JP7676121B2 - ｓＲＮＡの抽出方法及び生物の存在状態の判定方法 - Google Patents
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Description
本開示は、ｓＲＮＡの抽出方法及び生物の存在状態の判定方法に関する。
食品製造、医療、福祉、家庭等の衛生管理が必要とされる現場において、人体に対し好ましくない影響を与える細菌等の生物の管理は重要である。環境中の生物のほとんどは無害であるが、一部の生物は、食中毒、製品の腐敗又は変敗を引き起こし、人々の暮らしの大きな妨げとなる。
近年は細菌等の生物を何らかの方法で検出し（いわゆる「見える化」）、検出結果を生物に関する衛生管理の指標とする試みが普及しつつある。ここで、細菌等を検出する場合に最も基本的な検出方法は培養法である。培養法は、培地上で細菌等を培養し、細菌の形態を基に当該細菌を検出する方法である。
培養法以外の生物の検出方法として、生物の表面抗原を抗体で認識する方法（抗体法）が挙げられる。抗体法としては、イムノクロマト法、ラテックス凝集法、ＥＬＩＳＡ法等が代表的な方法として挙げられる。
上記の方法以外の生物の検出方法としては、生物に含まれる遺伝子を基に生物を検出する方法（遺伝子法）も挙げられる。
本開示の一実施形態は、生物から効率的にｓＲＮＡを抽出する方法、及び生物の存在状態を迅速に判定する方法を提供することを課題とする。
＜１＞ 生物と、ノニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、アミノ酸、オリゴペプチド、及びタンパク質からなる群より選択されるコーティング材でコーティングされた担体とを、第一の液体中で共存させることにより、前記生物を前記コーティングされた担体に吸着させること、及び
前記生物を吸着した前記コーティングされた担体を、前記第一の液体と同じであっても異なっていてもよい第二の液体中に浸漬することにより、前記生物由来のｓＲＮＡを前記第二の液体中に抽出すること、
を含む、生物からのｓＲＮＡの抽出方法。
＜２＞ 前記浸漬は加熱下で行われる、前記＜１＞に記載の抽出方法。
＜３＞ 前記生物は、細胞壁を有する生物である、＜１＞又は＜２＞に記載の抽出方法。
＜４＞ 前記第二の液体は、水性溶媒である、前記＜３＞に記載の抽出方法。
＜５＞ 生物と、ノニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、アミノ酸、オリゴペプチド、及びタンパク質からなる群より選択されるコーティング材でコーティングされた担体とを、第一の液体中で共存させることにより、前記生物を前記コーティングされた担体に吸着させること、
前記生物を吸着した前記コーティングされた担体を、前記第一の液体と同じであっても異なっていてもよい第二の液体中に浸漬することにより、前記生物由来のｓＲＮＡを前記第二の液体中に抽出すること、
前記抽出されたｓＲＮＡの存在状態を検出すること、及び
得られたｓＲＮＡの存在状態を基に、前記生物の存在状態を判定すること、
を含む、生物の存在状態の判定方法。
＜６＞ 前記ｓＲＮＡは１種又は複数種のｓＲＮＡである、前記＜５＞に記載の判定方法。
＜７＞ 前記浸漬は加熱下で行われる、前記＜５＞又は＜６＞に記載の判定方法。
＜８＞ 前記生物は、細胞壁を有する生物である、＜５＞～＜７＞のうちいずれか一つに記載の判定方法。
＜９＞ 前記第二の液体は、水性溶媒である、前記＜８＞に記載の判定方法。
＜１０＞ 前記水性溶媒が核酸増幅用試薬を含む、前記＜９＞に記載の判定方法。
＜１１＞ 前記浸漬が０℃～５０℃の温度範囲内の温度で行われる、前記＜５＞～＜１０＞のうちいずれか一つに記載の判定方法。
＜１２＞ 前記担体は、活性炭、シリカ、ゼオライト、多孔性セラミックス、炭素繊維、砂、及びガラスビーズからなる群より選択される少なくとも一種である、前記＜５＞～＜１１＞のうちいずれか一つに記載の判定方法。
＜１３＞ 前記ノニオン性界面活性剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、及びオクチルフェノールエトキシレートからなる群より選択される少なくとも一種である、前記＜５＞～＜１２＞のうちいずれか一つに記載の判定方法。
＜１４＞ 前記カチオン性界面活性剤は、ベンザルコニウム塩化物及び臭化セチルトリメチルアンモニウムからなる群より選択される少なくとも一種である、前記＜５＞～＜１２＞のうちいずれか一つに記載の判定方法。
＜１５＞ 前記アニオン性界面活性剤は、ドデシル硫酸ナトリウム及び１－オクタンスルホン酸ナトリウムからなる群より選択される少なくとも一種である、前記＜５＞～＜１２＞のうちいずれか一つに記載の判定方法。
＜１６＞ 前記アミノ酸は、グリシンである、前記＜５＞～＜１２＞のうちいずれか一つに記載の判定方法。
＜１７＞ 前記タンパク質は、脱脂粉乳、及びウシ血清アルブミンからなる群より選択される少なくとも一種である、前記＜５＞～＜１２＞のうちいずれか一つに記載の判定方法。
＜１８＞ 前記ｓＲＮＡは、前記生物中に存在する、前記＜５＞～＜１７＞のうちいずれか一つに記載の判定方法。
＜１９＞ 前記生物の存在状態を判定することが、２種以上の生物の総体的な存在状態を判定することを含む、前記＜５＞～＜１８＞のうちいずれか一つに記載の判定方法。
＜２０＞ 前記ｓＲＮＡの存在状態を検出することが、前記ｓＲＮＡの存在量を検出することを含む、前記＜５＞～＜１９＞のうちいずれか一つに記載の判定方法。
＜２１＞ 前記生物が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ、及びＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍからなる群より選ばれる少なくとも一種の細胞壁を有する生物を含む、前記＜５＞～＜２０＞のうちいずれか一つに記載の判定方法。
＜２２＞ 前記生物が植物を含む、前記＜５＞～＜２１＞のうちいずれか一つに記載の判定方法。
＜２３＞ 前記生物がベロ毒素生産菌を含む、前記＜５＞～＜２２＞のうちいずれか一つに記載の判定方法。
＜２４＞ 前記ｓＲＮＡそれぞれの塩基数が、５～５００の範囲内である、前記＜５＞～＜２３＞のうちいずれか一つに記載の判定方法。
＜２５＞ 前記ｓＲＮＡは、配列番号１で表されるヌクレオチド配列を有するＥＣ－５ｐ－３６、配列番号２で表されるヌクレオチド配列を有するＥＣ－３ｐ－４０、配列番号３で表されるヌクレオチド配列を有するＥＣ－５ｐ－７９、配列番号４で表されるヌクレオチド配列を有するＥＣ－３ｐ－３９３、配列番号５で表されるヌクレオチド配列を有するｆｏｘ＿ｍｉｌＲＮＡ＿５、配列番号６で表されるヌクレオチド配列を有するｍｉＲ１５６、及び配列番号７で表されるヌクレオチド配列を有するｍｉＲ７１６ｂからなる群より選択される少なくとも１種を含む、前記＜５＞～＜２４＞のうちいずれか一つに記載の判定方法。
＜２６＞ 前記ｓＲＮＡの存在状態を検出することがＰＣＲにより行われる、前記＜５＞～＜２５＞のうちいずれか一つに記載の判定方法。
前記生物を吸着した前記コーティングされた担体を、前記第一の液体と同じであっても異なっていてもよい第二の液体中に浸漬することにより、前記生物由来のｓＲＮＡを前記第二の液体中に抽出すること、
を含む、生物からのｓＲＮＡの抽出方法。
＜２＞ 前記浸漬は加熱下で行われる、前記＜１＞に記載の抽出方法。
＜３＞ 前記生物は、細胞壁を有する生物である、＜１＞又は＜２＞に記載の抽出方法。
＜４＞ 前記第二の液体は、水性溶媒である、前記＜３＞に記載の抽出方法。
＜５＞ 生物と、ノニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、アミノ酸、オリゴペプチド、及びタンパク質からなる群より選択されるコーティング材でコーティングされた担体とを、第一の液体中で共存させることにより、前記生物を前記コーティングされた担体に吸着させること、
前記生物を吸着した前記コーティングされた担体を、前記第一の液体と同じであっても異なっていてもよい第二の液体中に浸漬することにより、前記生物由来のｓＲＮＡを前記第二の液体中に抽出すること、
前記抽出されたｓＲＮＡの存在状態を検出すること、及び
得られたｓＲＮＡの存在状態を基に、前記生物の存在状態を判定すること、
を含む、生物の存在状態の判定方法。
＜６＞ 前記ｓＲＮＡは１種又は複数種のｓＲＮＡである、前記＜５＞に記載の判定方法。
＜７＞ 前記浸漬は加熱下で行われる、前記＜５＞又は＜６＞に記載の判定方法。
＜８＞ 前記生物は、細胞壁を有する生物である、＜５＞～＜７＞のうちいずれか一つに記載の判定方法。
＜９＞ 前記第二の液体は、水性溶媒である、前記＜８＞に記載の判定方法。
＜１０＞ 前記水性溶媒が核酸増幅用試薬を含む、前記＜９＞に記載の判定方法。
＜１１＞ 前記浸漬が０℃～５０℃の温度範囲内の温度で行われる、前記＜５＞～＜１０＞のうちいずれか一つに記載の判定方法。
＜１２＞ 前記担体は、活性炭、シリカ、ゼオライト、多孔性セラミックス、炭素繊維、砂、及びガラスビーズからなる群より選択される少なくとも一種である、前記＜５＞～＜１１＞のうちいずれか一つに記載の判定方法。
＜１３＞ 前記ノニオン性界面活性剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、及びオクチルフェノールエトキシレートからなる群より選択される少なくとも一種である、前記＜５＞～＜１２＞のうちいずれか一つに記載の判定方法。
＜１４＞ 前記カチオン性界面活性剤は、ベンザルコニウム塩化物及び臭化セチルトリメチルアンモニウムからなる群より選択される少なくとも一種である、前記＜５＞～＜１２＞のうちいずれか一つに記載の判定方法。
＜１５＞ 前記アニオン性界面活性剤は、ドデシル硫酸ナトリウム及び１－オクタンスルホン酸ナトリウムからなる群より選択される少なくとも一種である、前記＜５＞～＜１２＞のうちいずれか一つに記載の判定方法。
＜１６＞ 前記アミノ酸は、グリシンである、前記＜５＞～＜１２＞のうちいずれか一つに記載の判定方法。
＜１７＞ 前記タンパク質は、脱脂粉乳、及びウシ血清アルブミンからなる群より選択される少なくとも一種である、前記＜５＞～＜１２＞のうちいずれか一つに記載の判定方法。
＜１８＞ 前記ｓＲＮＡは、前記生物中に存在する、前記＜５＞～＜１７＞のうちいずれか一つに記載の判定方法。
＜１９＞ 前記生物の存在状態を判定することが、２種以上の生物の総体的な存在状態を判定することを含む、前記＜５＞～＜１８＞のうちいずれか一つに記載の判定方法。
＜２０＞ 前記ｓＲＮＡの存在状態を検出することが、前記ｓＲＮＡの存在量を検出することを含む、前記＜５＞～＜１９＞のうちいずれか一つに記載の判定方法。
＜２１＞ 前記生物が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ、及びＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍからなる群より選ばれる少なくとも一種の細胞壁を有する生物を含む、前記＜５＞～＜２０＞のうちいずれか一つに記載の判定方法。
＜２２＞ 前記生物が植物を含む、前記＜５＞～＜２１＞のうちいずれか一つに記載の判定方法。
＜２３＞ 前記生物がベロ毒素生産菌を含む、前記＜５＞～＜２２＞のうちいずれか一つに記載の判定方法。
＜２４＞ 前記ｓＲＮＡそれぞれの塩基数が、５～５００の範囲内である、前記＜５＞～＜２３＞のうちいずれか一つに記載の判定方法。
＜２５＞ 前記ｓＲＮＡは、配列番号１で表されるヌクレオチド配列を有するＥＣ－５ｐ－３６、配列番号２で表されるヌクレオチド配列を有するＥＣ－３ｐ－４０、配列番号３で表されるヌクレオチド配列を有するＥＣ－５ｐ－７９、配列番号４で表されるヌクレオチド配列を有するＥＣ－３ｐ－３９３、配列番号５で表されるヌクレオチド配列を有するｆｏｘ＿ｍｉｌＲＮＡ＿５、配列番号６で表されるヌクレオチド配列を有するｍｉＲ１５６、及び配列番号７で表されるヌクレオチド配列を有するｍｉＲ７１６ｂからなる群より選択される少なくとも１種を含む、前記＜５＞～＜２４＞のうちいずれか一つに記載の判定方法。
＜２６＞ 前記ｓＲＮＡの存在状態を検出することがＰＣＲにより行われる、前記＜５＞～＜２５＞のうちいずれか一つに記載の判定方法。
本開示によれば、生物から効率的にｓＲＮＡを抽出する方法、及び生物の存在状態を迅速に判定する方法が提供される。
以下において、本開示の内容について詳細に説明する。以下に記載する構成要件の説明は、本開示の代表的な実施態様に基づいてなされることがあるが、本開示はそのような実施態様に限定されるものではない。
本開示中に段階的に記載されている数値範囲において、１つの数値範囲で記載された上限値又は下限値は、他の段階的な記載の数値範囲の上限値又は下限値に置き換えてもよい。また、本開示中に記載されている数値範囲において、その数値範囲の上限値又は下限値は、実施例に示されている値に置き換えてもよい。
