JP7626511B1 - プロテオグリカンの測定方法 - Google Patents

Abstract

Ｃ末端および／またはＮ末端が維持されたプロテオグリカンを検出可能なプロテオグリカンの測定方法を提供する。
本開示のプロテオグリカンの測定方法は、前記プロテオグリカンのジスルフィド結合を切断する切断工程と、
得られたプロテオグリカンのチオール基をアルカリ性下で修飾する修飾工程と、
前記プロテオグリカンのＣ末端ドメインおよびＮ末端ドメインの少なくとも一方を蛍光で検出する検出工程と、を含む。

Description

本開示は、プロテオグリカンの測定方法に関する。

プロテオグリカンは、コラーゲンやヒアルロン酸等と共に細胞外マトリックスを構成する分子である。近年、グアニジン塩酸塩を用いた抽出や酢酸抽出等による、プロテオグリカンの精製が報告されている（特許文献１および非特許文献１）。

特許第３７３１１５０号公報

Kakizaki I, Tatara Y, Majima M, Kato Y, Endo M. Identification of proteoglycan from salmon nasal cartilage. Arch Biochem Biophys. 2011 Feb 1;506(1):58-65. doi: 10.1016/j.abb.2010.10.025. Epub 2010 Nov 5. PMID: 21056541.

前記プロテオグリカンは、ヒアルロン酸等と結合した状態で生体内に存在する。このため、前記ヒアルロン酸等と結合可能な状態のプロテオグリカンは、再生医療に使用できる可能性がある。しかしながら、前記プロテオグリカンは、抽出方法により、前記プロテオグリカンのＣ末端ドメイン（以下、「Ｃ末端」ともいう。）および／またはＮ末端ドメイン（以下、「Ｎ末端」ともいう。）が切断された状態で抽出されることがある。このため、前記プロテオグリカンの状態、より具体的には、前記プロテオグリカンのＣ末端および／またはＮ末端の存在または不存在を評価する必要がある。

そこで、本開示は、例えば、Ｃ末端および／またはＮ末端が維持されたプロテオグリカンを検出可能なプロテオグリカンの測定方法の提供等を目的とする。

前記目的を達成するために、本開示のプロテオグリカンの測定方法（以下、「測定方法」ともいう。）は、前記プロテオグリカンのジスルフィド結合を切断する切断工程と、
得られたプロテオグリカンのチオール基をアルカリ性下で修飾する修飾工程と、
前記プロテオグリカンのＣ末端ドメインおよびＮ末端ドメインの少なくとも一方を蛍光で検出する検出工程と、を含む。

本開示によれば、例えば、Ｃ末端および／またはＮ末端が維持されたプロテオグリカンを検出可能なプロテオグリカンの測定方法の提供等ができる。

図１は、各コンドロイチン硫酸の主な二糖構造を示す図である。 図２は、各種プロテオグリカンの構造を示す図である。 図３は、実施例１における、プロテオグリカンにおけるＣ末端ドメインの検出結果を示す写真である。 図４は、実施例１における、プロテオグリカンにおけるＮ末端ドメインの検出結果を示す写真である。 図５は、実施例１における、プロテオグリカンにおけるＣ末端ドメインの検出結果を示す写真である。 図６は、実施例２における、プロテオグリカンにおけるＣ末端ドメインの検出結果を示す写真である。 図７は、実施例３における、デコリンの検出結果を示す写真である。

以下、本開示について、例をあげて具体的に説明する。以下、特に言及しない限り、各開示は、他の開示の説明を援用できる。

＜定義＞
本明細書において、「プロテオグリカン」は、タンパク質（コアタンパク質）とグリコサミノグリカン（ＧＡＧ、「多糖」または「糖鎖」ともいう。）とが共有結合した分子（糖タンパク質）を意味する。前記プロテオグリカンは、例えば、皮膚、臓器、および軟骨等の細胞外マトリックスとして存在する。前記グリコサミノグリカンは、通常、分岐構造を有さない長鎖構造を有する糖鎖として知られている。前記プロテオグリカンは、例えば、以下があげられる。
・アグリカンファミリー（レクチカン（lectican）ファミリーまたはヒアレクタン（hyalectan）ファミリーともいう）：アグリカン（Aggrecan）、バーシカン（Versican）、ニューロカン（Neurocan）、ブレビカン（Brevican）等。
・スモールロイシンリッチプロテオグリカン（SLRPs：Small Leucine Rich Proteoglycans）ファミリー：バイグリカン（Biglycan）、デコリン（Decorin）、フィブロモジュリン（Fibromodulin）、ルーミカン（ルミカン、Lumican）、PG-Lb（エピフィカン、Epiphycan）、ケラトカン（Keratocan）、ミーメカン（Mimecan）等。
・基底膜のプロテオグリカン：パールカン（Perlecan）、アグリン（Agrin）、バーマカン等。
・その他：テスティカン（Testican）、ビグリカン（Biglycan）、セルグリシン（Serglycin）、シンデカン（Syndecan）、ディストログリカン（Dystroglycan）、クローストリン（Claustrin）、グリピカン（Glypican）、ケラトカン（Keratocan）等。
前記プロテオグリカンは、例えば、前記タンパク質に結合しているＧＡＧの種類によって、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、デルマタン硫酸プロテオグリカン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、またはケラタン硫酸プロテオグリカンに分類もできる。

前記ＧＡＧは、例えば、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸（ＣＳ）、デルマタン硫酸（ＤＳ、コンドロイチン硫酸Ｂ）、ヘパラン硫酸、ヘパリン、およびケラタン硫酸等があげられる。前記コンドロイチンは、グルクロン酸とアセチルガラクトサミンとの二糖構造を主な二糖構造とするＯ型糖鎖、およびイズロン酸およびアセチルガラクトサミンとの二糖構造を主な構造とするｉＯ型糖鎖があげられる（以下、それぞれ、「コンドロイチン硫酸Ｏ」、および「コンドロイチン硫酸ｉＯ」ともいう）。前記コンドロイチン硫酸（ＣＳ）は、グルクロン酸およびアセチルガラクトサミンの２糖が反復する糖鎖に硫酸基が付加された構造を有する。前記コンドロイチン硫酸は、例えば、グルクロン酸およびアセチルガラクトサミン４硫酸との二糖構造を主な二糖構造とするコンドロイチン硫酸Ａ（Ａ型）、グルクロン酸およびアセチルガラクトサミン６硫酸との二糖構造を主な二糖構造とするコンドロイチン硫酸Ｃ（Ｃ型）等があげられる。前記デルマタン硫酸（ＤＳ）は、イズロン酸およびアセチルガラクトサミンの２糖が反復する糖鎖に硫酸基が付加された構造を有する。前記デルマタン硫酸は、例えば、イズロン酸およびアセチルガラクトサミン４硫酸との二糖構造を主な二糖構造とするコンドロイチン硫酸ｉＡ（ｉＡ型）、イズロン酸およびアセチルガラクトサミン６硫酸との二糖構造を主な二糖構造とするコンドロイチン硫酸ｉＣ（ｉＣ型）等があげられる。各コンドロイチン硫酸は、例えば、図１に示す二糖構造を主な二糖構造として有する。なお、図１では、硫酸基（スルホ基）は、水素原子と結合しているが、本開示はこれに限定されず、前記ＧＡＧの硫酸基は、例えば、水素原子が脱離し、イオン化していてもよいし、塩を形成していてもよい。

本明細書において、「ドメイン」は、タンパク質における、立体構造または機能的にまとまった領域を意味する。前記アグリカン（Aggrecan）、前記バーシカン（Versican）、前記ニューロカン（Neurocan）、ブレビカン（Brevican）、およびデコリン（Decorin）の各ドメインを含む構造の一例を、図２に示す。

