JP7677793B2

JP7677793B2 - 硝酸レダクターゼ活性の回復改善

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Publication number: JP7677793B2
Application number: JP2020560948A
Authority: JP
Inventors: マリングトアスンティーナ; ナービンバロイジョーチュ; タポネンロビン; ソールトフト－イェンスンヤコプ; ユーゼビアギテ
Original assignee: セーホーエル．ハンセンアクティーゼルスカブ
Priority date: 2018-05-04
Filing date: 2019-05-03
Publication date: 2025-05-15
Anticipated expiration: 2039-05-03
Also published as: WO2019211458A1; EP3788175A1; US20210315239A1; US12004547B2; CN112352042A; JP2021521863A; JP2025067919A

Description

DSMZ

DSM 25789

DSMZ

DSM 25011

DSMZ

DSM 32827

DSMZ

DSM 32828

DSMZ

DSM 27311

DSMZ

DSM 32779

本発明は、食品を赤色化することと細菌培養物の分野に関する。特に本発明は、特定の生存率増強剤を用いることによる凍結および／または乾燥させた乳酸菌培養物またはミクロコッカス科（Micrococcaceae）培養物（特に硝酸レダクターゼ活性を有するブドウ球菌属の1つ以上の種を含む培養物）の硝酸レダクターゼ活性の保持、ならびに肉製品を赤色化するためのその培養物の使用に関する。最後に、クエン酸またはその塩を凍結防止剤として用いることにより、硝酸レダクターゼ活性を有する乳酸菌および／またはミクロコッカス科の細菌（例えばブドウ球菌属の菌株など）の硝酸レダクターゼ活性を増大させる方法が本発明によって提供される。

発色と色安定性は加工肉製品の最も重要な品質特性であるため、肉産業にとって非常に重要である。特徴的な塩漬色は、ヘム色素（ミオグロビン、ヘモグロビン）の濃度、それらの化学的状態、添加物、例えば窒素酸化物および還元剤に由来する可能性がある。標準的な発酵肉製品（サラミなど）では、特徴的な塩漬色は、添加した亜硝酸塩／硝酸塩に由来する化合物と天然の赤いミオグロビンの間の化学反応の結果であり、明るい赤色のニトロシルミオグロビンが同時に形成される。このニトロシルミオグロビンの中では、軸方向リガンドである一酸化窒素（NO）が、ヘムの中心にあるFe²⁺に配位している。

亜硝酸塩は、その望ましいあらゆる特性（発色、微生物学的安全性）にもかかわらず、ヒトの健康に対する安全性が疑問視されてきた。亜硝酸塩は、塩漬肉の中で、健康に関して疑問があるN-ニトロソアミンなどの望ましくない化合物の形成を引き起こす可能性がある。これらの化合物は、原則として、亜硝酸塩と、筋肉タンパク質中ならびに胃腸管の中の第二級アミンおよびアミノ酸との反応によって形成される可能性がある。

発色を目的とした乳酸菌培養物またはミクロコッカス科培養物からの菌株の使用は、これら培養物が、無機硝酸塩を還元して亜硝酸塩にし、この亜硝酸塩をさらに分解して、発色プロセスにおける活性化合物である上記の一酸化窒素（NO）にする能力に基づいている。高い硝酸レダクターゼ活性を有する菌株は肉の中で非常に速く発色することが報告されている（Meat Science 2008年4月：第78巻(4)：492～501ページ）。硝酸塩（nitrate）は、硝酸塩（nitrate salt）として直接提供すること、または天然の硝酸塩供給源（野菜粉末）を用いて間接的に提供することができよう。亜硝酸塩（nitrite salt）を添加する場合であっても、亜硝酸塩（nitrite）は一部が硝酸塩へと再変換されるため、特定の群からの菌株の添加が推奨される。

市販の出発培養物は、一般に凍結培養物として流通している。低温状態の凍結培養物では、細胞内の多くの代謝活性が停止しているため、細胞を長期にわたってこの中断状態だが生きている状態に維持することができる。

濃縮された凍結培養物は、製造容器の中に直接接種できるため市場において非常に興味深い。濃縮された凍結培養物を用いることにより、エンドユーザーは、そうでない場合に不可欠で時間がかかる中間的な発酵工程を回避する。この発酵工程の間に出発培養物は増幅されるため、エンドユーザーは、汚染のリスクが顕著に減る。濃縮培養物は、DVS（direct vat set（商標））培養物と呼ぶことができる。

濃縮された凍結培養物の代替物として、濃縮された凍結乾燥DVS（商標）培養物を調製することができる。これら培養物は、冷凍せずに輸送できるという追加の利点を有する。

一般に、生きている細胞の生存率に対して凍結と解凍が及ぼす可能性のある損傷効果は、細胞が脱水されることと、凍結させている間に細胞質の中に氷の結晶が形成されることに帰されてきた。

F.J. Chavarriらの論文（Biotechnology letters、第10巻、第1号、11～16ページ（1988年）、「苦くないストレプトコッカス・ラクチス菌株からの濃縮された凍結出発材料のための凍結防止剤（Cryoprotective agents for frozen concentrated starters from non-bitter Streptococcus Lactis strains）」）には、凍結させた純粋なストレプトコッカス・ラクチス培養物を保管したときの生存率を、5％ラクトースまたは5％スクロースを添加することによって改善できることが記載されている。ラクトースまたはスクロースは凍結防止剤として機能した。ストレプトコッカス・ラクチスは、以前の名称がラクトコッカス・ラクチス亜種ラクチスである。

同様に、R. Carcobaらの論文（Eur Food Res Technol（2000年）第211巻、433～437ページ、「新規な出発菌株ラクトコッカス・ラクチス亜種ラクチスCECT 5180の凍結細胞と凍結乾燥細胞の生存率と酸性化活性に対する凍結防止剤の影響（Influence of cryoprotectants on the viability and acidifying activity of frozen and freeze-dried cells of the novel starter strain Lactococcus lactis subsp. lactis CECT 5180）」）には、凍結させた純粋なラクトコッカス・ラクチス亜種ラクチス培養物を保管したときの生存率を、さまざまな凍結防止剤（糖（ラクトース、スクロース、トレハロース）、グルタミン酸、ゼラチンなど）を添加することによって改善できたことが記載されている。

凍結乾燥させた培養物の生存率は、他の凍結防止剤を用いて改善することもできる。例えばEP 0259739には、凍結乾燥させた培養物のためのいくつかの異なる凍結防止剤が記載されており、その中には乳酸菌を安定化させるためのクエン酸が含まれる。この特許には、ミクロコッカス科の細菌またはブドウ球菌科の種（ブドウ球菌属の種など）を安定化させるための薬剤は開示されていない。

先行技術に関する他の多くの文献にも、クエン酸またはクエン酸塩を凍結防止剤として用いることが記載されている（例えばEP 1441027、RU 2427624、Pinarkara 2016年、Conrad 2000年、Jakubowska 1980年を参照されたい）。これらの文献には、ミクロコッカス科の細菌、またはブドウ球菌科の種（ブドウ球菌属の種など）の安定化は開示されていない。

さらに、既知の凍結防止剤を用いることがテストされたときでさえ、ミクロコッカス科の細菌またはブドウ球菌科の種（ブドウ球菌属の種など）などの細菌の凍結と乾燥の間に硝酸レダクターゼ活性が失われているという問題がある。そのため、保護を目的として（例えば凍結と乾燥の間の細菌の硝酸レダクターゼ活性を保持すること、または増大させることを目的として）、食品産業、特に食肉産業で用いられる濃縮培養物に添加できる有効な凍結防止剤が必要とされている。凍結中と乾燥中の硝酸レダクターゼの安定性が改善されると、食品の発色が改善される。

本発明の発明者は、驚くべきことに、硝酸レダクターゼ活性を有する細菌（例えば硝酸レダクターゼ活性を有する乳酸菌やミクロコッカス科の細菌の培養物）の培養物が、クエン酸またはクエン酸塩の存在下では、凍結中および／または凍結乾燥中に、増大した安定性、および／または保持された硝酸レダクターゼ活性を有し、ミオグロビンを含有する食品を着色するためにその培養物を用いた際に赤色化を増大することを見いだした。例えば本明細書に含まれている下記の実施例は、ブドウ球菌属の種のさまざまな調製物でクエン酸塩を含むものはすべて、凍結培養物または凍結乾燥培養物の硝酸レダクターゼ活性が他の調製物と比べて改善および／または保持されることを実証している。

