JP7696975B2 - 腫瘍遺伝子変異量の正規化 - Google Patents

Description

相互参照
本出願は、２０１７年１１月３日に出願された米国仮出願第６２／５８１，５６３号に基づく優先権を主張し、この仮出願は、参照によりすべての目的で本明細書に全体的に組み込まれる。

背景
腫瘍は、細胞の異常な増殖である。細胞、例えば、腫瘍細胞が死滅すると、断片化ＤＮＡが体液中に放出されることが多い。よって、体液中の無細胞ＤＮＡの一部は、腫瘍ＤＮＡである。腫瘍は、良性である場合も悪性である場合もある。悪性腫瘍は、がんと称されることが多い。

がんは、全世界で、疾患の主要な原因である。年々、数千万人の人々が、世界中でがんを有すると診断され、半数より多くが、最終的にがんを原因として死亡する。多くの国では、がんは、心血管疾患に続いて２番目の共通死亡原因として位置付けられる。多くのがんでは、早期検出がアウトカムの改善と関連する。

がんは、通常、個体の正常細胞内における変異の蓄積によって引き起こされ、その少なくとも一部は、適切に制御されない細胞分裂をもたらす。このような変異として、一般的に、一塩基多様性（ＳＮＶ）、遺伝子融合、挿入および欠失（インデル）、トランスバージョン、トランスロケーション、およびインバージョンが挙げられる。がん内部の変異の数は、免疫療法に対するがん罹患性のインジケーターである。

がんは、腫瘍の生検と、それに続く、細胞病理学、バイオマーカーまたは細胞から抽出されたＤＮＡの解析によって検出されることが多い。しかし、より最近では、体液、例えば、血液または尿中の無細胞核酸（例えば、血中循環核酸、血中循環腫瘍核酸、エキソソーム、アポトーシス細胞および／またはネクローシス細胞由来の核酸）からもがんを検出することができることが提案されている（例えば、Ｓｉｒａｖｅｇｎａ ｅｔ ａｌ．，
Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２０１７を参照されたい）。このような試験は、それらが非侵襲性であり、生検およびがんの各部由来の試料核酸により、がんの疑いのある細胞を特定することなく実施することができるという利点を有する。しかしながら、このような試験は、体液に放出される核酸の量が少なく、解析可能な形態でこのような液体から核酸を回収するのと同様に変動するという事実によって複雑化されている。これらの変動要因によって、試料間の腫瘍遺伝子変異量（ＴＭＢ）を比較する予測値が曖昧となる可能性がある。

ＴＭＢは、腫瘍ゲノムにおける腫瘍細胞によって運ばれる変異の尺度である。ＴＭＢは、がんの徴候を有すると診断されたかまたはがんの徴候を有すると疑われる対象が、がん療法、例えば、がん免疫（Ｉ－Ｏ）療法から利益を得るかどうかを評価するために使用することができる、ある種のバイオマーカーである。

本開示の一態様は、がん型またはがん型の徴候を有する対象由来の無細胞核酸の試験試料中の腫瘍遺伝子変異量の指標を提供する方法であって：（ａ）試験試料の無細胞核酸中に存在する変異の数、および試験試料の無細胞核酸中で最も多く示される１つまたは複数の変異に基づくマイナー対立遺伝子比率を決定するステップと；（ｂ）試験試料中のがん遺伝子変異量の指標を決定するために、試料中に存在する変異の数を、同じがん型を有する他の対象由来の対照試料中に存在する変異の数および試験試料のマイナー対立遺伝子比率を含むマイナー対立遺伝子比率のビン内のマイナー対立遺伝子比率に対して正規化するステップとを含む、方法に関する。

一部の実施形態では、対照試料中に存在する変異の数は、平均（ａｖｅｒａｇｅ）である。

一部の実施形態では、ビンは、２０％以下、１０％以下または５％以下の幅を有する。

一部の実施形態では、方法は、試料中に存在する変異の数が、閾値を超えているかどうかを決定するステップをさらに含み、閾値は、免疫療法に正に応答する傾向がある対象を示すように設定される。

一部の実施形態では、正規化するステップは、試験試料中の変異の数を、対照試料中の変異の平均数で除することを含む。

一部の実施形態では、正規化するステップは、無細胞核酸の試験試料中の変異の決定された数から、ビン内の対照試料中の変異の数の平均を減算することを含む。

一部の実施形態では、方法は、対照試料中に存在する変異の平均数を減じた無細胞核酸の試験試料中の変異の数を、対照試料中に存在する変異の数の標準偏差で除し、Ｚスコアを算出するステップをさらに含む。平均は、平均値（ｍｅａｎ）であり得る。

一部の実施形態では、正規化するステップは、少なくとも１０、５０、１００または５００個の対照試料中の変異の数の平均および広がりを決定することと、試験試料中の平均からの偏差の標準スコアを決定することと、標準スコアが閾値数を超えているかどうかを決定することとを含む。平均は、平均値、中央値または最頻値であり得る。広がりは、分散、標準偏差、または四分位範囲として表され得る。偏差の標準スコアは、Ｚスコアであり得る。

一部の実施形態では、正規化するステップは、無細胞核酸の試験試料中の変異の決定された数を、同じビン内の対照試料中に存在する変異の平均数で除することをさらに含む。

一部の実施形態では、正規化するステップは、マイナー対立遺伝子比率の複数のビンに存在する変異の数の値を保存するためにプログラムされたコンピューターにおいて実施される。保存される値は、複数のビンのそれぞれに存在する変異の数の平均値および標準偏差であり得る。

一部の実施形態では、対象における腫瘍遺伝子変異量の標準スコア、および標準スコアが、免疫療法に対する応答性と一致して、対照対象に対する閾値を超えているかどうかを決定するステップを含む。

一部の実施形態では、（ａ）は、試験試料中の無細胞核酸分子の配列を決定することと、試料中に存在する変異の数およびマイナー対立遺伝子比率を特定するために、得られた配列を対応する参照配列と比較することとを含む。参照配列は、ｈＧ１９またはｈＧ３８である。

一部の実施形態では、対照試料は、少なくとも２５、５０、１００、２００または５００個の対照試料を含む。

一部の実施形態では、少なくとも５０，０００、１００，０００または１５０，０００ヌクレオチドは、核酸のセグメントにおいてシーケンシングされる。

一部の実施形態では、（ａ）は、試料中に存在するかまたは存在することが疑われる型のがんにおいて生じることが既知の所定の変異のパネルの有無を決定することを含み、必要に応じて、変異は、コード化タンパク質の配列に影響を及ぼす体細胞変異である。

一部の実施形態では、ステップ（ａ）は、アダプターを無細胞核酸に連結させることと、アダプターに結合するプライマーから無細胞核酸を増幅することと、増幅された核酸をシーケンシングすることとを含む。

一部の実施形態では、シーケンシングすることは、ブリッジ増幅シーケンシング、パイロシーケンシング、イオン半導体シーケンシング、ペアエンドシーケンシング、ライゲーションによるシーケンシングまたは単分子リアルタイムシーケンシングである。

一態様では、本開示は、対象を処置する方法であって：（ａ）試験試料の無細胞核酸中に存在する変異の数、および試験試料の無細胞核酸中で最も多く示される１つまたは複数の変異に基づくマイナー対立遺伝子比率を決定するステップと；（ｂ）試験試料中のがん遺伝子変異量の指標を決定するために、試料中に存在する変異の数を、同じがん型を有する他の対象由来の対照試料中に存在する変異の数および試験試料のマイナー対立遺伝子比率を含むマイナー対立遺伝子比率のビン内のマイナー対立遺伝子比率に対して正規化するステップと；（ｃ）腫瘍遺伝子変異量の指標が閾値を超える場合、免疫療法を対象に投与するステップとを含む、方法に関する。

一部の実施形態では、本方法は、各対象における腫瘍遺伝子変異量の指標を決定するために複数の対象で実施され、閾値を下回る腫瘍遺伝子変異の指標を有する対象よりも高い比率の、閾値を超えるがん遺伝子変異量の指標を有する対象は、がんに対する免疫療法を受ける。

一部の実施形態では、指標が第１の閾値を超えるすべての対象が免疫療法を受け、指標が第２の閾値を下回るすべての対象が免疫療法を受けない。

一部の実施形態では、指標は、Ｚスコアである。

一部の実施形態では、免疫療法は、チェックポイントインヒビター抗体の投与を含む。

一部の実施形態では、免疫療法は、ＰＤ－１、ＰＤ－２、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ－４０、ＯＸ４０、Ｂ７．１、Ｂ７Ｈｅ、ＬＡＧ３、ＣＤ１３７、ＫＩＲ、ＣＣＲ５、ＣＤ２７、またはＣＤ４０に対する抗体の投与を含む。

一部の実施形態では、免疫療法は、炎症促進性サイトカインの投与を含む。

一部の実施形態では、免疫療法は、がん型に対するＴ細胞の投与を含む。

一部の実施形態では、がん型は、固形腫瘍である。

一部の実施形態では、がん型は、腎がん、中皮腫、軟組織がん、原発性ＣＮＳがん、甲状腺がん、肝がん、前立腺がん、膵がん、ＣＵＰ、神経内分泌がん、ＮＳＣＬＣ、胃食道がん、頭頚部がん、ＳＣＬＣ、乳がん、黒色腫、胆管腺がん、婦人科系がん、結腸直腸がんまたは尿路上皮がんである。

一部の実施形態では、がん型は、造血器悪性腫瘍である。

一部の実施形態では、がん型は、白血病またはリンパ腫である。

一態様では、本開示は、がんを有する対象を処置する方法であって、免疫療法剤を対象に投与するステップを含み、対象が：（ａ）対象由来の試料の無細胞核酸中に存在する変異の数、および試験試料の無細胞核酸中で最も多く示される変異に対するマイナー対立遺伝子比率を決定するステップと；（ｂ）対象の試料中の腫瘍遺伝子変異量の指標を決定するために、試料中に存在する変異の数を、同じがん型を有する他の対象由来の対照試料中に存在する変異の数および試験試料のマイナー対立遺伝子比率を含むマイナー対立遺伝子比率のビン内のマイナー対立遺伝子比率に対して正規化するステップとによって決定された対象のがん遺伝子変異量の指標から、免疫療法に対して特定されており；対象が、閾値を超える腫瘍遺伝子変異量を有することが決定される、方法に関する。

本開示は、
（１）試験試料中の無細胞核酸をシーケンシングすることによって得られたシーケンシングリードを、通信ネットワークを通じて受容する通信インターフェース、ならびに
（２）通信インターフェースと通信するコンピューターであって、１つまたは複数のコンピュータープロセッサーと、１つまたは複数のコンピュータープロセッサーによる実行の際に：
（ａ）核酸シーケンサーによって得られたシーケンシングリードを、通信ネットワークを通じて受容するステップと；
（ｂ）試験試料由来のシーケンシングリードに存在する変異の数、および試験試料由来のシーケンシングリード中で最も多く示される１つまたは複数の変異に基づくマイナー対立遺伝子比率を決定するステップと；
（ｃ）試験試料中のがん遺伝子変異量の指標を決定するために、試験試料中に存在する変異の数を、同じがん型を有する他の対象由来の対照試料中に存在する変異の数および試験試料のマイナー対立遺伝子比率を含むマイナー対立遺伝子比率のビン内のマイナー対立遺伝子比率に対して正規化するステップ
とを含む方法を実施する、マシン実行可能コードを含むコンピューター可読媒体とを含むコンピューター
を含むシステムをさらに提供する。

一部の実施形態では、核酸シーケンサーによって、対象に由来する無細胞ＤＮＡ分子から得られたシーケンシングライブラリーがシーケンシングされ、シーケンシングライブラリーは、無細胞ＤＮＡ分子およびバーコードを含むアダプターを含む。一部の実施形態では、核酸シーケンサーによって、シーケンシングリードを得るために、シーケンシングライブラリーに関するシーケンシングバイシンセシスが実施される。一部の実施形態では、核酸シーケンサーによって、シーケンシングリードを得るために、シーケンシングライブラリーに関するパイロシーケンシング、単分子シーケンシング、ナノポアシーケンシング、半導体シーケンシング、シーケンシングバイライゲーションまたはシーケンシングバイハイブリダイゼーションが実施される。一部の実施形態では、核酸シーケンサーによって、シーケンシングリードを得るために、シーケンシングライブラリーに由来するクローン単一分子アレイが使用される。一部の実施形態では、核酸シーケンサーは、シーケンシングリードを得るために、シーケンシングライブラリーをシーケンシングするためのマイクロウェルのアレイを有するチップを含む。一部の実施形態では、コンピューター可読媒体は、メモリー、ハードドライブまたはコンピューターサーバーを含む。一部の実施形態では、通信ネットワークは、遠距離通信ネットワーク、インターネット、エクストラネット、またはイントラネットを含む。一部の実施形態では、通信ネットワークは、分散コンピューティングの可能な１つまたは複数のコンピューターサーバーを含む。一部の実施形態では、分散コンピューティングは、クラウドコンピューティングである。一部の方法では、コンピューターは、核酸シーケンサーから遠隔設置されているコンピューターサーバー上に設置されている。一部の実施形態では、シーケンシングライブラリーは、試料を１つまたは複数の試料から識別する試料バーコードをさらに含む。一部の実施形態では、システムは、ネットワークを通じて、コンピューターと通信する電子ディスプレイであって、（ａ）～（ｃ）を実施した際の結果を表示するためのユーザーインターフェースを含む電子ディスプレイをさらに含む。一部の実施形態では、ユーザーインターフェースは、グラフィカルユーザーインターフェース（ＧＵＩ）またはウェブベースユーザーインターフェースである。一部の実施形態では、電子ディスプレイは、パーソナルコンピューターにおいて存在する。一部の実施形態では、電子ディスプレイは、インターネット対応コンピューターにおいて存在する。一部の実施形態では、インターネット対応コンピューターは、コンピューターから遠隔した位置に設置されている。

一部の実施形態では、本明細書で開示されたシステムおよび方法の結果は、インプットとして使用され、紙形式でレポートが作成される。例えば、このレポートは、コールされたバリアントおよび／または脱アミノ化のエラーと考えられるバリアントのインジケーションを提供することができる。

