JP7681525B2

JP7681525B2 - 核酸複合体及びそれを含む医薬組成物

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Publication number: JP7681525B2
Application number: JP2021574117A
Authority: JP
Inventors: 裕太鈴木; 一斗山崎; 健嗣久原; 智彦田村; 大翼黒滝
Original assignee: Eisai R&D Management Co Ltd
Current assignee: Eisai R&D Management Co Ltd
Priority date: 2020-01-30
Filing date: 2021-01-28
Publication date: 2025-05-22
Anticipated expiration: 2041-01-28
Also published as: US20230151360A1; EP4071163A4; EP4071163A1; CN114929729A; TW202142260A; JPWO2021153687A1; CN114929729B; WO2021153687A1; TWI877296B

Description

本発明は、核酸複合体及び該核酸複合体を含む医薬組成物等に関する。

核酸医薬として、アンチセンス、デコイ核酸、リボザイム、アプタマー、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）などが知られている。中でもｍＲＮＡに作用する核酸医薬は、細胞内のあらゆる遺伝子を制御できる汎用性の高さから、今まで治療困難とされてきた疾患への臨床応用が期待されている。すなわち、核酸医薬は、低分子、抗体医薬に次ぐ、次世代医薬として期待されている。しかしながら核酸医薬は、核酸医薬の比較的大きなサイズ、リン酸バックボーンの負電荷による著しく低い細胞膜透過性、血中ヌクレアーゼによるｓｉＲＮＡの分解などにより、核酸医薬の作用点である細胞内への送達が困難であることが問題点として挙げられる（非特許文献１）。

かかる問題点に対して、核酸医薬に送達手段を適応して解決する方法が取られている。送達手段の１つとして、標的リガンドと核酸との核酸複合体（コンジュゲート核酸）が報告されている。標的リガンドとしては、細胞表面に発現する受容体に結合する形態が挙げられる。たとえば、肝実質細胞に高発現しているアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）に対するリガンドとして、Ｎ－アセチル－Ｄ－ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）等を利用した核酸複合体が複数報告されている（特許文献１，特許文献２，特許文献３，非特許文献２）。さらには、マクロファージや樹状細胞などの免疫細胞に高発現しているマンノース受容体（ＣＤ２０６）に対して送達させる薬物担体として、マンノースコンジュゲート及びマンノシル化された核酸複合体が報告されている（特許文献４）。またコレステロール及び脂肪酸などの脂溶性化合物を核酸医薬に修飾し、血漿中のリポプロテイン等との親和性を高めることで、対応するリポプロテイン受容体（ＬＤＬ受容体、ＨＤＬ受容体、スカベンジャー受容体ＳＲＢ１）を発現する細胞への送達を実現することが報告されている（非特許文献３）。

国際公開第２００９／０７３８０９号国際公開第２０１４／１７９６２０号国際公開第２０１６／１００４０１号国際公開第２０１８／００４００４号

Nature Reviews Drug Discovery. 8, 129-138 (2009). J. Am. Chem. Soc. 2014,136, 16958-16961. Nucleic Acids Research, 2019, Vol.47, No.3,1082-1096.

これまで多くの標的リガンド、並びにリガンドを含む核酸複合体が提案されているが、現状において、受容体への特異的な結合性の改善、核酸医薬の細胞内取り込みの増強について、十分に満足し得るものは未だに見出されていない。

本発明者らは上記課題を解決すべく、鋭意研究した結果、細胞選択的に取り込まれる核酸複合体を見出した。すなわち、本発明は下記の［１］－［２７］に関する。
［１］下記式（Ｉ）：
［ＸはＣＨ_２又はＯであり；
Ｙはマンノース又はＧａｌＮａｃを有する糖リガンドであり；
ｎは１から８までの整数を示し；
Ｚはオリゴヌクレオチドを含む基である。］
で表される核酸複合体又はその薬剤学的に許容される塩。
［２］下記式（ＩＩ）：
［Ｙはマンノース又はＧａｌＮａｃを有する糖リガンドであり；
Ｚはオリゴヌクレオチドを含む基である。］
で表される核酸複合体又はその薬剤学的に許容される塩。
［３］下記式（ＩＩＩ）：
［Ｚはオリゴヌクレオチドを含む基である。］
で表される核酸複合体又はその薬剤学的に許容される塩。
［４］下記式（ＩＶ）：
［Ｚはオリゴヌクレオチドを含む基である。］
で表される核酸複合体又はその薬剤学的に許容される塩。
［５］下記式（Ｖ）：
［Ｚはオリゴヌクレオチドを含む基である。］
で表される核酸複合体又はその薬剤学的に許容される塩。
［６］下記式（ＶＩ）：
［Ｚはオリゴヌクレオチドを含む基である。］
で表される核酸複合体又はその薬剤学的に許容される塩。
［７］下記式（ＶＩＩ）：で表される核酸複合体又はその薬剤学的に許容される塩。
［Ｚはオリゴヌクレオチドを含む基である。］
で表される核酸複合体又はその薬剤学的に許容される塩。
［８］下記式（ＶＩＩＩ）：
［Ｚはオリゴヌクレオチドを含む基である。〕
で表される核酸複合体又はその薬剤学的に許容される塩。
［９］下記式（ＩＸ）：
［Ｚはオリゴヌクレオチドを含む基である。］
で表される核酸複合体又はその薬剤学的に許容される塩。
［１０］下記式（Ｘ）：
［Ｚはオリゴヌクレオチドを含む基である。］
で表される核酸複合体又はその薬剤学的に許容される塩。
［１１］下記式（ＸＩ）：
［Ｚはオリゴヌクレオチドを含む基である。］
で表される核酸複合体又はその薬剤学的に許容される塩。
［１２］下記式（ＸＩＩ）：
［Ｚはオリゴヌクレオチドを含む基である。］
で表される核酸複合体又はその薬剤学的に許容される塩。
［１３］下記式（ＸＩＩＩ）：
［Ｚはオリゴヌクレオチドを含む基である。］
で表される核酸複合体又はその薬剤学的に許容される塩。
［１４］下記式（ＸＩＶ）：
［Ｚはオリゴヌクレオチドを含む基である。］
で表される核酸複合体又はその薬剤学的に許容される塩。
［１５］オリゴヌクレオチドが一本鎖である、上記［１］～［１４］いずれか記載の核酸複合体。
［１６］オリゴヌクレオチドが３’末端を介して結合している、上記［１５］の核酸複合体。
［１７］オリゴヌクレオチドが５’末端を介して結合している、上記［１５］の核酸複合体。
［１８］オリゴヌクレオチドが二本鎖である、上記［１］～［１４］いずれか記載の核酸複合体。
［１９］オリゴヌクレオチドが、一つの鎖の３’末端を介して結合している、上記［１８］の核酸複合体。
［２０］オリゴヌクレオチドが、一つの鎖の５’末端を介して結合している、上記［１８］の核酸複合体。
［２１］上記［１］～［２０］いずれか記載の核酸複合体を含む、医薬組成物。
［２２］細胞における標的遺伝子の発現を調節する、上記［２１］記載の医薬組成物。
［２３］細胞が樹状細胞、マクロファージ又は肝実質細胞である上記［２２］記載の医薬組成物。
［２４］細胞における標的遺伝子の発現を調節する方法に使用するための、上記［１］～［２０］いずれか記載の核酸複合体。
［２５］細胞が樹状細胞、マクロファージ又は肝実質細胞である上記［２４］記載の核酸複合体。
［２６］上記［１］～［２０］いずれか記載の核酸複合体又は上記［２１］の医薬組成物を対象に投与することを含む、対象の細胞における標的遺伝子の発現を調節する方法。
［２７］細胞が樹状細胞、マクロファージ又は肝実質細胞である上記［２６］記載の方法。

本発明に係る核酸複合体は、下記の薬理試験において示されているように、マンノース受容体又はＡＳＧＰＲが発現した細胞へ選択的に取り込まれる。本発明に係る核酸複合体を含む医薬組成物を哺乳動物（ヒトを含む）に投与することで、各種関連疾患を治癒できる可能性を有している。

以下、本発明の内容について詳細に説明する。

本明細書中における化合物は、その構造式が便宜上一定の異性体を表すことがあるが、便宜上の式の記載に限定されるものではなく、化合物の構造上生ずるすべての幾何異性体、光学異性体、回転異性体、立体異性体、互変異性体等の異性体及び異性体混合物を含み、いずれか一方の異性体でも、各異性体を任意の比率で含む混合物でもよい。したがって例えば、本明細書中の化合物には、光学異性体及びラセミ体が存在することがありえるが、本明細書においてはいずれにも限定されず、ラセミ体であっても、各光学活性体のいずれかであっても、各光学活性体を任意の比率で含む混合物でもよい。

また、本明細書中における化合物は結晶多形が存在することもあるが同様にいずれにも限定されず、いずれかの結晶形の単一物であっても混合物であってもよく、また、本明細書中における化合物には非晶質体も含まれ、そして、本明細書中における化合物には、無水物と溶媒和物（特に水和物）とが包含される。

本明細書中における化合物には、化合物の同位体標識された化合物も含まれる。同位体標識された化合物は１つ又はそれ以上の原子が自然界に通常見出される原子質量か質量数と異なった原子質量か質量数を有する原子で置き換えられていること以外、化合物と同一である。本明細書中における化合物に組み入れることができる同位元素は、例えば、水素、炭素、窒素、酸素、フッ素、リン、硫黄、沃素、及び塩素の同位元素であり、^２Ｈ、^３Ｈ、^１１Ｃ、^１４Ｃ、^１５Ｎ、^１８Ｏ、^１８Ｆ及び^３５Ｓ等が含まれる。

本明細書における「薬剤学的に許容される塩」とは、化合物と塩を形成されるものであれば特に限定されず、具体的には例えば、酸付加塩、金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩、アミノ酸付加塩等の塩が挙げられる。

酸付加塩の好ましい例としては、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩や、酢酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、ステアリン酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩等の有機酸塩が挙げられる。
金属塩の好ましい例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、亜鉛塩等が挙げられる。
アンモニウム塩の好ましい例としては、例えばアンモニウム、テトラメチルアンモニウム等の塩が挙げられる。
有機アミン付加塩の好ましい例としては、例えば、モルホリン、ピペリジン等の付加塩が挙げられる。
アミノ酸付加塩の好ましい例としては、例えば、リジン、グリシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸等の付加塩が挙げられる。

本明細書中における化合物がフリー体として得られる場合、化合物が形成していてもよい塩又はそれらの水和物の状態に常法に従って変換することができる。

本明細書中における化合物が塩又は水和物として得られる場合、フリー体に常法に従って変換することができる。

また、本明細書中における化合物について得られる種々の異性体（例えば幾何異性体、光学異性体、回転異性体、立体異性体、互変異性体等）は、通常の分離手段、例えば、再結晶、ジアステレオマー塩法、酵素分割法、種々のクロマトグラフィー（例えば薄層クロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等）を用いることにより精製し、単離することができる。

本発明に係る医薬組成物は、薬剤学的に許容される添加物を核酸複合体またはその薬剤学的に許容される塩と混和することにより製造することができる。本発明に係る医薬組成物は例えば第十七改正日本薬局方の製剤総則に記載の方法など既知の方法に従って製造することができる。

本発明に係る医薬組成物は、その剤形に応じて適切に患者に投与することができる。

本発明に係る核酸複合体の投与量は、症状の程度、年齢、性別、体重、投与形態・塩の種類、疾患の具体的な種類等に応じて異なるが、通常、成人の場合は１日あたり経口投与でオリゴヌクレオチドに換算した投与量が約３０μｇ～１０ｇ、好ましくは１００μｇ～１ｇを、注射投与で約１μｇ～１ｇ、好ましくは１００μｇ～３００ｍｇをそれぞれ１回又は数回に分けて投与する。

本発明に係る核酸複合体は、糖リガンドがリンカーを介してオリゴヌクレオチドと結合した核酸複合体であって、糖リガンドが、Ｏ、Ｎ、又はＣ結合、好ましくはＯ結合マンノース又はＧａｌＮａｃを有する、核酸複合体である。すなわち、本発明に係る核酸複合体は、（糖リガンド）－（リンカー）－（オリゴヌクレオチド）という構造を有する。

一実施形態では、核酸複合体は、２つ以上の糖、好ましくは３つ又は４つの糖を含む。一実施形態では、核酸複合体は、少なくとも３つのマンノース又は少なくとも３つのＧａｌＮａｃを含み、これらの核酸複合体はそれぞれマクロファージ又は肝実質細胞を標的とし送達され得る。

＜糖リガンドについて＞
マンノース受容体は、ＣＤ２０６が高発現する細胞、例えば、マクロファージや樹状細胞などの特定の細胞に高発現している。マンノースコンジュゲート及びマンノシル化された薬物担体はＣＤ２０６に対して高い結合親和性を示し、薬物分子、例えばオリゴヌクレオチドをマクロファージや樹状細胞などの細胞に送達するために首尾よく使用されている。

ＡＳＧＰＲは、肝実質細胞などの特定の細胞に高発現している。ＧａｌＮａｃコンジュゲート及びＧａｌＮａｃ化された薬物担体はＡＳＧＰＲに対して高い結合親和性を示し、薬物分子、例えばオリゴヌクレオチドを肝実質細胞などの細胞に送達するために首尾よく使用されている。

糖リガンドは標的細胞に発現している受容体に結合可能な糖類に由来する基を意味し、本発明に係る核酸複合体において好ましい糖リガンドの態様の一つとして、以下の構造が例示できる。波線は、リンカーとの結合手を意味する。

＜オリゴヌクレオチドについて＞
本発明に係る核酸複合体におけるオリゴヌクレオチドとしては、核酸医薬として用いることが知られたオリゴヌクレオチドを用いることができる。本明細書において、核酸医薬とは、アンチセンス、デコイ核酸、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ａｎｔｉｍｉＲＮＡ及びｍＲＮＡなどとして用いられるヌクレオチドを意味する。

また、オリゴヌクレオチドは、一本鎖又は二本鎖のオリゴヌクレオチドであってもよい。

本発明に係る核酸複合体におけるリンカーとオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドなどのヌクレオチドで結合してもよく、例えばオリゴヌクレオチドの３’末端又は５’末端で結合する。オリゴヌクレオチドが二本鎖である場合には、リンカーは、二本鎖核酸を構成するセンス鎖の３’末端又は５’末端と結合していることが好ましいが、当該結合に限定されるものではない。

核酸複合体におけるオリゴヌクレオチドが結合するリンカーの数は１つに限られず、２つ以上であってもよい。

いくつかの実施形態では、例えば、安定性を高めるために、突出に特定の塩基を含めるか、又は一本鎖突出（例えば、５’突出もしくは３’突出、もしくはその両方）に修飾ヌクレオチドもしくはヌクレオチド代用物を含めることが可能である。