したがって第1の態様では、本発明は、硝酸レダクターゼ活性を有する乳酸菌および／またはミクロコッカス科の細菌（例えばブドウ球菌属の種）を含み、かつクエン酸またはその塩（クエン酸塩）を含む濃縮培養物に関する。

本発明の第2の態様は、凍結させた濃縮培養物を作製する方法に関するものであり、この方法は、
a）クエン酸またはその塩（クエン酸塩）を含む調製物と、硝酸レダクターゼ活性を有する乳酸菌および／またはミクロコッカス科の細菌（例えばブドウ球菌属の種）を混合し；
b）a）で得られた混合物を凍結させて凍結材料を取得し；
c）その凍結材料を包装すること、
を含んでいる。

本発明の第3の態様は、乾燥させた濃縮培養物を作製する方法に関するものであり、この方法は、
a）クエン酸塩を含む調製物と、硝酸レダクターゼ活性を有する乳酸菌および／またはミクロコッカス科の細菌（例えばブドウ球菌属の種）を混合し；
b）a）で得られた混合物を乾燥させて乾燥材料を取得し；
c）任意により、b）で得られた乾燥材料を粉砕し；
d）その乾燥材料を包装すること、
を含んでいる。

本発明の第4の態様は、凍結乾燥させた濃縮培養物を作製する方法に関するものであり、この方法は、
a）クエン酸と、硝酸レダクターゼ活性を有する乳酸菌および／またはミクロコッカス科の細菌（例えばブドウ球菌属の種）を混合し；
b）a）で得られた混合物を凍結させて凍結材料を取得し；
c）その凍結材料から水を昇華させてb）の材料を凍結乾燥させ；
d）c）の凍結乾燥材料を包装すること、
を含んでいる。

本発明の第5の態様は、食品を赤色化する方法に関するものであり、この方法は、
a）本発明の濃縮培養物を食品に添加する工程と；
b）その食品を本発明の濃縮培養物とともに発酵させる、または熟成させる、または塩漬する工程、
を含んでいる。

本発明の第6の態様は、本発明の第1の態様による濃縮培養物を含む食品に関する。

第7の態様では、本発明は、食品を赤色化するための、本発明の第1の態様による濃縮培養物の使用に関する。

本発明の第8の態様は、乳酸菌およびミクロコッカス科の細菌（ブドウ球菌属の種など）からなる群から選択された細菌の硝酸レダクターゼ活性の保持および／または増大のための、クエン酸またはその塩の使用に関する。

本発明の第9の態様は、硝酸レダクターゼ活性を有する乳酸菌およびミクロコッカス科の細菌（例えばブドウ球菌属の種など）からなる群から選択された硝酸レダクターゼ活性を有する細菌の硝酸レダクターゼ活性を増大させるための方法に関するものであり、この方法は、
a）クエン酸塩を含む調製物と、硝酸レダクターゼ活性を有する乳酸菌および／またはミクロコッカス科の細菌（例えばブドウ球菌属の種など）を混合し、クエン酸塩と細菌を含む混合物を取得する工程と；
b）任意により、a）で得られた混合物を凍結させて凍結材料を取得する工程と；
c）任意により、a）の混合物、または工程b）の凍結材料を乾燥させて乾燥材料を取得する工程と；
d）任意により、工程b）から得られた凍結材料、または工程c）の乾燥材料を包装して包装された製品を取得する工程、
を含んでいる。

本発明を記述する文脈（特に下記の請求項の文脈）の中で用いられる「a」「an」および「the」、ならびに同様の用語は、単数形と複数形の両方を包含すると解釈するが、本明細書にそうでないことが示されている場合や、文脈から明確に矛盾する場合は別である。「含む（comprising）」、「有する（having）」、「包含する（including）」、「含む（containing）」という用語は、特に断わらない限り、オープンエンドな用語（すなわち「包含するが、それだけに限定されない」）と解釈する。本明細書では、数値の範囲への言及は、特に断わらない限り、その範囲に入るそれぞれ異なる数値に個別に言及する簡便な方法としてだけ機能することを想定しており、それぞれ異なる数値が本明細書で個別に言及されているかのようにして本明細書に組み込まれている。本明細書に記載されているどの方法も適切な任意の順番で実施することができるが、本明細書にそうでないことが示されている場合や、文脈から明確に矛盾する場合は別である。本明細書で用いられているどの実施例も、例示する用語（例えば「など」）も、特に断わらない限り、単に本発明をよりよく理解することだけが目的であり、本発明の範囲を制限することはない。本明細書に記載されていない用語は、本発明の実施にとって不可欠な記載されていないあらゆる要素を示すと解釈すべきである。

本発明は、乳酸菌およびミクロコッカス科の細菌（例えばブドウ球菌属の種）からなる群から選択された硝酸レダクターゼ活性を有する細菌と、クエン酸またはクエン酸塩（すなわちその塩）とを含む濃縮培養物に関する。

本発明は、硝酸レダクターゼ活性を有する乳酸菌および／またはミクロコッカス科の細菌（例えばブドウ球菌属の種）と、クエン酸塩を含む調製物との濃縮培養物に関する。

「硝酸レダクターゼ活性を有する乳酸菌および／またはミクロコッカス科の細菌」という用語は、本明細書では、硝酸塩を亜硝酸塩に変換することのできる乳酸菌および／またはミクロコッカス科の細菌の種を意味する。

本明細書では、「乳酸菌」（LAB）という用語は、糖を発酵させて酸（乳酸（最も多く生成する酸）、酢酸、プロピオン酸が含まれる）を生成させるグラム陽性の微好気性または嫌気性の細菌を指す。工業的に最も有用な乳酸菌は、ラクトバシラス（Lactobacillales）目の種の中にたいてい見いだされ、例えばラクトコッカス属の種、ブドウ球菌属の種、ラクトバシラス属の種（L.フェルメントゥム（L. fermentum）、L.ペンソスス（L. pensosus）、およびL.プランタルム（L. Plantarum）など）、ロイコノストック属の種、ペディオコッカス属の種（P.ペントサセウス（P. pentosaceus）、およびP.アシディラクティシ（P. acidilactici）など）、ブレビバクテリウム属の種、エンテロコッカス属の種、ならびにプロピオニバクテリウム属の種がある。それに加え、絶対嫌気性細菌であるビフィズス菌のグループに属する乳酸産生菌（すなわち食品用出発培養物として単独で、または乳酸菌と組み合わせて用いられることがしばしばあるビフィドバクテリウム属の種）は、一般に、乳酸菌のグループに包含される。本発明の一実施形態では、乳酸菌は、硝酸レダクターゼ活性を有する任意の乳酸菌であり得る。

本発明の一実施形態では、乳酸菌として、ラクトバシラス目の種、例えばラクトバシラス科の種、例えばラクトバシラス属の種が可能である。したがって本発明の一実施形態では、乳酸菌は、ラクトバシラス属の種、例えばラクトバシラス・ペントーサス（Lactobacillus pentosus）種である。

本発明の好ましい一実施形態では、ラクトバシラス・ペントーサス種は、ドイツ微生物細胞培養コレクション（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen：DSMZ）にアクセッション番号DSM 25011で寄託されたラクトバシラス・ペントーサス菌株CHCC4196である。

ラクトバシラス目とは別の科と目の一部だが、ブドウ球菌属のいくつかの細菌（例えばS.カルノーサス（S. carnosus）、S.エクオルム（S. equorum）、S.シウリ（S. sciuri）、S.ビツリヌス（S. vitulinus）、S.キシローサス（S. xylosus））さえ、LABと呼ばれてきた（Mogensen他（2002年）Bulletin of the IDF 第377号、10～19ページ）。