本明細書で開示された方法の様々なステップ、または本明細書で開示されたシステムによって実行されるステップは、同一もしくは異なる時間に、同一もしくは異なる地理的位置、例えば、国において、および／または同一もしくは異なる人々によって実行され得る。

図１は、腫瘍型による試料ごとの遺伝子変異量の分布を示す。臨床的適応内の他の試料に対する試料ごとのＳＮＶおよびインデル数。横棒は、９５パーセンタイルを示す。

図２は、本開示の方法を実施するためのコンピューターシステムを示す。

定義
対象は、動物、例えば、哺乳類種（好ましくは、ヒト）または鳥類（例えば、トリ）種、または他の生物、例えば、植物を指す。より詳細には、対象は、脊椎動物、例えば、マウス、霊長類、類人猿またはヒトなどの哺乳動物である。動物は、家畜、競技用動物、およびペットを含む。対象は、健康な個体、疾患もしくは疾患に対する素因を有するかもしくは疾患もしくは疾患に対する素因を有することが疑われる個体、または治療を必要とするかもしくは治療を必要とすることが疑われる個体であり得る。

例えば、対象は、がんを有すると診断されたことがある個体、がん治療を受ける予定である個体、および／または少なくとも１回のがん治療を受けたことがある個体である。対象は、がんを寛解していてもよい。別の例として、対象は、自己免疫疾患を有すると診断された個体である。別の例として、対象は、妊娠している個体または妊娠を計画している個体であり得、この対象は、疾患、例えば、がん、自己免疫疾患の診断を受けたことがあるかまたはそれを有することが疑われたことがあってもよい。

がんマーカーは、がんの存在またはがんを発症するリスクに関連する遺伝子変異体である。がんマーカーは、対象が、がんを有するかまたはがんマーカーを有さない同じ種の年齢および性別の一致する対象よりもがんを発症するリスクが高いことを示すインジケーションとなり得る。がんマーカーは、がんの原因となる場合もならない場合もある。

核酸の一端または両端にバーコードを付着させることができる。バーコードは、元の試料、核酸の形態またはプロセシングなどの情報を明らかにするためにデコードされ得る。バーコードを使用し、異なるバーコード（次に、バーコードを読み取ることによってデコンボリューションされる核酸に関する）を有する核酸を含む複数の試料のプーリングとパラレルプロセシングを可能とすることができる。バーコードは、分子識別子、試料識別子、タグまたはインデックスタグとも称され得る。バーコードは、試料を識別するために使用することができる（試料識別子）。さらにまたはあるいは、バーコードは、同一試料中の異なる分子を識別するために使用することができる。これは、試料中のそれぞれ異なる分子に一意的にバーコード付加すること、またはそれぞれの分子に非一意的なバーコード付加を使用することの両方を含む。非一意的なバーコード付加の事例では、限られた数のバーコードを使用して各分子にバーコード付加してもよく、その結果、異なる分子は、少なくとも１つのタグと組み合わせて参照ゲノム上にマッピングされるそれらの開始位置／停止位置に基づいて識別され得る。次いで、典型的には、十分な数の異なるバーコードを使用すると、その結果、同一の開始／停止を有するいずれか２つの分子のバーコードも同じである確率は低い（例えば、＜１０％、＜５％、＜１％、または＜０．１％）。いくつかのバーコードは、複数の試料、１つの試料内の分子の複数の形態、および同一の開始点および停止点を有する１つの形態内の複数の分子を標識するために複数の分子識別子を含む。このようなバーコードは、形態Ａ１ｉ中に存在することができ、ここで、文字は試料の種類を示し、アラビア数字は試料内の分子の形態を示し、ローマ数字は形態内の分子を示す。

アダプターは、通常、試料核酸分子のいずれか一端または両端への連結のために少なくとも部分的に二重鎖の短い核酸（例えば、５００、１００または５０ヌクレオチド未満の長さ）である。アダプターは、両端においてアダプターに隣接する核酸分子の増幅を可能とするプライマー結合部位、および／または次世代シーケンシング（ＮＧＳ）に対するプライマー結合部位を含むシーケンシングプライマー結合部位を含み得る。アダプターは、フローセル支持体に付着したオリゴヌクレオチドなどの捕捉用プローブに対する結合部位も含み得る。アダプターは、上述のバーコードも含み得る。好ましくは、バーコードは、核酸分子のアンプリコンおよびシーケンシングリードに含まれるように、プライマーおよびシーケンシングプライマー結合部位に対して配置される。核酸分子の各末端に、同一または異なるアダプターを連結することができる。同一のアダプターは、バーコードが異なることを除いて、各末端に連結されることがある。好ましいアダプターは、一端が、１つまたは複数の相補的ヌクレオチドに関しても平滑末端またはテイルである核酸分子に接合するために、本明細書に記載されているように平滑末端またはテイルである、Ｙ型アダプターである。別の好ましいアダプターは、解析される核酸に接合するために平滑またはテイル末端を同様に有する、釣鐘型アダプターである。

本明細書で使用される場合、用語「シーケンシング」は、生体分子、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸分子の配列を決定するために使用されるいくつかの技術のうちのいずれかを指す。例示的なシーケンシング方法として、これらに限定されないが、ターゲットシーケンシング、単分子リアルタイムシーケンシング、エクソンシーケンシング、電子顕微鏡に基づくシーケンシング、パネルシーケンシング、トランジスター媒介型シーケンシング、直接シーケンシング、ランダムショットガンシーケンシング、サンガーのジデオキシ末端シーケンシング、全ゲノムシーケンシング、ハイブリダイゼーションによるシーケンシング、パイロシーケンシング、キャピラリー電気泳動、ゲル電気泳動、デュプレックスシーケンシング、サイクルシーケンシング、一塩基伸長シーケンシング、固相シーケンシング、ハイスループットシーケンシング、超並列署名シーケンシング、エマルジョンＰＣＲ、低変性温度における共増幅ＰＣＲ（ＣＯＬＤ－ＰＣＲ）、マルチプレックスＰＣＲ、可逆的色素ターミネーターによるシーケンシング、ペアドエンドシーケンシング、短期シーケンシング、エクソヌクレアーゼシーケンシング、ライゲーションによるシーケンシング、短リードシーケンシング、単分子シーケンシング、シーケンシングバイシンセシス、リアルタイムシーケンシング、リバースターミネーターシーケンシング、ナノポアシーケンシング、４５４シーケンシング、Ｓｏｌｅｘａゲノムアナライザーシーケンシング、ＳＯＬｉＤ（商標）シーケンシング、ＭＳ－ＰＥＴシーケンシング、およびこれらの組合せが挙げられる。一部の実施形態では、シーケンシングは、例えば、ＩｌｌｕｍｉｎａまたはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから市販されている遺伝子アナライザーなどの遺伝子アナライザーにより実施することができる。

表現「次世代シーケンシング」またはＮＧＳは、従来のサンガーおよびキャピラリー電気泳動に基づく手法と比較してスループットが増加したシーケンシング技術を指し、例えば、一度に数十万もの比較的小さな配列リードを作成する能力を有する。次世代シーケンシング技法のいくつかの例として、これらに限定されないが、シーケンシングバイシンセシス、シーケンシングバイライゲーション、およびシーケンシングバイハイブリダイゼーションが挙げられる。

表現「シーケンシングラン」は、少なくとも１つの生体分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸分子）に関する一部の情報を決定するために実施されるシーケンシング実験の任意のステップまたは部分を指す。

ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）は、４種のヌクレオチド；アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびグアニン（Ｇ）を含むヌクレオチド鎖である。ＲＮＡ（リボ核酸）は、４種のヌクレオチド；Ａ、ウラシル（Ｕ）、Ｇ、およびＣを含むヌクレオチド鎖である。特定のヌクレオチド対は、相補的様式で互いに特異的に結合する（相補的塩基対合と称される）。ＤＮＡでは、アデニン（Ａ）はチミン（Ｔ）と対合し、シトシン（Ｃ）はグアニン（Ｇ）と対合する。ＲＮＡでは、アデニン（Ａ）はウラシル（Ｕ）と対合し、シトシン（Ｃ）はグアニン（Ｇ）と対合する。第１の核酸鎖が、第１の鎖におけるヌクレオチドと相補的であるヌクレオチドから構成される第２の核酸鎖に結合する場合、２つの鎖は結合して二本鎖を形成する。本明細書で使用される場合、「核酸シーケンシングデータ」、「核酸シーケンシング情報」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」、「ゲノム配列」、「遺伝子配列」、または「断片配列」、または「核酸シーケンシングリード」は、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸分子（例えば、全ゲノム、全トランスクリプトーム、エキソーム、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、または断片）におけるヌクレオチド塩基（例えば、アデニン、グアニン、シトシン、およびチミンまたはウラシル）の順序を表示する任意の情報またはデータを示す。本発明の教示によって、これらに限定されないが、キャピラリー電気泳動、マイクロアレイ、ライゲーションに基づくシステム、ポリメラーゼに基づくシステム、ハイブリダイゼーションに基づくシステム、直接的または間接的なヌクレオチド同定システム、パイロシーケンシング、イオンまたはｐＨベース検出システム、および電子署名ベースのシステムを含む技法、プラットフォームまたは技術のすべての利用可能な変形を使用して得られた配列情報が考慮されることが理解されるべきである。

「ポリヌクレオチド」、「核酸」、「核酸分子」、または「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオシド間の連結によって接合されたヌクレオシド（デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、またはその類似体を含む）の線状ポリマーを指す。典型的には、ポリヌクレオチドは、少なくとも３つのヌクレオシドを含む。オリゴヌクレオチドのサイズは、少数のモノマー単位、例えば、３～４から数百のモノマー単位の範囲である場合が多い。ポリヌクレオチドが、「ＡＴＧＣＣＴＧ」などの文字配列で表される場合は常に、ヌクレオチドは、別段に注記されていなければ、左から右への５’から３’の順であり、「Ａ」はデオキシアデノシンを示し、「Ｃ」はデオキシシチジンを示し、「Ｇ」はデオキシグアノシンを示し、「Ｔ」はチミジンを示すことが理解されよう。当技術分野の標準であるように、塩基自体、塩基を含むヌクレオシド、またはヌクレオチドを指すために、文字Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴを使用することができる。

参照配列は、実験的に決定された配列と比較するために使用される既知の配列である。例えば、既知の配列は、ゲノム全体、染色体、またはその任意のセグメントであり得る。参照は、典型的には、少なくとも２０、５０、１００、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、１０００、またはそれより多いヌクレオチドを含む。参照配列は、ゲノムもしくは染色体の単一の連続配列と整列させることができるか、またはゲノムもしくは染色体の異なる領域と整列させられている非連続的セグメントを含むことができる。参照ヒトゲノムとして、例えば、ｈＧ１９およびｈＧ３８が挙げられる。

第１の核酸配列またはその相補体と第２の核酸配列またはその相補体が、ヒト染色体の配列などの連続参照配列の非相同セグメントを除いて、重複して整列される場合、第１の単鎖核酸配列は、第２の単鎖核酸配列と重複する。全体的にまたは部分的に二本鎖の核酸は、その鎖のいずれかが他の核酸の鎖と重複する場合、別の全体的にまたは部分的に二本鎖の核酸と重複する。

「平均」は、限定されないが、平均値、中央値、最頻値を含む中心傾向の任意の統計的尺度を指す。

「広がり」は、限定されないが、分散、標準偏差および四分位範囲を含むばらつきの任意の統計的尺度を指す。

「標準スコア」は、限定されないが、正規化スコアまたはＺスコア（平均からの標準偏差の数）を含む平均からの距離の任意の統計的尺度を指す。

正規化した腫瘍遺伝子変異量は、対照対象と比較した腫瘍遺伝子変異の標準スコアを指す。これは、がん細胞から体液への核酸の放出、および解析可能な形態の体液からの核酸の回収などの、このような変異の検出に影響を及ぼす因子における試料間のランダムなバリエーションを説明するために調整された試験核酸分子試料中の腫瘍遺伝子変異量の指標を含む。

変異は、既知の参照配列からのバリエーションを指し、例えば、ＳＮＶ、コピー数のバリエーション／異常、インデルおよび遺伝子融合などの変異を含む。変異は、生殖細胞系列または体細胞の変異であり得る。比較のための好ましい参照配列は、試験試料をもたらす対象の種の野生型ゲノム配列、典型的には、ヒトゲノムである。

バリアントは、対立遺伝子と呼ばれることもある。バリアントは、通常、対立遺伝子がヘテロ接合性であるかホモ接合性であるかに応じて、５０％（０．５）または１００％（１）の頻度で存在する。例えば、生殖細胞系列のバリアントは遺伝性であり、通常、０．５または１の頻度を有する。しかしながら、体細胞のバリアントは、後天性のバリアントであり、通常、０．５未満の頻度を有する。

遺伝子座のメジャーおよびマイナー対立遺伝子は、それぞれ、参照配列のヌクレオチド、および参照配列と異なるバリアントヌクレオチドによって占められる、遺伝子座を有する核酸を指す。遺伝子座における測定値は、対立遺伝子が試料中で観察される頻度を測定する、対立遺伝子比率（ＡＦ）の形態を取ることができる。

用語「マイナー対立遺伝子頻度」は、マイナー対立遺伝子（例えば、最も多い対立遺伝子ではない）が所与の核酸集団、例えば、試料中で発生する頻度を指し得る。マイナー対立遺伝子頻度の低い遺伝子バリアントは、試料中の存在頻度が相対的に低い場合がある。

「マイナー対立遺伝子比率（ＭＡＦ）」は、所与の試料中の所与のゲノム位置における対立遺伝子の変更（例えば、変異）を有するＤＮＡ分子の比率を指す。体細胞バリアントのＭＡＦは、所与の遺伝子座に存在するすべての体細胞バリアントまたは対立遺伝子の０．５、０．１、０．０５、または０．０１未満であり得る。例えば、体細胞バリアントのＭＡＦは、０．０５未満である。マイナー対立遺伝子比率はまた、「変異体対立遺伝子比率」と交換可能に使用することができる。

用語「新生物」および「腫瘍」は、交換可能に使用される。これらは、対象における細胞の異常増殖を指した。新生物または腫瘍は、良性であっても、潜在的に悪性であっても、悪性であってもよい。悪性腫瘍は、がんまたはがん性腫瘍と称される。