本発明に係る核酸複合体を構成するするオリゴヌクレオチドは、哺乳動物細胞に導入された場合、標的遺伝子の発現を制御する能力を有するものであればいかなる形状でもよく、一本鎖のオリゴヌクレオチド又は二本鎖のオリゴヌクレオチドが好適に用いられる。

オリゴヌクレオチドとしては、ヌクレオチド又はヌクレオチドと同等の機能を有する分子の重合体であればいかなる分子であってもよく、例えばデオキシリボヌクレオチドの重合体であるＤＮＡ、リボヌクレオチドの重合体であるＲＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡの重合体であるキメラ核酸が挙げられる。また、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びキメラ核酸において、少なくとも一つのデオキシリボヌクレオチドやリボヌクレオチド等のヌクレオチドがヌクレオチドと同等の機能を有する分子で置換されたヌクレオチド重合体であってもよい。なお、ＲＮＡ中のウラシル（Ｕ）は、ＤＮＡにおいてはチミン（Ｔ）に一義的に読み替えられる。

ヌクレオチドと同等の機能を有する分子としては、例えば、ヌクレオチドに修飾を施したヌクレオチド誘導体等が挙げられ、例えばＤＮＡ又はＲＮＡと比較して、ヌクレアーゼ耐性の向上もしくは安定化させるため、相補鎖核酸とのアフィニティーを上げるため、細胞透過性を上げるため、又は可視化させるために、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドに修飾を施した分子等が好適に用いられる。

ヌクレオチド誘導体としては、例えば糖部修飾ヌクレオチド、リン酸ジエステル結合修飾ヌクレオチド、塩基修飾ヌクレオチド等、糖部、リン酸ジエステル結合及び塩基の少なくとも一つが修飾されたヌクレオチド等が挙げられる。

糖部修飾ヌクレオチドとしては、ヌクレオチドの糖の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の置換基で修飾もしくは置換したもの、又は任意の原子で置換したものであればいかなるものでもよいが、２’－修飾ヌクレオチドが好ましく用いられる。

２’－修飾ヌクレオチドとしては、例えばリボースの２’－ＯＨ基がＯＲ、Ｒ、Ｒ’ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ_２、ＮＨＲ、ＮＲ_２、Ｎ_３、ＣＮ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩからなる群（Ｒはアルキル又はアリール、好ましくは炭素数１～６のアルキルであり、Ｒ’はアルキレン、好ましくは炭素数１～６のアルキレンである）から選択される置換基で置換された２’－修飾ヌクレオチドが挙げられ、２’－修飾としては、好ましくはＦ、メトキシ基及びエトキシ基での置換が挙げられる。また、リボースの２’位の酸素原子と４’位の炭素がメチレンで架橋された２’－修飾ヌクレオチド、すなわちロック核酸であってもよい。

リン酸ジエステル結合修飾ヌクレオチドとしては、ヌクレオチドのリン酸ジエステル結合の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の置換基で修飾もしくは置換したもの、又は任意の原子で置換したものであればいかなるものでもよく、例えば、リン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に置換されたヌクレオチド、リン酸ジエステル結合がホスホロジチオエート結合に置換されたヌクレオチド、リン酸ジエステル結合がアルキルホスホネート結合に置換されたヌクレオチド、リン酸ジエステル結合がホスホロアミデート結合に置換されたヌクレオチド等が挙げられ、好ましくはリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に置換されたヌクレオチドが挙げられる。

オリゴヌクレオチドは、その分子中の一部あるいは全部の原子が質量数の異なる原子（同位体）で置換されたものも包含する。

一態様では本発明に係る核酸複合体におけるオリゴヌクレオチドは細胞における標的遺伝子の発現を調節する。

一態様では、本発明の核酸複合体におけるオリゴヌクレオチドは、リンカーを介してリガンド（リンカーリガンドとも称する）に結合する。

＜リンカーについて＞
本発明における「リンカー」としては、核酸複合体として用いることができる任意のリンカーを用いることができる。

リンカー構造の例示としては、例えば、国際公開第２００９／０７３８０９号、国際公開第２０１３／０７５０３５号、国際公開第２０１５／１０５０８３号に開示される構造を採用することができる。

一実施形態では、リンカーは、少なくとも１つの切断可能な結合基を含む。

切断可能な結合基とは、細胞外では十分に安定であるが、標的細胞内に入ると切断され、リンカーが結びついている部分を放出する基のことである。

例えば、リン酸ベースの切断可能な結合基は、リン酸基を分解又は加水分解する薬剤によって切断される。細胞内でリン酸基を切断する例は、ホスファターゼなどの酵素である。リン酸ベースの結合基の好ましい実施形態は、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－又はＯ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｏ－である。

リンカーの実施形態としては下記構造のいずれかであり、Ｘ、Ｙはそれぞれ存在ごとに独立して、ＸはＣＨ_２又はＯを表し、Ｙは糖リガンドを表し、Ｚはオリゴヌクレオチドを含む基を表し、ｎは１から８の整数を表す。

本発明に係る核酸複合体は、例えば、以下の製造例に記載した方法により、製造することができ、また、当該化合物の効果は、以下の試験例に記載した方法により確認することができる。ただし、これらは例示的なものであって、本発明は、いかなる場合も以下の具体例に制限されるものではなく、また本発明の範囲を逸脱しない範囲で変化させてもよい。本発明における実施例は当業者に知られている合成化学技術を使用して製造することができる。

また、本明細書に使用される略号は当業者に周知の慣用的な略号である。本明細書においては以下の略号を使用する。
Ｃｂｚ：ベンジルオキシカルボニル
ＣＴＣ：２－クロロトリチルクロリド
ＤＣＥ：１，２－ジクロロエタン
ＤＣＭ：ジクロロメタン
ＤＩＰＥＡ：Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
ＥＤＣＩ：１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩
ＥｔＯＡｃ：酢酸エチル
ＥＳＩ：エレクトロスプレーイオン化
Ｆｍｏｃ：９－フルオレニルメチルオキシカルボニル
ＨＢＴＵ：１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－ベンゾトリアゾリウム３－オキシドヘキサフルオロホスファート
ＨＯＢＴ：１－ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＩＭＳ：工業用変性アルコール
ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ：マトリックス支援レーザー脱離イオン化－飛行時間型マススペクトルメトリー
ＭｅＯＨ：メタノール
ＭＴＢＥ：メチルターシャリーブチルエーテル
ＮａＯＭｅ：ナトリウムメトキシド
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
^１Ｈ－ＮＭＲ：プロトン核磁気共鳴スペクトルメトリー
ＭＳ：マススペクトルメトリー
ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー

以下の実施例及び製造例中の「室温」は通常約１０℃から約３５℃を示す。％は特記しない限り重量又は体積パーセントを示す。

プロトン核磁気共鳴スペクトルの化学シフトは、テトラメチルシランに対するδ単位（ｐｐｍ）で記録、カップリング定数はヘルツ（Ｈｚ）で記録されている。パターンは、ｓ：シングレット、ｄ：ダブレット、ｔ：トリプレット、ｑ：カルテット、ｑｕｉｎ：クインテット、ｍ：マルチプレット、ｂｒ：ブロード、ｂｒ．ｓ：ブロードシングレット。

シリカゲルカラムクロマトグラフィーに関して、シリカゲルは、Ｍｅｒｃｋ社製ＳｉｌｉｃａＧｅｌ６０（７０－２３０ｍｅｓｈ、もしくは、２３０－４００ｍｅｓｈＡＳＴＭ）、富士シリシア化学社製ＰＳＱ６０Ｂ、又はプレパックカラム（カラム：ＹＡＭＡＺＥＮ社製Ｈｉ－Ｆｌａｓｈ^ＴＭＣｏｌｕｍｎ（Ｓｉｌｉｃａｇｅｌ）、もしくはＢｉｏｔａｇｅ社製Ｂｉｏｔａｇｅ^ＴＭＳＮＡＰＵｌｔｒａＳｉｌｉｃａＣａｒｔｒｉｄｇｅ）を用いた。

化合物の命名は、一般的に用いられる試薬を除き、「Ｅ－ノートブック」バージョン１２又は１３（パーキンエルマー社）又は「ＭａｒｖｉｎＳｋｅｔｃｈ」バージョン１６（ＣｈｅｍＡｘｏｎ社）で表示されるものを用いた。

下記製造例を参考に、当業者に公知の方法により製造することができる。

化合物６の合成スキーム

化合物２の合成

酢酸ヒドラジン（５．１９ｇ、５６．４ｍｍｏｌ）にＤＭＦ（２００ｍＬ）を加え、５５℃で撹拌後、反応混合物を１５℃に冷却し、１－Ｏ，２－Ｏ，３－Ｏ，４－Ｏ，６－Ｏ－ペンタアセチル－β－Ｄ－マンノピラノース（化合物１）（２０．０ｇ、５１．２ｍｍｏｌ）を加え、１５℃で１６時間攪拌した。反応混合物を水に加え、ＥｔＯＡｃで抽出した。併せた有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過後、減圧下で濃縮し、化合物２（１４．３ｇ）を得た。
^１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ（ｐｐｍ）：1.97-2.00 (m, 3H), 2.03 (s, 3H), 2.08 (s, 3H), 2.14 (s, 3H), 4.11-4.15 (m, 1H), 4.16-4.32 (m, 3H), 5.14-5.34 (m, 3H), 5.37-5.45 (m, 1H).

化合物３の合成

ＤＣＭ（５０ｍＬ）に化合物２（５．００ｇ、１４．４ｍｍｏｌ）、２，２，２－トリクロロアセトニトリル（２０．７ｇ、１４３ｍｍｏｌ）及びＣｓ_２ＣＯ_３（５．１４ｇ、１５．８ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で２時間撹拌した。反応混合物を濾過し、濾液を減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（５０：１－２０：１石油エーテル／ＥｔＯＡｃ）により精製し、化合物３（２．７０ｇ）を得た。
^１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ（ｐｐｍ）：2.01 (s, 3H), 2.04 (s, 2H), 2.08 (d, J=6.8Hz, 6H), 2.20 (s, 3H), 4.15-4.22 (m, 2H), 4.24-4.32 (m, 1H), 5.37-5.42 (m, 2H), 5.46-5.49 (m, 1H), 6.28 (d, J=1.8Hz, 1H), 8.79 (s, 1H).

化合物４の合成

化合物３（１４．０ｇ、２８．４ｍｍｏｌ）、６－（Ｃｂｚ－アミノ）－１－ヘキサノール（８．５７ｇ、３４．１ｍｍｏｌ）及びモレキュラーシーブ４Ａ（１０．０ｇ）をＤＣＭ（１４０ｍＬ）に加え、０℃で３０分間撹拌した。次いで、反応混合物にトリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネート（６．３２ｇ、２８．４ｍｍｏｌ）を－６５℃で滴下し、反応混合物を２５℃で１６時間撹拌した。反応混合物をＤＣＭで希釈し、濾過後、濾液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、水及び食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過後、減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（５０：１－２０：１石油エーテル／ＥｔＯＡｃ）により精製し、化合物４（７．５０ｇ）を得た。

化合物５の合成

化合物４（７．５０ｇ、１２．９ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（３００ｍＬ）に溶解させ、ＮａＯＭｅ（２．７９ｇ、５１．６ｍｍｏｌ）を加え、室温で３時間反応させた。反応混合物を一部濃縮し、冷水に注ぎ、酢酸をｐＨ＝５となるまで加え、得られた粗体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（５０：１－２０：１ＤＣＭ／ＭｅＯＨ）により精製し、化合物５（３．９０ｇ）を得た。
^１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ（ｐｐｍ）：1.26-1.63 (m, 8H) , 3.14 (d, J=6.3Hz, 2H) , 3.34 (d, J=8.8Hz, 1H), 3.54-3.74(m, 2H) , 3.80-4.01 (m, 4H) , 4.78 (s, 1H), 5.01-5.12 (m, 2H) , 5.16-5.47 (m, 6H), 7.28-7.41 (m, 5H).

化合物６の合成

乾燥１０％パラジウム－炭素（０．４０ｇ）にＭｅＯＨ（４０ｍＬ）、化合物５（３．９０ｇ、９．４３ｍｍｏｌ）を加え、２５℃、水素圧力下（５０ｐｓｉ）で３時間撹拌した。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して、化合物６（１．５０ｇ）を得た。
^１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）δ（ｐｐｍ）：
1.38-1.49 (m, 4H), 1.61 (dquin, J=13.3, 6.9, 6.9, 6.9, 6.9Hz, 4H), 2.73-2.88 (m, 2H), 3.31 (dt, J=3.3, 1.6Hz, 1H), 3.43 (dt, J=9.7, 6.1Hz, 1H), 3.48-3.89 (m, 8H).

化合物８の合成

６－アジドヘキサン酸（化合物７）（５０．２ｍｇ、３１９μｍｏｌ）及び化合物６（２６８ｍｇ、９５９μｍｏｌ）のＤＭＦ（３ｍＬ）溶液に、ＨＯＢｔ（１２９ｍｇ、９５９μｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（２４８ｍｇ、１．９２ｍｍｏｌ）及びＥＤＣＩ（１８３ｍｇ、９５９μｍｏｌ）を加え、２５℃で３時間撹拌した。反応混合物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）により精製して、化合物８（２０．１ｍｇ）を得た。
^１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ（ｐｐｍ）：
1.24-1.54 (m, 14H) 2.04 (t, J=7.40Hz, 2H) 3.00 (q, J=6.53Hz, 2H) 3.23-3.40 (m, 12H) 3.55-3.66 (m, 2H) 4.57 (s, 1H) 7.75 (br s, 1H)

化合物１１の合成スキーム

化合物１０の合成
ＣＴＣ樹脂（０．５０ｇ、０．５０ｍｍｏｌ、１．００ｍｍｏｌ／ｇ）とＮ－［（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ）カルボニル］－グルタミン酸５－ｔｅｒｔ－ブチル（化合物９）（２１２ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）を含む混合物に、ＤＣＭ（３０ｍＬ）及びＤＩＰＥＡ（２５８ｍｇ、２．００ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を２時間撹拌した。反応混合物にＭｅＯＨを加え（０．２ｍＬ）、３０分間撹拌した。反応混合物に６－アジドヘキサン酸（化合物７）（１１８ｍｇ、０．７５ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（２５８ｍｇ、２．００ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（２７０ｍｇ、７１２ｕｍｏｌ）及びＤＭＦ（３ｍＬ）を加え、２５℃にて１時間撹拌した。反応混合物に９０％ＴＦＡ／１０％ＤＣＭを加え、２時間攪拌した。反応混合物を濾過し、濾液を減圧下濃縮して、化合物１０（１１０ｍｇ）を得た。

化合物１１の合成

化合物１０（５０．０ｍｇ、１７４μｍｏｌ）及び化合物６（２９２ｍｇ、１．０５ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（３ｍＬ）溶液に、ＨＯＢｔ（１４１ｍｇ、１．０５ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（２７０ｍｇ、２．１０ｍｍｏｌ）及びＥＤＣＩ（２００ｍｇ、１．０５ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を２５℃で１６時間撹拌した。分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）により精製し、化合物１１（１８．１ｍｇ）を得た。
^１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ_６）δ（ｐｐｍ）：
1.16-1.56 (m, 24H), 1.62-1.73 (m, 1H), 1.76-1.87 (m, 1H), 2.00-2.07 (m, 2H), 2.09-2.15 (m, 2H), 2.95-3.07 (m, 4H), 3.22-3.41 (m, 18H), 3.65 (br s, 6H), 4.10-4.19 (m, 1H), 4.57 (d, J=1.00Hz, 2H), 7.74-7.93 (m, 3H).