本開示中に段階的に記載されている数値範囲において、１つの数値範囲で記載された上限値又は下限値は、他の段階的な記載の数値範囲の上限値又は下限値に置き換えてもよい。また、本開示中に記載されている数値範囲において、その数値範囲の上限値又は下限値は、実施例に示されている値に置き換えてもよい。
更に、本開示において成分の含有量の記載は、各成分に該当する物質が複数含有されている場合においては、特に断らない限り、含有される当該複数の物質の合計量を意味する。
また、本開示において、「質量％」と「重量％」とは同義であり、「質量部」と「重量部」とは同義である。
更に、本開示において、別個に記載されている複数の例示的態様は、互いに矛盾しない限り、互いに組み合わせて新たな態様を構成してもよい。
更に、本開示において、別個に記載されている複数の例示的態様は、互いに矛盾しない限り、互いに組み合わせて新たな態様を構成してもよい。
本開示に係る生物からのｓＲＮＡの抽出方法は、生物と、ノニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、アミノ酸、オリゴペプチド、及びタンパク質からなる群より選択されるコーティング材でコーティングされた担体とを、第一の液体中で共存させることにより、前記生物を前記コーティングされた担体に吸着させること、及び前記生物を吸着した前記コーティングされた担体を、前記第一の液体と同じであっても異なっていてもよい第二の液体中に浸漬することにより、前記生物由来のｓＲＮＡを前記第二の液体中に抽出すること、を含む（以下、単に「本開示に係る抽出方法」とも称する）。
本開示に係る、生物の存在状態の判定方法は、生物と、ノニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、アミノ酸、オリゴペプチド、及びタンパク質からなる群より選択されるコーティング材でコーティングされた担体とを、第一の液体中で共存させることにより、前記生物を前記コーティングされた担体に吸着させること、前記生物を吸着した前記コーティングされた担体を、前記第一の液体と同じであっても異なっていてもよい第二の液体中に浸漬することにより、前記生物由来のｓＲＮＡを前記第二の液体中に抽出すること、前記抽出されたｓＲＮＡの存在状態を検出すること、及び得られたｓＲＮＡの存在状態を基に、前記生物の存在状態を判定すること、を含む（以下、単に「本開示に係る判定方法」とも称する）。
本願発明者は鋭意研究の結果、生物と、ノニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、アミノ酸、オリゴペプチド、及びタンパク質からなる群より選択されるコーティング材でコーティングされた担体とを、第一の液体中で共存させることにより、前記生物を前記コーティングされた担体に吸着させること、及び前記生物を吸着した前記コーティングされた担体を、前記第一の液体と同じであっても異なっていてもよい第二の液体中に浸漬することにより、前記生物由来のｓＲＮＡを前記第二の液体中に抽出すること、を含む、生物からのｓＲＮＡの抽出方法によって、生物から効率的にｓＲＮＡを抽出できることを見出した。
さらには、生物と、ノニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、アミノ酸、オリゴペプチド、及びタンパク質からなる群より選択されるコーティング材でコーティングされた担体とを、第一の液体中で共存させることにより、前記生物を前記コーティングされた担体に吸着させること、前記生物を吸着した前記コーティングされた担体を、前記第一の液体と同じであっても異なっていてもよい第二の液体中に浸漬することにより、前記生物由来のｓＲＮＡを前記第二の液体中に抽出すること、前記抽出されたｓＲＮＡの存在状態を検出すること、及び得られたｓＲＮＡの存在状態を基に、前記生物の存在状態を判定すること、を含む、生物の存在状態の判定方法によって、生物の存在状態を迅速に判定できることを見出した。
さらには、生物と、ノニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、アミノ酸、オリゴペプチド、及びタンパク質からなる群より選択されるコーティング材でコーティングされた担体とを、第一の液体中で共存させることにより、前記生物を前記コーティングされた担体に吸着させること、前記生物を吸着した前記コーティングされた担体を、前記第一の液体と同じであっても異なっていてもよい第二の液体中に浸漬することにより、前記生物由来のｓＲＮＡを前記第二の液体中に抽出すること、前記抽出されたｓＲＮＡの存在状態を検出すること、及び得られたｓＲＮＡの存在状態を基に、前記生物の存在状態を判定すること、を含む、生物の存在状態の判定方法によって、生物の存在状態を迅速に判定できることを見出した。
生物の細胞には、ｓｍａｌｌ ＲＮＡと呼ばれる短いＲＮＡ断片が含まれている。ｓｍａｌｌ ＲＮＡ（以下、「ｓＲＮＡ」とも称する）は、発生、分化、トランスポゾンのサイレンシング、ウイルス防御等の生命プロセスの制御という重要な役割を担っている。
本願発明者は、生物内に存在するｓＲＮＡを収集しようとする場合、生物（例えば、生物の細胞）を担体に吸着させることが有益となりうると考えた。例えば、ある液体中に含まれる生物からｓＲＮＡを収集しようとする場合、生物を担体に吸着させることで、生物を溶媒成分と分離することができる。より具体的には、液体中に担体を加えて生物を吸着させ、担体を沈降させて上清を除去すれば、液体中に含まれる生物の濃度を増加させる、つまり濃縮することができる。あるいは、フィルタに担体を含ませ、生物を含む液体をフィルタ通過させることで、フィルタ中の担体に生物を吸着させ、前記液体の溶媒成分と分離することができる。さらには、上清除去した後に、あるいは液体をフィルタ通過させた後に、生物を吸着した担体に別の溶媒を加えることで、溶媒交換することができる。生物を吸着した担体に、元々の液体の溶媒と同じ種類の溶媒を加えた場合であっても、元々の液体中の成分のうち担体に結合しない夾雑成分を除去できるという効果がある。
生物を濃縮できればｓＲＮＡの収集効率を上昇させることができるし、溶媒交換が可能であればｓＲＮＡの抽出に適した溶媒を用いることができる。また、夾雑成分の除去は収集させるｓＲＮＡの純度の向上を可能にする。
生物を濃縮できればｓＲＮＡの収集効率を上昇させることができるし、溶媒交換が可能であればｓＲＮＡの抽出に適した溶媒を用いることができる。また、夾雑成分の除去は収集させるｓＲＮＡの純度の向上を可能にする。
本願発明者は、このように生物を吸着する担体を使用することは有用であると考えたが、実際には担体の使用に起因する問題も生じることを見出した。具体的には、担体は生物だけでなくｓＲＮＡも吸着してしまうため、たとえ生物を担体に吸着させて液体に浸漬させても、吸着された生物からのｓＲＮＡは担体に吸着し、溶液中に効率的に抽出できないことが分かった。
驚くべきことに、本願発明者は、担体を特定の物質でコーティングすることにより、担体が生物を吸着しつつも、ｓＲＮＡの液体中への抽出の阻害を低減させることが可能であることを見出した。より具体的には、生物と、ノニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、アミノ酸、オリゴペプチド、及びタンパク質からなる群より選択されるコーティング材（以下、「特定コーティング材」とも称する）でコーティングされた担体とを、第一の液体中で共存させ、前記生物を前記コーティングされた担体に吸着させることで、第二の液体において、より効率的にｓＲＮＡを抽出できることが見出された。担体の表面の一部又は全部を、特定コーティング材でコーティングすることで、担体表面の吸着性が変化し、前記生物の担体への吸着は可能としつつも、生物から放出されたｓＲＮＡの担体への吸着を低減させることができると推測される。
よって、特定コーティング材でコーティングされた担体と生物とを第一の液体中で共存させると、前記生物は担体に吸着し、前記生物を担体に捕捉することができ、さらには放出されたｓＲＮＡの特定コーティング材でコーティングされた担体への吸着は低減される。そのため、前記生物を吸着した前記コーティングされた担体を第二の液体中に浸漬すると、コーティングされていない担体へ前記生物を吸着させた場合と比較して、前記生物からより効率的にｓＲＮＡを抽出できる。
驚くべきことに、本願発明者は、担体を特定の物質でコーティングすることにより、担体が生物を吸着しつつも、ｓＲＮＡの液体中への抽出の阻害を低減させることが可能であることを見出した。より具体的には、生物と、ノニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、アミノ酸、オリゴペプチド、及びタンパク質からなる群より選択されるコーティング材（以下、「特定コーティング材」とも称する）でコーティングされた担体とを、第一の液体中で共存させ、前記生物を前記コーティングされた担体に吸着させることで、第二の液体において、より効率的にｓＲＮＡを抽出できることが見出された。担体の表面の一部又は全部を、特定コーティング材でコーティングすることで、担体表面の吸着性が変化し、前記生物の担体への吸着は可能としつつも、生物から放出されたｓＲＮＡの担体への吸着を低減させることができると推測される。
よって、特定コーティング材でコーティングされた担体と生物とを第一の液体中で共存させると、前記生物は担体に吸着し、前記生物を担体に捕捉することができ、さらには放出されたｓＲＮＡの特定コーティング材でコーティングされた担体への吸着は低減される。そのため、前記生物を吸着した前記コーティングされた担体を第二の液体中に浸漬すると、コーティングされていない担体へ前記生物を吸着させた場合と比較して、前記生物からより効率的にｓＲＮＡを抽出できる。
抽出されたｓＲＮＡは、任意の用途において使用することができ、例えば実験用の核酸として使用することができる。本開示によれば、抽出されたｓＲＮＡを用いる方法の一例として、生物の存在状態の判定方法が提供される。ｓＲＮＡは細胞内で重要な機能を有することから、同一の生物種内においては発現するｓＲＮＡはヌクレオチド配列の保存性を有する、つまり、各種のｓＲＮＡの発現プロファイルは同一の生物種の複数の細胞の間では共通している。一方、異なる生物種間では、ｓＲＮＡの発現プロファイルは生物種に応じた差示的なものとなる。そのため、ＤＮＡや１６Ｓ ｒＲＮＡと同様に、測定試料中に存在するｓＲＮＡの情報は生物種の判別に利用することができる。ｓＲＮＡを用いて生物種の判別をすることができることは、これまで知られていなかった。
例えば、生物種（Ａ）においてはヌクレオチド配列（Ａ）を有するｓＲＮＡ（Ａ）が発現するが、ヌクレオチド配列（Ｂ）を有するｓＲＮＡ（Ｂ）は発現せず、生物種（Ｂ）においてはｓＲＮＡ（Ｂ）は発現するがｓＲＮＡ（Ａ）は発現しない場合、測定試料中にｓＲＮＡ（Ａ）の存在は検出されるがｓＲＮＡ（Ｂ）の存在は検出されないならば、生物種（Ａ）の細胞は存在するが生物種（Ｂ）の細胞は存在しないと判定できる。ただし、ｓＲＮＡ（Ａ）が、生物種（Ａ）及び（Ｂ）以外の生物種（Ｃ）でも発現するｓＲＮＡである場合には、測定試料中にｓＲＮＡ（Ａ）の存在は検出されるがｓＲＮＡ（Ｂ）の存在は検出されないならば、生物種（Ａ）及び生物種（Ｃ）のうち１種以上の細胞が存在するが、生物種（Ｂ）の細胞は存在しないと判定できる。
さらに、ｓＲＮＡは鎖長が短いことから、１６Ｓ ｒＲＮＡと比較してＲＮａｓｅの攻撃を受けにくく、より安定して分析ができる。また、ｓＲＮＡの細胞内でのコピー数は、多いものでは数千～数万のコピー数であるため、ｓＲＮＡの存在状態についての情報を感度よく得ることができる。本開示に係る判定方法では、生物から第二の溶液中へと抽出されたｓＲＮＡの存在状態を検出して、これを基に生物の存在状態を判定する。
＜生物＞
本開示に係る抽出方法及び本開示に係る判定方法における生物は特に限定されず、細胞壁を有する生物であっても、細胞壁を有しない生物であってもよい。生物の例としては、動物、植物、微生物等が挙げられる。
一つの実施形態では、前記生物は、任意の細胞壁を有する生物である。一般的には、動物細胞以外の細胞、例えば植物細胞、微生物細胞等は細胞壁を有している。つまり、前記細胞壁を有する生物は、植物であってもよい。前記細胞壁を有する生物は、酵母、粘菌、カビ等の真菌であっても、大腸菌等の細菌であってもよい。