用語「腫瘍遺伝子変異量（ｔｕｍｏｒ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｂｕｒｄｅｎ）（ＴＭＢ）」、「腫瘍遺伝子変異量（ｔｕｍｏｒ ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ｂｕｒｄｅｎ）（ＴＭＢ）」、または「がん遺伝子変異量」は交換可能に使用される。これらは、腫瘍ゲノムのシーケンシングされた部分に存在する変異、例えば、体細胞変異の総数を指す。ＴＭＢは、調査されている腫瘍ゲノムのメガベース当たりのコード、塩基置換、およびインデル変異の数を指してもよい。これらは、がん治療剤または薬物、例えば、免疫チェックポイントインヒビター、抗体に対する感受性および／または耐性を検出、評価、算出、または予測するために示すことができる。ＴＭＢのレベルがより高い腫瘍は、より多くのネオ抗原、すなわちある種のがん特異的抗原を発現することができ、より強い免疫応答、したがって、免疫療法に対するより持続的な応答を可能とし得る。免疫系は、適切に応答するために、十分な数のネオ抗原に依拠し、体細胞変異の数は、腫瘍におけるネオ抗原の数を決定するためのプロキシとして作用している場合がある。ＴＭＢを使用して、薬物処置に対する免疫応答の強さおよび対象における薬物処置の有効性を推論することができる。生殖系列細胞および体細胞のバリアントは、参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ２０１８／５２０８７に記載されているような抗原性体細胞バリアントを特定するために生物情報学的に識別することができる。

閾値は、その閾値に対するそれらの関係に応じて、様々な試料に対して実験的に決定された同じパラメーターの値を特徴付けるために使用される所定値である。

用語「プロセシングすること」、「算出すること」、および「比較すること」は、交換可能に使用される。この用語は、差、例えば、数または配列の差を決定することを指すことができる。例えば、遺伝子発現、コピー数変動（ＣＮＶ）、インデル、および／または単一ヌクレオチド変異（ＳＮＶ）値または配列をプロセシングすることができる。

「がん型」は、例えば、組織病理学によって定義される型または亜型を指す。がん型は、任意の従来の基準、例えば、同一組織のがん（例えば、血液がん、ＣＮＳ、脳がん、肺がん（小細胞および非小細胞）、皮膚がん、鼻がん、喉がん、肝がん、骨がん、リンパ腫、膵がん、腸がん、直腸がん、甲状腺がん、膀胱がん、腎がん、口腔がん、胃がん、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、肺がん、小腸がん、軟組織がん、甲状腺がん、神経内分泌がん、胃食道がん、頭頚部がん、婦人科系がん、結腸直腸がん、尿路上皮がん、固形がん、不均質ながん、均質ながん）、原発不明のがんなど、および／もしくは同一細胞系列のがん（例えば、癌腫、肉腫、リンパ腫、胆管細胞癌、白血病、中皮腫、黒色腫、または神経膠芽腫）ならびに／またはがんマーカー、例えば、Ｈｅｒ２、ＣＡ１５－３、ＣＡ１９－９、ＣＡ－１２５、ＣＥＡ、ＡＦＰ、ＰＳＡ、ＨＣＧ、ホルモン受容体およびＮＭＰ－２２によって定義することができる。がんはまた、ステージ（例えば、ステージ１、２、３、または４）によって、および原発であるか続発であるかによって分類することもできる。
詳細な説明
Ｉ．一般

本開示は、様々な試料由来の腫瘍遺伝子変異量の値が、試料中で割合の高い変異のマイナー対立遺伝子比率を考慮する正規化レジームによって、互いにまたは対照標準物質に対して特に比較しやすいという結果を部分的に前提とする。このような解析によって、試験試料の腫瘍遺伝子変異量が、対照集団における腫瘍遺伝子変異量の分布上にある場合に、そしてそれ故、試験試料を与える個体が、がんを処置するために免疫療法に適している可能性があるかどうかのインジケーションが提供され得る。
ＩＩ．腫瘍遺伝子変異量の決定および正規化

試料中に存在する核酸は、以下にさらに記載されるようにプロセシングされ、シーケンシングされ得る。シーケンシングによって、試料中に存在するおよび試料中で検出される変異の総数、すなわち、好ましくは、マイナー対立遺伝子が、シーケンシングアーチファクトを表す可能性が統計的に低いように（例えば、ｐ≦０．０５）、試料中の様々な核酸分子において十分な頻度で検出される遺伝子座の総数が明らかになる。決定された変異の総数は、試料、またはその任意の比率、例えば、特定の染色体、または非連続的なゲノムセグメントのセット、例えば、がんに関連する変異が生じる遺伝子座を有することが既知であるようなセグメントのセットを提供する個体のゲノムのどこにでも存在する変異を示すことができる。決定された変異は、排他的に、コードタンパク質の配列に変化をもたらす変異、例えば、ＳＮＶ、インデル、融合であり得るか、またはコードタンパク質の配列に変化をもたらさない任意の種類の変異、例えば、コピー数のバリエーション、コピー数の異常を含み得る。いずれの種類の変異が決定されたとしても、コードタンパク質のアミノ酸配列を変化させる変異は、次のプロセシングの前に選抜され得る。変異には、生殖細胞系列変異、体細胞変異、またはその両方が含まれ得る。

コードタンパク質におけるアミノ酸の変化をコードする変異は、他の変異よりも免疫療法に対する適合性により相関する傾向があるが、すべての変異をサンプリングすることは、このような変異を計数することよりも、コードタンパク質配列における配列を変化させる変異の数とより相関することが可能であり、これは、検出レベルに満たない一部のこのような変異の損失に直接的に起因する。よって、両方の手法が利点を有し、両方の手法を使用することができる。

シーケンシングもまた、検出されたいずれかまたはすべての変異（または次のプロセシングのために選択されるそのサブセット）のマイナー対立遺伝子比率を提供する。マイナー対立遺伝子比率は、マイナー対立遺伝子（野生型対立遺伝子とは別個の）を有する変異の遺伝子座を含む試料中のすべてのシーケンシングされた核酸の比率を意味する。よって、マイナー対立遺伝子比率は、０から１の間の数を表され得る。１を超えるマイナー対立遺伝子が遺伝子座において生じる可能性がある場合、マイナー対立遺伝子比率は、マイナー対立遺伝子のいずれかの比率またはマイナー対立遺伝子のすべてまたはいずれかのサブセットの凝集比率として定義することができる。

最も多く示される変異体のマイナー対立遺伝子比率または最も多く示される変異体のセットの平均マイナー対立遺伝子比率が、次の正規化において使用される。最も多く示される変異体のセットが使用される場合、そのセットは、例えば、上位２、３、５または１０個の最も多く示される変異体を示すことができる。

試験試料について記載される解析は、比較のためのデータセットを提供するために、対照試料の集団に関して実行することもできる。対照集団は、例えば、少なくとも１０、２０、２５、５０、１００、２００、２５０、５００、１，０００、５，０００、１０，０００、５０，０００またはそれより多い個体由来の試料を含み得る。対照試料は、試験試料と同じがん型を有する対象由来の試料であり得る。それぞれの対照試料は、総腫瘍遺伝子変異量および最も多く示される変異または変異のセットのマイナー対立遺伝子比率に対して、同様に解析される。好ましくは、マイナー対立遺伝子比率は、試験試料と対照試料の間で同様にして（すなわち、最も多く示される変異または最も多く示される変異の同じセットに基づいて）決定される。変異の計数に対する場合も同様である。例えば、ゲノムのどの場所でも起こる変異が試験試料において計数される場合、対照試料においても同じであることが好ましい。同様に、コードタンパク質配列に影響を及ぼす変異のみが試験試料について計数される場合も、対照試料についても同じである。

次いで、対照試料を、決定されたマイナー対立遺伝子比率によって、ビンへとソートすることができる。ビンは等しいサイズのものであってもよく（例えば、０．０５～０．１、０．１～０．１５、０．１５～０．２、０．２～０．２５）、またはビンは、例えば、それぞれのビンに適合する対照試料の数を均一にするために、サイズを変えることができる。ビンはまた、マイナー対立遺伝子比率におけるバリエーション全体のパーセンテージとして規定されてもよい。例えば、対照集団中で最も多く示される変異（複数可）のマイナー対立遺伝子比率が、０．１から０．５の間で変動する場合、その範囲のパーセンテージ（例えば、ビン当たり５％、１０％または２０％）でビンを規定することができる。次いで、平均腫瘍遺伝子変異量は、各ビンにおける対照試料に対して決定される。例えば、０．１～０．１５のビンに３、４、および５の遺伝子変異量を有する３つの対照試料が存在する場合、そのビンに対する平均がん遺伝子変異量は４である。標準偏差は、ビン内のがん変異値に対して算出されてもよい。このようなビンのコレクションは、同一のがん型の試験試料と比較するためのデータをポピュレートすることができる。ビンは、２０％以下、１０％以下、または５％以下の幅を有してもよい。

対照集団は一度だけ解析される必要があり、得られたデータは任意の数の試験試料との比較のための役割を果たし得る。しかしながら、対照集団には、同一のがん型を有する追加の個体由来のデータが補足されてもよい。

同じ種類の解析が、これらの他の形態のがんを有する試験試料と比較するために他の型のがんを有する追加の対照集団で実施されてもよい。

次いで、試験試料で測定された腫瘍遺伝子変異の数を、試験試料のものを含むマイナー対立遺伝子頻度の範囲によって規定された対照試料のビンの変異の平均数と比較することができる。例えば、試験試料が、最も多く示されるマイナー対立遺伝子のマイナー対立遺伝子頻度０．１２５を有する場合、０．１から０．１５のマイナー対立遺伝子頻度を含むビンが比較のために選択され得る。単純な数値の比較（例えば、対照試料の平均腫瘍遺伝子変異量を試験試料の腫瘍遺伝子変異量から減算すること、または試験試料の腫瘍遺伝子変異量を対照試料の平均の値で除すること）は、試料の腫瘍遺伝子変異量が、平均であるか、平均を超えるかまたは平均未満かを示す。例えば、試験試料の腫瘍遺伝子変異量が５であり、マイナー対立遺伝子適合を表示するビンの平均が３である場合、
試験試料の腫瘍遺伝子変異量は、平均より２変異量多いかまたは５／３、すなわち平均の１６７％として表すことができる。

しかしながら、より定量的な比較は、Ｚスコアを算出することによって実施することができる。Ｚスコアは、試験試料の腫瘍遺伝子変異量から、マッチしたビンの平均腫瘍遺伝子変異量を減算し、その結果を、ビン内の腫瘍遺伝子変異のバリエーションの標準偏差によって除すことによって算出される。Ｚスコアは、正である（平均遺伝子変異量よりも高い）か、負である（平均がん遺伝子変異量よりも低い）かまたはゼロ（平均遺伝子変異量）であり得る。Ｚスコア（正または負）の大きさは、試験試料が、腫瘍遺伝子変異量の平均を超えるかまたは平均未満である程度のインジケーションである。

対象由来の試験試料の正規化された腫瘍遺伝子変異量（例えば、Ｚスコアで示される）は、免疫療法に対する対象の適合性のインジケーションを提供する。一般的に、正規化された腫瘍遺伝子変異量が多いほど（より高い正のＺスコアによって示され得る）、対象は免疫療法により適している。いずれの理論にも拘束されないが、より多くの変異は、免疫療法に対する非自己標的を形成するより多くのネオエピトープの存在を示す。逆に、例えば、負のＺスコアによって示される正規化された変異が少ないほど、対象の免疫療法に対する適合性は低い。

正規化された腫瘍遺伝子変異量の１つまたは複数の閾値は、対象が、免疫療法を受けるかもしくは受け続けるか、または受けるのをやめるかどうかを決定するために設定されるかまたはそれを決定するためのインジケーション（他の因子と組み合わせて使用することができる）を少なくとも提供することができる。例えば、閾値のまたは閾値を超える対象が免疫療法を受けるかまたは受け続けるように、および閾値を下回る対象が免疫療法を受けないかまたは受けるのをやめるように、閾値を設定することができる。あるいは、２つの閾値は、免疫療法を受けているかまたは受け続けているより高い閾値のまたはその閾値を超える対象、および免疫療法を受けていないかまたは受けるのをやめているより低い閾値のまたはその閾値より低い対象に関して、設定することができる。閾値の間の対象は、対象が免疫療法を受けるべきかまたは受け続けるべきかどうかについての追加の因子によって評価することができる。

閾値は、免疫療法に対する有益な応答またはその欠如と最も相関する閾値を決定するために、正規化された腫瘍遺伝子変異量に対して特徴付けられた対象における免疫療法に対する応答を観察することによって、経験的に決定することができる。あるいは、閾値は、例えば、療法を受けているかもしくは受け続けている、正のＺスコアを有する対象、および／または免疫療法を受けていないかまたは受けるのをやめている負のＺスコアを有する対象などの、スケールの所定の点で設定することができる。別の例として、１、２、または３を超えるＺスコアを有する対象は、療法を受けるかまたは受け続けることができる。別の例として、１未満のＺスコアを有する対象は、療法を受けるのをやめる場合がある。別の例として、正のＺスコアを有する対象と、そのがん型を有する対象の、例えば、少なくともＺスコアの最大７５％、５０％、２５％、１５％、１０％、または５％を示すＺスコアを有する対象とは、免疫療法を受けるかまたは受け続けることができ、他の対象は免疫療法を受けることができない。

上述のように、免疫療法が投与されるかまたは投与され続けるかどうかを決定する際に、正規化された腫瘍遺伝子変異量を他の因子とともに、またはそれを用いないで使用することができる。このような他の因子としては、他の因子の中で、対象の状態、以前に試みた他の療法に対する対象の応答、および対象に関して未だ試みられていない他の療法のアベイラビリティを挙げることができる。よって、閾値を超えるすべての対象が免疫療法を受けるかもしくは受け続ける訳ではなく、または閾値未満のすべての対象が免疫療法を受けるかもしくは受け続ける訳ではないが、一般的に、閾値を下回る正規化された腫瘍遺伝子変異量を有する対象に対する事例よりも高い比率の、閾値を超える正規化された腫瘍遺伝子変異量を有する対象が、免疫療法を受けるかまたは受け続ける。
ＩＩＩ．免疫療法

