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JP7696335B2 - 免疫療法に使用するための組成物および方法 - Google Patents

免疫療法に使用するための組成物および方法 Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年９月９日に出願された米国仮特許出願第６２／８９７，９４７号および２０２０年９月４日に出願された同第６３／０７５，０４１号の優先権を主張し、それらの各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
電子的に提出されたテキストファイルの説明
本明細書とともに電子的に提出されたテキストファイルの内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる：配列表のコンピュータ可読形式コピー（ファイル名：ＳＣＲＢ＿０１６＿０２ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、記録日：２０２０年９月９日、ファイルサイズ１２．０メガバイト）。
多くの承認された治療薬、例えば、がん治療薬は、正常細胞も疾患細胞も死滅させる細胞毒性薬である。これらの細胞毒性薬の治療効果は、疾患細胞が正常細胞よりも感受性が高いことに依存しており、それにより、許容できない副作用をもたらさない用量を使用して臨床反応を達成することが可能になる。しかしながら、これらの非特異的薬物の本質的に全てが、正常組織に深刻ではないにしてもいくらかの損傷をもたらし、これにより、多くの場合、治療適合性が制限される。
ゲノム工学は、疾患細胞、例えば、がん細胞に特異的に結合してそれを死滅させるようにプログラムされた免疫細胞の作製を可能にするという点で、細胞毒性薬に異なるアプローチを提供することができる。キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）技術の出現により、ある特定の種類のがんにおける治療効果の新たな様式がもたらされている。ＣＡＲを含む細胞を操作して、ＨＬＡタンパク質のミスマッチを減らし、野生型Ｔ細胞受容体または修飾された細胞の他の構成要素をレシピエント対象と比較して減少させるまたは排除することにより、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の可能性を、ミスマッチ（例えば、同種異系）移植片組織の宿主Ｔ細胞受容体認識およびそれに対する応答を排除することによって減少させるまたは排除する（例えば、Ｔａｋａｈｉｒｏ Ｋａｍｉｙａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｇｅｎｅｒａｔｅ Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ ｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ Ａｄｖａｎｃｅｓ ２：５１７（２０１８）を参照されたい）。したがって、このアプローチを使用して、がん、自己免疫疾患、および移植片拒絶反応などの疾患を有する対象における免疫腫瘍学的応用のための改善された治療指数を有する免疫細胞を生成することができた。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系が真核細胞におけるゲノム編集に適しているため、これらの２つの技術は、標的細胞に対して強力な細胞毒性を有する免疫細胞の操作を可能にし、さらに特にかかる細胞の同種異系移植の場合にそれらの細胞の移植に対する望ましくないレシピエント免疫応答の誘発に寄与する細胞マーカーの減少または排除も可能にする可能性を有する。したがって、免疫療法治療、例えば、同種異系ベースの免疫療法治療に使用するための、修飾された細胞およびかかる細胞を修飾してこれらの特性を呈する操作されたＣＡＲ－Ｔ細胞にする方法が必要とされている。
いくつかの態様では、本開示は、抗原プロセシング、抗原提示、抗原認識、および／または抗原応答に関与する１つ以上のタンパク質をコードする細胞遺伝子の標的核酸配列を修飾するために使用されるＣａｓＸ：ガイド核酸系（ＣａｓＸ：ｇＮＡ系）の組成物および方法を提供する。前述では、タンパク質は、ベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、Ｔ細胞受容体アルファ鎖定常領域（ＴＲＡＣまたはＴＣＲＡ）、クラスＩＩ主要組織適合性複合体トランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）、Ｔ細胞受容体ベータ定常１（ＴＲＢＣ１またはＴＣＲＢ）、Ｔ細胞受容体ベータ定常２（ＴＲＢＣ２）、プログラム細胞死１（ＰＤ－１）、サイトカイン誘導性ＳＨ２（ＣＩＳＨ）、ＩｇおよびＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）、アデノシンＡ２ａ受容体（ＡＤＯＲＡ２Ａ）、キラー細胞レクチン様受容体Ｃ１（ＮＫＧ２Ａ）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）、リンパ球活性化３（ＬＡＧ－３）、Ｔ細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン３（ＴＩＭ－３）、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、ヒト白血球抗原Ａ（ＨＬＡ－Ａ）、ヒト白血球抗原Ｂ（ＨＬＡ－Ｂ）、ＴＧＦβ受容体２（ＴＧＦβＲＩＩ）、分化抗原群２４７（ＣＤ２４７）、ＣＤ３ｄ分子（ＣＤ３Ｄ）、ＣＤ３ｅ分子（ＣＤ３Ｅ）、ＣＤ３ｇ分子（ＣＤ３Ｇ）、ＣＤ５２分子（ＣＤ５２）、ヒト白血球抗原Ｃ（ＨＬＡ－Ｃ）、デオキシシチジンキナーゼ（ｄＣＫ）、またはＦＫＢＰプロリルイソメラーゼ１Ａ（ＦＫＢＰ１Ａ）からなる群から選択される。ＣａｓＸ：ｇＮＡ系は、参照ＣａｓＸタンパク質、参照ＣａｓＸと比較して改善された特性を有するＣａｓＸバリアントタンパク質、参照配列であるガイド核酸（ｇＮＡ）、または参照配列と比較して改善された特性を有するｇＮＡバリアント、ならびにＣａｓＸヌクレアーゼによって導入された細胞中の標的核酸配列の切断部位に挿入されて標的核酸配列を修飾することができるドナー鋳型核酸を含み得る。これらの構成要素の実施形態は、本明細書の以下に説明される。いくつかの態様では、本開示は、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）として複合体形成された本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかのＣａｓＸとｇＮＡとの遺伝子編集対を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、抗原プロセシング、抗原提示、抗原認識、および／または抗原応答に関与するタンパク質をコードする細胞の遺伝子を修飾する方法であって、そこで、遺伝子がかかるタンパク質の発現からノックダウンまたはノックアウトされる、方法を提供する。
ＣａｓＸ：ｇＮＡ系によって修飾された細胞は、とりわけ、免疫療法用途、例えば、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の可能性が低く、対象におけるがんまたは自己免疫疾患の治療に使用するための１つ以上のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するようにも修飾された免疫細胞の調製および使用に有用である。かかる細胞は、宿主対移植片合併症を軽減するようにも操作される。他の実施形態では、ＣａｓＸ－ｇＮＡ系を使用して、ＣＡＲおよび／または操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする細胞に核酸をノックインするために使用され、ＣＡＲおよび／またはＴＣＲは、本明細書の以下に列記されるものを含む腫瘍細胞抗原に特異的な結合ドメインを含む。かかる結合ドメインは、直鎖状抗体、ＶＨＨなどの単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、または一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の形態であり得る。修飾された細胞の調製に使用され得る細胞には、前駆細胞、造血幹細胞、多能性幹細胞、またはＴ細胞、ＴＲＥＧ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、もしくは樹状細胞からなる群から選択される免疫細胞が含まれる。
いくつかの態様では、本開示は、ＣａｓＸタンパク質、ｇＮＡ、遺伝子編集対をコードするまたは含むか、または本明細書に記載のドナー鋳型核酸を含むポリヌクレオチドおよびベクターを提供する。いくつかの実施形態では、ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターまたはレンチウイルスベクターなどのウイルスベクターである。他の実施形態では、ベクターは、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）またはナノ粒子などの非ウイルス粒子である。
いくつかの態様では、本開示は、細胞集団における標的核酸配列を修飾する方法であって、集団の各細胞に、ａ）本明細書に開示される実施形態のうちのいずれかのＣａｓＸ：ｇＮＡ系、またはｂ）本明細書に開示される実施形態のうちのいずれかの核酸、またはｃ）本明細書に開示される実施形態のうちのいずれかのベクター、ｄ）本明細書に開示される実施形態のうちのいずれかのＶＬＰ、またはｅ）上記の（ａ）～（ｄ）のうちの２つ以上の組み合わせを導入することを含み、細胞の標的核酸配列がＣａｓＸタンパク質によって修飾される（例えば、一本鎖もしくは二本鎖切断、または標的核酸配列中の１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、置換、重複、もしくは逆位）、方法を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかのＣａｓＸ：ｇＮＡ系、ベクター、またはＶＬＰ（またはそれらの組み合わせ）による標的核酸のエクスビボ修飾法によって修飾された細胞集団であって、修飾された細胞におけるＭＨＣクラスＩ分子もしくはＴ細胞受容体の発現、または抗原プロセシング、抗原提示、抗原認識、および／もしくは抗原応答に関与するタンパク質の発現が減少しているまたは排除されている、細胞集団を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかのＣａｓＸ：ｇＮＡ系、ベクター、またはＶＬＰ（またはそれらの組み合わせ）による標的核酸の修飾のエクスビボ方法によって修飾された細胞集団であって、修飾された細胞が本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかのＣＡＲおよび／またはＴＣＲを検出可能なレベルで発現する、細胞集団を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、対象に抗腫瘍免疫を提供する方法であって、対象に、本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかの修飾された細胞の治療有効量を投与することを含む、方法を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、腫瘍抗原の発現に関連する疾患を有する対象を治療する方法であって、対象に、本明細書に記載の実施形態のうちのいずれか１つの修飾された細胞の治療有効量を投与することを含む、方法を提供する。
別の態様では、腫瘍抗原の発現に関連する疾患を有する対象の治療用の薬剤として使用するための、ＣａｓＸとｇＮＡとの遺伝子編集対、ならびに任意選択的にドナー鋳型および／またはＣＡＲおよび／もしくはＴＣＲをコードするポリヌクレオチドによって修飾された免疫細胞の組成物が本明細書に提供される。前述では、ＣａｓＸは、本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかのＣａｓＸバリアント（例えば、表４の配列）であり得、ｇＮＡは、本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかのｇＮＡバリアント（例えば、表２の配列）であり得る。他の実施形態では、本開示は、腫瘍抗原の発現に関連する疾患を有する対象の治療用の薬剤として使用するための、ＣａｓＸとｇＮＡとの遺伝子編集対、ドナー鋳型、および／またはＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含むまたはコードするベクターによって修飾された細胞の組成物を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系、ベクター、またはＶＬＰを含み、賦形剤および容器をさらに含むキットを提供する。
別の態様では、疾患または障害の治療用の薬剤として使用するための、ＣａｓＸ：ｇＮＡ系を含む組成物、ＣａｓＸ：ｇＮＡ系を含むまたはコードするベクター、ＣａｓＸ：ｇＮＡ系を含むＶＬＰ、またはＣａｓＸ：ｇＮＡ系を使用して編集された細胞集団が本明細書に提供される。
別の態様では、疾患または障害の治療法に使用するための、ＣａｓＸ：ｇＮＡ系、ＣａｓＸ：ｇＮＡ系を含む組成物、またはＣａｓＸ：ｇＮＡ系を含むまたはコードするベクター、ＣａｓＸ：ｇＮＡ系を含むＶＬＰ、ＣａｓＸ：ｇＮＡ系を使用して編集された細胞集団が本明細書に提供される。
参照による組み込み
本明細書で言及される全ての刊行物、特許、および特許出願は、個々の刊行物、特許、または特許出願が各々参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているのと同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。ＣａｓＸバリアントおよびｇＮＡバリアントを開示する２０２０年６月５日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０３６５０５の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明の新規の特徴は、添付の特許請求の範囲に具体的に記載されている。本発明の特徴および利点のより良い理解は、本発明の原理が利用される例示的な実施形態を説明する以下の発明を実施するための形態、およびその添付の図面を参照することによって得られるであろう。
実施例１に記載されるように、コロイド状クーマシー染色によって可視化されたＳｔＸ２精製画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを示す。 実施例１に記載されるように、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １６／６００ｐｇゲル濾過を使用したＳｔＸ２のサイズ排除クロマトグラフィーアッセイからのクロマトグラムを示す。 実施例１に記載されるように、コロイド状クーマシー染色によって可視化されたＳｔＸ２精製画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを示す。 実施例２に記載されるように、ＣａｓＸ構築物を組み立てるために使用したｐＳＴＸ３４プラスミドの構成要素の組織化を示す概略図である。 実施例２に記載されるように、ＣａｓＸ １１９バリアントを生成するステップを示す概略図である。 実施例２に記載されるように、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｓｔａｉｎ－Ｆｒｅｅ（商標）ゲル上で視覚化された精製試料のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを示す。 実施例２に記載されるように、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １６／６００ｐｇゲル濾過のクロマトグラムを示す。 実施例２に記載されるように、コロイド状クーマシーで染色したゲル濾過試料のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを示す。 実施例１０に記載されるように、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における６つの標的遺伝子の編集アッセイの結果を示す。各ドットは、個々のスペーサーを使用した結果を表す。 実施例１０に記載されるように、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における６つの標的遺伝子の編集アッセイの結果を示し、個々のバーは、個々のスペーサーで得た結果を表す。 実施例１０に記載されるように、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における４つの標的遺伝子の編集アッセイの結果を示す。各ドットは、ＣＴＣ ＰＡＭを利用した個々のスペーサーを使用した結果を表す。 実施例１４に記載されるように、ｓｇＲＮＡ１７４およびＣａｓＸバリアントによって形成されたＲＮＰの活性分率の定量のためのアッセイの結果のグラフである。等モル量のＲＮＰおよび標的を共インキュベートし、切断した標的の量を指定した時点で決定した。１時点あたりの３つの独立した複製物の平均および標準偏差を示す。組み合わせた複製物の二相適合を示す。「２」は、配列番号２の参照ＣａｓＸタンパク質を指す。 実施例１４に記載されるように、ＣａｓＸ２および修飾ｓｇＲＮＡによって形成されたＲＮＰの活性分率の定量を示す。等モル量のＲＮＰおよび標的を共インキュベートし、切断した標的の量を指定した時点で決定した。１時点あたりの３つの独立した複製物の平均および標準偏差を示す。組み合わせた複製物の二相適合を示す。 実施例１４に記載されるように、ガイド制限条件下でＣａｓＸ ４９１および修飾ｓｇＲＮＡによって形成されたＲＮＰの活性分率の定量を示す。等モル量のＲＮＰおよび標的を共インキュベートし、切断した標的の量を指定した時点で決定した。データの二相適合を示す。 実施例１４に記載されるように、ｓｇＲＮＡ１７４およびＣａｓＸバリアントによって形成されたＲＮＰの切断速度の定量を示す。標的ＤＮＡを指定したＲＮＰの２０倍の過剰量とインキュベートし、切断した標的の量を指定した時点で決定した。単一の複製物を示す４８８および４９１を除いて、１時点あたり３つの独立した複製物の平均および標準偏差を示す。組み合わせた複製物の単相適合を示す。 実施例１４に記載されるように、ＣａｓＸ２およびｓｇＲＮＡバリアントによって形成されたＲＮＰの切断速度の定量を示す。標的ＤＮＡを指定したＲＮＰの２０倍の過剰量とインキュベートし、切断した標的の量を指定した時点で決定した。１時点あたりの３つの独立した複製物の平均および標準偏差を示す。組み合わせた複製物の単相適合を示す。 実施例１４に記載されるように、ＣａｓＸ２およびｓｇＲＮＡバリアントによって形成されたＲＮＰの初期速度の定量を示す。先の切断実験の最初の２つの時点を線形モデルに適合させて、初期切断速度を決定した。 実施例１４に記載されるように、ＣａｓＸ４９１およびｓｇＲＮＡバリアントによって形成されたＲＮＰの切断速度の定量を示す。標的ＤＮＡを指定したＲＮＰの２０倍の過剰量と１０℃でインキュベートし、切断した標的の量を指定した時点で決定した。それらの時点の単相適合を示す。 実施例１７に記載されるように、参照ＣａｓＸタンパク質もしくは単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、またはそれらのバリアントの有効性をアッセイするための例示的な方法を説明する図および例示的な蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）プロットである。ｇＲＮＡスペーサーに相補的なｇＲＮＡ標的配列に結合したレポーター（例えば、ＧＦＰレポーター）をレポーター細胞株に組み込む。細胞をＣａｓＸタンパク質および／またはｓｇＲＮＡバリアントで形質転換またはトランスフェクトし、ｓｇＲＮＡのスペーサーモチーフはレポーターのｇＲＮＡ標的配列に相補的であり、かつそれを標的とする。標的配列を切断するＣａｓＸ：ｓｇＲＮＡリボ核タンパク質複合体の能力をＦＡＣＳによってアッセイする。レポーター発現を失った細胞は、ＣａｓＸ：ｓｇＲＮＡリボ核タンパク質複合体媒介性切断およびインデル形成の発生を示す。 実施例１９に記載されるように、ＥＧＦＰ破壊アッセイにおける遺伝子編集の結果を示す。編集を、ＧＦＰレポーターを有するＨＥＫ２９３細胞におけるインデル形成およびＧＦＰ破壊によって測定した。図２は、１０個の標的にわたって配列番号４の参照と比較した配列番号５のＣａｓＸ ｓｇＲＮＡバリアントの編集効率の改善を示す。１０個の標的全体で平均して、配列番号５のｓｇＲＮＡの編集効率は配列番号４と比較して１７６％改善した。 実施例２０に記載されるように、ＥＧＦＰ破壊アッセイにおける遺伝子編集の結果を示し、ここで、伸長したステムループ配列（Ｘ軸に示されている）を追加の配列と交換して足場を生成することにより、配列番号５のｓｇＲＮＡ足場でさらなる編集の改善が得られ、それらの足場の配列を表２に示す。 実施例２０に記載されるように、ＣａｓＸ参照ｓｇＲＮＡとして配列番号５に対して正規化したＤＭＥ変異によって生成されたｓｇＲＮＡバリアントの改善倍率を示すグラフである。 改善された切断を示す足場ステム変異、改善された切断を示すＤＭＥ変異を組み合わせる（積み重ねる）ことと、改善された切断を示すリボザイム付属物（付属物およびそれらの配列を実施例２０の表１５に列記する）を使用することとの両方によって作製されたバリアントの配列番号５の参照ＣａｓＸ ｓｇＲＮＡに対して正規化した改善倍率を示すグラフである。結果として得られたｓｇＲＮＡバリアントは、このアッセイで配列番号５と比較して２倍以上の切断の改善をもたらす。ＥＧＦＰ編集アッセイを、実施例１９に記載のＥ６（ＴＧＴＧＧＴＣＧＧＧＧＴＡＧＣＧＧＣＴＧ（配列番号１７））およびＥ７（ＴＣＡＡＧＴＣＣＧＣＣＡＴＧＣＣＣＧＡＡ（配列番号１８））のスペーサー標的配列を用いて行った。 実施例２１に記載されるように、ＪｕｒｋａｔおよびＨＥＫ ２９３ＴにおけるＨＬＡ１の発現レベルを示すグラフである。細胞を、ＨＬＡ１を標的とする蛍光抗体を使用したフローサイトメトリーによって分析した。 実施例２１に記載されるように、Ｓｔｘ ２．２で処理したＨＥＫ ２９３ＴゲノムＤＮＡのＴ７Ｅ１を示すアガロースゲルである。編集は、標的スペーサー（ｐ６．２．２．７．３７）を用いた場合にＢ２Ｍ遺伝子座で発生しているが、非標的スペーサー（ｐ６．２．２．０．１）では発生していない。 実施例２１に記載されるように、Ｓｔｘ ２．２と比較した、Ｓｔｘ分子１１９．６４（数字は、それぞれ、ＣａｓＸおよびガイドを指す）を使用したＨＥＫ ２９３Ｔ細胞におけるＢ２Ｍの編集（ノックアウト）の相対的な改善を示すグラフである。 実施例２１に記載されるように、同等の編集レベルを示す５つの高性能ＳａＣａｓ９スペーサーと比較した、Ｓｔｘ １１９．６４を使用したＨＥＫ ２９３Ｔ細胞におけるＢ２Ｍの編集（ノックアウト）の比較を示すグラフである。 実施例２１に記載されるように、ＳａＣａｓ９と同等の結果を有するＳｔｘ ２．２と比較した、Ｓｔｘ分子１１９．６４．７（数字は、それぞれ、ＣａｓＸ、ガイド、およびスペーサーを指す）を使用したＨＥＫ ２９３Ｔ細胞におけるＢ２Ｍの編集（ノックアウト）の相対的な改善を示すグラフである。 実施例２１に記載されるように、Ｓｔｘ １１９．６４で最大８０％修飾したＨＥＫ ２９３Ｔ Ｂ２Ｍ遺伝子座の編集パーセンテージのＮＧＳ分析を示すグラフである。 実施例２４に記載されるように、Ｂ２Ｍ遺伝子座でのＲＮＰ媒介編集の結果を示す。Ｊｕｒｋａｔ細胞に指定した用量を電気穿孔し、ＣａｓＸバリアントにスペーサー７．９または７．３７のいずれかを有するガイドを電気穿孔した。ＨＬＡノックダウンを抗体染色およびフローサイトメトリーで測定した。 実施例２４に記載されるように、ＣａｓＸ ＲＮＰにスペーサー７．９（上）および７．３７（下）を電気穿孔した後の細胞生存率アッセイの結果を示す。生細胞を、ＨＬＡノックダウン分析時にＤＡＰＩ染色およびフローサイトメトリーで計数した。 実施例２４に記載されるように、Ｂ２Ｍ遺伝子座でのＲＮＰ媒介編集のＮＧＳ分析の結果を示す。Ｊｕｒｋａｔ細胞に指定した用量のＲＮＰを電気穿孔し、ＮＧＳによりインデル形成について分析した。 実施例２５に記載されるように、インデル形成を示すＴＣＲ α／βの表面発現の喪失、ＨＤＲを示すＧＦＰの発現、および生細胞の数について分析したＴＲＡＣ遺伝子座での編集によるインデル率およびＨＤＲ率の結果を示す。「Ｔ」および「Ｂ」は、ｓｓＤＮＡがＴＲＡＣ遺伝子の方向に対して上鎖であるか下鎖であるかを示す。 実施例２６に記載されるように、Ｂ２ＭとＴＲＡＣ遺伝子座との共編集の結果を示す。Ｊｕｒｋａｔ細胞に指定した用量のＲＮＰを電気穿孔し、Ｂ２ＭおよびＴＲＡＣの編集をＨＬＡ－１およびＴＣＲ α／βの染色によって特定し、フローサイトメトリーによって検出した。 Ｂ２Ｍ遺伝子（配列番号７２５～２１００および２２８１～７０８５）を標的とするｇＮＡ標的配列（スペーサー）の表である表３Ａを示す。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 ＴＲＡＣ遺伝子（配列番号７０８６～２７４５４）を標的とするｇＮＡ標的配列（スペーサー）の表である表３Ｂを示す。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 ＣＩＩＴＡ遺伝子（配列番号２７４５５～５５５７２）を標的とするｇＮＡ標的配列（スペーサー）の表である表３Ｃを示す。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。
例示的な実施形態が本明細書に示され、説明されているが、かかる実施形態がほんの一例として提供されることは当業者には明らかであろう。本発明から逸脱することなく、当業者であれば、多数の変形、変更、および置き換えを想到するであろう。本明細書に記載の実施形態の様々な代替案が本開示を実践する際に使用され得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を定義し、かつ特許請求の範囲内の方法および構造ならびにそれらの同等物が特許請求の範囲に包含されるよう意図されている。
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味と同一の意味を有する。本明細書に記載される方法および材料と類似または同等の方法および材料が本開示の実践または試験に使用され得るが、好適な方法および材料が以下に記載される。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先される。加えて、材料、方法、および実施例は、例証にすぎず、限定するようには意図されていない。本発明から逸脱することなく、当業者であれば、多数の変形、変更、および置き換えを想到するであろう。
定義
本明細書で互換的に使用される「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかの任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。したがって、「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、多本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、多本鎖ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、ならびにプリンおよびピリミジン塩基を含むか、または他の天然、化学的もしくは生化学的に修飾された、非天然、または誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーを包含する。
「ハイブリダイズ可能な」または「相補的な」は、互換的に使用され、核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ）が、非共有結合的に結合する、すなわち、ワトソン－クリック塩基対および／またはＧ／Ｕ塩基対を形成し、温度および溶液イオン強度の適切なインビトロおよび／またはインビボ条件下で、配列特異的な逆平行の様式で別の核酸に「アニール」または「ハイブリダイズする」（すなわち、核酸が相補的核酸に特異的に結合する）ことを可能にするヌクレオチドの配列を含むことを意味する。特異的にハイブリダイズ可能であるためにポリヌクレオチドの配列がその標的核酸配列に対して１００％相補的である必要はないことが理解され、ポリヌクレオチドの配列は、標的核酸配列と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％の配列同一性を有し、依然として標的核酸配列にハイブリダイズすることができる。さらに、ポリヌクレオチドは、介在するまたは隣接するセグメントがハイブリダイゼーション事象に関与しないように、１つ以上のセグメントにわたってハイブリダイズすることができる（例えば、ループ構造またはヘアピン構造、「バルジ」など）。
本開示の目的のために、「遺伝子」は、遺伝子産物（例えば、タンパク質、ＲＮＡ）をコードするＤＮＡ領域、ならびにかかる調節配列がコード配列および／または転写配列に隣接しているか否かにかかわらず、遺伝子産物の産生を調節する全てのＤＮＡ領域を含む。したがって、遺伝子は、プロモーター配列、ターミネーター、リボソーム結合部位および内部リボソーム進入部位などの翻訳調節配列、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界要素、複製起点、マトリックス結合部位、および遺伝子座制御領域を含むが、必ずしもこれらに限定されない調節要素配列を含み得る。コード配列は、転写時または転写および翻訳時に遺伝子産物をコードし、本開示のコード配列は断片を含み得、完全長オープンリーディングフレームを含む必要はない。遺伝子は、転写される鎖、例えば、コード配列を含む鎖と、相補鎖との両方を含むことができる。
「下流」という用語は、参照ヌクレオチド配列に対して３’側に位置するヌクレオチド配列を指す。ある特定の実施形態では、下流ヌクレオチド配列は、転写開始点に続く配列に関連している。例えば、遺伝子の翻訳開始コドンは、転写開始部位の下流に位置する。
「上流」という用語は、参照ヌクレオチド配列の５’側に位置するヌクレオチド配列を指す。ある特定の実施形態では、上流ヌクレオチド配列は、コード領域または転写開始点の５’側に位置する配列に関連している。例えば、ほとんどのプロモーターは転写開始部位の上流に位置する。
「調節要素」という用語は、本明細書で「調節配列」という用語と互換的に使用され、プロモーター、エンハンサー、および他の発現調節要素（例えば、ポリアデニル化シグナルなどの転写終結シグナルおよびポリＵ配列）を含むよう意図されている。例示的な調節要素には、単一の転写物、メタロチオネイン、転写エンハンサー要素、転写終結シグナル、ポリアデニル化配列、翻訳開始の最適化のための配列、および翻訳終結配列からの複数の遺伝子の翻訳を可能にする、ＣＭＶ、ＣＭＶ＋イントロンＡ、ＳＶ４０、ＲＳＶ、ＨＩＶ－Ｌｔｒ、伸長因子１アルファ（ＥＦ１α）、ＭＭＬＶ－ｌｔｒ、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、またはＰ２Ａペプチドなどであるが、これらに限定されない転写プロモーターが含まれる。適切な調節要素の選択が、発現されるコードされた構成要素（例えば、タンパク質またはＲＮＡ）に依存するか、または核酸が異なるポリメラーゼを必要とするか、または融合タンパク質として発現されるようには意図されていない複数の構成要素を含むかに依存することが理解されよう。
「プロモーター」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位、転写開始部位、ＴＡＴＡボックス、および／またはＢ認識要素を含み、かつ会合した転写可能なポリヌクレオチド配列および／または遺伝子（または導入遺伝子）の転写および発現を支援または促進するＤＮＡ配列を指す。プロモーターは、合成的に産生することができるか、または既知のもしくは天然に存在するプロモーター配列または別のプロモーター配列から誘導することができる。プロモーターは、転写される遺伝子の近位または遠位にあり得る。プロモーターは、ある特定の特性を付与するために２つ以上の異種配列の組み合わせを含むキメラプロモーターも含むことができる。本開示のプロモーターは、既知のまたは本明細書に提供される他のプロモーター配列と組成が類似しているが、同一ではないプロモーター配列のバリアントを含むことができる。プロモーターは、構成的、発達的、組織特異的、誘導的などのプロモーターに作動可能に連結された会合したコードまたは転写可能な配列または遺伝子の発現パターンに関する基準に従って分類することができる。
「エンハンサー」という用語は、転写因子と呼ばれる特定のタンパク質が結合すると、会合した遺伝子の発現を調節する調節ＤＮＡ配列を指す。エンハンサーは、遺伝子のイントロン、または遺伝子のコード配列の５’側もしくは３’側に位置し得る。エンハンサーは、遺伝子の近位（すなわち、プロモーターの数十または数百塩基対（ｂｐ）以内）にあり得るか、または遺伝子の遠位に（すなわち、プロモーターから何千ｂｐ、何十万ｂｐ、またはさらには何百万ｂｐも離れて）位置し得る。単一の遺伝子は、２つ以上のエンハンサーによって調節され得るが、それらは全て本開示の範囲内であると想定される。
本明細書で使用される「組換え」とは、特定の核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）が、自然系で見つけられる内因性核酸と区別可能な構造的コードまたは非コード配列を有する構築物をもたらすクローニング、制限、および／またはライゲーションステップの様々な組み合わせの産物であることを意味する。一般に、構造的コード配列をコードするＤＮＡ配列は、ｃＤＮＡ断片および短いオリゴヌクレオチドリンカーから、または一連の合成オリゴヌクレオチドから組み立てられて、細胞に含まれるか、または無細胞転写および翻訳系に含まれる組換え転写単位から発現することができる合成核酸を提供することができる。かかる配列は、真核生物遺伝子に典型的に存在する内部非翻訳配列またはイントロンによって中断されないオープンリーディングフレームの形態で提供することができる。関連する配列を含むゲノムＤＮＡは、組換え遺伝子または転写単位の形成にも使用することができる。非翻訳ＤＮＡの配列は、オープンリーディングフレームの５’側または３’側に存在する場合があり、かかる配列は、コード領域の操作または発現を妨害せず、実際には、様々な機構によって所望の産物の産生を調節する役割を果たし得る（上記の「エンハンサー」および「プロモーター」を参照されたい）。
「組換えポリヌクレオチド」または「組換え核酸」という用語は、天然に存在しないもの、例えば、人間の介入によって２つの別様に分離された配列セグメントの人工的な組み合わせによって作製されるものを指す。この人工的な組み合わせは、多くの場合、化学合成手段、または核酸の単離されたセグメントの人工的な操作、例えば、遺伝子操作技術のいずれかによって達成される。かかる人工的な組み合わせは、通常、典型的には配列認識部位を導入または除去しながら、コドンを同じまたは保存的アミノ酸をコードする冗長コドンで置き換えるために行われる。あるいは、この人工的な組み合わせは、所望の機能を有する核酸セグメントを一緒に結合して、所望の機能の組み合わせを生成するために行われる。この人工的な組み合わせは、多くの場合、化学合成手段、または核酸の単離されたセグメントの人工的な操作、例えば、遺伝子操作技術のいずれかによって達成される。
同様に、「組換えポリペプチド」または「組換えタンパク質」という用語は、天然に存在しない、例えば、人間の介入によって２つの別様に分離されたアミノ配列セグメントの人工的な組み合わせによって作製される、ポリペプチドまたはタンパク質を指す。したがって、例えば、異種アミノ酸配列を含むポリペプチドは、組換え型である。
本明細書で使用される場合、「接触させること」という用語は、２つ以上の実体間の物理的結合を確立することを意味する。例えば、標的核酸配列をガイド核酸と接触させることは、標的核酸配列およびガイド核酸が物理的結合を共有するように作製される、例えば、それらの配列が配列類似性を共有する場合、ハイブリダイズすることができることを意味する。
「解離定数」または「Ｋｄ」は互換的に使用され、リガンド「Ｌ」とタンパク質「Ｐ」との間の親和性、すなわち、リガンドが特定のタンパク質にどれくらい密接に結合するかを意味する。これは、式Ｋｄ＝［Ｌ］［Ｐ］／［ＬＰ］を使用して計算することができ、式中、［Ｐ］、［Ｌ］、および［ＬＰ］は、それぞれ、タンパク質、リガンド、および複合体のモル濃度を表す。
「ノックアウト」という用語は、遺伝子の除去または遺伝子の発現を指す。例えば、遺伝子は、リーディングフレームの破壊につながるヌクレオチド配列の欠失または付加のいずれかによってノックアウトされる可能性がある。別の例として、遺伝子は、遺伝子の一部を無関係の配列で置き換えることによってノックアウトされ得る。本明細書で使用される「ノックダウン」という用語は、遺伝子またはその遺伝子産物の発現の低下を指す。遺伝子ノックダウンの結果として、タンパク質の活性または機能が減弱され得るか、タンパク質レベルが減少するまたは排除され得る。
本明細書で使用される場合、「相同性指向修復」（ＨＤＲ）とは、細胞における二本鎖切断の修復中に起こるＤＮＡ修復の形態を指す。このプロセスは、ヌクレオチド配列の相同性を必要とし、ドナー鋳型を使用して標的ＤＮＡを修復またはノックアウトし、ドナーから標的への遺伝情報の移動をもたらす。ドナー鋳型が標的ＤＮＡ配列とは異なり、ドナー鋳型の配列の一部または全てが標的ＤＮＡに組み込まれる場合、相同性指向修復は、挿入、欠失、または変異によって標的配列の配列の改変をもたらし得る。
本明細書で使用される場合、「非相同末端結合」（ＮＨＥＪ）とは、相同鋳型を必要としない（修復を誘導するために相同配列を必要とする相同性指向修復とは対照的に）、互いに対する切断末端の直接ライゲーションによるＤＮＡの二本鎖切断の修復を指す。ＮＨＥＪは、多くの場合、二本鎖切断部位の近くにヌクレオチド配列の喪失（欠失）をもたらす。
本明細書で使用される場合、「マイクロホモロジー媒介末端結合」（ＭＭＥＪ）とは、変異原性ＤＳＢ修復機構を指し、これは、相同鋳型を必要とすることなく（修復を誘導するために相同配列を必要とする相同性指向修復とは対照的に）、切断部位に隣接する欠失と常に会合している。ＭＭＥＪは、多くの場合、二本鎖切断部位の近くにヌクレオチド配列の喪失（欠失）をもたらす。
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、別のポリヌクレオチドまたはポリペプチドとある特定の「配列類似性」または「配列同一性」パーセントを有し、これは、整列させたときに塩基またはアミノ酸パーセンテージが同じであり、２つの配列を比較したときに同じ相対位置にあることを意味する。配列類似性（類似性パーセント、同一性パーセント、または相同性と称されることもある）は、いくつかの異なる様式で決定することができる。配列類似性を決定するために、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴのワールドワイドウェブ上で利用可能なＢＬＡＳＴを含む、当該技術分野で既知の方法およびコンピュータープログラムを使用して配列を整列させることができる。核酸内の核酸配列の特定のストレッチ間の相補性パーセントは、任意の簡便な方法を使用して決定することができる。方法の例には、ＢＬＡＳＴプログラム（基本的な局所アライメント検索ツール）およびＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９０，２１５，４０３－４１０、Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｍａｄｄｅｎ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，１９９７，７，６４９－６５６）、またはＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（Ａｄｖ． Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，１９８１，２，４８２－４８９）を使用するＧａｐプログラムの使用（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗｉｓ．）、例えば、デフォルト設定の使用が含まれる。
「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書で互換的に使用され、コードされたおよびコードされていないアミノ酸、化学的または生化学的に修飾または誘導体化されたアミノ酸、および修飾されたペプチド骨格を有するポリペプチドを含むことができる任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指す。この用語は、異種アミノ酸配列を有する融合タンパク質を含むが、これに限定されない融合タンパク質を含む。
「ベクター」または「発現ベクター」とは、プラスミド、ファージ、ウイルス、またはコスミドなどのレプリコンであり、これに別のＤＮＡセグメント、すなわち、「挿入物」が結合して、細胞内に結合したセグメントの複製または発現をもたらすことができる。
核酸、ポリペプチド、細胞、または生物に適用される、本明細書で使用される「天然に存在する」または「修飾されていない」または「野生型」という用語は、自然界で見つけられる核酸、ポリペプチド、細胞、または生物を指す。
本明細書で使用される場合、「変異」とは、参照アミノ酸配列または参照ヌクレオチド配列と比較した、１つ以上のアミノ酸またはヌクレオチドの挿入、欠失、置換、重複、または逆位を指す。
本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、または細胞が天然に存在する環境とは異なる環境に存在するポリヌクレオチド、ポリペプチド、または細胞を説明するよう意図されている。単離された遺伝子修飾された宿主細胞は、遺伝子修飾された宿主細胞の混合集団に存在し得る。
本明細書で使用される「宿主細胞」とは、真核細胞、原核細胞、または多細胞生物（例えば、細胞株）由来の細胞を意味し、これらの真核細胞または原核細胞は、核酸のレシピエント（例えば、発現ベクター）として使用され、核酸によって遺伝子修飾された元の細胞の子孫を含む。単細胞の子孫が、自然、偶発的、または意図的変異のため、形態またはゲノムもしくは全ＤＮＡ相補体が元の親と必ずしも完全に同一ではなくてもよいことが理解される。「組換え宿主細胞」（「遺伝子修飾された宿主細胞」とも称される）とは、異種核酸、例えば、発現ベクターが導入された宿主細胞である。
「保存的アミノ酸置換」という用語は、類似の側鎖を有するアミノ酸残基のタンパク質における互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンからなり、脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリンおよびスレオニンからなり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギンおよびグルタミンからなり、芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンからなり、塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リジン、アルギニン、およびヒスチジンからなり、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群は、システインおよびメチオニンからなる。例示的な保存的アミノ酸置換基は、バリン－ロイシン－イソロイシン、フェニルアラニン－チロシン、リジン－アルギニン、アラニン－バリン、およびアスパラギン－グルタミンである。
「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」という用語は、細胞で発現されると、細胞に、標的抗原、または標的抗原を有する標的細胞、典型的には特異的疾患関連抗原を有する疾患細胞に対する特異性を提供する少なくとも２つのドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、少なくとも細胞外抗原結合ドメイン（例えば、疾患（例えば、がん）に関与するタンパク質に対する結合特異性を有するｓｃＦｖ、膜貫通ドメイン、および以下に提供されるように１つ以上の刺激分子および／または共刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞質シグナル伝達ドメイン（本明細書では「細胞内シグナル伝達ドメイン」とも称される）を含む。いくつかの態様では、ポリペプチドのセットは互いに隣接している。その抗原結合ドメインを含む本開示のＣＡＲの一部分は、例えば、単一ドメイン抗体断片（ｓｄＡｂ）、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ヒト化抗体または二重特異性抗体を含む、抗原結合ドメインが隣接するポリペプチド鎖の一部として発現される様々な形態で存在する場合があり（Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ、Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．、Ｈｏｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６）、ヒンジ領域、例えば、免疫グロブリン分子のヒンジ領域、および受容体に可動性を提供するスペーサーをさらに含み得る。ヒンジ、スペーサー、および膜貫通ドメインは、ｓｃＦｖを活性化ドメインに結合し、ＣＡＲをＴ細胞膜に固定する。いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＲ組成物は、抗原結合ドメインを含む。さらなる実施形態では、ＣＡＲは、ｓｃＦｖを含む抗体断片を含む。所与のＣＤＲの正確なアミノ酸配列境界は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１），“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（「Ｋａｂａｔ」番号付けスキーム）によって説明されるスキーム、Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）ＪＭＢ ２７３，９２７－９４８（「Ｃｈｏｔｈｉａ」番号付けスキーム）によって説明されるスキーム、またはそれらの組み合わせを含む、いくつかの周知のスキームのうちのいずれかを使用して決定することができる。
「Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）」という用語は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子に結合したペプチド抗原の認識に関与するＴ細胞の表面に見られるタンパク質複合体を指す。ＴＣＲは、ＴＣＲアルファ鎖およびＴＣＲベータ鎖（それぞれ、ＴＲＡＣまたはＴＣＲＡ、およびＴＢＲＣ１またはＴＣＲＢによってコードされる）を含む複数のサブユニットから成り、これらの鎖内には、ＴＣＲが結合する抗原を決定する相補性決定領域（ＣＤＲ）がある。追加のサブユニットには、ＣＤ－イプシロン（ＣＤ３Ｅ）、ＣＤ３－デルタ（ＣＤ３Ｄ）、ＣＤ３－ガンマ（ＣＤ３Ｇ）、およびＣＤ３－ゼータ（ＣＤ３Ｚ）が含まれる。ＴＣＲアルファサブユニットおよびＴＣＲベータサブユニットの細胞外ドメインは、天然ＴＣＲの抗原結合部位を形成する。ＴＣＲの細胞外ドメインのＣＤＲは抗原結合セクションであり、多様な認識能力により、外来抗原または罹患細胞から効率的に保護され、最適な免疫応答がもたらされるようになる。ＴＣＲが抗原に適切に結合すると、会合したＣＤ３鎖の立体配座変化が誘発され、他の因子とともに、シグナル伝達プロセスおよびＴ細胞活性化を開始する。
本明細書で使用される場合、「操作されたＴＣＲ」とは、標的抗原、または標的抗原を有する標的細胞、典型的には特異的疾患関連抗原を有する疾患細胞に対する特異性を有する抗原結合ドメインを含むように操作されたＴＣＲを指す。例えば、操作されたＴＣＲは、ＴＣＲのＴＣＲアルファサブユニットもしくはＴＣＲベータサブユニットのいずれか、またはそれらの組み合わせに融合した抗原結合ドメインを含み得る。例えば、単一ドメイン抗体断片（ｓｄＡｂ）、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ヒト化抗体、または二重特異性抗体を含む任意の抗原結合ドメインが、本明細書に記載の操作されたＴＣＲとともに使用され得る。抗原結合ドメインに融合した１つ以上のサブユニットに加えて、操作されたＴＣＲは、細胞のゲノムによってコードされる野生型サブユニットも含み得る。例えば、操作されたＴＣＲは、ＴＣＲのＴＣＲサブユニットアルファまたはＴＣＲベータサブユニットのいずれか、ならびに野生型ＣＤ３－デルタ、ＣＤ３－ガンマ、ＣＤ３－イプシロン、およびＣＤ３－ゼータサブユニットに融合した抗原結合ドメインを含み得る。
「シグナル伝達ドメイン」とは、第２のメッセンジャーを生成することにより、またはかかるメッセンジャーに応答することによってエフェクターとして機能することにより、定義されたシグナル伝達経路を介して細胞活性を調節するように細胞内で情報を伝達することによって作用するタンパク質の機能的部分を指す。
「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、分子の細胞内部分を指し、本明細書で使用される場合、ＣＡＲの構成要素である。Ｔ細胞由来のシグナル伝達ドメインの例は、ＣＤ２４７分子（ＣＤ３－ゼータ、またはＣＤ３Ｚ）、ＣＤ２７分子（ＣＤ２７）、ＣＤ２８分子（ＣＤ２８）、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー９（４－１ＢＢ、または４１ＢＢ）、誘導性Ｔ細胞共刺激因子（ＩＣＯＳ）、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー４（ＯＸ４０）、またはそれらの組み合わせからなる群から選択されるポリペプチドに由来するものである。細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲ含有細胞、例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞の免疫エフェクター機能を促進するシグナルを生成する。例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞における免疫エフェクター機能の例には、サイトカインの分泌を含む、細胞溶解活性およびヘルパー活性が含まれる。細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして知られているシグナル伝達モチーフを含むことができる。ＩＴＡＭを含む初代細胞質シグナル伝達配列の例には、ＣＤ３ゼータ、ＩｇＥ受容体ＩｇのＦｃ断片（一般的なＦｃＲガンマ、またはＦＣＥＲ１Ｇ）、ＩｇＧ受容体ＩＩａのＦｃ断片（ＦｃガンマＲＩＩａ、またはＦＣＧＲ２Ａ）、Ｆｃ受容体ガンマＲＩＩＢ、ＣＤ３ｇ分子（ＣＤ３ガンマ、またはＣＤ３Ｇ）、ＣＤ３ｄ分子（ＣＤ３デルタ、またはＣＤ３Ｄ）、ＣＤ３ｅ分子（ＣＤ３イプシロン、またはＣＤ３Ｅ）、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＤＡＰ１０、およびＤＡＰ１２由来のものが挙げられるが、これらに限定されない。
「ゼータ」、または代替的に「ゼータ鎖」、「ＣＤ３－ゼータ」、もしくは「ＴＣＲ－ゼータ」という用語は、ＧｅｎＢａｎ受入番号ＢＡＧ３６６６４．１として提供されるタンパク質、または非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、もしくは非ヒト霊長類由来の同等の残基として定義され、「ゼータ刺激ドメイン」、または代替的に「ＣＤ３－ゼータ刺激ドメイン」もしくは「ＴＣＲ－ゼータ刺激ドメイン」は、Ｔ細胞活性化に必要な初期シグナルを機能的に伝達するのに十分なゼータ鎖の細胞質ドメイン由来のアミノ酸残基、またはその機能的誘導体として定義される。いくつかの実施形態では、ゼータの細胞質ドメインは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＢＡＧ３６６６４．１の残基５２～１６４、またはその機能的オルソログである非ヒト種由来の同等の残基を含む。
本明細書で使用される「抗原プロセシング、抗原提示、抗原認識、および／または抗原応答に関与するタンパク質」とは、抗原プロセシング、提示、認識、および／または応答に関与する細胞外、膜貫通、および細胞内タンパク質または糖タンパク質を指す。いくつかの事例では、タンパク質または糖タンパク質は細胞の表面で発現し、好都合に特定の細胞型のマーカーとしての役割を果たすことができる。例えば、Ｔ細胞およびＢ細胞表面タンパク質は、分化過程でそれらの系統および段階を特定する。いくつかの事例では、抗原プロセシング、抗原提示、抗原認識、および／または抗原応答に関与するタンパク質は、リガンドに対する結合親和性を有する受容体である。
「腫瘍抗原」は、がん細胞の表面に全体的にまたは断片（例えば、ＭＨＣペプチド）としてのいずれかで発現され、免疫細胞のがん細胞への優先的な標的に有用である。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、正常細胞およびがん細胞の両方によって発現されるマーカー、例えば、Ｂ細胞上のＣＤ１９である。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、正常細胞と比較してがん細胞で過剰発現される細胞表面分子である。
本明細書で使用される「抗体」という用語は、所望の抗原結合活性または免疫学的活性を呈する限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ナノボディ、ＶＨＨ抗体などの単一ドメイン抗体、および抗体断片を含むが、これらに限定されない様々な抗体構造を包含する。抗体は、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、およびＩｇＥなどのいくつかのタイプの分子を含む分子の大きいファミリーを表す。
「ヒト化」抗体とは、非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）由来のアミノ酸残基およびヒトフレームワーク領域（ＦＲ）由来のアミノ酸残基を含む抗体を指す。典型的には、ヒト化抗体は、可変ドメインの実質的に全てを含み、ＣＤＲの全てまたは実質的に全てが非ヒト抗体（アミノ酸置換を含み得る）の可変ドメインに対応し、ＦＲの全てまたは実質的に全てがヒト抗体の可変ドメインに対応する。
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体を指し、この集団は同一である、および／または同じエピトープに結合する。したがって、「モノクローナル」という修飾語は、抗体が実質的に均一な抗体の集団から得られたという特徴を示し、いずれかの特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるべきではない。
本明細書で使用される「抗原結合ドメイン」とは、抗原に特異的に結合する（「それと免疫反応する」）抗原結合部位を含む分子の免疫学的に活性な部分を指す。抗原結合ドメインは、ポリペプチドまたは他の物質を含む他の参照抗原に結合するよりも高い親和性または結合力で結合する場合、抗原に「特異的に結合する」または「特異的」である。抗原結合ドメインを含むタンパク質の例には、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆａｂ′－ＳＨ、Ｆ（ａｂ′）２、ダイアボディ、直鎖状抗体（ＵＳ５，６４１，８７０を参照されたい）、単一ドメイン抗体、単一ドメインラクダ科抗体、一本鎖断片可変（ｓｃＦｖ）抗体分子、またはエピトープに適合し、かつそれを認識してそれに結合する特定の形状を有する任意のポリペプチド鎖含有分子構造が挙げられるが、これらに限定されない。
「ｓｃＦｖ」または「一本鎖断片可変」は、本明細書で互換的に使用され、ｓｃＦｖが抗原結合に望ましい構造を形成することを可能にする短い可動性ペプチドリンカーによって一緒に結合される、抗体の重鎖可変領域（「ＶＨ」）および軽鎖可変領域（「ＶＬ」）、またはＶＨ鎖またはＶＬ鎖の２つのコピーを含む抗体断片フォーマットを指す。ｓｃＦｖは、免疫グロブリンの重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）の融合タンパク質であり、各々、ＶＨ－ＶＬまたはＶＬ－ＶＨのいずれかの順序であり得、かつ通常はリンカーによって結合される相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
「４－１ＢＢ」という用語は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＡ６２４７８．２として提供されるアミノ酸配列、または非ヒト種由来の同等の残基を有するＴＮＦ－Ｒスーパーファミリーのメンバーを指し、「４－１ＢＢ共刺激ドメイン」は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＡ６２４７８．２のアミノ酸残基２１４～２５５、または非ヒト種由来の同等の残基として定義される。
「免疫エフェクター細胞」とは、免疫応答、例えば、免疫エフェクター応答の促進に関与する細胞を指す。免疫エフェクター細胞の例には、ヘルパーＴ細胞および細胞傷害性Ｔ細胞などのＴ細胞、ガンマ－デルタＴ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、または樹状細胞が挙げられる。
「免疫エフェクター機能」または「免疫エフェクター応答」とは、標的細胞の免疫攻撃を増強または促進する、例えば、免疫エフェクター細胞の機能または応答を指す。本開示との関連で、免疫エフェクター機能または応答とは、標的細胞の死滅または成長もしくは増殖の阻害を促進するＴ細胞またはＮＫ細胞の特性を指す。
本明細書で使用される場合、「治療」または「治療すること」は、本明細書で互換的に使用され、治療的利益および／または予防的利益を含むが、これらに限定されない、有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチを指す。治療的利益とは、治療されている基礎障害または疾患の根絶または改善を意味する。治療的利益は、症状のうちの１つ以上の根絶もしくは改善、または対象が依然として基礎障害を患っている可能性があるにもかかわらず対象において改善が観察されるようになる基礎疾患に関連する１つ以上の臨床パラメーターの改善によって達成することもできる。
本明細書で使用される「治療有効量」および「治療有効用量」という用語は、ヒトまたは実験動物などの対象に単回投与または反復投与で投与された場合、病状または状態のいずれかの症状、態様、測定されたパラメーター、または特性にいくらかの検出可能かつ有益な効果をもたらすことができる、薬物または生物学的製剤の、単独でのまたは組成物の一部としての量を指す。かかる効果は、絶対に有益である必要はない。
本明細書で使用される場合、「投与すること」とは、対象にある投薬量の化合物（例えば、本開示の組成物）または組成物（例えば、薬学的組成物）を与える方法を意味する。
「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物には、家畜、非ヒト霊長類、ヒト、ウサギ、マウス、ラット、および他の齧歯類が含まれるが、これらに限定されない。
Ｉ．一般的な方法
本発明の実践は、別途示されない限り、免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノミクス、および組換えＤＮＡの従来の技法を使用し、これらは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ＨａＲＢｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ ２００１）、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ Ｅｄ．（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ １９９９）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｂｏｌｌａｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ １９９６）、Ｎｏｎｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９９）、Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ（Ｋａｐｌｉｆｔ＆Ｌｏｅｗｙ ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９５）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｎｕａｌ（Ｉ．Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９７）、およびＣｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄｏｙｌｅ＆Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ １９９８）などの標準教科書で見つけることができ、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
値の範囲が提供される場合、終点が含まれ、間にある値は、文脈が明確に別段の指示をしない限り、下限の単位の１０分の１まで、その範囲の上限および下限の間であり、その記載された範囲の他の記載された値および間にある値は、包含されることを理解されたい。これらのより小さな範囲の上限および下限は、独立してより小さな範囲に含まれることができ、また、記載された範囲において特に除外された限界を条件として、包含される。記載された範囲が限界の一方または両方を含む場合、それらの含まれる限界のいずれかまたは両方を除外する範囲も含まれる。
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味と同一の意味を有する。本明細書で言及される全ての刊行物は、刊行物が引用されるものに関連して方法および／または材料を開示および説明するために、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、別途文脈が明確に示さない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」が複数の指示対象を含むことに留意されたい。
明確にするために別個の実施形態の文脈で説明される本開示のある特定の特徴が単一の実施形態では組み合わせで提供される場合もあることが理解されよう。他の事例では、簡潔にするために単一の実施形態の文脈で説明される本発明の様々な特徴は、別個にまたは任意の適切な部分組み合わせで提供される場合もある。本発明に関連する実施形態の全ての組み合わせが、本発明によって具体的に包含され、かつありとあらゆる組み合わせが個別にかつ明示的に開示されたかのように本明細書に開示されるよう意図されている。加えて、様々な実施形態およびそれらの要素の全ての部分組み合わせも、本発明によって具体的に包含され、ありとあらゆるかかる部分組み合わせが個別にかつ明示的に本明細書に開示されたかのように本明細書に開示される。
ＩＩ．抗原プロセシング、提示、認識、および／または応答に関与するタンパク質の遺伝子編集のための系
第１の態様では、本開示は、真核細胞のゲノム編集に有用性を有するＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼおよび１つ以上のガイド核酸（ｇＮＡ）を含む系を提供する。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ）、ＣａｓＸ、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃａｓ１４、Ｃｐｆｌ、Ｃ２ｃｌ、Ｃｓｎ２、およびＣａｓ Ｐｈｉからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、本開示は、ＣａｓＸタンパク質と、抗原プロセシング、抗原提示、抗原認識、および／または抗原応答に関与するタンパク質をコードする１つ以上の細胞遺伝子の標的核酸配列を修飾するように特別に設計された１つ以上のガイド核酸（ｇＮＡ）とを含むＣａｓＸ：ｇＮＡ系を提供する。本開示のｇＮＡおよびＣａｓＸタンパク質は、本明細書でリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体と称される複合体を形成し、非共有結合的相互作用により結合することができる。予め複合体化されたＣａｓＸ：ｇＮＡの使用は、標的核酸配列の編集のための細胞または標的核酸配列への本系の構成要素の送達に利点を与える。ＲＮＰにおいて、ｇＮＡが、標的核酸配列の配列に相補的なヌクレオチド配列を有する標的配列（または「スペーサー」）を含むことによって本複合体に標的特異性を提供することができる一方で、予め複合体化されたＣａｓＸ：ｇＮＡのＣａｓＸタンパク質は、ガイドＮＡとの会合により標的核酸配列（例えば、修飾されるＢ２ＭまたはＴＲＡＣ遺伝子）内の標的部位にガイドされる（例えば、標的部位で安定化される）部位特異的活性を提供する。本複合体のＣａｓＸタンパク質は、ＣａｓＸタンパク質による標的配列の切断またはニッキングなどの本複合体の部位特異的活性および／またはキメラＣａｓＸタンパク質の場合には融合パートナーによって提供される活性を提供する。加えて、本開示は、ＣａｓＸ：ｇＮＡ系を使用して、抗原プロセシング、提示、認識、および／または応答に関与する１つ以上のタンパク質の発現を導入または調節するように細胞集団の標的核酸配列を修飾するのに有用な方法を提供する。抗原プロセシング、抗原提示、抗原認識、および／または抗原応答に関与するタンパク質が下方調節または排除されているかかる修飾された細胞集団は、免疫療法に有用である。本開示のＣａｓＸ：ｇＮＡ系は、１つ以上のＣａｓＸタンパク質と、１つ以上のガイド核酸（ｇＮＡ）と、任意選択的に、抗原プロセシング、抗原提示、抗原認識、および／または抗原応答に関与するタンパク質の修飾をコードする核酸を含む１つ以上のドナー鋳型核酸とを含み、この核酸は、遺伝子機能をノックダウン／ノックアウトするために、タンパク質をコードするゲノム核酸配列またはその調節要素と比較して、１つ以上のヌクレオチドの欠失、挿入、または変異を含む。いくつかの実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、修飾される細胞遺伝子の標的核酸配列の全てまたは一部分の少なくとも約１０、少なくとも約５０、少なくとも約１００、または少なくとも約２００、または少なくとも約３００、または少なくとも約４００、または少なくとも約５００、または少なくとも約６００、または少なくとも約７００、または少なくとも約８００、または少なくとも約９００、または少なくとも約１０００、または少なくとも約１０，０００、または少なくとも約１５，０００個のヌクレオチドを含む。他の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、修飾される細胞遺伝子の少なくとも約１０～約１０，０００個のヌクレオチド、または少なくとも約１００～約８０００個のヌクレオチド、または少なくとも約４００～約６０００個のヌクレオチド、または少なくとも約６００～約４０００個のヌクレオチド、または少なくとも約１０００～約２０００個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、一本鎖ＤＮＡ鋳型または一本鎖ＲＮＡ鋳型である。他の実施形態では、ドナー鋳型は、二本鎖ＤＮＡ鋳型である。
他の実施形態では、本開示は、修飾された細胞がＣＡＲを修飾された細胞で発現することができるように修飾される細胞に導入することができる、疾患抗原、任意選択的に、腫瘍細胞抗原に対する結合特異性を有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするポリ核酸を提供する。他の実施形態では、本開示は、本開示は、修飾された細胞がＴＣＲを修飾された細胞で発現することができるように修飾される細胞に導入することができる、疾患抗原、任意選択的に、腫瘍細胞抗原に対する結合特異性を有する操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードするポリ核酸を提供する。
ＣａｓＸ：ｇＮＡ系は、がん、自己免疫疾患、および移植片拒絶反応を含むある特定の疾患または状態を有する対象の治療に有用である。ＣａｓＸ：ｇＮＡ系の各構成要素、ならびに抗原プロセシング、抗原提示、抗原認識、および／または抗原応答に関与する１つ以上のタンパク質を修飾するための細胞内の標的核酸の編集におけるそれらの使用、ならびにＣＡＲおよび１つまたは複数の操作されたＴＣＲサブユニットをコードするポリ核酸の使用が本明細書に記載される。本明細書に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系およびポリ核酸は、がん、自己免疫疾患、および移植片拒絶反応などの疾患に関連する標的細胞を効率的に死滅させる修飾された細胞集団の作製に有用である。さらに、修飾された細胞集団を使用して、かかる疾患を有する対象に免疫を付与することができる。
ＩＩＩ．遺伝子編集のための系のガイド核酸
別の態様では、本開示は、抗原プロセシング、抗原提示、抗原認識、および／または抗原応答に関与するタンパク質をコードする遺伝子の標的鎖中の標的核酸配列に相補的な標的配列を含むガイド核酸（ｇＮＡ）であって、ｇＮＡが、相補的非標的鎖中にＴＣモチーフを含むプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に特異的なＣＲＩＳＰＲタンパク質と複合体を形成することができ、ＰＡＭ配列が、標的鎖中の標的核酸配列に相補的な非標的鎖中の配列の５’側の１ヌクレオチドに位置する、ｇＮＡに関する。
いくつかの実施形態では、本開示は、真核細胞のゲノム編集に有用なＣａｓＸ：ｇＮＡ系に利用されるガイド核酸（ｇＮＡ）に関する。本開示は、特別に設計されたガイド核酸（「ｇＮＡ」）であって、ｇＮＡの標的配列（またはスペーサー、以下でより完全に記載される）が、遺伝子編集ＣａｓＸ：ｇＮＡ系の構成要素として使用された場合に標的核酸配列に相補的である（それ故に、それにハイブリダイズすることができる）、ｇＮＡを提供する。いくつかの実施形態では、複数のｇＮＡが標的核酸配列の修飾のためにＣａｓＸ：ｇＮＡ系で送達されることが想定される。例えば、タンパク質をコードする遺伝子のノックダウン／ノックアウトが所望される場合、一対のｇＮＡを使用して、遺伝子内の２つの異なる部位で結合および切断することができる。
本開示は、遺伝子編集ＣａｓＸ：ｇＮＡ系の構成要素として標的核酸に相補的である（それ故に、それにハイブリダイズすることができる）標的配列を有する特別に設計されたガイド核酸（「ｇＮＡ」）を提供する。以下でより完全に記載されるように、抗原プロセシング、抗原提示、抗原認識、および／または抗原応答に関与するタンパク質をコードする細胞遺伝子の標的核酸配列に対する標的配列の代表的であるが非限定的な例を、表３Ａ、表３Ｂ、および表３Ｃに提示する（表３Ａ、表３Ｂ、および表３Ｃは、図３５～３７として提供される）。いくつかの実施形態では、複数のｇＮＡが標的核酸配列の修飾のためにＣａｓＸ：ｇＮＡ系で送達されることが想定される。例えば、タンパク質をコードする遺伝子のノックダウン／ノックアウトが所望される場合、標的核酸配列の異なるまたは重複する領域に対する標的配列を有する一対のｇＮＡを使用して、遺伝子内または遺伝子の近位の２つの異なるまたは重複する部位でＣａｓＸに結合して切断することができ、その後、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）、相同性指向修復（ＨＤＲ、例えば、イントロンの全てまたは一部分を置き換えるためにドナー鋳型の挿入を含むことができる）、相同性非依存性標的組み込み（ＨＩＴＩ）、マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）、一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）、または塩基除去修復（ＢＥＲ）によって編集される。
ａ．参照ｇＮＡおよびｇＮＡバリアント
いくつかの実施形態では、本開示のｇＮＡは、天然に存在するｇＮＡ（「参照ｇＮＡ」）の配列を含む。他の事例では、本開示の参照ｇＮＡは、参照ｇＮＡと比較して改善されたまたは変化した特性を有する１つ以上のｇＮＡバリアントを生成するために、ディープミューテーショナルエボルーション（ＤＭＥ）、ディープミューテーショナルスキャニング（ＤＭＳ）、エラープローンＰＣＲ、カセット変異誘発、ランダム変異誘発、スタガードエクステンションＰＣＲ、遺伝子シャフリング、またはドメインスワッピングを含み得る本明細書に記載の変異誘発などの１つ以上の変異誘発法に供され得る。ｇＮＡバリアントには、例えば、５’末端もしくは３’末端のいずれかに融合された、または内部に挿入された１つ以上の外因性配列を含むバリアントも含まれる。参照ｇＮＡの活性は、ｇＮＡバリアントの活性が比較されるベンチマークとして使用され、それにより、ｇＮＡバリアントの機能または他の特性の改善を測定することができる。他の実施形態では、参照ｇＮＡは、ｇＮＡバリアント、例えば、合理的に設計されたバリアントを生成するために、１つ以上の意図的な標的変異に供され得る。本明細書で使用される場合、ｇＮＡ、ｇＲＮＡ、およびｇＤＮＡという用語は、天然に存在する分子を含み、配列バリアントも含む。いくつかの実施形態では、ｇＮＡはデオキシリボ核酸分子（「ｇＤＮＡ」）であり、いくつかの実施形態では、ｇＮＡはリボ核酸分子（「ｇＲＮＡ」）であり、他の実施形態では、ｇＮＡはキメラであり、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含む。
ｇＮＡの標的配列は、コード配列、コード配列の相補体、非コード配列を含む標的核酸配列、および調節要素に結合することができる。ｇＮＡ足場（または「タンパク質結合配列」）は、ＣａｓＸタンパク質と相互作用し（例えば、それに結合し）、ＲＮＰを形成する（以下でより完全に記載される）。いくつかの実施形態では、標的配列および足場は各々、互いにハイブリダイズして二本鎖デュプレックス（ｄｇＲＮＡの場合はｄｓＲＮＡデュプレックス）を形成するヌクレオチドの相補的ストレッチを含む。ＣａｓＸタンパク質による標的核酸配列（例えば、ゲノムＤＮＡ）の部位特異的結合および／または切断は、ｇＮＡの標的配列と標的核酸配列との間の塩基対形成相補性によって決定される１つ以上の位置（例えば、標的核酸の配列）で起こり得る。したがって、例えば、本開示のｇＮＡは、ＴＣ ＰＡＭモチーフまたはＰＡＭ配列、例えば、ＡＴＣ、ＣＴＣ、ＧＴＣ、またはＴＴＣに相補的な配列に隣接する真核細胞内の核酸、例えば、真核生物核酸（例えば、真核生物染色体、染色体配列、真核生物ＲＮＡなど）における遺伝子の抗原プロセシング、抗原提示、抗原認識、および／または抗原応答に関与するタンパク質に相補的であり、それ故に、それにハイブリダイズすることができる配列および／またはその調節配列を有する。
核酸との関連で、切断とは、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかの核酸分子の共有結合骨格の破壊を指す。切断は、ホスホジエステル結合の酵素的または化学的加水分解を含むが、これらに限定されない様々な方法によって開始することができる。一本鎖切断および二本鎖切断の両方が可能であり、二本鎖切断は、２つの別個の一本鎖切断事象の結果として起こり得る。ＤＮＡ切断は、平滑末端またはスタガード末端のいずれかを生成することができる。
いくつかの実施形態では、本開示は、遺伝子編集に使用する前に一緒に結合することができ、それ故に、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）として「予め複合体化」される、本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかのＣａｓＸとｇＮＡとの遺伝子編集対を提供する。予め複合体化されたＲＮＰの使用は、標的核酸配列の編集のための細胞または標的核酸配列への系構成要素の送達に利点を与える。ＲＮＰのＣａｓＸタンパク質は、標的核酸配列にハイブリダイズすることができる標的配列を含むガイドＲＮＡとの会合により標的核酸配列内の標的部位にガイドされる（例えば、標的部位で安定化される）部位特異的活性を提供する。
ｇＮＡがｇＲＮＡであるいくつかの実施形態では、「ターゲッター」または「ターゲッターＲＮＡ」という用語は、ＣａｓＸデュアルガイドＲＮＡの（それ故に、例えば、介在ヌクレオチドによって「活性化因子」および「ターゲッター」が一緒に連結された場合、ＣａｓＸシングルガイドＲＮＡの）ｃｒＲＮＡ様分子（ｃｒＲＮＡ：「ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」）を指すために本明細書で使用される。したがって、例えば、ＣａｓＸガイドＲＮＡ（ｄｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ）は、ガイド配列と、ｃｒＲＮＡリピートとも称され得るｃｒＲＮＡのデュプレックス形成セグメントとを含む。ガイド配列の配列が標的核酸配列にハイブリダイズするため、ＰＡＭの位置が考慮される限り、ターゲッターは、特定の標的核酸配列にハイブリダイズするように使用者によって修飾され得る。したがって、いくつかの事例では、ターゲッターの配列は、天然に存在しない配列であり得る。他の事例では、ターゲッターの配列は、編集される遺伝子に由来する天然に存在する配列であり得る。デュアルガイドＲＮＡの場合、ターゲッターおよび活性化因子は各々、デュプレックス形成セグメントを有し、ターゲッターのデュプレックス形成セグメントおよび活性化因子のデュプレックス形成セグメントは互いに相補性を有し、互いにハイブリダイズして二本鎖デュプレックス（ｇＲＮＡの場合はｄｓＲＮＡデュプレックス）を形成する。いくつかの実施形態では、ターゲッターは、ガイドＲＮＡのガイド配列と、ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡデュプレックスの半分を形成するヌクレオチドのストレッチとの両方を含む。対応するｔｒａｃｒＲＮＡ様分子（活性化因子）も、ＣａｓＸガイドＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡデュプレックスの残りの半分を形成するヌクレオチドのデュプレックス形成ストレッチを含む。したがって、ターゲッターおよび活性化因子は、対応する対として、ハイブリダイズして、本明細書で「デュアルガイドＮＡ」、「デュアル分子ｇＮＡ」、「ｄｇＮＡ」、「デュアル分子ガイドＮＡ」、または「２分子ガイドＮＡ」と称されるＣａｓＸデュアルガイドＮＡを形成する。
いくつかの実施形態では、参照ｇＮＡの活性化因子およびターゲッターは、互いに共有結合し、本明細書で「単一分子ｇＮＡ」、「１分子ガイドＮＡ」、「シングルガイドＮＡ」、「シングルガイドＲＮＡ」、「単一分子ガイドＲＮＡ」、「１分子ガイドＲＮＡ」、「シングルガイドＤＮＡ」、「単一分子ＤＮＡ」、または「１分子ガイドＤＮＡ」（「ｓｇＲＮＡ」、「ｓｇＲＮＡ」、または「ｓｇＤＮＡ」）と称される単一分子を含む。いくつかの実施形態では、ｓｇＮＡは、「活性化因子」または「ターゲッター」を含み、それ故に、それぞれ、「活性化因子ＲＮＡ」および「ターゲッターＲＮＡ」であり得る。
まとめると、本開示のｇＮＡは、本開示のいくつかの実施形態では標的核酸に特異的な４つの別個の領域またはドメイン、ＲＮＡトリプレックス、足場ステム、伸長ステム、および標的配列を含む。ＲＮＡトリプレックス、足場ステム、および伸長ステムは、合わせて、参照ｇＮＡの「足場」と称される。いくつかの実施形態では、標的配列は、ｇＮＡの３’末端にある。
ｂ．ＲＮＡトリプレックス
本明細書に提供されるガイドＮＡ（参照ｓｇＮＡを含む）のいくつかの実施形態では、ＲＮＡトリプレックスが存在し、ＲＮＡトリプレックスは、２つの介在ステムループ（足場ステムループおよび伸長ステムループ）の後にＡＡＡＧで終了するＵＵＵ－－ｎＸ（約４～１５）－－ＵＵＵステムループ（配列番号１９）の配列を含み、トリプレックスを越えてデュプレックスシュードノットにも伸長し得るシュードノットを形成する。トリプレックスのＵＵ－ＵＵＵ－ＡＡＡ配列は、標的配列と足場ステムと伸長ステムとの間のネクサスとして形成される。例示的な参照ＣａｓＸ ｓｇＮＡでは、ＵＵＵ－ループ－ＵＵＵ領域が最初にコードされ、次いで、足場ステムループ、次いで、テトラループによって連結された伸長ステムループがコードされ、その後、スペーサーになる前にＡＡＡＧでトリプレックスを終了する。
ｃ．足場ステムループ
本開示のｓｇＮＡのいくつかの実施形態では、トリプレックス領域の後に足場ステムループが続く。足場ステムループは、ＣａｓＸタンパク質（参照またはＣａｓＸバリアントタンパク質など）が結合しているｇＮＡの領域である。いくつかの実施形態では、足場ステムループは、かなり短く安定したステムループである。いくつかの事例では、足場ステムループは多くの変化を許容せず、何らかの形態のＲＮＡバブルを必要とする。いくつかの実施形態では、足場ステムはＣａｓＸ ｓｇＮＡ機能に必要である。重要なステムループであるという点でＣａｓ９のネクサスステムにおそらく類似しているが、いくつかの実施形態では、ＣａｓＸ ｓｇＮＡの足場ステムは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系で見つけられる多くの他のステムループとは異なる必要なバルジ（ＲＮＡバブル）を有する。いくつかの実施形態では、このバルジの存在は、異なるＣａｓＸタンパク質と相互作用するｓｇＮＡにわたって保存されている。ｇＮＡの足場ステムループ配列の例示的な配列は、配列ＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＵＧＧ（配列番号２０）を含む。他の実施形態では、本開示は、足場ステムループが、ＭＳ２、Ｑβ、Ｕ１ヘアピンＩＩ、Ｕｖｓｘ、またはＰＰ７ステムループから選択されるステムループ配列などであるが、これらに限定されない、近位５’末端および３’末端を有する異種ＲＮＡ源由来のＲＮＡステムループ配列で置き換えられるｇＮＡバリアントを提供する。いくつかの事例では、ｇＮＡの異種ＲＮＡステムループは、タンパク質、ＲＮＡ構造、ＤＮＡ配列、または小分子に結合することができる。
ｄ．伸長ステムループ
本開示のＣａｓＸ ｓｇＮＡのいくつかの実施形態では、足場ステムループの後に伸長ステムループが続く。いくつかの実施形態では、伸長ステムは、ＣａｓＸタンパク質の大部分が結合していない合成ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡ融合を含む。いくつかの実施形態では、伸長ステムループは、高度に順応性であり得る。いくつかの実施形態では、シングルガイドｇＲＮＡは、伸長ステムループ内のｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡとの間のＧＡＡＡテトラループリンカーまたはＧＡＧＡＡＡリンカーで作製される。いくつかの事例では、ＣａｓＸ ｓｇＮＡのターゲッターおよび活性化因子は、介在ヌクレオチドによって互いに連結されており、リンカーは、３～２０ヌクレオチド長を有することができる。本開示のＣａｓＸ ｓｇＮＡのいくつかの実施形態では、伸長ステムは、リボ核タンパク質複合体のＣａｓＸタンパク質の外側に位置する大きい３２ｂｐループである。ｓｇＮＡの伸長ステムループ配列の例示的な配列は、配列ＧＣＧＣＵＵＡＵＵＵＡＵＣＧＧＡＧＡＧＡＡＡＵＣＣＧＡＵＡＡＡＵＡＡＧＡＡＧＣ（配列番号２１）を含む。いくつかの実施形態では、伸長ステムループは、ＧＡＧＡＡＡスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示は、伸長ステムループが、ＭＳ２、Ｑβ、Ｕ１ヘアピンＩＩ、Ｕｖｓｘ、またはＰＰ７ステムループから選択されるステムループ配列などであるが、これらに限定されない、近位５’末端および３’末端を有する異種ＲＮＡ源由来のＲＮＡステムループ配列で置き換えられるｇＮＡバリアントを提供する。かかる事例では、異種ＲＮＡステムループは、ｇＮＡの安定性を増加させる。他の実施形態では、本開示は、少なくとも１０、少なくとも１００、少なくとも５００、少なくとも１０００、または少なくとも１０，０００個のヌクレオチドを含む伸長ステムループ領域を有するｇＮＡバリアントを提供する。
ｅ．標的配列
本開示のｇＮＡのいくつかの実施形態では、伸長ステムループの後にトリプレックスの一部を形成する領域が続き、その後に標的配列（または「スペーサー」）が続く。標的配列は、ＣａｓＸリボ核タンパク質ホロ複合体を、修飾される遺伝子の標的核酸配列の特定の領域に標的させる。したがって、例えば、本開示のｇＮＡ標的配列は、ＰＡＭ配列ＴＴＣ、ＡＴＣ、ＧＴＣ、またはＣＴＣのうちのいずれか１つが標的配列に相補的な非標的鎖配列の５’側の１ヌクレオチドに位置する場合、ＲＮＰの構成要素として真核細胞の核酸（例えば、真核生物染色体、染色体配列、真核生物ＲＮＡなど）におけるＢ２Ｍ遺伝子の一部分に相補的であり、それ故に、それにハイブリダイズすることができる配列を有する。ＰＡＭ配列の位置が考慮される限り、ｇＮＡが任意の所望の標的核酸配列の所望の配列を標的することができるようにｇＮＡの標的配列を修飾することができる。いくつかの実施形態では、ｇＮＡ足場は、標的配列の５’側にあり、標的配列は、ｇＮＡの３’末端にある。いくつかの実施形態では、ＲＮＰによって認識されるＰＡＭ配列は、ＴＣである。他の実施形態では、ＲＮＰによって認識されるＰＡＭ配列は、ＮＴＣである。
いくつかの実施形態では、ｇＮＡの標的配列は、ベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、Ｔ細胞受容体アルファ鎖定常領域（ＴＲＡＣ）、クラスＩＩ主要組織適合性複合体トランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）、Ｔ細胞受容体ベータ定常１（ＴＲＢＣ１）、Ｔ細胞受容体ベータ定常２（ＴＲＢＣ２）、ヒト白血球抗原Ａ（ＨＬＡ－Ａ）、ヒト白血球抗原Ｂ（ＨＬＡ－Ｂ）、ＴＧＦβ受容体２（ＴＧＦβＲＩＩ）、プログラム細胞死１（ＰＤ－１）、サイトカイン誘導性ＳＨ２（ＣＩＳＨ）、リンパ球活性化３（ＬＡＧ－３）、ＩｇおよびＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）、アデノシンＡ２ａ受容体（ＡＤＯＲＡ２Ａ）、キラー細胞レクチン様受容体Ｃ１（ＮＫＧ２Ａ）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）、Ｔ細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン３（ＴＩＭ－３）、ならびに２Ｂ４（ＣＤ２４４）を含むが、これらに限定されない、抗原プロセシング、抗原提示、抗原認識、および／または抗原応答に関与するタンパク質をコードする遺伝子の一部分に特異的であり、それにハイブリダイズすることができる。特定の一実施形態では、遺伝子は、Ｂ２Ｍである。Ｂ２Ｍ遺伝子は、ほぼ全ての有核細胞の表面上の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ重鎖と会合した状態で見つけられる血清タンパク質をコードする。別の特定の実施形態では、遺伝子は、ＴＲＡＣである。ＴＲＡＣ遺伝子は、Ｔ細胞アルファ受容体の７０個の可変領域のうちの１つに連結したＣ末端定常領域をコードする。ベータ鎖の同様の合成後に、アルファ鎖とベータ鎖が対になって、アルファ－ベータＴ細胞受容体ヘテロ二量体を生成する。別の特定の実施形態では、遺伝子は、ＣＩＴＴＡである。ＣＩＩＴＡ遺伝子は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩの遺伝子の活性（転写）を制御するのに主に役立つタンパク質を作製するための指示を提供する。前述では、ゲノム標的は、標的のコード遺伝子がノックアウトまたはノックダウンされるよう意図されており、これにより、タンパク質（例えば、細胞マーカーまたは細胞内タンパク質）が細胞内で発現されないか、またはより低いレベルで発現されるようになるものである。いくつかの実施形態では、ｇＮＡの標的配列は、遺伝子のエクソンに特異的である。他の実施形態では、ｇＮＡの標的配列は、遺伝子のイントロンに特異的である。他の実施形態では、ｇＮＡの標的配列は、遺伝子の調節要素に特異的である。他の実施形態では、ｇＮＡの標的配列は、遺伝子のエクソン、イントロン、および／または調節要素の接合部に特異的である。他の実施形態では、ｇＮＡの標的配列は、遺伝子間領域に特異的である。標的配列が調節要素に特異的である事例では、かかる調節要素には、プロモーター領域、エンハンサー領域、遺伝子間領域、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）、保存要素、およびシス調節要素を含む領域が含まれるが、これらに限定されない。プロモーター領域は、コード配列の開始点から５ｋｂ以内のヌクレオチドを包含するよう意図されているか、または遺伝子エンハンサー要素もしくは保存要素の場合、標的核酸の遺伝子のコード配列から何千ｂｐ、何十万ｂｐ、さらには何百万ｂｐも離れて位置し得る。前述では、標的は、標的のコード遺伝子がノックアウトまたはノックダウンされるよう意図されており、これにより、標的タンパク質が細胞内で発現されないか、または細胞内でより低いレベルで発現されるようになるものである。
いくつかの実施形態では、ｇＮＡの標的配列は、１４～３５個の連続したヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的配列は、１４、１５、１６、１８、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５個の連続したヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的配列は、２０個の連続するヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態では、標的配列は、１９個の連続するヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態では、標的配列は、１８個の連続するヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態では、標的配列は、１７個の連続するヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態では、標的配列は、１６個の連続するヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態では、標的配列は、１５個の連続するヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態では、標的配列は、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５個の連続するヌクレオチドを有し、標的配列は、標的核酸配列に対して０～５、０～４、０～３、または０～２個のミスマッチを含み、標的配列を含むｇＮＡを含むＲＮＰが標的核酸に対して相補的結合を形成することができるように十分な結合特異性を保持することができる。
本開示のｇＮＡに包含するための標的配列の代表的であるが非限定的な例は、それぞれ、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、およびＣＩＩＴＡの標的配列を表す、表３Ａ、表３Ｂ、および表３Ｃに提示される（図３５～３７として含まれる）。
Ｂ２Ｍ遺伝子の編集のためにＣａｓＸ：ｇＮＡ系とともに利用されるｇＮＡ実施形態の例示的な標的配列（スペーサー配列）が表３Ａに提供される（配列番号７２５～２１００および２２８１～７０８５）。一実施形態では、Ｂ２Ｍ ｇＮＡの標的配列は、表３Ａに記載の配列からなる群から選択される配列と少なくとも約６５％、少なくとも約７５％、少なくとも約８５％、または少なくとも約９５％の同一性を有する配列を含む。別の実施形態では、ｇＮＡの標的配列は、表３Ａに記載の配列からなる群から選択される配列からなる。前述の実施形態では、標的配列のうちのいずれかで、チミン（Ｔ）ヌクレオチドがウラシル（Ｕ）ヌクレオチドのうちの１つ以上またはすべての代わりに使用され、これにより、ｇＮＡが、ｇＤＮＡもしくはｇＲＮＡ、またはＲＮＡおよびＤＮＡのキメラになり得る。いくつかの実施形態では、表３Ａの標的配列は、チミンヌクレオチドの代わりに少なくとも１、２、３、４、５、または６個以上のチミンヌクレオチドを有する。他の実施形態では、本開示のｇＮＡ、ｇＲＮＡ、またはｇＤＮＡは、表３Ａの１、２、３つ、またはそれ以上の標的配列、または表３Ａの１つ以上の配列と少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一の標的配列を含む。
ＴＲＡＣ遺伝子の編集のためにＣａｓＸ：ｇＮＡ系とともに利用されるｇＮＡ実施形態の例示的な標的配列（スペーサー配列）が表３Ｂに提供される。一実施形態では、ＴＲＡＣ ｇＮＡの標的配列は、表３Ｂに記載の配列からなる群から選択される配列と少なくとも約６５％、少なくとも約７５％、少なくとも約８５％、または少なくとも約９５％の同一性を有する配列を含む。別の実施形態では、ｇＮＡの標的配列は、表３Ｂに記載の配列からなる群から選択される配列からなる。前述の実施形態では、標的配列のうちのいずれかで、チミン（Ｔ）ヌクレオチドがウラシル（Ｕ）ヌクレオチドのうちの１つ以上またはすべての代わりに使用され、これにより、ｇＮＡが、ｇＤＮＡもしくはｇＲＮＡ、またはＲＮＡおよびＤＮＡのキメラになり得る。いくつかの実施形態では、表３Ｂの標的配列は、ウラシルヌクレオチドの代わりに少なくとも１、２、３、４、５、または６個以上のチミンヌクレオチドを有する。他の実施形態では、本開示のｇＮＡ、ｇＲＮＡ、またはｇＤＮＡは、表３Ｂの１、２、３つ、またはそれ以上の標的配列、または表３Ｂの１つ以上の配列と少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一の標的配列を含む。
ＣＩＩＴＡ遺伝子の編集のためにＣａｓＸ：ｇＮＡ系とともに利用されるｇＮＡ実施形態の例示的な標的配列（スペーサー配列）が表３Ｃに提供される。一実施形態では、ＴＲＡＣ ｇＮＡの標的配列は、表３Ｃに記載の配列からなる群から選択される配列と少なくとも約６５％、少なくとも約７５％、少なくとも約８５％、または少なくとも約９５％の同一性を有する配列を含む。別の実施形態では、ｇＮＡの標的配列は、表３Ｃに記載の配列からなる群から選択される配列からなる。前述の実施形態では、標的配列のうちのいずれかで、チミン（Ｔ）ヌクレオチドがウラシル（Ｕ）ヌクレオチドのうちの１つ以上またはすべての代わりに使用され、これにより、ｇＮＡが、ｇＤＮＡもしくはｇＲＮＡ、またはＲＮＡおよびＤＮＡのキメラになり得る。いくつかの実施形態では、表３Ｃの標的配列は、ウラシルヌクレオチドの代わりに少なくとも１、２、３、４、５、または６個以上のチミンヌクレオチドを有する。他の実施形態では、本開示のｇＮＡ、ｇＲＮＡ、またはｇＤＮＡは、表３Ｃの１、２、３つ、またはそれ以上の標的配列、または表３Ｃの１つ以上の配列と少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一の標的配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸ：ｇＮＡ系は、第１のｇＮＡを含み、さらに第２の（および任意選択的に第３、第４、第５、またはそれ以上の）ｇＮＡを含み、第２のｇＮＡまたはさらなるｇＮＡは、第１のｇＮＡの標的配列と比較して標的核酸配列の異なるまたは重複する部分に相補的な標的配列を有し、それにより、標的核酸内の複数の点が標的とされ、例えば、複数の切断がＣａｓＸによって標的核酸内に導入されるようになる。かかる事例では、第２のまたはさらなるｇＮＡがＣａｓＸタンパク質の追加のコピーと複合体形成されることが理解されよう。ｇＮＡの標的配列を選択することにより、標的核酸内の特定の位置を挟む標的核酸配列の定義された領域が、本明細書に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系を使用して修飾または編集され得る（ドナー鋳型の挿入を容易にすることを含む）。
ｆ．ｇＮＡ足場
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸ参照ｇＲＮＡは、Ｄｅｌｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒから単離されたまたはそれに由来する配列を含む。いくつかの実施形態では、配列は、ＣａｓＸ ｔｒａｃｒＲＮＡ配列である。Ｄｅｌｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒから単離されたまたはそれに由来する例示的なＣａｓＸ参照ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、ＡＣＡＵＣＵＧＧＣＧＣＧＵＵＵＡＵＵＣＣＡＵＵＡＣＵＵＵＧＧＡＧＣＣＡＧＵＣＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＵＧＧＡＣＧＡＡＧＣＧＣＵＵＡＵＵＵＡＵＣＧＧＡＧＡ（配列番号２２）およびＡＣＡＵＣＵＧＧＣＧＣＧＵＵＵＡＵＵＣＣＡＵＵＡＣＵＵＵＧＧＡＧＣＣＡＧＵＣＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＵＧＧＡＣＧＡＡＧＣＧＣＵＵＡＵＵＵＡＵＣＧＧ（配列番号２３）を含み得る。Ｄｅｌｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒから単離されたまたはそれに由来する例示的なｃｒＲＮＡ配列は、ＣＣＧＡＵＡＡＧＵＡＡＡＡＣＧＣＡＵＣＡＡＡＧ（配列番号２４）の配列を含み得る。いくつかの実施形態では、参照ｇＮＡは、Ｄｅｌｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒから単離されたまたはそれに由来する配列と少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、または１００％同一の配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸ参照ガイドＲＮＡは、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓから単離されたまたはそれに由来する配列を含む。いくつかの実施形態では、配列は、ＣａｓＸ ｔｒａｃｒＲＮＡ配列である。Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓから単離されたまたはそれに由来する例示的なＣａｓＸ参照ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、ＵＡＣＵＧＧＣＧＣＵＵＵＵＡＵＣＵＣＡＵＵＡＣＵＵＵＧＡＧＡＧＣＣＡＵＣＡＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＵＧＧＧＵＡＡＡＧＣＧＣＵＵＡＵＵＵＡＵＣＧＧＡＧＡ（配列番号２５）および
