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JP7742353B2 - 直交法で使用する古細菌ピロリジルｔＲＮＡ合成酵素 - Google Patents

直交法で使用する古細菌ピロリジルｔＲＮＡ合成酵素

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JP7742353B2
JP7742353B2 JP2022549880A JP2022549880A JP7742353B2 JP 7742353 B2 JP7742353 B2 JP 7742353B2 JP 2022549880 A JP2022549880 A JP 2022549880A JP 2022549880 A JP2022549880 A JP 2022549880A JP 7742353 B2 JP7742353 B2 JP 7742353B2
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Europaisches Laboratorium fuer Molekularbiologie EMBL
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Description

本発明は、真核細胞の効率的な直交翻訳システムに関する。具体的には、本発明は、原核生物ｔＲＮＡ合成酵素（ｐＲＳ）をコードするポリヌクレオチド、及び、原核生物ｔＲＮＡ（ｐｔＲＮＡ）と１つ以上のリボザイムとを含むＲＮＡ分子（本明細書では「ｐｔＲＮＡ－リボザイム」と呼ぶ）を含む真核細胞；当該真核細胞によって、１つ以上の非標準アミノ酸（ｎｃＡＡ）残基を含む目的のポリペプチド（ＰＯＩ）を発現させる方法；並びに、当該方法に有用なキットに関する。さらに本発明は、ｐｔＲＮＡ－リボザイムをコードするポリヌクレオチドに関する。
遺伝暗号の拡張（ＧＣＥ）は、翻訳後修飾の部位特異的導入、又はタンパク質の構造もしくは動態を研究するための特殊な色素によるタンパク質の標識を含むタンパク質工学のための最も強力なツールの一つである。具体的には、ＧＣＥは、宿主細胞の翻訳機構に直交するｔＲＮＡ／アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ｔＲＮＡ／ＲＳ）対を用いて、特に終止コドン抑制を用いて、ｎｃＡＡ残基の直接的な遺伝子コード化によるポリペプチドの翻訳修飾を可能にする。
理想的な直交ｔＲＮＡ／ＲＳ対は、宿主の翻訳機構と交差反応を示さないため、細胞のハウスキーピング翻訳活性や正常な生理機能に与える影響を最小限に抑えることができる。様々な原核生物（細菌及び古細菌）のｔＲＮＡ／ＲＳ対は、ポリペプチド中の様々なｎｃＡＡ残基を遺伝的にコードするために使用されてきた（例えば、人工のＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ｔＲＮＡ／チロシル－ＲＳ、大腸菌ｔＲＮＡ／ロイシル－ＲＳ、並びにＭｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ及びＭ．ｂａｒｋｅｒｉ ｔＲＮＡ／ピロリジル－ＲＳ対を含む）。（例えば、非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７を参照のこと）
長年にわたり、ＧＣＥの効率を向上させるために様々な開発が行われてきた。これらには、例えば、特許文献１に記載されているように、ＲＳが（核内ではなく）細胞質内に主に局在することを可能にするように核局在シグナル（ＮＬＳ）を欠く及び／又は核搬出シグナル（ＮＥＳ）を含む古細菌ＲＳの使用が含まれる。探索されてきたＧＣＥ効率を高めるためのさらなるアプローチには、いくつか例を挙げると、プロモーター工学、直交ＲＳのより良い進化、放出因子工学、及びｔＲＮＡの多鎖化などが含まれる。（総説については、非特許文献８を参照のこと）
しかしながら、真核細胞におけるＧＣＥの効率を向上させる戦略は、依然として高い需要がある。より効率的なＧＣＥにより、細胞は、１つ以上のｎｃＡＡ残基を含むＰＯＩをより大量に発現することができる。標識及び画像化の目的に利用できるより多量のＰＯＩは、例えば、低存在量のポリペプチドが標識される場合に有利である。したがって、本発明の目的は、ＧＣＥの効率を（さらに）向上させることであった。
国際公開第２０１８／０６９４８１号
Ｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １２４：９０２６，２００２ Ｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０１：９６４，２００３ Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １３１：８７２０，２００９ Ｙａｎａｇｉｓａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ １５：１１８７，２００８ Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ８３：３７９－４０８，２０１０ Ｌｅｍｋｅ，ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ １５：１６９１－１６９４，２０１４ Ｗａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １８４４：１０５９－１７０ Ｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ８３：３７９－４０８，２０１４
本発明者らは、驚くべきことに、ｔＲＮＡをリボザイムとともに含むＲＮＡ分子として直交ｔＲＮＡを発現させ、二本鎖ＲＮＡ－（ｄｓＲＮＡ－）結合ポリペプチドを共発現させると、真核細胞内でＧＣＥが発現させるＰＯＩの量を増加させることができることを見いだした。理論に束縛されることを望まないが、ｄｓＲＮＡ結合ポリペプチドは、プロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）による真核生物開始因子２α（ｅＩＦ－２α）のαサブユニットのリン酸化を阻害し、したがって、前記ＰＫＲ活性に伴うｅＩＦ－２α活性及びタンパク質合成の障害を緩和すると想定される。
理論に束縛されることを望まないが、リボザイムは、真核細胞内で困難なｔＲＮＡのプロセシングを改善し、したがって、ＧＣＥに利用可能なプロセシングされた機能的直交ｔＲＮＡの量を増加させると、さらに想定される。プロセシングされた機能的直交ｔＲＮＡの十分な供給は、特に、直交ｔＲＮＡがｔＲＮＡプロセシング機構及び伸長因子などの細胞内の非翻訳性要素とも相互作用する可能性を考慮すると、ＧＣＥ（例えば、アンバー抑制など）に不可欠である。
したがって、第１の態様において、本発明は、以下を含む真核細胞に関する：
（ａ）原核生物アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ｐＲＳ）をコードするポリヌクレオチド、及び
（ｂ）原核生物ｔＲＮＡ（ｐｔＲＮＡ）及び１つ以上のリボザイムをコードするポリヌクレオチド。
さらなる態様において、本発明は、以下を含む真核細胞に関する：
（ａ）原核生物アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ｐＲＳ）をコードするポリヌクレオチド、
（ｂ）原核生物ｔＲＮＡ（ｐｔＲＮＡ）をコードするポリヌクレオチド、及び
（ｃ）本明細書に記載のｄｓＲＮＡに結合することができるポリペプチド（ｄｓＲＮＡ結合ポリペプチド）をコードするポリヌクレオチド。
本発明の真核細胞では、項目（ａ）のポリヌクレオチドによってコードされるｐＲＳは、ｐｔＲＮＡをアシル化することができ、特にｐｔＲＮＡを非標準アミノ酸（ｎｃＡＡ）でアシル化することができる。また項目（ｂ）のポリヌクレオチドに含まれるｐｔＲＮＡ及びリボザイムをコードする配列は、転写がｐｔＲＮＡ及びリボザイムの両方を含むＲＮＡ分子（ｐｔＲＮＡ－リボザイム）を生成するように連結している。
本発明の文脈において使用される（例えば、使用されるポリヌクレオチドによってコードされる、又は発現される）ｄｓＲＮＡ結合ポリペプチドは、配列番号３７及び５７～５９のいずれか１つに示す配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
さらなる態様において、本発明は、本明細書に記載のｐｔＲＮＡとリボザイム（ｐｔＲＮＡ－リボザイム）を含むＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドに関する。
さらなる態様において、本発明は、本明細書に記載のｐｔＲＮＡ及びリボザイム（ｐｔＲＮＡ－リボザイム）を含むＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、又は２つ以上のポリヌクレオチドの組み合わせに関し、
（ｉ）本明細書に記載されるｔｅｔＯ結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列、又は
（ｉｉ）本明細書に記載されるｐＲＳをコードするヌクレオチド配列、又は
（ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）の両方、である。
前記２つ又は３つのヌクレオチド配列は、同じポリペプチド上に位置することができる。あるいは、前記２つ又は３つのヌクレオチド配列の各々は、別々のポリヌクレオチド上に位置することができる（したがって、それぞれ、２つ又は３つのポリヌクレオチドの組み合わせが生じる）。あるいは、前記３つのヌクレオチド配列のうちの２つは同じポリヌクレオチド上に位置し、第３のヌクレオチド配列（すなわち、ｐｔＲＮＡ－リボザイムコード化配列、又はｐＲＳコード化配列、又はｔｅｔＯ結合タンパク質コード化配列）は、別のポリヌクレオチド上に位置することができる（したがって、２つのポリヌクレオチドの組み合わせが生じる）。
さらなる態様において、本発明は、そのアミノ酸配列中に１つ以上の非標準アミノ酸（ｎｃＡＡ）残基を有する目的のポリペプチド（ＰＯＩ）を調製する方法に関し、該方法は、以下の工程を包む：
（ａ）真核細胞内で、以下を発現させる工程：
－ ｐＲＳ、及び、
－ ｐｔＲＮＡと本明細書に記載のリボザイム（ｐｔＲＮＡ－リボザイム）を含むＲＮＡ分子；
（ｂ）ＰＯＩの１つ以上のｎｃＡＡ残基に対応する１つ以上のｎｃＡＡ又はその塩の存在下で、真核細胞内でＰＯＩを発現させる工程；並びに、
（ｃ）任意に、発現したＰＯＩを回収する工程。
さらなる態様において、本発明は、そのアミノ酸配列中に１つ以上の非標準アミノ酸（ｎｃＡＡ）残基を有する目的のポリペプチド（ＰＯＩ）を調製する方法に関し、該方法は、以下の工程を包む：
（ａ）真核細胞内で、以下を発現させる工程：
－ ｐＲＳ、
－ 原核生物ｔＲＮＡ（ｐｔＲＮＡ）、及び、
－ 本明細書に記載のｄｓＲＮＡに結合することができるポリペプチド（ｄｓＲＮＡ結合ポリペプチド）；並びに、
（ｂ）ＰＯＩの１つ以上のｎｃＡＡ残基に対応する１つ以上のｎｃＡＡ又はその塩の存在下で、真核細胞内でＰＯＩを発現させる工程；並びに、
（ｃ）任意に、発現したＰＯＩを回収する工程。
本発明による目的のポリペプチド（ＰＯＩ）の調製方法において、ｐＲＳは、ｎｃＡＡ又はその塩でｐｔＲＮＡをアシル化することができ、ＰＯＩは、１つ以上のｎｃＡＡ残基をコードする１つ以上のセレクタコドンを含むヌクレオチド配列によってコードされている。前記セレクタコドンは、ｐｔＲＮＡのアンチコドンの逆相補体である。
前記方法の工程（ａ）及び（ｂ）は、同時に又は順々に実施することができる。例えば、発現工程（ａ）を最初に実施し、その後、発現工程（ｂ）を実施することができる。工程（ａ）に従ってｐＲＳ及びＲＮＡ分子（それぞれｐｔＲＮＡ－リボザイム又はｐｔＲＮＡ）の発現を開始する場合、工程（ｂ）に従ってＰＯＩの発現を開始するときに前記発現を継続することができる。
さらなる態様において、本発明は、そのアミノ酸配列中に１つ以上のｎｃＡＡ残基を有するＰＯＩを調製するためのキットに関し、当該キットは、ＰＯＩの１つ以上のｎｃＡＡ残基に対応する１つ以上のｎｃＡＡ、又はその塩と、以下を含む：
（ａ）本明細書に記載の本発明のポリヌクレオチド、又は２つ以上のポリヌクレオチドの組み合わせ、又は、
（ｂ）本明細書に記載されるｄｓＲＮ結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は、
（ｃ）本明細書に記載の本発明の真核細胞。
ＧＣＥでは、直交するｔＲＮＡ／ＲＳ対の制御されていない発現により、望ましくない副作用が生じる可能性がある。例えば、未使用のＲＳ及び／又は未使用のｔＲＮＡの過剰は、細胞の生存能力を損なう可能性がある。本発明は、ＧＣＥのための真核細胞、ポリヌクレオチド、方法及びキットをさらに提供することによって、この問題を解決し、（ｉ）ｔＲＮＡ（ｐｔＲＮＡ又はｐｔＲＮＡ－リボザイム）、ｐＲＳ又はその両方をコードするヌクレオチド配列の転写がテトラサイクリン応答性プロモーターエレメント（ＴＲＥ）により制御されるか、（ｉｉ）前記ヌクレオチド配列の転写がＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ）によって触媒され、前記ＲＮＡポリメラーゼの発現がＴＲＥによって制御される。したがって、前記ｔＲＮＡ及び／又はｐＲＳの発現は、例えばテトラサイクリンリプレッサー（ｔｅｔＲ）、テトラサイクリン制御転写活性化因子（ｔＴＡ）又はリバースｔＴＡ（ｒｔＴＡ）などのＴＲＥ（内のテトラサイクリンオペレーター（ｔｅｔＯ）配列）に結合するタンパク質の同時発現、及びテトラサイクリン又はドキシサイクリンなどのテトラサイクリン誘導体の存在（又は非存在）によって誘導性になる。
図１は、（ＨＤＶ）リボザイム（「ＨＤＶ－Ｒｉｂ．」）有り及び無しの場合について、Ｔ７ＲＮＡＰ制御されたｔＲＮＡの発現のための、ｔＲＮＡ発現カセットの模式図（５’から３’方向）を示す。 図２は、ＮＬＳ－ｉＲＦＰ－Ｆｌａｇ－ＧＦＰＹ３９－＞ＴＡＧ－６Ｈｉｓアンバー抑制レポーター、Ｔ７ＲＮＡＰ及びアンバー抑制対ｔＲＮＡＰｙｌ／ＰｙｌＲＳＡＦ用発現カセットを有するＨＥＫ２９３Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析の結果を示す。ｔＲＮＡＰｙｌはＨＤＶリボザイムとともに（「ｔＲＮＡＰｙｌ－ＨＤＶ ｒｉｂ．」）又は当該リボザイムなし（「ｔＲＮＡＰｙｌ」）のいずれかで発現した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、さらにＨＡタグ付きヒトＰＫＲ（２－１７４）の発現カセットを有していた。サンプルは、細胞にｎｃＡＡ ＳＣＯが供給されなかったコントロール（下段の「－ＳＣＯ」）を含む。象限内の数字は、測定した細胞の総数を基に算出したそれぞれの集団の細胞の割合を示す：レポーター遺伝子を発現させない細胞（左下；「ＤＮ」＝ダブルネガティブ）；ＧＦＰ蛍光のみを示す細胞（右下；「ＧＦＰのみ」）；アンバー抑制なしでｉＲＦＰのみを発現させる細胞（左上；「ｉＲＦＰのみ」）；アンバー抑制によりフルレポーター発現させる細胞（右上；「ＤＰ」＝ダブルポジティブ）。実施例１参照。プラスミドｐｃＤＮＡ３．１（ＣＭＶプロモーターを含む）を用いた実験。 図３は、ＮＬＳ－ｉＲＦＰ－Ｆｌａｇ－ＧＦＰＹ３９－＞ＴＡＧ－６Ｈｉｓアンバー抑制レポーター、Ｔ７ＲＮＡＰ及びアンバー抑制対ｔＲＮＡＰｙｌ／ＰｙｌＲＳＡＦ用発現カセットを有するＨＥＫ２９３Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析の結果を示す。ｔＲＮＡＰｙｌはＨＤＶリボザイムとともに（「ｔＲＮＡＰｙｌ－ＨＤＶ ｒｉｂ．」）又は当該リボザイムなし（「ｔＲＮＡＰｙｌ」）のいずれかで発現した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、さらにＨＡタグ付きヒトＰＫＲ（２－１７４）の発現カセットを有していた。サンプルは、細胞にｎｃＡＡ ＳＣＯが供給されなかったコントロール（下段の「－ＳＣＯ」）を含む。象限内の数字は、測定した細胞の総数を基に算出したそれぞれの集団の細胞の割合を示す：レポーター遺伝子を発現させない細胞（左下；「ＤＮ」＝ダブルネガティブ）；ＧＦＰ蛍光のみを示す細胞（右下；「ＧＦＰのみ」）；アンバー抑制なしでｉＲＦＰのみを発現させる細胞（左上；「ｉＲＦＰのみ」）；アンバー抑制によりフルレポーター発現させる細胞（右上；「ＤＰ」＝ダブルポジティブ）。実施例１参照。プラスミドｐＣＡＧＧＳ（ニワトリアクチンプロモーターとイントロンを有するＣＭＶエンハンサーを含む）を用いた実験。 図４ａは、ＮＬＳ－ｉＲＦＰ－Ｆｌａｇ－ＧＦＰＹ３９－＞ＴＡＧ－６Ｈｉｓアンバー抑制レポーター、ＮＥＳ－Ｔ７ＲＮＡＰ、及びアンバー抑制対ｔＲＮＡＰｙｌ／ＮＥＳ－ＰｙｌＲＳＡＦ用発現カセットを有するＨＥＫ Ｆｌｐ－Ｉｎ Ｔ－ＲＥｘ ２９３細胞のフローサイトメトリー分析の結果を示す。ｔＲＮＡＰｙｌはＨＤＶリボザイムとともに（「ｔＲＮＡＰｙｌ－ＨＤＶ ｒｉｂ．」）又は当該リボザイムなし（「ｔＲＮＡＰｙｌ」）のいずれかで発現し、ＮＥＳ－ＰｙｌＲＳＡＦ及びＮＥＳ－Ｔ７ＲＮＡＰはＴ－ＲＥｘシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて誘導的に発現させた。細胞にｎｃＡＡ ＢＯＣを供給し（「＋Ｂｏｃ」）、ＮＥＳ－ＰｙｌＲＳＡＦ及びＮＥＳ－Ｔ７ＲＮＡＰの発現は、テトラサイクリンで誘導された（左図；「＋Ｔｅｔ」）又は誘導されなかった（コントロール；右図）のいずれかであった。象限内の数字は、測定した細胞の総数を基に算出したそれぞれの集団の細胞の割合を示す：レポーター遺伝子を発現させない細胞（左下；「ＤＮ」＝ダブルネガティブ）；ＧＦＰ蛍光のみを示す細胞（右下；「ＧＦＰのみ」）；アンバー抑制なしでｉＲＦＰのみを発現させる細胞（左上；「ｉＲＦＰのみ」）；アンバー抑制によりフルレポーター発現する細胞（右上；「ＤＰ」＝ダブルポジティブ）。実施例２参照。 図４ｂは、ＮＬＳ－ｉＲＦＰ－Ｆｌａｇ－ＧＦＰＹ３９－＞ＴＡＧ－６Ｈｉｓアンバー抑制レポーター、ＮＥＳ－Ｔ７ＲＮＡＰ、及びアンバー抑制対ｔＲＮＡＰｙｌ／ＮＥＳ－ＰｙｌＲＳＡＦ用発現カセットを有するＨＥＫ２９３Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析の結果を示す。ｔＲＮＡＰｙｌはＨＤＶリボザイムとともに（「ｔＲＮＡＰｙｌ－ＨＤＶ ｒｉｂ．」）又は当該リボザイムなし（「ｔＲＮＡＰｙｌ」）で発現し、ＮＥＳ－ＰｙｌＲＳＡＦ及びＮＥＳ－Ｔ７ＲＮＡＰはＴｅｔ－Ｏｎシステムを用いて誘導的に発現させた。細胞にｎｃＡＡ ＢＯＣを供給し（「＋Ｂｏｃ」）、ＮＥＳ－ＰｙｌＲＳＡＦ及びＮＥＳ－Ｔ７ＲＮＡＰの発現は、ドキシサイクリンで誘導された（左図；「＋Ｄｏｘ」）又は誘導されなかった（コントロール；右図）のいずれかであった。象限内の数字は、測定した細胞の総数を基に算出したそれぞれの集団の細胞の割合を示す：レポーター遺伝子を発現させない細胞（左下；「ＤＮ」＝ダブルネガティブ）；ＧＦＰ蛍光のみを示す細胞（右下；「ＧＦＰのみ」）；アンバー抑制なしでｉＲＦＰのみを発現させる細胞（左上；「ｉＲＦＰのみ」）；アンバー抑制によりフルレポーター発現させる細胞（右上；「ＤＰ」＝ダブルポジティブ）。実施例２参照。 図５ａは、下記のための発現カセットを有するＨＥＫ２９３Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析の結果を示す：ＮＬＳ－ｉＲＦＰ－Ｆｌａｇ－ＧＦＰＹ３９－＞ＴＡＧ－６Ｈｉｓアンバー抑制レポーター、ｔｅｔＲ、及びアンバー抑制対ｔＲＮＡＰｙｌ／ＮＥＳ－ＰｙｌＲＳＡＦ（ｔＲＮＡＰｙｌの発現がＵ６プロモーターの前の８個のｔｅｔＯ配列及びＵ６プロモーターの後の２個のｔｅｔＯ配列を含むヒトＵ６プロモーターのテトラサイクリン誘導性変異体により制御され、ＮＥＳ－ＰｙｌＲＳＡＦの発現が（構成型）ＣＭＶプロモーターにより制御された）。 図５ｂは、下記のための発現カセットを有するＨＥＫ２９３Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析の結果を示す：ＮＬＳ－ｉＲＦＰ－Ｆｌａｇ－ＧＦＰＹ３９－＞ＴＡＧ－６Ｈｉｓアンバー抑制レポーター、ｔｅｔＲ、及びアンバー抑制対ｔＲＮＡＰｙｌ／ＮＥＳ－ＰｙｌＲＳＡＦ（ｔＲＮＡＰｙｌの発現が２個のｔｅｔＯ配列を含むヒトＨ１プロモーターのテトラサイクリン誘導性変異体により制御され、ＮＥＳ－ＰｙｌＲＳＡＦの発現が（構成型）ＣＭＶプロモーターにより制御された）。 図５ｃは、下記のための発現カセットを有するＨＥＫ２９３Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析の結果を示す：ＮＬＳ－ｉＲＦＰ－Ｆｌａｇ－ＧＦＰＹ３９－＞ＴＡＧ－６Ｈｉｓアンバー抑制レポーター、ｔｅｔＲ、及びアンバー抑制対ｔＲＮＡＰｙｌ／ＮＥＳ－ＰｙｌＲＳＡＦ（ｔＲＮＡＰｙｌの発現がＵ６プロモーターの前の８個のｔｅｔＯ配列及びＵ６プロモーターの後の２個のｔｅｔＯ配列を含むヒトＵ６プロモーターのテトラサイクリン誘導性変異体により制御され、ＮＥＳ－ＰｙｌＲＳＡＦの発現が２個のｔｅｔＯ配列を含むＣＭＶプロモーターのテトラサイクリン誘導性変異体により制御された）。 図５ｄは、下記のための発現カセットを有するＨＥＫ２９３Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析の結果を示す：ＮＬＳ－ｉＲＦＰ－Ｆｌａｇ－ＧＦＰＹ３９－＞ＴＡＧ－６Ｈｉｓアンバー抑制レポーター、ｔｅｔＲ、２個のｔｅｔＯ配列を含むＣＭＶプロモーターのテトラサイクリン誘導性変異体の制御下で発現するＮＥＳ－Ｔ７ＲＮＡＰ及びアンバー抑制対ｔＲＮＡＰｙｌ／ＮＥＳ－ＰｙｌＲＳＡＦ（ｔＲＮＡＰｙｌは、Ｔ７プロモーターの制御下でＨＤＶリボザイムとともに発現し、ＮＥＳ－ＰｙｌＲＳＡＦの発現が２個のｔｅｔＯ配列を含むＣＭＶプロモーターのテトラサイクリン誘導性変異体により制御された）。 図５ｅは、下記のための発現カセットを有するＨＥＫ２９３Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析の結果を示す：ＮＬＳ－ｉＲＦＰ－Ｆｌａｇ－ＧＦＰＹ３９－＞ＴＡＧ－６Ｈｉｓアンバー抑制レポーター、ｔｅｔＲ、２個のｔｅｔＯ配列を含むＣＭＶプロモーターのテトラサイクリン誘導性変異体の制御下で発現するＮＥＳ－Ｔ７ＲＮＡＰ及びアンバー抑制対ｔＲＮＡＰｙｌ／ＮＥＳ－ＰｙｌＲＳＡＦ（ｔＲＮＡＰｙｌは、Ｔ７プロモーターの制御下でＨＤＶリボザイムとともに発現し、ＮＥＳ－ＰｙｌＲＳＡＦの発現が（構成型）ＣＭＶプロモーターにより制御された）。 図５ｆは、下記のための発現カセットを有するＨＥＫ２９３Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析の結果を示す：ＮＬＳ－ｉＲＦＰ－Ｆｌａｇ－ＧＦＰＹ３９－＞ＴＡＧ－６Ｈｉｓアンバー抑制レポーター、ｔｅｔＲ、ＣＭＶプロモーターの制御下で発現するＮＥＳ－Ｔ７ＲＮＡＰ及びアンバー抑制対ｔＲＮＡＰｙｌ／ＮＥＳ－ＰｙｌＲＳＡＦ（ｔＲＮＡＰｙｌは、Ｔ７プロモーターの制御下でＨＤＶリボザイムとともに発現し、ＮＥＳ－ＰｙｌＲＳＡＦの発現が２個のｔｅｔＯ配列を含むＣＭＶプロモーターのテトラサイクリン誘導性変異体により制御された）。 さらにＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、ＨＡタグ付きヒトＰＫＲ（２－１７４）のための発現カセット（「＋ＰＫＲ（２－１７４）」；図５ａ～ｆのそれぞれの下段のヒストグラム）を有するか、又は前記発現カセットを欠いていた（＝コントロール；図５ａ～ｆのそれぞれの上段のヒストグラム）。この細胞に、ｎｃＡＡ ＢＯＣを供給したか（「Ｂｏｃ」；図５ａ～ｆのそれぞれの左右の列のヒストグラム）又は供給しなかった（中央の列のヒストグラム）、及び、誘導性エレメント（ｔＲＮＡＰｙｌ、ＮＥＳ－ＰｙｌＲＳＡＦ及び／又はＮＥＳ－Ｔ７ＲＮＡＰ）の発現は、テトラサイクリンで誘導された（「Ｔｅｔ」；図５ａ～ｆのそれぞれの左と中央の列のヒストグラム）又は誘導されなかった（右列のヒストグラム）。象限内の数字は、測定した細胞の総数を基に算出したそれぞれの集団の細胞の割合を示す：レポーター遺伝子を発現させない細胞（左下；「ＤＮ」＝ダブルネガティブ）；ＧＦＰ蛍光のみを示す細胞（右下；「ＧＦＰのみ」）；アンバー抑制なしでｉＲＦＰのみを発現させる細胞（左上；「ｉＲＦＰのみ」）；アンバー抑制によりフルレポーター発現させる細胞（右上；「ＤＰ」＝ダブルポジティブ）。実施例３参照。