免疫療法は、免疫系を刺激して、がん細胞を死滅させるかまたは少なくともがん細胞の増殖を阻害するための、好ましくは、がんのさらなる増殖を低減する、がんのサイズを低減するおよび／またはがんを除去するために作用する、１つまたは複数の薬剤による処置を指す。このような薬剤のいくつかはがん細胞に存在する標的に結合し；いくつかは免疫細胞であってがんではない細胞に存在する標的に結合し；いくつかはがん細胞と免疫細胞の両方に存在する標的に結合する。このような薬剤として、これらに限定されないが、チェックポイントインヒビターおよび／または抗体が挙げられる。チェックポイントインヒビターは、自己寛容を維持し、末梢組織の生理学的免疫応答の持続期間と振幅を調節して、付随的組織損傷を最小限にする免疫系経路のインヒビターである（例えば、Ｐａｒｄｏｌｌ， Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ １２， ２５２－２６４ （２０１２）を参照されたい）。例示的な薬剤としては、ＰＤ－１、ＰＤ－２、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ－４０、ＯＸ４０、Ｂ７．１、Ｂ７Ｈｅ、ＬＡＧ３、ＣＤ１３７、ＫＩＲ、ＣＣＲ５、ＣＤ２７、またはＣＤ４０のうちのいずれかに対する抗体が挙げられる。他の例示的な薬剤としては、炎症促進性サイトカイン、例えば、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、およびＴＮＦ－αが挙げられる。他の例示的な薬剤は、例えば、Ｔ細胞由来の腫瘍抗原を標的とするキメラ抗原の発現によって、腫瘍に対して活性化されたＴ細胞である。一部の実施形態では、免疫療法は、免疫系を刺激して、変異の存在によって野生型カウンターパートから識別された腫瘍抗原を攻撃する。
ＩＶ．他の適用

本発明の方法によって決定された正規化された腫瘍遺伝子変異量を使用して、対象の状態、特にがんの存在を診断し、状態を特徴付け（例えば、がんのステージを分類する、またはがんの異質性を決定する）、状態の処置に対する応答をモニターし、状態を発症する予後リスクまたは状態の次の経過をもたらす。正規化された腫瘍遺伝子変異量は、がんの特異的形態を特徴付けるために使用することもできる。がんは、組成とステージ分類の両方で異質であることが多い。遺伝子プロファイルデータは、特定のがん亜型の診断または処置において重要であり得るその特定の亜型の特徴付けを可能にし得る。この情報は、対象または開業医に、特定のがん型の予後に関する手がかりを与え、対象または開業医のいずれかが、疾患の進行に従う処置選択肢を採用することを可能にする。一部のがんは進行し、より侵攻性かつ遺伝的に不安定になる。他のがんは、良性、不活性または休止状態のままであり得る。正規化された腫瘍遺伝子変異量は、疾患進行を決定するのに有用であり得る。

正規化された腫瘍遺伝子変異量は、免疫療法を超えた処置を選択する際、および特定の処置選択肢の有効性を決定する際にも使用することができる。処置が成功である場合、より多くのがんが死に、核酸が取り出されるため、成功する処置選択肢は、最初に正規化された腫瘍遺伝子変異量を増加させることがあり、続いて、がんが退縮するかまたは死ぬため、正規化された腫瘍遺伝子変異量が減少する。成功する処置はまた、最初の増加を起こすことなく腫瘍遺伝子変異量および／またはマイナー対立遺伝子比率を減少させることも可能にする。さらに、処置後にがんが寛解状態にあることが観察される場合、正規化された腫瘍遺伝子変異量を使用して、体液中の正規化された変異の計数によって示されるように、残存する疾患または疾患の再発をモニターすることができる。
Ｖ．コンピューターによる実行

本方法は、湿式化学のステップ以外の本明細書または添付の特許請求の範囲に記載されたステップのいずれかまたはすべてが、好適なプログラムされたコンピューターで実施され得るように、コンピューターで実施することができる。コンピューターは、メインフレーム、パーソナルコンピューター、タブレット、スマートフォン、クラウド、オンラインデータストレージ、リモートデータストレージなどであり得る。コンピューターは、１つまたは複数の位置で操作することができる。

核酸集団を解析するためのコンピュータープログラムは、本明細書または添付の特許請求の範囲に記載された湿式化学ステップ以外のステップのいずれかを実施するためのコード；例えば、生のシーケンシングデータを受容するためのコード、このようなデータから核酸配列を決定するためのコード、所定の配列に存在する変異の数を決定するためのコード、コードされたタンパク質またはそれ以外の配列に影響を及ぼすような変異を分類するためのコード、変異のいずれかのマイナー対立遺伝子比率を決定するためのコード、および試料中に存在する変異の数を、同じがん型を有する他の対象由来の対照試料中に存在する変異の数および試験試料のマイナー対立遺伝子比率を含むマイナー対立遺伝子比率のビン内のマイナー対立遺伝子比率と比較して、試験試料中のがん遺伝子変異量の指標を決定するためのコード、ならびに必要に応じて関連する免疫療法の処置を用いて正規化された遺伝子変異量をアウトプットするためのコードを含むことができる。

本方法は、核酸集団を解析するためのシステム（例えば、データプロセシングシステム）において実行することができる。システムは、プロセッサー、システムバス、例えば、以下の：生のシーケンシングデータを受容するステップ、このようなデータから核酸配列を決定するステップ、決定された配列内の変異を特定するステップ、コードされたタンパク質配列またはそれ以外に影響を及ぼすような変異を分類するステップ、いずれかの決定された変異に対するマイナー対立遺伝子比率を決定し、試料中に存在する変異の数を、同じがん型を有する他の対象由来の対照試料中に存在する変異の数および試験試料のマイナー対立遺伝子比率を含むマイナー対立遺伝子比率のビン内のマイナー対立遺伝子比率と比較して、試験試料中のがん遺伝子変異量の指標を決定するステップ、ならびに必要に応じて免疫療法の処置による正規化された遺伝子変異量をアウトプットすることなどの本明細書または添付の特許請求の範囲に記載された１つまたは複数のステップを実行するために互いに連結された主記憶メモリーと、必要に応じて補助記憶メモリーを含むことができる。このシステムのメモリーは、異なるがん型を有する様々な集団由来の対照データを保存することもできる。いずれかのこのような集団では、データは、対象に存在する変異の数、このような変異の一部またはすべてのマイナー対立遺伝子頻度、ビン内に入る試料の変異の数に関する平均変異頻度の標準偏差によって特徴付けられるマイナー対立遺伝子頻度のビンを含むことができる。このシステムは、例えば、Ｚスコアとして発現される試料のがん遺伝子変異量などの結果、および／または免疫療法を投与することもしくは免疫療法を続けることなどの推奨される将来の処置をアウトプットするためのディスプレイまたはプリンターも含むことができる。システムは、他のアクセサリーの中で、がん型、解析が実行されるべき変異のセットまたは設定閾値を定義するなどの、ユーザーインプットを提供するためのキーボードおよび／またはポインターも含むことができる。システムは、生のシーケンシングデータを提供するためのメモリーに連結されたシーケンシング装置も含むことができる。

本発明の方法の様々なステップは、情報および／またはプログラムを利用し、コンピューター可読媒体（例えば、ハードドライブ、補助メモリー、外部メモリー、サーバー；データベース、ポータブルメモリーデバイス（例えば、ＣＤ－Ｒ、ＤＶＤ、ＺＩＰディスク、フラッシュメモリーカード）など）に保存される結果を作成することができる。例えば、コンピューター可読媒体に保存することができる、本方法で使用される情報およびそれによって作成された結果は、上記の異なるがん型を有する様々な集団由来の対照データ、参照配列、生のシーケンシングデータ、シーケンシングされた核酸、変異、マイナー対立遺伝子比率、正規化された遺伝子変異量の指標、例えば、Ｚスコア、閾値、および様々ながん型における閾値に対して正規化された遺伝子変異量に関連する免疫療法処置レジメンを含む。

本開示は、試料中の腫瘍遺伝子変異量の指標を提供するための使用説明書を含むキットも含む。キットは、実行される場合に、本方法のステップを実施する１つまたは複数のプログラムを含有するマシン可読媒体を含んでもよい。キットは、物理的なマシン可読媒体を含まなくてもよいが、むしろ、それを介してユーザーが試料中の腫瘍遺伝子変異量の分析を実施することができるプラットフォームを提供するクラウドまたはオンラインデータストレージにアクセスしてもよい。

本開示は、ハードウェアおよび／またはソフトウェアで実施することができる。例えば、本開示の異なる態様は、クライアントサイドロジックまたはサーバーサイドロジックのいずれかで実施することができる。本開示またはその構成成分は、適切に設定されたコンピューティングデバイス中にロードされた場合に、そのデバイスに、本開示に従って実施させるロジック命令および／またはデータを含有する固定媒体プログラムコンポーネントにおいて具現化することができる。ロジック命令を含有する固定媒体は、ビューワーのコンピューターに物理的にローディングするために固定媒体のビューワーに送達され得るか、またはロジック命令を含有する固定媒体は、ビューワーが、プログラムコンポーネントをダウンロードするために通信媒体を介してアクセスするリモートサーバーに存在してもよい。

本開示は、本開示の方法を実施するためにプログラミングされたコンピューターコントロールシステムを提供する。図２は、本開示の方法を実施するためにプログラミングされたか、またはそうでなければ本開示の方法を実施するよう構成されたコンピューターシステム９０１を示す。コンピューターシステム９０１は、セントラルプロセシングユニット（ＣＰＵ、本明細書ではまた「プロセッサー」および「コンピュータープロセッサー」）９０５（シングルコアもしくはマルチコアプロセッサー、または並行プロセシングのための複数のプロセッサーであってもよい）を含む。コンピューターシステム９０１は、メモリーまたはメモリー位置９１０（例えば、ランダムアクセスメモリー、リードオンリーメモリー、フラッシュメモリー）、電子保存ユニット９１５（例えば、ハードディスク）、１つまたは複数の他のシステムと通信するための通信インターフェース９２０（例えばネットワークアダプタ）、ならびにキャッシュメモリー、他のメモリー、データストレージ、および／または電子ディスプレイアダプターなどの周辺デバイス９２５も含む。メモリー９１０、保存ユニット９１５、インターフェース９２０および周辺デバイス９２５は、

マザーボードなどの通信バス（実線）通じてＣＰＵ９０５と通信する。保存ユニット９１５は、データを保存するためのデータ保存ユニット（またはデータ保管庫）であり得る。コンピューターシステム９０１は、通信インターフェース９２０の補助により、コンピューターネットワーク（「ネットワーク」）９３０に作動可能に接続され得る。ネットワーク９３０は、インターネット、インターネットおよび／もしくはエクストラネット、またはインターネットと通信するイントラネットおよび／もしくはエクストラネットであり得る。一部の事例では、ネットワーク９３０は、電気通信および／またはデータネットワークである。ネットワーク９３０は、ローカルエリアネットワークであり得る。ネットワーク９３０は、クラウドコンピューティングなどの分散コンピューティングを可能にし得る１つまたは複数のコンピューターサーバーを含み得る。ネットワーク９３０は、一部の事例では、コンピューターシステム９０１の補助により、コンピューターシステム９０１に接続されたデバイスがクライアントまたはサーバーとして機能することを可能にし得るピアツーピアネットワークを実施することができる。

ＣＰＵ９０５は、プログラムまたはソフトウェアにおいて具現化され得るマシン可読命令のシーケンスを実行することができる。命令は、メモリー９１０などのメモリー位置に保存され得る。命令は、ＣＰＵ９０５を対象とすることができ、これは、次にＣＰＵ９０５が本開示の方法を実施するようにプログラムするか、またはそうでなければ本開示の方法を実施するように構成することができる。ＣＰＵ９０５により実施される動作の例としては、取り出し、デコード、実行、および書き戻しを挙げることができる。

ＣＰＵ９０５は、回路、例えば、集積回路の一部であり得る。システム９０１の１つまたは複数の他のコンポーネントは、回路に含まれ得る。一部の事例では、回路は、アプリケーション特異的集積回路（ＡＳＩＣ）である。

保存ユニット９１５は、ドライバ、ライブラリー、および保存済みプログラムなどのファイルを保存することができる。保存ユニット９１５は、ユーザーデータ、例えば、ユーザープリファレンスおよびユーザープログラムを保存することができる。コンピューターシステム９０１は、一部の事例では、イントラネットまたはインターネットを通じてコンピューターシステム９０１と通信するリモートサーバー上に位置するなど、コンピューターシステム９０１の外部の１つまたは複数の追加のデータ保存ユニットを含み得る。

コンピューターシステム９０１は、ネットワーク９３０を通じて、１つまたは複数のリモートコンピューターシステムと通信することができる。例えば、コンピューターシステム９０１は、ユーザーのリモートコンピューターシステムと通信することができる。リモートコンピューターシステムの例としては、パーソナルコンピューター（例えば、ポータブルＰＣ）、スレートまたはタブレットＰＣ（例えば、Ａｐｐｌｅ（登録商標）のｉＰａｄ（登録商標）、Ｓａｍｓｕｎｇ（登録商標）のＧａｌａｘｙ Ｔａｂ）、電話、スマートフォン（例えば、Ａｐｐｌｅ（登録商標）のｉＰｈｏｎｅ（登録商標）、アンドロイド（登録商標）使用可能デバイス、Ｂｌａｃｋｂｅｒｒｙ（登録商標））、または携帯情報端末が挙げられる。ユーザーは、ネットワーク９３０を介してコンピューターシステム９０１にアクセスすることができる。

本明細書に記載されている方法は、コンピューターシステム９０１の電子保存場位置、例えば、メモリー９１０または電子保存ユニット９１５上に保存されたマシン（例えば、コンピュータープロセッサー）実行可能コードにより実施され得る。マシン実行可能またはマシン可読コードはソフトウェアの形態で提供され得る。使用中、コードはプロセッサー９０５によって実行され得る。一部の事例では、コードは、保存ユニット９１５から検索され、プロセッサー９０５によって容易にアクセスするためにメモリー９１０上に保存され得る。一部の状況では、電子保存ユニット９１５は除外されてもよく、マシン実行可能命令がメモリー９１０上に保存される。

コードは予めコンパイルされ、コードを実行するように適応されたプロセッサーを有するマシンで使用するために構成され得るか、またはランタイム中にコンパイルされ得る。コードは、コードが予めコンパイルされたかまたはコンパイルされてすぐの様式で実行することを可能にするように選択され得るプログラム言語で供給され得る。

