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JP7676305B2 - Ｃｎｓ送達のためのフソソーム組成物 - Google Patents

Ｃｎｓ送達のためのフソソーム組成物 Download PDF

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JP7676305B2 JP2021526394A JP2021526394A JP7676305B2 JP 7676305 B2 JP7676305 B2 JP 7676305B2 JP 2021526394 A JP2021526394 A JP 2021526394A JP 2021526394 A JP2021526394 A JP 2021526394A JP 7676305 B2 JP7676305 B2 JP 7676305B2
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マルツァーン， ジェフリー エー． ヴォン
ジェイコブ ローゼンブラム ルーベンス，
ジャゲシュ ヴィジャイクマール シャー，
マティアス， アルバート ルゾ
フェルディナンド プッチ，
ジョン マイルズ ミルウィド，
マイケル トラヴィス ミー，
ニール フランシス ゴードン，
Original Assignee
フラッグシップ パイオニアリング イノベーションズ ブイ， インコーポレイテッド
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Description

関連出願への相互参照
本出願は、２０１８年１１月１４日に出願された「ＣＮＳ細胞送達のためのフソソーム組成物」と題する米国仮出願第６２／７６７，３５８号、及び２０１９年９月１３日に出願された「ＣＮＳ細胞送達のためのフソソーム組成物」と題された米国特許出願公開第６２／９００，０６４号の優先権を主張し、それらの内容は、あらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれる。
配列表の参照による援用
本出願は、電子形式の配列表と共に提出されている。配列表は、２０１９年１１月１４日に作成され、８１９キロバイトのサイズの１８６１５２００３３４０ＳｅｑＬｉｓｔ．ＴＸＴという名称のファイルとして提供される。配列表の電子形式の情報は、その全体が参照により組み込まれる。
複雑な生物製剤は、様々な疾患の有望な治療候補である。しかしながら、原形質膜は細胞と細胞外空間との間のバリアとして機能するため、大きな生物学的因子を細胞に送達することは困難である。当該技術分野では、被験体の細胞に複雑な生物学的製剤を送達する新しい方法が必要とされている。
本開示は、少なくとも部分的に、ｉｎ ｖｉｖｏ送達のためのフソソーム方法及び組成物を提供する。幾つかの実施形態では、フソソームは、標的細胞に対する特異性を促進する要素の組み合わせ、例えば、１つ以上のフソゲン、正の標的細胞特異的調節エレメント、及び非標的細胞特異的調節エレメントを含む。幾つかの実施形態では、フソソーム組成物は、フソソームに対する免疫応答を低下させる１つ以上の改変を含む。
実施形態の列挙
１．以下：
ａ）フソゲンを含む脂質二重層、並びに
ｂ）以下：
（ｉ）外因性作用物質をコードするペイロード遺伝子、例えば、表５又は表６の外因性作用物質をコードするペイロード遺伝子であって、任意に、該外因性作用物質が、配列番号１３４～１５４のいずれか１つに記載されるか、配列番号１３４～１５４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むその機能性フラグメント又はその機能性バリアントである、ペイロード遺伝子と、
（ｉｉ）該ペイロード遺伝子に作動可能に連結された正の標的細胞特異的調節エレメント（例えば、標的細胞特異的プロモーター）とを含む核酸、を含むフソソームであって、該正の標的細胞特異的調節エレメントは、該正の標的細胞特異的調節エレメントを欠く他は同様のフソソームと比較して、標的細胞におけるペイロード遺伝子の発現を増加させ、該標的細胞がＣＮＳ細胞である、フソソーム。
２．前記核酸が、前記ペイロード遺伝子に作動可能に連結された非標的細胞特異的調節エレメント（ＮＴＣＳＲＥ）（例えば、非標的細胞特異的ｍｉＲＮＡ認識配列）を更に含み、前記ＮＴＣＳＲＥが、ＮＴＣＳＲＥを欠く他は同様のフソソームと比較して、非標的細胞において該ペイロード遺伝子の発現を減少させ、任意に、該標的細胞が第１のタイプのＣＮＳ細胞であり、該非標的細胞が第２の異なるタイプのＣＮＳ細胞又は非ＣＮＳ細胞であり、任意に、
該標的細胞がニューロンであり、該非標的細胞がグリア細胞（例えば、乏突起膠細胞、星状膠細胞又はミクログリア細胞）であるか、又は
標的細胞がグリア細胞（例えば、乏突起膠細胞、星状膠細胞又はミクログリア細胞）であり、該非標的細胞がニューロンである、実施形態１に記載のフソソーム。
３．以下：
ａ）フソゲンを含む脂質二重層；並びに
ｂ）以下：
（ｉ）外因性作用物質、例えば、表５又は表６の外因性作用物質をコードするペイロード遺伝子であって、任意に、該外因性作用物質が、配列番号１３４～１５４のいずれか１つに記載されるか、配列番号１３４～１５４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むその機能性フラグメント又はその機能性バリアントである、ペイロード遺伝子と、
（ｉｉ）ペイロード遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターとを含む核酸、を含むフソソームであって、該プロモーターが、例えば、表３のプロモーターの配列による、又はそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する配列による、ＳＹＮ、ＮＳＥ、ＣａＭＫＩＩ、ａチューブリン、ＰＤＧＦ、ｆＳＳＴ、ｆＮＰＹ、ＧＡＤ６７、ＤＬＸ５／６、ＶＧＬＵＴ１、Ｄｏｃｋ１０、ＣｈＡＴ、ＶＡＣｈＴ、Ｄｒｄ１ａ、ＴＰＨ－２、ＧＦＡＰ、ＥＡＡＴ１、ＧＳ、ＣＸ３ＣＲ１、ＴＭＥＭ１１９、ＭＢＰ、ＣＮＰ、又はＣＲＦＲ２βプロモーターから選択される、フソソーム。
４．以下：
ａ）フソゲンを含む脂質二重層；並びに
ｂ）以下：
（ｉ）外因性作用物質をコードするペイロード遺伝子、例えば、表５又は表６の外因性作用物質をコードするペイロード遺伝子であって、任意に、該外因性作用物質が、配列番号１３４～１５４のいずれか１つに記載されるか、配列番号１３４～１５４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むその機能性フラグメント又はその機能性バリアントである、ペイロード遺伝子と、
（ｉｉ）ペイロード遺伝子に作動可能に連結された非標的細胞特異的調節エレメント（ＮＴＣＳＲＥ）（例えば、非標的細胞特異的ｍｉＲＮＡ認識配列）とを含む核酸、を含むフソソームであって、該ＮＴＣＳＲＥが、ＮＴＣＳＲＥを欠く以外は同様のフソソームと比較して、非標的細胞又は組織においてペイロード遺伝子の発現を減少させる、フソソーム。
５．以下：
ａ）フソゲンを含む脂質二重層；並びに
ｂ）以下：
（ｉ）外因性作用物質をコードするペイロード遺伝子、例えば、表５又は表６の外因性作用物質をコードするペイロード遺伝子であって、任意に、該外因性作用物質が、配列番号１３４～１５４のいずれか１つに記載されるか、配列番号１３４～１５４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むその機能性フラグメント又はその機能性バリアントである、ペイロード遺伝子と、
（ｉｉ）ペイロード遺伝子に作動可能に連結された負の標的細胞特異的調節エレメント（負のＴＣＳＲＥ）（例えば、組織特異的なｍｉＲＮＡ認識配列）とを含む核酸、を含むフソソームであって、該負のＴＣＳＲＥが、負のＴＣＳＲＥを欠く他は同様の核酸と比較して、非標的細胞又は組織において外因性作用物質の発現を減少させる、フソソーム。
６．該核酸が、ペイロード遺伝子に作動可能に連結された正の標的細胞特異的調節エレメント（例えば、標的細胞特異的プロモーター）を更に含み、正の標的細胞特異的調節エレメントが、正の標的細胞特異的調節エレメントを欠く他は同様のフソソームと比較した標的細胞におけるペイロード遺伝子の発現を増加させ、該標的細胞が第１のタイプのＣＮＳ細胞であり、任意に、該非標的細胞が第２の異なるタイプのＣＮＳ細胞又は非ＣＮＳ細胞であり、任意に、
該標的細胞がニューロンであり、該非標的細胞がグリア細胞（例えば、乏突起膠細胞、星状膠細胞又はミクログリア細胞）であるか、又は
標的細胞がグリア細胞（例えば、乏突起膠細胞、星状膠細胞又はミクログリア細胞）であり、該非標的細胞がニューロンである、実施形態４又は５に記載のフソソーム。
７．以下：
ａ）フソゲンを含む脂質二重層と、
ｂ）核酸であって、外因性作用物質をコードするペイロード遺伝子、例えば、表５又は表６の外因性作用物質をコードするペイロード遺伝子を含み、任意に、該外因性作用物質が、配列番号１３４～１５４のいずれか１つに記載されるか、配列番号１３４～１５４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むその機能性フラグメント又はその機能性バリアントである、ペイロード遺伝子を含む核酸と、
ｃ）以下のうちの１つ又は両方：
（ｉ）脂質二重層上の第１の外因性の若しくは過剰発現された免疫抑制タンパク質；又は
（ｉｉ）他の点では同様の改変されていないソース細胞から生成されたフソソームと比較して、存在しないか若しくは低下したレベル（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％まで低下）で存在する第１の免疫賦活タンパク質と、を含む、フソソーム。
８．以下の１つ以上である、前述の実施形態のいずれかのフソソーム：
ｉ）フソソームが、非標的細胞とより、標的細胞と高い割合、例えば、少なくとも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、若しくは１００倍で融合する；
ｉｉ）フソソームが、別のフソソームとより、標的細胞と高い割合、例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、若しくは９０％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、若しくは１００倍で融合する；
ｉｉｉ）フソソームが、該フソソーム内の作用物質が、２４、４８、又は７２時間後に、標的細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、若しくは９０％まで送達されるような速度で、標的細胞と融合する；
ｉｖ）フソソームが、非標的細胞よりも、標的細胞に高い割合、例えば、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、又は１００倍で核酸、例えばレトロウイルス核酸を送達する；
ｖ）フソソームが、別のフソソームよりも、標的細胞に高い割合、例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、若しくは９０％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、若しくは１００倍で核酸、例えばレトロウイルス核酸を送達する；或いは
ｖｉ）フソソーム中の作用物質が、２４、４８、又は７２時間後に標的細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、若しくは９０％に送達されるような割合で、フソソームが標的細胞に核酸、例えばレトロウイルス核酸を送達する。
９．以下の１つ以上（例えば、２つ又は３つ全て）：フソソームがレトロウイルスベクターである、脂質二重層がエンベロープ、例えば、ウイルスエンベロープによって構成される、及び核酸がレトロウイルス核酸である、が適用される、前述の実施形態のいずれかのフソソーム。
１０．核酸が、以下の核酸配列の１つ以上（例えば、全て）：５’ＬＴＲ（例えば、Ｕ５を含み、機能的Ｕ３ドメインを欠く）、Ｐｓｉパッケージングエレメント（Ｐｓｉ）、ペイロード遺伝子に作動可能に連結された中央ポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）プロモーター、ペイロード遺伝子（任意に、オープンリーディングフレームの前にイントロンを含む）、ポリＡテール配列、ＷＰＲＥ、及び３’ＬＴＲ（例えば、Ｕ５及び機能的なＵ３を欠いている）、を含む、前述の実施形態のいずれかのフソソーム。
１１．ポリメラーゼ（例えば、逆転写酵素、例えば、ｐｏｌ又はその一部）、インテグラーゼ（例えば、ｐｏｌ又はその一部、例えば、機能的若しくは非機能的バリアント）、マトリックスタンパク質（例えば、ｇａｇ又はその一部）、キャプシドタンパク質（例えば、ｇａｇ又はその一部）、ヌクレオキャプシドタンパク質（例えば、ｇａｇ又はその一部）、及びプロテアーゼ（例えば、ｐｒｏ）の１つ以上（例えば、全て）を含む、前述の実施形態のいずれかのフソソーム。
１２．（ｉ）及び（ｉｉ）を含む、実施形態７のフソソーム。
１３．脂質二重層上に第２の外因性の又は過剰発現された免疫抑制タンパク質を更に含む、実施形態７～１２のいずれかのフソソーム。
１４．存在しないか、又は低下したレベルで存在する第２の免疫賦活タンパク質を含み、ここで、低下したレベルが、他の点では同様の未改変のソース細胞から生成されたフソソームと比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は、９０％である、実施形態７～１３のいずれかのフソソーム。
１５．該核酸、例えばレトロウイルスベクターが、該ペイロード遺伝子に作動可能に連結された正の標的細胞特異的調節エレメント（例えば、標的細胞特異的プロモーター）を更に含み、該正の標的細胞特異的調節エレメントが、該正の標的細胞特異的調節エレメントを欠く他は同様のフソソームと比較して、標的細胞における該ペイロード遺伝子の発現を増加させ、該標的細胞がＣＮＳ細胞である、実施形態７～１４のいずれかに記載のフソソーム。
１６．該核酸、例えばレトロウイルス核酸が、該ペイロード遺伝子に作動可能に連結された非標的細胞特異的調節エレメント（ＮＴＣＳＲＥ）（例えば、非標的細胞特異的ｍｉＲＮＡ認識配列）を更に含み、該ＮＴＣＳＲＥが、ＮＴＣＳＲＥを欠く他は同様のフソソームと比較して、非標的細胞又は組織において該ペイロード遺伝子の発現を減少させ、任意に、該標的細胞が第１のタイプのＣＮＳ細胞であり、該非標的細胞が第２の異なるタイプのＣＮＳ細胞又は非ＣＮＳ細胞であり、任意に、
該標的細胞がニューロンであり、該非標的細胞がグリア細胞（例えば、乏突起膠細胞、星状膠細胞又はミクログリア細胞）であるか、又は
標的細胞がグリア細胞（例えば、乏突起膠細胞、星状膠細胞又はミクログリア細胞）であり、該非標的細胞がニューロンである、実施形態７～１５のいずれかに記載のフソソーム。
１７．核酸、例えば、レトロウイルス核酸が、ペイロード遺伝子に作動可能に連結された負の標的細胞特異的調節エレメント（負のＴＣＳＲＥ）（例えば、組織特異的ｍｉＲＮＡ認識配列）を含み、負のＴＣＳＲＥが、負のＴＣＳＲＥを欠く他は同様の核酸、例えばレトロウイルス核酸と比較して、非標的細胞又は組織において外因性作用物質の発現を減少させる、実施形態７～１５のいずれかのフソソーム。
１８．被験体（例えば、ヒト被験体又はマウス）に投与される場合、以下の１つ以上である、実施形態７～１７のいずれかのフソソーム：
ｉ）フソソームが、（例えば、単回投与又は複数回投与の後）検出可能な抗体応答を生じないか、又は例えば、ＦＡＣＳ抗体検出アッセイ、例えば実施例１３若しくは実施例１４のアッセイによれば、フソソームに対する抗体が、バックグラウンドレベルの１０％未満、５％、４％、３％、２％、若しくは１％超のレベルで存在する；
ｉｉ）フソソームが、検出可能な細胞免疫応答（例えば、Ｔ細胞応答、ＮＫ細胞胞応答、又はマクロファージ応答）を産生しないか、又はフソソームに対する細胞免疫応答が、例えば、ＰＢＭＣ溶解アッセイ（例えば、実施例５のアッセイ）、ＮＫ細胞溶解アッセイ（例えば、実施例６のアッセイ）、ＣＤ８キラーＴ細胞溶解アッセイ（例えば、実施例７のアッセイ）、又はマクロファージ食作用アッセイ（例えば、実施例８のアッセイ）によれば、フソソーム対する細胞応答がバックグラウンドレベルを１０％未満、５％、４％、３％、２％、若しくは１％超のレベルで存在する；
ｉｉｉ）フソソームが、（例えば、単回投与又は複数回投与の後）検出可能な自然免疫応答、例えば、補体活性化を生じないか、又は例えば、補体活性アッセイ（例えば実施例９のアッセイ）によれば、フソソームに対する自然免疫応答が、バックグラウンドレベルの１０％未満、５％、４％、３％、２％、若しくは１％超のレベルで存在する；
ｉｖ）例えば、血清不活化アッセイ、例えば、実施例１１又は実施例１２のアッセイによれば、フソソームの１０％、５％、４％、３％、２％若しくは１％未満が血清によって不活化される；
ｖ）フソソームから外因性作用物質を受けた標的細胞が、検出可能な抗体応答（例えば、単回投与又は複数回投与の後）を生じないか、又は例えば、ＦＡＣＳ抗体検出アッセイ、例えば実施例１５のアッセイによれば、標的細胞に対する抗体が、バックグラウンドレベルの１０％未満、５％、４％、３％、２％、若しくは１％超のレベルで存在する；或いは
ｖｉ）フソソームから外因性作用物質を受けた標的細胞が、検出可能な細胞免疫応答（例えば、Ｔ細胞応答、ＮＫ細胞胞応答、又はマクロファージ応答）を産生しないか、又は標的細胞に対する細胞応答が、例えば、マクロファージ食作用アッセイ（例えば、実施例１６のアッセイ）、ＰＢＭＣ溶解アッセイ（例えば、実施例１７のアッセイ）、ＮＫ細胞溶解アッセイ（例えば、実施例１８のアッセイ）、又はＣＤ８キラーＴ細胞溶解アッセイ（例えば、実施例１９のアッセイ）によれば、標的細胞に対する細胞応答がバックグラウンドレベルの１０％未満、５％、４％、３％、２％、若しくは１％超のレベルで存在する。
１９．バックグラウンドレベルが、フソソームの投与前の同じ被験体において相当するレベルである、実施形態１８のフソソーム。
２０．免疫抑制タンパク質（例えば、第１の免疫抑制タンパク質又は第２の免疫抑制タンパク質）が補体調節タンパク質又はＣＤ４７である、実施形態７～１９のいずれかのフソソーム。
２１．免疫賦活タンパク質（例えば、第１の免疫賦活タンパク質又は第２の免疫賦活タンパク質）がＭＨＣ Ｉ（例えば、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、又はＨＬＡ－Ｇ）又はＭＨＣ ＩＩ（例えば、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＱ、又はＨＬＡ－ＤＲ）タンパク質である、実施形態７～２０のいずれかのフソソーム。
２２．該外因性作用物質が、ＳＹＮＥ１、ＳＥＴＸ、ＦＭＲ１、ＳＬＣ６Ａ８、ＵＢＥ３Ａ、ＳＯＤ１、ＴＤＰ４３、Ｃ９ｏｒｆ７２、ＦＸＮ、ＭＥＣＰ２、ＡＳＰＡ、又はＡＬＤＨ７Ａ１から選択されるか、又は該外因性作用物質が、ＴＰＰ１、ＦＵＣＡ１、ＧＡＬＣ、ＨＥＸＡ、ＨＥＸＢ、ＭＡＮＢＡ、ＡＲＳＡ、ＧＮＰＴＡＢ、又はＭＣＯＬＮ１から選択される、前述の実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
２３．フソゲンがＶＳＶ－Ｇを含む、前述の実施形態のいずれかのフソソーム。
２４．該正の標的細胞特異的調節エレメントが、ＣＮＳ細胞特異的プロモーター、ＣＮＳ細胞特異的エンハンサー、ＣＮＳ細胞特異的スプライス部位、ＲＮＡ若しくはタンパク質の半減期を延長するＣＮＳ細胞特異的部位、ＣＮＳ細胞特異的ｍＲＮＡ核外輸送促進部位、ＣＮＳ細胞特異的翻訳増強部位、又はＣＮＳ細胞特異的翻訳後修飾部位を含む、実施形態１、２、６、１５、２２、又は２３のいずれかに記載のフソソーム。
２５．正の標的細胞特異的調節エレメントがＣＮＳ細胞特異的プロモーターを含む、実施形態１、２、６、１５、又は２２～２４のフソソーム。
２６．該ＣＮＳ細胞特異的プロモーターが表３のモチーフを含む、実施形態２５に記載のフソソーム。
２７．該正のＣＮＳ細胞特異的調節エレメントが、ＳＹＮ、ＮＳＥ、ＣａＭＫＩＩ、ａチューブリン、ＰＤＧＦ、ｆＳＳＴ、ｆＮＰＹ、ＧＡＤ６７、ＤＬＸ５／６、ＶＧＬＵＴ１、Ｄｏｃｋ１０、ＣｈＡＴ、ＶＡＣｈＴ、Ｄｒｄ１ａ、ＴＰＨ－２、ＧＦＡＰ、ＥＡＡＴ１、ＧＳ、ＣＸ３ＣＲ１、ＴＭＥＭ１１９、ＭＢＰ、ＣＮＰ、又はＣＲＦＲ２βプロモーターから選択されるプロモーターを含む、実施形態２５又は２６に記載のフソソーム。
２８．負のＴＣＳＲＥ又はＮＴＣＳＲＥが、非標的細胞特異的ｍｉＲＮＡ認識配列、非標的細胞特異的プロテアーゼ認識部位、非標的細胞特異的ユビキチンリガーゼ部位、非標的細胞特異的転写抑制部位、又は非標的細胞特異的エピジェネティック抑制部位を含む、実施形態４～６、又は１６～２１のいずれかのフソソーム。
２９．負のＴＣＳＲＥ又はＮＴＣＳＲＥが、非標的細胞特異的ｍｉＲＮＡ認識配列、非標的細胞特異的プロテアーゼ認識部位、非標的細胞特異的ユビキチンリガーゼ部位、非標的細胞特異的転写抑制部位、又は非標的細胞特異的エピジェネティック抑制部位を含む、実施形態４～６、又は１６～２１、又は２８のいずれかのフソソーム。
３０．負のＴＣＳＲＥ又はＮＴＣＳＲＥが、非標的細胞特異的ｍｉＲＮＡ認識配列、非標的細胞特異的プロテアーゼ認識部位、非標的細胞特異的ユビキチンリガーゼ部位、非標的細胞特異的転写抑制部位、又は非標的細胞特異的エピジェネティック抑制部位を含む、実施形態４～６、１６～２１、２８又は２９のいずれかのフソソーム。
３１．負のＴＣＳＲＥ又はＮＴＣＳＲＥが、表４のｍｉＲＮＡによって、例えば、１つ以上（例えば、２つ以上の）ｍｉＲ－３３８－３ｐ、ｍｉＲ－９、ｍｉＲ－１２５ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－３４２－３ｐ又はｍｉＲ－１２４によって結合される非標的細胞特異的ｍｉＲＮＡ認識配列を含み、任意に、ｍｉＲＮＡが、配列番号１５６～１６２のいずれか１つに記載される配列であるか、又はそれを含む、実施形態４～６、１６～２１、又は２８～３０のいずれかに記載のフソソーム。
３２．負のＴＣＳＲＥ又は、ＮＴＣＳＲＥは、例えば、転写領域によって産生されたＲＮＡがＵＴＲ又はコード領域内にｍｉＲＮＡ認識配列を含むように、転写領域（例えば、外因性作用物質をコードする転写領域）内に位置又はコードされる、実施形態２８～３１のいずれかのフソソーム。
３３．核酸、例えばレトロウイルス核酸が１つ以上のインスレーター配列を含む、前述の実施形態のいずれかのフソソーム。
３４．核酸、例えば、レトロウイルス核酸が、２つのインスレーター配列、例えば、ペイロード遺伝子の上流の第１のインスレーター配列及びペイロード遺伝子の下流の第２のインスレーター配列を含み、例えば、第１のインスレーター配列及び第２のインスレーター配列が、同じ又は異なる配列を含む、実施形態３３のフソソーム。
３５．遺伝毒性ではないか、又は標的細胞における腫瘍形成の速度を増加させない、前述の実施形態のいずれかのフソソーム。
３６．核酸、例えばレトロウイルス核酸が標的細胞のゲノムに統合されることができる、前述の実施形態のいずれかのフソソーム。
３７．核酸、例えばレトロウイルス核酸が、統合能力のあるレンチウイルス又は統合能力のないレンチウイルスである、実施形態３６のフソソーム。
３８．該標的細胞が、ＣＮＳ細胞、汎ニューロン細胞、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、グルタミン酸作動性ニューロン、コリン作動性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、セロトニン作動性ニューロン、星状膠細胞、ミクログリア、乏突起膠細胞、又は脈絡叢細胞から選択される、前述する実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
３９．以下の１つ以上である、実施形態４～６及び９～３８のいずれかのフソソーム：
ｉ）被験体において検出可能に存在する外因性作用物質の１０％、５％、４％、３％、２％、又は１％未満が非標的細胞にある；
ｉｉ）外因性作用物質を検出可能に含む被験体の細胞のうちの少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％が標的細胞（例えば、単一細胞型の細胞）である；
ｉｉｉ）外因性作用物質を検出可能に含む被験体の細胞のうち１，０００，０００、５００，０００、２００，０００、１００，０００、５０，０００、２０，０００、又は１０，０００個未満の細胞が非標的細胞である；
ｉｖ）被験体の全標的細胞における外因性作用物質の平均レベルが、被験体の全非標的細胞における外因性作用物質の平均レベルよりも少なくとも１００倍、２００倍、５００倍、又は１，０００倍高いものである；或いは
ｖ）外因性作用物質が被験体の非標的細胞において検出されない。
４０．核酸、例えばレトロウイルス核酸が、正のＴＣＳＲＥ及び／又はＮＴＣＳＲＥ若しくは負のＴＣＳＲＥをコードする、前述の実施形態のいずれかのフソソーム。
４１．核酸、例えばレトロウイルス核酸が、正のＴＣＳＲＥ及び／又はＮＴＣＳＲＥ若しくは負のＴＣＳＲＥの補体を含む、前述の実施形態のいずれかのフソソーム。
４２．正のＴＣＳＲＥが、非標的細胞よりも標的 細胞において少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、４００％、５００％、７５０％、１０００％又はそれ以上活性である標的細胞特異的プロモーターを含む、実施形態４０又は４１のいずれかに記載のフソソーム。
４３．負のＴＣＳＲＥ又はＮＴＣＳＲＥが、標的細胞と比較して、非標的細胞において、遺伝子発現を少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％、又は１００％減少させるｍｉＲＮＡ認識配列を含む、実施形態４０～４２のいずれかのフソソーム。
４４．非標的細胞、例えば、ニューロン、グリア細胞、抗原提示細胞、ＭＨＣクラスＩＩ＋細胞、プロフェッショナル抗原提示細胞、非定型抗原提示細胞、マクロファージ、樹状細胞、骨髄性樹状細胞、形質細胞様樹状細胞、ＣＤ１１ｃ＋細胞、ＣＤ１１ｂ＋細胞、脾細胞、Ｂ細胞、肝細胞、内皮細胞、又は非癌性細胞に、核酸、例えば、レトロウイルス核酸を送達しない、前述の実施形態のいずれかのフソソーム。
４５．例えば、定量的ＰＣＲを使用すると、例えば、実施例１のアッセイを使用すると、非標的細胞型（例えば、１つ以上のニューロン、グリア細胞、抗原提示細胞、ＭＨＣクラスＩＩ＋細胞、プロフェッショナル抗原提示細胞、非定型抗原提示細胞、マクロファージ、樹状細胞、骨髄性樹状細胞、形質細胞様樹状細胞、ＣＤ１１ｃ＋細胞、ＣＤ１１ｂ＋細胞、脾細胞、Ｂ細胞、肝細胞、内皮細胞、又は非癌性細胞）の１０％、５％、２．５％、１％、０．５％、０．１％、０．０１％、０．００１％、０．０００１％、０．００００１％、又は０．０００００１％未満が、核酸、例えば、レトロウイルス核酸を含む、前述の実施形態のいずれかのフソソーム。
４６．標的細胞が、宿主ゲノムあたり、０．００００１～１０、．０００１～１０、．００１～１０、．０１～１０、．１～１０、．５～５、１～４、１～３、又は１～２コピーの核酸、例えば、レトロウイルス核酸又はその一部を含み、例えば、核酸のコピー数、例えば、レトロウイルス核酸がｉｎ ｖｉｖｏでの投与の後に評価される、前述の実施形態のいずれかのフソソーム。
４７．前述の実施形態のいずれかのフソソームであって：
非標的細胞（例えば、ニューロン、グリア細胞、抗原提示細胞、ＭＨＣクラスＩＩ＋細胞、プロフェッショナル抗原提示細胞、非定型抗原提示細胞、マクロファージ、樹状細胞、骨髄性樹状細胞、形質細胞様樹状細胞、ＣＤ１１ｃ＋細胞、ＣＤ１１ｂ＋細胞、脾細胞、Ｂ細胞、肝細胞、内皮細胞、又は非癌性細胞）の１０％、５％、２．５％、１％、０．５％、０．１％、０．０１％未満が、外因性作用物質を含む；或いは
外因性作用物質（例えば、タンパク質）が、非標的細胞、例えば、ニューロン、グリア細胞、抗原提示細胞、ＭＨＣクラスＩＩ＋細胞、プロフェッショナル抗原提示細胞、非定型抗原提示細胞、マクロファージ、樹状細胞、骨髄性樹状細胞、形質細胞様樹状細胞、ＣＤ１１ｃ＋細胞、ＣＤ１１ｂ＋細胞、脾細胞、Ｂ細胞、肝細胞、内皮細胞、又は非癌性細胞において検出可能に存在しない、前述の実施形態のいずれかのフソソーム。
４８．フソソームが核酸、例えば、レトロウイルス核酸を標的細胞、例えば、ＣＮＳ細胞、汎ニューロン細胞、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、グルタミン酸作動性ニューロン、コリン作動性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、セロトニン作動性ニューロン、グリア細胞、星状膠細胞、ミクログリア細胞、乏突起膠細胞、又は脈絡叢細胞に送達する、前述する実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
４９．標的細胞（例えば、１種以上のＣＮＳ細胞、汎ニューロン細胞、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、グルタミン酸作動性ニューロン、コリン作動性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、セロトニン作動性ニューロン、グリア細胞、星状膠細胞、ミクログリア細胞、乏突起膠細胞、又は脈絡叢細胞）の少なくとも０．００００１％、０．０００１％、０．００１％、０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％が、例えば、定量的ＰＣＲを使用した場合、例えば、実施例３のアッセイを使用した場合、核酸、例えば、レトロウイルス核酸を含む、前述の実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
５０．標的細胞（例えば、ＣＮＳ細胞、汎ニューロン細胞、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、グルタミン酸作動性ニューロン、コリン作動性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、セロトニン作動性ニューロン、グリア細胞、星状膠細胞、ミクログリア細胞、乏突起膠細胞、又は脈絡叢細胞）の少なくとも０．００００１％、０．０００１％、０．００１％、０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％が外因性作用物質を含む、前述の実施形態のいずれかに記載のフソソーム。
５１．投与時に、核酸、例えば、レトロウイルス核酸を含む標的細胞と、核酸、例えば、レトロウイルス核酸を含む非標的細胞との比が、例えば、定量的ＰＣＲアッセイによれば、例えば、実施例１及び実施例３のアッセイを使用して、少なくとも１．５、２、３、４、５、１０、２５、５０、１００、５００、１０００、５０００、１０，０００である、前述の実施形態のいずれかのフソソーム。
５２．標的細胞における核酸、例えばレトロウイルス核酸又はその一部の平均コピー数と、非標的細胞における核酸、例えばレトロウイルス核酸又はその一部の平均コピー数との比が、例えば、実施例１及び実施例３のアッセイを使用して、例えば、定量的ＰＣＲアッセイによれば、少なくとも１．５、２、３、４、５、１０、２５、５０、１００、５００、１０００、５０００、１０，０００である、前述の実施形態のいずれかのフソソーム。
５３．標的細胞における核酸、例えばレトロウイルス核酸又はその一部のコピー数の中央値と、非標的細胞における核酸、例えばレトロウイルス核酸又はその一部のコピー数の中央値との比が、例えば、定量的ＰＣＲアッセイによれば、例えば、実施例１及び実施例３のアッセイを使用して、少なくとも１．５、２、３、４、５、１０、２５、５０、１００、５００、１０００、５０００、１０，０００である、前述の実施形態のいずれかのフソソーム。
５４．外因性ＲＮＡ作用物質を含む非標的細胞に対する外因性ＲＮＡ作用物質を含む標的細胞の比が、例えば、逆転写定量的ＰＣＲアッセイによれば、少なくとも１．５、２、３、４、５、１０、２５、５０、１００、５００、１０００、５０００、１０，０００である、前述の実施形態のいずれかのフソソーム。
５５．非標的細胞の平均外因性ＲＮＡ作用物質レベルに対する標的細胞の平均外因性ＲＮＡ作用物質レベルの比が、逆転写定量的ＰＣＲアッセイによれば、少なくとも１．５、２、３、４、５、１０、２５、５０、１００、５００、１０００、５０００、１０，０００である、前述の実施形態のいずれかのフソソーム。
５６．非標的細胞の平均外因性ＲＮＡ作用物質レベルの中央値に対する標的細胞の外因性ＲＮＡ作用物質レベルの中央値の比が、逆転写定量的ＰＣＲアッセイによれば、少なくとも１．５、２、３、４、５、１０、２５、５０、１００、５００、１０００、５０００、１０，０００である、前述の実施形態のいずれかのフソソーム。
５７．外因性タンパク質作用物質を含む非標的細胞に対する外因性タンパク質作用物質を含む標的細胞の比が、例えば、ＦＡＣＳアッセイによれば、例えば、実施例２及び実施例４のアッセイを使用して、少なくとも１．５、２、３、４、５、１０、２５、５０、１００、５００、１０００、５０００、１０，０００である、前述の実施形態のいずれかのフソソーム。
５８．非標的細胞の平均外因性タンパク質作用物質レベルに対する標的細胞の平均外因性タンパク質作用物質レベルの比が、例えば、ＦＡＣＳアッセイによれば、例えば、実施例２及び実施例４のアッセイを使用して、少なくとも１．５、２、３、４、５、１０、２５、５０、１００、５００、１０００、５０００、１０，０００である、前述の実施形態のいずれかのフソソーム。
５９．非標的細胞の外因性タンパク質作用物質レベルの中央値に対する標的細胞の外因性タンパク質作用物質レベルの中央値の比が、例えば、ＦＡＣＳアッセイによれば、例えば、実施例２及び実施例４のアッセイを使用して、少なくとも１．５、２、３、４、５、１０、２５、５０、１００、５００、１０００、５０００、１０，０００である、前述の実施形態のいずれかのフソソーム。
６０．以下の１つ又は両方を含む、前述する実施形態のいずれかのフソソーム：
ｉ）脂質二重層上の外因性の又は過剰発現された免疫抑制タンパク質、例えばエンベロープ；及び
ｉｉ）他の点では同様の改変されていないソース細胞から生成されたフソソームと比較して、存在しないか若しくは低下したレベル（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は、９０％まで低下）で存在する免疫賦活タンパク質。
６１．以下：
ｉ）脂質二重層、例えば、エンベロープ上の第１の外因性の又は過剰発現された免疫抑制タンパク質、及び脂質二重層、例えば、エンベロープ上の第２の外因性又は過剰発現された免疫抑制タンパク質；
ｉｉ）脂質二重層、例えばエンベロープ上の第１の外因性又は過剰発現された免疫抑制タンパク質、及び他の点では存在しないか若しくは同様の未改変ソース細胞から生成されたフソソームと比較して、低下したレベル（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は、９０％まで低下）で存在する第２の免疫賦活タンパク質；或いは
ｉｉｉ）他の点では同様の改変されていないソース細胞から生成されたフソソームと比較して、存在しないか若しくは低下したレベル（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は、９０％まで低下）で存在する第１の免疫賦活タンパク質、及び他の点では同様の改変されていないソース細胞から生成されたフソソームと比較して、存在しないか若しくは低下したレベル（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は、９０％まで低下）で存在する第２の免疫賦活タンパク質。
６２．フソソームが、被験体への投与後、少なくとも０．５、１、２、３、４、６、１２、１８、２４、３６、又は４８時間循環している、前述の実施形態のいずれかのフソソーム。
６３．少なくとも０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％のフソソームが投与後３０分間循環している、前述の実施形態のいずれかのフソソーム。
６４．少なくとも０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％のフソソームが投与後１時間循環している、前述の実施形態のいずれかのフソソーム。
６５．少なくとも０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％のフソソームが投与後２時間循環している、前述の実施形態のいずれかのフソソーム。
６６．少なくとも０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％のフソソームが投与後４時間循環している、前述の実施形態のいずれかのフソソーム。
６７．少なくとも０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％のフソソームが投与後８時間循環している、前述の実施形態のいずれかのフソソーム。
６８．少なくとも０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％のフソソームが投与後１２時間循環している、前述の実施形態のいずれかのフソソーム。
６９．少なくとも０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％のフソソームが投与後１８時間循環している、前述の実施形態のいずれかのフソソーム。
７０．少なくとも０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％のフソソームが投与後２４時間循環している、前述の実施形態のいずれかのフソソーム。
７１．少なくとも０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％のフソソームが投与後３６時間循環している、前述の実施形態のいずれかのフソソーム。
７２．少なくとも０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％のフソソームが投与後４８時間循環している、前述の実施形態のいずれかのフソソーム。
７３．参照フソソーム、例えば、他の点ではフソソームと同様の未改変フソソームと比較して、適切な動物モデル、例えば、本明細書に記載の動物モデルへのフソソームの１回以上の投与後の体液性応答の低下によって測定される免疫原性の低下を有する、前述の実施形態のいずれかのフソソーム。
７４．体液性応答の低下が、血清サンプルにおいて、抗細胞抗体力価、例えば、抗レトロウイルス抗体力価によって、例えば、ＥＬＩＳＡによって測定される、実施形態７３のフソソーム。
７５．フソソームを投与された動物からの血清サンプルが、未改変細胞を投与された被験体からの血清サンプルと比較して、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又はそれ以上の抗フソソーム抗体力価の減少を有する、前述の実施形態のいずれかのフソソーム。
７６．フソソームを投与された被験体からの血清サンプルが、増加した、例えば、ベースラインから１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、又は４０％増加した抗細胞抗体力価を有し、例えば、ベースラインは、フソソーム投与前の同じ被験体の血清サンプルを指す、前述の実施形態のいずれかのフソソーム。
７７．前述の実施形態のいずれかのフソソームであって：
フソソーム又はフソソームを含む医薬組成物を投与される被験体が、フソソームと反応性の既存の抗体（例えば、ＩｇＧ又はＩｇＭ）を有するか、又は有することが知られているか、又はそれらについて試験される；
フソソームを投与される被験体が、フソソームと反応性の検出可能なレベルの既存の抗体を有していない；
フソソーム又はフソソームを含む医薬組成物を受けた被験体が、フソソームと反応性の抗体（例えば、ＩｇＧ又はＩｇＭ）を有するか、又は有することが知られているか、又はそれらについて試験される；
フソソーム又はフソソームを含む医薬組成物（例えば、少なくとも１回、２回、３回、４回、５回、又はそれ以上）を投与された被験体が、フソソームと反応性の検出可能なレベルの抗体を有していない；或いは
抗体のレベルが、２つの時点の間で１％、２％、５％、１０％、２０％、又は５０％を超えて上昇せず、第１の時点が、フソソームの最初の投与の前であり、第２の時点が、フソソームの１回以上の投与後である。
７８．フソソームが、例えば、ＨＬＡ－Ｇ又はＨＬＡ－Ｅ ｃＤＮＡでトランスフェクトされた細胞から、実施例５、６、又は７の方法によって産生される、前述の実施形態のいずれかのフソソーム。
７９．ＮＭＣ－ＨＬＡ－Ｇ細胞から生成されたフソソームが、ＮＭＣ又はＮＭＣ－空ベクターから生成されたフソソームと比較して、特定の時点で、溶解、例えば、ＰＢＭＣ媒介溶解、ＮＫ細胞胞媒介溶解、及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞媒介溶解の割合が減少する、前述の実施形態のいずれかのフソソーム。
８０．改変フソソームが、マクロファージによる食作用を回避する、前述の実施形態のいずれかのフソソーム。
８１．フソソームが、例えば、ＣＤ４７ ｃＤＮＡでトランスフェクトされた細胞から、実施例８の方法によって産生される、前述の実施形態のいずれかのフソソーム。
８２．マクロファージが、ＮＭＣに由来するベクター又はＮＭＣ空ベクターと比較して、ＮＭＣ－ＣＤ４７に由来するレトロウイルスベクターと共にインキュベートされると、食作用指数が低下する、前述の実施形態のいずれかのフソソーム。
８３．参照フソソーム、例えば他の点ではフソソームと同様の未改変フソソームと比較して、マクロファージ食作用において、例えば、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上のマクロファージ食作用の減少を有し、マクロファージ食作用の減少が、例えば、実施例８に記載されるように、ｉｎ ｖｉｔｒｏ食作用指数をアッセイすることによって決定される、前述の実施形態のいずれかのフソソーム。
８４．フソソーム組成物が、マクロファージ食作用のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいてマクロファージとインキュベートされた場合、例えば、実施例８のアッセイによって測定されるように、０、１、１０、１００、又はそれ以上の食作用指数を有する、前述の実施形態のいずれかのフソソーム。
８５．改変されており、未改変のフソソームと比較して補体活性が低下している、前述の実施形態のいずれかのフソソーム。
８６．例えば、補体調節タンパク質、例えば、ＤＡＦをコードするｃＤＮＡでトランスフェクトされた細胞から、実施例９の方法によって産生される、前述の実施形態のいずれかのフソソーム。
８７．２００ｐｇ／ｍｌのＣ３ａが存在するフソソームの用量が、対応するマウス血清（例えば、ＨＥＫ２９３マウス血清）とインキュベートした参照フソソーム（例えば、ＨＥＫ２９３レトロウイルスベクター）の場合よりも、対応するマウス血清（例えば、ＨＥＫ－２９３ ＤＡＦマウス血清）とインキュベートした改変フソソーム（例えば、ＨＥＫ２９３－ＤＡＦ）の場合に多い、前述の実施形態のいずれかのフソソーム。
８８．２００ｐｇ／ｍｌのＣ３ａが存在するフソソームの用量が、ナイーブマウス血清とインキュベートした参照フソソーム（例えば、ＨＥＫ２９３レトロウイルスベクター）場合よりも、ナイーブマウス血清とインキュベートした改変フソソーム（例えば、ＨＥＫ２９３－ＤＡＦ）の場合に多い、前述の実施形態のいずれかのフソソーム。
８９．フソソームが、実施例９のアッセイによると、投与の３０分後の患者血清における補体媒介性不活化に耐性である、前述の実施形態のいずれかのフソソーム。
９０．少なくとも０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％のフソソームが補体媒介不活化に耐性である、前述の実施形態のいずれかのフソソーム。
９１．補体調節タンパク質が、崩壊促進因子（ＤＡＦ、ＣＤ５５）に結合するタンパク質、例えばＨ因子（ＦＨ）様タンパク質－１（ＦＨＬ－１）、例えばＣ４ｂ結合タンパク質（Ｃ４ＢＰ）、例えば、補体受容体１（ＣＤ３５）、例えば、メンブレンコファクタータンパク質（ＭＣＰ、ＣＤ４６）、例えば、プロテクチン（ＣＤ５９）、例えば古典的及び代替補体経路ＣＤ／Ｃ５コンバターゼ酵素を阻害するタンパク質、例えばＭＡＣアッセンブリを調節するタンパク質の１つ以上を含む、実施形態８６～９０のいずれかのフソソーム。
９２．例えば、ＭＨＣクラスＩを標的とするｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡでトランスフェクトされた細胞から実施例１０の方法によって産生され、例えば、ＮＭＣ－ｓｈＭＨＣクラスＩに由来するレトロウイルスベクターが、ＮＭＣ及びＮＭＣベクター対照と比較してＭＨＣクラスＩの発現が低い、前述の実施形態のいずれかのフソソーム。
９３．フソソームに対する免疫原性の尺度が血清不活化であり、例えば、実施例１１に記載されるように、例えば、本明細書に記載されるように測定される血清不活化である、前述の実施形態のいずれかのフソソーム。
９４．外因性作用物質を受ける細胞のパーセントが、フソソームナイーブマウスからの血清及び熱不活化血清と共にインキュベートされたフソソームサンプル間で異ならない、前述の実施形態のいずれかのフソソーム。
９５．外因性作用物質を受ける細胞のパーセントが、フソソームナイーブマウスからの血清とインキュベートされたフソソームサンプルと無血清対照インキュベーションとの間で異ならない、実施形態のいずれかのフソソーム。
９６．外因性作用物質を受ける細胞のパーセントが、陽性対照血清とインキュベートされたフソソームサンプルにおいて、フソソームナイーブマウスからの血清とインキュベートされたフソソームサンプルよりも少ない、前述の実施形態のいずれかのフソソーム。
９７．改変されたフソソーム、例えば、本明細書に記載の方法によって改変されたものが、複数回（例えば、１回より多い、例えば、２回以上）の改変フソソームの投与に続いて、血清不活化の減少を有する（例えば、未改変フソソームの投与と比較して減少する）、前述の実施形態のいずれかのフソソーム。
９８．本明細書に記載のフソソームが、複数回の投与後に血清によって不活化されない、前述の実施形態のいずれかのフソソーム。
９９．フソソームの免疫原性の尺度が、例えば、複数回投与後の血清不活化、例えば、本明細書に記載のように、例えば、実施例１２に記載のように測定された複数回投与後の血清不活化である、前述の実施形態のいずれかのフソソーム。
１００．外因性作用物質を受ける細胞のパーセントが、改変（例えば、ＨＥＫ２９３－ＨＬＡ－Ｇ）フソソームで処理されたマウスからの血清及び熱不活化血清と共にインキュベートされたフソソームサンプル間で異ならない、前述の実施形態のいずれかのフソソーム。
１０１．外因性作用物質を受ける細胞のパーセントが、改変（例えば、ＨＥＫ２９３－ＨＬＡ－Ｇ）フソソームで１、２、３、５又は１０回処理されたマウスからの血清及び熱不活化血清と共にインキュベートされたフソソームサンプル間で異ならない、前述の実施形態のいずれかのフソソーム。
１０２．外因性作用物質を受ける細胞のパーセントが、ビヒクルで処理されたマウスから及び改変（例えば、ＨＥＫ２９３－ＨＬＡ－Ｇ）フソソームで処理されたマウスからの血清と共にインキュベートされたフソソームサンプル間で異ならない、前述の実施形態のいずれかのフソソーム。
１０３．外因性作用物質を受ける細胞のパーセントが、改変された（例えば、ＨＥＫ２９３－ＨＬＡ－Ｇ）フソソームよりも参照細胞（例えば、ＨＥＫ２９３）に由来するフソソームの場合に少ない、前述の実施形態のいずれかのフソソーム。
１０４．フソソームに対する免疫原性の尺度が抗体応答である、前述の実施形態のいずれかのフソソーム。
１０５．本明細書に記載のフソソームを受ける被験体が、例えば、実施例１３に記載されるように、本明細書に記載されるように測定される、フソソームに結合して認識する既存の抗体を有する、前述の実施形態のいずれかのフソソーム。
１０６．フソソームナイーブマウスからの血清が、陰性対照、例えば、ＩｇＭ及びＩｇＧが枯渇したマウスからの血清よりも多いシグナル（例えば、蛍光）を示し、例えば、免疫原性が発生したことを示す、前述の実施形態のいずれかのフソソーム。
１０７．フソソームナイーブマウスからの血清が、陰性対照と比較して同様のシグナル（例えば、蛍光）を示し、例えば、免疫原性が検出可能に発生しなかったことを示す、前述の実施形態のいずれかのフソソーム。
１０８．前述の実施形態のいずれかのフソソームであって、改変されたフソソームであり、例えば、本明細書に記載の方法によって改変され、例えば、実施例１４に記載されるように、例えば、本明細書に記載されるように測定すると、改変されたフソソームの複数回（例えば、１回より多い、例えば、２回以上）の投与の後に体液性応答が低下している（例えば、未改変フソソームの投与と比較して低下している）、フソソーム。
１０９．フソソームが、例えば、ＨＬＡ－Ｇ又はＨＬＡ－Ｅ ｃＤＮＡでトランスフェクトされた細胞から、実施例５、６、７、又は１４の方法によって産生される、前述の実施形態のいずれかのフソソーム。
１１０．体液性応答が、抗フソソーム抗体（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＧ１、及び／又はＩｇＧ２抗体）のレベルの値を決定することによって評価される、前述の実施形態のいずれかのフソソーム。
１１１．改変された（例えば、ＮＭＣ－ＨＬＡ－Ｇ）フソソームが、対照、例えば、ＮＭＣフソソーム又はＮＭＣ－空フソソームと比較して、注射後に抗ウイルスＩｇＭ又はＩｇＧ１／２抗体力価（例えば、ＦＡＣＳで蛍光強度によって測定される）が減少している、前述の実施形態のいずれかのフソソーム。
１１２．レシピエント細胞が、抗体応答によって標的化されていない、又は例えば、本明細書に記載されるように、例えば実施例１５に記載されるように測定した場合、抗体応答が参照レベル未満となる、前述の実施形態のいずれかのフソソーム。
１１３．シグナル（例えば、平均蛍光強度）が、フソソームで処理されたマウス及びＰＢＳで処理されたマウスからのレシピエント細胞で類似している、前述の実施形態のいずれかのフソソーム。
１１４．レシピエント細胞の免疫原性の尺度がマクロファージ応答である、前述の実施形態のいずれかのフソソーム。
１１５．レシピエント細胞がマクロファージによって標的化されない、又は参照レベル未満で標的化される、前述の実施形態のいずれかのフソソーム。
１１６．例えば、本明細書に記載されるように、例えば、実施例１６に記載されるように測定される食作用指数が、フソソームで処理されたマウス及びＰＢＳで処理されたマウスからのレシピエント細胞で類似している、前述の実施形態のいずれかのフソソーム。
１１７．レシピエント細胞の免疫原性の尺度がＰＢＭＣ応答である、前述の実施形態のいずれかのフソソーム。
１１８．レシピエント細胞がＰＢＭＣ応答を誘発しない、前述の実施形態のいずれかのフソソーム。
１１９．ＣＤ３＋／ＣＭＧ＋細胞のパーセントが、例えば、本明細書に記載されるように、例えば、実施例１７に記載されるように測定した場合、フソソームで処理されたマウス及びＰＢＳで処理されたマウスに由来するレシピエント細胞で類似している、前述の実施形態のいずれかのフソソーム。
１２０．レシピエント細胞の免疫原性の尺度がナチュラルキラー細胞応答である、前述の実施形態のいずれかのフソソーム。
１２１．レシピエント細胞がナチュラルキラー細胞応答を誘発しない、又は例えば、参照値よりも低いナチュラルキラー細胞応答を誘発する、前述の実施形態のいずれかのフソソーム。
１２２．ＣＤ３＋／ＣＭＧ＋細胞のパーセントが、例えば、本明細書に記載されるように、例えば、実施例１８に記載されるように測定した場合、フソソームで処理されたマウス及びＰＢＳで処理されたマウスに由来するレシピエント細胞で類似している、前述の実施形態のいずれかのフソソーム。
１２３．レシピエント細胞の免疫原性の尺度がＣＤ８＋Ｔ細胞応答である、前述の実施形態のいずれかのフソソーム。
１２４．レシピエント細胞がＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発しない、又は例えば、参照値よりも低いＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発する、前述の実施形態のいずれかのフソソーム。
１２５．ＣＤ３＋／ＣＭＧ＋細胞のパーセントが、例えば、本明細書に記載されるように、例えば、実施例１９に記載されるように測定した場合、フソソームで処理されたマウス及びＰＢＳで処理されたマウスに由来するレシピエント細胞で類似している、前述の実施形態のいずれかのフソソーム。
１２６．フソゲンが再標的化されたフソゲンである、前述の実施形態のいずれかのフソソーム。
１２７．前述の実施形態のいずれかのフソソームであって、（ｉ）外因性作用物質をコードする核酸に作動可能に連結された正の標的細胞特異的調節エレメント、又は（ｉｉ）外因性作用物質をコードする核酸に作動可能に連結された非対照細胞特異的調節エレメント若しくは負のＴＣＳＲＥのうちの１つ又は両方をコードする核酸、例えば、レトロウイルス核酸を含む、フソソーム。
１２８．前述の実施形態のいずれかのフソソーム及び薬学的に許容可能な担体、希釈剤、又は賦形剤を含む、医薬組成物。
１２９．外因性作用物質を被験体（例えば、ヒト被験体）に送達する方法であって、実施形態１～１２７のいずれかのフソソーム又は実施形態１２８に記載の医薬組成物を被験体に投与し、それにより外因性作用物質を被験体に送達する、方法。
１３０．被験体（例えば、ヒト被験体）、標的組織又は標的細胞（例えば、ＣＮＳ細胞、例えばニューロン又はグリア細胞）において、機能を調節する方法であって、被験体、標的組織又は標的細胞を、実施形態１～１２７のいずれかのフソソーム、又は実施形態１２８の医薬組成物に接触させること、例えば、それに投与することを含む、方法。
１３１．標的組織又は標的細胞が被験体に存在する、実施形態１３０の方法。
１３２．実施形態１～１２７のいずれかのフソソーム、又は請求項１２８の医薬組成物を被験体に投与することを含む、被験体（例えば、ヒト被験体）の遺伝子欠損を処置する方法。
１３３．遺伝子欠損が表５又は表６の遺伝子欠損である、実施形態１３２の方法。
１３４．遺伝子欠損が、外因性作用物質をコードするペイロード遺伝子によって処置することができる遺伝子欠損である、実施形態１３２又は１３３の方法。
１３５．遺伝的欠損がＣＮＳ疾患若しくは障害又はリソソーム疾患若しくは障害に関連し、方法が、ＣＮＳ疾患若しくは障害又はリソソーム疾患若しくは障害を処置する、実施形態１３２～１３４のいずれかに記載のフソソーム。
１３６．ＣＮＳ疾患若しくは障害又はリソソーム疾患若しくは障害が、脊髄小脳失調症；常染色体劣性、１型；眼球運動失行を伴う運動失調、２型；脆弱Ｘ症候群；脳クレアチン欠乏症候群１；アンジェルマン症候群；筋萎縮性側索硬化症；フリードライヒ運動失調；レット症候群；カナバン病；ピリドキシン依存性てんかん；バッテン病、フコシドーシス；クラッベ病；テイ・サックス病；サンドホフ病；ベータマンノース症；異染性白質ジストロフィー；ムコリピドーシスＩＩＩａ型；ムコリピドーシスＩＩＩｂ型；又はムコリピドーシスＩＶ型である、実施形態１３５に記載の方法。
１３７．遺伝子欠損を有する被験体（例えば、ヒト被験体）を処置する際に使用するための、実施形態１～１２７のいずれかのフソソーム又は実施形態１２８の医薬組成物。
１３８．遺伝子欠損を有する被験体（例えば、ヒト被験体）を処置する際に使用するための作用物質を製造するための、実施形態１～１２７のいずれかのフソソーム又は実施形態１２８の医薬組成物の使用。
１３９．フソソームが、遺伝子欠損を処置するための外因性作用物質をコードするペイロード遺伝子を含む、実施形態１３７の使用のためのフソソーム若しくは医薬組成物、又は実施形態１３８の使用。
１４０．遺伝的欠損がＣＮＳ疾患若しくは障害又はリソソーム疾患若しくは障害に関連し、方法が、ＣＮＳ疾患若しくは障害又はリソソーム疾患若しくは障害を処置する、実施形態１３７若しくは１３９に記載の使用のためのフソソーム若しくは医薬組成物、又は実施形態１３８若しくは１３９に記載の使用。
１４１．ＣＮＳ疾患若しくは障害又はリソソーム疾患若しくは障害が、脊髄小脳失調症；常染色体劣性、１型；眼球運動失行を伴う運動失調、２型；脆弱Ｘ症候群；脳クレアチン欠乏症候群１；アンジェルマン症候群；筋萎縮性側索硬化症；フリードライヒ運動失調；レット症候群；カナバン病；ピリドキシン依存性てんかん；バッテン病、フコシドーシス；クラッベ病；テイ・サックス病；サンドホフ病；ベータマンノース症；異染性白質ジストロフィー；ムコリピドーシスＩＩＩａ型；ムコリピドーシスＩＩＩｂ型；又はムコリピドーシスＩＶ型である、実施形態１３７、１３９若しくは１４０に記載の使用のためのフソソーム若しくは医薬組成物、又は実施形態１３８、１３９若しくは１４０に記載の使用。
１４２．以下：
ａ）核酸、例えば、レトロウイルス核酸、及びフソゲンを含む細胞を提供すること；
ｂ）フソソームの産生を可能にする条件下で上記細胞を培養すること、並びに
ｃ）上記細胞からフソソームを分離、濃縮、又は精製し、それによってフソソームを作製すること、を含む、実施形態１～１２７のいずれかのフソソームを作製する方法。
本発明の他の特徴、目的、及び利点は、説明及び図面、並びに特許請求の範囲から明らかになるであろう。
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。例えば、本明細書において、例えば、いずれかの表で言及される全てのＧｅｎＢａｎｋ、Ｕｎｉｇｅｎｅ、及びＥｎｔｒｅｚ配列は、参照により組み込まれる。特に明記されていない限り、本明細書の表を含め、本明細書で指定されている配列アクセッション番号は、２０１８年５月１５日現在のデータベースエントリを参照している。１つの遺伝子又はタンパク質が複数の配列アクセッション番号を参照する場合、全ての配列バリアントが含まれる。加えて、材料、方法、及び例は、単に例示であり、限定することを意図していない。
本発明の以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むとよりよく理解されるであろう。本発明を説明する目的で、ここに例示されている本明細書に記載の特定の実施形態が、本明細書に記載される。ただし、本発明は、図面に示される実施形態の正確な配置及び手段に限定されないことを理解されたい。
図１は、Ｆ－アクチンの色素によるフソソームの染色を定量化する。 図２は、３、５、及び２４時間の期間にわたるアクチンを重合するフソソーム及び親細胞の能力を示すグラフである。 図３は、ＮＴＡ及び顕微鏡法によって測定された、フソソーム及び親細胞のサイズ分布統計を示す表である。 図４は、フソソーム及び親細胞の平均サイズ及び体積を示す表である。 図５は、フソソーム又は細胞調製物について観察された可溶性：不溶性の比を示す一連の図である。 図６は、標的細胞又は非標的細胞へのＭｖＨ（ＣＤ８）＋Ｆフソソーム融合、及び標的融合の絶対量を示す一連の図である。 図７は、ＶＳＶ－Ｇフソソームにおける２－ＮＢＤＧ平均蛍光強度を示す図である。 図８は、ＶＳＶ－Ｇフソソームの細胞質ゾルにおけるエステラーゼ活性を示す図である。 図９Ａ～９Ｂは、マウスの生体発光イメージングによって検出された、フソソームによるＣｒｅリコンビナーゼ送達を示す一連の図である。（Ａ）ＩＶフソソーム処理マウス（１倍及び３倍の濃度）の曝露された肝臓及び脾臓の腹側画像及び発光シグナルオーバーレイ。下部は発光シグナルのみである。（Ｂ）フソソームを標的とした脾臓及び肝臓の全光束シグナル；γ－スケールはｌｏｇ１０スケールである。３倍のフソソーム処置の濃度で処置されたマウスは、処理後７２時間のバックグラウンドよりも脾臓で有意に大きなシグナルを示した（ｐ＝０．０００４）。 図９Ａ～９Ｂは、マウスの生体発光イメージングによって検出された、フソソームによるＣｒｅリコンビナーゼ送達を示す一連の図である。（Ａ）ＩＶフソソーム処理マウス（１倍及び３倍の濃度）の曝露された肝臓及び脾臓の腹側画像及び発光シグナルオーバーレイ。下部は発光シグナルのみである。（Ｂ）フソソームを標的とした脾臓及び肝臓の全光束シグナル；γ－スケールはｌｏｇ１０スケールである。３倍のフソソーム処置の濃度で処置されたマウスは、処理後７２時間のバックグラウンドよりも脾臓で有意に大きなシグナルを示した（ｐ＝０．０００４）。 図１０Ａ～１０Ｂは、生体発光イメージングによって検出された、フソソームによるマウス肝臓及び脾臓へのＣｒｅリコンビナーゼ送達を示す一連の図である。（Ａ）左から右へ；安楽死から５分以内に収集及び画像化された、切除された肝臓、心臓、肺、腎臓、小腸、膵臓、及び脾臓の背側画像及び発光シグナルオーバーレイ。下部は発光シグナルのみである。（Ｂ）フソソームを標的とした脾臓及び肝臓、並びに他の組織の全光束シグナル；γ－スケールはｌｏｇ１０スケールである。３倍の濃度のフソソーム処置で処置されたマウスは、シグナルが最も低い組織（心臓）と比較して、脾臓で有意に大きなシグナルを示した（ｐ＜０．０００１）。 図１０Ａ～１０Ｂは、生体発光イメージングによって検出された、フソソームによるマウス肝臓及び脾臓へのＣｒｅリコンビナーゼ送達を示す一連の図である。（Ａ）左から右へ；安楽死から５分以内に収集及び画像化された、切除された肝臓、心臓、肺、腎臓、小腸、膵臓、及び脾臓の背側画像及び発光シグナルオーバーレイ。下部は発光シグナルのみである。（Ｂ）フソソームを標的とした脾臓及び肝臓、並びに他の組織の全光束シグナル；γ－スケールはｌｏｇ１０スケールである。３倍の濃度のフソソーム処置で処置されたマウスは、シグナルが最も低い組織（心臓）と比較して、脾臓で有意に大きなシグナルを示した（ｐ＜０．０００１）。 図１１は、非エンドサイトーシス経路を介したＮｉｖＧ＋ＦフソソームによるＣｒｅカーゴの送達を示す表である。 図１２は、フソソーム及び親細胞においてビシンコニン酸アッセイによって測定されたＧＡＰＤＨ：総タンパク質比を示すグラフである。 図１３は、フソソーム及び親細胞においてビシンコニン酸アッセイによって測定された脂質：タンパク質比を示すグラフである。 図１４は、フソソーム及び親細胞においてビシンコニン酸アッセイによって測定されたタンパク質：ＤＮＡ比を示すグラフである。 図１５は、フソソーム及び親細胞においてビシンコニン酸アッセイによって測定された脂質：ＤＮＡ比を示すグラフである。 図１６は、エクソソーム及びフソソームにおけるエクソソームマーカーＣＤ６３のタンパク質レベルを示すグラフである。 図１７は、フソソーム及び親細胞で検出されたカルネキシンシグナルの強度を示すグラフである。 図１８は、フソソーム及び親細胞について決定された脂質：ＤＮＡ比を示すグラフである。 図１９Ａ～１９Ｂは、親細胞、エクソソーム、及びフソソームにおける総脂質の割合としての脂質種の割合を示す一連のグラフである。 図１９Ａ～１９Ｂは、親細胞、エクソソーム、及びフソソームにおける総脂質の割合としての脂質種の割合を示す一連のグラフである。 図２０は、示されるように、特定の区画に関連するタンパク質に関して、親細胞、エクソソーム、及びフソソームのタンパク質含有量を示す一連のグラフである。 図２１は、親細胞、エクソソーム、及びフソソームにおける総タンパク質含有量の割合としてのＡＲＲＤＣ１（左パネル）又はＴＳＧ１０１（右パネル）のレベルを示す一連のグラフである。
本開示は、少なくとも部分的に、ｉｎ ｖｉｖｏ送達のためのフソソーム方法及び組成物を提供する。幾つかの実施形態では、フソソームは、標的細胞に対する特異性を促進する要素の組み合わせ、例えば、１つ以上の再標的化されたフソゲン、正の標的細胞特異的調節エレメント、及び非標的細胞特異的調節エレメントを含む。幾つかの実施形態では、フソソーム組成物は、フソソームに対する免疫応答を低下させる１つ以上の改変を含む。
Ｉ．定義
請求項及び明細書で使用される用語は、特に明記しない限り、以下に記載されるように定義される。
本明細書で使用される場合、「検出可能に存在する」は、外因性作用物質が検出可能に存在するという文脈で使用される場合、外因性作用物質自体が検出可能に存在することを意味する。例えば、外因性作用物質がタンパク質である場合、それをコードする核酸が検出可能に存在するかどうかに関わらず、外因性タンパク質作用物質は検出可能に存在することができる。
本明細書で使用される場合、「フソソーム」は、内腔又は空洞を取り囲む両親媒性脂質の二重層、及び両親媒性脂質二重層と相互作用するフソゲンを指す。実施形態では、フソソームは核酸を含む。幾つかの実施形態では、フソソームは、膜で囲まれた調製物である。幾つかの実施形態では、フソソームは、ソース細胞に由来する。
本明細書で使用される場合、「フソソーム組成物」は、１つ以上のフソソームを含む組成物を指す。
本明細書で使用される場合、「フソゲン」は、２つの膜で囲まれた内腔の間に相互作用を作り出す作用物質又は分子を指す。実施形態では、フソゲンは、膜の融合を促進する。他の実施形態では、フソゲンは、２つの内腔（例えば、レトロウイルスベクターの内腔と標的細胞の細胞質）の間に接続、例えば、細孔を作り出す。幾つかの実施形態では、フソゲンは、２つ以上のタンパク質の複合体を含み、例えば、いずれのタンパク質も、融合活性のみを有するものではない。幾つかの実施形態では、フソゲンは、標的化ドメインを含む。
本明細書で使用される場合、「インスレーター配列」は、エンハンサーを遮断するか、又はヘテロクロマチンの拡散を防ぐヌクレオチド配列を指す。インスレーター配列は、野生型又は変異体であり得る。
本明細書で使用される「有効量」という用語は、治療される症状及び／又は状態を有意かつ積極的に修正するのに十分な（例えば、陽性の臨床反応を提供する）医薬組成物の量を意味する。医薬組成物に使用するための有効成分の有効量は、治療される特定の状態、状態の重症度、治療の期間、併用療法の性質、使用される特定の有効成分（複数の場合がある）、利用される特定の薬学的に許容可能な賦形剤及び／又は担体、並びに主治医の知識及び専門知識による同様の要因に応じて変化する。
ウイルス、ＶＬＰ又はフソソームに関して本明細書で使用される「外因性作用物質」は、対応する野生型ウイルス又は対応する野生型ソース細胞から作製されたフソゲンに含まれず、コード化されない作用物質を指す。幾つかの実施形態では、外因性作用物質は、天然に存在するタンパク質と比較して（例えば、挿入、欠失、又は置換によって）変更される配列を有するタンパク質又は核酸等、天然には存在しない。幾つかの実施形態では、外因性作用物質は、ソース細胞に自然に存在しない。幾つかの実施形態では、外因性作用物質は、ソース細胞に自然に存在するが、ウイルスに対して外因性である。幾つかの実施形態では、外因性作用物質は、レシピエント細胞に自然に存在しない。幾つかの実施形態では、外因性作用物質は、レシピエント細胞に自然に存在するが、所望のレベル又は所望の時間には存在しない。幾つかの実施形態では、外因性作用物質は、ＲＮＡ又はタンパク質を含む。
本明細書で使用される「薬学的に許容可能な」という用語は、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、又はその他の問題若しくは合併症を伴わず、合理的な利益／リスク比に見合う、ヒト及び動物の組織と接触して使用するのに適した賦形剤、組成物及び／又は剤形を指す。
本明細書で使用される場合、「プロモーター」は、遺伝子コード配列に作動可能に連結された場合に、遺伝子の転写を駆動するシス調節ＤＮＡ配列を指す。プロモーターは、転写因子結合部位を含み得る。幾つかの実施形態では、プロモーターは、遺伝子の遠位にある１つ以上のエンハンサーと協調して機能する。
本明細書で使用される場合、「正の標的細胞特異的調節エレメント」（又は正のＴＣＳＲＥ）は、非標的細胞と比較して標的細胞における外因性作用物質のレベルを増加させる核酸配列を指し、ここで、外因性作用物質をコードする核酸は、正のＴＣＳＲＥに作動可能に連結されている。幾つかの実施形態では、正のＴＣＳＲＥは、機能的核酸配列であり、例えば、正のＴＣＳＲＥは、プロモーター又はエンハンサーを含むことができる。幾つかの実施形態では、正のＴＣＳＲＥは、機能的ＲＮＡ配列をコードし、例えば、正のＴＣＳＲＥは、標的細胞におけるＲＮＡの正しいスプライシングを促進するスプライス部位をコードし得る。幾つかの実施形態では、正のＴＣＳＲＥは、機能的なタンパク質配列をコードする、又は正のＴＣＳＲＥは、タンパク質の正しい翻訳後修飾を促進するタンパク質配列をコードすることができる。幾つかの実施形態では、正のＴＣＳＲＥは、外因性作用物質のダウンレギュレーター又は阻害剤のレベル又は活性を減少させる。
本明細書で使用される場合、「負の標的細胞特異的調節エレメント」（又は負のＴＣＳＲＥ）は、標的細胞と比較して非標的細胞における外因性作用物質のレベルを減少させる核酸配列を指し、外因性作用物質をコードする核酸は、負のＴＣＳＲＥに作動可能に連結されている。幾つかの実施形態では、負のＴＣＳＲＥは、機能的核酸配列、例えば、非標的細胞においてレトロウイルス核酸の分解又は阻害を引き起こすｍｉＲＮＡ認識部位である。幾つかの実施形態では、核酸配列は、機能的ＲＮＡ配列をコードし、例えば、核酸は、外因性タンパク質作用物質をコードするｍＲＮＡに存在するｍｉＲＮＡ配列をコードし、その結果、ｍＲＮＡは、非標的細胞において分解又は阻害される。幾つかの実施形態では、負のＴＣＳＲＥは、外因性作用物質のダウンレギュレーター又は阻害剤のレベル又は活性を増加させる。
本明細書で使用される場合、「非標的細胞特異的調節エレメント」（又はＮＴＣＳＲＥ）は、標的細胞と比較して非標的細胞における外因性作用物質のレベルを低下させる核酸配列を指し、外因性作用物質をコードする核酸は、ＮＴＣＳＲＥに作動可能に連結されている。幾つかの実施形態では、ＮＴＣＳＲＥは、機能的核酸配列、例えば、非標的細胞においてレトロウイルス核酸の分解又は阻害を引き起こすｍｉＲＮＡ認識部位である。幾つかの実施形態では、核酸配列は、機能的ＲＮＡ配列をコードし、例えば、核酸は、外因性タンパク質作用物質をコードするｍＲＮＡに存在するｍｉＲＮＡ配列をコードし、その結果、ｍＲＮＡは、非標的細胞において分解又は阻害される。幾つかの実施形態において、ＮＴＣＳＲＥは、外因性薬剤のダウンレギュレーター又は阻害剤のレベル又は活性を増加させる。「負のＴＣＳＲＥ」及び「ＮＴＣＳＲＥ」という用語は、本明細書では同じ意味で使用される。
本明細書で使用される場合、「非ＣＮＳ細胞特異的調節エレメント」は、非標的細胞特異的調節エレメント（ＮＴＣＳＲＥ）を指し、標的細胞はＣＮＳ細胞である。したがって、非ＣＮＳ細胞特異的調節エレメントは、ＣＮＳ細胞と比較して、非ＣＮＳ細胞における外因性作用物質のレベルを低下させる核酸配列を指し、外因性作用物質をコードする核酸は、非ＣＮＳ細胞特異的調節エレメントに作動可能に連結されている。
本明細書で使用される場合、「再標的化されたフソゲン」は、天然に存在する形態のフソゲンの一部ではない配列を有する標的化部分を含むフソゲンを指す。実施形態では、フソゲンは、天然に存在する形態のフソゲンの標的化部分と比較して、異なる標的化部分を含む。実施形態では、天然に存在する形態のフソゲンは標的化ドメインを欠き、再標的化されたフソゲンは、天然に存在する形態のフソゲンには存在しない標的化部分を含む。実施形態では、フソゲンは、標的化部分を含むように改変される。実施形態では、フソゲンは、例えば、膜貫通ドメイン、融合形成に（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃａｌｌｙ）活性なドメイン、又は細胞質ドメインにおいて、フソゲンの天然に存在する形態と比較して、標的化部分の外側の１つ以上の配列変化を含む。
本明細書で使用される場合、「レトロウイルス核酸」は、単独で、又はヘルパー細胞、ヘルパーウイルス、又はヘルパープラスミドと組み合わせて、レトロウイルス又はレトロウイルスベクターにパッケージングするための少なくとも最小配列要件を含む核酸を指す。幾つかの実施形態では、レトロウイルス核酸は、外因性作用物質、正の標的細胞特異的調節エレメント、非標的細胞特異的調節エレメント、又は負のＴＣＳＲＥを更に含むか、又はコードする。幾つかの実施形態では、レトロウイルス核酸は、５’ＬＴＲ（例えば、統合を促進するため）、Ｕ３（例えば、ウイルスゲノムＲＮＡ転写を活性化するため）、Ｒ（例えば、Ｔａｔ結合領域）、Ｕ５、３’ＬＴＲ（例えば、統合を促進するため）、パッケージング部位（例えば、ｐｓｉ（Ψ））、ＲＲＥ（例えば、Ｒｅｖに結合し、核外エクスポートを促進するため）の１つ以上を含む。レトロウイルス核酸は、ＲＮＡ（例えば、ビリオンの一部である場合）又はＤＮＡ（例えば、ソース細胞に導入される場合、又はレシピエント細胞での逆転写後）を含み得る。幾つかの実施形態では、レトロウイルス核酸は、ヘルパー細胞、ヘルパーウイルス、又はｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖの１つ以上（例えば、全て）を含むヘルパープラスミドを使用してパッケージングされる。
本明細書で使用される場合、「標的細胞」は、フソソーム（例えば、レンチウイルスベクター）が外因性作用物質を送達することが望まれるタイプの細胞を指す。実施形態では、標的細胞は、特定の組織型又はクラスの細胞、例えば、ＣＮＳ細胞、例えばニューロン又はグリア細胞である。幾つかの実施形態では、標的細胞は、疾患細胞、例えば、癌細胞である。幾つかの実施形態では、フソゲン、例えば、再標的化されたフソゲン（単独で、又は正のＴＣＳＲＥ、ＮＴＣＳＲＥ、負のＴＣＳＲＥと組み合わせて、又はそれらの任意の組み合わせ）は、非標的細胞と比較して、標的細胞への外因性作用物質の優先的な送達を導く。
本明細書で使用される場合、「非標的細胞」は、レンチウイルスベクターが外因性作用物質を送達することが望ましくないタイプの細胞を指す。幾つかの実施形態では、非標的細胞は、特定の組織タイプ又はクラスの細胞である。幾つかの実施形態では、非標的細胞は、非疾患細胞、例えば、非癌性細胞である。幾つかの実施形態では、フソゲン、例えば、再標的化されたフソゲン（単独で、又は正のＴＣＳＲＥ、ＮＴＣＳＲＥ、負のＴＣＳＲＥと組み合わせて、又はそれらの任意の組み合わせ）は、標的細胞と比較して、非標的細胞への外因性作用物質のより低い送達を導く。
本明細書で使用される場合、「治療／処置する」、「治療／処置すること」、又は「治療／処置」という用語は、疾患又は障害、例えば、障害の根本原因又はその臨床症状の少なくとも１つを改善すること、例えば、疾患又は障害の発症を遅らせるか、阻止するか、又は低減することを指す。
本明細書で使用される場合、「細胞生物学的物質」は、内腔及び細胞膜を含む細胞の一部、又は部分的若しくは完全な核不活化を有する細胞を指す。幾つかの実施形態では、細胞生物学的物質は、細胞骨格成分、細胞小器官、及びリボソームの１つ以上を含む。実施形態では、細胞生物学的物質は、除核された細胞、微小胞、又は細胞ゴーストである。
ＩＩ．フソソーム、例えば、細胞由来のフソソーム
フソソームは様々な形をとることができる。例えば、幾つかの実施形態では、本明細書に記載のフソソームは、ソース細胞に由来する。フソソームは、例えば、細胞外小胞、微小胞、ナノベシクル、エクソソーム、アポトーシス小体（アポトーシス細胞由来）、微粒子（例えば、血小板から誘導され得る）、エクトソーム（例えば、血清中の好中球及び単球から誘導可能）、プロスタトソーム（前立腺癌細胞から得られる）、カーディオソーム（ｃａｒｄｉｏｓｏｍｅ）（心臓細胞から得られる）、又はそれらの任意の組み合わせであり得るか、又はそれらを含み得る。幾つかの実施形態では、フソソームはソース細胞から自然に放出され、幾つかの実施形態では、ソース細胞は、フソソームの形成を増強するように処理される。幾つかの実施形態では、フソソームは、直径が約１０～１０，０００ｎｍ、例えば、直径が約３０～１００ｎｍである。幾つかの実施形態では、フソソームは、１つ以上の合成脂質を含む。
幾つかの実施形態では、フソソームは、ウイルス、例えば、レトロウイルス、例えば、レンチウイルスであるか、又はそれを含む。例えば、幾つかの実施形態では、両親媒性脂質のフソソームの二重層は、ウイルスエンベロープであり、又はそれらを含む。ウイルスエンベロープは、フソゲン、例えば、ウイルスに内因性であるフソゲン又はシュードタイプ化されたフソゲンを含み得る。幾つかの実施形態では、フソソームの内腔又は空洞は、ウイルス核酸、例えば、レトロウイルス核酸、例えば、レンチウイルス核酸を含む。ウイルス核酸はウイルスゲノムであり得る。幾つかの実施形態では、フソソームは、例えば、その空洞又は内腔に、１つ以上のウイルス非構造タンパク質を更に含む。
フソソームは、標的細胞へのペイロードの送達を促進する様々な特性を有し得る。例えば、幾つかの実施形態では、フソソームとソース細胞は共に、標的細胞と融合することができる粒子を作るのに十分な核酸（複数可）を含む。実施形態では、これらの核酸（複数可）は、次の活性：ｇａｇポリタンパク質活性、ポリメラーゼ活性、インテグラーゼ活性、プロテアーゼ活性、及びフソゲン活性、の１つ以上（例えば、全て）を有するタンパク質をコードする。
フソソームはまた、標的細胞へのペイロードの送達を容易にする様々な構造を含み得る。例えば、幾つかの実施形態では、フソソームとソース細胞は共に、標的細胞と融合することができる粒子を作るのに十分な核酸（複数可）を含む。実施形態では、これらの核酸（複数可）は、次の活性：ｇａｇポリタンパク質活性、ポリメラーゼ活性、インテグラーゼ活性、プロテアーゼ活性、及びフソゲン活性、の１つ以上（例えば、全て）を有するタンパク質をコードする。
フソソームはまた、標的細胞へのペイロードの送達を容易にする様々な構造を含み得る。例えば、幾つかの実施形態では、フソソーム（例えば、ウイルス、例えば、レトロウイルス、例えば、レンチウイルス）は、次タンパク質：ｇａｇポリタンパク質、ポリメラーゼ（例えば、ｐｏｌ）、インテグラーゼ（例えば、機能的又は非機能的バリアント）、プロテアーゼ、及びフソゲン、の１つ以上（例えば、全て）を含む。幾つかの実施形態では、フソソームは更にｒｅｖを含む。幾つかの実施形態では、１つ以上の前述のタンパク質は、レトロウイルスゲノムにコードされ、幾つかの実施形態では、１つ以上の前述のタンパク質は、例えば、ヘルパー細胞、ヘルパーウイルス、又はヘルパープラスミドによってトランスで提供される。幾つかの実施形態では、フソソーム核酸（例えば、レトロウイルス核酸）は、次の核酸配列：５’ＬＴＲ（例えば、Ｕ５を含み、機能的Ｕ３ドメインを欠く）、Ｐｓｉパッケージングエレメント（Ｐｓｉ）、ペイロード遺伝子に作動可能に連結された中央ポリプリン管（ｃＰＰＴ）プロモーター、ペイロード遺伝子（任意に、オープンリーディングフレームの前にイントロンを含む）、ポリＡテール配列、ＷＰＲＥ、及び３’ＬＴＲ（例えば、Ｕ５及び機能的なＵ３を欠いている）、の１つ以上（例えば、全て）を含む。幾つかの実施形態では、フソソーム核酸（例えば、レトロウイルス核酸）は、１つ以上のインスレーター配列を更に含む。幾つかの実施形態では、フソソーム核酸（例えば、レトロウイルス核酸）は、１つ以上のｍｉＲＮＡ認識部位を更に含む。幾つかの実施形態では、１つ以上のｍｉＲＮＡ認識部位は、ポリＡテール配列の下流、例えば、ポリＡテール配列とＷＰＲＥとの間に位置する。
幾つかの実施形態では、本明細書で提供されるフソソームは、被験体、例えば、哺乳動物、例えば、ヒトに投与される。かかる実施形態では、被験体は、特定の疾患又は状態（例えば、本明細書に記載の疾患又は状態）のリスクがあるか、症状があるか、又は診断され得るか、又はそうであると識別され得る。一実施形態では、被験体は、表５又は表６に列挙されているもの等の遺伝子欠損を有する。幾つかの実施形態では、フソソームは、遺伝子欠損を処置するため等、疾患又は状態を処置するための外因性作用物質をコードする核酸配列を含む。
Ａ．ウイルスから生成されたフソソーム。
例えば、幾つかの実施形態では、フソソーム（例えば、ウイルス、例えば、レトロウイルス、例えば、レンチウイルス）は、次タンパク質：ｇａｇポリタンパク質、ポリメラーゼ（例えば、ｐｏｌ）、インテグラーゼ（例えば、機能的又は非機能的バリアント）、プロテアーゼ、及びフソゲン、の１つ以上（例えば、全て）を含む。幾つかの実施形態では、フソソームは更にｒｅｖを含む。幾つかの実施形態では、１つ以上の前述のタンパク質は、レトロウイルスゲノムにコードされ、幾つかの実施形態では、１つ以上の前述のタンパク質は、例えば、ヘルパー細胞、ヘルパーウイルス、又はヘルパープラスミドによってトランスで提供される。幾つかの実施形態では、フソソーム核酸（例えば、レトロウイルス核酸）は、次の核酸配列：５’ＬＴＲ（例えば、Ｕ５を含み、機能的Ｕ３ドメインを欠く）、Ｐｓｉパッケージングエレメント（Ｐｓｉ）、ペイロード遺伝子に作動可能に連結された中央ポリプリン管（ｃＰＰＴ）プロモーター、ペイロード遺伝子（任意に、オープンリーディングフレームの前にイントロンを含む）、ポリＡテール配列、ＷＰＲＥ、及び３’ＬＴＲ（例えば、Ｕ５及び機能的なＵ３を欠いている）、の１つ以上（例えば、全て）を含む。幾つかの実施形態では、フソソーム核酸（例えば、レトロウイルス核酸）は、１つ以上のインスレーター配列を更に含む。幾つかの実施形態では、フソソーム核酸（例えば、レトロウイルス核酸）は、１つ以上のｍｉＲＮＡ認識部位を更に含む。幾つかの実施形態では、１つ以上のｍｉＲＮＡ認識部位は、ポリＡテール配列の下流、例えば、ポリＡテール配列とＷＰＲＥとの間に位置する。
ｉ）レンチウイルス成分及びヘルパー細胞
幾つかの実施形態では、レトロウイルス核酸は、次の１つ以上（例えば、全て）を含む：５’プロモーター（例えば、パッケージされたＲＮＡ全体の発現を制御するため）、５’ＬＴＲ（例えば、Ｒ（ポリアデニル化テールシグナルを含む）及び／又はプライマー活性化シグナルを含むＵ５）、プライマー結合部位、ｐｓｉパッケージングシグナル、核エクスポート用のＲＲＥエレメント、導入遺伝子の発現を制御するための導入遺伝子のすぐ上流のプロモーター、導入遺伝子（又は他の外因性作用物質エレメント）、ポリプリントラクト、及び３’ＬＴＲ（例えば、変異したＵ３、Ｒ、及びＵ５を含む）。幾つかの実施形態では、レトロウイルス核酸は、ｃＰＰＴ、ＷＰＲＥ、及び／又はインスレーター配列の１つ以上を更に含む。
レトロウイルスは通常、そのゲノムＲＮＡを逆転写によって線形二本鎖ＤＮＡコピーに変換し、続いてそのゲノムＤＮＡを宿主ゲノムに共有結合で統合することにより複製する。特定の実施形態での使用に適した例示的なレトロウイルスとしては、限定されるものではないが、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ－ＭｕＬＶ）、モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭｏＭＳＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦＬＶ）、スプマウイルス、フレンドマウス白血病ウイルス、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ））、並びにレンチウイルスが挙げられる。
幾つかの実施形態では、レトロウイルスは、ガンマレトロウイルスである。幾つかの実施形態では、レトロウイルスはイプシロンレトロウイルスである。幾つかの実施形態では、レトロウイルスはアルファレトロウイルスである。幾つかの実施形態では、レトロウイルスはベータレトロウイルスである。幾つかの実施形態では、レトロウイルスはデルタレトロウイルスである。幾つかの実施形態では、レトロウイルスはレンチウイルスである。幾つかの実施形態では、レトロウイルスは、スプーマレトロウイルスである。幾つかの実施形態では、レトロウイルスは内在性レトロウイルスである。
例示的なレンチウイルスとしては、限定されるものではないが、以下が挙げられる：ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス；ＨＩＶ１型及びＨＩＶ２型を含む）；ビスナ・マエディウイルス（ＶＭＶ：ｖｉｓｎａ－ｍａｅｄｉ ｖｉｒｕｓ）ウイルス；ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ：ｃａｐｒｉｎｅ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ－ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）；ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ：ｅｑｕｉｎｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ａｎｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ）；ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ：ｆｅｌｉｎｅ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ）；ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ：ｂｏｖｉｎｅ ｉｍｍｕｎｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ）；及びサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ：ｓｉｍｉａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ。幾つかの実施形態では、ＨＩＶベースのベクター骨格（すなわち、ＨＩＶシス作用性配列エレメント）が使用される。
幾つかの実施形態では、本明細書のベクターは、別の核酸分子を移入又は輸送することができる核酸分子である。移入された核酸は、一般に、ベクター核酸分子に連結、例えば挿入されている。ベクターは、細胞内で自律複製を指示する配列を含み得るか、又は宿主細胞ＤＮＡへの統合能にするのに十分な配列を含み得る。有用なベクターとしては、プラスミド（例えば、ＤＮＡプラスミド又はＲＮＡプラスミド）、トランスポゾン、コスミド、細菌人工染色体、及びウイルスベクターが挙げられる。有用なウイルスベクターとしては、複製欠陥レトロウイルス及びレンチウイルスが挙げられる。
ウイルスベクターは、例えば、通常、核酸分子のトランスファー、又は細胞のゲノム若しくは核酸トランスファーを媒介するウイルス粒子への統合を促進する、ウイルス由来核酸エレメントを含む、核酸分子（例えばトランスファープラスミド）を含むことができる。ウイルス粒子は、通常、核酸（複数の場合がある）に加えて、様々なウイルス成分を含み、時には宿主細胞成分も含む。ウイルスベクターは、例えば、核酸を細胞に移入することができる、又は移入された核酸に（例えば、ネイキッドＤＮＡとして）移すことができるウイルス又はウイルス粒子を含むことができる。ウイルスベクター及びトランスファープラスミドは、主にウイルスに由来する構造及び／又は機能的遺伝子エレメントを含むことができる。レトロウイルスベクターは、主にレトロウイルスに由来する構造的及び機能的遺伝的要素、又はその一部を含むウイルスベクター若しくはプラスミドを含むことができる。レンチウイルスベクターは、主にレンチウイルスに由来する構造的及び機能的遺伝的要素、又はＬＴＲを含むその一部を含むウイルスベクター若しくはプラスミドを含むことができる。
実施形態では、レンチウイルスベクター（例えば、レンチウイルス発現ベクター）は、レンチウイルス転移プラスミド（例えば、ネイキッドＤＮＡとして）又は感染性レンチウイルス粒子を含み得る。クローニング部位、プロモーター、調節エレメント、異種核酸等のようなエレメントに関して、これらのエレメントの配列は、レンチウイルス粒子中にＲＮＡの形態で存在することができ、ＤＮＡプラスミド中にＤＮＡの形態で存在することができることが理解されるべきである。
本明細書に記載の幾つかのベクターでは、複製に寄与する、又は複製に必須である１つ以上のタンパク質コード領域の少なくとも一部が、対応する野生型ウイルスと比較して存在しない可能性がある。これにより、ウイルスベクターの複製に欠陥が生じる。幾つかの実施形態では、ベクターは、標的の非分裂宿主細胞を形質導入すること、及び／又はそのゲノムを宿主ゲノムに統合することができる。
野生型レトロウイルスゲノムの構造は、多くの場合、５’末端反復配列（ＬＴＲ）及び３’ＬＴＲを含み、その間又は内部に、ゲノムのパッケージングを可能にするパッケージングシグナル、プライマー結合部位、宿主細胞ゲノムへの統合を可能にするための統合部位、並びにウイルス粒子のアッセンブリを促進するパッケージング成分をコードするｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子がある。より複雑なレトロウイルスには、ＨＩＶのｒｅｖ及びＲＲＥ配列等の付加機能があり、統合されたプロウイルスのＲＮＡ転写産物を核から感染した標的細胞の細胞質に効率的にエクスポートできる。プロウイルスでは、ウイルス遺伝子の両端に末端反復配列（ＬＴＲ）と呼ばれる領域が隣接している。ＬＴＲは、プロウイルスの統合及び転写に関与している。ＬＴＲはエンハンサー－プロモーター配列としても機能し、ウイルス遺伝子の発現を制御することができる。レトロウイルスＲＮＡのキャプシド形成は、ウイルスゲノムの５’末端に位置するｐｓｉ配列によって起こる。
ＬＴＲ自体は通常、類似した（例えば、同一の）配列であり、Ｕ３、Ｒ、及びＵ５と呼ばれる３つの要素に分割できる。Ｕ３は、ＲＮＡの３’末端に固有の配列に由来する。ＲはＲＮＡの両端で繰り返される配列に由来し、Ｕ５はＲＮＡの５’末端に固有の配列に由来する。３つの要素のサイズは、レトロウイルスによって大きく異なる。
ウイルスゲノムの場合、転写開始部位は通常、一方のＬＴＲのＵ３とＲの境界にあり、ポリ（ａ）の付加（終了）部位はもう一方のＬＴＲのＲとＵ５の境界にある。Ｕ３には、プロウイルスの転写制御エレメントのほとんどが含まれ、これには、細胞、及び場合によってはウイルスの転写活性化タンパク質に応答するプロモーター及び複数のエンハンサー配列が含まれる。幾つかのレトロウイルスは、遺伝子発現の調節に関与するタンパク質をコードする次の遺伝子：ｔｏｔ、ｒｅｖ、ｔａｘ及びｒｅｘのいずれか１つ以上を含む。
構造遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ自体に関しては、ｇａｇはウイルスの内部構造タンパク質をコードしている。ｇａｇタンパク質は、タンパク質分解によって成熟タンパク質ＭＡ（マトリックス）、ＣＡ（キャプシド）、及びＮＣ（ヌクレオキャプシド）にプロセッシングされる。ｐｏｌ遺伝子は、ゲノムの複製を媒介するＤＮＡポリメラーゼ、関連するＲＮａｓｅ Ｈ、及びインテグラーゼ（ＩＮ）を含む逆転写酵素（ＲＴ）をコードする。ｅｎｖ遺伝子は、細胞受容体タンパク質と特異的に相互作用する複合体を形成する、ビリオンの表面（ＳＵ）糖タンパク質と膜貫通（ＴＭ）タンパク質をコードする。この相互作用は、例えばウイルス膜と細胞膜の融合によって感染を促進する。
複製欠損レトロウイルスベクターゲノムｇａｇでは、ｐｏｌ及びｅｎｖが存在しないか、機能していない可能性がある。ＲＮＡの両端のＲ領域は、通常、反復配列である。Ｕ５及びＵ３は、それぞれＲＮＡゲノムの５’及び３’の末端にある固有の配列を表している。
レトロウイルスには、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ以外のタンパク質をコードする追加の遺伝子が含まれている場合もある。追加の遺伝子の例としては、（ＨＩＶでは）ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｘ、ｖｐｕ、ｔａｔ、ｒｅｖ及びｎｅｆの１つ以上が挙げられる。ＥＩＡＶには（とりわけ）追加の遺伝子Ｓ２がある。追加の遺伝子によってコードされるタンパク質は様々な機能を果たし、その幾つかは細胞タンパク質によって提供される機能と重複している可能性がある。例えば、ＥＩＡＶでは、ｔａｔはウイルスＬＴＲの転写活性化因子として機能する（Ｄｅｒｓｅ ａｎｄ Ｎｅｗｂｏｌｄ １９９３ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９４：５３０－６；Ｍａｕｒｙ ｅｔ ａｌ．１９９４ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２００：６３２－４２）。ｔａｔは、ＴＡＲと呼ばれる安定したステムループＲＮＡ二次構造に結合する。Ｒｅｖは、Ｒｅｖ応答配列（ＲＲＥ）を介してウイルス遺伝子の発現を調節及び調整する（Ｍａｒｔａｒａｎｏ ｅｔ ａｌ．１９９４ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：３１０２－１１）。これら２つのタンパク質の作用機序は、霊長類ウイルスの類似の機構とおおむね同じであると考えられている。加えて、膜貫通タンパク質の開始時にｅｎｖコード配列にスプライシングされたｔａｔの最初のエクソンによってコードされるＥＩＡＶタンパク質Ｔｔｍが同定されている。
プロテアーゼ、逆転写酵素、インテグラーゼに加えて、非霊長類レンチウイルスには、ｄＵＴＰａｓｅをコードする４番目のｐｏｌ遺伝子産物が含まれている。これは、これらのレンチウイルスが特定の非分裂細胞又はゆっくりと分裂する細胞型に感染する能力において役割を果たす可能性がある。
実施形態では、組換えレンチウイルスベクター（ＲＬＶ）は、パッケージング成分の存在下で、標的細胞に感染することができるウイルス粒子へのＲＮＡゲノムのパッケージングを可能にするのに十分なレトロウイルス遺伝情報を有するベクターである。標的細胞の感染は、逆転写及び標的細胞ゲノムへの統合を含み得る。ＲＬＶは通常、ベクターによって標的細胞に送達される非ウイルスコード配列を保有する。実施形態では、ＲＬＶは、標的細胞内で感染性レトロウイルス粒子を産生するための独立した複製ができない。通常、ＲＬＶは機能的なｇａｇ－ｐｏｌ及び／又はｅｎｖ遺伝子及び／又は複製に関与する他の遺伝子を欠いている。ベクターは、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＰＣＴ特許出願の国際公開第９９／１５６８３号に記載されているように、スプリットイントロンベクターとして構成され得る。
幾つかの実施形態では、レンチウイルスベクターは、最小のウイルスゲノムを含み、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第９８／１７８１５号に記載されるように、例えば、ウイルスベクターは、感染して、形質導入を行い、標的宿主細胞に目的のヌクレオチド配列を送達するのに必要な機能を提供するために、非必須要素を除去し、必須要素を保持するように操作されている。
最小のレンチウイルスゲノムは、例えば、（５’）Ｒ－Ｕ５－１つ以上の第１ヌクレオチド配列－Ｕ３－Ｒ（３’）を含み得る。しかしながら、ソース細胞内でレンチウイルスゲノムを産生するために使用されるプラスミドベクターはまた、ソース細胞内のゲノムの転写を指示するためにレンチウイルスゲノムに作動可能に連結された転写調節制御配列を含み得る。これらの調節配列は、転写されたレトロウイルス配列、例えば５’Ｕ３領域に関連する天然配列を含み得るか、又は別のウイルスプロモーター、例えばＣＭＶプロモーター等の異種プロモーターを含み得る。一部のレンチウイルスゲノムは、効率的なウイルス産生を促進するための追加の配列を含む。例えば、ＨＩＶの場合、ｒｅｖ及びＲＲＥ配列が含まれる場合がある。代替的に又は組み合わせて、コドン最適化を使用することができ、例えば、外因性作用物質をコードする遺伝子は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第０１／７９５１８号に記載されるように、コドン最適化され得る。ｒｅｖ／ＲＲＥシステムと同様又は同じ機能を実行する代替配列を使用することもできる。例えば、ｒｅｖ／ＲＲＥシステムの機能的アナログは、マソン・ファイザー・サルウイルス（Ｍａｓｏｎ Ｐｆｉｚｅｒ ｍｏｎｋｅｙ ｖｉｒｕｓ）に見られる。これはＣＴＥとして知られており、感染細胞の因子と相互作用すると考えられているゲノム内のＲＲＥタイプの配列を含む。細胞因子は、ｒｅｖ類縁体と考えることができる。したがって、ＣＴＥはｒｅｖ／ＲＲＥシステムの代替として使用できる。加えて、ＨＴＬＶ－ＩのＲｅｘタンパク質は、ＨＩＶ－ＩのＲｅｖタンパク質を機能的に置き換えることができる。Ｒｅｖ及びＲｅｘにはＩＲＥ－ＢＰと同様の効果がある。
幾つかの実施形態では、レトロウイルス核酸（例えば、レンチウイルス核酸、例えば、霊長類又は非霊長類レンチウイルス核酸）は、（１）、ｇａｇにおける欠失が、ｇａｇコーディング配列の約３５０又は３５４ヌクレオチドの下流の１つ以上のヌクレオチドを除去する、欠失したｇａｇ遺伝子を含む；（２）レトロウイルス核酸に存在しない１つ以上のアクセサリー遺伝子を有する；（３）ｔａｔ遺伝子を欠いているが、５’ＬＴＲの終わりとｇａｇのＡＴＧの間にリーダー配列を含む；（４）（１）、（２）、（３）の組み合わせである。一実施形態では、レンチウイルスベクターは、特徴（１）及び（２）及び（３）の全てを含む。この戦略は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第９９／３２６４６号に更に詳細に記載されている。
幾つかの実施形態では、霊長類レンチウイルス最小システムは、ベクター産生、又は分裂細胞及び非分裂細胞の形質導入のいずれかのために、ＨＩＶ／ＳＩＶ追加遺伝子ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｘ、ｖｐｕ、ｔａｔ、ｒｅｖ及びｎｅｆのいずれも必要としない。幾つかの実施形態では、ＥＩＡＶ最小ベクターシステムは、ベクター産生又は分裂細胞及び非分裂細胞の形質導入のいずれにもＳ２を必要としない。
追加の遺伝子の欠失により、レンチウイルス（ＨＩＶ等）感染症の疾患に関連する遺伝子なしでベクターを作製できる可能性がある。特に、ｔａｔは疾患と関連している。第２に、追加の遺伝子の欠失により、ベクターはより異種のＤＮＡをパッケージングすることができる。第３に、Ｓ２のように機能が不明な遺伝子を省略して、望ましくない影響を与えるリスクを減らすことができる。最小レンチウイルスベクターの例は、国際公開第９９／３２６４６号及び国際公開第９８／１７８１５号に開示されている。
幾つかの実施形態では、レトロウイルス核酸は、少なくともｔａｔ及びＳ２（ＥＩＡＶベクターシステムである場合）、及びおそらくｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｘ、ｖｐｕ及びｎｅｆも欠いている。幾つかの実施形態では、レトロウイルス核酸はまた、ｒｅｖ、ＲＲＥ、又はその両方を欠いている。
幾つかの実施形態では、レトロウイルス核酸は、ｖｐｘを含む。Ｖｐｘポリペプチドは、ＳＡＭＨＤ１制限因子に結合してその分解を誘導し、細胞質内の遊離ｄＮＴＰを分解する。したがって、ＶｐｘがＳＡＭＨＤ１を分解し、逆転写活性が増加すると、細胞質内の遊離ｄＮＴＰの濃度が増加し、レトロウイルスゲノムの逆転写及び標的細胞ゲノムへの統合が促進される。
細胞が異なれば、特定のコドンの使用法も異なる。このコドンバイアスは、細胞型における特定のｔＲＮＡの相対的な存在量のバイアスに対応する。対応するｔＲＮＡの相対的な存在量と一致するように調整されるように配列内のコドンを変更することにより、発現を増加させることが可能である。同様に、対応するｔＲＮＡが特定の細胞型でまれであることが知られているコドンを意図的に選択することにより、発現を減少させることが可能である。したがって、追加の翻訳制御が利用可能である。コドン最適化の追加の説明は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第９９／４１３９７号に見られる。
ＨＩＶ及び他のレンチウイルスを含む多くのウイルスは、多数のまれなコドンを使用し、これらを一般的に使用される哺乳動物のコドンに対応するように変更することにより、哺乳動物のプロデューサー細胞におけるパッケージング成分の発現を増加させることができる。
コドン最適化には他にも多くの利点がある。それらの配列の変化のおかげで、パッケージング成分をコードするヌクレオチド配列は、それらから減少又は排除されたＲＮＡ不安定性配列（ＩＮＳ）を有する可能性がある。同時に、パッケージング成分のアミノ酸配列コード配列は、配列によってコードされるウイルス成分が同じままであるか、又は少なくともパッケージング成分の機能が損なわれないように十分に類似しているように保持される。幾つかの実施形態では、コドン最適化はまた、エクスポートのためのＲｅｖ／ＲＲＥ要件を克服し、最適化された配列をＲｅｖに依存しないようにする。幾つかの実施形態では、コドン最適化はまた、ベクターシステム内の異なるコンストラクト間（例えば、ｇａｇ－ｐｏｌ及びｅｎｖオープンリーディングフレームにおける重複領域間）の相同組換えを減少させる。幾つかの実施形態では、コドン最適化は、ウイルス力価の増加及び／又は改善された安全性をもたらす。
幾つかの実施形態では、ＩＮＳに関連するコドンのみがコドン最適化される。他の実施形態では、配列は、ｇａｇ－ｐｏｌのフレームシフト部位を含む配列を除いて、全体としてコドン最適化されている。
ｇａｇ－ｐｏｌ遺伝子は、ｇａｇ－ｐｏｌタンパク質をコードする２つの重複するリーディングフレームを含む。両方のタンパク質の発現は、翻訳中のフレームシフトに依存する。このフレームシフトは、翻訳中のリボソームの「スリッページ（ｓｌｉｐｐａｇｅ）」の結果として発生する。このスリッページは、少なくとも部分的にはリボソームを失速させるＲＮＡの二次構造によって引き起こされると考えられている。このような二次構造は、ｇａｇ－ｐｏｌ遺伝子のフレームシフト部位の下流に存在する。ＨＩＶの場合、重複領域は、ｇａｇの始まりの下流のヌクレオチド１２２２（ヌクレオチド１はｇａｇ ＡＴＧのＡ）からｇａｇの終わり（ｎｔ １５０３）まで広がる。結果として、フレームシフト部位及び２つのリーディングフレームの重複領域にまたがる２８１ｂｐフラグメントは、好ましくは、コドン最適化されていない。幾つかの実施形態では、このフラグメントを保持することは、ｇａｇ－ｐｏｌタンパク質のより効率的な発現を可能にするであろう。ＥＩＡＶの場合、重複の始まりはｎｔ １２６２にある（ヌクレオチド１はｇａｇ ＡＴＧのＡである）。重複の終わりはｎｔ １４６１にある。フレームシフト部位及びｇａｇ－ｐｏｌの重複が確実に維持されるようにするために、野生型配列をｎｔ １１５６～１４６５まで保持することができる。
例えば、便利な制限部位に対応するために、最適なコドン使用法からの導出を行うことができ、保存的アミノ酸変化をｇａｇ－ｐｏｌタンパク質に導入することができる。
幾つかの実施形態では、コドン最適化は、哺乳動物系におけるコドン使用頻度が低いコドンに基づく。第３及び時には第２と第３の塩基を変更してもよい。
遺伝暗号の分解性質のために当業者が多数のｇａｇ－ｐｏｌ配列を達成できることが理解されよう。また、コドン最適化されたｇａｇ－ｐｏｌ配列を生成するための開始点として使用できる多くのレトロウイルスバリアントが記載されている。レンチウイルスのゲノムはかなり変動する可能性がある。例えば、ＨＩＶ－Ｉにはまだ機能している擬似種が多くある。これはＥＩＡＶにも当てはまる。これらのバリアントは、形質導入プロセスの特定の部分を強化するために使用することができる。ＨＩＶ－Ｉバリアントの例は、ロスアラモス国立研究所が管理しているＨＩＶデータベースにある。ＥＩＡＶクローンの詳細は、国立衛生研究所が管理しているＮＣＢＩデータベースにある。
コドン最適化ｇａｇ－ｐｏｌ配列の戦略は、ＥＩＡＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＣＡＥＶ、ＶＭＲ、ＳＩＶ、ＨＩＶ－Ｉ、ＨＩＶ－２等のレトロウイルスに関連して使用できる。更に、この方法は、ＨＴＬＶ－Ｉ、ＨＴＬＶ－２、ＨＦＶ、ＨＳＲＶ、及びヒト内在性レトロウイルス（ＨＥＲＶ）、ＭＬＶ、及びその他のレトロウイルスからの遺伝子の発現を増加させるために使用できる。
上記のように、レトロウイルスベクターのパッケージング成分は、ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子の発現産物を含み得る。更に、パッケージングでは、４つのステムループの短い配列と、それに続くｇａｇ及びｅｎｖからの部分配列をパッケージングシグナルとして利用できる。したがって、（パッケージングコンストラクト上の完全なｇａｇ配列に加えて）レトロウイルスベクターゲノムに欠失されたｇａｇ配列を含めることができる。実施形態では、レトロウイルスベクターは、依然としてｅｎｖ配列を保持するベクター中の２５５～３６０ヌクレオチドのｇａｇ、又はスプライスドナー突然変異であるｇａｇ及びｅｎｖ欠失の特定の組み合わせにおける約４０ヌクレオチドのｇａｇを含むパッケージングシグナルを含む。幾つかの実施形態では、レトロウイルスベクターは、１つ以上の欠失を含むｇａｇ配列を含み、例えば、ｇａｇ配列は、Ｎ末端に由来する約３６０ヌクレオチドを含む。
レトロウイルスベクター、ヘルパー細胞、ヘルパーウイルス、又はヘルパープラスミドは、レトロウイルスの構造及びアクセサリータンパク質、例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｖｐｘ若しくはｎｅｆタンパク質、又は他のレトロウイルスタンパク質を含み得る。幾つかの実施形態では、レトロウイルスタンパク質は、同じレトロウイルスに由来する。幾つかの実施形態では、レトロウイルスタンパク質は、２つ以上のレトロウイルス、例えば、２、３、４、又はそれ以上のレトロウイルスに由来する。
ｇａｇ及びｐｏｌコード配列は、一般に、天然レンチウイルスのＧａｇ－Ｐｏｌ前駆体として編成されている。ｇａｇ配列は、ｐ５５とも呼ばれる５５ｋＤ Ｇａｇ前駆体タンパク質をコードする。ｐ５５は、ＭＡ（マトリックス［ｐ１７］）、ＣＡ（キャプシド［ｐ２４］）、ＮＣ（ヌクレオキャプシド［ｐ９］）、及びｐ６と呼ばれる４つの小さなタンパク質に成熟する過程で、ウイルスにコードされたプロテアーゼ４（ｐｏｌ遺伝子の産物）によって切断される。ｐｏｌ前駆体タンパク質は、ウイルスにコードされたプロテアーゼによってＧａｇから切断され、更に消化されて、プロテアーゼ（ｐ１０）、ＲＴ（ｐ５０）、ＲＮａｓｅ Ｈ（ｐ１５）、及びインテグラーゼ（ｐ３１）の活性を分離する。
ネイティブＧａｇ－Ｐｏｌ配列は、ヘルパーベクター（ヘルパープラスミドやヘルパーウイルス等）で利用することも、変更を加えることもできる。これらの改変にはキメラＧａｇ－Ｐｏｌが含まれ、ここで、Ｇａｇ及びＰｏｌ配列は異なるウイルス（例えば、異なる種、亜種、株、クレード等）から得られる、及び／又は転写及び／又は翻訳を改善するため及び／又は組換えを減らすために配列が改変されている。
様々な例において、レトロウイルス核酸は、（ｉ）野生型ＩＮＳ１と比較してＲＮＡの核外輸送の制限を低減する変異ＩＮＳ１阻害配列を含む、ｇａｇタンパク質の１５０～２５０（例えば、１６８）ヌクレオチド部分をコードするポリヌクレオチドを含み、（ｉｉ）フレームシフト及び早期終了をもたらす２つのヌクレオチド挿入を含み、及び／又は（ｉｉｉ）ｇａｇのＩＮＳ２、ＩＮＳ３、及びＩＮＳ４阻害配列を含まない。
幾つかの実施形態では、本明細書に記載のベクターは、レトロウイルス（例えば、レンチウイルス）配列及び非レンチウイルスウイルス配列の両方を含むハイブリッドベクターである。幾つかの実施形態では、ハイブリッドベクターは、逆転写、複製、組み込み、及び／又はパッケージングのためのレトロウイルス、例えばレンチウイルスの配列を含む。
ある特定の実施形態によれば、ウイルスベクター骨格配列のほとんど又は全ては、レンチウイルス、例えば、ＨＩＶ－１に由来する。しかしながら、レトロウイルス及び／又はレンチウイルス配列の多くの異なる供給源を使用することができ、又は特定のレンチウイルス配列における組み合わされた及び多数の置換及び変更が、本明細書に記載されている機能を実行するトランスファーベクターの能力を損なうことなく適応できることを理解されたい。様々なレンチウイルスベクターがＮａｌｄｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９６ａ、１９９６ｂ、及び１９９８）、Ｚｕｆｆｅｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）、Ｄｕｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９８、米国特許第６，０１３，５１６号、及び米国特許第５，９９４，１３６号に記載されており、それらの多くはレトロウイルス核酸を産生するように適合され得る。
プロウイルスの両端には、通常、長い末端反復（ＬＴＲ）が見られる。ＬＴＲは通常、レトロウイルス核酸の末端に位置するドメインを含み、このドメインは、自然の配列のコンテキストでは、直接反復であり、Ｕ３、Ｒ、及びＵ５領域を含む。ＬＴＲは一般に、レトロウイルス遺伝子の発現（例えば、遺伝子転写産物の促進、開始、及びポリアデニル化）及びウイルス複製を促進する。ＬＴＲは、転写制御エレメント、ポリアデニル化シグナル、及びウイルスゲノムの複製と統合のための配列を含む多数の調節シグナルを含むことができる。ウイルスのＬＴＲは通常、Ｕ３、Ｒ、Ｕ５と呼ばれる３つの領域に分けられる。Ｕ３領域には通常、エンハンサー及びプロモーターの要素が含まれている。Ｕ５領域は通常、プライマー結合部位とＲ領域の間の配列であり、ポリアデニル化配列を含むことができる。Ｒ（リピート）領域は、Ｕ３及びＵ５領域に隣接することができる。ＬＴＲは、典型的には、Ｕ３、Ｒ、及びＵ５領域で構成され、ウイルスゲノムの５’及び３’末端の両方に現れる可能性がある。幾つかの実施形態では、５’ＬＴＲに隣接して、ゲノムの逆転写（ｔＲＮＡプライマー結合部位）及びウイルスＲＮＡの粒子への効率的なパッケージング（Ｐｓｉ部位）のための配列がある。
パッケージングシグナルは、ウイルスキャプシド又は粒子へのウイルスＲＮＡの挿入を媒介するレトロウイルスゲノム内に位置する配列を含むことができる。例えば、Ｃｌｅｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５．Ｊ．ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６９，Ｎｏ．４；ｐｐ．２１０１－２１０９を参照。幾つかのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムのキャプシド形成に最小限のパッケージングシグナル（ｐｓｉ［Ψ］配列）を使用する。
様々な実施形態では、レトロウイルス核酸は、改変された５’ＬＴＲ及び／又は３’ＬＴＲを含む。ＬＴＲのいずれか又は両方は、１つ以上の欠失、挿入、又は置換を含むがこれらに限定されない１つ以上の改変を含み得る。３’ＬＴＲの改変は、ウイルスを複製欠陥にすることによって（例えば、感染性ビリオンが産生されないように完全で効果的な複製ができないウイルス（例えば、複製欠陥レンチウイルスの子孫））、レンチウイルス又はレトロウイルスシステムの安全性を改善するためにしばしば行われる。