ＵＡＣＵＧＧＣＧＣＵＵＵＵＡＵＣＵＣＡＵＵＡＣＵＵＵＧＡＧＡＧＣＣＡＵＣＡＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＵＧＧＧＵＡＡＡＧＣＧＣＵＵＡＵＵＵＡＵＣＧＧ（配列番号２６）を含み得る。Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓから単離されたまたはそれに由来する例示的なｃｒＲＮＡ配列は、ＵＣＵＣＣＧＡＵＡＡＡＵＡＡＧＡＡＧＣＡＵＣＡＡＡＧ（配列番号２７）の配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸ参照ｇＮＡは、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓから単離されたまたはそれに由来する配列と少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、または１００％同一の配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸ参照ｇＮＡは、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｓｕｎｇｂａｃｔｅｒｉａから単離されたまたはそれに由来する配列を含む。いくつかの実施形態では、配列は、ＣａｓＸ ｔｒａｃｒＲＮＡ配列である。Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｓｕｎｇｂａｃｔｅｒｉａから単離されたまたはそれに由来する例示的なＣａｓＸ参照ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、ＧＵＵＵＡＣＡＣＡＣＵＣＣＣＵＣＵＣＡＵＡＧＧＧＵ（配列番号２８）、ＧＵＵＵＡＣＡＣＡＣＵＣＣＣＵＣＵＣＡＵＧＡＧＧＵ（配列番号２９）、ＵＵＵＵＡＣＡＵＡＣＣＣＣＣＵＣＵＣＡＵＧＧＧＡＵ（配列番号３０）、およびＧＵＵＵＡＣＡＣＡＣＵＣＣＣＵＣＵＣＡＵＧＧＧＧＧ（配列番号３１）の配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸ参照ガイドＲＮＡは、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｓｕｎｇｂａｃｔｅｒｉａから単離されたまたはそれに由来する配列と少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、または１００％同一の配列を含む。
表１は、参照ｇＲＮＡ ｔｒａｃｒ配列および足場配列を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、ｇＮＡが表１の配列番号４～１６のうちのいずれか１つの配列を有する参照ｇＮＡ配列と比較して少なくとも１つのヌクレオチド修飾を有する配列を含む足場を有する、ｇＮＡ配列を提供する。ベクターがｇＮＡのＤＮＡコード配列を含むか、またはｇＮＡがｇＤＮＡもしくはＲＮＡおよびＤＮＡのキメラである実施形態では、チミン（Ｔ）塩基を本明細書に記載のｇＮＡ配列の実施形態のうちのいずれかのウラシル（Ｕ）塩基の代わりに使用することができることが理解されよう。
ｇ．ｇＮＡバリアント
別の態様では、本開示は、参照ｇＲＮＡ足場と比較して１つ以上の修飾を含むガイド核酸バリアント（本明細書では代替的に「ｇＮＡバリアント」または「ｇＲＮＡバリアント」と称される）に関する。本明細書で使用される場合、「足場」とは、スペーサー配列を除くｇＮＡ機能に必要なｇＮＡの全ての部分を指す。
いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、本開示の参照ｇＲＮＡ配列と比較して１つ以上のヌクレオチド置換、挿入、欠失、または交換もしくは置換された領域を含む。いくつかの実施形態では、変異が参照ｇＲＮＡ足場の任意の領域で起こり、ｇＮＡバリアントを生成することができる。いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアント配列の足場は、配列番号４または配列番号５の配列と少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、または少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する。
いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、参照ｇＲＮＡの特性を改善する、参照ｇＲＮＡ足場の１つ以上の領域内の１つ以上のヌクレオチド変化を含む。例示的な領域には、ＲＮＡトリプレックス、シュードノット、足場ステムループ、および伸長ステムループが含まれる。いくつかの事例では、バリアント足場ステムは、バブルをさらに含む。他の事例では、バリアント足場は、トリプレックスループ領域をさらに含む。さらに他の事例では、バリアント足場は、５’非構造領域をさらに含む。一実施形態では、ｇＮＡバリアント足場は、配列番号１４と少なくとも６０％の配列同一性を有する足場ステムループを含む。別の実施形態では、ｇＮＡバリアントは、ＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＧＵＧＧ（配列番号３２）の配列を有する足場ステムループを含む。別の実施形態では、本開示は、元の６ｎｔループおよび１３個の最もループに近位の塩基対（合計３２個のヌクレオチド）がＵｖｓｘヘアピン（４ｎｔのループおよび５個のループに近位の塩基対、合計１４個のヌクレオチド）に置き換えられ、伸長ステムのループから遠位の塩基がＡ９９の欠失およびＧ６４Ｕの置換により新たなＵｖｓｘヘアピンと隣接する完全に塩基対形成されたステムに変換された、配列番号５と比較して、Ｃ１８Ｇ置換、Ｇ５５挿入、Ｕ１欠失、および修飾された伸長ステムループを含むｇＮＡ足場を提供する。前述の実施形態では、ｇＮＡ足場は、配列ＡＣＵＧＧＣＧＣＵＵＵＵＡＵＣＵＧＡＵＵＡＣＵＵＵＧＡＧＡＧＣＣＡＵＣＡＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＧＵＧＧＧＵＡＡＡＧＣＵＣＣＣＵＣＵＵＣＧＧＡＧＧＧＡＧＣＡＵＣＡＡＡＧ（配列番号３３）を含む。
バリアントｇＮＡが本明細書に記載の参照ｇＲＮＡと比較された場合に１つ以上の改善された機能または特性を有するか、または１つ以上の新たな機能を追加する全てのｇＮＡバリアントは、本開示の範囲内であると想定される。かかるｇＮＡバリアントの代表的な例はガイド１７４（配列番号２２３８）であり、その設計は実施例に記載されている。いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、ｇＮＡバリアントを含むＲＮＰに新たな機能を追加する。いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、改善された安定性、改善された溶解性、ｇＮＡの改善された転写、ヌクレアーゼ活性に対する改善された抵抗性、ｇＮＡの増加したフォールディング率、フォールディング中の減少した副産物形成、増加した生産的フォールディング、ＣａｓＸタンパク質に対する改善された結合親和性、ＣａｓＸタンパク質と複合体形成された場合の標的ＤＮＡに対する改善された結合親和性、ＣａｓＸタンパク質と複合体形成された場合の改善された遺伝子編集、ＣａｓＸタンパク質と複合体形成された場合の改善された編集特異性、およびＣａｓＸタンパク質と複合体形成された場合の標的ＤＮＡの編集においてＡＴＣ、ＣＴＣ、ＧＴＣ、またはＴＴＣを含む１つ以上のＰＡＭ配列のより広範なスペクトルを利用する改善された能力、ならびにそれらの任意の組み合わせから選択される改善された特性を有する。いくつかの事例では、ｇＮＡバリアントの改善された特性のうちの１つ以上は、配列番号４または配列番号５の参照ｇＮＡと比較して少なくとも約１．１～約１００，０００倍改善される。他の事例では、ｇＮＡバリアントの１つ以上の改善された特性は、配列番号４または配列番号５の参照ｇＮＡと比較して少なくとも約１．１、少なくとも約１０、少なくとも約１００、少なくとも約１０００、少なくとも約１０，０００、少なくとも約１００，０００倍以上改善される。他の事例では、ｇＮＡバリアントの改善された特性のうちの１つ以上は、配列番号４または配列番号５の参照ｇＮＡと比較して約１．１～１００，００倍、約１．１～１０，００倍、約１．１～１，０００倍、約１．１～５００倍、１．１～１００倍、約１．１～５０倍、約１．１～２０倍、約１０～１００，００倍、約１０～１０，００倍、約１０～１，０００倍、約１０～５００倍、約１０～１００倍、約１０～５０倍、約１０～２０倍、約２～７０倍、約２～５０倍、約２～３０倍、約２～２０倍、約２～１０倍、約５～５０倍、約５～３０倍、約５～１０倍、約１００～１００，００倍、約１００～１０，００倍、約１００～１，０００倍、約１００～５００倍、約５００～１００，００倍、約５００～１０，００倍、約５００～１，０００倍、約５００～７５０倍、約１，０００～１００，００倍、約１０，０００～１００，００倍、約２０～５００倍、約２０～２５０倍、約２０～２００倍、約２０～１００倍、約２０～５０倍、約５０～１０，０００倍、約５０～１，０００倍、約５０～５００倍、約５０～２００倍、または約５０～１００倍改善される。他の事例では、ｇＮＡバリアントの１つ以上の改善された特性は、配列番号４または配列番号５の参照ｇＮＡと比較して約１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、４５倍、５０倍、５５倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１１０倍、１２０倍、１３０倍、１４０倍、１５０倍、１６０倍、１７０倍、１８０倍、１９０倍、２００倍、２１０倍、２２０倍、２３０倍、２４０倍、２５０倍、２６０倍、２７０倍、２８０倍、２９０倍、３００倍、３１０倍、３２０倍、３３０倍、３４０倍、３５０倍、３６０倍、３７０倍、３８０倍、３９０倍、４００倍、４２５倍、４５０倍、４７５倍、または５００倍改善される。
いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、本開示のｇＮＡバリアントを生成するために、参照ｇＲＮＡを、ディープミューテーショナルエボルーション（ＤＭＥ）、ディープミューテーショナルスキャニング（ＤＭＳ）、エラープローンＰＣＲ、カセット変異誘発、ランダム変異誘発、スタガードエクステンションＰＣＲ、遺伝子シャフリング、またはドメインスワッピングを含み得る以下の本明細書に記載の変異誘発などの１つ以上の変異誘発法に供することによって作製することができる。参照ｇＲＮＡの活性は、ｇＮＡバリアントの活性が比較されるベンチマークとして使用され、それにより、ｇＮＡバリアントの機能の改善を測定することができる。他の実施形態では、参照ｇＲＮＡは、ｇＮＡバリアント、例えば、合理的に設計されたバリアントを生成するために、１つ以上の意図的な標的変異、置換、またはドメイン交換に供され得る。かかる方法によって生成された例示的なｇＲＮＡバリアントは実施例に記載されており、ｇＮＡ足場の代表的な配列は表２に提示される。
いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、参照ガイド核酸足場配列と比較して１つ以上の修飾を含み、１つ以上の修飾は、ｇＮＡバリアントの領域における少なくとも１つのヌクレオチド置換、ｇＮＡバリアントの領域における少なくとも１つのヌクレオチド欠失、ｇＮＡバリアントの領域における少なくとも１つのヌクレオチド挿入、ｇＮＡバリアントの領域の全てもしくは一部分の置換、ｇＮＡバリアントの領域の全てもしくは一部分の欠失、または前述の任意の組み合わせから選択される。いくつかの事例では、修飾は、１つ以上の領域におけるｇＮＡバリアントの１～１５個の連続または非連続ヌクレオチドの置換である。他の事例では、修飾は、１つ以上の領域におけるｇＮＡバリアントの１～１０個の連続または非連続ヌクレオチドの欠失である。他の事例では、修飾は、１つ以上の領域におけるｇＮＡバリアントの１～１０個の連続または非連続ヌクレオチドの挿入である。他の事例では、修飾は、近位５’末端および３’末端を有する異種ＲＮＡ源由来のＲＮＡステムループ配列での足場ステムループまたは伸長ステムループの置換である。いくつかの事例では、本開示のｇＮＡバリアントは、１つの領域に２つ以上の修飾を含む。他の事例では、本開示のｇＮＡバリアントは、２つ以上の領域に修飾を含む。他の事例では、ｇＮＡバリアントは、この段落に記載される前述の修飾の任意の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、＋１ヌクレオチドがＧである場合、Ｕ６プロモーターからの転写が開始部位に関してより効率的かつより一貫しているため、５’ Ｇがインビボでの発現のためにｇＮＡバリアント配列に付加される。他の実施形態では、Ｔ７ポリメラーゼが＋１位にＧおよび＋２位にプリンを強く好むため、２つの５’ Ｇがインビトロ転写のためにｇＮＡバリアント配列に付加されて、生成効率を増加させる。いくつかの事例では、５’ Ｇ塩基が表１の参照足場に付加される。他の事例では、５’ Ｇ塩基が表２のバリアント足場に付加される。
表２は、例示的なｇＮＡバリアント足場配列を提供する。表２中、（－）は、配列番号５の参照配列に対する指定された位置での欠失を示し、（＋）は、配列番号５に対する指示された位置での指定された塩基の挿入を示し、（：）は、配列番号５に対する欠失または置換の指定された開始：終止座標での塩基の範囲を示し、複数の挿入、欠失、または置換は、例えば、Ａ１４Ｃ、Ｕ１７Ｇのようにコンマで区切られている。いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアント足場は、表２に列記される配列番号２１０１～２２８０の配列のうちのいずれか１つ、またはそれと少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を含む。ベクターがｇＮＡのＤＮＡコード配列を含むか、またはｇＮＡがｇＤＮＡもしくはＲＮＡおよびＤＮＡのキメラである実施形態では、チミン（Ｔ）塩基を本明細書に記載のｇＮＡ配列の実施形態のうちのいずれかのウラシル（Ｕ）塩基の代わりに使用することができることが理解されよう。
いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、配列－ＵＵＵ－Ｎ４－２５－ＵＵＵ－（配列番号３４）を含むｔｒａｃｒＲＮＡステムループを含む。例えば、ｇＮＡバリアントは、トリプレックス領域に寄与する２つのトリプレットＵモチーフが隣接する足場ステムループまたはその置換を含む。いくつかの実施形態では、足場ステムループまたはその置換は、少なくとも４個のヌクレオチド、少なくとも５個のヌクレオチド、少なくとも６個のヌクレオチド、少なくとも７個のヌクレオチド、少なくとも７個のヌクレオチド、少なくとも８個のヌクレオチド、少なくとも９個のヌクレオチド、少なくとも１０個のヌクレオチド、少なくとも１１個のヌクレオチド、少なくとも１２個のヌクレオチド、少なくとも１３個のヌクレオチド、少なくとも１４個のヌクレオチド、少なくとも１５個のヌクレオチド、少なくとも１６個のヌクレオチド、少なくとも１７個のヌクレオチド、少なくとも１８個のヌクレオチド、少なくとも１９個のヌクレオチド、少なくとも２０個のヌクレオチド、少なくとも２１個のヌクレオチド、少なくとも２２個のヌクレオチド、少なくとも２３個のヌクレオチド、少なくとも２４個のヌクレオチド、または少なくとも２５個のヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、スペーサー領域に対して５’側の位置に－ＡＡＡＧ－を有するｃｒＲＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、－ＡＡＡＧ－配列は、スペーサー領域に対してすぐ５’側にある。
いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントを産生するための参照ｇＮＡに対する少なくとも１つのヌクレオチド修飾は、参照ｇＲＮＡと比較してＣａｓＸバリアントｇＮＡに少なくとも１つのヌクレオチド欠失を含む。いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、参照ｇＮＡと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の連続または非連続ヌクレオチドの欠失を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの欠失は、参照ｇＮＡと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個以上の連続ヌクレオチドの欠失を含む。いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、参照ｇＮＡと比較して、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個以上のヌクレオチドの欠失を含み、この欠失は連続ヌクレオチドにはない。参照ｇＲＮＡと比較してｇＮＡバリアントに２つ以上の非連続欠失が存在する実施形態では、本明細書に記載される、いずれの長さの欠失、およびいずれの長さの欠失の組み合わせも、本開示の範囲内であると企図される。例えば、いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、１つのヌクレオチドの第１の欠失および２つのヌクレオチドの第２の欠失を含んでもよく、これらの２つの欠失は連続していない。いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、参照ｇＲＮＡの異なる領域に少なくとも２つの欠失を含む。いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、参照ｇＲＮＡの同じ領域に少なくとも２つの欠失を含む。例えば、領域は、伸長ステムループ、足場ステムループ、足場ステムバブル、トリプレックスループ、シュードノット、トリプレックス、またはｇＮＡバリアントの５’末端であり得る。参照ｇＲＮＡにおけるいずれのヌクレオチドの欠失も、本開示の範囲内であると企図される。
いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントを生成するための参照ｇＲＮＡの少なくとも１つのヌクレオチド修飾は、少なくとも１つのヌクレオチド挿入を含む。いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、参照ｇＲＮＡと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の連続または非連続ヌクレオチドの挿入を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヌクレオチドの挿入は、参照ｇＲＮＡと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個以上の連続ヌクレオチドの挿入を含む。いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、参照ｇＲＮＡと比較して２つ以上の挿入を含み、これらの挿入は連続していない。参照ｇＲＮＡと比較してｇＮＡバリアントに２つ以上の非連続挿入が存在する実施形態では、本明細書に記載される、いずれの長さの挿入、およびいずれの長さの挿入の組み合わせも、本開示の範囲内であると企図される。例えば、いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、１つのヌクレオチドの第１の挿入および２つのヌクレオチドの第２の挿入を含んでもよく、これらの２つの挿入は連続していない。いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、参照ｇＲＮＡの異なる領域に少なくとも２つの挿入を含む。いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、参照ｇＲＮＡの同じ領域に少なくとも２つの挿入を含む。例えば、領域は、伸長ステムループ、足場ステムループ、足場ステムバブル、トリプレックスループ、シュードノット、トリプレックス、またはｇＮＡバリアントの５’末端であり得る。参照ｇＲＮＡにおける任意の位置でのＡ、Ｇ、Ｃ、Ｕ（または対応するＤＮＡではＴ）、またはそれらの組み合わせのいずれの挿入も、本開示の範囲内であると企図される。
いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントを生成するための参照ｇＲＮＡの少なくとも１つのヌクレオチド修飾は、少なくとも１つの核酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、参照ｇＲＮＡと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個以上の連続または非連続置換ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、参照ｇＲＮＡと比較して、１～４個のヌクレオチド置換を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの置換は、参照ｇＲＮＡと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個以上の連続ヌクレオチドの置換を含む。いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、参照ｇＲＮＡと比較して２つ以上の置換を含み、これらの置換は連続していない。参照ｇＲＮＡと比較してｇＮＡバリアントに２つ以上の非連続置換が存在する実施形態では、本明細書に記載される、いずれの長さの置換ヌクレオチド、およびいずれの長さの置換ヌクレオチドの組み合わせも、本開示の範囲内であると企図される。例えば、いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、１つのヌクレオチドの第１の置換および２つのヌクレオチドの第２の置換を含んでもよく、これらの２つの置換は連続していない。いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、参照ｇＲＮＡの異なる領域に少なくとも２つの置換を含む。いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、参照ｇＲＮＡの同じ領域に少なくとも２つの置換を含む。例えば、領域は、トリプレックス、伸長ステムループ、足場ステムループ、足場ステムバブル、トリプレックスループ、シュードノット、トリプレックス、またはｇＮＡバリアントの５’末端であり得る。参照ｇＲＮＡにおける任意の位置でのＡ、Ｇ、Ｃ、Ｕ（または対応するＤＮＡではＴ）、またはそれらの組み合わせのいずれの置換も、本開示の範囲内であると企図される。
本明細書に記載の置換、挿入、および欠失のうちのいずれかを組み合わせて、本開示のｇＮＡバリアントを生成することができる。例えば、ｇＮＡバリアントは、参照ｇＲＮＡと比較して少なくとも１つの置換および少なくとも１つの欠失、参照ｇＲＮＡと比較して少なくとも１つの置換および少なくとも１つの挿入、参照ｇＲＮＡと比較して少なくとも１つの挿入および少なくとも１つの欠失、または参照ｇＲＮＡと比較して少なくとも１つの置換、１つの挿入、および１つの欠失を含み得る。
いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、配列番号４～１６のうちのいずれか１つと少なくとも２０％同一、少なくとも３０％同一、少なくとも４０％同一、少なくとも５０％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一の足場領域を含む。いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、配列番号４～１６のうちのいずれか１つと少なくとも６０％相同（または同一）の足場領域を含む。
いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、配列番号１４と少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一のｔｒａｃｒステムループを含む。いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、配列番号１４と少なくとも６０％相同（または同一）のｔｒａｃｒステムループを含む。
いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、配列番号１５と少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一の伸長ステムループを含む。いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、配列番号１５と少なくとも６０％相同（または同一）の伸長ステムループを含む。
いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、以下に記載されるように、外因性伸長ステムループを含み、この点で参照ｇＮＡとは異なる。いくつかの実施形態では、外因性伸長ステムループは、本明細書に開示される参照ステムループ領域（例えば、配列番号１５）と同一性をほとんどまたは全く有しない。いくつかの実施形態では、外因性ステムループは、少なくとも１０ｂｐ、少なくとも２０ｂｐ、少なくとも３０ｂｐ、少なくとも４０ｂｐ、少なくとも５０ｂｐ、少なくとも６０ｂｐ、少なくとも７０ｂｐ、少なくとも８０ｂｐ、少なくとも９０ｂｐ、少なくとも１００ｂｐ、少なくとも２００ｂｐ、少なくとも３００ｂｐ、少なくとも４００ｂｐ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも６００ｂｐ、少なくとも７００ｂｐ、少なくとも８００ｂｐ、少なくとも９００ｂｐ、少なくとも１，０００ｂｐ、少なくとも２，０００ｂｐ、少なくとも３，０００ｂｐ、少なくとも４，０００ｂｐ、少なくとも５，０００ｂｐ、少なくとも６，０００ｂｐ、少なくとも７，０００ｂｐ、少なくとも８，０００ｂｐ、少なくとも９，０００ｂｐ、少なくとも１０，０００ｂｐ、少なくとも１２，０００ｂｐ、少なくとも１５，０００ｂｐ、または少なくとも２０，０００ｂｐである。いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、少なくとも１０、少なくとも１００、少なくとも５００、少なくとも１０００、または少なくとも１０，０００個のヌクレオチドを含む伸長ステムループ領域を含む。いくつかの実施形態では、異種ステムループは、ｇＮＡの安定性を増加させる。いくつかの実施形態では、異種ＲＮＡステムループは、タンパク質、ＲＮＡ構造、ＤＮＡ配列、または小分子に結合することができる。いくつかの実施形態では、外因性ステムループ領域は、ＲＮＡステムループまたはヘアピン、例えば、熱安定性ＲＮＡ、例えば、ＭＳ２（ＡＣＡＵＧＡＧＧＡＵＵＡＣＣＣＡＵＧＵ（配列番号３５））、Ｑβ（ＵＧＣＡＵＧＵＣＵＡＡＧＡＣＡＧＣＡ（配列番号３６））、Ｕ１ヘアピンＩＩ（ＡＡＵＣＣＡＵＵＧＣＡＣＵＣＣＧＧＡＵＵ（配列番号３７））、Ｕｖｓｘ（ＣＣＵＣＵＵＣＧＧＡＧＧ（配列番号３８））、ＰＰ７（ＡＧＧＡＧＵＵＵＣＵＡＵＧＧＡＡＡＣＣＣＵ（配列番号３９））、ファージ複製ループ（ＡＧＧＵＧＧＧＡＣＧＡＣＣＵＣＵＣＧＧＵＣＧＵＣＣＵＡＵＣＵ（配列番号４０））、キッシングループ＿ａ（ＵＧＣＵＣＧＣＵＣＣＧＵＵＣＧＡＧＣＡ（配列番号４１））、キッシングループ＿ｂ１（ＵＧＣＵＣＧＡＣＧＣＧＵＣＣＵＣＧＡＧＣＡ（配列番号４２））、キッシングループ＿ｂ２（ＵＧＣＵＣＧＵＵＵＧＣＧＧＣＵＡＣＧＡＧＣＡ（配列番号４３））、ＧクアッドリプレックスＭ３ｑ（ＡＧＧＧＡＧＧＧＡＧＧＧＡＧＡＧＧ（配列番号４４））、Ｇクアッドリプレックステロメアバスケット（ＧＧＵＵＡＧＧＧＵＵＡＧＧＧＵＵＡＧＧ（配列番号４５））、サルシン－リシンループ（ＣＵＧＣＵＣＡＧＵＡＣＧＡＧＡＧＧＡＡＣＣＧＣＡＧ（配列番号４６））、またはシュードノット（ＵＡＣＡＣＵＧＧＧＡＵＣＧＣＵＧＡＡＵＵＡＧＡＧＡＵＣＧＧＣＧＵＣＣＵＵＵＣＡＵＵＣＵＡＵＡＵＡＣＵＵＵＧＧＡＧＵＵＵＵＡＡＡＡＵＧＵＣＵＣＵＡＡＧＵＡＣＡ（配列番号４７））を含む。いくつかの実施形態では、外因性ステムループは、ＲＮＡ足場を含む。本明細書で使用される場合、「ＲＮＡ足場」とは、１つ以上のタンパク質と相互作用し、かつそれらを組織化または局在化することができる多次元ＲＮＡ構造を指す。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ足場は、合成であるか、または天然に存在しない。いくつかの実施形態では、外因性ステムループは、長い非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）を含む。本明細書で使用される場合、ｌｎｃＲＮＡは、およそ２００ｂｐよりも長い非コードＲＮＡを指す。いくつかの実施形態では、外因性ステムループの５’末端と３’末端が塩基対を形成する、すなわち、それらが相互作用してデュプレックスＲＮＡの領域を形成する。いくつかの実施形態では、外因性ステムループの５’末端と３’末端が塩基対を形成し、外因性ステムループの５’末端と３’末端との間の１つ以上の領域は塩基対を形成しない。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヌクレオチド修飾は、（ａ）１つ以上の領域におけるｇＮＡバリアントの１～１５個の連続もしくは非連続ヌクレオチドの置換、（ｂ）１つ以上の領域におけるｇＮＡバリアントの１～１０個の連続もしくは非連続ヌクレオチドの欠失、（ｃ）１つ以上の領域におけるｇＮＡバリアントの１～１０個の連続もしくは非連続ヌクレオチドの挿入、（ｄ）近位５’末端および３’末端を有する異種ＲＮＡ源由来のＲＮＡステムループ配列での足場ステムループもしくは伸長ステムループの置換、または（ａ）～（ｄ）の任意の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、配列番号１４と少なくとも６０％の同一性を有する足場ステムループを含む。いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、配列番号１４と少なくとも６０％の同一性、少なくとも７０％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９８％の同一性または少なくとも９９％の同一性を有する足場ステムループを含む。いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、配列番号１４を含む足場ステムループを含む。
いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、ＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＧＵＧＧ（配列番号３２）の足場ステムループ配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、それと少なくとも１、２、３、４、または５つのミスマッチを有するＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＧＵＧＧ（配列番号３２）の足場ステムループ配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、３２個未満のヌクレオチド、３１個未満のヌクレオチド、３０個未満のヌクレオチド、２９個未満のヌクレオチド、２８個未満のヌクレオチド、２７個未満のヌクレオチド、２６個未満のヌクレオチド、２５個未満のヌクレオチド、２４個未満のヌクレオチド、２３個未満のヌクレオチド、２２個未満のヌクレオチド、２１個未満のヌクレオチド、または２０個未満のヌクレオチドを含む伸長ステムループ領域を含む。いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、３２個未満のヌクレオチドを含む伸長ステムループ領域を含む。いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、熱安定性ステムループをさらに含む。
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡバリアントは、配列番号２１０４、配列番号２１０６、配列番号２１６３、配列番号２１０７、配列番号２１６４、配列番号２１６５、配列番号２１６６、配列番号２１０３、配列番号２１６７、配列番号２１０５、配列番号２１０８、配列番号２１１２、配列番号２１６０、配列番号２１７０、配列番号２１１４、配列番号２１７１、配列番号２１１２、配列番号２１７３、配列番号２１０２、配列番号２１７４、配列番号２１７５、配列番号２１０９、配列番号２１７６、配列番号２２３８、配列番号２２３９、配列番号２２４０、配列番号２２４１、配列番号２２７４、または配列番号２２７５の配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、配列番号２２３６、２２３７、２２３８、２２４１、２２４４、２２４８、２２４９、もしくは２２５９～２２８０のうちのいずれか１つの配列を含むか、またはそれと少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、配列番号２２０１～２２８０のうちのいずれか１つの配列に対して１つ以上の追加の変化を含む。いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、配列番号２２３６、２２３７、２２３８、２２４１、２２４４、２２４８、２２４９、または２２５９～２２８０のうちのいずれか１つの配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡバリアントは、配列番号２１０４、配列番号２１６３、配列番号２１０７、配列番号２１６４、配列番号２１６５、配列番号２１６６、配列番号２１０３、配列番号２１６７、配列番号２１０５、配列番号２１０８、配列番号２１１２、配列番号２１６０、配列番号２１７０、配列番号２１１４、配列番号２１７１、配列番号２１１２、配列番号２１７３、配列番号２１０２、配列番号２１７４、配列番号２１７５、配列番号２１０９、配列番号２１７６、配列番号２２３８、配列番号２２３９、配列番号２２４０、配列番号２２４１、配列番号２２７４、または配列番号２２７５の配列に対して１つ以上の追加の変化を含む。
本開示のｇＮＡバリアントのいくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、少なくとも１つの修飾を含み、配列番号５の参照ガイド足場と比較した少なくとも１つの修飾は、（ａ）トリプレックスループにおけるＣ１８Ｇ置換、（ｂ）ステムバブルにおけるＧ５５挿入、（ｃ）Ｕ１欠失、（ｄ）伸長ステムループの修飾であって、（ｉ）６ｎｔのループおよび１３個のループ近位塩基対がＵｖｓｘヘアピンによって置き換えられ、（ｉｉ）完全に塩基形成されたループ遠位塩基をもたらすＡ９９の欠失およびＧ６５Ｕの置換である、伸長ステムループの修飾のうちの１つ以上から選択される。かかる実施形態では、ｇＮＡバリアントは、配列番号２２３６、２２３７、２２３８、２２４１、２２４４、２２４８、２２４９、または２２５９～２２８０のうちのいずれか１つの配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントの足場は、表２の配列番号２２０１～２２８０のうちのいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇＮＡの足場は、配列番号２２０１～２２８０のうちのいずれか１つの配列からなる、またはそれから本質的になる。いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアント配列の足場は、配列番号２２０１～２２８０のうちのいずれか１つと少なくとも約６０％同一、少なくとも約６５％同一、少なくとも約７０％同一、少なくとも約７５％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９１％同一、少なくとも約９２％同一、少なくとも約９３％同一、少なくとも約９４％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、または少なくとも約９９％同一である。
ｇＮＡバリアントの実施形態では、ｇＮＡは、少なくとも１４～約３５個のヌクレオチドを含む、上でより完全に記載されているスペーサー（または標的配列）領域をさらに含み、スペーサーは、標的ＤＮＡに相補的な配列で設計される。いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、標的ＤＮＡに相補的な少なくとも１０～３０個のヌクレオチドの標的配列を含む。いくつかの実施形態では、標的配列は、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、２０個のヌクレオチドを有する標的配列を含む。いくつかの実施形態では、標的配列は、２５個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的配列は、２４個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的配列は、２３個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的配列は、２２個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的配列は、２１個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的配列は、２０個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的配列は、１９個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的配列は、１８個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的配列は、１７個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的配列は、１６個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的配列は、１５個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的配列は、１４個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、本開示は、表３Ａ、表３Ｂ、または表３Ｃの配列と少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、または１００％同一の配列を含む本開示のｇＮＡバリアントに包含するための標的配列を提供する。いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントの標的配列は、配列の３’末端から単一のヌクレオチドが除去された、表３Ａ、表３Ｂ、または表３Ｃの配列を含む。他の実施形態では、ｇＮＡバリアントの標的配列は、配列の３’末端から２つのヌクレオチドが除去された、表３Ａ、表３Ｂ、または表３Ｃの配列を含む。他の実施形態では、ｇＮＡバリアントの標的配列は、配列の３’末端から３つのヌクレオチドが除去された、表３Ａ、表３Ｂ、または表３Ｃの配列を含む。他の実施形態では、ｇＮＡバリアントの標的配列は、配列の３’末端から４つのヌクレオチドが除去された、表３Ａ、表３Ｂ、または表３Ｃの配列を含む。他の実施形態では、ｇＮＡバリアントの標的配列は、配列の３’末端から５つのヌクレオチドが除去された、表３の配列を含む。
表３Ａ．Ｂ２ＭのｇＮＡ標的配列
表３Ａは図３５に提供され、全体を通して表３Ａと称される。
表３Ｂ．ＴＲＡＣのｇＮＡ標的配列
表３Ｂは図３６に提供され、全体を通して表３Ｂと称される。
表３Ｃ：ＣＩＩＴＡのｇＮＡ標的配列
表３Ｃは図３７に提供され、全体を通して表３Ｃと称される。
表３Ａ、表３Ｂ、および表３Ｃ中、左の列はＰＡＭ配列を示し、右の列は対応するスペーサー配列（本明細書では標的配列と称されることもある）の配列番号を示す。
いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントの足場は、配列番号１、配列番号２、または配列番号３を含む参照ＣａｓＸタンパク質を有するＲＮＰの一部である。他の実施形態では、ｇＮＡバリアントの足場は、表４、７、８、９、もしくは１１の配列のうちのいずれか１つ、またはそれと少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含むＣａｓＸバリアントタンパク質を有するＲＮＰの一部である。前述の実施形態では、ｇＮＡは、スペーサー配列をさらに含む。
いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントの足場は、配列番号４または配列番号５を含む参照ｇＲＮＡの配列に対して１つ以上の追加の変化を含むバリアントである。参照ｇＲＮＡの足場が配列番号４または配列番号５に由来する実施形態では、ｇＮＡバリアントの１つ以上の改善または追加された特性は、配列番号４または配列番号５の同じ特性と比較して改善される。
ｈ．ＣａｓＸタンパク質との複合体形成
いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、参照ｇＲＮＡと比較して、ＣａｓＸタンパク質（参照ＣａｓＸまたはＣａｓＸバリアントタンパク質など）と複合体を形成する改善された能力を有する。いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、参照ｇＲＮＡと比較して、ＣａｓＸタンパク質（参照またはバリアントタンパク質など）に対する改善された親和性を有し、それにより、実施例に記載されるように、ＣａｓＸタンパク質とリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成するその能力を改善する。リボ核タンパク質複合体形成を改善することにより、いくつかの実施形態では、機能的ＲＮＰが組み立てられる効率が改善され得る。いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントおよびそのスペーサーを含むＲＮＰの９０％超、９３％超、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超、または９９％超が、標的核酸の遺伝子編集の能力を有する。
ＣａｓＸタンパク質と複合体を形成するｇＮＡバリアントの能力を改善することができる例示的なヌクレオチド変化は、いくつかの実施形態では、足場ステムを熱安定性ステムループで置き換えることを含み得る。いかなる理論にも拘束されることを望むことなく、足場ステムを熱安定性ステムループで置き換えることにより、ＣａｓＸタンパク質とのｇＮＡバリアントの全体的な結合安定性を増加させることができる。あるいは、または加えて、ステムループの大部分を除去することにより、ｇＮＡバリアントのフォールディング動態が変化し、機能的な折り畳まれたｇＮＡが容易かつ迅速に作製され、例えば、ｇＮＡバリアントが自身に「絡まる」可能性の程度を減少させることによって、構造的に組み立てられ得る。いくつかの実施形態では、足場ステムループ配列の選択は、ｇＮＡに利用される異なるスペーサーによって変化し得る。いくつかの実施形態では、足場配列は、スペーサー、ひいては標的配列に合わせて調整され得る。生化学的アッセイを使用して、実施例のアッセイを含む、ＲＮＰを形成するためのｇＮＡバリアントに対するＣａｓＸタンパク質の結合親和性を評価することができる。例えば、当業者であれば、追加の非標識「コールド競合物」ｇＮＡの増加濃度に対する応答として、固定化されたＣａｓＸタンパク質に結合している蛍光標識ｇＮＡの量の変化を測定することができる。あるいは、または加えて、異なる量の蛍光標識ｇＮＡが固定化されたＣａｓＸタンパク質上に流されたときに蛍光シグナルがどのように変化するかを監視または確認することができる。あるいは、ＲＮＰを形成する能力は、定義された標的核酸配列に対するインビトロ切断アッセイを使用して評価することができる。
ｉ．ｇＮＡ安定性
いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、参照ｇＲＮＡと比較して改善された安定性を有する。安定性および効率的なフォールディングの増加は、いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントが標的細胞内に存続する程度を増加させることができ、それにより、遺伝子編集などのＣａｓＸ機能を実行することができる機能的ＲＮＰを形成する機会を増加させることができる。ｇＮＡバリアントの安定性の増加は、いくつかの実施形態では、より少ない量のｇＮＡが細胞に送達される同様の結果を可能にすることができ、次いで、遺伝子編集中のオフターゲット効果の機会を低減させることができる。
別の態様では、本開示は、足場ステムループおよび／または伸長ステムループがヘアピンループまたは熱安定性ＲＮＡステムループで置き換えられるｇＮＡを提供し、結果として生じたｇＮＡは、増加した安定性を有し、ループの選択に応じて、ある特定の細胞タンパク質またはＲＮＡと相互作用することができる。いくつかの実施形態では、置換ＲＮＡループは、ＭＳ２、Ｑβ、Ｕ１ヘアピンＩＩ、Ｕｖｓｘ、ＰＰ７、ファージ複製ループ、キッシングループ＿ａ、キッシングループ＿ｂ１、キッシングループ＿ｂ２、ＧクアッドリプレックスＭ３ｑ、Ｇクアッドリプレックステロメアバスケット、サルシン－リシンループ、およびシュードノットから選択される。かかる構成要素を含むｇＮＡバリアントの配列が表２Ｂに示される。
ガイドＲＮＡ安定性は、例えば、インビトロでガイドを組み立てること、細胞内環境を模倣する溶液中で様々な期間インキュベートすること、その後、本明細書に記載のインビトロ切断アッセイにより機能的活性を測定することを含む、様々な方法で評価することができる。あるいは、または加えて、ｇＮＡがｇＮＡの初期トランスフェクション／形質導入後の様々な時点で細胞から収集されて、参照ｇＲＮＡと比較してｇＮＡバリアントがどのくらい存続するかを決定することができる。
ｊ．溶解性
いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、参照ｇＲＮＡと比較して改善された溶解性を有する。いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、参照ｇＲＮＡと比較して改善されたＣａｓＸタンパク質：ｇＮＡ ＲＮＰの溶解性を有する。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質：ｇＮＡ ＲＮＰの溶解性は、ｇＮＡバリアントの５’末端または３’末端、例えば、参照ｓｇＲＮＡの５’側または３’側にリボザイム配列を付加することによって改善される。Ｍ１リボザイムなどのいくつかのリボザイムは、ＲＮＡ媒介性タンパク質フォールディングによりタンパク質の溶解性を増加させることができる。
本明細書に記載のｇＮＡバリアントを含むＣａｓＸ ＲＮＰの溶解性の増加は、当業者に既知の様々な手段によって、例えば、ＣａｓＸおよびｇＮＡバリアントが発現される溶解したＥ．ｃｏｌｉの可溶性画分のゲル上で濃度測定読み取りを行うことによって評価することができる。
ｋ．ヌクレアーゼ活性に対する抵抗性
いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、参照ｇＲＮＡと比較して改善されたヌクレアーゼ活性に対する抵抗性を有する。いかなる理論にも拘束されることを望むことなく、細胞で見つけられるヌクレアーゼなどのヌクレアーゼに対する抵抗性の増加は、例えば、細胞内環境におけるバリアントｇＮＡの持続性を増加させ、それにより、遺伝子編集を改善することができる。
多くのヌクレアーゼは加工性であり、ＲＮＡを３’から５’への様式で分解する。したがって、いくつかの実施形態では、ｇＮＡの一方もしくは両方の末端へのヌクレアーゼ抵抗性二次構造の付加、またはｓｇＮＡの二次構造を変化させるヌクレオチド変化により、ヌクレアーゼ活性に対する増加した抵抗性を有するｇＮＡバリアントを生成することができる。ヌクレアーゼ活性に対する抵抗性は、当業者に既知の様々な方法によって評価することができる。例えば、ヌクレアーゼ活性に対する抵抗性を測定するインビトロ法は、例えば、参照ｇＮＡおよびバリアントを１つ以上の例示的なＲＮＡヌクレアーゼと接触させることと、分解を測定することとを含み得る。あるいは、または加えて、本明細書に記載の方法を使用して細胞環境におけるｇＮＡバリアントの存続性を測定することにより、ｇＮＡバリアントがヌクレアーゼ抵抗性である程度を示すことができる。
ｌ．標的ＤＮＡに対する結合親和性
いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、参照ｇＲＮＡと比較して改善された標的ＤＮＡに対する親和性を有する。ある特定の実施形態では、ｇＮＡバリアントを含むリボ核タンパク質複合体は、参照ｇＲＮＡを含むＲＮＰの親和性と比較して改善された標的ＤＮＡに対する親和性を有する。いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡに対するＲＮＰの改善された親和性は、標的配列に対する改善された親和性、ＰＡＭ配列に対する改善された親和性、標的配列のＤＮＡを探し出すＲＮＰの改善された能力、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡに対する改善された親和性は、全体的なＤＮＡ結合親和性の増加の結果である。
理論に拘束されることを望むことなく、ＣａｓＸタンパク質のＯＢＤの機能に影響を与えるｇＮＡバリアントのヌクレオチド変化は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に結合するＣａｓＸバリアントタンパク質の親和性を増加させることができ、にＴＴＣ、ＡＴＣ、ＧＴＣ、およびＣＴＣからなる群から選択されるＰＡＭ配列を含む、配列番号２の参照ＣａｓＸタンパク質によって認識される標準的ＴＴＣ ＰＡＭ以外の増加したスペクトルのＰＡＭ配列に結合するまたはそれを利用する能力も増加させることができ、それにより、標的ＤＮＡ配列に対するＣａｓＸバリアントタンパク質の親和性および多様性を増加させ、参照ＣａｓＸと比較して、編集および／または結合することができる標的核酸配列の実質的な増加をもたらす。以下でより完全に記載されるように、参照ＣａｓＸと比較して、編集することができる標的核酸の配列の増加は、ＰＡＭおよびプロトスペーサー配列の両方、ならびに非標的鎖の配向に応じたそれらの方向性を指す。これは、標的鎖ではなく非標的鎖のＰＡＭ配列が切断を決定するか、または標的認識に機械的に関与していることを意味するものではない。例えば、ＴＴＣ ＰＡＭを参照する場合、それは、実際には、標的切断に必要な相補的ＧＡＡ配列である場合もあれば、両方の鎖由来のヌクレオチドのある組み合わせである場合もある。本明細書に開示されるＣａｓＸタンパク質の場合、ＰＡＭはプロトスペーサーの５’側に位置し、少なくとも単一のヌクレオチドがＰＡＭをプロトスペーサーの第１のヌクレオチドから分離している。あるいは、または加えて、標的ＤＮＡ鎖に対するＣａｓＸバリアントタンパク質の親和性を増加させるヘリカルＩおよび／またはヘリカルＩＩドメインの機能に影響を与えるｇＮＡの変化は、標的ＤＮＡに対するバリアントｇＮＡを含むＣａｓＸ ＲＮＰの親和性を増加させることができる。
ｍ．ｇＮＡ機能の付加または変化
いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、参照ｇＲＮＡに関してｇＮＡバリアントのトポロジーを変化させるより大きい構造変化を含み、それにより、異なるｇＮＡの機能性を可能にすることができる。例えば、いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、参照ｇＲＮＡ足場の内因性ステムループを、以前に特定された安定したＲＮＡ構造と、またはタンパク質もしくはＲＮＡ結合パートナーと相互作用してＣａｓＸに追加の部分を動員するか、またはこのＲＮＡ構造への結合パートナーを有するウイルスカプシドの内部などの特定の位置にＣａｓＸを動員するステムループと交換したものである。他の状況では、キッシングループで見られるように、ＲＮＡが互いに動員される場合があり、これにより、２つのＣａｓＸタンパク質が標的ＤＮＡ配列でのより効率的な遺伝子編集のために共局在化されるようになり得る。かかるＲＮＡ構造には、ＭＳ２、Ｑβ、Ｕ１ヘアピンＩＩ、Ｕｖｓｘ、ＰＰ７、ファージ複製ループ、キッシングループ＿ａ、キッシングループ＿ｂ１、キッシングループ＿ｂ２、ＧクアッドリプレックスＭ３ｑ、Ｇクアッドリプレックステロメアバスケット、サルシン－リシンループ、またはシュードノットが含まれ得る。
いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、末端融合パートナーを含む。例示的な末端融合には、自己切断リボザイムまたはタンパク質結合モチーフへのｇＲＮＡの融合が含まれ得る。本明細書で使用される場合、「リボザイム」とは、タンパク質酵素と同様の１つ以上の触媒活性を有するＲＮＡまたはそのセグメントを指す。例示的なリボザイム触媒活性には、例えば、ＲＮＡの切断および／もしくはライゲーション、ＤＮＡの切断および／もしくはライゲーション、またはペプチド結合形成が含まれ得る。いくつかの実施形態では、かかる融合は、足場フォールディングを改善するか、またはＤＮＡ修復機構を動員することができる。例えば、ｇＲＮＡは、いくつかの実施形態では、デルタ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）アンチゲノムリボザイム、ＨＤＶゲノムリボザイム、ハチェットリボザイム（メタゲノムデータからのもの）、ｅｎｖ２５ピストルリボザイム（Ａｌｉｉｓｔｉｐｅｓ ｐｕｔｒｅｄｉｎｉｓ由来の代表的なもの）、ＨＨ１５最小ハンマーヘッドリボザイム、タバコリングスポットウイルス（ＴＲＳＶ）リボザイム、野生型ウイルスハンマーヘッドリボザイム（および合理的なバリアント）、またはツイステッドシスター１もしくはＲＢＭＸリクルーティングモチーフに融合され得る。ハンマーヘッドリボザイムは、ＲＮＡ分子内の特定の部位で可逆的切断およびライゲーション反応を触媒するＲＮＡモチーフである。ハンマーヘッドリボザイムには、Ｉ型、ＩＩ型、およびＩＩＩ型ハンマーヘッドリボザイムが含まれる。ＨＤＶ、ピストル、およびハチェットリボザイムは、自己切断活性を有する。１つ以上のリボザイムを含むｇＮＡバリアントは、ｇＲＮＡ参照と比較して拡張されたｇＮＡ機能を可能にし得る。例えば、自己切断リボザイムを含むｇＮＡは、いくつかの実施形態では、転写され、ポリシストロン転写物の一部として成熟ｇＮＡに処理され得る。かかる融合は、ｇＮＡの５’末端または３’末端のいずれかで起こり得る。いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、５’末端および３’末端の両方に融合を含み、これらの融合は各々独立して、本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、ファージ複製ループまたはテトラループを含む。いくつかの実施形態では、ｇＮＡは、タンパク質に結合することができるヘアピンループを含む。例えば、いくつかの実施形態では、ヘアピンループは、ＭＳ２、Ｑβ、Ｕ１ヘアピンＩＩ、Ｕｖｓｘ、またはＰＰ７ヘアピンループである。
いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、１つ以上のＲＮＡアプタマーを含む。本明細書で使用される場合、「ＲＮＡアプタマー」とは、高い親和性および高い特異性で標的に結合するＲＮＡ分子を指す。
いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、１つ以上のリボスイッチを含む。本明細書で使用される場合、「リボスイッチ」とは、小分子に結合すると状態を変化させるＲＮＡ分子を指す。
いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、１つ以上のタンパク質結合モチーフをさらに含む。本開示の参照ｇＲＮＡまたはｇＮＡバリアントにタンパク質結合モチーフを付加することにより、いくつかの実施形態では、ＣａｓＸ ＲＮＰが追加のタンパク質と会合することを可能にし得、例えば、それらのタンパク質の機能性をＣａｓＸ ＲＮＰに付加することができる。
ｎ．化学的に修飾されたｇＮＡ
いくつかの実施形態では、本開示は、化学的に修飾されたｇＮＡに関する。いくつかの実施形態では、本開示は、ガイドＲＮＡ機能性を有し、かつヌクレアーゼによる切断に対する低下した感受性を有する化学的に修飾されたｇＮＡを提供する。４つの標準的リボヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｇ、およびＵ以外の任意のヌクレオチド、またはデオキシヌクレオチドを含むｇＮＡは、化学的に修飾されたｇＮＡである。いくつかの事例では、化学的に修飾されたｇＮＡは、天然ホスホジエステルヌクレオチド間結合以外の任意の骨格またはヌクレオチド間結合を含む。ある特定の実施形態では、保持される機能性は、本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかのＣａｓＸに結合する修飾されたｇＮＡの能力を含む。ある特定の実施形態では、保持される機能性は、標的核酸配列に結合する修飾されたｇＮＡの能力を含む。ある特定の実施形態では、保持される機能性は、ＣａｓＸタンパク質を標的とすること、または標的核酸配列に結合する予め複合体形成されたＣａｓＸタンパク質－ｇＮＡの能力を含む。ある特定の実施形態では、保持される機能性は、ＣａｓＸ－ｇＮＡによって標的ポリヌクレオチドをニッキングする能力を含む。ある特定の実施形態では、保持される機能性は、ＣａｓＸ－ｇＮＡによって標的核酸配列を切断する能力を含む。ある特定の実施形態では、保持される機能性は、本開示の実施形態のＣａｓＸタンパク質を有するＣａｓＸ系におけるｇＮＡの任意の他の既知の機能である。
いくつかの実施形態では、本開示は、ヌクレオチド糖修飾が、２′－Ｏ－Ｃ１－４アルキル、例えば、２′－Ｏ－メチル（２′－ＯＭｅ）、２′－デオキシ（２′－Ｈ）、２′－Ｏ－Ｃ１－３アルキル－Ｏ－Ｃ１－３アルキル、例えば、２′－メトキシエチル（「２′－ＭＯＥ」）、２′－フルオロ（「２′－Ｆ」）、２′－アミノ（「２′－ＮＨ２」）、２′－アラビノシル（「２′－アラビノ」）ヌクレオチド、２′－Ｆ－アラビノシル（「２′－Ｆ－アラビノ」）ヌクレオチド、２′－ロックド核酸（「ＬＮＡ」）ヌクレオチド、２′－アンロックド核酸（「ＵＬＮＡ」）ヌクレオチド、Ｌ型の糖（「Ｌ－糖」）、および４′－チオリボシルヌクレオチドからなる群から選択されるｇＮＡに組み込まれている、化学的に修飾されたｇＮＡを提供する。他の実施形態では、ガイドＲＮＡに組み込まれるヌクレオチド間結合修飾は、ホスホロチオエート「Ｐ（Ｓ）」（Ｐ（Ｓ））、ホスホノカルボキシレート（Ｐ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ）、例えば、ホスホノアセテート「ＰＡＣＥ」（Ｐ（ＣＨ２ＣＯＯ－））、チオホスホノカルボキシレート（（Ｓ）Ｐ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ）、例えば、チオホスホノアセテート「チオＰＡＣＥ」（（Ｓ）Ｐ（ＣＨ２）ｎＣＯＯ－））、アルキルホスホネート（Ｐ（Ｃ１－３アルキル）、例えば、メチルホスホネート－Ｐ（ＣＨ３）、ボラノホスホネート（Ｐ（ＢＨ３））、およびホスホロジチオエート（Ｐ（Ｓ）２）からなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、本開示は、核酸塩基（「塩基」）修飾が、２－チオウラシル（「２－チオＵ」）、２－チオシトシン（「２－チオＣ」）、４－チオウラシル（「４－チオＵ」）、６－チオグアニン（「６－チオＧ」）、２－アミノアデニン（「２－アミノＡ」）、２－アミノプリン、シュードウラシル、ヒポキサンチン、７－デアザグアニン、７－デアザ－８－アザグアニン、７－デアザアデニン、７－デアザ－８－アザアデニン、５－メチルシトシン（「５－メチルＣ」）、５－メチルウラシル（「５－メチルＵ」）、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－ヒドロキシメチルウラシル、５，６－デヒドロウラシル、５－プロピニルシトシン、５－プロピニルウラシル、５－エチニルシトシン、５－エチニルウラシル、５－アリルウラシル（「５－アリルＵ」）、５－アリルシトシン（「５－アリルＣ」）、５－アミノアリルウラシル（「５－アミノアリルＵ」）、５－アミノアリル－シトシン（「５－アミノアリルＣ」）、脱塩基ヌクレオチド、Ｚ塩基、Ｐ塩基、非構造化核酸（「ＵＮＡ」）、イソグアニン（「イソＧ」）、イソシトシン（「イソＣ」）、５－メチル－２－ピリミジン、ｘ（Ａ，Ｇ，Ｃ，Ｔ）、およびｙ（Ａ，Ｇ，Ｃ，Ｔ）からなる群から選択されるｇＮＡに組み込まれている、化学的に修飾されたｇＮＡを提供する。
他の実施形態では、本開示は、１つ以上の同位体修飾が、１つ以上の１５Ｎ、１３Ｃ、１４Ｃ、重水素、３Ｈ、３２Ｐ、１２５Ｉ、１３１Ｉ原子、またはトレーサーとして使用される他の原子もしくは元素を含むヌクレオチドを含む、ヌクレオチド糖、核酸塩基、ホスホジエステル結合、および／またはヌクレオチドホスフェートに導入されている、化学的に修飾されたｇＮＡを提供する。
いくつかの実施形態では、ｇＮＡに組み込まれる「末端」修飾は、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）、炭化水素リンカー（ヘテロ原子（Ｏ、Ｓ、Ｎ）置換炭化水素スペーサー、ハロ置換炭化水素スペーサー、ケト－、カルボキシル－、アミド－、チオニル－、カルバモイル－、チオノカルバマオイル含有炭化水素スペーサーを含む）、スペルミンリンカー、例えば、６－フルオレセインーヘキシル、クエンチャー（例えば、ダブシル、ＢＨＱ）、および他の標識（例えば、ビオチン、ジゴキシゲニン、アクリジン、ストレプトアビジン、アビジン、ペプチド、および／またはタンパク質）などのリンカーに結合した蛍光色素を含む色素（例えば、フルオレセイン、ローダミン、シアニン）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、「末端」修飾は、デオキシヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチドのオリゴヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、糖、オリゴ糖、ステロイド、脂質、葉酸、ビタミン、および／または他の分子を含む別の分子へのｇＮＡのコンジュゲーション（またはライゲーション）を含む。ある特定の実施形態では、本開示は、「末端」修飾（上記）が、ホスホジエステル結合として組み込まれ、かつｇＮＡ内の２つのヌクレオチド間のどこにでも組み込まれ得る、例えば、２－（４－ブチルアミドフルオレセイン）プロパン－１，３－ジオールビス（ホスホジエステル）リンカーなどのリンカーを介してｇＮＡ配列の内部に位置する、化学的に修飾されたｇＮＡを提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、アミン、チオール（またはスルフヒドリル）、ヒドロキシル、カルボキシル、カルボニル、チオニル、チオカルボニル、カルバモイル、チオカルバモイル、ホスホリル、アルケン、アルキン、ハロゲン、または蛍光色素、非蛍光標識、タグ（１４Ｃの場合、例えば、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、または１５Ｎ、１３Ｃ、重水素、３Ｈ、３２Ｐ、１２５Ｉなどの同位体標識を含む部分）、オリゴヌクレオチド（アプタマーを含む、デオキシヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチドを含む）、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、糖、オリゴ糖、ステロイド、脂質、葉酸、およびビタミンからなる群から選択される所望の部分に後にコンジュゲートされ得る官能基末端リンカーなどの末端官能基を含む末端修飾を有する化学的に修飾されたｇＮＡを提供する。コンジュゲーションは、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、イソチオシアネート、ＤＣＣ（またはＤＣＩ）、および／または“Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ” ｂｙ Ｇｒｅｇ Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ Ｅｓｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ，３ｒｄ ｅｄ．（２０１３）（この内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載の任意の他の標準方法によるカップリングを含むが、これらに限定されない、当該技術分野で周知の標準化学を用いる。
ＩＶ．標的核酸を修飾するためのタンパク質
本開示は、真核細胞のゲノム編集に有用なＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを含む系を提供する。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ）、ＣａｓＸ、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃａｓ１４、Ｃｐｆｌ、Ｃ２ｃｌ、Ｃｓｎ２、およびＣａｓ Ｐｈｉからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、本開示は、真核細胞の標的核酸配列を修飾するように特別に設計された、ＣａｓＸタンパク質と、１つ以上のガイド核酸（ｇＮＡ）とを含む系を提供する。
本明細書で使用される「ＣａｓＸタンパク質」という用語は、タンパク質のファミリーを指し、全ての天然に存在するＣａｓＸタンパク質、天然に存在するＣａｓＸタンパク質と少なくとも５０％の同一性を共有するタンパク質、および天然に存在する参照ＣａｓＸタンパク質と比較して１つ以上の改善された特性を有するＣａｓＸバリアントを包含する。ＣａｓＸタンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ Ｖ型タンパク質に属する。ＣａｓＸバリアント実施形態の例示的な改善された特性には、以下により完全に記載される、バリアントの改善されたフォールディング、ｇＮＡに対する改善された結合親和性、標的核酸に対する改善された結合親和性、標的ＤＮＡの編集および／または結合においてＰＡＭ配列のより広範なスペクトルを利用する改善された能力、標的ＤＮＡの改善された巻き戻し、増加した編集活性、改善された編集効率、改善された編集特異性、効果的に編集され得る真核生物ゲノムの増加した割合、増加したヌクレアーゼ活性、二本鎖切断のための増加した標的鎖負荷、一本鎖ニッキングのための減少した標的鎖負荷、減少したオフターゲット切断、ＤＮＡの非標的鎖の改善された結合、改善されたタンパク質安定性、改善されたタンパク質：ｇＮＡ（ＲＮＰ）複合体安定性、改善されたタンパク質溶解性、改善されたタンパク質：ｇＮＡ（ＲＮＰ）複合体溶解性、改善されたタンパク質収量、改善されたタンパク質発現、ならびに改善された融合特性が含まれるが、これらに限定されない。前述の実施形態では、ＣａｓＸバリアントおよびｇＮＡバリアントのＲＮＰの改善された特性のうちの１つ以上は、同等の様式でアッセイされた場合、配列番号１、配列番号２、または配列番号３の参照ＣａｓＸタンパク質と表１のｇＮＡとのＲＮＰと比較して、少なくとも約１．１～約１００，０００倍改善される。他の事例では、ＣａｓＸバリアントおよびｇＮＡバリアントのＲＮＰの１つ以上の改善された特性は、配列番号１、配列番号２、または配列番号３の参照ＣａｓＸタンパク質と表１のｇＮＡとのＲＮＰと比較して、少なくとも約１．１、少なくとも約１０、少なくとも約１００、少なくとも約１０００、少なくとも約１０，０００、少なくとも約１００，０００倍、またはそれ以上改善される。他の事例では、ＣａｓＸバリアントおよびｇＮＡバリアントのＲＮＰの改善された特性のうちの１つ以上は、同等の様式でアッセイされた場合、配列番号１、配列番号２、または配列番号３の参照ＣａｓＸタンパク質と表１のｇＮＡとのＲＮＰと比較して、約１．１～１００，００倍、約１．１～１０，００倍、約１．１～１，０００倍、約１．１～５００倍、約１．１～１００倍、約１．１～５０倍、約１．１～２０倍、約１０～１００，００倍、約１０～１０，００倍、約１０～１，０００倍、約１０～５００倍、約１０～１００倍、約１０～５０倍、約１０～２０倍、約２～７０倍、約２～５０倍、約２～３０倍、約２～２０倍、約２～１０倍、約５～５０倍、約５～３０倍、約５～１０倍、約１００～１００，００倍、約１００～１０，００倍、約１００～１，０００倍、約１００～５００倍、約５００～１００，００倍、約５００～１０，００倍、約５００～１，０００倍、約５００～７５０倍、約１，０００～１００，００倍、約１０，０００～１００，００倍、約２０～５００倍、約２０～２５０倍、約２０～２００倍、約２０～１００倍、約２０～５０倍、約５０～１０，０００倍、約５０～１，０００倍、約５０～５００倍、約５０～２００倍、または約５０～１００倍改善される。他の事例では、ＣａｓＸバリアントおよびｇＮＡバリアントのＲＮＰの１つ以上の改善された特性は、同等の様式でアッセイされた場合、配列番号１、配列番号２、または配列番号３の参照ＣａｓＸタンパク質と表１のｇＮＡとのＲＮＰと比較して、約１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、４５倍、５０倍、５５倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１１０倍、１２０倍、１３０倍、１４０倍、１５０倍、１６０倍、１７０倍、１８０倍、１９０倍、２００倍、２１０倍、２２０倍、２３０倍、２４０倍、２５０倍、２６０倍、２７０倍、２８０倍、２９０倍、３００倍、３１０倍、３２０倍、３３０倍、３４０倍、３５０倍、３６０倍、３７０倍、３８０倍、３９０倍、４００倍、４２５倍、４５０倍、４７５倍、または５００倍改善される。
ＣａｓＸバリアントという用語は、融合タンパク質であるバリアントを含み、すなわち、ＣａｓＸは、異種配列に「融合」されている。これには、ＣａｓＸバリアント配列と、ＣａｓＸの異種タンパク質またはそのドメインへのＮ末端、Ｃ末端、または内部融合とを含むＣａｓＸバリアントが含まれる。
本開示のＣａｓＸタンパク質は、以下のドメイン：以下により詳細に記載される、非標的鎖結合（ＮＴＳＢ）ドメイン、標的鎖負荷（ＴＳＬ）ドメイン、ヘリカルＩドメイン、ヘリカルＩＩドメイン、オリゴヌクレオチド結合ドメイン（ＯＢＤ）、およびＲｕｖＣ ＤＮＡ切断ドメイン（これらの最後のものは、触媒的に死んでいるＣａｓＸバリアントにおいて修飾されているか、または欠失している場合がある）のうちの少なくとも１つを含む。加えて、本開示のＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質と参照ｇＮＡとのＲＮＰと比較して、ＴＴＣ、ＡＴＣ、ＧＴＣ、またはＣＴＣから選択されるＰＡＭ配列を利用して標的ＤＮＡを効果的に編集するおよび／またはそれに結合する増強された能力を有する。いくつかの実施形態では、ＰＡＭ配列は、ＴＣモチーフを含む。前述では、ＰＡＭ配列は、同等のアッセイシステムにおける参照ＣａｓＸタンパク質と参照ｇＮＡとを含むＲＮＰの編集効率および／または結合と比較して、アッセイシステムにおいてｇＮＡの標的配列と同一性を有するプロトスペーサーの非標的鎖の５’側の少なくとも１つのヌクレオチドに位置する。一実施形態では、ＣａｓＸバリアントとｇＮＡバリアントとのＲＮＰは、同等のアッセイシステムにおいて参照ＣａｓＸタンパク質と参照ｇＮＡとを含むＲＮＰと比較して、標的ＤＮＡにおける標的配列のより高い編集効率および／または結合を呈し、標的ＤＮＡのＰＡＭ配列はＴＴＣである。別の実施形態では、ＣａｓＸバリアントとｇＮＡバリアントとのＲＮＰは、同等のアッセイシステムにおいて参照ＣａｓＸタンパク質と参照ｇＮＡとを含むＲＮＰと比較して、標的ＤＮＡにおける標的配列のより高い編集効率および／または結合を呈し、標的ＤＮＡのＰＡＭ配列はＡＴＣである。別の実施形態では、ＣａｓＸバリアントとｇＮＡバリアントとのＲＮＰは、同等のアッセイシステムにおいて参照ＣａｓＸタンパク質と参照ｇＮＡとを含むＲＮＰと比較して、標的ＤＮＡにおける標的配列のより高い編集効率および／または結合を呈し、標的ＤＮＡのＰＡＭ配列はＣＴＣである。別の実施形態では、ＣａｓＸバリアントとｇＮＡバリアントとのＲＮＰは、同等のアッセイシステムにおいて参照ＣａｓＸタンパク質と参照ｇＮＡとを含むＲＮＰと比較して、標的ＤＮＡにおける標的配列のより高い編集効率および／または結合を呈し、標的ＤＮＡのＰＡＭ配列はＧＴＣである。前述の実施形態では、１つ以上のＰＡＭ配列に対する編集効率および／または結合親和性の増加は、それらのＰＡＭ配列に対する配列番号１～３のＣａｓＸタンパク質のうちの１つと表１のｇＮＡとのＲＮＰの編集効率および／または結合親和性と比較して、少なくとも１．５倍高い。
いくつかの事例では、ＣａｓＸタンパク質は、天然に存在するタンパク質である（例えば、原核細胞に天然に存在し、原核細胞から単離される）。他の実施形態では、ＣａｓＸタンパク質は、天然に存在するタンパク質ではない（例えば、ＣａｓＸタンパク質は、ＣａｓＸバリアントタンパク質、キメラタンパク質などである）。天然に存在するＣａｓＸタンパク質（本明細書では「参照ＣａｓＸタンパク質」と称される）は、標的とされる二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の特定の配列で二本鎖切断を触媒するエンドヌクレアーゼとして機能する。配列特異性は、複合体形成される会合したｇＮＡの標的配列によって提供され、標的核酸内の標的配列にハイブリダイズする。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質は、標的核酸および／または標的核酸と会合したポリペプチド（例えば、ヒストンテイルのメチル化またはアセチル化）に結合するおよび／またはそれを修飾する（例えば、切断、ニッキング、メチル化、脱メチル化など）ことができる。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質は、触媒的に死んでいるが、標的核酸に結合する能力を保持している。例示的な触媒的に死んでいるＣａｓＸタンパク質は、ＣａｓＸタンパク質のＲｕｖＣドメインの活性部位に１つ以上の変異を含む。いくつかの実施形態では、触媒的に死んでいるＣａｓＸタンパク質は、配列番号１の残基６７２、７６９、および／または９３５に置換を含む。一実施形態では、触媒的に死んでいるＣａｓＸタンパク質は、配列番号１の参照ＣａｓＸタンパク質におけるＤ６７２Ａ、Ｅ７６９Ａ、および／またはＤ９３５Ａ置換を含む。他の実施形態では、触媒的に死んでいるＣａｓＸタンパク質は、配列番号２の参照ＣａｓＸタンパク質におけるアミノ酸６５９、７５６、および／または９２２の置換を含む。いくつかの実施形態では、触媒的に死んでいるＣａｓＸタンパク質は、配列番号２の参照ＣａｓＸタンパク質におけるＤ６５９Ａ、Ｅ７５６Ａ、および／またはＤ９２２Ａ置換を含む。さらなる実施形態では、触媒的に死んでいるＣａｓＸタンパク質は、ＣａｓＸタンパク質のＲｕｖＣドメインの全てまたは一部の欠失を含む。同じ前述の置換が本開示のＣａｓＸバリアントに同様に導入されて、ｄＣａｓＸバリアントをもたらすことができることが理解されよう。一実施形態では、ＲｕｖＣドメインの全てまたは一部がＣａｓＸバリアントから欠失され、ｄＣａｓＸバリアントをもたらす。触媒的に不活性なｄＣａｓＸバリアントタンパク質は、いくつかの実施形態では、塩基編集またはエピジェネティック修飾に使用することができる。ＤＮＡに対する親和性が高まるにつれて、いくつかの実施形態では、触媒的に不活性なｄＣａｓＸバリアントタンパク質は、触媒的に活性なＣａｓＸと比較して、それらの標的核酸をより速く見つけることができ、より長期間にわたって標的核酸に結合したままの状態を保つことができ、より安定した様式で標的核酸に結合することができるか、またはそれらの組み合わせであり、それにより、切断能力を保持するＣａｓＸバリアントと比較して、触媒的に死んでいるＣａｓＸバリアントタンパク質のそれらの機能を改善することができる。
ａ．非標的鎖結合ドメイン
本開示の参照ＣａｓＸタンパク質は、非標的鎖結合ドメイン（ＮＴＳＢＤ）を含む。ＮＴＳＢＤは、以前にいずれのＣａｓタンパク質でも見つけられなかったドメインであり、例えば、このドメインは、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ／Ｃｐｆ１、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１４、ＣＡＳＣＡＤＥ、ＣＳＭ、またはＣＳＹなどのＣａｓタンパク質に存在しない。理論または機構に拘束されることなく、ＣａｓＸにおけるＮＴＳＢＤは、非標的ＤＮＡ鎖への結合を可能にし、非標的鎖および標的鎖の巻き戻しを援助し得る。ＮＴＳＢＤは、巻き戻された状態の非標的ＤＮＡ鎖の巻き戻しまたは捕捉に関与していると推定される。ＮＴＳＢＤは、これまでに導出されたＣｒｙｏＥＭモデル構造の非標的鎖と直接接触しており、非標準的ジンクフィンガードメインを含んでいる可能性がある。ＮＴＳＢＤは、巻き戻し中のＤＮＡの安定化、ガイドＲＮＡ侵入、およびＲループ形成に関与している可能性もある。いくつかの実施形態では、例示的なＮＴＳＢＤは、配列番号１のアミノ酸１０１～１９１または配列番号２のアミノ酸１０３～１９２を含む。いくつかの実施形態では、参照ＣａｓＸタンパク質のＮＴＳＢＤは、４本鎖ベータシートを含む。
ｂ．標的鎖負荷ドメイン
本開示の参照ＣａｓＸタンパク質は、標的鎖負荷（ＴＳＬ）ドメインを含む。ＴＳＬドメインは、Ｃａｓ９、ＣＡＳＣＡＤＥ、ＣＳＭ、またはＣＳＹなどのある特定のＣａｓタンパク質では見つけられないドメインである。理論または機構に拘束されることを望むことなく、ＴＳＬドメインが、ＣａｓＸタンパク質のＲｕｖＣ活性部位への標的ＤＮＡ鎖の負荷の援助に関与していると考えられている。いくつかの実施形態では、ＴＳＬは、折り畳まれた状態で標的鎖を配置または捕捉する役割を果たし、これにより、標的鎖ＤＮＡ骨格の切断可能なリン酸がＲｕｖＣ活性部位に配置される。ＴＳＬは、ＴＳＬの大部分によって分離されているｃｙｓ４（ＣＸＸＣ、ＣＸＸＣジンクフィンガー／リボンドメイン（配列番号４８）を含む。いくつかの実施形態では、例示的なＴＳＬは、配列番号１のアミノ酸８２５～９３４または配列番号２のアミノ酸８１３～９２１を含む。
ｃ．ヘリカルＩドメイン
本開示の参照ＣａｓＸタンパク質は、ヘリカルＩドメインを含む。ＣａｓＸ以外のある特定のＣａｓタンパク質は、同様の方法で命名され得るドメインを有する。しかしながら、いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質のヘリカルＩドメインは、非ＣａｓＸタンパク質と比較して、１つ以上の特有の構造的特徴を含むか、または特有の配列を含むか、またはそれらの組み合わせである。例えば、いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質のヘリカルＩドメインは、同様の名前を有し得る他のＣａｓタンパク質のドメインと比較して、１つ以上の特有の二次構造を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質のヘリカルＩドメインは、他のＣＲＩＳＰＲタンパク質と比較して、配置、数、および長さの点で特有の構造および配列を有する１つ以上のアルファヘリックスを含む。ある特定の実施形態では、ヘリカルＩドメインは、結合したＤＮＡおよびガイドＲＮＡのスペーサーとの相互作用に関与する。理論に拘束されることを望むことなく、いくつかの事例では、ヘリカルＩドメインがプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の結合に寄与し得ると考えられている。いくつかの実施形態では、例示的なヘリカルＩドメインは、配列番号１のアミノ酸５７～１００および１９２～３３２、または配列番号２のアミノ酸５９～１０２および１９３～３３３を含む。いくつかの実施形態では、参照ＣａｓＸタンパク質のヘリカルＩドメインは、１つ以上のアルファヘリックスを含む。
ｄ．ヘリカルＩＩドメイン
本開示の参照ＣａｓＸタンパク質は、ヘリカルＩＩドメインを含む。ＣａｓＸ以外のある特定のＣａｓタンパク質は、同様の方法で命名され得るドメインを有する。しかしながら、いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質のヘリカルＩＩドメインは、同様の名前を有し得る他のＣａｓタンパク質のドメインと比較して、１つ以上の特有の構造的特徴を含むか、または特有の配列を含むか、またはそれらの組み合わせである。例えば、いくつかの実施形態では、ヘリカルＩＩドメインは、標的ＤＮＡ：ガイドＲＮＡチャネルに沿って整列する１つ以上の特有の構造的アルファヘリックス束を含む。いくつかの実施形態では、ヘリカルＩＩドメインを含むＣａｓＸにおいて、標的鎖およびガイドＲＮＡは、ヘリカルＩＩ（およびいくつかの実施形態では、ヘリカルＩドメイン）と相互作用して、ＲｕｖＣドメインが標的ＤＮＡに接近することを可能にする。ヘリカルＩＩドメインは、ガイドＲＮＡ足場ステムループおよび結合したＤＮＡへの結合に関与する。いくつかの実施形態では、例示的なヘリカルＩＩドメインは、配列番号１のアミノ酸３３３～５０９、または配列番号２のアミノ酸３３４～５０１を含む。
ｅ．オリゴヌクレオチド結合ドメイン
本開示の参照ＣａｓＸタンパク質は、オリゴヌクレオチド結合ドメイン（ＯＢＤ）を含む。ＣａｓＸ以外のある特定のＣａｓタンパク質は、同様の方法で命名され得るドメインを有する。しかしながら、いくつかの実施形態では、ＯＢＤは、１つ以上の特有の機能的特徴を含むか、またはＣａｓＸタンパク質に特有の配列を含むか、またはそれらの組み合わせである。例えば、いくつかの実施形態では、架橋ヘリックス（ＢＨ）、ヘリカルＩドメイン、ヘリカルＩＩドメイン、およびオリゴヌクレオチド結合ドメイン（ＯＢＤ）が一緒に、ＣａｓＸタンパク質のガイドＲＮＡへの結合に関与する。したがって、例えば、いくつかの実施形態では、ＯＢＤは、ヘリカルＩドメイン、もしくはヘリカルＩＩドメイン、またはそれらの両方と機能的に相互作用するという点でＣａｓＸタンパク質に特有であり、これらは各々、本明細書に記載のＣａｓＸタンパク質に特有であり得る。具体的には、ＣａｓＸにおいて、ＯＢＤは、ガイドＲＮＡ足場のＲＮＡトリプレックスに主に結合する。ＯＢＤは、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）への結合にも関与し得る。例示的なＯＢＤドメインは、配列番号１のアミノ酸１～５６および５１０～６６０、または配列番号２のアミノ酸１～５８および５０２～６４７を含む。
ｆ．ＲｕｖＣ ＤＮＡ切断ドメイン
本開示の参照ＣａｓＸタンパク質は、２つの部分的なＲｕｖＣドメイン（ＲｕｖＣ－ＩおよびＲｕｖＣ－ＩＩ）を含む、ＲｕｖＣドメインを含む。ＲｕｖＣドメインは、全ての１２型ＣＲＩＳＰＲタンパク質の祖先ドメインである。ＲｕｖＣドメインは、トランスポザーゼのようなＴＮＰＢ（トランスポザーゼＢ）に由来する。他のＲｕｖＣドメインと同様に、ＣａｓＸ ＲｕｖＣドメインは、マグネシウム（Ｍｇ）イオンの調整およびＤＮＡの切断に関与するＤＥＤ触媒三連構造を有する。いくつかの実施形態では、ＲｕｖＣは、ＤＮＡの両方の鎖の切断に関与する（１つずつ切断し、最初に標的配列中の１１～１４ヌクレオチド（ｎｔ）で非標的鎖を切断し、その後、標的配列の後の２～４ヌクレオチドで標的鎖を切断する可能性が高い）ＤＥＤモチーフ活性部位を有する。特にＣａｓＸにおいて、ＲｕｖＣドメインは、ＣａｓＸ機能に重要なガイドＲＮＡ足場ステムループの結合にも関与しているという点で特有である。例示的なＲｕｖＣドメインは、配列番号１のアミノ酸６６１～８２４および９３５～９８６、または配列番号２のアミノ酸６４８～８１２および９２２～９７８を含む。
ｇ．参照ＣａｓＸタンパク質
本開示は、参照ＣａｓＸタンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、参照ＣａｓＸタンパク質は、天然に存在するタンパク質である。例えば、参照ＣａｓＸタンパク質は、Ｄｅｌｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ種、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ種、またはＣａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｓｕｎｇｂａｃｔｅｒｉａ種などの天然に存在する原核生物から単離され得る。参照ＣａｓＸタンパク質（本明細書では参照ＣａｓＸタンパク質とも称される）は、ガイドＮＡと相互作用してリボ核タンパク質（ＲＮＰ）を形成することができるタンパク質のＣａｓＸ（Ｃａｓ１２ｅと称されることもある）ファミリーに属するＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、参照ＣａｓＸタンパク質を含むＲＮＰ複合体は、ｇＮＡの標的配列（またはスペーサー）と標的核酸内の標的配列との間の塩基対形成により標的核酸内の特定の部位を標的とすることができる。いくつかの実施形態では、参照ＣａｓＸタンパク質を含むＲＮＰは、標的ＤＮＡを切断することができる。いくつかの実施形態では、参照ＣａｓＸタンパク質を含むＲＮＰは、標的ＤＮＡをニッキングすることができる。いくつかの実施形態では、参照ＣａｓＸタンパク質を含むＲＮＰは、標的ＤＮＡを編集することができ、例えば、参照ＣａｓＸタンパク質がＤＮＡを切断またはニッキングすることができる実施形態では、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）、相同性指向修復（ＨＤＲ）、相同非依存性標的組み込み（ＨＩＴＩ）、マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）、一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）、または塩基除去修復（ＢＥＲ）が続く。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質を含むＲＮＰは、上でより完全に記載されるように、触媒的に死んでいる（触媒的に不活性であるか、または実質的にいずれの切断活性も有しない）ＣａｓＸタンパク質（ｄＣａｓＸ）であるが、標的ＤＮＡに結合する能力を保持する。
いくつかの事例では、参照ＣａｓＸタンパク質は、Ｄｅｌｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａから単離されるか、またはそれに由来する。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質は、以下の配列と少なくとも５０％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、または１００％同一の配列を含む：
１ ＭＥＫＲＩＮＫＩＲＫ ＫＬＳＡＤＮＡＴＫＰ ＶＳＲＳＧＰＭＫＴＬ ＬＶＲＶＭＴＤＤＬＫ ＫＲＬＥＫＲＲＫＫＰ ＥＶＭＰＱＶＩＳＮＮ
６１ ＡＡＮＮＬＲＭＬＬＤ ＤＹＴＫＭＫＥＡＩＬ ＱＶＹＷＱＥＦＫＤＤ ＨＶＧＬＭＣＫＦＡＱ ＰＡＳＫＫＩＤＱＮＫ ＬＫＰＥＭＤＥＫＧＮ
１２１ ＬＴＴＡＧＦＡＣＳＱ ＣＧＱＰＬＦＶＹＫＬ ＥＱＶＳＥＫＧＫＡＹ ＴＮＹＦＧＲＣＮＶＡ ＥＨＥＫＬＩＬＬＡＱ ＬＫＰＥＫＤＳＤＥＡ
１８１ ＶＴＹＳＬＧＫＦＧＱ ＲＡＬＤＦＹＳＩＨＶ ＴＫＥＳＴＨＰＶＫＰ ＬＡＱＩＡＧＮＲＹＡ ＳＧＰＶＧＫＡＬＳＤ ＡＣＭＧＴＩＡＳＦＬ
２４１ ＳＫＹＱＤＩＩＩＥＨ ＱＫＶＶＫＧＮＱＫＲ ＬＥＳＬＲＥＬＡＧＫ ＥＮＬＥＹＰＳＶＴＬ ＰＰＱＰＨＴＫＥＧＶ ＤＡＹＮＥＶＩＡＲＶ
３０１ ＲＭＷＶＮＬＮＬＷＱ ＫＬＫＬＳＲＤＤＡＫ ＰＬＬＲＬＫＧＦＰＳ ＦＰＶＶＥＲＲＥＮＥ ＶＤＷＷＮＴＩＮＥＶ ＫＫＬＩＤＡＫＲＤＭ
３６１ ＧＲＶＦＷＳＧＶＴＡ ＥＫＲＮＴＩＬＥＧＹ ＮＹＬＰＮＥＮＤＨＫ ＫＲＥＧＳＬＥＮＰＫ ＫＰＡＫＲＱＦＧＤＬ ＬＬＹＬＥＫＫＹＡＧ
４２１ ＤＷＧＫＶＦＤＥＡＷ ＥＲＩＤＫＫＩＡＧＬ ＴＳＨＩＥＲＥＥＡＲ ＮＡＥＤＡＱＳＫＡＶ ＬＴＤＷＬＲＡＫＡＳ ＦＶＬＥＲＬＫＥＭＤ
４８１ ＥＫＥＦＹＡＣＥＩＱ ＬＱＫＷＹＧＤＬＲＧ ＮＰＦＡＶＥＡＥＮＲ ＶＶＤＩＳＧＦＳＩＧ ＳＤＧＨＳＩＱＹＲＮ ＬＬＡＷＫＹＬＥＮＧ
５４１ ＫＲＥＦＹＬＬＭＮＹ ＧＫＫＧＲＩＲＦＴＤ ＧＴＤＩＫＫＳＧＫＷ ＱＧＬＬＹＧＧＧＫＡ ＫＶＩＤＬＴＦＤＰＤ ＤＥＱＬＩＩＬＰＬＡ
６０１ ＦＧＴＲＱＧＲＥＦＩ ＷＮＤＬＬＳＬＥＴＧ ＬＩＫＬＡＮＧＲＶＩ ＥＫＴＩＹＮＫＫＩＧ ＲＤＥＰＡＬＦＶＡＬ ＴＦＥＲＲＥＶＶＤＰ
６６１ ＳＮＩＫＰＶＮＬＩＧ ＶＤＲＧＥＮＩＰＡＶ ＩＡＬＴＤＰＥＧＣＰ ＬＰＥＦＫＤＳＳＧＧ ＰＴＤＩＬＲＩＧＥＧ ＹＫＥＫＱＲＡＩＱＡ
７２１ ＡＫＥＶＥＱＲＲＡＧ ＧＹＳＲＫＦＡＳＫＳ ＲＮＬＡＤＤＭＶＲＮ ＳＡＲＤＬＦＹＨＡＶ ＴＨＤＡＶＬＶＦＥＮ ＬＳＲＧＦＧＲＱＧＫ
７８１ ＲＴＦＭＴＥＲＱＹＴ ＫＭＥＤＷＬＴＡＫＬ ＡＹＥＧＬＴＳＫＴＹ ＬＳＫＴＬＡＱＹＴＳ ＫＴＣＳＮＣＧＦＴＩ ＴＴＡＤＹＤＧＭＬＶ
８４１ ＲＬＫＫＴＳＤＧＷＡ ＴＴＬＮＮＫＥＬＫＡ ＥＧＱＩＴＹＹＮＲＹ ＫＲＱＴＶＥＫＥＬＳ ＡＥＬＤＲＬＳＥＥＳ ＧＮＮＤＩＳＫＷＴＫ
９０１ ＧＲＲＤＥＡＬＦＬＬ ＫＫＲＦＳＨＲＰＶＱ ＥＱＦＶＣＬＤＣＧＨ ＥＶＨＡＤＥＱＡＡＬ ＮＩＡＲＳＷＬＦＬＮ ＳＮＳＴＥＦＫＳＹＫ
９６１ ＳＧＫＱＰＦＶＧＡＷ ＱＡＦＹＫＲＲＬＫＥ ＶＷＫＰＮＡ（配列番号１）
いくつかの事例では、参照ＣａｓＸタンパク質は、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓから単離されるか、またはそれに由来する。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質は、以下の配列と少なくとも５０％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、または１００％同一の配列を含む：
１ ＭＱＥＩＫＲＩＮＫＩ ＲＲＲＬＶＫＤＳＮＴ ＫＫＡＧＫＴＧＰＭＫ ＴＬＬＶＲＶＭＴＰＤ ＬＲＥＲＬＥＮＬＲＫ ＫＰＥＮＩＰＱＰＩＳ
６１ ＮＴＳＲＡＮＬＮＫＬ ＬＴＤＹＴＥＭＫＫＡ ＩＬＨＶＹＷＥＥＦＱ ＫＤＰＶＧＬＭＳＲＶ ＡＱＰＡＰＫＮＩＤＱ ＲＫＬＩＰＶＫＤＧＮ
１２１ ＥＲＬＴＳＳＧＦＡＣ ＳＱＣＣＱＰＬＹＶＹ ＫＬＥＱＶＮＤＫＧＫ ＰＨＴＮＹＦＧＲＣＮ ＶＳＥＨＥＲＬＩＬＬ ＳＰＨＫＰＥＡＮＤＥ
１８１ ＬＶＴＹＳＬＧＫＦＧ ＱＲＡＬＤＦＹＳＩＨ ＶＴＲＥＳＮＨＰＶＫ ＰＬＥＱＩＧＧＮＳＣ ＡＳＧＰＶＧＫＡＬＳ ＤＡＣＭＧＡＶＡＳＦ
２４１ ＬＴＫＹＱＤＩＩＬＥ ＨＱＫＶＩＫＫＮＥＫ ＲＬＡＮＬＫＤＩＡＳ ＡＮＧＬＡＦＰＫＩＴ ＬＰＰＱＰＨＴＫＥＧ ＩＥＡＹＮＮＶＶＡＱ
３０１ ＩＶＩＷＶＮＬＮＬＷ ＱＫＬＫＩＧＲＤＥＡ ＫＰＬＱＲＬＫＧＦＰ ＳＦＰＬＶＥＲＱＡＮ ＥＶＤＷＷＤＭＶＣＮ ＶＫＫＬＩＮＥＫＫＥ
３６１ ＤＧＫＶＦＷＱＮＬＡ ＧＹＫＲＱＥＡＬＬＰ ＹＬＳＳＥＥＤＲＫＫ ＧＫＫＦＡＲＹＱＦＧ ＤＬＬＬＨＬＥＫＫＨ ＧＥＤＷＧＫＶＹＤＥ
４２１ ＡＷＥＲＩＤＫＫＶＥ ＧＬＳＫＨＩＫＬＥＥ ＥＲＲＳＥＤＡＱＳＫ ＡＡＬＴＤＷＬＲＡＫ ＡＳＦＶＩＥＧＬＫＥ ＡＤＫＤＥＦＣＲＣＥ
４８１ ＬＫＬＱＫＷＹＧＤＬ ＲＧＫＰＦＡＩＥＡＥ ＮＳＩＬＤＩＳＧＦＳ ＫＱＹＮＣＡＦＩＷＱ ＫＤＧＶＫＫＬＮＬＹ ＬＩＩＮＹＦＫＧＧＫ
５４１ ＬＲＦＫＫＩＫＰＥＡ ＦＥＡＮＲＦＹＴＶＩ ＮＫＫＳＧＥＩＶＰＭ ＥＶＮＦＮＦＤＤＰＮ ＬＩＩＬＰＬＡＦＧＫ ＲＱＧＲＥＦＩＷＮＤ
６０１ ＬＬＳＬＥＴＧＳＬＫ ＬＡＮＧＲＶＩＥＫＴ ＬＹＮＲＲＴＲＱＤＥ ＰＡＬＦＶＡＬＴＦＥ ＲＲＥＶＬＤＳＳＮＩ ＫＰＭＮＬＩＧＩＤＲ
６６１ ＧＥＮＩＰＡＶＩＡＬ ＴＤＰＥＧＣＰＬＳＲ ＦＫＤＳＬＧＮＰＴＨ ＩＬＲＩＧＥＳＹＫＥ ＫＱＲＴＩＱＡＡＫＥ ＶＥＱＲＲＡＧＧＹＳ
７２１ ＲＫＹＡＳＫＡＫＮＬ ＡＤＤＭＶＲＮＴＡＲ ＤＬＬＹＹＡＶＴＱＤ ＡＭＬＩＦＥＮＬＳＲ ＧＦＧＲＱＧＫＲＴＦ ＭＡＥＲＱＹＴＲＭＥ
７８１ ＤＷＬＴＡＫＬＡＹＥ ＧＬＰＳＫＴＹＬＳＫ ＴＬＡＱＹＴＳＫＴＣ ＳＮＣＧＦＴＩＴＳＡ ＤＹＤＲＶＬＥＫＬＫ ＫＴＡＴＧＷＭＴＴＩ
８４１ ＮＧＫＥＬＫＶＥＧＱ ＩＴＹＹＮＲＹＫＲＱ ＮＶＶＫＤＬＳＶＥＬ ＤＲＬＳＥＥＳＶＮＮ ＤＩＳＳＷＴＫＧＲＳ ＧＥＡＬＳＬＬＫＫＲ
９０１ ＦＳＨＲＰＶＱＥＫＦ ＶＣＬＮＣＧＦＥＴＨ ＡＤＥＱＡＡＬＮＩＡ ＲＳＷＬＦＬＲＳＱＥ ＹＫＫＹＱＴＮＫＴＴ ＧＮＴＤＫＲＡＦＶＥ
９６１ ＴＷＱＳＦＹＲＫＫＬ ＫＥＶＷＫＰＡＶ（配列番号２）
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号２の配列、またはそれと少なくとも６０％の類似性を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号２の配列、またはそれと少なくとも８０％の類似性を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号２の配列、またはそれと少なくとも９０％の類似性を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号２の配列、またはそれと少なくとも９５％の類似性を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号２の配列からなる。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号２の配列と比較して少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、または少なくとも５０個の変異を有する配列を含むか、またはそれらからなる。これらの変異は、挿入、欠失、アミノ酸置換、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。
いくつかの事例では、参照ＣａｓＸタンパク質は、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｓｕｎｇｂａｃｔｅｒｉａから単離されるか、それに由来する。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質は、以下の配列と少なくとも５０％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、または１００％同一の配列を含む：
１ ＭＤＮＡＮＫＰＳＴＫ ＳＬＶＮＴＴＲＩＳＤ ＨＦＧＶＴＰＧＱＶＴ ＲＶＦＳＦＧＩＩＰＴ ＫＲＱＹＡＩＩＥＲＷ ＦＡＡＶＥＡＡＲＥＲ
６１ ＬＹＧＭＬＹＡＨＦＱ ＥＮＰＰＡＹＬＫＥＫ ＦＳＹＥＴＦＦＫＧＲ ＰＶＬＮＧＬＲＤＩＤ ＰＴＩＭＴＳＡＶＦＴ ＡＬＲＨＫＡＥＧＡＭ
１２１ ＡＡＦＨＴＮＨＲＲＬ ＦＥＥＡＲＫＫＭＲＥ ＹＡＥＣＬＫＡＮＥＡ ＬＬＲＧＡＡＤＩＤＷ ＤＫＩＶＮＡＬＲＴＲ ＬＮＴＣＬＡＰＥＹＤ
１８１ ＡＶＩＡＤＦＧＡＬＣ ＡＦＲＡＬＩＡＥＴＮ ＡＬＫＧＡＹＮＨＡＬ ＮＱＭＬＰＡＬＶＫＶ ＤＥＰＥＥＡＥＥＳＰ ＲＬＲＦＦＮＧＲＩＮ
２４１ ＤＬＰＫＦＰＶＡＥＲ ＥＴＰＰＤＴＥＴＩＩ ＲＱＬＥＤＭＡＲＶＩ ＰＤＴＡＥＩＬＧＹＩ ＨＲＩＲＨＫＡＡＲＲ ＫＰＧＳＡＶＰＬＰＱ
３０１ ＲＶＡＬＹＣＡＩＲＭ ＥＲＮＰＥＥＤＰＳＴ ＶＡＧＨＦＬＧＥＩＤ ＲＶＣＥＫＲＲＱＧＬ ＶＲＴＰＦＤＳＱＩＲ ＡＲＹＭＤＩＩＳＦＲ
３６１ ＡＴＬＡＨＰＤＲＷＴ ＥＩＱＦＬＲＳＮＡＡ ＳＲＲＶＲＡＥＴＩＳ ＡＰＦＥＧＦＳＷＴＳ ＮＲＴＮＰＡＰＱＹＧ ＭＡＬＡＫＤＡＮＡＰ
４２１ ＡＤＡＰＥＬＣＩＣＬ ＳＰＳＳＡＡＦＳＶＲ ＥＫＧＧＤＬＩＹＭＲ ＰＴＧＧＲＲＧＫＤＮ ＰＧＫＥＩＴＷＶＰＧ ＳＦＤＥＹＰＡＳＧＶ
４８１ ＡＬＫＬＲＬＹＦＧＲ ＳＱＡＲＲＭＬＴＮＫ ＴＷＧＬＬＳＤＮＰＲ ＶＦＡＡＮＡＥＬＶＧ ＫＫＲＮＰＱＤＲＷＫ ＬＦＦＨＭＶＩＳＧＰ
５４１ ＰＰＶＥＹＬＤＦＳＳ ＤＶＲＳＲＡＲＴＶＩ ＧＩＮＲＧＥＶＮＰＬ ＡＹＡＶＶＳＶＥＤＧ ＱＶＬＥＥＧＬＬＧＫ ＫＥＹＩＤＱＬＩＥＴ
６０１ ＲＲＲＩＳＥＹＱＳＲ ＥＱＴＰＰＲＤＬＲＱ ＲＶＲＨＬＱＤＴＶＬ ＧＳＡＲＡＫＩＨＳＬ ＩＡＦＷＫＧＩＬＡＩ ＥＲＬＤＤＱＦＨＧＲ
６６１ ＥＱＫＩＩＰＫＫＴＹ ＬＡＮＫＴＧＦＭＮＡ ＬＳＦＳＧＡＶＲＶＤ ＫＫＧＮＰＷＧＧＭＩ ＥＩＹＰＧＧＩＳＲＴ ＣＴＱＣＧＴＶＷＬＡ
７２１ ＲＲＰＫＮＰＧＨＲＤ ＡＭＶＶＩＰＤＩＶＤ ＤＡＡＡＴＧＦＤＮＶ ＤＣＤＡＧＴＶＤＹＧ ＥＬＦＴＬＳＲＥＷＶ ＲＬＴＰＲＹＳＲＶＭ
７８１ ＲＧＴＬＧＤＬＥＲＡ ＩＲＱＧＤＤＲＫＳＲ ＱＭＬＥＬＡＬＥＰＱ ＰＱＷＧＱＦＦＣＨＲ ＣＧＦＮＧＱＳＤＶＬ ＡＡＴＮＬＡＲＲＡＩ
８４１ ＳＬＩＲＲＬＰＤＴＤ ＴＰＰＴＰ（配列番号３）
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号３の配列、またはそれと少なくとも６０％の類似性を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号３の配列、またはそれと少なくとも８０％の類似性を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号３の配列、またはそれと少なくとも９０％の類似性を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号３の配列、またはそれと少なくとも９５％の類似性を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号３の配列からなる。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号３の配列と比較して少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、または少なくとも５０個の変異を有する配列を含むか、またはそれらからなる。これらの変異は、挿入、欠失、アミノ酸置換、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。
ｈ．ＣａｓＸバリアントタンパク質