抽出又は判定の対象物は、生物体全体である必要は無く、生物の部分、つまり、生物の細胞であってもよい。つまり、本開示に係る抽出方法及び本開示に係る判定方法における「生物」とは、生物個体全体の意味には限定されず、生物の部分、例えば生物の細胞をも包含する意味を有する。生物の部分においても、ｓＲＮＡは存在しており、また生物の部分の検出であっても生物の存在についての情報を与えるためである。前記生物の部分としては、多細胞生物の部分が挙げられ、例えば植物の花粉が挙げられる。ただし、生物の部分は、細胞の形状を維持している部分であることが好ましい。生物の部分が細胞の形状を維持していない場合には、第二の液体への浸漬前に、細胞内成分が既に周囲の媒体に流出しており、生物の部分を活性炭に吸着させても当該生物の部分はｓＲＮＡを含んでいない可能性があるためである。上記のとおり、本開示に係る抽出方法においては生物からｓＲＮＡを抽出することが記載され、本開示に係る判定方法においては生物の存在状態を判定することが記載されているが、ここでいう生物は、生物の部分も含む概念を表す。したがって、抽出された前記ｓＲＮＡあるいは判定された前記存在状態は、生物種又は生物種のグループについての情報を与えれば十分である。実際、例えば草本植物の検出の場合などは、試料中に含まれているのは生物体全体ではなくその一部であるのが一般的であろうが、本開示に係る抽出方法又は判定方法により、生物種又は生物種のグループの存在に関する抽出結果又は判定結果を得ることができる。このため、本開示に係る抽出方法及び判定方法における生物は植物であってもよく、この場合、試料に含まれる成分は例えば花粉であってもよい。
本開示に係る抽出方法及び本開示に係る判定方法における生物は特に限定されず、細胞壁を有する生物であっても、細胞壁を有しない生物であってもよい。生物の例としては、動物、植物、微生物等が挙げられる。
一つの実施形態では、前記生物は、任意の細胞壁を有する生物である。一般的には、動物細胞以外の細胞、例えば植物細胞、微生物細胞等は細胞壁を有している。つまり、前記細胞壁を有する生物は、植物であってもよい。前記細胞壁を有する生物は、酵母、粘菌、カビ等の真菌であっても、大腸菌等の細菌であってもよい。
抽出又は判定の対象物は、生物体全体である必要は無く、生物の部分、つまり、生物の細胞であってもよい。つまり、本開示に係る抽出方法及び本開示に係る判定方法における「生物」とは、生物個体全体の意味には限定されず、生物の部分、例えば生物の細胞をも包含する意味を有する。生物の部分においても、ｓＲＮＡは存在しており、また生物の部分の検出であっても生物の存在についての情報を与えるためである。前記生物の部分としては、多細胞生物の部分が挙げられ、例えば植物の花粉が挙げられる。ただし、生物の部分は、細胞の形状を維持している部分であることが好ましい。生物の部分が細胞の形状を維持していない場合には、第二の液体への浸漬前に、細胞内成分が既に周囲の媒体に流出しており、生物の部分を活性炭に吸着させても当該生物の部分はｓＲＮＡを含んでいない可能性があるためである。上記のとおり、本開示に係る抽出方法においては生物からｓＲＮＡを抽出することが記載され、本開示に係る判定方法においては生物の存在状態を判定することが記載されているが、ここでいう生物は、生物の部分も含む概念を表す。したがって、抽出された前記ｓＲＮＡあるいは判定された前記存在状態は、生物種又は生物種のグループについての情報を与えれば十分である。実際、例えば草本植物の検出の場合などは、試料中に含まれているのは生物体全体ではなくその一部であるのが一般的であろうが、本開示に係る抽出方法又は判定方法により、生物種又は生物種のグループの存在に関する抽出結果又は判定結果を得ることができる。このため、本開示に係る抽出方法及び判定方法における生物は植物であってもよく、この場合、試料に含まれる成分は例えば花粉であってもよい。
前記細胞壁を有する生物は、例えば、衛生管理の必要とされる現場（食品製造、医療、福祉、家庭等）において存在が衛生管理上の問題となりうる生物であってもよい。そのような生物としては、病原性微生物、腐敗微生物が挙げられる。病原性微生物は病原性真菌であってもよく、その例としては、白癬菌、カンジダ、アスペルギルス等が挙げられる。病原性微生物は病原性細菌であってもよく、その例としては、グラム陽性菌（例えばブドウ球菌、レンサ球菌、肺炎球菌、腸球菌、ジフテリア菌、結核菌、らい菌、炭疽菌、枯草菌、ウェルシュ菌、破傷風菌、ボツリヌス菌等）、グラム陰性菌（淋菌、脳膜炎菌、サルモネラ菌、大腸菌、緑膿菌、赤痢菌、インフルエンザ菌、百日咳菌、コレラ菌、腸炎ビブリオ菌、アシネトバクター、カンピロバクター、レジオネラ菌、ヘリコバクター等）等が挙げられる。病原性細菌はベロ毒素生産菌であってもよい。腐敗微生物としては、魚介類の場合、シュードモナス、マイクロコッカス、ビブリオ、フラボバクテリウム等の各属の細菌が、畜肉類の場合、シュードモナス、アクロモバクター、マイクロコッカス、フラボバクテリウム等の各属の細菌が、米飯及びめん類の場合、バチルス属の細菌が挙げられる。
ある実施形態においては、前記細胞壁を有する生物はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ、及びＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍからなる群より選ばれる少なくとも一種を含むことが好ましい。別のある実施形態においては、前記細胞壁を有する生物は植物を含み、前記植物はクロマツであってもよい。別のある実施形態においては、前記細胞壁を有する生物はベロ毒素生産菌を含む。
本開示に係る抽出方法及び判定方法においては細胞から第二の液体に抽出されたｓＲＮＡを用いるため、このような抽出を妨げるような物質を予め除去するための処理を行ってもよい。
＜試料＞
本開示に係る抽出方法又は本開示に係る判定方法において、生物と、ノニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、アミノ酸、オリゴペプチド、及びタンパク質からなる群より選択されるコーティング材でコーティングされた担体と、第一の液体を含む混合物を、試料とも称する。本開示に係る抽出方法における試料とは、抽出しようとする生物のｓＲＮＡの抽出に用いられる試料であり、本開示に係る判定方法における試料とは、検出しようとする生物の存在状態の判定に用いられる試料である。ｓＲＮＡの供給源となる生物を含む対象物又は生物の存在状態について判定したい対象物（以下、単に対象物とも称する）に生物が存在する場合に、試料も当該生物を含むように調製される限りは、試料について特に制限は無く、試料は対象物に特定コーティング材でコーティングされた担体を添加しただけの試料であっても、対象物から任意の処理により調製した調製物に特定コーティング材でコーティングされた担体を添加した試料であってもよい。対象物は、例えば、作業台の表面等の物体表面、食品等の物体自体、水道水等の液体、空気等の気体、生物種が不明な菌体、菌体培養液等である。作業をより簡便にする観点から、試料は対象物に特定コーティング材でコーティングされた担体を添加しただけの試料であることが好ましい。
本開示に係る抽出方法又は本開示に係る判定方法において、生物と、ノニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、アミノ酸、オリゴペプチド、及びタンパク質からなる群より選択されるコーティング材でコーティングされた担体と、第一の液体を含む混合物を、試料とも称する。本開示に係る抽出方法における試料とは、抽出しようとする生物のｓＲＮＡの抽出に用いられる試料であり、本開示に係る判定方法における試料とは、検出しようとする生物の存在状態の判定に用いられる試料である。ｓＲＮＡの供給源となる生物を含む対象物又は生物の存在状態について判定したい対象物（以下、単に対象物とも称する）に生物が存在する場合に、試料も当該生物を含むように調製される限りは、試料について特に制限は無く、試料は対象物に特定コーティング材でコーティングされた担体を添加しただけの試料であっても、対象物から任意の処理により調製した調製物に特定コーティング材でコーティングされた担体を添加した試料であってもよい。対象物は、例えば、作業台の表面等の物体表面、食品等の物体自体、水道水等の液体、空気等の気体、生物種が不明な菌体、菌体培養液等である。作業をより簡便にする観点から、試料は対象物に特定コーティング材でコーティングされた担体を添加しただけの試料であることが好ましい。
例えば、対象物としての液体の中に存在する生物からｓＲＮＡを抽出したい場合又は該生物の存在状態について判定したい場合には、当該液体に特定コーティング材でコーティングされた担体を添加しただけの試料を試料としてもよいし、当該液体に希釈等の処理を施したものに特定コーティング材でコーティングされた担体を添加した試料を試料としてもよい。なお、希釈と特定コーティング材でコーティングされた担体の添加はどちらが先でも、あるいは同時であってもよい。また、例えば対象物としての物体の表面（例えば作業台の表面）に存在する生物からｓＲＮＡを抽出したい場合又は対象物を当該生物について分析したい場合には、当該表面をワイプ、綿棒等で拭き、当該ワイプ、綿棒等、又はその一部を第一の液体に浸漬した後に当該ワイプ、綿棒等、又はその一部を取り除き、また該第一の液体に特定コーティング材でコーティングされた担体を添加することで試料としてもよい。なお、前記浸漬と特定コーティング材でコーティングされた担体の添加はどちらが先でも、あるいは同時であってもよい。当該ワイプ、綿棒等、又はその一部を取り除く操作は、該第一の液体に特定コーティング材でコーティングされた担体を添加する前であっても、後であっても、同時でもよい。
対象物としての物体の内部（例えば、食品の内部）に存在する生物からｓＲＮＡを抽出したい場合又は物体を当該生物について分析したい場合には、当該物体の全体又は一部を第一の液体に浸漬した後に当該物体を取り除き、また該第一の液体に特定コーティング材でコーティングされた担体を添加することで試料としてもよい。空気を対象物として、空気中に存在する生物からｓＲＮＡを抽出したい場合又は空気を当該生物について分析したい場合には、当該空気中に存在する空中浮遊物を収集して得られた対象物を、第一の液体に浸漬し、また該第一の液体に特定コーティング材でコーティングされた担体を添加することで試料としてもよい。なお、前記浸漬と特定コーティング材でコーティングされた担体の添加はどちらが先でも、あるいは同時であってもよい。該収集は、フィルタ、遠心分離（例えばサイクロン式分離）、単に容器を開放して静置しておくこと（例えば、シャーレ等の蓋を開けて静置しておくこと）等により行うことができる。
このように、試料は、例えば、対象物としての液体；該液体を希釈した希釈液；又は、対象物としての表面を拭いたワイプ、綿棒等、空気の濾過フィルタ上に捕集された捕集物、若しくは周囲雰囲気に開放された容器内に付着した付着物等、を第一の液体に浸漬して得られた液体に、特定コーティング材でコーティングされた担体を添加したものとすることができる。
なお試料に含まれる生物は、細胞壁及び細胞膜が破壊されていない細胞壁を有する生物、あるいは細胞膜が破壊されていない細胞壁を有しない生物を含むことが好ましい。つまり、前記試料は、細胞破砕処理、膜破壊処理等を受けていないことが好ましい。細胞壁あるいは細胞膜が破壊されていると、生物を担体に吸着させても、当該生物はｓＲＮＡを含んでいない可能性があるためである。なお、本開示に係る抽出方法及び本開示に係る判定方法においては、第二の液体へのｓＲＮＡの抽出までのプロセスにおいて、生物の細胞壁及び／又は細胞膜を破壊するような処理（細胞破砕処理、膜破壊処理等）を含まないことが好ましい。
＜担体＞
本開示に係る抽出方法及び本開示に係る判定方法における担体は、当業者が担体として用いているもののうち、生物、例えば細胞壁を有する生物、を吸着させることができる担体であれば特に制限されない。
本開示に係る抽出方法及び本開示に係る判定方法における担体は、当業者が担体として用いているもののうち、生物、例えば細胞壁を有する生物、を吸着させることができる担体であれば特に制限されない。
本開示に係る担体の粒径は、生物を吸着させることができれば特に限定されず、例えば、４メッシュの網ふるいに残留し４００メッシュの網ふるいを通過する（つまり目開き４７５０μｍの網ふるいを通過し３８μｍの網ふるいに残留する）、７メッシュの網ふるいに残留し１００メッシュの網ふるいを通過する（つまり目開き２８００μｍの網ふるいを通過し１５０μｍの網ふるいに残留する）、又は１０メッシュの網ふるいに残留し３２メッシュの網ふるいを通過する（つまり目開き１７００μｍの網ふるいを通過し５００μｍの網ふるいに残留する）等の粒径であってもよい。
本開示に係る担体のＢＥＴ比表面積は、生物を吸着させることができれば特に限定されず、例えば、５００ｍ２／ｇ～２，５００ｍ２／ｇ、又は１，０００ｍ２／ｇ～２，０００ｍ２／ｇ等のＢＥＴ比表面積であってもよい。
ＢＥＴ比表面積の測定方法は、流動式比表面積自動測定装置（株式会社島津製作所製「フローソーブＩＩＩ２３０５」）を使用し、装置の取扱説明書に従って測定する方法が挙げられる。測定対象とする担体は、２００℃で１５分加熱する前処理を行ってよい。
ＢＥＴ比表面積の測定方法は、流動式比表面積自動測定装置（株式会社島津製作所製「フローソーブＩＩＩ２３０５」）を使用し、装置の取扱説明書に従って測定する方法が挙げられる。測定対象とする担体は、２００℃で１５分加熱する前処理を行ってよい。