化合物１２の合成

ＣＴＣ樹脂（１．００ｇ、１．００ｍｍｏｌ、１．００ｍｍｏｌ／ｇ）及びＮ－［（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ）カルボニル］－グルタミン酸５－ｔｅｒｔ－ブチル（化合物９）（５１１ｍｇ、１．２０ｍｍｏｌ）にＤＣＭ（２０ｍＬ）、ＤＩＰＥＡ（５１６ｍｇ、４．００ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物をＮ_２バブリングして２時間撹拌した。反応混合物にＭｅＯＨを加え（１ｍＬ）、３０分間撹拌した。２０％ピペリジンのＤＭＦ（３０ｍＬ）溶液を反応混合物に加え３０分間撹拌し、樹脂をＤＭＦで洗浄し、Ｎ－［（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ）カルボニル］－グルタミン酸１－ｔｅｒｔ－ブチル（Ｎ－Ｆｍｏｃ－ｇｌｕｔａｍｉｃａｃｉｄ－１－ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌｅｓｔｅｒ）（８５１ｍｇ、２．００ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（７２０ｍｇ、１．９０ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（５１６ｍｇ、４．００ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（５ｍＬ）溶液を加え、２５℃で１時間撹拌した。２０％ピペリジンのＤＭＦ（３０ｍＬ）溶液を加え、３０分間撹拌し樹脂をＤＭＦで洗浄した。次いで、６－アジドヘキサン酸（化合物７）（０．３０ｇ、１．９１ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（７２０ｍｇ、１．９０ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（５１６ｍｇ、４．００ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（５ｍＬ）溶液を加え、２５℃で１時間撹拌し、樹脂をＤＭＦで洗浄し、ＭｅＯＨで洗浄し、減圧下で乾燥させた。得られた残渣（０．６０ｇ）に５０％ＴＦＡ／５０％ＤＣＭを加え、２時間撹拌し、反応混合物を減圧下で濃縮し、化合物１２（２４０ｍｇ）を得た。

化合物１３の合成
化合物１３の合成は化合物１２の合成方法に準じ、６－アジドヘキサン酸の代わりにＡｚｉｄｏ－ＰＥＧ８－ａｃｉｄ（ＣＡＳＮｏ．１２１４３１９－９２－２）を用いることで、化合物１３(３５０ｍｇ)を得た。
^１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ（ｐｐｍ）：
2.01 (s, 2H), 2.18 (s, 2H), 2.32-2.63 (m, 6H), 3.40 (t, J=5.0Hz, 2H), 3.54-3.71 (m, 32H), 4.49 (s, 2H), 7.67-8.03 (m, 2H).

化合物１４の合成

化合物１２（０．２０ｇ、４８１μｍｏｌ）及び化合物７（１．０８ｇ、３．８５ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（０．５ｍＬ）溶液に、ＤＩＰＥＡ（９９６ｍｇ、７．７０ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（５２０ｍｇ、３．８５ｍｍｏｌ）及びＥＤＣＩ（７３８ｍｇ、３．８５ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を２５℃で１６時間撹拌し、分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）により精製して、化合物１４（１０３ｍｇ）を得た。
^１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）δ（ｐｐｍ）：
1.26-1.72 (m, 32H), 1.82-1.97 (m, 2H), 2.03-2.13 (m, 2H), 2.22-2.41 (m, 6H), 3.14-3.24 (m, 6H), 3.37-3.47 (m, 3H), 3.49-3.55 (m, 3H), 3.60 (t, J=9.5Hz, 3H), 3.65-3.86 (m, 15H), 4.22-4.42 (m, 2H), 4.73 (s, 3H).

化合物１５の合成

化合物１３（０．２０ｇ、２７５μｍｏｌ）及び化合物７（６１６ｍｇ、２．２０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（０．５ｍＬ）溶液に、ＤＩＰＥＡ（５７０ｍｇ、４．４１ｍｍｏｌ）、ＨＯＢＴ（２９８ｍｇ、２．２０ｍｍｏｌ）及びＥＤＣＩ（４２３ｍｇ、２．２０ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を２５℃で１６時間撹拌した。反応混合物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）により精製して、化合物１５（１２７ｍｇ）を得た。
^１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）δ（ｐｐｍ）：
1.23-1.68 (m, 24H), 1.78-1.95 (m, 2H), 2.04-2.19 (m, 2H), 2.23-2.31 (m, 2H), 2.33-2.42 (m, 2H), 2.48-2.60 (m, 2H), 3.10-3.26 (m, 6H), 3.35-3.46 (m, 5H), 3.48-3.56 (m, 3H), 3.57-3.84 (m, 50H), 4.23-4.41 (m, 2H), 4.73 (s, 3H).

化合物１７の合成スキーム

化合物１６の合成
ＣＴＣ樹脂（０．５０ｍｍｏｌ、０．５０ｇ、１．００ｍｍｏｌ／ｇ）及びＮ－［（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ）カルボニル］－グルタミン酸５－ｔｅｒｔ－ブチル（化合物９）（２１２ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）に、ＤＣＭ（３０ｍＬ）及びＤＩＰＥＡ（２５８ｍｇ、２．００ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を２時間撹拌後、ＭｅＯＨ（０．２ｍＬ）を加え、３０分間撹拌した。反応混合物にＨＢＴＵ（３６０ｍｇ、９５０μｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（２５８ｍｇ、２．００ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（３ｍＬ）溶液及びＮ－［（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ）カルボニル］－グルタミン酸１－ｔｅｒｔ－ブチル（Ｎ－Ｆｍｏｃ－ｇｌｕｔａｍｉｃａｃｉｄ－１－ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌｅｓｔｅｒ）（４２５ｍｇ、１．００ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で１時間撹拌後、Ｎ－［（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ）カルボニル］－グルタミン酸１－ｔｅｒｔ－ブチル（Ｎ－Ｆｍｏｃ－ｇｌｕｔａｍｉｃａｃｉｄ－１－ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌｅｓｔｅｒ）（４２５ｍｇ、１．００ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（３６０ｍｇ、９５０μｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（２５８ｍｇ、２．００ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（３ｍＬ）溶液を加え２５℃にて１時間で加えた。次に、６－アジドヘキサン酸（化合物７）（１１８ｍｇ、７５０μｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（３６０ｍｇ、９５０μｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（２５８ｍｇ、２．００ｍｍｏｌ）を加え１時間撹拌した。９０％ＴＦＡ／１０％ＤＣＭを加え、室温で２時間攪拌した。反応混合物を濾過し、減圧下濃縮し、化合物１６（２００ｍｇ）を得た。

化合物１７の合成

化合物１６（５０．０ｍｇ、９１．８μｍｏｌ）及び化合物７（２５６ｍｇ、９１８μｍｏｌ）のＤＭＦ（３ｍＬ）溶液に、ＨＯＢｔ（１２４ｍｇ、９１８μｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（２３７ｍｇ、１．８４ｍｍｏｌ）及びＥＤＣＩ（１７６ｍｇ、９１８μｍｏｌ）を加え、反応混合物を２５℃で１６時間撹拌した。反応混合物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）により精製し、化合物１７（１８．２ｍｇ）を得た。
^１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ_６）δ（ｐｐｍ）：
1.19-1.56 (m, 40H), 1.66 (br s, 3H), 1.83 (br s, 3H), 2.00-2.15 (m, 7H), 2.94-3.05 (m, 8H), 3.29 (br d, J=5.02Hz, 24H), 3.52-3.71 (m, 24H), 4.13 (br s, 3H), 4.57 (s, 4H), 7.74-7.99 (m, 7H).

化合物２１及び２２の合成スキーム

化合物１９の合成

ガラクトサミンペンタアセテート化合物１８（１２．０ｇ、３０．８ｍｍｏｌ）、６－（Ｃｂｚ－アミノ）－１－ヘキサノール（１０．３ｇ、４１．１ｍｍｏｌ）及びＺｎＣｌ_２（５．６０ｇ、４１．１ｍｍｏｌ）（使用前に１１０℃で１時間減圧乾燥した）の混合物にＤＣＥ（１２０ｍＬ）を加え、反応混合物を７０℃で３時間撹拌した。反応混合物をＥｔＯＡｃ及び炭酸水素ナトリウム水溶液で希釈し、混合物を１０分間撹拌し、セライト（登録商標）濾過し、ＥｔＯＡｃで洗浄した。濾液を水及び食塩水で洗浄した。水層をＥｔＯＡｃで抽出し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過後、減圧下濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（２：１石油エーテル／ＥｔＯＡｃ）にて精製し、化合物１９（１４．０ｇ）を得た。
^１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ（ｐｐｍ）：1.35 (d, J=3.8Hz, 4H), 1.45-1.66 (m, 4H), 1.77 (s, 2H), 1.94 (s, 3H),2.00 (s, 3H), 2.05 (s, 3H), 2.14 (s, 3H), 3.20 (qq, J=13.4, 6.8Hz, 2H), 3.48 (dt, J=9.6, 6.5Hz, 1H), 3.79-4.03 (m, 3H), 4.08-4.19 (m, 2H), 4.65 (d, J=8.3Hz, 1H), 4.90 (s, 1H), 5.04-5.17 (m, 2H), 5.26 (dd, J=11.2, 3.1Hz, 1H), 5.30 (s, 1H), 5.34 (d, J=2.8Hz, 1H), 5.94 (d, J=8.8Hz, 1H), 7.28-7.42 (m, 5H).

化合物２０の合成

化合物１９（７．５０ｇ、１２．９ｍｍｏｌ）にＭｅＯＨ（３００ｍＬ）及びＮａＯＭｅ（２．７９ｇ、５１．７ｍｍｏｌ）を加え、室温にて３時間撹拌した。反応混合物を一部濃縮し、冷水に注ぎ、酢酸をｐＨ＝５となるまで加えた。次に、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（５０：０－５０：１ＤＣＭ／ＭｅＯＨ）により精製し、化合物２０（４．００ｇ）を得た。
^１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）δ（ｐｐｍ）：
1.19-1.35 (m, 4H), 1.40-1.56 (m, 4H), 1.93 (s, 2H), 3.06 (t, J=7.0Hz, 2H), 3.27 (dt, J=3.3, 1.6Hz, 1H), 3.31 (s, 1H), 3.37-3.49 (m, 2H), 3.55 (dd, J=10.8, 3.3Hz, 1H), 3.65-3.76 (m, 2H), 3.78-3.94 (m, 3H), 4.31 (d, J=8.5Hz, 1H), 5.02 (s, 2H), 7.17-7.44 (m, 5H).

化合物２１の合成

アルゴン雰囲気下、乾燥１０％パラジウム－炭素（２４０ｍｇ）に、ＭｅＯＨ（２５ｍＬ）及び化合物２０（２．４０ｇ、５．２８ｍｍｏｌ）を加え、水素圧力下（５０ｐｓｉ）で２５℃にて３時間撹拌した。反応混合物を濾過し、濾液を減圧下濃縮し、化合物２１（０．６６ｇ）を得た。
^１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）δ（ｐｐｍ）：
1.30-1.44 (m, 4H), 1.52-1.66 (m, 4H), 1.98 (s, 3H), 2.76-2.90 (m, 2H), 3.31 (dt, J=3.3, 1.6Hz, 2H), 3.44-3.51 (m, 2H), 3.58 (dd, J=10.8, 3.3Hz, 1H), 3.73-3.78 (m, 2H), 3.82-3.95 (m, 3H), 4.34 (d, J=8.5Hz, 1H).

化合物２２の合成
化合物１９（２０２ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）にエタノール（６ｍＬ），１０％パラジウム－炭素（５０％含水品）４２ｍｇ）を加え、水素雰囲気下、室温で３時間撹拌した。反応混合物をセライト（登録商標）で濾過し、エタノールで洗浄した。濾液を減圧下濃縮し、化合物２２（１５９ｍｇ）を得た。
^１Ｈ－ＮＭＲ (600 MHz, DMSO-d6) δ（ｐｐｍ）： 0.64 (br s, 1H) 1.27 (br s, 5H) 1.33-1.52 (m, 4H) 1.67 (br s, 1H) 1.80 (s, 3H) 2.61 (br t, J=6.88Hz, 2H) 3.40-3.60 (m, 5H) 3.58-3.77 (m, 4H) 4.23 (br d, J=8.25Hz, 1H) 4.31-4.97 (m, 5H) 7.53-7.71 (m, 1H); MS (ESI+): m/z 321 [M+H]+.

化合物２３の合成

化合物１２（６０２ｍｇ、１．８８ｍｍｏｌ）及び化合物２１（６０１ｍｇ、１．８８ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（０．５ｍＬ）溶液に、ＤＩＰＥＡ（４８５ｍｇ、３．７６ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（２５４ｍｇ、１．８８ｍｍｏｌ）及びＥＤＣＩ（３６０ｍｇ、１．８８ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を２５℃で１６時間撹拌した。残渣を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）により精製して、化合物２３（１０４ｍｇ）を得た。
^１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）δ（ｐｐｍ）：
1.29-1.70 (m, 32H), 1.82-2.01 (m, 11H), 2.08 (s, 2H), 2.22-2.38 (m, 8H),3.18 (d, J=6.3Hz, 6H), 3.42-3.52 (m, 6H), 3.60 (d, J=10.5Hz, 3H), 3.71-3.95 (m, 14H), 4.28 (s, 1H), 4.36 (d, J=8.3Hz, 3H).

化合物２４の合成
化合物２３の合成と同様にして、化合物１２の代わりに化合物１６を用いることで化合物２４を得た。
^１Ｈ－ＮＭＲ (600 MHz, DMSO-d6) δ（ｐｐｍ）： 1.15-1.59 (m, 44H) 1.68 (br d, J=9.90Hz, 3H) 1.79 (s, 12H) 1.82-1.92 (m, 5H) 1.97-2.22 (m, 9H) 3.02 (br d, J=5.50Hz, 10H) 3.32-3.58 (m, 19H) 3.61-3.72 (m, 13H) 4.06-4.27 (m, 8H) 4.43 (br s, 4H) 4.46-4.59 (m, 9H) 7.59 (br d, J=8.80Hz, 4H) 7.74 (br s, 1H) 7.83 (br s, 3H) 7.89 (br s, 3H); MS (ESI+): m/z 1754 [M+H]+.