本開示は、参照ＣａｓＸタンパク質のバリアント（本明細書では互換的に「ＣａｓＸバリアント」または「ＣａｓＸバリアントタンパク質」と称される）を提供し、ＣａｓＸバリアントは、配列番号１～３の配列を含む参照ＣａｓＸタンパク質の少なくとも１つのドメインに少なくとも１つの修飾を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して少なくとも１つの改善された特性を呈する。本明細書に記載の参照ＣａｓＸタンパク質と比較してＣａｓＸバリアントタンパク質の１つ以上の機能または特性を改善する全てのバリアントが、本開示の範囲内であると想定される。いくつかの実施形態では、修飾は、参照ＣａｓＸの１つ以上のアミノ酸の変異である。他の実施形態では、修飾は、異なるＣａｓＸ由来の１つ以上のドメインでの参照ＣａｓＸの１つ以上のドメインの置換である。いくつかの実施形態では、挿入は、異なるＣａｓＸタンパク質由来のドメインの一部または全ての挿入を含む。変異は、参照ＣａｓＸタンパク質のいずれか１つ以上のドメインで起こり得、例えば、１つ以上のドメインの一部もしくは全ての欠失、または参照ＣａｓＸタンパク質の任意のドメインにおける１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、もしくは挿入を含み得る。ＣａｓＸタンパク質のドメインには、非標的鎖結合（ＮＴＳＢ）ドメイン、標的鎖負荷（ＴＳＬ）ドメイン、ヘリカルＩドメイン、ヘリカルＩＩドメイン、オリゴヌクレオチド結合ドメイン（ＯＢＤ）、およびＲｕｖＣ ＤＮＡ切断ドメインが含まれる。ＣａｓＸタンパク質の改善された特性をもたらす参照ＣａｓＸタンパク質のアミノ酸配列のいずれの変化も、本開示のＣａｓＸバリアントタンパク質とみなされる。例えば、ＣａｓＸバリアントは、参照ＣａｓＸタンパク質配列と比較して、１つ以上のアミノ酸置換、挿入、欠失、もしくはスワップされたドメイン、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号１～３の配列を含む参照ＣａｓＸタンパク質の２つのドメインの少なくとも各々に少なくとも１つの修飾を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質の少なくとも２つのドメイン、少なくとも３つのドメイン、少なくとも４つのドメイン、または少なくとも５つのドメインに少なくとも１つの修飾を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質の少なくとも１つのドメインに２つ以上の修飾を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質の少なくとも１つのドメインに少なくとも２つの修飾、参照ＣａｓＸタンパク質の少なくとも１つのドメインに少なくとも３つの修飾、または参照ＣａｓＸタンパク質の少なくとも１つのドメインに少なくとも４つの修飾を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して２つ以上の修飾を含み、各修飾は、ＮＴＳＢＤ、ＴＳＬＤ、ヘリカルＩドメイン、ヘリカルＩＩドメイン、ＯＢＤ、およびＲｕｖＣ ＤＮＡ切断ドメインからなる群から独立して選択されるドメインに作製される。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質の少なくとも１つの修飾は、配列番号１～３の配列を含む参照ＣａｓＸタンパク質の１つのドメインの少なくとも一部分の欠失を含む。いくつかの実施形態では、欠失は、ＮＴＳＢＤ、ＴＳＬＤ、ヘリカルＩドメイン、ヘリカルＩＩドメイン、ＯＢＤ、またはＲｕｖＣ ＤＮＡ切断ドメインにある。
本開示のＣａｓＸバリアントタンパク質を生成するための好適な変異誘発法には、例えば、ディープミューテーショナルエボルーション（ＤＭＥ）、ディープミューテーショナルスキャニング（ＤＭＳ）、エラープローンＰＣＲ、カセット変異誘発、ランダム変異誘発、スタガードエクステンションＰＣＲ、遺伝子シャフリング、またはドメインスワッピングが含まれ得る。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、例えば、参照ＣａｓＸにおいて１つ以上の所望の変異を選択することによって設計される。ある特定の実施形態では、参照ＣａｓＸタンパク質の活性は、１つ以上のＣａｓＸバリアントの活性が比較されるベンチマークとして使用され、それにより、ＣａｓＸバリアントの機能の改善を測定する。ＣａｓＸバリアントの例示的な改善には、以下により完全に記載される、バリアントの改善されたフォールディング、ｇＮＡに対する改善された結合親和性、標的ＤＮＡに対する改善された結合親和性、１つ以上のＰＡＭ配列に対する改変された結合親和性、標的ＤＮＡの改善された巻き戻し、増加した編集活性、改善された効率、改善された編集特異性、増加したヌクレアーゼ活性、二本鎖切断のための増加した標的鎖負荷、一本鎖ニッキングのための減少した標的鎖負荷、減少したオフターゲット切断、ＤＮＡの非標的鎖の改善された結合、改善されたタンパク質安定性、改善されたタンパク質：ｇＮＡ複合体安定性、改善されたタンパク質溶解性、改善されたタンパク質：ｇＮＡ複合体溶解性、改善されたタンパク質収量、改善されたタンパク質発現、ならびに改善された融合特性が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書に記載のＣａｓＸバリアントのいくつかの実施形態では、少なくとも１つの修飾は、（ａ）配列番号１、配列番号２、もしくは配列番号３の参照ＣａｓＸと比較したＣａｓＸバリアントにおける１～１００個の連続もしくは非連続アミノ酸の置換、（ｂ）参照ＣａｓＸと比較したＣａｓＸバリアントにおける１～１００個の連続もしくは非連続アミノ酸の欠失、（ｃ）参照ＣａｓＸと比較したＣａｓＸにおける１～１００個の連続もしくは非連続アミノ酸の挿入、または（ｄ）（ａ）～（ｃ）の任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの修飾は、（ａ）配列番号１、配列番号２、もしくは配列番号３の参照ＣａｓＸと比較したＣａｓＸバリアントにおける５～１０個の連続もしくは非連続アミノ酸の置換、（ｂ）参照ＣａｓＸと比較したＣａｓＸバリアントにおける１～５個の連続もしくは非連続アミノ酸の欠失、（ｃ）参照ＣａｓＸと比較したＣａｓＸにおける１～５個の連続もしくは非連続アミノ酸の挿入、または（ｄ）（ａ）～（ｃ）の任意の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号１、配列番号２、または配列番号３の配列と比較して、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、または少なくとも５０個の変異を有する配列を含むか、またはそれらからなる。これらの変異は、挿入、欠失、アミノ酸置換、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質の少なくとも１つのドメインに少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、少なくとも約１～４個のアミノ酸置換、１～１０個のアミノ酸置換、１～２０個のアミノ酸置換、１～３０個のアミノ酸置換、１～４０個のアミノ酸置換、１～５０個のアミノ酸置換、１～６０個のアミノ酸置換、１～７０個のアミノ酸置換、１～８０個のアミノ酸置換、１～９０個のアミノ酸置換、１～１００個のアミノ酸置換、２～１０個のアミノ酸置換、２～２０個のアミノ酸置換、２～３０個のアミノ酸置換、３～１０個のアミノ酸置換、３～２０個のアミノ酸置換、３～３０個のアミノ酸置換、４～１０個のアミノ酸置換、４～２０個のアミノ酸置換、３～３００個のアミノ酸置換、５～１０個のアミノ酸置換、５～２０個のアミノ酸置換、５～３０個のアミノ酸置換、１０～５０個のアミノ酸置換、または２０～５０個のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して少なくとも約１００個のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、単一ドメインに１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、保存的置換である。他の実施形態では、置換は非保存的であり、例えば、極性アミノ酸が非極性アミノ酸に置換されるか、またはその逆も同様である。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、１個のアミノ酸置換、２～３個の連続アミノ酸置換、２～４個の連続アミノ酸置換、２～５個の連続アミノ酸置換、２～６個の連続アミノ酸置換、２～７個の連続アミノ酸置換、２～８個の連続アミノ酸置換、２～９個の連続アミノ酸置換、２～１０個の連続アミノ酸置換、２～２０個の連続アミノ酸置換、２～３０個の連続アミノ酸置換、２～４０個の連続アミノ酸置換、２～５０個の連続アミノ酸置換、２～６０個の連続アミノ酸置換、２～７０個の連続アミノ酸置換、２～８０個の連続アミノ酸置換、２～９０個の連続アミノ酸置換、２～１００個の連続アミノ酸置換、３～１０個の連続アミノ酸置換、３～２０個の連続アミノ酸置換、３～３０個の連続アミノ酸置換、４～１０個の連続アミノ酸置換、４～２０個の連続アミノ酸置換、３～３００個の連続アミノ酸置換、５～１０個の連続アミノ酸置換、５～２０個の連続アミノ酸置換、５～３０個の連続アミノ酸置換、１０～５０個の連続アミノ酸置換、または２０～５０個の連続アミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の連続アミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、少なくとも約１００個の連続アミノ酸置換を含む。本明細書で使用される場合、「連続アミノ酸」とは、ポリペプチドの一次配列において隣接しているアミノ酸を指す。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して２個以上の置換を含み、これらの２個以上の置換は参照ＣａｓＸ配列の連続アミノ酸に存在しない。例えば、第１の置換は、参照ＣａｓＸタンパク質の第１のドメインにあり得、第２の置換は、参照ＣａｓＸタンパク質の第２のドメインにあり得る。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の非連続置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して少なくとも２０個の非連続置換を含む。各非連続置換は、本明細書に記載の任意の長さのアミノ酸、例えば、１～４個のアミノ酸、１～１０個のアミノ酸などであり得る。いくつかの実施形態では、参照ＣａｓＸタンパク質と比較した２つ以上の置換は同じ長さではなく、例えば、第１の置換は１個のアミノ酸であり、第２の置換は３個のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、参照ＣａｓＸタンパク質と比較した２個以上の置換は、同じ長さであり、例えば、これらの両方の置換の長さは２個の連続アミノ酸である。
本明細書に記載の置換において、任意のアミノ酸が他の任意のアミノ酸に置換され得る。置換は、保存的置換であり得る（例えば、塩基性アミノ酸が別の塩基性アミノ酸に置換される）。置換は、非保存的置換であり得る（例えば、塩基性アミノ酸が酸性アミノ酸に置換されるか、またはその逆も同様である）。例えば、参照ＣａｓＸタンパク質のプロリンは、アルギニン、ヒスチジン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、またはバリンのうちのいずれかに置換されて、本開示のＣａｓＸバリアントタンパク質を生成することができる。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して少なくとも１個のアミノ酸欠失を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、１～４個のアミノ酸、１～１０個のアミノ酸、１～２０個のアミノ酸、１～３０個のアミノ酸、１～４０個のアミノ酸、１～５０個のアミノ酸、１～６０個のアミノ酸、１～７０個のアミノ酸、１～８０個のアミノ酸、１～９０個のアミノ酸、１～１００個のアミノ酸、２～１０個のアミノ酸、２～２０個のアミノ酸、２～３０個のアミノ酸、３～１０個のアミノ酸、３～２０個のアミノ酸、３～３０個のアミノ酸、４～１０個のアミノ酸、４～２０個のアミノ酸、３～３００個のアミノ酸、５～１０個のアミノ酸、５～２０個のアミノ酸、５～３０個のアミノ酸、１０～５０個のアミノ酸、または２０～５０個のアミノ酸の欠失を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して少なくとも約１００個の連続アミノ酸の欠失を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、または１００個の連続アミノ酸の欠失を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の連続アミノ酸の欠失を含む。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して２個以上の欠失を含み、これらの２個以上の欠失は連続アミノ酸ではない。例えば、第１の欠失は、参照ＣａｓＸタンパク質の第１のドメインにあり得、第２の欠失は、参照ＣａｓＸタンパク質の第２のドメインにあり得る。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の非連続欠失を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して少なくとも２０個の非連続欠失を含む。各非連続欠失は、本明細書に記載の任意の長さのアミノ酸、例えば、１～４個のアミノ酸、１～１０個のアミノ酸などであり得る。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、少なくとも１個のアミノ酸挿入を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、１個のアミノ酸の挿入、２～３個の連続アミノ酸、２～４個の連続アミノ酸、２～５個の連続アミノ酸、２～６個の連続アミノ酸、２～７個の連続アミノ酸、２～８個の連続アミノ酸、２～９個の連続アミノ酸、２～１０個の連続アミノ酸、２～２０個の連続アミノ酸、２～３０個の連続アミノ酸、２～４０個の連続アミノ酸、２～５０個の連続アミノ酸、２～６０個の連続アミノ酸、２～７０個の連続アミノ酸、２～８０個の連続アミノ酸、２～９０個の連続アミノ酸、２～１００個の連続アミノ酸、３～１０個の連続アミノ酸、３～２０個の連続アミノ酸、３～３０個の連続アミノ酸、４～１０個の連続アミノ酸、４～２０個の連続アミノ酸、３～３００個の連続アミノ酸、５～１０個の連続アミノ酸、５～２０個の連続アミノ酸、５～３０個の連続アミノ酸、１０～５０個の連続アミノ酸、または２０～５０個の連続アミノ酸の挿入を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の連続アミノ酸の挿入を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、少なくとも約１００個の連続アミノ酸の挿入を含む。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して２個以上の挿入を含み、これらの２個以上の挿入は配列の連続アミノ酸ではない。例えば、第１の挿入は、参照ＣａｓＸタンパク質の第１のドメインにあり得、第２の挿入は、参照ＣａｓＸタンパク質の第２のドメインにあり得る。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の非連続挿入を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して少なくとも１０～約２０個以上の非連続挿入を含む。各非連続挿入は、本明細書に記載の任意の長さのアミノ酸、例えば、１～４個のアミノ酸、１～１０個のアミノ酸などであり得る。
任意のアミノ酸、またはアミノ酸の任意の組み合わせが、本明細書に記載の挿入に挿入され得る。例えば、プロリン、アルギニン、ヒスチジン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシンもしくはバリン、またはそれらの任意の組み合わせが、本開示の参照ＣａｓＸタンパク質に挿入されて、ＣａｓＸバリアントタンパク質を生成することができる。
本明細書に記載の置換、挿入、および欠失の実施形態の任意の順列が組み合わせられて、本開示のＣａｓＸバリアントタンパク質を生成することができる。例えば、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質配列と比較した少なくとも１つの置換および少なくとも１つの欠失、参照ＣａｓＸタンパク質配列と比較した少なくとも１つの置換および少なくとも１つの挿入、参照ＣａｓＸタンパク質配列と比較した少なくとも１つの挿入および少なくとも１つの欠失、または参照ＣａｓＸタンパク質と比較した少なくとも１つの置換、１つの挿入、および１つの欠失を含み得る。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号１、配列番号２、または配列番号３のうちの１つと少なくとも約６０％の配列類似性、少なくとも７０％の類似性、少なくとも８０％の類似性、少なくとも８５％の類似性、少なくとも８６％の類似性、少なくとも８７％の類似性、少なくとも８８％の類似性、少なくとも８９％の類似性、少なくとも９０％の類似性、少なくとも９１％の類似性、少なくとも９２％の類似性、少なくとも９３％の類似性、少なくとも９４％の類似性、少なくとも９５％の類似性、少なくとも９６％の類似性、少なくとも９７％の類似性、少なくとも９８％の類似性、少なくとも９９％の類似性、少なくとも９９．５％の類似性、少なくとも９９．６％の類似性、少なくとも９９．７％の類似性、少なくとも９９．８％の類似性、または少なくとも９９．９％の類似性を有する。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２またはその一部と少なくとも約６０％の配列類似性を有する。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＹ７８９Ｔの置換、配列番号２のＰ７９３の欠失、配列番号２のＹ７８９Ｄの置換、配列番号２のＴ７２Ｓの置換、配列番号２のＩ５４６Ｖの置換、配列番号２のＥ５５２Ａの置換、配列番号２のＡ６３６Ｄの置換、配列番号２のＦ５３６Ｓの置換、配列番号２のＡ７０８Ｋの置換、配列番号２のＹ７９７Ｌの置換、配列番号２のＬ７９２Ｇの置換、配列番号２のＡ７３９Ｖの置換、配列番号２のＧ７９１Ｍの置換、配列番号２の６６１位でのＡの挿入、配列番号２のＡ７８８Ｗの置換、配列番号２のＫ３９０Ｒの置換、配列番号２のＡ７５１Ｓの置換、配列番号２のＥ３８５Ａの置換、配列番号２の６９６位でのＰの挿入、配列番号２の７７３位でのＭの挿入、配列番号２のＧ６９５Ｈの置換、配列番号２の７９３位でのＡＳの挿入、配列番号２の７９５位でのＡＳの挿入、配列番号２のＣ４７７Ｒの置換、配列番号２のＣ４７７Ｋの置換、配列番号２のＣ４７９Ａの置換、配列番号２のＣ４７９Ｌの置換、配列番号２のＩ５５Ｆの置換、配列番号２のＫ２１０Ｒの置換、配列番号２のＣ２３３Ｓの置換、配列番号２のＤ２３１Ｎの置換、配列番号２のＱ３３８Ｅの置換、配列番号２のＱ３３８Ｒの置換、配列番号２のＬ３７９Ｒの置換、配列番号２のＫ３９０Ｒの置換、配列番号２のＬ４８１Ｑの置換、配列番号２のＦ４９５Ｓの置換、配列番号２のＤ６００Ｎの置換、配列番号２のＴ８８６Ｋの置換、配列番号２のＡ７３９Ｖの置換、配列番号２のＫ４６０Ｎの置換、配列番号２のＩ１９９Ｆの置換、配列番号２のＧ４９２Ｐの置換、配列番号２のＴ１５３Ｉの置換、配列番号２のＲ５９１Ｉの置換、配列番号２の７９５位でのＡＳの挿入、配列番号２の７９６位でのＡＳの挿入、配列番号２の８８９位でのＬの挿入、配列番号２のＥ１２１Ｄの置換、配列番号２のＳ２７０Ｗの置換、配列番号２のＥ７１２Ｑの置換、配列番号２のＫ９４２Ｑの置換、配列番号２のＥ５５２Ｋの置換、配列番号２のＫ２５Ｑの置換、配列番号２のＮ４７Ｄの置換、配列番号２の６９６位でのＴの挿入、配列番号２のＬ６８５Ｉの置換、配列番号２のＮ８８０Ｄの置換、配列番号２のＱ１０２Ｒの置換、配列番号２のＭ７３４Ｋの置換、配列番号２のＡ７２４Ｓの置換、配列番号２のＴ７０４Ｋの置換、配列番号２のＰ２２４Ｋの置換、配列番号２のＫ２５Ｒの置換、配列番号２のＭ２９Ｅの置換、配列番号２のＨ１５２Ｄの置換、配列番号２のＳ２１９Ｒの置換、配列番号２のＥ４７５Ｋの置換、配列番号２のＧ２２６Ｒの置換、配列番号２のＡ３７７Ｋの置換、配列番号２のＥ４８０Ｋの置換、配列番号２のＫ４１６Ｅの置換、配列番号２のＨ１６４Ｒの置換、配列番号２のＫ７６７Ｒの置換、配列番号２のＩ７Ｆの置換、配列番号２のＭ２９Ｒの置換、配列番号２のＨ４３５Ｒの置換、配列番号２のＥ３８５Ｑの置換、配列番号２のＥ３８５Ｋの置換、配列番号２のＩ２７９Ｆの置換、配列番号２のＤ４８９Ｓの置換、配列番号２のＤ７３２Ｎの置換、配列番号２のＡ７３９Ｔの置換、配列番号２のＷ８８５Ｒの置換、配列番号２のＥ５３Ｋの置換、配列番号２のＡ２３８Ｔの置換、配列番号２のＰ２８３Ｑの置換、配列番号２のＥ２９２Ｋの置換、配列番号２のＱ６２８Ｅの置換、配列番号２のＲ３８８Ｑの置換、配列番号２のＧ７９１Ｍの置換、配列番号２のＬ７９２Ｋの置換、配列番号２のＬ７９２Ｅの置換、配列番号２のＭ７７９Ｎの置換、配列番号２のＧ２７Ｄの置換、配列番号２のＫ９５５Ｒの置換、配列番号２のＳ８６７Ｒの置換、配列番号２のＲ６９３Ｉの置換、配列番号２のＦ１８９Ｙの置換、配列番号２のＶ６３５Ｍの置換、配列番号２のＦ３９９Ｌの置換、配列番号２のＥ４９８Ｋの置換、配列番号２のＥ３８６Ｒの置換、配列番号２のＶ２５４Ｇの置換、配列番号２のＰ７９３Ｓの置換、配列番号２のＫ１８８Ｅの置換、配列番号２のＱＴ９４５ＫＩの置換、配列番号２のＴ６２０Ｐの置換、配列番号２のＴ９４６Ｐの置換、配列番号２のＴＴ９４９ＰＰの置換、配列番号２のＮ９５２Ｔの置換、配列番号２のＫ６８２Ｅの置換、配列番号２のＫ９７５Ｒの置換、配列番号２のＬ２１２Ｐの置換、配列番号２のＥ２９２Ｒの置換、配列番号２のＩ３０３Ｋの置換、配列番号２のＣ３４９Ｅの置換、配列番号２のＥ３８５Ｐの置換、配列番号２のＥ３８６Ｎの置換、配列番号２のＤ３８７Ｋの置換、配列番号２のＬ４０４Ｋの置換、配列番号２のＥ４６６Ｈの置換、配列番号２のＣ４７７Ｑの置換、配列番号２のＣ４７７Ｈの置換、配列番号２のＣ４７９Ａの置換、配列番号２のＤ６５９Ｈの置換、配列番号２のＴ８０６Ｖの置換、配列番号２のＫ８０８Ｓの置換、配列番号２の７９７位でのＡＳの挿入、配列番号２のＶ９５９Ｍの置換、配列番号２のＫ９７５Ｑの置換、配列番号２のＷ９７４Ｇの置換、配列番号２のＡ７０８Ｑの置換、配列番号２のＶ７１１Ｋの置換、配列番号２のＤ７３３Ｔの置換、配列番号２のＬ７４２Ｗの置換、配列番号２のＶ７４７Ｋの置換、配列番号２のＦ７５５Ｍの置換、配列番号２のＭ７７１Ａの置換、配列番号２のＭ７７１Ｑの置換、配列番号２のＷ７８２Ｑの置換、配列番号２のＧ７９１Ｆの置換、配列番号２のＬ７９２Ｄの置換、配列番号２のＬ７９２Ｋの置換、配列番号２のＰ７９３Ｑの置換、配列番号２のＰ７９３Ｇの置換、配列番号２のＱ８０４Ａの置換、配列番号２のＹ９６６Ｎの置換、配列番号２のＹ７２３Ｎの置換、配列番号２のＹ８５７Ｒの置換、配列番号２のＳ８９０Ｒの置換、配列番号２のＳ９３２Ｍの置換、配列番号２のＬ８９７Ｍの置換、配列番号２のＲ６２４Ｇの置換、配列番号２のＳ６０３Ｇの置換、配列番号２のＮ７３７Ｓの置換、配列番号２のＬ３０７Ｋの置換、配列番号２のＩ６５８Ｖの置換、配列番号２の６８８位でのＰＴの挿入、配列番号２の７９４位でのＳＡの挿入、配列番号２のＳ８７７Ｒの置換、配列番号２のＮ５８０Ｔの置換、配列番号２のＶ３３５Ｇの置換、配列番号２のＴ６２０Ｓの置換、配列番号２のＷ３４５Ｇの置換、配列番号２のＴ２８０Ｓの置換、配列番号２のＬ４０６Ｐの置換、配列番号２のＡ６１２Ｄの置換、配列番号２のＡ７５１Ｓの置換、配列番号２のＥ３８６Ｒの置換、配列番号２のＶ３５１Ｍの置換、配列番号２のＫ２１０Ｎの置換、配列番号２のＤ４０Ａの置換、配列番号２のＥ７７３Ｇの置換、配列番号２のＨ２０７Ｌの置換、配列番号２のＴ６２Ａの置換、配列番号２のＴ２８７Ｐの置換、配列番号２のＴ８３２Ａの置換、配列番号２のＡ８９３Ｓの置換、配列番号２の１４位でのＶの挿入、配列番号２の１３位でのＡＧの挿入、配列番号２のＲ１１Ｖの置換、配列番号２のＲ１２Ｎの置換、配列番号２のＲ１３Ｈの置換、配列番号２の１３位でのＹの挿入、配列番号２のＲ１２Ｌの置換、配列番号２の１３位でのＱの挿入、配列番号２のＶ１５Ｓの置換、配列番号２の１７位でのＤの挿入、またはそれらの組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、ＮＴＳＢドメインに少なくとも１つの修飾を含む。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、ＴＳＬドメインに少なくとも１つの修飾を含む。いくつかの実施形態では、ＴＳＬドメインにおける少なくとも１つの修飾は、配列番号２のアミノ酸Ｙ８５７、Ｓ８９０、またはＳ９３２のうちの１つ以上のアミノ酸置換を含む。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、ヘリカルＩドメインに少なくとも１つの修飾を含む。いくつかの実施形態では、ヘリカルＩドメインにおける少なくとも１つの修飾は、配列番号２のアミノ酸Ｓ２１９、Ｌ２４９、Ｅ２５９、Ｑ２５２、Ｅ２９２、Ｌ３０７、またはＤ３１８のうちの１つ以上のアミノ酸置換を含む。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、ヘリカルＩＩドメインに少なくとも１つの修飾を含む。いくつかの実施形態では、ヘリカルＩＩドメインにおける少なくとも１つの修飾は、配列番号２のアミノ酸Ｄ３６１、Ｌ３７９、Ｅ３８５、Ｅ３８６、Ｄ３８７、Ｆ３９９、Ｌ４０４、Ｒ４５８、Ｃ４７７、またはＤ４８９のうちの１つ以上のアミノ酸置換を含む。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、ＯＢＤドメインに少なくとも１つの修飾を含む。いくつかの実施形態では、ＯＢＤにおける少なくとも１つの修飾は、配列番号２のアミノ酸Ｆ５３６、Ｅ５５２、Ｔ６２０、またはＩ６５８のうちの１つ以上のアミノ酸置換を含む。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、ＲｕｖＣ ＤＮＡ切断ドメインに少なくとも１つの修飾を含む。いくつかの実施形態では、ＲｕｖＣ ＤＮＡ切断ドメインにおける少なくとも１つの修飾は、配列番号２のアミノ酸Ｋ６８２、Ｇ６９５、Ａ７０８、Ｖ７１１、Ｄ７３２、Ａ７３９、Ｄ７３３、Ｌ７４２、Ｖ７４７、Ｆ７５５、Ｍ７７１、Ｍ７７９、Ｗ７８２、Ａ７８８、Ｇ７９１、Ｌ７９２、Ｐ７９３、Ｙ７９７、Ｍ７９９、Ｑ８０４、Ｓ８１９、またはＹ８５７のうちの１つ以上のアミノ酸置換、またはアミノ酸Ｐ７９３の欠失を含む。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、配列番号２の参照ＣａｓＸ配列と比較して少なくとも１つの修飾を含み、（ａ）Ｌ３７９Ｒのアミノ酸置換、（ｂ）Ａ７０８Ｋのアミノ酸置換、（ｃ）Ｔ６２０Ｐのアミノ酸置換、（ｄ）Ｅ３８５Ｐのアミノ酸置換、（ｅ）Ｙ８５７Ｒのアミノ酸置換、（ｆ）Ｉ６５８Ｖのアミノ酸置換、（ｇ）Ｆ３９９Ｌのアミノ酸置換、（ｈ）Ｑ２５２Ｋのアミノ酸置換、（ｉ）Ｌ４０４Ｋのアミノ酸置換、および（ｊ）Ｐ７９３のアミノ酸欠失のうちの１つ以上から選択される。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質アミノ酸配列に対して少なくとも２つのアミノ酸変化を含む。少なくとも２つのアミノ酸変化は、参照ＣａｓＸタンパク質アミノ酸配列の置換、挿入、もしくは欠失、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。置換、挿入、または欠失は、本明細書に記載の参照ＣａｓＸタンパク質の配列における任意の置換、挿入、または欠失であり得る。いくつかの実施形態では、変化は、参照ＣａｓＸタンパク質配列に対する隣接アミノ酸変化、非隣接アミノ酸変化、または隣接アミノ酸変化と非隣接アミノ酸変化との組み合わせである。いくつかの実施形態では、参照ＣａｓＸタンパク質は、配列番号２である。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質に対して、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、または少なくとも１００個のアミノ酸変化を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質配列に対して、１～５０、３～４０、５～３０、５～２０、５～１５、５～１０、１０～５０、１０～４０、１０～３０、１０～２０、１５～５０、１５～４０、１５～３０、２～２５、２～２４、２～２２、２～２３、２～２２、２～２１、２～２０、２～１９、２～１８、２～１７、２～１６、２～１５、２～１４、２～１２、２～１１、２～１０、２～９、２～８、２～７、２～６、２～５、２～４、２～３、３～２５、３～２４、３～２２、３～２３、３～２２、３～２１、３～２０、３～１９、３～１８、３～１７、３～１６、３～１５、３～１４、３～１２、３～１１、３～１０、３～９、３～８、３～７、３～６、３～５、３～４、４～２５、４～２４、４～２２、４～２３、４～２２、４～２１、４～２０、４～１９、４～１８、４～１７、４～１６、４～１５、４～１４、４～１２、４～１１、４～１０、４～９、４～８、４～７、４～６、４～５、５～２５、５～２４、５～２２、５～２３、５～２２、５～２１、５～２０、５～１９、５～１８、５～１７、５～１６、５～１５、５～１４、５～１２、５～１１、５～１０、５～９、５～８、５～７、または５～６個のアミノ酸変化を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質配列に対して１５～２０個の変化を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質配列に対して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個のアミノ酸変化を含む。いくつかの実施形態では、参照ＣａｓＸバリアントタンパク質の配列に対する少なくとも２つのアミノ酸の変化は、配列番号２のＹ７８９Ｔの置換、配列番号２のＰ７９３の欠失、配列番号２のＹ７８９Ｄの置換、配列番号２のＴ７２Ｓの置換、配列番号２のＩ５４６Ｖの置換、配列番号２のＥ５５２Ａの置換、配列番号２のＡ６３６Ｄの置換、配列番号２のＦ５３６Ｓの置換、配列番号２のＡ７０８Ｋの置換、配列番号２のＹ７９７Ｌの置換、Ｌ７９２Ｇ配列番号２の置換、配列番号２のＡ７３９Ｖの置換、配列番号２のＧ７９１Ｍの置換、配列番号２の６６１位でのＡの挿入、配列番号２のＡ７８８Ｗの置換、配列番号２のＫ３９０Ｒの置換、配列番号２のＡ７５１Ｓの置換、配列番号２のＥ３８５Ａの置換、配列番号２の６９６位でのＰの挿入、配列番号２の７７３位でのＭの挿入、配列番号２のＧ６９５Ｈの置換、配列番号２の７９３位でのＡＳの挿入、配列番号２の７９５位でのＡＳの挿入、配列番号２のＣ４７７Ｒの置換、配列番号２のＣ４７７Ｋの置換、配列番号２のＣ４７９Ａの置換、配列番号２のＣ４７９Ｌの置換、配列番号２のＩ５５Ｆの置換、配列番号２のＫ２１０Ｒの置換、配列番号２のＣ２３３Ｓの置換、配列番号２のＤ２３１Ｎの置換、配列番号２のＱ３３８Ｅの置換、配列番号２のＱ３３８Ｒの置換、配列番号２のＬ３７９Ｒの置換、配列番号２のＫ３９０Ｒの置換、配列番号２のＬ４８１Ｑの置換、配列番号２のＦ４９５Ｓの置換、配列番号２のＤ６００Ｎの置換、配列番号２のＴ８８６Ｋの置換、配列番号２のＡ７３９Ｖの置換、配列番号２のＫ４６０Ｎの置換、配列番号２のＩ１９９Ｆの置換、配列番号のＧ４９２Ｐの置換、配列番号２のＴ１５３Ｉの置換、配列番号２のＲ５９１Ｉの置換、配列番号２の７９５位でのＡＳの挿入、配列番号２の７９６位でのＡＳの挿入、配列番号２の８８９位でのＬの挿入、配列番号２のＥ１２１Ｄの置換、配列番号２のＳ２７０Ｗの置換、配列番号２のＥ７１２Ｑの置換、配列番号２のＫ９４２Ｑの置換、配列番号２のＥ５５２Ｋの置換、配列番号２のＫ２５Ｑの置換、配列番号２のＮ４７Ｄの置換、配列番号２の６９６位でのＴの挿入、配列番号２のＬ６８５Ｉの置換、配列番号２のＮ８８０Ｄの置換、配列番号２のＱ１０２Ｒの置換、配列番号２のＭ７３４Ｋの置換、配列番号２のＡ７２４Ｓの置換、配列番号２のＴ７０４Ｋの置換、配列番号２のＰ２２４Ｋの置換、配列番号２のＫ２５Ｒの置換、配列番号２のＭ２９Ｅの置換、配列番号２のＨ１５２Ｄの置換、配列番号２のＳ２１９Ｒの置換、配列番号２のＥ４７５Ｋの置換、配列番号２のＧ２２６Ｒの置換、配列番号２のＡ３７７Ｋの置換、配列番号２のＥ４８０Ｋの置換、配列番号２のＫ４１６Ｅの置換、配列番号２のＨ１６４Ｒの置換、配列番号２のＫ７６７Ｒの置換、配列番号２のＩ７Ｆの置換、配列番号２のＭ２９Ｒの置換、配列番号２のＨ４３５Ｒの置換、配列番号２のＥ３８５Ｑの置換、配列番号２のＥ３８５Ｋの置換、配列番号２のＩ２７９Ｆの置換、配列番号２のＤ４８９Ｓの置換、配列番号２のＤ７３２Ｎの置換、配列番号２のＡ７３９Ｔの置換、配列番号２のＷ８８５Ｒの置換、配列番号２のＥ５３Ｋの置換、配列番号２のＡ２３８Ｔの置換、配列番号２のＰ２８３Ｑの置換、配列番号２のＥ２９２Ｋの置換、配列番号２のＱ６２８Ｅの置換、配列番号２のＲ３８８Ｑの置換、配列番号２のＧ７９１Ｍの置換、配列番号２のＬ７９２Ｋの置換、配列番号２のＬ７９２Ｅの置換、配列番号２のＭ７７９Ｎの置換、配列番号２のＧ２７Ｄの置換、配列番号２のＫ９５５Ｒの置換、配列番号２のＳ８６７Ｒの置換、配列番号２のＲ６９３Ｉの置換、配列番号２のＦ１８９Ｙの置換、配列番号２のＶ６３５Ｍの置換、配列番号２のＦ３９９Ｌの置換、配列番号２のＥ４９８Ｋの置換、配列番号２のＥ３８６Ｒの置換、配列番号２のＶ２５４Ｇの置換、配列番号２のＰ７９３Ｓの置換、配列番号２のＫ１８８Ｅの置換、配列番号２のＱＴ９４５ＫＩの置換、配列番号２のＴ６２０Ｐの置換、配列番号２のＴ９４６Ｐの置換、配列番号２のＴＴ９４９ＰＰの置換、配列番号２のＮ９５２Ｔの置換、配列番号２のＫ６８２Ｅの置換、配列番号２のＫ９７５Ｒの置換、配列番号２のＬ２１２Ｐの置換、配列番号２のＥ２９２Ｒの置換、配列番号２のＩ３０３Ｋの置換、配列番号２のＣ３４９Ｅの置換、配列番号２のＥ３８５Ｐの置換、配列番号２のＥ３８６Ｎの置換、配列番号２のＤ３８７Ｋの置換、配列番号２のＬ４０４Ｋの置換、配列番号２のＥ４６６Ｈの置換、配列番号２のＣ４７７Ｑの置換、配列番号２のＣ４７７Ｈの置換、配列番号２のＣ４７９Ａの置換、配列番号２のＤ６５９Ｈの置換、配列番号２のＴ８０６Ｖの置換、配列番号２のＫ８０８Ｓの置換、配列番号２の７９７位でのＡＳの挿入、配列番号２のＶ９５９Ｍの置換、配列番号２のＫ９７５Ｑの置換、配列番号２のＷ９７４Ｇの置換、配列番号２のＡ７０８Ｑの置換、配列番号２のＶ７１１Ｋの置換、配列番号２のＤ７３３Ｔの置換、配列番号２のＬ７４２Ｗの置換、配列番号２のＶ７４７Ｋの置換、配列番号２のＦ７５５Ｍの置換、配列番号２のＭ７７１Ａの置換、配列番号２のＭ７７１Ｑの置換、配列番号２のＷ７８２Ｑの置換、配列番号２のＧ７９１Ｆの置換、配列番号２のＬ７９２Ｄの置換、配列番号２のＬ７９２Ｋの置換、配列番号２のＰ７９３Ｑの置換、配列番号２のＰ７９３Ｇの置換、配列番号２のＱ８０４Ａの置換、配列番号２のＹ９６６Ｎの置換、配列番号２のＹ７２３Ｎの置換、配列番号２のＹ８５７Ｒの置換、配列番号２のＳ８９０Ｒの置換、配列番号２のＳ９３２Ｍの置換、配列番号２のＬ８９７Ｍの置換、配列番号２のＲ６２４Ｇの置換、配列番号２のＳ６０３Ｇの置換、配列番号２のＮ７３７Ｓの置換、配列番号２のＬ３０７Ｋの置換、配列番号２のＩ６５８Ｖの置換、配列番号２の６８８位でのＰＴの挿入、配列番号２の７９４位でのＳＡの挿入、配列番号２のＳ８７７Ｒの置換、配列番号２のＮ５８０Ｔの置換、配列番号２のＶ３３５Ｇの置換、配列番号２のＴ６２０Ｓの置換、配列番号２のＷ３４５Ｇの置換、配列番号２のＴ２８０Ｓの置換、配列番号２のＬ４０６Ｐの置換、配列番号２のＡ６１２Ｄの置換、配列番号２のＡ７５１Ｓの置換、配列番号２のＥ３８６Ｒの置換、配列番号２のＶ３５１Ｍの置換、配列番号２のＫ２１０Ｎの置換、配列番号２のＤ４０Ａの置換、配列番号２のＥ７７３Ｇの置換、配列番号２のＨ２０７Ｌの置換、Ｔ６２Ａ配列番号２の置換、配列番号２のＴ２８７Ｐの置換、配列番号２のＴ８３２Ａの置換、配列番号２のＡ８９３Ｓの置換、配列番号２の１４位でのＶの挿入、配列番号２の１３位でのＡＧの挿入、配列番号２のＲ１１Ｖの置換、配列番号２のＲ１２Ｎの置換、配列番号２のＲ１３Ｈの置換、配列番号２の１３位でのＹの挿入、配列番号２のＲ１２Ｌの置換、配列番号２の１３位でのＱの挿入、配列番号２のＶ１５Ｓの置換、および配列番号２の１７位でのＤの挿入からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、参照ＣａｓＸタンパク質に対する少なくとも２つのアミノ酸変化は、表４の配列に開示されるアミノ酸変化から選択される。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、この段落の前述の実施形態の任意の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質アミノ酸配列の２つ以上の置換、挿入、および／または欠失を含む。いくつかの実施形態では、参照ＣａｓＸタンパク質は、配列番号２を含むか、またはそれから本質的になる。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＳ７９４Ｒの置換およびＹ７９７Ｌの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＫ４１６Ｅの置換およびＡ７０８Ｋの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＡ７０８Ｋの置換およびＰ７９３の欠失を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、Ｐ７９３の欠失および配列番号２の７９５位でのＡＳの挿入を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＱ３６７Ｋの置換およびＩ４２５Ｓの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＡ７０８Ｋの置換、７９３位でのＰの欠失、およびＡ７９３Ｖの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＱ３３８Ｒの置換およびＡ３３９Ｅの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＱ３３８Ｒの置換およびＡ３３９Ｋの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＳ５０７Ｇの置換およびＧ５０８Ｒの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＬ３７９Ｒの置換、Ａ７０８Ｋの置換、および７９３位でのＰの欠失を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＣ４７７Ｋの置換、Ａ７０８Ｋの置換、および７９３位でのＰの欠失を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＬ３７９Ｒの置換、Ｃ４７７Ｋの置換、Ａ７０８Ｋの置換、および７９３位でのＰの欠失を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＬ３７９Ｒの置換、Ａ７０８Ｋの置換、７９３位でのＰの欠失、およびＡ７３９Ｖの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＣ４７７Ｋの置換、Ａ７０８Ｋの置換、７９３位でのＰの欠失、およびＡ７３９Ｖの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＬ３７９Ｒの置換、Ｃ４７７Ｋの置換、Ａ７０８Ｋの置換、７９３位でのＰの欠失、およびＡ７３９Ｖの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＬ３７９Ｒの置換、Ａ７０８Ｋの置換、７９３位でのＰの欠失、およびＭ７７９Ｎの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＬ３７９Ｒの置換、Ａ７０８Ｋの置換、７９３位でのＰの欠失、およびＭ７７１Ｎの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＬ３７９Ｒの置換、７０８Ｋの置換、７９３位でのＰの欠失、およびＤ４８９Ｓの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＬ３７９Ｒの置換、Ａ７０８Ｋの置換、７９３位でのＰの欠失、およびＡ７３９Ｔの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＬ３７９Ｒの置換、Ａ７０８Ｋの置換、７９３位でのＰの欠失、およびＤ７３２Ｎの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＬ３７９Ｒの置換、Ａ７０８Ｋの置換、７９３位でのＰの欠失、およびＧ７９１Ｍの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＬ３７９Ｒの置換、７０８Ｋの置換、７９３位でのＰの欠失、およびＹ７９７Ｌの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＬ３７９Ｒの置換、Ｃ４７７Ｋの置換、Ａ７０８Ｋの置換、７９３位でのＰの欠失、およびＭ７７９Ｎの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＬ３７９Ｒの置換、Ｃ４７７Ｋの置換、Ａ７０８Ｋの置換、７９３位でのＰの欠失、およびＭ７７１Ｎの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＬ３７９Ｒの置換、Ｃ４７７Ｋの置換、Ａ７０８Ｋの置換、７９３位でのＰの欠失、およびＤ４８９Ｓの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＬ３７９Ｒの置換、Ｃ４７７Ｋの置換、Ａ７０８Ｋの置換、７９３位でのＰの欠失、およびＡ７３９Ｔの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＬ３７９Ｒの置換、Ｃ４７７Ｋの置換、Ａ７０８Ｋの置換、７９３位でのＰの欠失、およびＤ７３２Ｎの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＬ３７９Ｒの置換、Ｃ４７７Ｋの置換、Ａ７０８Ｋの置換、７９３位でのＰの欠失、およびＧ７９１Ｍの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＬ３７９Ｒの置換、Ｃ４７７Ｋの置換、Ａ７０８Ｋの置換、７９３位でのＰの欠失、およびＹ７９７Ｌの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＬ３７９Ｒの置換、Ｃ４７７Ｋの置換、Ａ７０８Ｋの置換、７９３位でのＰの欠失、およびＴ６２０Ｐの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＡ７０８Ｋの置換、７９３位でのＰの欠失、およびＥ３８６Ｓの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＥ３８６Ｒの置換、Ｆ３９９Ｌの置換、および７９３位でのＰの欠失を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＲ５８１ＩおよびＡ７３９Ｖの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、この段落の前述の実施形態の任意の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質アミノ酸配列の２つ以上の置換、挿入、および／または欠失を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＡ７０８Ｋの置換、７９３位でのＰの欠失、およびＡ７３９Ｖの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＬ３７９Ｒの置換、Ａ７０８Ｋの置換、および７９３位でのＰの欠失を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＣ４７７Ｋの置換、Ａ７０８Ｋの置換、および７９３位でのＰの欠失を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＬ３７９Ｒの置換、Ｃ４７７Ｋの置換、Ａ７０８Ｋの置換、および７９３位でのＰの欠失を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＬ３７９Ｒの置換、Ａ７０８Ｋの置換、７９３位でのＰの欠失、およびＡ７３９Ｖの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＣ４７７Ｋの置換、Ａ７０８Ｋの置換、７９３位でのＰの欠失、およびＡ７３９の置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＬ３７９Ｒの置換、Ｃ４７７Ｋの置換、Ａ７０８Ｋの置換、７９３位でのＰの欠失、およびＡ７３９Ｖの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＬ３７９Ｒの置換、Ｃ４７７Ｋの置換、Ａ７０８Ｋの置換、７９３位でのＰの欠失、およびＴ６２０Ｐの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＭ７７１Ａの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＬ３７９Ｒの置換、Ａ７０８Ｋの置換、７９３位でのＰの欠失、およびＤ７３２Ｎの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、この段落の前述の実施形態の任意の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＷ７８２Ｑの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＭ７７１Ｑの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＲ４５８Ｉの置換およびＡ７３９Ｖの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＬ３７９Ｒの置換、Ａ７０８Ｋの置換、７９３位でのＰの欠失、およびＭ７７１Ｎの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＬ３７９Ｒの置換、Ａ７０８Ｋの置換、７９３位でのＰの欠失、およびＡ７３９Ｔの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＬ３７９Ｒの置換、Ｃ４７７Ｋの置換、Ａ７０８Ｋの置換、７９３位でのＰの欠失、およびＤ４８９Ｓの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＬ３７９Ｒの置換、Ｃ４７７Ｋの置換、Ａ７０８Ｋの置換、７９３位でのＰの欠失、およびＤ７３２Ｎの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＶ７１１Ｋの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＬ３７９Ｒの置換、Ｃ４７７Ｋの置換、Ａ７０８Ｋの置換、７９３位でのＰの欠失、およびＹ７９７Ｌの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＬ３７９Ｒの置換、Ａ７０８Ｋの置換、および７９３位でのＰの欠失を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＬ３７９Ｒの置換、Ｃ４７７Ｋの置換、Ａ７０８Ｋの置換、７９３位でのＰの欠失、およびＭ７７１Ｎの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＡ７０８Ｋの置換、７９３位でのＰの置換、およびＥ３８６Ｓの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＬ３７９Ｒの置換、Ｃ４７７Ｋの置換、Ａ７０８Ｋの置換、および７９３位でのＰの欠失を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＬ７９２Ｄの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＧ７９１Ｆの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＡ７０８Ｋの置換、７９３位でのＰの欠失、およびＡ７３９Ｖの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＬ３７９Ｒの置換、Ａ７０８Ｋの置換、７９３位でのＰの欠失、およびＡ７３９Ｖの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＣ４７７Ｋの置換、Ａ７０８Ｋの置換、および７９３位でのＰの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＬ２４９Ｉの置換およびＭ７７１Ｎの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＶ７４７Ｋの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＬ３７９Ｒの置換、Ｃ４７７の置換、Ａ７０８Ｋの置換、７９３位でのＰの欠失、およびＭ７７９Ｎの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、Ｆ７５５Ｍの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、この段落の前述の実施形態の任意の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２の参照ＣａｓＸ配列と比較して少なくとも１つの修飾を含み、少なくとも１つの修飾は、Ｌ３７９Ｒのアミノ酸置換、Ａ７０８Ｋのアミノ酸置換、Ｔ６２０Ｐのアミノ酸置換、Ｅ３８５Ｐのアミノ酸置換、Ｙ８５７Ｒのアミノ酸置換、Ｉ６５８Ｖのアミノ酸置換、Ｆ３９９Ｌのアミノ酸置換、Ｑ２５２Ｋのアミノ酸置換、および［Ｐ７９３］のアミノ酸欠失のうちの１つ以上から選択される。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２の参照ＣａｓＸ配列と比較して少なくとも１つの修飾を含み、少なくとも１つの修飾は、Ｌ３７９Ｒのアミノ酸置換、Ａ７０８Ｋのアミノ酸置換、Ｔ６２０Ｐのアミノ酸置換、Ｅ３８５Ｐのアミノ酸置換、Ｙ８５７Ｒのアミノ酸置換、Ｉ６５８Ｖのアミノ酸置換、Ｆ３９９Ｌのアミノ酸置換、Ｑ２５２Ｋのアミノ酸置換、Ｌ４０４Ｋのアミノ酸置換、および［Ｐ７９３］のアミノ酸欠失のうちの１つ以上から選択される。他の実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２の参照ＣａｓＸ配列と比較して前述の置換または欠失の任意の組み合わせを含む。他の実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、前述の置換または欠失に加えて、ＮＴＳＢおよび／または配列番号１の参照ＣａｓＸ由来のヘリカル１ｂドメインの置換をさらに含むことができる。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、４００～２０００個のアミノ酸、５００～１５００個のアミノ酸、７００～１２００個のアミノ酸、８００～１１００個のアミノ酸、または９００～１０００個のアミノ酸を含む。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、ｇＮＡ：標的ＤＮＡ複合体形成が起こるチャネルを形成する非隣接残基の領域に１つ以上の修飾を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、ｇＮＡに結合する界面を形成する非隣接残基の領域を含む１つ以上の修飾を含む。例えば、参照ＣａｓＸタンパク質のいくつかの実施形態では、ヘリカルＩ、ヘリカルＩＩ、およびＯＢＤドメインは全て、ｇＮＡ：標的ＤＮＡ複合体と接触するか、またはそれに近接しており、これらのドメインのうちのいずれか内の非隣接残基に対する１つ以上の修飾は、ＣａｓＸバリアントタンパク質の機能を改善することができる。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、非標的鎖ＤＮＡに結合するチャネルを形成する非隣接残基の領域に１つ以上の修飾を含む。例えば、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、ＮＴＳＢＤの非隣接残基に対して１つ以上の修飾を含むことができる。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、ＰＡＭに結合する界面を形成する非隣接残基の領域に１つ以上の修飾を含む。例えば、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、ヘリカルＩドメインまたはＯＢＤの非隣接残基に対して１つ以上の修飾を含むことができる。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、非隣接表面露出残基の領域を含む１つ以上の修飾を含む。本明細書で使用される場合、「表面露出残基」とは、ＣａｓＸタンパク質の表面上のアミノ酸、またはアミノ酸の少なくとも一部分、例えば、骨格もしくは側鎖の一部がタンパク質の表面上にあるアミノ酸を指す。水性細胞内環境に曝露されているＣａｓＸなどの細胞タンパク質の表面露出残基は、正に荷電した親水性アミノ酸、例えば、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、セリン、およびスレオニンからしばしば選択される。したがって、例えば、本明細書に提供されるバリアントのいくつかの実施形態では、表面露出残基の領域は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して１つ以上の挿入、欠失、または置換を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の正に荷電した残基は、１つ以上の他の正に荷電した残基、もしくは負に荷電した残基、もしくは非荷電残基、またはそれらの任意の組み合わせに置換される。いくつかの実施形態では、置換のための１つ以上のアミノ酸残基は、近くの結合した核酸であり、例えば、標的ＤＮＡと接触するＲｕｖＣドメインもしくはヘリカルＩドメイン内の残基、またはｇＮＡに結合するＯＢＤもしくはヘリカルＩＩドメイン内の残基は、１つ以上の正に荷電したアミノ酸または極性アミノ酸に置換され得る。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質のドメインに疎水性パッキングによりコアを形成する非隣接残基の領域に１つ以上の修飾を含む。いかなる理論にも拘束されることを望むことなく、疎水性パッキングによりコアを形成する領域は、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびシステインなどの疎水性アミノ酸が豊富である。例えば、いくつかの参照ＣａｓＸタンパク質では、ＲｕｖＣドメインは、活性部位に隣接する疎水性ポケットを含む。いくつかの実施形態では、その領域の２～１５個の残基は、荷電、極性、または塩基スタッキングである。荷電アミノ酸（本明細書では残基と称されることもある）には、例えば、アルギニン、リジン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸が含まれ得、これらのアミノ酸の側鎖が塩橋を形成し得るが、但し、架橋パートナーも存在することを条件とする。極性アミノ酸には、例えば、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、セリン、スレオニン、チロシン、およびシステインが含まれ得る。極性アミノ酸は、いくつかの実施形態では、それらの側鎖の同一性に応じて、プロトン供与体または受容体として水素結合を形成することができる。本明細書で使用される場合、「塩基スタッキング」は、アミノ酸残基（トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、またはヒスチジンなど）の芳香族側鎖と、核酸内のスタックされたヌクレオチド塩基との相互作用を含む。ＣａｓＸバリアントタンパク質の機能的部分を形成するために空間的にごく近接している非隣接アミノ酸の領域に対するいずれの修飾も、本開示の範囲内であると想定される。
ｉ．複数の供給源タンパク質由来のドメインを有するＣａｓＸバリアントタンパク質
ある特定の実施形態では、本開示は、２つ以上の異なるＣａｓＸタンパク質、例えば、２つ以上の天然に存在するＣａｓＸタンパク質、または本明細書に記載の２つ以上のＣａｓＸバリアントタンパク質配列由来のタンパク質ドメインを含むキメラＣａｓＸタンパク質を提供する。本明細書で使用される場合、「キメラＣａｓＸタンパク質」とは、２つの天然に存在するタンパク質などの異なる供給源から単離されたまたはそれらに由来する少なくとも２つのドメインを含むＣａｓＸを指し、いくつかの実施形態では、異なる種から単離され得る。例えば、いくつかの実施形態では、キメラＣａｓＸタンパク質は、第１のＣａｓＸタンパク質由来の第１のドメインと、第２の異なるＣａｓＸタンパク質由来の第２のドメインとを含む。いくつかの実施形態では、第１のドメインは、ＮＴＳＢ、ＴＳＬ、ヘリカルＩ、ヘリカルＩＩ、ＯＢＤ、およびＲｕｖＣドメインからなる群から選択され得る。いくつかの実施形態では、第２のドメインは、ＮＴＳＢ、ＴＳＬ、ヘリカルＩ、ヘリカルＩＩ、ＯＢＤ、およびＲｕｖＣドメインからなる群から選択され、第２のドメインは、前述の第１のドメインとは異なる。例えば、キメラＣａｓＸタンパク質は、配列番号２のＣａｓＸタンパク質由来のＮＴＳＢ、ＴＳＬ、ヘリカルＩ、ヘリカルＩＩ、ＯＢＤドメイン、および配列番号１のＣａｓＸタンパク質由来のＲｕｖＣドメインを含み得、またはその逆も同様である。さらなる例として、キメラＣａｓＸタンパク質は、配列番号２のＣａｓＸタンパク質由来のＮＴＳＢ、ＴＳＬ、ヘリカルＩＩ、ＯＢＤ、およびＲｕｖＣドメイン、ならびに配列番号１のＣａｓＸタンパク質由来のヘリカルＩドメインを含み得、またはその逆も同様である。したがって、ある特定の実施形態では、キメラＣａｓＸタンパク質は、第１のＣａｓＸタンパク質由来のＮＴＳＢ、ＴＳＬ、ヘリカルＩＩ、ＯＢＤ、およびＲｕｖＣドメインと、第２のＣａｓＸタンパク質由来のヘリカルＩドメインとを含み得る。キメラＣａｓＸタンパク質のいくつかの実施形態では、第１のＣａｓＸタンパク質のドメインは、配列番号１、配列番号２、または配列番号３の配列に由来し、第２のＣａｓＸタンパク質のドメインは、配列番号１、配列番号２、または配列番号３の配列に由来し、第１のＣａｓＸタンパク質と第２のＣａｓＸタンパク質は同じではない。いくつかの実施形態では、第１のＣａｓＸタンパク質のドメインは、配列番号１に由来する配列を含み、第２のＣａｓＸタンパク質のドメインは、配列番号２に由来する配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のＣａｓＸタンパク質のドメインは、配列番号１に由来する配列を含み、第２のＣａｓＸタンパク質のドメインは、配列番号３に由来する配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のＣａｓＸタンパク質のドメインは、配列番号２に由来する配列を含み、第２のＣａｓＸタンパク質のドメインは、配列番号３に由来する配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、ＣａｓＸバリアント３８７、３８８、３８９、３９０、３９５、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、および４９１からなる群から選択され、それらの配列は表４に記載される。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、第１のＣａｓＸタンパク質由来の第１の部分と、第２の異なるＣａｓＸタンパク質由来の第２の部分とを含む少なくとも１つのキメラドメインを含む。本明細書で使用される場合、「キメラドメイン」とは、異なる供給源、例えば、２つの天然に存在するタンパク質から単離されたまたはそれらに由来する少なくとも２つの部分を含むドメイン、または２つの参照ＣａｓＸタンパク質由来のドメインの一部分を指す。少なくとも１つのキメラドメインは、本明細書に記載のＮＴＳＢ、ＴＳＬ、ヘリカルＩ、ヘリカルＩＩ、ＯＢＤ、またはＲｕｖＣドメインのうちのいずれかであり得る。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸドメインの第１の部分は、配列番号１の配列を含み、ＣａｓＸドメインの第２の部分は、配列番号２の配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸドメインの第１の部分は、配列番号１の配列を含み、ＣａｓＸドメインの第２の部分は、配列番号３の配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸドメインの第１の部分は、配列番号２の配列を含み、ＣａｓＸドメインの第２の部分は、配列番号３の配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのキメラドメインは、キメラＲｕｖＣドメインを含む。前述の例として、キメラＲｕｖＣドメインは、配列番号１のアミノ酸６６１～８２４および配列番号２のアミノ酸９２２～９７８を含む。前述の代替例として、キメラＲｕｖＣドメインは、配列番号２のアミノ酸６４８～８１２および配列番号１のアミノ酸９３５～９８６を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質は、第１のＣａｓＸタンパク質由来の第１のドメインと、第２のＣａｓＸタンパク質由来の第２のドメインと、この段落に記載の実施形態のアプローチを使用して異なるＣａｓＸタンパク質から単離された少なくとも２つの部分を含む少なくとも１つのキメラドメインとを含む。前述の実施形態では、配列番号１、２、および３に由来するドメインまたはドメインの一部を有するキメラＣａｓＸタンパク質は、本明細書に開示される実施形態のうちのいずれかのアミノ酸の挿入、欠失、または置換をさらに含み得る。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、表４、表７、表８、表９、または表１１に記載の配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、表４に記載の配列からなる。他の実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、表４、表７、表８、表９、または表１１に記載の配列と少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一の配列を含む。他の実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、表４に記載の配列を含み、Ｎ末端、Ｃ末端、またはそれらの両方のいずれかにまたはそれらの近くに本明細書に開示される１つ以上のＮＬＳをさらに含む。いくつかの事例では、これらの表のＣａｓＸバリアントのＮ末端メチオニンが翻訳後修飾中に発現されたＣａｓＸバリアントから除去されることが理解されよう。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号４９～１４３、４３８、４４０、４４２、４４４、４４６、４４８～４６０、４７２、４７４、４７８、４８０、４８２、４８４、４８６、４８８、４９０、６１２、および６１３からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号４９～１４３、４３８、４４０、４４２、４４４、４４６、４４８～４６０、４７２、４７４、４７８、４８０、４８２、４８４、４８６、４８８、４９０、６１２、および６１３からなる群から選択される配列、またはそれと少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９６％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号４９～１４３からなる群から選択される配列、またはそれと少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９６％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号４９～１４３からなる群から選択される配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質、例えば、配列番号１、配列番号２、または配列番号３の参照タンパク質と比較して、ＣａｓＸタンパク質の１つ以上の改善された特性を有する。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントの少なくとも１つの改善された特性は、参照タンパク質と比較して少なくとも約１．１～約１００，０００倍改善される。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントの少なくとも１つの改善された特性は、参照ＣａｓＸタンパク質よりも少なくとも約１．１～約１０，０００倍改善される、少なくとも約１．１～約１，０００倍改善される、少なくとも約１．１～約５００倍改善される、少なくとも約１．１～約４００倍改善される、少なくとも約１．１～約３００倍改善される、少なくとも約１．１～約２００倍改善される、少なくとも約１．１～約１００倍改善される、少なくとも約１．１～約５０倍改善される、少なくとも約１．１～約４０倍改善される、少なくとも約１．１～約３０倍改善される、少なくとも約１．１～約２０倍改善される、少なくとも約１．１～約１０倍改善される、少なくとも約１．１～約９倍改善される、少なくとも約１．１～約８倍改善される、少なくとも約１．１～約７倍改善される、少なくとも約１．１～約６倍改善される、少なくとも約１．１～約５倍改善される、少なくとも約１．１～約４倍改善される、少なくとも約１．１～約３倍改善される、少なくとも約１．１～約２倍改善される、少なくとも約１．１～約１．５倍改善される、少なくとも約１．５～約３倍改善される、少なくとも約１．５～約４倍改善される、少なくとも約１．５～約５倍改善される、少なくとも約１．５～約１０倍改善される、少なくとも約５～約１０倍改善される、少なくとも約１０～約２０倍改善される、少なくとも１０～約３０倍改善される、少なくとも１０～約５０倍改善される、または少なくとも１０～約１００倍改善される。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントの少なくとも１つの改善された特性は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して少なくとも約１０～約１０００倍改善される。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質の１つ以上の改善された特性は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、少なくとも約５、少なくとも約１０、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、少なくとも約２５０、少なくとも約５００、または少なくとも約１０００、少なくとも約５，０００、少なくとも約１０，０００、または少なくとも約１００，０００倍改善される。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質の改善された特性は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、少なくとも約１．１、少なくとも約１．２、少なくとも約１．３、少なくとも約１．４、少なくとも約１．５、少なくとも約１．６、少なくとも約１．７、少なくとも約１．８、少なくとも約１．９、少なくとも約２、少なくとも約２．１、少なくとも約２．２、少なくとも約２．３、少なくとも約２．４、少なくとも約２．５、少なくとも約２．６、少なくとも約２．７、少なくとも約２．８、少なくとも約２．９、少なくとも約３、少なくとも約３．５、少なくとも約４、少なくとも約４．５、少なくとも約５、少なくとも約５．５、少なくとも約６、少なくとも約６．５、少なくとも約７．０、少なくとも約７．５、少なくとも約８、少なくとも約８．５、少なくとも約９、少なくとも約９．５、少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、少なくとも約５００、少なくとも約１，０００、少なくとも約１０，０００、または少なくとも約１００，０００倍改善される。他の事例では、ＣａｓＸバリアントの１つ以上の改善された特性は、配列番号１、配列番号２、または配列番号３の参照ＣａｓＸと比較して、約１．１～１００，００倍、約１．１～１０，００倍、約１．１～１，０００倍、約１．１～５００倍、約１．１～１００倍、約１．１～５０倍、約１．１～２０倍、約１０～１００，００倍、約１０～１０，００倍、約１０～１，０００倍、約１０～５００倍、約１０～１００倍、約１０～５０倍、約１０～２０倍、約２～７０倍、約２～５０倍、約２～３０倍、約２～２０倍、約２～１０倍、約５～５０倍、約５～３０倍、約５～１０倍、約１００～１００，００倍、約１００～１０，００倍、約１００～１，０００倍、約１００～５００倍、約５００～１００，００倍、約５００～１０，００倍、約５００～１，０００倍、約５００～７５０倍、約１，０００～１００，００倍、約１０，０００～１００，００倍、約２０～５００倍、約２０～２５０倍、約２０～２００倍、約２０～１００倍、約２０～５０倍、約５０～１０，０００倍、約５０～１，０００倍、約５０～５００倍、約５０～２００倍、または約５０～１００倍改善される。他の事例では、ＣａｓＸバリアントの１つ以上の改善された特性は、配列番号１、配列番号２、または配列番号３の参照ＣａｓＸと比較して、約１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、４５倍、５０倍、５５倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１１０倍、１２０倍、１３０倍、１４０倍、１５０倍、１６０倍、１７０倍、１８０倍、１９０倍、２００倍、２１０倍、２２０倍、２３０倍、２４０倍、２５０倍、２６０倍、２７０倍、２８０倍、２９０倍、３００倍、３１０倍、３２０倍、３３０倍、３４０倍、３５０倍、３６０倍、３７０倍、３８０倍、３９０倍、４００倍、４２５倍、４５０倍、４７５倍、または５００倍改善される。参照ＣａｓＸタンパク質における同じ特性と比較してＣａｓＸバリアントタンパク質において改善され得る例示的な特性には、バリアントの改善されたフォールディング、ｇＮＡに対する改善された結合親和性、標的ＤＮＡに対する改善された結合親和性、標的ＤＮＡの編集および／または結合においてＰＡＭ配列のより広範なスペクトルを利用する改善された能力、標的ＤＮＡの改善された巻き戻し、増加した編集活性、改善された編集効率、改善された編集特異性、増加したヌクレアーゼ活性、二本鎖切断のための増加した標的鎖負荷、一本鎖ニッキングのための減少した標的鎖負荷、減少したオフターゲット切断、ＤＮＡの非標的鎖の改善された結合、改善されたタンパク質安定性、改善されたＣａｓＸ：ｇＮＡ ＲＮＡ複合体安定性、改善されたタンパク質溶解性、改善されたＣａｓＸ：ｇＮＡ ＲＮＰ複合体溶解性、ｇＮＡと切断能力のあるＲＮＰを形成する改善された能力、改善されたタンパク質収量、改善されたタンパク質発現、および改善された融合特性が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、バリアントは、少なくとも１つの改善された特性を含む。他の実施形態では、バリアントは、少なくとも２つの改善された特性を含む。さらなる実施形態では、バリアントは、少なくとも３つの改善された特性を含む。いくつかの実施形態では、バリアントは、少なくとも４つの改善された特性を含む。なおさらなる実施形態では、バリアントは、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、またはそれ以上の改善された特性を含む。
例示的な改善された特性には、一例として、改善された編集効率が含まれる。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質およびｇＮＡを含む２０ｐＭ以下の濃度の本開示のＲＮＰは、少なくとも８０％の効率で二本鎖ＤＮＡ標的を切断することができる。いくつかの実施形態では、２０ｐＭ以下の濃度のＲＮＰは、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の効率で二本鎖ＤＮＡ標的を切断することができる。いくつかの実施形態では、５０ｐＭ以下、４０ｐＭ以下、３０ｐＭ以下、２０ｐＭ以下、１０ｐＭ以下、または５ｐＭ以下の濃度のＲＮＰは、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の効率で二本鎖ＤＮＡ標的を切断することができる。
これらの改善された特性は、以下により詳細に記載される。
ｊ．タンパク質安定性
いくつかの実施形態では、本開示は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して改善された安定性を有するＣａｓＸバリアントタンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質の改善された安定性は、タンパク質のより高い定常状態の発現をもたらし、これにより、編集効率が改善する。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質の改善された安定性により、より大部分が機能的立体配座で折り畳まれたままの状態を保つＣａｓＸタンパク質がもたらされ、編集効率が改善されるか、または製造目的のために精製性が改善される。本明細書で使用される場合、「機能的立体配座」とは、タンパク質がｇＮＡおよび標的ＤＮＡに結合することができる立体配座にあるＣａｓＸタンパク質を指す。ＣａｓＸバリアントを触媒的に死んだ状態にする１つ以上の変異をＣａｓＸバリアントが有しない実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、標的ＤＮＡを切断、ニッキング、または別様に修飾することができる。例えば、機能的ＣａｓＸバリアントは、いくつかの実施形態では、遺伝子編集に使用することができ、機能的立体配座は、「編集能力のある」立体配座を指す。ＣａｓＸバリアントタンパク質により大部分が機能的立体配座で折り畳まれたままの状態を保つＣａｓＸタンパク質がもたらされる実施形態を含む、いくつかの例示的な実施形態では、参照ＣａｓＸタンパク質と比較してより低い濃度のＣａｓＸバリアントが遺伝子編集などの用途に必要とされる。したがって、いくつかの実施形態では、改善された安定性を有するＣａｓＸバリアントは、１つ以上の遺伝子編集状況下で参照ＣａｓＸと比較して改善された効率を有する。
いくつかの実施形態では、本開示は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して改善された熱安定性を有するＣａｓＸバリアントタンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、特定の温度範囲でＣａｓＸバリアントタンパク質の改善された熱安定性を有する。いかなる理論にも拘束されることを望むことなく、いくつかの参照ＣａｓＸタンパク質は、地下水および堆積物に生態学的地位のある生物で本来機能しており、それ故に、いくつかの参照ＣａｓＸタンパク質は、ある特定の用途に望ましくあり得るより低温またはより高温で最適な機能を呈するように進化しているかもしれない。例えば、ＣａｓＸバリアントタンパク質の１つの用途は、哺乳動物細胞の遺伝子編集であり、これは、典型的には、約３７℃で行われる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＣａｓＸバリアントタンパク質は、少なくとも１６℃、少なくとも１８℃、少なくとも２０℃、少なくとも２２℃、少なくとも２４℃、少なくとも２６℃、少なくとも２８℃、少なくとも３０℃、少なくとも３２℃、少なくとも３４℃、少なくとも３５℃、少なくとも３６℃、少なくとも３７℃、少なくとも３８℃、少なくとも３９℃、少なくとも４０℃、少なくとも４１℃、少なくとも４２℃、少なくとも４４℃、少なくとも４６℃、少なくとも４８℃、少なくとも５０℃、少なくとも５２℃、またはそれ以上の温度で、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して改善された熱安定性を有する。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して改善された熱安定性および機能性を有し、これにより、ヒト遺伝子編集用途を含み得る哺乳動物遺伝子編集用途などの改善された遺伝子編集機能性がもたらされる。
いくつかの実施形態では、本開示は、ＲＮＰが機能的形態のままの状態を保つように、参照ＣａｓＸタンパク質：ｇＮＡ複合体と比較して改善されたＣａｓＸバリアントタンパク質：ｇＮＡ複合体の安定性を有するＣａｓＸバリアントタンパク質を提供する。安定性の改善には、増加した熱安定性、タンパク質分解に対する抵抗性、増強された薬物動態特性、様々なｐＨ条件、塩条件にわたる安定性、および等張性が含まれ得る。本複合体の改善された安定性は、いくつかの実施形態では、改善された編集効率をもたらし得る。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントとｇＮＡバリアントとのＲＮＰは、配列番号１～３の参照ＣａｓＸのＲＮＰおよび表１の配列番号４～１６のうちのいずれか１つのｇＮＡと比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、もしくは少なくとも２０％、または少なくとも５～２０％高いパーセンテージの切断能力のあるＲＮＰを有する。
いくつかの実施形態では、本開示は、参照ＣａｓＸタンパク質：ｇＮＡ複合体と比較して改善されたＣａｓＸバリアントタンパク質：ｇＮＡ複合体の熱安定性を有するＣａｓＸバリアントタンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して改善された熱安定性を有する。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質：ｇＮＡ複合体は、少なくとも１６℃、少なくとも１８℃、少なくとも２０℃、少なくとも２２℃、少なくとも２４℃、少なくとも２６℃、少なくとも２８℃、少なくとも３０℃、少なくとも３２℃、少なくとも３４℃、少なくとも３５℃、少なくとも３６℃、少なくとも３７℃、少なくとも３８℃、少なくとも３９℃、少なくとも４０℃、少なくとも４１℃、少なくとも４２℃、少なくとも４４℃、少なくとも４６℃、少なくとも４８℃、少なくとも５０℃、少なくとも５２℃、またはそれ以上の温度で、参照ＣａｓＸタンパク質を含む複合体と比較して改善された熱安定性を有する。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質：ｇＮＡ複合体と比較して改善されたＣａｓＸバリアントタンパク質：ｇＮＡ複合体の熱安定性を有し、これにより、ヒト遺伝子編集用途を含み得る哺乳動物遺伝子編集用途などの遺伝子編集用途の改善された機能がもたらされる。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質の改善された安定性および／または熱安定性は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較してより速いＣａｓＸバリアントタンパク質のフォールディング動態、参照ＣａｓＸタンパク質と比較してより遅いＣａｓＸバリアントタンパク質のアンフォールディング動態、参照ＣａｓＸタンパク質と比較してより大きいＣａｓＸバリアントタンパク質のフォールディング時の自由エネルギー放出、ＣａｓＸバリアントタンパク質の５０％がアンフォールドされる参照ＣａｓＸタンパク質と比較してより高い温度（Ｔｍ）、またはそれらの任意の組み合わせを含む。これらの特性は、広範囲の値で改善され得、例えば、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、少なくとも１．１、少なくとも１．５、少なくとも１０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも５００、少なくとも１，０００、少なくとも５，０００、または少なくとも１０，０００倍改善され得る。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質の改善された熱安定性は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較してより高いＣａｓＸバリアントタンパク質のＴｍを含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質のＴｍは、約２０℃～約３０℃、約３０℃～約４０℃、約４０℃～約５０℃、約５０℃～約６０℃、約６０℃～約７０℃、約７０℃～約８０℃、約８０℃～約９０℃、または約９０℃～約１００℃である。熱安定性は、分子の半分が変性する温度として定義される、「融解温度」（Ｔｍ）を測定することによって決定される。Ｔｍおよびアンフォールディングの自由エネルギーなどのタンパク質安定性の特性を測定する方法は、当業者に知られており、インビトロで標準生化学的技法を使用して測定することができる。例えば、Ｔｍは、試料および参照の温度を増加させるために必要な熱量の差が温度の関数として測定される熱分析技法である示差走査熱量測定を使用して測定され得る（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ（２００３）Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ ２０：１９５２－６０、Ｇｈｉｒｌａｎｄｏ ｅｔ ａｌ（１９９９）Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ ６８：４７－５２）。あるいは、または加えて、ＣａｓＸバリアントタンパク質のＴｍは、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｓｈｉｆｔシステムなどの市販の方法を使用して測定され得る。あるいは、または加えて、円偏光二色性を使用して、フォールディングおよびアンフォールディングの動態、ならびにＴｍを測定することができる（Ｍｕｒｒａｙ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ｓｃｉ ４０：３４３－９）。円偏光二色性（ＣＤ）は、タンパク質などの非対称分子による左回りおよび右回り円偏光の不均等な吸収に依存する。タンパク質のある特定の構造、例えば、アルファヘリックスおよびベータシートは、特徴的なＣＤスペクトルを有する。したがって、いくつかの実施形態では、ＣＤを使用して、ＣａｓＸバリアントタンパク質の二次構造を決定することができる。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質の改善された安定性および／または熱安定性は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して改善されたＣａｓＸバリアントタンパク質のフォールディング動態を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質のフォールディング動態は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、少なくとも約５、少なくとも約１０、少なくとも約５０、少なくとも約１００、少なくとも約５００、少なくとも約１，０００、少なくとも約２，０００、少なくとも約３，０００、少なくとも約４，０００、少なくとも約５，０００、または少なくとも約１０，０００倍改善される。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質のフォールディング動態は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、少なくとも約１ｋＪ／ｍｏｌ、少なくとも約５ｋＪ／ｍｏｌ、少なくとも約１０ｋＪ／ｍｏｌ、少なくとも約２０ｋＪ／ｍｏｌ、少なくとも約３０ｋＪ／ｍｏｌ、少なくとも約４０ｋＪ／ｍｏｌ、少なくとも約５０ｋＪ／ｍｏｌ、少なくとも約６０ｋＪ／ｍｏｌ、少なくとも約７０ｋＪ／ｍｏｌ、少なくとも約８０ｋＪ／ｍｏｌ、少なくとも約９０ｋＪ／ｍｏｌ、少なくとも約１００ｋＪ／ｍｏｌ、少なくとも約１５０ｋＪ／ｍｏｌ、少なくとも約２００ｋＪ／ｍｏｌ、少なくとも約２５０ｋＪ／ｍｏｌ、少なくとも約３００ｋＪ／ｍｏｌ、少なくとも約３５０ｋＪ／ｍｏｌ、少なくとも約４００ｋＪ／ｍｏｌ、少なくとも約４５０ｋＪ／ｍｏｌ、または少なくとも約５００ｋＪ／ｍｏｌ改善される。
参照ＣａｓＸタンパク質と比較してＣａｓＸバリアントタンパク質の安定性を増加させることができる例示的なアミノ酸変化には、ＣａｓＸバリアントタンパク質内の水素結合の数を増加させるアミノ酸変化、ＣａｓＸバリアントタンパク質内のジスルフィド架橋の数を増加させるアミノ酸変化、ＣａｓＸバリアントタンパク質内の塩橋の数を増加させるアミノ酸変化、ＣａｓＸバリアントタンパク質の部分間の相互作用を強化するアミノ酸変化、ＣａｓＸバリアントタンパク質の埋められた疎水性表面領域を増加させるアミノ酸変化、またはそれらの任意の組み合わせが含まれ得るが、これらに限定されない。
ｋ．タンパク質収量
いくつかの実施形態では、本開示は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して改善された発現および精製中の収量を有するＣａｓＸバリアントタンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、細菌宿主細胞または真核生物宿主細胞から精製されたＣａｓＸバリアントタンパク質の収量は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して改善される。いくつかの実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細胞である。いくつかの実施形態では、真核細胞は、酵母、植物（例えば、タバコ）、昆虫（例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ ｓｆ９細胞）、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、サル、またはヒト細胞である。いくつかの実施形態では、真核生物宿主細胞は、ヒト胎児腎２９３（ＨＥＫ２９３）細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ハイブリドーマ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、またはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を含むが、これらに限定されない哺乳動物細胞である。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質の改善された収量は、コドン最適化によって達成される。細胞は６４個の異なるコドンを使用し、それらのうちの６１個は２０個の標準アミノ酸をコードする一方で、別の３個は終止コドンとして機能する。いくつかの事例では、単一のアミノ酸が２つ以上のコドンによってコードされる。異なる生物は、同じ天然に存在するアミノ酸に対して異なるコドンを使用する傾向を呈する。したがって、タンパク質におけるコドンの選択、およびタンパク質が発現される生物と一致するコドンの選択は、いくつかの事例では、タンパク質の翻訳、ひいてはタンパク質発現レベルに有意な影響を及ぼす可能性がある。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、コドン最適化された核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質をコードする核酸は、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞、または哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、サル、またはヒトである。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化された核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、原核生物および真核生物における翻訳速度を低下させるヌクレオチド配列が除去された核酸によってコードされる。例えば、連続した３つを超えるチミン残基の続きが、ある特定の生物における翻訳速度を低下させることができるか、または内部ポリアデニル化シグナルが翻訳速度を低下させることができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される溶解性および安定性の改善は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して改善されたＣａｓＸバリアントタンパク質の収量をもたらす。
発現および精製中の改善されたタンパク質収量は、当該技術分野で既知の方法によって評価することができる。例えば、ＣａｓＸバリアントタンパク質の量は、ＳＤＳ－ｐａｇｅゲル上でタンパク質を泳動させ、かつＣａｓＸバリアントタンパク質を、量または濃度のいずれかが事前に分かっている対照と比較することによって決定して、タンパク質の絶対レベルを決定することができる。あるいは、または加えて、精製されたＣａｓＸバリアントタンパク質を同じ精製プロセスを受けている参照ＣａｓＸタンパク質の隣のＳＤＳ－ｐａｇｅゲル上で泳動させて、ＣａｓＸバリアントタンパク質の収量の相対的改善を決定することができる。あるいは、または加えて、タンパク質のレベルは、ウエスタンブロットもしくはＣａｓＸに対する抗体を用いたＥＬＩＳＡなどの免疫組織化学的方法を使用して、またはＨＰＬＣにより測定することができる。溶液中のタンパク質の場合、濃度は、タンパク質の固有のＵＶ吸光度を測定することによって、またはローリーアッセイ、スミス銅／ビシンコニンアッセイ、もしくはブラッドフォード色素アッセイなどのタンパク質依存的色変化を使用する方法によって決定することができる。かかる方法を使用して、ある特定の条件下での発現によって得られる総タンパク質（例えば、総可溶性タンパク質など）収量を計算することができる。これは、例えば、同様の発現条件下の参照ＣａｓＸタンパク質のタンパク質収量と比較することができる。
ｌ．タンパク質溶解性
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して改善された溶解性を有する。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質を含むリボ核タンパク質複合体と比較して改善されたＣａｓＸ：ｇＮＡリボ核タンパク質複合体バリアントの溶解性を有する。
いくつかの実施形態では、タンパク質溶解性の改善は、Ｅ．ｃｏｌｉからの精製などのタンパク質精製技法からのタンパク質のより多い収量をもたらす。タンパク質の溶解性が高いほど細胞内で凝集する可能性が低くなるため、いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質の改善された溶解性により、細胞内でのより効率的な活性が可能になり得る。タンパク質凝集体は、ある特定の実施形態では、細胞に有害であるか、または厄介である可能性があり、いかなる理論にも拘束されることを望むことなく、ＣａｓＸバリアントタンパク質の溶解性の増加により、タンパク質凝集のこの結果が改善され得る。さらに、ＣａｓＸバリアントタンパク質の改善された溶解性により、例えば、所望の遺伝子編集用途において、より高い有効量の機能性タンパク質の送達を可能にする製剤の増強が可能になり得る。いくつかの実施形態では、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して改善されたＣａｓＸバリアントタンパク質の溶解性により、少なくとも約５、少なくとも約１０、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、少なくとも約２５０、少なくとも約５００、または少なくとも約１０００倍の収量の、精製中のＣａｓＸバリアントタンパク質の改善された収量がもたらされる。いくつかの実施形態では、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して改善されたＣａｓＸバリアントタンパク質の溶解性により、細胞におけるＣａｓＸバリアントタンパク質の活性が、少なくとも約１．１、少なくとも約１．２、少なくとも約１．３、少なくとも約１．４、少なくとも約１．５、少なくとも約１．６、少なくとも約１．７、少なくとも約１．８、少なくとも約１．９、少なくとも約２、少なくとも約２．１、少なくとも約２．２、少なくとも約２．３、少なくとも約２．４、少なくとも約２．５、少なくとも約２．６、少なくとも約２．７、少なくとも約２．８、少なくとも約２．９、少なくとも約３、少なくとも約３．５、少なくとも約４、少なくとも約４．５、少なくとも約５、少なくとも約５．５、少なくとも約６、少なくとも約６．５、少なくとも約７．０、少なくとも約７．５、少なくとも約８、少なくとも約８．５、少なくとも約９、少なくとも約９．５、少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、または少なくとも約１５倍改善される。
ＣａｓＸタンパク質の溶解性を測定する方法、およびＣａｓＸバリアントタンパク質におけるその改善は、当業者には容易に明らかになるであろう。例えば、ＣａｓＸバリアントタンパク質の溶解性は、いくつかの実施形態では、溶解したＥ．ｃｏｌｉの可溶性画分のゲル上で濃度測定読み取りを行うことによって測定することができる。あるいは、または加えて、ＣａｓＸバリアントタンパク質の溶解性の改善は、完全なタンパク質精製の過程を通して可溶性タンパク質産物の維持を測定することによって測定することができる。例えば、可溶性タンパク質産物は、ゲル親和性精製、タグ切断、カチオン交換精製、サイズ決定カラム上でのタンパク質の泳動のうちの１つ以上のステップで測定することができる。いくつかの実施形態では、ゲル上でのタンパク質の全てのバンドの濃度測定は、精製プロセスにおける各ステップの後に読み取られる。改善された溶解性を有するＣａｓＸバリアントタンパク質が、いくつかの実施形態では、タンパク質精製プロセスにおける１つ以上のステップで参照ＣａｓＸタンパク質と比較してより高い濃度を維持し得る一方で、不溶性タンパク質バリアントは、緩衝液交換、濾過ステップ、精製カラムとの相互作用などのため、１つ以上のステップで失われ得る。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質の溶解性を改善することにより、タンパク質精製中のタンパク質のｍｇ／Ｌの観点で参照ＣａｓＸタンパク質と比較してより高い収量がもたらされる。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質の溶解性を改善することにより、本明細書に記載のＥＧＦＰ破壊アッセイなどの編集アッセイで評価される場合、より溶解性の低いタンパク質と比較してより多くの量の編集事象が可能になる。
ｍ．ｇＮＡに対するタンパク質親和性
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して改善されたｇＮＡに対する親和性を有し、リボ核タンパク質複合体の形成をもたらす。ｇＮＡに対するＣａｓＸバリアントタンパク質の親和性の増加は、例えば、ＲＮＰ複合体の生成のためにより低いＫｄをもたらすことができ、いくつかの事例では、より安定したリボ核タンパク質複合体形成をもたらすことができる。いくつかの実施形態では、ｇＮＡに対するＣａｓＸバリアントタンパク質の親和性の増加は、ヒト細胞に送達されたときにリボ核タンパク質複合体の安定性の増加をもたらす。この安定性の増加は、対象の細胞における複合体の機能および有用性に影響を与え得るのみならず、対象に送達されたときに血液中の薬物動態特性の改善ももたらし得る。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質の親和性の増加、および結果として生じたリボ核タンパク質複合体の安定性の増加は、所望の活性、例えば、インビボまたはインビトロ遺伝子編集を依然として有しながら、より低用量のＣａｓＸバリアントタンパク質を対象または細胞に送達することを可能にする。
いくつかの実施形態では、ｇＮＡに対するＣａｓＸバリアントタンパク質のより高い親和性（より緊密な結合）は、ＣａｓＸバリアントタンパク質およびｇＮＡの両方がＲＮＰ複合体に留まる場合、より多くの量の編集事象を可能にする。編集事象の増加は、本明細書に記載のＥＧＦＰ破壊アッセイなどの編集アッセイを使用して評価することができる。
いくつかの実施形態では、ｇＮＡに対するＣａｓＸバリアントタンパク質のＫｄは、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、少なくとも約１．１、少なくとも約１．２、少なくとも約１．３、少なくとも約１．４、少なくとも１．５、少なくとも約１．６、少なくとも約１．７、少なくとも約１．８、少なくとも約１．９、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約６、少なくとも約７、少なくとも約８、少なくとも約９、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、または少なくとも約１００倍増加する。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、配列番号２の参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、約１．１～約１０倍増加したｇＮＡに対する結合親和性を有する。
理論に拘束されることを望むことなく、いくつかの実施形態では、ヘリカルＩドメインにおけるアミノ酸変化が、ｇＮＡ標的配列に対するＣａｓＸバリアントタンパク質の結合親和性を増加させることができる一方で、ヘリカルＩＩドメインにおける変化は、ｇＮＡ足場ステムループに対するＣａｓＸバリアントタンパク質の結合親和性を増加させることができ、オリゴヌクレオチド結合ドメイン（ＯＢＤ）における変化は、ｇＲＮＡトリプレックスに対するＣａｓＸバリアントタンパク質の結合親和性を増加させる。
ｇＮＡに対するＣａｓＸタンパク質結合親和性を測定する方法には、精製されたＣａｓＸタンパク質およびｇＮＡを使用するインビトロ法が含まれる。ｇＮＡまたはＣａｓＸタンパク質がフルオロフォアで標識される場合、参照ＣａｓＸおよびバリアントタンパク質に対する結合親和性は、蛍光偏光によって測定することができる。あるいは、または加えて、結合親和性は、バイオレイヤー干渉法、電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）、またはフィルター結合によって測定することができる。参照ｇＮＡおよびそれらのバリアントなどの特異的なｇＮＡに対する本開示の参照ＣａｓＸおよびバリアントタンパク質などのＲＮＡ結合タンパク質の絶対親和性を定量するための追加の標準技法には、等温熱量測定（ＩＴＣ）および表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、ならびに実施例の方法が含まれるが、これらに限定されない。
ｎ．標的ＤＮＡに対する親和性
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、標的核酸に対する参照ＣａｓＸタンパク質の親和性と比較して改善された標的核酸に対する結合親和性を有する。いくつかの実施形態では、標的核酸に対する改善された親和性は、標的核酸配列に対する改善された親和性、ＰＡＭ配列に対する改善された親和性、標的核酸配列についてＤＮＡを探し出す改善された能力、またはそれらの任意の組み合わせを含む。理論に拘束されることを望むことなく、ＣａｓＸなどのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質が、ＤＮＡ分子に沿った一次元拡散によってそれらの標的核酸配列を見つけることができると考えられている。このプロセスには、（１）リボ核タンパク質のＤＮＡ分子への結合、その後に（２）標的核酸配列での停止が含まれると考えられ、これらのいずれも、いくつかの実施形態では、標的核酸配列に対するＣａｓＸタンパク質の改善された親和性の影響を受ける可能性があり、それにより、参照ＣａｓＸタンパク質と比較してＣａｓＸバリアントタンパク質の機能が改善する。