［発明の詳細な説明］
特に明記しない限り、又は文脈上必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとする。したがって、例えば、「ｐＲＳをコードするポリヌクレオチド」を含むと定義される真核細胞には、１つ以上の当該ポリヌクレオチドを含む真核細胞、並びに、単数又は複数の前記ポリヌクレオチドが１つ以上のｐＲＳをコードする真核細胞が含まれる。
特に明記しない限り、ヌクレオチド配列は本明細書中に５’から３’方向で示される。特に明記しない限り、アミノ酸配列は本明細書中にＮ末端からＣ末端の方向で示される。
１．原核生物アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素／原核生物ｔＲＮＡ（ｐＲＳ／ｐｔＲＮＡ）
本発明の真核細胞は、原核生物ＲＳ／ｔＲＮＡ（ｐＲＳ／ｐｔＲＮＡ）対をコードするポリヌクレオチドを含む（ｐＲＳはｐｔＲＮＡをアシル化することができる）。特に、ｐＲＳは、アミノ酸又はアミノ酸類似体（例えば、α－アミノ基がヒドロキシル基で置換され、及び／又はカルボン酸官能基がエステルを形成することで、アミノ酸と異なる化合物）、好ましくは非標準アミノ酸（ｎｃＡＡ）でｔＲＮＡをアシル化することができる。
本発明の文脈で使用されるｐｔＲＮＡ及びｐＲＳは、前記ｐｔＲＮＡ及びｐＲＳを発現させる真核生物（宿主）細胞（組換え）の翻訳機構に直交する。本明細書で使用される「直交」という用語は、この特定の分子（例えば、直交ｔＲＮＡ（Ｏ－ｔＲＮＡ）及び／又は直交ＲＳ（Ｏ－ＲＳ））が、目的の翻訳システム（例えば、宿主細胞）によって、低下した効率で使用されることを示す。
「翻訳システム」という用語は、一般に、成長するポリペプチド鎖（タンパク質）に天然に存在するアミノ酸を組み込むために必要な一連の構成要素を指す。翻訳システムの構成要素には、例えば、リボソーム、ｔＲＮＡ、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素、ｍＲＮＡなどが含まれる。本発明の文脈で使用される翻訳システムは、好ましくは真核細胞である。
具体的には、「直交」とは、Ｏ－ｔＲＮＡ又はＯ－ＲＳが、目的の翻訳システムの内因性ＲＳ又は内因性ｔＲＮＡをそれぞれ用いて機能できないこと又は効率が低下すること（例えば、２０％未満の効率、１０％未満の効率、５％未満の効率、又は１％未満の効率等）をいう（前記直交ＲＳ又は直交ｔＲＮＡが使用される）。例えば、目的の翻訳システムにおけるＯ－ｔＲＮＡは、内因性ＲＳによる内因性ｔＲＮＡの（アミノ）アシル化と比較した場合、翻訳システムの任意の内因性ＲＳによって、低下した又はゼロにさえなる効率で（アミノ）アシル化される。例えば、Ｏ－ＲＳは、内因性ＲＳによる内因性ｔＲＮＡの（アミノ）アシル化と比較した場合、低下した又はゼロにさえなる効率で、目的の翻訳システム内の任意の内因性ｔＲＮＡを（アミノ）アシル化する。本明細書で使用される「直交翻訳システム」は、成長するポリペプチド鎖にｎｃＡＡ残基を導入することができるＲＳ／Ｏ－ｔＲＮＡｎｃＡＡ対を用いた翻訳システムをいう。
別段の指示がない限り、本明細書で使用される「内因性ｔＲＮＡ」及び「内因性アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素」（「内因性ＲＳ」）という用語は、それぞれ本発明の状況で使用されるｐＲＳとｐｔＲＮＡを導入する前に最終的に翻訳システムとして使用される細胞に存在するｔＲＮＡ及びＲＳをそれぞれ意味する。
本発明の方法及び／又は融合タンパク質で使用されるｐｔＲＮＡ及びｐＲＳは、天然に存在することができ（すなわち、自然界の原核生物に見られるｐｔＲＮＡ及びｐＲＳである）又は天然に存在するｐｔＲＮＡ又はｐＲＳの変異によってそれぞれ誘導されうる。様々な実施形態において、ｐｔＲＮＡ及びｐＲＳは、原核生物、例えば、真正細菌又は古細菌から誘導される（例えば、大腸菌；Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉなどのＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ種；Ｍ．ｍａｚｅｉ、Ｍ．ｂａｒｋｅｒｉ、Ｍ．ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｍ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅなどのＭｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ種；Ｍ．ｂｕｒｔｏｎｉｉなどのＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ種；Ｄ．ｈａｆｎｉｅｎｓｅなどのＤｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種）。別の実施形態では、ｐｔＲＮＡは、第１の原核生物由来の天然に存在するｐｔＲＮＡ又は天然に存在するｐｔＲＮＡの変異体であり、ＲＳは、第２の原核生物由来の天然に存在するｐＲＳ又は天然に存在するｐＲＳの変異体から誘導される。
適切な（直交する）ｐｔＲＮＡ／ｐＲＳ対は、例えばライブラリスクリーニングの結果に基づいて、変異ｐｔＲＮＡ及びｐＲＳのライブラリから選択することができる。ｔＲＮＡ／ＲＳ対を進化させる方法は、例えば、ＷＯ ０２／０８５９２３及びＷＯ ０２／０６０７５に記載されている。
いくつかの原核生物のＲＳ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡ合成酵素、大腸菌チロシルｔＲＮＡ合成酵素、大腸菌ロイシルｔＲＮＡ合成酵素、及び、特定のＭｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ種（Ｍ．ｍａｚｅｉ，Ｍ．ｂａｒｋｅｒｉ，Ｍ．ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ，Ｍ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ等）、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ種（Ｍ．ｂｕｒｔｏｎｉｉ等）、Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種（Ｄ．ｈａｆｎｉｅｎｓｅ等）又はＭｅｔｈａｎｏｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ種（Ｍ．ａｌｖｕｓ等）由来のピロリジルｔＲＮＡ合成酵素が挙げられる）は、遺伝暗号の拡張に使用されてきた。
対応する直交ｐＲＳ／ｐｔＲＮＡ対は、ポリペプチドの様々な機能性を遺伝的にコードするために使用されている（Ｃｈｉｎ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２０１４，８３：３７９－４０８；Ｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ ２００１，１２４：９０２６；Ｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００３，３０１：９６４；Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ ２００９，１３１：８７２０；Ｗｉｌｌｉｓ ａｎｄ Ｃｈｉｎ，Ｎａｔ Ｃｈｅｍ ２０１８，１０：８３１－８３７）；Ｙａｎａｇｉｓａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ２００８，１５：１１８７）。このようなｐＲＳ及びｐｔＲＮＡは、本発明において使用することができる。
本発明の文脈においてｐＲＳとして使用することができるピロリジルｔＲＮＡ合成酵素（ＰｙｌＲＳ）は、野生型ＰｙｌＲＳ、又は、遺伝子操作されたＰｙｌＲＳとすることができる。野生型ＰｙｌＲＳの例としては、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｉｚｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｂａｒｋｅｒｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ ｂｕｒｔｏｎｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ ａｌｖｕｓ及びＤｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｆｎｉｅｎｓｅなどの古細菌及び真正細菌由来のＰｙｌＲＳが挙げられるが、これらには限定されない。遺伝子操作されたＰｙｌＲＳは、例えば、Ｎｅｕｍａｎｎら（Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ２００８，４：２３２）、Ｙａｎａｇｉｓａｗａら（Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ２００８，１５：１１８７）、及びＥＰ２１９２１８５Ａ１において記載されている。
ＰｙｌＲＳを用いた遺伝暗号の拡張の効率は、ＰｙｌＲＳのアミノ酸配列を核に向かわないように改変することで向上させることができる。この目的のために、核局在化シグナル（ＮＬＳ）は、ＰｙｌＲＳから除去することができ、又は適切な核搬出シグナル（ＮＥＳ）を導入することによって無効にすることができる。したがって、本発明の特定の実施形態では、ｐＲＳは、本明細書に記載されるＰｙｌＲＳ、又は機能的断片若しくは変異体であり、ＮＬＳを欠き、及び／又はＮＥＳを含む（例えばＷＯ２０１８／０６９４８１に記載される）。例えば、当該ＰｙｌＲＳはＮＥＳを有することができ、好ましくは、ｐＲＳの（メチオニン残基の）アミノ酸の１位と、ｐＲＳのアミノ酸の２位の間に挿入される。
用語「核外搬出シグナル」（「ＮＥＳ」と略される）は、それを含むポリペプチド（本発明のＮＥＳ含有ｐＲＳ又は本明細書で使用されるＮＥＳ－Ｔ７ＲＮＡＰ等）が真核細胞の核から搬出されるように指示できるアミノ酸配列を意味する。前記搬出は、大部分がＣｒｍ１（染色体領域維持１；カリオフェリンエクスポーチン１としても知られる）によって媒介されると考えられている。ＮＥＳは当技術分野において公知である。
例えば、データベースＶａｌｉｄＮＥＳ（ｈｔｔｐ：／／ｖａｌｉｄｎｅｓｓ．ｙｍ．ｅｄｕ．ｔｗ／）は、実験的に検証されたＮＥＳ含有タンパク質の配列情報を提供する。さらに、例えばＮＥＳｂａｓｅ１．０（ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｄａｔａｂａｓｅｄ／ＮＥＳｂａｓｅ－１．０／；Ｌｅ Ｃｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３１（１），２００３参照）等のＮＥＳデータベースや、ＮＥＳ予測のためのツール、例えばＮｅｔＮＥＳ（ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＮＥＳ／；Ｌａ Ｃｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ １７（６）：５２７－５３６，２００４参照）、ＮＥＳｐｒｅｄｉｃｔｏｒ（ＮｅｔＮＥＳ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／；Ｆｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４１：Ｄ３３８－Ｄ３４３，２０１３；Ｌａ Ｃｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ １７（６）：５２７－５３６，２００４参照）及びＮＥＳｓｅｎｔｉａｌ（ＶａｌｉｄＮＥＳと組み合わせたウェブインターフェース）が一般に向けて利用可能である。
疎水性のロイシンに富むＮＥＳが最も一般的であり、現在までに最も特徴がわかっているＮＥＳのグループを示す。疎水性ロイシンに富むＮＥＳは、３又は４個の疎水性残基を有する非保存的モチーフである。これらのＮＥＳの多くは、保存されたアミノ酸配列パターンＬｘｘＬｘＬ（配列番号２８）又はＬｘｘｘＬｘＬ（配列番号２９）を含む。なお、各Ｌはロイシン、イソロイシン、バリン、フェニルアラニン及びメチオニンのアミノ酸残基から独立して選択される。また各ｘは、任意のアミノ酸から独立して選択される（Ｌａ Ｃｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ １７（６）：５２７－５３６，２００４参照）。
本発明で使用されるｐＲＳ（特にＰｙｌＲＳ）のシグナルペプチドとして好適な特定のＮＥＳは、当技術分野で知られており（例えば、ＮＥＳデータベースから）、ＷＯ２０１８／０６９４８１等に記載されている。
特定の実施形態では、本発明で使用されるｐＲＳは、疎水性ロイシンに富むＮＥＳ、特にアミノ酸配列ＬｘｘＬｘＬ（配列番号２８）又はＬｘｘｘＬｘＬ（配列番号２９）を含むＮＥＳを含む。なお、各Ｌは独立してロイシン、イソロイシン、バリン、フェニルアラニン及びメチオニンから選択される。また各ｘは独立して任意のアミノ酸から選択される。より具体的には、ＮＥＳは、Ｌ１ｘｘＬ２ｘｘＬ１ｘＬ３（配列番号３０）、Ｌ１ｘｘｘＬ２ｘｘＬ１ｘＬ３（配列番号３１）、Ｌ１ｘｘＬ２ｘｘｘＬ１ｘＬ３（配列番号３２）及びＬ１ｘｘｘＬ２ｘｘｘＬ１ｘＬ３（配列番号３３）から選択されるアミノ酸配列を含む。なお、Ｌ１はロイシンであり、Ｌ２はロイシン、イソロイシン、バリン、フェニルアラニン及びメチオニンから選択され、Ｌ３はロイシン及びイソロイシンから選択される。また各ｘは独立して任意のアミノ酸から選択される。好ましくは、ＮＥＳは、ＨＩＶ－１ Ｒｅｖタンパク質に見られるアミノ酸配列ＬＰＰＬＥＲＬＴＬ（配列番号３４）を含み、又はより好ましくはアミノ酸配列ＡＣＰＶＰＬＱＬＰＰＬＥＲＬＴＬＤ（配列番号３５）を含む。
「核局在化シグナル」（「ＮＬＳ」と略され、当技術分野では「核局在化配列」とも呼ばれる）は、それを含むポリペプチド（例えば、ＮＬＳ－ｉＲＦＰ－Ｆｌａｇ－ＧＦＰＹ３９－＞ＴＡＧ－６Ｈｉｓ）を真核細胞の核に取り込むように「タグ」する（すなわち、指示できる）アミノ酸配列である。
前記輸送は、核膜孔を通って移動する複合体を形成するための、ＮＬＳ含有ポリペプチドのインポーチン（カリオフェリンとしても知られる）への結合によって媒介されると考えられている。ＮＬＳは当技術分野で公知である。
多数のＮＬＳデータベース及びＮＬＳ予測のためのツールが一般に向けて利用可能である。例えば、ＮＬＳｄｂ（Ｎａｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３１（１），２００３参照），ｃＮＬＳ Ｍａｐｐｅｒ（ｗｗｗ．ｎｌｓ－ｍａｐｐｅｒ．ａｉｂ．ｋｅｉｏ．ａｃ．ｊｐ；Ｋｏｓｕｇｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１０６（２５）：１０１７１－１０１７６，２００９；Ｋｏｓｕｇｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８４（１）：４７８－４８５，２００９参照），ＳｅｑＮＬＳ（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ８（１０）：ｅ７６８６４，２０１３参照）及びＮｕｃＰｒｅｄ（ｗｗｗ．ｓｂｃ．ｓｕ．ｓｅ／～ｍａｃｃａｌｌｒ／ｎｕｃｐｒｅｄ／；Ｂｒａｎｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２３（９）：１１５９－６０，２００７参照）である。
古典的なＮＬＳは、単節型（ｍｏｎｏｐａｒｔｉｔｅ）と双節型（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ）とすることができる。双節型ＮＬＳは、２つの塩基性アミノ酸クラスターと、前記クラスターを連結する約１０アミノ酸のスペーサーからなる。単節型ＮＬＳに含まれる典型的なコア配列は、ＫＸ１Ｘ２Ｘ３（配列番号：２０）である。なお、Ｘ１及びＸ３は独立してＫ及びＲから選択され、Ｘ２は任意のアミノ酸である。例示的なＮＬＳは、アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号：２１）を含むＮＬＳを含む。
本発明の文脈で使用することができる特定のｐＲＳの例には以下が含まれるが、これらに限定はされない：
－ Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ チロシルｔＲＮＡ合成酵素；
－ 大腸菌チロシルｔＲＮＡ合成酵素；
－ 大腸菌ロイシルｔＲＮＡ合成酵素；
－ Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ ピロリジルｔＲＮＡ合成酵素；
－ Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｂａｒｋｅｒｉ ピロリジルｔＲＮＡ合成酵素；
－ Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ ピロリジルｔＲＮＡ合成酵素；
－ Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ ピロリジルｔＲＮＡ合成酵素；
－ Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ ｂｕｒｔｏｎｉｉ ピロリジルｔＲＮＡ合成酵素；
－ Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｆｎｉｅｎｓｅ ピロリジルｔＲＮＡ合成酵素；
－ Ｍｅｔｈａｎｏｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ ａｌｖｕｓ ピロリジルｔＲＮＡ合成酵素；
並びに、これらのポリペプチドの機能的（すなわち、酵素的活性）断片及び変異体。
前記機能的断片及び変異体は、それらが由来するアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素に対して、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を含むことができる。
Ｍ．ｍａｚｅｉ ＰｙｌＲＳである本発明において有用なｐＲＳの特定の例として以下が挙げられるが、これらには限定されない：
－ ＰｙｌＲＳＡＦ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ ピロリジルｔＲＮＡ合成酵素二重変異体：Ｙ３０６Ａ、Ｙ３８４Ｆ；ユニプロット：Ｑ８ＰＷＹ１；配列番号２２）；
－ ＰｙｌＲＳＡＡ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ ピロリジルｔＲＮＡ合成酵素二重変異体：Ｎ３４６Ａ、Ｃ３４８Ａ；ユニプロット：Ｑ８ＰＷＹ１；配列番号２３）；
－ ＰｙｌＲＳＡＡＡＦ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉピロリジルｔＲＮＡ合成酵素四重変異体：Ｙ３０６Ａ、Ｎ３４６Ａ、Ｃ３４８Ａ、Ｙ３８４Ｆ；ユニプロット：Ｑ８ＰＷＹ１；配列番号２４）；
並びに、これらのポリペプチド断片の機能的（すなわち、酵素的活性）断片及び変異体。
前記機能的断片及び変異体は、それらが由来するＰｙｌＲＳに対して、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を含むことができる。
特定の実施形態によれば、本明細書に記載の野生型及び変異型Ｍ．ｍａｚｅｉ ＰｙｌＲＳは、ＷＯ２０１２／１０４４２２又はＷＯ２０１５／１０７０６４に記載のｎｃＡＡによるｔＲＮＡのアミノアシル化に使用される。この目的のための典型的なｎｃＡＡとしては以下が挙げられるが、これらには限定されない：２－アミノ－６－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノ）ヘキサン酸（ＢＯＣ）；２－アミノ－６－（シクロオクタ－２－イン－１－イルオキシカルボニルアミノ）ヘキサン酸（ＳＣＯ）；２－アミノ－６－（シクロオクタ－２－イン－１－イルオキシエトキシカルボニルアミノ）ヘキサノイド酸；２－アミノ－６［（４Ｅ－シクロオクタ－４－エン－１－イル）オキシカルボニルアミノ］ヘキサン酸（ＴＣＯ）；２－アミノ－６［（２Ｅ－シクロオクタ－２－エン－１－イル）オキシカルボニルアミノ］ヘキサン酸（ＴＣＯ＊）；２－アミノ－６－（プロパ－２－イノキシカルボニルアミノ）ヘキサン酸（ＰｒＫ）；
２－アミノ－６－（９－ビオシクロ［６．１．０］ノナ－４－イニルメトキシカルボニルアミノ）ヘキサノイド酸（ＢＣＮ）；及び、特にこれらのアミノ酸の２Ｓ－（Ｌ－）エナンチオマー。
本明細書に記載されるｐＲＳの機能的断片及び変異体は、親ｐＲＳのアシル化酵素活性を有する点で機能的であり、断片又は変異体の前記酵素活性の程度は、親ｐＲＳのそれよりも高くても低くてもよく、又はほぼ同じであってもよい。当該断片及び変異体は、本明細書に記載されるように、配列同一性の最小の程度によって特徴付けることができる。
本明細書で使用されるアミノ酸又はヌクレオチド配列の同一性は、それぞれ、このように特徴付けられたアミノ酸又はヌクレオチド配列の全長にわたる同一性を意味する。パーセンテージの同一性の値は、ＢＬＡＳＴアラインメント、ｂｌａｓｔｐアルゴリズム（タンパク質－タンパク質ＢＬＡＳＴ）に基づいて、又はＣｌｕｓｔａｌ法を使用して、当技術分野で知られているように決定することができる（Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔ Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．１９８９，５（２）：１５１－１）。
本発明において有用な特定のｐＲＳの機能的断片及び変異体は、例えば保存的アミノ酸置換、すなわちアミノ酸残基を、当技術分野で知られている類似の生化学的特性（例えば電荷、疎水性、及びサイズ）を有する異なるアミノ酸残基で置換することで得ることができる。典型的な例は、ＬｅｕのＩｌｅによる置換又はその逆、ＡｓｐのＧｌｕによる置換又はその逆、ＡｓｎのＧｌｎによる置換又はその逆などである。
本発明の文脈で使用できるｐｔＲＮＡには、Ｍ．ｍａｚｅｉのピロリジルｔＲＮＡ及びその機能的変異体が含まれるが、これらには限定されない。好適には、ｐｔＲＮＡのアンチコドンは、例えば、アンバー終止コドンＴＡＧに対するＣＵＡアンチコドン、オパール終止コドンＴＧＡに対するＵＣＡアンチコドン、又はオーカー終止コドンＴＡＡに対するＵＵＡアンチコドンなどのセレクタコドンに対するアンチコドンである。このピロリジルｔＲＮＡの例としては、これには限定されないが、配列番号２５（ｔＲＮＡＰｙｌ，ＣＵＡ）、配列番号２６（ｔＲＮＡＰｙｌ，ＵＣＡ）又は配列番号２７（ｔＲＮＡＰｙｌ，ＵＵＡ）のヌクレオチド配列によりコードされるものである。
