JP7628009B2

JP7628009B2 - ナノ粒子体を用いて検体中の抗原を検出するプラズモン増強蛍光分析を行う方法

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Publication number: JP7628009B2
Application number: JP2020169786A
Authority: JP
Inventors: 由枝小松; 文久北脇
Original assignee: PHC Holdings Corp
Current assignee: PHC Holdings Corp
Priority date: 2020-10-07
Filing date: 2020-10-07
Publication date: 2025-02-07
Anticipated expiration: 2040-10-07
Also published as: JP2022061692A

Description

本発明は、ナノ粒子体、特にプラズモン励起蛍光分析に用いるナノ粒子体に関する。

バイオセンサーは、検出対象である特定の抗原を特定の抗体に特異的に反応させて複合体を形成し、複合体における特異的な結合に由来する信号によって、抗原を検出する。
プラズモン励起蛍光分析では、複合体は抗体、抗原の他に、蛍光物質と金属をさらに含む。励起光が複合体に照射されると、複合体内の金属で表面プラズモン共鳴が発生し、金属の表面近傍で近接場が形成される。この近接場によって蛍光物質の蛍光強度が増大される。

例えば、特許文献１に記載の局在プラズモン増強センサでは、基材の一方の面に、高さが１００～１０００ｎｍ、幅が２０～１０００ｎｍ、アスペクト比が２～１０である多数の凸部が形成され、該凸部表面に厚さ４０～１２０ｎｍの金属膜が積層され、該金属表面に誘電体層が積層され、該誘電体層表面に検体中の被測定物質と特異的に結合して特異的結合物を構成しうる特異的結合メンバーが固定されている。

特開２００７－２４０３６１号公報

ところで、上記のようなセンサでは、本発明者らが鋭意検討した結果、検出感度をさらに改善する余地があることが分かった。

本発明はかかる課題に鑑みて為されたものである。すなわち、本発明の主たる目的は、比較的低濃度の生体物質の検出に資する、検出感度により優れるナノ粒子体を提供することにある。

本発明の一実施形態に係るナノ粒子体は、
金属ナノ粒子と、該金属ナノ粒子の表面に結合されたナノ抗体とを有し、
前記ナノ抗体の分子質量が６０，０００Ｄａ以下である。

図１は、ナノ粒子体を模式的に示す断面図である。図２は、複合体を模式的に示す断面図である。図３は、測定装置を模式的に示す図である

以下、本発明の実施形態であるナノ粒子体を図示の実施の形態により詳細に説明する。なお、図面は模式的なものを含み、実際の寸法や比率を反映していない場合がある。

＜第１実施形態：ナノ粒子体＞
第１実施形態に係るナノ粒子体は、
金属ナノ粒子と、金属ナノ粒子の表面に結合されたナノ抗体とを有し、
ナノ抗体の分子質量が６０，０００Ｄａ以下である。

本実施形態に係るナノ粒子体は、検出感度に優れる。その理由は以下のように推測される。本実施形態に係るナノ粒子体は、金属ナノ粒子と、金属ナノ粒子の表面に結合されたナノ抗体とを有する。このため、ナノ粒子体のナノ抗体は、検体中の抗原と抗原抗体反応し、複合体を形成する。形成された複合体は、抗原を介して２つのナノ粒子体が結合して構成される。つまり、２つの金属ナノ粒子体は、複合体において同一の抗原に対してそれぞれのナノ抗体が結合することによって、一定の距離で離間して配置されている。ここで、ナノ抗体の分子質量は６０，０００Ｄａ以下であるため、ナノ抗体の体積は、比較的小さい。このため、２つのナノ粒子体間の距離（離間距離）を小さくすることができる。よって、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（Surface Plasmon Fluorescence Spectroscopy：SPFS）において、複合体に励起光を照射すると、局在表面プラズモン共鳴（Localized Surface Plasmon Resonance：LSPR）が起き、金属ナノ粒子の表面近傍（特に、２つの金属粒子間の表面近傍）で効率的に近接場が形成される。この近接場によって、複合体の蛍光物質が効率的に励起され、蛍光強度が増大すると考えられる。したがって、本実施形態に係るナノ粒子体は、検出感度に優れる。特に、検体中の抗原の濃度が希薄であっても、検出することができる。