コンピューターシステム９０１などの本明細書において提供されるシステムおよび方法の態様は、プログラミングにおいて具現化され得る。技術の様々な態様は、典型的には、一種のマシン可読媒体において保有または具現化されるマシン（またはプロセッサー）実行可能コードおよび／または関連データの形態で、「製品」または「製造物品」として考えられ得る。マシン実行可能コードは、電子保存ユニット、例えば、メモリー（例えば、リードオンリーメモリー、ランダムアクセスメモリー、フラッシュメモリー）、またはハードディスク上に保存され得る。

「保存」式媒体は、コンピューター、プロセッサーなどの有形メモリーのいずれかもしくはすべて、またはそれらの関連モジュール（様々な半導体メモリー、テープドライブ、ディスクドライブなど）を含み得、これは常にソフトウェアプログラミングの非一時的な保存を提供することができる。ソフトウェアのすべてまたは一部は、時折、インターネットまたは様々な他の電気通信ネットワークを通じて通信され得る。例えば、このような通信は、１つのコンピューターまたはプロセッサーから別のコンピューターまたはプロセッサーに、例えば、管理サーバーまたはホストコンピューターからアプリケーションサーバーのコンピュータープラットフォームへのソフトウェアの読み込みを可能にし得る。よって、ソフトウェア要素を有し得る別の種類の媒体は、有線および光学地上通信ネットワークを通して、ならびに様々な無線リンク上で、ローカルデバイス間の物理インターフェースなどにわたって使用される光学波、電波および電磁波を含む。有線またはワイヤレスリンク、光学リンクなどのこのような波を運ぶ物理的要素もソフトウェアを保有する媒体と考えることができる。本明細書で使用される場合、非一時的な有形

「保存」媒体に限定されない限り、コンピューターまたはマシン「可読媒体」などの用語は、実行のための命令をプロセッサーに提供する際に関与する任意の媒体を指す。

よって、コンピューター実行可能コードなどのマシン可読媒体は、有形保存媒体、搬送波媒体または物理伝送媒体を含むが、これらに限定されない多くの形態を取ることができる。不揮発性保存媒体は、例えば、図面に示されるデータベースなどを実施するために使用され得る任意のコンピューターなどの保存デバイスのいずれかなどの光学または磁気ディスクを含む。揮発性保存媒体は、このようなコンピュータープラットフォームのメインメモリーなどの動的メモリーを含む。有形伝送媒体は、同軸ケーブル；コンピューターシステム内にバスを含むワイヤを含む、銅線および光学ファイバを含む。搬送波伝送媒体は、電気もしくは電磁シグナル、または高周波（ＲＦ）赤外（ＩＲ）データ通信中に生成されるものなどの音もしくは光波の形態を取ることができる。したがって、コンピューター可読媒体の一般的な形態は、例えば、フロッピー（登録商標）ディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ、任意の他の磁気媒体、ＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤもしくはＤＶＤ－ＲＯＭ、任意の他の光学媒体、パンチカード、紙テープ、穴のパターンを有する任意の他の物理的保存媒体、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＰＲＯＭおよびＥＰＲＯＭ、ＦＬＡＳＨ（登録商標）－ＥＰＲＯＭ、任意の他のメモリーチップもしくはカートリッジ、搬送波輸送データもしくは命令、このような搬送波などを輸送するケーブルもしくはリンク、またはコンピューターがプログラミングコードおよび／もしくはデータを読むことができる任意の他の媒体を含む。コンピューター可読媒体のこれらの形態の多くは、実行のためにプロセッサーに対する１つまたは複数の命令の１つまたは複数のシーケンスの保有に関与し得る。

コンピューターシステム９０１は、例えば、レポートを提供するためのユーザーインターフェース（ＵＩ）９４０を含む電子ディスプレイ９３５を含むか、またはそれと通信することができる。ＵＩの例としては、グラフィカルユーザーインターフェース（ＧＵＩ）およびウェブベースユーザーインターフェースが挙げられるが、これらに限定されない。

本開示の方法およびシステムは、１つまたは複数のアルゴリズムによって実施することができる。アルゴリズムは、セントラルプロセシングユニット９０５による実行の際にソフトウェアによって実施することができる。
ＶＩ．方法の一般的特徴
１．試料

試料は、対象から単離された任意の生体試料であり得る。試料としては、既知のまたは疑いのある固形腫瘍などの体組織、全血、血小板、血清、血漿、糞便、赤血球、白血球（ｗｈｉｔｅ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ）または白血球（ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ）、内皮細胞、組織生検、脳脊髄液 滑液、リンパ液、腹水、間質液または細胞外液、歯肉溝滲出液を含む細胞間の空間の液体、骨髄、胸水、脳脊髄液、唾液、粘液、痰、精液、汗、尿が挙げられる。試料は、好ましくは体液、特に血液ならびに血漿および血清などのその比率、ならびに尿である。このような試料は、腫瘍から取り出された核酸を含む。核酸は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含んでもよく、二本鎖および／または一本鎖形態であってもよい。試料は、対象から単離されたままの形態であってもよく、または細胞などの構成成分を除去もしくは添加する、別のものに対して１つの構成成分について濃縮する、またはＲＮＡをＤＮＡにもしくは一本鎖核酸を二本鎖になど核酸の一形態を別の形態に変換するために、さらなる処理に供されていてもよい。よって、例えば、解析用の体液は、無細胞核酸、例えば、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を含有する血漿または血清である。

体液の体積は、シーケンシングされた領域に対して所望されるリードデプスに応じて変わる。例示的な体積は、０．４～４０ｍｌ、５～２０ｍｌ、１０～２０ｍｌである。例えば、体積は、０．５ｍｌ、１ｍｌ、５ｍｌ、１０ｍｌ、２０ｍｌ、３０ｍｌ、または４０ｍｌであり得る。サンプリングされた血漿の体積は、５から２０ｍｌであり得る。

試料は、ゲノム均等物を含有する様々な量の核酸を含み得る。例えば、約３０ｎｇのＤＮＡの試料は、約１０，０００（１０^４）のハプロイドヒトゲノム均等物を含有することができ、ｃｆＤＮＡの場合には、約２，０００億（２×１０^４）の個々のポリヌクレオチド分子を含有することができる。同様に、約１００ｎｇのＤＮＡの試料は、約３０，０００のハプロイドヒトゲノム均等物を含有することができ、ｃｆＤＮＡの場合には、約６，０００億の個々の分子を含有することができる。

試料は、異なる供給源、例えば、細胞および無細胞由来の核酸を含むことができる。試料は、変異を有する核酸を含むことができる。例えば、試料は、生殖細胞系列変異および／または体細胞変異を有するＤＮＡを含むことができる。試料は、がん関連変異（例えば、がん関連体細胞変異）を有するＤＮＡを含むことができる。

増幅前の試料中の無細胞核酸の例示的な量は、約１ｆｇから約１μｇ、例えば、１ｐｇから２００ｎｇ、１ｎｇから１００ｎｇ、１０ｎｇから１０００ｎｇの範囲である。例えば、この量は、最大約６００ｎｇ、最大約５００ｎｇ、最大約４００ｎｇ、最大約３００ｎｇ、最大約２００ｎｇ、最大約１００ｎｇ、最大約５０ｎｇ、または最大約２０ｎｇの無細胞核酸分子であり得る。この量は、少なくとも１ｆｇ、少なくとも１０ｆｇ、少なくとも１００ｆｇ、少なくとも１ｐｇ、少なくとも１０ｐｇ、少なくとも１００ｐｇ、少なくとも１ｎｇ、少なくとも１０ｎｇ、少なくとも１００ｎｇ、少なくとも１５０ｎｇ、または少なくとも２００ｎｇの無細胞核酸分子であり得る。この量は、最大１フェムトグラム（ｆｇ）、１０ｆｇ、１００ｆｇ、１ピコグラム（ｐｇ）、１０ｐｇ、１００ｐｇ、１ｎｇ、１０ｎｇ、１００ｎｇ、１５０ｎｇ、または２００ｎｇの無細胞核酸分子であり得る。この方法は、１フェムトグラム（ｆｇ）から２００ｎｇを得ることを含むことができる。

無細胞核酸試料は、無細胞核酸を含有する試料を指す。無細胞核酸は、細胞内に含有されないかまたはそうでなければ細胞に結合していない核酸、言い換えれば、無傷細胞を除去している試料中に残っている核酸である。無細胞核酸は、対象由来の体液（例えば、血液、尿、ＣＳＦなど）を供給源とする封入されていないすべての核酸を指し得る。無細胞核酸として、ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）、ＲＮＡ（ｃｆＲＮＡ）、およびそのハイブリッド（ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、循環ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、循環ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、長鎖ノンコーディングＲＮＡ（長鎖ｎｃＲＮＡ）、またはこれらの任意の断片を含む）が挙げられる。無細胞核酸は、その二本鎖、一本鎖、またはハイブリッドであり得る。無細胞核酸は、分泌または細胞死のプロセス、例えば、細胞のネクローシスおよびアポトーシスを介して体液中に放出され得る。一部の無細胞核酸は、がん細胞から体液中に放出される（例えば、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）。他のものは、健康な細胞から放出される。ｃｔＤＮＡは、封入されていない腫瘍由来の断片化ＤＮＡであり得る。無細胞胎児ＤＮＡ（ｃｆｆＤＮＡ）は、母親の血流に遊離して循環している胎児ＤＮＡである。

無細胞核酸またはそれに関連するタンパク質は、１つまたは複数のエピジェネティックな修飾を有することができ、例えば、無細胞核酸は、アセチル化、５－メチル化、ユビキチン化、リン酸化、ＳＵＭＯ化、リボシル化、および／またはシトルリン化され得る。

無細胞核酸は、約１００～５００ヌクレオチドの例示的なサイズ分布を有し、１１０～約２３０ヌクレオチドの分子が分子の約９０％を示し、ヒトでは約１６８ヌクレオチドの最頻値および２４０から４４０ヌクレオチドの範囲に第２のマイナーピークを有する。無細胞核酸は、約１６０から約１８０ヌクレオチド、または約３２０から約３６０ヌクレオチド、または約４４０から約４８０ヌクレオチドであり得る。

無細胞核酸は、溶液中に見られる無細胞核酸が無傷細胞および体液の他の非可溶性構成成分から分離される分割ステップを介して、体液から単離され得る。分割ステップは、遠心分離または濾過などの技法を含み得る。あるいは、体液中の細胞は溶解させることができ、無細胞核酸と細胞内核酸は一緒に処理される。一般的には、緩衝液の添加と洗浄ステップの後に、無細胞核酸をアルコールで沈殿させることができる。夾雑物または塩を除去するためのシリカベースのカラムなどのさらなる清浄化ステップが使用されてもよい。例えば、非特異的なバルク担体核酸を、反応全体を通して添加し、収率などの手順の特定の態様を最適化してもよい。

このような処理の後に、試料は、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡおよび／または一本鎖ＲＮＡを含む様々な形態の核酸を含むことができる。必要に応じて、一本鎖ＤＮＡおよび／または一本鎖ＲＮＡが、次の処理および解析ステップに含まれるように、二本鎖形態に変換されてもよい。
２．増幅

アダプターに隣接する試料核酸を、ＰＣＲおよび典型的には、結合しているプライマーから増幅されるＤＮＡ分子に隣接するアダプターのプライマー結合部位までをプライミングする他の増幅方法によって増幅することができる。増幅方法は、伸長、変性およびサーモサイクリングから生じるアニーリングのサイクルを含むことができ、転写に媒介される増幅におけるようにアイソサーマルであってもよい。他の増幅方法として、リガーゼ連鎖反応、鎖置換増幅、核酸配列ベースの増幅、および自己持続配列ベースの複製が挙げられる。

従来の核酸増幅法を使用して、１つまたは複数の増幅を適用し、バーコードを核酸分子に導入することができる。増幅は、１つまたは複数の反応混合物中で行われてもよい。バーコードは、同時に導入されても、または任意の連続的順序で導入されてもよい。バーコードは、配列捕捉の前および／または後に導入されてもよい。一部の事例では、個々の核酸分子を標識するバーコードのみが、プローブ捕捉の前に導入されるが、試料を標識するバーコードは、配列捕捉後に導入される。一部の事例では、個々の核酸分子を標識するバーコードと試料を標識するバーコードの両方が、プローブ捕捉の前に導入される。一部の事例では、試料を標識するバーコードは、配列捕捉の後に導入される。通常、配列捕捉は、標的配列に対して相補的な一本鎖核酸分子を導入することを含み、例えば、ゲノム領域とこのような領域の変異のコード配列は、がん型に関連する。典型的には、増幅により、２００ｎｔから７００ｎｔ、２５０ｎｔから３５０ｎｔ、または３２０ｎｔから５５０ｎｔの範囲のサイズの個々の核酸および／または試料を標識するバーコードで、非一意的にまたは一意的にバーコードを付した複数の核酸アンプリコンを生じる。一部の実施形態では、アンプリコンは、約３００ｎｔのサイズを有する。一部の実施形態では、アンプリコンは、約５００ｎｔのサイズを有する。
３．バーコード

バーコードは、他の方法の中でも、化学合成、ライゲーション、重複伸長ＰＣＲによってアダプターに導入されるかまたはそうでなければアダプターに接合され得る。一般的には、反応における一意的または非一意的バーコードの割り当ては、米国特許出願第２００１００５３５１９号、同第２０１１０１６００７８号、および米国特許第６，５８２，９０８号および米国特許第７，５３７，８９８号およびＵＳ９，５９８，７３１に記載された方法およびシステムに従う。

バーコードは、ランダムに、または非ランダムに試料核酸に連結させ得る。一部の事例では、これらは、バーコード（例えば、一意的または非一意的バーコードの組合せ）のマイクロウェルに対する予期された比で導入される。例えば、バーコードは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０、１００、５００、１０００、５０００、１００００、５０，０００、１００，０００、５００，０００、１，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００または１，０００，０００，０００個より多いバーコードが、ゲノム試料当たりにロードされるようにロードされ得る。一部の事例では、バーコードは、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０、１００、５００、１０００、５０００、１００００、５０，０００、１００，０００、５００，０００、１，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００または１，０００，０００，０００個未満のバーコードが、ゲノム試料当たりにロードされるようにロードされ得る。一部の事例では、試料ゲノム当たりにロードされるバーコードの平均数は、ゲノム試料当たり約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０、１００、５００、１０００、５０００、１００００、５０，０００、１００，０００、５００，０００、１，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００もしくは１，０００，０００，０００個未満、またはそれより多いバーコードである。バーコードは、一意的であっても非一意的であってもよい。