幾つかの実施形態では、ベクターは、自己不活化（ＳＩＮ）ベクター、例えば、複製欠損ベクター、例えば、レトロウイルス又はレンチウイルスベクターであり、ここで、Ｕ３領域として知られる右（３’）ＬＴＲエンハンサー－プロモーター領域は、ウイルス複製の最初のラウンドを超えてウイルス転写を防ぐために（例えば、欠失又は置換によって）改変されている。これは、ウイルス複製中に右の（３’）ＬＴＲ Ｕ３領域を左の（５’）ＬＴＲ Ｕ３領域のテンプレートとして使用できるため、Ｕ３エンハンサープロモーターがないとウイルス複製が阻害されるためである。実施形態では、３’ＬＴＲは、Ｕ５領域が、例えば、外因性ポリ（Ａ）配列で除去、変更、又は置換されるように改変される。３’ＬＴＲ、５’ＬＴＲ、又は３’及び５’の両方のＬＴＲは改変されたＬＴＲであり得る。
幾つかの実施形態では、５’ＬＴＲのＵ３領域は、ウイルス粒子の産生中にウイルスゲノムの転写を駆動するために異種プロモーターで置き換えられる。使用できる異種プロモーターの例としては、例えば、ウイルス性シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば、初期又は後期）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（例えば、即時初期）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、及び単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）プロモーターが挙げられる。幾つかの実施形態では、プロモーターは、Ｔａｔ非依存的な方法で高レベルの転写を駆動することができる。特定の実施形態では、異種プロモーターは、ウイルスゲノムが転写される方法を制御することにおいて追加の利点を有する。例えば、ウイルスゲノムの全部又は一部の転写が誘導因子が存在する場合にのみ起こるように、異種プロモーターは誘導性であり得る。誘導因子には、宿主細胞が培養される１つ以上の化合物、又は温度又はｐＨ等の生理学的条件が含まれるが、これらに限定されない。
幾つかの実施形態では、ウイルスベクターは、例えば、レンチウイルス（例えば、ＨＩＶ）ＬＴＲのＲ領域に位置するＴＡＲ（トランス活性化応答）エレメントを含む。この要素は、レンチウイルストランスアクチベーター（ｔａｔ）遺伝子エレメントと相互作用して、ウイルス複製を強化する。しかしながら、このエレメントは、例えば、５’ＬＴＲのＵ３領域が異種プロモーターによって置き換えられている実施形態では必要とされない。
Ｒ領域、例えば、キャッピンググループの開始（すなわち、転写の開始）で始まり、ポリＡトラクトの開始の直前に終了するレトロウイルスＬＴＲ内の領域は、Ｕ３及びＵ５領域に隣接することができる。Ｒ領域は、ゲノムの一方の端からもう一方の端への新生ＤＮＡの転送において、逆転写中に役割を果たす。
レトロウイルス核酸はまた、ＦＬＡＰエレメント、例えば、その配列が、レトロウイルス、例えば、ＨＩＶ－１又はＨＩＶ－２の中央ポリプリン取らくと及び中央終結配列（ｃＰＰＴ及びＣＴＳ）を含む核酸を含み得る。適切なＦＬＡＰ要素は、米国特許第６，６８２，９０７号及びＺｅｎｎｏｕ，ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１：１７３，に記載されており、これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＨＩＶ－１逆転写中、中央ポリプリン取らくと（ｃＰＰＴ）でのプラス鎖ＤＮＡの中央開始と、中央終結配列（ＣＴＳ）での中央終結は、３本鎖ＤＮＡ構造、すなわち１つの中央ＤＮＡフラップの形成につながる可能性がある。幾つかの実施形態では、レトロウイルス又はレンチウイルスベクター骨格は、外因性作用物質をコードする遺伝子の上流又は下流に１つ以上のＦＬＡＰエレメントを含む。例えば、幾つかの実施形態では、転移プラスミドは、ＦＬＡＰエレメント、例えば、ＨＩＶ－１に由来する又はそれから単離されたＦＬＡＰエレメントを含む。
実施形態では、レトロウイルス又はレンチウイルス核酸は、１つ以上のエクスポートエレメント、例えば、核から細胞の細胞質へのＲＮＡ転写産物の輸送を調節するシス作用性転写後調節エレメントを含む。ＲＮＡエクスポートエレメントの例としては、限定されるものではないが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）（例えば、Ｃｕｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：１０５３；及びＣｕｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１．Ｃｅｌｌ ５８：４２３を参照）、及びＢ型肝炎ウイルスの転写後調節エレメント（ＨＰＲＥ）が挙げられ、これらは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。一般に、ＲＮＡエクスポートエレメントは遺伝子の３’ＵＴＲ内に配置され、１つ以上のコピーとして挿入できる。
幾つかの実施形態では、ウイルスベクターにおける異種配列の発現は、例えば、転写後調節エレメント、ポリアデニル化部位、及び転写終結シグナルの１つ以上をベクターに組み込むことによって増加する。様々な転写後調節エレメントは、例えば、ウッドチャック肝炎ウイルスの転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ；Ｚｕｆｆｅｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３：２８８６）；Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＰＲＥ）に存在する転写後調節エレメント（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５：３８６４）等（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，９：１７６６）のタンパク質での異種核酸の発現を増加させることができ、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。幾つかの実施形態では、本明細書に記載のレトロウイルス核酸は、ＷＰＲＥ又はＨＰＲＥ等の転写後調節エレメントを含む。
幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるレトロウイルス核酸は、ＷＰＲＥ又はＨＰＲＥ等の転写後調節エレメントを欠くか、又は含まない。
異種核酸転写産物の終結及びポリアデニル化を指示すエレメントは、例えば、外因性作用物質の発現を増加させるために含まれ得る。転写終結シグナルは、ポリアデニル化シグナルの下流に見られる場合がある。幾つかの実施形態では、ベクターは、外因性作用物質をコードするポリヌクレオチドの３’側のポリアデニル化配列を含む。ポリＡ部位は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによる新生ＲＮＡ転写産物の終結及びポリアデニル化の両方を指示するＤＮＡ配列を含み得る。ポリアデニル化配列は、コード配列の３’末端にポリＡテールを付加することによりｍＲＮＡの安定性を促進し、翻訳効率の向上に貢献する。レトロウイルス核酸で使用できるポリＡシグナルの実例には、ＡＡＴＡＡＡ、ＡＴＴＡＡＡ、ＡＧＴＡＡＡ、ウシ成長ホルモンポリＡ配列（ＢＧＨｐＡ）、ウサギβ－グロビンポリＡ配列（ｒβｇｐＡ）、又は別の適切な異種又は内因性ポリＡ配列が含まれる。
幾つかの実施形態では、レトロウイルス又はレンチウイルスベクターは、１つ以上のインスレーター配列、例えば、本明細書に記載のインスレーター配列を更に含む。
様々な実施形態では、ベクターは、外因性作用物質をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む。ベクターは、１つ以上のＬＴＲを有し得て、ここで、いずれかのＬＴＲは、１つ以上のヌクレオチド置換、付加、又は欠失等の１つ以上の改変を含む。ベクターは、形質導入効率を高めるための１つ以上のアクセサリーエレメント（例えば、ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）、ウイルスパッケージング（例えば、Ｐｓｉ（Ψ）パッケージングシグナル、ＲＲＥ）、及び／又は外因性遺伝子発現を増加させる他の要素（例えば、ポリ（Ａ）配列）であり、任意に、ＷＰＲＥ又はＨＰＲＥを含み得る。
幾つかの実施形態では、レンチウイルス核酸は、プロモーター（例えば、ＣＭＶ）、Ｒ配列（例えば、ＴＡＲを含む）、Ｕ５配列（例えば、統合のため）、ＰＢＳ配列（例えば、逆転写用）、ＤＩＳ配列（例えば、ゲノム二量体化用）、ｐｓｉパッケージングシグナル、部分的ｇａｇ配列、ＲＲＥ配列（例えば、核エクスポートのため）、ｃＰＰＴ配列（例えば、核インポートのため）、外因性作用物質の発現を駆動するプロモーター、外因性作用物質をコードする遺伝子、ＷＰＲＥ配列（例えば、効率的な導入遺伝子発現のため）、ＰＰＴ配列（例えば、逆転写のため）、Ｒ配列（例えば、ポリアデニル化及び終結のため）、及びＵ５シグナル（例えば、統合のため）の１つ以上を、その全て、例えば、５’から３’を含む。
ｉｉ）スプライス部位を除去するために操作されたベクター
幾つかのレンチウイルスベクターは、活性遺伝子の内部に統合され、異常な、場合によってはトランケートな転写産物の形成につながる可能性のある強力なスプライシング及びポリアデニル化シグナルを持っている。
プロトオンコジーン活性化のメカニズムは、挿入変異原のゲノムに含まれるプロモーターエレメント又はスプライス部位と、統合の標的となる細胞転写ユニットとの相互作用に由来するキメラ転写産物の生成を伴う可能性がある（Ｇａｂｒｉｅｌ ｅｔ ａｌ．２００９．Ｎａｔ Ｍｅｄ １５：１４３１－１４３６；Ｂｏｋｈｏｖｅｎ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８３：２８３－２９）。ベクター配列と細胞ｍＲＮＡを含むキメラ融合転写産物は、ベクター配列から始まり隣接する細胞遺伝子に進むリードスルー転写によって、又はその逆によって生成することができる。
幾つかの実施形態では、本明細書に記載のレンチウイルス核酸は、例えば、レンチウイルスベクターの安全性プロファイルを改善するために、スプライス部位の少なくとも２つが除去されたレンチウイルス骨格を含む。かかるスプライス部位の種及び同定の方法は、国際公開第２０１２１５６８３９号Ａ２に記載され、これらは全て参照により含まれている。
ｉｉｉ）レトロウイルスの生産方法
大規模なウイルス粒子の産生は、所望のウイルス力価を達成するためにしばしば有用である。ウイルス粒子は、ウイルスの構造及び／又はアクセサリー遺伝子、例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｖｐｘ若しくはｎｅｆ遺伝子、又はその他のレトロウイルス遺伝子を含むパッケージング細胞株にトランスファーベクターをトランスフェクトすることによって産生することができる。
実施形態では、パッケージングベクターは、パッケージングシグナルを欠き、そして１、２、３、４、又はそれ以上のウイルス構造及び／又はアクセサリー遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター又はウイルスベクターである。通常、パッケージングベクターはパッケージング細胞に含まれ、トランスフェクション、形質導入、又は感染を介して細胞に導入される。レトロウイルス、例えばレンチウイルスのトランスファーベクターを、トランスフェクション、形質導入、又は感染を介してパッケージング細胞株に導入して、ソース細胞又は細胞株を生成することができる。パッケージングベクターは、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、リポフェクション又はエレクトロポレーションを含む標準的な方法によって、ヒト細胞又は細胞株に導入することができる。幾つかの実施形態では、パッケージングベクターは、ネオマイシン、ハイグロマイシン、ピューロマイシン、ブラストシジン、ゼオシン、チミジンキナーゼ、ＤＨＦＲ、Ｇｌｎ合成酵素又はＡＤＡ等の主要な選択可能マーカーと共に細胞に導入され、続いて、適切な薬物の存在下で選択されてクローンが分離される。選択可能なマーカー遺伝子は、パッケージングベクターによって、例えば、ＩＲＥＳ又は自己切断ウイルスペプチドによってコードする遺伝子に物理的に連結することができる。
パッケージング細胞株には、パッケージングシグナルを含まないが、ウイルス粒子をパッケージングできるウイルス構造タンパク質及び複製酵素（例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ）を安定的又は一時的に発現する細胞株が含まれる。任意の適切な細胞株、例えば、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞を使用することができる。使用できる適切な細胞株としては、例えば、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、Ｃ３Ｈ １０Ｔ１／２細胞、ＦＬＹ細胞、Ｐｓｉ－２細胞、ＢＯＳＣ ２３細胞、ＰＡ３１７細胞、ＷＥＨＩ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＳＣ １細胞、ＢＳＣ ４０細胞、ＢＭＴ １０細胞、ＶＥＲＯ細胞、Ｗ１３８細胞、ＭＲＣ５細胞、Ａ５４９細胞、ＨＴ１０８０細胞、２９３細胞、２９３Ｔ細胞、Ｂ－５０細胞、３Ｔ３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｓａｏｓ－２細胞、Ｈｕｈ７細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｗ１６３細胞、２１１細胞、及び２１１Ａ細胞が挙げられる。実施形態では、パッケージング細胞は、２９３細胞、２９３Ｔ細胞、又はＡ５４９細胞である。
ソース細胞株としては、パッケージング細胞株及びパッケージングシグナルを含むトランスファーベクターコンストラクトを含む、組換えレトロウイルス粒子を産生することができる細胞株が挙げられる。ウイルスストック溶液を調製する方法は、例えば、Ｙ．Ｓｏｎｅｏｋａ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：６２８－６３３、及びＮ．Ｒ．Ｌａｎｄａｕ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：５１１０－５１１３によって解説されており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。感染性ウイルス粒子は、例えば、細胞溶解、又は細胞培養物の上清の収集によって、パッケージング細胞から収集され得る。必要に応じて、収集されたウイルス粒子は、濃縮又は精製され得る。
ｉｖ）プラスミド及び細胞株のパッケージング
幾つかの実施形態では、ソース細胞は、ウイルス構造タンパク質、及びウイルス粒子をパッケージングできる複製酵素（例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ）をコードする１つ以上のプラスミドを含む。幾つかの実施形態では、ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ前駆体のうちの少なくとも２つをコードする配列は、同じプラスミド上にある。幾つかの実施形態では、ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ前駆体をコードする配列は、異なるプラスミド上にある。幾つかの実施形態では、ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ前駆体をコードする配列は、同じ発現シグナル、例えば、プロモーターを有する。幾つかの実施形態では、ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ前駆体をコードする配列は、異なる発現シグナル、例えば、異なるプロモーターを有する。幾つかの実施形態では、ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ前駆体の発現は誘導可能である。幾つかの実施形態では、ウイルス構造タンパク質及び複製酵素をコードするプラスミドを同時に又は異なる時間にトランスフェクトする。幾つかの実施形態では、パッケージングベクターからウイルス構造タンパク質及び複製酵素をコードするプラスミドを同時に又は異なる時間にトランスフェクトする。
幾つかの実施形態では、ソース細胞株は、１つ以上の安定して組み込まれたウイルス構造遺伝子を含む。幾つかの実施形態では、安定して組み込まれたウイルス構造遺伝子の発現は誘導可能である。
幾つかの実施形態では、ウイルス構造遺伝子の発現は、転写レベルで調節される。幾つかの実施形態では、ウイルス構造遺伝子の発現は、翻訳レベルで調節される。幾つかの実施形態では、ウイルス構造遺伝子の発現は、翻訳後レベルで調節される。
幾つかの実施形態では、ウイルス構造遺伝子の発現は、テトラサイクリン（Ｔｅｔ）依存性システムによって調節され、ここで、Ｔｅｔ調節転写リプレッサー（Ｔｅｔ－Ｒ）は、プロモーターに含まれるＤＮＡ配列に結合し、立体障害によって転写を抑制する（Ｙａｏ ｅｔ ａｌ，１９９８；Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ，２００５）。ドキシサイクリン（ｄｏｘ）を添加すると、Ｔｅｔ－Ｒが放出され、転写が可能になる。複数の他の適切な転写調節プロモーター、転写因子、及び小分子誘導因子は、ウイルス構造遺伝子の転写を調節するのに適している。
幾つかの実施形態では、第３世代レンチウイルス成分、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ）Ｒｅｖ、Ｇａｇ／Ｐｏｌ、及びＴｅｔ調節プロモーターの制御下にあり、抗生物質耐性カセットと結合したエンベロープが、ソース細胞ゲノムに別々に組み込まれる。幾つかの実施形態では、ソース細胞は、Ｒｅｖ、Ｇａｇ／Ｐｏｌのそれぞれの１つのコピー、及びゲノムに組み込まれたエンベロープタンパク質のみを有する。
幾つかの実施形態では、外因性作用物質をコードする核酸（例えば、外因性作用物質をコードするレトロウイルス核酸）もまた、ソース細胞ゲノムに組み込まれる。幾つかの実施形態では、外因性作用物質をコードする核酸は、エピソーム的に維持される。幾つかの実施形態では、外因性作用物質をコードする核酸は、ゲノム内に安定して組み込まれたＲｅｖ、Ｇａｇ／Ｐｏｌ、及びエンベロープタンパク質を有するソース細胞にトランスフェクトされる。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＭｉｌａｎｉ ｅｔ ａｌ．ＥＭＢＯ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１７を参照。
幾つかの実施形態では、本明細書に記載のレトロウイルス核酸は、逆転写を受けることができない。かかる核酸は、実施形態では、外因性作用物質を一時的に発現することができる。レトロウイルス又はＶＬＰは、無効化された逆転写酵素タンパク質を含み得るか、又は逆転写酵素タンパク質を含まない場合がある。実施形態では、レトロウイルス核酸は、無効化されたプライマー結合部位（ＰＢＳ）及び／又はａｔｔ部位を含む。実施形態では、ｒｅｖ、ｔａｔ、ｖｉｆ、ｎｅｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｖｐｘ及びＳ２又はそれらの機能的等価物を含む１つ以上のウイルスアクセサリー遺伝子は、無効化されるか、又はレトロウイルス核酸に存在しない。実施形態では、Ｓ２、ｒｅｖ及びｔａｔから選択される１つ以上のアクセサリー遺伝子は、無効化されるか、又はレトロウイルス核酸に存在しない。
ｖ）レトロウイルス核酸をパッケージングするための戦略
通常、最新のレトロウイルスベクターシステムは、ウイルスＲＮＡのウイルス粒子への転写、逆転写、組み込み、翻訳、及びパッケージングのためのシス作用性ベクター配列を有するウイルスゲノム、及び（２）ウイルス粒子の産生に必要なトランス作用性レトロウイルス遺伝子配列（例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ）を発現するプロデューサー細胞株からなる。シス及びトランス作用のベクター配列を完全に分離することにより、ウイルスは感染の２回以上のサイクルで複製を維持することができない。生きたウイルスの生成は、幾つかの戦略によって、例えば、組換えを回避するためにシス及びトランス作用配列間の重複を最小限に抑えることによって、回避され得る。
ウイルスＲＮＡを欠くか又は欠く配列を含むウイルスベクター粒子は、配列からウイルスＲＮＡを除去又は排除した結果である可能性がある。一実施形態では、これは、ｇａｇ上の内因性パッケージングシグナル結合部位を使用することによって達成することができる。或いは、内因性パッケージングシグナル結合部位はｐｏｌ上にある。この実施形態では、送達されるＲＮＡは、同族のパッケージングシグナルを含むであろう。別の実施形態では、送達されるＲＮＡ上に位置する異種結合ドメイン（ｇａｇに対して異種である）、及びｇａｇ又はｐｏｌ上に位置する同族結合部位を使用して、送達されるＲＮＡのパッケージングを確実にすることができる。異種配列は非ウイルス性であってもよく、又はウイルス性であってもよく、その場合、異なるウイルスに由来する可能性がある。ベクター粒子を使用して治療用ＲＮＡを送達することができ、その場合、機能的インテグラーゼ及び／又は逆転写酵素は必要とされない。これらのベクター粒子はまた、目的の治療遺伝子を送達するために使用することができ、その場合、通常、ｐｏｌが含まれる。
一実施形態では、ｇａｇ－ｐｏｌが変更され、パッケージングシグナルが対応するパッケージングシグナルに置き換えられる。この実施形態では、粒子は、新しいパッケージング信号でＲＮＡをパッケージングすることができる。このアプローチの利点は、ウイルス配列を欠くＲＮＡ配列、例えばＲＮＡｉをパッケージングできることである。
別のアプローチは、パッケージ化されるＲＮＡの過剰発現に依存することである。一実施形態では、パッケージングされるＲＮＡは、パッケージングシグナルを含むＲＮＡの不在下で過剰発現される。これにより、かなりのレベルの治療用ＲＮＡがパッケージングされる可能性があり、この量は細胞に形質導入して生物学的効果をもたらすのに十分である。
幾つかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ウイルスｇａｇタンパク質又はレトロウイルスｇａｇ及びｐｏｌタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ｇａｇタンパク質又はｐｏｌタンパク質は、ＲＮＡ配列中の対応する配列を認識して、ウイルスベクター粒子へのＲＮＡ配列のパッケージングを容易にすることができる異種ＲＮＡ結合ドメインを含む。
幾つかの実施形態では、異種ＲＮＡ結合ドメインは、バクテリオファージコートタンパク質、Ｒｅｖタンパク質、Ｕ１小核リボヌクレオタンパク質粒子のタンパク質、Ｎｏｖａタンパク質、ＴＦ１１１Ａタンパク質、ＴＩＳ１１タンパク質、ｔｒｐ ＲＮＡ結合減衰タンパク質（ＴＲＡＰ）又はプソイドウリジン合成酵素に由来するＲＮＡ結合ドメインを含む。
幾つかの実施形態では、本明細書の方法は、複製能力のあるレトロウイルスの不在を検出又は確認することを含む。この方法は、ガンマレトロウイルス又はレンチウイルス等の複製能力のあるレトロウイルスに感染した特定の細胞において遺伝子産物が発現されるが、異種核酸で細胞を形質導入するために使用されるウイルスベクターには存在せず、複製能力のあるレトロウイルスを含まない細胞には存在及び／又は発現されない、又は存在及び／又は発現されるとは予想されていない、ウイルス遺伝子、例えば構造遺伝子又はパッケージング遺伝子等の１つ以上の標的遺伝子のＲＮＡレベルを評価することを含み得る。複製能力のあるレトロウイルスは、１つ以上の標的遺伝子のＲＮＡレベルが、例えば標的遺伝子を含む陽性対照サンプルから直接的又は間接的に測定できる参照値よりも高い場合に存在すると決定され得る。詳細な開示については、国際公開第２０１８０２３０９４号Ａ１を参照。
ｖｉ）ソース細胞内の外因性作用物質をコードする遺伝子の抑制
ソース細胞で（過剰）発現されたタンパク質は、ベクタービリオンの集合及び／又は感染力に間接的又は直接的な影響を与える可能性がある。外因性作用物質のベクタービリオンへの取り込みも、ベクター粒子の下流プロセシングに影響を与える可能性がある。
幾つかの実施形態では、組織特異的プロモーターを使用して、ソース細胞における外因性作用物質の発現を制限する。幾つかの実施形態では、異種翻訳制御システムは、真核細胞培養において使用されて、ソース細胞における外因性作用物質の翻訳を抑制する。より具体的には、レトロウイルス核酸は、外因性作用物質をコードする遺伝子に作動可能に連結された結合部位を含み得て、ここで、結合部位は、外因性作用物質の翻訳がソース細胞において抑制又は防止されるように、ＲＮＡ結合タンパク質と相互作用することができる。
幾つかの実施形態では、ＲＮＡ結合タンパク質は、トリプトファンＲＮＡ結合弱毒化タンパク質（ＴＲＡＰ）、例えば、細菌のトリプトファンＲＮＡ結合弱毒化タンパク質である。ＲＮＡ結合タンパク質（例えば、細菌のｔｒｐオペロンレギュレータータンパク質、トリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質、ＴＲＡＰ）、及びそれが結合するＲＮＡ標的の使用は、ソース細胞内の導入遺伝子の翻訳を抑制又は防止する。このシステムは、ベクター生産細胞系における導入遺伝子抑制（Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ Ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｉｎ ｖｅｃｔｏｒ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｃｅｌｌ ｓｙｓｔｅｍ）又はＴＲＩＰシステムと呼ばれる。
実施形態では、ＮＯＩ翻訳開始コドンの上流にＲＮＡ結合タンパク質（例えば、ＴＲＡＰ結合配列、ｔｂｓ）の結合部位を配置することにより、ベクターＲＮＡの産生又は安定性への悪影響を伴わずに、内部発現カセットに由来するｍＲＮＡの翻訳の特異的抑制が可能になる。外因性作用物質をコードする遺伝子のｔｂｓと翻訳開始コドンとの間のヌクレオチドの数は、０～１２ヌクレオチドで変化し得る。ｔｂｓは、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）の下流に配置して、マルチシストロン性ｍＲＮＡの外因性作用物質をコードする遺伝子の翻訳を抑制することができる。
ｖｉｉ）キルスイッチ（ｋｉｌｌ ｓｗｉｔｃｈ）システム及び増幅
幾つかの実施形態では、外因性作用物質をコードする遺伝子を保有するポリヌクレオチド又は細胞は、自殺遺伝子、例えば、誘導性自殺遺伝子を利用して、直接毒性の及び／又は制御されない増殖のリスクを低減する。特定の態様において、自殺遺伝子は、外因性作用物質を宿す宿主細胞に対して免疫原性ではない。自殺遺伝子の例には、カスパーゼ－９、カスパーゼ－８、又はシトシンデアミナーゼが含まれる。カスパーゼ－９は、特定の二量体化化学誘導物質（ＣＩＤ）を使用して活性化され得る。
特定の実施形態では、ベクターは、標的細胞、例えば、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞をｉｎ ｖｉｖｏでネガティブ選択に感受性にする遺伝子セグメントを含む。例えば、形質導入された細胞は、個体のｉｎ ｖｉｖｏ状態の変化の結果として排除され得る。ネガティブ選択可能な表現型は、投与された作用物質、例えば化合物に感受性を与える遺伝子の挿入に起因し得る。ネガティブ選択可能な遺伝子は当技術分野で知られており、とりわけ以下を含む：ガンシクロビル感受性を付与する単純ヘルペスウイルスＩ型チミジンキナーゼ（ＨＳＶ－Ｉ ＴＫ）遺伝子（Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １１：２２３，１９７７）；細胞ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）遺伝子、細胞アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＡＰＲＴ）遺伝子、及び細菌シトシンデアミナーゼ（Ｍｕｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８９：３３（１９９２））。
幾つかの実施形態では、形質導入された細胞、例えば、Ｔ細胞等の免疫エフェクター細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでネガティブ選択可能な表現型の細胞の選択を可能にするポジティブマーカーを更に含むポリヌクレオチドを含む。ポジティブ選択マーカーは、標的細胞に導入されると、遺伝子を保有する細胞のポジティブ選択を可能にする優性表現型を発現する遺伝子であり得る。このタイプの遺伝子としては、とりわけ、ハイグロマイシンＢに対する耐性を付与するハイグロマイシン－Ｂホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｐｈ）、抗生物質Ｇ４１８、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）に対する耐性をコードするＴｎ５由来のアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏ又はａｐｈ）、アデノシンデアミナーゼ遺伝子（ＡＤＡ）、及び多剤耐性（ＭＤＲ）遺伝子が挙げられる。
幾つかの実施形態では、ポジティブ選択可能マーカー及びネガティブ選択可能エレメントは、ネガティブの選択可能エレメントの喪失が必然的にポジティブの選択可能マーカーの喪失も伴うように連結される。例えば、一方を失うともう一方を失うことになるように、ポジティブ及びネガティブの選択可能なマーカーを融合することができる。上記の所望のポジティブ及びネガティブの選択機能の両方を与えるポリペプチドを発現産物としてもたらす融合ポリヌクレオチドの例は、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼチミジンキナーゼ融合遺伝子（ＨｙＴＫ）である。この遺伝子の発現は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのポジティブの選択に対してハイグロマイシンＢ耐性、及びｉｎ ｖｉｖｏでのネガティブの選択に対してガンシクロビル感受性を与えるポリペプチドを生成する。Ｌｕｐｔｏｎ Ｓ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．及びＣｅｌｌ．Ｂｉｏｌｏｇｙ １ １：３３７４－３３７８，１９９１を参照されたい。更に、実施形態では、キメラ受容体をコードするポリヌクレオチドは、融合遺伝子、特にｉｎ ｖｉｔｒｏでのポジティブの選択に対するハイグロマイシンＢ耐性、及びｉｎ ｖｉｖｏでのネガティブの選択に対するガンシクロビル感受性を与える融合遺伝子を含む、レトロウイルスベクター、例えば、前出のＬｕｐｔｏｎ Ｓ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ，（１９９１）に記載されるＨｙＴＫレトロウイルスベクターに存在する。ドミナントポジティブ選択マーカーとネガティブ選択マーカーの融合に由来する二機能性選択融合遺伝子の使用について説明しているＰＣＴ Ｕ５９１／０８４４２及びＰＣＴ／Ｕ５９４／０５６０１の公報も参照。
適切なポジティブ選択マーカーは、ｈｐｈ、ｎｃｏ、及びｇｐｔからなる群から選択される遺伝子に由来し、適切なネガティブ選択マーカーは、シトシンデアミナーゼ、ＨＳＶ－Ｉ ＴＫ、ＶＺＶ ＴＫ、ＨＰＲＴ、ＡＰＲＴ、及びｇｐｔからなる群から選択される遺伝子に由来し得る。他の適切なマーカーは、ポジティブ選択可能マーカーがｈｐｈ又はｎｅｏに由来し、ネガティブ選択可能マーカーがシトシンデアミナーゼ若しくはＴＫ遺伝子、又は選択可能マーカーに由来する、二機能性選択可能融合遺伝子である。
ｖｉｉｉ）レンチウイルスの統合を調節するための戦略
レトロウイルス又はレンチウイルスゲノムの標的細胞ゲノムへの統合を防ぐために、重要なタンパク質／配列が欠如しているか又は無効にされているレトロウイルス及びレンチウイルス核酸が開示されている。例えば、レトロウイルスインテグラーゼの高度に保存されたＤＤＥモチーフ（Ｅｎｇｅｌｍａｎ ａｎｄ Ｃｒａｉｇｉｅ（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：６３６１－６３６９；Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：７６４８－７６５２；Ｋｈａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：８５１－８６０）は、統合欠損レトロウイルス核酸の生産を可能にする。
例えば、幾つかの実施形態では、本明細書のレトロウイルス核酸は、当該インテグラーゼがウイルスゲノムの細胞ゲノムへの統合を触媒することができないようにする突然変異を含むレンチウイルスインテグラーゼを含む。幾つかの実施形態では、当該突然変異は、統合に直接影響を与えるＩ型突然変異、又はビリオン形態形成及び／又は逆転写に影響を与える多面発現欠陥を誘発するＩＩ型突然変異である。Ｉ型突然変異の実例の非限定的な例は、インテグラーゼの触媒コアドメインに関与する３つの残基のいずれかに影響を与える突然変異である：ＤＸ３９－５８ＤＸ３５Ｅ（ＨＩＶ－１のインテグラーゼのＤ６４、Ｄ１１６及びＥ１５２残基）。特定の実施形態では、当該インテグラーゼがウイルスゲノムの細胞ゲノムへの統合を触媒することができないようにする突然変異は、インテグラーゼの触媒コアドメインのＤＤＥモチーフの１つ以上のアミノ酸残基の置換であり、好ましくは当該ＤＥＥモチーフの１つ目のアスパラギン酸残基のアスパラギン残基による置換である。幾つかの実施形態では、レトロウイルスベクターは、インテグラーゼタンパク質を含まない。
幾つかの実施形態では、レトロウイルスは、活性な転写ユニットに統合される。幾つかの実施形態では、レトロウイルスは、転写開始部位、遺伝子の５’末端、又はＤＮＡｓｅ１切断部位の近くに統合されない。幾つかの実施形態では、レトロウイルスの統合は、癌原遺伝子を活性化せず、又は腫瘍抑制遺伝子を不活化しない。幾つかの実施形態では、レトロウイルスは遺伝毒性ではない。幾つかの実施形態では、レンチウイルスはイントロンに統合する。
幾つかの実施形態では、レトロウイルス核酸は、特定のコピー数で標的細胞のゲノムに統合する。平均コピー数は、単一の細胞、細胞の集団、又は個々の細胞コロニーから決定することができる。コピー数を決定するための例示的な方法には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及びフローサイトメトリーが含まれる。
幾つかの実施形態では、外因性作用物質をコードするＤＮＡは、ゲノム統合される。幾つかの実施形態では、外因性作用物質をコードするＤＮＡは、エピソーム的に維持される。幾つかの実施形態では、外因性作用物質をコードするエピソームＤＮＡに統合される比は、少なくとも０．０１、０．１、０．５、１．０、２、５、１０、１００である。
幾つかの実施形態では、外因性作用物質をコードするＤＮＡは線形である。幾つかの実施形態では、外因性作用物質をコードするＤＮＡは環状である。幾つかの実施形態では、外因性作用物質をコードするＤＮＡの線形コピーと環状コピーの比は、少なくとも０．０１、０．１、０．５、１．０、２、５、１０、１００である。
実施形態では、外因性作用物質をコードするＤＮＡは、１つのＬＴＲを含む環状である。幾つかの実施形態では、外因性作用物質をコードするＤＮＡは、２つのＬＴＲを含む環状である。幾つかの実施形態では、外因性作用物質をコードする環状の１つのＬＴＲを含むＤＮＡ、及び外因性作用物質をコードする環状の２つのＬＴＲを含むＤＮＡとの比は、少なくとも０．１、０．５、１．０、２、５、１０、２０、５０、１００である。
ｉｘ）エピソームウイルスの維持
統合が不十分なレトロウイルスでは、逆転写の環状ｃＤＮＡ副産物（例えば、１－ＬＴＲ及び２－ＬＴＲ）は、宿主ゲノムに統合されることなく細胞核に蓄積する可能性がある（Ｙａｎｅｚ－Ｍｕｎｏｚ Ｒ Ｊ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２００６，１２：３４８－３５３）。次に、他の外因性ＤＮＡのように、これらの中間体を、同じ周波数（例えば、１０３～１０５／細胞）で細胞ＤＮＡに統合することができる。
幾つかの実施形態では、エピソームレトロウイルス核酸は複製しない。エピソームウイルスＤＮＡは、真核生物の複製起点及び足場／核マトリックスと会合するためのマトリックス結合領域（Ｓ／ＭＡＲ）を含めることにより、複製細胞で維持されるように改変することができる。
したがって、幾つかの実施形態では、本明細書に記載のレトロウイルス核酸は、真核生物の複製起点又はそのバリアントを含む。対象となる真核生物の複製起点の例は、Ａｌａｄｊｅｍ ｅｔ ａｌ（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９５，２７０：８１５－８１９）によって記載されているβ－グロビン遺伝子の複製起点、Ｐｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００３，２７８（２２）：１９６４９－５９に記載されたような、以前にサルＣＶ－１細胞及びヒト皮膚線維芽細胞から単離されたアルファ－サテライト配列と関連する自立複製配列に由来するコンセンサス配列であり、ヒトｃ－ｍｙｃプロモーター領域の複製起点はＭｃＷｉｎｎｅｙ ａｎｄ Ｌｅｆｆａｋ（ＭｃＷｉｎｎｅｙ Ｃ．ａｎｄ Ｌｅｆｆａｋ Ｍ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９９０，１８（５）：１２３３－４２）によって記載されている。実施形態では、バリアントは、真核生物において複製を開始する能力を実質的に維持する。複製を開始する特定の配列の能力は、任意の適切な方法、例えば、ブロモデオキシウリジンの取り込み及び密度シフトに基づく自律複製アッセイによって決定することができる（Ａｒａｕｊｏ Ｆ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，前出；Ｆｒａｐｐｉｅｒ Ｌ．ｅｔ ａｌ．）
幾つかの実施形態では、レトロウイルス核酸は、足場／マトリックス付着領域（Ｓ／ＭＡＲ）又はそのバリアント、例えば、長さが数百塩基対の非コンセンサス様ＡＴリッチＤＮＡエレメントを含み、これは、タンパク質の足場又は細胞核のマトリックスへの周期的な付着によって、真核生物のゲノムの核ＤＮＡをクロマチンドメインへと組織化する。それらは典型的には、隣接領域、クロマチン境界領域、イントロン等の非コード領域に見られる。Ｓ／ＭＡＲ領域の例は、Ｂｏｄｅ ｅｔ ａｌ（Ｂｏｄｅ Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９２，２５５：１９５－７）によって記載されるヒトＩＦＮ－γ遺伝子（ｈＩＦＮ－γｌａｒｇｅ）の１．８ｋｂｐ Ｓ／ＭＡＲ、Ｒａｍｅｚａｎｉ（Ｒａｍｅｚａｎｉ Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ２００３，１０１：４７１７－２４）によって記載されているヒトＩＦＮ－γ遺伝子のＳ／ＭＡＲ ０．７Ｋｂｐ最小領域（ｈＩＦＮ－γｓｈｏｒｔ）、Ｍｅｓｎｅｒ Ｌ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２００３，１００：３２８１－８６）によって記載されているヒトヒトデヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子（ｈＤＨＦＲ）のＳ／ＭＡＲの０．２Ｋｂｐ最小領域である。実施形態では、Ｓ／ＭＡＲの機能的に同等のバリアントは、Ｓ／ＭＡＲ機能に寄与することが一緒に又は単独で示唆されている６つの規則のセットに基づいて選択された配列である（Ｋｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ（１９９６）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ３３，３０５；Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ（１９９７）Ｎｕｃｌ．これらのルールを、ｇｅｎｏｍｅｃｌｕｓｔｅｒ．ｓｅｃｓ．ｏａｋｌａｎｄ．ｅｄｕ／ＭＡＲ－Ｗｉｚで無料で入手できるＭＡＲ－Ｗｉｚコンピュータープログラムにマージした。実施形態では、バリアントは、それが由来するＳ／ＭＡＲの同じ機能、特に、核マトリックスに特異的に結合する能力を実質的に維持する。当業者は、例えば、Ｍｅｓｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｍｅｓｎｅｒ Ｌ．Ｄ．ｅｔ ａｌ，前出）に記載されたｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏのＭＡＲアッセイによって、特定のバリアントが核マトリックスに特異的に結合することができるかどうかを決定することができる。幾つかの実施形態では、特定のバリアントがＤＮＡ鎖分離の傾向を示す場合、特定の配列はＳ／ＭＡＲのバリアントである。この特性は、平衡統計力学の方法に基づく特定のプログラムを使用して決定できる。応力誘起二重不安定化（ＳＩＤＤ）分析手法は、Ｂｏｄｅ ｅｔ ａｌ（２００５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５８，５９７に定義されるように、「［．．．］課せられたレベルの超らせん応力が、ＤＮＡ配列に沿った各位置で二重鎖を開くために必要な自由エネルギーを減少させる程度を計算する。結果は、強い不安定化の部位が深部最小値として現れ、ＳＩＤＤプロファイルとして表示される［．．．］」。ＳＩＤＤアルゴリズム及び数学的基礎（Ｂｉ ａｎｄ Ｂｅｎｈａｍ（２００４）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２０，１４７７）、並びにＳＩＤＤプロファイルの分析は、ＷｅｂＳＩＤＤ（ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅｃｅｎｔｅｒ．ｕｃｄａｖｉｓ．ｅｄｕ／ｂｅｎｈａｍ）において無料で入手できるインターネットリソースを使用して実行できる。したがって、幾つかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、それがＳ／ＭＡＲと同様のＳＩＤＤプロファイルを示す場合、Ｓ／ＭＡＲ配列のバリアントと見なされる。
Ｂ．細胞由来のフソソーム
フソソームの組成物は、培養中の細胞、例えば、培養された哺乳動物細胞、例えば、培養されたヒト細胞から生成され得る。細胞は、始原細胞又は非始原（例えば、分化した）細胞であり得る。細胞は、初代細胞又は細胞株（例えば、哺乳動物、例えば、ヒト、本明細書に記載の細胞株）であり得る。実施形態では、培養細胞は、始原細胞、例えば、骨髄間質細胞、骨髄由来成体前駆細胞（ＭＡＰＣ）、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）、芽細胞、脳室下帯に形成された中間前駆細胞、神経幹細胞、筋肉幹細胞、衛星細胞、肝臓幹細胞、造血幹細胞、骨髄間質細胞、表皮幹細胞、胚性幹細胞、間葉系幹細胞、臍帯幹細胞、前駆細胞、筋肉前駆細胞、筋芽細胞、心筋芽球、神経前駆細胞、グリア前駆細胞、神経前駆細胞、肝芽球である。
幾つかの実施形態では、ソース細胞は、内皮細胞、線維芽球、血液細胞（例えば、マクロファージ、好中球、顆粒球、白血球）、幹細胞（例えば、間葉系幹細胞、臍帯幹細胞、骨髄幹細胞、造血幹細胞、誘導多能性幹細胞、例えば、被験体の細胞に由来する誘導多能性幹細胞）、胚性幹細胞（例えば、胚性卵黄嚢、胎盤、臍帯からの幹細胞、胎児の皮膚、思春期の皮膚、血液、骨髄、脂肪組織、赤血球産生組織、造血組織）、筋芽細胞、実質細胞（例えば、肝細胞）、肺胞細胞、ニューロン（例えば、網膜神経細胞）、前駆細胞（例えば、網膜前駆細胞、骨髄芽球、骨髄前駆細胞、胸腺細胞、減数母細胞、巨核芽球、前巨核芽球、メラニン形成芽細胞、リンパ芽球、骨髄前駆細胞、正赤芽球、又は血管芽球）、始原細胞（例えば、心臓始原細胞、衛星細胞、放射状グリア細胞、骨髄間質細胞、膵臓始原細胞、内皮始原細胞、芽球細胞）、又は不死化細胞（例えば、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３、ＨＦＦ－１、ＭＲＣ－５、ＷＩ－３８、ＩＭＲ９０、ＩＭＲ９１、ＰＥＲ．Ｃ６、ＨＴ－１０８０、又はＢＪ細胞）である。
培養細胞は、上皮、結合、筋肉、又は神経の組織又は細胞、並びにそれらの組み合わせに由来する細胞であり得る。フソソームは、任意の真核生物の（例えば哺乳動物）器官系に由来する培養細胞から、例えば、心臓血管系（心臓、血管系）；消化器系（食道、胃、肝臓、胆嚢、膵臓、腸、結腸、直腸及び肛門）；内分泌系（視床下部、下垂体、松果体又は松果体、甲状腺、副甲状腺、副腎）；排泄システム（腎臓、尿管、膀胱）；リンパ系（リンパ、リンパ節、リンパ管、扁桃腺、咽頭扁桃、胸腺、脾臓）；外皮系（皮膚、髪、爪）；筋肉系（例えば、骨格筋）；神経系（脳、脊髄、神経）；生殖器系（卵巣、子宮、乳腺、精巣、精管、精嚢、前立腺）；呼吸器系（咽頭、喉頭、気管、気管支、肺、横隔膜）；骨格系（骨、軟骨）、及びそれらの組み合わせから生成され得る。実施形態では、細胞は、高度に有糸分裂する組織（例えば、上皮、胚組織、骨髄、腸陰窩等の高度に有糸分裂する健康な組織）に由来する。実施形態では、組織サンプルは、代謝性の高い組織（例えば、骨格組織、神経組織、心筋細胞）である。
幾つかの実施形態では、細胞は、若いドナー、例えば、２５歳、２０歳、１８歳、１６歳、１２歳、１０歳、８歳、５歳、１歳以下のドナーに由来する。幾つかの実施形態では、細胞は胎児組織に由来する。
幾つかの実施形態では、細胞は、被験体に由来し、同じ被験体又は類似の遺伝的特徴（例えば、ＭＨＣ適合）を有する被験体に投与される。
特定の実施形態では、細胞は、長さが３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、又は１００００ヌクレオチドを超える（例えば、長さが４，０００～１０，０００ヌクレオチド、長さが６，０００～１０，０００ヌクレオチド）平均サイズのテロメアを有する。
幾つかの実施形態では、フソソームは、本明細書に記載のフソソーム組成物の供給源として使用するための望ましい表現型又は遺伝子型に基づいて同定、選択、又は選択された細胞クローンから生成される。例えば、細胞クローンは、低いミトコンドリア突然変異負荷、長いテロメア長、分化状態、又は特定の遺伝的特徴（例えば、レシピエントに一致する遺伝的特徴）に基づいて識別、選択、又は選択される。
本明細書に記載のフソソーム組成物は、１つの細胞又は組織源からの、又は供給源の組み合わせからのフソソームで構成され得る。例えば、フソソーム組成物は、異種供給源（例えば、動物、前述の種の細胞の組織培養物）、同種異系、自己由来、異なるタンパク質濃度及び分布をもたらす特定の組織（肝臓、骨格、神経、脂肪など）由来、異なる代謝状態の細胞由来（例えば、解糖系、呼吸系）のフソソームを含み得る。組成物はまた、本明細書の他の場所に記載されているように、異なる代謝状態、例えば、結合された又は非結合のフソソームを含み得る。
幾つかの実施形態では、フソソームは、フソゲン、例えば、本明細書に記載のフソゲンを発現するソース細胞から生成される。幾つかの実施形態では、フソゲンは、ソース細胞の膜、例えば、脂質二重層膜、例えば、細胞表面膜、又は細胞内膜（例えば、リソソーム膜）に配置される。幾つかの実施形態では、フソソームは、細胞表面膜に配置されたフソゲンを有するソース細胞から生成される。
幾つかの実施形態では、フソソームは、エクソソーム、マイクロベシクル、膜ベシクル、細胞外膜ベシクル、原形質膜ベシクル、巨大原形質膜ベシクル、アポトーシス小体、マイト粒子（ｍｉｔｏｐａｒｔｉｃｌｅ）、ピレノサイト、リソソーム、又は他の膜封入ベシクルの出芽を誘導することによって生成される。
幾つかの実施形態では、フソソームは、細胞除核を誘導することによって生成される。除核は、遺伝的、化学的（例えば、アクチノマイシンＤを使用、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ Ｄ，ｓｅｅ Ｂａｙｏｎａ－Ｂａｆａｌｕｙｅｔ ａｌ．，「Ａ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｅｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ＤＮＡ ｔｏ ρ ｃｅｌｌｓ」 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００３ Ａｕｇ １５；３１（１６）：ｅ９８を参照）、機械的な方法（例えば、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，「Ａ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｔｈｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｔｗｏ ｅｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｐｉｇ ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ：ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｑｕｅｅｚｉｎｇ ａｎｄ ｔｈｅ ａｓｐｉｒａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ．」Ａｎｉｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００８；１９（２）：７１－９を参照）などのアッセイ、又はそれらの組み合わせを使用して行われ得る。除核とは、核を完全に除去するだけでなく、細胞が核を含むが機能しないように、その典型的な位置から核を移動させることも指す。
実施形態では、フソソームを作製することは、細胞ゴースト、巨大原形質膜小胞、又はアポトーシス小体を産生することを含む。実施形態では、フソソーム組成物は、１つ以上細胞ゴースト、巨大原形質膜小胞及びアポトーシス小体を含む。
幾つかの実施形態では、フソソームは、細胞断片化を誘導することによって生成される。幾つかの実施形態では、細胞断片化は、化学的方法、機械的方法（例えば、遠心分離（例えば、超遠心分離、又は密度遠心分離）、凍結融解、又は超音波処理）、又はそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない以下の方法を使用して実施することができる。
幾つかの実施形態では、フソソームは、例えば、本明細書に記載されるように、以下の方法のいずれか１つ、全て、又は組み合わせによって、フソゲンを発現するソース細胞から生成され得る。
ｉ）マイト粒子、エクソソーム、又は他の膜で囲まれた小胞の出芽を誘発する；
ｉｉ）以下の方法のいずれか又はそれらの組み合わせによって、核の不活性化、例えば、除核を誘発する：
ａ）遺伝的方法；
ｂ）例えばアクチノマイシンＤを使用する化学的方法；又は
ｃ）機械的方法、例えば、圧搾又は吸引；又は
ｉｉｉ）例えば、以下の方法のいずれか又はそれらの組み合わせによって、細胞断片化を誘導する：
ａ）化学的方法；
ｂ）機械的方法、例えば、遠心分離（例えば、超遠心分離又は密度遠心分離）；凍結融解；又は超音波処理。
ｉ）フソソーム生成前の細胞への改変
幾つかの態様では、改変は、フソソーム生成の前に、被験体、組織又は細胞の改変などの細胞に対して行われる。そのような改変は、例えば、融合、フソゲンの発現又は活性、カーゴの構造若しくは機能、又は標的細胞の構造若しくは機能を改善するのに効果的であり得る。
ａ）物理的な改変
幾つかの実施形態では、細胞は、フソソームを生成する前に物理的に改変される。例えば、本明細書の他の場所に記載されているように、フソゲンは、細胞の表面に連結され得る。
幾つかの実施形態では、細胞は、フソソームを生成する前に化学薬剤で処理される。例えば、細胞は、化学的又は脂質フソゲンが、細胞の表面と非共有結合的又は共有結合的に相互作用するか、又は細胞の表面内に埋め込まれるように、化学的又は脂質フソゲンで処理され得る。幾つかの実施形態では、細胞は、細胞膜中の脂質の融合特性を増強するために薬剤で処理される。
幾つかの態様では、細胞は、器官、組織又は細胞型に対するフソソームの標的化を増強する合成又は内因性の小分子又は脂質のための１つ以上の共有結合性又は非共有結合性の付着部位を細胞表面に有するフソソームを生成する前に物理的に改変される。
実施形態では、フソソームは、内因性分子のレベルの増加又は減少を含む。例えば、フソソームは、天然に存在するソース細胞にも自然に存在するが、フソソームよりも高い又はより低いレベルで存在する内因性分子を含み得る。幾つかの実施形態では、ポリペプチドは、ソース細胞又はフソソームにおける外因性核酸から発現される。幾つかの実施形態では、ポリペプチドは、供給源から単離され、そしてソース細胞又はフソソームにロードされるか、又は結合される。
幾つかの実施形態では、細胞は、細胞内の内因性フソゲン（例えば、幾つかの実施形態では、ソース細胞に対して内因性である、また、幾つかの実施形態では、標的細胞に対して内因性である）の発現又は活性を増加させるためにフソソームを生成する前に、化学薬剤、例えば、小分子で処理される。幾つかの実施形態では、小分子は、内因性フソゲンの転写活性化因子の発現又は活性を増加させ得る。幾つかの実施形態では、小分子は、内因性フソゲンの転写抑制因子の発現又は活性を低下させ得る。幾つかの実施形態では、小分子は、内因性フソゲンの発現を増加させるエピジェネティック修飾因子である。
幾つかの実施形態では、フソソームは、融合停止化合物、例えば、リゾホスファチジルコリンで処理された細胞から生成される。幾つかの実施形態では、フソソームは、フソゲン、例えば、アキュターゼ（Ａｃｃｕｔａｓｅ）を切断しない解離試薬で処理された細胞から生成される。
幾つかの実施形態では、ソース細胞は、フソソームを生成してフソゲンの濃度を追加又は増加させる前に、例えば、ＣＲＩＳＰＲアクチベーターで物理的に修飾される。
幾つかの実施形態では、細胞は、量を増加又は減少させるか、又はオルガネラ、例えば、ミトコンドリア、ゴルジ装置、小胞体、細胞内小胞（リソソーム、オートファゴソームなど）の構造又は機能を増強するように物理的に改変される。
ｂ）遺伝子組換え
幾つかの実施形態では、細胞は、細胞内の内因性フソゲン（例えば、幾つかの実施形態では、ソース細胞に対して内因性である、また、幾つかの実施形態では、標的細胞に対して内因性である）の発現を増加させるためにフソソームを生成する前に、遺伝子改変される。幾つかの実施形態では、遺伝子改変は、内因性フソゲンの転写活性化因子の発現又は活性を増加させ得る。幾つかの実施形態では、遺伝子改変は、内因性フソゲンの転写抑制因子の発現又は活性を減少させ得る。幾つかの態様では、活性化因子又はリプレッサーは、ガイドＲＮＡによって内因性フソゲンを標的とする転写活性化因子又はリプレッサーに連結されたヌクレアーゼ不活性Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）である。幾つかの実施形態では、遺伝子改変は、内因性フソゲン遺伝子をエピジェネティックに改変して、その発現を増加させる。幾つかの態様では、エピジェネティック活性化因子は、ガイドＲＮＡによって内因性フソゲンを標的とするエピジェネティック修飾因子に連結されたヌクレアーゼ不活性ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）である。
幾つかの実施形態では、細胞は、細胞内の外因性フソゲンの発現、例えば導入遺伝子の送達を増加させるために、フソソームを生成する前に遺伝子改変される。幾つかの態様では、核酸、例えばＤＮＡ、ｍＲＮＡ又はｓｉＲＮＡは、例えば器官、組織又は細胞標的化に使用される細胞表面分子（タンパク質、グリカン、脂質又は低分子量分子）の発現を増加又は減少させるために、フソソームを生成する前に細胞に移入される。幾つかの実施形態では、核酸は、フソゲン子のリプレッサー、例えば、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡの構築物を標的とする。幾つかの実施形態では、核酸は、フソゲンリプレッサーの阻害因子をコードする。
幾つかの実施形態では、この方法は、フソゲンをコードするソース細胞に対して外因性である核酸をソース細胞に導入することを含む。外因性核酸は、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡであり得る。幾つかの実施形態では、外因性核酸は、例えば、ＤＮＡ、ｇＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｐｒｅ－ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡなどであり得る。幾つかの実施形態では、外因性ＤＮＡは、線状ＤＮＡ、環状ＤＮＡ、又は人工染色体であり得る。幾つかの実施形態では、ＤＮＡはエピソーム的に維持される。幾つかの実施形態では、ＤＮＡはゲノムに組み込まれる。外因性ＲＮＡは、化学的に修飾されたＲＮＡであり得て、例えば、１つ以上の骨格修飾、糖修飾、非カノニカル塩基、又はキャップを含み得る。骨格修飾としては、例えば、ホスホロチオエート、Ｎ３’ホスホルアミダイト、ボラノホスフェート、ホスホノアセテート、チオ－ＰＡＣＥ、モルフォリノホスホルアミダイト、又はＰＮＡが挙げられる。糖修飾としては、例えば、２’－Ｏ－Ｍｅ、２’Ｆ、２’Ｆ－ＡＮＡ、ＬＮＡ、ＵＮＡ、及び２’－Ｏ－ＭＯＥが挙げられる。非カノニカル塩基としては、例えば、５－ブロモ－Ｕ、及び５－ヨード－Ｕ、２，６－ジアミノプリン、Ｃ－５プロピニルピリミジン、ジフルオロトルエン、ジフルオロベンゼン、ジクロロベンゼン、２－チオウリジン、シュードウリジン、及びジヒドロウリジンが挙げられる。キャップとしては、例えば、ＡＲＣＡが挙げられる。追加の修飾は、例えば、Ｄｅｌｅａｖｅｙ ｅｔ ａｌ．，「Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｇｅｎｅ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ」Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌｕｍｅ １９，Ｉｓｓｕｅ ８，２４ Ａｕｇｕｓｔ ２０１２，Ｐａｇｅｓ ９３７－９５４で議論されており、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
幾つかの態様では、細胞は、細胞内のソース細胞と比較して外因性であるフソゲンの発現又は活性を増加させるために、フソソームを生成する前に化学薬剤、例えば小分子で処理される。幾つかの実施形態では、小分子は、外因性フソゲンの転写活性化因子の発現又は活性を増加させ得る。幾つかの実施形態では、小分子は、外因性フソゲンの転写抑制因子の発現又は活性を低下させ得る。幾つかの実施形態では、小分子は、外因性フソゲンの発現を増加させるエピジェネティック修飾因子である。
幾つかの実施形態では、核酸は、改変されたフソゲンをコードする。例えば、調節可能な融合活性、例えば、特定の細胞型、組織型、又は局所的な微小環境活性を有するフソゲン。そのような調節可能な融合活性には、低ｐＨ、高ｐＨ、熱、赤外光、細胞外酵素活性（真核生物又は原核生物）、又は小分子、タンパク質若しくは脂質の曝露によるフソゲン活性の活性化及び／又は開始が含まれ得る。幾つかの実施形態では、小分子、タンパク質、又は脂質は、標的細胞上に表示される。
幾つかの態様では、細胞は、シグナル伝達経路（例えば、Ｗｎｔ／ベータ－カテニン経路）の発現を変化させる（すなわち、アップレギュレート又はダウンレギュレートする）ために、フソソームを生成する前に遺伝子改変される。幾つかの態様では、細胞は、目的の１つ以上の遺伝子の発現を変化させる（例えば、アップレギュレート又はダウンレギュレートする）ために、フソソームを生成する前に遺伝子改変される。幾つかの実施形態では、細胞は、核酸（例えば、ｍｉＲＮＡ又はｍＲＮＡ）又は目的の核酸の発現を変更する（例えば、アップレギュレート又はダウンレギュレートする）ために、フソソームを生成する前に遺伝子改変される。幾つかの実施形態では、核酸、例えばＤＮＡ、ｍＲＮＡ又はｓｉＲＮＡは、例えばシグナル伝達経路、遺伝子又は核酸の発現を増加又は減少させるために、フソソームを生成する前に細胞に移入される。幾つかの実施形態では、核酸は、シグナル伝達経路、遺伝子若しくは核酸のリプレッサーを標的とするか、又はシグナル伝達経路、遺伝子若しくは核酸を抑制する。幾つかの実施形態では、核酸は、シグナル伝達経路、遺伝子、又は核酸をアップレギュレート又はダウンレギュレートする転写因子をコードする。幾つかの実施形態では、アクチベーター又はリプレッサーは、ガイドＲＮＡによってシグナル伝達経路、遺伝子、又は核酸を標的とする転写アクチベーター又はリプレッサーに連結されたヌクレアーゼ不活性ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）である。幾つかの実施形態では、遺伝子改変は、内因性シグナル伝達経路、遺伝子、又は核酸をその発現に対してエピジェネティックに改変する。幾つかの実施形態では、エピジェネティック活性化因子は、ガイドＲＮＡによってシグナル伝達経路、遺伝子又は核酸を標的とするエピジェネティック修飾因子に連結されたヌクレアーゼ不活性ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）である。幾つかの態様では、細胞のＤＮＡは、フソソームを生成する前に編集されて、シグナル伝達経路（例えば、Ｗｎｔ／ベータ－カテニン経路）、遺伝子、又は核酸の発現を変化させる（例えば、アップレギュレート又はダウンレギュレートする）。幾つかの実施形態では、ＤＮＡは、ガイドＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１又は他の遺伝子編集技術を使用して編集される。
細胞は、組換え法を使用して遺伝子改変され得る。所望の遺伝子をコードする核酸配列は、組換え法を使用して、例えば、遺伝子を発現する細胞からライブラリをスクリーニングすることによって、それを含むことが公知のベクターから遺伝子を誘導することによって、又は標準的な技術を使用して、それを含む細胞及び組織から直接単離することによって得ることができる。或いは、目的の遺伝子は、クローニングするのではなく、合成的に作製することができる。
天然又は合成核酸の発現は、典型的には、目的の遺伝子をコードする核酸をプロモーターに作動可能に連結し、構築物を発現ベクターに組み込むことによって達成される。ベクターは、真核生物における複製及び組込みに適し得る。典型的なクローニングベクターは、転写ターミネーター及び翻訳ターミネーター、開始配列、並びに所望の核酸配列の発現に有用なプロモーターを含む。
幾つかの態様では、細胞は、１つ以上の発現領域、例えば遺伝子で遺伝子改変され得る。幾つかの実施形態では、細胞は、外因性遺伝子（例えば、ＲＮＡ又はポリペプチド産物などの外因性遺伝子産物を発現することができる）及び／又は外因性調節核酸で遺伝子改変され得る。幾つかの実施形態では、細胞は、標的細胞に対して内因性である遺伝子産物をコードする外因性配列及び／又は内因性遺伝子の発現を調節することができる外因性調節核酸で遺伝子改変され得る。幾つかの実施形態では、細胞は、外因性遺伝子及び／又は外因性遺伝子の発現を調節する調節核酸で遺伝子改変され得る。幾つかの実施形態では、細胞は、外因性遺伝子及び／又は内因性遺伝子の発現を調節する調節核酸で遺伝子改変され得る。本明細書に記載の細胞は、例えば標的細胞の内因性又は外因性ゲノムの遺伝子産物に作用し得るタンパク質又は調節因子をコードする様々な外因性遺伝子を発現するように遺伝子改変され得ることが当業者によって理解されよう。幾つかの実施形態では、そのような遺伝子は、フソソームに特徴を付与し、例えば、標的細胞との融合を調節する。幾つかの実施形態では、細胞は、内因性遺伝子及び／又は調節核酸を発現するように遺伝子改変され得る。幾つかの実施形態では、内因性遺伝子又は調節核酸は、他の内因性遺伝子の発現を調節する。幾つかの実施形態では、細胞は、他の染色体上の内因性遺伝子及び／又は調節核酸のバージョンとは異なって（例えば、誘導的に、組織特異的に、構成的に、又はより高いレベル若しくはより低いレベルで）発現される内因性遺伝子及び／又は調節核酸を発現するように遺伝子改変され得る。
プロモーターエレメント、例えばエンハンサーは、転写開始の頻度を調節する。典型的には、これらは、開始部位の３０～１１０ｂｐ上流の領域に位置するが、幾つかのプロモーターは、最近、開始部位の下流にも機能的要素を含有することが示されている。プロモーターエレメント間の間隔はしばしば柔軟であり、その結果、エレメントが互いに反転又は移動した場合にプロモーター機能が保存される。チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターでは、活性が低下し始める前に、プロモーターエレメント間の間隔を５０ｂｐまで広げることができる。プロモーターに応じて、個々のエレメントは、転写を活性化するために協調的又は独立して機能し得るようである。
適切なプロモーターの一例は、前初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列である。このプロモーター配列は、それに作動可能に連結された任意のポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を駆動することができる強力な構成的プロモーター配列である。適切なプロモーターの別の例は、伸長成長因子－１α（ＥＦ－１α）である。しかしながら、限定されないが、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ロングターミナルリピート（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、鳥類白血病ウイルスプロモーター、エプスタインバーウイルス前初期プロモーター、ルース肉腫ウイルスプロモーターと並んで、限定されないがアクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、及びクレアチンキナーゼプロモーターなどのヒト遺伝子プロモーターを含む、他の構成的プロモーター配列も使用され得る。
更に、本発明は、構成的プロモーターの使用に限定されるべきではない。誘導性プロモーターも本発明の一部として企図される。誘導性プロモーターの使用は、そのような発現が望まれる場合に作動可能に連結されるポリヌクレオチド配列の発現をオンにすることができるか、又は発現が望まれない場合に発現をオフにすることができる分子スイッチを提供する。誘導性プロモーターの例としては、組織特異的プロモーター、メタロチオニンプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター及びテトラサイクリンプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、フソソームが生成される前、例えば、フソソームが生成される３、６、９、１２、２４、２６、４８、６０又は７２時間前に、フソゲンの発現がアップレギュレートされる。
供給源に導入される発現ベクターはまた、ウイルスベクターを介してトランスフェクト又は感染されることが求められる細胞の集団からの発現細胞の同定及び選択を容易にするために、選択マーカー遺伝子若しくはレポーター遺伝子のいずれか又は両方を含有することができる。他の態様では、選択マーカーは、別個のＤＮＡ片に担持され、同時トランスフェクションの手順で使用され得る。選択マーカー及びレポーター遺伝子の両方を、宿主細胞における発現を可能にするための適切な調節配列に隣接させることができる。有用な選択マーカーとしては、例えば、ｎｅｏなどの抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。
レポーター遺伝子は、潜在的にトランスフェクトされた細胞を同定し、調節配列の機能性を評価するために使用され得る。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエント供給源に存在しないか又はレシピエント供給源によって発現されず、その発現が何らかの容易に検出可能な特性、例えば酵素活性によって明らかにされるポリペプチドをコードする遺伝子である。レポーター遺伝子の発現は、ＤＮＡがレシピエント細胞に導入された後の適切な時点でアッセイされる。適切なレポーター遺伝子には、ルシフェラーゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼ、又は緑色蛍光タンパク質遺伝子（例えば、Ｕｉ－Ｔｅｉ ｅｔ ａｌ．，２０００ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４７９：７９－８２）をコードする遺伝子が含まれ得る。適切な発現系は周知であり、公知の技術を用いて調製され得るか、又は商業的に入手され得る。一般に、レポーター遺伝子の最高レベルの発現を示す最小５’隣接領域を有する構築物がプロモーターとして同定される。このようなプロモーター領域は、レポーター遺伝子に連結され、プロモーター駆動型転写を調節する能力について作用物質を評価するために使用され得る。
幾つかの実施形態では、細胞は、１つ以上のタンパク質の発現を変化させるように遺伝子改変され得る。１つ以上のタンパク質の発現は、特定の時間、例えば、供給源の発生又は分化状態のために改変され得る。幾つかの実施形態では、融合活性、構造又は機能に影響を及ぼす１つ以上のタンパク質、例えば、フソゲンタンパク質又は非フソゲンタンパク質の発現を変化させるように遺伝子改変された細胞の供給源から、フソソームが生成される。１つ以上のタンパク質の発現は、特定の位置（複数可）に制限されてもよく、又は供給源全体に広がっていてもよい。
幾つかの実施形態では、フソゲンタンパク質の発現は改変される。幾つかの実施形態では、フソソームは、フソゲンタンパク質の発現が改変された、例えば、少なくとも１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、９０％又はそれ以上のフソゲンの発現の増加又は減少を有する細胞から生成される。
幾つかの実施形態では、細胞は、フソゲンタンパク質を標的とする細胞質酵素（例えば、プロテアーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、デメチラーゼ、メチルトランスフェラーゼ、アセチラーゼ）を発現するように操作され得る。幾つかの態様では、細胞質酵素は、翻訳後修飾を変化させることによって１つ以上のフソゲンに影響を及ぼす。タンパク質の翻訳後タンパク質修飾は、栄養素の利用可能性及び酸化還元条件に対する応答性、並びにタンパク質－タンパク質相互作用に影響を及ぼし得る。幾つかの実施形態では、フソソームは、変更された翻訳後修飾、例えば、少なくとも１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、９０％又はそれ以上の翻訳後修飾の増加又は減少を有するフソゲンを含む。
改変を細胞に導入する方法には、物理的、生物学的及び化学的な方法が含まれる。例えば、Ｇｅｎｇ．＆Ｌｕ，Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｌａｂ ｏｎ ａ Ｃｈｉｐ．１３（１９）：３８０３－２１．２０１３；Ｓｈａｒｅｉ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ａ ｖｅｃｔｏｒ－ｆｒｅｅ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．ＰＮＡＳ ｖｏｌ．１１０ ｎｏ．６．２０１３；Ｙｉｎ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｏｎ－ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ－ｂａｓｅｄ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．１５：５４１－５５５．２０１４を参照。本明細書に記載のフソソームの生成に使用するために細胞を改変するための適切な方法としては、例えば、拡散、浸透圧、浸透圧パルス、浸透圧ショック、低張溶解、低張透析、イオノフォレシス、エレクトロポレーション、超音波処理、マイクロインジェクション、カルシウム沈殿、膜挿入、脂質媒介トランスフェクション、洗浄剤処理、ウイルス感染、受容体媒介エンドサイトーシス、タンパク質伝達ドメインの使用、粒子発火、膜融合、凍結融解、機械的破壊、及び濾過が挙げられる。
遺伝子改変の存在の確認には、様々なアッセイが含まれる。そのようなアッセイとしては、例えば、サザンブロッティング及びノーザンブロッティング、ＲＴ－ＰＣＲ及びＰＣＲなどの分子生物学的アッセイ；例えば、免疫学的手段（ＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロット）又は本明細書に記載のアッセイにより、特定のペプチドの存在若しくは不在を検出するなどの生化学的アッセイが挙げられる。
本開示は、幾つかの態様では、（ａ）脂質二重層、（ｂ）脂質二重層によって取り囲まれた内腔（例えば、細胞質ゾルを含む）、（ｃ）外因性又は過剰発現されたフソゲン（例えば、フソゲン脂質二重層に配置され、フソソームがソース細胞に由来する）を含み、フソソームは、部分的又は完全な核不活性化（例えば、核除去）を有するフソソームを提供する。
本開示は、幾つかの態様では、ソース細胞に由来する複数のフソソームを含むフソソーム組成物であって、複数のフソソームは、（ａ）脂質二重層；（ｂ）細胞質ゾルを含む内腔であって、脂質二重層に囲まれている内腔；（ｃ）脂質二重層内に配置された外因性又は過剰発現されたフソゲン；（ｄ）カーゴ、例えば、ペイロード遺伝子を含む核酸を含み；フソソームは核を含まず；フソソーム組成物中のウイルスキャプシドタンパク質の量は総タンパク質の１％未満であり、（ｉ）複数のフソソームは、標的細胞及び非標的細胞を含む細胞集団と接触される場合、カーゴは、非標的細胞又は参照細胞よりも少なくとも１０倍多く標的細胞に存在するか、又は（ｉｉ）複数のフソソームは標的細胞よりも、少なくとも少なくとも５０％の非標的細胞又は参照細胞とより速い速度で融合し、標的細胞が、汎ニューロン細胞、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、グルタミン酸作動性ニューロン、コリン作動性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、セロトニン作動性ニューロン、グリア細胞、星状膠細胞、ミクログリア細胞、乏突起膠細胞、又は脈絡叢細胞から選択される、フソソームを提供する。
本開示は、幾つかの態様では、ソース細胞に由来する複数のフソソームを含むフソソーム組成物を提供し、該複数のフソソームが、（ａ）脂質二重層と、（ｂ）細胞質ゾルを含む内腔であって、脂質二重層に囲まれた内腔と、（ｃ）脂質二重層に配置された外因性又は過剰発現されたフソゲンと、（ｄ）表５又は表６の外因性作用物質をコードするペイロード遺伝子を含む核酸とを含み、フソソームは核を含まず、フソソーム組成物中のウイルスキャプシドタンパク質の量は、総タンパク質の１％未満である、フソソーム組成物を提供する。
本開示は、幾つかの態様では、ソース細胞に由来する複数のフソソームを含むフソソーム組成物であって、該複数のフソソームが、（ａ）脂質二重層と、（ｂ）細胞質ゾルを含む内腔であって、脂質二重層に囲まれた内腔と、（ｃ）脂質二重層に配置された外因性又は過剰発現されたフソゲンと、（ｄ）ペイロード遺伝子を含む核酸とを含み、該核酸は、ペイロード遺伝子に作動可能に連結されたＮＴＣＳＲＥを含み、該ＮＴＣＳＲＥは、非標的細胞特異的ｍｉＲＮＡ認識配列、例えば、標的細胞よりも高いレベルで非標的細胞に存在するｍｉＲＮＡによって結合された非標的細胞特異的ｍｉＲＮＡ認識配列、例えば、表４のｍｉＲＮＡによって結合された非標的細胞特異的ｍｉＲＮＡ認識配列を含み、該標的細胞は、第１のタイプのＣＮＳ細胞であり、任意に、該非標的細胞は、第２の異なるタイプのＣＮＳ細胞又は非ＣＮＳ細胞であり、該フソソームは核を含まず、該フソソーム組成物中のウイルスキャプシドタンパク質の量は、総タンパク質の１％未満である、フソソーム組成物を提供する。
幾つかの態様では、ｍｉＲＮＡは、非標的細胞（例えば、本明細書に記載の非標的細胞）において、標的細胞（例えば、ＣＮＳ細胞）に存在するｍｉＲＮＡのレベルよりも少なくとも１０、１００、１，０００又は１万倍高いレベルで存在する。幾つかの実施形態では、ｍｉＲＮＡは、標的細胞（例えばＣＮＳ細胞、例えば本明細書に記載のＣＮＳ細胞）において検出可能には存在しない。幾つかの態様では、ｍｉＲＮＡは標的細胞（例えばＣＮＳ細胞、例えば本明細書に記載のＣＮＳ細胞）には存在しない。
本開示は、幾つかの態様では、ソース細胞に由来する複数のフソソームを含むフソソーム組成物であって、該複数のフソソームが、（ａ）脂質二重層と、（ｂ）細胞質ゾルを含む内腔であって、脂質二重層に囲まれた内腔と、（ｃ）脂質二重層に配置された外因性又は過剰発現されたフソゲンと、（ｄ）ペイロード遺伝子を含む核酸とを含み、該核酸は、ペイロード遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを含み、該プロモーターはＣＮＳ細胞特異的プロモーターであり、例えば、ＣＮＳ細胞、汎ニューロン細胞、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、グルタミン酸作動性ニューロン、コリン作動性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、セロトニン作動性ニューロン、グリア細胞、星状膠細胞、ミクログリア細胞、乏突起膠細胞、又は脈絡叢細胞に特異的なプロモーターであり、該フソソームは核を含まず、該フソソーム組成物中のウイルスキャプシドタンパク質の量は、総タンパク質の１％未満である、フソソーム組成物を提供する。
本開示は、幾つかの態様では、ソース細胞に由来する複数のフソソームを含むフソソーム組成物を提供し、該複数のフソソームが、（ａ）脂質二重層と、（ｂ）細胞質ゾルを含む内腔であって、脂質二重層に囲まれた内腔と、（ｃ）脂質二重層に配置された外因性又は過剰発現されたフソゲンと、（ｄ）ペイロード遺伝子を含む核酸とを含み、該核酸は、表３のプロモーターの配列、又はそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有する配列を有するプロモーターを含み、フソソームは核を含まず、フソソーム組成物中のウイルスキャプシドタンパク質の量は、総タンパク質の１％未満である、フソソーム組成物を提供する。
本開示は、幾つかの態様では、ソース細胞に由来する複数のフソソームを含むフソソーム組成物を提供し、該複数のフソソームが、（ａ）脂質二重層と、（ｂ）細胞質ゾルを含む内腔であって、脂質二重層に囲まれた内腔と、（ｃ）脂質二重層に配置された外因性又は過剰発現されたフソゲンと、（ｄ）核酸であって、（ｉ）ペイロード遺伝子、（ｉｉ）該ペイロード遺伝子に作動可能に連結されたＮＴＣＳＲＥであって、例えば、非標的細胞特異的ｍｉＲＮＡ認識配列、例えば、表４のｍｉＲＮＡによって結合された非標的細胞特異的ｍｉＲＮＡ認識配列を含むＮＴＣＳＲＥ、
（ｉｉｉ）任意に、正の標的細胞特異的調節エレメント、例えば、ペイロード遺伝子に作動可能に連結された正の標的細胞特異的調節エレメント（例えば、標的細胞特異的プロモーター）を含む核酸と、を含み、該正の標的細胞特異的調節エレメントが、該正の標的細胞特異的調節エレメントを欠く他は同様のフソソームと比較して、標的細胞における該ペイロード遺伝子の発現を増加させ、該標的細胞が第１のタイプのＣＮＳ細胞であり、任意に、該非標的細胞が、第２の異なるタイプのＣＮＳ細胞又は非ＣＮＳ細胞であり、任意に、該標的細胞がニューロンであり、該非標的細胞がグリア細胞（例えば、乏突起膠細胞、星状膠細胞又はミクログリア細胞）であるか、又は該標的細胞がグリア細胞（例えば、乏突起膠細胞、星状膠細胞又はミクログリア細胞）であり、該非標的細胞がニューロンであり、該フソソームが核を含まず、該フソソーム組成物中のウイルスキャプシドタンパク質の量は、総タンパク質の１％未満である、フソソーム組成物を提供する。
幾つかの実施形態では、以下の１つ以上が存在する：ｉ）フソソームは、細胞生物学的製剤を含むか、又はそれによって含まれる；ｉｉ）フソソームは除核細胞を含む；ｉｉｉ）フソソームは不活性化された核を含む；ｉｖ）フソソームは、例えば、実施例４２のアッセイにおいて、非標的細胞よりも標的細胞とより高い割合、例えば、少なくとも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、又は１００倍で融合する；ｖ）フソソームは、例えば、実施例４２のアッセイにおいて、他のフソソームよりも標的細胞とより高い割合、例えば、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、又は１００倍で融合する；ｖｉ）フソソーム内の薬剤が、実施例４２のアッセイにおいて、フソソーム内の薬剤が、２４、４８、又は７２時間後に少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％の標的細胞に送達されるような割合で、標的細胞と融合する；ｖｉｉ）フソゲンが、実施例２６のアッセイによって測定した場合、少なくとも１０、５０、１００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、若しくは１，０００，０００，０００コピー、又はこれ以下のコピー数で存在する；ｖｉｉｉ）フソソームが、実施例８８のアッセイによって測定した場合、少なくとも１０、５０、１００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、若しくは１，０００，０００，０００コピー、又はこれ以下のコピー数の治療剤を含む；ｉｘ）治療剤のコピー数に対するフソゲンのコピー数の比が、１，０００，０００：１～１００，０００：１、１００，０００：１～１０，０００：１、１０，０００：１～１，０００：１、１，０００：１～１００：１、１００：１～５０：１、５０：１～２０：１、２０：１～１０：１、１０：１～５：１、５：１～２：１、２：１～１：１、１：１～１：２、１：２～１：５、１：５～１：１０、１：１０～１：２０、１：２０～１：５０、１：５０～１：１００、１：１００～１：１，０００、１：１，０００～１：１０，０００、１：１０，０００～１：１００，０００、又は１：１００，０００～１：１，０００，０００である；ｘ）フソソームが、ソース細胞のものと実質的に類似する脂質組成物を含むか、又は１種以上のＣＬ、Ｃｅｒ、ＤＡＧ、ＨｅｘＣｅｒ、ＬＰＡ、ＬＰＣ、ＬＰＥ、ＬＰＧ、ＬＰＩ、ＬＰＳ、ＰＡ、ＰＣ、ＰＥ、ＰＧ、ＰＩ、ＰＳ、ＣＥ、ＳＭ及びＴＡＧが、ソース細胞の対応する脂質レベルの１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、又は７５％以内である；ｘｉ）フソソームが、例えば、実施例８７のアッセイを使用して、ソース細胞のプロテオミクス組成物と同様のプロテオミクス組成物を含む；ｘｉｉ）フソソームが、例えば、実施例４０のアッセイを使用して測定した場合、ソース細胞における対応する比率の１０％、２０％、３０％、４０％、又は５０％以内のタンパク質に対する脂質の比を含む；ｘｉｉｉ）フソソームが、実施例４１のアッセイを使用して測定した場合、ソース細胞における対応する比率の１０％、２０％、３０％、４０％、又は５０％以内の核酸（例えば、ＤＮＡ）に対するタンパク質の比を含む；ｘｉｖ）フソソームが、実施例９１のアッセイを使用して測定した場合、ソース細胞における対応する比率の１０％、２０％、３０％、４０％、又は５０％以内の核酸（例えば、ＤＮＡ）に対する脂質の比を含む；ｘｖ）フソソームは、例えば、実施例６０のアッセイにより、被験体、例えばマウスにおいて、参照細胞、例えばソース細胞の１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％以内の半減期を有する；ｘｖｉ）フソソームは、例えば、実施例５０のアッセイを使用して測定した場合、グルコース（例えば、標識されたグルコース、例えば、２－ＮＢＤＧ）を膜を介して、グルコースの不在下、陰性対照、例えばその他は同様のフソソームよりも、例えば、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％（例えば、約１１．６％多く）輸送する；ｘｖｉｉ）フソソームは、例えば、実施例５１のアッセイを使用して、参照細胞、例えば、ソース細胞又はマウス胚線維芽細胞におけるエステラーゼ活性の１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％以内のエステラーゼ活性を内腔に含む；ｘｖｉｉｉ）フソソームは、例えば、実施例５３に記載されるように、参照細胞、例えば、ソース細胞におけるクエン酸合成酵素活性の１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％以内の代謝活性レベルを含む；ｘｉｘ）フソソームは、例えば、実施例５４に記載されるように、参照細胞、例えばソース細胞に置ける呼吸レベルの１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％以内の呼吸レベル（例えば、酸素消費率）を含む；ｘｘ）フソソームは、例えば、実施例５５のアッセイを使用して、最大で１８，０００、１７，０００、１６，０００、１５，０００、１４，０００、１３，０００、１２，０００、１１，０００、又は１０，０００のアネキシンＶ染色レベルを含むか、又はフソソームは、実施例５５のアッセイにおいてメナジオンで処理された、その他は同様のフソソームのアネキシン－Ｖ染色レベルよりも少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、又は５０％低いアネキシン－Ｖ染色レベルを含むか、又はフソソームは、実施例５５のアッセイにおいてメナジオンで処理された、マクロファージのアネキシン－Ｖ染色レベルよりも少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、又は５０％低いアネキシン－Ｖ染色レベルを含む；ｘｘｉ）フソソームは、例えば、実施例３３のアッセイにより、ソース細胞の少なくとも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれより高いｍｉＲＮＡ含有量レベルを有する；ｘｘｉｉ）フソソームは、例えば、実施例３８のアッセイにより、ソース細胞の１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以内かそれより大きい、例えばソース細胞の１％～２％、２～３％、３％～４％、４％～５％、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、又は８０％～９０％以内の可溶性：不溶性タンパク質比を有する；ｘｘｉｉｉ）フソソームは、例えば実施例３９において、例えば質量分析法により測定される場合、ソース細胞のＬＰＳ含有量の５％、１％、０．５％、０．０１％、０．００５％、０．０００１％、０．００００１％未満、又はそれより低いＬＰＳレベルを有する；ｘｘｉｖ）フソソームは、例えば、実施例４９のアッセイを使用して、インスリンの不在下で、陰性対照、例えば、その他は同様のフソソームよりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％多いシグナル伝達、例えば、インスリンに応答した細胞外シグナル、例えば、ＡＫＴリン酸化、又はインスリンに応答したグルコース（例えば、標識グルコース、例えば、２－ＮＢＤＧ）の取り込みが可能である；ｘｘｖ）フソソームは、組織、例えば、肝臓、肺、心臓、脾臓、膵臓、消化管、腎臓、精巣、卵巣、脳、生殖器官、中枢神経系、末梢神経系、骨格筋、内皮、内耳、又は眼を標的都市、被験体、例えばマウスに投与された場合、例えば、実施例６４のアッセイにより、フソソームが投与された集団において少なくとも０．１％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％のフソソームが、２４、４８、又は７２時間後に標的組織に存在する；ｘｘｖｉ）フソソームは、例えば、実施例５６のアッセイにより、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％高い参照細胞、例えばソース細胞又は骨髄間葉系細胞（ＢＭＳＣ）によって誘導されるジュクスタクリンシグナル伝達レベル有する；ｘｘｖｉｉ）フソソームは、例えば、実施例５７のアッセイにより、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％より高いパラクリンシグナル伝達レベルを有する；ｘｘｖｉｉｉ）フソソームは、例えば、実施例５８のアッセイにより、参照細胞、例えばソース細胞又はＣ２Ｃ１２細胞における重合アクチンのレベルと比べて、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％以内のレベルでアクチンを重合する；ｘｘｉｘ）フソソームは、例えば、実施例５９のアッセイにより、参照細胞、例えばソース細胞又はＣ２Ｃ１２細胞の膜電位の約１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％以内の膜電位を有するか、又はフソソームは、約－２０～１５０ｍＶ、－２０～－５０ｍＶ、－５０～－１００ｍＶ、又は－１００～－１５０ｍＶの膜電位を有する；ｘｘｘ）フソソームは、例えば実施例４４のアッセイ（例えば、ソース細胞は好中球、リンパ球、Ｂ細部、マクロファージ又はＮＫ細胞である）を使用して、例えば、ソース細胞の又はソース細胞と同じタイプの細胞の少なくとも１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％の血管外漏出率で血管からの血管外漏出が可能である；ｘｘｘｉ）フソソームは、細胞膜、例えば、内皮細胞膜又は血液脳関門を通過することができる；ｘｘｘｉｉ）フソソームは、例えば、実施例４８のアッセイを使用して、例えば、参照細胞よりも、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％大きい割合でタンパク質を分泌することができる；ｘｘｘｉｉｉ）フソソームは、医薬品又は適正製造基準（ＧＭＰ）の基準を満たしている；ｘｘｘｉｖ）フソソームは適正製造基準（ＧＭＰ）に従って製造された；ｘｘｘｖ）フソソームは、所定の基準値未満の病原菌レベルを有し、例えば、病原菌を実質的に含まない；ｘｘｘｉｖ）フソソームは、所定の基準値未満の汚染物質レベルを有し、例えば、実質的に汚染物質を含まない；ｘｘｘｖｉｉ）フソソームは、例えば、本明細書に記載されるように、低い免疫原性を有する；ｘｘｘｖｉｉｉ）ソース細胞は、好中球、顆粒球、間葉系幹細胞、骨髄幹細胞、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、骨髄芽細胞、筋芽細胞、肝細胞、又はニューロン、例えば、網膜神経細胞から選択される；又はｘｘｘｉｘ）ソース細胞は、２９３細胞、ＨＥＫ細胞、ヒト内皮細胞若しくはヒト上皮細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、又は幹細胞以外である。
本開示はまた、幾つかの態様では、以下を含むフソソームを提供する：ａ）脂質二重層及び水溶液、例えば、水と混和性である内腔（フソソームはソース細胞に由来する）；ｂ）外因性又は過剰発現された脂質二重層に配置されたフソゲン；並びにｃ）内腔に配置されたオルガネラ、例えば、治療上有効な数のオルガネラ。
幾つかの実施形態では、以下の１つ以上が存在する：ｉ）ソース細胞は、内皮細胞、マクロファージ、好中球、顆粒球、白血球、幹細胞（例えば、間葉幹細胞、骨骨髄幹細胞、誘導多能性幹細胞、胚幹細胞）、骨髄芽細胞、筋芽細胞、肝細胞、又はニューロン、例えば網膜神経細胞から選択される；ｉｉ）オルガネラは、ゴルジ装置、リソソーム、小胞体、ミトコンドリア、空胞、エンドソーム、先体、オートファゴソーム、中心小体、グリコソーム、グリオキシソーム、ヒドロゲノソーム、メラノソーム、マイトソーム、クニドシスト、ペルオキシソーム、プロテアソーム、小胞、及びストレス顆粒から選択される；ｉｉｉ）フソソームは、５ｕｍ、１０ｕｍ、２０ｕｍ、５０ｕｍ、又は１００ｕｍより大きいサイズを有する；ｉｖ）フソソーム、又は複数のフソソームを含む組成物若しくは調製物は、１．０８ｇ／ｍｌ～１．１２ｇ／ｍｌ以外の密度を有し、例えば、フソソームは、例えば実施例３０のアッセイによって測定した場合、１．２５ｇ／ｍｌ±０．０５の密度を有する；ｖ）フソソームは、循環中のスカベンジャー系又は肝臓洞のクッパー細胞によって捕獲されない；ｖｉ）ソース細胞が２９３細胞以外である；ｖｉｉ）ソース細胞が形質転換又は不死化されていない；ｖｉｉｉ）アデノウイルス媒介の不死化以外の方法を使用してソース細胞を形質転換又は不死化する、例えば、自然突然変異又はテロメラーゼ発現によって不死化する；ｉｘ）フソゲンは、ＶＳＶＧ、ＳＮＡＲＥタンパク質、又は分泌顆粒タンパク質以外である；ｘ）フソソームは、Ｃｒｅ又はＧＦＰ、例えばＥＧＦＰを含まない；ｘｉ）フソソームは、Ｃｒｅ又はＧＦＰ以外の外因性タンパク質、例えばＥＧＦＰを更に含む；ｘｉｉ）フソソームは、外因性核酸（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、又はｓｉＲＮＡ）若しくは外因性タンパク質（例えば、抗体、例えば、抗体）を、例えば内腔に更に含む；又はｘｉｉｉ）フソソームはミトコンドリアを含まない。
本開示はまた、幾つかの態様では、（ａ）脂質二重層と、（ｂ）脂質二重層によって取り囲まれた内腔（例えば、細胞質ゾルを含む）と、（ｃ）外因性又は過剰発現されたフソゲン（例えば、フソゲンは脂質二重層に配置される）と、（ｄ）機能性核とを含み、フソソームはソース細胞に由来する、フソソームを提供する。
幾つかの実施形態では、以下の１つ以上が存在する：ｉ）ソース細胞は、樹状細胞又は腫瘍細胞以外であり、例えば、ソース細胞は、内皮細胞、マクロファージ、好中球、顆粒球、白血球、幹細胞（例えば、間葉幹細胞、骨髄幹細胞、誘導多能性幹細胞、胚幹細胞）、骨髄芽細胞、筋芽細胞、肝細胞、又はニューロン、例えば網膜神経細胞である；ｉｉ）フソゲンは融合糖タンパク質以外である；ｉｉｉ）フソゲンは、ファーテリンベータ以外の哺乳動物タンパク質である、ｉｖ）フソソームは、例えば、本明細書に記載されるように、低い免疫原性を有する；ｖ）フソソームは、医薬品又は適正製造基準（ＧＭＰ）の基準を満たしている；ｖｉ）フソソームは、適正製造基準（ＧＭＰ）に従って製造された；ｖｉｉ）フソソームは、所定の基準値未満の病原菌レベルを有し、例えば、病原菌を実質的に含まない；又はｖｉｉｉ）フソソームは、所定の基準値未満の汚染物質レベルを有し、例えば、実質的に汚染物質を含まない。
本開示はまた、幾つかの態様では、ソース細胞に由来する複数のフソソームを含むフソソーム組成物であって、複数のフソソームは、（ａ）脂質二重層と、（ｂ）細胞質ゾルを含む内腔であって、脂質二重層に囲まれた内腔と、（ｃ）脂質二重層に配置された外因性又は過剰発現されたフソゲンと、（ｄ）カーゴとを含み、フソソームは核を含まず、フソソーム組成物中のウイルスキャプシドタンパク質の量は、総タンパク質の１％未満であり、複数のフソソームは、エンドサイトーシスの阻害剤の存在下で標的細胞集団と接触した場合、及びエンドサイトーシスの阻害剤で処理されていない参照標的細胞集団と接触した場合、参照標的細胞集団と比較して、標的細胞集団中の少なくとも３０％の数の細胞にカーゴを送達する、フソソーム組成物を提供する。
本開示はまた、幾つかの態様では、ソース細胞に由来する複数のフソソームを含むフソソーム組成物であって、複数のフソソームは、（ａ）脂質二重層と、（ｂ）サイトゾルを含む内腔であって、脂質二重層に囲まれた内腔と、（ｃ）脂質二重層に配置された外因性又は過剰発現された再標的化フソゲンと、（ｄ）カーゴとを含み、フソソームは核を含まず、フソソーム組成物中のウイルスキャプシドタンパク質の量は、総タンパク質の１％未満であり、（ｉ）複数のフソソームが標的細胞及び非標的細胞を含む細胞集団と接触する場合、カーゴは非標的細胞よりも少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍多い標的細胞に存在し、又は（ｉｉ）複数のフソソームが、非標的細胞よりも少なくとも５０％高い割合で標的細胞と融合する、フソソーム組成物を提供する。
本開示はまた、幾つかの態様では、ソース細胞に由来する複数のフソソームを含むフソソーム組成物であって、複数のフソソームは、（ａ）脂質二重層と、（ｂ）脂質二重層によって囲まれた内腔と、（ｃ）外因性又は過剰発現されたフソゲンであって、脂質二重層中に配置されているフソゲンと、（ｄ）カーゴとを含み、フソソームは核を含まず、以下の１つ以上（例えば、少なくとも２、３、４、又は５つ）を含む：ｉ）フソゲンは、少なくとも１，０００コピーのコピー数で存在する；ｉｉ）フソソームは、少なくとも１，０００コピーのコピー数で治療剤を含む；ｉｉｉ）フソソームは脂質を含み、ＣＬ、Ｃｅｒ、ＤＡＧ、ＨｅｘＣｅｒ、ＬＰＡ、ＬＰＣ、ＬＰＥ、ＬＰＧ、ＬＰＩ、ＬＰＳ、ＰＡ、ＰＣ、ＰＥ、ＰＧ、ＰＩ、ＰＳ、ＣＥ、ＳＭ及びＴＡＧのうちの１つ又は複数がソース細胞の対応する脂質レベルの７５％以内である；ｉｖ）フソソームは、ソース細胞のプロテオミクス組成物と同様のプロテオミクス組成物を含む；ｖ）フソソームは、例えばインスリン非存在下において、陰性対照、例えばその他は同様のフソソームよりも少なくとも１０％多い、シグナル伝達、例えば、細胞外シグナル、例えば、インスリンに応答したＡＫＴリン酸化、又はインスリンに応答したグルコース（例えば、標識グルコース、例えば、２－ＮＢＤＧ）の取り込みを伝達することができる；ｖｉ）フソソームは、組織、例えば、肝臓、肺、心臓、脾臓、膵臓、消化管、腎臓、精巣、卵巣、脳、生殖器官、中枢神経系、末梢神経系、骨格筋、内皮、内耳、若しくは眼を標的とし、例えばマウスなどの被験体に投与された場合、投与されたフソソームの集団中のフソソームの少なくとも０．１％、若しくは１０％が２４時間後に標的組織に存在する；又はソース細胞は、好中球、顆粒球、間葉系幹細胞、骨髄幹細胞、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、骨髄芽細胞、筋芽細胞、肝細胞、若しくはニューロン、例えば網膜神経細胞から選択される、フソソーム組成物を提供する。
実施形態では、以下の１つ以上：ｉ）ソース細胞が２９３細胞以外である；ｉｉ）ソース細胞が形質転換又は不死化されていない；ｉｉｉ）アデノウイルス媒介の不死化以外の方法、例えば、自然突然変異又はテロメラーゼ発現によって不死化する方法を使用して、ソース細胞を形質転換又は不死化する；ｉｖ）フソゲンが、ＶＳＶＧ、ＳＮＡＲＥタンパク質、又は分泌顆粒タンパク質以外のものである；ｖ）治療剤はＣｒｅ又はＥＧＦＰ以外である；ｖｉ）治療剤は、例えば内腔内の核酸（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、又はｓｉＲＮＡ）又は外因性タンパク質（例えば抗体、例えば抗体）である；又はｖｉｉ）フソソームはミトコンドリアを含まない。
実施形態では、以下の１つ以上：ｉ）ソース細胞が２９３細胞又はＨＥＫ細胞以外である；ｉｉ）ソース細胞が形質転換又は不死化されていない；ｉｉｉ）アデノウイルス媒介の不死化以外の方法、例えば、自然突然変異又はテロメラーゼ発現によって不死化する方法を使用して、ソース細胞を形質転換又は不死化する；ｉｖ）フソゲンはウイルス性フソゲンではない；又はｖ）フソソームが４０～１５０ｎｍ以外のサイズ、例えば、１５０ｎｍ、２００ｎｍ、３００ｎｍ、４００ｎｍ、又は５００ｎｍを超えるサイズを有する。
実施形態では、以下の１つ以上：ｉ）治療剤は、ソース細胞によって発現される可溶性タンパク質である；ｉｉ）フソゲンは、ＴＡＴ、ＴＡＴ－ＨＡ２、ＨＡ－２、ｇｐ４１、アルツハイマー病のベータアミロイドペプチド、センダイウイルスタンパク質、又は両親媒性ネットネガティブペプチド（ＷＡＥ １１）以外のものである；ｉｉｉ）フソゲンは哺乳類のフソゲンである；ｉｖ）フソソームは、その内腔に、酵素、抗体、又は抗ウイルスポリペプチドから選択されるポリペプチドを含む；ｖ）フソソームは外因性の治療用膜貫通タンパク質を含まない；又はｖｉ）フソソームはＣＤ６３若しくはＧＬＵＴ４を含まない、又はフソソームは、例えば、実施例８９に記載の方法に従って決定される場合、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、又は１０％以下（例えば、約０．０４８％以下）のＣＤ６３を含む。
実施形態では、フソソームは、ｉ）ウイルスを含まない、感染性ではない、又は宿主細胞内で増殖しない；ｉｉ）ウイルスベクターではないｉｉｉ）ＶＬＰ（ウイルス様粒子）ではない；ｉｖ）ウイルス構造タンパク質、例えばｇａｇに由来するタンパク質、例えばウイルスキャプシドタンパク質、例えばウイルスカプセルタンパク質、例えばウイルスヌクレオカプシドタンパク質を含まない、又はウイルスキャプシドタンパク質の量が、例えば質量分析により、例えば実施例９３のアッセイを使用して、総タンパク質の１０％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．２％、又は０．１％未満である；ｖ）ウイルスマトリックスタンパク質を含まない；ｖｉ）ウイルスの非構造タンパク質；例えば、ｐｏｌ又はその断片若しくはバリアント、ウイルス逆転写酵素タンパク質、ウイルスインテグラーゼタンパク質、又はウイルスプロテアーゼタンパク質を含まない；ｖｉｉ）ウイルス核酸；例えば、ウイルスＲＮＡ又はウイルスＤＮＡを含まない；ｖｉｉｉ）１ベシクルあたり１０、５０、１００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、又は１，０００，０００，０００コピー未満のウイルス構造タンパク質を含む；又はｉｘ）フソソームはビロソームではない。
幾つかの実施形態では、フソソームは、約０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％未満のウイルスキャプシドタンパク質（例えば、約０．０５％のウイルスキャプシドタンパク質）を含む（又は含むと識別される）。実施形態では、ウイルスキャプシドタンパク質は、ウサギ内因性レンチウイルス（ＲＥＬＩＫ）キャプシドとシクロフィリンＡとの複合体である。実施形態では、ウイルスキャプシドタンパク質：総タンパク質比は、約０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、又は０．１である（又はそうであると識別される）。
幾つかの実施形態では、フソソームは、ｇａｇタンパク質、又はそのフラグメント若しくはバリアントを含まない（又は含まないものとして識別される）か、又はｇａｇタンパク質、又はそのフラグメント若しくはバリアントの量が、例えば実施例９３のアッセイにより、総タンパク質の１０％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．２％、又は０．１％未満である。
実施形態では、フソソーム上のウイルス構造タンパク質のコピー数に対するフソゲンのコピー数の比は、少なくとも１，０００，０００：１、１００，０００：１、１０，０００：１、１，０００：１、１００：１、５０：１、２０：１、１０：１、５：１、又は１：１であるか、又は１００：１～５０：１、５０：１～２０：１、２０：１～１０：１、１０：１～５：１の間、又は１：１である。実施形態では、フソソーム上のウイルスマトリックスタンパク質のコピー数に対するフソゲンのコピー数の比は、少なくとも１，０００，０００：１、１００．０００：１、１０，０００：１、１，０００：１、１００：１、５０：１、２０：１、１０：１、５：１、又は１：１である。
実施形態では、以下の１つ以上：ｉ）フソソームは、水と混和しない液滴を含まない；ｉｉ）フソソームは、水性内腔及び親水性外部を含む；ｉｉｉ）フソゲンはタンパク質フソゲンである；又はｉｖ）オルガネラは、ミトコンドリア、ゴルジ装置、リソソーム、小胞体、空胞、エンドソーム、先体、オートファゴソーム、中心小体、グリコソーム、グリオキシソーム、ヒドロメノソーム、メラノソーム、ミトソーム、クニドシスト、ペルオキシソーム、プロテアソーム、ベシクル、及び顆粒から選択される。
実施形態では、以下の１つ以上：ｉ）フソゲンは、哺乳動物フソゲン又はウイルスフソゲンである；ｉｉ）フソソームは、治療物質又は診断物質をフソソームにロードすることによって作製されたものではない；ｉｉｉ）ソース細胞に治療物質又は診断物質がロードされていない；ｉｖ）フソソームは、ドキソルビシン、デキサメタゾン、シクロデキストリン、ポリエチレングリコール、マイクロＲＮＡ、例えばｍｉＲ１２５、ＶＥＧＦ受容体、ＩＣＡＭ－１、Ｅ－セレクチン、酸化鉄、蛍光タンパク質、例えばＧＦＰ又はＲＦＰ、ナノ粒子、若しくはＲＮａｓｅを含まないか、又は前述のいずれかの外因性形態を含まない；又はｖ）フソソームは、１つ以上の翻訳後修飾、例えばグリコシル化を有する外因性治療剤を更に含む。
実施形態では、フソソームは単層又は多層である。
実施形態では、以下の１つ以上：ｉ）フソソームはエクソソームではない；ｉｉ）フソソームは微小胞である；ｉｉｉ）フソソームは非哺乳動物のフソゲンを含むｉｖ）フソソームは、フソゲンを組み込むように設計されている；ｖ）フソソームは外因性フソゲンを含む；ｖｉ）フソソームが少なくとも８０ｎｍ、１００ｎｍ、２００ｎｍ、５００ｎｍ、１０００ｎｍ、１２００ｎｍ、１４００ｎｍ、又は１５００ｎｍのサイズを有するか、又はフソソームの集団が少なくとも８０ｎｍ、１００ｎｍ、２００ｎｍ、５００ｎｍ、１０００ｎｍ、１２００ｎｍ、１４００ｎｍ、又は１５００ｎｍの平均サイズを有する；ｖｉｉ）フソソームは、１つ以上のオルガネラ、例えば、ミトコンドリア、ゴルジ装置、リソソーム、小胞体、液胞、エンドソーム、アクロソーム、オートファゴソーム、中心小体、グリコソーム、グリオキシソーム、ヒドロゲノソーム、メラノソーム、ミトソーム、クニドソーム、ペルオキシソーム、プロテアソーム、小胞及びストレス顆粒を含む；ｖｉｉｉ）フソソームは、細胞骨格又はその成分、例えば、アクチン、Ａｒｐ２／３、フォルミン、コロニン、ジストロフィン、ケラチン、ミオシン、又はチューブリンを含む；ｉｘ）フソソーム、又は複数のフソソームを含む組成物若しくは調製物が、例えば、Ｔｈｅｒｙ ｅｔ ａｌ．，「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｏｓｏｍｅｓ ｆｒｏｍ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｓ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｌｕｉｄｓ．」Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００６ Ａｐｒ；Ｃｈａｐｔｅｒ ３：Ｕｎｉｔ ３．２２に記載される、スクロース勾配遠心分離アッセイにおいて、１．０８～１．２２ｇ／ｍｌの浮遊密度を持たないか、少なくとも１．１８～１．２５ｇ／ｍｌ、又は１．０５～１．１２ｇ／ｍｌの密度を有する；ｘ）脂質二重層は、ソース細胞と比較して、セラミド又はスフィンゴミエリン又はそれらの組み合わせについて濃縮されている、又は脂質二重層は、ソース細胞と比較して、糖脂質、遊離脂肪酸、又はホスファチジルセリン、又はそれらの組み合わせについて濃縮されていない（例えば、枯渇している）；ｘｉ）フソソームは、例えば、実施例９２のアッセイで測定した場合、ホスファチジルセリン（ＰＳ）又はＣＤ４０リガンド、又はＰＳとＣＤ４０リガンドの両方を含む；ｘｉｉ）フソソームは、ソース細胞と比較して、ＰＳについて濃縮されており、例えば、Ｋａｎａｄａ Ｍ，ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｆａｔｅｓ ｏｆ ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｔｏ ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌｓ ｖｉａ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１２：Ｅ１４３３－Ｅ１４４２のアッセイによって、例えば、フソソームの集団において、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％がＰＳに陽性である。ｘｉｉｉ）フソソームは、実質的にアセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）を含まないか、又は例えば実施例５２のアッセイにより、０．００１、０．００２、０．００５、０．０１，０．０２、０．０５、０．１、０．２、０．５、１、２、５、１０、２０、５０、１００、２００、５００、又は１０００未満のＡＣｈＥ活性単位／μｇタンパク質を含む；ｘｉｖ）フソソームは、テトラスパニンファミリータンパク質（例えば、ＣＤ６３、ＣＤ９、又はＣＤ８１）、ＥＳＣＲＴ関連タンパク質（例えば、ＴＳＧ１０１、ＣＨＭＰ４Ａ－Ｂ、又はＶＰＳ４Ｂ）、Ａｌｉｘ、ＴＳＧ１０１、ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩ、ＧＰ９６、アクチニン－４、ミトフィリン、シンテニン－１、ＴＳＧ１０１、ＡＤＡＭ１０、ＥＨＤ４、シンテニン－１、ＴＳＧ１０１、ＥＨＤ１、フロチリン－１、ヒートショック７０－ｋＤａタンパク質（ＨＳＣ７０／ＨＳＰ７３、ＨＳＰ７０／ＨＳＰ７２）、若しくはそれらの任意の組み合わせを実質的に含まないか、又は０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、５％若しくは１０％未満の個々のエクソソームマーカータンパク質及び／又は０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％若しくは２５％上記のいずれかのタンパク質の総エクソソームマーカータンパク質を含むか、又は例えば、実施例８９のアッセイによって、ソース細胞と比較してこれらのタンパク質のいずれか１つ以上が濃縮されていないか、又はこれらのタンパク質のいずれか１つ以上が濃縮されていない；ｘｖ）フソソームは、５００、２５０、１００、５０、２０、１０、５、又は１ｎｇ ＧＡＰＤＨ／μｇ総タンパク質未満のグリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）のレベル、又は例えば、実施例３６のアッセイを使用して、ｎｇ／ｕｇの単位で総タンパク質あたり１％、２．５％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％未満のソース細胞中のＧＡＰＤＨのレベルを含む；ｘｖｉ）フソソームは、１つ以上の小胞体タンパク質（例えば、カルネキシン）、１つ以上のプロテアソームタンパク質、又は１つ以上のミトコンドリアタンパク質、又はそれらの任意の組み合わせに富んでいる、例えば、カルネキシンの量が５００、２５０、１００、５０、２０、１０、５、又は１ｎｇ カルネキシン／μｇ総タンパク質未満であるか、又はフソソームは、例えば、実施例３７又は９０のアッセイを使用すると、ソース細胞と比べて、ｎｇ／ｕｇの単位で１％、２．５％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％少ない総タンパク質あたりのカルネキシンを含むか、又は、フソソーム内のカルネキシンの平均含有量が約１×１０－４、１．５×１０－４、２×１０－４、２．１×１０－４、２．２×１０－４、２．３×１０－４、２．４×１０－４、２．４３×１０－４、２．５×１０－４、２．６×１０－４、２．７×１０－４、２．８×１０－４、２．９×１０－４、３×１０－４、３．５×１０－４、又は４×１０－４未満であるか、又は、フソソームが、親細胞よりも約７０％、７５％、８０％、８５％、８８％、９０％、９５％、９９％、又はそれ以上少ない総タンパク質あたりのカルネキシンの量を含む；ｘｖｉｉ）フソソームは、例えば、実施例３４のアッセイを使用して測定される、外因性作用物質（例えば、外因性タンパク質、ｍＲＮＡ、又はｓｉＲＮＡ）を含む；又はｘｖｉｉｉ）フソソームは、原子間力顕微鏡検査によって、例えば、Ｋａｎａｄａ Ｍ，ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｆａｔｅｓ ｏｆ ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｔｏ ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌｓ ｖｉａ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１２：Ｅ１４３３－Ｅ１４４２のアッセイによって、少なくとも３０分間、マイカ表面に固定化することができる。
