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JP7681681B2 - 切断可能リンカー組成物および方法 - Google Patents

切断可能リンカー組成物および方法 Download PDF

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JP7681681B2 JP2023510318A JP2023510318A JP7681681B2 JP 7681681 B2 JP7681681 B2 JP 7681681B2 JP 2023510318 A JP2023510318 A JP 2023510318A JP 2023510318 A JP2023510318 A JP 2023510318A JP 7681681 B2 JP7681681 B2 JP 7681681B2
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Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年８月１１日出願の米国仮特許出願第６３／０６４，２６８号に基づく利益を主張し、当該出願は参照により本明細書に援用される。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出されその全体を参照により本明細書に援用される配列表を含んでいる。当該ＡＳＣＩＩコピーは、２０２１年８月５日作製、名称５２４２６＿７２０＿６０１＿ＳＬ．ｔｘｔであり、サイズは５８，３２５バイトである。
本明細書中の特定の実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列（ＬＳＧＲＳＤＡＧ）による切断可能リンカーを含む単離ポリペプチドが開示される。いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、配列番号３のアミノ酸配列（ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＡＧ）を含む。いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、配列番号２６のアミノ酸配列（ＡＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＡＧ）を含む。いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、配列番号４のアミノ酸配列（ＡＡＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＡＧ）を含む。いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、配列番号５のアミノ酸配列（ＳＰＬＧＬＳＧＲＳＤＡＧ）を含む。いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、配列番号６のアミノ酸配列（ＬＳＧＲＳＤＡＧＳＰＬＧＬＡＧ）を含む。いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、プロテアーゼにより切断可能である。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは腫瘍特異的プロテアーゼを含む。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）またはセリンプロテアーゼを含む。いくつかの実施形態では、マトリックスメタロプロテアーゼは、ＭＭＰ２、ＭＭＰ７、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１３、またはＭＭＰ１４を含む。いくつかの実施形態では、セリンプロテアーゼは、マトリプターゼ、ウロキナーゼ、またはヘプシンを含む。いくつかの実施形態では、単離ポリペプチドは、標的抗原に結合する抗原結合性ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、抗原結合性ドメインは、切断可能リンカーに対するＣ末端である。いくつかの実施形態では、単離ポリペプチドは、サイトカイン受容体に結合するサイトカインまたはサイトカインフラグメントをさらに含む。いくつかの実施形態では、サイトカインまたはサイトカインフラグメントは、切断可能リンカーに対するＣ末端である。いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、式Ｉ：Ａ１－Ｌ１－Ｐ１による配置で、標的抗原に結合する抗原結合性ドメインに、またはサイトカイン受容体に結合するサイトカインもしくはサイトカインフラグメントにペプチドを接続し、式中、Ａ１は、標的抗原に結合する抗原結合性ドメイン、またはサイトカイン受容体に結合するサイトカインもしくはサイトカインフラグメントを含み、Ｌ１は切断可能リンカーを含み、Ｐ１は、標的抗原への抗原結合性ドメインの結合を損なわせるか、またはサイトカイン受容体へのサイトカインの結合を損なわせるペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｐ１は、Ｎ末端で切断可能リンカーに接続され、Ａ１は、Ｃ末端で切断可能リンカーに接続される。いくつかの実施形態では、Ｐ１は、Ｃ末端で切断可能リンカーに接続され、Ａ１は、Ｎ末端で切断可能リンカーに接続される。いくつかの実施形態では、Ｐ１は、イオン相互作用、静電相互作用、疎水性相互作用、Ｐｉ－スタッキング相互作用、およびＨ結合相互作用、またはそれらの組合せを介してＡ１に結合される。いくつかの実施形態では、Ｐ１は、標的抗原またはサイトカイン受容体に対し７０％未満の配列相同性を有する。いくつかの実施形態では、Ｐ１は、長さが少なくとも１０のアミノ酸のペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｐ１は、長さが少なくとも１０のアミノ酸および長さが２０以下のアミノ酸のペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｐ１は、長さが少なくとも１６のアミノ酸のペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｐ１は、長さが４０以下のアミノ酸のペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｐ１は、環状ペプチドまたは直鎖ペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｐ１は環状ペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｐ１は半減期延長部分にさらに連結される。いくつかの実施形態では、半減期延長部分は単一ドメイン抗体である。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は１０Ｇを含む。いくつかの実施形態では、Ａ１は、抗体、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、重鎖可変ドメイン（ＶＨドメイン）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬドメイン）、ラクダ科由来単一ドメイン抗体の可変ドメイン（ＶＨＨ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ軽鎖ポリペプチド、またはＦａｂ重鎖ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、標的抗原は腫瘍抗原を含む。いくつかの実施形態では、Ａ１は、Ｆａｂ軽鎖ポリペプチドまたはＦａｂ重鎖ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ａ１は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、標的抗原はエフェクター細胞抗原を含む。いくつかの実施形態では、Ａ１はｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、抗ＣＤ３ｅ一本鎖可変フラグメントを含む。いくつかの実施形態では、Ａ１はサイトカインを含む。いくつかの実施形態では、サイトカインまたはサイトカインフラグメントは、野生型サイトカインである。いくつかの実施形態では、サイトカインまたはサイトカインフラグメントは、サイトカインの突然変異タンパク質である。いくつかの実施形態では、サイトカイン受容体は、インターフェロン受容体またはインターロイキン受容体である。いくつかの実施形態では、サイトカイン受容体は、インターフェロン受容体、ＧＭ－ＣＳＦ受容体、ＩＬ－２受容体、ＩＬ－４受容体、ＩＬ－６受容体、ＩＬ－７受容体、ＩＬ－１０受容体、ＩＬ－１２受容体、ＩＬ－１５受容体、ＩＬ－２１受容体、またはＴＧＦ－β受容体を含む。いくつかの実施形態では、サイトカインまたはサイトカインフラグメントは、インターフェロン、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、またはＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、サイトカインまたはサイトカインフラグメントは、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－６、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、またはＴＧＦβを含む。いくつかの実施形態では、単離ポリペプチドは、第２の抗原結合性ドメインまたは第２のサイトカインもしくは第２のサイトカインフラグメントを含む第２の単離ポリペプチドと複合体を形成する。いくつかの実施形態では、第２の単離ポリペプチドは、式ＩＩ：Ａ２－Ｌ２－Ｐ２による配置にあり、式中、Ａ２は第２の抗原結合性ドメインまたは第２のサイトカインを含み、Ｌ２は第２の切断可能リンカーを含み、Ｐ２は、第２の標的抗原への第２の抗原結合性ドメインの結合を阻害するか、または第２のサイトカイン受容体への第２のサイトカインまたは第２のサイトカインフラグメントの結合を阻害する第２のペプチドを含む。いくつかの実施形態では、第２の切断可能リンカーは、配列番号１のアミノ酸配列（ＬＳＧＲＳＤＡＧ）を含む。いくつかの実施形態では、第２の切断可能リンカーは、配列番号３のアミノ酸配列（ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＡＧ）を含む。いくつかの実施形態では、第２の切断可能リンカーは、配列番号２６のアミノ酸配列（ＡＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＡＧ）を含む。いくつかの実施形態では、第２の切断可能リンカーは、配列番号４のアミノ酸配列（ＡＡＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＡＧ）を含む。いくつかの実施形態では、第２の切断可能リンカーは、配列番号５のアミノ酸配列（ＳＰＬＧＬＳＧＲＳＤＡＧ）を含む。いくつかの実施形態では、第２の切断可能リンカーは、配列番号６のアミノ酸配列（ＬＳＧＲＳＤＡＧＳＰＬＧＬＡＧ）を含む。いくつかの実施形態では、Ｐ２は、Ｎ末端で第２の切断可能リンカーに接続され、Ａ２は、Ｃ末端で第２の切断可能リンカーに接続される。いくつかの実施形態では、Ｐ２は、Ｃ末端で第２の切断可能リンカーに接続され、Ａ２は、Ｎ末端で第２の切断可能リンカーに接続される。いくつかの実施形態では、Ｐ２は、イオン相互作用、静電相互作用、疎水性相互作用、Ｐｉ－スタッキング相互作用、およびＨ結合相互作用、またはそれらの組合せを介してＡ２に結合される。いくつかの実施形態では、Ｐ２は、第２の標的抗原または第２のサイトカイン受容体に対し７０％未満の配列相同性を有する。いくつかの実施形態では、Ｐ２は、長さが少なくとも１０のアミノ酸のペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｐ２は、長さが少なくとも１０のアミノ酸および長さが２０以下のアミノ酸のペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｐ２は、長さが少なくとも１６のアミノ酸のペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｐ２は、長さが４０以下のアミノ酸のペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｐ２は、環状ペプチドまたは直鎖ペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｐ２は環状ペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ａ２は、抗体、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、重鎖可変ドメイン（ＶＨドメイン）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬドメイン）、ラクダ科由来単一ドメイン抗体の可変ドメイン（ＶＨＨ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ軽鎖ポリペプチド、またはＦａｂ重鎖ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、第２の標的抗原は腫瘍抗原を含む。いくつかの実施形態では、Ａ２は、Ｆａｂ軽鎖ポリペプチドまたはＦａｂ重鎖ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ａ２は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、第２の標的抗原はエフェクター細胞抗原を含む。いくつかの実施形態では、Ａ２はｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、抗ＣＤ３ｅ一本鎖可変フラグメントを含む。いくつかの実施形態では、Ａ２は第２のサイトカインを含む。いくつかの実施形態では、第２のサイトカインまたは第２のサイトカインフラグメントは、野生型サイトカインである。いくつかの実施形態では、第２のサイトカインまたは第２のサイトカインフラグメントは、サイトカインの突然変異タンパク質である。いくつかの実施形態では、第２のサイトカイン受容体は、インターフェロン受容体またはインターロイキン受容体である。いくつかの実施形態では、第２のサイトカイン受容体は、インターフェロン受容体、ＧＭ－ＣＳＦ受容体、ＩＬ－２受容体、ＩＬ－４受容体、ＩＬ－６受容体、ＩＬ－７受容体、ＩＬ－１０受容体、ＩＬ－１２受容体、ＩＬ－１５受容体、ＩＬ－２１受容体、またはＴＧＦ－β受容体を含む。いくつかの実施形態では、第２のサイトカインまたは第２のサイトカインフラグメントは、インターフェロン、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、またはＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、第２のサイトカインまたは第２のサイトカインフラグメントは、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－６、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、またはＴＧＦβを含む。
本明細書には、上記実施形態のいずれかによる切断可能リンカーを含む単離ポリペプチドと、薬学的に許容可能な賦形剤とを含む医薬組成物が開示される。
本明細書には、上記実施形態のいずれかによる切断可能リンカーを含む単離ポリペプチドをコードする、単離された組換え核酸分子が開示される。
本明細書には、上記実施形態による単離された組換え核酸分子を含むベクターが開示される。
本明細書には、切断可能リンカーを含む単離ポリペプチドを産生する方法であって、ポリペプチドの発現を生じさせる条件下で、上記実施形態のベクターを含む細胞を培養する工程を含む方法が開示される。
本明細書には、切断可能リンカーを含む単離ポリペプチドを製造する方法であって、（ａ）ポリペプチドの発現を生じさせる条件下で上記実施形態の単離された組換え核酸分子を含む細胞を培養する工程と、（ｂ）ポリペプチドを単離する工程とを含む方法が開示される。
本開示の新規な特徴は、添付の特許請求の範囲で具体的に記載される。本開示の特徴と利点は、本開示の原理が利用される例示的実施形態を説明する以下の詳細な説明、および添付図面を参照することで、より良く理解されるであろう。
ＥＧＦＲマスキングを含むポリペプチド複合体ＰＣ－１、ＰＣ－２、ＰＣ－３、ＰＣ－４、およびＰＣ－５の結合を例示する図である。 腫瘍プロテアーゼＭＴＳＰ１による切断後のポリペプチド複合体ＰＣ－１、ＰＣ－２、ＰＣ－３、ＰＣ－４、およびＰＣ－５の結合を例示する図である。 ＣＤ３εマスキングを含むポリペプチド複合体ＰＣ－１、ＰＣ－２、ＰＣ－３、ＰＣ－４、およびＰＣ－５の結合を例示する図である。 腫瘍プロテアーゼＭＴＳＰ１による切断後のポリペプチド複合体ＰＣ－１、ＰＣ－２、ＰＣ－３、ＰＣ－４、およびＰＣ－５の結合を例示する図である。 ポリペプチド複合体ＰＣ－２、ＰＣ－３、ＰＣ－４、ＰＣ－５、ＰＣ－１、およびＰＣ－６のＥＧＦＲ－ビオチンへの結合を、ＥＬＩＳＡにより測定したものを例示する図である。 ＣＤ３ε－ビオチンへの結合を、ＥＬＩＳＡにより測定したものを例示する図である。 ポリペプチド複合体ＰＣ－２、ＰＣ－３、ＰＣ－４、ＰＣ－５、ＰＣ－１、およびＰＣ－６における腫瘍標的細胞ＨＣＴ１１６に対する細胞毒性を例示する図である。 ポリペプチド複合体ＰＣ－２、ＰＣ－３、ＰＣ－４、ＰＣ－５、ＰＣ－１、およびＰＣ－６における腫瘍標的細胞ＨＣＴ１１６に対する細胞毒性を例示する図である。 ポリペプチド複合体ＰＣ－２、ＰＣ－３、ＰＣ－４、ＰＣ－５、ＰＣ－１、およびＰＣ－６における腫瘍標的細胞ＨＣＴ１１６に対する細胞毒性を例示する図である。 ポリペプチド複合体ＰＣ－２、ＰＣ－３、ＰＣ－４、ＰＣ－５、ＰＣ－１、およびＰＣ－６における腫瘍標的細胞ＨＣＴ１１６に対する細胞毒性を例示する図である。 ポリペプチド複合体ＰＣ－２、ＰＣ－３、ＰＣ－４、ＰＣ－５、ＰＣ－１、およびＰＣ－６における腫瘍標的細胞ＨＣＴ１１６に対する細胞毒性を例示する図である。 カニクイザルにおけるポリペプチドＰＣ－１、ＰＣ－２、ＰＣ－３、ＰＣ－７、ＰＣ－４、およびＰＣ－５の薬物動態を例示する図である。 カニクイザルにおけるポリペプチドＰＣ－１、ＰＣ－２、ＰＣ－３、ＰＣ－７、ＰＣ－４、およびＰＣ－５の薬物動態を例示する図である。 カニクイザルにおけるポリペプチドＰＣ－１、ＰＣ－２、ＰＣ－３、ＰＣ－７、ＰＣ－４、およびＰＣ－５の薬物動態を例示する図である。 カニクイザルにおけるポリペプチドＰＣ－１、ＰＣ－２、ＰＣ－３、ＰＣ－７、ＰＣ－４、およびＰＣ－５の薬物動態を例示する図である。 カニクイザルにおけるポリペプチド複合体ＰＣ－１、ＰＣ－２、ＰＣ－３、ＰＣ－７、ＰＣ－４、およびＰＣ－５のサイトカイン放出を例示する図である。 カニクイザルにおけるポリペプチド複合体ＰＣ－１、ＰＣ－２、ＰＣ－３、ＰＣ－７、ＰＣ－４、およびＰＣ－５のサイトカイン放出を例示する図である。 カニクイザルにおけるポリペプチド複合体ＰＣ－１、ＰＣ－２、ＰＣ－３、ＰＣ－７、ＰＣ－４、およびＰＣ－５のサイトカイン放出を例示する図である。 カニクイザルにおけるポリペプチド複合体ＰＣ－１、ＰＣ－２、ＰＣ－３、ＰＣ－７、ＰＣ－４、およびＰＣ－５のサイトカイン放出を例示する図である。 カニクイザルにおけるポリペプチド複合体ＰＣ－１、ＰＣ－２、ＰＣ－３、ＰＣ－４、およびＰＣ－５のＡＳＴ値とＡＬＴ値のグラフを例示する図である。 カニクイザルにおけるポリペプチド複合体ＰＣ－１、ＰＣ－２、ＰＣ－３、ＰＣ－４、およびＰＣ－５のＡＳＴ値とＡＬＴ値のグラフを例示する図である。
抗体、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、サイトカイン治療薬などタンパク質による治療薬は、種々の疾患および障害に対して有効であると証明されている。あらゆる治療法と同様、健康な組織におけるタンパク質による治療薬のオフターゲット効果を最小限に抑えつつ、疾患組織におけるタンパク質による治療薬の活性を維持する必要がある。このような戦略の１つは、タンパク質による治療薬の不活性形態を作り出すことであり、このとき、タンパク質による治療薬に必要な結合部位がタンパク質による治療薬に関連するペプチドで遮断されることで、健康な組織における場合にタンパク質による治療薬がその同族受容体もしくは標的抗原に結合するかまたは相互作用するのを防止する。所望の疾患状態の微小環境でタンパク質による治療薬を活性化するべく、ペプチドは、疾患状態の微小環境に特異的なプロテアーゼにより切断可能なリンカーを用いて、タンパク質による治療薬に連結される。後にペプチドは、疾患状態の微小環境にあるときにタンパク質による治療薬から放出される。
したがって、本明細書には、健康な組織でのタンパク質による治療薬のオフターゲット効果を縮小しつつ疾患組織でのタンパク質による治療薬の活性を維持するのに使用される、タンパク質による治療薬の様々な形式に適用できる切断可能リンカーが開示される。本明細書に開示される切断可能リンカーには所望の特性があり、例えば、対照リンカーと比較して、腫瘍プロテアーゼによるタンパク質分解速度上昇や、腫瘍プロテアーゼの拡張パネルにより切断可能でありながら同等の安全性プロファイルも有していることが挙げられるが、これらに限定されない。
特定の定義
本明細書で使用される用語は、具体的事例のみ説明することを目的とし、限定を意図したものではない。本明細書で使用するとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、前後関係から明らかでない限り、同様に複数形も含むことが意図される。さらに、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有すること（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｗｉｔｈ）」、またはその変形といった用語は、詳細な説明および／または特許請求の範囲のいずれかで使用される限り、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語と同様に含まれることが意図される。
「約（ａｂｏｕｔ）」または「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」という用語は、当業者が判定した特定の値において許容可能な誤差範囲内にあることを意味し、値の測定または判定の仕方、例えば、測定システムの限界に部分的に依存することになる。例えば、「約」は、所与の値で実施されるごとに、１または１より多くの標準偏差内にあること意味し得る。特定の値が本出願および特許請求の範囲に記載されている場合、別段明記されていない限り、「約」という用語は、特定の値における許容可能な誤差範囲を意味するものと仮定されたい。
「フラグメント」は、本明細書で使用するとき、全長に満たないアミノ酸配列を含むペプチドまたはポリペプチドを示す。
「ペプチド」、「Ｐ１」、または「Ｐ２」は、本明細書で使用するとき、５０未満のアミノ酸のアミノ酸配列を示しており、具体的には、サイトカインリガンド結合性ドメイン、そのフラグメント、もしくは突然変異タンパク質、サイトカイン受容体、そのフラグメント、もしくは突然変異タンパク質、および、サイトカインに結合するか同系サイトカイン受容体に結合するいずれかの抗体または抗体結合性フラグメント（例えば、単一ドメイン抗体、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ）を除く。
本明細書中のいくつかの実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列（ＬＳＧＲＳＤＡＧ）による切断可能リンカーを含む単離ポリペプチドが開示される。
いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、配列番号３のアミノ酸配列（ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＡＧ）を含む。いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、配列番号２６のアミノ酸配列（ＡＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＡＧ）を含む。いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、配列番号４のアミノ酸配列（ＡＡＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＡＧ）を含む。いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、配列番号５のアミノ酸配列（ＳＰＬＧＬＳＧＲＳＤＡＧ）を含む。いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、配列番号６のアミノ酸配列（ＬＳＧＲＳＤＡＧＳＰＬＧＬＡＧ）を含む。
いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、配列番号１のアミノ酸配列（ＬＳＧＲＳＤＡＧ）からなる。いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、配列番号３のアミノ酸配列（ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＡＧ）からなる。いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、配列番号２６のアミノ酸配列（ＡＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＡＧ）からなる。いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、配列番号４のアミノ酸配列（ＡＡＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＡＧ）からなる。いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、配列番号５のアミノ酸配列（ＳＰＬＧＬＳＧＲＳＤＡＧ）からなる。いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、配列番号６のアミノ酸配列（ＬＳＧＲＳＤＡＧＳＰＬＧＬＡＧ）からなる。
いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、配列番号３、４、５、および６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、配列番号３（ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＡＧ）のリンカー１、配列番号４（ＡＡＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＡＧ）のリンカー２、配列番号５（ＳＰＬＧＬＳＧＲＳＤＡＧ）のリンカー３、または配列番号６（ＬＳＧＲＳＤＡＧＳＰＬＧＬＡＧ）リンカー４のアミノ酸配列による切断可能リンカーを含む単離ポリペプチド、または、リンカー１、リンカー２、リンカー３、またはリンカー４のアミノ酸配列に対して１、２、または３つのアミノ酸置換、付加、もしくは欠失を有する切断可能リンカーを含む単離ポリペプチドである。
いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、リンカー１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、リンカー１のアミノ酸配列からなる。いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、リンカー１のアミノ酸配列に対して１つのアミノ酸置換、付加、または欠失を有する。いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、リンカー１のアミノ酸配列に対して２つのアミノ酸置換、付加、または欠失を有する。いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、リンカー１のアミノ酸配列に対して３つのアミノ酸置換、付加、または欠失を有する。
いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、リンカー２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、リンカー２のアミノ酸配列からなる。いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、リンカー２のアミノ酸配列に対して１つのアミノ酸置換、付加、または欠失を有する。いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、リンカー２のアミノ酸配列に対して２つのアミノ酸置換、付加、または欠失を有する。いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、リンカー２のアミノ酸配列に対して３つのアミノ酸置換、付加、または欠失を有する。
いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、リンカー３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、リンカー３のアミノ酸配列からなる。いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、リンカー３のアミノ酸配列に対して１つのアミノ酸置換、付加、または欠失を有する。いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、リンカー３のアミノ酸配列に対して２つのアミノ酸置換、付加、または欠失を有する。いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、リンカー３のアミノ酸配列に対して３つのアミノ酸置換、付加、または欠失を有する。
いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、リンカー４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、リンカー４のアミノ酸配列からなる。いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、リンカー４のアミノ酸配列に対して１つのアミノ酸置換、付加、または欠失を有する。いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、リンカー４のアミノ酸配列に対して２つのアミノ酸置換、付加、または欠失を有する。いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、リンカー４のアミノ酸配列に対して３つのアミノ酸置換、付加、または欠失を有する。
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換、付加、または欠失は、本明細書に記載のいずれかのタンパク質のアミノ酸配列に対し少なくとも７５％同一、例えば、７７％、８０％、８２％、８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列をもたらす。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換である。一般的なアミノ酸のうち、例えば、「保存的アミノ酸置換」は、（１）グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン、（２）フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン、（３）セリンおよびトレオニン、（４）アスパルテートおよびグルタメート、（５）グルタミンおよびアスパラギン、ならびに（６）リシン、アルギニン、およびヒスチジンのそれぞれの中のアミノ酸間での置換により例示される。
いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、修飾アミノ酸もしくは非天然アミノ酸、または修飾非天然アミノ酸、あるいはそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、修飾アミノ酸または修飾非天然アミノ酸は、翻訳後修飾を含む。いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、アセチル化、アクリル化、ＡＤＰ－リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質もしくは脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、ガンマカルボシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解処理、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化などタンパク質へのアミノ酸の転移ＲＮＡ媒介型付加、ユビキチン化を含むが、これらに限定されない修飾を含む。修飾は、ペプチド骨格を含む切断可能なリンカーまたはアミノ酸側鎖に対してあらゆる場所で行われる。
いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、プロテアーゼにより切断可能である。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、健康な組織、または疾患状態の微小環境でない微小環境でのレベルと比較して、疾患状態の微小環境において高レベルで存在する。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは腫瘍特異的プロテアーゼを含む。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）またはセリンプロテアーゼを含む。いくつかの実施形態では、マトリックスメタロプロテアーゼは、ＭＭＰ２、ＭＭＰ７、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１３、またはＭＭＰ１４を含む。いくつかの実施形態では、または、メタロプロテアーゼは、ＭＭＰ２、ＭＭＰ７、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１３、およびＭＭＰ１４からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、マトリックスメタロプロテアーゼはＭＭＰ２を含む。いくつかの実施形態では、マトリックスメタロプロテアーゼはＭＭＰ７を含む。いくつかの実施形態では、マトリックスメタロプロテアーゼはＭＭＰ９を含む。いくつかの実施形態では、マトリックスメタロプロテアーゼはＭＭＰ１３を含む。いくつかの実施形態では、マトリックスメタロプロテアーゼはＭＭＰ１４を含む。いくつかの実施形態では、セリンプロテアーゼは、マトリプターゼ、ウロキナーゼ、またはヘプシンを含む。いくつかの実施形態では、セリンプロテアーゼは、マトリプターゼ、ウロキナーゼ、およびヘプシンからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、セリンプロテアーゼはマトリプターゼを含む。いくつかの実施形態では、セリンプロテアーゼはウロキナーゼを含む。いくつかの実施形態では、セリンプロテアーゼはヘプシンを含む。いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、種々のプロテアーゼにより切断される。いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、または２０より多くの異なるプロテアーゼにより切断される。
いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、切断可能リンカー配列を有さないリンカーでのタンパク質分解速度と比較して、タンパク質分解速度が上昇している。いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、切断可能リンカー配列を有さないリンカーでのタンパク質分解速度と比較して、タンパク質分解速度が少なくとも５倍上昇している。いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、切断可能リンカー配列を有さないリンカーでのタンパク質分解速度と比較して、タンパク質分解速度が少なくとも８倍上昇している。いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、切断可能リンカー配列を有さないリンカーでのタンパク質分解速度と比較して、タンパク質分解速度が少なくとも１０倍上昇している。いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、切断可能リンカー配列を有さないリンカーでのタンパク質分解速度と比較して、タンパク質分解速度が少なくとも１５倍上昇している。いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、切断可能リンカー配列を有さないリンカーでのタンパク質分解速度と比較して、タンパク質分解速度が少なくとも２０倍上昇している。いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、切断可能リンカー配列を有さないリンカーでのタンパク質分解速度と比較して、タンパク質分解速度が少なくとも２５倍上昇している。いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、切断可能リンカー配列を有さないリンカーでのタンパク質分解速度と比較して、タンパク質分解速度が少なくとも３０倍上昇している。いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、切断可能リンカー配列を有さないリンカーでのタンパク質分解速度と比較して、タンパク質分解速度が少なくとも４０倍上昇している。いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、切断可能リンカー配列を有さないリンカーでのタンパク質分解速度と比較して、タンパク質分解速度が少なくとも５０倍上昇している。いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、切断可能リンカー配列を有さないリンカーでのタンパク質分解速度と比較して、タンパク質分解速度が少なくとも６０倍上昇している。いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、切断可能リンカー配列を有さないリンカーでのタンパク質分解速度と比較して、タンパク質分解速度が少なくとも７０倍上昇している。いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、切断可能リンカー配列を有さないリンカーでのタンパク質分解速度と比較して、タンパク質分解速度が少なくとも７５倍上昇している。いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、切断可能リンカー配列を有さないリンカーでのタンパク質分解速度と比較して、タンパク質分解速度が少なくとも８０倍上昇している。いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、切断可能リンカー配列を有さないリンカーでのタンパク質分解速度と比較して、タンパク質分解速度が少なくとも９０倍上昇している。いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、切断可能リンカー配列を有さないリンカーでのタンパク質分解速度と比較して、タンパク質分解速度が少なくとも１００倍上昇している。いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、切断可能リンカー配列を有さないリンカーでのタンパク質分解速度と比較して、タンパク質分解速度が少なくとも１２０倍上昇している。いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、プロテアーゼにより切断される。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは腫瘍特異的プロテアーゼを含む。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）またはセリンプロテアーゼを含む。いくつかの実施形態では、マトリックスメタロプロテアーゼは、ＭＭＰ２、ＭＭＰ７、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１３、またはＭＭＰ１４を含む。いくつかの実施形態では、セリンプロテアーゼは、マトリプターゼ、ウロキナーゼ、またはヘプシンを含む。
いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、切断可能リンカー配列を有さないヒト血清中の安定性と比較して、ヒト血清中の安定性が向上している。いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、切断可能リンカー配列を有さないリンカーでのヒト血清中の安定性と比較して、ヒト血清中の安定性が少なくとも５倍向上している。いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、切断可能リンカー配列を有さないリンカーでのヒト血清中の安定性と比較して、ヒト血清中の安定性が少なくとも８倍向上している。いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、切断可能リンカー配列を有さないリンカーでのヒト血清中の安定性と比較して、ヒト血清中の安定性が少なくとも１０倍向上している。いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、切断可能リンカー配列を有さないリンカーでのヒト血清中の安定性と比較して、ヒト血清中の安定性が少なくとも１５倍向上している。いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、切断可能リンカー配列を有さないリンカーでのヒト血清中の安定性と比較して、ヒト血清中の安定性が少なくとも２０倍向上している。いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、切断可能リンカー配列を有さないリンカーでのヒト血清中の安定性と比較して、ヒト血清中の安定性が少なくとも２５倍向上している。いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、切断可能リンカー配列を有さないリンカーでのヒト血清中の安定性と比較して、ヒト血清中の安定性が少なくとも３０倍向上している。いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、切断可能リンカー配列を有さないリンカーでのヒト血清中の安定性と比較して、ヒト血清中の安定性が少なくとも４０倍向上している。いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、切断可能リンカー配列を有さないリンカーでのヒト血清中の安定性と比較して、ヒト血清中の安定性が少なくとも５０倍向上している。いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、切断可能リンカー配列を有さないリンカーでのヒト血清中の安定性と比較して、ヒト血清中の安定性が少なくとも６０倍向上している。いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、切断可能リンカー配列を有さないリンカーでのヒト血清中の安定性と比較して、ヒト血清中の安定性が少なくとも７０倍向上している。いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、切断可能リンカー配列を有さないリンカーでのヒト血清中の安定性と比較して、ヒト血清中の安定性が少なくとも７５倍向上している。いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、切断可能リンカー配列を有さないリンカーでのヒト血清中の安定性と比較して、ヒト血清中の安定性が少なくとも８０倍向上している。いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、切断可能リンカー配列を有さないリンカーでのヒト血清中の安定性と比較して、ヒト血清中の安定性が少なくとも９０倍向上している。いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、切断可能リンカー配列を有さないリンカーでのヒト血清中の安定性と比較して、ヒト血清中の安定性が少なくとも１００倍向上している。いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、切断可能リンカー配列を有さないリンカーでのヒト血清中の安定性と比較して、ヒト血清中の安定性が少なくとも１２０倍向上している。
いくつかの実施形態では、切断可能リンカーを含む単離ポリペプチドは、同じアミノ酸配列のものではあるが配列番号２のアミノ酸配列による切断可能リンカーを含む単離ポリペプチドと比較して、タンパク質分解速度が上昇している。
いくつかの実施形態では、切断可能リンカーを含む単離ポリペプチドは、同じアミノ酸配列のものではあるが配列番号２のアミノ酸配列による切断可能リンカーを含む単離ポリペプチドと比較して、血清安定性が向上しているか同等である。
いくつかの実施形態では、切断可能リンカーを含む単離ポリペプチドは、同じアミノ酸配列のものではあるが配列番号２のアミノ酸配列による切断可能リンカーを含む単離ポリペプチドと比較して、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの腫瘍細胞死滅が向上しているか同等である。
いくつかの実施形態では、切断可能リンカーを含む単離ポリペプチドは、同じアミノ酸配列のものではあるが配列番号２のアミノ酸配列による切断可能リンカーを含む単離ポリペプチドと比較して、カニクイザルにおける薬物動態パラメータが向上しているか同等である。
いくつかの実施形態では、切断可能リンカーを含む単離ポリペプチドは、同じアミノ酸配列のものではあるが配列番号２のアミノ酸配列による切断可能リンカーを含む単離ポリペプチドと比較して、カニクイザルにおける肝毒性値が向上しているか同等である。
いくつかの実施形態では、単離ポリペプチドは、標的抗原に結合する抗原結合性ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、抗原結合性ドメインは、切断可能リンカーに対するＣ末端である。いくつかの実施形態では、単離ポリペプチドは、サイトカイン受容体に結合するサイトカインまたはサイトカインフラグメントをさらに含む。いくつかの実施形態では、サイトカインまたはサイトカインフラグメントは、切断可能リンカーに対するＣ末端である。
いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、式Ｉ：
Ａ１－Ｌ１－Ｐ１
（式Ｉ）
による配置で、標的抗原に結合する抗原結合性ドメインに、またはサイトカイン受容体に結合するサイトカインにペプチドを接続させ、
式中、Ａ１は、標的抗原に結合する抗原結合性ドメイン、またはサイトカイン受容体に結合するサイトカインを含み、Ｌ１は切断可能リンカーを含み、Ｐ１は、標的抗原への抗原結合性ドメインの結合を損なわせるか、またはサイトカイン受容体へのサイトカインの結合を損なわせるペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｐ１は、Ｎ末端で切断可能リンカーに接続され、Ａ１は、Ｃ末端で切断可能リンカーに接続される。いくつかの実施形態では、Ｐ１は、Ｃ末端で切断可能リンカーに接続され、Ａ１は、Ｎ末端で切断可能リンカーに接続される。
いくつかの実施形態では、単離ポリペプチドは、第２の抗原結合性ドメインまたは第２のサイトカインを含む第２の単離ポリペプチドと複合体を形成する。いくつかの実施形態では、第２の単離ポリペプチドは、式ＩＩ：
Ａ２－Ｌ２－Ｐ２
（式ＩＩ）
による配置にあり、
式中、Ａ２は、第２の抗原結合性ドメインまたは第２のサイトカインを含み、Ｌ２は第２の切断可能リンカーを含み、Ｐ２は、第２の標的抗原への第２の抗原結合性ドメインの結合を損なわせるか、または第２のサイトカイン受容体への第２のサイトカインの結合を損なわせる第２のペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、Ｐ２は、Ｎ末端で第２の切断可能リンカーに接続され、Ａ２は、Ｃ末端で第２の切断可能リンカーに接続される。いくつかの実施形態では、Ｐ２は、Ｃ末端で第２の切断可能リンカーに接続され、Ａ２は、Ｎ末端で第２の切断可能リンカーに接続される。