化合物２８の合成スキーム

化合物２５の合成
ＣＴＣ樹脂（１．３３ｍｍｏｌ／ｇ，０．３７５ｇ，０．５０ｍｍｏｌ）と化合物９（２１２ｍｇ，０．５０ｍｍｏｌ）を含む混合物にＤＣＭ（３０ｍＬ）を加え、ＤＩＰＥＡ（０．３５ｍＬ，２．００ｍｍｏｌ）を滴下し、反応液を２時間撹拌した。反応液にＭｅＯＨ（０．２ｍＬ，４．９４ｍｍｏｌ）を加え、３５分間撹拌した。反応液に２０％ピペリジンのＤＭＦ（１５ｍＬ）溶液で３０分間撹拌した。反応混合物を濾過し、得られた固体をＤＭＦで洗浄した。次いでＮ－［（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ）カルボニル］－Ｄ－グルタミン酸１－ｔｅｒｔ－ブチル（Ｎ－Ｆｍｏｃ－Ｄ－ｇｌｕｔａｍｉｃａｃｉｄ－１－ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌｅｓｔｅｒ）（２１３ｍｇ，０．４９９ｍｍｏｌ）及びＮ－［（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ）カルボニル］－Ｌ－グルタミン酸１－ｔｅｒｔ－ブチル（Ｎ－Ｆｍｏｃ－Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｃａｃｉｄ－１－ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌｅｓｔｅｒ）（２１３ｍｇ，０．４９９ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（３６０ｍｇ，０．９４９ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ（３ｍＬ）及びＤＩＰＥＡ（０．３５ｍＬ，２．００ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を窒素でバブリングさせながら１時間撹拌した。２０％ピペリジンのＤＭＦ（１５ｍＬ）溶液を加え、３０分間撹拌した。そして、樹脂をＤＭＦで洗浄した。次いでＮ－［（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ）カルボニル］－Ｄ－グルタミン酸１－ｔｅｒｔ－ブチル（Ｎ－Ｆｍｏｃ－Ｄ－ｇｌｕｔａｍｉｃａｃｉｄ－１－ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌｅｓｔｅｒ）（２１３ｍｇ，０．４９９ｍｍｏｌ），Ｎ－［（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ）カルボニル］－Ｌ－グルタミン酸１－ｔｅｒｔ－ブチル（Ｎ－Ｆｍｏｃ－Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｃａｃｉｄ－１－ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌｅｓｔｅｒ）（２１３ｍｇ，０．４９９ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（３６０ｍｇ，０．９４９ｍｍｏｌ）及びＤＭＦ（３ｍＬ）を加え、ＤＩＰＥＡ（０．３５ｍＬ，２．００ｍｍｏｌ）をゆっくりと滴下した。反応混合物を窒素でバブリングさせながら８０分撹拌した。そして、樹脂をＤＭＦで洗浄し、ＭｅＯＨで洗浄し、減圧下で乾燥させた。得られた残渣に５０％ＴＦＡ／５０％ＤＣＭを加え、２時間撹拌し濾過後、濾液を減圧下濃縮して、化合物２５（３０７．３ｍｇ）を得た。
ＭＳ（ＥＳＩ）Ｍ/Ｚ：６１０〔Ｍ＋Ｈ〕^＋
^１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ_６）δ（ｐｐｍ）：
1.77 (m, 5H), 1.94 (m, 3H), 2.12-2.23 (m, 6H), 2.26 (m, 2H), 2.38 (br t, J=7.34Hz, 2H), 4.13-4.21 (m, 3H), 5.09 (s, 2H), 7.30-7.40 (m, 5H), 8.05-8.15 (m, 3H).

化合物２６の合成
化合物２２（１５４ｍｇ，０．３４４ｍｍｏｌ）と化合物２５（２１．０ｍｇ，０．０３４ｍｍｏｌ）にＤＭＦ（２ｍＬ）溶液にＨＯＢｔ（５２．８ｍｇ，０．３４４ｍｍｏｌ），ＤＩＰＥＡ（０．１２ｍＬ，０．６８９ｍｍｏｌ）及びＥＤＣＩ（６６．０ｍｇ，０．３４４ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で１８時間撹拌し、水及びＥｔＯＡｃ、少量のメタノールを加え抽出し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させた。濾過後減圧下濃縮した。残渣を分取ＨＰＬＣにより精製して化合物２６（１６．７ｍｇ）を得た。
ＭＳ（ＥＳＩ）Ｍ/Ｚ：１１６２〔Ｍ＋２Ｈ〕^＋
^１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ_６）δ（ｐｐｍ）：
1.23 (br s, 16H), 1.31-1.41 (m, 8H), 1.41-1.48 (m, 8H), 1.60-1.73 (m, 4H), 1.77 (s, 12H), 1.78-1.87 (m, 4H), 1.89 (s, 12H), 1.99 (s, 12H), 2.01-2.07 (m, 2H), 2.10 (s, 12H), 2.11-2.21 (m, 6H), 2.33-2.37 (m, 2H), 2.95-3.07 (m, 8H), 3.37-3.43 (m, 4H), 3.65-3.72 (m, 4H), 3.82-3.90 (m, 4H), 3.98-4.05 (m, 12H), 4.09-4.20 (m, 3H), 4.48 (d, J=8.44Hz, 4H), 4.97 (dd, J=11.19, 3.12Hz, 4H), 5.08 (s, 2H), 5.21 (d, J=3.30Hz, 4H), 7.30-7.39 (m, 5H), 7.80 (m, 8H), 7.86-7.95 (m, 3H).

化合物２７の合成
化合物２６（１９．０ｍｇ，８．１８μｍｏｌ）のエタノール（３ｍＬ）溶液に１０％パラジウム－炭素（５０％含水品）（５．３ｍｇ）を加えた。反応混合物を水素雰囲気下、室温で３時間撹拌した。反応混合物をセライト（登録商標）で濾過し、エタノールで洗浄した。濾液を減圧下濃縮し、化合物２７（１９．６ｍｇ）を得た。
^１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ_６）δ（ｐｐｍ）：
1.24 (br s, 22H), 1.30-1.40 (m, 8H), 1.45 (br s, 8H), 1.61-1.74 (m, 4H), 1.77 (s, 12H), 1.80-1.87 (m, 2H), 1.89 (s, 12H), 1.99 (s, 12H), 2.01-2.07 (m, 2H), 2.10 (s, 12H), 2.12-2.25 (m, 4H), 2.93-3.06 (m, 8H), 3.36-3.46 (m, 4H), 3.64-3.72 (m, 4H), 3.82-3.91 (m, 4H), 3.98-4.20 (m, 16H), 4.50 (br d, J=8.07Hz, 4H), 4.94-5.02 (m, 4H), 5.21 (d, J=2.93Hz, 4H) 7.73-8.03 (m, 11H).

化合物２８の合成
窒素雰囲気下、化合物２７（１７．４ｍｇ，７．７９μｍｏｌ）のＤＭＦ（２ｍＬ）溶液にトリエチルアミン（８．７μＬ，６２μｍｏｌ）及びトリフルオロ酢酸ペンタフルオロフェニル（５．４μＬ，３１μｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で１．５時間撹拌した。反応液に水を加え、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム、硫酸水素ナトリウム、飽和食塩水で洗浄した。減圧下濃縮後、残渣をペンタンでトリチュレートし、濾取し４０度で減圧下乾燥させ化合物２８（１１．７２ｍｇ）を得た。
ＭＳ（ＥＳＩ）Ｍ/Ｚ：１２００〔Ｍ＋２Ｈ〕^＋
^１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ_６）δ（ｐｐｍ）：
1.24 (br s, 20H), 1.31-1.40 (m, 8H), 1.41-1.49 (m, 8H), 1.61-1.72 (m, 2H), 1.77 (s, 12H), 1.79-1.86 (m, 2H), 1.89 (s, 12H), 1.99 (s, 12H), 2.01-2.07 (m, 2H), 2.10 (s, 12H), 2.12-2.21 (m, 4H), 2.25-2.31 (m, 2H), 2.80 (br t, J=7.34Hz, 2H), 2.95-3.08 (m, 8H), 3.37-3.43 (m, 4H), 3.65-3.72 (m, 4H), 3.82-3.90 (m, 4H), 3.97-4.06 (m, 12H), 4.10-4.22 (m, 3H), 4.48 (d, J=8.44Hz, 4H), 4.97 (dd, J=11.00, 2.93Hz, 4H), 5.21 (d, J=2.93Hz, 4H), 7.70-7.86 (m, 8H), 7.86-8.01 (m, 3H).

実施例１～７：核酸複合体１～７の合成
ＳＥＱ－１及びＳＥＱ－２はジーンデザイン社にて委託合成した。ＳＥＱ－２（１．３μｍｏｌ）にｓｏｄｉｕｍｔｅｔｒａｂｏｒａｔｅｂｕｆｆｅｒｐＨ８．５（最終濃度４０ｍＭ）を加え、ＤＭＳＯに溶解したＤＢＣＯ－ＮＨＳｅｓｔｅｒ（ＣＡＳＮｏ．１３５３０１６－７１－３、６０μｍｏｌ）を加え、室温にて１５分攪拌した。反応液に水を加えた後、ＰＤ－１０カラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ社）にてゲル濾過精製を行った。さらにＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ３Ｋ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）にて精製・濃縮することで、粗生成物（ＳＥＱ－３）を得た。粗生成物（４０ｎｍｏｌ）にｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍａｃｅｔａｔｅｐＨ７．０（最終濃度５０ｍＭ）を加え、水に溶解した化合物8、１１、１４、１５、１７、２３、２４（４００ｎｍｏｌ）をそれぞれ加え、室温にて１５分攪拌した。反応液をＰＤ－１０カラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ社）にてゲル濾過精製を行った。さらにＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ３Ｋ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）にて精製・濃縮することで、核酸複合体、すなわち化合物８、１１、１４、１５、１７、２３、２４に対応する核酸複合体１～７を得た。

核酸複合体１

核酸複合体２

核酸複合体３

核酸複合体４

核酸複合体５

核酸複合体６

核酸複合体７

実施例８：核酸複合体８の合成
ＳＥＱ－２（２６．６ｎｍｏｌ）にｓｏｄｉｕｍｔｅｔｒａｂｏｒａｔｅｂｕｆｆｅｒｐＨ８．５及び、ＤＭＳＯに溶解した化合物２８（１２０ｎｍｏｌ）を加え、室温にて攪拌した。反応液に水を加えた後、ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ３Ｋ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）にて精製を行った。得られた粗生成物に５倍量の２８％アンモニア水を加え、室温にて３時間静置した。反応液に水を加えた後、ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ３Ｋ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）にて精製を行った。さらに逆相ＨＰＬＣにて精製することで、核酸複合体８を得た。

核酸複合体８

核酸配列の説明
本実施例に用いた核酸の配列は(5'-3')はA(F)^G(M)^G(F)A(M)C(F)U(M)G(F)G(M)U(F)C(M)U(F)U(F)U(M)C(F)U(M)A(F)U(M)A(F)U(M)^C(F)^U(M)であり、大文字のアルファベットはＲＮＡを表し、（Ｍ）は２’－Ｏ－メチル修飾ＲＮＡを、（Ｆ）は２’－フルオロＲＮＡを、＾はホスホロチオエート結合を示す。またそれぞれのオリゴヌクレオチドの５’末端には蛍光色素であるシアニン色素Ｃｙ３（励起波長５５５ｎｍ，蛍光波長５７０ｎｍ）が結合している。ＳＥＱ－１，２及び本実施例において合成した核酸複合体について、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳによる分子量の測定を行い、その結果を表１に示す。

＜試験例１＞
核酸複合体のヒトＣＤ２０６発現Ｌｅｎｔｉ－Ｘ２９３Ｔ細胞に対するｉｎｖｉｔｒｏ取り込み活性評価
実施例で合成した核酸複合体について、ヒトＣＤ２０６発現Ｌｅｎｔｉ－Ｘ２９３Ｔ細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）に、それぞれ以下の方法で導入し、取り込みを評価した。ヒトＣＤ２０６発現Ｌｅｎｔｉ－Ｘ２９３Ｔ細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を２×１０^４個／１００μＬ／ｗｅｌｌとなるように９６－ｗｅｌｌＰＤＬ－ｃｏａｔｉｎｇｐｌａｔｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に播種し、３７℃の５％ＣＯ_２インキュベーター内で２日間培養した。最終濃度が１００ｎｍｏｌ／Ｌとなるように、ＳＥＱ－１又は合成した核酸複合体を添加し、３７℃の５％ＣＯ_２インキュベーター内で２時間インキュベーションした。１０μｇ／ｍＬＨｏｅｃｈｓｔ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を含む４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ（Ｗａｋｏ）を添加し、常温で３０分間細胞を固定し、４回ＰＢＳで洗浄した。ＩＮＣｅｌｌＡｎａｌｙｚｅｒ２２００（ＧＥヘルスケア社）で蛍光イメージング解析を行い、ｗｅｌｌ内のＣｙ３蛍光強度を核数で補正し、１細胞当たりの平均Ｃｙ３蛍光強度を算出した。この際、糖リガンド修飾の無い核酸であるＳＥＱ－１を添加したｗｅｌｌの蛍光強度を１として、各核酸複合体を添加したｗｅｌｌの蛍光強度を相対値として算出した。

結果を表２に示す。この結果から、糖リガンドを含まないＳＥＱ－１と比較して、ＧａｌＮａｃを有する核酸複合体６はＣＤ２０６が発現した細胞に効率的に取り込まれない一方、マンノースを有する核酸複合体核酸複合体１から５はＣＤ２０６が発現した細胞に効率的に取り込まれることが明らかになった。

＜試験例２＞
核酸複合体のヒトＡＳＧＲ１発現Ｌｅｎｔｉ－Ｘ２９３Ｔ細胞に対するｉｎｖｉｔｒｏ取り込み活性評価
実施例で合成した核酸複合体について、ヒトＡＳＧＲ１発現Ｌｅｎｔｉ－Ｘ２９３Ｔ細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）に、それぞれ以下の方法で導入し、取り込み活性を評価した。ヒトＡＳＧＲ１発現Ｌｅｎｔｉ－Ｘ２９３Ｔ細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）は、２×１０^４個／１００μＬ／ｗｅｌｌとなるように９６－ｗｅｌｌＰＤＬ－ｃｏａｔｉｎｇｐｌａｔｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に播種し、３７℃の５％ＣＯ_２インキュベーター内で１日又は２日間培養した。最終濃度が１００ｎｍｏｌ／Ｌとなるように、ＳＥＱ－１又は合成した核酸複合体を添加し、３７℃の５％ＣＯ_２インキュベーター内で２時間インキュベーションした。その後の蛍光イメージング解析は試験例１と同様の方法で実施した。

結果を表３に示す。この結果から、糖リガンドを含まないＳＥＱ－１と比較して、マンノースを有する核酸複合体１から５はＡＳＧＲ１が発現した細胞に効率的に取り込まれない一方、ＧａｌＮａｃを有する核酸複合体６から８はＡＳＧＲ１が発現した細胞に効率的に取り込まれることが明らかになった。