本明細書において、「Ｎ末端ドメイン（Ｎ末端）」は、例えば、プロテオグリカンがアグリカン等のレクチカン（lectican）ファミリーである場合、前記プロテオグリカンのＧ１ドメイン、ＩＧＤドメイン（interglobular domain）、Ｇ２ドメインおよび／またはＫＳ－ｒｉｃｈドメインを意味する。前記「Ｎ末端ドメイン」は、例えば、前記プロテオグリカンがデコリン等のスモールロイシンリッチプロテオグリカンである場合、前記プロテオグリカンのロイシンリッチリピート（Leucine-rich repeat）ドメインよりＮ末端側のドメインを意味する。前記Ｇ１ドメインは、ヒアルロン酸およびリンクタンパク質等と結合することが知られている。前記プロテオグリカンがデコリンの場合、前記Ｎ末端ドメインは、コンドロイチン硫酸またはデルマタン硫酸を側鎖に有し、４つのシステイン残基を有する。

本明細書において、「Ｃ末端ドメイン（Ｃ末端）」は、例えば、プロテオグリカンがアグリカン等のレクチカン（lectican）ファミリーである場合、前記プロテオグリカンのＧ３ドメインを含むＣ末端ドメインを意味する。前記「Ｃ末端ドメイン」は、例えば、前記プロテオグリカンがデコリン等のスモールロイシンリッチプロテオグリカンである場合、前記プロテオグリカンのロイシンリッチリピート（Leucine-rich repeat）ドメインよりＣ末端側のドメインを意味する。前記Ｇ３ドメインは、テネイシン等と結合することが知られている。前記プロテオグリカンがデコリンの場合、前記Ｃ末端ドメインは、２つのシステイン残基を有する。

本明細書において、「中間ドメイン」は、例えば、前記プロテオグリカンがレクチカンファミリーである場合、プロテオグリカンのＮ末端ドメインとＣ末端ドメインとの間のドメインであって、少なくとも１つのグリコサミノグリカンの結合ドメイン（ＧＡＧ）を含むドメインを意味する。前記「中間ドメイン」は、例えば、前記プロテオグリカンがデコリン等のスモールロイシンリッチプロテオグリカンである場合、前記プロテオグリカンのＮ末端ドメインとＣ末端ドメインとの間のドメインであってロイシンリッチリピート（Leucine-rich repeat）を含むドメインを意味する。

本明細書において、「アルカリ性」は、ｐＨ７を超える水溶液を意味する。本明細書において、対象の水溶液のｐＨが、７未満、７、および７を超える場合、前記水溶液は、それぞれ、酸性、中性、およびアルカリ性と分類する。

本明細書において、「ジスルフィド結合」（Ｓ－Ｓ結合）は、２つのチオール基（－ＳＨ）間で形成される硫黄原子間の結合を意味する。

本明細書において、「還元剤」は、酸化還元反応において、他の物質を還元することができる（他の物質に電子を与えることができる）物質を意味する。

本明細書において、「修飾」は、タンパク質を構成するアミノ酸残基等の特定の官能基への化学修飾を意味する。

本明細書において、「アルキル化」は、有機化合物を構成する水素原子をアルキル基（Ｃ_ｎＨ_２ｎ＋１）に置換する化学反応を意味する。前記アルキル化を引き起こす物質を、アルキル化剤という。

本明細書において、「精製」は、同定し、分離すること、自然状態での成分から回収すること、同定され、かつ分離された状態、および／または自然状態での成分から回収された状態を意味する。前記「精製」は、例えば、少なくとも１つの精製工程を得ることにより実施できる。前記精製は、単離ということもできる。

本明細書において、「抽出」は、対象物から特定の成分を取り出すこと、および／または対象物から特定の成分が取り出された状態を意味する。前記抽出は、例えば、溶媒等の抽出液を用いて実施できる。前記「抽出」は、例えば、少なくとも１つの抽出工程を得ることにより実施できる。本明細書において、前記対象から取り出された成分を含む物は、抽出物という。また、前記対象から取り出された成分を含む液は、抽出液という。前記抽出物および前記抽出液は、例えば、前記プロテオグリカンを含んでもよい。前記抽出物または前記抽出液は、例えば、前記抽出に供した動物組織由来のプロテオグリカン以外の成分（他の成分）を含んでもよい。前記他の成分は、例えば、脂質、核酸、タンパク質等があげられる。

以下、本開示について例をあげて説明するが、本開示は以下の例等に限定されるものではなく、任意に変更して実施できる。また、本開示および各実施形態における各説明は、特に言及がない限り、互いに援用可能である。なお、本明細書において、「～」という表現を用いた場合、その前後の数値または物理値を含む意味で用いる。また、本明細書において、「Ａおよび／またはＢ」という表現には、「Ａのみ」、「Ｂのみ」、「ＡおよびＢの双方」が含まれる。

＜プロテオグリカンの測定方法＞
ある態様において、本開示は、プロテオグリカンの測定方法を提供する。本開示の測定方法は、プロテオグリカンのジスルフィド結合を切断する切断工程と、得られたプロテオグリカンのチオール基をアルカリ性下で修飾する修飾工程と、前記プロテオグリカンのＣ末端ドメインおよびＮ末端ドメインの少なくとも一方を蛍光で検出する検出工程と、を含む。本開示の測定方法によれば、Ｃ末端および／またはＮ末端が維持されたプロテオグリカンを検出できる。また、本開示の測定方法によれば、前記プロテオグリカンのＮ末端およびＣ末端を同時に測定することもできるため、例えば、測定に用いるプロテオグリカンのサンプル数を減らすこともできる。

本発明者らは、鋭意研究の結果、抽出液の種類等に依存して、前記プロテオグリカンのＣ末端および／またはＮ末端が維持または切断された状態でプロテオグリカンが抽出されることを見出した。そこで、本発明者らは、さらなる研究の結果、精製されたプロテオグリカンのジスルフィド結合を切断し、アルカリ性下で前記プロテオグリカンのチオール基を修飾して、前記プロテオグリカンがヒアルロン酸等との複合体形成を阻害した状態とすることにより、蛍光検出法によりプロテオグリカンのＣ末端および／またはＮ末端を検出できることを見出し、本開示を確立するに至った。このため、本開示の測定方法では、Ｃ末端および／またはＮ末端が維持されたプロテオグリカンを検出可能である。

前記切断工程では、プロテオグリカンのジスルフィド結合を切断する。これにより、前記切断工程では、例えば、前記プロテオグリカンの立体構造を崩すことができ、前記プロテオグリカンがＣ末端および／またはＮ末端を有する場合、前記プロテオグリカンと前記ヒアルロン酸等とで形成されている複合体形成を解消できる。このため、前記切断工程により、前記プロテオグリカンがＣ末端および／またはＮ末端を有する場合、前記プロテオグリカンのＣ末端および／またはＮ末端を露出、すなわち、検出可能な状態とできる。

前記切断工程は、例えば、前記プロテオグリカンおよび前記プロテオグリカンのジスルフィド結合を切断可能な成分を含む反応系（切断系）により実施できる。前記切断系は、例えば、水溶液等の液系である。具体的には、前記切断工程では、例えば、前記プロテオグリカンとジスルフィド結合を切断可能な成分とを接触させることにより、前記プロテオグリカン中に存在するジスルフィド結合を切断する。前記プロテオグリカンと前記ジスルフィド結合を切断可能な成分との接触は、例えば、固体と液体との公知の接触方法により実施でき、具体的には、前記プロテオグリカンと前記ジスルフィド結合を切断可能な成分を含む溶液とを混合することにより、実施できる。

