JP7693253B2 - トランスポゾンシステムおよびその用途 - Google Patents

Description

本発明は、トランスポゾンベクター、これを含むトランスポゾンシステム、トランスポゾンキット、前記トランスポゾンベクターが挿入された細胞、およびこれらの用途等に関する。
本発明は、２０２１年７月９日に出願された韓国特許出願第１０－２０２１－００９０１３３号および２０２２年７月１１日に出願された韓国特許出願第１０－２０２２－００８５３０６号に基づく優先権を主張し、当該出願の明細書および図面に開示されたすべての内容は本出願に援用される。

ＣＡＲ（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）－Ｔ ｃｅｌｌは、腫瘍抗原（例えば、ＣＤ１９）等に結合する抗体の配列をＣＤ３／４－１ＢＢ／ＣＤ２８等のＴ ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇに必要なｄｏｍａｉｎと結合してＴ細胞に挿入した細胞治療剤である。これらのＣＡＲ遺伝子をＴ細胞に挿入する方法は、様々なものがあるが、ほとんどがレンチウイルス（ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）伝達システムを使用している。ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓの特徴は、細胞の染色体にｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎされるので、継続的に遺伝子を発現できることにある。このようなレンチウイルスは、生産コストが高いため、治療剤の価格を高める主要要因となるが、一度生産すれば多数の患者に使用することができるという長所がある。

一方、個々の患者に合わせた治療ＴＣＲ－Ｔは、各患者が持っている新抗原（ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ）に反応するＴＣＲ（Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）配列を探索し、この配列を遺伝子伝達システムを介してＴ細胞内に伝達して生産する。しかしながら、個別化医療であるから、患者ごとに適用されるＴＣＲ配列が異なっているので、これをレンチウイルスに適用することはほとんど不可能である。したがって、レンチウイルスより生産が容易であり、生産コストが低く、染色体に挿入（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）されて継続的に遺伝子発現が可能な非ウイルス性（ｎｏｎ－ｖｉｒａｌ）伝達体であるトランスポゾンを用いてＴＣＲ－Ｔ細胞を開発する必要がある。

本発明者らは、上述したような必要を満たすために、鋭意研究した結果、ターゲット細胞、特に免疫細胞の染色体（ｇｅｎｏｍｅ）内に外因性遺伝子を挿入（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）できる遺伝子伝達体としてトランスポゾンを開発し、前記トランスポゾンの５’ＩＴＲ（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ；逆方向末端反復）および３’ＩＴＲを改変してさらに製作したトランスポゾンｍｕｔａｎｔも、優れた遺伝子伝達効率を有することを確認したところ、これに基づいて本発明を完成した。

したがって、本発明の目的は、優れた遺伝子伝達効果を発揮できる５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲを含むトランスポゾンベクターを提供することにある。

本発明の他の目的は、前記トランスポゾンベクターおよびトランスポザーゼ（タンパク質またはこれをコード化する核酸分子）を含む、標的ＤＮＡ伝達用トランスポゾンシステムを提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、前記トランスポゾンシステムおよび指示書を含む標的ＤＮＡ伝達用トランスポゾンキットを提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、前記トランスポゾンベクターおよびトランスポザーゼが導入された細胞を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、前記トランスポゾンベクターおよびトランスポザーゼを細胞に導入する段階を含む、標的ＤＮＡ配列を細胞のゲノム内に挿入する方法を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、前記トランスポゾンベクターおよびトランスポザーゼが導入された免疫細胞を有効成分として含む、薬学的組成物を提供することにある。

しかしながら、本発明が解決しようとする技術的課題は、以上で言及した課題に制限されず、言及されていない他の課題は、下記の記載から当業者が明確に理解することができる。

本発明は、配列番号１で表される核酸配列のうち７１個以上の連続した核酸配列を有する５’ＩＴＲ（５’Ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）；および配列番号２で表される核酸配列のうち６６個以上の連続した核酸配列を有する３’ＩＴＲ（３’Ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）を含むトランスポゾンベクターを提供する。

本発明の一具現例において、前記５’ＩＴＲは、以下の中から選択され：
配列番号１で表される核酸配列を有する５’ＩＴＲ；
配列番号５で表される核酸配列を有する５’ＩＴＲ；または
配列番号６で表される核酸配列を有する５’ＩＴＲ、
前記３’ＩＴＲは、以下の中から選択されるが、これに限定されない：
配列番号２で表される核酸配列を有する３’ＩＴＲ；
配列番号９で表される核酸配列を有する３’ＩＴＲ；
配列番号１０で表される核酸配列を有する３’ＩＴＲ；または
配列番号１１で表される核酸配列を有する３’ＩＴＲ。

本発明の他の具現例において、前記５’ＩＴＲは、配列番号７、５’－ＡＣＡＣＴＴＧＧ－３’、または配列番号８で表される核酸配列のうち１つ以上を含んでもよいが、これに限定されない。

本発明のさらに他の具現例において、前記３’ＩＴＲは、配列番号１３または配列番号１４で表される核酸配列のうち１つ以上を含んでもよいが、これに限定されない。

本発明のさらに他の具現例において、前記５’ＩＴＲの核酸配列は、トランスポゾンベクター内の標的ＤＮＡが挿入される位置の上部（ｕｐｓｔｒｅａｍ）に５’から３’方向に含まれたり、前記３’ＩＴＲの核酸配列は、トランスポゾンベクター内の標的ＤＮＡが挿入される位置の下部（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ）に５’から３’方向に含まれ得るが、これに限定されない。

本発明のさらに他の具現例において、前記トランスポゾンベクターは、（前記３’ＩＴＲの代わりに）前記３’ＩＴＲの核酸配列の逆相補的（ｒｅｖｅｒｓｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）配列を有するアンチセンスＤＮＡがトランスポゾンベクター内の標的ＤＮＡが挿入される位置の下部に５’から３’方向に含まれ得るが、これに限定されない。

本発明のさらに他の具現例において、前記３’ＩＴＲの逆相補的配列は、配列番号１５～１７のうちいずれか１つで表される核酸配列を含んでもよいが、これに限定されない。

本発明のさらに他の具現例において、前記トランスポゾンベクターは、前記５’ＩＴＲの下部および３’ＩＴＲの上部に１つ以上の標的ＤＮＡ配列を含んでもよいが、これに限定されない。

本発明のさらに他の具現例において、前記標的ＤＮＡ配列は、治療用ポリペプチドコーディング配列、ｓｉＲＮＡコーディング配列、ｍｉＲＮＡコーディング配列、レポータタンパク質コーディング配列、抗原特異的受容体コーディング配列、組換え抗体コーディング配列またはその断片、中和抗体コーディング配列またはその断片、免疫チェックポイント阻害剤コーディング配列、サイトカイン受容体コーディング配列、ＣＡＲ（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）コーディング配列またはその断片、およびＴＣＲ（Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）コーディング配列またはその断片からなる群から選択されたいずれか１つ以上であってもよいが、これに限定されない。

本発明のさらに他の具現例において、前記トランスポゾンベクターは、プロモーター、１つ以上の標的ＤＮＡ、およびポリＡシグナルを含むものであり、前記５’ＩＴＲ、前記プロモーター、前記標的ＤＮＡ、前記ポリＡシグナル、および前記３’ＩＴＲが順次に作動可能に連結されたものであってもよいが、これに限定されない。

本発明のさらに他の具現例において、前記トランスポゾンベクターは、環状プラスミド、線状化ｄｓＤＮＡ（ｌｉｎｅａｒｌｉｚｅｄ ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ），ヘアピンｄｓＤＮＡ（ｈａｉｒｐｉｎ ｄｓＤＮＡ）、またはミニサークルｄｓＤＮＡであってもよいが、これに限定されない。

本発明のさらに他の具現例において、前記トランスポゾンベクターは、サイズが１，０００～２０，０００ｂｐであってもよいが、これに限定されない。

また、本発明は、ａ）標的ＤＮＡが挿入された前記トランスポゾンベクター；および
ｂ）トランスポザーゼタンパク質またはトランスポザーゼをコード化する配列を含む核酸分子を含む、標的ＤＮＡ伝達用トランスポゾンシステムを提供する。

本発明の一具現例において、前記トランスポザーゼタンパク質は、配列番号１８で表されるアミノ酸配列を含んでもよいが、これに限定されない。

また、本発明は、標的ＤＮＡ伝達用トランスポゾンシステム、および指示書を含む標的ＤＮＡ伝達用トランスポゾンキットを提供する。

また、本発明は、ａ）標的ＤＮＡが挿入された前記トランスポゾンベクター；および
ｂ）トランスポザーゼタンパク質またはトランスポザーゼをコード化する配列を含む核酸分子が導入された細胞を提供する。

本発明の一具現例において、前記細胞内で前記トランスポザーゼによって前記トランスポゾンベクターから前記標的ＤＮＡが切除され、切除された前記標的ＤＮＡが前記細胞のゲノム内に挿入されるものであってもよいが、これに限定されない。

本発明の他の具現例において、前記細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、マクロファージ、および肥満細胞からなる群から選択され得るが、これに限定されない。

本発明のさらに他の具現例において、前記細胞は、前記トランスポゾンベクターが導入された後、支持細胞（ｆｅｅｄｅｒ ｃｅｌｌｓ）と共培養されたものであってもよいが、これに限定されない。

本発明のさらに他の具現例において、前記支持細胞は、放射線で照射された細胞であってもよいが、これに限定されない。

本発明のさらに他の具現例において、前記細胞は、前記トランスポゾンベクターの導入後７日以上前記標的ＤＮＡを発現することができるが、これに限定されない。

また、本発明は、ａ）標的ＤＮＡが挿入された前記トランスポゾンベクター；および
ｂ）トランスポザーゼタンパク質またはトランスポザーゼをコード化する配列を含む核酸分子を細胞に導入する段階を含む、標的ＤＮＡ配列を細胞のゲノム内に挿入する方法を提供する。前記方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで行われるものであってもよいが、これに限らない。

本発明の一具現例において、前記導入は、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）を通じて行われ得るが、これに限定されない。

本発明のさらに他の具現例において、前記方法は、前記導入段階後、前記トランスポゾンベクターが挿入された前記細胞を支持細胞と共培養する段階をさらに含んでもよいが、これに限定されない。

本発明のさらに他の具現例において、前記支持細胞と共培養する段階は、前記導入段階直後に行われ得るが、これに限定されない。

本発明のさらに他の具現例において、前記トランスポゾンベクターは、環状プラスミド、線状化ｄｓＤＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ）、ヘアピンｄｓＤＮＡ、またはミニサークルｄｓＤＮＡであってもよいが、これに限定されない。

また、本発明は、ａ）標的ＤＮＡが挿入された前記トランスポゾンベクター；および
ｂ）トランスポザーゼタンパク質またはトランスポザーゼをコード化する配列を含む核酸分子が導入された免疫細胞を有効成分として含む、がんの予防または治療用薬学的組成物であって、
前記標的ＤＮＡは、腫瘍抗原特異的ＣＡＲ（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）コーディング配列またはその断片、腫瘍ウイルス特異的中和抗体コーディング配列またはその断片、免疫チェックポイント阻害剤コーディング配列、および腫瘍抗原特異的ＴＣＲ（Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）コーディング配列またはその断片からなる群から選択された１つ以上であることを特徴とする、がんの予防または治療用薬学的組成物を提供する。

また、本発明は、前記免疫細胞をこれを必要とする個体に投与する段階を含む、がんの予防または治療方法を提供する。

また、本発明は、前記免疫細胞のがんの予防または治療用途を提供する。

また、本発明は、がん治療用薬剤の製造のための前記免疫細胞の用途を提供する。

さらに、本発明は、腫瘍抗原特異的ＣＡＲ（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）コーディング配列またはその断片、腫瘍ウイルス特異的中和抗体コーディング配列またはその断片、免疫チェックポイント阻害剤コーディング配列、および腫瘍抗原特異的ＴＣＲ（Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）コーディング配列またはその断片からなる群から選択された１つ以上が挿入された本発明のトランスポゾンベクターを用いてがん治療用薬剤を製造する方法を提供する。

さらに、本発明は、腫瘍抗原特異的ＣＡＲ（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）コーディング配列またはその断片、腫瘍ウイルス特異的中和抗体コーディング配列またはその断片、免疫チェックポイント阻害剤コーディング配列、および腫瘍抗原特異的ＴＣＲ（Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）コーディング配列またはその断片からなる群から選択された１つ以上が挿入された本発明のトランスポゾンベクターのがん治療用薬剤の製造のための用途を提供する。

本発明の一具現例において、前記腫瘍抗原は、ＣＤ１９、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＥＧＦＲ、ＴＡＧ７２、ＩＬ１３Ｒα２（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １３ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ－２ ｓｕｂｕｎｉｔ）、ＣＤ５２、ＣＤ３３、ＣＤ２０、ＴＳＬＰＲ、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＧＤ３、ＣＤ１７１、ＮＣＡＭ（Ｎｅｕｒａｌ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）、ＦＢＰ（Ｆｏｌａｔｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）、Ｌｅ（Ｙ）（Ｌｅｗｉｓ－Ｙ ａｎｔｉｇｅｎ）、ＰＳＣＡ（Ｐｒｏｓｔａｔｅ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ａｎｔｉｇｅｎ）、ＰＳＭＡ（Ｐｒｏｓｔａｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｎｔｉｇｅｎ）、ＣＥＡ（Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ）、ＨＥＲ２（Ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２）、Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ、ＣＤ４４ｖ６（Ｈｙａｌｕｒｏｎａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｖａｒｉａｎｔ ６）、Ｂ７－Ｈ３、Ｇｌｙｐｉｃａｎ－３、ＲＯＲ１（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｌｉｋｅ ｏｒｐｈａｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １）、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、ＦＯＬＲ１（ｆｏｌａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＷＴ１（Ｗｉｌｍ’ｓ ｔｕｍｏｒ ａｎｔｉｇｅｎ）、ＶＥＧＦＲ２（Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ２）、腫瘍ウイルス抗原、ＴＰ５３、ＫＲＡＳ、および新抗原（ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ）からなる群から選択された１つ以上であってもよいが、これに限定されない。

また、本発明は、ａ）標的ＤＮＡが挿入された請求項１に記載のトランスポゾンベクター；および
ｂ）トランスポザーゼタンパク質またはトランスポザーゼをコード化する配列を含む核酸分子を含むトランスポゾンシステムを含む、がんの予防または治療用キットであって、
前記標的ＤＮＡは、腫瘍抗原特異的ＣＡＲ（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）コーディング配列またはその断片、腫瘍ウイルス特異的中和抗体コーディング配列またはその断片、免疫チェックポイント阻害剤コーディング配列、および腫瘍抗原特異的ＴＣＲ（Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）コーディング配列またはその断片からなる群から選択された１つ以上であることを特徴とする、がんの予防または治療用キットを提供する。

本発明は、トランスポゾンベクター、これを含むトランスポゾンシステム、トランスポゾンキット、前記トランスポゾンベクターが挿入された細胞、およびこれらの用途に関し、外因性遺伝子をターゲット細胞の染色体内に効果的に伝達し、遺伝子改変細胞を高収率で製作することができることを確認し、完成されたものである。特に、本発明によるトランスポゾンは、ＴＣＲまたはＣＡＲをコード化する遺伝子を免疫細胞に効果的に伝達することができ、これを通じて、前記ＴＣＲまたはＣＡＲを発現した細胞は、抗原に対する高い反応性を示すことが確認されたところ、本発明によるトランスポゾンシステムを用いて様々なＴＣＲ－Ｔ細胞およびＣＡＲ－Ｔ細胞を製作できることが期待される。特に、従来ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＡＲ製作だけでなく、標的細胞への伝達のために高コストを必要としたが、本発明のトランスポゾンを用いる場合、低コストで高収率のＣＡＲ－Ｔ細胞を収得することができるので、ＣＡＲ－Ｔ細胞治療剤の生産コストを低減することによって、治療剤の価格を低減することができる。さらに、本発明のトランスポゾンは、腫瘍ウイルス－ターゲット中和抗体のような抗体遺伝子を抗体の大量生産に用いられるＨＥＫ２９３細胞に効果的に伝達できることが確認されたところ、本発明のトランスポゾンを用いて様々な抗体を大量で容易に生産することができる。特に、本発明によるトランスポゾンは、遺伝子伝達媒介体として伝達可能な遺伝子の種類に制限がないので、抗体遺伝子等に加えて、目的に応じて様々な遺伝子を発現するゲノム改変細胞株の開発に積極的に活用されることが期待される。

本発明の一具現例によるトランスポゾンベクターの模式図を示す図である。 本発明の一具現例によるトランスポゾンベクターとトランスポザーゼベクターを単独または一緒にＴ細胞に挿入後、１日、２日、３日および６日後にＧＦＰ発現程度を蛍光顕微鏡で観察した結果を示す図である。 は、本発明の一具現例によるトランスポゾンベクターとトランスポザーゼベクターを単独または一緒にＴ細胞に挿入後、１日、２日、３日、６日および７日後のＧＦＰ発現程度をＦＡＣＳで確認した結果を示す図である。 本発明の一具現例によるトランスポゾンベクターとトランスポザーゼベクターを単独または一緒にＴ細胞に挿入後、１日、２日、３日、６日および７日後のＧＦＰ発現程度を示すグラフである。 本発明の一具現例によるトランスポゾンベクターとトランスポザーゼベクターをＴ細胞に挿入し、７日後にＧＦＰを発現する単一細胞を分離した後、１０日間培養した後、当該細胞におけるＧＦＰ発現程度を蛍光顕微鏡で観察した結果を示す図である。 本発明の一具現例によるトランスポゾンベクターとトランスポザーゼベクターをＴ細胞に挿入後、Ｓｐｌｉｎｋｅｒｅｔｔｅ ＰＣＲ方法を用いた染色体内標的ＤＮＡ挿入（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）位置を確認した結果を示す図である。 本発明によるトランスポゾン突然変異を製作するためのトランスポゾンｏｒｉｇｉｎａｌ ｂａｃｋｂｏｎｅベクターマップである。 本発明による５’ＩＴＲ突然変異（ｍｕｔａｎｔ）および３’ＩＴＲ突然変異（ｍｕｔａｎｔ）を含むトランスポゾンベクターの模式図である。 未処理対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、ｐＢａｔトランスポゾンのみを導入したグループ（ｐＢａｔ Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ ｏｎｌｙ）、Ｐｉｇｇｙｂａｃトランスポザーゼのみを導入したグループ（ｐＢａｃ）、およびＧＦＰプラスミドを導入したグループ（ｐＥＧＦＰ）においてｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）７日後のＧＦＰ発現程度を蛍光顕微鏡で確認した結果である。 Ｂ３ＩＳを含むトランスポゾン（図８ｂ）、ｒ３Ｍ１ ｍｕｔａｎｔを含むトランスポゾン（図８ｃ）、ｒ３Ｍ２ ｍｕｔａｎｔを含むトランスポゾン（図８ｄ）、またはｒ３Ｍ３ ｍｕｔａｎｔを含むトランスポゾン（図８ｅ）を導入したグループにおいてｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ７日後のＧＦＰ発現程度を蛍光顕微鏡で確認した結果である。 対照群グループにおいてｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ７日後のＧＦＰ発現細胞の割合をＦＡＣＳ分析を通じて確認した結果である。 Ｂ３ＩＳを含むトランスポゾン（図９ｂ）、ｒ３Ｍ１ ｍｕｔａｎｔを含むトランスポゾン（図９ｃ）、ｒ３Ｍ２ ｍｕｔａｎｔを含むトランスポゾン（図９ｄ）、またはｒ３Ｍ３ ｍｕｔａｎｔを含むトランスポゾン（図９ｅ）を導入したグループにおいてｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ７日後のＧＦＰ発現細胞の割合をＦＡＣＳ分析を通じて確認した結果である。 対照群グループにおいてｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ １４日後のＧＦＰ発現細胞の割合をＦＡＣＳ分析を通じて確認した結果である。 Ｂ３ＩＳを含むトランスポゾン（図１０ｂ）、ｒ３Ｍ１ ｍｕｔａｎｔを含むトランスポゾン（図１０ｃ）、ｒ３Ｍ２ ｍｕｔａｎｔを含むトランスポゾン（図１０ｄ）、またはｒ３Ｍ３ ｍｕｔａｎｔを含むトランスポゾン（図１０ｅ）を導入したグループにおいてｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ １４日後のＧＦＰ発現細胞の割合をＦＡＣＳ分析を通じて確認した結果である。 本発明の一具現例によるトランスポゾンベクターを細胞にｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎした後の経時的なＧＦＰ発現細胞の割合を測定したグラフである。 本発明の一具現例によるトランスポゾンベクターがｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎされた細胞をｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ １４日目にｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇしたことを示す図である。 本発明の一具現例によるトランスポゾンベクターがｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎされた細胞をｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇしてさらに培養した後、ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ３１日目にＧＦＰ発現を蛍光顕微鏡で観察した結果である。 ｐＢａｔおよびｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンそれぞれのＩＴＲ配列をａｌｉｇｎｍｅｎｔして選別したｍｕｔａｎｔ ｆｏｒｍを示す図である（図１３ａ、５’ＩＴＲ突然変異；図１３ｂ、３’ＩＴＲ突然変異）。 未処理対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、ＧＦＰ発現プラスミドが導入されたグループ（ｐＥＧＦＰ）、トランスポザーゼなしにｐＢａｔトランスポゾンのみが導入されたグループ（ｐＢａｔ Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ ｏｎｌｙ）、およびトランスポザーゼおよびｏｒｉｇｉｎａｌ ｐＢａｔトランスポゾンが導入されたグループ（ｐＢａｔ ｃｏｎｔｒｏｌ）においてｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ（電気穿孔法）後の７日目にＧＦＰ発現程度を蛍光顕微鏡で確認した結果である。 Ｂ３ＩＳを含むトランスポゾン（図１４ｂ）、３Ｍ１ ｍｕｔａｎｔを含むトランスポゾン（図１４ｃ）、３Ｍ２ ｍｕｔａｎｔを含むトランスポゾン（図１４ｄ）、３Ｍ３ ｍｕｔａｎｔを含むトランスポゾン（図１４ｅ）、または３Ｍ４ ｍｕｔａｎｔを含むトランスポゾン（図１４ｆ）を導入したグループにおいてｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ後の７日目にＧＦＰ発現程度を蛍光顕微鏡で確認した結果である。 ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ７日後の対照群グループのＧＦＰ発現細胞の割合をＦＡＣＳ分析を通じて確認した結果である。 Ｂ３ＩＳを含むトランスポゾン（図１５ｂ）、３Ｍ１ ｍｕｔａｎｔを含むトランスポゾン（図１５ｃ）、３Ｍ２ ｍｕｔａｎｔを含むトランスポゾン（図１５ｄ）、３Ｍ３ ｍｕｔａｎｔを含むトランスポゾン（図１５ｅ）、または３Ｍ４ ｍｕｔａｎｔを含むトランスポゾン（図１５ｆ）を導入したグループにおいてｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ７日後のＧＦＰ発現細胞の割合をＦＡＣＳ分析を通じて確認した結果である。 対照群グループにおいてｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ １４日後のＧＦＰ発現程度を蛍光顕微鏡で確認した結果である。 Ｂ３ＩＳを含むトランスポゾン（図１６ｂ）、３Ｍ１ ｍｕｔａｎｔを含むトランスポゾン（図１６ｃ）、３Ｍ２ ｍｕｔａｎｔを含むトランスポゾン（図１６ｄ）、３Ｍ３ ｍｕｔａｎｔを含むトランスポゾン（図１６ｅ）、または３Ｍ４ ｍｕｔａｎｔを含むトランスポゾン（図１６ｆ）を導入したグループにおいてｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ １４日後のＧＦＰ発現程度を蛍光顕微鏡で確認した結果である。 対照群グループにおいてｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ １４日後のＧＦＰ発現細胞の割合をＦＡＣＳ分析を通じて確認した結果である。 Ｂ３ＩＳを含むトランスポゾン（図１７ｂ）、３Ｍ１ ｍｕｔａｎｔを含むトランスポゾン（図１７ｃ）、３Ｍ２ ｍｕｔａｎｔを含むトランスポゾン（図１７ｄ）、３Ｍ３ ｍｕｔａｎｔを含むトランスポゾン（図１７ｅ）、または３Ｍ４ ｍｕｔａｎｔを含むトランスポゾン（図１７ｆ）を導入したグループにおいてｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ １４日後のＧＦＰ発現細胞の割合をＦＡＣＳ分析を通じて確認した結果である。 本発明の一具現例によるトランスポゾンベクターを細胞にｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎした後の経時的なＧＦＰ発現細胞の割合（図１７ｇ）およびｈｉｇｈ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ＧＦＰを発現する細胞の割合（図１７ｈ）を測定したグラフである。 ｐＥＧＦＰ、野生型トランスポゾン（Ｎａｉｖｅ－ＧＦＰ）、または本発明の一具現例によるトランスポゾンベクターをトランスポザーゼプラスミドとともにＰＢＭＣ細胞に電気穿孔法で挿入させた後、１日（図１８ａ）または７日（図１８ｂ）後にＧＦＰ発現程度を蛍光顕微鏡で確認した結果を示す図である。 対照群グループ（電気穿孔法を行わないＰＢＭＣ（「Ｎｏ ＥＰ」）、未処理対照群（「Ｃｏｎｔｒｏｌ」）、またはｐＥＧＦＰ導入群のうちＧＦＰを発現するＣＤ３^＋Ｔ細胞およびＣＤ８^＋Ｔ細胞の割合を電気穿孔後の７日目にＦＡＣＳ分析で確認した結果である。 Ｎａｉｖｅ－ＧＦＰまたは本発明の一具現例によるトランスポゾンベクターをトランスポザーゼプラスミドとともに電気穿孔法でＰＢＭＣに導入させた後、７日目にＧＦＰを発現するＣＤ３^＋Ｔ細胞およびＣＤ８^＋Ｔ細胞の割合をＦＡＣＳ分析で確認した結果である。 対照群グループまたは本発明の一具現例によるトランスポゾンベクターおよびトランスポゾンを電気穿孔法でＰＢＭＣに導入させたグループにおいて電気穿孔後の７日目にＧＦＰを発現するＣＤ３^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞の割合をＦＡＣＳ分析で確認した結果である。 対照群グループまたは本発明の一具現例によるトランスポゾンベクターおよびトランスポゾンを電気穿孔法でＰＢＭＣに導入させたグループにおいて電気穿孔後の７日目にＧＦＰを発現するＣＤ３^＋ＣＤ８^－Ｔ細胞の割合をＦＡＣＳ分析で確認した結果である。 対照群グループまたは本発明の一具現例によるトランスポゾンベクターおよびトランスポザーゼプラスミドを電気穿孔法でＰＢＭＣに導入させたグループにおいて電気穿孔後の７日目に１Ｇ４ ＴＣＲを発現するＣＤ３^＋Ｔ細胞およびＣＤ８^＋Ｔ細胞の割合をＦＡＣＳ分析で確認した結果である。 本発明の一具現例によるトランスポゾンベクターおよびトランスポゾンを電気穿孔法でＰＢＭＣに導入させた後、７日目に１Ｇ４ ＴＣＲを発現するＣＤ３^＋Ｔ細胞およびＣＤ８^＋Ｔ細胞の割合をＦＡＣＳ分析で確認した結果である。 対照群グループまたは本発明の一具現例によるトランスポゾンベクターおよびトランスポゾンを電気穿孔法でＰＢＭＣに導入させたグループにおいて電気穿孔後の７日目に１Ｇ４ ＴＣＲを発現するＣＤ３^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞の割合をＦＡＣＳ分析で確認した結果である。 対照群グループまたは本発明の一具現例によるトランスポゾンベクターおよびトランスポゾンを電気穿孔法でＰＢＭＣに導入させたグループにおいて電気穿孔後の７日目に１Ｇ４ ＴＣＲを発現するＣＤ３^＋ＣＤ８^－Ｔ細胞の割合をＦＡＣＳ分析で確認した結果である。 対照群グループにおいてＧＦＰを発現するＣＤ３^＋Ｔ細胞およびＣＤ８^＋Ｔ細胞の割合を電気穿孔後１４日目にＦＡＣＳ分析で確認した結果である。 対照群グループまたは本発明の一具現例によるトランスポゾンベクターおよびトランスポゾンを電気穿孔法でＰＢＭＣに導入させたグループにおいて電気穿孔後１４日目にＧＦＰを発現するＣＤ３^＋Ｔ細胞およびＣＤ８^＋Ｔ細胞の割合をＦＡＣＳ分析で確認した結果である。 対照群グループまたは本発明の一具現例によるトランスポゾンベクターおよびトランスポゾンを電気穿孔法でＰＢＭＣに導入させたグループにおいて電気穿孔後１４日目にＧＦＰを発現するＣＤ３^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞の割合をＦＡＣＳ分析で確認した結果である。 対照群グループまたは本発明の一具現例によるトランスポゾンベクターおよびトランスポゾンを電気穿孔法でＰＢＭＣに導入させたグループにおいて電気穿孔後１４日目にＧＦＰを発現するＣＤ３^＋ＣＤ８^－Ｔ細胞の割合をＦＡＣＳ分析で確認した結果である。 対照群グループまたは本発明の一具現例によるトランスポゾンベクターおよびトランスポザーゼプラスミドを電気穿孔法でＰＢＭＣに導入させたグループにおいて１Ｇ４ ＴＣＲを発現するＣＤ３^＋Ｔ細胞およびＣＤ８^＋Ｔ細胞の割合を電気穿孔後１４日目にＦＡＣＳ分析で確認した結果である。 本発明の一具現例によるトランスポゾンベクターおよびトランスポゾンを電気穿孔法でＰＢＭＣに導入させた後、１４日目に１Ｇ４ ＴＣＲを発現するＣＤ３^＋Ｔ細胞およびＣＤ８^＋Ｔ細胞の割合をＦＡＣＳ分析で確認した結果である。 対照群グループまたは本発明の一具現例によるトランスポゾンベクターおよびトランスポザーゼプラスミドを電気穿孔法でＰＢＭＣに導入させたグループにおいて電気穿孔後１４日目に１Ｇ４ ＴＣＲを発現するＣＤ３^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞の割合をＦＡＣＳ分析で確認した結果である。 対照群グループまたは本発明の一具現例によるトランスポゾンベクターおよびトランスポザーゼプラスミドを電気穿孔法でＰＢＭＣに導入させたグループにおいて電気穿孔後１４日目に１Ｇ４ ＴＣＲを発現するＣＤ３^＋ＣＤ８^－Ｔ細胞（ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞）の割合をＦＡＣＳ分析で確認した結果である。 本発明の一具現例によるトランスポゾンベクターおよびトランスポザーゼプラスミドを電気穿孔法でＰＢＭＣに導入し、電気穿孔直後（「直後」で表記）または１日後に（「１日後」で表記）ｆｅｅｄｅｒ ｃｅｌｌ（Ａ３７５）でＴ細胞を活性化した後、電気穿孔後の７日目にＣＤ３^＋Ｔ細胞のうち１Ｇ４ ＴＣＲを発現するＴ細胞の割合をＦＡＣＳ分析で確認した結果である。 本発明の一具現例によるトランスポゾンベクターおよびトランスポザーゼプラスミドを電気穿孔法でＰＢＭＣに導入し、電気穿孔直後または１日後にｆｅｅｄｅｒ ｃｅｌｌでＴ細胞を活性化した後、電気穿孔後１０日目にＣＤ３^＋Ｔ細胞のうち１Ｇ４ ＴＣＲを発現するＴ細胞の割合、ＣＤ４^＋細胞、およびＣＤ８^＋細胞の割合、およびｍｅｍｏｒｙタイプＴ細胞の割合をＦＡＣＳ分析で確認した結果である。 本発明の一具現例によるトランスポゾンベクターおよびトランスポザーゼプラスミドを電気穿孔法でＰＢＭＣに導入し、電気穿孔直後または１日後にｆｅｅｄｅｒ ｃｅｌｌでＴ細胞を活性化した後、電気穿孔後１４日目にＣＤ３^＋Ｔ細胞のうち１Ｇ４ ＴＣＲを発現するＴ細胞の割合、ＣＤ４^＋細胞、およびＣＤ８^＋細胞の割合、およびｍｅｍｏｒｙタイプＴ細胞の割合をＦＡＣＳ分析で確認した結果である。 本発明の一具現例によるトランスポゾンベクターおよびトランスポザーゼプラスミドを電気穿孔法でＰＢＭＣに導入し、ｆｅｅｄｅｒ ｃｅｌｌでＴ細胞を活性化した後の経時的な細胞生存率を確認した結果である。 本発明の一具現例によるトランスポゾンベクターおよびトランスポザーゼプラスミドを電気穿孔法でＰＢＭＣに導入し、ｆｅｅｄｅｒ ｃｅｌｌでＴ細胞を活性化した後の経時的なＴＣＲ発現ＣＤ３^＋Ｔ細胞の割合を確認した結果である。 本発明の一具現例によるトランスポゾンベクターおよびトランスポザーゼプラスミドを電気穿孔法でＰＢＭＣに導入し、Ｔ細胞を活性化した後、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する全体Ｔ細胞、ＣＤ４^＋細胞、およびＣＤ８^＋細胞の割合を確認した結果である。 本発明の一具現例によるトランスポゾンベクターおよびトランスポザーゼプラスミドを電気穿孔法でＰＢＭＣに導入し、Ｔ細胞を活性化した後、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する全体Ｔ細胞の割合（図３２ａ）およびＣＤ４^＋細胞とＣＤ８^＋細胞の割合を確認した結果（図３２ｂ）である。 本発明の一具現例によるトランスポゾンベクターおよびトランスポザーゼプラスミドを電気穿孔法でＰＢＭＣに導入し、Ｔ細胞を活性化した後、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する全体Ｔ細胞、ＣＤ４^＋細胞、ＣＤ８^＋細胞の割合、およびｍｅｍｏｒｙタイプＴ細胞の割合を確認した結果である。 本発明の一具現例によるトランスポゾンベクターおよびトランスポザーゼプラスミドを電気穿孔法でＰＢＭＣに導入し、Ｔ細胞を活性化した後、ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ７日目の細胞生存率（図３４ａ）、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現ＣＤ３^＋Ｔ細胞の割合（図３４ｂ）、およびｍｅｍｏｒｙタイプＴ細胞の割合（図３４ｃ）を確認した結果である。 本発明の一具現例によるトランスポゾンシステムで製作されたＣＡＲ－Ｔ細胞のターゲット抗原（ＣＤ１９）を発現するＢ細胞株（ＢＪＡＢ）に対する反応性を確認した結果である。 様々な形態（ｐｌａｓｍｉｄ、ｌｉｎｅａｒ ｄｓＲＮＡ、またはｍｉｎｉｃｉｒｃｌｅ ｄｓＲＮＡ）のトランスポゾンベクター、およびトランスポザーゼプラスミドを電気穿孔法でＪｕｋａｔ細胞に導入した後、ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ７日後に蛍光顕微鏡を用いてＧＦＰ発現細胞を観察した写真である。 様々な形態のトランスポゾンベクター、およびトランスポザーゼプラスミドを電気穿孔法でＪｕｋａｔ細胞に導入した後、ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ７日後にＧＦＰ発現細胞の割合をＦＡＣＳ分析で確認した結果である。 様々な形態のトランスポゾンベクター、およびトランスポザーゼプラスミドを電気穿孔法でＪｕｋａｔ細胞に導入した後、ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ １４日後に蛍光顕微鏡を用いてＧＦＰ発現細胞を観察した写真である。 様々な形態のトランスポゾンベクター、およびトランスポザーゼプラスミドを電気穿孔法でＪｕｋａｔ細胞に導入した後、ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ １４日後にＧＦＰ発現細胞の割合をＦＡＣＳ分析で確認した結果である。 本発明によるトランスポゾンベクターを導入した後の経時的なＧＦＰ発現細胞の割合を測定した結果である。 本発明によるトランスポゾンベクターを導入した後の経時的なｈｉｇｈ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ＧＦＰ発現細胞の割合を測定した結果である。 本発明の一具現例によるトランスポゾンベクターをＨＥＫ２９３細胞に導入した後の経時的な細胞のＧＦＰ発現レベルを蛍光顕微鏡で観察した結果である。 本発明の一具現例によるトランスポゾンベクターをＨＥＫ２９３細胞に導入した後の経時的な細胞のＧＦＰ発現レベルをＦＡＣＳ分析で観察した結果である。 本発明の一具現例によるトランスポゾンベクターをＨＥＫ２９３細胞に導入した後の経時的なＪＷＷ－２ ｍＲＮＡ発現レベルをｑＰＣＲで確認した結果である。 本発明の一具現例によるトランスポゾンベクターをＨＥＫ２９３細胞に導入した後の経時的なＪＷＷ－２タンパク質発現レベルをＥＬＩＳＡ分析で確認した結果である。 トランスポゾンベクターのサイズによる遺伝子伝達効率を確認するために、陰性対照群（ＥＰ ｏｎｌｙ）、ＧＦＰプラスミド処理群（ｐＥＧＦＰ）、野生型トランスポゾン処理群（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）、Ｂ３ＩＳ－Ｂ５ＩＥトランスポゾン処理群、または小さいサイズのＢ３ＩＳ－Ｂ５ＩＥトランスポゾン処理群においてｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ １日後のＧＦＰ発現レベルを蛍光顕微鏡で確認した結果である。 トランスポゾンベクターのサイズによる遺伝子伝達効率を確認するために、様々なプラスミドおよびトランスポゾンをＪｕｒｋａｔ細胞にｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎし、１日後にＧＦＰ発現レベルをＦＡＣＳ分析で確認した結果である。 様々なプラスミドまたはトランスポゾンをＪｕｒｋａｔ細胞にｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎし、７日後にＧＦＰ発現レベルを蛍光顕微鏡で確認した結果である。 様々なプラスミドまたはトランスポゾンをＪｕｒｋａｔ細胞にｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎし、７日後にＧＦＰ発現レベルをＦＡＣＳ分析で確認した結果である。 様々なプラスミドまたはトランスポゾンをＪｕｒｋａｔ細胞にｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎし、１４日後にＧＦＰ発現レベルを蛍光顕微鏡で確認した結果である。 様々なプラスミドまたはトランスポゾンをＪｕｒｋａｔ細胞にｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎし、１４日後にＧＦＰ発現レベルをＦＡＣＳ分析で確認した結果である。 様々なプラスミドまたはトランスポゾンをＪｕｒｋａｔ細胞にｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎし、経時的なＧＦＰ－発現細胞の割合をグループ別に確認した結果である。 様々なプラスミドまたはトランスポゾンをＪｕｒｋａｔ細胞にｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎし、経時的なｈｉｇｈ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ＧＦＰ－発現細胞の割合をグループ別に確認した結果である。