本発明者らは、従来のナノ粒子体の検出感度が低い理由を検討し、抗原を捕捉した複合体では、効果的に局在表面プラズモン共鳴を起こすことができないことに着目した。その理由として、金属ナノ粒子間の離間距離が比較的大きいことを見出した。このような知見に基づいて、本発明者らはさらに検討し、比較的小さな体積を有するナノ抗体を採用することにより、ナノ粒子体間の離間距離を十分に狭めた複合体を形成し、蛍光強度を増大させ検出感度を向上させることに想到した。つまり、本発明者らによって「ナノ抗体の分子質量が６０，０００Ｄａ以下である」が想到された。

ナノ粒子体は、抗体抗原反応により抗原を捕捉し、２つのナノ粒子体と抗原とから構成される複合体を形成することができる。図１を参照して、ナノ粒子体を説明する。図１は、ナノ粒子体を模式的に示す断面図である。本実施形態に係るナノ粒子体１は、金属ナノ粒子２と、金属ナノ粒子２の表面に結合されたナノ抗体４とを有する。

ナノ粒子体１は、プラズモン励起蛍光分析に用いることができる。ナノ粒子体１は、抗原抗体反応により検体中の抗原を捕捉し、後述する複合体を形成する。複合体に励起光を照射すると、局在表面プラズモン共鳴を起こし近接場を形成する。この近接場によって、蛍光強度が増大する。

ナノ粒子体１はまた、非特異的な結合部位をブロッキング剤によってブロッキングされてもよい。ブロッキングされたナノ粒子体１は、ナノ抗体４の検出対象以外の物質への非特異的な結合の形成が抑制され、バックグラウンドおよび偽陽性信号を低減することができる。ブロッキング剤としては、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、スキムミルク、およびカゼインのようなタンパク質、ならびに化学合成ポリマーである。

（金属ナノ粒子）
金属ナノ粒子２は、金属の種類によって異なるが、特定の波長を有する光と相互作用し、局在表面プラズモン共鳴を起こす。銀ナノ粒子では４００ｎｍから５３０ｎｍ、金ナノ粒子では５１０ｎｍから５８０ｎｍにプラズモンの共鳴ピークがある。これは粒子径により異なる。例えば、粒子径が２０ｎｍの銀からなるナノ粒子は、波長４０５ｎｍの光と共鳴し、粒子径が２０ｎｍの金からなるナノ粒子は、波長５２４ｎｍの光と共鳴する。金属ナノ粒子２の粒子径（平均一次粒子径）は、例えば、５ｎｍ～１００ｎｍである。金属ナノ粒子２の粒子径は、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）または透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いて、金属ナノ粒子２の画像を撮像し、画像での金属ナノ粒子２の粒子径を測長し、複数の粒子径の平均値（測定数：少なくとも１０以上）を算出することにより得ることができる。
金属ナノ粒子２は、好ましくは金または銀を含んで成り、より好ましくは銀を含んで成る。

（ナノ抗体）
ナノ抗体４は、抗原抗体反応により、その先端部（抗原結合部位：Antigen Binding Site）で、特定の抗原と特異的に結合する。この特異的結合は、非共有結合であり、例えば、水素結合、ならびに分子間力、疎水的相互作用および電荷的相互作用に起因する結合である。ナノ抗体４は、例えば、ＶＨＨ（variable domain of heavy chain antibody）抗体およびその変異体である。ＶＨＨ抗体は、単一ドメイン抗体である。変異体は、抗原に対する特異的結合性を有する範囲内で、アミノ酸配列の一部を組み換えた抗体または置換基を導入した抗体である。ナノ抗体４は、好ましくはＶＨＨ抗体である。ナノ抗体４がＶＨＨ抗体であると、ＶＨＨ抗体は比較的体積が小さいため、複合体における離間距離を狭め、近接場をより効率的に形成し、蛍光強度をさらに増大させることができる。