本開示に係る担体の平均孔径は、生物を吸着させることができれば特に限定されず、例えば、直径２０オングストローム以下、直径１０オングストローム～２００オングストローム、直径２０オングストローム～５００オングストローム、又は直径５００オングストローム以上等の平均孔径であってもよい。
平均孔径の測定方法は、担体を上面から走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）にて観察し、無作為に選択した５０個の空孔における孔径を測定し、その平均値を取ることによって算出することができる。
平均孔径の測定方法は、担体を上面から走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）にて観察し、無作為に選択した５０個の空孔における孔径を測定し、その平均値を取ることによって算出することができる。
本開示に係る第一の液体中における担体の濃度は、生物を吸着させることができれば特に限定されず、例えば、０．０１ｇ／ｍｌ～１００ｇ／ｍｌ、０．１ｇ／ｍｌ～７０ｇ／ｍｌ、１ｇ／ｍｌ～５０ｇ／ｍｌ、又は５ｇ／ｍｌ～４０ｇ／ｍｌ等の濃度であってもよい。
前記担体の例としては、活性炭、シリカ、ゼオライト、多孔性セラミックス、炭素繊維、砂、及びガラスビーズからなる群より選択される少なくとも一種が挙げられる。
前記活性炭の例としては、ヤシガラ又は石炭を原料として生産された活性炭が挙げられる。
前記担体は、粒状の担体であってもよく、粒状の担体がフィルタ又はカラム等の内部にセットされた状態の担体であってもよい。
前記活性炭の例としては、ヤシガラ又は石炭を原料として生産された活性炭が挙げられる。
前記担体は、粒状の担体であってもよく、粒状の担体がフィルタ又はカラム等の内部にセットされた状態の担体であってもよい。
＜コーティング材＞
本開示に係る抽出方法及び本開示に係る判定方法において、前述した担体は、コーティング材でコーティングされている。前記コーティング材は、ノニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、アミノ酸、オリゴペプチド、及びタンパク質からなる群より選択される。
本開示に係る抽出方法及び本開示に係る判定方法において、前述した担体は、コーティング材でコーティングされている。前記コーティング材は、ノニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、アミノ酸、オリゴペプチド、及びタンパク質からなる群より選択される。
ノニオン性界面活性剤とは、１分子中に親水性基と疎水性基を有し、水中でイオンに解離する基を有しない化合物を意味する。
本開示に係るノニオン性界面活性剤は、ヒドロキシ基を有していてもよく、ポリオールエステル系ノニオン性界面活性剤、アルカノールアミド型ノニオン性界面活性剤、アルキルグルコシド型ノニオン性界面活性剤、アルコキシレート型ノニオン性界面活性剤、又は脂肪酸アルキルエステル型ノニオン性界面活性剤であってもよい。前記ノニオン性界面活性剤は、具体的には、ポリソルベート２０（例えばＴｗｅｅｎ ２０）、ポリソルベート８０（例えばＴｗｅｅｎ ８０）、及びオクチルフェノールエトキシレート（例えばＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）からなる群より選択される少なくとも一種とすることができる。
本開示に係るノニオン性界面活性剤は、ヒドロキシ基を有していてもよく、ポリオールエステル系ノニオン性界面活性剤、アルカノールアミド型ノニオン性界面活性剤、アルキルグルコシド型ノニオン性界面活性剤、アルコキシレート型ノニオン性界面活性剤、又は脂肪酸アルキルエステル型ノニオン性界面活性剤であってもよい。前記ノニオン性界面活性剤は、具体的には、ポリソルベート２０（例えばＴｗｅｅｎ ２０）、ポリソルベート８０（例えばＴｗｅｅｎ ８０）、及びオクチルフェノールエトキシレート（例えばＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）からなる群より選択される少なくとも一種とすることができる。
以下に、ポリソルベート２０の構造式を示す。なお式中、ｗ、ｘ、ｙ、及びｚは整数を表し、ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚ＝２０である。
以下に、ポリソルベート８０の構造式を示す。なお式中、ｗ、ｘ、ｙ、及びｚは整数を表し、ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚ＝２０である。
以下に、オクチルフェノールエトキシレートの構造式を示す。なお式中、ｘは平均の重合度を表しており、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００では約９．５である。
カチオン性界面活性剤とは、１分子中に親水性基と疎水性基を有し、水中で電離してカチオンとなる化合物を意味する。
本開示に係るカチオン性界面活性剤は、アミン塩型カチオン性界面活性剤又は第４級アンモニウム塩型カチオン性界面活性剤であってもよい。前記カチオン性界面活性剤は、具体的には、ベンザルコニウム塩化物（例えばオスバン）及び臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）からなる群より選択される少なくとも一種とすることができる。
本開示に係るカチオン性界面活性剤は、アミン塩型カチオン性界面活性剤又は第４級アンモニウム塩型カチオン性界面活性剤であってもよい。前記カチオン性界面活性剤は、具体的には、ベンザルコニウム塩化物（例えばオスバン）及び臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）からなる群より選択される少なくとも一種とすることができる。
以下に、ベンザルコニウム塩化物の構造式を示す。なお式中、Ｒは、Ｃ８Ｈ１７～Ｃ１８Ｈ３７の炭化水素基を示す。
アニオン性界面活性剤とは、１分子中に親水性基と疎水性基を有し、水中で電離してアニオンとなる化合物を意味する。
本開示に係るアニオン性界面活性剤は、スルホサクシネート型アニオン性界面活性剤、スルホン酸塩型アニオン性界面活性剤、硫酸エステル型アニオン性界面活性剤、又は脂肪酸塩型アニオン性界面活性剤であってもよい。前記アニオン性界面活性剤は、具体的には、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）及び１－オクタンスルホン酸ナトリウムからなる群より選択される少なくとも一種とすることができる。
本開示に係るアニオン性界面活性剤は、スルホサクシネート型アニオン性界面活性剤、スルホン酸塩型アニオン性界面活性剤、硫酸エステル型アニオン性界面活性剤、又は脂肪酸塩型アニオン性界面活性剤であってもよい。前記アニオン性界面活性剤は、具体的には、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）及び１－オクタンスルホン酸ナトリウムからなる群より選択される少なくとも一種とすることができる。
アミノ酸とは、１分子内にアミノ基（－ＮＨ２）とカルボキシ基（－ＣＯＯＨ）とを有する化合物を意味する。
本開示に係るアミノ酸は、疎水性アミノ酸又は親水性アミノ酸であってもよく、酸性アミノ酸、塩基性アミノ酸、又は中性アミノ酸であってもよい。なお本開示において、疎水性アミノ酸とは、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、フェニルアラニン、バリン、アラニン、グリシン、プロリン、及びメチオニンからなる群から選ばれるアミノ酸を表す。親水性アミノ酸とは、セリン、トレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、及びシステインからなる群から選ばれるアミノ酸を表す。また、酸性アミノ酸とは、アスパラギン酸又はグルタミン酸を表す。塩基性アミノ酸とは、リジン、アルギニン、及びヒスチジンからなる群から選ばれるアミノ酸を表す。中性アミノ酸とは、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、及び前記疎水性アミノ酸に記載されたアミノ酸からなる群から選ばれるアミノ酸を表す。また、アミノ酸はα－アミノ酸であっても、β－アミノ酸であっても、それら以外のアミノ酸であってもよい。本開示に係るアミノ酸は、具体的には、例えばグリシンとすることができる。
本開示に係るアミノ酸は、疎水性アミノ酸又は親水性アミノ酸であってもよく、酸性アミノ酸、塩基性アミノ酸、又は中性アミノ酸であってもよい。なお本開示において、疎水性アミノ酸とは、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、フェニルアラニン、バリン、アラニン、グリシン、プロリン、及びメチオニンからなる群から選ばれるアミノ酸を表す。親水性アミノ酸とは、セリン、トレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、及びシステインからなる群から選ばれるアミノ酸を表す。また、酸性アミノ酸とは、アスパラギン酸又はグルタミン酸を表す。塩基性アミノ酸とは、リジン、アルギニン、及びヒスチジンからなる群から選ばれるアミノ酸を表す。中性アミノ酸とは、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、及び前記疎水性アミノ酸に記載されたアミノ酸からなる群から選ばれるアミノ酸を表す。また、アミノ酸はα－アミノ酸であっても、β－アミノ酸であっても、それら以外のアミノ酸であってもよい。本開示に係るアミノ酸は、具体的には、例えばグリシンとすることができる。
オリゴペプチドとは、１分子中にアミノ酸残基が鎖状に２～２０残基程度結合したポリマーを意味する。
本開示に係るオリゴペプチドは、１分子中にアミノ酸残基が鎖状に２～２０残基程度結合したポリマーであってもよく、１分子中にアミノ酸残基が鎖状に５～１５残基程度結合したポリマーであってもよく、１分子中にアミノ酸残基が鎖状に７～１３残基程度結合したポリマーであってもよい。
本開示に係るオリゴペプチドは、１分子中にアミノ酸残基が鎖状に２～２０残基程度結合したポリマーであってもよく、１分子中にアミノ酸残基が鎖状に５～１５残基程度結合したポリマーであってもよく、１分子中にアミノ酸残基が鎖状に７～１３残基程度結合したポリマーであってもよい。
タンパク質とは、１分子中にアミノ酸が鎖状に多数（例えば２１残基以上）連結してできた化合物を意味する。
本開示に係るタンパク質は、乳製品、粉乳、ゼラチン、ヘモグロビン、アルブミン、血清又は血漿であってもよい。前記タンパク質は、具体的には、脱脂粉乳（例えばスキムミルク）、及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）からなる群より選択される少なくとも一種とすることができる。
本開示に係るタンパク質は、乳製品、粉乳、ゼラチン、ヘモグロビン、アルブミン、血清又は血漿であってもよい。前記タンパク質は、具体的には、脱脂粉乳（例えばスキムミルク）、及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）からなる群より選択される少なくとも一種とすることができる。
前記特定コーティング材により担体をコーティングする方法は、担体と特定コーティング材を接触させ、担体の一部又は全部がコーティングされる方法であれば特に限定されない。なお、コーティングは、担体と特定コーティング材を接触させることにより行うことができるが、このような接触は例えば液体中に担体と特定コーティング材を共存させることで行ってもよい。特定コーティング材が担体表面に接触すると、特定コーティング材は担体表面に吸着される。コーティングにおいて、必ずしも担体の表面全部をコーティングする必要は無く、担体の一部がコーティングされれば、生物を担体へ吸着させ、かつ前記生物から放出されたｓＲＮＡの担体への吸着を低減することができる。
コーティングにおいて、担体の質量に対する特定コーティング材の質量は、０．０００１倍～１０倍の質量であってもよく、０．００１倍～５倍の質量であってもよく、０．０１倍～２倍の質量であってもよく、等倍の質量であってもよい。
なお特定コーティング材は、特定コーティング材を溶媒に溶解させた特定コーティング材溶液として、担体に接触させてもよい。このとき、担体の質量に対する特定コーティング材溶液の質量は、０．１倍～１０００倍の質量であってもよく、０．５倍～１００倍の質量であってもよく、１倍～１０倍の質量であってもよく、等倍の質量であってもよい。なおこのとき、担体の質量に対する特定コーティング材溶液中の特定コーティング材の質量は、０．０００１倍～１０倍の質量であってもよく、０．００１倍～５倍の質量であってもよく、０．０１倍～２倍の質量であってもよく、等倍の質量であってもよい。