いくつかの実施形態では、改善された標的核酸親和性を有するＣａｓＸバリアントタンパク質は、ＤＮＡに対する増加した全体的な親和性を有する。いくつかの実施形態では、改善された標的核酸親和性を有するＣａｓＸバリアントタンパク質は、ＴＴＣ、ＡＴＣ、ＧＴＣ、およびＣＴＣからなる群から選択されるＰＡＭ配列に対する結合親和性を含む、配列番号２の参照ＣａｓＸタンパク質によって認識される標準的ＴＴＣ ＰＡＭ以外の特定のＰＡＭ配列に対する増加した親和性を有する。理論に拘束されることを望むことなく、これらのタンパク質バリアントがＤＮＡ全体とより強力に相互作用し、野生型ＣａｓＸの能力を超える追加のＰＡＭ配列に結合する能力に起因して標的ＤＮＡ内の配列に接近してそれを編集する増加した能力を有し、それにより、標的配列に対するＣａｓＸタンパク質のより効率的な探索プロセスが可能になる可能性がある。ＤＮＡに対するより高い全体的な親和性は、いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質が結合および巻き戻しステップを効率的に開始および終了することができる頻度も増加させ、それにより、標的鎖の侵入およびＲループ形成を促進し、最終的には、標的核酸配列の切断を促進することができる。
理論に拘束されることを望むことなく、巻き戻された状態の非標的ＤＮＡ鎖の巻き戻しまたはその捕捉の効率を増加させるＮＴＳＢＤにおけるアミノ酸変化が、標的ＤＮＡに対するＣａｓＸバリアントタンパク質の親和性を増加させることができる可能性がある。あるいは、または加えて、巻き戻し中にＤＮＡを安定化させるＮＴＳＢＤの能力を増加させるＮＴＳＢＤにおけるアミノ酸変化は、標的ＤＮＡに対するＣａｓＸバリアントタンパク質の親和性を増加させることができる。あるいは、または加えて、ＯＢＤにおけるアミノ酸変化は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に結合するＣａｓＸバリアントタンパク質の親和性を増加させ、それにより、標的核酸に対するＣａｓＸバリアントタンパク質の親和性を増加させることができる。あるいは、または加えて、標的核酸鎖に対するＣａｓＸバリアントタンパク質の親和性を増加させるヘリカルＩおよび／またはＩＩ、ＲｕｖＣ、ならびにＴＳＬドメインにおけるアミノ酸変化は、標的核酸に対するＣａｓＸバリアントタンパク質の親和性を増加させることができる。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号１、配列番号２、または配列番号３の参照タンパク質と比較して増加した標的核酸配列に対する結合親和性を有する。いくつかの実施形態では、標的核酸分子に対する本開示のＣａｓＸバリアントタンパク質の親和性は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、少なくとも約１．１、少なくとも約１．２、少なくとも約１．３、少なくとも１．４、少なくとも約１．５、少なくとも約１．６、少なくとも約１．７、少なくとも約１．８、少なくとも約１．９、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約６、少なくとも約７、少なくとも約８、少なくとも約９、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、または少なくとも約１００倍増加する。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、標的核酸の非標的鎖に対する改善された結合親和性を有する。本明細書で使用される場合、「非標的鎖」という用語は、ｇＮＡの標的配列とワトソン－クリック塩基対を形成せず、かつ標的鎖に相補的であるＤＮＡ標的核酸配列の鎖を指す。
標的核酸分子に対するＣａｓＸタンパク質（参照またはバリアントなど）の親和性を測定する方法には、電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）、フィルター結合、等温熱量測定（ＩＴＣ）、および表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、蛍光偏光、ならびにバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）が含まれ得る。標的に対するＣａｓＸタンパク質の親和性を測定するさらなる方法には、ＤＮＡ切断事象を経時的に測定するインビトロ生化学的アッセイが含まれる。
標的核酸に対するより高い親和性を有するＣａｓＸバリアントタンパク質は、いくつかの実施形態では、標的核酸に対する増加した親和性を有しない参照ＣａｓＸタンパク質よりも迅速に標的核酸配列を切断することができる。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、触媒的に死んでいる（ｄＣａｓＸ）。いくつかの実施形態では、本開示は、標的ＤＮＡに結合する能力を保持する触媒的に死んでいるＣａｓＸタンパク質を含むＲＮＰを提供する。例示的な触媒的に死んでいるＣａｓＸバリアントタンパク質は、ＣａｓＸタンパク質のＲｕｖＣドメインの活性部位に１つ以上の変異を含む。いくつかの実施形態では、触媒的に死んでいるＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号１の残基６７２、７６９、および／または９３５での置換を含む。いくつかの実施形態では、触媒的に死んでいるＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号１の参照ＣａｓＸタンパク質におけるＤ６７２Ａ、Ｅ７６９Ａ、および／またはＤ９３５Ａの置換を含む。いくつかの実施形態では、触媒的に死んでいるＣａｓＸタンパク質は、配列番号２の残基６５９、７６５、および／または９２２での置換を含む。いくつかの実施形態では、触媒的に死んでいるＣａｓＸタンパク質は、配列番号２の参照ＣａｓＸタンパク質におけるＤ６５９Ａ、Ｅ７５６Ａ、および／またはＤ９２２Ａ置換を含む。さらなる実施形態では、触媒的に死んでいるＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質のＲｕｖＣドメインの全てまたは一部の欠失を含む。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質のＤＮＡに対する改善された親和性は、ＣａｓＸバリアントタンパク質の触媒的に不活性なバージョンの機能も改善する。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質の触媒的に不活性なバージョンは、ＲｕｖＣにおけるＤＥＤモチーフに１つ以上の変異を含む。触媒的に死んでいるＣａｓＸバリアントタンパク質は、いくつかの実施形態では、塩基編集またはエピジェネティック修飾に使用することができる。ＤＮＡに対する親和性が高いほど、いくつかの実施形態では、触媒的に死んでいるＣａｓＸバリアントタンパク質は、触媒的に活性なＣａｓＸと比較して、それらの標的核酸をより速く見つけることができる、より長期間にわたって標的核酸に結合したままの状態を保つことができる、より安定した様式で標的核酸に結合することができる、またはそれらの組み合わせであり、それにより、触媒的に死んでいるＣａｓＸバリアントタンパク質の機能を改善する。
ｏ．標的部位に対する改善された特異性
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して改善された標的核酸配列に対する特異性を有する。本明細書で使用される場合、「標的特異性」と称されることもある「特異性」とは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系リボ核タンパク質複合体が、標的ＤＮＡ配列と類似しているが、同一ではないオフターゲット配列を切断する程度を指し、例えば、より高い特異性を有するＣａｓＸバリアントＲＮＰは、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して配列のオフターゲット切断の低減を呈する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質の特異性、および潜在的に有害なオフターゲット効果の低減は、哺乳動物対象における使用に許容される治療指数を達成するために極めて重要であり得る。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、ｇＮＡの標的配列に相補的な標的配列内の標的部位に対する改善された特異性を有する。
理論に拘束されることを望むことなく、標的核酸鎖に対するＣａｓＸバリアントタンパク質の特異性を増加させるヘリカルＩおよびＩＩドメインにおけるアミノ酸変化が、標的ＤＮＡ全体に対するＣａｓＸバリアントタンパク質の特異性を増加させることができる可能性がある。いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡに対するＣａｓＸバリアントタンパク質の特異性を増加させるアミノ酸変化は、ＤＮＡに対するＣａｓＸバリアントタンパク質の親和性の減少ももたらし得る。
ＣａｓＸタンパク質（バリアントまたは参照など）の標的特異性を試験する方法には、シークエンシングによる切断効果のインビトロ報告のためのガイドおよび環状化（ｇｕｉｄｅ ａｎｄ Ｃｉｒｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ ｏｆ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｂｙ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（ＣＩＲＣＬＥ－ｓｅｑ）、または同様の方法が含まれ得る。手短には、ＣＩＲＣＬＥ－ｓｅｑ技法では、ゲノムＤＮＡがステムループアダプターのライゲーションによって剪断および環状化され、このステムループアダプターがステムループ領域でニッキングされて、４ヌクレオチドパリンドロームオーバーハングを露出させる。続いて、分子内ライゲーションおよび残りの直鎖状ＤＮＡの分解が行われる。その後、ＣａｓＸ切断部位を含む環状ＤＮＡ分子がＣａｓＸで線形化され、アダプターアダプターが露出した末端にライゲーションされ、続いて、ハイスループットシークエンシングが行われて、オフターゲット部位に関する情報を含むペアエンドリードが生成される。オフターゲット事象、ひいてはＣａｓＸタンパク質特異性を検出するために使用することができる追加のアッセイには、ミスマッチ検出ヌクレアーゼアッセイおよび次世代シークエンシング（ＮＧＳ）などの、選択されたオフターゲット部位で形成されるインデル（挿入および欠失）を検出および定量するために使用されるアッセイが含まれる。例示的なミスマッチ検出アッセイには、ＣａｓＸおよびｓｇＮＡで処理された細胞由来のゲノムＤＮＡをＰＣＲ増幅し、変性させ、再ハイブリダイズして、１つの野生型鎖およびインデルを有する１つの鎖を含むヘテロデュプレックスＤＮＡを形成するヌクレアーゼアッセイが含まれる。ミスマッチは、ＳｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼまたはＴ７エンドヌクレアーゼＩなどのミスマッチ検出ヌクレアーゼによって認識されて切断される。
ｐ．ＤＮＡの巻き戻し
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して改善されたＤＮＡを巻き戻す能力を有する。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、増強されたＤＮＡ巻き戻し特性を有する。不十分なｄｓＤＮＡ巻き戻しは、ＤＮＡを切断するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質ａｎａＣａｓ９またはＣａｓ１４ｓの能力を損なうまたは妨げることが以前に示されている。したがって、いかなる理論にも拘束されることを望むことなく、いくつかのＣａｓＸバリアントタンパク質によるＤＮＡ切断活性の増加が、少なくとも部分的に、標的部位でｄｓＤＮＡを見つけて巻き戻す能力の増加に起因する可能性が高い。
理論に拘束されることを望むことなく、ＮＴＳＢドメインにおけるアミノ酸変化が、増加したＤＮＡ巻き戻し特性を有するＣａｓＸバリアントタンパク質を産生することができると考えられている。あるいは、または加えて、ＰＡＭと相互作用するＯＢＤまたはヘリカルドメイン領域におけるアミノ酸変化も、増加したＤＮＡ巻き戻し特性を有するＣａｓＸバリアントタンパク質を産生することができる。
ＤＮＡを巻き戻すＣａｓＸタンパク質（バリアントまたは参照など）の能力を測定する方法には、蛍光偏光またはバイオレイヤー干渉法においてｄｓＤＮＡ標的の速度の増加を観測するインビトロアッセイが含まれるが、これらに限定されない。
ｑ．触媒活性
本明細書に開示されるＣａｓＸ：ｇＮＡ系のリボ核タンパク質複合体は、標的核酸配列に結合し、かつ標的核酸配列を切断する参照ＣａｓＸタンパク質またはバリアントを含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して改善された触媒活性を有する。理論に拘束されることを望むことなく、いくつかの事例では、標的鎖の切断が、ｄｓＤＮＡ切断を引き起こす際にＣａｓ１２様分子の制限因子になり得ると考えられている。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、ＤＮＡの標的鎖の屈曲およびこの鎖の切断を改善し、その結果、ＣａｓＸリボ核タンパク質複合体によるｄｓＤＮＡ切断の全体的な効率が改善される。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して増加したヌクレアーゼ活性を有する。増加したヌクレアーゼ活性を有するバリアントは、例えば、ＲｕｖＣヌクレアーゼドメインにおけるアミノ酸変化によって生成することができる。一実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、ニッカーゼ活性を有するヌクレアーゼドメインを含む。前述の実施形態では、ＣａｓＸ：ｇＮＡ系のＣａｓＸニッカーゼは、非標的鎖のＰＡＭ部位の３’側の１０～１８ヌクレオチド内に一本鎖切断を生じる。別の実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、二本鎖切断活性を有するヌクレアーゼドメインを含む。前述の実施形態では、ＣａｓＸ：ｇＮＡ系のＣａｓＸは、標的鎖上のＰＡＭ部位の５’側の１８～２６ヌクレオチドおよび非標的鎖上の３’側の１０～１８ヌクレオチド内に二本鎖切断を生じる。ヌクレアーゼ活性は、実施例の方法を含む様々な方法によってアッセイすることができる。一実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、参照野生型ＣａｓＸと比較して、少なくとも２倍、または少なくとも３倍、または少なくとも４倍、または少なくとも５倍、または少なくとも６倍、または少なくとも７倍、または少なくとも８倍、または少なくとも９倍、または少なくとも１０倍大きいＫ切断定数を有する。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、二本鎖切断のための増加した標的鎖負荷を有する。増加した標的鎖負荷活性を有するバリアントは、例えば、ＴＬＳドメインにおけるアミノ酸変化によって生成することができる。
理論に拘束されることを望むことなく、ＴＳＬドメインにおけるアミノ酸変化は、改善された触媒活性を有するＣａｓＸバリアントタンパク質をもたらし得る。あるいは、または加えて、ＲＮＡ：ＤＮＡデュプレックスの結合チャネル周辺のアミノ酸変化も、ＣａｓＸバリアントタンパク質の触媒活性を改善することができる。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して増加した付随的切断活性を有する。本明細書で使用される場合、「付随的切断活性」とは、標的核酸配列の認識および切断後の核酸の追加の非標的切断を指す。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して減少した付随的切断活性を有する。
いくつかの実施形態、例えば、標的ＤＮＡ切断が望ましい結果ではない用途を包含する実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質の触媒活性を改善することは、ＣａｓＸバリアントタンパク質の触媒活性を変化させること、減少させること、または無効にすることを含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質を含むリボ核タンパク質複合体は、標的ＤＮＡに結合し、標的ＤＮＡを切断しない。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質を含むＣａｓＸリボ核タンパク質複合体は、標的ＤＮＡに結合するが、標的ＤＮＡに一本鎖ニックを生成する。いくつかの実施形態、特にＣａｓＸタンパク質がニッカーゼである実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、一本鎖ニッキングのための減少した標的鎖負荷を有する。減少した標的鎖負荷を有するバリアントは、例えば、ＴＳＬドメインにおけるアミノ酸変化によって生成され得る。
ＣａｓＸタンパク質の触媒活性を特徴付けるための例示的な方法には、インビトロ切断アッセイが含まれ得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、アガロースゲル上でのＤＮＡ産物の電気泳動は、鎖切断の動態を調べることができる。
ｒ．標的ＤＮＡおよびＲＮＡに対する親和性
いくつかの実施形態では、参照ＣａｓＸタンパク質またはそのバリアントを含むリボ核タンパク質複合体は、標的ＤＮＡに結合し、標的ＤＮＡを切断する。いくつかの実施形態では、参照ＣａｓＸタンパク質のバリアントは、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、標的ＲＮＡに対するＣａｓＸバリアントタンパク質の特異性を増加させ、標的ＲＮＡに対するＣａｓＸバリアントタンパク質の活性を増加させる。例えば、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して増加した標的ＲＮＡに対する結合親和性または増加した標的ＲＮＡの切断を呈し得る。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質を含むリボ核タンパク質複合体は、標的ＲＮＡに結合し、および／または標的ＲＮＡを切断する。一実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、配列番号１、配列番号２、または配列番号３の参照タンパク質と比較して、少なくとも約２倍～約１０倍増加した標的核酸配列に対する結合親和性を有する。
ｓ．変異の組み合わせ
いくつかの実施形態では、本開示は、別個のＣａｓＸバリアントタンパク質由来の変異の組み合わせであるバリアントを提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のいずれかのドメインに対するいずれのバリアントも、本明細書に記載の他のバリアントと組み合わせることができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のいずれかのドメイン内のいずれのバリアントも、同じドメイン内の本明細書に記載の他のバリアントと組み合わせることができる。異なるアミノ酸変化の組み合わせにより、いくつかの実施形態では、機能がアミノ酸変化の組み合わせによってさらに改善される新たな最適化されたバリアントが生成され得る。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質機能に対するアミノ酸変化を組み合わせる効果は線形である。本明細書で使用される場合、線形である組み合わせとは、機能に対する効果が単独でアッセイされたときの個々のアミノ酸変化の各々の効果の合計に等しい組み合わせを指す。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質機能に対するアミノ酸変化を組み合わせる効果は相乗的である。本明細書で使用される場合、相乗的である組み合わせとは、機能に対する効果が単独でアッセイされたときの個々のアミノ酸変化の各々の効果の合計よりも大きい組み合わせを指す。いくつかの実施形態では、アミノ酸変化を組み合わせることにより、ＣａｓＸタンパク質の２つ以上の機能が参照ＣａｓＸタンパク質と比較して改善されたＣａｓＸバリアントタンパク質が生成される。
ｔ．ＣａｓＸ融合タンパク質
いくつかの実施形態では、本開示は、ＣａｓＸに融合された異種タンパク質を含むＣａｓＸタンパク質を提供する。いくつかの事例では、ＣａｓＸは、参照ＣａｓＸタンパク質である。他の事例では、ＣａｓＸは、本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかのＣａｓＸバリアントである。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、目的とする異なる活性を有する１つ以上のタンパク質またはそれらのドメインに融合される（すなわち、融合タンパク質の一部である）。例えば、いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、転写を阻害する、標的核酸配列を修飾する、または核酸と会合したポリペプチドを修飾する（例えば、ヒストン修飾）タンパク質（またはそのドメイン）に融合される。
いくつかの実施形態では、異種ポリペプチド（またはシステイン残基または非天然アミノ酸などの異種アミノ酸）がＣａｓＸタンパク質内の１つ以上の位置に挿入されて、ＣａｓＸ融合タンパク質を生成することができる。他の実施形態では、システイン残基は、ＣａｓＸタンパク質内の１つ以上の位置に挿入され、続いて、以下に記載の異種ポリペプチドのコンジュゲーションが行われ得る。いくつかの代替の実施形態では、異種ポリペプチドまたは異種アミノ酸は、参照またはＣａｓＸバリアントタンパク質のＮ末端またはＣ末端に付加することができる。他の実施形態では、異種ポリペプチドまたは異種アミノ酸は、ＣａｓＸタンパク質の配列の内部に挿入することができる。
いくつかの実施形態では、参照ＣａｓＸまたはバリアント融合タンパク質は、ＲＮＡガイド配列特異的標的核酸結合および切断活性を保持する。いくつかの事例では、参照ＣａｓＸまたはバリアント融合タンパク質は、異種タンパク質の挿入を有しない対応する参照ＣａｓＸまたはバリアントタンパク質の５０％以上の活性（例えば、切断および／または結合活性）を有する（保持する）。いくつかの事例では、参照ＣａｓＸまたはバリアント融合タンパク質は、異種タンパク質の挿入を有しない対応するＣａｓＸタンパク質の活性（例えば、切断および／または結合活性）の少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％以上、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約１００％を保持する。
いくつかの事例では、参照ＣａｓＸまたはバリアント融合ポリペプチドは、異種アミノ酸または異種ポリペプチドが挿入されていないＣａｓＸタンパク質の活性と比較して、標的核酸結合活性を保持する（有する）。例えば、いくつかの事例では、参照ＣａｓＸまたはバリアント融合ポリペプチドは、対応するＣａｓＸタンパク質（挿入を有しないＣａｓＸタンパク質）の結合活性の５０％以上を有する（保持する）。例えば、いくつかの事例では、参照ＣａｓＸまたはバリアントポリペプチドは、対応する親ＣａｓＸタンパク質（挿入を有しないＣａｓＸタンパク質）の結合活性の６０％以上（７０％以上、８０％以上、９０％以上、９２％以上、９５％以上、９８％以上、または１００％）を有する（保持する）。
いくつかの事例では、参照ＣａｓＸまたはバリアント融合ポリペプチドは、異種アミノ酸または異種ポリペプチドが挿入されていない親ＣａｓＸタンパク質の活性と比較して、標的核酸結合および／または切断活性を保持する（有する）。例えば、いくつかの事例では、参照ＣａｓＸまたはバリアント融合ポリペプチドは、対応する親ＣａｓＸタンパク質（挿入を有しないＣａｓＸタンパク質）の結合および／または切断活性の５０％以上を有する（保持する）。例えば、いくつかの事例では、参照ＣａｓＸまたはバリアント融合ポリペプチドは、対応するＣａｓＸ親ポリペプチド（挿入を有しないＣａｓＸタンパク質）の結合および／または切断活性の６０％以上（７０％以上、８０％以上、９０％以上、９２％以上、９５％以上、９８％以上、または１００％）を有する（保持する）。ＣａｓＸタンパク質および／またはＣａｓＸ融合ポリペプチドの切断および／または結合活性を測定する方法は、当業者に知られており、任意の簡便な方法を使用することができる。
様々な異種ポリペプチドが、本開示の参照ＣａｓＸまたはＣａｓＸバリアント融合タンパク質への包含に好適である。いくつかの事例では、融合パートナーは、標的ＤＮＡの転写を調節する（例えば、転写を阻害する、転写を増加させる）ことができる。例えば、いくつかの事例では、融合パートナーは、転写を阻害するタンパク質（またはタンパク質由来のドメイン）（例えば、転写抑制因子、転写阻害タンパク質の動員、メチル化などの標的ＤＮＡの修飾、ＤＮＡ修飾因子の動員、標的ＤＮＡと会合したヒストンの調節、ヒストンのアセチル化および／またはメチル化を修飾するものなどのヒストン修飾因子の動員などにより機能するタンパク質）である。いくつかの事例では、融合パートナーは、転写を増加させるタンパク質（またはタンパク質由来のドメイン）（例えば、転写活性化因子、転写活性化タンパク質の動員、脱メチル化などの標的ＤＮＡの修飾、ＤＮＡ修飾因子の動員、標的ＤＮＡと会合したヒストンの調節、ヒストンのアセチル化および／またはメチル化を修飾するものなどのヒストン修飾因子の動員などにより作用するタンパク質）である。
いくつかの事例では、融合パートナーは、標的核酸配列を修飾する酵素活性（例えば、ヌクレアーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、脱アミノ化活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン活性、酸化活性、ピリミジン二量体形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポサーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、フォトリアーゼ活性、またはグリコシラーゼ活性）を有する。
いくつかの事例では、融合パートナーは、標的核酸と会合したポリペプチド（例えば、ヒストン）を修飾する酵素活性（例えば、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、または脱ミリストイル化活性）を有する。
転写を増加させるために融合パートナーとして使用することができるタンパク質（またはその断片）の例には、ＶＰ１６、ＶＰ６４、ＶＰ４８、ＶＰ１６０、ｐ６５サブドメイン（例えば、ＮＦｋＢ由来）、ならびにＥＤＬＬ活性化ドメインおよび／またはＴＡＬ活性化ドメイン（例えば、植物における活性のため）などの転写活性化因子；ＳＥＴドメイン含有１Ａ、ヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ（ＳＥＴ１Ａ）、ＳＥＴドメイン含有１Ｂ、ヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ（ＳＥＴ１Ｂ）、リジンメチルトランスフェラーゼ２Ａ（ＭＬＬ１～５、ＡＳＣＬ１（ＡＳＨ１）アカエテ－スクート（ａｃｈａｅｔｅ－ｓｃｕｔｅ）ファミリーｂＨＬＨ転写因子１（ＡＳＨ１）、ＳＥＴおよびＭＹＮＤドメイン含有２（ＳＹＭＤ２）、核受容体結合ＳＥＴドメインタンパク質１（ＮＳＤ１）などのヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ；リジンデメチラーゼ３Ａ（ＪＨＤＭ２ａ）／リジン特異的デメチラーゼ３Ｂ（ＪＨＤＭ２ｂ）、リジンデメチラーゼ６Ａ（ＵＴＸ）、リジンデメチラーゼ６Ｂ（ＪＭＪＤ３）などのヒストンリジンデメチラーゼ；リジンアセチルトランスフェラーゼ２Ａ（ＧＣＮ５）、リジンアセチルトランスフェラーゼ２Ｂ（ＰＣＡＦ）、ＣＲＥＢ結合タンパク質（ＣＢＰ）、Ｅ１Ａ結合タンパク質ｐ３００（ｐ３００）、ＴＡＴＡボックス結合ダンパク質関連因子１（ＴＡＦ１）、リジンアセチルトランスフェラーゼ５（ＴＩＰ６０／ＰＬＩＰ）、リジンアセチルトランスフェラーゼ６Ａ（ＭＯＺ／ＭＹＳＴ３）、リジンアセチルトランスフェラーゼ６Ｂ（ＭＯＲＦ／ＭＹＳＴ４）、ＳＲＣプロトオンコジーン、非受容体チロシンキナーゼ（ＳＲＣ１）、核受容体コアクチベーター３（ＡＣＴＲ）、ＭＹＢ結合タンパク質１ａ（Ｐ１６０）、クロックサーカディアン調節因子（ＣＬＯＣＫ）などのヒストンアセチルトランスフェラーゼ；ならびにテン－イレブントランスロケーション（Ｔｅｎ－Ｅｌｅｖｅｎ Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）（ＴＥＴ）ジオキシゲナーゼ１（ＴＥＴ１ＣＤ）、ｔｅｔメチルシトシンジオキシゲナーゼ１（ＴＥＴ１）、デメテル（ｄｅｍｅｔｅｒ）（ＤＭＥ）、デメテル様１（ＤＭＬ１）、デメテル様２（ＤＭＬ２）、タンパク質ＲＯＳ１（ＲＯＳ１）などのＤＮＡデメチラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
転写を減少させるために融合パートナーとして使用することができるタンパク質（またはその断片）の例には、Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢまたはＳＫＤ）などの転写抑制因子；ＫＯＸ１抑制ドメイン；Ｍａｄ ｍＳＩＮ３相互作用ドメイン（ＳＩＤ）；ＥＲＦ抑制因子ドメイン（ＥＲＤ）、ＳＲＤＸ抑制ドメイン（例えば、植物における抑制のため）など；ＰＲ／ＳＥＴドメイン含有タンパク質（Ｐｒ－ＳＥＴ７／８）、リジンメチルトランスフェラーゼ５Ｂ（ＳＵＶ４－２０Ｈ１）、ＰＲ／ＳＥＴドメイン２（ＲＩＺ１）などのヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ；リジンデメチラーゼ４Ａ（ＪＭＪＤ２Ａ／ＪＨＤＭ３Ａ）、リジンデメチラーゼ４Ｂ（ＪＭＪＤ２Ｂ）、リジンデメチラーゼ４Ｃ（ＪＭＪＤ２Ｃ／ＧＡＳＣ１）、リジンデメチラーゼ４Ｄ（ＪＭＪＤ２Ｄ）、リジンデメチラーゼ５Ａ（ＪＡＲＩＤ１Ａ／ＲＢＰ２）、リジンデメチラーゼ５Ｂ（ＪＡＲＩＤ１Ｂ／ＰＬＵ－１）、リジンデメチラーゼ５Ｃ（ＪＡＲＩＤ１Ｃ／ＳＭＣＸ）、リジンデメチラーゼ５Ｄ（ＪＡＲＩＤ１Ｄ／ＳＭＣＹ）などのヒストンリジンデメチラーゼ；ヒストンデアセチラーゼ１（ＨＤＡＣ１）、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ９、サーチュイン１（ＳＩＲＴ１）、ＳＩＲＴ２、ＨＤＡＣ１１などのヒストンリジンデアセチラーゼ；ＨｈａＩ ＤＮＡ ｍ５ｃ－メチルトランスフェラーゼ（Ｍ．ＨｈａＩ）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ１（ＤＮＭＴ１）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３ａ（ＤＮＭＴ３ａ）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３ｂ（ＤＮＭＴ３ｂ）、メチルトランスフェラーゼ１（ＭＥＴ１）、Ｓ－アデノシル－Ｌ－メチオニン依存性メチルトランスフェラーゼスーパーファミリータンパク質（ＤＲＭ３）（植物）、ＤＮＡシトシンメチルトランスフェラーゼＭＥＴ２ａ（ＺＭＥＴ２）、クロモメチラーゼ１（ＣＭＴ１）、クロモメチラーゼ２（ＣＭＴ２）（植物）などのＤＮＡメチラーゼ；ならびにラミンＡ、ラミンＢなどの末梢動員要素が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの事例では、融合パートナーは、標的核酸配列（例えば、ｓｓＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ）を修飾する酵素活性を有する。融合パートナーによって提供され得る酵素活性の例には、制限酵素（例えば、ＦｏｋＩヌクレアーゼ）によって提供されるものなどのヌクレアーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ（例えば、Ｈｈａｌ ＤＮＡ ｍ５ｃ－メチルトランスフェラーゼ（Ｍ．Ｈｈａｌ）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ１（ＤＮＭＴ１）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３ａ（ＤＮＭＴ３ａ）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３ｂ（ＤＮＭＴ３ｂ）、ＭＥＴＩ、ＤＲＭ３（植物）、ＺＭＥＴ２、ＣＭＴ１、ＣＭＴ２（植物）など）によって提供されるものなどのメチルトランスフェラーゼ活性；デメチラーゼ（例えば、テン－イレブントランスロケーション（ＴＥＴ）ジオキシゲナーゼ１（ＴＥＴ１ ＣＤ）、ＴＥＴ１、ＤＭＥ、ＤＭＬ１、ＤＭＬ２、ＲＯＳ１など）によって提供されるものなどのデメチラーゼ活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、デアミナーゼ（例えば、シトシンデアミナーゼ酵素、例えば、ラットＡＰＯＢＥＣｌなどのＡＰＯＢＥＣタンパク質）によって提供されるものなどの脱アミノ化活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン化活性、酸化活性、ピリミジン二量体形成活性、インテグラーゼおよび／またはレゾルバーゼ（例えば、Ｇｉｎインベルターゼの超活性変異体、ＧｉｎＨ１０６ＹなどのＧｉｎインベルターゼ；ヒト免疫不全ウイルス１型インテグラーゼ（ＩＮ）；Ｔｎ３レゾルバーゼなど）によって提供されるものなどのインテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性、レコンビナーゼ（例えば、Ｇｉｎレコンビナーゼの触媒ドメイン）によって提供されるものなどのレコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、フォトリアーゼ活性、およびグリコシラーゼ活性）が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの事例では、本開示の参照ＣａｓＸまたはＣａｓＸバリアントタンパク質は、転写を増加させるためのドメイン（例えば、ＶＰ１６ドメイン、ＶＰ６４ドメイン）、転写を減少させるためのドメイン（例えば、ＫＲＡＢドメイン、例えば、Ｋｏｘ１タンパク質由来のもの）、ヒストンアセチルトランスフェラーゼのコア触媒ドメイン（例えば、ヒストンアセチルトランスフェラーゼｐ３００）、検出可能なシグナルを提供するタンパク質／ドメイン（例えば、ＧＦＰなどの蛍光タンパク質）、ヌクレアーゼドメイン（例えば、Ｆｏｋｌヌクレアーゼ）、および塩基エディター（例えば、ＡＰＯＢＥＣ１などのシチジンデアミナーゼ）から選択されるポリペプチドに融合される。
いくつかの事例では、融合パートナーは、標的核酸配列（例えば、ｓｓＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ）と会合したタンパク質（例えば、ヒストン、ＲＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ結合タンパク質など）を修飾する酵素活性を有する。融合パートナーによって提供され得る酵素活性（標的核酸に関連するタンパク質を修飾するもの）の例には、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）（例えば、斑入り３～９ホモログ１のサプレッサー（ＳＵＶ３９Ｈ１、別名、ＫＭＴ１Ａ）、真性染色質ヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ２（Ｇ９Ａ、別名、ＫＭＴ１ＣおよびＥＨＭＴ２）、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＥＳＥＴ／ＳＥＴＤＢ１など、ＳＥＴ１Ａ、ＳＥＴ１Ｂ、ＭＬＬ１～５、ＡＳＨ１、ＳＹＭＤ２、ＮＳＤ１、ＤＯＴ１Ｌ、Ｐｒ－ＳＥＴ７／８、ＳＵＶ４－２０Ｈ１、ＥＺＨ２、ＲＩＺ１）によって提供されるものなどのメチルトランスフェラーゼ活性、ヒストンデメチラーゼ（例えば、リジンデメチラーゼ１Ａ（ＫＤＭ１Ａ、別名、ＬＳＤ１）、ＪＨＤＭ２ａ／ｂ、ＪＭＪＤ２Ａ／ＪＨＤＭ３Ａ、ＪＭＪＤ２Ｂ、ＪＭＪＤ２Ｃ／ＧＡＳＣ１、ＪＭＪＤ２Ｄ、ＪＡＲＩＤ１Ａ／ＲＢＰ２、ＪＡＲＩＤ１Ｂ／ＰＬＵ－１、ＪＡＲＩＤ１Ｃ／ＳＭＣＸ、ＪＡＲＩＤ１Ｄ／ＳＭＣＹ、ＵＴＸ、ＪＭＪＤ３など）によって提供されるものなどのデメチラーゼ活性、ヒストンアセチラーゼトランスフェラーゼ（例えば、ヒトアセチルトランスフェラーゼｐ３００、ＧＣＮ５、ＰＣＡＦ、ＣＢＰ、ＴＡＦ１、ＴＩＰ６０／ＰＬＩＰ、ＭＯＺ／ＭＹＳＴ３、ＭＯＲＦ／ＭＹＳＴ４、ＨＢ０１／ＭＹＳＴ２、ＨＭＯＦ／ＭＹＳＴ１、ＳＲＣ１、ＡＣＴＲ、Ｐ１６０、ＣＬＯＣＫなどの触媒コア／断片）によって提供されるものなどのアセチルトランスフェラーゼ活性、ヒストンデアセチラーゼ（例えば、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ９、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＨＤＡＣ１１など）によって提供されるものなどのデアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、および脱ミリストイル化活性が挙げられるが、これらに限定されない。
好適な融合パートナーの追加の例は、（ｉ）化学的に制御可能な対象ＲＮＡガイドポリペプチドまたは条件付きで活性なＲＮＡガイドポリペプチドを生成するためのジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）不安定化ドメイン、および（ｉｉ）葉緑体輸送ペプチドである。
好適な葉緑体輸送ペプチドには、ＭＡＳＭＩＳＳＳＡＶＴＴＶＳＲＡＳＲＧＱＳＡＡＭＡＰＦＧＧＬＫＳＭＴＧＦＰＶＲＫＶＮＴＤＩＴＳＩＴＳＮＧＧＲ ＶＫＣＭＱＶＷＰＰＩＧＫＫＫＦＥＴＬＳＹＬＰＰＬＴＲＤＳＲＡ（配列番号１４４）、ＭＡＳＭＩＳＳＳＡＶＴＴＶＳＲＡＳＲＧＱＳＡＡＭＡＰＦＧＧＬＫＳＭＴＧＦＰＶＲＫＶＮＴＤＩＴＳＩＴＳＮＧＧＲＶＫＳ（配列番号１４５）、ＭＡＳＳＭＬＳＳＡＴＭＶＡＳＰＡＱＡＴＭＶＡＰＦＮＧＬＫＳＳＡＡＦＰＡＴＲＫＡＮＮＤＩＴＳＩＴＳＮＧＧＲＶＮＣＭＱＶ ＷＰＰＩＥＫＫＫＦＥＴＬＳＹＬＰＤＬＴＤＳＧＧＲＶＮＣ（配列番号１４６）、ＭＡＱＶＳＲＩＣＮＧＶＱＮＰＳＬＩＳＮＬＳＫＳＳＱＲＫＳＰＬＳＶＳＬＫＴＱＱＨＰＲＡＹＰＩＳＳＳＷＧＬＫＫＳＧＭＴＬＩＧ ＳＥＬＲＰＬＫＶＭＳＳＶＳＴＡＣ（配列番号１４７）、ＭＡＱＶＳＲＩＣＮＧＶＷＮＰＳＬＩＳＮＬＳＫＳＳＱＲＫＳＰＬＳＶＳＬＫＴＱＱＨＰＲＡＹＰＩＳＳＳＷＧＬＫＫＳＧＭＴＬＩＧ ＳＥＬＲＰＬＫＶＭＳＳＶＳＴＡＣ（配列番号１４８）、ＭＡＱＩＮＮＭＡＱＧＩＱＴＬＮＰＮＳＮＦＨＫＰＱＶＰＫＳＳＳＦＬＶＦＧＳＫＫＬＫＮＳＡＮＳＭＬＶＬＫＫＤＳＩＦＭＱＬＦ ＣＳＦＲＩＳＡＳＶＡＴＡＣ（配列番号１４９）、ＭＡＡＬＶＴＳＱＬＡＴＳＧＴＶＬＳＶＴＤＲＦＲＲＰＧＦＱＧＬＲＰＲＮＰＡＤＡＡＬＧＭＲＴＶＧＡＳＡＡＰＫＱＳＲＫＰＨ ＲＦＤＲＲＣＬＳＭＶＶ（配列番号１５０）、ＭＡＡＬＴＴＳＱＬＡＴＳＡＴＧＦＧＩＡＤＲＳＡＰＳＳＬＬＲＨＧＦＱＧＬＫＰＲＳＰＡＧＧＤＡＴＳＬＳＶＴＴＳＡＲＡＴＰＫＱ ＱＲＳＶＱＲＧＳＲＲＦＰＳＶＶＶＣ（配列番号１５１）、ＭＡＳＳＶＬＳＳＡＡＶＡＴＲＳＮＶＡＱＡＮＭＶＡＰＦＴＧＬＫＳＡＡＳＦＰＶＳＲＫＱＮＬＤＩＴＳＩＡＳＮＧＧＲＶＱＣ（配列番号１５２）、ＭＥＳＬＡＡＴＳＶＦＡＰＳＲＶＡＶＰＡＡＲＡＬＶＲＡＧＴＶＶＰＴＲＲＴＳＳＴＳＧＴＳＧＶＫＣＳＡＡＶＴＰＱＡＳＰＶＩＳ ＲＳＡＡＡＡ（配列番号１５３）、およびＭＧＡＡＡＴＳＭＱＳＬＫＦＳＮＲＬＶＰＰＳＲＲＬＳＰＶＰＮＮＶＴＣＮＮＬＰＫＳＡＡＰＶＲＴＶＫＣＣＡＳＳＷＮＳＴＩＮＧＡＡＡＴＴＮＧＡＳＡＡＳＳ（配列番号１５４）が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの事例では、本開示の参照ＣａｓＸまたはバリアントポリペプチドは、エンドソームエスケープペプチドを含むことができる。いくつかの事例では、エンドソームエスケープポリペプチドは、アミノ酸配列ＧＬＦＸＡＬＬＸＬＬＸＳＬＷＸＬＬＬＸＡ（配列番号１５５）を含み、ここで、各Ｘは独立して、リジン、ヒスチジン、およびアルギニンから選択される。いくつかの事例では、エンドソームエスケープポリペプチドは、アミノ酸配列ＧＬＦＨＡＬＬＨＬＬＨＳＬＷＨＬＬＬＨＡ（配列番号１５６）またはＨＨＨＨＨＨＨＨＨ（配列番号１５７）を含む。
ｓｓＲＮＡ標的核酸配列を標的とする際に使用するための融合パートナーの非限定的な例には、スプライシング因子（例えば、ＲＳドメイン）；タンパク質翻訳構成要素（例えば、翻訳開始、伸長、および／または放出因子、例えば、ｅＩＦ４Ｇ）；ＲＮＡメチラーゼ；ＲＮＡ編集酵素（例えば、ＡからＩへの、および／またはＣからＵへの編集酵素を含む、ＲＮＡデアミナーゼ、例えば、ＲＮＡ上で作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ））；ヘリカーゼ；ＲＮＡ結合タンパク質などが挙げられる（が、これらに限定されない）。異種ポリペプチドが全タンパク質を含むことができるか、またはいくつかの事例では、タンパク質の断片（例えば、機能的ドメイン）を含むことができることが理解される。
融合パートナーは、エンドヌクレアーゼ（例えば、ＳＭＧ５およびＳＭＧ６などのタンパク質由来のＲＮａｓｅ ＩＩＩ、ＣＲＲ２２ ＤＹＷドメイン、Ｄｉｃｅｒ、およびＰＩＮ（ＰｉｌＴ Ｎ末端）ドメイン；ＲＮＡ切断の刺激に関与するタンパク質およびタンパク質ドメイン（例えば、ＣＰＳＦ、ＣｓｔＦ、ＣＦＩｍ、およびＣＦＩＩｍ）；エキソヌクレアーゼ（例えば、ＸＲＮ－１またはエキソヌクレアーゼＴ）；デアデニラーゼ（例えば、ＨＮＴ３）；ナンセンス媒介型ＲＮＡ分解に関与するタンパク質およびタンパク質ドメイン（例えば、ＵＰＦ１、ＵＰＦ２、ＵＰＦ３、ＵＰＦ３ｂ、ＲＮＰ ＳＩ、Ｙ１４、ＤＥＫ、ＲＥＦ２、およびＳＲｍ１６０）；ＲＮＡの安定化に関与するタンパク質およびタンパク質ドメイン（例えば、ＰＡＢＰ）；翻訳の抑制に関与するタンパク質およびタンパク質ドメイン（例えば、Ａｇｏ２およびＡｇｏ４）；翻訳の刺激に関与するタンパク質およびタンパク質ドメイン（例えば、Ｓｔａｕｆｅｎ）；翻訳の調節に関与する（例えば、調節することができる）タンパク質およびタンパク質ドメイン（例えば、開始因子、伸長因子、放出因子などの翻訳因子、例えば、ｅＩＦ４Ｇ）；ＲＮＡのポリアデニル化に関与するタンパク質およびタンパク質ドメイン（例えば、ＰＡＰ１、ＧＬＤ－２、およびＳｔａｒ－ＰＡＰ）；ＲＮＡのポリウリジン化に関与するタンパク質およびタンパク質ドメイン（例えば、ＣＩＤ１および末端ウリジレートトランスフェラーゼ）；ＲＮＡ局在に関与するタンパク質およびタンパク質ドメイン（例えば、ＩＭＰ１、ＺＢＰ１、Ｓｈｅ２ｐ、Ｓｈｅ３ｐ、およびＢｉｃａｕｄａｌ－Ｄ由来）；ＲＮＡの核保持に関与するタンパク質およびタンパク質ドメイン（例えば、Ｒｒｐ６）；ＲＮＡの核外搬出に関与するタンパク質およびタンパク質ドメイン（例えば、ＴＡＰ、ＮＸＦ１、ＴＨＯ、ＴＲＥＸ、ＲＥＦ、およびＡｌｙ）；ＲＮＡスプライシングの抑制に関与するタンパク質およびタンパク質ドメイン（例えば、ＰＴＢ、Ｓａｍ６８、およびｈｎＲＮＰ Ａ１）；ＲＮＡスプライシングの刺激に関与するタンパク質およびタンパク質ドメイン（例えば、セリン／アルギニンリッチ（ＳＲ）ドメイン）；転写効率の低減に関与するタンパク質およびタンパク質ドメイン（例えば、ＦＵＳ（ＴＬＳ））；ならびに転写の刺激に関与するタンパク質およびタンパク質ドメイン（例えば、ＣＤＫ７およびＨＩＶ Ｔａｔ）を含む群から選択されるエフェクタードメインを含むが、これらに限定されない、過渡的であるか不可逆的であるか、直接であるか間接的であるかにかかわらず、ｓｓＲＮＡと相互作用することができる任意のドメイン（本開示の目的のために、分子内および／または分子間二次構造、例えば、ヘアピン、ステムループなどの二本鎖ＲＮＡデュプレックスを含む）であり得る。あるいは、エフェクタードメインは、エンドヌクレアーゼ；ＲＮＡ切断を刺激することができるタンパク質およびタンパク質ドメイン；エキソヌクレアーゼ；デアデニラーゼ；ナンセンス媒介型ＲＮＡ分解活性を有するタンパク質およびタンパク質ドメイン；ＲＮＡを安定化することができるタンパク質およびタンパク質ドメイン；翻訳を抑制することができるタンパク質およびタンパク質ドメイン；翻訳を刺激することができるタンパク質およびタンパク質ドメイン；翻訳を調節することができるタンパク質およびタンパク質ドメイン（例えば、開始因子、伸長因子、放出因子などの翻訳因子、例えば、ｅＩＦ４Ｇ）；ＲＮＡをポリアデニル化することができるタンパク質およびタンパク質ドメイン；ＲＮＡをポリウリジン化することができるタンパク質およびタンパク質ドメイン；ＲＮＡ局在活性を有するタンパク質およびタンパク質ドメイン；ＲＮＡの核保持が可能なタンパク質およびタンパク質ドメイン；ＲＮＡ核外搬出活性を有するタンパク質およびタンパク質ドメイン；ＲＮＡスプライシングを抑制することができるタンパク質およびタンパク質ドメイン；ＲＮＡスプライシングを刺激することができるタンパク質およびタンパク質ドメイン；転写効率を低減することができるタンパク質およびタンパク質ドメイン；ならびに転写を刺激することができるタンパク質およびタンパク質ドメインを含む群から選択され得る。別の好適な異種ポリペプチドは、ＷＯ２０１２／０６８６２７（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）により詳細に記載されるＰＵＦ ＲＮＡ結合ドメインである。
融合パートナーとして（全体またはその断片として）使用することができるいくつかのＲＮＡスプライシング因子は、別個の配列特異的ＲＮＡ結合モジュールおよびスプライシングエフェクタードメインを有するモジュール機構を有する。例えば、セリン／アルギニンリッチ（ＳＲ）タンパク質ファミリーのメンバーは、エクソン封入を促進するｐｒｅ－ｍＲＮＡおよびＣ末端ＲＳドメインにおいてエクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）に結合するＮ末端ＲＮＡ認識モチーフ（ＲＲＭ）を含む。別の例として、ｈｎＲＮＰタンパク質ｈｎＲＮＰ Ａ１は、そのＲＲＭドメインを介してエクソンスプライシングサイレンサー（ＥＳＳ）に結合し、Ｃ末端グリシンリッチドメインを介してエクソン封入を阻害する。いくつかのスプライシング因子は、２つの選択的部位間の調節配列に結合することによってスプライス部位（ｓｓ）の選択的使用を調節することができる。例えば、ＡＳＦ／ＳＦ２が、ＥＳＥを認識してイントロン近位部位の使用を促進することができる一方で、ｈｎＲＮＰ Ａ１は、ＥＳＳに結合してスプライシングをイントロン遠隔部位の使用にシフトすることができる。かかる因子の１つの用途は、内因性遺伝子、特に疾患関連遺伝子の選択的スプライシングを調節するＥＳＦを生成することである。例えば、Ｂｃｌ－ｘ ｐｒｅ－ｍＲＮＡは、２つの選択的５’スプライス部位を有する２つのスプライシングアイソフォームを生成して、反対の機能を有するタンパク質をコードする。長いスプライシングアイソフォームＢｃｌ－ｘＬは、長命の分裂終了細胞内で発現される強力なアポトーシス阻害因子であり、多くのがん細胞内で上方調節され、アポトーシスシグナルから細胞を保護する。短いアイソフォームＢｃｌ－ｘＳは、アポトーシス促進アイソフォームであり、高いターンオーバー率で、細胞内で高レベルで発現される（例えば、リンパ球を分化する）。２つのＢｃｌ－ｘスプライシングアイソフォームの比率は、コアエクソン領域またはエクソン伸長領域のいずれか（すなわち、２つの選択的５’スプライス部位間）に位置する複数のｃｃ要素によって調節される。さらなる例については、ＷＯ２０１０／０７５３０３（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
さらに好適な融合パートナーには、境界要素（例えば、ＣＴＣＦ）であるタンパク質（またはその断片）、末梢動員をもたらすタンパク質およびその断片（例えば、ラミンＡ、ラミンＢなど）、タンパク質ドッキング要素（例えば、ＦＫＢＰ／ＦＲＢ、Ｐｉｌｌ／Ａｂｙｌなど）が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの事例では、異種ポリペプチド（融合パートナー）は、細胞内局在化を提供し、すなわち、異種ポリペプチドは、細胞内局在化配列（例えば、核を標的とするための核局在シグナル（ＮＬＳ）、融合タンパク質を核外に維持するための配列、例えば、核外輸送配列（ＮＥＳ）、融合タンパク質を細胞質に保持するための配列、ミトコンドリアを標的とするためのミトコンドリア局在化シグナル、葉緑体を標的とするための葉緑体局在化シグナル、ＥＲ保持シグナルなど）を含む。いくつかの実施形態では、対象ＲＮＡガイドポリペプチドもしくは条件付きで活性なＲＮＡガイドポリペプチドおよび／または対象ＣａｓＸ融合ポリペプチドがＮＬＳを含まないため、そのタンパク質は核を標的としない（これは、例えば、標的核酸配列が細胞質ゾルに存在するＲＮＡである場合、有利であり得る）。いくつかの実施形態では、融合パートナーは、追跡および／または精製を容易にするためのタグ（例えば、蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏなど；ヒスチジンタグ、例えば、６ＸＨｉｓタグ；ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ；ＦＬＡＧタグ；Ｍｙｃタグなど）を提供することができる（すなわち、異種ポリペプチドは、検出可能な標識である）。
いくつかの事例では、参照またはＣａｓＸバリアントポリペプチドは、核局在化シグナル（ＮＬＳ）（例えば、いくつかの事例では、２つ以上、３つ以上、４つ以上、または５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上のＮＬＳ）を含む（それに融合される）。したがって、いくつかの事例では、参照またはＣａｓＸバリアントポリペプチドは、１つ以上のＮＬＳ（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上、または５つ以上のＮＬＳ）を含む。いくつかの事例では、１つ以上のＮＬＳ（２つ以上、３つ以上、４つ以上、または５つ以上のＮＬＳ）は、Ｎ末端および／もしくはＣ末端に、またはその近く（例えば、その５０アミノ酸以内）に配置される。いくつかの事例では、１つ以上のＮＬＳ（２つ以上、３つ以上、４つ以上、または５つ以上のＮＬＳ）は、Ｎ末端に、またはその近く（例えば、その５０アミノ酸以内）に配置される。いくつかの事例では、１つ以上のＮＬＳ（２つ以上、３つ以上、４つ以上、または５つ以上のＮＬＳ）は、Ｃ末端に、またはその近く（例えば、その５０アミノ酸以内）に配置される。いくつかの事例では、１つ以上のＮＬＳ（３つ以上、４つ以上、または５つ以上のＮＬＳ）は、Ｎ末端およびＣ末端の両方に、またはそれらの近く（例えば、それらの５０アミノ酸以内）に配置される。いくつかの事例では、あるＮＬＳがＮ末端に配置され、あるＮＬＳがＣ末端に配置される。いくつかの事例では、参照またはＣａｓＸバリアントポリペプチドは、１～１０個のＮＬＳ（例えば、１～９、１～８、１～７、１～６、１～５、２～１０、２～９、２～８、２～７、２～６、または２～５個のＮＬＳ）を含む（またはそれらに融合される）。いくつかの事例では、参照またはＣａｓＸバリアントポリペプチドは、２～５個のＮＬＳ（例えば、２～４個または２～３個のＮＬＳ）を含む（またはそれらに融合される）。
ＮＬＳの非限定的な例には、アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１５８）を有するＳＶ４０ウイルスラージＴ抗原のＮＬＳ、ヌクレオプラスミン由来のＮＬＳ（例えば、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号１５９）を有するヌクレオプラスミン二分ＮＬＳ、アミノ酸配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号１６０）またはＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰ（配列番号１６１）を有するｃ－ｍｙｃ ＮＬＳ、配列ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹ（配列番号１６２）を有するｈＲＮＰＡｌ Ｍ９ ＮＬＳ、インポーチン－アルファ由来のＩＢＢドメインの配列ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ（配列番号１６３）、筋腫Ｔタンパク質の配列ＶＳＲＫＲＰＲＰ（配列番号１６４）およびＰＰＫＫＡＲＥＤ（配列番号１６５）、ヒトｐ５３の配列ＰＱＰＫＫＫＰＬ（配列番号１６６）、マウスｃ－ａｂｌ ＩＶの配列ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ（配列番号１６７）、インフルエンザウイルスＮＳ１の配列ＤＲＬＲＲ（配列番号１６８）およびＰＫＱＫＫＲＫ（配列番号１６９）、肝炎ウイルスデルタ抗原の配列ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ（配列番号１７０）、マウスＭｘｌタンパク質の配列ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ（配列番号１７１）、ヒトポリ（ＡＤＰ－リボース）ポリメラーゼの配列ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ（配列番号１７２）、ステロイドホルモン受容体（ヒト）グルココルチコイドの配列ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫ（配列番号１７３）、ボルナ病ウイルスＰタンパク質（ＢＤＶ－Ｐ１）の配列ＰＲＰＲＫＩＰＲ（配列番号１７４）、Ｃ型肝炎ウイルス非構造タンパク質（ＨＣＶ－ＮＳ５Ａ）の配列ＰＰＲＫＫＲＴＶＶ（配列番号１７５）、ＬＥＦ１の配列ＮＬＳＫＫＫＫＲＫＲＥＫ（配列番号１７６）、ＯＲＦ５７ ｓｉｍｉｒａｅの配列ＲＲＰＳＲＰＦＲＫＰ（配列番号１７７）、ＥＢＶ ＬＡＮＡの配列ＫＲＰＲＳＰＳＳ（配列番号１７８）、Ａ型インフルエンザタンパク質の配列ＫＲＧＩＮＤＲＮＦＷＲＧＥＮＥＲＫＴＲ（配列番号１７９）、ヒトＲＮＡヘリカーゼＡ（ＲＨＡ）の配列ＰＲＰＰＫＭＡＲＹＤＮ（配列番号１８０）、核小体ＲＮＡヘリカーゼＩＩの配列ＫＲＳＦＳＫＡＦ（配列番号１８１）、ＴＵＳ－タンパク質の配列ＫＬＫＩＫＲＰＶＫ（配列番号１８２）、インポーチン－アルファに関連する配列ＰＫＫＫＲＫＶＰＰＰＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号１８３）、ＨＴＬＶ－１のＲｅｘタンパク質由来の配列ＰＫＴＲＲＲＰＲＲＳＱＲＫＲＰＰＴ（配列番号１８４）、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓのＥＧＬ－１３タンパク質由来の配列ＭＳＲＲＲＫＡＮＰＴＫＬＳＥＮＡＫＫＬＡＫＥＶＥＮ（配列番号１８５）、ならびに配列ＫＴＲＲＲＰＲＲＳＱＲＫＲＰＰＴ（配列番号１８６）、ＲＲＫＫＲＲＰＲＲＫＫＲＲ（配列番号１８７）、ＰＫＫＫＳＲＫＰＫＫＫＳＲＫ（配列番号１８８）、ＨＫＫＫＨＰＤＡＳＶＮＦＳＥＦＳＫ（配列番号１８９）、ＱＲＰＧＰＹＤＲＰＱＲＰＧＰＹＤＲＰ（配列番号１９０）、ＬＳＰＳＬＳＰＬＬＳＰＳＬＳＰＬ（配列番号１９１）、ＲＧＫＧＧＫＧＬＧＫＧＧＡＫＲＨＲＫ（配列番号１９２）、ＰＫＲＧＲＧＲＰＫＲＧＲＧＲ（配列番号１９３）、ＰＫＫＫＲＫＶＰＰＰＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号１８３）、およびＰＫＫＫＲＫＶＰＰＰＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１９４）に由来する配列が挙げられる。一般に、ＮＬＳ（または複数のＮＬＳ）は、真核細胞の核内での参照またはＣａｓＸバリアント融合タンパク質の蓄積を駆動するのに十分な強度を有する。核内での蓄積の検出は、任意の好適な技法によって行われ得る。例えば、検出可能なマーカーは、参照またはＣａｓＸバリアント融合タンパク質に融合されてもよく、これにより、細胞内の位置が可視化されるようになり得る。細胞核が細胞から単離される場合もあり、その後、その内容物が、タンパク質を検出するための任意の好適なプロセス、例えば、免疫組織化学、ウエスタンブロット、または酵素活性アッセイによって分析され得る。核内での蓄積が間接的に決定される場合もある。
いくつかの事例では、参照またはＣａｓＸバリアント融合タンパク質は、「タンパク質形質導入ドメイン」またはＰＴＤ（別名、ＣＰＰ（細胞透過性ペプチド））を含み、これは、タンパク質、ポリヌクレオチド、炭水化物、または脂質二層、ミセル、細胞膜、細胞小器官膜、もしくは小胞膜の横断を促進する有機もしくは無機化合物を指す。小さい極性分子から大きい巨大分子に及び得る別の分子および／またはナノ粒子に結合したＰＴＤは、例えば、細胞外空間から細胞内空間に、または細胞質ゾルから細胞小器官内に移動する分子の膜横断を促進する。いくつかの実施形態では、ＰＴＤは、参照またはＣａｓＸバリアント融合タンパク質のアミノ末端に共有結合している。いくつかの実施形態では、ＰＴＤは、参照またはＣａｓＸバリアント融合タンパク質のカルボキシル末端に共有結合している。いくつかの事例では、ＰＴＤは、好適な挿入部位で参照またはＣａｓＸバリアント融合タンパク質の配列の内部に挿入される。いくつかの事例では、参照またはＣａｓＸバリアント融合タンパク質は、１つ以上のＰＴＤ（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上のＰＴＤ）を含む（それにコンジュゲートされる、それに融合される）。いくつかの事例では、ＰＴＤは、１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む。ＰＴＤの例には、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１９５）、ＲＫＫＲＲＱＲＲ（配列番号１９６）、ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ（配列番号１９７）、ＴＨＲＬＰＲＲＲＲＲＲ（配列番号１９８）、およびＧＧＲＲＡＲＲＲＲＲＲ（配列番号１９９）を含むＨＩＶ ＴＡＴのペプチド形質導入ドメイン；細胞内への直接侵入に十分ないくつかのアルギニン（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０～５０個のアルギニン（配列番号２００））を含むポリアルギニン配列；ＶＰ２２ドメイン（Ｚｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９（６）：４８９－９６）；Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａタンパク質形質導入ドメイン（Ｎｏｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５２（７）：１７３２－１７３７）；切断型ヒトカルシトニンペプチド（Ｔｒｅｈｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２１：１２４８－１２５６）；ポリリジン（Ｗｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：１３００３－１３００８）；ＲＲＱＲＲＴＳＫＬＭＫＲ（配列番号２０１）；トランスポータンＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号２０２）；ＫＡＬＡＷＥＡＫＬＡＫＡＬＡＫＡＬＡＫＨＬＡＫＡＬＡＫＡＬＫＣＥＡ（配列番号２０３）；およびＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号２０４）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＰＴＤは、活性化可能なＣＰＰ（ＡＣＰＰ）である（Ａｇｕｉｌｅｒａ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｉｎｔｅｇｒ Ｂｉｏｌ（Ｃａｍｂ）Ｊｕｎｅ；１（５－６）：３７１－３８１）。ＡＣＰＰは、正味電荷をほぼゼロまで減少させ、それにより、細胞への接着および取り込みを阻害する、切断可能なリンカーを介して一致するポリアニオン（例えば、Ｇｌｕ９または「Ｅ９」）に結合されたポリカチオン性ＣＰＰ（例えば、Ａｒｇ９または「Ｒ９」）を含む。リンカーの切断時、ポリアニオンが放出され、ポリアルギニンおよびその本来の接着性を局所的にアンマスクし、それ故にＡＣＰＰを「活性化」して、膜を横断する。
いくつかの実施形態では、参照またはＣａｓＸバリアント融合タンパク質は、リンカーポリペプチド（例えば、１つ以上のリンカーポリペプチド）を介して内部に挿入された異種アミノ酸または異種ポリペプチド（異種アミノ酸配列）に連結されたＣａｓＸタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態では、参照またはＣａｓＸバリアント融合タンパク質は、リンカーポリペプチド（例えば、１つ以上のリンカーポリペプチド）を介してＣ末端および／またはＮ末端で異種ポリペプチド（融合パートナー）に連結され得る。リンカーポリペプチドは、様々なアミノ酸配列のうちのいずれかを有し得る。タンパク質は、概ね可動性のスペーサーペプチドによって結合され得るが、他の化学結合は除外されない。好適なリンカーには、４アミノ酸～４０アミノ酸長、または４アミノ酸～２５アミノ酸長のポリペプチドが含まれる。これらのリンカーは、一般に、リンカーをコードする合成オリゴヌクレオチドを使用してタンパク質と共役させることによって生成される。ある程度の可動性を有するペプチドリンカーを使用することができる。好ましいリンカーが概ね可動性のペプチドをもたらす配列を有することを踏まえて、連結ペプチドは、実質的にいずれのアミノ酸配列も有し得る。グリシンおよびアラニンなどの小さいアミノ酸の使用は、可動性ペプチドの作製に有用である。かかる配列の作製は、当業者にとって慣例である。様々な異なるリンカーが市販されており、使用に好適であるとみなされている。リンカーポリペプチドの例には、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ、グリシン－セリンポリマー（例えば、（ＧＳ）ｎ、ＧＳＧＧＳｎ（配列番号２０５）、ＧＧＳＧＧＳｎ（配列番号２０６）、およびＧＧＧＳｎ（配列番号２０７）を含み、ここで、ｎは少なくとも１の整数である）、グリシン－アラニンポリマー、アラニン－セリンポリマー、グリシン－プロリンポリマー、プロリンポリマー、およびプロリン－アラニンポリマーが挙げられる。リンカーの例は、ＧＧＳＧ（配列番号２０８）、ＧＧＳＧＧ（配列番号２０９）、ＧＳＧＳＧ（配列番号２１０）、ＧＳＧＧＧ（配列番号２１１）、ＧＧＧＳＧ（配列番号２１２）、ＧＳＳＳＧ（配列番号２１３）、ＧＰＧＰ（配列番号２１４）、ＧＧＰ、ＰＰＰ、ＰＰＡＰＰＡ（配列番号２１５）、ＰＰＰＧＰＰＰ（配列番号２１６）などを含むが、これらに限定されないアミノ酸配列を含むことができる。当業者であれば、上記のいずれかの要素にコンジュゲートされたペプチドの設計が全てまたは部分的に可動性のリンカーを含むことができ、これにより、リンカーが、可動性リンカーのみならず、可動性の低い構造を与える１つ以上の部分も含むことができるようになることを認識するであろう。
Ｖ．抗原プロセシング、提示、認識、および／または応答に関与するタンパク質およびそれらの調節領域をコードする核酸を修飾するためのＣａｓＸ：ｇＮＡ系および方法
本明細書に提供されるＣａｓＸタンパク質、ガイド核酸、およびそれらのバリアントは、治療、診断、および研究を含む様々な用途に有用である。本開示の遺伝子を編集するための方法を達成するために、プログラム可能なＣａｓＸ：ｇＮＡ系が本明細書に提供される。本明細書に提供されるＣａｓＸ：ｇＮＡ系のプログラム可能な性質は、目的とするタンパク質をコードする遺伝子の標的核酸配列内の所定の目的とする１つ以上の領域で所望の効果（ニッキング、切断、修復など）を達成するための正確な標的を可能にする。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるＣａｓＸ：ｇＮＡ系は、表４、７、８、９、または１１のＣａｓＸバリアント、または表４の配列と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するバリアントと、ｇＮＡ（例えば、表２の足場バリアント、または表２の配列と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するバリアントを含むｇＮＡ）、またはＣａｓＸバリアントタンパク質およびｇＮＡをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含み、ｇＮＡの標的配列は、標的タンパク質をコードする標的核酸配列、その調節要素、もしくはそれらの両方、またはそれに相補的な配列に相補的であり、それ故に、それとハイブリダイズすることができる。他の事例では、ＣａｓＸ：ｇＮＡ系は、参照ＣａｓＸまたは参照ｇＮＡを含むことができる。いくつかの事例では、ＣａｓＸ：ｇＮＡ系は、ドナー鋳型核酸をさらに含む。
様々な戦略および方法を用いて、細胞表面マーカータンパク質、膜貫通タンパク質、または細胞内または細胞外タンパク質をコードする標的核酸配列を修飾することができる、および／または本明細書に提供されるＣａｓＸ：ｇＮＡ系を使用して細胞内に抗原プロセシング、抗原提示、抗原認識、および／もしくは抗原応答に関与するタンパク質を導入することができる。本明細書で使用される場合、「修飾する」には、切断、ニッキング、編集、欠失、ノックイン、ノックアウト、修復／修正などが含まれるが、これらに限定されない。「ノックアウト」という用語は、遺伝子の除去または遺伝子の発現を指す。例えば、遺伝子は、リーディングフレームの破壊につながるヌクレオチド配列の欠失または付加のいずれかによってノックアウトされる可能性がある。別の例として、遺伝子は、遺伝子の一部を無関係の配列または１つ以上の置換された塩基で置き換えることによってノックアウトされ得る。本明細書で使用される「ノックダウン」という用語は、遺伝子またはその遺伝子産物の発現の低下を指す。遺伝子ノックダウンの結果として、タンパク質の活性または機能が減弱され得るか、タンパク質レベルが減少するまたは排除され得る。かかる実施形態では、抗原プロセシング、抗原提示、抗原認識、および／または抗原応答に関与するタンパク質をコードする遺伝子の一部分もしくはその調節要素に特異的な標的配列、またはその配列の相補体を有するｇＮＡが利用され得る。利用されるＣａｓＸタンパク質およびｇＮＡに応じて、その事象が切断事象である場合があり、発現のノックダウン／ノックアウトを可能にし得る。いくつかの実施形態では、タンパク質の遺伝子発現は、ランダム挿入または欠失（インデル）を導入することによって、例えば、不正確な非相同ＤＮＡ末端結合（ＮＨＥＪ）修復経路を利用することによって破壊または排除され得る。かかる実施形態では、抗原プロセシング、抗原提示、抗原認識、および／または抗原応答に関与するタンパク質の標的領域は、遺伝子のコード配列（エクソン）を含み、ヌクレオチドの挿入または欠失により、フレームシフト変異がもたらされ得る。このアプローチをイントロンなどの他の非コード領域または調節要素に使用して、標的遺伝子の発現を妨害することもできる。
いくつかの実施形態では、本開示の方法は、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）標的核酸内で部位特異的二本鎖切断（ＤＳＢ）または一本鎖切断（ＳＳＢ）を生成し、その後、それらが非相同末端結合（ＮＨＥＪ）、相同性指向修復（ＨＤＲ）、相同性非依存性標的組み込み（ＨＩＴＩ）、マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）、一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）、または塩基除去修復（ＢＥＲ）のいずれかによって修復され、その結果、標的核酸配列を修飾することができる、ＣａｓＸタンパク質および１つ以上のｇＮＡ（例えば、ＣａｓＸタンパク質が標的核酸の一方の鎖のみを切断することができるニッカーゼである場合）を提供する。いくつかの実施形態では、ｇＮＡのうちの１つまたは一対（または３つまたは４つ）を利用することが望ましい場合があり、それらは各々、抗原プロセシング、抗原提示、抗原認識、および／または抗原応答対立遺伝子に関与するタンパク質の異なる領域に特異的な標的配列を有し、その後、切断部位に挿入されるポリヌクレオチド配列を含むドナー鋳型の導入が続く。
一実施形態では、本開示は、細胞集団における遺伝子の標的核酸配列を修飾する方法であって、遺伝子が、抗原プロセシング、抗原提示、抗原認識、および／または抗原応答に関与するタンパク質をコードし、集団の各細胞に、ａ）本明細書に記載の実施形態のうちのいずれか１つのＣａｓＸ：ｇＮＡ系、ｂ）本明細書に記載の実施形態のうちのいずれか１つのＣａｓＸ：ｇＮＡ系をコードする核酸、ｃ）上記の（ｂ）の核酸を含むベクター、ｄ）本明細書に記載の実施形態のうちのいずれか１つのＣａｓＸ：ｇＮＡ系を含むＶＬＰ、またはｅ）（ａ）～（ｄ）のうちの２つ以上の組み合わせを導入することを含み、細胞の標的核酸配列がＣａｓＸタンパク質によって修飾される、方法を提供する。一実施形態では、ＣａｓＸ：ｇＮＡ系は、ＲＮＰとして細胞に導入される。本方法のいくつかの実施形態では、細胞は、齧歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、および非ヒト霊長類細胞からなる群から選択される。本方法の他の実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。本方法の他の実施形態では、細胞は、前駆細胞、造血幹細胞、および多能性幹細胞からなる群から選択される。本方法の他の実施形態では、細胞は、人工多能性幹細胞である。本方法の他の実施形態では、細胞は、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、または樹状細胞からなる群から選択される免疫細胞である。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ガンマ－デルタＴ細胞、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される。Ｔ細胞が修飾される細胞である場合、恐らくＣＤ４ Ｔ細胞が注入されたＣＴＬの機能および生存を維持するために成長因子および他のシグナルを提供するため、ＣＡＲ－Ｔ細胞を操作する際にＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞との混合物が選択されることが多い（Ｂａｒｒｅｔｔ，ＤＭ，ｅｔ ａｌ．Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＣＡＲ）ａｎｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＴＣＲ）Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ Ｅｎｔｅｒ Ｍａｉｎ Ｓｔｒｅｅｔ ａｎｄ Ｗａｌｌ Ｓｔｒｅｅｔ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９５（３）：７５５－７６１（２０１５））。いくつかの実施形態では、細胞は、当該細胞を投与される対象に対して自己である。本方法の他の実施形態では、細胞は、当該細胞を投与される対象に対して同種異系である。
細胞集団における遺伝子の標的核酸配列を修飾する方法のいくつかの実施形態では、修飾は、集団の細胞の標的核酸配列に１つ以上の一本鎖切断を導入することを含む。本方法の他の実施形態では、修飾は、集団の細胞の標的核酸配列に１つ以上の二本鎖切断を導入することを含む。本方法の他の実施形態では、修飾は、集団の細胞の標的核酸配列に１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、置換、重複、または逆位を導入することを含み、これにより、抗原プロセシング、抗原提示、抗原認識、および／または抗原応答に関与する１つ以上のタンパク質をコードする集団の細胞における遺伝子のノックダウンまたはノックアウトがもたらされる。いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、ベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、Ｔ細胞受容体アルファ鎖定常領域（ＴＲＡＣ）、ＩＣＰ４７ポリペプチド、クラスＩＩ主要組織適合性複合体トランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）、Ｔ細胞受容体ベータ定常１（ＴＲＢＣ１）、Ｔ細胞受容体ベータ定常２（ＴＲＢＣ２）、ヒト白血球抗原Ａ（ＨＬＡ－Ａ）、ヒト白血球抗原Ｂ（ＨＬＡ－Ｂ）、ＴＧＦβ受容体２（ＴＧＦβＲＩＩ）、プログラム細胞死１（ＰＤ－１）、サイトカイン誘導性ＳＨ２（ＣＩＳＨ）、リンパ球活性化３（ＬＡＧ－３）、ＩｇおよびＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）、アデノシンＡ２ａ受容体（ＡＤＯＲＡ２Ａ）、キラー細胞レクチン様受容体Ｃ１（ＮＫＧ２Ａ）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）、Ｔ細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン３（ＴＩＭ－３）、ならびに２Ｂ４（ＣＤ２４４）から選択される。例示的な一実施形態では、細胞表面マーカータンパク質はＢ２Ｍであり、ｇＮＡの標的配列は、表３Ａの配列から選択される配列を含む。別の例示的な実施形態では、細胞表面マーカータンパク質はＴＲＡＣであり、ｇＮＡの標的配列は、表３Ｂの配列から選択される配列を含む。別の例示的な実施形態では、細胞内タンパク質はＣＩＩＴＡであり、ｇＮＡの標的配列は、表３Ｃの配列から選択される配列を含む。本方法の別の実施形態では、修飾される遺伝子は、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、およびＣＩＩＴＡからなる群から選択されるタンパク質のうちの少なくとも２つである。前述の一実施形態では、集団の細胞は、１つ以上のタンパク質の発現が修飾されていない細胞と比較して少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％減少するように修飾されている。前述の別の実施形態では、集団の細胞は、修飾されていない細胞と比較して細胞の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％が１つ以上のタンパク質を検出可能なレベルで発現しないように修飾されている。本方法の別の実施形態では、細胞は、修飾された細胞の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％がＭＨＣクラスＩ分子を検出可能なレベルで発現しないように修飾されている。本方法の別の実施形態では、細胞は、修飾された細胞の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％が野生型Ｔ細胞受容体を検出可能なレベルで発現しないように修飾されている。
いくつかの実施形態では、本方法は、集団の細胞の標的核酸配列の切断部位へのドナー鋳型の挿入を含む。本系が抗原プロセシング、抗原提示、抗原認識、および／または抗原応答に関与するタンパク質をノックダウン／ノックアウトするために使用されるかノックインするために使用されるかに応じて、ドナー鋳型は、短い一本鎖もしくは二本鎖オリゴヌクレオチド、または抗原プロセシング、抗原提示、抗原認識、および／または抗原応答に関与するタンパク質の遺伝子をコードする長い一本鎖もしくは二本鎖オリゴヌクレオチドであり得る。ノックダウン／ノックアウトの場合、ドナー鋳型配列は、典型的には、それが置換するゲノム配列と同一ではなく、ゲノム配列に対して１つ以上の単一塩基変化、挿入、欠失、逆位、または転位を含み得るが、但し、相同性指向修復を支援するのに十分な標的配列との相同性を有することを条件とし、これにより、標的タンパク質が発現されないか、またはより低いレベルで発現されるようにフレームシフトまたは他の変異が生じ得る。ある特定の実施形態では、ノックダウン／ノックアウト修飾の場合、ドナー鋳型配列は、組換えが所望される標的ゲノム配列と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または９９．９％の配列同一性を有するであろう。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型配列は、２つの相同領域（「相同アーム」）と隣接する非相同配列を含み、これにより、標的ＤＮＡ領域と２つの隣接配列との間の相同性指向修復が標的領域に非相同配列の挿入をもたらすようになる。上流配列および下流配列は、標的ＤＮＡの組み込み部位の両側と配列類似性を共有し、配列の挿入を容易にする。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型配列の相同領域は、組換えが所望される標的ゲノム配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するであろう。ドナー鋳型配列は、ゲノム配列と比較してある特定の配列相違、例えば、制限部位、ヌクレオチド多型、選択可能なマーカー（例えば、薬剤耐性遺伝子、蛍光タンパク質、酵素など）などを含み得、これらは、切断部位でのドナー核酸の挿入の成功を評価するために使用され得るか、またはいくつかの事例では、他の目的のために（例えば、標的とされたゲノム遺伝子座での発現を示すために）使用され得る。あるいは、これらの配列相違には、マーカー配列の除去のために後に活性化することができる、ＦＬＰ、ｌｏｘＰ配列などの隣接組換え配列が含まれ得る。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、標的遺伝子の少なくとも約１０、少なくとも約５０、少なくとも約１００、または少なくとも約２００、または少なくとも約３００、または少なくとも約４００、または少なくとも約５００、または少なくとも約６００、または少なくとも約７００、または少なくとも約８００、または少なくとも約９００、または少なくとも約１０００、または少なくとも約１０，０００、または少なくとも１５，０００個のヌクレオチドを含む。他の実施形態では、ドナー鋳型は、標的遺伝子の少なくとも約２０～約１０，０００個のヌクレオチド、または少なくとも約２００～約８０００個のヌクレオチド、または少なくとも約４００～約６０００個のヌクレオチド、または少なくとも約６００～約４０００個のヌクレオチド、または少なくとも約１０００～約２０００個のヌクレオチドを含む。他の実施形態では、本開示は、ＣａｓＸ：ｇＮＡ系および遺伝子をコードする核酸に２０個以下のヌクレオチド、１０個以下のヌクレオチド、５個以下のヌクレオチド、４個以下のヌクレオチド、３個以下のヌクレオチド、２個のヌクレオチド、または単一のヌクレオチドの欠失、挿入、または変異を含むドナー鋳型を使用して細胞の標的配列を改変する方法であって、ドナー鋳型の挿入により、標的タンパク質の発現が、修飾されていない細胞と比較して、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％減少する細胞がもたらされる、方法を提供する。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、一本鎖ＤＮＡ配列を含む。他の実施形態では、ドナー鋳型は、一本鎖ＲＮＡ鋳型を含む。他の実施形態では、ドナー鋳型は、二本鎖ＤＮＡ配列を含む。
他の事例では、外因性ドナー鋳型が、相同性非依存性標的組み込み（ＨＩＴＩ）機構によるＣａｓＸ切断によって生成された末端間に挿入される。ＨＩＴＩによって挿入される外因性配列は、任意の長さ、例えば、１～５０ヌクレオチド長の比較的短い配列、または約５０～１０００ヌクレオチド長のより長い配列であり得る。相同性の欠如は、例えば、２０～５０％以下の配列同一性を有することおよび／または低ストリンジェンシーで特異的ハイブリダイゼーションを欠くことであり得る。他の事例では、相同性の欠如は、５、６、７、８、または９ｂｐ以下の同一性を有するという基準をさらに含み得る。ドナー鋳型の挿入は、相同性指向修復（ＨＤＲ）または相同性非依存性標的組み込み（ＨＩＴＩ）によって媒介される。いくつかの事例では、ドナー鋳型の挿入により、抗原プロセシング、抗原提示、抗原認識、および／または抗原応答に関与する１つ以上のタンパク質をコードする集団の細胞における遺伝子のノックダウンまたはノックアウトがもたらされる。いくつかの事例では、集団の細胞は、１つ以上のタンパク質の発現が修飾されていない細胞と比較して少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％減少するように修飾されている。他の事例では、集団の細胞は、細胞が１つ以上のタンパク質を検出可能なレベルで発現しないように修飾されている。特定の実施形態では、１つ以上のタンパク質は、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、およびＣＩＩＴＡからなる群から選択される。一実施形態では、本方法は、細胞集団においてエクスビボで行われる。別の実施形態では、本方法は、対象においてインビボで行われる。
細胞集団における遺伝子の標的核酸配列を修飾する方法のいくつかの実施形態では、修飾は、以下により完全に記載される、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチドの挿入をさらに含み、これにより、集団の修飾された細胞におけるＣＡＲの検出可能なレベルでの発現がもたらされる。例示的なＣＡＲ、およびかかる受容体を操作して細胞に導入するための方法には、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、国際特許出願公開第ＷＯ２０１３／１２６７２６号、同第ＷＯ２０１２／１２９５１４号、同第ＷＯ２０１４／０３１６８７号、同第ＷＯ２０１３／１６６３２１号、同第ＷＯ２０１３／０７１１５４号、同第ＷＯ２０１３／１２３０６１号、米国特許出願公開第ＵＳ２００２／１３１９６０号、同第ＵＳ２０１３／２８７７４８号、同第ＵＳ２０１３／０１４９３３７号、同第ＵＳ２０１９／０１３６２３０号、米国特許第６，４５１，９９５号、同第７，４４６，１９０号、同第８，２５２，５９２号、同第８，３３９，６４５号、同第８，３９８，２８２号、同第７，４４６，１７９号、同第６，４１０，３１９号、同第７，０７０，９９５号、同第７，２６５，２０９号、同第７，３５４，７６２号、同第７，４４６，１９１号、同第８，３２４，３５３号、および同第８，４７９，１１８号に記載のものが含まれる。ポリヌクレオチドは、当該技術分野で既知の従来の方法、例えば、電気穿孔またはマイクロインジェクションを使用して、本明細書に記載のベクター、またはプラスミドとしてのベクターによって修飾される細胞に導入することができる。
細胞集団における遺伝子の標的核酸配列を修飾する方法のいくつかの実施形態では、修飾は、ＴＣＲ（本明細書では操作されたＴ細胞受容体または操作されたＴＣＲと称される）を、抗原プロセシング、抗原提示、抗原認識、および／または抗原応答に関与する所望のタンパク質に再標的することができる抗原結合ドメインに連結されたＴＣＲのサブユニットを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの挿入をさらに含む。Ｔ細胞の操作により、集団の修飾された細胞における操作されたＴＣＲの検出可能なレベルでの発現がもたらされ、がんまたは自己免疫疾患などの疾患の治療に有用な第２の定義された特異性のＴＣＲを有する細胞が得られる。ＴＣＲの１つ以上のサブユニットは、ＴＣＲアルファ、ＴＣＲベータ、ＣＤ３－デルタ、ＣＤ３－イプシロン、ＣＤ－ガンマ、またはＣＤ３－ゼータのうちのいずれかを含み得る。したがって、操作されたＴＣＲは、ＴＣＲ細胞外ドメインまたは膜貫通ドメインの少なくとも一部分を含む融合タンパク質と、抗原結合ドメインとを含み、ここで、ＴＣＲサブユニットと抗原結合ドメインが作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、操作されたＴＣＲは、ＴＣＲ細胞外ドメインまたは膜貫通ドメインの少なくとも一部分を含む融合タンパク質と、刺激ドメインを含むＴＣＲ細胞内ドメインと、抗原結合ドメインとを含み、ここで、ＴＣＲサブユニットと抗原ドメインが作動可能に連結されている。ＣＡＲまたは第２のＴＣＲを発現する修飾されたＴ細胞集団がインビトロ／エクスビボでそれぞれの標的細胞を認識および破壊する能力に加えて、修飾された細胞集団は、がんまたは自己免疫疾患などの疾患を有する対象の治療に有用である。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲまたは操作されたＴＣＲは、疾患抗原、任意選択的に、腫瘍細胞抗原に対する特異的結合親和性を有する抗原結合ドメインを有する。前述では、腫瘍細胞抗原は、分化抗原群１９（ＣＤ１９）、分化抗原群３（ＣＤ３）、ＣＤ３ｄ分子（ＣＤ３Ｄ）、ＣＤ３ｇ分子（ＣＤ３Ｇ）、ＣＤ３ｅ分子（ＣＤ３Ｅ）、ＣＤ２４７分子（ＣＤ２４７、またはＣＤ３Ｚ）、ＣＤ８ａ分子（ＣＤ８）、ＣＤ７分子（ＣＤ７）、膜メタロエンドペプチダーゼ（ＣＤ１０）、膜貫通４－ドメインＡ１（ＣＤ２０）、ＣＤ２２分子（ＣＤ２２）、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー８（ＣＤ３０）、Ｃ型レクチンドメインファミリー１２メンバーＡ（ＣＬＬ１）、ＣＤ３３分子（ＣＤ３３）、ＣＤ３４分子（ＣＤ３４）、ＣＤ３８分子（ＣＤ３８）、インテグリンサブユニットアルファ２ｂ（ＣＤ４１）、ＣＤ４４分子（インド人血液型）（ＣＤ４４）、ＣＤ４７分子（ＣＤ４７）、インテグリンアルファ６（ＣＤ４９ｆ）、神経細胞接着分子１（ＣＤ５６）、ＣＤ７０分子（ＣＤ７０）、ＣＤ７４分子（ＣＤ７４）、ＣＤ９９分子（Ｘｇ血液型）（ＣＤ９９）、インターロイキン３受容体サブユニットアルファ（ＣＤ１２３）、プロミニン１（ＣＤ１３３）、シンデカン１（ＣＤ１３８）、カルボニクスアンヒドラーゼＩＸ（ＣＡＩＸ）、ＣＣケモカイン受容体４（ＣＣＲ４）、ＡＤＡＭメタロペプチダーゼドメイン１２（ＡＤＡＭ１２）、接着Ｇタンパク質共役型受容体Ｅ２（ＡＤＧＲＥ２）、胎盤様型２アルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰＰＬ２）、アルファ４インテグリン、アンジオポエチン－２（ＡＮＧ２）、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、ＣＤ４４Ｖ６、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＥＡＣ、ＣＥＡ細胞接着分子５（ＣＥＡＣＡＭ５）、クローディン６（ＣＬＤＮ６）、ＣＬＤＮ１８、Ｃ型レクチンドメインファミリー１２メンバーＡ（ＣＬＥＣ１２Ａ）、間葉上皮移行因子（ｃＭＥＴ）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）、上皮成長因子受容体１（ＥＧＦ１Ｒ）、上皮成長因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、上皮糖タンパク質２（ＥＧＰ－２）、上皮細胞接着分子（ＥＧＰ－４０またはＥｐＣＡＭ）、ＥＰＨ受容体Ａ２（ＥｐｈＡ２）、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ３（ＥＮＰＰ３）、ｅｒｂ－ｂ２受容体チロシンキナーゼ２（ＥＲＢＢ２）、ｅｒｂ－ｂ２受容体チロシンキナーゼ３（ＥＲＢＢ３）、ｅｒｂ－ｂ２受容体チロシンキナーゼ４（ＥＲＢＢ４）、葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）、胎児ニコチン性アセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）、葉酸受容体アルファ（ＦｒアルファまたはＦＯＬＲ１）、Ｇタンパク質共役型受容体１４３（ＧＰＲ１４３）、代謝型グルタミン酸受容体８（ＧＲＭ８）、グリピカン－３（ＧＰＣ３）、ガングリオシドＧＤ２、ガングリオシドＧＤ３、ヒト上皮成長因子受容体１（ＨＥＲ１）、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）、ヒト上皮成長因子受容体３（ＨＥＲ３）、インテグリンＢ７、細胞間細胞接着分子－１（ＩＣＡＭ－１）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、インターロイキン－１３受容体α２（ＩＬ－ｌ３Ｒ－ａ２）、Ｋ－軽鎖、キナーゼ挿入ドメイン受容体（ＫＤＲ）、ルイス－Ｙ（ＬｅＹ）、コンドロモジュリン－１（ＬＥＣＴ１）、Ｌ１細胞粘着分子（Ｌ１ＣＡＭ）、リゾホスファチジン酸受容体３（ＬＰＡＲ３）、メラノーマ関連抗原１（ＭＡＧＥ－Ａ１）、メソテリン（ＭＳＬＮ）、ムチン１（ＭＵＣ１）、細胞表面結合ムチン１６（ＭＵＣ１６）、メラノーマ関連抗原３（ＭＡＧＥＡ３）、腫瘍タンパク質ｐ５３（ｐ５３）、Ｔ細胞によって認識されるメラノーマ抗原１（ＭＡＲＴ１）、糖タンパク質１００（ＧＰ１００）、プロテイナーゼ３（ＰＲ１）、エフリン－Ａ受容体２（ＥｐｈＡ２）、ナチュラルキラーグループ２Ｄリガンド（ＮＫＧ２Ｄリガンド）、ニューヨーク食道扁平上皮がん１（ＮＹ－ＥＳＯ－１）、がん胎児性抗原（ｈ５Ｔ４）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、プログラム死リガンド１（ＰＤＬ－１）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、トロホブラスト糖タンパク質（ＴＰＢＧ）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ－７２）、腫瘍関連カルシウムシグナルトランスデューサー２（ＴＲＯＰ－２）、チロシナーゼ、スルビビン、血管内皮成長因子受容体２（ＶＥＧＦ－Ｒ２）、ウィルムス腫瘍－１（ＷＴ－１）、白血球免疫グロブリン様受容体Ｂ２（ＬＩＬＲＢ２）、メラノーマ優先発現抗原（ＰＲＡＭＥ）、Ｔ細胞受容体ベータ定常１（ＴＲＢＣ１）、ＴＲＢＣ２、および（Ｔ細胞免疫グロブリンムチン－３）ＴＩＭ－３からなる群から選択され得る。一実施形態では、ＣＡＲまたは操作されたＴＣＲは、直鎖状抗体、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、および一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）からなる群から選択される抗原結合ドメインを含む。別の実施形態では、ＣＡＲは、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含み、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２４７分子（ＣＤ３－ゼータ）、ＣＤ２７分子（ＣＤ２７）、ＣＤ２８分子（ＣＤ２８）、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー９（４－１ＢＢ）、誘導性Ｔ細胞共刺激因子（ＩＣＯＳ）、またはＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー４（ＯＸ４０）から単離されたまたはそれに由来する１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。別の実施形態では、ＣＡＲは、細胞外ヒンジドメインまたはスペーサーをさらに含む。一実施形態では、細胞外ヒンジドメインは免疫グロブリン様ドメインであり、ヒンジドメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４から単離されるか、またはそれに由来する。別の実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＤ８ａ分子（ＣＤ８）またはＣＤ２８から単離されるか、またはそれに由来する。別の実施形態では、ＣＡＲは、膜貫通ドメインをさらに含む。膜貫通ドメインは、ＣＤ３－ゼータ、ＣＤ４、ＣＤ８、およびＣＤ２８からなる群から単離され得るか、またはそれに由来し得る。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲまたは操作されたＴＣＲの抗原結合ドメインは、直鎖状抗体、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、および一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）からなる群から選択される。特定の実施形態では、抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、腫瘍細胞抗原または標的細胞マーカーに対する特異的結合親和性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。典型的には、ＶＨは、各ＣＤＲに接続するフレームワーク領域（ＦＲ）が散在した、ＣＤＲ－Ｈ１領域、ＣＤＲ－Ｈ２領域、ＣＤＲ－Ｈ３領域を含み、ＶＬは、ＦＲが散在した、ＣＤＲ－Ｌ１領域、ＣＤＲ－Ｌ２領域、およびＣＤＲ－Ｌ３領域を含む。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、約１０－５～１０－１２Ｍならびにその範囲内の全ての個々の値および範囲の平衡結合定数を有する腫瘍細胞抗原に対する親和性を呈し、かかる結合親和性は「特異的」である。他の実施形態では、ｓｃＦｖは、参照抗体と同一の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）および軽鎖ＣＤＲを含む。いくつかの事例では、参照抗体は、ヒト化抗体である。ヒト化抗体とは、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含む、特異的キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはそれらの抗原結合断片である非ヒト（例えば、マウス）抗体の形態を指す。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエント抗体のＣＤＲ由来の残基が所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、またはウサギなどの非ヒト種のＣＤＲ由来の残基によって置き換えられるヒト免疫グロブリンである。いくつかの事例では、Ｆｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、ＦＲ領域の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のＦＲ領域である。本方法のいくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原結合ドメインを提供するために利用される参照抗体は、表５に記載の配列からなる群から選択されるＶＨおよびＶＬならびに／または重鎖および軽鎖ＣＤＲを含む。表５のＶＨおよびＶＬ配列が、ＣＤＲ－Ｈ１領域、ＣＤＲ－Ｈ２領域、ＣＤＲ－Ｈ３領域、ＣＤＲ－Ｌ１領域、ＣＤＲ－Ｌ２領域、およびＣＤＲ－Ｈ３領域（表５の下線が引かれた配列で示される）を含み、対応するＶＨおよびＶＬのフレームワーク領域ではなく代替フレームワーク領域を利用するが、標的細胞マーカーに対する特異的結合親和性を依然として保持するこれらのＣＤＲを用いてＣＡＲおよび／または操作されたＴＣＲ実施形態の抗原結合ドメインを構築することができることが理解されよう。いくつかの事例では、ＣＤＲまたはＶＬおよびＶＨは、標的細胞マーカーに対する特異的結合親和性が保持されている限り、１つ以上のアミノ酸置換、欠失、または挿入を有することができる。前述の実施形態では、コードされたＣＡＲまたはＴＣＲの構成要素としてのｓｃＦｖのＣＤＲまたはＶＨおよびＶＬをコードする核酸が、細胞集団を修飾するために利用される。
いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＲおよび／または操作されたＴＣＲは、ＶＨおよびＶＬを含む抗原結合ドメインを含み、ＶＨおよびＶＬは、配列番号２１７および配列番号２１８、配列番号２１９および配列番号２２０、配列番号２２１および配列番号２２２、配列番号２２３および配列番号２２４、配列番号２２５および配列番号２２６、配列番号２２７および配列番号２２８、配列番号２２９および配列番号２３０、配列番号２３１および配列番号２３２、配列番号２３３および配列番号２３４、配列番号２３５および配列番号２３６、配列番号２３７および配列番号２３８、配列番号２３９および配列番号２４０、配列番号２４１および配列番号２４２、配列番号２４３および配列番号２４４、配列番号２４５および配列番号２４６、配列番号２４７および配列番号２４８、配列番号２４９および配列番号２５０、配列番号２５１および配列番号２５２、配列番号２５３および配列番号２５４、配列番号２５５および配列番号２５６、配列番号２５７および配列番号２５８、配列番号２５９および配列番号２６０、配列番号２６１および配列番号２６２、配列番号２６３および配列番号２６４、配列番号２６５および配列番号２６６、配列番号２６７および配列番号２６８、配列番号２６９および配列番号２７０、配列番号２７１および配列番号２７２、配列番号２７３および配列番号２７４、配列番号２７５および配列番号２７６、配列番号２７７および配列番号２７８、配列番号２７９および配列番号２８０、配列番号２８１および配列番号２８２、配列番号２８３および配列番号２８４、配列番号２８５および配列番号２８６、配列番号２８７および配列番号２８８、配列番号２８９および配列番号２９０、配列番号２９１および配列番号２９２、配列番号２９３および配列番号２９４、配列番号２９５および配列番号２９６、配列番号２９７および配列番号２９８、配列番号２９９および配列番号３００、配列番号３０１および配列番号３０２、配列番号３０３および配列番号３０４、配列番号３０５および配列番号３０６、配列番号３０７および配列番号３０８、配列番号３０９および配列番号３１０、配列番号３１１および配列番号３１２、配列番号３１３および配列番号３１４、配列番号３１５および配列番号３１６、配列番号３１７および配列番号３１８、配列番号３１９および配列番号３２０、配列番号３２１および配列番号３２２、配列番号３２３および配列番号３２４、配列番号３２５および配列番号３２６、配列番号３２７および配列番号３２８、配列番号３２９および配列番号３３０、配列番号３３１および配列番号３３２、配列番号３３３および配列番号３３４、配列番号３３５および配列番号３３６、配列番号３３７および配列番号３３８、配列番号３３９および配列番号３４０、配列番号３４１および配列番号３４２、配列番号３４３および配列番号３４４、配列番号３４５および配列番号３４６、配列番号３４７および配列番号３４８、配列番号３４９および配列番号３５０、配列番号３５１および配列番号３５２、配列番号３５３および配列番号３５４、配列番号３５５および配列番号３５６、配列番号３５７および配列番号３５８、配列番号３５９および配列番号３６０、配列番号３６１および配列番号３６２、配列番号３６３および配列番号３６４、配列番号３６５および配列番号３６６、配列番号３６７および配列番号３６８、配列番号３６９および配列番号３７０、配列番号３７１および配列番号３７２、配列番号３７３および配列番号３７４、配列番号３７５および配列番号３７６、配列番号３７７および配列番号３７８、配列番号３７９および配列番号３８０、配列番号３８１および配列番号３８２、配列番号３８３および配列番号３８４、配列番号３８５および配列番号３８６、配列番号３８７および配列番号３８８、配列番号３８９および配列番号３９０、配列番号３９１および配列番号３９２、配列番号３９３および配列番号３９４、配列番号３９５および配列番号３９６、配列番号３９７および配列番号３９８、配列番号３９９および配列番号４００、配列番号４０１および配列番号４０２、配列番号４０３および配列番号４０４、配列番号４０５および配列番号４０６、配列番号４０７および配列番号４０８、配列番号４０９および配列番号４１０、配列番号４１１および配列番号４１２、配列番号４１３および配列番号４１４、配列番号４１５および配列番号４１６、配列番号４１７および配列番号４１８、配列番号４１９および配列番号４２０、配列番号４２１および配列番号４２２、配列番号４２３および配列番号４２４、配列番号４２５および配列番号４２６、配列番号４２７および配列番号４１８、配列番号４１９および配列番号４３０、配列番号４３１および配列番号４３２、配列番号４３３および配列番号４３４、配列番号４３５および配列番号４３６、またはそれらと少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、集団の細胞は、修飾された細胞の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または操作されたＴＣＲを検出可能なレベルで発現するように修飾されている。一実施形態では、細胞集団における遺伝子の標的核酸配列を修飾する方法は、細胞集団においてエクスビボで行われる。別の実施形態では、本方法は、対象においてインビボで行われ、対象は、齧歯動物、マウス、ラット、非ヒト霊長類、およびヒトからなる群から選択される。