ブドウ球菌は、単独で、またはペアになって、または鎖になって、またはクラスターになって増殖するグラム陽性菌である。ブドウ球菌はブドウ球菌科のメンバーであり、ブドウ球菌科は、バシラス目とバシラス綱のメンバーである。ブドウ球菌属の種として、硝酸レダクターゼ活性を有するブドウ球菌属の任意の種が可能であり、例えばスタフィロコッカス・ビツリヌス（Staphylococcus vitulinus）、スタフィロコッカス・カルノーサス（Staphylococcus carnosus）、スタフィロコッカス・キシローサス（Staphylococcus xylosus）という種の群からなる群から選択されたブドウ球菌がある。ブドウ球菌属の興味ある他の種は、スタフィロコッカス・シムランス（S. simulans）、スタフィロコッカス・サプロフィティクス（S. saprophyticus）、スタフィロコッカス・レントゥス（S. lentus）、スタフィロコッカス・パステウリ（S. pasteuri）、スタフィロコッカス・シウリ（S. sciuri）、スタフィロコッカス・ヘモリティクス（S. haemolyticus）、スタフィロコッカス・ワルネリ（S. warneri）、スタフィロコッカス・エクオルム（S. equorum）、スタフィロコッカス・コーニイ（S. cohnii）、スタフィロコッカス・エピデルミディス（S. 表皮ブドウ球菌）（S. epidermidis）、スタフィロコッカス・ホミニス（S. hominis）、スタフィロコッカス・カピティス（S. capitis）、スタフィロコッカス・インテルメディウス（S. intermedius）、およびスタフィロコッカス・スクシヌス（S. succinus）である。したがって本発明の一実施形態では、硝酸レダクターゼ活性を有する乳酸菌は、スタフィロコッカス・ビツリヌス、スタフィロコッカス・カルノーサス、スタフィロコッカス・キシローサス、スタフィロコッカス・シムランス、スタフィロコッカス・サプロフィティクス、スタフィロコッカス・レントゥス、スタフィロコッカス・パステウリ、スタフィロコッカス・シウリ、スタフィロコッカス・ヘモリティクス、スタフィロコッカス・ワルネリ、スタフィロコッカス・エクオルム、スタフィロコッカス・コーニイ、スタフィロコッカス・エピデルミディス、スタフィロコッカス・ホミニス、スタフィロコッカス・カピティス、スタフィロコッカス・インテルメディウス、スタフィロコッカス・スクシヌスからなる群から選択された種であり、より好ましくは、硝酸レダクターゼ活性を有する乳酸菌は、スタフィロコッカス・ビツリヌス、スタフィロコッカス・カルノーサス、スタフィロコッカス・キシローサスからなる群から選択された種である。

本発明の好ましい一実施形態では、硝酸レダクターゼ活性を有するブドウ球菌属の種は、硝酸レダクターゼ活性を有するスタフィロコッカス・ビツリヌス種またはスタフィロコッカス・カルノーサス種である。

より好ましい一実施形態では、硝酸レダクターゼ活性を有するブドウ球菌属の種は、スタフィロコッカス・カルノーサス種である。

本発明の好ましい一実施形態では、スタフィロコッカス・ビツリヌス種は、ドイツ微生物細胞培養コレクション（DSMZ）にアクセッション番号DSM 25789で寄託されたスタフィロコッカス・ビツリヌス菌株CHCC10896、ドイツ微生物細胞培養コレクション（DSMZ）にアクセッション番号DSM 27311で寄託されたスタフィロコッカス・ビツリヌス菌株CHCC11576と、これらの突然変異体からなる群から選択される。本発明の別の好ましい一実施形態では、スタフィロコッカス・カルノーサス種は、ドイツ微生物細胞培養コレクション（DSMZ）にアクセッション番号DSM 32779で寄託されたスタフィロコッカス・カルノーサス CHCC4055と、その突然変異体である。

ミクロコッカス科は、単独で、ペアになって、四つ組で、パケット（packets）で、不規則な塊になって、または鎖になって存在する球形細胞を含有するグラム陽性菌の1つの科である。遊離して生きている種、腐生種、寄生している種、病原性の種が存在する。属のタイプは、ミクロコッカス属である。ミクロコッカス科の細菌として、硝酸レダクターゼ活性を有するミクロコッカス科の任意の細菌が可能である。特に興味あるミクロコッカス科の細菌は、コクリア属の種である。

ミクロコッカス科に属する他の属は、放線菌目（Actinomycetales）のアカリコメス属（Acaricomes）、アルスロバクター属（Arthrobacter）、アウリティディバクター属（Auritidibacter）、シトリコッカス属（Citricoccus）、エンテラクチノコッカス属（Enteractinococcus）、コクリア属（Kocuria）、ミクロコッカス属（Micrococcus）、ネステレンコニア属（Nesterenkonia）、レニバクテリウム属（Renibacterium）、ロティア属（Rothia）、シノモナス属（Sinomonas）、ヤニエラ属（Yaniella）、ツィーエングリウエラ属（Zhihengliuella）である。したがって本発明の一実施形態では、硝酸レダクターゼ活性を有する細菌は、放線菌目のアカリコメス属、アルスロバクター属、アウリティディバクター属、シトリコッカス属、エンテラクチノコッカス属、コクリア属、ミクロコッカス属、ネステレンコニア属、レニバクテリウム属、ロティア属、シノモナス属、ヤニエラ、属、ツィーエングリウエラ属からなる群から選択された1つ以上の種である。より好ましい一実施形態では、硝酸レダクターゼ活性を有する細菌は、コクリア属の種からなる群から選択された1つ以上の種である。

本発明の好ましい一実施形態では、コクリア属の種はコクリア・サルシシア（Kocuria salsicia）である。本発明のより好ましい一実施形態では、コクリア属の種は、ドイツ微生物細胞培養コレクション（DSMZ）にアクセッション番号DSM 32827で寄託されたコクリア・サルシシア菌株CHCC5184と、ドイツ微生物細胞培養コレクション（DSMZ）にアクセッション番号DSM 32828で寄託されたコクリア・サルシシア菌株CHCC5185と、これらに由来する突然変異体から選択されたコクリア属の種である。

本発明の好ましい一実施形態では、濃縮培養物は、硝酸レダクターゼ活性を有するコクリア属の種および／またはブドウ球菌属の種と、クエン酸塩を含む調製物を含んでいる。したがって好ましい一実施形態では、濃縮培養物は、コクリア属の種とブドウ球菌属の種からなる群から選択された硝酸レダクターゼ活性を有する細菌と、クエン酸またはその塩（クエン酸塩）を含む調製物を含んでいる。

本発明の文脈では、「突然変異体（mutant）」という用語は、例えば遺伝子操作、および／または放射線、および／または化学的処理によって本発明の菌株から誘導される菌株と理解すべきである。突然変異体は、機能的に同等な突然変異体であること、例えば母菌株と（例えば硝酸レダクターゼ活性に関して）実質的に同じ特性、または改善された特性を有する突然変異体であることが好ましい。このような突然変異体は本発明の一部である。特に「突然変異体」という用語は、本発明の菌株に対して従来から使用されている任意の突然変異誘発処理（化学的突然変異誘発物質であるエチルメタンスルホン酸（EMS）やN-メチル-N'-ニトロ-N-ニトログアニジン（NTG）を用いた処理、UV光を用いた処理が含まれる）を実施することによって得られた菌株、または自発的に生じる突然変異体を意味する。突然変異体は、いくつかの突然変異誘発処理（1回の処理は、1つの突然変異誘発処理の後にスクリーニング工程／選択工程を伴うと理解すべきである）を経ている可能性があるが、本発明では20回以下、または10回以下、または5回以下の処理（またはスクリーニング工程／選択工程）が実施されることが好ましい。本発明の好ましい突然変異体では、母菌株と比べて、細菌ゲノムの1％未満、0.1％未満、0.01％未満、0.001％未満、それどころか0.0001％未満のヌクレオチドが、別のヌクレオチドで置換されるか、欠失している。

本発明の好ましい一実施形態では、種の硝酸レダクターゼ活性は、凍結処理または乾燥処理の後に、クエン酸塩が存在していない種と比べて少なくとも10％（例えば少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％）改善されている。

問題となるブドウ球菌属の種の硝酸レダクターゼ活性の改善率は、本明細書の実施例に記載されているように、例えばグリース試験の動力学的設定で（「比色分析と分光測光」、『Vogel's Textbook of Quantitative Chemical Analysis』、第5版、Longman社、702ページ、ISBN 0-582-44693-7を参照されたい）所与の時間における硝酸塩から亜硝酸塩への変換率（硝酸レダクターゼ活性）を求めることによってと、亜硝酸塩の濃度を測定することによって容易に求めることができる。

クエン酸またはその塩（クエン酸塩）を含む調製物は、クエン酸またはその塩だけを含むこと（例えば調製物をクエン酸塩だけにすることができる）、または他の追加成分を含むことができる。したがって本発明の濃縮培養物は、乳酸菌とミクロコッカス科からなる群から選択された硝酸レダクターゼ活性を有する細菌の1つ以上の菌株（例えばブドウ球菌属の１つ以上の種）と、クエン酸またはその塩を含むこと、またはこれらからなることができる。