ナノ抗体４の分子質量は、６０，０００Ｄａ以下であり、好ましくは３０，０００Ｄａ以下であり、より好ましくは２０，０００Ｄａ以下である。分子質量が６０，０００Ｄａ以下（特に、３０，０００Ｄａ以下、または２０，０００Ｄａ以下）であると、ナノ抗体４の体積が比較的小さいため、複合体における離間距離を狭め、近接場をより効率的に形成し、蛍光強度をさらに増大させることができる。分子質量の測定方法は、電気泳動（ＳＤＳ-ＰＡＧＥ）、ゲルろ過クロマトグラフィー、および静的光散乱法などである。

ナノ抗体４は、金属ナノ粒子２に直接結合している。ここで、「直接結合」の結合とは、共有単結合のような化学結合だけでなく、物理吸着のような非化学結合性の結合も含まれる。ナノ抗体４が金属ナノ粒子２の表面に直接結合している場合、複合体における２つの金属ナノ粒子間の離間距離をさらに狭めることができる点で、好ましい。

＜第２実施形態：複合体＞
図２を参照して、複合体を説明する。図２は、複合体を模式的に示す断面図である。複合体４０は、検出対象である抗原３０と、２つのナノ粒子体１０，２０とを含んで成る。２つのナノ粒子体１０，２０は、複合体４０において、抗原３０を介して結合されている。２つのナノ粒子体１０，２０のうち、一方を第１ナノ粒子体１０と称し、もう一方のナノ粒子体を第２ナノ粒子体２０と称する。このように複合体４０は、ナノ粒子体１として第１ナノ粒子体１０と第２ナノ粒子体２０とを含む。

複合体４０において、第１ナノ粒子体１０は、第１金属ナノ粒子１２と、第１金属ナノ粒子１２の表面に結合された第１ナノ抗体１４と、第１ナノ抗体１４に標識された蛍光物質１６とを有する。このように第１ナノ粒子体１０は、さらに蛍光物質１６を有することができる。第２ナノ粒子体２０は、第２金属ナノ粒子２２と、第２金属ナノ粒子２２の表面に結合された第２ナノ抗体２４とを有する。

第１ナノ粒子体１０と第２ナノ粒子体２０との間の離間距離Ｌは、１０ｎｍ～５０ｎｍであり、好ましくは１０ｎｍ～２５ｎｍである。離間距離Ｌは、第１金属ナノ粒子１２と第２金属ナノ粒子２２との間の距離であって、第１ナノ粒子体１０の表面上の第１点Ｐ１と、第２ナノ粒子体２０の表面上の第２点Ｐ２とで結ばれる線分が最小となる距離である。離間距離Ｌが５０ｎｍ以下である場合、複合体４０に励起光が照射されると、第１，第２金属ナノ粒子１２，２２間の表面近傍の空間でより効率的に近接場が発生するため、蛍光強度をより増大させることができる。

（ナノ粒子体）
以下、第１金属ナノ粒子１２を例に挙げて説明するが、第２金属ナノ粒子２２は第１金属ナノ粒子１２と実質的に同一である。第１金属ナノ粒子１２は、第１コア１２ａと、第１コア１２ａの表面を被覆する第１被覆層１２ｂとを有する。つまり、第１金属ナノ粒子１２は、コア－シェル構造を有する。第１被覆層１２ｂは、金属消光防止膜として機能することができる。第１被覆層１２ｂは、第１コア１２ａを完全に覆っている。第１被覆層１２ｂが第１コア１２ａを完全に覆っている場合、蛍光物質１６が第１コア１２ａに接触せず、蛍光物質１６が第１コア１２ａ表面から所定の距離（少なくとも被覆層１２ｂの厚みに相当する距離）を確実に設けて配置される。かかる場合、励起された蛍光物質１６が第１コア１２ａを構成する材質（例えば、金属（より具体的には、金または銀等））によって消光されにくいため、検出される蛍光強度の低下が抑制され、検出感度が向上するからである。この消光は、励起した蛍光物質１６から第１金属ナノ粒子１２の材質へのエネルギー移動の過程および／または第１金属ナノ粒子１２の材質により誘起される無輻射（熱放出）の過程と考えられる。