なお特定コーティング材は、特定コーティング材を溶媒に溶解させた特定コーティング材溶液として、担体に接触させてもよい。このとき、担体の質量に対する特定コーティング材溶液の質量は、０．１倍～１０００倍の質量であってもよく、０．５倍～１００倍の質量であってもよく、１倍～１０倍の質量であってもよく、等倍の質量であってもよい。なおこのとき、担体の質量に対する特定コーティング材溶液中の特定コーティング材の質量は、０．０００１倍～１０倍の質量であってもよく、０．００１倍～５倍の質量であってもよく、０．０１倍～２倍の質量であってもよく、等倍の質量であってもよい。
担体と特定コーティング材とを接触させる温度は、室温で行っても加熱又は冷却しながら行ってもよい。担体又は特定コーティング材の変性をなるべく起こさないように、接触は０℃～５０℃の温度範囲内の温度で行うことが好ましく、４℃～４０℃の温度範囲内の温度で行うことがより好ましく、１０℃～４０℃の温度範囲内の温度で行うことがさらに好ましく、２０℃～４０℃の温度範囲内の温度で行うことがさらにより好ましく、２５℃～４０℃の温度範囲内の温度で行うことがさらにより好ましく、３０℃～３７℃の温度範囲内の温度で行うことがいっそう好ましい。接触は室温で行ってもよい。接触は加熱下で行ってもよい。
担体と特定コーティング材との接触時間は、担体の一部又は全部が特定コーティング材によってコーティングされる限りは、特に制限されない。その接触時間は、例えば１０秒～３０時間であり、１０秒～１０時間であってもよく、１．０分～５．０時間であってもよく、あるいは５．０分～１．０時間であってもよい。接触時間は、あるいは、０．５０時間～６．０時間であってもよく、０．７０時間～４．５時間であってもよく、０．８０時間～２．０時間であってもよい。担体と特定コーティング材とを接触させる時の状態は、静置であってもよく、振とうしながらであってもよく、攪拌しながらであってもよい。
前記特定コーティング材と接触させた担体は、さらに水洗してもよい。水洗の方法は、例えば、前記特定コーティング材と接触させた担体を含む懸濁液を、遠心分離し、上清を除去し、水を添加する、という一連の操作を１回～数回繰り返すのであってもよい。水洗に用いる水は、滅菌水、緩衝液、水道水、生理食塩水、又は後述する水性溶媒であってもよい。
前記特定コーティング材と接触させた担体は、さらに水洗してもよい。水洗の方法は、例えば、前記特定コーティング材と接触させた担体を含む懸濁液を、遠心分離し、上清を除去し、水を添加する、という一連の操作を１回～数回繰り返すのであってもよい。水洗に用いる水は、滅菌水、緩衝液、水道水、生理食塩水、又は後述する水性溶媒であってもよい。
前記特定コーティング材により担体をコーティングする方法は、例えば、担体としてのヤシガラ活性炭５０ｍｇと特定コーティング材としてのポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ ２０）の２％溶液１００μＬとを混合して、室温で１０分以上静置する方法であってもよい。このようにして得たポリソルベート２０でコーティングされた活性炭をさらに水洗してもよい。具体的には、静置後に、前記特定コーティング材と接触させた担体を含む懸濁液を１４０００ｒｐｍ（回転／分）で２分間遠心分離し、上清を除去した後に、さらに３００μＬの滅菌水を添加し、１４０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、上清を除去することで、水洗済みのコーティングされた担体を得てもよい。
＜第一の液体＞
本開示に係る抽出方法及び本開示に係る判定方法における第一の液体は、生物と、ノニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、アミノ酸、オリゴペプチド、及びタンパク質からなる群より選択される特定コーティング材でコーティングされた担体とが、共存する際に存在する液体である。本開示に係る抽出方法及び本開示に係る判定方法における第一の液体は、特に限定されないが、例えば、滅菌水、緩衝液、生理食塩水、生物の培養のための液体培地、又は、後述する水性溶媒であってもよい。第一の液体は、試料の調製過程によって決まり、例えばｓＲＮＡの供給源となる生物を含む対象物又は生物の存在状態について判定したい対象物が液体であって、特定コーティング材でコーティングされた担体を添加して用いる場合には当該対象物の液体部分ということになる。また、前記対象物が固体であって、第一の液体に浸漬させ、その前若しくはその後若しくはそれと同時に特定コーティング材でコーティングされた担体を添加して試料とする場合には、第一の液体として所望の液体を用いることができる。ｓＲＮＡを含む生物を効率的に吸着する観点からは、第一の液体は、生物の細胞壁及び細胞膜（細胞壁を有する生物の場合）あるいは生物の細胞膜（細胞壁を有しない生物の場合）を破壊しない液体であることが好ましい。
本開示に係る抽出方法及び本開示に係る判定方法における第一の液体は、生物と、ノニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、アミノ酸、オリゴペプチド、及びタンパク質からなる群より選択される特定コーティング材でコーティングされた担体とが、共存する際に存在する液体である。本開示に係る抽出方法及び本開示に係る判定方法における第一の液体は、特に限定されないが、例えば、滅菌水、緩衝液、生理食塩水、生物の培養のための液体培地、又は、後述する水性溶媒であってもよい。第一の液体は、試料の調製過程によって決まり、例えばｓＲＮＡの供給源となる生物を含む対象物又は生物の存在状態について判定したい対象物が液体であって、特定コーティング材でコーティングされた担体を添加して用いる場合には当該対象物の液体部分ということになる。また、前記対象物が固体であって、第一の液体に浸漬させ、その前若しくはその後若しくはそれと同時に特定コーティング材でコーティングされた担体を添加して試料とする場合には、第一の液体として所望の液体を用いることができる。ｓＲＮＡを含む生物を効率的に吸着する観点からは、第一の液体は、生物の細胞壁及び細胞膜（細胞壁を有する生物の場合）あるいは生物の細胞膜（細胞壁を有しない生物の場合）を破壊しない液体であることが好ましい。
上述のとおり、対象物が初めから液体の状態であれば、対象物に特定コーティング材でコーティングされた担体を添加することで試料とすることができるが、この場合は対象物の液体部分が第一の液体ということになる。例えば、水道水に特定コーティング材でコーティングされた担体を添加することで、水道水中における生物からｓＲＮＡを抽出する、又は水道水中における生物の存在状態を判定することができる。また、例えば、生物を培養した培養液に特定コーティング材でコーティングされた担体を添加することで、培養液中における生物からｓＲＮＡを抽出する、又は培養液中における生物の存在状態を判定することができる。対象物が生物を含む場合、上記の試料は第一の液体中に生物を含む。
対象物が液体ではあるものの、夾雑物が多い等の理由で前処理を行いたい場合には、夾雑物を濾過、遠心、透析等により除去する等の手法により少なくとも部分的に除去し、特定コーティング材でコーティングされた担体を添加することで試料を調製してもよい。例えば、泥水中の生物からｓＲＮＡを抽出又は泥水中の生物の存在状態を検査する場合、泥水中の泥を濾過等で除去してから、濾液（生物を含む）に特定コーティング材でコーティングされた担体を添加することで試料を調製し、生物からのｓＲＮＡの抽出又は生物の存在状態の判定を行うことができる。
第一の液体中において、生物とコーティングされた担体とがある程度の時間（例えば、後述の浸漬時間の例として例示した時間）接触するようにしておけば、前記生物は、前記コーティングされた担体に吸着する。
前記コーティングされた担体と前記生物とが第一の液体中で接触する操作である限りは、当該操作は前述の、前記コーティングされた担体と前記生物とを第一の液体中で共存させることに含まれる。コーティングされた担体と生物とを、第一の液体中で共存させる操作は、コーティングされた担体と生物とを第一の液体中で静置して又は撹拌等しながら、生物のコーティングされた担体への吸着のために人為的に経時させる操作であってもよい。
生物と特定コーティング材でコーティングされた担体とを第一の液体中で共存させることにより前記生物を前記コーティングされた担体に吸着させることは、生物が吸着したコーティングされた担体から第一の液体を部分的に又は完全に除去することを含んでいてもよい。例えば、生物と特定コーティング材でコーティングされた担体とを第一の液体中で所定時間共存させた後に、第一の液体を全量又は部分量除去してもよい。
コーティングされた担体が粒子状である場合、第一の液体を全量又は部分量除去することは、例えば、スピンダウン又は５００ｒｐｍ（回転／分）で３分程度の低速遠心分離等の後に、上清を取り除く操作であってもよい。
コーティングされた担体がフィルタ又はカラム等として装置の内部にセットされた状態である場合、試料にフィルタを通過させることは、それ自体、第一の液体を部分的に又は完全に除去することを含んでいる。前記コーティングされた担体は、試料を流し終わったら、装置の内部から取り出されてもよい。例えば、前記コーティングされた担体を単独で取り出してもよく、又は前記コーティングされた担体を含むフィルタ又はカラムを取り出してもよい。
第一の液体を部分的に又は完全に除去することにより、液量を減少させる、言い換えれば生物の濃度を上昇させることができる。また同時に、コーティングされた担体に吸着しなかった物質、例えば、夾雑物又は特定コーティング材の全量のうち吸着しなかった部分を除去することができる。このため、例えば、前記生物由来の高純度のｓＲＮＡを抽出するがより容易になりうる。
コーティングされた担体が粒子状である場合、第一の液体を全量又は部分量除去することは、例えば、スピンダウン又は５００ｒｐｍ（回転／分）で３分程度の低速遠心分離等の後に、上清を取り除く操作であってもよい。
コーティングされた担体がフィルタ又はカラム等として装置の内部にセットされた状態である場合、試料にフィルタを通過させることは、それ自体、第一の液体を部分的に又は完全に除去することを含んでいる。前記コーティングされた担体は、試料を流し終わったら、装置の内部から取り出されてもよい。例えば、前記コーティングされた担体を単独で取り出してもよく、又は前記コーティングされた担体を含むフィルタ又はカラムを取り出してもよい。
第一の液体を部分的に又は完全に除去することにより、液量を減少させる、言い換えれば生物の濃度を上昇させることができる。また同時に、コーティングされた担体に吸着しなかった物質、例えば、夾雑物又は特定コーティング材の全量のうち吸着しなかった部分を除去することができる。このため、例えば、前記生物由来の高純度のｓＲＮＡを抽出するがより容易になりうる。
＜第二の液体＞
本開示に係る抽出方法及び本開示に係る判定方法における第二の液体は、前記生物を吸着した前記コーティングされた担体を浸漬させ、前記生物由来のｓＲＮＡを前記第二の液体中に抽出するために用いられる。本開示に係る抽出方法及び本開示に係る判定方法における第二の液体は、特に限定されないが、一般的な核酸抽出溶媒であってもよく、後述する水性溶媒であってもよい。細胞膜を溶解させて、細胞内の核酸を迅速に放出させる観点からフェノール、グアニジン塩、水酸化ナトリウム等の強い変性剤を使うことも可能である。ただし、このような変性剤を用いた場合、その後に核酸増幅処理等を行おうとする場合には溶媒交換等の手間が必要となる。
本開示に係る抽出方法及び本開示に係る判定方法における第二の液体は、前記生物を吸着した前記コーティングされた担体を浸漬させ、前記生物由来のｓＲＮＡを前記第二の液体中に抽出するために用いられる。本開示に係る抽出方法及び本開示に係る判定方法における第二の液体は、特に限定されないが、一般的な核酸抽出溶媒であってもよく、後述する水性溶媒であってもよい。細胞膜を溶解させて、細胞内の核酸を迅速に放出させる観点からフェノール、グアニジン塩、水酸化ナトリウム等の強い変性剤を使うことも可能である。ただし、このような変性剤を用いた場合、その後に核酸増幅処理等を行おうとする場合には溶媒交換等の手間が必要となる。
本開示に係る抽出方法及び本開示に係る判定方法における第二の液体は、前述の第一の液体と同じであっても異なっていてもよい。つまり、第一の液体を共存に用いた後、該第一の液体を除去せず又は部分的に除去して、該第一の液体をそのまま第二の液体として（つまり溶媒交換せず）浸漬に用いてもよい。又は、第一の液体を共存に用いた後、該第一の液体を部分量又は全量除去して、新たに準備した第一の液体を添加して浸漬に用いてもよい。又は、第一の液体を共存に用いた後、該第一の液体を部分量又は全量除去して、該第一の液体の組成とは異なる組成である第二の液体を添加して浸漬に用いてもよい。第一の液体を除去する場合には、全量除去した方が溶媒交換の観点からは好ましい。とはいえ、第一の液体を完全に全量除去することは操作上困難であるので、ここでいう「全量」は、操作の技術的制約により除去しきれない微量の第一の液体の残存を許容する概念である。