実施形態では、以下の１つ以上：ｉ）フソソームはエクソソームである；ｉｉ）フソソームは微小胞ではない；ｉｉｉ）フソソームのサイズは８０ｎｍ、１００ｎｍ、２００ｎｍ、５００ｎｍ、１０００ｎｍ、１２００ｎｍ、１４００ｎｍ、又は１５００ｎｍ未満であるか、又はフソソームの集団の平均サイズは８０ｎｍ、１００ｎｍ、２００ｎｍ、５００ｎｍ、１０００ｎｍ、１２００ｎｍ、１４００ｎｍ、又は１５００ｎｍ未満である；ｉｖ）フソソームは細胞小器官を含まない；ｖ）フソソームは、細胞骨格又はその成分、例えば、アクチン、Ａｒｐ２／３、フォルミン、コロニン、ジストロフィン、ケラチン、ミオシン、又はチューブリンを含まない；ｖｉ）フソソーム、又は複数のフソソームを含む組成物若しくは調製物は、例えばＴｈｅｒｙ ｅｔ ａｌ．，「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｏｓｏｍｅｓ ｆｒｏｍ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｓ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｌｕｉｄｓ．」Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００６ Ａｐｒ；Ｃｈａｐｔｅｒ ３：Ｕｎｉｔ ３．２２に記載される、スクロース勾配遠心分離アッセイにおいて、１．０８～１．２２ｇ／ｍｌの浮遊密度を持つ；ｖｉｉ）脂質二重層は、ソース細胞と比較して、セラミド又はスフィンゴミエリン又はそれらの組み合わせについて濃縮されていない（例えば、枯渇している）か、又は、脂質二重層は、ソース細胞と比較して、糖脂質、遊離脂肪酸、又はホスファチジルセリン、又はそれらの組み合わせが濃縮されている；ｖｉｉｉ）フソソームは、例えば、実施例９２のアッセイで測定した場合、ホスファチジルセリン（ＰＳ）若しくはＣＤ４０リガンド、又はＰＳ及びＣＤ４０ リガンドの両方を含まないか、又はソース細胞に対して枯渇している；ｉｘ）フソソームは、ソース細胞と比較してＰＳが濃縮されておらず（例えば、枯渇している）、例えば、Ｋａｎａｄａ Ｍ，ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｆａｔｅｓ ｏｆ ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｔｏ ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌｓ ｖｉａ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１２：Ｅ１４３３－Ｅ１４４２のアッセイにより、例えば、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％未満のフソソームの集団においてＰＳに陽性である。ｘ）フソソームは、実質的にアセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）を含み、例えば、実施例５２のアッセイにより、例えば、少なくとも０．００１、０．００２、０．００５、０．０１，０．０２、０．０５、０．１、０．２、０．５、１、２、５、１０、２０、５０、１００、２００、５００、又は１０００未満のＡＣｈＥ活性単位／μｇタンパク質を含む；ｘｉ）フソソームは、テトラスパニンファミリータンパク質（例えば、ＣＤ６３、ＣＤ９、又はＣＤ８１）、ＥＳＣＲＴ関連タンパク質（例えば、ＴＳＧ１０１、ＣＨＭＰ４Ａ－Ｂ、又はＶＰＳ４Ｂ）、Ａｌｉｘ、ＴＳＧ１０１、ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩ、ＧＰ９６、アクチニン－４、ミトフィリン、シンテニン－１、ＴＳＧ１０１、ＡＤＡＭ１０、ＥＨＤ４、シンテニン－１、ＴＳＧ１０１、ＥＨＤ１、フロチリン－１、ヒートショック７０－ｋＤａタンパク質（ＨＳＣ７０／ＨＳＰ７３、ＨＳＰ７０／ＨＳＰ７２）、又はそれらの任意の組み合わせを含み、例えば、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、５％若しくは１０％未満の個々のエクソソームマーカータンパク質及び／又は０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％若しくは２５％上記のいずれかのタンパク質の総エクソソームマーカータンパク質を含むか、又は、例えば、実施例８９のアッセイによって、ソース細胞と比べてこれらのタンパク質のいずれか１つ以上が濃縮されている；ｘｉｉ）フソソームは、５００、２５０、１００、５０、２０、１０、５、又は１ｎｇ ＧＡＰＤＨ／μｇ総タンパク質未満のグリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）のレベル、又は、例えば、実施例３６のアッセイを使用して、ｎｇ／ｕｇの単位で総タンパク質あたりのＧＡＰＤＨのレベルを少なくとも１％、２．５％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％を超える、ソース細胞中のＧＡＰＤＨレベル未満のＧＡＰＤＨのレベルを含む；ｘｉｉｉ）フソソームは、１つ以上の小胞体タンパク質（例えば、カルネキシン）、１つ以上のプロテアソームタンパク質、又は１つ以上のミトコンドリアタンパク質、又はそれらの任意の組み合わせに富んでいない（例えば、枯渇している）、例えば、カルネキシンの量が５００、２５０、１００、５０、２０、１０、５、又は１ｎｇ カルネキシン／μｇ総タンパク質未満であるか、又はフソソームは、例えば、実施例９０のアッセイを使用して、ソース細胞と比べて、ｎｇ／ｕｇの単位で１％、２．５％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％少ない総タンパク質あたりのカルネキシンを含むか、又はフソソーム内のカルネキシンの平均含有量が約１×１０－４、１．５×１０－４、２×１０－４、２．１×１０－４、２．２×１０－４、２．３×１０－４、２．４×１０－４、２．４３×１０－４、２．５×１０－４、２．６×１０－４、２．７×１０－４、２．８×１０－４、２．９×１０－４、３×１０－４、３．５×１０－４、又は４×１０－４未満であるか、又はフソソームが、親細胞よりも約７０％、７５％、８０％、８５％、８８％、９０％、９５％、９９％、又はそれ以上少ない総タンパク質あたりのカルネキシンの量を含むか、又はｘｉｖ）原子間力顕微鏡検査によって、例えば、Ｋａｎａｄａ Ｍ，ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｆａｔｅｓ ｏｆ ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｔｏ ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌｓ ｖｉａ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１２：Ｅ１４３３－Ｅ１４４２のアッセイによって、少なくとも３０分間、フソソームを雲母表面に固定化できない。
実施形態では、以下の１つ以上：ｉ）フソソームはＶＬＰを含まない；ｉｉ）フソソームはウイルスを含まない；ｉｉｉ）フソソームは複製能力のあるウイルスを含まない；ｉｖ）フソソームは、ウイルスタンパク質、例えばウイルス構造タンパク質、例えばカプシドタンパク質又はウイルス基質タンパク質を含まない；ｖ）フソソームは、エンベロープウイルス由来のカプシドタンパク質を含まない；ｖｉ）フソソームはヌクレオカプシドタンパク質を含まない；又はｖｉｉ）フソゲンがウイルスフソゲンではない。
実施形態では、フソソームは細胞質ゾルを含む。
実施形態では、以下の１つ以上：ｉ）フソソーム又はソース細胞は、例えば、実施例６５のアッセイにより、被験体に移植された場合、奇形腫を形成しない；ｉｉ）フソソームは、例えば、実施例４５のアッセイを使用して、参照細胞、例えばマクロファージよりも、例えば、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％以上の走化性が可能である；ｉｉｉ）フソソームは、例えば損傷部位にホーミングすることができ、例えば、実施例４６のアッセイを使用して、フソソーム又は細胞生物学的物質はヒト細胞からのものであり、例えば、ソース細胞は好中球である；ｉｖ）フソソームは食作用が可能であり、例えば、フソソームによる食作用は、実施例４７のアッセイを使用して０．５、１、２、３、４、５、又は６時間以内に検出可能であり、例えば、ソース細胞はマクロファージである。
実施形態では、フソソーム又はフソソーム組成物は、被験体、例えばヒト被験体に投与後、５日以下、例えば、４日以下、３日以下、２日以下、１日以下の間、例えば約１２～７２時間にわたり、上記いずれかの特徴の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ又はそれ以上を保持する。
実施形態では、フソソームは、以下の特徴の１つ以上を有する；ａ）ソース細胞からの１つ以上の内因性タンパク質、例えば、膜タンパク質又は細胞質ゾルタンパク質を含む；ｂ）少なくとも１０、２０、５０、１００、２００、５００、１０００、２０００、若しくは５０００種の異なるタンパク質を含む；ｃ）少なくとも１、２、５、１０、２０、５０、又は１００種の異なる糖タンパク質を含む；ｄ）フソソーム内のタンパク質の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、若しくは９０％が天然に存在するタンパク質である；ｅ）少なくとも１０、２０、５０、１００、２００、５００、１０００、２０００、若しくは５０００の異なるＲＮＡを含む；又はｆ）少なくとも２、３、４、５、１０、若しくは２０種の例えば、ＣＬ、Ｃｅｒ、ＤＡＧ、ＨｅｘＣｅｒ、ＬＰＡ、ＬＰＣ、ＬＰＥ、ＬＰＧ、ＬＰＩ、ＬＰＳ、ＰＡ、ＰＣ、ＰＥ、ＰＧ、ＰＩ、ＰＳ、ＣＥ、ＳＭ、及びＴＡＧから選択される、異なる脂質を含む。
実施形態では、フソソームは、以下の特性のうちの１、２、３、４、５以上を有するように操作されているか、又はフソソームが天然に存在する細胞ではなく、又は核が天然に以下の特性の１、２、３、４、５以上を有していないフソソームである：ａ）部分的な核不活性化は、核機能の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれ以上の減少、例えば、転写が実施例２４のアッセイ及びＤＮＡ複製は実施例２５のアッセイによって測定される場合、例えば、転写又はＤＮＡ複製の減少、又はその両方をもたらす；ｂ）フソソームが転写できないか、転写活性が、例えば実施例２４のアッセイを使用して、参照細胞、例えばソース細胞の転写活性の１％、２．５％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％未満である；ｃ）フソソームは核ＤＮＡ複製ができないか、核ＤＮＡ複製が、例えば実施例２５のアッセイを使用して、参照細胞、例えばソース細胞の核ＤＮＡ複製の１％、２．５％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％未満である；ｄ）フソソームはクロマチンを欠いているか、実施例３２のアッセイを使用して、参照細胞、例えばソース細胞のクロマチン含有量の１％、２．５％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％未満である；ｅ）フソソームが核膜を欠いているか、例えば、実施例３１のアッセイによって、参照細胞、例えばソース細胞又はジャーカット細胞の核膜の量の５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、又は１％未満である；ｆ）フソソームは、機能的な核膜孔複合体を欠いているか、実施例３１のアッセイにより、核移行又は核外輸送の活性が、少なくとも５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、若しくは１％減少しているか、又は核膜孔タンパク質、例えば、ＮＵＰ９８又はインポーチン７を１つ以上欠いている；ｇ）フソソームはヒストンを含まないか、又はヒストンレベルが、例えば、実施例３２のアッセイにより、ソース細胞のヒストンレベルの（例えば、Ｈ１、Ｈ２ａ、Ｈ２ｂ、Ｈ３、又はＨ４の）１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、若しくは９０％未満である；ｈ）フソソームは、２０、１０、５、４、３、２、又は１未満の染色体を含む；ｉ）核機能が排除されている；ｊ）フソソームは、除核された哺乳動物細胞である；ｋ）核が、例えば、機械的な力で押し出されて、放射線によって、若しくは化学的アブレーションによって、除去又は不活性化されている；又はｌ）フソソームは、間期又は有糸分裂中に完全に又は部分的に除去されたＤＮＡを有する哺乳動物細胞に由来する。
実施形態では、フソソームは、ｍｔＤＮＡ又はベクターＤＮＡを含む。実施形態では、フソソームはＤＮＡを含まない。
実施形態では、ソース細胞は、初代細胞、不死化細胞又は細胞株（例えば、骨髄芽球細胞株、例えば、Ｃ２Ｃ１２）である。実施形態では、フソソームは、例えば、（例えば、ＭＨＣタンパク質又はＭＨＣ複合体を除去するため、例えばゲノム編集によって）免疫原性が低下した、改変されたゲノムを有するソース細胞に由来する。実施形態では、ソース細胞は、抗炎症シグナルで処理された細胞培養物に由来する。実施形態では、ソース細胞は、免疫抑制物質で処理された細胞培養物に由来する。実施形態では、ソース細胞は、例えば、本明細書に記載のアッセイを使用して、実質的に非免疫原性である。実施形態では、ソース細胞は、外因性作用物質、例えば、治療薬を含む。実施形態では、ソース細胞は組換え細胞である。
実施形態では、フソソームは、外因性作用物質、例えば、治療薬、例えば、タンパク質又は核酸（例えば、ＤＮＡ、染色体（例えば、ヒト人工染色体）、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ）を更に含む。実施形態では、外因性作用物質は、少なくとも１０、２０、５０、１００、２００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、又は１，０００，０００，０００コピーが、例えば、フソソームによって含まれるか、又はフソソームあたり１０、２０、５０、１００、２００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００又は１，０００，０００コピーの平均レベルで存在する。実施形態では、フソソームは、例えば、哺乳動物細胞をｓｉＲＮＡ又は遺伝子編集酵素で処理することにより、レベルが変化した、例えば、増加又は減少した、１つ以上の内因性分子、例えば、タンパク質又は核酸を有する。実施形態では、内因性作用物質は、例えば、少なくとも１０、２０、５０、１００、２００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、又は１，０００，０００，０００コピーの平均レベルで存在するか（例えば、フソソームによって含まれる）、又はフソソームあたり１０、２０、５０、１００、２００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００又は１，０００，０００コピーの平均レベルで存在する。実施形態では、内因性分子（例えば、ＲＮＡ又はタンパク質）は、ソース細胞におけるその濃度よりも、少なくとも１、２、３、４、５、１０、２０、５０、１００、５００、１０３、５．０×１０３、１０４、５．０×１０４、１０５、５．０×１０５、１０６、５．０×１０６、１．０×１０７、５．０×１０７、又は１．０×１０８高い濃度で存在する。
実施形態では、活性物質は、タンパク質、タンパク質複合体（例えば、少なくとも２、３、４、５、１０、２０、又は５０個のタンパク質、例えば、少なくとも２、３、４、５、１０、２０、又は５０の異なるタンパク質）ポリペプチド、核酸（例えば、ＤＮＡ、染色体、又はＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、又はｍｉＲＮＡ）又は小分子から選択される。実施形態では、外因性作用物質は、部位特異的ヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９分子、ＴＡＬＥＮ、又はＺＦＮを含む。
実施形態では、フソゲンは、ウイルスフソゲン、例えば、ＨＡ、ＨＩＶ－１ ＥＮＶ、ＨＨＶ－４、ｇｐ１２０、又はＶＳＶ－Ｇである。実施形態では、フソゲンは、哺乳動物のフソゲン、例えば、ＳＮＡＲＥ、Ｓｙｎｃｙｔｉｎ、ｍｙｏｍａｋｅｒ、ｍｙｏｍｉｘｅｒ、ｍｙｏｍｅｒｇｅｒ、又はＦＧＦＲＬ１である。実施形態では、フソゲンは、４～５、５～６、６～７、７～８、８～９、又は９～１０のｐＨで活性である。実施形態では、フソゲンは、４～５、５～６、６～７、７～８、８～９、又は９～１０のｐＨでは活性ではない。実施形態では、フソソームは、標的細胞の表面で標的細胞に融合する。実施形態では、フソゲンは、リソソームに依存しない方法で融合を促進する。実施形態では、フソゲンはタンパク質フソゲンである。実施形態では、フソゲンは、脂質フソゲン、例えば、オレイン酸、モノオレイン酸グリセロール、グリセリド、ジアシルグリセロール、又は修飾された不飽和脂肪酸である。実施形態では、フソゲンは、化学フソゲン、例えば、ＰＥＧである。実施形態では、フソゲンは、小分子フソゲン、例えば、ハロタン、メロキシカム、ピロキシカム、テノキシカム、及びクロルプロマジン等のＮＳＡＩＤである。実施形態では、フソゲンは組換え体である。実施形態では、フソゲンは、生化学的に組み込まれ、例えば、フソゲンは、精製されたタンパク質として提供され、フソゲンと脂質二重層との会合を可能にする条件下で脂質二重層と接触される。実施形態では、フソゲンは、生合成的に組み込まれ、例えば、フソゲンが脂質二重層と結合することを可能にする条件下で、ソース細胞において発現される。
実施形態では、フソソームは標的細胞に結合する。実施形態では、標的細胞は、ＨｅＬａ細胞以外であるか、又は標的細胞は、形質転換又は不死化されていない。
フソソーム組成物を含む幾つかの実施形態では、複数のフソソームは同じである。幾つかの実施形態では、複数のフソソームは異なる。幾つかの実施形態では、複数のフソソームは、１つ以上のソース細胞に由来する。幾つかの実施形態では、複数のフソソームの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％は、フソソーム組成物中のフソソームの平均径の１０％、２０％、３０％、４０％、又は５０％以内の直径を有する。幾つかの実施形態では、複数のフソソームの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％は、フソソーム組成物中のフソソームの平均体積の１０％、２０％、３０％、４０％、又は５０％以内の体積を有する。幾つかの実施形態では、フソソーム組成物は、例えば、実施例２８に基づいて、サイズ分布におけるソース細胞集団の変動１０％、５０％、又は９０％以内で、約９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％未満のサイズ分布における変動を有する。幾つかの実施形態では、複数のフソソームの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％は、フソソーム組成物におけるフソソーム中の平均フソゲンコピー数の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％以内のコピー数のフソゲンを有する。幾つかの実施形態では、複数のフソソームの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％は、フソソーム組成物におけるフソソーム中の治療薬の平均コピー数の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％以内のコピー数の治療薬を有する。幾つかの実施形態では、フソソーム組成物は、少なくとも１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、又は１０１５又はそれ以上のフソソームを含む。幾つかの実施形態では、フソソーム組成物は、少なくとも１μｌ、２μｌ、５μｌ、１０μｌ、２０μｌ、５０μｌ、１００μｌ、２００μｌ、５００μｌ、１ｍｌ、２ｍｌ、５ｍｌ、又は１０ｍｌの容量である。
幾つかの実施形態では、フソソーム組成物は、参照標的細胞集団と比較して、標的細胞集団の細胞数の少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％にカーゴを送達する。
幾つかの実施形態では、フソソーム組成物は、参照標的細胞集団又は非標的細胞集団と比較して、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のカーゴを標的細胞集団に送達する。幾つかの実施形態では、フソソーム組成物は、参照標的細胞集団又は非標的細胞集団と比較して、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％多いカーゴを標的細胞集団に送達する。
幾つかの実施形態では、カーゴの１０％未満がエンドサイトーシスによって細胞に入る。
幾つかの実施形態では、エンドサイトーシスの阻害剤は、リソソーム酸性化阻害剤、例えば、バフィロマイシンＡ１である。幾つかの実施形態では、エンドサイトーシスの阻害剤は、ダイナミン阻害剤、例えば、ダイナソアである。
幾つかの実施形態では、標的細胞集団は、生理学的ｐＨ（例えば、７．３～７．５、例えば、７．３８～７．４２）にある。
幾つかの実施形態では、送達されるカーゴは、エンドサイトーシス阻害アッセイ、例えば、実施例８０のアッセイを使用して決定される。
幾つかの実施形態では、カーゴは、ダイナミン非依存性経路又はリソソーム酸性化非依存性経路、マクロピノサイトーシス非依存性経路（例えば、エンドサイトーシスの阻害剤が、例えば、２５μＭの濃度のマクロピノサイトーシス阻害剤、例えば、５－（Ｎ－エチル－Ｎ－イソプロピル）アミロリド（ＥＩＰＡ））、又はアクチン非依存性経路（例えば、エンドサイトーシスの阻害剤が、例えば、６μＭの濃度のアクチン重合の阻害剤、例えば、ラトランクリンＢ）を介して細胞に入る。
幾つかの実施形態では、複数のフソソームは、標的化部分を更に含む。実施形態では、標的化部分は、フソゲンによって含まれる、又は別個の分子によって含まれる。
幾つかの実施形態では、複数のフソソームが標的細胞及び非標的細胞を含む細胞集団と接触する場合、カーゴは、標的細胞において非標的細胞よりも少なくとも１０倍多く存在する。
幾つかの実施形態では、複数のフソソームが標的細胞及び非標的細胞を含む細胞集団と接触する場合、カーゴは、標的細胞において非標的細胞よりも少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、若しくは５０倍多く存在する、及び／又はカーゴは、標的細胞において参照細胞よりも２倍、５倍、１０倍、２０倍若しくは５０倍多く存在する。
幾つかの実施形態では、複数のフソソームが、非標的細胞よりも標的細胞と５０％高い割合で融合する。
幾つかの実施形態では、フソソームは、標的細胞集団と接触すると、エンドソーム又はリソソーム以外の標的細胞位置、例えば、細胞質ゾルにカーゴを送達する。実施形態では、カーゴの５０％、４０％、３０％、２０％、又は１０％未満がエンドソーム又はリソソームに送達される。
幾つかの実施形態では、複数のフソソームは、エクソソーム、微小胞、又はそれらの組み合わせを含む。
幾つかの実施形態では、複数のフソソームは、少なくとも５０ｎｍ、１００ｎｍ、２００ｎｍ、５００ｎｍ、１０００ｎｍ、１２００ｎｍ、１４００ｎｍ、又は１５００ｎｍの平均サイズを有する。他の実施形態では、複数のフソソームは、１００ｎｍ、８０ｎｍ、６０ｎｍ、４０ｎｍ、又は３０ｎｍ未満の平均サイズを有する。
幾つかの実施形態では、フソゲン（例えば、再標的化されたフソゲン）は、哺乳動物のフソゲンを含む。幾つかの実施形態では、フソゲン（例えば、再標的化されたフソゲン）は、ウイルス性フソゲンを含む幾つかの実施形態では、フソゲン（例えば、再標的化されたフソゲン）は、タンパク質フソゲンである。幾つかの実施形態では、フソゲン（例えば、再標的化されたフソゲン）は、ニパウイルスタンパク質Ｆ、麻疹ウイルスＦタンパク質、ツパイアパラミクソウイルスＦタンパク質、パラミクソウイルスＦタンパク質、ヘンドラウイルスＦタンパク質、ヘニパウイルスＦタンパク質、モルビリウイルスＦタンパク質、レスピロウイルスＦタンパク質であり、センダイウイルスＦタンパク質、ルブラウイルスＦタンパク質、若しくはアブラウイルスＦタンパク質、又はそれらの誘導体から選択される配列を含む。
幾つかの実施形態では、フソゲン（例えば、再標的化されたフソゲン）は、４～５、５～６、６～７、７～８、８～９、又は９～１０のｐＨで活性である。幾つかの実施形態では、フソゲン（例えば、再標的化されたフソゲン）は、４～５、５～６、６～７、７～８、８～９、又は９～１０のｐＨでは活性ではない。
幾つかの実施形態では、フソゲンは、フソソームあたり少なくとも１、２、５、又は１０コピーのコピー数で存在する。
幾つかの実施形態では、フソゲン（例えば、再標的化されたフソゲン）は、ニパウイルスタンパク質Ｇ、麻疹タンパク質Ｈ、ツパイアパラミクソウイルスＨタンパク質、パラミクソウイルスＧタンパク質、パラミクソウイルスＨタンパク質、パラミクソウイルスＨＮタンパク質、モルビリウイルスＨタンパク質、レスピロウイルスＨＮタンパク質であり、センダイウイルスＨＮタンパク質、ルブラウイルスＨＮタンパク質、アブラウイルスＨＮタンパク質、又はそれらの誘導体を含む。幾つかの実施形態では、フソゲン（例えば、再標的化されたフソゲン）は、ニパウイルスＦ及びＧタンパク質、麻疹ウイルスＦ及びＨタンパク質、ツパイアパラミクソウイルスＦ及びＨタンパク質、パラミクソウイルスＦ及びＧタンパク質若しくはＦ及びＨタンパク質若しくはＦ及びＨＮタンパク質、ヘンドラウイルスＦ及びＧタンパク質、ヘニパウイルスＦ及びＧタンパク質、モルビリウイルスＦ及びＨタンパク質、レスピロウイルスＦ及びＨＮタンパク質、センダイウイルスＦ及びＨＮタンパク質、ルブラウイルスＦ及びＨＮタンパク質、又はアブラウイルスＦ及びＨＮタンパク質、又はそれらの誘導体、又はそれらの任意の組み合わせから選択される配列を含む。
幾つかの実施形態では、カーゴは、外因性タンパク質又は外因性核酸を含む。幾つかの実施形態では、カーゴは、細胞質ゾルタンパク質を含むか、又はそれをコードする。幾つかの実施形態では、カーゴは、膜タンパク質を含むか、又はそれをコードする。幾つかの実施形態では、カーゴは治療剤を含む。幾つかの実施形態では、カーゴは、フソソームあたり、少なくとも１、２、５、１０、２０、５０、１００、又は２００コピーのコピー数（例えば、フソソームあたり最大約１，０００コピー）で存在する。幾つかの実施形態では、カーゴのコピー数に対するフソゲン（例えば、再標的化されたフソゲン）のコピー数の比は、１０００：１～１：１、又は５００：１～１：１、又は２５０：１～１：１、又は１５０：１～１：１、又は１００：１～１：１、又は７５：１～１：１、５０：１～１：１、２５：１～１：１、２０：１～１：１、又は１５：１～１：１、又は１０：１～１：１、又は５：１～１：１、又は２：１～１：１、又は１：１～１：２である。
幾つかの実施形態では、フソソーム組成物は、ウイルスキャプシドタンパク質又はＤＮＡ組み込みポリペプチドを含む。幾つかの実施形態では、カーゴはウイルスゲノムを含む。
幾つかの実施形態では、フソソームは、例えば、遺伝子治療のために、例えば、標的細胞のゲノムを安定に改変するために、核酸を標的細胞に送達することができる。
幾つかの実施形態では、フソソーム組成物はウイルスヌクレオキャプシドタンパク質を含まず、例えば、質量分析によれば、例えば、実施例９３のアッセイを使用すると、ウイルスヌクレオキャプシドタンパク質の量は、総タンパク質の１０％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．２％、又は０．１％未満である。
実施形態では、フソソーム組成物は、少なくとも１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、又は１０１５のフソソームを含む。実施形態では、フソソーム組成物は、少なくとも１０ｍｌ、２０ｍｌ、５０ｍｌ、１００ｍｌ、２００ｍｌ、５００ｍｌ、１Ｌ、２Ｌ、５Ｌ、１０Ｌ、２０Ｌ、又は５０Ｌを含む。
実施形態では、フソソームは、例えば、（例えば、ＭＨＣタンパク質又はＭＨＣ複合体を除去するため、例えばゲノム編集によって）免疫原性を低下させるために改変されたゲノムを有する哺乳動物細胞に由来する。実施形態では、ソース細胞は、抗炎症シグナルで処理された細胞培養物に由来する。実施形態では、上記方法は、例えば、核を不活化する、例えば、細胞を除核する前又は後に、工程ａ）のソース細胞を免疫抑制物質又は抗炎症シグナルと接触させることを更に含む。
一態様では、本明細書で提供されるのは、ソース細胞に由来する複数のフソソームを含むフソソーム組成物であって、複数のフソソームは以下：（ａ）脂質二重層；（ｂ）細胞質ゾルを含む内腔であって、脂質二重層に囲まれている内腔；（ｃ）脂質二重層内に配置された外因性又は過剰発現されたフソゲン；（ｄ）カーゴを含み；フソソームは核を含まず；フソソーム組成物中のウイルスキャプシドタンパク質の量は、総タンパク質の１％未満であり；複数のフソソームは、エンドサイトーシスの阻害剤の存在下で標的細胞集団と接触した場合、及びエンドサイトーシスの阻害剤で処理されていない参照標的細胞集団と接触した場合、参照標的細胞集団と比較して、標的細胞集団において少なくとも３０％の数の細胞にカーゴを送達する。
実施形態では、フソソーム組成物は、参照標的細胞集団若しくは非標的細胞集団と比較して、標的細胞集団中の細胞数の少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％若しくは８０％にカーゴを送達する、又は参照標的細胞集団若しくは非標的細胞集団と比較して、例えば、カーゴの少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％若しくは８０％を標的細胞集団に送達する。幾つかの実施形態では、カーゴの１０％未満がエンドサイトーシスによって細胞に入る。幾つかの実施形態では、エンドサイトーシスの阻害剤は、リソソーム酸性化阻害剤、例えば、バフィロマイシンＡ１である。実施形態では、送達されるカーゴは、エンドサイトーシス阻害アッセイ、例えば、実施例８０のアッセイを使用して決定される。実施形態では、カーゴは、ダイナミン非依存性経路又はリソソーム酸性化非依存性経路、マクロピノサイトーシス非依存性経路（例えば、エンドサイトーシスの阻害剤が、例えば、２５μＭの濃度のマクロピノサイトーシス阻害剤、例えば、５－（Ｎ－エチル－Ｎ－イソプロピル）アミロリド（ＥＩＰＡ））、又はアクチン非依存性経路（例えば、エンドサイトーシスの阻害剤が、例えば、６μＭの濃度のアクチン重合の阻害剤、例えば、ラトランクリンＢ）を介して細胞に入る。
Ｃ．フソゲン及びシュードタイピング
幾つかの実施形態では、本明細書に記載のフソソーム（例えば、小胞又は細胞の一部を含む）は、例えば膜、例えば細胞膜へのフソソームの融合を促進するために、１つ以上のフソゲンを含む。また、これらの組成物は、合成中又は合成後に、１つ以上のフソゲンを含むように行われる表面修飾を含み得る。表面修飾は、膜への修飾、例えば脂質又はタンパク質の膜への挿入を含み得る。
幾つかの実施形態では、フソソームは、特定の細胞又は組織タイプ（例えばＣＮＳ細胞）を標的とするために、それらの外面上に（例えば、細胞膜に組み込まれた）１つ以上のフソゲンを含む。幾つかの態様では、１つ以上のフソゲンによって標的とされる特定の細胞型は、ＣＮＳ細胞、汎ニューロン細胞、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、グルタミン酸作動性ニューロン、コリン作動性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、セロトニン作動性ニューロン、グリア細胞、星状膠細胞、ミクログリア細胞、乏突起膠細胞、又は脈絡叢細胞である。フソソームは、標的化ドメインを含み得る。フソゲンには、タンパク質ベース、脂質ベース、及び化学ベースのフソゲンが含まれるが、これらに限定されない。フソゲンは、パートナー、例えば標的細胞の表面上の特徴に結合し得る。幾つかの実施形態では、標的細胞の表面上のパートナーは、標的細胞部分である。特定の実施形態では、フソゲンは、ＣＮＳ細胞、汎ニューロン細胞、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、グルタミン酸作動性ニューロン、コリン作動性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、セロトニン作動性ニューロン、グリア細胞、星状膠細胞、ミクログリア細胞、乏突起膠細胞、又は脈絡叢細胞のうちからの標的細胞に結合するフソゲン又は再標的化フソゲンである。幾つかの実施形態では、フソゲンを含むフソソームは、膜を標的細胞の脂質二重層に統合するであろう。幾つかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のフソゲンは、フソソームに含まれ得る。
本明細書に記載のフソソーム（例えば、レトロウイルスベクター）は、フソゲン、例えば、内因性フソゲン又はシュードタイプ化されたフソゲンを含むことができる。
ｉ）タンパク質フソゲン
幾つかの実施形態では、フソゲンは、タンパク質（例えば、糖タンパク質）、脂質、又は小分子を含む。フソゲンは、例えば、哺乳動物のフソゲン又はウイルスのフソゲンであり得る。幾つかの実施形態では、フソゲンは、タンパク質フソゲン、例えば、哺乳動物タンパク質又は哺乳動物タンパク質のホモログ（例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の同一性）、ウイルスタンパク質又はウイルスタンパク質のホモログ等の非哺乳動物タンパク質（例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の同一性）、天然タンパク質又は天然タンパク質の誘導体、合成タンパク質、そのフラグメント、そのバリアント、タンパク質融合１つ以上のフソゲン又はフラグメント、及びそれらの任意の組み合わせを含む。幾つかの実施形態では、ウイルスフソゲンは、クラスＩウイルス膜融合タンパク質、クラスＩＩウイルス膜タンパク質、クラスＩＩＩウイルス膜融合タンパク質、ウイルス膜糖タンパク質、又は他のウイルス融合タンパク質、又はそれらのホモログ、それらのフラグメント、それらのバリアント、又は１つ以上のタンパク質若しくはそのフラグメントを含むタンパク質融合である。
実施形態では、フソゲンは、ウイルスフソゲン、例えば、ＨＡ、ＨＩＶ－１ ＥＮＶ、ＨＨＶ－４、ｇｐ１２０、又はＶＳＶ－Ｇである。実施形態では、フソゲンは、哺乳動物のフソゲン、例えば、ＳＮＡＲＥ、Ｓｙｎｃｙｔｉｎ、ｍｙｏｍａｋｅｒ、ｍｙｏｍｉｘｅｒ、ｍｙｏｍｅｒｇｅｒ、又はＦＧＦＲＬ１である。実施形態では、フソゲンは、４～５、５～６、６～７、７～８、８～９、又は９～１０のｐＨで活性である。実施形態では、フソゲンは、４～５、５～６、６～７、７～８、８～９、又は９～１０のｐＨでは活性ではない。実施形態では、フソソームは、標的細胞の表面で標的細胞に融合する。実施形態では、フソゲンは、リソソームに依存しない方法で融合を促進する。実施形態では、フソゲンはタンパク質フソゲンである。実施形態では、フソゲンは、脂質フソゲン、例えば、オレイン酸、モノオレイン酸グリセロール、グリセリド、ジアシルグリセロール、又は修飾された不飽和脂肪酸である。実施形態では、フソゲンは、化学フソゲン、例えば、ＰＥＧである。実施形態では、フソゲンは、小分子フソゲン、例えば、ハロタン、メロキシカム、ピロキシカム、テノキシカム、及びクロルプロマジン等のＮＳＡＩＤである。実施形態では、フソゲンは組換え体である。実施形態では、フソゲンは、生化学的に組み込まれ、例えば、フソゲンは、精製されたタンパク質として提供され、フソゲンと脂質二重層との会合を可能にする条件下で脂質二重層と接触される。実施形態では、フソゲンは、生合成的に組み込まれ、例えば、フソゲンが脂質二重層と結合することを可能にする条件下で、ソース細胞において発現される。
幾つかの実施形態では、フソゲン（例えば、再標的化されたフソゲン）は、哺乳動物のフソゲンを含む。幾つかの実施形態では、フソゲン（例えば、再標的化されたフソゲン）は、ウイルス性フソゲンを含む幾つかの実施形態では、フソゲン（例えば、再標的化されたフソゲン）は、タンパク質フソゲンである。幾つかの実施形態では、フソゲン（例えば、再標的化されたフソゲン）は、ニパウイルスタンパク質Ｆ、麻疹ウイルスＦタンパク質、ツパイアパラミクソウイルスＦタンパク質、パラミクソウイルスＦタンパク質、ヘンドラウイルスＦタンパク質、ヘニパウイルスＦタンパク質、モルビリウイルスＦタンパク質、レスピロウイルスＦタンパク質であり、センダイウイルスＦタンパク質、ルブラウイルスＦタンパク質、若しくはアブラウイルスＦタンパク質、又はそれらの誘導体から選択される配列を含む。
幾つかの実施形態では、フソゲン（例えば、再標的化されたフソゲン）は、４～５、５～６、６～７、７～８、８～９、又は９～１０のｐＨで活性である。幾つかの実施形態では、フソゲン（例えば、再標的化されたフソゲン）は、４～５、５～６、６～７、７～８、８～９、又は９～１０のｐＨでは活性ではない。
幾つかの実施形態では、フソゲンは、フソソームあたり少なくとも１、２、５、又は１０コピーのコピー数で存在する。
幾つかの実施形態では、フソゲン（例えば、再標的化されたフソゲン）は、ニパウイルスタンパク質Ｇ、麻疹タンパク質Ｈ、ツパイアパラミクソウイルスＨタンパク質、パラミクソウイルスＧタンパク質、パラミクソウイルスＨタンパク質、パラミクソウイルスＨＮタンパク質、モルビリウイルスＨタンパク質、レスピロウイルスＨＮタンパク質であり、センダイウイルスＨＮタンパク質、ルブラウイルスＨＮタンパク質、アブラウイルスＨＮタンパク質、又はそれらの誘導体を含む。幾つかの実施形態では、フソゲン（例えば、再標的化されたフソゲン）は、ニパウイルスＦ及びＧタンパク質、麻疹ウイルスＦ及びＨタンパク質、ツパイアパラミクソウイルスＦ及びＨタンパク質、パラミクソウイルスＦ及びＧタンパク質若しくはＦ及びＨタンパク質若しくはＦ及びＨＮタンパク質、ヘンドラウイルスＦ及びＧタンパク質、ヘニパウイルスＦ及びＧタンパク質、モルビリウイルスＦ及びＨタンパク質、レスピロウイルスＦ及びＨＮタンパク質、センダイウイルスＦ及びＨＮタンパク質、ルブラウイルスＦ及びＨＮタンパク質、又はアブラウイルスＦ及びＨＮタンパク質、又はそれらの誘導体、又はそれらの任意の組み合わせから選択される配列を含む。
非哺乳動物フソゲンには、ウイルスフソゲン、その相同体、そのフラグメント、及び１つ以上のタンパク質又はそのフラグメントを含む融合タンパク質が含まれる。ウイルス性フソゲンには、クラスＩフソゲン、クラスＩＩフソゲン、クラスＩＩＩフソゲン、及びクラスＩＶフソゲンが含まれる。実施形態では、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ｇｐ４１等のクラスＩフソゲンは、中央のコイルドコイル構造を有するαヘリックスヘアピンの特徴的な三量体との特徴的な融合後コンフォメーションを有する。クラスＩウイルス融合タンパク質には、中央の融合後６ヘリックスバンドルを有するタンパク質が含まれる。クラスＩウイルス融合タンパク質としては、インフルエンザＨＡ、パラインフルエンザＦ、ＨＩＶ Ｅｎｖ、エボラＧＰ、オルトミクソウイルス由来ヘマグルチニン、パラミクソウイルス由来Ｆタンパク質（例えば、麻疹（Ｋａｔｏｈ ｅｔ ａｌ．ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１０，１０：３７））、レトロウイルス由来ＥＮＶタンパク質、及びフィロウイルス及びコロナウイルスのフソゲンが挙げられる。実施形態では、デング熱Ｅ糖タンパク質等のクラスＩＩウイルスフソゲンは、リフォールディングしてヘアピンの三量体をもたらす細長い外部ドメインを形成するβシートの構造的特徴を有する。実施形態では、クラスＩＩウイルスフソゲンは、中央のコイルドコイルを欠いている。クラスＩＩウイルスフソゲンは、アルファウイルス（例えば、Ｅ１タンパク質）及びフラビウイルス（例えば、Ｅ糖タンパク質）に見られる。クラスＩＩウイルス性フソゲンには、セムリキ森林ウイルス、シンビス、風疹ウイルス、及びデング熱ウイルスに由来するフソゲンが含まれる。実施形態では、水疱性口内炎ウイルスＧ糖タンパク質等のクラスＩＩＩウイルスフソゲンは、クラスＩ及びＩＩに見られる構造的特徴を併せ持つ。実施形態では、クラスＩＩＩウイルスフソゲンは、αヘリックス（例えば、クラスＩウイルスフソゲンと同様に６ヘリックスバンドルを形成してタンパク質を折り返す）、及びその末端に両親媒性融合ペプチドを有するβシートを含み、クラスＩＩウイルスフソゲンを連想させる。クラスＩＩＩウイルスフソゲンは、ラブドウイルス及びヘルペスウイルスに見られる。実施形態では、クラスＩＶウイルスフソゲンは、無エンベロープレオウイルスによってコードされる、融合関連小膜貫通（ＦＡＳＴ）タンパク質である（ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｊ．ｅｍｂｏｊ．７６００７６７，Ｎｅｓｂｉｔｔ，Ｒａｅ Ｌ．，「Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｕｓｉｎｇ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ Ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ＦＡＳＴ ｐｒｏｔｅｉｎｓ」（２０１２）．Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ．Ｐａｐｅｒ ３８８）。実施形態では、クラスＩＶウイルスフソゲンは、ヘアピンを形成しないほど十分に小さい（ｄｏｉ：１０．１１４６／ａｎｎｕｒｅｖ－ｃｅｌｌｂｉｏ－１０１５１２－１２２４２２，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｄｅｖｃｅｌ．２００７．１２．００８）。
ウイルスエンベロープタンパク質（ｅｎｖ）を含むフソゲンは、一般に、フソソームに感染して形質転換できる宿主細胞の範囲を決定する。ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＥＩＶ等のレンチウイルスの場合、天然ｅｎｖタンパク質にはｇｐ４１とｇｐ１２０が含まれる。幾つかの実施形態では、本明細書に記載のソース細胞によって発現されるウイルスｅｎｖタンパク質は、以前に記載されているように、ウイルスのｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子とは別のベクターにコードされている。
使用できるレトロウイルス由来のｅｎｖ遺伝子の実例としては、限定されるものではないが、ＭＬＶエンベロープ、１０Ａ１エンベロープ、ＢＡＥＶ、ＦｅＬＶ－Ｂ、ＲＤ１１４、ＳＳＡＶ、エボラ、センダイ、ＦＰＶ（家禽疫病ウイルス）、及びインフルエンザウイルスエンベロープが挙げられる。同様に、ＲＮＡウイルス（例えば、ピコルナウイルス科（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）、カリシウイルス科（Ｃａｌｃｉｖｉｒｉｄａｅ）、アストロウイルス科（Ａｓｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）、トガウイルス科（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ）、フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）、コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）、パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）、フィロウイルス科（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、オルトミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、ブニヤウイルス科（Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ）、アレナウイルス科（Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ）、レオウイルス科（Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ）のＲＮＡウイルスファミリー）と並んで、ＤＮＡウイルス（ヘパドナウイルス科（Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）、サーコウイルス科（Ｃｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅ）、パルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）、パポバウイルス科（Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ）、アデノウイルス科（Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ）、ヘルペスウイルス科（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）、ポックスウイルス科（Ｐｏｘｙｉｒｉｄａｅ）、及びイリドウイルス科（Ｉｒｉｄｏｖｉｒｉｄａｅ）のウイルスファミリー）に由来するエンベロープをコードする遺伝子を利用することができる。代表的な例としては、ＦｅＬＶ、ＶＥＥ、ＨＦＶＷ、ＷＤＳＶ、ＳＦＶ、狂犬病、ＡＬＶ、ＢＩＶ、ＢＬＶ、ＥＢＶ、ＣＡＥＶ、ＳＮＶ、ＣｈＴＬＶ、ＳＴＬＶ、ＭＰＭＶ、ＳＭＲＶ、ＲＡＶ、ＦｕＳＶ、ＭＨ２、ＡＥＶ、ＡＭＶ、ＣＴ１０、ＥＩＡＶ等が挙げられる。
幾つかの実施形態では、フソソーム上に表示するためのエンベロープタンパク質としては、限定されるものではないが、以下の供給源のいずれかが挙げられる：Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ３Ｎ２及びＨ５Ｎ１（鳥インフルエンザ）等のインフルエンザＡ、インフルエンザＢ、インフルエンザＣウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｄ型ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ロタウイルス、ノーウォークウイルス群の任意のウイルス、腸内アデノウイルス、パルボウイルス、デング熱ウイルス、サル痘、モノネガウイルス、狂犬病ウイルス等のリッサウイルス、ラゴスコウモリウイルス、モコラウイルス、デュベンヘイジウイルス、ヨーロッパコウモリウイルス１及び２、オーストラリアコウモリウイルス、エフェメロウイルス、ベシキュロウイルス、小胞性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、単純ヘルペスウイルス１型及び２型等のヘルペスウイルス、バリセラ帯状疱疹、サイトメガロウイルス、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、ヒトヘルペスウイルス（ＨＨＶ）、ヒトヘルペスウイルス６型及び８型、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、パピローマウイルス、ネズミガンマヘルペスウイルス、アルゼンチン出血熱ウイルス等のアリーナウイルス、ボリビア出血熱ウイルス、サビア関連出血熱ウイルス、ベネズエラ出血熱ウイルス、ラッサ熱ウイルス、マチュポウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス等のブニヤウイルス科、ハンタウイルス、出血性腎症候群を引き起こすウイルス、リフトバレー熱ウイルス、エボラ出血熱及びマールブルグ出血熱を含むフィロウイルス科（フィロウイルス）、キャサヌール森林病ウイルスを含むフラビウイルス科、オムスク出血熱ウイルス、ダニ媒介性脳炎を引き起こすウイルス及びヘンドラウイルス及びニパウイルス等のパラミクソウイルス科、ｖａｒｉｏｌａ ｍａｊｏｒ及びｖａｒｉｏｌａ ｍｉｎｏｒ（天然痘）ベネズエラウマ脳炎ウイルス等のアルファウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、ＳＡＲＳ関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、西ナイルウイルス、任意の脳炎を引き起こすウイルス。
幾つかの実施形態では、本明細書に記載のソース細胞は、ＶＳＶ－Ｇ糖タンパク質でシュードタイプ化されたフソソーム、例えば、組換えレトロウイルス、例えば、レンチウイルスを産生する。
フソソーム又はシュードタイプ化されたウイルスは、一般に、そのエンベロープタンパク質の１つ以上に改変があり、例えば、エンベロープタンパク質は、別のウイルスからのエンベロープタンパク質で置換されている。例えば、ＨＩＶは、ラブドウイルスからの融合タンパク質、例えば、水疱性口内炎ウイルスＧタンパク質（ＶＳＶ－Ｇ）エンベロープタンパク質でシュードタイプ化することができ、ＨＩＶエンベロープタンパク質（ｅｎｖ遺伝子によってコードされる）は通常、ウイルスをＣＤ４＋提示細胞に標的化するため、ＨＩＶはより広範囲の細胞に感染する。幾つかの実施形態では、レンチウイルスエンベロープタンパク質は、ＶＳＶ－Ｇでシュードタイプ化される。一実施形態では、ソース細胞は、ＶＳＶ－Ｇエンベロープ糖タンパク質でシュードタイプ化された組換えレトロウイルス、例えばレンチウイルスを産生する。
更に、フソゲン又はウイルスエンベロープタンパク質を、形質導入ベクターがその正常範囲外の宿主細胞を標的にして感染することを可能にする、又はより具体的には細胞又は組織型への形質導入を制限することを可能にするポリペプチド配列を含むように改変又は操作することができる。例えば、フソゲン又はエンベロープタンパク質は、受容体リガンド、抗体（抗体の抗原結合部分又は一本鎖抗体等の組換え抗体型分子を使用する）等の標的配列、及び形質導入ベクターコート上に表示されると、目的の標的細胞へのビリオン粒子の直接送達を容易にするポリペプチド部分又はその改変物（例えば、グリコシル化部位が標的配列に存在する場合）とインフレームで結合することができる。更に、エンベロープタンパク質は、細胞機能を調節する配列を更に含むことができる。形質導入ベクターで細胞機能を調節すると、混合細胞集団における特定の細胞型の形質導入効率が増加又は減少する可能性がある。例えば、幹細胞は、血液又は骨髄に見られる他の細胞型ではなく、幹細胞に特異的に結合するリガンド又は結合パートナーを含むエンベロープ配列でより特異的に形質導入することができる。非限定的な例は、幹細胞因子（ＳＣＦ）及びＦｌｔ－３リガンドである。他の例としては、例えば、抗体（例えば、細胞型に特異的な一本鎖抗体）、及び肺癌、肝臓、膵臓、心臓、内皮、平滑、乳房、前立腺、上皮、血管の癌等の組織に結合する本質的に任意の抗原（受容体を含む）が挙げられる。
タンパク質フソゲン又はウイルスエンベロープタンパク質は、フソゲンタンパク質又はターゲッティングタンパク質（例えば、ヘマグルチニンタンパク質）のアミノ酸残基を変異させることによって再標的化され得る。幾つかの実施形態では、フソゲンはランダムに変異している。幾つかの実施形態では、フソゲンは合理的に変異している。幾つかの実施形態では、フソゲンは定向進化にさらされる。幾つかの実施形態では、フソゲンはトランケートされ、ペプチドのサブセットのみがレトロウイルスベクター又はＶＬＰで使用される。例えば、麻疹ヘマグルチニンタンパク質のアミノ酸残基を変異させてタンパク質の結合特性を変化させ、融合をリダイレクトすることができる（ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ９４２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ｖｏｌ．１６ ｎｏ．８，１４２７－１４３６ Ａｕｇ．２００８，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ１０６０，ＤＯＩ：１０．１１２８／ＪＶＩ．７６．７．３５５８－３５６３．２００２，ＤＯＩ：１０．１１２８／ＪＶＩ．７５．１７．８０１６－８０２０．２００１，ｄｏｉ：１０．１０７３ｐｎａｓ．０６０４９９３１０３）。
幾つかの実施形態では、タンパク質フソゲン又はウイルスエンベロープタンパク質は、ｉ）天然のフソゲンタンパク質配列若しくはウイルスエンベロープタンパク質配列中のアミノ酸を変異させること、及び／又はｉｉ）フソゲン若しくはウイルスエンベロープタンパク質がその正常範囲外の宿主細胞を標的とし、融合若しくは感染することを可能にするポリペプチド配列を含むように、フソゲンタンパク質若しくはウイルスエンベロープタンパク質を操作することによって再標的化される。
幾つかの実施形態では、フソソームは、特定の細胞又は組織タイプを標的とするために、それらの外面上に（例えば、細胞膜に組み込まれた）１つ以上のフソゲンを含む。フソゲンには、タンパク質ベース、脂質ベース、及び化学ベースのフソゲンが含まれるが、これらに限定されない。フソゲンは、標的細胞の表面上のパートナーに結合する可能性がある。幾つかの実施形態では、フソゲンを含むフソソームは、膜を標的細胞の脂質二重層に統合するであろう。
幾つかの実施形態では、フソゲンは、パラミクソウイルスフソゲンである。幾つかの実施形態では、フソゲンは、ニパウイルスタンパク質Ｆ、麻疹ウイルスＦタンパク質、ツパイアパラミクソウイルスＦタンパク質、パラミクソウイルスＦタンパク質、ヘンドラウイルスＦタンパク質、ヘニパウイルスＦタンパク質、モルビリウイルスＦタンパク質、レスピロウイルスＦタンパク質であり、センダイウイルスＦタンパク質、ルブラウイルスＦタンパク質、又はアブラウイルスＦタンパク質である。
幾つかの実施形態では、フソゲンは、ポックスウイルス科のフソゲンである。
追加の例示的なフソゲンは、米国特許第９，６９５，４４６号、米国特許出願公開第２００４／００２８６８７号、米国特許第６，４１６，９９７号、米国特許第７，３２９，８０７号、米国特許出願公開第２０１７／０１１２７７３号、米国特許出願公開第２００９／０２０２６２２号、国際公開第２００６／０２７２０２号、及び米国特許出願公開第２００４／０００９６０４号に開示されており、これら全ての内容が参照により本明細書に組み込まれる。
幾つかの実施形態では、本明細書に記載のフソゲンは、表１のアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は該配列の一部、例えば１００、２００、３００、４００、５００、又は６００アミノ酸長に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、幾つかの実施形態では、本明細書に記載のフソゲンは、表１の任意のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態では、本明細書に記載の核酸配列は、表１のアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は該配列の一部、例えば４０、５０、６０、８０、１００、２００、３００、４００、５００、又は６００アミノ酸長に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする。
幾つかの実施形態では、本明細書に記載のフソゲンは、配列番号１～５７のいずれか１つに示されるアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は該配列の一部、例えば１００、２００、３００、４００、５００、又は６００アミノ酸長に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、幾つかの実施形態では、本明細書に記載のフソゲンは、配列番号１～５７のいずれか１つに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態では、本明細書に記載の核酸配列は、配列番号１～５７のいずれか１つに示されるアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は該配列の一部、例えば４０、５０、６０、８０、１００、２００、３００、４００、５００、又は６００アミノ酸長に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする。


幾つかの実施形態では、本明細書に記載のフソゲンは、表２のアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は該配列の一部、例えば１００、２００、３００、４００、５００、又は６００アミノ酸長に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、幾つかの実施形態では、本明細書に記載のフソゲンは、表２の任意のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態では、本明細書に記載の核酸配列は、表２のアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は該配列の一部、例えば４０、５０、６０、８０、１００、２００、３００、４００、５００、又は６００アミノ酸長に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする。
幾つかの実施形態では、本明細書に記載のフソゲンは、配列番号５８～１３３のいずれか１つに示されるアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は該配列の一部、例えば１００、２００、３００、４００、５００、又は６００アミノ酸長に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、幾つかの実施形態では、本明細書に記載のフソゲンは、配列番号５８～１３３のいずれか１つに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態では、本明細書に記載の核酸配列は、配列番号５８～１３３のいずれか１つに示されるアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は該配列の一部、例えば４０、５０、６０、８０、１００、２００、３００、４００、５００、又は６００アミノ酸長に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする。
ｉｉ）脂質フソゲン
幾つかの実施形態では、フソソームは、飽和脂肪酸などの融合性脂質で処理され得る。幾つかの実施形態では、飽和脂肪酸は、１０～１４個の炭素を有する。幾つかの実施形態では、飽和脂肪酸は、より長鎖のカルボン酸を有する。幾つかの実施形態では、飽和脂肪酸はモノエステルである。
幾つかの実施形態では、フソソームを不飽和脂肪酸で処理することができる。幾つかの実施形態では、不飽和脂肪酸は、Ｃ１６～Ｃ１８の不飽和脂肪酸を有する。幾つかの実施形態では、不飽和脂肪酸には、オレイン酸、モノオレイン酸グリセロール、グリセリド、ジアシルグリセロール、修飾不飽和脂肪酸、及びそれらの任意の組み合わせが含まれる。
理論に拘束されることを望まないが、幾つかの実施形態では、負の湾曲脂質は膜融合を促進する。幾つかの態様では、フソソームは、膜中に、１つ以上の負の湾曲脂質、例えばソース細胞に対して外因性の負の湾曲脂質を含む。実施形態では、負の湾曲脂質又はその前駆体は、ソース細胞又はフソソームを含む培地に添加される。実施形態では、ソース細胞は、１つ以上の脂質合成遺伝子を発現又は過剰発現するように操作される。負の湾曲脂質は、例えば、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、コレステロール、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、又は脂肪酸（ＦＡ）であり得る。
理論に拘束されることを望まないが、幾つかの実施形態では、正の湾曲脂質は膜融合を阻害する。幾つかの実施形態では、フソソームは、膜において、１つ以上の正の湾曲脂質、例えば、外因性の正の湾曲脂質のレベルの低下を含む。実施形態では、レベルは、例えば、ソース細胞における脂質合成遺伝子のノックアウト又はノックダウンによって、脂質の合成を阻害することによって減少する。正の湾曲脂質は、例えば、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）、ホスファチジルイノシトール（ＰｔｄＩｎｓ）、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）、リゾホスファチジルエタノールアミン（ＬＰＥ）、又はモノアシルグリセロール（ＭＡＧ）であり得る。
ｉｉｉ）化学フソゲン
幾つかの実施形態では、フソソームは、融合性化学物質で処理され得る。幾つかの実施形態では、融合性化学物質は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はその誘導体である。
幾つかの実施形態では、化学フソゲンは、２つの膜の間に局所的な脱水を誘発し、それは、二重層の好ましくない分子パッキングにつながる。幾つかの実施形態では、化学フソゲンは、脂質二重層の近くの領域の脱水を誘発し、細胞間の水性分子の置換を引き起こし、２つの膜間の相互作用を可能にする。
幾つかの実施形態では、化学フソゲンは陽イオンである。陽イオンの幾つかの非限定的な例としては、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋、Ｌａ３＋、Ｓｒ３＋、及びＨ＋が挙げられる。
幾つかの実施形態では、化学フソゲンは、表面極性を改変することによって標的膜に結合し、これは、水和依存性の膜間反発を変化させる。
幾つかの実施形態では、化学フソゲンは、可溶性で脂溶性である。幾つかの非限定的な例には、オレオイルグリセロール、ジオレオイルグリセロール、トリオレオイルグリセロール、並びにそれらのバリアント及び誘導体が含まれる。
幾つかの実施形態では、化学フソゲンは水溶性化学物質である。幾つかの非限定的な例には、ポリエチレングリコール、ジメチルスルホキシド、並びにそれらのバリアント及び誘導体が含まれる。
幾つかの実施形態では、化学フソゲンは小さな有機分子である。非限定的な例には、ｎ－ヘキシルブロミドが含まれる。
幾つかの実施形態では、化学フソゲンは、フソゲン又は標的膜の構成、細胞生存率、又はイオン輸送特性を変化させない。
幾つかの実施形態では、化学フソゲンは、ホルモン又はビタミンである。幾つかの非限定的な例には、アブシジン酸、レチノール（ビタミンＡ１）、トコフェロール（ビタミンＥ）、並びにそれらのバリアント及び誘導体が含まれる。
幾つかの実施形態では、フソソームは、アクチン及び重合されたアクチンを安定化する薬剤を含む。理論に拘束されることを望まないが、フソソーム内の安定化されたアクチンは、標的細胞との融合を促進することができる。実施形態では、重合アクチンを安定化する薬剤は、アクチン、ミオシン、ビオチン－ストレプトアビジン、ＡＴＰ、神経性ウィスコット－アルドリッチ症候群タンパク質（Ｎ－ＷＡＳＰ）、又はフォルミンから選択される。例えば、Ｌａｎｇｍｕｉｒ．２０１１ Ａｕｇ １６；２７（１６）：１００６１－７１及びＷｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１６ Ａｕｇ ３１；７を参照されたい。実施形態では、フソソームは、ソース細胞に対して外因性又は過剰発現されるアクチン、例えば野生型アクチン又は重合を促進する突然変異を含むアクチンを含む。実施形態では、フソソームは、ＡＴＰ又はホスホクレアチン、例えば、外因性ＡＴＰ又はホスホクレアチンを含む。
ｉｖ）小分子フソゲン
幾つかの実施形態では、フソソームは、融合性小分子で処理され得る。幾つかの非限定的な例としては、ハロタン、メロキシカム、ピロキシカム、テノキシカム、及びクロルプロマジン等の非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）が挙げられる。
幾つかの実施形態では、小分子フソゲンは、ミセル様凝集体中に存在するか、又は凝集体を含まない場合がある。
ｖ）フソゲン修飾
幾つかの実施形態では、フソゲンは、切断可能なタンパク質に連結される。幾つかの場合、切断可能なタンパク質は、プロテアーゼへの曝露によって切断され得る。操作された融合タンパク質は、膜貫通タンパク質の任意のドメインに結合し得る。操作された融合タンパク質は、膜間空間内に位置するタンパク質ドメインに、切断ペプチドによって連結され得る。切断ペプチドは、膜間プロテアーゼ（例えば、位置Ｐ１の非極性脂肪族アミノ酸（バリン、イソロイシン又はメチオニンが好ましい）、及びＰ２位及びＰ３位の親水性残基（アルギニンが好ましい）を必要とするＨＴＲＡ２／ＯＭＩ）の１つ又は組み合わせによって切断され得る。
幾つかの実施形態では、フソゲンは、親和性タグに連結されている。幾つかの実施形態では、親和性タグは、フソソームの分離及び単離を助ける。幾つかの実施形態では、親和性タグは切断可能である。幾つかの実施形態では、親和性タグは、フソゲンに非共有結合的に連結されている。幾つかの実施形態では、親和性タグは、フソソーム上に存在し、フソゲンとは別である。
幾つかの実施形態では、フソゲンタンパク質は、タンパク質分解配列、例えばミトコンドリア又はサイトゾル分解配列を含むように、当技術分野で公知の任意の方法又は本明細書に記載の任意の方法によって操作される。フソゲンは、タンパク質分解配列、例えば、カスパーゼ２タンパク質配列（例えば、Ｖａｌ－Ａｓｐ－Ｖａｌ－Ａｌａ－Ａｓｐ－｜－（配列番号１５５））又は他のタンパク質分解配列（例えば、Ｇａｓｔｅｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ；２００５：５７１－６０７を参照）、野生型タンパク質分解配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％以上の同一性を有する改変タンパク質分解配列、細胞質タンパク質分解配列（例えばユビキチン）、又は野生型タンパク質分解物に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％以上の同一性を有する改変細胞質タンパク質分解配列を含むように操作され得るが、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、組成物は、タンパク質分解配列、例えば野生型タンパク質分解配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％以上の同一性、細胞質ゾルのタンパク質分解配列（例えばユビキチン）、又は野生型タンパク質分解配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％以上の同一性を有する改変された細胞質ゾルのタンパク質分解配列で改変されたタンパク質を含むソース細胞又はコンドリソーム中のミトコンドリアを含む。
幾つかの実施形態では、フソゲンは、特定のタンパク質を認識するプロテアーゼドメイン、例えばプロテアーゼの過剰発現、例えばプロテアーゼ活性を有する操作された融合タンパク質で改変され得る。例えば、プロテアーゼ又はプロテアーゼ由来のプロテアーゼドメイン、例えばＭＭＰ、ミトコンドリアプロセシングペプチダーゼ、ミトコンドリア中間体ペプチダーゼ、内膜ペプチダーゼ。
Ａｌｆｏｎｚｏ，Ｊ．Ｄ．＆Ｓｏｌｌ，Ｄ．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｔＲＮＡ ｉｍｐｏｒｔ－ｔｈｅ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ ｔｏ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄ ｈａｓ ｊｕｓｔ ｂｅｇｕｎ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９０：７１７－７２２．２００９；Ｌａｎｇｅｒ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｒｅｌｅａｓｅｄ ｆｒｏｍ Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ．ＴＨＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ．Ｖｏｌ．２８０，Ｎｏ．４．２６９１－２６９９，２００５；Ｖｌｉｅｇｈ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ ｍａｒｋｅｔ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ．１５（１／２）．２０１０；Ｑｕｉｒｏｓ Ｐ．Ｍ．ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ ｒｏｌｅｓ ｆｏｒ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ ｉｎ ｈｅａｌｔｈ，ａｇｅｉｎｇ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｖ１６，２０１５；Ｗｅｂｅｒ－Ｌｏｔｆｉ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．ＤＮＡ ｉｍｐｏｒｔ ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ ａｎｄ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｇｅｎｅｔｉｃｓ．Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ．Ｖｏｌ．３０．Ｎ １．７１－７３，２０１４を参照。
ＩＩＩ．正の標的細胞特異的調節エレメント
幾つかの実施形態では、本明細書に記載のフソソーム、例えばウイルス、例えばレトロウイルスは、組織特異的プロモーター、組織特異的エンハンサー、組織特異的スプライス部位、ＲＮＡ若しくはタンパク質の半減期を延長する組織特異的部位、組織特異的ｍＲＮＡ核外輸送促進部位、組織特異的翻訳増強部位、又は組織特異的翻訳後修飾部位などの、正の標的細胞特異的調節エレメントを含む核酸（例えば、外因性作用物質をコードする遺伝子）、例えばレトロウイルス核酸を含む。
幾つかの態様では、本明細書に記載のフソソーム、例えばウイルス、例えばレトロウイルスは、領域、例えば複製起点、選択カセット、プロモーター、エンハンサー、翻訳開始シグナル（シャインダルガノ配列又はコザック配列）、イントロン、ポリアデニル化配列、５’及び３’非翻訳領域などの非翻訳領域を含み得る核酸、例えばレトロウイルス核酸を含み、これらは宿主細胞タンパク質と相互作用して転写及び翻訳を行い、作動可能に連結されたポリヌクレオチドの転写又は発現を指示、増加、調節、又は制御することができる。かかるエレメントは、その強度及び特異性が異なる場合がある。利用されるベクターシステム及び宿主に応じて、ユビキタスプロモーター及び誘導性プロモーターを含む、任意の数の適切な転写及び翻訳エレメントを使用することができる。
特定の実施形態では、制御エレメントは、細胞特異的な方法で、作動可能に連結されたポリヌクレオチドの転写又は発現を指示、増加、調節、又は制御することができる。特定の実施形態では、核酸、例えばレトロウイルス核酸は、特定の細胞、細胞型、又は細胞系統、例えば標的細胞に特異的な１つ以上の発現制御配列を含み、すなわち、特定の細胞、細胞型、又は細胞系統に特異的な発現制御配列に作動可能に連結されたポリヌクレオチドの発現が、標的細胞では発現されるが、非標的細胞では発現されない（又はより低いレベルで発現される）。
特定の実施形態では、核酸、例えばレトロウイルス核酸は、プロモーター及び／又はエンハンサー等の外因性、内因性、又は異種の制御配列を含み得る。
実施形態では、プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼが結合する認識部位を含む。ＲＮＡポリメラーゼは、プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドを開始及び転写する。特定の実施形態では、哺乳動物細胞において作動するプロモーターは、転写が開始される部位から約２５～３０塩基上流に位置するＡＴリッチ領域及び／又は転写開始から７０～８０塩基上流に見出される別の配列、ＣＮＣＡＡＴ領域を含み、ここでＮは任意のヌクレオチドであり得る。
実施形態では、エンハンサーは、増強された転写を提供することができ、場合によっては、別の制御配列に対する配向とは無関係に機能することができる配列を含むＤＮＡのセグメントを含む。エンハンサーは、プロモーター及び／又は他のエンハンサーエレメントと協調的又は相加的に機能することができる。幾つかの実施形態では、ＤＮＡのプロモーター／エンハンサーセグメントは、プロモーター及びエンハンサー機能の両方を提供することができる配列を含む。
例示的なユビキタス発現制御配列としては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時初期プロモーター、ウイルスシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば、初期又は後期）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）ＬＴＲプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲ、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）プロモーター、ワクシニアウイルス由来のＨ５、Ｐ７．５、及びＰ１１プロモーター、伸長因子１－アルファ（ＥＦ１ａ）プロモーター、初期増殖応答１（ＥＧＲ１）、フェリチンＨ（ＦｅｒＨ）、フェリチンＬ（ＦｅｒＬ）、グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、真核生物翻訳開始因子４Ａ１（ＥＩＦ４Ａ１）、熱ショック７０ｋＤａタンパク質５（ＨＳＰＡ５）、熱ショックタンパク質９０ｋＤａベータ、メンバー１（ＨＳＰ９０Ｂ１）、熱ショックタンパク質７０ｋＤａ（ＨＳＰ７０）、β－キネシン（β－ＫＩＮ）、ヒトＲＯＳＡ ２６遺伝子座（Ｏｒｉｏｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２５，１４７７－１４８２（２００７））、ユビキチンＣプロモーター（ＵＢＣ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ－１（ＰＧＫ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ－アクチン（ＣＡＧ）プロモーター、β－アクチンプロモーター及び骨髄増殖肉腫ウイルスエンハンサー、陰性対照領域欠失、ｄ１５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーター（Ｃｈａｌｌｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．６９（２）：７４８－５５（１９９５））が挙げられる。
幾つかの実施形態では、プロモーターは、異種遺伝子と対にされて、異種遺伝子に対するそのプロモーターの調節機能を付与し得る。幾つかの実施形態では、第１の遺伝子のプロモーターからのシス調節エレメントは、異なる遺伝子のプロモーターのセグメントに連結されて、両方のプロモーターの特性を有するキメラプロモーターを作製し得る。
幾つかの態様では、プロモーターは、組織特異的プロモーター、例えばＣＮＳ細胞、例えば汎ニューロン細胞、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、グルタミン酸作動性ニューロン、コリン作動性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、セロトニン作動性ニューロン、星状膠細胞、ミクログリア、乏突起膠細胞、又は脈絡叢細胞における発現を駆動するプロモーターである。様々な適切なＣＮＳ細胞特異的プロモーターを以下の表３ に記載する。幾つかの実施形態では、本明細書に記載のフソソーム（例えば、ウイルスベクター）は、その核酸中に、表３のプロモーターの配列を有するプロモーター、又はその転写活性フラグメント、又はそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するバリアントを含む。幾つかの実施形態では、本明細書に記載のフソソーム（例えば、ウイルスベクター）は、その核酸中に、表３に列挙される遺伝子の転写開始部位の３ｋｂ以内の領域に由来する転写因子結合部位を有するプロモーターを含む。幾つかの実施形態では、本明細書に記載のフソソーム（例えば、ウイルスベクター）は、その核酸中に、表３に列挙される遺伝子の転写開始部位のすぐ上流の２．５ｋｂ、２ｋｂ、１．５ｋｂ、１ｋｂ、又は０．５ｋｂ以内の領域、又はその転写活性フラグメント、又はそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するバリアントを含む。
幾つかの実施形態では、ＣＮＳ細胞特異的プロモーターは、Ｈｉｏｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅｒ．２００７ Ｊｕｎ；１４（１１）：８７２－８２（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載され、例えば、ＣＮＳ細胞特異的プロモーターは、ＳＹＮ、ＮＳＥ、ＣａＭＫＩＩ、チューブリン又はＰＤＧＦプロモーターである。幾つかの態様では、ＣＮＳ細胞特異的プロモーターは、Ｎａｔｈａｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｎｅｕｒａｌ Ｃｉｒｃｕｉｔｓ，２００９，３：１９．ｄｏｉ：１０．３３８９／ｎｅｕｒｏ．０４．０１９．２００９（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるプロモーターであり、例えば、ＣＮＳ細胞特異的プロモーターは、ｆＳＳＴ又はｆＮＰＹプロモーターである。幾つかの態様では、ＣＮＳ細胞特異的プロモーターは、Ｄｅｌｚｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１２ Ａｕｇ；２３（４）：２４２－５４（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるプロモーターであり、例えば、ＣＮＳ細胞特異的プロモーターはＧＡＤ６７又はＤＬＸ５／６プロモーターである。幾つかの態様では、ＣＮＳ細胞特異的プロモーターは、Ｅｇａｓｈｉｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１８ Ｏｃｔ １１；８（１）：１５１５６（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるプロモーターであり、例えば、ＣＮＳ細胞特異的プロモーターは、ＶＧＬＵＴ１又はＤｏｃｋ１０プロモーターである。幾つかの実施形態では、ＣＮＳ細胞特異的プロモーターは、Ｎａｃｉｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，１９９９ Ｊａｎ；７２（１）：１７－２８（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるプロモーターであり、例えば、ＣＮＳ細胞特異的プロモーターはＣｈＡＴプロモーターである。幾つかの態様では、ＣＮＳ細胞特異的プロモーターはＶＡＣｈＴプロモーターである。幾つかの態様では、ＣＮＳ細胞特異的プロモーターは、Ｄｅｌｚｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１２ Ａｕｇ；２３（４）：２４２－２５４（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるプロモーターであり、例えば、ＣＮＳ細胞特異的プロモーターはＤｒｄ１ａプロモーターである。幾つかの実施形態では、ＣＮＳ細胞特異的プロモーターは、Ｂｅｎｚｅｋｈｒｏｕｆａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００９ Ｍａｙ；１６（５）：６８１－８（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるプロモーターであり、例えば、ＣＮＳ細胞特異的プロモーターはＴＰＨ－２プロモーターである。一部の実施形態では、該ＣＮＳ細胞特異的プロモーターは、Ｍｅｒｉｅｎｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１５ Ｏｃｔ；２２（１０）：８３０－９（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるプロモーターであり、例えば、ＣＮＳ細胞特異的プロモーターは、ＧＦＡＰ、ＥＡＡＴ１、又はＧＳプロモーターである。幾つかの態様では、ＣＮＳ細胞特異的プロモーターは、Ｉｍｍｇｅｎ ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるプロモーターであり、例えばＣＮＳ細胞特異的プロモーターはＣＸ３ＣＲ１プロモーターである。幾つかの実施形態では、ＣＮＳ細胞特異的プロモーターはＴＭＥＭ１１９プロモーターである。幾つかの態様では、ＣＮＳ細胞特異的プロモーターは、ＭｃＩｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｓ．２００５ Ｎｏｖ １；８２（３）：３９７－４０３（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるプロモーターであり、例えば、ＣＮＳ細胞特異的プロモーターはＭＢＰプロモーターである。一部の実施形態では、該ＣＮＳ細胞特異的プロモーターは、Ｋａｇｉａｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．２０１４ Ｎｏｖ－Ｄｅｃ；１６（１１－１２）：３６４－７３（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるプロモーターであり、例えば、ＣＮＳ細胞特異的プロモーターはＭＢＰ又はＣＮＰプロモーターである。幾つかの態様では、ＣＮＳ細胞特異的プロモーターは、Ｒｅｇｅｖ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１０ Ｍａｒ ２；１０７（９）：４４２４－９（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるプロモーターであり、例えば、ＣＮＳ細胞特異的プロモーターはＣＲＦＲ２βプロモーターである。幾つかの態様では、ＣＮＳ細胞特異的プロモーターは、前述のいずれかの転写活性断片である。幾つかの態様では、ＣＮＳ細胞特異的プロモーターは、前述のいずれかと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するバリアントである。
内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）は通常、シストロン（タンパク質をコードする領域）の開始コドン（ＡＴＧ等）への直接の内部リボソーム侵入を促進し、それによって遺伝子のキャップに依存しない翻訳をもたらす。例えば、Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ，（１９９０）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ １５（１２）：４７７－８３）、及びＪａｃｋｓｏｎ ａｎｄ Ｋａｍｉｎｓｋｉ．（１９９５）ＲＮＡ １（１０）：９８５－１０００を参照。特定の実施形態では、ベクターは、１つ以上の外因性作用物質をコードする１つ以上の外因性遺伝子を含む。特定の実施形態では、複数の外因性タンパク質作用物質のそれぞれの効率的な翻訳を達成するために、ポリヌクレオチド配列は、１つ以上のＩＲＥＳ配列又は自己切断ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列によって分離され得る。
本明細書において、核酸、例えばレトロウイルス核酸はまた、１つ以上のコザック配列、例えば、リボソームの小サブユニットへのｍＲＮＡの最初の結合を容易にし、翻訳を増加させる短いヌクレオチド配列を含み得る。コンセンサスコザック配列は（ＧＣＣ）ＲＣＣＡＴＧＧであり、Ｒはプリン（Ａ又はＧ）である（Ｋｏｚａｋ，（１９８６）Ｃｅｌｌ．４４（２）：２８３－９２、及びＫｏｚａｋ，（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５（２０）：８１２５－４８）。
異種転写因子及びインデューサーに応答するプロモーター
幾つかの実施形態では、核酸、レトロウイルス核酸は、外因性作用物質の条件付き発現、例えば、誘導性発現、抑制可能な発現、細胞型特異的発現、又は組織特異的発現を含むがこれに限定されない任意のタイプの条件付き発現を可能にするエレメントを含む。幾つかの実施形態では、外因性作用物質の条件付き発現を達成するために、細胞、組織、又は生物を、外因性作用物質を発現させる、又は外因性作用物質の発現の増加若しくは減少を引き起こす処理又は条件に供することによって発現を制御する。
誘導性プロモーター／システムの実例としては、限定されるものではないが、グルココルチコイド又はエストロゲン受容体をコードする遺伝子のプロモーター（対応するホルモンを用いる処理によって誘導可能）等のステロイド誘導性プロモーター、メタロチオニンプロモーター（様々な重金属を用いる処理によって誘導可能）、ＭＸ－１プロモーター（インターフェロンによって誘導可能）、「ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ」ミフェプリストン調節可能システム（Ｓｉｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｇｅｎｅ，３２３：６７）、クメート誘導性遺伝子スイッチ（国際公開第２００２／０８８３４６号公報）、テトラサイクリン依存性調節システム等が挙げられる。
導入遺伝子の発現は、インデューサー分子の存在又は不在によって活性化又は抑制され得る。場合によっては、インデューサー分子は段階的に遺伝子発現を活性化又は抑制し、場合によっては、インデューサー分子は全か無か（ａｌｌ－ｏｒ－ｎｏｔｈｉｎｇ）の方法で遺伝子発現を活性化又は抑制する。
一般的に使用される誘導性プロモーター／システムはテトラサイクリン（Ｔｅｔ）調節システムである。Ｔｅｔシステムは、それぞれの標的細胞における２つの要素の共発現に基づいている：（ｉ）最小プロモーターに融合され、目的の遺伝子に接続されたＴｅｔオペレーター配列（ＴｅｔＯ）の繰り返しを含むテトラサイクリン応答エレメント（例えば、外因性作用物質をコードする遺伝子）及び（ｉｉ）転写トランスアクチベーター（ｔＴＡ）、Ｔｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）の融合タンパク質、及び単純ヘルペスウイルス由来ＶＰ１６タンパク質のトランス活性化ドメイン。最初に記載されたバージョンでは、導入遺伝子の発現はテトラサイクリン又はその強力な類縁体であるドキシサイクリン（Ｄｏ）の不在下で活性であったが（Ｔｅｔ－ＯＦＦシステムと呼ばれる）、トランスアクチベータータンパク質内の４つのアミノ酸の改変は、Ｄｏｘ（Ｔｅｔ－ＯＮシステム）の存在下でのみＴｅｔＯに結合する逆ｔＴＡ（ｒｔＴＡ）をもたらした。幾つかの実施形態では、トランス活性化因子において、ＶＰ１６ドメインは最小の活性化ドメインによって置き換えられ、潜在的なスプライスドナー及びスプライスアクセプター部位が除去され、タンパク質はコドン最適化されており、Ｄｏｘに対して感受性が高く、ベースライン活性が低下している、改善されたトランス活性化因子バリアントｒｔＴＡ２Ｓ－Ｍ２をもたらした。更に、調節を強化するために隣接するオペレーターから３６ヌクレオチド間隔でＴｅｔＯを改変することを含む、様々なＴｅｔ応答性プロモーターエレメントが生成されている。追加の改変は、基礎活性を更に低下させ、発現ダイナミックレンジを増加させるのに役立つ場合がある。例として、ｐＴｅｔ－Ｔ１１（略称：ＴＩＩ）バリアントは、高いダイナミックレンジと低いバックグラウンド活性を示す。
条件付き発現は、部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼを使用することによっても達成できる。特定の実施形態によれば、核酸、例えばレトロウイルス核酸は、部位特異的リコンビナーゼ、例えば、野生型タンパク質である可能性のある１つ以上の組換え部位（例えば、２、３、４、５、７、１０、１２、１５、２０、３０、５０等）（Ｌａｎｄｙ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３：６９９－７０７（１９９３）を参照）、又は変異体、誘導体（例えば、組換えタンパク質配列又はそのフラグメントを含む融合タンパク質）、フラグメント、及びそれらのバリアントを含む、組換え反応に関与する切除又は統合タンパク質、酵素、補因子又は関連タンパク質によって媒介される組換えのための少なくとも１つ（典型的には２つ）の部位（複数可）を含む。リコンビナーゼの実例としては、限定されるものではないが、Ｃｒｅ、Ｉｎｔ、ＩＨＦ、Ｘｉｓ、Ｆｌｐ、Ｆｉｓ、Ｈｉｎ、Ｇｉｎ、ΦＣ３１、Ｃｉｎ、Ｔｎ３リゾルバーゼ、ＴｎｄＸ、ＸｅｒＣ、ＸｅｒＤ、ＴｎｐＸ、Ｈｊｃ、Ｇｉｎ、ＳｐＣＣＥ１及びＰａｒＡが挙げられる。
外因性作用物質の発現を調節するリボスイッチ
本明細書で提供される組成物及び方法の幾つかは、１つ以上のリボスイッチ、又は１つ以上のリボスイッチを含むポリヌクレオチドを含む。リボスイッチは、遺伝子発現を調節する細菌の一般的な機能であり、生物学的機能のＲＮＡ制御を実現する手段である。リボスイッチは、ｍＲＮＡの５’非翻訳領域に存在する可能性があり、リボスイッチ活性を誘導又は抑制する小分子リガンドの結合を通じて遺伝子発現の調節制御を可能にすることができる。幾つかの実施形態では、リボスイッチは、小分子リガンドの生成に関与する遺伝子産物を制御する。リボスイッチは通常、シス方式で動作するが、トランス方式で動作するリボスイッチが特定されている。天然のリボスイッチは、３次元の折りたたまれたＲＮＡ構造を介してリガンドに結合するアプタマードメイン、及びリガンドの有無に基づいてリボスイッチの活性を誘導又は抑制する機能スイッチングドメインである、２つのドメインで構成されている。したがって、リボスイッチによって達成される２つのリガンド感受性コンフォメーションがあり、オン状態とオフ状態を表す（Ｇａｒｓｔ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。機能スイッチングドメインは、内部リボソーム侵入部位、レトロウイルス遺伝子コンストラクトにおけるプレｍＲＮＡスプライスドナーのアクセシビリティ、翻訳、転写の終了、転写産物分解、ｍｉＲＮＡ発現、又はｓｈＲＮＡ発現を調節することによってポリヌクレオチドの発現に影響を与える可能性がある（Ｄａｍｂａｃｈ ａｎｄ Ｗｉｎｋｌｅｒ ２００９）。アプタマー及び機能スイッチングドメインをモジュラーコンポーネントとして使用でき、合成ＲＮＡデバイスが、ネイティブアプタマー、変異／進化したネイティブアプタマー、又はランダムＲＮＡライブラリのスクリーニングから特定される完全合成アプタマーとして遺伝子発現を制御できるようにする（ＭｃＫｅａｇｕｅ ｅｔ ａｌ ２０１６）。
プリンリボスイッチファミリーは、５００を超える配列が見つかった最大のファミリーの１つである（Ｍａｎｄａｌ ｅｔ ａｌ ２００３；米国特許出願公開第２００８０２６９２５８号；及び国際公開第２００６０５５３５１号公報）。プリンリボスイッチは、３つの保存されたらせん構造／ステム構造（ＰＩ、Ｐ２、Ｐ３）と介在するループ／接合エレメント（Ｊｌ－２、Ｌ２、Ｊ２－３、Ｌ３、Ｊ３－１）からなる同様の構造を共有している。リボスイッチのプリンファミリーのアプタマードメインは、配列の変化により、アデニン、グアニン、アデノシン、グアノシン、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン等の様々なプリン化合物による親和性／調節が自然に変化する（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．２００７）。
幾つかの実施形態では、核酸、例えば本明細書に記載のレトロウイルス核酸は、プロモーター及びリボスイッチに作動可能に連結された外因性作用物質をコードするポリヌクレオチドを含む。リボスイッチは、１つ以上、例えば、以下の全てを含む：ａ．）アプタマードメイン、例えば、ヌクレオシド類縁体抗ウイルス薬に結合することができ、ヌクレオシド類縁体抗ウイルス薬と比較してグアニン又は２’－デオキシグアノシンへの結合が減少しているアプタマードメイン；ｂ．）機能スイッチングドメイン、例えば、外因性作用物質の発現を調節することができる機能スイッチングドメインであって、アプタマードメインによるヌクレオシド類似体の結合が、機能スイッチングドメインの発現調節活性を誘導又は抑制し、それによって外因性作用物質の発現を調節する。幾つかの実施形態では、外因性作用物質は、ポリペプチド、ｍｉＲＮＡ、又はｓｈＲＮＡであり得る。例えば、一実施形態では、リボスイッチは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸に作動可能に連結されている。本明細書で提供される非限定的な実例では、外因性遺伝子は、１つ以上の操作されたシグナル伝達ポリペプチドをコードする。例えば、リボスイッチ及び１つ以上の操作されたシグナル伝達ポリヌクレオチドをコードする標的ポリヌクレオチドは、ソース細胞のゲノム、複製能力のない組換えレトロウイルス粒子、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞に見出すことができる。
アプタマードメインは、例えば、モジュラーコンポーネントとして使用でき、ＲＮＡ転写産物に影響を与えるために機能スイッチングドメインのいずれかと組み合わせることができる。本明細書に開示される実施形態のいずれにおいても、リボスイッチは、以下の活性のいずれかを調節することによってＲＮＡ転写産物に影響を及ぼし得る：内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、プレｍＲＮＡスプライスドナーのアクセシビリティ、翻訳、転写の終結、転写産物分解、ｍｉＲＮＡ発現、又はｓｈＲＮＡ発現。幾つかの実施形態では、機能スイッチングドメインは、抗ＩＲＥＳのＩＲＥＳへの結合を制御することができる（例えば、Ｏｇａｗａ，ＲＮＡ（２０１１），１７：４７８－４８８を参照、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。本明細書に開示される実施形態のいずれかにおいて、小分子リガンドの存在又は不在が、ＲＮＡ転写産物にリボスイッチが影響を与える可能性をもたらす。幾つかの実施形態では、リボスイッチは、リボザイムを含み得る。リボザイムを有するリボスイッチは、小分子リガンドの存在下で標的ポリヌクレオチドの転写産物分解を阻害又は増強することができる。幾つかの実施形態では、リボザイムは、リボザイムのピストルクラス、リボザイムのハンマーヘッドクラス、リボザイムのツイストクラス、リボザイムのハチェットクラス、又はＨＤＶ（デルタ肝炎ウイルス）であり得る。
ＩＶ．非標的細胞特異的調節エレメント
幾つかの実施形態では、非標的細胞特異的調節エレメント又は負のＴＣＳＲＥは、組織特異的ｍｉＲＮＡ認識配列、組織特異的プロテアーゼ認識部位、組織特異的ユビキチンリガーゼ部位、組織特異的転写抑制部位、又は組織特異的エピジェネティック抑制部位を含む。
幾つかの実施形態では、非標的細胞は、内因性ｍｉＲＮＡを含む。幾つかの実施形態では、本明細書中に記載されるフソソーム、例えばウイルス、例えばレトロウイルスは、そのｍｉＲＮＡに対する認識配列を含み得る核酸、例えばレトロウイルス核酸（例えば、外因性作用物質をコードする遺伝子）を含む。したがって、核酸、レトロウイルスの核酸が非標的細胞に入ると、ｍｉＲＮＡは外因性作用物質の発現をダウンレギュレートする可能性がある。これは、標的細胞と非標的細胞の特異性を高めるのに役立つ。
幾つかの実施形態では、ｍｉＲＮＡは、２０～２２ヌクレオチドの小さな非コードＲＮＡであり、典型的には、プレｍｉＲＮＡとして知られる約７０ヌクレオチドのフォールドバックＲＮＡ前駆体構造から切り出される。一般に、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡと標的の間の相補性の程度に応じて、２つの方法のいずれかでターゲットを負に調節する。まず、タンパク質をコードするｍＲＮＡ配列に完全又はほぼ完全な相補性で結合するｍｉＲＮＡは、通常、ＲＮＡを介した干渉（ＲＮＡｉ）経路を誘導する。ｍＲＮＡ標的の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）内の不完全な相補部位に結合することによって調節効果を発揮するｍｉＲＮＡは、通常、ＲＮＡｉ経路に使用されるものに類似するか又はおそらく同じＲＩＳＣ複合体を介して、転写後、明らかに翻訳レベルで標的遺伝子の発現を抑制する。翻訳制御と一致して、このメカニズムを使用するｍｉＲＮＡは、標的遺伝子のタンパク質レベルを低下させるが、これらの遺伝子のｍＲＮＡレベルは最小限の影響しか受けない。ｍｉＲＮＡ（例えば、天然に存在するｍｉＲＮＡ又は人工的に設計されたｍｉＲＮＡ）は、任意のｍＲＮＡ配列を特異的に標的にすることができる。例えば、一実施形態では、当業者は、ヒトｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ－３０又はｍｉＲ－２１）一次転写産物として発現される短いヘアピンＲＮＡコンストラクトを設計することができる。この設計は、ヘアピン構造にＤｒｏｓｈａプロセシング部位を追加し、ノックダウン効率を大幅に向上させることが示されている（Ｐｕｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，２００４）。ヘアピンステムは、２２ｎｔのｄｓＲＮＡ（例えば、アンチセンスは目的の標的に対して完全な相補性を持つ）とヒトｍｉＲに由来する１５～１９ｎｔのループで構成されている。ヘアピンの片側又は両側にｍｉＲループ及びｍｉＲ３０隣接配列を追加すると、マイクロＲＮＡを使用しない従来のｓｈＲＮＡデザインと比較して、発現したヘアピンのＤｒｏｓｈａ及びＤｉｃｅｒプロセッシングが１０倍超増加する。Ｄｒｏｓｈａ及びＤｉｃｅｒプロセッシングが増えると、ｓｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡの生成が増え、発現したヘアピンの効力が高まる。
何百もの異なるｍｉＲＮＡ遺伝子が、発生の間及び組織タイプ間で差次的に発現している。幾つかの研究は、発生のタイミング、細胞分化、増殖、アポトーシス、発癌、インスリン分泌、及びコレステロール生合成等、幅広い生物学的プロセスにおけるｍｉＲＮＡの重要な調節的役割を示唆している。（Ｂａｒｔｅｌ ２００４ Ｃｅｌｌ １１６：２８１－９７；Ａｍｂｒｏｓ ２００４ Ｎａｔｕｒｅ ４３１：３５０－５５；Ｄｕ ｅｔ ａｌ．２００５ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３２：４６４５－５２；Ｃｈｅｎ ２００５ Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５３：１７６８－７１；Ｋｒｕｔｚｆｅｌｄｔ ｅｔ ａｌ．２００５ Ｎａｔｕｒｅ ４３８：６８５－８９を参照）。分子分析は、ｍｉＲＮＡが異なる組織で異なる発現プロファイルを持っていることを示している。算出手法を使用して、約７，０００の予測されるヒトｍｉＲＮＡ標的の発現を分析した。データは、ｍｉＲＮＡの発現が多くのヒト組織におけるｍＲＮＡ発現の組織特異性に広く寄与することを示唆している。（Ｓｏｏｄ ｅｔ ａｌ．２００６ ＰＮＡＳ ＵＳＡ １０３（８）：２７４６－５１を参照）
したがって、ｍｉＲＮＡベースのアプローチは、内因性マイクロＲＮＡ種を使用して非標的細胞型での外因性作用物質の発現をサイレンシングすることにより、外因性作用物質の発現を標的細胞集団に制限するために使用できる。マイクロＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳を阻害するか、ｍＲＮＡの分解を引き起こすことにより、多くの生物で配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングを誘導する。例えば、Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．２００６ Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．１２（５）：５８５－９１．、及び国際公開第２００７／０００６６８号公報を参照、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。幾つかの実施形態では、核酸、例えばレトロウイルス核酸は、１つ以上（例えば、複数）の組織特異的なｍｉＲＮＡ認識配列を含む。幾つかの実施形態では、組織特異的ｍｉＲＮＡ認識配列は、長さが約２０～２５、２１～２４、又は２３ヌクレオチドである。実施形態では、組織特異的ｍｉＲＮＡ認識配列は、非標的細胞に存在するｍｉＲＮＡに対して完全な相補性を有する。幾つかの実施形態では、外因性作用物質は、ＧＦＰを含まず、例えば、蛍光タンパク質を含まず、例えば、レポータータンパク質を含まない。幾つかの実施形態では、オフターゲット細胞は造血細胞ではなく、及び／又はｍｉＲＮＡは造血細胞には存在しない。
幾つかの実施形態では、本明細書において方法は、標的細胞における外因性作用物質の組織特異的発現を含み、外因性作用物質をコードするヌクレオチドを及び少なくとも１つの組織特異的マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む複数のフソソーム、例えばウイルス、例えばレトロウイルスベクターを、標的細胞及び非標的細胞を含む複数の細胞と接触させることを含み、外因性作用物質は、標的細胞に対して優先的に、例えば限定されて発現される。
例えば、核酸、例えば、レトロウイルス核酸は、非標的細胞、例えば、造血始原細胞（ＨＳＰＣ）、造血幹細胞（ＨＳＣ）において、対応するｍｉＲＮＡを有するヌクレオチド配列に作動可能に連結された少なくとも１つのｍｉＲＮＡ認識配列を含み得て、これは、非標的細胞ではヌクレオチド配列の発現を防止又は低減するが、標的細胞、例えば分化細胞では発現を防止又は低減しない。幾つかの実施形態では、核酸、例えばレトロウイルス核酸は、非標的細胞において有効量で存在する（例えば、内因性ｍｉＲＮＡの濃度が導入遺伝子の発現を低減又は防止するのに十分である）ｍｉＲＮＡに対する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ配列標的を含み、また導入遺伝子を含む。実施形態では、このシステムで使用されるｍｉＲＮＡは、ＨＳＰＣ及びＨＳＣ等の非標的細胞で強く発現されるが、例えば骨髄及びリンパ系統の分化した子孫では発現されず、標的細胞での発現と治療効果を維持しながら、感受性幹細胞集団における導入遺伝子の発現を防止又は低減する。
幾つかの実施形態では、負のＴＳＣＲＥ又はＮＴＳＣＲＥは、ｍｉＲＮＡ認識部位を含む。例示的なｍｉＲＮＡを表４に提供する。幾つかの実施形態では、核酸（例えば、フソソーム核酸又はレトロウイルス核酸）は、表４のｍｉＲＮＡに相補的であるか、又はそれに対して少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の相補性を有する配列を含む。幾つかの実施形態では、核酸（例えば、フソソーム核酸又はレトロウイルス核酸）は、内因性ｍｉＲＮＡ、例えば、表４のｍｉＲＮＡ内のシード配列に完全に相補的である配列を含む。幾つかの実施形態では、ｍｉＲＮＡは、配列番号１５６～１６２のいずれか１つに記載の配列を含む。実施形態では、シード配列は、少なくとも６、７、８、９、又は１０ヌクレオチド長である。
幾つかの実施形態では、負のＴＳＣＲＥ又はＮＴＳＣＲＥは、本明細書に記載のｍｉＲＮＡに対するｍｉＲＮＡ認識部位を含む。例示的なｍｉＲＮＡとしては、Ｂｕｔｏｖｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１４ Ｊａｎ；１７（１）：１３１－４３（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に見られるもの、例えば、ｍｉＲ－３３８－３ｐ、ｍｉＲ－９、ｍｉＲ－１２５ｂ－５ｐ、又はｍｉＲ－３４２－３ｐなどが挙げられる。更なる例示的なｍｉＲＮＡは、Ｄｅｌｚｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ，２０１３ Ｏｃｔ；１４（１１）：１３３６－４６（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）において、例えば、ｍｉＲ－１２４が見出される。
幾つかの実施形態では、本明細書中に記載されるフソソームは、ペイロード遺伝子及び正の標的細胞特異的調節エレメントを含む核酸を含み、例えば、標的細胞は、ニューロン、例えば、汎ニューロン細胞、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、グルタミン酸作動性ニューロン、コリン作動性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン又はセロトニン作動性ニューロンである。幾つかの態様では、核酸は、非標的細胞特異的調節エレメント（ＮＴＣＳＲＥ）を更に含み、例えば、ＮＴＳＣＲＥは、グリア細胞（例えば、星状膠細胞、ミクログリア細胞又は乏突起膠細胞）において発現されるｍｉＲＮＡに対するｍｉＲＮＡ認識部位を含む。
幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるフソソームは、ペイロード遺伝子及び 正の標的細胞特異的調節エレメントを含む核酸を含み、例えば標的細胞はグリア細胞、例えば星状膠細胞、ミクログリア細胞又は乏突起膠細胞である。幾つかの態様では、核酸は、非標的細胞特異的調節エレメント（ＮＴＣＳＲＥ）を更に含み、例えば、ＮＴＳＣＲＥは、ニューロン、例えば、汎ニューロン細胞、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、グルタミン酸作動性ニューロン、コリン作動性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン又はセロトニン作動性ニューロンにおいて発現されるｍｉＲＮＡに対するｍｉＲＮＡ認識部位を含む。