本発明は、トランスポゾンベクター、これを含むトランスポゾンシステム、トランスポゾンキット、前記トランスポゾンベクターが挿入された細胞、およびこれらの用途に関し、外因性遺伝子をターゲット細胞の染色体内に効果的に伝達し、遺伝子改変細胞を高収率で製作することができることを確認し、完成されたものである。

したがって、本発明は、配列番号１で表される核酸配列のうち７１個以上の連続した核酸配列を有する５’ＩＴＲ（５’Ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）；および配列番号２で表される核酸配列のうち６６個以上の連続した核酸配列を有する３’ＩＴＲ（３’Ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）を含むトランスポゾンベクターを提供する。

本願において使用された用語「トランスポゾン」は、ドナーポリヌクレオチド（例えば、ベクター）から特定の遺伝子を切除することによって、ゲノム内のその位置を変化させ、標的部位（例えば、細胞のゲノムまたは染色体外ＤＮＡ）に統合させることができるポリヌクレオチドを指す。トランスポゾンは、シス－作用（ｃｉｓ－ａｃｔｉｎｇ）ヌクレオチド配列が両側面に位置する核酸配列を含むポリヌクレオチドであり、ここで、少なくとも１つのシス－作用ヌクレオチド配列が前記核酸配列の５’に位置し、少なくとも１つのシス－作用ヌクレオチド配列が前記核酸配列の３’に位置する。シス－作用ヌクレオチド配列は、トランスポゾンの各末端に少なくとも１つの逆方向反復（Ｉｎｖｅｒｔｅｄ Ｒｅｐｅａｔ；ＩＲ）を含むが、これをＩＴＲ（Ｉｎｖｅｒｔｅｄ Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｒｅｐｅａｔ）と言い、そこへトランスポザーゼが結合する。本願において、トランスポゾン核酸配列の５’末端に位置するＩＴＲを５’ＩＴＲと称し、トランスポゾン核酸配列の３’末端に位置するＩＴＲを３’ＩＴＲと称する。

本願において使用された用語「ベクター」は、連結された他の核酸分子を輸送できる核酸分子を指す。具体的には、前記ベクターは、試験管内、生体外または生体内で宿主細胞への塩基の導入および／または転移のための任意の媒介物を意味し、他のＤＮＡ断片が結合し、結合した断片の複製をもたらすことができる複製単位（ｒｅｐｌｉｃｏｎ）でありうる。「複製単位」とは、生体内でＤＮＡ複製の自己ユニットとして機能する、すなわち、自らの調節によって複製可能な、任意の遺伝単位（例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、染色体、ウイルスなど）をいう。前記ベクターは、バクテリア、プラスミド、ファージ、コスミド（ｃｏｓｍｉｄ）、エピゾーム、ウイルス、および挿入可能なＤＮＡ断片、すなわち同種組換えによって宿主細胞ゲノムに挿入され得る断片を含むが、これに限らない。

本発明によるベクターは、プラスミドＤＮＡ、線状ＤＮＡ、ヘアピンＤＮＡ、またはミニサークルＤＮＡであり、二本鎖のＤＮＡからなるものであってもよく、あるいは、組換えウイルス性ベクターであってもよいが、これに限定されない。前記ベクターは、トランスポゾン配列および標的ＤＮＡを含み、これをターゲット細胞内に伝達できるものであれば、制限なく使用することができ、当業者は、当業界に一般的に知られている様々なベクターを選択して使用することができる。

本発明の組換えベクターは、好ましくは、ＲＮＡ重合酵素が結合する転写開始因子であるプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、転写を調節するための任意のオペレーター配列、エンハンサー（ｅｎｈａｎｃｅｒ）配列、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列と転写および翻訳の終結を調節する配列、ターミネーター等を含んでもよいし、より好ましくは、ポリヒスチジンタグ（最小５個以上のヒスチジン残基で構成されたアミノ酸モチーフ）、シグナルペプチド（ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）遺伝子、小胞体残留シグナルペプチド（ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）、クローニングサイト（ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｉｔｅ）等をさらに含んでもよいし、タグ用遺伝子、形質転換体を選別するための抗生剤耐性遺伝子等の選別用マーカー遺伝子等をさらに含んでもよい。前記組換えベクターにおいて前記各遺伝子のポリヌクレオチド配列は、プロモーターに作動可能に連結される。本明細書において使用される用語「作動可能に連結（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」は、プロモーター配列のようなヌクレオチド発現調節配列と他のヌクレオチド配列間の機能的な結合を意味し、これによって前記調節配列は、前記他のヌクレオチド配列の転写および／または翻訳を調節する。

前記組換えベクターは、原核細胞または真核細胞を宿主として構築され得る。例えば、本発明のベクターが発現ベクターであり、原核細胞を宿主とする場合には、転写を進行させることができる強力なプロモーター（例えば、ｐＬλプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター等）、翻訳の開始のためのリボソーム結合部位および転写／翻訳終結配列を含むことが一般的である。真核細胞を宿主とする場合、ベクターが真核細胞で作動する複製起点は、ｆ１複製起点、ＳＶ４０複製起点、ｐＭＢ１複製起点、アデノ複製起点、ＡＡＶ複製起点およびＢＢＶ複製起点等を含んでもよいが、これに限定されるものではない。また、哺乳動物細胞のゲノムに由来したプロモーター（例えば、メタロチオニンプロモーター）または哺乳動物ウイルスに由来したプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルスプロモーターおよびＨＳＶのｔｋプロモーター）が使用でき、転写終結配列としてポリアデニル化配列を一般的に有する。また、シグナル配列としてｐｏｌｙ Ａ ｓｉｇｎａｌ（ポリＡシグナル）等を含んでもよいが、これに限定されるものではない。

前記タグ用遺伝子としては、代表的にＡｖｉタグ、Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎタグ、ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍａｔｅタグ、Ｅタグ、ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグ、Ｈｉｓタグ（ポリヒスチジンタグ）、Ｍｙｃタグ、Ｓタグ、ＳＢＰタグ、ＩｇＧ－Ｆｃタグ、ＣＴＢタグ、Ｓｏｆｔａｇ １タグ、Ｓｏｆｔａｇ ３タグ、Ｓｔｒｅｐタグ、ＴＣタグ、Ｖ５タグ、ＶＳＶタグ、Ｘｐｒｅｓｓタグ等が含まれ得る。好ましくは、本発明によるベクターは、ｍｙｃタグを含んでもよい。

本発明において、前記ベクターは、原核または真核宿主細胞内に外因性核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を導入するのに通常使用される様々な技術を用いて細胞内に伝達され得る。例えば、本発明によるベクターは、リン酸カルシウム共沈（ｃａｌｃｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｃｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）；電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）；マイクロ流体遺伝子編集（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ ｇｅｎｅ ｅｄｉｔｉｎｇ）；ヌクレオフェクション（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ）；細胞スキージング（ｃｅｌｌ ｓｑｕｅｅｚｉｎｇ）；ソノポレーション（ｓｏｎｏｐｏｒａｔｉｏｎ）；光学形質感染（ｏｐｔｉｃａｌ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）；インペールフェクション（ｉｍｐａｌｅｆｅｃｔｉｏｎ）；遺伝子銃（ｇｅｎｅ ｇｕｎ）；マグネトフェクション（ｍａｇｎｅｔｏｆｅｃｔｉｏｎ）；ウイルス形質導入（ｖｉｒａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）；ＤＥＡＥ－デキストラントランスフェクション；リポフェクション（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ）；またはデンドリマー、リポソーム、またはカチオン性重合体を介した形質感染によって細胞に挿入され得るが、これに限定されない。

本願において使用された用語「核酸」または「核酸分子」は、ＤＮＡ（ｇＤＮＡおよびｃＤＮＡ）およびＲＮＡ分子を包括的に含む意味を有し、核酸において基本構成単位であるヌクレオチドは、自然のヌクレオチドだけでなく、糖または塩基部位が改変された類似体（ａｎａｌｏｇｕｅ）も含む。本発明による核酸の配列は改変され得る。前記改変は、ヌクレオチドの追加、欠失、または非保存的置換または保存的置換を含む。本発明による核酸は、前記ヌクレオチド配列に対して実質的な同一性を示すヌクレオチド配列も含む。実質的な同一性は、本発明のヌクレオチド配列と任意の他の配列を最大限対応するようにアラインし、当業界において通常用いられるアルゴリズムを用いてアライン（ａｌｉｇｎ）された配列を分析した場合に、最小８０％の相同性、より好ましくは、最小９０％の相同性、最も好ましくは、最小９５％の相同性を示すヌクレオチド配列を意味する。

すなわち、本発明において、特定の配列番号で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、当該塩基配列にのみ制限されず、前記塩基配列の変異体が本発明の範囲内に含まれる。本発明の特定の配列番号で表される塩基配列からなる核酸分子とは、これを構成する核酸分子の作用性等価物、例えば、核酸分子の一部塩基配列が欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）、置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）または挿入（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）により改変されたが、核酸分子と機能的に同じ作用ができる変異体（ｖａｒｉａｎｔｓ）を含む概念である。具体的には、本発明に開示されたポリヌクレオチドは、特定の配列番号で表される塩基配列とそれぞれ７０％以上、より好ましくは、８０％以上、さらに好ましくは、９０％以上、最も好ましくは、９５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含んでもよい。例えば、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の配列相同性を有するポリヌクレオチドを含む。ポリヌクレオチドに対する「配列相同性の％」は、２つの最適に配列された配列と比較領域を比較することによって確認され、比較領域におけるポリヌクレオチド配列の一部は、２つの配列の最適配列に対する参考配列（追加または削除を含まない）に比べて追加または削除（すなわち、ギャップ）を含んでもよい。

本願において使用された用語「形質感染効率（ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃａｃｙ）」は、宿主細胞の集団内に導入されたポリヌクレオチドを含有する細胞の数を指す。一般的に、形質感染効率は、レポータ遺伝子（ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｇｅｎｅ）、例えばＧＦＰをコード化するポリヌクレオチドを標的細胞の集団に形質感染させることによって決定することができる。したがって、形質感染効率は、導入されたポリヌクレオチドによってコード化された遺伝子産物を分析することによって決定することができる。例えば、ＧＦＰ活性を有する細胞の数の測定による。

本発明によるトランスポゾンベクターは、１つ以上の５’ＩＴＲおよび１つ以上の３’ＩＴＲを含んでもよい。

本発明によるトランスポゾンベクターは、後述する１つ以上の５’ＩＴＲと１つ以上の３’ＩＴＲを含むにあたって、
５’ＩＴＲの核酸配列は、その５’から３’方向の配列がトランスポゾンベクター（あるいはトランスポゾンコーディングポリヌクレオチド分子）の５’末端内に５’から３’方向に含まれ、および／または３’ＩＴＲの核酸配列は、その５’から３’方向の配列がトランスポゾンベクターの３’末端内に５’から３’方向に含まれ得る。換言すれば、５’ＩＴＲの核酸配列は、トランスポゾンベクター内の標的ＤＮＡが挿入される位置の上部（ｕｐｓｔｒｅａｍ）に５’から３’方向に含まれたり、および／または３’ＩＴＲの核酸配列は、トランスポゾンベクター内の標的ＤＮＡが挿入される位置の下部（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ）に５’から３’方向に含まれ得る。前記ベクターの５’末端または３’末端内に５’から３’方向に含まれるというのは、好ましくは、ポリヌクレオチド分子のｓｅｎｓｅ鎖の５’から３’方向に含まれることを意味する。

本発明による前記５’ＩＴＲは、配列番号１で表される１５７個の核酸配列のうち７１個以上の連続した核酸配列を有することを特徴とする。好ましくは、前記７１個以上の連続した核酸配列は、配列番号１で表される核酸配列のうち５’から３’方向に７１個以上の連続した核酸配列を意味する。ここで、７１個以上の核酸配列は、配列番号１で表される全体核酸配列の中から選択され得、例えば、配列番号１で表される核酸配列の５’から３’方向に１番目のヌクレオチド（配列番号１で「Ｔ」）から７１個以上を選択することができるが、これに限らない。例えば、前記５’ＩＴＲは、配列番号１で表される１５７個の核酸配列のうち７０個以上、８０個以上、９０個以上、１００個以上、１１０個以上、１２０個以上、１３０個以上、１４０個以上、または１５０個以上の連続した核酸配列を有することができる。また、前記５’ＩＴＲは、１５７個以下、１４０個以下、１３０個以下、１２０個以下、または１１５個以下である。ここで、７１個以上を選択するに際して、１番目のヌクレオチドから順次に選択することができるが、一部のヌクレオチドを欠失、追加または変異して選択することもできる。

本発明による前記５’ＩＴＲは、配列番号１で表される１５７個の核酸配列のうち、７１個以下の核酸配列を有することもできるが、３３個超過の核酸配列を有しなければならない。例えば、本発明による前記５’ＩＴＲは、トランスポゾンベクター内に含まれていて、本発明において目的とするトランスポゾンベクターとして有効な効果を発揮する場合、配列番号１で表される１５７個の核酸配列のうち３４個以上、３５個以上、３８個以上、４０個以上、５０個以上または６０個以上の核酸配列を有することもでき、７１個以上に制限されない。ここで、３３個超過を選択するに際して、配列番号１で表される核酸配列の５’から３’方向に１番目のヌクレオチドから順次に選択することができるが、一部のヌクレオチドを欠失、追加または変異して選択することもできる。

例えば、本発明による前記５’ＩＴＲは、配列番号７（５’－ＴＴＡＡＣＡＣＴＴＧＧＡＴＴＧＣＧＧＧＡＡＡＣＧＡＧ－３’）で表される核酸配列を含む。ここで、配列番号７は、配列番号１で表される核酸配列のうち５’末端で１番目～２６番目のヌクレオチドに該当する。

例えば、本発明による前記５’ＩＴＲは、５’－ＡＣＡＣＴＴＧＧ－３’で表される核酸配列（８ｍｅｒ）を含む。前記配列は、配列番号１で表される核酸配列のうち５’末端で４番目～１１番目のヌクレオチドに該当する。

例えば、本発明による前記５’ＩＴＲは、配列番号８（５’－ＴＧＣＧＧＧＡＡＡＣＧＡＧＴＴ－３’）で表される核酸配列（１５ｍｅｒ）を含む。ここで、配列番号８は、配列番号１で表される核酸配列のうち５’末端で１４番目～２８番目のヌクレオチドに該当する。

例えば、本発明による前記５’ＩＴＲは、上述した配列番号７、５’－ＡＣＡＣＴＴＧＧ－３’、または配列番号８で表される核酸配列のうち１つ以上を含む。

本発明の一具現例において、前記５’ＩＴＲは、下記からなる群から選ばれたいずれか１つでありうる：
ａ）配列番号１で表される核酸配列を有する５’ＩＴＲ；
ｂ）配列番号５で表される核酸配列を有する５’ＩＴＲ；および
ｃ）配列番号６で表される核酸配列を有する５’ＩＴＲ。

本発明による前記３’ＩＴＲは、配列番号２で表される２１２個の核酸配列のうち６６個以上の核酸配列を有することを特徴とする。ここで、６６個以上の核酸配列は、配列番号２で表される全体核酸配列の中から選択され得、例えば、配列番号２（配列番号２で「Ａ」）で表されるｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ核酸配列の３’から５’方向に１番目のヌクレオチドから６６個以上を選択することができるが、これに限らない。例えば、前記３’ＩＴＲは、配列番号２で表される２１２個の核酸配列のうち６０個以上、７０個以上、８０個以上、９０個以上、１００個以上、１１０個以上、１２０個以上、１３０個以上、１４０個以上、１５０個以上、１６０個以上、１７０個以上、１８０個以上、１９０個以上、２００個以上、または２１０個以上の連続した核酸配列を有することができる。また、前記３’ＩＴＲは、２１２個以下、２００個以下、１９０個以下、１８０個以下、１７０個以下、または１６０個以下である。ここで、６６個以上を選択するに際して、１番目のヌクレオチドから順次に選択することができるが、一部のヌクレオチドを欠失、追加または変異して選択することもできる。

本発明による前記３’ＩＴＲは、配列番号２で表される２１２個の核酸配列のうち、６６個以下の核酸配列を有することもできるが、３７個超過の核酸配列を有しなければならない。例えば、本発明による前記３’ＩＴＲは、トランスポゾンベクター内に含まれていて、本発明において目的とするトランスポゾンベクターとして有効な効果を発揮する場合、配列番号２で表される２１２個の核酸配列のうち４０個以上、５０個以上または６０個以上の核酸配列を有することもでき、６６個以上に制限されない。ここで、３７個超過を選択するに際して、配列番号２で表されるｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ核酸配列の３’から５’方向に１番目のヌクレオチドから順次に選択することができるが、一部のヌクレオチドを欠失、追加または変異して選択することもできる。

例えば、本発明による前記３’ＩＴＲは、配列番号１３（５’－ｔｔｇｇｃｇｇｇａａａｔｔｃａｃｃｃｇａｃａｃｃｇｔａｇｔｇ－３’）で表される核酸配列（３０ｍｅｒ）を含む。ここで、配列番号１３は、配列番号２で表される核酸配列のうち３’末端から５番目～３４番目のヌクレオチドに該当する。

例えば、本発明による前記３’ＩＴＲは、配列番号１４（５’－ａａｃｔｃｔｇａｔｔｔｔｇｃｇｃｇｇ－３’）で表される核酸配列（１８ｍｅｒ）を含む。ここで、配列番号１４は、配列番号２で表される核酸配列のうち３’末端から６９番目～８６番目のヌクレオチドに該当する。

例えば、本発明による前記３’ＩＴＲは、配列番号１３または配列番号１４で表される核酸配列のうち１つ以上を含む。

本発明の一具現例において、前記３’ＩＴＲは、下記からなる群から選ばれたいずれか１つでありうる：
ａ）配列番号２で表される核酸配列を有する３’ＩＴＲ；
ｂ）配列番号９で表される核酸配列を有する３’ＩＴＲ；
ｃ）配列番号１０で表される核酸配列を有する３’ＩＴＲ；および
ｄ）配列番号１１で表される核酸配列を有する３’ＩＴＲ。

本発明によるトランスポゾンベクターにおいて、上述した１つ以上の５’ＩＴＲと１つ以上の３’ＩＴＲの組み合わせを含むにあたって、
前記５’ＩＴＲの核酸配列は、トランスポゾンベクターの５’末端内に５’から３’方向に含まれたり、または上述した配列番号で表示した５’ＩＴＲの核酸配列の逆相補的（ｒｅｖｅｒｓｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）配列を有するアンチセンスＤＮＡ（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＤＮＡ）の５’から３’方向の配列がトランスポゾンベクターの５’末端内に５’から３’方向に含まれることもできる。言い換えれば、前記５’ＩＴＲの核酸配列は、トランスポゾンベクター内の標的ＤＮＡが挿入される位置の上部（ｕｐｓｔｒｅａｍ）に５’から３’方向に含まれたり、前記５’ＩＴＲの核酸配列の逆相補的配列としてトランスポゾンベクター内の標的ＤＮＡが挿入される位置の上部に５’から３’方向に含まれ得る。

また、前記３’ＩＴＲの核酸配列は、トランスポゾンベクターの３’末端内に５’から３’方向に含まれたり、または上述した配列番号で表示した３’ＩＴＲの逆相補的配列を有するアンチセンスＤＮＡの５’から３’方向の核酸配列がトランスポゾンベクターの３’末端内にｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄの５’から３’方向に含まれ得る。言い換えれば、前記３’ＩＴＲの核酸配列は、トランスポゾンベクター内の標的ＤＮＡが挿入される位置の下部（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ）に５’から３’方向に含まれたり、前記３’ＩＴＲの核酸配列の逆相補的配列を有するアンチセンスＤＮＡがトランスポゾンベクター内の標的ＤＮＡが挿入される位置の下部に５’から３’方向に含まれ得る。

例えば、配列番号９で表される３’ＩＴＲの核酸配列（３Ｍ３）は、５’－ａａｃｃｔａａａｔａａｔｔｇｃｃｃｇｃｇｃｃａｔｃｔｔａｔａｔｔｔｔｇｇｃｇｇｇａａａｔｔｃａｃｃｃｇａｃａｃｃｇｔａｇｔｇｔｔａａ－３’であり、このような３’ＩＴＲは、トランスポゾンベクターのｓｅｎｓｅ鎖の３’末端内に５’から３’方向に、順次に５’－ａａｃｃｔａａａｔａａｔｔｇｃｃｃｇｃｇｃｃａｔｃｔｔａｔａｔｔｔｔｇｇｃｇｇｇａａａｔｔｃａｃｃｃｇａｃａｃｃｇｔａｇｔｇｔｔａａ－３’の配列順にトランスポゾンベクターの３’末端内に含まれる。一方、配列番号９で表される３’ＩＴＲのａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄの５’から３’方向の核酸配列がトランスポゾンベクターのｓｅｎｓｅ鎖の３’末端内に５’から３’方向に含まれる場合、順次に５’－ｔｔａａｃａｃｔａｃｇｇｔｇｔｃｇｇｇｔｇａａｔｔｔｃｃｃｇｃｃａａａａｔａｔａａｇａｔｇｇｃｇｃｇｇｇｃａａｔｔａｔｔｔａｇｇｔｔ－３’の配列順にトランスポゾンベクターの３’末端内に含まれる。一具体例において、このような配列番号９で表される３’ＩＴＲの核酸配列のｒｅｖｅｒｓｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ配列は、配列番号１５で表される（ｒ３Ｍ３）。

本発明の一具現例において、前記３’ＩＴＲの逆相補的配列は、配列番号１５～１７のうちいずれか１つで表される核酸配列を含むものであってもよい。

本発明によるトランスポゾンベクターは、上述した１つ以上の５’ＩＴＲと１つ以上の３’ＩＴＲの組み合わせを含んでもよい。

例えば、配列番号１で表される核酸配列を有する５’ＩＴＲと配列番号１１で表される核酸配列を有する３’ＩＴＲの組み合わせを含んでもよいし、上述した３種の５’ＩＴＲ（Ｂ５１Ｅ、５Ｍ３、および５Ｍ４）と７種の３’ＩＴＲ（Ｂ３ＩＳ、３Ｍ１、３Ｍ２、３Ｍ３、ｒ３Ｍ１、ｒ３Ｍ２、およびｒ３Ｍ３）を用いて、合計２１種の組み合わせの５’ＩＴＲと３’ＩＴＲを含むトランスポゾンを得ることができるが、これら２１種の組み合わせに限定されない。

本発明の一具現例において、前記トランスポゾンベクターは、前記５’ＩＴＲ下部（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ）と３’ＩＴＲ上部（ｕｐｓｔｒｅａｍ）の間に１つ以上の標的ＤＮＡ配列を含むことを特徴とする、トランスポゾンベクターであってもよいが、これに限定されるものではない。

本発明において、「標的ＤＮＡ」とは、本発明のトランスポゾンを用いて細胞内に伝達しようとする外因性ＤＮＡ分子を指す。前記標的ＤＮＡは、トランスポゾンベクターに挿入され、ターゲット細胞内に導入された後に発現することができるものであれば、十分である。すなわち、前記標的ＤＮＡは、特定の種類のＤＮＡに限定されないことが自明であり、当業者は、目的に応じて所望の標的ＤＮＡを制限なく選択することができる。

本発明の一具現例において、前記標的ＤＮＡ配列は、抗生剤耐性タンパク質、治療用ポリペプチド、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、レポータタンパク質、サイトカイン、キナーゼ（ｋｉｎａｓｅ）、抗原、抗原特異的受容体、サイトカイン受容体、自殺ポリペプチド（ｓｕｉｃｉｄｅ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）、組換え抗体、様々なウイルスまたはその他抗原に対する中和抗体、またはこれらの一部をコード化するものであってもよく、例えば、ＣＡＲ（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＴＣＲ（Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、またはこれらの一部をコード化するものであってもよいが、これに限らない。

本発明において、前記「治療用ポリペプチド」は、任意の疾患を予防、改善、および／または治療する効果があるポリペプチドまたはペプチドを指し、当業者は、目的に応じて特定の疾患に対して治療効果等を示すポリペプチドを適切に選択することができる。前記疾患は、具体的な種類に制限されないが、一具現例において前記疾患は、がんでありうる。

本発明の一具現例において、前記トランスポゾンベクターは、前記５’ＩＴＲ下部（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ）と３’ＩＴＲ上部（ｕｐｓｔｒｅａｍ）の間にプロモーターが作動可能に連結されていてもよいが、これに限らない。

例えば、前記トランスポゾンベクターは、前記５’ＩＴＲ下部（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ）および標的ＤＮＡクローニングサイト上部（ｕｐｓｔｒｅａｍ）の間にプロモーターがさらに含まれていてもよい。

前記「作動可能に連結」は、核酸発現調節配列（例：プロモーター、シグナル配列、または転写調節因子結合位置のアレイ）と他の核酸配列間の機能的な結合を意味し、これによって前記調節配列は、前記他の核酸配列の転写および／または翻訳を調節する。

前記プロモーターには、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ｌａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、シミアン（ｓｉｍｉａｎ）ウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、マウス乳がんウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ ｋｉｎａｓｅ）プロモーター、チキンβ－アクチン（ＣＡＧ）プロモーター、延長因子（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）１－アルファ（ＥＦ１α）プロモーター、ヒトＨ１プロモーター、およびＵ６プロモーターが含まれ得るが、これに限らない。

本発明の一具現例において、前記トランスポゾンベクターは、前記５’ＩＴＲ下部（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ）および３’ＩＴＲ上部（ｕｐｓｔｒｅａｍ）の間にプロモーターの他に、エンハンサー（ｅｎｈａｎｃｅｒ）、サイレンサー（ｓｉｌｅｎｃｅｒ）、インシュレーター（ｉｎｓｕｌａｔｏｒ）、終結因子、およびポリＡシグナルのうち１つ以上さらに作動可能に連結されていてもよいが、これに限らない。

前記エンハンサーには、例えば、ＣＭＶエンハンサーが含まれ得るが、これに限らない。

例えば、前記トランスポゾンベクターは、プロモーター、１つ以上の標的ＤＮＡ、およびポリＡシグナルを含み、前記５’ＩＴＲ、前記プロモーター、前記標的ＤＮＡ、前記ポリＡシグナル、および前記３’ＩＴＲが順次に作動可能に連結され得る。

あるいは、前記トランスポゾンベクターは、エンハンサーをさらに含み、前記５’ＩＴＲ、前記エンハンサー、前記プロモーター、前記標的ＤＮＡ、前記ポリＡシグナル、および前記３’ＩＴＲが順次に作動可能に連結されたものであってもよいが、これに限らない。

本発明のトランスポゾンベクターは、二本鎖のＤＮＡ分子（ｄｓ ＤＮＡ）であり、具体的な形態に制限されるものではないが、好ましくは、環状プラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ）であってもよく、あるいは、線状化ｄｓＤＮＡやミニサークル（ｍｉｎｉｃｉｒｃｌｅ）ＤＮＡであってもよいが、これに限定されるものではない。前記線状化ｄｓＤＮＡは、合成したり環状プラスミドを制限酵素等で切断して収得することができる。前記「ミニサークルＤＮＡ」は、原核抗生剤耐性遺伝子および原核複製起点（ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）のような複製に必要な任意のプラスミド／ベクターバックボーン配列（ｂａｃｋｂｏｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）が典型的に欠如した核酸分子であり、一般的なプラスミドに比べてサイズがさらに小さい環状ＤＮＡ分子を指す。ミニサークルは、プラスミドの組換え酵素（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ）認識部位間の位置特異的分子内組換えによってバクテリアプラスミドから生体内で生成され得、バクテリアプラスミドバックボーンＤＮＡが欠如したミニサークルＤＮＡベクターを生成するが、これに限らない。例えば、ミニサークルＤＮＡは、酵素分解／ライゲーション方法によって製造され得、商業的に利用可能なキット、すなわちミニサークルＤＮＡ生産キット（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）等を用いて製造され得る。また、本発明によるトランスポゾンは、ヘアピンｄｓＤＮＡ（ｈａｉｒｐｉｎ ｄｓＤＮＡ）でありうる。前記ヘアピン構造は、一本鎖のＤＮＡ内で塩基対間の結合が形成された構造であり、一本鎖内の２つの領域が互いに逆相補的であるときに発生する。ヘアピンｄｓＤＮＡ形態のトランスポゾンは、末端が切断された状態でなく、ループ構造を取っているので、線状化ｄｓＤＮＡに比べて安定している。ヘアピンｄｓＤＮＡ形態のトランスポゾンは、環状プラスミドを制限酵素で切断して線状化した後、線状化ｄｓＤＮＡ分子の両末端をヘアピン形態（例えば、ｌｉｎｅａｒ ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ ｃｌｏｓｅｄ（ＬＣＣ）ＤＮＡ ｍｉｎｉｖｅｃｔｏｒ、ｍｉｎｉｍａｌｉｓｔｉｃ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ ｄｅｆｉｎｅｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ（ＭＩＤＧＥ）、ｍｉｃｒｏ－ｌｉｎｅａｒ ｖｅｃｔｏｒ（ＭｉＬＶ））で作って製造することができる。プラスミドあるいは線状化プラスミドの両末端をヘアピン形態で製造する方法は、当業界において一般的に知られており、具体的には、［Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ．２０２０ Ｊａｎ １６；１７：３５９－３６８］等の論文を参照することができる。

また、本発明によるトランスポゾンベクターは、サイズが１，０００～２０，０００ｂｐであってもよいが、これに限定されない。本発明者らは、具体的な実施例を通じて本発明によるトランスポゾンベクターの遺伝子伝達機能に優れていることを確認し、特にトランスポゾンベクターのサイズが小さいほど遺伝子伝達効率がさらに高くなることを確認した。したがって、前記トランスポゾンベクターは、サイズが１，０００～２０，０００ｂｐ、１，０００～１５，０００ｂｐ、１，０００～１３，０００ｂｐ、１，０００～１０，０００ｂｐ、１，０００～９，０００ｂｐ、１，０００～８，０００ｂｐ、１，０００～７，０００ｂｐ、１，０００～６，０００ｂｐ、１，０００～５，０００ｂｐ、１，０００～４，０００ｂｐ、または１，０００～３，０００ｂｐであってもよいが、これに限らない。

また、本発明は、ａ）標的ＤＮＡが挿入された本発明のトランスポゾンベクター；および
ｂ）トランスポザーゼタンパク質またはトランスポザーゼをコード化する配列を含む核酸分子を含む、標的ＤＮＡ伝達用トランスポゾンシステムを提供する。

本発明において、「トランスポザーゼ（ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ）」は、トランスポゾンの両末端（特に、逆方向末端反復）を認識して結合した後、当該部分を切断して両末端の間の遺伝子切片（すなわち、標的ＤＮＡを含む部位）を染色体内の他の位置に移動および挿入させる酵素を指す。本発明においてトランスポザーゼは、本発明によるトランスポゾンの５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲに結合および切断し、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲの間に存在する標的ＤＮＡをターゲット細胞の染色体内に挿入（または統合）させることができれば十分であり、具体的な種類に限定されない。例えば、本発明においてトランスポザーゼは、天然トランスポザーゼはもちろん、人工的に製造された組換えトランスポザーゼも制限なく含む。本発明の一具現例において、前記トランスポザーゼは、ｐＢａｔ ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅでありうる。

本発明において、前記トランスポザーゼは、タンパク質自体が細胞内に導入され得、あるいは前記トランスポザーゼタンパク質をコード化する配列を含む核酸分子（ＤＮＡまたはＲＮＡ分子）の形態で細胞内に導入された後、細胞内で発現することができる。

本発明の一具現例において、前記トランスポザーゼをコード化する配列を含む核酸分子は、以下の中から選択され得る：
ｉ）配列番号１８で表されるアミノ酸配列を含むトランスポザーゼタンパク質；
ｉｉ）配列番号１９の核酸配列を含むベクター（「トランスポザーゼベクター」あるいは「トランスポザーゼプラスミド」）、および
ｉｉｉ）配列番号２０の核酸配列を含むｍＲＮＡ分子。
すなわち、前記トランスポザーゼベクターは、配列番号１９で表される核酸配列を有することができるが、これに限らず、例えば、ＴｈｙＰＬＧＭＨ、ｍｙｃＰＢａｓｅ、ＴＰＬＧＭＨ、またはＨＡｈｙＰＢａｓｅの配列を含むこともできる。