クエン酸またはクエン酸塩として、任意のクエン酸塩が可能であり、例えばクエン酸マグネシウム、クエン酸三マグネシウム、クエン酸一ナトリウム、クエン酸二ナトリウム、クエン酸三ナトリウムおよび／またはクエン酸三カリウムがある。任意により、クエン酸塩は水和した形態である。本発明の好ましい一実施形態では、クエン酸塩は、クエン酸ナトリウム、特にクエン酸三ナトリウム、例えばクエン酸三ナトリウム一水和物である。

クエン酸またはクエン酸塩の量は、乾燥前または凍結前の全組成物を基準にして少なくとも0.05％w/w、例えば乾燥前または凍結前の全組成物を基準にして少なくとも0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、例えば少なくとも0.6％である。クエン酸塩の量は、乾燥前または凍結前の全組成物を基準にして最大で10％w/w、例えば最大で8％、6％、5％、4％、3％、例えば最大で2％である。

クエン酸またはクエン酸塩の量は、乾燥後または凍結後の全組成物を基準にして少なくとも0.2％w/w、例えば乾燥後または凍結後の全組成物を基準にして少なくとも0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％である。

クエン酸またはクエン酸塩の量は、乾燥後または凍結後の全組成物を基準にして最大で50％w/w、例えば乾燥後または凍結後の全組成物を基準にして最大で40％、30％、25％、20％、16％、15％、14％、13％、例えば最大で12％である。

特定の一実施形態では、本発明の濃縮培養物は乾燥（凍結乾燥）しており、約0.1％w/w～約30％w/wのクエン酸またはその塩（例えばクエン酸三ナトリウム）、例えば約0.5％w/w～約25％w/wのクエン酸またはその塩（例えばクエン酸三ナトリウム）、例えば約1.0％w/w～約20.0％w/wのクエン酸またはその塩（例えばクエン酸三ナトリウム）、より好ましくは約1.0％w/w～約10％w/wのクエン酸またはその塩（例えばクエン酸三ナトリウム）、より一層好ましくは約2.0％w/w～約8.0％w/wのクエン酸またはその塩を含んでいる。

スクロースは二糖であり、クエン酸を含む本発明の調製物の中にさらに含めることができる。したがって濃縮培養物が乾燥（凍結乾燥）している一実施形態では、乾燥培養物は、約0.5％w/w～約30％w/wのスクロース、例えば約1.0％w/w～約8.0％w/wのスクロース、または例えば約2.0％w/w～約5.0％w/wのスクロースを含んでいる。

マルトデキストリンは多糖であり、クエン酸を含む本発明の調製物の中にさらに含めることができる。マルトデキストリンはDE（デキストロース当量（dextrose equivalent））によって分類され、3～20のDEを有する。DE値が大きいほど、グルコース鎖は短く、甘さはより甘く、溶解度はより大きく、熱抵抗はより小さい。好ましい一実施形態では、本発明の濃縮培養物は、3～20のDEが可能なマルトデキストリンをさらに含んでいて、その中でもマルトデキストリンDE 12が好ましい。したがって本発明の好ましい一実施形態では、濃縮培養物は、クエン酸またはその塩の調製物と、乳酸および／またはミクロコッカス科の細菌（例えばブドウ球菌属の1つ以上の種）と、多糖（例えばマルトデキストリン）を含むか、またはこれらからなる。

濃縮培養物が乾燥（凍結乾燥）している一実施形態では、乾燥培養物は、約0.5％w/w～約30％w/wのマルトデキストリン、例えば約1.0％w/w～約15.0％w/wのマルトデキストリン、または例えば約2.0％w/w～約12.0％w/wのマルトデキストリンを含んでいる。

イノシトールなどの糖アルコールを、クエン酸を含む本発明の調製物の中にさらに含めることができる。本発明の一実施形態では、本発明の濃縮培養物は、イノシトールまたはその誘導体（例えばリン酸イノシトールの形態）をさらに含んでいる。

したがって一実施形態では、本発明の濃縮培養物は、硝酸レダクターゼ活性を有する乳酸菌および／またはミクロコッカス科の細菌（例えばブドウ球菌属の種）と、クエン酸またはその塩と、イノシトールまたはその誘導体（例えばリン酸イノシトールの形態）を含むか、またはこれらからなる。

別の特定の一実施形態では、本発明の濃縮培養物は、硝酸レダクターゼ活性を有するブドウ球菌属の種と、クエン酸またはその塩と、イノシトールを含むか、またはこれらからなる。

したがって濃縮培養物が乾燥（凍結乾燥）している一実施形態では、乾燥培養物は、約0.5％w/w～約20％w/wの糖アルコール（例えばイノシトールまたはその誘導体）、例えば約0.5％w/w～約30.0％w/wのイノシトール、または例えば約1.0％w/w～約15.0％w/wのイノシトール、または約2.0％w/w～約12.0％w/wのイノシトールを含んでいる。

本発明の特定の一実施形態では、クエン酸塩は、クエン酸またはクエン酸の塩である。

本発明の濃縮培養物は、単糖、および／または二糖、および／または三糖、および／またはオリゴ糖、および／または多糖をさらに含むことができる。

二糖は、スクロース、ラクトース、マルトースからなる群から選択することができるが、これらに限定されない。

本発明のより具体的な一実施形態では、濃縮培養物は、乳酸菌および／またはミクロコッカス科の1つ以上の種（例えばブドウ球菌属の1つ以上の種）と、クエン酸またはその塩と、二糖（好ましくはスクロース）を含むか、またはこれらからなる。

本発明の一実施形態では、濃縮培養物は、1つ以上の多糖を含んでいる。多糖としてマルトデキストリンからなる群を選択することができるが、これらに限定されない。

本発明のより具体的な一実施形態では、濃縮培養物は、乳酸菌および／またはミクロコッカス科の1つ以上の種（例えばブドウ球菌属の1つ以上の種）と、クエン酸またはその塩と、多糖（好ましくはマルトデキストリン）と、任意により水を含むか、またはこれらからなる。

したがって本発明のより具体的な一実施形態では、濃縮培養物は、乳酸菌および／またはミクロコッカス科の1つ以上の種（例えばブドウ球菌属の1つ以上の種）と、クエン酸またはその塩と、二糖（例えばスクロース）と、多糖（例えばマルトデキストリン）と、任意により水を含むか、またはこれらからなる。

したがって本発明のより具体的な一実施形態では、濃縮培養物は、乳酸菌および／またはミクロコッカス科の1つ以上の種（例えばブドウ球菌属の1つ以上の種）と、クエン酸またはその塩と、二糖（例えばスクロース）と、多糖（例えばマルトデキストリン）と、任意により水からなる。

本発明のさらに別のより具体的な一実施形態では、濃縮培養物は、乳酸菌および／またはミクロコッカス科の1つ以上の種（例えばブドウ球菌属の1つ以上の種）と、クエン酸またはその塩と、スクロースと、マルトデキストリンと、任意により水を含むか、またはこれらからなる。

本発明のさらに別のより具体的な一実施形態では、濃縮培養物は、ブドウ球菌属の1つ以上の種と、クエン酸またはその塩と、スクロースと、マルトデキストリンと、任意により水を含むか、またはこれらからなる。

本発明の濃縮培養物は、アミノ酸、および／またはペプチド、および／またはタンパク質をさらに含むことができる。

本発明の濃縮培養物を取得する方法は、クエン酸塩の調製物と、硝酸レダクターゼ活性を有する乳酸菌および／またはミクロコッカス科の細菌の1つ以上の種を混合することによる。得られた濃縮培養物は、あとで乾燥させるか凍結させることができる。

クエン酸またはその塩と細菌を含む混合物が凍結されている態様では、凍結操作は、混合物を低温生成用の物体、流体、気体のいずれかと接触させることによって、例えば混合物を液体窒素と接触させることによって、例えば混合物を液体窒素の中に浸すことによって実現でき、そうすることでペレット、糸、紐のいずれかが形成される（そのうちでペレットが好ましい）。あるいは混合物を塊の状態でトレイに入れて（例えば凍結装置の中で）凍結させた後、より小さな部分（例えばペレット）に分割し、例えば粉砕してより小さな粒子にすることができる。

