のタンパク質を含む清澄化された溶液又は混合物が得られると、プロセス関連不純物（例えば、細胞から産生された他のタンパク質（ＨＣＰといったもの）、及び酸性バリアント又は塩基性バリアントといった生成物関連物質）からの関心対象のタンパク質の分離が実施される。アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、ＣＥＸ、ＡＥＸ）、混合モード（ＭＭ）クロマトグラフィー、及び／又は疎水性相互作用クロマトグラフィーを含む、１種以上の異なる生成技術の組合せが使用され得る。こうした生成工程は、例えば電荷、疎水性度、及び／又は見かけ上のサイズを基に生物学的試料内の成分の混合物を分離する。多数のクロマトグラフィー樹脂は、本明細書にて言及されたそれぞれのクロマトグラフィー技術のために市販されており、これにより関与する特定のタンパク質に対する生成スキームを正確に作ることができる。それぞれの分離方法により、タンパク質は、異なる速度でカラムを通過し、カラムを更に通過するたびに増加する物理的分離を実現するか、又は分離樹脂（若しくは媒体）に選択的に吸着するかのいずれかが可能となる。次いで、タンパク質を差次的に収集することができる。場合によっては、他の成分がカラム樹脂に特異的に吸着しつつ、関心対象のタンパク質は吸着しない場合、関心対象のタンパク質は、生物学的試料の成分から分離される。
Ａ．一次回収及びウイルス不活化
特定の実施形態において、本明細書に開示される生成方法の初期工程は、生物学的試料からの関心対象のタンパク質の清澄及び一次回収に関与している。一次回収は、宿主細胞及び付随する細胞細片から関心対象のタンパク質を分離する１回以上の遠心分離工程を含む。試料の遠心分離は、例えば限定するものではないが、７，０００ｘｇからおよそ１２，７５０ｘｇで実施され得る。大規模な生成という観点では、こうした遠心分離は、例えば得られる上清中、１５０ＮＴＵの混濁度レベルを実現するように設定された流速で生産ラインにて実施される。こうした上清は次いで、更なる処理のために収集され、又は試料の更なる清澄のために１つ以上のデプスフィルタに通してライン中にろ過され得る。
特定の実施形態において、一次回収は試料を清澄化する１回以上の深層ろ過工程の使用を含み、それにより関心対象のタンパク質の処理を支援することができる。他の実施形態において、一次回収は遠心分離後に１回以上の深層ろ過工程の使用を含むことができる。本発明の観点で使用され得るデプスフィルタの非限定的な例としては、Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋Ｘ０ＨＣ、Ｆ０ＨＣ、Ｄ０ＨＣ、Ａ１ＨＣ、Ｂ１ＨＣデプスフィルタ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、３Ｍ（商標）モデル３０／６０ＺＡ、６０／９０ ＺＡ、ＶＲ０５、ＶＲ０７、Ｄｅｌｉｐｉｄデプスフィルタ（３Ｍ Ｃｏｒｐ．）が挙げられる。Ｓａｒｔｏｒｉｕｓの０．４５／０．２μｍ Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ（商標）二重層といった０．２μｍのフィルタ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅのＥｘｐｒｅｓｓ ＳＨＲ又はＳＨＣフィルタカートリッジは、典型的にはデプスフィルタに追従する。当業者に周知である他のフィルタもまた使用され得る。
特定の実施形態において、一次回収プロセスはまた、生物学的試料に存在し得るウイルスを減少又は不活化させるためのポイントであり得る。ウイルス減少／不活化の様々な方法のうちいずれか１つ以上は、熱不活化（低温殺菌法）、ｐＨ不活化、バッファ／界面活性剤処理、紫外線及びγ線照射、及びβ－プロピオラクトン又は例えば米国特許第４，５３４，９７２号（その全体の教示が本明細書に参照として組み入れられる）にて説明される銅フェナントロリンといった特定の化学的不活化剤の添加を含む、生成の一次回収段階中に使用され得る。本発明のある特定の例示的な実施形態において、試料は一次回収段階で界面活性剤によるウイルス不活化に曝される。他の実施形態において、試料は一次回収段階中に低ｐＨによる不活化に曝されてもよい。
ウイルス減少／不活化が使用されるそれらの実施形態において、生物学的試料は必要に応じ、更なる生成工程のために調整され得る。例えば、低ｐＨのウイルス不活化後、試料のｐＨは、生成プロセスを継続する前に、約４．５～約８．５といったより中性のｐＨに典型的には調整される。加えて、混合物は所望の伝導度を得るため、注射用水（ＷＦＩ）で希釈されてもよい。
Ｂ．アフィニティークロマトグラフィー
特定の例示的な実施形態において、関心対象のタンパク質の生成のため、生物学的試料をアフィニティークロマトグラフィーに供することが有利な場合がある。クロマトグラフィー材料は、関心対象のタンパク質と選択的又は特異的に結合可能又は相互作用可能である。そのようなクロマトグラフィー材料の非限定的な例としては、プロテインＡ、プロテインＧが挙げられる。また、例えば関心対象のタンパク質に結合可能又は相互作用可能であるタンパク質又はその部分を含むクロマトグラフィー材料もまた挙げられる。一態様において、関心対象のタンパク質は、アフリベルセプト、ＭｉｎｉＴｒａｐ、又はこれらに関連するタンパク質などの抗ＶＥＧＦタンパク質である。
アフィニティークロマトグラフィーは、生物学的試料を好適なプロテインＡ樹脂を含むカラムに供することを伴う。本明細書にて使用される場合、「プロテインＡ」とは、その天然源から回収されたプロテインＡ、合成により産生されたプロテインＡ（例えば、ペプチド合成による又は組換え技術による）、ＣＨ２／ＣＨ３領域を有するタンパク質に結合する能力を保持するそれらのバリアントを包含する。特定の態様において、プロテインＡ樹脂は、領域を有するであろう分子のＦｃ部分と特異的に相互作用することにより、アフィニティーベースの産生及び様々な抗体アイソタイプの単離にとって有用である。
タンパク質Ａ樹脂について複数の製造元がある。好適な樹脂の１つは、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製のＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）である。好適な樹脂としては、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製のＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ ＬＸ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ ｐｃｃ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｘｔｒａ、ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ；ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製のＰｒｏＳｅｐ ＨＣ、ＰｒｏＳｅｐ Ｕｌｔｒａ及びＰｒｏＳｅｐ Ｕｌｔｒａ Ｐｌｕｓ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＭａｐＣａｐｔｕｒｅが挙げられるがこれらに限定されない。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）で充填された好適なカラムの非限定的な例は、径約１．０ｃｍ×長さ約２１．６ｃｍのカラム（１７ｍＬの床体積）である。好適なカラムは、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ＳｕＲｅなどの樹脂又は類似の樹脂を含んでもよい。プロテインＡは、Ｒｅｐｌｉｇｅｎ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ及びＦｅｒｍａｔｅｃｈから市販され得る。
アフィニティーカラムは試料の負荷前に好適なバッファで平衡化され得る。カラムの負荷後、好適な洗浄バッファを使用し、カラムを１回又は複数回洗浄することができる。カラムは次いで、例えばグリシン－ＨＣＬ、酢酸、又はクエン酸といった適切な溶出バッファを使用して溶出され得る。溶出液は、ＵＶ検出器などの当業者に周知の技術を使用してモニタリングされ得る。関心対象の溶出画分を収集し、次いで更なる処理のために調製され得る。
一態様において、溶出液は例えば、界面活性剤又は低ｐＨのいずれかによりウイルス不活化に供されてもよい。所望のウイルス不活化結果を得るため、好適な界面活性剤濃度又は好適なｐＨ（及び時間）が選択され得る。ウイルス不活化後、溶出液はその後の生成工程のため、通常はｐＨ及び／又は伝導度が調整される。
混濁及び／又は様々な不純物を関心対象のタンパク質から取り除くため、追加のクロマトグラフィーのポリッシュ工程前に、溶出液は、デプスフィルタを通してろ過に供され得る。好適なデプスフィルタの例としては、Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋ＸＯＨＣ、ＦＯＨＣ、ＤＯＨＣ、ＡＩＨＣ、Ｘ０ＳＰ及びＢＩＨＣポッドフィルタ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）又はＺｅｔａ Ｐｌｕｓ ３０ＺＡ／６０ＺＡ、６０ＺＡ／９０ＺＡ、Ｄｅｌｉｐｉｄ、ＶＲ０７及びＶＲ０５フィルタ（３Ｍ）が挙げられるがこれらに限定されない。Ｅｍｐｈａｚｅ ＡＥＸ Ｈｙｂｒｉｄ Ｐｕｒｉｆｉｅｒマルチメカニズムフィルタはまた、溶出液を清澄化するために使用されてもよい。所望の不純物の除去及び深層ろ過工程からの生成物回収を得るため、特定のｐＨ及び伝導度に調整するために溶出液プールが必要となり得る。
Ｃ．陰イオン交換クロマトグラフィー
ある特定の実施形態において、関心対象のタンパク質は、生物学的試料を少なくとも１つの陰イオン交換分離工程に供することにより生成される。あるシナリオにおいて、陰イオン交換工程は、アフィニティークロマトグラフィー（例えば、プロテインＡアフィニティー）手順後に生じ得る。それ以外のシナリオにおいて、陰イオン交換工程はアフィニティークロマトグラフィー工程前に生じ得る。更に他のプロトコルにおいて、陰イオン交換はアフィニティークロマトグラフィー工程前と工程後の両方で生じ得る。一態様において、関心対象のタンパク質は、アフリベルセプト又はＭｉｎｉＴｒａｐのいずれかである。
陽イオン交換材料に対し、陰イオン交換材料の使用は、部分的には関心対象のタンパク質の局所電荷をベースとしている。陰イオン交換クロマトグラフィーは、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、及び当業者に公知である他のモードのクロマトグラフィーといった他のクロマトグラフィー手順と組み合わせて使用され得る。
分離を実施する際には、初期タンパク質組成物（生物学的試料）は、例えばバッチ生成技術又はクロマトグラフィー技術の使用といった様々な技術のうちいずれかを使用することで、陰イオン交換材料と接触させた状態で配置され得る。
バッチ生成という観点では、陰イオン交換材料は所望の出発バッファ中で調製され、又はこれと平衡化される。調製すると、陰イオン交換材料のスラリーが得られる。生物学的試料をスラリーと接触させ、陰イオン交換材料へのタンパク質吸着を可能にする。ＡＥＸ材料に結合しない酸性種を含む溶液は、スラリーを静置させ、上清を取り除くことにより、スラリーから分離される。スラリーは、１回以上の洗浄工程及び／又は溶出工程に供され得る。
クロマトグラフィー分離という観点では、クロマトグラフィーのカラムは、クロマトグラフィー支持体材料（樹脂又は固相）を収容するために使用される。関心対象のタンパク質を含む試料は、特定のクロマトグラフィーのカラムに負荷される。次いで、カラムは好適な洗浄バッファを使用して１回以上の洗浄工程に供され得る。樹脂上へと吸着されていない試料の成分は、カラムを通って流れる可能性がある。樹脂に吸着される成分は、適切な溶出バッファを使用して差次的に溶出され得る。
負荷条件に類似する条件を使用して、又は代替的には、ステップワイズ方式又は直線グラジエント方式にて、洗浄液のｐＨを減少させる及び／又はイオン強度／伝導度を増加させることにより、洗浄工程は典型的に、ＡＥＸクロマトグラフィーにて実施される。一態様において、負荷バッファ及び洗浄バッファの両方に使用される塩水溶液は、関心対象のタンパク質の等電点（ｐＩ）であるｐＨ又はこれに近いｐＨを有する。典型的には、ｐＨは関心対象のタンパク質のｐＩよりも約０～２単位高い又は低いが、これは０～０．５単位高い又は低い範囲内であってもよい。これはまた、関心対象のタンパク質のｐＩに存在してもよい。
陰イオン作用物質は、酢酸塩、塩化物、ギ酸塩及びこれらの組合せからなる群から選択されてよい。陽イオン作用物質は、トリス、アルギニン、ナトリウム及びこれらの組合せからなる群から選択されてよい。特定の例において、バッファ溶液はトリス／ギ酸塩バッファである。バッファは、ピリジン、ピペラジン、Ｌ－ヒスチジン、ビス－トリス、ビス－トリスプロパン、イミダゾール、Ｎ－エチルモルホリン、ＴＥＡ（トリエタノールアミン）、トリス、モルホリン、Ｎ－メチルジエタノールアミン、ＡＭＰＤ（２－アミノ－２－メチル－１，３－プロパンジオール）、ジエタノールアミン、エタノールアミン、ＡＭＰ（２－アミノ－２－メチル－１－プロパオール（ｐｒｏｐａｏｌ））、ピペラジン、１，３－ジアミノプロパン及びピペリジンからなる群から選択されてもよい。
充填された陰イオン交換クロマトグラフィーカラム、陰イオン交換膜デバイス、陰イオン交換モノリス型デバイス、又はデプスフィルタ媒体は、結合－溶出モード、フロースルーモード、又はハイブリッドモードのいずれかで操作され得、この場合、タンパク質は、クロマトグラフィー材料への結合を呈し、更には負荷バッファと同様又は実質的に類似のバッファを使用してこうした材料から洗浄され得る。
結合－溶出モードにおいて、特定のタンパク質は、樹脂ベースのマトリックスに吸着する条件下で、カラム又は膜デバイスは適切なイオン強度及びｐＨを有するバッファを用いて最初に条件づけされる。例えば、フィードの負荷中、関心対象のタンパク質は静電気引力作用により樹脂に吸着され得る。平衡化バッファ又は異なるｐＨ及び／若しくは伝導度を有する別のバッファを用いてカラム又は膜デバイスを洗浄した後、陰イオン交換マトリックスの荷電部位に対して溶質と競合する溶出バッファのイオン強度（すなわち伝導度）を増加させることにより、生成物の回収を達成する。ｐＨを変化させ、それにより溶質の電荷を変えることは、溶質の溶出を達成する別の方法である。伝導度又はｐＨにおける変化は、段階的（グラジエント溶出）又はステップワイズ（ステップ溶出）であってもよい。
フロースルーモードにおいて、関心対象のタンパク質は樹脂又は膜に結合しないが、一方で酸性種は、カラム上に保持されるか、又は関心対象のタンパク質と比較して異なる溶出プロファイルを有するかのいずれかとなるように、カラム又は膜デバイスは、選択されたｐＨ及び伝導度にて操作される。この方針の観点では、酸性種は好適な条件下でクロマトグラフィー材料と相互作用又は結合し、一方で、関心対象のタンパク質と、関心対象のタンパク質の特定の凝集体及び／又は断片とは、カラムを通過する。
陰イオン交換樹脂の非限定的な例としては、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、第四級アミノエチル（ＱＡＥ）、及び第四級アミン（Ｑ）基が挙げられる。追加の非限定的な例としては、架橋ポリ［スチレン－ジビニルベンゼン］からなる骨格を有する強固なポリマービーズであるＰｏｒｏｓ ５０ＰＩ及びＰｏｒｏｓ ５０ＨＱ；高流動性アガロースビーズであるＣａｐｔｏ Ｑ Ｉｍｐｒｅｓ及びＣａｐｔｏ ＤＥＡＥ；ポリマーベースのビーズであるＴｏｙｏｐｅａｒｌ ＱＡＥ－５５０、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＤＥＡＥ－６５０及びＴｏｙｏｐｅａｒｌ ＧｉｇａＣａｐ Ｑ－６５０；触手状イオン交換体を有する合成ポリマー樹脂であるＦｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤ ＴＭＡＥ Ｈｉｃａｐ；第一級アミンの配位子を有する耐塩性クロマトグラフィー膜であるＳａｒｔｏｂｉｎｄ ＳＴＩＣ（登録商標）ＰＡ ｎａｎｏ；強陰イオン交換クロマトグラフィー膜であるＳａｒｔｏｂｉｎｄ Ｑ ｎａｎｏ；無機ろ過助剤、純化セルロース、及びイオン交換樹脂から構築されたゼータプラスデプスフィルタであるＣＵＮＯ ＢｉｏＣａｐ；無機ろ過助剤、セルロース、及び混合セルロースエステルから構築された深層ろ過媒体であるＸＯＨＣが挙げられる。
特定の実施形態において、試料のタンパク質負荷量は、約５０ｇ／Ｌ～約５００ｇ／Ｌ、又は約７５ｇ／Ｌ～約３５０ｇ／Ｌ、又は約２００ｇ／Ｌ～約３００ｇ／Ｌであるカラムへの総タンパク質負荷量に調整され得る。他の実施形態において、負荷タンパク質混合物のタンパク質濃度は、約０．５ｇ／Ｌ～約５０ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ～約２０ｇ／Ｌ、又は約３ｇ／Ｌ～約１０ｇ／Ｌである、カラムに負荷された材料のタンパク質濃度に調整される。更に他の実施形態において、負荷タンパク質混合物のタンパク質濃度は、約３７ｇ／Ｌのカラムに対する材料のタンパク質濃度（ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）に調整される。
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、界面活性剤、アミノ酸、糖類、カオトロピック剤といった添加剤は、より良好な分離、回収、及び／又は生成物の品質を達成するよう分離の性能を向上させるために加えられ得る。
アフリベルセプト及び／又はＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐに関連するものを含む特定の実施形態において、本発明の方法を使用して、少なくとも１０％のタンパク質バリアントを選択的に取り除き、大幅に減少させ、又は本質的に取り除くことができ、それによってタンパク質バリアントが減少したタンパク質組成物が生成される。
タンパク質バリアントは、以下のような１つ以上の残基の修飾を含み得る：１つ以上のアスパラギンが脱アミド化される；１つ以上のアスパラギン酸がアスパルタート－グリシン及び／又はＡｓｎ－Ｇｌｙに変換される；１つ以上のメチオニンが酸化される；１つ以上のトリプトファンがＮ－ホルミルキヌレニンに変換される；１つ以上のトリプトファンがモノ－ヒドロキシルトリプトファンである；１つ以上のトリプトファンがジ－ヒドロキシルトリプトファンである；１つ以上のトリプトファンがトリ－ヒドロキシルトリプトファンである；１つ以上のアルギニンがＡｒｇ３－デオキシグルコソンに変換される；Ｃ末端グリシンが存在しない；並びに／又は１つ以上の非グリコシル化グリコサイトが存在する。ＡＥＸの使用は、当該アフィニティー溶出液中の抗ＶＥＧＦバリアントの酸化種及び酸性種を減少させることも観察された。アフィニティー溶出液と比較すると、ＡＥＸの使用後、フロースルー画分は、抗ＶＥＧＦバリアントの酸化種及び／又は酸性種中、少なくとも約２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％又は５％の減少を示し得る。
アフリベルセプト及び／又はＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐのタンパク質バリアントとしては、
（ｉ）Ｈｉｓ８６、Ｈｉｓ１１０、Ｈｉｓ１４５、Ｈｉｓ２０９、Ｈｉｓ９５、Ｈｉｓ１９、及び／若しくはＨｉｓ２０３から選択されるヒスチジン残基からの酸化ヒスチジン、（ｉｉ）Ｔｒｐ５８及び／又はＴｒｐ１３８のトリプトファン残基から選択される酸化トリプトファン残基、（ｉｉｉ）Ｔｙｒ６４の酸化チロシン残基、（ｉｖ）Ｐｈｅ４４及び／又はＰｈｅ１６６から選択される酸化フェニルアラニン残基、並びに／又は（ｖ）Ｍｅｔ１０、Ｍｅｔ２０、Ｍｅｔ１６３、及び／又はＭｅｔ１９２から選択される酸化メチオニン残基
のうち、１つ以上が挙げられ得る。
Ｄ．陽イオン交換クロマトグラフィー
本発明の組成物は、関心対象のタンパク質を含む生物学的試料を少なくとも１回の陽イオン交換（ＣＥＸ）工程に供することにより生成され得る。特定の例示的な実施形態において、ＣＥＸ工程はＡＥＸ工程に追加され、ＡＥＸ工程前又は工程後のいずれかで実施される。一態様において、関心対象のタンパク質は、アフリベルセプト、ＭｉｎｉＴｒａｐ、又はこれらに関連する分子のいずれかである。
上記にて述べられる陰イオン交換材料といった陰イオン交換材料に対する陽イオン交換材料の使用は、部分的には、所与の溶液及び所望の分離条件にて関心対象のタンパク質の局所電荷に基づいている。陰イオン交換工程の使用前の陽イオン交換工程の使用、又は陽イオン交換工程の使用前の陰イオン交換工程の使用は、本発明の範囲内である。更には、他のクロマトグラフィー手順と組み合わせた陽イオン交換工程のみの使用も、本発明の範囲内である。
陽イオン交換を実施する際には、関心対象のタンパク質を含む試料は、ＡＥＸについて上にて説明されるように、例えばバッチ生成技術又はクロマトグラフィー技術といった様々な技術のうちいずれかを使用することで、陽イオン交換材料と接触され得る。
塩水溶液は、関心対象のタンパク質の等電点（ｐＩ）よりも低いｐＨを有する負荷バッファ及び洗浄バッファの両方として使用されてもよい。一態様において、ｐＨはタンパク質のｐＩよりも約０～５単位低い。別の態様において、ｐＨはタンパク質のｐＩよりも１～２単位低い範囲内にある。更に別の態様において、ｐＨはタンパク質のｐＩよりも１～１．５単位低い範囲内にある。
特定の実施形態において、塩水溶液中の陰イオン作用物質の濃度は、約３．５～約１０．５、又は約４～約１０、又は約４．５～約９．５、又は約５～約９、又は約５．５～約８．５、又は約６～約８、又は約６．５～約７．５のｐＨを達成するように増加又は減少される。一態様において、陰イオン作用物質の濃度は、５、又は５．５、又は６、又は６．５、又は６．８、又は７．５のｐＨを達成するように、塩水溶液中で増加又は減少される。ＣＥＸ法で使用するのに好適なバッファ系としては、ギ酸トリス、酢酸トリス、硫酸アンモニウム、塩化ナトリウム、又は硫酸ナトリウムが挙げられるがこれらに限定されない。
特定の実施形態において、塩水溶液の伝導度及びｐＨは、陽イオン作用物質の濃度を増加又は減少させることにより調整される。一態様において、陽イオン作用物質は、約２０ｍＭ～約５００ｍＭ、約５０ｍＭから約３５０ｍＭ、約１００ｍＭ～約３００ｍＭ、又は１００ｍＭ～約２００ｍＭの範囲である濃度に維持される。陽イオン作用物質の非限定的な例としては、ナトリウム、トリス、トリエチルアミン、アンモニウム、アルギニン、及びこれらの組合せからなる群から選択される。
充填された陽イオン交換クロマトグラフィーカラム又は陰イオン交換膜デバイスは、結合－溶出モード、フロースルーモード、又はハイブリッドモードのいずれかで操作され得、この場合、生成物はクロマトグラフィー材料への結合又はこれとの相互作用を呈し、更には負荷バッファと同様又は実質的に類似のバッファを使用して、こうした材料から洗浄され得る（これらのモードの詳細は上にて概説されている）。
陽イオン置換基は、カルボキシメチル（ＣＭ）、スルホエチル（ＳＥ）、スルホプロピル（ＳＰ）、リン酸塩（Ｐ）、及びスルホン酸塩（Ｓ）を含む。追加の陽イオン材料としては、高流動性アガロースビーズであるＣａｐｔｏ ＳＰ ＩｍｐＲｅｓ；官能化ヒドロゲルでコーティング及び浸透されたセラミックビーズであり、２５０～４００μｅｑ／ｍＬのイオン基であるＣＭ Ｈｙｐｅｒ Ｄ ｇｒａｄｅ Ｆ；５０～１００μｅｑ／ｍＬのイオン交換容量を有する親水性ポリビニルエーテルのベースマトリックスであるＥｓｈｍｕｎｏ Ｓ；５５～７５με／ｍＬであり、高度に架橋されたマクロ多孔質親水性ポリマーマトリックスから構成される疎水性陽イオン交換媒体であるＮｕｖｉａ Ｃ Ｐｒｉｍｅ；９０～１５０με／ｍＬのイオン基を有するＵＮＯｓｐｈｅｒｅベースマトリックスを有するＮｕｖｉａ Ｓ；架橋ポリ［スチレン－ジビニルベンゼン］からなる骨格を有する強固なポリマービーズであるＰｏｒｏｓ ＨＳ；架橋ポリ［スチレン－ジビニルベンゼン］からなる骨格を有する強固なポリマービーズであるＰｏｒｏｓ ＸＳ；０．２２５ｍｅｑ／ｍＬのイオン交換容量を有するポリマーベースのビーズであるＴｏｙｏ Ｐｅａｒｌ Ｇｉｇａ Ｃａｐ ＣＭ ６５０Ｍ；ポリマーベースのビーズであるＴｏｙｏ Ｐｅａｒｌ Ｇｉｇａ Ｃａｐ Ｓ ６５０Ｍ；ポリマーベースのビーズであるＴｏｙｏ Ｐｅａｒｌ ＭＸ ＴＲＰが挙げられるが、これらに限定されない。ＣＥＸクロマトグラフィーは、本明細書に説明されるように、ＭＭ樹脂と共に使用され得ることに留意されたい。
関心対象のタンパク質を含む試料のタンパク質負荷量は、約５ｇ／Ｌ～約１５０ｇ／Ｌ、又は約１０ｇ／Ｌ～約１００ｇ／Ｌ、約２０ｇ／Ｌ～約８０ｇ／Ｌ、約３０ｇ／Ｌ～約５０ｇ／Ｌ、又は約４０ｇ／Ｌ～約５０ｇ／Ｌの、カラムに対する総タンパク質負荷量に調整される。特定の実施形態において、負荷タンパク質混合物のタンパク質濃度は、約０．５ｇ／Ｌ～約５０ｇ／Ｌ、又は約１ｇ／Ｌ～約２０ｇ／Ｌであるカラムへと負荷された材料のタンパク質濃度に調整される。
ポリエチレングリコール、界面活性剤、アミノ酸、糖類、カオトロピック剤といった添加剤は、より良好な分離、回収、及び／又は生成物の品質を達成するよう分離の性能を向上させるために加えられ得る。
特定の実施形態において、アフリベルセプト又は抗ＶＥＧＦ抗体又はＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐに関連するものを含む、本発明の方法は、試料中のオキソバリアントのすべてを選択的に取り除くか、有意に低減するか、又は本質的に取り除くために使用され得、この場合、関心対象のタンパク質はＣＥＸ手順のフロースルー中に本質的には存在するが、一方でオキソバリアントはカラム媒体により実質的に捕捉される。
Ｅ．混合モードのクロマトグラフィー
混合モード（「ＭＭ」）クロマトグラフィーはまた、本発明の組成物を調製するために使用されてもよい。本明細書にて「マルチモーダルクロマトグラフィー」とも称されるＭＭクロマトグラフィーは、試料からの分析物又は関心対象のタンパク質と少なくとも２つの異なる相互作用をもたらすことが可能である配位子を含む支持体を利用する、クロマトグラフィー方針である。これらの部位のうち一方が、配位子と関心対象のタンパク質との間に誘引性の電荷－電荷相互作用をもたらし、もう一方は電子受容体－供与体相互作用及び／又は疎水性相互作用及び／又は親水性相互作用をもたらす。電子供与体－受容体相互作用としては、水素結合、π－π、陽イオン－π、電荷移動、双極子－双極子、誘起双極子などの相互作用が挙げられる。
混合モード分離に使用されるカラム樹脂は、Ｃａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅであり得る。Ｃａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅは、マルチモーダル機能を有する強陰イオン交換体である。この強陰イオン交換体のベースマトリックスは、例えばイオン性相互作用、水素結合、及び疎水性相互作用といった相互作用に対して異なる機能性を呈する配位子（Ｎ－ベンジル－Ｎ－メチルエタノールアミン）を有する高架橋アガロースである。特定の態様において、混合モード分離に使用される樹脂は、ＰＰＡ－ＨｙｐｅｒＣｅｌとＨＥＡ－ＨｙｐｅｒＣｅｌから選択される。ＰＰＡ－ＨｙｐｅｒＣｅｌ及びＨＥＡ－ＨｙｐｅｒＣｅｌのベースマトリックスは、高多孔質の架橋セルロースである。それらの配位子は、それぞれフェニルプロピルアミン及びヘキシルアミンである。フェニルプロピルアミン及びヘキシルアミンは、タンパク質分離のため、異なる選択性及び疎水性の選択肢を提供する。追加の混合モードのクロマトグラフィー支持体としては、Ｎｕｖｉａ Ｃ Ｐｒｉｍｅ、Ｔｏｙｏ Ｐｅａｒｌ ＭＸ Ｔｒｐ ６５０Ｍ、及びＥｓｈｍｕｎｏ（登録商標）ＨＣＸが挙げられるがこれらに限定されない。特定の態様において、混合モードのクロマトグラフィー樹脂は、時にベースマトリックスと表示され、直接又はスペーサを介して有機支持体又は無機支持体に結合される配位子から構成され得る。支持体は、本質的には球形粒子といった粒子、モノリス、フィルタ、膜、表面、キャピラリー、及びそれらの同等物といった形態であってもよい。特定の態様において、支持体は、架橋された炭水化物材料、例えば、アガロース、寒天、セルロース、デキストラン、キトサン、コンニャク、カラギーナン、ゲラン、アルギナート、及びそれらの同等物などの天然ポリマーから調製され得る。高い吸着能力を得るには、支持体は多孔質であり得、次いで配位子は外面及び細孔表面に結合される。このような天然ポリマー支持体は、標準的な方法、例えば逆懸濁ゲル化（Ｓ Ｈｊｅｒｔｅｎ：Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ７９（２），３９３－３９８（１９６４）、その全体の教示が本明細書に参照として組み入れられる）に従い調製され得る。代替的には、支持体は、架橋された合成ポリマー、例えば、スチレン又はスチレン誘導体、ジビニルベンゼン、アクリルアミド、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル、ビニルエステル、ビニルアミド、及びそれらの同等物などの合成ポリマーから調製され得る。このような合成ポリマーは、標準的な方法に従い調製され得る。「Ｓｔｙｒｅｎｅ ｂａｓｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒ ｓｕｐｐｏｒｔｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｂｙ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ」（Ｒ Ａｒｓｈａｄｙ：Ｃｈｉｍｉｃａ ｅ Ｌ’Ｉｎｄｕｓｔｒｉａ ７０（９），７０－７５（１９８８）、その全体の教示が本明細書に参照として組み入れられる）を参照されたい。多孔質天然又は合成ポリマー支持体はまた、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）といった製造元からも入手可能である。
関心対象のタンパク質を含む生物学的試料混合物のタンパク質負荷量は、約２５ｇ／Ｌ～約７５０ｇ／Ｌ、又は約７５ｇ／Ｌ～約５００ｇ／Ｌ、又は約１００ｇ／Ｌ～約３００ｇ／Ｌの、カラムに対する総タンパク質負荷量に調整され得る。特定の例示的な実施形態において、負荷タンパク質混合物のタンパク質濃度は、約１ｇ／Ｌ～約５０ｇ／Ｌ、又は約９ｇ／Ｌ～約２５ｇ／Ｌである、カラムに負荷された材料のタンパク質濃度に調整される。
ポリエチレングリコール、界面活性剤、アミノ酸、糖類、カオトロピック剤といった添加剤は、より良好な分離、回収、及び／又は生成物の品質を達成するよう分離の性能を向上させるために加えられ得る。
アフリベルセプト及び／又はＭｉｎｉＴｒａｐに関連するものを含む特定の実施形態において、本発明の方法は、オキソバリアントを含む、すべてのＰＴＭを選択的に取り除くか、有意に減少させるか、又は本質的に取り除くために使用され得る。
本発明の組成物の製造方法はまた、連続クロマトグラフィーモードで実施可能である。このモードでは、少なくとも２つのカラムが使用される（「第１」カラム及び「第２」カラムと称される）。特定の実施形態において、この連続クロマトグラフィーモードは、例えばオキソバリアントといったＰＴＭを含む溶出画分及び／又はストリップ画分が第２カラム（希釈の有無にかかわらず）へと順次又は同時に負荷され得るように、実施可能である。
一実施形態において、連続モード向けの媒体の選択は、疎水性ペンダント官能基及び陰イオン交換官能基を有する多くのクロマトグラフィー樹脂、モノリス型媒体、膜吸着媒体又は深層ろ過媒体のうち１つであり得る。
Ｆ．疎水性相互作用クロマトグラフィー
本発明の組成物はまた、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を使用して調製されてもよい。
分離を実施する際には、生物学的試料は、例えばバッチ生成技術を使用して、又はカラム若しくは膜クロマトグラフィーを使用して、ＨＩＣ材料と接触される。ＨＩＣ処理の前に、樹脂又は膜への所望のタンパク質結合／相互作用を得るため、塩バッファの濃度を調整することが望ましい場合がある。
イオン交換クロマトグラフィーは選択的分離のために関心対象のタンパク質の局所電荷に依存する一方で、疎水性相互作用クロマトグラフィーは、選択的分離を達成するためにタンパク質の疎水特性を利用する。タンパク質上又はタンパク質内の疎水基は、クロマトグラフィー樹脂又は膜の疎水基と相互作用する。典型的には、好適な条件の下では、タンパク質（又はタンパク質の一部）の疎水性が高くなればなるほど、カラム又は膜とより強く相互作用する。したがって、好適な条件の下では、ＨＩＣは、試料中の関心対象のタンパク質からの、プロセス関連不純物（例えばＨＣＰ）及び生成物関連物質（例えば凝集体又は断片）の分離を促進させるために使用され得る。
イオン交換クロマトグラフィー同様、ＨＩＣカラム又はＨＩＣ膜デバイスはまた、溶出モード、フロースルーモード、又はハイブリッドモードで操作され得、この場合、生成物はクロマトグラフィー材料との結合又は相互作用を呈し、更には負荷バッファと同様又は実質的に類似のバッファを使用し、こうした材料から洗浄され得る。（これらのモードの詳細は、ＡＥＸ処理に関連して上で概説されている。）疎水性相互作用は高いイオン強度では最も強いことから、この形態の分離は、イオン交換クロマトグラフィーに関連して典型的には使用される工程といった塩溶出工程後に好都合に使用される。代替的には、塩はＨＩＣを使用する前に試料に加えられ得る。ＨＩＣカラムへのタンパク質の吸着は、高い塩濃度により有利に機能するが、実際の濃度は、関心対象のタンパク質の性質、塩の種類、及び選択される特定のＨＩＣ配位子に応じて、広範囲にわたって変化する可能性がある。様々なイオンは、疎水性相互作用（塩析作用）を促進させるか、水の構造を破壊して（カオトロピック効果）疎水性相互作用を弱めるかに応じ、いわゆる疎溶媒性系列（ｓｏｌｕｐｈｏｂｉｃ）に配置され得る。陽イオンは、Ｂａ２＋；Ｃａ２＋；Ｍｇ２＋；Ｌｉ＋；Ｃｓ＋；Ｎａ＋；Ｋ＋；Ｒｂ＋；ＮＨ４＋など塩析作用を増加させるといった点で順位付けられる。一方陰イオンは、ＰＯ４ ３－；ＳＯ４ ２－；ＣＨ３ＣＯ３ －；ＣＩ－；Ｂｒ－；ＮＯ３ －；ＣｌＯ４ －；Ｉ－；ＳＣＮ－などカオトロピック効果を増加させるといった点で順位付けられる。
一般的に、Ｎａ＋、Ｋ＋又はＮＨ４＋の硫酸塩は、ＨＩＣを使用する配位子－タンパク質相互作用を効果的に促進させる。以下の関係性：（ＮＨ４）２ＳＯ４＞Ｎａ２ＳＯ４＞ＮａＣｌ＞ＮＨ４Ｃ１＞ＮａＢｒ＞ＮａＳＣＮにより与えられるように、相互作用の強度に影響を与える塩が製剤化されてもよい。一般的には、約０．７５Ｍ～約２Ｍの硫酸アンモニウム、又は約１Ｍ～約４ＭのＮａＣｌの塩濃度が有用である。
ＨＩＣ媒体は通常、疎水性配位子（例えば、アルキル基又はアリール基）が結合されるベースマトリックス（例えば架橋アガロース又は合成コポリマー材料）を含む。好適なＨＩＣ媒体は、フェニル基で官能化されたアガロース樹脂又は膜を含む（例えば、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製のＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）又はＳａｒｔｏｒｉｕｓ製のＰｈｅｎｙｌ Ｍｅｍｂｒａｎｅ）。多くのＨＩＣ樹脂が市販されている。例としては、Ｃａｐｔｏ Ｐｈｅｎｙｌ、低置換又は高置換を伴うＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、Ｏｃｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）；Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（商標）ＥＭＤ Ｐｒｏｐｙｌ又はＦｒａｃｔｏｇｅｌ（商標）ＥＭＤ Ｐｈｅｎｙｌ（Ｅ．Ｍｅｒｃｋ，Ｇｅｒｍａｎｙ）；Ｍａｃｒｏ－Ｐｒｅｐ（商標）メチルカラム又はＭａｃｒｏ－Ｐｒｅｐ（商標）ｔ－ブチルカラム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）；ＷＰ ＨＩ－Ｐｒｏｐｙｌ（Ｃ３）（商標）（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）；及びＴｏｙｏｐｅａｒｌ（商標）エーテル、フェニル又はブチル（ＴｏｓｏＨａａｓ，ＰＡ）；ＴｏｙｏＳｃｒｅｅｎ ＰＰＧ；ＴｏｙｏＳｃｒｅｅｎフェニル；ＴｏｙｏＳｃｒｅｅｎブチル；ＴｏｙｏＳｃｒｅｅｎヘキシル；ＧＥ ＨｉＳｃｒｅｅｎ及びＢｕｔｙｌ ＦＦ ＨｉＳｃｒｅｅｎオクチルＦＦが挙げられるがこれらに限定されない。
関心対象のタンパク質を含む試料のタンパク質負荷量は、約５０ｇ／Ｌ～約１０００ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ～約１５０ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ～約１００ｇ／Ｌ、約２０ｇ／Ｌ～約８０ｇ／Ｌ、約３０ｇ／Ｌ～約５０ｇ／Ｌ、又は約４０ｇ／Ｌ～約５０ｇ／Ｌの、カラムに対する総タンパク質負荷量に調整される。特定の実施形態において、負荷タンパク質混合物のタンパク質濃度は、約０．５ｇ／Ｌ～約５０ｇ／Ｌ、又は約１ｇ／Ｌ～約２０ｇ／Ｌである、カラムへと負荷された材料のタンパク質濃度に調整される。
任意の特定の生成プロセスのために選択されるｐＨは、タンパク質の安定性及び活性と両立することから、特定のｐＨ条件はそれぞれの用途に特異的であり得る。ただし、ｐＨ５．０～８．５では特定のｐＨ値がＨＩＣ分離の最終選択性及び解像度にほぼ有意性を有さないことを理由として、こうした条件は有利に機能し得る。ｐＨの上昇は疎水性相互作用を弱め、８．５より高いか又は５．０未満のｐＨではタンパク質の保持をより大きく変化させる。更には、イオン強度の変更、有機溶媒の存在、温度及びｐＨ（正味表面電荷が存在しないときには特に等電点ｐＩにおけるもの）は、タンパク質の構造及び溶解度に影響を与え、結果としてＨＩＣ媒体におけるものといった、他の疎水性表面との相互作用にも影響を与え得る。したがって特定の実施形態において、本発明はプロセス関連不純物及び／又は生成物関連物質における所望の減少を達成するため、前述のもののうち１つ以上を調整する生成方針を取り入れている。
特定の実施形態において、オンラインモード、アットラインモード、又はインラインモードで関心対象のタンパク質及び不純物をモニタリングするために、ＵＶ、ＮＩＲ、ＦＴＩＲ、蛍光、ラマンといった分光法を使用することができ、次いでこれは、ＨＩＣ吸着性溶出液から収集された、プールされた材料中の凝集体のレベルを制御するために使用され得る。特定の実施形態において、オンライン、アットライン、又はインラインでのモニタリング方法は、クロマトグラフィー工程の溶出液ライン上で、又は収集容器中でのいずれかで使用することができ、これにより所望の生成物の品質／回収が達成可能となる。特定の実施形態において、ＵＶシグナルは、適切な生成物の品質／回収を達成するための代用として使用され得、このＵＶシグナルは、通常のプロセスの変動に対処し、目標生成物の品質を達成可能とするため、積分法、微分法、移動平均などの処理技術を含むがこれに限定されずに適切に処理され得る。特定の実施形態において、こうした測定は、負荷／洗浄のイオン濃度／伝導度がフィードバックにより制御され、その結果、生成物の品質の制御を促進させることができるよう、インライン希釈法と組み合わせることができる。
Ｇ．サイズ排除クロマトグラフィー
サイズ排除クロマトグラフィー又はゲルろ過は、分子サイズの関数として成分の分離に依存する。分離は、流体中に存在する時間と比較して、物質が多孔質固定相中で費やす時間量に依存する。分子が細孔内に存在する確率は、分子及び細孔のサイズに依存する。加えて、物質が細孔内へと浸透する能力は、小さな巨大分子についてはより高い巨大分子の拡散移動度により決定される。非常に大きい巨大分子は、固定相の細孔に全く浸透しないことがある。また、非常に小さな巨大分子では、浸透する確率は１に近い。大きな分子サイズの成分は、より迅速に固定相を過ぎ去って移動するが、小さい分子サイズの成分は、固定相の細孔を通る経路がより長くなるため、固定相内により長く保持される。
クロマトグラフィー材料は、サイズ排除材料を含むことができ、この場合サイズ排除材料は樹脂又は膜である。サイズ排除に使用されるマトリックスは、好ましくは、例えば架橋アガロース及び／又は粒状ビーズ形態のデキストランといった架橋された多糖類の複合体であり得る不活性ゲル媒体である。架橋度は、膨潤したゲルビーズ中に存在する細孔のサイズを決定する。特定のサイズを超える分子はゲルビーズに侵入しないため、これによりクロマトグラフィーの床を最速で移動する。サイズ及び形状に応じた様々な程度でゲルビーズに侵入する、例えば界面活性剤、タンパク質、ＤＮＡ及びその同等物といった小分子は、床を通過するのが遅延する。したがって、分子サイズが小さくなるほど、概して分子は溶出される。
ウイルスのサイズ排除クロマトグラフィーに適切な多孔質クロマトグラフィー樹脂は、異なる物理的特性を有するデキストロース、アガロース、ポリアクリルアミド、又はシリカから作製されてもよい。ポリマーの組合せもまた使用され得る。最も一般的に使用されるのは、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから商品名「ＳＥＰＨＡＤＥＸ」で入手可能であるものである。異なる構成の材料を由来とする他のサイズ排除支持体は、例えばＴｏｙｏｐｅａｒｌ ５５Ｆ（ポリメタクリラート、Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製、Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ Ｐａ．）及びＢｉｏ－Ｇｅｌ Ｐ－３０ Ｆｉｎｅ（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）も適切である。
関心対象のタンパク質を含む試料のタンパク質負荷量は、約５０ｇ／Ｌ～約１０００ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ～約１５０ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ～約１００ｇ／Ｌ、約２０ｇ／Ｌ～約８０ｇ／Ｌ、約３０ｇ／Ｌ～約５０ｇ／Ｌ、又は約４０ｇ／Ｌ～約５０ｇ／Ｌの、カラムに対する総タンパク質負荷量に調整され得る。特定の実施形態において、負荷タンパク質混合物のタンパク質濃度は、約０．５ｇ／Ｌ～約５０ｇ／Ｌ、又は約１ｇ／Ｌ～約２０ｇ／Ｌである、カラムへと負荷された材料のタンパク質濃度に調整される。
Ｈ．ウイルスろ過
ウイルスろ過は生成プロセス中のウイルス減少を目的とした工程である。この工程は、通常クロマトグラフィーのポリッシュ後に実施される。ウイルス減少は、Ａｓａｈｉ Ｋａｓｅｉ Ｐｈａｒｍａ製のＰｌａｎｏｖａ ２０Ｎ（商標）、Ｐｌａｎｏｖａ ５０Ｎ、又はＢｉｏＥｘ、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製のＶｉｒｅｓｏｌｖｅ（商標）フィルタ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ製のＶｉｒｏＳａｒｔ ＣＰＶ、Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製のＵｌｔｉｐｏｒ ＤＶ２０又はＵｌｔｉｐｏｒ ＤＶ５０（商標）を含むがこれらに限定されない好適なフィルタの使用により達成され得る。所望のろ過性能を得るための好適なフィルタを選択することは、当業者には明らかであろう。
Ｉ．限外ろ過／透析ろ過
本発明の特定の実施形態は、関心対象のタンパク質を更に濃縮及び製剤化するために限外ろ過及び透析ろ過を利用する。限外ろ過は、Ｍｉｃｒｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｌ．Ｚｅｍａｎ ａｎｄ Ａ．Ｚｙｄｎｅｙ（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９９６）；及び：Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｍｕｎｉｒ Ｃｈｅｒｙａｎ（Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，１９８６；ＩＳＢＮ Ｎｏ．８７７６２－４５６－９）中に詳細が説明されており、それらの全体の教示が本明細書に参照として組み入れられる。ろ過プロセスの１つには、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ」と題されるＭｉｌｌｉｐｏｒｅカタログの１７７～２０２頁（Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓ．，１９９５／９６）（その全体の教示が本明細書に参照として組み入れられる）に説明されるようなタンジェンシャルフローろ過である。限外ろ過は、０．１μｍより小さい細孔径を有するフィルタを使用したろ過を意味すると一般には考えられる。こうした小さい細孔径を有するフィルタを使用することにより、タンパク質を膜表面の上に保持させつつ、フィルタの膜細孔を通して試料バッファを浸透させることで試料の体積を減少させることができる。
当業者は、ＵＦ／ＤＦ操作に適切な膜フィルタデバイスを選択することができる。本発明に好適な膜カセットの例としては、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製の１０ｋＤ、３０ｋＤ、又は５０ｋＤ膜を有するＰｅｌｌｉｃｏｎ２カセット又はＰｅｌｌｉｃｏｎ３カセット；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製のＫｖｉｃｋ １０ｋＤ、３０ｋＤ、又は５０ｋＤ膜カセット；及びＰａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製のＣｅｎｔｒａｍａｔｅ又はＣｅｎｔｒａｓｅｔｔｅ １０ｋＤ、３０ｋＤ、又は５０ｋＤカセットが挙げられるが、これらに限定されない。
Ｊ．例示的な生成方針
一次回収は、生成バイオリアクタの回収物からの細胞及び細胞細片（ＨＣＰを含む）を取り除くためにｐＨ低下、遠心分離、及びろ過を順次利用することで進められる。本発明は、一次回収から、関心対象のタンパク質を含む生物学的試料を、（特に順序は問わないが）ＡＥＸ、ＣＥＸ、ＳＥＣ、ＨＩＣ及び／又はＭＭを含む、１種以上の生成工程に供することに関する。本発明の特定の態様は、更なる処理工程を含む。追加的な処理手順の例としては、エタノール沈殿、等電点電気泳動、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）でのクロマトグラフィー、更なる陰イオン交換クロマトグラフィー、及び／又は更なる陽イオン交換クロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈殿、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティークロマトグラフィー（例えば、捕捉試薬としてプロテインＡ又はプロテインＧ、抗体、特異的基質、リガンド又は抗原を使用する）が挙げられる。特定の態様では、カラム温度（及び他のパラメータ）は、分離効率及び／又は任意の特定の生成工程の収率を向上させるために独立して変更され得る。
特定の実施形態において、未結合フロースルー画分及び洗浄画分は更に分画され、目標生成物の純度をもたらす画分の組合せがプールされ得る。
カラム負荷工程及び洗浄工程は、特定の目標生成物の品質及び収率を達成するように、カラム流出液又は収集プールのいずれか又はこの両方の中で、生成物関連の不純物／物質のレベルを、インライン、アットライン、又はオフライン測定することによって、制御することができる。特定の実施形態において、負荷濃度は、分離効率及び／又は収率を向上させるために必要な分配を達成するため、バッファ又は他の溶液を用いてインライン又はバッチ又は連続希釈により動的に制御され得る。
そのような生成手順の例を図５～８に示す。
図５は、アフリベルセプトの産生に使用される例示的な一実施形態を表す。図５を参照すると、この方法は、（ａ）ＣＤＭ中で培養された宿主細胞においてアフリベルセプトを発現させる工程、（ｂ）アフィニティー捕捉樹脂を含み得る第１クロマトグラフィー支持体を使用して、アフリベルセプトを捕捉する工程、及び（ｃ）少なくともアフリベルセプトの一部と、陰イオン交換クロマトグラフィーを含み得る第２クロマトグラフィー支持体とを接触させる工程、を含む。工程（ｃ）は、ＡＥＸカラムを洗浄すること、及びアフリベルセプトを含む試料の（１つ以上の）フロースルー画分を収集することを更に含み得る。任意選択で、工程（ｃ）は、第２クロマトグラフィー支持体をストリップし、ストリップされた画分を収集することを含み得る。工程は、上記に言及された方法論と併せてルーチンの方法論により実行され得る。当業者は、ＡＥＸよりも又はＡＥＸに加えて、ＣＥＸの利用を選択する可能性があることを理解するだろう。特に順序は問わないが、追加のクロマトグラフィー工程は、ＨＩＣ及びＳＥＣを含むがこれらに限定されない工程として利用されてもよい。
図５の例示的な実施形態に加え、他の追加の例示的な実施形態は、（ｄ）工程（ｃ）の当該アフリベルセプトの少なくとも一部と、第３クロマトグラフィー支持体とを接触させる工程を含み得る。一態様において、プロトコルは、（ｅ）工程（ｄ）のアフリベルセプトの少なくとも一部を、第４クロマトグラフィー支持体と接触させる工程を含み得る。本実施形態の一態様において、プロトコルは任意選択で、工程（ｃ）のアフリベルセプトを含む試料を、５．５未満のｐＨに供する工程を含み得る。一態様において、本方法は工程（ａ）の前に清澄工程を含む。
図６は、ＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐの産生に使用される例示的な一実施形態を表す。この方法は、（ａ）ＣＤＭ中で培養された宿主細胞においてアフリベルセプトを発現させる工程、（ｂ）アフィニティークロマトグラフィー樹脂を含み得る第１クロマトグラフィー支持体を使用して、アフリベルセプトを捕捉する工程、（ｃ）アフリベルセプトを切断し、それによりＦｃドメインを取り除き、ＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐを含む試料を形成する工程、（ｄ）工程（ｃ）の試料と、アフィニティークロマトグラフィーであり得る第２クロマトグラフィー支持体とを、接触させる工程、及び（ｅ）工程（ｄ）のフロースルーと、陰イオン交換クロマトグラフィーを含み得る第３クロマトグラフィー支持体とを、接触させる工程、を含む。工程（ｄ）は、（１つ以上の）フロースルー画分の収集を含み、この場合、Ｆｃドメインが存在しないことにより、ＭｉｎｉＴｒａｐがとどまる一方で、アフリベルセプト又はＦｃドメインを有する任意の他のタンパク質は、工程（ｄ）のアフィニティーカラムと本質的に相互作用する必要がある。任意選択で、工程（ｄ）は、第３クロマトグラフィー支持体をストリップし、ストリップされた画分を収集することを含み得る。工程は、上記に概説された方法論と併せてルーチンの方法論により実行され得る。特に順序は問わないが、追加のクロマトグラフィー工程は、ＨＩＣ及びＳＥＣなどを含み得るがこれらに限定されない。
図７は、アフリベルセプトの産生のための例示的な一実施形態を表す。この方法は、（ａ）ＣＤＭ中で培養された宿主細胞においてアフリベルセプトを発現させる工程、（ｂ）陽イオン交換クロマトグラフィーを含み得る第１クロマトグラフィー支持体を使用して、アフリベルセプトを捕捉する工程、及び（ｃ）工程（ｂ）のフロースルーを、陰イオン交換クロマトグラフィーを含み得る第２クロマトグラフィー支持体と、接触させる工程、を含む。任意選択で、工程（ｃ）は、第２クロマトグラフィー支持体をストリップし、ストリップされた画分を収集することを含み得る。工程は、上記に示唆されたプロトコルと併せてルーチンの方法論により実行され得る。特に順序は問わないが、他のクロマトグラフィー手順が利用されてもよく、これはＨＩＣ及びＳＥＣを含むがこれらに限定されない。
図８は、ＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐを産生するための例示的な一実施形態を表す。この方法は、（ａ）ＣＤＭ中で培養された宿主細胞においてアフリベルセプトを発現させる工程、（ｂ）イオン交換クロマトグラフィーを含み得る第１クロマトグラフィー支持体を使用して、アフリベルセプトを捕捉する工程、（ｃ）アフリベルセプトを含む工程（ｂ）のフロースルー画分を、アフィニティークロマトグラフィーに供して、アフリベルセプトを含む溶出液を溶出する工程、（ｄ）工程（ｃ）のアフリベルセプトを切断動作に供し、そうすることでＦｃドメインを切断して、結果ＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐを形成する工程、を含む。一態様において、工程（ｂ）のイオン交換はＡＥＸを含む。代替的には、工程（ｂ）はＣＥＸを含んでもよい。特に順序は問わないが、追加のクロマトグラフィー工程は、ＨＩＣ及び／又はＳＥＣの追加といった、工程（ｄ）後の更なるイオン交換クロマトグラフィー工程などを含んでもよい。
ＶＩＩ．組成物を含む医薬製剤
本発明はまた、抗ＶＥＧＦ組成物を含む製剤（上にて説明される）を開示する。抗ＶＥＧＦタンパク質に好適な製剤としては、米国特許第７，６０８，２６１号、米国特許第７，８０７，１６４号、米国特許第８，０９２，８０３号、米国特許第８，４８１，０４６号、米国特許第８，８０２，１０７号、米国特許第９，３４０，５９４号、米国特許第９，９１４，７６３号、米国特許第９，５８０，４８９号、米国特許第１０，４００，０２５号、米国特許第８，１１０，５４６号、米国特許第８，４０４，６３８号、米国特許第８，７１０，００４号、米国特許第８，９２１，３１６号、米国特許第９，４１６，１６７号、米国特許第９，５１１，１４０号、米国特許第９，６３６，４００号及び米国特許第１０，４０６，２２６号（その全体が本明細書に参照としてすべて組み入れられる）に説明される製剤が挙げられるが、これらに限定されない。
上流プロセス技術（上記のセクションＩＶに説明される）、下流プロセス技術（上記のセクションＶに説明される）は、製剤を製造するために、単独で又は互いに組み合わせて使用されてもよい。
本発明は、１種以上の成分／賦形剤を伴う抗ＶＥＧＦ組成物を含む製剤、並びにそれらを使用する方法、及びこうした組成物を作製する方法を開示する。本発明の一実施形態において、本発明の医薬製剤は、およそ５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、又は６．２のｐＨを有する。
抗ＶＥＧＦ組成物のための医薬製剤を調製するため、抗ＶＥＧＦ組成物は薬学的に許容される担体又は賦形剤と混合される。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｕ．Ｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ：Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（１９８４）；Ｈａｒｄｍａｎ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．；Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．；Ａｖｉｓ，ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）（１９９３）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）（１９９０），Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｄｉｓｐｅｒｓｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎ．Ｙ．；Ｗｅｉｎｅｒ ａｎｄ Ｋｏｔｋｏｓｋｉｅ（２０００）Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｎｄ Ｓａｆｅｔｙ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．を参照されたい（これらの全体の教示は本明細書に参照として組み入れられる）。本発明の一実施形態において、医薬製剤は無菌である。
本発明の医薬製剤としては、抗ＶＥＧＦ組成物と、例えば水、緩衝剤、保存剤、及び／又は界面活性剤を含む薬学的に許容される担体とを含む。
本発明は、本明細書に記載される抗ＶＥＧＦ組成物のいずれかと、薬学的に許容される担体とを含む医薬製剤を提供する。例えば、ポリペプチドの濃度は、約４０ｍｇ／ｍＬ、約６０ｍｇ／ｍＬ、約８０ｍｇ／ｍＬ、９０ｍｇ／ｍＬ、約１００ｍｇ／ｍＬ、約１１０ｍｇ／ｍＬ、約１２０ｍｇ／ｍＬ、約１３０ｍｇ／ｍＬ、約１４０ｍｇ／ｍＬ、約１５０ｍｇ／ｍＬ、約２００ｍｇ／ｍＬ又は約２５０ｍｇ／ｍＬである。
本発明の範囲は、抗ＶＥＧＦタンパク質及び薬学的に許容される担体を含む、例えば凍結乾燥など乾燥させた組成物を含み、この組成物は、実質的に（約８５％～約９９％以上）水を欠いている。
一実施形態において、本明細書に開示される抗ＶＥＧＦ組成物と共に対象に投与される更なる治療薬は、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ２００３（Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；５７ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｎｏｖ．１，２００２）、その全体の教示が本明細書に参照として組み入れられる）に従い対象に投与される。
本発明は、本明細書に説明される抗ＶＥＧＦ組成物又は薬学的に許容される担体を含む医薬製剤のいずれかを含む、容器（例えばキャップ、又はクロマトグラフィーカラム、中空の太い針、又はシリンジのシリンダを備えた、プラスチック製バイアル及びガラス製バイアル）を提供する。本発明はまた、本明細書に記載される抗ＶＥＧＦ組成物又は製剤を含む、例えばシリンジ、事前充填シリンジ、又は自動注射器といった注射デバイスを提供する。一態様において、容器は、自然光又はそれ以外の光を遮断するため、着色されている（例えば茶色）。
本発明は、１種以上の更なる治療薬を伴う抗ＶＥＧＦ組成物を含む組合せを含む。抗ＶＥＧＦ組成物及び更なる治療薬は、単一の組成物にて又は別個の組成物にて存在し得る。例えば、治療薬はＡｎｇ－２阻害薬（例えば、ネスバクマブ）、Ｔｉｅ－２受容体活性化因子、抗ＰＤＧＦ抗体又はその抗原結合断片、抗ＰＤＧＦ受容体又はＰＤＧＦ受容体β抗体又はそれらの抗原結合断片、及び／又は追加のＶＥＧＦアンタゴニスト（例えばアフリベルセプト、コンベルセプト、ベバシズマブ、ラニビズマブ）、例えばペガプタニブ（例えばペガプタニブナトリウム）といった抗ＶＥＧＦアプタマー、例えばブロルシズマブといった一本鎖（例えば、ＶＬ－ＶＨ）抗ＶＥＧＦ抗体、例えばアビシパル ペゴルＤＡＲＰｉｎといった抗ＶＥＧＦ ＤＡＲＰｉｎ、例えばＡＮＧ２に結合する、ＲＧ７７１６といった二重特異性抗ＶＥＧＦ抗体、又はＦｃ融合タンパク質として発現される、細胞外ドメイン１～３を含むヒト血管内皮増殖因子受容体－３（ＶＥＧＦＲ－３）の可溶型である。
ＶＩＩＩ．処置方法
本発明は、対象において、本明細書に開示される治療有効量の組成物を投与することを含む（上記セクションＩＩＩ）、がん（例えば、その増殖及び／又は転移は、例えばＶＥＧＦ介在血管新生など、ＶＥＧＦが少なくとも部分的に介在する）又は血管新生性眼障害を処置又は予防する方法を提供する。
上流プロセス技術（上記セクションＩＶ）、下流プロセス技術（上記セクションＶ及びＶＩ）は、眼科学的疾患及び腫瘍学的疾患を含む様々な障害を処置又は予防するために使用され得る、セクションＩＩＩに説明される組成物及び／又はセクションＶＩＩに説明される製剤を製造するため、単独で又は互いに組み合わせて使用され得る。
本発明はまた、本明細書に記載される（セクションＩＩＩ及びセクションＶＩＩ）組成物を対象（例えば、ヒト）に投与するための方法も提供し、この方法は、例えば約５０μＬ、約７０μＬ、又は約１００μＬといった約１００μＬ以下で、約０．５ｍｇ、約２ｍｇ、約４ｍｇ、約６ｍｇ、約８ｍｇ、約１０ｍｇ、約１２ｍｇ、約１４ｍｇ、約１６ｍｇ、約１８ｍｇ、又は約２０ｍｇの関心対象のタンパク質（例えば、アフリベルセプト又はＭｉｎｉＴｒａｐ）と、任意選択で更なる治療薬とを有する組成物を、例えば硝子体内注射などの眼球内注射により、対象の身体へと導入する工程を含む。
本発明は、必要がある対象において、例えばＶＥＧＦ介在血管新生といったその増殖及び／又は転移が少なくとも部分的にＶＥＧＦによって介在されるがん、又は血管新生性眼障害を処置するための方法を提供する。この方法は、治療有効量の本明細書に記載される組成物（上記セクションＩＩＩ及びセクションＶＩＩ）、例えば約１００μＬ以下で、２ｍｇ、４ｍｇ、６ｍｇ、８ｍｇ、又は１０ｍｇの関心対象のタンパク質と、任意選択で更なる治療薬とを、対象に投与することを含む。本発明の一実施形態において、投与は硝子体内注射により行われる。本明細書の方法を使用して処置可能又は予防可能である血管新生性眼障害の非限定的な例としては、以下が挙げられる：
・加齢黄斑変性症（例えば、湿性又は乾性）、
・黄斑浮腫、
・網膜静脈閉塞症後の黄斑浮腫、
・網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）、
・網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、
・網膜静脈分枝閉塞症（ＢＲＶＯ）、
・糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、
・脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）、
・虹彩新生血管、
・血管新生緑内障、
・緑内障の術後線維症、
・増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）、
・視神経円板血管新生、
・角膜血管新生、
・網膜血管新生、
・硝子体血管新生、
・パンヌス、
・翼状片、
・血管性網膜症、
・糖尿病性黄斑浮腫に罹っている対象における糖尿病性網膜症；及び
・糖尿病性網膜症（例えば、非増殖性糖尿病性網膜症（例えば、約４７若しくは５３の糖尿病性網膜症重症度スケール（ＤＲＥＳＳ）レベル）によって特徴付けられる）又は増殖性糖尿病性網膜症（例えば、ＤＭＥに罹患していない対象））。
こうした組成物又は製剤（セクションＩＩＩ及びセクションＶＩＩ）の投与の方法は、熟練した医師により変更及び決定することができる。投与経路としては、非経口、経口（ｎｏｎ－ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ）、経口（ｏｒａｌ）、直腸、経粘膜、腸管、非経口；筋肉内、皮下、皮内、髄内、髄液内、直接脳室内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、眼内、吸入、送気、局所、皮膚、眼内、硝子体内、経皮、又は動脈内が挙げられる。
本明細書の一実施形態において、本発明の医薬製剤（本発明の組成物又は製剤を含む）の硝子体内注射は、製剤を含むシリンジ及び針（例えば、３０ゲージの注射針）で眼を刺す工程、及び製剤（例えば、約１００マイクロリットル以下、約４０、５０、５５、５６、５７、５７．１、５８、６０又は７０マイクロリットル）を、例えば約２、４、６、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、又は８．９、１０又は２０ｍｇの関心対象のタンパク質を本明細書に記載される治療有効量で送達するための十分な量で、眼の硝子体へと注射する工程を含む。任意選択で、方法は、局所麻酔薬（例えば、プロパラカイン、リドカイン、又はテトラカイン）、抗菌薬（例えば、フルオロキノロン）、消毒薬（例えば、ポビドンヨード）、及び／又は瞳孔拡張剤を、注射される眼に投与する工程を含む。一態様において、注射される眼の周辺の無菌野は注射前に設置される。硝子体内注射後、対象は眼圧、炎症、及び／又は血圧の上昇についてモニタリングされる。
血管新生性眼障害に対する関心対象のタンパク質の有効量又は治療有効量は、任意の臨床的に測定可能な程度（例えば、血管新生性眼障害に関しては、糖尿病性網膜症の重症度スコア（ＤＲＳＳ）の低減又はこの維持を生じさせること、視覚の改善又はこの維持（例えば、ＥＴＤＲＳの文字についての増加により測定されるような、例えば最善に補正された視力に関して）、視野の増加若しくはこの維持、及び／又は中心網膜の厚みの減少若しくはこの維持、及びがんに関しては、対象内のがん細胞の増殖、生存率、及び／又は転移の停止又は退行）、例えば、こうしたがん又は血管新生性眼障害の１つ以上の症状又は徴候の退行、安定化、又は除去を引き起こすのに十分な、関心対象のタンパク質の量を指す。
本発明の一実施形態において、血管新生性眼障害を処置又は予防するための、アフリベルセプトといった関心対象のタンパク質の有効量又は治療有効量は、例えば約１００μＬ以下で、約０．５ｍｇ、約２ｍｇ、約３ｍｇ、約４ｍｇ、約５ｍｇ、約６ｍｇ、約７ｍｇ、約７．２５ｍｇ、約７．７ｍｇ、約７．９ｍｇ、約８．０ｍｇ、約８．１ｍｇ、約８．２ｍｇ、約８．３ｍｇ、約８．４ｍｇ、約８．５ｍｇ、約８．６ｍｇ、約８．７ｍｇ、約８．８ｍｇ、約８．９ｍｇ、約９ｍｇ、約１０ｍｇ、約１１ｍｇ、約１２ｍｇ、約１３ｍｇ、約１４ｍｇ、約１５ｍｇ、約１６ｍｇ、約１７ｍｇ、約１８ｍｇ、約１９ｍｇ又は２０ｍｇである。この量は、投与される対象の年齢及び体型、標的疾患、条件、及び投与の経路などに応じて変更されてもよい。特定の例示的な実施形態において、初期投与後、初期投与とおおよそ同じ、又はそれより少ない、又はそれより多くなり得る量で、関心対象のタンパク質の二次投与、又はその後の複数回の投与があってもよく、この場合、その後の投与は、少なくとも１日～３日、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも５週間、少なくとも６週間、少なくとも７週間、少なくとも８週間、少なくとも９週間、少なくとも１０週間、少なくとも１２週間、又は少なくとも１４週間、間隔をあけられる。
投与量の値は、緩和すべき状態の種類及び重症度により変更され得ることに留意されたい。任意の特定の対象について、特定の投与レジメンは、個々の必要性、及び組成物の投与を管理又は監督する者の専門的判断に従って、経時的に調整されるべきであり、本明細書に記載の投与量範囲は例示的なものにすぎず、特許請求される組成物の範囲又は実施を限定することを意図するものではないことを更に理解されたい。
ＩＸ．タンパク質バリアントのアッセイ方法
本明細書に説明される技術を使用して生成されたクロマトグラフィー試料中のタンパク質バリアントのレベルは、以下の実施例に説明されるように分析され得る。ある特定の実施形態において、ｃＩＥＦ法は、フッ化炭素コーティングされたキャピラリーカートリッジ（１００μｍ×５ｃｍ）を備えるｉＣＥ３分析器（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ）を使用して利用される。両性電解質溶液は、０．３５％のメチルセルロース（ＭＣ）、４％のＰｈａｒｍａｌｙｔｅ３－１０担体両性電解質、４％のＰｈａｒｍａｌｙｔｅ５－８担体両性電解質、１０ｍＭのＬ－アルギニンＨＣｌ、２４％のホルムアミドの混合物からなり、精製水中、５．１２及び９．７７のｐＩマーカからなる。アノード液は、０．１０％のメチルセルロース中８０ｍＭのリン酸であり、カソード液は、０．１０％のメチルセルロース中１００ｍＭの水酸化ナトリウムであった。試料を、精製水を用いて１０ｍｇ／ｍＬに希釈した。試料を両性電解質溶液と混合し、次いで１分間１５００Ｖの電位を導入し、次いで７分間３０００Ｖの電位を導入して電気泳動にかけた。電気泳動にかけたバリアントの画像は、キャピラリーを通して２８０ｎｍの紫外線を通過させ、電荷結合デバイスのデジタルカメラレンズに入れることによって得た。次いで、この画像を分析し、様々な電荷バリアントの分布を決定した。当業者は、所望の結果を達成しつつ、正確なパラメータを変更させることができる。
特許、特許出願、公開特許出願、受託番号、技術論文、及び学術論文を含む様々な刊行物が、本明細書全体を通して引用される。これらのそれぞれの引用された参考文献は、その全体が参照により組み入れられる。
本発明は、以下の実施例を参照することによってより完全に理解されるであろう。しかしながら、それらは本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
実施例で述べられるＭｉｎｉＴｒａｐ（ＭＴ）１～６は以下の通りである：
ＭＴ１：ＣＤＭ１を使用して産生されたアフリベルセプトの切断により得られるＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐ。
ＭＴ２：ＣＤＭ２を使用して産生されたアフリベルセプトの切断により得られるＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐ。
ＭＴ３：ＣＤＭ３を使用して産生されたアフリベルセプトの切断により得られるＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐ。
ＭＴ４：ダイズ加水分解物を使用して産生されたアフリベルセプトの切断により得られるＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐ。
ＭＴ５：組換えＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐ（二量体）。
ＭＴ６：組換えＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐ（ｓｃＦｖ）。
ＭＴ１、ＭＴ５及びＭＴ６の特性評価は、以下の実施例８にて説明される。
試料の色評価
ｂ＊値を測定する分光光度アッセイ方法（ＣＩＥＬＡＢ）は、色評価を実施するのに好適であることが分かった。
可視光線スペクトラム（３８０～７８０ｎｍ）にわたって１ｍＬのタンパク質試料の吸光度を定量化し、一連の行列演算を使用して吸光度曲線をＣＩＥＬＡＢ色空間へと変換した。機器は、１時間におよそ６個の試料を処理可能である。アッセイの高スループットフォーマットは、ＣＬＡＲＩＯｓｔａｒ ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）を使用した。０．３ｍＬの試料を必要とする９６ウェルプレートを使用し、最大９６個の試料を分析できる。
ＢＹ標準をｂ＊値に変換するため、ＢＹ参照標準（ＢＹ１～ＢＹ７）を、高スループットアッセイフォーマットを使用して定量化した。
上に述べられるＢＹ標準に従い、溶液を調製した。それぞれの標準についてのｂ＊値は図９に示される通りである。この方法は、以下の表３に示す通り、試料の必要量がより少なく、実行時間がより短い、より速いアッセイを提供する。この方法を使用して評価したすべての試料について、試験試料のタンパク質濃度を５ｇ／Ｌ又は１０ｇ／Ｌのいずれかに標準化した。
（表３）
［実施例１］合成培地を使用したタンパク質の産生
１．１ 細胞供給源及び回収
本研究ではアフリベルセプト産生細胞株を利用した。合成培地（ＣＤＭ）を使用してアフリベルセプト産生細胞株を培養し、回収した。
１．２ アフリベルセプトのタンパク質分解性切断
ＭＴ１を生成するため、固定化したＩｄｅＳ酵素（Ｇｅｎｏｖｉｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）から得たＦａｂＲＩＣＡＴＯＲ（登録商標））を有するカラムを使用した。細胞培養回収物から得たアフリベルセプト（１．０ｍＬの切断バッファ中、２０ｍｇ）をカラムに加え、１８℃で３０分間インキュベートした。３０分後、切断バッファ（１．０ｍＬ）でカラムを洗浄した。消化混合物と洗浄溶液を合わせた。分析用プロテインＡアフィニティーカラム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（商標）、ＰＯＲＯＳ（商標）２０μＭプロテインＡカートリッジ、２．１×３０ｍｍ、０．１ｍＬ（カタログ番号２－１００１－００）に混合物を負荷し、ここから溶出させた。ＰＯＲＯＳ（商標）２０μＭプロテインＡカートリッジ、２．１×３０ｍｍ、０．１ｍＬ（カタログ番号２－１００１－００）向けのＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（商標）のプロトコルに従い、処理を行った。カラム高さは２０±１．０ｃｍであり、保持時間は１５分間であった。また、平衡化／洗浄は４０ｍＭのトリス、５４ｍＭの酢酸塩（ｐＨ７．０±０．１）を使用して実施された。
［実施例２］色を最小化させるための陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）
（Ａ）色形成を減少するためにＡＥＸを利用した
ＣＤＭ１を使用して発現されたアフリベルセプトの産生中の呈色を取り除くため、ＡＥＸクロマトグラフィーを実施した。
２．１ デザイン
表２－２に説明されるようなＡＥＸプロトコルを用い、表２－１に詳述されるように、この調査のために５回のＡＥＸ分離を実施した。ＡＫＴＡ Ａｖａｎｔベンチトップ型液体クロマトグラフィーコントローラに、１５．７ｍＬのＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラム（床高さ１９．５ｃｍ、内径１．０ｃｍ）及び１４．１ｍＬのＰＯＲＯＳ ５０ ＨＱカラム（床高さ１８．０ｃｍ、内径１．０ｃｍ）を統合した。
２Ｍのトリス塩基又は２Ｍの酢酸を使用し、ＡＥＸ負荷のｐＨを目標±０．０５ｐＨ単位に調整した。５Ｍの塩化ナトリウム及び脱イオン水を使用し、ＡＥＸ負荷の伝導度を目標±０．１ｍＳ／ｃｍに調整した。高分子量（ＨＭＷ）、色及び収率について、すべてのプール試料を分析した。
（表２－１）ＡＥＸ色低減のための研究デザインの概要
（表２－２）色低減のためのＡＥＸプロトコル
２．２ 結果
産生へのＡＥＸ分離の利用は、色の著しい低減を呈した（表２－３）。例えば、表２－３で確認されるように、ＡＥＸ分離１におけるフロースルー（ＦＴ）及び洗浄液（ｐＨ８．３０～８．５０、１．９０～２．１０ｍＳ／ｃｍ）中で観察される色は、３．０６のｂ＊値を有するＡＥＸの負荷（「ＡＥＸ負荷」）の色と比較して、１．０５のｂ＊値を有した。ｂ＊値における増加は、試料の黄褐色の強度を反映する。
樹脂（Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ又はＰＯＲＯＳ ５０ ＨＱ）並びにｐＨ及び伝導度設定点（ｐＨ８．４０及び２．００ｍＳ／ｃｍ、ｐＨ８．００及び２．５０ｍＳ／ｃｍ、又はｐＨ７．８０及び４．００ｍＳ／ｃｍ）の色低減に対する影響を評価するために、５回のＡＥＸ分離を実施した。ＰＯＲＯＳ ５０ ＨＱに関して、設定点をより低いｐＨ及びより高い伝導度に変更すると、収率（６４．４、８１．９、及び９１．４％）及びプールＨＭＷレベル（１．０２、１．２９、及び１．８３％）は増加した。設定点をより低いｐＨ及びより高い伝導度に変更すると、色（ｂ＊値）も増加した（１．０５、１．３３、及び１．５５）。より高いｐＨレベル及びより低い伝導度は、ＰＯＲＯＳ ５０ ＨＱについてのＡＥＸ分離を通して、最大の色低減をもたらした。
Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗに関して、設定点をより低いｐＨ及びより高い伝導度に変更すると、収率（４９．５％及び７７．７％）及びプールＨＭＷレベル（０．５９％及び１．２５％）は増加した。設定点をより低いｐＨ及びより高い伝導度に変更すると、色（ｂ＊値）も増加した（０．９６、及び１．３５）。
ＡＥＸの使用は黄褐色を低減させる。表２－３を参照されたい。加えて、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ ＦｌｏｗはＰＯＲＯＳ ５０ ＨＱよりも、両方の樹脂について評価した２つの設定点については、色を低減させると判定された。ｐＨ８．００及び２．５０ｍＳ／ｃｍの設定点において、ＰＯＲＯＳ ５０ ＨＱプールは１．３３のｂ＊値を有し、一方でＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗプールは０．９６のｂ＊値を有した。同様に、ｐＨ７．８０及び４．００ｍＳ／ｃｍの設定点において、ＰＯＲＯＳ ５０ ＨＱプールは１．５５のｂ＊値を有し、一方でＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗプールは１．３５のｂ＊値を有した（表２－３）。
（表２－３）ＡＥＸ色低減調査の実験結果の概要
ＡＥＸ、陰イオン交換クロマトグラフィー；ＨＭＷ、高分子量種；Ｎ／Ａ、該当なし
色測定のため、画分を１０ｇ／Ｌのタンパク質濃度に調整した。
２．３ 結論
ＡＥＸの使用は黄褐色を低減させることが分かった。表２－３を参照されたい。表２－３を参照すると、ＡＥＸ負荷は３．０６のｂ＊値を有するが、ＡＥＸクロマトグラフィーに供すると（ＡＥＸ分離１～５）、ｂ＊値が減少し、これは黄褐色の減少を示している。この場合もまた、ｂ＊値が減少するにつれて呈色が低減し、ｂ＊値が増加するにつれて、所与の試料における黄褐色の増加を反映している。
２つのＡＥＸ樹脂（ＰＯＲＯＳ ５０ ＨＱ及びＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ）及び３つの設定点（ｐＨ８．４０及び２．００ｍＳ／ｃｍ、ｐＨ８．００及び２．５０ｍＳ／ｃｍ、及びｐＨ７．８０及び４．００ｍＳ／ｃｍ）を使用し、色低減を評価した。両方の樹脂について、より高いｐＨ及びより低い伝導度の設定点について、色低減はより大きかった。加えて、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ ＦｌｏｗはＰＯＲＯＳ ５０ ＨＱよりも、両方の樹脂について評価した２つの設定点（ｐＨ８．００及び２．５０ｍＳ／ｃｍ、及びｐＨ７．８０及び４．００ｍＳ／ｃｍ）においては、より色低減をもたらした。しかし、５回すべてのＡＥＸ分離法は、ＡＥＸ用の負荷溶液（「ＡＥＸ負荷」）と比較すると著しい色低減をもたらし、ＣＤＭを使用して発現されたアフリベルセプト産生のプロセスにおけるＡＥＸ生成の重要性を実証した。（１０ｇ／Ｌの濃度での）ＡＥＸ負荷の初期ｂ＊値は、約０．５～約３０の範囲であり、より具体的には約１．０～約２５．０、及び更により具体的には約２．０～約２０．０の範囲であり得る。ＡＥＸの使用後、（１０ｇ／Ｌの濃度での）フロースルーのｂ＊値は、０．５～約１０．０の範囲であり、より具体的には約０．５～約７．０、及び更により具体的には約０．５～約５．０の範囲であり得る。
２．４ ペプチドマッピング
試料調製。翻訳後修飾（ＰＴＭ）を同定及び定量化するため、上記実験（表２－３）のＡＥＸ負荷及びフロースルーから得られた還元及びアルキル化アフリベルセプト試料のトリプシンマッピング（Ｔｒｙｐｔｉｃ ｍａｐｐｉｎｇ）を実施した。各試料のアリコート（負荷及びフロースルー）を、８．０Ｍの尿素、０．１Ｍのトリス－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を使用して変性し、ＤＴＴで還元し、次いでヨードアセトアミドでアルキル化した。変性、還元及びアルキル化された試料を、最初に組換えＬｙｓ－Ｃ（ｒＬｙｓ－Ｃ）を用い、３７℃で３０分間、１：１００（ｗ／ｗ）の酵素対基質比にて消化し、最終尿素濃度が１．８Ｍとなるように０．１Ｍのトリス－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で希釈して、続いてトリプシンを用い、３７℃で２時間、１：２０（ｗ／ｗ）の酵素対物質比にて消化し、次いでＰＮＧａｓｅＦを用いて、３７℃で１時間、１：５（ｗ／ｗ）の酵素基質比で脱グリコシル化した。ギ酸（ＦＡ）を用いてｐＨを２．０未満とすることにより、消化を停止した。
ＬＣ－ＭＳ分析。各試料から得られたｒＬｙｓ－Ｃ／トリプシンペプチドの２０μｇのアリコートを分離し、Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＣＳＨ Ｃ１８カラム（１３０Å、１．７μｍ、２．１×１５０ｍｍ）を使用して逆相超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）、続いてオンラインＰＤＡ検出（２８０ｎｍ、３２０ｎｍ及び３５０ｎｍの波長にて）及び質量分析により分析した。移動相Ａは水中０．１％ＦＡであり、移動相Ｂはアセトニトリル中０．１％ＦＡであった。試料注入後、０．１％のＢにて５分間保持してグラジエントを開始し、続いて、最適なペプチド分離のため、７５分間かけて３５％までＢを直線状に増加させた。ＭＳ／ＭＳ実験のペプチドフラグメンテーションに利用される高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）を備えたＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅハイブリッド四重極Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計を使用し、ＭＳ及びＭＳ／ＭＳ実験を実施した。ペプチド同一性の割り当ては、実験的に決定されたフルＭＳスペクトラム中の所与のペプチドの正確な質量、及び対応するＨＣＤ ＭＳ／ＭＳスペクトラム中のｂフラグメントイオン及びｙフラグメントイオンに基づいていた。負荷及びフロースルーからのペプチドの抽出イオンクロマトグラムを生成した（図１０を参照されたい）。図１０の抽出イオンクロマトグラムで確認されるように、ＡＥＸ分離１～５（表２－３にて同定される）からの「ＡＥＸ負荷」及び「ＡＥＸ ＦＴ／洗浄液」において同定されたペプチド断片を示す。ペプチドマッピング分析から図１０で同定されるこれらのいくつかのペプチドの相対的な存在量を図１１に示す。
図１１を参照すると、この図は、分析される様々なペプチド断片及びそれらの相対的な酸化レベルを示している。特に、３列目は、単離及び分析されたペプチド断片のアミノ酸残基（「ペプチド配列」）を示している。各ペプチド配列は、下線が引かれたアミノ酸残基を有する。下線が引かれたアミノ酸残基は、ペプチド配列中の酸化されたアミノ酸を示す。酸化アミノ酸は、ヒスチジン（Ｈ）酸化又はトリプトファン（Ｗ）酸化のいずれかに対応する。この図ではまた、それぞれのペプチド配列の行の右側に向かって、酸化種の存在量を示している。行中のこの陰影は、それぞれの列の見出しに示される異なるＡＥＸ分離を使用した、特定の試料中の酸化残基の相対的な量の差を示している。例えば、図１１の２つ目のペプチド（ＥＩＧＬＬＴＣＥＡＴＶＮＧＨＬＹＫ（配列番号１８））を参照して、水平方向に沿って読み取ると、特定の試料（「アフリベルセプトＡＥＸ負荷」）中のこのペプチドの酸化された相対的総集団は、およそ０．０１３％酸化されている。同じ行にわたって進むと、陰影がシフトしており、これは酸化種の相対的な存在量における変化を示している。例えば、この同じペプチド配列を使用すると、ＡＥＸ分離についての酸化種の相対的な存在量は、異なるＡＥＸ分離プロトコルに従った場合、０．００６％～０．０１０％である。したがって、ＡＥＸクロマトグラフィーは酸化種の存在量を減少させると理解することができる。
（Ｂ）ＭｉｎｉＴｒａｐ産生における色形成を低減させるためにＡＥＸを使用した
ＣＤＭ１を使用して発現された全長アフリベルセプトの切断実施時に得られるＭＴ１の産生中に生じる呈色を取り除くため、ＡＥＸクロマトグラフィーを実施した。
２．５ デザイン
表２－４にて説明されるように、本調査のために４回のＡＥＸ分離を実施した。ＭＴ１（「ＭＴ１ろ過プール」）のろ過試料から、ＡＥＸ負荷を得た。この実験のため、ＡＫＴＡ Ａｖａｎｔベンチトップ型液体クロマトグラフィーコントローラに、１５．７ｍＬのＣａｐｔｏ Ｑカラム（床高さ２０．０ｃｍ、内径１．０ｃｍ）、１４．１ｍＬのＰＯＲＯＳ ５０ ＨＱカラム（床高さ１８．０ｃｍ、内径１．０ｃｍ）、及び１６．５ｍＬのＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラム（床高さ２１．０ｃｍ、内径１．０ｃｍ）を統合した。
２Ｍのトリス塩基又は２Ｍの酢酸を使用し、ＡＥＸ負荷のｐＨを目標±０．０５ｐＨ単位に調整した。５Ｍの塩化ナトリウム及び脱イオン水を使用し、ＡＥＸ負荷の伝導度を目標±０．１ｍＳ／ｃｍに調整した。ＨＭＷ、色及び収率について、すべてのプール試料を分析した。
（表２－４）ＡＥＸ色低減調査のための研究デザインの概要
（表２－５）色低減調査のために使用されるフロースルーＡＥＸプロトコル
ＡＥＸ、陰イオン交換クロマトグラフィー；ＣＶ、カラム体積
（表２－６）色低減調査のために使用される結合及び溶出ＡＥＸプロトコル
ＡＥＸ、陰イオン交換クロマトグラフィー；ＣＶ、カラム体積
２．６ 結果
４回のＡＥＸ分離はすべて、ＡＥＸ分離１～４のフロースルー及び洗浄液の呈色に関して確認されるように、色の低減をもたらした（表２－７）。最初の３回のＡＥＸ分離を結合及び溶出モードにて評価したが（表２－６）、生成物の大部分は負荷ブロック及び洗浄液ブロックに存在していたことが観察された（６２％～９４％）。
最初の３回の分離では、Ｃａｐｔｏ Ｑ、ＰＯＲＯＳ ５０ ＨＱ及びＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ樹脂について、ｐＨ８．４及び２．０ｍＳ／ｃｍの設定点を評価した。３回の分離はすべて、良好な収率（８０％超）であった。ＰＯＲＯＳ ５０ ＨＱ ＡＥＸプールは、ＡＥＸプール中では最も弱い黄色であり（ｂ＊値２．０９）、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ ＡＥＸプール（ｂ＊値２．２２）、及びＣａｐｔｏ Ｑ ＡＥＸプール（ｂ＊値２．５５）が続いた。
（表２－７）ＡＥＸ色低減調査の実験結果の概要
ＡＥＸ、陰イオン交換クロマトグラフィー；ＨＭＷ、高分子量種
色測定のため、画分を５ｇ／Ｌのタンパク質濃度に調整した。
２．７ 結論
アフリベルセプトについて確認されるように（上のセクション２．３を参照されたい）、ＡＥＸの使用により、ＭｉｎｉＴｒａｐ産生に関して黄褐色が低減すること（表２－７）が分かった。表２－７を参照すると、ＡＥＸ負荷は４．１７のｂ＊値を有するが、ＡＥＸクロマトグラフィーに供すると（ＡＥＸ分離１～４）、ｂ＊値が減少し、これは黄褐色における減少を示している。この場合もまた、ｂ＊値が減少するにつれて呈色も低減する。（５ｇ／Ｌの濃度での）ＡＥＸ負荷の初期ｂ＊値は、約０．５～約２５の範囲であり、より具体的には約１．０～約２０．０、及び更により具体的には約１．５～約１５．０の範囲であり得る。ＡＥＸの使用後、（５ｇ／Ｌの濃度での）フロースルーのｂ＊値は、０．５～約１０．０の範囲であり、より具体的には約０．５～約７．０、及び更により具体的には約０．５～約５．０の範囲であり得る。
［実施例３］酸化ペプチド調査
３．１ ペプチドマッピング
試料調製。翻訳後修飾を同定及び定量化するため、還元及びアルキル化ＭｉｎｉＴｒａｐ（ＭＴ１）及びＭＴ４（ダイズ加水分解細胞培養を使用して産生された異なる全長アフリベルセプトを使用し、ＭＴ１と類似するＭｉｎｉＴｒａｐ）試料のトリプシンマッピングを実施した。各試料のアリコートは、０．１Ｍのトリス－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中８．０Ｍの尿素を使用して変性させ、ＤＴＴで還元し、次いでヨードアセトアミドでアルキル化した。変性させ、還元し、かつアルキル化した原薬を、最初に組換えＬｙｓ－Ｃ（ｒＬｙｓ－Ｃ）を用い、３７℃で３０分間、１：１００（ｗ／ｗ）の酵素対基質比にて消化し、最終尿素濃度が１．８Ｍとなるように０．１Ｍのトリス－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で希釈して、続いてトリプシンを用い、３７℃で２時間、１：２０（ｗ／ｗ）の酵素対物質比にて消化し、次いでＰＮＧａｓｅＦを用いて、３７℃で１時間、１：５（ｗ／ｗ）の酵素基質比で脱グリコシル化した。ギ酸（ＦＡ）を用いてｐＨを２．０未満とすることにより、消化を停止した。
ＬＣ－ＭＳ分析。各試料から得られたｒＬｙｓ－Ｃ／トリプシンペプチドの２０μｇのアリコートを分離し、Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＣＳＨ Ｃ１８カラム（１３０Å、１．７μｍ、２．１×１５０ｍｍ）を使用して逆相超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）、続いてオンラインＰＤＡ検出（２８０ｎｍ、３２０ｎｍ及び３５０ｎｍの波長にて）及び質量分析により分析した。移動相Ａは水中０．１％ＦＡであり、移動相Ｂはアセトニトリル中０．１％ＦＡであった。試料注入後、０．１％のＢで５分間保持してグラジエントを開始し、続いて最適なペプチド分離のため、７５分間かけて３５％までＢを直線状に増加させた。ＭＳ／ＭＳ実験のペプチドフラグメンテーションに利用される高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）を備えたＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅハイブリッド四重極Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計にて、ＭＳ及びＭＳ／ＭＳ実験を実施した。ペプチド同一性の割り当ては、実験的に決定されたフルＭＳスペクトラム中の所与のペプチドの正確な質量、及び対応するＨＣＤ ＭＳ／ＭＳスペクトラム中のｂフラグメントイオン及びｙフラグメントイオンに基づいた。ＭＴ１試料中の（１つ以上の）酸化アミノ酸残基の部位特異的割合を計算するために積分されたピーク領域を用い、酸化ペプチド及び対応する天然ペプチドの抽出イオンクロマトグラムを生成した。
３５０ｎｍでの吸光度の増加に関連するペプチド断片