いくつかの実施形態では、第２の切断可能リンカーは、配列番号１のアミノ酸配列（ＬＳＧＲＳＤＡＧ）を含む。いくつかの実施形態では、第２の切断可能リンカーは、配列番号３のアミノ酸配列（ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＡＧ）を含む。いくつかの実施形態では、第２の切断可能リンカーは、配列番号２６のアミノ酸配列（ＡＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＡＧ）を含む。いくつかの実施形態では、第２の切断可能リンカーは、配列番号４のアミノ酸配列（ＡＡＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＡＧ）を含む。いくつかの実施形態では、第２の切断可能リンカーは、配列番号５のアミノ酸配列（ＳＰＬＧＬＳＧＲＳＤＡＧ）を含む。いくつかの実施形態では、第２の切断可能リンカーは、配列番号６のアミノ酸配列（ＬＳＧＲＳＤＡＧＳＰＬＧＬＡＧ）を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ１またはＬ２は、長さが少なくとも８のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、Ｌ１またはＬ２は、長さが少なくとも１０のアミノ酸であるが、長さが５０以下のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、Ｌ１またはＬ２は、長さが少なくとも１０のアミノ酸であるが、長さが３０以下のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、Ｌ１またはＬ２は、長さが少なくとも１８のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、Ｌ１またはＬ２は、長さが少なくとも２６のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、Ｌ１またはＬ２は、長さが少なくとも３０のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、Ｌ１またはＬ２は、長さが少なくとも４０のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、Ｌ１またはＬ２は、長さが少なくとも５０のアミノ酸である。
ペプチド（Ｐ１またはＰ２）
いくつかの実施形態では、Ｐ１は、標的抗原への抗原結合性ドメインの結合を損なわせるペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｐ１は、サイトカイン受容体へのサイトカインの結合を損なわせるペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｐ１は、イオン相互作用、静電相互作用、疎水性相互作用、Ｐｉ－スタッキング相互作用、およびＨ結合相互作用、またはそれらの組合せを介してＡ１に結合される。いくつかの実施形態では、Ｐ１は、サイトカイン受容体結合部位またはその付近でＡ１に結合される。いくつかの実施形態では、Ｐ１は、抗原結合部位またはその付近でＡ１に結合される。いくつかの実施形態では、Ｐ１は、Ｌ１がプロテアーゼにより切断されてＰ１を標的抗原またはサイトカイン受容体に曝露すると、Ａ１と結合を解除されるようになる。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは腫瘍特異的プロテアーゼを含む。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）またはセリンプロテアーゼを含む。いくつかの実施形態では、マトリックスメタロプロテアーゼは、ＭＭＰ２、ＭＭＰ７、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１３、またはＭＭＰ１４を含む。いくつかの実施形態では、セリンプロテアーゼは、マトリプターゼ、ウロキナーゼ、またはヘプシンを含む。いくつかの実施形態では、Ｐ１は、非立体的遮断（ｎｏｎ－ｓｔｅｒｉｃ ｂｌｏｃｋｉｎｇ）により標的抗原またはサイトカイン受容体へのＡ１の結合を損なわせる。いくつかの実施形態では、Ｐ１は、共有結合相互作用により標的抗原またはサイトカイン受容体へのＡ１の結合を損なわせる。いくつかの実施形態では、Ｐ１は、サイトカイン、サイトカイン結合性フラグメント、サイトカイン突然変異タンパク質、またはそれらのサイトカインの同族受容体の組合せではない。いくつかの実施形態では、Ａ１は、サイトカイン受容体に結合する抗体またはそのフラグメントではない。
いくつかの実施形態では、Ｐ２は、第２の標的抗原への第２の抗原結合性ドメインの結合を損なわせるペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｐ２は、第２のサイトカイン受容体への第２のサイトカインの結合を損なわせるペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｐ２は、イオン相互作用、静電相互作用、疎水性相互作用、Ｐｉ－スタッキング相互作用、およびＨ結合相互作用、またはそれらの組合せを介してＡ２に結合される。いくつかの実施形態では、Ｐ２は、サイトカイン受容体結合部位またはその付近でＡ２に結合される。いくつかの実施形態では、Ｐ２は、抗原結合部位またはその付近でＡ２に結合される。いくつかの実施形態では、Ｐ２は、Ｌ２がプロテアーゼにより切断されてＰ２を標的抗原またはサイトカイン受容体に曝露すると、Ａ２と結合を解除されるようになる。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは腫瘍特異的プロテアーゼを含む。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）またはセリンプロテアーゼを含む。いくつかの実施形態では、マトリックスメタロプロテアーゼは、ＭＭＰ２、ＭＭＰ７、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１３、またはＭＭＰ１４を含む。いくつかの実施形態では、セリンプロテアーゼは、マトリプターゼ、ウロキナーゼ、またはヘプシンを含む。いくつかの実施形態では、Ｐ２は、非立体的遮断により標的抗原またはサイトカイン受容体へのＡ２の結合を損なわせる。いくつかの実施形態では、Ｐ２は、共有結合相互作用により標的抗原またはサイトカイン受容体へのＡ２の結合を損なわせる。いくつかの実施形態では、Ｐ２は、サイトカイン、サイトカイン結合性フラグメント、サイトカイン突然変異タンパク質、またはそれらのサイトカインの同族受容体の組合せではない。いくつかの実施形態では、Ａ２は、サイトカイン受容体に結合する抗体またはそのフラグメントではない。
いくつかの実施形態では、Ｐ１は、標的抗原に対し７０％未満の配列相同性を有する。いくつかの実施形態では、Ｐ１は、標的抗原に対し７５％未満の配列相同性を有する。いくつかの実施形態では、Ｐ１は、標的抗原に対し８０％未満の配列相同性を有する。いくつかの実施形態では、Ｐ１は、標的抗原に対し８５％未満の配列相同性を有する。いくつかの実施形態では、Ｐ１は、標的抗原に対し９０％未満の配列相同性を有する。いくつかの実施形態では、Ｐ１は、標的抗原に対し９５％未満の配列相同性を有する。いくつかの実施形態では、Ｐ１は、標的抗原に対し９８％未満の配列相同性を有する。いくつかの実施形態では、Ｐ１は、標的抗原に対し９９％未満の配列相同性を有する。
いくつかの実施形態では、Ｐ１は、サイトカイン受容体に対し７０％未満の配列相同性を有する。いくつかの実施形態では、Ｐ１は、サイトカイン受容体に対し７５％未満の配列相同性を有する。いくつかの実施形態では、Ｐ１は、サイトカイン受容体に対し８０％未満の配列相同性を有する。いくつかの実施形態では、Ｐ１は、サイトカイン受容体に対し８５％未満の配列相同性を有する。いくつかの実施形態では、Ｐ１は、サイトカイン受容体に対し９０％未満の配列相同性を有する。いくつかの実施形態では、Ｐ１は、サイトカイン受容体に対し９５％未満の配列相同性を有する。いくつかの実施形態では、Ｐ１は、サイトカイン受容体に対し９８％未満の配列相同性を有する。いくつかの実施形態では、Ｐ１は、サイトカイン受容体に対し９９％未満の配列相同性を有する。
いくつかの実施形態では、Ｐ２は、第２の標的抗原に対し７０％未満の配列相同性を有する。いくつかの実施形態では、Ｐ２は、第２の標的抗原に対し７５％未満の配列相同性を有する。いくつかの実施形態では、Ｐ２は、第２の標的抗原に対し８０％未満の配列相同性を有する。いくつかの実施形態では、Ｐ２は、第２の標的抗原に対し８５％未満の配列相同性を有する。いくつかの実施形態では、Ｐ２は、第２の標的抗原に対し９０％未満の配列相同性を有する。いくつかの実施形態では、Ｐ２は、第２の標的抗原に対し９５％未満の配列相同性を有する。いくつかの実施形態では、Ｐ２は、第２の標的抗原に対し９８％未満の配列相同性を有する。いくつかの実施形態では、Ｐ２は、第２の標的抗原に対し９９％未満の配列相同性を有する。
いくつかの実施形態では、Ｐ２は、第２のサイトカイン受容体に対し７０％未満の配列相同性を有する。いくつかの実施形態では、Ｐ２は、第２のサイトカイン受容体に対し７５％未満の配列相同性を有する。いくつかの実施形態では、Ｐ２は、第２のサイトカイン受容体に対し８０％未満の配列相同性を有する。いくつかの実施形態では、Ｐ２は、第２のサイトカイン受容体に対し８５％未満の配列相同性を有する。いくつかの実施形態では、Ｐ２は、第２のサイトカイン受容体に対し９０％未満の配列相同性を有する。いくつかの実施形態では、Ｐ２は、第２のサイトカイン受容体に対し９５％未満の配列相同性を有する。いくつかの実施形態では、Ｐ２は、第２のサイトカイン受容体に対し９８％未満の配列相同性を有する。いくつかの実施形態では、Ｐ２は、第２のサイトカイン受容体に対し９９％未満の配列相同性を有する。
いくつかの実施形態では、Ｐ１またはＰ２は、サイトカイン、サイトカイン受容体、またはサイトカインもしくはサイトカイン受容体に結合する抗体もしくはそのフラグメントに対し５０％未満の配列相同性を共有するデノボアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｐ１またはＰ２は、サイトカイン、サイトカイン受容体、またはサイトカインもしくはサイトカイン受容体に結合する抗体もしくはそのフラグメントに対し４０％未満の配列相同性を共有するデノボアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｐ１またはＰ２は、サイトカイン、サイトカイン受容体、またはサイトカインもしくはサイトカイン受容体に結合する抗体もしくはそのフラグメントに対し３０％未満の配列相同性を共有するデノボアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｐ１またはＰ２は、サイトカイン、サイトカイン受容体、またはサイトカインもしくはサイトカイン受容体に結合する抗体もしくはそのフラグメントに対し２０％未満の配列相同性を共有するデノボアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｐ１またはＰ２は、サイトカイン、サイトカイン受容体、またはサイトカインもしくはサイトカイン受容体に結合する抗体もしくはそのフラグメントに対し１０％未満の配列相同性を共有するデノボアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｐ１またはＰ２は、ランダムアミノ酸配列を含有するペプチドライブラリから同定される。
いくつかの実施形態では、Ｐ１またはＰ２は、標的抗原に対し５０％未満の配列相同性を共有するデノボアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｐ１またはＰ２は、標的抗原に対し４０％未満の配列相同性を共有するデノボアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｐ１またはＰ２は、標的抗原に対し３０％未満の配列相同性を共有するデノボアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｐ１またはＰ２は、標的抗原に対し２０％未満の配列相同性を共有するデノボアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｐ１またはＰ２は、標的抗原に対し１０％未満の配列相同性を共有するデノボアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｐ１またはＰ２は、ランダムアミノ酸配列を含有するペプチドライブラリから同定される。
いくつかの実施形態では、Ｐ１またはＰ２は、長さが少なくとも５のアミノ酸のペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｐ１またはＰ２は、長さが少なくとも６のアミノ酸のペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｐ１またはＰ２は、長さが少なくとも１０のアミノ酸のペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｐ１またはＰ２は、長さが少なくとも１０のアミノ酸および長さが２０以下のアミノ酸のペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｐ１またはＰ２は、長さが少なくとも１６のアミノ酸のペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｐ１またはＰ２は、長さが４０以下のアミノ酸のペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｐ１またはＰ２は、少なくとも２つのシステインアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態では、Ｐ１またはＰ２は、環状ペプチドまたは直鎖ペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｐ１またはＰ２は、環状ペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｐ１またはＰ２は、直鎖ペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、Ｐ１またはＰ２は、修飾アミノ酸もしくは非天然アミノ酸、または修飾非天然アミノ酸、あるいはそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、修飾アミノ酸または修飾非天然アミノ酸は、翻訳後修飾を含む。いくつかの実施形態では、Ｐ１またはＰ２は、アセチル化、アクリル化、ＡＤＰ－リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質もしくは脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、ガンマカルボシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解処理、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化などタンパク質へのアミノ酸の転移ＲＮＡ媒介型付加、ユビキチン化を含むが、これらに限定されない修飾を含む。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、および末端を含むＰ１またはＰ２に対してあらゆる場所で行われる。
いくつかの実施形態では、Ｐ１またはＰ２は、アルブミンまたはアルブミンフラグメントを含まない。いくつかの実施形態では、Ｐ１またはＰ２は、アルブミン結合ドメインを含まない。
Ａ１とＡ２
いくつかの実施形態では、Ａ１またはＡ２は、抗原認識分子である。いくつかの実施形態では、抗原認識分子は、抗体または抗体フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗体フラグメントは、一本鎖可変フラグメント、単一ドメイン抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗体フラグメントは、ラクダ科由来単一ドメイン抗体の一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、重鎖可変ドメイン（ＶＨドメイン）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬドメイン）、または可変ドメイン（ＶＨＨ）を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗体フラグメントは、一本鎖可変フラグメントを含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗体フラグメントは、ヒト化またはヒトである。
いくつかの実施形態では、Ａ１またはＡ２は、Ｆａｂである。いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、（ａ）Ｆａｂ軽鎖ポリペプチドおよび（ｂ）Ｆａｂ重鎖ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｌ１またはＬ２は、Ｆａｂ軽鎖ポリペプチドのＮ末端に結合される。いくつかの実施形態では、Ｌ１またはＬ２は、Ｆａｂ重鎖ポリペプチドのＮ末端に結合される。いくつかの実施形態では、Ｌ１またはＬ２は、Ｆａｂ軽鎖ポリペプチドのＣ末端に結合される。いくつかの実施形態では、Ｌ１またはＬ２は、Ｆａｂ重鎖ポリペプチドのＣ末端に結合される。
いくつかの実施形態では、Ａ１またはＡ２は、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。いくつかの実施形態では、Ｌ１またはＬ２は、ｓｃＦｖのＮ末端に結合される。いくつかの実施形態では、Ｌ１またはＬ２は、ｓｃＦｖのＣ末端に結合される。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインを含む。いくつかの実施形態では、Ｌ１またはＬ２は、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）の軽鎖可変ドメインのＮ末端に結合される。いくつかの実施形態では、Ｌ１またはＬ２は、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）の重鎖可変ドメインのＮ末端に結合される。
いくつかの実施形態では、抗体またはその抗体フラグメントは、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗体フラグメントは、分化クラスタ３（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ３：ＣＤ３）結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗体フラグメントは、分化クラスタ３イプシロン（ＣＤ３ε）結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、標的抗原はＥＧＦＲを含む。いくつかの実施形態では、標的抗原はＣＤ３を含む。いくつかの実施形態では、標的抗原はＣＤ３εを含む。
いくつかの実施形態では、Ａ１またはＡ２は、エフェクター細胞上でＴＣＲ－ＣＤ３複合体の一部であるポリペプチドに結合する。いくつかの実施形態では、標的抗原は抗ＣＤ３エフェクター細胞抗原である。いくつかの実施形態では、ＴＣＲ－ＣＤ３複合体の一部であるポリペプチドは、ヒトＣＤ３εである。いくつかの実施形態では、Ａ１またはＡ２は、抗ＣＤ３ｅ一本鎖可変フラグメントを含む。いくつかの実施形態では、Ａ１またはＡ２は、ＣＤ３発現細胞上でのＣＤ３に対する結合のＫＤが１μＭ以下である抗ＣＤ３ｅ一本鎖可変フラグメントを含む。いくつかの実施形態では、Ａ１またはＡ２は、それぞれヒトＣＤ３に特異的に結合可能である可変軽鎖および可変重鎖を含む。いくつかの実施形態では、Ａ１またはＡ２は、ムロモナブ－ＣＤ３（ＯＫＴ３）、オテリキシズマブ（ＴＲＸ４）、テプリズマブ（ＭＧＡ０３１）、ビジリズマブ（Ｎｕｖｉｏｎ）、ＳＰ３４、Ｘ３５、ＶＩＴ３、ＢＭＡ０３０（ＢＷ２６４／５６）、ＣＬＢ－Ｔ３／３、ＣＲＩＳ７、ＹＴＨ１２．５、Ｆ１１１－４０９、ＣＬＢ－Ｔ３．４．２、ＴＲ－６６、ＷＴ３２、ＳＰｖ－Ｔ３ｂ、１１Ｄ８、ＸＩＩＩ－１４１、ＸＩＩＩ－４６、ＸＩＩＩ－８７、１２Ｆ６、Ｔ３／ＲＷ２－８Ｃ８、Ｔ３／ＲＷ２－４Ｂ６、ＯＫＴ３Ｄ、Ｍ－Ｔ３０１、ＳＭＣ２、Ｆ１０１．０１、ＵＣＨＴ－１、ＷＴ－３１、１５８６５、１５８６５ｖ１２、１５８６５ｖ１６、および１５８６５ｖ１９からなる群から選択される相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
いくつかの実施形態では、Ａ１またはＡ２は、可溶性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）である。天然のＴＣＲは、主要組織適合遺伝子複合体分子（ＭＨＣ）に結合される抗原を認識するＴ細胞の表面上に発現される膜貫通受容体である。天然のＴＣＲはヘテロ二量体であり、ジスルフィド結合を介して連結されるαポリペプチド鎖およびβポリペプチド鎖を含む。αポリペプチド鎖とβポリペプチド鎖は、例えば２個のＣＤ３εポリペプチド、１個のＣＤ３γポリペプチド、１個のＣＤ３δポリペプチド、および２個のＣＤ３ζポリペプチドを含む付属タンパク質との複合体の一部として発現される。ＴＣＲが標的抗原およびＭＨＣと係合すると、Ｔ細胞は活性化され、関連する酵素、共受容体、アダプタ分子、および活性化または放出された転写因子が媒介する一連のシグナル伝達イベントが生じる。
天然のＴＣＲでは、αポリペプチド鎖およびβポリペプチド鎖は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインを含む。各細胞外ドメインは、可変領域（Ｖ）、結合領域（Ｊ）、および定常領域（Ｃ）を含む。定常領域は膜貫通ドメインに対するＮ末端であり、膜貫通ドメインは細胞質ドメインに対するＮ末端である。αポリペプチド鎖とβポリペプチド鎖両方の可変領域は、３つの超可変または相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。βポリペプチド鎖は、通常可変領域と結合領域との間に短い多様性領域を含有する。３つのＣＤＲはフレームワーク配列に埋め込まれており、１つのＣＤＲはＣＤＲ３という名の超可変領域である。α鎖可変領域（Ｖα）およびβ鎖可変領域（Ｖβ）は、それらのフレームワーク配列、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２配列、ならびに部分的に定義されたＣＤＲ３配列により区別されるいくつかの種類の領域である。
ＴＣＲは、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（ＩＭＧＴ）のＴＣＲ命名法を用いて記述される。ＩＭＧＴ命名法でＶαは、固有の「ＴＲＡＶ」番号により参照される。同様に、Ｖβは固有の「ＴＲＢＶ」番号により参照される。対応する結合領域と定常領域は、α結合領域および定常領域ではそれぞれＴＲＡＪとＴＲＡＣと称され、β結合領域および定常領域ではそれぞれＴＲＢＪとＴＲＢＣと称される。ＩＭＧＴ命名法により定義される配列は当該技術分野で公知であり、オンラインのＩＭＧＴ公開データベース内にある。