前記ジスルフィド結合を切断可能な成分は、例えば、還元剤があげられる。前記切断工程において前記還元剤を用いる場合、前記切断は、還元剤によるチオール基への還元ということもできる。前記還元剤は、特に制限されず、例えば、ジスルフィド結合を遊離のチオール基に還元できる化合物である。前記還元剤は、例えば、ジチオスレイトール（DL-dithiothreitol、ＤＴＴ）、β－メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（Tris(2-carboxyethyl)phosphine、ＴＣＥＰ）、グルタチオン等があげられる。

前記切断工程における切断条件（温度、時間等）は、特に制限されず、例えば、前記ジスルフィド結合が前記チオール基に十分に切断される条件に設定できる。また、前記切断条件は、例えば、前記還元剤等の種類に応じて、適宜設定できる。前記切断における反応温度は、例えば、好ましくは、４５～１００℃、より好ましくは、５０～６０℃である。前記切断における反応時間は、例えば、好ましくは、３分～６時間、より好ましくは、５分～３時間である。

前記プロテオグリカンは、例えば、動物由来のプロテオグリカンがあげられる。前記動物は、特に制限されず、例えば、シロサケ、アトランティックサーモン等のサケ科魚類、コガネカレイ等のカレイ科魚類等の魚類；ニワトリ等の鳥類動物（鳥類）；ブタ等の哺乳類動物（哺乳類）等があげられる。前記動物は、好ましくは、サケ、ニワトリ、ブタ、およびカレイ等があげられる。

前記プロテオグリカンは、例えば、プロテオグリカンを含む組織由来のプロテオグリカンがあげられる。前記組織は、一例として、皮膚等の上皮組織；軟骨等の軟骨組織；消化器官；循環器官；呼吸器官；および胎盤等があげられる。具体例として、前記組織は、例えば、軟骨、ひれ、消化器、循環器、呼吸器、および耳等があげられる。

前記プロテオグリカンの糖鎖は、例えば、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸（コンドロイチン硫酸Ｂ）、ヘパラン硫酸、ヘパリン、およびケラタン硫酸等があげられる。前記糖鎖は、好ましくは、コンドロイチン硫酸である。

本開示の測定方法に用いるプロテオグリカンは、自家調製したプロテオグリカンを用いてもよいし、市販のプロテオグリカンを用いてもよい。前者の場合、本開示の測定方法は、例えば、前記切断工程に先立ち、動物または動物組織からプロテオグリカンを抽出および／または精製する工程を含んでもよい。前記自家調製したプロテオグリカンを用いる場合、前記プロテオグリカンは、酢酸抽出によって精製したプロテオグリカンでもよいし、グアニジン抽出によって精製したプロテオグリカンでもよい。前記酢酸抽出を行う場合、特許第３７３１１５０号公報の方法を参照してプロテオグリカンを精製することができる。前記グアニジン抽出を行う場合、下記参考文献１～２の方法を参照してプロテオグリカンを精製することができる。
参考文献１： Kakizaki I, Tatara Y, Majima M, Kato Y, Endo M. Identification of proteoglycan from salmon nasal cartilage. Arch Biochem Biophys. 2011 Feb 1;506(1):58-65. doi: 10.1016/j.abb.2010.10.025. Epub 2010 Nov 5. PMID: 21056541.
参考文献２： Kakizaki I, Mineta T, Sasaki M, Tatara Y, Makino E, Kato Y. Biochemical and atomic force microscopic characterization of salmon nasal cartilage proteoglycan. Carbohydr Polym. 2014 Mar 15;103:538-49. doi: 10.1016/j.carbpol.2013.12.083. Epub 2014 Jan 7. Erratum in: Carbohydr Polym. 2015 Jan 22;115:805. PMID: 24528764.

前記プロテオグリカンは、前記切断工程前に、プロテオグリカンの分子量を測定してもよい。前記プロテオグリカンの分子量は、ＧＰＣ（Gel Permeation Chromatography：ゲル浸透クロマトグラフィー）法によって測定されるピークトップ分子量を意味する。前記プロテオグリカンの分子量は、ＧＰＣ法等を用いて実施できる。前記ＧＰＣ法は、例えば、下記の条件で行い、前記標準試料（分子量マーカー、プルラン）を個別にＨＰＬＣシステムに注入し、分子量検量線を得ることで算出できる。

（ピークトップ分子量（Ｍｐ）の測定条件）
ＨＰＬＣシステム：ＬＣ－２０ＡＤ（株式会社島津製作所製）
カラム：ＴＳＫｇｅｌ Ｇ５０００－ＰＷＸＬ φ７．８ｍｍ×３００ｍｍ（東ソー社製）
溶出液：ｐＨ６．８ リン酸緩衝液
流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
検出器：示唆屈折率検出器（ＲＩＤ－２０Ａ 島津製作所社製）
注入量：５０μＬ
分子量マーカー：Ｓｈｏｄｅｘ ＳＴＡＮＤＡＲＤ Ｐ－８２（プルラン）

前記分子量マーカーのピークトップ分子量（Ｍｐ）および重量平均分子量（Ｍｗ）／数平均分子量（Ｍｎ）は、下記の通りである。
STD P-800：Ｍｐ：739,000、Ｍｗ／Ｍｎ：1.24
STD P-400：Ｍｐ：348,000、Ｍｗ／Ｍｎ：1.33
STD P-200：Ｍｐ：216,000、Ｍｗ／Ｍｎ：1.22
STD P-100：Ｍｐ：107,000、Ｍｗ／Ｍｎ：1.12
STD P-50：Ｍｐ：49,400、Ｍｗ／Ｍｎ：1.08
STD P-20：Ｍｐ：22,000、Ｍｗ／Ｍｎ：1.08
STD P-10：Ｍｐ：9,800、Ｍｗ／Ｍｎ：1.07
STD P-5：Ｍｐ：6,300、Ｍｗ／Ｍｎ：1.09

前記測定に供されるプロテオグリカンのピークトップ分子量は、例えば、３０万～１３０万、４０万～１２０万である。

つぎに、前記修飾工程では、前記切断工程で得られたプロテオグリカンの遊離したチオール基を、アルカリ性下で修飾する。これにより、前記修飾工程では、例えば、前記プロテオグリカンの遊離したチオール基が修飾され、ジスルフィド結合がチオール基間で再形成されるのを阻害できる。このため、前記修飾工程により、前記プロテオグリカンがＣ末端および／またはＮ末端を有する場合、前記プロテオグリカンのＣ末端および／またはＮ末端が露出した状態を維持、すなわち、検出可能な状態を維持できる。したがって、本開示の測定方法は、前記修飾工程により、前記プロテオグリカンのＣ末端および／またはＮ末端を検出可能な状態で維持できることにより、後述の検出工程において、前記Ｃ末端および／またはＮ末端を検出できる。

前記修飾工程は、例えば、前記切断工程で得られたプロテオグリカンおよび前記修飾に用いる修飾剤を含む反応系（修飾系）により実施できる。前記反応系は、例えば、水溶液等の液系である。前記反応系は、例えば、前記プロテオグリカンおよび前記修飾剤を混合することにより調製できる。

前記修飾工程は、アルカリ性下で行うことが好ましい。前記修飾工程におけるｐＨ（修飾ｐＨ）は、例えば、好ましくはｐＨ７．５～ｐＨ８．５であり、さらに好ましくは、ｐＨ７．８～ｐＨ８．２である。前記修飾工程は、例えば、ｐＨ７．５以上で実施することにより、前記チオール基を好適に修飾でき、これにより、前記プロテオグリカンのＣ末端および／またはＮ末端を好適に検出できる。前記修飾工程において、前記反応系のｐＨの調整は、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カリウム、炭酸水素ナトリウム、ホウ酸ナトリウム等のアルカリ；塩酸、硫酸、硝酸、クエン酸、リン酸等の酸；を用いて実施できる。