本発明の好ましい一実施形態では、クエン酸またはその塩と細菌を含む混合物は、トレイの中で凍結された後、凍結乾燥される。

本発明の好ましい一実施形態では、クエン酸またはその塩と細菌を含む混合物は、トレイの中で凍結され、凍結乾燥され、粉砕されて粒子にされる。

本発明の別の好ましい一実施形態では、クエン酸またはその塩と細菌を含む混合物は、トレイの中で凍結された後、凍結乾燥され、粉砕される。

クエン酸またはその塩と細菌を含む混合物を乾燥させて乾燥材料を取得する態様では、乾燥操作は、本分野のさまざまな技術（例えば真空乾燥、スプレー乾燥、凍結乾燥、流動床乾燥、および／または脱水）を使用して実現することができる。好ましい一実施形態では、乾燥操作は、凍結乾燥またはスプレー乾燥によって実現され、特定の一実施形態では凍結乾燥によって実現される。したがって乾燥法として、真空乾燥、および／または凍結乾燥、および／またはスプレー乾燥が可能だが、これらに限定されることはない。

好ましい一実施形態では、乾燥培養物は、
a）クエン酸塩を含む調製物と、硝酸レダクターゼ活性を有する乳酸菌および／またはミクロコッカス科の細菌と、任意により他の諸成分を混合し；
b）a）で得られた混合物を乾燥させて乾燥材料を取得し；
c）任意により、b）で得られた乾燥材料を粉砕し；
d）その乾燥材料を包装することによって得られる。

乾燥操作は、真空乾燥、および／または凍結乾燥、および／またはスプレー乾燥によって実現できるが、これらに限定されない。

本発明のより好ましい一実施形態では、凍結乾燥培養物は、
a）クエン酸塩を含む調製物と、硝酸レダクターゼ活性を有する乳酸菌および／またはミクロコッカス科の細菌と、任意により他の諸成分を混合し；
b）a）で得られた混合物を凍結させて凍結材料を取得し；
c）その凍結材料から水を昇華させることによってb）の材料を凍結乾燥させ；
d）任意により、c）で得られた凍結乾燥材料を粉砕し；
e）その凍結乾燥材料を包装することによって得られる。

本発明の別の好ましい一実施形態では、スプレー乾燥培養物は、
a）クエン酸塩を含む調製物と、硝酸レダクターゼ活性を有する乳酸菌および／またはミクロコッカス科の細菌と、任意により他の諸成分を混合し；
b）a）で得られた混合物をスプレー乾燥させてスプレー乾燥材料を取得し；
c）そのスプレー乾燥材料を包装することによって得られる。

本発明の別の好ましい一実施形態では、凍結培養物は、
a）クエン酸塩を含む調製物と、硝酸レダクターゼ活性を有する乳酸菌および／またはミクロコッカス科の細菌と、任意により他の諸成分を混合し；
b）a）で得られた混合物を凍結させて凍結材料を取得し；
c）その凍結材料を包装することによって得られる。

本発明の特定の一実施形態では、濃縮培養物はペレット化される。

本発明の好ましい一実施形態では、本発明の濃縮培養物を取得する方法は、クエン酸塩の調製物と、硝酸レダクターゼ活性を有するブドウ球菌を混合物ことによる。得られた培養物はあとで乾燥または凍結させることができる。

乾燥させる方法として、真空乾燥、および／または凍結乾燥、および／またはスプレー乾燥が可能だが、これらに限定されない。

好ましい一実施形態では、乾燥培養物は、
a）クエン酸塩を含む調製物と、硝酸レダクターゼ活性を有するブドウ球菌属の種と、任意により他の諸成分を混合し；
b）a）で得られた混合物を乾燥させて乾燥材料を取得し；
c）任意により、b）で得られた乾燥材料を粉砕し；
d）その乾燥材料を包装することによって得られる。

本発明のより好ましい一実施形態では、凍結乾燥培養物は、
a）クエン酸塩を含む調製物と、硝酸レダクターゼ活性を有するブドウ球菌属の種と、任意により他の諸成分を混合し；
b）a）で得られた混合物を凍結させて凍結材料を取得し；
c）その凍結材料から水を昇華させることによってb）の材料を凍結乾燥させ；
d）任意により、c）で得られた凍結乾燥材料を粉砕し；
e）その凍結乾燥材料を包装することによって得られる。

本発明の別の好ましい一実施形態では、スプレー乾燥培養物は、
a）クエン酸塩を含む調製物と、硝酸レダクターゼ活性を有するブドウ球菌属の種と、任意により他の諸成分を混合し；
b）a）で得られた混合物をスプレー乾燥させてスプレー乾燥材料を取得し；
c）そのスプレー乾燥材料を包装することによって得られる。

本発明の別の好ましい一実施形態では、凍結培養物は、
a）クエン酸塩を含む調製物と、硝酸レダクターゼ活性を有するブドウ球菌属の種と、任意により他の諸成分を混合し；
b）a）で得られた混合物を凍結させて凍結材料を取得し；
c）その凍結材料を包装することによって得られる。

本発明の1つの態様は、乳酸菌およびミクロコッカス科の細菌（例えばブドウ球菌属の種）からなる群から選択された硝酸レダクターゼ活性を有する細菌の硝酸レダクターゼ活性を増大させる方法に関する。したがってこの方法の一実施形態は、
a）クエン酸またはその塩を含む調製物と、乳酸菌およびミクロコッカス科の細菌（例えばブドウ球菌属の種など）からなる群から選択された硝酸レダクターゼ活性を有する細菌とを混合し、クエン酸塩と細菌を含む混合物を取得する工程と；
b）任意により、a）で得られた混合物を凍結させて凍結材料を取得する工程と；
c）任意により、a）の混合物、または工程b）の凍結材料を乾燥させて乾燥材料を取得する工程と；
d）任意により、工程b）から得られた凍結材料、または工程c）の乾燥材料を包装して包装された製品を取得する工程、
を含んでいる。

好ましい一実施形態では、硝酸レダクターゼ活性を有する細菌の硝酸レダクターゼ活性を増大させるこの方法は、
a）クエン酸塩を含む調製物と、乳酸菌およびミクロコッカス科の細菌（例えばブドウ球菌属の種など）からなる群から選択された硝酸レダクターゼ活性を有する細菌をと混合し、クエン酸塩と細菌を含む混合物を取得する工程と；
b）a）で得られた混合物を凍結させて凍結材料を取得する工程と；
c）工程b）の凍結材料を乾燥させて乾燥材料を取得する工程と；
d）任意により、工程c）の乾燥材料を包装して包装された製品を取得する工程、
を含んでいる。

本発明の1つの態様は、乳酸菌およびミクロコッカス科の細菌（ブドウ球菌属の種など）からなる群から選択された細菌の硝酸レダクターゼ活性の保持および／または増大のための、クエン酸またはその塩を含む調製物の使用に関する。この態様では、クエン酸またはその塩を含む調製物は、本明細書に記載の任意の実施形態によって規定することができる。さらに、乳酸菌およびミクロコッカス科の細菌（ブドウ球菌属の種など）からなる群から選択される細菌は、本明細書に記載の任意の実施形態に従って選択することができる。

本発明はさらに、食品を赤色化する方法に関するものであり、この方法は、本発明の濃縮培養物を食品に添加し、この食品を濃縮培養物とともに発酵させること、または熟成させること、または塩漬することを含んでいる。

食品として、ミオグロビンを含有する食品源に基づく任意の製品が可能である。好ましい一実施形態では、食品は肉製品である。

肉製品として、肉を含む任意の製品が可能である。肉として、牛肉、豚肉、鶏肉、狩猟肉（game meat）、他の任意のカテゴリーの肉のいずれかが可能である。

食品として、魚に基づく製品および／または甲殻類に基づく製品も可能である。

好ましい一実施形態では、乳酸菌および／またはミクロコッカス科の細菌を含む濃縮培養物を1.0×10⁸～1.0×10¹² CFU/kgの量で添加する。例えば1.0×10⁹～1.0×10¹¹ CFU/kgの乳酸菌および／またはミクロコッカス科の細菌を添加する。この濃縮培養物は、乳酸菌および／またはミクロコッカス科の細菌を2.0×10⁹～5.0×10¹⁰ CFU/kgの量で添加することが好ましい。