ＭＴ１及びＭＴ４に関するトリプシンペプチドマップを比較した際に、ＭＴ１におけるＰＴＭを観察した（図１２Ａは２０．０～７５分に溶出されたペプチドの吸光度を示している）。様々なＵＶピークを有するペプチドが強調されている。クロマトグラムの拡大図を図１２Ｂに示し、これは１６～３０分に溶出したペプチドの吸光度を示している。ＭＴ１とＭＴ４との間のＵＶ吸光度で著しく対照的であるペプチドは、ＴＮＹＬＴＨ＊Ｒ（配列番号２１）、ＩＩＷ（＋４）ＤＳＲ（配列番号２８）及びＩＩＩＷ（＋１３２）ＤＳＲ（配列番号１２４）であった（＊又は下線は残基の酸化を表す）。更に、クロマトグラムの拡大図を図１２Ｃに示し、これは３０～７５分に溶出したペプチドの吸光度を示している。ＭＴ１とＭＴ４との間のＵＶ吸光度で著しく対照的であるペプチドは、ＤＫＴＨ＊ＴＣ＊ＰＰＣ＊ＰＡＰＥＬＬＧ（配列番号１７）、ＴＥＬＮＶＧＩＤＦＮＷＥＹＰＳＳＫＨ＊ＱＨＫ（配列番号２０）、ＥＩＧＬＬＴＣＥＡＴＶＮＧＨ＊ＬＹＫ（配列番号１８）及びＱＴＮＴＩＩＤＶＶＬＳＰＳＨ＊ＧＩＥＬＳＶＧＥＫ（配列番号１９）であった（＊は残基の酸化を表す）。ペプチドマッピングにより、ＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐ間で存在量において有意に異なるペプチドの同一性が明らかとなった。ペプチドマッピング分析から同定されたペプチドの相対的な存在量を表３－１に示す。ＭＴ１（ＣＤＭ中で産生）中の２－オキソ－ヒスチジンの量は、ＭＴ４（ダイズ加水分解物中で産生）より高かった。これは、アフリベルセプトを発現するために使用された培地が、酸化ヒスチジン又は酸化トリプトファンを有するペプチドの相対的な存在量に有意な影響を有し得ることを示唆している。例えば、ペプチドＱＴＮＴＩＩＤＶＶＬＳＰＳＨ＊ＧＩＥＬＳＶＧＥＫ（配列番号１９）に関しては、ＭＴ１（ＣＤＭ中で産生）中のペプチドの相対的な存在量のパーセントは、ＭＴ４（ダイズ加水分解物中で産生；ＭＴ１と比較すると約１５分の１）中のペプチドの相対的な存在量のパーセントと比較して０．０１５パーセントであった。
（表３－１）
色及び２－オキソ－ヒスチジンの定量。質量分析法により測定されるように、プロテアーゼ消化により生成されたオリゴペプチド中の２－オキソ－ヒスチジンの割合も示す（表３－２）（値は、未修飾ペプチドに対して正規化した）。表３－２（Ｉ）は、ＡＥＸフロースルー：ＭＴ１ ロット１、ＭＴ１ ロット２のＡＥＸフロースルー、ＭＴ１ ロット３のＡＥＸフロースルーに関して観察された酸化ヒスチジン／トリプトファンのパーセントを示す。表３－２（ＩＩ）は、ＭＴ１ ロット３に対するＣＥＸ分離の実施時に得られた酸性画分１、酸性画分２、及び主要画分に関して観察された酸化ヒスチジン／トリプトファンのパーセントを示す。この表から、酸性バリアントは酸化種から構成されていることが明らかである。表３－２（Ｉ）から、ペプチド／タンパク質を含む２－オキソ－ヒスチジン及びトリプトファン二酸化の％は、ＡＥＸストリップと比較すると、ＡＥＸフロースルー中では減少している。ＡＥＸカラムをストリップすることで、こうした修飾ペプチドの割合が高くなることが明らかである。例えば、修飾ペプチドである、ＡＥＸフロースルー（ＭＴ１ ロット１）中の「ＥＩＧＬＬＴＣ［＋５７］ＥＡＴＶＮＧＨ［＋１４］ＬＹＫ（配列番号１８）」は０．０１３％であり、「ＡＥＸストリップ」中では０．０８０％であった。これはまた、ＡＥＸカラムが修飾ペプチドを捕捉し、そうすることでＡＥＸフロースルー中の修飾ペプチドの割合を減少させていることも実証している。
（表３－２（Ｉ））２－オキソ－ヒスチジン／トリプトファンの割合
（表３－２（ＩＩ））２－オキソ－ヒスチジン／トリプトファンの割合
表３－２（ＩＩ）において、［＋５７］は、ヨードアセトアミドによるシステインのアルキル化がシステインのカルボキシメチルアミン部分を追加することを表す。これは未修飾システインと比べて約＋５７の正味の質量増加である。
表３－２（ＩＩ）において、［＋１４］は、ヒスチジンから２－オキソ－ヒスチジンへの変化を表しており、１個の酸素原子が炭素２に加えられるが、２個の水素原子が失われる（１つは炭素２から、もう１つは窒素３から失われる）。これは未修飾ヒスチジンよりも約＋１４の正味の質量増加である。
表３－２（ＩＩ）において、［＋３２］は、Ｎ－ホルミルキヌレニンの形成の原因となるトリプトファン二酸化を表す。これは未修飾トリプトファンよりも約＋３２の正味の質量増加である（図４）。
ＡＥＸクロマトグラフィーにより処理された、プロテアーゼ消化されたＦａｂＲＩＣＡＴＯＲ切断型アフリベルセプトからのオリゴペプチド（ＭＴ４）中の２－オキソ－ヒスチジン（及びトリプトファン二酸化）の割合を評価するため、第２の実験セットを実施した（図１３及び以下の表３－３）。プロテアーゼ消化されたＦａｂＲＩＣＡＴＯＲ切断型アフリベルセプトからのオリゴペプチド（ＭＴ４）に対する、ＡＥＸストリップ中の２－オキソ－ヒスチジン及びトリプトファン二酸化のパーセントは、ＡＥＸフロースルー中の２－オキソ－ヒスチジン及びトリプトファン二酸化のパーセントよりも有意に高かった（以下の表３－３中の「ＭＴ１」を参照）。
（表３－３）２－オキソ－ヒスチジンの割合
ａＣ末端ペプチドがＭｉｎｉＴｒａｐと異なるので、全長アフリベルセプトについては異なるペプチドを使用して計算した値
ＡＥＸストリップ中の２－オキソ－ヒスチジン及びトリプトファン二酸化のパーセントは、ＭＴ１産生中の、ＡＥＸフロースルー中の２－オキソ－ヒスチジン及びトリプトファン二酸化のパーセントよりも有意に高かった（上の表３－３中の「ＭＴ１」を参照）。表３－２と比較すると、表３－３は、ＡＥＸカラムのストリップは、ＡＥＸフロースルー中の２－オキソ－ヒスチジン及びトリプトファン二酸化のパーセントと比較して、２－オキソ－ヒスチジン及びトリプトファン二酸化のパーセントが有意に高い試料を生成するという類似した結果を示す。これは、２－オキソ－ヒスチジン及びトリプトファン二酸化種が分離中にはＡＥＸカラムに結合されており、ＡＥＸカラムのストリップ時に取り除かれることを示唆している。このことは、図１４で確認される抽出イオンクロマトグラムで更に明らかである。
強陽イオン交換クロマトグラム（ＣＥＸ）
抗ＶＥＧＦタンパク質を含む試料中に存在する酸性種及び他のバリアントを同定するため、一連の実験を実施した。
ＭｏｎｏＳ（１０／１００）ＧＬカラム（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）を使用して、強陽イオン交換クロマトグラフィーを実施した。試料分離について、使用した移動相は２０ｍＭの２－（Ｎ－モルフォリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）（ｐＨ５．７、移動相Ａ）及び４０ｍＭのリン酸ナトリウム、１００ｍＭの塩化ナトリウム（ｐＨ９．０、移動相Ｂ）であった。２８０ｎｍで検出されるＭＴ１の電荷バリアントを溶出するため、非直線ｐＨグラジエントを使用した。メインピークよりも早い相対保持時間で溶出するピークは、酸性種として本明細書では呼ばれる。
いかなる濃縮も行う前の、ＭＴ１ ロット２（ＢＹ３以下）からの試料を、図１５に示されるような方法を使用してＣＥＸに供した。ＭＴ１のバリアントの複雑さを減少させるために、脱シアリル化を試料に適用した。その後、移動相として１倍のＤＰＢＳ（ｐＨ７．２±０．２）を使用し、分取ＳＥＣ処理（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００プレップグレード ＸＫ２６／１００）を行った。脱シアリル化ＭｉｎｉＴｒａｐ（ｄｓＭＴ１）を含む分取ＳＥＣカラムから得られた画分を合わせ、ＭＴ１の電荷バリアントを濃縮するために、塩－ｐＨのデュアルグラジエントを使用し、強陽イオン交換（ＳＣＸ）クロマトグラフィーに更に供した。この手順により、合計７個の画分が得られた（Ｆ１～Ｆ７、ＭＣは対照方法を表す。図１６及び図１７）。
ＣＥＸを実施した際に、酸性種はメインピークよりも早く溶出し、塩基性種はメインピーク後に溶出する。図１７で観察されるように、ピーク３～５はメインピークである。ピーク１及びピーク２はＭＴ１の主要種（ピーク３～５）の溶出前に溶出し、したがって酸性種を含む。ピーク６はＭＴ１の主要種（ピーク３～５）の溶出後に溶出し、したがって塩基性種を含む。表３－４は、ＭＣにおけるピークの相対的な存在量を示す（図１６にて示される）。例えば、表３－４の２つ目の行（ＭＣと標識される）は、ＭＣ中の酸性種のすべての相対量が約１９．８％（すなわちピーク１＋ピーク２）であることを示す。表３－４はまた、各個別の画分に関するピークの相対的な存在量を示す。異なる画分中に重複する種が存在するが（図１６及び図１７に反映される）、画分Ｆ１及びＦ２の大部分は酸性種である（すなわち、ピーク１及びピーク２）。例えば、画分Ｆ１は６３．７％のピーク１及び１９．２％のピーク２から構成される（合計で８２．９％の酸性種）。画分Ｆ２は９．６％のピーク１及び７５．９％のピーク２から構成される（合計で８５．５％の酸性種）。画分Ｆ３～Ｆ５の大部分は、ＭＴ１の主要種である（ピーク３～５）。最後に、画分Ｆ６～Ｆ７の大部分は塩基性種（ピーク６）であるが、これは主要種の一部を含む（例えばピーク４及びピーク５）。
（酸性種を含む）画分Ｆ１及びＦ２は、（主要種又は「ＭＴ１」を含む）画分Ｆ３～Ｆ５と比較すると、強い黄褐色を有することもまた観察された。１３ｍｇ／ｍＬ以上の濃度にて色に関してすべての画分を検査した。本実施例から明らかであるように、試料中の酸性種の存在は、黄褐色の出現に符合し、黄褐色の除去（又は最小化）は、ＭＴ１からの酸性種の除去（又は最小化）により達成され得る。
（表３－４）分析ＣＥＸに基づくピークの相対的な存在量
ＮＤ：検出されず
ＭＴ１ ロット２及び画分Ｆ１～Ｆ７の３Ｄクロマトグラムを図１８Ａ～Ｈに示す。ＭＴ１ ロット２は有意なスペクトル特性を何ら呈さなかった（図１８Ａ）。画分１及び画分２（酸性種を含む）は３２０～３６０ｎｍの間でスペクトル特性を呈した（図１８Ｂ中の円を参照されたい）。この特性は、画分２と比較して画分１においてより顕著であった（図１８Ｂ及び図１８Ｃ）。また、画分３及び画分４～７においては、この特性は存在せず（主要種、ＭＴ１）（図１８Ｄ及び１８Ｈ）、黄褐色を呈さなかった。
したがって、上において観察されるように、ＣＥＸは酸性種／酸性画分（画分１及び画分２）の同定をもたらし、これは主要種／画分（画分３～６）と比較して強い黄褐色を示す。この結果はまた、明確なスペクトル特性が画分Ｆ１～Ｆ２の３Ｄクロマトグラム中には存在し、画分Ｆ３～Ｆ７には存在しない、という形で観察された。
画像キャピラリー等電点電気泳動（ｉｃＩＥＦ）の電気泳動図
ｉｃＩＥＦにより、画分Ｆ１～７及びＭＣ（ＣＥＸ後のＭＴ１－ロット２由来）中のバリアントの分布を更に評価した（図１９）。
フルオロカーボンでコーティングしたキャピラリーカートリッジ（１００μｍ×５ｃｍ）を備えるｉＣＥ３分析器（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ）を使用し、ｉｃＩＥＦにより、画分Ｆ１～７及びＭＣ（ＣＥＸ後のＭＴ１－ロット２由来）中のバリアントの分布を更に評価した。両性電解質溶液は、０．３５％のメチルセルロース（ＭＣ）、０．７５％のＰｈａｒｍａｌｙｔｅ３－１０担体両性電解質、４．２％のＰｈａｒｍａｌｙｔｅ ８－１０．５担体両性電解質、及び精製水中、０．２％の７．４０のｐＩマーカ、及び０．１５％の９．７７のｐＩマーカからなった。アノード液は０．１０％のメチルセルロース中８０ｍＭのリン酸であり、カソード液は０．１０％のメチルセルロース中１００ｍＭの水酸化ナトリウムであった。試料を精製水中に希釈し、１：２００の酵素対基質比（ＭＴ１ １ミリグラムあたりのシアリダーゼＡの単位）でシアリダーゼＡを各希釈試料に加えた。続いておよそ１６時間にわたり周囲温度でこれをインキュベートした。シアリダーゼＡ処理した試料を両性電解質溶液と混合し、次いで１分間１５００Ｖの電位を導入し、次いで７分間３０００Ｖの電位を導入して電気泳動にかけた。電気泳動にかけたＭＴ１バリアントの画像は、２８０ｎｍの紫外線をキャピラリーを通して電荷結合デバイスのデジタルカメラレンズに入れることで得た。次いで、この画像を分析し、様々な電荷バリアントの分布を決定した（図１９）。図１９を参照すると、画分Ｆ１及びＦ２（又は酸性画分）は、ＭＣ及び画分Ｆ３～Ｆ７（主要種、ＭＴ１）について明確に観察されるようなＭＴ１に関するピークが存在しないことを示した。したがって、ｉｃｌＥＦ電気泳動図は、検討中のタンパク質（この場合はＭＴ１）の異なる電荷バリアントの分布を検知及び判定可能であると考えられた。したがって、ＣＥＸ分析を実施している酸性画分は、（ａ）２－オキソ－ヒスチジン又はジオキソ－トリプトファンのパーセントの相対的な存在量の増加（表３－２（ＩＩ））、（ｂ）黄褐色の増加（データ図示せず）、及び（ｃ）画分１及び画分２の３Ｄクロマトグラム上にて確認されるスペクトル特性の存在（図１８Ｂ及び図１８Ｃ）を示した。
［実施例４］光誘起研究
この実施例では、タンパク質試料を様々な量の冷白色（ＣＷ）蛍光灯又は紫外線Ａ（ＵＶＡ）光に曝露することにより、例えばＭＴ１といったＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐ（ＭＴ）の光誘起を実施した。光に曝露した試料の色及び酸化アミノ酸含有量を判定した。上で説明したように、曝露後にＬＣＭＳ分析を実施した。ＭＴを冷白色光又はＵＶＡ光に曝露することで、例えばヒスチジンといった酸化アミノ酸残基の増加が生じた（表４－１、表４－２及び表４－３）。
（表４－１）光誘起研究デザイン
ＩＣＨは、ＩＣＨ統一三極ガイドライン：新原薬及び新製剤の光安定性試験ガイドラインＱ１Ｂを指す。これは、少なくとも１２０万ルクス＊時間で冷白色蛍光灯、及び少なくとも２００Ｗ＊時間／ｍ２の近紫外線エネルギーを用いて実施される光安定性研究を明記している。
表４－２は、冷白色光及び紫外線に曝露されたＭＴ試料の呈色における増加を示す。例えば、試料に対するｂ値（ｔ＝０）は９．５８であった。この試料を２４０万ルクス＊時間で冷白色光に曝露すると、ｂ値は２２．１４に増加した。ｂ値におけるこの増加は、２４０万ルクス＊時間でＭＴを冷白色光に曝露することにより、この試料の黄褐色が試料（ｔ＝０）と比較して増加することを示している。同様に、ＭＴ試料（ｔ＝０）を４００Ｗ＊時間／ｍ２で紫外線に曝露すると、ｂ値は９．５８から１０．７２へと増加する。ｂ値におけるこの増加は、ＭＴ試料を４００Ｗ＊時間／ｍ２で紫外線に曝露することにより、試料（ｔ＝０）と比較して、この試料の黄褐色の増加が生じたことを示している。
（表４－２）冷白色光及び紫外線に曝露された試料の色
試料の色は、ＣＩＥＬＡＢ色空間（Ｌ＊、ａ＊、ｂ＊変数）を使用し、ＥＰのＢＹ色標準と比較して示される。ここでＬ＊＝白～黒（Ｌ＊は明度）、ａ＊＝マゼンダ～アクア、ｂ＊＝黄色～青色であり、ｂ値が高くなるほど黄色が強くなる。
（表４－３（Ｉ））紫外線ストレスＭｉｎｉＴｒａｐ由来のペプチド中の２－オキソ－ヒスチジンレベル
（表４－３（ＩＩ））冷白色光ストレスＭｉｎｉＴｒａｐ由来のペプチド中の２－オキソ－ヒスチジンレベル
冷白色光又はＵＶＡ光へのアフリベルセプトＭＴの曝露は、酸化ヒスチジン（２－オキソ－ヒスチジン）の出現に符合した（表４－３）。表４－３を参照すると、オキソ－ヒスチジンを有するペプチド「ＳＤＴＧＲＰＦＶＥＭＹＳＥＩＰＥＩＩＨＭＴＥＧＲ（配列番号２２）」は、ＭＴ試料（ｔ＝０）中に０．００７％であり、一方でその存在量は、４０時間紫外線に曝露した場合には０．３２４％に増加し（表４－３（Ｉ））、３００時間冷白色光に曝露した場合には１．３０９％に増加した（表４－３（ＩＩ））。
１３．９８Ｄａ種（図２に示される）及び１５．９９Ｄａ種（図３に示される）といった２－オキソ－ヒスチジンの２つの種を観察した。１３．９８Ｄａ種は光ストレスＭｉｎｉＴｒａｐ試料で優勢であった。１５．９９Ｄａ種は、銅金属触媒プロセスの生成物であることが知られている（Ｓｃｈｏｎｅｉｃｈ，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｍｅｄ Ａｎａｌ．２１：１０９３－１０９７（２０００））。更には、１３．９８Ｄａ種は光駆動プロセスの生成物である（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．８６（１０：４９４０－４９４８（２０１４）））。
冷白色光及びＵＶＡ光に曝露される試料中の酸化ヒスチジンの存在量が増加するのと同様に、冷白色光又はＵＶＡ光へのＭＴの曝露もまた、他のＰＴＭの形成を誘導した（表４－４及び表４－５）。
（表４－４（Ｉ））紫外線ストレスＭｉｎｉＴｒａｐ由来のペプチド中の他のＰＴＭ
（表４－４（ＩＩ））冷白色光ストレスＭｉｎｉＴｒａｐ由来のペプチド中の他のＰＴＭ
（表４－５（Ｉ））紫外線ストレスＭｉｎｉＴｒａｐ由来のペプチド中のトリプトファン／チロシン／フェニルアラニンの酸化レベル
（表４－５（ＩＩ））冷白色光ストレスＭｉｎｉＴｒａｐ由来のペプチド中のトリプトファン／チロシン／フェニルアラニンの酸化レベル
このように、冷白色光又はＵＶＡ光へのＭＴの曝露は、酸化残基（例えばヒスチジン／トリプトファン（オキソ－トリプトファン）など）の出現に符合した。オキソ－トリプトファンの４つの種である、＋４Ｄａ、＋１６Ｄａ、＋３２Ｄａ及び＋４８Ｄａを観察した。＋４Ｄａ種はキヌレニンの形成により説明される（図４）が、一方で１６Ｄａ、＋３２Ｄａ及び＋４８Ｄａはトリプトファン残基の一酸化物、二酸化物及び三酸化物である。図２０に示すように、ＭＴ試料のトリプシン消化物のペプチドマッピングを３２０ｎｍでモニタリングした。酸化残基を含むペプチドの相対的な存在を、図２０にて比較することができる。例えば、ペプチドＩＩＷ（＋４）ＤＳＲＫ（配列番号１１４）に関して、ｔ＝０でのＭＴ試料、及び４０時間ＵＶＡに曝露されたＭＴ１試料、及び３００時間ＣＷＬに曝露されたＭＴ試料について、その存在における有意差を確認することができた。
ＨＭＷ／低分子量（ＬＭＷ）種の存在に関して、冷白色光又はＵＶＡ光へのＭＴの曝露もまた評価した（表４－６）。
（表４－６）拡張したＵＶＡ及びＣＷＬストレス後にＨＭＷ／ＬＭＷが生成された
各試料についてＨＭＷ／ＬＭＷ種に関する呈色を追跡調査するため、上で示されるように、すべてのストレス試料（ＣＷＬ及びＵＶＡ）について、フルスペクトルＰＤＡ検出（ＳＥＣ－ＰＤＡ）を伴う分析用サイズ排除クロマトグラフィーを実施した。ＣＷＬストレスＭＴのＳＥＣ－ＰＤＡ分析は、ＬＭＷ種を除くすべてのサイズバリアントに関して、約３５０ｎｍでの吸光度における有意な増加を明らかにする（図２１）。一方ＵＶＡストレスＭＴに対するＳＥＣ－ＰＤＡは、約３５０ｎｍでの吸光度において増加がないことを明らかにする（図２２）。ＣＷＬ処理ストレス試料とは異なり、ＵＶＡ処理ストレス試料は、有意に定量化可能な黄褐色を少しも生成しなかった。
ＵＶＡ及びＣＷＬによりストレスが加えられた試料について３２０ｎｍ及び２８０ｎｍでの吸光度比を調査したのち、同様の結果を得た。生の強度又は総ピーク領域のいずれかにより分析されるＡ３２０／Ａ２８０比は、ＣＷＬストレス試料における黄色強度の増加に符合した（図２３）。一方、Ａ３２０／Ａ２８０比は、ＵＶＡ曝露ストレス試料における黄色強度の増加に符合しなかった（図２４）。これは、ＵＶＡストレスに供されたＭＴ１試料は、ＣＷＬストレス後に観察される同様の黄褐色を生じなかったという以前の観察を実証している。
［実施例５］呈色を低減する上流の方法
５．１ 合成培地のインキュベーション調査
アフリベルセプトを含む新鮮な合成培地（ＣＤＭ）へと加えられた様々な成分の、呈色に関する効果を調査した。
１本以上の、１０ｍＬのワーキングボリューム（新鮮なＣＤＭ１）を有する５０ｍＬの空気抜きキャップ付き振盪管を７日間インキュベートし、０日目及び７日目に試料を採取した。アフリベルセプト試料（５ｍＭのリン酸ナトリウム、５ｍＭのクエン酸ナトリウム、及び１００ｍＭの塩化ナトリウムを含むｐＨ６．２の緩衝水溶液中の、アフリベルセプト組換えタンパク質）を、６ｇ／Ｌの濃度で振盪管へと加えた。
累積濃度に到達させるために加えた成分：
・システイン：１６．６ｍＭ
・鉄：０．２３ｍＭ
・銅：０．００７１ｍＭ
・亜鉛：０．５４ｍＭ
加えられた各成分の、ｂ＊値（ＣＩＥのＬ＊、ａ＊、ｂ＊色空間）に対する見積もり効果は図２５Ａに記載されており、予測されたｂ＊値に対する実際のｂ＊値のプロットは図２５Ｂに記載される。システインの添加により、最も大幅な黄褐色の増加を生じた。鉄及び亜鉛もまた色を生成した。葉酸及びＢビタミン群（チアミン、ナイアシンアミド、Ｄ－パントテン酸、Ｄ－ビオチン、及びピリドキシン）は黄褐色を増加させた。リボフラビン及びビタミンＢ１２は統計学的には色に影響しなかった。
５．２ システイン及び金属の減少による、ｂ＊値に対する効果
アフリベルセプト産生細胞株の種培養から、バイオリアクタ（例えば、２Ｌ）に播種した。３５．５℃の温度、７．１±０．２５のｐＨ、２２ｃｃｍのエアスパージ設定点で、播種した培養物を増殖させた。必要に応じて、グルコース、消泡剤及び基礎培地をバイオリアクタに補充した。アフリベルセプトが発現される時の、システイン濃度及び金属濃度の低下による、色に対する効果をＣＤＭ１で評価した。
０日目の培地＝ＣＤＭ１、１．４８ｍＭのシステインを含む
・栄養フィード：
-２日目＝合成フィード（ＣＤＦ）＋１．３～２．１ｍＭのシステイン
-４日目＝ＣＤＦ＋１．６～１．７ｍＭのシステイン
-６日目＝ＣＤＦ＋１．６～１．７ｍＭのシステイン
-８日目＝ＣＤＦ＋１．６～１．７ｍＭのシステイン
バイオリアクタの条件は以下の通りであった：
・システインを、培養物１Ｌあたり約６～７ミリモルの累積濃度、培養物１Ｌあたり８～９ミリモルの累積濃度、又は培養物１Ｌあたり１０～１１ミリモルの累積濃度で加えた。
・１倍レベルでのＣＤＭ１中の金属（ＣＤＭ１レベルの０．５倍、１倍、又は１．５倍）は以下に列挙する（濃度は種菌追加前のものである）：
- Ｆｅ＝培養物１リットルあたり６８～８３マイクロモル
- Ｚｎ＝培養物１リットルあたり６～７マイクロモル
- Ｃｕ＝培養物１リットルあたり０．１～０．２マイクロモル
- Ｎｉ＝培養物１リットルあたり０．５～１マイクロモル
６～７ミリモル／Ｌまで累積システインレベルを減少させると、力価には有意な影響はないが黄褐色は低減した。培地中の金属濃度を０．５倍に減少させると、力価の有意な上昇を伴って色が低減した。力価、ＶＣＣ（生存細胞濃度）、生存率、アンモニア又は浸透圧に対しては最小限の影響であった（図２６Ａ～Ｅを参照されたい）。ｂ＊値及び力価に対する、金属含有量及びシステインの予測見積もり効果を図２７に記載する。
５．３ ｂ＊値に対する抗酸化剤の影響の評価
アフリベルセプトを含む使用済みＣＤＭへと加えられる抗酸化剤であるタウリン、ヒポタウリン、チオクト酸、グルタチオン、グリシン及びビタミンＣの、色に対する効果を評価した。１本以上の、１０ｍＬのワーキングボリューム（ＣＤＭ１）を有する５０ｍＬの空気抜きキャップ付き振盪管を７日間インキュベートし、０日目及び７日目に試料を採取した。
使用済みＣＤＭ１への成分添加のための条件は以下の通りである：
・アフリベルセプト試料（５ｍＭのリン酸ナトリウム、５ｍＭのクエン酸ナトリウム、及び１００ｍＭの塩化ナトリウムを含むｐＨ６．２の緩衝水溶液中の、アフリベルセプト組換えタンパク質）は、６ｇ／Ｌの濃度で振盪管へと加えた。
・抗酸化剤は以下の濃度にて使用済みＣＤＭ１に加えた：
- タウリン＝培養物中１０ｍＭ
- ヒポタウリン＝培養物中１０ｍＭ
- グリシン＝培養物中１０ｍＭ
- チオクト酸＝培養物中０．００２４ｍＭ
- 還元型グルタチオン＝培養物中２ｍＭ
- ヒドロコルチゾン＝培養物中０．００１４ｍＭ
- ビタミンＣ（アスコルビン酸）＝培養物中０．０２８ｍＭ
複数の抗酸化剤は、使用済み培地における色形成を減少させた（ヒポタウリン、タウリン及びグリシンの組み合わせ；チオクト酸；並びにビタミンＣ）。グルタチオンはｂ＊値を増加させた。
（表５－１）ＭｉｎｉＴｒａｐの色形成に対する、抗酸化剤の効果の概要
＊ｂ＊値を有意に減少させた抗酸化剤：ヒポタウリン／タウリン／グリシン、チオクト酸、ビタミンＣ。
ｂ＊値（ＣＩＥのＬ＊、ａ＊、ｂ＊色空間）に対する、様々な抗酸化剤の予測効果の概要は、図２８（Ａ～Ｃ）に記載されている。
アフリベルセプトを含む使用済みＣＤＭへと加えた抗酸化剤の更なる追加の、色に対する効果を評価した。１本以上の、１０ｍＬのワーキングボリューム（ＣＤＭ１）を有する５０ｍＬの空気抜きキャップ付き振盪管を７日間インキュベートし、０日目及び７日目に試料を採取した。
使用済みＣＤＭ１への成分添加のための条件は以下の通りである：
・アフリベルセプト試料（５ｍＭのリン酸ナトリウム、５ｍＭのクエン酸ナトリウム、及び１００ｍＭの塩化ナトリウムを含むｐＨ６．２の緩衝水溶液中の、アフリベルセプト組換えタンパク質）は、６ｇ／Ｌの濃度で振盪管へと加えた。
・２つのＤＯＥ実験を実施した：
・（ｉ）抗酸化剤は以下の濃度にて使用済みＣＤＭ１に加えた：
- タウリン＝培養物中１０ｍＭ
- ヒポタウリン＝培養物中１０ｍＭ
- グリシン＝培養物中１０ｍＭ
- チオクト酸＝培養物中０．００２４ｍＭ
- ビタミンＣ（アスコルビン酸）＝培養物中０．０２８ｍＭ
・（ｉｉ）抗酸化剤は以下の累積濃度に達成するように加えた：
- ＡＴＡ＝２．５μＭ～５μＭ
- デフェロキサミンメシル酸塩（ＤＦＯ）＝５μＭ～１０μＭ
- カタラーゼ＝１０１．５ｍｇ／Ｌ
- Ｓ－カルボキシメチル－Ｌ－システイン＝１０ｍＭ
ヒポタウリンは使用済み培地における色形成を減少させることが分かった（図２８Ｄ）。ＤＦＯもまた、使用済み培地における色形成を有意に減少させた（図２８Ｄ）。他の抗酸化剤は色形成に統計学的な影響を有さなかった。
（表５－２）ＭｉｎｉＴｒａｐの色形成に対する、抗酸化剤の効果の概要
振盪フラスコ抗酸化剤調査
細胞培養物における色形成を減少させるそれらの能力に関して、タウリン、ヒポタウリン、グリシン、チオクト酸及びビタミンＣを個別及び組合せで評価した（表５－３）。
アフリベルセプト産生細胞株の種培養から、２５０ｍＬの振盪フラスコに播種した。５％のＣＯ２で制御されたインキュベータで３５．５℃にて、播種した細胞を増殖させた。必要に応じて、グルコース及び基礎培地を振盪フラスコに補充した。上に説明されるプロセスを使用した。この場合、金属はＣＤＭ１中で０．５倍の濃度で存在し、システインを６～７ｍＭの累積濃度で加えた。
（表５－３）
図２８Ｅは、ｂ＊値（ＣＩＥのＬ＊、ａ＊、ｂ＊色空間）及び最終力価に対する、表５－３の抗酸化剤の予測効果を示す。タウリン、ヒポタウリン、グリシンは、力価に負の影響を与えることなくｂ＊値を減少させた。
［実施例６］ＣＤＭを使用するアフリベルセプト産生のためのグリコシル化及び生存率研究
アフリベルセプト産生細胞株の種培養から、バイオリアクタ（例えば、２Ｌ）に播種した。３５．５℃の温度、７．１±０．２５のｐＨ、２２ｃｃｍのエアスパージ設定点で、播種した培養物を増殖させた。必要に応じて、グルコース、消泡剤及び基礎培地をバイオリアクタに補充した。ＣＤＭ１を使用してアフリベルセプトタンパク質の産生を実施した（独自仕様）。ＣＤＭ１（独自仕様）、ＣＤＭ２（商業的に入手）、及びＣＤＭ３（商業的に入手）を使用して、アフリベルセプト融合タンパク質を発現する宿主細胞株の産生を実施した。追加の培地成分を含まないＣＤＭ１、ＣＤＭ２及びＣＤＭ３を使用し、一連の実験を実施した。ガラクトシル化プロファイルを変更するため、マンガン（塩化マンガン四水和物、Ｓｉｇｍａ、３．２ｍｇ／Ｌ）、ガラクトース（Ｓｉｇｍａ、８ｇ／Ｌ）、及びウリジン（Ｓｉｇｍａ、６ｇ／Ｌ）をフィードに加えたＣＤＭ１～３を使用し、もう一つの一連の実験を実施した。最後に、ガラクトシル化プロファイルを変更するためにマンガン（塩化マンガン四水和物、Ｓｉｇｍａ、３．２ｍｇ／Ｌ）、ガラクトース（Ｓｉｇｍａ、８ｇ／Ｌ）、及びウリジン（Ｓｉｇｍａ、６ｇ／Ｌ）をフィードに加え、組成物のシアリル化プロファイルを変更するためにデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ、１２ｍｇ／Ｌ）をフィードに加えたＣＤＭ１～３を使用し、一連の実験を実施した。遠心分離、次いで０．４５μｍのろ過により、それぞれのＣＤＭを使用した清澄化された回収物を調製した。
Ｎ－グリカン分析の前に、プロテインＡにより試料を処理した。
力価測定
これらの実施例を通して、特段明記しない限り、低ｐＨ及び段階溶出グラジエントで作動し２８０ｎｍで検出するＡｇｉｌｅｎｔ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）１２００シリーズ ＨＰＬＣ又はその同等物を用いて、アフリベルセプト力価を毎日測定した。参照標準の検量線に対し、濃度を割り当てた。
生存細胞密度（ＶＣＤ）及び細胞生存率値
これらの実施例を通して、特段明記しない限り、Ｎｏｖａ ＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ Ｆｌｅｘ自動細胞計測器（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）によるトリパンブルー排除法により、生存細胞密度（ＶＣＤ）及び細胞生存率値を測定した。Ｎｏｖａ ＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ Ｆｌｅｘ（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いて、グルコース、乳酸塩、オフラインｐＨ、溶存酸素（ＤＯ）、ｐＣＯ２測定、及び浸透圧を測定した。
Ｎ－グリカンオリゴ糖プロファイリング
ＧｌｙｃｏＷｏｒｋｓ Ｒａｐｉｄ Ｄｅｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ及びＧｌｙｃｏＷｏｒｋｓ ＲａｐｉＦｌｕｏｒ－ＭＳラベルキット（Ｗａｔｅｒｓ部品番号１８６００８９３９及び１８６００８０９１のそれぞれ）を使用し、Ｗａｔｅｒｓ ＧｌｙｃｏＷｏｒｋｓプロトコルに従い、Ｎ－グリカン分析のために、ＣＤＭ１～３回収物からのおよそ１５μｇのプロテインＡ処理試料を調製した。５０．５℃で５分間、ＰＮＧａｓｅ－Ｆで試料を処理し、続いて２５℃で５分間冷却することでアフリベルセプトタンパク質からＮ－グリカンを取り除いた。室温で５分間反応させることで、ＲａｐｉＦｌｕｏｒ－ＭＳ蛍光色素により、放出されたグリカンを標識した。アセトニトリルを反応混合物に加えることでタンパク質を沈殿させ、２，２０４×ｇで１０分間の遠心分離によりウェルの底にペレット化した。標識グリカンを含む上清を収集し、ポストカラム蛍光検出を伴う親水性相互作用液体クロマトグラフィー（Ｗａｔｅｒｓ ＢＥＨアミドカラム）を使用してＵＰＬＣで分析した。カラムに結合させた後、標識グリカンを分離し、アセトニトリル及び５０ｍＭの水性ギ酸アンモニウム（ｐＨ４．４）から構成される二成分移動相グラジエントを使用して溶出させた。２６５ｎｍの励起波長及び４２５ｎｍの発光波長を用い、蛍光検出器を使用して標識グリカンを検出した。得られたクロマトグラムにおけるＮ－グリカンピークの相対的領域割合を使用し、（１）コアフコース残基を含有するＮ－グリカン（総フコシル化、表６－１）、（２）少なくとも１つのシアル酸残基を含有するＮ－グリカン（総シアリル化、表６－２）、（３）マンノース－５として同定されるＮ－グリカン（マンノース－５、表６－３）、（４）少なくとも１つのガラクトース残基を含有するＮ－グリカン（総ガラクトシル化、表６－４）、及び（５）公知の同一性のＮ－グリカン（同定された全ピーク、表６－５）の合計割合として、Ｎ－グリカン分布を報告した。
結果
追加成分有り又は無しでのＣＤＭ１～３に関しての、生存細胞数（ＶＣＣ）、生存率、及び回収物力価の結果を図２９～３１に示す。
９個の培養物中、ウリジン、マンガン、及びガラクトースを含むＣＤＭ１培養物は、１２日目に最も高い力価を示した（５．５ｇ／Ｌ）。追加成分を含まないＣＤＭ１もまた、他の７つの培養物と比較すると、１２日目に高い力価を示した（約４．２５ｇ／Ｌ）（図２９）。
細胞生存率結果は、過程６日目まで様々な条件にわたり類似していた。過程７日目の後、追加の培地成分有り又は無しでのＣＤＭ２及びＣＤＭ３培養物は、約９０％超の生存率を示した（図３０）。
ウリジン、マンガン及びガラクトースを有するＣＤＭ１培養物は、６日目頃に最大のＶＣＣを示した（図３１）。
培養物及び栄養補助剤の影響は、Ｎ－グリカンの全体分布において有意な影響を有した（表６－１～６－５）。ダイズ加水分解物を使用して作製されたプロテインＡ処理したアフリベルセプト（２つの試料を評価した）を使用し、グリカンレベルを比較した。同定された総ピークを表６－５に列挙する。
（表６－１）総フコシル化（％）
Ｕはウリジンであり、Ｍはマンガンであり、Ｇはガラクトースであり、Ｄｅｘはデキサメタゾンである。
（表６－２）総シアリル化（％）
Ｕはウリジンであり、Ｍはマンガンであり、Ｇはガラクトースであり、Ｄｅｘはデキサメタゾンである。
（表６－３）マンノース－５（％）
Ｕはウリジンであり、Ｍはマンガンであり、Ｇはガラクトースであり、Ｄｅｘはデキサメタゾンである。
（表６－４）総ガラクトシル化（％）
Ｕはウリジンであり、Ｍはマンガンであり、Ｇはガラクトースであり、Ｄｅｘはデキサメタゾンである。
（表６－５）同定された総ピーク（％）
Ｕはウリジンであり、Ｍはマンガンであり、Ｇはガラクトースであり、Ｄｅｘはデキサメタゾンである。
様々なＣＤＭの培養物のうち、１２日目に観察された総フコシル化、総シアリル化、総ガラクトシル化及びマンノース－５は、それぞれ、４２．６１％～４６．２６％、３０．８４％～３９．１４％、５９．０２～６６％及び８．８６％～１３．３８％であった。グリコシル化のこれらの値は、ダイズ加水分解物を使用して観察されたグリコシル化値と異なる。
最後に、ウリジン、マンガン、及びガラクトースを添加したＣＤＭ１、ＣＤＭ２、及びＣＤＭ３中のアフリベルセプトを発現する細胞から得られた清澄化された回収物について、色測定を実施した。バイオリアクタ調査工程に関する操作パラメータは、当業者に公知であるだろう。
［実施例７］抗ＶＥＧＦタンパク質のアフィニティー生成
７．１ ＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐの発現
組換えＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐのコーディング領域（例えば、ＭＴ５、配列番号４６）をシグナル配列に機能的に結合し、哺乳動物発現ベクターにクローニングして、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ－Ｋ１）細胞へと形質移入し、１２日間にわたり４００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンを用いて選択した後、安定的に形質移入されたプールを単離した。タンパク質不含合成培地にて増殖した、安定したＣＨＯ細胞プールを使用し、調査のためにタンパク質を産生した。組換えポリペプチドを細胞から増殖培地へと分泌させた。
ＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐの構成ドメインの配列
・ヒト Ｆｌｔ１（アクセッション番号 ＮＰ＿００１１５３３９２．１）
・ヒト Ｆｌｋ１（アクセッション番号 ＮＰ＿００２２４４．１）
・ヒト Ｆｃ（ＩＧＨＧ１、アクセッション番号 Ｐ０１８５７－１）
このプロセスから（ＭＴ５）を有する組換えＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐを得て、更にこれを処理した。
７．２ アフィニティークロマトグラフィーカラムの調製
ＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐ（ＭＴ５）に結合可能である５つの異なるタンパク質を評価した。使用されるタンパク質は、ＶＥＧＦ１６５（配列番号７２）、ｍＡｂ１（配列番号７３が重鎖であり、配列番号７４が軽鎖である、マウス抗ＶＥＧＦＲ１ ｍＡｂ ヒトＩｇＧ１）、ｍＡｂ２（配列番号７５が重鎖であり、配列番号７６が軽鎖である、マウス抗ＶＥＧＦＲ１ ｍＡｂ ヒトＩｇＧ１）、ｍＡｂ３（配列番号７７が重鎖であり、配列番号７８が軽鎖である、マウス抗ＶＥＧＦＲ１ ｍＡｂマウス ＩｇＧ１）、及びｍＡｂ４（配列番号７９が重鎖であり、配列番号８０が軽鎖である、マウス抗ＶＥＧＦＲ１ ｍＡｂ マウスＩｇＧ１）、を含む。
１ｍＬ／分を超えない流速にて、６カラム体積（ＣＶ）の１ｍＭ氷冷塩酸でカラムを洗浄することにより、カラムを活性化した。各タンパク質１０ｍｇを３つのＨｉＴｒａｐ ＮＨＳ－活性化 ＨＰアフィニティーカラム（１ｍＬ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号１７－０７１６－０１）に負荷した。カップリングが起こることができるよう、室温で３０分間このカラムを閉鎖した。１８カラム体積の０．５Ｍ酢酸ナトリウム、０．５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ４．０）でカラムを洗浄し、１８カラム体積の０．５Ｍトリス－ＨＣｌ、０．５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ８．３）でオープンサイトをブロックした（洗浄を以下の順で実施した：６カラム体積の０．５Ｍトリス－ＨＣｌ、０．５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ８．３）；６カラム体積の０．５Ｍ酢酸ナトリウム（酢酸ナトリウム：ＪＴ Ｂａｋｅｒ、カタログ番号３４７０－０１）、０．５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ４．０）；６カラム体積の０．５Ｍトリス（ｐＨ８．３）；室温で３０分間カラムをインキュベート；６カラム体積の０．５Ｍ酢酸ナトリウムバッファ、０．５ＭのＮａＣｌ（ｐＨ４．０）；６カラム体積の０．５Ｍトリス－ＨＣｌ、０．５ ＮａＣｌ（ｐＨ８．３）；及び６カラム体積の０．５Ｍ酢酸ナトリウムバッファ、０．５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ４．０））。カラムをｐＨ７．５のＤＰＢＳ中に保管した。評価した５つのカラムは、カラム１（ＶＥＧＦ１６５を含む）、カラム２（ｍＡｂ１を含む）、カラム３（ｍＡｂ２を含む）、カラム４（ｍＡｂ３を含む）及びカラム５（ｍＡｂ４を含む）と称される。
７．３ アフィニティークロマトグラフィーを使用するＭｉｎｉＴｒａｐの産生
試料調製。ＭｉｎｉＴｒａｐのための２つの異なる生成プロセスを実施した。１つの場合において、それぞれのアフィニティーカラムを使用し、ＭｉｎｉＴｒａｐ試料を有する材料を生成した。この場合、親材料（ＭｉｎｉＴｒａｐ）を１倍のＤＰＢＳバッファで２０ｍｇ／ｍＬに希釈し、これをカラムに加え、室温で３０分間含めた。アフィニティーカラムを使用し、ＭｉｎｉＴｒａｐを約７０００ｐｐｍのＨＣＰで単離した。
代替的には、０．４ｍｇ／ｍＬのタンパク質を上清中に含む回収された培養物上清を使用し、異なるアフィニティーカラム（１～５）に負荷した。更なる希釈は行わなかった。次いで９ＣＶの１倍のＤＰＢＳバッファでアフィニティーカラムを洗浄し、次いでＩｇＧ溶出バッファ（ｐＨ２．８）でタンパク質を溶出した（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号２１００９）。
次いで、上で説明されるように得られたＭｉｎｉＴｒａｐ材料を、０．４５μｍのフィルタに通してろ過するか、又は上のセクション７．２に説明されるように調製されたカラムへ負荷する前に、遠心分離にかけた。およそ０．４ｍｇ／ｍＬのタンパク質を含む２５ｍＬの負荷溶液をそれぞれのカラムに負荷し、２０分間インキュベートした。平衡化のための溶出前に、９ＣＶのＤＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１４１９０－１４４）で各カラムを洗浄した。洗浄画分中のＭＴ５の量を表７－１に示す。洗浄後、ｐＨ２．８の６ＣＶ（市販の溶出バッファ（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号２１００９））、１００ｍＭのグリシンバッファ（ｐＨ２．５）を使用して溶出し、１Ｍのトリス（ｐＨ７．５）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１５５６７－０２７）を加えることにより画分を素早く中和した。溶出画分中のＭｉｎｉＴｒａｐの量もまた表７－１に示す。
５つすべてのアフィニティーカラムから、ＭｉｎｉＴｒａｐ（ＭＴ５）を首尾よく生成した。ＶＥＧＦ１６５を有するカラムからの収率は、ｍＡｂ１カラム及びｍＡｂ２カラムと比較すると高かった。ヒト化抗ＶＥＧＦＲ１ ｍＡｂを含むｍＡｂ３及びｍＡｂ４もまた、ｍＡｂ１及びｍＡｂ２と類似の収率で、ＭＴ５の首尾よい生成を示した。表７－１では、１００％の結合効率、及びアフィニティー捕捉タンパク質対ＭＴ５のモル比１：１に基づき、予測収率を計算した。
（表７－１）
７．４ カラム安定性調査
セクション７．３に述べられる方法に従い、カラム１及びカラム２を使用して複数回の運転を実行した（カラム１については表７－２及びカラム２については表７－３）。
（表７－２）
（表７－３）
カラムを約５週間にわたり、４℃で保管した。各産生から同様の量のＭＴ５を溶出した。これは良好なカラム安定性を実証している。
７．５ 生成されたＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐの安定性調査
３つのカラム（カラム１、カラム２、及びカラム３）からの溶出画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を行った。非還元型及び還元型ＳＤＳ－ＰＡＧＥ試料バッファ中で試料を調製し、１倍のＭＥＳ（カタログ番号ＮＰ０３２２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用し、４～１２％勾配のＮｕＰａｇｅ ｂｉｓ－トリスゲルで運転を実行した。
（１）分子量標準物質、（２）負荷溶液、（３）カラム１からのカラム洗浄液、（４）カラム２からの溶出画分、（５）カラム１からの溶出画分、（６）カラム３からの溶出画分、（７）ｐＨ２．８で１分間保管したＭＴ５、（８）ｐＨ２．８で３０分間保管したＭＴ５、及び（９）分子量標準物質、をウェルに負荷した（図３３及び図３４）。分析は、３つのアフィニティーカラムすべて（カラム１～３）からの溶出画分から得られた画分が同様のサイズプロファイルを示し、アフィニティーカラムの使用がＭｉｎｉＴｒａｐを不安定化させなかったことを実証した。
７．６ 宿主細胞タンパク質レベルの計算
ＣＨＯ ＨＣＰ ＥＬＩＳＡキット、３Ｇ（Ｆ５５０）（Ｃｙｇｕｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用し、宿主細胞タンパク質の濃度の標準曲線を得た（図３２及び表７－４）。図３２に示される標準曲線及び表７－４に列挙した曲線式を使用し、負荷溶液及び溶出画分中のＨＣＰの量を計算した。
（表７－４）
標準曲線を使用して総ＨＣＰを計算した。図３５Ａに宿主細胞タンパク質の総量についてのチャートを示す。図３５Ｂもまた、カラム１、２、４及び５からの洗浄液及び溶出画分と比較した、負荷中の宿主細胞タンパク質の総量を示す。カラムを使用して複数回の運転を実行した。図３５Ｂ中の（＃）は、画分を評価した運転を表す。
ＭｉｎｉＴｒａｐに結合可能なタンパク質を使用するアフィニティー捕捉の使用は、約７０００ｐｐｍから約２５～５０ｐｐｍへとＨＣＰが効率的に減少したことを示した。収率について観察されるように、ＶＥＧＦ１６５を有するカラムは、ｍＡｂ１カラム及びｍＡｂ２カラムによって示されるものよりも、ＨＣＰからのＭｉｎｉＴｒａｐのより高い純度を示した。
７．７ アフィニティー生成前後のＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐのＳＥＣプロファイル
３つのカラム（カラム１～３）からの溶出画分のＳＥＣプロファイルを、負荷溶液中のＭｉｎｉＴｒａｐのＳＥＣプロファイルと比較した。図３６及び表７－５にて確認されるように、アフィニティー生成前後のＭＴ５のＳＥＣプロファイルは非常に類似していた。
（表７－５）
７．８ ＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐの、カラム前及び後の試料の ｍＡｂ１、ｍＡｂ２ 、及び ＶＥＧＦ１６５ への結合の動態
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器を使用して、動態調査を実施した。
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器を使用するリアルタイム表面プラズモン共鳴バイオセンサを使用し、カラム１及びカラム２からの溶出液及び負荷溶液中のＭｉｎｉＴｒａｐに結合するＶＥＧＦ１６５について、平衡解離定数（ＫＤ値）を測定した。２５℃で、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、及び０．０５％のｖ／ｖの界面活性剤であるＴｗｅｅｎ－２０、ｐＨ７．４（ＨＢＳ－ＥＴ）ランニングバッファを使用して、すべての結合調査を実施した。ＭＴ５を捕捉するため、ｍＡｂ１を用いてＢｉａｃｏｒｅセンサ表面をアミンカップリングにより最初に誘導した（ｄｅｒｉｖｉｔｉｚｅｄ）。結合調査の略画表示を図３７に示す。
簡潔には、カラムからの溶出液及び負荷溶液をＨＢＳ－ＥＰ（Ｂｉａｃｏｒｅ）バッファ中に希釈し、約７０ＲＵの捕捉レベルにて固定化したタンパク質マトリックス全体に注入した。次いで、ＶＥＧＦ１６５を５０μＬ／分の流速で注入した。未処理の参照表面上へ等価濃度の分析物を同時注入し、バルク屈折率バックグラウンドを減算するためにブランクセンサグラムとして機能させた。１０ｍＭグリシンを２５μＬ／分で５分間２回注入することで、サイクルとサイクルの間にセンサチップ表面を再生させた。次いで、動態速度パラメータを決定するため、ＢＩＡ評価４．０．１ソフトウェアを使用して、得られた実験用結合センサグラムを評価した。各試料のデータセットを１：１のラングミュアモデルに適合させた。これらの調査のため、最大分析結合能力（ＲＵ）及びＲｍａｘ特性の適合度を局所的に選択しつつ、グローバルフィット分析プロトコルの下で結合及び解離データを分析した。この場合、ソフトウェアは単一の解離定数（ｋｄ）、会合定数（ｋａ）、及び親和定数（Ｋｄ）を計算した。平衡解離定数はＫＤ＝ｋｄ／ｋａである。０．０３～２ｎＭの範囲の異なるＶＥＧＦ１６５濃度を使用することにより、オンレートの動態、オフレートの動態、及び全体の親和性を決定した（表７－６）。動態速度定数から解離半減期（ｔ１／２）を計算した：ｔ１／２＝ｌｎ（２）／６０＊Ｋｄ。２５℃でのアフィニティークロマトグラフィー生成の前後に得られたＶＥＧＦ１６５に対するＭＴ５の結合動態パラメータを表７－６に示す。
アフィニティークロマトグラフィー工程の（１つ以上の）効果を評価するために負荷溶液と比較した、アフィニティークロマトグラフィーにより産生されたＭＴ５の親和性（ＫＤ）、オンレート（ｋａ、Ｍ－１ｓ－１）及びオフレート（ｋｄ）は、異なる試料からのＭＴ５が、動態において変化しないことを示した。ＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐ構築物のＳＰＲセンサグラムを図３８に示す。
（表７－６）
７．９ 複数の生成サイクル
７．３に示されるように、カラム１（ｈＶＥＧＦ１６５）及びカラム２（ｍＡｂ１）を使用して、工程７．１により得られるような回収物のクロマトグラフィー生成を実施した。カラムを、複数のクロマトグラフィーサイクルに使用した。カラムの収率は、追加の運転により有意に変化することはなかった。これは、カラムが結合能力を保持していたことを示唆している（表７－７）。
（表７－７）
７．４に説明される方法を使用して、カラム１及びカラム２に関する負荷溶液、洗浄画分及び溶出画分のＨＣＰ計算を得た（図３９）。計算された総ＨＣＰは、カラムの繰り返しの使用が、ＭｉｎｉＴｒａｐに結合するカラムの能力を低減しないことを示した。
７．１０ アフィニティークロマトグラフィーカラムの最適化
カラム１（ＶＥＧＦ１６５）及びカラム２（ｍＡｂ１）を使用して、セクション７．１にて得られるような回収物質のクロマトグラフィー生成を実施した。最適化調査のため、１０ｍｇの代わりに１４ｍｇ又は４５ｍｇのＶＥＧＦ１６５又は抗ＶＥＧＦ Ｒ１ ｍＡｂを２つのＨｉＴｒａｐ ＮＨＳ活性化ＨＰアフィニティーカラム（１ｍＬ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に負荷し、カラムを閉鎖して室温で３０分間カップリングさせた。上の７．２及び７．３に述べられるように、カラム調製及びＭｉｎｉＴｒａｐを含む回収物の生成を実行した。洗浄画分及び溶出画分中のＭＴ５の量を表７－８に示す。１０ｍｇと比較した、１４ｍｇ又は４５ｍｇのアフィニティーカラム（ＶＥＧＦ１６５又は抗ＶＥＧＦ Ｒ１ ｍＡｂ（ｍＡｂ１））結合量は、両方のカラムからのＭｉｎｉＴｒａｐの収率の増加を示す。したがって、タンパク質対カラム比を最適化することにより、又はｐＨ、インキュベーション時間、インキュベーション温度等を変更することによって結合効率を増加させることにより、概説した方法を使用したカラム収率を向上させることができる。
（表７－８）
７．１１ アフィニティークロマトグラフィーを伴うＣＥＸの使用
上のセクション７．３にて述べたように、カラム１を使用してＭＴ５発現からの細胞培養物試料を生成した。得られた溶出液を陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）カラム（ＨｉＴｒａｐ Ｃａｐｔｏ Ｓ、１ｍＬ）に供した。カラムの操作条件を表７－９に示す。
（表７－９）
元々の／出発細胞培養物試料、アフィニティークロマトグラフィーのカラム１の溶出液、及びＣＥＸ溶出液における総ＨＣＰは、それぞれ、約２３０，０００ｎｇ／ｍＬ、約９，０００ｎｇ／ｍＬ、及び約８５０ｎｇ／ｍＬであった。上に言及したように、Ｃｙｇｎｕｓ ＣＨＯ ＨＣＰ ＥＬＩＳＡキット ３Ｇを使用し、ＨＣＰ量を定量化決定した。
７．１２ 他の抗ＶＥＧＦタンパク質を生成するためのアフィニティークロマトグラフィーの使用
他の抗ＶＥＧＦタンパク質を生成する能力を調査するため、カラム１を評価した。この調査のため、アフリベルセプト及びＶＥＧＦ結合能力を有するｓｃＦｖ断片を使用した。セクション７．３に述べられるように、生成プロセスを実施した。表７－１０は、カラム１が、他の抗ＶＥＧＦタンパク質の結合及び溶出に成功したことを実証している。
（表７－１０）
［実施例８］ＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐ構築物の質量分析法に基づく特性評価
材料。実施例１にて説明されるように、アフリベルセプトからＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐ（ＭＴ１）を生成した。実施例７にて説明されるように、ＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐ５（ＭＴ５）を生成した。組換えＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐのコーディング領域（ＭＴ５）をシグナル配列に機能的に結合し、哺乳動物の発現ベクターにクローニングして、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ－Ｋ１）細胞へと形質移入し、１２日間にわたり４００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンを用いて選択した後、安定的に形質移入されたプールを単離するといった方法によりＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐ（ＭＴ６）を生成した。分析用のタンパク質を生成するため、ＣＤＭ中で増殖させた安定したＣＨＯ細胞プールを使用した。
８．１ 糖タンパク質の脱グリコシル化
ＭＴ１、ＭＴ２及びＭＴ３の清澄化された回収物からの試料を、１％（ｗ／ｖ）のＲＧ界面活性剤（ＲａｐｉＧｅｓｔ ＳＦ、Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）及び５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．９）の２８．８μＬの溶液に入れ、０．５２ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈又は再構成した。これらの溶液を約９５℃で２分間にわたり加熱し、５０℃まで冷却させて、１．２μＬのＰＮＧａｓｅ Ｆ溶液（ＧｌｙｃｏＷｏｒｋｓ Ｒａｐｉｄ ＰＮＧａｓｅ Ｆ、Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）と混合した。５０℃で５分間、試料をインキュベートすることにより脱グリコシル化を完了させた。
８．２ ＨＩＬＩＣ－蛍光－ＥＳＩ－ＭＳ（ＭＳ／ＭＳ）分析
蛍光と質量分析検出とを組み合わせたＨＩＬＩＣ分離により、ＭＴ１を分析した。ＭＴ２及びＭＴ３をＨＩＬＩＣのみを使用して分析した。フォトダイオードアレイ及び蛍光（ＦＬＲ）検出器を搭載し、Ｗａｔｅｒｓ Ｓｙｎａｐｔ Ｇ２－Ｓ質量分析計（ＭＳ条件）をインターフェース接続したＷａｔｅｒｓ ２Ｄ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣを使用してクロマトグラフィーを実施した。Ｗａｔｅｒｓ ＵＰＬＣグリカンＢＥＨアミドカラム（１５０×２．１ｍｍ、１．７μｍ）を用いて、親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）モードの分離を使用した。カラム温度を６０℃に設定し、オートサンプラー温度を５℃に設定した。注入量は５０μＬであった。フォトダイオードアレイスキャン範囲は１９０～７００ｎｍであった。ＦＬＲを、ＲａｐｉＦｌｕｏｒ標識グリカンについては励起２６５ｎｍ、発光４２５ｎｍ、糖ペプチド中に存在するチロシンについては励起２７４ｎｍ、及び発光３０３ｎｍに設定した。初期流速は０．４ｍＬ／分であり、移動相Ａは１００ｍＭのギ酸アンモニウム（ｐＨ４．４）からなり、移動相Ｂはアセトニトリルであった。
８．３ ＭＳ条件
Ｗａｔｅｒｓ Ｓｙｎａｐｔ Ｇ２－Ｓ質量分析計を使用し、液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）実験を実施した。スキャン範囲は、正イオンモード分析及び負イオンモード分析について、質量対電荷比１００～２４００であった。スキャン時間は１秒であり、ｇｌｕ－フィブリノペプチドＢを校正物（「ロックマス」）として一定に注入（２μＬ／分）した。１２０℃のソース温度、５００℃の脱溶媒和温度でキャピラリー電圧を２．５ｋＶに設定した。窒素ネブライザガスフローを７００Ｌ／時間に設定した。
８．４ ネイティブＳＥＣ－ＭＳ
すべてのオンラインＳＥＣ－ＭＳ分析のため、ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｉ クラスシステム（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）を、Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦハイブリッド四重極Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｂｒｅｍｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に連結した。ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ ＳＥＣカラム（２００Å、１．７μｍ、４．６×３００ｍｍ）を３０℃に設定し、タンパク質分離のためにこれを使用した。移動相はｐＨ６．８である１００ｍＭの酢酸アンモニウムであった。各分離は０．３ｍＬ／分の流速で３０分間行い、注入量を４０μｇに設定した。オンラインＳＥＣ－ナノ－ＥＳＩ－ＭＳデータ取得のため、以下のＭＳパラメータを使用した。各取得は、試料注入直後に開始して２５分であった。３ｋＶのスプレー電圧、２００℃のキャピラリー温度、及び７０Ｓ－レンズのＲＦレベルであるポジティブモードにて、脱グリコシル化された試料をイオン化した。インソースＣＩＤを７５ｅＶに設定した。２０００～８０００のｍ／ｚの質量範囲を有する１５Ｋの分解能にて、フルＭＳスキャンを得た。フルＭＳスキャンのため、１００ｍｓの最大注入時間、３ｅ６の自動ゲインコントロール目標値、１０マイクロスキャンを使用した。
８．５ ペプチドマッピング
ペプチドマッピングのための試料調製。５ｍｍｏｌ／Ｌの最終濃度まで５００ｍｍｏｌ／Ｌのジチオトレイトール（ＤＴＴ）を加え、続いて４℃で６０分間インキュベートすることにより還元を達成した。１０ｍｍｏｌ／Ｌの最終濃度まで５００ｍｍｏｌ／Ｌのヨードアセトアミド（ＩＡＭ）を加え、４℃で６０分間、暗所でインキュベートすることによりアルキル化を実施した。Ｚｅｂａ（商標）Ｓｐｉｎ ７Ｋ ＭＷＣＯサイズ排除脱塩カラム（Ｐ／Ｎ８９８８２）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を製造業者の指示に従って使用し、変性バッファを消化バッファ（０．１ｍｏｌ／Ｌのトリス中、１ｍｏｌ／Ｌの尿素、ｐＨ７．８）と交換した。（バッファ交換後、紫外可視分光法により測定されるＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐタンパク質濃度に基づき）１：１８（酵素：試料）の質量比で組換えブタトリプシン（Ｓｉｇｍａから購入、カタログ番号０３７０８９８５００１）を加えた。ＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐタンパク質の濃度を０．５μｇ／μＬに調整し、室温で４時間のインキュベーション中に消化を進行させた。消化が完了したときに、ＬＣ－ＭＳグレードの水中０．１％ギ酸を１：１の体積比で加えた。分析まで、－８０℃で消化物を保管した。
トリプシン消化物のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析。４０℃に設定したサーモスタットカラムオーブンで囲まれたＣ１８カラムに、オートサンプラーを用いて１つ以上の２．５μｇ（１０μＬ）のペプチド消化物を負荷した。注入を待つ間、試料を７℃に維持した。９８％の移動相Ａ（水中、０．１体積％であるギ酸の画分）及び２％の移動相Ｂ（アセトニトリル中、０．１体積％であるギ酸の画分）で、０．２００ｍＬ／分で一定に設定した流速で、クロマトグラフィー方法を開始した。１０分間洗浄した後、４５％の移動相Ｂを含む最終組成物に到達するように、移動相Ｂの含量が１分あたり０．３９％の速度で増加する勾配で１１０分にわたりペプチドを溶出させた。次の試料を注入する前に、９７％の移動相Ｂでカラムを１５分間洗浄し、次いで９８％の移動相Ａで２５分間、平衡化させた。運転の最初の１．５分間及び最後の５分間の溶出液は廃棄した。２１４ｎｍでのＵＶ吸収、続いてＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｅｌｉｔｅ又はＤｉｓｃｏｖｅｒｙ ＸＬでの質量分析法により、クロマトグラフィーカラムから溶出したペプチドを分析した。３つのタンデムＭＳ（ＭＳ／ＭＳ）分析及び１つのＭＳのみの分析のそれぞれを含む、ＰＳ８６７０及びＲＭ８６７１試料に関する反復ペプチドマッピングデータを収集した。データ依存モードにてペプチド同定するため、ＭＳ／ＭＳ分析を実施した。このモードでは、実験のうち１つのサイクルは、１回の３００ｍ／ｚ～２０００ｍ／ｚのフルＭＳスキャン、続いてサイクルを開始させるＭＳスキャンにおいて、５００の最小のしきい値カウントにて検出された１番目に強いイオンから５番目に強いイオンで実施される５回の連続したＭＳ／ＭＳ事象からなる。マイクロスキャン＝３で、順次質量分析（ＭＳｎ）ＡＧＣターゲットを１Ｅ４に設定した。ＭＳ／ＭＳフラグメントを分析するため、通常スキャン速度のセントロイドモードにて、イオントラップを使用した。１Ｅ６のフルスキャンＡＧＣターゲット及びマイクロスキャン＝１で、高分解ＦＴＭＳ分析器（Ｒ＝３０，０００）を使用し、プロファイルモードにてフルＭＳスキャンを収集した。２Ｄａの分離幅を使用し、ＭＳ／ＭＳのためにイオンを選択し、次いで３５の正規化ＣＩＤエネルギー、０．２５の活性化Ｑ及び１０ｍ秒の活性化時間を使用する、ヘリウムガスによる衝突誘起解離（ＣＩＤ）によりフラグメント化した。デフォルトの電荷状態をｚ＝２に設定した。プリカーサイオンが３０秒以内に２回事象を引き起こす場合には、データ依存する質量を排除リストに４５秒間配置した。排除質量幅を±１Ｄａに設定した。割り当てられていない電荷状態には電荷状態を拒否させることが可能であった。拒否質量リストは、１２２．０８ｍ／ｚ、１８５．９４ｍ／ｚ、３５５．００ｍ／ｚ、３７１．００ｍ／ｚ、３９１．００ｍ／ｚ、４１３．３０ｍ／ｚ、８０３．１０ｍ／ｚ、１２２２．１０ｍ／ｚ、１３２２．１０ｍ／ｚ、１４２２．１０ｍ／ｚ、１５２２．１０ｍ／ｚ、１６２２．１０ｍ／ｚ、１７２２．１０ｍ／ｚ、１８２２．１０ｍ／ｚ、及び１９２２．１０ｍ／ｚで一般的な夾雑物を含んだ。ＴＩＣ非還元型ペプチドマップ及び還元型ペプチドマップを生成するため、ＭＳのみの分析を実施した。
８．６ 結果
ＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐ構築物の構造。ＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐ ＭＴ１、ＭＴ５及びＭＴ６の構造を図４０、図４１、図４３及び図４４に示す。
ＳＥＣ－ＭＳを使用する最初の質量分析により、脱グリコシル化後の無処置のタンパク質レベルでの３つの分子すべての同一性が確認された（図４２）。ネイティブＳＥＣ－ＭＳ分析の総イオンクロマトグラム（ＴＩＣ）は、およそ１２～１３分間で無処置のＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐ分子を検出するということを実証した。ＴＩＣの低分子量（ＬＭＷ）領域の拡大は、３つすべてのタンパク質試料におけるＬＭＷ不純物の存在を示した。
ＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐのデコンボリューションされたマススペクトルはそれらの同一性を更に確認し、二量体であるＭＴ１及びＭＴ５（図４３）及び一本鎖タンパク質であるＭＴ６（図４４）を含む試料中に存在する主要なＰＴＭを解明のためのデータを提供した。
ＭＴ１試料の分析。３つの異なるＬＭＷ不純物であるＬＭＷ１、ＬＭＷ２、及びＬＭＷ３を試験するため、ＭＴ１を含む試料のＳＥＣ－ＭＳ分析のＴＩＣから同定されたＬＭＷ種を抽出した（図４５Ａ及び図４５Ｂ）。ＬＭＷ１種はアフリベルセプトの切断種を含んだ。ＬＭＷ２種は、ＭｉｎｉＴｒａｐを生成するために実施されたアフリベルセプトの切断からの試料中に存在するＦｃ不純物を含んだ。ＬＭＷ３種はＭＴ１（二量体）分子から切断された可能性のある単量体を含んだ。
ＭＴ１試料は、アフリベルセプトを切断してＭｉｎｉＴｒａｐタンパク質を形成するために使用されたＦａｂＲＩＣＡＴＯＲ酵素の存在を示さなかった。当該酵素が存在する場合には、これは約１１．５分及び１２．５分にて検出される。ＭＴ１試料のＳＥＣ－ＭＳ分析中、こうしたピークは検出されなかった（図４６）。
ＭＴ５試料の分析。２つの異なるＬＭＷ不純物であるＬＭＷ１及びＬＭＷ２の存在を試験するため、ＭＴ５を含む試料のＳＥＣ－ＭＳ分析のＴＩＣから同定されたＬＭＷ種を抽出した（図４７）。
ＭＴ６試料の分析。３つの異なるＬＭＷ不純物であるＬＭＷ１、ＬＭＷ２及びＬＭＷ３の存在を試験するため、ＭＴ１を含む試料のＳＥＣ－ＭＳ分析のＴＩＣから同定されたＬＭＷ種を抽出した（図４８）。ＬＭＷ２種はＭＴ６の断片を含み、切断は、Ｇ４Ｓリンカー（配列番号１１１）を有するＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐの断片を生成した。ＬＭＷ５種はＭＴ６の断片を含み、切断はＧ４Ｓリンカー（配列番号１１１）の直前又は直後に起こった。
その質量、及びＷａｔｅｒｓ及びｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｒａｉｎｉｎｇ（Ｄｕｂｌｉｎ，Ｉｒｅｌａｎｄ）が先駆けとなって開発したグルコース単位値を使用したＨＩＬＩＣクロマトグラフィー方法における溶出順により、ＭＴ６試料中のグリカンを同定した（図４９Ａ及び図４９Ｂ）。
遊離チオールの定量化。ＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐ構築物のシステイン残基は、（１つ以上の）分子内及び分子間ジスルフィド結合の形成に関与している可能性がある。又はこれらは遊離チオールとして存在している場合がある。ペプチド及びタンパク質中のスルフィド結合の存在により、タンパク質に立体構造の剛性を与えると示されてきた。様々な試薬及び分離技術によりチオールを検出することができる。非常に低いレベルの遊離チオールについての３つのＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐ構築物の分析を表８－１に示す。
（表８－１）
トリスルフィドの定量化。ＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐ構築物のシステイン残基における遊離チオールと同様に、トリスルフィド結合はタンパク質の構造に影響し得る。非常に低いレベルの遊離チオールを用いた条件の下で、３つのＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐ構築物の分析を表８－２に示す。
（表８－２）
ヒンジ領域における鎖内ジスルフィド。ヒンジ領域内の不対合形成されたジスルフィド結合は、ＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐ構築物の構造、機能及び安定性に影響を有し得る。ＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐ構築物のヒンジ領域における非常に低い鎖内ジスルフィド結合又はその欠如についての３つのＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐ構築物の分析［ＴＨＴＣ＊ＰＰＣ＊ＰＡＰＥＬＬＧ、Ｃ＊は鎖内スルフィド結合が形成され得る場所を示す］（配列番号８３）を、表８－３に示す。
（表８－３）
交差ジスルフィド結合及び平行ジスルフィド結合異性体の定量化。ヒンジ領域内の平行ジスルフィド結合により結合された二量体であるＭＴ１及びＭＴ５について、ヒンジ領域内のジスルフィド結合が交差し得る異性体が存在している可能性がある（図５０）。
平行対交差ジスルフィド結合のタイプの定量化は、ＦａｂＲＩＣＡＴＯＲ消化分子であるＭＴ１と比較するとＭＴ２組換え発現タンパク質はＦｃヒンジ領域内にわずかに高いレベルの交差ジスルフィド架橋を有することを示した（表８－４）。
（表８－４）
翻訳後修飾（ＰＴＭ）
（表８－５）
３つすべてのＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐ構築物中のＰＴＭの評価は、同等のレベルのＰＴＭを示した（表８－５）。Ａｓｎ８４で観察された脱アミド化は、スクシンイミドを形成する場合には約３．１～３．２％の範囲であり、アスパラギン酸／イソアスパラギン酸を形成する場合には１８．９～２１．９％であった。３つすべてのＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐ構築物について、約０．７～６．８％の範囲にて、複数のメチオニン残基（例えばＭｅｔ１０、Ｍｅｔ２０ｍ、Ｍｅｔ１６３及びＭｅｔ１９２）の酸化を観察した。ＭＴ１及びＭＴ５とは対照的にリンカーを含むＭＴ６は、リンカー上のメチオニン残基の追加的な酸化を示した（例えば、Ｍｅｔ２４５及びＭｅｔ２５５）。ＭＴ１及びＭＴ５中の約０．１％及び２．０％のＣ末端グリシン（Ｇｌｙ２１１）は、グリシンの損失を示した。これはＣ末端グリシンを欠いているＭＴ６については観察されなかった。
高度な糖化最終産物の修飾は、リジン及びアルギニン糖化に関連した。ＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐ構築物の糖化はその構造及び機能を改変することが可能であり、これは抗ＶＥＧＦ活性を損なわせることにつながる。
（表８－６）
３つすべてのＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐ構築物中の修飾の評価は、同等のレベルを示した（表８－６）。
修飾部位。セクション８．５（表８－７）に例示される還元ペプチドマッピングを使用して、セクション８．４に従い無処置の質量分析により明らかにされるように、ＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐ構築物上の修飾部位を確認及び定量化した。ペプチド配列ＴＮＹＬＴＨＲ（配列番号２１）の部位Ｔ９０Ｎ９１の＊＊は、切断後にアスパラギンがアスパラギン酸に変換されたことを表し、一方で、ペプチド配列ＱＴＮＴＩＩＤＶＶＬＳＰＳＨＧＩＥＬＳＶＧＥＫ（配列番号１９）の部位Ｎ９９Ｔ１００に関し、＊は、トリプシンによる高レベルの非特異的な切断を表す。これら２つの切断部位は、ＭＴ１及びＭＴ５の評価中にＬＭＷ種不純物を形成することが分かった。Ｍ２４５Ｙ２４６での切断は、固有のリンカーを有するＭＴ３でのみ見られ、ＭＴ３調製中のＬＭＷ２種不純物の原因であった。
（表８－７）
グリコサイト占有率の定量化。Ｎ－グリコシル化は一般的なＰＴＭである。Ｎ－グリカンの巨大不均一性（グリコシル化部位占有率）及び微小不均一性（部位特異的グリカン構造）を含む、部位特異的Ｎ－グリコシル化を特徴付けることは、糖タンパク質の生合成及び機能の理解にとって重要である。グリコシル化の程度は、タンパク質がどの程度発現されているかに応じて変化し得る。Ｎ３６でのグリコシル化のレベルは、３つすべてのＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐに関して類似していた（表８－８及び図５１）。同様に、Ｎ６８でのグリコシル化のレベルもまた、３つすべてのＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐに関して類似していた（表８－８及び図５２）。Ｎ１２３でのグリコシル化のレベルもまた、３つすべてのＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐに関して類似していた（表８－８及び図５３）が、ＭＴ１調製物についてはマンノース－５が上昇していることが分かった。ＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐ構築物に関しては、Ａｓｎ１９６でのグリコシル化は、ＭＴ１と比較すると、ＭＴ５及びＭＴ６については低かった（表８－８及び図５４）。加えて、マンノース－５もまた、ＭＴ４及びＭＴ６調製物よりもＭＴ１調製物について上昇した。
（表８－８）
Ｎ－グリカンの分析。Ｎ３６でのグリコシル化を表８－９に示す。Ｇ２Ｆ、Ｇ２ＦＳ、Ｇ２ＦＳ２は、３つすべてのＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐで見られる主要なＮ－グリカンであった。表８－１０に示されるＮ６８でのグリコシル化に関しては、Ｇ２Ｆ及びＧ２ＦＳは、３つすべてのＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐで見られる主要なＮ－グリカンであった。Ｎ１２３でのグリコシル化については表８－１１に示され、Ｇ２Ｆ及びＧ２Ｓは、３つすべてのＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐで見られる主要なＮ－グリカンであり、マンノース－５は、ＭＴ５及びＭＴ６と比較するとＭＴ１中で高レベルで検出された。表８－１２に示されるＮ１９６でのグリコシル化については、Ｇ２、Ｇ２Ｓ、Ｇ２Ｓ２は、３つすべてのＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐで見られる主要なＮ－グリカンであり、マンノース－５は、ＭＴ５及びＭＴ６と比較するとＭＴ１中で高レベルで検出された。
（表８－９）
（表８－１０）
（表８－１１）
（表８－１２）
ＭＴ３のリンカーでのＯ－グリカン。ＭＴ３におけるＯ－グリカンを調査するため、ＭＴ３のＧＳリンカーを評価した。Ｏ－キシロシル化は、ＭＴ３のＧＳリンカー
下線をつけたセリン残基はグリコシル化されている）（配列番号９８）上に位置づけられるセリン残基で見られる。Ｏ－グリカンの組成を表８－１３に示す。
（表８－１３）
ＨＩＬＩＣ－ＦＬＲ－ＭＳ分析。セクション８．２に説明されているように、すべてのＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐに関して、ＨＩＬＩＣ－ＦＬＲ－ＭＳ分析を実施した。この分析は、ＭＴ５及びＭＴ６のＮ－結合グリカンが、類似しているが、ＭＴ１に関して得られたものとは異なっていたことを示した（図５５は、フルスケール及び並べて表示したクロマトグラムを示し、図５６はフルスケール及びオーバーレイ表示のクロマトグラムを示し、図５７はフルスケールで並べて表示され、正規化したクロマトグラムを示す）。
最後に、３つすべてのＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐタンパク質についてのグリコシル化％及び詳細なグリカン同定及び定量化は、表８－１４及び図５８Ａ～Ｃにそれぞれ列挙されている。すべてのグリカン分析で観察されるように、ＭＴ５及びＭＴ６のグリコシル化プロファイル及びマンノースレベルは類似しているが、ＭＴ１とは異なっている。
（表８－１４）
［実施例９］上流培地及びフィードプロセスの最適化を使用した生成及び色定量化
（Ａ）最適化されていないＣＤＭ（対照バイオリアクタ）
実施例５に説明されるＭｉｎｉＴｒａｐの製造を利用した。
調査工程に関する操作パラメータは、当業者に公知の通りである。
０日目の培地＝ＣＤＭ１、これは以下の栄養素、抗酸化剤及び金属を含んでいた。
・８～９ｍＭの累積濃度にてシステインを加えた。
・出発培地中の金属は、１倍濃度にて以下に列挙される（濃度は種菌の追加前のものである）：
- Ｆｅ＝培養物１リットルあたり６８～８３マイクロモル
- Ｚｎ＝培養物１リットルあたり６～７マイクロモル
- Ｃｕ＝培養物１リットルあたり０．１～０．２マイクロモル
- Ｎｉ＝培養物１リットルあたり０．５～１マイクロモル
ＭＴ１を回収する際に、図５９に示される生成手順に従った。クロマトグラフィーの操作パラメータは当業者に公知である。アフィニティー捕捉の操作パラメータ（図５９の工程３）、アフィニティーフロースルー（図５９の工程５）、ＡＥＸ（図５９の工程８）、及びＨＩＣ（図５９の工程９）を表９－１に概説する。実施例１．２に概説される手順を使用して、アフィニティー捕捉及びろ過工程後のアフリベルセプトのタンパク質分解性切断を実行した。
（表９－１）
表９－２は、様々なクロマトグラフィー工程を実施する際に得られたプールの色定量化を示す。５ｇ／Ｌのタンパク質濃度を有するプールからの試料を使用し、色定量化を行った。
アフィニティー捕捉プールは、アフィニティー捕捉工程を実施する際に収集された溶出液を指す（図５９の工程３）。酵素プールは、酵素的切断工程を実施する際に収集されたフロースルーを指す（図５９の工程４）。アフィニティーフロースループールは、アフィニティーフロースルー工程を実施する際に収集されたフロースルーを指す（図５９の工程５）。アフィニティーフロースルー溶出液は、アフィニティーフロースルー工程を実施する際に収集された溶出液を指す（図５９の工程５）。ＡＥＸプール及びＡＥＸストリップは、陰イオン交換クロマトグラフィー工程を実施する際に得られたフロースルー画分及びストリップされた画分を指す（図５９の工程８）。ＨＩＣプールは、疎水性相互作用クロマトグラフィー工程を実施する際に収集されたフロースルーを指す（図５９の工程９）。
表９－２で確認される各工程は、色の低減を示す（プールのｂ＊値における低減から観察される）。例えば、アフィニティーフロースルークロマトグラフィーを実施する際に、フロースルー画分は２．１６のｂ＊値を有する（アフィニティー捕捉工程から収集されたフロースルーに対する、２．５２のｂ＊値から低減している）。ｂ＊値における２．１６から０．７４への低減で観察されるように、ＡＥＸ分離後のフロースルー及び洗浄液は色を更に低減させる。予想される通り、ＡＥＸカラムをストリップすることで、ｂ＊値（８．１０対０．７４）から確認されるように、ＡＥＸ分離後のフロースルー及び洗浄液からの呈色よりも大幅に濃い黄褐色を有する試料をもたらした。最後に、ＨＩＣ工程は色の更なる低減をもたらした（５ｇ／Ｌのタンパク質濃度に関して、ｂ＊値は、２８．５ｇ／Ｌのタンパク質濃度でＨＩＣプールについて得られたｂ＊値から正規化され得る）。
（表９－２）様々な生成工程での試料の色定量化
（Ｂ）最適化ＣＤＭ（低システイン、低金属、及び抗酸化剤を増加したバイオリアクタ）
以下のプロトコルを使用し、システイン濃度の低下、金属濃度の低下、及び抗酸化剤の増加の、呈色に対する効果を評価した：
０日目の培地＝ＣＤＭ１
- ５～６ｍＭの累積濃度にてシステインを加えた
・以下の累積濃度に到達するようにＣＤＭ１に抗酸化剤を加えた（濃度は種菌追加の前のものである）：
- タウリン＝培養物中１０ｍＭ
- グリシン＝培養物中１０ｍＭ
- チオクト酸＝培養物中０．００２４ｍＭ
- ビタミンＣ（アスコルビン酸）＝培養物中０．０２８ｍＭ
・出発培地中の金属を１倍レベルで以下に列挙する。
- Ｆｅ＝培養物１リットルあたり６８～８３マイクロモル
- Ｚｎ＝培養物１リットルあたり６～７マイクロモル
- Ｃｕ＝培養物１リットルあたり０．１～０．２マイクロモル
- Ｎｉ＝培養物１リットルあたり０．５～１マイクロモル
- 含まれるすべての金属の低減は、培地に関して、上に記載されたものの０．２５倍濃度を使用
ＭＴ１試料を回収する際、図５９に示される生成手順に従った。クロマトグラフィーの操作パラメータは当業者に公知である。アフィニティー捕捉、アフィニティーフロースルー、及びＨＩＣの操作パラメータを表９－１に概説する。実施例１．２に概説される手順を使用し、アフィニティー捕捉及びろ過工程後のアフリベルセプトのタンパク質分解性切断を実行した。
表９－３は、様々なクロマトグラフィー工程を実施する際に得られたプールの色定量化を示す。５ｇ／Ｌのタンパク質濃度を有するプールからの試料を使用し、色定量化を行った。表９－３で確認される工程は、表９－２における工程について確認されるのと類似の生成をもたらした。
（表９－３）ＭｉｎｉＴｒａｐの様々な生成工程での試料の色定量化
表９－２及び表９－３と比較すると、「低システイン、低金属、及び抗酸化剤を増加したバイオリアクタの条件」は、「対照バイオリアクタの条件」（２．５２のｂ＊値）と比較して、アフィニティー捕捉プール（１．７７のｂ＊値）について色が弱かった。
１６０ｇ／Ｌの濃度を有するＭＴ試料は、表９－２及び表９－３に列挙される工程を使用してＭＴを形成する場合には、「低システイン、低金属、及び抗酸化剤を増加したバイオリアクタの条件」については１３．４５のｂ＊値、「対照バイオリアクタの条件」については１７．４５のｂ＊値を有すると予測される。上流培地及びフィードを最適化することにより、色に関して２３％の低減が得られる。同様に、１１０ｇ／Ｌの濃度を有するＭＴ試料は、表９－２及び表９－３に列挙される工程を使用してＭＴを形成する場合には、「低システイン、低金属、及び抗酸化剤を増加したバイオリアクタの条件」については９．２５のｂ＊値、「対照バイオリアクタの条件」については１２のｂ＊値を有すると予測される。
各生成ユニット操作が色低減にどれくらい寄与しているかを理解するため、各生成プロセス中間体のｂ＊値を、アフィニティー捕捉プールの色に対する割合として、計算した（表９－４）。
（表９－４）
ＡＥＸユニット操作は、最も大きな色低減をもたらす（ｂ＊に関して１．０８～１．４２の変化）。一方、ＨＩＣユニット操作は追加のいくらの色低減をもたらす（ｂ＊に関して０．０８～０．１９の変化）。評価したユニット操作は全体的に、アフィニティー捕捉プールに存在する色の７６．３％～７８．２％を取り除いた。
プロテアーゼ消化により生成されたオリゴペプチド中の２－オキソ－ヒスチジンの割合及びオキソ－トリプトファンの割合について、表９－５及び表９－６にそれぞれ示されるように質量分析により測定することで、「対照バイオリアクタの条件」及び「低システイン、低金属、及び抗酸化剤を増加したバイオリアクタの条件」に関する様々な生成プロセス中間体の色もまた調査した。実施例３に述べられるように、ペプチドマッピングを実施した。
表９－５を参照すると、異なる生成工程中のプールにおけるヒスチジン酸化レベルを比較した場合、形成されたＭＴに関するヒスチジン酸化レベルの割合の相対的な存在量は、生成プロセスが進行するにつれてプール中で減少することが明らかである。例えば、「対照バイオリアクタの条件」中のＨ２０９については、ヒスチジン酸化レベルのパーセントは酵素的切断プールについては０．０６２であり、これはＡＥＸフロースルーについては０．０２９に減少し、ＨＩＣプールについては更に０．０２０に減少した。同様に、「低システイン、低金属、及び抗酸化剤を増加したバイオリアクタの条件」中のＨ２０９については、ヒスチジン酸化レベルのパーセントは酵素的切断プールについては０．０３９であり、これはＡＥＸフロースルーについては０．０２３に減少し、ＨＩＣプールについては更に０．０１６に減少した。したがって、生成方法により、ＭＴ中のヒスチジン酸化レベルの割合に減少がもたらされた。呈色が低減するにつれ、試料中の一部の酸化残基の存在もまた低減した。ヒスチジン酸化と同様に、「対照バイオリアクタの条件」及び「低システイン、低金属、及び抗酸化剤を増加したバイオリアクタの条件」の両方について、異なる生成工程におけるプールに関するトリプトファン酸化レベルもまた追跡調査した（表９－６）。
（表９－５）
（表９－６）
例の列挙
例示的に列挙された以下の例は、限定を意図するものではなく、当業者により理解される本願明細書に基づき、ＣＤＭ及びタンパク質バリアントや黄褐色を増減させるための改変条件を用いてアフリベルセプト及びＶＥＧＦ ＭｉｎｉＴｒａｐを含む抗ＶＥＧＦ組成物を産生するための追加のバリエーションが、本願明細書に沿って実施され得ることが理解されるであろう。
１．合成培地（ＣＤＭ）中で培養された細胞の清澄化された回収物からアフリベルセプトを精製する方法であって、
（ａ）前記アフリベルセプトと結合可能なポリペプチドを含むアフィニティークロマトグラフィーカラムを使用して、前記清澄化された回収物からのアフリベルセプトを結合させる工程であって、前記ポリペプチドが、抗体、融合タンパク質、リガンド、ＳｃＦｖ、又はこれらの断片である、結合させる工程と、
（ｂ）工程（ａ）の前記アフリベルセプトを溶出して、前記アフリベルセプトを、そのＦｃドメインを除去するために酵素的切断に供し、それによってＭｉｎｉＴｒａｐ溶出液を形成する工程と、
任意選択で、
（ｃ）前記溶出したＭｉｎｉＴｒａｐを第２クロマトグラフィー捕捉工程に供する工程と、
（ｄ）工程（ｃ）の第２クロマトグラフィーを洗浄する工程であって、前記ＭｉｎｉＴｒａｐがフロースルー画分中に回収される、洗浄する工程と
を含む、方法。
２．前記アフリベルセプトと結合可能な前記ポリペプチドが、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、及び配列番号８０から選択される単離されたアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
３．平衡化バッファを使用して（ａ）の前記アフィニティークロマトグラフィーカラムを平衡化する工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
４．前記平衡化バッファが、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水又はトリス塩酸である、請求項３に記載の方法。
５．前記平衡化バッファが約８．３～約８．６のｐＨを有する、請求項４に記載の方法。
６．１つ以上のフロースルー画分を得るために、平衡化バッファを用いてカラム（ｄ）を洗浄する工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
７．前記平衡化バッファがダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水であり、約７．０～約８．６のｐＨを有する、請求項６に記載の方法。
８．１つ以上の溶出画分を得るために、（ａ）のカラムを溶出液で１回以上洗浄する工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
９．前記溶出バッファが、約２．５のｐＨを有する１００ｍＭのグリシンバッファを含む、請求項８に記載の方法。
１０．前記溶出バッファのｐＨが、約２．０～約３．５である、請求項８に記載の方法。
１１．中和バッファの追加により、前記溶出画分を中和する工程を更に含む、請求項８に記載の方法。
１２．前記中和バッファがトリス塩酸である、請求項１１に記載の方法。
１３．（ｃ）における宿主細胞タンパク質の量が、前記清澄化された回収物中の宿主細胞タンパク質の量と比較して約９０％、約９５％、約９８％、又は約９９％だけ著しく減少する、請求項１に記載の方法。
１４．（ｄ）の前記第２捕捉クロマトグラフィーが、陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）を含む、請求項１に記載の方法。
１５．前記ＡＥＸカラム用の前記平衡化バッファ及び洗浄バッファの両方の伝導度が、約１．５０～約３．０ｍＳ／ｃｍであり得る、請求項１４に記載の方法。
１６．（ｄ）の前記１つ以上のフロースルー画分からのＭｉｎｉＴｒａｐが、２０％未満のＭｉｎｉＴｒａｐの総酸性種を含み、酸性種が、ＭｉｎｉＴｒａｐの強陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）クロマトグラムにおけるメインピークよりも早く溶出するピークに対応しており、クロマトグラムが、２０ｍＭの２－（Ｎ－モルフォリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）（ｐＨ５．７）の第１移動相、及び４０ｍＭのリン酸ナトリウム、１００ｍＭの塩化ナトリウム（ｐＨ９．０）（移動相Ｂ）の第２移動相を使用して生成され、クロマトグラムが２８０ｎｍでの検出を使用して生成される、請求項１４に記載の方法。
１７．ＭｉｎｉＴｒａｐを産生する方法であって、
（ａ）アフリベルセプトを発現するように遺伝子改変された宿主細胞を提供する工程と、
（ｂ）前記アフリベルセプトを発現する好適な条件の下で、前記宿主細胞を培養する工程と、
（ｃ）アフリベルセプトと前記宿主細胞により産生された少なくとも１つの不純物とを含む調製物を回収する工程と、
（ｄ）好適な条件の下で、前記調製物をアフィニティークロマトグラフィーに供する工程であって、前記アフィニティークロマトグラフィーが、前記アフリベルセプトと結合又は相互作用可能なポリペプチドを含む、供する工程と、
（ｅ）前記アフリベルセプトを、そのＦｃドメインを除去するために酵素的切断に供し、それによってＭｉｎｉＴｒａｐを形成する工程と
を含む、方法。
１８．前記アフリベルセプトと結合可能な前記ポリペプチドが、抗体、融合タンパク質、リガンド、ＳｃＦｖ、又はこれらの断片である、請求項１７に記載の方法。
１９．前記アフリベルセプトと結合可能な前記ポリペプチドが、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、及び配列番号８０から選択される単離されたアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載の方法。
２０．平衡化バッファを使用して前記アフィニティークロマトグラフィーカラムを平衡化する工程を更に含む、請求項１７に記載の方法。
２１．１つ以上のフロースルー画分を得るために、前記アフィニティークロマトグラフィーカラムを平衡化バッファを用いて洗浄する工程を更に含む、請求項１７に記載の方法。
２２．１つ以上の溶出画分を得るために、前記アフィニティークロマトグラフィーカラムを溶出バッファで１回以上洗浄する工程を更に含む、請求項１７に記載の方法。
２３．前記溶出バッファのｐＨが、約２．０～約４．０である、請求項２２に記載の方法。
２４．前記溶出バッファが、約２．５のｐＨを有する１００ｍＭのグリシンバッファを含む、請求項２２に記載の方法。
２５．中和バッファの追加により、前記１つ以上の溶出画分を中和する工程を更に含む、請求項２２に記載の方法。
２６．抗ＶＥＧＦタンパク質を精製する方法であって、前記抗ＶＥＧＦタンパク質を含む試料を、好適な条件の下でアフィニティークロマトグラフィーに供する工程を含み、前記アフィニティークロマトグラフィーが、前記抗ＶＥＧＦタンパク質と結合又は相互作用可能であるポリペプチドを含む、方法。
２７．（ａ）平衡化バッファを使用して前記アフィニティークロマトグラフィーカラムを平衡化する工程と、
（ｂ）平衡化バッファを用いて前記アフィニティークロマトグラフィーカラムを１回以上洗浄する工程と、
（ｃ）１つ以上の溶出画分を得るために、前記アフィニティークロマトグラフィーカラムを溶出バッファで１回以上洗浄する工程と、
（ｄ）中和バッファの追加により、前記１つ以上の溶出画分を中和する工程と
を更に含む、請求項２６に記載の方法。
２８．前記溶出画分中の宿主細胞タンパク質の量が、前記試料中の宿主細胞タンパク質の量と比較して約９０％、約９５％、約９８％、又は約９９％だけ著しく減少する、請求項２７に記載の方法。
配列情報
SEQUENCE LISTING
<110> REGENERON PHARMACEUTICALS, INC.
<120> ANTI-VEGF PROTEIN COMPOSITIONS AND METHODS FOR PRODUCING THE SAME
<150> US 62/944,635
<151> 2019-12-06
<150> US 63/065,012
<151> 2020-08-13
<160> 124
<170> PatentIn version 3.5