好ましい形式は、２０～５０×２０～５０タグを作成する標的分子の両端にライゲーションされた２０～５０個の異なるバーコード、例えば、４００～２５００個のバーコードを使用する。このようなバーコードの数は、同じ開始点と停止点を有する異なる分子が、異なる組合せのタグを受ける確率が高い（例えば、少なくとも９４％、９９．５％、９９．９９％、９９．９９９％）という点で十分である。

一部の事例では、バーコードは、所定のまたはランダムもしくはセミランダムな配列のオリゴヌクレオチドであってもよい。他の事例では、バーコードが複数のバーコードにおいて互いに必ずしも一意的である訳ではないように、複数のバーコードを使用してもよい。この例では、バーコードは、個々の分子に付着されてもよく（例えば、ライゲーションまたはＰＣＲ増幅によって）、その結果、バーコードとそれが付着し得る配列の組合せによって、個々に追跡されてもよい一意的配列が作成される。本明細書に記載されているように、配列リードの始まり（開始）と終わり（停止）部分の配列データと組み合わせた非一意的バーコードの検出は、特定の分子に対する一意的同一性の割り当てを可能にし得る。個々の配列リードの長さ、塩基対の数を使用して、このような分子の一意的同一性を割り当ててもよい。本明細書に記載されているように、一意的同一性が割り当てられた核酸の一本鎖由来の断片は、それによって、親鎖、および／または相補鎖由来の断片の次の特定を可能にし得る。
４．シーケンシング

事前増幅の有無にかかわらず、必要に応じてアダプターに隣接する試料核酸は、シーケンシングの対象であり得る。シーケンシング方法としては、例えば、サンガーのシーケンシング、ハイスループットシーケンシング、パイロシーケンシング、シーケンシングバイシンセシス、単一分子シーケンシング、ナノポアシーケンシング、半導体シーケンシング、シーケンシングバイライゲーション、シーケンシングバイハイブリダイゼーション、ＲＮＡ－Ｓｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、Ｄｉｇｉｔａｌ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｈｅｌｉｃｏｓ）、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）、Ｓｉｎｇｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＳＭＳＳ）（Ｈｅｌｉｃｏｓ）、超並列シーケンシング、Ｃｌｏｎａｌ Ｓｉｎｇｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ａｒｒａｙ（Ｓｏｌｅｘａ）、ショットガンシーケンシング、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ、Ｒｏｃｈｅ Ｇｅｎｉａ、Ｍａｘｉｍ－Ｇｉｌｂｅｒｔシーケンシング、プライマーウォーキング、ＰａｃＢｉｏを使用するシーケンシング、ＳＯＬｉＤ、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔまたはナノポアプラットフォームが挙げられる。シーケンシング反応は、種々の試料プロセシングユニットで実施することができ、試料プロセシングユニットは、マルチレーン、マルチチャンネル、マルチウェル、または実質的に同時に複数の試料セットをプロセシングする他の手段であってもよい。試料プロセシングユニットは、同時に複数のランのプロセシングを可能にする複数の試料チャンバーを含んでもよい。

シーケンシング反応は、がんまたは他の疾患のマーカーを含有することが既知のタイプの１つまたは複数の断片で実施することができる。シーケンシング反応は、試料中に存在する任意の核酸断片でも実施することができる。シーケンシング反応は、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、９９．９％または１００％のゲノムの配列被覆度を提供することができる。他の事例では、ゲノムの配列被覆度は、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、９９．９％または１００％未満であり得る。

同時に起こるシーケンシング反応は、マルチプレックスシーケンシングを使用して実施されてもよい。一部の事例では、無細胞ポリヌクレオチドは、少なくとも１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、５００００、１００，０００回のシーケンシング反応でシーケンシングすることができる。他の事例では、無細胞ポリヌクレオチドは、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、５００００、１００，０００回未満のシーケンシング反応でシーケンシングすることができる。シーケンシング反応は、逐次的にまたは同時に実施することができる。次のデータ解析は、シーケンシング反応のすべてまたは一部で実施することができる。一部の事例では、データ解析は、少なくとも１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、５００００、１００，０００回のシーケンシング反応で実施することができる。他の事例では、データ解析は、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、５００００、１００，０００回未満のシーケンシング反応で実施することができる。例示的なリードデプスは、遺伝子座（塩基）当たり１０００～５００００リードである。

一部の方法では、核酸集団は、一方または両方の末端に一本鎖オーバーハングを有する二本鎖核酸の酵素による平滑末端化によって、シーケンシングのために調製される。この集団は、ヌクレオチド（例えば、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴまたはＵ）の存在下で、５’－３’ポリメラーゼ活性および３’－５’エクソヌクレアーゼ活性を有するタンパク質で処理され得る。例示的なタンパク質は、クレノウラージフラグメント（Ｋｌｅｎｏｗ ｌａｒｇｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）およびＴ４ポリメラーゼである。５’オーバーハングでは、タンパク質は、５’末端と同一平面上になるまで、対応する鎖の凹んだ３’末端を伸長させて、平滑末端を生成する。３’オーバーハングでは、タンパク質は、対応する鎖の５’末端まで、および時にはそれを超えるまで、３’末端から消化する。対応する鎖の５’末端を超えて消化が進む場合、５’オーバーハングでは、ポリメラーゼ活性によってギャップを埋めることができる。二本鎖核酸の平滑末端化によって、アダプターの付着と次の増幅が促進される。

核酸集団は、一本鎖核酸の二本鎖への変換および／またはＲＮＡのＤＮＡへの変換などの追加のプロセシングに対する対象であり得る。核酸のこれらの形態はまた、アダプターに連結され、増幅され得る。

事前増幅の有無にかかわらず、上記のような平滑末端化に対する核酸対象、および必要に応じて、試料中の他の核酸は、シーケンシングされて、シーケンシングされた核酸を生成することができる。シーケンシングされた核酸は、核酸の配列または配列が決定された核酸の配列を指し得る。シーケンシングは、試料中の個々の核酸分子の増幅産物のコンセンサス配列に直接的または間接的に由来する試料中の個々の核酸分子の配列データを提供するために実施することができる。

一部の方法では、平滑末端化後の試料中に一本鎖オーバーハングを有する二本鎖核酸を、バーコードを含むアダプターの両端に連結させ、シーケンシングによって、核酸配列およびアダプターによって導入されたインラインバーコードが決定される。平滑末端ＤＮＡ分子は、少なくとも部分的な二本鎖アダプター（例えば、Ｙ型または釣鐘型アダプター）の平滑末端と平滑末端ライゲーションされ得る。あるいは、試料核酸とアダプターの平滑末端は、ライゲーションを促進するために、相補的ヌクレオチドでテイル処理され得る。

同一核酸の任意の２つの事例が、両端に連結したアダプターからのアダプターバーコードの同一の組合せを受ける確率が低くなる（例えば、１または０．１％未満）のに十分な数のアダプターと試料を接触させることができる。この方式でアダプターを使用することにより、参照核酸において同じ開始点および停止点を有し、同じバーコードの組合せに連結される核酸配列のファミリーの特定が可能となる。このようなファミリーは、増幅前に、試料中の核酸の増幅産物の配列を示す。ファミリーメンバーの配列は、平滑末端化およびアダプター付着によって修飾される場合、元の試料中の核酸分子に関するコンセンサスヌクレオチドまたは完全なコンセンサス配列を派生するようにコンパイルすることができる。言い換えれば、試料中の核酸の特定の位置を占めるヌクレオチドは、ファミリーメンバーの配列の対応する位置を占めるヌクレオチドのコンセンサスであることが決定される。ファミリーは、二本鎖核酸の一方または両方の鎖の配列を含むことができる。ファミリーのメンバーが、二本鎖核酸由来の両方の鎖の配列を含む場合、一本鎖の配列は、コンセンサスヌクレオチドまたは配列を派生するすべての配列をコンパイルするために、それらの相補体に変換される。一部のファミリーは、単一メンバーの配列のみを含む。この事例では、この配列は、増幅前に、試料中の核酸の配列として得ることができる。あるいは、単一メンバーの配列しか含まないファミリーは、次の解析から排除され得る。

シーケンシングされた核酸におけるヌクレオチドの変異は、シーケンシングされた核酸を参照配列と比較することによって決定することができる。参照配列は、既知の配列、例えば、目的物由来の既知の全ゲノム配列または部分的ゲノム配列、ヒト対象の全ゲノム配列であることが多い。参照配列は、ｈＧ１９であってもよい。シーケンシングされた核酸は、上述のように、試料中の核酸に対して直接的に決定される配列、またはこのような核酸の増幅産物の配列のコンセンサスを示すことができる。比較は、参照配列の１つまたは複数の指定された位置で実施することができる。参照配列の指定された位置に対応する位置を含むシーケンシングされた核酸のサブセットは、各配列が最大限に配列された場合に特定することができる。このようなサブセット内で、存在する場合、どのシーケンシングされた核酸が指定された位置にヌクレオチド変異を含むか、および必要に応じて、存在する場合、どれが参照ヌクレオチドを含むか（すなわち、参照配列におけるものと同じか）を決定することができる。ヌクレオチド変異を含むサブセットにおけるシーケンシングされた核酸の数が閾値を超える場合、バリアントヌクレオチドが指定された位置でコールされ得る。閾値は、単純な数、例えば、ヌクレオチドバリアントを含むサブセット内の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のシーケンシングされた核酸であってもよく、または比、例えば、少なくとも０．５であってもよく、サブセット内のシーケンシングされた核酸のうちの１、２、３、４、５、１０、１５、または２０個は、他の可能性の中で、ヌクレオチドバリアントを含む。比較は、参照配列における目的の任意の指定された位置に対して繰り返すことができる。比較は、参照配列における少なくとも２０、１００、２００、または３００の連続する位置、例えば、２０～５００、または５０～３００の連続する位置を占める指定された位置に対して実施できることもある。

上記または下記で引用されるすべての特許出願、ウェブサイト、他の刊行物、受託番号などは、各個別の項目が参照によってそのように組み込まれることが具体的かつ個別に示されているのと同程度に、すべての目的で、参照によりその全体が組み込まれる。様々な配列バージョンが、異なる時点の受託番号に関連する場合、この出願の有効出願日の受託番号に関連するバージョンを意味する。有効出願日は、該当する場合、実際の出願日または受託番号に言及する優先出願の出願日の早いほうを意味する。同様に、刊行物、ウェブサイトなどの異なるバージョンが異なる時点で公開されている場合、別段示されていなければ、本出願の有効出願日に最も近く公開されたバージョンを意味する。本開示の任意の構成、ステップ、エレメント、実施形態、または態様は、別段具体的に示されていなければ、いずれかの他のものと組み合わせて使用することができる。本開示は、明確化および理解を目的として、例証および実施例によって幾分詳細に記載されているが、特定の変更および修正が添付の特許請求の範囲の範囲内で実践され得ることは明らかであろう。

この実施例は、様々ながん型を有する個体におけるＺスコアの分布を決定する。
採血、輸送、および血漿の単離

すべてのｃｆＤＮＡ抽出、プロセシング、およびシーケンシングを、ＣＬＩＡ認定、ＣＡＰ認定の研究室で実施した。簡潔には、臨床試料について、二重遠心分離によって無細胞血液採取管に採取した１０ｍｌの全血から血漿を単離し、そこからｃｆＤＮＡを抽出し、非ランダムバーコードで標識し、シーケンシングライブラリーを調製するために５～３０ｎｇを使用し、次いで、これをハイブリッド捕捉によって濃縮し、プールし、ペアエンド合成によってシーケンシングした（ＮｅｘｔＳｅｑ ５００および／またはＨｉＳｅｑ
２５００、Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．）。健康なドナーから同様に調製したｃｆＤＮＡと、モデル細胞株の培養上清から上記のように単離し、検出可能なｇＤＮＡが残存しなくなるまでＡｇｅｎｃｏｕｒｔ Ａｍｐｕｒｅ ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）を使用して連続的にサイズを選択したｃｆＤＮＡとを使用して、人為的な分析用試料を作成した。
バイオインフォマティクス分析およびバリアントの検出