トランスポザーゼベクターは、当業界に一般的に知られている通常の方法により製作され得、例えば、Ｙａａ－Ｊｙｕｈｎ Ｊａｍｅｓ Ｍｅｉｒ等（Ａ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ，ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ，ａｎｄ ｐｏｔｅｎｔｉａｌｌｙ ｓａｆｅｒ ｐｉｇｇｙＢａｃ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｇｅｎｏｍｅ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ，ＦＡＳＥＢ、２０１３：２７，４４２９－４４４３）に記述された方法によることができるが、これに限らない。

トランスポザーゼベクターは、トランスポザーゼをコード化する核酸配列に作動可能に連結されたプロモーターを含んでもよい。

前記プロモーターは、例えば、サイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶ）、ラウス肉腫ウイルスプロモーター（ＲＳＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、マウス乳がんウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、チキンβ－アクチン（ＣＡＧ）プロモーター、延長因子１－アルファ（ＥＦ１－α）プロモーター、ヒトＨ１プロモーター、およびＵ６プロモーターから選択されるが、これに限らない。

なお、特定の配列番号で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドは、当該アミノ酸配列にのみ制限されず、前記アミノ酸配列の変異体が本発明の範囲内に含まれる。本発明の特定の配列番号で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド分子とは、これを構成するポリペプチド分子の作用性等価物、例えば、ポリペプチド分子の一部のアミノ酸配列が欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）、置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）または挿入（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）により改変されたが、当該ポリペプチドと機能的に同じ作用ができる変異体（ｖａｒｉａｎｔｓ）を含む概念である。具体的には、本発明に開示されたポリペプチドは、特定の配列番号で表されるアミノ酸配列とそれぞれ７０％以上、より好ましくは、８０％以上、より一層好ましくは、９０％以上、最も好ましくは、９５％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。例えば、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の配列相同性を有するポリペプチドを含む。ポリペプチドに対する「配列相同性の％」は、２つの最適に配列された配列と比較領域を比較することによって確認され、比較領域におけるポリペプチド配列の一部は、２つの配列の最適配列に対する参考配列（追加または削除を含まない）に比べて追加または削除（すなわち、ギャップ）を含んでもよい。

また、本発明は、前記標的ＤＮＡ伝達トランスポゾンシステムおよび指示書を含む標的ＤＮＡ伝達トランスポゾンキットを提供する。

前記指示書には、本願のトランスポゾンシステムをどのように使用するかを伝達または知らせるために使用できるパンフレット、録画（ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ）、ダイヤグラム、または他の表現媒体（例えば、ＣＤ、ＶＣＤ、ＤＶＤ、ＵＳＢ）を含む。前記指示書は、容器に取り付けられてもよく、または本願のトランスポゾンシステムを含む容器とは独立して包装されてもよい。

前記キットには、さらに、本願のトランスポゾンシステムを含むための容器（ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）が含まれ得る。

また、前記キットには、さらに、トランスポゾンシステムを安定化し／安定化するか、細胞形質感染を行うための緩衝溶液（ｂｕｆｆｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）をさらに含んでもよい。緩衝溶液は、例えば、リン酸緩衝食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）、トリス系食塩水（Ｔｒｉｓ－ｂａｓｅｄ ｓａｌｉｎｅ）、トリス－ＥＤＴＡバッファー（Ｔｒｉｓ－ＥＤＴＡ ｂｕｆｆｅｒ）、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）バッファー、または（Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）－２－アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）バッファーであってもよいが、これに限らない。

また、本発明は、ａ）標的ＤＮＡが挿入されたトランスポゾンベクター；および
ｂ）トランスポザーゼタンパク質またはトランスポザーゼをコード化する配列を含む核酸分子が導入された細胞を提供する。

本発明において、前記細胞は、細胞内で前記トランスポザーゼによって前記トランスポゾンベクターから前記標的ＤＮＡが切除され、切除された前記標的ＤＮＡが前記細胞のゲノム内に統合されたものであってもよい。すなわち、前記標的ＤＮＡは、本発明のトランスポゾンおよびトランスポザーゼによってターゲット細胞のゲノム内に挿入され、安定的に発現することができる。細胞のゲノム内に挿入された標的ＤＮＡは、前記トランスポゾンベクターおよびトランスポザーゼが細胞内に導入された後、前記細胞で５日以上、７日以上、１０日以上、１５日以上、２０日以上、または３０日以上発現することができるが、これに限定されるものではない。

すなわち、本発明は、前記トランスポゾンによって標的ＤＮＡがゲノム内に挿入され、遺伝子操作された細胞を提供する。本発明において、「操作」とは、細胞に検出可能な変化を招く細胞の任意の操作を指し、ここで、操作は、細胞に異種／同種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ／ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドを挿入することおよび細胞に固有なポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドを突然変異させることを含むが、これに限定されるものではない。

本発明の一具現例において、前記細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞（ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ）、単核球、マクロファージ、好酸球、肥満細胞、好塩球、および顆粒球のような骨髄細胞、および樹状細胞からなる群から選択される１つ以上の免疫細胞であるか；または骨髄、脂肪組織、末梢血液、臍帯血、または歯髄（ｄｅｎｔａｌ ｐｕｌｐ）に由来した幹細胞であってもよいが、これに限らない。また、前記細胞は、昆虫由来細胞、植物由来細胞、魚類由来細胞、または哺乳類由来細胞、特にヒト由来細胞であってもよいが、これに限らない。

本願において使用された用語、「免疫細胞」は、免疫反応で役割をする細胞を総称する。

また、前記細胞は、前記トランスポゾンベクターおよびトランスポザーゼ（タンパク質または核酸分子）が導入された後、支持細胞（ｆｅｅｄｅｒ ｃｅｌｌｓ）と共培養されたものであってもよい。前記支持細胞は、自分は増殖せず、標的ＤＮＡが導入された細胞が増殖することができるように成長因子等を含む細胞外分泌物を提供する補助細胞を指す。前記支持細胞は、具体的な種類に限定されず、当業界に支持細胞の役割をすることが知られた細胞であれば、制限なく適用することができる。非制限的な例示としては、線維芽細胞、ヒト骨髄由来間葉系細胞、ヒト羊膜上皮細胞、脂肪由来間葉系幹細胞、黒色腫細胞（Ａ３７５細胞）等が挙げられる。好ましくは、前記支持細胞は、前記標的ＤＮＡが導入された細胞と共培養される前にあらかじめ放射線が照射されたものであってもよい。

前記支持細胞との共培養は、特に本発明によるトランスポゾンシステムを用いて免疫細胞にＣＡＲまたはＴＣＲ等を導入するに際して、遺伝子伝達効率を増進させ、前記遺伝子が導入された細胞の増殖および前記遺伝子の発現率を増進させるのに寄与することができる。前記遺伝子が導入された細胞の活性化方法は、支持細胞の共培養に限定されず、ターゲット細胞の種類によって適切な細胞活性化方法が制限なく使用できる。例えば、前記細胞がＴ細胞である場合、ＴｒａｎｓａｃｔあるいはＤｙｎａｂｅａｄ等を用いて活性化することができる。

前記支持細胞との共培養は、トランスポゾンベクターおよびトランスポザーゼがｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ等を用いて細胞内に導入された直後に行われることが好ましいが、これに限定されるものではなく、前記導入後１日～１０日以内、１日～５日以内、１日～３日以内、１日～２日以内、１日以内、２０時間以内、１０時間以内、５時間以内、３時間以内、１時間以内、３０分以内、あるいは１０分以内に行われ得る。

また、本発明は、ａ）標的ＤＮＡが挿入されたトランスポゾンベクター；および
ｂ）トランスポザーゼタンパク質またはトランスポザーゼをコード化する配列を含む核酸分子を細胞に導入する段階を含む、標的ＤＮＡ配列を細胞のゲノム内に挿入する方法を提供する。

また、前記方法は、前記導入段階後、前記トランスポゾンベクターが挿入された前記細胞を支持細胞と共培養する段階をさらに含んでもよい。

本願において使用された用語、「導入」は、細胞または有機体へのポリヌクレオチド（例えば、トランスポゾンベクターまたはトランスポザーゼベクター）の導入（伝達）を指す。 ポリヌクレオチドの核酸は、ネイキッドＤＮＡ（ｎａｋｅｄ ＤＮＡ）またはＲＮＡの形態であるか、様々なタンパク質と結合したり、またはベクターに統合してもよい。本願に使用された用語「導入」は、可能な限り、最も広い意味を伝達し、例えば、形質感染方法（ポリヌクレオチドを物理的および／または化学的処理によって真核細胞に導入させる方法）、形質転換方法（ポリヌクレオチドを物理的および／または化学的処理によって原核細胞に導入させる方法）、ウイルス方法／ウイルス形質導入方法（ポリヌクレオチドをウイルスまたはウイルスベクターによって真核および／または原核細胞に導入させる方法）、接合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）方法（ポリヌクレオチドを１つの細胞から他の細胞に直接細胞対細胞接触によって、または細胞間の細胞質橋（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｂｒｉｄｇｅ）により導入する方法）、および融合方法（同型（ｈｏｍｏｔｙｐｉｃ）細胞融合および異型（ｈｅｔｅｒｏｔｙｐｉｃ）細胞融合を含む２個の細胞を融合する方法）による導入を含む。好ましくは、前記導入は、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）を通じて行われる。

また、本発明は、本発明によるトランスポゾンベクターによって標的ＤＮＡがゲノム内に挿入された細胞を有効成分として含む様々な用途の組成物を提供する。この際、前記細胞は、自己由来または同種由来細胞でありうる。

本発明の一具現例において、本発明の細胞を有効成分として含む免疫関連疾患の予防または治療用薬学組成物を提供する。

本願において使用された用語「免疫関連疾患」は、免疫体系が疾患の発症機序（ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ）に関連したり、免疫体系の適切な刺激または抑制が疾患からの治療および／または予防をもたらすことができる疾患および／または状態を指す。本願発明によって治療され得る例示的な免疫関連疾患は、腫瘍、感染性疾患、アレルギー、自己免疫疾患、移植片対宿主病（ｇｒａｆｔ－ｖｅｒｓｕｓ－ｈｏｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ）、または炎症性疾患を含むが、これに限定されるものではない。

本発明者らは、具体的な実施例を通じて本発明のトランスポゾンを用いて製作したＣＡＲ Ｔ細胞が抗原に反応して細胞毒性Ｔ細胞およびｍｅｍｏｒｙ Ｔ細胞等に分化することを確認した。したがって、当業者は、本発明のトランスポゾンを用いて適切な抗原特異的ＣＡＲあるいはＴＣＲ遺伝子を免疫細胞内に伝達することによって、免疫機能がさらに活性化した遺伝子操作細胞を製作することができ、これを用いて免疫関連疾患を予防あるいは治療することができる。

例えば、当業者は、本発明によるトランスポゾンに目的抗原をコードする遺伝子を挿入した後、これを免疫細胞に伝達し、当該抗原に対する細胞の免疫機能を増進させることができる。免疫機能を増進させるというのは、例えば、当該抗原に対する抗原提示細胞、ナチュラルキラー細胞、Ｔ細胞（特に、細胞毒性Ｔ細胞）等の機能を活性化させること、または制御性Ｔ細胞、ＭＤＳＣｓ（ｍｙｅｌｏｉｄ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｃｅｌｌｓ）、またはＭ２マクロファージ等の活性を調節することを意味し得るが、これに限定されるものではない。

特に、本発明は、ａ）標的ＤＮＡが挿入されたトランスポゾンベクター；および
ｂ）トランスポザーゼタンパク質またはトランスポザーゼをコード化する配列を含む核酸分子が導入された免疫細胞を有効成分として含む、がんの予防または治療用薬学的組成物であって、
前記標的ＤＮＡは、腫瘍抗原特異的ＣＡＲコーディング配列またはその断片、腫瘍ウイルス特異的中和抗体コーディング配列またはその断片、免疫チェックポイント阻害剤コーディング配列、および腫瘍抗原特異的ＴＣＲコーディング配列または断片からなる群から選択された１つ以上であることを特徴とする、がんの予防または治療用薬学的組成物を提供する。

本発明において、前記免疫細胞は、染色体内に腫瘍抗原特異的ＣＡＲ、腫瘍抗原特異的ＴＣＲ、またはこれらの機能性断片が挿入され、細胞表面に腫瘍抗原特異的ＣＡＲまたはＴＣＲを発現し、したがって、腫瘍抗原に反応することができる。

腫瘍抗原に関する具体的な説明は、上述した通りである。

前記腫瘍ウイルス（ｏｎｃｏｖｉｒｕｓ）は、がんを起こすウイルスを指し、腫瘍ウイルス抗原は、当該腫瘍ウイルスが特異的に生成するタンパク質、外皮ウイルス、毒素等を指す。腫瘍ウイルス抗原は、例えば、Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ（ＣＭＶ）ａｎｔｉｇｅｎ、Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ（ＥＢＶ）ａｎｔｉｇｅｎ、ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａ ｖｉｒｕｓ（ＨＰＶ）ａｎｔｉｇｅｎ、ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ（ＨＢＶ）ａｎｔｉｇｅｎ、ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ（ＨＣＶ）ａｎｔｉｇｅｎ、Ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ（ＨＩＶ）ａｎｔｉｇｅｎ、ｈｕｍａｎ ｈｅｒｐｅｓ ｖｉｒｕｓ－８（ＨＨＶ－８）ａｎｔｉｇｅｎ、およびｈｕｍａｎ Ｔ－ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｈｉｃ ｖｉｒｕｓ（ＨＴＬＶ－１）ａｎｔｉｇｅｎ等があるが、これに限定されるものではなく、がんを誘発するウイルス特異抗原であれば、制限なく含まれ得る。

前記新抗原（ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ）は、がん細胞にのみ特異的に現れる抗原ペプチドを指す。新抗原は、正常細胞では発現せず、がん細胞にのみ発現し、これを吸収した抗原提示細胞の表面に提示されると、Ｔ細胞受容体と結合して免疫反応を誘導することができる。新抗原は、共有新抗原（ｓｈａｒｅｄ ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ）および個人特異的新抗原（ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ）を全部含む。共有新抗原は、共有発生頻度の高い新抗原であり、２人以上の患者に共通して現れる新抗原を指す。個人特異的新抗原は、特定の患者にのみ特異的に現れる新抗原であり、これを標的として患者特異的オーダーメード治療が可能である。

前記免疫チェックポイント阻害剤（ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）は、免疫細胞あるいはがん細胞に発現する免疫チェックポイントを阻害できるものであれば、制限なく含まれ得る。すなわち、前記免疫チェックポイントは、免疫チェックポイントをターゲットとする抗体であってもよく、具体的な例としては、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＰＤ－１抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗ＴＩＭ３抗体、抗ＢＴＬＡ抗体、抗４－１ＢＢ抗体、抗ＯＸ４０抗体、またはこれらの機能性断片が挙げられる、これに限定されるものではない。

前記免疫細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、マクロファージ等から選択され得、好ましくは、Ｔ細胞でありうる。

本発明において「がん（ｃａｎｃｅｒ）」は、固形がんおよび血液がんを全部含む。本発明の一具現例において、前記がんは、乳がん、大腸がん、肺がん、頭頸部がん、小細胞肺がん、胃がん、肝がん、血液がん、骨がん、膵がん、皮膚がん、頭部がん、頸部がん、皮膚黒色腫、眼内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門がん、結腸がん、卵管がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、膣がん、陰門がん、ホジキン病、食道がん、小腸がん、内分泌腺がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、前立腺がん、慢性または急性白血病、リンパ球リンパ腫、膀胱がん、腎臓がん、尿管がん、腎細胞がん、腎盂がん、ＣＮＳ腫瘍、原発性ＣＮＳリンパ腫、脊髄腫瘍、脳幹神経膠腫、および下垂体腺腫からなる群から選択された１つ以上であってもよいが、これに限定されない。

本発明において、前記腫瘍抗原特異的ＣＡＲまたはＴＣＲは、治療しようとするがんに特に過発現したり、当該がんにのみ特異的に発現する共通腫瘍抗原（ｓｈａｒｅｄ ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ）、あるいは当該がんにのみ発生する体細胞突然変異（ｓｏｍａｔｉｃ ｍｕｔａｔｉｏｎ）により発現する新抗原（ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ）に対するＣＡＲまたはＴＣＲでありうる。すなわち、前記腫瘍抗原は、がん細胞特異的に発現したり、がん細胞に特に発現が高いものであれば、制限なく含まれ、具体的な種類に限定されるものではないが、ＣＤ１９、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＥＧＦＲ、ＴＡＧ７２、ＩＬ１３Ｒα２（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １３ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ－２ ｓｕｂｕｎｉｔ）、ＣＤ５２、ＣＤ３３、ＣＤ２０、ＴＳＬＰＲ、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＧＤ３、ＣＤ１７１、ＮＣＡＭ（Ｎｅｕｒａｌ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）、ＦＢＰ（Ｆｏｌａｔｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）、Ｌｅ（Ｙ）（Ｌｅｗｉｓ－Ｙ ａｎｔｉｇｅｎ）、ＰＳＣＡ（Ｐｒｏｓｔａｔｅ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ａｎｔｉｇｅｎ）、ＰＳＭＡ（Ｐｒｏｓｔａｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｎｔｉｇｅｎ）、ＣＥＡ（Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ）、ＨＥＲ２（Ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２）、Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ、ＣＤ４４ｖ６（Ｈｙａｌｕｒｏｎａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｖａｒｉａｎｔ ６）、Ｂ７－Ｈ３、Ｇｌｙｐｉｃａｎ－３、ＲＯＲ１（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｌｉｋｅ ｏｒｐｈａｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １）、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、ＦＯＬＲ１（ｆｏｌａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＷＴ１（Ｗｉｌｍ’ｓ ｔｕｍｏｒ ａｎｔｉｇｅｎ）、ＶＥＧＦＲ２（Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ２）、腫瘍ウイルス抗原、ＴＰ５３、ＫＲＡＳ、および新抗原（ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ）等から選択され得る。しかしながら、当業者は、治療しようとするがんの種類によって当業界に一般的に知られている適切な腫瘍抗原を選択して本発明に適用することができる。

本発明の組成物内の前記細胞の含有量は、疾患の症状、症状の進行程度、患者の状態等によって適切に調節可能であり、例えば、全体組成物の重量を基準として０．０００１～９９．９重量％、または０．００１～５０重量％であってもよいが、これに限定されるものではない。前記含有量の割合は、溶媒を除去した乾燥量を基準とした値である。

本発明による薬学的組成物は、薬学的組成物の製造に通常使用する適切な担体、賦形剤および希釈剤をさらに含んでもよい。前記賦形剤は、例えば、希釈剤、結合剤、崩解剤、滑沢剤、吸着剤、保湿剤、フィルムコーティング物質、および制御放出添加剤からなる群から選択された１つ以上でありうる。

本発明による薬学的組成物は、それぞれ通常の方法によって散剤、顆粒剤、徐放性顆粒剤、腸溶性顆粒剤、液剤、点眼剤、エリキシル剤、乳剤、懸濁液剤、酒精剤、トローチ剤、芳香水剤、リモナーデ剤、錠剤、徐放性錠剤、腸溶性錠剤、舌下錠、硬質カプセル剤、軟質カプセル剤、徐放性カプセル剤、腸溶性カプセル剤、丸剤、チンキ剤、軟エキス剤、乾燥エキス剤、流動エキス剤、注射剤、カプセル剤、灌流液、硬膏剤、ローション剤、パスタ剤、噴霧剤、吸入剤、パッチ剤、滅菌注射溶液、またはエアロゾルなどの外用剤などの形態に剤形化して使用でき、前記外用剤は、クリーム、ジェル、パッチ、噴霧剤、軟膏剤、硬膏剤、ローション剤、リニメント剤、パスタ剤またはカタプラズマ剤などの剤形を有することができる。

本発明による薬学的組成物に含まれ得る担体、賦形剤および希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、オリゴ糖、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アカシアガム、アルギネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾアート、プロピルヒドロキシベンゾアート、タルク、マグネシウムステアレートおよび鉱物油が挙げられる。

製剤化する場合には、通常使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を使用して調製される。

本発明による錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、トローチ剤の添加剤としてコーンスターチ、ジャガイモデンプン、小麦デンプン、乳糖、白糖、ブドウ糖、果糖、Ｄ－マンニトール、沈降炭酸カルシウム、合成ケイ酸アルミニウム、リン酸一水素カルシウム、硫酸カルシウム、塩化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、精製ラノリン、微結晶セルロース、デキストリン、アルギン酸ナトリウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カオリン、ヨウ素、コロイド状シリカゲル、ヒドロキシプロピルスターチ、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）１９２８、ＨＰＭＣ２２０８、ＨＰＭＣ２９０６、ＨＰＭＣ２９１０、プロピレングリコール、カゼイン、乳酸カルシウム、プリモジェルなど賦形剤；ゼラチン、アラビアガム、エタノール、寒天粉、酢酸フタル酸セルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ブドウ糖、精製水、カゼインナトリウム、グリセリン、ステアリン酸、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、微結晶セルロース、デキストリン、ヒドロキシセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ヒドロキシメチルセルロース、精製セラック、デンプン糊、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンなどの結合剤が使用でき、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、コーンスターチ、寒天粉、メチルセルロース、ベントナイト、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルセルロースナトリウム、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クエン酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、無水ケイ酸、 Ｌ－ヒドロキシプロピルセルロース、デキストラン、イオン交換樹脂、酢酸ポリビニル、ホルムアルデヒド処理カゼインおよびゼラチン、アルギン酸、アミロース、グア―ガム（Ｇｕａｒ ｇｕｍ）、重曹、ポリビニルピロリドン、リン酸カルシウム、ゲル化デンプン、アラビアガム、アミロベクチン、ペクチン、ポリリン酸ナトリウム、エチルセルロース、白糖、ケイ酸マグネシウムアルミニウム、Ｄ－ソルビトール液、硬質無水ケイ酸など崩解剤；ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、水素化植物油（Ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ ｖｅｇｅｔａｂｌｅ ｏｉｌ）、タルク、石松子、カオリン、ワセリン、ステアリン酸ナトリウム、カカオ脂、サリチル酸ナトリウム、サリチル酸マグネシウム、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）４０００、ＰＥＧ ６０００、流動パラフィン、水素添加大豆油（Ｌｕｂｒｉ ｗａｘ）、ステアリン酸アルミニウム、ステアリン酸亜鉛、ラウリル硫酸ナトリウム、酸化マグネシウム、マクロゴール（Ｍａｃｒｏｇｏｌ）、合成ケイ酸アルミニウム、無水ケイ酸、高級脂肪酸、高級アルコール、シリコーン油、パラフィン油、ポリエチレングリコール脂肪酸エーテル、デンプン、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、オレイン酸ナトリウム、ＤＬ－ロイシン、硬質無水ケイ酸などの滑沢剤；が使用できる。

本発明による液剤の添加剤としては、水、希塩酸、希硫酸、クエン酸ナトリウム、モノステアリン酸スクロース類、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル類（ツインエステル）、ポリオキシエチレンモノアルキルエテール類、ラノリンエーテル類、ラノリンエステル類、酢酸、塩酸、アンモニア水、炭酸アンモニウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、プロラミン、ポリビニルピロリドン、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどが使用できる。

本発明によるシロップ剤には、白糖の溶液、他の糖類あるいは甘味剤などが使用でき、必要に応じて芳香剤、着色剤、保存剤、安定剤、懸濁化剤、乳化剤、粘稠剤などが使用できる。

本発明による乳剤には、精製水が使用でき、必要に応じて乳化剤、保存剤、安定剤、芳香剤などが使用できる。

本発明による懸濁剤には、アカシア、トラガカンタ、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、微結晶セルロース、アルギン酸ナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ＨＰＭＣ１８２８、ＨＰＭＣ２９０６、ＨＰＭＣ２９１０などの懸濁化剤が使用でき、必要に応じて界面活性剤、保存剤、安定剤、着色剤、芳香剤が使用できる。

本発明による注射剤には、注射用蒸留水、０．９％塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、デキストロース注射液、デキストロース＋塩化ナトリウム注射液、ピイジー（ＰＥＧ）、乳酸リンゲル注射液、エタノール、プロピレングリコール、非揮発性油－ゴマ油、綿実油、落花生油、ダイズ油、とうもろこし油、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、安息香酸ベンゼンのような溶剤；安息香酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、ヨウ素、ウレタン、モノエチルアセトアミド、ブタゾリジン、プロピレングリコール、ツイン類、ニコチン酸アミド、ヘキサミン、ジメチルアセトアミドのような溶解補助剤；弱酸およびその塩（酢酸と酢酸ナトリウム）、弱塩基およびその塩（アンモニアおよび酢酸アンモニウム）、有機化合物、タンパク質、アルブミン、ペプトン、ガム類のような緩衝剤；塩化ナトリウムのような等張剤；重亜硫酸ナトリウム（ＮａＨＳＯ_３）二酸化炭素ガス、メタ重亜硫酸ナトリウム（Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_５）、亜硫酸ナトリウム（Ｎａ_２ＳＯ_３）、窒素ガス（Ｎ_２）、エチレンジアミンテトラ酢酸のような安定剤；ソジウムビサルファイト０．１％、ソジウムホルムアルデヒドスルホキシレート、チオウレア、エチレンジアミンテトラ酢酸ジナトリウム、アセトンソジウムビサルファイトのような硫酸化剤；ベンジルアルコール、クロロブタノール、塩酸プロカイン、ブドウ糖、グルコン酸カルシウムのような無痛化剤；ＣＭＣナトリウム、アルギン酸ナトリウム、ツイン８０、モノステアリン酸アルミニウムのような懸濁化剤を含んでもよい。

本発明による坐剤には、カカオ脂、ラノリン、ウィテプソル、ポリエチレングリコール、グリセロゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ステアリン酸とオレイン酸の混合物、スバナル（Ｓｕｂａｎａｌ）、綿実油、落花生油、ヤシ油、カカオバター＋コレステロール、レシチン、ラネットワックス、モノステアリン酸グリセロール、ツインまたはスパン、イムハウゼン（Ｉｍｈａｕｓｅｎ）、モノレン（モノステアリン酸プロピレングリコール）、グリセリン、アデプスソリダス（Ａｄｅｐｓ ｓｏｌｉｄｕｓ）、ブチラムテゴ－Ｇ（Ｂｕｙｔｙｒｕｍ Ｔｅｇｏ－Ｇ）、セベスファーマ１６（Ｃｅｂｅｓ Ｐｈａｒｍａ １６）、ヘキサライドベース９５、コトマー（Ｃｏｔｏｍａｒ）、ヒドロコテＳＰ、Ｓ－７０－ＸＸＡ、Ｓ－７０－ＸＸ７５（Ｓ－７０－ＸＸ９５）、ヒドロコテ（Ｈｙｄｒｏｋｏｔｅ）２５、ヒドロコテ７１１、イドロポスタル（Ｉｄｒｏｐｏｓｔａｌ）、マッサエストラリウム（Ｍａｓｓａ ｅｓｔｒａｒｉｕｍ、Ａ、ＡＳ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｉ、Ｔ）、マッサ－ＭＦ、マスポール、マスポール－１５、ネオスポスタル－Ｎ、パラマウント－Ｂ、スポシロ（ＯＳＩ、ＯＳＩＸ、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｈ、Ｌ）、坐剤基剤ＩＶタイプ（ＡＢ、Ｂ、Ａ、ＢＣ、ＢＢＧ、Ｅ、ＢＧＦ、Ｃ、Ｄ、２９９）、スポスタル（Ｎ、Ｅｓ）、ウェコビー（Ｗ、Ｒ、Ｓ、Ｍ、Ｆｓ）、テゲスタートリグリセライド基剤（ＴＧ－９５、ＭＡ、５７）のような基剤が使用できる。

経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は、前記抽出物に少なくとも１つ以上の賦形剤、例えば、デンプン、カルシウムカーボネート（ｃａｌｃｉｕｍ ｃａｒｂｏｎａｔｅ）、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）またはラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）、ゼラチンなどを混ぜて調製される。また、単純な賦形剤以外に、マグネシウムステアレート、タルクのような潤滑剤も使用される。

経口投与のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが該当するが、頻用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外に様々な賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれ得る。非経口投与のための製剤には、滅菌水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物油、エチルオレートのような注射可能なエステルなどが使用できる。

本発明による薬学的組成物は、薬学的に有効な量で投与する。本発明において、「薬学的に有効な量」は、医学的治療に適用可能な合理的なベネフィット／リスクの割合で疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効用量レベルは、患者疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物感受性、投与時間、投与経路および排出比率、治療期間、同時使用される薬物を含む要素およびその他医学分野によく知られた要素によって決定できる。

本発明による薬学的組成物は、個別治療剤として投与したり他の治療剤と併用して投与でき、従来の治療剤とは順次にまたは同時に投与でき、単一または多重投与できる。上記した要素を全部考慮して副作用なしに最小限の量で最大効果を得ることができる量を投与することが重要であり、これは、本発明の属する技術分野における通常の技術者によって容易に決定できる。

本発明の薬学的組成物は、個体に多様な経路で投与できる。投与のすべての方式は、予想され得るが、例えば、経口服用、皮下注射、腹腔投与、静脈注射、筋肉注射、脊髄の周囲空間（硬膜内）注射、舌下投与、頬粘膜投与、直腸内挿入、膣内挿入、眼球投与、耳投与、鼻腔投与、吸入、口または鼻を通した噴霧、皮膚投与、経皮投与などにより投与できる。

本発明の薬学的組成物は、治療する疾患、投与経路、患者の年齢、性別、体重および疾患の重症度などの様々な関連因子とともに、活性成分である薬物の種類によって決定される。具体的には、本発明による組成物の有効量は、患者の年齢、性別、体重によって変わることができ、一般的には、体重１ｋｇ当たり０．００１～１５０ｍｇ、好ましくは、０．０１～１００ｍｇを毎日または隔日投与したり１日に１～３回に分けて投与できる。しかし、投与経路、疾患の重症度、性別、体重、年齢などによって増減できるので、前記投与量がいかなる方法でも本発明の範囲を限定するものではない。

本発明において「個体」とは、疾患の治療を必要とする対象を意味し、より具体的には、ヒトまたは非ヒトである霊長類、マウス（ｍｏｕｓｅ）、ラット（ｒａｔ）、イヌ、ネコ、ウマ、およびウシなどの哺乳類を意味する。

本発明において「投与」とは、任意の適切な方法で個体に所定の本発明の組成物を提供することを意味する。

本発明において「予防」とは、目的とする疾患の発症を抑制したり遅延させるすべての行為を意味し、「治療」とは、本発明による薬学的組成物の投与により目的とする疾患とそれによる代謝異常症状が好転したり有益に変更されるすべての行為を意味し、「改善」とは、本発明による組成物の投与により目的とする疾患に関連したパラメーター、例えば症状の程度を減少させるすべての行為を意味する。

また、本発明は、ａ）標的ＤＮＡが挿入されたトランスポゾンベクター；および
ｂ）トランスポザーゼタンパク質またはトランスポザーゼをコード化する配列を含む核酸分子を含むトランスポゾンシステムを含む、がんの予防または治療用キットであって、
前記標的ＤＮＡは、腫瘍抗原特異的ＣＡＲ（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）コーディング配列またはその断片、腫瘍ウイルス特異的中和抗体コーディング配列またはその断片、免疫チェックポイント阻害剤コーディング配列、および腫瘍抗原特異的ＴＣＲ（Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）コーディング配列またはその断片からなる群から選択された１つ以上であることを特徴とする、がんの予防または治療用キットを提供する。

前記キットは、前記標的ＤＮＡを発現させるための免疫細胞をさらに含んでもよい。

また、前記キットは、本発明のトランスポゾンベクターまたは前記ベクターが導入された細胞に関する具体的な説明（特徴、製造方法、保管方法、投与方法等）が記載された指示書をさらに含んでもよい。

以下、本発明の理解を助けるために好適な実施例を提示する。しかしながら、下記の実施例は、本発明をより容易に理解するために提供されるものに過ぎず、下記実施例によって本発明の内容が限定されるのではない。

［実験方法］
実施例Ａ．ＩＴＲ探索および機能の確認
１．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ
Ｔｒａｎｓｐｏｓａｂｌｅ ｅｌｅｍｅｎｔ（ＴＥ ｏｒ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ）の場合、種間の変異が大きいので、Ｍｙｏｔｉｓ ｌｕｃｉｆｕｇｕｓ ７ｘ ａｓｓｅｍｂｌｙ（ｍｙｏＬｕｃ２）でＲｅｐｅａｔＭｏｄｅｌｅｒ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０．１を用いてｄｅ ｎｏｖｏ方式でｒｅｐｅａｔ ｆａｍｉｌｙを探索し、モデリングして、コウモリ種の特異的なｒｅｐｅａｔ ｌｉｂｒａｒｙを生成した。このように得られたｒｅｐｅａｔ ｌｉｂｒａｒｙとＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒにあるｍａｍｍａｌｉａ ｌｉｂｒａｒｙ情報を合わせた後、ｒｍｂｌａｓｔ ２．１０．０＋検索エンジンと共にＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒｓｉｏｎ ４．１．１を用いてｔｒａｎｓｐｏｓａｂｌｅ ｅｌｅｍｅｎｔｓに対してマスキングをし、マスキングしたＤＮＡ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎｓ配列を確保した。

確保した５’ＩＴＲと３’ＩＴＲで配列は、下記の通りである。
ａ．５’ＩＴＲ＿１５７（配列番号１）
５’－ｔｔａａｃａｃｔｔｇｇａｔｔｇｃｇｇｇａａａｃｇａｇｔｔａａｇｔｃｇｇｃｔｃｇｃｇｔｇａａｔｔｇｃｇｃｇｔａｃｔｃｃｇｃｇｇｇａｇｃｃｇｔｃｔｔａａｃｔｃｇｇｔｔｃａｔａｔａｇａｔｔｔｇｃｇｇｔｇｇａｇｔｇｃｇｇｇａａａｃｇｔｇｔａａａｃｔｃｇｇｇｃｃｇａｔｔｇｔａａｃｔｇｃｇｔａｔｔａｃｃａａａｔａｔｔｔｇｔｔ－３’
ｂ．３’ＩＴＲ＿２１２（配列番号２）
５’－ａａｔｔａｔｔｔａｔｇｔａｃｔｇａａｔａｇａｔａａａａａａａｔｇｔｃｔｇｔｇａｔｔｇａａｔａａａｔｔｔｔｃａｔｔｔｔｔｔａｃａｃａａｇａａａｃｃｇａａａａｔｔｔｃａｔｔｔｃａａｔｃｇａａｃｃｃａｔａｃｔｔｃａａａａｇａｔａｔａｇｇｃａｔｔｔｔａａａｃｔａａｃｔｃｔｇａｔｔｔｔｇｃｇｃｇｇｇａａａｃｃｔａａａｔａａｔｔｇｃｃｃｇｃｇｃｃａｔｃｔｔａｔａｔｔｔｔｇｇｃｇｇｇａａａｔｔｃａｃｃｃｇａｃａｃｃｇｔａｇｔｇｔｔａａ－３’