生物と、特定コーティング材でコーティングされた担体とを、第一の液体中で共存させることと、前記生物を吸着した前記コーティングされた担体を、前記第一の液体と同じであっても異なっていてもよい第二の液体中に浸漬することとは、同じ処理の中で起こっても、別々の処理として行われてもよい。なお本開示に係る抽出方法及び本開示に係る判定方法における第一の液体中での共存及び吸着の後は、第一の液体の一部又は全部を除去し、その後に、前記第一の液体と同じ組成であっても異なる組成であってもよい第二の液体による浸漬及び抽出を行うことが、夾雑物を除去しｓＲＮＡ抽出用の溶媒の選択肢が広がる観点から好ましい。第一の液体の一部又は全部を除去する方法は、例えば遠心分離又は自然沈降させた後に、上清を除去する等の方法でもよい。
さらには、本開示に係る判定方法において、第二の液体による抽出の後は、前記生物を吸着した前記コーティングされた担体の一部又は全部を除去し、その後に第二の液体を用いてｓＲＮＡの存在状態を検出することが好ましい。ｓＲＮＡの存在状態の検出において、前記生物を吸着した前記コーティングされた担体は、検出のための反応系にとって夾雑物となりえるからである。前記生物を吸着した前記コーティングされた担体の一部又は全部を除去する方法は、例えばフィルタ濾過する等の方法でもよい。
生物と、特定コーティング材でコーティングされた担体とを、第一の液体中で共存させることと、前記生物を吸着した前記コーティングされた担体を、前記第一の液体と同じであっても異なっていてもよい第二の液体中に浸漬することとは、同じ処理の中で起こっても、別々の処理として行われてもよい。なお本開示に係る抽出方法及び本開示に係る判定方法における第一の液体中での共存及び吸着の後は、第一の液体の一部又は全部を除去し、その後に、前記第一の液体と同じ組成であっても異なる組成であってもよい第二の液体による浸漬及び抽出を行うことが、夾雑物を除去しｓＲＮＡ抽出用の溶媒の選択肢が広がる観点から好ましい。第一の液体の一部又は全部を除去する方法は、例えば遠心分離又は自然沈降させた後に、上清を除去する等の方法でもよい。
さらには、本開示に係る判定方法において、第二の液体による抽出の後は、前記生物を吸着した前記コーティングされた担体の一部又は全部を除去し、その後に第二の液体を用いてｓＲＮＡの存在状態を検出することが好ましい。ｓＲＮＡの存在状態の検出において、前記生物を吸着した前記コーティングされた担体は、検出のための反応系にとって夾雑物となりえるからである。前記生物を吸着した前記コーティングされた担体の一部又は全部を除去する方法は、例えばフィルタ濾過する等の方法でもよい。
第二の液体中には、上記の生物を吸着した、コーティングされた担体以外の共在成分を含まないことも、好ましい実施形態である。生物が第二の液体とある程度の時間（例えば、後述の浸漬時間の例として例示した時間）接触するようにしておけば、前記生物からｓＲＮＡの漏出が起こり、後述の浸漬を行った場合と同様に、第二の液体中にｓＲＮＡが抽出される。
前記生物を吸着した前記コーティングされた担体が第二の液体に接触する操作である限りは、当該操作は前述の、前記生物を吸着した前記コーティングされた担体を第二の液体中に浸漬することに含まれる。前記生物を吸着した前記コーティングされた担体を第二の液体中に浸漬する場合、操作は、前記生物を吸着した前記コーティングされた担体を浸漬させた第二の液体を静置して又は撹拌等しながら、ｓＲＮＡの抽出のために人為的に経時させる操作であってもよい。
＜水性溶媒＞
本開示に係る抽出方法及び本開示に係る判定方法における第二の液体は、水性溶媒であってもよい。
本開示に係る抽出方法及び本開示に係る判定方法における水性溶媒は、水を主体とする液体であって、水性溶媒は純水そのものでもよく、細胞膜の変性を生じさせない限りは水に加えて他の成分（以下、「共在成分」とも称する）を含む水溶液であってもよい。水性溶媒における、水以外の溶媒成分の含有量はなるべく少ない方が好ましく、水以外の溶媒成分の量は水の量に対して１質量％以下、０．１質量％以下、０．０１質量％以下、０．００１質量％以下、又は０質量％（つまり、溶媒成分としては水のみを含む）としてもよい。また、本開示において、「水性溶媒」は細胞膜を変性させて膜を破壊する成分は含まないか、細胞膜の変性を引き起こさない程度の少量のみ含む。言い換えると、水性溶媒は細胞膜の変性を引き起こさないという点で水と共通した基本的な性質を有しており、この基本的な性質を損なわない限りにおいて共在成分を含むことができる溶媒である。このため、本開示に係る水性溶媒には、細胞膜を破壊して細胞内成分を取り出すための抽出液（例えば、２０１３－９３号公報で言及されている細胞成分抽出液ＥＸＴＲＡＧＥＮ（トーソー株式会社製））は含まれない。
本開示に係る抽出方法及び本開示に係る判定方法における第二の液体は、水性溶媒であってもよい。
本開示に係る抽出方法及び本開示に係る判定方法における水性溶媒は、水を主体とする液体であって、水性溶媒は純水そのものでもよく、細胞膜の変性を生じさせない限りは水に加えて他の成分（以下、「共在成分」とも称する）を含む水溶液であってもよい。水性溶媒における、水以外の溶媒成分の含有量はなるべく少ない方が好ましく、水以外の溶媒成分の量は水の量に対して１質量％以下、０．１質量％以下、０．０１質量％以下、０．００１質量％以下、又は０質量％（つまり、溶媒成分としては水のみを含む）としてもよい。また、本開示において、「水性溶媒」は細胞膜を変性させて膜を破壊する成分は含まないか、細胞膜の変性を引き起こさない程度の少量のみ含む。言い換えると、水性溶媒は細胞膜の変性を引き起こさないという点で水と共通した基本的な性質を有しており、この基本的な性質を損なわない限りにおいて共在成分を含むことができる溶媒である。このため、本開示に係る水性溶媒には、細胞膜を破壊して細胞内成分を取り出すための抽出液（例えば、２０１３－９３号公報で言及されている細胞成分抽出液ＥＸＴＲＡＧＥＮ（トーソー株式会社製））は含まれない。
ただし、水性溶媒は、１価又は２価の直鎖、分枝鎖又は脂環式のＣ２～Ｃ８アルコール、及びアセトンについては、これらの総量で６５質量％以下含んでいてもよい。このような量での特定の種類のアルコールの添加は、ｓＲＮＡの水性溶媒への抽出効率を上昇させうる。具体的には、１価又は２価の直鎖、分枝鎖又は脂環式のＣ２～Ｃ８アルコール、及びアセトンそれぞれの含有量としては、水性溶媒の全量に対して６５質量％以下であり、６０質量％以下であってもよく、５５質量％以下であってもよく、５０質量％以下であってもよく、４０質量％以下であってもよく、３０質量％以下であってもよく、２０質量％以下であってもよく、１０質量％以下であってもよく、あるいは５．０質量％以下であってもよい。
前記水性溶媒中における１価又は２価の直鎖、分枝鎖又は脂環式のＣ２～Ｃ８アルコールの含有量の範囲の下限値は特に限定されず、０質量％（非含有）でもよい。前記水性溶媒中における１価又は２価の直鎖、分枝鎖又は脂環式のＣ２～Ｃ８アルコールの含有量は０．５質量％以上であってもよく、１．０質量％以上であってもよく、５．０質量％以上であってもよく、１０質量％以上であってもよく、２０質量％以上であってもよく、４０質量％以上であってもよい。上記の上限値と下限値の値は、任意に組み合わせて数値範囲を形成してよい。
水性溶媒が、１価又は２価の直鎖、分枝鎖又は脂環式のＣ２～Ｃ８アルコール、及びアセトンのうち２種類以上を含む場合、これらの合計量も上記範囲内にあることが好ましい。
前記水性溶媒中における１価又は２価の直鎖、分枝鎖又は脂環式のＣ２～Ｃ８アルコールの含有量の範囲の下限値は特に限定されず、０質量％（非含有）でもよい。前記水性溶媒中における１価又は２価の直鎖、分枝鎖又は脂環式のＣ２～Ｃ８アルコールの含有量は０．５質量％以上であってもよく、１．０質量％以上であってもよく、５．０質量％以上であってもよく、１０質量％以上であってもよく、２０質量％以上であってもよく、４０質量％以上であってもよい。上記の上限値と下限値の値は、任意に組み合わせて数値範囲を形成してよい。
水性溶媒が、１価又は２価の直鎖、分枝鎖又は脂環式のＣ２～Ｃ８アルコール、及びアセトンのうち２種類以上を含む場合、これらの合計量も上記範囲内にあることが好ましい。
１価の直鎖、分枝鎖又は脂環式のＣ２～Ｃ８アルコールは、１価の直鎖、分枝鎖又は脂環式のＣ２～Ｃ５アルコールであることが好ましく、１価の直鎖、分枝鎖又は脂環式のＣ２～Ｃ４アルコールであることがより好ましい。１価の直鎖、分枝鎖又は脂環式のＣ２～Ｃ８アルコールの例としては、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、２－メチル－２－プロパノール、１－ペンタノール、２－ペンタノール、３－ペンタノール、２－メチル－１－ブタノール、２－メチル－２－ブタノール、３－メチル－１－ブタノール、３－メチル－２－ブタノール、２，２－ジメチル－１－プロパノールが挙げられる。
２価の直鎖、分枝鎖又は脂環式のＣ２～Ｃ８アルコールは、２価の直鎖、分枝鎖又は脂環式のＣ２～Ｃ６アルコールであることが好ましく、２価の直鎖、分枝鎖又は脂環式のＣ２～Ｃ４アルコールであることがより好ましい。２価の直鎖、分枝鎖又は脂環式のＣ２～Ｃ８アルコールの例としては、１，２－エタンジオール、１，２－プロパンジオール、１，３－プロパンジオール、１，２－ブタンジオール、１，３－ブタンジオール、１，４－ブタンジオール、２，３－ブタンジオールが挙げられる。
これらの１価又は２価の直鎖、分枝鎖又は脂環式のＣ２～Ｃ８アルコールの１種類又は複数種類を任意に選択して用いることができる。
２価の直鎖、分枝鎖又は脂環式のＣ２～Ｃ８アルコールは、２価の直鎖、分枝鎖又は脂環式のＣ２～Ｃ６アルコールであることが好ましく、２価の直鎖、分枝鎖又は脂環式のＣ２～Ｃ４アルコールであることがより好ましい。２価の直鎖、分枝鎖又は脂環式のＣ２～Ｃ８アルコールの例としては、１，２－エタンジオール、１，２－プロパンジオール、１，３－プロパンジオール、１，２－ブタンジオール、１，３－ブタンジオール、１，４－ブタンジオール、２，３－ブタンジオールが挙げられる。
これらの１価又は２価の直鎖、分枝鎖又は脂環式のＣ２～Ｃ８アルコールの１種類又は複数種類を任意に選択して用いることができる。
本開示によれば、前記生物が細胞壁を有する生物であり、第二の液体が水性溶媒である場合であっても、ｓＲＮＡの抽出が可能である。
ｓＲＮＡは微生物の細胞膜によって細胞内に閉じ込められており、直接的に測定することが困難であると考えられていた。ｓＲＮＡを解析するには、フェノール、グアニジン塩、水酸化ナトリウム等の強い変性剤（細胞膜を変性させる程度に強い変性剤）で細胞膜を変性させて核酸を取り出し、さらに変性剤を除去又は中和する操作が必要となると考えられていた。これは、実際、微生物のＤＮＡ及び１６Ｓ ｒＲＮＡを細胞外に取り出すには、水酸化ナトリウム等の強い変性剤（細胞膜を変性させる程度に強い変性剤）で細胞膜を変性させることが必要であって、強い変性剤を用いない場合にはＤＮＡ及び１６Ｓ ｒＲＮＡを取り出すことは出来なかったためである。このように、従来の核酸抽出法においては、変性剤で処理する操作と、変性剤を除去又は中和する操作に手間がかかるため、操作が煩雑となり、簡便ではない。
ｓＲＮＡは微生物の細胞膜によって細胞内に閉じ込められており、直接的に測定することが困難であると考えられていた。ｓＲＮＡを解析するには、フェノール、グアニジン塩、水酸化ナトリウム等の強い変性剤（細胞膜を変性させる程度に強い変性剤）で細胞膜を変性させて核酸を取り出し、さらに変性剤を除去又は中和する操作が必要となると考えられていた。これは、実際、微生物のＤＮＡ及び１６Ｓ ｒＲＮＡを細胞外に取り出すには、水酸化ナトリウム等の強い変性剤（細胞膜を変性させる程度に強い変性剤）で細胞膜を変性させることが必要であって、強い変性剤を用いない場合にはＤＮＡ及び１６Ｓ ｒＲＮＡを取り出すことは出来なかったためである。このように、従来の核酸抽出法においては、変性剤で処理する操作と、変性剤を除去又は中和する操作に手間がかかるため、操作が煩雑となり、簡便ではない。
以上のような状況を考慮して、本願発明者は鋭意研究の結果、細胞壁を有する生物の細胞を水、又は水に加えて細胞変性作用を大きくは上昇させない程度の追加成分を含む水溶液中に細胞壁を有する生物の細胞を浸漬することにより、細胞中のｓＲＮＡを抽出することができることを見出した。この知見は驚くべきものである。なぜなら、細胞壁を有さない生物の細胞については、細胞を低張液に浸漬させると、浸透圧によって細胞膜が破裂して、上述の変性剤を用いなくとも周辺環境中にＤＮＡ及び１６Ｓ ｒＲＮＡを取り出すことができる可能性がある一方、これまでの技術常識からすれば、細胞壁を有する生物の細胞についてはこのような手法は適用できないからである。より具体的には、細胞壁を有する生物の細胞は、細胞壁によって構造が維持されるため、周辺環境の浸透圧の変化によって細胞膜が破裂することがなく、溶菌しにくい。このため、これまでの技術常識からすれば、上述の細胞膜の変性操作無くしては、細胞壁を有する生物の細胞内に存在する核酸を周辺環境中に放出させることは困難であると考えられる。このため、水中への浸漬によって細胞壁を有する生物の細胞からｓＲＮＡを細胞外に抽出できることは驚くべきことである。