本発明の文脈で用いられるｐｔＲＮＡは、所定の翻訳システム（例えば、本発明の真核細胞）においてメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の読み取りを変化させるサプレッサーｔＲＮＡとして作用することができる。サプレッサーｔＲＮＡは、例えば、終止コドン、４塩基コドン、又は希少コドンを介して読み取ることができる。
本発明で用いられるＯ－ＲＳ／Ｏ－ｔＲＮＡ（ｐＲＳ／ｐｔＲＮＡ）対は、好ましくは以下の性質を有する：Ｏ－ｔＲＮＡがＯ－ＲＳによって優先的に（ｎｃＡＡで）アシル化される。さらに、直交対は（ｎｃＡＡでアシル化された）Ｏ－ｔＲＮＡが、ＰＯＩの成長するポリペプチド鎖に前記アミノ酸又はｎｃＡＡ残基を組み込むために使用されるように、目的の翻訳システム（例えば、本発明の真核細胞）で機能する。組み入れは部位特異的に行われる。具体的には、Ｏ－ｔＲＮＡは、ＰＯＩをコードするｍＲＮＡ中のセレクタコドン（例えば、Ａｍｂｅｒ、Ｏｃｈｒｅ又はＯｐａｌ終止コドン）を認識する（そのアンチコドンを介して特異的に結合する）。
「優先的にアシル化する」という用語は、目的の翻訳システムの内因性ｔＲＮＡ又はアミノ酸と比較して、Ｏ－ＲＳがＯ－ｔＲＮＡをｎｃＡＡでアシル化する効率が、例えば、約５０％の効率、約７０％の効率、約７５％の効率、約８５％の効率、約９０％の効率、約９５％の効率、又は約９９％以上の効率であることをいう。ｎｃＡＡ残基は次に、例えば、所定のセレクタコドンに対して約７５％超の効率、所定のセレクタコドンに対して約８０％超の効率、所定のセレクタコドンに対して約９０％超の効率、所定のセレクタコドンに対して約９５％超の効率、又は所定のセレクタコドンに対して約９９％超の効率で、高い適合度で成長するポリペプチド鎖に取り込まれる。
２．リボザイムとｐｔＲＮＡ－リボザイム
本発明の一態様では、ｐｔＲＮＡは、ｐｔＲＮＡ配列と１つ以上のリボザイム（ｐｔＲＮＡ－リボザイム）を含むＲＮＡ分子の形態で発現する。
本明細書で使用する「リボザイム」という用語は、部位特異的な自己切断が可能なＲＮＡ分子、又はその一部を意味する。具体的には、リボザイムは、（同じ）リボザイムのリボヌクレオチド配列内の２つのリボヌクレオチド間のホスホジエステル結合の部位特異的切断を触媒することができる。
リボザイムは、当技術分野で周知である。本発明のｐｔＲＮＡ－リボザイムに使用できるリボザイムの例としては、これには限定されないが、ハンマーヘッドリボザイム（例えば、配列番号４のハンマーヘッドリボザイム）、ヘアピンリボザイム（例えば、配列番号５のヘアピンリボザイム）、Ｖａｒｋｕｄ ｓａｔｅｌｌｉｔｅ（ＶＳ）リボザイム（例えば、配列番号６のＶＳリボザイム）、グルコサミン－６－リン酸合成酵素（ｇｌｍＳ）リボスイッチ（例えば、配列番号７のｇｌｍＳリボスイッチ）及び肝炎デルタウイルス（ＨＤＶ）リボザイム（例えば、配列番号１、２又は３のＨＤＶリボザイム）を挙げることができる。
これらのリボザイムに関する情報は、例えば、Ｆｅｒｒｅ－Ｄ’Ａｍａｒｅら（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ Ｂｉｏｌ ２０１０，２：ａ００３５７４）、Ｃｏｃｈｒａｎｅら（Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ２００７，１４（１）：９７－１０５）及びＳｃｈｕｅｒｅｒら（Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２００２，３０（１２）：ｅ５６）で見出すことができる。本発明の好ましい実施形態では、リボザイムは、配列番号１のＨＤＶリボザイムである。
本発明で用いられるｐｔＲＮＡとリボザイムを含むＲＮＡは、ＲＮＡのリボザイム触媒による部位特異的（自己）切断により、ｐｔＲＮＡの５’末端及び／又は３’末端を遊離するようにｐｔＲＮＡに対して位置する１つ以上のリボザイムを含む。したがって、前記リボザイム触媒による（自己）切断により、ｐｔＲＮＡ配列を含むＲＮＡ分子が得られる。なお、ｐｔＲＮＡ配列の５’末端及び／又は３’末端は、それぞれ前記ＲＮＡ分子の５’末端又は３’末端に一致する。
特定の実施形態では、ｐｔＲＮＡとリボザイムを含むＲＮＡのリボザイム触媒による（自己）切断により、ｐｔＲＮＡからなるＲＮＡ分子が得られる。好ましい実施形態では、リボザイムは、ＨＤＶリボザイム、特に配列番号１のＨＤＶリボザイムであり、連続したｐｔＲＮＡ－リボザイム融合を形成するように、ｐｔＲＮＡの３’末端に直接（すなわち、間にリボヌクレオチドなしで）共有結合（融合）している。
３．ｐｔＲＮＡ及び／又はｐＲＳの誘導性発現及び構成的発現
さらなる態様として、本発明は、ｐｔＲＮＡ（もしくはｐｔＲＮＡ－リボザイム）もしくはｐＲＳ又はその両方の発現が（構成的とは対照的に）誘導性である、本明細書に記載の真核細胞、ＰＯＩを調製する方法及び関連する主題を提供する。具体的には、前記誘導性は、ｐＲＳもしくはｐｔＲＮＡ／ｐｔＲＮＡ－リボザイム又はその両方をコードするヌクレオチド配列の転写が、テトラサイクリン応答性プロモーターエレメントによって（直接）制御されるか、その転写がＲＮＡポリメラーゼによって触媒される（前記ＲＮＡポリメラーゼの発現は、テトラサイクリン応答性プロモーターエレメントによって制御されている）という点で達成されている。
ＴＲＥ制御転写に適したシステムは当技術分野で周知であり、誘導性遺伝子発現のための標準的なツールとなっている。例えば、Ｇｏｓｓｅｎ ａｎｄ Ｂｕｊａｒｄ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９９２，８９（１２）：５５４７－５５５１；Ｙａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１９９８，９（１３）：１９３９－１９５０；Ｄａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，２０１６，１６（３）：１５６－１６７を参照のこと。
用語「テトラサイクリン応答性プロモーターエレメント」（「テトラサイクリン応答性エレメント」又は「ＴＲＥ」と略記）は、１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７以上、例えば２又は７）のテトラサイクリンオペレーター（ｔｅｔＯ）配列を含むプロモーター配列のことをいう。ｔｅｔＯは、例えば、テトラサイクリンリプレッサー（ｔｅｔＲ）、テトラサイクリン制御転写活性化因子（ｔＴＡ）又はリバースｔＴＡ（ｒｔＴＡ）タンパク質などのｔｅｔＯ結合タンパク質に結合することができる配列番号８の配列又はその機能的変異体を有するポリヌクレオチドセグメントである。ＴＲＥは、配列番号９に示す最小限のＣＭＶプロモーター配列の少なくとも一部をさらに含むことができる。
本発明の文脈では、ＴＲＥ制御配列の転写は、特に、本明細書に記載のＲＮＡ分子（ｐｔＲＮＡ又はｐｔＲＮＡ－リボザイム）の転写合成、ｐＲＳコード化配列の転写、又は本明細書に記載のｐｔＲＮＡ又はｐｔＲＮＡ－リボザイムの転写合成を触媒するＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７Ｒ ＮＡポリメラーゼ）の転写合成である。
ｐＲＳ、ｐｔＲＮＡ／ｐｔＲＮＡ－リボザイム及びＴ７ＲＮＡＰの１つ以上の発現が本明細書に記載のＴＲＥによって制御される本発明の真核細胞は、好適には、本明細書に記載のテトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体のそれぞれの存在又は不在下で、前記ＴＲＥ制御されたコード化配列を発現誘導できるよう、本明細書に記載のｔｅｔＯ結合タンパク質（ｔｅｔＲ、ｒｔＴＡ又はｔＴＡ）をコードするポリヌクレオチドをさらに含む。
本発明の文脈で使用できるＴＲＥの特定の例には、配列番号１０～１２のいずれか１つの配列を含む（又は有する）ＴＲＥが含まれる。配列番号１０又は配列番号１１の配列を含む（又は有する）ＴＲＥは、ｔＴＡと同様に、ｒｔＴＡと組み合わせて有用である。配列番号１２の配列を含む（又は有する）ＴＲＥは、ｔｅｔＲと組み合わせると特に有用である。
ｔｅｔＯ結合タンパク質と、本明細書に記載のＲＮＡ分子（ｐｔＲＮＡ又はｐｔＲＮＡ－リボザイム）、ｐＲＳ－ｍＲＮＡ、及び／又はＲＮＡポリメラーゼｍＲＮＡの転写合成を制御するために選択されたＴＲＥは、したがって、好適には、誘導的転写制御が可能となるように互いに一致（結合）するように選択される。
ｒｔＴＡ及びｔＴＡは、例えば、Ｄａｓら（Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０１６，１６：１５６－１６７）及びそこに引用される文献から、当技術分野において一般的に知られている。例示的なｒｔＴＡタンパク質は、Ｄａｓら（ｓｕｐｒａ）の図２Ｂに記載されたものから選択することができる。
ｒｔＴＡは、テトラサイクリン又はテトラサイクリン類似体の存在下（特にドキシサイクリンの存在下）でｔｅｔＯ配列に結合する第１ポリペプチドを含む融合タンパク質である。前記第１ポリペプチドは、真核細胞内で転写を活性化する第２ポリペプチドに（作動的に）連結している。
第１ポリペプチドは、好ましくは、例えば、Ｄａｓら（ｓｕｐｒａ）の図２に示されるｒｔＴＡのリストから選択される２０７ａａ ＴｅｔＲの変異体である。第２ポリペプチドは、好ましくは、単純ヘルペスウイルスＶＰ１６タンパク質の１２７ａａ転写活性化ドメインである。第１及び第２のポリペプチドは、好ましくは、配列番号１４の配列及びその機能的等価物を含む融合タンパク質等の融合タンパク質を形成するように共有結合している。
ｒｔＴＡは、ドキシサイクリン又はその機能的類似体の存在下で、ＴＲＥ（のｔｅｔＯ配列）に結合する。ｒｔＴＡの前記結合は、ＲＮＡポリメラーゼの結合を促進又は増強し、それによってＴＲＥ制御配列の転写を促進する。このいわゆる「Ｔｅｔ－Ｏｎ」システムでは、ＴＲＥ制御配列の転写は、このように、ドキシサイクリン又はその機能的類似体を加えることによって、ｒｔＴＡの存在下で誘導される。したがって、ｐＲＳ、ｐｔＲＮＡ／ｐｔＲＮＡ－リボザイム及びＴ７ＲＮＡＰの１つ以上の転写（したがって発現）が、このＴｅｔ－Ｏｎシステムによって制御される、本発明の方法は、好適には、以下の工程をさらに含む：
－ 真核細胞内でｒｔＴＡを発現させる工程；及び、
－ 前記細胞をドキシサイクリン又はその機能的類似体と接触させる（それにより、ＴＲＥ制御配列の転写を誘導する）工程。
ｒｔＴＡは、少なくともＴＲＥ制御配列の発現と同時に（すなわち、ＴＲＥ制御配列の発現の前に、及び／又は同時に）細胞内で発現する。
ｔＴＡは、テトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体の非存在下でｔｅｔＯ配列に結合する第１ポリペプチドを含む融合タンパク質である。前記第１ポリペプチドは、真核細胞内で転写を活性化する第２ポリペプチドに（作動的に）連結している。第１ポリペプチドは、好ましくは、２０７ａａ ＴｅｔＲ又はその機能的誘導体である。第２ポリペプチドは、好ましくは、単純ヘルペスウイルスＶＰ１６タンパク質の１２７ａａ転写活性化ドメインである。第１及び第２ポリペプチドは、好ましくは、融合タンパク質を形成するように共有結合している。
ｔＴＡは、テトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体の非存在下（又は低濃度下）で、ＴＲＥ（のｔｅｔＯ配列）に結合する。前記ｔＴＡの結合は、ＲＮＡポリメラーゼの結合を促進又は増強し、それによってＴＲＥ制御配列の転写を促進する。このいわゆる「Ｔｅｔ－Ｏｆｆ」システムでは、ＴＲＥ制御配列の転写は、このように、以前に存在したテトラサイクリン、ドキシサイクリン、又はそれらの機能的類似体を除去（又は濃度を低下）することによって、ｔＴＡの存在下で誘導される。したがって、ｐＲＳ、ｐｔＲＮＡ／ｐｔＲＮＡ－リボザイム及びＴ７ＲＮＡＰの１つ以上の転写（したがって発現）が、このＴｅｔ－Ｏｆｆシステムによって制御される本発明の方法は、好適には、以下の工程をさらに含む：
－ 真核細胞内でｔＴＡを発現させる工程；及び、
－ ＴＲＥ制御配列の発現前の前記細胞と、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、又はそれらの機能的類似体との接触を保ち（それによってｔＴＡのＴＲＥへの結合を抑制し、したがって前記ＴＲＥ制御配列の転写合成の（トランス）活性化を抑制する）、次いで、ＴＲＥ制御配列の転写を誘導するように前記テトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの類似体の濃度を下げるか、好ましくは除去する工程。
ｔＴＡは、少なくともＴＲＥ制御配列の発現と同時に（すなわち、ＴＲＥ制御配列の発現の前に、及び／又は同時に）細胞内で発現する。
テトラサイクリンリプレッサー（ｔｅｔＲ）タンパク質は、当技術分野で一般的に知られている。例えば、Ｈｉｌｌｅｎ ａｎｄ Ｂｅｒｅｎｓ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １９９４，４８：３４５－３６９を参照のこと。本発明の文脈において好適に使用できる例示的なｔｅｔＲタンパク質は、配列番号１３に示すアミノ酸配列及びその機能的等価物を含む（又は有する）ポリペプチドを含む。
ｔｅｔＲは、ドキシサイクリン又はその機能的類似体の非存在下（又は低濃度下）で、ＴＲＥ（のｔｅｔＯ配列）に結合する。ｔｅｔＲの前記結合は、ＲＮＡポリメラーゼの結合を阻害又は阻止し、それによってＴＲＥ制御配列の転写を阻害する。
このいわゆる「Ｔ－ＲＥｘ」システムでは、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、又はそれらの機能的類似体を添加することにより、ＴＲＥ制御配列の転写がｔｅｔＲの存在下でこのように誘導される。したがって、ｐＲＳ、ｐｔＲＮＡ／ｐｔＲＮＡ－リボザイム及びＴ７ＲＮＡＰの１つ以上の転写（したがって発現）が、このＴ－ＲＥｘシステムによって制御される、本発明の方法は、好適には、以下の工程をさらに含む：
－ 真核細胞内でｔｅｔＲを発現させる工程；及び、
－ 前記細胞をテトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体と接触させる（それによって、ＴＲＥ制御配列の転写を誘導する）工程。
ｔｅｔＲは、少なくともＴＲＥ制御配列の発現前（すなわち、発現前、又は発現前と同時の両方の前）に細胞内で発現する。
本明細書に記載されたＲＮＡ分子（ｐｔＲＮＡ又はｐｔＲＮＡ－リボザイム）の転写及び／又はｐＲＳコード化配列の転写は、構成型プロモーターにより制御することができる。構成型プロモーター及び当該プロモーターに結合するＲＮＡポリメラーゼは当技術分野でよく知られており、例えば、ＣＭＶプロモーター（ヒトサイトメガロウイルス由来）、ＳＶ４０プロモーター（シミアン空胞形成ウイルス４０由来）、Ｕ６プロモーター（ヒトＵ６小核プロモーター由来）及びＨ１プロモーター（ヒトポリメラーゼＩＩＩ ＲＮＡプロモーター由来）等の真核生物プロモーター、並びに、例えば、Ｔ７プロモーター（Ｔ７バクテリオファージ由来）、Ｓｐ６プロモーター（Ｓｐ６バクテリオファージ由来）等の原核生物プロモーターを挙げることができる。
本明細書に記載されたＲＮＡ分子（ｐｔＲＮＡ又はｐｔＲＮＡ－リボザイム）の転写及び／又は構成型プロモーター転写によって制御されるｐＲＳコード化配列の転写は、構成的であっても誘導的であってもよい。構成的転写は、特に、前記プロモーターを介した転写を触媒するＲＮＡポリメラーゼが真核細胞内で構成的に発現している場合に達成されうる。
あるいは、前記プロモーターを介して転写を触媒するＲＮＡポリメラーゼが、例えばＴＲＥの（直接）制御下で、真核細胞内で誘導的に発現する場合、転写は誘導性となりうる。特定の実施形態において、本明細書に記載されるＲＮＡ分子（ｐｔＲＮＡ又はｐｔＲＮＡ－リボザイム）の発現及び／又はｐＲＳコード化配列の転写が構成型プロモーターによって制御され、前記プロモーターを介して転写を触媒するＲＮＡポリメラーゼの誘導性発現によって誘導可能となる場合、構成型プロモーターは原核生物プロモーター、特に真核細胞に自然に存在しないＲＮＡポリメラーゼを必要とするプロモーターである。特に、Ｓｐ６プロモーター、及び、好ましくはＴ７プロモーターが挙げられる。
用語「Ｔ７プロモーター」は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ＲＮＡＰ）により特定の遺伝子の転写を開始させるＤＮＡの領域を指す。特定の実施形態によれば、本発明の文脈において使用されるＴ７プロモーターは、配列番号１５～１７のいずれか１つに示す配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む（又はそれから構成される）。本発明の好ましい実施形態では、Ｔ７プロモーターは、配列番号１５又は１６のアミノ酸配列を含む。
本発明の好ましい実施形態において、ｐＲＳ及びｐｔＲＮＡの一方もしくは両方、又はｐｔＲＮＡ－リボザイムのそれぞれの転写（及びそれによる発現）が構成型プロモーターによって制御される場合、前記構成型プロモーターはＴ７プロモーターであり、好ましくは配列番号１５～１７のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む（又はそれから構成される）。Ｔ７プロモーターが使用される実施形態では、真核細胞は、好適には、さらにＴ７ＲＮＡＰを発現させる。前記Ｔ７ＲＮＡＰは、構成的に発現してもよいし、誘導的に、例えば、ＴＲＥの（直接的な）制御下で発現してもよい。
「Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ」（Ｔ７ＲＮＡＰ）は、Ｔ７プロモーターに結合し、Ｔ７プロモーターの下流の配列の転写を触媒するタンパク質である。天然に存在するＴ７ＲＮＡＰのアミノ酸配列は当技術分野で知られている。例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ アクセッション番号：Ｐ００５７３．２を参照のこと。特定の実施形態によれば、本発明の文脈において使用されるＴ７ＲＮＡＰは、配列番号１８に示す配列又は配列番号１９に示す配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む（アミノ酸位置２～１７をカバーするＮＥＳを含む）。
真核細胞内のその局在を指示するために、Ｔ７ＲＮＡＰ（又は、真核細胞内で組換え発現した別のＲＮＡポリメラーゼ）は、特にそのＮ末端に、例えば、ＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸位置１と２の間に挿入されたシグナルペプチドを有することができる。一実施形態では、Ｔ７ＲＮＡＰは、核局在化シグナル（ＮＬＳ）又は核搬出シグナル（ＮＥＳ）のそれぞれを、本明細書の上記（セクション１参照）で定義したように有することができる。このＮＥＳ－Ｔ７ＲＮＡＰのアミノ酸配列を配列番号１９に示す。別の実施形態では、Ｔ７ＲＮＡＰは、この核局在化又は搬出タグ／シグナルを有さない可能性がある。
４．ｄｓＲＮＡ結合ポリペプチド
本発明の一態様は、本明細書に記載のＰＯＩを調製するための真核細胞及び方法を提供する。ここで、真核細胞は、ｐｔＲＮＡ／ｐＲＳ対（ｐｔＲＮＡはｐｔＲＮＡ－リボザイムとして発現できる）をコードするポリヌクレオチドを含み、さらにｄｓＲＮＡ結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。また当該ＰＯＩを調製するための方法は、このｐｔＲＮＡ／ｐＲＳ対を真核細胞内で発現させること、及びｄｓＲＮＡ結合ポリペプチドを発現させることを含む。
本発明で用いられるｄｓＲＮＡ結合ポリペプチドは、３０個以上、好ましくは８０個以上の塩基対を有する二本鎖ＲＮＡ分子（ｄｓＲＮＡ）に結合可能なポリペプチドであり、その結合はｄｓＲＮＡの特定のヌクレオチド配列に依存しない。当該結合は、リンカー領域に隣接する２つのｄｓＲＮＡ結合モチーフ（それぞれα－β－β－αフォールドを含む）を含むプロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）のｄｓＲＮＡ結合ドメインによってもたらされる。本発明で用いられる好ましいｄｓＲＮＡ結合ポリペプチドは、配列番号３６のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
したがって、本発明で使用されるｄｓＲＮＡ結合ポリペプチドは、配列番号３７、及び５７～５９のいずれか１つに示される配列に対して、少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む、又はそれから構成されている。より好ましくは、本発明で使用されるｄｓＲＮＡ結合ポリペプチドは、配列番号：３８、及び５７～５９のいずれか１つに記載の配列と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％）同一性を有するアミノ酸配列を含む、又はそれから構成される。
好適には、ｄｓＲＮＡ結合ポリペプチドは、機能的なＰＫＲキナーゼドメインを欠き、好ましくは、真核生物開始因子２α（ｅＩＦ－２α）をリン酸化することができない。
ＰＯＩを調製するための本発明の方法において、ｄｓＲＮＡ結合ポリペプチドは、少なくともｐｔＲＮＡ／ｐＲＳ対の発現と同時に（すなわち、同時に、又は発現前と同時の両方で）発現する。
５．ポリヌクレオチド
また本発明は、ポリヌクレオチド、又は２つ以上のポリヌクレオチドの組み合わせに関し、以下を含む：
－ 本明細書に記載のＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列であって、前記ＲＮＡがｐｔＲＮＡとリボザイム（ｐｔＲＮＡ－リボザイム）を含むヌクレオチド配列；及び、任意に、
（ｉ）本明細書に記載のｔｅｔＯ結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列、又は、
（ｉｉ）本明細書に記載のｐＲＳをコードするヌクレオチド配列、又は、
（ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）の両方；
及び／又は、
（ａ）前記コードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列。
さらに本発明は、ポリヌクレオチド、又は２つ以上のポリヌクレオチドの組み合わせに関し、以下を含む：
－ 本明細書に記載のｄｓＲＮＡ結合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；及び、
（ｉ）本明細書に記載のｐｔＲＮＡ又はｐｔＲＮＡ－リボザイムをコードするヌクレオチド配列、又は、
（ｉｉ）本明細書に記載のｐＲＳをコードするヌクレオチド配列、又は、
（ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）の両方；
及び、任意に、
－ 本明細書に記載のｔｅｔＯ結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列；
及び／又は、
（ａ）前記コードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列。
特に明記しない限り、又は文脈上必要とされない限り、本明細書で使用する「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド分子」又は「核酸分子」という用語は、ヌクレオチド及びリボヌクレオチドのポリマーをいう。すなわち、ｃＤＮＡ及びｍＲＮＡを含む一本鎖又は二本鎖のＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子などの核酸及びリボ核酸の両方をいう。