したがって、本明細書に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系および方法を従来の分子生物学的方法と組み合わせて使用して、細胞集団を修飾して（その例は以下により完全に記載される）、例えば、望ましくない免疫原性（宿主対移植片応答または移植片対宿主応答など）を低下させるまたは排除し、かつ主要組織適合性複合体の構成要素、例えば、ＨＬＡタンパク質、例えば、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、もしくはＢ２Ｍ（Ｂ２Ｍ遺伝子がコードする）、または主要組織適合性複合体の１つ以上の構成要素の発現を調節するタンパク質の遺伝子を改変することによって生存率、増殖、および／または有効性を増強するか、ＴＲＡＣなどのＴ細胞受容体の一部であるタンパク質を排除するか、ＣＩＩＴＡなどの主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩおよびＩＩ遺伝子のγ－インターフェロン活性化転写を調節する転写コアクチベーターの発現を抑制するか、または修飾された細胞がＴＧＦβなどの因子の免疫抑制効果から逃れることを可能にする同種異系ＣＡＲまたはＴＣＲで操作されたＴ細胞機能を有する細胞を産生することができる。ＨＬＡタンパク質におけるミスマッチを減らし、野生型Ｔ細胞受容体または修飾された細胞の他の構成要素をレシピエント対象のものと比較して減少させるまたは排除することにより、宿主対移植片病（ＧＶＨＤ）の可能性を、ミスマッチ（例えば、同種異系）移植片組織の宿主Ｔ細胞受容体認識またはそれに対する応答を排除することによって減少させるまたは排除する（例えば、Ｔａｋａｈｉｒｏ Ｋａｍｉｙａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｇｅｎｅｒａｔｅ Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ ｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ Ａｄｖａｎｃｅｓ ２：５１７（２０１８）を参照されたい）。したがって、このアプローチを使用して、がん、自己免疫疾患、および移植片拒絶反応などの疾患を有する対象における免疫腫瘍学的応用のための改善された治療指数を有する免疫細胞を生成することができた。
ＶＩ．ポリヌクレオチドおよびベクター
別の態様では、本開示は、ＣａｓＸタンパク質をコードするＣａｓＸ：ｇＮＡ系のポリヌクレオチド、および本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかのｇＮＡ（例えば、ｇＤＮＡおよびｇＲＮＡ）のポリヌクレオチドに関する。さらなる態様では、本開示は、修飾された細胞における標的タンパク質の修飾に使用するためのドナー鋳型ポリヌクレオチドを提供する。なおさらなる態様では、本開示は、本明細書に記載のＣａｓＸタンパク質およびｇＮＡをコードするポリヌクレオチド、ならびに実施形態のＣＡＲをコードするドナー鋳型およびポリヌクレオチドを含むベクターに関する。さらに別の態様では、本開示は、実施形態の操作されたＴＣＲの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターに関する。
いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号１～３の参照ＣａｓＸをコードするポリヌクレオチド配列を提供する。他の実施形態では、本開示は、本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかのＣａｓＸバリアントをコードするポリヌクレオチド配列を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、表４に記載のＣａｓＸバリアントポリペプチド配列、またはそれと少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列をコードする単離されたポリヌクレオチド配列を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかのｇＮＡ配列をコードする単離されたポリヌクレオチド配列を提供する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、表１または表２に記載のｇＮＡ足場配列、またはそれと少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列をコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２１０１～２２８０からなる群から選択されるｇＮＡ足場配列、またはそれと少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列をコードする。他の実施形態では、本開示は、表３Ａ、表３Ｂ、または表３Ｃの標的配列ポリヌクレオチド、またはそれと少なくとも約６５％、少なくとも約７５％、少なくとも約８５％、または少なくとも約９５％の同一性を有する配列、ならびに標的配列をコードするＤＮＡを提供する。いくつかの実施形態では、足場配列をコードするポリヌクレオチドは、ＣａｓＸおよび標的配列に結合することができるｇＮＡがｓｇＮＡまたはｄｇＮＡとして発現され得るように、標的配列をコードする配列をさらに含む。他の実施形態では、本開示は、抗原プロセシング、抗原提示、抗原認識、および／または抗原応答に関与するタンパク質をコードする標的遺伝子とハイブリダイズするｇＮＡ配列をコードする単離されたポリヌクレオチド配列を提供する。いくつかの事例では、ポリヌクレオチド配列は、標的遺伝子エクソンとハイブリダイズするｇＮＡ配列をコードする。他の事例では、ポリヌクレオチド配列は、標的遺伝子イントロンとハイブリダイズするｇＮＡ配列をコードする。他の事例では、ポリヌクレオチド配列は、標的遺伝子イントロン－エクソン接合部とハイブリダイズするｇＮＡ配列をコードする。他の事例では、ポリヌクレオチド配列は、標的遺伝子の遺伝子間領域とハイブリダイズするｇＮＡ配列をコードする。他の事例では、ポリヌクレオチド配列は、標的遺伝子の調節要素とハイブリダイズするｇＮＡ配列をコードする。いくつかの事例では、細胞表面マーカー調節要素は、遺伝子の５’側にある。他の事例では、調節要素は、細胞表面マーカー遺伝子の３’側にある。他の事例では、調節要素は、標的遺伝子の５’ＵＴＲを含む。さらに他の事例では、調節要素は、標的遺伝子の３’ＵＴＲを含む。
他の実施形態では、本開示は、ドナー鋳型核酸であって、ドナー鋳型が、遺伝子編集が意図される標的核酸の標的配列と完全同一性ではないが相同性を有するヌクレオチド配列を含む、ドナー鋳型核酸を提供する。ノックダウン／ノックアウトの場合、ドナー鋳型配列は、典型的には、、それが置換するゲノム配列と同一ではなく、ゲノム配列に対して１つ以上の単一塩基変化、挿入、欠失、逆位、または転位を含み得るが、但し、相同性指向修復を支援するのに十分な標的配列との相同性を有するか、またはドナー鋳型が相同アームを有することを条件とし、挿入時に、標的タンパク質が発現されないか、またはより低いレベルで発現されるようにフレームシフトまたは他の変異が生じ得る。ある特定の実施形態では、ノックダウン／ノックアウト修飾の場合、ドナー鋳型配列は、組換えが所望される標的ゲノム配列と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または９９．９％の配列同一性を有するであろう。いくつかの実施形態では、標的配列は、タンパク質標的遺伝子とハイブリダイズし、かつＣａｓＸによって導入された切断部位に挿入され、遺伝子配列の修飾をもたらす配列を有する。いくつかの事例では、標的配列は、標的遺伝子エクソンとハイブリダイズする配列を有する。他の事例では、標的配列は、標的遺伝子イントロンとハイブリダイズする配列を有する。他の事例では、標的配列は、標的遺伝子のイントロン－エクソン接合部とハイブリダイズする配列を有する。他の事例では、標的配列は、標的遺伝子の遺伝子間領域とハイブリダイズする配列を有する。さらに他の事例では、標的配列は、標的遺伝子の調節要素とハイブリダイズする配列を有する。前述の実施形態では、ドナー鋳型は、１０～１５，０００ヌクレオチド、５０～１０，０００ヌクレオチド、または１００～１０００ヌクレオチドのサイズの範囲であり得る。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、一本鎖ＤＮＡ鋳型である。他の実施形態では、ドナー鋳型は、一本鎖ＲＮＡ鋳型である。他の実施形態では、ドナー鋳型は、二本鎖ＤＮＡ鋳型である。
他の実施形態では、本開示は、ＣＡＲまたは操作されたＴＣＲの発現のために集団の標的細胞に導入される、疾患抗原、任意選択的に、腫瘍細胞抗原に特異的な結合ドメインを有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、操作されたＴＣＲ、または操作されたＴＣＲの１つ以上のサブユニットをコードするポリヌクレオチドを提供する。前述では、腫瘍細胞抗原は、分化群１９（ＣＤ１９）、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ７、ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＬＬ１、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４７、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ９９、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、カルボニクスアンヒドラーゼＩＸ（ＣＡＩＸ）、ＣＣケモカイン受容体４（ＣＣＲ４）、ＡＤＡＭメタロペプチダーゼドメイン１２（ＡＤＡＭ１２）、接着Ｇタンパク質共役型受容体Ｅ２（ＡＤＧＲＥ２）、胎盤様型２アルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰＰＬ２）、アルファ４インテグリン、アンジオポエチン－２（ＡＮＧ２）、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、ＣＤ４４Ｖ６、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＥＡＣ、ＣＥＡＣＡＭ５、クローディン６（ＣＬＤＮ６）、ＣＬＤＮ１８、Ｃ型レクチンドメインファミリー１２メンバーＡ（ＣＬＥＣ１２Ａ）、間葉上皮移行因子（ｃＭＥＴ）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）、上皮成長因子受容体１（ＥＧＦ１Ｒ）、ＥＧＦＲ－ＶＩＩＩ、上皮糖タンパク質２（ＥＧＰ－２）、ＥＧＰ－４０、ＥｐｈＡ２、ＥＮＰＰ３、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、ｅｒｂ－Ｂ２、ｅｒｂ－３、ｅｒｂ－４、葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）、胎児アセチルコリン受容体、葉酸受容体－α、葉酸受容体１（ＦＯＬＲ１）、Ｇタンパク質共役型受容体１４３（ＧＰＲ１４３）、代謝型グルタミン酸受容体８（ＧＲＭ８）、グリピカン－３（ＧＰＣ３）、ガングリオシドＧＤ２、ガングリオシドＧＤ３、ヒト上皮成長因子受容体１（ＨＥＲ１）、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）、ＨＥＲ３、インテグリンＢ７、細胞間細胞接着分子－１（ＩＣＡＭ－１）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、インターロイキン－１３受容体α２（ＩＬ－ｌ３Ｒ－ａ２）、Ｋ－軽鎖、キナーゼ挿入ドメイン受容体（ＫＤＲ）、ルイス－Ｙ（ＬｅＹ）、コンドロモジュリン－１（ＬＥＣＴ１）、Ｌ１細胞粘着分子、リゾホスファチジン酸受容体３（ＬＰＡＲ３）、メラノーマ関連抗原１（ＭＡＧＥ－Ａ１）、メソテリン、ムチン１（ＭＵＣ１）、ＭＵＣ１６、メラノーマ関連抗原３（ＭＡＧＥＡ３）、腫瘍タンパク質ｐ５３（ｐ５３）、Ｔ細胞によって認識されるメラノーマ抗原１（ＭＡＲＴ１）、糖タンパク質１００（ＧＰ１００）、プロテイナーゼ３（ＰＲ１）、エフリン－Ａ受容体２（ＥｐｈＡ２）、ナチュラルキラーグループ２Ｄリガンド（ＮＫＧ２Ｄリガンド）、ニューヨーク食道扁平上皮がん１（ＮＹ－ＥＳＯ－１）、がん胎児性抗原（ｈ５Ｔ４）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、プログラム死リガンド１（ＰＤＬ－１）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、トロホブラスト糖タンパク質（ＴＰＢＧ）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ－７２）、腫瘍関連カルシウムシグナルトランスデューサー２（ＴＲＯＰ－２）、チロシナーゼ、スルビビン、血管内皮成長因子受容体２（ＶＥＧＦ－Ｒ２）、ウィルムス腫瘍－１（ＷＴ－１）、白血球免疫グロブリン様受容体Ｂ２（ＬＩＬＲＢ２）、メラノーマ優先発現抗原（ＰＲＡＭＥ）、Ｔ細胞受容体ベータ定常１（ＴＲＢＣ１）、ＴＲＢＣ２、および（Ｔ細胞免疫グロブリンムチン－３）ＴＩＭ－３からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲまたは操作されたＴＣＲは、直鎖状抗体、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、および一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）からなる群から選択される抗原結合ドメインを含む。特定の実施形態では、抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖである。実施形態のｓｃＦｖにおける使用に好適な例示的なＣＤＲならびにＶＬおよびＶＨ配列は、表５の配列を含む本明細書に記載される。一実施形態では、ｓｃＦｖのＶＨ、ＶＬ、および／またはＣＤＲは、表５の配列と比較して１つ以上のアミノ酸修飾を有し、ｓｃＦｖは、腫瘍抗原に対する結合親和性を保持し、修飾は、置換、欠失、および挿入からなる群から選択される。
ＣＡＲを含む実施形態では、ＣＡＲは、１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含むことができ、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２４７分子（ＣＤ３－ゼータ）、ＣＤ２７分子（ＣＤ２７）、ＣＤ２８分子（ＣＤ２８）、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー９（４－１ＢＢ）、誘導性Ｔ細胞共刺激因子（ＩＣＯＳ）、またはＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー４（ＯＸ４０）から単離されたまたはそれに由来する少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインを含む。別の実施形態では、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインは、ａ）ＣＤ３－ゼータ細胞内シグナル伝達ドメイン、ｂ）ＣＤ３－ゼータ細胞内シグナル伝達ドメインおよび４－１ＢＢまたはＣＤ２８細胞内シグナル伝達ドメイン、ｃ）ＣＤ－ゼータ細胞内シグナル伝達ドメイン、４－１ＢＢ細胞内シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ２８細胞内シグナル伝達ドメイン、またはｄ）ＣＤ－ゼータ細胞内シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２８細胞内シグナル伝達ドメイン、４－１ＢＢ細胞内シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ２７またはＯＸ４０細胞内シグナル伝達ドメインを含む。別の実施形態では、ＣＡＲは、細胞外ヒンジドメインをさらに含み、ヒンジドメインが免疫グロブリン様ドメインであるか、またはヒンジドメインが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、もしくはＩｇＧ４からから単離されるか、またはそれに由来するか、またはヒンジドメインが、ＣＤ８ａ分子（ＣＤ８）もしくはＣＤ２８から単離されるか、またはそれに由来する。別の実施形態では、ＣＡＲは、膜貫通ドメインをさらに含み、膜貫通ドメインが、ＣＤ３－ゼータ、ＣＤ４、ＣＤ８、およびＣＤ２８からなる群からから単離されるか、またはそれに由来する。
操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む実施形態では、ＴＣＲは、ＴＣＲアルファ、ＴＣＲベータ、ＣＤ３－デルタ、ＣＤ３－イプシロン、ＣＤ－ガンマ、またはＣＤ３－ゼータからなる群から選択される１つ以上のサブユニットをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、ＴＣＲは、細胞内シグナル伝達ドメイン由来の刺激ドメインを含む細胞内ドメインをさらに含み、ＴＣＲの抗原結合ドメインが１つ以上のサブユニットに作動可能に連結されている。
いくつかの実施形態では、本開示は、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、およびＩＬ－１８からなる群から選択される免疫刺激性サイトカインをコードする誘導性発現カセットをコードするポリヌクレオチドであって、ポリヌクレオチドが、ＣＡＲを発現する集団の修飾された標的細胞に導入される予定であり、対象に投与されたときに、サイトカインの発現により、修飾された細胞が免疫抑制性腫瘍環境に対して抵抗性になる、ポリヌクレオチドをさらに提供する。前述の構成要素を有するＣＡＲをコードするポリヌクレオチドは、以下に記載のいくつかの従来の方法によって細胞に導入することができる。
いくつかの実施形態では、本開示は、参照ＣａｓＸ、ＣａｓＸバリアント、またはそれらのバリアントを含む本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかのｇＮＡをコードするポリヌクレオチド配列、または標的配列に相補的な配列を生成する方法、ならびにポリヌクレオチド配列によって発現またはＲＮＡ転写されるタンパク質を発現させる方法に関する。一般に、本方法は、本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかの参照ＣａｓＸ、ＣａｓＸバリアント、またはｇＮＡをコードするポリヌクレオチド配列を生成することと、コード遺伝子を宿主細胞に適切な発現ベクターに組み込むこととを含む。本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかのコードされた参照ＣａｓＸ、ＣａｓＸバリアント、またはｇＮＡを産生するために、本方法は、適切な宿主細胞を、コードポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換することと、本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかの結果として生じた参照ＣａｓＸ、ＣａｓＸバリアント、またはｇＮＡが形質転換された宿主細胞で発現または転写されることを引き起こすまたは許容する条件下で宿主細胞を培養し、それにより、本明細書に記載の方法または当該技術分野で既知の標準精製法によって回収される参照ＣａｓＸ、ＣａｓＸバリアント、またはｇＮＡを産生することとを含む。本開示のポリヌクレオチドおよび発現ベクターを作製するために、分子生物学における標準組換え技法が使用される。
本開示によれば、適切な宿主細胞での発現を指示する組換えＤＮＡ分子を生成するために、本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかの参照ＣａｓＸ、ＣａｓＸバリアント、ｇＮＡ、ＣＡＲ、または免疫刺激性サイトカインの発現カセットをコードするポリヌクレオチド配列が使用される。いくつかのクローニング戦略が本開示を行う際に好適であり、それらの多くは、本開示の組成物をコードする遺伝子またはその相補体を含む構築物を生成するために使用される。いくつかの実施形態では、クローニング戦略は、組成物の発現のために宿主細胞を形質転換するために使用される参照ＣａｓＸ、ＣａｓＸバリアント、またはｇＮＡをコードするヌクレオチドを含む構築物をコードする遺伝子を作製するために使用される。
１つのアプローチでは、参照ＣａｓＸ、ＣａｓＸバリアント、またはｇＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む構築物が最初に調製される。かかる構築物を調製するための例示的な方法は、実施例に記載されている。その後、構築物を使用して、ポリペプチド構築物の発現および回収のための原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞などの宿主細胞の形質転換に好適な発現ベクターを作製する。所望される場合、宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉである。他の実施形態では、宿主細胞は、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ハイブリドーマ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、ＣＨＯ、または酵母細胞から選択される。発現ベクターの作製、宿主細胞の形質転換、ならびに参照ＣａｓＸ、ＣａｓＸバリアント、またはｇＮＡの発現および回収のための例示的な方法は、実施例に記載されている。
参照ＣａｓＸ、ＣａｓＸバリアント、ｇＮＡ構築物、ＣＡＲ、ＴＣＲサブユニットを含む１つ以上の融合ポリペプチド、または免疫刺激性サイトカインをコードする１つまたは複数の遺伝子は、完全に合成的に、または実施例により完全に記載されている方法を含む、制限酵素媒介クローニング、ＰＣＲ、およびオーバーラップ伸長などの酵素プロセスと組み合わせて合成的にのいずれかにより、１つ以上のステップで作製され得る。本明細書に開示される方法を使用して、例えば、所望の配列の様々な構成要素（例えば、ＣａｓＸおよびｇＮＡ）遺伝子をコードするポリヌクレオチドの配列を連結することができる。ポリペプチド組成物をコードする遺伝子は、標準遺伝子合成技法を使用してオリゴヌクレオチドから組み立てられる。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質、ＣＡＲ、操作されたＴＣＲ、または操作されたＴＣＲの１つ以上のサブユニットをコードするヌクレオチド配列は、コドン最適化されている。このタイプの最適化は、コードヌクレオチド配列の変異を伴い、同じＣａｓＸタンパク質、ＣＡＲ、またはＴＣＲをコードしながら、対象とする宿主生物または細胞のコドン選択を模倣することができる。したがって、コドンは変化し得るが、コードされたタンパク質は変化しないままである。例えば、ＣａｓＸタンパク質の対象とする標的細胞がヒト細胞である場合、ヒトコドン最適化ＣａｓＸをコードするヌクレオチド配列を使用することができる。別の非限定的な例として、対象とする宿主細胞がマウス細胞である場合、マウスコドン最適化ＣａｓＸをコードするヌクレオチド配列を生成することができる。別の非限定的な例として、対象とする宿主細胞が植物細胞である場合、植物コドン最適化ＣａｓＸタンパク質バリアントをコードするヌクレオチド配列を生成することができる。別の非限定的な例として、対象とする宿主細胞が昆虫細胞である場合、昆虫コドン最適化ＣａｓＸタンパク質をコードするヌクレオチド配列を生成することができる。参照ＣａｓＸ、ＣａｓＸバリアント、またはｇＮＡの産生に利用される宿主細胞に適切なコドン使用頻度およびアミノ酸組成を最適化するアルゴリズムを使用して遺伝子設計を行うことができる。本開示の一方法では、構築物の構成要素をコードするポリヌクレオチドのライブラリが作製され、その後、上述のように組み立てられる。その後、結果として生じた遺伝子が組み立てられ、結果として生じた遺伝子を使用して、宿主細胞を形質転換し、本明細書に記載されるように、参照ＣａｓＸ、ＣａｓＸバリアント、またはｇＮＡ組成物を生成および回収して、その特性を評価する。
いくつかの実施形態では、ｇＮＡをコードするヌクレオチド配列は、制御要素、例えば、プロモーターなどの転写制御要素に作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、制御要素、例えば、プロモーターなどの転写制御要素に作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列は、制御要素、例えば、プロモーターなどの転写制御要素に作動可能に連結される。
転写制御要素は、プロモーターであり得る。いくつかの事例では、プロモーターは、構成的に活性なプロモーターである。いくつかの事例では、プロモーターは、調節可能なプロモーターである。いくつかの事例では、プロモーターは、誘導性プロモーターである。いくつかの事例では、プロモーターは、組織特異的プロモーターである。いくつかの事例では、プロモーターは、細胞型特異的プロモーターである。いくつかの事例では、転写制御要素（例えば、プロモーター）は、標的された細胞型または標的された細胞集団において機能的である。例えば、いくつかの事例では、転写制御要素は、真核細胞、例えば、ニューロン、脊髄運動ニューロン、オリゴデンドロサイト、またはグリア細胞において機能的であり得る。
真核生物プロモーター（真核細胞において機能的なプロモーター）の非限定的な例には、ＥＦ１アルファプロモーター、ＥＦ１アルファコアプロモーター、前初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来の長い末端反復（ＬＴＲ）、ならびにマウスメタロチオネイン－Ｉ由来のプロモーターが含まれる。真核生物プロモーターのさらなる非限定的な例には、ＣＭＶプロモーター全長プロモーター、最小ＣＭＶプロモーター、ニワトリβ－アクチンプロモーター、ｈＰＧＫプロモーター、ＨＳＶ ＴＫプロモーター、ミニＴＫプロモーター、ニューロン特異的発現をもたらすヒトシナプシンＩプロモーター、ニューロンでの選択的発現のためのＭｅｃｐ２プロモーター、最小ＩＬ－２プロモーター、ラウス肉腫ウイルスエンハンサー／プロモーター（単一）、脾臓フォーカス形成ウイルスの長い末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＳＶ４０エンハンサーおよび初期プロモーター、ＴＢＧプロモーター：ヒトチロキシン結合グロブリン遺伝子（肝臓特異的）由来のプロモーター、ＰＧＫプロモーター、ヒトユビキチンＣプロモーター、ＵＣＯＥプロモーター（ＨＮＲＰＡ２Ｂ１－ＣＢＸ３のプロモーター）、ヒストンＨ２プロモーター、ヒストンＨ３プロモーター、Ｕ１ａ１核内低分子ＲＮＡプロモーター（２２６ｎｔ）、Ｕ１ｂ２核内低分子ＲＮＡプロモーター（２４６ｎｔ）２６、ＴＴＲ最小エンハンサー／プロモーター、ｂ－キネシンプロモーター、ヒトｅＩＦ４Ａ１プロモーター、ＲＯＳＡ２６プロモーター、およびグリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーターが挙げられる。
適切なベクターおよびプロモーターの選択は、例えば、抗原プロセシング、抗原提示、抗原認識、および／または抗原応答に関与するタンパク質またはその調節要素を修飾するための発現の制御に関連するため、十分に当業者の能力レベルの範囲内である。発現ベクターは、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写ターミネーターも含み得る。発現ベクターは、発現を増幅するのに適切な配列も含み得る。発現ベクターは、ＣａｓＸタンパク質に融合し、それ故に、キメラＣａｓＸタンパク質をもたらすことができる、精製または検出に使用され得るタンパク質タグ（例えば、６ｘＨｉｓタグ、血球凝集素タグ、蛍光タンパク質など）をコードするヌクレオチド配列も含み得る。
いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントもしくはＣａｓＸタンパク質、ＣＡＲ、または免疫刺激性サイトカインの発現カセットの各々をコードするヌクレオチド配列は、誘導性プロモーター、構成的に活性なプロモーター、空間的に制限されたプロモーター（すなわち、転写制御要素、エンハンサー、組織特異的プロモーター、細胞型特異的プロモーターなど）、または時間的に制限されたプロモーターに作動可能に連結される。他の実施形態では、ｇＮＡ、ＣａｓＸ、ＣＡＲ、または免疫刺激性サイトカインの発現カセットをコードする個々のヌクレオチド配列は、前述のプロモーターのカテゴリーのうちの１つに連結され、その後、以下に記載の従来の方法によって修飾される細胞に導入される。
ある特定の実施形態では、好適なプロモーターは、ウイルスから得ることができ、したがって、ウイルスプロモーターと称され得るか、またはそれらは、原核生物もしくは真核生物を含む、任意の生物から得ることができる。好適なプロモーターを使用して、任意のＲＮＡポリメラーゼ（例えば、ｐｏｌ Ｉ、ｐｏｌ ＩＩ、ｐｏｌ ＩＩＩ）による発現を駆動することができる。例示的なプロモーターには、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳がんウイルスの長い末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ ＭＬＰ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、例えば、ＣＭＶ前初期プロモーター領域（ＣＭＶＩＥ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ヒトＵ６核内低分子プロモーター（Ｕ６）、増強されたＵ６プロモーター、ヒトＨＩプロモーター（ＨＩ）、ＰＯＬ１プロモーター、７ＳＫプロモーター、ｔＲＮＡプロモーターなどが含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸおよびｇＮＡをコードし、かつ任意選択的に、ドナー鋳型またはＣＡＲをコードするポリ核酸を含む１つ以上のヌクレオチド配列は各々、真核細胞で作動可能なプロモーターに（その制御下で）作動可能に連結される。誘導性プロモーターの例には、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、イソプロピル－ベータ－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）調節プロモーター、ラクトース誘導プロモーター、熱ショックプロモーター、テトラサイクリン調節プロモーター、ステロイド調節プロモーター、金属調節プロモーター、エストロゲン受容体調節プロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されない。したがって、誘導性プロモーターは、いくつかの実施形態では、ドキシサイクリン、エストロゲンおよび／またはエストロゲン類似体、ＩＰＴＧなどを含むが、これらに限定されない分子によって調節することができる。
ある特定の実施形態では、使用に好適な誘導性プロモーターには、本明細書に記載されるか、または当業者に既知の任意の誘導性プロモーターが含まれ得る。誘導性プロモーターの例には、化学的／生化学的調節型および物理的調節型プロモーター、例えば、アルコール調節型プロモーター、テトラサイクリン調節型プロモーター（例えば、アンヒドロテトラサイクリン（ａＴｃ）応答性プロモーター、および他のテトラサイクリン応答性プロモーター系、例えば、テトラサイクリンリプレッサータンパク質（ｔｅｔＲ）、テトラサイクリンオペレーター配列（ｔｅｔＯ）、およびテトラサイクリントランス活性化因子融合タンパク質（ｔＴＡ）、ステロイド調節型プロモーター（例えば、ラットグルココルチコイド受容体、ヒトエストロゲン受容体、ガエクジソン受容体に基づくプロモーター、およびステロイド／レチノイド／甲状腺受容体スーパーファミリー由来のプロモーター）、金属調節型プロモーター（例えば、酵母、マウス、およびヒト由来のメタロチオネイン（金属イオンに結合し、封鎖するタンパク質）に由来するプロモーター）、病因調節型プロモーター（例えば、サリチル酸、エチレン、またはベンゾチアジアゾール（ＢＴＨ）によって誘導される）、温度／熱誘導性プロモーター（例えば、ヒートショックプロモーター）、および光調節型プロモーター（例えば、植物細胞由来の光応答性プロモーター）が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの事例では、プロモーターは、空間的に制限されたプロモーター（すなわち、細胞型特異的プロモーター、組織特異的プロモーターなど）であり、これにより、多細胞生物において、プロモーターが特定細胞のサブセットで活性（すなわち、「オン」）になる。空間的に制限されたプロモーターは、エンハンサー、転写制御要素、制御配列などとも称され得る。任意の簡便な空間的に制限されたプロモーターが標的とされる宿主細胞（例えば、真核細胞、原核細胞）において機能的である限り、そのプロモーターを使用することができる。
いくつかの事例では、プロモーターは、可逆的プロモーターである。可逆的誘導性プロモーターを含む好適な可逆的プロモーターは、当該技術分野で既知である。かかる可逆的プロモーターは、多くの生物、例えば、真核生物および原核生物から単離され得るか、またはそれらに由来し得る。第２の生物に使用するための第１の生物、例えば、第１の原核生物および第２の真核生物、第１の真核生物および第２の原核生物などに由来する可逆的プロモーターの修飾は、当該技術分野で周知である。かかる可逆的プロモーター、およびかかる可逆的プロモーターに基づくが、追加の制御タンパク質も含む系には、アルコール調節型プロモーター（例えば、アルコールデヒドロゲナーゼＩ（ａｌｃＡ）遺伝子プロモーター、アルコールトランス活性化因子タンパク質（ＡｌｃＲ）に応答性のプロモーターなど）、テトラサイクリン調節型プロモーター（例えば、Ｔｅｔ活性化因子、Ｔｅｔオン、Ｔｅｔオフなどを含むプロモーター系）、ステロイド調節型プロモーター（例えば、ラットグルココルチコイド受容体プロモーター系、ヒトエストロゲン受容体プロモーター系、レチノイドプロモーター系、甲状腺プロモーター系、エクジソンプロモーター系、ミフェプリストンプロモーター系など）、金属調節型プロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター系など）、病原体関連調節型プロモーター（例えば、サリチル酸調節型プロモーター、エチレン調節型プロモーター、ベンゾチアジアゾール調節型プロモーターなど）、温度調節型プロモーター（例えば、ヒートショック誘導性プロモーター（例えば、ＨＳＰ－７０、ＨＳＰ－９０、大豆ヒートショックプロモーターなど）、光調節型プロモーター、合成誘導性プロモーターなどが含まれるが、これらに限定されない。
本開示の組換え発現ベクターは、本開示のＣａｓＸタンパク質、ｇＮＡ、およびＣＡＲの強力な発現を促進する要素も含み得る。例えば、組換え発現ベクターは、ポリアデニル化シグナル（ポリＡ）、イントロン配列、またはウッドチャック肝炎転写後調節要素（ＷＰＲＥ）などの転写後調節要素のうちの１つ以上を含み得る。例示的なポリＡ配列には、ｈＧＨポリ（Ａ）シグナル（短い）、ＨＳＶ ＴＫポリ（Ａ）シグナル、合成ポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナル、β－グロビンポリ（Ａ）シグナルなどが含まれる。当業者であれば、本明細書に記載の組換え発現ベクターへの包含に好適な要素を選択することができるであろう。
次いで、参照ＣａｓＸ、ＣａｓＸバリアント、ｇＮＡ配列、およびＣＡＲ、操作されたＴＣＲ、または操作されたＴＣＲの１つ以上のサブユニットをコードするポリヌクレオチドを、１つ以上の発現ベクターに個別にクローニングすることができる。いくつかの実施形態では、本開示は、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクター、プラスミド、ミニサークル、ナノプラスミド、ＤＮＡベクター、およびＲＮＡベクターからなる群から選択されるポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。いくつかの実施形態では、ベクターは、ＣａｓＸタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターである。他の実施形態では、本開示は、ＣａｓＸタンパク質をコードするヌクレオチド配列およびｇＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターを提供する。いくつかの事例では、ＣａｓＸタンパク質バリアントをコードするヌクレオチド配列および／またはｇＮＡをコードするヌクレオチド配列は、選択した細胞型において作動可能なプロモーターに作動可能に連結される。他の実施形態では、ＣａｓＸタンパク質バリアントをコードするヌクレオチド配列およびｇＮＡをコードするヌクレオチド配列は、プロモーターに作動可能に連結された別個のベクターに提供される。他の実施形態では、ベクターは、ドナー鋳型、または１つ以上のＣＡＲ、操作されたＴＣＲ、１つ以上の操作されたＴＣＲサブユニットをコードするポリヌクレオチドを含み得るか、または別個のベクターを利用して、ドナー鋳型または１つ以上のＣＡＲまたは操作されたＴＣＲサブユニットを修飾される標的細胞に導入することができる。
いくつかの実施形態では、（ｉ）ドナー鋳型が標的核酸（例えば、標的ゲノム）の標的配列と相同性を有するヌクレオチド配列を含む、ドナー鋳型核酸のヌクレオチド配列、（ｉｉ）真核細胞などの標的細胞において作動可能なプロモーターに作動可能に連結された標的ゲノム（例えば、シングルまたはデュアルガイドＲＮＡとして構成される）の遺伝子座の標的配列にハイブリダイズするｇＮＡをコードするヌクレオチド配列、（ｉｉｉ）真核細胞などの標的細胞において作動可能なプロモーターに作動可能に連結されたＣａｓＸタンパク質をコードするヌクレオチド配列、（ｉｖ）真核細胞などの標的細胞において作動可能なプロモーターに作動可能に連結されたＣＡＲをコードするヌクレオチド配列、（ｖ）真核細胞などの標的細胞において作動可能なプロモーターに作動可能に連結された免疫刺激性サイトカインの発現カセットをコードするヌクレオチド配列のうちの１つ以上を含む１つ以上の組換え発現ベクターが本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型、ｇＮＡ、ＣａｓＸタンパク質、ＣＡＲ、操作されたＴＣＲまたはその１つ以上のサブユニット、および発現カセットをコードする配列は、異なる組換え発現ベクターにあり、他の実施形態では、（ドナー鋳型、ＣａｓＸ、ｇＮＡ、ＣＡＲ、操作されたＴＣＲまたはその１つ以上のサブユニット、および発現カセットの）１つ以上のポリヌクレオチド配列は、同じ組換え発現ベクターにある。他の事例では、ＣａｓＸおよびｇＮＡは、ＲＮＰとして標的細胞に送達され（例えば、電気穿孔または化学的手段によって）、ドナー鋳型、ならびに／またはＣＡＲ、もしくは操作されたＴＣＲもしくはその１つ以上のサブユニット、および発現カセットをコードするポリヌクレオチドはベクターによって送達される。
ポリヌクレオチド配列は、様々な手順によってベクターに挿入される。一般に、ＤＮＡは、当該技術分野で既知の技法を使用して適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクター構成要素には、一般に、シグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター、および転写終結配列のうちの１つ以上が含まれるが、これらに限定されない。これらの構成要素のうちの１つ以上を含む好適なベクターの構築は、当業者に既知の標準ライゲーション技法を用いる。かかる技法は当該技術分野で周知であり、科学文献および特許文献で十分に説明されている。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、またはファージの形態であり得、これらを組換えＤＮＡ手順に好都合に供することができ、ベクターの選択は、多くの場合、それが導入される宿主細胞に依存する。したがって、ベクターは、自己複製ベクター、すなわち、染色体外実体として存在するベクターであり得、その複製は、染色体複製とは無関係であり、例えば、プラスミドである。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入されると、宿主細胞ゲノムに組み込まれ、それが組み込まれた染色体と一緒に複製されるものであり得る。好適な宿主細胞に導入されると、抗原プロセシング、抗原提示、抗原認識、および／または抗原応答に関与するタンパク質の発現は、当該技術分野で既知の任意の核酸またはタンパク質アッセイを使用して決定することができる。例えば、参照ＣａｓＸまたはＣａｓＸバリアントの転写ｍＲＮＡの存在は、ポリヌクレオチドの任意の領域に相補的なプローブを使用して、従来のハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、ノーザンブロット分析）、増幅手順（例えば、ＲＴ－ＰＣＲ）、ＳＡＧＥ（米国特許第５，６９５，９３７号）、およびアレイベースの技術（例えば、米国特許第５，４０５，７８３号、同第５，４１２，０８７号、および同第５，４４５，９３４号を参照されたい）によって検出および／または定量することができる。
本開示は、宿主細胞と適合性があり、宿主細胞によって認識され、かつポリペプチドの制御された発現またはＲＮＡの転写のためにポリペプチドをコードする遺伝子に作動可能に連結された複製配列および制御配列を含むプラスミド発現ベクターの使用を提供する。かかるベクター配列は、様々な細菌、酵母、ウイルスでよく知られている。使用することができる有用な発現ベクターには、例えば、染色体、非染色体、および合成ＤＮＡ配列のセグメントが含まれる。「発現ベクター」とは、好適な宿主にポリペプチドをコードするＤＮＡの発現をもたらすことができる好適な制御配列に作動可能に連結されたＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物を指す。ベクターが選択した宿主細胞で複製可能であり、かつ実行可能であることが要件である。必要に応じて、低コピー数または高コピー数のベクターを使用することができる。ベクターの制御配列には、転写をもたらすためのプロモーター、かかる転写を制御するための任意のオペレーター配列、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳の終結を制御する配列が含まれる。プロモーターは、選択した宿主細胞で転写活性を示し、かつ宿主細胞に対して相同または異種のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子に由来し得る任意のＤＮＡ配列であり得る。
ポリヌクレオチドおよび組換え発現ベクターは、様々な方法によって標的宿主細胞に送達することができる。かかる方法には、ウイルス感染、トランスフェクション、リポフェクション、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介トランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、マイクロインジェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、パーティクルガンテクノロジー、ヌクレオフェクション、ドナーＤＮＡに融合されるか、またはそれを動員する細胞浸透ＣａｓＸタンパク質による直接付加、細胞圧搾、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクション、ナノ粒子媒介核酸送達、ならびに市販のＱｉａｇｅｎ製のＴｒａｎｓＭｅｓｓｅｎｇｅｒ（登録商標）試薬、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ製のＳｔｅｍｆｅｃｔ（商標）ＲＮＡトランスフェクションキット、およびＭｉｒｕｓ Ｂｉｏ ＬＬＣ製のＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）－ｍＲＮＡトランスフェクションキット、Ｌｏｎｚａヌクレオフェクション、Ｍａｘａｇｅｎ電気穿孔などの使用が含まれるが、これらに限定されない。
組換え発現ベクター配列は、エクスビボ、インビトロ、またはインビボで、細胞のその後の感染および形質転換のために、ウイルスまたはウイルス様粒子（本明細書では「ＶＬＰ」または「ビリオン」とも称される）にパッケージングすることができる。かかるＶＬＰまたはビリオンは、典型的には、ベクターゲノムをカプシド化またはパッケージングするタンパク質を含む。好適な発現ベクターには、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、アデノウイルス、レトロウイルスベクター（例えば、マウス白血病ウイルス）、脾臓壊死ウイルスに基づくウイルス発現ベクター、ならびにルース肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳腺腫瘍ウイルスなどのレトロウイルスに由来するベクターなどが含まれ得る。いくつかの実施形態では、本開示の組換え発現ベクターは、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。特定の実施形態では、本開示の組換え発現ベクターは、組換えレトロウイルスベクターである。別の特定の実施形態では、本開示の組換え発現ベクターは、組換えレンチウイルスベクターである。
ＡＡＶは、対象に投与するために調製される細胞のインビボまたはエクスビボのいずれかで、真核細胞などの細胞への送達のためにウイルスベクターを用いる状況下でヒト疾患を治療するのに役立つ小さい（２０ｎｍ）非病原性ウイルスである。構築物、例えば、本明細書に記載のＣａｓＸタンパク質および／またはｇＮＡ実施形態のうちのいずれかをコードし、任意選択的に、ドナー鋳型またはＣＡＲをコードするポリヌクレオチドをコードし、かつＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列と隣接することができる構築物が生成され、それにより、ＡＡＶウイルス粒子へのＡＡＶベクターのパッケージングが可能になる。
「ＡＡＶ」ベクターとは、天然に存在する野生型ウイルス自体またはその誘導体を指し得る。この用語は、別途要求されない限り、全てのサブタイプ、血清型および偽型、ならびに天然型および組換え型の両方を包含する。本明細書で使用される場合、「血清型」という用語は、定義された抗血清とのカプシドタンパク質反応性に基づいて他のＡＡＶによって特定され、かつそれらと区別されるＡＡＶを指し、例えば、霊長類ＡＡＶの多くの既知の血清型が存在する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ－Ｒｈ７４（アカゲザル由来のＡＡＶ）、およびＡＡＶＲｈ１０、ならびにこれらの血清型の修飾されたカプシドから選択される。例えば、血清型ＡＡＶ－２は、ＡＡＶ－２のｃａｐ遺伝子からコードされたカプシドタンパク質と、同じＡＡＶ－２血清型由来の５’および３′ＩＴＲ配列を含むゲノムとを含むＡＡＶを指すために使用される。偽型ＡＡＶとは、１つの血清型由来のカプシドタンパク質と、第２の血清型の５′－３′ＩＴＲを含むウイルスゲノムとを含むＡＡＶを指す。偽型ｒＡＡＶは、カプシド血清型の細胞表面結合特性およびＩＴＲ血清型と一致する遺伝的特性を有すると予想されるであろう。偽型組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は、当該技術分野で説明されている標準技法を使用して生成される。本明細書で使用される場合、例えば、ｒＡＡＶ１は、同じ血清型由来のカプシドタンパク質および５′－３′ＩＴＲの両方を有するＡＡＶを指すために使用され得るか、または血清型１由来のカプシドタンパク質と、異なるＡＡＶ血清型、例えば、ＡＡＶ血清型２由来の５′－３′ＩＴＲとを有するＡＡＶを指し得る。本明細書に例示される各例について、ベクター設計および産生についての記述は、カプシドおよび５′－３′ＩＴＲ配列の血清型を説明する。
「ＡＡＶウイルス」または「ＡＡＶウイルス粒子」とは、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質（好ましくは、野生型ＡＡＶのカプシドタンパク質の全てによる）およびカプシド化されたポリヌクレオチドから成るウイルス粒子を指す。粒子が異種ポリヌクレオチド（すなわち、哺乳動物細胞に送達される野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド）をさらに含む場合、それは、典型的には、「ｒＡＡＶ」と称される。例示的な異種ポリヌクレオチドは、ＣａｓＸタンパク質および／またはｓｇＮＡと、任意選択的に、本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかのドナー鋳型とを含むポリヌクレオチドである。
「アデノ随伴ウイルス逆方向末端反復」または「ＡＡＶ ＩＴＲ」とは、ＤＮＡ複製起点およびウイルスに対するパッケージングシグナルとしてシスで一緒に機能するＡＡＶゲノムの各末端で見つけられる当該技術分野で認識されている領域を意味する。ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ ｒｅｐコード領域と一緒に、２つの隣接するＩＴＲ間に挿入されたヌクレオチド配列の効率的な切除およびそれからの救出、ならびに哺乳動物細胞ゲノムへのその組み込みを提供する。
ＡＡＶ ＩＴＲ領域のヌクレオチド配列は既知である。例えば、Ｋｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．（１９９４）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３－８０１；Ｂｅｒｎｓ，Ｋ．Ｉ．“Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ”ｉｎ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ ａｎｄ Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ，ｅｄｓ．）を参照されたい。本明細書で使用される場合、ＡＡＶ ＩＴＲは、示される野生型ヌクレオチド配列を有する必要はないが、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失、または置換によって改変されてもよい。加えて、ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ－Ｒｈ７４、およびＡＡＶＲｈ１０、ならびにこれらの血清型の修飾されたカプシドを含むが、これらに限定されない、いくつかのＡＡＶ血清型うちののいずれかに由来し得る。さらに、ＡＡＶベクターにおける選択されたヌクレオチド配列に隣接する５’および３’ＩＴＲは、それらが意図されたとおりに機能する限り、すなわち、宿主細胞ゲノムまたはベクターからの目的とする配列の切除および救出を可能にし、かつＡＡＶ Ｒｅｐ遺伝子産物が細胞内に存在する場合、レシピエント細胞ゲノムへの異種配列の組み込みを可能にするように機能する限り、必ずしも同一である必要はなく、または同じＡＡＶ血清型もしくは分離株に由来する必要はない。異種配列を宿主細胞に組み込むためのＡＡＶ血清型の使用は、当該技術分野で既知である（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１８／１９５５５５Ａ１およびＵＳ２０１８／０２５８４２４Ａ１を参照されたい）。
「ＡＡＶ ｒｅｐコード領域」とは、複製タンパク質Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、およびＲｅｐ４０をコードするＡＡＶゲノムの領域を意味する。これらのＲｅｐ発現産物は、ＤＮＡ複製起点でのＡＡＶの認識、結合、およびニッキング、ＤＮＡヘリカーゼ活性、ならびにＡＡＶ（または他の異種）プロモーターからの転写の調節を含む多くの機能を有することが示されている。Ｒｅｐ発現産物は、ＡＡＶゲノムを複製するために集合的に必要とされる。
「ＡＡＶ ｃａｐコード領域」とは、カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３、またはそれらの機能的相同体をコードするＡＡＶゲノムの領域を意味する。これらのＣａｐ発現産物は、ウイルスゲノムをパッケージングするのに集合的に必要とされるパッケージング機能を提供する。
いくつかの実施形態では、宿主細胞への、ＣａｓＸ、ｇＮＡ、および任意選択的にサイトカインに対するＣＡＲおよび／または発現カセットをコードするドナー鋳型ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの送達に利用されるＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ－Ｒｈ７４（アカゲザル由来のＡＡＶ）、およびＡＡＶＲｈ１０を含むが、これらに限定されないいくつかのＡＡＶ血清型のうちのいずれかに由来し得、ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ血清型２に由来する。
ｒＡＡＶウイルス粒子を産生するために、ＡＡＶ発現ベクターが既知の技法を使用して、例えば、トランスフェクションによって好適な宿主細胞に導入される。ウイルス粒子を形成するためにパッケージング細胞が典型的に使用され、かかる細胞には、アデノウイルスをパッケージングするＨＥＫ２９３細胞またはＨＥＫ２９３Ｔ細胞（および当該技術分野で既知の他の細胞）が含まれる。いくつかのトランスフェクション技法が当該技術分野で一般に知られており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。特に好適なトランスフェクション法には、リン酸カルシウム共沈殿、培養細胞への直接マイクロインジェクション、電気穿孔、リポソーム媒介遺伝子導入、脂質媒介形質導入、および高速マイクロプロジェクタイルを使用した核酸送達が含まれる。
いくつかの実施形態では、上記のＡＡＶ発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞は、ＡＡＶ ＩＴＲと隣接するヌクレオチド配列を複製およびカプシド化してｒＡＡＶウイルス粒子を産生するために、ＡＡＶヘルパー機能を提供することができるようになる。ＡＡＶヘルパー機能は、一般に、ＡＡＶ由来のコード配列であり、これは、ＡＡＶ遺伝子産物を提供するように発現され、次いで、生産的ＡＡＶ複製のためにトランスで機能することができる。ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶ発現ベクターから欠失している必要なＡＡＶ機能を補完するために本明細書で使用される。したがって、ＡＡＶヘルパー機能には、ｒｅｐおよびｃａｐコード領域、またはそれらの機能的相同体をコードする、主要なＡＡＶ ＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）の一方または両方が含まれる。付属機能は、当業者に既知の方法を使用して、宿主細胞に導入され、その後、発現され得る。一般に、付属機能は、無関係のヘルパーウイルスによる宿主細胞の感染によって提供される。いくつかの実施形態では、付属機能は、付属機能ベクターを使用して提供される。利用される宿主／ベクター系に応じて、構成的および誘導性プロモーター、転写エンハンサー要素、転写ターミネーターなどを含む、いくつかの好適な転写および翻訳制御要素のうちのいずれかが発現ベクターに使用され得る。
他の実施形態では、好適なベクターには、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）が含まれ得る。ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、ウイルスによく似た粒子であるが、ウイルス遺伝物質を含まず、それ故に、非感染性である。いくつかの実施形態では、ＶＬＰは、１つ以上のウイルス構造タンパク質とともにパッケージングされる、目的とする導入遺伝子、例えば、ＣａｓＸタンパク質および／またはｇＮＡ実施形態のうちのいずれかをコードするポリヌクレオチド、および任意選択的に本明細書に記載のドナー鋳型ポリヌクレオチドまたはＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含む。
他の実施形態では、本開示は、ＣａｓＸ：ｇＮＡ ＲＮＰ複合体、および任意選択的にドナー鋳型、またはＣＡＲ、操作されたＴＣＲ、もしくは操作されたＴＣＲのサブユニットを含む融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、インビトロで生成されるＶＬＰを提供する。様々なウイルス由来の構造タンパク質の組み合わせを使用して、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、アデノ随伴ウイルス）、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ＨＩＶ）、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ（例えば、Ｃ型肝炎ウイルス）、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ニパ）、およびバクテリオファージ（例えば、Ｑβ、ＡＰ２０５）を含むウイルスファミリー由来の成分を含む、ＶＬＰを作製することができる。いくつかの実施形態では、本開示は、ＨＩＶなどのレンチウイルスを含むレトロウイルスの成分を使用して設計されたＶＬＰ系を提供し、様々な成分をコードするポリヌクレオチドを含む個々のプラスミドがパッケージング細胞に導入され、次いで、ＶＬＰが生成される。いくつかの実施形態では、本開示は、マトリックスタンパク質（ＭＡ）、ヌクレオカプシドタンパク質（ＮＣ）、カプシドタンパク質（ＣＡ）、ｐ１～ｐ６タンパク質、およびプロテアーゼ切断部位の群から選択されるｇａｇポリタンパク質の１つ以上の構成要素を含むＶＬＰであって、結果として生じたＶＬＰ粒子がＣａｓＸ：ｇＮＡ ＲＮＰをカプシド化し、ＶＬＰ粒子が、標的細胞に向性を提供する表面上に標的糖タンパク質をさらに含み、投与時および標的細胞への進入時に、ＲＮＰ分子が細胞の核に自由に輸送される、ＶＬＰを提供する。他の実施形態では、本開示は、マトリックスタンパク質（ＭＡ）、ヌクレオカプシドタンパク質（ＮＣ）、カプシドタンパク質（ＣＡ）、ｐ１～ｐ６タンパク質、ｐｏｌポリタンパク質の１つ以上の構成要素、プロテアーゼ切断部位の群から選択されるｇａｇポリタンパク質の１つ以上の構成要素を含むＶＬＰであって、結果として生じたＶＬＰ粒子がＣａｓＸ：ｇＮＡ ＲＮＰをカプシド化し、ＶＬＰ粒子が、標的細胞に向性を提供する表面上に標的糖タンパク質をさらに含み、投与時および標的細胞への進入時に、ＲＮＰ分子が細胞の核に自由に輸送される、ＶＬＰを提供する。前述のものは、分裂細胞および非分裂細胞へのウイルス形質導入が効率的であり、かつ別様に外来タンパク質を検出するであろう対象の免疫監視機構を逃れる強力な短命のＲＮＰを送達するという点で、当該技術分野において他のベクターに勝る利点を提供する。いくつかの実施形態では、宿主細胞にＶＬＰを作製するための系は、ｉ）ｇａｇポリタンパク質またはその一部分、ｉｉ）本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかのＣａｓＸタンパク質、ｉｉｉ）プロテアーゼ切断部位、ｉｖ）プロテアーゼ、ｖ）本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかのガイドＲＮＡ、ｖｉ）ｐｏｌポリタンパク質またはその一部分、ｖｉｉ）標的細胞へのＶＬＰの結合および融合を提供する偽型糖タンパク質または抗体断片、およびｖｉｉｉ）ＣＡＲまたは設計されたＴＣＲから選択される１つ以上の構成要素をコードするポリヌクレオチドを含む。エンベロープタンパク質または糖タンパク質は、アルゼンチン出血熱ウイルス、オーストラリアコウモリウイルス、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ多核多角体病ウイルス、トリ白血病ウイルス、ヒヒ内因性ウイルス、ボリビア出血熱ウイルス、ボルナ病ウイルス、ブレダウイルス、ブンヤムウェラウイルス、チャンディプラウイルス、チクングンヤウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、デング熱ウイルス、ドゥベンヘイジウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、エボラ出血熱ウイルス、エボラザイールウイルス、腸管アデノウイルス、エフェメロウイルス、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、ヨーロッパコウモリウイルス１、ヨーロッパコウモリウイルス２、Ｆｕｇ合成糖タンパク質融合、テナガザル白血病ウイルス、ハンタウイルス、ヘンドラウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、Ｇ型肝炎ウイルス（ＧＢウイルスＣ）、１型単純ヘルペスウイルス、２型単純ヘルペスウイルス、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＨＶ５）、ヒト泡沫状ウイルス、ヒトヘルペスウイルス（ＨＨＶ）、ヒトヘルペスウイルス７、６型ヒトヘルペスウイルス、８型ヒトヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ－１）、ヒトメタ肺炎ウイルス、ヒトＴリンパ向性ウイルス１、インフルエンザＡ、インフルエンザＢ、インフルエンザウイルス、日本脳炎ウイルス、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＨＨＶ８）、キャサヌル森林病ウイルス、ラクロスウイルス、ラゴスコウモリウイルス、ラッサ熱ウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、マチュポウイルス、マールブルグ出血熱ウイルス、麻疹ウイルス、中東呼吸器症候群関連コロナウイルス、モコラウイルス、モロニーマウス白血病ウイルス、サル痘、マウス乳腺腫瘍ウイルス、ムンプスウイルス、マウスガンマヘルペスウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ニパウイルス、ニパウイルス、ノーウォークウイルス、オムスク出血熱ウイルス、乳頭腫ウイルス、パルボウイルス、仮性狂犬病ウイルス、クアランフィルウイルス、狂犬病ウイルス、ＲＤ１１４内因性ネコレトロウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、リフトバレー熱ウイルス、ロスリバーウイルス、ロタウイルス、ラウス肉腫ウイルス、風疹ウイルス、サビア関連出血熱ウイルス、ＳＡＲＳ関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、センダイウイルス、タカリベウイルス、トゴトウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、水疱瘡ウイルス（ＨＨＶ３）、水疱瘡ウイルス（ＨＨＶ３）、大痘瘡ウイルス、小痘瘡ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ベネズエラ出血熱ウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ＶＳＶ－Ｇ、ベシクロウイルス、ウエストナイルウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、およびジカウイルスからなる群を含むが、それらに限定されない、ＶＬＰに向性を付与するための当該技術分野で既知の任意のエンベロープウイルスに由来し得る。いくつかの実施形態では、ＶＬＰの生成に使用されるパッケージング細胞は、ＨＥＫ２９３細胞、Ｌｅｎｔｉ－Ｘ ２９３Ｔ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｓａｏｓ－２細胞、ＨｕＨ７細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ａ５４９細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ハイブリドーマ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞、ＷＩ３８細胞、ＭＲＣ５細胞、Ａ５４９細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞、またはＨＴ１０８０細胞からなる群から選択される。
ＶＩＩ．細胞
いくつかの実施形態では、本開示は、抗原プロセシング、抗原提示、抗原認識、および／または抗原応答に関与する細胞の１つ以上のタンパク質をノックダウンまたはノックアウトするように修飾された細胞集団を提供する。他の実施形態では、本開示は、１つ以上のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または疾患抗原に対する結合親和性を有する操作されたＴＣＲのサブユニットを含む融合ポリペプチドをノックインするように修飾された細胞集団を提供する。さらに他の実施形態では、本開示は、１つ以上のＴ細胞由来のシグナル伝達鎖ポリペプチドをノックインするように修飾された細胞集団を提供する。いくつかの実施形態では、細胞集団は、前述の修飾、例えば、抗原プロセシング、抗原提示、抗原認識、および／または抗原応答に関与する細胞の１つ以上のタンパク質のノックダウン／ノックアウト、１つ以上のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または疾患抗原に特異的な操作されたＴＣＲの融合ポリペプチドのノックインのうちの全てを含む。この様式で改変されたかかる修飾細胞は、それを必要とする対象に使用するための免疫療法用途、例えば、ＣＡＲを有する細胞のエクスビボ調製に有用である。
いくつかの実施形態では、本開示は、ＣａｓＸタンパク質および１つ以上のｇＮＡを含むＣａｓＸ：ｇＮＡ系を含む細胞集団であって、ｇＮＡが、抗原プロセシング、抗原提示、抗原認識、および／または抗原応答に関与するタンパク質をコードする遺伝子の標的核酸配列に相補的な標的配列を含み、ＣａｓＸおよびｇＮＡが、タンパク質をコードする遺伝子を修飾するように設計される、細胞集団を提供する。前述の一実施形態では、ＣａｓＸ：ｇＮＡ系は、抗原プロセシング、抗原提示、抗原認識、および／または抗原応答に関与する１つ以上のタンパク質をコードする遺伝子をノックダウン／ノックアウトし、修飾された細胞集団をもたらすように設計される。前述の別の実施形態では、ＣａｓＸ：ｇＮＡ系は、ＭＨＣクラスＩ分子をコードする遺伝子をノックダウン／ノックアウトし、修飾された細胞集団をもたらすように設計される。いくつかの実施形態では、タンパク質は、免疫細胞表面マーカーである。他の実施形態では、タンパク質は、細胞内タンパク質である。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸおよび１つ以上のｇＮＡは、ＲＮＰとして複合体形成されて細胞集団に導入され、これにより、その後、ＲＮＰが標的遺伝子を修飾することができるようになる。他の事例では、ＣａｓＸおよび１つ以上のｇＮＡは、ベクターを使用してポリヌクレオチドをコードするものとして細胞集団に導入される。
他の実施形態では、細胞集団は、細胞を、ＣａｓＸタンパク質、標的配列を含む１つ以上のｇＮＡ、およびドナー鋳型と接触させることによって修飾されており、ドナー鋳型は、抗原プロセシング、抗原提示、抗原認識、および／または抗原応答に関与するタンパク質をコードする細胞遺伝子の標的核酸配列の全てまたは一部分に挿入されるか、またはそれに置き換わる。前述の実施形態では、ドナー鋳型は、標的遺伝子の少なくとも一部分を含み、標的遺伝子部分は、エクソン、イントロン、イントロン－エクソン接合部、または調節要素から選択され、細胞の修飾により、野生型配列の変異および標的遺伝子のノックダウンまたはノックアウトがもたらされる。いくつかの事例では、ドナー鋳型は、一本鎖ＤＮＡ鋳型または一本鎖ＲＮＡ鋳型である。他の事例では、ドナー鋳型は、二本鎖ＤＮＡ鋳型である。いくつかの事例では、細胞は、ＣａｓＸおよびｇＮＡと接触し、ここで、ｇＮＡは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）である。他の事例では、細胞は、ＣａｓＸおよびｇＮＡと接触し、ここで、ｇＮＡは、ガイドＤＮＡ（ｇＤＮＡ）である。他の事例では、細胞は、ＣａｓＸおよびｇＮＡと接触し、ここで、ｇＮＡは、ＤＮＡおよびＲＮＡを含むキメラである。本明細書に記載されるように、組み合わせのうちのいずれかの実施形態では、当該ｇＮＡ分子の各々（ｓｇＲＮＡまたはｄｇＲＮＡとして構成され得る、足場と標的配列との組み合わせ）は、本明細書に記載のＣａｓＸ分子と複合体形成されるＲＮＰとして提供され得る。ＲＮＰは、電気穿孔、インジェクション、ヌクレオフェクション、リポソームによる送達、ナノ粒子による送達、またはＣａｓＸ：ｇＮＡの１つ以上の構成要素にコンジュゲートされたタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）の使用を含む任意の好適な方法により、修飾される細胞に導入することができる。ＣａｓＸ：ｇＮＡ系の構成要素を使用して細胞を修飾する追加の方法には、ウイルス感染、トランスフェクション、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、パーティクルガンテクノロジー、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクションなどが含まれる。方法の選択は、一般に、形質転換される細胞の型および形質転換が行われている状況、例えば、インビトロ、エクスビボ、またはインビボに依存する。これらの方法の一般的考察は、Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９５で見つけることができる。
例示的な実施形態では、抗原プロセシング、抗原提示、抗原認識、および／または抗原応答に関与するタンパク質は、ベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、Ｔ細胞受容体アルファ鎖定常領域（ＴＲＡＣ）、クラスＩＩ主要組織適合性複合体トランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）、ＩＣＰ４７、Ｔ細胞受容体ベータ定常１（ＴＲＢＣ１）、Ｔ細胞受容体ベータ定常２（ＴＲＢＣ２）、ヒト白血球抗原Ａ（ＨＬＡ－Ａ）、ヒト白血球抗原Ｂ（ＨＬＡ－Ｂ）、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、２Ｂ４、ＴＩＧＩＴ、ＣＩＳＨ、ＡＤＯＲＡ２Ａ、ＮＫＧ２Ａ、またはＴＧＦβ受容体２（ＴＧＦβＲＩＩ）から選択される。他の実施形態では、タンパク質は、分化群２４７（ＣＤ２４７）、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ５２、ヒト白血球抗原Ｃ（ＨＬＡ－Ｃ）、デオキシシチジンキナーゼ（ｄＣＫ）、またはＦＫＢＰ１Ａから選択される。さらに他の実施形態では、細胞における修飾されるタンパク質は、ｉ）ベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、Ｔ細胞受容体アルファ鎖定常領域（ＴＲＡＣ）、クラスＩＩ主要組織適合性複合体トランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）、ＩＣＰ４７、Ｔ細胞受容体ベータ定常１（ＴＲＢＣ１）、Ｔ細胞受容体ベータ定常２（ＴＲＢＣ２）、ＴＩＧＩＴ、ＣＩＳＨ、ＡＤＯＲＡ２Ａ、ＮＫＧ２Ａ、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、２Ｂ４、ヒト白血球抗原Ａ（ＨＬＡ－Ａ）、ヒト白血球抗原Ｂ（ＨＬＡ－Ｂ）、またはＴＧＦβ受容体２（ＴＧＦβＲＩＩ）のうちの１つから選択され、別のタンパク質は、ｉｉ）分化群２４７（ＣＤ２４７）、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ５２、ヒト白血球抗原Ｃ（ＨＬＡ－Ｃ）、デオキシシチジンキナーゼ（ｄＣＫ）、またはＦＫＢＰ１Ａのうちの１つから選択される。
いくつかの実施形態では、細胞集団は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の構成要素の減少したまたは排除された発現を有する１つ以上の細胞を含む。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞受容体は、天然Ｔ細胞受容体である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の構成要素の減少したまたは排除された発現は、ＴＲＡＣの減少したまたは排除された発現を含む。他の実施形態では、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の構成要素の減少したまたは排除された発現は、ＴＲＢＣ１の減少したまたは排除された発現を含む。さらに他の実施形態では、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の構成要素の減少したまたは排除された発現は、ＴＲＢＣ２の減少したまたは排除された発現を含む。さらに他の実施形態では、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の構成要素の減少したまたは排除された発現は、ＣＤ３Ｇの減少したまたは排除された発現を含む。なお他の実施形態では、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の構成要素の減少したまたは排除された発現は、ＣＤ３Ｄの減少したまたは排除された発現を含む。他の実施形態では、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の構成要素の減少したまたは排除された発現は、ＣＤ３Ｅの減少したまたは排除された発現を含む。いくつかの事例では、ＴＣＲの当該構成要素の減少したまたは排除された発現は、ＴＣＲの構成要素に特異的な本明細書に記載の１つ以上、例えば、１つまたは２つ、例えば、１つのｇＮＡ分子の細胞への導入の結果である。例えば、ＣａｓＸ：ｇＮＡ系を用いる方法は、ＴＣＲに対するｇＮＡ分子の標的ドメインの標的配列でまたはその近くで、インデル、例えば、フレームシフト変異、例えば本明細書に記載のフレームシフト変異を細胞に導入することができる。他の事例では、ＴＣＲの当該構成要素の減少したまたは排除された発現は、ＣａｓＸ、１つ以上のｇＮＡ、およびノックダウンまたはノックアウトされるＴＣＲと比較して１つ以上の変異を含むドナー鋳型の導入の結果である。いくつかの実施形態では、細胞集団は、ＴＣＲの構成要素、例えば、ＴＲＡＣの減少したまたは排除された発現を呈する少なくとも約５０％、例えば、少なくとも約６０％、例えば、少なくとも約７０％、例えば、少なくとも約８０％、例えば、少なくとも約９０％、またはそれ以上の細胞を含む（本明細書に記載されるように）。複数の実施形態では、ＴＣＲの構成要素の当該減少したまたは排除された発現は、フローサイトメトリーまたは当該技術分野で既知の他の方法によって測定されるものである。他の実施形態では、修飾された細胞の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％は、野生型Ｔ細胞受容体を検出可能なレベルで発現しない。
いくつかの実施形態では（ＴＣＲの構成要素の減少したまたは排除された発現の代わりにまたはそれに加えてのいずれかを含む）、細胞または細胞集団は、ベータ－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）の減少したまたは排除された発現を有する１つ以上の細胞を含む。複数の実施形態では、当該Ｂ２Ｍの当該減少したまたは排除された発現は、Ｂ２Ｍをコードする遺伝子を標的とする本明細書に記載の１つ以上、例えば、１つまたは２つ、例えば、１つのｇＮＡ分子の当該細胞への導入の結果である。前述の実施形態では、ｇＮＡの標的配列は、表３Ａ、表１３、および表１６に記載の配列からなる群から選択される配列、またはそれと少なくとも約６５％、少なくとも約７５％、少なくとも約８５％、もしくは少なくとも約９５％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、修飾された細胞は、当該Ｂ２Ｍに対するｇＮＡ分子の標的ドメインの標的配列でまたはその近くに、インデル、例えば、本明細書に記載のフレームシフト変異を含む。いくつかの実施形態では、細胞集団は、Ｂ２Ｍの減少したまたは排除された発現を呈する少なくとも約５０％、例えば、少なくとも約６０％、例えば、少なくとも約７０％、例えば、少なくとも約８０％、例えば、少なくとも約９０％、またはそれ以上の細胞を含む（本明細書に記載されるように）。複数の実施形態では、Ｂ２Ｍの当該減少したまたは排除された発現は、フローサイトメトリーまたは当該技術分野で既知の他の方法によって測定されるものである。
ある特定の実施形態では（ＴＣＲの構成要素および／またはＢ２Ｍの減少または排除された発現の代わりにまたはそれに加えてのいずれかを含む）、細胞または細胞集団は、ＣＩＩＴＡの減少したまたは排除された発現を有する１つ以上の細胞を含む。前述の実施形態では、ｇＮＡの標的配列は、表３Ｃに記載の配列からなる群から選択される配列、またはそれと少なくとも約６５％、少なくとも約７５％、少なくとも約８５％、もしくは少なくとも約９５％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、当該ＣＩＩＴＡの当該減少したまたは排除された発現は、本明細書に記載の当該ＣＩＩＴＡをコードする遺伝子を標的とする１つ以上、例えば、１つまたは２つ、例えば、１つのｇＮＡ分子の当該細胞への導入の結果である。前述では、ｇＮＡの標的配列は、表３Ｃに記載の配列からなる群から選択される配列、またはそれと少なくとも約６５％、少なくとも約７５％、少なくとも約８５％、もしくは少なくとも約９５％の同一性を有する配列を含む。複数の実施形態では、細胞は、当該ＣＩＩＴＡに対するｇＮＡ分子の標的ドメインの標的配列でまたはその近くに、インデル、例えば、フレームシフト変異、例えば、本明細書に記載のフレームシフト変異を含む。複数の実施形態では、細胞集団は、ＣＩＩＴＡ．の減少したまたは排除された発現を呈する少なくとも約５０％、例えば、少なくとも約６０％、例えば、少なくとも約７０％、例えば、少なくとも約８０％、例えば、少なくとも約９０％、またはそれ以上の細胞を含む（本明細書に記載されるように）。複数の実施形態では、ＣＩＩＴＡの当該減少したまたは排除された発現は、フローサイトメトリーまたは当該技術分野で既知の他の方法によって測定されるものである。
他の実施形態では、本開示は、細胞集団であって、細胞の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％がＢ２Ｍ、ＴＲＡＣ、およびＣＩＩＴＡからなる群から選択されるタンパク質のうちの少なくとも２つを検出可能なレベルで発現しないように細胞が修飾されている、細胞集団を提供する。さらに他の実施形態では、本開示は、細胞集団であって、細胞の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％がタンパク質Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、およびＣＩＩＴＡを検出可能なレベルで発現しないように細胞が修飾されている、細胞集団を提供する。他の実施形態では、本開示は、細胞集団であって、修飾された細胞の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％がＭＨＣクラスＩ分子または野生型Ｔ細胞受容体を検出可能なレベルで発現しないように細胞が修飾されている、細胞集団を提供する。他の実施形態では、本開示は、ＣＡＲを産生するように修飾された細胞集団であって、細胞の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％が、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、およびＩＬ－１８からなる群から選択される１つ以上の免疫刺激性サイトカインをコードする誘導性発現カセットを含む、細胞集団を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、ｉ）ＭＨＣクラスＩ分子および／または野生型Ｔ細胞受容体の減少したまたは排除された発現を有し、かつｉｉ）ＣＡＲまたは操作されたＴＣＲを発現するように修飾された細胞集団を提供する。かかる細胞は、ＣＡＲまたは操作されたＴＣＲのリガンドである細胞の腫瘍抗原に特異的に結合することができ、かかる結合時に、修飾された細胞は、ｉ）活性化されるようになること、ｉｉ）修飾された細胞の増殖の誘導、ｉｉｉ）修飾された細胞によるサイトカイン分泌、またはｉｖ）当該腫瘍抗原を有する細胞の細胞傷害性の誘導から選択される応答をもたらすことができる。例えば、細胞集団は、野生型ＴＲＡＣおよびＴＲＢＣ１の減少したまたは排除された発現を有し、抗原結合ドメインに融合されたＴＲＡＣおよび／またはＴＲＢＣ１膜貫通および細胞内ドメインを含む融合ポリペプチドを発現し得る。活性化には、クローン性増殖および分化、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－２を含むサイトカインの発現が含まれる。サイトカインの産生および細胞傷害性の評価は、ＥＬＩＳＡ、５１ＣＲ放出、フローサイトメトリー、および当該技術分野で既知の他のアッセイなどの標準アッセイによって決定することができる。
両方のＴ細胞受容体の構成要素、例えば、ＴＲＡＣの細胞または細胞集団における発現を減少させるまたは排除することを目的とする例示的な実施形態（追加の標的、例えば、２つ以上の追加の標的の発現または機能も減少するまたは排除される実施形態を含む）では、ＴＲＡＣを標的とするｇＮＡ標的配列分子は、表３Ｂの配列から選択される。例えば、細胞は、ＴＣＲの構成要素（例えば、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、および／またはＣＤ３Ｄ）の低下したまたは排除された発現、および免疫抑制タンパク質または免疫チェックポイントタンパク質、例えば、ＦＫＢＰ１Ａ、またはＰＤ－１、ＣＩＳＨ、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、２Ｂ４、ＴＩＧＩＴ、ＡＤＯＲＡ２Ａ、ＮＫＧ２Ａ、分化群２４７（ＣＤ２４７）、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ５２、ヒト白血球抗原Ｃ（ＨＬＡ－Ｃ）、およびデオキシシチジンキナーゼ（ｄＣＫ）からなる群から選択されるタンパク質の標的の低下したまたは排除された発現を呈する。本明細書に記載されるように、組み合わせのうちのいずれかの実施形態では、当該ｇＮＡ分子の各々（例えば、ｓｇＲＮＡまたはｄｇＲＮＡとして構成され得る、足場と標的配列との組み合わせ）は、細胞集団の修飾のための本明細書に記載のＣａｓＸ分子を有するＲＮＰとして提供され得る。組み合わせのうちのいずれかの他の実施形態では、当該ｇＮＡ分子の各々（例えば、ｓｇＲＮＡまたはｄｇＲＮＡとして構成され得る、足場と標的配列との組み合わせ）およびＣａｓＸは、細胞集団の修飾のためのベクター内のコードされたポリヌクレオチドとして提供され得る。
いくつかの実施形態では、細胞集団は、例えば、齧歯類細胞、ラット細胞、マウス細胞、ウサギ細胞、またはイヌ細胞に由来する動物細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、非ヒト霊長類細胞、例えば、カニクイザル細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、前駆細胞、造血幹細胞、または多能性幹細胞である。一実施形態では、細胞は、人工多能性幹細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、免疫細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、免疫エフェクター細胞（例えば、１つ以上の免疫エフェクター細胞を含む細胞集団）、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、または樹状細胞である。Ｔ細胞には、制御性Ｔ細胞（ＴＲＥＧ）、ガンマ－デルタＴ細胞、ヘルパーＴ細胞、および細胞傷害性Ｔ細胞が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、またはそれらの組み合わせからなる群から選択されるＴ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞集団は、当該細胞集団を投与される対象に対して自己または同種異系（遺伝的にミスマッチ）である。
いくつかの実施形態では、本開示は、ＣＡＲまたは操作されたＴＣＲを発現し、かつ上述のように、抗原プロセシング、提示、認識、または応答に関与する１つ以上のタンパク質を減少させるまたは排除するように修飾されている細胞または細胞集団を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲまたは操作されたＴＣＲ細胞は、ＣＡＲまたは操作されたＴＣＲをコードするポリヌクレオチド、またはそのポリヌクレオチドを含むベクターの導入により、エクスビボで、本明細書に記載の方法によって修飾および／または改変される。他の実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲまたは操作されたＴＣＲ細胞は、本明細書に記載されるように細胞に導入されるＣａｓＸ：ｇＮＡ分子および／または組成物（例えば、ＣａｓＸ、２つ以上のｇＮＡ分子、および任意選択的にドナー鋳型、ならびにＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含む組成物）を利用して、インビボで、本明細書に記載の方法によって修飾および／または改変される。これらの実施形態では、細胞は、本明細書に記載されるように、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または操作されたＴＣＲを発現するように修飾されているか、修飾されるか、または修飾されるであろう（例えば、細胞は、ＣＡＲをコードする、または操作されたＴＣＲのサブユニットを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むか、または含むであろう）。複数の実施形態では、ＣＡＲまたは操作されたＴＣＲは、分化群１９（ＣＤ１９）、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ７、ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＬＬ１、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４７、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ９９、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、カルボニクスアンヒドラーゼＩＸ（ＣＡＩＸ）、ＣＣケモカイン受容体４（ＣＣＲ４）、ＡＤＡＭメタロペプチダーゼドメイン１２（ＡＤＡＭ１２）、接着Ｇタンパク質共役型受容体Ｅ２（ＡＤＧＲＥ２）、胎盤様型２アルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰＰＬ２）、アルファ４インテグリン、アンジオポエチン－２（ＡＮＧ２）、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、ＣＤ４４Ｖ６、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＥＡＣ、ＣＥＡＣＡＭ５、クローディン６（ＣＬＤＮ６）、ＣＬＤＮ１８、Ｃ型レクチンドメインファミリー１２メンバーＡ（ＣＬＥＣ１２Ａ）、間葉上皮移行因子（ｃＭＥＴ）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）、上皮成長因子受容体１（ＥＧＦ１Ｒ）、ＥＧＦＲ－ＶＩＩＩ、上皮糖タンパク質２（ＥＧＰ－２）、ＥＧＰ－４０、ＥｐｈＡ２、ＥＮＰＰ３、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、ｅｒｂ－Ｂ２，３，４、葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）、胎児アセチルコリン受容体、葉酸受容体－α、葉酸受容体１（ＦＯＬＲ１）、Ｇタンパク質共役型受容体１４３（ＧＰＲ１４３）、代謝型グルタミン酸受容体８（ＧＲＭ８）、グリピカン－３（ＧＰＣ３）、ガングリオシドＧＤ２、ガングリオシドＧＤ３、ヒト上皮成長因子受容体１（ＨＥＲ１）、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）、ＨＥＲ３、インテグリンＢ７、細胞間細胞接着分子－１（ＩＣＡＭ－１）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、インターロイキン－１３受容体α２（ＩＬ－ｌ３Ｒ－ａ２）、Ｋ－軽鎖、キナーゼ挿入ドメイン受容体（ＫＤＲ）、ルイス－Ｙ（ＬｅＹ）、コンドロモジュリン－１（ＬＥＣＴ１）、Ｌ１細胞粘着分子、リゾホスファチジン酸受容体３（ＬＰＡＲ３）、メラノーマ関連抗原１（ＭＡＧＥ－Ａ１）、メソテリン、ムチン１（ＭＵＣ１）、ＭＵＣ１６、メラノーマ関連抗原３（ＭＡＧＥＡ３）、腫瘍タンパク質ｐ５３（ｐ５３）、Ｔ細胞によって認識されるメラノーマ抗原１（ＭＡＲＴ１）、糖タンパク質１００（ＧＰ１００）、プロテイナーゼ３（ＰＲ１）、エフリン－Ａ受容体２（ＥｐｈＡ２）、ナチュラルキラーグループ２Ｄリガンド（ＮＫＧ２Ｄリガンド）、ニューヨーク食道扁平上皮がん１（ＮＹ－ＥＳＯ－１）、がん胎児性抗原（ｈ５Ｔ４）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、プログラム死リガンド１（ＰＤＬ－１）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、トロホブラスト糖タンパク質（ＴＰＢＧ）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ－７２）、腫瘍関連カルシウムシグナルトランスデューサー２（ＴＲＯＰ－２）、チロシナーゼ、スルビビン、血管内皮成長因子受容体２（ＶＥＧＦ－Ｒ２）、ウィルムス腫瘍－１（ＷＴ－１）、白血球免疫グロブリン様受容体Ｂ２（ＬＩＬＲＢ２）、メラノーマ優先発現抗原（ＰＲＡＭＥ）、Ｔ細胞受容体ベータ定常１（ＴＲＢＣ１）、ＴＲＢＣ２、および（Ｔ細胞免疫グロブリンムチン－３）ＴＩＭ－３からなる群から選択される抗原に対する特異的結合親和性を有する。前述では、ＣＡＲまたは操作されたＴＣＲは、参照抗体、例えば、表５の（表５のＶＬ、ＶＨ、および／またはＣＤＲ配列を有する）抗体に由来し得る、単一ドメイン抗体、直鎖状抗体、または一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）から選択される抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、約１０－５～１０－１２Ｍならびにその範囲内の全ての個々の値および範囲（例えば、１０－５Ｍ、１０－６Ｍ、１０－７Ｍ、１０－８Ｍ、１０－９Ｍ、１０－１０Ｍ、１０－１１Ｍ、または１０－１２Ｍ）の平衡結合定数を有する標的抗原に対する親和性を呈し、かかる結合親和性は「特異的」である。いくつかの実施形態では、ＣＡＲまたは操作されたＴＣＲは、抗原結合ドメインと、ＣＤ３－ゼータ、ＣＤ４、ＣＤ８、およびＣＤ２８からなる群から選択されるポリペプチドに由来する膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを含み、これらはスペーサー配列によって連結され得る。いくつかの実施形態では、コードされたＣＡＲは、ＣＤ３－ゼータ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（４１ＢＢ）、ＩＣＯＳ、またはＯＸ４０を含むが、これらに限定されない１つ以上のＴ細胞由来のシグナル伝達鎖ポリペプチドをさらに含み、これらはＣＡＲ抗原結合ドメインに直接連結されているか、またはドメインヒンジおよび／またはスペーサーを介して連結されているかのいずれかである。ヒンジドメインは、免疫グロブリン様ヒンジ、またはＣＤ８ａ分子（ＣＤ８）もしくはＣＤ２８から単離されたまたはそれに由来するヒンジドメインであり得る。ヒンジ、スペーサー、および膜貫通ドメインは、抗原結合ドメインを活性化ドメインに結合し、ＣＡＲをＴ細胞膜に固定する。他の実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲまたは操作されたＴＣＲを発現する細胞は、第２のＣＡＲまたは操作されたＴＣＲ、例えば、同じ標的または異なる標的（例えば、上記の本明細書に記載のがん関連抗原または本明細書に記載の異なるがん関連抗原以外の標的）に対する異なる抗原結合ドメインを含む第２のＣＡＲをさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、第２のＣＡＲまたは操作されたものは、がん関連抗原と同じがん細胞型で発現される標的に対する抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲを発現する細胞は、第１の抗原を標的とし、かつ共刺激シグナル伝達ドメインを有するが一次シグナル伝達ドメインを有しない細胞内シグナル伝達ドメインを含む第１のＣＡＲと、第２の異なる抗原を標的とし、かつ一次シグナル伝達ドメインを有するが共刺激シグナル伝達ドメインを有しない細胞内シグナル伝達ドメインを含む第２のＣＡＲとを含む。理論に拘束されることを望まないが、共刺激性Ｔ細胞由来のシグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（４１ＢＢ）、ＩＣＯＳ、またはＯＸ４０を第１のＣＡＲに配置し、一次シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータを第２のＣＡＲに配置することにより、ＣＡＲ活性を両方の標的が発現される細胞に制限することができる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲを発現する細胞は、本明細書に記載の標的抗原に結合する抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および共刺激ドメインを含む第１の疾患（例えば、がん）関連抗原ＣＡＲと、異なる標的抗原（例えば、第１の標的抗原と同じ細胞型で発現される抗原）を標的とし、かつ抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および一次シグナル伝達ドメインを含む第２のＣＡＲとを含む。他の実施形態では、ＣＡＲ発現細胞は、本明細書に記載の標的抗原に結合する抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および一次シグナル伝達ドメインを含む第１のＣＡＲと、第１の標的抗原以外の抗原（例えば、第１の標的抗原と同じがん細胞型で発現される抗原）を標的とし、かつ抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および共刺激シグナル伝達ドメインを含む第２のＣＡＲとを含む。
別の実施形態では、本開示は、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、および／またはＩＬ－１８などの免疫刺激性サイトカインの発現をコードする誘導性発現カセットで修飾されたＣＡＲまたは操作されたＴＣＲ発現細胞の集団であって、対象に投与されたときに、サイトカインがＣＡＲまたは操作されたＴＣＲ細胞の増殖および持続性を改善する一方で、それらを免疫抑制性腫瘍環境に対して抵抗性にする、集団を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、細胞集団であって、集団の修飾された細胞の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％がＣＡＲまたは操作されたＴＣＲを検出可能なレベルで発現する、細胞集団を提供する。
複数の実施形態では、１つ以上のタンパク質の発現または機能が本明細書に記載の方法によって減少しているまたは排除されている本発明のＣＡＲまたは操作されたＴＣＲ発現細胞の集団は、刺激、例えば、ＣＡＲまたは操作されたＴＣＲのその標的抗原への結合に応答して活性化するようになる能力および増殖する能力を維持する。複数の実施形態では、増殖はエクスビボで生じ、これにより、細胞集団が増殖することができるようになる。一実施形態では、ＣＡＲまたは操作されたＴＣＲ発現細胞の集団は、適切な成長条件下における適切な培地中でのインビトロ培養によって増殖する。他の実施形態では、増殖は、インビボで生じる。複数の実施形態では、増殖は、エクスビボおよびインビボの両方で生じる。これらの実施形態では、増殖のレベルは、同じ細胞型（例えば、同じ型のＣＡＲ発現細胞）によって呈される増殖のレベルと実質的に同じであるが、１つ以上のタンパク質の発現または機能を減少させていないまたは排除していない。