前記修飾は、例えば、アルキル化、グルタチオン化、スルホン化、スルフェン化またはスルフィン化、ニトロソ化（ニトロシル化）等の化学修飾があげられる。前記修飾は、例えば、前記修飾により付与される修飾基を含む修飾剤（反応剤）を用いることにより実施できる。具体例として、前記アルキル化は、例えば、アルキル化剤を用いて実施できる。前記アルキル化剤は、例えば、前記チオール基と反応して前記チオール基をアルキル化できる化合物である。前記アルキル化剤は、例えば、ヨードアセトアミド、ヨウ化メチル、ヨード酢酸等の有機ヨウ化物塩、エチレンオキサイド等のアルキレンオキサイド等があげられる。前記アルキル化剤は、例えば、１種類を使用してもよいし、複数種類を併用してもよい。前記スルフェン化またはスルフィン化は、例えば、前記チオール基を酸化できる化合物を用いて実施できる。前記チオール基を酸化できる化合物は、例えば、酸化剤があげられる。前記ニトロソ化は、例えば、一酸化窒素（ＮＯ）を供与できる化合物を用いて実施でき、具体例として、Ｓ－ニトロソグルタチオン等を用いて実施できる。

前記修飾工程における修飾条件（温度、時間等）は、特に制限されず、例えば、前記チオール基が十分に修飾される条件に設定できる。前記修飾における反応温度は、例えば、好ましくは、１５～４０℃である。前記修飾における反応時間は、例えば、好ましくは、５分以上、より好ましくは、５分以上～１６時間である。

前記修飾工程において、前記修飾は、例えば、前記修飾剤以外の成分を含んでもよい。前記他の成分は、例えば、バッファー等の緩衝剤、およびｐＨ調節剤等があげられる。

本開示の測定方法は、前記修飾工程後、前記検出工程に先立ち、任意に、前記プロテオグリカンを基材等の担体に固相化する固相化工程を含んでもよい。前記固相化方法は、例えば、タンパク質の公知の固相化方法により実施でき、具体的には、共有結合法、イオン結合法、物理的吸着法、疎水性相互作用等により実施できる。

前記担体は、例えば、マイクロウェルプレート等のプレート、（マイクロアレイ基板、メンブレン（例えば、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜、ニトロセルロース膜、ポリスチレン不織布等）、低蛍光性の担体（例えば、低蛍光性のプレート、低蛍光性のメンブレンなど）等があげられる。

本開示の測定方法は、例えば、前記固相化工程後、後述の検出工程で用いる抗体等の成分が非特異的に結合しないように、前記担体に対してブロッキングを実施してもよい。前記ブロッキングに用いるブロッキング剤は、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等のアルブミン、スキムミルク、市販のブロッキング試薬等があげられる。

つぎに、前記検出工程では、前記修飾されたプロテオグリカンのＣ末端ドメインおよびＮ末端ドメインの少なくとも一方を蛍光で検出する。これにより、前記検出工程では、例えば、前記プロテオグリカンのＣ末端および／またはＮ末端の存在または不存在を検出できる。前記検出方法は、具体的には、修飾されたプロテオグリカンとプローブとを接触させ、前記プロテオグリカンに結合したプローブを蛍光で検出することにより実施できる。前記検出では、基板等にプローブまたはプロテオグリカンを固相化したものを用いてもよい。

前記検出工程では、前記修飾されたプロテオグリカンのＣ末端ドメインおよびＮ末端ドメインのうち、一方を検出してもよいし、両方を検出してもよい。後者の場合、前記検出工程では、例えば、前記プロテオグリカンのＣ末端ドメインおよびＮ末端ドメインを同時に蛍光で検出することが好ましい。

前記検出対象のプロテオグリカンのＮ末端ドメインは、例えば、Ｇ１ドメイン、ＩＧＤドメイン、およびＧ２ドメインがあげられ、好ましくは、Ｇ１ドメインである。前記検出では、例えば、前記Ｎ末端ドメインのうち、１、２、または３個のドメインを検出してもよい。前記検出対象のプロテオグリカンのＣ末端ドメインは、例えば、Ｇ３ドメインがあげられる。

前記検出は、例えば、標的成分を蛍光検出により実施でき、具体例として、免疫学的測定法により実施できる。前記免疫学的測定法は、例えば、プローブとプロテオグリカンとの結合を検出する直接法；第１のプローブとプロテオグリカンとを結合させ、さらに第２のプローブを用いて前記プロテオグリカンに結合した第１のプローブを検出する間接法；第１のプローブとプロテオグリカンとを結合させ、さらに第２のプローブを用いて前記第１のプローブに結合したプロテオグリカンを検出するサンドイッチ法；ウエスタンブロッティング法、免疫沈降法、および免疫組織化学的染色法等があげられる。前記免疫学的測定方法は、定量的方法であってもよいし、定性的方法であってもよい。

前記プローブは、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、抗原結合断片等の標的特異的なタンパク質；アプタマー等の標的特異的な核酸分子；等があげられる。前記抗体は、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびＩｇＹから選択される免疫グロブリンのうち、いずれのアイソタイプの抗体であってもよい。前記抗体断片は、例えば、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、およびＦｖ等の抗体断片等があげられる。

前記プローブは、例えば、標識化されていてもよい。具体例として、前記抗体は、例えば、検出のために標識された抗体であってもよい。前記標識は、例えば、蛍光色素標識、酵素標識、および放射線標識等があげられる。前記蛍光検出を直接法により実施する場合、前記プローブは、例えば、蛍光標識されたプローブが好ましい。前記蛍光検出を間接法により実施する場合、前記第２のプローブは、例えば、蛍光標識されたプローブが好ましい。

前記蛍光検出は、例えば、蛍光検出器を用いて実施できる。

つぎに、本開示の実施例について説明する。ただし、本開示は、以下の実施例により制限されない。市販の試薬は、特に示さない限り、それらのプロトコルに基づいて使用した。なお、「ｍｏｌ／ｌ」は、「Ｍ」と標記することもある。

［実施例１］
本開示の測定方法により、プロテオグリカンのＣ末端およびＮ末端を検出できた。

（１）グアニジン抽出によるプロテオグリカンの精製
原材料として、シロサケの鼻軟骨、ニワトリの胸軟骨、ブタの気管支軟骨、およびコガネカレイの鰭を各１００～１５０ｇ用意した。前記原材料に、５倍量（Ｗ／Ｖ）の４Ｍグアニジン塩酸塩水溶液を添加した。前記添加後、４℃で１週間の条件下で、浸漬抽出を行った。前記抽出後、６０メッシュ篩いおよびろ紙（３μｍ）を用いて、ろ過を行った。前記ろ過後、３倍量（ｖ／ｖ）のエタノールを添加した。前記添加後、４℃で１晩の条件下で、静置した。前記静置後、ろ紙（３μｍ）を用いて、ろ過し、析出物を回収した。前記回収後、リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）を添加し、前記析出物を溶解した。前記溶解後、分子量分画膜（ＭＷ５万、旭化成社製）を用いて分画精製を行った。前記分画精製後、プロテオグリカン画分を回収した。前記回収後、前記プロテオグリカン画分を凍結乾燥させ、グアニジン抽出によるプロテオグリカンを得た。