２．ｐＢａｔ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎベクター
Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓを通じて確保したＤＮＡ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎの５’ＩＴＲと３’ＩＴＲそれぞれをｐＣＡＧ－ＥＧＦＰ ｖｅｃｔｏｒ内にクローニングし、５’ＩＴＲは、ベクター内ｃｈｉｃｋｅｎ ｂｅｔａ－ａｃｔｉｎ ｐｒｏｍｏｔｅｒの前に、かつ３’ＩＴＲは、ＳＶ４０ ｐｏｌｙ（Ａ）ｓｉｇｎａｌの後に位置するように製作した（図１）。

３．遺伝子伝達（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）
Ｔ細胞株であるＪｕｒｋａｔ ｃｅｌｌをＰＢＳでｗａｓｈｉｎｇした後に、細胞１×１０^５当たりｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ ９０μＬで懸濁した。Ｎｅｏｎ ｔｕｂｅにｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｉｃ ｂｕｆｆｅｒ ３ｍＬを入れ、Ｎｅｏｎ ｐｉｐｅｔｔｅ ｓｔａｔｉｏｎに刺した。細胞にｐＣＡＧ－ＥＧＦＰ－ＩＴＲプラスミドＤＮＡとｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅプラスミドＤＮＡ（ここで、トランスポザーゼは、配列番号１９の核酸配列を有する）を細胞１×１０^５当たりそれぞれ１μｇを入れ、総ボリュームを細胞１×１０^５当たり１００μＬに合わせた。対照群としては、ＩＴＲを含まないｐＥＧＦＰプラスミドＤＮＡを使用した。Ｎｅｏｎ ｐｉｐｅｔｔｅで細胞１×１０^５を取って、１，６００Ｖ、１０ｍｓ、３ｐｕｌｓｅｓのｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎをし、２４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅの４００μＬ培地（ＲＰＭＩ、１０％ ＦＢＳ、Ｎｏ Ｐ／Ｓ）が入っているｗｅｌｌに細胞を入れた。３７℃、ＣＯ_２培養器で１日培養し、抗生剤が含まれた培地をｗｅｌｌ当たり５００μＬずつ追加した。Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ １日、７日、１４日後に細胞におけるＧＦＰ発現程度を蛍光顕微鏡とＦＡＣＳで確認した。

Ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ（配列番号１９）
ａｔｇｔｃｇｃａａｃａｃｔｃａｇａｔｔａｃｔｃｃｇａｃｇａｔｇａａｔｔｔｔｇｔｇｃｔｇａｃａａａｃｔｇｔｃｃａａｔｔａｔｔｃａｔｇｃｇａｔａｇｃｇａｃｃｔｃｇａａａａｃｇｃｔｔｃｃａｃｇｔｃｔｇａｔｇａａｇａｔａｇｃａｇｃｇａｔｇａｔｇａａｇｔａａｔｇｇｔｇａｇｇｃｃｔｃｇｃａｃｃｃｔｃｃｇｃｃｇｔｃｇｃｃｇｃａｔｃａｇｃｔｃｔｔｃｇａｇｃｔｃｔｇａｔｔｃｔｇａａｔｃｃｇａｔａｔｔｇａｇｇｇｔｇｇｃｃｇｃｇａｇｇａｇｔｇｇｔｃｃｃａｃｇｔａｇａｃａａｔｃｃｇｃｃｇｇｔｇｃｔｇｇａｇｇａｃｔｔｃｃｔａｇｇｃｃａｃｃａａｇｇｔｃｔｇａａｃａｃｔｇａｃｇｃａｇｔａａｔｃａａｃａａｔａｔｃｇａａｇａｔｇｃａｇｔｔａａａｃｔｇｔｔｔａｔｃｇｇｔｇａｃｇａｔｔｔｃｔｔｃｇａｇｔｔｔｃｔｇｇｔｇｇａｇｇａａｔｃｔａａｃｃｇｇｔａｃｔａｔａａｃｃａｇａａｔｃｇｔａａｔａａｃｔｔｃａａｇｃｔｃｔｃｔａａａａａｇｔｃｔｃｔｇａａｇｔｇｇａａｇｇａｃａｔｃａｃｃｃｃｔｃａｇｇａｇａｔｇａａａａａｇｔｔｃｃｔｃｇｇｔｃｔｇａｔｃｇｔｔｃｔｇａｔｇｇｇｃｃａａｇｔｔｃｇｃａａｇｇａｔｃｇｔｃｇｔｇａｃｇａｃｔａｔｔｇｇａｃｔａｃｃｇａａｃｃｇｔｇｇａｃｇｇａａａｃｔｃｃａｔａｃｔｔｔｇｇｃａａｇａｃｃａｔｇａｃｔｃｇｔｇａｃｃｇｔｔｔｃｃｇｔｃａｇａｔｃｔｇｇａａｇｇｃｃｔｇｇｃａｃｔｔｃａａｔａａｃａａｃｇｃｔｇａｃａｔｔｇｔｃａａｃｇａｇｔｃｔｇａｔｃｇｔｃｔｇｔｇｔａａｇｇｔｔｃｇｃｃｃｔｇｔｇｃｔｇｇａｔｔａｃｔｔｃｇｔｔｃｃａａａａｔｔｃａｔｔａａｃａｔｔｔａｃａａａｃｃａｃａｔｃａｇｃａｇｃｔｇｔｃｃｃｔｇｇａｔｇａｇｇｇｃａｔｃｇｔｇｃｃｇｔｇｇｃｇｃｇｇｃｃｇｃｃｔｇｔｔｃｔｔｃｃｇｔｇｔｃｔａｔａａｔｇｃｔｇｇｃａａｇａｔｔｇｔｇａａｇｔａｃｇｇｔａｔｃｃｔｇｇｔｔｃｇｃｃｔｇｃｔｇｔｇｃｇａａａｇｃｇａｃａｃｔｇｇｃｔａｃａｔｃｔｇｔａａｃａｔｇｇａｇａｔｃｔａｃｔｇｃｇｇｃｇａｇｇｇｃａａａｃｇｔｃｔｃｃｔｃｇａａａｃｔａｔｃｃａｇａｃｃｇｔｃｇｔｇｔｃｔｃｃａｔａｃａｃｇｇａｔｔｃｃｔｇｇｔａｔｃａｔａｔｔｔａｃａｔｇｇａｔａａｃｔａｔｔａｔａａｃａｇｃｇｔｇｇｃｔａａｃｔｇｔｇａａｇｃｔｃｔｇａｔｇａａａａａｔａａｇｔｔｃｃｇｔａｔｔｔｇｃｇｇｔａｃｔａｔｃｃｇｔａａｇａａｔｃｇｔｇｇａａｔｔｃｃｇａａａｇａｔｔｔｃｃａｇａｃｃａｔｃｔｃｃｃｔｇａａａａａｇｇｇｔｇａａａｃｔａａｇｔｔｃａｔｔｃｇｃａａａａａｃｇａｃａｔｃｃｔｃｃｔｇｃａａｇｔｃｔｇｇｃａｇｔｃｔａａａａａｇｃｃｔｇｔａｔａｔｃｔｇａｔｃｔｃａｔｃｔａｔｔｃａｃａｇｃｇｃｔｇａａａｔｇｇａａｇａａｔｃｔｃａｇａａｃａｔｔｇａｔｃｇｃａｃｃｔｃｃａａｇａａａａａｇａｔｃｇｔｃａａａｃｃｇａａｔｇｃａｔｔｇａｔｔｇａｔｔａｃａａｃａａｇｃａｃａｔｇａａｇｇｇｃｇｔｔｇａｔｃｇｔｇｃｔｇａｃｃａｇｔａｃｃｔｇｔｃｔｔａｔｔａｃｔｃｔａｔｃｃｔｇｃｇｃｃｇｔａｃｔｇｔｇａａｇｔｇｇａｃｔａａａｃｇｔｃｔｃｇｃｔａｔｇｔａｃａｔｇａｔｔａａｔｔｇｔｇｃｇｃｔｇｔｔｃａａｔｔｃｔｔａｃｇｃｔｇｔｇｔａｔａａａａｇｃｇｔｇｃｇｔｃａｇｃｇｃａａａａｔｇｇｇｃｔｔｔａａａａｔｇｔｔｃｃｔｇａａｇｃａｇａｃｇｇｃｔａｔｔｃａｃｔｇｇｃｔｇａｃｃｇａｃｇａｔａｔｔｃｃｇｇａａｇａｔａｔｇｇａｃａｔｔｇｔｃｃｃｇｇａｔｃｔｃｃａｇｃｃｇｇｔａｃｃｇａｇｃａｃｃａｇｃｇｇｔａｔｇｃｇｔｇｃｔａａａｃｃｔｃｃｇａｃｔａｇｔｇａｔｃｃｇｃｃｔｔｇｃｃｇｔｃｔｇｔｃｔａｔｇｇａｔａｔｇｃｇｔａａｇｃａｔａｃｃｃｔｇｃａｇｇｃａａｔｔｇｔｇｇｇｃｔｃｔｇｇｃａａａａａｇａａａａａｔａｔｃｃｔｇｃｇｔｃｇｔｔｇｃｃｇｃｇｔａｔｇｃｔｃｔｇｔａｃａｃａａａｃｔｇｃｇｔｔｃｔｇａｇａｃｔｃｇｔｔａｔａｔｇｔｇｔａａａｔｔｔｔｇｃａａｔａｔｔｃｃａｃｔｃｃａｃａａｇｇｇｔｇｃｇｔｇｃｔｔｃｇａｇａａｇｔａｃｃａｔａｃｇｃｔｇａａｇａａｃｔａｔ

Ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ ｍＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ（配列番号２０）
ａｕｇｕｃｇｃａａｃａｃｕｃａｇａｕｕａｃｕｃｃｇａｃｇａｕｇａａｕｕｕｕｇｕｇｃｕｇａｃａａａｃｕｇｕｃｃａａｕｕａｕｕｃａｕｇｃｇａｕａｇｃｇａｃｃｕｃｇａａａａｃｇｃｕｕｃｃａｃｇｕｃｕｇａｕｇａａｇａｕａｇｃａｇｃｇａｕｇａｕｇａａｇｕａａｕｇｇｕｇａｇｇｃｃｕｃｇｃａｃｃｃｕｃｃｇｃｃｇｕｃｇｃｃｇｃａｕｃａｇｃｕｃｕｕｃｇａｇｃｕｃｕｇａｕｕｃｕｇａａｕｃｃｇａｕａｕｕｇａｇｇｇｕｇｇｃｃｇｃｇａｇｇａｇｕｇｇｕｃｃｃａｃｇｕａｇａｃａａｕｃｃｇｃｃｇｇｕｇｃｕｇｇａｇｇａｃｕｕｃｃｕａｇｇｃｃａｃｃａａｇｇｕｃｕｇａａｃａｃｕｇａｃｇｃａｇｕａａｕｃａａｃａａｕａｕｃｇａａｇａｕｇｃａｇｕｕａａａｃｕｇｕｕｕａｕｃｇｇｕｇａｃｇａｕｕｕｃｕｕｃｇａｇｕｕｕｃｕｇｇｕｇｇａｇｇａａｕｃｕａａｃｃｇｇｕａｃｕａｕａａｃｃａｇａａｕｃｇｕａａｕａａｃｕｕｃａａｇｃｕｃｕｃｕａａａａａｇｕｃｕｃｕｇａａｇｕｇｇａａｇｇａｃａｕｃａｃｃｃｃｕｃａｇｇａｇａｕｇａａａａａｇｕｕｃｃｕｃｇｇｕｃｕｇａｕｃｇｕｕｃｕｇａｕｇｇｇｃｃａａｇｕｕｃｇｃａａｇｇａｕｃｇｕｃｇｕｇａｃｇａｃｕａｕｕｇｇａｃｕａｃｃｇａａｃｃｇｕｇｇａｃｇｇａａａｃｕｃｃａｕａｃｕｕｕｇｇｃａａｇａｃｃａｕｇａｃｕｃｇｕｇａｃｃｇｕｕｕｃｃｇｕｃａｇａｕｃｕｇｇａａｇｇｃｃｕｇｇｃａｃｕｕｃａａｕａａｃａａｃｇｃｕｇａｃａｕｕｇｕｃａａｃｇａｇｕｃｕｇａｕｃｇｕｃｕｇｕｇｕａａｇｇｕｕｃｇｃｃｃｕｇｕｇｃｕｇｇａｕｕａｃｕｕｃｇｕｕｃｃａａａａｕｕｃａｕｕａａｃａｕｕｕａｃａａａｃｃａｃａｕｃａｇｃａｇｃｕｇｕｃｃｃｕｇｇａｕｇａｇｇｇｃａｕｃｇｕｇｃｃｇｕｇｇｃｇｃｇｇｃｃｇｃｃｕｇｕｕｃｕｕｃｃｇｕｇｕｃｕａｕａａｕｇｃｕｇｇｃａａｇａｕｕｇｕｇａａｇｕａｃｇｇｕａｕｃｃｕｇｇｕｕｃｇｃｃｕｇｃｕｇｕｇｃｇａａａｇｃｇａｃａｃｕｇｇｃｕａｃａｕｃｕｇｕａａｃａｕｇｇａｇａｕｃｕａｃｕｇｃｇｇｃｇａｇｇｇｃａａａｃｇｕｃｕｃｃｕｃｇａａａｃｕａｕｃｃａｇａｃｃｇｕｃｇｕｇｕｃｕｃｃａｕａｃａｃｇｇａｕｕｃｃｕｇｇｕａｕｃａｕａｕｕｕａｃａｕｇｇａｕａａｃｕａｕｕａｕａａｃａｇｃｇｕｇｇｃｕａａｃｕｇｕｇａａｇｃｕｃｕｇａｕｇａａａａａｕａａｇｕｕｃｃｇｕａｕｕｕｇｃｇｇｕａｃｕａｕｃｃｇｕａａｇａａｕｃｇｕｇｇａａｕｕｃｃｇａａａｇａｕｕｕｃｃａｇａｃｃａｕｃｕｃｃｃｕｇａａａａａｇｇｇｕｇａａａｃｕａａｇｕｕｃａｕｕｃｇｃａａａａａｃｇａｃａｕｃｃｕｃｃｕｇｃａａｇｕｃｕｇｇｃａｇｕｃｕａａａａａｇｃｃｕｇｕａｕａｕｃｕｇａｕｃｕｃａｕｃｕａｕｕｃａｃａｇｃｇｃｕｇａａａｕｇｇａａｇａａｕｃｕｃａｇａａｃａｕｕｇａｕｃｇｃａｃｃｕｃｃａａｇａａａａａｇａｕｃｇｕｃａａａｃｃｇａａｕｇｃａｕｕｇａｕｕｇａｕｕａｃａａｃａａｇｃａｃａｕｇａａｇｇｇｃｇｕｕｇａｕｃｇｕｇｃｕｇａｃｃａｇｕａｃｃｕｇｕｃｕｕａｕｕａｃｕｃｕａｕｃｃｕｇｃｇｃｃｇｕａｃｕｇｕｇａａｇｕｇｇａｃｕａａａｃｇｕｃｕｃｇｃｕａｕｇｕａｃａｕｇａｕｕａａｕｕｇｕｇｃｇｃｕｇｕｕｃａａｕｕｃｕｕａｃｇｃｕｇｕｇｕａｕａａａａｇｃｇｕｇｃｇｕｃａｇｃｇｃａａａａｕｇｇｇｃｕｕｕａａａａｕｇｕｕｃｃｕｇａａｇｃａｇａｃｇｇｃｕａｕｕｃａｃｕｇｇｃｕｇａｃｃｇａｃｇａｕａｕｕｃｃｇｇａａｇａｕａｕｇｇａｃａｕｕｇｕｃｃｃｇｇａｕｃｕｃｃａｇｃｃｇｇｕａｃｃｇａｇｃａｃｃａｇｃｇｇｕａｕｇｃｇｕｇｃｕａａａｃｃｕｃｃｇａｃｕａｇｕｇａｕｃｃｇｃｃｕｕｇｃｃｇｕｃｕｇｕｃｕａｕｇｇａｕａｕｇｃｇｕａａｇｃａｕａｃｃｃｕｇｃａｇｇｃａａｕｕｇｕｇｇｇｃｕｃｕｇｇｃａａａａａｇａａａａａｕａｕｃｃｕｇｃｇｕｃｇｕｕｇｃｃｇｃｇｕａｕｇｃｕｃｕｇｕａｃａｃａａａｃｕｇｃｇｕｕｃｕｇａｇａｃｕｃｇｕｕａｕａｕｇｕｇｕａａａｕｕｕｕｇｃａａｕａｕｕｃｃａｃｕｃｃａｃａａｇｇｇｕｇｃｇｕｇｃｕｕｃｇａｇａａｇｕａｃｃａｕａｃｇｃｕｇａａｇａａｃｕａｕ

４．ＦＡＣＳ分析
Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎされた細胞をｗｅｌｌ別に１．５ｍＬチューブに移した。１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離後、上清を除去し、ＰＢＳ（２％ＦＢＳ）５００μＬでｗａｓｈｉｎｇした。２回さらにｗａｓｈｉｎｇを繰り返した後、ＰＢＳ（２％ＦＢＳ、１ｘＤＡＰＩ）で細胞を懸濁してＦＡＣＳ ｔｕｂｅに移し、ＦＡＣＳ分析をした。生細胞（ＤＡＰＩ ｎｅｇａｔｉｖｅ）のうちＧＦＰを発現する細胞の割合（％）をグループ別に比較した。

５．蛍光顕微鏡の確認
Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ蛍光顕微鏡を用いて１００倍の倍率でＧＦＰを発現する細胞を観察した。

６．Ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ
Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ７日後、ＧＦＰを発現する細胞をＢＤ社のＦＡＣＳＡｒｉａ（アリア）装備を用いてｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌにｓｏｒｔｉｎｇし、９６ｗｅｌｌプレートに１０％ＦＢＳが含まれたＲＰＭＩ培地を添加し、３７℃、５％ＣＯ_２培養器で培養した。そして、１０日後、細胞内でＧＦＰが発現するかを蛍光顕微鏡で観察し、ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ位置を確認するために、Ｓｐｌｉｎｋｅｒｅｔｔｅ ＰＣＲを行った。

７．Ｓｐｌｉｎｋｅｒｅｔｔｅ ＰＣＲ方法を用いた染色体内ＤＮＡ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ位置の確認
Ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌにｓｏｒｔｉｎｇされて培養された細胞を回収し、ＰＢＳでｗａｓｈｉｎｇした。細胞ペレットからｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ（ｇＤＮＡ）キットを用いてｇＤＮＡを抽出し、定量した。１００ｎｇのｇＤＮＡをＳａｕ３ＡＩ制限酵素を用いて３７℃で１時間ｄｉｇｅｓｔｉｏｎした。Ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄ ＤＮＡ ２個（ＧＡＴＣＣＣＡＣＴＡＧＴＧＴＣＧＡＣＡＣＣＡＧＴＣＴＣＴＡＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＡＡＡＡＡＡＡ、ＣＧＡＡＧＡＧＴＡＡＣＣＧＴＴＧＣＴＡＧＧＡＧＡＧＡＣＣＧＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＡＧＡＣＴＧＧＴＧＴＣＧＡＣＡＣＴＡＧＴＧＧ、それぞれ配列番号２１および２２）をａｎｎｅａｌｉｎｇし（９５℃で３分間放置した後、常温まで温度を下げる）、Ｓａｕ３ＡＩ ａｄａｐｔｏｒを作った。Ｓａｕ３ＡＩでｄｉｇｅｓｔｉｏｎされたｇＤＮＡ ２０ｎｇとａｎｎｅａｌｉｎｇされたＳａｕ３ＡＩ ａｄａｐｔｏｒを１６℃で８時間反応させた後、１ｓｔ ＰＣＲ（９８℃２０秒、５５℃１５秒、７２℃２分、２９ ｃｙｃｌｅ）と２ｎｄ ＰＣＲ（９８℃２０秒、５５℃１５秒、７２℃２分、２９ ｃｙｃｌｅ）を行った。電気泳動で確認した後、シーケンシングを進めた。

１ｓｔ ＰＣＲプライマー：
５’１ｓｔ Ｆ －ＣＧＡＡＧＡＧＴＡＡＣＣＧＴＴＧＣＴＡＧＧＡＧＡＧＡＣＣ（配列番号２３）、５’１ｓｔ Ｒ－ＣＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＣＣＡＡ（配列番号２４）、３’１ｓｔ Ｆ－ＣＡＴＴＡＣＣＣＴＧＴＴＡＴＣＣＣＴＡＧＣＴＡＧＣＡ（配列番号２５）、３’１ｓｔ Ｒ－ＣＧＡＡＧＡＧＴＡＡＣＣＧＴＴＧＣＴＡＧＧＡＧＡＧＡＣＣ（配列番号２６）。

２ｎｄ ＰＣＲプライマー：
５’２ｎｄ Ｆ－ＧＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＡＧＡＣＴＧＧＴＧＴＣＧＡＣ（配列番号２７）、５’２ｎｄ Ｒ－ＧＧＴＣＡＴＡＧＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧＣＴ（配列番号２８）、３’２ｎｄ Ｆ－ＣＡＴＴＴＣＡＡＴＣＧＡＡＣＣＣＡＴＡＣＴＴＣＡＡＡＡ（配列番号２９）、３’２ｎｄ Ｒ－ＧＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＡＧＡＣＴＧＧＴＧＴＣＧＡＣ（配列番号３０）。

実施例Ｂ．ＩＴＲ ｍｕｔａｎｔの製作および機能の確認
１．細胞およびベクター
後述するように、ｐＢａｔトランスポゾンｍｕｔａｎｔ ｆｏｒｍプラスミドを製作して実験に使用し、遺伝子伝達効率を確認するための細胞としてＪｕｋａｔ ｃｅｌｌｓ（ＡＴＣＣ、Ｃａｔ ｎｏ．ＴＩＢ－１５２、Ｌｏｔ ｎｏ．７００１７５６０）を使用した。

２．ＩＴＲ ｍｕｔａｎｔ ｆｏｒｍの製作
ＩＴＲ ｍｕｔａｎｔの製作のためにｏｒｉｇｉｎａｌトランスポゾンプラスミドベクターの５’ＩＴＲの前にＢａｍＨＩサイトを挿入し、３’ＩＴＲの後にＳａｌＩサイトを挿入して、ｂａｃｋｂｏｎｅトランスポゾンプラスミドベクター（ｐｌａｓｍｉｄ ｖｅｃｔｏｒ）を製作した。

５’ＩＴＲ ｍｕｔａｎｔプラスミドベクターは、ｂａｃｋｂｏｎｅトランスポゾンプラスミドベクターをＢａｍＨＩとＥｃｏＲＶ制限酵素で切って５’ＩＴＲ ｍｕｔａｎｔを挿入して製作した。

３’ＩＴＲ ｍｕｔａｎｔプラスミドベクターは、ｂａｃｋｂｏｎｅトランスポゾンプラスミドベクターをＢｍｔＩとＳａｌＩ制限酵素で切って３’ＩＴＲ ｍｕｔａｎｔを挿入して製作した。

３．クローニング
５’ＩＴＲと３’ＩＴＲのｍｕｔａｎｔを製作するためにｐＣＡＧ－ＧＦＰ－ＩＴＲベクターにおいて５’ＩＴＲの前にＢａｍＨＩ ｓｉｔｅを追加し、３’ＩＴＲの後にＳａｌＩ ｓｉｔｅを追加した。５’ＩＴＲの場合、ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎベクターとｐＵＣ５７－５’ＩＴＲ ｍｕｔａｎｔベクターそれぞれにＢａｍＨＩとＥｃｏＲＶを入れ、３７℃で２時間、５０℃で２時間反応させてｄｉｇｅｓｔｉｏｎした。３’ＩＴＲの場合は、ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎベクターとｐＵＣ５７－３’ＩＴＲ ｍｕｔａｎｔベクターそれぞれにＢｍｔＩとＳａｌＩを入れ、３７℃で２時間反応させてｄｉｇｅｓｔｉｏｎした。Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ後、ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎし、Ｔ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅを用いてｌｉｇａｔｉｏｎし、ＤＨ５αにｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎさせて、ＬＢ ｐｌａｔｅ（Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎを含む）にｓｐｒｅａｄｉｎｇした。形成されたコロニーをＬＢ ｂｒｏｔｈ（Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎを含む）に成長させて、ｍｉｎｉ－ｐｒｅｐでｐｌａｓｍｉｄを得、シーケンシングをし、シーケンスを確認した。シーケンスが確認されたｍｕｔａｎｔベクターは、ｍｉｄｉ－ｐｒｅｐをし、ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎするＤＮＡを準備した。

４．Ｎｅｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）
Ｔ細胞株であるＪｕｒｋａｔ ｃｅｌｌをＰＢＳでｗａｓｈｉｎｇした後に、細胞１×１０^５当たりｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ ９０μＬで懸濁した。Ｎｅｏｎ ｔｕｂｅにｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｉｃ ｂｕｆｆｅｒ ３ｍＬを入れ、Ｎｅｏｎ ｐｉｐｅｔｔｅ ｓｔａｔｉｏｎに刺した。細胞にｍｕｔａｎｔ ＤＮＡとｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ ＤＮＡを細胞１×１０^５当たりそれぞれ１μｇを入れ、総ボリュームを細胞１×１０^５当たり１００μＬに合わせた。Ｎｅｏｎ ｐｉｐｅｔｔｅで細胞１×１０^５を取って、１，６００Ｖ、１０ｍｓ、３ｐｕｌｓｅｓのｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎをし、２４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅの４００μＬ培地（ＲＰＭＩ、１０％ＦＢＳ、Ｎｏ Ｐ／Ｓ）が入っているｗｅｌｌに細胞を入れた。３７℃、ＣＯ_２培養器で１日培養し、抗生剤が含まれた培地をｗｅｌｌ当たり５００μＬずつ追加した。Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ １日、７日、１４日後に細胞におけるＧＦＰ発現程度を蛍光顕微鏡とＦＡＣＳで確認した。

５．ＦＡＣＳ
Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎされた細胞をｗｅｌｌ別に１．５ｍＬチューブに移した。１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離後、上清を除去し、ＰＢＳ（２％ＦＢＳ）５００μＬでｗａｓｈｉｎｇした。２回さらにｗａｓｈｉｎｇを繰り返した後、ＰＢＳ（２％ＦＢＳ、１ｘＤＡＰＩ）で細胞を懸濁してＦＡＣＳ ｔｕｂｅに移し、ＦＡＣＳ分析をした。生細胞（ＤＡＰＩ ｎｅｇａｔｉｖｅ）のうちＧＦＰを発現する細胞の割合（％）をグループ別に比較した。

６．蛍光顕微鏡
Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ蛍光顕微鏡を用いて１００倍の倍率でＧＦＰを発現する細胞を観察した。

７．Ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇおよび培養
Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ １４日後、ＧＦＰを発現するＪｕｒｋａｔ ｃｅｌｌをｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇした。各ｗｅｌｌ別に細胞をｃｏｎｉｃａｌ ｔｕｂｅに移し、１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離して上清を除去した後、ｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（ＰＢＳ＋２％ＦＢＳ）で細胞ペレットを懸濁して洗浄し、ｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを用いて２回さらに細胞を洗浄した。次に、１ｘＤＡＰＩが含まれているｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ ２００μＬを各ｗｅｌｌに入れて細胞を懸濁し、ＦＡＣＳ ｆｉｌｔｅｒ ｔｕｂｅに移した。そして、１ｘＤＡＰＩが入っているｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ １ｍＬを追加した。９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅの各ｗｅｌｌに完全培地１００μＬを入れ、ｗｅｌｌ当たりｃｅｌｌを１個ずつｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇをした。Ｓｏｒｔｉｎｇしたｐｌａｔｅは、３７℃およびＣＯ_２培養器に培養した。３日後に、各ｗｅｌｌに完全培地を１００μＬを追加し、２～３日間隔で完全培地１００μＬずつ各ｗｅｌｌを交替して培養した。９６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅでｃｅｌｌが成長すると、２４ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに移し、各ｗｅｌｌに完全培地で体積を５００μＬになるように合わせた。２～３日後に、２４ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅの各ｗｅｌｌに完全培地５００μＬを追加し、２～３日後に、各ｗｅｌｌに完全培地１ｍＬを追加し、合計２ｍＬに作った。２～３日間隔で完全培地１ｍＬを交替しながら培養した。

実施例Ｃ．ＩＴＲ ｍｕｔａｎｔ（ｒｅｖｅｒｓｅ）の製作および機能の確認
１．細胞およびベクター
後述するように、ｐＢａｔトランスポゾンｍｕｔａｎｔ ｆｏｒｍプラスミドを製作して実験に使用し、遺伝子伝達効率を確認するための細胞としてＪｕｋａｔ ｃｅｌｌｓ（ＡＴＣＣ、Ｃａｔ ｎｏ．ＴＩＢ－１５２、Ｌｏｔ ｎｏ．７００１７５６０）を使用した。

２．ＩＴＲ ｍｕｔａｎｔ ｆｏｒｍの製作
ＩＴＲ ｍｕｔａｎｔは、実施例Ｂと同じ方法で製作した。

３．Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ、ＦＡＣＳ、蛍光顕微鏡分析、およびｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ
実施例Ｂと同様の方法で細胞にｍｕｔａｎｔ ＤＮＡとｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ ＤＮＡをＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）した。Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎを行った後、７日および１４日が経過したとき、蛍光顕微鏡で細胞のＧＦＰ発現程度を観察し、ＦＡＣＳ分析を通じて生細胞（ＤＡＰＩ ｎｅｇａｔｉｖｅ）のうちＧＦＰ発現細胞の割合を確認した。また、実施例Ｂと同じ方法でＳｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇおよび培養を行った。
Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎグループは、下記表１のように準備した。

実施例Ｄ．ＰＢＭＣに対するｐＢａｔトランスポゾンの遺伝子伝達効率の確認
上記の実施例において、Ｊｕｒｋａｔ細胞株におけるｐＢａｔ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ（トランスポゾン）システムによる遺伝子伝達効率を確認するときには、Ｎｅｏｎ装備を用いてｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ（電気穿孔法）を行った。しかしながら、Ｎｅｏｎ装備を用いたｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎの場合、ｐｒｉｍａｒｙ Ｔ細胞では効率が非常に低く、ｓｍａｌｌ ｓｃａｌｅの細胞数（最大１０^６個）で進行されなければならないという制限点がある。したがって、本実施例では、Ｍａｘｃｙｔｅ装備を用いてＰＢＭＣにおけるｐＢａｔ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎシステムによる遺伝子伝達効率を確認した。このために、ＧＦＰ遺伝子を含むｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ（Ｎａｉｖｅ－ＧＦＰ、３Ｍ３－５Ｍ３－ＧＦＰ）と１Ｇ４ ＴＣＲ遺伝子を含むｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ（Ｂ３ＩＳ－Ｂ５ＩＥ－１Ｇ４、３Ｍ３－５Ｍ３－１Ｇ４）を用いてｍｕｔａｎｔ ｆｏｒｍ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎの遺伝子伝達効率を比較した。Ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅは、プラスミドＤＮＡで発現させた。

１．試験物質
１－１．ＤＮＡおよびＲＮＡ分子
ｐＢａｔトランスポゾンプラスミドベクターは、下記の４種を使用し、対照群としては、ｐＥＧＦＰ（ｐＢａｔ Ｂ３ＩＳ－Ｂ５ＩＥ）を使用した。トランスポザーゼの発現のために、ｐＢａｔ ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅプラスミドを共に導入させた（配列番号１９）。

１－２．細胞
トランスポゾンの遺伝子伝達効率を確認するための対象細胞としては、ヒトから採血して収得した新鮮なＰＢＭＣおよびＡ３７５細胞（ＡＴＣＣ、Ｃａｔ ｎｏ．ＣＲＬ－１６１９、Ｌｏｔ ｎｏ．７００３２９６６）を使用した。

２．血液からＰＢＭＣの分離
下記過程を通じてヒトから採血して収得した血液からＰＢＭＣを収得した：Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅを４個の５０ｍＬ ｃｏｎｉｃａｌ ｔｕｂｅにそれぞれ１５ｍＬずつ分注した後、健常者から収得した全血８０ｍＬ中３０ｍＬを各チューブのＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ層上に混ざらないようにゆっくり追加した。次に、１０００ｘｇ、Ｂｒｅａｋ ０条件で１５分間遠心分離した。遠心分離を終えたチューブからピペットを用いてＰＢＭＣ層だけを注意深く吸い取り、新しい５０ｍＬ ｃｏｒｎｉｃａｌ ｔｕｂｅに移した。前記チューブにｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（ＤＰＢＳ＋２％ＦＢＳ）を総体積が５０ｍＬになるように充填した後、ｉｎｖｅｒｔｉｎｇし、４５０ｘｇで１０分間遠心分離を行った後、上清を除去した。次に、ペレットにｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ ５０ｍＬを添加してペレットを再懸濁させた後、４５０ｘｇで１０分間遠心分離後、上清を除去した。さらに、ペレットにｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ ５０ｍＬを添加してペレットを再懸濁した後、ＰＢＭＣの個数および生存率（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）を確認した。次に、さらに４５０ｘｇで１０分間遠心分離後、上清を除去し、収得した細胞ペレットをＰＢＭＣを２０ｍＬのＲＰＭＩ ｍｅｄｉａで再懸濁させた後（合計８×１０^７個の細胞）、Ｔ７５ ｆｌａｓｋに移した。その後、実験を進めるまで細胞は常温で保管した。

３．電気穿孔法（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）
細胞への遺伝子伝達は、電気穿孔法を用いて行われた。まず、ヒト血液から分離したＰＢＭＣをｃｏｒｎｉｃａｌチューブに集めた後、１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除去した後に、５０ｍＬのＰＢＳで細胞を懸濁した。懸濁した細胞に対してｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇを行い、１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離後、上清を除去した。収得した細胞ペレットには、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ ｂｕｆｆｅｒを添加し、濃度が４×１０^６個／５０μＬになるように細胞を懸濁させた。次に、１．５ｍＬチューブをｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ条件ごとに（表３）準備した。各チューブにトランスポゾンベクターをＰＢＭＣ ４×１０^６個当たり５μｇになるように入れ、４×１０^６個のＰＢＭＣをトランスポゾンベクターが入っている各チューブに追加した。次に、前記細胞懸濁液（４×１０^６個／５０μＬ）をＯＣ１００Ｘ２ ａｓｓｅｍｂｌｙにバブルが生じないように気を付けて入れた。ＥｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎのためにＭａｘｃｙｔｅ ＧＴｘでＲｅｓｔｉｎｇ Ｔ ｃｅｌｌ １４－３プロトコルを行った。前記ＯＣ１００ｘ２ ａｓｓｅｍｂｌｙをＧＴｘに刺してプロトコルを行い、ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎを進めた。Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎが終わった後、ＯＣ１００ｘ２ ａｓｓｅｍｂｌｙから細胞懸濁液を１２ｗｅｌｌプレートに移した（４×１０^６個／５０μＬ／ｗｅｌｌ）。Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地５０μＬでＯＣ１００Ｘ２ｗｅｌｌを洗浄し、プレートの各ｗｅｌｌに追加し、３７℃およびＣＯ_２培養器で２０分間回復時間を有した。回復時間が終わった後、完全培地（ＡＩＭ－Ｖ＋３％ＨＳ＋２００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２）８００μＬずつを６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅの各ｗｅｌｌに注意深く追加した後、さらに３７℃およびＣＯ_２培養器に入れ、１日間培養した。