本方法は、当業者に既知の任意の数の技法を使用して、対象から収集された血液の単位から得ることができる免疫細胞、例えば、Ｔ細胞、ＴＲＥＧ細胞、ガンマ－デルタＴ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、または樹状細胞を提供する。例示的な一態様では、個体の循環血液由来の細胞は、アフェレーシスによって得られる。アフェレーシス産物には、典型的には、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球、赤血球、および血小板を含むリンパ球が含まれている。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、またはそれらの組み合わせである。アフェレーシスによって収集された細胞を洗浄して、血漿分画を除去し、任意選択的に、その後の処理ステップのために好適な緩衝液または培地中に細胞を入れることができる。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、赤血球を溶解し、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配による遠心分離または向流遠心水簸によって単球を枯渇させることによって、末梢血リンパ球から単離される。本方法は、ｉ）標的核酸の編集のためにＣａｓＸ：ｇＮＡ系の構成要素を導入するステップと、ｉｉ）ＣＡＲおよび／または実施形態の操作されたＴＣＲの１つ以上の融合ポリペプチドをコードする核酸を細胞に導入するステップと、ｉｉｉ）ｉ）細胞を増殖させるステップと、ｉｖ）対象へのその後の投与のために細胞を凍結保存するステップとを含み得る。造血幹細胞および前駆細胞のエクスビボ増殖の手順は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，１９９，９４２号に記載されており、本発明の細胞に適用することができる。
Ｔ細胞ならびに／またはＣＤ４＋および／もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞のサブタイプおよび亜集団の中には、ナイーブＴ細胞、エフェクターＴ細胞、メモリーＴ細胞、およびそれらのサブタイプ、例えば、幹細胞メモリーＴ、セントラルメモリーＴ、エフェクターメモリーＴ、または最終分化エフェクターメモリーＴ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、未熟Ｔ細胞、成熟Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、粘膜関連インバリアントＴ細胞、天然に存在する適応性制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞、ヘルパーＴ細胞、例えば、ＴＨ１細胞、ＴＨ２細胞、ＴＨ３細胞、ＴＨ１７細胞、ＴＨ９細胞、ＴＨ２２細胞、濾胞性ヘルパーＴ細胞、アルファ／ベータＴ細胞、およびデルタ／ガンマＴ細胞がある。
本明細書に記載の方法は、例えば、本明細書に記載の陰性選択技法を使用して、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ制御性細胞枯渇集団であるＴ細胞、ＣＤ２５＋枯渇細胞の特定の亜集団の選択を含み得る。好ましくは、Ｔ制御性枯渇細胞集団は、ＣＤ２５＋細胞の３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、Ｔ制御性細胞、例えば、ＣＤ２５＋Ｔ細胞が、抗ＣＤ２５抗体もしくはその断片、またはＣＤ２５結合リガンドＩＬ－２を使用して集団から除去されることを提供する。他の実施形態では、抗ＣＤ２５抗体は、基質、例えば、ビーズにコンジュゲートされるか、または細胞集団が添加および洗浄されて分離をもたらす基質上に別様にコーティングされる。
他の実施形態では、Ｔ細胞は、赤血球を溶解し、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配による遠心分離または向流遠心水簸によって単球を枯渇させることによって、末梢血リンパ球から単離される。細胞は、典型的には、一次細胞、例えば、対象から直接単離されたものおよび／または対象から単離されて凍結されたものである。
本明細書に記載の方法は、ＣＤ２５、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＣＤ２０、ＣＤ１４、またはＣＤ１１ｂを含まない疾患抗原、例えば、腫瘍抗原を発現する細胞を集団から除去し、それにより、本明細書に記載のＣＡＲの発現に好適なＴ制御性枯渇、例えば、ＣＤ２５＋枯渇、および腫瘍抗原枯渇細胞集団を提供することをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原発現細胞は、Ｔ制御性細胞、例えば、ＣＤ２５＋細胞と同時に除去される。例えば、抗ＣＤ２５抗体もしくはその断片および抗腫瘍抗原抗体もしくはその断片は、同じ基質、例えば、ビーズに結合することができ、それを使用して、細胞または抗ＣＤ２５抗体もしくはその断片を除去することができるか、または抗腫瘍抗原抗体もしくはその断片を別個のビーズに結合することができ、その混合物を使用して、細胞を除去することができる。他の実施形態では、Ｔ制御性細胞、例えば、ＣＤ２５＋細胞の除去、および腫瘍抗原発現細胞の除去は順次起こり、例えば、いずれかの順序で起こり得る。
刺激用のＴ細胞は、洗浄ステップ後に凍結することもでき、凍結およびその後の解凍ステップは、細胞集団内の顆粒球およびある程度の単球を除去することにより、より均一な生成物を提供する。血漿および血小板を除去する洗浄ステップ後、細胞が好適な凍結溶液中に懸濁され得る。ある特定の事例では、凍結保存された細胞は、解凍および洗浄されて、それを室温で１時間静置させた後、本開示の方法を使用して活性化される。
他の実施形態では、本開示の細胞（例えば、本開示の免疫細胞および／または本発明のＣＡＲ発現細胞）は、人工多能性幹細胞（「ｉＰＳＣ」）または胚性幹細胞（ＥＳＣ）であるか、または当該ｉＰＳＣおよび／またはＥＳＣから生成された（例えば、分化した）Ｔ細胞である。ｉＰＳＣは、例えば、当該技術分野で既知の方法によって、末梢血Ｔリンパ球、例えば、健常ボランティアから単離された末梢血Ｔリンパ球から生成することができる。同様に、かかる細胞は、当該技術分野で既知の方法によってＴ細胞に分化させることができる（例えば、Ｔｈｅｍｅｌｉ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：９２８（２０１３）、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２６７８、およびＷＯ２０１４／１６５７０７（これらの各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。
いくつかの実施形態では、本開示は、がんまたは腫瘍に関連する疾患を有する対象に抗腫瘍免疫（免疫療法）を提供する方法に使用するための修飾された細胞の集団を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の修飾された細胞実施形態のうちのいずれかの集団の治療有効量を対象に投与することを含む方法。
いくつかの実施形態では、総細胞の用量および／または細胞の個々の亜集団の用量は、１０４もしくは約１０４～１０９もしくは約１０９細胞／キログラム（ｋｇ）体重、例えば、１０５～１０６細胞／ｋｇ体重、例えば、１×１０５もしくは約１×１０５細胞／ｋｇ、１．５×１０５もしくは１．５×１０５細胞／ｋｇ、２×１０５もしくは２×１０５細胞／ｋｇ、または１×１０６もしくは１×１０６細胞／ｋｇ体重の範囲内である。例えば、いくつかの実施形態では、細胞は、１０４もしくは約１０４～１０９もしくは約１０９細胞／キログラム（ｋｇ）体重、例えば、１０５～１０６細胞／ｋｇ体重、例えば、１×１０５もしくは約１×１０５細胞／ｋｇ、１．５×１０５もしくは１．５×１０５細胞／ｋｇ、２×１０５もしくは２×１０５細胞／ｋｇ、または１×１０６もしくは１×１０６細胞／ｋｇ体重で、またはそのある特定の誤差範囲内で投与される。
いくつかの実施形態では、修飾された細胞の有効量の投与により、対象における疾患に関連する臨床パラメーターまたは臨床評価項目の改善がもたらされ、臨床パラメーターまたは臨床評価項目は、完全奏効、部分奏効、または不完全奏効としての腫瘍縮小；無増悪期間、治療成功期間、バイオマーカー応答；無増悪生存期間；無病生存期間；無再発期間；無転移期間；全生存期間；生活の質の改善；および症状の改善からなる群の１つまたはいずれかの組み合わせから選択される。
いくつかの実施形態では、本開示は、対象における免疫療法のための細胞を調製する方法であって、抗原プロセシング、抗原提示、抗原認識、および／または抗原応答に関与する１つ以上のタンパク質の発現を減少させるまたは排除することによって免疫エフェクター細胞を修飾することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、抗原プロセシング、抗原提示、抗原認識、および／または抗原応答に関与する１つ以上のタンパク質は、ベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、Ｔ細胞受容体アルファ鎖定常領域（ＴＲＡＣ）、ＩＣＰ４７ポリペプチド、クラスＩＩ主要組織適合性複合体トランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）、Ｔ細胞受容体ベータ定常１（ＴＲＢＣ１）、Ｔ細胞受容体ベータ定常２（ＴＲＢＣ２）、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、２Ｂ４、ＣＩＳＨ、ＡＤＯＲＡ２Ａ、ＴＩＧＩＴ、ＮＫＧ２Ａ、ヒト白血球抗原Ａ（ＨＬＡ－Ａ）、ヒト白血球抗原Ｂ（ＨＬＡ－Ｂ）、ＴＧＦβ受容体２（ＴＧＦβＲＩＩ）、分化群２４７（ＣＤ２４７）、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ５２、ヒト白血球抗原Ｃ（ＨＬＡ－Ｃ）、デオキシシチジンキナーゼ（ｄＣＫ）、またはＦＫＢＰ１Ａから選択される。いくつかの実施形態では、本方法は、免疫エフェクター細胞の標的核酸配列を、ＣａｓＸタンパク質およびガイド核酸（ｇＮＡ）を含むＣａｓＸ：ｇＮＡ系と接触させることを含み、ｇＮＡが、（ａ）タンパク質をコードする遺伝子もしくは遺伝子の一部分の標的核酸配列、その遺伝子の調節要素、またはそれらの両方に相補的であるか、または（ｂ）１つ以上のタンパク質をコードする遺伝子の標的核酸配列の相補体に相補的である標的配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、１つ以上のタンパク質の発現が修飾されていない細胞と比較して少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％減少するように修飾されている。本方法の他の実施形態では、細胞は、細胞が１つ以上のタンパク質を検出可能なレベルで発現しないように修飾されている。本方法の例示的な実施形態では、ノックダウンまたはノックアウトされるタンパク質は、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、またはＣＩＩＴＡから選択される。本方法の他の実施形態では、細胞は、修飾された細胞の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％がＭＨＣクラスＩ分子を検出可能なレベルで発現しないように修飾されている。本方法の他の実施形態では、細胞は、修飾された細胞の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％が野生型Ｔ細胞受容体を検出可能なレベルで発現しないように修飾されている。
いくつかの実施形態では、本開示は、抗原プロセシング、抗原提示、抗原認識、および／または抗原応答に関与するタンパク質の発現を減少させるまたは排除することによって免疫エフェクター細胞を修飾することに加えて、腫瘍細胞抗原に特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を導入することによって細胞を修飾することをさらに含む、対象における免疫療法のための細胞を調製する方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの腫瘍細胞抗原リガンドは、分化群１９（ＣＤ１９）、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ７、ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＬＬ１、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４７、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ９９、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、カルボニクスアンヒドラーゼＩＸ（ＣＡＩＸ）、ＣＣケモカイン受容体４（ＣＣＲ４）、ＡＤＡＭメタロペプチダーゼドメイン１２（ＡＤＡＭ１２）、接着Ｇタンパク質共役型受容体Ｅ２（ＡＤＧＲＥ２）、胎盤様型２アルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰＰＬ２）、アルファ４インテグリン、アンジオポエチン－２（ＡＮＧ２）、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、ＣＤ４４Ｖ６、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＥＡＣ、ＣＥＡＣＡＭ５、クローディン６（ＣＬＤＮ６）、ＣＬＤＮ１８、Ｃ型レクチンドメインファミリー１２メンバーＡ（ＣＬＥＣ１２Ａ）、間葉上皮移行因子（ｃＭＥＴ）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）、上皮成長因子受容体１（ＥＧＦ１Ｒ）、ＥＧＦＲ－ＶＩＩＩ、上皮糖タンパク質２（ＥＧＰ－２）、ＥＧＰ－４０、ＥｐｈＡ２、ＥＮＰＰ３、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、ｅｒｂ－Ｂ２、ｅｒｂ－３、ｅｒｂ－４、葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）、胎児アセチルコリン受容体、葉酸受容体－α、葉酸受容体１（ＦＯＬＲ１）、Ｇタンパク質共役型受容体１４３（ＧＰＲ１４３）、代謝型グルタミン酸受容体８（ＧＲＭ８）、グリピカン－３（ＧＰＣ３）、ガングリオシドＧＤ２、ガングリオシドＧＤ３、ヒト上皮成長因子受容体１（ＨＥＲ１）、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）、ＨＥＲ３、インテグリンＢ７、細胞間細胞接着分子－１（ＩＣＡＭ－１）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、インターロイキン－１３受容体α２（ＩＬ－ｌ３Ｒ－ａ２）、Ｋ－軽鎖、キナーゼ挿入ドメイン受容体（ＫＤＲ）、ルイス－Ｙ（ＬｅＹ）、コンドロモジュリン－１（ＬＥＣＴ１）、Ｌ１細胞粘着分子、リゾホスファチジン酸受容体３（ＬＰＡＲ３）、メラノーマ関連抗原１（ＭＡＧＥ－Ａ１）、メソテリン、ムチン１（ＭＵＣ１）、ＭＵＣ１６、メラノーマ関連抗原３（ＭＡＧＥ－Ａ３）、腫瘍タンパク質ｐ５３（ｐ５３）、Ｔ細胞によって認識されるメラノーマ抗原１（ＭＡＲＴ１）、糖タンパク質１００（ＧＰ１００）、プロテイナーゼ３（ＰＲ１）、エフリン－Ａ受容体２（ＥｐｈＡ２）、ナチュラルキラーグループ２Ｄリガンド（ＮＫＧ２Ｄリガンド）、ニューヨーク食道扁平上皮がん１（ＮＹ－ＥＳ０－１）、がん胎児性抗原（ｈ５Ｔ４）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、プログラム死リガンド１（ＰＤＬ－１）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、トロホブラスト糖タンパク質（ＴＰＢＧ）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ－７２）、腫瘍関連カルシウムシグナルトランスデューサー２（ＴＲＯＰ－２）、チロシナーゼ、スルビビン、血管内皮成長因子受容体２（ＶＥＧＦ－Ｒ２）、ウィルムス腫瘍－１（ＷＴ－１）、白血球免疫グロブリン様受容体Ｂ２（ＬＩＬＲＢ２）、メラノーマ優先発現抗原（ＰＲＡＭＥ）、Ｔ細胞受容体ベータ定常１（ＴＲＢＣ１）、ＴＲＢＣ２、および（Ｔ細胞免疫グロブリンムチン－３）ＴＩＭ－３から選択される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、直鎖状抗体、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、または一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）から選択される抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、腫瘍細胞抗原に対する特異的な結合親和性を有する参照抗体に由来するｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、表５に記載の配列からなる群から選択されるＶＨおよびＶＬならびに／または重鎖および軽鎖ＣＤＲを含む。前述の実施形態では、ＶＨ、ＶＬ、および／またはＣＤＲは、１つ以上のアミノ酸置換を有することができ、ｓｃＦｖは、腫瘍抗原に対する特異的結合親和性を保持する。
対象における免疫療法のための細胞を調製する方法の他の実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸は、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸をさらに含み、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２４７分子（ＣＤ３－ゼータ）、ＣＤ２７分子（ＣＤ２７）、ＣＤ２８分子（ＣＤ２８）、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー９（４－１ＢＢ）、誘導性Ｔ細胞共刺激因子（ＩＣＯＳ）、またはＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー４（ＯＸ４０）から単離されたまたはそれに由来する少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインを含む。一実施形態では、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインは、ａ）ＣＤ３－ゼータ細胞内シグナル伝達ドメイン、ｂ）ＣＤ３－ゼータ細胞内シグナル伝達ドメインおよび４－１ＢＢまたはＣＤ２８細胞内シグナル伝達ドメイン、ｃ）ＣＤ－ゼータ細胞内シグナル伝達ドメイン、４－１ＢＢ細胞内シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ２８細胞内シグナル伝達ドメイン、またはｄ）ＣＤ－ゼータ細胞内シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２８細胞内シグナル伝達ドメイン、４－１ＢＢ細胞内シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ２７またはＯＸ４０細胞内シグナル伝達ドメインを含む。他の実施形態では、ＣＡＲは、細胞外ヒンジドメインをさらに含み、ヒンジドメインが免疫グロブリン様ドメインであるか、またはヒンジドメインが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、もしくはＩｇＧ４からから単離されるか、またはそれに由来するか、またはヒンジドメインが、ＣＤ８ａ分子（ＣＤ８）もしくはＣＤ２８から単離されるか、またはそれに由来する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、膜貫通ドメインをさらに含み、膜貫通ドメインが、ＣＤ３－ゼータ、ＣＤ４、ＣＤ８、およびＣＤ２８からなる群からから単離されるか、またはそれに由来する。前述では、ＣＡＲの構成要素は、適切なリンカーに作動可能に連結されて、単一のキメラ融合ポリペプチドを形成する。
いくつかの実施形態では、ＴＣＲは、ＴＣＲアルファ、ＴＣＲベータ、ＣＤ３－デルタ、ＣＤ３－イプシロン、ＣＤ－ガンマ、またはＣＤ３－ゼータからなる群から選択される１つ以上のサブユニットを含み、細胞外抗原結合ドメインとサブユニットが単一のキメラ融合ポリペプチドを形成するように配置された抗原結合ドメインに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、単一のキメラ融合ポリペプチドは、ＴＣＲサブユニットと抗原結合ドメインとの間にリンカーを含む。
いくつかの実施形態では、ＴＣＲは、ＴＣＲアルファ、ＴＣＲベータ、ＣＤ３－デルタ、ＣＤ３－イプシロン、ＣＤ－ガンマ、またはＣＤ３－ゼータからなる群から選択される１つ以上のサブユニットを含み、細胞外抗原結合ドメインと細胞内シグナル伝達ドメイン（と適切なリンカー）が単一の単一のキメラ融合ポリペプチドを形成するように配置された抗原結合ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含む１つ以上の細胞内ドメインに連結されている。１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２４７分子（ＣＤ３－ゼータ）、ＣＤ２７分子（ＣＤ２７）、ＣＤ２８分子（ＣＤ２８）、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー９（４－１ＢＢ）、誘導性Ｔ細胞共刺激因子（ＩＣＯＳ）、またはＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー４（ＯＸ４０）からなる群から単離され得るか、またはそれに由来し得る。
いくつかの実施形態では、本方法は、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、およびＩＬ－１８からなる群から選択される免疫刺激性サイトカインをコードする誘導性発現カセットをコードするポリ核酸を免疫細胞に導入することをさらに含む。他の実施形態では、本方法は、細胞集団を必要とする対象へのその後の投与のために、適切な培地中および適切な条件下でのインビトロ培養によって細胞集団を増殖させることをさらに含む。
対象における免疫療法のための細胞を調製する方法のいくつかの実施形態では、本方法は、ＴＣＲアルファ、ＴＣＲベータ、ＣＤ３－デルタ、ＣＤ３－イプシロン、ＣＤ－ガンマ、またはＣＤ３－ゼータからなる群から選択される１つ以上のサブユニットを含むＴＣＲをコードするポリ核酸を免疫細胞に導入することをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＴＣＲは、細胞内シグナル伝達ドメイン由来の刺激ドメインを含む細胞内ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＴＣＲの抗原結合ドメインは、１つ以上のサブユニットに作動可能に連結されている。いくつかの事例では、ＴＣＲの抗原結合ドメインは、表５に記載の配列からなる群から選択される可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）ならびに／または重鎖および軽鎖ＣＤＲを含むｓｃＦｖである。
ＶＩＩＩ．治療法
別の態様では、本開示は、腫瘍抗原の発現に関連する疾患を有するか、または自己免疫疾患を有する対象を治療する方法に関する。いくつかの実施形態では、本開示は、疾患の治療を必要とする対象における疾患を治療するための免疫療法の方法を提供する。本開示のいくつかの実施形態では、本治療法は、対象に、本明細書に記載の実施形態のＣａｓＸ：ｇＮＡ系組成物およびポリ核酸によって修飾された細胞または細胞集団の治療有効量を投与することによって、対象の疾患を予防、治療、および／または改善することができる。いくつかの実施形態では、本治療法は、対象に、ＣａｓＸ：ｇＮＡ組成物および任意選択的にドナー鋳型によって修飾された細胞または細胞集団を投与することを含み、抗原プロセシング、抗原提示、抗原認識、および／または抗原応答に関与する１つ以上のタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子が修飾される。いくつかの事例では、細胞または細胞集団は、本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかのＣＡＲまたは操作されたＴＣＲを発現するように修飾されている。一実施形態では、疾患は、がんである。別の実施形態では、疾患は、自己免疫疾患である。抗体療法とは異なり、これらの実施形態の修飾された細胞は、インビボで複製することができ、基礎疾患の持続的制御につながり得る長期の存続性をもたらす。様々な態様では、対象に投与される修飾された細胞またはその子孫は、対象に修飾された細胞を投与した後、少なくとも１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、７ヶ月間、８ヶ月間、９ヶ月間、１０ヶ月間、１１ヶ月間、１２ヶ月間、１３ヶ月間、１４ヶ月間、１５ヶ月間、１６ヶ月間、１７ヶ月間、１８ヶ月間、１９ヶ月間、２０ヶ月間、２１ヶ月間、２２ヶ月間、２３ヶ月間、２年間、３年間、４年間、または５年間にわたって対象に存続する。本治療法により、修飾された細胞の投与は、腫瘍細胞などの基礎疾患を引き起こすかまたはそれに関連する細胞の死滅をもたらす。
一実施形態では、本開示は、腫瘍抗原の発現に関連する疾患を有する対象を治療する方法であって、細胞集団を投与することを含み、細胞は、抗原プロセシング、抗原提示、抗原認識、および／または抗原応答に関与する１つ以上のタンパク質の発現が、修飾されていない細胞と比較して、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％減少するように修飾されているか、または細胞がタンパク質を検出可能なレベルで発現しない、方法を提供する。一実施形態では、タンパク質は、ベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、Ｔ細胞受容体アルファ鎖定常領域（ＴＲＡＣ）、クラスＩＩ主要組織適合性複合体トランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）、ＩＣＰ４７ポリペプチド、Ｔ細胞受容体ベータ定常１（ＴＲＢＣ１）、Ｔ細胞受容体ベータ定常２（ＴＲＢＣ２）、プログラム細胞死－１受容体（ＰＤ－１）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ－３）、Ｔ細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン３（ＴＩＭ－３）、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、ＣＩＳＨ、ＡＤＯＲＡ２Ａ、ＴＩＧＩＴ、ＮＧＫ２Ａ、ヒト白血球抗原Ａ（ＨＬＡ－Ａ）、ヒト白血球抗原Ｂ（ＨＬＡ－Ｂ）、およびＴＧＦβ受容体２（ＴＧＦβＲＩＩ）からなる群から選択される。別の実施形態では、タンパク質は、分化群２４７（ＣＤ２４７）、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ５２、ヒト白血球抗原Ｃ（ＨＬＡ－Ｃ）、デオキシシチジンキナーゼ（ｄＣＫ）、およびＦＫＢＰ１Ａからなる群から選択される。特定の実施形態では、タンパク質は、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、およびＣＩＩＴＡからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、修飾される細胞は、齧歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、非ヒト霊長類細胞、またはヒト細胞からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、修飾される細胞は、前駆細胞、造血幹細胞、および多能性幹細胞からなる群から選択される。一事例では、細胞は、人工多能性幹細胞である。いくつかの実施形態では、修飾される細胞は、Ｔ細胞、Ｔｒｅｇ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、または樹状細胞から選択される免疫細胞である。免疫細胞がＴ細胞である場合、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ガンマ－デルタＴ細胞、またはそれらの組み合わせであり得る。特定の実施形態では、修飾される細胞は、細胞が投与される対象に対して自己である。別の実施形態では、修飾される細胞は、細胞に投与される対象に対して同種異系である。対象に投与するための細胞を修飾する方法は、本明細書に記載されているが、簡潔には、修飾は、細胞を、ａ）本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかのＣａｓＸタンパク質およびｇＮＡを含むＣａｓＸ：ｇＮＡ系、ｂ）ＣａｓＸタンパク質およびｇＮＡをコードする核酸、ｃ）ｂ）の核酸を含むベクターまたはｄ）ａ）～ｃ）のうちのいずれかと接触させることを含み、（上に列記されるもののうちの）１つ以上のタンパク質の発現が減少するか、または細胞が１つ以上のタンパク質を検出可能なレベルで発現しない。前述の標的タンパク質の場合、本治療法は、１つ以上の標的タンパク質の発現をノックダウンまたはノックアウトすることを含む。前述の治療法の実施形態では、細胞は、修飾された細胞の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％が腫瘍細胞抗原に特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または操作されたＴＣＲを検出可能なレベルで発現するように修飾することもできる。前述では、ＣＡＲまたは操作されたＴＣＲは、分化群１９（ＣＤ１９）、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ７、ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＬＬ１、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４７、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ９９、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、カルボニクスアンヒドラーゼＩＸ（ＣＡＩＸ）、ＣＣケモカイン受容体４（ＣＣＲ４）、ＡＤＡＭメタロペプチダーゼドメイン１２（ＡＤＡＭ１２）、接着Ｇタンパク質共役型受容体Ｅ２（ＡＤＧＲＥ２）、胎盤様型２アルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰＰＬ２）、アルファ４インテグリン、アンジオポエチン－２（ＡＮＧ２）、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、ＣＤ４４Ｖ６、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＥＡＣ、ＣＥＡＣＡＭ５、クローディン６（ＣＬＤＮ６）、ＣＬＤＮ１８、Ｃ型レクチンドメインファミリー１２メンバーＡ（ＣＬＥＣ１２Ａ）、間葉上皮移行因子（ｃＭＥＴ）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）、上皮成長因子受容体１（ＥＧＦ１Ｒ）、ＥＧＦＲ－ＶＩＩＩ、上皮糖タンパク質２（ＥＧＰ－２）、ＥＧＰ－４０、ＥｐｈＡ２、ＥＮＰＰ３、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、ｅｒｂ－Ｂ２、ｅｒｂ－３、ｅｒｂ－４、葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）、胎児アセチルコリン受容体、葉酸受容体－α、葉酸受容体１（ＦＯＬＲ１）、Ｇタンパク質共役型受容体１４３（ＧＰＲ１４３）、代謝型グルタミン酸受容体８（ＧＲＭ８）、グリピカン－３（ＧＰＣ３）、ガングリオシドＧＤ２、ガングリオシドＧＤ３、ヒト上皮成長因子受容体１（ＨＥＲ１）、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）、ＨＥＲ３、インテグリンＢ７、細胞間細胞接着分子－１（ＩＣＡＭ－１）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、インターロイキン－１３受容体α２（ＩＬ－ｌ３Ｒ－ａ２）、Ｋ－軽鎖、キナーゼ挿入ドメイン受容体（ＫＤＲ）、ルイス－Ｙ（ＬｅＹ）、コンドロモジュリン－１（ＬＥＣＴ１）、Ｌ１細胞粘着分子、リゾホスファチジン酸受容体３（ＬＰＡＲ３）、メラノーマ関連抗原１（ＭＡＧＥ－Ａ１）、メソテリン、ムチン１（ＭＵＣ１）、ＭＵＣ１６、メラノーマ関連抗原３（ＭＡＧＥＡ３）、腫瘍タンパク質ｐ５３（ｐ５３）、Ｔ細胞によって認識されるメラノーマ抗原１（ＭＡＲＴ１）、糖タンパク質１００（ＧＰ１００）、プロテイナーゼ３（ＰＲ１）、エフリン－Ａ受容体２（ＥｐｈＡ２）、ナチュラルキラーグループ２Ｄリガンド（ＮＫＧ２Ｄリガンド）、ニューヨーク食道扁平上皮がん１（ＮＹ－ＥＳＯ－１）、がん胎児性抗原（ｈ５Ｔ４）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、プログラム死リガンド１（ＰＤＬ－１）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、トロホブラスト糖タンパク質（ＴＰＢＧ）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ－７２）、腫瘍関連カルシウムシグナルトランスデューサー２（ＴＲＯＰ－２）、チロシナーゼ、スルビビン、血管内皮成長因子受容体２（ＶＥＧＦ－Ｒ２）、ウィルムス腫瘍－１（ＷＴ－１）、白血球免疫グロブリン様受容体Ｂ２（ＬＩＬＲＢ２）、メラノーマ優先発現抗原（ＰＲＡＭＥ）、Ｔ細胞受容体ベータ定常１（ＴＲＢＣ１）、ＴＲＢＣ２、および（Ｔ細胞免疫グロブリンムチン－３）ＴＩＭ－３からなる群から選択される腫瘍細胞抗原に特異的であり得る。本治療法のいくつかの実施形態では、ＣＡＲまたは操作されたＴＣＲは、直鎖状抗体、単鎖ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、および一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）からなる群から選択される抗原結合ドメインを含む。いくつかの事例では、ＣＡＲは、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（４１ＢＢ）、ＩＣＯＳ、およびＯＸ４０からなる群から選択される１つ以上のポリペプチドをさらに含む。ＣＤ３－ゼータ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（４１ＢＢ）、ＩＣＯＳ、またはＯＸ４０のうちの１つ以上は、免疫グロブリン様ドメインヒンジおよび／またはスペーサー配列によってＣＡＲ抗原結合ドメインに連結することができ、ＣＤ３－ゼータ、ＣＤ４、ＣＤ８、およびＣＤ２８からなる群から選択されるポリペプチドに由来する膜貫通ドメインをさらに含む。他の事例では、細胞は、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、およびＩＬ－１８からなる群から選択される免疫刺激性サイトカインをコードする誘導性発現カセットをコードするポリ核酸を免疫細胞に導入することによってさらに修飾される。
腫瘍抗原の発現に関連する疾患を有する対象を治療する方法のいくつかの実施形態では、本明細書に記載の実施形態のうちのいずれか１つの修飾された細胞集団の治療有効量を対象に投与することにより、がんまたは腫瘍を治療する（例えば、治癒するまたは重症度を軽減する）もしくは予防する（例えば、再発の可能性を低下させる）か、または対象における疾患に関連する臨床パラメーターまたは臨床評価項目の改善をもたらすことを助ける際に有益な効果をもたらすことができ、臨床パラメーターまたは臨床評価項目は、完全奏効、部分奏効、または不完全奏効としての腫瘍縮小；無増悪期間、治療成功期間、バイオマーカー応答；無増悪生存期間；無病生存期間；無再発期間；無転移期間；全生存期間；生活の質の改善；および症状の改善からなる群の１つまたはいずれかの組み合わせから選択される。
前述の実施形態では、腫瘍抗原の発現に関連する疾患は、がんである。いくつかの実施形態では、がんは、固形腫瘍または液体腫瘍を含む。いくつかの実施形態では、がんは、結腸がん、直腸がん、腎細胞がん、肝がん、非小細胞肺がん、小腸がん、食道がん、黒色腫、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部がん、皮膚または眼球内悪性黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門部がん、胃がん、精巣がん、卵管がん、子宮内膜がん、頸がん、膣がん、外陰がん、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、内分泌系がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、小児固形腫瘍、膀胱がん、腎臓がんまたは尿管がん、腎盂がん、中枢神経系（ＣＮＳ）新生物、ＣＮＳ原発リンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮がん、扁平上皮がん、Ｔ細胞リンパ腫、環境誘発性がん、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性白血病、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、Ｂ細胞急性リンパ性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞新生物、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞または大細胞濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性状態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成および骨髄異形成症候群、ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞新生物、ワルデンストレームマクログロブリン血症、または前白血病、当該がんの組み合わせ、または当該がんの転移性病巣からなる群から選択される本方法では、ＣＡＲまたは操作されたＴＣＲを有する修飾された細胞が、ＣＡＲまたは操作されたＴＣＲのリガンドを有する細胞の腫瘍抗原に結合すると、投与された細胞は、ｉ）活性化されるようになること、ｉｉ）修飾された細胞の増殖を誘導すること、ｉｉｉ）修飾された細胞によるサイトカイン分泌、またはｉｖ）当該腫瘍抗原を有する細胞の細胞傷害性を誘導することができる。腫瘍抗原の発現に関連する疾患を有する対象を治療する方法の他の実施形態では、本方法は、化学療法剤を投与することをさらに含む。化学療法剤の非限定的な例には、免疫抑制剤、例えば、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸塩、およびＦＫ５０６、または他の免疫切除剤（ｉｍｍｕｎｏａｂｌａｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ）、例えば、アレムツズマブ、抗ＣＤ３抗体もしくは他の抗腫瘍抗体療法、サイトキシン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、およびサイトカインが挙げられる。
いくつかの実施形態では、本開示は、自己免疫疾患を有する対象を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、自己免疫疾患を有する対象は、抗原プロセシング、提示、認識、および／または応答に関与する１つ以上のタンパク質の発現を減少させるように修飾された同種免疫細胞（例えば、Ｔｒｅｇ細胞）の集団の有効量を投与される。
別の実施形態では、本発明は、腫瘍抗原の発現に関連する疾患を有する対象を治療する方法であって、対象に、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または操作されたＴＣＲを検出可能なレベルで発現するように修飾され、かつ細胞の治療有効用量を使用した１回以上の連続投与を含む治療レジメンに従って減少したレベルまたは検出不能なレベルのＭＨＣクラスＩ分子および／または野生型Ｔ細胞受容体を有する複数の細胞を投与することを含む、方法を提供する。治療レジメンの一実施形態では、細胞の治療有効用量は、単回投与として投与される。治療レジメンの別の実施形態では、細胞の治療有効用量は、少なくとも２週間、または少なくとも１ヶ月間、または少なくとも２ヶ月間、または少なくとも３ヶ月間、または少なくとも４ヶ月間、または少なくとも５ヶ月間、または少なくとも６ヶ月間にわたって２回以上の投与として、または年１回、または２年もしくは３年毎に対象に投与される。いくつかの実施形態では、総細胞の用量および／または細胞の個々の亜集団の用量は、１投与あたり１０４もしくは約１０４～１０９もしくは約１０９細胞／キログラム（ｋｇ）体重、例えば、１０５～１０６細胞／ｋｇ体重、例えば、１投与あたり１×１０５もしくは約１×１０５細胞／ｋｇ、１．５×１０５もしくは１．５×１０５細胞／ｋｇ、２×１０５もしくは２×１０５細胞／ｋｇ、または１×１０６もしくは１×１０６細胞／ｋｇ体重の範囲内である。例えば、いくつかの実施形態では、細胞は、１投与あたり１０４もしくは約１０４～１０９もしくは約１０９細胞／キログラム（ｋｇ）体重、例えば、１０５～１０６細胞／ｋｇ体重、例えば、１投与あたり１×１０５もしくは約１×１０５細胞／ｋｇ、１．５×１０５もしくは１．５×１０５細胞／ｋｇ、２×１０５もしくは２×１０５細胞／ｋｇ、または１×１０６もしくは１×１０６細胞／ｋｇ体重で、またはそのある特定の誤差範囲内で投与される。
別の実施形態では、本発明は、腫瘍抗原の発現に関連する疾患を有する対象を治療する方法であって、対象に、本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかのＣＡＲまたは操作されたＴＣＲを発現するように修飾され、かつ抗原プロセシング、抗原提示、抗原認識、および／または抗原応答に関与する１つ以上のタンパク質の発現が修飾されていない細胞と比較して少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％減少するようにさらに修飾された複数の細胞を投与することを含み、投与が、細胞の治療有効用量を使用した１回以上の連続投与を含む治療レジメンに従う、方法を提供する。治療レジメンの一実施形態では、細胞の治療有効用量は、単回投与として投与される。治療レジメンの別の実施形態では、細胞の治療有効用量は、少なくとも２週間、または少なくとも１ヶ月間、または少なくとも２ヶ月間、または少なくとも３ヶ月間、または少なくとも４ヶ月間、または少なくとも５ヶ月間、または少なくとも６ヶ月間にわたって２回以上の投与として、または毎年、または２年もしくは３年毎に対象に投与される。いくつかの実施形態では、治療レジメンにより、対象における疾患に関連する臨床パラメーターまたは臨床評価項目の改善がもたらされ、臨床パラメーターまたは臨床評価項目は、完全奏効、部分奏効、または不完全奏効としての腫瘍縮小；無増悪期間、治療成功期間、バイオマーカー応答；無増悪生存期間；無病生存期間；無再発期間；無転移期間；全生存期間；生活の質の改善；および症状の改善からなる群の１つまたはいずれかの組み合わせから選択される。治療レジメンの前述の実施形態では、１つ以上のタンパク質は、ベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、Ｔ細胞受容体アルファ鎖定常領域（ＴＲＡＣ）、クラスＩＩ主要組織適合性複合体トランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）、ＩＣＰ４７ポリペプチド、Ｔ細胞受容体ベータ定常１（ＴＲＢＣ１）、Ｔ細胞受容体ベータ定常２（ＴＲＢＣ２）、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、２Ｂ４、ＣＩＳＨ、ＡＤＯＲＡ２Ａ、ＴＩＧＩＴ、ＮＫＧ２Ａ、ヒト白血球抗原Ａ（ＨＬＡ－Ａ）、ヒト白血球抗原Ｂ（ＨＬＡ－Ｂ）、およびＴＧＦβ受容体２（ＴＧＦβＲＩＩ）からなる群から選択される。別の実施形態では、細胞は、分化群２４７（ＣＤ２４７）、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ５２、ヒト白血球抗原Ｃ（ＨＬＡ－Ｃ）、デオキシシチジンキナーゼ（ｄＣＫ）、およびＦＫＢＰ１Ａからなる群から選択される１つ以上のタンパク質の発現を減少させるようにさらに修飾される。
細胞は、任意の好適な手段、例えば、ボーラス注入により、注射により、例えば、実質内、静脈内、動脈内、脳室内、大槽内、髄腔内、頭蓋内、腰椎内、腹腔内注射、または皮下注射、眼内注射、眼周囲注射、網膜下注射、硝子体内注射、経中隔注射、強膜下注射、脈絡膜内注射、前房内注射、結膜下注射、結膜下注射、テノン嚢下注射、眼球後方注射、眼球周囲注射、または後傍強膜送達により投与することができる。いくつかの実施形態では、それらは、非経口、肺内、および鼻腔内投与により投与され、局所治療が所望される場合、病巣内投与により投与される。
いくつかの実施形態では、腫瘍抗原の発現に関連する疾患を有する対象の治療用の薬剤として使用するための、ＣａｓＸとｇＮＡ遺伝子との編集対、ならびに任意選択的にドナー鋳型および／またはＣＡＲ、操作されたＴＣＲ、もしくはそれらのサブユニットを含む融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドによって修飾された免疫細胞の組成物が本明細書に提供される。前述では、ＣａｓＸは、本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかのＣａｓＸバリアント（例えば、表４の配列）であり得、ｇＮＡは、本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかのｇＮＡバリアント（例えば、表２の配列）であり得る。他の実施形態では、本開示は、腫瘍抗原の発現に関連する疾患を有する対象の治療用の薬剤として使用するための、ＣａｓＸとｇＮＡとの遺伝子編集対、ドナー鋳型、および／またはＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含むまたはコードするベクターによって修飾された細胞の組成物を提供する。
ＩＸ．キットおよび製造品
別の態様では、本明細書に記載の実施形態の組成物を含むキットが本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、キットは、ＣａｓＸタンパク質と、抗原プロセシング、抗原提示、抗原認識、および／または抗原応答に関与するタンパク質をコードする細胞遺伝子に相補的な標的配列を含む本開示の実施形態のうちのいずれかの１つまたは複数のｇＮＡと、賦形剤と、好適な容器（例えば、チューブ、バイアル、またはプレート）とを含む。他の実施形態では、キットは、ＣａｓＸタンパク質と、抗原プロセシング、抗原提示、抗原認識、および／または抗原応答に関与するタンパク質をコードする細胞遺伝子に相補的な標的配列を含む本開示の実施形態のうちのいずれかの１つまたは複数のｇＮＡとをコードする核酸と、ＣＡＲまたは操作されたＴＣＲをコードする核酸と、賦形剤と、好適な容器とを含む。他の実施形態では、キットは、ＣａｓＸタンパク質と、抗原プロセシング、抗原提示、抗原認識、および／または抗原応答に関与するタンパク質をコードする細胞遺伝子に相補的な標的配列を含む本開示の実施形態のうちのいずれかの１つまたは複数のｇＮＡとをコードする核酸を含むベクターと、ＣＡＲまたは操作されたＴＣＲをコードする核酸と、賦形剤と、好適な容器とを含む。さらに他の実施形態では、キットは、ＣａｓＸタンパク質と、抗原プロセシング、抗原提示、抗原認識、および／または抗原応答に関与するタンパク質をコードする細胞遺伝子に相補的な標的配列を含む本開示の実施形態のうちのいずれかの１つまたは複数のｇＮＡとを含むＶＬＰと、ＣＡＲをコードする核酸と、賦形剤と、好適な容器とを含む。
いくつかの実施形態では、キットは、緩衝液、ヌクレアーゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、リポソーム、治療剤、標識、標識可視化試薬、または前述の任意の組み合わせをさらに含む。いくつかの実施形態では、キットは、薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤をさらに含む。
いくつかの実施形態では、キットは、遺伝子編集用途に適切な対照組成物および使用説明書を含む。
本記述は、多数の例示的な構成、方法、パラメーターなどを記載する。しかしながら、かかる記述が本開示の範囲を限定ようには意図されておらず、代わりに、例示的な実施形態の記述として提供されることを認識されたい。
本開示の非限定的な実施形態の例
上記の本主題の実施形態は、単独で、または１つ以上の他実施形態と組み合わせて有益であり得る。前述の記述を限定することなく、１～２３４で番号付けられた本開示のある特定の非限定的な態様が以下に提供される。本開示を読んだ際に当業者に明らかになるように、個別に番号付けされた実施形態は各々、先行または後続の個別に番号付けされた実施形態のうちのいずれかと使用されてもよく、またはそれらと組み合わせられてもよい。これは、全てのかかる実施形態の組み合わせを支援するよう意図されており、以下に明示的に提供される実施形態の組み合わせに限定されない。
実施形態セット番号１：
１．ＣａｓＸポリペプチドおよびガイド核酸（ｇＮＡ）を含むＣａｓＸ：ｇＮＡ系であって、ｇＮＡが、（ａ）抗原プロセシング、抗原提示、抗原認識、および／または抗原応答に関与するタンパク質をコードする核酸配列および／またはその調節領域に相補的であるか、または（ｂ）抗原プロセシング、抗原提示、抗原認識、および／または抗原応答に関与するタンパク質をコードする核酸配列の相補体またはその調節領域に相補的である標的配列を含む、ＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
２．タンパク質が免疫細胞表面マーカーである、１に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
３．タンパク質が細胞内タンパク質である、１に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
４．タンパク質が、ベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、Ｔ細胞受容体アルファ鎖定常領域（ＴＲＡＣ）、クラスＩＩ主要組織適合性複合体トランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）、Ｔ細胞受容体ベータ定常１（ＴＲＢＣ１）、Ｔ細胞受容体ベータ定常２（ＴＲＢＣ２）、ヒト白血球抗原Ａ（ＨＬＡ－Ａ）、およびヒト白血球抗原Ｂ（ＨＬＡ－Ｂ）からなる群から選択される、１～３のいずれか１つに記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
５．（ａ）分化群２４７（ＣＤ２４７）、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ５２、ヒト白血球抗原Ｃ（ＨＬＡ－Ｃ）、デオキシシチジンキナーゼ（ｄＣＫ）、およびＦＫＢＰ１Ａからなる群から選択されるタンパク質をコードする核酸配列に相補的であるか、または（ｂ）分化群２４７（ＣＤ２４７）、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ５２、ヒト白血球抗原Ｃ（ＨＬＡ－Ｃ）、デオキシシチジンキナーゼ（ｄＣＫ）、およびＦＫＢＰ１Ａからなる群から選択されるタンパク質をコードする核酸配列の相補体に相補的である標的配列を含むｇＮＡをさらに含む、４に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
６．ｇＮＡがガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）である、１～５のいずれか１つに記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
７．ｇＮＡがガイドＤＮＡ（ｇＤＮＡ）である、１～５のいずれか１つに記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
８．ｇＮＡがＤＮＡおよびＲＮＡを含むキメラである、１～５のいずれか１つに記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
９．タンパク質がＢ２Ｍである、４に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
１０．ｇＮＡの標的配列が、表３Ａに記載の配列からなる群から選択される配列と少なくとも約６５％、少なくとも約７５％、少なくとも約８５％、または少なくとも約９５％の同一性を有する配列を含む、９に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
１１．タンパク質がＴＲＡＣである、４に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
１２．ｇＮＡの標的配列が、表３Ｂに記載の配列からなる群から選択される配列と少なくとも約６５％、少なくとも約７５％、少なくとも約８５％、または少なくとも約９５％の同一性を有する配列を含む、１１に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
１３．タンパク質がＣＩＩＴＡである、４に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
１４．ｇＮＡが、表２の配列と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む足場を有する、１～１３のいずれか１つに記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
１５．標的配列が、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の連続したヌクレオチドからなる、１～１４のいずれか１つに記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
１６．ＣａｓＸポリペプチドが、配列番号１～３のうちのいずれか１つまたは表４の配列、またはそれと少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９５％の配列同一性を有する配列を含む、１～１５のいずれか１つに記載の組成物。
１７．ＣａｓＸタンパク質とｇＮＡがリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）で一緒に会合している、１～１６のいずれか１つに記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
１８．ドナー鋳型核酸をさらに含む、１～１７のいずれか１つに記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
１９．ドナー鋳型が、ｉ）疾患抗原、任意選択的に、腫瘍細胞抗原に特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、および／またはｉｉ）４に記載のタンパク質をコードする核酸を含む、１８に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
２０．腫瘍細胞抗原が、ＣＤ４７、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＦＬＴ３、ＢＣＭＡ、ＥＧＦＲ、およびメソテリンからなる群から選択される、１９に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
２１．ＣＡＲが、直鎖状抗体、単鎖ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、および一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）からなる群から選択される抗原結合ドメインを含む、１９または２０に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
２２．ＣＡＲが、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（４１ＢＢ）、ＩＣＯＳ、およびＯＸ４０からなる群から選択される１つ以上のポリペプチドをさらに含む、１９に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
２３．ＣＤ３ゼータ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（４１ＢＢ）、ＩＣＯＳ、またはＯＸ４０のうちの１つ以上が、免疫グロブリン様ドメインヒンジおよび任意選択的にスペーサー配列によってＣＡＲ抗原結合ドメインに連結されている、２２に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
２４．ドナー鋳型が、４に記載のタンパク質をコードする遺伝子もしくは遺伝子の一部分核酸またはその遺伝子の調節領域を含み、核酸が、タンパク質をコードするゲノム核酸配列またはその調節領域と比較して１つ以上のヌクレオチドの欠失、挿入または、変異を含む、１８～２３のいずれか１つに記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
２５．１～１７のいずれか１つに記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系をコードする配列を含む、核酸。
２６．２５に記載の核酸を含む、ベクター。
２７．ドナー鋳型を含むベクターであって、ドナー鋳型が、ｉ）疾患抗原、任意選択的に、腫瘍細胞抗原に特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、および／またはｉｉ）ベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、Ｔ細胞受容体アルファ鎖定常領域（ＴＲＡＣ）、クラスＩＩ主要組織適合性複合体トランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）、Ｔ細胞受容体ベータ定常１（ＴＲＢＣ１）、Ｔ細胞受容体ベータ定常２（ＴＲＢＣ２）、ヒト白血球抗原Ａ（ＨＬＡ－Ａ）、およびヒト白血球抗原Ｂ（ＨＬＡ－Ｂ）からなる群から選択されるタンパク質をコードする遺伝子もしくは遺伝子の一部分、またはｉｉｉ）ｉｉ）の遺伝子の調節領域をコードする核酸を含む、ベクター。
２８．腫瘍細胞抗原が、ＣＤ４７、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＦＬＴ３、ＢＣＭＡ、ＥＧＦＲ、およびメソテリンからなる群から選択される、２７に記載のベクター。
２９．ＣＡＲが、直鎖状抗体、単鎖ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、および一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）からなる群から選択される抗原結合ドメインを含む、２７または２８に記載のベクター。
３０．ＣＡＲが、抗原結合ドメインに連結されたＣＤ３ゼータ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（４１ＢＢ）、ＩＣＯＳ、およびＯＸ４０からなる群から選択される１つ以上のポリペプチドをさらに含む、２９に記載のベクター。
３１．ＣＤ３ゼータ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（４１ＢＢ）、ＩＣＯＳ、またはＯＸ４０のうちの１つ以上が、免疫グロブリン様ドメインヒンジおよび任意選択的にリンカー配列によってＣＡＲ抗原結合ドメインに連結されている、３０に記載のベクター。
３２．２５に記載の核酸をさらに含む、２７～３１のいずれか１つに記載のベクター。
３３．ベクターが、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクター、プラスミド、ミニサークル、ナノプラスミド、およびＲＮＡベクターからなる群から選択される、２６～３２のいずれか１つに記載のベクター。
３４．細胞の標的配列を改変する方法であって、細胞を、ａ）１～２４のいずれか１つに記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系、ｂ）２５に記載の核酸、ｃ）２６～３３のいずれか１つに記載のベクター、またはｄ）上記のａ）～ｃ）のうちのいずれかと接触させることを含む、方法。
３５．タンパク質の発現が操作されていない細胞と比較して少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％減少するように細胞が操作されている、３４に記載の方法。
３６．細胞がタンパク質を検出可能なレベルで発現しないように細胞が操作されている、３４または３５に記載の方法。
３７．タンパク質が、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、およびＣＩＩＴＡからなる群から選択される、３５または３６に記載の方法。
３８．３４または３５に記載の方法によって操作された細胞集団であって、操作された細胞の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％がＭＨＣクラスＩ分子を検出可能なレベルで発現しないように細胞が操作されている、細胞集団。
３９．３４または３５に記載の方法によって操作された細胞集団であって、操作された細胞の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％が野生型Ｔ細胞受容体を検出可能なレベルで発現しないように細胞が操作されている、細胞集団。
４０．操作された細胞の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を検出可能なレベルで発現するように細胞が操作されている、３８または３９に記載細胞集団。
４１．細胞が、非霊長類哺乳動物細胞、非ヒト霊長類細胞、またはヒト細胞である、３８～４０のいずれか１つに記載の細胞集団。
４２．細胞が、前駆細胞、造血幹細胞、および多能性幹細胞からなる群から選択される、３８～４１のいずれか１つに記載の細胞集団。
４３．細胞が人工多能性幹細胞である、４２に記載の細胞集団。
４４．細胞が免疫細胞である、３８～４１のいずれか１つに記載の細胞集団。
４５．免疫細胞が、Ｔ細胞、ＴＲＥＧ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、または樹状細胞である、４４に記載の細胞集団。
４６．免疫細胞がＴ細胞であり、Ｔ細胞が、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、またはそれらの組み合わせである、４５に記載の細胞集団。
４７．細胞が、細胞を投与される患者に対して自己である、３８～４６のいずれか１つに記載の細胞集団。
４８．細胞が、細胞を投与される患者に対して同種異系である、３８～４６のいずれか１つに記載の細胞集団。
４９．１～２４のいずれか１つに記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系を含む、細胞集団。
５０．細胞が、ｉ）疾患抗原、任意選択的に、腫瘍細胞抗原に特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する、および／またはｉｉ）４に記載のタンパク質の発現を妨害するように操作されている、４９に記載の細胞集団。
５１．操作された細胞の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％がＣＡＲを検出可能なレベルで発現する、５０に記載の細胞集団。
５２．タンパク質の発現が操作されていない細胞と比較して少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％減少するように細胞が操作されている、５０または５１に記載の細胞集団。
５３．細胞が、細胞を投与される患者に対して自己である、４９～５２のいずれか１つに記載の細胞集団。
５４．細胞が、細胞を投与される患者に対して同種異系である、４９～５２のいずれか１つに記載の細胞集団。
５５．操作された細胞の少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％がＭＨＣクラスＩ分子を検出可能なレベルで発現しない、４９～５４のいずれか１つに記載の細胞集団。
５６．操作された細胞の少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％が野生型Ｔ細胞受容体を検出可能なレベルで発現しない、４９～５５のいずれか１つに記載の細胞集団。
５７．対象に抗腫瘍免疫を提供する方法であって、対象に、４９～５６のいずれか１つに記載の細胞の有効量を投与することを含む、方法。
５８．腫瘍抗原の発現に関連する疾患を有するか、または自己免疫疾患を有する対象を治療する方法であって、対象に、４９～５６のいずれか１つに記載の細胞の有効量を投与することを含む、方法。
５９．腫瘍抗原の発現に関連する疾患が、結腸がん、直腸がん、腎細胞がん、肝がん、非小細胞肺がん、小腸がん、食道がん、黒色腫、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部がん、皮膚または眼球内悪性黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門部がん、胃がん、精巣がん、卵管がん、子宮内膜がん、頸がん、膣がん、外陰がん、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、内分泌系がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、小児固形腫瘍、膀胱がん、腎臓がんまたは尿管がん、腎盂がん、中枢神経系（ＣＮＳ）新生物、ＣＮＳ原発リンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮がん、扁平上皮がん、Ｔ細胞リンパ腫、環境誘発性がん、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性白血病、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、Ｂ細胞急性リンパ性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞新生物、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞または大細胞濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性状態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成および骨髄異形成症候群、ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞新生物、ワルデンストレームマクログロブリン血症、前白血病、当該がんの組み合わせ、ならびに当該がんの転移性病巣からなる群から選択されるがんである、５８に記載の方法。
６０．方法が、化学療法剤を投与することをさらに含む、５７～５９のいずれか１つに記載の方法。
６１．免疫療法のための細胞を調製する方法であって、ｉ）抗原プロセシング、抗原提示、抗原認識、および／または抗原応答に関与するタンパク質、またはｉｉ）そのタンパク質の調節領域の発現を減少させるまたは排除することによって免疫細胞を修飾することを含む、方法。
６２．免疫細胞の核酸を、ＣａｓＸポリペプチドおよびガイド核酸（ｇＮＡ）を含むＣａｓＸ：ｇＮＡ系と接触させることを含み、ｇＮＡが、（ａ）タンパク質をコードする遺伝子もしくは遺伝子の一部分の核酸配列またはその遺伝子の調節領域に相補的であるか、または（ｂ）タンパク質をコードする核酸配列の相補体またはその調節領域に相補的である標的配列を含む、６１に記載の方法。
６３．タンパク質が、ベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、Ｔ細胞受容体アルファ鎖定常領域（ＴＲＡＣ）、クラスＩＩ主要組織適合性複合体トランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）、Ｔ細胞受容体ベータ定常１（ＴＲＢＣ１）、Ｔ細胞受容体ベータ定常２（ＴＲＢＣ２）、ヒト白血球抗原Ａ（ＨＬＡ－Ａ）、およびヒト白血球抗原Ｂ（ＨＬＡ－Ｂ）からなる群から選択される、６１に記載の方法。
６４．（ａ）分化群２４７（ＣＤ２４７）、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ５２、ヒト白血球抗原Ｃ（ＨＬＡ－Ｃ）、デオキシシチジンキナーゼ（ｄＣＫ）、およびＦＫＢＰ１Ａからなる群から選択されるタンパク質をコードする核酸配列に相補的であるか、または（ｂ）分化群２４７（ＣＤ２４７）、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ５２、ヒト白血球抗原Ｃ（ＨＬＡ－Ｃ）、デオキシシチジンキナーゼ（ｄＣＫ）、およびＦＫＢＰ１Ａからなる群から選択されるタンパク質をコードする核酸配列の相補体に相補的である標的配列を含むｇＮＡをさらに含む、６３に記載の方法。
６５．タンパク質の発現が操作されていない細胞と比較して少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％減少するように細胞が操作されている、６１～６４のいずれか１つに記載の方法。
６６．細胞がタンパク質を検出可能なレベルで発現しないように細胞が操作されている、６１～６５のいずれか１つに記載の方法。
６７．タンパク質が、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、およびＣＩＩＴＡからなる群から選択される、６５または６６に記載の方法。
６８．操作された細胞の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％がＭＨＣクラスＩ分子を検出可能なレベルで発現しないように細胞が操作されている、６１～６７のいずれか１つに記載の方法。
６９．操作された細胞の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％が野生型Ｔ細胞受容体を検出可能なレベルで発現しないように細胞が操作されている、６１～６８に記載の方法。
７０．免疫細胞の核酸をドナー鋳型核酸と接触させることをさらに含み、ドナー鋳型が腫瘍細胞抗原に特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含む、６１～６９のいずれか１つに記載の方法。
７１．腫瘍細胞抗原が、ＣＤ４７、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＦＬＴ３、ＢＣＭＡ、ＥＧＦＲ、およびメソテリンからなる群から選択される、７０に記載の方法。
７２．ＣＡＲが、直鎖状抗体、単鎖ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、および一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）からなる群から選択される抗原結合ドメインを含む、７０または７１に記載の方法。
７３．ＣＡＲが、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（４１ＢＢ）、ＩＣＯＳ、およびＯＸ４０からなる群から選択される１つ以上のポリペプチドを含む、７２に記載の方法。
７４．ＣＤ３ゼータ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（４１ＢＢ）、ＩＣＯＳ、またはＯＸ４０のうちの１つ以上が、免疫グロブリン様ドメインヒンジおよび任意選択的にスペーサー配列によってＣＡＲ抗原結合ドメインに連結されている、７３に記載の方法。
７５．当該細胞の集団を増殖させることをさらに含む、６１～７４のいずれか１つに記載の方法。
７６．治療を必要とする対象を治療する方法であって、６１～７５のいずれか１つに記載の方法によって調製された細胞を投与することを含む、方法。
７７．治療を必要とする対象を治療する方法であって、６１～７５のいずれか１つに記載の方法によって調製された細胞を免疫抑制剤と組み合わせて投与することを含む、方法。
７８．細胞が対象に対して自己である、７６または７７に記載の方法。
７９．細胞が対象に対して同種異系である、７６または７７に記載の方法。
８０．対象が腫瘍抗原の発現に関連する疾患を有し、当該投与が腫瘍抗原の発現に関連する当該疾患を治療する、７６～７９のいずれか１つに記載の方法。
８１．腫瘍抗原の発現に関連する疾患が、結腸がん、直腸がん、腎細胞がん、肝がん、非小細胞肺がん、小腸がん、食道がん、黒色腫、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部がん、皮膚または眼球内悪性黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門部がん、胃がん、精巣がん、卵管がん、子宮内膜がん、頸がん、膣がん、外陰がん、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、内分泌系がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、小児固形腫瘍、膀胱がん、腎臓がんまたは尿管がん、腎盂がん、中枢神経系（ＣＮＳ）新生物、ＣＮＳ原発リンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮がん、扁平上皮がん、Ｔ細胞リンパ腫、環境誘発性がん、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性白血病、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、Ｂ細胞急性リンパ性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞新生物、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞または大細胞濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性状態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成および骨髄異形成症候群、ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞新生物、ワルデンストレームマクログロブリン血症、前白血病、当該がんの組み合わせ、ならびに当該がんの転移性病巣からなる群から選択されるがんである、８０に記載の方法。
実施例１：ＣａｓＸ Ｓｔｘ２の作製、発現、および精製
１．増殖および発現
Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓに由来するＣａｓＸ Ｓｔｘ２（本明細書ではＣａｓＸ２とも称される）の発現構築物（配列番号２のＣａｓＸアミノ酸配列を有し、以下の表６の配列によってコードされる）を、Ｅ．ｃｏｌｉ用にコドン最適化した遺伝子断片（Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）から構築した。組み立てた構築物は、ＴＥＶ切断可能なＣ末端ＴｗｉｎＳｔｒｅｐタグを含み、この構築物を、アンピシリン耐性遺伝子を含むｐＢＲ３２２誘導体プラスミド骨格にクローニングした。発現構築物を化学的コンピテントＢＬ２１＊（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌｉに形質転換し、種培養物を、ＵｌｔｒａＹｉｅｌｄフラスコ（Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ）内で、カルベニシリンを補充したＬＢブロス中、３７℃、２００ＲＰＭで一晩増殖させた。翌日、この培養物を使用して、１：１００（種培養物：発現培養物）の比率で発現培養物を播種した。発現培養物はカルベニシリンを補充したＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ（Ｎｏｖａｇｅｎ）であり、この発現培養物をＵｌｔｒａＹｉｅｌｄフラスコ内で、３７℃、２００ＲＰＭで増殖させた。培養物が２の光学密度（ＯＤ）に達した時点で、それらを１６℃に冷却し、ＩＰＴＧ（イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド）を添加して、１Ｍストックから１ｍＭの最終濃度にした。培養物を１６℃、２００ＲＰＭで２０時間誘発した後、４℃で１５分間にわたる４，０００×ｇでの遠心分離によって回収した。細胞ペーストを秤量し、細胞ペースト１グラムあたり５ｍＬの溶解緩衝液の比率で溶解緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＴＣＥＰ、１ｍＭベンズアミジン塩酸塩、１ｍＭ ＰＭＳＦ、０．５％ＣＨＡＰＳ、１０％グリセロール、ｐＨ８）中に再懸濁した。再懸濁した時点で、精製するまで試料を－８０℃で凍結させた。
２．精製
凍結した試料を磁気撹拌しながら４℃で一晩解凍した。結果として得られた溶解物の粘度を超音波処理によって減少させ、Ｅｍｕｌｓｉｆｌｅｘ Ｃ３（Ａｖｅｓｔｉｎ）を使用して１７ｋ ＰＳＩで３回通過させて均質化することによって溶解を完了した。溶解物を４℃で３０分間にわたる５０，０００×ｇでの遠心分離によって清澄化し、上清を回収した。清澄化した上清を重力流によりＨｅｐａｒｉｎ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラム（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に適用した。カラムを、５ＣＶのヘパリン緩衝液Ａ（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＴＣＥＰ、１０％グリセロール、ｐＨ８）で洗浄し、その後、５ＣＶのヘパリン緩衝液Ｂ（緩衝液ＡのＮａＣｌ濃度を５００ｍＭに調整したもの）で洗浄した。タンパク質を、５ＣＶのヘパリン緩衝液Ｃ（緩衝液ＡのＮａＣｌ濃度を１Ｍに調整したもの）で溶出し、画分を収集した。画分をＢｒａｄｆｏｒｄアッセイによってタンパク質についてアッセイし、タンパク質含有画分をプールした。プールしたヘパリン溶出液を重力流によってＳｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎ ＸＴ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗカラム（ＩＢＡ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に適用した。カラムを、５ＣＶのＳｔｒｅｐ緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＴＣＥＰ、１０％グリセロール、ｐＨ８）で洗浄した。タンパク質を、５０ｍＭのＤ－ビオチンを添加した５ＣＶのＳｔｒｅｐ緩衝液を使用してカラムから溶出し、画分を収集した。ＣａｓＸ含有画分をプールし、３０ｋＤａのカットオフスピンコンセントレーターを使用して４℃で濃縮し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇカラム（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）でのサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。カラムを、ＡＫＴＡ Ｐｕｒｅ ＦＰＬＣシステム（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって操作されるＳＥＣ緩衝液（２５ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＴＣＥＰ、１０％グリセロール、ｐＨ７．２５）で平衡化した。適切な分子量で溶出したＣａｓＸ含有画分をプールし、３０ｋＤａのカットオフスピンコンセントレーターを使用して４℃で濃縮し、アリコートし、液体窒素中で急速凍結した後、－８０℃で保管した。
３．結果
図１および図３に示されるように、精製を通して得られた試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離し、コロイド状クーマシー染色によって視覚化した。図１では、レーンは、左から右に、分子量標準、ペレット：細胞溶解後の不溶性部分、溶解物：細胞溶解後の可溶性部分、フロースルー：ヘパリンカラムに結合しなかったタンパク質、洗浄：洗浄緩衝液中のカラムから溶出したタンパク質、溶出：溶出緩衝液を用いてヘパリンカラムから溶出したタンパク質、フロースルー：ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎＸＴカラムに結合しなかったタンパク質、溶出：溶出緩衝液を用いてＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ ＸＴカラムから溶出したタンパク質、注入：ｓ２００ゲル濾過カラムに注入した濃縮タンパク質、凍結：濃縮して凍結させたｓ２００溶出からのプールした画分である。図３では、レーンは、右から左に、注入（ゲル濾過カラムに注入したタンパク質の試料）分子量マーカーであり、レーン３～９は、指定した溶出体積からの試料である。ゲル濾過の結果を図２に示す。６８．３６ｍＬのピークは、ＣａｓＸの見かけの分子量に対応し、ＣａｓＸタンパク質の大部分を含有した。コロイド状クーマシー染色によって評価した場合、平均収量は、７５％の純度で培養液１リットルあたり０．７５ｍｇの精製ＣａｓＸタンパク質であった。
実施例２：ＣａｓＸ構築物１１９、４３８、および４５７
ＣａｓＸ １１９、４３８、および４５７構築物（表７の配列）を生成するために、コドン最適化ＣａｓＸ ３７構築物（Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ ＣａｓＸ配列番号２をコードし、Ａ７０８Ｋ置換および融合ＮＬＳによる［Ｐ７９３］欠失、ならびに連結したガイド配列および非標的配列を有する実施例１の野生型ＣａｓＸ Ｓｔｘ２構築物に基づく）を、標準クローニング法を使用して、哺乳動物発現プラスミド（ｐＳｔＸ、図４を参照されたい）にクローニングした。ＣａｓＸ １１９を構築するために、ＣａｓＸ ３７構築物ＤＮＡを、それぞれ、プライマーｏＩＣ５３９およびｏＩＣ８８ならびにｏＩＣ８７およびｏＩＣ５４０を使用して、製造業者のプロトコルに従ってＱ５ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ番号Ｍ０４９１Ｌ）を使用した２つの反応でＰＣＲ増幅した（図５を参照されたい）。ＣａｓＸ ４５７を構築するために、ＣａｓＸ ３６５構築物ＤＮＡを、それぞれ、プライマーｏＩＣ５３９およびｏＩＣ２１２、ｏＩＣ２１１およびｏＩＣ３７６、ｏＩＣ３７５およびｏＩＣ５５１、ならびにｏＩＣ５５０およびｏＩＣ５４０を使用して、製造業者のプロトコルに従ってＱ５ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ番号Ｍ０４９１Ｌ）を使用した４つの反応でＰＣＲ増幅した。ＣａｓＸ ４３８を構築するために、ＣａｓＸ １１９構築物ＤＮＡを、それぞれ、プライマーｏＩＣ５３９およびｏＩＣ６８９、ｏＩＣ６８８およびｏＩＣ３７６、ｏＩＣ３７５およびｏＩＣ５５１、ならびにｏＩＣ５５０およびｏＩＣ５４０を使用して、製造業者のプロトコルに従ってＱ５ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ番号Ｍ０４９１Ｌ）を使用した４つの反応でＰＣＲ増幅した。その後、結果として得られたＰＣＲ増幅産物を、製造業者のプロトコルに従ってＺｙｍｏｃｌｅａｎ ＤＮＡクリーンおよびコンセントレーター（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号４０１４）を使用して精製した。ＸｂａＩおよびＳｐｅＩを使用してｐＳｔＸ骨格を消化して、プラスミドｐＳｔｘ３４における２つの部位間のＤＮＡの２９３１塩基対断片を除去した。消化した骨格断片を、製造業者のプロトコルに従ってＺｙｍｏｃｌｅａｎ Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号Ｄ４００２）を使用して１％アガロースゲル（Ｇｏｌｄ Ｂｉｏ、カタログ番号Ａ－２０１－５００）からゲル抽出によって精製した。その後、３つの断片を、製造業者のプロトコルに従ってＧｉｂｓｏｎアセンブリ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ番号Ｅ２６２１Ｓ）を使用してつなぎ合わせた。ｐＳｔｘ３４において組み立てた産物を、カルベニシリンを含有するＬＢ寒天プレート（ＬＢ：Ｔｅｋｎｏｖａ、カタログ番号Ｌ９３１５、寒天：Ｑｕａｒｔｚｙ、カタログ番号２１４５１０）上にプレーティングした、化学的コンピテントまたは電気的コンピテントＴｕｒｂｏ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ細菌細胞に形質転換した。個々のコロニーを採取し、製造業者のプロトコルに従ってＱｉａｇｅｎ Ｑｉａｐｒｅｐ ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２７１０４）を使用してミニプレップした。結果として得られたプラスミドを、サンガーシークエンシングを使用して配列決定して、正しいアセンブリを確実にした。ｐＳｔＸ３４は、タンパク質に対するＥＦ－１αプロモーターならびにピューロマイシンおよびカルベニシリンの両方に対する選択マーカーを含む。目的とする遺伝子を標的とする標的配列をコードする配列を、ＣａｓＸ ＰＡＭ位置に基づいて設計した。標的配列ＤＮＡを、標的配列およびこの配列の逆相補体からなる一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）オリゴ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）として注文した。これらの２つのオリゴを一緒にアニーリングし、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ番号Ｍ０２０２Ｌ）およびプラスミドの適切な制限酵素を使用してＧｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅアセンブリによって個別にまたはバルクでｐＳｔＸにクローニングした。Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ産物を、カルベニシリンを含有するＬＢ寒天プレート（ＬＢ：Ｔｅｋｎｏｖａ、カタログ番号Ｌ９３１５、寒天：Ｑｕａｒｔｚｙ、カタログ番号２１４５１０）上にプレーティングした、ＮＥＢ Ｔｕｒｂｏ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ（ＮＥＢ、カタログ番号Ｃ２９８４Ｉ）などの化学的または電気的コンピテント細胞に形質転換した。個々のコロニーを採取し、製造業者のプロトコルに従ってＱｉａｇｅｎ Ｑｉａｐｒｅｐ ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２７１０４）を使用してミニプレップした。結果として得られたプラスミドを、サンガーシークエンシングを使用して配列決定して、正しいライゲーションを確実にした。ＳａＣａｓ９およびＳｐｙＣａｓ９対照プラスミドを、ｐＳｔＸのタンパク質およびガイド領域をそれぞれのタンパク質およびガイドと交換して、上記のｐＳｔＸプラスミドと同様に調製した。ＳａＣａｓ９およびＳｐｙＣａｓ９の標的配列は、文献からから得たものまたは確立された方法に従って合理的に設計したもののいずれかであった。ＣａｓＸ １１９および４５７タンパク質の発現および回収を、実施例１の一般的な方法論を使用して行った（しかしながら、ＤＮＡ配列をＥ．ｃｏｌｉにおける発現のためにコドン最適化した）。ＣａｓＸ １１９の分析アッセイの結果を図６～８に示す。コロイド状クーマシー染色によって評価した場合、ＣａｓＸ １１９の平均収量は、７５％の純度で培養液１リットルあたり１．５６ｍｇの精製ＣａｓＸタンパク質であった。図６は、記載されるように、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｓｔａｉｎ－Ｆｒｅｅ（商標）ゲル上で視覚化された、精製試料のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを示す。レーンは、左から右に、ペレット：細胞溶解後の不溶性部分、溶解物：細胞溶解後の可溶性部分、フロースルー：ヘパリンカラムに結合しなかったタンパク質、洗浄：洗浄緩衝液中のカラムから溶出したタンパク質、溶出：溶出緩衝液を用いてヘパリンカラムから溶出したタンパク質、フロースルー：ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎＸＴカラムに結合しなかったタンパク質、溶出：溶出緩衝液を用いてＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ ＸＴカラムから溶出したタンパク質、注入：ｓ２００ゲル濾過カラムに注入した濃縮タンパク質、凍結：濃縮して凍結させたｓ２００溶出からのプールした画分である。
図７は、記載されるように、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １６／６００ ｐｇゲル濾過のクロマトグラムを示す。溶出体積に対して２８０ｎｍの吸光度としてプロットしたＣａｓＸバリアント１１９タンパク質のゲル濾過泳動。６５．７７ｍＬのピークは、ＣａｓＸバリアント１１９の見かけの分子量に対応し、ＣａｓＸバリアント１１９タンパク質の大部分を含有した。図８は、記載されるように、コロイド状クーマシーで染色したゲル濾過使用のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを示す。指定した画分由来の試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離し、コロイド状クーマシーで染色した。右から左に、注入：ゲル濾過カラムに注入したタンパク質の試料、分子量マーカー、レーン３～１０：指定した溶出体積からの試料。
実施例３：ＣａｓＸ構築物４８８および４９１
ＣａｓＸ ４８８構築物（表８の配列）を生成するために、コドン最適化ＣａｓＸ １１９構築物（Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ ＣａｓＸ配列番号２をコードし、Ａ７０８Ｋ置換、Ｌ３７９Ｒ置換、および融合ＮＬＳによる［Ｐ７９３］欠失、ならびに連結したガイド配列および非標的配列を有する実施例１の野生型ＣａｓＸ Ｓｔｘ２構築物に基づく）を、標準クローニング法を使用して、哺乳動物発現プラスミド（ｐＳｔＸ、図４を参照されたい）にクローニングした。構築物ＣａｓＸ １（ＣａｓＸ配列番号１をコードする実施例１のＣａｓＸ Ｓｔｘ１構築物に基づく）を、標準クローニング法を使用して目的のベクターにクローニングした。ＣａｓＸ ４８８を構築するために、ＣａｓＸ １１９構築物ＤＮＡを、プライマーｏＩＣ７６５およびｏＩＣ７６２を使用して、製造業者のプロトコルに従ってＱ５ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ番号Ｍ０４９１Ｌ）を使用してＰＣＲ増幅した（図５を参照されたい）。ＣａｓＸ １構築物を、プライマーｏＩＣ７６６およびｏＩＣ７８４を使用して、製造業者のプロトコルに従ってＱ５ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ番号Ｍ０４９１Ｌ）を使用してＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物を、製造業者のプロトコルに従ってＺｙｍｏｃｌｅａｎ Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号Ｄ４００２）を使用して１％アガロースゲル（Ｇｏｌｄ Ｂｉｏ、カタログ番号Ａ－２０１－５００）からゲル抽出によって精製した。その後、２つの断片を、製造業者のプロトコルに従ってＧｉｂｓｏｎアセンブリ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ番号Ｅ２６２１Ｓ）を使用してつなぎ合わせた。ｐＳｔｘ１において組み立てた産物を、カナマイシンを含有するＬＢ寒天プレート（ＬＢ：Ｔｅｋｎｏｖａ、カタログ番号Ｌ９３１５、寒天：Ｑｕａｒｔｚｙ、カタログ番号２１４５１０）上にプレーティングした、化学的コンピテントＴｕｒｂｏ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ細菌細胞に形質転換した。個々のコロニーを採取し、製造業者のプロトコルに従ってＱｉａｇｅｎ Ｑｉａｐｒｅｐ ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２７１０４）を使用してミニプレップした。結果として得られたプラスミドを、サンガーシークエンシングを使用して配列決定して、正しいアセンブリを確実にした。その後、制限酵素クローニングを使用して、正しいクローンを哺乳動物発現ベクターｐＳｔｘ３４にサブクローニングした。ｐＳｔｘ１におけるｐＳｔｘ３４骨格およびＣａｓＸ ４８８クローンを、それぞれ、ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで消化した。消化した骨格断片および挿入物断片を、製造業者のプロトコルに従ってＺｙｍｏｃｌｅａｎ Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号Ｄ４００２）を使用して１％アガロースゲル（Ｇｏｌｄ Ｂｉｏ、カタログ番号Ａ－２０１－５００）からゲル抽出によって精製した。その後、きれいな骨格および挿入物を、製造業者のプロトコルに従ってＴ４リガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、カタログ番号Ｍ０２０２Ｌ）を使用して一緒にライゲーションした。ライゲーションした産物を、カルベニシリンを含有するＬＢ寒天プレート（ＬＢ：Ｔｅｋｎｏｖａ、カタログ番号Ｌ９３１５、寒天：Ｑｕａｒｔｚｙ、カタログ番号２１４５１０）上にプレーティングした、化学的コンピテントＴｕｒｂｏ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ細菌細胞に形質転換した。個々のコロニーを採取し、製造業者のプロトコルに従ってＱｉａｇｅｎ Ｑｉａｐｒｅｐ ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２７１０４）を使用してミニプレップした。結果として得られたプラスミドを、サンガーシークエンシングを使用して配列決定して、正しいアセンブリを確実にした。
ＣａｓＸ ４９１（表８の配列）を生成するために、ＣａｓＸ ４８４構築物ＤＮＡを、プライマーｏＩＣ７６５およびｏＩＣ７６２を使用して、製造業者のプロトコルに従ってＱ５ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ番号Ｍ０４９１Ｌ）を使用してＰＣＲ増幅した（図５を参照されたい）。ＣａｓＸ １構築物を、プライマーｏＩＣ７６６およびｏＩＣ７８４を使用して、製造業者のプロトコルに従ってＱ５ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ番号Ｍ０４９１Ｌ）を使用してＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物を、製造業者のプロトコルに従ってＺｙｍｏｃｌｅａｎ Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号Ｄ４００２）を使用して１％アガロースゲル（Ｇｏｌｄ Ｂｉｏ、カタログ番号Ａ－２０１－５００）からゲル抽出によって精製した。その後、２つの断片を、製造業者のプロトコルに従ってＧｉｂｓｏｎアセンブリ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ番号Ｅ２６２１Ｓ）を使用してつなぎ合わせた。ｐＳｔｘ１において組み立てた産物を、カナマイシンを含有するＬＢ寒天プレート（ＬＢ：Ｔｅｋｎｏｖａ、カタログ番号Ｌ９３１５、寒天：Ｑｕａｒｔｚｙ、カタログ番号２１４５１０）上にプレーティングした、化学的コンピテントＴｕｒｂｏ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ細菌細胞に形質転換した。個々のコロニーを採取し、製造業者のプロトコルに従ってＱｉａｇｅｎ Ｑｉａｐｒｅｐ ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２７１０４）を使用してミニプレップした。結果として得られたプラスミドを、サンガーシークエンシングを使用して配列決定して、正しいアセンブリを確実にした。その後、制限酵素クローニングを使用して、正しいクローンを哺乳動物発現ベクターｐＳｔｘ３４にサブクローニングした。ｐＳｔｘ１におけるｐＳｔｘ３４骨格およびＣａｓＸ ４９１クローンを、それぞれ、ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで消化した。消化した骨格断片および挿入物断片を、製造業者のプロトコルに従ってＺｙｍｏｃｌｅａｎ Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号Ｄ４００２）を使用して１％アガロースゲル（Ｇｏｌｄ Ｂｉｏ、カタログ番号Ａ－２０１－５００）からゲル抽出によって精製した。その後、きれいな骨格および挿入物を、製造業者のプロトコルに従ってＴ４リガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、カタログ番号Ｍ０２０２Ｌ）を使用して一緒にライゲーションした。ライゲーションした産物を、カルベニシリンを含有するＬＢ寒天プレート（ＬＢ：Ｔｅｋｎｏｖａ、カタログ番号Ｌ９３１５、寒天：Ｑｕａｒｔｚｙ、カタログ番号２１４５１０）上にプレーティングした、化学的コンピテントＴｕｒｂｏ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ細菌細胞に形質転換した。個々のコロニーを採取し、製造業者のプロトコルに従ってＱｉａｇｅｎ Ｑｉａｐｒｅｐ ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２７１０４）を使用してミニプレップした。結果として得られたプラスミドを、サンガーシークエンシングを使用して配列決定して、正しいアセンブリを確実にした。ｐＳｔＸ３４は、タンパク質に対するＥＦ－１αプロモーターならびにピューロマイシンおよびカルベニシリンの両方に対する選択マーカーを含む。目的とする遺伝子を標的とする標的配列をコードする配列を、ＣａｓＸ ＰＡＭ位置に基づいて設計した。標的配列ＤＮＡを、標的配列およびこの配列の逆相補体からなる一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）オリゴ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）として注文した。これらの２つのオリゴを一緒にアニーリングし、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ番号Ｍ０２０２Ｌ）およびプラスミドの適切な制限酵素を使用してＧｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅアセンブリによって個別にまたはバルクでｐＳｔＸにクローニングした。Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ産物を、カルベニシリンを含有するＬＢ寒天プレート（ＬＢ：Ｔｅｋｎｏｖａ、カタログ番号Ｌ９３１５、寒天：Ｑｕａｒｔｚｙ、カタログ番号２１４５１０）上にプレーティングした、ＮＥＢ Ｔｕｒｂｏ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ（ＮＥＢ、カタログ番号Ｃ２９８４Ｉ）などの化学的または電気的コンピテント細胞に形質転換した。個々のコロニーを採取し、製造業者のプロトコルに従ってＱｉａｇｅｎ Ｑｉａｐｒｅｐ ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２７１０４）を使用してミニプレップした。結果として得られたプラスミドを、サンガーシークエンシングを使用して配列決定して、正しいライゲーションを確実にした。ＳａＣａｓ９およびＳｐｙＣａｓ９対照プラスミドを、ｐＳｔＸのタンパク質およびガイド領域をそれぞれのタンパク質およびガイドと交換して、上記のｐＳｔＸプラスミドと同様に調製した。ＳａＣａｓ９およびＳｐｙＣａｓ９の標的配列は、文献からから得たものまたは確立された方法に従って合理的に設計したもののいずれかであった。ＣａｓＸ構築物の発現および回収を、実施例１および実施例２の一般的な方法論を使用して行い、同様の結果が得られた。