特に明記しない限り、又は文脈上必要とされない限り、「［発現産物］をコードするヌクレオチド配列」という表現は、前記発現産物を直接コードする配列及び／又はそれに相補的なヌクレオチド配列を指すことを意図する。
本発明のポリヌクレオチド又は２つ以上のポリヌクレオチドの組み合わせに含まれると規定されたコード化ヌクレオチド配列は、同一のポリペプチド上に位置すること、又は２つ以上の異なるポリヌクレオチド上に分布することができ、したがって、前記異なるポリペプチドの組み合わせが結果として得られる（例えば、各コード化ヌクレオチド配列は、異なる組み合わせのポリペプチド上に位置することができる）。
さらに本発明は、調節ヌクレオチド配列の遺伝的制御下に、本明細書に記載の本発明のポリヌクレオチド、又はポリヌクレオチドの組み合わせの（特定のコード化）ヌクレオチド配列を含む、特に組換え、発現構築物又は発現カセットに関する。
本発明の一態様において、本発明の発現カセットは、本明細書に記載のｐｔＲＮＡ－リボザイムをコードするヌクレオチド配列を含むことができる。本発明の前記態様において、前記発現カセットは、以下を含む１つ以上のさらなる発現カセットを任意にさらに含んでもよく、又は、任意に組み合わされてもよい：
（ｉ）本明細書に記載されるｔｅｔＯ結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列、又は、
（ｉｉ）本明細書に記載されるｐＲＳをコードするヌクレオチド配列、又は、
（ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）の両方。
本発明のさらなる態様において、本発明の発現カセットは、本明細書に記載のｄｓＲＮＡ結合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むことができる。本発明の前記態様において、前記発現カセットは、以下を含む１つ以上のさらなる発現カセットをさらに含んでもよく、又は、任意に組み合わされてもよい：
（ｉ）本明細書に記載のｐｔＲＮＡ又はｐｔＲＮＡ－リボザイムをコードするヌクレオチド配列、又は、
（ｉｉ）本明細書に記載のｐＲＳをコードするヌクレオチド配列、又は、
（ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）の両方。
また本発明は、これらの発現カセットの１つ以上、又は発現カセットの組み合わせを含むベクター（発現ベクター）、特に組換えベクターにも関する。
発現カセットは、発現産物をコードするヌクレオチド配列（その５’（上流）に位置するプロモーター配列に機能的に連結している）と、典型的には前記コード化配列の３’（下流）に位置するターミネーター配列（例えば、Ｔ７ターミネーター配列）と、任意にさらなる調節エレメントを含む。当該さらなる調節エレメントの例としては、ターゲティング配列、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、選択可能マーカー、増幅シグナル、複製起点などが挙げられるが、これらには限定されない。
適切な調節配列は、例えば、「Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）」に記載されている。
ポリヌクレオチド（例えば、発現カセット）のエレメント、例えばプロモーター、コード化配列、ターミネーター、レギュレーターなどの「機能的」連結は、これらのエレメントが、コード化配列が転写され、任意の調節エレメントが前記転写のその調節を行うことができるように配置されることを意味する。これは、１つの同じ核酸分子におけるエレメントの直接的な連結によって達成することができる。しかし、このような直接的な連結は必ずしも必要ではない。
遺伝子制御配列、例えばエンハンサー配列は、より離れた位置から、又は別のＤＮＡ分子からさえも標的配列にその機能を発揮することができる。転写される核酸配列がプロモーター配列の下流（すなわち３’末端）に配置され、２つの配列が共有結合される配置が好ましい。プロモーター配列と発現させる核酸配列との間の距離は、２００塩基対より小さくても、１００塩基対より小さくても、５０塩基対より小さくてもよい。
細胞における発現のために、発現カセットは、有利には、発現ベクターに挿入される。発現ベクターは、細胞内でコード化ヌクレオチド配列の最適な発現を可能にする発現に使用する細胞に応じて選択される。ベクターは当業者には周知であり、例えば「Ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒｓ」（Ｐｏｕｗｅｌｓ Ｐ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｄ．，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ－Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ－Ｏｘｆｏｒｄ，１９８５）に示されている。
発現ベクターの例としては、プラスミド、ウイルスベクター（ファージ）、例えばＳＶ４０、ＣＭＶ、バキュロウイルス及びアデノウイルス、トランスポゾン、ＩＳエレメント、ファスミド、コスミド、及び直鎖状もしくは環状ＤＮＡが挙げられるが、これらに限定はされない。例えば、書籍「Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ」（Ｅｄｓ．Ｐｏｕｗｅｌｓ Ｐ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ－Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ－Ｏｘｆｏｒｄ，１９８５，ＩＳＢＮ ０ ４４４ ９０４０１８）を参照のこと。これらのベクターは、（宿主）細胞内で自律的に複製することができ、又は染色体上で複製することもできる。本発明の１つ以上の発現カセットを含む発現ベクターは、本発明のさらなる態様を表す。
本発明による真核細胞内でのＰＯＩの発現のために、例えば、ＰＯＩをコードするポリヌクレオチド（例えば、発現ベクター）を細胞に導入することが可能である。あるいは、ＰＯＩがｎｃＡＡ残基を有することを意図するそれらのアミノ酸位置にセレクタコドンが含まれるように、細胞の既存の遺伝子を改変することができる。（組換え）ポリペプチドをコードする核酸分子を細胞に導入する、又は細胞の既存の遺伝子を改変する方法は、当技術分野で知られている。
用語「発現」は、本発明の文脈において、真核細胞内の対応するヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドの産生を説明する。用語「発現」は、真核細胞内のヌクレオチド配列によってコードされるＲＮＡ分子（本明細書に記載のｐｔＲＮＡ又はｐｔＲＮＡ－リボザイム）の産生にも使用される。
本発明の発現カセット及び発現ベクターを含む本発明のポリヌクレオチドは、当技術分野で公知の一般的なクローニング技術を使用して調製することができる。一般的な組換え技術及びクローニング技術は、例えば、下記文献中に記載の通り使用される：Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）；及び、Ｔ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｍ．Ｌ．Ｂｅｒｍａｎ ａｎｄ Ｌ．Ｗ．Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４）；及び、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ． ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）。
本発明の発現カセット及び発現ベクターを含む本発明のポリヌクレオチド、又はポリヌクレオチドの組み合わせは、例えば、当技術分野で既知の方法によって単離することができる。
「単離された」ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドの「単離された」組み合わせは、ポリヌクレオチドの天然源（例えば、細胞）に存在する他のポリヌクレオチドから分離される。さらに、組み換え技術によって生産される場合は、他の細胞材料又は培養液を本質的に含まないことが可能であり、化学的に合成される場合は、化学的前駆体又は他の化学物質を含まないことが可能である。
本発明によるポリヌクレオチドは、分子生物学の標準的な技術及び本発明に従って提供される配列情報によって単離することができる。例えば、ｃＤＮＡは、具体的に開示された完全配列又はそのセグメントの１つをハイブリダイゼーションプローブとして使用して、また標準的なハイブリダイゼーション技術を使用して、適切なｃＤＮＡバンクから単離することができる。（例えば、下記文献中に記載の通り：Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ． ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）
さらに、開示された配列の１つ又はそのセグメントを含むポリヌクレオチドは、この配列に基づいて構築されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応によって単離することができる。このようにして増幅されたポリヌクレオチドは、適切なベクターにクローニングすることができ、ＤＮＡ配列解析によって特徴づけることができる。
６．ｎｃＡＡ残基を１つ以上有するＰＯＩ
本発明は、１つ以上のｎｃＡＡ残基を有するＰＯＩを調製する方法を提供する。ＰＯＩのｎｃＡＡ残基は、セレクタコドンによってコードされる。
本明細書で使用される「セレクタコドン」という用語は、翻訳過程中にｐｔＲＮＡに認識される（すなわち結合する）コドンであって、真核細胞の内因性ｔＲＮＡには認識されないコドンを意味する。
またこの用語は、例えばＤＮＡプラスミド等、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）ではないポリヌクレオチドのポリペプチドをコードする配列中の対応するコドンにも使用される。好ましくは、セレクタコドンは、天然の真核細胞において少量のコドンである。好適には、本発明で用いられるｐｔＲＮＡのアンチコドンは、ｍＲＮＡ中のセレクタコドンに特異的に結合し（ハイブリダイズし）、そうしてｎｃＡＡ残基を前記ｍＲＮＡによってコードされるポリペプチドの成長鎖に部位特異的に組み込む。既知の６４個の遺伝的コドン（トリプレット）は、２０個の標準アミノ酸残基及び３個の終止コドンをコードする。
翻訳の終結には終止コドン１個のみが必要なので、他の２個は原則として非タンパク質原性アミノ酸をコードするために使用できる。例えば、アンバーコドン、ＵＡＧは、ｎｃＡＡの取り込みを指示するｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ翻訳システムにおいて、セレクタコドンとしてうまく使用されてきた。本発明の方法で利用されるセレクタコドンは、使用される翻訳システムのタンパク質生合成機構の遺伝的コドンのフレームワークを拡張する。
具体的には、セレクタコドンには、これらには限定されないが、終止コドン（例えばアンバー（ＵＡＧ）、オーカー（ＵＡＡ）及びオパール（ＵＧＡ）コドン）等のナンセンスコドン；３個を超える塩基から成るコドン（例えば、４塩基コドン）；並びに天然又は非天然の塩基対に由来するコドンが含まれる。所定のシステムについて、セレクタコドンは天然の３塩基コドン（すなわち天然トリプレット）のうちの１つを含むこともできる。このとき内因性の翻訳システム（例えば、該天然トリプレットを認識するｔＲＮＡを欠いているシステム又は該天然のトリプレットがレアコドンであるシステム）は、前記天然トリプレットを使用しない（又は、ほとんど使用しない）。
所定の翻訳システムにおいて、終止コドン、４塩基コドン又はレアコドン（本発明の真核細胞におけるｐｔＲＮＡなど）等を介して読めるように、ｍＲＮＡの読みを変更させる組換えｔＲＮＡは、サプレッサーｔＲＮＡと呼ばれる。セレクタコドンとして機能する終止コドン（例えばアンバーコドン）の抑制効率は、サプレッサーｔＲＮＡとして機能する（アミノアシル化）組み換えｔＲＮＡ（ｐｔＲＮＡ）と、終止コドンに結合してリボソームから成長するポリペプチド鎖の放出を開始する放出因子（例えばＲＦ１）との間の競合に依存する。したがって、終止コドンのそのような抑制効率は、放出因子－（例えば、ＲＦ１－）欠損株を用いて高めることができる。
標的ポリペプチド（本明細書では、目的のポリペプチド又はＰＯＩとも言う）をコードするヌクレオチド配列は、１つ以上、例えば２つ以上、３つ以上等のコドン（例えばセレクタコドン）を含むことができる。それらは、ｐｔＲＮＡに含まれるアンチコドンの逆相補体である。ＰＯＩをコードするヌクレオチド配列を生成するために、従来の部位特異的変異誘発法を使用して、前記セレクタコドンをヌクレオチド配列の目的の部位に導入することができる。
略語「ｎｃＡＡ」は、一般に、２０種の天然に存在する「標準」タンパク質を構成するアミノ酸（Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｃ、Ｇ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）ではなく、セレノシステイン又はピロリシンでもない非標準アミノ酸又は非天然アミノ酸（又はアミノ酸残基）をいう。多数のｎｃＡＡが当技術分野で周知である。本発明の方法及びキットに有用なｎｃＡＡは、先行技術に記載されている（例えば、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ８３：３７９－４０８，２０１０；Ｌｅｍｋｅ，ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ １５：１６９１－１６９４，２０１４を参照のこと）。
本明細書で使用される用語「ｎｃＡＡ」はアミノ酸類似体、例えば、アミノ酸とは異なり、α－アミノ基がヒドロキシル基（α－ヒドロキシル酸）及び／又はカルボン酸官能基で置換され、エステルを形成する化合物も指す。ポリペプチドに翻訳的に組み込まれた場合、α－ヒドロキシル酸（残基）はそのα－ヒドロキシル基を介して、隣接するアミノ酸（類似体）残基のカルボン酸官能基にエステル結合で結合される。
翻訳システム（真核細胞等）において、アミノ酸類似体であるｎｃＡＡ（カルボン酸官能基が式－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－Ｒのエステルを形成している）が、ポリペプチドの調製に使用される場合、Ｒは原位置で、例えば酵素的に、ＰＯＩに組み込まれる前の翻訳システムにおいて除去されると考えられる。したがって、Ｒは、ｎｃＡＡ又はその塩を本発明のＰｙｌＲＳによって認識及び処理される形態に変換する翻訳システムの能力に適合するように適切に選択される。
本発明の文脈において特に好ましいｎｃＡＡは、翻訳後にさらに修飾することができるものである。例えば、ｎｃＡＡは、他の分子（本明細書では「結合相手分子」という）の適切な基（本明細書では「ドッキング基」という）との反応を促進する基（本明細書では「標識基」という）を有することができ、それにより結合相手分子はｎｃＡＡに共有結合する。標識基を有するＵＡＡがＰＯＩに翻訳的に組み込まれた場合、標識基はＰＯＩの一部となる。
したがって、本発明の方法に従って調製されたＰＯＩは、１つ以上の結合相手分子と反応させることができ、それにより、結合相手分子はＰＯＩの非標準アミノ酸（ｎｃＡＡ）残基（の標識基）に共有結合する。この結合反応は、ＰＯＩを発現させる細胞又は組織内のＰＯＩのｉｎ ｓｉｔｕカップリング、又は単離されたもしくは部分的に単離されたＰＯＩの部位特異的結合に使用することができる。
標識基と（結合相手分子の）ドッキング基の組み合わせについて、特に有用な選択肢は、金属フリークリック反応により反応できるものである。このようなクリック反応としては、歪み促進逆電子要請型Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ環状付加反応（ＳＰＩＥＤＡＣ；例えば、Ｄｅｖａｒａｊ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ ２００９，４８：７０１３参照）、並びに、歪のあるシクロアルキニル基、又は、アミノ基で置換された三重結合が結合していない環原子を１つ以上有する歪のあるシクロアルキニル類似体基と、アジド、ニトリルオキシド、ニトロン及びジアゾカルボニル試薬との環状付加反応（例えば、Ｓａｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ ２０１０，１３３：９４９；Ａｇａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ ２００４，１２６：１５０４６参照）、例えば、歪み促進アルキン－アジド環状付加反応（ＳＰＡＡＣ）を挙げることができる。このようなクリック反応は、ＰＯＩのｎｃＡＡ標識基とカップリング相手分子の適切な基との超高速二重直交型共有結合部位特異的カップリングを可能にする。
上記のクリック反応を介して反応できるドッキング基及び標識基の対は当技術分野において公知である。ドッキング基を含む適切なｎｃＡＡの例としては、これらには限定されないが、例えばＷＯ２０１２／１０４４２２及びＷＯ２０１５／１０７０６４に記載のｎｃＡＡが挙げられる。
（結合相手分子に含まれる）ドッキング基と（ＰＯＩのｎｃＡＡ残基に含まれる）標識基の特定の適切な対の例としては、これらには限定されないが、以下を挙げることができる：
（ａ）アジド基、ニトリルオキシド官能基（すなわち、式で表される基、ニトロン官能基又はジアゾカルボニル基）から選択される基を含む（又は本質的にそれから成る）ドッキング基と、任意に置換された歪のあるアルキニル基を含む（又は本質的にそれから成る）標識基との組み合わせ（これらの基は、銅フリー歪み促進アルキン－アジド環状付加反応（ＳＰＡＡＣ）において共有結合的に反応することができる）；
（ｂ）任意に置換された歪のあるアルキニル基を含む（又は本質的にそれから成る）ドッキング基と、アジド基、ニトリルオキシド官能基から選択される基を含む（又は本質的になる）標識基との組み合わせ（これらの基は、銅フリー歪み促進アルキン－アジド環状付加反応（ＳＰＡＡＣ）において共有結合的に反応することができる）；
（ｃ）任意に置換された歪のあるアルキニル基、任意に置換された歪のあるアルケニル基及びノルボルネニル基から選択される基を含む（又は本質的にそれから成る）ドッキング基と、任意に置換されたテトラアルキニル基を含む（又は本質的にそれから成る）標識基との組み合わせ（これらの基は、銅フリー歪み促進逆電子要請型Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ環状付加反応（ＳＰＩＥＤＡＣ）において共有結合的に反応することができる）；
（ｄ）任意に置換されたテトラジニル基を含む（又は本質的にそれから成る）ドッキング基と、任意に置換された歪のあるアルキニル基、任意に置換された歪のあるアルケニル基及びノルボルネニル基から選択される基を含む（又は本質的にそれから成る）標識基との組み合わせ（これらの基は、銅フリー歪み促進逆電子要請型Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ環状付加反応（ＳＰＩＥＤＡＣ）において共有結合的に反応することができる）。
任意に置換された歪のあるアルキニル基としては、これらには限定されないが、任意に置換されたｔｒａｎｓ－シクロオクテニル基（例えば、ＷＯ２０１２／１０４４２２及びＷＯ２０１５／１０７０６４に記載のもの）が挙げられる。任意に置換された歪のあるアルケニル基としては、これらには限定されないが、任意に置換されたシクロオクチニル基（例えば、ＷＯ２０１２／１０４４２２及びＷＯ２０１５／１０７０６４に記載のもの）が挙げられる。任意に置換されたテトラジニル基としては、これらには限定されないが、ＷＯ２０１２／１０４４２２及びＷＯ２０１５／１０７０６４に記載のものが挙げられる。
アジド基は式－Ｎ３の基である。
ニトロン官能基は、式－Ｃ（Ｒｘ）＝Ｎ＋（Ｒｙ）－Ｏ－の基である。式中、Ｒｘ及びＲｙは有機残基、例えば本明細書に記載のＣ１－Ｃ６－アルキルから独立して選択される残基である。
ジアゾカルボニル基は、式－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ＝Ｎ２の基である。
ニトリルオキシド官能基は、式－Ｃ≡Ｎ＋－Ｏ－又は好ましくは、式－Ｃ＝Ｎ＋（Ｒｘ）－Ｏ－の基である。式中、Ｒｘは有機残基、例えば本明細書に記載のＣ１－Ｃ６－アルキルから選択される残基である。
「シクロオクチニル」は、環構造中に８個の炭素原子及び１個の三重結合を有する不飽和脂環式基である。
「ｔｒａｎｓ－シクロオクテニル」は、環構造中に８個の炭素原子及びトランス配置の１個の二重結合を有する不飽和脂環式基である。
「テトラジニル」は、４個の窒素環原子及び２個の炭素環原子を有する６員単環式芳香族基である。
特に指示のない限り、用語「置換された」は、基が１、２又は３個、特に１又は２個の置換基で置換されていることを意味する。特定の実施形態において、これらの置換基は、水素、ハロゲン、Ｃ１－Ｃ４－アルキル，（ＲａＯ）２Ｐ（Ｏ）Ｏ－Ｃ１－Ｃ４－アルキル，（ＲｂＯ）２Ｐ（Ｏ）－Ｃ１－Ｃ４－アルキル，ＣＦ３，ＣＮ，ヒドロキシル，Ｃ１－Ｃ４－アルコキシ，－Ｏ－ＣＦ３，Ｃ２－Ｃ５－アルケノキシ，Ｃ２－Ｃ５－アルカノイルオキシ，Ｃ１－Ｃ４－アルキルアミノカルボニルオキシ又はＣ１－Ｃ４－アルキルチオ，Ｃ１－Ｃ４－アルキルアミノ，ジ－（Ｃ１－Ｃ４－アルキル）アミノ，Ｃ２－Ｃ５－アルケニルアミノ，Ｎ－Ｃ２－Ｃ５－アルケニル－Ｎ－Ｃ１－Ｃ４－アルキル－アミノ及びジ－（Ｃ２－Ｃ５－アルケニル）アミノ（式中、Ｒａ及びＲｂは独立して水素もしくはＣ２－Ｃ５－アルカノイルオキシメチルである）から独立して選択することができる。
ハロゲンという用語は、いずれの場合も、フッ素、臭素、塩素又はヨウ素基、特にフッ素基を意味する。
Ｃ１－Ｃ４－アルキルは、１～４個、特に１～３個の炭素原子を有する直鎖又は分岐鎖のアルキル基である。例としては、メチル並びにエチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、２－ブチル、イソブチル及びｔｅｒｔ－ブチル等のＣ２－Ｃ４－アルキルが挙げられる。
Ｃ２－Ｃ５－アルケニルは、２、３、４又は５個の炭素原子を有する単一不飽和炭化水素基である。例としては、ビニル，アリル（２－プロペン－１－イル），１－プロペン－１－イル，２－プロペン－２－イル，メタリル（２－メチルプロパ－２－エン－１－イル），１－メチルプロパ－２－エン－１－イル，２－ブテン－１－イル，３－ブテン－１－イル，２－ペンテン－１－イル，３－ペンテン－１－イル，４－ペンテン－１－イル，１－メチルブタ－２－エン－１－イル及び２－エチルプロパ－２－エン－１－イルが挙げられる。
Ｃ１－Ｃ４－アルコキシは、式Ｒ－Ｏ－の基である。式中、Ｒは本明細書で定義されるＣ１－Ｃ４－アルキル基である。
Ｃ２－Ｃ５－アルケノキシは、式Ｒ－Ｏ－の基である。式中、Ｒは本明細書で定義されるＣ２－Ｃ５－アルケニルである。
Ｃ２－Ｃ５－アルカノイルオキシは、式Ｒ－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－の基である。式中、Ｒは本明細書で定義されるＣ１－Ｃ４－アルキルである。