幾つかの実施形態では、負のＴＳＣＲＥ又はＮＴＳＣＲＥは、本明細書に記載のｍｉＲＮＡに対するｍｉＲＮＡ認識部位を含む。例示的なｍｉＲＮＡとしては、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ－Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００６ Ｊａｎ １，３４；Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｌｏｄｉｓｈ，Ｓｅｍｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００５ Ａｐｒ；１７（２）：１５５－６５；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００４ Ｊａｎ ２；３０３（５６５４）：８３－６；Ｂａｒａｄ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２００４ Ｄｅｃ；１４（１２）：２４８６－２４９４；Ｋｒｉｃｈｅｖｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ．２００３ Ｏｃｔ；９（１０）：１２７４－８１；Ｋａｓａｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．２００４ Ｓｅｐ １７；３２２（２）：４０３－１０；Ｈｏｕｂａｖｉｙ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ Ｃｅｌｌ．２００３ Ａｕｇ；５（２）：３５１－８；Ｌａｇｏｓ－Ｑｕｉｎｔａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ．２００２ Ａｐｒ ３０；１２（９）：７３５－９；Ｃａｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２００４ Ｍａｒ ２；１０１（９）：２９９９－３００４；Ｓｅｍｐｅｒｅ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．２００４；５（３）：Ｒ１３；Ｍｅｔｚｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ Ｃａｎｃｅｒ．２００４ Ｆｅｂ；３９（２）：１６７－９；Ｃａｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２００２ Ｎｏｖ ２６；９９（２４）：１５５２４－９；Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．２００４ Ｏｃｔ；３６（１０）：１０７９－８３；Ｍｉｃｈａｅｌ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００３ Ｏｃｔ；１（１２）：８８２－９１；及びｗｗｗ．ｍｉＲＮＡ．ｏｒｇに見られるものが挙げられる。２００４ Ｏｃｔ；３６（１０）：１０７９－８３；Ｍｉｃｈａｅｌ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００３ Ｏｃｔ；１（１２）：８８２－９１；ａｎｄ ａｔ ｗｗｗ．ｍｉＲＮＡ．ｏｒｇ．に見られるものが挙げられる。
幾つかの実施形態では、負のＴＳＣＲＥ又はＮＴＳＣＲＥは、ｍｉＲ－１ｂ、ｍｉＲ－１８９ｂ、ｍｉＲ－９３、ｍｉＲ－１２５ｂ、ｍｉＲ－１３０、ｍｉＲ－３２、ｍｉＲ－１２８、ｍｉＲ－２２、ｍｉＲ１２４ａ、ｍｉＲ－２９６、ｍｉＲ－１４３、ｍｉＲ－１５、ｍｉＲ－１４１、ｍｉＲ－１４３、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－１２７、ｍｉＲ９９ａ、ｍｉＲ－１８３、ｍｉＲ－１９ｂ、ｍｉＲ－９２、ｍｉＲ－９、ｍｉＲ－１３０ｂ、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－３０ｂ、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－９９ａ、ｍｉＲ－２１２、ｍｉＲ－３０ｃ、ｍｉＲ－２１３、ｍｉＲ－２０、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－１５２、ｍｉＲ－１３９、ｍｉＲ－３０ｂ、ｍｉＲ－７、ｍｉＲ－３０ｃ、ｍｉＲ－１８、ｍｉＲ－１３７、ｍｉＲ－２１９、ｍｉＲ－１ｄ、ｍｉＲ－１７８、ｍｉＲ－２４、ｍｉＲ－１２２ａ、ｍｉＲ－２１５、ｍｉＲ－１２４ａ、ｍｉＲ－１９０、ｍｉＲ－１４９、ｍｉＲ－１９３、ｌｅｔ－７ａ、ｍｉＲ－１３２、ｍｉＲ－２７ａ、ｍｉＲ－９＊、ｍｉＲ－２００ｂ、ｍｉＲ－２６６、ｍｉＲ－１５３、ｍｉＲ－１３５、ｍｉＲ－２０６、ｍｉＲ－２４、ｍｉＲ－１９ａ、ｍｉＲ－１９９、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－１９４、ｍｉＲ－１２５ａ、ｍｉＲ－１５ａ、ｍｉＲ－１４５、ｍｉＲ－１３３、ｍｉＲ－９６、ｍｉＲ－１３１、ｍｉＲ－１２４ｂ、ｍｉＲ－１５１、ｍｉＲ－７ｂ、ｍｉＲ－１０３、及びｍｉＲ－２０８から選択されるｍｉＲＮＡに対するｍｉＲＮＡ認識部位を含む。
幾つかの実施形態では、核酸（例えば、レトロウイルス核酸）は、２つ以上のｍｉＲＮＡ認識部位を含む。幾つかの実施形態では、第１のｍｉＲＮＡ認識部位及び第２のｍｉＲＮＡ認識部位は、同じｍｉＲＮＡによって認識され、幾つかの実施形態では、第１のｍｉＲＮＡ認識部位及び第２のｍｉＲＮＡ認識部位は、異なるｍｉＲＮＡによって認識される。幾つかの実施形態では、第１のｍｉＲＮＡ認識部位及び第２のｍｉＲＮＡ認識部位は、同じ非標的細胞に存在するｍｉＲＮＡによって認識され、幾つかの実施形態では、第１のｍｉＲＮＡ認識部位及び第２のｍｉＲＮＡ認識部位は、異なる非標的細胞に存在するｍｉＲＮＡによって認識される。幾つかの実施形態では、第１のｍｉＲＮＡ認識部位及び第２のｍｉＲＮＡ認識部位のうちの一方又は両方は、表４のｍｉＲＮＡによって認識される。幾つかの実施形態では、フソソーム核酸（例えば、レトロウイルス核酸）上の１つ以上のｍｉＲＮＡ認識部位は、外因性作用物質と共にシスで転写される。幾つかの実施形態では、フソソーム核酸（例えば、レトロウイルス核酸）上の１つ以上のｍｉＲＮＡ認識部位は、ポリＡテール配列の下流、例えば、ポリＡテール配列とＷＰＲＥとの間に位置する。幾つかの実施形態では、フソソーム核酸（例えば、レトロウイルス核酸）上の１つ以上のｍｉＲＮＡ認識部位は、ＷＰＲＥの下流に位置する。
Ｖ．免疫調節
幾つかの実施形態では、本明細書に記載のフソソーム、例えばレトロウイルスベクター又はＶＬＰは、ＣＤ４７の上昇を含む。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第９，０５０，２６９号を参照。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるフソソーム、例えばレトロウイルスベクター又はＶＬＰは、補体調節タンパク質の上昇を含む。例えば、スペイン国特許第２６２７４４５号Ｔ３及び米国特許第６７９０６４１号を参照、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。幾つかの実施形態では、本明細書に記載のフソソーム、例えばレトロウイルスベクター又はＶＬＰは、ＭＨＣタンパク質、例えば、ＭＨＣ－１クラス１又はクラスＩＩを欠くか、又はレベルの低下を含む。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１７０１６５３４８号を参照。
フソソーム、例えばレトロウイルスベクター又はＶＬＰが被験体の免疫系によって認識されることがある。エンベロープウイルスベクター粒子（例えば、レトロウイルスベクター粒子）の場合、ウイルスエンベロープの表面に提示される膜結合タンパク質が認識され得て、ウイルス粒子自体が中和され得る。更に、標的細胞に感染すると、ウイルスエンベロープは細胞膜と統合され、その結果、ウイルスエンベロープタンパク質が細胞の表面に提示されるか、又は細胞の表面と密接に会合したままになる可能性がある。したがって、免疫系は、ウイルスベクター粒子が感染した細胞も標的にする可能性がある。両方の効果は、ウイルスベクターによる外因性作用物質送達の有効性の低下につながる可能性がある。
ウイルス粒子エンベロープは通常、ソース細胞の膜に由来する。したがって、そこからウイルス粒子が出芽する細胞膜に発現される膜タンパク質は、ウイルスエンベロープに組み込まれる可能性がある。
免疫調節タンパク質ＣＤ４７
細胞外物質の細胞への内在化は、一般にエンドサイトーシスと呼ばれるプロセスによって実行される（Ｒａｂｉｎｏｖｉｔｃｈ，１９９５，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．５（３）：８５－７；Ｓｉｌｖｅｒｓｔｅｉｎ，１９９５，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．５（３）：１４１－２；Ｓｗａｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．５（３）：８９－９３；Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８４（２）：６２７－３７）。エンドサイトーシスは、粒子の取り込みを伴う食作用と、体液及び溶質の取り込みを伴う飲作用の２つの一般的なカテゴリーに分類される。
膜受容体ＣＤ４７を欠くノックアウトマウスを用いた研究に基づいて、プロフェッショナル食細胞は非自己及び自己と区別することが示されている（Ｏｌｄｅｎｂｏｒｇ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８８（５４７３）：２０５１－４）。ＣＤ４７は、マクロファージに見られる免疫抑制性受容体ＳＩＲＰアルファ（シグナル調節タンパク質）と相互作用するＩｇスーパーファミリーのユビキタスなメンバーである（Ｆｕｊｉｏｋａ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６（１２）：６８８７－９９；Ｖｅｉｌｌｅｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３（３５）：２２７１９－２８；Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４（２）：５５９－６２）。ＣＤ４７－ＳＩＲＰα相互作用はマウスの自己マクロファージを不活化するように見えるが、ＣＤ４７の重度の減少（おそらく９０％）は、貧血の証拠をほとんど又は全く示さない幾つかのＲｈ遺伝子型に由来するヒト血液細胞で見られ（Ｍｏｕｒｏ－Ｃｈａｎｔｅｌｏｕｐ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｂｌｏｏｄ １０１（１）：３３８－３４４）、食作用性単球との細胞相互作用の増強の証拠もほとんど又は全くない（Ａｒｎｄｔ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．１２５（３）：４１２－４）。
幾つかの実施形態では、フソソーム、例えばレトロウイルスベクター又はＶＬＰ（例えば、半径が約１μｍ、約４００ｎｍ、又は約１５０ｎｍ未満のウイルス粒子は、例えば、フソソーム、例えばレトロウイルスベクター又はＶＬＰの露出表面上に、ＣＤ４７の少なくとも生物学的に活性な部分を含む。幾つかの態様では、フソソーム、例えばレトロウイルスベクター（例えば、レンチウイルス）又はＶＬＰは脂質コートを含む。実施形態では、フソソーム、例えばレトロウイルスベクター又はＶＬＰにおいて生物学的に活性なＣＤ４７の量は、約２０～２５０、２０～５０、５０～１００、１００～１５０、１５０～２００、又は２００～２５０分子／μｍ２である。幾つかの実施形態では、ＣＤ４７はヒトＣＤ４７である。
本明細書に記載の方法は、食細胞による粒子の食作用を回避することを含めることができる。該方法は、ＣＤ４７を含むフソソーム、例えばレトロウイルスベクター又はＶＬＰが食細胞に曝露され、フソソーム、例えばウイルス粒子が食細胞による食作用を回避するか、又は他の点では同様の未改変のフソソーム、例えばレトロウイルスベクター若しくはＶＬＰと比較して、食作用の低下を示すように、フソソーム、例えばレトロウイルスベクター又はＶＬＰにおけるＣＤ４７の少なくとも生物学的に活性な部分を含む少なくとも１つのペプチドを発現させることを含み得る。幾つかの実施形態では、被験体におけるフソソーム、例えばレトロウイルスベクター又はＶＬＰの半減期は、未改変である他は同様であるフソソーム、例えばレトロウイルスベクター又はＶＬＰと比べて延長される。
ＭＨＣの欠失
主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）は、ウイルスエンベロープに組み込むことができる宿主細胞膜タンパク質であり、本質的に多型性が高いため、身体の免疫応答の主要な標的である（ＭｃＤｅｖｉｔｔ Ｈ．Ｏ．（２０００）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：１－１７ ソース細胞の原形質膜に露出したＭＨＣ－Ｉ分子は、ベクターの出芽の過程でウイルス粒子エンベロープに組み込まれる可能性がある。ソース細胞に由来し、ウイルス粒子に組み込まれたこれらのＭＨＣ－Ｉ分子を、次に、標的細胞の原形質膜に移すことができる。或いは、ＭＨＣ－Ｉ分子は、ウイルス粒子が標的細胞膜を吸収して結合したままになる傾向の結果として、標的細胞膜と密接に関連したままである可能性がある。
形質導入された細胞の原形質膜上又はその近くに外因性ＭＨＣ－Ｉ分子が存在すると、被験体にアロ反応性免疫応答が誘発される可能性がある。これは、ｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子導入とそれに続く被験体への形質導入細胞の投与、又はウイルス粒子の直接ｉｎ ｖｉｖｏ投与のいずれかで、形質導入細胞の免疫媒介性の死滅又は食作用をもたらす可能性がある。更に、ウイルス粒子を有するＭＨＣ－Ｉを血流にｉｎ ｖｉｖｏで投与する場合、ウイルス粒子は、それらの標的細胞に到達する前に、既存のＭＨＣ－Ｉ特異的抗体によって中和され得る。
したがって、幾つかの実施形態では、ソース細胞は、細胞の表面でのＭＨＣ－Ｉの発現を減少させるように改変される（例えば、遺伝子操作される）。実施形態では、供給源は、β２－ミクログロブリン（β２Ｍ）をコードする遺伝子の遺伝子操作された破壊を含む。実施形態では、ソース細胞は、ＭＨＣ－Ｉ α鎖をコードする１つ以上の遺伝子の遺伝子操作された破壊を含む。細胞は、β２－ミクログロブリンをコードする遺伝子の全てのコピーに遺伝子操作された破壊を含む可能性がある。細胞は、ＭＨＣ－Ｉ α鎖をコードする遺伝子の全てのコピーに遺伝子操作された破壊を含む可能性がある。細胞は、β２－ミクログロブリンをコードする遺伝子の遺伝子操作された破壊と、ＭＨＣ－Ｉ α鎖をコードする遺伝子の遺伝子操作された破壊の両方を含み得る。幾つかの実施形態では、レトロウイルスベクター又はＶＬＰは、減少した数の表面に露出されたＭＨＣ－Ｉ分子を含む。表面に露出したＭＨＣ－Ｉ分子の数を、ＭＨＣ－Ｉに対する免疫応答が治療的に適切な程度まで減少するように減少することができる。幾つかの実施形態では、エンベロープウイルスベクター粒子は、表面に露出されたＭＨＣ－Ｉ分子を実質的に欠いている。
ＨＬＡ－Ｇ／Ｅの過剰発現
幾つかの実施形態では、レトロウイルスベクター又はＶＬＰは、そのエンベロープ上に、免疫寛容原性タンパク質、例えば、ＩＬＴ－２又はＩＬＴ－４アゴニスト、例えば、ＨＬＡ－Ｅ若しくはＨＬＡ－Ｇ、又は任意の他のＩＬＴ－２又はＩＬＴ－４アゴニストを表示する。幾つかの実施形態では、レトロウイルスベクター又はＶＬＰは、参照レトロウイルス、例えば、他の点ではレトロウイルスと同様の未改変のレトロウイルスと比較して、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＩＬＴ－２又はＩＬＴ－４の発現が増加している。
幾つかの実施形態では、レトロウイルス組成物は、未改変のレトロウイルスと比較してＭＨＣクラスＩを減少させ、未改変のレトロウイルスと比較してＨＬＡ－Ｇを増加させた。
幾つかの実施形態では、レトロウイルスベクター又はＶＬＰは、ＨＬＡ－Ｇ又はＨＬＡ－Ｅの発現の増加、例えば、参照細胞レトロウイルス、例えば、他の点ではレトロウイルスと同様の未改変のレトロウイルスと比較して、例えば、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上のＨＬＡ－Ｇ又はＨＬＡ－Ｅの発現の増加をもたらし、ＨＬＡ－Ｇ又はＨＬＡ－Ｅの発現は、フローサイトメトリー、例えばＦＡＣＳを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏでアッセイされる。
幾つかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｇ発現が増加したレトロウイルスは、例えば、奇形腫形成アッセイにおいて、免疫細胞浸潤の減少によって測定されるように、免疫原性の減少を示す。
補体調節タンパク質
補体活性は通常、幾つかの補体調節タンパク質（ＣＲＰ）によって制御される。これらのタンパク質は、偽炎症及び宿主組織の損傷を防ぐ。ＣＤ５５／崩壊促進因子（ＤＡＦ）及びＣＤ４６／膜補因子タンパク質（ＭＣＰ）を含むタンパク質の１つのグループは、古典的及び代替経路のＣ３／Ｃ５転換酵素を阻害する。ＣＤ５９を含む別のタンパク質セットはＭＡＣアッセンブリを調節する。ＣＲＰは、異種移植組織の拒絶反応を防ぐために使用されており、ウイルス及びウイルスベクターを補体の不活化から保護することも示されている。
膜に存在する補体制御因子としては、例えば、崩壊促進因子（ＤＡＦ）又はＣＤ５５、Ｈ因子（ＦＨ）様タンパク質－１（ＦＨＬ－１）、Ｃ４ｂ結合タンパク質（Ｃ４ＢＰ）、補体受容体１（ＣＤ３５）、膜補因子タンパク質（ＭＣＰ）又はＣＤ４６、及びＣＤ５９（プロテクチン）（例えば、膜侵襲複合体（ＭＡＣ）の形成を防ぎ、細胞を溶解から保護するため）が挙げられる。
アルブミン結合タンパク質
幾つかの実施形態では、レンチウイルスは、アルブミンに結合する。幾つかの実施形態では、レンチウイルスは、その表面上に、アルブミンに結合するタンパク質を含む。幾つかの実施形態では、レンチウイルスは、その表面にアルブミン結合タンパク質を含む。幾つかの実施形態では、アルブミン結合タンパク質は、連鎖球菌のアルブミン結合タンパク質である。幾つかの実施形態では、アルブミン結合タンパク質は、連鎖球菌のアルブミン結合ドメインである。
レンチウイルスエンベロープでの非フソゲンタンパク質の発現
幾つかの実施形態では、レンチウイルスは、その表面上に１つ以上のタンパク質を含むように操作される。幾つかの実施形態では、タンパク質は、被験体との免疫相互作用に影響を与える。幾つかの実施形態では、タンパク質は、被験体におけるレンチウイルスの薬理学に影響を与える。幾つかの実施形態では、タンパク質は受容体である。幾つかの実施形態では、タンパク質はアゴニストである。幾つかの実施形態では、タンパク質はシグナル伝達分子である。幾つかの実施形態では、レンチウイルス表面上のタンパク質は、ＯＫＴ３又はＩＬ７を含む。
幾つかの実施形態では、マイトジェン膜貫通タンパク質及び／又はサイトカインベースの膜貫通タンパク質は、ソース細胞に存在することを含み、これは、ソース細胞膜から出芽するときにレトロウイルスに組み込まれ得る。マイトジェン膜貫通タンパク質及び／又はサイトカインベースの膜貫通タンパク質は、ウイルスエンベロープ糖タンパク質の一部ではなく、ソース細胞上の別個の細胞表面分子として発現させることができる。
例示的な特徴
本明細書に記載の態様のいずれかの幾つかの実施形態では、フソソーム、例えばレトロウイルスベクター、ＶＬＰ、又は医薬組成物は、実質的に非免疫原性である。免疫原性は、例えば、本明細書に記載されるように定量化することができる。
幾つかの実施形態では、レトロウイルスベクター又はＶＬＰは、標的細胞と融合して、レシピエント細胞を産生する。幾つかの実施形態では、１つ以上のレトロウイルスベクター又はＶＬＰに融合したレシピエント細胞は、免疫原性について評価される。実施形態では、レシピエント細胞は、例えば、抗ＩｇＭ抗体で染色することによって、細胞表面上の抗体の存在について分析される。他の実施形態では、免疫原性は、ＰＢＭＣ細胞溶解アッセイによって評価される。実施形態では、レシピエント細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）と共にインキュベートされ、次いで、ＰＢＭＣによる細胞の溶解について評価される。他の実施形態では、免疫原性は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞溶解アッセイによって評価される。実施形態では、レシピエント細胞は、ＮＫ細胞と共にインキュベートされ、次いで、ＮＫ細胞による細胞の溶解について評価される。他の実施形態では、免疫原性は、ＣＤ８＋Ｔ細胞溶解アッセイによって評価される。実施形態では、レシピエント細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞と共にインキュベートされ、次いで、ＣＤ８＋Ｔ細胞による細胞の溶解について評価される。
幾つかの実施形態では、レトロウイルスベクター又はＶＬＰは、参照レトロウイルスベクター又はＶＬＰ、例えば、他の点ではソース細胞と同様の未改変のソース細胞、又はＨＥＫ２９３細胞から産生されるものと比較して、高レベルの免疫抑制物質（例えば、免疫抑制タンパク質）を含む。幾つかの実施形態では、レベルの上昇、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、２倍、３倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、又は１００倍である。幾つかの実施形態では、レトロウイルスベクター又はＶＬＰは、参照細胞に存在しない免疫抑制物質を含む。幾つかの実施形態では、レトロウイルスベクター又はＶＬＰは、参照レトロウイルスベクター又はＶＬＰ、例えば、他の点ではソース細胞に類似する未改変のソース細胞、又はＨＥＫ２９３細胞から産生されるものと比較して、減少したレベルの免疫賦活物質（例えば、免疫賦活タンパク質）を含む。幾つかの実施形態では、低下したレベルは、参照レトロウイルスベクター又はＶＬＰと比較して少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％である。幾つかの実施形態では、免疫賦活物質は、レトロウイルスベクター又はＶＬＰには実質的に存在しない。
幾つかの実施形態では、レトロウイルスベクター若しくはＶＬＰ、又はレトロウイルスベクター若しくはＶＬＰが由来するソース細胞は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０つ、１１つ、１２つ、又はそれより多い以下の特徴を有する：
ａ．参照レトロウイルスベクター又はＶＬＰ、例えば未改変レトロウイルスベクター又は他の点ではソース細胞と同様のソース細胞、ＨｅＬａ細胞若しくはＨＥＫ２９３細胞に由来するＶＬＰと比較して、ＭＨＣクラスＩ又はＭＨＣクラスＩＩの発現が５０％未満、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、若しくは５％以下；
ｂ．参照レトロウイルスベクター又はＶＬＰ、例えば未改変レトロウイルスベクター、又は他の点ではソース細胞と同様の細胞、又はＨＥＫ細胞、又は本明細書に記載される参照細胞に由来するＶＬＰと比較して、限定されるものではないが、ＬＡＧ３、ＩＣＯＳ－Ｌ、ＩＣＯＳ、Ｏｘ４０Ｌ、ＯＸ４０、ＣＤ２８、Ｂ７、ＣＤ３０、ＣＤ３０Ｌ４－１ＢＢ、４－１ＢＢＬ、ＳＬＡＭ、ＣＤ２７、ＣＤ７０、ＨＶＥＭ、ＬＩＧＨＴ、Ｂ７－Ｈ３又はＢ７－Ｈ４を含む１つ以上の共刺激タンパク質の発現が５０％未満、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、又は５％以下；
ｃ．マクロファージ貪食を抑制する表面タンパク質、例えばＣＤ４７の発現、例えば、本明細書に記載の方法によって検出可能な発現、例えば、参照レトロウイルスベクター又はＶＬＰ、例えば、未改変のレトロウイルスベクター、又は他の点ではソース細胞と同様の細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞若しくはＨＥＫ２９３細胞に由来するＶＬＰと比較して、１．５倍超、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、又はそれ以上のマクロファージ貪食を抑制する表面タンパク質、例えばＣＤ４７の発現；
ｄ．可溶性免疫抑制性サイトカイン、例えばＩＬ－１０の発現、例えば、本明細書に記載の方法によって検出可能な発現、例えば、参照レトロウイルスベクター又はＶＬＰ、例えば、未改変のレトロウイルスベクター、又は他の点ではソース細胞と同様の細胞若しくはＨＥＫ２９３細胞に由来するＶＬＰと比較して、１．５倍超、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、又はそれ以上の可溶性免疫抑制性サイトカイン、例えばＩＬ－１０の発現；
ｅ．可溶性免疫抑制タンパク質、例えばＰＤ－Ｌ１の発現、例えば、本明細書に記載の方法によって検出可能な発現、例えば、参照レトロウイルスベクター又はＶＬＰ、例えば、未改変のレトロウイルスベクター、又は他の点ではソース細胞と同様の細胞若しくはＨＥＫ２９３細胞に由来するＶＬＰと比較して、１．５倍超、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、又はそれ以上の可溶性免疫抑制タンパク質、例えばＰＤ－Ｌ１の発現；
ｆ．参照レトロウイルスベクター又はＶＬＰ、例えば未改変レトロウイルスベクター、又は他の点ではソース細胞と同様の細胞、若しくはＨＥＫ２９３細胞、若しくはＵ－２６６細胞に由来するＶＬＰと比較して、可溶性免疫賦活サイトカイン、例えばＩＦＮ－ガンマ又はＴＮＦ－ａの発現が５０％未満、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、若しくは５％以下；
ｇ．参照レトロウイルスベクター又はＶＬＰ、例えば未改変レトロウイルスベクター、又は他の点ではソース細胞と同様の細胞、若しくはＨＥＫ２９３細胞、若しくはＡ５４９細胞、若しくはＳＫ－ＢＲ－３細胞に由来するＶＬＰと比較して、内因性免疫賦活抗原、例えばＺｇ１６又はＨｏｒｍａｄ１の発現が５０％未満、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、若しくは５％以下；
ｈ．参照レトロウイルスベクター又はＶＬＰ、例えば未改変のレトロウイルスベクター、又は他の点ではソース細胞と同様の細胞、若しくはＨＥＫ２９３細胞、若しくはＪｕｒｋａｔ細胞に由来するＶＬＰと比較した、例えば、本明細書に記載の方法による検出可能な、ＨＬＡ－Ｅ又はＨＬＡ－Ｇの発現；
ｉ．例えば、ＮＫ細胞の活性化を抑制するように作用するシアル酸を含む、表面のグリコシル化プロファイル；
ｊ．参照レトロウイルスベクター又はＶＬＰ、例えば未改変レトロウイルスベクター又は他の点ではソース細胞と同様の細胞、ＨＥＫ２９３細胞若しくはＪｕｒｋａｔ細胞に由来するＶＬＰと比較して、ＴＣＲα／βの発現が５０％未満、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、若しくは５％以下；
ｋ．参照レトロウイルスベクター又はＶＬＰ、例えば未改変レトロウイルスベクター、又は他の点ではソース細胞と同様の細胞、ＨＥＫ２９３細胞若しくはＨｅＬａ細胞に由来するＶＬＰと比較して、ＡＢＯ血液型の発現が５０％未満、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、若しくは５％以下；
ｌ．参照レトロウイルスベクター又はＶＬＰ、例えば未改変レトロウイルスベクター、又は他の点ではソース細胞と同様の細胞、ＨＥＫ２９３細胞若しくはＪｕｒｋａｔ細胞に由来するＶＬＰと比較して、マイナー組織適合抗原（ＭＨＡ）の発現が５０％未満、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、若しくは５％以下；又は
ｍ．参照レトロウイルスベクター又はＶＬＰ、例えば、未改変レトロウイルスベクター、又はそ他の点ではソース細胞と同様の細胞、ＨＥＫ２９３細胞若しくはＪｕｒｋａｔ細胞に由来するＶＬＰと比較して、ミトコンドリアＭＨＡが１０％未満、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％以下であるか、又は検出可能なミトコンドリアＭＨＡを有していない。
実施形態では、共刺激タンパク質は４－１ＢＢ、Ｂ７、ＳＬＡＭ、ＬＡＧ３、ＨＶＥＭ、又はＬＩＧＨＴであり、参照細胞はＨＤＬＭ－２である。幾つかの実施形態では、共刺激タンパク質はＢＹ－Ｈ３であり、参照細胞はＨｅＬａである。幾つかの実施形態では、共刺激タンパク質は、ＩＣＯＳＬ又はＢ７－Ｈ４であり、参照細胞は、ＳＫ－ＢＲ－３である。幾つかの実施形態では、共刺激タンパク質はＩＣＯＳ又はＯＸ４０であり、参照細胞はＭＯＬＴ－４である。幾つかの実施形態では、共刺激タンパク質はＣＤ２８であり、参照細胞はＵ－２６６である。幾つかの実施形態では、共刺激タンパク質はＣＤ３０Ｌ又はＣＤ２７であり、参照細胞はＤａｕｄｉである。
幾つかの実施形態では、レトロウイルスベクター、ＶＬＰ、又は医薬組成物は、免疫系、例えば、自然免疫系による免疫原性応答を実質的に誘発しない。実施形態では、免疫原性応答は、例えば、本明細書に記載されるように、定量化することができる。幾つかの実施形態では、自然免疫系による免疫原性応答は、限定されるものではないが、ＮＫ細胞、マクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、樹状細胞、肥満細胞、又はガンマ／デルタＴ細胞を含む、自然免疫細胞による応答を含む。幾つかの実施形態では、自然免疫系による免疫原性応答は、可溶性血液成分及び膜結合成分を含む補体系による応答を含む。
幾つかの実施形態では、レトロウイルスベクター、ＶＬＰ、又は医薬組成物は、免疫系、例えば、適応免疫系による免疫原性応答を実質的に誘発しない。幾つかの実施形態では、適応免疫系による免疫原性応答は、限定されるものではないが、Ｔリンパ球（例えば、ＣＤ４ Ｔ細胞、ＣＤ８ Ｔ細胞、及び／又はガンマデルタＴ細胞）、又はＢリンパ球の数又は活性の変化、例えば、増加を含む、適応免疫細胞による免疫原性応答を含む。幾つかの実施形態では、適応免疫系による免疫原性応答は、限定されるものではないが、サイトカイン又は抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、又はＩｇＤ）の数又は活性の変化、例えば、増加を含む、可溶性血液成分のレベルの増加を含む。
幾つかの実施形態では、レトロウイルスベクター、ＶＬＰ、又は医薬組成物は、免疫原性が低下するように改変される。幾つかの実施形態では、レトロウイルスベクター、ＶＬＰ、又は医薬組成物は、参照レトロウイルスベクター又はＶＬＰ、例えば、未改変のレトロウイルスベクター、又はその他の点ではソース細胞と同様の細胞、ＨＥＫ２９３細胞、又はＪｕｒｋａｔ細胞に由来するＶＬＰの免疫原性よりも５％未満、１０％、２０％、３０％、４０％、又は５０％よりも低い免疫原性を有する。
本明細書に記載の態様のいずれかの幾つかの実施形態では、レトロウイルスベクター、ＶＬＰ、又は医薬組成物は、改変されたゲノムを有する、例えば、本明細書に記載の方法を使用して、例えば免疫原性を低下させるように改変された、ソース細胞、哺乳動物細胞に由来する。免疫原性は、例えば、本明細書に記載されるように定量化することができる。
幾つかの実施形態では、レトロウイルスベクター、ＶＬＰ、又は医薬組成物は、例えば、以下のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、又はそれ以上のノックアウトを伴う枯渇した哺乳動物細胞に由来する：
ａ．ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ又はＭＨＡ；
ｂ．ＬＡＧ３、ＩＣＯＳ－Ｌ、ＩＣＯＳ、Ｏｘ４０Ｌ、ＯＸ４０、ＣＤ２８、Ｂ７、ＣＤ３０、ＣＤ３０Ｌ ４－１ＢＢ、４－１ＢＢＬ、ＳＬＡＭ、ＣＤ２７、ＣＤ７０、ＨＶＥＭ、ＬＩＧＨＴ、Ｂ７－Ｈ３、又はＢ７－Ｈ４を含むがこれらに限定されない１つ以上の共刺激タンパク質；
ｃ．可溶性免疫刺激サイトカイン、例えば、ＩＦＮ－γ又はＴＮＦ－α；
ｄ．内因性免疫刺激抗原、例えば、Ｚｇ１６又はＨｏｒｍａｄ１；
ｅ．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）；
ｆ．ＡＢＯ式血液型をコードする遺伝子、例えばＡＢＯ遺伝子；
ｇ．免疫活性化を促進する転写因子、例えばＮＦｋＢ；
ｈ．ＭＨＣ発現を制御する転写因子、例えば、クラスＩＩトランスアクチベーター（ＣＩＩＴＡ）、Ｘｂｏｘ ５の調節因子（ＲＦＸ５）、ＲＦＸ関連タンパク質（ＲＦＸＡＰ）、又はＲＦＸアンキリンリピート（ＲＦＸＡＮＫ；ＲＦＸＢとしても知られる）；又は
ｉ．ＭＨＣクラスＩの発現を低下させるＴＡＰタンパク質（ＴＡＰ２、ＴＡＰ１、ＴＡＰＢＰ等）。
幾つかの実施形態では、レトロウイルスベクター又はＶＬＰは、免疫抑制物質、例えば、以下のうちの１つ、２つ、３つ、又はそれ以上の発現の増加をもたらす遺伝子改変を伴うソース細胞に由来する（例えば、遺伝子改変の前に、細胞はその因子を発現しなかった）：
ａ．マクロファージの貪食を抑制する表面タンパク質、例えばＣＤ４７；参照レトロウイルスベクター又はＶＬＰ、例えば、未改変レトロウイルスベクター、又は他の点ではソース細胞と同様の細胞、ＨＥＫ２９３細胞若しくはＪｕｒｋａｔ細胞に由来するＶＬＰと比較したＣＤ４７の発現の増加；
ｂ．可溶性免疫抑制性サイトカイン、例えば、ＩＬ－１０、参照レトロウイルスベクター又はＶＬＰ、例えば、未改変のレトロウイルスベクター、又は他の点ではソース細胞と同様の細胞、ＨＥＫ２９３細胞若しくはＪｕｒｋａｔ細胞に由来するＶＬＰと比較した、ＩＬ－１０の発現の増加；
ｃ．可溶性免疫抑制タンパク質、例えば、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、又はＢＴＬＡ；参照レトロウイルスベクター又はＶＬＰ、例えば、未改変のレトロウイルスベクター、又は他の点ではソース細胞と同様の細胞、ＨＥＫ２９３細胞若しくはＪｕｒｋａｔ細胞に由来するＶＬＰと比較した、免疫抑制タンパク質の発現の増加；
ｄ．免疫寛容原性タンパク質、例えば、ＩＬＴ－２又はＩＬＴ－４アゴニスト、例えば、ＨＬＡ－Ｅ又はＨＬＡ－Ｇ又は他の内因性ＩＬＴ－２又はＩＬＴ－４アゴニスト、例えば、参照レトロウイルスベクター又はＶＬＰ、例えば、未改変のレトロウイルスベクター、又は他の点ではソース細胞と同様の細胞、ＨＥＫ２９３細胞若しくはＪｕｒｋａｔ細胞に由来するＶＬＰと比較した、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＩＬＴ－２又はＩＬＴ－４の発現の増加；又は
ｅ．補体活性を抑制する表面タンパク質、例えば補体調節タンパク質、例えば崩壊促進因子（ＤＡＦ、ＣＤ５５）に結合するタンパク質、例えば因子Ｈ（ＦＨ）様タンパク質－１（ＦＨＬ－１）、例えばＣ４ｂ結合タンパク質（Ｃ４ＢＰ）、例えば補体受容体１（ＣＤ３５）、例えば膜補体タンパク質（ＭＣＰ、ＣＤ４６）、例えばプロフェクチン（ＣＤ５９）、例えば、古典的及び代替の補体経路ＣＤ／Ｃ５コンバターゼ酵素を阻害するタンパク質、例えばＭＡＣアッセンブリを調節するタンパク質；例えば、参照レトロウイルスベクター又はＶＬＰ、例えば未改変のレトロウイルスベクター、又は他の点ではソース細胞と同様の細胞、ＨＥＫ２９３細胞若しくはＪｕｒｋａｔ細胞に由来するＶＬＰと比較して、補体調節タンパク質の発現が増加している。
幾つかの実施形態では、発現レベルの増加は、参照レトロウイルスベクター又はＶＬＰと比較して、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、２倍、３倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、若しくは１００倍、又はそれ以上である。
幾つかの実施形態では、レトロウイルスベクター又はＶＬＰは、免疫賦活物質の発現が減少するように改変されたソース細胞、例えば、以下のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、又はそれ以上に由来する：
ａ．参照レトロウイルスベクター又はＶＬＰ、例えば未改変レトロウイルスベクター又は他の点ではソース細胞と同様の細胞、ＨＥＫ２９３細胞若しくはＨｅＬａ細胞に由来するＶＬＰと比較して、ＭＨＣクラスＩ又はＭＨＣクラスＩＩの発現が５０％未満、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、若しくは５％以下；
ｂ．参照レトロウイルスベクター又はＶＬＰ、例えば未改変レトロウイルスベクター又はそれ以外はソース細胞であるＨＥＫ２９３細胞に類似する細胞、若しくは本明細書に記載される参照細胞に由来するＶＬＰと比較して、限定されるものではないが、ＬＡＧ３、ＩＣＯＳ－Ｌ、ＩＣＯＳ、Ｏｘ４０Ｌ、ＯＸ４０、ＣＤ２８、Ｂ７、ＣＤ３０、ＣＤ３０Ｌ ４－１ＢＢ、４－１ＢＢＬ、ＳＬＡＭ、ＣＤ２７、ＣＤ７０、ＨＶＥＭ、ＬＩＧＨＴ、Ｂ７－Ｈ３、又はＢ７－Ｈ４を含む１つ以上の共刺激タンパク質の発現が５０％未満、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、又は５％以下；
ｃ．参照レトロウイルスベクター又はＶＬＰ、例えば未改変レトロウイルスベクター又はそれ以外はソース細胞であるＨＥＫ２９３細胞に類似する細胞、若しくはＵ－２６６細胞に由来するＶＬＰと比較して、可溶性免疫賦活サイトカイン、例えばＩＦＮ－ガンマ又はＴＮＦ－ａの発現が５０％未満、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、若しくは５％以下；
ｄ．参照レトロウイルスベクター又はＶＬＰ、例えば未改変レトロウイルスベクター又はそれ以外はソース細胞であるＨＥＫ２９３細胞に類似する細胞、又はＡ５４９細胞若しくはＳＫ－ＢＲ－３細胞に由来するＶＬＰと比較して、内因性免疫賦活抗原、例えばＺｇ１６又はＨｏｒｍａｄ１の発現が５０％未満、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、若しくは５％以下；
ｅ．参照レトロウイルスベクター又はＶＬＰ、例えば未改変レトロウイルスベクター又はそれ以外はソース細胞であるＨＥＫ２９３細胞に類似する細胞、若しくはＪｕｒｋａｔ細胞に由来するＶＬＰと比較して、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の発現が５０％未満、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、若しくは５％以下；
ｆ．参照レトロウイルスベクター又はＶＬＰ、例えば未改変レトロウイルスベクター、又は他の点ではソース細胞と同様の細胞、ＨＥＫ２９３細胞若しくはＨｅＬａ細胞に由来するＶＬＰと比較して、ＡＢＯ血液型の発現が５０％未満、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、若しくは５％以下；
ｇ．参照レトロウイルスベクター又はＶＬＰ、例えば未改変レトロウイルスベクター、又は他の点ではソース細胞と同様の細胞、ＨＥＫ２９３細胞若しくはＪｕｒｋａｔ細胞に由来するＶＬＰと比較して、免疫活性化を駆動する転写因子、例えばＮＦｋＢの発現が５０％未満、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、若しくは５％以下；
ｈ．参照レトロウイルスベクター又はＶＬＰ、例えば未改変レトロウイルスベクター、又は他の点ではソース細胞と同様の細胞、ＨＥＫ２９３細胞若しくはＪｕｒｋａｔ細胞に由来するＶＬＰと比較して、ＭＨＣ発現を制御する転写因子、例えば、クラスＩＩトランスアクチベーター（ＣＩＩＴＡ）、Ｘｂｏｘ ５の調節因子（ＲＦＸ５）、ＲＦＸ関連タンパク質（ＲＦＸＡＰ）、又はＲＦＸアンキリンリピート（ＲＦＸＡＮＫ；ＲＦＸＢとしても知られる）の発現が５０％未満、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、又は５％以下；
ｉ．参照レトロウイルスベクター又はＶＬＰ、例えば未改変レトロウイルスベクター、又は他の点ではソース細胞と同様の細胞、ＨＥＫ２９３細胞若しくはＨｅＬａ細胞に由来するＶＬＰと比較して、ＴＡＰタンパク質、例えば、ＭＨＣクラスＩ発現を減少させるＴＡＰ２、ＴＡＰ１、又はＴＡＰＢＰの発現が５０％未満、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、若しくは５％以下。
幾つかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩ発現を減少させるためにｓｈＲＮＡ発現レンチウイルスを使用して改変された哺乳動物細胞、例えばＨＥＫ２９３に由来するレトロウイルスベクター、ＶＬＰ、又は医薬組成物は、未改レトロウイルスベクター又はＶＬＰ、例えば、改変されていない細胞（例えば、間葉系幹細胞）に由来するレトロウイルスベクター又はＶＬＰと比較して、ＭＨＣクラスＩの発現が少ない。幾つかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｇの発現を増加させるためにＨＬＡ－Ｇを発現するレンチウイルスを使用して改変された哺乳動物細胞、例えばＨＥＫ２９３に由来するレトロウイルスベクター又はＶＬＰは、例えば、改変されていない細胞（例えば、ＨＥＫ２９３）に由来する未改変レトロウイルスベクター又はＶＬＰと比較してＨＬＡ－Ｇの発現が増加している。
幾つかの実施形態では、レトロウイルスベクター、ＶＬＰ、又は医薬組成物は、ソース細胞、例えば、実質的に免疫原性ではない哺乳動物細胞に由来し、ソース細胞は、ＩＦＮ－ガンマＥＬＩＳＰＯＴアッセイによってｉｎ ｖｉｔｒｏでアッセイした場合に０ｐｇ／ｍＬ～０ｐｇ／ｍＬ超のレベルのＴ細胞ＩＦＮ－ガンマ分泌を刺激する、例えば誘導する。
幾つかの実施形態では、レトロウイルスベクター、ＶＬＰ、又は医薬組成物は、ソース細胞、例えば、哺乳動物細胞に由来し、哺乳動物細胞は、免疫抑制物質、例えば、糖質コルチコイド（例えば、デキサメタゾン）、細胞増殖抑制物質（例えば、メトトレキサート）、抗体（例えば、ムロモナブ－ＣＤ３）、又はイムノフィリンモジュレーター（例、シクロスポリン又はラパマイシン）で処理された細胞培養物に由来する。
幾つかの実施形態では、レトロウイルスベクター、ＶＬＰ、又は医薬組成物は、ソース細胞、例えば、哺乳動物細胞に由来し、哺乳動物細胞は、外因性作用物質、例えば、治療薬を含む。
幾つかの実施形態では、レトロウイルスベクター、ＶＬＰ、又は医薬組成物は、ソース細胞、例えば、哺乳動物細胞に由来し、哺乳動物細胞は、組換え細胞である。
幾つかの実施形態では、レトロウイルスベクター、ＶＬＰ、又は医薬品は、ウイルスイムノエバシン、例えば、ｈＣＭＶ ＵＳ２、又はＵＳ１１を発現するように遺伝子改変された哺乳動物細胞に由来する。
幾つかの実施形態では、レトロウイルスベクター若しくはＶＬＰの表面、又はソース細胞の表面は、ポリマー、例えば、免疫原性及び免疫媒介性クリアランスを低下させる生体適合性ポリマー、例えばＰＥＧで共有結合又は非共有結合的に修飾される。
幾つかの実施形態では、レトロウイルスベクター若しくはＶＬＰの表面、又はソース細胞の表面は、シアル酸、例えば、ＮＫ抑制グリカンエピトープを含む糖ポリマーを含むシアル酸で共有結合又は非共有結合的に修飾される。
幾つかの実施形態では、レトロウイルスベクター若しくはＶＬＰの表面、又はソース細胞の表面は、ＡＢＯ血液型を取り除くために、例えば、グリコシダーゼ酵素、例えば、α－Ｎ－アセチルガラクトサミニダーゼで酵素的に処理される。
幾つかの実施形態では、レトロウイルスベクター若しくはＶＬＰの表面、又はソース細胞の表面は、酵素的に処理されて、レシピエントの血液型に一致するＡＢＯ血液型の発現を生じさせる、例えば誘導する。
免疫原性を評価するためのパラメーター
幾つかの実施形態では、レトロウイルスベクター又はＶＬＰは、実質的に免疫原性ではない、又は免疫原性の低下を有するように改変された、例えば、本明細書に記載の方法を使用して改変されたソース細胞、例えば哺乳動物細胞に由来する。ソース細胞及びレトロウイルスベクター又はＶＬＰの免疫原性は、本明細書に記載のアッセイのいずれかによって決定することができる。
幾つかの実施形態では、レトロウイルスベクター又はＶＬＰは、ｉｎ ｖｉｖｏ移植片生着において、参照レトロウイルスベクター又はＶＬＰ、例えば未改変レトロウイルスベクター又は他の点ではソース細胞と同様の細胞に由来するＶＬＰと比較して、増加、例えば、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上の増加を有する。
幾つかの実施形態では、レトロウイルスベクター又はＶＬＰは、参照レトロウイルスベクター又はＶＬＰ、例えば、未改変レトロウイルスベクター又は他の点ではソース細胞と同様の細胞に由来するＶＬＰを適切な動物モデル、例えば本明細書に記載の動物モデルへの１回以上の移植後の体液性応答と比較して、適切な動物モデル、例えば、本明細書に記載の動物モデルへのレトロウイルスベクター又はＶＬＰの１回以上の移植後の体液性応答の低下によって測定される免疫原性の低下を有する。幾つかの実施形態では、体液性応答の低下は、血清サンプルにおいて、抗細胞抗体力価、例えば、抗レトロウイルス又は抗ＶＬＰ抗体力価によって、例えば、ＥＬＩＳＡによって測定される。幾つかの実施形態では、レトロウイルスベクター又はＶＬＰを投与された動物からの血清サンプルは、未変性レトロウイルスベクター又はＶＬＰを投与された動物からの血清サンプルと比較して、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上抗ウイルス又は抗ＶＬＰ抗体力価の減少を有する。幾つかの実施形態では、レトロウイルスベクター又はＶＬＰを投与された動物からの血清サンプルは、例えば、ベースラインから１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、又は４０％増加した、抗レトロウイルス又は抗ＶＬＰ抗体力価を有し、例えば、ベースラインは、レトロウイルスベクター又はＶＬＰの投与前の同じ動物からの血清サンプルを指す。
幾つかの実施形態では、レトロウイルスベクター又はＶＬＰは、参照レトロウイルスベクター又はＶＬＰ、例えば、未改変レトロウイルスベクター又は他の点ではソース細胞と同様の細胞に由来するＶＬＰと比較して、マクロファージ食作用において、例えば、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上のマクロファージ食作用の減少を有し、マクロファージ食作用の減少は、実施例８に記載されるように、ｉｎ ｖｉｔｒｏ食作用指数をアッセイすることによって決定される。幾つかの実施形態では、レトロウイルスベクター又はＶＬＰは、例えば、マクロファージ食作用のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいてマクロファージと共にインキュベートされた場合、実施例８のアッセイによって測定されるように、０、１、１０、１００、又はそれ以上の食作用指数を有する。
幾つかの実施形態では、ソース細胞又はレシピエント細胞はＰＢＭＣによる細胞毒性媒介細胞溶解が減少しており、例えば、実施例１７のアッセイを使用して、参照細胞、例えば、他の点ではソース細胞と同様の未改変細胞、又は未改変レトロウイルスベクター若しくはＶＬＰを受けたレシピエント細胞、又は間葉系幹細胞と比較して、細胞毒性媒介細胞溶解が、例えば、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上減少している。実施形態では、ソース細胞は、外因性ＨＬＡ－Ｇを発現する。
幾つかの実施形態では、ソース細胞又はレシピエント細胞はＮＫ媒介細胞が減少しており、参照細胞、例えば、他の点ではソース細胞と同様の未改変細胞、又は未改変レトロウイルスベクター若しくはＶＬＰを受けたレシピエント細胞比較して、ＮＫ媒介細胞溶解が、例えば、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上減少しており、ここで、ＮＫ媒介細胞溶解はクロミウム放出アッセイ又はユーロピウム放出アッセイによって、例えば、実施例１８のアッセイを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏでアッセイされる。
幾つかの実施形態では、ソース細胞又はレシピエント細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞媒介細胞が減少しており、参照細胞、例えば、他の点ではソース細胞と同様の未改変細胞、又は未改変レトロウイルスベクター若しくはＶＬＰを受けたレシピエント細胞比較して、ＣＤ８ Ｔ細胞媒介細胞溶解が、例えば、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上減少しており、ここで、ＣＤ８ Ｔ細胞媒介細胞溶解は実施例１９により使用してｉｎ ｖｉｔｒｏでアッセイされる。
幾つかの実施形態では、ソース細胞又はレシピエント細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞増殖及び／又は活性化が減少しており、参照細胞、例えば、他の点ではソース細胞と同様の未改変細胞、又は未改変レトロウイルスベクター若しくはＶＬＰを受けたレシピエント細胞比較して、例えば、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上減少しており、ここで、ＣＤ４ Ｔ細胞増殖はｉｎ ｖｉｔｒｏでアッセイ（例えば、変性又は未変性の哺乳動物ソース細胞、及びＣＤ４＋Ｔ細胞のＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓとの共培養アッセイ）される。
幾つかの実施形態では、レトロウイルスベクター又はＶＬＰは、Ｔ細胞ＩＦＮ－ガンマ分泌の減少、例えば、参照細胞レトロウイルスベクター又はＶＬＰ、例えば、未改変レトロウイルスベクター又は他の点ではソース細胞と同様の細胞に由来するＶＬＰと比較して、例えば、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上のＴ細胞ＩＦＮ－ガンマ分泌の減少を引き起こし、Ｔ細胞ＩＦＮ－ガンマ分泌は、例えば、ＩＦＮ－ガンマＥＬＩＳＰＯＴによってｉｎ ｖｉｔｒｏでアッセイされる。
幾つかの実施形態では、レトロウイルスベクター又はＶＬＰは、免疫原性サイトカイン分泌の減少、例えば、参照細胞レトロウイルスベクター又はＶＬＰ、例えば、未改変レトロウイルスベクター又は他の点ではソース細胞と同様の細胞に由来するＶＬＰと比較して、例えば、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上の免疫原性サイトカイン分泌の減少を引き起こし、免疫原性サイトカイン分泌は、ＥＬＩＳＡ又はＥＬＩＳＰＯＴを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏでアッセイされる。
幾つかの実施形態では、レトロウイルスベクター又はＶＬＰは、免疫抑制性サイトカイン分泌の増加、例えば、参照細胞レトロウイルスベクター又はＶＬＰ、例えば、未改変レトロウイルスベクター又は他の点ではソース細胞と同様の細胞に由来するＶＬＰと比較して、例えば、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上の免疫抑制性サイトカイン分泌の増加をもたらし、免疫抑制性サイトカイン分泌は、ＥＬＩＳＡ又はＥＬＩＳＰＯＴを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏでアッセイされる。
幾つかの実施形態では、レトロウイルスベクター又はＶＬＰは、ＨＬＡ－Ｇ又はＨＬＡ－Ｅの発現の増加、例えば、参照細胞レトロウイルスベクター又はＶＬＰ、例えば、未改変レトロウイルスベクター又は他の点ではソース細胞と同様の細胞に由来するＶＬＰと比較して、例えば、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上のＨＬＡ－Ｇ又はＨＬＡ－Ｅの発現の増加をもたらし、ＨＬＡ－Ｇ又はＨＬＡ－Ｅの発現は、フローサイトメトリー、例えばＦＡＣＳを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏでアッセイされる。幾つかの実施形態では、レトロウイルスベクター又はＶＬＰは、ＨＬＡ－Ｇ又はＨＬＡ－Ｅの発現が増加するように、例えば、ＨＬＡ－Ｇ又はＨＬＡ－Ｅの発現が１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上増加するように改変されているソース細胞に由来し、ＨＬＡ－Ｇ又はＨＬＡ－Ｅの発現は、フローサイトメトリー、例えばＦＡＣＳを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏでアッセイされる。幾つかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｇ発現が増加した改変細胞に由来するレトロウイルスベクター又はＶＬＰは、免疫原性の低下を示す。
幾つかの実施形態では、レトロウイルスベクター又はＶＬＰは、Ｔ細胞阻害物質リガンド（例えば、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１）の発現の増加、例えば、参照細胞レトロウイルスベクター又はＶＬＰ、例えば、未改変レトロウイルスベクター又は他の点ではソース細胞と同様の細胞に由来するＶＬＰと比較して、例えば、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上のＴ細胞阻害物質リガンドの発現の増加を有する又はそれをもたらし、Ｔ細胞阻害物質リガンドの発現は、フローサイトメトリー、例えばＦＡＣＳを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏでアッセイされる。
幾つかの実施形態では、レトロウイルスベクター又はＶＬＰは、共刺激リガンドの発現が減少しており、例えば、参照細胞レトロウイルスベクター又はＶＬＰ、例えば、未改変レトロウイルスベクター又は他の点ではソース細胞と同様の細胞に由来するＶＬＰと比較して、共刺激リガンドの発現が、例えば、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上の減少しており、共刺激リガンドの発現は、フローサイトメトリー、例えばＦＡＣＳを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏでアッセイされる。
幾つかの実施形態では、レトロウイルスベクター又はＶＬＰは、ＭＨＣクラスＩ又はＭＨＣクラスＩＩの発現が減少しており、例えば、参照細胞レトロウイルスベクター又はＶＬＰ、例えば、未改変レトロウイルスベクター又は他の点ではソース細胞と同様の細胞、又はＨｅＬａ細胞に由来するＶＬＰと比較して、ＭＨＣクラスＩ又はＭＨＣクラスＩＩの発現が、例えば、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上減少しており、ＭＨＣクラスＩ又はＩＩの発現は、フローサイトメトリー、例えばＦＡＣＳを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏでアッセイされる。
幾つかの実施形態では、レトロウイルスベクター又はＶＬＰは、実質的に非免疫原性である細胞供給源、例えば、哺乳動物細胞供給源に由来する。幾つかの実施形態では、免疫原性は、例えば、本明細書に記載されるように、定量化することができる。幾つかの実施形態では、哺乳動物細胞源は、以下の特徴のいずれか１つ、全て、又は組み合わせを含む：
ａ．ソース細胞は自家細胞供給源、例えば、レトロウイルスベクター又はＶＬＰを受ける、例えば投与されたレシピエントから得られた細胞から得られる；
ｂ．ソース細胞は、レシピエント、例えば、レトロウイルスベクター又はＶＬＰを受ける、例えば投与される本明細書に記載のレシピエントに一致した、例えば、同様の性別の同種異形細胞供給源から得られる；
ｃ．ソース細胞は、例えば１つ以上の対立遺伝子において、レシピエントのＨＬＡとＨＬＡが一致する同種異系細胞供給源から得られる；
ｄ．ソース細胞は、ＨＬＡホモ接合体である同種異系細胞供給源から得られる；
ｅ．ソース細胞は、ＭＨＣクラスＩ及びＩＩを欠いている（又は参照細胞と比較してレベルが低下している）同種異系細胞ソースから得られる；又は
ｆ．ソース細胞は、限定されるものではないが、幹細胞、間葉系幹細胞、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、セルトリ細胞又は網膜色素上皮細胞を含む、実質的に非免疫原性であることが知られている細胞供給源から得られる。
幾つかの実施形態では、レトロウイルスベクター又はＶＬＰを投与される被験体は、レトロウイルスベクター又はＶＬＰと反応する既存の抗体（例えば、ＩｇＧ又はＩｇＭ）を有するか、又は有することが知られているか、又はそれらについて試験される。幾つかの実施形態では、レトロウイルスベクター又はＶＬＰを投与される被験体は、レトロウイルスベクター又はＶＬＰと反応する検出可能なレベルの既存の抗体を有さない。抗体の試験は、例えば、実施例１３に記載されている。
幾つかの実施形態では、レトロウイルスベクター又はＶＬＰを受けた被験体は、レトロウイルスベクター又はＶＬＰと反応する抗体（例えば、ＩｇＧ又はＩｇＭ）を有するか、又は有することが知られているか、又はそれらについて試験される。幾つかの実施形態では、レトロウイルスベクター又はＶＬＰ（例えば、少なくとも１回、２回、３回、４回、５回、又はそれ以上）を受けた被験体は、レトロウイルスベクター又はＶＬＰと反応する検出可能なレベルの抗体を有していない。実施形態では、抗体のレベルは、２つの時点の間で１％、２％、５％、１０％、２０％、又は５０％を超えて上昇せず、第１の時点は、レトロウイルスベクター又はＶＬＰの最初の投与の前であり、第２の時点は、レトロウイルスベクター又はＶＬＰの１回以上の投与後である。抗体の試験は、例えば、実施例１４に記載されている。
ＶＩ．外因性作用物質
幾つかの実施形態では、フソソーム、例えば、レトロウイルスベクター、ＶＬＰ、又は本明細書に記載の医薬組成物は、外因性作用物質を含む。幾つかの実施形態では、フソソーム、例えばレトロウイルスベクター、ＶＬＰ、又は本明細書に記載の医薬組成物は、外因性作用物質をコードする核酸を含む。
Ａ．外因性タンパク質剤
幾つかの実施形態では、外因性作用物質は、細胞質ゾルタンパク質、例えば、レシピエント細胞で産生され、レシピエント細胞の細胞質に局在するタンパク質を含む。幾つかの実施形態では、外因性作用物質は、分泌されたタンパク質、例えば、レシピエント細胞によって産生及び分泌されるタンパク質を含む。幾つかの実施形態では、外因性作用物質は、核タンパク質、例えば、レシピエント細胞で産生され、レシピエント細胞の核に移入されるタンパク質を含む。幾つかの実施形態では、外因性作用物質は、オルガネラタンパク質（例えば、ミトコンドリアタンパク質）、例えば、レシピエント細胞で産生され、レシピエント細胞のオルガネラ（例えば、ミトコンドリア）に移入されるタンパク質を含む。幾つかの実施形態では、タンパク質は、野生型タンパク質又は変異体タンパク質である。幾つかの実施形態では、タンパク質は、融合タンパク質又はキメラタンパク質である。
幾つかの実施形態では、外因性作用物質は、ＳＹＮＥ１、ＳＥＴＸ、ＦＭＲ１、ＳＬＣ６Ａ８、ＵＢＥ３Ａ、ＳＯＤ１、ＴＤＰ４３、Ｃ９ｏｒｆ７２、ＦＸＮ、ＭＥＣＰ２、ＡＳＰＡ、ＡＬＤＨ７Ａ１、ＴＰＰ１、ＦＵＣＡ１、ＧＡＬＣ、ＨＥＸＡ、ＨＥＸＢ、ＭＡＮＢＡ、ＡＲＳＡ、ＧＮＰＴＡＢ、又はＭＣＯＬＮ１の中からの遺伝子によってコードされる。幾つかの実施形態では、外因性作用物質は、中からの遺伝子によってコードされる。幾つかの実施形態では、外因性作用物質は、ＳＹＮＥ１、ＳＥＴＸ、ＦＭＲ１、ＳＬＣ６Ａ８、ＵＢＥ３Ａ、ＳＯＤ１、ＴＤＰ４３、Ｃ９ｏｒｆ７２、ＦＸＮ、ＭＥＣＰ２、ＡＳＰＡ、又はＡＬＤＨ７Ａ１の中からの遺伝子によってコードされる。幾つかの実施形態では、外因性作用物質は、ＴＰＰ１、ＦＵＣＡ１、ＧＡＬＣ、ＨＥＸＡ、ＨＥＸＢ、ＭＡＮＢＡ、ＡＲＳＡ、ＧＮＰＴＡＢ、又はＭＣＯＬＮ１の中からの遺伝子によってコードされる。
幾つかの実施形態では、外因性作用物質は、下記表５のタンパク質を含む。幾つかの実施形態では、外因性作用物質は、表５のタンパク質のいずれかの野生型ヒト配列、その機能的フラグメント（例えば、その酵素的に活性なフラグメント）、又はその機能的バリアントを含む。幾つかの実施形態では、外因性作用物質は、表５のアミノ酸配列、例えば、表５の列２のＵｎｉｐｒｏｔタンパク質アクセッション番号配列又は表５の列３のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態では、ペイロード遺伝子は、表５のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする。
幾つかの実施形態では、標的細胞は、例えば外因性作用物質がＳＹＮＥ１である場合、例えば脊髄小脳失調症、常染色体劣性、１型の処置のための小脳内の細胞である。幾つかの実施形態では、標的細胞は、例えば外因性作用物質がＳＥＴＸである場合、例えば、眼球運動失行を伴う運動失調２型の処置のための脳、脊髄、及び／又は筋肉の細胞である。幾つかの実施形態では、標的細胞は、例えば外因性作用物質がＦＭＲ１である場合、例えば脆弱Ｘ症候群の処置のためのニューロン又は星状膠細胞である。幾つかの実施形態では、標的細胞は、例えば外因性作用物質がＳＯＤ１、ＴＤＰ４３、又はＣ９ｏｒｆ７２である場合、例えば筋萎縮性側索硬化症の処置のための運動ニューロンである。幾つかの実施形態では、標的細胞は、例えば外因性作用物質が ＦＸＮである場合、例えばフリードライヒ運動失調症の処置のための神経系、心臓、肝臓、及び／又は骨格筋の細胞である。幾つかの実施形態では、標的細胞は、例えば外因性作用物質が ＭＥＣＰ２である場合、例えば レット症候群の処置のための脳内のニューロンである。幾つかの実施形態では、標的細胞は、例えば外因性作用物質がＡＳＰＡである場合、例えばカナバン病の処置のための乏突起膠細胞又はニューロンである。
幾つかの実施形態では、外因性作用物質は、下記表６のタンパク質を含む。幾つかの実施形態では、外因性作用物質は、表６のタンパク質のいずれかの野生型ヒト配列、その機能的フラグメント（例えば、その酵素的に活性なフラグメント）、又はその機能的バリアントを含む。幾つかの実施形態では、外因性作用物質は、表６のアミノ酸配列、例えば、表６の列２のＵｎｉｐｒｏｔタンパク質アクセッション番号配列又は表６の列３のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態では、ペイロード遺伝子は、表６のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする。
幾つかの実施形態では、標的細胞は、例えば外因性作用物質がＧＡＬＣである場合、例えばクラッベ病の処置のための乏突起膠細胞である。幾つかの実施形態では、標的細胞は、例えば外因性作用物質がＨＥＸＡである場合、例えばテイ・サックス病の処置のためのニューロンである。幾つかの実施形態では、標的細胞は、例えば外因性作用物質がＨＥＸＢである場合、例えばサンドホフ病の処置のためのニューロンである。
幾つかの実施形態では、タンパク質作用物質は、凝固因子以外、例えば、第ＶＩＩ因子又は第ＩＸ因子以外のものである。幾つかの実施形態では、タンパク質作用物質、レポータータンパク質、例えば、蛍光タンパク質、例えば、ＧＦＰ又はルシフェラーゼ以外のものである。幾つかのタンパク質作用物質は、細胞表面受容体、ＮＧＦ受容体、ガラクトセレブロシダーゼ、ｇｐ９１ ｐｈｏｘ、ＩＦＮ－アルファ、ＴＫ、ＧＣＶ、及び自己免疫抗原、サイトカイン、血管新生阻害剤、又は抗癌剤、或いはそのフラグメント又はバリアント以外のものである。
ＶＩＩ．インスレーター配列
幾つかの実施形態では、フソソームレトロウイルス若しくはレンチウイルスベクター又はＶＬＰは更に、１つ以上のインスレーター配列、例えば、本明細書で説明されるインスレーター配列を含む。インスレーター配列は、ゲノムＤＮＡに存在するシス作用エレメントによって媒介されて転移配列の脱調節発現（例えば、位置効果；例えば、Ｂｕｒｇｅｓｓ－Ｂｅｕｓｓｅ ｅｔ ａｌ，２００２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９９：１６４３３、及びＺｈａｎ ｅｔ ａｌ，２００１，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，１０９：４７１を参照）又はトランスファーされた配列に隣接する内因性配列の脱調節発現につながる可能性がある組み込み部位効果から、レンチウイルス発現配列、例えば治療用ポリペプチドを保護することに寄与する可能性がある。幾つかの実施形態では、トランスファーベクターが、１つ以上のインスレーター配列３’ＬＴＲを含み、プロウイルスが宿主ゲノムに組み込まれると、プロウイルスは、３’ＬＴＲを複製することによって、５’ＬＴＲ及び／又は３’ＬＴＲにおいて、１つ以上のインスレーターを含む。適切なインスレーターしては、限定されるものではないが、ニワトリのβ－グロビンインスレーター（Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ，１９９３．Ｃｅｌｌ ７４：５０５、Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ，１９９７．Ｎ４Ｓ ９４：５７５、及びＢｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９．Ｃｅｌｌ ９８：３８７、参照により本明細書に組み込まれる）、又はニワトリＨＳ４等のヒトβ－グロビン遺伝子座に由来するインスレーターが挙げられる。幾つかの実施形態では、インスレーターは、ＣＣＣＴＣ結合因子（ＣＴＣＦ）に結合する。幾つかの実施形態では、インスレーターはバリアインスレーターである。幾つかの実施形態では、インスレーターは、エンハンサー遮断インスレーターである。例えば、Ｅｍｅｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２０１１及びＢｒｏｗｎｉｎｇ ａｎｄ Ｔｒｏｂｒｉｄｇｅ，Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅｓ，２０１６を参照、これらはいずれも参照によりそれらの全体が含まれる。
幾つかの実施形態では、レトロウイルス核酸中のインスレーターは、レシピエント細胞における遺伝毒性を低減する。遺伝毒性は、例えば、Ｃｅｓａｎａ ｅｔ ａｌ，「Ｕｎｃｏｖｅｒｉｎｇ ａｎｄ ｄｉｓｓｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ｇｅｎｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ｓｅｌｆ－ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｉｎ ｖｉｖｏ」Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１４ Ａｐｒ；２２（４）：７７４－８５．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔ．２０１４．３．Ｅｐｕｂ ２０１４ Ｊａｎ ２０に記載されるように測定され得る。
ＶＩＩＩ．標的細胞のフソソーム含有量の評価
本開示はまた、幾つかの態様では、被験体における標的細胞のフソソーム含有量（例えば、標的細胞へのフソソーム融合）を評価する方法を提供し、フソソーム組成物（例えば、本明細書に記載のフソソーム組成物）を受けた被験体からの生物学的サンプルを提供すること、及び生物学的サンプル中の標的細胞と、本明細書に記載のフソソームとの融合から生じる生物学的サンプルの１つ以上の特性を決定するためにアッセイを実施することを含む。幾つかの態様では、本開示は、例えば、実施例７１に記載されるように、標的細胞との融合を測定する方法を提供する。幾つかの実施形態では、生物学的サンプルの１つ以上の特性を決定することは、フソゲンの存在、カーゴ又はペイロードのレベル、又はカーゴ又はペイロードに関連する活性を決定することを含む。
幾つかの態様では、本開示は、標的細胞のフソソーム含有量（例えば、被験体における標的細胞へのフソソーム融合）を評価する方法を提供し、例えば、本明細書に記載されるように、フソソーム組成物を受けた被験体からの生物学的サンプルを提供すること、及びフソゲン、例えば本明細書に記載されるフソゲンの存在について生物学的サンプルを試験することを含む。幾つかの例では、検出されたフソゲンのレベルは、例えば、フソソーム組成物を受けていない被験体からの対応する生物学的サンプルにおいて観察されるものより、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％、２０００％、３０００％、４０００％、５０００％、１０，０００％、５０，０００％、又は１００，０００％大きい。幾つかの実施形態では、被験体は、フソソーム組成物の投与前の同じ被験体であり、幾つかの実施形態では、被験体は、異なる被験体である。
幾つかの態様では、本開示は、標的細胞のフソソーム含有量（例えば、被験体における標的細胞へのフソソーム融合）を評価する方法を提供し、例えば、本明細書に記載されるように、フソソーム組成物を受けた被験体からの生物学的サンプルを提供すること、及び、例えば、本明細書に記載されるフソソームによって送達されるカーゴ又はペイロードの存在について生物学的サンプルを試験することを含む。幾つかの例では、検出されたカーゴ又はペイロードのレベルは、例えば、フソソーム組成物を受けていない被験体からの対応する生物学的サンプルにおいて観察されるものより、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％、２０００％、３０００％、４０００％、５０００％、１０，０００％、５０，０００％、又は１００，０００％大きい。幾つかの実施形態では、被験体は、フソソーム組成物の投与前の同じ被験体であり、幾つかの実施形態では、被験体は、異なる被験体である。
幾つかの態様では、本開示は、標的細胞のフソソーム含有量（例えば、被験体における標的細胞へのフソソーム融合）を評価する方法を提供し、例えば、本明細書に記載されるように、フソソーム組成物を受けた被験体からの生物学的サンプルを提供すること、及びフソソーム組成物に関連する活性、例えば、フソソーム組成物によって送達されるカーゴ又はペイロードに関連する活性の変化について生物学的サンプルを試験することを含む。幾つかの例では、検出された活性のレベルは、例えば、フソソーム組成物を受けていない被験体（例えば、フソソーム組成物の投与前の同じ被験体）からの対応する生物学的サンプルのそれと比較して、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％、２０００％、３０００％、４０００％、５０００％、１０，０００％、５０，０００％、又は１００，０００％増加する。幾つかの例では、検出された活性のレベルは、例えば、フソソーム組成物を受けていない被験体からの対応する生物学的サンプルのそれと比較して、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％、２０００％、３０００％、４０００％、５０００％、１０，０００％、５０，０００％、又は１００，０００％減少する。幾つかの実施形態では、被験体は、フソソーム組成物の投与前の同じ被験体であり、幾つかの実施形態では、被験体は、異なる被験体である。
一態様では、本開示は、例えば本明細書に記載のように、被験体における標的細胞へのフソソームの融合を評価する方法を提供し、フソソーム組成物を受けた被験体からの生物学的サンプルを提供すること、及び生物学的サンプルにおいて融合していないフソソームのレベルを評価することを含む。
被験体において、レシピエント細胞の形成をもたらす標的細胞のフソソーム含有量を評価する方法（例えば、標的細胞へのフソソーム融合）の幾つかの実施形態では、該方法は、被験体から生物学的サンプルを収集することを更に含む。実施形態では、生物学的サンプルは、１つ以上のレシピエント細胞を含む。
被験体における標的細胞のフソソーム含有量（例えば、標的細胞へのフソソーム融合）を評価する方法の幾つかの実施形態では、該方法は、生物学的サンプル中の融合していないフソソームから、例えば、遠心分離によって、生物学的サンプル中のレシピエント細胞を分離することを更に含む。幾つかの実施形態では、この方法は、例えば遠心分離によって、生物学的サンプル中の融合していないフソソームと比較してレシピエント細胞を濃縮することを更に含む。幾つかの実施形態では、この方法は、例えばＦＡＣＳによって、生物学的サンプル中の非標的細胞と比較して標的細胞を濃縮することを更に含む。
被験体における標的細胞のフソソーム含有量（例えば、標的細胞へのフソソーム融合）を評価する方法の幾つかの実施形態では、フソソーム組成物に関連する活性は、代謝産物の存在又はレベル、バイオマーカーの存在又はレベル（例えば、タンパク質レベル又は翻訳後修飾、例えば、リン酸化若しくは切断）から選択される。
被験体における標的細胞のフソソーム含有量（例えば、標的細胞へのフソソーム融合）を評価する方法の幾つかの実施形態では、フソソーム組成物に関連する活性は免疫原性である。実施形態では、標的細胞はＣＤ３＋細胞であり、生物学的サンプルは被験体から収集された血液サンプルである。実施形態では、血球は、例えば、緩衝塩化アンモニウム溶液を使用して、血液サンプルから濃縮される。実施形態では、濃縮された血球は、抗ＣＤ３抗体（例えば、マウス抗ＣＤ３－ＦＩＴＣ抗体）と共にインキュベートされ、ＣＤ３＋細胞は、例えば、蛍光活性化細胞ソーティングによって選択される。実施形態では、細胞、例えば選別された細胞、例えばＣＤ３＋細胞は、抗ＩｇＭ抗体で染色することによって、細胞表面上の抗体の存在について分析される。幾つかの実施形態では、抗体が参照レベルを超えるレベルで存在する場合、被験体は、レシピエント細胞に対して免疫応答を有すると識別される。
実施形態では、免疫原性は、細胞溶解アッセイによってアッセイされる。実施形態では、生物学的サンプルからのレシピエント細胞は、他の細胞を溶解することができる免疫エフェクター細胞と共インキュベートされる。実施形態では、免疫エフェクター細胞は、被験体由来、又はフソソーム組成物を投与されていない被験体由来ものである。例えば、実施形態では、免疫原性は、ＰＢＭＣ細胞溶解アッセイによって評価される。実施形態では、生物学的サンプルからのレシピエント細胞は、被験体に由来する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）又はフソソーム組成物を投与されていない被験体に由来する対照ＰＢＭＣと共インキュベートされ、次いで、ＰＢＭＣによるレシピエント細胞の溶解について評価される。実施形態では、免疫原性は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞溶解アッセイによって評価される。実施形態では、レシピエント細胞は、被験体に由来するＮＫ細胞又はフソソーム組成物を投与されていない被験体に由来する対照ＮＫ細胞と共インキュベートされ、次いで、ＮＫ細胞によるレシピエント細胞の溶解について評価される。実施形態では、免疫原性は、ＣＤ８＋Ｔ細胞溶解アッセイによって評価される。実施形態では、レシピエント細胞は、被験体に由来するＣＤ８＋Ｔ細胞又はフソソーム組成物を投与されていない被験体に由来する対照ＣＤ８＋Ｔ細胞と共インキュベートされ、次いで、ＣＤ８＋Ｔ細胞によるレシピエント細胞の溶解について評価される。幾つかの実施形態では、細胞溶解が参照レベルを超えるレベルで起こる場合、被験体は、レシピエント細胞に対して免疫応答を有すると識別される。
幾つかの実施形態では、免疫原性は、例えばマクロファージによる、レシピエント細胞の食作用によってアッセイされる。実施形態では、レシピエント細胞は、マクロファージによって食作用の標的とされない。実施形態では、生物学的サンプルは、被験体から収集された血液サンプルである。実施形態では、血球は、例えば、緩衝塩化アンモニウム溶液を使用して、血液サンプルから濃縮される。実施形態では、濃縮された血球は、抗ＣＤ３抗体（例えば、マウス抗ＣＤ３－ＦＩＴＣ抗体）と共にインキュベートされ、ＣＤ３＋細胞は、例えば、蛍光活性化細胞ソーティングによって選択される。実施形態では、蛍光標識されたＣＤ３＋細胞は、マクロファージと共にインキュベートされ、次いで、例えば、フローサイトメトリーによって、マクロファージ内の細胞内蛍光について試験される。幾つかの実施形態では、マクロファージ食作用が参照レベルを超えるレベルで起こる場合、被験体は、レシピエント細胞に対して免疫応答を有すると識別される。
ＩＸ．フソソームの物理的及び機能的特徴
幾つかの実施形態では、フソソームは、作用物質、例えば、タンパク質、核酸（例えば、ｍＲＮＡ）、細胞小器官、又は代謝産物を、標的細胞の細胞質ゾルに送達する（例えば、送達する）ことができる。同様に、幾つかの実施形態では、本明細書の方法は、標的細胞の細胞質ゾルに作用物質を送達することを含む。幾つかの実施形態では、作用物質は、標的細胞に存在しないか、変異体であるか、又は野生型よりも低いレベルであるタンパク質（又はタンパク質をコードする核酸、例えば、タンパク質をコードするｍＲＮＡ）である。幾つかの実施形態では、標的細胞は、遺伝性疾患、例えば、単一遺伝子性疾患、例えば、単一遺伝子性細胞内タンパク質疾患を有する被験体に由来する。幾つかの実施形態では、作用物質は、転写因子、例えば、外因性転写因子又は内因性転写因子を含む。幾つかの実施形態では、フソソームは又は方法は、１つ以上（例えば、少なくとも２、３、４、５、１０、２０、又は５０）の追加の転写因子、例えば、外因性転写因子、内因性転写因子、又はそれらの組み合わせを更に含む、又はそれを送達することを更に含む。
幾つかの実施形態では、フソソームは、複数の作用物質（例えば、少なくとも２、３、４、５、１０、２０、又は５０の作用物質）を含み（例えば、標的細胞に送達することができる）、ここで、複数の作用物質はそれぞれ、例えば、経路が生合成経路、異化経路、又はシグナル伝達カスケードである、標的細胞内の経路の段階に作用する。実施形態では、複数の各作用物質は、経路をアップレギュレートするか、又は経路をダウンレギュレートする。幾つかの実施形態では、フソソームは、経路の段階に作用しない、例えば、第２の経路の段階に作用する１つ以上の追加の作用物質（例えば、第２の複数の作用物質を含む）を更に含む、又は送達することを更に含む。幾つかの実施形態では、フソソームは、又は方法は、複数の作用物質（例えば、少なくとも２、３、４、５、１０、２０、又は５０の作用物質）を含む（例えば、標的細胞に送達することができる）又はそれを送達することを更に含み、ここで、複数の作用物質はそれぞれ単一の経路の一部であり、経路は生合成経路、異化経路、又はシグナル伝達カスケードである、シグナル経路である。幾つかの実施形態では、フソソームは、シグナル経路の一部である、例えば、第２の経路の一部である、１つ以上の追加の作用物質（例えば、第２の複数の作用物質を含む）を更に含む、又は送達することを更に含む。
幾つかの実施形態では、標的細胞は、凝集した又は誤って折りたたまれたタンパク質を含む。幾つかの実施形態では、フソソームは、標的細胞における凝集した若しくは誤って折りたたまれたタンパク質のレベルを低下させることができる（例えば、レベルを低下させる）か、又は本明細書の方法は、標的細胞における凝集した若しくは誤って折りたたまれたタンパク質のレベルを低下させることを含む。
幾つかの実施形態では、作用物質は、転写因子、酵素（例えば、核酵素又はサイトゾル酵素）、ＤＮＡ（例えば、Ｃａｓ９、ＺＦＮ、又はＴＡＬＥＮ）、ｍＲＮＡ（例えば、細胞内タンパク質をコードするｍＲＮＡ）、細胞小器官、又は代謝産物への配列特異的修飾を媒介する試薬から選択される。
幾つかの実施形態では、フソソームは、標的細胞の細胞膜に作用物質、例えば、タンパク質を送達することができる（例えば、送達する）。同様に、幾つかの実施形態では、本明細書の方法は、標的細胞の細胞膜に作用物質を送達することを含む。幾つかの実施形態では、タンパク質を送達することは、標的細胞がタンパク質を産生し、それを膜に局在化するように、タンパク質をコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ）を標的細胞に送達することを含む。幾つかの実施形態では、フソソームはタンパク質を含み、又は方法はタンパク質を送達することを含み、標的細胞とのフソソームの融合が標的細胞の細胞膜に該タンパク質を運ぶ。幾つかの実施形態では、作用物質は、細胞表面リガンド又は細胞表面受容体に結合する抗体を含む。幾つかの実施形態では、フソソームは細胞表面受容体に結合する第２の細胞表面リガンド若しくは抗体を含む若しくはコードし、任意に、細胞表面受容体に結合する１つ以上の追加の細胞表面リガンド若しくは抗体（例えば、１、２、３、４、５、１０、２０、５０、又はそれ以上）を更に含む若しくはコードする第２の作用物質を更に含む、又は方法は、該第２の作用物質を送達することを更に含む。幾つかの実施形態では、第１の作用物質及び第２の作用物質は複合体を形成し、任意に、複合体は、１つ以上の追加の細胞表面リガンドを更に含む。幾つかの実施形態では、作用物質は、細胞表面受容体、例えば、外因性細胞表面受容体を含むか、又はコードする。幾つかの実施形態では、フソソームは、第２の受容体を含む若しくはコードし、任意に、１つ以上の追加の細胞表面受容体（例えば、１、２、３、４、５、１０、２０、５０、又はそれ以上の細胞表面受容体）を更に含む若しくはコードする第２の作用物質を更に含む、又は方法は、該第２の作用物質を送達することを更に含む。
幾つかの実施形態では、第１の作用物質及び第２の作用物質は複合体を形成し、任意に、複合体は、１つ以上の追加の細胞表面受容体を更に含む。幾つかの実施形態では、作用物質は、抗原又は抗原提示タンパク質を含む又はコードする。
幾つかの実施形態では、フソソームは、例えば、標的細胞がタンパク質を産生及び分泌することを可能にする条件下で、標的細胞に対してタンパク質をコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ）を送達することによって、分泌物質、例えば、分泌タンパク質を標的部位（例えば、細胞外領域）に送達することができる（例えば、送達する）。同様に、幾つかの実施形態では、本明細書の方法は、本明細書に記載のように分泌された作用物質を送達することを含む。実施形態では、分泌されたタンパク質は、内因性又は外因性である。実施形態では、分泌されたタンパク質は、タンパク質治療薬、例えば、抗体分子、サイトカイン、又は酵素を含む。実施形態では、分泌されたタンパク質は、オートクリンシグナル伝達分子又はパラクリンシグナル伝達分子を含む。実施形態では、分泌される作用物は、分泌顆粒を含む。
幾つかの実施形態では、フソソームは、例えば、転写因子若しくはｍＲＮＡから選択される作用物質、又は複数の当該作用物質を送達することによって、標的細胞（例えば、免疫細胞）をリプログラミングすることができる（例えば、リプログラムする）。同様に、幾つかの実施形態では、本明細書の方法は、標的細胞をリプログラミングすることを含む。実施形態では、リプログラミングは、非ドーパミン作動性ニューロンを誘導してドーパミン作動性ニューロンの１つ以上の特性を引き継ぐことによって、又は疲弊Ｔ細胞を誘導して、疲弊していないＴ細胞、例えばキラーＴ細胞の１つ以上の特徴を引き継ぐことによって、膵臓内分泌細胞を誘導して膵臓ベータ細胞の１つ以上の特性を引き継ぐことを含む。幾つかの実施形態では、作用物質は抗原を含む。幾つかの実施形態では、フソソームは、抗原を含む第１の薬剤及び抗原提示タンパク質を含む第２の薬剤を含む。
幾つかの実施形態では、フソソームは、１つ以上の細胞表面受容体を標的細胞（例えば、免疫細胞）に供与することができる（例えば、供与する）。同様に、幾つかの実施形態では、本明細書の方法は、１つ以上の細胞表面受容体を供与することを含む。
幾つかの実施形態では、フソソームは、標的腫瘍細胞を改変することができる、例えば改変する。同様に、幾つかの実施形態では、本明細書の方法は、標的腫瘍細胞を改変することを含む。実施形態では、フソソームは、免疫賦活リガンド、抗原提示タンパク質、腫瘍抑制タンパク質、又はアポトーシス促進タンパク質をコードするｍＲＮＡを含む。幾つかの実施形態では、フソソームは、免疫抑制リガンド、マイトジェンシグナル、又は成長因子の標的細胞におけるレベルを低下させることができるｍｉＲＮＡを含む。
幾つかの実施形態では、フソソームは、免疫調節性である、例えば、免疫賦活性である薬剤を含む。
幾つかの実施形態では、フソソームは、標的細胞に抗原を提示させることができる（例えば、提示させる）。同様に、幾つかの実施形態では、本明細書の方法は、標的細胞上に抗原を提示することを含む。
幾つかの実施形態では、フソソームは、標的組織における再生を促進する。同様に、幾つかの実施形態では、本明細書の方法は、標的組織における再生を促進することを含む。実施形態では、標的細胞は、心筋細胞、例えば、心筋細胞（例えば、静止心筋細胞）、肝芽細胞（例えば、胆管肝芽細胞）、上皮細胞、ナイーブＴ細胞、マクロファージ（例えば、腫瘍）浸潤性マクロファージ）、又は線維芽細胞（例えば、心臓線維芽細胞）である。実施形態では、ソース細胞は、Ｔ細胞（例えば、Ｔｒｅｇ）、マクロファージ、又は心筋細胞である。
幾つかの実施形態では、フソソームは、例えば、遺伝子治療のために、例えば、標的細胞のゲノムを安定に改変するために、核酸を標的細胞に送達することができる（例えば、送達する）。同様に、幾つかの実施形態では、本明細書の方法は、核酸を標的細胞に送達することを含む。幾つかの実施形態では、標的細胞は、酵素欠損を有し、例えば、酵素の活性の低下（例えば、活性なし）をもたらす酵素の突然変異を含む。
幾つかの実施形態では、フソソームは、標的細胞におけるＤＮＡ（例えば、Ｃａｓ９、ＺＦＮ、又はＴＡＬＥＮ）への配列特異的修飾を媒介する試薬を送達することができる（例えば、送達する）。同様に、幾つかの実施形態では、本明細書の方法は、試薬を標的細胞に送達することを含む。実施形態では、標的細胞は、ＣＮＳ細胞である。
幾つかの実施形態では、フソソームは、例えば、標的細胞における遺伝子発現を一時的に改変するために、核酸を標的細胞に送達することができる（例えば、送達する）。
幾つかの実施形態では、フソソームは、例えば、タンパク質欠損を一時的に救済するために、タンパク質を標的細胞に送達することができる（例えば、送達する）。同様に、幾つかの実施形態では、本明細書の方法は、タンパク質を標的細胞に送達することを含む。実施形態では、タンパク質は、膜タンパク質（例えば、膜輸送体タンパク質）、細胞質タンパク質（例えば、酵素）、又は分泌タンパク質（例えば、免疫抑制タンパク質）である。
幾つかの実施形態では、フソソームは、例えば、標的細胞が欠陥のある細胞小器官ネットワークを有する場合に、細胞小器官を標的細胞に送達することができる（例えば、送達する）。同様に、幾つかの実施形態では、本明細書の方法は、細胞小器官を標的細胞に送達することを含む。実施形態では、ソース細胞は、肝細胞、骨格筋細胞、又はニューロンである。
幾つかの実施形態では、フソソームは、例えば、標的細胞が遺伝子突然変異を有する場合に、核を標的細胞に送達することができる（例えば、送達する）。同様に、幾つかの実施形態では、本明細書の方法は、核を標的細胞に送達することを含む。幾つかの実施形態では、核は自己由来であり、標的細胞と比較して１つ以上の遺伝的変化を含み、例えば、ＤＮＡ（例えば、Ｃａｓ９、ＺＦＮ、又はＴＡＬＥＮ）に対する配列特異的修飾、又は人工染色体、ゲノムに組み込まれた追加の遺伝的変化、欠失、又はそれらの任意の組み合わせを含む。実施形態では、自家核の供給源は、幹細胞、例えば、造血幹細胞である。実施形態では、標的細胞は、筋細胞（例えば、骨格筋細胞又は心筋細胞）、肝細胞、又はニューロンである。
幾つかの実施形態では、フソソームは、細胞内分子送達が可能であり、例えば、タンパク質作用物質を標的細胞に送達することができる。同様に、幾つかの実施形態では、本明細書の方法は、標的細胞の細胞内領域に分子を送達することを含む。実施形態では、タンパク質作用物質は阻害剤である。実施形態では、タンパク質作用物質は、ナノボディ、ｓｃＦｖ、ラクダ抗体、ペプチド、大環状分子、又は小分子を含む。
幾つかの実施形態では、フソソームは、標的細胞にタンパク質、例えば、治療用タンパク質を分泌させる（例えば、その分泌を引き起こす）ことができる。同様に、幾つかの実施形態では、本明細書の方法は、標的細胞にタンパク質を分泌させることを含む。
幾つかの実施形態では、フソソームは、作用物質、例えば、タンパク質を分泌することができる（例えば、分泌する）。幾つかの実施形態では、作用物質、例えば、分泌された作用物質は、被験体の標的部位に送達される。幾つかの実施形態では、作用物質は、組換え的に作製することができないか、又は組換え的に作製することが困難なタンパク質である。幾つかの実施形態では、タンパク質を分泌するフソソームは、ＭＳＣ又は軟骨細胞から選択されたソース細胞に由来する。
幾つかの実施形態では、フソソームは、その膜上に１つ以上の細胞表面リガンド（例えば、１、２、３、４、５、１０、２０、５０、又はそれ以上の細胞表面リガンド）を含む。同様に、幾つかの実施形態では、本明細書の方法は、１つ以上の細胞表面リガンドを標的細胞に提示することを含む。幾つかの実施形態では、細胞表面リガンドを有するフソソームは、好中球（例えば、標的細胞が腫瘍浸潤リンパ球である）、樹状細胞（例えば、標的細胞がナイーブＴ細胞である）、又は好中球（例えば、標的は腫瘍細胞又はウイルス感染細胞である）から選択されるソース細胞に由来する。幾つかの実施形態では、フソソームは、膜複合体、例えば、少なくとも２、３、４、又は５つのタンパク質を含む複合体、例えば、ホモ三量体、ヘテロ三量体、ホモ三量体、ヘテロ三量体、ホモ四量体、又はヘテロ四量体を含む。幾つかの実施形態では、フソソームは、抗体、例えば、毒性抗体を含み、例えば、フソソームは、例えば、標的部位にホーミングすることによって、抗体を標的部位に送達することができる。幾つかの実施形態では、ソース細胞は、ＮＫ細胞又は好中球である。
幾つかの実施形態では、本明細書の方法は、標的細胞からのタンパク質の分泌又は標的細胞の表面上のリガンド提示を引き起こすことを含む。幾つかの実施形態では、フソソームは、標的細胞の細胞死を引き起こすことができる。幾つかの実施形態では、フソソームは、ＮＫソース細胞に由来する。
幾つかの実施形態では、フソソーム又は標的細胞は、（例えば、病原体の）食作用が可能である。同様に、幾つかの実施形態では、本明細書の方法は、食作用を引き起こすことを含む。
幾つかの実施形態では、フソソームは、その局所環境を感知し、それに応答する。幾つかの実施形態では、フソソームは、代謝産物、インターロイキン、又は抗原のレベルを感知することができる。
実施形態では、フソソームは、走化性、血管外漏出、又は１つ以上の代謝活性が可能である。実施形態では、代謝活性は、キヌレニン、糖新生、プロスタグランジン脂肪酸酸化、アデノシン代謝、尿素回路、及び発熱呼吸から選択される。幾つかの実施形態では、ソース細胞は好中球であり、フソソームは傷害部位にホーミングすることができる。幾つかの実施形態では、ソース細胞はマクロファージであり、フソソームは食作用が可能である。幾つかの実施形態では、ソース細胞は褐色脂肪組織細胞であり、フソソームは脂肪分解が可能である。
幾つかの実施形態では、フソソームは、複数の作用物質（例えば、少なくとも２、３、４、５、１０、２０、又は５０の作用物質）を含む（例えば、標的細胞に送達することができる）。実施形態では、フソソームは、阻害性核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ）及びｍＲＮＡを含む。
幾つかの実施形態では、フソソームは、膜タンパク質又は膜タンパク質をコードする核酸を含む（例えば、標的細胞に送達することができる）。実施形態では、フソソームは、標的細胞を再プログラミング又は分化転換することができ、例えば、フソソームは、標的細胞の再プログラミング又は分化転換を誘導する１つ以上の作用物質を含む。
幾つかの実施形態では、被験体は再生を必要としている。幾つかの実施形態では、被験体は、癌、自己免疫疾患、感染症、代謝性疾患、神経変性疾患、又は遺伝性疾患（例えば、酵素欠損症）に罹患している。
幾つかの実施形態（例えば、カーゴの非エンドサイトーシス送達をアッセイするための実施形態）では、カーゴ送達は、以下の工程の１つ以上（例えば、全て）を使用してアッセイされる：（ａ）３０，０００個のＨＥＫ－２９３Ｔ標的細胞を１００ｎＭバフィロマイシンＡ１を含む第１の９６ウェルプレートに入れ、同数の同様の細胞をバフィロマイシンＡ１を欠く９６ウェルプレートの第２のウェルに入れる工程、（ｂ）標的細胞をＤＭＥＭ培地で３７℃及び５％ＣＯ２で４時間培養する工程、（ｃ）カーゴを含む１０ｕｇのフソソームと標的細胞を接触させる工程、（ｄ）標的細胞及びフソソームを３７℃及び５％ＣＯ２で２４時間インキュベートする工程、及び（ｅ）カーゴを含む第１のウェル及び第２のウェルの細胞の割合を決定する工程。工程（ｅ）は、顕微鏡法を使用して、例えば免疫蛍光法を使用してカーゴを検出することを含み得る。工程（ｅ）は、カーゴを間接的に検出すること、例えば、カーゴの下流効果、例えば、レポータータンパク質の存在を検出することを含み得る。幾つかの実施形態では、上記の工程（ａ）～（ｅ）の１つ以上は、実施例８０に記載されるように実行される。
幾つかの実施形態では、エンドサイトーシスの阻害剤（例えば、クロロキン又はバフィロマイシンＡ１）は、エンドソームの酸性化を阻害する。幾つかの実施形態では、カーゴ輸送は、リソソーム酸性化とは無関係である。幾つかの実施形態では、エンドサイトーシスの阻害剤（例えば、ダイナソアル）は、ダイナミンを阻害する。幾つかの実施形態では、カーゴ輸送は、ダイナミン活性とは無関係である。
幾つかの実施形態（例えば、標的細胞対非標的細胞へのカーゴの特異的送達のための実施形態）では、カーゴ送達は、以下の工程の１つ以上（例えば、全て）を使用してアッセイされる：（ａ）３０，０００個のＣＤ８ａ及びＣＤ８ｂを過剰発現するＨＥＫ－２９３Ｔ標的細胞を第１の９６ウェルプレートに入れ、３０，０００個のＣＤ８ａ及びＣＤ８ｂを過剰発現しないＨＥＫ－２９３Ｔ非標的細胞を９６ウェルプレートの第２のウェルに入れる工程、（ｂ）細胞をＤＭＥＭ培地で３７℃及び５％ＣＯ２で４時間培養する工程、（ｃ）カーゴを含む１０ｕｇのフソソームと標的細胞を接触させる工程、（ｄ）標的細胞及びフソソームを３７℃及び５％ＣＯ２で２４時間インキュベートする工程、及び（ｅ）カーゴを含む第１のウェル及び第２のウェルの細胞の割合を決定する工程。工程（ｅ）は、顕微鏡法を使用して、例えば免疫蛍光法を使用してカーゴを検出することを含み得る。工程（ｅ）は、カーゴを間接的に検出すること、例えば、カーゴの下流効果、例えば、レポータータンパク質の存在を検出することを含み得る。幾つかの実施形態では、上記の工程（ａ）～（ｅ）の１つ以上は、実施例７１に記載されるように実行される。
幾つかの実施形態では、フソソームは、例えば、実施例４２のアッセイにおいて、非標的細胞よりも標的細胞と、例えば、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、又は１００倍速い速度で融合する。幾つかの実施形態では、フソソームは、例えば、実施例４２のアッセイにおいて、他のフソソームよりも、例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％速い速度で標的細胞と融合する。フソソームが、例えば、実施例４２のアッセイにおいて、フソソーム内の作用物質が、２４、４８、又は７２時間後に、標的細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、若しくは９０％まで送達されるような速度で標的細胞と融合する。実施形態では、標的化融合の量は、例えば、実施例４２のアッセイにおいて、約３０％～７０％、３５％～６５％、４０％～６０％、４５％～５５％、又は４５％～５０％、例えば、約４８．８％である。実施形態では、標的化融合の量は、例えば、実施例４３のアッセイにおいて、約２０％～４０％、２５％～３５％、又は３０％～３５％、例えば、約３２．２％である。
幾つかの実施形態では、フソゲンは、例えば、実施例２６のアッセイによって測定した場合、少なくとも１０、５０、１００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、若しくは１，０００，０００，０００コピー、又はそれ以下のコピー数で存在する。幾つかの実施形態では、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のフソソームに含まれるフソゲンは細胞膜内に配置されている。実施形態では、フソソームはまた、内部に、例えば、細胞質又は細胞小器官にフソゲンを含む。幾つかの実施形態では、フソゲンは、例えば、実施例９４に記載される方法及び／又は質量分析アッセイに従って決定した場合、フソソームにおいて約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、５％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、２０％若しくはそれ以上、又は約１～３０％、５～２０％、１０～１５％、１２～１５％、１３～１４％、又は１３．６％の総タンパク質を含む（又は含むと識別される）。実施形態では、フソゲンは、フソソーム中の総タンパク質の約１３．６％を含む（又は含むと同定される）。幾つかの実施形態では、フソゲンは、例えば、実施例９４に記載の方法に従って決定されるように、１つ以上の目的の追加のタンパク質よりも多かれ少なかれ豊富である（又はそうであると識別される）。一実施形態では、フソゲンは、約１４０、１４５、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７（例えば、１５６．９）、１５８、１５９、１６０、１６５、又は１７０のＥＧＦＰに対する比を有する（又は有すると識別される）。別の実施形態では、フソゲンは、例えば、質量分析アッセイによれば、約２７００、２８００、２９００、２９１０（例えば、２９１２）、２９２０、２９３０、２９４０、２９５０、２９６０、２９７０、２９８０、２９９０若しくは３０００、又は約１０００～５０００、２０００～４０００、２５００～３５００、２９００～２９３０、２９１０～２９１５、又は２９１２．０のＣＤ６３に対する比を有する（又は有すると識別される）。一実施形態では、フソゲンは、約６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０（例えば、６６４．９）、６７０、６８０、６９０、又は７００のＡＲＲＤＣ１に対する比率を有する（又は有すると識別される）。別の実施形態では、フソゲンは、約５０、５５、６０、６５、７０（例えば、６９）、７５、８０若しくは８５、又は約１～３０％、５～２０％、１０～１５％、１２～１５％、１３～１４％、又は１３．６％のＧＡＰＤＨに対する比を有する（又は有すると識別される）。別の実施形態では、フソゲンは、例えば、質量分析アッセイによれば、約５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０（例えば、５５８．４）、５７０、５８０、５９０若しくは６００、又は約３００～８００、４００～７００、５００～６００、５２０～５９０、５３０～５８０、５４０～５７０、５５０～５６０若しくは５５８．４のＣＮＸに対する比を有する（又は有すると識別される）。
幾つかの実施形態では、フソソームは、例えば、実施例８８のアッセイによって測定した場合、少なくとも１０、５０、１００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、若しくは１，０００，０００，０００コピー又はそれ以下のコピー数で治療剤を含む。幾つかの実施形態では、フソソームは、例えば、実施例８８のアッセイによって測定した場合、少なくとも１０、５０、１００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、若しくは１，０００，０００，０００コピーのコピー数でタンパク質治療剤を含む。幾つかの実施形態では、フソソームは、少なくとも１０、５０、１００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、若しくは１，０００，０００，０００コピーのコピー数で核酸を含む。幾つかの実施形態では、フソソームは、少なくとも１０、５０、１００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、若しくは１，０００，０００，０００コピーのコピー数でＤＮＡを含む。幾つかの実施形態では、フソソームは、少なくとも１０、５０、１００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、若しくは１，０００，０００，０００コピーのコピー数でＲＮＡを含む。幾つかの実施形態では、フソソームは、少なくとも１０、５０、１００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、若しくは１，０００，０００，０００コピーのコピー数で外因性治療薬を含む。幾つかの実施形態では、フソソームは、少なくとも１０、５０、１００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、又は１，０００，０００，０００コピーのコピー数の外因性タンパク質治療薬を含む。幾つかの実施形態では、フソソームは、少なくとも１０、５０、１００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、若しくは１，０００，０００，０００コピーのコピー数で核酸（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）を含む。幾つかの実施形態では、フソゲンのコピー数と治療薬のコピー数の比は、１，０００，０００：１～１００，０００：１、１００，０００：１～１０，０００：１、１０，０００：１～１，０００：１、１，０００：１～１００：１、１００：１～５０：１、５０：１～２０：１、２０：１～１０：１、１０：１～５：１、５：１～２：１、２：１～１：１、１：１～１：２、１：２～１：５、１：５～１：１０、１：１０～１：２０、１：２０～１：５０、１：５０～１：１００、１：１００～１：１，０００、１：１，０００～１：１０，０００、１：１０，０００～１：１００，０００、又は１：１００，０００～１：１，０００，０００である。
幾つかの実施形態では、フソソームは、治療薬を少なくとも１０、５０、１００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、又は１，０００，０００，０００コピーで標的細胞に送達する。幾つかの実施形態では、フソソームは、タンパク質を少なくとも１０、５０、１００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、又は１，０００，０００，０００コピーで標的細胞に送達する。幾つかの実施形態では、フソソームは、核酸を少なくとも１０、５０、１００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、又は１，０００，０００，０００コピーで標的細胞に送達する。幾つかの実施形態では、フソソームは、ＲＮＡを少なくとも１０、５０、１００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、又は１，０００，０００，０００コピーで標的細胞に送達する。幾つかの実施形態では、フソソームは、ＤＮＡを少なくとも１０、５０、１００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、又は１，０００，０００，０００コピーで標的細胞に送達する。
幾つかの実施形態では、フソソームは、フソソームによって含まれるカーゴ（例えば、治療薬、例えば、内因性治療薬又は外因性治療薬）の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％を標的細胞に送達する。幾つかの実施形態では、標的細胞（複数の場合がある）と融合するフソソームは、標的細胞（複数の場合がある）と融合するフソソームによって含まれるカーゴ（例えば、治療薬、例えば、内因性治療薬又は外因性治療薬）の平均で少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％を標的細胞に送達する。幾つかの実施形態では、フソソーム組成物は、フソソーム組成物によって含まれるカーゴ（例えば、治療薬、例えば、内因性治療薬又は外因性治療薬）の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％を標的組織に送達する。
幾つかの実施形態では、フソソームは、フソソーム中の総タンパク質１ｍｇあたり０．０００００００１ｍｇのフソゲン～１ｍｇのフソゲンを含み、例えば、フソソーム中の総タンパク質１ｍｇあたり０．０００００００１～０．００００００１、０．００００００１～０．０００００１、０．０００００１～０．００００１、０．００００１～０．０００１、０．０００１～０．００１、０．００１～０．０１、０．０１～０．１、又は０．１～１ｍｇのフソゲンを含む。幾つかの実施形態では、フソソームは、フソソーム中の脂質１ｍｇあたり０．０００００００１ｍｇのフソゲン～５ｍｇのフソゲンを含み、例えば、フソソーム中の脂質１ｍｇあたり０．０００００００１～０．００００００１、０．００００００１～０．０００００１、０．０００００１～０．００００１、０．００００１～０．０００１、０．０００１～０．００１、０．００１～０．０１、０．０１～０．１、０．１～１、又は１～５ｍｇのフソゲンを含む。
幾つかの実施形態では、カーゴはタンパク質カーゴである。実施形態では、カーゴは、内因性又は合成タンパク質カーゴである。幾つかの実施形態では、フソソームは、フソソームあたり、少なくとも１、２、３、４、５、１０、２０、５０、１００、又はそれ以上のタンパク質カーゴを有する（又は有すると識別される）。一実施形態では、フソソームは、例えば、実施例８８に記載される方法に従って定量化した場合、フソソームあたり約１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１６６、１７０、１８０、１９０、又は２００のタンパク質作用物質分子を有する（又は有すると同定される）。幾つかの実施形態では、内因性又は合成タンパク質カーゴは、約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％以上のフソソーム中の総タンパク質を含む（又は含むと識別される）。一実施形態では、合成タンパク質カーゴは、フソソーム中の総タンパク質の約１３．６％を含む（又は含むと識別される）。幾つかの実施形態では、合成タンパク質カーゴは、４×１０－３、５×１０－３、６×１０－３（例えば、６．３７×１０－３）、７×１０－３、又は８×１０－３のＶＳＶ－Ｇに対する比を有する（又は有すると識別される）。実施形態では、合成タンパク質カーゴは、約１０、１５、１６、１７、１８（例えば、１８．６）、１９、２０、２５若しくは３０、又は約１０～３０、１５～２５、１６～１９、１８～１９若しくは１８．６のＣＤ６３に対する比を有する（又は有すると識別される）実施形態では、合成タンパク質カーゴは、約２、３、４（例えば、４．２４）、５、６、又は７のＡＲＲＤＣ１に対する比を有する（又は有すると識別される）。実施形態では、合成タンパク質カーゴは、約０．１、０．２、０．３、０．４（例えば、０．４４）、０．５、０．６、又は０．７のＧＡＰＤＨに対する比を有する（又は有すると識別される）。実施形態では、合成タンパク質カーゴは、約１、２、３（例えば、３．５６）、４、５、又は６のＣＮＸに対する比を有する（又は有すると識別される）。実施形態では、合成タンパク質カーゴは、約１０、１５、１６、１７、１８、１９（例えば、１９．５２）、２０、２１、２２、２３、２４、２５、又は３０のＴＳＧ１０１に対する比を有する（又は有すると識別される）。
幾つかの実施形態では、フソゲンは、例えば、質量分析アッセイによれば、フソソーム中の総タンパク質の少なくとも０．５％、１％、５％、１０％、又はそれ以上を含む（又は含むと識別される）。一実施形態では、フソゲンは、例えば、質量分析アッセイによれば、フソソーム中の総タンパク質の約１～３０％、５～２０％、１０～１５％、１２～１５％、１３～１４％、又は１３．６％を含む（又は含むと識別される）。幾つかの実施形態では、フソゲンは、目的の他のタンパク質よりも豊富である。実施形態では、フソゲンは、例えば、質量分析アッセイによれば、ペイロードタンパク質、例えば、ＥＧＦＰに対する比が約１４５～１７０、１５０～１６５、１５５～１６０、１５６．９である（又は有すると識別される）。実施形態では、フソゲンは、例えば、質量分析アッセイによれば、約１０００～５０００、２０００～４０００、２５００～３５００、２９００～２９３０、２９１０～２９１５、又は２９１２．０のＣＤ６３に対する比を有する（又は有すると同定される）。実施形態では、フソゲンは、例えば、質量分析アッセイによれば、約３００～１０００、４００～９００、５００～８００、６００～７００、６４０～６９０、６５０～６８０、６６０～６７０、又は６６４．９のＡＲＲＤＣ１に対する比を有する。実施形態では、フソゲンは、例えば、質量分析アッセイによれば、約２０～１２０、４０～１００、５０～９０、６０～８０、６５～７５、６８～７０、又は６９．０のＧＡＰＤＨに対する比を有する（又は有すると同定される）。実施形態では、フソゲンは、例えば、質量分析アッセイによれば、約２００～９００、３００～８００、４００～７００、５００～６００、５２０～５９０、５３０～５８０、５４０～５７０、５５０～５６０、又は５５８．４のＣＮＸに対する比を有する。実施形態では、質量分析エッセイは、実施例９４のアッセイである。
幾つかの実施形態では、フソソームとソース細胞の両方に存在する（例えば、それらの間で共有される）脂質種の数は、例えば質量分析アッセイを使用すると、少なくとも３００、４００、５００、５５０、５６０若しくは５６９である（又はそうであると識別される）、又は５００～７００、５５０～６００若しくは５６０～５８０である。実施形態では、ソース細胞における対応する脂質レベルの少なくとも２５％のレベルでフソソームに存在する脂質種の数（両方ともサンプル内の総脂質レベルに対して正規化される）は、例えば、質量分析アッセイを使用すると、少なくとも３００、４００、５００、５３０、５４０若しくは５４８である、又は４００～７００、５００～６００、５２０～５７０、５３０～５６０、又は５４０～５５０である（又はそうであると識別される）。幾つかの実施形態では、ソース細胞中の総脂質種に対する、フソソーム及びソース細胞の両方に存在する（例えば、それらの間で共有される）脂質種の分率は、例えば質量分析アッセイを使用すると、約０．４～１．０、０．５～０．９、０．６～０．８若しくは０．７である、又は少なくとも０．４、０．５、０．６若しくは０．７である（又はそうであると識別される）。実施形態では、質量分析アッセイは、実施例８６のアッセイである。