実施例４：ＣａｓＸ構築物２７８～２８０、２８５～２８８、２９０、２９１、２９３、３００、４９２、および４９３の設計および生成
ＣａｓＸ ２７８～２８０、２８５～２８８、２９０、２９１、２９３、３００、４９２、および４９３構築物（表９の配列）を生成するために、哺乳動物発現ベクターにおけるコドン最適化ＣａｓＸ １１９構築物（Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ ＣａｓＸ配列番号２をコードし、Ａ７０８Ｋ置換および融合ＮＬＳによる［Ｐ７９３］欠失、ならびに連結したガイド配列および非標的配列を有する実施例２のＣａｓＸ Ｓｔｘ３７構築物に基づく）のＮ末端およびＣ末端を操作して、ＮＬＳ配列（表１０の配列）を欠失または付加した。構築物２７８、２７９、および２８０は、ＳＶ４０ ＮＬＳ配列のみを使用したＮ末端およびＣ末端の操作物であった。構築物２８０は、Ｎ末端にＮＬＳを有さず、Ｃ末端に２つのＳＶ４０ ＮＬＳ’が付加されており、２つのＳＶ４０ ＮＬＳ配列間にトリプルプロリンリンカーを有した。構築物２７８、２７９、および２８０を、第１の断片の各々に対するプライマーｏＩＣ５２７およびｏＩＣ５２８、ｏＩＣ７３０およびｏＩＣ５２２、ならびにｏＩＣ７３０およびｏＩＣ５３０を使用し、かつ第２の断片の各々を作製するためにｏＩＣ５２９およびｏＩＣ５２０、ｏＩＣ５１９およびｏＩＣ７３１、ならびにｏＩＣ５２９およびｏＩＣ７３１を使用して、製造業者のプロトコルに従ってＱ５ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ番号Ｍ０４９１Ｌ）を用いてｐＳｔｘ３４．１１９．１７４．ＮＴを増幅することによって作製した。これらの断片を、製造業者のプロトコルに従ってＺｙｍｏｃｌｅａｎ Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号Ｄ４００２）を使用して１％アガロースゲル（Ｇｏｌｄ Ｂｉｏ、カタログ番号Ａ－２０１－５００）からゲル抽出によって精製した。それぞれの断片を、製造業者のプロトコルに従ってＧｉｂｓｏｎアセンブリ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ番号Ｅ２６２１Ｓ）を使用して一緒にクローニングした。ｐＳｔｘ３４において組み立てた産物を、カルベニシリンを含有するＬＢ寒天プレート（ＬＢ：Ｔｅｋｎｏｖａ、カタログ番号Ｌ９３１５、寒天：Ｑｕａｒｔｚｙ、カタログ番号２１４５１０）上にプレーティングし、かつ３７℃でインキュベートした、化学的コンピテントＴｕｒｂｏ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ細菌細胞に形質転換した。個々のコロニーを採取し、製造業者のプロトコルに従ってＱｉａｇｅｎ Ｑｉａｐｒｅｐ ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２７１０４）を使用してミニプレップした。結果として得られたプラスミドを、サンガーシークエンシングを使用して配列決定して、正しいアセンブリを確実にした。目的とする遺伝子を標的とする標的配列をコードする配列を、ＣａｓＸ ＰＡＭ位置に基づいて設計した。標的配列ＤＮＡを、標的配列およびこの配列の逆相補体からなる一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）オリゴ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）として注文した。これらの２つのオリゴを一緒にアニーリングし、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ番号Ｍ０２０２Ｌ）およびプラスミドの適切な制限酵素を使用してＧｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅアセンブリによって個別にまたはバルクでｐＳｔＸにクローニングした。Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ産物を、カルベニシリンを含有するＬＢ寒天プレート（ＬＢ：Ｔｅｋｎｏｖａ、カタログ番号Ｌ９３１５、寒天：Ｑｕａｒｔｚｙ、カタログ番号２１４５１０）上にプレーティングし、かつ３７℃でインキュベートした、ＮＥＢ Ｔｕｒｂｏ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ（ＮＥＢ、カタログ番号Ｃ２９８４Ｉ）などの化学的または電気的コンピテント細胞に形質転換した。個々のコロニーを採取し、製造業者のプロトコルに従ってＱｉａｇｅｎ Ｑｉａｐｒｅｐ ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２７１０４）を使用してミニプレップした。結果として得られたプラスミドを、サンガーシークエンシングを使用して配列決定して、正しいライゲーションを確実にした。
構築物２８５～２８８、２９０、２９１、２９３、および３００を生成するために、ネステッドＰＣＲ法をクローニングのために使用した。使用した骨格ベクターおよびＰＣＲ鋳型は、ＣａｓＸ １１９、ガイド１７４、および非標的スペーサーを有する構築物ｐＳｔｘ３４ ２７９．１１９．１７４．ＮＴであった（配列については、実施例８および実施例９ならびにそれらに記載の表を参照されたい）。構築物２７８は、ＳＶ４０ＮＬＳ－ＣａｓＸ１１９の配置を有する。構築物２７９は、ＣａｓＸ１１９－ＳＶ４０ＮＬＳの配置を有する。構築物２８０は、ＣａｓＸ１１９－ＳＶ４０ＮＬＳ－ＰＰＰリンカー－ＳＶ４０ＮＬＳの配置を有する。構築物２８５は、ＣａｓＸ１１９－ＳＶ４０ＮＬＳ－ＰＰＰリンカー－ＳｙｎｔｈＮＬＳ３の配置を有する。構築物２８６は、ＣａｓＸ１１９－ＳＶ４０ＮＬＳ－ＰＰＰリンカー－ＳｙｎｔｈＮＬＳ４の配置を有する。構築物２８７は、ＣａｓＸ１１９－ＳＶ４０ＮＬＳ－ＰＰＰリンカー－ＳｙｎｔｈＮＬＳ５の配置を有する。構築物２８８は、ＣａｓＸ１１９－ＳＶ４０ＮＬＳ－ＰＰＰリンカー－ＳｙｎｔｈＮＬＳ６の配置を有する。構築物２９０は、ＣａｓＸ１１９－ＳＶ４０ＮＬＳ－ＰＰＰリンカー－ＥＧＬ－１３ ＮＬＳの配置を有する。構築物２９１は、ＣａｓＸ１１９－ＳＶ４０ＮＬＳ－ＰＰＰリンカー－ｃ－Ｍｙｃ ＮＬＳの配置を有する。構築物２９３は、ＣａｓＸ１１９－ＳＶ４０ＮＬＳ－ＰＰＰリンカー－核小体ＲＮＡヘリカーゼＩＩ ＮＬＳの配置を有する。構築物３００は、ＣａｓＸ１１９－ＳＶ４０ＮＬＳ－ＰＰＰリンカー－Ａ型インフルエンザタンパク質ＮＬＳの配置を有する。構築物４９２は、ＳＶ４０ＮＬＳ－ＣａｓＸ１１９－ＳＶ４０ＮＬＳ－ＰＰＰリンカー－ＳＶ４０ＮＬＳの配置を有する。構築物４９３は、ＳＶ４０ＮＬＳ－ＣａｓＸ１１９－ＳＶ４０ＮＬＳ－ＰＰＰリンカー－ｃ－Ｍｙｃ ＮＬＳの配置を有する。各バリアントは３つのＰＣＲのセットを有し、それらのうちの２つはネステッドであり、それらをゲル抽出によって精製し、消化し、その後、消化および精製した骨格にライゲーションした。ｐＳｔｘ３４において組み立てた産物を、カルベニシリンを含有するＬＢ寒天プレート（ＬＢ：Ｔｅｋｎｏｖａ、カタログ番号Ｌ９３１５、寒天：Ｑｕａｒｔｚｙ、カタログ番号２１４５１０）上にプレーティングし、かつ３７℃でインキュベートした、化学的コンピテントＴｕｒｂｏ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ細菌細胞に形質転換した。個々のコロニーを採取し、製造業者のプロトコルに従ってＱｉａｇｅｎ Ｑｉａｐｒｅｐ ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２７１０４）を使用してミニプレップした。結果として得られたプラスミドを、サンガーシークエンシングを使用して配列決定して、正しいアセンブリを確実にした。目的とする遺伝子を標的とする標的配列をコードする配列を、ＣａｓＸ ＰＡＭ位置に基づいて設計した。標的配列ＤＮＡを、標的配列およびこの配列の逆相補体からなる一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）オリゴ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）として注文した。これらの２つのオリゴを一緒にアニーリングし、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ番号Ｍ０２０２Ｌ）およびプラスミドの適切な制限酵素を使用してＧｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅアセンブリによって個別にまたはバルクで結果として得られたｐＳｔＸにクローニングした。Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ産物を、カルベニシリンを含有するＬＢ寒天プレート（ＬＢ：Ｔｅｋｎｏｖａ、カタログ番号Ｌ９３１５、寒天：Ｑｕａｒｔｚｙ、カタログ番号２１４５１０）上にプレーティングし、かつ３７℃でインキュベートした、ＮＥＢ Ｔｕｒｂｏ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ（ＮＥＢ、カタログ番号Ｃ２９８４Ｉ）などの化学的または電気的コンピテント細胞に形質転換した。個々のコロニーを採取し、製造業者のプロトコルに従ってＱｉａｇｅｎ Ｑｉａｐｒｅｐ ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２７１０４）を使用してミニプレップした。結果として得られたプラスミドを、サンガーシークエンシングを使用して配列決定して、正しいライゲーションを確実にした。
構築物４９２および４９３を生成するために、製造業者のプロトコルに従ってＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ（ＮＥＢ番号Ｒ０１４５ＳおよびＮＥＢ番号Ｒ３１３６Ｓ）を使用して構築物２８０および２９１を消化した。次に、それらを、製造業者のプロトコルに従ってＺｙｍｏｃｌｅａｎ Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号Ｄ４００２）を使用して１％アガロースゲル（Ｇｏｌｄ Ｂｉｏ、カタログ番号Ａ－２０１－５００）からゲル抽出によって精製した。最後に、それらを、製造業者のプロトコルに従ってＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ番号Ｍ０２０２Ｓ）を使用して、ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩならびにＺｙｍｏｃｌｅａｎ Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｋｉｔを使用して消化および精製したｐＳｔｘ３４．１１９．１７４．ＮＴにライゲーションした。ｐＳｔｘ３４において組み立てた産物を、カルベニシリンを含有するＬＢ寒天プレート（ＬＢ：Ｔｅｋｎｏｖａ、カタログ番号Ｌ９３１５、寒天：Ｑｕａｒｔｚｙ、カタログ番号２１４５１０）上にプレーティングし、かつ３７℃でインキュベートした、化学的コンピテントＴｕｒｂｏ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ細菌細胞に形質転換した。個々のコロニーを採取し、製造業者のプロトコルに従ってＱｉａｇｅｎ Ｑｉａｐｒｅｐ ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２７１０４）を使用してミニプレップした。結果として得られたプラスミドを、サンガーシークエンシングを使用して配列決定して、正しいアセンブリを確実にした。目的とする遺伝子を標的とする標的スペーサー配列をコードする配列を、ＣａｓＸ ＰＡＭ位置に基づいて設計した。標的配列ＤＮＡを、標的スペーサー配列およびこの配列の逆相補体からなる一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）オリゴ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）として注文した。これらの２つのオリゴを一緒にアニーリングし、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ番号Ｍ０２０２Ｌ）およびそれぞれのプラスミドの適切な制限酵素を使用してＧｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅアセンブリによって個別にまたはバルクで各ｐＳｔＸにクローニングした。Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ産物を、カルベニシリンを含有するＬＢ寒天プレート（ＬＢ：Ｔｅｋｎｏｖａ、カタログ番号Ｌ９３１５、寒天：Ｑｕａｒｔｚｙ、カタログ番号２１４５１０）上にプレーティングし、かつ３７℃でインキュベートした、ＮＥＢ Ｔｕｒｂｏ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ（ＮＥＢ、カタログ番号Ｃ２９８４Ｉ）などの化学的または電気的コンピテント細胞に形質転換した。個々のコロニーを採取し、製造業者のプロトコルに従ってＱｉａｇｅｎ Ｑｉａｐｒｅｐ ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２７１０４）を使用してミニプレップした。結果として得られたプラスミドを、サンガーシークエンシングを使用して配列決定して、正しいライゲーションを確実にした。これらのプラスミドを、実施例１および実施例２の一般的な方法論を利用してＣａｓＸタンパク質を産生および回収するために使用した。
実施例５：ＣａｓＸ構築物３８７、３９５、４８５～４９１、および４９４の設計および生成
ＣａｓＸ ３９５、ＣａｓＸ ４８５、ＣａｓＸ ４８６、ＣａｓＸ ４８７を生成するために、コドン最適化ＣａｓＸ １１９（Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ ＣａｓＸ配列番号２をコードし、Ａ７０８Ｋ置換および融合ＮＬＳによる［Ｐ７９３］欠失、ならびに連結したガイド配列および非標的配列を有する実施例２のＣａｓＸ ３７構築物に基づく）、ＣａｓＸ ４３５、ＣａｓＸ ４３８、およびＣａｓＸ ４８４（各々、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ ＣａｓＸ配列番号２をコードし、Ｌ３７９Ｒ置換、Ａ７０８Ｋ置換、および融合ＮＬＳによる［Ｐ７９３］欠失、ならびに連結したガイド配列および非標的配列を有する実施例２のＣａｓＸ １１９構築物に基づく）を、標準クローニング法を使用して、それぞれ、ＫａｎＲマーカー、ｃｏｌＥ１ ｏｒｉ、および融合ＮＬＳ（ｐＳｔｘ１）を有するＣａｓＸを含む４ｋｂのステージングベクターにクローニングした。Ｇｉｂｓｏｎプライマーを、それ自体のベクターにおいてアミノ酸１９２～３３１からＣａｓＸ配列番号１ヘリカルＩドメインを増幅するように設計して、それぞれ、ｐＳｔｘ１におけるＣａｓＸ １１９、ＣａｓＸ ４３５、ＣａｓＸ ４３８、およびＣａｓＸ ４８４上のこの対応する領域（ａａ１９３～３３２）を置き換えた。ＣａｓＸ配列番号１由来のヘリカルＩドメインを、製造業者のプロトコルに従ってＱ５ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ番号Ｍ０４９１Ｌ）を使用してプライマーｏＩＣ７６８およびｏＩＣ７８４で増幅した。所望のＣａｓＸバリアントを含有する目的のベクターを、製造業者のプロトコルに従ってＱ５ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ番号Ｍ０４９１Ｌ）を使用してプライマーｏＩＣ７６５およびｏＩＣ７６４で増幅した。２つの断片を、製造業者のプロトコルに従ってＺｙｍｏｃｌｅａｎ Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号Ｄ４００２）を使用して１％アガロースゲル（Ｇｏｌｄ Ｂｉｏ、カタログ番号Ａ－２０１－５００）からゲル抽出によって精製した。その後、挿入物断片および骨格断片を、製造業者のプロトコルに従ってＧｉｂｓｏｎアセンブリ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ番号Ｅ２６２１Ｓ）を使用してつなぎ合わせた。ｐＳｔｘ１ステージングベクターにおいて組み立てた産物を、カナマイシンを含有するＬＢ寒天プレート（ＬＢ：Ｔｅｋｎｏｖａ、カタログ番号Ｌ９３１５、寒天：Ｑｕａｒｔｚｙ、カタログ番号２１４５１０）上にプレーティングし、かつ３７℃でインキュベートした、化学的コンピテントＴｕｒｂｏ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ細菌細胞に形質転換した。個々のコロニーを採取し、製造業者のプロトコルに従ってＱｉａｇｅｎ Ｑｉａｐｒｅｐ ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２７１０４）を使用してミニプレップした。結果として得られたプラスミドを、サンガーシークエンシングを使用して配列決定して、正しいアセンブリを確実にした。その後、正しいクローンを切断し、標準クローニング法を使用して哺乳動物発現プラスミド（図５を参照されたい）に貼り付けた。結果として得られたプラスミドを、サンガーシークエンシングを使用して配列決定して、正しいアセンブリを確実にした。目的とする遺伝子を標的とする標的スペーサー配列をコードする配列を、ＣａｓＸ ＰＡＭ位置に基づいて設計した。標的スペーサー配列ＤＮＡを、標的配列およびこの配列の逆相補体からなる一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）オリゴ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）として注文した。これらの２つのオリゴを一緒にアニーリングし、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ番号Ｍ０２０２Ｌ）およびプラスミドの適切な制限酵素を使用してＧｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅアセンブリによって個別にまたはバルクでｐＳｔＸにクローニングした。Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ産物を、カルベニシリンを含有するＬＢ寒天プレート（ＬＢ：Ｔｅｋｎｏｖａ、カタログ番号Ｌ９３１５、寒天：Ｑｕａｒｔｚｙ、カタログ番号２１４５１０）上にプレーティングし、かつ３７℃でインキュベートした、ＮＥＢ Ｔｕｒｂｏ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ（ＮＥＢ、カタログ番号Ｃ２９８４Ｉ）などの化学的または電気的コンピテント細胞に形質転換した。個々のコロニーを採取し、製造業者のプロトコルに従ってＱｉａｇｅｎ Ｑｉａｐｒｅｐ ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２７１０４）を使用してミニプレップした。結果として得られたプラスミドを、サンガーシークエンシングを使用して配列決定して、正しいライゲーションを確実にした。
ＣａｓＸ ４８８、ＣａｓＸ ４８９、ＣａｓＸ ４９０、およびＣａｓＸ ４９１（表１１の配列）を生成するために、コドン最適化ＣａｓＸ １１９（Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ ＣａｓＸ配列番号２をコードし、Ａ７０８Ｋ置換および融合ＮＬＳによる［Ｐ７９３］欠失、ならびに連結したガイド配列および非標的配列を有する実施例２のＣａｓＸ ３７構築物に基づく）、ＣａｓＸ ４３５、ＣａｓＸ ４３８、およびＣａｓＸ ４８４（各々、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ ＣａｓＸ配列番号２をコードし、Ｌ３７９Ｒ置換、Ａ７０８Ｋ置換、および融合ＮＬＳによる［Ｐ７９３］欠失、ならびに連結したガイド配列および非標的配列を有する実施例２のＣａｓＸ１１９構築物に基づく）を、標準クローニング法を使用して、それぞれ、ＫａｎＲマーカー、ｃｏｌＥ１ ｏｒｉ、および融合ＮＬＳ（ｐＳｔｘ１）を有するＳＴＸで構成された４ｋｂのステージングベクターにクローニングした。Ｇｉｂｓｏｎプライマーを、それ自体のベクターにおいてアミノ酸１０１～１９１からＣａｓＸ Ｓｔｘ１ ＮＴＳＢドメインおよびアミノ酸１９２～－３３１からヘリカルＩドメインを増幅するように設計して、それぞれ、ｐＳｔｘ１におけるＣａｓＸ １１９、ＣａｓＸ ４３５、ＣａｓＸ ４３８、およびＣａｓＸ ４８４上のこの類似する領域（ａａ１０３～３３２）を置き換えた。ＣａｓＸ配列番号１由来のＮＴＳＢおよびヘリカルＩドメインを、製造業者のプロトコルに従ってＱ５ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ番号Ｍ０４９１Ｌ）を使用してプライマーｏＩＣ７６６およびｏＩＣ７８４で増幅した。所望のＣａｓＸバリアントを含有する目的のベクターを、製造業者のプロトコルに従ってＱ５ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ番号Ｍ０４９１Ｌ）を使用してプライマーｏＩＣ７６２およびｏＩＣ７６５で増幅した。２つの断片を、製造業者のプロトコルに従ってＺｙｍｏｃｌｅａｎ Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号Ｄ４００２）を使用して１％アガロースゲル（Ｇｏｌｄ Ｂｉｏ、カタログ番号Ａ－２０１－５００）からゲル抽出によって精製した。その後、挿入物断片および骨格断片を、製造業者のプロトコルに従ってＧｉｂｓｏｎアセンブリ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ番号Ｅ２６２１Ｓ）を使用してつなぎ合わせた。ｐＳｔｘ１ステージングベクターにおいて組み立てた産物を、カナマイシンを含有するＬＢ寒天プレート（ＬＢ：Ｔｅｋｎｏｖａ、カタログ番号Ｌ９３１５、寒天：Ｑｕａｒｔｚｙ、カタログ番号２１４５１０）上にプレーティングし、かつ３７℃でインキュベートした、化学的コンピテントＴｕｒｂｏ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ細菌細胞に形質転換した。個々のコロニーを採取し、製造業者のプロトコルに従ってＱｉａｇｅｎ Ｑｉａｐｒｅｐ ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２７１０４）を使用してミニプレップした。結果として得られたプラスミドを、サンガーシークエンシングを使用して配列決定して、正しいアセンブリを確実にした。その後、正しいクローンを切断し、標準クローニング法を使用して哺乳動物発現プラスミド（図５を参照されたい）に貼り付けた。結果として得られたプラスミドを、サンガーシークエンシングを使用して配列決定して、正しいアセンブリを確実にした。目的とする遺伝子を標的とする標的スペーサー配列をコードする配列を、ＣａｓＸ ＰＡＭ位置に基づいて設計した。標的スペーサー配列ＤＮＡを、標的配列およびこの配列の逆相補体からなる一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）オリゴ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）として注文した。これらの２つのオリゴを一緒にアニーリングし、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ番号Ｍ０２０２Ｌ）およびプラスミドの適切な制限酵素を使用してＧｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅアセンブリによって個別にまたはバルクでｐＳｔＸにクローニングした。Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ産物を、カルベニシリンを含有するＬＢ寒天プレート（ＬＢ：Ｔｅｋｎｏｖａ、カタログ番号Ｌ９３１５、寒天：Ｑｕａｒｔｚｙ、カタログ番号２１４５１０）上にプレーティングし、かつ３７℃でインキュベートした、ＮＥＢ Ｔｕｒｂｏ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ（ＮＥＢ、カタログ番号Ｃ２９８４Ｉ）などの化学的または電気的コンピテント細胞に形質転換した。個々のコロニーを採取し、製造業者のプロトコルに従ってＱｉａｇｅｎ Ｑｉａｐｒｅｐ ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２７１０４）を使用してミニプレップした。結果として得られたプラスミドを、サンガーシークエンシングを使用して配列決定して、正しいライゲーションを確実にした。
ＣａｓＸ ３８７およびＣａｓＸ ４９４（表１１の配列）を生成するために、コドン最適化ＣａｓＸ １１９（Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ ＣａｓＸ配列番号２をコードし、Ａ７０８Ｋ置換および融合ＮＬＳによる［Ｐ７９３］欠失、ならびに連結したガイド配列および非標的配列を有する実施例２のＣａｓＸ ３７構築物に基づく）、ならびにＣａｓＸ ４８４（Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ ＣａｓＸ配列番号２をコードし、Ｌ３７９Ｒ置換、Ａ７０８Ｋ置換、および融合ＮＬＳによる［Ｐ７９３］欠失、ならびに連結したガイド配列および非標的配列を有する実施例２のＣａｓＸ１１９構築物に基づく）を、標準クローニング法を使用して、それぞれ、ＫａｎＲマーカー、ｃｏｌＥ１ ｏｒｉ、および融合ＮＬＳ（ｐＳｔｘ１）を有するＳＴＸで構成された４ｋｂのステージングベクターにクローニングした。Ｇｉｂｓｏｎプライマーを、それ自体のベクターにおいてアミノ酸１０１～１９１からＣａｓＸ Ｓｔｘ１ ＮＴＳＢドメインを増幅するように設計して、それぞれ、ｐＳｔｘ１におけるＣａｓＸ １１９およびＣａｓＸ ４８４上のこの類似する領域（ａａ１０３～１９２）を置き換えた。ＣａｓＸ Ｓｔｘ１由来のＮＴＳＢドメインを、製造業者のプロトコルに従ってＱ５ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ番号Ｍ０４９１Ｌ）を使用してプライマーｏＩＣ７６６およびｏＩＣ７６７で増幅した。所望のＣａｓＸバリアントを含有する目的のベクターを、製造業者のプロトコルに従ってＱ５ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ番号Ｍ０４９１Ｌ）を使用してプライマーｏＩＣ７６３およびｏＩＣ７６２で増幅した。２つの断片を、製造業者のプロトコルに従ってＺｙｍｏｃｌｅａｎ Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号Ｄ４００２）を使用して１％アガロースゲル（Ｇｏｌｄ Ｂｉｏ、カタログ番号Ａ－２０１－５００）からゲル抽出によって精製した。その後、挿入物断片および骨格断片を、製造業者のプロトコルに従ってＧｉｂｓｏｎアセンブリ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ番号Ｅ２６２１Ｓ）を使用してつなぎ合わせた。ｐＳｔｘ１ステージングベクターにおいて組み立てた産物を、カナマイシンを含有するＬＢ寒天プレート（ＬＢ：Ｔｅｋｎｏｖａ、カタログ番号Ｌ９３１５、寒天：Ｑｕａｒｔｚｙ、カタログ番号２１４５１０）上にプレーティングし、かつ３７℃でインキュベートした、化学的コンピテントＴｕｒｂｏ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ細菌細胞に形質転換した。個々のコロニーを採取し、製造業者のプロトコルに従ってＱｉａｇｅｎ Ｑｉａｐｒｅｐ ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２７１０４）を使用してミニプレップした。結果として得られたプラスミドを、サンガーシークエンシングを使用して配列決定して、正しいアセンブリを確実にした。その後、正しいクローンを切断し、標準クローニング法を使用して哺乳動物発現プラスミド（図５を参照されたい）に貼り付けた。結果として得られたプラスミドを、サンガーシークエンシングを使用して配列決定して、正しいアセンブリを確実にした。目的とする遺伝子を標的とする標的配列をコードする配列を、ＣａｓＸ ＰＡＭ位置に基づいて設計した。標的配列ＤＮＡを、標的配列およびこの配列の逆相補体からなる一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）オリゴ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）として注文した。これらの２つのオリゴを一緒にアニーリングし、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ番号Ｍ０２０２Ｌ）およびプラスミドの適切な制限酵素を使用してＧｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅアセンブリによって個別にまたはバルクでｐＳｔＸにクローニングした。Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ産物を、カルベニシリンを含有するＬＢ寒天プレート（ＬＢ：Ｔｅｋｎｏｖａ、カタログ番号Ｌ９３１５、寒天：Ｑｕａｒｔｚｙ、カタログ番号２１４５１０）上にプレーティングし、かつ３７℃でインキュベートした、ＮＥＢ Ｔｕｒｂｏ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ（ＮＥＢ、カタログ番号Ｃ２９８４Ｉ）などの化学的または電気的コンピテント細胞に形質転換した。個々のコロニーを採取し、製造業者のプロトコルに従ってＱｉａｇｅｎ Ｑｉａｐｒｅｐ ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２７１０４）を使用してミニプレップした。結果として得られたプラスミドを、サンガーシークエンシングを使用して配列決定して、正しいライゲーションを確実にした。結果として得られた構築物の配列を表１１に列記する。
実施例６：ＲＮＡガイドの生成
ＲＮＡシングルガイドおよびスペーサーの生成について、インビトロ転写のための鋳型を、推奨プロトコルに従ってＱ５ポリメラーゼ（ＮＥＢ Ｍ０４９１）を用いてＰＣＲを行うことによって生成し、鋳型オリゴは各骨格に対するものであり、増幅プライマーはＴ７プロモーターおよびスペーサー配列を有した。Ｔ７プロモーターに対するＤＮＡプライマー配列、ガイドおよびスペーサーに対するガイドおよびスペーサーを以下の表１２に提示する。各足場に対する「骨格ｆｗｄ」および「骨格ｒｅｖ」とラベル付けした鋳型オリゴは各々、２０ｎＭの最終濃度で含まれ、増幅プライマー（Ｔ７プロモーターおよび特有のスペーサープライマー）は各々、１ｕＭの最終濃度で含まれた。ｓｇ２、ｓｇ３２、ｓｇ６４、およびｓｇ１７４ガイドは、転写効率を増加させるためにｓｇ２、ｓｇ３２、およびｓｇ６４を追加の５’Ｇで修飾したことを除いて、それぞれ、配列番号５、２１０４、２１０６、および２２３８に対応する（表１２の配列を表２と比較する）。７．３７スペーサーは、ベータ２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）を標的とする。ＰＣＲ増幅後、鋳型をフェノール－クロロホルム－イソアミルアルコール抽出により洗浄および単離し、その後、エタノールで沈殿させた。
インビトロ転写を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ８．０、３０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、２ｍＭスペルミジン、２０ｍＭ ＤＴＴ、５ｍＭ ＮＴＰ、０．５μＭ鋳型、および１００μｇ／ｍＬ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを含有する緩衝液中で行った。反応物を３７℃で一晩インキュベートした。転写体積１ｍＬあたり２０単位のＤＮａｓｅ Ｉ（Ｐｒｏｍｅｇａ番号Ｍ６１０１））を添加し、１時間インキュベートした。ＲＮＡ産物を変性ＰＡＧＥにより精製し、エタノールで沈殿させ、１倍リン酸緩衝生理食塩水中に再懸濁した。ｓｇＲＮＡを折り畳むために、試料を７０℃で５分間加熱し、その後、室温に冷却した。反応物に１ｍＭの最終ＭｇＣｌ２濃度を補充し、５０℃で５分間加熱し、その後、室温に冷却した。最終ＲＮＡガイド産物を－８０℃で保管した。
実施例７：ＲＮＰアセンブリ
ＣａｓＸの精製した野生型およびＲＮＰならびにシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を、実験の直前に調製するか、または後で使用するために調製し、液体窒素中で急速凍結し、－８０℃で保管するかのいずれかを行った。ＲＮＰ複合体を調製するために、ＣａｓＸタンパク質をｓｇＲＮＡと１：１．２のモル比でインキュベートした。簡潔には、ｓｇＲＮＡを、緩衝液番号１（２５ｍＭ ＮａＰｉ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２００ｍＭトレハロース、１ｍＭ ＭｇＣｌ２）に添加し、その後、ＣａｓＸをｓｇＲＮＡ溶液にゆっくり旋回させながら添加し、３７℃で１０分間インキュベートして、ＲＮＰ複合体を形成した。ＲＮＰ複合体を、使用前に、２００μｌの緩衝液番号１で事前に湿らせた０．２２μｍのＣｏｓｔａｒ ８１６０フィルターに通して濾過した。必要に応じて、ＲＮＰ試料を、所望の体積が得られるまで、０．５ｍｌのＵｌｔｒａ １００－Ｋｄカットオフフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ部品番号ＵＦＣ５１００９６）で濃縮した。切断能力のあるＲＮＰの形成を、実施例１４に記載されるように評価した。
実施例８：ガイドＲＮＡに対する結合親和性の評価
精製した野生型および改善されたＣａｓＸを、塩化マグネシウムおよびヘパリンを含有する低塩緩衝液中で３’Ｃｙ７．５部分を含有する合成シングルガイドＲＮＡとインキュベートして、非特異的結合および凝集を防止する。ｓｇＲＮＡを１０ｐＭの濃度で維持する一方で、タンパク質を別個の結合反応において１ｐＭから１００μＭまで滴定する。反応を平衡状態にさせた後、試料を、それぞれ、タンパク質および核酸に結合するニトロセルロース膜および正に荷電したナイロン膜を用いた真空マニホールドフィルター結合アッセイにかける。ガイドＲＮＡを特定するために膜を画像化し、結合ＲＮＡの非結合ＲＮＡに対する割合を、タンパク質濃度毎にナイロン膜に対するニトロセルロース膜上の蛍光量によって決定して、タンパク質－ｓｇＲＮＡ複合体の解離定数を計算する。この実験をｓｇＲＮＡの改善されたバリアントでも行い、これらの変異が野生型および変異タンパク質に対するガイドの親和性にも影響を与えるかを決定する。我々は、電気移動度シフトアッセイを行い、フィルター結合アッセイと定性的に比較し、凝集ではなく可溶性結合がタンパク質－ＲＮＡ会合の主因であることも確認する。
実施例９：標的ＤＮＡに対する結合親和性の評価
精製した野生型および改善されたＣａｓＸを、標的核酸に相補的な標的配列を有するシングルガイドＲＮＡと複合体形成する。ＲＮＰ複合体を、塩化マグネシウムおよびヘパリンを含有する低塩緩衝液中でＰＡＭおよび標的鎖に５’ Ｃｙ７．５標識を有する適切な標的核酸配列を含有する二本鎖標的ＤＮＡとインキュベートして、非特異的結合および凝集を防止する。標的ＤＮＡを１ｎＭの濃度で維持する一方で、ＲＮＰを別個の結合反応において１ｐＭから１００μＭまで滴定する。反応を平衡状態にさせた後、試料を天然５％ポリアクリルアミドゲル上で泳動させて、結合標的ＤＮＡと非結合標的ＤＮＡを分離する。標的ＤＮＡの移動度シフトを特定するためにゲルを画像化し、結合ＤＮＡの非結合ＤＮＡに対する割合をタンパク質濃度毎に計算して、ＲＮＰ－標的ＤＮＡ三重複合体の解離定数を決定する。
実施例１０：遺伝子標的ＰＣＳＫ９、ＰＭＰ２２、ＴＲＡＣ、ＳＯＤ１、Ｂ２Ｍ、およびＨＴＴの編集
この試験の目的は、６つの遺伝子標的の核酸配列を編集するＣａｓＸバリアント１１９およびｇＮＡバリアント１７４の能力を評価することであった。
材料および方法
Ｂ２ＭおよびＳＯＤ１を除く全ての標的に対するスペーサーを、ＰＡＭ要件（ＴＴＣまたはＣＴＣ）に基づく不偏様式で、目的とする所望の遺伝子座を標的とするように設計した。Ｂ２ＭおよびＳＯＤ１を標的とするスペーサーは、これらの遺伝子に対して行ったレンチウイルススペーサースクリーニングにより、標的とされたエクソン内で以前に特定された。他の標的に対して設計されたスペーサーは、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）オリゴ対としてＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）から注文したものであった。ｓｓＤＮＡスペーサー対を一緒にアニーリングし、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅクローニングにより、以下の構成要素：ＥＦ１Ａプロモーター下のコドン最適化ＣａｓＸ １１９タンパク質＋ＮＬＳ、Ｕ６プロモーター下のガイド足場１７４、カルベニシリンおよびピューロマイシン耐性遺伝子を含有する基礎哺乳動物発現プラスミド構築物にクローニングした。組み立てた産物を、カルベニシリンを含有するＬｂ寒天プレート（ＬＢ：Ｔｅｋｎｏｖａ、カタログ番号Ｌ９３１５、寒天：Ｑｕａｒｔｚｙ、カタログ番号２１４５１０）上にプレーティングし、かつ３７℃でインキュベートした、化学的コンピテントＥ．ｃｏｌｉに形質転換した。個々のコロニーを採取し、製造業者のプロトコルに従ってＱｉａｇｅｎ Ｑｉａｐｒｅｐ ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２７１０４）を使用してミニプレップした。結果として得られたプラスミドを、サンガーシークエンシング（Ｑｕｉｎｔａｒａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によりガイド足場領域を通して配列決定して、正しいライゲーションを確実にした。
ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｓｅｒａｄｉｇｍ、番号１５００－５００）、１００単位／ｍｌのペニシリンおよび１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン（１００×－Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐ、ＧＩＢＣＯ、番号１５１４０－１２２）、ピルビン酸ナトリウム（１００×、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、番号１１３６００７０）、非必須アミノ酸（１００×、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、番号１１１４００５０）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（１００×、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、番号１５６３００８０）、および２－メルカプトエタノール（１０００×、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、番号２１９８５０２３）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｅｌｌｇｒｏ、番号１０－０１３－ＣＶ）中で増殖させた。細胞を、ＴｒｙｐｌＥを使用して３～５日毎に通過させ、３７℃および５％ＣＯ２でインキュベーター内に維持した。
０日目に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を３０ｋ細胞／ウェルで９６ウェル平底プレートに播種した。１日目に、細胞に、製造業者のプロトコルに従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００を使用して１００ｎｇのプラスミドＤＮＡをトランスフェクトした。２日目に、細胞を、ピューロマイシンを含有するＦＢ培地に切り替えた。３日目に、この培地を、ピューロマイシンを含有する新鮮なＦＢ培地と交換した。この時点以降のプロトコルは、目的とする遺伝子に応じて異なった。ＰＣＳＫ９、ＰＭＰ２２、およびＴＲＡＣの場合、４日目に、細胞が選択を完了したことを確認し、ピューロマイシンを含まないＦＢ培地に切り替えた。Ｂ２Ｍ、ＳＯＤ１、およびＨＴＴの場合、４日目に、細胞が選択を完了したことを確認し、ピューロマイシンを含まないＦＢ培地を含有する新たなプレートにＴｒｙｐｌＥを使用して１：３で通過させた。ＰＣＳＫ９、ＰＭＰ２２、およびＴＲＡＣの場合、７日目に、細胞をプレートから持ち上げ、ｄＰＢＳ中で洗浄し、計数し、Ｑｕｉｃｋ Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｌｕｃｉｇｅｎ、ＱＥ０９０５０）中に１０，０００細胞／μｌで再懸濁した。ゲノムＤＮＡを製造業者のプロトコルに従って抽出し、－２０℃で保管した。Ｂ２Ｍ、ＳＯＤ１、およびＨＴＴの場合、７日目に、細胞をプレートから持ち上げ、ｄＰＢＳ中で洗浄し、ゲノムＤＮＡを、製造業者のプロトコルに従ってＱｕｉｃｋ－ＤＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｐｌｕｓ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ、Ｄ４０６８）で抽出し、－２０℃で保管した。
ＮＧＳ分析：各実験試料由来の細胞の編集を、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）分析を使用して評価した。全てのＰＣＲを、ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ ＲｅａｄｙＭｉｘ ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＫＲ０３７０）を使用して行った。ゲノムＤＮＡ試料ＰＣＲの鋳型は、ＰＣＳＫ９、ＰＭＰ２２、およびＴＲＡＣの場合、１０ｋ細胞／μＬでＱＥ中５μｌのゲノムＤＮＡであった。ゲノムＤＮＡ試料ＰＣＲの鋳型は、Ｂ２Ｍ、ＳＯＤ１、およびＨＴＴの場合、水中４００ｎｇのゲノムＤＮＡであった。目的とする標的ゲノム位置に特異的なプライマーを設計して、標的アンプリコンを形成した。これらのプライマーは、Ｉｌｌｕｍｉｎａリードおよびリード２配列を導入するために５’末端に追加の配列を含む。さらに、それらは、固有の分子識別子（ＵＭＩ）として機能する７ｎｔのランダマー配列を含む。アンプリコンの質および定量を、Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＤＮＡ ａｎａｌｙｚｅｒ ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ、ｄｓＤＮＡ ３５－１５００ｂｐ）を使用して評価した。アンプリコンを、製造業者の指示に従ってＩｌｌｕｍｉｎａ Ｍｉｓｅｑで配列決定した。結果として得られた配列決定リードを参照配列と整列させ、インデルについて分析した。推定された切断位置と整列しなかった編集を有する試料またはスペーサー領域に予期しない対立遺伝子を有する試料を廃棄した。
結果
様々な遺伝子座でＣａｓＸ：ｇＮＡ １１９．１７４によって達成された編集を検証するために、クローンプラスミドトランスフェクション実験をＨＥＫ ２９３Ｔ細胞に行った。複数のスペーサー（表１３、実際のｇＮＡスペーサーのコードＤＮＡおよびＲＮＡ配列を列記する）を設計し、ＣａｓＸ １１９ヌクレアーゼおよびガイド１７４足場をコードする発現プラスミドにクローニングした。ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞にプラスミドＤＮＡをトランスフェクトし、ピューロマイシンで選択し、トランスフェクトした６日後にゲノムＤＮＡを回収した。ゲノムＤＮＡを、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）により分析し、挿入または欠失（インデル）の分析のために参照ＤＮＡ配列と整列させた。ＣａｓＸ：ｇＮＡ １１９．１７４は、図９および図１０に示されるように、６つの標的遺伝子にわたってインデルを効率的に生成することができた。インデル率はスペーサー間で異なったが、編集率中央値は一貫して６０％以上であり、いくつかの事例では、９１％ものインデル率が観察された。加えて、非標準的ＣＴＣ ＰＡＭを有するスペーサーが試験した全ての標的遺伝子でインデルを生成することができることが示された（図１１）。
結果は、ＣａｓＸバリアント１１９およびｇＮＡバリアント１７４がヒト細胞における多種多様な遺伝子座でインデルを一貫して効率的に生成することができることを示す。本アッセイに使用した多くのスペーサーの不偏選択が、遺伝子座を編集する１１９．１７４ ＲＮＰ分子の全体的な有効性を示す一方で、ＴＴＣ ＰＡＭおよびＣＴＣ ＰＡＭの両方でスペーサーを標的とする能力は、ＴＴＣ ＰＡＭのみで編集する参照ＣａｓＸと比較してその多様性の増加を示す。
実施例１１：インビトロでの差次的ＰＡＭ認識の評価
精製した野生型ＣａｓＸおよび操作したＣａｓＸバリアントを、一定の標的配列を有するシングルガイドＲＮＡと複合体形成する。ＲＮＰ複合体を、１００ｎＭの最終濃度でＭｇＣｌ２を含有する緩衝液に添加し、１０ｎＭの濃度で５’Ｃｙ７．５標識二本鎖標的ＤＮＡとインキュベートする。標的核酸配列に隣接する異なるＰＡＭを含有する異なるＤＮＡ基質を用いて別個の反応を行う。反応のアリコートを一定の時点で採取し、等体積の５０ｍＭ ＥＤＴＡおよび９５％ホルムアミドを添加してクエンチする。試料を変性ポリアクリルアミドゲル上で泳動させ、切断ＤＮＡ基質と非切断ＤＮＡ基質を分離する。結果を可視化し、ＣａｓＸバリアントによる非標準的ＰＡＭの切断速度を決定する。
実施例１２：二本鎖切断のためのヌクレアーゼ活性の評価
精製した野生型および操作したＣａｓＸバリアントを、一定のＰＭ２２標的配列を有するシングルガイドＲＮＡと複合体形成する。ＲＮＰ複合体を、１００ｎＭの最終濃度でＭｇＣｌ２を含有する緩衝液に添加し、１０ｎＭの濃度で標的鎖または非標的鎖のいずれかに５’Ｃｙ７．５標識を有する二本鎖標的ＤＮＡとインキュベートする。反応のアリコートを一定の時点で採取し、等体積の５０ｍＭ ＥＤＴＡおよび９５％ホルムアミドを添加してクエンチする。試料を変性ポリアクリルアミドゲル上で泳動させ、切断ＤＮＡ基質と非切断ＤＮＡ基質を分離する。結果を可視化し、野生型バリアントおよび操作したバリアントによる標的鎖および非標的鎖の切断速度を決定する。標的結合に対する変化と核酸分解反応自体の触媒作用速度に対する変化をより明確に区別するために、タンパク質濃度を１０ｎＭ～１ｕＭの範囲にわたって滴定し、各濃度での切断速度を決定して、擬似ミカエリス・メンテンフィットを生成し、ｋｃａｔ＊およびＫＭ＊を決定する。ＫＭ＊に対する変化は結合の変化を示し、ｋｃａｔ＊に対する変化は触媒作用の変化を示す。
実施例１３：切断のための標的鎖負荷の評価
精製した野生型および操作したＣａｓＸ １１９を、一定のＰＭ２２標的配列を有するシングルガイドＲＮＡと複合体形成する。ＲＮＰ複合体を、１００ｎＭの最終濃度でＭｇＣｌ２を含有する緩衝液に添加し、１０ｎＭの濃度で標的鎖に５’Ｃｙ７．５標識および非標的鎖に５’Ｃｙ５標識を有する二本鎖標的ＤＮＡとインキュベートする。反応のアリコートを一定の時点で採取し、等体積の５０ｍＭ ＥＤＴＡおよび９５％ホルムアミドを添加してクエンチする。試料を変性ポリアクリルアミドゲル上で泳動させ、切断ＤＮＡ基質と非切断ＤＮＡ基質を分離する。結果を可視化し、これらのバリアントによる両方の鎖の切断速度を決定する。非標的鎖切断ではなく標的鎖切断の速度の変化は、切断のための活性部位における標的鎖の負荷の改善を示すであろう。この活性を、事前に切断した基質を模倣して、非標的鎖にギャップを有するｄｓＤＮＡ基質でアッセイを繰り返すことによってさらに単離することができる。この状況における非標的鎖の改善された切断は、むしろ標的鎖の負荷および切断のさらなる証拠を与えるであろう。
実施例１４：ＣａｓＸ：ｇＮＡのインビトロ切断アッセイ
１．野生型参照ＣａｓＸと比較したタンパク質バリアントの切断能力のある分率を決定する
参照ＣａｓＸと比較して活性なＲＮＰを形成するＣａｓＸバリアントの能力を、インビトロ切断アッセイを使用して決定した。切断アッセイのベータ－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）７．３７標的を以下のように作製した。配列ＴＧＡＡＧＣＴＧＡＣＡＧＣＡＴＴＣＧＧＧＣＣＧＡＧＡＴＧＴＣＴＣＧＣＴＣＣＧＴＧＧＣＣＴＴＡＧＣＴＧＴＧＣＴＣＧＣＧＣＴ（非標的鎖、ＮＴＳ（配列番号５９６））を有するＤＮＡオリゴおよび配列ＴＧＡＡＧＣＴＧＡＣＡＧＣＡＴＴＣＧＧＧＣＣＧＡＧＡＴＧＴＣＴＣＧＣＴＣＣＧＴＧＧＣＣＴＴＡＧＣＴＧＴＧＣＴＣＧＣＧＣＴ（標的鎖、ＴＳ（配列番号５９７））を有するＤＮＡオリゴを、５’蛍光標識（それぞれ、ＬＩ－ＣＯＲ ＩＲＤｙｅ ７００および８００）とともに購入した。ｄｓＤＮＡ標的を、１倍切断緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＴＣＥＰ、５％グリセロール、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２）中で１：１の比率でオリゴを混合し、１０分間かけて９５℃に加熱し、溶液を室温に冷却することによって形成した。
ＣａｓＸ ＲＮＰを、別途特定されない限り１倍切断緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＴＣＥＰ、５％グリセロール、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２）中で１．５倍過剰の指定したガイドとともに１μＭの最終濃度で指定したＣａｓＸおよびガイド（グラフを参照されたい）で、３７℃で１０分間再構成し、その後、使用する準備が整うまで氷に移した。７．３７標的を、７．３７標的に相補的なスペーサーを有するｓｇＲＮＡとともに使用した。
切断反応物を、１００ｎＭの最終ＲＮＰ濃度および１００ｎＭの最終標的濃度で調製した。反応を３７℃で行い、７．３７標的ＤＮＡの添加によって開始した。アリコートを５、１０、３０、６０、および１２０分時点で採取し、９５％ホルムアミド、２０ｍＭ ＥＤＴＡに添加することによってクエンチした。試料を、９５℃で１０分間加熱することによって変性させ、１０％尿素－ＰＡＧＥゲル上で泳動させた。ゲルを、ＬＩ－ＣＯＲ Ｏｄｙｓｓｅｙ ＣＬｘで画像化し、ＬＩ－ＣＯＲ Ｉｍａｇｅ Ｓｔｕｄｉｏソフトウェアを使用して定量するか、Ｃｙｔｉｖａ Ｔｙｐｈｏｏｎで画像化し、Ｃｙｔｉｖａ ＩＱＴＬソフトウェアを使用して定量するかのいずれかを行った。結果として得られたデータを、Ｐｒｉｓｍを使用してプロットして分析した。我々は、半化学量論的量の酵素が延長した時間スケール下でさえも化学量論的量を超える標的を切断することができず、代わりに、存在する酵素の量に対応する定常状態に近づくという観察によって示されるように、ＣａｓＸがアッセイ条件下で単回代謝回転酵素として本質的に作用すると仮定した。したがって、等モル量のＲＮＰによって長時間スケールにわたって切断された標的の分率は、ＲＮＰのどのくらいの分率が適切に形成され、切断に対して活性であるかを示す。切断反応がこの濃度体制下で単相から明らかに逸脱するため、切断追跡を二相速度モデルに適合させ、３つの独立した複製の各々の定常状態を決定した。平均および標準偏差を計算して、活性分率を決定した（表１４）。グラフを図１２に示す。
見かけの活性（切断能力のある）分率を、ＣａｓＸ２＋ガイド１７４＋７．３７スペーサー、ＣａｓＸ１１９＋ガイド１７４＋７．３７スペーサー、ＣａｓＸ４５７＋ガイド１７４＋７．３７スペーサー、ＣａｓＸ４８８＋ガイド１７４＋７．３７スペーサー、およびＣａｓＸ４９１＋ガイド１７４＋７．３７スペーサーに対して形成されたＲＮＰについて決定した。決定した活性分率を表１４に示す。全てのＣａｓＸバリアントが野生型ＣａｓＸ２よりも高い活性分率を有し、これは、操作したＣａｓＸバリアントが野生型ＣａｓＸと比較して試験した条件下で同一のガイドと有意に活性な安定したＲＮＰを形成することを示す。これは、ｓｇＲＮＡに対する親和性の増加、ｓｇＲＮＡの存在下での安定性もしくは溶解性の増加、または操作したＣａｓＸ：ｓｇＲＮＡ複合体の切断能力のある立体構造のより高い安定性に起因し得る。ＲＮＰの溶解性の増加は、ＣａｓＸ２と比較してＣａｓＸ４５７、ＣａｓＸ４８８、またはＣａｓＸ４９１をｓｇＲＮＡに添加したときに形成された観察された沈殿物の顕著な減少によって示された。
２．インビトロ切断アッセイ－野生型参照ＣａｓＸと比較したＣａｓＸバリアントのｋ切断を決定する
図１３および表１４に示されるように、同じプロトコルを使用して、ＣａｓＸ２．２．７．３７、ＣａｓＸ２．３２．７．３７、ＣａｓＸ２．６４．７．３７、およびＣａｓＸ２．１７４．７．３７の切断能力のある分率が、１６±３％、１３±３％、５±２％、および２２±５％であると決定した。
ガイドのＲＮＰ形成への寄与をより良好に分離するために、ガイドの第２のセットを異なる条件下で試験した。７．３７スペーサーを有する１７４、１７５、１８５、１８６、１９６、２１４、および２１５ガイドを、前述のように過剰なガイドではなく、ガイドの場合に１μＭおよびタンパク質の場合に１．５μＭの最終濃度でＣａｓＸ４９１と混合した。結果を図１４および表１４に示す。これらのガイドの多くは、１７４を超えるさらなる改善を示し、１８５および１９６は、これらのガイド制限条件下で、１７４の１７％と比較して、それぞれ、４４％および４６％の切断能力のある分率を達成した。
データは、ＣａｓＸバリアントおよびｓｇＲＮＡバリアントの両方が、野生型ＣａｓＸおよび野生型ｓｇＲＮＡと比較して、ガイドＲＮＡとより高度な活性ＲＮＰを形成することができることを示す。
野生型参照ＣａｓＸと比較したＣａｓＸバリアント１１９、４５７、４８８、および４９１の見かけの切断速度を、標的７．３７の切断のためのインビトロ蛍光アッセイを使用して決定した。
ＣａｓＸ ＲＮＰを、１倍切断緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＴＣＥＰ、５％グリセロール、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２）中で１．５倍過剰の指定したガイドとともに１μＭの最終濃度で指定したＣａｓＸ（図１５を参照されたい）で、３７℃で１０分間再構成し、その後、使用する準備が整うまで氷に移した。切断反応を、２００ｎＭの最終ＲＮＰ濃度および１０ｎＭの最終標的濃度で設定した。反応を、別途記述されない限り３７℃で行い、標的ＤＮＡの添加により開始した。アリコートを０．２５、０．５、１、２、５、および１０分時点で採取し、９５％ホルムアミド、２０ｍＭ ＥＤＴＡに添加することによってクエンチした。試料を、９５℃で１０分間加熱することによって変性させ、１０％尿素－ＰＡＧＥゲル上で泳動させた。ゲルを、ＬＩ－ＣＯＲ Ｏｄｙｓｓｅｙ ＣＬｘで画像化し、ＬＩ－ＣＯＲ Ｉｍａｇｅ Ｓｔｕｄｉｏソフトウェアを使用して定量するか、Ｃｙｔｉｖａ Ｔｙｐｈｏｏｎで画像化し、Ｃｙｔｉｖａ ＩＱＴＬソフトウェアを使用して定量した。結果として得られたデータを、Ｐｒｉｓｍを使用してプロットして分析し、各ＣａｓＸ：ｓｇＲＮＡ組み合わせ複製の非標的鎖切断の見かけの一次速度定数（ｋ切断）を決定した。独立した適合を有する３つの複製の平均および標準偏差を表１４に提示し、切断追跡を図１５に示す。
野生型ＣａｓＸ２、ならびにＣａｓＸバリアント１１９、４５７、４８８、および４９１の見かけの切断速度定数を決定し、ガイド１７４およびスペーサー７．３７を各アッセイで利用した（表１４および図１５を参照されたい）。全てのＣａｓＸバリアントが野生型ＣａｓＸ２と比較して改善された切断速度を有した。上で決定されたようにより高い切断能力のある分率を有するにもかかわらず、ＣａｓＸ４５７は１１９よりもゆっくりと切断した。ＣａｓＸ４８８およびＣａｓＸ４９１は、大幅に最も速い切断速度を示し、標的は第１の時点でほぼ完全に切断されたため、真の切断速度はこのアッセイの分解能を超え、報告されたｋ切断を下限とみなすべきである。
データは、ＣａｓＸバリアントが野生型ＣａｓＸ２と比較してより高いレベルの活性を有し、少なくとも３０倍高いｋ切断速度に達することを示す。
３．インビトロ切断アッセイ：ガイドバリアントと野生型ガイドとの比較
切断アッセイを、ガイドバリアント３２、６４、および１７４と比較した野生型参照ＣａｓＸ２および参照ガイド２を用いて行い、これらのバリアントが切断を改善したかも決定した。実験を上述のように行った。結果として得られたＲＮＰの多くが試験した時間内に標的の完全な切断に近づかなかったため、我々は、一次速度定数ではなく、初期反応速度（Ｖ０）を決定した。最初の２つの時点（１５秒および３０秒）をＣａｓＸ：ｓｇＲＮＡ組み合わせおよび複製の各々のラインと適合させた。３つの複製の勾配の平均および標準偏差を決定した。
アッセイした条件下で、ガイド２、３２、６４、および１７４を有するＣａｓＸ２のＶ０は、２０．４±１．４ｎＭ／分、１８．４±２．４ｎＭ／分、７．８±１．８ｎＭ／分、および４９．３±１．４ｎＭ／分であった（表１４ならびに図１６および図１７を参照されたい）。ガイド１７４は、結果として得られたＲＮＰの切断速度の実質的な改善を示した（２と比較して約２．５倍、図１７を参照されたい）一方で、実施したガイド３２および６４は、ガイド２と同様またはそれよりも劣っていた。注目すべきことに、ガイド６４は、ガイド２よりも遅い切断速度を支持するが、インビボではるかにより良好に機能する（データ示さず）。ガイド６４を生成するための配列改変のうちのいくつかは、トリプレックス形成に関与するヌクレオチドを犠牲にしてインビボ転写を改善する可能性が高い。ガイド６４の改善された発現は、インビボでのその改善された活性を説明する可能性が高いが、その低下した安定性は、インビトロでの不適切なフォールディングをもたらす可能性がある。
相対的切断速度を決定するために、スペーサー７．３７およびＣａｓＸ４９１を有するガイド１７４、１７５、１８５、１８６、１９６、２１４、および２１５を使用して追加の実験を行った。切断速度を我々のアッセイで測定可能な範囲に低下させるために、切断反応物を１０℃でインキュベートした。結果を図１８および表１４に示す。これらの条件下で、２１５は、１７４よりも速い切断速度を支持した唯一のガイドであった。ガイド制限条件下でＲＮＰの最も高い活性分率を呈した１９６は、１７４と本質的に同じ反応速度を有し、異なるバリアントが別個の特性の改善をもたらすことを再び強調する。
データは、本アッセイの条件下で、ＣａｓＸを有するガイドバリアントの大半を使用することにより、野生型ガイドを有するものよりも高いレベルの活性を有するＲＮＰが得られ、初期切断速度の約２倍～６倍超の範囲の改善がもたらされることを裏付ける。表１４の数字は、左から右に、ＲＮＰ構築物のＣａｓＸバリアント、ｓｇＲＮＡ足場、およびスペーサー配列を示す。
実施例１５：ニッキングバリアントの特定
精製した修飾ＣａｓＸバリアントを、一定の標的配列を有するシングルガイドＲＮＡと複合体形成する。ＲＮＰ複合体を、１００ｎＭの最終濃度でＭｇＣｌ２を含有する緩衝液に添加し、１０ｎＭの濃度で標的鎖に５’フルオレセイン標識および非標的鎖に５’Ｃｙ５標識を有する二本鎖標的ＤＮＡとインキュベートする。反応のアリコートを一定の時点で採取し、等体積の５０ｍＭ ＥＤＴＡおよび９５％ホルムアミドを添加してクエンチする。試料を変性ポリアクリルアミドゲル上で泳動させ、切断ＤＮＡ基質と非切断ＤＮＡ基質を分離する。一方の鎖のみの効率的な切断は、本バリアントが一本鎖ニッカーゼ活性を有していたことを示す。
実施例１６：ＲＮＰ産生のためのＣａｓＸバリアントの改善された発現および溶解度特性の評価
野生型および修飾ＣａｓＸバリアントは、同じ条件下で、ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌｉで発現する。全てのタンパク質は、ＩＰＴＧ誘導性Ｔ７プロモーターの制御下にある。細胞を３７℃のＴＢ培地中で０．６のＯＤまで増殖させ、その時点で増殖温度を１６℃に低下させ、０．５ｍＭのＩＰＴＧを添加することにより発現を誘導させる。１８時間発現させた後に細胞を回収する。可溶性タンパク質画分を抽出し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上で分析する。可溶性ＣａｓＸ発現の相対レベルをクーマシー染色によって特定する。タンパク質を上記のプロトコルに従って並行して精製し、純粋なタンパク質の最終収量を比較する。精製したタンパク質の溶解度を決定するために、タンパク質が沈殿し始めるまで、構築物を保存緩衝液中で濃縮する。沈殿したタンパク質を遠心分離により除去し、可溶性タンパク質の最終濃度を測定して、各バリアントの最大溶解度を決定する。最後に、ＣａｓＸバリアントをシングルガイドＲＮＡと複合体形成させ、沈殿が始まるまで濃縮する。沈殿したＲＮＰを遠心分離により除去し、可溶性ＲＮＰの最終濃度を測定して、ガイドＲＮＡに結合したときの各バリアントの最大溶解度を決定する。
実施例１７：ｓｇＮＡおよびＣａｓＸタンパク質活性を測定するために使用するアッセイ
いくつかのアッセイを使用して、ＣａｓＸタンパク質ならびにｓｇＮＡディープミューテーショナルエボルーション（ＤＭＥ）ライブラリおよび修飾バリアントの初期スクリーニングを実行し、ＣａｓＸ参照ｓｇＮＡおよびタンパク質と比較した選択タンパク質およびｓｇＮＡバリアントの活性を測定した。
Ｅ．ｃｏｌｉ ＣＲＩＳＰＲｉスクリーニング：
簡潔には、カルベニシリン（Ｃａｒｂ）耐性プラスミド上にＧＦＰ ｇＮＡを有するクロラムフェニコール（ＣＭ）耐性プラスミド上の死んでいるＣａｓＸ ＤＭＥライブラリの生物学的トリプリケートを、遺伝的に組み込まれて構成的に発現されたＧＦＰおよびＲＦＰを有するＭＧ１６５５に（５倍超のライブラリサイズで）形質転換した。細胞を、ＥＺ－ＲＤＭ＋Ｃａｒｂ、ＣＭ、およびアンヒドロテトラサイクリン（ａＴｃ）誘導物質中で一晩増殖させた。Ｅ．ｃｏｌｉを、ＲＦＰ抑制ではなくＧＦＰの上位１％のゲートに基づいてＦＡＣＳ分類し、収集し、すぐに再分類して、機能性の高いＣａｓＸ分子についてさらに濃縮した。その後、二重分類したライブラリを増殖させ、ＤＮＡをｈｉｇｈｓｅｑでのディープシークエンシングのために収集した。このＤＮＡもプレート上で再形質転換し、個々のクローンをさらなる分析のために採取した。
Ｅ．ｃｏｌｉ毒素の選択：
簡潔には、アラビノース誘導性毒素を含むカルベニシリン耐性プラスミドをＥ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換し、電気的コンピテントにした。クロラムフェニコール耐性プラスミド上に毒素標的ｇＮＡを有するＣａｓＸ ＤＭＥライブラリの生物学的トリプリケートを、この細胞に（５倍超のライブラリサイズで）形質転換し、ＬＢ＋ＣＭおよびアラビノース誘導物質中で増殖させた。毒素プラスミドを切断したＥ．ｃｏｌｉは誘導培地中で生存し、対数中期まで増殖させ、機能的ＣａｓＸ切断因子を有するプラスミドを回収した。この選択を必要に応じて繰り返した。その後、選択したライブラリを増殖させ、ＤＮＡをｈｉｇｈｓｅｑでのディープシークエンシングのために収集した。このＤＮＡもプレート上で再形質転換し、個々のクローンをさらなる分析および試験のために採取した。
レンチウイルスベースのスクリーニングであるＥＧＦＰスクリーニング：
レンチウイルス粒子を、トランスフェクション時に７０％～９０％のコンフルエンシーでＨＥＫ２９３細胞中で産生した。細胞を、ＣａｓＸ ＤＭＥライブラリを含むプラスミドのポリエチレンイミンベースのトランスフェクションを使用してトランスフェクトした。レンチウイルスベクターを、粒子産生のためにレンチウイルスパッケージングプラスミドおよびＶＳＶ－Ｇエンベローププラスミドで共トランスフェクトした。トランスフェクトした１２時間後に培地を交換し、トランスフェクトした３６～４８時間後にウイルスを収集した。ウイルス上清を、０．４５ｍｍの膜フィルターを使用して濾過し、適切な場合、細胞培養培地中で希釈し、組み込まれたＧＦＰレポーターを有する標的細胞であるＨＥＫ細胞に添加した。必要に応じて、ポリブレンを補充して、形質導入効率を高めた。形質導入細胞を、ピューロマイシンを使用して形質導入後２４～４８時間にわたって選択し、７～１０日間増殖させた。その後、細胞をＧＦＰ破壊について分類し、機能性の高いＣａｓＸ ｓｇＮＡまたはタンパク質バリアントについて収集した（図１９を参照されたい）。その後、ライブラリをゲノムから直接ＰＣＲにより増幅し、ｈｉｇｈｓｅｑでのディープシークエンシングのために収集した。このＤＮＡをプレート上で再クローニングおよび再形質転換することもでき、個々のクローンをさらなる分析のために採取した。
実施例１８：ＨＥＫ ＥＧＦＰレポーターの編集効率のアッセイ
ＣａｓＸ参照ｓｇＮＡおよびタンパク質ならびにそれらのバリアントの編集効率をアッセイするために、ＥＧＦＰ ＨＥＫ２９３Ｔレポーター細胞を９６ウェルプレートに播種し、製造業者のプロトコルに従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ならびに参照またはＣａｓＸバリアントタンパク質、Ｐ２Ａ－ピューロマイシン融合物、および参照またはバリアントｓｇＮＡをコードする１００～２００ｎｇのプラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。翌日、細胞を１．５μｇ／ｍｌのピューロマイシンで２日間にわたって選択し、選択した７日後に蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）によって分析して、細胞からのＥＧＦＰタンパク質のクリアランスを可能にした。編集によるＥＧＦＰ破壊を、Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーターおよびハイスループットオートサンプラーを使用して追跡した。
実施例１９：ＣａｓＸ参照ｓｇＲＮＡの切断効率
配列番号４（下記）の参照ＣａｓＸ ｓｇＲＮＡは、ＷＯ ２０１８０６４３７１およびＵＳ１０５７０４１５Ｂ２に記載されており、それらの内容は、参照により本明細書に組み込まれる：
ＡＣＡＵＣＵＧＧＣＧＣＧＵＵＵＡＵＵＣＣＡＵＵＡＣＵＵＵＧＧＡＧＣＣＡＧＵＣＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＵＧＧＡＣＧＡＡＧＣＧＣＵＵＡＵＵＵＡＵＣＧＧＡＧＡＧＡＡＡＣＣＧＡＵＡＡＧＵＡＡＡＡＣＧＣＡＵＣＡＡＡＧ（配列番号４）。
配列番号５（下記）を生成するための配列番号４のｓｇＲＮＡ参照配列に対する改変がＣａｓＸ切断効率を改善することができることが見出された。配列は、ＵＡＣＵＧＧＣＧＣＵＵＵＵＡＵＣＵＣＡＵＵＡＣＵＵＵＧＡＧＡＧＣＣＡＵＣＡＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＵＧＧＧＵＡＡＡＧＣＧＣＵＵＡＵＵＵＡＵＣＧＧＡＧＡＧＡＡＡＵＣＣＧＡＵＡＡＡＵＡＡＧＡＡＧＣＡＵＣＡＡＡＧ（配列番号５）である。
ＣａｓＸ参照ｓｇＲＮＡおよびそのバリアントの編集効率をアッセイするために、ＥＧＦＰ ＨＥＫ２９３Ｔレポーター細胞を９６ウェルプレートに播種し、製造業者のプロトコルに従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ならびに参照ＣａｓＸタンパク質、Ｐ２Ａ－ピューロマイシン融合物、およびｓｇＲＮＡをコードする１００～２００ｎｇのプラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。翌日、細胞を１．５μｇ／ｍｌのピューロマイシンで２日間にわたって選択し、選択した７日後に蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）によって分析して、細胞からのＥＧＦＰタンパク質のクリアランスを可能にした。編集によるＥＧＦＰ破壊を、Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーターおよびハイスループットオートサンプラーを使用して追跡した。
ＣａｓＸ参照およびｓｇＮＡバリアントによるＥＧＦＰレポーターの切断を試験する場合、以下のスペーサー標的配列を使用した：
Ｅ６（ＴＧＴＧＧＴＣＧＧＧＧＴＡＧＣＧＧＣＴＧ（配列番号１７））およびＥ７（ＴＣＡＡＧＴＣＣＧＣＣＡＴＧＣＣＣＧＡＡ（配列番号１８））。
配列番号４のｓｇＲＮＡと比較して配列番号５のｓｇＲＮＡの切断効率が増加した例を図２０に示す。配列番号５の編集効率は、配列番号４と比較して１７６％改善した。したがって、配列番号５を、以下に記載される、ＤＭＥおよび追加のｓｇＮＡバリアント設計のための参照ｓｇＲＮＡとして選択した。
実施例２０：標的切断が改善されたｇＮＡバリアントの設計、作製、および評価
ガイド核酸（ｇＮＡ）バリアントを、参照ｇＮＡと比較した切断活性の改善を評価するために設計および試験した。これらのガイドを、本明細書に記載されるように、ＤＭＥまたは合理的設計および伸長ステムなどのガイド部品の交換もしくは付加または末端でのリボザイムの付加により発見した。
実験計画：全てのガイドを、以下のようにＨＥＫ２９３Ｔ細胞株またはＨＥＫ２９３Ｔレポーター細胞株で試験した。哺乳類細胞を、３７℃および５％ＣＯ２のインキュベーター内で維持した。ＨＥＫ２９３Ｔヒト腎臓細胞およびその誘導体を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｓｅｒａｄｉｇｍ、番号１５００－５００）ならびに１００単位／ｍｌのペニシリンおよび１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン（１００×－Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐ、ＧＩＢＣＯ、番号１５１４０－１２２）を補充し、かつピルビン酸ナトリウム（１００×、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、番号１１３６００７０）、非必須アミノ酸（１００×、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、番号１１１４００５０）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（１００×、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、番号１５６３００８０）、および２－メルカプトエタノール（１０００×、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、番号２１９８５０２３）をさらに含み得るダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｅｌｌｇｒｏ、番号１０－０１３－ＣＶ）中で増殖させた。細胞を９６ウェルプレートに２０，０００～３０，０００細胞／ウェルで播種し、製造業者のプロトコルに従って、０．２５～１ｕＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、番号Ｌ３０００００８）、レポーターまたは標的遺伝子を標的とするＣａｓＸおよび参照またはバリアントＣａｓＸガイドを含む５０～５００ｎｇのプラスミドを使用してトランスフェクトした。２４～７２時間後、培地を交換し、０．３～３．０ｕｇ／ｍｌのピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ、番号Ｐ８８３３）を添加して、形質転換を選択した。選択した２４～９６時間後、細胞をフローサイトメトリーによって分析し、適切な前方および側方散乱についてゲートし、単細胞を選択し、その後、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）または抗体レポーター発現（Ａｔｔｕｎｅ Ｎｘｔ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）についてゲートして、フルオロフォアの発現レベルを定量した。試料毎に少なくとも１０，０００個の事象を収集した。ＨＥＫ２９３Ｔ－ＧＦＰゲノム編集レポーター細胞株の場合、フローサイトメトリーを使用して、ＧＦＰ陰性（編集済み）細胞のパーセンテージを定量し、各バリアントのＧＦＰ破壊を伴う細胞数を参照ガイドと比較して、倍率変化測定値を生成した。
結果：ＤＭＥにより生成されたｓｇＮＡバリアントからの結果を測定し、配列番号４の参照ｇＮＡと比較した結果を図２２に提示し、ほとんどのバリアントが参照ｇＮＡと比較して０．１～約１．５倍の改善を示した。合理的設計およびガイド部品の交換または付加（伸長ステムなどまたは末端でのリボザイムの付加）により生成されたバリアントの結果を、それぞれ、図２１および２３に示し、この場合もやはり、多くの構築物で改善が見られた。図２３に番号で示されているバリアントへの追加をそれらのコード配列とともに以下の表１５に列記する。我々は、Ｃ１８Ｇなどの単一変異が参照と比較してガイド活性を改善することを観察した。加えて、ＭＳ２、ＱＢ、ＰＰ７、ＵｖｓＸなどの異なるステムループを伸長ステムループと合理的に交換することにより、元の伸長ステムループを切断する場合と同様に、参照ガイドと比較して活性が改善された。最後に、我々は、ほとんどのリボザイムが活性を破壊する一方で、参照ガイドＲＮＡに３’ＨＤＶを付加することにより、活性を最大２０～５０％改善させることができることを実証する。
結論：結果は、ＤＭＥおよび合理的設計を使用してｇＮＡのパフォーマンスを向上させることができ、かつこれらのバリアントＲＮＡの多くを本明細書に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系の構成要素として標的配列とともに使用して標的核酸配列を編集することができるという結論を裏付ける。
実施例２１：Ｂ２Ｍ遺伝子座のＣａｓＸ編集
目標：Ｂ２Ｍ遺伝子座の編集に最適なＣａｓＸおよびｇＮＡ分子を特定するために実験を行った。
材料および方法：
１．Ｂ２Ｍ標的構築物の生成：
Ｂ２Ｍ標的構築物を生成するために、コドン最適化ＣａｓＸ ２（構築物２．２）および構築物１１９．６４分子（表１６のＣａｓＸ配列、ガイド配列は表１および表２に列記されている）および融合ＮＬＳ（本明細書で「ＳｔＸ」と称される）、ガイド足場、および非標的標的配列を、標準クローニング法を使用して、コードＤＮＡ配列を使用して哺乳動物発現プラスミド（ｐＳｔＸ）にクローニングした。ｐＳｔＸは、ピューロマイシンおよびカルベニシリンの両方の選択マーカーを含む。目的とする遺伝子を標的とする標的配列をコードする配列を、ＳｔＸ ＰＡＭ位置に基づいて設計した（ＲＮＡ標的配列を列記する表１７、プラスミドを対応するＤＮＡコード配列で作製した）。標的配列ＤＮＡを、標的配列およびこの配列の逆相補体からなる一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）オリゴ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）として注文した。これらの２つのオリゴを一緒にアニーリングし、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ番号Ｍ０２０２Ｌ）およびプラスミドの適切な制限酵素を使用してＧｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅアセンブリによって個別にまたはバルクでｐＳｔｘにクローニングした。Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ産物を、カルベニシリンを含有するＬｂ寒天プレート（ＬＢ：Ｔｅｋｎｏｖａ、カタログ番号Ｌ９３１５、寒天：Ｑｕａｒｔｚｙ、カタログ番号２１４５１０）上にプレーティングした、ＮＥＢ Ｔｕｒｂｏ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ（ＮＥＢ、カタログ番号Ｃ２９８４Ｉ）などの化学的または電気的コンピテント細胞に形質転換した。個々のコロニーを採取し、製造業者のプロトコルに従ってＱｉａｇｅｎ Ｑｉａｐｒｅｐ ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２７１０４）を使用してミニプレップした。結果として得られたプラスミドを、サンガーシークエンシングを使用して配列決定して、正しいライゲーションを確実にした。ＳａＣａｓ９およびＳｐｙＣａｓ９対照プラスミドを、ｐＳｔｘのタンパク質およびガイド領域をそれぞれのタンパク質およびガイドと交換して、上記のｐＳｔｘプラスミドと同様に調製した。ＳａＣａｓ９およびＳｐｙＣａｓ９の標的配列は、文献からから得たものまたは確立された方法に従って合理的に設計したもののいずれかであった。
２．哺乳類細胞株におけるＢ２Ｍ編集活性の評価：
２つのＳｔＸバリアントの活性を、ヒト胎児腎（ＨＥＫ２９３Ｔ）細胞およびヒトＴリンパ球細胞（Ｊｕｒｋａｔｓ）を含む哺乳類細胞で評価した。哺乳類細胞を、３７℃および５％ＣＯ２のインキュベーター内で維持した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞およびその誘導体を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｓｅｒａｄｉｇｍ、番号１５００－５００）ならびに１００単位／ｍｌのペニシリンおよび１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン（１００×－Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐ、ＧＩＢＣＯ、番号１５１４０－１２２）を補充し、かつピルビン酸ナトリウム（１００×、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、番号１１３６００７０）、非必須アミノ酸（１００×、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、番号１１１４００５０）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（１００×、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、番号１５６３００８０）、および２－メルカプトエタノール（１０００×、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、番号２１９８５０２３）をさらに含み得るダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｅｌｌｇｒｏ、番号１０－０１３－ＣＶ）中で増殖させた。ＪｕｒｋａｔおよびＫ５６２を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｓｅｒａｄｉｇｍ、番号１５００－５００）ならびに１００単位／ｍｌのペニシリンおよび１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン（１００×－Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐ、ＧＩＢＣＯ、番号１５１４０－１２２）を補充し、かつピルビン酸ナトリウム（１００×、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、番号１１３６００７０）、非必須アミノ酸（１００×、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、番号１１１４００５０）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（１００×、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、番号１５６３００８０）、および２－メルカプトエタノール（１０００×、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、番号２１９８５０２３）をさらに含み得るＲＰＭＩ培地中で培養した。ＨＥＫ２９３Ｔなどの接着細胞を９６ウェルプレートに２０，０００～３０，０００細胞／ウェルで播種し、製造業者のプロトコルに従って、０．２５～１ｕＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、番号Ｌ３０００００８）、レポーターまたは標的遺伝子を標的とするＣａｓＸおよび参照またはバリアントＣａｓＸガイドを含む５０～５００ｎｇのプラスミドを使用してトランスフェクトした。あるいは、Ｊｕｒｋａｔなどの懸濁細胞を、製造業者のプロトコルに従ってＬｏｎｚａ ４Ｄ－ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒを使用して０．５～４．０ｕｇのプラスミドＤＮＡ／２００ｋ細胞でヌクレオフェクトした。ヌクレオフェクトした後、Ｊｕｒｋａｔなどの懸濁細胞を９６ウェルプレート中で培養した。２４～７２時間後、培地を交換し、０．３～３．０ｕｇ／ｍｌのピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ、番号Ｐ８８３３）を添加して、形質転換を選択した。以下の対照またはそれらの組み合わせ：非標的標的配列を有するＳｔＸ分子、Ｂ２Ｍを標的とするＳａ．Ｃａｓ９および／またはＳｐｙＣａｓ９、および非標的標的配列を有するＳａ．Ｃａｓ９およびＳｐｙ．Ｃａｓ９を、各トランスフェクションまたはヌクレオフェクション実験に使用した。選択した２４～９６時間後、またはそれ以降に、細胞をフローサイトメトリーによって分析し、適切な前方および側方散乱についてゲートし、単細胞を選択し、その後、抗体レポーター発現（Ａｔｔｕｎｅ Ｎｘｔ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）についてゲートして、フルオロフォアの発現レベルを定量した。試料毎に少なくとも１０，０００個の事象を収集した。その後、データを使用して、抗体標識陰性（編集済み）細胞のパーセンテージを計算した。
加えて、各実験試料由来の細胞における編集を、Ｔ７Ｅ１およびＮＧＳを使用してアッセイした。このために、各実験試料由来の細胞のサブセットを溶解させ、製造業者のプロトコルに従ってＱｕｉｋｅｘｔｒａｃｔ溶液（Ｌｕｃｉｇｅｎ、カタログ番号ＱＥ０９０５０）を使用してゲノムＤＮＡを抽出した。Ｔ７Ｅ１の場合、ゲノムＤＮＡを、最初に、目的とする標的ゲノム位置でプライマーを用いてＰＣＲ増幅する。その後、この増幅したＤＮＡをＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｔ７Ｅ１に従って処理し、ゲル電気泳動によって分析した。
３．ＮＧＳ分析
ＮＧＳ分析のために、ゲノムＤＮＡを、目的とする標的ゲノム位置に特異的なプライマーを用いてＰＣＲ増幅して、標的アンプリコンを形成した。これらのプライマーは、Ｉｌｌｕｍｉｎａリード１およびリード２配列を導入するために５’末端に追加の配列を含む。さらに、それらは、固有の分子識別子（ＵＭＩ）として機能する１６ｎｔのランダマー配列を含む。アンプリコンの質および定量を、Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＤＮＡ ａｎａｌｙｚｅｒ ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ、ｄｓＤＮＡ ３５－１５００ｂｐ）を使用して評価した。アンプリコンを、製造業者の指示に従ってＩｌｌｕｍｉｎａ Ｍｉｓｅｑで配列決定した。
配列決定からの生ｆａｓｔｑファイルを以下のように処理した：（１）プログラムｃｕｔａｄａｐｔ（ｖ．２．１）を使用して、配列を品質およびアダプター配列のためにトリムした。（２）プログラムｆｌａｓｈ２（ｖ２．２．００）を使用して、リード１およびリード２からの配列を単一の挿入配列に統合した。（３）同じＵＭＩ配列を有する挿入配列を単一の配列に統合した。第１のステップでは、塩基毎の投票戦略（ｐｅｒ－ｂａｓｅ ｖｏｔｉｎｇ ｓｔｒａｔｅｇｙ）を使用して、同じＵＭＩを有する全ての個々の挿入配列から単一のコンセンサス配列を生成した。第２のステップでは、個々の挿入配列をコンセンサス配列と比較した。挿入配列の６７％以上がコンセンサス配列と完全に一致する場合、コンセンサス配列をそのＵＭＩに対して採用した。そうでない場合、最も高い配列品質を有する個々の挿入配列をそのＵＭＩに使用する。（４）コンセンサス挿入配列を、予想されるアンプリコン配列および標的配列とともに、プログラムＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ２（ｖ ２．０．２９）にかけた。このプログラムは、標的配列の３′末端付近のウィンドウ（標的配列の３’末端から－３ｂｐを中心とする２０ｂｐウィンドウ）内の修飾されたリードのパーセントを定量する。ＳｔＸ分子の修飾パーセントを、このウィンドウ内での挿入および／または欠失を含む合計リードパーセントによって定量した。
結果：
ＨＬＡ１発現のレベルを最初に複数のヒト細胞株で評価した（図２４）。このアッセイの基礎は、ＨＬＡ１の必須構造タンパク質であるＢ２ＭのノックアウトによるＨＬＡ１発現レベルの減少である。Ｔ７Ｅ１アッセイにより、ＨＥＫ細胞におけるＢ２Ｍ遺伝子座の編集が確認された（図２５）。我々は、ＨＬＡ１に特異的な蛍光抗体を使用してこれをスクリーニングした。様々なＰＡＭ特異性を有する６８個のＢ２Ｍ標的配列（表１７を参照されたい）のＨＥＫ２９３Ｔ細胞における初期スクリーニングを、ＳｐｙＣａｓ９を対照として使用した初期Ｓｔｘ分子２．２で試験し、ａ）その後、ＳａＣａｓ９と互換性のある２６個のＢ２Ｍ標的配列で同様のスクリーニングを行い（表１７を参照されたい）、ＳａＣａｓ９分子を有するこの標的の対照を確立した。ＨＬＡ１発現の変化パーセントとして表される編集アッセイの結果を表１７に提示する。
Ｓｔｘ １１９．６４バリアントは、Ｓｔｘ ２．２よりも実質的な改善を示し、フローサイトメトリーによりＨＥＫ２９３Ｔ細胞で測定した場合、ＨＥＫ細胞の内因性Ｂ２Ｍ遺伝子座で最大２０倍高い編集効率であった（図２６）。Ｓｔｘ １１９．６４と、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞の内因性Ｂ２Ｍを標的とする５つの最良のＳａＣａｓ９スペーサーとの比較は、同等のレベルの編集を示す（図２７および図２８）。ＨＥＫ ２９３ｔＴＢ２Ｍ遺伝子座のＮＧＳ分析は、Ｓｔｘ １１９．６４で最大８０％の修飾を示す（図２９）。主に挿入配列であるＳｐｙＣａｓ９とは対照的に、これらの修飾は主に欠失である。
結論：結果は、Ｓｔｘ ＣａｓＸの編集パフォーマンスをＳｔｘ ２．２の配列に導入された選択的変異によって改善することができることを裏付ける。
実施例２２：キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）およびＴＣＲを発現させるように遺伝子操作された細胞におけるＢ２Ｍの遺伝子破壊
初代ヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を、健常ドナーから得たヒトＰＢＭＣ試料から免疫親和性に基づく選択によって分離する。結果として得られた細胞を、ヒト血清、ＩＬ－２（１００Ｕ／ｍＬ）、ＩＬ－７（１０ｎｇ／ｍＬ）、およびＩＬ－１５（５ｎｇ／ｍＬ）を含む培地中で抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８試薬と３７℃で培養することによって刺激した後、２４～４８時間にわたるレンチウイルス形質導入によりキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）で操作する。細胞を、Ｔ２Ａリボソームスイッチをコードする配列によって分離された、形質導入の代理マーカーとして使用するための、例示的な抗ＣＤ１９ ＣＡＲをコードする核酸分子および切断型ＥＧＦＲ（ＥＧＦＲｔ）をコードする核酸を含むレンチウイルスベクターを使用して形質導入する。ＣＡＲは、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ（ＶＨとＶＬが短いリンカーによって結合されている表５の抗ＣＤ１９配列など）、Ｉｇ由来のスペーサー、ヒトＣＤ２８由来の膜貫通ドメイン、ヒト４－１ＢＢ由来の細胞内シグナル伝達ドメイン、およびヒトＣＤ３ゼータ由来のシグナル伝達ドメインを含む。操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を導入するために、細胞を、リンカー配列によって（ＣＡＲ抗ＣＤ１９配列と同じであっても異なってもよい）表５の抗ＣＤ１９配列に連結されたヒト全長Ｔ細胞受容体α鎖をコードする核酸分子を含み、かつＣＤ３イプシロンまたはＣＤ３ガンマの細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含むレンチウイルスベクターを使用して形質導入する。
形質導入後、細胞を、ヒト血清、ならびにＩＬ－２（５０Ｕ／ｍＬ）、ＩＬ－７（５ｎｇ／ｍＬ）、およびＩＬ－１５（０．５ｎｇ／ｍＬ）を含む培地中で３６～４８時間培養する。その後、細胞を、標的配列ＧＵＧＵＡＧＵＡＣＡＡＧＡＧＡＵＡＧＡＡ（表１７のＴＴＣ ９（配列番号６１６））を有するＢ２Ｍ標的ｇＮＡおよびガイド１７４を有するＣａｓＸ １１９を使用して調製したＲＮＰで電気穿孔する。その後、細胞を、同じ濃度のＩＬ－２、ＩＬ－７、およびＩＬ－１５を含む同じ培地中で、３０℃で一晩培養し、次いで、電気穿孔後１２～１５日まで３７℃で培養する。
ＣＡＲおよびＢ２Ｍ発現
Ｂ２Ｍの細胞表面発現、ＴＣＲおよびＣＡＲ発現（代理マーカーで示される）を、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体と結合したビーズで２４時間再刺激した後、電気穿孔後１２日目に評価する。フローサイトメトリーにより、細胞を、抗ＥＧＦＲ抗体で染色してＣＡＲ発現を確認し（代理マーカーであるＥＧＦＲｔの表面発現で示される）、抗ＴＣＲアルファで染色してＴＣＲ発現を確認し、抗Ｂ２Ｍ抗体で染色して表面上でのＢ２Ｍのノックダウン発現を確認する。フローサイトメトリーにより、細胞の大半が、Ｂ２Ｍの発現、ＣＡＲ発現集団の発現（ＥＧＦＲｔマーカーで示される）、およびＴＣＲ発現集団におけるＴＣＲの発現の減少を示すと予想される。
修飾されて操作されたＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の表現型の特徴もフローサイトメトリーによって評価し、表現型、分化状態、および／または活性化状態を示すものを含む様々なマーカーの表面発現を評価する。細胞を、Ｂ２Ｍを認識するものおよび上述のＥＧＦＲｔマーカー（ＣＡＲ発現の代理）に加えて、－Ｃモチーフケモカイン受容体７（ＣＣＲ７）、４－１ＢＢ、ＴＩＭ－３、ＣＤ２７、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、Ｌａｇ－３、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２５、およびＣＤ６９に特異的な抗体で染色する。
実施例２３：細胞毒性アッセイ
ＪＶＭ－２細胞（ＣＤ１９を発現するヒト慢性Ｂ細胞白血病細胞株）および実施例２２のＣＡＲ－Ｔ細胞株を、１０％ＦＣＳ（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、１００ＩＵ／ｍＬのペニシリン、および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を補充したＲＰＭＩ １６４０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）中で培養する。細胞毒性を、標準５１Ｃｒ放出アッセイで測定する。９６ウェルＵ底マイクロタイタープレート（１試料あたり三連ウェル）内で、ＣＡＲ－Ｔ細胞に、様々なエフェクター／ターゲット細胞比でクロム５１（５１Ｃｒ）標識標的細胞（１ウェルあたり５×１０３細胞）を播種する。プレートを３７℃および５％ＣＯ２で６時間インキュベートする。５１Ｃｒ放出を、液体シンチレーションカウンターを使用して１００μＬの上清中で測定する。最大放出が界面活性剤放出標的細胞数から得られ、自発的放出がエフェクター細胞の不在下での標的細胞数から得られる。細胞毒性を以下のように計算する：特異的溶解％＝［（実験的放出－自発的放出）／（最大放出－自発的放出）］。データがＣＤ１９＋標的細胞に溶解をもたらすＣＡＲ－Ｔ細胞の能力を裏付けることが予想される。
実施例２４：Ｂ２Ｍ遺伝子座での編集
材料および方法
ＣａｓＸバリアント１１９、４８８、および４９１を上記の実施例に記載されるように発現させ、精製した。足場１７４ならびにスペーサー７．９（配列ＧＵＧＵＡＧＵＡＣＡＡＧＡＧＡＵＡＧＡＡ（配列番号６１６）を有する）およびスペーサー７．３７（配列ＧＧＣＣＧＡＧＡＵＧＵＣＵＣＧＣＵＣＣＧ（配列番号５９２）を有する）を有するシングルガイドＲＮＡを、上記の実施例に記載されるように転写し、精製した。個々のＲＮＰを、２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、および２００ｍＭトレハロースを含む緩衝液（緩衝液１）中でタンパク質を１．２倍モル過剰のガイドと混合することによって組み立てた。ＲＮＰを３７℃で１０分間インキュベートし、その後、サイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。ＲＮＰの濃度を、Ｐｉｅｒｃｅ ６６０ｎｍタンパク質アッセイを使用して精製後に決定した。
精製したＲＮＰを、Ｊｕｒｋａｔ細胞のＢ２Ｍ遺伝子座での編集について試験した。ＲＮＰを、Ｌｏｎｚａ ４－Ｄ ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒシステムを使用して電気穿孔により送達した。別途特定されない限り、７００，０００個の細胞を２０ｕＬのＬｏｎｚａ緩衝液Ｐ３中に再懸濁し、緩衝液１中で適切な濃度および５ｕＬの最終体積に希釈したＲＮＰに添加した。細胞を、プロトコルＥＨ－１１５を使用したＬｏｎｚａ ９６ウェルシャトルシステムを使用して電気穿孔した。細胞を事前に平衡化したＲＰＭＩ中で回収し、その後、各電気穿孔条件を９６ウェルプレートの３つのウェルに分割した。ヌクレオフェクション後１日目および４日目に培地を交換した。ヌクレオフェクション後７日目に、細胞を蛍光抗ＨＬＡ １抗体で染色し、Ａｔｔｕｎｅ Ｎｘｔフローサイトメーターを使用して表面ＨＬＡの除去を評価した。次世代シークエンシングを実行した場合、各条件由来の細胞の半分をさらに３日間継代した後、回収した。ゲノムＤＮＡを単離し、Ｂ２Ｍ遺伝子の関連領域（７．３７の場合はエクソン１、７．９の場合はエクソン２）をＰＣＲ増幅し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑを使用して配列決定した。結果として得られた配列リードを、Ｃｒｉｓｐｒｅｓｓｏを使用して編集プロファイルについて分析した。
結果
ＣａｓＸバリアント１１９、４８８、または４９１のいずれかおよびＢ２Ｍ標的ガイド１７４．７．９または１７４．７．３７から成るＣａｓＸ ＲＮＰを、２５ｕＬのヌクレオフェクション条件あたり１．２５、５、２０、および８０ｐｍｏｌ用量でＪｕｒｋａｔ細胞にヌクレオフェクトした。スペースの制約のため、ＲＮＰ １１９．１７４．７．３７の１．２５ｐｍｏｌ用量を省略した。７．９を標的とするＲＮＰは、２０ｐｍｏｌ用量および８０ｐｍｏｌ用量で全てのタンパク質バリアントの９０％超の細胞中の表面ＨＬＡを排除した（図３０）。より低い用量では、ＣａｓＸ ４８８ ＲＮＰおよびＣａｓＸ ４９１ ＲＮＰがＣａｓＸ １１９ ＲＮＰを上回った。７．３７を標的とするＲＮＰは、約８０％の編集上限を有するように見え、５ｐｍｏｌの用量で１１９の編集が実質的に減少したが、４８８および４９１の最低用量でさえ編集の減少は比較的わずかであった（図３０）。全ての用量にわたって、４８８ベースのＲＮＰおよび４９１ベースのＲＮＰの性能はほぼ同一であった。緩衝液のみの対照と比較したＲＮＰでの処理後の生存細胞の数によって測定されるように、ＲＮＰのいずれも顕著なＲＮＰ依存性毒性を呈さなかった（図３１）。４９１は、測定の標準偏差と比較して差が小さいものの、４８８よりも優れた生存率を潜在的に有し、より優れた生産特性も有し（データ示さず）、将来のＲＮＰ編集実験の好ましい候補になる。
ＨＬＡの表現型ノックダウンを検証するために、Ｂ２Ｍの標的領域のディープシークエンシングを、各ＲＮＰの１．２５、５、および２０ｐｍｏｌ用量で行った。４８８．１７４．７．９（ＣａｓＸ ４８８、ｇＮＡ １７４およびスペーサー７．９）ＲＮＰおよび４９１．１７４．７．９（ＣａｓＸ ４９１、ｇＮＡ １７４およびスペーサー７．９）ＲＮＰは、２０ｐｍｏｌ用量でＢ２Ｍ遺伝子座の９９％超にインデルを生成し、それぞれ、５ｐｍｏｌ用量でＢ２Ｍ遺伝子座の９５％および９７％にインデルを生成した（図３２）。対応する７．３７ ＲＮＰは、２０ｐｍｏｌ用量および５ｐｍｏｌ用量の両方で９９％超のインデルをもたらし、これは、この場所での編集の多くが依然として機能的Ｂ２Ｍ産生をもたらし、表現型ノックアウトに明らかな上限をもたらすことを示す。ＮＧＳデータは表現型分析と一致しており、１１９ベースのＲＮＰと比較して４８８および４９１で一貫してより高い編集を示し、ピコモル範囲内で非常に低用量のＲＮＰで効率的な編集も示す。
実施例２５．ＴＲＡＣ遺伝子座でのＮＨＥＪおよびＨＤＲ
方法および材料