ロック済み臨床用Ｇｕａｒｄａｎｔ３６０バイオインフォマティクスパイプライン（ｌｏｃｋｅｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｇｕａｒｄａｎｔ３６０ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ｐｉｐｅｌｉｎｅ）を使用して、すべてのバリアント検出解析を実施し、ポストホック解析による変化なしを報告した。すべての検証および臨床試料に対して予測的にロックし、適用した、独立したトレーニングコホートを使用して、すべての決定閾値を決定した。以前に記載したように［ＰＭＩＤ ２６４７４０７３］、ＩｌｌｕｍｉｎａのＲＴＡソフトウェア（ｖ２．１２）によって作成したベースコールファイルをｂｃｌ２ｆａｓｔｑ（ｖ２．１９）を使用してデマルチプレックスし、分子バーコード検出、シーケンシングアダプタートリミング、およびベースクオリティトリミング（リードの末端におけるＱ２０未満のベースを切り捨てる）のためにカスタムパイプラインでプロセシングした。次いで、プロセシングしたリードを、ＢＷＡ－ＭＥＭ［Ｌｉ ｅｔ ａｌ． ２０１３ ａｒＸｉｖ：１３０３．３９９７ｖ２］に対して整列させ、これを使用して、ｈＧ１９、推定バーコードとリードスタート／ストップ位置の両方を使用して、オリジナルのユニークｃｆＤＮＡ分子の二重鎖コンセンサス表示を構築した。ＮｅｘｔＳｅｑ ５００とＨｉＳｅｑ ２５００の両方で、６２名の健康なドナーのトレーニングセットをシーケンシングすることによって、パネルの各位置に対して独立して決定したシーケンシングプラットフォームおよび位置特異的参照エラーノイズプロファイルに対してリードおよびコンセンサス分子の特徴を比較することによって、ＳＮＶを検出した。観察された位置のＳＮＶエラープロファイルを使用して、バリアント分子の数および特徴に関してＳＮＶ検出のためのコーリングカットオフを規定し、これは、位置によって異なったが、最も一般的なユニーク分子であり、平均試料（ユニーク分子被覆度が５，０００）では、対立遺伝子比率－０．０４％の検出限界に相当する。インデルを検出するために、鎖特異的かつｌａｔｅ ＰＣＲエラーを見込む、ホモポリマーまたは反復コンテキストにおいて頻繁に生じるＰＣＲアーチファクトを説明するために、生成バックグラウンドノイズモデルを構築した。次いで、バックグラウンドノイズ分布に対する観察された特徴量バリアント分子サポートに対する尤度比スコアによって検出を決定した。報告の必要な閾値（ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）は、トレーニング試料における性能によって決定される場合、事象特異的であるが、臨床的に実行可能なインデルに対して最も一般的には２以上のユニーク分子であり、平均試料では、対立遺伝子比率－０．０２％の検出限界に相当する。融合事象を重複するペアエンドリードを併合することによって検出し、シーケンシングしたｃｆＤＮＡ分子の表示を形成し、次いで、これを整列させ、ソフトクリッピングを含むバーコード付加とアライメントの情報に基づき、初期のユニークｃｆＤＮＡ分子に対してマッピングした。方向性およびブレークポイントプロキシミティを使用してソフトクリップリードを解析し、候補融合事象を示す分子のクラスターを特定し、次いで、これを使用して融合参照を構築し、これに対して、第１のパスのアライナーによってソフトクリップされたリードを再整列させた。特異的な報告の必要な閾値を、遡及的およびトレーニングセット解析によって決定したが、一般的には、１以上の、質的要求に合致する再整列後のユニーク分子であり、これは、平均試料では、対立遺伝子比率－０．０４％の検出限界に相当する。ＣＮＡを検出するために、プローブレベルのユニーク分子被覆度を、全体的なユニーク分子スループット、プローブ効率、ＧＣ含量、およびシグナル飽和に対して正規化し、遺伝子レベルでしっかりとまとめた。ＣＮＡの決定は、試料当たりの二倍体ベースラインからの絶対コピー数の偏差と、それぞれの試料自体の二倍体ベースライン内のバックグラウンドのバリエーションのコンテキストにおいて、プローブレベルで正規化されたシグナルのベースラインのバリエーションからの偏差との両方に対するトレーニングセットで確立された決定閾値に基づいた。試料当たりの正規化された腫瘍量は、腫瘍型およびｃｔＤＮＡ比率について期待された遺伝子変異量に対する正規化によって決定され、Ｚスコアとして報告した。

図１は、Ｘ軸に示したがん型のうちの１つを有する異なる個体由来の試料におけるがん遺伝子変異量に対するＺスコアをプロットしている。Ｚスコアの分布は異なるがん型に対して変化するが、一般的には、ゼロ未満の最頻値で非対称であることが一般的であるが、少数の個体は、高度に正のＺスコアを示している。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目１)
がん型またはがん型の徴候を有する対象由来の無細胞核酸の試験試料における腫瘍遺伝子変異量の指標を提供する方法であって、
（ａ）無細胞核酸の前記試験試料中に存在する変異の数、および無細胞核酸の前記試験試料中で最も多く示される１つまたは複数の変異に基づくマイナー対立遺伝子比率を決定するステップと、
（ｂ）前記試験試料中のがん遺伝子変異量の指標を決定するために、前記試料中に存在する前記変異の数を、同じがん型を有する他の対象由来の対照試料中に存在する変異の数および前記試験試料の前記マイナー対立遺伝子比率を含むマイナー対立遺伝子比率のビン内のマイナー対立遺伝子比率に対して正規化するステップ
とを含む、方法。
(項目２)
対照試料中に存在する前記変異の数が、平均である、項目１に記載の方法。
(項目３)
前記ビンが、２０％以下、１０％以下または５％以下の幅を有する、先行する項目のいずれかに記載の方法。
(項目４)
前記試料中に存在する前記変異の数が、閾値を超えているかどうかを決定するステップをさらに含み、前記閾値が、免疫療法に正に応答する傾向がある対象を示すように設定される、先行する項目のいずれかに記載の方法。
(項目５)
前記正規化するステップが、前記試験試料中の前記変異の数を、前記対照試料中の変異の平均数で除することを含む、先行する項目のいずれかに記載の方法。
(項目６)
前記正規化するステップが、無細胞核酸の前記試験試料中の変異の前記決定された数から、前記ビン内の前記対照試料中の変異の数の平均を減算することを含む、項目１から４に記載の方法。
(項目７)
前記対照試料中に存在する変異の前記平均数を減じた無細胞核酸の前記試験試料中の前記変異の数を、前記対照試料中に存在する前記変異の数の標準偏差で除し、Ｚスコアを算出するステップをさらに含む、項目６に記載の方法。
(項目８)
前記平均が、平均値である、項目７に記載の方法。
(項目９)
正規化するステップが、少なくとも１０、５０、１００または５００個の対照試料中の変異の数の平均および広がりを決定することと、前記試験試料中の前記平均からの偏差の標準スコアを決定することと、前記標準スコアが閾値数を超えているかどうかを決定することとを含む、項目１から４に記載の方法。
(項目１０)
前記平均が、平均値、中央値または最頻値である、項目９に記載の方法。
(項目１１)
前記広がりが、分散、標準偏差、または四分位範囲として表される、項目９に記載の方法。
(項目１２)
偏差の前記標準スコアが、Ｚスコアである、項目９に記載の方法。
(項目１３)
前記正規化するステップが、無細胞核酸の前記試験試料中の変異の前記決定された数を、同じビン内の前記対照試料中に存在する変異の前記平均数で除することをさらに含む、項目１から４に記載の方法。
(項目１４)
前記正規化するステップが、マイナー対立遺伝子比率の複数のビンに存在する変異の数の値を保存するためにプログラムされたコンピューターにおいて実施される、先行する項目のいずれかに記載の方法。
(項目１５)
前記保存される値が、前記複数のビンのそれぞれに存在する前記変異の数の平均値および標準偏差である、項目１３に記載の方法。
(項目１６)
前記対象における腫瘍遺伝子変異量の標準スコア、および前記標準スコアが、免疫療法に対する応答性と一致して、対照対象に対する閾値を超えているかどうかを決定するステップを含む、先行する項目のいずれかに記載の方法。
(項目１７)
（ａ）が、前記試験試料中の無細胞核酸分子の配列を決定することと、前記試料中に存在する前記変異の数および前記マイナー対立遺伝子比率を特定するために、得られた配列を対応する参照配列と比較することとを含む、項目１に記載の方法。
(項目１８)
前記参照配列が、ｈＧ１９またはｈＧ３８である、項目１７に記載の方法。
(項目１９)
前記対照試料が、少なくとも２５、５０、１００、２００または５００個の対照試料を含む、項目７に記載の方法。
(項目２０)
少なくとも５０，０００、１００，０００または１５０，０００ヌクレオチドが、前記無細胞核酸のセグメントにおいてシーケンシングされる、項目１５に記載の方法。
(項目２１)
ステップ（ａ）が、前記試料中に存在するかまたは存在することが疑われる前記型のがんにおいて生じることが既知の所定の変異のパネルの有無を決定することを含み、必要に応じて、前記変異が、コード化タンパク質の配列に影響を及ぼす体細胞変異である、項目１に記載の方法。
(項目２２)
ステップ（ａ）が、アダプターを前記無細胞核酸に連結させることと、前記アダプターに結合するプライマーから前記無細胞核酸を増幅することと、前記増幅された核酸をシーケンシングすることとを含む、項目１に記載の方法。
(項目２３)
前記シーケンシングするステップが、ブリッジ増幅シーケンシング、パイロシーケンシング、イオン半導体シーケンシング、ペアエンドシーケンシング、ライゲーションによるシーケンシングまたは単分子リアルタイムシーケンシングである、項目１に記載の方法。
(項目２４)
対象を処置する方法であって、
（ａ）無細胞核酸の試験試料中に存在する変異の数、および無細胞核酸の前記試験試料中で最も多く示される１つまたは複数の変異に基づくマイナー対立遺伝子比率を決定するステップと、
（ｂ）前記試験試料中のがん遺伝子変異量の指標を決定するために、前記試料中に存在する前記変異の数を、同じがん型を有する他の対象由来の対照試料中に存在する変異の数および前記試験試料の前記マイナー対立遺伝子比率を含むマイナー対立遺伝子比率のビン内のマイナー対立遺伝子比率に対して正規化するステップと、
（ｃ）腫瘍遺伝子変異量の前記指標が閾値を超える場合、免疫療法を前記対象に投与するステップ
とを含む、方法。
(項目２５)
各対象における腫瘍遺伝子変異量の指標を決定するために複数の対象で実施され、前記閾値を下回る腫瘍遺伝子変異量の前記指標を有する対象よりも高い比率の、閾値を超えるがん遺伝子変異量の前記指標を有する対象が、前記がんに対する免疫療法を受ける、項目２４に記載の方法。
(項目２６)
前記指標が第１の閾値を超えるすべての対象が免疫療法を受け、前記指標が第２の閾値を下回るすべての対象が免疫療法を受けない、項目２５に記載の方法。
(項目２７)
前記指標が、Ｚスコアである、項目２４または２５に記載の方法。
(項目２８)
前記免疫療法が、チェックポイントインヒビター抗体の投与を含む、項目２４または２５に記載の方法。
(項目２９)
前記免疫療法が、ＰＤ－１、ＰＤ－２、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ－４０、ＯＸ４０、Ｂ７．１、Ｂ７Ｈｅ、ＬＡＧ３、ＣＤ１３７、ＫＩＲ、ＣＣＲ５、ＣＤ２７、またはＣＤ４０に対する抗体の投与を含む、項目２４または２５に記載の方法。
(項目３０)
前記免疫療法が、炎症促進性サイトカインの投与を含む、項目２４または２５に記載の方法。
(項目３１)
前記免疫療法が、前記がん型に対するＴ細胞の投与を含む、項目２４または２５に記載の方法。
(項目３２)
前記がん型が、固形腫瘍である、先行する項目のいずれかに記載の方法。
(項目３３)
前記がん型が、腎がん、中皮腫、軟組織がん、原発性ＣＮＳがん、甲状腺がん、肝がん、前立腺がん、膵がん、ＣＵＰ、神経内分泌がん、ＮＳＣＬＣ、胃食道がん、頭頚部がん、ＳＣＬＣ、乳がん、黒色腫、胆管腺がん、婦人科系がん、結腸直腸がんまたは尿路上皮がんである、項目１から３２のいずれかに記載の方法。
(項目３４)
前記がん型が、造血器悪性腫瘍である、項目１から３２のいずれかに記載の方法。
(項目３５)
前記がん型が、白血病またはリンパ腫である、項目３３に記載の方法。
(項目３６)
がんを有する対象を処置する方法であって、免疫療法剤を前記対象に投与するステップを含み、前記対象が、
（ａ）前記対象由来の無細胞核酸の試験試料中に存在する変異の数、および無細胞核酸の前記試験試料中で最も多く示される前記変異に対するマイナー対立遺伝子比率を決定するステップと、
（ｂ）前記対象の前記試料中の腫瘍遺伝子変異量の指標を決定するために、前記試料中に存在する前記変異の数を、同じがん型を有する他の対象由来の対照試料中に存在する変異の数および前記試験試料の前記マイナー対立遺伝子比率を含むマイナー対立遺伝子比率のビン内のマイナー対立遺伝子比率に対して正規化するステップであって、前記対象が、閾値を超える腫瘍遺伝子変異量を有することが決定される、ステップと
によって決定された前記対象のがん遺伝子変異量の前記指標から、免疫療法に対して特定されている、方法。
(項目３７)
がんを有する対象を処置する方法であって、
各対象に対して、前記対象由来の試料の腫瘍遺伝子変異量の指標を受容するステップを含み、腫瘍遺伝子変異量の前記指標が、
（ａ）前記対象由来の試料の無細胞核酸の試験試料中に存在する変異の数、および前記試験試料の無細胞核酸の前記試験試料中で最も多く示される前記変異に対するマイナー対立遺伝子比率を決定するステップと、
（ｂ）前記対象の前記試料中の腫瘍遺伝子変異量の前記指標を決定するために、前記試料中に存在する前記変異の数を、同じがん型を有する他の対象由来の対照試料中に存在する変異の数および前記試験試料の前記マイナー対立遺伝子比率を含むマイナー対立遺伝子比率のビン内のマイナー対立遺伝子比率に対して正規化するステップと、
（ｃ）免疫療法を、腫瘍遺伝子変異量が閾値を超えることが決定された少なくとも１つの対象に投与するステップと
によって決定される、方法。
(項目３８)
試験試料中の無細胞核酸をシーケンシングすることによって得られたシーケンシングリードを、通信ネットワークを通じて受容する通信インターフェース、ならびに
前記通信インターフェースと通信するコンピューターであって、１つまたは複数のコンピュータープロセッサーと、前記１つまたは複数のコンピュータープロセッサーによる実行の際に、
（ａ）核酸シーケンサーによって得られた前記シーケンシングリードを、前記通信ネットワークを通じて受容するステップと、
（ｂ）前記試験試料由来の前記シーケンシングリードに存在する変異の数、および前記試験試料由来のシーケンシングリード中で最も多く示される１つまたは複数の変異に基づくマイナー対立遺伝子比率を決定するステップと、
（ｃ）前記試験試料中のがん遺伝子変異量の指標を決定するために、前記試験試料中に存在する前記変異の数を、同じがん型を有する他の対象由来の対照試料中に存在する変異の数および前記試験試料の前記マイナー対立遺伝子比率を含むマイナー対立遺伝子比率のビン内のマイナー対立遺伝子比率に対して正規化するステップと
を含む方法を実施する、マシン実行可能コードを含むコンピューター可読媒体とを含むコンピューター
を含むシステム。
(項目３９)
前記核酸シーケンサーが、対象に由来する無細胞ＤＮＡ分子から得られたシーケンシングライブラリーをシーケンシングし、前記シーケンシングライブラリーが、前記無細胞ＤＮＡ分子およびバーコードを含むアダプターを含む、項目３８に記載のシステム。
(項目４０)
前記核酸シーケンサーが、前記シーケンシングライブラリーに関するシーケンシングバイシンセシスを実施して、前記シーケンシングリードを得る、項目３８に記載のシステム。
(項目４１)
前記核酸シーケンサーが、前記シーケンシングライブラリーに関するパイロシーケンシング、単分子シーケンシング、ナノポアシーケンシング、半導体シーケンシング、シーケンシングバイライゲーションまたはシーケンシングバイハイブリダイゼーションを実施して、前記シーケンシングリードを得る、項目３８に記載のシステム。
(項目４２)
前記核酸シーケンサーが、前記シーケンシングライブラリーに由来するクローン単一分子アレイを使用して、前記シーケンシングリードを得る、項目３８に記載のシステム。
(項目４３)
前記核酸シーケンサーが、前記シーケンシングライブラリーをシーケンシングして前記シーケンシングリードを得るためのマイクロウェルのアレイを有するチップを含む、項目３８に記載のシステム。
(項目４４)
前記コンピューター可読媒体が、メモリー、ハードドライブまたはコンピューターサーバーを含む、項目３８に記載のシステム。
(項目４５)
前記通信ネットワークが、遠距離通信ネットワーク、インターネット、エクストラネット、またはイントラネットを含む、項目３８に記載のシステム。
(項目４６)
前記通信ネットワークが、分散コンピューティングが可能な１つまたは複数のコンピューターサーバーを含む、項目３８に記載のシステム。
(項目４７)
分散コンピューティングが、クラウドコンピューティングである、項目４６に記載のシステム。
(項目４８)
前記コンピューターが、前記核酸シーケンサーから遠隔設置されているコンピューターサーバー上に設置されている、項目３８に記載のシステム。
(項目４９)
前記シーケンシングライブラリーが、試料を１つまたは複数の試料から識別する試料バーコードをさらに含む、項目３９に記載のシステム。
(項目５０)
ネットワークを通じて、前記コンピューターと通信する電子ディスプレイであって、（ａ）～（ｃ）を実施した際の結果を表示するためのユーザーインターフェースを含む電子ディスプレイをさらに含む、項目３８に記載のシステム。
(項目５１)
前記ユーザーインターフェースが、グラフィカルユーザーインターフェース（ＧＵＩ）またはウェブベースユーザーインターフェースである、項目５０に記載のシステム。
(項目５２)
前記電子ディスプレイが、パーソナルコンピューターにおいて存在する、項目５１に記載のシステム。
(項目５３)
前記電子ディスプレイが、インターネット対応コンピューターにおいて存在する、項目５１に記載のシステム。
(項目５４)
前記インターネット対応コンピューターが、前記コンピューターから遠隔した位置に設置されている、項目５３に記載のシステム。