４．Ｆｅｅｄｅｒ ｃｅｌｌの添加
Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ １日後に、５０Ｇｙ放射線照射されたｆｅｅｄｅｒ ｃｅｌｌとしてＡ３７５を電気穿孔されたＰＢＭＣ（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｅｄ ＰＢＭＣ）に追加した。具体的には、１５０πディッシュ８個で培養中のＡ３７５（ｐ８）細胞の培地を除去した後、５ｍＬのＰＢＳでディッシュを洗浄し、０．０５％ Ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ ２ｍＬを添加した。３７℃およびＣＯ_２培養器に３分間インキュベートした後、新培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１ｘ Ｐ／Ｓ）１０ｍＬを入れ、ディッシュの底部から離脱した細胞を回収した。次に、細胞懸濁液を１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離後、上清を除去し、新培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１ｘ Ｐ／Ｓ）３０ｍＬで沈殿した細胞を懸濁させた。収得したＡ３７５細胞は、９×１０^７個／２０ｍＬの濃度で１個のＴ７５フラスコに入れ、５０Ｇｙで放射線照射をした。放射線照射されたＡ３７５細胞は、新しい５０ｍＬ ｃｏｎｉｃａｌチューブに回収し、１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離後、上清を除去した。ＰＢＳ ５０ｍＬで細胞ペレットを懸濁した後、１，５００ｒｐｍで５分間追加遠心分離し、次に、上清を除去した後、ＰＢＳ ５０ｍＬで細胞ペレットを再懸濁し、ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇを行った。Ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇを終えた細胞サンプルは、１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離後、上清を除去し、培地（ＡＩＭ－Ｖ＋３％ＨＳ＋１ｘ Ｐ／Ｓ＋２００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２）で２×１０^６個／１００μＬになるように細胞ペレットを懸濁した。準備したＦｅｅｄｅｒ ｃｅｌｌ懸濁液は、電気穿孔１日後に培養されたＰＢＭＣに１００μＬ（２×１０^６個）ずつ追加し、３７℃およびＣＯ_２培養器で培養した。

５．細胞培養
Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ３日後、培地（ＡＩＭ－Ｖ＋３％ＨＳ＋１ｘ Ｐ／Ｓ＋２００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２）１ｍＬを添加した後、３７℃およびＣＯ_２培養器で培養した（１次培地添加）。Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ６日後、培地（ＡＩＭ－Ｖ＋３％ＨＳ＋１ｘ Ｐ／Ｓ＋２００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２）２ｍＬを添加した後、３７℃およびＣＯ_２培養器で培養した（２次培地添加）。Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ７日後、培養中の細胞を懸濁させた後、細胞懸濁液２．５ｍＬは、ＦＡＣＳ分析のために新しいチューブに移し、残りの１．５ｍＬの細胞懸濁液には、新培地（ＡＩＭ－Ｖ＋３％ＨＳ＋１ｘ Ｐ／Ｓ＋２００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２）１．５ｍＬを添加し、３７℃およびＣＯ_２培養器で培養した。Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ １０日後、培養中の細胞を懸濁させた後、各ｗｅｌｌごとに１．５ｍＬの細胞懸濁液を新しいｗｅｌｌに移し（１：１ ｓｐｌｉｔ）、培地（ＡＩＭ－Ｖ＋３％ＨＳ＋１ｘ Ｐ／Ｓ＋２００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２）１．５ｍＬずつを添加し、３７℃およびＣＯ_２培養器で培養した。Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ １４日後、各ｗｅｌｌの細胞を新しいチューブに移し、ＦＡＣＳ分析を進めた。

６．蛍光顕微鏡を用いたＧＦＰ発現の観察
ＧＦＰ遺伝子を含むｐＢａｔトランスポゾンベクターグループは、ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ １日、７日後に、蛍光顕微鏡を通じてＧＦＰの発現を観察した。

７．ＦＡＣＳ分析
ＦＡＣＳ分析は、ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ７日および１４日後に進め、ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ７日後には、蛍光顕微鏡でＧＦＰ発現観察後にＦＡＣＳ分析を進めた。具体的には、各ｗｅｌｌ別に細胞を懸濁させた後、１６個の１．５ｍＬチューブに移した。各チューブを１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除去した後、ｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（ＰＢＳ＋２％ＦＢＳ）１ｍＬで細胞を懸濁した。遠心分離および上清除去過程を２回さらに行い、細胞を洗浄した。各チューブ当たりｈｕｍａｎ ＴｒｕＳｔａｉｎ ＦｃＸ １μＬ＋ｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ ３０μＬずつを添加後、室温で５分間反応させた。抗体を表４のように各ｔｕｂｅ当たり各１μＬずつ追加した後、４℃で３０分間反応させた。反応を終えた細胞は、ｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒで洗浄し、１ｘＤＡＰＩが入っているｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ ２００μＬで懸濁してＦＡＣＳチューブに移し、ＦＡＣＳ分析を進めた。

実施例Ｅ．ｐＢａｔトランスポゾンシステムを用いたＴＣＲ－Ｔ製作時のＴ細胞の活性化時期による遺伝子伝達効率の確認
１．試験物質および細胞
ｐＢａｔトランスポゾンプラスミドとしてＧＦＰ遺伝子を含むｐＢａｔ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ ３Ｍ３－５Ｍ３－ＧＦＰおよび１Ｇ４ ＴＣＲ遺伝子を含むｐＢａｔ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ ３Ｍ３－５Ｍ３－１Ｇ４ ＴＣＲを使用し、トランスポザーゼの発現のためにｐＢａｔ ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅプラスミドを共に導入させた。
トランスポゾンの遺伝子伝達効率を確認するための対象細胞としては、ヒトから採血して収得した新鮮なＰＢＭＣおよびＡ３７５細胞（ＡＴＣＣ、Ｃａｔ ｎｏ．ＣＲＬ－１６１９、Ｌｏｔ ｎｏ．７００３２９６６）を使用した。Ａ３７５細胞は、放射線（５０Ｇｙ）照射後に凍結保管されたものを使用した。実施例Ｄと同じ方法でヒト全血から新鮮なＰＢＭＣを分離した。

２．電気穿孔法（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）
トランスポゾンおよびトランスポザーゼプラスミドをＰＢＭＣに導入するために電気穿孔法を行った。全体的な過程は、実施例Ｄと同一に進め、サンプル別の具体的なＥｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ条件は、下記表５の通りである。

Ｍａｘｃｙｔｅ ＳＴｘのＲｅｓｔｉｎｇ Ｔ ｃｅｌｌ １４－３プロトコルによってＥｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎを行った後、ＯＣ１００ｘ２ ａｓｓｅｍｂｌｙから細胞懸濁液（５×１０^６個／１００μＬ／ｗｅｌｌ）をＴ２５ ｆｌａｓｋに移し、ＡｌｙＳ培地１００μＬでＯＣ１００Ｘ２ ｗｅｌｌを洗浄し、各Ｔ２５ ｆｌａｓｋに追加した。３７℃およびＣＯ_２培養器で２０分間ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎされた細胞を回復させた後、「３Ｍ３－５Ｍ３－１Ｇ４＋ＤＮＡ（直後）群」を除いたｆｌａｓｋに培地（ＡＬｙＳ＋３％ＨＳ＋２００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２）８００μＬずつを各Ｔ２５ ｆｌａｓｋに注意深く追加し、３７℃およびＣＯ_２培養器に入れて培養した。

３．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ後のＴ細胞の活性化
Ｔ細胞の活性化方法として１Ｇ４ ＴＣＲのターゲット抗原であるＮＹ－ＥＳＯ－１抗原を発現するＡ３７５細胞（５０Ｇｙ放射線が照射されたもの）をｆｅｅｄｅｒ ｃｅｌｌに追加し、特異的に１Ｇ４ ＴＣＲ－Ｔ細胞を活性化する方法を行った。この際、Ｔ細胞の活性化時期をｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ直後または１日後に分けて進め、活性化時期による結果を比較した。表６のように「３Ｍ３－５Ｍ３－１Ｇ４＋ＤＮＡ（直後）群」には、ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ直後、「３Ｍ３－５Ｍ３－１Ｇ４＋ＤＮＡ（直後）群」を除いたすべての群には、ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ １日後に５０Ｇｙ放射線照射されたＡ３７５細胞をｆｅｅｄｅｒ ｃｅｌｌとしてｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｅｄ ＰＢＭＣに追加した。

３－１．「Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ直後に放射線照射されたＡ３７５細胞」を用いたＴ細胞活性化および培養
ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ直後にｆｅｅｄｅｒ ｃｅｌｌを添加してＴ細胞を活性化する３Ｍ３－５Ｍ３－１Ｇ４＋ＤＮＡ（直後）グループは、下記方法でＴ細胞を活性化し、培養した：
凍結保管中の５０Ｇｙ放射線照射されたＡ３７５バイアル１個を３７℃ ｗａｔｅｒ ｂａｔｈで解凍させた。５０ｍＬチューブにＡＬｙＳ培地を９ｍＬを入れ、解凍したＡ３７５細胞懸濁液１ｍＬをゆっくり追加した。前記チューブを常温で１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除去し、細胞ペレットは、１０ｍＬのＡＬｙＳ培地で懸濁して細胞計数を進めた後、５×１０^６個のＡ３７５細胞を１５ｍＬチューブに移し、１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離後、上清を除去した。細胞ペレットは、培地（ＡＬｙＳ＋３％ＨＳ＋２００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２）８００μＬで懸濁し、前記表６のようにＥｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ後に回復を終えた３Ｍ３－５Ｍ３－１Ｇ４＋ＤＮＡ（直後）群に追加し、３７℃およびＣＯ_２培養器で培養した。１日後、培地（ＡＬｙＳ＋３％ＨＳ＋２００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２）１．５ｍＬを添加し、３７℃およびＣＯ_２培養器で培養した。２日後、培地（ＡＩＭ－Ｖ＋３％ＨＳ＋１ｘ Ｐ／Ｓ＋２００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２）５ｍＬを添加した後、３７℃およびＣＯ_２培養器で培養した。３日後、培地（ＡＩＭ－Ｖ＋３％ＨＳ＋１ｘ Ｐ／Ｓ＋２００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２）１０ｍＬを添加した後、３７℃およびＣＯ_２培養器で培養した。６日後、Ｔ２５ ｆｌａｓｋで培養中の細胞を懸濁させた後、Ｔ７５ ｆｌａｓｋに移し、培地（ＡＩＭ－Ｖ＋３％ＨＳ＋１ｘ Ｐ／Ｓ＋２００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２）３０ｍＬを添加した後、ｆｌａｓｋを３７℃およびＣＯ_２培養器で培養した。８日後、Ｔ７５ ｆｌａｓｋに培地（ＡＩＭ－Ｖ＋３％ＨＳ＋１ｘ Ｐ／Ｓ＋２００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２）２０ｍＬを添加し、３７℃およびＣＯ_２培養器で培養した。１０日後、ピペットを用いてＴ７５ ｆｌａｓｋから培地４０ｍＬを除去し、培地（ＡＩＭ－Ｖ＋３％ＨＳ＋１ｘ Ｐ／Ｓ＋２００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２）を３０ｍＬ添加した後、３７℃およびＣＯ_２培養器で培養した。

３－２．「Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ １日後に放射線照射されたＡ３７５細胞」を用いたＴ細胞活性化および培養
前記表６においてグループ１、２、４、および５は、下記の方法でＴ細胞を活性化し、培養した：
Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ １日後、凍結保管中の５０Ｇｙ放射線照射されたＡ３７５バイアル１個を３７℃ｗａｔｅｒ ｂａｔｈで解凍させた。５０ｍＬチューブにＡＬｙＳ培地を９ｍＬ入れ、解凍したＡ３７５細胞懸濁液１ｍＬをゆっくり追加した。前記チューブを常温で１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除去し、細胞ペレットを１０ｍＬのＡＬｙＳ培地で懸濁し、細胞計数を進めた後、５×１０^６個のＡ３７５細胞を１５ｍＬチューブに移し、１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を除去し、細胞ペレットを２×１０^６個／５００μＬになるように培地（ＡＬｙＳ＋３％ＨＳ＋２００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２）で懸濁した後、表６においてＴ細胞活性化方法が「放射線照射されたＡ３７５細胞」である条件のうち「３Ｍ３－５Ｍ３－１Ｇ４＋ＤＮＡ（直後）群」を除いた群のｆｌａｓｋに追加した。次に、培地（ＡＬｙＳ＋３％ＨＳ＋２００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２）１ｍＬを添加し、３７℃およびＣＯ_２培養器で培養した。３日後、Ｔ２５ ｆｌａｓｋに培地（ＡＩＭ－Ｖ＋３％ＨＳ＋１ｘ Ｐ／Ｓ＋２００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２）５ｍＬを添加し、３７℃およびＣＯ_２培養器で培養した。６日後、Ｔ２５ ｆｌａｓｋに培地（ＡＩＭ－Ｖ＋３％ＨＳ＋１ｘ Ｐ／Ｓ＋２００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２）５ｍＬを添加し、３７℃およびＣＯ_２培養器で培養した。８日後、「ＥＰ ｏｎｌｙ（１日後）放射線照射されたＡ３７５細胞群とＮｏ ＥＰ群」は、Ｔ２５ ｆｌａｓｋで培養中の細胞を懸濁させた後、Ｔ７５ ｆｌａｓｋに移し、培地（ＡＩＭ－Ｖ＋３％ＨＳ＋１ｘ Ｐ／Ｓ＋２００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２）１０ｍＬずつ添加し、他の群のｆｌａｓｋには培地５ｍＬを添加した後、３７℃およびＣＯ_２培養器で培養した。１０日後、ピペットを用いてｆｌａｓｋから１０ｍＬを除去し、新培地（ＡＩＭ－Ｖ＋３％ＨＳ＋１ｘ Ｐ／Ｓ＋２００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２）１０ｍＬを添加した後、３７℃およびＣＯ_２培養器で培養した。

４．ＦＡＣＳ分析
トランスポゾンシステムによる遺伝子伝達効率を分析するためにＦＡＣＳを進め、全体的に実施例Ｄに記述されたＦＡＣＳ方法と同一に行った。

実施例Ｆ．ｐＢａｔトランスポゾンシステムを用いたＣＡＲ－Ｔの製作
１．試験物質および細胞
ｐＢａｔトランスポゾンプラスミドとしてＣＤ１９ ＣＡＲ遺伝子を含むｐＢａｔ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ ３Ｍ３－５Ｍ３－ＣＤ１９ ＣＡＲを使用し、トランスポザーゼの発現のためにｐＢａｔ ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅプラスミドを共に導入させた。
トランスポゾンの遺伝子伝達効率を確認するための対象細胞としては、健常者から分離して凍結保管されたＬＫ０５３ ＰＢＭＣを使用した。

２．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ後のＴ細胞の活性化
２－１．ＰＢＭＣのｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎおよび培養
ＬＮ_２に保管中のＬＫ０５３ ＰＢＭＣ細胞バイアル２個を３７℃ ｗａｔｅｒ ｂａｔｈで解凍させた後、５０ｍＬチューブに培地（ＡＩＭ－Ｖ＋３％ＨＳ）１８ｍＬを入れ、解凍した細胞懸濁液２ｍＬをゆっくり追加した。前記チューブを常温で１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除去し、細胞ペレットを２０ｍＬの培地（ＡＩＭ－Ｖ＋３％ＨＳ）で懸濁し、細胞計数を進めた。３．５×１０^７個のＰＢＭＣを常温で１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を除去し、細胞ペレットをＰＢＳ １０ｍＬで懸濁した。次に、細胞懸濁液を常温で１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を完全に除去し、細胞ペレットを５×１０^６個／５０μＬになるようにｗａｒｍ ｏｐｔｉ－ＭＥＭ ３５０μＬで懸濁した。

１．５ｍＬチューブに表７に示した条件別にプラスミドを各５μｇずつ添加し、準備したＰＢＭＣ懸濁液を５０μＬ（５×１０^６個）ずつ追加した。ＯＣ１００Ｘ２ ａｓｓｅｍｂｌｙに６）項の細胞懸濁液をバブルが生じないように気を付けて入れた。Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎは、実施例Ｄと同様に、Ｍａｘｃｙｔｅ ＳＴｘのＲｅｓｔｉｎｇ Ｔ ｃｅｌｌ １４－３プロトコルによって行った。Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎが終わった後、ＯＣ１００ｘ２ ａｓｓｅｍｂｌｙから細胞懸濁液を２個のＴ２５ ｆｌａｓｋにそれぞれ移し、ＡＩＭ－Ｖ培地５０μＬでＯＣ１００Ｘ２ｗｅｌｌを洗浄し、各Ｔ２５ ｆｌａｓｋに追加した。３７℃およびＣＯ_２培養器で２０分間Ｔ２５ ｆｌａｓｋを底が短いエッジに傾けたまま培養し、細胞回復のための時間を与えた。回復時間が終わった後、完全培地（ＡＩＭ－Ｖ＋３％ＨＳ＋２００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２）９００μＬずつをＴ２５ ｆｌａｓｋに注意深く追加した。３７℃およびＣＯ_２培養器でＴ２５ ｆｌａｓｋを底が短いエッジに傾けたまま１日間培養した。

２－２．Ｔ細胞活性化および培養
Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ １日後、Ｔ２５ ｆｌａｓｋに完全培地（ＡＩＭ－Ｖ＋３％ＨＳ＋２００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２）を１．５ｍＬずつ追加し、ｔｒａｎｓａｃｔを５０μＬずつ添加した後、３７℃およびＣＯ_２培養器で２日間培養し、Ｔ細胞を活性化させた。Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ３日後、Ｔ２５ ｆｌａｓｋに完全培地（ＡＩＭ－Ｖ＋３％ＨＳ＋２００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２）を２．５ｍＬずつ追加し、３７℃およびＣＯ_２培養器でＴ２５ ｆｌａｓｋを立てた状態で培養し続けた。Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ６日後、Ｔ２５ ｆｌａｓｋに完全培地（ＡＩＭ－Ｖ＋３％ＨＳ＋２００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２）を３ｍＬずつ追加し、３７℃およびＣＯ_２培養器でＴ２５ ｆｌａｓｋを立てた状態で培養し続けた。Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ７日後、細胞を懸濁し、１ｍＬずつＦＡＣＳチューブに移し、ＦＡＣＳ分析を進め、残った細胞は、３７℃およびＣＯ_２培養器でＴ２５ ｆｌａｓｋを立てた状態で培養し続けた。

３．ＦＡＣＳ分析
トランスポゾンシステムによる遺伝子伝達効率を分析するために、ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ７日後にＦＡＣＳを進め、全体的に実施例Ｄに記述されたＦＡＣＳ方法と同一に行った。

実施例Ｇ．ｐＢａｔトランスポゾンシステムを用いたＣＡＲ－Ｔ製作のさらなる検証
１．試験物質および細胞
ｐＢａｔトランスポゾンプラスミドとしてＣＤ１９ ＣＡＲ遺伝子を含むｐＢａｔ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ ３Ｍ３－５Ｍ３－ＣＤ１９ ＣＡＲを使用し、トランスポザーゼの発現のためにｐＢａｔ ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅプラスミドを共に導入させた。
トランスポゾンの遺伝子伝達効率を確認するための対象細胞としては、健常者から分離して凍結保管されたＬＫ０５３ ＰＢＭＣを使用した。

２．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ後のＴ細胞の活性化
Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎを用いたＰＢＭＣへの３Ｍ３－５Ｍ３－ＣＤ１９ ＣＡＲトランスポゾンおよびトランスポザーゼプラスミドの導入およびＥｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ後のＴ細胞の活性化は、実施例Ｆに記載されたのと同じ方法で行った。

３．ＦＡＣＳ分析
トランスポゾンシステムによる遺伝子伝達効率を分析するために、ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ７日後にＦＡＣＳを進め、全体的に実施例Ｄに記述されたＦＡＣＳ方法と同一に行った。

実施例Ｈ．ｐＢａｔトランスポゾンシステムで製作されたＣＡＲ－Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ効能の確認
１．細胞
実施例ＦまたはＧと同じ方法でｐＢａｔトランスポゾンシステムでＣＤ１９ ＣＡＲ遺伝子を導入させて２週間培養したＣＡＲ－Ｔ細胞（ＬＫ０５３ ＣＡＲ－Ｔ）を使用した。対照群としては、ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞の製作時に同一にｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎおよび２週培養を行った細胞（ＬＫ０５３ ｃｏｎｔｒｏｌ）を使用した。

２．Ｔ細胞の解凍および安定化（ｒｅｓｔｉｎｇ）
ＬＮ_２に保管中のＬＫ０５３ ｃｏｎｔｒｏｌ Ｔ細胞およびトランスポゾンシステムで製作されたＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔバイアル２個ずつを３７℃ ｗａｔｅｒ ｂａｔｈで解凍させた。５０ｍＬチューブ２個に培地（ＡＬｙＳ＋３％ＨＳ）を１８ｍＬずつ入れ、解凍した細胞懸濁液をそれぞれ２ｍＬずつゆっくり追加した。常温で１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を除去し、細胞ペレットを１０ｍＬの培地（ＡＬｙＳ＋３％ＨＳ）で懸濁して細胞計数を進めた。次に、細胞をＴ７５ ｆｌａｓｋに移し、１×１０^７個／１０ｍＬになるように培地（ＡＬｙＳ＋３％ ｓｅｒｕｍ）を合計５０ｍＬで添加した後、３７℃およびＣＯ_２培養器で１日間培養して安定化させた。

３．Ｔ細胞およびＢ細胞株の共培養（ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅ）
ＣＤ１９発現Ｂ細胞株であるＢＪＡＢ細胞を培養後、１５ｍＬチューブに回収し、常温で１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離して上清を除去し、細胞ペレットをＡＬｙＳ培地２ｍＬで懸濁して細胞計数を進めた。さらに細胞懸濁液を常温で１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を完全に除去し、１×１０^５個／１００μＬになるように培地（ＡＬｙＳ＋３％ＨＳ）で細胞ペレットを懸濁した。懸濁したＢＪＡＢ細胞を表８の条件によって９６ｗｅｌｌプレートにｗｅｌｌ当たり１×１０^５個ずつ入れた。上記の実施例で安定化させたｃｏｎｔｒｏｌ Ｔ細胞およびＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞をそれぞれ５０ｍＬチューブに回収し、常温で１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離して上清を除去し、細胞ペレットを培地（ＡＬｙＳ＋３％ＨＳ）１０ｍＬで懸濁した後、細胞計数を進めた。ｃｏｎｔｒｏｌ Ｔ細胞およびＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞をそれぞれ２個ずつの１５ｍＬチューブに２×１０^６個と６×１０^６個に分けて入れた。次に、各細胞懸濁液を常温で１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を完全に除去した。２×１０^６個の細胞ペレットは、１×１０^５個／１００μＬになるように培地（ＡＬｙＳ＋３％ＨＳ）２ｍＬで懸濁し、６×１０^６個の細胞ペレットは、４×１０^５個／１００μＬになるように培地（ＡＬｙＳ＋３％ＨＳ）１．５ｍＬで懸濁した。

準備した細胞は、ＢＪＡＢ細胞があらかじめ分注された９６ｗｅｌｌプレートに表８の条件によってｗｅｌｌ当たり１００μＬずつ追加した。陽性対照群であるＰＭＡ／Ｉｏｎｏ群には、ＰＭＡ １００ ｎＭとｉｏｎｏｍｙｃｉｎ １μｇ／ｍＬを処理し、３７℃およびＣＯ_２培養器で２４時間培養した。２４時間後、プレートを常温で１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞がターゲット細胞と反応時に分泌するＩＦＮ－γ量を測定するために、各ｗｅｌｌから培養液１３０μＬずつを回収し、新しい９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに移し、ホイルで密封し、－８０℃に保管した。

４．ＩＦＮ－γＥＬＩＳＡ ａｓｓａｙ
Ｈｕｍａｎ ＩＦＮ－ｇａｍｍａ ＥＬＩＳＡ ａｓｓａｙキットのプロトコルにより進めた。上記の実施例で－８０℃に保管された培養液を氷でゆっくり解凍させ、Ｓｔａｎｄａｒｄ ＩＦＮ－γをｎｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ １００μＬで溶かして、２０，０００ｐｇ／ｍＬの濃度で準備した。２０，０００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ－γをａｓｓａｙ ｄｉｌｕｅｎｔで希釈して、１，５００、７５０、３７５、１８７．５、９３．７５、４６．８７５、および２３．４３８ｐｇ／ｍＬの濃度のｓｔａｎｄａｒｄ ＩＦＮ－γをそれぞれ作成した。２０ｘ ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒを滅菌蒸留水１／２０希釈して、１ｘ ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒを作成し、ＩＦＮ－γＥＬＩＳＡプレートに２００μＬずつ入れ、プレートをひっくり返して溶液を除去した（１番目の洗浄）。次に、１ｘ ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒを３００μＬ入れ、プレートをひっくり返して溶液を除去した（２番目の洗浄）。前記２つの洗浄過程を２回繰り返して合計４回の洗浄を進めた。最後の溶液の除去時にペーパータオルを用いて溶液を完全に除去した。解凍した培養液は、洗浄を終えたＩＦＮ－γＥＬＩＳＡプレートに１００μＬずつ入れた。次に、各濃度のｓｔａｎｄａｒｄ ＩＦＮ－γを１００μＬずつ２個のｗｅｌｌに入れた。他の２個のｗｅｌｌには、ＡＬｙＳ培地を１００μＬずつ入れ、ｂｌａｎｋを準備した。プレートカバーを付着し、常温で２時間反応させ、反応を終えたプレートは、ひっくり返して培養液を除去し、１ｘ ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒを２００μＬ入れた後、プレートをひっくり返して溶液を除去した（１番目の洗浄）。次に、１ｘ ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒを３００μＬを入れ、プレートをひっくり返して溶液を除去した（２番目の洗浄）。洗浄過程を２回繰り返して合計４回の洗浄を進めた。最後の溶液の除去時にペーパータオルを用いて溶液を完全に除去した。洗浄過程中にｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｙをｎｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ ３００μＬで溶かし、ａｓｓａｙ ｄｉｌｕｅｎｔで１／２０希釈して準備した。洗浄したプレートの各ｗｅｌｌに希釈したｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｙを１００μＬずつ分注し、プレートカバーを付着し、常温で２時間反応させた。プレートをひっくり返して培養液を除去し、１ｘ ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒを２００μＬ入れた後、プレートをひっくり返して溶液を除去した（１番目の洗浄）。次に、１ｘ ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒを３００μＬを入れ、プレートをひっくり返して溶液を除去した（２番目の洗浄）。洗浄過程を２回繰り返して合計４回の洗浄を進めた。最後の溶液の除去時にペーパータオルを用いて溶液を完全に除去した。洗浄過程中にｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰをａｓｓａｙ ｄｉｌｕｅｎｔで１／２０希釈して準備した。洗浄したプレートの各ｗｅｌｌに希釈したｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰを１００μＬずつ添加した。プレートカバーを付着し、常温で３０分間反応させた。反応を終えたプレートは、ひっくり返して培養液を除去し、１ｘ ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒを２００μＬを入れた後、プレートをひっくり返して溶液を除去した（１番目の洗浄）。次に、１ｘ ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒを３００μＬを入れ、プレートをひっくり返して溶液を除去した（２番目の洗浄）。洗浄過程を２回繰り返して合計４回の洗浄を進めた。最後の溶液の除去時にペーパータオルを用いて溶液を完全に除去した。洗浄したプレートの各ｗｅｌｌにＴＭＢを１００μＬずつ入れ、常温で５分間反応させた。Ｓｔｏｐ ｓｏｌｕｔｉｏｎを１００μＬずつ各ｗｅｌｌに入れ、反応を中止させた。Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ ｓｋｙ装備で４５０ｎｍの吸光度を測定し、濃度を計算した。

実施例Ｉ．ｐＢａｔ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ伝達形態による遺伝子の伝達効率の確認
１．細胞およびＤＮＡ分子
トランスポゾンの遺伝子伝達効率を確認するための対象細胞としては、Ｊｕｒｋａｔ ｃｅｌｌ（ＡＴＣＣ、Ｃａｔ Ｎｏ．ＴＩＢ－１５２、Ｌｏｔ ｎｏ．７００１７５６０）を使用した。
トランスポゾンシステムの場合、対照群としてｐＥＧＦＰ－Ｃ１プラスミドを使用し、トランスポゾン伝達形態による遺伝子伝達効率を確認するために、下記３つのトランスポゾンを使用した：ｉ）Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ ３Ｍ３－５Ｍ３－ＧＦＰプラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ形態）、ｉｉ）Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ ３Ｍ３－５Ｍ３－ＧＦＰ ｌｉｎｅａｒ ｄｓＤＮＡ（線状ｄｓＤＮＡ形態）、およびｉｉｉ）Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ ３Ｍ３－５Ｍ３－ＧＦＰ ｍｉｎｉｃｉｒｃｌｅ ｄｓＤＮＡ（ｍｉｎｉｃｉｒｃｌｅ ｄｓＤＮＡ形態）。
また、トランスポザーゼの発現のために、ｐＢａｔ ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅプラスミドを共に導入させた。

２．Ｎｅｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ
培養中のＪｕｒｋａｔ細胞を５０ｍＬチューブに回収し、常温で１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清の除去後、細胞ペレットを１０ｍＬの培地（ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ）で懸濁した後、細胞計数を進めた。細胞４×１０^６個を１５ｍＬチューブに移し、培地（ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ）を最終体積が２ｍＬになるように追加した後、常温で１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。遠心分離を終えたサンプルから上清を除去し、細胞ペレットをＯｐｔｉ－ＭＥＭ ５ｍＬで懸濁させた後、さらに常温で１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。次に、Ｎｅｏｎチューブにｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｉｃ ｂｕｆｆｅｒを３ｍＬずつ入れ、２４ｗｅｌｌプレートにｗｅｌｌ当たり４００μＬの培地（ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ）を入れた。遠心分離を終えたＪｕｒｋａｔ細胞サンプルから上清を除去し、１×１０^５個／１００μＬになるように細胞ペレットをＯｐｔｉ－ＭＥＭで懸濁した。再懸濁した細胞のうち４．２×１０^５個の細胞を１．５ｍＬチューブに移した。それぞれの１．５ｍＬチューブに表９のように各条件別にＤＮＡあるいはｍＲＮＡを細胞１×１０^５個当たり１μｇずつ追加した。この際、追加されるＤＮＡあるいはｍＲＮＡの総ｖｏｌｕｍｅは、ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ｖｏｌｕｍｅ（１００μＬ）の１０％（１０μＬ）が超えないようにした。

次に、Ｎｅｏｎ機器にｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｃ ｂｕｆｆｅｒが入っているＮｅｏｎチューブを装着させ、Ｎｅｏｎ ｐｉｐｅｔｔｅおよびＮｅｏｎ ｔｉｐを用いて準備した細胞懸濁液１００μＬをゆっくり吸入した後、Ｎｅｏｎ機器に刺した。１，６００Ｖ、１０ｍｓ、および３ｐｕｌｓｅの条件でｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎを進め、ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎが完了した細胞は、培地（ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ）があらかじめ分注された２４ｗｅｌｌプレートにそれぞれ播種し、３７℃およびＣＯ_２培養器で培養した。

Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ １日後、各条件で２個のｗｅｌｌ（１日後の観察プレート）は、細胞を回収してＦＡＣＳ分析を進め、残りの２個のｗｅｌｌ（７日後の観察プレート）は、各ｗｅｌｌに培養培地（ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ＋１ｘ Ｐ／Ｓ）を１．５ｍＬずつ追加し、３７℃およびＣＯ_２培養器で培養した。

Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ７日後、ＦＡＣＳ分析のために各ｗｅｌｌの培地をピぺッティングして細胞を浮遊させ、全体２ｍＬ中１ｍＬの細胞を回収した。そして、各ｗｅｌｌ当たり残っている１ｍＬの細胞懸濁液に培養培地（ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ＋１ｘ Ｐ／Ｓ）を１ｍＬずつ追加して入れ、３７℃およびＣＯ_２培養器で培養した。

Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ １１日後、各ｗｅｌｌの培地をピぺッティングして細胞を浮遊させ、全体２ｍＬ中１ｍＬの細胞を新しいｗｅｌｌに移した。すべてのｗｅｌｌに培養培地（ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ＋１ｘ Ｐ／Ｓ）を１ｍＬずつ追加して入れ、３７℃およびＣＯ_２培養器で培養した。

Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ １４日後、各ｗｅｌｌの培地をピぺッティングして細胞を浮遊させ、全体２ｍＬ中１ｍＬの細胞を回収し、ＦＡＣＳ分析を進めた。

３．蛍光顕微鏡を用いたＧＦＰ発現の観察
Ｊｕｒｋａｔ細胞で発現するＧＦＰ蛍光は、ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ １日、７日、１４日後に蛍光顕微鏡を用いて観察した。

４．ＦＡＣＳ分析
ＦＡＣＳ分析は、ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ後、１、７、および１４日目に蛍光顕微鏡でＧＦＰ発現を観察して進め、上記の実施例と同じ方法で行った。

実施例Ｊ．ｐＢａｔ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎシステムによる抗体遺伝子の伝達効率の確認
１．細胞およびＤＮＡ分子
トランスポゾンの遺伝子伝達効率を確認するための対象細胞としては、ＨＥＫ２９３細胞株（韓国細胞株銀行、Ｃａｔ ｎｏ．ＫＣＬＢ２１５７３ Ｔ、Ｌｏｔ ｎｏ．４６２６９）を使用した。

トランスポゾンシステムの抗体遺伝子伝達効率を確認するために、代表例としてＪＷＷ－２抗体を使用した（ＪＷＷ－２ ｈｕｍａｎ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ；Ａｄｄｇｅｎｅ、Ｃａｔ ｎｏ．６６７４９）。

また、トランスポゾンシステムは、対照群としてｐＥＧＦＰ－Ｃ１プラスミドを使用し、トランスポゾンシステム別の遺伝子伝達効率を確認するために、ＪＷＷ抗体遺伝子が挿入されたＴｒａｎｓｐｏｓｏｎ Ｂ３ＩＳ－Ｂ５ＩＥ－ＪＷＷ－２、Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ ３Ｍ３－５Ｍ３－ＪＷＷ－２、Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ ３Ｍ３－５Ｍ４－ＪＷＷ－２、Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ Ｂ３ＩＳ－Ｂ５ＩＥ－ＧＦＰ、およびＴｒａｎｓｐｏｓｏｎ ３Ｍ３－５Ｍ３－ＧＦＰを使用した。

また、トランスポザーゼの発現のために、ｐＢａｔ ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅプラスミドを共に導入させた。

２．Ｎｅｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ
ＨＥＫ２９３細胞を３日間培養した１００πプレートから培地を除去した後、ＰＢＳを４ｍＬ追加してプレートを洗浄し、除去した。次に、Ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡを１ｍＬ追加し、３７℃およびＣＯ_２培養器で２分間反応させた。培養を終えた細胞は、培養培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ、１ｘ Ｐ／Ｓ）を用いて１５ｍＬチューブに回収し、常温で１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除去した後、ＰＢＳ ５ｍＬで細胞を懸濁し、細胞計数を進めた。さらに、常温で１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除去し、ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒで４×１０^５個／９０μＬとなるように細胞を懸濁した。１．５ｍＬチューブ１個には、細胞２６×１０^５個、６個には、細胞１８×１０^５個ずつ移した。６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅにｗｅｌｌ当たり９００μＬ培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）を入れ、Ｎｅｏｎチューブには、ｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｉｃ ｂｕｆｆｅｒを３ｍＬずつ分注した。次に、上記で準備したチューブに各条件別に細胞４×１０^５個当たり１μｇずつ下記の表のように追加した。

全体ｖｏｌｕｍｅをｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒで４×１０^５個当たり１００μＬに合わせ、Ｎｅｏｎ機器にｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｉｃ ｂｕｆｆｅｒが入っているＮｅｏｎチューブを装着した。Ｎｅｏｎ ｐｉｐｅｔｔｅとＮｅｏｎ ｔｉｐを用いて上記で準備した細胞懸濁液１００μＬをゆっくり吸い上げた後、Ｎｅｏｎ機器に刺した。１，３００Ｖ、２０ｍｓ、および３ｐｕｌｓｅの条件でｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎを進めた後、完了したＨＥＫ２９３細胞は、ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ培地が入っている６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅにそれぞれ分注し、３７℃およびＣＯ_２培養器で培養した。

Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ １日後、各グループから２ｗｅｌｌずつ細胞を回収し、ＧＦＰを含むグループは、ＧＦＰを測定するためにＦＡＣＳ分析を実施し、ＪＷＷ－２を含むグループは、抗体発現を確認するために、ｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。細胞の一部が回収されたすべてのｗｅｌｌには、培養培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ、１ｘ Ｐ／Ｓ）を１ｍＬずつ追加し、３７℃およびＣＯ_２培養器で培養した。Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ３日後、各ｗｅｌｌから培養培地を１ｍＬずつ回収して発現した抗体を測定するためにｄｅｅｐ ｆｒｅｅｚｅｒに保管し、細胞は、１個のｗｅｌｌから２個のｗｅｌｌに継代して３７℃およびＣＯ_２培養器で培養した（グループ別に２個のｗｅｌｌｓから４個のｗｅｌｌｓに継代）。Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ７日後、各グループからｗｅｌｌ ２個ずつの細胞を回収し、ＧＦＰを含むグループは、ＦＡＣＳでＧＦＰ発現を分析し、ＪＷＷ－２を含むグループは、ｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。残りのｗｅｌｌの細胞は、１個のｗｅｌｌから２個のｗｅｌｌに継代して３７℃およびＣＯ_２培養器で培養した（グループ別に２個のｗｅｌｌｓから４個のｗｅｌｌｓに継代）。Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ １０日後、１５）の各ｗｅｌｌから培養培地を回収し、ｄｅｅｐ ｆｒｅｅｚｅｒに保管した。

３．蛍光顕微鏡を用いたＧＦＰ発現観察およびＦＡＣＳ分析
Ｊｕｒｋａｔ細胞に発現するＧＦＰ蛍光は、ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ １日、７日、１０日後に蛍光顕微鏡を用いて観察した。蛍光顕微鏡を用いたタンパク質観察およびＦＡＣＳ分析は、上記の実施例と同じ方法で行った。

４．Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ分析
Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ １日および７日後、回収したＨＥＫ２９３細胞からＲｎｅａｓｙ ｋｉｔを用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡをマニュアルの通り抽出した。ｃＤＮＡ合成キットを用いて各ｐｒｅｍｉｘチューブ当たり１．０μｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡを入れ、マニュアルの通りｃＤＮＡを合成した。下記のようにｑＰＣＲのためのｍｉｘｔｕｒｅを製造した。

Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ用９６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅの各ｗｅｌｌに３）のｍｉｘｔｕｒｅを入れた。ｑＰＣＲ装備にｐｌａｔｅを入れ、下記と同じ条件でｑＰＣＲを進め、完了後、ｍｅｌｔｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓを進めた。

５．ＥＬＩＳＡ ａｓｓａｙ
ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ３日後および１０日後に回収し、凍結保管した培地を氷でゆっくり溶かし、４℃で１，６００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を注意深く取って、新しい１．５ｍＬチューブに移した。ＩｇＧ１標準品バイアルに６００μＬの１Ｘ ａｓｓａｙ ｄｉｌｕｅｎｔを添加して３００ｎｇ／ｍＬ ｓｔａｎｄａｒｄを作成し、下記のように１Ｘ ａｓｓａｙ ｄｉｌｕｅｎｔで希釈し、濃度別に準備した。

各濃度のｓｔａｎｄａｒｄとｓａｍｐｌｅを１００μＬずつＥＬＩＳＡプレートにｄｕｐｌｉｃａｔｅに入れた。２時間３０分間常温で弱く振りながら反応させた。溶液を除去し、１Ｘ ｗａｓｈ ｓｏｌｕｔｉｏｎを３００μＬずつ各ｗｅｌｌに入れ、洗浄した後、除去した。前記過程を３回さらに行い、合計４回洗浄した。次に、１Ｘ ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ＩｇＧ１ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｙを１００μＬずつ各ｗｅｌｌに入れた。１時間常温で弱く振りながら反応させ、次に、前述の洗浄過程を合計４回行った。洗浄を終えたサンプルの各ウェルには、１Ｘ ＨＲＰ－Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎを１００μＬずつ添加し、４５分間常温で弱く振りながら反応させた。４回の洗浄過程後、ＴＭＢ ｏｎｅ－ｓｔｅｐ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｒｅａｇｅｎｔを各ｗｅｌｌに１００μＬずつ入れた。３０分間常温で弱く振りながら反応させた後、Ｓｔｏｐ ｓｏｌｕｔｉｏｎを５０μＬずつ各ｗｅｌｌに追加した。４５０ｎｍで吸光度を測定し、ＪＷＷ－２抗体の濃度を分析した。

実施例Ｋ．ｐＢａｔ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎのベクターサイズによる遺伝子伝達効率の確認
１．細胞およびＤＮＡ分子
トランスポゾンの遺伝子伝達効率を確認するための対象細胞としては、Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ、Ｃａｔ Ｎｏ．ＴＩＢ－１５２、Ｌｏｔ ｎｏ．７００１７５６０）を使用した。
トランスポゾンのベクターサイズによる遺伝子伝達効率を確認するために、Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ（野生型）、Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ Ｂ３ＩＳ－Ｂ５ＩＥ（７，５６２ｂｐ）、およびＴｒａｎｓｐｏｓｏｎ ＥＦ１α－Ｂ３ＩＳ－Ｂ５ＩＥ－ＥＧＦＰ－ＫａｎＲ（４，１４９ｂｐ）を使用し、対照群としてｐＥＧＦＰ－Ｃ１プラスミドを使用した。
また、トランスポザーゼの発現のために、ｐＢａｔ ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅプラスミドを共に導入させた。

２．Ｎｅｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ
Ｊｕｒｋａｔ細胞にトランスポゾンベクターを導入させるために、実施例Ｂ等と同じ方法でＮｅｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎを行った。実験条件は、下記の表と同じである。

３．蛍光顕微鏡観察およびＦＡＣＳ分析
トランスポゾン別の遺伝子伝達効率を確認するために、上記の実施例と同じ方法で蛍光顕微鏡観察およびＦＡＣＳ分析を行った。

［実験結果］
実験例Ａ．ＩＴＲ探索および機能の確認
１．蛍光顕微鏡観察（図２ａ～図２ｄ）
配列番号１と配列番号２を含むＩｎｔａｃｔトランスポゾンとトランスポザーゼを単独または一緒にＴ細胞にｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）後、１、２、３、６日目に蛍光顕微鏡でＧＦＰ発現を確認した。その結果、３日目までは、ＩＴＲを含まないＧＦＰ ｃｏｎｔｒｏｌでも発現することから見て、ｔｒａｎｓｉｅｎｔに発現することが判断された。しかしながら、６日目には、ＧＦＰ ｃｏｎｔｒｏｌでは、ＧＦＰを発現する細胞は観察されなかったが、ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎとｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅが一緒にｃｏ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎされた細胞では、ＧＦＰが弱く発現することを確認し、これにより、ＩＴＲを通じて細胞の染色体内にｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎされたことが分かった。

２．ＦＡＣＳ分析（図３ａ～図３ｅ）
蛍光顕微鏡で観察された細胞をＦＡＣＳでＧＦＰ発現割合を確認した。その結果、蛍光顕微鏡観察結果と同様に、７日目にＩＴＲを含まないＧＦＰ ｃｏｎｔｒｏｌでは、ＧＦＰがほとんど発現しなかったが、ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎとｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅが一緒にｃｏ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎされた細胞では、ＧＦＰが発現することを確認した。
Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ３日後までは、程度の差はあったが、ｐＣＡＧ－ＥＧＦＰ－ＩＴＲ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎだけでなく、ＩＴＲを含まないＧＦＰ ｃｏｎｔｒｏｌでもＧＦＰが発現することから見て、ｔｒａｎｓｉｅｎｔに発現することが判断された。しかしながら、６日後の場合、ＩＴＲを含まないＧＦＰ ｃｏｎｔｒｏｌでは、ＧＦＰがほとんど発現せず、ｐＣＡＧ－ＥＧＦＰ－ＩＴＲ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎとｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅを一緒にｃｏ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎした細胞だけでＧＦＰが発現することから見て、染色体内にｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎされたことが分かった。

３．ＧＦＰ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇおよびＧＦＰ発現の確認（図５）
ｐＣＡＧ－ＥＧＦＰ－ＩＴＲ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎおよびｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅを一緒にｃｏ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎした後、７日目にＧＦＰを発現する細胞を分離（ｓｏｒｔｉｎｇ）し、分離した細胞を１０日間さらに培養した後、蛍光顕微鏡でＧＦＰ発現を確認した。その結果、ｐＣＡＧ－ＥＧＦＰ－ＩＴＲ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎおよびｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅを一緒にｃｏ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎした細胞で持続的にＧＦＰが発現することを確認し、染色体内にｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎによってｓｔａｂｌｅにＧＦＰを発現することが分かった。

４．Ｓｐｌｉｎｋｅｒｅｔｔｅ ＰＣＲ方法を用いた染色体内ＤＮＡ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ位置の確認（図６ａ～図６ｄ）
Ｓｏｒｔｉｎｇ後、ＧＦＰを発現する細胞において実際ＩＴＲによって染色体内に挿入されたかを確認するために、３個のｃｌｏｎｅに対してｓｐｌｉｎｋｅｒｅｔｔｅ ＰＣＲを用いて分析した。ＰＣＲ結果、ｓｉｎｇｌｅ ｂａｎｄのみが確認され、このｓｉｎｇｌｅ ｂａｎｄのＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔをｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇして分析した結果、それぞれ染色体（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）２、１２、および１４番に挿入されたことを確認した。

実験例Ｂ．ＩＴＲ ｍｕｔａｎｔの製作および機能の確認
上記の実験例を通じて本発明者らが発掘したトランスポゾンが対象細胞の染色体内に遺伝子を伝達および挿入させることができることを確認した。これより、本実験例では、前記トランスポゾンの３’ＩＴＲおよび５’ＩＴＲ領域に対するｄｅｌｅｔｉｏｎ ｍｕｔａｎｔを製作し、各ｍｕｔａｎｔ ｆｏｒｍの遺伝子伝達効率を比較することによって、機能がさらに改善された突然変異トランスポゾンを製作しようとした。

１．ＩＴＲに対するｍｕｔａｎｔ ｆｏｒｍの製作
本発明によるトランスポゾン突然変異を製作するためのｏｒｉｇｉｎａｌ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ ｂａｃｋｂｏｎｅベクターマップは、図７ａに示した。また、ｐＢａｔ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎの５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲを改変して得られるｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ ｍｕｔａｎｔベクターの種類を図７ｂに全体的に示した（３’ＩＴＲ ｍｕｔａｎｔ（ｒｅｖｅｒｓｅ）をも含む）。

本実験例では、ｐＢａｔのＩＴＲ配列をｐｉｇｇｙＢａｃのＩＴＲ配列とａｌｉｇｎｍｅｎｔしてｍｕｔａｎｔ ｆｏｒｍを選定し、この際、ＩＲ／ＴＲの位置は、知られたｐｉｇｇｙＢａｃ ＩＴＲ配列を基に予測した。Ｍｕｔａｎｔ形態は、ＩＴとＴＲ配列が含まれたり含まれないように、そして、ｐｉｇｇｙＢａｃとａｌｉｇｎｍｅｎｔされない位置を選定してデザインした（図１３ａおよび図１３ｂ）。

５’ＩＴＲ（１５７ｂｐ）のうち５’末端から１３ｂｐ、３３ｂｐ、７１ｂｐ、または１１０ｂｐの配列を有する４個のｍｕｔａｎｔをデザインし、３’ＩＴＲ（２１２ｂｐ）のうち３７ｂｐ、６６ｂｐ、９１ｂｐ、または１５１ｂｐの配列を有する４個のｍｕｔａｎｔをデザインした。

各ｍｕｔａｎｔの配列は、下記の通りである。後述するように、３’ＩＴＲ ｍｕｔａｎｔの場合、偶然にプラスミドの製作時にｓｅｎｓｅ鎖のｒｅｖｅｒｓｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ配列を有するａｎｔｉｓｅｎｓｅ鎖が導入されたｍｕｔａｎｔが製作されたので、これらのａｎｔｉｓｅｎｓｅ鎖の配列を共に記載した（下記の表１１で「ｒｅｖｅｒｓｅ」で表記された配列）。

上述した５’ＩＴＲと３’ＩＴＲをそれぞれ組み合わせて合計１６種のｐＢａｔトランスポゾンｍｕｔａｎｔ ｆｏｒｍに対するプラスミドを表１２のように製作しようとした。各Ｍｕｔａｎｔ遺伝子は、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社に合成を依頼して製作した。この際、トランスポゾンｏｒｉｇｉｎａｌプラスミドにｍｕｔａｎｔ遺伝子をクローニングするために、トランスポゾンベクターにおいて５’ＩＴＲの前にＢａｍＨＩ ｅｎｚｙｍｅ ｓｉｔｅを挿入し、３’ＩＴＲの後にＳａｌＩ ｅｎｚｙｍｅ ｓｉｔｅを挿入した。そして、５’ＩＴＲ ｍｕｔａｎｔは、両側にＢａｍＨＩおよびＢｓｐＱＩ ｅｎｚｙｍｅ ｓｉｔｅを入れて製作し、３’ＩＴＲ ｍｕｔａｎｔは、ＢｍｔＩとＳａｌＩ ｅｎｚｙｍｅ ｓｉｔｅを入れて製作した。

ただし、３’ＩＴＲ ｍｕｔａｎｔの場合、配列番号３Ｍ１、３Ｍ２および３Ｍ３のｓｅｎｓｅ配列でクローニングされなければならないが、３’ＩＴＲのａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ配列（すなわち、ｒｅｖｅｒｓｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ配列）の５’から３’方向がトランスポゾンのｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄの５’方向から３’方向にクローニングされ、３’ＩＴＲの５’末端に５’－ｔｔａａ－３’配列から始まるプラスミドで製作された。また、５Ｍ１ ｍｕｔａｎｔ ｆｏｒｍの場合、ＤＮＡサイズが小さくて、クローニングされなかった。したがって、５Ｍ１ ｍｕｔａｎｔを含むプラスミドは進行せず、３’ＩＴＲ ｍｕｔａｎｔは、逆に配列を含むプラスミドに進行され、名称に「ｒ」で表示した。

２．Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ７日後、Ｊｕｒｋａｔ ｃｅｌｌにおけるＧＦＰ発現観察
Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ７日後、Ｊｕｒｋａｔ ｃｅｌｌにおけるＧＦＰ発現を蛍光顕微鏡を用いて観察し、ＦＡＣＳで分析した。図８ａに示されたように、プラスミドなしにｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎだけを行った陰性対照群では、ＧＦＰ発現が観察されず、ＧＦＰを含むプラスミド（ｐＥＧＦＰ）をｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎした陽性対照群では、非常に弱くＧＦＰ発現されることを確認した。ＴｒａｎｓｐｏｓａｓｅなしにｐＢａｔトランスポゾンのみをｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎした群でも、ＧＦＰ発現が非常に低く、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンなしにｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅのみをｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎした群（ｐＢａｃ）では、ＧＦＰ発現が観察されなかった。一方、図８ｂ～図８ｅに示されたように、５Ｍ４ ｍｕｔａｎｔ ｆｏｒｍを含むすべてのグループにおいて高レベルのＧＦＰ発現が確認され、残りのトランスポゾンｍｕｔａｎｔ ｆｏｒｍ（逆に）でも、ＧＦＰ発現が観察された。
また、ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ７日後、ＧＦＰを発現するＪｕｒｋａｔ ｃｅｌｌの割合を確認するために、ＦＡＣＳ分析を行った。分析方法は、図９ａのように、ｓｉｎｇｌｅｔｓ→ｃｅｌｌｓ→ｌｉｖｅ ｃｅｌｌｓ→ＧＦＰ^＋ ｃｅｌｌｓの順にｇａｔｉｎｇして分析した。そして、Ｌｉｖｅ ｃｅｌｌにおけるＧＦＰ^＋ ｃｅｌｌの割合は、ｈｉｓｔｏｇｒａｍで分析した。分析結果、ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ７日後、ｐＥＧＦＰ群およびｐＢａｔトランスポゾンのみをｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎした群では、ＧＦＰ発現細胞の割合がそれぞれ０．５％と１．６％に過ぎず、ｐＢａｃ群のＧＦＰ発現細胞の割合は０％であったところ、ＧＦＰを発現するｓｔａｂｌｅ ｃｅｌｌが殆どないことを確認することができた（図９ａおよび表１３）。一方、本発明によるｐＢａｔ ｍｕｔａｎｔトランスポゾンを導入したグループでは、ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ後、７日が経過した後にも、ＧＦＰ発現細胞が存在することを確認した（図９ｂ～図９ｅ）。

３．Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ １４日後、Ｊｕｒｋａｔ ｃｅｌｌにおけるＧＦＰ発現観察
Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ １４日後、ＧＦＰを発現するＪｕｒｋａｔ ｃｅｌｌの割合を確認するために、ＦＡＣＳ分析を行った。分析結果、ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ １４日後、ｐＥＧＦＰ群およびｐＢａｔトランスポゾンのみをｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎした群では、ＧＦＰを発現する細胞の割合がそれぞれ０．４％および０．８％であり、ｐＢａｃ群のＧＦＰ陽性細胞の割合は、０％であり、ＧＦＰを発現する細胞が殆どないことが明らかにされた（図１０ａ）。一方、本発明によるｐＢａｔ ｍｕｔａｎｔトランスポゾンを導入したグループでは、ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ後、１４日が経過した後にも、ＧＦＰ発現細胞が存在することを確認した（図１０ｂ～図１０ｅ）。

前記結果を総合して、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ後、時間経過によるグループ別のＧＦＰ発現細胞の割合を確認した結果は、表１３および図１１に示した。

４．Ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇおよび培養後のＧＦＰ発現の確認
Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ １４日後、ｒ３Ｍ１－Ｂ５ＩＥ、ｒ３Ｍ１－５Ｍ３、ｒ３Ｍ１－５Ｍ４、ｒ３Ｍ３－Ｂ５ＩＥ、およびｒ３Ｍ３－Ｍ４処理群においてＧＦＰを発現するＪｕｒｋａｔ ｃｅｌｌをそれぞれ９６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに移した後、ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇした（図１２ａ）。次に、ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌにｓｏｒｔｉｎｇされた細胞を１４日間さらに培養した後、ＧＦＰ発現を観察した。その結果、ｒ３Ｍ１－Ｂ５ＩＥ群の細胞は、トランスポゾンのｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ後、３１日が経過した後にも、ＧＦＰを安定的に発現することを確認した（図１２ｂ）。

本実験例では、実験例Ａを通じて発掘したトランスポゾンを基に染色体内挿入効率および遺伝子発現効率に優れたトランスポゾンベクターを製作した。このために、トランスポゾンの５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲをそれぞれ改変し、４種の５’ＩＴＲ ｍｕｔａｎｔおよび４種の３’ＩＴＲ ｍｕｔａｎｔを製作した。ただし、３’ＩＴＲ ｍｕｔａｎｔの場合、ｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄでなく、３’ＩＴＲのａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ配列の５’から３’方向がトランスポゾンのｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄの５’方向から３’方向にクローニングされ、３’ＩＴＲの５’末端に５’－ｔｔａａ－３’配列から始まるプラスミドで製作された（名称に「ｒ」で表記する）。５’ＩＴＲ ｍｕｔａｎｔおよび３’ＩＴＲ ｍｕｔａｎｔを組み合わせて合計１６種のトランスポゾンベクターを製作し、これらの遺伝子伝達効率を評価した。

実験結果に示されたように、トランスポゾンベクターをｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎした後、７日目以降からは、対照群においてＧＦＰ発現はほとんど確認されなかった。一方、本発明によるトランスポゾン突然変異およびトランスポザーゼが導入された細胞は、ＧＦＰ遺伝子がＪｕｒｋａｔ ｃｅｌｌの染色体内に挿入され、ＧＦＰが安定的に発現することが確認され、特に、５Ｍ４を含むトランスポゾンベクターが導入された細胞は、相対的に高いＧＦＰ発現が確認された。

また、本発明によるトランスポゾンベクターが導入された細胞は、ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ後、１４日が経過した後にも、ＧＦＰ発現を維持し、特に、３’ＩＴＲ配列が逆に含まれたベクターでｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎされた細胞においても、ＧＦＰが安定的に発現することを確認した。

前記結果は、本発明によるトランスポゾンベクターが細胞の染色体内にターゲット遺伝子を導入させて、安定した発現を誘導できることを示す。

実験例Ｃ．ＩＴＲ ｍｕｔａｎｔの製作および機能の確認
本実験例では、実験例Ｂと同様に、本発明者らが発掘したトランスポゾンの突然変異体を製作し、染色体内挿入効率および遺伝子発現効率がさらに増進された突然変異（ｍｕｔａｎｔ）を製作した。特に、本実験例では、実験例Ｂとは異なって、３’ＩＴＲ ｍｕｔａｎｔをｓｅｎｓｅ鎖配列でクローニングし、突然別がベクターを製作した。

１．ＩＴＲに対するｍｕｔａｎｔ ｆｏｒｍの製作
Ｍｕｔａｎｔ ｆｏｒｍは、全体的に実験例Ｂと同じ方式でデザインした（図１３ａおよび図１３ｂ）。ｐＢａｔおよびｐｉｇｇｙＢａｃそれぞれのＩＴＲ配列のａｌｉｇｎｍｅｎｔ分析結果を基に４種の５’ＩＴＲ突然変異および４種類の３’ＩＴＲ突然変異を製作した。

４種の５’ＩＴＲ突然変異の各配列は、前記表１０に示したのと同一であり（５Ｍ１、５Ｍ２、５Ｍ３、および５Ｍ４）、４種の３’ＩＴＲ突然変異の各配列は、前記表１１に示したのと同一である（３Ｍ１、３Ｍ２、３Ｍ３、および３Ｍ４）。

前記５’ＩＴＲ突然変異および３’ＩＴＲ突然変異をそれぞれ組み合わせて合計２６種のｐＢａｔトランスポゾンｍｕｔａｎｔ ｆｏｒｍを製作しようとした（表１４）。このためにそれぞれのｍｕｔａｎｔ ｆｏｒｍの遺伝子は、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔに依頼して合成し、トランスポゾンｏｒｉｇｉｎａｌプラスミドにＩＴＲ ｍｕｔａｎｔをクローニングするためにトランスポゾンベクターにおいて５’ＩＴＲの前にＢａｍＨＩサイトを挿入し、３’ＩＴＲの後にＳａｌＩサイトを挿入した。そして、５’ＩＴＲ ｍｕｔａｎｔは、ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＶ、３’ＩＴＲ ｍｕｔａｎｔは、ＢｍｔＩとＳａｌＩ制限酵素を用いて製作した。

また、本実験例では、３’ＩＴＲ ｍｕｔａｎｔのａｎｔｉｓｅｎｓｅ配列でクローニングした実験例Ｂとは異なって、３’ＩＴＲ ｍｕｔａｎｔのｓｅｎｓｅ配列でクローニングを進めた（３Ｍ１、３Ｍ２、３Ｍ３、および３Ｍ４）。

２．Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ７日後、Ｊｕｒｋａｔ ｃｅｌｌにおけるＧＦＰ発現観察
製作されたトランスポゾンベクターは、ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｎｅｏｎ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）を通じてＪｕｒｋａｔ ｃｅｌｌ内に導入させた。Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ７日後、トランスポゾンの遺伝子伝達効率を確認するために、Ｊｕｒｋａｔ ｃｅｌｌにおけるＧＦＰ発現を蛍光顕微鏡を用いて観察し、ＦＡＣＳで分析した。分析結果、図１４ａのように、プラスミドなしにｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎだけを行った陰性対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）では、ＧＦＰ発現が観察されず、ＧＦＰ発現プラスミド（ｐＥＧＦＰ）をｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎした陽性対照群では、弱くＧＦＰ発現することを確認した。ＴｒａｎｓｐｏｓａｓｅなしにｐＢａｔトランスポゾンのみをｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎした群でも、ＧＦＰ発現が非常に低く、ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅおよびｉｎｔａｃｔ ｐＢａｔ（ｏｒｉｇｉｎａｌ）を共にｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎした群（ｐＢａｔ ｃｏｎｔｒｏｌ）でも、ＧＦＰ発現は低く観察された。一方、本発明によるｍｕｔａｎｔ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎをｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎした群では、概してＧＦＰが検出され、特に５Ｍ３または５Ｍ４ ｍｕｔａｎｔ ｆｏｒｍを含むグループにおいて高レベルのＧＦＰ発現が観察された（図１４ｂ～図１４ｆ）。

Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ７日後、ＧＦＰを発現するＪｕｒｋａｔ ｃｅｌｌの割合を確認するためにＦＡＣＳ分析を行った。図１５ａのように、ｓｉｎｇｌｅｔｓ→ｃｅｌｌｓ→ｌｉｖｅ ｃｅｌｌｓ→ＧＦＰ^＋ ｃｅｌｌｓの順にｇａｔｉｎｇして分析した。そして、Ｌｉｖｅ ｃｅｌｌにおけるＧＦＰ^＋ ｃｅｌｌの割合は、ｈｉｓｔｏｇｒａｍで分析した。分析結果、ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ７日後、ｐＥＧＦＰ群では、ＧＦＰ発現細胞の割合が約２％であり、ｐＢａｔトランスポゾンのみをｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎした群およびｐＢａｔ ｃｏｎｔｒｏｌ群では、約１％に過ぎなかった（図１５ａ）。

ＧＦＰ－（ｎｅｇａｔｉｖｅ）に近く基準を定めてＧＦＰ^＋ ｃｅｌｌの割合を確認した結果、本発明によるｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ ｍｕｔａｎｔが導入された群は、概してＧＦＰが高レベルで発現することが確認された（図１５ｂ～図１５ｆ）。特に、５Ｍ３または５Ｍ４ ｍｕｔａｎｔが含まれたトランスポゾンが導入された群の場合、ＧＦＰをｈｉｇｈ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙで発現するｃｅｌｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎが存在した。したがって、ｈｉｇｈ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙに近く基準を定めてＧＦＰ発現細胞の割合を確認した。その結果、５Ｍ３または５Ｍ４ ｍｕｔａｎｔを含むｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ（３’ＩＴＲでは、Ｂ３ＩＳ、３Ｍ１、３Ｍ２、または３Ｍ３を含む）が導入されたグループにおいてＧＦＰ発現が確認され、Ｂ５ＩＥ、５Ｍ１、または５Ｍ２を含むトランスポゾンを処理した群と比較したとき、ｈｉｇｈ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ＧＦＰ^＋ ｃｅｌｌの割合が顕著に高かった。

各群の一番目のｗｅｌｌサンプルでＧＦＰ発現細胞を９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅにｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌにｓｏｒｔｉｎｇして培養し、増殖した細胞は、回収および凍結し、液体窒素タンクに保管した。

３．Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ １４日後、Ｊｕｒｋａｔ ｃｅｌｌにおけるＧＦＰ発現観察
Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ １４日後、Ｊｕｒｋａｔ ｃｅｌｌにおけるＧＦＰ発現を蛍光顕微鏡を用いて観察し、ＦＡＣＳで分析した。分析結果、図１６ａのように、プラスミドなしにｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎだけを行った陰性対照群では、ＧＦＰ発現が観察されず、ＧＦＰを含むプラスミド（ｐＥＧＦＰ）をｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎした陽性対照群、およびｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅなしにｐＢａｔトランスポゾンのみをｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎした群でも、ＧＦＰがほとんど観察されなかった。ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅとｉｎｔａｃｔ ｐＢａｔ（ｏｒｉｇｉｎａｌ）を共にｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎした群（ｐＢａｔ ｃｏｎｔｒｏｌ）では、ＧＦＰが非常に低い水準で観察された。一方、本発明によるトランスポゾンｍｕｔａｎｔをｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎしたグループは、概してＧＦＰが発現したことが確認され、特に、５Ｍ３または５Ｍ４ ｍｕｔａｎｔ ｆｏｒｍを含むグループにおいて高レベルのＧＦＰの発現が確認された（図１６ｂ～図１６ｆ）。

また、ＧＦＰを発現するＪｕｒｋａｔ ｃｅｌｌの割合を確認するためにＦＡＣＳ分析を行った結果、ｐＥＧＦＰ群、ｐＢａｔトランスポゾンのみをｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎした群、およびｐＢａｔ ｃｏｎｔｒｏｌ群は、全部、ＧＦＰ発現細胞の割合が約１％に過ぎず、ＧＦＰを発現する細胞が殆どないことが確認された（図１７ａ）。

ＧＦＰ－（ｎｅｇａｔｉｖｅ）に近く基準を定めてＧＦＰ^＋ ｃｅｌｌの割合を確認した結果、本発明によるｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ ｍｕｔａｎｔが導入された群は、概してＧＦＰが高レベルで発現した（図１７ｂ～図１７ｆ）。特に、５Ｍ３または５Ｍ４ ｍｕｔａｎｔ ｆｏｒｍを含むトランスポゾンが導入された群は、その他の群に比べて、ＧＦＰ陽性細胞の割合が高いことが示された。また、Ｈｉｇｈ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙに近く基準を定めてＧＦＰ^＋ ｃｅｌｌの割合を確認した結果でも、同じ傾向性が確認された。

前記結果を総合して、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ後、時間経過によるグループ別ＧＦＰ発現細胞の割合を確認した結果は、表１５と図１７ｇおよび図１７ｈに示した。表および図面から確認できるように、５Ｍ３または５Ｍ４ ｍｕｔａｎｔ ｆｏｒｍを含むトランスポゾンが特に遺伝子伝達効率が高かった。

本実験例では、実験例Ａを通じて発掘したトランスポゾンを基に染色体内挿入効率および遺伝子発現効率に優れたトランスポゾンベクターを製作した。このために、トランスポゾンの５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲをそれぞれ改変して４種の５’ＩＴＲ ｍｕｔａｎｔおよび４種の３’ＩＴＲ ｍｕｔａｎｔを製作した。製作された５’ＩＴＲ ｍｕｔａｎｔおよび３’ＩＴＲ ｍｕｔａｎｔは、全部、実験例Ｂで製作されたのと同一であり、ただし、実験例Ｂのように、３’ＩＴＲ ｍｕｔａｎｔをｒｅｖｅｒｓｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ配列でクローニングせず、本来意図に合うように正方向の配列（ｓｅｎｓｅ鎖配列）でクローニングして製作した。５’ＩＴＲ ｍｕｔａｎｔおよび３’ＩＴＲ ｍｕｔａｎｔを組み合わせて合計２６種のトランスポゾンベクターを製作し、これらの遺伝子伝達効率を評価した。

実験結果に示されたように、トランスポゾンベクターをｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎした後、７日目以降からは、対照群においてＧＦＰ発現はほとんど確認されなかった。一方、本発明によるトランスポゾン突然変異およびトランスポザーゼが導入された細胞は、概してＧＦＰ遺伝子がＪｕｒｋａｔ ｃｅｌｌの染色体内に挿入され、ＧＦＰが安定的に発現することが確認され、特に、５Ｍ３または５Ｍ４を含むトランスポゾンベクターが導入された細胞は、ｏｒｉｇｉｎａｌトランスポゾンを含むその他トランスポゾンベクターが導入された細胞に比べて相対的に高いＧＦＰ発現が確認された。すなわち、これは、ＩＴＲのうち５Ｍ３および５Ｍ４に該当する部分がトランスポゾンの遺伝子伝達および染色体内挿入に必須の領域であることを示唆し、本発明によるトランスポゾン突然変異ベクターが細胞の染色体内にターゲット遺伝子を導入させて安定した発現を誘導できることを示す。

実験例Ｄ．ＰＢＭＣに対するｐＢａｔトランスポゾンの遺伝子伝達効率の確認
実施例Ｄで記述したように、Ｍａｘｃｙｔｅ装備を用いてＰＢＭＣにおけるｐＢａｔ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎシステムによる遺伝子伝達効率を確認しようとした。このために、ＧＦＰ遺伝子を含むｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ（Ｎａｉｖｅ－ＧＦＰ、３Ｍ３－５Ｍ３－ＧＦＰ）および１Ｇ４ ＴＣＲ遺伝子を含むｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ（Ｂ３ＩＳ－Ｂ５ＩＥ－１Ｇ４、３Ｍ３－５Ｍ３－１Ｇ４）を用いてｍｕｔａｎｔ ｆｏｒｍ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎの遺伝子伝達効率を比較した。

１．蛍光顕微鏡を用いたＧＦＰ発現観察
Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ １日後および７日後にｐＢａｔ－ＧＦＰグループにおいてＧＦＰが発現することか蛍光顕微鏡で観察した。Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ １日後にｐＥＧＦＰとｐＢａｔ－ＧＦＰグループの全部でＧＦＰが発現することを図１８ａのように確認した。Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ７日後には、図１８ｂのように、ｐＥＧＦＰグループではＧＦＰが観察されなかったが、ｐＢａｔ－ＧＦＰグループでは、ＧＦＰが発現することを観察し、これは、ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅによってトランスポゾンベクターのＩＴＲ内にあるＧＦＰ遺伝子がＰＢＭＣの染色体内に挿入（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）されて安定（ｓｔａｂｌｅ）に発現するためであると判断される。また、Ｎａｉｖｅ－ＧＦＰ群より３Ｍ３－５Ｍ３－ＧＦＰ群においてＧＦＰが強く発現することから見て、ＩＴＲ配列を改変（ｍｕｔａｔｉｏｎ）した３Ｍ３－５Ｍ３ベクターが遺伝子挿入および発現効率が高いと思われる。

２．細胞生存率および細胞数の変化観察
Ｍａｘｃｙｔｅ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ後、細胞生存率および細胞数の変化を確認するために、ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ １日後および１４日後に細胞計数を進めた。下記の表１６のように、ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ １日後にＮＯ ＥＰ群（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎしない群）とｃｏｎｔｒｏｌ群（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎだけを行った群）では、９０％以上の高い生存率を示したが、ｐＥＧＦＰ群では、６９．５％の生存率を示し。ｐＢａｔトランスポゾンを導入したグループでは、全部約３３％～６２％の低い生存率を示した。細胞数も、ｐＥＧＦＰ群とｐＢａｔトランスポゾン群（３Ｍ３－５Ｍ３－１Ｇ４＋ＤＮＡ群除外）において全部１×１０^６個以下計数されたところ、最初ｓｅｅｄｉｎｇされたＰＢＭＣ細胞数（４×１０^６個）に比べて７５％以上減少したことが示された。一方、ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ １４日後には、すべてのグループにおいて８８％以上の良好な生存率を確認し、細胞数も、ｐＢａｔ－ＧＦＰ群が、約２×１０^６～６×１０^６個、ｐＢａｔ－１Ｇ４グループが、約３．８×１０^６～１２×１０^６個であることが確認されたところ、培養期間中に細胞が増殖するにつれて全体的に細胞数が増加したことを確認した。特に、ｐＢａｔ－１Ｇ４グループにおいて細胞が多く増殖したことが示された。前記結果は、ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎによって細胞が損傷を受けて１日後に生存率が大きく低下したが、培養期間中に回復しながら増殖し、１４日後には、細胞生存率と数が共に増加したためであると判断される。また、添加されたｆｅｅｄｅｒ ｃｅｌｌ（放射線照射されたＡ３７５細胞）が１Ｇ４ ＴＣＲのｃｏｕｎｔｅｒ ｐａｒｔｎｅｒであるＨＬＡ＊０２：０１およびＮＹ－ＥＳＯ１を発現しているので、ｆｅｅｄｅｒ ｃｅｌｌによって１Ｇ４ ＴＣＲを発現するＴ細胞が活性化して増殖したと判断される。