いくつかの実施形態では、可溶性ＴＣＲは、ＴＣＲα細胞外ドメインまたはそのフラグメントの可変領域、およびＴＣＲβ細胞外ドメインまたはそのフラグメントの可変領域を含む、一本鎖ＴＣＲである。いくつかの実施形態では、可溶性ＴＣＲは、ＴＣＲα細胞外ドメインを含むαＴＣＲポリペプチド、およびＴＣＲβ細胞外ドメインを含むβＴＣＲポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、可溶性ＴＣＲは、ＴＣＲα細胞外ドメインまたはそのフラグメントの可変領域、およびＴＣＲβ細胞外ドメインまたはそのフラグメントの可変領域を含む、一本鎖ＴＣＲである。いくつかの実施形態では、可溶性ＴＣＲは、ＴＣＲα細胞外ドメインを含むαＴＣＲポリペプチド、およびＴＣＲβ細胞外ドメインを含むβＴＣＲポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｌ１は、αＴＣＲポリペプチドのＮ末端に結合される。いくつかの実施形態では、Ｌ１は、βＴＣＲポリペプチドのＮ末端に結合される。いくつかの実施形態では、Ａ２は、αＴＣＲポリペプチドのＣ末端に結合される。いくつかの実施形態では、Ａ２は、αＴＣＲポリペプチドのＮ末端に結合される。いくつかの実施形態では、Ａ２は、βＴＣＲポリペプチドのＣ末端に結合される。いくつかの実施形態では、Ａ２は、βＴＣＲポリペプチドのＮ末端に結合される。いくつかの実施形態では、Ｌ１は、αＴＣＲポリペプチドのＮ末端に結合され、Α２は、βＴＣＲポリペプチドのＮ末端に結合される。いくつかの実施形態では、Ｌ１は、αＴＣＲポリペプチドのＮ末端に結合され、Α２は、βＴＣＲポリペプチドのＣ末端に結合される。いくつかの実施形態では、Ｌ１は、αＴＣＲポリペプチドのＮ末端に結合され、Α２は、αＴＣＲポリペプチドのＣ末端に結合される。いくつかの実施形態では、Ｌ１は、βＴＣＲポリペプチドのＮ末端に結合され、Α２は、αＴＣＲポリペプチドのＮ末端に結合される。いくつかの実施形態では、Ｌ１は、βＴＣＲポリペプチドのＮ末端に結合され、Α２は、βＴＣＲポリペプチドのＣ末端に結合される。いくつかの実施形態では、Ｌ１は、βＴＣＲポリペプチドのＮ末端に結合され、Α２は、αＴＣＲポリペプチドのＣ末端に結合される。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体は、Ｐ１もしくはＰ２またはＬ１もしくはＬ２を有していないポリペプチドまたはポリペプチド複合体の標的抗原または第２の標的抗原に対する結合親和性と比較して、標的抗原または第２の標的抗原に対する結合親和性が弱い。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体は、Ｐ１もしくはＰ２またはＬ１もしくはＬ２を有していないポリペプチドまたはポリペプチド複合体の一形態の標的抗原に対する結合親和性と比較して、標的抗原または第２の標的抗原に対する結合親和性が少なくとも５倍弱い。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体は、Ｐ１もしくはＰ２またはＬ１もしくはＬ２を有していないポリペプチドまたはポリペプチド複合体の標的抗原または第２の標的抗原に対する結合親和性と比較して、標的抗原または第２の標的抗原に対する結合親和性が少なくとも８倍弱い。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体は、Ｐ１もしくはＰ２またはＬ１もしくはＬ２を有していないポリペプチドまたはポリペプチド複合体の標的抗原または第２の標的抗原に対する結合親和性と比較して、標的抗原または第２の標的抗原に対する結合親和性が少なくとも１０倍弱い。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体は、Ｐ１もしくはＰ２またはＬ１もしくはＬ２を有していないポリペプチドまたはポリペプチド複合体の標的抗原または第２の標的抗原に対する結合親和性と比較して、標的抗原または第２の標的抗原に対する結合親和性が少なくとも２０倍弱い。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体は、Ｐ１もしくはＰ２またはＬ１もしくはＬ２を有していないポリペプチドまたはポリペプチド複合体の標的抗原または第２の標的抗原に対する結合親和性と比較して、標的抗原または第２の標的抗原に対する結合親和性が少なくとも２５倍弱い。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体は、Ｐ１もしくはＰ２またはＬ１もしくはＬ２を有していないポリペプチドまたはポリペプチド複合体の標的抗原または第２の標的抗原に対する結合親和性と比較して、標的抗原または第２の標的抗原に対する結合親和性が少なくとも３０倍弱い。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体は、Ｐ１もしくはＰ２またはＬ１もしくはＬ２を有していないポリペプチドまたはポリペプチド複合体の標的抗原または第２の標的抗原に対する結合親和性と比較して、標的抗原または第２の標的抗原に対する結合親和性が少なくとも４０倍弱い。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体は、Ｐ１もしくはＰ２またはＬ１もしくはＬ２を有していないポリペプチドまたはポリペプチド複合体の標的抗原または第２の標的抗原に対する結合親和性と比較して、標的抗原または第２の標的抗原に対する結合親和性が少なくとも５０倍弱い。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体は、Ｐ１もしくはＰ２またはＬ１もしくはＬ２を有していないポリペプチドまたはポリペプチド複合体の標的抗原または第２の標的抗原に対する結合親和性と比較して、標的抗原または第２の標的抗原に対する結合親和性が少なくとも６０倍弱い。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体は、Ｐ１もしくはＰ２またはＬ１もしくはＬ２を有していないポリペプチドまたはポリペプチド複合体の標的抗原または第２の標的抗原に対する結合親和性と比較して、標的抗原または第２の標的抗原に対する結合親和性が少なくとも７０倍弱い。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体は、Ｐ１もしくはＰ２またはＬ１もしくはＬ２を有していないポリペプチドまたはポリペプチド複合体の標的抗原または第２の標的抗原に対する結合親和性と比較して、標的抗原または第２の標的抗原に対する結合親和性が少なくとも７５倍弱い。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体は、Ｐ１もしくはＰ２またはＬ１もしくはＬ２を有していないポリペプチドまたはポリペプチド複合体の標的抗原または第２の標的抗原に対する結合親和性と比較して、標的抗原または第２の標的抗原に対する結合親和性が少なくとも８０倍弱い。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体は、Ｐ１もしくはＰ２またはＬ１もしくはＬ２を有していないポリペプチドまたはポリペプチド複合体の標的抗原または第２の標的抗原に対する結合親和性と比較して、標的抗原または第２の標的抗原に対する結合親和性が少なくとも９０倍弱い。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体は、Ｐ１もしくはＰ２またはＬ１もしくはＬ２を有していないポリペプチドまたはポリペプチド複合体の標的抗原または第２の標的抗原に対する結合親和性と比較して、標的抗原または第２の標的抗原に対する結合親和性が少なくとも１００倍弱い。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体は、Ｐ１もしくはＰ２またはＬ１もしくはＬ２を有していないポリペプチドまたはポリペプチド複合体の標的抗原または第２の標的抗原に対する結合親和性と比較して、標的抗原または第２の標的抗原に対する結合親和性が少なくとも１２０倍弱い。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体は、Ｌ１またはＬ２が切断されているポリペプチドまたはポリペプチド複合体の標的抗原または第２の標的抗原に対する結合親和性と比較して、標的抗原または第２の標的抗原に対する結合親和性が弱い。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体は、Ｌ１またはＬ２が切断されているポリペプチドまたはポリペプチド複合体の標的抗原または第２の標的抗原に対する結合親和性と比較して、標的抗原または第２の標的抗原に対する結合親和性が少なくとも５倍弱い。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体は、Ｌ１またはＬ２が切断されているポリペプチドまたはポリペプチド複合体の標的抗原または第２の標的抗原に対する結合親和性と比較して、標的抗原または第２の標的抗原に対する結合親和性が少なくとも８倍弱い。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体は、Ｌ１またはＬ２が切断されているポリペプチドまたはポリペプチド複合体の標的抗原または第２の標的抗原に対する結合親和性と比較して、標的抗原または第２の標的抗原に対する結合親和性が少なくとも１０倍弱い。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体は、Ｌ１またはＬ２が切断されているポリペプチドまたはポリペプチド複合体の標的抗原または第２の標的抗原に対する結合親和性と比較して、標的抗原または第２の標的抗原に対する結合親和性が少なくとも２０倍弱い。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体は、Ｌ１またはＬ２が切断されているポリペプチドまたはポリペプチド複合体の標的抗原または第２の標的抗原に対する結合親和性と比較して、標的抗原または第２の標的抗原に対する結合親和性が少なくとも２５倍弱い。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体は、Ｌ１またはＬ２が切断されているポリペプチドまたはポリペプチド複合体の標的抗原または第２の標的抗原に対する結合親和性と比較して、標的抗原または第２の標的抗原に対する結合親和性が少なくとも３０倍弱い。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体は、Ｌ１またはＬ２が切断されているポリペプチドまたはポリペプチド複合体の標的抗原または第２の標的抗原に対する結合親和性と比較して、標的抗原または第２の標的抗原に対する結合親和性が少なくとも４０倍弱い。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体は、Ｌ１またはＬ２が切断されているポリペプチドまたはポリペプチド複合体の標的抗原または第２の標的抗原に対する結合親和性と比較して、標的抗原または第２の標的抗原に対する結合親和性が少なくとも５０倍弱い。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体は、Ｌ１またはＬ２が切断されているポリペプチドまたはポリペプチド複合体の標的抗原または第２の標的抗原に対する結合親和性と比較して、標的抗原または第２の標的抗原に対する結合親和性が少なくとも６０倍弱い。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体は、Ｌ１またはＬ２が切断されているポリペプチドまたはポリペプチド複合体の標的抗原または第２の標的抗原に対する結合親和性と比較して、標的抗原または第２の標的抗原に対する結合親和性が少なくとも７０倍弱い。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体は、Ｌ１またはＬ２が切断されているポリペプチドまたはポリペプチド複合体の標的抗原または第２の標的抗原に対する結合親和性と比較して、標的抗原または第２の標的抗原に対する結合親和性が少なくとも７５倍弱い。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体は、Ｌ１またはＬ２が切断されているポリペプチドまたはポリペプチド複合体の標的抗原または第２の標的抗原に対する結合親和性と比較して、標的抗原または第２の標的抗原に対する結合親和性が少なくとも８０倍弱い。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体は、Ｌ１またはＬ２が切断されているポリペプチドまたはポリペプチド複合体の標的抗原または第２の標的抗原に対する結合親和性と比較して、標的抗原または第２の標的抗原に対する結合親和性が少なくとも９０倍弱い。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体は、Ｌ１またはＬ２が切断されているポリペプチドまたはポリペプチド複合体の標的抗原または第２の標的抗原に対する結合親和性と比較して、標的抗原または第２の標的抗原に対する結合親和性が少なくとも１００倍弱い。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体は、Ｌ１またはＬ２が切断されているポリペプチドまたはポリペプチド複合体の標的抗原または第２の標的抗原に対する結合親和性と比較して、標的抗原または第２の標的抗原に対する結合親和性が少なくとも１２０倍弱い。いくつかの実施形態では、Ｌ１またはＬ２は、プロテアーゼにより切断される。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは腫瘍特異的プロテアーゼを含む。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）またはセリンプロテアーゼを含む。いくつかの実施形態では、マトリックスメタロプロテアーゼは、ＭＭＰ２、ＭＭＰ７、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１３、またはＭＭＰ１４を含む。いくつかの実施形態では、セリンプロテアーゼは、マトリプターゼ、ウロキナーゼ、またはヘプシンを含む。
いくつかの実施形態では、Ａ１またはＡ２は、サイトカインまたはサイトカインフラグメントである。いくつかの実施形態では、Ａ１またはＡ２は、サイトカインまたはサイトカインフラグメントの突然変異タンパク質である。いくつかの実施形態では、サイトカインまたはサイトカインフラグメントは、サイトカインまたはサイトカインフラグメントの突然変異タンパク質である。
サイトカインは、様々な生物学的経路での細胞間シグナル伝達に関与する、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンホカイン、アディポカイン、間葉成長因子、腫瘍壊死因子を含む多様な小ペプチド群である。サイトカインは、免疫応答および炎症応答で特に重要である。シグナル伝達は、リガンド結合における細胞外ドメインとシグナル伝達を可能にする細胞内ドメインとを含む膜貫通受容体である、対応するサイトカイン受容体によるサイトカインの認識に続いて生じる。
サイトカインの多様性はサイトカイン受容体の対応する多様性を伴い、一本鎖またはサブユニットまたは二量体／多量体ドメインを含むことができる。サイトカイン受容体として、インターロイキン受容体により例示されるＩ型サイトカイン受容体、およびインターフェロン受容体により例示されるＩＩ型サイトカイン受容体が挙げられ、ともにサイトカイン受容体相同ドメイン（ＣＨＤ）を含む。Ｉ型サイトカイン受容体のＣＨＤは共通のアミノ酸モチーフ（ＷＳＸＷＳ（配列番号２７））を共有しているが、ＩＩ型サイトカイン受容体はこのモチーフを欠いている。サイトカイン受容体は、αサブユニット、βサブユニット、γサブユニット、またはそれらの二量体もしくは三量体の組合せを含むことができる。一例では、ＩＬ－２に対する高親和性受容体は、ＩＬ－２Ｒαサブユニット、ＩＬ－２Ｒβサブユニット、およびＩＬ－２Ｒγサブユニットを含み、ＩＬ－２に対する中間親和性受容体は、ＩＬ－２ＲβサブユニットおよびＩＬ－２Ｒγサブユニットのみを含み、ＩＬ－２に対する低親和性受容体は、ＩＬ－２Ｒαサブユニットのみを含む。
いくつかの実施形態では、サイトカインは、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンホカイン、アディポカイン、成長因子、または腫瘍壊死因子である。いくつかの実施形態では、インターフェロン（ＩＦＮ）は、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、またはそれらのフラグメントである。いくつかの実施形態では、インターロイキン（ＩＬ）は、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、またはそれらのフラグメントである。いくつかの実施形態では、成長因子は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）またはそのフラグメントである。いくつかの実施形態では、サイトカインはＴＧＦ－βである。
いくつかの実施形態では、サイトカイン突然変異タンパク質は、種々の野生型サイトカインである。いくつかの実施形態では、サイトカイン突然変異タンパク質は、野生型サイトカインの突然変異体である。いくつかの実施形態では、サイトカイン突然変異タンパク質は、野生型サイトカインと比べて１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、または５０より多くのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、サイトカイン突然変異タンパク質は、野生型サイトカインと比べて多くとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、または５０より多くのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、サイトカイン突然変異タンパク質は、自然に生じないサイトカインである。いくつかの実施形態では、サイトカイン突然変異タンパク質は、自然に生じるサイトカインと比べて少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、または５０より多くのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、サイトカイン突然変異タンパク質は、自然に生じるサイトカインと比べて多くとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、または５０より多くのアミノ酸置換を含む。
いくつかの実施形態では、サイトカインまたはサイトカインフラグメントは、サイトカイン受容体に結合する。いくつかの実施形態では、サイトカイン受容体は、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンホカイン、アディポカイン、成長因子、または腫瘍壊死因子に対する受容体である。いくつかの実施形態では、サイトカイン受容体は、Ｉ型サイトカイン受容体またはＩＩ型サイトカイン受容体である。いくつかの実施形態では、サイトカイン受容体は、二量体または三量体である。いくつかの実施形態では、サイトカイン受容体は、αサブユニット、βサブユニット、γサブユニット、またはそれらのあらゆる組合せを含む。例えば、いくつかの実施形態では、サイトカイン受容体は、αサブユニット、βサブユニット、およびγサブユニットを含む。別の例では、いくつかの実施形態では、サイトカイン受容体は、βサブユニットおよびγサブユニットを含む。いくつかの実施形態では、サイトカイン受容体は、αサブユニットおよびβサブユニットを含む。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体は、Ｐ１もしくはＰ２またはＬ１もしくはＬ２を有していないポリペプチドまたはポリペプチド複合体のサイトカイン受容体に対する結合親和性と比較して、サイトカイン受容体に対する結合親和性が弱い。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体は、Ｐ１もしくはＰ２またはＬ１もしくはＬ２を有していないポリペプチドまたはポリペプチド複合体の一形態のサイトカイン受容体に対する結合親和性と比較して、サイトカイン受容体に対する結合親和性が少なくとも５倍弱い。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体は、Ｐ１もしくはＰ２またはＬ１もしくはＬ２を有していないポリペプチドまたはポリペプチド複合体の一形態のサイトカイン受容体に対する結合親和性と比較して、サイトカイン受容体に対する結合親和性が少なくとも８倍弱い。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体は、Ｐ１もしくはＰ２またはＬ１もしくはＬ２を有していないポリペプチドまたはポリペプチド複合体の一形態のサイトカイン受容体に対する結合親和性と比較して、サイトカイン受容体に対する結合親和性が少なくとも１０倍弱い。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体は、Ｐ１もしくはＰ２またはＬ１もしくはＬ２を有していないポリペプチドまたはポリペプチド複合体の一形態のサイトカイン受容体に対する結合親和性と比較して、サイトカイン受容体に対する結合親和性が少なくとも２０倍弱い。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体は、Ｐ１もしくはＰ２またはＬ１もしくはＬ２を有していないポリペプチドまたはポリペプチド複合体の一形態のサイトカイン受容体に対する結合親和性と比較して、サイトカイン受容体に対する結合親和性が少なくとも２５倍弱い。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体は、Ｐ１もしくはＰ２またはＬ１もしくはＬ２を有していないポリペプチドまたはポリペプチド複合体の一形態のサイトカイン受容体に対する結合親和性と比較して、サイトカイン受容体に対する結合親和性が少なくとも３０倍弱い。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体は、Ｐ１もしくはＰ２またはＬ１もしくはＬ２を有していないポリペプチドまたはポリペプチド複合体の一形態のサイトカイン受容体に対する結合親和性と比較して、サイトカイン受容体に対する結合親和性が少なくとも４０倍弱い。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体は、Ｐ１もしくはＰ２またはＬ１もしくはＬ２を有していないポリペプチドまたはポリペプチド複合体の一形態のサイトカイン受容体に対する結合親和性と比較して、サイトカイン受容体に対する結合親和性が少なくとも５０倍弱い。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体は、Ｐ１もしくはＰ２またはＬ１もしくはＬ２を有していないポリペプチドまたはポリペプチド複合体の一形態のサイトカイン受容体に対する結合親和性と比較して、サイトカイン受容体に対する結合親和性が少なくとも６０倍弱い。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体は、Ｐ１もしくはＰ２またはＬ１もしくはＬ２を有していないポリペプチドまたはポリペプチド複合体の一形態のサイトカイン受容体に対する結合親和性と比較して、サイトカイン受容体に対する結合親和性が少なくとも７０倍弱い。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体は、Ｐ１もしくはＰ２またはＬ１もしくはＬ２を有していないポリペプチドまたはポリペプチド複合体の一形態のサイトカイン受容体に対する結合親和性と比較して、サイトカイン受容体に対する結合親和性が少なくとも７５倍弱い。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体は、Ｐ１もしくはＰ２またはＬ１もしくはＬ２を有していないポリペプチドまたはポリペプチド複合体の一形態のサイトカイン受容体に対する結合親和性と比較して、サイトカイン受容体に対する結合親和性が少なくとも８０倍弱い。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体は、Ｐ１もしくはＰ２またはＬ１もしくはＬ２を有していないポリペプチドまたはポリペプチド複合体の一形態のサイトカイン受容体に対する結合親和性と比較して、サイトカイン受容体に対する結合親和性が少なくとも９０倍弱い。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体は、Ｐ１もしくはＰ２またはＬ１もしくはＬ２を有していないポリペプチドまたはポリペプチド複合体の一形態のサイトカイン受容体に対する結合親和性と比較して、サイトカイン受容体に対する結合親和性が少なくとも１００倍弱い。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体は、Ｐ１もしくはＰ２またはＬ１もしくはＬ２を有していないポリペプチドまたはポリペプチド複合体の一形態のサイトカイン受容体に対する結合親和性と比較して、サイトカイン受容体に対する結合親和性が少なくとも１２０倍弱い。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体は、Ｐ１もしくはＰ２またはＬ１もしくはＬ２を有していないポリペプチドまたはポリペプチド複合体の一形態のサイトカイン受容体に対する結合親和性と比較して、サイトカイン受容体に対する結合親和性が少なくとも１５０倍弱い。いくつかの実施形態では、サイトカインまたはサイトカインフラグメントは、インターフェロン、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、またはＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、サイトカインまたはサイトカインフラグメントは、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－６、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、またはＴＧＦ－βを含む。いくつかの実施形態では、サイトカイン受容体は、インターフェロン受容体、ＧＭ－ＣＳＦ受容体、ＩＬ－２受容体、ＩＬ－７受容体、ＩＬ－１２受容体、ＩＬ－１５受容体、またはＩＬ－２１受容体を含む。いくつかの実施形態では、サイトカイン受容体は、ＩＬ－２受容体、ＩＬ－１２受容体、ＩＬ－６受容体、ＩＬ－４受容体、ＩＬ－１０受容体、またはＴＧＦ－β受容体を含む。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体は、Ｌ１またはＬ２が切断されているポリペプチドまたはポリペプチド複合体のサイトカイン受容体に対する結合親和性と比較して、サイトカイン受容体に対する結合親和性が弱い。