＜試験例３＞
マウス肝実質細胞及びクッパー細胞における核酸複合体の取り込み評価（Ｉｎｖｉｖｏ評価）
ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝３）にＳＥＱ－１、核酸複合体３及び６をそれぞれ１ｍｇ／ｋｇで皮下投与した。投与４時間後、肝臓を潅流し、フローサイトメーターにて肝実質細胞及びクッパー細胞を分離して、蛍光強度を測定した。この際、ＳＥＱ－１を投与した群の蛍光強度を１として、各核酸複合体投与群の蛍光強度を相対値として算出した。
結果を表４に示す。この結果から、糖リガンドを含まないＳＥＱ－１と比較して、ＣＤ２０６陽性と報告されているマウスクッパ－細胞にマンノースを有する核酸複合体3が、ＡＳＧＲ１陽性と報告されているマウス肝実質細胞にＧａｌＮａｃを有する核酸複合体６が効率よく取り込まれていることが明らかになった。

化合物３７の合成スキーム

化合物３０の合成

酢酸ヒドラジン（１．２９ｇ，１４．０６ｍｍｏｌ）とＤＭＦ（５０ｍＬ）の混合物を５０℃で加熱した。次いで、これを１５℃の水浴中で冷却し、α－Ｄ－マンノースペンタアセテート（４．９９ｇ，１２．８ｍｍｏｌ）を添加した。得られた溶液を１５－１９℃の水浴中で１６時間撹拌した。混合物に水とＥｔＯＡｃを加え抽出し、水層をＥｔＯＡｃでさらに抽出した。合わせた有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣をＢｉｏｔａｇｅＩｓｏｌｅｒａ（１００ｇＫＰ－Ｓｉｌ、２０－１００％ＥｔＯＡｃ／シクロヘキサン）を用いたカラムクロマトグラフィーによって精製し、α及びβジアステレオマーの９：１混合物として化合物３０（４．１９ｇ）を得た。
α異性体
¹H NMR(600 MHz, CDCl₃)δｐｐｍ：
2.00 (s, 3H), 2.05 (s, 3H), 2.11 (s, 3H), 2.16 (s, 3H), 3.00 (d, J=4.03Hz, 1H), 4.15 (br d, J=10.64Hz, 1H), 4.22-4.28 (m, 2H), 5.23-5.33 (m, 3H), 5.43 (br dd, J=10.27, 3.30Hz, 1H)

化合物３１の合成
化合物３０（３．６４ｇ，１０．５ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（２１８ｍＬ）溶液に、窒素雰囲気下、トリクロロアセトニトリル（１０．４８ｍＬ，１０４．５ｍｍｏｌ）、次いでＤＢＵ（０．１５８ｍＬ，１．０５ｍｍｏｌ）を滴下した。混合物を窒素雰囲気下、室温で２．２５時間撹拌した。減圧下濃縮し、残渣をＢｉｏｔａｇｅＩｓｏｌｅｒａ（１００ｇＫＰ－Ｓｉｌ、０－５０％ＥｔＯＡｃ／シクロヘキサン）を用いたカラムクロマトグラフィーにより精製し、化合物３１（４．５６７ｇ）を得た。
¹H NMR(600 MHz, CDCl₃)δppm：
2.01 (s, 3H), 2.07 (s, 3H), 2.08 (s, 3H), 2.20 (s, 3H), 4.14-4.23 (m, 2H), 4.28 (dd, J=12.47, 4.77Hz, 1H), 5.38-5.43 (m, 2H), 5.47 (br s, 1H), 6.28 (s, 1H), 8.79(s, 1H)

化合物３３の合成

化合物３１（２．４５ｇ，４．９６ｍｍｏｌ）及びＮ－Ｃｂｚ－６－アミノ－ヘキサン－１－オール（１．８７ｇ，７．４５ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（９０ｍＬ）溶液を２℃（内部温度）に冷却し、窒素雰囲気下、三フッ化ホウ素ジエチルエーテラート（０．１２６ｍＬ，０．９９３ｍｍｏｌ）を滴下した。得られた混合物を２℃で２５分間撹拌し、次いで室温で、１時間２０分撹拌した。混合物に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え抽出し、水層をＤＣＭで抽出した。合わせた有機層を飽和食塩水で洗浄し、疎水性濾紙で濾過し、減圧下濃縮した。残渣をＢｉｏｔａｇｅＩｓｏｌｅｒａ（１００ｇＫＰ－Ｓｉｌ、０－１００％ＥｔＯＡｃ／シクロヘキサン）を用いたカラムクロマトグラフィーにより精製し、化合物３３（１．３７ｇ）を得た。
¹H NMR(600 MHz, CDCl₃)δppm：
1.32-1.43 (m, 4H), 1.49-1.53 (m, 2H), 1.56-1.64 (m, 2H), 1.99 (s, 3H), 2.04 (s, 3H), 2.10 (s, 3H), 2.15 (s, 3H), 3.20 (q, J=6.72Hz, 2H), 3.40-3.48 (m, 1H), 3.64-3.71 (m, 1H), 3.97 (ddd, J=9.90, 5.32, 2.38Hz, 1H), 4.08-4.12 (m, 1H), 4.28 (dd, J=12.29, 5.32Hz, 1H), 4.79 (d, J=1.47Hz, 2H), 5.10 (s, 2H), 5.22 (dd, J=3.30, 1.83Hz, 1H), 5.28 (t, J=9.54Hz, 1H), 5.34 (dd, J=10.64, 3.67Hz, 1H), 7.29-7.33 (m, 1H), 7.36 (d, J=4.03Hz, 4H)

化合物３４の合成

化合物３３（１．３５ｇ，２．３１ｍｍｏｌ）のＩＭＳ（３８ｍＬ）溶液に、窒素雰囲気下、１０％パラジウム－炭素（０．２９３ｇ、５０％含水品）を加え、水素雰囲気下、室温で１．５時間撹拌した。混合物をセライト（登録商標）で濾過し、ＩＭＳで洗浄した。濾液に、４Ｎ塩化水素の１，４－ジオキサン溶液（０．７８ｍＬ，３．１２ｍｍｏｌ）を加え、減圧下濃縮し、化合物３４（１．０６ｇ）を得た。
¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ ppm：
1.30-1.37 (m, 4H), 1.51-1.61 (m, 4H), 1.94 (s, 3H), 2.03 (s, 6H), 2.11 (s, 3H), 2.72-2.80 (m, 2H), 3.42-3.50 (m, 1H), 3.63 (dt, J=9.72, 6.88Hz, 1H), 3.88-3.96 (m, 1H), 4.06 (dd, J=12.10, 2.57Hz, 1H), 4.15 (dd, J=12.29, 5.32Hz, 1H), 4.87 (s, 1H), 5.04-5.15 (m, 3H), 7.80 (br s, 3H)

化合物３５の合成

化合物３４（５１０ｍｇ，１．０５ｍｍｏｌ）及び化合物２５（１２８．４ｍｇ，０．２１ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（３ｍＬ）溶液に、ＨＯＢｔ（１６１ｍｇ，１．０５ｍｍｏｌ）及びＥＤＣＩ（２０２ｍｇ，１．０５ｍｍｏｌ）を順次加えた。得られた混合物を室温で１０分間撹拌し、次いでＤＩＰＥＡ（０．１８ｍＬ，１．０５ｍｍｏｌ）を加えた。得られた溶液を室温で２２時間撹拌した。化合物３４（５０５．９ｍｇ，１．０４ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１．５ｍＬ）溶液、ＨＯＢｔ（１６１ｍｇ，１．０５ｍｍｏｌ）及びＥＤＣＩ（２０２ｍｇ，１．０５ｍｍｏｌ）を追加し、１０分後にＤＩＰＥＡ（０．１８ｍＬ，１．０５ｍｍｏｌ）を加えた。混合物をさらに３時間撹拌した。混合物を分取ＨＰＬＣにより精製し、化合物３４（４６．３ｍｇ）を得た。
¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ ppm：
1.21-1.45 (m, 24H), 1.49-1.59 (m, 8H), 1.61-1.89 (m, 8H), 1.93 (s, 12H), 2.01 (s, 24H), 2.10 (s, 12H), 2.07-2.23 (m, 8H), 2.33-2.37 (m, 2H), 2.96-3.08 (m, 7H), 3.41-3.48 (m, 4H), 3.57-3.65 (m, 4H), 3.88-3.94 (m, 4H), 4.05 (dd, J=12.10, 1.83Hz, 4H), 4.10-4.20 (m, 8H), 4.85 (s, 4H), 5.06-5.13 (m, 14H), 7.31-7.40 (m, 6H), 7.69-7.94 (m, 6H);
LCMS (ESI+): m/z 1164.58 [M+2H]²⁺.

化合物３６の合成

化合物３５（４０．７ｍｇ，０．０２ｍｍｏｌ）のＩＭＳ（６ｍＬ）溶液に、窒素雰囲気下、１０％パラジウム－炭素（１１．５ｍｇ、５０％含水品）を加え、水素雰囲気下、室温で２時間撹拌した。混合物をセライト（登録商標）で濾過し、ＩＭＳで洗浄した。合わせた濾液を減圧下で濃縮し、化合物３６（４３．８ｍｇ）を得た。
¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ ppm：
1.20-1.44 (m, 24H), 1.51-1.60 (m, 8H), 1.61-1.88 (m, 8H), 1.93 (s, 12H), 2.02 (s, 12H), 2.02 (s, 12H), 2.10 (s, 12H), 2.12-2.27 (m, 10H), 2.96-3.08 (m, 7H), 3.41-3.48 (m, 4H), 3.58-3.65 (m, 4H), 3.88-3.94 (m, 4H), 4.04 (br d, J=10.27Hz, 4H), 4.09-4.29 (m, 8H), 4.85 (s, 4H), 5.04-5.14 (m, 12H), 7.71-8.01 (br m, 7H)

化合物３７の合成

化合物３６（３２．８ｍｇ，０．０１５ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（３ｍＬ）溶液に、トリメチルアミン（１６．３μＬ、０．１２ｍｍｏｌ）を加え、次いでトリフルオロ酢酸ペンタフルオロフェニル（１０．０μＬ、０．０６ｍｍｏｌ）を滴下し、得られた混合物を室温で１．２５時間撹拌した。反応混合物を水に注ぎ、飽和食塩水を加え、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、１Ｍ硫酸水素ナトリウム水溶液及び飽和食塩水で順次洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下濃縮した。残渣をペンタンでトリチュレートした。次いで、固体を４０℃で減圧乾燥させて、化合物３７（３６．７ｍｇ）を得た。
¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ ppm：
1.20-1.47 (m, 24H), 1.51-1.61 (m, 8H), 1.62-1.91 (m, 8H), 1.93 (s, 12H), 2.01 (s, 24H), 2.10 (s, 12H), 2.12-2.33 (m, 8H), 2.80 (br t, J=6.79Hz, 2H), 2.96-3.09 (m, 7H), 3.41-3.50 (m, 4H), 3.58-3.65 (m, 4H), 3.91 (br s, 4H), 4.04 (br d, J=12.10Hz, 4H), 4.10-4.28 (m, 8H), 4.85 (br s, 4H), 5.06-5.15 (m, 12H), 7.68-8.03 (m, 7H);
LCMS (ESI+): m/z 1202.46 [M+2H]²⁺.

化合物４４の合成スキーム

化合物３９の合成

無水塩化亜鉛（３．６５ｇ，２６．８ｍｍｏｌ）をアルゴン下で２５０ｍＬの３口フラスコに秤量した。フラスコを減圧下１１０℃で１時間乾燥させ、次いで減圧下で一晩放冷した。次いで、フラスコをアルゴンで満たし、（（２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ，６Ｒ）－３－アセトアミド－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２，４，５－トリイルトリアセテート（７．８５ｇ，２０．２ｍｍｏｌ）、Ｎ－Ｃｂｚ－６－アミノ－ヘキサン－１－オール（６．７４ｇ，２６．８ｍｍｏｌ）及びＤＣＥ（８５ｍＬ）を添加した。混合物をアルゴン下、７０℃（外部温度）で３時間加熱後、混合物を冷却し、次いで酢酸エチル及び飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で希釈した。混合物を２０分間撹拌し、セライト（登録商標）で濾過し、酢酸エチルで洗浄した。合わせた濾液を分配し、有機層を水、次いで飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下濃縮した。残渣を、ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈを用いたカラムクロマトグラフィー（３３０ｇＰｕｒｉＦｌａｓｈＳｉ、２０－１００％ＥｔＯＡｃ／シクロヘキサン）により精製して、化合物３９（９．４２ｇ）を得た。
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ ppm：
1.30-1.43 (m, 4H), 1.45-1.65 (m, 4H), 1.94 (s, 3H), 2.00 (s, 3H), 2.05 (s, 3H), 2.13 (s, 3H), 3.12-3.29 (m, 2H), 3.48 (dt, J=9.63, 6.50Hz, 1H), 3.79-4.02 (m, 3H), 4.06-4.21 (m, 2H), 4.65 (br d, J=8.19Hz, 1H), 4.78-4.93 (m, 1H), 5.06-5.18 (m, 2H), 5.27 (dd, J=11.25, 3.06Hz, 1H), 5.34 (d, J=2.81Hz, 1H), 5.77 (br d, J=8.44Hz, 1H), 7.29-7.42 (m, 5H)
LCMS (m/z 581 [M+H]⁺)

化合物４０の合成

化合物３９（９．２３ｇ，１５．９ｍｍｏｌ）のＩＭＳ（２７５ｍＬ）溶液に、窒素雰囲気下、４Ｍ塩化水素のジオキサン溶液（５．１７ｍＬ，２０．７ｍｍｏｌ）及び１０％パラジウム－炭素（１．８９５ｇ；５０％含水品）を加え、水素雰囲気下、室温で２．５時間撹拌した。混合物をセライト（登録商標）で濾過し、ＩＭＳで洗浄した。濾液を減圧下濃縮し、化合物４０（８．０７ｇ）を得た。
¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ ppm：
1.22-1.35 (m, 4H), 1.39-1.62 (m, 4H), 1.78 (s, 3H), 1.89 (s, 3H), 2.00 (s, 3H), 2.10 (s, 3H), 2.69-2.82 (m, 2H), 3.41-3.47 (m, 2H), 3.64-3.77 (m, 1H), 3.81-3.93 (m, 1H), 3.95-4.12 (m, 2H), 4.49 (d, J=8.56Hz, 1H), 4.97 (dd, J=11.25, 3.42Hz, 1H), 5.22 (d, J=3.42Hz, 1H), 7.62-7.80 (m, 3H), 7.86 (d, J=9.29Hz, 1H)
LCMS (m/z 447 [M+H]⁺)