３．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ７日後のｐＢａｔ－ＧＦＰグループのＦＡＣＳ分析
Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ７日後、ＦＡＣＳ分析を通じてＧＦＰの発現割合を確認した。図１９ａに示されたように、ｓｉｎｇｌｅｔｓ→ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ→ｌｉｖｅ細胞→ＣＤ３^＋Ｔ細胞→ＧＦＰ^＋Ｔ細胞→ＣＤ８^＋Ｔ細胞の順にｇａｔｉｎｇして、ＣＤ３^＋Ｔ細胞への遺伝子伝達効率を確認し、遺伝子が伝達されたＴ細胞のうちＣＤ８^＋ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ細胞の割合も分析した。

Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ７日後、ＣＤ３^＋Ｔ細胞のうちＧＦＰを発現する細胞の割合は、ｃｏｎｔｒｏｌ群では０％、ｐＥＧＦＰ群では０．４７％であった（図１９ａ）。一方、Ｎａｉｖｅ－ＧＦＰ＋ＤＮＡ群では、ＧＦＰ^＋Ｔ細胞の割合が６．９４％および３．６１％であることが確認され、３Ｍ３－５Ｍ３－ＧＦＰ＋ＤＮＡ群では、２．５８％および６．４３％であり、対照群よりも増加したことが確認された（図１９ｂ）。また、ＧＦＰ^＋Ｔ細胞のうちＣＤ８^＋Ｔ細胞の割合を確認した結果、ｐＢａｔ ｎａｉｖｅグループが約３５％、ｐＢａｔ ３Ｍ３－５Ｍ３グループが約６０％であることが確認された。これを通じて、ｐＢａｔ－ＧＦＰグループは、ＧＦＰ遺伝子が伝達されたＴ細胞が特異的に増殖されたものでなく、無作為的にＴ細胞の増殖が行われたと判断される。

また、ｓｉｎｇｌｅｔｓ→ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ→ｌｉｖｅ細胞→ＣＤ３^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞あるいはＣＤ３^＋ＣＤ８^－Ｔ細胞→ＧＦＰ^＋細胞にｇａｔｉｎｇして、ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ７日後、ＣＤ３^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞とＣＤ３^＋ＣＤ８^－Ｔ細胞における遺伝子伝達効率を分析した。その結果、図２０ａおよび図２０ｂに示されたように、ＣＤ３^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞とＣＤ３^＋ＣＤ８^－Ｔ細胞におけるＧＦＰ^＋細胞の割合は、グループ別に約１％～８％であり、大きな差を示さなかった。

４．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ７日後のｐＢａｔ １Ｇ４グループのＦＡＣＳ分析
Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ７日後、ＦＡＣＳ分析を通じて１Ｇ４ ＴＣＲの発現割合を確認した。分析方法は、図２１ａに示されたように、ｓｉｎｇｌｅｔｓ→ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ→ｌｉｖｅ細胞→ＣＤ３^＋Ｔ細胞→ｍＴＣＲβ^＋Ｔ細胞→ＣＤ８^＋Ｔ細胞の順にｇａｔｉｎｇしてＣＤ３^＋Ｔ細胞への遺伝子伝達効率を確認し、遺伝子が伝達されたＴ細胞のうちＣＤ８^＋ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ細胞の割合も分析した。

Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ７日後、ＣＤ３^＋Ｔ細胞のうちｍＴＣＲβ^＋細胞の割合は、ｃｏｎｔｒｏｌ群では０％であるのに対し、Ｂ３ＩＳ－Ｂ５ＩＥ－１Ｇ４＋ＤＮＡ群では４０．７％および３５．８％であり、３Ｍ３－５Ｍ３－１Ｇ４＋ＤＮＡ群では５３．７％、５０．２％、６８．８％、および５５．１％であることが確認されたところ、３Ｍ３－５Ｍ３－１Ｇ４ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎおよびｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ ＤＮＡの組み合わせにおいてｍＴＣＲβ＋細胞の割合が最も高いことを確認した（図２１ａおよび図２１ｂ）。また、ｍＴＣＲβ^＋Ｔ細胞集団（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）においてＣＤ８^＋Ｔ細胞の割合を分析した結果、全体的に約６１～６９％で同様の割合で存在することを確認した。

また、ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ７日後、ｍＴＣＲβを発現するＣＤ８^＋Ｔ細胞およびＣＤ８^－Ｔ細胞の割合を分析するために、ｓｉｎｇｌｅｔｓ→ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ→ｌｉｖｅ細胞→ＣＤ３^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞あるいはＣＤ３^＋ＣＤ８^－Ｔ細胞→ｍＴＣＲβ＋細胞にｇａｔｉｎｇして、各Ｔ細胞における遺伝子伝達効率を分析した。その結果、図２２ａおよび図２２ｂに示されたように、ＣＤ３^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞あるいはＣＤ３^＋ＣＤ８^－Ｔ細胞のうちｍＴＣＲβ^＋細胞の割合は、ＣＤ３^＋ＣＤ８^－Ｔ細胞よりもＣＤ３^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞においてさらに高かった。

５．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ １４日後のｐＢａｔ－ＧＦＰグループのＦＡＣＳ分析
Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ １４日後、ＣＤ３^＋Ｔ細胞のうちＧＦＰを発現する細胞の割合は、ｃｏｎｔｒｏｌおよびｐＥＧＦＰ群が全部０％であった。一方、Ｎａｉｖｅ－ＧＦＰ＋ＤＮＡ群では、ＧＦＰを発現するＣＤ３^＋Ｔ細胞の割合が１．６２％および５．２４％であり、３Ｍ３－５Ｍ３－ＧＦＰ＋ＤＮＡ群では、０．８１％および４．３１％であったところ、ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ７日後に観察したのと同様の傾向が確認された（図２３ａおよび図２３ｂ）。ｐＢａｔ ｎａｉｖｅグループおよびｐＢａｔ ３Ｍ３－５Ｍ３グループ間に有意差が観察されず、ＧＦＰ^＋Ｔ細胞のうちＣＤ８^＋Ｔ細胞の割合は、ｐＢａｔ ｎａｉｖｅグループでは約４１％であり、ｐＢａｔ ３Ｍ３－５Ｍ３グループでは約６０％であることが確認された。また、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ １４日後、ＣＤ３^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞とＣＤ３^＋ＣＤ８^－Ｔ細胞における遺伝子伝達効率を分析した結果、図２４ａおよび図２４ｂに示されたように、ＣＤ３^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞およびＣＤ３^＋ＣＤ８^－Ｔ細胞におけるＧＦＰ^＋細胞の割合は、約１％～１０％であり、差異がなかった。

６．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ １４日後のｐＢａｔ １Ｇ４グループのＦＡＣＳ分析
Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ １４日後、ＦＡＣＳ分析を通じて１Ｇ４ ＴＣＲの発現割合を確認した。分析方法は、図２５ａのように、ｓｉｎｇｌｅｔｓ→ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ→ｌｉｖｅ細胞→ＣＤ３^＋Ｔ細胞→ｍＴＣＲβ^＋Ｔ細胞→ＣＤ８^＋Ｔ細胞の順にｇａｔｉｎｇして、ＣＤ３^＋Ｔ細胞への遺伝子伝達効率を確認し、遺伝子が伝達されたＴ細胞のうちＣＤ８^＋ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ細胞の割合も分析した。

Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ １４日後、ＣＤ３^＋Ｔ細胞のうちｍＴＣＲβ^＋細胞の割合は、ｃｏｎｔｒｏｌ群では０％であり、Ｂ３ＩＳ－Ｂ５ＩＥ－１Ｇ４＋ＤＮＡ群では２５．１％および２７．２％であり、３Ｍ３－５Ｍ３－１Ｇ４＋ＤＮＡ群では４２．１％、３６．０％、５０．０％、および３５．３％であったところ、ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ７日後よりも全体的に若干減少したが、３Ｍ３－５Ｍ３－１Ｇ４ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎおよびｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ ＤＮＡの組み合わせにおいてｍＴＣＲβ^＋細胞の割合が最も高いことを確認した（図２５ａおよび図２５ｂ）。また、ｍＴＣＲβ^＋Ｔ細胞のうちＣＤ８^＋Ｔ細胞の割合を分析した結果、全体的に約７５％～９０％であり、グループ間の大きな差がなく、ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ７日後よりも全体的に増加したことを確認した。これは、培養時に添加されたｆｅｅｄｅｒ ｃｅｌｌによって１Ｇ４ ＴＣＲを発現するＣＤ８^＋ Ｔ ｃｅｌｌが増加したことに起因した結果と判断される。

また、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ １４日後、ＣＤ３^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞およびＣＤ３^＋ＣＤ８^－Ｔ細胞における遺伝子伝達効率を分析した。その結果、図２６ａおよび図２６ｂに示されたように、ＣＤ３^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞におけるｍＴＣＲβ^＋細胞の割合がＣＤ３^＋ＣＤ８^－Ｔ細胞のものより高く、ＣＤ３^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞のうちｍＴＣＲβ^＋細胞の割合は、ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ７日後の割合と同様であったが、ＣＤ３^＋ＣＤ８^－Ｔ細胞のうちｍＴＣＲβ^＋細胞の割合は、すべてのグループにおいて７日後の結果と比較して大きく減少した。

以上の結果から分かるように、ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ １日後には、陰性対照群に比べて、トランスポゾンおよびトランスポザーゼ（プラスミドＤＮＡ）を含む群におい細胞数および生存率が相対的に低かった。しかしながら、培養期間中に細胞が増殖しつつ、ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ７日後には、トランスポゾンおよびトランスポザーゼが導入された細胞の数が大きく増加し、生存率も、陰性対照群より増加した。Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ １日後、放射線照射されたＡ３７５細胞をｆｅｅｄｅｒ ｃｅｌｌに追加して培養した後にＧＦＰあるいは１Ｇ４ ＴＣＲ発現を観察した結果、ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ７日目にＣＤ３^＋Ｔ細胞のうちＧＦＰ発現細胞の割合は１～７％であり、１４日目には０．８～６％であった。一方、ＣＤ３^＋Ｔ細胞のうち１Ｇ４ ＴＣＲ発現細胞の割合は、ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ７日目に１４～６９％であり、１４日目に１０～５０％であり、非常に高く現れた。このように、ＧＦＰ発現細胞の割合に比べて、１Ｇ４ ＴＣＲ発現細胞の割合が特に高い理由は、ｆｅｅｄｅｒ ｃｅｌｌであるＡ３７５細胞が１Ｇ４ ＴＣＲのターゲット抗原であるＮＹ－ＥＳＯ－１を発現していて、前記抗原によって活性化したＴ細胞が活発に増殖したためと判断される。これは、ｐＢａｔ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎシステムを用いてｐｒｉｍａｒｙ Ｔ細胞に遺伝子を伝達するとき、遺伝子が導入されたＴ細胞を培養期間中に抗原等で刺激する場合、さらに高い遺伝子伝達効率を得ることができることを示唆する。

ＣＤ３^＋Ｔ細胞のうちＣＤ８^＋またはＣＤ８－Ｔ細胞への遺伝子伝達は、ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ７日目および１４日目の両方でＣＤ８^－Ｔ細胞よりＣＤ８^＋Ｔ細胞への遺伝子伝達効率がさらに高かった。また、Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎのｍｕｔａｎｔ ｆｏｒｍによる遺伝子伝達効率を比較した結果、３Ｍ３－５Ｍ３－１Ｇ４ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎを導入したグループにおいて１Ｇ４ ＴＣＲ発現Ｔ細胞の割合が最も高いことが確認された。前記結果は、本発明によるトランスポゾンシステムがＰＢＭＣでも優れた遺伝子伝達機能を行うことを示す。

実験例Ｅ．ｐＢａｔトランスポゾンシステムを用いたＴＣＲ－Ｔ製作時のＴ細胞の活性化時期による遺伝子伝達効率の確認
健常者のＰＢＭＣにｐＢａｔトランスポゾンシステムで１Ｇ４ ＴＣＲ遺伝子を伝達して１Ｇ４ ＴＣＲ－Ｔ細胞を製作するに際して、Ｔ細胞の活性化時期によって１Ｇ４ ＴＣＲ遺伝子の伝達および発現効率に差異があるかを確認した。

１．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ７日後の１Ｇ４ ＴＣＲ発現分析
実験に使用したＴＣＲのｃｏｎｓｔａｎｔ ｒｅｇｉｏｎがｍｏｕｓｅ ｃｏｎｓｔａｎｔ ｒｅｇｉｏｎであるから、これに対する抗体を用いたＦＡＣＳ分析を通じて１Ｇ４ ＴＣＲの発現割合を確認し、分析方法は、図２７のように、ｓｉｎｇｌｅｔｓ→ｌｉｖｅ細胞→ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ→ＣＤ３^＋Ｔ細胞→ｍＴＣＲβ^＋Ｔ細胞の順にｇａｔｉｎｇして、ＣＤ３^＋Ｔ細胞への遺伝子伝達効率を確認した。
Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ７日後、放射線照射されたＡ３７５細胞を用いてＴ細胞を活性化させたグループは、全部、目視で観察時に細胞増殖率が低く、図２７に示されたように、ＣＤ３^＋Ｔ細胞のうちｍＴＣＲβ^＋Ｔ細胞がほとんど観察されなかった。

２．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ １０日後の１Ｇ４ ＴＣＲ発現分析
Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ １０日後、ＣＤ３^＋Ｔ細胞のうち１Ｇ４ ＴＣＲ遺伝子発現効率を確認し、ＣＤ８とＣＤ４マーカーを用いて１Ｇ４ ＴＣＲを発現するＴ細胞（ＣＤ３^＋ｍＴＣＲβ^＋Ｔ細胞）のうちＣＤ８^＋あるいはＣＤ４^＋Ｔ細胞の割合を分析し、また、ＣＤ４５ＲＡとＣＤ６２Ｌマーカーを用いてｍｅｍｏｒｙタイプＴ細胞の割合も分析した。

Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ １０日後、ＣＤ３^＋Ｔ細胞のうちｍＴＣＲβを発現する細胞の割合は、図２８のように、Ｎｏ ＥＰ、ＥＰ ｏｎｌｙ、および３Ｍ３－５Ｍ３－ＧＦＰ＋ＤＮＡ（１日後）グループが全部０％であった。一方、３Ｍ３－５Ｍ３－１Ｇ４＋ＤＮＡ（直後）グループのｍＴＣＲβ発現細胞の割合は、５６％であり、３Ｍ３－５Ｍ３－１Ｇ４＋ＤＮＡ（１日後）グループは、２０％であることが確認されたところ、放射線照射されたＡ３７５細胞をｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ直後に追加したグループにおいてｍＴＣＲβ発現細胞の割合がさらに高いことを確認した。

また、１Ｇ４ ＴＣＲ発現Ｔ細胞のうちＣＤ８^＋Ｔ細胞とＣＤ４^＋Ｔ細胞の割合を測定した結果、３Ｍ３－５Ｍ３－１Ｇ４＋ＤＮＡ（直後）グループは、それぞれ２２％および７３％であることが確認され、３Ｍ３－５Ｍ３－１Ｇ４＋ＤＮＡ（１日後）グループは、それぞれ２８％および６７％であることが確認されたところ、ＣＤ８^＋Ｔ細胞に比べてＣＤ４^＋Ｔ細胞の割合が約３倍程度さらに高いことを確認した。

ＭｅｍｏｒｙタイプＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ６２Ｌマーカーを用いて区分することができる。ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ６２ＬマーカーとしてＭｅｍｏｒｙタイプＴ細胞の区別時に、ＣＤ４５ＲＡ^＋ＣＤ６２Ｌ^－Ｔ細胞は、Ｔｅｆｆ、ＣＤ４５ＲＡ^－ＣＤ６２Ｌ^＋Ｔ細胞は、Ｔｅｍ、ＣＤ４５ＲＡ^－ＣＤ６２Ｌ^＋Ｔ細胞は、Ｔｃｍ、ＣＤ４５ＲＡ^＋ＣＤ６２Ｌ^＋Ｔ細胞は、Ｔｓｃｍ細胞に区分される。１Ｇ４ ＴＣＲを発現するＴ細胞のうちｍｅｍｏｒｙタイプＴ細胞の割合は、３Ｍ３－５Ｍ３－１Ｇ４＋ＤＮＡ（直後）群では、Ｔｅｆｆ ０％、Ｔｅｍ ２％、Ｔｃｍ ７９％、およびＴｓｃｍ ２０％であり、３Ｍ３－５Ｍ３－１Ｇ４＋ＤＮＡ（１日後）群では、Ｔｅｆｆ ０％、Ｔｅｍ ５％、Ｔｃｍ ８２％、およびＴｓｃｍ １３％であったところ、Ｔｃｍ細胞が最も多く存在し、Ｔｓｃｍ細胞が２番目に多く存在することを確認した（表１７）。

３．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ １４日後の１Ｇ４ ＴＣＲ発現分析
Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ １４日後、ＣＤ３^＋Ｔ細胞のうちｍＴＣＲβを発現する細胞の割合は、図２９のように、Ｎｏ ＥＰ、ＥＰ ｏｎｌｙ、および３Ｍ３－５Ｍ３－ＧＦＰ＋ＤＮＡ（１日後）グループにおいて全部０％であった。一方、３Ｍ３－５Ｍ３－１Ｇ４＋ＤＮＡ（直後）グループおよび３Ｍ３－５Ｍ３－１Ｇ４＋ＤＮＡ（１日後）グループは、ＣＤ３^＋Ｔ細胞のうちｍＴＣＲβ発現細胞の割合がそれぞれ７３％および１５％であったところ、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ後、１０日後の結果と同様に、放射線照射されたＡ３７５細胞をｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ直後に追加したグループにおいてｍＴＣＲβ発現細胞の割合がさらに高いことを確認した。

１Ｇ４ ＴＣＲ発現Ｔ細胞内ＣＤ８^＋Ｔ細胞およびＣＤ４^＋Ｔ細胞の割合は、３Ｍ３－５Ｍ３－１Ｇ４＋ＤＮＡ（直後）群は、それぞれ２１％および７５％であり、３Ｍ３－５Ｍ３－１Ｇ４＋ＤＮＡ（１日後）群は、それぞれ３４％および６２％であることが確認されたところ、ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ７日目の結果と同様に、ＣＤ８^＋Ｔ細胞よりＣＤ４^＋Ｔ細胞の割合が約２～３倍程度さらに多いことが分かった。

ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ６２Ｌマーカーを用いてｍｅｍｏｒｙタイプＴ細胞を区分する場合、１Ｇ４ ＴＣＲ発現Ｔ細胞内ｍｅｍｏｒｙタイプＴ細胞の割合は、３Ｍ３－５Ｍ３－１Ｇ４＋ＤＮＡ（直後）群では、Ｔｅｆｆ ０％、Ｔｅｍ ３％、Ｔｃｍ ７７％、およびＴｓｃｍ ２０％であり、３Ｍ３－５Ｍ３－１Ｇ４＋ＤＮＡ（１日後）群では、Ｔｅｆｆ ５％、Ｔｅｍ １４％、Ｔｃｍ ５９％、およびＴｓｃｍ ２２％であったところ、Ｔｃｍ細胞が最も多く存在し、Ｔｓｃｍ細胞が２番目に多く存在した（表１８）。

以上の結果を総合して、ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎでベクター導入後、ｆｅｅｄｅｒ ｃｅｌｌと共培養された細胞のＥｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ７日、１０日、および１４日後の細胞生存率を比較してみれば、図３０ａのように、Ｎｏ ＥＰおよびＥＰ ｏｎｌｙ群を除いたグループにおいて７日後の生存率が減少してから次第に回復することを確認した。１Ｇ４ ＴＣＲ発現Ｔ細胞の割合は、図３０ｂのように、３Ｍ３－５Ｍ３－１Ｇ４＋ＤＮＡ（直後）群において１０日と１４日後に全部最も高かった。前記結果は、トランスポゾンおよびトランスポザーゼプラスミドをｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎで細胞内に導入した後、１日以上が経過した後に、ｆｅｅｄｅｒ ｃｅｌｌｓを追加することよりも、ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ直後にｆｅｅｄｅｒ ｃｅｌｌｓを追加してＴ細胞を活性化させることが、遺伝子伝達および発現に有利であることを示す。

実験例Ｆ．ｐＢａｔトランスポゾンシステムを用いたＣＡＲ－Ｔの製作
上記の実験例でｐＢａｔトランスポゾンシステムでＰＢＭＣにＴＣＲ遺伝子を伝達してＴＣＲ－Ｔ細胞を製作することができることを確認したところ、次に、本発明のトランスポゾンシステムがＴＣＲ遺伝子の他に他の遺伝子も効果的に伝達して遺伝子組み換えＴ細胞を製作できるかを確認しようとした。このために、本実施例では、３Ｍ３－５Ｍ３ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎベクターにおいて５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲの間のＴＣＲ遺伝子をＣＤ１９ ＣＡＲ遺伝子に代替して、３Ｍ３－５Ｍ３－ＣＤ１９ ＣＡＲベクターを製作した。遺伝子伝達のために、Ｍａｘｃｙｔｅ装備を用いて３Ｍ３－５Ｍ３－ＣＤ１９ ＣＡＲ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎベクターおよびｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅベクターを共にＰＢＭＣにｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎし、培養する中に、ＣＤ１９を発現するＣＡＲ－Ｔ細胞の割合を確認し、ｐＢａｔトランスポゾンシステムによるＣＡＲ－Ｔ製作効率を確認しようとした。

１．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ７日後のＣＤ１９ ＣＡＲ発現分析
Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ７日後、ＦＡＣＳ分析を通じてＣＤ１９ ＣＡＲの発現を確認した。分析方法は、図３１のようにｓｉｎｇｌｅｔｓ→ｌｉｖｅ細胞→ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ→ＣＤ３^＋Ｔ細胞→ＦＬＡＧ^＋Ｔ細胞→ＣＤ８^＋あるいはＣＤ４^＋Ｔ細胞の順にｇａｔｉｎｇして、ＣＤ３^＋Ｔ細胞へのＣＤ１９ ＣＡＲ遺伝子伝達効率を確認し、遺伝子が伝達されたＴ細胞のうちＣＤ８^＋またはＣＤ４^＋Ｔ細胞の割合も分析した。ＴｒａｎｓｐｏｓｏｎベクターのＣＤ１９ ＣＡＲ遺伝子においてｌｅａｄｅｒ配列およびＣＤ１９ｓｃＦｖの間にＦＬＡＧ ｔａｇ配列が位置しているので、ＣＤ１９ ＣＡＲタンパク質の発現は、ａｎｔｉ－ＦＬＡＧ ｔａｇ抗体で確認した。

Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ７日後、ＣＤ３^＋Ｔ細胞のうちＦＬＡＧを発現する細胞の割合は、プラスミドなしにｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ（ＥＰ）だけを進めたＥＰ ｏｎｌｙ陰性対照群では、Ｔ細胞の活性化時期に関係なく、０％であることを確認した。一方、３Ｍ３－５Ｍ３ ＣＤ１９ ＣＡＲをｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎで導入した後、Ｔ細胞を活性化させたグループ（３Ｍ３－５Ｍ３ ＣＤ１９ ＣＡＲ）は、ＦＬＡＧ陽性ＣＤ３^＋細胞の割合が５９％と非常に高く現れた。ＦＬＡＧ発現Ｔ細胞内ＣＤ８^＋細胞およびＣＤ４^＋細胞の割合は、それぞれ３８％および５７％であったところ、ＣＤ４^＋Ｔ細胞が多く存在することを確認した（図３１）。

２．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ７日後のＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞の割合の確認
Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ７日後、３Ｍ３－５Ｍ３－ＣＤ１９ ＣＡＲグループにおけるＣＤ１９ ＣＡＲ発現Ｔ細胞の割合を確認した結果、図３２ａに示されたように、３Ｍ３－５Ｍ３－ＣＡＲを導入したグループにおいて約５９％と非常に高レベルが確認された。また、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現Ｔ細胞内ＣＤ８^＋あるいはＣＤ４^＋細胞の割合を比較した結果、ＣＤ４^＋細胞の割合がＣＤ８^＋細胞に比べて高いことが分かった（図３２ｂ）。
前記結果を通じて、本発明によるトランスポゾンシステムは、ＴＣＲだけでなく、ＣＡＲ遺伝子も効果的に細胞内に伝達して発現させることができることが確認された。特に、ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎでトランスポゾンおよびトランスポザーゼを導入した後、Ｔ細胞を活性化すると、遺伝子伝達および発現効率がさらに向上することができると判断される。

実験例Ｇ．ｐＢａｔトランスポゾンシステムを用いたＣＡＲ－Ｔ製作のさらなる検証
上記の実施例と同様に、ＣＡＲ遺伝子を含む本発明のトランスポゾンシステムを用いてＰＢＭＣに前記遺伝子を導入し、ＣＡＲ－Ｔ細胞が効果的に製作されたかをさらに検証した。

１．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ後の培養された総細胞数の確認
Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ７日後、培養された細胞の生存率と総細胞数を確認した結果は、下記の表１９に示した。

２．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ７日後のＣＤ１９ ＣＡＲタンパク質発現分析
ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎベクターに挿入されたＣＤ１９ ＣＡＲ遺伝子においてｌｅａｄｅｒ配列およびＣＤ１９ｓｃＦｖの間にＦＬＡＧ ｔａｇ遺伝子が存在するので、前記遺伝子が導入されて発現する細胞は、ａｎｔｉ－ＦＬＡＧ ｔａｇ抗体を用いたＦＡＣＳで確認した。分析方法は、図３３のように、ｓｉｎｇｌｅｔｓ→ｌｉｖｅ細胞→ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ→ＣＤ３^＋Ｔ細胞→ＦＬＡＧ^＋Ｔ細胞の順にｇａｔｉｎｇして、ＣＤ３^＋Ｔ細胞内へのＣＤ１９ ＣＡＲ遺伝子の伝達効率を確認した。また、ＣＤ８およびＣＤ４マーカーを用いてＣＤ１９ ＣＡＲを発現するＴ細胞（ＣＤ３^＋ＦＬＡＧ^＋Ｔ細胞）のうちＣＤ８^＋あるいはＣＤ４^＋Ｔ細胞の割合を分析し、ＣＤ４５ＲＡとＣＣＲ７マーカーを用いてｍｅｍｏｒｙタイプＴ細胞の割合も分析した。ＣＤ４５ＲＡとＣＣＲ７マーカーを用いたｍｅｍｏｒｙタイプＴ細胞の区分時に、ＣＤ４５ＲＡ^＋ＣＣＲ７^－Ｔ細胞は、Ｔｅｆｆ（Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｔ ｃｅｌｌ）、ＣＤ４５ＲＡ^－ＣＣＲ７^＋Ｔ細胞は、Ｔｅｍ（Ｅｆｆｅｃｔ ｍｅｍｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌ）、ＣＤ４５ＲＡ^－ＣＣＲ７^＋Ｔ細胞は、Ｔｃｍ（Ｃｅｎｔｒａｌ ｍｅｍｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌ）、ＣＤ４５ＲＡ^＋ＣＣＲ７^＋Ｔ細胞は、Ｔｓｃｍ（Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｌｉｋｅ ｍｅｍｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌ）に区分される。
Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ７日後、ＣＤ３^＋Ｔ細胞のうちＦＬＡＧを発現する細胞の割合は、図３３のように、プラスミドなしにｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ（ＥＰ）だけを進めた陰性対照群であるＥＰ ｏｎｌｙ群では０％であった。一方、ＣＤ１９ ＣＡＲ遺伝子を含んだトランスポゾンおよびトランスポザーゼベクターを導入させた３Ｍ３－５Ｍ３ ＣＤ１９ ＣＡＲ群（「ＣＤ１９ ＣＡＲ＋ＤＮＡ」）の場合、ＦＬＡＧ発現細胞の割合が６５％に達した。そして、ＣＤ１９ ＣＡＲ＋ＤＮＡ群においてＦＬＡＧ発現Ｔ細胞内ＣＤ８^＋Ｔ細胞およびＣＤ４^＋Ｔ細胞の割合は、それぞれ２７％と７１％であり、ＣＤ４^＋Ｔ細胞が相対的にさらに多く存在することを確認した。また、ＣＤ１９ ＣＡＲ＋ＤＮＡ群においてＦＬＡＧ発現Ｔ細胞内ｍｅｍｏｒｙタイプＴ細胞の割合は、Ｔｅｆｆ ３％、Ｔｅｍ １２％、Ｔｃｍ ７６％、およびＴｓｃｍ １０％であり、Ｔｃｍ細胞が最も多く存在し、Ｔｓｃｍ細胞も１０％程度存在することを確認した。

ＣＤ１９ ＣＡＲ遺伝子を含むトランスポゾンベクターおよびトランスポザーゼベクターのｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ後、Ｔ細胞を活性化し、ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ７日目に細胞生存率を確認した結果は、図３４ａに、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現Ｔ細胞の割合を確認した結果は図３４ｂに示し、ｍｅｍｏｒｙタイプＴ細胞の割合を確認した結果は図３４ｃに示した。
前記結果を通じて、本発明によるトランスポゾンシステムは、ＴＣＲだけでなく、ＣＡＲ遺伝子も効果的に細胞内に効果的に伝達することができ、また、伝達された遺伝子が正常に発現することが確認された。したがって、本発明のトランスポゾンシステム利用時に高収率でＣＡＲ－Ｔ細胞を製作できることが期待される。

実験例Ｈ．ｐＢａｔトランスポゾンシステムで製作されたＣＡＲ－Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ効能の確認
上記の実施例を通じて、ｐＢａｔトランスポゾンシステムが対象細胞にＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子等を効果的に伝達することができ、これを用いて優れた収率でＣＡＲ－Ｔ細胞等を製作することができることを確認した。したがって、本実施例では、ｐＢａｔトランスポゾンシステムで製作されたＣＡＲ－Ｔ細胞のターゲット抗原に対する反応性を確認して、本発明によるトランスポゾンシステムで製作されたＣＡＲ－Ｔ細胞が実際に正常な機能を行うかを確認した。
具体的には、ＣＤ１９を発現するＢ細胞であるＢＪＡＢ細胞株とともに、ｃｏｎｔｒｏｌ Ｔ細胞またはＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞を２４時間共培養した後、１００μＬの培養液でＩＦＮ－γＥＬＩＳＡ ａｓｓａｙを進めて、ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗原に対する反応性を確認した。図３５から確認できるように、ｃｏｎｔｒｏｌ Ｔ細胞だけを単独で培養したりまたはＢＪＡＢだけを単独で培養したときには、ＩＦＮ－γが測定されなかった。また、ｃｏｎｔｒｏｌ Ｔ細胞とＢＪＡＢ細胞を共培養したグループは、ＩＦＮ－γ測定されたが、その濃度は、４０ｐｇ／ｍＬ以下と非常に低かった。一方、本発明によるトランスポゾンシステムで製作されたＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞およびＢＪＡＢ細胞を共培養したときには、ＩＦＮ－γ濃度が顕著に増加したことが分かった。特に、ＢＪＡＢ細胞に比べてＣＡＲ－Ｔ細胞の割合が１：１であるとき、ＩＦＮ－γの平均濃度は、３８５ｐｇ／ｍＬであり、１：４の割合では、平均５３５ｐｇ／ｍＬであることが確認されたところ、ＣＡＲ－Ｔ細胞の割合が増加するほどＩＦＮ－γの濃度が増加したことが分かった。

すなわち、ｃｏｎｔｒｏｌ Ｔ細胞の場合、ＢＪＡＢ細胞と共培養しても、ＩＦＮ－γが非常に低いレベルで生成されたところ、Ｔ細胞が抗原に対して特別な反応性を示さなかったが、本発明のトランスポゾンで製作されたＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＢＪＡＢ細胞と共培養時にＩＦＮ－γレベルが大きく増加したところ、前記ＣＡＲ－Ｔ細胞が抗原を効果的に認識して活性化したことを確認することができた。前記結果は、本発明のトランスポゾンシステムを用いて優れた抗原反応性を示すＣＡＲ－Ｔ細胞を製作することができることを裏付ける。

実験例Ｉ．ｐＢａｔ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ伝達形態による遺伝子の伝達効率の確認
上記の実験例を通じて本発明によるトランスポゾンシステムが効果的に遺伝子を伝達することができ、これを通じて、ＣＡＲ－Ｔ細胞等外来遺伝子が導入された細胞を製作することができることを確認した。これより、本実施例では、様々な形態のトランスポゾンを用いてトランスポゾンの形態による遺伝子伝達の効率に差異があるかを確認した。

１．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ７日後のＪｕｒｋａｔ細胞におけるＧＦＰ発現観察
Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎを通じて様々なトランスポゾンを細胞内に導入させた後、７日後にＧＦＰを含むｔｒａｎｓｐｏｓｏｎを導入させたグループにおいてＧＦＰが発現するかを蛍光顕微鏡で観察した。図３６ａに示されたように、ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ（ＥＰ）しないＮｏ ＥＰ群（陰性対照群）では、１日目と同一にＧＦＰが発現せず、ＧＦＰプラスミドを導入させたｐＥＧＦＰ群（陽性対照群１）では、非常に弱くＧＦＰが発現したが、ＧＦＰ ｍＲＮＡを導入させたＧＦＰ ｍＲＮＡ群（陽性対照群２）では、ＧＦＰシグナルが全く検出されなかった。ＧＦＰを含むｔｒａｎｓｐｏｓｏｎを導入させたグループ（３Ｍ３－５Ｍ３－ＧＦＰ ｐｌａｓｍｉｄ、３Ｍ３－５Ｍ３－ＧＦＰ ｌｉｎｅａｒ ｄｓＤＮＡ、３Ｍ３－５Ｍ３－ＧＦＰ ｍｉｎｉｃｉｒｃｌｅ ｄｓＤＮＡ）では、弱いＧＦＰシグナルが検出された。
また、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ７日後、Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＧＦＰ発現をＦＡＣＳ分析で確認した。具体的には、図３６ｂのように、ｓｉｎｇｌｅｔｓ→ｃｅｌｌｓ→ｌｉｖｅ ｃｅｌｌｓ→ＧＦＰ^＋ ｃｅｌｌｓの順にｇａｔｉｎｇして、分析した。ＧＦＰ^－（ｎｅｇａｔｉｖｅ）に近く基準を定めてＧＦＰ発現細胞の割合を分析した結果、図３６ｂのように、Ｎｏ ＥＰ群では、ＧＦＰ発現細胞がなく、ｐＥＧＦＰ群では、ＧＦＰ発現細胞の割合が８％であり、ＧＦＰ ｍＲＮＡ群では、０％であった。３Ｍ３－５Ｍ３－ＧＦＰ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎを導入させたグループの場合、ＧＦＰ発現細胞の割合がプラスミド群では、１５％、ｌｉｎｅａｒ ｄｓＤＮＡ群では、５％、ｍｉｎｉｃｉｒｃｌｅ ｄｓＤＮＡ群では、４％と観測されたところ、プラスミド形態のトランスポゾンを導入したグループにおいてＧＦＰ発現細胞の割合が最も高いことを確認した。