ＣａｓＸバリアント４９１およびｇＲＮＡ １７４．１５．３または１７４．１５．５のいずれかから成るＲＮＰを組み立て、上述のように精製した。相同性指向修復の鋳型を、切断部位の両側のおよそ５００ｂｐと、隣接するＰ２ＡおよびＴ２Ａ自己切断ペプチド配列を有するｅＧＦＰ配列とに対応するヒトゲノムＤＮＡ由来の相同性アームをＰＣＲ増幅することによって生成した（使用したプライマーは表１８に記載のものである）。結果として得られた鋳型がＴＲＡＣとインフレームのＰ２Ａ－ｅＧＦＰ－Ｔ２Ａ構築物を含むように、オーバーラップエクステンションＰＣＲを使用して断片を組み合わせた。その後、組み立てた鋳型配列を、ＰｓｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を使用してプラスミド骨格にクローニングした。二本鎖ＤＮＡ鋳型を生成するために、指定したプライマーを使用して適切なプラスミドをＰＣＲ増幅し、生成物をフェノール－クロロホルム抽出およびエタノール沈殿によって精製した。一本鎖ＤＮＡ鋳型を生成するために、同じプライマーを使用してプラスミドをＰＣＲ増幅したが、２つのうちの１つが５’リン酸塩を含んでいた。結果として得られた生成物を精製し、５’リン酸塩で鎖を分解するラムダエキソヌクレアーゼを使用して消化し、主に所望の鎖のｓｓＤＮＡを生成する。ｓｓＤＮＡ生成物をフェノール－クロロホルム抽出およびエタノール沈殿によって精製した。
最終体積２ｕＬにするために水中で所望の濃度に希釈した鋳型ＤＮＡを必要に応じて反応物に付加したことを除いて、電気穿孔を主に上述のように実行した。５０ｐｍｏｌのＲＮＰを使用し、鋳型ＤＮＡの量は、ｄｓＤＮＡの場合、２～８ｕｇであり、ｓｓＤＮＡの場合、１～４ｕｇであった。ヌクレオフェクションの７日後、細胞を、蛍光抗ＴＣＲ α／β抗体を使用して染色し、Ａｔｔｕｎｅ Ｎｘｔフローサイトメーターを使用してＴＣＲノックアウトおよびＧＦＰ発現について評価した。Ｊｕｒｋａｔ細胞は、遺伝子座に編集がない場合、有意なＴＣＲ陰性集団を有する。これを補正するために、ＴＣＲを発現していない細胞を、通常のＴＣＲ発現および提示を有する細胞と同等の率で、ＴＲＡＣ遺伝子座で編集し、式Ｅｃ＝（ＴＣＲＮｅｇＯｂｓ－ＴＣＲＮｅｇｃｔｒｌ）／（１－ＴＣＲＮｅｇｃｔｒｌ）を適用し、式中、Ｅｃは、補正された編集であり、ＴＣＲＮｅｇＯｂｓは、観察されたＴＣＲ陰性細胞率であり、ＴＣＲＮｅｇｃｔｒｌは、緩衝液のみの対照で観察された平均ＴＣＲ陰性細胞率である。ＴＣＲα遺伝子座のサイレンシングが我々のＨＤＲ効率を過小評価する可能性があるが、ＧＦＰ＋細胞には補正を適用しなかった。
結果
ドナーの不在下でのＴＲＡＣ標的ＲＮＰは、それぞれ、スペーサー１５．３および１５．５の５０ｐｍｏｌ用量で７５％および８３％の細胞中の表面ＴＣＲ α／βを排除した（図３３）。ｄｓＤＮＡは、最も高いＨＤＲ率をもたらし、１０％超に達するように見えたが、ほぼ全ての細胞の死にもつながった。ｓｓＤＮＡの生存率に対する影響ははるかに低く、いくつかの事例では、ドナーなしの対照および緩衝液のみの対照と比較して生存率が上昇するように見えた。ｓｓＤＮＡによるＨＤＲ率は、ＲＮＰおよびドナーの両方の用量によって１％～６％の範囲で異なり、スペーサー１５．５およびドナーＤＮＡの上方鎖で最も高い率が達成された。両方のスペーサーについて、鋳型の上方鎖に由来するドナーＤＮＡは、より高いレベルのＨＤＲをもたらしたが、これがこの系におけるｓｓＤＮＡ鋳型の一貫した特性であるかはまだ不明である。
実施例２６．Ｂ２ＭおよびＴＲＡＣ遺伝子座での同時編集
方法および材料
ＲＮＰを、ＣａｓＸ ４９１、ならびにガイド１７４．７．９、１７４．７．３７、および１７４．１５．３を使用して上述のように組み立てた。ＲＮＰを、サイズ排除クロマトグラフィーではなくアニオン交換を使用して精製した。
電気穿孔を主に上述のように行った。Ｂ２ＭおよびＴＲＡＣを標的とするＲＮＰの共電気穿孔を、最終体積５ｕＬになるように各ＲＮＰを等モル量で混合することによって実行した。ＲＮＰ用量を、各ＲＮＰのみの場合、２０ｐｍｏｌから０．３７２５ｐｍｏｌ、共電気穿孔条件の場合、２０ｐｍｏｌから０．６２５ｐｍｏｌの２倍希釈で作製した。モル量は、ある条件下での両方のＲＮＰの合計量ではなく、個々のＲＮＰを指す。ＴＲＡＣノックアウトのみを測定する場合、バックグラウンド補正を上述のように適用した。ダブルノックアウトの割合を決定する場合、我々は、ＴＲＡＣおよびＢ２Ｍでの編集が互いに独立しており、細胞のＴＣＲ状態とは無関係であると想定し、式ＤｂｌＮｅｇｃ＝（ＤｂｌＮｅｇｏｂｓ－ＴＣＲＮｅｇｃｔｒｌ×ＨＬＡＮｅｇｏｂｓ）／（１－ＴＣＲＮｅｇｃｔｒｌ）を適用し、式中、ＤｂｌＮｅｇｃは、補正された二重陰性率であり、ＤｂｌＮｅｇｏｂｓは、所与の試料の観察されたＴＣＲ－／ＨＬＡ－率であり、ＴＣＲＮｅｇｃｔｒｌは、緩衝液のみの対照中の総ＴＣＲ－率であり、ＨＬＡＮｅｇｏｂｓは、所与の試料の観察された総ＨＬＡ－率である。
結果
Ｂ２ＭおよびＴＲＡＣでの編集は、様々なＲＮＰレベルにわたって良好な用量反応を示した。ＴＲＡＣ遺伝子座での編集は、概して、Ｂ２Ｍ遺伝子座よりも低く、最大編集率５７％であった（図３４）。ダブルノックアウト率は、最も高いＲＮＰ用量で４５％に達した。各用量でのダブルノックアウト率は、２つの遺伝子座が独立して編集されるという予想と一致する。ＴＲＡＣ標的ＲＮＰの用量を増加させて、その部位での編集効率の低下を補うことにより、共編集の割合が改善され続ける可能性が高い。
本開示は以下の態様を提供し得る。
［項１］
ＣａｓＸタンパク質および第１のガイド核酸（ｇＮＡ）を含むＣａｓＸ：ｇＮＡ系であって、前記ｇＮＡが、抗原プロセシング、抗原提示、抗原認識、および／または抗原応答に関与する第１のタンパク質をコードする遺伝子の標的核酸配列に相補的な標的配列を含む、ＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
［項２］
前記第１のタンパク質が免疫細胞表面マーカーまたは免疫チェックポイントタンパク質である、項１に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
［項３］
前記第１のタンパク質が細胞内タンパク質である、項１に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
［項４］
前記タンパク質が、ベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、Ｔ細胞受容体アルファ鎖定常領域（ＴＲＡＣ）、クラスＩＩ主要組織適合性複合体トランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）、Ｔ細胞受容体ベータ定常１（ＴＲＢＣ１）、Ｔ細胞受容体ベータ定常２（ＴＲＢＣ２）、ヒト白血球抗原Ａ（ＨＬＡ－Ａ）、ヒト白血球抗原Ｂ（ＨＬＡ－Ｂ）、ＴＧＦβ受容体２（ＴＧＦβＲＩＩ）、プログラム細胞死１（ＰＤ－１）、サイトカイン誘導性ＳＨ２（ＣＩＳＨ）、リンパ球活性化３（ＬＡＧ－３）、ＩｇおよびＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）、アデノシンＡ２ａ受容体（ＡＤＯＲＡ２Ａ）、キラー細胞レクチン様受容体Ｃ１（ＮＫＧ２Ａ）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）、Ｔ細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン３（ＴＩＭ－３）、ならびに２Ｂ４（ＣＤ２４４）からなる群から選択される、項１～３のいずれか一項に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
［項５］
前記第１のタンパク質がＢ２Ｍである、項４に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
［項６］
前記第１のｇＮＡの前記標的配列が、配列番号７２５～２１００、２２８１～７０８５、５４７～５５１、５９１～５９５、および６１４～６８１からなる群から選択される配列、またはそれと少なくとも約６５％、少なくとも約７５％、少なくとも約８５％、もしくは少なくとも約９５％の同一性を有する配列を含む、項５に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
［項７］
前記第１のｇＮＡの前記標的配列が、配列番号７２５～２１００、２２８１～７０８５、５４７～５５１、５９１～５９５、および６１４～６８１からなる群から選択される配列を含む、項５に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
［項８］
前記第１のタンパク質がＴＲＡＣである、項４に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
［項９］
前記第１のｇＮＡの前記標的配列が、配列番号７０８６～２７４５４、５２２～５２９、および５６６～５７３からなる群から選択される配列、またはそれと少なくとも約６５％、少なくとも約７５％、少なくとも約８５％、もしくは少なくとも約９５％の同一性を有する配列を含む、項８に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
［項１０］
前記第１のｇＮＡの前記標的配列が、配列番号７０８６～２７４５４、５２２～５２９、および５６６～５７３からなる群から選択される配列を含む、項８に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
［項１１］
前記第１のタンパク質がＣＩＩＴＡである、項４に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
［項１２］
前記第１のｇＮＡの前記標的配列が、配列番号２７４５５～５５５７２からなる群から選択される配列、またはそれと少なくとも約６５％、少なくとも約７５％、少なくとも約８５％、もしくは少なくとも約９５％の同一性を有する配列を含む、項１１に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
［項１３］
前記第１のｇＮＡの前記標的配列が、配列番号２７４５５～５５５７２からなる群から選択される配列を含む、項１１に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
［項１４］
ベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、Ｔ細胞受容体アルファ鎖定常領域（ＴＲＡＣ）、クラスＩＩ主要組織適合性複合体トランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）、Ｔ細胞受容体ベータ定常１（ＴＲＢＣ１）、Ｔ細胞受容体ベータ定常２（ＴＲＢＣ２）、ヒト白血球抗原Ａ（ＨＬＡ－Ａ）、ヒト白血球抗原Ｂ（ＨＬＡ－Ｂ）、ＴＧＦβＲＩＩ、ＰＤ－１、ＣＩＳＨ、ＬＡＧ－３、ＴＩＧＩＴ、ＡＤＯＲＡ２Ａ、ＮＫＧ２Ａ、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ－３、およびＣＤ２４４からなる群から選択される第２のタンパク質をコードする免疫細胞遺伝子の標的核酸配列に相補的な標的配列を含む第２のｇＮＡをさらに含み、前記第２のタンパク質が前記第１のタンパク質とは異なる、項１～１３のいずれか一項に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
［項１５］
前記第１のｇＮＡ標的配列がＢ２Ｍ遺伝子標的核酸配列に相補的であり、前記第２のｇＮＡ標的配列がＴＲＡＣ遺伝子標的核酸配列に相補的である、項１４に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
［項１６］
前記第１のｇＮＡ標的配列がＢ２Ｍ遺伝子標的核酸配列に相補的であり、前記第２のｇＮＡ標的配列がＣＩＩＴＡ遺伝子標的核酸配列に相補的である、項１４に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
［項１７］
前記第１のｇＮＡ標的配列がＴＲＡＣ遺伝子標的核酸配列に相補的であり、前記第２のｇＮＡ標的配列がＣＩＩＴＡ遺伝子標的核酸配列に相補的である、項１４に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
［項１８］
ベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、Ｔ細胞受容体アルファ鎖定常領域（ＴＲＡＣ）、クラスＩＩ主要組織適合性複合体トランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）、Ｔ細胞受容体ベータ定常１（ＴＲＢＣ１）、Ｔ細胞受容体ベータ定常２（ＴＲＢＣ２）、ヒト白血球抗原Ａ（ＨＬＡ－Ａ）、ヒト白血球抗原Ｂ（ＨＬＡ－Ｂ）、ＴＧＦβＲＩＩ、ＰＤ－１、ＣＩＳＨ、ＬＡＧ－３、ＴＩＧＩＴ、ＡＤＯＲＡ２Ａ、ＮＫＧ２Ａ、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ－３、およびＣＤ２４４からなる群から選択される第３のタンパク質をコードする免疫細胞遺伝子の標的核酸配列に相補的な標的配列を含む第３のｇＮＡをさらに含み、前記第３のタンパク質が前記第１のタンパク質および前記第２のタンパク質とは異なる、項１４～１７のいずれか一項に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
［項１９］
前記第１のｇＮＡ標的配列がＢ２Ｍをコードする遺伝子の標的核酸配列に相補的であり、前記第２のｇＮＡ標的配列がＴＲＡＣをコードする遺伝子の標的核酸配列に相補的であり、前記第３のｇＮＡ標的配列がＣＩＩＴＡをコードする遺伝子の標的核酸配列に相補的である、項１８に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
［項２０］
分化抗原群２４７（ＣＤ２４７）、ＣＤ３ｄ分子（ＣＤ３Ｄ）、ＣＤ３ｅ分子（ＣＤ３Ｅ）、ＣＤ３ｇ分子（ＣＤ３Ｇ）、ＣＤ５２分子（ＣＤ５２）、ヒト白血球抗原Ｃ（ＨＬＡ－Ｃ）、デオキシシチジンキナーゼ（ｄＣＫ）、およびＦＫＢＰプロリルイソメラーゼ１Ａ（ＦＫＢＰ１Ａ）からなる群から選択されるタンパク質をコードする免疫細胞遺伝子の標的核酸配列に相補的な標的配列を有する追加のｇＮＡをさらに含む、項１～１９のいずれか一項に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
［項２１］
前記第１のｇＮＡ、前記第２のｇＮＡ、前記第３のｇＮＡ、および／または前記追加のｇＮＡがガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）である、項１～２０のいずれか一項に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
［項２２］
前記ｇＮＡがガイドＤＮＡ（ｇＤＮＡ）である、項１～２０のいずれか一項に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
［項２３］
前記ｇＮＡがＤＮＡおよびＲＮＡを含むキメラである、項１～２０のいずれか一項に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
［項２４］
前記ｇＮＡが単一分子ｇＮＡ（ｓｇＮＡ）である、項１～２３のいずれか一項に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
［項２５］
前記ｇＮＡが二分子ｇＮＡ（ｄｇＮＡ）である、項１～２３のいずれか一項に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
［項２６］
前記ｇＮＡの前記標的配列が、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のヌクレオチドを含む、項１～２５のいずれか一項に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
［項２７］
前記ｇＮＡが、配列番号４～１６の参照ｇＮＡ配列もしくは配列番号２１０１～２２８０のｇＮＡバリアント配列からなる群から選択される配列、またはそれと少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を含む足場を有する、項１～２６のいずれか一項に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
［項２８］
前記ｇＮＡバリアント足場が、配列番号４～１６からなる群から選択される参照ｇＮＡ配列と比較して少なくとも１つの修飾を有する配列を含む、項２７に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
［項２９］
前記参照ｇＮＡの前記少なくとも１つの修飾が、前記ｇＮＡ配列のヌクレオチドの少なくとも１つの置換、欠失、または置換を含む、項２８に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
［項３０］
前記ｇＮＡが化学的に修飾される、先行項のいずれか一項に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
［項３１］
前記ＣａｓＸタンパク質が、配列番号１～３のうちのいずれか１つの配列を有する参照ＣａｓＸタンパク質、配列番号４９～１４３、４３８、４４０、４４２、４４４、４４６、４４８～４６０、４７２、４７４、４７８、４８０、４８２、４８４、４８６、４８８、４９０、６１２、もしくは６１３の配列、またはそれと少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９６％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を有するＣａｓＸバリアントタンパク質を含む、先行項のいずれか一項に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
［項３２］
前記ＣａｓＸバリアントタンパク質が、配列番号１～３から選択される配列を有する参照ＣａｓＸタンパク質と比較して少なくとも１つの修飾を含む、項３１に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
［項３３］
前記少なくとも１つの修飾が、前記参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、前記ＣａｓＸバリアントタンパク質のドメインに少なくとも１つのアミノ酸置換、欠失、または置換を含む、項３２に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
［項３４］
前記ドメインが、非標的鎖結合（ＮＴＳＢ）ドメイン、標識鎖負荷（ＴＳＬ）ドメイン、ヘリックスＩドメイン、ヘリックスＩＩドメイン、オリゴヌクレオチド結合ドメイン（ＯＢＤ）、およびＲｕｖＣ ＤＮＡ切断ドメインからなる群から選択される、項３３に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
［項３５］
前記ＣａｓＸタンパク質が１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）をさらに含む、項３１～３４のいずれか一項に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
［項３６］
前記１つ以上のＮＬＳが、ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１５８）、ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号１５９）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号１６０）、ＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰ（配列番号１６１）、ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹ（配列番号１６２）、ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ（配列番号１６３）、ＶＳＲＫＲＰＲＰ（配列番号１６４）、ＰＰＫＫＡＲＥＤ（配列番号１６５）、ＰＱＰＫＫＫＰＬ（配列番号１６６）、ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ（配列番号１６７）、ＤＲＬＲＲ（配列番号１６８）、ＰＫＱＫＫＲＫ（配列番号１６９）、ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ（配列番号１７０）、ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ（配列番号１７１）、ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ（配列番号１７２）、ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫ（配列番号１７３）、ＰＲＰＲＫＩＰＲ（配列番号１７４）、ＰＰＲＫＫＲＴＶＶ（配列番号１７５）、ＮＬＳＫＫＫＫＲＫＲＥＫ（配列番号１７６）、ＲＲＰＳＲＰＦＲＫＰ（配列番号１７７）、ＫＲＰＲＳＰＳＳ（配列番号１７８）、ＫＲＧＩＮＤＲＮＦＷＲＧＥＮＥＲＫＴＲ（配列番号１７９）、ＰＲＰＰＫＭＡＲＹＤＮ（配列番号１８０）、ＫＲＳＦＳＫＡＦ（配列番号１８１）、ＫＬＫＩＫＲＰＶＫ（配列番号１８２）、ＰＫＴＲＲＲＰＲＲＳＱＲＫＲＰＰＴ（配列番号１８４）、ＲＲＫＫＲＲＰＲＲＫＫＲＲ（配列番号１８７）、ＰＫＫＫＳＲＫＰＫＫＫＳＲＫ（配列番号１８８）、ＨＫＫＫＨＰＤＡＳＶＮＦＳＥＦＳＫ（配列番号１８９）、ＱＲＰＧＰＹＤＲＰＱＲＰＧＰＹＤＲＰ（配列番号１９０）、ＬＳＰＳＬＳＰＬＬＳＰＳＬＳＰＬ（配列番号１９１）、ＲＧＫＧＧＫＧＬＧＫＧＧＡＫＲＨＲＫ（配列番号１９２）、ＰＫＲＧＲＧＲＰＫＲＧＲＧＲ（配列番号１９３）、ＭＳＲＲＲＫＡＮＰＴＫＬＳＥＮＡＫＫＬＡＫＥＶＥＮ（配列番号１８５）、ＰＫＫＫＲＫＶＰＰＰＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号１８３）、およびＰＫＫＫＲＫＶＰＰＰＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１９４）からなる配列の群から選択される、項３５に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
［項３７］
前記１つ以上のＮＬＳが前記ＣａｓＸタンパク質のＣ末端でまたはその近くで発現される、項３５または項３６に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
［項３８］
前記１つ以上のＮＬＳが前記ＣａｓＸタンパク質のＮ末端でまたはその近くで発現される、項３５または項３６に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
［項３９］
前記ＣａｓＸタンパク質のＮ末端にまたはその近くに、かつＣ末端にまたはその近くに位置する１つ以上のＮＬＳを含む、項３５または項３６に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
［項４０］
前記ＣａｓＸバリアントが前記バリアントｇＮＡとリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を形成することができる、項３１～３９のいずれか一項に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
［項４１］
前記ＣａｓＸバリアントタンパク質と前記ｇＮＡバリアントとのＲＮＰが、配列番号１、配列番号２、または配列番号３の参照ＣａｓＸタンパク質のＲＮＰ、および配列番号４～１６のうちのいずれか１つの配列を含むｇＮＡと比較して、少なくとも１つ以上の改善された特性を呈する、項４０に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
［項４２］
前記改善された特性が、前記ＣａｓＸバリアントの改善されたフォールディング、ガイド核酸（ｇＮＡ）に対する改善された結合親和性、標的ＤＮＡに対する改善された結合親和性、標的ＤＮＡの編集においてＡＴＣ、ＣＴＣ、ＧＴＣ、またはＴＴＣを含む１つ以上のＰＡＭ配列のより広範なスペクトルを利用する改善された能力、前記標的ＤＮＡの改善された巻き戻し、増加した編集活性、改善された編集効率、改善された編集特異性、増加したヌクレアーゼ活性、二本鎖切断のための増加した標識鎖負荷、一本鎖ニッキングのための減少した標識鎖負荷、減少したオフターゲット切断、非標的ＤＮＡ鎖の改善された結合、改善されたタンパク質安定性、改善されたタンパク質溶解性、改善されたタンパク質：ｇＮＡ複合体（ＲＮＰ）安定性、改善されたタンパク質：ｇＮＡ複合体溶解性、改善されたタンパク質収量、改善されたタンパク質発現、および改善された融合特性からなる群のうちの１つ以上から選択される、項４１に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
［項４３］
前記ＣａｓＸバリアントタンパク質と前記ｇＮＡバリアントとの前記ＲＮＰの前記改善された特性が、配列番号１、配列番号２、または配列番号３の前記参照ＣａｓＸタンパク質と配列番号４～１６のうちのいずれか１つの前記ｇＮＡとの前記ＲＮＰと比較して、少なくとも約１．１～約１００倍またはそれ以上改善される、項４１または項４２に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
［項４４］
前記ＣａｓＸバリアントタンパク質の前記改善された特性が、配列番号１、配列番号２、または配列番号３の前記参照ＣａｓＸタンパク質および配列番号４～１６のうちのいずれか１つの配列を含む前記ｇＮＡと比較して、少なくとも約１．１、少なくとも約２、少なくとも約１０、少なくとも約１００倍またはそれ以上改善される、項４１または項４２に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
［項４５］
前記改善された特性が編集効率を含み、前記ＣａｓＸバリアントタンパク質と前記ｇＮＡバリアントとの前記ＲＮＰが、配列番号２の前記参照ＣａｓＸタンパク質と配列番号４～１６のうちのいずれか１つの配列を含む前記ｇＮＡとの前記ＲＮＰと比較して、編集効率の１．１～１００倍の改善を含む、項４１～４３のいずれか一項に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
［項４６］
前記ＣａｓＸバリアントと前記ｇＮＡバリアントとを含む前記ＲＮＰが、細胞アッセイシステムにおいて、前記ＰＡＭ配列ＴＴＣ、ＡＴＣ、ＧＴＣ、またはＣＴＣのうちのいずれか１つが、前記ｇＮＡの前記標的配列と同一性を有するプロトスペーサーの非標的鎖の５’側の１ヌクレオチドに位置する場合、同等のアッセイシステムにおける配列番号２の参照ＣａｓＸタンパク質と配列番号４～１６のうちのいずれか１つの配列を含む前記ｇＮＡとを含むＲＮＰの編集効率および／または結合と比較して、前記標的ＤＮＡにおいてより高い標的配列の編集効率および／または結合を呈する、項４０～４５のいずれか一項に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
［項４７］
前記ＰＡＭ配列がＴＴＣである、項４６に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
［項４８］
前記ＰＡＭ配列がＡＴＣである、項４６に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
［項４９］
前記ＰＡＭ配列がＣＴＣである、項４６に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
［項５０］
前記ＰＡＭ配列がＧＴＣである、項４６に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
［項５１］
前記１つ以上のＰＡＭ配列に対する前記増加した結合親和性が、前記ＰＡＭ配列に対する配列番号１～３の前記参照ＣａｓＸタンパク質のうちのいずれか１つの結合親和性と比較して少なくとも１．５倍～少なくとも１０倍高い、項４６～５０のいずれか一項に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
［項５２］
前記ＲＮＰが、配列番号１～３の前記参照ＣａｓＸと配列番号４～１６のうちのいずれか１つの配列を含む前記ｇＮＡとのＲＮＰと比較して少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、または少なくとも２０％高いパーセンテージの切断能力のあるＲＮＰを有する、項４０～５１のいずれか一項に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
［項５３］
前記ＣａｓＸバリアントタンパク質がニッカーゼ活性を有するＲｕｖＣ ＤＮＡ切断ドメインを含む、項３１～５２のいずれか一項に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
［項５４］
前記ＣａｓＸバリアントタンパク質が二本鎖切断活性を有するＲｕｖＣ ＤＮＡ切断ドメインを含む、項３１～５２のいずれか一項に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
［項５５］
前記ＣａｓＸタンパク質が触媒的に不活性なＣａｓＸ（ｄＣａｓＸ）タンパク質であり、前記ｄＣａｓＸおよび前記ｇＮＡが前記ＳＯＤ１標的核酸に結合する能力を保持する、項１～４０のいずれか一項に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
［項５６］
前記ｄＣａｓＸが、残基：
ａ．配列番号１の前記ＣａｓＸタンパク質に対応するＤ６７２、Ｅ７６９、および／もしくはＤ９３５、または
ｂ．配列番号２の前記ＣａｓＸタンパク質に対応するＤ６５９、Ｅ７５６および／もしくはＤ９２２に変異を含む、項５５に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
［項５７］
前記変異が前記残基のアラニンでの置換である、項５６に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
［項５８］
ドナー鋳型核酸をさらに含む、項１～５４のいずれか一項に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
［項５９］
前記ドナー鋳型が、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＴＧＦβＲＩＩ、ＰＤ－１、ＣＩＳＨ、ＬＡＧ－３、ＴＩＧＩＴ、ＡＤＯＲＡ２Ａ、ＮＫＧ２Ａ、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ－３、およびＣＤ２４４からなる群から選択されるタンパク質をコードする遺伝子の全てまたは一部分を含むポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドが、前記タンパク質をコードするゲノムポリヌクレオチド配列と比較して１つ以上のヌクレオチドの欠失、挿入、または変異を含む、項５８に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
［項６０］
項３１～５７のいずれか一項に記載のＣａｓＸをコードする配列を含む、ポリヌクレオチド。
［項６１］
項１～３０のいずれか一項に記載のｇＮＡをコードする配列を含む、ポリヌクレオチド。
［項６２］
項５８または項５９に記載のドナー鋳型を含む、ポリヌクレオチド。
［項６３］
項６０～６２に記載のポリヌクレオチドのうちの１つ以上を含む、ベクター。
［項６４］
項６０～６２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
［項６５］
前記ベクターがプロモーターをさらに含む、項６３または項６４に記載のベクター。
［項６６］
前記ベクターが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクター、プラスミド、ミニサークル、ナノプラスミド、ＤＮＡベクター、およびＲＮＡベクターからなる群から選択される、項６３～６５のいずれか一項に記載のベクター。
［項６７］
前記ベクターがＡＡＶベクターである、項６６に記載のベクター。
［項６８］
前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ－Ｒｈ７４、またはＡＡＶＲｈ１０から選択される、項６７に記載のベクター。
［項６９］
前記ベクターがレトロウイルスベクターである、項６６に記載のベクター。
［項７０］
マトリックスタンパク質（ＭＡ）、ヌクレオカプシドタンパク質（ＮＣ）、カプシドタンパク質（ＣＡ）、ｐ１～ｐ６タンパク質、およびプロテアーゼ切断部位の群から選択されるＧａｇポリタンパク質の１つ以上の構成要素を含み、前記ＶＬＰの標的細胞への結合および融合を提供する標的糖タンパク質をさらに含む、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
［項７１］
項３１～５７のいずれか一項に記載のＣａｓＸタンパク質および項１～３０のいずれか一項に記載のｇＮＡを含み、任意選択的に、項６２に記載のポリヌクレオチドを含む、項７０に記載のＶＬＰ。
［項７２］
前記ＣａｓＸタンパク質と前記ｇＮＡがＲＮＰで一緒に会合している、項７１に記載のＶＬＰ。
［項７３］
細胞集団における遺伝子の標的核酸配列を修飾する方法であって、前記遺伝子が、抗原プロセシング、抗原提示、抗原認識、および／または抗原応答に関与するタンパク質をコードし、前記集団の各細胞に、
ａ．項１～５９のいずれか一項に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系、
ｂ．項６０～６２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、
ｃ．項６３のいずれか一項に記載のベクター、
ｄ．項７０～７２のいずれか一項に記載のＶＬＰ、または
ｅ．（ａ）～（ｄ）のうちの２つ以上の組み合わせを導入することを含み、
前記細胞の前記標的核酸配列が前記ＣａｓＸタンパク質によって修飾される、方法。
［項７４］
前記ＣａｓＸ：ｇＮＡ系がＲＮＰとして前記細胞に導入される、項７３に記載の方法。
［項７５］
前記細胞が、疾患抗原、任意選択的に、腫瘍細胞抗原に対する結合親和性を有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチドの導入によって修飾される、項７３または項７４に記載の方法。
［項７６］
前記細胞が、疾患抗原、任意選択的に、腫瘍細胞抗原に対する結合親和性を有する結合ドメインを含む操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードするポリヌクレオチドの導入によって修飾される、項７３または項７４に記載の方法。
［項７７］
前記腫瘍細胞抗原が、分化抗原群１９（ＣＤ１９）、分化抗原群３（ＣＤ３）、ＣＤ３ｄ分子（ＣＤ３Ｄ）、ＣＤ３ｇ分子（ＣＤ３Ｇ）、ＣＤ３ｅ分子（ＣＤ３Ｅ）、ＣＤ２４７分子（ＣＤ２４７、またはＣＤ３Ｚ）、ＣＤ８ａ分子（ＣＤ８）、ＣＤ７分子（ＣＤ７）、膜メタロエンドペプチダーゼ（ＣＤ１０）、膜貫通４－ドメインＡ１（ＣＤ２０）、ＣＤ２２分子（ＣＤ２２）、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー８（ＣＤ３０）、Ｃ型レクチンドメインファミリー１２メンバーＡ（ＣＬＬ１）、ＣＤ３３分子（ＣＤ３３）、ＣＤ３４分子（ＣＤ３４）、ＣＤ３８分子（ＣＤ３８）、インテグリンサブユニットアルファ２ｂ（ＣＤ４１）、ＣＤ４４分子（インド人血液型）（ＣＤ４４）、ＣＤ４７分子（ＣＤ４７）、インテグリンアルファ６（ＣＤ４９ｆ）、神経細胞接着分子１（ＣＤ５６）、ＣＤ７０分子（ＣＤ７０）、ＣＤ７４分子（ＣＤ７４）、ＣＤ９９分子（Ｘｇ血液型）（ＣＤ９９）、インターロイキン３受容体サブユニットアルファ（ＣＤ１２３）、プロミニン１（ＣＤ１３３）、シンデカン１（ＣＤ１３８）、カルボニクスアンヒドラーゼＩＸ（ＣＡＩＸ）、ＣＣケモカイン受容体４（ＣＣＲ４）、ＡＤＡＭメタロペプチダーゼドメイン１２（ＡＤＡＭ１２）、接着Ｇタンパク質共役型受容体Ｅ２（ＡＤＧＲＥ２）、胎盤様型２アルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰＰＬ２）、アルファ４インテグリン、アンジオポエチン－２（ＡＮＧ２）、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、ＣＤ４４Ｖ６、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＥＡＣ、ＣＥＡ細胞接着分子５（ＣＥＡＣＡＭ５）、クローディン６（ＣＬＤＮ６）、クローディン１８（ＣＬＤＮ１８）、Ｃ型レクチンドメインファミリー１２メンバーＡ（ＣＬＥＣ１２Ａ）、間葉上皮移行因子（ｃＭＥＴ）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）、上皮成長因子受容体１（ＥＧＦ１Ｒ）、上皮成長因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、上皮糖タンパク質２（ＥＧＰ－２）、上皮細胞接着分子（ＥＧＰ－４０またはＥｐＣＡＭ）、ＥＰＨ受容体Ａ２（ＥｐｈＡ２）、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ３（ＥＮＰＰ３）、ｅｒｂ－ｂ２受容体チロシンキナーゼ２（ＥＲＢＢ２）、ｅｒｂ－ｂ２受容体チロシンキナーゼ３（ＥＲＢＢ３）、ｅｒｂ－ｂ２受容体チロシンキナーゼ４（ＥＲＢＢ４）、葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）、胎児ニコチン性アセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）、葉酸受容体アルファ（ＦＲアルファまたはＦＯＬＲ１）、Ｇタンパク質共役型受容体１４３（ＧＰＲ１４３）、代謝型グルタミン酸受容体８（ＧＲＭ８）、グリピカン－３（ＧＰＣ３）、ガングリオシドＧＤ２、ガングリオシドＧＤ３、ヒト上皮成長因子受容体１（ＨＥＲ１）、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）、ヒト上皮成長因子受容体３（ＨＥＲ３）、インテグリンＢ７、細胞間細胞接着分子－１（ＩＣＡＭ－１）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、インターロイキン－１３受容体α２（ＩＬ－ｌ３Ｒ－ａ２）、Ｋ－軽鎖、キナーゼ挿入ドメイン受容体（ＫＤＲ）、ルイス－Ｙ（ＬｅＹ）、コンドロモジュリン－１（ＬＥＣＴ１）、Ｌ１細胞粘着分子（Ｌ１ＣＡＭ）、リゾホスファチジン酸受容体３（ＬＰＡＲ３）、メラノーマ関連抗原１（ＭＡＧＥ－Ａ１）、メソテリン（ＭＳＬＮ）、ムチン１（ＭＵＣ１）、細胞表面結合ムチン１６（ＭＵＣ１６）、メラノーマ関連抗原３（ＭＡＧＥ－Ａ３）、腫瘍タンパク質ｐ５３（ｐ５３）、Ｔ細胞によって認識されるメラノーマ抗原１（ＭＡＲＴ１）、糖タンパク質１００（ＧＰ１００）、プロテイナーゼ３（ＰＲ１）、エフリン－Ａ受容体２（ＥｐｈＡ２）、ナチュラルキラーグループ２Ｄリガンド（ＮＫＧ２Ｄリガンド）、ニューヨーク食道扁平上皮がん１（ＮＹ－ＥＳＯ－１）、がん胎児性抗原（ｈ５Ｔ４）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、プログラム死リガンド１（ＰＤＬ－１）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、トロホブラスト糖タンパク質（ＴＰＢＧ）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ－７２）、腫瘍関連カルシウムシグナルトランスデューサー２（ＴＲＯＰ－２）、チロシナーゼ（ＴＹＲ）、スルビビン、血管内皮成長因子受容体２（ＶＥＧＦ－Ｒ２）、ウィルムス腫瘍－１（ＷＴ－１）、白血球免疫グロブリン様受容体Ｂ２（ＬＩＬＲＢ２）、メラノーマ優先発現抗原（ＰＲＡＭＥ）、Ｔ細胞受容体ベータ定常１（ＴＲＢＣ１）、ＴＲＢＣ２、および（Ｔ細胞免疫グロブリンムチン－３）ＴＩＭ－３からなる群から選択される、項７４または項７５に記載の方法。
［項７８］
前記ＣＡＲおよび／または前記ＴＣＲが、直鎖状抗体、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、および一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）からなる群から選択される抗原結合ドメインを含む、項７５～７７のいずれか一項に記載の方法。
［項７９］
前記抗原結合ドメインが、前記腫瘍細胞抗原に対する結合親和性を有するｓｃＦｖである、項７８に記載の方法。
［項８０］
前記抗原結合ドメインが、表５に記載の配列からなる群から選択される可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）ならびに／または重鎖および軽鎖ＣＤＲを含むｓｃＦｖである、項７９に記載の方法。
［項８１］
前記ｓｃＦｖの前記ＶＨ、前記ＶＬ、および／または前記ＣＤＲが１つ以上のアミノ酸修飾を有し、前記ｓｃＦｖが前記腫瘍抗原に対する結合親和性を保持し、前記修飾が、置換、欠失、および挿入からなる群から選択される、項８０に記載の方法。
［項８２］
前記ＣＡＲが少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含む、項７５～８１のいずれか一項に記載の方法。
［項８３］
前記少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ２４７分子（ＣＤ３－ゼータ）、ＣＤ２７分子（ＣＤ２７）、ＣＤ２８分子（ＣＤ２８）、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー９（４－１ＢＢ）、誘導性Ｔ細胞共刺激因子（ＩＣＯＳ）、またはＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー４（ＯＸ４０）から単離されたまたはそれに由来する少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインを含む、項８２に記載の方法。
［項８４］
前記少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインが、
ａ．ＣＤ３－ゼータ細胞内シグナル伝達ドメイン、
ｂ．ＣＤ３－ゼータ細胞内シグナル伝達ドメインおよび４－１ＢＢまたはＣＤ２８細胞内シグナル伝達ドメイン、
ｃ．ＣＤ－ゼータ細胞内シグナル伝達ドメイン、４－１ＢＢ細胞内シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ２８細胞内シグナル伝達ドメイン、または
ｄ．ＣＤ－ゼータ細胞内シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２８細胞内シグナル伝達ドメイン、４－１ＢＢ細胞内シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ２７またはＯＸ４０細胞内シグナル伝達ドメインを含む、項８３に記載の方法。
［項８５］
前記ＣＡＲが細胞外ヒンジドメインをさらに含む、項７５～８４のいずれか一項に記載の方法。
［項８６］
前記ヒンジドメインが免疫グロブリン様ドメインである、項８５に記載の方法。
［項８７］
前記ヒンジドメインが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４から単離または誘導される、項８６に記載の方法。
［項８８］
前記ヒンジドメインが、ＣＤ８ａ分子（ＣＤ８）またはＣＤ２８から単離または誘導される、項８６に記載の方法。
［項８９］
前記ＣＡＲが膜貫通ドメインをさらに含む、項７５～８８のいずれか一項に記載の方法。
［項９０］
前記膜貫通ドメインが、ＣＤ３－ゼータ、ＣＤ４、ＣＤ８、およびＣＤ２８からなる群から単離または誘導される、項８９に記載の方法。
［項９１］
前記ＴＣＲが、ＴＣＲアルファ、ＴＣＲベータ、ＣＤ３－デルタ、ＣＤ３－イプシロン、ＣＤ－ガンマ、またはＣＤ３－ゼータからなる群から選択される１つ以上のサブユニットを含む、項７６～８１のいずれか一項に記載の方法。
［項９２］
前記ＴＣＲが、ＣＤ２４７分子（ＣＤ３－ゼータ）、ＣＤ２７分子（ＣＤ２７）、ＣＤ２８分子（ＣＤ２８）、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー９（４－１ＢＢ）、誘導性Ｔ細胞共刺激因子（ＩＣＯＳ）、またはＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー４（ＯＸ４０）からなる群から選択される１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含む、項９１に記載の方法。
［項９３］
前記ＴＣＲの前記抗原結合ドメインが、ＴＣＲアルファ、ＴＣＲベータ、ＣＤ３－デルタ、ＣＤ３－イプシロン、ＣＤ－ガンマ、またはＣＤ３－ゼータからなる群から選択される１つ以上のＴＣＲサブユニットに作動可能に連結される、項９０または項９１に記載の方法。
［項９４］
前記ＴＣＲの前記抗原結合ドメインが、表５に記載の配列からなる群から選択される可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）ならびに／または重鎖および軽鎖ＣＤＲを含むｓｃＦｖである、項９３に記載の方法。
［項９５］
前記ｓｃＦｖの前記ＶＨ、前記ＶＬ、および／または前記ＣＤＲが１つ以上のアミノ酸修飾を有し、前記ｓｃＦｖが前記腫瘍抗原に対する結合親和性を保持し、前記修飾が、置換、欠失、および挿入からなる群から選択される、項９４に記載の方法。
［項９６］
前記細胞が、齧歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、および非ヒト霊長類細胞からなる群から選択される、項７３～９５のいずれか一項に記載の方法。
［項９７］
前記細胞がヒト細胞である、項７３～９５のいずれか一項に記載の方法。
［項９８］
前記細胞が、前駆細胞、造血幹細胞、および多能性幹細胞からなる群から選択される、項７３～９７のいずれか一項に記載の方法。
［項９９］
前記細胞が人工多能性幹細胞である、項９８に記載の方法。
［項１００］
前記細胞が免疫細胞である、項７３～９７のいずれか一項に記載の方法。
［項１０１］
前記免疫細胞が、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、または樹状細胞からなる群から選択される、項１００に記載の方法。
［項１０２］
前記Ｔ細胞が、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ターミナルエフェクターＴ細胞、メモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞、制御性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、ガンマ－デルタＴ細胞、サイトカイン誘導性キラー（ＣＩＫ）Ｔ細胞、および腫瘍浸潤リンパ球、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、項１０１に記載の方法。
［項１０３］
前記修飾が、前記集団の前記細胞の前記標的核酸配列に１つ以上の一本鎖切断を導入することを含む、項７３～１０２のいずれか一項に記載の方法。
［項１０４］
前記修飾が、前記集団の前記細胞の前記標的核酸配列に１つ以上の二本鎖切断を導入することを含む、項７３～１０２のいずれか一項に記載の方法。
［項１０５］
前記修飾が、前記集団の前記細胞の前記標的核酸配列に１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、置換、重複、または逆位を導入することを含み、これにより、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＴＧＦβＲＩＩ、ＰＤ－１、ＣＩＳＨ、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＡＤＯＲＡ２Ａ、ＮＫＧ２Ａ、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ－３、およびＣＤ２４４からなる群から選択される１つ以上のタンパク質をコードする前記集団の前記細胞における遺伝子のノックダウンまたはノックアウトがもたらされる、項７３～１０４のいずれか一項に記載の方法。
［項１０６］
前記方法が、前記集団の前記細胞の前記標的核酸配列の前記切断部位への項５８または項５９に記載のドナー鋳型の挿入を含む、項７３～１０４のいずれか一項に記載の方法。
［項１０７］
前記ドナー鋳型の前記挿入が、相同性指向修復（ＨＤＲ）または相同性非依存性標的組み込み（ＨＩＴＩ）によって媒介される、項１０６に記載の方法。
［項１０８］
前記ドナー鋳型の挿入により、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＴＧＦβＲＩＩ、ＰＤ－１、ＣＩＳＨ、ＬＡＧ－３、ＴＩＧＩＴ、ＡＤＯＲＡ２Ａ、ＮＫＧ２Ａ、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ－３、およびＣＤ２４４からなる群から選択される１つ以上のタンパク質をコードする前記集団の前記細胞における前記遺伝子のノックダウンまたはノックアウトがもたらされる、項１０６または項１０７に記載の方法。
［項１０９］
前記１つ以上のタンパク質の発現が修飾されていない細胞と比較して少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％減少するように前記集団の前記細胞が修飾されている、項１０５～１０８のいずれか一項に記載の方法。
［項１１０］
前記細胞の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％が修飾されていない細胞と比較して前記１つ以上のタンパク質を検出可能なレベルで発現しないように前記集団の前記細胞が修飾されている、項１０５～１０９のいずれか一項に記載の方法。
［項１１１］
前記１つ以上のタンパク質が、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、およびＣＩＩＴＡからなる群から選択される、項１０５～１１０のいずれか一項に記載の方法。
［項１１２］
前記細胞の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％がＢ２Ｍ、ＴＲＡＣ、およびＣＩＩＴＡからなる群から選択される前記タンパク質のうちの少なくとも２つを検出可能なレベルで発現しないように前記集団の前記細胞が修飾されている、項１１１に記載の方法。
［項１１３］
前記細胞集団の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％がＭＨＣクラスＩ分子を検出可能なレベルで発現しないように前記細胞が修飾されている、項１０５～１１２のいずれか一項に記載の方法。
［項１１４］
前記細胞集団の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％が野生型Ｔ細胞受容体を検出可能なレベルで発現しないように前記細胞が修飾されている、項１０５～１１３のいずれか一項に記載の方法。
［項１１５］
前記細胞集団が前記ＣＡＲを検出可能なレベルで発現する、項１０５～１１４のいずれか一項に記載の方法。
［項１１６］
前記細胞集団が前記ＴＣＲを検出可能なレベルで発現する、項１０５～１１５のいずれか一項に記載の方法。
［項１１７］
前記方法が前記細胞集団においてエクスビボで行われる、項７３～１１５のいずれか一項に記載の方法。
［項１１８］
前記方法が対象においてインビボで行われる、項７３～１１５のいずれか一項に記載の方法。
［項１１９］
前記対象が、齧歯類、マウス、ラット、および非ヒト霊長類からなる群から選択される、項１１８に記載の方法。
［項１２０］
前記対象がヒトである、項１１８に記載の方法。
［項１２１］
項７３～１１７のいずれか一項に記載の方法によってエクスビボで修飾された細胞集団。
［項１２２］
前記細胞集団の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％がＭＨＣクラスＩ分子を検出可能なレベルで発現しないように前記細胞が修飾されている、項１２１に記載の細胞集団。
［項１２３］
前記細胞集団の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％が野生型Ｔ細胞受容体を検出可能なレベルで発現しないように前記細胞が修飾されている、項１２１または項１２２に記載の細胞集団。
［項１２４］
前記細胞集団の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％が前記キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を検出可能なレベルで発現するように前記細胞が修飾されている、項１２１～１２３のいずれか一項に記載の細胞集団。
［項１２５］
前記細胞集団の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％がインターロイキン７（ＩＬ－７）、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、およびＩＬ－１８からなる群から選択される免疫刺激サイトカインを検出可能なレベルで発現するように前記細胞が修飾されている、項１２１～１２４に記載の細胞集団。
［項１２６］
前記細胞集団の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％が前記ＴＣＲを検出可能なレベルで発現するように前記細胞が修飾されている、項１２１～１２５のいずれか一項に記載の細胞集団。
［項１２７］
前記腫瘍抗原を有する細胞の前記腫瘍抗原への前記ＣＡＲの結合時に、前記細胞集団が、ｉ）活性化されるようになること、ｉｉ）前記細胞集団の増殖の誘導、ｉｉｉ）前記細胞集団によるサイトカイン分泌、ｉｖ）前記腫瘍抗原を有する前記細胞の細胞傷害性の誘導、またはｖ）（ｉ）～（ｉｖ）のうちのいずれか１つの組み合わせから選択される応答をもたらすことができる、項１２４～１２６のいずれか一項に記載の細胞集団。
［項１２８］
対象に抗腫瘍免疫を提供する方法であって、前記対象に、項１２１～１２７のいずれか一項に記載の細胞集団の治療有効量を投与することを含む、方法。
［項１２９］
治療を必要とする対象を治療する方法であって、前記対象に、項１２１～１２７のいずれか一項に記載の細胞集団の治療有効量を投与することを含む、方法。
［項１３０］
前記対象ががんまたは自己免疫疾患を有する、項１２９に記載の方法。
［項１３１］
前記がんが、結腸がん、直腸がん、腎細胞がん、肝がん、非小細胞肺がん、小腸がん、食道がん、黒色腫、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部がん、皮膚または眼球内悪性黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門部がん、胃がん、精巣がん、卵管がん、子宮内膜がん、頸がん、膣がん、外陰がん、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、内分泌系がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、小児固形腫瘍、膀胱がん、腎臓がんまたは尿管がん、腎盂がん、中枢神経系（ＣＮＳ）新生物、ＣＮＳ原発リンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮がん、扁平上皮がん、Ｔ細胞リンパ腫、環境誘発性がん、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性白血病、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、Ｂ細胞急性リンパ性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞新生物、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞または大細胞濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性状態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成および骨髄異形成症候群、ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞新生物、ワルデンストレームマクログロブリン血症、前白血病、前記がんの組み合わせ、ならびに前記がんの転移性病巣からなる群から選択される、項１３０に記載の方法。
［項１３２］
前記がんが腫瘍細胞抗原を発現する、項１３０または１３１に記載の方法。
［項１３３］
前記ＣＡＲが前記腫瘍細胞抗原に対する特異的結合親和性を有する、項１３２に記載の方法。
［項１３４］
前記腫瘍抗原への前記ＣＡＲの結合時に、前記細胞集団が、ｉ）活性化されるようになること、ｉｉ）前記細胞集団の増殖の誘導、ｉｉｉ）前記細胞集団によるサイトカイン分泌、ｉｖ）前記腫瘍抗原を有する前記細胞の細胞傷害性の誘導、またはｖ）（ｉ）～（ｉｖ）のうちのいずれか１つの組み合わせをもたらすことができる、項１３３に記載の方法。
［項１３５］
前記細胞集団が、実質内、静脈内、動脈内、脳室内、嚢内、髄腔内、頭蓋内、腰部、腹腔内、皮下、眼球内、眼周囲、網膜下、硝子体内、肺内、鼻腔内、およびそれらの組み合わせから選択される投与経路によって前記対象に投与される、項１２８～１３４のいずれか一項に記載の方法。
［項１３６］
前記細胞集団の前記治療有効量の前記投与により、完全奏効、部分奏効、または不完全奏効としての腫瘍縮小；無増悪期間、治療成功期間、バイオマーカー応答；無増悪生存期間；無病生存期間；無再発期間；無転移期間；全生存期間；生活の質の改善；および症状の改善のうちの１つ以上から選択される前記対象における前記疾患に関連する臨床パラメーターまたは臨床評価項目の改善がもたらされる、項１２８～１３５のいずれか一項に記載の方法。
［項１３７］
前記方法が化学療法剤を投与することをさらに含む、項１２８～１３６のいずれか一項に記載の方法。
［項１３８］
対象における免疫療法のための細胞を調製する方法であって、抗原プロセシング、抗原提示、抗原認識、および／または抗原応答に関与する１つ以上のタンパク質の発現を減少させるまたは排除することによって免疫細胞を修飾することを含む、方法。
［項１３９］
前記免疫細胞の標的核酸配列をＣａｓＸタンパク質と１つ以上のｇＮＡとを含むＣａｓＸ：ｇＮＡ系と接触させることを含み、各ｇＮＡが、抗原プロセシング、抗原提示、抗原認識、および／または抗原応答に関与する前記１つ以上のタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子の標的核酸配列に相補的な標的配列を含む、項１３８に記載の方法。
［項１４０］
前記１つ以上のタンパク質が、Ｂ２Ｍ、ＴＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＴＧＦβＲＩＩ、ＰＤ－１、ＣＩＳＨ、ＬＡＧ－３、ＴＩＧＩＴ、ＡＤＯＲＡ２Ａ、ＮＫＧ２Ａ、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ－３、およびＣＤ２４４からなる群から選択される、項１３８または項１３９に記載の方法。
［項１４１］
前記１つ以上のタンパク質が、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、およびＣＩＩＴＡからなる群から選択される、項１４０に記載の方法。
［項１４２］
ＣＤ２４７、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ５２、ヒト白血球抗原Ｃ（ＨＬＡ－Ｃ）、デオキシシチジンキナーゼ（ｄＣＫ）、およびＦＫＢＰ１Ａからなる群から選択されるタンパク質をコードする遺伝子の核酸配列に相補的な標的配列を含むｇＮＡをさらに含む、項１４０または項１４１に記載の方法。
［項１４３］
前記１つ以上のタンパク質の発現が修飾されていない細胞と比較して少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％減少するように前記細胞が修飾されている、項１３８～１４２のいずれか一項に記載の方法。
［項１４４］
前記細胞が前記１つ以上のタンパク質を検出可能なレベルで発現しないように前記細胞が修飾されている、項１３８～１４３のいずれか一項に記載の方法。
［項１４５］
前記修飾された細胞の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％がＭＨＣクラスＩ分子を検出可能なレベルで発現しないように前記細胞が修飾されている、項１３８～１４４のいずれか一項に記載の方法。
［項１４６］
前記修飾された細胞の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％が野生型Ｔ細胞受容体を検出可能なレベルで発現しないように前記細胞が修飾されている、項１３８～１４５に記載の方法。
［項１４７］
前記免疫細胞に、腫瘍細胞抗原に対する特異的結合親和性を有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするポリ核酸を導入することをさらに含む、項１３８～１４６のいずれか一項に記載の方法。
［項１４８］
前記免疫細胞に、疾患抗原、任意選択的に、腫瘍細胞抗原に対する結合親和性を有する結合ドメインを含む操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードするポリ核酸を導入することをさらに含む、項１３８～１４７のいずれか一項に記載の方法。
［項１４９］
前記腫瘍細胞抗原が、ＣＤ１９、ＣＤ３、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ２４７、ＣＤ８、ＣＤ７、ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＬＬ１、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４７、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ９９、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＡＩＸ、ＣＣＲ４、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＧＲＥ２、ＡＬＰＰＬ２、ＡＮＧ２、ＢＣＭＡ、ＣＤ４４Ｖ６、ＣＥＡ、ＣＥＡＣ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＬＤＮ６、ＣＬＤＮ１８、ＣＬＥＣ１２Ａ、ｃＭＥＴ、ＣＴＬＡ－４、ＥＧＦ１Ｒ、ＥＧＦＲ－ｖＩＩＩ、ＥＧＰ－２、ＥＧＰ－４０、ＥｐｈＡ２、ＥＮＰＰ３、ＥｐＣＡＭ、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＦＢＰ、ＡＣｈＲ、ＦＲアルファ、ＧＰＲ１４３、ＧＲＭ８、ｇＧＰＣ３、ガングリオシドＧＤ２、ガングリオシドＧＤ３、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、インテグリンＢ７、ＩＣＡＭ－ｌ、ｈＴＥＲＴ、ＩＬ－ｌ３Ｒ－ａ２、Ｋ－軽鎖、ＫＤＲ、ルイス－Ｙ、ＬＥＣＴ１、Ｌ１ＣＡＭ、ＬＰＡＲ３、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＳＬＮ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＭＡＧＥ－Ａ３、ｐ５３、ＭＡＲＴ１、ＧＰ１００、ＰＲ１、ＥｐｈＡ２、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ｈ５Ｔ４、ＰＳＭＡ、ＰＤＬ－１、ＲＯＲ１、ＴＰＢＧ、ＴＡＧ－７２、ＴＲＯＰ－２、ＴＹＲ、サバイビン、ＶＥＧＦ－Ｒ２、ＷＴ－１、ＬＩＬＲＢ２、ＰＲＡＭＥ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、およびＴＩＭ－３からなる群から選択される、項１４７に記載の方法。
［項１５０］
前記ＣＡＲが、直鎖状抗体、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、および一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）からなる群から選択される抗原結合ドメインを含む、項１４７または項１４８に記載の方法。
［項１５１］
前記抗原結合ドメインが、表５に記載の配列からなる群から選択される可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）ならびに／または重鎖および軽鎖ＣＤＲを含むｓｃＦｖである、項１５０に記載の方法。
［項１５２］
前記ｓｃＦｖの前記ＶＨ、前記ＶＬ、および／または前記ＣＤＲが１つ以上のアミノ酸修飾を有し、前記ｓｃＦｖが前記腫瘍抗原に対する結合親和性を保持し、前記修飾が、置換、欠失、および挿入からなる群から選択される、項１５１に記載の方法。
［項１５３］
前記ＣＡＲが少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含む、項１４７～１５２のいずれか一項に記載の方法。
［項１５４］
前記少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ２４７分子（ＣＤ３－ゼータ）、ＣＤ２７分子（ＣＤ２７）、ＣＤ２８分子（ＣＤ２８）、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー９（４－１ＢＢ）、誘導性Ｔ細胞共刺激因子（ＩＣＯＳ）、またはＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー４（ＯＸ４０）から単離されたまたはそれに由来する少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインを含む、項１５３に記載の方法。
［項１５５］
前記少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインが、
ａ．ＣＤ３－ゼータ細胞内シグナル伝達ドメイン、
ｂ．ＣＤ３－ゼータ細胞内シグナル伝達ドメインおよび４－１ＢＢまたはＣＤ２８細胞内シグナル伝達ドメイン、
ｃ．ＣＤ－ゼータ細胞内シグナル伝達ドメイン、４－１ＢＢ細胞内シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ２８細胞内シグナル伝達ドメイン、
ｄ．ＣＤ－ゼータ細胞内シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２８細胞内シグナル伝達ドメイン、４－１ＢＢ細胞内シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ２７またはＯＸ４０細胞内シグナル伝達ドメインを含む、項１５４に記載の方法。
［項１５６］
前記ＣＡＲが細胞外ヒンジドメインをさらに含む、項１４７～１５５のいずれか一項に記載の方法。
［項１５７］
前記ヒンジドメインが免疫グロブリン様ドメインである、項１５６に記載の方法。
［項１５８］
前記ヒンジドメインが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４から単離または誘導される、項１５７に記載の方法。
［項１５９］
前記ヒンジドメインが、ＣＤ８ａ分子（ＣＤ８）またはＣＤ２８から単離または誘導される、項１５７に記載の方法。
［項１６０］
前記ＣＡＲが膜貫通ドメインをさらに含む、項１４７～１５９のいずれか一項に記載の方法。
［項１６１］
前記膜貫通ドメインが、ＣＤ３－ゼータ、ＣＤ４、ＣＤ８、およびＣＤ２８からなる群から単離または誘導される、項１６０に記載の方法。
［項１６２］
前記ＴＣＲが、ＴＣＲアルファ、ＴＣＲベータ、ＣＤ３－デルタ、ＣＤ３－イプシロン、ＣＤ－ガンマ、またはＣＤ３－ゼータからなる群から選択される１つ以上のサブユニットを含む、項１４８～１６１のいずれか一項に記載の方法。
［項１６３］
前記ＴＣＲが、細胞内シグナル伝達ドメイン由来の刺激ドメインを含む細胞内ドメインをさらに含む、項１６２に記載の方法。
［項１６４］
前記ＴＣＲの前記抗原結合ドメインが前記ＴＣＲアルファまたは前記ＴＣＲベータサブユニットに作動可能に連結される、項１６２または項１６３に記載の方法。
［項１６５］
前記ＴＣＲの前記抗原結合ドメインが、表５に記載の配列からなる群から選択される可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）ならびに／または重鎖および軽鎖ＣＤＲを含むｓｃＦｖである、項１６４に記載の方法。
［項１６６］
前記ｓｃＦｖの前記ＶＨ、前記ＶＬ、および／または前記ＣＤＲが１つ以上のアミノ酸修飾を有し、前記ｓｃＦｖが前記腫瘍抗原に対する結合親和性を保持し、前記修飾が、置換、欠失、および挿入からなる群から選択される、項１６５に記載の方法。
［項１６７］
前記免疫細胞に、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、およびＩＬ－１８からなる群から選択される免疫刺激サイトカインをコードするポリヌクレオチドを導入することをさらに含む、項１４７～１６６のいずれか一項に記載の方法。
［項１６８］
適切な成長条件下における適切な培地中でのインビトロ培養によって前記細胞の集団を増殖させることをさらに含む、項１３８～１６７のいずれか一項に記載の方法。
［項１６９］
前記細胞が、前記細胞を受容する前記対象に対して自己である、項１３８～１６８のいずれか一項に記載の方法。
［項１７０］
前記細胞が、前記細胞を受容する前記対象に対して同種異系である、項１３８～１６８のいずれか一項に記載の方法。
［項１７１］
前記対象ががんまたは自己免疫疾患を有する、項１３８～１７０のいずれか一項に記載の方法。
［項１７２］
前記がんが、結腸がん、直腸がん、腎細胞がん、肝がん、非小細胞肺がん、小腸がん、食道がん、黒色腫、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部がん、皮膚または眼球内悪性黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門部がん、胃がん、精巣がん、卵管がん、子宮内膜がん、頸がん、膣がん、外陰がん、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、内分泌系がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、小児固形腫瘍、膀胱がん、腎臓がんまたは尿管がん、腎盂がん、中枢神経系（ＣＮＳ）新生物、ＣＮＳ原発リンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮がん、扁平上皮がん、Ｔ細胞リンパ腫、環境誘発性がん、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性白血病、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、Ｂ細胞急性リンパ性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞新生物、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞または大細胞濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性状態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成および骨髄異形成症候群、ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞新生物、ワルデンストレームマクログロブリン血症、前白血病、前記がんの組み合わせ、ならびに前記がんの転移性病巣からなる群から選択される、項１７１に記載の方法。
［項１７３］
前記がんが腫瘍細胞抗原を発現する、項１７１または項１７２に記載の方法。
［項１７４］
前記ＣＡＲが前記腫瘍細胞抗原に対する特異的結合親和性を有する、項１７３に記載の方法。
［項１７５］
前記腫瘍抗原への前記ＣＡＲの結合時に、前記細胞が、ｉ）活性化されるようになること、ｉｉ）前記細胞の増殖の誘導、ｉｉｉ）前記細胞によるサイトカイン分泌の誘導、ｉｖ）前記腫瘍抗原を有する前記細胞の細胞傷害性の誘導、またはｖ）（ｉ）～（ｉｖ）のうちのいずれか１つの組み合わせをもたらすことができる、項１７４に記載の方法。
［項１７６］
前記細胞が、実質内、静脈内、動脈内、脳室内、嚢内、髄腔内、頭蓋内、腰部、腹腔内、皮下、眼球内、眼周囲、網膜下、硝子体内、肺内、鼻腔内、およびそれらの組み合わせから選択される投与経路によって前記対象に投与される、項１３８～１７５のいずれか一項に記載の方法。
［項１７７］
前記細胞の治療有効量の前記投与により、完全奏効、部分奏効、または不完全奏効としての腫瘍縮小；無増悪期間、治療成功期間、バイオマーカー応答；無増悪生存期間；無病生存期間；無再発期間；無転移期間；全生存期間；生活の質の改善；および症状の改善のうちの１つ以上から選択される前記対象における前記疾患に関連する臨床パラメーターまたは臨床評価項目の改善がもたらされる、項１３８～１７６のいずれか一項に記載の方法。
［項１７８］
前記方法が化学療法剤を投与することをさらに含む、項１３８～１７７のいずれか一項に記載の方法。
［項１７９］
キットであって、
ａ．項１～５９のいずれか一項に記載のＣａｓＸ系、
ｂ．項６３～６９のいずれか一項に記載のベクター、または
ｃ．項７０～７２のいずれか一項に記載のＶＬＰを含み、
賦形剤および容器をさらに含む、キット。
［項１８０］
緩衝液、ヌクレアーゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、リポソーム、治療剤、標識、標識可視化試薬、または前述の任意の組み合わせをさらに含む、項１７９に記載のキット。
［項１８１］
疾患または障害の治療用の薬剤として使用するための、項１～５４のいずれか一項に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系、項６０～６２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、項６３～６９のいずれか一項に記載のベクター、項７０～７２のいずれか一項に記載のＶＬＰ、または項１２１～１２７のいずれか一項に記載の細胞集団。
［項１８２］
疾患または障害の治療を必要とする対象における疾患または障害を治療する方法に使用するための、項１～５４のいずれか一項に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系、項６０～６２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、項６３～６９のいずれか一項に記載のベクター、項７０～７２のいずれか一項に記載のＶＬＰ、または項１２１～１２７のいずれか一項に記載の細胞集団。
［項１８３］
前記疾患または障害ががんまたは自己免疫疾患である、項１８１または項１８２に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系、ポリヌクレオチド、ベクター、ＶＬＰ、または細胞集団。
［項１８４］
抗原プロセシング、抗原提示、抗原認識、および／または抗原応答に関与するタンパク質をコードする遺伝子の標的鎖中の標的核酸配列に相補的な標的配列を含むガイド核酸（ｇＮＡ）であって、前記ｇＮＡが、相補的非標的鎖中にＴＣモチーフを含むプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に特異的なＣＲＩＳＰＲタンパク質と複合体を形成することができ、前記ＰＡＭ配列が、前記標的鎖中の前記標的核酸配列に相補的な前記非標的鎖中の配列の５’側の１ヌクレオチドに位置する、ｇＮＡ。
［項１８５］
前記ＣＲＩＳＰＲタンパク質がＴＣ ＰＡＭ配列に特異的である、項１８４に記載のｇＮＡ。
［項１８６］
前記ＣＲＩＳＰＲタンパク質がＴＴＣ ＰＡＭ配列に特異的である、項１８４に記載のｇＮＡ。
［項１８７］
前記ＣＲＩＳＰＲタンパク質がＡＴＣ ＰＡＭ配列に特異的である、項１８４に記載のｇＮＡ。
［項１８８］
前記ＣＲＩＳＰＲタンパク質がＣＴＣ ＰＡＭ配列に特異的である、項１８４に記載のｇＮＡ。
［項１８９］
前記ＣＲＩＳＰＲタンパク質がＧＴＣ ＰＡＭ配列に特異的である、項１８４に記載のｇＮＡ。
［項１９０］
前記標的配列が前記ｇＮＡの３’末端に位置する、項１８４～１８９のいずれか一項に記載のｇＮＡ。
［項１９１］
前記ＣＲＩＳＰＲタンパク質がＶ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質である、項１８４～１９０のいずれか一項に記載のｇＮＡ。
［項１９２］
前記タンパク質が免疫細胞表面マーカーである、項１８４～１９１に記載のｇＮＡ配列。
［項１９３］
前記タンパク質が免疫チェックポイントタンパク質である、項１８４～１９１に記載のｇＮＡ配列。
［項１９４］
前記タンパク質が細胞内タンパク質である、項１８４～１９１に記載のｇＮＡ配列。
［項１９５］
前記タンパク質が、ベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、Ｔ細胞受容体アルファ鎖定常領域（ＴＲＡＣ）、クラスＩＩ主要組織適合性複合体トランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）、Ｔ細胞受容体ベータ定常１（ＴＲＢＣ１）、Ｔ細胞受容体ベータ定常２（ＴＲＢＣ２）、ヒト白血球抗原Ａ（ＨＬＡ－Ａ）、ヒト白血球抗原Ｂ（ＨＬＡ－Ｂ）、ＴＧＦβ受容体２（ＴＧＦβＲＩＩ）、プログラム細胞死１（ＰＤ－１）、サイトカイン誘導性ＳＨ２（ＣＩＳＨ）、リンパ球活性化３（ＬＡＧ－３）、ＩｇおよびＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）、アデノシンＡ２ａ受容体（ＡＤＯＲＡ２Ａ）、キラー細胞レクチン様受容体Ｃ１（ＮＫＧ２Ａ）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）、Ｔ細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン３（ＴＩＭ－３）、ならびに２Ｂ４（ＣＤ２４４）からなる群から選択される、項１８４～１９１に記載のｇＮＡ配列。
［項１９６］
前記タンパク質がＢ２Ｍである、項１９５に記載のｇＮＡ。
［項１９７］
前記ｇＮＡの前記標的配列が、配列番号７２５～２１００、２２８１～７０８５、５４７～５５１、５９１～５９５、および６１４～６８１からなる群から選択される配列、またはそれと少なくとも約６５％、少なくとも約７５％、少なくとも約８５％、もしくは少なくとも約９５％の同一性を有する配列を含む、項１９６に記載のｇＮＡ。
［項１９８］
前記ｇＮＡの前記標的配列が、配列番号７２５～２１００、２２８１～７０８５、５４７～５５１、５９１～５９５、および６１４～６８１からなる群から選択される配列を含む、項１９６に記載のｇＮＡ。
［項１９９］
前記タンパク質がＴＲＡＣである、項１９５に記載のｇＮＡ。
［項２００］
前記ｇＮＡの前記標的配列が、配列番号７０８６～２７４５４、５２２～５２９、および５６６～５７３からなる群から選択される配列、またはそれと少なくとも約６５％、少なくとも約７５％、少なくとも約８５％、もしくは少なくとも約９５％の同一性を有する配列を含む、項１９９に記載のｇＮＡ。
［項２０１］
前記ｇＮＡの前記標的配列が、配列番号７０８６～２７４５４、５２２～５２９、および５６６～５７３からなる群から選択される配列を含む、項１９９に記載のｇＮＡ。
［項２０２］
前記タンパク質がＣＩＩＴＡである、項１９５に記載のｇＮＡ。
［項２０３］
前記ｇＮＡの前記標的配列が、配列番号２７４５５～５５５７２からなる群から選択される配列、またはそれと少なくとも約６５％、少なくとも約７５％、少なくとも約８５％、もしくは少なくとも約９５％の同一性を有する配列を含む、項２０２に記載のｇＮＡ。
［項２０４］
前記ｇＮＡの前記標的配列が、配列番号２７４５５～５５５７２からなる群から選択される配列を含む、項２０２に記載のｇＮＡ。
［項２０５］
前記ｇＮＡがガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）である、項１８４～２０４のいずれか一項に記載のｇＮＡ。
［項２０６］
前記ｇＮＡがガイドＤＮＡ（ｇＤＮＡ）である、項１８４～２０４のいずれか一項に記載のｇＮＡ。
［項２０７］
前記ｇＮＡがＤＮＡおよびＲＮＡを含むキメラである、項１８４～２０４のいずれか一項に記載のｇＮＡ。
［項２０８］
前記ｇＮＡが単一分子ｇＮＡ（ｓｇＮＡ）である、項１８４～２０４のいずれか一項に記載のｇＮＡ。
［項２０９］
前記ｇＮＡが二分子ｇＮＡ（ｄｇＮＡ）である、項１８４～２０８のいずれか一項に記載のｇＮＡ。
［項２１０］
前記ｇＮＡの前記標的配列が、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のヌクレオチドを含む、項１８４～２０９のいずれか一項に記載のｇＮＡ。
［項２１１］
前記ｇＮＡが、配列番号４～１６の参照ｇＮＡ配列もしくは配列番号２１０１～２２８０のｇＮＡバリアント配列からなる群から選択される配列、またはそれと少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を含む足場を有する、項１８４～２１０のいずれか一項に記載のｇＮＡ。
［項２１２］
前記ｇＮＡバリアント足場が、配列番号４～１６からなる群から選択される参照ｇＮＡ配列と比較して少なくとも１つの修飾を有する配列を含む、項２１１に記載のｇＮＡ。
［項２１３］
前記参照ｇＮＡの前記少なくとも１つの修飾が、前記ｇＮＡ配列のヌクレオチドの少なくとも１つの置換、欠失、または置換を含む、項２１２に記載のｇＮＡ。
［項２１４］
前記ｇＮＡが化学的に修飾される、項１８４～２１３のいずれか一項に記載のｇＮＡ。
［項２１５］
前記ｇＮＡが、クラスＩＩ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質とリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を形成することができる、項１８４～２１４のいずれか一項に記載のｇＮＡ。
［項２１６］
前記クラスＩＩ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質が、配列番号１～３のうちのいずれか１つを含むタンパク質、配列番号４９～１４３、４３８、４４０、４４２、４４４、４４６、４４８～４６０、４７２、４７４、４７８、４８０、４８２、４８４、４８６、４８８、４９０、６１２、もしくは６１３の配列、またはそれと少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９６％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を含むタンパク質から選択される、項２１５に記載のｇＮＡ。
［項２１７］
クラスＩＩ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質であって、前記ＣＲＩＳＰＲタンパク質とｇＮＡとを含む２０ｐＭ以下の濃度のＲＮＰが、少なくとも８０％の効率で二本鎖ＤＮＡ標的を切断することができる、クラスＩＩ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。

Claims (30)

  1. キメラＣａｓＸバリアントタンパク質および第１のガイド核酸（ｇＮＡ）を含むＣａｓＸ：ｇＮＡ系であって、
    ここで前記第１のｇＮＡが抗原プロセシング、抗原提示、抗原認識、および／または抗原応答に関与する第１のタンパク質をコードする遺伝子の標的核酸配列に相補的な標的配列を含み、
    ここで前記キメラＣａｓＸバリアントタンパク質が、
    （ａ）配列番号１３８に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、
    （ｂ）配列番号１のＮＳＴＢドメインのアミノ酸１０１～１９１の配列、またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を持つ配列、および
    （ｃ）配列番号１のヘリカルＩドメインのアミノ酸１９２～３３２の配列、またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を持つ配列、を含み、
    ここで前記キメラＣａｓＸバリアントタンパク質と前記第１のｇＮＡとが、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を形成することができ、前記ＲＮＰが、同等のアッセイシステムにおける、配列番号２の参照ＣａｓＸタンパク質と配列番号４～１６のうちのいずれか１つの参照ｇＮＡとを含むＲＮＰと比較して、少なくとも１つ以上の改善された特性を呈し、
    ここで前記少なくとも１つの改善された特性が、標的配列に対するＲＮＰのより高い編集効率および／または結合を含む、ＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
  2. 前記第１のタンパク質が、
    （ａ）免疫細胞表面マーカーまたは免疫チェックポイントタンパク質である；
    （ｂ）細胞内タンパク質である；または
    （ｃ）ベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、Ｔ細胞受容体アルファ鎖定常領域（ＴＲＡＣ）、クラスＩＩ主要組織適合性複合体トランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）、Ｔ細胞受容体ベータ定常１（ＴＲＢＣ１）、Ｔ細胞受容体ベータ定常２（ＴＲＢＣ２）、ヒト白血球抗原Ａ（ＨＬＡ－Ａ）、ヒト白血球抗原Ｂ（ＨＬＡ－Ｂ）、ＴＧＦβ受容体２（ＴＧＦβＲＩＩ）、プログラム細胞死１（ＰＤ－１）、サイトカイン誘導性ＳＨ２（ＣＩＳＨ）、リンパ球活性化３（ＬＡＧ－３）、ＩｇおよびＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）、アデノシンＡ２ａ受容体（ＡＤＯＲＡ２Ａ）、キラー細胞レクチン様受容体Ｃ１（ＮＫＧ２Ａ）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）、Ｔ細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン３（ＴＩＭ－３）、ならびに２Ｂ４（ＣＤ２４４）からなる群から選択される、請求項１に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
  3. ベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、Ｔ細胞受容体アルファ鎖定常領域（ＴＲＡＣ）、クラスＩＩ主要組織適合性複合体トランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）、Ｔ細胞受容体ベータ定常１（ＴＲＢＣ１）、Ｔ細胞受容体ベータ定常２（ＴＲＢＣ２）、ヒト白血球抗原Ａ（ＨＬＡ－Ａ）、ヒト白血球抗原Ｂ（ＨＬＡ－Ｂ）、ＴＧＦβＲＩＩ、ＰＤ－１、ＣＩＳＨ、ＬＡＧ－３、ＴＩＧＩＴ、ＡＤＯＲＡ２Ａ、ＮＫＧ２Ａ、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ－３、およびＣＤ２４４からなる群から選択される第２のタンパク質をコードする免疫細胞遺伝子の標的核酸配列に相補的な標的配列を含む第２のｇＮＡをさらに含み、前記第２のタンパク質が前記第１のタンパク質とは異なる、請求項１または２に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
  4. 前記第１のｇＮＡおよび／または前記第２のｇＮＡがガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）である、請求項３に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
  5. 前記第１のｇＮＡおよび／または前記第２のｇＮＡが、ＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＧＵＧＧ（配列番号３２）の足場ステムループ配列を含み、配列番号２２３８の配列またはそれと少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項３または４に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
  6. 前記第１のｇＮＡおよび／または前記第２のｇＮＡが化学的に修飾される、請求項３～５のいずれか一項に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
  7. 前記キメラＣａｓＸバリアントタンパク質が、
    （ａ）標識鎖負荷（ＴＳＬ）ドメイン；
    （ｂ）ヘリカルＩＩドメイン；および
    （ｃ）オリゴヌクレオチド結合ドメイン（ＯＢＤ）、を含み、
    ここで前記キメラＣａｓＸバリアントタンパク質が、配列番号２のヘリカルＩドメインのアミノ酸５９～１０２またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を持つ配列、および配列番号２のＲｕｖＣドメインのアミノ酸６４８～８１２および９２２～９７８またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を持つ配列、を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
  8. 前記キメラＣａｓＸバリアントタンパク質が、配列番号２の参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、以下：
    （ａ）Ｌ３７９Ｒのアミノ酸置換；
    （ｂ）Ａ７０８Ｋのアミノ酸置換；
    （ｃ）Ｔ６２０Ｐのアミノ酸置換；
    （ｄ）Ｅ３８５Ｐのアミノ酸置換；
    （ｅ）Ｙ８５７Ｒのアミノ酸置換；
    （ｆ）Ｉ６５８Ｖのアミノ酸置換；
    （ｇ）Ｆ３９９Ｌのアミノ酸置換；
    （ｈ）Ｑ２５２Ｋのアミノ酸置換；
    （ｉ）Ｌ４０４Ｋのアミノ酸置換；および
    （ｊ）Ｐ７９３のアミノ酸欠失、
    からなる群より選択される１つの修飾を含む、請求項７に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
  9. 前記キメラＣａｓＸバリアントタンパク質が、１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
  10. 前記ＲＮＰが、配列番号２の前記参照ＣａｓＸと配列番号４～１６のうちのいずれか１つの配列を含む前記参照ｇＮＡとのＲＮＰと比較して少なくとも２０％高いパーセンテージの切断能力のあるＲＮＰを有する、請求項１～９のいずれか一項に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
  11. 前記キメラＣａｓＸバリアントタンパク質が、触媒的に不活性なＣａｓＸ（ｄＣａｓＸ）タンパク質であり、前記ｄＣａｓＸおよび前記ｇＮＡが標的核酸に結合する能力を保持する、請求項１～９のいずれか一項に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
  12. ドナー鋳型核酸をさらに含む、請求項１～９のいずれか一項に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系。
  13. （ａ）請求項１～１２のいずれか一項に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系のキメラＣａｓＸバリアントタンパク質をコードする配列；および
    （ｂ）抗原プロセシング、抗原提示、抗原認識、および／または抗原応答に関与する第１のタンパク質をコードする遺伝子の標的核酸配列に相補的な標的配列を含むｇＮＡ、を含む１つ以上のポリヌクレオチド。
  14. 請求項１３に記載の１つ以上のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
  15. 前記ベクターが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクター、プラスミド、ミニサークル、ナノプラスミド、ナノ粒子、ＤＮＡベクター、およびＲＮＡベクターからなる群から選択される、請求項１４に記載のベクター。
  16. インビトロまたはエクスビボの細胞集団における遺伝子の標的核酸配列を修飾する方法であって、ここで前記細胞集団がヒト生殖細胞またはヒト胚細胞を除き、前記遺伝子が、抗原プロセシング、抗原提示、抗原認識、および／または抗原応答に関与するタンパク質をコードし、
    ここで前記方法が、前記細胞に、
    （ａ）請求項１～１２のいずれか一項に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡ系、
    （ｂ）請求項１３に記載の１つ以上のポリヌクレオチド、
    （ｃ）請求項１４または１５に記載のベクター、または
    （ｄ）（ａ）～（ｃ）のうちの２つ以上の組み合わせ、を導入することを含み、
    ここで前記細胞の前記標的核酸配列が前記キメラＣａｓＸバリアントタンパク質よって修飾される、方法。
  17. 前記ＣａｓＸ：ｇＮＡ系がＲＮＰとして前記細胞に導入される、および／または前記細胞が、疾患抗原に対する結合親和性を有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチドの導入によって修飾される、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記疾患抗原が、腫瘍細胞抗原である、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記細胞集団が、対象における抗腫瘍免疫の提供における使用のために好適である、請求項１６～１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記細胞集団が、対象の治療における使用のために好適である、請求項１６～１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記対象ががんまたは自己免疫疾患を有する、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記がんが腫瘍細胞抗原を発現する、および前記ＣＡＲが前記腫瘍細胞抗原に対する特異的結合親和性を有する、請求項２１に記載の方法。
  23. 対象における免疫療法のための細胞を調製する方法における使用のための、ＣａｓＸ：ｇＮＡ系を含む組成物であって、前記方法が、抗原プロセシング、抗原提示、抗原認識および／または抗原応答に関与する１つ以上のタンパク質の発現を減少させるまたは排除することによって免疫細胞を修飾することを含み、ここで前記細胞がヒト生殖細胞またはヒト胚細胞を除き、
    前記方法が、前記免疫細胞の標的核酸配列を前記組成物と接触させることを含み、
    前記ＣａｓＸ：ｇＮＡ系が、キメラＣａｓＸバリアントタンパク質および１つ以上のｇＮＡを含み、ここで前記キメラＣａｓＸバリアントタンパク質が、
    （ａ）配列番号１３８に対する少なくとも９０％の同一性、
    （ｂ）配列番号１のＮＳＴＢドメインのアミノ酸１０１～１９１の配列、またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を持つ配列、および
    （ｃ）配列番号１のヘリカルＩドメインのアミノ酸１９２～３３２の配列、またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を持つ配列、を含み、
    ここで各ｇＮＡが、抗原プロセシング、抗原提示、抗原認識、および／または抗原応答に関与する前記１つ以上のタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子の標的核酸配列に相補的な標的配列を含む、組成物。
  24. 前記１つ以上のタンパク質が、Ｂ２Ｍ、ＴＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＴＧＦβＲＩＩ、ＰＤ－１、ＣＩＳＨ、ＬＡＧ－３、ＴＩＧＩＴ、ＡＤＯＲＡ２Ａ、ＮＫＧ２Ａ、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ－３、およびＣＤ２４４からなる群から選択される、請求項２３に記載の組成物。
  25. 前記方法が、
    （ａ）腫瘍細胞抗原に対する特異的結合親和性を有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、および／または
    （ｂ）疾患抗原に対する結合親和性を有する結合ドメインを含む操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）であって、前記疾患抗原が腫瘍細胞抗原であるＴＣＲ、
    をコードするポリ核酸を前記免疫細胞に導入することを含む、請求項２３または２４に記載の組成物。
  26. 前記細胞が、
    （ａ）前記細胞を受容する前記対象に対して自己である、または
    （ｂ）前記細胞を受容する前記対象に対して同種異系である、
    請求項２３～２５のいずれか一項に記載の組成物。
  27. 前記対象ががんまたは自己免疫疾患を有する、請求項２３～２６のいずれか一項に記載の組成物。
  28. 前記がんが腫瘍細胞抗原を発現する、および前記ＣＡＲが前記腫瘍細胞抗原に対する特異的結合親和性を有する、請求項２７に記載の組成物。
  29. 前記細胞の治療有効量の前記投与により、完全奏効、部分奏効、または不完全奏効としての腫瘍縮小；無増悪期間、治療成功期間、バイオマーカー応答；無増悪生存期間；無病生存期間；無再発期間；無転移期間；全生存期間；生活の質の改善；および症状の改善のうちの１つ以上から選択される前記対象における前記疾患に関連する臨床パラメーターまたは臨床評価項目の改善がもたらされる、請求項２３～２８のいずれか一項に記載の組成物。
  30. 抗原プロセシング、抗原提示、抗原認識、および／または抗原応答に関与するタンパク質をコードする遺伝子の標的鎖中の標的核酸配列に相補的な標的配列を含むガイド核酸（ｇＮＡ）であって、ここで前記ｇＮＡが、
    （ａ）ＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＧＵＧＧ（配列番号３２）の足場ステムループ配列を含み、かつ
    （ｂ）配列番号２２３８の配列に対する少なくとも７０％の同一性を含み、
    ここで前記ｇＮＡが、相補的非標的鎖中にＴＣモチーフを含むプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に特異的なＣａｓＸバリアントタンパク質とリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を形成することができ、前記ＰＡＭ配列は、前記標的鎖中の前記標的核酸配列に相補的な前記非標的鎖中の配列の５’側の１ヌクレオチドに位置し、前記標的配列が前記ｇＮＡの３’末端に位置し、ここで前記ＣａｓＸバリアントタンパク質が、配列番号１３８と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、ｇＮＡ。
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