<210> 1
<211> 339
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 1
Met Arg Lys Arg Cys Tyr Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Ala Ala Val
1 5 10 15
Thr Leu Phe Val Leu Ser Val Asp Arg Gly Val Ile Ala Asp Ser Phe
20 25 30
Ser Ala Asn Gln Glu Ile Arg Tyr Ser Glu Val Thr Pro Tyr His Val
35 40 45
Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Pro Ala Asn Phe Thr Gln
50 55 60
Gly Glu Asp Val Phe His Ala Pro Tyr Val Ala Asn Gln Gly Trp Tyr
65 70 75 80
Asp Ile Thr Lys Thr Phe Asn Gly Lys Asp Asp Leu Leu Cys Gly Ala
85 90 95
Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp Phe Asp Gln Asn Lys Asp
100 105 110
Gln Ile Lys Arg Tyr Leu Glu Glu His Pro Glu Lys Gln Lys Ile Asn
115 120 125
Phe Asn Gly Glu Gln Met Phe Asp Val Lys Glu Ala Ile Asp Thr Lys
130 135 140
Asn His Gln Leu Asp Ser Lys Leu Phe Glu Tyr Phe Lys Glu Lys Ala
145 150 155 160
Phe Pro Tyr Leu Ser Thr Lys His Leu Gly Val Phe Pro Asp His Val
165 170 175
Ile Asp Met Phe Ile Asn Gly Tyr Arg Leu Ser Leu Thr Asn His Gly
180 185 190
Pro Thr Pro Val Lys Glu Gly Ser Lys Asp Pro Arg Gly Gly Ile Phe
195 200 205
Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asp Gln Ser Lys Leu Leu Thr Ser Arg
210 215 220
His Asp Phe Lys Glu Lys Asn Leu Lys Glu Ile Ser Asp Leu Ile Lys
225 230 235 240
Lys Glu Leu Thr Glu Gly Lys Ala Leu Gly Leu Ser His Thr Tyr Ala
245 250 255
Asn Val Arg Ile Asn His Val Ile Asn Leu Trp Gly Ala Asp Phe Asp
260 265 270
Ser Asn Gly Asn Leu Lys Ala Ile Tyr Val Thr Asp Ser Asp Ser Asn
275 280 285
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Ser Asn Gly Asn Leu Lys Ala Ile Tyr Val Thr Asp Ser Asp Ser Asn
275 280 285
Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly Val Asn Ser Ala Gly
290 295 300
Lys Val Ala Ile Ser Ala Lys Glu Ile Lys Glu Asp Asn Ile Gly Ala
305 310 315 320
Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Thr Gly Gln Asp Ser Trp Asn
325 330 335
Gln Thr Asn