Claims (30)

1. がん型またはがん型の徴候を有する対象由来の無細胞核酸の試験試料中のＺスコアを、前記対象が治療に正に応答する傾向があるかどうかの指標として得る方法であって、
   （ａ）無細胞核酸の前記試験試料中に存在する変異の数、および、無細胞核酸の前記試験試料中で最も多く示される１つまたは複数の変異についてのマイナー対立遺伝子比率を決定するステップと；
   （ｂ）前記試料中に存在する変異の前記数を、対照試料のビン内の、同じがん型を有する他の対象由来の対照試料中に存在する変異の数に対して正規化するステップであって、前記対照試料が、前記試験試料の前記マイナー対立遺伝子比率を含む一定範囲のマイナー対立遺伝子比率を有し、前記正規化するステップが、無細胞核酸の前記試験試料中の決定された変異の前記数から、前記ビン内の前記対照試料中の変異の数の平均値、中央値または最頻値を減算することを含み、さらに、前記対照試料中に存在する変異の数の前記平均値、中央値または最頻値を減じた無細胞核酸の前記試験試料中の変異の前記数を、前記対照試料中に存在する変異の前記数の標準偏差で除し、Ｚスコアを算出することを含む、ステップと、
   （ｃ）前記Ｚスコアが１つ以上の閾値にあるか、１つ以上の閾値を上回るか、１つ以上の閾値を下回るかを決定するステップであって、前記１つ以上の閾値が、前記対象が前記治療に正に応答する傾向があるか、または、前記治療に正に応答する傾向がないかを示すために設定されており、前記試験試料の前記マイナー対立遺伝子比率を含む一定範囲のマイナー対立遺伝子比率を有する前記対照試料の前記ビンが、前記対照試料のビンのセットから選択され、前記対照試料のビンの前記セットのそれぞれが、前記対照試料の一定範囲のマイナー対立遺伝子比率を有し、前記対照試料の前記ビンのそれぞれが、前記対照試料のマイナー対立遺伝子比率の範囲全体の割合として定義され、前記マイナー対立遺伝子比率が、所与の試料中の所与のゲノム位置に変異を有するＤＮＡ分子の比率を指す、ステップと
   を含む、方法。
2. 前記ビンが、前記対照試料のマイナー対立遺伝子比率の範囲全体の２０％以下、１０％以下、または５％以下の幅を有する、請求項１に記載の方法。
3. １つの閾値が設定され、前記Ｚスコアが前記閾値にあるかまたは前記閾値を上回る対象は、前記治療に正に応答する傾向があり、前記Ｚスコアが前記閾値を下回る対象は、前記治療に正に応答する傾向がない、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記Ｚスコアが正のスコアである対象は、前記治療に正に応答する傾向があり、前記Ｚスコアが負のスコアである対象は、前記治療に正に応答する傾向がない、請求項１または２に記載の方法。
5. 前記Ｚスコアが第１の閾値にあるかまたは第１の閾値を上回る対象は、前記治療に正に応答する傾向があり、前記Ｚスコアが第２の閾値にあるかまたは第２の閾値を下回る対象は、前記治療に正に応答する傾向がない、請求項１または２に記載の方法。
6. 前記Ｚスコアが１、２または３を上回る対象は、前記治療に正に応答する傾向がある、請求項１または２に記載の方法。
7. 前記Ｚスコアが１を下回る対象は、前記治療に正に応答する傾向がない、請求項１または２に記載の方法。
8. 前記治療に正に応答する傾向がある前記対象は、前記治療を受ける候補である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記治療が免疫療法である、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記免疫療法が、チェックポイントインヒビター抗体の投与を含む、請求項９に記載の方法。
11. 前記免疫療法が、ＰＤ－１、ＰＤ－２、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ－４０、ＯＸ４０、Ｂ７．１、Ｂ７Ｈｅ、ＬＡＧ３、ＣＤ１３７、ＫＩＲ、ＣＣＲ５、ＣＤ２７、またはＣＤ４０に対する抗体、炎症促進性サイトカイン、および／あるいは、前記がん型に対するＴ細胞の投与を含む、請求項９に記載の方法。
12. （ｂ）に記載される前記正規化するステップに使用される前記対照試料が、少なくとも２５、５０、１００、２００、または５００の対照試料を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記正規化するステップが、マイナー対立遺伝子比率の複数のビンに存在する変異の前記数の値を保存するためにプログラムされたコンピューターにおいて実施される、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記保存される値が、前記複数のビンのそれぞれに存在する変異の前記数の平均値および標準偏差である、請求項１３に記載の方法。
15. 少なくとも５０，０００、１００，０００または１５０，０００ヌクレオチドが、前記無細胞核酸のセグメントにおいてシーケンシングされる、請求項１３または１４に記載の方法。
16. （ａ）が、
    （ｉ）前記試験試料中の無細胞核酸分子の配列を決定することと、前記試料中に存在する変異の前記数および前記マイナー対立遺伝子比率を特定するために、前記得られた配列を対応する参照配列と比較すること；
    （ｉｉ）前記試料中に存在するかまたは存在することが疑われる型のがんにおいて生じることが既知の所定の変異のパネルの有無を決定すること；または
    （ｉｉｉ）アダプターを前記無細胞核酸に連結させることと、前記アダプターに結合するプライマーから前記無細胞核酸を増幅することと、前記増幅された核酸をシーケンシングすること
    を含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
17. （ａ）（ｉ）に記載される前記参照配列がｈＧ１９またはｈＧ３８由来である、請求項１６に記載の方法。
18. （ａ）（ｉｉ）に記載される前記所定の変異がコード化タンパク質の前記配列に影響を及ぼす体細胞変異である、請求項１６または１７に記載の方法。
19. 前記シーケンシングすることが、ブリッジ増幅シーケンシング、パイロシーケンシング、イオン半導体シーケンシング、ペアエンドシーケンシング、ライゲーションによるシーケンシングまたは単分子リアルタイムシーケンシングである、請求項１６～１８のいずれか一項に記載の方法。
20. 前記がん型が、
    （ａ）固形腫瘍；
    （ｂ）腎がん、中皮腫、軟組織がん、原発性ＣＮＳがん、甲状腺がん、肝がん、前立腺がん、膵がん、ＣＵＰ、神経内分泌がん、ＮＳＣＬＣ、胃食道がん、頭頚部がん、ＳＣＬＣ、乳がん、黒色腫、胆管腺がん、婦人科系がん、結腸直腸がんまたは尿路上皮がん；
    （ｃ）白血病またはリンパ腫；あるいは
    （ｄ）造血器悪性腫瘍
    である、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
21. システムであって、
    がん型またはがん型の徴候を有する対象由来の試験試料中の無細胞核酸をシーケンシングすることによって生成されたシーケンシングリードを、通信ネットワークを通じて受容する通信インターフェース、ならびに
    前記通信インターフェースと通信するコンピューターであって、１つまたは複数のコンピュータープロセッサーと、前記１つまたは複数のコンピュータープロセッサーによる実行の際に：
    （ａ）核酸シーケンサーによって生成されたシーケンシングリードを、前記通信ネットワークを通じて受容するステップと；
    （ｂ）前記試験試料由来の前記シーケンシングリードに存在する変異の数、および前記試験試料由来のシーケンシングリード中で最も多く示される１つまたは複数の変異についてのマイナー対立遺伝子比率を決定するステップと；
    （ｃ）前記試料中に存在する変異の前記数を、対照試料のビン内の、同じがん型を有する他の対象由来の対照試料中に存在する変異の数に対して正規化するステップであって、前記対照試料が、前記試験試料の前記マイナー対立遺伝子比率を含む一定範囲のマイナー対立遺伝子比率を有し、前記正規化するステップが、無細胞核酸の前記試験試料中の前記決定された変異の前記数から、前記ビン内の前記対照試料中の変異の数の平均値、中央値または最頻値を減算することを含み、さらに、前記対照試料中に存在する変異の数前記平均値、中央値または最頻値を減じた無細胞核酸の前記試験試料中の変異の前記数を、前記対照試料中に存在する変異の前記数の標準偏差で除し、Ｚスコアを算出することを含む、ステップ
    とを含む方法を実施する、マシン実行可能コードを含むコンピューター可読媒体とを含むコンピューター
    を含み、
    前記試験試料の前記マイナー対立遺伝子比率を含む一定範囲のマイナー対立遺伝子比率を有する前記対照試料の前記ビンが、前記対照試料のビンのセットから選択され、前記対照試料のビンの前記セットのそれぞれが、前記対照試料の一定範囲のマイナー対立遺伝子比率を有し、前記対照試料の前記ビンのそれぞれが、前記対照試料のマイナー対立遺伝子比率の範囲全体の割合として定義され、前記マイナー対立遺伝子比率が、所与の試料中の所与のゲノム位置に変異を有するＤＮＡ分子の比率を指す、
    システム。
22. 前記核酸シーケンサーが、対象に由来する無細胞ＤＮＡ分子から精製されたシーケンシングライブラリーをシーケンシングし、前記シーケンシングライブラリーが、前記無細胞ＤＮＡ分子、および、バーコードを含むアダプターを含む、請求項２１に記載のシステム。
23. 前記シーケンシングライブラリーは、試料を１つまたは複数の試料から識別する試料バーコードをさらに含む、請求項２２に記載のシステム。
24. （ａ）前記コンピューター可読媒体が、メモリー、ハードドライブまたはコンピューターサーバーを含む；
    （ｂ）前記通信ネットワークが、遠距離通信ネットワーク、インターネット、エクストラネット、またはイントラネットを含む；
    （ｃ）前記通信ネットワークが、分散コンピューティングの可能な１つまたは複数のコンピューターサーバーを含む；および／あるいは
    （ｄ）前記コンピューターが、前記核酸シーケンサーから遠隔設置されているコンピューターサーバー上に設置されている、
    請求項２１～２３のいずれか一項に記載のシステム。
25. （ｃ）に記載される前記分散コンピューティングが、クラウドコンピューティングである、請求項２４に記載のシステム。
26. 前記核酸シーケンサーが、
    （ａ）前記シーケンシングリードを生成するために、前記シーケンシングライブラリーに関するシーケンシングバイシンセシスを実施する；
    （ｂ）前記シーケンシングリードを生成するために、前記シーケンシングライブラリーに関するパイロシーケンシング、単分子シーケンシング、ナノポアシーケンシング、半導体シーケンシング、シーケンシングバイライゲーションまたはシーケンシングバイハイブリダイゼーションを実施する；
    （ｃ）前記シーケンシングリードを生成するために、前記シーケンシングライブラリーに由来するクローン単一分子アレイを使用する；および／あるいは
    （ｄ）前記シーケンシングリードを生成するために、前記シーケンシングライブラリーをシーケンシングするためのマイクロウェルのアレイを有するチップを含む、
    請求項２２～２３、ならびに、請求項２２を直接または間接的に引用する場合の請求項２４～２５のいずれか一項に記載のシステム。
27. ネットワークを通じて、前記コンピューターと通信する電子ディスプレイであって、（ａ）～（ｃ）を実施した際の結果を表示するためのユーザーインターフェースを含む電子ディスプレイをさらに含む、請求項２１～２６のいずれか一項に記載のシステム。
28. 前記ユーザーインターフェースが、グラフィカルユーザーインターフェース（ＧＵＩ）またはウェブベースユーザーインターフェースである、請求項２７に記載のシステム。
29. 前記電子ディスプレイが、パーソナルコンピューターにおいて、および／または、インターネット対応コンピューターにおいて存在する、請求項２７または請求項２８に記載のシステム。
30. 前記インターネット対応コンピューターは、前記コンピューターから遠隔した位置に設置されている、請求項２９に記載のシステム。