（２）酢酸抽出によるプロテオグリカンの精製
原材料として、シロサケの鼻軟骨を１００～１５０ｇ用意した。酢酸抽出によるプロテオグリカンの精製は、下記参考文献１に記載の方法を参照して精製した。前記精製により、酢酸抽出によるプロテオグリカンを得た。
参考文献１：特許６３１７０５３号公報

（３）シロサケの鼻軟骨由来のプロテオグリカンのＣ末端ドメインの検出
前記実施例１（１）または前記実施例１（２）で得た、グアニジン抽出によるプロテオグリカンおよび酢酸抽出によるプロテオグリカンのＣ末端ドメインの検出を行った。具体的には、２０μｇのシロサケの鼻軟骨由来の前記各プロテオグリカンに、２０ｍｍｏｌ／ｌのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含むＰＢＳ（ｐＨ８．０）を０．１ｍｌ添加した。前記添加後、１０分間静置し、ジスルフィド結合の切断を行った。前記切断後、４０ｍｍｏｌ／ｌのヨードアセトアミドを添加し、３０分間、ｐＨ８．０の条件下で、アルキル化を行った。前記アルキル化後、１０μｌ、５０μｌ、または１００μｌの前記プロテオグリカン（０．５ｍｇ／ｍｌ、以下、固相化に用いる場合は同様の濃度）、または５０μｌの０．５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ（コントロール）を、メンブレンに固相化した。前記固相化（疎水性相互作用）は、バイオドット（BioRad社製）および低蛍光性のＰＶＤＦ膜（イモビロン－ＦＬメンブレン、メルク社製）を用いて行った。前記固相化後、１／１０００倍に希釈した一次抗体（抗アグリカンＧ３ドメイン抗体、Anti-Aggrecan Antibody clone 1-C-6、MABT84、メルク社製）を添加し、４℃、１６時間の条件下で、一次反応を行った。前記一次反応後、0.05％ Tween-20含有ＴＢＳ（トリスバッファー）を用いて洗浄した。前記洗浄後、１／２５００倍に希釈した二次抗体（ヤギ抗マウス IgG StarBright Blue 700、12004159、BioRad社製）を添加し、２５℃、１時間の条件下で、二次反応を行った。前記二次反応後、マルチプレックス蛍光検出器（ChemiDoc Touch MP、BioRad社製）を用いて、蛍光の検出を行った。これらの結果を、図３に示す。なお、比較例（非還元）において、ジスルフィド結合の切断およびアルキル化を行わなかったこと以外、同様の方法でＣ末端の検出を行った。

図３は、プロテオグリカンにおけるＣ末端ドメインの検出結果を示す写真である。図３の上段は、ジスルフィド結合の切断およびアルキル化を行った場合の結果を示し、図３の下段は、ジスルフィド結合の切断およびアルキル化を行わなかった場合の結果を示す。図３において、「薄」は、１０μｌの各プロテオグリカンを示し、「中」は、５０μｌの各プロテオグリカンを示し、「高」は、１００μｌの各プロテオグリカンを示す。図３に示すように、ジスルフィド結合の切断およびアルキル化を行わなかった場合、抽出方法に関わらず、全てのサンプルにおいて、Ｃ末端ドメインのシグナルは弱く検出された。他方、酢酸抽出によるプロテオグリカンにおいて、ジスルフィド結合の切断およびアルキル化を行った場合、Ｃ末端ドメインのシグナルは強く検出できた。また、グアニジン抽出によるプロテオグリカンにおいて、ジスルフィド結合の切断およびアルキル化を行った場合、酢酸抽出によるプロテオグリカンと比較して、シグナルは弱く検出されたが、Ｃ末端ドメインのシグナルを検出することができた。これらの結果から、本発明の測定方法を用いることにより、グアニジン抽出によるプロテオグリカンおよび酢酸抽出によるプロテオグリカンでは、Ｃ末端ドメインが保存されていることがわかった。

（４）各種プロテオグリカンのＮ末端ドメインの検出
前記実施例１（１）または前記実施例１（２）で得た、グアニジン抽出によるプロテオグリカンおよび酢酸抽出によるプロテオグリカンのＮ末端ドメインの検出を行った。具体的には、プロテオグリカンとして、シロサケの鼻軟骨由来のプロテオグリカン、ニワトリの胸軟骨由来のプロテオグリカン、ブタの気管支軟骨由来のプロテオグリカン、またはコガネカレイのヒレ由来のプロテオグリカンを用いたこと、固相化に１０μｌまたは５０μｌの前記プロテオグリカンを用いたこと、一次抗体に１／１０００倍に希釈した抗アグリカンIGDドメイン抗体（Aggrecan Antibody、DF7561、エピトープ：V355-V375、Affinity Biosciences社製）、ならびに、二次抗体に１／２５００倍に希釈したヤギ抗ウサギIgG StarBright Blue 700（12004162、BioRad社製）を用いたこと以外、前記実施例１（３）と同様の方法で検出を行った。これらの結果を、図４に示す。

図４は、プロテオグリカンにおけるＮ末端ドメインの検出結果を示す写真である。図４の上段（低濃度）は、１０μｌの各プロテオグリカンの結果を示し、図４の下段（高濃度）は、５０μｌの各プロテオグリカンの結果を示す。図４に示すように、酢酸抽出したシロサケの鼻軟骨由来のプロテオグリカンでは、Ｎ末端ドメインを検出することはできなかった。他方、グアニジン抽出したシロサケの鼻軟骨由来のプロテオグリカン、ニワトリの胸軟骨由来のプロテオグリカン、ブタ気管支軟骨由来のプロテオグリカン、およびコガネカレイのヒレ由来のプロテオグリカンでは、Ｎ末端ドメインを検出することができた。これらの結果から、本発明の測定方法を用いることにより、酢酸抽出によるシロサケの鼻軟骨由来のプロテオグリカンでは、Ｎ末端が保存されておらず、グアニジン抽出による各種動物由来のプロテオグリカンでは、Ｎ末端ドメインが保存されていることがわかった。

（５）各種プロテオグリカンのＣ末端ドメインの検出
前記実施例１（１）または前記実施例１（２）で得た、グアニジン抽出によるプロテオグリカンおよび酢酸抽出によるプロテオグリカンのＣ末端ドメインの検出を行った。具体的には、プロテオグリカンとして、シロサケの鼻軟骨由来、ニワトリの胸軟骨由来、またはブタの気管支軟骨由来を用いたこと、および固相化に１０μｌまたは５０μｌの前記プロテオグリカンを用いたこと以外、前記実施例１（３）と同様の方法で検出を行った。これらの結果を、図５に示す。

図５は、プロテオグリカンにおけるＣ末端ドメインの検出結果を示す写真である。図５の上段は、１０μｌの各プロテオグリカンの結果を示し、図５の下段は、５０μｌの各プロテオグリカンの結果を示す。図５に示すように、酢酸抽出したシロサケの鼻軟骨由来のプロテオグリカン、ならびに、グアニジン抽出したシロサケの鼻軟骨由来のプロテオグリカン、ニワトリの胸軟骨由来のプロテオグリカン、およびブタ気管支軟骨由来のプロテオグリカンでは、Ｃ末端ドメインを検出することができた。これらの結果から、本発明の測定方法を用いることにより、酢酸抽出によるシロサケの鼻軟骨由来のプロテオグリカンおよびグアニジン抽出による各種動物由来のプロテオグリカンでは、Ｃ末端ドメインが保存されていることがわかった。