このように、従来からｓＲＮＡの存在自体は知られていたものの、ｓＲＮＡは強い変性剤を用いなければ細胞壁を有する細胞の外に取り出すことはできないと考えられていた。しかし、本開示においては、驚くべきことに、細胞壁を有する細胞が水性溶媒中に置かれた場合、強い変性剤などで細胞膜を破壊しなくても細胞内のｓＲＮＡは細胞周囲の水性溶媒中に抽出される（つまり、水性溶媒中へと漏出する）ことが見出された。当該抽出は室温でも可能である。水性溶媒中に抽出されたｓＲＮＡは、関心のある特定の生物の存在の検出や、測定試料中に存在する生物の種類の同定に用いることができる。このため、水性溶媒によるｓＲＮＡの抽出を用いれば、手間をかけることなく簡便に、関心のある細胞壁のある生物からｓＲＮＡを検出できる。
水性溶媒のｐＨは、強酸性又は強アルカリ性の条件における細胞膜の変性を防ぐ観点から、ｐＨ５～ｐＨ９の範囲内のｐＨであることが好ましく、ｐＨ６～ｐＨ８の範囲内のｐＨであることがより好ましく、ｐＨ６．５～ｐＨ７．５の範囲内のｐＨであることがさらに好ましい。水性溶媒は、上記のとおり水以外に共在成分を含んでいてもよい。共在成分の総含有量は、水性溶媒の全量に対して３０質量％以下、１０質量％以下、１質量％以下、０．１質量％以下、０．０１質量％以下、又は０．００１質量％以下であってもよい。水性溶媒に含まれていてもよい共在成分の例としては、塩、緩衝剤、界面活性剤、ＤＴＴ、ＲＮａｓｅ阻害剤等が挙げられる。ｓＲＮＡは鎖長が短いことから、１６Ｓ ｒＲＮＡ等のより長いＲＮＡと比較してＲＮａｓｅの攻撃を受けにくいが、ＤＴＴやＲＮａｓｅ阻害剤といったＲＮＡ安定化剤を共存させることによってｓＲＮＡをより安定化することができる。
水性溶媒は、共在成分を、細胞膜を変性させて膜を破壊する量では含まない。また、細胞膜の変性を防ぐ観点から、水性溶媒はフェノール、グアニジン、上述の１価又は２価の直鎖、分枝鎖又は脂環式のＣ２～Ｃ８アルコール以外のアルコール、イオン性界面活性剤、及びＮａＯＨなどの強アルカリは含まないことが好ましい。水性溶媒がフェノール、グアニジン、上述の１価又は２価の直鎖、分枝鎖又は脂環式のＣ２～Ｃ８アルコール以外のアルコール、イオン性界面活性剤、及びＮａＯＨなどの強アルカリ等の変性成分を含む場合には、その総含有量は、水性溶媒の全量に対して０．１質量％以下であることが好ましく、０．０１質量％以下であることが好ましく、０．００１質量％以下であることがさらに好ましい。強アルカリ等の変性成分を含まないか、含んでいても含有量が上記範囲内である場合、第二の液体による浸漬後にさらなる処理のためにこれら変性成分を取り除くための追加の処理を行うことが不要となり、ｓＲＮＡの抽出又は生物の存在状態の判定がより簡便に行える。変性成分を含まないこと、又は含んでいても上記の含有量範囲内であることはこの観点からも、好ましい。
界面活性剤は、その種類及び量によっては細胞膜を変性及び破壊するため、水性溶媒が界面活性剤を含む場合にはその種類及び量を制限する必要がある。水性溶媒の表面張力は２０℃において５０ｍＮ／ｍ～７２．８ｍＮ／ｍ（水の表面張力）であることが好ましく、６０ｍＮ／ｍ～７２．８ｍＮ／ｍであることがより好ましく、６５ｍＮ／ｍ～７２．８ｍＮ／ｍであることがさらに好ましく、７０ｍＮ／ｍ～７２．８ｍＮ／ｍであることがいっそう好ましい。水性溶媒が界面活性剤を含む場合には、該界面活性剤はノニオン性界面活性剤であることが好ましく、ノニオン性界面活性剤の例としてはポリソルベート２０又はポリソルベート８０（例えばＴｗｅｅｎ ２０又はＴｗｅｅｎ ８０等のＴｗｅｅｎシリーズの界面活性剤）、ＮＰ－４０（ノニルフェノールエトキシレート）、及びオクチルフェノールエトキシレート（例えばＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００等のＴｒｉｔｏｎシリーズの界面活性剤）等が挙げられる。
水性溶媒の性質を純水に近いものとする観点からは、水性溶媒中の塩濃度は、０ｍｏｌ／Ｌ～０．２ｍｏｌ／Ｌであることが好ましく、０ｍｏｌ／Ｌ～０．１ｍｏｌ／Ｌであることがより好ましく、０ｍｏｌ／Ｌ～０．０５ｍｏｌ／Ｌであることがさらに好ましい。
共在成分は、溶媒成分である必要は無く、水中に懸濁する微粒子、水溶性物質等であってもよい。また、水性溶媒は、核酸増幅用試薬を共在成分として含んでいてもよい。前記核酸増幅用試薬は、ポリメラーゼ、ヌクレオチド３リン酸（ｄＮＴＰの混合物）、プライマー、Ｍｇ２＋イオン等を含む、核酸の増幅に必要な試薬である。前記核酸増幅用試薬は、ＲＮＡを鋳型にＤＮＡ鎖を合成できる活性（逆転写活性）を有するポリメラーゼを含んでいることが好ましい。核酸増幅用試薬にはＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００等の弱い界面活性剤（特にノニオン性界面活性剤）が含まれる場合があるが、核酸増幅用試薬用の濃度では、細胞を変性させて膜を破壊することはないので、核酸増幅用試薬中の界面活性剤はそのまま水性溶媒に含まれてもよい。例えば、水性溶媒がＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含む場合には、細胞膜の変性を防ぐ観点及び核酸増幅を効率的に行う観点から、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の含有量は水性溶媒の全量に対して０．０１質量％～５質量％であることが好ましく、０．０５質量％～３質量％であることがより好ましく、０．１質量％～２質量％であることがさらに好ましい。核酸増幅用試薬は、例えば、ＰＣＲ用の試薬、等温遺伝子増幅用の試薬等であってもよい。水性溶媒に核酸増幅用試薬を含ませることによって、細胞から漏出したｓＲＮＡを含む第二の液体を用いて、試薬添加操作や温度サイクル操作を行うことなく、そのまま核酸増幅を行うことが可能となる。
なお、上記では生物が細胞壁を有する生物である場合を中心に水性溶媒の使用を記載したが、水性溶媒は、細胞壁を有しない生物からｓＲＮＡを抽出するために用いても構わない。
なお、上記では生物が細胞壁を有する生物である場合を中心に水性溶媒の使用を記載したが、水性溶媒は、細胞壁を有しない生物からｓＲＮＡを抽出するために用いても構わない。
水性溶媒中における溶媒以外の共在成分の例としては、水性溶媒の全量に対して５．０質量％以下のノニオン性界面活性剤、水性溶媒の全量に対して１．０質量％以下の抗菌ペプチド、及び１．０Ｍ以下の還元剤も挙げられる。ノニオン性界面活性剤は、１分子中に親水性基と疎水性基を有し、水中でイオンに解離する基を有しない化合物である。ノニオン性界面活性剤は、ヒドロキシ基を有していてもよく、例えば、親水性のポリオキシアルキレン（ポリオキシプロピレン、ポリオキシエチレン等）鎖部分と、アルキル、アリール、アルキレン、アリーレン等の疎水性部分を有する化合物であってもよい。あるいは、ノニオン性界面活性剤は、ポリオールエステル系、アルカノールアミド型、アルキルグルコシド、アルコキシレート型、又は脂肪酸アルキルエステル型であってもよい。より具体的には、ポリオキシエチレンアルキルエーテル型、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル型等であってもよい。前記ノニオン性界面活性剤は、具体的には、ポリソルベート２０（例えばＴｗｅｅｎ ２０）、ポリソルベート８０（例えばＴｗｅｅｎ ８０）、ノニルフェノールエトキシレート（ＮＰ－４０）、オクチルフェノールエトキシレート（例えばＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）、及びポリ(エチレングリコール)-block-ポリ(プロピレングリコール)-block-ポリ(エチレングリコール)（例えば、Ｓｙｎｐｅｒｏｉｎｃ Ｆ１０８）からなる群より選択される少なくとも一種類を含んでいてもよい。
前記水性溶媒中におけるノニオン性界面活性剤の含有量は、細胞壁を有する生物の細胞膜へのダメージを低減する観点から、水性溶媒の全量に対して５．０質量％以下である。前記水性溶媒中におけるノニオン性界面活性剤の含有量は、水性溶媒の全量に対して４．０質量％以下であってもよく、３．０質量％以下であってもよく、２．０質量％以下であってもよく、あるいは１．５質量％以下であってもよい。
前記水性溶媒中におけるノニオン性界面活性剤の含有量の範囲の下限値は特に限定されず、０質量％（非含有）でもよい。前記水性溶媒中におけるノニオン性界面活性剤の含有量は０．０１質量％以上であってもよく、０．１質量％以上であってもよく、０．３質量％以上であってもよく、０．５質量％以上であってもよく、０．７質量％以上であってもよい。上記の上限値と下限値の値は、任意に組み合わせて数値範囲を形成してよい。
前記水性溶媒中におけるノニオン性界面活性剤の含有量の範囲の下限値は特に限定されず、０質量％（非含有）でもよい。前記水性溶媒中におけるノニオン性界面活性剤の含有量は０．０１質量％以上であってもよく、０．１質量％以上であってもよく、０．３質量％以上であってもよく、０．５質量％以上であってもよく、０．７質量％以上であってもよい。上記の上限値と下限値の値は、任意に組み合わせて数値範囲を形成してよい。
前記抗菌ペプチドは、当業界で知られた抗菌ペプチドであれば特に限定されない。抗菌性ペプチドは、基本的には、親水性の面と、疎水性の面とを有する両親媒性のペプチドであって、これにより細胞膜に存在することが可能である。抗菌ペプチドの例としては、陰イオン性ペプチドであるマクシミンＨ５及びダームシジン；システイン残基を含まない直鎖陽イオン性α-ヘリックスペプチドであるセクロピン、アンドロピン、モリシン、セラトトキシン、メリチン、マガイニン（マガイニンＩ及びマガイニンＩＩ）, デルマセプチン、ボンビニン、ブレビニン－１、エスクレチン、ブフォリンＩＩ、ＣＡＰ１８、及びＬＬ３７；プロリン、アルギニン、フェニルアラニン、及びトリプトファンのうち一つ以上に富む陽イオン性ペプチドであるアバエシン、アピダエシン、プロフェニン、インドリシジン；並びに、ジスルフィド結合を含むブレビニン、プロテグリン、タキプレシン、ディフェンシン、及びドロソマイシンが挙げられる。当業界で知られた抗菌ペプチドの１種類又は複数種類を任意に選択して用いることができる。
前記水性溶媒中における抗菌ペプチドの含有量は、細胞壁を有する生物の細胞膜へのダメージを低減する観点から、水性溶媒の全量に対して１．０質量％以下である。前記水性溶媒中における抗菌ペプチドの含有量は、水性溶媒の全量に対して０．８質量％以下であってもよく、０．５質量％以下であってもよく、０．２質量％以下であってもよく、あるいは０．１５質量％以下であってもよい。
前記水性溶媒中における抗菌ペプチドの含有量の範囲の下限値は特に限定されず、０質量％（非含有）でもよい。前記水性溶媒中における抗菌ペプチドの含有量は０．００１質量％以上であってもよく、０．００５質量％以上であってもよく、０．０１質量％以上であってもよく、０．０５質量％以上であってもよく、０．０７質量％以上であってもよい。上記の上限値と下限値の値は、任意に組み合わせて数値範囲を形成してよい。
前記水性溶媒中における抗菌ペプチドの含有量の範囲の下限値は特に限定されず、０質量％（非含有）でもよい。前記水性溶媒中における抗菌ペプチドの含有量は０．００１質量％以上であってもよく、０．００５質量％以上であってもよく、０．０１質量％以上であってもよく、０．０５質量％以上であってもよく、０．０７質量％以上であってもよい。上記の上限値と下限値の値は、任意に組み合わせて数値範囲を形成してよい。
前記還元剤は、当業界で知られた還元剤であれば特に限定されない。還元剤の例としては、シュウ酸 、ギ酸、没食子酸、アスコルビン酸、β－メルカプトエタノール、及びジチオトレイトールが挙げられる。還元剤はメルカプト基を有する還元剤であることが好ましく、例えばβ－メルカプトエタノール又はジチオトレイトールであってもよい。還元剤として、当業界で知られた還元剤の１種類又は複数種類を任意に選択して用いることができる。
前記水性溶媒中における還元剤の濃度は、細胞壁を有する生物の細胞膜へのダメージを低減する観点から、１．０Ｍ以下である。前記水性溶媒中における還元剤の濃度は、０．８Ｍ以下であってもよく、０．５Ｍ以下であってもよく、０．２Ｍ以下であってもよく、あるいは０．１５Ｍ以下であってもよい。
前記水性溶媒中における還元剤の濃度の範囲の下限値は特に限定されず、０Ｍ（非含有）でもよい。前記水性溶媒中における還元剤の濃度は０．００１Ｍ以上であってもよく、０．００５Ｍ以上であってもよく、０．０１Ｍ以上であってもよく、０．０５Ｍ以上であってもよく、０．０７Ｍ以上であってもよい。上記の上限値と下限値の値は、任意に組み合わせて数値範囲を形成してよい。