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体は、Ｌ１またはＬ２が切断されているポリペプチドまたはポリペプチド複合体のサイトカイン受容体に対する結合親和性と比較して、サイトカイン受容体に対する結合親和性が少なくとも５倍弱い。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体は、Ｌ１またはＬ２が切断されているポリペプチドまたはポリペプチド複合体のサイトカイン受容体に対する結合親和性と比較して、サイトカイン受容体に対する結合親和性が少なくとも８倍弱い。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体は、Ｌ１またはＬ２が切断されているポリペプチドまたはポリペプチド複合体のサイトカイン受容体に対する結合親和性と比較して、サイトカイン受容体に対する結合親和性が少なくとも１０倍弱い。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体は、Ｌ１またはＬ２が切断されているポリペプチドまたはポリペプチド複合体のサイトカイン受容体に対する結合親和性と比較して、サイトカイン受容体に対する結合親和性が少なくとも１５倍弱い。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体は、Ｌ１またはＬ２が切断されているポリペプチドまたはポリペプチド複合体のサイトカイン受容体に対する結合親和性と比較して、サイトカイン受容体に対する結合親和性が少なくとも２０倍弱い。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体は、Ｌ１またはＬ２が切断されているポリペプチドまたはポリペプチド複合体のサイトカイン受容体に対する結合親和性と比較して、サイトカイン受容体に対する結合親和性が少なくとも２５倍弱い。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体は、Ｌ１またはＬ２が切断されているポリペプチドまたはポリペプチド複合体のサイトカイン受容体に対する結合親和性と比較して、サイトカイン受容体に対する結合親和性が少なくとも３０倍弱い。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体は、Ｌ１またはＬ２が切断されているポリペプチドまたはポリペプチド複合体のサイトカイン受容体に対する結合親和性と比較して、サイトカイン受容体に対する結合親和性が少なくとも４０倍弱い。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体は、Ｌ１またはＬ２が切断されているポリペプチドまたはポリペプチド複合体のサイトカイン受容体に対する結合親和性と比較して、サイトカイン受容体に対する結合親和性が少なくとも５０倍弱い。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体は、Ｌ１またはＬ２が切断されているポリペプチドまたはポリペプチド複合体のサイトカイン受容体に対する結合親和性と比較して、サイトカイン受容体に対する結合親和性が少なくとも６０倍弱い。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体は、Ｌ１またはＬ２が切断されているポリペプチドまたはポリペプチド複合体のサイトカイン受容体に対する結合親和性と比較して、サイトカイン受容体に対する結合親和性が少なくとも７０倍弱い。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体は、Ｌ１またはＬ２が切断されているポリペプチドまたはポリペプチド複合体のサイトカイン受容体に対する結合親和性と比較して、サイトカイン受容体に対する結合親和性が少なくとも７５倍弱い。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体は、Ｌ１またはＬ２が切断されているポリペプチドまたはポリペプチド複合体のサイトカイン受容体に対する結合親和性と比較して、サイトカイン受容体に対する結合親和性が少なくとも８０倍弱い。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体は、Ｌ１またはＬ２が切断されているポリペプチドまたはポリペプチド複合体のサイトカイン受容体に対する結合親和性と比較して、サイトカイン受容体に対する結合親和性が少なくとも９０倍弱い。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体は、Ｌ１またはＬ２が切断されているポリペプチドまたはポリペプチド複合体のサイトカイン受容体に対する結合親和性と比較して、サイトカイン受容体に対する結合親和性が少なくとも１００倍弱い。いくつかの実施形態では、サイトカインまたはサイトカインフラグメントは、インターフェロン、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、またはＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、サイトカイン受容体は、インターフェロン受容体、ＧＭ－ＣＳＦ受容体、ＩＬ－２受容体、ＩＬ－７受容体、ＩＬ－１２受容体、ＩＬ－１５受容体、またはＩＬ－２１受容体を含む。いくつかの実施形態では、Ｌ１またはＬ２は、プロテアーゼにより切断される。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは腫瘍特異的プロテアーゼを含む。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）またはセリンプロテアーゼを含む。いくつかの実施形態では、マトリックスメタロプロテアーゼは、ＭＭＰ２、ＭＭＰ７、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１３、またはＭＭＰ１４を含む。いくつかの実施形態では、セリンプロテアーゼは、マトリプターゼ、ウロキナーゼ、またはヘプシンを含む。
半減期延長部分
いくつかの実施形態では、Ｐ１は半減期延長部分にさらに連結される。いくつかの実施形態では、Ｐ１は、式Ｉａ：
Ａ１－Ｌ１－Ｐ１－Ｌ３－Ｈ１
（式Ｉａ）
による配置で半減期延長部分に連結され、
式中、Ｈ１は半減期延長部分であり、Ｌ３はＨ１をＰ１に接続するリンカーである。いくつかの実施形態では、Ｌ３は切断不能リンカーである。いくつかの実施形態では、半減期延長部分（Ｈ１）は、Ａ１が標的抗原に結合するのを防止しない。いくつかの実施形態では、半減期延長部分（Ｈ１）は、Ａ１に対する結合親和性を有していない。いくつかの実施形態では、半減期延長部分（Ｈ１）は、標的抗原に対する結合親和性を有していない。いくつかの実施形態では、半減期延長部分（Ｈ１）は、Ａ１を標的抗原から保護しない。いくつかの実施形態では、半減期延長部分（Ｈ１）は、Ａ１に直接連結しない。
いくつかの実施形態では、半減期延長部分（Ｈ１）は、Ａ１がサイトカイン受容体に結合するのを防止しない。いくつかの実施形態では、半減期延長部分（Ｈ１）は、サイトカインまたはサイトカイン受容体に対する結合親和性を有していない。いくつかの実施形態では、半減期延長部分（Ｈ１）は、サイトカインまたはサイトカインフラグメントをサイトカイン受容体から保護しない。いくつかの実施形態では、半減期延長部分（Ｈ１）は、サイトカインまたはサイトカインフラグメントに直接連結しない。
いくつかの実施形態では、Ｈ１は、反復配列モチーフを有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｈ１は、高秩序二次構造を有するアミノ酸配列を含む。「高度秩序二次構造」とは、本文脈で使用するとき、Ｈ１のアミノ酸残基の少なくとも約５０％、約７０％、約８０％、または約９０％が、 分光測色法（例えば、「ｆａｒ－ＵＶ」スペクトル領域（１９０～２５０ｎｍ）での円偏光二色分光法、ならびにＣｈｏｕ－ＦａｓｍａｎアルゴリズムやＧａｒｎｉｅｒ－Ｏｓｇｕｔｈｏｒｐｅ－Ｒｏｂｓｏｎ（「ＧＯＲ」）アルゴリズムなどのコンピュータプログラムまたはアルゴリズムによる）を含むがこれに限定されない手段で測定したときに二次構造に寄与することを意味する。
いくつかの実施形態では、Ｈ１はポリマーを含む。いくつかの実施形態では、ポリマーはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。いくつかの実施形態では、Ｈ１はアルブミンを含む。いくつかの実施形態では、Ｈ１はＦｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、アルブミンは血清アルブミンである。いくつかの実施形態では、アルブミンはヒト血清アルブミンである。いくつかの実施形態では、Ｈ１は、ポリペプチド、リガンド、または小分子を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチド、リガンド、または小分子は、血清タンパク質もしくはそのフラグメント、循環免疫グロブリンもしくはそのフラグメント、またはＣＤ３５／ＣＲ１に結合する。いくつかの実施形態では、血清タンパク質は、チロキシン結合タンパク質、トランスサイレチン、１－酸糖タンパク質、トランスフェリン、トランスフェリン受容体もしくはそのトランスフェリン結合部分、フィブリノゲン、またはアルブミンを含む。いくつかの実施形態では、循環免疫グロブリン分子は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ｓｌｇＡ、ＩｇＭ、またはＩｇＤを含む。いくつかの実施形態では、血清タンパク質はアルブミンである。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、単一ドメイン抗体、一本鎖可変フラグメント、またはＦａｂを含む。いくつかの実施形態では、抗体は単一ドメイン抗体を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、アルブミンに結合する単一ドメイン抗体を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト血清アルブミンに結合する単一ドメイン抗体を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト抗体またはヒト化抗体である。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、６４５ｇＨ１ｇＬ１、６４５ｄｓｇＨ５ｇＬ４、２３－１３－Ａ０１－ｓｃ０２、Ａ１０ｍ３、またはそれらのフラグメント、ＤＯＭ７ｒ－３１、ＤＯＭ７ｈ－１１－１５、Ａｌｂ－１、Ａｌｂ－８、Ａｌｂ－２３、１０Ｇ、１０ＧＥ、およびＳＡ２１からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、Ｈ１は単一ドメイン抗体を含む。いくつかの実施形態では、Ｈ１は、アルブミンに結合する単一ドメイン抗体を含む。いくつかの実施形態では、Ｈ１は、ヒト血清アルブミンに結合する単一ドメイン抗体を含む。
いくつかの実施形態では、Ｈ１は、修飾アミノ酸もしくは非天然アミノ酸、または修飾非天然アミノ酸、あるいはそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、修飾アミノ酸または修飾非天然アミノ酸は、翻訳後修飾を含む。いくつかの実施形態では、Ｈ１は、アセチル化、アクリル化、ＡＤＰ－リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質もしくは脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、ガンマカルボシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解処理、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化などタンパク質へのアミノ酸の転移ＲＮＡ媒介型付加、ユビキチン化を含むが、これらに限定されない修飾を含む。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、および末端を含むＨ１に対してあらゆる場所で行われる。
ポリペプチドまたはポリペプチド複合体をコードするポリヌクレオチド
本明細書中のいくつかの実施形態では、本明細書に開示されるポリペプチドまたはポリペプチド複合体をコードする、単離された組換え核酸分子が開示される。本明細書中のいくつかの実施形態では、切断可能リンカーを含むポリペプチドをコードする単離された組換え核酸分子が開示される。
本明細書中のいくつかの実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列（ＬＳＧＲＳＤＡＧ）による切断可能リンカーを含むポリペプチドをコードする、単離された組換え核酸分子が開示される。
いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、配列番号３のアミノ酸配列（ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＡＧ）を含む。いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、配列番号２６のアミノ酸配列（ＡＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＡＧ）を含む。いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、配列番号４のアミノ酸配列（ＡＡＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＡＧ）を含む。いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、配列番号５のアミノ酸配列（ＳＰＬＧＬＳＧＲＳＤＡＧ）を含む。いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、配列番号６のアミノ酸配列（ＬＳＧＲＳＤＡＧＳＰＬＧＬＡＧ）を含む。
本明細書中のいくつかの実施形態では、リンカー１（ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＡＧ）（配列番号３）、リンカー２（ＡＡＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＡＧ）（配列番号４）、リンカー３（ＳＰＬＧＬＳＧＲＳＤＡＧ）（配列番号５）、またはリンカー４（ＬＳＧＲＳＤＡＧＳＰＬＧＬＡＧ）（配列番号６）のアミノ酸配列による切断可能リンカーを含む単離ポリペプチド、または、リンカー１、リンカー２、リンカー３、またはリンカー４のアミノ酸配列に対して１、２、または３つのアミノ酸置換、付加、もしくは欠失を有する切断可能リンカーを含む単離ポリペプチドをコードする、単離された組換え核酸分子が開示される。本明細書中のいくつかの実施形態では、リンカー１のアミノ酸配列（ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＡＧ）（配列番号３）による切断可能リンカーを含む単離ポリペプチドをコードする、単離された組換え核酸分子が開示される。本明細書中のいくつかの実施形態では、リンカー２のアミノ酸配列（ＡＡＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＡＧ）（配列番号４）による切断可能リンカーを含む単離ポリペプチドをコードする、単離された組換え核酸分子が開示される。本明細書中のいくつかの実施形態では、リンカー３のアミノ酸配列（ＳＰＬＧＬＳＧＲＳＤＡＧ）（配列番号５）による切断可能リンカーを含む単離ポリペプチドをコードする、単離された組換え核酸分子が開示される。本明細書中のいくつかの実施形態では、リンカー４のアミノ酸配列（ＬＳＧＲＳＤＡＧＳＰＬＧＬＡＧ）（配列番号６）による切断可能リンカーを含む単離ポリペプチドをコードする、単離された組換え核酸分子が開示される。本明細書中のいくつかの実施形態では、アミノ酸配列ＬＳＧＲＳＤＡＧ（配列番号１）による切断可能リンカーを含む単離ポリペプチドをコードする、単離された組換え核酸分子が開示される。
本明細書中のいくつかの実施形態では、式Ｉ：
Ａ１－Ｌ１－Ｐ１
（式Ｉ）
によるポリペプチドまたはポリペプチド複合体をコードする、単離された組換え核酸分子が開示され、
式中、Ａ１は、標的抗原に結合する抗原結合性ドメイン、またはサイトカイン受容体に結合するサイトカインを含み、Ｌ１は切断可能リンカーを含み、Ｐ１は、標的抗原への抗原結合性ドメインの結合を損なわせるか、またはサイトカイン受容体へのサイトカインの結合を損なわせるペプチドを含む。本明細書中のいくつかの実施形態では、式Ｉ：
Ａ１－Ｌ１－Ｐ１
（式Ｉ）
を含むポリペプチドまたはポリペプチド複合体をコードする、単離された組換え核酸分子が開示され、
式中、Ａ１は、標的抗原に結合する抗原結合性ドメイン、またはサイトカイン受容体に結合するサイトカインを含み、Ｌ１は切断可能リンカーを含み、Ｐ１は、標的抗原への抗原結合性ドメインの結合を損なわせるか、またはサイトカイン受容体へのサイトカインの結合を損なわせるペプチドを含む。本明細書中のいくつかの実施形態では、式Ｉ：
Ａ１－Ｌ１－Ｐ１
（式Ｉ）
によるポリペプチドまたはポリペプチド複合体をコードする、単離された組換え核酸分子が開示され、
式中、Ａ１は、標的抗原に結合する抗原結合性ドメイン、またはサイトカイン受容体に結合するサイトカインであり、Ｌ１は切断可能リンカーであり、Ｐ１は、標的抗原への抗原結合性ドメインの結合を損なわせるか、またはサイトカイン受容体へのサイトカインの結合を損なわせるペプチドである。本明細書中のいくつかの実施形態では、式Ｉ：
Ａ１－Ｌ１－Ｐ１
（式Ｉ）
を含むポリペプチドまたはポリペプチド複合体をコードする、単離された組換え核酸分子が開示され、
式中、Ａ１は、標的抗原に結合する抗原結合性ドメイン、またはサイトカイン受容体に結合するサイトカインであり、Ｌ１は切断可能リンカーであり、Ｐ１は、標的抗原への抗原結合性ドメインの結合を損なわせるか、またはサイトカイン受容体へのサイトカインの結合を損なわせるペプチドである。
本明細書中のいくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体であって、単離ポリペプチドが、第２の抗原結合性ドメインまたは第２のサイトカインを含む第２の単離ポリペプチドと複合体を形成する、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体が開示される。本明細書中のいくつかの実施形態では、式ＩＩ：
Ａ２－Ｌ２－Ｐ２
（式ＩＩ）
によるポリペプチドまたはポリペプチド複合体をコードする、単離された組換え核酸分子が開示され、
式中、Ａ２は、第２の抗原結合性ドメインまたは第２のサイトカインを含み、Ｌ２は第２の切断可能リンカーを含み、Ｐ２は、第２の標的抗原への第２の抗原結合性ドメインの結合を損なわせるか、または第２のサイトカイン受容体への第２のサイトカインの結合を損なわせる第２のペプチドを含む。本明細書中のいくつかの実施形態では、式ＩＩ：
Ａ２－Ｌ２－Ｐ２
（式ＩＩ）
を含むポリペプチドまたはポリペプチド複合体をコードする、単離された組換え核酸分子が開示され、
式中、Ａ２は、第２の抗原結合性ドメインまたは第２のサイトカインを含み、Ｌ２は第２の切断可能リンカーを含み、Ｐ２は、第２の標的抗原への第２の抗原結合性ドメインの結合を損なわせるか、または第２のサイトカイン受容体への第２のサイトカインの結合を損なわせる第２のペプチドを含む。本明細書中のいくつかの実施形態では、式ＩＩ：
Ａ２－Ｌ２－Ｐ２
（式ＩＩ）
によるポリペプチドまたはポリペプチド複合体をコードする、単離された組換え核酸分子が開示され、
式中、Ａ２は、第２の抗原結合性ドメインまたは第２のサイトカインであり、Ｌ２は第２の切断可能リンカーであり、Ｐ２は、第２の標的抗原への第２の抗原結合性ドメインの結合を損なわせるか、または第２のサイトカイン受容体への第２のサイトカインの結合を損なわせる第２のペプチドである。本明細書中のいくつかの実施形態では、式ＩＩ：
Ａ２－Ｌ２－Ｐ２
（式ＩＩ）
を含むポリペプチドまたはポリペプチド複合体をコードする、単離された組換え核酸分子が開示され、
式中、Ａ２は、第２の抗原結合性ドメインまたは第２のサイトカインであり、Ｌ２は第２の切断可能リンカーであり、Ｐ２は、第２の標的抗原への第２の抗原結合性ドメインの結合を損なわせるか、または第２のサイトカイン受容体への第２のサイトカインの結合を損なわせる第２のペプチドである。
医薬組成物
本明細書中のいくつかの実施形態では、（ａ）本明細書に開示されるポリペプチドまたはポリペプチド複合体と、（ｂ）薬学的に許容可能な賦形剤とを含む医薬組成物が開示される。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、（ａ）配列番号１のアミノ酸配列（ＬＳＧＲＳＤＡＧ）による切断可能リンカーを含むポリペプチドまたはポリペプチド複合体と、（ｂ）薬学的に許容可能な賦形剤とを含む。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列（ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＡＧ）による切断可能リンカーを含むポリペプチドまたはポリペプチド複合体と、（ｂ）薬学的に許容可能な賦形剤とを含む。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、（ａ）配列番号２６のアミノ酸配列（ＡＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＡＧ）による切断可能リンカーを含むポリペプチドまたはポリペプチド複合体と、（ｂ）薬学的に許容可能な賦形剤とを含む。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、（ａ）配列番号４のアミノ酸配列（ＡＡＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＡＧ）による切断可能リンカーを含むポリペプチドまたはポリペプチド複合体と、（ｂ）薬学的に許容可能な賦形剤とを含む。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、（ａ）配列番号５のアミノ酸配列（ＳＰＬＧＬＳＧＲＳＤＡＧ）による切断可能リンカーを含むポリペプチドまたはポリペプチド複合体と、（ｂ）薬学的に許容可能な賦形剤とを含む。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、（ａ）配列番号６のアミノ酸配列（ＬＳＧＲＳＤＡＧＳＰＬＧＬＡＧ）による切断可能リンカーを含むポリペプチドまたはポリペプチド複合体と、（ｂ）薬学的に許容可能な賦形剤とを含む。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、（ａ）リンカー１（ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＡＧ）（配列番号３）、リンカー２（ＡＡＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＡＧ）（配列番号４）、リンカー３（ＳＰＬＧＬＳＧＲＳＤＡＧ）（配列番号５）、もしくはリンカー４（ＬＳＧＲＳＤＡＧＳＰＬＧＬＡＧ）（配列番号６）のアミノ酸配列による切断可能リンカーを含むポリペプチドもしくはポリペプチド複合体、または、リンカー１、リンカー２、リンカー３、もしくはリンカー４のアミノ酸配列に対して１、２、もしくは３つのアミノ酸置換、付加、もしくは欠失を有する切断可能リンカーを含むポリペプチドもしくポリペプチド複合体と、（ｂ）薬学的に許容可能な賦形剤とを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、（ａ）リンカー１のアミノ酸配列（ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＡＧ）（配列番号３）による切断可能リンカーを含むポリペプチドまたはポリペプチド複合体と、（ｂ）薬学的に許容可能な賦形剤とを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、（ａ）リンカー２のアミノ酸配列（ＡＡＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＡＧ）（配列番号４）による切断可能リンカーを含むポリペプチドまたはポリペプチド複合体と、（ｂ）薬学的に許容可能な賦形剤とを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、（ａ）リンカー３のアミノ酸配列（ＳＰＬＧＬＳＧＲＳＤＡＧ）（配列番号５）による切断可能リンカーを含むポリペプチドまたはポリペプチド複合体と、（ｂ）薬学的に許容可能な賦形剤とを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、（ａ）リンカー４のアミノ酸配列（ＬＳＧＲＳＤＡＧＳＰＬＧＬＡＧ）（配列番号６）による切断可能リンカーを含むポリペプチドまたはポリペプチド複合体と、（ｂ）薬学的に許容可能な賦形剤とを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、（ａ）アミノ酸配列ＬＳＧＲＳＤＡＧ（配列番号１）による切断可能リンカーを含むポリペプチドまたはポリペプチド複合体と、（ｂ）薬学的に許容可能な賦形剤とを含む。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、（ａ）式Ｉ：