Ｃ１－Ｃ４－アルキルアミノカルボニルオキシは、式Ｒ－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－の基である。式中、Ｒは本明細書で定義されるＣ１－Ｃ４－アルキルである。
Ｃ１－Ｃ４－アルキルチオは、式Ｒ－Ｓ－の基である。式中、Ｒは本明細書で定義されるＣ１－Ｃ４－アルキルである。
Ｃ１－Ｃ４－アルキルアミノは、式Ｒ－ＮＨ－の基である。式中、Ｒは本明細書で定義されるＣ１－Ｃ４－アルキルである。
ジ－（Ｃ１－Ｃ４－アルキル）アミノは、式Ｒｘ－Ｎ（Ｒｙ）－の基である。式中、Ｒｘ及びＲｙは、独立して本明細書で定義されるＣ１－Ｃ４－アルキルである。
Ｃ２－Ｃ５－アルケニルアミノは、式Ｒ－ＮＨ－の基である。式中、Ｒは本明細書で定義されるＣ２－Ｃ５－アルケニルである。
Ｎ－Ｃ２－Ｃ５－アルケニル－Ｎ－Ｃ１－Ｃ４－アルキルアミノは、式Ｒｘ－Ｎ（Ｒｙ）－の基である。式中、Ｒｘは本明細書で定義されるＣ２－Ｃ５－アルケニルであり、ＲｙはＣ１－Ｃ４－アルキルである。
ジ－（Ｃ２－Ｃ５－アルケニル）アミノは、式Ｒｘ－Ｎ（Ｒｙ）－の基である。式中、Ｒｘ及びＲｙは、独立して本明細書で定義されるＣ２－Ｃ５－アルケニルである。
Ｃ２－Ｃ５－アルカノイルオキシメチルは、式Ｒｘ－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－ＣＨ２－の基である。式中、Ｒｘは本明細書で定義されるＣ１－Ｃ４－アルキルである。
本発明の文脈で使用されるｎｃＡＡは、それらの塩の形で使用することができる。本明細書に記載のｎｃＡＡの塩は、酸又は塩基付加塩、特に生理学的に許容される酸又は塩基との付加塩を意味する。生理学的に許容される酸付加塩は、塩基型のｎｃＡＡを適切な有機酸又は無機酸で処理することによって形成できる。酸性プロトンを含有するｎｃＡＡは、適切な有機及び無機塩基で処理することによってそれらの無毒性の金属又はアミン付加塩の形態に変換できる。また本発明の文脈で記載されているｎｃＡＡ及びその塩は、それらの水和物及び溶媒付加形態、例えば、水和物、アルコラート等をも含む。
生理学的に許容される酸又は塩基は、特に、ｎｃＡＡ残基を有するＰＯＩの調製に使用される翻訳システムにより許容されるものである。例えば、生きた真核細胞に対して実質的に無毒である。
本発明の文脈において有用なｎｃＡＡ及びその塩は、当技術分野において周知であり、例えば本明細書に引用した様々な刊行物に記載の方法と同様に調製することができる。
カップリング相手分子の性質は使用目的に依存する。例えば、ＰＯＩは、イメージング法に適した分子と結合していてもよく、又は生物活性分子と結合して機能化されていてもよい。例えば、ドッキング基に加えて、カップリング相手分子は、これらには限定されないが、下記から選択される基を有することができる：色素（例えば、ダンシル、クマリン、フルオレセイン、アクリジン、ローダミン、シリコンローダミン、ＢＯＤＩＰＹ又はシアニン色素等の蛍光色素、発光色素又は燐光色素）；試薬と接触して蛍光を発することができる分子；発色団（例えば、フィトクロム、フィコビリン、ビリルビン等）；放射性標識（例えば、水素、フッ素、炭素、リン、硫黄又はヨウ素の放射性形態、例えば、トリチウム、１８Ｆ，１１Ｃ，１４Ｃ，３２Ｐ，３３Ｐ，３３Ｓ，３５Ｓ，１１Ｉｎ，１２５Ｉ，１２３Ｉ，１３１Ｉ，２１２Ｂ，９０Ｙ又は１８６Ｒｈ等）；ＭＲＩ感受性スピン標識；親和性タグ（例えば、ビオチン、Ｈｉｓタグ、Ｆｌａｇタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、糖、脂質、ステロール、ＰＥＧリンカー、ベンジルグアニン、ベンジルシトシン又は補助因子）；ポリエチレングリコール基（例えば、分岐状ＰＥＧ、線状ＰＥＧ、様々な分子量のＰＥＧ等）；光架橋剤（ｐ－アジドヨードアセトアニリド等）；ＮＭＲプローブ；Ｘ線プローブ；ｐＨプローブ；ＩＲプローブ；樹脂；固体支持体及び生物活性化合物（例えば、合成薬）。適切な生物活性化合物としては、これらには限定されないが、細胞傷害性化合物（例えば、癌化学療法化合物）、抗ウイルス化合物、生物学的応答調節剤（例えば、ホルモン、ケモカイン、サイトカイン、インターロイキン等）、微小管作用薬、ホルモン調節剤及びステロイド化合物等が挙げられる。有用なカップリング相手分子の具体例としては、これらには限定されないが、受容体／リガンド対の構成要素、抗体／抗原対の構成要素、レクチン／炭水化物対の構成要素、酵素／基質対の構成要素、ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン、及び、ジゴキシン／抗ジゴキシンが挙げられる。
特に、本明細書に記載のクリック反応により、結合相手分子（のドッキング基）にｉｎ ｓｉｔｕで共有結合する特定のｎｃＡＡ残基（の標識基）の能力は、ＰＯＩを発現させる真核細胞内又は組織内でそのｎｃＡＡ残基を有するＰＯＩを検出するために、そしてＰＯＩの分布と結末を研究するために使用できる。したがって、例えば、真核細胞における発現によってＰＯＩを調製するための本発明の方法は、細胞又はその細胞の組織内のＰＯＩを検出するために超解像顕微鏡法（ＳＲＭ）と組み合わせることができる。いくつかのＳＲＭ法が当技術分野において公知であり、本発明の真核細胞によって発現されるＰＯＩを検出するためにクリックケミストリーを利用するように適合させることができる。そのＳＲＭ法の具体例としては、ＤＮＡ－ＰＡＩＮＴ（ナノスケールトポグラフィにおけるイメージングのためのＤＮＡ点集積（ＤＮＡ ｐｏｉｎｔ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ）；例えば、Ｊｕｎｇｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １１：３１３－３１８，２０１４に記載）、ｄＳＴＯＲＭ（直接確率的光学再構築顕微鏡法）及びＳＴＥＤ（誘導放出抑制）顕微鏡法が挙げられる。
７．本発明の真核細胞
本発明の真核細胞は、本明細書に記載のポリヌクレオチド、特に、本明細書に記載のｐＲＳをコードし、ｐｔＲＮＡ又はｐｔＲＮＡ－リボザイムをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを導入することにより作製できる。そして、１つの態様において、真核細胞に導入されるポリヌクレオチドは、ｄｓＲＮＡ結合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。
任意に、導入されたポリヌクレオチドは、さらに本明細書に記載のｔｅｔＯ結合タンパク質及び／又は構成的ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７ＲＮＡＰ）をコードするヌクレオチド配列を含む。前記ヌクレオチド配列は、同一のポリヌクレオチド上に位置することも、２つ以上の異なるポリヌクレオチド上に分布することも可能である。
本発明の真核細胞は、哺乳類細胞（例えば、ヒト、マウス、ラット、カニクイザル細胞）、鳥類細胞（例えば、ニワトリ細胞）、昆虫細胞、酵母細胞及び植物細胞から選択することができるが、それらに限定されるものではない。本発明の真核細胞は、個々の細胞として存在してもよいし、組織の一部（例えば、（培養）組織、器官又は生体全体の中の細胞）であってもよい。
アミノ酸配列中に１つ以上の非標準アミノ酸（ｎｃＡＡ）残基を含むＰＯＩは、真核細胞、特に本発明の真核細胞を用いて、本発明にしたがって調製することができる。真核細胞は、ｐＲＳがｐｔＲＮＡをアシル化できるという点で対となっているｐＲＳとｐｔＲＮＡを発現させる。特定の実施形態では、ｐｔＲＮＡは、本明細書に記載のｐｔＲＮＡ－リボザイムの形態で発現する。
真核細胞は、ＰＯＩの１つ以上のｎｃＡＡ残基に対応する１つ以上のｎｃＡＡ又はその塩の存在下で、さらにＰＯＩを発現させる。この目的のために、真核細胞は、発現されるべきｐＲＳ、ｐｔＲＮＡ及びＰＯＩをコードするポリヌクレオチドを含み、さらに前記ｎｃＡＡ又はその塩を（例えば、供給により）含む。前記ｐＲＳ、ｐｔＲＮＡ及び／又はＰＯＩの１つの発現がＴＲＥの制御下にある場合、真核細胞は、好適には、本明細書に記載のように用いられるそれぞれのＴＲＥに一致するように選択されるｔｅｔＯ結合タンパク質をさらに発現させる。そして真核細胞を、本明細書に記載のテトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体と（例えば、これらを含む培地で培養して）接触させる。
ＴＲＥ制御発現の誘導を含む、真核細胞内での組換え発現は、当技術分野における標準的な手段である。したがって、当業者は、目的の発現産物（ここでは、少なくともｐｔＲＮＡ、ｐＲＳ及びＰＯＩ）の（組換え）発現を可能にするように、真核細胞を培養する条件を選択することが十分に可能である。細胞の種類に応じて、液体培地を用いて培養することができる。培養は、バッチ式でも、セミバッチ式でも、連続式でもよい。栄養分は、培養の初期に供給することも、後から半連続的又は連続的に供給することもできる。
本発明の方法に従ってＰＯＩ（標的ポリペプチド）を作製するために、真核細胞を好適な条件下で、好ましくはｎｃＡＡ又はその塩の存在下（例えば、それを含む培地中）で、細胞のリボソームにおける翻訳を可能とするのに適した時間の間、培養する。
ＰＯＩをコードするポリヌクレオチド（及び任意に、他の要素ｐＲＳ、ｐｔＲＮＡなど）に応じて、例えばアラビノース、イソプロピルβ－Ｄ－チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）又はＴＲＥ制御発現の場合には、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、又はそれらの機能的類似体等の転写を誘導する化合物を添加することによって発現を誘導することが必要となりうる。ＰＯＩをコードする（そして、ｐｔＲＮＡに含まれるアンチコドンの逆相補体である１つ以上のコドンを含む）ｍＲＮＡは、リボソームと結合する。
次いで、それぞれのアミノアシルｔＲＮＡが認識（結合）するコドンがコードする位置に、アミノ酸及びｎｃＡＡが段階的に結合することによりＰＯＩが形成される。この結果、ｎｃＡＡは、ｐｔＲＮＡに含まれるアンチコドンの逆相補体である（セレクタ）コドンがコードする位置で、ＰＯＩに組み込まれる。
本明細書に記載の１つ以上の非標準アミノ酸（ｎｃＡＡ）残基を含むＰＯＩを調製するために使用される真核細胞は、ｐＲＳ、ｐｔＲＮＡ、ＰＯＩ及び／又はさらなる要素、例えば本明細書に記載のｄｓＲＮＡ結合ポリペプチド及び／又はｔｅｔＯ結合ポリペプチドなどをコードするポリヌクレオチドを真核（宿主）細胞に導入することによって産生できる。前記ヌクレオチド配列は、別々の核酸分子（ベクター）上又は同じ核酸分子（例えば、ベクター）上に、任意の組み合わせで位置することができ、組み合わせて又は順々に細胞内に導入することができる。
好ましくは、記載した核酸分子をそれぞれの細胞に導入するために、当業者に知られている一般的なクローニング及びトランスフェクション技術（例えば、共沈、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ウイルス媒介遺伝子送達、リポフェクション、マイクロインジェクション等）が使用される。好適な技術は、例えば下記文献に記載されている：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９９７；又は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９。
翻訳後、本発明に従って調製されたＰＯＩは、任意に、真核細胞から回収することができる。又は分泌される場合には培養液から回収することができる。そして、当技術分野で一般に知られている手順に従って、部分的にもしくは十分に、均質になるように精製することができる。この目的のために、ＰＯＩは、当業者に知られ、当業者によって使用される手順に従って、部分的にもしくは十分に、均質になるように回収及び精製することができる。
標的ポリペプチドが培地に分泌されない限り、回収は通常、細胞破壊を必要とする。細胞破壊の方法は当技術分野において周知であり、例えば超音波（ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ）処理による物理的破壊、（例えば、フレンチプレスを用いた）液体剪断破壊、機械的方法（例えばブレンダーもしくは粉砕機を利用するもの）又は、凍結融解サイクル、並びに、脂質－脂質、タンパク質－タンパク質及び／又はタンパク質－脂質の相互作用を破壊する薬剤（洗剤等）を用いた化学的溶解、並びに、物理的破壊技術と化学的溶解の組み合わせを挙げることができる。細胞溶解物又は培地からポリペプチドを精製するための標準的な手順もまた当技術分野で周知である。例えば、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸又は塩基抽出、カラムクロマトグラフィー、アフィニティーカラムクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、ゲル電気泳動等を挙げることができる。タンパク質リフォールディング工程は、必要に応じて、正しく折り畳まれた成熟タンパク質を作製する際に用いることができる。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、アフィニティークロマトグラフィー又は他の適切な方法は、高純度が望まれる最終精製工程において使用することができる。本発明のポリペプチドに対して作製された抗体は、精製試薬として、すなわちポリペプチドの親和性に基づく精製に使用することができる。様々な精製／タンパク質折り畳み法が当技術分野において周知である。例えば、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｂｅｒｌｉｎ（１９９３）；Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１８２：Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９０）；及び本明細書中に引用する参考文献に記載のものが挙げられる。
すでに述べたように、当業者は、合成、発現及び／又は精製の後、ポリペプチドが関連するポリペプチドの所望の立体構造とは異なる立体構造を有する場合があることを認識するであろう。例えば、過剰発現したポリペプチド、及び原核細胞システムにより産生されたポリペプチドは、しばしばカオトロピック剤への曝露により最適化され、適切な折り畳みを達成する。
例えばＥ．ｃｏｌｉ由来の溶解物からの精製中に、発現したポリペプチドは、必要に応じて変性され、次いで復元される。これは、例えばグアニジンＨＣｌ等のカオトロピック剤の中にタンパク質を可溶化することにより達成される。一般に、発現したポリペプチドを変性及び破壊し、次いでポリペプチドを好ましい立体構造にリフォールディングすることが時には望ましい。例えば、グアニジン、尿素、ＤＴＴ、ＤＴＥ及び／又はシャペロニンを目的の翻訳産物に添加することができる。タンパク質を還元、変性及び復元する方法は当業者に周知である。ポリペプチドは、例えば酸化型グルタチオン及びＬ－アルギニンを含有するレドックス緩衝液中でリフォールディングすることができる。
本発明の方法によって発現したＰＯＩは、公知の技術、例えば、Ｑ－セファロース（商品名）クロマトグラフィーなどの分子篩クロマトグラフィー（ゲルろ過）、イオン交換クロマトグラフィー、及び疎水性クロマトグラフィー、並びに、限外ろ過、結晶化、塩析、透析、及びネイティブゲル電気泳動などの一般的な別のタンパク質精製技術等によって精製することが可能である。好適な方法は、例えば下記文献に記載されている：Ｃｏｏｐｅｒ，Ｔ．Ｇ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｃｈｅ Ａｒｂｅｉｔｓｍｅｔｈｏｄｅｎ［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ］，Ｖｅｒｌａｇ Ｗａｌｔｅｒ ｄｅ Ｇｒｕｙｔｅｒ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：又は、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｒ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｂｅｒｌｉｎ。
ＰＯＩを単離するために、ＰＯＩを、より容易な精製に役立つ可能性のあるタグと連結することが有利であろう。これは、対応するタグをコードする配列を、ＰＯＩをコードするヌクレオチド配列に導入することによって達成することができる。タンパク質精製のための適切なタグは、当技術分野において周知であり、例えば、ヒスチジンタグ（例えば、Ｈｉｓ６タグ）及び抗体の抗原として認識できるエピトープ（例えば、Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ． ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｄ．，１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（Ｎ．Ｙ．）Ｐｒｅｓｓに記載）が挙げられる。これらのタグは、タンパク質を固体担体、例えばポリマーマトリックス（例えばクロマトグラフィーカラムの充填物として使用することができ、又はマイクロタイタープレート上もしくは他の担体上で使用することができる）に付着させるのに役立つ場合がある。
ＰＯＩに連結されたタグは、ＰＯＩを検出するために機能することもできる。タンパク質検出用のタグは、当技術分野において周知であり、例えば、蛍光色素、基質との反応後に検出可能な反応生成物を形成する酵素マーカー等が挙げられる。
また、本発明の方法によって生産されるＰＯＩも記載される。当該ＰＯＩは、本明細書に記載の真核細胞を利用する本発明の方法によって調製することができる。
８．キット
また、本発明は、そのアミノ酸配列中に１つ以上の非標準アミノ酸（ｎｃＡＡ）残基を有するＰＯＩを調製するためのキットを提供する。本発明のキットは、ＰＯＩの１つ以上のｎｃＡＡ残基に対応する１つ以上のｎｃＡＡ、又はその塩を含む。さらに本発明のキットは、本発明のポリヌクレオチド、もしくはポリヌクレオチドの組み合わせ、及び／又は本明細書に記載のｄｓＲＮＡ結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び／又は本発明の真核細胞を含むことができる。
さらにキットは、容易に検出可能な（例えば蛍光）レポーターポリペプチドをコードする１つ以上のレポーターコンストラクトを含むことができる。レポーターコンストラクトは、レポーターポリペプチドのコード化配列に位置する少なくとも１つのセレクタコドンを含む。前記セレクタコドンによってコードされる位置にアミノ酸又はｎｃＡＡをうまく組み込むことによって、レポーターポリペプチドの翻訳合成が可能となる。
本発明のキットは、本明細書に記載のｎｃＡＡ残基含有ＰＯＩを調製するための本発明の方法において使用することができる。
９．具体的な実施形態
本発明は、以下の特定の実施形態を示す：
１）第１の実施形態によれば、本発明は、以下を含む真核細胞に関する：
（ａ）原核生物のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ｐＲＳ）をコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）原核生物ｔＲＮＡ（ｐｔＲＮＡ）及び１つ以上のリボザイムをコードするポリヌクレオチド。
該真核細胞では、
ｐＲＳは、ｐｔＲＮＡをアシル化することができ、
ｐｔＲＮＡ及びリボザイムをコードする配列が、転写によってｐｔＲＮＡ及びリボザイムの両方を含むＲＮＡ分子（ｐｔＲＮＡ－リボザイム）を生成するように連結されている。
第２の実施形態は、リボザイムが、ハンマーヘッドリボザイム、ヘアピンリボザイム、Ｖａｒｋｕｄ ｓａｔｅｌｌｉｔｅリボザイム、グルコサミン－６－リン酸合成酵素リボスイッチ、及び肝炎デルタウイルス（ＨＤＶ）リボザイムから選択される、実施形態１の真核細胞に関する。
第３の実施形態は、リボザイムが、ｐｔＲＮＡ－リボザイムにおいてｐｔＲＮＡの３’末端に直接連結しているＨＤＶリボザイムである、実施形態１又は実施形態２の真核細胞に関する。
第４の実施形態は、実施形態１～３のいずれか１つの真核細胞に関する：
該真核細胞では、
（ｉ）ｐｔＲＮＡ－リボザイムの転写合成が、テトラサイクリン応答性プロモーターエレメント（ＴＲＥ）によって制御されるか、又は
（ｉｉ）ｐｔＲＮＡ－リボザイムがＲＮＡポリメラーゼによって転写合成され、前記ＲＮＡポリメラーゼの発現がＴＲＥによって制御される。
第５の実施形態は、ｐＲＳコード化配列の転写がテトラサイクリン応答性プロモーターエレメント（ＴＲＥ）によって制御される、実施形態１～４のいずれか１つの真核細胞に関する。
第６の実施形態は、テトラサイクリンオペレーター（ｔｅｔＯ）配列に結合するタンパク質（ｔｅｔＯ結合タンパク質）をコードするポリヌクレオチドをさらに含み、ｔｅｔＯ結合タンパク質が以下からなる群から選択される、実施形態４又は実施形態５の真核細胞に関する：
（ｉ）テトラサイクリンリプレッサー（ｔｅｔＲ）；
（ｉｉ）テトラサイクリン制御転写活性化因子（ｔＴＡ）；及び
（ｉｉｉ）リバースｔＴＡ（ｒｔＴＡ）。
第７の実施形態は、実施形態１～６のいずれか１つの真核細胞に関する：
該真核細胞では、
（ｉ）ｐｔＲＮＡ－リボザイムの転写合成が、Ｔ７プロモーターによって制御される、及び／又は
（ｉｉ）ｐＲＳコード化配列の転写がＴ７プロモーターによって制御され、
該真核細胞は、さらに以下を含む：
（ｃ）Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ＲＮＡＰ）をコードするポリヌクレオチド。
第８の実施形態は、Ｔ７ＲＮＡＰの発現がＴＲＥによって制御される、実施形態７の真核細胞に関する。
第９の実施形態は、実施形態７又は実施形態８の真核細胞に関し、Ｔ７ＲＮＡＰは以下を有する：
（ｉ）核局在化シグナル（ＮＬＳ）；又は、
（ｉｉ）核搬出シグナル（ＮＥＳ）；又は、
（ｉｉｉ）ＮＥＳ及びＮＬＳを有さない。
第１０の実施形態は、下記実施形態１１～１３のいずれか１つで定義されたｄｓＲＮＡ結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、実施形態１～９のいずれか１つの真核細胞に関する。
第１１の実施形態は、以下を含む真核細胞に関する：
（ａ）原核生物アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ｐＲＳ）をコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）原核生物ｔＲＮＡ（ｐｔＲＮＡ）をコードするポリヌクレオチド；及び、
（ｃ）二本鎖ＲＮＡに結合可能なポリペプチド（ｄｓＲＮＡ結合ポリペプチド）をコードし、配列番号３７及び５７～５９のいずれか１つに示す配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド。
第１２の実施形態は、ｄｓＲＮＡ結合ポリペプチドに含まれるアミノ酸配列が、配列番号３８に示す配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する、実施形態１１の真核細胞に関する。
第１３の実施形態は、ｄｓＲＮＡ結合ポリペプチドが、真核生物開始因子２α（ｅＩＦ－２α）をリン酸化することができない、実施形態１１又は実施形態１２の真核細胞に関する。
第１４の実施形態は、実施形態１１～１３のいずれか１つの真核細胞に関する：
該真核細胞では、
（ｉ）ｐｔＲＮＡの転写合成が、テトラサイクリン応答性プロモーターエレメント（ＴＲＥ）によって制御されるか、又は、