<210> 13
<211> 339
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 13
Met Arg Lys Arg Cys Tyr Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Ala Ala Val
1 5 10 15
Thr Leu Phe Val Leu Ser Val Asp Arg Gly Val Ile Ala Asp Ser Phe
20 25 30
Ser Ala Asn Gln Glu Ile Arg Tyr Ser Glu Val Thr Pro Tyr His Val
35 40 45
Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Pro Ala Asn Phe Thr Gln
50 55 60
Gly Glu Asp Val Phe His Ala Pro Tyr Val Ala Asn Gln Gly Trp Tyr
65 70 75 80
Asp Ile Thr Lys Thr Phe Asp Gly Lys Asp Asp Leu Leu Cys Gly Ala
85 90 95
Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp Phe Asp Gln Asn Lys Asp
100 105 110
Gln Ile Lys Arg Tyr Leu Glu Glu His Pro Glu Lys Gln Lys Ile Asn
115 120 125
Phe Arg Gly Glu Gln Met Phe Asp Val Lys Glu Ala Ile Asp Thr Lys
130 135 140
Asn His Gln Leu Asp Ser Lys Leu Phe Glu Tyr Phe Lys Glu Lys Ala
145 150 155 160
Phe Pro Tyr Leu Ser Thr Lys His Leu Gly Val Phe Pro Asp His Val
165 170 175
Ile Asp Met Phe Ile Asn Gly Tyr Arg Leu Ser Leu Thr Asn His Gly
180 185 190
Pro Thr Pro Val Lys Glu Gly Ser Lys Asp Pro Arg Gly Gly Ile Phe
195 200 205
Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asp Gln Ser Lys Leu Leu Thr Ser Arg
210 215 220
His Asp Phe Lys Glu Lys Asn Leu Lys Glu Ile Ser Asp Leu Ile Lys
225 230 235 240
Lys Glu Leu Thr Glu Gly Lys Ala Leu Gly Leu Ser His Thr Tyr Ala
245 250 255
Asn Val Arg Ile Asn His Val Ile Asn Leu Trp Gly Ala Asp Phe Asp
260 265 270
Ser Asp Gly Asn Leu Lys Ala Ile Tyr Val Thr Asp Ser Asp Ser Asn
275 280 285
Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly Val Asn Ser Ala Gly
290 295 300
Lys Val Ala Ile Ser Ala Lys Glu Ile Lys Glu Asp Asn Ile Gly Ala
305 310 315 320
Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Thr Gly Gln Asp Ser Trp Asn
325 330 335
Gln Thr Asn