幾つかの実施形態では、ソース細胞とフソソームの両方に存在する（例えば、それらの間で共有される）タンパク質種の数は、例えば、質量分析アッセイを使用すると、少なくとも５００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１４８７、１５００若しくは１６００である、又は１２００～１７００、１３００～１６００、１４００～１５００、１４５０～１５００若しくは１４８０～１４９０である（又はそうであると識別される）。実施形態では、ソース細胞の対応するタンパク質レベルの少なくとも２５％のレベルでフソソームに存在するタンパク質種の数（両方ともサンプル内の総タンパク質レベルに正規化される）は、例えば質量分析アッセイを使用すると、少なくとも５００、６００、７００、８００、９００、９５０、９５７、１０００、又は１２００である（又はそうであると識別される）。幾つかの実施形態では、ソース細胞中の総タンパク質種に対する、フソソーム及びソース細胞の両方に存在する（例えば、それらの間で共有される）タンパク質種の分率は、例えば、質量分析アッセイを使用すると、約０．１～０．６、０．２～０．５、０．３～０．４若しくは０．３３３である、又は少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．３３３若しくは０．４である（又はそうであると識別される）。実施形態では、質量分析アッセイは、実施例８７のアッセイである。
幾つかの実施形態では、ＣＤ６３は、例えば、質量分析アッセイ、例えば、実施例８９のアッセイによれば、フソソーム中の総タンパク質の０．０４８％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、又は１０％未満の量で存在する（又は存在すると識別される）。
幾つかの実施形態では、フソソームは、フィルター、例えば、約１～１０、２～８、３～７、４～６、又は５ｕｍのフィルターを通して押し出すことによって生産される。幾つかの実施形態では、フソソームは、約１～５、２～５、３～５、４～５、又は５ｕｍの平均径を有する（又は有すると識別される）。幾つかの実施形態では、フソソームは、少なくとも１、２、３、４、又は５ｕｍの平均径を有する（又は有すると識別される）。
幾つかの実施形態では、フソソームは、ソース細胞と比較して、以下の脂質の１つ以上（例えば、少なくとも２、３、４、５、又は全て）が濃縮されている（又は濃縮されていると識別される）：コレステリルエステル、遊離コレステロール、エーテル結合リゾホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルセリン、ホスファチデート、エーテル結合ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、及びスフィンゴミエリン。幾つかの実施形態では、フソソームは、ソース細胞と比較して、以下の脂質の１つ以上（例えば、少なくとも２、３、４、５、又は全て）が枯渇している（又は枯渇していると識別される）：セラミド、カルジオリピン、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルグリセロール、リゾホスファチジルイノシトール、エーテル結合ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、及びトリアシルグリセロール。幾つかの実施形態では、フソソームは、１つ以上の前述の濃縮された脂質について濃縮されている（又は濃縮されていると識別される）、又は、前述の枯渇脂質の１つ以上について枯渇している。幾つかの実施形態では、フソソームは、ソース細胞における対応するレベルよりも、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、２倍、５倍、又は１０倍高い総脂肪の割合として濃縮された脂肪を含む（又は含むと識別される）。幾つかの実施形態では、フソソームは、ソース細胞における対応するレベルの９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、又は１０％未満であるレベルの総脂肪の割合として枯渇された脂肪を含む（又は含むと識別される）。実施形態では、脂質濃縮は、質量分析アッセイ、例えば、実施例９６のアッセイによって測定される。
幾つかの実施形態では、ＣＥ脂質レベルは、フソソームにおいてエクソソームよりも約２倍、及び／又はフソソームにおいて親細胞よりも（サンプル中の総脂質と比較して）約５、６、７、８、９、又は１０倍高い（又はそうであると識別される）。幾つかの実施形態では、セラミド脂質レベルは、（サンプル中の総脂質と比較して）親細胞においてフソソームよりも約２、３、４、又は５倍高い（又はそうであると識別される）。幾つかの実施形態では、コレステロールレベルは、エクソソームにおいて、フソソームよりも約１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９若しくは２倍、及び／又はフソソームにおいて（サンプル中の総脂質と比較して）親細胞よりも約２倍大きい（又はそうであると識別される）。幾つかの実施形態では、ＣＬ脂質レベルは、（サンプル中の総脂質と比較して）親細胞において、フソソームよりも少なくとも約５、１０、２０、３０、又は４０倍大きい（又はそうであると識別される）。幾つかの実施形態では、ＤＡＧ脂質レベルは、エクソソームにおいてフソソームよりも約２倍若しくは３倍高く、及び／又は親細胞においてフソソームよりも約１．５倍又は２倍高い（サンプル中の総脂質と比較して）。幾つかの実施形態では、ＰＣ脂質レベルは、エクソソームとフソソームとの間でほぼ等しい（又はそうであると識別される）、及び／又は親細胞において、フソソームよりも約１．３、１．４、１．５、１．６、１．７若しくは１．８倍高い（サンプル中の総脂質と比較して）。幾つかの実施形態では、ＰＣ Ｏ脂質レベルは、エクソソームとフソソームとの間でほぼ等しい（又はそうであると識別される）、及び／又は親細胞において、フソソームよりも約２倍高い（サンプル中の総脂質と比較して）。幾つかの実施形態では、ＰＥ脂質レベルは、フソソームにおいてエクソソームよりも約１．３、１．４、１．５、１．６、１．７若しくは１．８倍高い（又はそうであると識別される）、及び／又は親細胞においてフソソームよりも約１．３、１．４、１．５、１．６、１．７若しくは１．８倍高い（サンプルの総脂質と比較して）。幾つかの実施形態では、ＰＥ Ｏ－脂質レベルは、エクソソームとフソソームとの間でほぼ等しい（又はそうであると識別される）、及び／又は親細胞においてフソソームよりも約１．５、１．６、１．７、１．８、１．９若しくは２倍高い（相対的）サンプル中の総脂質に）。幾つかの実施形態では、ＰＧ脂質レベルは、エクソソームとフソソームとの間でほぼ等しい（又はそうであると識別される）、及び／又はフソソームでは親細胞よりも約２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０倍高い（サンプル中の総脂質と比較して）。幾つかの実施形態では、ＰＩ脂質レベルは、エクソソームとフソソームとの間でほぼ等しい（又はそうであると識別される）、及び／又はフソソームでは親細胞よりも約３、４、５、６、又は７倍高い（サンプル中の総脂質と比較して）。幾つかの実施形態では、ＰＳ脂質レベルは、エクソソームとフソソームとの間でほぼ等しい、及び／又はフソソームでは親細胞よりも約２倍高い（サンプル中の総脂質と比較して）。幾つかの実施形態では、ＳＭ脂質レベルは、エクソソームとフソソームとの間でほぼ等しい（又はそうであると識別される）、及び／又はフソソームでは親細胞よりも約２、２．５、又は３倍高い（サンプル中の総脂質と比較して）。幾つかの実施形態では、ＴＡＧ脂質レベルは、エクソソームとフソソームとの間でほぼ等しい（又はそうであると識別される）、及び／又はフソソームでは親細胞よりも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００倍高い（サンプル中の総脂質と比較して）。
幾つかの実施形態では、フソソームは、エクソソームと比較して、以下の脂質の１つ以上（例えば、少なくとも２、３、４、５、又は全て）が濃縮されている（又は濃縮されていると識別される）：コレステリルエステル、セラミド、ジアシルグリセロール、リゾホスファチデート、及びホスファチジルエタノールアミン、及びトリアシルグリセロール。幾つかの実施形態では、フソソームは、エクソソームと比較して（サンプル中の総脂質と比較して）、以下の脂質の１つ以上（例えば、少なくとも２、３、４、５、又は全て）が枯渇している（又は枯渇していると識別される）：遊離コレステロール、ヘキソシルセラミド、リゾホスファチジルコリン、エーテル結合リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、エーテル結合リゾホスファチジルエタノールアミン、及びリゾホスファチジルセリン。幾つかの実施形態では、フソソームは、１つ以上の前述の濃縮された脂質について濃縮され又は、前述の枯渇脂質の１つ以上について枯渇している（又はそのように識別される）。幾つかの実施形態では、フソソームは、エクソソームにおける対応するレベルよりも、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、２倍、５倍、又は１０倍高い総脂肪の割合として濃縮された脂肪を含む（又は含むと識別される）。幾つかの実施形態では、フソソームは、エクソソームにおける対応するレベルの９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、又は１０％未満であるレベルの総脂肪の割合として枯渇された脂肪を含む（又は含むと識別される）。実施形態では、脂質濃縮は、質量分析アッセイ、例えば、実施例９６のアッセイによって測定される。
幾つかの実施形態では、セラミド脂質レベルは、フソソームではエクソソームよりも約２倍高く（又はそうであると識別される）、及び／又はフソソームでは親細胞よりも約２倍高い（サンプル中の総脂質と比較して）。幾つかの実施形態では、ＨｅｘＣｅｒ脂質レベルは、エクソソームではフソソームよりも約１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、又は２倍高い（又はそうであると識別される）、及び／又はフソソームと親細胞でほぼ等しい（サンプル中の総脂質と比較して）。幾つかの実施形態では、ＬＰＡ脂質レベルは、フソソームではエクソソームよりも約３倍若しくは４倍高く（又はそうであると識別される）、及び／又はフソソームでは親細胞よりも約１．３、１．４、１．５、１．６、１．７若しくは１．８倍高い（サンプル中の総脂質と比較して）。幾つかの実施形態では、ＬＰＣ脂質レベルは、エクソソームではフソソームよりも約２倍高く（又はそうであると識別される）、及び／又はフソソームでは親細胞よりも約１．５．１．６、１．７、１．８、１．９若しくは２倍高い（サンプル中の総脂質と比較して）。幾つかの実施形態では、ＬＰＣ Ｏ脂質レベルは、エクソソームではフソソームよりも約３倍若しくは４倍高い（又はそうであると識別される）、及び／又はフソソームと親細胞との間でほぼ等しい（サンプル中の総脂質と比較して）。幾つかの実施形態では、ＬＰＥ脂質レベルは、エクソソームではフソソームよりも約１．５、１．６、１．７、１．８、１．９若しくは２倍高く（又はそうであると識別される）、及び／又はフソソームでは親細胞よりも約１．５．１．６、１．７、１．８、１．９若しくは２倍高い（サンプル中の総脂質と比較して）。幾つかの実施形態では、ＬＰＥ Ｏ脂質レベルは、エクソソームではフソソームよりも約２倍若しくは３倍高い（又はそうであると識別される）、及び／又はフソソームと親細胞との間でほぼ等しい（サンプル中の総脂質と比較して）。幾つかの実施形態では、ＬＰＳ脂質レベルは、エクソソームではフソソームよりも（サンプル中の総脂質と比較して）約３倍高い（又はそうであると識別される）。幾つかの実施形態では、ＰＡ脂質レベルは、フソソームではエクソソームよりも約１．５、１．６、１．７、１．８、１．９若しくは２倍高く（又はそうであると識別される）、及び／又はフソソームでは親細胞よりも約２倍高い（サンプル中の総脂質と比較して）。幾つかの実施形態では、ＰＧ脂質レベルは、フソソソームとエクソソームとの間でほぼ等しい（又はそうであると識別される）、及び／又はフソソームでは親細胞よりも約１０、１１、１２、１３、１４若しくは１５倍高い（サンプル中の総脂質と比較して）。
幾つかの実施形態では、フソソームは、ソース細胞の脂質組成物と実質的に同様の脂質組成物を含むか、又はＣＬ、Ｃｅｒ、ＤＡＧ、ＨｅｘＣｅｒ、ＬＰＡ、ＬＰＣ、ＬＰＥ、ＬＰＧ、ＬＰＩ、ＬＰＳ、ＰＡ、ＰＣ、ＰＥ、ＰＧ、ＰＩ、ＰＳ、ＣＥ、ＳＭ及びＴＡＧの１つ以上が、ソース細胞内の対応する脂質レベルの１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、又は５０％以内である。実施形態では、フソソームの脂質組成は、それらが由来する細胞に類似している。実施形態では、フソソーム及び親細胞は、例えば、実施例８６に従って決定した場合、親細胞の任意の複製サンプルにおいて識別される脂質種の約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、又は９０％以上が、フソソームの任意の複製サンプルに存在する（又は存在すると識別される）場合、同様の脂質組成を有する（又は有すると識別される）。実施形態では、識別された脂質のうち、フソソームの平均レベルは、親細胞の対応する平均脂質種レベルの約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、又は４０％よりも大きい（サンプル中の総脂質と比較して）。一実施形態では、フソソームの脂質組成物は、親細胞と比較して特定の脂質について濃縮及び／又は枯渇している（サンプル中の総脂質と比較して）。
幾つかの実施形態では、フソソームの脂質組成は、例えば、実施例９６に記載の方法に従って決定する場合、親細胞と比較して特定の脂質が濃縮及び／又は枯渇している（又はそうであると識別される）。
幾つかの実施形態では、フソソームは、親細胞よりも大きい総脂質に対するホスファチジルセリンの比を有する（又は有すると同定される）。実施形態では、フソソームは、親細胞に対して約１１０％、１１５％、１２０％、１２１％、１２２％、１２３％、１２４％、１２５％、１３０％、１３５％、１４０％、又はそれ以上のホスファチジルセリンの総脂質に対する比を有する（又は有すると識別される）。幾つかの実施形態では、フソソームは、親細胞と比較して、コレステリルエステル、遊離コレステロール、エーテル結合リゾホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルセリン、ホスファチデート、エーテル結合ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、及び／又はスフィンゴミエリンが濃縮されている（又はそうであると識別される）。幾つかの実施形態では、フソソームは、親細胞と比較して、セラミド、カルジオリピン、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルグリセロール、リゾホスファチジルイノシトール、エーテル結合ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、及び／又はトリアシルグリセロールが枯渇している（又はそうであると識別される）。幾つかの実施形態では、フソソームは、エクソソームと比較して、コレステリルエステル、セラミド、ジアシルグリセロール、リゾホスファチデート、ホスファチジルエタノールアミン、及び／又はトリアシルグリセロールが濃縮されている（又はそうであると識別される）。幾つかの実施形態では、フソソームは、エクソソームと比較して、遊離コレステロール、ヘキソシルセラミド、リゾホスファチジルコリン、エーテル結合リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、エーテル結合リゾホスファチジルエタノールアミン、及び／又はリゾホスファチジルセリンが枯渇している（又はそうであると識別される）。
幾つかの実施形態では、フソソームは、ソース細胞内のカルジオリピン：セラミドの比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のカルジオリピン：セラミドの比を有する；又は、ソース細胞内のカルジオリピン：ジアシルグリセロールの比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のカルジオリピン：ジアシルグリセロールの比を有する；又は、ソース細胞内のカルジオリピン：ヘキソシルセラミドの比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のカルジオリピン：ヘキソシルセラミドの比を有する；又は、ソース細胞内のカルジオリピン：リゾホスファチジン酸の比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のカルジオリピン：リゾホスファチジン酸の比を有する；又は、ソース細胞内のカルジオリピン：リゾホスファチジルコリンの比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のカルジオリピン：リゾホスファチジルコリンの比を有する；又は、ソース細胞内のカルジオリピン：リゾホスファチジルエタノールアミンの比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のカルジオリピン：リゾホスファチジルエタノールアミンの比を有する；又は、ソース細胞内のカルジオリピン：リゾホスファチジルグリセロールの比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のカルジオリピン：リゾホスファチジルグリセロールの比を有する；又は、ソース細胞内のカルジオリピン：リゾホスファチジルイノシトールの比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のカルジオリピン：リゾホスファチジルイノシトールの比を有する；又は、ソース細胞内のカルジオリピン：リゾホスファチジルセリンの比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のカルジオリピン：リゾホスファチジルセリンの比を有する；又は、ソース細胞内のカルジオリピン：ホスファチジン酸の比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のカルジオリピン：ホスファチジン酸の比を有する；又は、ソース細胞内のカルジオリピン：ホスファチジルコリンの比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のカルジオリピン：ホスファチジルコリンの比を有する；又は、ソース細胞内のカルジオリピン：ホスファチジルエタノールアミンの比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のカルジオリピン：ホスファチジルエタノールアミンの比を有する；又は、ソース細胞内のカルジオリピン：ホスファチジルグリセロールの比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のカルジオリピン：ホスファチジルグリセロールの比を有する；又は、ソース細胞内のカルジオリピン：ホスファチジルイノシトールの比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のカルジオリピン：ホスファチジルイノシトールの比を有する；又は、ソース細胞内のカルジオリピン：ホスファチジルセリンの比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のカルジオリピン：ホスファチジルセリンの比を有する；又は、ソース細胞内のカルジオリピン：コレステロールエステルの比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のカルジオリピン：コレステロールエステルの比を有する；又は、ソース細胞内のカルジオリピン：スフィンゴミエリンの比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のカルジオリピン：スフィンゴミエリンの比を有する；又は、ソース細胞内のカルジオリピン：トリアシルグリセロールの比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のカルジオリピン：トリアシルグリセロールの比を有する；又は、ソース細胞内のホスファチジルコリン：セラミドの比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のホスファチジルコリン：セラミドの比を有する；又は、ソース細胞内のホスファチジルコリン：ジアシルグリセロールの比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のホスファチジルコリン：ジアシルグリセロールの比を有する；又は、ソース細胞内のホスファチジルコリン：ヘキソシルセラミドの比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のホスファチジルコリン：ヘキソシルセラミドの比を有する；又は、ソース細胞内のホスファチジルコリン：リゾホスファチジン酸塩の比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のホスファチジルコリン：リゾホスファチジン酸塩の比を有する；又は、ソース細胞内のホスファチジルコリン：リゾホスファチジルコリンの比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のホスファチジルコリン：リゾホスファチジルコリンの比を有する；又は、ソース細胞内のホスファチジルコリン：リゾホスファチジルエタノールアミンの比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のホスファチジルコリン：リゾホスファチジルエタノールアミンの比を有する；又は、ソース細胞内のホスファチジルコリン：リゾホスファチジルグリセロールの比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のホスファチジルコリン：リゾホスファチジルグリセロールの比を有する；又は、ソース細胞内のホスファチジルコリン：リゾホスファチジルイノシトールの比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のホスファチジルコリン：リゾホスファチジルイノシトールの比を有する；又は、ソース細胞内のホスファチジルコリン：リゾホスファチジルセリンの比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のホスファチジルコリン：リゾホスファチジルセリンの比を有する；又は、ソース細胞内のカルジオリピン：ホスファチジル酸の比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のホスファチジルコリン：ホスファチジル酸の比を有する；又は、ソース細胞内のホスファチジルコリン：ホスファチジルエタノールアミンの比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のホスファチジルコリン：ホスファチジルエタノールアミンの比を有する；又は、ソース細胞内のホスファチジルコリン：ホスファチジルグリセロールの比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のカルジオリピン：ホスファチジルグリセロールの比を有する；又は、ソース細胞内のホスファチジルコリン：ホスファチジルイノシトールの比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のホスファチジルコリン：ホスファチジルイノシトールの比を有する；又は、ソース細胞内のホスファチジルコリン：ホスファチジルセリンの比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のホスファチジルコリン：ホスファチジルセリンの比を有する；又は、ソース細胞内のホスファチジルコリン：コレステロールエステルの比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のホスファチジルコリン：コレステロールエステルの比を有する；又は、ソース細胞内のホスファチジルコリン：スフィンゴミエリンの比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のホスファチジルコリン：スフィンゴミエリンの比を有する；又は、ソース細胞内のホスファチジルコリン：トリアシルグリセロールの比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のホスファチジルコリン：トリアシルグリセロールの比を有する；又は、ソース細胞内のホスファチジルエタノールアミン：セラミドの比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のホスファチジルエタノールアミン：セラミドの比を有する；又は、ソース細胞内のホスファチジルエタノールアミン：ジアシルグリセロールの比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のホスファチジルエタノールアミン：ジアシルグリセロールの比を有する；又は、ソース細胞内のホスファチジルエタノールアミン：ヘキソシルセラミドの比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のホスファチジルエタノールアミン：ヘキソシルセラミドの比を有する；又は、ソース細胞内のホスファチジルエタノールアミン：リゾホスファチジン酸塩の比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のホスファチジルエタノールアミン：リゾホスファチジン酸塩の比を有する；又は、ソース細胞内のホスファチジルエタノールアミン：リゾホスファチジルコリンの比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のホスファチジルエタノールアミン：リゾホスファチジルコリンの比を有する；又は、ソース細胞内のホスファチジルエタノールアミン：リゾホスファチジルエタノールアミンの比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のホスファチジルエタノールアミン：リゾホスファチジルエタノールアミンの比を有する；又は、ソース細胞内のホスファチジルエタノールアミン：リゾホスファチジルグリセロールの比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のホスファチジルエタノールアミン：リゾホスファチジルグリセロールの比を有する；又は、ソース細胞内のホスファチジルエタノールアミン：リゾホスファチジルイノシトールの比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のホスファチジルエタノールアミン：リゾホスファチジルイノシトールの比を有する；又は、ソース細胞内のホスファチジルエタノールアミン：リゾホスファチジルセリンの比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のホスファチジルエタノールアミン：リゾホスファチジルセリンの比を有する；又は、ソース細胞内のホスファチジルエタノールアミン：ホスファチジルの比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のホスファチジルエタノールアミン：ホスファチジルの比を有する；又は、ソース細胞内のホスファチジルエタノールアミン：ホスファチジルグリセロールの比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のホスファチジルエタノールアミン：ホスファチジルグリセロールの比を有する；ソース細胞内のホスファチジルエタノールアミン：ホスファチジルイノシトールの比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のホスファチジルエタノールアミン：ホスファチジルイノシトールの比を有する；又は、ソース細胞内のホスファチジルエタノールアミン：ホスファチジルセリンの比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のホスファチジルエタノールアミン：ホスファチジルセリンの比を有する；又は、ソース細胞内のホスファチジルエタノールアミン：コレステロールエステルの比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のホスファチジルエタノールアミン：コレステロールエステルの比を有する；又はソース細胞内のホスファチジルエタノールアミン：スフィンゴミエリンの比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内の、ホスファチジルエタノールアミン：スフィンゴミエリンの比を有する；又は、ソース細胞内のホスファチジルエタノールアミン：トリアシルグリセロールの比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のホスファチジルエタノールアミン：トリアシルグリセロールの比を有する；又は、ソース細胞内のホスファチジルセリン：セラミドの比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のホスファチジルセリン：セラミドの比を有する；又は、ソース細胞内のホスファチジルセリン：ジアシルグリセロールの比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のホスファチジルセリン：ジアシルグリセロールの比を有する；又は、ソース細胞内のホスファチジルセリン：ヘキソシルセラミドの比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のホスファチジルセリン：ヘキソシルセラミドの比を有する；又は、ソース細胞内のホスファチジルセリン：リゾホスファチジン酸塩の比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のホスファチジルセリン：リゾホスファチジン酸塩の比を有する；又は、ソース細胞内のホスファチジルセリン：リゾホスファチジルコリンの比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のホスファチジルセリン：リゾホスファチジルコリンの比を有する；又は、ソース細胞内のホスファチジルセリン：リゾホスファチジルエタノールアミンの比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０
％以内のホスファチジルセリン：リゾホスファチジルエタノールアミンの比を有する；又は、ソース細胞内のホスファチジルセリン：リゾホスファチジルグリセロールの比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のホスファチジルセリン：リゾホスファチジルグリセロールの比を有する；又はソース細胞内のホスファチジルセリン：リゾホスファチジルイノシトールの比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内の、ホスファチジルセリン：リゾホスファチジルイノシトールの比を有する；又は、ソース細胞内のホスファチジルセリン：リゾホスファチジルセリンの比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のホスファチジルセリン：リゾホスファチジルセリンの比を有する；又は、ソース細胞内のホスファチジルセリン：ホスファチジルセリンの比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のホスファチジルセリン：ホスファチジルセリンの比を有する；又は、ソース細胞内のホスファチジルセリン：ホスファチジルグリセロールの比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のホスファチジルセリン：ホスファチジルグリセロールの比を有する；又は、ソース細胞内のホスファチジルセリン：ホスファチジルイノシトールの比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のホスファチジルセリン：ホスファチジルイノシトールの比を有する；又は、ソース細胞内のホスファチジルセリン：コレステロールエステルの比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のホスファチジルセリン：コレステロールエステルの比を有する；又は、ソース細胞内のホスファチジルセリン：スフィンゴミエリンの比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のホスファチジルセリン：スフィンゴミエリンの比を有する；又は、ソース細胞内のホスファチジルセリン：トリアシルグリセロールの比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のホスファチジルセリン：トリアシルグリセロールの比を有する；又は、ソース細胞内のスフィンゴミエリン：セラミドの比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のスフィンゴミエリン：セラミドの比を有する；又は、ソース細胞内のスフィンゴミエリン：ジアシルグリセロールの比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のスフィンゴミエリン：ジアシルグリセロールの比を有する；又は、ソース細胞内のスフィンゴミエリン：ヘキソシルセラミドの比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のスフィンゴミエリン：ヘキソシルセラミドの比を有する；又は、ソース細胞内のスフィンゴミエリン：リゾホスファチジン酸塩の比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のスフィンゴミエリン：リゾホスファチジン酸塩の比を有する；又は、ソース細胞内のスフィンゴミエリン：リゾホスファチジルコリンの比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のスフィンゴミエリン：リゾホスファチジルコリンの比を有する；又は、ソース細胞内のスフィンゴミエリン：リゾホスファチジルエタノールアミンの比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のスフィンゴミエリン：リゾホスファチジルエタノールアミンの比を有する；又は、ソース細胞内のスフィンゴミエリン：リゾホスファチジルグリセロールの比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のスフィンゴミエリン：リゾホスファチジルグリセロールの比を有する；又は、ソース細胞内のスフィンゴミエリン：リゾホスファチジルイノシトールの比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のスフィンゴミエリン：リゾホスファチジルイノシトールの比を有する；又は、ソース細胞内のスフィンゴミエリン：リゾホスファチジルセリンの比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のスフィンゴミエリン：リゾホスファチジルセリンの比を有する；又は、ソース細胞内のスフィンゴミエリン：ホスファチジン酸塩の比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のスフィンゴミエリン：ホスファチジン酸塩の比を有する；又は、ソース細胞内のスフィンゴミエリン：ホスファチジルグリセロールの比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のスフィンゴミエリン：ホスファチジルグリセロールの比を有する；又は、ソース細胞内のスフィンゴミエリン：ホスファチジルイノシトールの比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のスフィンゴミエリン：ホスファチジルイノシトールの比を有する；又は、ソース細胞内のスフィンゴミエリン：コレステロールエステルの比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のスフィンゴミエリン：コレステロールエステルの比を有する；又は、ソース細胞内のスフィンゴミエリン：トリアシルグリセロールの比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のスフィンゴミエリン：トリアシルグリセロールの比を有する；又は、ソース細胞内のコレステロールエステル：セラミドの比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のコレステロールエステル：セラミドの比を有する；又は、ソース細胞内のコレステロールエステル：ジアシルグリセロールの比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のコレステロールエステル：ジアシルグリセロールの比を有する；又は、ソース細胞内のコレステロールエステル：ヘキソシルセラミドの比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のコレステロールエステル：ヘキソシルセラミドの比を有する；又は、ソース細胞内のコレステロールエステル：リゾホスファチジン酸塩の比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のコレステロールエステル：リゾホスファチジン酸塩の比を有する；又は、ソース細胞内のコレステロールエステル：リゾホスファチジルコリンの比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のコレステロールエステル：リゾホスファチジルコリンの比を有する；又は、ソース細胞内のコレステロールエステル：リゾホスファチジルエタノールアミンの比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のコレステロールエステル：リゾホスファチジルエタノールアミンの比を有する；又は、ソース細胞内のコレステロールエステル：リゾホスファチジルグリセロールの比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のコレステロールエステル：リゾホスファチジルグリセロールの比を有する；又は、ソース細胞内のコレステロールエステル：リゾホスファチジルイノシトールの比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のコレステロールエステル：リゾホスファチジルイノシトールの比を有する；又は、ソース細胞内のコレステロールエステル：リゾホスファチジルセリンの比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のコレステロールエステル：リゾホスファチジルセリンの比を有する；又は、ソース細胞内のコレステロールエステル：ホスファチジン酸塩の比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のコレステロールエステル：ホスファチジン酸塩の比を有する；又は、ソース細胞内のコレステロールエステル：ホスファチジルグリセロールの比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のコレステロールエステル：ホスファチジルグリセロールの比を有する；又は、ソース細胞内のコレステロールエステル：ホスファチジルイノシトールの比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のコレステロールエステル：ホスファチジルイノシトールの比を有する；又は、ソース細胞内のコレステロールエステル：トリアシルグリセロールの比の１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以内のコレステロールエステル：トリアシルグリセロールの比を有する。
幾つかの実施形態では、フソソームは、例えば、実施例８７のアッセイを使用して、ソース細胞のものと同様のプロテオミクス組成物を含む。幾つかの実施形態では、フソソームのタンパク質組成は、それらが由来する親細胞に類似している。幾つかの実施形態では、タンパク質の複数のカテゴリーのそれぞれの分画含有量は、例えば、実施例８７に記載されるように、各カテゴリーからの強度シグナルの合計をサンプル中の全ての同定されたタンパク質の強度シグナルの合計で割ったものとして決定される。幾つかの実施形態では、フソソームは、例えば、実施例９７に記載される方法に従って決定した場合、親細胞及び／又はエクソソームと比較したコンパートメント特異的タンパク質の量の変化を含む（又は含むと識別される）。幾つかの実施形態では、フソソームは、親細胞及びエクソソームと比較して、小胞体タンパク質が枯渇している（又は枯渇していると識別される）。幾つかの実施形態では、フソソームは、エクソソームと比較して、エクソソームタンパク質が枯渇している（又は枯渇していると識別される）。幾つかの実施形態では、フソソームは、エクソソームタンパク質であるとして、フソソーム中のタンパク質の１５％、２０％、又は２５％未満のタンパク質をフソソーム中に有する。幾つかの実施形態では、フソソームは、親細胞と比較して、ミトコンドリアタンパク質が枯渇している（又は枯渇していると識別される）。幾つかの実施形態では、フソソームは、親細胞と比較して、核タンパク質が濃縮されている（又は濃縮していると識別される）。幾つかの実施形態では、フソソームは、親細胞及びエクソソームと比較して、リボソームタンパク質が濃縮されている（又は濃縮していると識別される）。幾つかの実施形態では、フソソームにおいて少なくとも０．０２５％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％又は１０％のタンパク質がリボソームタンパク質である、又はフソソームにおいて約０．０２５～０．２％、０．０５～０．１５％、０．０６～１．４％、０．０７％～１．３％、０．０８％～１．２％、０．０９％～１．１％、１％～２０％、３％～１５％、５％～１２．５％、７．５％～１１％、又は８．５％～１０．５％、又は９％～１０％がリボソームタンパク質である。
幾つかの実施形態では、フソソームは、例えば、実施例４０のアッセイを使用して測定した場合、ソース細胞における対応する比率の１０％、２０％、３０％、４０％、又は５０％以内であるタンパク質に対する脂質の比率を含む；実施形態では、フソソームは、有核細胞の脂質質量対タンパク質比にほぼ等しい脂質質量対タンパク質の比を含む（又は含むと識別される）。実施形態では、フソソームは、親細胞よりも大きい脂質：タンパク質比を含む（又は含むと識別される）。実施形態では、フソソームは、親細胞の脂質：タンパク質比の約１１０％、１１５％、１２０％、１２５％、１３０％、１３１％、１３２％、１３２．５％、１３３％、１３４％、１３５％、１４０％、１４５％、又は１５０％の脂質：タンパク質比を含む（又は含むと識別される）。幾つかの実施形態では、フソソーム又はフソソーム組成物は、例えば、実施例８３のアッセイにおいて、約１００～１８０、１１０～１７０、１２０～１６０、１３０～１５０、１３５～１４５、１４０～１４２、又は１４１μｍｏｌ／ｇのリン脂質：タンパク質比を有する（又は有すると同定される）。幾つかの実施形態では、フソソーム又はフソソーム組成物は、例えば、実施例８３のアッセイにおいて、ソース細胞における対応する比の約６０～９０％、７０～８０％、又は７５％であるリン脂質：タンパク質比を有する（又は有すると同定される）。
幾つかの実施形態では、フソソームは、例えば、実施例４１のアッセイを使用して測定した場合、ソース細胞における対応する比の１０％、２０％、３０％、４０％、又は５０％以内である核酸（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）に対するタンパク質の比を含む。実施形態では、フソソームは、親細胞のものと同様のタンパク質質量対ＤＮＡ質量の比を含む（又は含むと識別される）。実施形態では、フソソームは、親細胞の約８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９８．２％、９９％、１００％、１０１％、１０２％、１０３％、１０４％、１０５％、又は１１０％であるタンパク質：ＤＮＡの比を含む（又は含むと識別される）。幾つかの実施形態では、フソソームは、例えば、実施例４１のアッセイを使用して測定した場合、例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％超のソース細胞における対応する比よりも大きいタンパク質対ＤＮＡの比を含む。幾つかの実施形態では、フソソーム又はフソソーム組成物は、例えば、実施例８４のアッセイにより、約２０～３５、２５～３０、２６～２９、２７～２８、又は２７．８ｇ／ｇであるタンパク質：ＤＮＡの比を含む（又は含むと識別される）。幾つかの実施形態では、フソソーム又はフソソーム組成物は、例えば、実施例８４のアッセイにより、ソース細胞における対応する比の約１％、２％、５％、１０％、又は２０％以内であるタンパク質：ＤＮＡの比を含む（又は含むと識別される）。
幾つかの実施形態では、フソソームは、例えば、実施例９１のアッセイを使用して測定した場合、ソース細胞における対応する比の１０％、２０％、３０％、４０％、又は５０％以内である核酸（例えば、ＤＮＡ）に対する脂質の比を含む。幾つかの実施形態では、フソソーム又はフソソーム組成物は、例えば、実施例８５のアッセイにより、約２．０～６．０、３．０～５．０、３．５～４．５、３．８～４．０、又は３．９２μｍｏｌ／ｍｇである脂質：ＤＮＡの比を含む（又は含むと識別される）。幾つかの実施形態では、フソソームは、例えば、実施例９１のアッセイを使用して測定した場合、例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％超のソース細胞における対応する比よりも大きい核酸（例えば、ＤＮＡ）に対する脂質の比を含む。実施形態では、フソソームは、親細胞よりも大きい脂質：ＤＮＡ比を含む（又は含むと識別される）。実施形態では、フソソームは、親細胞と比較して、約１０５％、１１０％、１１５％、１２０％、１２５％、１３０％、１３５％、１４０％、１４５％、１５０％、又はそれよりも大きい脂質：ＤＮＡ比を含む。
幾つかの実施形態では、フソソーム組成物は、被験体、例えばマウスにおいて、例えば、実施例６０のアッセイにより、参照細胞組成物、例えば、ソース細胞の半減期の１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％以内の半減期を有する。幾つかの実施形態では、フソソーム組成物は、例えば、実施例６０のアッセイによれば例えば、ヒト被験体又はマウスにおいて、例えば、マウスにおいて、少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、１２時間、又は２４時間の被験体における半減期を有する。実施形態では、フソソーム組成物は、被験体において、例えば、実施例７９のアッセイにおいて、少なくとも１、２、４、６、１２、又は２４時間の半減期を有する。幾つかの実施形態では、治療剤は、フソソーム組成物の半減期よりも長い、例えば、少なくとも１０％、２０％、５０％、２倍、５倍、又は１０倍の被験体における半減期を有する。例えば、フソソームは、治療剤を標的細胞に送達することができ、治療剤は、フソソームがもはや存在しないか、又は検出可能でなくなった後に存在することができる。
幾つかの実施形態では、フソソームは、例えば、実施例５０のアッセイを使用して測定した場合、グルコースの不在下で、陰性対照、例えば、他の点では同様のフソソームよりも、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％多くグルコース（例えば、標識グルコース、例えば、２－ＮＢＤＧ）を、膜を横切って、輸送する。幾つかの実施形態では、フソソームは、例えば、実施例７２のアッセイにおいて、フロレチンで処理された他は同様のフソソームよりも高いレベルで、膜を横切ってグルコース（例えば、標識グルコース、例えば、２－ＮＢＤＧ）を輸送する（又は輸送するものとして識別される）。実施形態では、フロレチンで処理されていないフソソームは、例えば、実施例７２のアッセイにおいて、フロレチンで処理された他は同様のフソソームよりも、グルコースを少なくとも１％、２％、３％、５％、又は１０％高い（及び、任意に、最大１５％高い）レベルで輸送する（又は輸送しないと識別される）。幾つかの実施形態では、フソソームは、例えば、実施例５１のアッセイを使用して、参照細胞、例えば、ソース細胞又はマウス胚線維芽細胞におけるエステラーゼ活性の１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％以内の内腔におけるエステラーゼ活性を含む；幾つかの実施形態では、フソソームは、例えば、実施例７３のアッセイによれば、未染色の対照よりも少なくとも１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、２０００倍、又は５０００倍である内腔内のエステラーゼ活性を含む（又は含むと識別される）。幾つかの実施形態では、フソソームは、例えば、実施例７３のアッセイによれば、ソース細胞よりも約１０～１００倍低い内腔内のエステラーゼ活性を含む（又は含むと同定される）。幾つかの実施形態では、フソソームは、例えば、実施例７４のアッセイによれば、１Ｅ５～１Ｅ６、６Ｅ５～８Ｅ５、６．５Ｅ５～７Ｅ５、又は６．８３Ｅ５のエクソソーム等価物のアセチルコリンエステラーゼ活性を含む（又は、含むと識別される）。幾つかの実施形態では、フソソームは、例えば、実施例５３に記載されるように、参照細胞、例えばソース細胞における代謝活性レベルの１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％以内の代謝活性（例えば、クエン酸合成酵素活性）レベルを含む；幾つかの実施形態では、フソソームは、例えば、実施例５３に記載されるように、参照細胞、例えばソース細胞における代謝活性レベルの少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％の代謝活性（例えば、クエン酸合成酵素活性）レベルを含む；幾つかの実施形態では、フソソームは、例えば、実施例７５のアッセイによれば、約１Ｅ－２～２Ｅ－２、１．３Ｅ－２～１．８Ｅ－２、１．４Ｅ－２～１．７Ｅ－２、１．５Ｅ－２～１．６Ｅ－２、又は１．５７Ｅ－２ｕｍｏｌ／ｕｇフソソーム／分であるクエン酸合成酵素活性を含む（又は含むと識別される）。幾つかの実施形態では、フソソームは、例えば、実施例５４に記載されるように、参照細胞、例えばソース細胞における呼吸レベルの１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％以内の呼吸レベル（例えば、酸素消費率）、例えば、基礎呼吸レベル、結合呼吸レベル又は最大呼吸レベルを含む。幾つかの実施形態では、フソソームは、例えば、実施例５４に記載されるように、参照細胞、例えばソース細胞における呼吸レベルの少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％の呼吸レベル（例えば、酸素消費率）、例えば、基礎呼吸レベル、非結合呼吸レベル又は最大呼吸レベルを含む。実施形態では、フソソームは、例えば、実施例７６のアッセイによれば、約８～１５、９～１４、１０～１３、１１～１２、又は１１．３ｐｍｏｌ／分／２０μｇのフソソームの基礎呼吸数を含む（又は含むと識別される）。実施形態では、フソソームは、例えば、実施例７６のアッセイによれば、約８～１３、９～１２、１０～１１、１０～１０．２、又は１０．１ｐｍｏｌ／分／２０μｇのフソソームの非結合呼吸数を含む（又は含むと識別される）。実施形態では、フソソームは、例えば、実施例７６のアッセイによれば、約１５～２５、１６～２４、１７～２３、１８～２２、１９～２１、又は２０ｐｍｏｌ／分／２０μｇのフソソームの最大呼吸数を含む（又は含むと識別される）。実施形態では、フソソームは、例えば、実施例７６のアッセイによれば、非結合呼吸数よりも、例えば、約１％、２％、５％、又は１０％、例えば、最大約１５％より高い基礎呼吸数を有する（又は有すると識別される）。実施形態では、フソソームは、例えば、実施例７６のアッセイによれば、基礎呼吸数よりも、例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％高い最大呼吸数を有する（又は有すると識別される）。幾つかの実施形態では、フソソームは、例えば、実施例５５のアッセイを使用して、最大で１８，０００、１７，０００、１６，０００、１５，０００、１４，０００、１３，０００、１２，０００、１１，０００、若しくは１０，０００ＭＦＩのアネキシンＶ染色レベルを含むか、又はフソソームは、実施例５５のアッセイにおいてメナジオンで処理された他の点では同様のフソソームのアネキシンＶ染色レベルよりも少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、若しくは９０％低いアネキシンＶ染色レベルを含むか、又はフソソームは、実施例５５のアッセイにおいてメナジオンで処理されたマクロファージのアネキシンＶ染色レベルよりも少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、若しくは９０％低いアネキシンＶ染色レベルを含む。実施形態では、フソソームは、例えば、実施例７７のアッセイによれば、アンチマイシンＡで処理された他は同様のフソソームのアネキシンＶ染色レベルよりも少なくとも約１％、２％、５％、又は１０％低いアネキシンＶ染色レベルを含む（又は含むと識別される）。実施形態では、フソソームは、例えば、実施例７７のアッセイによれば、アンチマイシンＡで処理された他は同様のフソソームのアネキシンＶ染色レベルの約１％、２％、５％、又は１０％のアネキシンＶ染色レベルを含む（又は含むと識別される）。
幾つかの実施形態では、フソソームは、例えば、実施例３３のアッセイにより、ソース細胞のものよりも少なくとも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれ以上のｍｉＲＮＡ含有量レベルを有する。幾つかの実施形態では、フソソームは、例えば、実施例３３のアッセイによれば、ソース細胞のｍｉＲＮＡ含有レベルの少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれ以上（例えば、ソース細胞のｍｉＲＮＡ含有量レベルの最大１００％）のｍｉＲＮＡ含有レベルを有する。幾つかの実施形態では、フソソームは、例えば、実施例６６のアッセイによれば、ソース細胞の全ＲＮＡ含有レベルの少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれ以上（例えば、ソース細胞の全ＲＮＡ含有量レベルの最大１００％）の全ＲＮＡ含有レベルを有する。
幾つかの実施形態では、フソソームは可溶性：不溶性タンパク質比は、例えば、実施例３８のアッセイによれば、ソース細胞のものの１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以内若しくはそれよりも大きいか、又は、例えば、ソース細胞のものの１％～２％、２％～３％、３％～４％、４％～５％、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、若しくは８０％～９０％以内若しくはそれよりも大きい。実施形態では、フソソームは、例えば、実施例３８のアッセイによれば、約０．３～０．８、０．４～０．７、又は０．５～０．６、例えば、約０．５６３の可溶性：不溶性タンパク質比を有する。幾つかの実施形態では、フソソームの集団は、約０．３～０．８、０．４～０．７、０．５～０．６、又は０．５６３、又は約０．１、０．２、０．３、０．４、又は０．５を超える可溶性：不溶性タンパク質の質量比を有する（又は有すると同定される）。幾つかの実施形態では、フソソームの集団は、ソース細胞よりも、例えば、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、又は２０倍高い可溶性：不溶性タンパク質質量比を有する（又は有すると同定される）。実施形態では、可溶性：不溶性タンパク質の質量比は、実施例７０のアッセイによって決定される。実施形態では、可溶性：不溶性タンパク質の質量比は、親細胞よりもフソソーム集団においてより低い（又はそうであると識別される）。実施形態では、親細胞に対するフソソームの比率が約３％、４％、５％、６％、７％、又は８％である（又はそうであると識別される）場合、フソソームの集団の可溶性：不溶性の比率は、親細胞の可溶性：不溶性の比率にほぼ等しい（又はそうであると識別される）。
幾つかの実施形態では、フソソームは、例えば、実施例３９のアッセイにおいて、例えば質量分析により測定した場合、ソース細胞のＬＰＳ含有量の５％未満、１％、０．５％、０．０１％、０．００５％、０．０００１％、０．００００１％以下のＬＰＳレベルを有する。幾つかの実施形態では、フソソームは、例えば、実施例４９のアッセイを使用してインスリンの不在下で陰性対照、例えば他の点では同様のフソソームよりも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％多い、シグナル伝達、例えば、インスリンに応答した細胞外シグナルの送達、例えば、ＡＫＴリン酸化、又はインスリンに応答したグルコース（例えば、標識グルコース、例えば、２－ＮＢＤＧ）取り込みが可能である；幾つかの実施形態では、フソソームは、組織、例えば、肝臓、肺、心臓、脾臓、膵臓、胃腸管、腎臓、精巣、卵巣、脳、生殖器官、中枢神経系、末梢神経系、骨格筋、内皮、内耳、又は眼等を標的とし、被験体、例えばマウスに投与された場合、例えば、実施例６４のアッセイによって２４、４８又は７２時間後、例えば、投与されたフソソームの集団の少なくとも０．１％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％のフソソームが標的組織に存在する。幾つかの実施形態では、フソソームは、例えば、実施例５６のアッセイにより、参照細胞、例えばソース細胞又は骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）によって誘導されるジャクスタクリンシグナル伝達よりも、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％大きいジャクスタクリンシグナル伝達レベルを有する。幾つかの実施形態では、フソソームは、例えば、実施例５６のアッセイにより、参照細胞、例えばソース細胞又は骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）によって誘導されるジャクスタクリンシグナル伝達よりも、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％（例えば、最大１００％）のジャクスタクリンシグナル伝達レベルを有する。幾つかの実施形態では、フソソームは、例えば、実施例５７のアッセイにより、参照細胞、例えばソース細胞又はマクロファージによって誘導されるパラクリンシグナル伝達のレベルよりも、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％大きいパラクリンシグナル伝達レベルを有する。幾つかの実施形態では、フソソームは、例えば、実施例５７のアッセイにより、参照細胞、例えばソース細胞又はマクロファージによって誘導されるパラクリンシグナル伝達のレベルの、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％（例えば、最大１００％）のパラクリンシグナル伝達レベルを有する。幾つかの実施形態では、フソソームは、例えば、実施例５８のアッセイにより、参照細胞、例えばソース細胞又はＣ２Ｃ１２細胞において重合されるアクチンレベルと比較して、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％以内のレベルでアクチンを重合する。幾つかの実施形態では、フソソームは、例えば、実施例８１のアッセイによれば、例えば、少なくとも３、５、又は２４時間にわたって、経時的に一定であるレベルでアクチンを重合する（又は、アクチンを重合していると識別される）。実施形態では、アクチン重合のレベルは、例えば実施例８１のアッセイによれば、５時間にわたって１％、２％、５％、１０％、又は２０％未満変化する。幾つかの実施形態では、フソソームは、例えば、実施例５９のアッセイによって、参照細胞、例えば、ソース細胞又はＣ２Ｃ１２細胞の膜電位の約１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％以内の膜電位を有するか、又はフソソームは、約－２０～－１５０ｍＶ、－２０～－５０ｍＶ、－５０～－１００ｍＶ若しくは－１００～－１５０ｍＶの膜電位を有するか、又はフソソームは－１ｍｖ、－５ｍｖ、－１０ｍｖ、－２０ｍｖ、－３０ｍｖ、－４０ｍｖ、－５０ｍｖ、－６０ｍｖ、－７０ｍｖ、－８０ｍｖ、－９０ｍｖ、－１００ｍｖ未満の膜電位を有する。幾つかの実施形態では、フソソームは、例えば、実施例７８のアッセイでは、約－２５～－～３５、－２７～－３２、－２８～－３１、－２９～－３０、又は－２９．６ミリボルトの膜電位を有する（又は有すると識別される）。幾つかの実施形態では、フソソームは、例えば、実施例４４のアッセイを使用して、ソース細胞の割合の、例えば、少なくとも１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％の割合で、血管からの血管外漏出が可能であり、ソース細胞は、好中球、リンパ球、Ｂ細胞、マクロファージ、又はＮＫ細胞である；幾つかの実施形態では、フソソームは、例えば、実施例４５のアッセイを使用して、参照細胞と比較して、例えば、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％（例えば、最大１００％）の走化性が可能である。幾つかの実施形態では、フソソームは、例えば、実施例４７のアッセイを使用して、参照細胞と比較して、例えば、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％（例えば、最大１００％）の食作用が可能である。幾つかの実施形態では、フソソームは、細胞膜、例えば、内皮細胞膜又は血液脳関門を通過することができる。幾つかの実施形態では、フソソームは、例えば、実施例４８のアッセイを使用して、参照細胞、例えば、マウス胚性線維芽細胞よりも、例えば、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％より大きい割合でタンパク質を分泌することができる。幾つかの実施形態では、フソソームは、例えば、実施例４８のアッセイを使用して、参照細胞、例えば、マウス胚性線維芽細胞よりも、例えば、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％（例えば、最大１００％）の割合でタンパク質を分泌することができる。
幾つかの実施形態では、フソソームは転写能力がないか、例えば、実施例２４のアッセイを使用して、参照細胞、例えばソース細胞の転写活性の１％、２．５％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％未満の転写活性を有する。幾つかの実施形態では、フソソームは核ＤＮＡ複製ができないか、例えば、実施例２５のアッセイを使用して、参照細胞、例えばソース細胞の核ＤＮＡ複製の１％、２．５％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％未満の核ＤＮＡ複製を有する；幾つかの実施形態では、フソソームはクロマチンを欠いているか、例えば、実施例３２のアッセイを使用して、参照細胞、例えばソース細胞のクロマチン含有量の１％、２．５％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％未満のクロマチン含有量を有する。
幾つかの実施形態では、フソソームの特徴は、参照細胞と比較することによって説明される。実施形態では、参照細胞はソース細胞である。実施形態では、参照細胞は、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３、ＨＦＦ－１、ＭＲＣ－５、ＷＩ－３８、ＩＭＲ９０、ＩＭＲ９１、ＰＥＲ．Ｃ６、ＨＴ－１０８０、又はＢＪ細胞である。幾つかの実施形態では、フソソームの集団の特徴は、参照細胞の集団、例えば、ソース細胞の集団、又はＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３、ＨＦＦ－１、ＭＲＣ－５、ＷＩ－３８、ＩＭＲ９０、ＩＭＲ９１、ＰＥＲ．Ｃ６、ＨＴ－１０８０若しくはＢＪ細胞の集団と比較することによって説明される。
幾つかの実施形態では、フソソームは、医薬品又は適正製造基準（ＧＭＰ）基準を満たしている。幾つかの実施形態では、フソソームは適正製造基準（ＧＭＰ）に従って製造された。幾つかの実施形態では、フソソームは、所定の基準値を下回る病原体レベルを有し、例えば、病原体を実質的に含まない。幾つかの実施形態では、フソソームは、所定の基準値を下回る汚染物質レベルを有し、例えば、汚染物質を実質的に含まない。幾つかの実施形態では、フソソームは、例えば、本明細書に記載されるように、免疫原性が低い。
幾つかの実施形態では、フソソーム組成物の免疫原性は、血清不活化アッセイ（例えば、抗体媒介中和又は補体媒介分解を検出するアッセイ）によってアッセイされる。幾つかの実施形態では、フソソームは、血清によって不活化されないか、又は所定の値より低いレベルで不活化される。幾つかの実施形態では、フソソームナイーブ被験体（例えば、ヒト又はマウス）の血清を、試験フソソーム組成物と接触させる。幾つかの実施形態では、１回以上のフソソームの投与を受けた、例えば、少なくとも２回のフソソームの投与を受けた被験体の血清を、試験フソソーム組成物と接触させる。次に、実施形態では、血清に曝露されたフソソームを、標的細胞にカーゴを送達する能力について試験する。幾つかの実施形態では、血清インキュベートされたフソソームでの処理後にカーゴを検出可能に含む細胞のパーセントは、血清と接触していない陽性対照フソソームでの処理後のカーゴを検出可能に含む細胞のパーセントの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％である。幾つかの実施形態では、血清不活化は、実施例９９のアッセイを使用して測定される。
幾つかの実施形態では、フソソーム組成物の免疫原性は、フソソームに応答して補体活性化を検出することによってアッセイされる。幾つかの実施形態では、フソソームは、補体を活性化しないか、又は所定の値より低いレベルで補体を活性化する。幾つかの実施形態では、フソソームナイーブ被験体（例えば、ヒト又はマウス）の血清を、試験フソソーム組成物と接触させる。幾つかの実施形態では、１回以上のフソソームの投与を受けた、例えば、少なくとも２回のフソソームの投与を受けた被験体の血清を、試験フソソーム組成物と接触させる。
次に、実施形態では、血清及びフソソームを含む組成物を、例えば、ＥＬＩＳＡによって、活性化された補体因子（例えば、Ｃ３ａ）について試験する。幾つかの実施形態では、本明細書に記載の改変を含むフソソーム（例えば、参照細胞と比較して高レベルの補体調節タンパク質）は、改変がない以外は同様のフソソームと比較して、例えば、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％減少した補体活性化を経る。幾つかの実施形態では、補体活化は、実施例１００のアッセイを使用して測定される。
幾つかの実施形態では、フソソーム又はフソソームの集団は、血清によって実質的に不活化されないであろう。幾つかの実施形態では、フソソーム又はフソソームの集団は、例えば、実施例９９に記載の方法に従って定量化されるように、血清不活化に耐性がある。実施形態では、フソソーム又はフソソームの集団は、血清によって実質的に不活化されないか、又は、例えば、本明細書に記載の方法に従って、被験体へのフソソーム若しくはフソソームの集団の複数回投与後の血清不活化に耐性がある。幾つかの実施形態では、フソソームは、例えば、実施例９９に記載の方法に従って定量化されるように、例えば、改変フソソームの複数回投与後、対応する未改変フソソームと比較して、血清不活化が減少するように改変される。
幾つかの実施形態では、フソソームは、例えば、実施例１００に記載される方法に従って測定されるように、補体活性を実質的に誘導しない。幾つかの実施形態では、フソソームは、対応する未改変フソソームと比較して、補体活性の低下を誘発するように改変される。実施形態では、補体活性は、補体タンパク質（例えば、ＤＡＦ、崩壊促進因子（ＤＡＦ、ＣＤ５５）に結合するタンパク質、例えばＨ因子（ＦＨ）様タンパク質－１（ＦＨＬ－１）、Ｃ４ｂ結合タンパク質（Ｃ４ＢＰ）、補体受容体１（ＣＤ３５）、メンブレンコファクタータンパク質（ＭＣＰ、ＣＤ４６）、プロフェクチン（ＣＤ５９）、古典的及び代替補体経路ＣＤ／Ｃ５コンバターゼ酵素を阻害するタンパク質、又は細胞においてＭＡＣアッセンブリを調節するタンパク質等の他の補体調節タンパク質）の発現又は活性を決定することによって測定される。
幾つかの実施形態では、ソース細胞は、内皮細胞、線維芽球、血液細胞（例えば、マクロファージ、好中球、顆粒球、白血球）、幹細胞（例えば、間葉系幹細胞、臍帯幹細胞、骨髄幹細胞、造血幹細胞、誘導多能性幹細胞、例えば、被験体の細胞に由来する誘導多能性幹細胞）、胚性幹細胞（例えば、胚性卵黄嚢、胎盤、臍帯からの幹細胞、胎児の皮膚、思春期の皮膚、血液、骨髄、脂肪組織、赤血球産生組織、造血組織）、筋芽細胞、実質細胞（例えば、肝細胞）、肺胞細胞、ニューロン（例えば、網膜神経細胞）、前駆細胞（例えば、網膜前駆細胞、骨髄芽球、骨髄前駆細胞、胸腺細胞、減数母細胞、巨核芽球、前巨核芽球、メラニン形成芽細胞、リンパ芽球、骨髄前駆細胞、正赤芽球、又は血管芽球）、前駆細胞（例えば、心臓始原細胞、衛星細胞、放射状グリア細胞、骨髄間質細胞、膵臓始原細胞、内皮始原細胞、芽球細胞）、又は不死化細胞（例えば、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３、ＨＦＦ－１、ＭＲＣ－５、ＷＩ－３８、ＩＭＲ９０、ＩＭＲ９１、ＰＥＲ．Ｃ６、ＨＴ－１０８０、又はＢＪ細胞）である。幾つかの実施形態では、ソース細胞は、２９３細胞、ＨＥＫ細胞、ヒト内皮細胞、又はヒト上皮細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、又は幹細胞以外のものである。
幾つかの実施形態では、ソース細胞は、ＡＲＲＤＣ１、又はその活性フラグメント若しくはバリアントを発現する（例えば、過剰発現する）。幾つかの実施形態では、フソソーム又はフソソーム組成物は、例えば、質量分析アッセイによれば、１～３、１～１０、１～１００、３～１０、４～９、５～８、６～７、１５～１００、６０～２００、８０～１８０、１００～１６０、１２０～１４０、３～１００、４～１００、５～１００、６～１００、１５～１００、８０～１００、３～２００、４～２００、５～２００、６～２００、１５～２００、８０～２００、１００～２００、１２０～２００、３００～１０００、４００～９００、５００～８００、６００～７００、６４０～６９０、６５０～６８０、６６０～６７０、１００～１０，０００、又は約６６４．９のＡＲＲＤＣ１に対するフソゲンの比率を有する。幾つかの実施形態では、例えば、質量分析、例えば、実施例９８に記載される方法に従って測定した場合、総タンパク質含有量の割合としてのＡＲＲＤＣ１のレベルは、少なくとも約０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％である。０．１％、０．１５％、０．２％、０．２５％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％である、又は総タンパク質含有量の割合としてのＡＲＲＤＣ１のレベルは約０．０５～１．５％、０．１％～０．３％、０．０５～０．２％、０．１～０．２％、０．２５～７．５％、０．５％～１．５％、０．２５～１％である、０．５～１％、０．０５～１．５％、１０％～３０％、５～２０％、又は１０～２０％である。幾つかの実施形態では、フソソーム又はフソソーム組成物は、例えば質量分析アッセイ、例えば、実施例９４のアッセイを使用すると、約１００～１，０００、１００～４００、１００～５００、２００～４００、２００～５００、２００～１，０００、３００～４００、１，０００～１０，０００、２，０００～５，０００、３，０００～４，０００、３，０５０～３，１００、３，０６０～３，０７０、又は約３，０６４、１０，０００～１００，０００、１０，０００～２００，０００、１０，０００～５００，０００、２０，０００～５００，０００、３０，０００～４００，０００のＴＳＧ１０１に対するフソゲンの比を有する。幾つかの実施形態では、フソソーム又はフソソーム組成物は、例えば、質量分析アッセイ、例えば、実施例９５のアッセイを使用すると、約１～３、１～３０、１～２０、１～２５、１．５～３０、１０～３０、１５～２５、１８～２１、１９～２０、１０～３００、１０～２００、１５～３００、１５～２００、１００～３００、１００～２００、１５０～３００、又は約１９．５のｔｓｇ１０１に対するカーゴの比を有する。幾つかの実施形態では、例えば、質量分析により、例えば、実施例９８に記載の方法に従って測定した場合、総タンパク質含有量の割合としてのＴＳＧ１０１のレベルは、少なくとも約０．０００１％、０．０００２％、０．０００３％、０．０００４％、０．０００５％、０．０００６％、０．０００７％、０．００１％、０．００２％、０．００３％、０．００４％、０．００５％、０．００６％、０．００７％；０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％である、又は総タンパク質含有量の割合としてのＴＳＧ１０１のレベルは、約０．０００１～０．００１、０．０００１～０．００２、０．０００１～０．０１、０．０００１～０．１、０．００１～０．０１、０．００２～０．００６、０．００３～０．００５、０．００１～０．１、０．０１～０．１、０．０２～０．０６、０．０３～０．０５、又は０．００４である。
幾つかの実施形態では、フソソームは、カーゴ、例えば、治療剤、例えば、内因性治療剤又は外因性治療剤を含む。幾つかの実施形態では、治療薬は、タンパク質、例えば、酵素、膜貫通タンパク質、受容体、抗体、核酸、例えば、ＤＮＡ、染色体（例えば、ヒト人工染色体）、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、又は小分子の１つ以上から選択される。幾つかの実施形態では、治療薬は、ミトコンドリア以外の細胞小器官、例えば、核、ゴルジ装置、リゾソーム、小胞体、液胞、エンドソーム、アクロソーム、オートファゴソーム、中心小体、グリコソーム、グリオキシソーム、ハイドロジェノソーム、メラノソーム、マイトソーム、刺胞細胞、ペルオキシソーム、プロテアソーム、小胞、及びストレス顆粒から選択される細胞小器官である。幾つかの実施形態では、細胞小器官はミトコンドリアである。
幾つかの実施形態では、フソソームは、エンドサイトーシスによって標的細胞に入り、例えば、エンドサイトーシス経路を介して送達される治療剤のレベルは、例えば、実施例６２のアッセイを使用すると、０．０１～０．６、０．０１～０．１、０．１～０．３若しくは０．３～０．６であり、又は同様のフソソームと接触したクロロキン処理参照細胞よりも、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％大きい。幾つかの実施形態では、標的細胞に入るフソソーム組成物中のフソソームの少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％のフソソームが、非エンドサイトーシス経路を介して入り、例えば、フソソームは、細胞表面との融合を介して標的細胞に入る。幾つかの実施形態では、所与のフソソームについて、非エンドサイトーシス経路を介して送達される治療薬のレベルは、例えば、実施例６２のアッセイを使用すると、０．１～０．９５、０．１～０．２、０．２～０．３、０．３～０．４、０．４～０．５、０．５～０．６、０．６～０．７、０．７～０．８、０．８～０．９、０．９～０．９５であるか、又はクロロキンで処理された参照細胞よりも少なくとも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％より大きい若しくはそれ以上である。幾つかの実施形態では、標的細胞に入るフソソーム組成物中のフソソームの少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％のフソソームが、細胞質に入る（例えば、エンドソーム又はリソソームに入らない）。幾つかの実施形態では、標的細胞に入るフソソーム組成物中のフソソームの９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％未満、又は１％が、エンドソーム又はリソソームに入る。幾つかの実施形態では、フソソームは、非エンドサイトーシス経路によって標的細胞に入り、例えば、送達される治療剤のレベルは、例えば、実施例６２のアッセイを使用すると、クロロキンで処理された参照細胞のレベルの少なくとも９０％、９５％、９８％、又は９９％である。一実施形態では、フソソームは、ダイナミン媒介経路を介して作用物質を標的細胞に送達する。一実施形態では、ダイナミン媒介経路を介して送達される作用物質のレベルは、０．０１～０．６の範囲であるか、又は例えば、実施例６３のアッセイで測定した場合、同様のフソソームと接触させたダイナソア処理標的細胞よりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％若しくはそれ以上大きい。一実施形態では、フソソームは、マクロピノサイトーシスを介して作用物質を標的細胞に送達する。一実施形態では、マクロピノサイトーシスを介して送達される作用物質のレベルは、０．０１～０．６の範囲であるか、又は例えば、実施例６３のアッセイで測定した場合、同様のフソソームと接触させたＥＩＰＡ処理標的細胞よりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％若しくはそれ以上大きい。一実施形態では、フソソームは、アクチン媒介経路を介して作用物質を標的細胞に送達する。一実施形態では、アクチン媒介経路を介して送達される作用物質のレベルは、０．０１～０．６の範囲となるか、又は例えば、実施例６３のアッセイで測定した場合、同様のフソソームと接触させたラトランクリンＢ処理標的細胞よりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％若しくはそれ以上大きくなる。
幾つかの実施形態では、フソソームは、例えば、実施例３０のアッセイによると、１未満、１～１．１、１．０５～１．１５、１．１～１．２、１．１５～１．２５、１．２～１．３、１．２５～１．３５、又は１．３５ｇ／ｍｌ超の密度を有する。
幾つかの実施形態では、フソソーム組成物は、タンパク質質量で０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、４％、５％、又は１０％未満のソース細胞を含むか、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、４％、５％、又は１０％未満の細胞は機能的な核を有する細胞を含む。幾つかの実施形態では、フソソーム組成物中のフソソームの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％が、細胞小器官、例えばミトコンドリアを含む。
幾つかの実施形態では、フソソームは、外因性治療薬を更に含む。幾つかの実施形態では、外因性治療薬は、タンパク質、例えば、酵素、膜貫通タンパク質、受容体、抗体、核酸、例えば、ＤＮＡ、染色体（例えば、ヒト人工染色体）、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、又は小分子の１つ以上から選択される。
実施形態では、フソソームは、エンドサイトーシス又は非エンドサイトーシス経路によって細胞に入る。
実施形態では、フソソーム組成物は、４℃未満の温度で少なくとも１、２、３、６若しくは１２時間；１、２、３、４、５若しくは６日；１、２、３若しくは４週間；１、２、３若しくは６か月；又は１、２、３、４若しくは５年安定である。実施形態では、フソソーム組成物は、－２０℃未満の温度で少なくとも１、２、３、６若しくは１２時間；１、２、３、４、５若しくは６日；１、２、３若しくは４週間；１、２、３若しくは６か月；又は１、２、３、４若しくは５年安定である。実施形態では、フソソーム組成物は、－８０Ｃ未満の温度で少なくとも１、２、３、６若しくは１２時間；１、２、３、４、５若しくは６日；１、２、３若しくは４週間；１、２、３若しくは６か月；又は１、２、３、４若しくは５年安定である。
実施形態では、フソソームは、例えば、実施例２７のアッセイによって測定した場合、ソース細胞の約０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以内のサイズを有するか、又はフソソームの集団はそのような平均サイズを有する。実施形態では、フソソームは、例えば、実施例２７のアッセイによって測定した場合、ソース細胞の約０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％未満のサイズを有するか、又はフソソームの集団はそのような平均サイズを有する。実施形態では、フソソームは、親細胞よりも小さいサイズを有する（又は有すると識別される）。実施形態では、フソソームは、親細胞の約５０％、６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、８０％、又は９０％以内のサイズを有する（又は有すると識別される）。一実施形態では、フソソームは、例えばサンプルの９０％以内で、親細胞のサイズ分布の変動の約７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、１％又はそれ未満を有する（又は有すると識別される）。一実施形態では、フソソームは、例えばサンプルの９０％以内で、親細胞のサイズ分布の変動の約４０％、４５％、５０％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６５％又は７０％少ない（又は少ないと識別される）。幾つかの実施形態では、フソソームは、直径が３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、又は７０ｎｍを超える平均サイズを有する（又は有すると識別される）。実施形態では、フソソームは、直径が約１００、１１０、１２０、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１４０、又は１５０ｎｍの平均サイズを有する。実施形態では、フソソームは、例えば、実施例２７のアッセイによって測定した場合、ソース細胞の約０．０１％～０．０５％、０．０５％～０．１％、０．１％～０．５％、０．５％～１％、１％～２％、２％～３％、３％～４％、４％～５％、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、又は８０％～９０％内のサイズを有するか、又はフソソームの集団はそのような平均サイズを有する。実施形態では、フソソームは、例えば、実施例２７のアッセイによって測定した場合、ソース細胞の約０．０１％～０．０５％、０．０５％～０．１％、０．１％～０．５％、０．５％～１％、１％～２％、２％～３％、３％～４％、４％～５％、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、又は８０％～９０％未満サイズを有するか、又はフソソームの集団はそのような平均サイズを有する。実施形態では、フソソームは、例えば、実施例６９のアッセイによって測定した場合、約５００ｎｍ未満（例えば、約１０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、又は４５０ｎｍ）の直径を有するか、又はフソソームの集団はそのような平均直径を有する。実施形態では、フソソームは、例えば、実施例６９のアッセイよって測定した場合、約８０～１８０、９０～１７０、１００～１６０、１１０～１５０、１２０～１４０、若しくは１３０ｎｍの直径を有するか、又はフソソームの集団はそのような平均直径を有する。実施形態では、フソソームは、例えば、実施例６９のアッセイよって測定した場合、約１１，０００ｎｍ～２１，０００ｎｍの直径を有するか、又はフソソームの集団はそのような平均直径を有する。実施形態では、フソソームは、例えば、実施例６９のアッセイよって測定した場合、１０～２２，０００、１２～２０，０００、１４～１８，７２０ｎｍ、２０～１６，０００ｎｍの直径を有するか、又はフソソームの集団はそのような平均直径を有する。実施形態では、フソソームは、例えば、実施例６９のアッセイによって測定した場合、約０．０１～０．１μｍ３、０．０２～１μｍ３、０．０３～１μｍ３、０．０４～１μｍ３、０．０５～０．０９μｍ３、０．０６～０．０８μｍ３、０．０７μｍ３の体積を有するか、又はフソソームの集団はそのような平均体積を有する。実施形態では、フソソームは直径を有し、又はフソソームの集団は平均径を有し、実施例２９のアッセイによって測定した場合、少なくとも約１０ｎｍ、２０ｎｍ、３０ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、１５０ｎｍ、２００ｎｍ、又は２５０ｎｍである。実施形態では、フソソームは直径を有し、又はフソソームの集団は平均径を有し、実施例２９のアッセイによって測定した場合、約１０ｎｍ、２０ｎｍ、３０ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、１５０ｎｍ、２００ｎｍ、又は２５０ｎｍ（例えば、±２０％）である。実施形態では、フソソームは直径を有し、又はフソソームの集団は平均径を有し、実施例２９のアッセイによって測定した場合、少なくとも約５００ｎｍ、７５０ｎｍ、１，０００ｎｍ、１，５００ｎｍ、２，０００ｎｍ、２，５００ｎｍ、３，０００ｎｍ、５，０００ｎｍ、１０，０００ｎｍ、又は２０，０００ｎｍである。実施形態では、フソソームは直径を有し、又はフソソームの集団は平均径を有し、実施例２９のアッセイによって測定した場合、約５００ｎｍ、７５０ｎｍ、１，０００ｎｍ、１，５００ｎｍ、２，０００ｎｍ、２，５００ｎｍ、３，０００ｎｍ、５，０００ｎｍ、１０，０００ｎｍ、又は２０，０００ｎｍ（例えば、±２０％）である。実施形態では、フソソームの集団は、以下の１つ以上を有する（又は有すると識別される）：例えば、実施例６８のアッセイによって、約４０～９０ｎｍ、４５～６０ｎｍ、５０～５５ｎｍ又は５３ｎｍの１０％分位数直径；約７０～１００ｎｍ、８０～９５ｎｍ、８５～９０ｎｍ、又は８８ｎｍの２５％分位数の直径；約２００～２５０ｎｍ、２１０～２４０ｎｍ、２２０～２３０ｎｍ、又は２２６ｎｍの７５％分位数の直径；又は約４０００～５０００ｎｍ、４３００～４６００ｎｍ、４４００～４５００ｎｍ、４４５０ｎｍの９０％分位数。
実施形態では、フソソーム組成物は、例えば、実施例８２のアッセイにおいて、約３５～４０、３６～３９、３７～３８、又は３７．２ｎｇ／ｍＬのＧＡＰＤＨ濃度を含む（又は含むと同定される）。実施形態では、フソソーム組成物のＧＡＰＤＨ濃度は、例えば、実施例８２のアッセイにおいて、ソース細胞のＧＡＰＤＨ濃度の約１％、２％、５％、１０％、又は２０％以内である（又はそうであると識別される）。実施形態では、フソソーム組成物のＧＡＰＤＨ濃度は、例えば、実施例８２のアッセイにおいて、ソース細胞のＧＡＰＤＨ濃度の少なくとも約１％、２％、５％、１０％、又は２０％より少ない（又はそうであると識別される）。実施形態では、フソソーム組成物は、総タンパク質グラムあたり約３０、３５、４０、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、又は７０μｇ未満のＧＡＰＤＨを含む（又は含むと識別される）。実施形態では、フソソーム組成物は、総タンパク質１グラムあたり約５００、２５０、１００、又は５０μｇ未満のＧＡＰＤＨを含む（又は含むと識別される）。実施形態では、親細胞は、フソソーム組成物よりも、総タンパク質あたり少なくとも１％、２．５％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、３０％、５０％、又はそれ以上のＧＡＰＤＨを含む（又は含むと識別される）。
実施形態では、フソソームにおけるカルネキシンの平均分画含有量は、１×１０－４、１．５×１０－４、２×１０－４、２．１×１０－４、２．２×１０－４、２．３×１０－４、；２．４×１０－４、２．４３×１０－４、２．５×１０－４、２．６×１０－４、２．７×１０－４、２．８×１０－４、２．９×１０－４、３×１０－４、３．５×１０－４、又は４×１０－４未満である（又はそうであると識別される）。実施形態では、フソソームは、総タンパク質あたりのカルネキシンの量を含み、これは、親細胞の量よりも約７０％、７５％、８０％、８５％、８８％、９０％、９５％、９９％、又はそれ以上少ない。
幾つかの実施形態では、フソソームは、膜の曲率に影響を与える脂質を含むか、又はその脂質が濃縮されている（例えば、Ｔｈｉａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１４（１２）：７７５－７８５，２０１３）。一部の脂質は、小さな親水性のヘッドグループ及び大きな疎水性のテールを持っており、局所領域に集中することで融合細孔の形成を促進する。幾つかの実施形態では、フソソームは、コレステロール、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ジグリセリド（ＤＡＧ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、脂肪酸（ＦＡ）等の負の湾曲脂質を含むか、又はそれらが濃縮されている。幾つかの実施形態では、フソソームは、以下のような正の湾曲脂質を含まないか、枯渇しているか、又はほとんど持っていない；リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）、ホスファチジルイノシトール（Ｐｔｄｌｎｓ）、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）、リゾホスファチジルエタノールアミン（ＬＰＥ）、モノアシルグリセロール（ＭＡＧ）。
幾つかの実施形態では、脂質がフソソームに加えられる。幾つかの実施形態では、脂質は、フソソームの形成の前又は形成中に脂質をそれらの膜に組み込む培養中のソース細胞に添加される。幾つかの実施形態では、脂質は、リポソームの形態で細胞又はフソソームに添加される。幾つかの実施形態では、メチル－ベータシクロデキスタン（ｍβ－ＣＤ）は、脂質を濃縮又は枯渇させるために使用される（例えば、Ｋａｉｎｕ ｅｔ ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５１（１２）：３５３３－３５４１，２０１０を参照）。
Ｘ．医薬組成物及びそれらを製造する方法
本開示はまた、幾つかの態様では、本明細書に記載のフソソーム組成物及び薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、記載されるいずれかのフソソーム、例えばレトロウイルスベクター、又はＶＬＰを含むことができる。
幾つかの実施形態では、レトロウイルスベクターの１つ以上の形質導入ユニットが被験体に投与される。幾つかの実施形態では、１ｋｇあたり少なくとも１、１０、１００、１０００、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、又は１０１４の形質導入単位を被験体に投与する。幾つかの実施形態では、血液１ｍｌあたり標的細胞あたり少なくとも１、１０、１００、１０００、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、又は１０１４の形質導入単位を被験体に投与する。
レトロウイルスウイルス、例えばレンチウイルスの濃縮及び精製
幾つかの実施形態では、本明細書に記載のレトロウイルスベクター製剤は、例えば、時系列で、以下の工程（ｉ）～（ｖｉ）の１つ以上、例えば、全てを含むプロセスによって産生され得る：
（ｉ）レトロウイルスベクターを産生する細胞を培養する工程；
（ｉｉ）レトロウイルスベクターを含む上清を回収する工程；
（ｉｉｉ）必要に応じて上清を清澄化する工程；
（ｉｖ）レトロウイルスベクターを精製してレトロウイルスベクター調製物を得る工程；
（ｖ）任意に、レトロウイルスベクター調製物をフィルター滅菌する工程；及び
（ｖｉ）レトロウイルスベクター調製物を濃縮して最終的なバルク産物を産生する工程。
幾つかの実施形態では、プロセスは、清澄化工程（ｉｉｉ）を含まない。他の実施形態では、プロセスは、清澄化工程（ｉｉｉ）を含む。幾つかの実施形態では、工程（ｖｉ）は、限外濾過、又はタンジェント流濾過、より好ましくは中空繊維限外濾過を使用して実行される。幾つかの実施形態では、工程（ｉｖ）の精製方法は、イオン交換クロマトグラフィー、より好ましくは陰イオン交換クロマトグラフィーである。幾つかの実施形態では、工程（ｖ）のフィルター滅菌は、０．２２μｍ又は０．２μｍの滅菌フィルターを使用して実行される。幾つかの実施形態では、工程（ｉｉｉ）は、フィルターの清澄化によって実行される。幾つかの実施形態では、工程（ｉｖ）は、クロマトグラフィー、限外濾過／ダイアフィルトレーション、又は遠心分離から選択される方法又は方法の組み合わせを使用して実行される。幾つかの実施形態では、クロマトグラフィー法又は方法の組み合わせは、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、及び固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィーから選択される。幾つかの実施形態では、遠心分離方法は、ゾーン遠心分離、等密度遠心分離、及びペレット遠心分離から選択される。幾つかの実施形態では、限外濾過／ダイアフィルトレーション法は、タンジェンシャルフローダイアフィルトレーション、撹拌セルダイアフィルトレーション及び透析から選択される。幾つかの実施形態では、精製を向上させるために核酸を分解するプロセスに少なくとも１つの工程が含まれる。幾つかの実施形態では、当該工程はヌクレアーゼ処理である。
幾つかの実施形態では、ベクターの濃縮は、濾過の前に行われる。幾つかの実施形態では、ベクターの濃縮は、濾過後に行われる。幾つかの実施形態では、濃縮及び濾過の工程が繰り返される。
幾つかの実施形態では、最終濃縮工程は、フィルター滅菌工程の後に実行される。幾つかの実施形態では、プロセスは、治療薬としてヒトへの投与に適した臨床グレードの製剤を製造するための大規模プロセスである。幾つかの実施形態では、フィルター滅菌工程は、濃縮工程の前に行われる。幾つかの実施形態では、濃縮工程はプロセスの最後の工程であり、フィルター滅菌工程はプロセスの最後から２番目の工程である。幾つかの実施形態では、濃縮工程は、限外濾過、好ましくはタンジェント流濾過、より好ましくは中空繊維限外濾過を使用して実行される。幾つかの実施形態では、フィルター滅菌工程は、約０．２２μｍの最大孔径を有する滅菌フィルターを使用して実行される。別の好ましい実施形態では、最大孔径は０．２μｍである。
幾つかの実施形態では、ベクター濃度は、フィルター滅菌前の調製物１ｍｌあたり約４．６×１０１１のＲＮＡゲノムコピー以下である。適切な濃度レベルは、適切な場合、例えば希釈工程を使用してベクター濃度を制御することによって達成することができる。したがって、幾つかの実施形態では、レトロウイルスベクター調製物は、フィルター滅菌の前に希釈される。
清澄化は、細胞破片やその他の不純物を除去する濾過工程によって行うことができる。効果的な除去及び許容可能な回収率を達成するために、適切なフィルターは、セルロースフィルター、再生セルロース繊維、無機濾過助剤（例えば、珪藻土、パーライト、ヒュームドシリカ）と組み合わせたセルロース繊維、無機濾過助剤及び有機樹脂と組み合わせたセルロースフィルター、又はそれらの任意の組み合わせ、及びポリマーフィルター（例として、限定されないが、ナイロン、ポリプロピレン、ポリエーテルスルホンが挙げられる）を利用する。多段階プロセスを使用することができる。例示的な２段階又は３段階のプロセスは、大きな沈殿物及び細胞破片を除去するための粗いフィルター（複数の場合がある）と、それに続く０．２ミクロンより大きく１ミクロン未満の公称孔径を有する第２段階フィルター（複数の場合がある）のポリッシングからなり得る。最適な組み合わせは、沈殿物のサイズ分布と並んで、その他の変数の関数である可能性がある。更に、比較的小さな孔径のフィルター又は遠心分離を使用する単一段階の操作は、清澄化にも使用され得る。より一般的には、限定されるものではないが、後続の工程で膜及び／又は樹脂を汚さないように適切な清澄度の濾液を提供する、全量濾過、精密濾過、遠心分離、又は全量若しくは深層濾過と組み合わせた濾過助剤（珪藻土等）のボディフィードを含む任意の清澄化アプローチが本発明の清澄化工程における使用に許容可能となるであろう。
幾つかの実施形態では、深層濾過及び膜濾過が使用される。この点で有用な市販の製品は、例えば、国際公開第０３／０９７７９７号の２０～２１頁に言及されている。使用できる膜は、異なる材料で構成されていてもよく、細孔サイズが異なっていてもよく、組み合わせて使用されてもよい。それらは、幾つかのベンダーから商業的に入手できる。幾つかの実施形態では、清澄化に使用されるフィルターは、１．２～０．２２μｍの範囲にある。幾つかの実施形態では、清澄化に使用されるフィルターは、１．２／０．４５μｍフィルター又は０．２２μｍの最小公称孔径を有する非対称フィルターのいずれかである。
幾つかの実施形態では、上記方法は、ヌクレアーゼを用いて、汚染しているＤＮＡ／ＲＮＡ、すなわち主に宿主細胞の核酸を分解する。本発明での使用に適した例示的なヌクレアーゼとしては、あらゆる形態のＤＮＡ及びＲＮＡ（一本鎖、二本鎖線状又は環状）又は当技術分野において調製物から不要又は汚染されたＤＮＡ及び／又はＲＮＡを除去する目的で一般的に使用される他の任意のＤＮａｓｅ及び／又はＲＮａｓｅを攻撃し分解するＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）ヌクレアーゼ（欧州特許第０２２９８６６号）が挙げられる。好ましい実施形態では、ヌクレアーゼは、特定のヌクレオチド間の内部ホスホジエステル結合を加水分解することによって核酸を迅速に加水分解し、それによって上清を含むベクター中のポリヌクレオチドのサイズを減少させるＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）ヌクレアーゼである。Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）ヌクレアーゼは、Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ（コードＷ２１４９５０）から市販されている。ヌクレアーゼが使用される濃度は、好ましくは１～１００ユニット／ｍｌの範囲内である。
幾つかの実施形態では、ベクター懸濁液は、例えば、ベクター濃縮及び／又はバッファー交換をするために、プロセス中に少なくとも１回の限外濾過（バッファー交換に使用される場合、ダイアフィルトレーションと呼ばれることもある）に供される。ベクターを濃縮するために使用されるプロセスは、希釈剤がベクター調製物から除去されるように希釈剤をフィルターに強制的に通過させるが、ベクターはフィルターを通過できないため、濃縮された形でベクター調製物に残ることによってベクターの濃度が増加する任意の濾過プロセス（例えば、限外濾過（ＵＦ））を含み得る。ＵＦは、例えば、Ｍｉｃｒｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｌ．Ｚｅｍａｎ ａｎｄ Ａ．Ｚｙｄｎｅｙ（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９９６）；及びＵｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｍｕｎｉｒ Ｃｈｅｒｙａｎ（Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，１９８６；ＩＳＢＮ Ｎｏ．８７７６２－４５６－９）に詳述されている。適切な濾過プロセスは、例えば、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｅｎｔｉｔｌｅｄ「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ」ｐｐ．１７７－２０２（Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓ．，１９９５／９６）に記載されているタンジェント流濾過（「ＴＦＦ」）である。ＴＦＦは、ウイルスを含む生成物の細胞採取、浄化、精製、及び濃縮のためにバイオプロセシング業界で広く使用されている。このシステムは、フィード溶液、透過液、及び保持液の３つの異なるプロセスストリームで構成されている。用途に応じて、異なる孔径のフィルターを使用できる。幾つかの実施形態では、保持液は、生成物（レンチウイルスベクター）を含む。選択された特定の限外濾過膜は、ベクターを保持するのに十分小さいが、不純物を効果的に除去するのに十分大きい孔径を有し得る。製造業者及び膜の種類に応じて、レトロウイルスベクターの場合、１００～１０００ｋＤａの公称分子量カットオフ（ＮＭＷＣ）、例えば、３００ｋＤａ又は５００ｋＤａのＮＭＷＣの膜が適切な場合がある。膜組成物は、再生セルロース、ポリエーテルスルホン、ポリスルホン、又はそれらの誘導体であり得るが、これらに限定されない。膜はフラットシート（フラットスクリーンとも呼ばれる）又は中空繊維にすることができる。適切なＵＦは、中空繊維ＵＦ、例えば、０．１μｍ未満の孔径を有するフィルターを使用する濾過である。生成物は一般に保持されるが、透過によって体積を減らすことができる（又は、バッファー及び不純物を含む透過液が透過側で除去される速度と同じ速度でバッファーを添加することにより、ダイアフィルトレーション中に一定に保つことができる）。
バイオ医薬品業界でＴＦＦに最も広く使用されている２つの形状は、プレート＆フレーム（フラットスクリーン）、及び中空糸モジュールである。限外濾過及び精密濾過用の中空糸ユニットは、１９７０年代初頭にＡｍｉｃｏｎ及びＲａｍｉｃｏｎによって開発されたが（Ｃｈｅｒｙａｎ，Ｍ．Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｈａｎｄｂｏｏｋ）、現在はＳｐｅｃｔｒｕｍ及びＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅを含む複数のベンダーが存在する。中空糸モジュールは、高密度のスキン層を備えた一連の自立型繊維で構成されている。繊維径は０．５ｍｍ～３ｍｍの範囲である。特定の実施形態では、中空繊維がＴＦＦに使用される。特定の実施形態では、５００ｋＤａ（０．０５μｍ）の孔径の中空繊維が使用される。限外濾過は、ダイアフィルトレーション（ＤＦ）を含み得る。微量溶質は、限外濾過される溶液にＵＦ速度に等しい速度で溶媒を加えることによって除去できる。これにより、溶液から微小種が一定の量で洗い流され、保持されたベクターが精製される。
ＵＦ／ＤＦを、精製プロセスの様々な段階でベクター懸濁液を濃縮及び／又はバッファー交換するために使用できる。この方法は、クロマトグラフィー又は他の精製工程の後に上清のバッファーを交換するためにＤＦ工程を利用することができるが、クロマトグラフィーの前に使用することもできる。
幾つかの実施形態では、クロマトグラフィー工程からの溶出液は、濃縮され、限外濾過－ダイアフィルトレーションによって更に精製される。このプロセス中に、ベクターは製剤バッファーに交換される。最終的な所望の濃度への濃縮は、フィルター滅菌工程の後に行うことができる。当該滅菌濾過後、フィルター滅菌された物質は無菌ＵＦによって濃縮されて、バルクベクター産生物を産生する。
実施形態では、限外濾過／ダイアフィルトレーションは、タンジェント流ダイアフィルトレーション、撹拌セルダイアフィルトレーション及び透析であり得る。
精製技術は、細胞環境からのベクター粒子の分離、及び必要に応じて、ベクター粒子の更なる精製を伴う傾向がある。この精製には、様々なクロマトグラフィー法の１つ以上を使用できる。イオン交換、より具体的には陰イオン交換、クロマトグラフィーが適切な方法であり、他の方法を使用することができる。幾つかのクロマトグラフィー技術の説明を以下に示す。
イオン交換クロマトグラフィーは、生体分子及びウイルスベクター等の荷電種が、その表面に固定された反対の電荷を有する基を持つ固定相（膜、又は代わりにカラム内のパッキング等）に可逆的に結合できるという事実を利用している。イオン交換体には２つのタイプがある。陰イオン交換体は、正電荷を有する基を持つ固定相であるため、負電荷を持つ化学種を結合できる。陽イオン交換体は負の電荷を有する基を持っているため、正の電荷を持つ化学種を結合できる。媒質のｐＨは、化学種の電荷を変える可能性があるため、これに影響を及ぼす。そのため、タンパク質等の種の場合、ｐＨがｐＩを超えると正味電荷は負になり、ｐＩを下回ると正味電荷は正になる。
結合種の置換（溶出）は、適切なバッファーを使用することで行うことができる。そのため、一般に、固定相のイオン部位に対するバッファーイオンの競合によって化学種が置換されるまで、バッファーのイオン濃度を増加する。代替的な溶出方法では、化学種の正味電荷が固定相への結合に有利でなくなるまで、バッファーのｐＨを変更する必要がある。例としては、化学種が正味の正電荷を帯びたと想定され、陰イオン交換体に結合しなくなるまでｐＨを下げることが挙げられる。
不純物が帯電していない場合、又は不純物が所望の化学種とは反対の符号の電荷を持っているが、イオン交換体の電荷と同じ符号である場合は、ある程度の精製を行うことができる。これは、非荷電種及びイオン交換体と同じ符号の電荷を持つ種は、通常結合しないためである。結合種が異なれば、結合の強さは、電荷密度及び様々な化学種の電荷の分布等の要因によって異なる。したがって、イオン勾配又はｐＨ勾配を（連続勾配として、又は一連の工程として）適用することにより、目的の化学種が不純物とは別に溶出され得る。
サイズ排除クロマトグラフィーは、サイズに応じて化学種を分離する手法である。典型的には、これは、明確なサイズの孔を有する粒子が充填されたカラムを使用して実行される。クロマトグラフィー分離では、分離する混合物中の化学種のサイズに関して適切な孔径を持つ粒子を選択する。混合物を溶液（又はウイルスの場合は懸濁液）としてカラムに適用し、バッファーで溶出すると、細孔へのアクセスが制限されている（又は全くない）ため、最大の粒子が最初に溶出する。小さい粒子は細孔に入る可能性があるため、後で溶出し、カラムを通過する経路が長くなる。したがって、ウイルスベクターの精製にサイズ排除クロマトグラフィーを使用することを検討する場合、タンパク質等のより小さな不純物の前にベクターが溶出されることが予想される。
タンパク質等の化学種の表面には、固定相の弱い疎水性部位に可逆的に結合できる疎水性領域がある。塩濃度が比較的高い媒質では、この結合が促進される。典型的には、ＨＩＣでは、精製するサンプルは高塩濃度環境で固定相に結合する。次に、塩濃度を減少させる勾配（連続的又は一連の工程として）を適用することにより、溶出を達成する。一般的に使用される塩は硫酸アンモニウムである。疎水性のレベルが異なる種は、異なる塩濃度で溶出される傾向があるため、標的の化学種を不純物から精製できる。ｐＨ、温度、並びに界面活性剤、カオトロピック塩及び有機物等の溶出媒質への添加剤等の他の要因も、ＨＩＣ固定相への化学種の結合の強さに影響を与える可能性がある。これらの要因の１つ以上を調整又は利用して、生成物の溶出及び精製を最適化できる。
ウイルスベクターはそれらの表面にタンパク質等の疎水性部分を持っているため、ＨＩＣを精製手段として使用できる可能性がある。
ＨＩＣと同様に、ＲＰＣは疎水性の違いに応じて化学種を分離する。ＨＩＣで採用されているものよりも疎水性の高い固定相が採用される。固定相は、多くの場合、アルキル基やフェニル基等の疎水性部分が結合した材料、通常はシリカからなる。或いは、固定相は、結合基のない有機ポリマーである可能性がある。分離される化学種の混合物を含むサンプルは、結合を促進する比較的高い極性の水性媒質において固定相に適用される。次に、イソプロパノール又はアセトニトリル等の有機溶媒を添加して水性媒質の極性を下げることにより、溶出を達成する。一般に、有機溶媒濃度を増加させる勾配（連続的又は一連の工程として）が使用され、化学種はそれぞれの疎水性の順に溶出される。
溶出媒体のｐＨ、及び添加剤の使用等の他の要因も、ＲＰＣ固定相への化学種の結合の強さに影響を与える可能性がある。これらの要因の１つ以上を調整又は利用して、生成物の溶出及び精製を最適化できる。一般的な添加剤はトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）である。これにより、サンプル中のカルボキシル部分等の酸性基のイオン化が抑制される。また、溶出媒体のｐＨを低下させ、シリカマトリックスを持つ固定相の表面に存在する可能性のある遊離シラノール基のイオン化を抑制する。ＴＦＡは、イオン対形成剤として知られる添加剤のクラスの１つである。これらは、サンプル内の化学種に存在する、反対の電荷を持つイオン基と相互作用する。相互作用は電荷をマスクする傾向があり、化学種の疎水性を高める。ＴＦＡ及びペンタフルオロプロピオン酸等の陰イオン対形成剤は、化学種にある正に帯電した基と相互作用する。トリエチルアミン等のカチオン性イオン対形成剤は、負に帯電した基と相互作用する。
ウイルスベクターはそれらの表面にタンパク質等の疎水性部分を持っているため、ＲＰＣを精製手段として使用できる可能性がある。