化合物４１の合成

２５０ｍＬのＱｕｉｃｋｆｉｔ（登録商標）三角フラスコ中のＣＴＣ樹脂（１．３３ｍｍｏｌ／ｇ，１．３１ｇ，１．７４ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ（０．３７０ｇ，０．８７ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ－Ｄ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ（０．３７０ｇ，０．８７ｍｍｏｌ）及びＤＣＭ（１０５ｍＬ）の混合物に、ＤＩＰＥＡ（１．２１５ｍＬ，６．９６ｍｍｏｌ）を滴下した。フラスコに栓をし、プレートシェーカーに取り付け、３００ｒｐｍで２時間振盪した。ＭｅＯＨ（０．７ｍＬ，１７．３ｍｍｏｌ）を添加し、混合物をさらに３５分間振盪した。混合物を７０ｍＬプラスチック相分離カートリッジで濾過し、窒素でバブリングしながら２０％ピペリジンのＤＭＦ溶液（５０ｍＬ）で３０分間処理した。溶液を排出させ、樹脂をＤＭＦで洗浄した。
カートリッジ中の樹脂に、Ｆｍｏｃ－Ｄ－Ｇｌｕ－ＯｔＢｕ（０．７４０ｇ，１．７４ｍｍｏｌ）、Ｎ－Ｆｍｏｃ－Ｌ－グルタミン酸－１－ｔ－ブチルエステル（０．７４０ｇ，１．７４ｍｍｏｌ）及びＨＢＴＵ（１．２５３ｇ，３．３０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１０ｍＬ）溶液を添加し、次いでＤＩＰＥＡ（１．２２ｍＬ，６．９６ｍｍｏｌ）を滴下した。混合物を窒素でバブリングしながら１時間混合した。次いで、溶液を、窒素気流で溶媒除去し、樹脂を、窒素でバブリングにより混合しながら、２０％ピペリジンＤＭＦ（５０ｍＬ）溶液で３５分間処理した。溶液を排出させ、樹脂をＤＭＦで洗浄した。
カートリッジ中の残りの樹脂に、１，５－ペンタン二酸モノベンジルエステル（０．５８０ｇ，２．６１ｍｍｏｌ）及びＨＢＴＵ（１．２５３ｇ，３．３０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１０ｍＬ）溶液、次いでＤＩＰＥＡ（１．２１５ｍＬ，６．９６ｍｍｏｌ）を滴下した。混合物を、８０分間、窒素でバブリングして混合した。溶液を排出させ、樹脂をＤＭＦ次いでＭｅＯＨで洗浄した。次いで、樹脂を吸引乾燥した。樹脂を２５×１５０ｍｍ試験管に移し、３０分間減圧乾燥させた後、ＤＣＭ（５ｍＬ）及びＴＦＡ（５ｍＬ）で処理して、プレートシェーカーで２時間振盪した。次いで、混合物を相分離カートリッジに通して濾過し、ＤＣＭで洗浄した。濾液を減圧下濃縮し、化合物４１（０．５８５９ｇ）を得た。
¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ ppm：
1.68-1.84 (m, 4H), 1.86-2.01 (m, 2H), 2.13-2.23 (m, 4H), 2.23-2.29 (m, 2H), 2.38 (t, J=7.52Hz, 2H), 4.11-4.22 (m, 2H), 5.09 (s, 2H), 7.29-7.42 (m, 5H), 8.06-8.17 (m, 2H)
LCMS (m/z 481 [M+H]⁺)

化合物４２の合成

化合物４０（４．０６ｇ，８．４１ｍｍｏｌ）及び化合物４１（０．５８２１ｇ，１．２１ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（８ｍＬ）溶液に、ＨＯＢｔ（１．３９２ｇ，９．０９ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ（１．７４２ｇ，９．０９ｍｍｏｌ）、次いでＤＩＰＥＡ（１．５８７ｍＬ，９．０９ｍｍｏｌ）を順次添加した。混合物を室温で２０時間撹拌した。混合物を分取ＨＰＬＣで精製して、化合物４２（０．４８ｇ）を得た。
¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ ppm：
1.23 (br s, 12H), 1.29-1.40 (m, 6H), 1.40-1.48 (m, 6H), 1.60-1.71 (m, 2H), 1.76 (s, 9H), 1.76-1.87 (m, 4H), 1.89 (s, 9H), 1.99 (s, 9H), 2.00-2.07 (m, 2H), 2.10 (s, 9H), 2.11-2.15 (m, 2H), 2.18 (br t, J=7.15Hz, 2H), 2.34-2.38 (m, 2H), 2.94-3.07 (m, 6H), 3.36-3.43 (m, 3H), 3.65-3.73 (m, 3H), 3.82-3.91 (m, 3H), 3.98-4.06 (m, 9H), 4.10-4.20 (m, 2H), 4.48 (d, J=8.44Hz, 3H), 4.97 (dd, J=11.19, 3.12Hz, 3H), 5.08 (s, 2H), 5.21 (d, J=3.30Hz, 3H), 7.30-7.39 (m, 5H), 7.71-7.76 (m, 1H), 7.77-7.85 (m, 5H), 7.87-7.93 (m, 2H)
LCMS (m/z 1766 [M+H]⁺)

化合物４３の合成

化合物４２（０．４３ｇ，０．２４３ｍｍｏｌ）のＩＭＳ（８５ｍＬ）溶液に、窒素雰囲気下、１０％パラジウム－炭素（０．１５８ｇ，０．０７４ｍｍｏｌ；５０％含水品）を加え、水素雰囲気下、室温で２．７５時間撹拌した。混合物をセライト（登録商標）で濾過し、ＩＭＳで洗浄した。濾液を減圧下濃縮し、残渣をＤＣＭ／ＥｔＯＨ（２：１）に溶解し、セライト（登録商標）で濾過し、ＤＣＭ－ＥｔＯＨ（２：１）で洗浄した。濾液を減圧下濃縮し、化合物４３（０．４２５２ｇ）を得た。
¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆)δppm：
1.18-1.29 (m, 12H), 1.31-1.41 (m, 6H), 1.41-1.49 (m, 6H), 1.62-1.75 (m, 4H), 1.77 (s, 9H), 1.81-1.87 (m, 2H), 1.89 (s, 9H), 1.99 (s, 9H), 2.01-2.08 (m, 2H), 2.10 (s, 9H), 2.12-2.24 (m, 6H), 2.95-3.07 (m, 6H), 3.37-3.45 (m, 3H), 3.66-3.73 (m, 3H), 3.82-3.92 (m, 3H), 3.98-4.06 (m, 9H), 4.09-4.20 (m, 2H), 4.49 (d, J=8.44Hz, 3H), 4.97 (dd, J=11.19, 2.38Hz, 3H), 5.21 (d, J=3.30Hz, 3H), 7.73-8.04 (m, 8H), 11.81-12.20 (m, 1H).
LCMS (m/z 1676 [M+H]⁺).

化合物４４の合成

化合物４３（０．４２３９ｇ，０．２５３ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（５０ｍＬ）溶液に、窒素雰囲気下、トリエチルアミン（０．２８２ｍＬ，２．０２４ｍｍｏｌ）、次いでトリフルオロ酢酸ペンタフルオロフェニル（０．１７４ｍＬ，１．０１２ｍｍｏｌ）を滴下した。混合物を室温で１時間撹拌し、水に注いだ。水層に飽和食塩水を加え、ＥｔＯＡｃで抽出した。合わせた有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、１Ｍ硫酸水素ナトリウム水溶液及び飽和食塩水で順次洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、次いで減圧下濃縮し得られた残渣にＥｔＯＡｃを加え、１Ｍ硫酸水素ナトリウム水溶液、次いで飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下濃縮させることで、化合物４４（０．４５１３ｇ）を得た。
¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆)δ ppm：
1.24 (br s, 12H), 1.31-1.40 (m, 6H), 1.41-1.48 (m, 6H), 1.61-1.73 (m, 2H), 1.76 (s, 9H), 1.79-1.93 (m, 13H), 1.99 (s, 9H), 2.01-2.06 (m, 2H), 2.10 (s, 9H), 2.11-2.18 (m, 2H), 2.27 (br t, J=7.34Hz, 2H), 2.80 (t, J=6.97Hz, 2H), 2.96-3.07 (m, 6H), 3.37-3.43 (m, 3H), 3.69 (dt, J=9.63, 6.19Hz, 3H), 3.82-3.91 (m, 3H), 3.98-4.06 (m, 9H), 4.09-4.22 (m, 2H), 4.48 (d, J=8.44Hz, 3H), 4.97 (dd, J=11.37, 3.30Hz, 3H), 5.21 (d, J=3.30Hz, 3H), 7.73 (br t, J = 5.14Hz, 1H), 7.77-7.85 (m, 5H), 7.91 (br dd, J = 11.19, 7.89Hz, 1H), 7.98 (br d, J = 8.07Hz, 1H)
LCMS (m/z 1843.56 [M+H]⁺)

化合物４７の合成スキーム

化合物４５の合成

化合物３４（１３８３ｍｇ，２．８６ｍｍｏｌ）及び化合物４１（１８３．１ｍｇ，０．３８１ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（３．０ｍＬ）溶液に、ＨＯＢｔ（４３８ｍｇ，２．８６ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ（５４８ｍｇ，２．８６ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（０．５０ｍＬ，２．８６ｍｍｏｌ）を順次加えた。得られた混合物を室温で２４時間撹拌した。混合物を分取ＨＰＬＣにより精製して、化合物４５（１３３．４ｍｇ）を得た。
¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ ppm：
1.23-1.34 (m, 12H), 1.34-1.43 (m, 6H), 1.50-1.59 (m, 6H), 1.62-1.72 (m, 2H), 1.74-1.80 (m, 2H), 1.81-1.89 (m, 2H), 1.93 (s, 9H), 2.01 (s, 18H), 2.03-2.07 (m, 2H), 2.10 (s, 9H), 2.11-2.15 (m, 2H), 2.16-2.21 (m, 2H), 2.33-2.38 (m, 2H), 2.97-3.07 (m, 6H), 3.41-3.48 (m, 3H), 3.57-3.64 (m, 3H), 3.87-3.94 (m, 3H), 4.05 (dd, J=12.10, 2.57Hz, 3H), 4.10-4.19 (m, 5H), 4.85 (s, 3H), 5.0-5.13 (m, 11H), 7.29-7.39 (m, 5H), 7.71 (br t, J=4.95Hz, 1H), 7.76-7.84 (m, 2H), 7.85-7.91 (m, 2H)
LCMS (m/z 1769 [M+H]⁺)

化合物４６の合成

化合物４５（１０１．９ｍｇ，０．０５８ｍｍｏｌ）のＩＭＳ（２０ｍＬ）溶液に、窒素雰囲気下、１０％パラジウム－炭素（３７．４ｍｇ；５０％含水品）を添加した。混合物を水素雰囲気下、室温で２．５時間撹拌した。混合物をセライト（登録商標）で濾過し、次いでＩＭＳで洗浄した。合わせた濾液を減圧下濃縮し、化合物４６（９５．９ｍｇ）を得た。
¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ ppm：
1.28 (br s, 12H), 1.34-1.44 (m, 6H), 1.49-1.60 (m, 6H), 1.61-1.76 (m, 4H), 1.81-1.90 (m, 2H), 1.93 (s, 9H), 2.02 (s, 9H), 2.02 (s, 9H), 2.04-2.08 (m,2H), 2.10 (s, 9H), 2.12-2.23 (m, 6H), 2.96-3.07 (m, 6H), 3.40-3.48 (m, 3H), 3.57-3.65 (m, 3H), 3.86-3.94 (m, 3H), 4.05 (dd, J=12.10, 2.38Hz, 3H), 4.09-4.18 (m, 5H), 4.85 (s, 3H), 5.01-5.14 (m, 9H), 7.62-8.17 (m, 5H), 11.84-12.15 (m, 1H).
LCMS (m/z 1679 [M+H]⁺).

化合物４７の合成

化合物４６（９４．６ｍｇ，０．０５６ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（９ｍＬ）溶液に、窒素雰囲気下、トリエチルアミン（６２．８μＬ，０．４５１ｍｍｏｌ）を加え、トリフルオロ酢酸ペンタフルオロフェニル（３８．７μＬ，０．２２５ｍｍｏｌ）を滴下した。得られた混合物を室温で１時間撹拌した。混合物を水に注ぎ、飽和食塩水を加え、ＥｔＯＡｃで抽出した。合わせた有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、１Ｍ硫酸水素ナトリウム水溶液及び飽和食塩水で順次洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、次いで減圧下濃縮することで、化合物４７（１０９．０ｍｇ）を得た。
¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ ppm：
1.23-1.33 (m, 12H), 1.34-1.43 (m, 6H), 1.50-1.60 (m, 6H), 1.62-1.77 (m, 2H), 1.80-1.91 (m, 4H), 1.93 (s, 9H), 2.01 (s, 18H), 2.03-2.07 (m, 2H), 2.10 (s, 9H), 2.12-2.20 (m, 2H), 2.25-2.30 (m, 2H), 2.77-2.82 (m, 2H), 2.96-3.08 (m, 6H), 3.41-3.48 (m, 3H), 3.53-3.68 (m, 3H), 3.86-3.95 (m, 3H), 4.00-4.07 (m, 3H), 4.10-4.23 (m, 5H), 4.85 (s, 3H) 5.04-5.13 (m, 9H), 7.71 (br t, J=5.32Hz, 1H), 7.78-7.85 (m, 2H), 7.89 (dd, J=12.84, 8.07Hz, 1H), 7.96 (d, J=8.07Hz, 1H)
LCMS (m/z 1845.47 [M+H]⁺)

化合物５３ａ、５３ｂ及び５３ｃの合成スキーム

化合物４９ａの合成

５０ｍＬの三口フラスコに入れた塩化亜鉛（２８５ｍｇ，２．０９ｍｍｏｌ）を減圧下１１０℃で１時間乾燥させ、減圧下で一晩放冷した。フラスコを窒素置換し、化合物３８（６１１ｍｇ，１．５７ｍｍｏｌ）及び化合物４８ａ（５００ｍｇ，２．０９ｍｍｏｌ）のＤＣＥ（５ｍＬ）溶液を加えた。混合物を窒素雰囲気下、７０℃（外部温度）で３時間加熱した。混合物を放冷し、酢酸エチル（１０ｍＬ）／飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（５ｍＬ）で希釈した。混合物を１０分間撹拌し、セライト（登録商標）で濾過し、酢酸エチルで洗浄した。合わせた濾液を水及び飽和食塩水で洗浄した。有機層を疎水性濾紙で濾過し、減圧下濃縮した。残渣をＢｉｏｔａｇｅＩｓｏｌｅｒａ（５０ｇＫＰ－Ｓｉｌ、０－５０％（３：１ＥｔＯＡｃ－ＩＭＳ）／ＭＴＢＥ）を用いたカラムクロマトグラフィーによって精製することで、化合物４９ａ（５９９．４ｍｇ）を得た。
¹H NMR (600 MHz, CDCl₃) δ ppm：
1.90 (s, 3H), 2.00 (s, 3H), 2.04 (s, 3H), 2.13 (s, 3H), 3.26-3.86 (m, 8H), 3.87-4.00 (m, 2H), 4.05-4.19 (m, 2H), 4.76 (br d, J=7.70Hz, 1H), 5.10-5.20 (m, 2H), 5.26 (br dd, J=6.60, 3.30Hz, 1H), 5.32 (br s, 1H), 5.43 (br s, 1H), 5.75 (br d, J=7.34Hz, 1H), 7.28-7.42 (m, 5H).
LCMS (m/z 569 [M+H]⁺).