（ｉｉ）ｐｔＲＮＡがＲＮＡポリメラーゼによって転写合成され、前記ＲＮＡポリメラーゼの発現がＴＲＥによって制御される。
第１５の実施形態は、実施形態１１～１４のいずれか１つの真核細胞に関する：
該真核細胞では、
（ｉ）ｐＲＳコード化配列の転写が、テトラサイクリン応答性プロモーターエレメント（ＴＲＥ）によって制御されるか、又は、
（ｉｉ）ｐＲＳコード化配列の転写がＲＮＡポリメラーゼによって触媒され、前記ＲＮＡポリメラーゼの発現がＴＲＥによって制御される。
第１６の実施形態は、テトラサイクリンオペレーター（ｔｅｔＯ）配列に結合するタンパク質（ｔｅｔＯ結合タンパク質）をコードするポリヌクレオチドをさらに含み、ｔｅｔＯ結合タンパク質が以下からなる群から選択される、実施形態１４又は実施形態１５の真核細胞に関する：
（ｉ）テトラサイクリンリプレッサー（ｔｅｔＲ）；
（ｉｉ）テトラサイクリン制御転写活性化因子（ｔＴＡ）；及び
（ｉｉｉ）リバースｔＴＡ（ｒｔＴＡ）。
第１７の実施形態は、実施形態１１～１６のいずれか１つの真核細胞に関する：
該真核細胞では、
（ｉ）ｐｔＲＮＡの転写合成が、Ｔ７プロモーターによって制御されるか、又は、
（ｉｉ）ｐＲＳコード化配列の転写が、Ｔ７プロモーターによって制御されるか、又は、
（ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）の両方、であり、
該真核細胞は、さらに以下を含む：
（ｃ）Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ＲＮＡＰ）をコードするポリヌクレオチド。
第１８の実施形態は、Ｔ７ＲＮＡＰの発現がＴＲＥによって制御される、実施形態１７の真核細胞に関する。
第１９の実施形態は、実施形態１７又は実施形態１８の真核細胞に関し、Ｔ７ＲＮＡＰは以下を有する：
（ｉ）核局在化シグナル（ＮＬＳ）；又は、
（ｉｉ）核搬出シグナル（ＮＥＳ）；又は、
（ｉｉｉ）ＮＥＳ及びＮＬＳを有さない。
第２０の実施形態は、真核細胞が実施形態１～９のいずれか１つの細胞である、実施形態１１～１３のいずれか１つの真核細胞に関する。
第２１の実施形態は、実施形態１～４及び７のいずれか１つに定義される、ｐｔＲＮＡ及び１つ以上のリボザイム（ｐｔＲＮＡ－リボザイム）を含むＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドに関する：
より詳細には、
ａ）リボザイムが、ｐｔＲＮＡ－リボザイムにおいてｐｔＲＮＡの３’末端に直接連結しているＨＤＶリボザイムであり；又は、
ｂ）ｐｔＲＮＡが、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ種、特にＭ．ｍａｚｅｉのピロリジルｔＲＮＡに由来する；又は、
ｃ）ｐｔＲＮＡ分子が、３’末端アミノアシル受容体幹モチーフＣＣＡを欠いてコードされる；又は、
ｄ）ｐｔＲＮＡが、以下のヌクレオチド配列（配列番号：６０）ｇｇａａａｃｃｔｇａｔｃａｔｇｔａｇａｔｃｇａａｔｇｇａｃｔｘｘｘａａｔｃｃｇｔｔｃａｇｃｃｇｇｇｔｔａｇａｔｔｃｃｃｇｇｇｇｔｔｔｃｃｇ（ｘｘｘはアンチコドンをコードする）によってコードされる。
第２２の実施形態は、実施形態１～４及び７のいずれか１つに定義される、ｐｔＲＮＡ及び１つ以上のリボザイム（ｐｔＲＮＡ－リボザイム）を含むＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列；及び、
（ｉ）実施形態６に定義されるｔｅｔＯ結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列、又は、
（ｉｉ）実施形態１、５及び７のいずれか１つに定義されるｐＲＳをコードするヌクレオチド配列、又は、
（ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）の両方、
を含むポリヌクレオチド、又は２つ以上のポリヌクレオチドの組み合わせに関する。
第２３の実施形態は、そのアミノ酸配列中に１つ以上の非標準アミノ酸（ｎｃＡＡ）残基を有する目的のポリペプチド（ＰＯＩ）を調製する方法に関する：
該方法は、以下の工程を含み：
（ａ）真核細胞内で、
－ 原核生物アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ｐＲＳ）；及び、
－ 原核生物ｔＲＮＡ（ｐｔＲＮＡ）及び１つ以上のリボザイム（ｐｔＲＮＡ－リボザイム）を含むＲＮＡ分子、
を発現させる工程；
並びに、同時又は順々に、
（ｂ）真核細胞内で、ＰＯＩの１つ以上のｎｃＡＡ残基に対応する１つ以上のｎｃＡＡ又はその塩の存在下で、ＰＯＩを発現させる工程；及び、
（ｃ）任意に、発現したＰＯＩを回収する工程；
ｐＲＳは、ｐｔＲＮＡをｎｃＡＡ又はその塩でアシル化することが可能であり、
ＰＯＩは、１つ以上のｎｃＡＡ残基をコードする１つ以上のセレクタコドンを含むヌクレオチド配列によってコードされ、且つ、
セレクタコドンは、ｐｔＲＮＡのアンチコドンの逆相補体である。
第２４の実施形態は、リボザイムが、ハンマーヘッドリボザイム、ヘアピンリボザイム、Ｖａｒｋｕｄ ｓａｔｅｌｌｉｔｅリボザイム、グルコサミン－６－リン酸合成酵素リボスイッチ、及び肝炎デルタウイルス（ＨＤＶ）リボザイムから選択される、実施形態２３の方法に関する。
第２５の実施形態は、リボザイムが、ｐｔＲＮＡ－リボザイムにおいてｐｔＲＮＡの３’末端に直接連結しているＨＤＶリボザイムである、実施形態２３又は実施形態２４の方法に関する。
Ｔ７制御全般
第２６の実施形態は、ｐｔＲＮＡ－リボザイムの転写合成がＴ７プロモーターによって制御される、実施形態２３～２５のいずれか１つの方法に関する：
さらに該方法は、（ｉ）ｐｔＲＮＡ－リボザイムもしくは（ｉｉ）ｐＲＳ又は（ｉｉｉ）その両方のそれぞれの、それによって制御された発現の前に、又はそれと同時に、真核細胞内でＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ＲＮＡＰ）を発現させる工程を含む。
Ｔ－ＲＥＸシステム（ｔｅｔＲ、＋ｔｅｔ／ｄｏｘ）
第２７の実施形態は、実施形態２３～２５のいずれか１つの方法に関する：
該方法では、
（ｉ）ｐｔＲＮＡ－リボザイムの転写合成が、テトラサイクリン応答性プロモーターエレメント（ＴＲＥ）によって制御されるか、又は
（ｉｉ）ｐｔＲＮＡ－リボザイムがＲＮＡポリメラーゼによって転写合成され、前記ＲＮＡポリメラーゼの発現がＴＲＥによって制御され；
さらに該方法は、少なくともｐｔＲＮＡリボザイムの発現の前に、真核細胞内でテトラサイクリンリプレッサー（ｔｅｔＲ）を発現させる工程を含み；
ｐｔＲＮＡ－リボザイムの発現は、真核細胞をテトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体と接触させ、それによってｐｔＲＮＡ－リボザイムの転写合成を誘導することを含む。
第２８の実施形態は、実施形態２３～２５及び２７のいずれか１つの方法に関する：
該方法では、
（ｉ）ｐＲＳコード化配列の転写が、テトラサイクリン応答性プロモーターエレメント（ＴＲＥ）により制御される；又は
（ｉｉ）ｐＲＳコード化配列の転写が、ＲＮＡポリメラーゼによって触媒され、前記ＲＮＡポリメラーゼの発現が、ＴＲＥによって制御され；
さらに該方法は、少なくともｐＲＳの発現の前に、真核細胞内でテトラサイクリンリプレッサー（ｔｅｔＲ）を発現させる工程を含み；
ｐＲＳの発現は、真核細胞をテトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体と接触させ、それによってｐＲＳコード化配列の転写を誘導することを含む。
第２９の実施形態は、実施形態２７又は実施形態２８の方法に関する：
該方法は、
（ｉ）ｐｔＲＮＡ－リボザイムの転写合成が、Ｔ７プロモーターによって制御されるか；又は
（ｉｉ）ｐＲＳコード化配列の転写が、Ｔ７プロモーターによって制御されるか；又は
（ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）の両方であり、
さらに該方法は下記工程を含み：
－ （ｉ）ｐｔＲＮＡ－リボザイムもしくは（ｉｉ）ｐＲＳ又は（ｉｉｉ）その両方のそれぞれの、それによって制御された発現の前に、又はそれと同時に、真核細胞内でＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ＲＮＡＰ）を発現させる（Ｔ７ＲＮＡＰの発現はＴＲＥによって制御される）工程；
－ Ｔ７ＲＮＡＰの発現と少なくとも同時に真核細胞内でｔｅｔＲを発現させる工程；
Ｔ７ＲＮＡＰの発現は、真核細胞をテトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体と接触させ、それによってＴ７ＲＮＡＰコード化配列の転写を誘導することを含む。
Ｔｅｔ－Ｏｆｆシステム（ｔＴＡ、－ｔｅｔ／ｄｏｘ）
第３０の実施形態は、実施形態２３～２５のいずれか１つの方法に関する：
該方法では、
（ｉ）ｐｔＲＮＡ－リボザイムの転写合成が、テトラサイクリン応答性プロモーターエレメント（ＴＲＥ）によって制御されるか、又は
（ｉｉ）ｐｔＲＮＡ－リボザイムがＲＮＡポリメラーゼによって転写合成され、前記ＲＮＡポリメラーゼの発現がＴＲＥによって制御され、
さらに該方法は下記工程を含む：
（１）ｐｔＲＮＡ－リボザイムの発現の前に、及びそれと同時に、テトラサイクリン制御転写活性化因子（ｔＴＡ）を真核細胞内で発現させる工程；及び
（２）ｐｔＲＮＡ－リボザイムの発現の前の真核細胞と、テトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体との接触を保ち、それによってｐｔＲＮＡ－リボザイムの転写合成を抑制し、次いで、ｐｔＲＮＡ－リボザイムの転写合成を誘導するために前記テトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体の濃度を下げるか、好ましくは除去する工程。
第３１の実施形態は、実施形態２３～２５及び３０のいずれか１つの方法に関する：
該方法では、
（ｉ）ｐＲＳコード化配列の転写が、ＴＲＥによって制御されるか、又は
（ｉｉ）ｐＲＳコード化配列の転写がＲＮＡポリメラーゼによって触媒され、前記ＲＮＡポリメラーゼの発現が、ＴＲＥによって制御され、
さらに該方法は下記工程を含む：
（１）ｐＲＳの発現の前に、及びそれと同時に、テトラサイクリン制御転写活性化因子（ｔＴＡ）を真核細胞内で発現させる工程；及び
（２）ｐＲＳの発現の前の真核細胞と、テトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体との接触を保ち、それによってｐＲＳコード化配列の転写を抑制し、次いで、ｐＲＳコード化配列の転写を誘導するために前記テトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体の濃度を下げるか、好ましくは除去する工程。
第３２の実施形態は、実施形態３０又は実施形態３１の方法に関する：
該方法では、
（ｉ）ｐｔＲＮＡ－リボザイムの転写合成が、Ｔ７プロモーターによって制御されるか、又は
（ｉｉ）ｐＲＳコード化配列の転写が、Ｔ７プロモーターによって制御されるか、又は
（ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）の両方であり、
さらに該方法は下記工程を含む：
（３）（ｉ）ｐｔＲＮＡ－リボザイムもしくは（ｉｉ）ｐＲＳ又は（ｉｉｉ）その両方のそれぞれの、それによって制御された発現の前に、又はそれと同時に、真核細胞内でＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ＲＮＡＰ）を発現させる（Ｔ７ＲＮＡＰの発現はＴＲＥによって制御される）工程；
（４）Ｔ７ＲＮＡＰの発現の前に、及びそれと同時に、ｔＴＡを真核細胞内で発現させる工程；及び
（５）Ｔ７ＲＮＡＰの発現の前の真核細胞と、テトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体との接触を保ち、それによってＴ７ＲＮＡＰコード化配列の転写を抑制し、次いで、Ｔ７ＲＮＡＰコード化配列の転写を誘導するために前記テトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体の濃度を下げるか、好ましくは除去する工程。
Ｔｅｔ－Ｏｎシステム（ｒｔＴＡ、＋ｄｏｘ）
第３３の実施形態は、実施形態２３～２５のいずれか１つの方法に関する：
該方法では、
（ｉ）ｐｔＲＮＡ－リボザイムの転写合成が、テトラサイクリン応答性プロモーターエレメント（ＴＲＥ）によって制御されるか、又は
（ｉｉ）ｐｔＲＮＡ－リボザイムがＲＮＡポリメラーゼによって転写合成され、前記ＲＮＡポリメラーゼの発現がＴＲＥによって制御され；
さらに該方法は、少なくともｐｔＲＮＡの発現と同時に、真核細胞内でリバースｔＴＡ（ｒｔＴＡ）を発現させる工程を含み；
ｐｔＲＮＡ－リボザイムの発現は、真核細胞をドキシサイクリン又はその機能的類似体と接触させ、それによってｐｔＲＮＡ－リボザイムの転写合成を誘導することを含む。
第３４の実施形態は、実施形態２３～２５及び３３のいずれか１つの方法に関する：
該方法では、
（ｉ）ｐＲＳコード化配列の転写が、テトラサイクリン応答性プロモーターエレメント（ＴＲＥ）によって制御されるか、又は
（ｉｉ）ｐＲＳコード化配列の転写がＲＮＡポリメラーゼによって触媒され、前記ＲＮＡポリメラーゼの発現がＴＲＥによって制御され；
さらに該方法は、少なくともｐＲＳの発現と同時に、真核細胞内でリバースｔＴＡ（ｒｔＴＡ）を発現させる工程を含み；
ｐＲＳの発現は、真核細胞をドキシサイクリン又はその機能的類似体と接触させ、それによってｐＲＳコード化配列の転写を誘導することを含む。
第３５の実施形態は、実施形態３３又は実施形態３４の方法に関する：
該方法は、
（ｉ）ｐｔＲＮＡ－リボザイムの転写合成が、Ｔ７プロモーターによって制御されるか；又は
（ｉｉ）ｐＲＳコード化配列の転写が、Ｔ７プロモーターによって制御されるか；又は
（ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）の両方であり、
さらに該方法は下記工程を含み：
－ （ｉ）ｐｔＲＮＡ－リボザイムもしくは（ｉｉ）ｐＲＳ又は（ｉｉｉ）その両方のそれぞれの、それによって制御された発現の前に、又はそれと同時に、真核細胞内でＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ＲＮＡＰ）を発現させる（Ｔ７ＲＮＡＰの発現はＴＲＥによって制御される）工程；
－ Ｔ７ＲＮＡＰの発現と少なくとも同時に真核細胞内でｒｔＴＡを発現させる工程；
Ｔ７ＲＮＡＰの発現は、真核細胞をドキシサイクリン又はその機能的類似体と接触させ、それによってＴ７ＲＮＡＰコード化配列の転写を誘導することを含む。
第３６の実施形態は、さらに下記工程を含む、実施形態２３～２５のいずれか１つの方法に関する：
真核細胞内で、実施形態１１～１３のいずれか１つに定義されるｄｓＲＮＡ結合ポリペプチドを発現させる工程。
第３７の実施形態は、そのアミノ酸配列中に１つ以上の非標準アミノ酸（ｎｃＡＡ）残基を有する目的のポリペプチド（ＰＯＩ）を調製する方法に関する：
該方法は、以下の工程を含み：
（ａ）真核細胞内で、
－ 原核生物のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ｐＲＳ）；
－ 原核生物ｔＲＮＡ（ｐｔＲＮＡ）；及び
－ 二本鎖ＲＮＡに結合できるポリペプチド（ｄｓＲＮＡ結合ポリペプチド）、
を発現させる工程；
並びに、同時又は順々に、
（ｂ）真核細胞内で、ＰＯＩの１つ以上のｎｃＡＡ残基に対応する１つ以上のｎｃＡＡ又はその塩の存在下で、ＰＯＩを発現させる工程；及び、
（ｃ）任意に、発現したＰＯＩを回収する工程；
ｐＲＳは、ｐｔＲＮＡをｎｃＡＡ又はその塩でアシル化することが可能であり、
ｄｓＲＮＡ結合ポリペプチドは、配列番号３７、及び５７～５９のいずれか１つに示す配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
ＰＯＩは、１つ以上のｎｃＡＡ残基をコードする１つ以上のセレクタコドンを含むヌクレオチド配列によってコードされ、且つ、
セレクタコドンは、ｐｔＲＮＡのアンチコドンの逆相補体である。
第３８の実施形態は、ｄｓＲＮＡ結合ポリペプチドに含まれるアミノ酸配列が、配列番号３８に示す配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する、実施形態３７の方法に関する。
第３９の実施形態は、ｄｓＲＮＡ結合ポリペプチドが、真核生物開始因子２α（ｅＩＦ－２α）をリン酸化することができない、実施形態３７又は実施形態３８の方法に関する。
Ｔ７制御全般
第４０の実施形態は、実施形態３７～３９のいずれか１つの方法に関する：
該方法は、
（ｉ）ｐｔＲＮＡの転写合成が、Ｔ７プロモーターによって制御されるか、又は
（ｉｉ）ｐＲＳコード化配列の転写が、Ｔ７プロモーターによって制御されるか、又は
（ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）の両方であり、
さらに該方法は、（ｉ）ｐｔＲＮＡもしくは（ｉｉ）ｐＲＳ又は（ｉｉｉ）その両方のそれぞれの、それによって制御された発現の前に、又はそれと同時に、真核細胞内でＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ＲＮＡＰ）を発現させる工程を含む。
Ｔ－ＲＥＸシステム（ｔｅｔＲ、＋ｔｅｔ／ｄｏｘ）
第４１の実施形態は、実施形態３７～３９のいずれか１つの方法に関する：
該方法では、
（ｉ）ｐｔＲＮＡの転写合成が、テトラサイクリン応答性プロモーターエレメント（ＴＲＥ）によって制御されるか、又は
（ｉｉ）ｐｔＲＮＡがＲＮＡポリメラーゼによって転写合成され、前記ＲＮＡポリメラーゼの発現がＴＲＥによって制御され；
さらに該方法は、少なくともｐｔＲＮＡの発現の前に、真核細胞内でテトラサイクリンリプレッサー（ｔｅｔＲ）を発現させる工程を含み；
ｐｔＲＮＡの発現は、真核細胞をテトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体と接触させ、それによってｐｔＲＮＡの転写合成を誘導することを含む。
第４２の実施形態は、実施形態３７～３９及び４１のいずれか１つの方法に関する：
該方法では、
（ｉ）ｐＲＳコード化配列の転写が、テトラサイクリン応答性プロモーターエレメント（ＴＲＥ）によって制御されるか、又は
（ｉｉ）ｐＲＳコード化配列の転写がＲＮＡポリメラーゼによって触媒され、前記ＲＮＡポリメラーゼの発現がＴＲＥによって制御され；
さらに該方法は、少なくともｐＲＳの発現の前に、真核細胞内でテトラサイクリンリプレッサー（ｔｅｔＲ）を発現させる工程を含み；且つ、
ｐＲＳの発現は、真核細胞をテトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体と接触させ、それによってｐＲＳコード化配列の転写を誘導することを含む。
第４３の実施形態は、実施形態４１又は実施形態４２の方法に関する：
該方法は、
（ｉ）ｐｔＲＮＡの転写合成が、Ｔ７プロモーターによって制御されるか；又は
（ｉｉ）ｐＲＳコード化配列の転写が、Ｔ７プロモーターによって制御されるか；又は
（ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）の両方であり、
さらに該方法は下記工程を含み：
－ （ｉ）ｐｔＲＮＡもしくは（ｉｉ）ｐＲＳ又は（ｉｉｉ）その両方のそれぞれの、それによって制御された発現の前に、又はそれと同時に、真核細胞内でＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ＲＮＡＰ）を発現させる（Ｔ７ＲＮＡＰの発現はＴＲＥによって制御される）工程；
－ Ｔ７ＲＮＡＰの発現と少なくとも同時に真核細胞内でｔｅｔＲを発現させる工程；
Ｔ７ＲＮＡＰの発現は、真核細胞をテトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体と接触させ、それによってＴ７ＲＮＡＰコード化配列の転写を誘導することを含む。
Ｔｅｔ－Ｏｆｆシステム（ｔＴＡ、－ｔｅｔ／ｄｏｘ）
第４４の実施形態は、実施形態３７～３９のいずれか１つの方法に関する：
該方法では、
（ｉ）ｐｔＲＮＡの転写合成が、テトラサイクリン応答性プロモーターエレメント（ＴＲＥ）によって制御されるか、又は
（ｉｉ）ｐｔＲＮＡがＲＮＡポリメラーゼによって転写合成され、前記ＲＮＡポリメラーゼの発現がＴＲＥによって制御され、
さらに該方法は下記工程を含む：
（１）ｐｔＲＮＡの発現の前に、及びそれと同時に、テトラサイクリン制御転写活性化因子（ｔＴＡ）を真核細胞内で発現させる工程；及び
（２）ｐｔＲＮＡの発現の前の真核細胞と、テトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体との接触を保ち、それによってｐｔＲＮＡの転写合成を抑制し、次いで、ｐｔＲＮＡの転写合成を誘導するために前記テトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体の濃度を下げるか、好ましくは除去する工程。
第４５の実施形態は、実施形態３７～３９及び４４のいずれか１つの方法に関する：
該方法では、
（ｉ）ｐＲＳコード化配列の転写が、ＴＲＥによって制御されるか、又は
（ｉｉ）ｐＲＳコード化配列の転写がＲＮＡポリメラーゼによって触媒され、前記ＲＮＡポリメラーゼの発現が、ＴＲＥによって制御され、
さらに該方法は下記工程を含む：
（１）ｐＲＳの発現の前に、及びそれと同時に、テトラサイクリン制御転写活性化因子（ｔＴＡ）を真核細胞内で発現させる工程；及び
（２）ｐＲＳの発現の前の真核細胞と、テトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体との接触を保ち、それによってｐＲＳコード化配列の転写を抑制し、次いで、ｐＲＳコード化配列の転写を誘導するために前記テトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体の濃度を下げるか、好ましくは除去する工程。
第４６の実施形態は、実施形態４４又は実施形態４５の方法に関する：
該方法では、
（ｉ）ｐｔＲＮＡの転写合成が、Ｔ７プロモーターによって制御されるか、又は
（ｉｉ）ｐＲＳコード化配列の転写が、Ｔ７プロモーターによって制御されるか、又は
（ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）の両方であり、
さらに該方法は下記工程を含む：
（３）（ｉ）ｐｔＲＮＡもしくは（ｉｉ）ｐＲＳ又は（ｉｉｉ）その両方のそれぞれの、それによって制御された発現の前に、又はそれと同時に、真核細胞内でＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ＲＮＡＰ）を発現させる（Ｔ７ＲＮＡＰの発現はＴＲＥによって制御される）工程；
（４）Ｔ７ＲＮＡＰの発現の前に、及びそれと同時に、ｔＴＡを真核細胞内で発現させる工程；及び
（５）Ｔ７ＲＮＡＰの発現の前の真核細胞と、テトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体との接触を保ち、それによってＴ７ＲＮＡＰコード化配列の転写を抑制し、次いで、Ｔ７ＲＮＡＰコード化配列の転写を誘導するために前記テトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体の濃度を下げるか、好ましくは除去する工程。
Ｔｅｔ－Ｏｎシステム（ｒｔＴＡ、＋ｄｏｘ）
第４７の実施形態は、実施形態３７～３９のいずれか１つの方法に関する：
該方法では、