<210> 14
<211> 339
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 14
Met Arg Lys Arg Cys Tyr Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Ala Ala Val
1 5 10 15
Thr Leu Phe Val Leu Ser Val Asp Arg Gly Val Ile Ala Asp Ser Phe
20 25 30
Ser Ala Asn Gln Glu Ile Arg Tyr Ser Glu Val Thr Pro Tyr His Val
35 40 45
Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Pro Ala Asn Phe Thr Gln
50 55 60
Gly Glu Asp Val Phe His Ala Pro Tyr Val Ala Asn Gln Gly Trp Tyr
65 70 75 80
Asp Ile Thr Lys Thr Phe Asp Gly Lys Asp Asp Leu Leu Cys Gly Ala
85 90 95
Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp Phe Asp Gln Asn Lys Asp
100 105 110
Gln Ile Lys Arg Tyr Leu Glu Glu His Pro Glu Lys Gln Lys Ile Asn
115 120 125
Phe Asn Gly Glu Gln Met Phe Asp Val Lys Glu Ala Ile Asp Thr Lys
130 135 140
Asn His Gln Leu Asp Ser Lys Leu Phe Glu Tyr Phe Lys Glu Lys Ala
145 150 155 160
Phe Pro Tyr Leu Ser Thr Lys His Leu Gly Val Phe Pro Asp His Val
165 170 175
Ile Asp Met Phe Ile Leu Gly Tyr Arg Leu Ser Leu Thr Asn His Gly
180 185 190
Pro Thr Pro Val Lys Glu Gly Ser Lys Asp Pro Arg Gly Gly Ile Phe
195 200 205
Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asp Gln Ser Lys Leu Leu Thr Ser Arg
210 215 220
His Asp Phe Lys Glu Lys Asn Leu Lys Glu Ile Ser Asp Leu Ile Lys
225 230 235 240
Lys Glu Leu Thr Glu Gly Lys Ala Leu Gly Leu Ser His Thr Tyr Ala
245 250 255
Asn Val Arg Ile Asn His Val Ile Asn Leu Trp Gly Ala Asp Phe Asp
260 265 270
Ser Asp Gly Asn Leu Lys Ala Ile Tyr Val Thr Asp Ser Asp Ser Asn
275 280 285
Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly Val Asn Ser Ala Gly
290 295 300
Lys Val Ala Ile Ser Ala Lys Glu Ile Lys Glu Asp Asn Ile Gly Ala
305 310 315 320
Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Thr Gly Gln Asp Ser Trp Asn
325 330 335
Gln Thr Asn