Ａ１－Ｌ１－Ｐ１
（式Ｉ）
による単離ポリペプチドまたはポリペプチド複合体であって、
式中、Ａ１は、標的抗原に結合する抗原結合性ドメイン、またはサイトカイン受容体に結合するサイトカインを含み、Ｌ１は切断可能リンカーを含み、Ｐ１は、標的抗原への抗原結合性ドメインの結合を損なわせるか、またはサイトカイン受容体へのサイトカインの結合を損なわせるペプチドを含む、単離ポリペプチドまたはポリペプチド複合体と、（ｂ）薬学的に許容可能な賦形剤とを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、（ａ）式Ｉ：
Ａ１－Ｌ１－Ｐ１
（式Ｉ）
を含む単離ポリペプチドまたはポリペプチド複合体であって、
式中、Ａ１は、標的抗原に結合する抗原結合性ドメイン、またはサイトカイン受容体に結合するサイトカインを含み、Ｌ１は切断可能リンカーを含み、Ｐ１は、標的抗原への抗原結合性ドメインの結合を損なわせるか、またはサイトカイン受容体へのサイトカインの結合を損なわせるペプチドを含む、単離ポリペプチドまたはポリペプチド複合体と、（ｂ）薬学的に許容可能な賦形剤とを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、（ａ）式Ｉ：
Ａ１－Ｌ１－Ｐ１
（式Ｉ）
による単離ポリペプチドまたはポリペプチド複合体であって、
式中、Ａ１は、標的抗原に結合する抗原結合性ドメイン、またはサイトカイン受容体に結合するサイトカインであり、Ｌ１は切断可能リンカーであり、Ｐ１は、標的抗原への抗原結合性ドメインの結合を損なわせるか、またはサイトカイン受容体へのサイトカインの結合を損なわせるペプチドである、単離ポリペプチドまたはポリペプチド複合体と、（ｂ）薬学的に許容可能な賦形剤とを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、（ａ）式Ｉ：
Ａ１－Ｌ１－Ｐ１
（式Ｉ）
を含む単離ポリペプチドまたはポリペプチド複合体であって、
式中、Ａ１は、標的抗原に結合する抗原結合性ドメイン、またはサイトカイン受容体に結合するサイトカインであり、Ｌ１は切断可能リンカーであり、Ｐ１は、標的抗原への抗原結合性ドメインの結合を損なわせるか、またはサイトカイン受容体へのサイトカインの結合を損なわせるペプチドである、単離ポリペプチドまたはポリペプチド複合体と、（ｂ）薬学的に許容可能な賦形剤とを含む。
本明細書中のいくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体であって、単離ポリペプチドが、第２の抗原結合性ドメインまたは第２のサイトカインを含む第２の単離ポリペプチドと複合体を形成する、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体が開示される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、（ａ）式ＩＩ：
Ａ２－Ｌ２－Ｐ２
（式ＩＩ）
による単離ポリペプチドまたはポリペプチド複合体であって、
式中、Ａ２は、第２の抗原結合性ドメインまたは第２のサイトカインを含み、Ｌ２は第２の切断可能リンカーを含み、Ｐ２は、第２の標的抗原への第２の抗原結合性ドメインの結合を損なわせるか、または第２のサイトカイン受容体への第２のサイトカインの結合を損なわせる第２のペプチドを含む、単離ポリペプチドまたはポリペプチド複合体と、（ｂ）薬学的に許容可能な賦形剤とを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、（ａ）式ＩＩ：
Ａ２－Ｌ２－Ｐ２
（式ＩＩ）
を含む単離ポリペプチドまたはポリペプチド複合体であって、
式中、Ａ２は、第２の抗原結合性ドメインまたは第２のサイトカインを含み、Ｌ２は第２の切断可能リンカーを含み、Ｐ２は、第２の標的抗原への第２の抗原結合性ドメインの結合を損なわせるか、または第２のサイトカイン受容体への第２のサイトカインの結合を損なわせる第２のペプチドを含む、単離ポリペプチドまたはポリペプチド複合体と、（ｂ）薬学的に許容可能な賦形剤とを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、（ａ）式ＩＩ：
Ａ２－Ｌ２－Ｐ２
（式ＩＩ）
による単離ポリペプチドまたはポリペプチド複合体であって、
式中、Ａ２は、第２の抗原結合性ドメインまたは第２のサイトカインであり、Ｌ２は第２の切断可能リンカーであり、Ｐ２は、第２の標的抗原への第２の抗原結合性ドメインの結合を損なわせるか、または第２のサイトカイン受容体への第２のサイトカインの結合を損なわせる第２のペプチドである、単離ポリペプチドまたはポリペプチド複合体と、（ｂ）薬学的に許容可能な賦形剤とを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、（ａ）式ＩＩ：
Ａ２－Ｌ２－Ｐ２
（式ＩＩ）
を含む単離ポリペプチドまたはポリペプチド複合体であって、
式中、Ａ２は、第２の抗原結合性ドメインまたは第２のサイトカインであり、Ｌ２は第２の切断可能リンカーであり、Ｐ２は、第２の標的抗原への第２の抗原結合性ドメインの結合を損なわせるか、または第２のサイトカイン受容体への第２のサイトカインの結合を損なわせる第２のペプチドである、単離ポリペプチドまたはポリペプチド複合体と、（ｂ）薬学的に許容可能な賦形剤とを含む。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体は、検出可能ラベル、治療剤、または薬物動態修飾部分（ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ ｍｏｉｅｔｙ）をさらに含む。いくつかの実施形態では、検出可能ラベルは、蛍光ラベル、放射性ラベル、酵素、核酸プローブ、または造影剤を含む。
対象への投与において、本明細書に開示されるポリペプチドまたはポリペプチド複合体は、１つまたは複数の薬学的に許容可能な担体または賦形剤と一体的に医薬組成物に入れて提供される場合もある。「薬学的に許容可能な担体」という用語には、成分の生体活性の有効性を妨げず投与対象である患者に対し有毒ではないいずれかの担体が含まれるが、これらに限定されない。好適な医薬担体の例は当該技術分野で周知であり、リン酸緩衝生理食塩水、水、油／水乳剤などの乳剤、種々の種類の湿潤剤、滅菌溶液などが挙げられる。このような担体は従来の方法により製剤化可能であり、好適な用量で対象に投与できる。好ましくは、医薬組成物は無菌である。これらの組成物は、保存料、乳化剤、分散剤などの補助剤をさらに含有する場合もある。微生物作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤を含めることにより確実となる場合もある。
医薬組成物は、（所望の投与方法に応じて）いずれかの好適な形態にあってよい。医薬組成物は単位剤形で提供され、密封容器に入れて提供され、およびキットの一部として提供されてもよい。このようなキットには使用説明書が含まれる場合もある。上述の単位剤形が複数含まれる場合もある。
医薬組成物は、非経口（例えば、皮下、筋肉内、または静脈内）経路を含むあらゆる適切な経路による投与に適合させられる場合もある。このような組成物は、薬学の分野で公知の方法により、例えば、滅菌条件下で有効成分を担体または賦形剤と混合することによって調製される場合がある。
本開示の物質の投与量は、処置対象である疾患または障害、処置対象である個体の年齢や状態などに依存して広範囲間で変動する可能性があり、最終的には使用される適切な投与量を医師が決定することになる。
表１では、本明細書に記載の構築物のアミノ酸配列を提供する。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体は、表１に明記される配列を含む。いくつかの実施形態では、配列は、配列番号１、２、４、５、７、８、９、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５に対して少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、配列は、配列番号１、２、４、５、７、８、９、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５に対して少なくともまたは約９５％の相同性を含む。いくつかの実施形態では、配列は、配列番号１、２、４、５、７、８、９、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５に対して少なくともまたは約９７％の相同性を含む。いくつかの実施形態では、配列は、配列番号１、２、４、５、７、８、９、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５に対して少なくともまたは約９９％の相同性を含む。いくつかの実施形態では、配列は、配列番号１、２、４、５、７、８、９、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５に対して少なくともまたは約１００％の相同性を含む。いくつかの例では、配列は、配列番号１、２、４、５、７、８、９、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５の、少なくともまたは約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、または４００を超えるアミノ酸を有する部分を少なくとも含む。
参照ポリペプチド配列に関する配列同一性率（％）は、配列をアライメントし、必要な場合にギャップを導入することにより最大の配列同一性率を達成したが、いずれの保存的置換も配列同一性の一部として認めなかった後に、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の割合である。アミノ酸配列同一性率を求める目的のアライメントは、公知の様々な方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、Ｍｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを用いて達成できる。比較される配列の全長にわたり最大のアライメントを達成するために必要なアルゴリズムを含む、配列をアライメントするのに適切なパラメータの判定が可能である。しかし、本明細書中の目的では、アミノ酸配列同一性％の値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ－２を用いて生成される。ＡＬＩＧＮ－２配列比較コンピュータプログラムは、著者Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．であり、ソースコードは、ワシントンＤ．Ｃ．，２０５５９の米国著作権局にユーザ文書とともに提出されており、米国著作権登録第ＴＸＵ５１００８７号の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ－２プログラムはカリフォルニア州サウスサンフランシスコＧｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．から公的に入手可能か、またはソースコードからコンパイルされる場合がある。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、ｄｉｇｉｔａｌ ＵＮＩＸ（登録商標）Ｖ４．０Ｄを含むＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステムで使用するためにコンパイルする必要がある。すべての配列比較パラメータはＡＬＩＧＮ－２プログラムにより設定され、変更はない。
ＡＬＩＧＮ－２がアミノ酸配列の比較に利用される状況で、所与のアミノ酸配列Ａの、所与のアミノ酸Ｂに対する（ｔｏ，ｗｉｔｈ，ｏｒ ａｇａｉｎｓｔ）アミノ酸配列同一性率（あるいは、所与のアミノ酸配列Ｂに対する特定のアミノ酸配列同一性％を有するか含んでいる所与のアミノ酸配列Ａという句とすることができる）は、１００×分数Ｘ／Ｙとして算出され、式中、Ｘは、プログラムのＡとＢのアライメントにおける配列アライメントプログラムＡＬＩＧＮ－２によって同一の一致としてスコア付けされたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂのアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さはアミノ酸配列Ｂの長さに等しく、Ｂに対するＡのアミノ酸配列同一性％は、Ａに対するＢのアミノ酸配列同一性％に等しくないことを認識されたい。別段の言及のない限り、本明細書で使用するアミノ酸配列同一性％の値は全て、ＡＬＩＧＮ－２コンピュータプログラムを用いて直前の段落に記載するように取得される。
切断可能リンカーを含むポリペプチドの産生
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド（例えば、抗体およびその結合性フラグメント）は、当該技術分野で公知であってポリペプチド（例えば、抗体）の合成に有用とされるあらゆる方法、具体的には、化学合成または組換え発現により産生され、好ましくは組換え発現技法により産生される。
いくつかの例では、抗体またはその結合性フラグメントは組換えにより発現され、抗体またはその結合性フラグメントをコードする核酸は、化学合成されたオリゴヌクレオチド（例えば、Ｋｕｔｍｅｉｅｒらによる１９９４年のＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１７：２４２に記載するもの）から組み立てられ、このオリゴヌクレオチドは、抗体をコードする配列の複数部分を含有する重複オリゴヌクレオチドの合成、それらオリゴヌクレオチドのアニーリングとライゲーション、ならびにライゲーションされたオリゴヌクレオチドのＰＣＲ増幅に関与する。
代替的に、抗体をコードする核酸分子は、任意選択で好適なソース（例えば、抗体ｃＤＮＡライブラリ、または免疫グロブリンを発現するいずれかの組織もしくは細胞から生成したｃＤＮＡライブラリ）から、配列の３’末端と５’末端にハイブリダイズ可能な合成プライマーを用いたＰＣＲ増幅、または、特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いたクローニングにより生成される。
いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、任意選択で動物を免疫化することにより生成されることでポリクローナル抗体を生成し、またはより好ましくは、例えばＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５－４９７）に記載されるように、もしくはＫｏｚｂｏｒら（１９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７２）かＣｏｌｅら（１９８５ ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７－９６）に記載されるように、モノクローナル抗体を生成することにより生成される。代替的に、抗体の少なくともＦａｂ部分をコードするクローンが、特異的抗原を結合するＦａｂフラグメントのクローンに対しＦａｂ発現ライブラリ（例えば、Ｈｕｓｅらによる１９８９年のＳｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５－１２８１に記載のもの）をスクリーニングすることにより、または抗体ライブラリをスクリーニングすることにより、任意選択で取得される（例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎらによる１９９１年のＮａｔｕｒｅ ３５２：６２４、Ｈａｎｅらによる１９９７年のＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：４９３７を参照）。
いくつかの実施形態では、適切な抗原特異性を持つマウス抗体分子からの抗体とともに、適切な生体活性を持つヒト抗体分子からの遺伝子をスプライシングすることにより「キメラ抗体」を産生するために開発された技法（Ｍｏｒｒｉｓｏｎらによる１９８４年のＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：８５１－８５５、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒらによる１９８４年のＮａｔｕｒｅ ３１２：６０４－６０８、Ｔａｋｅｄａらによる１９８５年のＮａｔｕｒｅ ３１４：４５２－４５４）が使用される。キメラ抗体は、マウスモノクローナル抗体およびヒト免疫グロブリン定常領域に由来する可変領域を有するものなど、様々な部分が様々な動物種に由来する分子である。
いくつかの実施形態では、一本鎖抗体の産生について記述された技法（米国特許第４，６９４，７７８号、Ｂｉｒｄによる１９８８年のＳｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２、Ｈｕｓｔｏｎによる１９８８年のＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３、およびＷａｒｄによる１９８９年のＮａｔｕｒｅ ３３４：５４４－５４）が、一本鎖抗体を産生するのに適している。一本鎖抗体は、Ｆｖ領域の重鎖フラグメントと軽鎖フラグメントとをアミノ酸架橋を介し連結することにより形成され、一本鎖ポリペプチドが生じる。大腸菌中の機能性Ｆｖフラグメントを組み立てるための技法も任意選択で使用される（Ｓｋｅｒｒａらによる１９８８年のＳｃｉｅｎｃｅ ２４２：１０３８－１０４１）。
いくつかの実施形態では、抗体のヌクレオチド配列を含む発現ベクター、または抗体のヌクレオチド配列は、従来技法（例えば、電気穿孔法、リポソームトランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿）により宿主細胞へと導入され、その後導入された細胞は従来技法により培養されて抗体が産生される。特定の実施形態では、抗体の発現は、構成的、誘導性、または組織特異的プロモータにより調節される。
いくつかの実施形態では、種々の宿主発現ベクター系を利用して、本明細書に記載の抗体またはその結合性フラグメントが発現される。かかる宿主発現系は、抗体のコーディング配列を産生して精製するビヒクルを表すだけでなく、適切なヌクレオチドコーディング配列で形質転換されるかトランスフェクトされると抗体またはその結合性フラグメントをｉｎ ｓｉｔｕで発現する細胞も表す。これらには、抗体またはその結合性フラグメントのコーディング配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、もしくはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（例えば、大腸菌や枯草菌）；抗体またはその結合性フラグメントのコーディング配列を含有する組換え酵母菌発現ベクターで形質転換された酵母菌（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ Ｐｉｃｈｉａ）；抗体またはその結合性フラグメントのコーディング配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；抗体またはその結合性フラグメントのコーディング配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）やタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ））もしくは組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）に感染した植物細胞系；または哺乳動物細胞ゲノム（例えば、メタロチオネインプロモータ）もしくは哺乳動物ウイルス（例えば、アデノウィルス後期プロモータ、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモータ）に由来するプロモータを含有する組換え発現構築物を持つ哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨ、２９３、２９３Ｔ、３Ｔ３細胞）などの微生物が挙げられるが、このようなものに限定されない。
組換えタンパク質の長期で高収率の産生には、安定した発現が好ましい。いくつかの例では、抗体を安定して発現する細胞株は、任意選択で操作される。複製ウイルス起源を含有する発現ベクターを用いるというよりは、宿主細胞は、適切な発現制御要素（例えば、プロモータ、エンハンサ、配列、転写ターミネータ、ポリアデニル化部位など）により制御されるＤＮＡ、および選択可能なマーカで形質転換される。外来ＤＮＡを導入後、操作された細胞は濃縮培地中で１～２日間成長されて、選択的培地に切り替えられる。組換えプラスミド中の選択可能マーカは選択に対する耐性を付与し、細胞が安定してプラスミドをそれらの染色体に一体化し、クローニングされて細胞株へと拡張される病巣を生じさせるように成長するのを可能にする。この方法は、抗体またはその結合性フラグメントを発現する細胞株を操作するのに使用するのが都合の良い可能性がある。
いくつかの例では、多くの選択システムが使用され、限定されないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒらによる１９７７年のＣｅｌｌ １１：２２３）、ヒポキサンチンーグアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＳｚｙｂａｌｓｋａとＳｚｙｂａｌｓｋｉによる１９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ４８：２０２）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙらによる１９８０年のＣｅｌｌ ２２：８１７）の遺伝子が、それぞれｔｋ細胞、ｈｇｐｒｔ細胞、またはａｐｒｔ細胞で利用される。また、代謝拮抗薬耐性が、以下の遺伝子に対する選択の基礎として使用される：メトトレキサートに対する耐性を与えるｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒらによる１９８０年のＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：３５７；Ｏ’Ｈａｒｅらによる１９８１年のＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：１５２７）、ミコフェノール酸に対する耐性を与えるｇｐｔ（ＭｕｌｌｉｇａｎとＢｅｒｇによる１９８１年のＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：２０７２）、アミノグリコシドＧ－４１８に対する耐性を与えるｎｅｏ（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ １２：４８８－５０５；ＷｕとＷｕによる１９９１年のＢｉｏｔｈｅｒａｐｙ ３：８７－９５；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖによる１９９３年のＡｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３－５９６；Ｍｕｌｌｉｇａｎによる１９９３年のＳｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６－９３２；およびＭｏｒｇａｎとＡｎｄｅｒｓｏｎによる１９９３年のＡｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１－２１７；Ｍａｙ １９９３，ＴＩＢ ＴＥＣＨ １１（５）：１５５－２１５）、ならびにヒグロマイシンに対する耐性を与えるｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅらによる１９８４年のＧｅｎｅ ３０：１４７）。使用され得る組換えＤＮＡ技法の分野で公知の方法は、Ａｕｓｕｂｅｌら（編、１９９３年のＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ；Ｋｒｉｅｇｌｅｒによる１９９０年のＧｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ；およびＤｒａｃｏｐｏｌｉら（編）による１９９４年のＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ．の１２章と１３章；Ｃｏｌｂｅｒｒｅ－Ｇａｒａｐｉｎらによる１９８１年のＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１）に記載されている。