アフィニティークロマトグラフィーは、タンパク質又はヌクレオチド等の生体分子と特異的に結合する特定のリガンドを固定相に固定化できるという事実を利用している。次に、修飾された固定相を使用して、関連する生体分子を混合物から分離することができる。特異性の高いリガンドの例は、標的抗原を精製するための抗体及び酵素を精製するための酵素阻害剤である。広範囲の抗体を単離するためのプロテインＡリガンドの使用等、より一般的な相互作用も利用できる。
通常、アフィニティークロマトグラフィーは、目的の化学種を含む混合物を、関連するリガンドが付着した固定相に適用することによって実行される。適切な条件下では、これにより化学種が固定相に結合する。次に、未結合の成分は、溶出媒質が適用される前に洗い流される。溶出媒質は、標的種へのリガンドの結合を破壊するように選択される。これは通常、適切なイオン強度、ｐＨを選択するか、又はリガンド部位について標的種と競合する物質を使用することによって達成される。一部の結合種では、尿素等のカオトロピック試薬を使用して、リガンドからの置換を行う。ただし、これにより、化学種が不可逆的に変性する可能性がある。
ウイルスベクターは、それらの表面に、適切なリガンドに特異的に結合できる可能性のあるタンパク質等の部分を有する。これは、潜在的に、アフィニティークロマトグラフィーがそれらの分離に使用できることを意味する。
タンパク質等の生体分子は、金属イオンと配位結合を形成できる電子供与部分を表面に持つことができる。これは、Ｎｉ２＋、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋又はＦｅ３＋等の固定化金属イオンを担持する固定相への結合を容易にすることができる。ＩＭＡＣで使用される固定相には、キレート剤、典型的には、ニトリロ酢酸又はイミノ二酢酸が共有結合によって付着しており、また金属イオンを保持するのはキレート剤である。キレート化された金属イオンは、生体分子への配位結合を形成するために、少なくとも１つの配位部位を利用できるようにしておく必要がある。生体分子の表面には、固定化された金属イオンに結合できる可能性のある幾つかの部分が存在する可能性がある。これらには、ヒスチジン、トリプトファン、システイン残基、及びリン酸基が含まれる。ただし、タンパク質の場合、主なドナーはヒスチジン残基のイミダゾール基のようである。天然タンパク質を、表面に適切なドナー部分を示す場合、ＩＭＡＣを使用して分離できる。それ以外の場合、ＩＭＡＣは、幾つかの連結されたヒスチジン残基の鎖を持つ組換えタンパク質の分離に使用できる。
通常、ＩＭＡＣは、目的の化学種を含む混合物を固定相に適用することによって実行される。適切な条件下では、これにより化学種が固定相に配位結合する。次に、未結合の成分は、溶出媒質が適用される前に洗い流される。溶出には、塩濃度を上げる又はｐＨを下げる勾配（連続的又は一連の工程として）を使用できる。また、一般的に使用される手順は、イミダゾール濃度を増加させる勾配の適用である。異なるドナー特性を有する生体分子、例えば、異なる環境にヒスチジン残基を有する生体分子は、勾配溶出を使用することによって分離することができる。
ウイルスベクターは、それらの表面に、ＩＭＡＣ固定相に結合できる可能性のあるタンパク質等の部分を有する。これは、潜在的に、ＩＭＡＣをそれらの分離に使用できることを意味する。
適切な遠心分離技術としては、ゾーン遠心分離、等密度超遠心分離、及びペレット遠心分離が含まれる。
フィルター滅菌は、医薬品グレードの材料のプロセスに適している。フィルター滅菌により、得られた製剤に汚染物質が実質的に含まれなくなる。フィルター滅菌後の汚染物質のレベルは、製剤が臨床使用に適しているようなものである。フィルター滅菌工程後の更なる濃縮（例えば限外濾過による）を、無菌状態で行うことができる。幾つかの実施形態では、滅菌フィルターは、０．２２μｍの最大孔径を有する。
本明細書のレトロウイルスベクターはまた、フロースルー超遠心分離及び高速遠心分離、並びにタンジェント流濾過を使用してレンチウイルスベクターを濃縮及び精製する方法に供することができる。フロースルー超遠心分離は、ＲＮＡ腫瘍ウイルスの精製に使用できる（Ｔｏｐｌｉｎ ｅｔ ａｌ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １５：５８２－５８９，１９６７；Ｂｕｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ４５：４９９－５０３，１９７０）。フロースルー超遠心分離は、レンチウイルスベクターの精製に使用できる。この方法は、以下の工程の１つ以上を含むことができる。例えば、レンチウイルスベクターは、細胞工場又はバイオリアクターシステムを使用して細胞から産生することができる。一過性トランスフェクションシステムを使用することができ、パッケージング又はプロデューサー細胞株も同様に使用することができる。必要に応じて、材料を超遠心分離機にロードする前の事前浄化工程を使用できる。フロースルー超遠心分離は、連続フロー又はバッチ沈降を使用して実行できる。沈降に使用される材料は、例えば、塩化セシウム、酒石酸カリウム、臭化カリウムであり、これらは全て腐食性であるが、低粘度で高密度をもたらす。ＣｓＣｌは、作成できる密度勾配が広いことから（１．０～１．９ｇ／ｃｍ３）、高純度を実現できるため、プロセスの開発に頻繁に使用される。臭化カリウムは、高密度で、例えば、２５℃等の高温で使用することができ、これは、幾つかのタンパク質の安定性と適合しない可能性がある。ショ糖は安価で毒性がないため広く使用されており、ほとんどのタンパク質、細胞内画分、細胞全体の分離に適した勾配を形成できる。典型的には最大密度は約１．３ｇ／ｃｍ３である。ショ糖の浸透ポテンシャルは細胞に有毒である可能性があり、その場合、複雑な勾配材料、例えばナイコデンツ（Ｎｙｃｏｄｅｎｚ）を使用することができる。勾配は、勾配の１つ以上の工程で使用できる。一実施形態は、段階的なショ糖勾配を使用することである。材料の量は、１回の実行で０．５リットル～２００リットルを超える場合がある。流速は１時間あたり５～２５リットル超にすることができる。適切な動作速度は２５，０００～４０，５００ｒｐｍで、最大１２２，０００×ｇの力が発生する。ローターは、必要な体積分率で静的にアンロードできる。一実施形態は、遠心分離された材料を１００ｍｌの画分でアンロードすることである。次に、精製及び濃縮されたレンチウイルスベクターを含む単離された画分を、ゲル濾過又はサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、所望のバッファー中で交換することができる。陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィーは、バッファー交換又は更なる精製のための代替又は追加の方法としても使用できる。加えて、タンジェント流濾過は、必要に応じてバッファー交換や最終配合にも使用できる。タンジェント流濾過（ＴＦＦ）は、２工程のＴＦＦ手順が実施される超高速又は高速遠心分離の代替工程としても使用できる。第１の工程はベクター上清の量を減らし、第２の工程はバッファー交換、最終製剤、及び材料の更なる濃縮に使用され得る。ＴＦＦ膜の膜サイズは１００～５００キロダルトンであり、第１のＴＦＦ工程の膜サイズは５００キロダルトンであり、第２のＴＦＦの膜サイズは３００～５００キロダルトンである。最終バッファーには、ベクターを長期間保存できるようにする材料が含まれていなければならない。
実施形態では、この方法は、接着細胞を含む細胞工場、又はベクター及びヘルパーコンストラクトでトランスフェクト又は形質導入されてレンチウイルスベクターを産生する懸濁細胞を含むバイオリアクターのいずれかを使用する。非限定的な例又はバイオリアクターとしては、Ｗａｖｅバイオリアクターシステム及びＸｃｅｌｌｅｒｅｘバイオリアクターが挙げられる。いずれも使い捨てシステムである。ただし、使い捨てではないシステムを使用することもできる。コンストラクトは、本明細書に記載されるもの、並びに他のレンチウイルス形質導入ベクターであり得る。或いは、細胞株を、形質導入又はトランスフェクションを必要とせずにレンチウイルスベクターを産生するように操作することができる。トランスフェクション後、レンチウイルスベクターを採取及び濾過して粒子を除去した後、連続フロー高速遠心分離又は超遠心分離を使用して遠心分離する。好ましい実施形態は、高速遠心分離機を備えたＪＣＦ－Ａゾーン及び連続フローローターのような高速連続フロー装置を使用することである。また、中規模のレンチウイルスベクター生産のためのＣｏｎｔｉｆｕｇｅ Ｓｔｒａｔｕｓ遠心分離機の使用も好ましい。また、遠心分離の速度が５，０００×ｇ ＲＣＦより大きく２６，０００×ｇ ＲＣＦ未満の任意の連続フロー遠心分離機も適している。好ましくは、連続流遠心力は、２０時間～４時間のスピン時間で約１０，５００×ｇ～２３，５００×ｇのＲＣＦであり、より遅い遠心力でより長い遠心時間を使用する。レンチウイルスベクターが、ウイルスベクターペレットを生じるベクターの直接遠心分離で時々発生するような濾過できない凝集体を形成しないように、レンチウイルスベクターを、より密度の高い材料のクッション上で遠心分離してもよい（非限定的な例はスクロースであるが、他の試薬を使用してクッションを形成することができ、これらは当該技術分野でよく知られている）。クッション上での連続フロー遠心分離により、ベクターは大きな凝集体の形成を回避しながら、レンチウイルスベクターを産生する大量のトランスフェクトされた材料からベクターを高レベルに濃縮することができる。更に、スクロースの２番目に密度の低い層を使用して、レンチウイルスベクター調製物をバンドすることができる。連続フロー遠心分離機の流量は、１分あたり１～１００ｍｌであるが、より高い流量及びより低い流量を使用することもできる。流量は、高流量のために大量のベクターが失われることなく、ベクターが遠心分離機のコアに入るのに十分な時間を提供するように調整される。より高い流量が望ましい場合は、連続フロー遠心分離機から流出する材料を再循環させて、もう一度遠心分離機を通過させることができる。連続フロー遠心分離を使用してウイルスを濃縮した後、タンジェント流濾過（ＴＦＦ）を使用してベクターを更に濃縮するか、ＴＦＦシステムをバッファー交換に使用することができる。ＴＦＦシステムの非限定的な例は、ＧＢ－Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅによって製造されたＸａｍｐｌｅｒカートリッジシステムである。推奨されるカートリッジは、ＭＷカットオフが５００，０００ＭＷ以下のカートリッジである。好ましくは、カートリッジは、３００，０００ＭＷのＭＷカットオフで使用される。１００，０００ＭＷカットオフのカートリッジも使用できる。より大きな容量の場合、より大きなカートリッジを使用することができ、ベクター調製物の最終充填の前に、この最終バッファー交換及び／又は濃縮工程に適したＴＦＦシステムを見つけることは当業者にとって容易である。最終的な充填調製物は、ベクターを安定化する因子（糖が一般的に使用され、当該技術分野で知られている）を含み得る。
タンパク質含有量
幾つかの実施形態では、レトロウイルス粒子は、様々なソース細胞ゲノム由来タンパク質、外因性タンパク質、及びウイルスゲノム由来タンパク質を含む。幾つかの実施形態では、レトロウイルス粒子は、ソース細胞ゲノム由来タンパク質対ウイルスゲノム由来タンパク質、ソース細胞ゲノム由来タンパク質対外因性タンパク質、及び外因性タンパク質対ウイルスゲノム由来タンパク質の様々な比率を含む。
幾つかの実施形態では、ウイルスゲノム由来のタンパク質は、ＧＡＧポリプロテイン前駆体、ＨＩＶ－１インテグラーゼ、ＰＯＬポリプロテイン前駆体、キャプシド、ヌクレオキャプシド、ｐ１７マトリックス、ｐ６、ｐ２、ＶＰＲ、Ｖｉｆである。
幾つかの実施形態では、ソース細胞由来タンパク質は、シクロフィリンＡ、熱ショック７０ｋＤ、ヒト伸長因子－１アルファ（ＥＦ－１Ｒ）、ヒストンＨ１、Ｈ２Ａ、Ｈ３、Ｈ４、ベータグロビン、トリプシン前駆体、パルブリン、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ、Ｌｃｋ、ユビキチン、ＳＵＭＯ－１、ＣＤ４８、シンテニン－１、ヌクレオホスミン、異種核リボヌクレオプロテインＣ１／Ｃ２、ヌクレオリン、プロバブルＡＴＰ依存性ヘリカーゼＤＤＸ４８、マトリン－３、移行性ＥＲ ＡＴＰアーゼ、ＧＴＰ結合核タンパク質Ｒａｎ、異種核リボヌクレオプロテインＵ、インターロイキンエンハンサー結合因子２、オクタマー結合タンパク質を含む非ＰＯＵドメイン、ＲｕｖＢ様２、ＨＳＰ ９０－ｂ、ＨＳＰ ９０－ａ、伸長因子２、Ｄ－３－ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ、ａ－エノラーゼ、Ｃ－１－テトラヒドロ葉酸合成酵素、細胞質、ピルビン酸キナーゼ、アイソザイムＭ１／Ｍ２、ユビキチン活性化酵素Ｅ１、２６Ｓプロテアーゼ調節サブユニットＳ１０Ｂ、６０Ｓ酸性リボソームタンパク質Ｐ２、６０Ｓ酸性リボソームタンパク質Ｐ０、４０Ｓリボソームタンパク質ＳＡ、４０Ｓリボソームタンパク質Ｓ２、４０Ｓリボソームタンパク質Ｓ３、６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ４、６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ３、４０Ｓリボソームタンパク質Ｓ３ａ、４０Ｓリボソームタンパク質Ｓ７、６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ７ａ、６０Ｓ酸性リボソームタンパク質Ｌ３１、６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ１０ａ、６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ６、２６Ｓプロテアソーム非ＡＴＰアーゼ調節サブユニット１、チューブリンｂ－２鎖、アクチン、細胞質１、アクチン、大動脈平滑筋、チューブリンａ－ユビキタス鎖、クラスリン重鎖１、ヒストンＨ２Ｂ．ｂ、ヒストンＨ４、ヒストンＨ３．１、ヒストンＨ３．３、ヒストンＨ２Ａタイプ８、２６Ｓプロテアーゼ調節サブユニット６Ａ、ユビキチン－４、ＲｕｖＢ様１、２６Ｓプロテアーゼ調節サブユニット７、ロイシル－ｔＲＮＡ合成酵素、細胞質、６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ１９、２６Ｓプロテアソーム非ＡＴＰアーゼ調節サブユニット１３、ヒストンＨ２Ｂ．Ｆ、Ｕ５小核リボヌクレオプロテイン２００ｋＤａヘリカーゼ、ポリ［ＡＤＰ－リボース］ポリメラーゼ－１、ＡＴＰ依存性ＤＮＡヘリカーゼＩＩ、ＤＮＡ複製ライセンス因子ＭＣＭ５、ヌクレアーゼ感受性エレメント結合タンパク質１、ＡＴＰ依存性ＲＮＡヘリカーゼＡ、インターロイキンエンハンサー結合因子３、転写伸長因子Ｂポリペプチド１、Ｐｒｅ－ｍＲＮＡプロセシングスプライシング因子８、タンパク質を含むブドウ球菌ヌクレアーゼドメイン１、プログラム化細胞死６－相互作用タンパク質、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写サブユニット８ホモログのメディエーター、核ＲＮＡヘリカーゼＩＩ、エンドプラスミン、ＤｎａＪホモログサブファミリーＡメンバー１、熱ショック７０ｋＤａタンパク質１Ｌ、Ｔ－複合タンパク質１ ｅサブユニット、ＧＣＮ１様タンパク質１、セロトランスフェリン、フルクトース二リン酸アルドラーゼＡ、イノシン－５’一リン酸デヒドロゲナーゼ２、２６Ｓプロテアーゼ調節サブユニット６Ｂ、脂肪酸合成酵素、ＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ触媒サブユニット、４０Ｓリボソームタンパク質Ｓ１７、６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ７、６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ１２、６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ９、４０Ｓリボソームタンパク質Ｓ８、４０Ｓリボソームタンパク質Ｓ４ Ｘアイソフォーム、６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ１１、２６Ｓプロテアソーム非ＡＴＰａｓｅ調節サブユニット２、コートマーａサブユニット、ヒストンＨ２Ａ．ｚ、ヒストンＨ１．２、ダイニン重鎖細胞質ゾルである。Ｓａｐｈｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００５、及びＷｈｅｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，２００７を参照。
幾つかの実施形態では、レトロウイルスベクターはペグ化されている。
粒径
幾つかの実施形態では、レトロウイルスベクターの直径の中央値は、１０～１０００ｎＭ、２５～５００ｎｍ、４０～３００ｎｍ、５０～２５０ｎｍ、６０～２２５ｎｍ、７０～２００ｎｍ、８０～１７５ｎｍ、又は９０～１５０ｎｍである。
幾つかの実施形態では、レトロウイルスベクターの９０％は、レトロウイルスの直径の中央値の５０％以内に入る。幾つかの実施形態では、レトロウイルスベクターの９０％は、レトロウイルスの直径の中央値の２５％以内に入る。幾つかの実施形態では、レトロウイルスベクターの９０％は、レトロウイルスの直径の中央値の２０％以内に入る。幾つかの実施形態では、レトロウイルスベクターの９０％は、レトロウイルスの直径の中央値の１５％以内に入る。幾つかの実施形態では、レトロウイルスベクターの９０％は、レトロウイルスの直径の中央値の１０％以内に入る。
ＸＩ．適応症及び使用法
本明細書に記載のフソソーム、レトロウイルスベクター、ＶＬＰ、又は医薬組成物を、被験体、例えば、哺乳動物、例えば、ヒトに投与することができる。かかる実施形態では、被験体は、特定の疾患又は状態（例えば、本明細書に記載の疾患又は状態）のリスクがあるか、症状があるか、又は診断され得るか、又はそうであると識別され得る。幾つかの実施形態では、疾患は、遺伝子欠損症、例えば、表５又は表６に列挙される遺伝子欠損症である。
本開示はまた、特定の態様では、被験体（例えば、ヒト被験体）、標的組織、又は細胞にフソソーム組成物を投与する方法であって、本明細書に記載の複数のフソソームを含むフソソーム組成物、本明細書に記載のフソソーム組成物、又は本明細書に記載の医薬組成物を被験体に投与すること、又はそれと標的組織若しくは細胞を接触させることを含み、それによって被験体にフソソーム組成物を投与する、方法を提供する。
本開示はまた、特定の態様では、治療剤（例えば、ポリペプチド、核酸、代謝産物、細胞小器官、又は細胞内構造物）を被験体、標的組織、又は細胞に送達する方法であって、本明細書に記載の複数のフソソーム、本明細書に記載の複数のフソソームを含むフソソーム組成物、本明細書に記載のフソソーム組成物、又は本明細書に記載の医薬組成物を、被験体に投与すること、又はそれを標的組織若しくは細胞と接触させることを含み、治療剤が送達されるような量及び／又は時間でフソソーム組成物が投与される、方法を提供する。
本開示はまた、特定の態様では、機能を被験体、標的組織、又は細胞に送達する方法であって、本明細書に記載の複数のフソソーム、本明細書に記載の複数のフソソームを含むフソソーム組成物、本明細書に記載のフソソーム組成物、又は本明細書に記載の医薬組成物を、被験体に投与すること、又はそれを標的組織若しくは細胞と接触させることを含み、機能が送達されるような量及び／又は時間でフソソーム組成物が投与される、方法を提供する。
哺乳動物（例えば、ヒト）組織に由来する標的細胞としては、上皮、結合、筋肉、又は神経の組織又は細胞、並びにそれらの組み合わせに由来する細胞が挙げられる。標的となる哺乳類（例、ヒト）の細胞及び臓器系には、心臓血管系（心臓、血管系）、消化器系（食道、胃、肝臓、胆嚢、膵臓、腸、結腸、直腸、肛門）、内分泌系（視床下部、下垂体、松果体又は松果腺、甲状腺、副甲状腺、副腎）、排泄系（腎臓、尿管、膀胱）、リンパ系（リンパ、リンパ節、リンパ管、扁桃腺、アデノイド、胸腺、脾臓）、外皮系（皮膚、髪、爪）、筋肉系（例えば、骨格筋）、神経系（脳、脊髄、神経）’、生殖器系（卵巣、子宮、乳腺、精巣、精管、精嚢、前立腺）、呼吸器系（咽頭、喉頭、気管、気管支、肺、横隔膜）、骨格系（骨、軟骨）、及びそれらの組み合わせが含まれる。幾つかの実施形態では、非標的細胞又は臓器系は、心臓血管系（心臓、血管系）；消化器系（食道、胃、肝臓、胆嚢、膵臓、腸、結腸、直腸及び肛門）；内分泌系（視床下部、下垂体、松果体又は松果体、甲状腺、副甲状腺、副腎）；排泄システム（腎臓、尿管、膀胱）；リンパ系（リンパ、リンパ節、リンパ管、扁桃腺、咽頭扁桃、胸腺、脾臓）；外皮系（皮膚、髪、爪）；筋肉系（例えば、骨格筋）；神経系（脳、脊髄、神経）；生殖器系（卵巣、子宮、乳腺、精巣、精管、精嚢、前立腺）；呼吸器系（咽頭、喉頭、気管、気管支、肺、横隔膜）；骨格系（骨、軟骨）、及びそれらの組み合わせから選択される。
本明細書に記載の医薬組成物の投与は、経口、吸入、経皮又は非経口（静脈内、腫瘍内、腹腔内、筋肉内、腔内、及び皮下を含む）投与によるものであり得る。フソソームは、単独で投与することも、医薬組成物として製剤化することもできる。
実施形態では、フソソーム組成物は、標的細胞に対する効果を媒介し、効果は、少なくとも１、２、３、４、５、６若しくは７日、２、３若しくは４週間、又は１、２、３、６若しくは１２か月の間持続する。幾つかの実施形態（例えば、フソソーム組成物が外因性タンパク質を含む場合）では、効果は、１、２、３、４、５、６若しくは７日未満、２、３若しくは４週間、又は１、２、３、６若しくは１２か月の間持続する。
実施形態では、本明細書に記載のフソソーム組成物は、細胞又は組織、例えば、ヒトの細胞又は組織にｅｘ－ｖｉｖｏで送達される。
本明細書に記載のフソソーム組成物を、被験体、例えば、哺乳動物、例えば、ヒトに投与することができる。かかる実施形態では、被験体は、特定の疾患又は状態（例えば、本明細書に記載の疾患又は状態）のリスクがあるか、症状があるか、又は診断され得るか、又はそうであると識別され得る。
幾つかの実施形態では、フソソームの供給源は、フソソーム組成物が投与されるのと同じ被験体に由来するものである。他の実施形態では、供給源と被験体は異なる。例えば、フソソーム及びレシピエント組織の供給源は、自家（同じ被験体に由来）又は異種（異なる被験体に由来）であり得る。いずれの場合も、本明細書に記載のフソソーム組成物のドナー組織は、レシピエント組織とは異なる組織タイプであり得る。例えば、ドナー組織は筋肉組織であり得て、レシピエント組織は結合組織（例えば、脂肪組織）であり得る。他の実施形態では、ドナー組織及びレシピエント組織は、同じ又は異なるタイプであり得るが、異なる器官系からのものであり得る。
幾つかの実施形態では、フソソームは、膜融合を阻害するタンパク質の阻害物質と同時投与される。例えば、Ｓｕｐｐｒｅｓｓｙｎは細胞間融合を阻害するヒトタンパク質である（Ｓｕｇｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，「Ａ ｎｏｖｅｌ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｃｅｌｌ－ｃｅｌｌ ｆｕｓｉｏｎ」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ３：１４６２ ＤＯＩ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ０１４６２）。したがって、幾つかの実施形態では、フソソームは、サプレッシン（ｓｙｐｒｅｓｓｙｎ）の阻害剤、例えば、ｓｉＲＮＡ又は阻害性抗体と同時投与される。
本明細書に記載の組成物はまた、限定されるものではないが、以下を含む様々な他の生物の細胞又は組織の機能又は生理学を同様に調節するために使用され得る：家畜又は使役動物（ウマ、ウシ、ブタ、ニワトリ等）、ペット又は動物園の動物（ネコ、イヌ、トカゲ、トリ、ライオン、トラ、クマ等）、水産養殖動物（魚、カニ、エビ、カキ等）、植物種（樹木、作物、観賞用花等）、発酵種（サッカロミセス等）。本明細書に記載のフソソーム組成物は、かかる非ヒト供給源から作製され、非ヒト標的細胞若しくは組織、又は被験体に投与され得る。
フソソーム組成物は、標的に対して自家、同種異系、又は異種である可能性がある。
ＸＩＩ．追加の治療剤
幾つかの実施形態では、フソソーム組成物は、追加の作用物質、例えば、治療剤と共に、被験体、例えば、レシピエント、例えば、本明細書に記載のレシピエントに同時投与される。幾つかの実施形態では、同時投与される治療薬は、免疫抑制物質、例えば、糖質コルチコイド（例えば、デキサメタゾン）、細胞増殖抑制物質（例えば、メトトレキサート）、抗体（例えば、ムロモナブ－ＣＤ３）、又はイムノフィリンモジュレーター（例えば、シクロスポリン又はラパマイシン）である。実施形態では、免疫抑制物質は、フソソームの免疫介在性クリアランスを減少させる。幾つかの実施形態では、フソソーム組成物は、免疫賦活物質、例えば、アジュバント、インターロイキン、サイトカイン、又はケモカインと同時投与される。
幾つかの実施形態では、フソソーム組成物及び免疫抑制物質は、同じ時に投与され、例えば、同時に投与される。幾つかの実施形態では、フソソーム組成物は、免疫抑制物質の投与の前に投与される。幾つかの実施形態では、フソソーム組成物は、免疫抑制物質の投与後に投与される。
幾つかの実施形態では、免疫抑制物質は、イブプロフェン、アセトアミノフェン、シクロスポリン、タクロリムス、ラパマイシン、ミコフェノール酸、シクロホスファミド、グルココルチコイド、シロリムス、アザスリオピン、又はメトトレキサート等の小分子である。
幾つかの実施形態では、免疫抑制物質は、ムロノマブ（抗ＣＤ３）、ダクリズマブ（抗ＩＬ１２）、バシリキシマブ、インフリキシマブ（抗ＴＮＦａ）、又はリツキシマブ（抗ＣＤ２０）を含むがこれらに限定されない抗体分子である。
幾つかの実施形態では、免疫抑制物質とのフソソーム組成物の同時投与は、フソソーム組成物のみの投与と比較して、被験体におけるフソソーム組成物の持続性の増強をもたらす。幾つかの実施形態では、同時投与におけるフソソーム組成物の増強された持続性は、単独で投与された場合のフソソーム組成物の持続性と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上である。幾つかの実施形態では、同時投与におけるフソソーム組成物の増強された持続性は、単独で投与されたときのフソソーム組成物の生存と比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、１０、１５、２０、２５、又は３０日以上である。
以下の実施例は、本発明の理解を助けるために記載されているが、いかなる方法でもその範囲を制限することを意図しておらず、またそのように解釈されるべきではない。
実施例１．レトロウイルス核酸送達の特異性を検出するためのオフターゲット細胞のアッセイ
この実施例では、単一細胞のベクターコピー数を測定することにより、オフターゲットレシピエント細胞の核酸を定量する方法について説明する。
一実施形態では、処理されたマウスは、オフターゲット細胞において、未処理のマウスからのものと同様のベクターコピー数、例えば、ベクターがないか、又は陰性対照レベルと同様のベクター数を有する。一実施形態では、処理されたマウスは、未処理のマウスからのものと同様の割合のベクターを含むオフターゲット細胞を有し、例えば、細胞がないか、又は陰性対照レベルと同様の細胞数を有する。
この実施例では、オフターゲットのレシピエント細胞はＣＤ１１ｃ＋細胞である。ただし、このプロトコルは、適切な表面マーカーが存在し、被験体から分離できる任意の細胞タイプに適合させることができる。特に、本明細書に記載の方法は、プロトコルに最適化されたヒト、ラット、サルに等しく適用可能である可能性がある。
マウスは、本明細書に記載されるように産生されたレトロウイルスベクター又はＰＢＳ（陰性対照）で処理される。処理の２８日後、レトロウイルスベクターを受けたマウス及びＰＢＳ処理を受けたマウスから末梢血を採取する。血液を５μＭのＥＤＴＡを含む１ｍｌのＰＢＳに集め、凝固を防ぐためにすぐに混合する。チューブを氷上に保持し、赤血球を緩衝塩化アンモニウム（ＡＣＫ）溶液を使用して除去する。細胞を、細胞染色バッファー（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄカタログ番号：４２０２０１）中で１０分間、Ｆｃブロック（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ カタログ番号＃：１０１３１９）した後、マウスＣＤ１１ｃ：ＡＰＣ－Ｃｙ７抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ カタログ番号：１１７３２３）又はアイソタイプ対照ＡＰＣ－Ｃｙ７抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ カタログ番号：４００２３０）により、４℃、暗所で３０分間染色する。ＰＢＳで２回洗浄した後、細胞をＦＡＣＳＤｉｖａ（商標）ソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンノゼ）を実行して６４０ｎｍレーザー励起及び７８０－／＋６０ｎｍで収集される発光を用いて、ＦＡＣＳ Ａｒｉａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンノゼ）で分析し、アイソタイプ対照ＡＰＣ－Ｃｙ７抗体標識細胞を使用してネガティブゲートを設定する。ＡＰＣ－Ｃｙ７陽性細胞を、ベクターコピー数解析のためにプレートの単一ウェルに分類した。
ベクターのコピー数を、シングルセルネステッドＰＣＲを使用して評価する。ＰＣＲは、ベクター及び内因性対照遺伝子に特異的なプライマー及びプローブを使用したｑＰＣＲで実行される。ベクターのコピー数は、ベクターのｑＰＣＲシグナルの量を内因性対照遺伝子のｑＰＣＲシグナルの量で割ることによって決定される。ベクターを受け取った細胞は、少なくとも１．０のベクターコピー数を持つ。ベクターコピー数は、複数の細胞のベクターコピー数を平均することにより、集団全体で評価される。
幾つかの実施形態では、レトロウイルスベクターで処理されたマウスは、ビヒクルで処理されたマウスからのものと同様のオフターゲット細胞における平均ベクターコピー数を有する。幾つかの実施形態では、レトロウイルスベクターで処理されたマウスは、ビヒクルで処理されたマウスからのものと同様の割合のベクターを受け取ったオフターゲット細胞を有する。
実施例２．外因性タンパク質作用物質の送達の特異性を検出するためのオフターゲット細胞のアッセイ
この実施例は、単一細胞における外因性作用物質の発現による、オフターゲットレシピエント細胞における外因性作用物質の発現の定量化を説明する。
一実施形態では、処理されたマウスは、オフターゲット細胞において、未処理のマウスからのものと同様の外因性作用物質の発現を有する。一実施形態では、処理されたマウスは、未処理のマウスからのものと同様の外因性作用物質を発現するオフターゲット細胞の割合を有する。
この実施例では、オフターゲットのレシピエント細胞はＣＤ１１ｃ＋細胞である。ただし、このプロトコルは、適切な表面マーカーが存在し、被験体から分離できる任意の細胞タイプに適合させることができる。特に、本明細書に記載の方法は、プロトコルに最適化されたヒト、ラット、サルに等しく適用可能である可能性がある。この実施例では、外因性作用物質は蛍光タンパク質であり、発現はフローサイトメトリーによって測定される。他の実施形態では、外因性タンパク質作用物質の発現は、タンパク質の免疫染色で測定することができる。他の実施形態では、外因性タンパク質作用物質の発現は、顕微鏡検査又はウエスタンブロットを介して測定することができる。
マウスを、本出願に記載されている方法のいずれかを介して産生されたｔｄｔｏｍａｔｏ蛍光タンパク質作用物質を含むレトロウイルスベクター又はＰＢＳ（陰性対照）で処理する。処理の２８日後、レトロウイルスベクターを受けたマウス及びＰＢＳ処理を受けたマウスから末梢血を採取する。血液を５μＭのＥＤＴＡを含む１ｍｌのＰＢＳに集め、凝固を防ぐためにすぐに混合する。チューブを氷上に保持し、赤血球を緩衝塩化アンモニウム（ＡＣＫ）溶液を使用して除去する。細胞を、細胞染色バッファー（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄカタログ番号：４２０２０１）中で１０分間、Ｆｃブロック（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ カタログ番号＃：１０１３１９）した後、マウスＣＤ１１ｃ：ＡＰＣ－Ｃｙ７抗体（Ｂｉｏｌｇｅｎｄ カタログ番号：１１７３２３）又はアイソタイプ対照ＡＰＣ－Ｃｙ７抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ カタログ番号：４００２３０）により、４℃、暗所で３０分間染色する。ＰＢＳで２回洗浄した後、ＦＡＣＳＤｉｖａ（商標）ソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンノゼ）を実行してＦＡＣＳ Ａｒｉａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンノゼ）で細胞を分析する。ＣＤ１１ｃのネガティブゲートは、アイソタイプ対照ＡＰＣ－Ｃｙ７抗体標識細胞を使用し、６４０ｎｍのレーザー励起及び７８０－／＋６０で収集された発光で設定される。ｔｄｔｏｍａｔｏ発現のネガティブゲートは、ビヒクルで処理されたマウスから単離された細胞、並びに５５２ｎｍレーザー励起及び５８５－／＋４２ｎｍで収集された発光で設定される。
ｔｄｔｏｍａｔｏ陽性のＣＤ１１ｃ＋細胞の割合を測定する。幾つかの実施形態では、ｔｄｔｏｍａｔｏ陽性であるＣＤ１１ｃ＋細胞の割合は、処理されたマウス及び未処理のマウスからの細胞において類似している。ｔｄｔｏｍａｔｏ蛍光レベルの中央値をＣＤ１１ｃ＋細胞で測定する。幾つかの実施形態では、ＣＤ１１ｃ＋細胞における中央値ｔｄｔｏｍａｔｏ蛍光レベルは、処理されたマウス及び未処理のマウスからの細胞において類似している。
実施例３．レトロウイルス核酸送達の特異性を検出するための標的細胞のアッセイ
この実施例では、単一細胞のベクターコピー数を測定することにより、標的レシピエント細胞の核酸を定量する方法について説明する。
一実施形態では、処理されたマウスは、未処理のマウスからのものよりも、標的細胞においてより多いベクターコピー数を有する。一実施形態では、処理されたマウスは、未処理のマウスからのものよりも、ベクターを含む標的細胞の割合が大きい。
この実施例では、標的レシピエント細胞はＣＤ３＋細胞である。ただし、このプロトコルは、適切な表面マーカーが存在し、被験体から分離できる任意の細胞タイプに適合させることができる。特に、本明細書に記載の方法は、プロトコルに最適化されたヒト、ラット、サルに等しく適用可能である可能性がある。
マウスをレトロウイルスベクターで処理し、上記の実施例１に記載したように血液サンプルを収集する。細胞を、マウスＣＤ３：ＡＰＣ－Ｃｙ７抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄカタログ番号：１００３３０）又は上記の実施例１で説明したプロトコルを使用したアイソタイプ対照で染色する。ベクターコピー数は、実施例１に記載されているように、単一細胞ネステッドＰＣＲを使用して評価される。
幾つかの実施形態では、レトロウイルスベクターで処理されたマウスは、ビヒクルで処理されたマウスからのものよりも標的細胞においてより大きな平均ベクターコピー数を有する。幾つかの実施形態では、レトロウイルスベクターで処理されたマウスは、ビヒクルで処理されたマウスからのものよりも、ベクターを受け取った標的細胞の割合が高い。
実施例４．外因性タンパク質作用物質の送達の特異性を検出するための標的細胞のアッセイ
この実施例は、単一細胞における外因性タンパク質作用物質の発現による、標的レシピエント細胞における外因性タンパク質作用物質の発現の定量化を説明する。
一実施形態では、処理されたマウスは、未処理のマウスからのものよりも、標的細胞においてより大きな外因性タンパク質作用物質の発現を有する。一実施形態では、処理されたマウスは、未処理のマウスからのものよりも、外因性タンパク質作用物質を発現する標的細胞の割合が高い。
この実施例では、標的レシピエント細胞はＣＤ３＋細胞である。ただし、このプロトコルは、適切な表面マーカーが存在し、被験体から分離できる任意の細胞タイプに適合させることができる。特に、本明細書に記載の方法は、プロトコルに最適化されたヒト、ラット、サルに等しく適用可能である可能性がある。この実施例では、外因性タンパク質作用物質は蛍光タンパク質であり、発現はフローサイトメトリーによって測定される。他の実施形態では、外因性タンパク質作用物質の発現は、タンパク質の免疫染色で測定することができる。他の実施形態では、外因性タンパク質作用物質の発現は、顕微鏡検査又はウエスタンブロットを介して測定することができる。
マウスをレトロウイルスベクターで処理し、上記の実施例２に記載のように血液サンプルを収集する。細胞をマウスＣＤ３：ＡＰＣ－Ｃｙ７抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄカタログ番号：１００３３０）又はアイソタイプ対照で染色し、実施例２に記載されているプロトコルを使用してフローサイトメトリーで分析する。
ｔｄｔｏｍａｔｏ陽性のＣＤ３＋細胞の割合を測定する。幾つかの実施形態では、ｔｄｔｏｍａｔｏ陽性であるＣＤ３＋細胞の割合は、未処理のマウスよりも処理されたマウスからの細胞においてより大きい。ｔｄｔｏｍａｔｏ蛍光レベルの中央値をＣＤ３＋細胞で測定する。幾つかの実施形態では、ＣＤ３＋細胞における中央値ｔｄｔｏｍａｔｏ蛍光レベルは、未処理のマウスよりも処理されたマウスからの細胞においてより大きい。
実施例５．ＰＢＭＣ細胞溶解によって媒介される細胞毒性の低下のためのＨＬＡ－Ｇ又はＨＬＡ－Ｅによるレトロウイルスベクターの修飾
この実施例は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）による細胞溶解に起因して細胞毒性が低下するように改変された細胞に由来するレトロウイルスベクターを記載している。
一実施形態では、ＰＢＭＣによるレトロウイルスベクターの細胞毒性媒介細胞溶解は、溶解がレトロウイルスベクターの活性を低下させる、例えば、阻害又は停止することから、レトロウイルスベクターの免疫原性の尺度である。
レトロウイルスベクターを、未修飾細胞（以下、ＮＭＣ、陽性対照）、ＨＬＡ－Ｇ又はＨＬＡ－Ｅ ｃＤＮＡをトランスフェクトした細胞（以下、ＮＭＣ－ＨＬＡ－Ｇ）、及び空ベクター対照をトランスフェクトした細胞（以下、ＮＭＣ－空ベクター、陰性対照）から作製する。
レトロウイルスベクターのＰＢＭＣを介した溶解は、Ｂｏｕｍａ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３５（２）：８５－９２；１９９２＆ｖａｎ Ｂｅｓｏｕｗ ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ７０（１）：１３６－１４３；２０００に記載されている。ＰＢＭＣ（以下、エフェクター細胞）を適切なドナーから分離し、同種異系ガンマ線照射ＰＭＢＣ及び２００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２（プロロイキン、Ｃｈｉｒｏｎ ＢＶ、オランダ国アムステルダム）を用いて丸底９６ウェルプレートで３７℃で７日間刺激する。レトロウイルスベクターは、ユーロピウム－ジエチレントリアミンペンタアセテート（ＤＴＰＡ）（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）で標識されている。
７日目に、細胞毒性媒介溶解アッセイを、１０００：１～１：１及び１：１．２５～１：１０００の範囲のエフェクター／ターゲット比でプレーティングしてから１、２、３、４、５、６、８、１０、１５、２０、２４、又は４８時間後に、６３Ｅｕ標識レトロウイルスベクターをエフェクター細胞と共に９６ウェルプレートでインキュベートすることにより行う。インキュベーション後、プレートを遠心分離し、上清のサンプルをバックグラウンド蛍光の低い９６ウェルプレート（フルオロイムノプレート、Ｎｕｎｃ、デンマーク国ロスキレ）に移す。
続いて、エンハンスメントソリューション（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、オランダ国フローニンゲン）を各ウェルに加える。放出されたユーロピウムを、時間分解蛍光光度計（Ｖｉｃｔｏｒ １４２０マルチラベルカウンター、ＬＫＢ－Ｗａｌｌａｃ、フィンランド国）で測定する。蛍光は１秒あたりのカウント数（ＣＰＳ）で表される。標的レトロウイルスベクターによるユーロピウムの最大放出パーセントは、適切な数（１×１０２～１×１０８）のレトロウイルスベクターを１％ｔｒｉｔｏｎ（ｓｉｇｍａ－ａｌｄｒｉｃｈ）と適切な時間インキュベートすることによって決定される。標的レトロウイルスベクターによるユーロピウムの自発的放出は、エフェクター細胞を含まない標識された標的レトロウイルスベクターのインキュベーションによって測定される。次に、漏れ率は次のように計算される：（自然放出／最大放出）×１００％。細胞毒性を介した溶解の割合は、％溶解＝［（測定された溶解－自発的溶解－自発的放出）／（最大放出－自発的放出）］×１００％として計算される。データを様々なエフェクターターゲット比の関数として溶解の割合を調べることによって分析する。
一実施形態では、ＮＭＣ－ＨＬＡ－Ｇ細胞から生成されたレトロウイルスベクターは、ＮＭＣ又はＮＭＣ－空ベクターから生成されたレトロウイルスベクターと比較して、特定の時点での標的細胞による溶解の割合が減少する。
実施例６．ＮＫ溶解活性を低下させるためのＨＬＡ－Ｇ又はＨＬＡ－Ｅによるレトロウイルスベクターの改変
この実施例は、ＮＫ細胞による細胞毒性媒介性細胞溶解を減少させるように改変された細胞源に由来するレトロウイルスベクター組成物の生成を説明する。一実施形態では、ＮＫ細胞によるレトロウイルスベクターの細胞毒性媒介細胞溶解は、レトロウイルスベクターの免疫原性の尺度である。
レトロウイルスベクターを、未修飾細胞（以下、ＮＭＣ、陽性対照）、ＨＬＡ－Ｇ又はＨＬＡ－Ｅ ｃＤＮＡをトランスフェクトした細胞（以下、ＮＭＣ－ＨＬＡ－Ｇ）、及び空ベクター対照をトランスフェクトした細胞（以下、ＮＭＣ－空ベクター、陰性対照）から作製する。
レトロウイルスベクターのＮＫ細胞を介した溶解は、Ｂｏｕｍａ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３５（２）：８５－９２；１９９２＆ｖａｎ Ｂｅｓｏｕｗ ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ７０（１）：１３６－１４３；２０００に記載されている。Ｃｒｏｐ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ（２０）：１５４７－１５５９；２０１１に従って、ＮＫ細胞（以下、エフェクター細胞）を適切なドナーから分離し、同種異系ガンマ線照射ＰＭＢＣ及び２００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２（プロロイキン、Ｃｈｉｒｏｎ ＢＶ、オランダ国アムステルダム）を用いて丸底９６ウェルプレートで３７℃で７日間刺激する。レトロウイルスベクターは、ユーロピウム－ジエチレントリアミンペンタアセテート（ＤＴＰＡ）（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）で標識されている。細胞毒性を介した溶解アッセイ及びデータ分析を、上記の実施例５に記載されているように実施する。
一実施形態では、ＮＭＣ－ＨＬＡ－Ｇ細胞から生成されたレトロウイルスベクターは、ＮＭＣ又はＮＭＣ－空ベクターから生成されたレトロウイルスベクターと比較して、特定の時点での標的細胞による溶解の割合が減少する。
実施例７．ＣＤ８キラーＴ細胞溶解を減少させるためのＨＬＡ－Ｇ又はＨＬＡ－Ｅによるレトロウイルスベクターの改変
この実施例は、ＣＤ８＋細胞による細胞毒性媒介性細胞溶解を減少させるように改変された細胞源に由来するレトロウイルスベクター組成物の生成を説明する。一実施形態では、ＣＤ８＋細胞によるレトロウイルスベクターの細胞毒性媒介細胞溶解は、レトロウイルスベクターの免疫原性の尺度である。
レトロウイルスベクターを、未修飾細胞（以下、ＮＭＣ、陽性対照）、ＨＬＡ－Ｇ又はＨＬＡ－Ｅ ｃＤＮＡをトランスフェクトした細胞（以下、ＮＭＣ－ＨＬＡ－Ｇ）、及び空ベクター対照をトランスフェクトした細胞（以下、ＮＭＣ－空ベクター、陰性対照）から作製する。
レトロウイルスベクターのＣＤ８＋細胞を介した溶解は、Ｂｏｕｍａ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３５（２）：８５－９２；１９９２＆ｖａｎ Ｂｅｓｏｕｗ ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ７０（１）：１３６－１４３；２０００に記載されている。Ｃｒｏｐ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ（２０）：１５４７－１５５９；２０１１に従って、ＣＤ８＋細胞（以下、エフェクター細胞）を適切なドナーから分離し、同種異系ガンマ線照射ＰＭＢＣ及び２００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２（プロロイキン、Ｃｈｉｒｏｎ ＢＶ、オランダ国アムステルダム）を用いて丸底９６ウェルプレートで３７℃で７日間刺激する。レトロウイルスベクターは、ユーロピウム－ジエチレントリアミンペンタアセテート（ＤＴＰＡ）（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）で標識されている。細胞毒性を介した溶解アッセイ及びデータ分析を、上記の実施例５に記載されているように実施する。
一実施形態では、ＮＭＣ－ＨＬＡ－Ｇ細胞から生成されたレトロウイルスベクターは、ＮＭＣ又はＮＭＣ－空ベクターから生成されたレトロウイルスベクターと比較して、特定の時点での標的細胞による溶解の割合が減少する。
実施例８：マクロファージ食作用を回避するためのＣＤ４７によるレトロウイルスベクターの改変
この実施例は、改変レトロウイルスベクターによる食作用の回避の定量化を説明する。一実施形態では、改変されたレトロウイルスベクターは、マクロファージによる食作用を回避するであろう。
細胞は食作用に関与し、粒子を貪食し、バクテリア又は死細胞等の外来侵入者の隔離及び破壊を可能にする。幾つかの実施形態では、マクロファージによるレンチウイルスベクターの食作用は、それらの活性を低下し得る。幾つかの実施形態では、レンチウイルスベクターの食作用は、レトロウイルスベクターの免疫原性の尺度である。
レトロウイルスベクターは、ＣＤ４７を欠く細胞（以下、ＮＭＣ、陽性対照）、ＣＤ４７ ｃＤＮＡをトランスフェクトした細胞（以下、ＮＭＣ－ＣＤ４７）、及び空ベクター対照をトランスフェクトした細胞（以下、ＮＭＣ－空ベクター、陰性対照）から産生される。レトロウイルスベクターを作製する前に、細胞をＣＳＦＥで標識する。
マクロファージを介した免疫クリアランスの低下は、以下のプロトコルに従った食作用アッセイで決定される。マクロファージを、採取後すぐに共焦点ガラス底皿に蒔く。マクロファージをＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓで１時間インキュベートして付着させる。ＮＭＣ、ＮＭＣ－ＣＤ４７、ＮＭＣ－空ベクターから産生された適切な数のレトロウイルスベクターを、プロトコルに示されているようにｔｏｏｌｓ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｓｆｓ／ｍａｎｕａｌｓ／ｍｐ０６６９４．ｐｄｆ、マクロファージに加え、２時間インキュベートする。
２時間後、ディッシュを穏やかに洗浄し、細胞内蛍光を調べる。貪食されたレトロウイルス粒子によって放出された細胞内蛍光を、４８８励起で共焦点顕微鏡によって画像化する。食作用陽性マクロファージの数を、イメージングソフトウェアを使用して定量化する。データは、食作用指数＝（貪食された細胞の総数／カウントされたマクロファージの総数）×（貪食された細胞を含むマクロファージの数／カウントされたマクロファージの総数）×１００として表される。
一実施形態では、マクロファージが、ＮＭＣに由来するベクター又はＮＭＣ空ベクターと比較して、ＮＭＣ－ＣＤ４７に由来するレトロウイルスベクターと共にインキュベートされると、食作用指数が低下する。
実施例９：補体を回避するための補体調節タンパク質によるレトロウイルスベクターの改変
この実施例は、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを使用したレトロウイルスベクターに対する補体活性の定量化を説明する。幾つかの実施形態では、本明細書に記載の改変レトロウイルスベクターは、改変されていないレトロウイルスベクターと比較して、補体活性が低下している。
この実施例では、マウスからの血清を、レトロウイルスベクターに対する補体活性について評価する。この実施例では、全ての補体経路の中心ノードである補体Ｃ３ａのレベルを測定する。本明細書に記載の方法は、プロトコルに最適化されたヒト、ラット、サルに等しく適用可能である可能性がある。
この実施例では、レトロウイルスベクターは、補体調節タンパク質ＤＡＦをコードするｃＤＮＡでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３－ＤＡＦレトロウイルスベクター）又は相補的（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）調節タンパク質を発現しないＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３レトロウイルスベクター）から生成される。他の実施形態では、崩壊促進因子（ＤＡＦ、ＣＤ５５）に結合するタンパク質、例えばＨ因子（ＦＨ）様タンパク質－１（ＦＨＬ－１）、例えばＣ４ｂ結合タンパク質（Ｃ４ＢＰ）、例えば、補体受容体１（ＣＤ３５）、例えば、メンブレンコファクタータンパク質（ＭＣＰ、ＣＤ４６）、例えば、プロフェクチン（ＣＤ５９）、例えば古典的及び代替補体経路ＣＤ／Ｃ５コンバターゼ酵素を阻害するタンパク質、例えばＭＡＣアッセンブリを調節するタンパク質等の他の補体調節タンパク質を使用することができる。
血清を、ナイーブマウス、ＨＥＫ２９３－ＤＡＦレトロウイルスベクターを投与されたマウス、又はＨＥＫ２９３レトロウイルスベクターを投与されたマウスから回収する。血清を、新鮮な全血を採取し、数時間完全に凝固させることによって、マウスから収集する。遠心分離により血餅をペレット化し、血清上清を除去する。陰性対照は、熱不活化マウス血清である。陰性対照サンプルを、摂氏５６度で１時間加熱する。血清をアリコートで冷凍することができる。
標的細胞集団の細胞の５０％がレトロウイルスベクターの外因性作用物質を受ける用量について、異なるレトロウイルスベクターを試験する。レトロウイルスベクターは、本明細書に記載の外因性作用物質のいずれかを含み得る。レシピエント細胞への外因性作用物質のレトロウイルス送達をアッセイするための多くの方法もまた、本明細書に記載されている。この特定の例では、外因性作用物質はＣｒｅタンパク質（レトロウイルス核酸によってコードされる）であり、標的細胞は、ＣＭＶプロモーターの下で「ＬｏｘＰ－ＧＦＰ－ｓｔｏｐ－ＬｏｘＰ－ＲＦＰ」カセットを安定して発現するＲＰＭＩ８２２６細胞であり、Ｃｒｅによる組換えにより送達のマーカーとして、ＧＦＰからＲＦＰ発現に切り替わる。レシピエント細胞の５０％がＲＦＰ陽性であると特定された用量を、更なる実験に使用する。幾つかの実施形態では、レシピエント細胞の５０％が外因性作用物質を受けることが特定された用量は、レトロウイルスベクター全体で類似しているであろう。
標的細胞の５０％が外因性作用物質を受けるレトロウイルスベクターの用量で開始する、レトロウイルスベクターのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）での２倍希釈物を、同じレトロウイルスベクター又はナイーブマウス（アッセイ容量、２０μＬ）で処理したマウスからの血清の１：１０希釈液と混合し、３７℃で１時間インキュベートする。サンプルを更に１：５００に希釈し、Ｃ３ａに特異的な酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）で使用する。ＥＬＩＳＡは、ＬｉｆｅＳｐａｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃが販売しているマウス補体Ｃ３ａ ＥＬＩＳＡキット製品ＬＳ－Ｆ４２１０であり、サンプル中のＣ３ａの濃度を測定する。２００ｐｇ／ｍｌのＣ３ａが存在するレトロウイルスベクターの用量を、マウスから単離された血清全体で比較する。
幾つかの実施形態では、２００ｐｇ／ｍｌのＣ３ａが存在するレトロウイルスベクターの用量は、ＨＥＫ２９３マウス血清とインキュベートしたＨＥＫ２９３レトロウイルスベクターよりもＨＥＫ－２９３ ＤＡＦマウス血清とインキュベートしたＨＥＫ２９３－ＤＡＦレトロウイルスベクターの方が多く、レトロウイルスベクターを標的とする補体活性はＨＥＫ２９３－ＤＡＦレトロウイルスベクターよりもＨＥＫ２９３レトロウイルスベクターで処理されたマウスにおいて大きいことを示す。幾つかの実施形態では、２００ｐｇ／ｍｌのＣ３ａが存在するレトロウイルスベクターの用量は、ナイーブマウス血清とインキュベートしたＨＥＫ２９３レトロウイルスベクターよりもナイーブマウス血清とインキュベートしたＨＥＫ２９３－ＤＡＦレトロウイルスベクターの方が多く、レトロウイルスベクターを標的とする補体活性はＨＥＫ２９３－ＤＡＦレトロウイルスベクターよりもＨＥＫ２９３レトロウイルスベクターで処理されたマウスにおいて大きいことを示す。
実施例１０：免疫原性を低下させるための免疫原性タンパク質をノックダウンするためのレトロウイルスベクターの改変
この実施例は、免疫原性である分子の発現を減少させるように改変された細胞源に由来するレトロウイルスベクター組成物の生成、及び発現現象の定量化を説明する。一実施形態では、レトロウイルスベクターは、免疫原性である分子の発現を低下させるように改変された細胞源に由来し得る。
免疫反応を賦活する治療法は、治療効果を低下させるか、又はレシピエントに毒性を引き起こす可能性がある。そのため、免疫原性は、安全で効果的な治療用レトロウイルスベクターにとって重要な特性である。特定の免疫活性化剤の発現は、免疫反応を引き起こす可能性がある。ＭＨＣクラスＩは、免疫活性化剤の一例である。
レトロウイルスベクターは、正常にＭＨＣ－１を発現する未改変細胞（以下、ＮＭＣ、陽性対照）、ＭＨＣクラスＩを標的とするｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡをトランスフェクトした細胞（以下、ＮＭＣ－ｓｈＭＨＣクラスＩ）、及び非標的スクランブルｓｈＲＮＡベクター対照（以下、ＮＭＣ－ベクター対照、陰性対照）をコードするＤＮＡでトランスフェクトされた細胞から産生される。レトロウイルス産生の前に、細胞をＣＳＦＥで標識する。
レトロウイルスベクターを、フローサイトメトリーを使用してＭＨＣクラスＩの発現についてアッセイする。適切な数のレトロウイルスベクターを洗浄し、ＰＢＳに再懸濁し、ＭＨＣクラスＩに対する蛍光標識モノクローナル抗体（Ｈａｒｌａｎ Ｓｅｒａ－Ｌａｂ、英国ベルトン）の１：１０＝１：４０００希釈液と共に氷上で３０分間保持する。レトロウイルスベクターをＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳに再懸濁する。非特異的蛍光は、同等の希釈率で適切な蛍光標識アイソタイプ対照抗体とインキュベートしたレトロウイルスベクター調製物の等量を使用して決定される。レトロウイルスベクターをフローサイトメーター（ＦＡＣＳｏｒｔ、Ｂｅｃｔｏｎ－Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）でアッセイし、データをフロー分析ソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ－Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で分析する。
ＮＭＣ、ＮＭＣ－ｓｈＭＨＣクラスＩ、及びＮＭＣ－ベクター対照に由来するレトロウイルスベクターの平均蛍光データを比較する。一実施形態では、ＮＭＣ－ｓｈＭＨＣクラスＩに由来するレトロウイルスベクターは、ＮＭＣ及びＮＭＣ－ベクター対照と比較して、ＭＨＣクラスＩの発現が低いであろう。
実施例１１：レトロウイルスベクターの既存の血清不活化の測定
この実施例は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ送達アッセイを使用したレトロウイルスベクターの既存の血清不活化の定量化を説明する。
幾つかの実施形態では、レトロウイルスベクターの免疫原性の尺度は、血清不活化である。レトロウイルスベクターの血清不活化は、抗体を介した中和又は補体を介した分解が原因である可能性がある。一実施形態では、本明細書に記載のレトロウイルスベクターの一部のレシピエントは、それらの血清中にレトロウイルスベクターに結合して不活化する因子を有するであろう。
この実施例では、レトロウイルスベクターナイーブマウスを、血清中のレトロウイルスベクターを不活化する因子の存在について評価する。特に、本明細書に記載の方法は、プロトコルに最適化されたヒト、ラット、サルに等しく適用可能である可能性がある。
陰性対照は熱不活化マウス血清であり、陽性対照は異種ソース細胞から生成されたレトロウイルスベクターの複数回の注射を受けたマウスに由来する血清である。血清を、新鮮な全血を採取し、数時間完全に凝固させることによって、マウスから収集する。遠心分離により血餅をペレット化し、血清上清を除去する。陰性対照サンプルを、摂氏５６度で１時間加熱する。血清をアリコートで冷凍することができる。
実施例９に記載されるように、標的細胞集団の細胞の５０％がレトロウイルスベクターの外因性作用物質を受ける用量について、レトロウイルスベクターを試験する。
レトロウイルスベクターの血清不活化を評価するために、レトロウイルスベクターを正常又は熱不活化血清（又は非血清対照として１０％熱不活化ＦＢＳを含む培地）に１：５に希釈し、混合物を３７℃で１時間インキュベートする。インキュベーション後、培地を反応液に加えて更に１：５に希釈し、１：１０の比率で２回段階希釈する。この工程に続いて、レトロウイルスベクターは、レシピエント細胞の５０％が外因性作用物質を受け取った（例えば、ＲＦＰ陽性である）以前に特定された用量で存在するはずである。
次に、血清に曝露されたレトロウイルスベクターを標的細胞とインキュベートする。外因性作用物質を受け取り、したがってＲＦＰ陽性である細胞の割合を計算する。幾つかの実施形態では、外因性作用物質を受ける細胞の割合は、レトロウイルスベクターナイーブマウスからの血清及び熱不活化血清と共にインキュベートされたレトロウイルスベクターサンプル間で異ならず、レトロウイルスベクターの血清不活化がないことを示す。幾つかの実施形態では、外因性作用物質を受ける細胞の割合は、レトロウイルスベクターナイーブマウスからの血清と共にインキュベートされたレトロウイルスベクターサンプルと無血清対照インキュベーションの間で異ならず、レトロウイルスベクターの血清不活化がないことを示す。幾つかの実施形態では、外因性作用物質を受ける細胞の割合は、レトロウイルスベクターナイーブマウスからの血清と共にインキュベートされたレトロウイルスベクターサンプルよりも、陽性対照血清と共にインキュベートされたレトロウイルスベクターサンプルにおいてより少なく、レトロウイルスベクターの血清不活化がないことを示す。
実施例１２：複数回投与後のレトロウイルスベクターの血清不活化の測定
この実施例は、レトロウイルスベクターの複数回投与後のｉｎ ｖｉｔｒｏ送達アッセイを使用したレトロウイルスベクターの血清不活化の定量化を説明する。一実施形態では、改変ウイルスベクター、例えば、本明細書に記載の方法によって改変されたものは、複数回（例えば、１より多い、例えば、２回以上）の改変レトロウイルスベクターの投与に続いて、血清不活化の減少を有する（例えば、未改変レトロウイルスベクターの投与と比較して減少する）であろうと考えられる。一実施形態では、本明細書に記載のレトロウイルスベクターは、複数回の投与後に血清によって不活化されないであろう。
幾つかの実施形態では、レトロウイルスベクターの免疫原性の尺度は、血清不活化である。一実施形態では、レトロウイルスベクターの反復注射は、抗レトロウイルスベクター抗体、例えば、レトロウイルスベクターを認識する抗体の開発につながる可能性がある。一実施形態では、レトロウイルスベクターを認識する抗体は、レトロウイルスベクターの活性又は寿命を制限し、補体分解を媒介できる方法で結合することができる。
この実施例では、レトロウイルスベクターの１回以上の投与後に血清不活化を調べる。レトロウイルスベクターは、前の実施例のいずれかによって産生される。この例では、レトロウイルスは、ＨＬＡ－Ｇ又はＨＬＡ－Ｅ ｃＤＮＡでトランスフェクトされた細胞（以下、ＮＭＣ－ＨＬＡ－Ｇ）、及び空ベクター対照（以下、ＮＭＣ－空ベクター、陰性対照）でトランスフェクトされた細胞から作製される。幾つかの実施形態では、レトロウイルスベクターは、他の免疫調節タンパク質を発現している細胞に由来する。
血清を、様々なコホートから採取する：ビヒクル（レトロウイルスベクターナイーブ群）、ＨＥＫ２９３－ＨＬＡ－Ｇレトロウイルスベクター、又はＨＥＫ２９３レトロウイルスベクターを１、２、３、５、１０回全身及び／又は局所注射したマウス。血清を、新鮮な全血を採取し、数時間完全に凝固させることによって、マウスから収集する。遠心分離により血餅をペレット化し、血清上清を除去する。陰性対照は、熱不活化マウス血清である。陰性対照サンプルを、摂氏５６度で１時間加熱する。血清をアリコートで冷凍することができる。
実施例９に記載されるように、標的細胞集団の細胞の５０％がレトロウイルスベクターの外因性作用物質を受ける用量について、レトロウイルスベクターを試験する。
レトロウイルスベクターの血清不活化を評価するために、レトロウイルスベクターを血清に曝露し、上記の実施例１１に記載されているように標的細胞とインキュベートする。
外因性作用物質を受け取り、したがってＲＦＰ陽性である細胞の割合を計算する。幾つかの実施形態では、外因性作用物質を受ける細胞の割合は、ＨＥＫ２９３－ＨＬＡ－Ｇレトロウイルスベクターで処理されたマウスからの血清及び熱不活化血清と共にインキュベートされたレトロウイルスベクターサンプル間で異ならない可能性があり、レトロウイルスベクターの血清不活化又は適応免疫応答がないことを示す。幾つかの実施形態では、外因性作用物質を受ける細胞の割合は、ＨＥＫ２９３－ＨＬＡ－Ｇレトロウイルスベクターで１、２、３、５又は１０回処理されたマウスからインキュベートされたレトロウイルスベクターサンプル間で異ならならず、レトロウイルスベクターの血清不活化又は適応免疫応答がないことを示す。幾つかの実施形態では、外因性作用物質を受ける細胞の割合は、ビヒクルで処理されたマウスからの血清及びＨＥＫ２９３－ＨＬＡ－Ｇレトロウイルスベクターで処理されたマウスからの血清とインキュベートされたレトロウイルスベクターサンプル間で異ならない可能性があり、レトロウイルスベクターの血清不活化又は適応免疫応答がないことを示す。幾つかの実施形態では、外因性作用物質を受ける細胞の割合は、ＨＥＫ２９３－ＨＬＡ－ＧレトロウイルスベクターよりもＨＥＫ２９３由来のレトロウイルスベクターの方が少なく、ＨＥＫ２９３－ＨＬＡ－Ｇレトロウイルスベクター血清不活化又は適応免疫応答のがないことを示している。
実施例１３：レトロウイルスベクターに対して反応性のある既存のＩｇＧ及びＩｇＭ抗体の測定
この実施例では、フローサイトメトリーを使用して測定された既存の抗レトロウイルスベクター抗体価の定量化について説明する。
幾つかの実施形態では、レトロウイルスベクターの免疫原性の尺度は、抗体応答である。レトロウイルスベクターを認識する抗体は、レトロウイルスベクターの活性又は寿命を制限できる方法で結合することができる。一実施形態では、本明細書に記載のレトロウイルスベクターの一部のレシピエントは、レトロウイルスベクターに結合して認識する既存の抗体を有するであろう。
この実施例では、抗レトロウイルスベクター抗体力価は、異種ソース細胞を使用して産生されたレトロウイルスベクターを使用して試験される。この実施例では、レトロウイルスベクターナイーブマウスを、抗レトロウイルスベクター抗体の存在について評価する。特に、本明細書に記載の方法は、プロトコルに最適化されたヒト、ラット、サルに等しく適用可能である可能性がある。
陰性対照は、ＩｇＭ及びＩｇＧが枯渇したマウス血清であり、陽性対照は、異種ソース細胞から生成されたレトロウイルスベクターの注射を複数回受けたマウスに由来する血清である。
レトロウイルスベクターに結合する既存の抗体の存在を評価するために、レトロウイルスベクターナイーブマウスの血清を最初に５６℃で３０分間加熱して分解し、続いて３％ＦＣＳ及び０．１％ＮａＮ３を含むＰＢＳで３３％に希釈する。等量の血清及びレトロウイルスベクター（１ｍＬあたり１×１０２～１×１０８レトロウイルスベクター）懸濁液を４℃で３０分間インキュベートし、仔ウシ血清クッション（ｃｕｓｈｉｏｎ）を介してＰＢＳで洗浄する。
ＩｇＭ異種反応性抗体は、レトロウイルスベクターをマウスＩｇＭのＦｃ部分に特異的なＰＥ複合ヤギ抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）と４℃で４５分間インキュベートすることにより染色される。特に、抗マウスＩｇＧ１又はＩｇＧ２二次抗体も使用することができる。全ての群のレトロウイルスベクターを２％ＦＣＳを含むＰＢＳで２回洗浄し、ＦＡＣＳシステム（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で分析する。蛍光データは、対数増幅を使用して収集され、平均蛍光強度として表される。
一実施形態では、陰性対照血清は、無血清又は二次単独対照に匹敵する無視できる蛍光を示すであろう。一実施形態では、陽性対照は、陰性対照よりも多く、無血清又は二次単独対照よりも多い蛍光を示すであろう。一実施形態では、免疫原性が生じる場合、レトロウイルスベクターナイーブマウスからの血清は、陰性対照よりも多くの蛍光を示すであろう。一実施形態では、免疫原性が生じない場合、レトロウイルスベクターナイーブマウスからの血清は、陰性対照と比較して同様の蛍光を示すであろう。
実施例１４：レトロウイルスベクターの複数回投与後のＩｇＧ及びＩｇＭ抗体応答の測定
この実施例は、改変レトロウイルスベクターの複数回投与後の改変レトロウイルスベクターの体液性応答の定量化を説明する。一実施形態では、改変ウイルスベクター、例えば、本明細書に記載の方法によって改変されたものは、複数回（例えば、１より多い、例えば、２回以上）の改変レトロウイルスベクターの投与に続いて、体液性応答の減少を有する（例えば、未改変レトロウイルスベクターの投与と比較して減少する）であろうと考えられる。
幾つかの実施形態では、レトロウイルスベクターの免疫原性の尺度は、抗体応答である。一実施形態では、レトロウイルスベクターの反復注射は、抗レトロウイルスベクター抗体、例えば、レトロウイルスベクターを認識する抗体の開発につながる可能性がある。一実施形態では、レトロウイルスベクターを認識する抗体は、レトロウイルスベクターの活性又は寿命を制限できる方法で結合することができる。
この実施例では、抗レトロウイルスベクター抗体力価は、レトロウイルスベクターの１回以上の投与後に検査される。レトロウイルスベクターは、前の実施例のいずれかによって産生される。この例では、レトロウイルスは、免疫調節タンパク質（ＮＭＣ）でトランスフェクトされていない細胞、ＨＬＡ－Ｇ又はＨＬＡ－Ｅ ｃＤＮＡでトランスフェクトされた細胞（以下、ＮＭＣ－ＨＬＡ－Ｇ）、及び空ベクター対照（以下、ＮＭＣ－空ベクター、陰性対照）でトランスフェクトされた細胞から作製される。幾つかの実施形態では、レトロウイルスベクターは、他の免疫調節タンパク質を発現している細胞に由来する。
血清を、様々なコホートから採取する：ビヒクル（レトロウイルスベクターナイーブ群）、ＮＭＣレトロウイルスベクター、ＮＭＣ－ＨＬＡ－Ｇレトロウイルスベクター又はＮＭＣ空ベクターレトロウイルスベクターを１、２、３、５、１０回全身及び／又は局所注射したマウス。
抗レトロウイルスベクター抗体の存在及び存在量を評価するために、マウスの血清を最初に５６℃で３０分間加熱して分解し、続いて３％ＦＣＳ及び０．１％ＮａＮ３を含むＰＢＳで３３％に希釈する。等量の血清及びレトロウイルスベクター（１ｍＬあたり１×１０２～１×１０８レトロウイルスベクター）を４℃で３０分間インキュベートし、仔ウシ血清クッション（ｃｕｓｈｉｏｎ）を介してＰＢＳで洗浄する。
レトロウイルスベクター反応性ＩｇＭ抗体は、レトロウイルスベクターをマウスＩｇＭのＦｃ部分に特異的なＰＥ複合ヤギ抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）と４℃で４５分間インキュベートすることにより染色される。特に、抗マウスＩｇＧ１又はＩｇＧ２二次抗体も使用することができる。全ての群のレトロウイルスベクターを２％ＦＣＳを含むＰＢＳで２回洗浄し、ＦＡＣＳシステム（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で分析する。蛍光データは、対数増幅を使用して収集され、平均蛍光強度として表される。
一実施形態では、ＮＭＣ－ＨＬＡ－Ｇレトロウイルスベクターは、ＮＭＣレトロウイルスベクター又はＮＭＣ空レトロウイルスベクターと比較して、注射後の抗ウイルスＩｇＭ（又はＩｇＧ１／２）抗体力価（ＦＡＣＳの蛍光強度によって測定される）が減少する。
実施例１５：レトロウイルスベクターレシピエント細胞に対するＩｇＧ及びＩｇＭ力価抗体応答の測定
この実施例では、フローサイトメトリーを使用したレシピエント細胞（レトロウイルスベクターと融合した細胞）に対する抗体価の定量化について説明する。幾つかの実施形態では、レシピエント細胞の免疫原性の尺度は、抗体応答である。レシピエント細胞を認識する抗体は、細胞の活性又は寿命を制限できる方法で結合することができる。一実施形態では、レシピエント細胞は、抗体応答の標的とならないか、又は抗体応答が参照レベルを下回るであろう。
この実施例では、被験体（例えば、ヒト、ラット、又はサル）における抗レシピエント細胞抗体力価を試験する。更に、プロトコルを、適切な表面マーカーが存在する任意の細胞型に適合させることができる。この実施例では、標的レシピエント細胞はＣＤ３＋細胞である。
マウスを、本出願に記載されている方法のいずれかを介して産生されたレトロウイルスベクター又はＰＢＳ（陰性対照）で５日間毎日処理する。最終処理の２８日後、レトロウイルスベクターを受けたマウス及びＰＢＳ処理を受けたマウスから末梢血を採取する。血液を５μＭのＥＤＴＡを含む１ｍｌのＰＢＳに集め、凝固を防ぐためにすぐに混合する。チューブを氷上に保持し、赤血球を緩衝塩化アンモニウム（ＡＣＫ）溶液を使用して除去する。ウシ血清アルブミンで１０分間ブロックした後、細胞をマウスＣＤ３－ＦＩＴＣ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ カタログ番号：１１－００３２－８２）で、暗所で４℃で３０分間染色する。ＰＢＳで２回洗浄した後、ＦＡＣＳＤｉｖａ（商標）ソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンノゼ）を実行して４８８ｎｍのレーザー励起及び５３０＋／－３０ｎｍで発光収集により、細胞をＬＳＲ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンノゼ）で分析する。ＣＤ３＋細胞を選別する。
次に、選別したＣＤ３＋細胞を、反応混合物とマウスＩｇＭのＦｃ部分に特異的なＰＥ複合ヤギ抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）との４℃で４５分間のインキュベーションによりＩｇＭ抗体で染色する。特に、抗マウスＩｇＧ１又はＩｇＧ２二次抗体も使用することができる。全ての群の細胞を２％ＦＣＳを含むＰＢＳで２回洗浄し、ＦＡＣＳシステム（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で分析する。蛍光データは、対数増幅を使用して収集され、平均蛍光強度として表される。レトロウイルスベクターで処理されたマウス及びＰＢＳで処理されたマウスからの選別されたＣＤ３細胞について平均蛍光強度を計算する。
低い平均蛍光強度は、レシピエント細胞に対する体液性応答が低いことを示している。ＰＢＳで処理されたマウスは、平均蛍光強度が低いと予想される。一実施形態では、平均蛍光強度は、レトロウイルスベクターで処理されたマウス及びＰＢＳで処理されたマウスからのレシピエント細胞について類似している。
実施例１６：レトロウイルスベクターレシピエント細胞に対する食細胞応答の測定
この実施例は、食作用アッセイを用いたレシピエント細胞に対するマクロファージ応答の定量化を説明する。
幾つかの実施形態では、レシピエント細胞の免疫原性の尺度は、マクロファージ応答である。マクロファージは食作用に関与し、細胞を貪食し、細菌又は死細胞等の外来侵入者の隔離及び破壊を可能にする。幾つかの実施形態では、マクロファージによるレシピエント細胞の食作用は、それらの活性を低下し得る。
一実施形態では、レシピエント細胞はマクロファージの標的とされない。この実施例では、被験体のレシピエント細胞に対するマクロファージ応答を試験する。更に、プロトコルを、適切な表面マーカーが存在する任意の細胞型に適合させることができる。この実施例では、標的レシピエント細胞はＣＤ３＋細胞である。
マウスを、本出願に記載されている方法のいずれかを介して産生されたレトロウイルスベクター又はＰＢＳ（陰性対照）で５日間毎日処理する。最終処理の２８日後、レトロウイルスベクターを受けたマウス及びＰＢＳ処理を受けたマウスから末梢血を採取する。血液を５μＭのＥＤＴＡを含む１ｍｌのＰＢＳに集め、凝固を防ぐためにすぐに混合する。チューブを氷上に保持し、赤血球を緩衝塩化アンモニウム（ＡＣＫ）溶液を使用して除去する。
ウシ血清アルブミンで１０分間ブロックした後、細胞をマウスＣＤ３－ＦＩＴＣ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ カタログ番号：１１－００３２－８２）で、暗所で４℃で３０分間染色する。ＰＢＳで２回洗浄した後、ＦＡＣＳＤｉｖａ（商標）ソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンノゼ）を実行して４８８ｎｍのレーザー励起及び５３０＋／－３０ｎｍで発光収集により、細胞をＬＳＲ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンノゼ）で分析する。次に、ＣＤ３＋細胞を選別する。
食作用アッセイは、以下のプロトコルに従ってマクロファージ媒介免疫クリアランスを評価するために実行される。マクロファージを、採取後すぐに共焦点ガラス底皿に蒔く。マクロファージをＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓで１時間インキュベートして付着させる。レトロウイルスベクター及びＰＢＳを受けたマウスに由来する選別されてＦＩＴＣ染色された適切な数のＣＤ３＋細胞を、例えば、Ｖｙｂｒａｎｔ（商標）食作用アッセイキット製品情報挿入（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、２００１年３月１８日改訂、ｔｏｏｌｓ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｓｆｓ／ｍａｎｕａｌｓ／ｍｐ０６６９４．ｐｄｆに見られる）に記載されるように、プロトコルに指示されるマクロファージに加え、２時間インキュベートする。
２時間後、ディッシュを穏やかに洗浄し、細胞内蛍光を調べる。マクロファージを識別するために、細胞を最初にＦｃ受容体ブロッキング抗体（ｅＢｉｏｓｃｅｎｃｅ カタログ番号１４－０１６１－８６、クローン９３）と氷上で１５分間インキュベートして、マクロファージ上に豊富に発現されるＦｃ受容体への標識化ｍＡｂの結合を遮断する。この工程に続いて、抗Ｆ４／８０－ＰＥ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ カタログ番号１２－４８０１－８２、クローンＢＭ８）及び抗ＣＤ１１ｂ－ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ カタログ番号５５０９９３、クローンＭ１／７０）複合抗体を、マクロファージ表面抗原を染色するために添加する。細胞を暗所で４℃で３０分間インキュベートした後、遠心分離してＰＢＳで洗浄する。次に、細胞をＰＢＳに再懸濁する。次に、サンプルのフローサイトメトリーを実行し、マクロファージは、それぞれ５３３ｎｍ及び６４７ｎｍのレーザー励起を使用して、Ｆ４／８０－ＰＥ及びＣＤ１１ｂ－ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５に対する陽性蛍光シグナルを介して識別される。マクロファージをゲーティングした後、貪食されたレシピエント細胞によって放出される細胞内蛍光を、４８８ｎｍレーザー励起によって評価する。食作用陽性マクロファージの数を、イメージングソフトウェアを使用して定量化する。データは、食作用指数＝（貪食された細胞の総数／カウントされたマクロファージの総数）×（貪食された細胞を含むマクロファージの数／カウントされたマクロファージの総数）×１００として表される。
低い食作用指数は、低い食作用及びマクロファージによる標的化を示している。ＰＢＳで処理されたマウスは、食作用指数が低いと予想される。一実施形態では、食作用指数は、レトロウイルスベクターで処理されたマウス及びＰＢＳで処理されたマウスに由来するレシピエント細胞について類似している。
実施例１７：レトロウイルスベクターレシピエント細胞に対するＰＢＭＣ応答の測定
この実施例は、細胞溶解アッセイを用いたレシピエント細胞に対するＰＢＭＣ応答の定量化を説明する。
幾つかの実施形態では、レシピエント細胞の免疫原性の尺度は、ＰＢＭＣ応答である。一実施形態では、ＰＢＭＣによるレシピエント細胞の細胞毒性媒介細胞溶解は、溶解がレトロウイルスベクターの活性を低下させる、例えば、阻害又は停止することから、免疫原性の尺度である。
一実施形態では、レシピエント細胞は、ＰＢＭＣ応答を誘発しない。この実施例では、被験体のレシピエント細胞に対するＰＢＭＣ応答を試験する。
更に、プロトコルを、適切な表面マーカーが存在する任意の細胞型に適合させることができる。この実施例では、標的レシピエント細胞はＣＤ３＋細胞である。
マウスを、本出願に記載されている方法のいずれかを介して産生されたレトロウイルスベクター又はＰＢＳ（陰性対照）で５日間毎日処理する。最終処理の２８日後、レトロウイルスベクターを受けたマウス及びＰＢＳ処理を受けたマウスから末梢血を採取する。血液を５μＭのＥＤＴＡを含む１ｍｌのＰＢＳに集め、凝固を防ぐためにすぐに混合する。チューブを氷上に保持し、赤血球を緩衝塩化アンモニウム（ＡＣＫ）溶液を使用して除去する。細胞を、細胞染色バッファー（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ カタログ番号：４２０２０１）中で１０分間、Ｆｃブロック（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ カタログ番号＃：１０１３１９）した後、マウスＣＤ３：ＡＰＣ－Ｃｙ７抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ カタログ番号：１００３３０）又はアイソタイプ対照ＡＰＣ－Ｃｙ７抗体（ＩＣ：ＡＰＣ－Ｃｙ７）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ カタログ番号：４００２３０）により、４℃、暗所で３０分間染色する。ＰＢＳで２回洗浄した後、細胞をＦＡＣＳＤｉｖａ（商標）ソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンノゼ）を実行して６４０ｎｍレーザー励起及び７８０－／＋６０ｎｍで収集される発光を用いて、ＦＡＣＳ Ａｒｉａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンノゼ）で分析し、アイソタイプ対照ＡＰＣ－Ｃｙ７抗体標識細胞を使用してネガティブゲートを設定した後、ＡＰＣ－Ｃｙ７陽性細胞を選別及び収集する。選別したＣＤ３＋細胞を、ＣｅｌｌＭａｓｋ（商標）Ｇｒｅｅｎ Ｐｌａｓｍａメンブレン染色（ＣＭＧ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ カタログ番号：Ｃ３７６０８）又は陰性対照としてのＤＭＳＯのいずれかで標識する。
レトロウイルスベクター又はＰＢＳで処理したマウスからＣＤ３＋細胞を単離する７日前に、Ｃｒｏｐ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ（２０）：１５４７－１５５９；２０１１の方法に従ってレトロウイルスベクター又はＰＢＳで処理したマウスから単離し、丸底９６ウェルプレートにおいてＩＬ－２組換えマウスタンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ カタログ番号：４０２－ＭＬ－０２０）及びＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ カタログ番号：１１４５６Ｄ）の存在下で３７℃で７日間プレーティングする。７日目に、刺激されたＰＢＭＣをＣＤ３＋／ＣＭＧ＋又はＣＤ３＋／ＤＭＳＯ対細胞と１０００：１～１：１及び１：１．２５～１：１０００のＰＢＭＣ：ＣＤ３＋／ＣＭＧ＋又はＰＢＭＣ：ＣＤ３＋／ＤＭＳＯ対照細胞の範囲のプレーティング比で１、２、３、４、５、６、８、１０、１５、２０、２４、４８時間共培養する。陰性対照として、ウェルのセットはＣＤ３＋／ＣＭＧ＋及びＣＤ３＋／ＤＭＳＯ対照細胞のみを受け、ＰＢＭＣは受けない。インキュベーション後、プレートを遠心分離して処理し、上記のようにマウスＣＤ３：ＡＰＣ－Ｃｙ７抗体又はＩＣ：ＡＰＣ－Ｃｙ７抗体のいずれかで標識する。ＰＢＳで２回洗浄した後、細胞をＰＢＳに再懸濁し、ＦＡＣＳＤｉｖａ（商標）ソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、サンノゼ、カリフォルニア州）を実行して、ＦＡＣＳ Ａｒｉａ（ＡＰＣ－Ｃｙ７：６４０ｎｍレーザー励起／７８０－／＋６０ｎｍで収集された発光、及びＣＭＧ５６１ｎｍレーザー励起／５８５－／＋１６ｎｍで収集された発光）で分析する。次に、ＦＳＣ／ＳＳＣイベントデータを最初に使用して、「セル」というラベルの付いたイベントのゲートを設定する。次に、この「セル」ゲートを使用してイベントを表示し、ＩＣ：ＡＰＣ－Ｃｙ７／ＤＭＳＯのみで標識したサンプルを分析する６４０ｎｍ及び５６１ｎｍのレーザーに対してＰＭＴ電圧を設定する。このサンプルを、ＡＰＣ－Ｃｙ７とＣＭＧの両方の陰性細胞のゲートを設定するためにも使用する。次に、ＰＢＭＣを受けなかったＣＤ３＋／ＣＭＧ＋細胞を使用して、ＣＤ３＋及びＣＭＧ＋細胞のポジティブゲートを設定する。
全細胞集団におけるＣＤ３＋／ＣＭＧ＋細胞の割合を調べることにより、データを分析する。治療群を比較した場合に、ＰＢＭＣ：ＣＤ３＋／ＣＭＧ＋細胞の任意の所与のアッセイ比でのＣＤ３＋／ＣＭＧ＋細胞の割合が比較的低いことは、レシピエント細胞の溶解を示している。一実施形態では、ＣＤ３＋／ＣＭＧ＋の割合は、レトロウイルスベクターで処理されたマウス及びＰＢＳで処理されたマウスに由来するレシピエント細胞について類似している。
実施例１８：レトロウイルスベクターレシピエント細胞に対するＮＫ細胞胞応答の測定
この実施例は、細胞溶解アッセイを用いたレシピエント細胞に対するナチュラルキラー細胞応答の定量化を説明する。
幾つかの実施形態では、レシピエント細胞の免疫原性の尺度は、ナチュラルキラー細胞応答である。一実施形態では、ナチュラルキラー細胞によるレシピエント細胞の細胞毒性媒介細胞溶解は、溶解がレトロウイルスベクターの活性を低下させる、例えば、阻害又は停止することから、免疫原性の尺度である。
一実施形態では、レシピエント細胞は、ナチュラルキラー細胞応答を誘発しない。この実施例では、被験体のレシピエント細胞に対するナチュラルキラー細胞応答を試験する。更に、プロトコルを、適切な表面マーカーが存在する任意の細胞型に適合させることができる。この実施例では、標的レシピエント細胞はＣＤ３＋細胞である。
マウスをレトロウイルスベクターで処理し、血液サンプルを採取し、ＣＤ３＋細胞を上記の実施例１７に記載したように選別する。ＮＫ細胞を単離し、ＣＤ３＋細胞と共に培養し、実施例１７で使用したＰＢＭＣ細胞の代わりにＮＫ細胞を使用することを除いて、実施例１７で上記のプロトコルに従ってＦＡＣＳによって分析する。
全細胞集団におけるＣＤ３＋／ＣＭＧ＋細胞の割合を調べることにより、データを分析する。治療群を比較した場合に、ＮＫ細胞：ＣＤ３＋／ＣＭＧ＋細胞の任意の所与のアッセイ比でのＣＤ３＋／ＣＭＧ＋細胞の割合が比較的低いことは、レシピエント細胞の溶解を示している。一実施形態では、ＣＤ３＋／ＣＭＧ＋の割合は、レトロウイルスベクターで処理されたマウス及びＰＢＳで処理されたマウスに由来するレシピエント細胞について類似している。
実施例１９：レトロウイルスベクターレシピエント細胞に対するＣＤ８ Ｔ細胞応答の測定
この実施例では、細胞溶解アッセイによるレシピエント細胞（レトロウイルスベクターと融合した細胞）に対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答の定量化について説明する。
幾つかの実施形態では、レシピエント細胞の免疫原性の尺度は、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答である。一実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞によるレシピエント細胞の細胞毒性媒介細胞溶解は、溶解がレトロウイルスベクターの活性を低下させる、例えば、阻害又は停止することから、免疫原性の尺度である。
一実施形態では、レシピエント細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発しない。この実施例では、被験体のレシピエント細胞に対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答を試験する。更に、プロトコルを、適切な表面マーカーが存在する任意の細胞型に適合させることができる。この実施例では、標的レシピエント細胞はＣＤ３＋細胞である。
マウスをレトロウイルスベクターで処理し、血液サンプルを採取し、ＣＤ３＋細胞を上記の実施例１７に記載したように選別する。ＣＤ８＋Ｔ細胞を単離し、ＣＤ３＋細胞と共に培養し、実施例１７で使用したＰＢＭＣ細胞の代わりにＣＤ８＋Ｔ細胞を使用することを除いて、実施例１７で上記のプロトコルに従ってＦＡＣＳによって分析する。
全細胞集団におけるＣＤ３＋／ＣＭＧ＋細胞の割合を調べることにより、データを分析する。治療群を比較した場合に、ＣＤ８＋細胞：ＣＤ３＋／ＣＭＧ＋細胞の任意の所与のアッセイ比でのＣＤ３＋／ＣＭＧ＋細胞の割合が比較的低いことは、レシピエント細胞の溶解を示している。一実施形態では、ＣＤ３＋／ＣＭＧ＋の割合は、レトロウイルスベクターで処理されたマウス及びＰＢＳで処理されたマウスに由来するレシピエント細胞について類似している。
実施例２０：ＣＮＳ特異的プロモーター活性の測定
この実施例では、非標的細胞と比較したＣＮＳ細胞におけるＣＮＳ細胞特異的プロモーター（正のＴＣＳＲＥ）の活性の測定について説明する。
２つの細胞型を別々に培養し、本明細書に記載されるように産生されたレトロウイルスベクターで処理する。レトロウイルスベクターはＶＳＶ－Ｇでシュードタイプ化され、ＣＮＳ細胞特異的プロモーター、例えば表３のＣＮＳ細胞特異的プロモーターの制御下のｔｄｔｏｍａｔｏ蛍光タンパク質レポーターをコードする。
形質導入の２日後、細胞内の遺伝子発現をフローサイトメトリーで測定し、細胞内の平均ベクターコピー数を定量的ＰＣＲで測定する。細胞集団における細胞あたりのｔｄｔｏｍａｔｏ遺伝子発現の中央値は、集団ベクターのコピー数に正規化されている。
幾つかの実施形態では、ＣＮＳ細胞の集団は、非標的細胞の集団よりも、ベクターコピー数に対するｔｄｔｏｍａｔｏ発現の比率がより大きいであろう。これは、ＣＮＳ細胞特異的プロモーターがＣＮＳ細胞でより活性であることを示している。
実施例２１：制限的なマイクロＲＮＡからの発現の変化の測定
この実施例は、非標的細胞と比較したＣＮＳ細胞における非標的細胞制限マイクロＲＮＡ（ＮＴＣＳＲＥ）の活性の測定を記載する。
２つの細胞型を別々に培養し、本明細書に記載されるように産生されたレトロウイルスベクターで処理する。レトロウイルスベクターはＶＳＶ－Ｇでシュードタイプ化され、ユビキタスに活性なプロモーター及び非標的細胞制限マイクロＲＮＡ、例えば表４のマイクロＲＮＡの制御下のｔｄｔｏｍａｔｏ蛍光タンパク質レポーターをコードする。
形質導入の２日後、細胞内の遺伝子発現をフローサイトメトリーで測定し、細胞内の平均ベクターコピー数を定量的ＰＣＲで測定する。細胞集団における細胞あたりのｔｄｔｏｍａｔｏ遺伝子発現の中央値は、集団ベクターのコピー数に正規化されている。
幾つかの実施形態では、ＣＮＳ細胞の集団は、非標的細胞の集団よりも、ベクターコピー数に対するｔｄｔｏｍａｔｏ発現の比率がより大きいであろう。これは、非標的細胞制限マイクロＲＮＡが非標的細胞における発現を減少させることを実証するであろう。
実施例２２：ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＶＳＶ－Ｇ偽型によるフリードライヒ運動失調症の処置
この実施例は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞への治療用導入遺伝子の送達について説明する。この例では、治療導入遺伝子はフラタキシン（ｆｘｎ）である。
ニューロンをＹＧ８Ｒマウスの脳から培養し、本明細書に記載のように産生されたレトロウイルスベクター又はＰＢＳで形質導入する。レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ－Ｇでシュードタイプ化され、ニューロン特異的プロモーター（陽性ＴＣＳＲＥ）及びミクログリア細胞制限マイクロＲＮＡ配列（ＮＴＣＳＲＥ）の制御下でｆｘｎ遺伝子を保有する。
Ｆｘｎ発現に十分な時間が経過した後、細胞を画像化のため調製する。細胞を固定して透過処理し、ブロックして、抗Ｆｘｎ抗体（例えば、ａｂｃａｍ カタログ番号ａｂ１７５４０２）で免疫染色する。免疫染色後、細胞をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８に結合した二次抗体（例えば、ａｂｃａｍ カタログ番号ａｂ１５００７７）で対比染色する。細胞を、３７Ｃ及び５％ＣＯ２に維持した状態で、６３倍の油浸対物レンズを備えたＺｅｉｓｓ ＬＳＭ ７１０共焦点顕微鏡で画像化する。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒを、４８８ｎｍレーザー励起及び５１０±１５ｎｍでの発光に供する。細胞あたりのＡｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒの平均強度を計算して、細胞あたりのＦｘｎ発現レベルを決定する。各群について、少なくとも３０～４０個の細胞を画像化及び分析する。
幾つかの態様では、細胞あたりのＦｘｎ発現のレベルは、ＰＢＳで処置したニューロンよりも、Ｆｘｎ遺伝子をコードするレトロウイルスベクターで処置したニューロンでより高くなる。
実施例２３：ｉｎ ｖｉｖｏでのＶＳＶ－Ｇシュードタイプ化レトロウイルスによるフリードライヒ運動失調の処置
この実施例は、ｉｎ ｖｉｖｏでの細胞への治療用導入遺伝子の送達について説明する。この例では、治療導入遺伝子はフラタキシン（ｆｘｎ）である。
ＶＳＶ－Ｇでシュードタイプ化され、ニューロン特異的プロモーター（陽性ＴＣＳＲＥ）及びミクログリア細胞制限マイクロＲＮＡ配列（ＮＴＣＳＲＥ）の制御下でｆｘｎ遺伝子作用物質を保有するレトロウイルスベクターをＹＧ８Ｒマウスの小脳内に注射する。レトロウイルスベクターは、本出願に記載されている方法のいずれかを介して産生される。陰性対照マウスをＰＢＳで処理する。
処置の２８日後、脳切片を、レトロウイルス又はＰＢＳにより処置されるマウスから得て、先の実施例に記載されるようにＦｘｎ発現について染色する。幾つかの態様では、細胞あたりのＦｘｎ発現のレベルは、ＰＢＳにより処置されるマウスからの脳におけるよりも、Ｆｘｎ遺伝子をコードするレトロウイルスベクターにより処置されるマウスからの脳における方が高くなる。
別の群のマウスでは、レトロウイルス又はＰＢＳによる処置の２８日後、マウスを、Ｒｏｃｃａ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．９（４１３），ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｔｒａｎｓｌｍｅｄ．ａａｊ２３４７に記載される神経行動試験に供した。幾つかの態様では、レトロウイルスで処置したマウスは、ＰＢＳで処置したマウスと比較して、神経行動試験において有意な改善を示す。
実施例２４：フソソームにおける転写活性の欠如
この実施例は、フソソーム生成に使用される親細胞、例えば、ソース細胞と比較したフソソームにおける転写活性を定量化する。一実施形態では、転写活性は、親細胞、例えば、ソース細胞と比較して、フソソームでは低いか、又は存在しないであろう。
フソソームは、治療薬を送達するためのシャーシ（ｃｈａｓｓｉｓ）である。細胞又は局所組織環境に高効率で送達できるｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、タンパク質、及び／又は細胞小器官等の治療薬を使用して、通常は活性ではない、又はレシピエント組織の病理学的低レベル若しくは高レベルで活性ではない経路を調節することができる。一実施形態では、フソソームが転写することができない、又はフソソームがそれらの親細胞よりも低い転写活性を有するという観察は、核物質の除去が十分に起こったことを実証するであろう。
フソソームは、前の実施例に記載された方法のいずれかによって調製される。次に、フソソームを生成するために使用される十分な数のフソソーム及び親細胞を、２０％ウシ胎児血清、１×ペニシリン／ストレプトマイシン及び蛍光タグ付可能なアルキン－ヌクレオシドＥＵを含むＤＭＥＭの６ウェル低付着マルチウェルプレートに３７℃及び５％ＣＯ２で１時間プレーティングする。陰性対照のため、十分な数のフソソーム及び親細胞を、２０％ウシ胎児血清、１×ペニシリン／ストレプトマイシンを含むがアルキン－ヌクレオシドＥＵを含まないＤＭＥＭのマルチウェルプレートにも蒔く。
１時間のインキュベーション後、イメージングキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の製造元の指示に従ってサンプルを処理する。陰性対照を含む細胞及びフソソームサンプルを１×ＰＢＳバッファーで３回洗浄し、１×ＰＢＳバッファーに再懸濁し、励起用の４８８ｎｍアルゴンレーザー及び５３０＋／－３０ｎｍ発光を使用してフローサイトメトリー（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、米国カリフォルニア州サンノゼ）で分析する。取得及び分析にはＢＤ ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェアを使用した。光散乱チャネルを線形ゲインに設定し、蛍光チャネルを対数スケールで設定し、各条件で最低１０，０００個の細胞を分析する。
一実施形態では、陰性対照において５３０＋／－３０ｎｍの発光によって測定される転写活性は、アルキン－ヌクレオシドＥＵの省略のためにヌルになる。幾つかの実施形態では、フソソームは、親細胞よりも約７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％以下の転写活性を有するであろう。
Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，２００８，Ｏｃｔ １４；１０５（４１）：１５７７９－８４．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．０８０８４８０１０５．Ｅｐｕｂ ２００８ Ｏｃｔ ７．も参照。
実施例２５：ＤＮＡ複製又は複製活性の欠如
この実施例では、フソソームでのＤＮＡ複製を定量化する。一実施形態では、フソソームは、細胞と比較して低い速度でＤＮＡを複製する。
フソソームは、前の実施例に記載された方法のいずれかによって調製される。フソソーム及び親細胞のＤＮＡ複製活性を、蛍光標識可能なヌクレオチド（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ 番号Ｃ１０６３２）の組み込みによって評価する。ジメチルスルホキシドを含むＥｄＵ原液を調製した後、フソソームと同数の細胞を最終濃度１０μＭのＥｄＵと共に２時間インキュベートする。次に、サンプルを３．７％ＰＦＡを使用して１５分間固定し、１×ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）で洗浄し、１×ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）中の０．５％界面活性剤溶液で１５分間透過処理する。
透過処理後、０．５％界面活性剤を含むＰＢＳバッファーに懸濁したフソソームと細胞を、１×ＰＢＳバッファー、ｐＨ７．４で洗浄し、１×ＰＢＳバッファー、ＣｕＳＯ４（成分Ｆ）、ａｚｉｄｅ－ｆｌｕｏｒ ４８８、１×反応バッファー添加剤の反応カクテル中、２１℃で３０分間インキュベートする。
フソソーム及び細胞ＤＮＡ複製活性の陰性対照を、上記と同じように処理されたサンプルで作製するが、１×反応カクテルにアジド－ｆｌｕｏｒ ４８８は含まれていない。
次に、細胞及びフソソームのサンプルを洗浄し、１×ＰＢＳバッファーに再懸濁し、フローサイトメトリーで分析する。フローサイトメトリーは、ＦＡＣＳサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、米国カリフォルニア州サンノゼ）を使用して４８８ｎｍのアルゴンレーザー励起で行い、５３０＋／－３０ｎｍの発光スペクトルを収集する。取得及び分析にはＦＡＣＳ分析ソフトウェアを使用する。光散乱チャネルを線形ゲインに設定し、蛍光チャネルを対数スケールで設定し、各条件で最低１０，０００個の細胞を分析する。相対的なＤＮＡ複製活性を、各サンプルのａｚｉｄｅ－ｆｌｕｏｒ ４８８の強度の中央値に基づいて計算する。全ての事象を、前方及び側方散乱チャネルでキャプチャする（或いは、ゲートを適用して、フソソーム集団のみを選択することもできる）。フソソームの正規化された蛍光強度値は、フソソームの中央値蛍光強度値から、それぞれの陰性対照サンプルの中央値蛍光強度値を差し引くことによって決定される。次に、フソソームサンプルの正規化された相対的なＤＮＡ複製活性は、ＤＮＡ複製活性の定量的測定値を生成するために、それぞれの有核細胞サンプルに対して正規化される。
一実施形態では、フソソームは、親細胞よりも少ないＤＮＡ複製活性を有する。
Ｓａｌｉｃ，２４１５－２４２０，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．０７１２１６８１０５も参照。
実施例２６：フソゲンの定量
この例では、フソソームあたりのフソゲンの絶対数の定量化について説明する。
フソソーム組成物を、前の実施例に記載のように操作してＧＦＰでタグ付けされたフソゲン（ＶＳＶ－Ｇ）を発現することを除いて、前の実施例に記載の方法のいずれかによって産生する。更に、陰性対照のフソソームは、フソゲン（ＶＳＶ－Ｇ）又はＧＦＰが存在しない状態で操作される。
次に、ＧＦＰタグ付きフソゲンを含むフソソーム及び陰性対照を以下のようにフソゲンの絶対数についてアッセイする。市販の組換えＧＦＰを段階希釈して、タンパク質濃度の検量線を作成する。次に、検量線のＧＦＰ蛍光と既知量のフソソームのサンプルを、ＧＦＰライトキューブ（４６９／３５励起フィルター及び５２５／３９発光フィルター）を使用して蛍光光度計で測定しフソソーム調製物中のＧＦＰ分子の平均モル濃度を計算する。次に、モル濃度をＧＦＰ分子の数に変換し、サンプルあたりのフソソームの数で割って、フソソームあたりのＧＦＰタグ付きフソゲン分子の平均数を求め、これにより、フソソームあたりのフソゲンの数の相対的な推定値が得られる。
一実施形態では、ＧＦＰ蛍光は、フソゲン又はＧＦＰが存在しない陰性対照と比較して、ＧＦＰタグを有するフソソームで高くなる。一実施形態では、ＧＦＰ蛍光は、存在するフソゲンの数に関連している。
或いは個々のフソソームは、製造元の指示に従って単一細胞分取システム（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）を使用して単離され、ｑＲＴ－ＰＣＲは、Ｃｔ値に基づいてフソゲン又はＧＦＰのｃＤＮＡレベルを定量化するように設計された市販のプローブセット（Ｔａｑｍａｎ）及びマスターミックスを使用して実行される。フソゲン遺伝子又はＧＦＰ遺伝子のクローン化されたフラグメントと同じ配列のＲＮＡ標準を合成（Ａｍｓｂｉｏ）により生成した後、段階希釈で単一細胞分取システムｑＲＴ－ＰＣＲ実験反応に添加して、フソゲン又はＧＦＰのＲＮＡの濃度に対するＣｔの標準曲線を確立する。
フソソームからのＣｔ値を、フソソームあたりのフソゲン又はＧＦＰ ＲＮＡの量を決定するために、標準曲線と比較する。
一実施形態では、フソゲン及びＧＦＰ ＲＮＡは、フソゲン又はＧＦＰが存在しない陰性対照と比較して、フソゲンを発現するように操作されたフソソームで高くなる。
フソゲンは、前述のように脂質二重層構造を分析し、本明細書の他の実施例に記載されるようにＬＣ－ＭＳによって脂質二重層中のフソゲンを定量化することによって、脂質二重層内で更に定量化され得る。
実施例２７：フソソームの平均サイズの測定
この例では、フソソームの平均サイズの測定について説明する。
フソソームは、前の実施例に記載された方法のいずれかによって調製される。市販のシステム（ｉＺＯＮ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して平均サイズを決定するためにフソソームを測定した。このシステムは、製造元の指示に従って、ソフトウェア及び４０ｎｍ～１０μｍのサイズ範囲内の粒子を分析するように設計されたナノポアと共に使用される。フソソーム及び親細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁し、最終濃度範囲を０．０１～０．１μｇタンパク質／ｍＬにする。その他の機器設定を以下の表に示すように調整する：
全てのフソソームを単離から２時間以内に分析する。一実施形態では、フソソームは、約１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以内のサイズを有するか、又は親細胞よりも大きいであろう。
実施例２８：フソソームの平均サイズ分布の測定
この実施例では、フソソームの粒度分布の測定について説明する。
フソソームを、前の実施例に記載された方法のいずれかによって生成し、前の実施例に記載されたような市販のシステムを使用して粒子の平均サイズを決定するために試験する。一実施形態では、中央値を中心とするフソソームの１０％、５０％、及び９０％のサイズしきい値を親細胞と比較して、フソソームの粒度分布を評価する。
一実施形態では、フソソームは、サンプルの１０％、５０％、又は９０％以内で、親細胞のサイズ分布の変動の約９０％未満、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、又はそれ未満を有し得る。
実施例２９：フソソームの平均体積
この実施例はフソソームの平均量の測定について説明する。理論に拘束されることを望まないが、フソソームのサイズ（例えば、体積）を変えることは、それらを別個のカーゴ積載、治療計画又は適用に関して用途の広いものにすることができる。
フソソームを、前の実施例に記載されているように調製する。陽性対照は、既知のサイズのＨＥＫ２９３細胞又はポリスチレンビーズである。陰性対照は、３６ゲージの針を約５０回通過するＨＥＫ２９３細胞である。
前の実施例で説明したように、透過型電子顕微鏡による分析を使用して、フソソームのサイズを決定する。フソソームの直径を測定し、次に体積を計算する。
一実施形態では、フソソームは、直径が約５０ｎｍ以上の平均サイズを有するであろう。
実施例３０：フソソームの平均密度
フソソーム密度を、Ｔｈｅｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００６ Ａｐｒ；Ｃｈａｐｔｅｒ ３：Ｕｎｉｔ ３．２２．に記載されているように連続ショ糖勾配遠心分離アッセイを介して測定する。フソソームは、前の実施例に記載されているように得られる。
最初に、ショ糖勾配を調製する。２Ｍ及び０．２５スクロース溶液は、ＨＥＰＥＳ／スクロース原液４ｍｌとＨＥＰＥＳ原液１ｍｌ又はＨＥＰＥＳ／スクロース原液０．５ｍｌとＨＥＰＥＳ原液４．５ｍｌをそれぞれ混合することによって生成される。これらの２つの画分は、全てのシャッターを閉じた状態でグラジエントメーカーにロードされ、マグネチックスターラーを備えた近位コンパートメントの２Ｍスクロース溶液、及び遠位コンパートメントの０．２５Ｍスクロース溶液である。グラジエントメーカーをマグネチックスターラープレートに置き、近位コンパートメントと遠位コンパートメントの間のシャッターを開き、マグネチックスターラープレートをオンにする。ＨＥＰＥＳ原液を次のように作製する：２．４ｇ Ｎ－２－ヒドロキシエチルピペラジン－Ｎ’－２－エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ；最終２０ｍＭ）、３００ Ｈ２Ｏを、１０Ｎ ＮａＯＨでｐＨ７．４に調整し、最後にＨ２Ｏで容量を５００ｍｌに調整する。ＨＥＰＥＳ／スクロース原液を次の用に作成する：２．４ｇヒドロキシエチルピペラジン－Ｎ’－２－エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ；最終２０ｍＭ）、４２８ｇプロテアーゼフリースクロース（ＩＣＮ；最終２．５Ｍ）、１５０ｍｌ Ｈ２Ｏ、ｐＨを１０Ｎ ＮａＯＨで７．４に調整し、最後にＨ２Ｏで容量を５００ｍｌに調整する。
フソソームを２ｍｌのＨＥＰＥＳ／スクロース原液に再懸濁し、ＳＷ ４１遠心分離管の底に注ぐ。外側のチューブを、２ｍｌのフソソームのすぐ上にあるＳＷ ４１チューブに配置する。外側のシャッターを開き、２Ｍ（下）から０．２５Ｍ（上）の連続しスクロース勾配をフソソームの上にゆっくりと注ぐ。ＳＷ ４１チューブは、勾配が注がれるときに下げられるため、チューブは常に液体の上部よりわずかに上になる。
勾配のある全てのチューブは、互いに、又は同じ重量のスクロース溶液を有する他のチューブとバランスが取れている。勾配を、ブレーキを低く設定したＳＷ ４１スイングバケットローターで、２１０，０００×ｇ、４℃で一晩（１４時間以上）遠心分離する。
マイクロピペッターを使用して、上から下に１１個の１ｍｌ画分を収集し、ＴＬＡ－１００．３ローター用の３ｍｌチューブに入れる。サンプルを取っておき、９６ウェルプレートの別々のウェルで、各画分５０μＬを使用して屈折率を測定する。プレートを蒸発を防ぐために粘着ホイルで覆い、室温で１時間以内で保管する。屈折計を使用して、９６ウェルプレートに保存された材料からの各画分の１０～２０μＬの屈折率（したがって、スクロース濃度、及び密度）を測定する。
屈折率をｇ／ｍｌに変換するための表は、Ｂｅｃｋｍａｎのウェブサイトからダウンロードできる超遠心分離カタログにある。
次に、各画分をタンパク質含有量分析のために調製する。２ミリリットルの２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４を各１ｍｌ勾配画分に加え、２～３回ピペッティングして混合する。各チューブの片側に油性ペンでマークを付け、チューブをＴＬＡ－１００．３ローターにマークされた側を上にして配置する。
希釈画分を含む３ｍｌチューブを、１１０，０００×ｇ、４℃で１時間遠心分離する。ＴＬＡ－１００．３ローターは６本のチューブを保持するため、他のチューブを遠心分離できるようになるまで４℃に保ったまま、勾配ごとに２回の遠心分離を行う。
上澄みを３ｍｌチューブのそれぞれから吸引し、ペレットの上に滴が残る。ペレットはおそらく見えないが、その位置はチューブのマークから推測できる。目に見えないペレットを再懸濁し、マイクロ遠心管に移す。各再懸濁画分の半分を、別の実施例に記載されているビシンコニン酸アッセイによるタンパク質含有量分析に使用する。これにより、フソソーム調製物の様々な勾配画分にわたり分布が得られる。この分布を、フソソームの平均密度を決定するために使用する。後半の体積分率は－８０℃で保存され、タンパク質分析で画分全体のフソソーム分布が明らかになると、他の目的（機能分析や免疫分離による更なる精製等）に使用される。
一実施形態では、このアッセイを使用すると、フソソームの平均密度は、１．２５ｇ／ｍｌ＋／－０．０５標準偏差となる。一実施形態では、フソソームの平均密度は、１～１．１、１．０５～１．１５、１．１～１．２、１．１５～１．２５、１．２～１．３、又は１．２５～１．３５の範囲にあるであろう。一実施形態では、フソソームの平均密度は、１未満又は１．３５を超えるであろう。
実施例３１：核エンベロープ含有量の測定
この例では、除核されたフソソームの核膜含有量の測定について説明する。核膜は、細胞の細胞質からＤＮＡを分離する。
一実施形態では、精製されたフソソーム組成物は、本明細書に記載のように除核されたＨＥＫ－２９３Ｔ（２９３［ＨＥＫ－２９３］（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１５７３（商標））等の哺乳動物細胞を含む。この実施例では、フソソーム生成後に残っている無傷の核膜の量を測定するためのプロキシとして、様々な核膜タンパク質の定量化について説明する。