第１コア１２ａは、好ましくは金または銀を含んで成り、より好ましくは銀を含んで成る。第１被覆層１２ｂは、例えば、無機物（より具体的には、ＳｉＯ_２）を含んで成る。第１被覆層１２ｂが無機物を含んで成ると、プラズモン励起蛍光分析において励起した蛍光物質１６が消光されにくく、検出される蛍光強度の低下が抑制されるからである。

第１被覆層１２ｂの厚みは、好ましくは、５ｎｍ～５０ｎｍである。第１被覆層１２ｂの厚みが５０ｎｍ以下であると、２つの金属ナノ粒子１２，２２間の空間に近接場が効率的に形成される離間距離となるため、検出感度がさらに向上する。また、第１被覆層１２ｂの厚みが５ｎｍ以上であると、第１コア１２ａと蛍光物質１６が所定の距離を設けて配置されるため、測定において励起した蛍光物質１６の消光が抑制され、検出感度がさらに向上する。

（蛍光物質）
蛍光物質１６は、第１ナノ粒子体１０に標識されており、第２ナノ粒子体２０には標識されていない。蛍光物質１６は、局在表面プラズモン共鳴で形成される近接場により励起され、蛍光を発する。蛍光物質１６は、例えば、ユーロピウム、ルテニウムのような金属の錯体（金属錯体）である。蛍光物質１６は、図２に示すように、第１金属ナノ粒子１２と第２金属ナノ粒子２２との間に位置づけられていることが好ましい。金属ナノ粒子１２，２２間では近接場が効率的に生じる空間であるため、金属ナノ粒子１２，２２間の空間に蛍光物質１６が位置づけられることで蛍光強度が増大されやすいからである。

蛍光物質１６は、ストークスシフトが大きいことが好ましい。ここで、ストークスシフトは、蛍光物質１６の吸収スペクトルにおける吸収ピーク波長（最大励起波長）と、蛍光スペクトルにおける蛍光ピーク波長（最大蛍光波長）との差である。蛍光物質１６のストークスシフトが大きい場合、吸収スペクトルと蛍光スペクトルとが重なりにくく、検出する蛍光に励起光（の散乱光）が入りにくく、より正確な蛍光強度を測定することができる。

蛍光物質１６の蛍光スペクトルは、シャープであることが好ましい。蛍光スペクトルがシャープであると、吸収スペクトルとの重なりにくいため、検出する蛍光に励起光（の散乱光）が入りにくく、より正確な蛍光強度を測定することができる。

（抗原）
抗原３０は、少なくとも２つの抗原決定基（epitope）を有し、抗原決定基で第１，第２ナノ抗体１４，２４と特異的結合を形成する。抗原３０は、例えば、ＴｎＴ（登録商標）のようなタンパク質およびウィルスである。抗原３０は、例えば、血液、血漿、血清、尿、および唾液に由来する抗原である。つまり、抗原３０を含む検体としては、例えば、血液、血漿、血清、尿、および唾液である。検体は、溶媒および緩衝液（より具体的には、リン酸緩衝生理食塩水（phosphate-buffered saline：ＰＢＳ）、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、およびＭＥＳ緩衝液など）をさらに含んでもよい。

＜第３実施形態：測定装置＞
図３を参照して、測定装置を説明する。図３は、測定装置を示す図である。図３に示すように、測定装置１００は、励起用光源１１０と、励起光照射光学系１２０と、試薬容器１３０と、受光光学系１４０と、受光素子１５０とを備える。
励起用光源１１０は、励起光１１２を照射する。励起用光源１１０は、例えば、レーザーである。励起光照射光学系１２０は、励起光１１２の集光のように断面径の調整等を行い、入射励起光１２２を出力する。励起光照射光学系１２０は、レンズ１２４および偏光素子（λ／２板）１２６である。励起光照射光学系１２０から出力した入射励起光１２２は、試薬容器１３０に入射し、試薬容器１３０内の測定試料に照射される。試薬容器１３０は、例えば、着脱可能な容器（より具体的には、セル、およびプレパラート等）、およびマイクロ流路チップである。マイクロ流路チップは、微小な流路を有するチップである。試薬容器１３０がマイクロ流路チップである場合、例えば、第１実施形態に係るナノ粒子体（試薬）と検体とを混合して連続的に供給することができる。このため、あらかじめ測定試料を混合して調製する必要がなく、連続的に測定することが可能となる。