<210> 15
<211> 339
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 15
Met Arg Lys Arg Cys Tyr Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Ala Ala Val
1 5 10 15
Thr Leu Phe Val Leu Ser Val Asp Arg Gly Val Ile Ala Asp Ser Phe
20 25 30
Ser Ala Asn Gln Glu Ile Arg Tyr Ser Glu Val Thr Pro Tyr His Val
35 40 45
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50 55 60
Gly Glu Asp Val Phe His Ala Pro Tyr Val Ala Asn Gln Gly Trp Tyr
65 70 75 80
Asp Ile Thr Lys Thr Phe Asn Gly Lys Asp Asp Leu Leu Cys Gly Ala
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100 105 110
Gln Ile Lys Arg Tyr Leu Glu Glu His Pro Glu Lys Gln Lys Ile Asn
115 120 125
Phe Arg Gly Glu Gln Met Phe Asp Val Lys Glu Ala Ile Asp Thr Lys
130 135 140
Asn His Gln Leu Asp Ser Lys Leu Phe Glu Tyr Phe Lys Glu Lys Ala
145 150 155 160
Phe Pro Tyr Leu Ser Thr Lys His Leu Gly Val Phe Pro Asp His Val
165 170 175
Ile Asp Met Phe Ile Leu Gly Tyr Arg Leu Ser Leu Thr Asn His Gly
180 185 190
Pro Thr Pro Val Lys Glu Gly Ser Lys Asp Pro Arg Gly Gly Ile Phe
195 200 205
Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asp Gln Ser Lys Leu Leu Thr Ser Arg
210 215 220
His Asp Phe Lys Glu Lys Asn Leu Lys Glu Ile Ser Asp Leu Ile Lys
225 230 235 240
Lys Glu Leu Thr Glu Gly Lys Ala Leu Gly Leu Ser His Thr Tyr Ala
245 250 255
Asn Val Arg Ile Asn His Val Ile Asn Leu Trp Gly Ala Asp Phe Asp
260 265 270
Ser Asp Gly Asn Leu Lys Ala Ile Tyr Val Thr Asp Ser Asp Ser Asn
275 280 285
Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly Val Asn Ser Ala Gly
290 295 300
Lys Val Ala Ile Ser Ala Lys Glu Ile Lys Glu Asp Asn Ile Gly Ala
305 310 315 320
Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Thr Gly Gln Asp Ser Trp Asn
325 330 335
Gln Thr Asn