（ｉ）ｐｔＲＮＡの転写合成が、テトラサイクリン応答性プロモーターエレメント（ＴＲＥ）によって制御されるか、又は
（ｉｉ）ｐｔＲＮＡがＲＮＡポリメラーゼによって転写合成され、前記ＲＮＡポリメラーゼの発現がＴＲＥによって制御され；
さらに該方法は、少なくともｐｔＲＮＡの発現と同時に、真核細胞内でリバースｔＴＡ（ｒｔＴＡ）を発現させる工程を含み；
ｐｔＲＮＡの発現は、真核細胞をドキシサイクリン又はその機能的類似体と接触させ、それによってｐｔＲＮＡの転写合成を誘導することを含む。
第４８の実施形態は、実施形態３７～３９及び４７のいずれか１つの方法であるる：
該方法では、
（ｉ）ｐＲＳコード化配列の転写が、テトラサイクリン応答性プロモーターエレメント（ＴＲＥ）によって制御されるか、又は
（ｉｉ）ｐＲＳコード化配列の転写がＲＮＡポリメラーゼによって触媒され、前記ＲＮＡポリメラーゼの発現がＴＲＥによって制御され；
さらに該方法は、少なくともｐＲＳの発現と同時に、真核細胞内でリバースｔＴＡ（ｒｔＴＡ）を発現させる工程を含み；且つ、
ｐＲＳの発現は、真核細胞をドキシサイクリン又はその機能的類似体と接触させ、それによってｐＲＳコード化配列の転写を誘導することを含む。
第４９の実施形態は、実施形態４７又は実施形態４８の方法に関する：
該方法は、
（ｉ）ｐｔＲＮＡの転写合成が、Ｔ７プロモーターによって制御されるか；又は
（ｉｉ）ｐＲＳコード化配列の転写が、Ｔ７プロモーターによって制御されるか；又は
（ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）の両方であり、
さらに該方法は下記工程を含み：
－ （ｉ）ｐｔＲＮＡもしくは（ｉｉ）ｐＲＳ又は（ｉｉｉ）その両方のそれぞれの、それによって制御された発現の前に、又はそれと同時に、真核細胞内でＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ＲＮＡＰ）を発現させる（Ｔ７ＲＮＡＰの発現はＴＲＥによって制御される）工程；
－ Ｔ７ＲＮＡＰの発現と少なくとも同時に真核細胞内でｒｔＴＡを発現させる工程；
Ｔ７ＲＮＡＰの発現は、真核細胞をドキシサイクリン又はその機能的類似体と接触させ、それによってＴ７ＲＮＡＰコード化配列の転写を誘導することを含む。
第５０の実施形態は、ｐｔＲＮＡが、１つ以上のリボザイム（ｐｔＲＮＡ－リボザイム）をさらに含むＲＮＡ分子の一部を発現させる、実施形態３７～４９のいずれか１つの方法に関する。
第５１の実施形態は、実施形態５０の方法に関し、該方法は、実施形態２３～３５のいずれか１つの方法である。
第５２の実施形態は、そのアミノ酸配列中に１つ以上の非標準アミノ酸（ｎｃＡＡ）残基を有する目的のポリペプチド（ＰＯＩ）を調製するためのキットに関する：
該キットは、ＰＯＩの１つ以上のｎｃＡＡ残基に対応する１つ以上のｎｃＡＡ、又はその塩；及び
（ａ）実施形態２１のポリヌクレオチド；又は
（ｂ）実施形態２２のポリヌクレオチド、もしくは２つ以上のポリヌクレオチドの組み合わせ；又は
（ｃ）実施形態１１～１３のいずれか１つに定義されるｄｓＲＮＡ結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；又は
（ｄ）実施形態１～２０のいずれか１つの真核細胞、
を含む。
次に、以下の実験セクションの特定の非限定的な実施形態を参照することにより、本発明をより詳細に説明する。
材料と方法
特に明記しない限り、組換えポリペプチドのクローニング及び発現は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ． ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９に記載されている標準的な方法で実施した。
Ａ）クローニング
レポーター遺伝子ＮＬＳ－ｉＲＦＰ－Ｆｌａｇ－ＧＦＰＹ３９－＞ＴＡＧ－６Ｈｉｓ（配列番号：３９）は、Ｎｉｋｉｃら（Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ ２０１６，５５：１６１７２－１６１７６）に記載されているように、ｐＣＩプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングした。ＮＬＳ－ｉＲＦＰ－Ｆｌａｇ－ＧＦＰＹ３９－＞ＴＡＧ－６Ｈｉｓは、ＧＦＰの３９位がアンバー終止コドンＴＡＧによってコードされるＧＦＰに融合されたｉＲＦＰ（ｉＲＦＰ－ＧＦＰＹ３９ＴＡＧ）を含む。
ＮＥＳシグナルを有する又は有さないＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子（ＮＥＳ－Ｔ７ＲＮＡＰ又はＴ７ＲＮＡＰ）のコード化配列を、ｐｃＤＮＡ３．１プラスミド又はｐＣＡＧＧＳプラスミドに挿入した。ｐｃＤＮＡ３．１プラスミドとｐＣＡＧＧＳプラスミドは、プロモーターが異なる。ｐｃＤＮＡ３．１プラスミドはＣＭＶプロモーターを含む。ｐＣＡＧＧＳプラスミドは、ニワトリアクチンプロモーターとイントロンを有するＣＭＶエンハンサーを含む（配列番号：５６）
構成的発現のために、Ｔ７ＲＮＡＰコード化配列又はＮＥＳ－Ｔ７ＲＮＡＰコード化配列は、ＣＭＶプロモーター（ｐｃＤＮＡ３．１プラスミド）の下流、又はニワトリアクチンプロモーターとイントロン（ｐＣＡＧＧＳプラスミド）の下流に挿入された。Ｔ－ＲＥｘシステムを介した誘導性発現のために、ＮＥＳ－Ｔ７ＲＮＡＰコード化配列は、２つのｔｅｔＯ配列を含む「Ｔ－ＲＥｘ」プロモーター（配列番号：１２、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の下流に挿入された。Ｔｅｔ－Ｏｎシステムを介した誘導性発現のために、ＮＥＳ－Ｔ７ＲＮＡＰコード化配列は、８つのｔｅｔＯ配列を含む「Ｔｅｔ－Ｏｎ」プロモーター（配列番号：１０）の下流に挿入された。ＮＥＳ－Ｔ７ＲＮＡＰの構成的「Ｔ－ＲＥｘ」及び「Ｔｅｔ－Ｏｎ」発現のための発現カセットを、それぞれ配列番号４０～４３に示す。
構成的発現のために、ＮＥＳシグナルを有する又は有さないＰｙｌＲＳＡＦ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ由来）のコード化配列（ＮＥＳ－ＰｙｌＲＳＡＦ又はＰｙｌＲＳＡＦ）を、ＣＭＶプロモーターの下流のｐｃＤＮＡ３．１プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入した。Ｔ－ＲＥｘシステムを介した誘導性発現のために、ＮＥＳ－ＰｙｌＲＳＡＦコード化配列を、２つのｔｅｔＯ配列を含む「Ｔ－ＲＥｘ」プロモーター（配列番号：１２、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の下流でプラスミドｐＤＥＳＴに挿入した。
Ｔｅｔ－Ｏｎシステムを介した誘導性発現のために、ＮＥＳ－ＰｙｌＲＳＡＦコード化配列を、８個のｔｅｔＯ配列を含む「Ｔｅｔ－Ｏｎ」プロモーター（配列番号：１０）の下流でｐｃＤＮＡ３．１プラスミドに挿入した。ＮＥＳ－ＰｙｌＲＳＡＦの構成的「Ｔ－ＲＥｘ」及び「Ｔｅｔ－Ｏｎ」発現のための発現カセットを、それぞれ配列番号４４～４７に示す。
ｔＲＮＡＰｙｌのＴ７プロモーター制御発現カセット（配列番号：４８）は、ｔＲＮＡＰｙｌコード化配列の上流にＴ７プロモーター配列をクローニングし、ｔＲＮＡＰｙｌコード化配列の下流にＴ７終止シグナルをクローニングし、この発現カセットをｐ２ＲＺプラスミドに挿入して生成した（Ａｖｉｓら，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．９４１：８３－９８，２０１２；（図１参照））。ＨＤＶリボザイムを有するこの発現カセットの変異体（ｔＲＮＡＰｙｌ－ＨＤＶ）を、ｔＲＮＡＰｙｌの直接下流にＨＤＶリボザイムコード化配列を挿入するように、制限クローニング、部位特異的変異誘発、及び制限のないクローニングを組み合わせて生成した（配列番号：４９、図１参照）。
Ｔ－ＲＥｘシステムを介した誘導性発現のために、ｔＲＮＡＰｙｌコード化配列をＵ６プロモーターの前に８個のｔｅｔＯ配列、後に２個のｔｅｔＯ配列を含むヒトＵ６プロモーター又は２個のｔｅｔＯ配列を含むヒトＨ１プロモーターのいずれかの変異体の下流で、プラスミドｐＵＣ５７（Ｕ６プロモーターの場合）及びｐＰＢＥＸ（Ｈ１プロモーターの場合）に挿入することにより、ｔｅｔ誘導性プロモーターの制御下にある２つの異なる発現カセットを生成した（配列番号：５０及び５１）。
ｒｔＴＡ又はｔｅｔＲの発現カセットは、ＣＭＶプロモーターの下流にｒｔＴＡコード化配列（配列番号：１４）を含み、ＣＭＶプロモーターの下流にｔｅｔＲコード化配列（配列番号：１３）を含んだ。
ヒトプロテインキナーゼＲのＮ末端ｄｓＲＮＡ結合ドメイン（残基２－１７４）（「ＰＫＲ（２－１７４）」）を、イントロンＡ（ｈＣＭＶ主要前初期（ＩＥ１）遺伝子の転写領域の最大のイントロンであり、タンパク質の発現を増強させる。サイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）は、ヒトβヘルペスウイルス５（ＨＨＶ－５）とも呼ばれる；Ｃｈａｐｍａｎ，Ｂ．Ｓ． ｅｔ ａｌ ＮＡＲ，１９９１，Ｖｏｌ．１９，Ｎ０ １４，２９７９－３９８６参照）を融合したＣＭＶプロモーターの制御下でＮ末端ＨＡタグとともに構成的発現のために、ｐＩ．１８プラスミド（ＵＳ ６，１８７，７５９ Ｂ１；ｈＣＭＶプロモーター、イントロンＡ、ターミネーター配列、及び多重クローニング部位を含むｐＵＣベースのプラスミド）にクローニングした。ＨＡ－ＰＫＲ（２－１７４）のアミノ酸配列は、配列番号３６に示す。
Ｂ）細胞培養とトランスフェクション
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－３２１６）及びＨＥＫ Ｆｌｐ－Ｉｎ Ｔ－ＲＥｘ ２９３細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃Ｒ７８００７）を、１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ Ｐ０７８１、１０，０００Ｕ／ｍｌペニシリン、１０ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、０．９％ＮａＣｌ）、１％Ｌ－グルタミン（Ｓｉｇｍａ ＃Ｇ７５１３）、１％ピルビン酸ナトリウム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＃１１３６０）、及び１０％Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ、Ｓｉｇｍａ ＃Ｆ７５２４）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ＃４１９６５－０３９）中で維持した。
ＨＥＫ Ｆｌｐ－Ｉｎ Ｔ－ＲＥｘ ２９３細胞について、メーカーのマニュアルに従って、培地にブラストサイジン（１５μｇ／ｍｌ）を添加した。ＨＥＫ Ｆｌｐ－Ｉｎ Ｔ－ＲＥｘ ２９３細胞株はＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５７３）に由来し、構成型ＣＭＶプロモーターの制御下でｔｅｔリプレッサー（ｔｅｔＲ）遺伝子を安定して発現する。ユーザーガイド「Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｌｐ－ＩｎＴＭ Ｔ－ＲＥｘＴＭ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ」（カタログ番号：Ｒ７８０－０７、文書部分番号：２５－０３６９、出版番号：ＭＡＮ００００１８７、改訂２．０、１４．０９．１５、Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓを参照のこと。
細胞を３７℃、５％ ＣＯ２雰囲気下で培養し、２～３日ごとに１５～２０継代まで継代した。
細胞はトランスフェクションの１５～２０時間前に播種し（約１１０，０００個／ウェル）、２４ウェルプレートの細胞培養プレートで、３７℃、５％ ＣＯ２雰囲気で７０～８０％の培養密度になるまで増殖させた。ＨＥＫ ＴｅｔＯｎ－３Ｇ細胞のために、細胞培養プレートは、前もってポリリジン臭化水素酸塩で４～１０時間コーティングした。３及び４回のプラスミドトランスフェクションでは、１．２μｇの全ＤＮＡ／ウェルを使用した。５又は６回のプラスミドトランスフェクションでは、１．５μｇの全ＤＮＡ／ウェルを使用した。トランスフェクションは、ＤＮＡ対ＰＥＩ比を１対３として、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いて行った。
Ｃ）発現誘導とｎｃＡＡの補給
トランスフェクションの４時間後に、培地を新鮮な培地に交換した。実験及びサンプルに応じて、前記新鮮な培地は、１μｇ／ｍｌテトラサイクリン（Ｔ－ＲＥｘシステム、ｔｅｔＲ共発現システムにおける発現誘導用）又は１μｇ／ｍｌドキシサイクリン（Ｔｅｔ－Ｏｎシステムにおける発現誘導用）及び／又は２５０μＭの使用されるｎｃＡＡ（例えばＢＯＣ）を含むか、又はこれらのいずれも含まない（表示濃度＝細胞培養における終濃度）。
次いで、細胞を３７℃、５％ ＣＯ２雰囲気で２日間培養し、その後、本明細書に記載の方法で解析した。
Ｄ）フローサイトメトリー分光法（ＦＣＳ）による解析
細胞は１ｘＰＢＳで１回洗浄し、フローサイトメトリー分光法で解析した。データの取得と解析は、ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ装置（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）とＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ）を用いて実施した。ＧＦＰ蛍光は４８８ｎｍレーザーを用いて５３０／３０ｎｍで検出し、ｉＲＦＰ蛍光は６７０ｎｍレーザーを用いて７３０／４５ｎｍで検出し、取得した。
測定されたイベントは、最初に生細胞のＦＳＣ－Ａ ｘ ＳＳＣ－Ａ散布図で、次に一重項のＦＳＣ－Ａ ｘ ＳＳＣ－Ｗ散布図でゲーティングした。図では、一重項ゲートのイベントをＧＦＰシグナル対ｉＲＦＰシグナルのプロットとして示しており、４つの異なる種を示す４つの領域に分割している：左上はｉＲＦＰ蛍光を持つ細胞（ＧＦＰを欠く）；右上はｉＲＦＰとＧＦＰの両方の蛍光を持つ細胞（全長タンパク質ｉＲＦＰ－ＧＦＰを発現、「ダブルポジティブサンプル」あるいは「ＤＰ」と呼ばれる）、右下はＧＦＰ蛍光を持つ細胞（ｉＲＦＰを欠く）、左下はｉＲＦＰとＧＦＰの両方を欠く細胞である。
レポーターＮＬＳ－ｉＲＦＰ－Ｆｌａｇ－ＧＦＰＹ３９－＞ＴＡＧ－６Ｈｉｓは、ｉＲＦＰ（赤外蛍光タンパク質）とＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）の融合体であり、ＧＦＰのアミノ酸位置３９がアンバー（ＴＡＧ）終止コドンでコードされている。適切にトランスフェクトされると細胞はｉＲＦＰ（赤色蛍光として検出可能）を発現させ、アンバーコドンを抑制してｎｃＡＡ（ここではＢＯＣ又はＳＣＯ）をコードした場合のみ、さらにＧＦＰ（緑色蛍光として検出可能）を発現させる。したがって、細胞内の緑色蛍光（ＧＦＰ）と赤色蛍光（ｉＲＦＰ）の比率は、アンバー抑制効率の指標となる。
実施例１：ＲＮＡリボザイムとして発現させたｔＲＮＡＰｙｌを用いたアンバー抑制
ＰＫＲ（２－１７４）の存在下、レポーター遺伝子ＮＬＳ－ｉＲＦＰ－Ｆｌａｇ－ＧＦＰＹ３９－＞ＴＡＧ－６Ｈｉｓ、ＰｙｌＲＳＡＦ、ｔＲＮＡＰｙｌ、及びｎｃＡＡ ＳＣＯを用いてアンバー抑制を試験した。
ＰＫＲ（２－１７４）は、Ｎ－末端ＨＡタグ（配列番号：３６）とともにＨＡ－ＰＫＲ（２－１７４）として発現させた。ｔＲＮＡＰｙｌはＨＤＶリボザイムとともにｔＲＮＡ－リボザイムＲＮＡ分子（ｔＲＮＡＰｙｌ－ＨＤＶ）として発現させた。ＰｙｌＲＳＡＦは、ＣＭＶプロモーターの制御下で発現させた。細胞はさらにＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ＲＮＡＰ）を発現させた。
ＰｙｌＲＳＡＦとＴ７ＲＮＡＰを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－３２１６）を用いて構成的に発現させた。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、レポーター遺伝子ＮＬＳ－ｉＲＦＰ－Ｆｌａｇ－ＧＦＰＹ３９－＞ＴＡＧ－６Ｈｉｓ、ＣＭＶプロモーター制御下のＰｙｌＲＳＡＦ、Ｔ７プロモーター制御下のｔＲＮＡＰｙｌ－ＨＤＶ、及びＣＭＶプロモーター制御下のＴ７ＲＮＡＰ用発現カセットを有するベクターと、上記Ａ）及びＢ）のセクションに記載のそれぞれの構築物及びトランスフェクション法を使用して、トランスフェクトした。
コントロールは、細胞にＳＣＯ（「－ｎｃＡＡ」）を与えなかったこと、及び／又はＨＤＶリボザイムなしでｔＲＮＡＰｙｌを発現させたことを除いて、同様に調製した。
細胞を、上記セクションＤ）に記載のように、ＦＣＳによって分析した。図２（ｐｃＤＮＡ３．１プラスミドを使用）及び図３（ｐＣＡＧＧＳプラスミドを使用）に示す結果は、ＨＤＶリボザイムとともにｔＲＮＡＰｙｌを発現させると、リボザイムなしで発現したｔＲＮＡＰｙｌと比較して、より効率的なアンバー抑制が得られた。理論に縛られることなく、この効果はリボザイムがｔＲＮＡのプロセシングを改善したことに起因すると推測される。
実施例２：様々な誘導性発現システムを用いたアンバー抑制
レポーター遺伝子ＮＬＳ－ｉＲＦＰ－Ｆｌａｇ－ＧＦＰＹ３９－＞ＴＡＧ－６Ｈｉｓ、ＰｙｌＲＳＡＦ、ｔＲＮＡＰｙｌ、及びｎｃＡＡ ＢＯＣを用いてアンバー抑制を試験した。ｔＲＮＡＰｙｌは、ＨＤＶリボザイムとともにｔＲＮＡ－リボザイムＲＮＡ分子（ｔＲＮＡＰｙｌ－ＨＤＶ）としてＴ７プロモーター制御下に発現した。ＰｙｌＲＳＡＦはＮＥＳシグナルとともに発現させた（ＮＥＳ－ＰｙｌＲＳＡＦ）。この細胞はさらにＴ７ ＲＮＡポリメラーゼをＮＥＳシグナルとともに発現させた（ＮＥＳ－Ｔ７ＲＮＡＰ）。
ＮＥＳ－ＰｙｌＲＳＡＦとＮＥＳ－Ｔ７ＲＮＡＰは、Ｔ－ＲＥｘシステム又はＴｅｔ－Ｏｎシステムを用いて誘導的に発現させた。
Ｔ－ＲＥｘシステムについては、ＨＥＫ Ｆｌｐ－Ｉｎ Ｔ－ＲＥｘ ２９３細胞を、レポーター遺伝子ＮＬＳ－ｉＲＦＰ－Ｆｌａｇ－ＧＦＰＹ３９－＞ＴＡＧ－６Ｈｉｓ、「Ｔ－ＲＥｘ」プロモーターの制御下のＮＥＳ－ＰｙｌＲＳＡＦ、Ｔ７プロモーターの制御下のｔＲＮＡＰｙｌ－ＨＤＶ、及び「Ｔ－ＲＥｘ」プロモーター制御下のＮＥＳ－Ｔ７ＲＮＡＰ用発現カセットを有するベクターと、上記のセクションＡ）及びＢ）に記載したそれぞれの構築物及びトランスフェクション方法を使用してトランスフェクションした。ＨＥＫ Ｆｌｐ－Ｉｎ Ｔ－ＲＥｘ ２９３細胞は、ｔｅｔリプレッサー（ｔｅｔＲ）遺伝子を安定的に発現する。ＮＥＳ－Ｔ７ＲＮＡＰ（ひいてはｔＲＮＡＰｙｌ－ＨＤＶ）及びＮＥＳ－ＰｙｌＲＳＡＦの発現をテトラサイクリンの添加により誘導し、細胞に上記セクションＣ）に記載のｎｃＡＡ ＢＯＣを供給した。
Ｔｅｔ－Ｏｎシステムについては、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－３２１６）を、レポーター遺伝子ＮＬＳ－ｉＲＦＰ－Ｆｌａｇ－ＧＦＰＹ３９－＞ＴＡＧ－６Ｈｉｓ、「Ｔｅｔ－Ｏｎ」プロモーターの制御下のＮＥＳ－ＰｙｌＲＳＡＦ、Ｔ７プロモーター制御下のｔＲＮＡＰｙｌ－ＨＤＶ、「Ｔｅｔ－Ｏｎ」プロモーター制御下のＮＥＳ－Ｔ７ＲＮＡＰ、及びｒｔＴＡ用発現カセットを有するベクターと、ＰＫＲ（２－１７４）の存在下で、上記セクションＡ）及びＢ）に記載のそれぞれの構築物及びトランスフェクション方法を用いて共トランスフェクトした。ＰＫＲ（２－１７４）は、ＨＡ－ＰＫＲ（２－１７４）として、Ｎ末端のＨＡ－ｔａｇ（配列番号：３６）と共に発現させた。ＮＥＳ－Ｔ７ＲＮＡＰ（ひいてはｔＲＮＡＰｙｌ－ＨＤＶ）及びＮＥＳ－ＰｙｌＲＳＡＦの発現を、ドキシサイクリンの添加によって誘導し、上記セクションＣ）に記載のように細胞にｎｃＡＡ ＢＯＣを供給した。
コントロールは、テトラサイクリンもドキシサイクリンも添加しないことを除いて、同様に調製した。
この細胞は、上記セクションＤ）に記載のようにＦＣＳによって分析した。図４に示す結果から、誘導的に発現させたｔＲＮＡＰｙｌ－ＨＤＶ及びＮＥＳ－ＰｙｌＲＳＡＦとともにＢＯＣを用いたアンバー抑制は、Ｔ－ＲＥｘシステム（図４ａ）及びＴｅｔ－Ｏｎシステム（図４ｂ）の両方で有効に機能することが示された。
実施例３：誘導性及び非誘導性発現システムにおけるＰＫＲ（２－１７４）のアンバー抑制効果
ＰＫＲ（２－１７４）の存在下又は非存在下で、レポーター遺伝子ＮＬＳ－ｉＲＦＰ－Ｆｌａｇ－ＧＦＰＹ３９－＞ＴＡＧ－６Ｈｉｓ、ＰｙｌＲＳＡＦ、ｔＲＮＡＰｙｌ、ｔｅｔＲ、及びｎｃＡＡ ＢＯＣを用いてアンバー抑制を試験した。
ＰＫＲ（２－１７４）は、Ｎ－末端ＴＡ－タグ（配列番号：３６）と共にＨＡ－ＰＫＲ（２－１７４）として発現させた。
ｔＲＮＡＰｙｌ用の３つの異なる発現カセットのうちの１つを使用した：Ｔ７－ｔＲＮＡＰｙｌ－ＨＤＶ（Ｔ７プロモーターの制御下で、ｔＲＮＡＰｙｌはｔＲＮＡ－リボザイムＲＮＡ分子（ｔＲＮＡＰｙｌ－ＨＤＶ）としてＨＤＶリボザイム（ｔＲＮＡＰｙｌの３’－末端に位置する）と共に発現した）；８ｘｔｅｔＯ－Ｕ６－ｔｅｔＯ－ｔＲＮＡＰｙｌ（ｔＲＮＡＰｙｌの発現が、Ｕ６プロモーターの前の８つのｔｅｔＯ配列とＵ６プロモーターの後の２つのｔｅｔＯ配列を含むヒトＵ６プロモーターのテトラサイクリン誘導性変異体により制御される（配列番号：５０））；及び、Ｈ１－ＴｅｔＯ－ｔＲＮＡＰｙｌ（ｔＲＮＡＰｙｌの発現が、２つのｔｅｔＯ配列を含むヒトＨ１プロモーターのテトラサイクリン誘導性変異体によって制御される（配列番号：５１））。
ＰｙｌＲＳＡＦは、ＮＥＳシグナルと一緒に発現させた（ＮＥＳ－ＰｙｌＲＳＡＦ）。ＮＥＳ－ＰｙｌＲＳＡＦ用の２つの異なる発現カセットのうち１つを使用した：ＣＭＶ－ｔｅｔＯ－ＮＥＳ－ＰｙｌＲＳＡＦ（ＮＥＳ－ＰｙｌＲＳＡＦの発現が、２つのｔｅｔＯ配列を含むＣＭＶプロモーターのテトラサイクリン誘導性変異体によって制御される（配列番号：４６））；ＣＭＶ－ＮＥＳ－ＰｙｌＲＳＡＦ（ＮＥＳ－ＰｙｌＲＳＡＦの発現が、（構成型）ＣＭＶプロモーターによって制御される（配列番号：４５））。
ｔＲＮＡＰｙｌの発現が、Ｔ７プロモーター（発現カセットＴ７－ｔＲＮＡＰｙｌ－ＨＤＶ）によって制御された細胞は、ＮＥＳシグナル（ＮＥＳ－Ｔ７ＲＮＡＰ）と共に発現されるＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ用の２つの異なる発現カセットのうちの１つをさらに含む：ＣＭＶ－ｔｅｔＯ－Ｔ７ＲＮＡＰ（ＮＥＳ－Ｔ７ＲＮＡＰ発現が、２つのｔｅｔＯ配列を含むＣＭＶプロモーターのテトラサイクリン誘導性変異体の制御下にある（配列番号：１２）；ＣＭＶ－ＮＥＳ－Ｔ７ＲＮＡＰ（ＮＥＳ－Ｔ７ＲＮＡＰ発現が、（構成型）ＣＭＶプロモーターの制御下にある（配列番号：４３））。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、以下の発現カセットの組み合わせを搭載したベクターをトランスフェクトした（×は組み合わせにおけるそれぞれの発現カセットの存在を示す）。
コントロールは同じ方法で調製したが、ＨＡ－ＰＫＲ（２－１７４）の発現カセットは含まなかった。
ｔｅｔ誘導性エレメントの発現のためにテトラサイクリンを添加し、上記セクションＣ）に記載のように、細胞にｎｃＡＡ ＢＯＣを供給した。コントロール試料は、テトラサイクリン及びＢｏｃの一方又は両方の添加を除外したことを以外は、同様に調製した。
細胞を、上記セクションＤ）に記載のように、ＦＣＳによって分析した。図５に示す結果は、ＰＫＲ（２－１７４）の共発現により、ダブルポジティブ細胞で検出されるＧＦＰ蛍光の強度が増加し、細胞あたりの完全なレポーター遺伝子発現産物の量が増加する（アンバー抑制が成功した結果）ことを示す。