この実施例では、１０×１０６ ＨＥＫ－２９３Ｔ及び１０×１０６ ＨＥＫ－２９３Ｔから調製されたフソソームの当量を、３．７％ＰＦＡを用いて１５分間固定し、１×ＰＢＳバッファー、ｐＨ７．４で洗浄し、同時に透過処理した後、１％ウシ血清アルブミン及び０．５％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００、ｐＨ７．４を含む１×ＰＢＳバッファーを使用して１５分間ブロックする。透過処理後、フソソーム及び細胞を、様々な一次抗体、例えば、１％ウシ血清アルブミン及び０．５％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００、ｐＨ７．４を含む１×ＰＢＳバッファーで希釈した製造業者推奨濃度の（抗ＲａｎＧＡＰ１抗体［ＥＰＲ３２９５］（Ａｂｃａｍ－ａｂ９２３６０）、抗ＮＵＰ９８抗体［ＥＰＲ６６７８］－核膜孔マーカー（Ａｂｃａｍ－ａｂ１２４９８０）、抗核膜孔複合タンパク質抗体［Ｍａｂ４１４］－（Ａｂｃａｍ－ａｂ２４６０９）、抗インポート７抗体（Ａｂｃａｍ－ａｂ２１３６７０）と共に、４℃で１２時間インキュベートする。次に、フソソーム及び細胞を１×ＰＢＳバッファー、ｐＨ７．４で洗浄し、１％ウシ血清アルブミン及び０．５％界面活性剤、ｐＨ７．４を含む１×ＰＢＳバッファーで希釈した製造業者推奨濃度の先に指定した一次抗体を検出する適切な蛍光二次抗体と共に、２１℃で２時間インキュベートする。次に、フソソーム及び細胞を１×ＰＢＳバッファーで洗浄し、１μｇ／ｍｌのヘキスト３３３４２を含む３００μＬの１×ＰＢＳバッファー、ｐＨ７．４に再懸濁して、２０μｍのＦＡＣＳチューブで濾過し、フローサイトメトリーで分析する。
陰性対照は、同じ染色手順を使用して生成されるが、一次抗体は追加されない。フローサイトメトリーは、ＦＡＣＳサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、米国カリフォルニア州サンノゼ）を使用して４８８ｎｍのアルゴンレーザー励起で実施し、５３０＋／－３０ｎｍの発光スペクトルを収集する。取得及び分析には、ＦＡＣＳ取得ソフトウェアを使用する。光散乱チャネルを線形ゲインに設定し、蛍光チャネルを対数スケールで設定し、各条件で最低１０，０００個の細胞を分析する。相対的な無傷の核膜含有量を、各サンプルの蛍光強度の中央値に基づいて計算する。全てのイベントを、前方及び側方散乱チャネルでキャプチャする。
フソソームの正規化された蛍光強度値は、フソソームの中央値蛍光強度値から、それぞれの陰性対照サンプルの中央値蛍光強度値を差し引くことによって決定される。次に、無傷の核膜含有量の定量的測定値を生成するために、フソソームサンプルの正規化された蛍光をそれぞれの有核細胞サンプルに対して正規化する。
一実施形態では、除核されたフソソームは、有核親細胞と比較して１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％未満の蛍光強度又は核膜含有量を含むであろう。
実施例３２：クロマチンレベルの測定
この例では、除核されたフソソームのクロマチンの測定について説明する。
ＤＮＡを凝縮してクロマチンにし、核内に収めることができる。一実施形態では、本明細書に記載の方法のいずれか１つによって産生される精製フソソーム組成物は、低レベルのクロマチンを含むであろう。
前述の方法のいずれかによって調製された除核フソソーム及び陽性対照細胞（例えば、親細胞）を、ヒストンタンパク質Ｈ３又はヒストンタンパク質Ｈ４に特異的な抗体を用いたＥＬＩＳＡを使用してクロマチン含有量についてアッセイする。ヒストンはクロマチンの主要なタンパク質成分であり、Ｈ３及びＨ４が主要なヒストンタンパク質である。
ヒストンは、市販のキット（例えば、Ａｂｃａｍ抽出キット（ａｂ１１３４７６））又は当技術分野で知られている他の方法を使用して、フソソーム調製物及び細胞調製物から抽出される。これらのアリコートを、使用するまで－８０℃で保存する。標準液の段階希釈は、精製ヒストンタンパク質（Ｈ３又はＨ４）をアッセイバッファーの溶液で１～５０ｎｇ／μｌに希釈することによって調製する。アッセイバッファーは、製造業者が提供するキット（例えば、Ａｂｃａｍ Ｈｉｓｔｏｎｅ Ｈ４ Ｔｏｔａｌ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ａｂ１５６９０９）又はＡｂｃａｍ Ｈｉｓｔｏｎｅ Ｈ３ ｔｏｔａｌ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ａｂ１１５０９１））から入手できる。アッセイバッファーを、抗ヒストンＨ３又は抗Ｈ４抗体でコーティングされた４８ウェル又は９６ウェルプレートの各ウェルに加え、サンプル又は標準対照をウェルに加えてえ、各ウェルの総量５０μｌにする。次にプレートを覆い、３７度で９０～１２０分間インキュベートする。
インキュベーション後、プレートに付着した抗ヒストン抗体に結合したヒストンを検出用に調製する。上清を吸引し、プレートを１５０μｌの洗浄バッファーで洗浄する。次に、抗ヒストンＨ３又は抗Ｈ４捕捉抗体を含む捕捉バッファーを、５０μｌの容量で１μｇ／ｍＬの濃度でプレートに添加する。次に、プレートをオービタルシェーカー上で室温で６０分間インキュベートする。
次に、プレートを吸引し、洗浄バッファーを使用して６回洗浄する。次に、捕捉抗体によって活性化可能なシグナルレポーター分子を各ウェルに添加する。プレートを覆い、室温で３０分間インキュベートする。次に、プレートを吸引し、洗浄バッファーを使用して４回洗浄する。停止液を加えることにより反応を停止させる。プレートの各ウェルの吸光度を４５０ｎｍで読み取り、各サンプルのヒストン濃度を、４５０ｎｍでの吸光度ｖｓ．標準サンプルのヒストン濃度の標準曲線に従って計算する。
一実施形態では、フソソームサンプルは、有核親細胞のヒストン濃度の１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％未満を含むであろう。
実施例３３：フソソーム中のｍｉＲＮＡ含有量の測定
この例では、フソソーム中のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の定量について説明する。一実施形態では、フソソームはｍｉＲＮＡを含む。
ｍｉＲＮＡは、他の活性の中でも、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）がタンパク質に翻訳される速度を制御する調節エレメントである。一実施形態では、ｍｉＲＮＡを運ぶフソソームを使用して、ｍｉＲＮＡを標的部位に送達することができる。
フソソームは、前の実施例に記載された方法のいずれかによって調製される。フソソーム又は親細胞からのＲＮＡは前述のように調製される。少なくとも一つのｍｉＲＮＡ遺伝子は、ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／Ｓｏｆｔｗａｒｅ／Ｒｆａｍ／ｍｉｒｎａ／ｉｎｄｅｘ．ｓｈｔｍｌにあるＳａｎｇｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ ｍｉＲＮＡ Ｒｅｇｉｓｔｒｙから選択される。ｍｉＲＮＡはＣｈｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３３（２０），２００５に記載されているように調製される。全てのＴａｑＭａｎ ｍｉＲＮＡアッセイは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ（Ａ２５５７６、マサチューセッツ州ウォルサム）から入手できる。
ｑＰＣＲはｍｉＲＮＡ ｃＤＮＡに関する製造業者の仕様に従って実行され、ＣＴ値は、本明細書に記載されているように、リアルタイムＰＣＲシステムを用いて生成及び分析される。
一実施形態では、フソソームのｍｉＲＮＡ含有量は、それらの親細胞の少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又はそれ以上である。
実施例３４：フソソームにおける内因性ＲＮＡ又は合成ＲＮＡの発現の定量
この実施例では、発現が変化した内因性ＲＮＡ、又はフソソームで発現する合成ＲＮＡのレベルの定量化について説明する。
フソソーム又は親細胞は、フソソームへの細胞機能を媒介する内因性又は合成ＲＮＡの発現を変化させるように操作されている。
トランスポザーゼベクター（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）には、ピューロマイシン耐性遺伝子のオープンリーディングフレーム、及びタンパク質作用物質のクローン化フラグメントのオープンリーディングフレームが含まれている。ベクターエレクトロポレーター（Ａｍａｘａ）及び２９３Ｔ細胞株特異的核トランスフェクションキット（Ｌｏｎｚａ）を使用して２９３Ｔにエレクトロポレーションする。
２０％ウシ胎児血清及び１×ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭで３～５日間ピューロマイシンで選択した後、前の実施例に記載される方法のいずれかにより、安定して発現する細胞株からフソソームを調製する。
個々のフソソームを単離し、フソソームあたりのタンパク質作用物質又はＲＮＡを、前の実施例で説明したように定量化する。
実施形態では、フソソームは、少なくとも１、２、３、４、５、１０、２０、５０、１００、５００、１０３、５．０×１０３、１０４、５．０×１０４、１０５、５．０×１０５、１０６、５．０×１０６、又はそれ以上のフソソームあたりのＲＮＡを有するであろう。
実施例３５：フソソーム中のプロテオーム組成の測定
この実施例では、フソソームのタンパク質組成の定量化について説明する。一実施形態では、フソソームのタンパク質組成は、それらが由来する細胞に類似している。
フソソームは、前の実施例に記載された方法のいずれかによって調製される。フソソームを溶解バッファー（７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０中の４％（ｗ／ｖ））に再懸濁し、時々ボルテックスしながら室温で１５分間インキュベートする。次に、混合物を氷浴中で５分間超音波処理して溶解し、１３，０００ＲＰＭで５分間スピンダウンする。タンパク質含有量を比色分析（Ｐｉｅｒｃｅ）によって決定し、各サンプルのタンパク質を新しいチューブに移し、容量を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８で均等化する。
タンパク質を、１０ｍＭ ＤＴＴを使用して６５℃で１５分間還元し、１５ｍＭヨードアセトアミドを使用して室温、暗所で３０分間アルキル化する。６倍量の冷（－２０℃）アセトンを徐々に加えてタンパク質を沈殿させ、－８０℃で一晩インキュベートする。タンパク質ペレットを冷（－２０℃）メタノールで３回洗浄する。タンパク質を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．３に再懸濁する。
次に、３７℃で撹拌しながら消化の最初の４時間にトリプシン／ｌｙｓＣをタンパク質に添加する。サンプルを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８で希釈し、０．１％デオキシコール酸ナトリウムに更にトリプシン／ｌｙｓＣを加えて、３７℃で一晩撹拌しながら消化する。消化を停止し、２％ｖ／ｖギ酸を添加してデオキシコール酸ナトリウムを除去する。サンプルをボルテックスし、１３，０００ＲＰＭで１分間遠心分離して清澄化する。ペプチドを逆相固相抽出（ＳＰＥ）によって精製し、乾燥する。サンプルを２０μＬの３％ＤＭＳＯ、０．２％ギ酸水溶液で再構成し、ＬＣ－ＭＳで分析する。
定量測定を行うために、タンパク質標準も機器で実行する。標準ペプチド（Ｐｉｅｒｃｅ、等モル、ＬＣ－ＭＳグレード、８８３４２番）を４、８、２０、４０、及び１００ ｆｍｏｌ／ｕｌに希釈し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳで分析する。タンパク質あたり５つの最良のペプチド（３ ＭＳ／ＭＳ遷移／ペプチド）の平均ＡＵＣ（曲線下面積）を濃度ごとに計算して、標準曲線を作成する。
取得は、２５μｍ ｉＤキャピラリーを備えたエレクトロスプレーインターフェースを装備し、マイクロ超高速液体クロマトグラフィー（μＵＨＰＬＣ）（Ｅｋｓｉｇｅｎｔ、米国カリフォルニア州レッドウッドシティー）と連結した高分解能質量分析計（ＡＢＳｃｉｅｘ、米国カリフォルニア州フォスターシティー）により実施する。分析ソフトウェアを、機器の制御、並びにデータ処理及び取得に使用する。ソース電圧は５．２ｋＶに設定され、２２５℃に維持され、カーテンガスは２７ｐｓｉに設定され、ガス１は１２ｐｓｉ及びガス２は１０ｐｓｉに設定される。取得は、タンパク質データベースの場合は情報依存取得（ＩＤＡ）モードで、サンプルの場合はＳＷＡＴＨ取得モードで実行される。分離は、６０℃に維持された逆相カラム内径０．３μｍ、２．７μｍ粒子、長さ１５０ｍｍ（Ａｄｖａｎｃｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、デラウェア州ウィルミントン）で実行される。サンプルを、５μＬループにループを過剰充填することによって注入する。１２０分の（サンプル）ＬＣ勾配では、移動相は、３μＬ／分の流速で、次の溶媒Ａ（水中の０．２％ｖ／ｖギ酸及び３％ＤＭＳＯ ｖ／ｖ）及び溶媒Ｂ（ＥｔＯＨ中の０．２％ｖ／ｖギ酸及び３％ＤＭＳＯ水溶液）を含む。
タンパク質の絶対定量では、タンパク質あたり５つの最良のペプチド（ペプチドあたり３ ＭＳ／ＭＳイオン）のＡＵＣの合計を使用して、標準曲線（５点、Ｒ２＞０．９９）を生成する。サンプル分析用のデータベースを生成するために、ＤＩＡＵｍｐｉｒｅアルゴリズムが１２個のサンプルのそれぞれで実行され、出力ＭＧＦファイルと組み合わされて１つのデータベースになる。このデータベースは、ソフトウェア（ＡＢＳｃｉｅｘ）と共に使用され、５つの遷移／ペプチドと５つのペプチド／タンパク質の最大値を使用して、各サンプルのタンパク質を定量化する。計算されたスコアが１．５を超えるか、ＦＤＲが１％未満の場合、ペプチドは適切に測定されたと見なされる。適切に測定された各ペプチドのＡＵＣの合計を検量線にマッピングし、ｆｍｏｌとして報告する。
次に、得られたタンパク質定量データを分析して、既知のクラスのタンパク質のタンパク質レベル及び割合を次のように決定する：酵素は、酵素委員会（ＥＣ）番号で注釈が付けられたタンパク質として識別される；ＥＲ関連タンパク質は、ミトコンドリアではなく、ＥＲの遺伝子オントロジー（ＧＯ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｏｎｔｏｌｏｇｙ．ｏｒｇ）細胞内コンパートメント分類を持つタンパク質として識別される；エクソソーム関連タンパク質は、ミトコンドリアではなく、エクソソームの遺伝子オントロジー細胞内コンパートメント分類を持つタンパク質として識別される；及びミトコンドリアタンパク質は、ＭｉｔｏＣａｒｔａデータベース（Ｃａｌｖｏ ｅｔ ａｌ．，ＮＡＲ ２０１５ｌ ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｖ１００３）でミトコンドリアとして識別されるタンパク質として識別される。これらの各カテゴリーのモル比は、各クラスの全てのタンパク質のモル量の合計を、各サンプルで特定された全てのタンパク質のモル量の合計で割ったものとして決定される。
フソソームプロテオミクス組成を、親細胞のプロテオミクス組成と比較する。特定されたタンパク質の５０％超がフソソームに存在する場合、フソソームと親細胞の間で同様のプロテオミクス組成が観察され、それらの特定されたタンパク質のうち、そのレベルは、親細胞において対応するタンパク質レベルの２５％超である。
実施例３６：フソソーム中のＧＡＰＤＨの測定
このアッセイでは、フソソーム内のグリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）のレベル、及び親細胞と比較したフソソーム内のＧＡＰＤＨの相対レベルの定量化について説明する。
ＧＡＰＤＨを、ＧＡＰＤＨ用の標準的な市販のＥＬＩＳＡ（ａｂ１７６６４２、Ａｂｃａｍ）を製造元の指示に従って使用して、親細胞及びフソソームで測定する。
総タンパク質レベルは、ＧＡＰＤＨの測定に使用されたのと同じ量のサンプルで前述したように、ビシンコニン酸アッセイを介して同様に測定される。実施形態では、このアッセイを使用すると、フソソーム中の総タンパク質あたりのＧＡＰＤＨのレベルは、１００ｎｇ ＧＡＰＤＨ／μｇ総タンパク質未満となるであろう。同様に、実施形態では、親細胞からフソソームへの総タンパク質と比較したＧＡＰＤＨレベルの減少は、１０％の減少よりも大きいであろう。
一実施形態では、ｎｇ ＧＡＰＤＨ／μｇ総タンパク質単位の調製物中のＧＡＰＤＨ含有量は、５００未満、２５０未満、１００未満、５０未満、２０未満、１０未満、５未満、又は１未満となる。
一実施形態では、親細胞から調製物までの総タンパク質あたりのＧＡＰＤＨ（ｎｇ／μｇ）の減少は、１％超、２．５％超、５％超、１０％超、１５％超、２０％超、３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、又は９０％超となる。
実施例３７：フソソームにおけるカルネキシンの測定
このアッセイでは、フソソーム内のカルネキシン（ＣＮＸ）のレベル、及び親細胞と比較したフソソーム内のＣＮＸの相対レベルの定量化について説明する。
カルネキシンを、製造元の指示に従って、カルネキシン用の標準的な市販のＥＬＩＳＡ（ＭＢＳ７２１６６８、ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ）を使用して、開始細胞及び調製物で測定する。
総タンパク質レベルは、カルネキシンの測定に使用されたのと同じ量のサンプルで前述したように、ビシンコニン酸アッセイを介して同様に測定される。実施形態では、このアッセイを使用すると、フソソーム中の総タンパク質あたりのカルネキシンのレベルは、１００ｎｇカルネキシン／μｇ総タンパク質未満となるであろう。同様に、実施形態では、親細胞からフソソームへの総タンパク質と比較したカルネキシンレベルの増加は、１０％の増加よりも大きいであろう。
一実施形態では、ｎｇカルネキシン／μｇ総タンパク質単位の調製物中のカルネキシン含有量は、５００、２５０、１００、５０、２０、１０、５、又は１未満となる。
一実施形態では、ｎｇ／μｇ単位の親細胞から調製物までの総タンパク質あたりのカルネキシンの減少は、１％、２．５％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％超となる。
実施例３８：可溶性タンパク質質量と不溶性タンパク質質量との比較
この実施例では、フソソーム中のタンパク質質量の可溶性：不溶性比の定量化について説明する。一実施形態では、フソソーム中のタンパク質質量の可溶性：不溶性の比は、有核細胞と同様である。
フソソームは、前の実施例に記載された方法のいずれかによって調製される。フソソーム調製物を、標準的なビシンコニン酸アッセイ（ＢＣＡ）を使用して（例えば、市販のＰｉｅｒｃｅ（商標）ＢＣＡタンパク質アッセイキット、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ製品番号２３２２５を使用）試験し、可溶性：不溶性タンパク質比を決定する。可溶性タンパク質サンプルは、調製したフソソーム又は親細胞を１×１０＾７細胞又はフソソーム／ｍｌの濃度でＰＢＳに懸濁し、１６００ｇで遠心分離してフソソーム又は細胞をペレット化することにより調製する。上清を可溶性タンパク質画分として収集する。
ペレット中のフソソーム又は細胞を、２％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ－１００を含むＰＢＳで激しくピペッティング及びボルテックスすることにより溶解する。溶解画分は不溶性タンパク質画分を表す。
付属のＢＳＡを使用して、ウェルあたり０～２０μｇのＢＳＡの検量線を作成する（３回行う）。フソソーム又は細胞調製物を、測定量が標準の範囲内になるように希釈する。フソソーム調製物を３回分析し、平均値を使用する。可溶性タンパク質濃度を不溶性タンパク質濃度で割って、可溶性：不溶性タンパク質比を算出する。
一実施形態では、フソソーム可溶性：不溶性タンパク質比は、親細胞と比較して１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又はそれ以上に含まれる。
実施例３９：フソソーム中のＬＰＳの測定
この例では、親細胞と比較したフソソーム中のリポ多糖（ＬＰＳ）のレベルの定量化について説明する。一実施形態では、フソソームは、親細胞と比較してより低いレベルのＬＰＳを有するであろう。
ＬＰＳは細菌膜の成分であり、自然免疫応答の強力な誘導因子である。
ＬＰＳ測定は、前の例で説明した質量分析に基づいている。
一実施形態では、フソソームの脂質含有量の５％未満、１％、０．５％、０．０１％、０．００５％、０．０００１％、０．００００１％以下がＬＰＳとなる。
実施例４０：フソソーム中の脂質対タンパク質の比
この実施例では、フソソームの脂質質量とタンパク質質量の比率の定量化について説明する。一実施形態では、フソソームは、有核細胞と同様の脂質質量対タンパク質質量の比を有するであろう。
総脂質含有量は、前の実施例で概説したリピドミクスデータセットで特定された全ての脂質のモル含有量の合計として計算される。フソソームの総タンパク質含有量を、本明細書に記載されているようにビシンコニン酸アッセイを介して測定する。
或いは、脂質とタンパク質の比率は、特定の脂質種と特定のタンパク質の比率として説明することができる。特定の脂質種は、前の実施例で産生されたリピドミクスデータから選択される。特定のタンパク質は、前の実施例で作成されたプロテオミクスデータから選択される。選択した脂質種とタンパク質の様々な組み合わせを使用して、特定の脂質：タンパク質の比率を定義する。
実施例４１：フソソーム中のＤＮＡに対するタンパク質の比
この実施例では、フソソームのタンパク質質量とＤＮＡの比率の定量化について説明する。一実施形態では、フソソームは、細胞よりもはるかに大きいタンパク質質量対ＤＮＡ質量の比を有するであろう。
フソソーム及び細胞の総タンパク質含有量は、前の実施例に記載されているように測定される。フソソーム及び細胞のＤＮＡ質量は、前の実施例に記載されているように測定される。次に、総核酸に対するタンパク質の比率を、総タンパク質含有量を総ＤＮＡ含有量で割って、典型的なフソソーム調製物の所与の範囲内の比率をもたらすことによって決定する。
或いは、タンパク質と核酸の比率は、半定量的リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）を使用して、ＧＡＰＤＨ等の特定のハウスキーピング遺伝子のレベルとして核酸レベルを定義することによって決定される。
次に、ＧＡＰＤＨ核酸に対するタンパク質の比率は、総タンパク質含有量を総ＧＡＰＤＨ ＤＮＡ含有量で割って、典型的なフソソーム調製物のタンパク質：核酸比の特定の範囲を定義することによって決定される。
実施例４２：標的細胞との融合の測定
この実施例では、非標的細胞と比較した標的細胞とのフソソーム融合の定量化について説明する。
一実施形態では、標的細胞とのフソソーム融合は、フソソームの内腔内で運ばれるカーゴの、レシピエント細胞の細胞質ゾルへの細胞特異的送達を可能にする。本明細書に記載の方法によって産生されたフソソームを、以下のように標的細胞との融合速度についてアッセイする。
この実施例では、フソソームは、原形質膜上にＭｙｏｍａｋｅｒを発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を含む。更に、フソソームはｍＴａｇＢＦＰ２蛍光タンパク質及びＣｒｅリコンビナーゼを発現する。標的細胞は、ＭｙｏｍａｋｅｒとＭｙｏｍｉｘｅｒの両方を発現する筋芽細胞であり、非標的細胞は、ＭｙｏｍａｋｅｒもＭｙｏｍｉｘｅｒも発現しない線維芽細胞である。Ｍｙｏｍａｋｅｒを発現するフソソームは、ＭｙｏｍａｋｅｒとＭｙｏｍｉｘｅｒの両方を発現する標的細胞と融合するが、非標的細胞とは融合しないと予測されている（Ｑｕｉｎｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，８，１５６６５．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１５６６５） （Ｍｉｌｌａｙ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｎａｔｕｒｅ，４９９（７４５８），３０１－３０５．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１２３４３）。標的細胞型と非標的細胞型の両方をマウスから単離し、ＣＭＶプロモーターの下でＣｒｅによる組換えによりｔｄＴｏｍａｔｏ発現をオンにして、融合を示す、「ＬｏｘＰ－ｓｔｏｐ－Ｌｏｘｐ－ｔｄＴｏｍａｔｏ」カセットを安定して発現する。
標的又は非標的レシピエント細胞を、黒色の透明な底の９６ウェルプレートに蒔く。標的細胞と非標的細胞の両方を、異なる融合群に対してプレーティングする。次に、レシピエント細胞をプレーティングしてから２４時間後、Ｃｒｅリコンビナーゼタンパク質及びＭｙｏｍａｋｅｒを発現するフソソームをＤＭＥＭ培地の標的又は非標的レシピエント細胞に適用する。フソソームの用量は、ウェルに蒔いたレシピエント細胞の数と相関している。フソソームを適用した後、細胞プレートを４００ｇで５分間遠心分離して、フソソームとレシピエント細胞との間の接触を開始するのを助ける。
フソソーム適用の４時間後に開始し、細胞ウェルを画像化して、フィールド又はウェル内のＲＦＰ陽性細胞及びＧＦＰ陽性細胞を明確に識別する。
個の実施例では、自動顕微鏡（ｗｗｗ．ｂｉｏｔｅｋ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｉｍａｇｉｎｇ－ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ－ａｕｔｏｍａｔｅｄ－ｃｅｌｌ－ｉｍａｇｅｒｓ／ｌｉｏｎｈｅａｒｔ－ｆｘ－ａｕｔｏｍａｔｅｄ－ｌｉｖｅ－ｃｅｌｌ－ｉｍａｇｅｒ／）を使用して細胞プレートを画像化する。所与のウェルの総細胞集団を、最初にＤＭＥＭ培地中のヘキスト３３３４２で１０分間細胞を染色することによって決定する。ヘキスト３３３４２は、ＤＮＡにインターカレートすることで細胞核を染色するため、個々の細胞を識別するためにこれを使用する。染色後、ヘキスト培地を通常のＤＭＥＭ培地に交換する。
ヘキストを、４０５ｎｍ ＬＥＤ及びＤＡＰＩフィルターキューブを使用して画像化する。ＧＦＰを、４６５ｎｍ ＬＥＤ及びＧＦＰフィルターキューブを使用して画像化し、ＲＦＰを５２３ｎｍ ＬＥＤ及びＲＦＰフィルターキューブを使用して画像化する。標的細胞及び非標的細胞のウェルの画像を、最初に陽性対照ウェル、すなわち、フソソームの代わりにＣｒｅリコンビナーゼをコードするアデノウイルスで処理されたレシピエント細胞のＬＥＤ強度及び積分時間を確立することによって取得する。
取得設定は、ヘキスト、ＲＦＰ、及びＧＦＰの強度が最大ピクセル強度値になるが、飽和しないように設定される。次に、確立された設定を使用して、対象のウェルを画像化する。融合活性の経時的データを取得するために、ウェルを４時間ごとに画像化する。
ＧＦＰ及びＲＦＰ陽性ウェルの分析を、蛍光顕微鏡又はその他のソフトウェア（Ｒａｓｂａｎｄ，Ｗ．Ｓ．、ＩｍａｇｅＪ、米国国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランド、米国、ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／、１９９７－２００７）を備えたソフトウェアを用いて実行する。
画像を、幅６０μｍのローリングボールバック背景減算アルゴリズムを使用して前処理する。総細胞マスクは、ヘキスト陽性細胞に設定されている。バックグラウンド強度を大幅に超えるヘキスト強度の細胞をしきい値処理し、ヘキスト陽性細胞には小さすぎる又は大きすぎる領域を除外する。
全細胞マスク内で、ＧＦＰ及びＲＦＰ陽性細胞を、バックグラウンドを大幅に超える細胞に再度しきい値設定を行い、細胞領域全体のヘキスト（核）マスクを拡張して、ＧＦＰ及びＲＦＰ細胞の蛍光全体を含めることによって識別する。標的又は非標的レシピエント細胞を含む対照ウェルで同定されたＲＦＰ陽性細胞の数を使用して、フソソームを含むウェルのＲＦＰ陽性細胞の数から差し引く（非特異的ＬｏｘＰ組換えを差し引くため）。次に、ＲＦＰ陽性細胞（融合したレシピエント細胞）の数を、各時点でのＧＦＰ陽性細胞（融合していないレシピエント細胞）とＲＦＰ陽性細胞の合計で割って、レシピエント細胞集団内のフソソーム融合の速度を定量化する。速度は、レシピエント細胞に適用されたフソソームの所与の用量に対して正規化されている。標的融合（標的細胞へのフソソーム融合）の速度については、的融合の速度を定量化するため、非標的細胞への融合速度を標的細胞への融合速度から差し引く。
一実施形態では、標的細胞とのフソソームの平均融合速度は、標的細胞融合の場合、１時間あたり０．０１～４．０ ＲＦＰ／ＧＦＰ細胞の範囲、又はフソソームを含む非標的レシピエント細胞よりも、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上多くなる。一実施形態では、フソソームが適用されていない群は、１時間あたり０．０１ ＲＦＰ／ＧＦＰ細胞未満のバックグラウンド率を示すであろう。
実施例４３：膜タンパク質を送達するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ融合
この実施例では、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞とのフソソーム融合について説明する。一実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞とのフソソーム融合は、レシピエント細胞への活性膜タンパク質の送達をもたらす。
この実施例では、センダイウイルスＨＶＪ－Ｅタンパク質を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞（Ｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２２（Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１４），１－８．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｇｔ．２０１４．１２）からフソソームが生成される。一実施形態では、フソソームは、主に筋肉及び脂肪組織に見られ、細胞へのグルコースのインスリン調節輸送に関与する膜タンパク質である、ＧＬＵＴ４を発現するように生成される。ＧＬＵＴ４を含む場合と含まない場合のフソソームは、前の実施例に記載される方法のいずれかによって説明したように、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞から調製される。
次に、Ｃ２Ｃ１２細胞等の筋肉細胞を、ＧＬＵＴ４を発現するフソソーム、ＧＬＵＴ４を発現しないフソソーム、ＰＢＳ（陰性対照）、又はインスリン（陽性対照）で処理する。Ｃ２Ｃ１２細胞に対するＧＬＵＴ４の活性は、蛍光２－デオキシグルコース類縁体である２－［Ｎ－（７－ニトロベンズ－２－オキサ－１，３－ジオキサール－４－イル）アミノ］－２－デオキシグルコース（２－ＮＢＤＧ）の取り込みによって測定される。Ｃ２Ｃ１２細胞の蛍光を、前の実施例に記載された方法を使用する顕微鏡法によって評価する。
一実施形態では、ＧＬＵＴ４及びインスリンを発現するフソソームで処理されたＣ２Ｃ１２細胞は、ＰＢＳ又はＧＬＵＴ４を発現しないフソソームで処理されたＣ２Ｃ１２細胞と比較して増加した蛍光を示すと予想される。
また、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ２９，１６０５６０４，２０１７も参照。
実施例４４：血管からの血管外漏出の測定
この実施例では、ｉｎ ｖｉｔｒｏマイクロ流体システム（Ｊ．Ｓ Ｊｏｅｎ ｅｔ ａｌ．２０１３，ｊｏｕｒｎａｌｓ．ｐｌｏｓ．ｏｒｇ／ｐｌｏｓｏｎｅ／ａｒｔｉｃｌｅ？ｉｄ＝１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００５６９１０）で試験した内皮単層全体のフソソーム血管外漏出の定量化について説明する。
細胞は血管系から周囲の組織に血管外漏出する。理論に拘束されることを望まないが、血管外漏出は、フソソームが血管外組織に到達するための１つの方法である。
このシステムには、ＥＣＭ模倣ゲルを注入できるチャンバーによって分離された３つの独立してアドレス指定可能なメディアチャネルが含まれる。簡単に言えば、マイクロ流体システムは、成形されたＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン；Ｓｉｌｇａｒｄ １８４；Ｄｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、ミシガン州）を有し、これを介してアクセスポートが開けられ、カバーガラスに結合されてマイクロ流体チャネルが形成される。チャネルの断面寸法は、１ｍｍ（幅）×１２０μｍ（高さ）である。マトリックスの接着を強化するために、ＰＤＭＳチャネルをＰＤＬ（ポリ－Ｄ－リジンヒドロブロミド；１ｍｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）溶液でコーティングする。
次に、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；Ｇｉｂｃｏ）及びＮａＯＨを含むＩ型コラーゲン（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、米国カリフォルニア州サンノ）溶液（２．０ｍｇ／ｍＬ）を、４つの別々の充填ポートを介してデバイスのゲル領域に注入し、３０分間インキュベートしてヒドロゲルを形成する。ゲルが重合すると、内皮細胞培地（Ｌｏｎｚａ又はＳｉｇｍａ等の供給業者から入手）をすぐにチャネルにピペットで移し、ゲルの脱水を防ぐ。培地を吸引すると、希釈されたヒドロゲル（ＢＤ ｓｃｉｅｎｃｅ）溶液（３．０ｍｇ／ｍＬ）を細胞チャネルに導入し、過剰なヒドロゲル溶液を冷培地を使用して洗い流す。
内皮細胞を中央チャネルに導入し、沈降させて内皮を形成させる。内皮細胞の播種から２日後、内皮細胞が完全な単層を形成した同じチャネルにフソソーム又はマクロファージ細胞（陽性対照）を導入する。フソソームは、単層に付着し、単層を越えてゲル領域に移動するように導入される。培養物を、３７℃、５％ＣＯ２の加湿インキュベーターで維持する。フソソームのＧＦＰ発現バージョンを、蛍光顕微鏡による生細胞の画像化を可能にするために使用する。翌日、細胞を固定し、チャンバー内でＤＡＰＩ染色を使用して核を染色し、共焦点顕微鏡を使用して複数の関心領域を画像化して、内皮単層を通過したフソソームの数を決定する。
一実施形態では、ＤＡＰＩ染色は、フソソーム及び陽性対照細胞が、播種後に内皮バリアを通過できることを示すであろう。
実施例４５：走化性細胞移動度の測定
この実施例では、フソソーム走化性の定量化について説明する。細胞は、走化性を介して化学勾配に向かって、又は化学勾配から離れて移動することができる。一実施形態では、走化性は、フソソームが傷害部位にホーミングすること、又は病原体を追跡することを可能にする。前の実施例に記載された方法のいずれかによって産生された精製フソソーム組成物を、その走化性について以下のとおりアッセイする。
十分な数のフソソーム又はマクロファージ細胞（陽性対照）を、ＤＭＥＭ培地中、製造業者が提供するプロトコル（ｉｂｉｄｉ．ｃｏｍ／ｉｍｇ／ｃｍｓ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｌａｂｗａｒｅ／ｃｈａｎｎｅｌ＿ｓｌｉｄｅｓ／Ｓ＿８０３２Ｘ＿Ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ／ＩＮ＿８０３２Ｘ＿Ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ．ｐｄｆ）に従ってマイクロスライドウェルにロードする。フソソームを３７℃、５％ＣＯ２で１時間放置して付着させる。細胞接着に続いて、ＤＭＥＭ（陰性対照）又はＭＣＰ１走化性物質を含むＤＭＥＭを中央チャネルの隣接するリザーバーにロードし、Ｚｅｉｓｓ倒立広視野顕微鏡を使用してフソソームを２時間連続して画像化する。画像を、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（Ｒａｓｂａｎｄ，Ｗ．Ｓ．、ＩｍａｇｅＪ、米国国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランド、米国、ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／、１９９７～２００７）を使用して分析する。観察された各フソソーム又は細胞の移動調整データを、手動追跡プラグイン（Ｆａｂｒｉｃｅ Ｃｏｒｄｅｌｉｅｒｅｓ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｃｕｒｉｅ、フランス国オルセー）を使用して取得する。走化性プロット及び移動速度を、Ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ ａｎｄ Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ Ｔｏｏｌ（ｉｂｉｄｉ）を使用して決定する。
一実施形態では、フソソームの平均累積距離及び移動速度は、ケモカインに対する陽性対照細胞の応答よりも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％範囲内又はそれ以上となる。ケモカインに対する細胞の応答は、例えば、Ｈｏｗａｒｄ Ｅ．Ｇｅｎｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，４（１）：４７－５９，２００９に記載されている。
実施例４６：ホーミング電位の測定
この実施例では、傷害の部位へのフソソームのホーミングを説明する。細胞は、遠位部位から移動することができる、及び／又は特定の部位、例えば、ホーミングするある部位に蓄積し得る。通常、その部位は傷害部位である。一実施形態では、フソソームは、例えば、傷害部位に移動するか、又は傷害部位に蓄積する。
８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に、滅菌生理食塩水中の筋毒素であるノテキシン（ＮＴＸ）（Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ＆Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐ）を、右前脛骨筋（ＴＡ）に３０Ｇ針を使用して２μｇ／ｍＬの濃度で筋肉内（ＩＭ）注射することにより投与する。前脛骨筋（ＴＡ）の皮膚を、化学脱毛剤を使用して４５秒間脱毛した後、水で３回すすいで準備する。この濃度を、筋線維の最大の変性、並びにそれらの衛星細胞、運動軸索及び血管への最小の損傷を確保するように選択する。
ＮＴＸ注射後１日目に、マウスはホタルルシフェラーゼを発現するフソソーム又は細胞のＩＶ注射を受ける。フソソームは、前の実施例に記載された方法のいずれかによってホタルルシフェラーゼを安定して発現する細胞から産生される。生物発光画像化システム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、注射後０、１、３、７、２１、及び２８での動物全体の生物発光画像を取得する。
画像化の５分前に、ルシフェラーゼを可視化するために、マウスに生物発光基質（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を１５０ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内注射する。画像化システムは、全てのデバイス設定を補正するように調整されている。生物発光シグナルは、放射輝度光子を使用して測定され、測定値として総フラックスが使用される。光子／秒で値を与えるため、ＲＯＩのシグナルを囲むことによって関心領域（ＲＯＩ）を生成する。ＲＯＩは、ＮＴＸで処理されたＴＡ筋肉と反対側のＴＡ筋肉の両方で評価され、ＮＴＸ処理とＮＴＸ未処理のＴＡ筋肉間の光子／秒の比率は、ＮＴＸ処理筋肉へのホーミングの尺度として計算される。
一実施形態では、フソソーム及び細胞におけるＮＴＸ処理及びＮＴＸ未処理のＴＡ筋肉間の光子／秒の比は、１より大きく、傷害時のルシフェラーゼ発現フソソームの部位特異的蓄積を示す。
例えば、Ｐｌａｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｕｓｃｌｅ Ｎｅｒｖｅ ３４（５）Ｌ ５７７－８５，２００６を参照。
実施例４７：食作用活性の測定
この実施例は、フソソームの食作用を実証する。一実施形態では、フソソームは、食作用活性を有し、例えば、食作用が可能である。細胞は食作用に関与し、粒子を貪食し、バクテリア又は死細胞等の外来侵入者の隔離及び破壊を可能にする。
部分的又は完全な核不活化を有する哺乳動物マクロファージからのフソソームを含む、前の実施例に記載の方法のいずれか１つによって産生される精製フソソーム組成物は、病原体生体粒子を介してアッセイされる食作用が可能であった。この推定は、以下のプロトコルに従って蛍光食作用アッセイを使用することによって行われた。
マクロファージ（陽性対照）及びフソソームを、採取直後に別々の共焦点ガラス底皿に蒔いた。マクロファージ及びフソソームをＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓで１時間インキュベートして付着させた。フルオレセイン標識大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２及び非フルオレセイン標識大腸菌Ｋ－１２（陰性対照）を、製造元のプロトコルに示されているようにマクロファージ／フソソームに添加し、２時間インキュベートした。ｔｏｏｌｓ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｓｆｓ／ｍａｎｕａｌｓ／ｍｐ０６６９４．ｐｄｆ．２時間後、トリパンブルーを加えることにより遊離蛍光粒子を消光させた。貪食された粒子によって放出された細胞内蛍光を、４８８励起で共焦点顕微鏡によって画像化した。食作用陽性フソソームの数をＩｍａｇｅ Ｊソフトウェアを使用して定量化した。
食作用性フソソームの平均数は、生体粒子導入後２時間で少なくとも３０％であり、陽性対照マクロファージでは３０％を超えていた。
実施例４８：タンパク質分泌の可能性の測定
この実施例では、フソソームによる分泌の定量化について説明する。一実施形態では、フソソームは、分泌、例えば、タンパク質分泌が可能である。細胞は分泌物を介して物質を処分又は排出することができる。一実施形態では、フソソームは、分泌を介してそれらの環境において化学的に相互作用し、通信する。
所定の速度でタンパク質を分泌するフソソームの能力を、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃのガウシアルシフェラーゼフラッシュアッセイ（カタログ番号１６１５８）を使用して決定する。前の実施例に記載される方法のいずれかによって産生されたマウス胚性線維芽細胞（陽性対照）又はフソソームを増殖培地でインキュベートし、最初にフソソームを１６００ｇで５分間ペレット化し、次に上清を収集することにより、培地のサンプルを収集することによって１５分ごとに培地のサンプルを収集する。収集したサンプルを、ピペットで底が透明な９６ウェルプレートに入れる。次に、製造元の指示に従って、アッセイバッファーの希釈標準溶液を調製する。
簡単に説明すると、ルシフェリン又は発光分子であるセレンテラジンをフラッシュアッセイバッファーと混合し、サンプルを含む９６ウェルプレートの各ウェルに混合物をピペットで移す。細胞又はフソソームを欠く陰性対照ウェルには、バックグラウンドのガウシアルシフェラーゼシグナルを測定するための増殖培地又はアッセイバッファーが含まれる。更に、発光シグナルを１時間あたりのガウシアルシフェラーゼ分泌分子に変換するために、精製されたガウシアルシフェラーゼの標準曲線（Ａｔｈｅｎａ Ｅｎｚｙｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号０３０８）を準備する。
５００ミリ秒の積算時間を使用して、プレートの発光をアッセイする。バックグラウンドがウシアルシフェラーゼシグナルを全てのサンプルから差し引いた後、ガウシアルシフェラーゼ標準曲線を計算する。サンプルの測定値が検量線に収まらない場合は、適切に希釈して再分析する。このアッセイを使用して、フソソームがガウシアルシフェラーゼを所定の範囲内の速度（分子／時間）で分泌する能力を決定する。
一実施形態では、フソソームは、陽性対照細胞よりも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又はそれ以上の速度でタンパク質を分泌することができるであろう。
実施例４９：シグナル伝達電位の測定
この実施例では、フソソームにおけるシグナル伝達の定量化について説明する。一実施形態では、フソソームはシグナル伝達が可能である。細胞は、シグナル伝達として知られるプロセスで、リン酸化等のシグナル伝達カスケードを介して細胞外環境から分子シグナルを送受信できる。部分的又は完全な核不活化を有する哺乳動物細胞からのフソソームを含む、前の実施例に記載の方法のいずれか１つによって産生される精製フソソーム組成物は、インスリンによって誘導されるシグナル伝達が可能である。インスリンによって誘発されるシグナル伝達は、ＡＫＴリン酸化レベル、インスリン受容体シグナル伝達カスケードの重要な経路、及びインスリンに応答したグルコース取り込みを測定することによって評価される。
ＡＫＴリン酸化を測定するために、細胞、例えば、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）（陽性対照）、及びフソソームを４８ウェルプレートに蒔き、３７℃、５％ＣＯ２の加湿インキュベーターに２時間放置する。細胞接着に続いて、インスリン（例えば、１０ｎＭ）、又はインスリンを含まない陰性対照溶液を、細胞又はフソソームを含むウェルに３０分間添加する。３０分後、タンパク質溶解物がフソソーム又は細胞から作られ、リン酸化ＡＫＴレベルをインスリン刺激及び対照非刺激サンプルでのウエスタンブロッティングによって測定する。
インスリン又は陰性対照溶液に応答したグルコース取り込みは、標識グルコース（２－ＮＢＤＧ）を使用して、グルコース取り込みの欄で説明されているように測定される。（Ｓ．Ｇａｌｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２５（２）：８１９－８２９，２００５）．
一実施形態では、フソソームは、インスリンに応答して、ＡＫＴリン酸化及びグルコース取り込みを陰性対照に対して少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％以上増強するであろう。
実施例５０：細胞膜を横切ってグルコースを輸送する能力の測定
この実施例では、生細胞でのグルコース取り込みを監視し、脂質二重層を通過する能動輸送を測定するために使用できる蛍光グルコース類似体である、２－ＮＢＤＧ（２－（Ｎ－（７－ニトロベンズ－２－オキサ－１，３－ジアゾール－４－イル）アミノ）－２－デオキシグルコース）のレベルの定量化について説明する。一実施形態では、このアッセイを使用して、フソソームの脂質二重層を横切るグルコース取り込み及び能動輸送のレベルを測定することができる。
フソソーム組成物は、前の実施例に記載された方法のいずれかによって産生される。次に、十分な数のフソソームを、グルコースを含まず、２０％ウシ胎児血清、及び１×ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ中で３７℃及び５％ＣＯ２で２時間インキュベートする。２時間のグルコース飢餓期間の後、培地を、グルコースを含ないＤＭＥＭ、２０％ウシ胎児血清、１×ペニシリン／ストレプトマイシン及び２０ｕＭ ２－ＮＢＤＧ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を含むように交換し、更に３７℃で５％ＣＯ２で２時間インキュベートする。
陰性対照のフソソームを、２－ＮＢＤＧの代わりに同量のＤＭＳＯを加えることを除いて、同じように処理する。
次に、フソソームを１×ＰＢＳで３回洗浄し、適切なバッファーに再懸濁し、９６ウェルの画像化プレートに移す。次に、ＧＦＰライトキューブ（４６９／３５励起フィルター及び５２５／３９発光フィルター）を使用して蛍光光度計で２－ＮＢＤＧ蛍光を測定し、１時間のロード期間で、フソソーム膜を通過してフソソームに蓄積された２－ＮＢＤＧの量を定量化する。
一実施形態では、２－ＮＢＤＧ蛍光は、陰性（ＤＭＳＯ）対照と比較して、２－ＮＢＤＧ処理したフソソームで高くなる。５２５／３９発光フィルターを使用した蛍光測定は、存在する２－ＮＢＤＧ分子の数と相関する。
実施例５１：細胞質ゾル中のエステラーゼ活性の測定
この実施例は、フソソームにおける代謝活性の代用としてのエステラーゼ活性の定量化を説明している。フソソームの細胞質ゾルエステラーゼ活性は、カルセイン－ＡＭ染色の定量的評価によって決定される（Ｂｒａｔｏｓｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ６６（１）：７８－８４，２００５）。
膜透過性色素であるカルセイン－ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、米国オレゴン州ユージーン）をジメチルスルホキシド中の１０ｍＭの原液、及びＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）中の１００ｍＭの希釈標準溶液として調製する。前の実施例に記載される方法のいずれかによって産生されたフソソーム又は陽性対照の親マウス胚性線維芽細胞をＰＢＳバッファーに懸濁し、カルセイン－ＡＭ希釈標準溶液（カルセイン－ＡＭ中の最終濃度：５ｍＭ）と共に暗所で３７℃で３０分間インキュベートし、次にＰＢＳバッファーで希釈して、カルセイン蛍光保持の即時フローサイトメトリー分析を行う。
フソソーム及び対照の親マウス胚性線維芽細胞を（Ｊａｃｏｂ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ １２（６）：５５０－５５８，１９９１）に記載されているように、サポニンによるゼロエステラーゼ活性の陰性対照として実験的に透過処理する。フソソーム及び細胞を、０．０５％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）中の１％サポニン溶液中で１５分間インキュベートする。原形質膜透過性の可逆性により、サポニンを更なる染色及び洗浄工程に使用される全てのバッファーに含める。サポニン透過処理後、フソソームと細胞を０．１％サポニン及び０．０５％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳバッファーに懸濁し、カルセイン－ＡＭと共に最終濃度５ｍＭまでインキュベートし（３７℃、暗所で４５分間）、０．１％サポニン及び０．０５％アジ化ナトリウムを含む同じＰＢＳで３回洗浄して、フローサイトメトリーで分析する。フローサイトメトリー分析は、ＦＡＣＳサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、米国カリフォルニア州サンノゼ）で、４８８ｎｍのアルゴンレーザー励起を使用して実行され、発光は５３０＋／－３０ｎｍで収集される。取得及び分析にはＦＡＣＳソフトウェアを使用する。光散乱チャネルを線形ゲインに設定し、蛍光チャネルを対数スケールで設定し、各条件で最低１０，０００個の細胞を分析する。相対的なエステラーゼ活性を、各サンプルのカルセイン－ＡＭの強度に基づいて計算する。全ての事象を、前方及び側方散乱チャネルでキャプチャする（或いは、ゲートを適用して、フソソーム集団のみを選択することもできる）。フソソームの蛍光強度（ＦＩ）値は、それぞれの陰性対照のサポニン処理サンプルのＦＩ値を差し引くことによって決定される。フソソームサンプルの正規化されたエステラーゼ活性は、細胞質ゾルのエステラーゼ活性の定量的測定値を生成するために、それぞれの陽性対照細胞サンプルに対して正規化されている。
一実施形態では、フソソーム調製物は、陽性対照細胞と比較して、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％以内又はそれ以上のエステラーゼ活性を有するであろう。
Ｂｒａｔｏｓｉｎ Ｄ，Ｍｉｔｒｏｆａｎ Ｌ，Ｐａｌｉｉ Ｃ，Ｅｓｔａｑｕｉｅｒ Ｊ，Ｍｏｎｔｒｅｕｉｌ Ｊ．Ｎｏｖｅｌ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｓｓａｙ ｕｓｉｎｇ ｃａｌｃｅｉｎ－ＡＭ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ａｇｉｎｇ．Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ａ．２００５ Ｊｕｌ；６６（１）：７８－８４、及びＪａｃｏｂ ＢＣ，Ｆａｖｒｅ Ｍ，Ｂｅｎｓａ ＪＣ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｅｌｌ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｓａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｓａｐｏｎｉｎ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｐａｒａｍｅｔｒｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｂｙ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ １９９１；１２：５５０－５５８も参照。
実施例５２：フソソーム中のアセチルコリンエステラーゼ活性の測定
アセチルコリンエステラーゼ活性を、以前に記載された手順（Ｅｌｌｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．７，８８，１９６１）及び製造業者の推奨事項に従うキット（ＭＡＫ１１９、ＳＩＧＭＡ）を使用して測定する。
簡単に説明すると、フソソームを、ＰＢＳ、ｐＨ８中の１．２５ｍＭアセチルチオコリンに懸濁し、ＰＢＳ、ｐＨ７中の０．１ｍＭ ５，５－ジチオ－ビス（２－ニトロ安息香酸）と混合する。インキュベーションは室温で行うが、光学密度の読み取りを開始する前に、フソソームと基質溶液を３７℃で１０分間予熱する。
吸光度の変化を、プレートリーダー分光光度計（ＥＬＸ８０８、ＢＩＯ－ＴＥＫ機器、米国バーモント州ウィヌースキー）を使用して４５０ｎｍで１０分間モニターする。これとは別に、サンプルを、正規化のためのビシンコニン酸アッセイを介してフソソームのタンパク質含有量を決定するために使用する。このアッセイを使用して、フソソームは１００ ＡＣｈＥ活性単位／μｇタンパク質未満を有すると決定される。
一実施形態では、ＡＣｈＥ活性単位／タンパク質値μｇは、０．００１、０．０１、０．１、１、１０、１００、又は１０００未満となる。
実施例５３：代謝活性レベルの測定
この実施例は、フソソームにおけるクエン酸合成酵素活性の測定の定量化を説明する。
クエン酸合成酵素は、トリカルボン酸（ＴＣＡ）回路内の酵素であり、オキサロ酢酸（ＯＡＡ）とアセチルＣｏＡの間の反応を触媒してクエン酸を生成する。アセチルＣｏＡが加水分解されると、チオール基を持つＣｏＡ（ＣｏＡ－ＳＨ）が放出される。チオール基は化学試薬５，５－ジチオビス－（２－ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）と反応して、５－チオ－２－ニトロ安息香酸（ＴＮＢ）を形成し、これは、４１２ｎｍで分光光度的に測定できる黄色の生成物（Ｇｒｅｅｎ２００８）である。Ａｂｃａｍヒトクエン酸合成酵素活性アッセイキット（製品番号ａｂ１１９６９２）等の市販のキットには、この測定を実行するために必要な全ての試薬が含まれている。
アッセイを製造業者の推奨に従って実行する。フソソームサンプル溶解物を、前の実施例に記載される方法のいずれかによって産生されたフソソームを収集し、それらを抽出バッファー（Ａｂｃａｍ）に氷上で２０分間可溶化することによって調製する。遠心分離後に上清を収集し、タンパク質含有量をビシンコニン酸アッセイ（ＢＣＡ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で評価し、次の定量プロトコルが開始されるまで調製物を氷上に置く。
簡単に説明すると、フソソーム溶解物サンプルを、提供されたマイクロプレートウェル内の１×インキュベーションバッファー（Ａｂｃａｍ）で希釈し、１セットのウェルは１×インキュベーションバッファーのみを受ける。プレートを密封し、３００ｒｐｍで振とうしながら室温で４時間インキュベートする。次に、バッファーをウェルから吸引し、１×洗浄バッファーを追加する。この洗浄工程をもう一度繰り返す。次に、１×活性溶液を各ウェルに添加し、プレートをマイクロプレートリーダーで２０秒ごとに３０分間振とうしながら、４１２ｎｍでの吸光度を測定することにより分析する。
バックグラウンド値（１×インキュベーションバッファーのみのウェル）を全てのウェルから差し引き、クエン酸合成酵素活性を、ロードしたフソソーム用海産物サンプル１μｇあたりの１分あたりの吸光度の変化として表す（ΔｍＯＤ＠４１２ｎｍ／分／ｕｇタンパク質）。運動測定の１００～４００秒の線形部分のみを活性の計算に使用する。
一実施形態では、フソソーム調製物は、対照細胞と比較して、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％以内又はそれ以上の合成酵素活性を有するであろう。
例えば、Ｇｒｅｅｎ ＨＪ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ，ｅｎｚｙｍａｔｉｃ，ａｎｄ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｍｕｓｃｌｅ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｒｅｅ ｃｏｎｓｅｃｕｔｉｖｅ ｄａｙｓ ｏｆ ｅｘｅｒｃｉｓｅ ａｎｄ ｒｅｃｏｖｅｒｙ．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｇｕｌ Ｉｎｔｅｇｒ Ｃｏｍｐ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２９５：Ｒ１２３８－Ｒ１２５０，２００８を参照。
実施例５４：呼吸レベルの測定
この例では、フソソームの呼吸レベルの測定の定量化について説明する。細胞内の呼吸レベルは、代謝を促進する酸素消費量の尺度になり得る。Ｓｅａｈｏｒｓｅ細胞外フラックスアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ）により、酸素消費率のフソソーム呼吸を測定する（Ｚｈａｎｇ ２０１２）。
前の実施例に記載された方法又は細胞のいずれかによって産生されたフソソームを、９６ウェルのＳｅａｈｏｒｓｅマイクロプレート（Ａｇｉｌｅｎｔ）に播種する。マイクロプレートを短時間遠心分離して、ウェルの底にあるフソソーム及び細胞をペレット化する。酸素消費量アッセイを、増殖培地を除去し、２５ｍＭグルコース及び２ｍＭグルタミン（Ａｇｉｌｅｎｔ）を含む低緩衝ＤＭＥＭ最小培地で交換して、マイクロプレートを３７℃で６０分間インキュベートして、温度及びｐＨの平衡を可能にすることによって開始する。
次に、マイクロプレートを細胞外フラックスアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ）で分析し、付着したフソソーム及び細胞のすぐ周囲の培地中の細胞外酸素及びｐＨの変化を測定する。定常状態の酸素消費量（基礎呼吸数）及び細胞外酸性化率を取得した後、ＡＴＰ合成酵素を阻害するオリゴマイシン（５μＭ）及びミトコンドリアを脱共役するプロトンイオノフォアＦＣＣＰ（カルボニルシアニド４－（トリフルオロメトキシ）フェニルヒドラゾン；２μＭ）をマイクロプレートの各ウェルに添加し、最大酸素消費率の値を取得する。
最後に、５μＭのアンチマイシンＡ（ミトコンドリア複合体ＩＩＩの阻害剤）を添加して、呼吸の変化が主にミトコンドリアの呼吸によるものであることを確認する。アンチマイシンＡ添加後の最小酸素消費率を、全ての酸素消費測定値から差し引いて、ミトコンドリア以外の呼吸成分を除去する。オリゴマイシン（基礎からの酸素消費率の少なくとも２５％の減少）又はＦＣＣＰ（オリゴマイシン後の酸素消費率の少なくとも５０％の増加）に適切に応答しない細胞サンプルを分析から除外する。次に、フソソームの呼吸レベルをＯ２／分／１ｅ４フソソームとして測定する。
次に、この呼吸レベルを、それぞれの細胞呼吸レベルに正規化する。一実施形態では、フソソームは、それぞれの細胞サンプルと比較して、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％以上の呼吸レベルを有するであろう。
例えば、Ｚｈａｎｇ Ｊ，Ｎｕｅｂｅｌ Ｅ，Ｗｉｓｉｄａｇａｍａ ＤＲＲ，ｅｔ ａｌ．Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ ｅｎｅｒｇｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｃｅｌｌｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．２０１２；７（６）：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１２．０４８．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１２．０４８を参照。
実施例５５：フソソームのホスファチジルセリンレベルの測定
この実施例は、フソソームの表面に結合するアネキシンＶのレベルの定量化について説明する。
死にかけている細胞は、プログラムされた細胞死経路におけるアポトーシスのマーカーであるホスファチジルセリンを細胞表面に表示し得る。アネキシンＶはホスファチジルセリンに結合するため、アネキシンＶ結合は細胞内での生存能力の代用となる。
フソソームを、本明細書に記載されるように産生した。アポトーシスシグナルを検出するために、フソソーム又は陽性対照細胞を５％アネキシンＶ蛍光５９４（Ａ１３２０３、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、マサチューセッツ州ウォルサム）で染色した。各群（下記表に詳述）には、アポトーシス誘導物質であるメナジオンで処理した実験群を含めた。メナジオンを１００μＭで４時間添加した。全てのサンプルをフローサイトメーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、マサチューセッツ州ウォルサム）で実行し、蛍光強度を波長５６１ｎｍのＹＬ１レーザー及び５８５／１６ｎｍの発光フィルターで測定した。細胞外ホスファチジルセリンの存在を、全ての群でアネキシンＶの蛍光強度を比較することによって定量化した。
陰性対照の未染色フソソームは、アネキシンＶ染色に対して陽性ではなかった。
一実施形態では、フソソームは、メナジオンに応答して細胞表面上のホスファチジルセリン表示をアップレギュレートすることができ、非メナジオン刺激フソソームがアポトーシスを受けていないことを示している。一実施形態では、メナジオンで刺激された陽性対照細胞は、メナジオンで刺激されなかったフソソームよりも高レベルのアネキシンＶ染色を示した。
実施例５６：ジャクスタクラインシグナル伝達レベルの測定
この実施例では、フソソームにおけるジャクスタクリンシグナル伝達の定量化について説明する。
細胞は、ジャクスタクラインシグナル伝達を介して細胞接触依存性シグナル伝達を形成することができる。一実施形態では、フソソームにおけるジャクスタクリンシグナル伝達の存在は、フソソームがそれらのすぐ近くの細胞を刺激し、抑制し、及び一般には通信することができることを示すであろう。
部分的又は完全な核不活化を有する哺乳動物骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）から前の実施例に記載された方法のいずれかによって産生されたフソソームは、マクロファージにおけるジャクスタクリンシグナル伝達を介してＩＬ－６分泌を誘発する。一次マクロファージ及びＢＭＳＣを共培養する。骨髄由来マクロファージを最初に６ウェルプレートに播種し、２４時間インキュベートした後、初代マウスＢＭＳＣ由来フソソーム又はＢＭＳＣ細胞（陽性対照親細胞）を１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地のマクロファージに置く。上清を様々な時点（２、４、６、２４時間）で収集し、ＥＬＩＳＡアッセイによってＩＬ－６分泌について分析する。（Ｃｈａｎｇ Ｊ．ｅｔ ａｌ．，２０１５）。
一実施形態では、ＢＭＳＣフソソームによって誘導されるジャクスタクリンシグナル伝達のレベルは、培地中のマクロファージ分泌ＩＬ－６レベルの増加によって測定される。一実施形態では、ジャクスタクリンシグナル伝達のレベルは、陽性対照の骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）によって誘発されるレベルよりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又はそれ以上大きくなる。
実施例５７：パラクリンシグナリングレベルの測定
この例では、フソソームにおけるパラクリンシグナル伝達の定量化について説明する。
細胞は、パラクリンシグナル伝達を介して局所微小環境内の他の細胞と通信することができる。一実施形態では、フソソームは、パラクリンシグナル伝達が可能であり、例えば、それらの局所環境内の細胞と通信することができる。一実施形態では、パラクリン由来の分泌を介して内皮細胞においてＣａ２＋シグナル伝達を誘発するフソソームの能力は、以下のプロトコルにより、カルシウムインジケーター、ｆｌｕｏ－４ ＡＭを介したＣａ２＋シグナル伝達を測定する。
実験プレートを調製するため、マウス肺微小血管内皮細胞（ＭＰＭＶＥＣ）を０．２％ゼラチンコーティング２５ｍｍガラス底共焦点皿（８０％コンフルエンス）に蒔く。ＭＰＭＶＥＣを、２％ＢＳＡ及び０．００３％プルロン酸を含むＥＣＭ中で、最終濃度５μＭ ｆｌｕｏ－４ ＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に室温で３０分間インキュベートし、ｆｌｕｏ－４ ＡＭのローディングを可能にする。ロード後、ＭＰＭＶＥＣは、色素の損失を最小限に抑えるために、スルフィンピラゾンを含む実験用画像化溶液（０．２５％ＢＳＡを含むＥＣＭ）で洗浄する。ｆｌｕｏ－４をロードした後、５００μＬの予熱した実験用画像化溶液をプレートに加え、プレートをＺｅｉｓｓ共焦点イメージングシステムで画像化する。
別のチューブで、新たに単離したマウスマクロファージを培地中の１μｇ／ｍｌ ＬＰＳ（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）で処理するか、ＬＰＳで処理しない（陰性対照）。刺激後、前の実施例に記載された方法のいずれかによってマクロファージからフソソームが生成される。
次に、フソソーム又は親マクロファージ（陽性対照）を、２％ＢＳＡ及び０．００３％プルロン酸を含むＥＣＭ中のｃｅｌｌ ｔｒａｃｋｅｒ ｒｅｄ、ＣＭＴＰＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識する。次に、フソソームとマクロファージを洗浄し、実験用イメージング溶液に再懸濁する。標識されたフソソームとマクロファージを、共焦点プレートのｆｌｕｏ－４ ＡＭをロードしたＭＰＭＶＥＣに加える。
緑色及び赤色の蛍光シグナルは、Ｆｌｕｏ－４ ＡＭ及びｃｅｌｌ ｔｒａｃｋｅｒ ｒｅｄの蛍光に対してそれぞれ４８８及び５６１ｎｍで励起される、アルゴンイオンレーザー光源を備えたＺｅｉｓｓ共焦点イメージングシステムを使用して、３秒ごとに１０～２０分間記録される。Ｆｌｕｏ－４の蛍光強度の変化を、イメージングソフトウェアを使用して分析する（Ｍａｌｌｉｌａｎｋａｒａｍａｎ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ．（５８）：３５１１，２０１１）。陰性対照のフソソーム及び細胞群で測定されたＦｌｕｏ－４強度のレベルを、ＬＰＳで刺激されたフソソーム及び細胞群から差し引く。
一実施形態では、フソソーム、例えば、活性化フソソームは、陽性対照細胞群よりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又はそれ以上のＦｌｕｏ－４蛍光強度の増加を誘導する。
実施例５８：移動度についてアクチンを重合する能力の測定
この実施例では、フソソームにおけるアクチン等の細胞骨格成分の定量について説明する。一実施形態では、フソソームは、アクチン等の細胞骨格成分を含み、アクチン重合が可能である。
細胞は、細胞骨格成分であるアクチンを運動性及びその他の細胞質プロセスに使用する。細胞骨格は、運動駆動力を生み出し、運動のプロセスを調整するために不可欠である
Ｃ２Ｃ１２細胞を、本明細書に記載されるように除核した。１２．５％及び１５％のフィコール層から得られたフソソームをプールして「軽」とラベル付けし、１６～１７％の層から得られたフソソームをプールして「中」とラベル付けした。フソソーム又は細胞（親Ｃ２Ｃ１２細胞、陽性対照）をＤＭＥＭ＋Ｇｌｕｔａｍａｘ＋１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）に再懸濁し、２４ウェル超低付着プレート（３４７３番、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ、ニューヨーク州コーニング）に蒔き、３７℃＋５％ＣＯ２でインキュベートした。サンプルを定期的に採取し（５．２５時間、８．７５時間、２６．５時間）、１６５μＭローダミンファロイジンで染色し（陰性対照は染色されなかった）、Ｆ－アクチン細胞骨格含有量を測定するために、ＦＣレーザーＹＬ１（５８５／１６フィルターで５６１ｎｍ）を使用してフローサイトメーター（Ａ２４８５８番、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、マサチューセッツ州ウォルサム）で測定する。フソソーム中のローダミンファロイジンの蛍光強度を、未染色のフソソーム及び染色された親Ｃ２Ｃ１２細胞と共に測定した。
フソソームの蛍光強度は、全ての時点で陰性対照よりも大きく（図１）、フソソームは、親のＣ２Ｃ１２細胞と同様の速度でアクチンを重合することができた。
下記表に列挙される追加の細胞骨格成分を、製造業者の指示に従って、市販のＥＬＩＳＡシステム（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ及びＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ）を介して測定する。
次に、マイクロウェルストリップから１００ｕＬの適切に希釈された溶解物を適切なウェルに追加する。マイクロウェルをテープで密封し、３７℃で２時間インキュベートする。インキュベーション後、密封テープを剥がし、内容物を廃棄する。各マイクロウェルを２００ｕＬの１×洗浄バッファーで４回洗浄する。個々に洗浄した後、プレートを吸収性の布に打ち付けて、残りの洗浄液を各ウェルから除去する。ただし、実験中はいつでもウェルが完全に乾燥しているわけではない。
次に、陰性対照ウェルを除いて、１００ｕｌの再構成された検出抗体（緑色）を個々のウェルに追加する。次にウェルを密閉し、３７℃で１時間インキュベートする。インキュベーションが完了した後、洗浄手順を繰り返す。１００ｕＬの再構成されたＨＲＰ結合二次抗体（赤色）を各ウェルに加える。ウェルをテープで密封し、３７℃で３０分間インキュベートする。次に、密封テープを剥がし、洗浄手順を繰り返す。次に、１００ｕＬのＴＭＢ基質を各ウェルに加える。ウェルをＣ．３７℃で１０分間インキュベートし、次いで、テープで密封する。この最後のインキュベーションが完了したら、１００ｕＬの停止溶液を各ウェルに加え、プレートを数秒間穏やかに振とうする。
アッセイの分光光度分析を、停止溶液を添加してから３０分以内に実施する。ウェルの下側をリントフリーティッシュで拭き、４５０ｎｍで吸光度を読み取る。一実施形態では、検出抗体で染色されたフソソームサンプルは、陰性対照のフソソームサンプルよりも４５０ｎｍでより多くの光を吸収し、検出抗体で染色された細胞サンプルよりも少ない光を吸収する。
実施例５９：平均膜電位の測定
この実施例では、フソソームのミトコンドリア膜電位の定量化について説明する。一実施形態では、ミトコンドリア膜を含むフソソームは、ミトコンドリア膜電位を維持するであろう。
ミトコンドリアの代謝活性を、ミトコンドリアの膜電位によって測定することができる。フソソーム調製物の膜電位を、ミトコンドリア膜電位を評価するための市販の色素、ＴＭＲＥ（ＴＭＲＥ：テトラメチルローダミン、エチルエステル、過塩素酸塩、Ａｂｃａｍ、カタログ番号Ｔ６６９）を使用して定量化する。
フソソームは、前の実施例で説明した方法のいずれかによって生成される。フソソーム又は親細胞を増殖培地（１０％ウシ胎児血清を含むフェノールレッドフリーのＤＭＥＭ）で６アリコート（未処理及びＦＣＣＰ処理で３連）で希釈する。サンプルの１つのアリコートを、ミトコンドリア膜電位を排除し、ＴＭＲＥ染色を防ぐ脱共役剤であるＦＣＣＰと共にインキュベートする。ＦＣＣＰで処理したサンプルの場合、２μＭのＦＣＣＰをサンプルに添加し、分析前に５分間インキュベートする。次に、フソソームと親細胞を３０ｎＭ ＴＭＲＥで染色する。各サンプルについて、未染色（ＴＭＲＥなし）のサンプルも並行して調製する。サンプルを３７℃で３０分間インキュベートする。次に、サンプルを４８８ｎｍアルゴンレーザーを備えたフローサイトメーターで分析し、励起及び発光を５３０＋／－３０ｎｍで収集する。
膜電位値（ミリボルト、ｍＶ）は、ＴＭＲＥの強度に基づいて計算される。全ての事象を、前方及び側方散乱チャネルでキャプチャする（或いは、ゲートを適用して、小さな破片を排除することもできる）。未処理サンプルとＦＣＣＰ処理サンプルの両方の蛍光強度（ＦＩ）値は、未処理サンプル及びＦＣＣＰ処理サンプルの幾何平均から未染色サンプルの蛍光強度の幾何平均を差し引くことによって正規化される。各調製物に関する膜電位状態は、ＴＭＲＥ蛍光に基づいてフソソーム又は細胞のミトコンドリア膜電位を決定するために使用できる修正ネルンスト方程式（以下を参照）で正規化された蛍光強度値を使用して計算される（ＴＭＲＥはネルンスト様式でミトコンドリアに蓄積するため）。
フソソーム又は細胞膜電位を次の式で計算する：（ｍＶ）＝－６１．５＊ｌｏｇ（ＦＩ未処理－正規化／ＦＩＦＣＣＰ－処理－正規化）。一実施形態では、Ｃ２Ｃ１２マウス筋芽細胞からのフソソーム調製物に対してこのアッセイを使用すると、フソソーム調製物の膜電位状態は、親細胞よりも約１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％以内又はそれよりも大きくなる。一実施形態では、膜電位の範囲は、約－２０～－１５０ｍＶである。
実施例６０：被験体における持続性半減期の測定
この実施例では、フソソーム半減期の測定について説明する。
フソソームは、前の実施例に記載された方法のいずれかによって産生されたガウシアルシフェラーゼを発現する細胞に由来し、純粋、１：２、１：５、及び１：１０の希釈をバッファー中で行う。フソソームを欠くバッファーを陰性対照として使用する。
各用量を、３匹の８週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に静脈内投与する。フソソームの静脈内投与の１、２、３、４、５、６、１２、２４、４８、及び７２時間後に、眼窩後静脈から血液を採取する。動物を実験の終わりにＣＯ２吸入によって犠牲にする。
血液を室温で２０分間遠心分離する。血清サンプルを、バイオアナリシスまで－８０℃で直ちに凍結する。次に、各血液サンプルを使用して、サンプルをガウシアルシフェラーゼ基質（Ｎａｎｏｌｉｇｈｔ、アリゾナ州パイントップ）と混合した後、ガウシアルシフェラーゼ活性アッセイを実行する。簡単に説明すると、ルシフェリン又は発光分子であるセレンテラジンをフラッシュアッセイバッファーと混合し、９６ウェルプレートの血液サンプルを含むウェルに混合物をピペットで移す。血液を欠く陰性対照ウェルは、バックグラウンドのガウシアルシフェラーゼシグナルを測定するための増殖培地又はアッセイバッファーを含む。
更に、発光シグナルを１時間あたりのガウシアルシフェラーゼ分泌分子に変換するために、陽性対照の精製されたガウシアルシフェラーゼの標準曲線（Ａｔｈｅｎａ Ｅｎｚｙｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号０３０８）を準備する。５００ミリ秒の積算時間を使用して、プレートの発光をアッセイする。バックグラウンドがウシアルシフェラーゼシグナルを全てのサンプルから差し引いた後、ガウシアルシフェラーゼ標準曲線を計算する。サンプルの測定値が検量線に収まらない場合は、適切に希釈して再分析する。１、２、３、４、５、６、１２、２４、４８、及び７２時間に採取したサンプルからのルシフェラーゼシグナルを、検量線に内挿する。消失速度定数ｋｅ（ｈ－１）は次の１コンパートメントモデルの等式を用いて計算される：Ｃ（ｔ）＝Ｃ０×ｅ－ｋｅｘｔ、式中、Ｃ（ｔ）（ｎｇ／ｍＬ）は、時間ｔ（ｈ）のフソソームの濃度であり、Ｃ０は時間＝０（ｎｇ／ｍＬ）のフソソームの濃度である。消失半減期Ｔ１／２、Ｅ（ｈ）を、ｌｎ（２）／ｋｅとして計算する。
一実施形態では、フソソームは、陰性対照細胞より少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又はそれ以の半減期を有するであろう。
実施例６１：非エンドサイトーシス経路によるフソソームの送達
この実施例では、非エンドサイトーシス経路を介したレシピエント細胞へのＣｒｅのフソソーム送達の定量化について説明する。
一実施形態では、フソソームは、フソソーム媒介性の非エンドサイトーシス経路を介して作用物質を送達する。理論に拘束されることを望まないが、エンドサイトーシス媒介フソソーム取り込みを全く必要とせずに、フソソームの内腔内で運ばれる作用物質、例えばＣｒｅのレシピエント細胞の細胞質ゾルへの直接の送達は、フソソーム媒介非エンドサイトーシス経路送達により起こる。
この実施例では、フソソームは、その原形質膜上にセンダイウイルスＨ及びＦタンパク質タンパク質を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞（Ｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２２（Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１４），１－８．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｇｔ．２０１４．１２３）を含む。更に、フソソームはｍＴａｇＢＦＰ２蛍光タンパク質及びＣｒｅリコンビナーゼを発現する。標的細胞は、ＣＭＶプロモーター下で「Ｌｏｘｐ－ＧＦＰ－ｓｔｏｐ－Ｌｏｘｐ－ＲＦＰ」カセットを安定して発現するＲＰＭＩ８２２６細胞であり、Ｃｒｅによる組換えによりＧＦＰからＲＦＰ発現に切り替わり、融合及びＣｒｅをマーカーとして送達を示す。
本明細書に記載の方法によって産生されたフソソームを、以下のように非エンドサイトーシス経路を介したＣｒｅの送達についてアッセイする。レシピエント細胞を、黒色の透明な底の９６ウェルプレートに蒔く。次に、レシピエント細胞をプレーティングしてから２４時間後、Ｃｒｅリコンビナーゼタンパク質を発現し、特定のフソゲンタンパク質を保有するフソソームを、ＤＭＥＭ培地でレシピエント細胞に適用する。非エンドサイトーシス経路を介したＣｒｅ送達のレベルを決定するために、フソソームを受けるレシピエント細胞の並行群を、エンドソーム酸性化の阻害剤であるクロロキン（３０μｇ／ｍＬ）で処理する。フソソームの用量は、ウェルに蒔いたレシピエント細胞の数と相関している。フソソームを適用した後、細胞プレートを４００ｇで５分間遠心分離して、フソソームとレシピエント細胞との間の接触を開始するのを助ける。次に、細胞を１６時間インキュベートし、作用物質の送達、Ｃｒｅを画像化によって評価する。
細胞を、フィールド又はウェル内のＲＦＰ陽性細胞とＧＦＰ陽性細胞を明確に識別するために画像化する。この実施例では、自動蛍光顕微鏡を使用して細胞プレートを画像化している。所与のウェルの総細胞集団を、最初にＤＭＥＭ培地中のヘキスト３３３４２で１０分間細胞を染色することによって決定する。ヘキスト３３３４２は、ＤＮＡにインターカレートすることで細胞核を染色するため、個々の細胞を識別するためにこれを使用する。染色後、ヘキスト培地を通常のＤＭＥＭ培地に交換する。
ヘキストを、４０５ｎｍ ＬＥＤ及びＤＡＰＩフィルターキューブを使用して画像化する。ＧＦＰを、４６５ｎｍ ＬＥＤ及びＧＦＰフィルターキューブを使用して画像化し、ＲＦＰを５２３ｎｍ ＬＥＤ及びＲＦＰフィルターキューブを使用して画像化する。様々な細胞群の画像を、最初に陽性対照ウェル、すなわち、フソソームの代わりにＣｒｅリコンビナーゼをコードするアデノウイルスで処理されたレシピエント細胞のＬＥＤ強度及び積分時間を確立することによって取得する。
取得設定は、ヘキスト、ＲＦＰ、及びＧＦＰの強度が最大ピクセル強度値になるが、飽和しないように設定される。次に、確立された設定を使用して、対象のウェルを画像化する。
ＧＦＰ及びＲＦＰ陽性ウェルの分析を、蛍光顕微鏡又はその他のソフトウェア（Ｒａｓｂａｎｄ，Ｗ．Ｓ．、ＩｍａｇｅＪ、米国国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランド、米国、１９９７～２００７）を備えたソフトウェアを用いて実行する。画像を、幅６０μｍのローリングボールバック背景減算アルゴリズムを使用して前処理する。総細胞マスクは、ヘキスト陽性細胞に設定されている。バックグラウンド強度を大幅に超えるヘキスト強度の細胞を用いてしきい値を設定し、ヘキスト陽性細胞には小さすぎる又は大きすぎる領域を除外する。
全細胞マスク内で、ＧＦＰ及びＲＦＰ陽性細胞を、バックグラウンドを大幅に超える細胞に再度しきい値を設定し、細胞領域全体のヘキスト（核）マスクを拡張して、ＧＦＰ及びＲＦＰ細胞の蛍光全体を含めることによって識別する。
レシピエント細胞を含む対照ウェルで同定されたＲＦＰ陽性細胞の数を使用して、フソソームを含むウェルのＲＦＰ陽性細胞の数から差し引く（非特異的ＬｏｘＰ組換えを差し引くため）。次に、ＲＦＰ陽性細胞（Ｃｒｅを受け取ったレシピエント細胞）の数をＧＦＰ陽性細胞（Ｃｒｅを受け取っていないレシピエント細胞）とＲＦＰ陽性細胞の合計で割って、レシピエント細胞集団に送達されたフソソームＣｒｅの割合を定量化する。レベルは、レシピエント細胞に適用されたフソソームの所与の用量に対して正規化されている。非エンドサイトーシス経路を介して送達されるフソソームＣｒｅの値を計算するために、クロロキンの存在下でのフソソームＣｒｅ送達のレベル（ＦｕｓＬ＋ＣＱ）と並んで、クロロキンの不在下でのフソソームＣｒｅ送達のレベル（ＦｕｓＬ－ＣＱ）を決定する。非エンドサイトーシス経路を介して送達されるフソソームＣｒｅの正規化された値を決定するために、次の式を使用する：［（ＦｕｓＬ－ＣＱ）－（ＦｕｓＬ＋ＣＱ）］／（ＦｕｓＬ－ＣＱ）。
一実施形態では、所与のフソソームについて非エンドサイトーシス経路を介して送達されるフソソームＣｒｅの平均レベルは、０．１～０．９５の範囲、又はクロロキンで処理されたレシピエント細胞少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上となる。
実施例６２：エンドサイトーシス経路によるフソソームの送達
この実施例では、エンドサイトーシス経路を介したレシピエント細胞へのＣｒｅのフソソーム送達について説明する。
一実施形態では、フソソームは、フソソーム媒介性のエンドサイトーシス経路を介して作用物質を送達する。理論に拘束されることを望まないが、エンドサイトーシスに依存する取り込み経路を有するレシピエント細胞への、フソソームの内腔で運ばれる作用物質、例えばカーゴの送達は、フソソーム媒介エンドサイトーシス経路送達を介して起こる。
この実施例では、フソソームは、その原形質膜上にフソゲンタンパク質を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を２μｍフィルターを通して押し出すことによって産生された微小胞を含む（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｄｅｖｉｃｅｓ，１８（３）．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／ｓ１０５４４－０１６－００６６－ｙ）（Ｒｉｅｄｅｌ，Ｋｏｎｄｏｒ－Ｋｏｃｈ，＆Ｇａｒｏｆｆ，１９８４，Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ，３（７），１４７７－８３．ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｕｂｍｅｄ／６０８６３２６から取得）。更に、フソソームはｍＴａｇＢＦＰ２蛍光タンパク質及びＣｒｅリコンビナーゼを発現する。標的細胞は、ＣＭＶプロモーター下で「ＬｏｘＰ－ＧＦＰ－ｓｔｏｐ－ＬｏｘＰ－ＲＦＰ」カセットを安定して発現するＰＣ３細胞であり、Ｃｒｅによる組換えによりＧＦＰからＲＦＰ発現に切り替わり、融合及びＣｒｅをマーカーとして送達を示す。
本明細書に記載の方法によって産生されたフソソームを、以下のようにエンドサイトーシス経路を介したＣｒｅの送達についてアッセイする。レシピエント細胞を、使用するイメージングシステムと互換性のある細胞培養マルチウェルプレートに蒔く（この実施例では、細胞を黒色の透明な底の９６ウェルプレートに蒔く）。次に、レシピエント細胞をプレーティングしてから２４時間後、Ｃｒｅリコンビナーゼタンパク質を発現し、特定のフソゲンタンパク質を保有するフソソームを、ＤＭＥＭ培地でレシピエント細胞に適用する。エンドサイトーシス経路を介したＣｒｅ送達のレベルを決定するために、フソソームを受けるレシピエント細胞の並行群を、エンドソーム酸性化の阻害剤であるクロロキン（３０μｇ／ｍＬ）で処理する。フソソームの用量は、ウェルに蒔いたレシピエント細胞の数と相関している。フソソームを適用した後、細胞プレートを４００ｇで５分間遠心分離して、フソソームとレシピエント細胞との間の接触を開始するのを助ける。次に、細胞を１６時間インキュベートし、作用物質の送達、Ｃｒｅを画像化によって評価する。
細胞を、フィールド又はウェル内のＲＦＰ陽性細胞とＧＦＰ陽性細胞を明確に識別するために画像化する。この実施例では、自動蛍光顕微鏡を使用して細胞プレートを画像化している。所与のウェルの総細胞集団を、最初にＤＭＥＭ培地中のヘキスト３３３４２で１０分間細胞を染色することによって決定する。ヘキスト３３３４２は、ＤＮＡにインターカレートすることで細胞核を染色するため、個々の細胞を識別するためにこれを使用する。染色後、ヘキスト培地を通常のＤＭＥＭ培地に交換する。
ヘキストを、４０５ｎｍ ＬＥＤ及びＤＡＰＩフィルターキューブを使用して画像化する。ＧＦＰを、４６５ｎｍ ＬＥＤ及びＧＦＰフィルターキューブを使用して画像化し、ＲＦＰを５２３ｎｍ ＬＥＤ及びＲＦＰフィルターキューブを使用して画像化する。様々な細胞群の画像を、最初に陽性対照ウェル、すなわち、フソソームの代わりにＣｒｅリコンビナーゼをコードするアデノウイルスで処理されたレシピエント細胞のＬＥＤ強度及び積分時間を確立することによって取得する。
取得設定は、ヘキスト、ＲＦＰ、及びＧＦＰの強度が最大ピクセル強度値になるが、飽和しないように設定される。次に、確立された設定を使用して、対象のウェルを画像化する。
ＧＦＰ及びＲＦＰ陽性ウェルの分析を、蛍光顕微鏡又はその他のソフトウェア（Ｒａｓｂａｎｄ，Ｗ．Ｓ．、ＩｍａｇｅＪ、米国国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランド、米国、１９９７～２００７）を備えたソフトウェアを用いて実行する。画像を、幅６０μｍのローリングボールバック背景減算アルゴリズムを使用して前処理する。総細胞マスクは、ヘキスト陽性細胞に設定されている。バックグラウンド強度を大幅に超えるヘキスト強度の細胞をしきい値処理し、ヘキスト陽性細胞には小さすぎる又は大きすぎる領域を除外する。
全細胞マスク内で、ＧＦＰ及びＲＦＰ陽性細胞を、バックグラウンドを大幅に超える細胞に再度しきい値設定を行い、細胞領域全体のヘキスト（核）マスクを拡張して、ＧＦＰ及びＲＦＰ細胞の蛍光全体を含めることによって識別する。
レシピエント細胞を含む対照ウェルで同定されたＲＦＰ陽性細胞の数を使用して、フソソームを含むウェルのＲＦＰ陽性細胞の数から差し引く（非特異的ＬｏｘＰ組換えを差し引くため）。次に、ＲＦＰ陽性細胞（Ｃｒｅを受け取ったレシピエント細胞）の数をＧＦＰ陽性細胞（Ｃｒｅを受け取っていないレシピエント細胞）とＲＦＰ陽性細胞の合計で割って、レシピエント細胞集団に送達されたフソソームＣｒｅの割合を定量化する。レベルは、レシピエント細胞に適用されたフソソームの所与の用量に対して正規化されている。エンドサイトーシス経路を介して送達されるフソソームＣｒｅの値を計算するために、クロロキンの存在下でのフソソームＣｒｅ送達のレベル（ＦｕｓＬ＋ＣＱ）と並んで、クロロキンの不在下でのフソソームＣｒｅ送達のレベル（ＦｕｓＬ－ＣＱ）を決定する。エンドサイトーシス経路を介して送達されるフソソームＣｒｅの正規化された値を決定するために、次の式を使用する：（ＦｕｓＬ＋ＣＱ）／（ＦｕｓＬ－ＣＱ）。
一実施形態では、所与のフソソームについてエンドサイトーシス経路を介して送達されるフソソームＣｒｅの平均レベルは、０．０１～０．６の範囲、又はクロロキンで処理されたレシピエント細胞少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上となる。
実施例６３：ダイナミン媒介経路、マクロピノサイトーシス経路又はアクチン媒介経路によるフソソームの送達
この実施例では、ダイナミン媒介経路を介したレシピエント細胞へのＣｒｅのフソソーム送達について説明する。微小胞を含むフソソームを、前の実施例で説明したように産生することができる。フソソームを受けるレシピエント細胞の群をダイナミンの阻害剤であるダイナソア（１２０μＭ）で処理することを除いて、フソソームを、前の実施例に従って、ダイナミン媒介経路を介したＣｒｅの送達についてアッセイする。ダイナミン媒介経路を介して送達されるフソソームＣｒｅの値を計算するために、ダイナソアの存在下でのフソソームＣｒｅ送達のレベル（ＦｕｓＬ＋ＤＳ）と並んで、ダイナソアの不在下でのフソソームＣｒｅ送達のレベル（ＦｕｓＬ－ＤＳ）を決定する。送達されたフソソームＣｒｅの正規化された値を、前の実施例で説明したように計算することができる。
この実施例では、マクロピノサイトーシスによるレシピエント細胞へのＣｒｅの送達について説明する。微小胞を含むフソソームを、前の実施例で説明したように産生することができる。フソソームを受けるレシピエント細胞の群をマクロピノサイトーシスの阻害剤である５－（Ｎ－エチル－Ｎ－イソプロピル）アミロライド（ＥＩＰＡ）（２５μＭ）で処理する以外は、前述の実施例に従ってマクロピノサイトーシス介してＣｒｅの送達についてフソソームをアッセイする。マクロピノサイトーシスを介して送達されるフソソームＣｒｅの値を計算するために、ＥＩＰＡの存在下でのフソソームＣｒｅ送達のレベル（ＦｕｓＬ＋ＥＰＩＡ）と並んで、ＥＰＩＡの不在下でのフソソームＣｒｅ送達のレベル（ＦｕｓＬ－ＥＩＰＡ）を決定する。送達されたフソソームＣｒｅの正規化された値を、前の実施例で説明したように計算することができる。
この実施例では、アクチン媒介経路を介したレシピエント細胞へのＣｒｅのフソソーム送達についても説明する。微小胞を含むフソソームを、前の実施例で説明したように産生することができる。フソソームを受けるレシピエント細胞の群がアクチン重合の阻害剤であるラトランクリンＢ（６μＭ）で処理されることを除いて、フソソームを前の実施例に従ってマクロピノサイトーシスによるＣｒｅの送達についてアッセイする。アクチン媒介経路を介して送達されるフソソームＣｒｅの値を計算するために、ラトランクリンＢの存在下でのフソソームＣｒｅ送達のレベル（ＦｕｓＬ＋ＬａｔＢ）と並んで、ラトランクリンＢの不在下でのフソソームＣｒｅ送達のレベル（ＦｕｓＬ－ＬａｔＢ）を決定する。送達されたフソソームＣｒｅの正規化された値を、前の実施例で説明したように計算することができる。
実施例６４：タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ送達
この実施例では、フソソームによる眼への治療剤の送達について説明する。
フソソームは、前の実施例に記載された方法のいずれかを使用して造血幹細胞及び始原細胞に由来し、マウスノックアウトが不足しているタンパク質がロードされている。
フソソームを、タンパク質が不足しているマウスの右眼の網膜下に注射し、ビヒクル対照を、マウスの左眼に注射する。マウスのサブセットは、生後２か月に達したときに安楽死させる。
採取した網膜組織の組織学及びＨ＆Ｅ染色を実施して、マウスの各網膜で救出された細胞の数を数える（Ｓａｎｇｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，１２６（８）：３１０４－３１１６，２０１６に記載）。
注入されたタンパク質のレベルを、ＰＤＥ６Ｂタンパク質に特異的な抗体を用いたウエスタンブロットを介して、２か月齢で安楽死させたマウスから採取した網膜で測定する。
一実施形態では、フソソームを投与されるマウスの左眼は、ビヒクルで処理されるマウスの右眼と比較して、網膜の外顆粒レベルに存在する核の数が増加するであろう。タンパク質の増加は、変異したＰＢＥ６Ｂタンパク質の相補性を示唆している。
実施例６５：フソソーム投与後の奇形腫形成の評価
この実施例は、フソソームによる奇形腫形成がないことを説明する。一実施形態では、フソソームを被験体に投与されたときに奇形腫の形成をもたらさないであろう。
フソソームは、前の実施例で説明した方法のいずれかによって産生される。フソソーム、腫瘍細胞（陽性対照）又はビヒクル（陰性対照）をＰＢＳでマウスの左側腹部（１２～２０週齢）に皮下注射する。奇形腫、例えば腫瘍の成長を、フソソーム、腫瘍細胞、又はビヒクル注射後８週間のキャリパー測定による腫瘍体積の決定によって週に２～３回分析する。
一実施形態では、フソソーム又はビヒクルを投与されたマウスは、キャリパー測定を介して、測定可能な腫瘍形成、例えば奇形腫を有さないであろう。一実施形態では、腫瘍細胞で処理された陽性対照動物は、８週間の観察にわたってキャリパーによって測定されるように、かなりの腫瘍、例えば奇形腫のサイズを示すであろう。
実施例６６：フソソーム及びソース細胞における全ＲＮＡの測定
この実施例は、ソース細胞と比較したフソソーム中のＲＮＡの量を定量化する方法を説明する。一実施形態では、フソソームは、ソース細胞と同様のＲＮＡレベルを有するであろう。このアッセイでは、ＲＮＡレベルはトータルＲＮＡを測定することによって決定される。
フソソームは、前の実施例に記載された方法のいずれかによって調製される。フソソーム及びソース細胞のタンパク質によって測定されたものと同じ質量の調製物を使用して、全ＲＮＡを単離し（例えば、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙカタログ番号７４１０４等のキットを使用）、続いて標準的な分光法を使用してＲＮＡ濃度を決定し、ＲＮＡ（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＮａｎｏＤｒｏｐを使用）による吸光度を評価する。
一実施形態では、フソソーム中のＲＮＡの濃度は、タンパク質の質量あたりソース細胞の濃度の５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％となる。
実施例６７：細胞から自由に放出される融合性微小胞の単離
この実施例では、細胞から自由に放出される融合性微小胞の分離について説明する。融合性微小胞を以下のように単離した。９．２×１０６ＨＥＫ－２９３Ｔ（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＣＲＬ－３２１６）を、１００ｍｍコラーゲンコーティングディッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）において、完全培地ＧｌｕｔａＭＡＸ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、１０％胎児子牛血清（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、及びペニシリン／ストレプトマイシン抗生物質（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ））７．５ｍＬ中、ＶＳＶｇに対するオープンリーディングフレームを含むｐｃＤＮＡ３．１発現プラスミド１０μｇ及びＳＶ４０核局在化配列を有するバクテリオファージＰ１ Ｃｒｅリコンビナーゼのオープンリーディングフレームを含むｐｃＤＮＡ３．１発現プラスミド１５ｕｇを含むＸｆｅｃｔトランスフェクション試薬（Ｔａｋａｒａ、カタログ番号６３１３１７）を使用して逆トランスフェクトした。播種の１２時間後、７．５ｍＬの完全培地を注意深く加えた。２００×ｇで１０分間遠心分離することにより、細胞を培地から分離した。上清を収集し、５００×ｇで１０分間を２回、２，０００×ｇで１５分間を１回、１０，０００×ｇで３０分間を１回、７０，０００×ｇで６０分間を１回を順次遠心分離した。自由に放出されたフソソームを、最後の遠心分離工程中にペレット化し、ＰＢＳに再懸濁し、７０，０００×ｇで再ペレット化した。最終ペレットをＰＢＳに再懸濁した。
Ｗｕｂｂｏｌｔｓ Ｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｂ Ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ Ｅｘｏｓｏｍｅｓ：Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅｉｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍｕｌｔｉｖｅｓｉｃｕｌａｒ Ｂｏｄｙ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：１０９６３－１０９７２ ２００３も参照。
実施例６８：フソソームの平均サイズ分布の測定
この実施例では、フソソームの粒度分布の測定について説明する。
フソソームを、ＶＳＶ－ＧによるＨＥＫ２９３Ｔの一過性トランスフェクション、除核、及びその後のフィコールによる分画によって、本明細書に記載されているように調製した。図３に示すように、実施例２７の方法を使用して、フソソームを測定してサイズ分布を決定した。フソソームは、サンプルの９０％以内で、親細胞のサイズ分布の変動の約５０％未満、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、又はそれ未満を有し得る。フソソームは、サンプルの９０％以内で、親細胞のサイズ分布の変動の５８％未満を有し得る。
実施例６９：フソソームの平均体積
この実施例はフソソームの平均量の測定について説明する。フソソームのサイズ（例えば、体積）を変えることは、それらを別個のカーゴ積載、治療計画又は適用に関して用途の広いものにすることができる。
フソソームを、ＶＳＶ－ＧによるＨＥＫ２９３Ｔの一過性トランスフェクション、除核、及びその後のフィコールによる分画によって、本明細書に記載されているように調製した。陽性対照はＨＥＫ２９３Ｔ細胞であった。
実施例２７に記載されているようなＮＴＡ及び共焦点顕微鏡法の組み合わせによる分析を使用して、フソソームのサイズを決定した。図４に示すように、フソソームの直径を測定し、体積を計算した。フソソームは、直径が５０ｎｍを超える平均サイズを有することができると考えられる。フソソームは、直径１２９ｎｍの平均サイズを有し得ると考えられる。
実施例７０：可溶性タンパク質質量と不溶性タンパク質質量との比較
この実施例では、フソソーム中のタンパク質質量の可溶性：不溶性比の定量化について説明する。フソソームにおけるタンパク質質量の可溶性：不溶性の比率は、場合によっては、有核細胞のそれと類似し得る。
フソソームを、ＶＳＶ－ＧによるＨＥＫ２９３Ｔの一過性トランスフェクション、除核、及びその後のフィコールによる分画によって、本明細書に記載されているように調製した。フソソーム調製物を、標準的なビシンコニン酸アッセイ（ＢＣＡ）を使用して（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＢＣＡタンパク質アッセイキット、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ製品番号２３２２５）試験し、可溶性：不溶性タンパク質比を決定した。可溶性タンパク質サンプルを、１×１０７細胞又はＰＢＳ中約１ｍｇ／ｍＬの総フソソームの濃度で調製フソソーム又は親細胞を懸濁し、１，５００×ｇで遠心分離して細胞をペレット化し、１６，０００×ｇでフソソームをペレット化することによって調製した。上清を可溶性タンパク質画分として収集した。
次に、フソソーム又は細胞をＰＢＳに再懸濁した。この懸濁液は、不溶性タンパク質画分を表す。
付属のＢＳＡを使用して、ウェルあたり０～１５μｇのＢＳＡの検量線を作成した（２回行う）。フソソーム又は細胞調製物を、測定量が標準の範囲内になるように希釈した。フソソーム調製物を２回分析し、平均値を使用した。可溶性タンパク質濃度を不溶性タンパク質濃度で割って、可溶性：不溶性タンパク質比を算出した（図５）。
実施例７１：標的細胞との融合の測定
麻疹ウイルス（ＭｖＨ）の操作されたヘマグルチニン糖タンパク質及び融合タンパク質（Ｆ）を細胞表面に発現するＨＥＫ－２９３Ｔ細胞に由来するフソソーム、並びにＣｒｅリコンビナーゼタンパク質を、本明細書に記載するように生成した。ＭｖＨは、その天然の受容体結合が除去され、細胞表面抗原を認識する一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）を介して標的細胞の特異性が提供されるように設計されており、この場合、ｓｃＦｖは、Ｔ細胞受容体に対する供受容体、ＣＤ８を標的とするように設計されている。表面にフソゲンＶＳＶ－Ｇを発現し、Ｃｒｅリコンビナーゼタンパク質を含むＨＥＫ－２９３Ｔ細胞に由来する対照フソソームを使用した。標的細胞を、ＣＭＶプロモーター下で「Ｌｏｘｐ－ＧＦＰ－ｓｔｏｐ－Ｌｏｘｐ－ＲＦＰ」カセットを発現するように設計されたＨＥＫ－２９３Ｔ細胞であり、共受容体ＣＤ８ａ及びＣＤ８ｂを過剰発現するように設計した。非標的細胞は、「Ｌｏｘｐ－ＧＦＰ－ｓｔｏｐ－Ｌｏｘｐ－ＲＦＰ」カセットを発現しているがＣＤ８ａ／ｂの過剰発現がない同じＨＥＫ－２９３Ｔ細胞であった。標的又は非標的レシピエント細胞を３０，０００細胞／ウェルで黒色の透明底９６ウェルプレートに蒔き、３７℃及び５％ＣＯ２で１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地で培養した。レシピエント細胞をプレーティングしてから４～６時間後、Ｃｒｅリコンビナーゼタンパク質を発現するフソソーム及びＭｖＨ＋Ｆを、ＤＭＥＭ培地の標的又は非標的レシピエント細胞に適用した。レシピエント細胞を１０μｇのフソソームで処理し、３７℃及び５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。
自動顕微鏡（ｗｗｗ．ｂｉｏｔｅｋ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｉｍａｇｉｎｇ－ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ－ａｕｔｏｍａｔｅｄ－ｃｅｌｌ－ｉｍａｇｅｒｓ／ｌｉｏｎｈｅａｒｔ－ｆｘ－ａｕｔｏｍａｔｅｄ－ｌｉｖｅ－ｃｅｌｌ－ｉｍａｇｅｒ／）を使用して細胞プレートを画像化した。所与のウェルの総細胞集団は、ＤＭＥＭ培地中のヘキスト３３３４２で１０分間細胞を染色することによって決定された。ヘキスト３３３４２は、ＤＮＡにインターカレートすることで細胞核を染色するため、個々の細胞を識別するためにこれを使用する。ヘキストを、４０５ｎｍ ＬＥＤ及びＤＡＰＩフィルターキューブを使用して画像化した。ＧＦＰを、４６５ｎｍ ＬＥＤ及びＧＦＰフィルターキューブを使用して画像化し、ＲＦＰを５２３ｎｍ ＬＥＤ及びＲＦＰフィルターキューブを使用して画像化した。標的細胞及び非標的細胞のウェルの画像を、最初に陽性対照ウェル、すなわち、フソソームの代わりにＣｒｅリコンビナーゼをコードするアデノウイルスで処理されたレシピエント細胞のＬＥＤ強度及び積分時間を確立することによって取得した。
取得設定を、ヘキスト、ＲＦＰ、及びＧＦＰの強度が最大ピクセル強度値になるが、飽和しないように設定する。次に、確立された設定を使用して、対象のウェルを画像化した。ヘキストチャネルにオートフォーカスした後、ＧＦＰ及びＲＦＰチャネルに確立された焦点面を使用することにより、各ウェルにフォーカスを設定した。ＧＦＰ及びＲＦＰ陽性細胞の分析は、自動蛍光顕微鏡を備えたＧｅｎ５ソフトウェア（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｔｅｋ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｓｏｆｔｗａｒｅ－ｒｏｂｏｔｉｃｓ－ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｇｅｎ５－ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ－ｒｅａｄｅｒ－ａｎｄ－ｉｍａｇｅｒ－ｓｏｆｔｗａｒｅ／）を使用して実行した。
画像を、幅６０μｍのローリングボールバック背景減算アルゴリズムを使用して前処理した。バックグラウンド強度を大幅に超えるＧＦＰ強度を持つ細胞をしきい値処理し、ＧＦＰ陽性細胞には小さすぎる又は大きすぎる領域を除外した。同じ分析手順をＲＦＰチャネルに適用した。次に、ＲＦＰ陽性細胞（Ｃｒｅを投与されたレシピエント細胞）の数をＧＦＰ陽性細胞（送達を示さなかったレシピエント細胞）とＲＦＰ陽性細胞の合計で割って、標的及び批評的レシピエント細胞集団とのフソソーム融合の量を示説明する、パーセントＲＦＰ変換を定量化した。標的融合（標的レシピエント細胞へのフソソーム融合）の量について、パーセントＲＦＰ変換値は、標的レシピエント細胞である（すなわち、ＣＤ８を発現する）レシピエント細胞の割合に正規化され、これは、フィコエリトリン（ＰＥ）に複合化された抗ＣＤ８抗体で染色し、フローサイトメトリーで分析することによって評価された。最後に、標的融合の絶対量を、標的細胞融合量から非標的細胞融合の量を差し引くことによって決定した（０未満の任意の値は０であると見なした）。
このアッセイでは、操作されたＭｖＨ（ＣＤ８）＋Ｆを表面に発現し、Ｃｒｅリコンビナーゼタンパク質を含むＨＥＫ－２９３Ｔ細胞に由来するフソソームは、レシピエント細胞が、「Ｌｏｘｐ－ＧＦＰ－ｓｔｏｐ－Ｌｏｘｐ－ＲＦＰ」カセットを発現する標的ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞の場合、２５．２＋／－６．４％のＲＦＰ変換率を示、これらのレシピエント細胞の５１．１％がＣＤ８陽性であることが観察された。これらの結果から、ＲＦＰ変換の正規化された割合又は標的融合の量を、標的融合について４９．３＋／－１２．７％であると決定した。同じフソソームは、レシピエントが「Ｌｏｘｐ－ＧＦＰ－ｓｔｏｐ－Ｌｏｘｐ－ＲＦＰ」を発現しているがＣＤ８を発現していない非標的ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞である場合、０．５＋／－０．１％のＲＦＰ変換割合を示した。上記に基づいて、ＭｖＨ（ＣＤ８）＋Ｆフソソームの標的融合の絶対量は４８．８％であると決定され、対照ＶＳＶ－Ｇフソソームの標的融合の絶対量を０％であると決定した（図６）。
実施例７２：細胞膜を横切ってグルコースを輸送する能力の測定
水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ－Ｇ）由来のエンベロープ糖タンパク質Ｇを細胞表面に発現し、Ｃｒｅリコンビナーゼタンパク質を発現するＨＥＫ－２９３Ｔ細胞からのフソソームを、フィコール勾配による超遠心分離の標準的な手順に従って生成し、本明細書に記載される小さな粒子のフソソームを得た。細胞膜を横切ってグルコースを輸送するフソソームの能力を測定するために、生細胞におけるグルコース取り込みをモニターするために使用できる蛍光グルコース類似体である２－ＮＢＤＧ（２－（Ｎ－（７－ニトロベンズ－２－オキサ－１，３－ジアゾール－４－イル）アミノ）－２－デオキシグルコース）のレベルを定量化して、脂質二重層を横切る能動輸送を評価した。Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ Ｉｎｃ．から市販されているキット（カタログ番号Ｋ６８２）を、製造業者の指示に従ってアッセイに使用した。
簡単に説明すると、フソソームサンプルを、最初に、製造業者の指示に従って、ビシンコニン酸アッセイ（ＢＣＡ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号２３２２５）によって総タンパク質含有量について測定した。次に、卓上遠心分離機で３０００ｇで５分間遠心分離して４０ｕｇのフソソーム総タンパク質をペレット化し、続いて０．５％ウシ胎児血清を添加した４００ｕＬのＤＭＥＭに再懸濁した。これをサンプルごとに２回ずつ行い、複製の１つを、グルコース取り込み阻害の対照として、グルコース取り込みを阻害する天然フェノールである４ｕＬのフロレチン（キットに付属）で処理した。次に、サンプルを室温で１時間インキュベートした。インキュベーション後、フソソームサンプルをペレット化し、あらかじめ調製した４００ｕＬのグルコース取り込みミックスに再懸濁した（配合については下記表１０を参照）。フロレチンで前処理したサンプルを、フロレチンとのグルコース取り込みミックスに再懸濁し、前処理していないサンプルを、フロレチンの代わりに２０ｕＬのＰＢＳを含むグルコース取り込みミックスに再懸濁した。また、フローサイトメトリー分析の陰性対照として０．５％ＦＢＳのみを含むＤＭＥＭ培地にフソソームサンプルの並行セットを再懸濁した。
次いで、試料を３７℃、５％ＣＯ２で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞をペレット化し、１ｍＬの１×分析バッファー（キットに付属）で１回洗浄し、再度ペレット化し、４００ｕＬの１×分析バッファーに再懸濁した。