化合物５０ａの合成

化合物４９ａ（５９４．２ｍｇ，１．０５ｍｍｏｌ）のＩＭＳ（１８ｍＬ）溶液に、窒素雰囲気下、４Ｍ塩化水素の１，４－ジオキサン溶液（０．３４ｍＬ，１．３６ｍｍｏｌ）及び１０％パラジウム－炭素（５０％含水品、１２５ｍｇ）を加えた。混合物を、水素雰囲気下、室温で２．５時間撹拌した。混合物をセライト（登録商標）で濾過し、ＩＭＳで洗浄した。合わせた濾液を減圧下濃縮し、減圧下濃縮することで、化合物５０ａ（５０７．９ｍｇ）を得た。
¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ ppm：
1.77-1.84 (m, 3H), 1.86-1.92 (m, 3H), 1.97-2.03 (m, 3H), 2.06-2.13 (m, 3H), 2.92-3.00 (m, 2H), 3.52-3.75 (m, 5H), 3.83 (ddd, J=11.28, 5.41, 3.85Hz, 1H), 3.86-3.93 (m, 1H), 3.95-4.17 (m, 3H), 4.57 (d, J=8.44Hz 1H), 4.99 (dd, J=11.19, 3.48Hz, 1H), 5.23 (d, J=3.67Hz, 1H), 7.81 (br s, 3H), 7.85-7.92 (m, 1H)
LCMS (m/z 435 [M+H]⁺)

化合物５１ａの合成

化合物５０ａ（５０６．５ｍｇ，１．０８ｍｍｏｌ）及び化合物４１（６８．９ｍｇ，０．１４ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２．０ｍＬ）溶液に、ＨＯＢｔ（１６５ｍｇ，１．０８ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ（２０６ｍｇ，１．０８ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（１８８μＬ、１．０８ｍｍｏｌ）を順次添加した。得られた混合物を室温で２０時間撹拌した。混合物を分取ＨＰＬＣによって精製することで、化合物５１ａ（４０．０ｍｇ）を得た。
¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ ppm 1.62-1.73 (m, 2H), 1.77 (s, 9H), 1.80-1.87 (m, 2H), 1.89 (s, 9H), 1.99 (s, 9H), 2.02-2.08 (m, 2H), 2.10 (s, 9H), 2.11-2.24 (m, 4H), 2.34-2.38 (m, 2H), 3.13-3.22 (m, 4H), 3.34-3.42 (m, 7H), 3.44-3.54 (m, 7H), 3.55-3.61 (m, 3H), 3.73-3.80 (m, 3H), 3.84-3.91 (m, 3H), 3.97-4.08 (m, 9H), 4.13-4.25 (m, 2H), 4.55 (dd, J=8.07, 3.67Hz, 3H), 4.99 (br d, J=11.00Hz, 3H), 5.07-5.10 (m, 2H), 5.22 (d, J=3.30Hz, 3H), 7.31-7.40 (m, 5H), 7.60-7.97 (m, 8H)
LCMS (m/z 1730/1731 [M+H]⁺)

化合物５２ａの合成

化合物５１ａ（４２．７ｍｇ，０．０３ｍｍｏｌ）のＩＭＳ（８ｍＬ）溶液に、窒素雰囲気下で１０％パラジウム－炭素（５０％含水品；１６．０ｍｇ）を加えた。混合物を水素雰囲気下、室温で２．５時間撹拌した。混合物をセライト（登録商標）で濾過し、ＩＭＳで洗浄した。濾液を減圧下濃縮し、化合物５２ａ（４１．２ｍｇ）を得た。
¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ ppm 1.62-1.75 (m, 4H), 1.78 (s, 9H), 1.81-1.87 (m, 2H), 1.89 (s, 9H), 2.00 (s, 9H), 2.05-2.32 (m, 17H), 3.12-3.23 (m, 4H), 3.36-3.43 (m, 7H), 3.45-3.54 (m, 7H), 3.55-3.61 (m, 3H), 3.74-3.81 (m, 3H), 3.83-3.92 (m, 3H), 3.98-4.08 (m, 9H), 4.11-4.23 (m, 2H), 4.51-4.59 (m, 3H), 4.99 (br d, J=11.00Hz, 3H), 5.22 (d, J=3.30Hz, 3H), 7.62-8.04 (m, 8H)
LCMS (m/z 1640/1641 [M+H]⁺)

化合物５３ａの合成

化合物５２ａ（４１．６ｍｇ，０．０３ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（４ｍＬ）溶液に、窒素雰囲気下、トリエチルアミン（２８μＬ、０．２０ｍｍｏｌ）、次いでトリフルオロ酢酸ペンタフルオロフェニル（１７μＬ、０．１０ｍｍｏｌ）を滴下した。得られた混合物を室温で１．５時間撹拌し、水に注ぎ、飽和食塩水を加え、ＥｔＯＡｃで抽出した。合わせた有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、１Ｍ硫酸水素ナトリウム水溶液及び飽和食塩水で順次洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下濃縮した。残渣をＤＣＭ／ＭｅＯＨ入りのサンプルバイアルに移し、溶媒を蒸発させた後、４０℃で２時間減圧乾燥させることで、化合物５２ｃ（２７．１ｍｇ）を得た。
¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ ppm：
1.57-1.75 (m, 4H), 1.77 (s, 9H), 1.86-1.95 (m, 11H), 2.00 (s, 9H), 2.05-2.33 (m, 15H), 2.77-2.88 (m, 2H), 3.11-3.24 (m, 4H), 3.41-3.54 (m, 14H), 3.55-3.62 (m, 3H), 3.74-3.81 (m, 3H), 3.84-3.91 (m, 3H), 3.98-4.07 (m, 9H), 4.11-4.23 (m, 2H), 4.55 (br dd, J=8.07, 3.67Hz, 3H), 4.99 (br d, J=11.00Hz, 3H), 5.22 (d, J=3.30Hz, 3H), 7.65-8.04 (m, 8H)
LCMS (m/z 1806.83 [M+H]⁺)

化合物４９ｂの合成

５０ｍＬの三口フラスコに入れた塩化亜鉛（０．４６６ｇ，３．４２ｍｍｏｌ）を減圧下１１０℃で９５分間乾燥させ、減圧下で一晩放冷した。フラスコを窒素置換し、化合物３８（１．００ｇ，２．５７ｍｍｏｌ）及び化合物４８ｂ（０．９７ｇ，３．４２ｍｍｏｌ）のＤＣＥ（１０ｍＬ）溶液を加えた。混合物を窒素雰囲気下、７０℃（外部温度）で３時間加熱した。混合物を放冷し、酢酸エチル（２０ｍＬ）／飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（１０ｍＬ）で希釈した。混合物を１５分間撹拌し、セライト（登録商標）で濾過し、酢酸エチルで洗浄した。濾液を水及び飽和食塩水で洗浄した。有機層を疎水性濾紙で濾過し、減圧下濃縮した。残渣をＢｉｏｔａｇｅＩｓｏｌｅｒａ（１００ｇＳｆａｒＤｕｏＳｉ、０－５０％（３：１ＥｔＯＡｃ－ＩＭＳ）／ＭＴＢＥ）を用いたカラムクロマトグラフィーによって精製することで、化合物４９ｂ（１．１４ｇ）を得た。
¹H NMR (600 MHz, CDCl₃) δppm：
1.92 (s, 3H), 1.98 (s, 3H), 2.03 (s, 3H), 2.14 (s, 3H), 3.32-3.50 (m, 2H), 3.53-3.73 (m, 8H), 3.77-3.94 (m, 3H), 4.02-4.22 (m, 3H), 4.74 (br d, J=8.44Hz, 1H), 5.03-5.08 (m, 1H), 5.11 (br s, 2H), 5.26 (br s, 1H), 5.40-5.53 (m, 1H), 6.11-6.21 (m, 1H), 7.30-7.40 (m, 5H).
LCMS (m/z 613 [M+H]⁺).

化合物５０ｂの合成

化合物４９ｂ（１．１４ｇ，１．８６ｍｍｏｌ）のＩＭＳ（３２ｍＬ）溶液に、窒素雰囲気下、４Ｍ塩化水素の１，４－ジオキサン（０．６０ｍＬ，２．４２ｍｍｏｌ）溶液及び１０％パラジウム－炭素（５０％含水品；０．２２１ｇ）を加えた。混合物を、水素雰囲気下、室温で２．５時間撹拌した。混合物をセライト（登録商標）で濾過し、ＩＭＳで洗浄した。合わせた濾液を減圧下濃縮し、化合物５０ｂ（０．９７ｇ）を得た。
¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ ppm 1.79 (s, 3H), 1.89 (s, 3H), 2.00 (s, 3H,) 2.11 (s, 3H), 2.94-3.02 (m, 2H), 3.50-3.62 (m, 9H), 3.77-3.84 (m, 1H), 3.86-3.94 (m, 1H), 3.98-4.10 (m, 3H), 4.54 (d, J=8.44Hz, 1H), 4.97 (dd, J=11.19, 3.48Hz, 1H), 5.22 (d, J=3.67Hz, 1H), 7.70-7.93 (m, 4H)
LCMS (m/z 479 [M+H]⁺)

化合物５１ｂの合成

化合物５０ｂ（５５６ｍｇ，１．０８ｍｍｏｌ）及び化合物４１（７４．１ｍｇ，０．１５ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（３ｍＬ）溶液に、ＨＯＢｔ（１６５ｍｇ，１．０８ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ（２０７ｍｇ，１．０８ｍｍｏｌ）、及びＤＩＰＥＡ（１８９μＬ、１．０８ｍｍｏｌ）を順次添加した。得られた混合物を室温で１９時間撹拌した。混合物を分取ＨＰＬＣによって精製することで、化合物５１ｂ（６７．５ｍｇ）を得た。
¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ ppm 1.61-1.74 (m, 2H), 1.77 (s, 9H), 1.80-1.85 (m, 2H), 1.89 (s, 9H), 2.00 (s, 9H), 2.03-2.08 (m, 2H), 2.10 (s, 9H), 2.12-2.24 (m, 4H), 2.35-2.38 (m, 2H), 3.10-3.23 (m, 4H), 3.36-3.42 (m, 7H), 3.44-3.63 (m, 22H), 3.74-3.81 (m, 3H), 3.83-3.91 (m, 3H), 3.99-4.08 (m, 9H), 4.13-4.25 (m, 2H), 4.55 (d, J=8.44Hz, 3H), 4.95-5.00 (m, 3H), 5.09 (s, 2H), 5.21 (d, J=3.30Hz, 3H), 7.31-7.41 (m, 5H), 7.72-7.86 (m, 4H), 7.86-7.99 (m, 4H)
LCMS (m/z 1862/1863 [M+H]⁺)

化合物５２ｂの合成

化合物５１ｂ（６６．１ｍｇ，０．０４ｍｍｏｌ）のＩＭＳ（１３ｍＬ）溶液に、窒素雰囲気下で１０％パラジウム－炭素（５０％含水品；２３．１ｍｇ）を加えた。混合物を水素雰囲気下、室温で２．５時間撹拌した。混合物をセライト（登録商標）で濾過し、ＩＭＳで洗浄した。合わせた濾液を減圧下濃縮し、化合物５２ｂ（６１．３ｍｇ）を得た。
¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ ppm 1.63-1.75 (m, 4H), 1.77 (s, 9H), 1.81-1.87 (m, 2H), 1.89 (s, 9H),2.00 (s, 9H), 2.03-2.24 (m, 17H), 3.09-3.23 (m, 4H), 3.35-3.43 (m, 7H), 3.44-3.64 (m, 22H), 3.74-3.81 (m, 3H), 3.84-3.91 (m, 3H), 3.98-4.07 (m, 9H), 4.10-4.24 (m, 2H), 4.56 (br d, J=8.80Hz, 3H), 4.98 (br d, J=11.00Hz, 3H), 5.22 (d, J=2.93Hz, 3H), 7.70-8.06 (m, 8H).
LCMS (m/z 1772/1773 [M+H]⁺)

化合物５３ｂの合成

化合物５２ｂ（６０．７ｍｇ，０．０３ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（６ｍＬ）溶液に、窒素雰囲気下、トリエチルアミン（３８μＬ，０．２７ｍｍｏｌ）、次いでトリフルオロ酢酸ペンタフルオロフェニル（２４μＬ，０．１４ｍｍｏｌ）を滴下した。得られた混合物を室温で７７分間撹拌し、水に注ぎ、飽和食塩水を加え、ＥｔＯＡｃで抽出した。合わせた有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、１Ｍ硫酸水素ナトリウム水溶液、４％塩化リチウム水溶液及び飽和食塩水で順次洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、次いで濃縮し、４０℃で４時間減圧乾燥させることで、化合物５３ｂ（２９．３ｍｇ）を得た。
¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ ppm：
1.62-1.75 (m, 2H), 1.77 (s, 9H), 1.85-1.95 (m, 13H), 2.00 (s, 9H), 2.10 (s, 9H), 2.12-2.33 (m, 6H), 2.78-2.86 (m, 2H), 3.12-3.24 (m, 4H), 3.35-3.44 (m, 7H), 3.45-3.64 (m, 22H), 3.75-3.81 (m, 3H), 3.83-3.92 (m, 3H), 3.99-4.06 (m, 9H), 4.12-4.26 (m, 2H), 4.55 (d, J=8.44Hz, 3H), 4.98 (dd, J=11.19, 2.02Hz, 3H), 5.21 (d, J=3.67Hz, 3H), 7.64-8.03 (m, 8H)
LCMS (m/z 1939.01 [M+H]⁺)

化合物４９ｃの合成

５０ｍＬの三口フラスコに入れた塩化亜鉛（２１０ｍｇ，１．５４ｍｍｏｌ）を減圧下１１０℃で７５分間乾燥させ、減圧下で一晩放冷した。フラスコを窒素置換し、化合物３８（４５０．２ｍｇ，１．１６ｍｍｏｌ）及び化合物４８ｃ（５０３．４ｍｇ，１．５４ｍｍｏｌ）のＤＣＥ（５ｍＬ）溶液を加えた。混合物をアルゴン雰囲気下、７０℃（外部温度）で３時間加熱した。混合物を放冷し、酢酸エチル（１０ｍＬ）／飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（５ｍＬ）で希釈した。混合物を１５分間撹拌し、セライト（登録商標）で濾過し、酢酸エチルで洗浄した。濾液を水及び飽和食塩水で洗浄した。有機層を疎水性濾紙で濾過し、減圧下濃縮した。残渣をＢｉｏｔａｇｅＩｓｏｌｅｒａ（５０ｇＳｆａｒＳｉ、０－５０％（３：１ＥｔＯＡｃ－ＩＭＳ）／ＭＴＢＥ）を用いたカラムクロマトグラフィーによって精製することで、化合物４９ｃ（４６９．０ｍｇ）を得た。
¹H NMR (600 MHz, CDCl₃) δ ppm：
1.95 (s, 3H), 1.96 (s, 3H), 2.04 (s, 3H), 2.15 (s, 3H), 3.39 (br d, J=4.77Hz, 2H), 3.52-3.72 (m, 12H), 3.79-3.94 (m, 3H), 4.09-4.14 (m, 1H), 4.14-4.18 (m, 1H), 4.18-4.25 (m, 1H), 4.77 (br d, J=8.44Hz, 1H), 4.98-5.06 (m, 1H), 5.10 (br s, 2H), 5.31 (br s, 1H), 5.34-5.45 (m, 1H), 6.29-6.39 (m, 1H), 7.29-7.33 (m, 1H), 7.36 (d, J=4.40Hz, 4H)
LCMS (m/z 657 [M+H]⁺)