（６）各種プロテオグリカンの各種ドメインの検出
前記実施例１（１）または前記実施例１（２）で得た、グアニジン抽出によるプロテオグリカンおよび酢酸抽出によるプロテオグリカンの各種ドメインの検出を行った。前記各種ドメインは、Ｎ末端ドメイン１（エピトープ：Val20-Gly675、Ｇ１－ＩＧＤ－Ｇ２ドメイン）、Ｎ末端ドメイン２（エピトープ：aa50-150、Ｇ１ドメイン）、Ｃ末端ドメイン１（エピトープ：aa2358-2481、Ｇ３ Ｌｅｃｔｉｎ－ＢＤドメイン）、およびＣ末端ドメイン２（エピトープ：aa2255-2280）であった。具体的には、１次抗体に、上記各種ドメインを検出可能な抗体、および、２次抗体に、前記１次抗体を検出可能な抗体を使用したこと以外、前記実施例１（３）と同様の方法で検出を行った。

前記１次抗体について、下記表１に示す。なお、前記Ｎ末端ドメイン１を検出する１次抗体は、５００倍希釈、前記Ｎ末端ドメイン２を検出する１次抗体は、９００倍希釈、Ｃ末端ドメイン１を検出する１次抗体は、３０倍希釈、前記Ｃ末端ドメイン２を検出する１次抗体は、１００倍希釈で使用した。

また、前記２次抗体は、１／２５００倍に希釈したヤギ抗ウサギIgG StarBright Blue 700（12004162、BioRad社製）または１／２５００倍に希釈したヤギ抗マウス IgG StarBright Blue 700（12004159、BioRad社製）を使用した。

酢酸抽出したシロサケの鼻軟骨由来のプロテオグリカンでは、Ｎ末端ドメインはほとんど検出されず、Ｃ末端ドメインはＧ３の一部について検出されたが、Lectinドメインは検出されなかった。グアニジン抽出したシロサケの鼻軟骨由来のプロテオグリカン、ニワトリの胸軟骨由来のプロテオグリカン、およびブタ気管支軟骨由来のプロテオグリカンでは、Ｎ末端ドメインについては全てのドメインが検出され、Ｃ末端ドメインについてはＧ３ドメインの全てのドメインが検出された。これらの結果から、本発明の測定方法を用いることにより、酢酸抽出によるシロサケの鼻軟骨由来のプロテオグリカンでは、Ｃ末端ドメインのＧ３ドメインのみが保存されており、ならびに、グアニジン抽出による各種動物由来のプロテオグリカンでは、Ｎ末端の全てのドメインおよびＣ末端の全てのＧ３ドメインが保存されていることがわかった。

［実施例２］
本開示の測定方法により、プロテオグリカンのＣ末端およびＮ末端を検出できた。

（１）各種プロテオグリカンの各種ドメインの検出
前記実施例１（１）で得たグアニジン抽出によるシロサケの鼻軟骨由来のプロテオグリカン（ｓＣＳＰＧ－Ｇｄｍ）、前記実施例１（２）で得た酢酸抽出によるシロサケの鼻軟骨由来のプロテオグリカン（ｓＣＳＰＧ－ＡｃＯＨ）、前記実施例１（１）で得たグアニジン抽出によるニワトリの胸軟骨由来のプロテオグリカン（ｃＣＳＰＧ）、および前記実施例１（１）で得たグアニジン抽出によるブタの気管支軟骨由来のプロテオグリカン（ｐＣＳＰＧ）の各種ドメインの検出を行った。前記各種ドメインは、Ｇ１ドメイン、ＩＧＤドメイン、Ｇ１－ＩＧＤ－Ｇ２ドメイン、Ｇ３ドメイン１、Ｇ３ドメイン２（エピトープ：aa2255-2280）、およびＧ３レクチンドメインである。具体的には、１次抗体に、上記各種ドメインを検出可能な抗体、および、２次抗体に、前記１次抗体を検出可能な抗体を使用したこと以外、前記実施例１（３）と同様の方法で検出を行った。これらの結果を図６に示す。

前記１次抗体について、下記表２に示す。なお、前記Ｇ１ドメインを検出する１次抗体は、９００倍希釈、前記ＩＧＤドメインを検出する１次抗体は、１０００倍希釈、前記Ｇ１－ＩＧＤ－Ｇ２ドメインを検出する１次抗体は、５００倍希釈、前記Ｇ３ドメイン１を検出する１次抗体は、１０００倍希釈、前記Ｇ３ドメイン２（エピトープ：aa2255-2280）を検出する１次抗体は、１００倍希釈、前記Ｇ３レクチンドメインを検出する１次抗体は、３０倍希釈で使用した。

前記２次抗体は、１／２５００倍に希釈したヤギ抗ウサギIgG StarBright Blue 700（12004162、BioRad社製）または１／２５００倍に希釈したヤギ抗マウス IgG StarBright Blue 700（12004159、BioRad社製）を使用した。

また、前記各種プロテオグリカンについて、ピークトップ分子量の測定を行った。具体的には、前記各種プロテオグリカンについて、以下の測定条件でＨＰＬＣ分析を行った。これらの結果を、図６に示す。

（ＨＰＬＣの測定条件）
ＨＰＬＣシステム：ＬＣ－１０ＡＤ
カラム：ＴＳＫｇｅｌ Ｇ５０００－ＰＷＸＬ Φ７．８ｍｍ×３００ｍｍ（東ソー社製）
溶出液：ｐＨ６．８ リン酸緩衝液
流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
検出器：示唆屈折率検出器（ＲＩＤ－１０Ａ 島津製作所社製）
注入量：５０μｌ
分子量マーカー：Ｓｈｏｄｅｘ ＳＴＡＮＤＡＲＤ Ｐ－８２（プルラン）

図６は、プロテオグリカンにおけるＣ末端ドメインの検出結果を示す写真である。図６は上段から下段にかけて、Ｇ１ドメイン、ＩＧＤドメイン、Ｇ１－ＩＧＤ－Ｇ２ドメイン、Ｇ３ドメイン１、Ｇ３ドメイン２（エピトープ：aa2255-2280）、およびＧ３レクチンドメインの結果を示す。また、図６は、左列から右列にかけて、ＢＳＡ（１）、酢酸抽出のシロサケの鼻軟骨由来のプロテオグリカン（２）（ｓＣＳＰＧ－ＡｃＯＨ）、グアニジン抽出のシロサケの鼻軟骨由来のプロテオグリカン（３）（ｓＣＳＰＧ－Ｇｄｍ）、グアニジン抽出のニワトリの胸軟骨由来のプロテオグリカン（４）（ｃＣＳＰＧ）、およびグアニジン抽出のブタの気管支軟骨由来のプロテオグリカン（５）（ｐＣＳＰＧ）の結果を示す。図６に示すように、酢酸抽出したプロテオグリカンでは、Ｎ末端ドメインはほとんど検出されず、Ｃ末端ドメインはＧ３の一部について検出された。他方、酢酸抽出によるプロテオグリカン、グアニジン抽出によるプロテオグリカン、ｃＣＳＰＧ、ｐＣＳＰＧでは、Ｎ末端ドメインおよびＣ末端ドメインの両方が検出された。また、酢酸抽出によるプロテオグリカン、グアニジン抽出によるプロテオグリカン、ｃＣＳＰＧ、およびｐＣＳＰＧのピークトップ分子量は、それぞれ、４８万、６８万、６３万、および６４万であった。