<210> 16
<211> 339
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 16
Met Arg Lys Arg Cys Tyr Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Ala Ala Val
1 5 10 15
Thr Leu Phe Val Leu Ser Val Asp Arg Gly Val Ile Ala Asp Ser Phe
20 25 30
Ser Ala Asn Gln Glu Ile Arg Tyr Ser Glu Val Thr Pro Tyr His Val
35 40 45
Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Pro Ala Asn Phe Thr Gln
50 55 60
Gly Glu Asp Val Phe His Ala Pro Tyr Val Ala Asn Gln Gly Trp Tyr
65 70 75 80
Asp Ile Thr Lys Thr Phe Asp Gly Lys Asp Asp Leu Leu Cys Gly Ala
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100 105 110
Gln Ile Lys Arg Tyr Leu Glu Glu His Pro Glu Lys Gln Lys Ile Asn
115 120 125
Phe Arg Gly Glu Gln Met Phe Asp Val Lys Glu Ala Ile Asp Thr Lys
130 135 140
Asn His Gln Leu Asp Ser Lys Leu Phe Glu Tyr Phe Lys Glu Lys Ala
145 150 155 160
Phe Pro Tyr Leu Ser Thr Lys His Leu Gly Val Phe Pro Asp His Val
165 170 175
Ile Asp Met Phe Ile Leu Gly Tyr Arg Leu Ser Leu Thr Asn His Gly
180 185 190
Pro Thr Pro Val Lys Glu Gly Ser Lys Asp Pro Arg Gly Gly Ile Phe
195 200 205
Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asp Gln Ser Lys Leu Leu Thr Ser Arg
210 215 220
His Asp Phe Lys Glu Lys Asn Leu Lys Glu Ile Ser Asp Leu Ile Lys
225 230 235 240
Lys Glu Leu Thr Glu Gly Lys Ala Leu Gly Leu Ser His Thr Tyr Ala
245 250 255
Asn Val Arg Ile Asn His Val Ile Asn Leu Trp Gly Ala Asp Phe Asp
260 265 270
Ser Asp Gly Asn Leu Lys Ala Ile Tyr Val Thr Asp Ser Asp Ser Asn
275 280 285
Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly Val Asn Ser Ala Gly
290 295 300
Lys Val Ala Ile Ser Ala Lys Glu Ile Lys Glu Asp Asn Ile Gly Ala
305 310 315 320
Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Thr Gly Gln Asp Ser Trp Asn
325 330 335
Gln Thr Asn