略語：
ＢＣＮ＝２－アミノ－６－（９－ビオシクロ［６．１．０］ノナ－４－イニルメトキシカルボニルアミノ）ヘキサノイド酸
ＢＯＣ＝２－アミノ－６－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノ）ヘキサン酸、実施例において「ＢＯＣ」は特に（２Ｓ）－２－アミノ－６－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノ）ヘキサン酸＝Ｂｏｃ－ｌ－Ｌｙｓ－ＯＨ＝Ｎ－α－ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル－ｌ－リシン
ＣＭＶ＝サイトメガロウイルス
Ｃｒｍ１＝染色体領域維持１（カリオフェリンエクスポーチン１としても知られる）
ｄｓＲＮＡ＝二本鎖ＲＮＡ
ｄＳＴＯＲＭ＝直接確率的光学再構築顕微鏡法
Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）ＡＩ＝大腸菌株ＢＦ－ｏｍｐＴ ｇａｌ ｄｃｍ ｌｏｎ ｈｓｄＳＢ（ｒＢ －ｍＢ －）λ（ＤＥ３［ｌａｃＩ ｌａｃＵＶ５－Ｔ７ｐ０７ ｉｎｄ１ ｓａｍ７ ｎｉｎ５］）［ｍａｌＢ＋］Ｋ－１２（λＳ）ａｒａＢ：：Ｔ７ＲＮＡＰ－ｔｅｔＡ
ｅＩＦ－２α＝真核生物開始因子２のαサブユニット
ＦＢＳ＝ウシ胎児血清
ＦＩＳＨ＝蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
ＧＣＥ＝遺伝暗号の拡張
ＧＦＰ＝緑色蛍光タンパク質
ｇｌｍＳ＝グルコサミン－６－リン酸シンテターゼ
Ｈ１プロモーター＝ヒトＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター
ＨＤＶ＝デルタ型肝炎ウイルス
ＩＰＴＧ＝イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド
ｉＲＦＰ＝赤外蛍光タンパク質
ｎｃＡＡ＝非標準アミノ酸
ＮＥＳ＝核外搬出シグナル
ＮＬＳ＝核局在化シグナル
Ｏ－ｔＲＮＡ＝直交ｔＲＮＡ
Ｏ－ＲＳ＝直交ＲＳ
ＰＡＩＮＴ＝ナノスケールトポグラフィにおけるイメージングのための点集積
ＰＢＳ＝リン酸緩衝生理食塩水
ＰＫＲ＝プロテインキナーゼＲ；別名：ｄｓＲＮＡ依存性プロテインキナーゼ、インターフェロン（ＩＦＮ）誘導性ｄｓＲＮＡ活性化セリン／スレオニン－プロテインキナーゼ、ｐ６８キナーゼ
ＰＭＳＦ＝フッ化フェニルメチルスルホニル
ＰＯＩ＝目的のポリペプチド、標的ポリペプチド
ＰｒＫ＝２－アミノ－６－（プロパ－２－イノキシカルボニルアミノ）ヘキサン酸
ｐＲＳ＝原核生物ＲＳ
ｐｔＲＮＡ＝原核生物ｔＲＮＡ
ｐｔＲＮＡ－リボザイム＝ｐｔＲＮＡと少なくとも１つのリボザイムを含む原核生物ＲＮＡ分子
ＰｙｌＲＳ＝ピロリジルｔＲＮＡ合成酵素
ＰｙｌＲＳＡＦ＝アミノ酸置換Ｙ３０６Ａ及びＹ３８４Ｆを含む変異型Ｍ．ｍａｚｅｉピロリジルｔＲＮＡ合成酵素
ＲＰ－ＨＰＬＣ＝逆相高速液体クロマトグラフィー
ＲＳ＝アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素
ＲＴ＝室温
ｒｔＴＡ＝リバースｔＴＡ
ＳＣＯ＝２－アミノ－６－（シクロオクタ－２－イン－１－イルオキシカルボニルアミノ）ヘキサン酸
ＳＰＡＡＣ＝（銅フリー）歪み促進アルキン－アジド環状付加反応
ＳＰＩＥＤＡＣ＝（銅フリー）歪み促進逆電子要請型Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ環状付加反応
ＳＲＭ＝超解像顕微鏡法
ＳＶ４０＝シミアン空胞形成ウイルス４０
Ｔ７ＲＮＡＰ＝Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ
ＴＣＯ＝２－アミノ－６［（２Ｅ－シクロオクタ－２－エン－１－イル）オキシカルボニルアミノ］ヘキサン酸
ＴＣＯ＊＝２－アミノ－６［（２Ｅ－シクロオクタ－２－エン－１－イル）オキシカルボニルアミノ］ヘキサン酸
ｔｅｔＲ＝テトラサイクリンリプレッサー
ｔｅｔＯ＝テトラサイクリンオペレーター
ｔＴＡ＝テトラサイクリン制御転写活性化因子
ＴＲＥ＝テトラサイクリン応答性プロモーターエレメント（テトラサイクリン応答性エレメントともいう）
ｔＲＮＡＰｙｌ＝野生型又は改変型ＰｙｌＲＳによってピロリジンでアシル化され、ｎｃＡＡをＰＯＩに部位特異的に組み込むために、好ましくはセレクタコドンの逆相補体であるアンチコドンを有するｔＲＮＡ（実施例で使用したｔＲＮＡＰｙｌでは、アンチコドンはＣＵＡである）
Ｕ６プロモーター＝哺乳類細胞内で、通常、Ｕ６ ＲＮＡ（核小体ＲＮＡ）の発現を制御するプロモーター
ＶＳ＝Ｖａｒｋｕｄ ｓａｔｅｌｌｉｔｅ

Claims (27)

  1. 以下を含む真核細胞であって：
    （ａ）原核生物のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ｐＲＳ）をコードするポリヌクレオチド；
    （ｂ）原核生物ｔＲＮＡ（ｐｔＲＮＡ）及び１つ以上のリボザイムをコードするポリヌクレオチド；
    ｐＲＳは、ｐｔＲＮＡをアシル化することができ、且つ、
    ｐｔＲＮＡ及びリボザイムをコードする配列が、転写によってｐｔＲＮＡ及びリボザイムの両方を含むＲＮＡ分子（ｐｔＲＮＡ－リボザイム）を生成するように連結されている、真核細胞。
  2. リボザイムが、ハンマーヘッドリボザイム、ヘアピンリボザイム、Ｖａｒｋｕｄ ｓａｔｅｌｌｉｔｅリボザイム、グルコサミン－６－リン酸合成酵素リボスイッチ、及び肝炎デルタウイルス（ＨＤＶ）リボザイムから選択される、請求項１に記載の真核細胞。
  3. リボザイムが、ｐｔＲＮＡ－リボザイムにおいてｐｔＲＮＡの３’末端に直接連結しているＨＤＶリボザイムである、請求項１又は２に記載の真核細胞。
  4. （ｉ）ｐｔＲＮＡ－リボザイムの転写合成が、テトラサイクリン応答性プロモーターエレメント（ＴＲＥ）によって制御されるか、又は
    （ｉｉ）ｐｔＲＮＡ－リボザイムが、ＲＮＡポリメラーゼによって転写合成され、前記ＲＮＡポリメラーゼの発現がＴＲＥによって制御される、
    請求項１～３のいずれか一項に記載の真核細胞。
  5. ｐＲＳコード化配列の転写が、テトラサイクリン応答性プロモーターエレメント（ＴＲＥ）によって制御される、請求項１～４のいずれか一項に記載の真核細胞。
  6. さらに、テトラサイクリンオペレーター（ｔｅｔＯ）配列に結合するタンパク質（ｔｅｔＯ結合タンパク質）をコードするポリヌクレオチドを含み、
    ｔｅｔＯ結合タンパク質が、以下からなる群から選択される、請求項４又は５に記載の真核細胞：
    （ｉ）テトラサイクリンリプレッサー（ｔｅｔＲ）；
    （ｉｉ）テトラサイクリン制御転写活性化因子（ｔＴＡ）；及び
    （ｉｉｉ）リバースｔＴＡ（ｒｔＴＡ）。
  7. 請求項１～６のいずれか一項に記載の真核細胞であって、
    （ｉ）ｐｔＲＮＡ－リボザイムの転写合成が、Ｔ７プロモーターによって制御される、及び／又は
    （ｉｉ）ｐＲＳコード化配列の転写が、Ｔ７プロモーターによって制御される、
    さらに、
    （ｃ）Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ＲＮＡＰ）をコードするポリヌクレオチドを含む、真核細胞。
  8. Ｔ７ＲＮＡＰの発現がＴＲＥによって制御される、請求項７に記載の真核細胞。
  9. Ｔ７ＲＮＡＰが、以下を有する：
    （ｉ）核局在化シグナル（ＮＬＳ）；もしくは、
    （ｉｉ）核搬出シグナル（ＮＥＳ）；又は、
    Ｔ７ＲＮＡＰが、
    （ｉｉｉ）ＮＥＳ及びＮＬＳを有さない、
    請求項７又は８に記載の真核細胞。
  10. ｄｓＲＮＡ結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の真核細胞。
  11. 請求項１～４及び７のいずれか一項に定義される、ｐｔＲＮＡ及び１つ以上のリボザイム（ｐｔＲＮＡ－リボザイム）を含むＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドであって、
    ａ）リボザイムが、ｐｔＲＮＡ－リボザイムにおいてｐｔＲＮＡの３’末端に直接連結しているＨＤＶリボザイムであり、前記ｐｔＲＮＡは３’末端アミノアシル受容体幹モチーフＣＣＡを欠いているか；又は、
    ｂ）ｐｔＲＮＡが、メタノサルキナ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ）種のピロリジルｔＲＮＡに由来するか；又は、
    ｃ）ｐｔＲＮＡ分子が、３’末端アミノアシル受容体幹モチーフＣＣＡを欠いてコードされるか；又は、
    ｄ）ｐｔＲＮＡが、以下のヌクレオチド配列（配列番号：６０）ｇｇａａａｃｃｔｇａｔｃａｔｇｔａｇａｔｃｇａａｔｇｇａｃｔｎｎｎａａｔｃｃｇｔｔｃａｇｃｃｇｇｇｔｔａｇａｔｔｃｃｃｇｇｇｇｔｔｔｃｃｇ（ｎｎｎはアンチコドンをコードする）によってコードされる、ポリヌクレオチド。
  12. 前記メタノサルキナ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ）種はメタノサルキナ・マゼイ（Ｍ．ｍａｚｅｉ）である、請求項１１に記載のポリヌクレオチド。
  13. 請求項１～４及び７のいずれか一項に定義される、ｐｔＲＮＡ及び１つ以上のリボザイム（ｐｔＲＮＡ－リボザイム）を含むＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列；並びに、
    （ｉ）請求項６に定義されるｔｅｔＯ結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列、又は、
    （ｉｉ）請求項６に定義されるｔｅｔＯ結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、請求項１、５及び７のいずれか一項に定義されるｐＲＳをコードするヌクレオチド配列、
    を含むポリヌクレオチド、又は２つ以上のポリヌクレオチドの組み合わせ。
  14. そのアミノ酸配列中に１つ以上の非標準アミノ酸（ｎｃＡＡ）残基を有する目的のポリペプチド（ＰＯＩ）を調製する方法であって、
    以下の工程を含み：
    （ａ）真核細胞内で、
    － 原核生物アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ｐＲＳ）；及び、
    － 原核生物ｔＲＮＡ（ｐｔＲＮＡ）及び１つ以上のリボザイム（ｐｔＲＮＡ－リボザイム）を含むＲＮＡ分子、
    を発現させる工程；
    並びに、同時又は順々に、
    （ｂ）真核細胞内で、ＰＯＩの１つ以上のｎｃＡＡ残基に対応する１つ以上のｎｃＡＡ又はその塩の存在下で、ＰＯＩを発現させる工程；及び、
    （ｃ）任意に、発現したＰＯＩを回収する工程；
    ｐＲＳは、ｐｔＲＮＡをｎｃＡＡ又はその塩でアシル化することが可能であり、
    ＰＯＩは、１つ以上のｎｃＡＡ残基をコードする１つ以上のセレクタコドンを含むヌクレオチド配列によってコードされ、且つ、
    セレクタコドンは、ｐｔＲＮＡのアンチコドンの逆相補体である、方法。
  15. ｐｔＲＮＡ－リボザイムの転写合成がＴ７プロモーターによって制御される請求項１４に記載の方法であって、
    さらに、（ｉ）ｐｔＲＮＡ－リボザイムもしくは（ｉｉ）ｐＲＳ又は（ｉｉｉ）その両方のそれぞれの、それによって制御された発現の前に、又はそれと同時に、真核細胞内でＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ＲＮＡＰ）を発現させる工程を含む、方法。
  16. 請求項１４に記載の方法であって、
    （ｉ）ｐｔＲＮＡ－リボザイムの転写合成が、テトラサイクリン応答性プロモーターエレメント（ＴＲＥ）によって制御されるか；又は
    （ｉｉ）ｐｔＲＮＡ－リボザイムがＲＮＡポリメラーゼによって転写合成され、前記ＲＮＡポリメラーゼの発現がＴＲＥによって制御され；
    さらに該方法は、少なくともｐｔＲＮＡ－リボザイムの発現の前に、真核細胞内でテトラサイクリンリプレッサー（ｔｅｔＲ）を発現させる工程を含み；且つ、
    ｐｔＲＮＡ－リボザイムの発現が、真核細胞をテトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体と接触させ、それによってｐｔＲＮＡ－リボザイムの転写合成を誘導することを含む、方法。
  17. 請求項１４～１６のいずれか一項に記載の方法であって、
    （ｉ）ｐＲＳコード化配列の転写が、テトラサイクリン応答性プロモーターエレメント（ＴＲＥ）により制御されるか；又は
    （ｉｉ）ｐＲＳコード化配列の転写が、ＲＮＡポリメラーゼによって触媒され、前記ＲＮＡポリメラーゼの発現が、ＴＲＥによって制御され；
    さらに該方法が、少なくともｐＲＳの発現の前に、真核細胞内でテトラサイクリンリプレッサー（ｔｅｔＲ）を発現させる工程を含み；且つ、
    ｐＲＳの発現が、真核細胞をテトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体と接触させ、それによってｐＲＳコード化配列の転写を誘導することを含む、方法。
  18. 請求項１６又は１７に記載の方法であって、
    （ｉ）ｐｔＲＮＡ－リボザイムの転写合成が、Ｔ７プロモーターによって制御されるか；又は
    （ｉｉ）ｐＲＳコード化配列の転写が、Ｔ７プロモーターによって制御されるか；又は
    （ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）の両方であり、
    さらに該方法は下記工程を含み：
    － （ｉ）ｐｔＲＮＡ－リボザイムもしくは（ｉｉ）ｐＲＳ又は（ｉｉｉ）その両方のそれぞれの、それによって制御された発現の前に、又はそれと同時に、真核細胞内でＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ＲＮＡＰ）を発現させる（Ｔ７ＲＮＡＰの発現はＴＲＥによって制御される）工程；及び
    － Ｔ７ＲＮＡＰの発現と少なくとも同時に真核細胞内でｔｅｔＲを発現させる工程；
    Ｔ７ＲＮＡＰの発現が、真核細胞をテトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体と接触させ、それによってＴ７ＲＮＡＰコード化配列の転写を誘導することを含む、方法。
  19. 請求項１４に記載の方法であって、
    （ｉ）ｐｔＲＮＡ－リボザイムの転写合成が、テトラサイクリン応答性プロモーターエレメント（ＴＲＥ）によって制御されるか；又は
    （ｉｉ）ｐｔＲＮＡ－リボザイムがＲＮＡポリメラーゼによって転写合成され、前記ＲＮＡポリメラーゼの発現がＴＲＥによって制御され；
    さらに下記工程を含む方法：
    （１）ｐｔＲＮＡ－リボザイムの発現の前に、及びそれと同時に、テトラサイクリン制御転写活性化因子（ｔＴＡ）を真核細胞内で発現させる工程；及び
    （２）ｐｔＲＮＡ－リボザイムの発現の前の真核細胞と、テトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体との接触を保ち、それによってｐｔＲＮＡ－リボザイムの転写合成を抑制し、次いで、ｐｔＲＮＡ－リボザイムの転写合成を誘導するために前記テトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体の濃度を下げる工程。
  20. 請求項１４に記載の方法であって、
    （ｉ）ｐｔＲＮＡ－リボザイムの転写合成が、テトラサイクリン応答性プロモーターエレメント（ＴＲＥ）によって制御されるか；又は
    （ｉｉ）ｐｔＲＮＡ－リボザイムがＲＮＡポリメラーゼによって転写合成され、前記ＲＮＡポリメラーゼの発現がＴＲＥによって制御され；
    さらに下記工程を含む方法：
    （１）ｐｔＲＮＡ－リボザイムの発現の前に、及びそれと同時に、テトラサイクリン制御転写活性化因子（ｔＴＡ）を真核細胞内で発現させる工程；及び
    （２）ｐｔＲＮＡ－リボザイムの発現の前の真核細胞と、テトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体との接触を保ち、それによってｐｔＲＮＡ－リボザイムの転写合成を抑制し、次いで、ｐｔＲＮＡ－リボザイムの転写合成を誘導するために前記テトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体を除去する工程。
  21. 請求項１４～２０のいずれか一項に記載の方法であって、
    （ｉ）ｐＲＳコード化配列の転写が、ＴＲＥによって制御されるか、又は
    （ｉｉ）ｐＲＳコード化配列の転写がＲＮＡポリメラーゼによって触媒され、前記ＲＮＡポリメラーゼの発現が、ＴＲＥによって制御され、
    さらに下記工程を含む方法：
    （１）ｐＲＳの発現の前に、及びそれと同時に、テトラサイクリン制御転写活性化因子（ｔＴＡ）を真核細胞内で発現させる工程；及び
    （２）ｐＲＳの発現の前の真核細胞と、テトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体との接触を保ち、それによってｐＲＳコード化配列の転写を抑制し、次いで、ｐＲＳコード化配列の転写を誘導するために前記テトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体の濃度を下げる工程。
  22. 請求項１４～２０のいずれか一項に記載の方法であって、
    （ｉ）ｐＲＳコード化配列の転写が、ＴＲＥによって制御されるか、又は
    （ｉｉ）ｐＲＳコード化配列の転写がＲＮＡポリメラーゼによって触媒され、前記ＲＮＡポリメラーゼの発現が、ＴＲＥによって制御され、
    さらに下記工程を含む方法：
    （１）ｐＲＳの発現の前に、及びそれと同時に、テトラサイクリン制御転写活性化因子（ｔＴＡ）を真核細胞内で発現させる工程；及び
    （２）ｐＲＳの発現の前の真核細胞と、テトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体との接触を保ち、それによってｐＲＳコード化配列の転写を抑制し、次いで、ｐＲＳコード化配列の転写を誘導するために前記テトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体を除去する工程。
  23. 請求項１９～２２のいずれか一項に記載の方法であって、
    （ｉ）ｐｔＲＮＡ－リボザイムの転写合成が、Ｔ７プロモーターによって制御されるか、又は
    （ｉｉ）ｐＲＳコード化配列の転写が、Ｔ７プロモーターによって制御されるか、又は
    （ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）の両方であり、
    さらに下記工程を含む方法：
    （３）（ｉ）ｐｔＲＮＡ－リボザイムもしくは（ｉｉ）ｐＲＳ又は（ｉｉｉ）その両方のそれぞれの、それによって制御された発現の前に、又はそれと同時に、真核細胞内でＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ＲＮＡＰ）を発現させる（Ｔ７ＲＮＡＰの発現はＴＲＥによって制御される）工程；
    （４）Ｔ７ＲＮＡＰの発現の前に、及びそれと同時に、ｔＴＡを真核細胞内で発現させる工程；及び
    （５）Ｔ７ＲＮＡＰの発現の前の真核細胞と、テトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体との接触を保ち、それによってＴ７ＲＮＡＰコード化配列の転写を抑制し、次いで、Ｔ７ＲＮＡＰコード化配列の転写を誘導するために前記テトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体の濃度を下げる工程。
  24. 請求項１９～２２のいずれか一項に記載の方法であって、
    （ｉ）ｐｔＲＮＡ－リボザイムの転写合成が、Ｔ７プロモーターによって制御されるか、又は
    （ｉｉ）ｐＲＳコード化配列の転写が、Ｔ７プロモーターによって制御されるか、又は
    （ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）の両方であり、
    さらに下記工程を含む方法：
    （３）（ｉ）ｐｔＲＮＡ－リボザイムもしくは（ｉｉ）ｐＲＳ又は（ｉｉｉ）その両方のそれぞれの、それによって制御された発現の前に、又はそれと同時に、真核細胞内でＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ＲＮＡＰ）を発現させる（Ｔ７ＲＮＡＰの発現はＴＲＥによって制御される）工程；
    （４）Ｔ７ＲＮＡＰの発現の前に、及びそれと同時に、ｔＴＡを真核細胞内で発現させる工程；及び
    （５）Ｔ７ＲＮＡＰの発現の前の真核細胞と、テトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体との接触を保ち、それによってＴ７ＲＮＡＰコード化配列の転写を抑制し、次いで、Ｔ７ＲＮＡＰコード化配列の転写を誘導するために前記テトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体を除去する工程。
  25. 請求項１４に記載の方法であって、
    （ｉ）ｐｔＲＮＡ－リボザイムの転写合成が、テトラサイクリン応答性プロモーターエレメント（ＴＲＥ）によって制御されるか、又は
    （ｉｉ）ｐｔＲＮＡ－リボザイムがＲＮＡポリメラーゼによって転写合成され、前記ＲＮＡポリメラーゼの発現がＴＲＥによって制御され；
    さらに該方法は、少なくともｐｔＲＮＡの発現と同時に、真核細胞内でリバースｔＴＡ（ｒｔＴＡ）を発現させる工程を含み；且つ、
    ｐｔＲＮＡ－リボザイムの発現が、真核細胞をドキシサイクリン又はその機能的類似体と接触させ、それによってｐｔＲＮＡ－リボザイムの転写合成を誘導することを含む、方法。
  26. 請求項１４～２５のいずれか一項に記載の方法であって、
    （ｉ）ｐＲＳコード化配列の転写が、テトラサイクリン応答性プロモーターエレメント（ＴＲＥ）によって制御されるか、又は
    （ｉｉ）ｐＲＳコード化配列の転写がＲＮＡポリメラーゼによって触媒され、前記ＲＮＡポリメラーゼの発現がＴＲＥによって制御され；
    さらに該方法は、少なくともｐＲＳの発現と同時に、真核細胞内でリバースｔＴＡ（ｒｔＴＡ）を発現させる工程を含み；且つ、
    ｐＲＳの発現が、真核細胞をドキシサイクリン又はその機能的類似体と接触させ、それによってｐＲＳコード化配列の転写を誘導することを含む、方法。
  27. そのアミノ酸配列中に１つ以上の非標準アミノ酸（ｎｃＡＡ）残基を有する目的のポリペプチド（ＰＯＩ）を調製するためのキットであって、
    該キットは、ＰＯＩの１つ以上のｎｃＡＡ残基に対応する１つ以上のｎｃＡＡ、もしくは、その塩、及び
    （ａ）請求項１１又は１２に記載のポリヌクレオチド、又は
    （ｂ）請求項１３に記載のポリヌクレオチド、もしくは２つ以上のポリヌクレオチドの組み合わせと、
    （ｃ）ｄｓＲＮＡ結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、それぞれと組み合わせて含むか；あるいは、
    該キットは、ＰＯＩの１つ以上のｎｃＡＡ残基に対応する１つ以上のｎｃＡＡ、もしくは、その塩；及び
    （ｄ）請求項１～１０のいずれか一項に記載の真核細胞、を含む、キット。
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