好ましい一実施形態では、ブドウ球菌属の種を含む濃縮培養物を1.0×10⁸～1.0×10¹² CFU/kgの量で添加する。例えば1.0×10⁹～1.0×10¹¹ CFU/kgのブドウ球菌属の種を添加する。この濃縮培養物は、ブドウ球菌属の種を2.0×10⁹～5.0×10¹⁰ CFU/kgの量で添加することが好ましい。

本発明は、上記の食品を赤色化する方法によって得ることのできる食品、または食品を赤色化するための使用によって得ることのできる食品にも関する。

項目

以下の番号付きの項目が本発明をさらに説明している。

1．クエン酸塩の調製物と、硝酸レダクターゼ活性を有する乳酸菌および／またはミクロコッカス科の細菌を含む濃縮培養物。

2．ミクロコッカス科の前記細菌が、硝酸レダクターゼ活性を有するブドウ球菌属の種である、項1の濃縮培養物。

3．前記ブドウ球菌属の種が、スタフィロコッカス・キシローサス、および／またはスタフィロコッカス・カルノーサス、および／またはスタフィロコッカス・ビツリヌスからなる群から選択される、項2の濃縮培養物。

4．前記クエン酸塩が、クエン酸またはクエン酸の塩である、項1～3のいずれか1項の濃縮培養物。

5．単糖、および／または二糖、および／または三糖、および／またはオリゴ糖、および／または多糖をさらに含む、項1～4のいずれか1項の濃縮培養物。

6．前記二糖を、スクロース、ラクトース、マルトース、およびトレハロースからなる群から選択することができる、項5の濃縮培養物。

7．前記多糖がマルトデキストリンである、項5の濃縮培養物。

8．アミノ酸、および／またはペプチド、および／またはタンパク質をさらに含む、項1～7のいずれか1項の濃縮培養物。

9．乾燥している、項1～8のいずれか1項の濃縮培養物。

10．凍結、凍結乾燥、真空乾燥、および／またはスプレー乾燥された、項1～9のいずれか1項の濃縮培養物。

11．a）硝酸レダクターゼ活性を有する乳酸菌および／またはミクロコッカス科の細菌を、クエン酸塩を含む調製物と混合することを含む、項1の濃縮培養物を作製する方法。

12．乾燥させた濃縮培養物を作製する方法であって、
a）クエン酸塩の調製物と、硝酸レダクターゼ活性を有する乳酸菌および／またはミクロコッカス科の細菌を混合し；
b）a）で得られた混合物を乾燥させて乾燥材料を取得し；
c）任意により、b）で得られた乾燥材料を粉砕し；
d）その乾燥材料を包装すること、
を含む方法。

13．前記乾燥操作を、真空乾燥、および／または凍結乾燥、および／またはスプレー乾燥によって実施する、項12の方法。

14．凍結させた濃縮培養物を作製する方法であって、
a）クエン酸塩の調製物と、硝酸レダクターゼ活性を有する乳酸菌および／またはミクロコッカス科の細菌を混合し；
b）a）で得られた混合物を凍結させて凍結材料を取得し；
c）その凍結材料を包装すること、
を含む方法。

15．凍結乾燥させた濃縮培養物を作製する方法であって、
a）クエン酸塩の調製物と、硝酸レダクターゼ活性を有する乳酸菌および／またはミクロコッカス科の細菌を混合し；
b）a）で得られた混合物を凍結させて凍結材料を取得し；
c）その凍結材料から水を昇華させてb）の材料を凍結乾燥させ；
d）任意により、c）で得られた凍結乾燥材料を粉砕し；
e）その凍結乾燥材料を包装すること、
を含む方法。

16．スプレー乾燥させた濃縮培養物を作製する方法であって、
a）クエン酸塩の調製物と、硝酸レダクターゼ活性を有する乳酸菌および／またはミクロコッカス科の細菌を混合し；
b）a）で得られた混合物をスプレー乾燥させてスプレー乾燥材料を取得し；
c）そのスプレー乾燥材料を包装すること、
を含む方法。

17．項2の濃縮培養物を作製する方法であって、
a）硝酸レダクターゼ活性を有するブドウ球菌属の種を、クエン酸塩を含む調製物と混合すること、
を含む方法。

18．ミクロコッカス科の前記細菌がブドウ球菌属の種である、項11～16のいずれか1項の方法。

19．乾燥させた濃縮培養物を作製する方法であって、
a）硝酸レダクターゼ活性を有するブドウ球菌属の種を、クエン酸塩を含む調製物と混合し；
b）a）で得られた混合物を乾燥させて乾燥材料を取得し；
c）任意により、b）で得られた乾燥材料を粉砕し；
d）その乾燥材料を包装すること、
を含む方法。

20．凍結させた濃縮培養物を作製する方法であって、
a）クエン酸塩を含む調製物と、硝酸レダクターゼ活性を有するブドウ球菌属の種を混合し；
b）a）で得られた混合物を凍結させて凍結材料を取得し；
c）その凍結材料を包装すること、
を含む方法。

21．凍結乾燥させた濃縮培養物を作製する方法であって、
a）クエン酸塩を含む調製物と、硝酸レダクターゼ活性を有するブドウ球菌属の種を混合し；
b）a）で得られた混合物を凍結させて凍結材料を取得し；
c）その凍結材料から水を昇華させてb）の材料を凍結乾燥させ；
d）任意により、c）で得られた凍結乾燥材料を粉砕し；
e）その凍結乾燥材料を包装すること、
を含む方法。

22．スプレー乾燥させた濃縮培養物を作製する方法であって、
a）クエン酸塩を含む調製物と、硝酸レダクターゼ活性を有するブドウ球菌属の種を混合し；
b）a）で得られた混合物をスプレー乾燥させてスプレー乾燥材料を取得し；
c）そのスプレー乾燥材料を包装すること、
を含む方法。

23．硝酸レダクターゼ活性を有する前記ブドウ球菌属の種が、スタフィロコッカス・ビツリヌス種またはスタフィロコッカス・カルノーサス種である、項17～22のいずれか1項の方法。

24．前記スタフィロコッカス・ビツリヌス種が、ドイツ微生物細胞培養コレクション（DSMZ）にアクセッション番号DSM 25789で寄託されたスタフィロコッカス・ビツリヌス種CHCC10896と、ドイツ微生物細胞培養コレクション（DSMZ）にアクセッション番号DSM 27311で寄託されたスタフィロコッカス・ビツリヌス種CHCC11576と、これらの突然変異体からなる群から選択される、項23の方法。

25．前記濃縮培養物がペレット化される、項11～24のいずれか1項の方法。

26．食品を赤色化する方法であって、
a）項1～10のいずれか1項の濃縮培養物を肉製品に添加する工程と；
b）その肉製品を前記濃縮培養物とともに発酵させる、または熟成させる、または塩漬する工程を含む方法。

27．前記食品が肉製品である、項26の方法。

28．食品を赤色化することを目的とした、項1～10のいずれか1項の濃縮培養物の使用。

本発明の実施形態を非限定的な実施例によって以下に説明する。

以下の方法を使用して硝酸レダクターゼ活性（NRA）を求めることができる。

亜硝酸レダクターゼ活性は、亜硝酸塩を定量するためのグリース（Griess）試験によって求めることができる。この方法は動力学的実験として実施され、亜硝酸塩の形成（硝酸塩の変換）を時間の関数としてモニタリングする。反応速度を異なる細胞密度で取得する。

結果は、活性な細胞1個につき単位時間に形成される亜硝酸塩として報告される。「ISO 19344：2015 ミルクと乳製品 - 出発培養物、プロバイオティクス、発酵製品 - フローサイトメトリーによる乳酸菌の定量（Milk and milk products - Starter cultures, probiotics and fermented products - Quantification of lactic acid bacteria by flow cytometry）」のプロトコルCに従い、乾燥サンプル1グラム当たりの活性な細胞の数が、フローサイトメトリーと、膜電位感受性染料DiOC₂(3)を用いた染色によって測定される。

硝酸レダクターゼ活性を求めるため、凍結乾燥させた細菌をリン酸ナトリウム緩衝液（pH 7）の中に4つの異なる濃度で懸濁させ、各サンプルが、0.6、1.3、1.9、2.5×10⁹個の活性な細胞/mlとなるようにする。磁性撹拌棒を懸濁液に入れた後、無機油の層を最上部に置いてサンプルを環境中の酸素から保護する。温度を45℃に平衡させた後、グルコースと硝酸塩を含むリン酸ナトリウム緩衝液（pH 7）をサンプルに添加する。10分後、20分後、30分後、40分後、50分後、60分後に、懸濁液の小さなアリコートを吸引し、リン酸（1 M）へと移して亜硝酸塩の濃度を求める。