化合物５０ｃの合成

化合物４９ｃ（０．４５ｇ，０．６９ｍｍｏｌ）のＩＭＳ（１２ｍＬ）溶液に、窒素雰囲気下、４Ｍ塩化水素の１，４－ジオキサン溶液（２２５μＬ，０．９０ｍｍｏｌ）及び１０％パラジウム－炭素（５０％含水品；０．０８３ｇ）を加えた。混合物を、水素雰囲気下、室温で２．５時間撹拌した。混合物をセライト（登録商標）で濾過し、ＩＭＳで洗浄した。濾液を減圧下濃縮し、化合物５０ｃ（０．４０ｇ）を得た。
¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ ppm 1.78 (s, 3H), 1.89 (s, 3H), 2.00 (s, 3H), 2.11 (s, 3H), 2.94-3.01 (m, 2H), 3.48-3.62 (m, 13H), 3.76-3.82 (m, 1H), 3.85-3.93 (m, 1H), 3.99-4.08 (m, 3H), 4.55 (d, J=8.44Hz, 1H), 4.94-5.01 (m, 1H), 5.22 (d, J=3.67Hz, 1H), 7.75-7.88 (m, 4H)
LCMS (m/z 423 [M+H]⁺)

化合物５１ｃの合成

化合物５０ｃ（３７９．８ｍｇ，０．６７９ｍｍｏｌ）及び化合物４１（４７．２ｍｇ，０．１０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２ｍＬ）溶液に、ＨＯＢｔ（１０４ｍｇ，０．６８ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ（１３０ｍｇ，０．６８ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（１１９μＬ，０．６８ｍｍｏｌ）を順次加えた。得られた混合物を室温で１９時間撹拌した。混合物を、分取ＨＰＬＣによって精製することで、化合物５１ｃ（５３．８ｍｇ）を得た。
¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ ppm 1.61-1.73 (m, 2H), 1.77 (s, 9H), 1.79-1.85 (m, 2H), 1.89 (s, 9H), 2.00 (s, 9H), 2.03-2.08 (m, 2H), 2.10 (s, 9H), 2.12-2.22 (m, 4H), 2.33-2.37 (m, 2H), 3.07-3.23 (m, 4H), 3.34-3.42 (m, 7H), 3.43-3.55 (m, 30H), 3.55-3.62 (m, 4H), 3.75-3.81 (m, 3H), 3.85-3.92 (m, 3H), 3.99-4.07 (m, 9H), 4.13-4.24 (m, 2H), 4.56 (d, J=8.80Hz, 3H), 4.97 (dd, J=11.00, 3.30Hz, 3H), 5.06-5.11 (m, 2H), 5.21 (d, J=3.30Hz, 3H), 7.30-7.39 (m, 5H), 7.62-7.84 (m, 5H), 7.85-7.95 (m, 3H)
LCMS (m/z 1994/1995 [M+H]⁺)

化合物５２ｃの合成

化合物５１ｃ（８４ｍｇ，０．０４ｍｍｏｌ）のＩＭＳ（１７ｍＬ）溶液に、窒素雰囲気下で１０％パラジウム－炭素（５０％含水品；２７．３ｍｇ）を加えた。混合物を水素雰囲気下、室温で２．５時間撹拌した。混合物をセライト（登録商標）で濾過し、ＩＭＳで洗浄した。濾液を減圧下濃縮し、化合物５２ｃ（７８．９ｍｇ）を得た。
¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ ppm 1.60-1.75 (m, 4H), 1.78 (s, 9H), 1.80-1.87 (m, 2H), 1.89 (s, 9H), 2.00 (s, 9H), 2.03-2.32 (m, 17H), 3.12-3.23 (m, 4H), 3.36-3.42 (m, 7H), 3.43-3.63 (m, 34H), 3.74-3.81 (m, 3H), 3.84-3.92 (m, 3H), 3.99-4.07 (m, 9H), 4.09-4.22 (m, 2H), 4.57 (br d, J=8.44Hz, 3H), 4.98 (dd, J=11.19, 3.12Hz, 3H), 5.21 (d, J=3.30Hz, 3H), 7.61-8.05 (m, 8H), 12.01 (br s, 1H)
LCMS (m/z 1904/1905 [M+H]⁺)

化合物５３ｃの合成

化合物５２ｃ（７７．３ｍｇ，０．０４ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（３ｍＬ）溶液に、窒素雰囲気下、トリエチルアミン（４５μＬ，０．３３ｍｍｏｌ）、次いでトリフルオロ酢酸ペンタフルオロフェニル（２７μＬ、０．１６ｍｍｏｌ）を滴下した。得られた混合物を室温で１．５時間撹拌し、水に注ぎ、飽和食塩水を加え、次いでＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、１Ｍ硫酸水素ナトリウム水溶液、次いで飽和食塩水で順次洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、次いで減圧下濃縮した。残渣をＤＣＭ／ＭｅＯＨ入りのサンプルバイアルに移し、溶媒を蒸発させた後、４０℃で２時間減圧乾燥させて、残渣を得た。これをＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ）に溶解し、４％塩化リチウム水溶液（５ｍＬ）、次いで飽和食塩水（５ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、次いで蒸発させた。残渣をＥｔＯＡｃ入りのサンプルバイアルに移し、蒸発させ、４０℃で減圧乾燥させた。ＤＣＭを残渣に添加し、減圧下濃縮し、残渣を４０℃で４時間減圧乾燥させることで、化合物５３ｃ（１９．４ｍｇ）を得た。
¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ ppm：
1.59-1.73 (m, 2H), 1.77 (s, 9H), 1.85-1.95 (m, 13H), 2.00 (s, 9H), 2.10 (s, 9H), 2.12-2.34 (m, 6H), 2.77-2.89 (m, 2H), 3.11-3.23 (m, 4H), 3.35-3.44 (m, 7H), 3.45-3.63 (m, 34H), 3.75-3.80 (m, 3H), 3.84-3.91 (m, 3H), 4.00-4.07 (m, 9H), 4.16-4.26 (m, 2H), 4.56 (d, J=8.80Hz, 3H), 4.97 (dd, J=11.37, 3.30Hz, 3H), 5.21 (d, J=3.67Hz, 3H), 7.62-8.03 (m, 8H).
QC LCMS (m/z 1035.97 [M+2H]²⁺)

実施例９～１２：核酸複合体９～１２の合成
Ｂ２Ｍ（β２－マイクログロブリン）標的ｓｉＲＮＡのセンス鎖（２１５ｎｍｏｌ）にｓｏｄｉｕｍｔｅｔｒａｂｏｒａｔｅｂｕｆｆｅｒｐＨ８．５及び、ＤＭＳＯに溶解した化合物２８又は４４（１０００ｎｍｏｌ）を加え、室温にて攪拌した。反応液に水を加えた後、Ｖｉｖａｓｐｉｎ３Ｋ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）にて精製を行った。得られた粗生成物に５倍量の２８％アンモニア水を加え、室温にて２時間静置した。反応液に水を加えた後、Ｖｉｖａｓｐｉｎ３Ｋ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）にて精製を繰り返し行うことで、核酸複合体９～１２を得た。本実施例において合成した核酸複合体の分子量を、ＥＳＩ－ＭＳ又はＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳにより行った。使用したセンス鎖の配列、アンチセンス鎖の配列及び分子量を表５に示す。

核酸複合体の配列及び分子量を表６に示す。

核酸複合体９

核酸複合体１０

核酸複合体１１

核酸複合体１２

実施例１３～１６：核酸複合体１３～１６（ｓｉ－ＲＮＡ）の調製
アンチセンス鎖（ｓｉＢ２Ｍ－ａｓ）と核酸複合体９～１２を等モル量加えることで、Ｂ２Ｍを標的とするｓｉ－ＲＮＡを調製した。表７にｓｉ－ＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖を示す。

＜試験例４＞
実施例１３～１６で調製した核酸複合体（ｓｉ－ＲＮＡ）を、１．０ｍｇ／ｋｇ又は５．０ｍｇ／ｋｇにて、ＢＡＬＢ／ｃマウス（一群につき３匹）に皮下投与し、投与から７日後に肝臓を採取した。肝臓中のＢ２Ｍ及び内部対照としてＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ）のｍＲＮＡ発現量をＴａｑＭａｎプローブ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いてｑＰＣＲにより測定した。無処置群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）のマウス肝臓中のＢ２ＭｍＲＮＡ発現レベルを１００％とし、核酸複合体投与群のＢ２ＭｍＲＮＡ発現レベル（相対値）を算出した。表８に結果を示す。

表８に示した結果から明らかなように、ｓｉＲＮＡ－２、ｓｉＲＮＡ－３、ｓｉＲＮＡ－４及びｓｉＲＮＡ－５は用量依存的な遺伝子発現抑制効果を示した。糖リガンドを含まないｓｉＲＮＡ－１は５．０ｍｇ／ｋｇにおいても遺伝子発現抑制効果がほぼ認められないに対し、糖リガンドを含むｓｉＲＮＡは１．０ｍｇ／ｋｇにおいても高い遺伝子発現抑制効果を示した。

実施例１７～１９：核酸複合体１７～１９の合成
核酸として、３－１０－３モチーフを有するＧａｐｍｅｒ型ＬＮＡアンチセンス（ＡＳＯ；ＩＳＩＳ－５４９１４８）を用い、化合物４４、４７又は５３ａを用いた以外は、実施例９～１１と同様の方法で核酸複合体を調製した。使用したセンス鎖の配列、アンチセンス鎖の配列及び分子量を表９に示す。

核酸複合体の配列及び分子量を表１０に示す。

核酸複合体１７

核酸複合体１８

核酸複合体１９

＜試験例５＞
核酸複合体のヒトＣＤ２０６発現Ｌｅｎｔｉ－Ｘ２９３Ｔ細胞に対するｉｎｖｉｔｒｏ取り込み活性評価
試験例１と同様にして、核酸複合体１７～１９の評価を行った。試験例５では、糖リガンド修飾の無い核酸であるＡＳＯ＿３’Ｃｙ３を添加したｗｅｌｌの蛍光強度を１として、各核酸複合体を添加したｗｅｌｌの蛍光強度を相対値として算出した。

結果を表１１に示す。この結果から、糖リガンドを含まない核酸であるＡＳＯ＿３’Ｃｙ３と比較して、ＧａｌＮａｃを有する核酸複合体１７及び１９はＣＤ２０６が発現した細胞に効率的に取り込まれない一方、マンノースを有する核酸複合体１８はＣＤ２０６が発現した細胞に効率的に取り込まれることが明らかになった。

＜試験例６＞
核酸複合体のヒトＡＳＧＲ１発現Ｌｅｎｔｉ－Ｘ２９３Ｔ細胞に対するｉｎｖｉｔｒｏ取り込み活性評価
試験例２と同様にして、核酸複合体１７～１９の評価を行った。試験例６では、糖リガンド修飾の無い核酸であるＡＳＯ＿３’Ｃｙ３を添加したｗｅｌｌの蛍光強度を１として、各核酸複合体を添加したｗｅｌｌの蛍光強度を相対値として算出した。

結果を表１２に示す。この結果から、糖リガンド修飾の無い核酸であるＡＳＯ＿３’Ｃｙ３と比較して、マンノースを有する核酸複合体１８はＡＳＧＲ１が発現した細胞に効率的に取り込まれない一方、ＧａｌＮａｃを有する核酸複合体１７及び１９はＡＳＧＲ１が発現した細胞に効率的に取り込まれることが明らかになった。

Claims

下記式（ＩＩＩ）：

［Ｚはオリゴヌクレオチドを含む基である。］
で表される核酸複合体又はその薬剤学的に許容される塩。
下記式（ＩＶ）：

［Ｚはオリゴヌクレオチドを含む基である。］
で表される核酸複合体又はその薬剤学的に許容される塩。
下記式（Ｖ）：

［Ｚはオリゴヌクレオチドを含む基である。］
で表される核酸複合体又はその薬剤学的に許容される塩。
下記式（ＶＩ）：

［Ｚはオリゴヌクレオチドを含む基である。］
で表される核酸複合体又はその薬剤学的に許容される塩。
下記式（ＶＩＩ）：

［Ｚはオリゴヌクレオチドを含む基である。］
で表される核酸複合体又はその薬剤学的に許容される塩。
下記式（ＶＩＩＩ）：

［Ｚはオリゴヌクレオチドを含む基である。］
で表される核酸複合体又はその薬剤学的に許容される塩。
下記式（ＩＸ）：

［Ｚはオリゴヌクレオチドを含む基である。］
で表される核酸複合体又はその薬剤学的に許容される塩。
下記式（Ｘ）：

［Ｚはオリゴヌクレオチドを含む基である。］
で表される核酸複合体又はその薬剤学的に許容される塩。
下記式（ＸＩ）：

［Ｚはオリゴヌクレオチドを含む基である。］
で表される核酸複合体又はその薬剤学的に許容される塩。
オリゴヌクレオチドが一本鎖である、請求項１～９のいずれか一項に記載の核酸複合体又はその薬剤学的に許容される塩。
オリゴヌクレオチドが３’末端を介して結合している、請求項１０に記載の核酸複合体又はその薬剤学的に許容される塩。
オリゴヌクレオチドが５’末端を介して結合している、請求項１０に記載の核酸複合体又はその薬剤学的に許容される塩。
オリゴヌクレオチドが二本鎖である、請求項１～９のいずれか一項に記載の核酸複合体又はその薬剤学的に許容される塩。
オリゴヌクレオチドが、一つの鎖の３’末端を介して結合している、請求項１３に記載の核酸複合体又はその薬剤学的に許容される塩。
オリゴヌクレオチドが、一つの鎖の５’末端を介して結合している、請求項１３に記載の核酸複合体又はその薬剤学的に許容される塩。
請求項１～１５のいずれか一項に記載の核酸複合体又はその薬剤学的に許容される塩を含む、医薬組成物。
細胞における標的遺伝子の発現を調節する、請求項１６に記載の医薬組成物。
細胞が樹状細胞、マクロファージ又は肝実質細胞である請求項１７に記載の医薬組成物。