次に、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴアコースティックフォーカシングサイトメーターを使用するフローサイトメトリー分析により、サンプルの２－ＮＢＤＧ取り込みを測定した。２－ＮＢＤＧを４８８ｎｍレーザーで励起し、発光を５１３±２６ｎｍで捕捉した。前方及び側方散乱ゲーティングを、当初はフソソームサイズのイベントをキャプチャし、小さな破片を廃棄するために使用した。２－ＮＢＤＧ陽性のイベントを、２－ＮＢＤＧ陰性対照サンプルが２－ＮＢＤＧ染色陽性のイベントの０．５％未満を示した最小レベルでゲーティングすることによって決定した。次に、２－ＮＢＤＧ蛍光陽性のゲート細胞を、フロレチン処理ありとなしのフソソームのグルコース取り込みの値を計算するために、２－ＮＢＤＧの平均蛍光強度（Ｆ．Ｉ．）について評価した。
このアッセイでは、ＶＳＶ－Ｇ及びＣｒｅを発現するＨＥＫ－２９３Ｔ細胞に由来するフソソームは、フロレチン処理なしで６３１．０＋／－１．４の２－ＮＢＤＧ平均Ｆ．Ｉ．、及びフロレチン処理ありで５６５．５＋／－４．９の平均Ｆ．Ｉ．を示した（図７）。
実施例７３：細胞質ゾル中のエステラーゼ活性の測定
Ｃ２Ｃ１２細胞からのフソソームは、フィコール勾配による超遠心分離の標準的な手順に従って生成され、本明細書に記載されるような小粒子フソソームを得た。フソソームの細胞質ゾルにおけるエステラーゼ活性を測定するために、生細胞の細胞膜を受動的に通過し、細胞質ゾルエステラーゼによって緑色の蛍光カルセインへと変換されるフルオレセイン誘導体及び非蛍光性の生体色素であって、無傷の膜及び不活性な多剤耐性タンパク質を持つ細胞によって保持されるカルセインＡＭ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ、カタログ番号５６４０６１）でサンプルを染色した。
簡単に説明すると、フソソームサンプルを、最初に、製造業者の指示に従って、ビシンコニン酸アッセイ（ＢＣＡ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号２３２２５）によって総タンパク質含有量について測定した。次に、卓上遠心分離機で３０００ｇで５分間遠心分離して２０ｕｇのフソソーム総タンパク質をペレット化し、続いて０．５％ウシ胎児血清を添加した４００ｕＬのＤＭＥＭに再懸濁した。膜透過性色素であるカルセイン－ＡＭをジメチルスルホキシド中の１０ｍＭの原液、及びＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）中の１ｍＭの希釈標準溶液として調製した。ＶＳＶ－Ｇフソソームは、ＤＭＥＭ培地で希釈したカルセイン－ＡＭの１μＭ溶液で染色した。サンプルを３７℃、暗所で３０分間インキュベートした後、遠心分離によりペレット化した。ＰＢＳバッファーで２回洗浄した後、フソソームをＰＢＳに再懸濁し、フローサイトメトリーで分析した。
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴアコースティックフォーカシングイトメーターを使用して、サンプルのカルセイン蛍光保持を測定した。カルセインＡＭを４８８ｎｍレーザーで励起し、発光を５１３±２６ｎｍで捕捉した。前方及び側方散乱ゲーティングを、当初はフソソームサイズのイベントをキャプチャし、小さな破片を廃棄するために使用した。カルセイン陽性のイベントを、カルセイン陰性対照サンプルがカルセイン染色陽性のイベントの０．５％未満を示した最小レベルでゲーティングすることによって決定した。次に、カルセイン蛍光陽性のゲート細胞を、フソソームの細胞質ゾル中のエステラーゼ活性の値を計算するために、カルセインの平均蛍光強度（Ｆ．Ｉ．）について評価した。
このアッセイにより、Ｃ２Ｃ１２細胞に由来するフソソームは、６３１．０＋／－１．４のエステラーゼ活性（平均カルセインＦ．Ｉ．）を示した（図８）。
実施例７４：フソソーム中のアセチルコリンエステラーゼ活性の測定
細胞表面に胎盤細胞間融合タンパク質シンシチン－１（Ｓｙｎ１）を発現し、Ｃｒｅリコンビナーゼタンパク質を発現するＨＥＫ－２９３Ｔ細胞からのフソソームを本明細書に記載のように生成した。アセチルコリンエステラーゼ活性をＦｌｕｏｒｏＣｅｔ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号ＦＣＥＴ９６Ａ－１）を使用して、製造業者の推奨に従って測定した。
簡単に説明すると、フソソームを１２０，０００ｇで９０分間の超遠心分離によりペレット化し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に注意深く再懸濁した。次のフソソームを、製造業者の指示に従って、ビシンコニン酸アッセイ（ＢＣＡ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号２３２２５）によって総タンパク質含有量について定量化した。タンパク質濃度のＢＣＡ定量後、１０００ｎｇの総フソソームタンパク質をＰＢＳで６０ｕＬの容量に希釈し、続いて６０ｕＬの溶解バッファーを添加して粒子を溶解した。氷上で３０分間インキュベートした後、サンプルをＦｌｕｏｒｏＣｅｔアッセイで実行する準備を整えた。
９６ウェルプレートの複製ウェルで、５０ｕＬの溶解フソソームサンプルを５０ｕＬのバッファーＡの希釈標準原液及び５０ｕＬのバッファーＢの希釈標準原液と混合した。並行して、１２６ｕＬの１×反応バッファーに提供された２ｕＬの標準曲線をピペッティングして標準曲線を作成した。次に、この標準溶液を５倍段階希釈して、２．０Ｅ＋０８、１．０Ｅ＋０８、５．０Ｅ＋０７、２．５Ｅ＋０７、１．２５Ｅ＋０７、及び６．２５Ｅ＋０６のアセチルコリンエステラーゼ活性のエクソソーム等価物からなる６点の検量線を作成した。次に、各標準液５０ｕＬを、９６ウェルプレートの複製ウェルでバッファーＡの希釈標準原液５０ｕＬ及びバッファーＢの希釈標準原液５０ｕＬと混合した。５０ｕＬの１×反応バッファーをブランクとして使用した。プレートの側面を軽くたたいて混合し、続いて暗所において室温で２０分間インキュベートした。次に、励起：５３０～５７０ｎｍ及び発光：５９０～６００ｎｍに設定された蛍光プレートリーダーを使用して、プレートを直ちに測定した。プレートを３０秒間振とうしてから読み取った。
次に、ブランクウェルからＲＦＵ値を差し引いた後、相対蛍光単位（ＲＦＵ）を、アセチルコリンエステラーゼ活性の既知のエクソソーム当量に対してプロットした。次に、線形回帰直線を計算し、その式を使用して、測定されたＲＦＵ値からフソソームサンプルのアセチルコリンエステラーゼ活性（エクソソーム同等物）を決定した。Ｓｙｎ１フソソームについて測定されたアセチルコリンエステラーゼ活性を表１１に示す。
実施例７５：代謝活性レベルの測定
水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ－Ｇ）由来のエンベロープ糖タンパク質Ｇを細胞表面に発現し、Ｃｒｅリコンビナーゼタンパク質を発現するＨＥＫ－２９３Ｔ細胞からのフソソームを本明細書に記載されるように生成した。フソソーム調製物の代謝活性レベルを決定するために、クエン酸合成酵素活性を、必要な全ての試薬を提供するＳｉｇｍａから市販されているキット（カタログ番号ＣＳ０７２０）を使用して評価した。クエン酸合成酵素は、トリカルボン酸（ＴＣＡ）回路内の酵素であり、オキサロ酢酸（ＯＡＡ）とアセチルＣｏＡの間の反応を触媒してクエン酸を生成する。アセチルＣｏＡが加水分解されると、チオール基を持つＣｏＡ（ＣｏＡ－ＳＨ）が放出される。チオール基は化学試薬５，５－ジチオビス－（２－ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）と反応して、５－チオ－２－ニトロ安息香酸（ＴＮＢ）を形成し、これは、４１２ｎｍで分光光度的に測定できる黄色の生成物を有する。
アッセイを製造業者の推奨に従って実行した。簡単に説明すると、フソソームサンプルを、最初に、製造業者の指示に従って、ビシンコニン酸アッセイ（ＢＣＡ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号２３２２５）によって総タンパク質含有量について測定した。次に、４００ｕｇのフソソーム総タンパク質を、卓上遠心分離機で３０００ｇで５分間遠心分離することによりペレット化した。再度ペレット化し、氷冷ＰＢＳに再懸濁することにより、フソソームを１回洗浄した。フソソームを再びペレット化し、上清を除去した。ペレットを、１×プロテアーゼ阻害剤を含む１００ｕＬのＣｅｌｌＬｙｔｉｃ Ｍバッファーで溶解した。ピペッティングにより混合した後、溶解したサンプルを室温で１５分間インキュベートして溶解を完了した。次に、サンプルを１２，０００ｇで１０分間遠心分離し、上清を新しいマイクロ遠心チューブに移し、次のアッセイが行われるまで－８０℃で保存した。
クエン酸合成酵素活性アッセイを開始するために、全てのアッセイ溶液を使用前に室温まで温めた。溶解したフソソームサンプルを、以下の表１２に従ってアッセイ溶液と混合した。
表１２の容量は、９６ウェルプレートの単一ウェルの容量を表している。サンプルを２回測定した。反応の全ての成分を混合し、９６ウェルプレートの単一ウェルにピペットで移した。次に、４１２ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダーで１．５分間分析し、ベースライン反応を測定した。次に、１０ｕＬの１０ｍＭ ＯＡＡ溶液を各ウェルに添加して、反応を開始した。プレートをマイクロプレートリーダーで１０秒間振とうした後、４１２ｎｍでの吸光度を１．５分間読み取り、１０秒ごとに測定した。
クエン酸合成酵素活性を計算するために、４１２ｎｍでの吸光度を各反応の時間に対してプロットした。１分あたりの吸光度の変化を、ＯＡＡ添加前（内因性活性）と後（総活性）のプロットの線形範囲に対して計算した。次に、サンプルの総活性から内因性活性を差し引くことにより、正味のクエン酸合成酵素活性を計算した。次に、この値を使用して、製造元から提供された式と定数値に基づいてクエン酸合成酵素活性を計算した。ＶＳＶ－Ｇフソソームの測定されたクエン酸合成酵素活性は１．５７Ｅ－０２＋／－１．８６Ｅ－０３ｕｍｏｌ／ｕｇフソソーム／分であった。
実施例７６：呼吸レベルの測定
水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ－Ｇ）由来のエンベロープ糖タンパク質Ｇを細胞表面に発現するＨＥＫ－２９３Ｔ細胞からのフソソームを、フィコール勾配による超遠心分離の標準的な手順に従って生成し、本明細書に記載される小さな粒子のフソソームを得た。Ｓｅａｈｏｒｓｅ細胞外フラックスアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ）でミトコンドリアの酸素消費率を測定することにより、フソソーム調製物の呼吸レベルを決定した。
簡単に説明すると、フソソームサンプルを、最初に、製造業者の指示に従って、ビシンコニン酸アッセイ（ＢＣＡ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号２３２２５）によって総タンパク質含有量について測定した。次に、卓上遠心分離機で３０００ｇで５分間遠心分離により２０μｇのフソソーム総タンパク質をペレット化し、続いて、２５ｍＭグルコース及び２ｍＭグルタミン（ｐＨ７．４）を添加したＸＦアッセイ培地（Ａｇｉｌｅｎｔ カタログ番号１０３５７５－１００）１５０μＬに再懸濁した（４重）。次に、再懸濁したサンプルを９６ウェルＳｅａｈｏｒｓｅプレート（Ａｇｉｌｅｎｔ）の１つのウェルに加えた。
酸素消費アッセイを、サンプルを含む９６ウェルのＳｅａｈｏｒｓｅプレートを３７℃で６０分間インキュベートして、温度及びｐＨが平衡に達するようにすることで開始した。次に、マイクロプレートをＸＦ９６細胞外フラックスアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ）でアッセイして、フソソームのすぐ周囲の培地における酸素及びｐＨの細胞外フラックス変化を測定した。定常状態の酸素消費量及び細胞外酸性化率を取得した後、ＡＴＰ合成酵素を阻害するオリゴマイシン（５μＭ）及びミトコンドリアを脱共役するプロトンイオノフォアＦＣＣＰ（カルボニルシアニド４－（トリフルオロメトキシ）フェニルヒドラゾン；２μＭ）を、試薬送達チャンバーを通してマイクロプレートの各ウェルに順次注入して、最大酸素消費率の値を取得した。最後に、５μＭのアンチマイシンＡ（ミトコンドリア複合体ＩＩＩの阻害剤）を注入して、呼吸の変化が主にミトコンドリアの呼吸によるものであることを確認した。アンチマイシンＡ呼吸数を、他の３つの呼吸数から差し引いて、基底、非結合（オリゴマイシン耐性）、及び最大（ＦＣＣＰ誘導）ミトコンドリア呼吸数を決定した。
このアッセイを使用して、ドナーＶＳＶ－Ｇフソソームが、下記表１３に従って、基礎、非結合、及び最大の酸素消費（呼吸）数を示すことが決定された。
実施例７７：フソソームのホスファチジルセリンレベルの測定
水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ－Ｇ）由来のエンベロープ糖タンパク質Ｇを細胞表面に発現し、Ｃｒｅリコンビナーゼタンパク質を発現するＨＥＫ－２９３Ｔ細胞からのフソソームを、フィコール勾配による超遠心分離の標準的な手順に従って生成し、本明細書に記載される小さな粒子のフソソームを得た。フソソームのホスファチジルセリンレベルを測定するために、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７色素（カタログ番号Ａ２３２０４）と複合化された市販のアネキシンＶを製造業者の指示に従って使用して、アネキシンＶ染色を行った。アネキシンＶは、原形質膜の外側の小葉に露出したときにホスファチジルセリンに結合できる細胞タンパク質であるため、サンプルに結合するアネキシンＶの読み取りは、サンプル中のホスファチジルセリンレベルの評価を提供できる。
簡単に説明すると、フソソームサンプルを、最初に、製造業者の指示に従って、ビシンコニン酸アッセイ（ＢＣＡ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，カタログ番号２３２２５）によって総タンパク質含有量について測定した。次に、卓上遠心分離機で３０００ｇで５分間遠心分離（３連のサンプル）して４０μｇのフソソーム総タンパク質をペレット化し、続いて２％ウシ胎児血清を添加した４００ｕＬのＤＭＥＭに再懸濁した。１つのサンプルを４０μＭのアンチマイシンＡで処理した。次に、サンプルを３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、サンプルを再度遠心分離によりペレット化し、１００μＬのアネキシン結合バッファー（ＡＢＢ；１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ７．４）に再懸濁した。次に、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７と複合化された５μＬのアネキシンＶを各サンプルに添加した（アネキシンＶ染色のない陰性対照を除く）。サンプルを室温で１５分間インキュベートした後、４００μＬのＡＢＢを添加した。
次に、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴアコースティックフォーカシングサイトメーターを使用するフローサイトメトリー分析により、サンプルのアネキシンＶ染色を測定した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７と複合化されたアネキシンＶを６３８ｎｍレーザーで励起し、６７０±１４ｎｍで発光を捕捉した。前方及び側方散乱ゲーティングを、当初はフソソームサイズのイベントをキャプチャし、小さな破片を廃棄するために使用した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（アネキシンＶ）染色に陽性イベントを、未染色のアネキシンＶ陰性対照サンプルがＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７染色に陽性のイベントの０．５％未満を示した最小レベルでゲーティングすることによって決定した。次に、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７染色に陽性のゲートイベントを、親集団全体のアネキシンＶ陽性イベント（前方／側方散乱ゲートのフソソームサイズイベント）の割合について評価し、この値をフソソームサンプルでホスファチジルセリンレベルの定量化として使用した。
このアッセイでは、ＶＳＶ－Ｇ及びＣｒｅを発現するＨＥＫ－２９３Ｔ細胞に由来するフソソームは、アンチマイシンＡ処理なしで６３．３±２．３％の％アネキシンＶ陽性フソソームを示し、アンチマイシンＡ処理により６７．６±５．７％のアネキシンＶ陽性フソソームの割合を示した。
実施例７８：平均ミトコンドリア膜電位の測定
水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ－Ｇ）由来のエンベロープ糖タンパク質Ｇを細胞表面に発現し、Ｃｒｅリコンビナーゼタンパク質を発現するＨＥＫ－２９３Ｔ細胞からのフソソームを、フィコール勾配による超遠心分離の標準的な手順に従って生成し、本明細書に記載される小さな粒子のフソソームを得た。フソソームの平均ミトコンドリア膜電位レベルを測定するために、ミトコンドリア膜電位に感受性の市販の色素、テトラメチルローダミン、エチルエステル、過塩素酸塩（ＴＭＲＥ；Ａｂｃａｍ、カタログ番号Ｔ６６９）を使用して、ミトコンドリア膜電位を評価した。ＴＭＲＥ蛍光強度（ＦＩ）をサンプル中のミトコンドリアの量に正規化するために、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ ＦＭ色素（ＭＴＧ；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ｍ７５１４）を使用してサンプルを共染色し、ＴＭＲＥ ＦＩをＭＴＧ ＦＩ、たがってサンプル中のミトコンドリアの量に正規化した。更に、カルボニルシアニド－ｐ－トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン（ＦＣＣＰ；Ｓｉｇｍａ カタログ番号Ｃ２９２０）を使用して、ミトコンドリア膜電位を完全に脱分極させ、ＴＭＲＥ ＦＩの減少に基づいたミリボルト単位の定量化を可能にするために、サンプルの並列セットを処理した。
簡単に説明すると、フソソームサンプルを、最初に、製造業者の指示に従って、ビシンコニン酸アッセイ（ＢＣＡ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，カタログ番号２３２２５）によって総タンパク質含有量について測定した。次に、４０μｇのフソソーム総タンパク質を卓上遠心分離機で３０００ｇで５分間遠心分離（未処理及びＦＣＣＰ処理の複製のサンプルについて４重のサンプル）してペレット化し、続いて２％ウシ胎児血清を添加し、それぞれ３０ｎＭ及び２００ｎＭの最終濃度でＴＭＲＥ及びＭＴＧ色素を含む、１００ｕＬのＤＭＥＭに再懸濁した。フソソームサンプルの並行セットを、陰性対照として染色せずに残した。サンプルを３７℃で４５分間インキュベートした。インキュベーション後、サンプルを遠心分離によりペレット化し、３０ｎｍ ＴＭＲＥを含むフェノールレッドフリーの４００μＬのＤＭＥＭ培地に再懸濁した。フローサイトメトリーによる評価の前に、１セットの複製を２０μＭ ＦＣＣＰで５分間処理した。
次に、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴアコースティックフォーカシングサイトメーターを使用するフローサイトメトリー分析により、サンプルのアネキシンＶ染色を測定した。ＭＴＧを４８８ｎｍレーザーで励起し、発光を５３０±３０ｎｍで捕捉した。ＴＭＲＥを５６１ｎｍレーザーで励起し、発光を５８５±１６ｎｍで捕捉した。前方及び側方散乱ゲーティングを、当初はフソソームサイズのイベントをキャプチャし、小さな破片を廃棄するために使用した。ＭＴＧ及びＴＭＲＥに陽性のイベントを、未染色陰性対照サンプルがＭＴＧ又はＴＭＲＥ染色陽性のイベントの０．５％未満を示した最小レベルでゲーティングすることによって決定した。次に、ＭＴＧ及びＴＭＲＥ染色に陽性のゲートイベントを、ＭＴＧ及びＴＭＲＥの平均ＦＩについて評価した。
膜電位値（ミリボルト、ｍＶ）を、ＴＭＲＥ ＦＩ値をＭＴＧ ＦＩ値に正規化した後のＴＭＲＥの強度に基づいて計算する。このＴＭＲＥ／ＭＴＧ比の値により、ＴＭＲＥ強度をサンプル中のミトコンドリアの量に正規化できる。未処理サンプルとＦＣＣＰ処理サンプルの両方のＴＭＲＥ／ＭＴＧ比の値を計算し、ＴＭＲＥ蛍光に基づいてミトコンドリア膜電位を決定できる修正ネルンスト方程式（以下を参照）を使用して、ミリボルト単位の膜電位を決定するために使用する（ＴＭＲＥはネルンスト様式でミトコンドリアに蓄積するため）。フソソーム膜電位を次の式で計算する：（ｍＶ）＝－６１．５＊ｌｏｇ（ＦＩ未処理／ＦＩ（ＦＣＣＰ－処理））。この式を使用することにより、ＶＳＶ－Ｇフソソームサンプルの計算されたミトコンドリア膜電位は－２９．６±１．５ミリボルトであった。
実施例７９：被験体における標的化能の測定（ＢｉＶｓ－Ｃｒｅ Ｇｅｓｉｃｌｅｓ）
この実施例は、特定の身体部位を標的とするフソソームの能力を評価する。フソソームは、本明細書に記載の方法を使用して誘導され、ｃｒｅ－リコンビナーゼタンパク質がロードされていた。
２用量のフソソーム（１×及び３×）をＬｏｘＰルシフェラーゼ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、００５１２５）に送達し、マウスに尾静脈から静脈内（Ｉ．Ｖ．）注射した。マウスをヒートランプ（２５０Ｗ（赤外線）ヒートランプ電球を使用）の下に約５分間（又はマウスがひげを過度に手入れし始めるまで）置いて、尾静脈を拡張させた。マウスを拘束具の上に置き、静脈をよりよく視覚化するために尾を７０％エタノールで拭き取った。
ツベルクリンシリンジを使用して、２００μＬのフソソーム１×溶液（８．５ｅ８±１．４ｅ８粒子／μＬ、平均（ＳＥＭ））又は３×溶液（２．５５ｅ９±１．４ｅ８粒子／μＬ、平均（ＳＥＭ））を静脈内注射した。注射が完了したら、注射器を取り外し、注射部位に圧力をかけた。
融合後、ＣＲＥタンパク質は核に転座して組換えを行い、ルシフェラーゼの構成的発現をもたらした。処理から３日後、被験体の腹側領域を、その領域を脱毛することによって準備した（Ｎａｉｒ除毛クリームを４５秒間、続いて７０％エタノールでその領域を洗浄した）。次に、被験体を腹腔内投与によりＤ－ルシフェリン（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、１５０ｍｇ／ｋｇ）で処理した。これにより、ｉｎ ｖｉｖｏ生物発光イメージングによるルシフェラーゼ発現の検出が可能になった。動物が動かないようにコーン麻酔器（イソフルラン）を収容するｉｎ ｖｉｖｏ生物発光イメージングチャンバー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）に動物を入れた。Ｄ－ルシフェリンの薬物動態クリアランスによる最大生物発光シグナルを観察するために、注射後３～１５分の間に光子収集を行った。最大放射輝度は、光子／秒／ｃｍ２／ラジアンで記録された。領域全体の放射輝度を統合する総フラックスは、Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）内の関心領域（ＲＯＩ）ツールを使用して定量化し、光子／秒で報告された。
フソソームによるタンパク質（Ｃｒｅリコンビナーゼ）送達の証拠は、図９Ａ～９Ｂに示すように、動物のレシピエント組織における生物発光イメージングによって検出された。シグナルは主に脾臓と肝臓で見られ、３×群が最も高いシグナルを示した。
全身イメージングに続いて、マウスを頸椎脱臼し、肝臓、心臓、肺、腎臓、小腸、膵臓、及び脾臓を収集し、安楽死から５分以内にイメージングした。フソソームによる肝臓及び脾臓へのタンパク質（Ｃｒｅリコンビナーゼ）送達の証拠は、動物の抽出されたレシピエント組織における生物発光イメージングによって検出された。これは、図１０Ａ～１０Ｂからわかる。シグナルは脾臓で最も高く、心臓で最も低く、３×群が最も高い有意なシグナルを示した（心臓と比較してｐ＝０．０００４）。
実施例８０：リソソーム酸性化とは独立した経路を介するフソソームの送達
多くの場合、標的細胞への複雑な生物学的カーゴの侵入は、エンドサイトーシスによって達成される。エンドサイトーシスでは、カーゴがエンドソームに入る必要があり、エンドソームは成熟して酸性化したリソソームになる。不利なことに、エンドサイトーシスを介して細胞に入るカーゴは、エンドソーム又はリソソームに捕捉され、細胞質に到達できなくなる場合がある。カーゴはまた、リソソームの酸性条件によって損傷を受ける可能性がある。一部のウイルスは、標的細胞への非エンドサイトーシス侵入が可能であるが、このプロセスは完全には理解されていない。この実施例は、ウイルスのフソゲンを残りのウイルスから分離し、他のウイルスタンパク質を欠くフソソームに非エンドサイトーシスの侵入を与えることができることを示している。
細胞表面にニパウイルス受容体結合Ｇタンパク質及び融合Ｆタンパク質（ＮｉｖＧ＋Ｆ）を発現し、Ｃｒｅリコンビナーゼタンパク質を発現するＨＥＫ－２９３Ｔ細胞からのフソソームを、フィコール勾配による超遠心分離の標準的な手順に従って生成し、本明細書に記載される小さな粒子のフソソームを得た。非エンドサイトーシス経路を介したレシピエント細胞へのフソソームの送達を実証するために、ＮｉｖＧ＋Ｆフソソームを使用してレシピエントＣＭＶプロモーター下で「Ｌｏｘｐ－ＧＦＰ－ｓｔｏｐ－Ｌｏｘｐ－ＲＦＰ」カセットを発現するように設計されたＨＥＫ－２９３Ｔ細胞を処理した。ＮｉｖＦタンパク質は、ｐＨ非依存性エンベロープ糖タンパク質であり、活性化とその後の融合活性のために環境酸性化を必要としないことが示されている（Ｔａｍｉｎ，２００２）。
レシピエント細胞を３０，０００細胞／ウェルで黒色の透明底９６ウェルプレートに蒔いた。レシピエント細胞をプレーティングしてから４～６時間後、Ｃｒｅリコンビナーゼタンパク質を発現するＮｉｖＧ＋Ｆフソソームを、ＤＭＥＭ培地の標的又は非標的レシピエント細胞に適用した。フソソームサンプルを、最初に、製造業者の指示に従って、ビシンコニン酸アッセイ（ＢＣＡ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，カタログ番号２３２２５）によって総タンパク質含有量について測定した。レシピエント細胞を１０μｇのフソソームで処理し、３７℃及び５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。ＮｉｖＧ＋Ｆフソソームを介したＣｒｅ送達が非エンドサイトーシス経路を介したことを実証するために、ＮｉｖＧ＋Ｆフソソーム処理を受けたレシピエント細胞の平行ウェルを、エンドソーム／リソソーム酸性化の阻害剤であるバフィロマイシンＡ１（Ｂａｆ；１００ｎＭ；Ｓｉｇｍａ，カタログ番号Ｂ１７９３）で同時処理した。
自動顕微鏡（ｗｗｗ．ｂｉｏｔｅｋ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｉｍａｇｉｎｇ－ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ－ａｕｔｏｍａｔｅｄ－ｃｅｌｌ－ｉｍａｇｅｒｓ／ｌｉｏｎｈｅａｒｔ－ｆｘ－ａｕｔｏｍａｔｅｄ－ｌｉｖｅ－ｃｅｌｌ－ｉｍａｇｅｒ／）を使用して細胞プレートを画像化した。所与のウェルの総細胞集団は、ＤＭＥＭ培地中のヘキスト３３３４２で１０分間細胞を染色することによって決定された。ヘキスト３３３４２は、ＤＮＡにインターカレートすることで細胞核を染色するため、個々の細胞を識別するためにこれを使用した。ヘキスト染色を、４０５ｎｍ ＬＥＤ及びＤＡＰＩフィルターキューブを使用して画像化した。ＧＦＰを、４６５ｎｍ ＬＥＤ及びＧＦＰフィルターキューブを使用して画像化し、ＲＦＰを５２３ｎｍ ＬＥＤ及びＲＦＰフィルターキューブを使用して画像化した。標的細胞及び非標的細胞のウェルの画像を、最初に、フソソームの代わりにＣｒｅリコンビナーゼをコードするアデノウイルスで処理されたレシピエント細胞を含む陽性対照ウェルのＬＥＤ強度及び積分時間を確立することによって取得した。
取得設定は、ヘキスト、ＲＦＰ、及びＧＦＰの強度が最大ピクセル強度値になるが、飽和しないように設定された。次に、確立された設定を使用して、対象のウェルを画像化した。ヘキストチャネルにオートフォーカスした後、ＧＦＰ及びＲＦＰチャネルに確立された焦点面を使用することにより、各ウェルにフォーカスを設定した。ＧＦＰ及びＲＦＰ陽性細胞の分析は、自動蛍光顕微鏡を備えたＧｅｎ５ソフトウェア（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｔｅｋ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｓｏｆｔｗａｒｅ－ｒｏｂｏｔｉｃｓ－ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｇｅｎ５－ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ－ｒｅａｄｅｒ－ａｎｄ－ｉｍａｇｅｒ－ｓｏｆｔｗａｒｅ／）を使用して実行した。
画像を、幅６０μｍのローリングボールバック背景減算アルゴリズムを使用して前処理した。バックグラウンド強度を大幅に超えるＧＦＰ強度を持つ細胞をしきい値処理し、ＧＦＰ陽性細胞には小さすぎる又は大きすぎる領域を除外した。同じ分析手順をＲＦＰチャネルに適用した。次に、ＲＦＰ陽性細胞（Ｃｒｅを投与されたレシピエント細胞）の数をＧＦＰ陽性細胞（送達を示さなかったレシピエント細胞）とＲＦＰ陽性細胞の合計で割って、レシピエント細胞とのフソソーム融合の量を示す、ＲＦＰ変換の割合を定量化した。
このアッセイでは、表面にＮｉｖＧ＋Ｆを発現し、Ｃｒｅリコンビナーゼタンパク質を含むＨＥＫ－２９３Ｔ細胞に由来するフソソームは、リソソーム非依存性経路を介した有意な送達を示し、これは、エンドサイトーシスを介した取り込みを阻害するためにレシピエント細胞をＢａｆで同時処理した場合でも、ＮｉｖＧ＋ＦフソソームによるＣｒｅカーゴの有意な送達によって証明されるように、非エンドサイトーシス経路を介した侵入と一致している（図１１）。この場合、Ｂａｆ同時処理によるカーゴ送達の抑制は２３．４％であった。
実施例８１：移動度についてアクチンを重合する能力の測定
フソソームは、本明細書に記載されているように、細胞表面に水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ－Ｇ）からのエンベロープ糖タンパク質Ｇを発現するＨＥＫ－２９３Ｔ細胞から産生されたフソソームを収集及び調製する標準的な手順によって産生された。対照粒子（非融合性フソソーム）は、ｐｃＤＮＡ３．１空ベクターで一過性に逆トランスフェクトされたＨＥＫ－２９３Ｔ細胞から産生された。次に、フソソーム及び親細胞を、ローダミンファロイジンフローサイトメトリーアッセイ及びチューブリンＥＬＩＳＡを用いて、アクチンを重合する能力について（時間の経過と共に）アッセイした。簡単に言えば、標準ＶＳＶ－Ｇのフソソーム調製物６０μＬに対応するおよそ１×１０６のフソソーム及びフソソームを生成するために使用される１×１０５親細胞を、完全な９６ウェル低付着マルチウェルプレートで完全培地１ｍＬに播種し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。プレーティング後３時間、５時間、２４時間に定期的にサンプルを採取した。サンプルを２１，０００×ｇで１０分間遠心分離し、リン酸緩衝生理食塩水中の２００ｕＬ４％（ｖ／ｖ）ＰＦＡに１０分間再懸濁し、１ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、２１，０００×ｇで１０分間遠心分離し、再度洗浄して、更に使用するまで４℃で保存した。
ロアミン－ファロイジン染色では、サンプルを２１，０００×ｇで１０分間遠心分離し、リン酸緩衝生理食塩水中の０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００ １００ｕＬで２０分間インキュベートした。２０分間のインキュベーション後、１６５μＭローダミン－ファロイジンを含むリン酸緩衝生理食塩水中の０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を更に１００ｕＬサンプルに加え、ピペットで混合し、陰性対照を受け取り、リン酸緩衝生理食塩水のみに溶解した１００ｕＬの０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を更に１００ｕＬ加えた。サンプルを４５分間インキュベートした後、１ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、２１，０００×ｇで１０分間遠心分離し、再度洗浄し、３００ｕＬのリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁し、下記表に示すように、励起に５６１ｎｍレーザー及び５８５＋／－１６ｎｍフィルター発光を使用するフローサイトメトリー（Ａｔｔｕｎｅ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で分析した：
取得にはＡｔｔｕｎｅ ＮｘＴソフトウェアを使用し、分析にはＦｌｏｗＪｏを使用した。データ収集のため、ＦＳＣ及びＳＳＣチャネルを直線軸上に設定して、細胞又はフソソームを代表する集団を決定した。その後、この集団をゲートして、このゲート内のイベントのみを使用して、５８５＋／－１６ｎｍ発光チャネルのイベントを対数スケールで表示した。細胞又はフソソームゲート内の最低１０，０００のイベントを、各条件で収集した。データ分析のため、ＦＳＣ及びＳＳＣチャネルを直線軸上に設定して、細胞又はフソソームを代表する集団を決定した。その後、この集団をゲートして、このゲート内のイベントのみを使用して、５８５＋／－１６ｎｍ発光チャネルのイベントを対数スケールで表示した。陰性対照５８５＋／－１６ｎｍの発光を使用して、ヒストグラムのどこにゲートを配置するかを決定し、ゲートに含まれる正の値が１％未満になるようにした。上記の分析基準を使用すると、親細胞は、３時間、５時間、及び２４時間の時点で、それぞれ１９．９％、２４．８％、及び８２．５％のローダミン－ファロイジン陽性イベントを示した。フソソームは、３時間、５時間、及び２４時間の時点で、それぞれ４４．６％、４１．９％、及び３４．９％のローダミン－ファロイジンであった（図２）。この例は、親細胞が増加するのに対し、フソソームは時間の経過と共にアクチンの量が増加しないことを示している。
実施例８２：フソソーム中のＧＡＰＤＨの測定
この実施例では、フソソーム内のグリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）のレベル、及び親細胞と比較したフソソーム内のＧＡＰＤＨの相対レベルの定量化について説明する。フソソームを、実施例６７及び８６に記載されているように調製した。
ＧＡＰＤＨを、ＧＡＰＤＨ用の標準的な市販のＥＬＩＳＡ（ａｂ１７６６４２、Ａｂｃａｍ）を製造元の指示に従って使用して、親細胞及びフソソームで測定した。総タンパク質レベルを、ビシンコニン酸アッセイを介して同様に測定した。測定されたＧＡＰＤＨ及びタンパク質レベルを以下の表に示す。
ＧＡＰＤＨ：総タンパク質比も図１２に示す。
実施例８３：フソソーム中の脂質対タンパク質の比
この実施例では、フソソームの脂質質量とタンパク質質量の比率の定量化について説明する。フソソームは、有核細胞のそれと同様の脂質質量対タンパク質質量の比を有することができると考えられる。フソソーム及び親細胞を、本明細書の実施例６７及び８６に記載されているように調製した。
脂質含有量は、市販のリン脂質アッセイキット（ＭＡＫ１２２ Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）を製造元の指示に従って使用して、総脂質のサブセットとしてコリン含有リン脂質を使用して計算した。フソソームの総タンパク質含有量を、本明細書に記載されているようにビシンコニン酸アッセイを介して測定した。測定されたリン脂質レベル、タンパク質レベル、及びタンパク質に対するリン脂質の比率を図１３及び下記表に示す：
実施例８４：フソソーム中のＤＮＡに対するタンパク質の比
この実施例では、フソソームのタンパク質質量とＤＮＡの比率の定量化について説明する。フソソームは、細胞のそれよりもはるかに大きいタンパク質質量対ＤＮＡ質量の比を有することができると考えられる。フソソームを、実施例６７及び８６に記載されているように調製した。
フソソーム及び細胞の総タンパク質含有量を、本明細書に記載されているようにビシンコニン酸を介して測定した。フソソーム及び細胞のＤＮＡ質量は、市販の分離キット（＃６９５０４ Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ国ヒルデン）を製造元の指示に従って使用して、全ＤＮＡを抽出した後、２８０ｎｍでの吸収によって測定した。総核酸に対するタンパク質の比率を、総タンパク質含有量を総ＤＮＡ含有量で割って、典型的なフソソーム調製物の所与の範囲内の比率をもたらすことによって決定した。測定されたタンパク質レベル、ＤＮＡレベル、及びタンパク質対ＤＮＡの比を図１４及び下記表に示す：
実施例８５：フソソーム中のＤＮＡに対する脂質の比
この実施例では、親細胞と比較したフソソームの脂質とＤＮＡの比率の定量化について説明する。一実施形態では、フソソームは、親細胞と比較して、ＤＮＡに対する脂質のより大きな比率を有するであろう。フソソームを、実施例６７及び８６に以前に記載されたように調製した。
この比率は、実施例４０に概説されている脂質含有量として定義され、核酸含有量は、実施例４１に記載されているように決定される。測定された脂質レベル、ＤＮＡレベル、及び脂質対ＤＮＡの比を図１５及び下記表に示す：
実施例８６：フソソーム中の脂質組成の測定
この実施例では、フソソームの脂質組成の定量化について説明する。フソソームの脂質組成は、それらが由来する細胞に類似している可能性があると考えられる。脂質組成は、サイズ、静電相互作用、及びコロイド挙動等、フソソーム及び細胞の重要な生物物理学的パラメーターに影響を与える。
脂質測定は質量分析に基づいていた。フソソームを、１０ｃｍディッシュでのＶＳＶ－Ｇ及びＧＦＰの一過性トランスフェクションによって本明細書に記載されるように調製し、続いてトランスフェクションの４８時間後の馴化培地の濾過及び超遠心分離によってフソソームを得た。トランスフェクトされた細胞を、馴化培地と並行して採取し、分析のために提出した。エクソソームを、ＶＳＶ－Ｇ又はＧＦＰでトランスフェクトされていない細胞からも採取した。
質量分析に基づく脂質分析は、記載されているように（Ｓａｍｐａｉｏ ｅｔ ａｌ．２０１１）、Ｌｉｐｏｔｙｐｅ ＧｍｂＨ（ドイツ国ドレスデン）によって実施された。脂質を、２段階のクロロホルム／メタノール手順を使用して抽出した（Ｅｊｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ．２００９）。サンプルを、カルジオリピン１６：１／１５：０／１５：０／１５：０（ＣＬ）、セラミド１８：１；２／１７：０（Ｃｅｒ）、ジアシルグリセロール１７：０／１７：０（ＤＡＧ）、ヘキソシルセラミド１８：１；２／１２：０（ＨｅｘＣｅｒ）、リゾホスファチジル酸１７：０（ＬＰＡ）、リゾホスファチジルコリン１２：０（ＬＰＣ）、リゾホスファチジルエタノールアミン１７：１（ＬＰＥ）、リゾホスファチジルグリセロール１７：１（ＬＰＧ）、リゾホスファチジルイノシトール１７：１（ＬＰＩ）、リゾホスファチジルセリン１７：１（ＬＰＳ）、ホスファチデート１７：０／１７：０（ＰＡ）、ホスファチジルコリン１７：０／１７：０（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン１７：０／１７：０（ＰＥ）、ホスファチジルグリセロール１７：０／１７：０（ＰＧ）、ホスファチジルイノシトール１６：０／１６：０（ＰＩ）、ホスファチジルセリン１７：０／１７：０（ＰＳ）、コレステロールエステル２０：０（ＣＥ）、スフィンゴミエリン１８：１；２／１２：０；０（ＳＭ）、トリアシルグリセロール１７：０／１７：０／１７：０（ＴＡＧ）及びコレステロールＤ６（Ｃｈｏｌ）を含む内部脂質標準混合物でスパイクした。
抽出後、有機相を注入プレートに移し、高速真空濃縮器で乾燥させた。第１段階の乾燥抽出物をクロロホルム／メタノール／プロパノール（１：２：４、Ｖ：Ｖ：Ｖ）中の７．５ｍＭ酢酸アンモニウムに再懸濁し、第２段階の乾燥抽出物をクロロホルム／メタノール中のメチルアミンの３３％エタノール溶液（０．００３：５：１；Ｖ：Ｖ：Ｖ）に再懸濁した。全ての液体処理工程を、有機溶媒ピペッティング用のＡｎｔｉ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｃｏｎｔｒｏｌ機能を備えたＨａｍｉｌｔｏｎ Ｒｏｂｏｔｉｃｓ ＳＴＡＲｌｅｔロボットプラットフォームを使用して行った。
サンプルを、ＴｒｉＶｅｒｓａ ＮａｎｏＭａｔｅイオン源（Ａｄｖｉｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を備えたＱＥｘａｃｔｉｖｅ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に直接注入して分析した。サンプルを、ＭＳの場合はＲｍ／ｚ＝２００＝２８００００、ＭＳＭＳ実験の場合はＲｍ／ｚ＝２００＝１７５００の分解能で、正イオンモードと負イオンモードの両方で１回の取得で分析した。ＭＳＭＳを、１Ｄａの増分でスキャンされた対応するＭＳ質量範囲を含むインクルージョンリストによってトリガーした（Ｓｕｒｍａ ｅｔ ａｌ．２０１５）。ＭＳとＭＳＭＳの両方のデータを組み合わせて、ＣＥ、ＤＡＧ、及びＴＡＧイオンをアンモニウム付加物として、ＰＣ、ＰＣ Ｏ－を酢酸付加物として、ＣＬ、ＰＡ、ＰＥ、ＰＥ Ｏ－、ＰＧ、ＰＩ及びＰＳを脱プロトン化陰イオンとして監視した。ＭＳを、ＬＰＡ、ＬＰＥ、ＬＰＥ Ｏ－、ＬＰＩ、及びＬＰＳを脱プロトン化陰イオンとして、Ｃｅｒ、ＨｅｘＣｅｒ、ＳＭ、ＬＰＣ及びＬＰＣ Ｏ－をアセチル化誘導体の酢酸付加物として、並びにコレステロールをアセチル化誘導体のアンモニウム付加物として監視するためだけに使用した（Ｌｉｅｂｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．２００６）。
データを、ＬｉｐｉｄＸｐｌｏｒｅｒに基づく社内開発の脂質識別ソフトウェアを使用して分析した（Ｈｅｒｚｏｇ ｅｔ ａｌ．２０１１；Ｈｅｒｚｏｇ ｅｔ ａｌ．２０１２）。データの後処理及び正規化は、社内で開発されたデータ管理システムを使用して実行された。更なるデータ分析のため、シグナル対ノイズ比が５を超え、シグナル強度が対応するブランクサンプルよりも５倍高い脂質同定のみを検討した。
フソソーム脂質組成を親細胞の脂質組成と比較し、検出されなかった脂質種にゼロの値を割り当てた。フソソーム及び親細胞で同定された脂質種を以下の表に示す。
フソソーム及び親細胞は、≧親細胞の複製サンプルで同定された脂質種の７０％が、任意のフソソームの複製サンプルに存在し、同定された脂質のうち、フソソームの平均レベルが、親細胞における対応する平均脂質種レベルの２５％を超える可能性がある場合、同様の脂質組成を有し得ると考えられる。
実施例８７：フソソーム中のプロテオーム組成の測定
この実施例では、フソソームのタンパク質組成の定量化について説明する。フソソームのタンパク質組成は、それらが由来する親細胞に類似している可能性があると考えられる。
フソソーム及び親細胞を、実施例６７及び８６の方法により、本明細書に記載されるように調製した。
各サンプルを溶解バッファー（６Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、４％ＣＨＡＰＳ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０）に再懸濁し、氷浴で超音波処理し、小さなゲージのシリンジに通した。タンパク質を６５℃で１５分間１０ｍＭ ＤＴＴで還元させ、１５ｍＭヨードアセトアミド（ＩＡＡ）を用いて暗所、室温で３０分間アルキル化した。過剰なＩＡＡを、追加の１０ｍＭ ＤＴＴでクエンチした。次に、８倍量の氷冷アセトン＋１倍量の氷冷メタノールを加えてタンパク質を沈殿させ、－８０℃に一晩置いた。沈殿したタンパク質を遠心分離によりペレット化した。残りの溶解バッファーを２００μｌの氷冷メタノールで３回洗浄した。タンパク質を０．７５Ｍ尿素＋５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０＋１μｇトリプシン／ＬｙｓＣに再懸濁し、撹拌しながら３７℃で４時間前消化した。更に１μｇのトリプシン／ＬｙｓＣをタンパク質に加え、消化を一晩続けました。ペプチドを逆相ＳＰＥで精製し、ＬＣ－ＭＳで分析した。
各条件の複製サンプルを溶解し、１つのチューブにまとめた。次に、このプールをサンプルと同じ調製プロトコルにかけ、情報依存型取得でＬＣ－ＭＳによって分析するか、又は以下に説明するようにゲル上で分離した。
合計１００μｇのプールされたタンパク質を２×Ｌａｅｍｍｌｉローディングバッファーに入れ、１２．５％ＳＤＳ ＰＡＧＥで分離した。タンパク質をクマシーブルーで簡単に染色し、タンパク質レーンを１２の画分に分けた。次に、各画分を５０％アセトニトリルで脱水し、還元のために１０ｍＭ ＤＴＴで再水和した。ゲル片を６５℃で１５分間置き、暗所で１５ｍＭ ＩＡＡ用いて室温で３０分間アルキル化した。ゲルを更に５０％アセトニトリルで脱水し、１μｇのトリプシン／ＬｙｓＣを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８で３７℃で一晩再水和した。ペプチドを、脱水及び超音波処理によってゲルから抽出した。ペプチドを逆相ＳＰＥで精製し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ（画分あたり１×ＩＤＡ）で分析した。
取得は、２５μｍ ｉＤキャピラリーを備えたエレクトロスプレーインターフェースを装備し、Ｅｋｓｉｇｅｎｔ μＵＨＰＬＣ（Ｅｋｓｉｇｅｎｔ、米国カリフォルニア州レッドウッドシティ）に連結されたＡＢＳｃｉｅｘ ＴｒｉｐｌｅＴＯＦ ５６００（ＡＢＳｃｉｅｘ、米国カリフォルニア州フォスターシティ）を使用して行った。Ａｎａｌｙｓｔ ＴＦ １．７ソフトウェアを使用して、機器を制御し、データの処理及び取得を行った。ゲル又は未分画プールからの１２の画分に対して、情報依存型取得（ＩＤＡ）モードで取得を実行した。サンプルをＳＷＡＴＨ取得モードで分析した。ＩＤＡモードの場合、電源電圧は５．２ｋＶに設定され、２２５℃に維持され、カーテンガス（ｃｕｒｔａｉｎ ｇａｓ）は２７ｐｓｉ、ガス１は１２ｐｓｉ、ガス２は１０ｐｓｉに設定された。ＳＷＡＴＨモードの場合、電源電圧は５．５ｋＶに設定され、２２５℃に維持され、カーテンガスは２５ｐｓｉ、ガス１は１６ｐｓｉ、ガス２は１５ｐｓｉに設定され。分離は、６０℃に維持された逆相ＨＡＬＯ Ｃ１８－ＥＳカラム、内径０．３ｍｍ、粒子２．７μｍ、長さ１５０ｍｍ（Ａｄｖａｎｃｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、デラウェア州ウィルミントン）で行った。サンプルを、５μＬのループにループオーバーフィルすることによって注入した。６０分のＬＣ勾配では、移動相は、３μＬ／分の流速で、次の溶媒Ａ（水中の０．２％ｖ／ｖギ酸及び３％ＤＭＳＯ ｖ／ｖ）及び溶媒Ｂ（ＥｔＯＨ中の０．２％ｖ／ｖギ酸及び３％ＤＭＳＯ）で構成されていた。
サンプル分析用のイオンライブラリを生成するために、ＩＤＡの実行によって生成されたｗｉｆｆファイルに対してＰｒｏｔｅｉｎＰｉｌｏｔソフトウェアを実行した。このデータベースは、Ｐｅａｋｖｉｅｗソフトウェア（ＡＢＳｃｉｅｘ）で使用され、３つのトランジション／ペプチド及び１５のペプチド／タンパク質を使用して、各サンプルのタンパク質を定量化した。定量化されたタンパク質の数を最大化するために、サンプルを、同じパラメーターを使用して、公開されているヒトＳＷＡＴＨデータベース（Ａｔｌａｓ）で定量化した。Ｐｅａｋｖｉｅｗによって計算されたスコアが１．５よりも優れており、ＦＤＲが１％未満の場合、ペプチドは適切に測定されたと見なされた。各データベースからの定量化を、両方のデータベースからのタンパク質名を使用して１つの最終的な定量化に結合した。全てのサンプルの総シグナルの平均と比較したときに、そのサンプル内の全てのタンパク質の総シグナルを考慮に入れて、全てのサンプルの補正係数を算出した。
フソソームプロテオミクス組成物を親細胞プロテオミクス組成物と比較した。同定されたタンパク質の３３％超がフソソームに存在する場合、フソソームと親細胞の間で同様のプロテオミクス組成が観察され、それらの同定されたタンパク質のうち、下記表に示すように、そのレベルは、親細胞において対応するタンパク質レベルの２５％超であった。
実施例８８：フソソームあたりの内因性タンパク質又は合成タンパク質のレベルの定量
この実施例では、フソソームの内因性又は合成タンパク質カーゴの定量について説明する。フソソームは、場合によっては、内因性又は合成タンパク質カーゴを含むことができる。この実施例に記載されているフソソーム又は親細胞は、内因性タンパク質の発現を変更するか、又は治療的な若しくは新規の細胞機能を媒介する合成カーゴを発現するように設計された。
ＧＦＰを発現するフソソーム及び親細胞を、実施例６７及び８６の方法により、本明細書に記載されるように調製した。フソソーム中のＧＦＰの定量化を、市販のＥＬＩＳＡキット（ａｂ１７１５８１ Ａｂｃａｍ、英国ケンブリッジ）を製造元の指示に従って使用して行った。フソソームの定量化を、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ ＮＳ３００（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、英国ウスターシャー、マルバーン）を使用したナノ粒子追跡分析によって実行した。結果を下記の表に示す。
フソソームは、フソソームあたり、少なくとも１、２、３、４、５、１０、２０、５０、１００、又はそれ以上のタンパク質作用物質分子を有することができると考えられる。一実施形態では、フソソームは、フソソームあたり１６６個のタンパク質作用物質分子を有するであろう。
実施例８９：フソソーム中のエキソソソームタンパク質のマーカーの測定
このアッセイは、エクソソームの特異的マーカーであることが知られているタンパク質の割合の定量化について説明している。
フソソームを、実施例６７及び８６の方法により、本明細書に記載されるように調製した。親細胞がＶＳＶ－Ｇ又はＧＦＰでトランスフェクトされなかったことを除いて、エクソソームを、実施例６７及び８６の方法によって、フソソームについて本明細書に記載されるように調製した。フソソーム及びエクソソームの質量分析によるタンパク質の定量化は、本明細書の実施例３５に記載されているように実施した。
得られたタンパク質定量データを分析して、既知のエクソソームマーカーＣＤ６３のタンパク質レベル及び割合を決定した。群あたりの平均対数強度を、質量分析からの強度値に１を加算し、ｌｏｇ１０で変換し、反復全体の平均を計算することによって計算した。結果を図１６に示す。
実施例９０：フソソームにおけるカルネキシンの測定
このアッセイでは、フソソーム内のカルネキシン（ＣＮＸ）のレベル、及び親細胞と比較したフソソーム内のＣＮＸの相対レベルの定量化について説明する。
フソソーム及び親細胞を、本明細書の実施例６７及び８６に記載されているように調製した。カルネキシン及び総タンパク質を、実施例３５の方法に従って実施された質量分析を使用して測定した。親細胞及びフソソームについて決定されたカルネキシンシグナル強度を図１７に示す。
実施形態では、このアッセイを使用すると、フソソーム中のＣＮＸの平均分画含有量（実施例３５で本明細書に記載されるように計算される）は、２．４３×１０－４未満となであろう。
一実施形態では、親細胞から調製物までの総タンパク質あたりのカルネキシンの減少は、ｎｇ／μｇで、８８％を超えるであろう。
実施例９１：フソソーム中のＤＮＡに対する脂質の比
この実施例では、親細胞と比較したフソソームの脂質とＤＮＡの比率の定量化について説明する。一実施形態では、フソソームは、親細胞と比較して、ＤＮＡに対する脂質のより大きな比率を有するであろう。フソソームを、実施例６７及び８６に以前に記載されたように調製した。
この比率は、実施例４０に概説されている脂質含有量として定義され、核酸含有量は、実施例４１に記載されているように決定される。図１８及び下記表に示すように、フソソームは親細胞よりも高い脂質：ＤＮＡ比を示すことがわかった。
実施例９２：フソソーム上の表面マーカーの分析
このアッセイでは、フソソームの表面マーカーの同定について説明する。
フソソームを、本明細書で実施例６７及び８６に記載されているように調製した。ホスファチジルセリンを、本明細書の実施例６７及び８６に記載されているように、質量分析によって測定した。下記表に示すように、フソソームの総脂質に対するホスファチジルセリンの量は、親細胞の総脂質に対するホスファチジルセリンの量よりも１２１％多いと決定された。
実施例９３：フソソーム中のウイルスキャプシドタンパク質の分析
この実施例では、サンプル調製物の構成を分析し、ウイルスキャプシド源に由来するタンパク質の割合を評価した。
フソソームを、実施例６７及び８６の方法により、本明細書に記載されるように調製した。フソソーム質量分析によるタンパク質の定量化は、本明細書の実施例３５に記載されているように実施した。ウイルスキャプシドタンパク質の分画含有量を、本明細書の実施例３５に記載されているように計算し、フソソームサンプルに対して平均し、パーセントとして表した。
このアプローチを使用すると、下記表に示すように、サンプルに０．０５％のウイルスキャプシドタンパク質が含まれていることがわかった。検出された唯一のウイルスキャプシドタンパク質は、ウサギ内因性レンチウイルス（ＲＥＬＩＫ）キャプシドとシクロフィリンＡ（ＰＤＢ ２ＸＧＹ｜Ｂ）の複合体であった。
実施例９４：フソソーム中のフソゲンタンパク質比の定量
この実施例では、総タンパク質又はフソソーム内の他の目的のタンパク質に対するフソゲンタンパク質の比率の定量化について説明する。対象となる他のタンパク質としては、限定されるものではないが、ＥＧＦＰ、ＣＤ６３、ＡＲＲＤＣ１、ＧＡＰＤＨ、カルネキシン（ＣＮＸ）、及びＴＳＧ１０１が挙げられる。フソソームを、実施例６７及び８６の方法により、本明細書に記載されるように調製した。フソソーム質量分析によるタンパク質の定量化は、本明細書の実施例３５に記載されているように実施した。全タンパク質の定量化を、本明細書の実施例３５に記載されているように計算し、フソソームサンプルに対して平均し、分率として表した。
下記表に示すように、フソゲンは、ＥＧＦＰに対する比率が１５６．９、ＣＤ６３に対する比率が２９１２．０、ＡＲＲＤＣ１に対する比率が６６４．９、ＧＡＰＤＨに対する比率が６９．０、ＣＮＸに対する比率が５５８．４、及びＴＳＧ１０１に対する比率が３０６４．１であることがわかった。
実施例９５：フソソームにおける内因性及び合成タンパク質比の定量化
この実施例では、総タンパク質又はフソソーム内の他の目的のタンパク質と比較した、内因性又は合成タンパク質カーゴの定量化について説明する。対象となる他のタンパク質としては、限定されるものではないが、ＶＳＶ－Ｇ、ＣＤ６３、ＡＲＲＤＣ１、ＧＡＰＤＨ、カルネキシン（ＣＮＸ）、又はＴＳＧ１０１が挙げられる。フソソームを、実施例６７及び８６の方法により、本明細書に記載されるように調製した。フソソーム質量分析によるタンパク質の定量化は、本明細書の実施例３５に記載されているように実施した。全タンパク質の定量化を、本明細書の実施例３５に記載されているように計算し、フソソームサンプルに対して平均し、分率として表した。
下記表に示すように、合成タンパク質カーゴは、ＶＳＶ－Ｇに対する比率が６．３７×１０－３、ＣＤ６３に対する比率が１８．６、ＡＲＲＤＣ１に対する比率が４．２４、ＧＡＰＤＨに対する比率が０．４４、ＣＮＸに対する比率が３．５６、及びＴＳＧ１０１に対する比率が１９．５２であることがわかった。
実施例９６：フソソーム中の濃縮脂質組成
この実施例では、フソソーム、親細胞、及びエクソソームの脂質組成の定量化について説明する。フソソームの脂質組成は、それらが由来する細胞と比較して、特定の脂質について濃縮及び／又は枯渇させることができると考えられる。脂質組成は、サイズ、静電相互作用、及びコロイド挙動等、フソソーム及び細胞の重要な生物物理学的パラメーターに影響を与える。
脂質組成を、実施例６７及び８６に記載されるとおりに測定した。フソソームを、１０ｃｍディッシュでのＶＳＶ－Ｇ及びＧＦＰの一過性トランスフェクションによって本明細書に記載されるように調製し、続いてトランスフェクションの４８時間後の馴化培地の濾過及び超遠心分離によってフソソームを得た。トランスフェクトされた細胞を、馴化培地と並行して採取し、分析のために提出した。親細胞がＶＳＶ－Ｇ又はＧＦＰでトランスフェクトされなかったことを除いて、エクソソームを、フソソームについて本明細書に記載されるように調製した。
フソソーム、エクソソーム、及び親細胞の脂質組成を図１９Ａ～１９Ｂに示す。親細胞と比較して、フソソームは、コレステリルエステル、遊離コレステロール、エーテル結合リゾホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルセリン、ホスファチデート、エーテル結合ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、及びスフィンゴミエリンが豊富であった。親細胞と比較して、フソソームは、セラミド、カルジオリピン、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルグリセロール、リゾホスファチジルイノシトール、エーテル結合ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、及びトリアシルグリセロールが枯渇している。エクソソームと比較して、フソソームは、コレステリルエステル、セラミド、ジアシルグリセロール、リゾホスファチデート、及びホスファチジルエタノールアミン、トリアシルグリセロールが豊富であった。エクソソームと比較して、フソソームは遊離コレステロール、ヘキソシルセラミド、リゾホスファチジルコリン、エーテル結合リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、エーテル結合リゾホスファチジルエタノールアミン、及びリゾホスファチジルセリンが枯渇している。
実施例９７：フソソームのコンパートメント特異的プロテオミクス含有量の測定
この実施例では、フソソーム、フソソーム親細胞、及びエクソソームの特定の細胞内コンパートメントに由来することが知られているタンパク質の割合の定量化について説明する。
フソソーム及び親細胞を、実施例６７及び８６の方法により、本明細書に記載されるように調製した。親細胞がＶＳＶ－Ｇ又はＧＦＰでトランスフェクトされなかったことを除いて、エクソソームを、実施例６７及び８６の方法によって、フソソームについて本明細書に記載されるように調製した。フソソーム及びエクソソームの質量分析によるタンパク質の定量化は、本明細書の実施例３５に記載されているように実施した。得られたタンパク質定量化データを分析して、証拠コードＩＤＡ（直接アッセイにより推定）で遺伝子オントロジー細胞コンパートメントアノテーション用語（エクソソーム：ＧＯ：００７００６２、小胞体：ＧＯ：０００５７８３、リボソーム：ＧＯ：０００５８４０、ＧＯ：００２２６２５、ＧＯ：００２２６２６、ＧＯ：００２２６２７、ＧＯ：００４４３９１、ＧＯ：００４２７８８、ＧＯ：００００３１３）により注釈が付けられた既知のエクソソーム、小胞体、リボソーム、核、及びミトコンドリアタンパク質のタンパク質レベル及び割合を決定した。各サンプルの総タンパク質に対するコンパートメント固有のタンパク質の分率を、フソソームサンプル、エクソソームサンプル、及び親細胞について決定した。
図２０に示すように、フソソームは、親細胞及びエクソソームと比較して、小胞体タンパク質が枯渇していることがわかった。フソソームはまた、エクソソームと比較してエクソソームタンパク質が枯渇していることがわかった。フソソームは、親細胞と比較してミトコンドリアタンパク質が枯渇していた。フソソームは、親細胞と比較して核タンパク質が豊富であった。フソソームは、親細胞及びエクソソームと比較して、リボソームタンパク質が豊富であった。
実施例９８：フソソーム中のＴＳＧ１０１及びＡＲＲＤＣ１含有量の測定
この実施例では、細胞からのフソソーム放出に重要であることが知られているタンパク質の割合の定量化について説明する。
フソソーム及び親細胞を、実施例６７及び８６の方法により、本明細書に記載されるように調製した。親細胞がＶＳＶ－Ｇ又はＧＦＰでトランスフェクトされなかったことを除いて、エクソソームを、実施例６７及び８６の方法によって、フソソームについて本明細書に記載されるように調製した。フソソーム及びエクソソームの質量分析によるタンパク質の定量化は、本明細書の実施例３５に記載されているように実施した。得られたタンパク質定量データを分析して、タンパク質ＴＳＧ１０１及びＡＲＲＤＣ１のタンパク質レベル及び割合を決定した。群あたりの平均対数強度を、質量分析からの強度値に１を加算し、ｌｏｇ１０で変換し、反復全体の平均を計算することによって計算した。エクソソーム又は親細胞に対するフソソーム中のＴＳＧ１０１又はＡＲＲＤＣ１の総タンパク質含有量の割合を、同じサンプル内の全てのタンパク質の強度の合計で割って、複製物に対して平均し、パーセントで表される、各サンプルのＴＳＧ１０１又はＡＲＲＤＣ１の平均対数強度として決定した。
図２１に示すように、ＡＲＲＤＣ１は、親細胞又はエクソソームよりもフソソームの総タンパク質含有量の割合としてより高いレベルで存在することがわかった。総タンパク質含有量の割合としてのＡＲＲＤＣ１のレベルは、フソソームで少なくとも０．０２％であった。ＴＳＧ１０１は、親細胞又はエクソソームよりもフソソームの総タンパク質含有量の割合としてより高いレベルで存在することがわかった。総タンパク質含有量の割合としてのＴＳＧ１０１のレベルは、フソソームで少なくとも０．００４％であった。
実施例９９：複数回投与後のフソソームの血清不活化の測定
この実施例は、フソソームの複数回投与後のｉｎ ｖｉｔｒｏ送達アッセイを使用したフソソームの血清不活化の定量化を説明する。改変されたフソソーム、例えば、本明細書に記載の方法によって改変されたものは、複数回（例えば、１回より多い、例えば、２回以上）の改変フソソームの投与に続いて、血清不活化の減少を有し得る（例えば、未改変フソソームの投与と比較して減少する）と考えられる。場合によっては、本明細書に記載のフソソームは、複数回の投与後に血清によって不活化されないであろう。
フソソームの免疫原性の尺度は血清不活化である。一実施形態では、フソソームの反復注射は、抗フソソーム抗体、例えば、フソソームを認識する抗体の開発につながる可能性がある。一実施形態では、フソソームを認識する抗体は、フソソームの活性又は寿命を制限し、補体分解を媒介できる方法で結合することができる。
この実施例では、フソソームを１回以上投与した後、血清不活化を調べる。フソソームを、先の実施例のいずれか１つによって産生する。この実施例では、フソソームは以下から生成される：ＨＬＡ－Ｇのレンチウイルス媒介発現で改変されたＨＥＫ２９３細胞（以下、ＨＥＫ２９３－ＨＬＡ－Ｇ）、及び空ベクターのレンチウイルス媒介発現で改変されたＨＥＫ２９３（以下、ＨＥＫ２９３）。幾つかの実施形態では、フソソームは、他の免疫調節タンパク質を発現している細胞に由来する。
血清を、様々なコホートから採取する：ビヒクル（フソソームナイーブ群）、ＨＥＫ２９３－ＨＬＡ－Ｇフソソーム、又はＨＥＫ２９３フソソームを１、２、３、５、１０回全身及び／又は局所注射したマウス。血清を、新鮮な全血を採取し、数時間完全に凝固させることによって、マウスから収集する。遠心分離により血餅をペレット化し、血清上清を除去する。陰性対照は、熱不活化マウス血清である。陰性対照サンプルを、摂氏５６度で１時間加熱する。血清をアリコートで冷凍することができる。
フソソームを、レシピエント集団の細胞の５０％がフソソームにおいてペイロードを受ける用量について試験する。フソソームは、本明細書に記載されている他の実施例のいずれかを介して産生され得て、本明細書に記載されているペイロードのいずれかを含み得る。レシピエント細胞へのペイロードのフソソーム送達をアッセイするための多くの方法もまた、本明細書に記載されている。この特定の例では、ペイロードはＣｒｅタンパク質であり、レシピエント細胞はＣＭＶプロモーター下で「ＬｏｘＰ－ＧＦＰ－ｓｔｏｐ－ＬｏｘＰ－ＲＦＰ」カセットを安定して発現するＲＰＭＩ８２２６細胞であり、これは、Ｃｒｅによる組換えによりＧＦＰからＲＦＰに発現が切り替わり、融合及びＣｒｅをマーカーとして送達を示す。レシピエント細胞の５０％がＲＦＰ陽性であると特定された用量を、更なる実験に使用する。他の実施形態では、レシピエント細胞の５０％がペイロードを受けることが特定された用量を、更なる実験に使用する。
フソソームの血清不活化を評価するために、フソソームを正常又は熱不活化血清（又は非血清対照として１０％熱不活化ＦＢＳを含む培地）に１：５に希釈し、混合物を３７Ｃで１時間インキュベートする。インキュベーション後、培地を反応液に加えて更に１：５に希釈し、１：１０の比率で２回段階希釈する。この工程に続いて、フソソームは、レシピエント細胞の５０％がペイロードを受け取った（例えば、ＲＦＰ陽性である）以前に特定された用量で存在するはずである。レシピエント細胞の５０％がペイロードを受けることが特定された用量は、フソソーム全体で類似している可能性があると考えられる。
次に、血清に曝露されたフソソームをレシピエント細胞とインキュベートする。ペイロードを受け取り、したがってＲＦＰ陽性である細胞の割合を計算する。ペイロードを受ける細胞の割合は、ＨＥＫ２９３－ＨＬＡ－Ｇフソソームで処理されたマウスの血清及び熱不活化血清でインキュベートされたフソソームサンプル間で異ならない可能性があり、フソソームの血清不活化又は適応免疫応答がないことを示す。ペイロードを受ける細胞の割合は、ＨＥＫ２９３－ＨＬＡ－Ｇフソソームで１、２、３、５、又は１０回処理されたマウスからのインキュベートされたフソソームサンプル間で異ならない可能性があり、これは、フソソームの血清不活化又は適応免疫応答がなかったことを示す。場合によっては、ペイロードを受ける細胞の割合は、ビヒクルで処理したマウス及びＨＥＫ２９３－ＨＬＡ－Ｇフソソームで処理したマウスからの血清とインキュベートしたフソソームサンプル間で差がなく、フソソームの血清不活化又は適応免疫応答がないことを示す。場合によっては、ペイロードを受ける細胞の割合は、ＨＥＫ２９３－ＨＬＡ－ＧフソソームよりもＨＥＫ２９３に由来するフソソームの方が少なく、ＨＥＫ２９３－ＨＬＡ－Ｇフソソームの血清不活化又は適応免疫応答がないことを示している。
実施例１００：フソソームの補体ターゲティングの測定
この実施例は、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを使用したフソソームに対する補体活性の定量化を説明する。本明細書に記載の改変フソソームは、対応する未改変フソソームと比較して、補体活性の低下を誘発し得ると考えられる。
この実施例では、マウスからの血清を、フソソームに対する補体活性について評価する。この実施例では、全ての補体経路の中心ノードである補体Ｃ３ａのレベルを測定する。特に、本明細書に記載の方法は、プロトコルに最適化されたヒト、ラット、サルに等しく適用可能である可能性がある。
この実施例では、フソソームは、前の例のいずれかによって産生される。フソソームは、レンチウイルスを介した相補的調節タンパク質ＤＡＦの発現で改変されたＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３－ＤＡＦフソソーム）又は相補的調節タンパク質を発現しないＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３フソソーム）から生成される。崩壊促進因子（ＤＡＦ、ＣＤ５５）に結合するタンパク質、例えばＨ因子（ＦＨ）様タンパク質－１（ＦＨＬ－１）、例えばＣ４ｂ結合タンパク質（Ｃ４ＢＰ）、例えば、補体受容体１（ＣＤ３５）、例えば、メンブレンコファクタータンパク質（ＭＣＰ、ＣＤ４６）、例えば、プロフェクチン（ＣＤ５９）、例えば古典的及び代替補体経路ＣＤ／Ｃ５コンバターゼ酵素を阻害するタンパク質、例えばＭＡＣアッセンブリを調節するタンパク質等の他の補体調節タンパク質も使用することができる。
血清を、ナイーブマウス、ＨＥＫ２９３－ＤＡＦフソソームを投与されたマウス、又はＨＥＫ２９３フソソームを投与されたマウスから回収する。血清を、新鮮な全血を採取し、数時間完全に凝固させることによって、マウスから収集する。遠心分離により血餅をペレット化し、血清上清を除去する。陰性対照は、熱不活化マウス血清である。陰性対照サンプルを、摂氏５６度で１時間加熱する。血清をアリコートで冷凍することができる。
異なるフソソームを、レシピエント集団の細胞の５０％がフソソームにおいてペイロードを受ける用量について試験する。フソソームは、本明細書に記載されている他の実施例のいずれかを介して産生され得て、本明細書に記載されているペイロードのいずれかを含み得る。レシピエント細胞へのペイロードのフソソーム送達をアッセイするための多くの方法もまた、本明細書に記載されている。この特定の例では、ペイロードはＣｒｅタンパク質であり、レシピエント細胞はＣＭＶプロモーター下で「ＬｏｘＰ－ＧＦＰ－ｓｔｏｐ－ＬｏｘＰ－ＲＦＰ」カセットを安定して発現するＲＰＭＩ８２２６細胞であり、これは、Ｃｒｅによる組換えによりＧＦＰからＲＦＰに発現が切り替わり、融合及びＣｒｅをマーカーとして送達を示す。レシピエント細胞の５０％がＲＦＰ陽性であると特定された用量を、更なる実験に使用する。他の実施形態では、レシピエント細胞の５０％がペイロードを受けることが特定された用量を、更なる実験に使用する。好ましい実施形態では、レシピエント細胞の５０％がペイロードを受けることが特定された用量は、フソソーム全体で類似している。
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）中でレシピエント細胞の５０％がペイロードを受けるフソソームの用量で開始するフソソームの２倍希釈液を、同じフソソーム又はナイーブマウス（アッセイ容量、２０μＬ）で処理したマウスの血清の１：１０希釈液と混合して、３７℃で１時間インキュベートした。サンプルを更に１：５００に希釈し、Ｃ３ａに特異的な酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）で使用する。ＥＬＩＳＡは、ＬｉｆｅＳｐａｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃが販売しているマウス補体Ｃ３ａ ＥＬＩＳＡキット製品ＬＳ－Ｆ４２１０であり、サンプル中のＣ３ａの濃度を測定する。２００ｐｇ／ｍｌのＣ３ａが存在するフソソームの用量を、マウスから単離された血清全体で比較する。
場合によっては、２００ｐｇ／ｍｌのＣ３ａが存在するフソソームの用量は、ＨＥＫ２９３マウス血清とインキュベートしたＨＥＫ２９３フソソームよりもＨＥＫ－２９３ ＤＡＦマウス血清とインキュベートしたＨＥＫ２９３－ＤＡＦフソソームの方が多く、フソソームを標的とする補体活性はＨＥＫ２９３－ＤＡＦフソソームよりもＨＥＫ２９３フソソームで処理されたマウスにおいて大きいことを示す。場合によっては、２００ｐｇ／ｍｌのＣ３ａが存在するフソソームの用量は、ナイーブマウス血清とインキュベートしたＨＥＫ２９３フソソームよりもナイーブマウス血清とインキュベートしたＨＥＫ２９３－ＤＡＦフソソームの方が多く、フソソームを標的とする補体活性はＨＥＫ２９３－ＤＡＦフソソームよりもＨＥＫ２９３フソソームで処理されたマウスにおいて大きいことを示す。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目１)
以下：
ａ）フソゲンを含む脂質二重層、並びに
ｂ）以下：
（ｉ）外因性作用物質をコードするペイロード遺伝子と、
（ｉｉ）前記ペイロード遺伝子に作動可能に連結された正の標的細胞特異的調節エレメントとを含む核酸、を含むフソソームであって、前記正の標的細胞特異的調節エレメントが、前記正の標的細胞特異的調節エレメントを欠く他は同様のフソソームと比較して、標的細胞におけるペイロード遺伝子の発現を増加させ、前記標的細胞が、ＣＮＳ細胞である、フソソーム。
(項目２)
前記核酸が、前記ペイロード遺伝子に作動可能に連結された非標的細胞特異的調節エレメント（ＮＴＣＳＲＥ）を更に含み、前記ＮＴＣＳＲＥが、ＮＴＣＳＲＥを欠く他は同様のフソソームと比較して、非標的細胞において前記ペイロード遺伝子の発現を減少させ、前記標的細胞が第１のタイプのＣＮＳ細胞であり、前記非標的細胞が第２の異なるタイプのＣＮＳ細胞又は非ＣＮＳ細胞であり、任意に、
前記標的細胞がニューロンであり、前記非標的細胞がグリア細胞であり、任意に、前記グリア細胞が乏突起膠細胞、星状膠細胞若しくはミクログリア細胞であるか、又は
前記標的細胞がグリア細胞であり、任意に、前記グリア細胞が乏突起膠細胞、星状膠細胞又はミクログリア細胞であり、前記非標的細胞がニューロンである、項目１に記載のフソソーム。
(項目３)
以下：
ａ）フソゲンを含む脂質二重層；並びに
ｂ）以下：
（ｉ）外因性作用物質をコードするペイロード遺伝子と、
（ｉｉ）前記ペイロード遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターとを含む核酸、を含むフソソームであって、前記プロモーターが、ＳＹＮ、ＮＳＥ、ＣａＭＫＩＩ、ａチューブリン、ＰＤＧＦ、ｆＳＳＴ、ｆＮＰＹ、ＧＡＤ６７、ＤＬＸ５／６、ＶＧＬＵＴ１、Ｄｏｃｋ１０、ＣｈＡＴ、ＶＡＣｈＴ、Ｄｒｄ１ａ、ＴＰＨ－２、ＧＦＡＰ、ＥＡＡＴ１、ＧＳ、ＣＸ３ＣＲ１、ＴＭＥＭ１１９、ＭＢＰ、ＣＮＰ、又はＣＲＦＲ２βプロモーターから選択される、フソソーム。
(項目４)
以下：
ａ）フソゲンを含む脂質二重層；並びに
ｂ）以下：
（ｉ）外因性作用物質をコードするペイロード遺伝子と、
（ｉｉ）前記ペイロード遺伝子に作動可能に連結された非標的細胞特異的調節エレメント（ＮＴＣＳＲＥ）とを含む核酸、を含むフソソームであって、
前記ＮＴＣＳＲＥが、前記ＮＴＣＳＲＥを欠く他は同様のフソソームと比較して、非標的細胞又は組織において前記ペイロード遺伝子の発現を減少させ、標的細胞が第１のタイプのＣＮＳ細胞であり、前記非標的細胞が第２の異なるタイプのＣＮＳ細胞又は非ＣＮＳ細胞であり、
前記ＮＴＣＳＲＥが、非標的細胞特異的ｍｉＲＮＡ認識配列、非標的細胞特異的プロテアーゼ認識部位、非標的細胞特異的ユビキチンリガーゼ部位、非標的細胞特異的転写抑制部位、又は非標的細胞特異的エピジェネティック抑制部位を含む、フソソーム。
(項目５)
前記核酸が、前記ペイロード遺伝子に作動可能に連結された正の標的細胞特異的調節エレメントを更に含み、前記正の標的細胞特異的調節エレメントが、前記正の標的細胞特異的調節エレメントを欠く他は同様のフソソームと比較して、標的細胞における前記ペイロード遺伝子の発現を増加させ、前記標的細胞がＣＮＳ細胞である、項目４に記載のフソソーム。
(項目６)
以下：
（ｉ）前記脂質二重層上の第１の外因性若しくは過剰発現された免疫抑制タンパク質、又は
（ｉｉ）存在しないか若しくは低下したレベルで存在する第１の免疫賦活タンパク質、のいずれか又は両方を更に含み、任意に、前記低下したレベルが、他の点は同様の未改変ソース細胞から生成されたフソソームと比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は、９０％の低下である、項目１～５のいずれかに記載のフソソーム。
(項目７)
前記ペイロード遺伝子が、リソソーム蓄積症若しくは障害、又はＣＮＳの疾患若しくは障害を処置する遺伝子であり、任意に、前記疾患又は障害が遺伝的欠損である、項目１～６のいずれかに記載のフソソーム。
(項目８)
フソソームであって、
ａ）フソゲンを含む脂質二重層と、
ｂ）リソソーム蓄積症若しくは障害、又はＣＮＳの疾患若しくは障害を処置するための外因性作用物質をコードするペイロード遺伝子を含む核酸と、
ｃ）以下のうちの１つ又は両方：
（ｉ）脂質二重層上の第１の外因性の若しくは過剰発現された免疫抑制タンパク質；又は
（ｉｉ）存在しないか若しくは他の点では同様の未改変ソース細胞から生成されたフソソームと比較して、低下したレベル（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％まで低下）で存在する第１の免疫賦活タンパク質とを含む、フソソーム。
(項目９)
（ｉ）及び（ｉｉ）を含む、項目６～８のいずれかに記載のフソソーム。
(項目１０)
（ｉ）を含み、前記脂質二重層上に第２の外因性又は過剰発現された免疫抑制タンパク質を更に含む、項目６～８のいずれかに記載のフソソーム。
(項目１１)
（ｉｉ）を含み、更に、存在しないか若しくは低下したレベルで存在する第２の免疫賦活タンパク質を含み、任意に、前記低下したレベルが、他の点では同様の未改変ソース細胞から生成されたフソソームと比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は、９０％の低下である、項目６～１０のいずれかに記載のフソソーム。
(項目１２)
前記核酸が、前記ペイロード遺伝子に作動可能に連結された正の標的細胞特異的調節エレメントを更に含み、前記正の標的細胞特異的調節エレメントが、前記正の標的細胞特異的調節エレメントを欠く他は同様のフソソームと比較して、標的細胞における前記ペイロード遺伝子の発現を増加させ、前記標的細胞がＣＮＳ細胞である、項目８～１１のいずれかに記載のフソソーム。
(項目１３)
前記核酸が、前記ペイロード遺伝子に作動可能に連結された非標的細胞特異的調節エレメント（ＮＴＣＳＲＥ）を更に含み、前記ＮＴＣＳＲＥが、前記ＮＴＣＳＲＥを欠く他は同様のフソソームと比較して、非標的細胞又は組織において前記ペイロード遺伝子の発現を減少させ、前記標的細胞が第１のタイプのＣＮＳ細胞であり、前記非標的細胞が第２の異なるタイプのＣＮＳ細胞又は非ＣＮＳ細胞であり、任意に、
前記標的細胞がニューロンであり、前記非標的細胞がグリア細胞であり、任意に、前記グリア細胞が乏突起膠細胞、星状膠細胞若しくはミクログリア細胞であるか、又は
前記標的細胞がグリア細胞であり、任意に、前記グリア細胞が乏突起膠細胞、星状膠細胞又はミクログリア細胞であり、前記非標的細胞がニューロンである、項目８～１２のいずれかに記載のフソソーム。
(項目１４)
被験体に投与される場合、以下：
ｉ）前記フソソームが検出可能な抗体応答を生じないか、又は前記フソソームに対する抗体がバックグラウンドレベルより１０％未満、５％、４％、３％、２％、若しくは１％超のレベルで存在する、
ｉｉ）前記フソソームが、検出可能な細胞性免疫応答を生じないか、又は前記フソソームに対する細胞性免疫応答がバックグラウンドレベルの１０％未満、５％、４％、３％、２％、若しくは１％超のレベルで存在する、
ｉｉｉ）前記フソソームが、検出可能な先天性免疫応答を生じないか）、又は前記フソソームに対する先天性免疫応答がバックグラウンドレベルの１０％未満、５％、４％、３％、２％、若しくは１％超のレベルで存在する、
ｉｖ）フソソームの１０％、５％、４％、３％、２％、若しくは１％未満が血清によって不活化される、
ｖ）前記フソソームから前記外因性薬剤を受容した標的細胞が検出可能な抗体応答を生じず、又は前記標的細胞に対する抗体がバックグラウンドレベルより１０％、５％、４％、３％、２％、若しくは１％未満高いレベルで存在する、或いは
ｖｉ）前記フソソームから前記外因性作用物質を受容した標的細胞が検出可能な細胞性免疫応答を生じないか、又は前記標的細胞に対する細胞性応答がバックグラウンドレベルの１０％未満、５％、４％、３％、２％、若しくは１％超のレベルで存在する、の１つ又は複数である、項目６～１３のいずれかに記載のフソソーム。
(項目１５)
前記バックグラウンドレベルが、前記フソソームの投与前の同じ被験体における対応するレベルである、項目１４に記載のフソソーム。
(項目１６)
前記免疫抑制タンパク質が補体調節タンパク質又はＣＤ４７である、項目６～１５のいずれかに記載のフソソーム。
(項目１７)
前記免疫賦活タンパク質がＭＨＣ Ｉ又はＭＨＣ ＩＩタンパク質である、項目６～１６のいずれかに記載のフソソーム。
(項目１８)
以下：
ｉ）前記フソソームが非標的細胞とよりも前記ＣＮＳ標的細胞と高い割合で融合し、任意に、前記高い割合が、少なくとも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、又は１００倍である、
ｉｉ）前記フソソームが、別のフソソームとよりもＣＮＳ標的細胞と高い割合で融合し、任意に、前記高い割合は少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、又は１００倍である、
ｉｉｉ）前記フソソームが、前記フソソームにおける前記外因性作用物質が２４、４８、又は７２時間後にＣＮＳ標的細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％に送達されるような割合でＣＮＳ標的細胞と融合する、
ｉｖ）前記フソソームが、前記核酸を前記ＣＮＳ標的細胞に非標的細胞よりも高い割合で送達し、任意に、前記高い割合が少なくとも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、又は１００倍である、
ｖ）前記フソソームが、前記核酸を前記ＣＮＳ標的細胞に別のフソソームよりも高い割合で送達し、任意に、前記高い割合が、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、又は１００倍である、或いは
ｖｉ）前記フソソームが前記核酸を前記ＣＮＳ標的細胞に、前記フソソームにおける前記外因性作用物質が２４、４８、又は７２時間に標的細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％に送達されるような割合で送達する、の１つ以上である、項目１～１７のいずれかに記載のフソソーム。
(項目１９)
前記外因性作用物質が、ＳＹＮＥ１、ＳＥＴＸ、ＦＭＲ１、ＳＬＣ６Ａ８、ＵＢＥ３Ａ、ＳＯＤ１、ＴＤＰ４３、Ｃ９ｏｒｆ７２、ＦＸＮ、ＭＥＣＰ２、ＡＳＰＡ、若しくはＡＬＤＨ７Ａ１から選択されるか、又は前記外因性作用物質が、ＴＰＰ１、ＦＵＣＡ１、ＧＡＬＣ、ＨＥＸＡ、ＨＥＸＢ、ＭＡＮＢＡ、ＡＲＳＡ、ＧＮＰＴＡＢ、若しくはＭＣＯＬＮ１から選択される、項目１～１８のいずれかに記載のフソソーム。
(項目２０)
前記ペイロード遺伝子が、ＳＹＮＥ１、ＳＥＴＸ、ＦＭＲ１、ＳＬＣ６Ａ８、ＵＢＥ３Ａ、ＳＯＤ１、ＴＤＰ４３、Ｃ９ｏｒｆ７２、ＦＸＮ、ＭＥＣＰ２、ＡＳＰＡ、及びＡＬＤＨ７Ａ１の中より選択される、項目１～１９のいずれかに記載のフソソーム。
(項目２１)
前記ペイロード遺伝子が、配列番号１３４～１４５のいずれか１つに記載の配列を含む外因性作用物質、又はその機能的フラグメント、又は配列番号１３４～１４５のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むその機能性バリアントをコードする、項目１～２０のいずれかに記載のフソソーム。
(項目２２)
前記ペイロード遺伝子が、ＴＰＰ１、ＦＵＣＡ１、ＧＡＬＣ、ＨＥＸＡ、ＨＥＸＢ、ＭＡＮＢＡ、ＡＲＳＡ、ＧＮＰＴＡＢ及びＭＣＯＬＮ１から選択される、項目１～１９のいずれかに記載のフソソーム。
(項目２３)
前記ペイロード遺伝子が、配列番号１４６～１５４のいずれか１つに記載の配列を含む外因性作用物質、又はその機能的フラグメント、又は配列番号１４６～１５４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むその機能性バリアントをコードする、項目１～１９及び２２のいずれかに記載のフソソーム。
(項目２４)
前記フソゲンがＣＮＳ細胞を標的とし、任意に、前記ＣＮＳ細胞が、ニューロン又はグリア細胞であり、任意に、前記ＣＮＳ細胞が、汎ニューロン細胞、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、グルタミン酸作動性ニューロン、コリン作動性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、セロトニン作動性ニューロン、グリア細胞、星状膠細胞、ミクログリア細胞、乏突起膠細胞、又は脈絡叢細胞である、項目１～２３のいずれかに記載のフソソーム。
(項目２５)
前記フソゲンが、ウイルスエンベロープタンパク質である、項目１～２４のいずれかに記載のフソソーム。
(項目２６)
前記フソゲンがＶＳＶ－Ｇを含む、項目１～２５のいずれか一項に記載のフソソーム。
(項目２７)
前記フソゲンが、ニパウイルスＦ及びＧタンパク質、麻疹ウイルスＦ及びＨタンパク質、ツパイアパラミクソウイルスＦ及びＨタンパク質、パラミクソウイルスＦ及びＧタンパク質若しくはＦ及びＨタンパク質若しくはＦ及びＨＮタンパク質、ヘンドラウイルスＦ及びＧタンパク質、ヘニパウイルスＦ及びＧタンパク質、モルビリウイルスＦ及びＨタンパク質、レスピロウイルスＦ及びＨＮタンパク質、センダイウイルスＦ及びＨＮタンパク質、ルブラウイルスＦ及びＨＮタンパク質、又はアブラウイルスＦ及びＨＮタンパク質、又はそれらの誘導体、又はそれらの任意の組み合わせから選択される配列を含む、項目１～２６のいずれかに記載のフソソーム。
(項目２８)
前記フソゲンが、野生型パラミクソウイルスフソゲンに対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する、少なくとも１００アミノ酸長のドメインを含み、任意に、前記野生型パラミクソウイルスフソゲンが、配列番号１～１３３のいずれか１つに記載されている、項目１～２４及び２７のいずれかに記載のフソソーム。
(項目２９)
前記野生型パラミクソウイルスがニパウイルスであり、任意に、前記ニパウイルスがヘニパウイルスである、項目２７に記載のフソソーム。
(項目３０)
前記フソゲンがＣＮＳ細胞への送達のため再標的化され、任意に、前記ＣＮＳ細胞が、ニューロン又はグリア細胞であり、任意に、前記ＣＮＳ細胞が、汎ニューロン細胞、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、グルタミン酸作動性ニューロン、コリン作動性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、セロトニン作動性ニューロン、グリア細胞、星状膠細胞、ミクログリア細胞、乏突起膠細胞、又は脈絡叢細胞である、項目１～２９のいずれかに記載のフソソーム。
(項目３１)
前記正の標的細胞特異的調節エレメントが、ＣＮＳ細胞特異的プロモーター、ＣＮＳ細胞特異的エンハンサー、ＣＮＳ細胞特異的スプライス部位、ＲＮＡ若しくはタンパク質の半減期を延長するＣＮＳ細胞特異的部位、ＣＮＳ細胞特異的ｍＲＮＡ核外輸送促進部位、ＣＮＳ細胞特異的翻訳増強部位、又はＣＮＳ細胞特異的翻訳後修飾部位を含む、項目１、２、５、６、７及び１２～３０のいずれかに記載のフソソーム。
(項目３２)
前記正の標的細胞特異的調節エレメントがＣＮＳ細胞特異的プロモーターを含む、項目１、２、５、６、７、又は１２～３１のいずれかに記載のフソソーム。
(項目３３)
前記正のＣＮＳ細胞特異的調節エレメントが、ＳＹＮ、ＮＳＥ、ＣａＭＫＩＩ、ａチューブリン、ＰＤＧＦ、ｆＳＳＴ、ｆＮＰＹ、ＧＡＤ６７、ＤＬＸ５／６、ＶＧＬＵＴ１、Ｄｏｃｋ１０、ＣｈＡＴ、ＶＡＣｈＴ、Ｄｒｄ１ａ、ＴＰＨ－２、ＧＦＡＰ、ＥＡＡＴ１、ＧＳ、ＣＸ３ＣＲ１、ＴＭＥＭ１１９、ＭＢＰ、ＣＮＰ、又はＣＲＦＲ２βプロモーターから選択されるプロモーターを含む、項目３２に記載のフソソーム。
(項目３４)
前記ＮＴＣＳＲＥが、非標的細胞特異的ｍｉＲＮＡ認識配列、非標的細胞特異的プロテアーゼ認識部位、非標的細胞特異的ユビキチンリガーゼ部位、非標的細胞特異的転写抑制部位、又は非標的細胞特異的エピジェネティック抑制部位を含む、項目２、４～７、及び１３～３３のいずれかに記載のフソソーム。
(項目３５)
前記ＮＴＣＳＲＥが、組織特異的ｍｉＲＮＡ認識配列、組織特異的プロテアーゼ認識部位、組織特異的ユビキチンリガーゼ部位、組織特異的転写抑制部位、又は組織特異的エピジェネティック抑制部位を含む、項目２、４～７、及び１３～３４のいずれかに記載のフソソーム。
(項目３６)
前記ＮＴＣＳＲＥが、非標的細胞特異的ｍｉＲＮＡ認識配列、非標的細胞特異的プロテアーゼ認識部位、非標的細胞特異的ユビキチンリガーゼ部位、非標的細胞特異的転写抑制部位、又は非標的細胞特異的エピジェネティック抑制部位を含む、項目２、４～７、及び１３～３５のいずれかに記載のフソソーム。
(項目３７)
前記ＮＴＣＳＲＥが、非標的細胞特異的ｍｉＲＮＡ認識配列を含み、前記ｍｉＲＮＡ認識配列が、１つ以上のｍｉＲ－３３８－３ｐ、ｍｉＲ－９、ｍｉＲ－１２５ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－３４２－３ｐ、又はｍｉＲ－１２４によって結合され得て、任意に、前記ｍｉＲＮＡが、配列番号１５６～１６２のいずれか１つに記載される配列を含む、項目２、４～７、及び１３～３５のいずれかに記載のフソソーム。
(項目３８)
前記ＮＴＣＳＲＥが外因性作用物質をコードする転写領域内に位置するか又はコードされており、任意に、前記転写領域によって産生されるＲＮＡが、ＵＴＲ又はコード領域内のｍｉＲＮＡ認識配列を含む、項目３４～３７のいずれかに記載のフソソーム。
(項目３９)
前記核酸が１つ以上のインスレーター配列を含む、項目１～３８のいずれかに記載のフソソーム。
(項目４０)
前記核酸が２つのインスレーター配列を含み、任意に、前記２つのインスレーター配列が前記ペイロード遺伝子の上流の第１のインスレーター配列及び前記ペイロード遺伝子の下流の第２のインスレーター配列を含み、任意に、前記第１のインスレーター配列及び第２のインスレーター配列が、同一又は異なる配列を含む、項目３９に記載のフソソーム。
(項目４１)
前記フソソームがレトロウイルスベクター粒子である、項目１～４０のいずれかに記載のフソソーム。
(項目４２)
前記核酸がＣＮＳ細胞のゲノムに組み込まれることができる、項目１～４１のいずれかに記載のフソソーム。
(項目４３)
前記標的細胞がＣＮＳ細胞から選択され、任意に、前記ＣＮＳ細胞が、ニューロン又はグリア細胞であり、任意に、前記ＣＮＳ細胞が、汎ニューロン細胞、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、グルタミン酸作動性ニューロン、コリン作動性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、セロトニン作動性ニューロン、グリア細胞、星状膠細胞、ミクログリア細胞、乏突起膠細胞、又は脈絡叢細胞である、項目１～４２のいずれかに記載のフソソーム。
(項目４４)
項目１～４３のいずれかにいずれかに記載のフソソームと、薬学的に許容可能な担体、希釈剤、又は賦形剤とを含む、医薬組成物。
(項目４５)
項目１～４３のいずれかに記載のフソソーム又は項目４４に記載の医薬組成物を被験体に投与し、それにより外因性作用物質を前記被験体に送達することを含む、外因性作用物質を被験体に送達する方法。
(項目４６)
被験体において、ＣＮＳ組織又はＣＮＳ細胞の機能を調節する方法であって、前記被験体のＣＮＳ組織又はＣＮＳ細胞を、項目１～４３のいずれかに記載のフソソーム又は項目４５に記載の医薬組成物と接触させることを含む、方法。
(項目４７)
前記ＣＮＳ細胞が、ニューロン又はグリア細胞であり、任意に、前記ＣＮＳ細胞が、汎ニューロン細胞、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、グルタミン酸作動性ニューロン、コリン作動性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、セロトニン作動性ニューロン、グリア細胞、星状膠細胞、ミクログリア細胞、乏突起膠細胞、又は脈絡叢細胞である、項目４６に記載の方法。
(項目４８)
前記ＣＮＳ組織又は前記ＣＮＳ細胞が被験体に存在する、項目４６又は項目４７に記載の方法。
(項目４９)
ＣＮＳ疾患若しくは障害、又はリソソーム疾患若しくは障害を処置する方法であって、項目１～４３のいずれか一項に記載のフソソーム又は項目４４に記載の医薬組成物を被験体に投与することを含む、方法。
(項目５０)
前記ＣＮＳ疾患若しくは障害又は前記リソソーム疾患若しくは障害が遺伝的欠損によって引き起こされる、項目４９に記載の方法。
(項目５１)
被験体において遺伝子欠損を処置する方法であって、項目１～４３のいずれかに記載のフソソーム又は項目４４に記載の医薬組成物を前記被験体に投与することを含む、方法。
(項目５２)
前記遺伝子欠損が、前記外因性作用物質をコードするペイロード遺伝子によって処置することができる遺伝子欠損である、項目５０又は項目５１に記載の方法。
(項目５３)
前記疾患又は障害が、脊髄小脳失調症；常染色体劣性、１型；眼球運動失行を伴う運動失調、２型；脆弱Ｘ症候群；脳クレアチン欠乏症候群１；アンジェルマン症候群；筋萎縮性側索硬化症；フリードライヒ運動失調；レット症候群；カナバン病；ピリドキシン依存性てんかん；バッテン病、フコシドーシス；クラッベ病；テイ・サックス病；サンドホフ病；ベータマンノース症；異染性白質ジストロフィー；ムコリピドーシスＩＩＩａ型；ムコリピドーシスＩＩＩｂ型；又はムコリピドーシスＩＶ型から選択される、項目４９、項目５０又は項目５２に記載の方法。
(項目５４)
前記被験体がヒト被験体である、項目４９～５３のいずれかに記載の方法。
(項目５５)
ＣＮＳ疾患若しくは障害又はリソソーム疾患若しくは障害を有する被験体の処置において使用するための、項目１～４３のいずれか一項に記載のフソソーム又は項目４４に記載の医薬組成物。
(項目５６)
ＣＮＳ疾患若しくは障害又はリソソーム疾患若しくは障害を有する被験体を処置する際に使用するための医薬を製造するための、項目１～４３のいずれか一項に記載のフソソーム又は項目４４に記載の医薬組成物の使用。
(項目５７)
前記ＣＮＳ疾患若しくは障害又はリソソーム疾患若しくは障害が遺伝的欠損によって引き起こされる、項目５５に記載の使用のためのフソソーム若しくは医薬組成物、又は項目５６に記載の使用。
(項目５８)
前記疾患又は障害が、脊髄小脳失調症；常染色体劣性、１型；眼球運動失行を伴う運動失調、２型；脆弱Ｘ症候群；脳クレアチン欠乏症候群１；アンジェルマン症候群；筋萎縮性側索硬化症；フリードライヒ運動失調；レット症候群；カナバン病；ピリドキシン依存性てんかん；バッテン病、フコシドーシス；クラッベ病；テイ・サックス病；サンドホフ病；ベータマンノース症；異染性白質ジストロフィー；ムコリピドーシスＩＩＩａ型；ムコリピドーシスＩＩＩｂ型；又はムコリピドーシスＩＶ型から選択される、項目５５若しくは項目５７に記載の使用のためのフソソーム若しくは医薬組成物、又は項目５６若しくは項目５７に記載の使用。
(項目５９)
遺伝子欠損を処置する際に使用するための、項目１～４３のいずれかに記載のフソソーム又は項目４４に記載の医薬組成物。
(項目６０)
遺伝子欠損を処置する際に使用するための薬剤を製造するための、項目１～４３のいずれかに記載のフソソーム又は項目４４に記載の医薬組成物の使用。
(項目６１)
前記遺伝子欠損が、前記外因性作用物質をコードするペイロード遺伝子によって処置することができる遺伝子欠損である、項目５７～５９のいずれかに記載の使用のためのフソソーム若しくは医薬組成物、又は項目５７、５８及び６０に記載の使用。
(項目６２)
以下：
ａ）前記核酸及び前記フソゲンを含む細胞を提供すること、
ｂ）フソソームの産生を可能にする条件下で上記細胞を培養すること、並びに
ｃ）上記細胞からフソソームを分離、濃縮、又は精製し、それによってフソソームを作製することを含む、項目１～４３のいずれかに記載のフソソームを作製する方法。

Claims (38)

  1. 以下：
    ａ）再標的化されたパラミクソウイルスフソゲンを含む脂質二重層であって、前記フソゲンが、ウイルスエンベロープタンパク質である、脂質二重層、並びに
    ｂ）以下：
    （ｉ）外因性作用物質をコードするペイロード遺伝子と、
    （ｉｉ）前記ペイロード遺伝子に作動可能に連結された正の標的細胞特異的調節エレメントとを含む核酸、を含むフソソームであって、
    前記正の標的細胞特異的調節エレメントが、前記正の標的細胞特異的調節エレメントを欠く他は同様のフソソームと比較して、ＣＮＳ細胞における前記ペイロード遺伝子の発現を増加させ、
    前記再標的化されたパラミクソウイルスフソゲンが標的化ドメインに連結され、前記標的化ドメインが抗体、抗体の抗原結合部分、又は受容体リガンドであり、前記再標的化されたパラミクソウイルスフソゲンが、非ＣＮＳ細胞よりもＣＮＳ細胞への前記外因性作用物質の優先的な送達をもたらす、フソソーム。
  2. 前記核酸が、前記ペイロード遺伝子に作動可能に連結された非標的細胞特異的調節エレメント（ＮＴＣＳＲＥ）を更に含み、前記ＮＴＣＳＲＥが、ＮＴＣＳＲＥを欠く他は同様のフソソームと比較して、非標的細胞において前記ペイロード遺伝子の発現を減少させ、前記標的細胞が第１のタイプのＣＮＳ細胞であり、前記非標的細胞が第２の異なるタイプのＣＮＳ細胞又は非ＣＮＳ細胞である、請求項１に記載のフソソーム。
  3. 以下：
    ａ）再標的化されたパラミクソウイルスフソゲンを含む脂質二重層であって、前記フソゲンが、ウイルスエンベロープタンパク質である、脂質二重層；並びに
    ｂ）以下：
    （ｉ）外因性作用物質をコードするペイロード遺伝子と、
    （ｉｉ）前記ペイロード遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターとを含む核酸、を含むフソソームであって、前記プロモーターが、ＳＹＮ、ＮＳＥ、ＣａＭＫＩＩ、ａチューブリン、ＰＤＧＦ、ｆＳＳＴ、ｆＮＰＹ、ＧＡＤ６７、ＤＬＸ５／６、ＶＧＬＵＴ１、Ｄｏｃｋ１０、ＣｈＡＴ、ＶＡＣｈＴ、Ｄｒｄ１ａ、ＴＰＨ－２、ＧＦＡＰ、ＥＡＡＴ１、ＧＳ、ＣＸ３ＣＲ１、ＴＭＥＭ１１９、ＭＢＰ、ＣＮＰ、又はＣＲＦＲ２βプロモーターから選択され、
    前記再標的化されたパラミクソウイルスフソゲンが標的化ドメインに連結され、前記標的化ドメインが抗体、抗体の抗原結合部分、又は受容体リガンドであり、前記再標的化されたパラミクソウイルスフソゲンが、非ＣＮＳ細胞よりもＣＮＳ細胞への前記外因性作用物質の優先的な送達をもたらす、フソソーム。
  4. 以下：
    （ｉ）前記フソソームが前記脂質二重層上の第１の外因性若しくは過剰発現された免疫抑制タンパク質をさらに含む、および／又は
    （ｉｉ）第１の免疫賦活タンパク質が前記フソソームに存在しないか若しくは前記フソソームが、低下したレベルで存在する第１の免疫賦活タンパク質をさらに含み、前記低下したレベルが、他の点は同様の未改変ソース細胞から生成されたフソソームと比較して、少なくとも１０％の低下である、請求項１～３のいずれかに記載のフソソーム。
  5. 前記ペイロード遺伝子が、リソソーム蓄積症若しくは障害、又はＣＮＳの疾患若しくは障害を処置する遺伝子であり、前記疾患又は障害が遺伝的欠損である、請求項１～４のいずれかに記載のフソソーム。
  6. 前記フソソームが（ｉ）及び（ｉｉ）を含むか、
    前記フソソームが（ｉ）を含み、前記脂質二重層上に第２の外因性又は過剰発現された免疫抑制タンパク質を更に含むか、または
    前記フソソームが（ｉｉ）を含み、更に、存在しないか若しくは低下したレベルで存在する第２の免疫賦活タンパク質を含み、前記低下したレベルが、他の点では同様の未改変ソース細胞から生成されたフソソームと比較して、少なくとも１０％の低下である、
    請求項４に記載のフソソーム。
  7. 前記核酸が、前記ペイロード遺伝子に作動可能に連結された正の標的細胞特異的調節エレメントを更に含み、前記正の標的細胞特異的調節エレメントが、前記正の標的細胞特異的調節エレメントを欠く他は同様のフソソームと比較して、標的細胞における前記ペイロード遺伝子の発現を増加させ、前記標的細胞がＣＮＳ細胞である、および／または
    前記核酸が、前記ペイロード遺伝子に作動可能に連結された非標的細胞特異的調節エレメント（ＮＴＣＳＲＥ）を更に含み、前記ＮＴＣＳＲＥが、前記ＮＴＣＳＲＥを欠く他は同様のフソソームと比較して、非標的細胞又は組織において前記ペイロード遺伝子の発現を減少させ、前記標的細胞が第１のタイプのＣＮＳ細胞であり、前記非標的細胞が第２の異なるタイプのＣＮＳ細胞もしくは非ＣＮＳ細胞である、
    請求項３に記載のフソソーム。
  8. 前記標的細胞がニューロンであり、前記非標的細胞がグリア細胞であり、前記グリア細胞が乏突起膠細胞、星状膠細胞若しくはミクログリア細胞であるか、又は
    前記標的細胞がグリア細胞であり、前記グリア細胞が乏突起膠細胞、星状膠細胞又はミクログリア細胞であり、前記非標的細胞がニューロンである、請求項６又は７に記載のフソソーム。
  9. 前記免疫抑制タンパク質が補体調節タンパク質又はＣＤ４７である、および／または
    前記免疫賦活タンパク質がＭＨＣ Ｉ又はＭＨＣ ＩＩタンパク質である、
    請求項４又は６～８のいずれかに記載のフソソーム。
  10. 前記ペイロード遺伝子が、ＳＹＮＥ１、ＳＥＴＸ、ＦＭＲ１、ＳＬＣ６Ａ８、ＵＢＥ３Ａ、ＳＯＤ１、ＴＤＰ４３、Ｃ９ｏｒｆ７２、ＦＸＮ、ＭＥＣＰ２、ＡＳＰＡ、ＡＬＤＨ７Ａ１、ＴＰＰ１、ＦＵＣＡ１、ＧＡＬＣ、ＨＥＸＡ、ＨＥＸＢ、ＭＡＮＢＡ、ＡＲＳＡ、ＧＮＰＴＡＢ、若しくはＭＣＯＬＮ１から選択される、請求項１～９のいずれかに記載のフソソーム。
  11. 前記フソゲンが前記ＣＮＳ細胞を標的とし、前記ＣＮＳ標的細胞が、ニューロン又はグリア細胞であり、前記ＣＮＳ標的細胞が、汎ニューロン細胞、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、グルタミン酸作動性ニューロン、コリン作動性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、セロトニン作動性ニューロン、グリア細胞、星状膠細胞、ミクログリア細胞、乏突起膠細胞、又は脈絡叢細胞である、請求項１～１０のいずれかに記載のフソソーム。
  12. 前記パラミクソウイルスフソゲンが、パラミクソウイルスＦ及びＧタンパク質若しくはＦ及びＨタンパク質若しくはＦ及びＨＮタンパク質から選択される配列を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載のフソソーム。
  13. 前記パラミクソウイルスフソゲンが、ニパウイルスＦ及びＧタンパク質、麻疹ウイルスＦ及びＨタンパク質、ツパイアパラミクソウイルスＦ及びＨタンパク質、ヘンドラウイルスＦ及びＧタンパク質、ヘニパウイルスＦ及びＧタンパク質、モルビリウイルスＦ及びＨタンパク質、レスピロウイルスＦ及びＨＮタンパク質、センダイウイルスＦ及びＨＮタンパク質、ルブラウイルスＦ及びＨＮタンパク質、又はアブラウイルスＦ及びＨＮタンパク質、又はそれらの任意の組み合わせから選択される配列を含む、請求項１～１２のいずれかに記載のフソソーム。
  14. 前記正の標的細胞特異的調節エレメントが、ＣＮＳ細胞特異的プロモーター、ＣＮＳ細胞特異的エンハンサー、ＣＮＳ細胞特異的スプライス部位、ＲＮＡ若しくはタンパク質の半減期を延長するＣＮＳ細胞特異的部位、ＣＮＳ細胞特異的ｍＲＮＡ核外輸送促進部位、ＣＮＳ細胞特異的翻訳増強部位、又はＣＮＳ細胞特異的翻訳後修飾部位を含む、請求項１、２、又は７のいずれかに記載のフソソーム。
  15. 前記正の標的細胞特異的調節エレメントがＣＮＳ細胞特異的プロモーターを含む、請求項１、２、４、５、又は７～１４のいずれかに記載のフソソーム。
  16. 前記正のＣＮＳ細胞特異的調節エレメントが、ＳＹＮ、ＮＳＥ、ＣａＭＫＩＩ、ａチューブリン、ＰＤＧＦ、ｆＳＳＴ、ｆＮＰＹ、ＧＡＤ６７、ＤＬＸ５／６、ＶＧＬＵＴ１、Ｄｏｃｋ１０、ＣｈＡＴ、ＶＡＣｈＴ、Ｄｒｄ１ａ、ＴＰＨ－２、ＧＦＡＰ、ＥＡＡＴ１、ＧＳ、ＣＸ３ＣＲ１、ＴＭＥＭ１１９、ＭＢＰ、ＣＮＰ、又はＣＲＦＲ２βプロモーターから選択されるプロモーターを含む、請求項１５に記載のフソソーム。
  17. 前記ＮＴＣＳＲＥが、非標的細胞特異的ｍｉＲＮＡ認識配列、非標的細胞特異的プロテアーゼ認識部位、非標的細胞特異的ユビキチンリガーゼ部位、非標的細胞特異的転写抑制部位、又は非標的細胞特異的エピジェネティック抑制部位を含む、および／または
    前記ＮＴＣＳＲＥが、組織特異的ｍｉＲＮＡ認識配列、組織特異的プロテアーゼ認識部位、組織特異的ユビキチンリガーゼ部位、組織特異的転写抑制部位、又は組織特異的エピジェネティック抑制部位を含む、
    請求項２、４、又は７のいずれかに記載のフソソーム。
  18. 前記ＮＴＣＳＲＥが、非標的細胞特異的ｍｉＲＮＡ認識配列を含み、前記ｍｉＲＮＡ認識配列が、１つ以上のｍｉＲ－３３８－３ｐ、ｍｉＲ－９、ｍｉＲ－１２５ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－３４２－３ｐ、又はｍｉＲ－１２４によって結合されており、前記ｍｉＲＮＡが、配列番号１５６～１６２のいずれか１つに記載される配列であるか又は前記配列を含む、請求項２、４、７、又は１７のいずれかに記載のフソソーム。
  19. 前記ＮＴＣＳＲＥが前記外因性作用物質をコードする転写領域内に位置するか又はコードされており、前記転写領域によって産生されるＲＮＡが、ＵＴＲ又はコード領域内のｍｉＲＮＡ認識配列を含む、請求項１７または請求項１８に記載のフソソーム。
  20. 前記核酸が１つ以上のインスレーター配列を含む、請求項１～１９のいずれかに記載のフソソーム。
  21. 前記核酸が２つのインスレーター配列を含み、前記２つのインスレーター配列が前記ペイロード遺伝子の上流の第１のインスレーター配列及び前記ペイロード遺伝子の下流の第２のインスレーター配列を含み、前記第１のインスレーター配列及び第２のインスレーター配列が、同一又は異なる配列を含む、請求項２０に記載のフソソーム。
  22. 前記フソソームがレトロウイルスベクター粒子であり、前記レトロウイルスベクター粒子がレンチウイルスベクター粒子である、請求項１～２１のいずれかに記載のフソソーム。
  23. 請求項１～２２のいずれかに記載のフソソームと、薬学的に許容可能な担体、希釈剤、又は賦形剤とを含む、医薬組成物。
  24. 外因性作用物質を被験体に送達する方法における使用のための、請求項１～２２のいずれか一項に記載の複数のフソソームを含むフソソーム組成物又は請求項２３に記載の医薬組成物。
  25. 前記外因性作用物質が前記被験体のＣＮＳ細胞に送達される、請求項２４に記載のフソソーム組成物又は医薬組成物。
  26. 被験体において、または被験体のＣＮＳ組織又はＣＮＳ細胞において機能を調節する方法における使用のための、請求項１～２２のいずれか一項に記載の複数のフソソームを含むフソソーム組成物又は請求項２３に記載の医薬組成物。
  27. 前記ＣＮＳ細胞が、ニューロン又はグリア細胞であり、前記ＣＮＳ細胞が、汎ニューロン細胞、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、グルタミン酸作動性ニューロン、コリン作動性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、セロトニン作動性ニューロン、グリア細胞、星状膠細胞、ミクログリア細胞、乏突起膠細胞、又は脈絡叢細胞である、および／または
    前記ＣＮＳ組織又は前記ＣＮＳ細胞が前記被験体に存在する、
    請求項２６に記載のフソソーム組成物又は医薬組成物。
  28. ＣＮＳ疾患若しくは障害又はリソソーム疾患若しくは障害を有する被験体の処置において使用するための、請求項１～２２のいずれか一項に記載のフソソームを含む組成物又は請求項２３に記載の医薬組成物。
  29. ＣＮＳ疾患若しくは障害又はリソソーム疾患若しくは障害を有する被験体を処置する際に使用するための医薬を製造するための、請求項１～２２のいずれか一項に記載のフソソーム又は請求項２３に記載の医薬組成物の使用。
  30. 前記ＣＮＳ疾患若しくは障害又はリソソーム疾患若しくは障害が遺伝的欠損によって引き起こされる、請求項２８に記載の使用のための組成物若しくは医薬組成物。
  31. 前記疾患又は障害が、脊髄小脳失調症；常染色体劣性、１型；眼球運動失行を伴う運動失調、２型；脆弱Ｘ症候群；脳クレアチン欠乏症候群１；アンジェルマン症候群；筋萎縮性側索硬化症；フリードライヒ運動失調；レット症候群；カナバン病；ピリドキシン依存性てんかん；バッテン病、フコシドーシス；クラッベ病；テイ・サックス病；サンドホフ病；ベータマンノース症；異染性白質ジストロフィー；ムコリピドーシスＩＩＩａ型；ムコリピドーシスＩＩＩｂ型；又はムコリピドーシスＩＶ型から選択される、請求項２８若しくは請求項３０に記載の使用のための組成物若しくは医薬組成物。
  32. 遺伝子欠損を有する被験体を処置する際に使用するための、請求項１～２２のいずれかに記載のフソソームを含む組成物又は請求項２３に記載の医薬組成物。
  33. 遺伝子欠損を有する被験体を処置する際に使用するための薬剤を製造するための、請求項１～２２のいずれかに記載のフソソーム又は請求項２３に記載の医薬組成物の使用。
  34. 前記被験体はヒト被験体である、請求項２４～２７のいずれか一項に記載のフソソーム組成物もしくは医薬組成物、あるいは、請求項２８および３０～３２のいずれか一項に記載の組成物もしくは医薬組成物。
  35. 以下：
    ａ）前記核酸及び前記フソゲンを含む細胞を提供すること、
    ｂ）フソソームの産生を可能にする条件下で前記細胞を培養すること、並びに
    ｃ）前記細胞からフソソームを分離、濃縮、又は精製し、それによってフソソームを作製することを含む、請求項１～２２のいずれかに記載のフソソームを作製する方法。
  36. 前記ＣＮＳ疾患若しくは障害又はリソソーム疾患若しくは障害が遺伝的欠損によって引き起こされる、請求項２９に記載の使用。
  37. 前記疾患又は障害が、脊髄小脳失調症；常染色体劣性、１型；眼球運動失行を伴う運動失調、２型；脆弱Ｘ症候群；脳クレアチン欠乏症候群１；アンジェルマン症候群；筋萎縮性側索硬化症；フリードライヒ運動失調；レット症候群；カナバン病；ピリドキシン依存性てんかん；バッテン病、フコシドーシス；クラッベ病；テイ・サックス病；サンドホフ病；ベータマンノース症；異染性白質ジストロフィー；ムコリピドーシスＩＩＩａ型；ムコリピドーシスＩＩＩｂ型；又はムコリピドーシスＩＶ型から選択される、請求項２９又は３６に記載の使用。
  38. 前記被験体はヒト被験体である、請求項２９または３３に記載の使用。
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