いくつかの例では、抗体の発現レベルは、ベクター増幅により上昇する（検討のため、ＢｅｂｂｉｎｇｔｏｎとＨｅｎｔｓｃｈｅｌによるｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｖｅｃｔｏｒｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌ．３．（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７）を参照）。抗体を発現するベクター系のマーカが増幅可能であると、宿主細胞の培養中に存在する阻害剤のレベルが上昇することで、マーカ遺伝子のコピー数が増加することになる。増幅した領域は抗体の塩基配列と関連付けられるので、抗体の産生も増加することになる（Ｃｒｏｕｓｅらによる１９８３年のＭｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３：２５７）。
場合により、抗体の精製における当該技術分野で公知のあらゆる方法が、例えばクロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、具体的にはタンパク質Ａの後の特異的抗原に対する親和性、およびサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、差動的溶解性（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）、またはその他あらゆるタンパク質精製の標準技法により使用される。
発現ベクター
いくつかの実施形態では、ベクターは、真核生物源または原核生物源のいずれかに由来するあらゆる好適なベクターを含む。場合により、ベクターは、細菌源（例えば、大腸菌）、昆虫源、酵母菌源（例えば、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、藻類源、または哺乳動物源から得られる。例示的な細菌ベクターとして、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＳＫ７５、ｐＢＡＤベクターシリーズ、ｐＢＡＤＭベクターシリーズ、ｐＥＴベクターシリーズ、ｐＥＴＭベクターシリーズ、ｐＧＥＸベクターシリーズ、ｐＨＡＴ、ｐＨＡＴ２、ｐＭａｌ－ｃ２、ｐＭａｌ－ｐ２、ｐＱＥベクターシリーズ、ｐＲＳＥＴ Ａ、ｐＲＳＥＴ Ｂ、ｐＲＳＥＴ Ｃ、ｐＴｒｃＨｉｓ２シリーズ、ｐＺＡ３１－Ｌｕｃ、ｐＺＥ２１－ＭＣＳ－１、ｐＦＬＡＧ ＡＴＳ、ｐＦＬＡＧ ＣＴＳ、ｐＦＬＡＧ ＭＡＣ、ｐＦＬＡＧ Ｓｈｉｆｔ－１２ｃ、ｐＴＡＣ－ＭＡＴ－１、ｐＦＬＡＧ ＣＴＣ、またはｐＴＡＣ－ＭＡＴ－２が挙げられる。
例示的な昆虫ベクターとして、ｐＦａｓｔＢａｃ１、ｐＦａｓｔＢａｃ ＤＵＡＬ、ｐＦａｓｔＢａｃ ＥＴ、ｐＦａｓｔＢａｃ ＨＴａ、ｐＦａｓｔＢａｃ ＨＴｂ、ｐＦａｓｔＢａｃ ＨＴｃ、ｐＦａｓｔＢａｃ Ｍ３０ａ、ｐＦａｓｔＢａｃｔ Ｍ３０ｂ、ｐＦａｓｔＢａｃ、Ｍ３０ｃ、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＶＬ１３９３ Ｍ１０、ｐＶＬ１３９３ Ｍ１１、ｐＶＬ１３９３ Ｍ１２、ｐＰｏｌｈ－ＦＬＡＧ１やｐＰｏｌｈ－ＭＡＴ ２などのＦＬＡＧベクター、またはｐＰｏｌｈ－ＭＡＴ１やｐＰｏｌｈ－ＭＡＴ２などのＭＡＴベクターが挙げられる。
場合により、酵母菌ベクターとして、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ｐＤＥＳＴ（商標）１４ベクター、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ｐＤＥＳＴ（商標）１５ベクター、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ｐＤＥＳＴ（商標）１７ベクター、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ｐＤＥＳＴ（商標）２４ベクター、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ｐＹＥＳ－ＤＥＳＴ５２ベクター、ｐＢＡＤ－ＤＥＳＴ４９ Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）デスティネーションベクター、ｐＡＯ８１５ Ｐｉｃｈｉａベクター、ｐＦＬＤ１ Ｐｉｃｈｉ ｐａｓｔｏｒｉｓベクター、ｐＧＡＰＺＡ，Ｂ，＆Ｃ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓベクター、ｐＰＩＣ３．５Ｋ Ｐｉｃｈｉａベクター、ｐＰＩＣ６ Ａ，Ｂ，＆Ｃ Ｐｉｃｈｉａベクター、ｐＰＩＣ９Ｋ Ｐｉｃｈｉａベクター、ｐＴＥＦ１／Ｚｅｏ、ｐＹＥＳ２酵母菌ベクター、ｐＹＥＳ２／ＣＴ酵母菌ベクター、ｐＹＥＳ２／ＮＴ Ａ，Ｂ，＆Ｃ酵母菌ベクター、またはｐＹＥＳ３／ＣＴ酵母菌ベクターが挙げられる。
例示的な藻類ベクターには、ｐＣｈｌａｍｙ－４ベクターやＭＣＳベクターが挙げられる。
哺乳動物ベクターの例には、一過性発現ベクターや安定発現ベクターが挙げられる。哺乳動物一過性発現ベクターには、ｐＲＫ５、ｐ３ｘＦＬＡＧ－ＣＭＶ ８、ｐＦＬＡＧ－Ｍｙｃ－ＣＭＶ １９、ｐＦＬＡＧ－Ｍｙｃ－ＣＭＶ ２３、ｐＦＬＡＧ－ＣＭＶ ２、ｐＦＬＡＧ－ＣＭＶ ６ａ，ｂ，ｃ、ｐＦＬＡＧ－ＣＭＶ ５．１、ｐＦＬＡＧ－ＣＭＶ ５ａ，ｂ，ｃ、ｐ３ｘＦＬＡＧ－ＣＭＶ ７．１、ｐＦＬＡＧ－ＣＭＶ ２０、ｐ３ｘＦＬＡＧ－Ｍｙｃ－ＣＭＶ ２４、ｐＣＭＶ－ＦＬＡＧ－ＭＡＴ１、ｐＣＭＶ－ＦＬＡＧ－ＭＡＴ２、ｐＢＩＣＥＰ－ＣＭＶ ３、またはｐＢＩＣＥＰ－ＣＭＶ ４が挙げられ得る。哺乳動物安定発現ベクターには、ｐＦＬＡＧ－ＣＭＶ ３、ｐ３ｘＦＬＡＧ－ＣＭＶ ９、ｐ３ｘＦＬＡＧ－ＣＭＶ １３、ｐＦＬＡＧ－Ｍｙｃ－ＣＭＶ ２１、ｐ３ｘＦＬＡＧ－Ｍｙｃ－ＣＭＶ ２５、ｐＦＬＡＧ－ＣＭＶ ４、ｐ３ｘＦＬＡＧ－ＣＭＶ １０、ｐ３ｘＦＬＡＧ－ＣＭＶ １４、ｐＦＬＡＧ－Ｍｙｃ－ＣＭＶ ２２、ｐ３ｘＦＬＡＧ－Ｍｙｃ－ＣＭＶ ２６、ｐＢＩＣＥＰ－ＣＭＶ １、またはｐＢＩＣＥＰ－ＣＭＶ ２が挙げられ得る。
いくつかの例では、無細胞系は、細胞からの細胞質成分および／または核成分の混合物であり、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの核酸合成に使用される。場合により、無細胞系は、原核細胞成分または真核細胞成分のいずれかを利用する。時に核酸合成は、例えば、ショウジョウバエ細胞、アフリカツメガエル卵、またはＨｅＬａ細胞に基づく無細胞系で得られる。例示的な無細胞系として、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｓ３０ Ｅｘｔｒａｃｔ系、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｔ７ Ｓ３０系、またはＰＵＲＥｘｐｒｅｓｓ（登録商標）が挙げられるが、これらに限定されない。
宿主細胞
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、天然由来細胞または遺伝子修飾細胞などのいずれかの好適な細胞を含む。いくつかの例では、宿主細胞は産生宿主細胞である。いくつかの例では、宿主細胞は真核生物細胞である。他の例では、宿主細胞は原核生物細胞である。場合により、真核生物細胞には、真菌（例えば、酵母菌細胞）、動物細胞、または植物細胞が挙げられる。場合により、原核生物細胞は細菌細胞である。細菌細胞の例には、グラム陽性菌やグラム陰性菌が挙げられる。時にグラム陰性菌は、嫌気性菌、桿菌、またはその両方である。
いくつかの例では、グラム陽性菌には、放線菌門、ファーミキューテス門、テネリクテス門が挙げられる。場合により、グラム陰性菌には、アクウィフェクス、デイノコッカス－サーマス、フィブロバクテル－クロロビウム／バクテロイデス（ＦＣＢ群）、フソバクテリウム、ゲンマティモナス、ニトロスピラ、プランクトミケス－ウェルコミクロビウム／クラミジア（ＰＶＣ群）、プロテオバクテリア、スピロヘータ、またはシネルギステスが挙げられる。他の細菌は、アシドバクテリア、クロロフレキシ、クリシオゲネス、シアノバクテリア、デフェリバクター、Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｉ、サーモデスルフォバクテリア、またはテルモトガであり得る。細菌細胞は、大腸菌、ボツリヌス菌、またはＣｏｌｉ ｂａｃｉｌｌｉであり得る。
例示的な原核生物宿主細胞には、ＢＬ２１、Ｍａｃｈ１（商標）、Ｄ Ｈ１０Ｂ（商標）、ＴＯＰ１０、ＤＨ５α、ＤＨ１０Ｂａｃ（商標）、ＯｍｎｉＭａｘ（商標）、ＭｅｇａＸ（商標）、ＤＨ１２Ｓ（商標）、ＩＮＶ１１０、ＴＯＰ１０Ｆ’、ＩｎｖαＦ、ＴＯＰ１０／Ｐ３、ｃｃｄＢ Ｓｕｒｖｉｖａｌ、ＰＩＲ１、ＰＩＲ２、Ｓｔｂｌ２（商標）、Ｓｔｂｌ３（商標）、またはＳｔｂｌ４（商標）が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの例では、動物細胞は、脊椎動物または無脊椎動物由来の細胞を含む。場合により、動物細胞は、海洋無脊椎動物、魚類、昆虫、両生類、爬虫類、または哺乳動物由来の細胞を含む。場合により、真菌細胞は、ビール酵母菌、パン酵母菌、またはワイン酵母菌などの酵母菌細胞を含む。
真菌には、酵母菌、カビ、糸状菌、担子菌、接合菌などの子嚢菌類が挙げられる。いくつかの例では、酵母菌は子嚢菌門または担子菌門を含む。場合により、子嚢菌門には、サッカロミケス亜門（真性酵母菌、例えば、ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（パン酵母菌））やタフリナ菌亜門（例えば、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔｅｓ（分裂酵母菌））が挙げられる。場合により、担子菌門には、ハラタケ亜門（例えば、Ｔｒｅｍｅｌｌｏｍｙｃｅｔｅｓ）やサビキン亜門（例えば、Ｍｉｃｒｏｂｏｔｒｙｏｍｙｃｅｔｅｓ）が挙げられる。
例示的な酵母菌または糸状菌としては、例えばサッカロミケス属、シゾサッカロミケス属、カンジダ属、ピキア属、ハンゼヌラ属、クリベロミセス、ジゴサッカロマイセス属、ヤロウイア属、トリコスポロン属、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉ属、アスペルギルス属、フザリウム属、またはトリコデルマ属が挙げられる。例示的な酵母菌または糸状菌としては、例えば、サッカロミケス・セレビシエ、シゾサッカロミケス・ポンベ、Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉ、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・トロピカリス、Ｃａｎｄｉｄａ ｓｔｅｌｌａｔｏｉｄｅａ、カンジダ・グラブラータ、カンジダ・クルセイ、カンジダ・パラプシローシス、カンジダ・ギリエルモンディ、カンジダ・ヴィスワナーティ、カンジダ・ルシタニエ、ロドトルラ‐ムチラギノーザ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ ａｎｇｕｓｔａ、ピキア・パストリス、ピキア・アノマラ、ハンセヌラ・ポリモルファ、クルイベロマイセス・ラクティス、チゴサッカロミセス・ルーキシィ、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕ－Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、アスペルギルス・ニデュランス、アワモリコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）、ニホンコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、トリコデルマ・リーゼイ、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、ブレタノミセス・ブリュッセル、Ｃａｎｄｉｄａ ｓｔｅｌｌａｔａ、シゾサッカロミケス・ポンベ、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂａｉｌｉｉ、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、クリプトコッカス・ガッティ、またはサッカロミケス・ブラウディが挙げられる。
例示的な酵母菌宿主細胞には、ＧＳ１１５、ＫＭ７１Ｈ、ＳＭＤ１１６８、ＳＭＤ１１６８Ｈ、Ｘ－３３などのピキア・パストリス酵母菌株や、ＩＮＶＳｃ１などのサッカロミケス・セレビシエ酵母菌株が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの例では、さらなる動物細胞として、軟体動物、節足動物、環形動物、または海綿動物から得た細胞が挙げられる。場合により、さらなる動物細胞は、例えば、霊長類、類人猿、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、またはげっ歯類由来の哺乳動物細胞である。場合により、げっ歯類には、マウス、ラット、ハムスター、スナネズミ、ハムスター、チンチラ、ファンシーラット、またはモルモットが挙げられる。
例示的な哺乳動物宿主細胞として、２９３Ａ細胞株、２９３ＦＴ細胞株、２９３Ｆ細胞、２９３Ｈ細胞、ＣＨＯ ＤＧ４４細胞、ＣＨＯ－Ｓ細胞、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＦＵＴ８ ＫＯ ＣＨＯＫ１、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞、Ｆｌｐ－Ｉｎ（商標）Ｔ－ＲＥｘ（商標）２９３細胞株、Ｆｌｐ－Ｉｎ（商標）－２９３細胞株、Ｆｌｐ－Ｉｎ（商標）－３Ｔ３細胞株、Ｆｌｐ－Ｉｎ（商標）－ＢＨＫ細胞株、Ｆｌｐ－Ｉｎ（商標）－ＣＨＯ細胞株、Ｆｌｐ－Ｉｎ（商標）－ＣＶ－１細胞株、Ｆｌｐ－Ｉｎ（商標）－Ｊｕｒｋａｔ細胞株、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３－Ｆ細胞、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＣＨＯ－Ｓ細胞、ＧｒｉｐＴｉｔｅ（商標）２９３ＭＳＲ細胞株、ＧＳ－ＣＨＯ細胞株、ＨｅｐａＲＧ（商標）細胞、Ｔ－ＲＥｘ（商標）Ｊｕｒｋａｔ細胞株、Ｐｅｒ．Ｃ６細胞、Ｔ－ＲＥｘ（商標）－２９３細胞株、Ｔ－ＲＥｘ（商標）－ＣＨＯ細胞株、Ｔ－ＲＥｘ（商標）－ＨｅＬａ細胞株が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの例では、哺乳動物宿主細胞は、安定な細胞株であるか、または、目的の遺伝物質をそれ自体のゲノムに組み込んでいるとともに多くの世代の細胞分裂後に遺伝物質の生成物を発現する能力を有する細胞株である。場合により、哺乳動物宿主細胞は、一過性細胞株であるか、または、目的の遺伝物質をそれ自体のゲノムに組み込まないとともに多くの世代の細胞分裂後に遺伝物質の生成物を発現する能力を有していない細胞株である。
例示的な昆虫宿主細胞として、ショウジョウバエＳ２細胞、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２ １細胞、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ（商標）細胞、ｅｘｐｒｅｓＳＦ＋（登録商標）細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの例では、植物細胞には藻類由来の細胞が挙げられる。例示的な昆虫細胞株には、クラミドモナス・ラインハルティイ１３７ｃやＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ ＰＰＣ７９４２由来の株が挙げられるが、これらに限定されない。
製造品
本発明の別の態様では、上述した障害の処置、予防、および／または診断に有用な材料を含有する製造品が提供される。製造品は、容器と、容器上にあるか容器に付随するラベルまたは添付文書とを備える。好適な容器には、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ溶液バッグなどが挙げられる。容器は、ガラスやプラスチックなどの種々の材料から形成されてよい。容器は、疾病を処置、予防、および／もしくは診断するのにそれ自体でまたは別の組成物と組み合わせて有効である組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有する場合もある（例えば、溶液は、皮下注射針が貫通可能なストッパを有する点滴バッグまたはバイアルの場合がある）。組成物中の少なくとも１つの活性剤は、ＣＤ３に特異的に結合する第１の抗原結合部位と、腫瘍抗原に特異的に結合する第２の抗原結合部位とを含む二重特異性抗体である。
ラベルまたは添付文書は、組成物が選択対象の疾病を処置するのに使用されることを示す。さらに、製造品は、（ａ）本発明の二重特異性抗体を含む組成物を含有する第１の容器と、（ｂ）さらなる細胞毒性またはその他の治療剤を含む組成物を含有する第２の容器とを備えていてもよい。この本発明の実施形態における製造品は、組成物が特定の疾病を処置するのに使用され得ることを示す添付文書をさらに備える場合もある。
代替的または付加的に、製造品は、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液などの薬学的に許容可能な緩衝液を含む第２（または第３）の容器をさらに備える場合もある。さらに、他の緩衝液、希釈剤、フィルタ、針、およびシリンジを含む、商業上とユーザの観点から望ましい他の材料をさらに備える場合もある。
処置方法
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の切断可能リンカーを含む単離ポリペプチドは、癌を処置する方法に使用される。いくつかの実施形態では、癌は、ＥＧＦＲを発現する細胞を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドまたはポリペプチド複合体は、大腸癌（ＣＲＣ）、頭頚部の扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、前立腺癌、乳癌、乳癌／直腸癌、頭頚部癌、食道癌、肝臓癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、膀胱癌、腎臓癌、または膵臓癌を処置する方法に使用される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドまたはポリペプチド複合体は、ＥＧＦＲ阻害剤による処置に耐性のある対象を処置する方法に使用される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドまたはポリペプチド複合体は、ＫＲＡＳ突然変異を有する対象を処置する方法に使用される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドまたはポリペプチド複合体は、ＥＧＦＲ阻害剤による処置に耐性がありＫＲＡＳ突然変異を有する対象を処置する方法に使用される。
本発明の好ましい実施形態が本明細書中で示されるとともに記述されてきたが、かかる実施形態はほんの一例として提供されることは当業者に明白であろう。現在、多数の変形、変更、および置換えが、本発明から逸脱することなく当業者に想到されるであろう。本明細書に記載の本発明の実施形態に対する種々の代替物が本発明の実施に使用され得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲は本発明の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲内にある方法と構造、およびそれらの等価物がそれによりカバーされることが意図される。
実施形態
実施形態１は、配列番号１のアミノ酸配列（ＬＳＧＲＳＤＡＧ）による切断可能リンカーを含む単離ポリペプチドを含む。
実施形態２は、切断可能リンカーが、配列番号３のアミノ酸配列（ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＡＧ）を含む、実施形態１に記載の単離ポリペプチドを含む。
実施形態３は、切断可能リンカーが、配列番号２６のアミノ酸配列（ＡＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＡＧ）を含む、実施形態１から２のいずれか１つに記載の単離ポリペプチドを含む。
実施形態４は、切断可能リンカーが、配列番号４のアミノ酸配列（ＡＡＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＡＧ）を含む、実施形態１から３のいずれか１つに記載の単離ポリペプチドを含む。
実施形態５は、切断可能リンカーが、配列番号５のアミノ酸配列（ＳＰＬＧＬＳＧＲＳＤＡＧ）を含む、実施形態１から４のいずれか１つに記載の単離ポリペプチドを含む。
実施形態６は、切断可能リンカーが、配列番号６のアミノ酸配列（ＬＳＧＲＳＤＡＧＳＰＬＧＬＡＧ）を含む、実施形態１から５のいずれか１つに記載の単離ポリペプチドを含む。
実施形態７は、切断可能リンカーがプロテアーゼにより切断可能である、実施形態１から６のいずれか１つに記載の単離ポリペプチドを含む。
実施形態８は、プロテアーゼが腫瘍特異的プロテアーゼを含む、実施形態７に記載の単離ポリペプチドを含む。
実施形態９は、プロテアーゼが、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）またはセリンプロテアーゼを含む、実施形態７から８のいずれか１つに記載の単離ポリペプチドを含む。
実施形態１０は、マトリックスメタロプロテアーゼが、ＭＭＰ２、ＭＭＰ７、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１３、またはＭＭＰ１４を含む、実施形態９に記載の単離ポリペプチドを含む。
実施形態１１は、セリンプロテアーゼが、マトリプターゼ、ウロキナーゼ、またはへプシンを含む、実施形態９に記載の単離ポリペプチドを含む。
実施形態１２は、標的抗原に結合する抗原結合ドメインをさらに含む、実施形態１から１１のいずれか１つに記載の単離ポリペプチドを含む。
実施形態１３は、抗原結合性ドメインが、切断可能リンカーに対するＣ末端である、実施形態１２に記載の単離ポリペプチドを含む。
実施形態１４は、サイトカイン受容体に結合するサイトカインまたはサイトカインフラグメントをさらに含む、実施形態１から１１のいずれか１つに記載の単離ポリペプチドを含む。
実施形態１５は、サイトカインまたはサイトカインフラグメントが、切断可能リンカーに対するＣ末端である、実施形態１４に記載の単離ポリペプチドを含む。
実施形態１６は、切断可能リンカーが、式Ｉ：Ａ１－Ｌ１－Ｐ１による配置で、標的抗原に結合する抗原結合性ドメインに、またはサイトカイン受容体に結合するサイトカインもしくはサイトカインフラグメントにペプチドを接続し、式中、Ａ１は、標的抗原に結合する抗原結合性ドメイン、またはサイトカイン受容体に結合するサイトカインもしくはサイトカインフラグメントを含み、Ｌ１は切断可能リンカーを含み、Ｐ１は、標的抗原への抗原結合性ドメインの結合を損なわせるか、またはサイトカイン受容体へのサイトカインの結合を損なわせるペプチドを含む、実施形態１から１５のいずれか１つに記載の単離ポリペプチドを含む。
実施形態１７は、Ｐ１がＮ末端で切断可能リンカーに接続され、Ａ１がＣ末端で切断可能リンカーに接続される、実施形態１６に記載の単離ポリペプチドを含む。
実施形態１８は、Ｐ１がＣ末端で切断可能リンカーに接続され、Ａ１がＮ末端で切断可能リンカーに接続される、実施形態１６に記載の単離ポリペプチドを含む。
実施形態１９は、Ｐ１が、イオン相互作用、静電相互作用、疎水性相互作用、Ｐｉ－スタッキング相互作用、およびＨ結合相互作用、またはそれらの組合せを介してＡ１に結合される、実施形態１６から１８のいずれか１つに記載の単離ポリペプチドを含む。
実施形態２０は、Ｐ１が、標的抗原またはサイトカイン受容体に対し７０％未満の配列相同性を有する、実施形態１６から１９のいずれか１つに記載の単離ポリペプチドを含む。
実施形態２１は、Ｐ１が、長さが少なくとも１０のアミノ酸のペプチド配列を含む、実施形態１６から２０のいずれか１つに記載の単離ポリペプチドを含む。
実施形態２２は、Ｐ１が、長さが少なくとも１０のアミノ酸および長さが２０以下のアミノ酸のペプチド配列を含む、実施形態１６から２１のいずれか１つに記載の単離ポリペプチドを含む。
実施形態２３は、Ｐ１が、長さが少なくとも１６のアミノ酸のペプチド配列を含む、実施形態１６から２２のいずれか１つに記載の単離ポリペプチドを含む。
実施形態２４は、Ｐ１が、長さが４０以下のアミノ酸のペプチド配列を含む、実施形態１６から２３のいずれか１つに記載の単離ポリペプチドを含む。