入射励起光１２２が照射された測定試料は、蛍光（検出光１３２）を発する。受光光学系１４０は、試薬容器１３０への入射励起光１２２の進行方向に対して直角方向に配置される。受光光学系１４０は、測定試料から発せられた検出光１３２の断面径等を調整し、入射励起光１２２の散乱光を取り除く、もしくは光量を調整することが出来る。受光光学系１４０は、レンズ１４４および光学フィルタ１４６である。光学フィルタ１４６は、例えば、バンドパスフィルタ、およびダイクロイックミラーである。

受光光学系１４０を通過した蛍光１４２は、受光素子１５０で検出される。受光素子１５０は、例えば、ＰＤ、ＡＰＤ、ＰＭＴ、ＣＣＤカメラ、および分光器である。受光素子１５０は、単一波長の蛍光量の測定、蛍光スペクトルの測定、および２次元平面の蛍光イメージング作成が可能である。

本発明は上述の実施形態に限定されず、本発明の要旨を逸脱しない範囲で設計変更可能である。

前記実施形態では、ナノ粒子体１，１０，２０は、それぞれ１つのナノ抗体４，１４，２４を有していたが、これに限定されない。ナノ粒子体１，１０，２０は、それぞれ２以上のナノ抗体４，１４，２４を有してもよい。

前記実施形態では、蛍光物質１６が第１ナノ粒子体１０に標識されている一方、第２ナノ粒子体２０に標識されていないが、これに限定されない。蛍光物質１６は、第１ナノ粒子体１０および第２ナノ粒子体２０の少なくとも一方に標識され得る。より具体的には、第２ナノ粒子体２０のみに標識されてもよく、第１ナノ粒子体１０および第２ナノ粒子体２０の両方に標識されてもよい。

前記実施形態では、ナノ抗体４，１４，２４は、金属ナノ粒子２，１２，２２の表面に直接結合しているが、これに限定されない。金属ナノ粒子２，１２，２２の表面とナノ抗体４，１４，２４との間に、例えば、ビオジン‐アビジン結合を形成する任意の化合物を介在させることによって、ナノ抗体４，１４，２４が金属ナノ粒子２，１２，２２の表面に間接的に結合してもよい。

前記実施形態では、金属ナノ粒子１２，２２はコア－シェル構造を有していたが、有していなくてもよい。また、前記実施形態では、被覆層１２ｂ，２２ｂはコア１２ａ，２２ａを完全に（連続的に）覆っていたが、コア１２ａ，２２ａを部分的に覆っていてもよい。

前記実施形態では、蛍光物質１６は、第１ナノ抗体１４に標識されていたが、これに限定されない。蛍光物質１６は、第１金属ナノ粒子１２に標識されてもよい。

前記実施形態では、測定装置１００における受光光学系１４０は、試薬容器１３０への入射励起光１２２の進行方向に対して直角方向に配置されているが、これに限定されない。受光光学系１４０は、例えば、入射励起光１２２の進行方向に対して平行方向に配置されてもよく、または入射励起光１２２の進行方向に対して鋭角もしくは鈍角となる方向に配置されてもよい。

１・・・ナノ粒子体
２・・・金属ナノ粒子
４・・・ナノ抗体
１０・・・第１ナノ粒子体
１２・・・第１金属ナノ粒子
１２ａ・・・第１コア
１２ｂ・・・第１被覆層
１４・・・第１ナノ抗体
１６・・・蛍光物質
２０・・・第２ナノ粒子体
２２・・・第２金属ナノ粒子
２２ａ・・・第２コア
２２ｂ・・・第２被覆層
２４・・・第２ナノ抗体
３０・・・抗原
４０・・・複合体
Ｌ・・・離間距離