グリース-イロスベー（Griess-Ilosvay）試薬（スルファニル酸と1-ナフチルアミンを含む酢酸）を、リン酸の中に希釈したサンプルに添加する。暗所でしばらく（5～30分間）インキュベートした後、亜硝酸塩とグリース試薬のジアゾ化生成物の分光光度測定を実施する（540 nmでの吸光度）。亜硝酸塩標準曲線を用いることにより、調べるサンプル中の亜硝酸塩の濃度を吸光度の測定値を用いて計算することができる。次いで硝酸塩の変換率を異なる希釈度（細胞濃度）のサンプルについて求めることができ、そこから今度は細胞1個当たりの硝酸塩変換率を求めることができる。単位時間に形成される亜硝酸塩の濃度と細胞濃度の関係は、許容可能であるためには決定係数が0.975超（R²＞0.975、相関係数、R＞0.95）にならねばならない。

実施例1：スタフィロコッカス・カルノーサスの調製

調製物1：
クエン酸三ナトリウム：9.7％
スクロース：5.6％
マルトデキストリンDE12 ：12.9％
水：71.8％

調製物2：
アスコルビン酸ナトリウム：27.8％
イノシトール：15.6％
水：56.6％

これら調製物を100℃で20分間沸騰させた。調製物の用量は、調製物1を8 g混合した100 gのスタフィロコッカス・カルノーサス濃縮物、調製物2を12.4 g混合した100 gのスタフィロコッカス・カルノーサス濃縮物、陰性対照として用いる100 gのスタフィロコッカス・カルノーサス濃縮物（いかなる凍結防止剤の添加もなし）であった。混合した後、サンプルを-50℃に維持した後に凍結乾燥させ、粉砕した。

凍結乾燥の前と後の硝酸レダクターゼ活性（NRA）を測定した。

問題となるブドウ球菌属の種の硝酸塩から亜硝酸塩への変換率（硝酸レダクターゼ活性）は、本明細書の実施例に記載されているように、所与の時間における亜硝酸塩の濃度を例えばグリース試験の動力学的設定（「比色分析と分光測光（Colorimetry and Spectrophotometry）」、『Vogel's Textbook of Quantitative Chemical Analysis』、第5版、Longman社、702ページ。ISBN 0-582-44693-7を参照されたい）で測定することによって求めた。結果を表1に掲載する。

クエン酸塩を含むサンプルのNRAは、凍結防止剤の添加がないサンプルと比べてほぼ2倍大きい回復率であり、アスコルビン酸ナトリウムを含むサンプルと比べて7倍大きい回復率であることが結論づけられた。

実施例2：スタフィロコッカス・ビツリヌスの調製

調製物1と2を100℃で20分間沸騰させた。

調製物の用量は、調製物1を8 g混合した100 gのスタフィロコッカス・ビツリヌス濃縮物、調製物2を12.4 g混合した100 gのスタフィロコッカス・ビツリヌス濃縮物、陰性対照として用いる100 gのスタフィロコッカス・ビツリヌス濃縮物（いかなる凍結防止剤の添加もなし）であった。混合した後、サンプルを-50℃に維持した後に凍結乾燥させ、粉砕した。凍結乾燥の前と後の硝酸塩変換率または硝酸レダクターゼ活性を測定した。問題となるブドウ球菌属の種の硝酸塩から亜硝酸塩への変換率（硝酸レダクターゼ活性）は、本明細書の実施例に記載されているように、所与の時間における亜硝酸塩の濃度を例えばグリース試験の動力学設定（「比色分析と分光測光」、『Vogel's Textbook of Quantitative Chemical Analysis』、第5版、Longman社、702ページ。ISBN 0-582-44693-7を参照されたい）で測定することによって求めた。結果を表2に掲載する。

クエン酸塩を含むサンプルのNRAは、凍結防止剤の添加がないサンプルと比べてほぼ2倍大きい回復率であり、アスコルビン酸ナトリウムを含むサンプルと比べて8倍大きい回復率であることが結論づけられた。

実施例3：イノシトールとクエン酸塩を含むさまざまな調製物がスタフィロコッカス・カルノーサスの硝酸塩変換率（NRA）に及ぼす効果

イノシトールを含むさまざまな調製物を下記の表3に従って調製した。これら調製物では、クエン酸三ナトリウム一水和物またはアスコルビン酸ナトリウムをイノシトールと組み合わせて用いた。

実施例1に記載されているようにして、これらの調製物を沸騰させ、スタフィロコッカス・カルノーサスの濃縮物と混合し、凍結させ、凍結乾燥させた。硝酸レダクターゼ活性は上記のようにして測定した。

この結果として、以下の表4に示す凍結乾燥製品になった。

アスコルビン酸とイノシトールを含むAI調製物を、クエン酸塩とイノシトールを含むCI調製物を比較した上の表からわかるように、調製物の中にクエン酸塩が存在していると、スタフィロコッカス・カルノーサスの硝酸塩変換率（NRA）によって測定したとき、凍結乾燥製品の硝酸レダクターゼ活性の回復率がより大きくなった。

実施例4：スクロースとマルトデキストリンを含むさまざまな初期調製物がスタフィロコッカス・カルノーサスの硝酸塩変換率（NRA）に及ぼす効果

スクロースとマルトデキストリンを含むさまざまな調製物を下記の表5に従って調製した。これらの調製物は、5.5 kgのスクロース／100 kgの細菌濃縮物と、13 kgのマルトデキストリンDE12／100 kgの細菌濃縮物に加え、アスコルビン酸ナトリウムまたはクエン酸三ナトリウム一水和物を含んでいた。実施例1に記載されているようにしてこれらの調製物を沸騰させ、スタフィロコッカス・カルノーサスの濃縮物と混合し、凍結させ、凍結乾燥させた。硝酸レダクターゼ活性は上記のようにして測定した。

この結果として、以下の表6に示す凍結乾燥製品になった。

上の表6からわかるように、スクロースとマルトデキストリンを含む調製物では、調製物の中にクエン酸塩が存在していると、凍結後に凍結乾燥させた製品では、アスコルビン酸ナトリウムを含む調製物と比べてNRAが高くなった。

実施例5：スクロースとマルトデキストリンを含むさらに別のさまざまな調製物がスタフィロコッカス・カルノーサスの硝酸塩変換率（NRA）に及ぼす効果

上の実施例4に示した初期調製物に加え、さまざまな濃度のアスコルビン酸塩またはクエン酸塩と、一定濃度のスクロースとマルトデキストリンを含むさらに別の調製物を下記の表7に従って調製した。これらの調製物は、5.5 kgのスクロース／100 kgの細菌濃縮物と、13 kgのマルトデキストリンDE12／100 kgの細菌濃縮物に加え、アスコルビン酸ナトリウムまたはクエン酸三ナトリウム一水和物を含んでいた。実施例1に記載されているようにして、これらの調製物を沸騰させ、スタフィロコッカス・カルノーサスの濃縮物と混合し、凍結させ、凍結乾燥させた。硝酸レダクターゼ活性は上記のようにして測定した。

この結果として、以下の表8に示す凍結乾燥製品になった。

上の表8の結果からわかるように、一定濃度のスクロースとマルトデキストリンを含むが、アスコルビン酸塩とクエン酸塩はさまざまな濃度で含む追加の調製物では、調製物の中にクエン酸塩が存在していると、凍結乾燥させた製品では、アスコルビン酸ナトリウムを含む調製物（NRA回復率が30％未満）と比べてNRAが大きくなった。

実施例6：さまざまな濃度のスクロース、マルトデキストリン、クエン酸塩がスタフィロコッカス・カルノーサスの硝酸レダクターゼ活性（NRA）に及ぼす効果を調べるための統計的実験設定

上の実施例4と5に示した調製物に加え、さまざまな濃度のアスコルビン酸塩またはクエン酸塩と、スクロースと、マルトデキストリンDE12を含む調製物を下記の表9に従って調製し、統計的実験の設定を使用してこれら調製物のNRAに対する効果を調べた。試験をトリプリケートで実施して中心点平均NRAと標準偏差を確定した（下記の調製物番号20～22を参照されたい）。