実施形態２５は、Ｐ１が環状ペプチドまたは直鎖ペプチドを含む、実施形態１６から２４のいずれか１つに記載の単離ポリペプチドを含む。
実施形態２６は、Ｐ１が環状ペプチドを含む、実施形態１６から２５のいずれか１つに記載の単離ポリペプチドを含む。
実施形態２７は、Ｐ１が半減期延長部分にさらに連結される、実施形態１６から２６のいずれか１つに記載の単離ポリペプチドを含む。
実施形態２８は、半減期延長部分が単一ドメイン抗体である、実施形態２７に記載の単離ポリペプチドを含む。
実施形態２９は、単一ドメイン抗体が１０Ｇを含む、実施形態２８に記載の単離ポリペプチドを含む。
実施形態３０は、Ａ１が、抗体、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、重鎖可変ドメイン（ＶＨドメイン）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬドメイン）、ラクダ科由来単一ドメイン抗体の可変ドメイン（ＶＨＨ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ軽鎖ポリペプチド、またはＦａｂ重鎖ポリペプチドを含む、実施形態１６から２９のいずれか１つに記載の単離ポリペプチドを含む。
実施形態３１は、標的抗原が腫瘍抗原を含む、実施形態１６から３０のいずれか１つに記載の単離ポリペプチドを含む。
実施形態３２は、Ａ１がＦａｂ軽鎖ポリペプチドまたはＦａｂ重鎖ポリペプチドを含む、実施形態３０から３１のいずれか１つに記載の単離ポリペプチドを含む。
実施形態３３は、Ａ１が上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）結合ドメインを含む、実施形態１６から３２のいずれか１つに記載の単離ポリペプチドを含む。
実施形態３４は、標的抗原がエフェクター細胞抗原を含む、実施形態１６から３０のいずれか１つに記載の単離ポリペプチドを含む。
実施形態３５は、Ａ１がｓｃｆｖを含む、実施形態３４に記載の単離ポリペプチドを含む。
実施形態３６は、ｓｃＦｖが抗ＣＤ３ｅ一本鎖可変フラグメントを含む、実施形態３５に記載の単離ポリペプチドを含む。
実施形態３７は、Ａ１がサイトカインを含む、実施形態１６から２９のいずれか１つに記載の単離ポリペプチドを含む。
実施形態３８は、サイトカインまたはサイトカインフラグメントが野生型サイトカインである、実施形態３７に記載の単離ポリペプチドを含む。
実施形態３８は、サイトカインまたはサイトカインフラグメントが、サイトカインの突然変異タンパク質である、実施形態３７に記載の単離ポリペプチドを含む。
実施形態４０は、サイトカイン受容体がインターフェロン受容体またはインターロイキン受容体である、実施形態３７から３９のいずれか１つに記載の単離ポリペプチドを含む。
実施形態４１は、サイトカイン受容体が、インターフェロン受容体、ＧＭ－ＣＳＦ受容体、ＩＬ－２受容体、ＩＬ－４受容体、ＩＬ－６受容体、ＩＬ－７受容体、ＩＬ－１０受容体、ＩＬ－１２受容体、ＩＬ－１５受容体、ＩＬ－２１受容体、またはＴＧＦ－β受容体を含む、実施形態３７から４０のいずれか１つに記載の単離ポリペプチドを含む。
実施形態４２は、サイトカインまたはサイトカインフラグメントが、インターフェロン、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、またはＩＬ－２１を含む、実施形態３７から４１のいずれか１つに記載の単離ポリペプチドを含む。
実施形態４３は、サイトカインまたはサイトカインフラグメントが、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－６、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、またはＴＧＦβを含む、実施形態３７から４２のいずれか１つに記載の単離ポリペプチドを含む。
実施形態４４は、第２の抗原結合性ドメインまたは第２のサイトカインもしくは第２のサイトカインフラグメントを含む第２の単離ポリペプチドと複合体を形成する、実施形態１から４３のいずれか１つに記載の単離ポリペプチドを含む。
実施形態４５は、第２の単離ポリペプチドが、式ＩＩ：Ａ２－Ｌ２－Ｐ２による配置にあり、式中、Ａ２は第２の抗原結合性ドメインまたは第２のサイトカインを含み、Ｌ２は第２の切断可能リンカーを含み、Ｐ２は、第２の標的抗原への第２の抗原結合性ドメインの結合を阻害するか、または第２のサイトカイン受容体への第２のサイトカインまたは第２のサイトカインフラグメントの結合を阻害する第２のペプチドを含む、実施形態４４に記載の単離ポリペプチドを含む。
実施形態４６は、第２の切断可能リンカーが、配列番号１のアミノ酸配列（ＬＳＧＲＳＤＡＧ）を含む、実施形態４５に記載の単離ポリペプチドを含む。
実施形態４７は、第２の切断可能リンカーが、配列番号３のアミノ酸配列（ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＡＧ）を含む、実施形態４５から４６のいずれか１つに記載の単離ポリペプチドを含む。
実施形態４８は、第２の切断可能リンカーが、配列番号２６のアミノ酸配列（ＡＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＡＧ）を含む、実施形態４５から４７のいずれか１つに記載の単離ポリペプチドを含む。
実施形態４９は、第２の切断可能リンカーが、配列番号４のアミノ酸配列（ＡＡＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＡＧ）を含む、実施形態４５から４８のいずれか１つに記載の単離ポリペプチドを含む。
実施形態５０は、第２の切断可能リンカーが、配列番号５のアミノ酸配列（ＳＰＬＧＬＳＧＲＳＤＡＧ）を含む、実施形態４５から４９のいずれか１つに記載の単離ポリペプチドを含む。
実施形態５１は、第２の切断可能リンカーが、配列番号６のアミノ酸配列（ＬＳＧＲＳＤＡＧＳＰＬＧＬＡＧ）を含む、実施形態４５から５０のいずれか１つに記載の単離ポリペプチドを含む。
実施形態５２は、Ｐ２がＮ末端で第２の切断可能リンカーに接続され、Ａ２がＣ末端で第２の切断可能リンカーに接続される、実施形態４５から５１のいずれか１つに記載の単離ポリペプチドを含む。
実施形態５３は、Ｐ２がＣ末端で第２の切断可能リンカーに接続され、Ａ２がＮ末端で第２の切断可能リンカーに接続される、実施形態４５から５１のいずれか１つに記載の単離ポリペプチドを含む。
実施形態５４は、Ｐ２が、イオン相互作用、静電相互作用、疎水性相互作用、Ｐｉ－スタッキング相互作用、およびＨ結合相互作用、またはそれらの組合せを介してＡ２に結合される、実施形態４５から５３のいずれか１つに記載の単離ポリペプチドを含む。
実施形態５５は、Ｐ２が、第２の標的抗原または第２のサイトカイン受容体に対し７０％未満の配列相同性を有する、実施形態４５から５４のいずれか１つに記載の単離ポリペプチドを含む。
実施形態５６は、Ｐ２が、長さが少なくとも１０のアミノ酸のペプチド配列を含む、実施形態４５から５５のいずれか１つに記載の単離ポリペプチドを含む。
実施形態５７は、Ｐ２が、長さが少なくとも１０のアミノ酸および長さが２０以下のアミノ酸のペプチド配列を含む、実施形態４５から５６のいずれか１つに記載の単離ポリペプチドを含む。
実施形態５８は、Ｐ２が、長さが少なくとも１６のアミノ酸のペプチド配列を含む、実施形態４５から５７のいずれか１つに記載の単離ポリペプチドを含む。
実施形態５９は、Ｐ２が、長さが４０以下のアミノ酸のペプチド配列を含む、実施形態４５から５６のいずれか１つに記載の単離ポリペプチドを含む。
実施形態６０は、Ｐ２が環状ペプチドまたは直鎖ペプチドを含む、実施形態４５から５９のいずれか１つに記載の単離ポリペプチドを含む。
実施形態６１は、Ｐ２が環状ペプチドを含む、実施形態４５から６０のいずれか１つに記載の単離ポリペプチドを含む。
実施形態６２は、Ａ２が、抗体、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、重鎖可変ドメイン（ＶＨドメイン）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬドメイン）、ラクダ科由来単一ドメイン抗体の可変ドメイン（ＶＨＨ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ軽鎖ポリペプチド、またはＦａｂ重鎖ポリペプチドを含む、実施形態４５から６１のいずれか１つに記載の単離ポリペプチドを含む。
実施形態６３は、第２の標的抗原が腫瘍抗原を含む、実施形態４５から６２のいずれか１つに記載の単離ポリペプチドを含む。
実施形態６４は、Ａ２がＦａｂ軽鎖ポリペプチドまたはＦａｂ重鎖ポリペプチドを含む、実施形態６２に記載の単離ポリペプチドを含む。
実施形態６５は、Ａ２が上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）結合ドメインを含む、実施形態４５から６４のいずれか１つに記載の単離ポリペプチドを含む。
実施形態６６は、第２の標的抗原がエフェクター細胞抗原を含む、実施形態４５から６２のいずれか１つに記載の単離ポリペプチドを含む。
実施形態６７は、Ａ２がｓｃｆｖを含む、実施形態６２に記載の単離ポリペプチドを含む。
実施形態６８は、ｓｃＦｖが抗ＣＤ３ｅ一本鎖可変フラグメントを含む、実施形態６６から６７のいずれか１つに記載の単離ポリペプチドを含む。
実施形態６９は、Ａ２が第２のサイトカインを含む、実施形態４５から６１のいずれか１つに記載の単離ポリペプチドを含む。
実施形態７０は、第２のサイトカインまたは第２のサイトカインフラグメントが野生型サイトカインである、実施形態６９に記載の単離ポリペプチドを含む。
実施形態７１は、第２のサイトカインまたは第２のサイトカインフラグメントが、サイトカインの突然変異タンパク質である、実施形態６９に記載の単離ポリペプチドを含む。
実施形態７２は、第２のサイトカイン受容体がインターフェロン受容体またはインターロイキン受容体である、実施形態６９から７１のいずれか１つに記載の単離ポリペプチドを含む。
実施形態７３は、第２のサイトカイン受容体が、インターフェロン受容体、ＧＭ－ＣＳＦ受容体、ＩＬ－２受容体、ＩＬ－４受容体、ＩＬ－６受容体、ＩＬ－７受容体、ＩＬ－１０受容体、ＩＬ－１２受容体、ＩＬ－１５受容体、ＩＬ－２１受容体、またはＴＧＦ－β受容体を含む、実施形態６９から７２のいずれか１つに記載の単離ポリペプチドを含む。
実施形態７４は、第２のサイトカインまたは第２のサイトカインフラグメントが、インターフェロン、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、またはＩＬ－２１を含む、実施形態６９から７３のいずれか１つに記載の単離ポリペプチドを含む。
実施形態７５は、第２のサイトカインまたは第２のサイトカインフラグメントが、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－６、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、またはＴＧＦβを含む、実施形態６９から７４のいずれか１つに記載の単離ポリペプチドを含む。
実施形態７６は、上記実施形態のいずれか１つに記載の切断可能リンカーを含む単離ポリペプチドと、薬学的に許容可能な賦形剤とを含む医薬組成物を含む。
実施形態７７は、上記実施形態のいずれか１つに記載の切断可能リンカーを含む単離ポリペプチドをコードする、単離された組換え核酸分子を含む。
実施形態７８は、実施形態７７に記載の単離された組換え核酸分子を含むベクターを含む。
実施形態７９は、上記実施形態のいずれか１つに記載の切断可能リンカーを含む単離ポリペプチドを産生する方法であって、ポリペプチドの発現を生じさせる条件下で、実施形態７８に記載のベクターを含む細胞を培養する工程を含む方法を含む。
実施形態８０は、切断可能リンカーを含む単離ポリペプチドを製造する方法であって、（ａ）ポリペプチドの発現を生じさせる条件下で実施形態７７に記載の単離された組換え核酸分子を含む細胞を培養する工程と、（ｂ）ポリペプチドを単離する工程とを含む方法を含む。
実施例１．タンパク質分解速度と血清安定性
ポリペプチド複合体を、腫瘍および血清プロテアーゼ活性について評価した。
簡潔に説明すると、様々な腫瘍プロテアーゼにより認識される切断可能リンカーを用いてポリペプチド複合体へと遺伝的に融合したペプチドマスクを含む、ポリペプチド複合体ＰＣ－１、ＰＣ－２、ＰＣ－３、ＰＣ－４、およびＰＣ－５を生成した。ポリペプチド複合体を様々な腫瘍プロテアーゼに曝露した。切断速度は、ポリペプチド複合体をＭＭＰ２、ＭＭＰ７、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１４、ｕＰａ、ＭＴＳＰ１、およびヘプシンに曝露したときに判定した。見かけの切断速度と相対的血清安定性に関するデータは表２～４に見られる。
データより、血清タンパク質分解活性が血液より高いことが認められる。またデータより、切断可能リンカー配列がヒト血清中の安定性を維持しながらタンパク質分解速度を上昇させたことも認められる。
実施例２．切断可能リンカーと同等のマスキングの確認
ポリペプチド複合体をＥＧＦＲおよびＣＤ３ε結合について評価した。
簡潔に説明すると、ＥＧＦＲマスキングを含むポリペプチド複合体ＰＣ－１、ＰＣ－２、ＰＣ－３、ＰＣ－４、およびＰＣ－５の結合を判定した。図１Ａに見られるように、ＥＧＦＲマスキングは、様々なポリペプチド複合体に対する結合を遮断する。腫瘍プロテアーゼＭＴＳＰ１による切断後、ポリペプチド複合体は結合可能となる（図１Ｂ）。
ＥＧＦＲ結合シフトの詳細は表５～８に見られる。
ポリペプチド複合体をさらにＣＤ３ε結合について評価した。簡潔に説明すると、ＣＤ３εマスキングを含むポリペプチド複合体ＰＣ－１、ＰＣ－２、ＰＣ－３、ＰＣ－４、およびＰＣ－５の結合を判定した。図２Ａに見られるように、このマスクは、様々なポリペプチド複合体に対する結合を遮断する。腫瘍プロテアーゼＭＴＳＰ１による切断後、ポリペプチド複合体は結合可能となる（図２Ｂ）。
ＣＤ３ε結合シフトの詳細は表９～１２に見られる。
ポリペプチド複合体の結合を、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて評価した。ビオチン化ペプチドをニュートラアビジン被覆プレート上で捕捉した。結合したポリペプチド複合体を検出するために二次抗体を使用した。マスクを含み、かつマスク切断後のＰＣ－２、ＰＣ－３、ＰＣ－４、ＰＣ－５、ＰＣ－１、およびＰＣ－６に関するデータは図３Ａ～図３Ｂに見られ、ＥＣ５０結合データを表１３～１４に要約する。
実施例３．切断可能リンカーと同等のＴ細胞シフトの確認
次にポリペプチド複合体を、機能的なｉｎ ｖｉｔｒｏ腫瘍細胞死滅および関連するＴ細胞活性化試験で評価した。
簡潔に説明すると、ＨＣＴ１１６細胞を、９６ウェルの組織培養処理済平底プレート上に蒔き、一晩かけて付着させた。翌日、培養培地と接着していない細胞を除去し、示された濃度で滴定されたポリペプチド複合体を含む新鮮な培地と交換した。ＰＣ－２、ＰＣ－３、ＰＣ－４、ＰＣ－５、ＰＣ－１、およびＰＣ－６のデータは、図１４、表１５～１６に見られる。
実施例４．Ｉｎ ｖｉｖｏでのカニクイザルＰＫ比較
ポリペプチド複合体をカニクイザルの薬物動態と安全性について評価した。
カニクイザル
若いオスのナイーブカニクイザルを対にして群ごとに収容し、身体に固有のタトゥーを入れて識別した。動物をすべて、試験開始前の３日間、収容条件に順応させた。開始前に、すべての動物が試験獣医師による身体検査を受けた。試験獣医師の見識において健康であり、その他の点で基準を満たしている動物のみを試験に登録した。食事は投与前に一晩控えた。Ｐｕｒｉｎａ５０４９を、動物の大きさに適した量で毎日与えた。自動給水装置により水道水を自由に飲めるようにした。
薬物動態
ポリペプチド複合体ＰＣ－１、ＰＣ－２、ＰＣ－３、ＰＣ－４、およびＰＣ－５のポリペプチド複合体薬物動態を、オスのナイーブカニクイザルで２～３ｋｇに秤量して判定した。簡潔に説明すると、収容された２群のサルを投与群ごとに使用し、投与前に周囲に順応させた。投薬と出血の前、ケタミンＨＣＬ１０～２０ｍｇ／ｋｇ ＩＭで動物を鎮静させた。濃縮被験物質を滅菌リン酸緩衝生理食塩水で希釈し、ｋｇでの動物の質量に対する量を動物に投与した。各被験物質の用量を１ｍＬ／ｋｇの投与量として静脈内投与した。投与において、左肢と右肢をクリップで止めてアルコールで調製した（ｐｒｅｐｐｅｄ）。伏在静脈を確認し、標準カテーテルを配してＩＶボーラス注入を行った（左肢または右肢のいずれかに）。被験物質投与溶液をシリンジによりカテーテルに流し入れ（ａｔｔａｃｈｅｄ）、シリンジを手で圧迫することでボーラス注入を行った。
採血において、ケタミンを用いて動物を鎮静させ、大腿三角筋を調製し、２２Ｇの１．５インチ針、バキュテナーシース、および採取管を用いて大腿静脈から採血を行った。静脈穿刺後、止血を成し遂げるまで静脈を手で圧迫し続けた。採血は動物の体重に基づき行われ、ＩＡＣＵＣが明記するＡＧＩ最大出血量を超えなかった。血液をＥＤＴＡ管に採取し、血漿へと処理した。血液試料を冷やして３０００ｘｇで１０分間遠心分離し、血漿から細胞を分離した。血漿の上清を採取し、解析前に冷凍保存した。
カニクイザル血漿試料中のポリペプチド複合体濃度をＥＬＩＳＡで判定した。簡潔に説明すると、抗ｈｉｓタグ捕捉抗体をＥＬＩＳＡプレート上で直接被覆させた。カニクイザル血清中のポリペプチド複合体の標準希釈物を使用して、動物ＰＫ試験試料を比較可能な検量線を生成した。標準試料と試験試料をプレートに添加し、一晩冷却してインキュベートした。試験試料の様々な希釈物をいくつか使用して、シグナルが標準曲線の適切なダイナミックレンジ内にたどり着いたことを確認した。プレートを洗浄し、抗ヒトＨＲＰ検出抗体で短時間インキュベートした。標準ＥＬＩＳＡ技法を用いてプレートを洗浄し、発達させ、停止させた。公知のポリペプチド複合体濃度に対する４５０ｎｍでの吸光度をプロットする標準曲線を使用し、マウスＰＫ血漿試料ごとの明らかでない被験物質濃度を算出した。ポリペプチド複合体濃度を時間に対してプロットし、標準の二段階分布と除去薬物動態モデルに適合させた。カニクイザルから得たポリペプチド複合体ＰＣ－１、ＰＣ－７、ＰＣ－４、およびＰＣ－５において算出した薬物動態とパラメータを、図５Ａ～５Ｄ、表１７～２０に示す。
これらのデータより、切断可能リンカーを含むポリペプチド複合体はカニクイザルで血清半減期を延ばしたことが認められる。
実施例５．Ｉｎ ｖｉｖｏでのカニクイザルのサイトカイン放出
カニクイザルのサイトカイン放出を測定した。
処置後の血漿に存在するサイトカインを、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製の非ヒト霊長類Ｔｈ１／Ｔｈ２ ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ ｂｅａｄ ａｒｒａｙのアッセイキット（カタログ番号５５７８００）を製造業者の指示に従い用いて測定した。データを図６Ａ～図６Ｄ、表２１に示す。
実施例６．Ｉｎ ｖｉｖｏでのカニクイザルの肝ＡＬＴ／ＡＳＴ
ＡＬＴ／ＡＳＴ値を測定した。図７Ａと図７Ｂ、および表２２に見られるように、ポリペプチド複合体はカニクイザルで肝毒性を防止した。
本発明の好ましい実施形態が本明細書中で示されるとともに記述されてきたが、かかる実施形態はほんの一例として提供されることは当業者に明白であろう。現在、多数の変形、変更、および置換えが、本発明から逸脱することなく当業者に想到されるであろう。本明細書に記載の本発明の実施形態に対する種々の代替物が本発明の実施に使用され得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲は本発明の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲内にある方法と構造、およびそれらの等価物がそれによりカバーされることが意図される。

Claims (23)

  1. 配列番号６のアミノ酸配列（ＬＳＧＲＳＤＡＧＳＰＬＧＬＡＧ）による切断可能リンカーを含む単離ポリペプチドであって、前記単離ポリペプチドが標的抗原に結合する抗原結合性ドメインをさらに含み、前記切断可能リンカーが、式Ｉ：Ａ １ －Ｌ １ －Ｐ １ による配置で、前記標的抗原に結合する前記抗原結合性ドメインにペプチドを接続し、式中、Ａ １ は、前記標的抗原に結合する前記抗原結合性ドメインを含み、Ｌ １ は前記切断可能リンカーを含み、Ｐ １ は、前記標的抗原への前記抗原結合性ドメインの結合を損なわせるペプチドを含む、単離ポリペプチド。
  2. 前記切断可能リンカーがプロテアーゼにより切断可能である、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
  3. 前記プロテアーゼが腫瘍特異的プロテアーゼを含む、請求項２に記載の単離ポリペプチド。
  4. 前記プロテアーゼが、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）またはセリンプロテアーゼを含む、請求項２に記載の単離ポリペプチド。
  5. 前記マトリックスメタロプロテアーゼが、ＭＭＰ２、ＭＭＰ７、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１３、またはＭＭＰ１４を含む、請求項４に記載の単離ポリペプチド。
  6. 前記セリンプロテアーゼが、マトリプターゼ、ウロキナーゼ、またはヘプシンを含む、請求項４に記載の単離ポリペプチド。
  7. 前記抗原結合性ドメインが、前記切断可能リンカーに対するＣ末端である、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
  8. Ｐ１がＮ末端で前記切断可能リンカーに接続され、Ａ１がＣ末端で前記切断可能リンカーに接続される、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
  9. Ｐ１が、前記標的抗原に対し７０％未満の配列同一性を有する、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
  10. Ｐ１が、長さが少なくとも１０のアミノ酸および長さが２０以下のアミノ酸のペプチド配列を含む、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
  11. Ｐ１が半減期延長部分にさらに連結される、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
  12. 前記半減期延長部分が単一ドメイン抗体である、請求項１１に記載の単離ポリペプチド。
  13. Ａ１が、抗体、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、重鎖可変ドメイン（ＶＨドメイン）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬドメイン）、ラクダ科由来単一ドメイン抗体の可変ドメイン（ＶＨＨ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ軽鎖ポリペプチド、またはＦａｂ重鎖ポリペプチドを含む、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
  14. Ａ１が前記ｓｃＦｖを含む、請求項１３に記載の単離ポリペプチド。
  15. 前記ｓｃＦｖが抗ＣＤ３ｅ一本鎖可変フラグメントを含む、請求項１４に記載の単離ポリペプチド。
  16. 請求項１に記載の単離ポリペプチドと、第２の抗原結合性ドメインを含む第２の単離ポリペプチドとを含む、複合体。
  17. 前記第２の単離ポリペプチドが、式ＩＩ：Ａ２－Ｌ２－Ｐ２による配置にあり、式中、Ａ２は前記第２の抗原結合性ドメインを含み、Ｌ２は第２の切断可能リンカーを含み、Ｐ２は、第２の標的抗原への前記第２の抗原結合性ドメインの結合を損なわせる第２のペプチドを含み、前記第２の抗原結合性ドメインがＦａｂ軽鎖ポリペプチドまたはＦａｂ重鎖ポリペプチドを含み、前記第２の標的抗原が腫瘍抗原を含む、請求項１６に記載の複合体。
  18. 前記第２の切断可能リンカーが、配列番号１のアミノ酸配列（ＬＳＧＲＳＤＡＧ）を含む、請求項１７に記載の複合体。
  19. 前記第２の切断可能リンカーが、配列番号３のアミノ酸配列（ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＡＧ）を含む、請求項１７に記載の複合体。
  20. 前記第２の切断可能リンカーが、配列番号２６のアミノ酸配列（ＡＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＡＧ）を含む、請求項１７に記載の複合体。
  21. 前記第２の切断可能リンカーが、配列番号４のアミノ酸配列（ＡＡＧＬＬＡＰＰＧＧＬＳＧＲＳＤＡＧ）を含む、請求項１７に記載の複合体。
  22. 前記第２の切断可能リンカーが、配列番号５のアミノ酸配列（ＳＰＬＧＬＳＧＲＳＤＡＧ）を含む、請求項１７に記載の複合体。
  23. 前記第２の切断可能リンカーが、配列番号６のアミノ酸配列（ＬＳＧＲＳＤＡＧＳＰＬＧＬＡＧ）を含む、請求項１７に記載の複合体。
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