Claims

ナノ粒子体を用いて検体中の抗原を検出するプラズモン増強蛍光分析を行う方法であって、
前記ナノ粒子体として含まれる第１ナノ粒子体および第２ナノ粒子体を用いて、検体中の抗原を捕捉して、前記第１ナノ粒子体と前記第２ナノ粒子体とが抗原を介して結合された複合体を形成することと、
前記複合体に励起光を照射することと
を含んで成り、
前記複合体において、前記第１ナノ粒子体と前記第２ナノ粒子体との間の離間距離が１０ｎｍ～２５ｎｍであり、
前記第１ナノ粒子体は、第１金属ナノ粒子と、該第１金属ナノ粒子の表面に結合された第１ナノ抗体とを有し、
前記第２ナノ粒子体は、第２金属ナノ粒子と、該第２金属ナノ粒子の表面に結合された第２ナノ抗体とを有し、
前記第１ナノ粒子体および前記第２ナノ粒子体の少なくとも一方に、蛍光物質が標識されており、
前記第１および第２ナノ抗体の分子質量が２０，０００Ｄａ以下である、方法。
前記複合体において、前記第１ナノ粒子体の前記第１金属ナノ粒子と前記第２ナノ粒子体の前記第２金属ナノ粒子との間に前記蛍光物質が位置づけられている、請求項１に記載の方法。
前記第１および第２ナノ抗体がＶＨＨ抗体である、請求項１または２に記載の方法。
前記第１および第２金属ナノ粒子が金または銀を含んで成る、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
前記第１および第２金属ナノ粒子が、コアと、該コアの表面を被覆する被覆層とを有する、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
前記被覆層はＳｉＯ_２を含んで成る、請求項５に記載の方法。
前記第１ナノ抗体は前記第１金属ナノ粒子に直接結合しており、前記第２ナノ抗体は前記第２金属ナノ粒子に直接結合している、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
前記第１ナノ粒子体には前記蛍光物質が標識されている一方、前記第２ナノ粒子体には前記蛍光物質が標識されていない、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
前記抗原が、血液、血漿、尿、または唾液に由来する抗原である、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
金属ナノ粒子と、該金属ナノ粒子の表面に結合されたナノ抗体とを有するナノ粒子体であって、
前記ナノ抗体の分子質量が２０，０００Ｄａ以下であり、
前記ナノ粒子体として第１ナノ粒子体と第２ナノ粒子体とが含まれ、
前記第１ナノ粒子体および前記第２ナノ粒子体の少なくとも一方に、蛍光物質が標識されており、
前記第１ナノ粒子体と前記第２ナノ粒子体とが抗原を介して結合された複合体において、前記第１ナノ粒子体と前記第２ナノ粒子体との間の離間距離が１０ｎｍ～２５ｎｍである、ナノ粒子体。
前記ナノ粒子体が、プラズモン励起蛍光分析に用いるナノ粒子体である、請求項１０に記載のナノ粒子体。
前記ナノ抗体がＶＨＨ抗体である、請求項１０または１１に記載のナノ粒子体。
前記金属ナノ粒子が金または銀を含んで成る、請求項１０～１２のいずれか１項に記載のナノ粒子体。
前記金属ナノ粒子が、コアと、該コアの表面を被覆する被覆層とを有する、請求項１０～１３のいずれか１項に記載のナノ粒子体。
前記被覆層はＳｉＯ_２を含んで成る、請求項１４に記載のナノ粒子体。
前記ナノ抗体は前記金属ナノ粒子に直接結合している、請求項１０～１５のいずれか１項に記載のナノ粒子体。
前記第１ナノ粒子体には前記蛍光物質が標識されている一方、前記第２ナノ粒子体には前記蛍光物質が標識されていない、請求項１０～１６のいずれか１項に記載のナノ粒子体。
前記複合体において、前記第１ナノ粒子体の前記金属ナノ粒子と前記第２ナノ粒子体の前記金属ナノ粒子との間に前記蛍光物質が位置づけられている、請求項１０～１７のいずれか１項に記載のナノ粒子体。
前記抗原が、血液、血漿、尿、または唾液に由来する抗原である、請求項１０～１８のいずれか１項に記載のナノ粒子体。