また、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ７日後には、ＧＦＰの強度（ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）が強い細胞が存在し、ｈｉｇｈ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙに近く基準を定めてＧＦＰ発現細胞の割合を比較した。３Ｍ３－５Ｍ３－ＧＦＰ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎの伝達形態によるｈｉｇｈ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ＧＦＰ発現細胞の割合を確認した結果、プラスミド群では、１１％、ｌｉｎｅａｒ ｄｓＤＮＡ群では、４％、ｍｉｎｉｃｉｒｃｌｅ ｄｓＤＮＡ群では、３％であることが確認された。すなわち、上記の結果と同様に、プラスミド形態のトランスポゾンを導入したグループにおいてＧＦＰ遺伝子伝達効率が最も高いことが分かった。

２．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ １４日後のＪｕｒｋａｔ細胞におけるＧＦＰ発現観察
次に、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ １４日後、ＧＦＰ遺伝子を含むｔｒａｎｓｐｏｓｏｎが導入されたグループにおいてＧＦＰが発現するかを蛍光顕微鏡で観察した。図３７ａに示されたように、Ｎｏ ＥＰ群およびＧＦＰ ｍＲＮＡ群では、ＧＦＰが検出されず、ｐＥＧＦＰ群でもＧＦＰがほとんど観察されなかった。一方、３Ｍ３－５Ｍ３－ＧＦＰ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎを導入させたグループは、全部高レベルのＧＦＰシグナルが検出された。特に、ＧＦＰは、プラスミド群において最も高レベルで発現し、ｌｉｎｅａｒ ｄｓＤＮＡ群およびｍｉｎｉｃｉｒｃｌｅ ｄｓＤＮＡ群は、プラスミド群に比べて、相対的に弱く発現することを確認した。

また、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ １４日後、Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＧＦＰ発現をＦＡＣＳ分析で確認した。具体的には、図３７ｂのように、ｓｉｎｇｌｅｔｓ→ｃｅｌｌｓ→ｌｉｖｅ ｃｅｌｌｓ→ＧＦＰ^＋ ｃｅｌｌｓの順にｇａｔｉｎｇして、分析した。ＧＦＰ^－（ｎｅｇａｔｉｖｅ）に近く基準を定めてＧＦＰ発現細胞の割合を分析した結果、図３７ｂのように、Ｎｏ ＥＰ群では、ＧＦＰ発現細胞がなく、ｐＥＧＦＰ群およびＧＦＰ ｍＲＮＡ群でも、ＧＦＰがほとんど発現しなかった。一方、３Ｍ３－５Ｍ３－ＧＦＰ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎを導入させたグループでは、ＧＦＰ発現が確認された。具体的には、プラスミド群のＧＦＰ発現細胞の割合は、１０％、ｌｉｎｅａｒ ｄｓＤＮＡ群は、４％、ｍｉｎｉｃｉｒｃｌｅ ｄｓＤＮＡ群は、３％であることが確認されたところ、７日後の結果と傾向が同様であり、特にプラスミド形態のトランスポゾンを導入させたグループのＧＦＰ発現細胞の割合が最も高いことを確認した。

次に、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ７日後に観察したように、ＧＦＰの強度（ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）をｈｉｇｈ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙに近く基準を定めてＧＦＰ発現細胞の割合を比較した。３Ｍ３－５Ｍ３－ＧＦＰ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎの伝達形態によるｈｉｇｈ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ＧＦＰ発現細胞の割合は、プラスミド群では、９％、ｌｉｎｅａｒ ｄｓＤＮＡ群では、４％、ｍｉｎｉｃｉｒｃｌｅ ｄｓＤＮＡ群では、３％と観測されたところ、同様に、プラスミド形態のトランスポゾンが導入されたグループにおいて最も高いことを確認し、７日後にもＧＦＰを発現する細胞がそのまま維持された。

３．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ後の時期別ＧＦＰ発現比較
Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ７日、または１４後、ＧＦＰ－ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎグループにおけるＧＦＰ発現細胞の割合をＧＦＰ^－（ｎｅｇａｔｉｖｅ）に近く基準を定めて比較した結果、７日後には、４％～２４％、１４日後には、３％～１９％と確認されたところ、ＧＦＰ発現細胞の割合が次第に減少することを確認した（図３８ａ）。３Ｍ３－５Ｍ３－ＧＦＰ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎの伝達形態によるＧＦＰ発現細胞の割合を比較した結果、ｌｉｎｅａｒ ｄｓＤＮＡ群およびｍｉｎｉｃｉｒｃｌｅ ｄｓＤＮＡ群に比べて、プラスミド群においてＧＦＰ発現細胞の割合が約２．５倍さらに高いことが明らかにされたところ、プラスミド形態でｔｒａｎｓｐｏｓｏｎを伝達するとき、遺伝子伝達効率が最も良いことが分かった。

また、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ７日、または１４後、ＧＦＰ－ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎグループにおけるＧＦＰ発現細胞の割合をＧＦＰ ｈｉｇｈ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙに近く基準を定めて比較した結果、７日後には、２％～１８％、１４日後には、２％～１６％と確認されたところ、ＧＦＰ発現細胞の割合が同様であることを確認した（図３８ｂ）。３Ｍ３－５Ｍ３－ＧＦＰ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎの伝達形態によるＧＦＰ発現細胞の割合の場合、ｌｉｎｅａｒ ｄｓＤＮＡ群およびｍｉｎｉｃｉｒｃｌｅ ｄｓＤＮＡ群に比べて、プラスミド群において約２倍高いことから見て、プラスミド形態でｔｒａｎｓｐｏｓｏｎを伝達するとき、遺伝子伝達効率が最も良いことを再確認した。また、すべての群において７日後および１４日後にＧＦＰ ｈｉｇｈ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙで発現する細胞の割合がほぼ類似していることから見て、７日目にｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅによってＪｕｒｋａｔ細胞の染色体内にＧＦＰ遺伝子がｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎされた細胞が１４日まで同じ状態を維持すると判断される。

以上から分かるように、ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ後、細胞染色体内に遺伝子が挿入され、安定（ｓｔａｂｌｅ）に発現する７日および１４日目に３Ｍ３－５Ｍ３－ＧＦＰ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎの伝達形態による遺伝子伝達効率を比較してみた結果、ｍｉｎｉｃｉｒｃｌｅ ＤＮＡ、ｌｉｎｅａｒ ＤＮＡ、およびｐｌａｓｍｉｄ形態のｔｒａｎｓｐｏｓｏｎが全部効果的にターゲット細胞に遺伝子を伝達したことを確認し、ｐｌａｓｍｉｄ形態のｔｒａｎｓｐｏｓｏｎで伝達したとき、特に伝達効率がさらに高いことを確認した。

実験例Ｊ．ｐＢａｔ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎシステムによる抗体遺伝子の伝達効率の確認
上記の実施例を通じて、ｐＢａｔ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ突然変異の遺伝子伝達および発現効率を確認した結果、本発明によるトランスポゾンシステムがＧＦＰ遺伝子はもちろん、ＴＬＲ等の受容体タンパク質の遺伝子あるいはＣＡＲのようなキメラ抗体の遺伝子も効果的にターゲット細胞（Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＰＢＭＣ等）に伝達することができることを確認した。さらに、３Ｍ３－５Ｍ３あるいは３Ｍ３－５Ｍ４のｍｕｔａｎｔ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎの遺伝子伝達効率が特に高いことが分かった。したがって、これらの改良されたｍｕｔａｎｔ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ伝達体が、ＪＷＷ－２抗体遺伝子のようなその他の抗体遺伝子も効果的に伝達することができるかを確認し、特にタンパク質の大量生産に多く用いられるＨＥＫ２９３細胞でも遺伝子の伝達および発現効率が高いかを確認しようとした。

１．ＨＥＫ２９３細胞におけるｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ後の時期別ＧＦＰ発現観察
Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ １日、７日、および１０日後、ＧＦＰ発現を蛍光顕微鏡を用いて観察した。分析結果、図３９ａのように、プラスミドなしにｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ（ＥＰ）だけを行った陰性対照群であるＮｏ ＥＰ群では、すべての時期にＧＦＰ発現が観察されず、ｐＥＧＦＰプラスミドをｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎした陽性対照群（ｐＥＧＦＰ群）では、ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ １日後には、ＧＦＰが良好に発現したが、７日と１０日後には多く減少することを確認した。ＧＦＰ遺伝子を含むｔｒａｎｓｐｏｓｏｎグループを確認した結果、Ｂ３ＩＳ－Ｂ５ＩＥ－ＧＦＰ群は、１日後にＧＦＰ発現が良好に行われたが、７日と１０日後には、ＧＦＰ発現レベルが多少減少したのに対し、突然変異トランスポゾンである３Ｍ３－５Ｍ３－ＧＦＰを処理した群（３Ｍ３－５Ｍ３－ＧＦＰ群）は、１日後から１０日後まですべての期間にわたって高レベルのＧＦＰ発現を示すことを確認した。前記結果は、本発明によるトランスポゾンシステムが優れた遺伝子伝達機能を発揮することを示す。

また、ＨＥＫ２９３細胞におけるＧＦＰ発現をＦＡＣＳ分析で確認した結果、図３９ｂのように、ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ １日後、Ｎｏ ＥＰ群ではＧＦＰが全く発現せず、ｐＥＧＦＰ群では、ＧＦＰ発現細胞の割合が平均約５２％であり、Ｂ３ＩＳ－Ｂ５ＩＥ－ＧＦＰ群は、約３６％、３Ｍ３－５Ｍ３－ＧＦＰ群は、約４４％であることが確認された。そして、ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ７日後、ＧＦＰ発現細胞の割合をさらに測定した結果、ｐＥＧＦＰ群は、平均約４３％、Ｂ３ＩＳ－Ｂ５ＩＥ－ＧＦＰ群は、約１９％、３Ｍ３－５Ｍ３－ＧＦＰ群は、約３８％であった。特に、Ｂ３ＩＳ－Ｂ５ＩＥ－ＧＦＰ群は、ＧＦＰ強度（ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）が弱いのに対し、３Ｍ３－５Ｍ３－ＧＦＰ群は、ＧＦＰの発現強度（ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）が相対的に高く、発現細胞の割合も大きいことを確認した。

２．ＨＥＫ２９３細胞におけるｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ後のＪＷＷ抗体のｍＲＮＡ発現観察
Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ １日後および７日後、ＨＥＫ２９３細胞からｔｏｔａｌ ＲＮＡを分離し、ｑＰＣＲでＪＷＷ－２のｍＲＮＡ発現を確認した。分析結果、図４０ａのように、ＪＷＷ－２遺伝子を含むｔｒａｎｓｐｏｓｏｎグループのみにおいてＪＷＷ－２遺伝子が増幅されることを確認した。Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ １日後には、Ｂ３ＩＳ－Ｂ５ＩＥ－ＪＷＷ－２群においてＪＷＷ－２遺伝子のｍＲＮＡ発現が最も高く、次に、３Ｍ３－５Ｍ３－ＪＷＷ－２群、３Ｍ３－５Ｍ４－ＪＷＷ－２群の順に高かった。しかしながら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ７日後には、３Ｍ３－５Ｍ３－ＪＷＷ－２群においてＪＷＷ－２ ｍＲＮＡ発現レベルが最も高く、次に３Ｍ３－５Ｍ４－ＪＷＷ－２群、Ｂ３ＩＳ－Ｂ５ＩＥ－ＪＷＷ－２群の順に高いことを確認した。

３．ＨＥＫ２９３細胞におけるｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ後のＪＷＷ抗体のタンパク質発現観察
Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ３日後および１０日後、ＨＥＫ２９３細胞を培養した培地を回収し、ＨＥＫ２９３細胞から分泌されたＪＷＷ－２抗体タンパク質を定量した。具体的には、ＪＷＷ－２抗体のＦｃ ｒｅｇｉｏｎであるｈｕｍａｎ ＩｇＧ１をターゲットとする抗体を用いたＥＬＩＳＡ ａｓｓａｙを進めた。図４０ｂに示されたように、ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ３日後、ＥＰ ｏｎｌｙ群を除いて、ＪＷＷ－２抗体遺伝子を含むｔｒａｎｓｐｏｓｏｎグループにおいて全部ｈｕｍａｎ ＩｇＧ１が検出された。特に３Ｍ３－５Ｍ３－ＪＷＷ－２群の場合、ＪＷＷ－２タンパク質レベルがｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ３日後は１．６ｎｇ／ｍＬ、１０日後は０．９ｎｇ／μＬと最も高く、３Ｍ３－５Ｍ４－ＪＷＷ－２群は、３日後に１．２ｎｇ／ｍＬ、１０日後に０．５ｎｇ／ｍＬであることが確認された。そして、Ｂ３ＩＳ－Ｂ５ＩＥ－ＪＷＷ－２群は、３日後に０．５ｎｇ／ｍＬ、１０日後に０ｎｇ／ｍＬであることが確認された。したがって、本発明によるトランスポゾンシステムを用いてＪＷＷ－２遺伝子を伝達した細胞は、全部高レベルでＪＷＷ－２抗体を発現し、特に突然変異トランスポゾンを用いたグループにおいて遺伝子伝達効率が高いことを確認することができた。

上記の実験例において、ＧＦＰ遺伝子を用いてｐＢａｔ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ突然変異に対する遺伝子伝達および発現効率研究を確認した結果、本発明によるトランスポゾンシステムが全部遺伝子伝達機能に優れ、３Ｍ３－５Ｍ３あるいは３Ｍ３－５Ｍ４のｍｕｔａｎｔ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎの遺伝子伝達効率が特に高いことをＪｕｒｋａｔ細胞で確認した。したがって、これらの改良されたｍｕｔａｎｔ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ伝達体が、ＧＦＰ遺伝子でなく、ＪＷＷ－２抗体遺伝子に対して、そしてＪｕｒｋａｔ細胞でなく、タンパク質の生産に多く使用されるＨＥＫ２９３細胞において遺伝子の伝達および発現効率が高いかをＪＷＷ－２抗体遺伝子を用いて確認しようとした。上述したように、ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ７日後および１０日後、いずれも、３Ｍ３－５Ｍ３－ＧＦＰ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎベクターにおいてＢ３ＩＳ－Ｂ５ＩＥ－ＧＦＰ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎベクターよりＧＦＰを発現する細胞の割合が高いことを確認し、これを通じて、Ｊｕｒｋａｔ細胞だけでなく、ＨＥＫ２９３細胞でも、ｍｕｔａｎｔ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎの遺伝子伝達効率が高いことを確認した。

また、ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ １日後、ＪＷＷ－２ ｍＲＮＡの発現は、ｔｒａｎｓｉｅｎｔ発現によりＢ３ＩＳ－Ｂ５ＩＥ－ＪＷＷ－２と３Ｍ３－５Ｍ３－ＪＷＷ－２、および、３Ｍ３－５Ｍ４－ＪＷＷ－２が、全部、ＪＷＷ－２のｍＲＮＡが良好に発現することを確認した一方で、ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅによってＨＥＫ２９３細胞染色体内にＪＷＷ－２遺伝子が挿入されて安定（ｓｔａｂｌｅ）に発現するｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ７日後、ＪＷＷ－２ ｍＲＮＡの発現は、１日目にｔｒａｎｓｉｅｎｔに発現する割合に比べて減少したが、発現が維持されることを確認し、Ｂ３ＩＳ－Ｂ５ＩＥ－ＪＷＷ－２ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎベクターよりｍｕｔａｎｔ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎベクターである３Ｍ３－５Ｍ３－ＪＷＷ－２ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎベクターにおいて染色体内挿入されて発現するＪＷＷ－２ ｍＲＮＡ量が若干高いことを観察した。そして、ＪＷＷ－２抗体タンパク質の発現は、ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ３日後および１０日後に全部同一にＢ３ＩＳ－Ｂ５ＩＥ－ＪＷＷ－２ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎベクターよりもｍｕｔａｎｔ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎベクターである３Ｍ３－５Ｍ３－ＪＷＷ－２および３Ｍ３－５Ｍ４－ＪＷＷ－２ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎベクターにおいて染色体内挿入されて発現するＪＷＷ－２抗体タンパク質の濃度が高いことを観察し、特に３Ｍ３－５Ｍ３－ＪＷＷ－２トランスポゾンベクターにおいて高いことを確認した。したがって、ＩＴＲ ｍｕｔａｔｉｏｎを通じて製作された改良ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎベクター（３Ｍ３－５Ｍ３、３Ｍ３－５Ｍ４）が、抗体遺伝子もターゲット細胞への伝達および染色体内挿入されることを確認し、抗体タンパク質発現も誘導できることを確認した。

実験例Ｋ．ｐＢａｔ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎのベクターサイズによる遺伝子伝達効率の確認
上記の実験例を通じて、本発明によるトランスポゾンベクターが抗体遺伝子、受容体遺伝子、およびＣＡＲ遺伝子等様々な遺伝子をターゲット細胞内に効果的に伝達し、その発現を誘導することができることを確認した。

細胞内にＤＮＡを伝達するとき、一般的にＤＮＡのサイズが小さいほど核への伝達効率が高くなることが知られている（ＭｃＬｅｎａｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．,２００７）。したがって、本発明のトランスポゾンシステムも、ベクターのサイズが遺伝子伝達効率に影響を及ぼすかを確認するために、トランスポゾンベクターのサイズを最小化した後、遺伝子伝達効率が増加するかを確認した。Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎベクターのサイズの最小化のために、ＩＲＥＳとｐｕｒｏｍｙｃｉｎ抵抗性遺伝子を除去し、ｏｒｉサイト１個を除去して合計２個のｏｒｉサイトを１個に減らし、ＣＡＧプロモーターをＥＦ１αプロモーターに変更し、臨床試験での使用のために、ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ抵抗性遺伝子は、ｋａｎａｍｙｃｉｎ抵抗性遺伝子に変更した。結果的に、本発明のトランスポゾンベクターサイズを従来７，５６２ｂｐサイズから４，１４９ｂｐのサイズに減少させた。

１．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ １日後のＪｕｒｋａｔ細胞におけるＧＦＰ発現観察
Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ １日後、ＧＦＰが発現するかを蛍光顕微鏡で観察した。その結果、図４１ａのように、プラスミドなしにｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ（ＥＰ）だけを進めたＥＰ ｏｎｌｙ群を除いたすべての群においてＧＦＰが発現することを確認した。
また、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ １日後、Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＧＦＰ発現をＦＡＣＳ分析で確認した。図４１ｂのように、ｓｉｎｇｌｅｔｓ→ｃｅｌｌｓ→ｌｉｖｅ ｃｅｌｌｓ→ＧＦＰ^＋ ｃｅｌｌｓの順にｇａｔｉｎｇして、分析した。分析結果、ＥＰ ｏｎｌｙ群では、ＧＦＰが全く観察されず、ｐＥＧＦＰ群では、ＧＦＰ発現細胞の割合が約３１．８％であることを確認した。ｐＢａｔ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎベクターおよびｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅベクターをｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎした群では、ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎベクターのサイズによって差異が現れたが、ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎベクターをｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎした群（ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ）では、ＧＦＰ発現細胞の割合が１４．９％であることが確認され、ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎベクターの５’ＩＴＲと３’ＩＴＲ外側遺伝子にｅｎｚｙｍｅ ｓｉｔｅを追加したベクターをｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎした群（Ｂ３ＩＳ－Ｂ５ＩＥ）では、２０．７％であり、ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎベクターのサイズを７，５６２ｂｐから４，１４９ｂｐに減らしたベクターをｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎした群（Ｂ３ＩＳ－Ｂ５ＩＥ ｓｍａｌｌ）では、４７．８％であることが確認された。すなわち、ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎベクターのサイズが小さいとき、ＧＦＰ発現細胞の割合が高いことを確認した。

２．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ７日後のＪｕｒｋａｔ細胞におけるＧＦＰ発現観察
Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ７日後、ＧＦＰが発現するかを蛍光顕微鏡で観察した。その結果、図４２ａのように、ＥＰ ｏｎｌｙ群を除いたすべての群においてＧＦＰが発現することを確認した（図４２ａ）。
Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ７日後、Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＧＦＰ発現をＦＡＣＳ分析で確認した結果（図４２ｂ）、ＥＰ ｏｎｌｙ群では、ＧＦＰが観察されず、ｐＥＧＦＰ群では、ＧＦＰ発現細胞の割合が約１．３％であることを確認した。一方、Ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ群では、ＧＦＰ発現細胞の割合が２．９％であり、Ｂ３ＩＳ－Ｂ５Ｉ Ｅ群では、３．２％、Ｂ３ＩＳ－Ｂ５ＩＥ ｓｍａｌｌ群では、８．２％であることを確認したところ、対照群に比べてＧＦＰ発現レベルがさらに高いことが分かった。特に、ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎベクターのサイズが小さいＢ３ＩＳ－Ｂ５ＩＥ ｓｍａｌｌ群においてＧＦＰ発現細胞の割合が高いことが分かった。

３．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ １４日後のＪｕｒｋａｔ細胞におけるＧＦＰ発現観察
Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ １４日後、ＧＦＰが発現するかを蛍光顕微鏡で観察した。その結果、図４３ａのように、ＥＰ ｏｎｌｙ群とｐＥＧＦＰ群では、ＧＦＰ発現が観察されず、トランスポゾンを使用したグループでは、全部ＧＦＰ発現細胞が確認された。
Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ １４日後、Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＧＦＰ発現をＦＡＣＳ分析で確認した（図４３ｂ）。分析結果、ＥＰ ｏｎｌｙ群とｐＥＧＦＰ群では、ＧＦＰ発現が観察されなかった。一方、トランスポゾンを使用したグループでは、全部ＧＦＰ発現が確認されたところ、トランスポゾンによって遺伝子が細胞の染色体内に挿入され、安定的に発現していることが分かった。特に、Ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ群では、ＧＦＰ発現細胞の割合が２．０％、Ｂ３ＩＳ－Ｂ５ＩＥ群では、２．０％であったが、Ｂ３ＩＳ－Ｂ５ＩＥ ｓｍａｌｌ群では、８．０％であったところ、ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎベクターのサイズが小さいとき、ＧＦＰ発現細胞の割合が最も多いことを確認した。

４．Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＧＦＰ発現割合の比較
Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ後、経時的なＧＦＰ発現細胞の割合を比較してみると、図４４ａのように、すべての群において１日後に１０％～３２％、７日後に４％～１７％、１４日後に０％～１０％のように次第に減少する傾向はあるが、トランスポゾンを処理したグループは、全部ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ後に１４日が経過したときにも、ＧＦＰ遺伝子が安定的に発現することを確認することができた。特に、１日、７日、１４日全部トランスポゾンベクターサイズが相対的に小さいＢ３ＩＳ－Ｂ５ＩＥ ｓｍａｌｌ群においてＧＦＰ発現細胞の割合が最も高いことを確認した。また、ｈｉｇｈ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ＧＦＰ発現細胞の割合も、対照群に比べてトランスポゾンを使用したグループにおいて顕著に高いことを確認することができた（図４４ｂ）。

以上説明したように、ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ １４日後まで小さいサイズのｔｒａｎｓｐｏｓｏｎベクターを処理したグループにおいて標的遺伝子（ＧＦＰ）発現細胞の割合が最も高いことが分かった。具体的には、ＧＦＰ遺伝子がＪｕｒｋａｔ細胞染色体内に挿入されて安定に発現するｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ７日後および１４日後に、Ｂ３ＩＳ－Ｂ５Ｉ Ｅ群に比べて相対的に小さいサイズのベクターを使用したＢ３ＩＳ－Ｂ５ＩＥ ｓｍａｌｌ群においてＧＦＰ発現細胞の割合がそれぞれ２倍および４倍増加したことが分かった。これは、ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎベクターサイズが小さいほどｐＢａｔトランスポゾンの遺伝子伝達効率が高くなることを示すものである。
下記表２０は、本明細書に記載された主な配列情報を示す。

本発明は、トランスポゾンベクター、これを含むトランスポゾンシステム、トランスポゾンキット、前記トランスポゾンベクターが挿入された細胞、およびこれらの用途に関し、外因性遺伝子をターゲット細胞の染色体内に効果的に伝達し、遺伝子改変細胞を高収率で製作することができることを確認し、完成されたものである。特に、本発明によるトランスポゾンは、ＴＣＲまたはＣＡＲをコード化する遺伝子を免疫細胞に効果的に伝達することができ、これを通じて、前記ＴＣＲまたはＣＡＲを発現した細胞は、抗原に対する高い反応性を示すことが確認されたところ、本発明によるトランスポゾンシステムを用いて様々なＴＣＲ－Ｔ細胞およびＣＡＲ－Ｔ細胞を製作できることが期待される。特に、従来ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＡＲ製作だけでなく、標的細胞への伝達のために高い費用を必要としたが、本発明のトランスポゾンを利用する場合、低コストで高収率のＣＡＲ－Ｔ細胞を収得することができるので、ＣＡＲ－Ｔ細胞治療剤の生産コストを低減することによって、治療剤の価格を低減することができる。さらに、本発明のトランスポゾンは、腫瘍ウイルス－ターゲット中和抗体のような抗体遺伝子を抗体の大量生産に用いられるＨＥＫ２９３細胞に効果的に伝達できることが確認されたところ、本発明のトランスポゾンを通じて様々な抗体を大量で容易に生産することができる。特に、本発明によるトランスポゾンは、遺伝子伝達媒介体として伝達可能な遺伝子の種類に制限がないので、抗体遺伝子等に加えて、目的に応じて様々な遺伝子を発現するゲノム改変細胞株の開発に積極的に活用されることが期待される。

Claims (28)

1. 配列番号１で表される核酸配列のうち５’末端から３’方向に７１個以上１５７個以下の連続した核酸配列からなる５’ＩＴＲ（５’Ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）；および配列番号２で表される核酸配列のうち３’末端から５’方向に６６個以上２１２個以下の連続した核酸配列からなる３’ＩＴＲ（３’Ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）を含むトランスポゾンベクター。
2. 請求項１に記載のトランスポゾンベクターであって、該ベクターは以下の（ｉ）または（ｉｉ）：
   （ｉ）前記５’ＩＴＲは、以下：
   配列番号１で表される核酸配列からなる５’ＩＴＲ；
   配列番号５で表される核酸配列からなる５’ＩＴＲ；または
   配列番号６で表される核酸配列からなる５’ＩＴＲ、から選択される、または
   （ｉｉ）前記３’ＩＴＲは、以下：
   配列番号２で表される核酸配列からなる３’ＩＴＲ；
   配列番号９で表される核酸配列からなる３’ＩＴＲ；
   配列番号１０で表される核酸配列からなる３’ＩＴＲ；または
   配列番号１１で表される核酸配列からなる３’ＩＴＲ、から選択される、
   である、トランスポゾンベクター。
3. 前記５’ＩＴＲは、配列番号７、５’－ＡＣＡＣＴＴＧＧ－３’、または配列番号８で表される核酸配列のうち１つ以上を含むことを特徴とする請求項１または２に記載のトランスポゾンベクター。
4. 前記３’ＩＴＲは、配列番号１３または配列番号１４で表される核酸配列のうち１つ以上を含むことを特徴とする請求項１または２に記載のトランスポゾンベクター。
5. 前記５’ＩＴＲの核酸配列は、トランスポゾンベクター内の外因性ＤＮＡ分子が挿入される位置の上部（ｕｐｓｔｒｅａｍ）に５’から３’方向に含まれることを特徴とする、請求項１または２に記載のトランスポゾンベクター。
6. 前記３’ＩＴＲの核酸配列は、トランスポゾンベクター内の外因性ＤＮＡ分子が挿入される位置の下部（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ）に５’から３’方向に含まれることを特徴とする請求項１または２に記載のトランスポゾンベクター。
7. 前記トランスポゾンベクターは、前記５’ＩＴＲの下部および３’ＩＴＲの上部に１つ以上の外因性ＤＮＡ分子配列を含むことを特徴とする請求項１に記載のトランスポゾンベクター。
8. 前記外因性ＤＮＡ分子配列は、治療用ポリペプチドコーディング配列、ｓｉＲＮＡコーディング配列、ｍｉＲＮＡコーディング配列、レポータタンパク質コーディング配列、抗原特異的受容体コーディング配列、組換え抗体コーディング配列、中和抗体コーディング配列、免疫チェックポイント阻害剤コーディング配列、サイトカイン受容体コーディング配列、ＣＡＲ（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）コーディング配列、およびＴＣＲ（Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）コーディング配列からなる群から選択されたいずれか１つ以上であることを特徴とする請求項７に記載のトランスポゾンベクター。
9. 前記トランスポゾンベクターは、プロモーター、１つ以上の外因性ＤＮＡ分子、およびポリＡシグナルを含むものであり、前記５’ＩＴＲ、前記プロモーター、前記外因性ＤＮＡ分子、前記ポリＡシグナル、および前記３’ＩＴＲが順次に作動可能に連結されたことを特徴とする請求項１に記載のトランスポゾンベクター。
10. 前記トランスポゾンベクターは、環状プラスミド、線状化ｄｓＤＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ）、ヘアピンｄｓＤＮＡ、またはミニサークルｄｓＤＮＡであることを特徴とする請求項１に記載のトランスポゾンベクター。
11. 前記トランスポゾンベクターは、サイズが１，０００～５，０００ｂｐであることを特徴とする請求項１に記載のトランスポゾンベクター。
12. 配列番号１で表される核酸配列のうち５’末端から３’方向に７１個以上１５７個以下の連続した核酸配列からなる５’ＩＴＲ（５’Ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）；および配列番号１５～１７のうちいずれか１つで表される核酸配列からなる３’ＩＴＲを含む、トランスポゾンベクター。
13. ａ）外因性ＤＮＡ分子が挿入された請求項１に記載のトランスポゾンベクター；および
    ｂ）トランスポザーゼタンパク質またはトランスポザーゼタンパク質をコード化する配列を含む核酸分子を含む、外因性ＤＮＡ分子伝達用トランスポゾンシステム。
14. 前記トランスポザーゼタンパク質は、配列番号１８で表されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１３に記載の標的ＤＮＡ伝達用トランスポゾンシステム。
15. ａ）外因性ＤＮＡ分子が挿入された請求項１に記載のトランスポゾンベクター；および
    ｂ）トランスポザーゼタンパク質またはトランスポザーゼタンパク質をコード化する配列を含む核酸分子が導入された細胞。
16. 前記トランスポザーゼによって前記トランスポゾンベクターから前記外因性ＤＮＡ分子が切除され、切除された前記外因性ＤＮＡ分子が前記細胞のゲノム内に挿入されることを特徴とする請求項１５に記載の細胞。
17. 前記細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、マクロファージ、および肥満細胞からなる群から選ばれたことを特徴とする請求項１５に記載の細胞。
18. 前記細胞は、前記トランスポゾンベクターが導入された後、支持細胞（ｆｅｅｄｅｒ ｃｅｌｌｓ）と共培養されたことを特徴とする請求項１５に記載の細胞。
19. 前記支持細胞は、放射線で照射された細胞であることを特徴とする請求項１８に記載の細胞。
20. 前記細胞は、前記トランスポゾンベクターの導入後７日以上前記外因性ＤＮＡ分子を発現することを特徴とする請求項１５に記載の細胞。
21. ａ）外因性ＤＮＡ分子が挿入された請求項１に記載のトランスポゾンベクター；および
    ｂ）トランスポザーゼタンパク質またはトランスポザーゼタンパク質をコード化する配列を含む核酸分子を単離された細胞に導入する段階を含む、外因性ＤＮＡ分子配列を細胞のゲノム内に挿入する方法。
22. 前記導入は、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて行われる、請求項２１に記載の標的ＤＮＡ配列を細胞のゲノム内に挿入する方法。
23. 前記方法は、前記導入段階後、前記トランスポゾンベクターが挿入された前記細胞を支持細胞と共培養する段階をさらに含むことを特徴とする請求項２１に記載の標的ＤＮＡ配列を細胞のゲノム内に挿入する方法。
24. 前記支持細胞と共培養する段階は、前記導入段階直後に行われる、請求項２３に記載の標的ＤＮＡ配列を細胞のゲノム内に挿入する方法。
25. 前記トランスポゾンベクターは、環状プラスミド、線状化ｄｓＤＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ）、ヘアピンｄｓＤＮＡ、またはミニサークルｄｓＤＮＡであることを特徴とする請求項２１に記載の標的ＤＮＡ配列を細胞のゲノム内に挿入する方法。
26. ａ）外因性ＤＮＡ分子が挿入された請求項１に記載のトランスポゾンベクター；および
    ｂ）トランスポザーゼタンパク質またはトランスポザーゼタンパク質をコード化する配列を含む核酸分子が導入された免疫細胞を有効成分として含む、がんの予防または治療用薬学的組成物であって、
    前記外因性ＤＮＡ分子は、腫瘍抗原特異的ＣＡＲ（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）コーディング配列、腫瘍ウイルス特異的中和抗体コーディング配列、免疫チェックポイント阻害剤コーディング配列、および腫瘍抗原特異的ＴＣＲ（Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）コーディング配列からなる群から選択された１つ以上であることを特徴とする、がんの予防または治療用薬学的組成物。
27. 前記腫瘍抗原は、ＣＤ１９、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＥＧＦＲ、ＴＡＧ７２、ＩＬ１３Ｒα２（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １３ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ－２ ｓｕｂｕｎｉｔ）、ＣＤ５２、ＣＤ３３、ＣＤ２０、ＴＳＬＰＲ、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＧＤ３、ＣＤ１７１、ＮＣＡＭ（Ｎｅｕｒａｌ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）、ＦＢＰ（Ｆｏｌａｔｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）、Ｌｅ（Ｙ）（Ｌｅｗｉｓ－Ｙ ａｎｔｉｇｅｎ）、ＰＳＣＡ（Ｐｒｏｓｔａｔｅ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ａｎｔｉｇｅｎ）、ＰＳＭＡ（Ｐｒｏｓｔａｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｎｔｉｇｅｎ）、ＣＥＡ（Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ）、ＨＥＲ２（Ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２）、Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ、ＣＤ４４ｖ６（Ｈｙａｌｕｒｏｎａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｖａｒｉａｎｔ ６）、Ｂ７－Ｈ３、Ｇｌｙｐｉｃａｎ－３、ＲＯＲ１（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｌｉｋｅ ｏｒｐｈａｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １）、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、ＦＯＬＲ１（ｆｏｌａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＷＴ１（Ｗｉｌｍ’ｓ ｔｕｍｏｒ ａｎｔｉｇｅｎ）、ＶＥＧＦＲ２（Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ２）、腫瘍ウイルス抗原、ＴＰ５３、ＫＲＡＳ、および新抗原（ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ）からなる群から選ばれた１つ以上であることを特徴とする請求項２６に記載のがんの予防または治療用薬学的組成物。
28. ａ）外因性ＤＮＡ分子が挿入された請求項１に記載のトランスポゾンベクター；および
    ｂ）トランスポザーゼタンパク質またはトランスポザーゼタンパク質をコード化する配列を含む核酸分子が導入された免疫細胞のがん治療用薬剤の製造のための使用であって、
    前記外因性ＤＮＡ分子は、腫瘍抗原特異的ＣＡＲ（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）コーディング配列、腫瘍ウイルス特異的中和抗体コーディング配列、免疫チェックポイント阻害剤コーディング配列、および腫瘍抗原特異的ＴＣＲ（Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）コーディング配列からなる群から選択された１つ以上であることを特徴とする、がん治療用薬剤の製造のための使用。