この結果として、以下の表10に示す凍結乾燥製品になった。

調製物20～22のNRAを用いて中心点平均NRAと標準偏差を求めた。その結果、凍結調製物における平均NRDは72％、標準偏差は4.5％になった。対応する凍結乾燥調製物では、平均NRDは52％、標準偏差は7.5％であった。凍結乾燥調製物におけるNRAの平均回復率は、72％、標準偏差は3.1％と求まった。

上の表10のデータからわかるように、NRAは、実験的設定のさまざまな調製物のすべてにおいて、マルトデキストリンとスクロースの濃度に関係なく比較的よく保持された。

実施例7：スクロースとマルトデキストリンを含むさまざまな調製物がスタフィロコッカス・ビツリヌスの硝酸塩変換率（NRA）に及ぼす効果

実施例3と4で実証されたブドウ球菌属のさまざまな種に対する効果を確認するため、スタフィロコッカス・ビツリヌスを用いて同様の実験を実施した。

さまざまな濃度のアスコルビン酸塩またはクエン酸塩と、一定濃度のスクロースとマルトデキストリンを含む調製物を下記の表11に従って調製した。これらの調製物は、5.5 kgのスクロース／100 kgの細菌濃縮物と、13 kgのマルトデキストリンDE12／100 kgの細菌濃縮物に加え、アスコルビン酸ナトリウムまたはクエン酸三ナトリウム一水和物を含んでいた。実施例1に記載されているようにして、これらの調製物を沸騰させ、スタフィロコッカス・ビツリヌスの濃縮物と混合し、凍結させ、凍結乾燥させた。硝酸レダクターゼ活性は上記のようにして測定した。

この結果として、以下の表12に示す凍結乾燥製品になった。

上の表12の結果からわかるように、一定濃度のスクロースとマルトデキストリンと、さまざまな濃度のクエン酸塩を含む調製物では、調製物の中にクエン酸塩が存在していると、1という低いNRAを有するアスコルビン酸ナトリウムを含む調製物と比べてすべての凍結乾燥製品でNRAがより高かった。

さらに、イノシトールとクエン酸塩を含むすべての調製物で、アスコルビン酸塩を含む調製物よりもNRAが高かった。したがって上記の実施例の結果から、クエン酸塩はスタフィロコッカス・ビツリヌスのNRAの保持および／または増大に有用であることが確認される。

参考文献
EP0259739

EP1441027

RU2427624

R. Carcoba et al (Eur Food Res Technol (2000) 211, 433 - 437, “Influence of cryoprotectants on the viability and acidifying activity of frozen and freeze-dried cells of the novel starter strain Lactococcus lactis subsp. lactis CECT 5180.

Colorimetry and Spectrophotometry” Vogel's Textbook of Quantitative Chemical Analysis, 5th Edition. Longman. p. 702. ISBN 0-582-44693-7

Conrad et al., “Stabilization and preservation of Lactobacillus acidophilus in saccharide matrices”, Cryobiology, 41, p. 17-24, 2000.

Chavarri et al., “Cryoprotective agents for frozen concentrated starters from non-bitter Streptococcus Lactis strains”, (Biotechnology letters, vol 10, 1, 11- 16 (1988).

Gotterup et al., “Colour formation in fermented sausages by meat-associated staphylococci with different nitrite- and nitrate-reductase activities”, Meat science 2008 Apr; 78(4): 492-501.

Jukubowska et al., “Evaluation of lactic acid streptococci for the preparation of frozen concentrated starter cultures”, Acta Microbiologica Polonica, vol. 29, no. 2, p. 134-144, 1980.

Mogensen et al., “Inventory of microorganisms with a documented history of use in food”, (2002) Bulletin of the IDF No. 377, 10-19.

Pinarkara, Yasemin, “Effect of cryogenics on survival during drying and storage of freeze dried lactic acid bacteria”, Intl. Scientific Researches Journal, Ponte, vol. 72, no. 2, p. 82-94, 2016

寄託と、専門家のみへの試料分譲（expert solution）

寄託した下記の微生物は、本特許が認められる日付までは専門家だけが入手できるようにされることを出願人は要求する。

2012年3月15日にドイツ微生物細胞培養コレクション（DSMZ）GmbH（インホッフェンシュトラーセ7B、D-38124 ブラウンシュヴァイク、ドイツ国）にアクセッション番号DSM 25789で寄託されたスタフィロコッカス・ビツリヌスCHCC10896。

2013年6月11日にドイツ微生物細胞培養コレクション（DSMZ）GmbH（インホッフェンシュトラーセ7B、D-38124 ブラウンシュヴァイク、ドイツ国）にアクセッション番号DSM 27311で寄託されたスタフィロコッカス・ビツリヌス菌株CHCC11576。

2018年3月20日にドイツ微生物細胞培養コレクション（DSMZ）GmbH（インホッフェンシュトラーセ7B、D-38124 ブラウンシュヴァイク、ドイツ国）にアクセッション番号DSM 32779で寄託されたスタフィロコッカス・カルノーサス菌株CHCC4055。

2011年7月12日にドイツ微生物細胞培養コレクション（DSMZ）GmbH（インホッフェンシュトラーセ7B、D-38124 ブラウンシュヴァイク、ドイツ国）にアクセッション番号DSM 25011で寄託されたラクトバシラス・ペントーサス菌株CHCC4196。

2018年6月5日にドイツ微生物細胞培養コレクション（DSMZ）GmbH（インホッフェンシュトラーセ7B、D-38124 ブラウンシュヴァイク、ドイツ国）にアクセッション番号DSM 32827で寄託されたコクリア・サルシシア菌株CHCC5184。

2018年6月5日にドイツ微生物細胞培養コレクション（DSMZ）GmbH（インホッフェンシュトラーセ7B、D-38124 ブラウンシュヴァイク、ドイツ国）にアクセッション番号DSM 32828で寄託されたコクリア・サルシシア菌株CHCC5185。

これらの寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に従ってなされた。

Claims

クエン酸またはその塩の調製物の使用であって、凍結乾燥前に硝酸レダクターゼ活性を有する細菌と混合することで、凍結中および／または凍結乾燥中の前記硝酸レダクターゼ活性を保持および／または増大するための、使用であり、
前記硝酸レダクターゼ活性を有する細菌が、スタフィロコッカス・カルノーサスおよびスタフィロコッカス・ビツリヌスからなる群から選択される、使用。
前記硝酸レダクターゼ活性を有する細菌が、濃縮培養物の中に含まれる、請求項1に記載の使用であって、前記濃縮培養物は、クエン酸またはその塩の調製物と、硝酸レダクターゼ活性を有する細菌とを含む、使用。
凍結中および／または凍結乾燥中の硝酸レダクターゼ活性を有する細菌の硝酸レダクターゼ活性を保持するため、および／または増大させるための方法であって、前記方法は、
a）クエン酸またはその塩を含む調製物と、硝酸レダクターゼ活性を有する細菌とを混合して、クエン酸またはその塩と細菌を含む混合物を取得する工程と；
b）a）で得られた混合物を凍結させて、凍結材料を取得する工程と；
c）任意により、a）の混合物、または工程b）の凍結材料を乾燥させて、乾燥材料を取得する工程と；
d）任意により、工程b）から得られた凍結材料、または工程c）の乾燥材料を包装して、包装された製品を取得する工程、
を含み、
前記硝酸レダクターゼ活性を有する細菌が、スタフィロコッカス・カルノーサスおよびスタフィロコッカス・ビツリヌスからなる群から選択される、方法。
a）の混合物または工程b）の凍結材料を乾燥させて、乾燥材料を取得する、請求項3に記載の方法。
a）の混合物または工程b）の凍結材料を、脱水、流動床乾燥、凍結乾燥、真空乾燥、および／またはスプレー乾燥によって、乾燥させる、請求項3または4に記載の方法。
a）の混合物または工程b）の凍結材料を、凍結乾燥によって、乾燥させる、請求項5に記載の方法。
a）の混合物をトレイの中で凍結させ、そして凍結乾燥させる、請求項3～6のいずれか1項に記載の方法。
前記凍結材料または前記乾燥材料が、より小さな部分に分割される工程をさらに含む、請求項3～7のいずれか1項に記載の方法。
前記工程が、前記材料を粉砕または微粉化してより小さな粒子にすることにより行われる、請求項8に記載の方法。
前記細菌が、請求項3～9のいずれか1項に定義された方法によって生成する濃縮培養物の中に含まれる、請求項1または2に記載の使用。