（２）各プロテオグリカン中のＧＡＧの分析
前記実施例２（１）で使用した各種プロテオグリカンについて、ＧＡＧの分析を行った。具体的には、前記実施例２（１）で使用した各種プロテオグリカンから、ＧＡＧを精製した。１０ｇの前記ｓＣＳＰＧ－Ｇｄｍ、前記ｃＣＳＰＧ、または前記ｐＣＳＰＧを８０ｍｌの沸騰水で１０分間処理した。前記処理後、１００ｍｌの０．５ｍｏｌ／ｌ ホウ酸緩衝液（ｐＨ７．０）を添加した。前記添加後、０．６７ｇのプロテアーゼＮアマノＧ（天野エンザイム社製）を添加後、５５℃の条件下で、７日間インキュベーションした。前記インキュベーション後、濃度５％ トリクロロ酢酸でクエンチングを行った。前記クエンチング後、不溶物を濾過し、１．２５％ ＮａＯＡｃ（酢酸ナトリウム）含有８０％エタノールで沈殿させた。前記沈殿後、０℃で遠心分離し、得られた沈殿物を真空乾燥させて粗糖鎖を得た。つぎに、１００ｍｇの前記粗糖鎖を０．１５ｍｏｌ／ｌ ＬｉＣｌ含有０．０５ｍｏｌ／ｌ 酢酸（ｐＨ ４．０）で希釈した。前記希釈後、ＤＥＡＥ－セルロースカラム（φ２．２×１５ｃｍ、和光純薬社製）にアプライした。前記アプライ後、０．１５、０．５、１．０、または２．０ｍｏｌ／ｌ ＬｉＣｌ含有１６０ｍｌのバッファーで前記カラムを段階的に洗浄した。前記洗浄後、カルバゾール陽性画分を回収および透析し、前記透析後のサンプルを、ゲル浸透用カラム（LH-20、Ｈ_２Ｏ、φ1.1×80cm）で脱塩して、ＧＡＧを得た。その後、５０μｇの前記ＧＡＧを、５０μｇのＨ_２Ｏで希釈した。前記希釈後、直線連結型サイズ排除カラム（OHpak SB-G 6B 100×4.6mmおよびSB-805 HQ 250×4.6mm）を用いて、ＨＰＬＣ分析を行った。

（ＨＰＬＣの測定条件）
ＨＰＬＣシステム：ＬＣ－１０ＡＤ（株式会社島津製作所製）
カラム：OHpak SB-G 6B 100×4.6mmおよびSB-805 HQ 250×4.6mm
溶出液：０．１ｍｏｌ／ｌ ＮａＮＯ_３
流量：１ｍＬ／ｍｉｎ

この結果、グアニジン抽出のシロサケの鼻軟骨由来のＧＡＧ（ｓＧＡＧ）のピークトップ分子量（Ｍｐ）は、８．４万、グアニジン抽出のニワトリの胸軟骨由来のＧＡＧ（ｃＧＡＧ）のピークトップ分子量（Ｍｐ）は、７．７万、グアニジン抽出のブタの気管支軟骨由来のＧＡＧ（ｐＧＡＧ）のピークトップ分子量（Ｍｐ）は、５．１万であった。

（３）各プロテオグリカン中の二糖構造
前記実施例２（２）で得られた各種ＧＡＧについて、各プロテオグリカンの二糖構造を分析した。具体的には、前記実施例２（２）で得られた５０μｇの各種ＧＡＧを、５０μｌ Ｈ_２Ｏ、ＢＳＡ溶液（０．０５ｍｇ/５μｌ）、および１０μｌの２５０ｍｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ＡｃＯＨ）溶液で希釈した（ｐＨ８．０）。前記希釈後、得られた希釈液について、コンドロイチナーゼＡＢＣ（２５ｍＵ／２５μｌ、Sigma Aldrich社製）またはコンドロイチナーゼＡＣ（２５ｍＵ／２５μｌ、Sigma Aldrich社製）を用いて、３７℃または３０℃の条件下で、８時間消化した。前記消化後、前記消化によって生じた不飽和二糖を、PA-03（PA-G）カラムを用いて、ＨＰＬＣ分析に供した。前記分析では、前記標準不飽和二糖のＨＰＬＣピーク面積に基づき、各二糖構造の含有割合（構成割合）を算出した。これらの結果を、下記表３に示す。

前記表３に示すように、二糖構造の含有量は、以下の通りとなった。

・グアニジン抽出のシロサケの鼻軟骨由来のＧＡＧ（ｓＧＡＧ）
コンドロイチン硫酸Ｏ：11%、コンドロイチン硫酸ｉＯ：0%、コンドロイチン硫酸Ａ：27%、コンドロイチン硫酸ｉＡ：0%、コンドロイチン硫酸Ｃ：61%、コンドロイチン硫酸ｉＣ：0%
・グアニジン抽出のニワトリの胸軟骨由来のＧＡＧ（ｃＧＡＧ）
コンドロイチン硫酸Ｏ：5.2%、コンドロイチン硫酸ｉＯ：0%、コンドロイチン硫酸Ａ：63%、コンドロイチン硫酸ｉＡ：6.5%、コンドロイチン硫酸Ｃ：24%、コンドロイチン硫酸ｉＣ：0.3%
・グアニジン抽出のブタの気管支軟骨由来のＧＡＧ（ｐＧＡＧ）
コンドロイチン硫酸Ｏ：6.1%、コンドロイチン硫酸ｉＯ：0%、コンドロイチン硫酸Ａ：52%、コンドロイチン硫酸ｉＡ：20%、コンドロイチン硫酸Ｃ：19%、コンドロイチン硫酸ｉＣ：2.1%

［実施例３］
つぎに、本開示の測定方法により、プロテオグリカンとしてアグリカンの代わりに、デコリンを検出できるか検討した。前記デコリンは、コアタンパク質に１本鎖のＧＡＧを有する、小型のロイシンリッチプロテオグリカンである。

まず、ウシ由来のプロテオグリカン（デルマタン硫酸プロテオグリカン：ＤＳＰＧ）を用意した。原材料として、ウシ（ホルスタイン）の第四胃を約８２４ｇ用意した。前記第四胃は、洗浄し、可能な限り脂を除去しながら約２ｃｍ角に細断した。前記細断後、４倍量のエタノール（３２８８ｍｌ）を添加し、１０分静置し、これを１回繰り返し行った。その後、４倍量のエタノール（３２８８ｍｌ）を添加し、一晩静置した。前記静置後、前記エタノールを除去し、風乾を行った。前記風乾後、減圧乾燥を行い、１７３ｇの脱脂乾燥物を得た。つぎに、前記脱脂乾燥物について、グアニジン抽出によるプロテオグリカンの精製を行った。具体的には、８７ｇの前記実施例２（１－１）の脱脂乾燥物を、３５０ｍｌの４Ｍグアニジン塩酸塩水溶液を添加し、４℃で３日間の条件下で、浸漬抽出を行った。前記浸漬抽出後、３４７ｍｌの４Ｍグアニジン塩酸塩水溶液を添加し、４℃で３日間の条件下で、さらに浸漬抽出を行った。前記浸漬抽出後、吸引濾過および透析を行った。前記透析後、凍結乾燥を行い、９．９３ｇのプロテオグリカン固形物を得た。

前記プロテオグリカンについて、中性緩衝バッファー（ｐＨ７．５）による塩交換を行った。具体的には、前記中性緩衝バッファー（ｐＨ７．５）による塩交換は、前記ウシの胃由来プロテオグリカンに、６０ｍｌの中性緩衝バッファー（ｐＨ７．５）を添加した。前記添加後、超音波破砕を行い、一晩静置した。前記静置後、遠心分離を行い、上清を得た。前記上清について、透析および凍結乾燥を行った。