<210> 17
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> May be oxidized
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> May be carboxymethylated
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> May be carboxymethylated
<400> 17
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15

<210> 18
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> May be carboxymethylated
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> May be oxidized
<400> 18
Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr
1 5 10 15
Lys

<210> 19
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> May be oxidized
<400> 19
Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile
1 5 10 15
Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys
20

<210> 20
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (18)..(18)
<223> May be oxidized
<400> 20
Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser
1 5 10 15
Lys His Gln His Lys
20

<210> 21
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> May be oxidized
<400> 21
Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg
1 5

<210> 22
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (19)..(19)
<223> May be oxidized
<400> 22
Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu
1 5 10 15
Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg
20

<210> 23
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> May be oxidized
<400> 23
Val His Glu Lys Asp Lys
1 5

<210> 24
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> May be oxidized
<400> 24
Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu
1 5 10 15
Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg
20

<210> 25
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(20)
<223> May be oxidized
<400> 25
Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu
1 5 10 15
Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg
20

<210> 26
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> May be oxidized
<400> 26
Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys
1 5

<210> 27
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> May be carboxymethylated
<400> 27
Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr
1 5 10 15
Lys

<210> 28
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> May be oxidized
<400> 28
Ile Ile Trp Asp Ser Arg
1 5

<210> 29
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> May be oxidized
<400> 29
Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser
1 5 10 15
Lys

<210> 30
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> May be oxidized
<400> 30
Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys
1 5 10

<210> 31
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> May be oxidized
<400> 31
Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys
1 5 10

<210> 32
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> May be oxidized
<400> 32
Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg
1 5 10

<210> 33
<211> 227
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> Leu or Pro
<220>
<221> MOD_RES
<222> (173)..(173)
<223> Ala or Thr
<400> 33
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Xaa Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Xaa Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225

<210> 34
<211> 103
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 34
Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu
1 5 10 15
Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val
20 25 30
Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr
35 40 45
Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe
50 55 60
Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu
65 70 75 80
Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg
85 90 95
Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp
100

<210> 35
<211> 93
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 35
Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr
1 5 10 15
Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile
20 25 30
Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly
35 40 45
Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala
50 55 60
Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly
65 70 75 80
His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr
85 90

<210> 36
<211> 102
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 36
Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys
1 5 10 15
Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp
20 25 30
Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu Val
35 40 45
Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu
50 55 60
Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr
65 70 75 80
Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe
85 90 95
Val Arg Val His Glu Lys
100

<210> 37
<211> 97
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 37
Pro Phe Val Ala Phe Gly Ser Gly Met Glu Ser Leu Val Glu Ala Thr
1 5 10 15
Val Gly Glu Arg Val Arg Ile Pro Ala Lys Tyr Leu Gly Tyr Pro Pro
20 25 30
Pro Glu Ile Lys Trp Tyr Lys Asn Gly Ile Pro Leu Glu Ser Asn His
35 40 45
Thr Ile Lys Ala Gly His Val Leu Thr Ile Met Glu Val Ser Glu Arg
50 55 60
Asp Thr Gly Asn Tyr Thr Val Ile Leu Thr Asn Pro Ile Ser Lys Glu
65 70 75 80
Lys Gln Ser His Val Val Ser Leu Val Val Tyr Val Pro Pro Gly Pro
85 90 95
Gly

<210> 38
<211> 92
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 38
Phe Val Ala Phe Gly Ser Gly Met Glu Ser Leu Val Glu Ala Thr Val
1 5 10 15
Gly Glu Arg Val Arg Ile Pro Ala Lys Tyr Leu Gly Tyr Pro Pro Pro
20 25 30
Glu Ile Lys Trp Tyr Lys Asn Gly Ile Pro Leu Glu Ser Asn His Thr
35 40 45
Ile Lys Ala Gly His Val Leu Thr Ile Met Glu Val Ser Glu Arg Asp
50 55 60
Thr Gly Asn Tyr Thr Val Ile Leu Thr Asn Pro Ile Lys Ser Glu Lys
65 70 75 80
Gln Ser His Val Val Ser Leu Val Val Tyr Val Pro
85 90

<210> 39
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 39
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
1 5

<210> 40
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 40
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Pro Cys
1 5 10

<210> 41
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 41
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Pro Cys
1 5 10 15

<210> 42
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 42
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15

<210> 43
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 43
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Leu Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15

<210> 44
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 44
Asp Lys Thr His Thr Cys
1 5

<210> 45
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 45
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Leu Cys Pro Ala Pro
1 5 10

<210> 46
<211> 221
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 46
Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu
1 5 10 15
Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val
20 25 30
Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr
35 40 45
Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe
50 55 60
Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu
65 70 75 80
Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg
85 90 95
Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile
100 105 110
Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr
115 120 125
Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys
130 135 140
His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly
145 150 155 160
Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr
165 170 175
Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met
180 185 190
Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Asp Lys Thr
195 200 205
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
210 215 220

<210> 47
<211> 315
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 47
Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His
1 5 10 15
Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro
20 25 30
Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro
35 40 45
Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser
50 55 60
Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val
65 70 75 80
Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn
85 90 95
Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser
100 105 110
Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn
115 120 125
Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His
130 135 140
Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met
145 150 155 160
Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp
165 170 175
Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys
180 185 190
Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Asn Leu Ser Val Ala Phe Gly
195 200 205
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210 215 220
Ile Pro Ala Lys Tyr Leu Gly Tyr Pro Pro Pro Glu Ile Lys Trp Tyr
225 230 235 240
Lys Asn Gly Ile Pro Leu Glu Ser Asn His Thr Ile Lys Ala Gly His
245 250 255
Val Leu Thr Ile Met Glu Val Ser Glu Arg Asp Thr Gly Asn Tyr Thr
260 265 270
Val Ile Leu Thr Asn Pro Ile Ser Lys Glu Lys Gln Ser His Val Val
275 280 285
Ser Leu Val Val Tyr Val Pro Pro Gly Pro Gly Asp Lys Thr His Thr
290 295 300
Cys Pro Leu Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
305 310 315

<210> 48
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 48
Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu
1 5 10 15
Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val
20 25 30
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35 40 45
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210

<210> 49
<211> 217
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 49
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Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Asp Lys Thr
195 200 205
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Pro Cys
210 215

<210> 50
<211> 220
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 50
Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu
1 5 10 15
Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val
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Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr
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115 120 125
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<210> 51
<211> 440
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 51
Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu
1 5 10 15
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Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys
130 135 140
His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly
145 150 155 160
Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr
165 170 175
Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met
180 185 190
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195 200 205
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355 360 365
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435 440

<210> 52
<211> 425
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 52
Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu
1 5 10 15
Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val
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35 40 45
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly
145 150 155 160
Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr
165 170 175
Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met
180 185 190
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195 200 205
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405 410 415
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420 425

<210> 53
<211> 455
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 53
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1 5 10 15
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Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Gly Gly Gly
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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
210 215 220
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
225 230 235 240
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Asp Thr Gly Arg Pro
245 250 255
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260 265 270
Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr
275 280 285
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325 330 335
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355 360 365
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405 410 415
Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu
420 425 430
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435 440 445
Phe Val Arg Val His Glu Lys
450 455

<210> 54
<211> 470
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 54
Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu
1 5 10 15
Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val
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35 40 45
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50 55 60
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100 105 110
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115 120 125
Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys
130 135 140
His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly
145 150 155 160
Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr
165 170 175
Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met
180 185 190
Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Gly Gly Gly
195 200 205
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
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Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
225 230 235 240
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
245 250 255
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe
260 265 270
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275 280 285
Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val
290 295 300
Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg
305 310 315 320
Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr
325 330 335
Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu
340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr
435 440 445
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450 455 460
Val Arg Val His Glu Lys
465 470

<210> 55
<211> 432
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 55
Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu
1 5 10 15
Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val
20 25 30
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35 40 45
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly
145 150 155 160
Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr
165 170 175
Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met
180 185 190
Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Asp Lys Thr
195 200 205
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
210 215 220
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
225 230 235 240
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
245 250 255
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
260 265 270
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
275 280 285
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
290 295 300
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
305 310 315 320
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
325 330 335
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
340 345 350
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
355 360 365
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
370 375 380
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
385 390 395 400
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
405 410 415
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
420 425 430

<210> 56
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 56
Ile Ile Trp Asp Ser Arg
1 5

<210> 57
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 57
Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr
1 5 10 15
Lys

<210> 58
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 58
Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile
1 5 10 15
Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys
20

<210> 59
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 59
Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser
1 5 10 15
Lys His Gln His Lys
20

<210> 60
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 60
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15

<210> 61
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 61
Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg
1 5

<210> 62
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> May be carboxymethylated
<400> 62
Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr
1 5 10 15
Lys

<210> 63
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 63
Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile
1 5 10 15
Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys
20

<210> 64
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> May be oxidized
<400> 64
Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu
1 5 10 15
Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg
20

<210> 65
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(20)
<223> May be oxidized
<400> 65
Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu
1 5 10 15
Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg
20

<210> 66
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> May be oxidized
<400> 66
Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys
1 5

<210> 67
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> May be carboxymethylated
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (15)..(15)
<223> May be oxidized
<400> 67
Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr
1 5 10 15
Lys

<210> 68
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 68
Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu
1 5 10 15
Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg
20

<210> 69
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> May be oxidized
<400> 69
Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys
1 5 10

<210> 70
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> May be oxidized
<400> 70
Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys
1 5 10

<210> 71
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> May be oxidized
<400> 71
Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg
1 5 10

<210> 72
<211> 165
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 72
Ala Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys
1 5 10 15
Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu
20 25 30
Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys
35 40 45
Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu
50 55 60
Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile
65 70 75 80
Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe
85 90 95
Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg
100 105 110
Gln Glu Asn Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His Leu Phe
115 120 125
Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser
130 135 140
Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg Cys
145 150 155 160
Asp Lys Pro Arg Arg
165

<210> 73
<211> 451
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 73
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ser
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Thr Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Phe Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Gly Asn Tyr Gly Gly Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450

<210> 74
<211> 213
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 74
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Thr Thr Ser Gln Asp Ser Asn Asn Tyr
20 25 30
Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
His Tyr Ala Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser Asn Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Leu Gln Tyr Asp Tyr Leu Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210

<210> 75
<211> 451
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 75
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Asn Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Phe Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Gly Asn Tyr Gly Gly Tyr Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450

<210> 76
<211> 213
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 76
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Thr Ser Gln Asp Ser Asn Lys Tyr
20 25 30
Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
His Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser Asn Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210

<210> 77
<211> 445
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 77
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ser
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Thr Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Phe Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Gly Asn Tyr Gly Gly Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser
115 120 125
Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val
130 135 140
Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro
195 200 205
Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly
210 215 220
Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln
260 265 270
Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu
290 295 300
Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg
305 310 315 320
Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro
340 345 350
Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr
355 360 365
Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly
385 390 395 400
Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu
405 410 415
Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn
420 425 430
His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
435 440 445

<210> 78
<211> 213
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 78
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Thr Thr Ser Gln Asp Ser Asn Asn Tyr
20 25 30
Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
His Tyr Ala Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser Asn Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Leu Gln Tyr Asp Tyr Leu Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro
100 105 110
Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn
130 135 140
Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn
145 150 155 160
Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr
180 185 190
Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210

<210> 79
<211> 445
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 79
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Asn Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Phe Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Gly Asn Tyr Gly Gly Tyr Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser
115 120 125
Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val
130 135 140
Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro
195 200 205
Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly
210 215 220
Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln
260 265 270
Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu
290 295 300
Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg
305 310 315 320
Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro
340 345 350
Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr
355 360 365
Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly
385 390 395 400
Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu
405 410 415
Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn
420 425 430
His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
435 440 445

<210> 80
<211> 200
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 80
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Thr Ser Gln Asp Ser Asn Lys Tyr
20 25 30
Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
His Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser Asn Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro
100 105 110
Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn
130 135 140
Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn
145 150 155 160
Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr
180 185 190
Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser
195 200

<210> 81
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 81
Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg
1 5

<210> 82
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 82
Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg
1 5

<210> 83
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> May be oxidized
<400> 83
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10

<210> 84
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 84
Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala
1 5 10 15
Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys
20

<210> 85
<211> 26
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (26)..(26)
<223> May or may not be present
<400> 85
Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys
1 5 10 15
Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys
20 25

<210> 86
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (28)..(28)
<223> May or may not be present
<400> 86
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Thr His
1 5 10 15
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
20 25

<210> 87
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 87
Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr
1 5 10 15
Lys

<210> 88
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 88
Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile
1 5 10 15
Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys
20

<210> 89
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> May be oxidized
<400> 89
Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu
1 5 10 15
Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg
20

<210> 90
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(20)
<223> May be oxidized
<400> 90
Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu
1 5 10 15
Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg
20

<210> 91
<211> 54
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> May be oxidized
<400> 91
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Asp
20 25 30
Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile
35 40 45
His Met Thr Glu Gly Arg
50

<210> 92
<211> 54
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (50)..(50)
<223> May be oxidized
<400> 92
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Asp
20 25 30
Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile
35 40 45
His Met Thr Glu Gly Arg
50

<210> 93
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> May be oxidized
<400> 93
Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys
1 5

<210> 94
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (15)..(15)
<223> May be oxidized
<400> 94
Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr
1 5 10 15
Lys

<210> 95
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 95
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10

<210> 96
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 96
Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile
1 5 10 15
Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys
20

<210> 97
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> See specification as filed for detailed description of
substitutions and preferred embodiments
<400> 97
Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg
1 5

<210> 98
<211> 54
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 98
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Asp
20 25 30
Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile
35 40 45
His Met Thr Glu Gly Arg
50

<210> 99
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 99
Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu
1 5 10 15
Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg
20

<210> 100
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> May or may not be present
<400> 100
Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys
1 5 10

<210> 101
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> May or may not be present
<400> 101
Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys
1 5 10

<210> 102
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> May or may not be present
<400> 102
Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg
1 5

<210> 103
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> May or may not be present
<400> 103
Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg
1 5

<210> 104
<211> 60
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(60)
<223> This sequence may encompass 1-15 'Gly Gly Gly Ser'
repeating units
<400> 104
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
20 25 30
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
35 40 45
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
50 55 60

<210> 105
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(21)
<223> This region may encompass 1-5 'Pro Pro Cys'
repeating units
<400> 105
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
Pro Cys Pro Pro Cys
20

<210> 106
<211> 226
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (212)..(226)
<223> This region may encompass 1-5 'Pro Pro Cys'
repeating units
<400> 106
Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu
1 5 10 15
Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val
20 25 30
Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr
35 40 45
Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe
50 55 60
Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu
65 70 75 80
Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg
85 90 95
Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile
100 105 110
Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr
115 120 125
Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys
130 135 140
His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly
145 150 155 160
Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr
165 170 175
Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met
180 185 190
Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Asp Lys Thr
195 200 205
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
210 215 220
Pro Cys
225

<210> 107
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 107
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15

<210> 108
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 108
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30

<210> 109
<211> 45
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 109
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
35 40 45

<210> 110
<211> 60
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
50 55 60

<210> 111
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 111
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5

<210> 112
<211> 485
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (206)..(280)
<223> This region may encompass 1-15 'Gly Gly Gly Gly Ser'
repeating units
<400> 112
Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu
1 5 10 15
Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val
20 25 30
Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr
35 40 45
Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe
50 55 60
Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu
65 70 75 80
Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg
85 90 95
Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile
100 105 110
Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr
115 120 125
Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys
130 135 140
His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly
145 150 155 160
Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr
165 170 175
Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met
180 185 190
Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Gly Gly Gly
195 200 205
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
210 215 220
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
225 230 235 240
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
245 250 255
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
260 265 270
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val
275 280 285
Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg
290 295 300
Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr
305 310 315 320
Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile
325 330 335
Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys
340 345 350
Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr
355 360 365
Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val
370 375 380
Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu
385 390 395 400
Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe
405 410 415
Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu Val Asn
420 425 430
Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser
435 440 445
Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr
450 455 460
Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val
465 470 475 480
Arg Val His Glu Lys
485

<210> 113
<211> 211
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 113
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
1 5 10 15
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
20 25 30
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
35 40 45
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
50 55 60
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
65 70 75 80
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
85 90 95
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
100 105 110
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
115 120 125
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
130 135 140
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
145 150 155 160
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
165 170 175
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
180 185 190
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
195 200 205
Pro Gly Lys
210

<210> 114
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> May be oxidized
<400> 114
Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys
1 5

<210> 115
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> May be oxidized
<400> 115
Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg
1 5

<210> 116
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 116
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
1 5 10

<210> 117
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> May be oxidized
<400> 117
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
1 5 10 15

<210> 118
<211> 26
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> May be oxidized
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> May be carboxymethylated
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> May be carboxymethylated
<400> 118
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
1 5 10 15
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
20 25

<210> 119
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> May be oxidized
<400> 119
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
1 5 10 15

<210> 120
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 120
Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met
1 5 10

<210> 121
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 121
Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys
1 5 10

<210> 122
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 122
Asn Ser Thr Phe Val Arg
1 5

<210> 123
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> May or may not be present
<400> 123
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10

<210> 124
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> May be oxidized
<400> 124
Ile Ile Ile Trp Asp Ser Arg
1 5

Claims (21)

  1. アフリベルセプトを産生する方法であって、
    （ａ）合成培地（ＣＤＭ）を含む細胞培養培地中で培養された細胞の清澄化された回収物を産生する工程と、
    （ｂ）前記アフリベルセプトと結合又は相互作用可能なポリペプチドを含むアフィニティークロマトグラフィーカラムを使用して、前記清澄化された回収物からのアフリベルセプトを結合させる工程であって、前記ポリペプチドが、
    配列番号７３の重鎖および配列番号７４の軽鎖を含む抗体、
    配列番号７５の重鎖および配列番号７６の軽鎖を含む抗体、
    配列番号７７の重鎖および配列番号７８の軽鎖を含む抗体、ならびに
    配列番号７９の重鎖および配列番号８０の軽鎖を含む抗体
    から選択される、結合させる工程と、
    （ｃ）工程（ｂ）の前記アフリベルセプトを溶出し、アフィニティー溶出液を形成する工程と、
    任意選択で、
    （ｄ）（ｃ）の前記溶出したアフリベルセプトを第２クロマトグラフィー捕捉工程に供する工程と、
    （ｅ）フロースルー画分を収集する工程であって、前記フロースルー画分がアフリベルセプトを有する、収集する工程と
    を含む、方法。
  2. 平衡化バッファを使用して（ｂ）の前記アフィニティークロマトグラフィーカラムを平衡化する工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記平衡化バッファが、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水又はトリス塩酸である、請求項２に記載の方法。
  4. 前記平衡化バッファが８．３～８．６のｐＨを有する、請求項３に記載の方法。
  5. １つ以上のフロースルー画分を得るために、平衡化バッファを用いてカラム（ｄ）を洗浄する工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
  6. 前記平衡化バッファがダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水であり、７．０～８．６のｐＨを有する、請求項５に記載の方法。
  7. １つ以上の溶出画分を得るために、（ｂ）のカラムを溶出バッファに供する工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
  8. 前記溶出バッファが、２．５のｐＨを有する１００ｍＭのグリシンバッファを含む、請求項７に記載の方法。
  9. 前記溶出バッファのｐＨが、２．０～３．５である、請求項７に記載の方法。
  10. 中和バッファの追加により、前記溶出画分を中和する工程を更に含む、請求項７に記載の方法。
  11. 前記中和バッファがトリス塩酸である、請求項１０に記載の方法。
  12. （ｃ）における宿主細胞タンパク質の量が、前記清澄化された回収物中の宿主細胞タンパク質の量と比較して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％著しく減少する、請求項１に記載の方法。
  13. （ｄ）の前記第２捕捉クロマトグラフィーが、陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）を含む、請求項１に記載の方法。
  14. 前記方法が、平衡化バッファでＡＥＸのカラムを平衡化する工程および洗浄バッファでＡＥＸのカラムを洗浄する工程をさらに含み、前記ＡＥＸカラム用の前記平衡化バッファ及び洗浄バッファの両方の伝導度が、１．５０～３．０ｍＳ／ｃｍであり得る、請求項１３に記載の方法。
  15. （ｅ）の前記フロースルー画分からのアフリベルセプトが、２０％未満のアフリベルセプトの総酸性種を含み、酸性種が、アフリベルセプトの陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）クロマトグラムにおけるメインピークよりも早く溶出するピークに対応しており、クロマトグラムが、２０ｍＭの２－（Ｎ－モルフォリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）（ｐＨ５．７）の第１移動相、及び４０ｍＭのリン酸ナトリウム、１００ｍＭの塩化ナトリウム（ｐＨ９．０）の第２移動相を使用して生成され、クロマトグラムが２８０ｎｍでの検出を使用して生成される、請求項１３に記載の方法。
  16. アフリベルセプトを産生する方法であって、
    （ａ）アフリベルセプトを発現するように遺伝子改変された宿主細胞を提供する工程と、
    （ｂ）前記アフリベルセプトを発現する好適な条件の下で、前記宿主細胞を培養する工程と、
    （ｃ）アフリベルセプトと前記宿主細胞により産生された少なくとも１つの不純物とを含む調製物を回収する工程と、
    （ｄ）好適な条件の下で、前記調製物をアフィニティークロマトグラフィーに供する工程であって、前記アフィニティークロマトグラフィーが、前記アフリベルセプトと結合又は相互作用可能なポリペプチドを含むカラムを使用し、前記ポリペプチドが、
    配列番号７３の重鎖および配列番号７４の軽鎖を含む抗体、
    配列番号７５の重鎖および配列番号７６の軽鎖を含む抗体、
    配列番号７７の重鎖および配列番号７８の軽鎖を含む抗体、ならびに
    配列番号７９の重鎖および配列番号８０の軽鎖を含む抗体
    から選択される、供する工程と
    を含む、方法。
  17. 前記抗体が、配列番号７３の重鎖および配列番号７４の軽鎖を含む、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記抗体が、配列番号７５の重鎖および配列番号７６の軽鎖を含む、請求項１６に記載の方法。
  19. 前記抗体が、配列番号７７の重鎖および配列番号７８の軽鎖を含む、請求項１６に記載の方法。
  20. 前記抗体が、配列番号７９の重鎖および配列番号８０の軽鎖を含む、請求項１６に記載の方法。
  21. 前記方法が、（ｄ）のカラムを溶出バッファに供して１つ以上の溶出画分を得る工程をさらに含み、前記溶出画分中の宿主細胞タンパク質の量が、（ｃ）における宿主細胞タンパク質の量と比較して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％著しく減少する、請求項１６に記載の方法。
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