つぎに、FOCUS Protein Reduction-Alkylation（786-231、G-Biosciences社製）を用いて、プロテオグリカンの還元・アルキル化を行った。前記中性緩衝バッファー（ｐＨ７．５）による塩交換を行った後の１ｍｇ／ｍｌ プロテオグリカン ５００μｌに、２．５μｌのReductant Bufferを添加し、１０秒間撹拌した。前記撹拌後、１０ｍｌのFOCUS Protein Reductantを添加し、５５℃、１時間の条件下で静置した。前記静置後、２．５ｍｌのAlkylation Bufferを添加し、１０秒間撹拌した。前記撹拌後、０．４ｍｏｌ／ｌのIodoacetamideを添加し、遮光下、室温（約２５℃、以下、同様。）、１時間の条件下で、静置し、サンプルのアルキル化を行った。つぎに、メタノールを用いて、ＰＶＤＦ膜（イモビロン－ＦＬメンブレン、メルク社製）を１分間処理し、親水化した。前記親水化後、５分間の条件下で、前記ＰＶＤＦ膜をＴＢＳに置換した。前記置換後、ろ過ブロッティング装置（BioRad社製）に、前記ＰＶＤＦ膜をセットした。前記セット後、アルキル化したサンプルをウェルにアプライし、吸引した。前記吸引後、前記ろ過ブロッティング装置から前記ＰＶＤＦ膜を回収し、前記ＰＶＤＦ膜を、室温の条件下で、静置乾燥した。前記静置乾燥後、前記ＰＶＤＦ膜を0.05％ Tween-20含有ＴＢＳ（トリスバッファー、TBS-T）で洗浄した。前記洗浄後、前記ＰＶＤＦ膜を、EveryBlotブロッキングバッファー（BioRad社製）を用いて、５分間の条件下で、ブロッキングを行った。前記ブロッキング後、１／１０００倍に希釈した一次抗体（抗Decorin抗体、Cat No: 14667-1-AP、Proteintech社製）を添加し、４℃、１８時間の条件下で、一次反応を行った。前記一次反応後、TBS-Tを用いて、５分間、５回の条件下で、洗浄した。前記洗浄後、１／２５００倍に希釈したStarBright Blue（BioRad社製）および０．０５％ ＳＤＳを添加し、室温、１時間の条件下で、二次反応を行った。前記二次反応後、TBS-Tを用いて、５分間、６回の条件下で、洗浄した。前記洗浄後、ＰＶＤＦ膜を超純水で洗浄し、超純水に置換した。前記置換後、マルチプレックス蛍光検出器（ChemiDoc Touch MP、BioRad社製）を用いて、前記ＰＶＤＦ膜の蛍光の検出を行った。これらの結果を、図７に示す。

図７は、デコリンの検出結果を示す写真である。図７において、左列は、ＢＳＡの結果を示し、右列は、ウシ由来のＤＳＰＧの結果を示す。図７に示すように、ウシ由来ＤＳＰＧにおいて、シグナルを検出することができた。これらの結果から、グアニジン抽出し、中性緩衝バッファー（ｐＨ７．５）によって塩置換したウシ由来のプロテオグリカンは、本開示の測定方法を用いることにより、コアタンパク質としてデコリンが保存されていることがわかった。

以上、実施形態および実施例を参照して本開示を説明したが、本開示は、上記実施形態および実施例に限定されるものではない。本開示の構成や詳細には、本開示のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をすることができる。

この出願は、２０２３年５月１１日に出願された日本出願特願２０２３－０７８７２９、および２０２３年１２月７日に出願された日本特許出願特願２０２３－２０６８３０を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。

＜付記＞
上記の実施形態および実施例の一部または全部は、以下の付記のように記載されうるが、以下には限られない。
＜プロテオグリカンの測定方法＞
（付記１）
プロテオグリカンの測定方法であって、
前記プロテオグリカンのジスルフィド結合を切断する切断工程と、
得られたプロテオグリカンのチオール基をアルカリ性下で修飾する修飾工程と、
前記プロテオグリカンのＣ末端ドメインおよびＮ末端ドメインの少なくとも一方を蛍光で検出する検出工程と、
を含む、プロテオグリカンの測定方法。
（付記２）
前記検出工程では、前記プロテオグリカンのＣ末端ドメインおよびＮ末端ドメインを同時に蛍光で検出する、付記１に記載の測定方法。
（付記３）
前記切断は、還元剤によるチオール基への還元である、付記１または２に記載の測定方法。
（付記４）
前記アルカリ性は、ｐＨ７．５～ｐＨ８．５である、付記１から３のいずれかに記載の測定方法。
（付記５）
前記修飾工程では、前記チオール基を修飾することにより、ジスルフィド結合の形成を阻害する、付記１から４のいずれかに記載の測定方法。
（付記６）
前記修飾工程では、前記チオール基をアルキル化修飾する、付記１から５のいずれかに記載の測定方法。
（付記７）
前記検出工程に先立ち、前記プロテオグリカンを固相化する固相化工程を実施する、付記１から６のいずれかに記載の測定方法。
（付記８）
前記Ｎ末端ドメインは、Ｇ１ドメイン、ＩＧＤドメイン、および／または、Ｇ２ドメインである、付記１から７のいずれかに記載の測定方法。
（付記９）
前記Ｃ末端ドメインは、Ｇ３ドメインである、付記１から７のいずれかに記載の測定方法。
（付記１０）
前記検出工程では、免疫学的測定法により検出する、付記１から９のいずれかに記載の測定方法。
（付記１１）
前記プロテオグリカンのピークトップ分子量は、４０万～１２０万である、付記１から１０のいずれかに記載の測定方法。
（付記１２）
前記プロテオグリカンは、動物由来のプロテオグリカンである、付記１から１１のいずれかに記載の測定方法。
（付記１３）
前記プロテオグリカンは、レクチカンファミリーのプロテオグリカンである、付記１２に記載の測定方法。
（付記１４）
前記プロテオグリカンは、アグリカンである、付記１２または１３に記載の測定方法。
（付記１５）
前記動物は、サケ、ニワトリ、ブタ、およびカレイからなる群から選択される、付記１２から１４のずれかに記載の測定方法。

以上説明したように、本開示によれば、例えば、Ｃ末端および／またはＮ末端が維持されたプロテオグリカンを検出可能なプロテオグリカンの測定方法等を提供すること等ができる。このため、本開示は、例えば、再生医療分野において、極めて有用といえる。

Claims (10)

1. プロテオグリカンの測定方法であって、
   前記プロテオグリカンのジスルフィド結合を還元剤によりチオール基へ還元することにより切断する切断工程と、
   得られたプロテオグリカンのチオール基をｐＨ７．５～ｐＨ８．５下でアルキル化修飾することにより、ジスルフィド結合の形成を阻害する修飾をする修飾工程と、
   前記プロテオグリカンのＣ末端ドメインおよびＮ末端ドメインを同時に蛍光で検出する検出工程と、を含む、
   プロテオグリカンの測定方法。
2. 前記検出工程に先立ち、前記プロテオグリカンを固相化する固相化工程を実施する、請求項１に記載の測定方法。
3. 前記Ｎ末端ドメインは、Ｇ１ドメイン、ＩＧＤドメイン、および／または、Ｇ２ドメインである、請求項１または２に記載の測定方法。
4. 前記Ｃ末端ドメインは、Ｇ３ドメインである、請求項１または２に記載の測定方法。
5. 前記検出工程では、免疫学的測定法により検出する、請求項１または２のいずれか一項に記載の測定方法。
6. 前記プロテオグリカンのピークトップ分子量は、４０万～１２０万である、請求項１または２に記載の測定方法。
7. 前記プロテオグリカンは、動物由来のプロテオグリカンである、請求項１または２に記載の測定方法。
8. 前記プロテオグリカンは、レクチカンファミリーのプロテオグリカンである、請求項７に記載の測定方法。
9. 前記プロテオグリカンは、アグリカンである、請求項７に記載の測定方法。
10. 前記動物は、サケ、ニワトリ、ブタ、およびカレイからなる群から選択される、請求項７に記載の測定方法。