前記水性溶媒中における還元剤の濃度の範囲の下限値は特に限定されず、０Ｍ（非含有）でもよい。前記水性溶媒中における還元剤の濃度は０．００１Ｍ以上であってもよく、０．００５Ｍ以上であってもよく、０．０１Ｍ以上であってもよく、０．０５Ｍ以上であってもよく、０．０７Ｍ以上であってもよい。上記の上限値と下限値の値は、任意に組み合わせて数値範囲を形成してよい。
＜共存＞
本開示に係る抽出方法及び本開示に係る判定方法における生物と、特定コーティング材でコーティングされた担体とを、第一の液体中で共存させることは、室温で行っても加熱又は冷却しながら行ってもよい。細胞膜の変性をなるべく起こさないように、共存は０℃～５０℃の温度範囲内の温度で行うことが好ましく、４℃～４０℃の温度範囲内の温度で行うことがより好ましく、１０℃～４０℃の温度範囲内の温度で行うことがさらに好ましく、２０℃～４０℃の温度範囲内の温度で行うことがさらにより好ましく、２５℃～４０℃の温度範囲内の温度で行うことがさらにより好ましく、３０℃～３７℃の温度範囲内の温度で行うことがいっそう好ましい。生物と、特定コーティング材でコーティングされた担体とを、第一の液体中で共存させることは室温で行ってもよい。生物と、特定コーティング材でコーティングされた担体とを、第一の液体中で共存させることは加熱下で行ってもよい。
生物と、特定コーティング材でコーティングされた担体とを、第一の液体中で共存させる時間は、生物が、十分な量、特定コーティング材でコーティングされた担体へ吸着する限りは、特に制限されない。生物と、特定コーティング材でコーティングされた担体とを、第一の液体中で共存させる時間は、例えば１０秒～３０時間であり、１０秒～１０時間であってもよく、１．０分～５．０時間であってもよく、あるいは５．０分～１．０時間であってもよい。生物と、特定コーティング材でコーティングされた担体とを、第一の液体中で共存させる時間は、あるいは、０．５０時間～６．０時間であってもよく、０．７０時間～４．５時間であってもよく、０．８０時間～２．０時間であってもよい。
本開示に係る抽出方法及び本開示に係る判定方法における生物と、特定コーティング材でコーティングされた担体とを、第一の液体中で共存させることは、室温で行っても加熱又は冷却しながら行ってもよい。細胞膜の変性をなるべく起こさないように、共存は０℃～５０℃の温度範囲内の温度で行うことが好ましく、４℃～４０℃の温度範囲内の温度で行うことがより好ましく、１０℃～４０℃の温度範囲内の温度で行うことがさらに好ましく、２０℃～４０℃の温度範囲内の温度で行うことがさらにより好ましく、２５℃～４０℃の温度範囲内の温度で行うことがさらにより好ましく、３０℃～３７℃の温度範囲内の温度で行うことがいっそう好ましい。生物と、特定コーティング材でコーティングされた担体とを、第一の液体中で共存させることは室温で行ってもよい。生物と、特定コーティング材でコーティングされた担体とを、第一の液体中で共存させることは加熱下で行ってもよい。
生物と、特定コーティング材でコーティングされた担体とを、第一の液体中で共存させる時間は、生物が、十分な量、特定コーティング材でコーティングされた担体へ吸着する限りは、特に制限されない。生物と、特定コーティング材でコーティングされた担体とを、第一の液体中で共存させる時間は、例えば１０秒～３０時間であり、１０秒～１０時間であってもよく、１．０分～５．０時間であってもよく、あるいは５．０分～１．０時間であってもよい。生物と、特定コーティング材でコーティングされた担体とを、第一の液体中で共存させる時間は、あるいは、０．５０時間～６．０時間であってもよく、０．７０時間～４．５時間であってもよく、０．８０時間～２．０時間であってもよい。
生物と、特定コーティング材でコーティングされた担体とを、第一の液体中で共存させるやり方は特に限定されず、生物が、特定コーティング材でコーティングされた担体と接触することになる任意の処理を挙げることができる。共存は、例えば、容器中に格納された第一の液体中で前記生物と前記コーティングされた担体を共存することで行うことができる。この際、第一の液体は静置していても、撹拌していてもよい。
生物と、特定コーティング材でコーティングされた担体とを、第一の液体中で共存させることによって、生物の特定コーティング材でコーティングされた担体への吸着が起こり、第一の液体中に前記生物を吸着した前記コーティングされた担体を含む試料が得られる。
生物と、特定コーティング材でコーティングされた担体とを、第一の液体中で共存させることによって、生物の特定コーティング材でコーティングされた担体への吸着が起こり、第一の液体中に前記生物を吸着した前記コーティングされた担体を含む試料が得られる。
＜浸漬＞
本開示に係る抽出方法及び本開示に係る判定方法における浸漬は、室温で行っても加熱又は冷却しながら行ってもよい。機器を必要としない観点からは浸漬は室温で行うことが好ましい。細胞膜の変性をなるべく起こさないようにする観点及び操作を簡便化する観点からは、浸漬は０℃～５０℃の温度範囲内の温度で行うことが好ましく、４℃～４０℃の温度範囲内の温度で行うことがより好ましく、１０℃～４０℃の温度範囲内の温度で行うことがさらに好ましく、２０℃～４０℃の温度範囲内の温度で行うことがさらにより好ましく、２５℃～４０℃の温度範囲内の温度で行うことがさらにより好ましく、３０℃～３７℃の温度範囲内の温度で行うことがいっそう好ましい。浸漬は室温で行ってもよい。一方、ｓＲＮＡの抽出速度を増加させる観点から浸漬を加熱下で行ってもよい。
浸漬時間は、ｓＲＮＡの細胞外への漏出が十分な量で起こる限りは、特に制限されない。浸漬時間は、例えば１０秒～３０時間であり、１０秒～１０時間であってもよく、１．０分～５．０時間であってもよく、あるいは５．０分～１．０時間であってもよい。浸漬時間は、あるいは、０．５０時間～６．０時間であってもよく、０．７０時間～４．５時間であってもよく、０．８０時間～２．０時間であってもよい。
本開示に係る抽出方法及び本開示に係る判定方法における浸漬は、室温で行っても加熱又は冷却しながら行ってもよい。機器を必要としない観点からは浸漬は室温で行うことが好ましい。細胞膜の変性をなるべく起こさないようにする観点及び操作を簡便化する観点からは、浸漬は０℃～５０℃の温度範囲内の温度で行うことが好ましく、４℃～４０℃の温度範囲内の温度で行うことがより好ましく、１０℃～４０℃の温度範囲内の温度で行うことがさらに好ましく、２０℃～４０℃の温度範囲内の温度で行うことがさらにより好ましく、２５℃～４０℃の温度範囲内の温度で行うことがさらにより好ましく、３０℃～３７℃の温度範囲内の温度で行うことがいっそう好ましい。浸漬は室温で行ってもよい。一方、ｓＲＮＡの抽出速度を増加させる観点から浸漬を加熱下で行ってもよい。
浸漬時間は、ｓＲＮＡの細胞外への漏出が十分な量で起こる限りは、特に制限されない。浸漬時間は、例えば１０秒～３０時間であり、１０秒～１０時間であってもよく、１．０分～５．０時間であってもよく、あるいは５．０分～１．０時間であってもよい。浸漬時間は、あるいは、０．５０時間～６．０時間であってもよく、０．７０時間～４．５時間であってもよく、０．８０時間～２．０時間であってもよい。
浸漬を加熱下で行う場合、浸漬温度及び浸漬時間は、例えば、５０℃～１００℃の温度範囲内の温度で１０秒～３０時間であってもよく、７０℃～１００℃の温度範囲内の温度で１．０分～１０時間であってもよく、８０℃～１００℃の温度範囲内の温度で３．０分～１時間であってもよく、９５℃の温度で５．０分であってもよい。
浸漬のやり方は特に限定されず、前記生物を吸着した前記コーティングされた担体が、第二の液体と接触することになる任意の処理を挙げることができる。浸漬は、例えば、容器中に格納された第二の液体に前記生物を吸着した前記コーティングされた担体を浸漬することで行うことができる。
浸漬を行うことによって、ｓＲＮＡの細胞外への漏出が起こり、第二の液体中にｓＲＮＡを含む試料が得られる。
浸漬を行うことによって、ｓＲＮＡの細胞外への漏出が起こり、第二の液体中にｓＲＮＡを含む試料が得られる。
上述の「水性溶媒」の項で説明した細胞壁を有する細胞からのｓＲＮＡの漏出は、驚くべきことに、核酸一般に起こる現象ではなく、ｓＲＮＡにおいて特に起こる現象である。このため、例えば従来から生物種の判別のために用いられてきた１６Ｓ ｒＲＮＡを水性溶媒中に漏出させようとして細胞壁を有する細胞を水性溶媒中に浸漬したとしても、１６Ｓ ｒＲＮＡは細胞壁を有する細胞から全く漏出しないか、漏出したとしても低い量でしか漏出しない。この違いは、１６Ｓ ｒＲＮＡ（１６００塩基程度）とｓＲＮＡとの長さの違いが一因ではないかと考えられる。つまり、ｍＲＮＡ及び１６Ｓ ｒＲＮＡに比べて鎖長の短いｓＲＮＡは、驚くべきことに、細胞膜を破壊しなくても細胞壁を有する細胞の外の水性溶媒に漏出する。一方、ｍＲＮＡ、１６Ｓ ｒＲＮＡ等のより大きな分子はこのような漏出は実質的に示さず、細胞膜の変性を伴う抽出操作を行わなければ細胞壁を有する細胞の外に取り出すことができない。
＜ｓＲＮＡ＞
本開示に係る抽出方法及び本開示に係る判定方法におけるｓＲＮＡとは、ｓｍａｌｌ ＲＮＡとも称され、細胞に含まれる短鎖のＲＮＡを意味する。ｓＲＮＡの具体的な鎖長は、５塩基～５００塩基であることが好ましく、８塩基～５００塩基であることがより好ましく、１０塩基～２００塩基であることがさらに好ましく、１２塩基～１００塩基であることがいっそう好ましく、１５塩基～３０塩基であることが特に好ましい。
なお、ｓＲＮＡの中には、真核細胞に含まれる２０塩基～３０塩基程度のＲＮＡであるｍｉｃｒｏ ＲＮＡなどもある。また、原核生物でも同程度の特に短いｓＲＮＡのことをｍｉｃｒｏＲＮＡ－ｓｉｚｅ ｓｍａｌｌ ＲＮＡと呼ぶ場合もある。
本開示に係る抽出方法及び本開示に係る判定方法におけるｓＲＮＡとは、ｓｍａｌｌ ＲＮＡとも称され、細胞に含まれる短鎖のＲＮＡを意味する。ｓＲＮＡの具体的な鎖長は、５塩基～５００塩基であることが好ましく、８塩基～５００塩基であることがより好ましく、１０塩基～２００塩基であることがさらに好ましく、１２塩基～１００塩基であることがいっそう好ましく、１５塩基～３０塩基であることが特に好ましい。
なお、ｓＲＮＡの中には、真核細胞に含まれる２０塩基～３０塩基程度のＲＮＡであるｍｉｃｒｏ ＲＮＡなどもある。また、原核生物でも同程度の特に短いｓＲＮＡのことをｍｉｃｒｏＲＮＡ－ｓｉｚｅ ｓｍａｌｌ ＲＮＡと呼ぶ場合もある。
本開示に係る抽出方法及び本開示に係る判定方法におけるｓＲＮＡは、生物が細胞外に放出したｓＲＮＡを抽出又は存在状態を検出する観点から、前記生物中に存在することが好ましい。つまり、ｓＲＮＡは、前記生物の細胞に内包されていることが好ましい。
生物に存在するｓＲＮＡについては研究が進められており、各生物において見出されたｓＲＮＡの配列情報は、Rfam(EMBL EBI) 、Small RNA Database(MD Anderson Cancer Center) 、miRBase(Griffiths-Jones lab at the Faculty of Biology, Medicine and Health, University of Manchester)、National Center for Biotechnology Information (NCBI)のデータベース等のデータベースに蓄積されている他、学術論文にも種々報告されている。このため、各種の生物に含まれるｓＲＮＡの情報は、データベース検索を始めとする公知の方法で得ることが可能である（杏林医会誌４１巻１号ｐｐ．１３～１８ ２０１０年４月参照）。例えば、National Center for Biotechnology Information (NCBI)のデータベースに含まれる核酸配列と、検索対象の核酸配列とを、Nucleotide BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)を用いて比較及び同一配列の検索（当該同一配列の由来となる生物の情報を含む）をすることができる。
ｓＲＮＡは、生物の種類に応じて差示的に発現する。例えば、Rfam、Small RNA Database、miRBase、National Center for Biotechnology Information (NCBI)データベース等の配列データベースを参照すると、特定のｓＲＮＡがどの１種又は複数種の生物において発現しているかを検索することができ、また、特定の生物においてどの１種又は複数種のｓＲＮＡが発現しているかを検索することができる。
本開示に係る抽出方法及び本開示に係る判定方法において、前記ｓＲＮＡは１種又は複数種のｓＲＮＡであってもよい。
本開示に係る判定方法においては、ｓＲＮＡは、関心のある特定の生物において差示的な発現状態を示すものであることが好ましい。このようにすることで、ｓＲＮＡの存在状態から生物の存在状態をよりよく判別できる。
ここで、「差示的な発現状態」とは、前記特定の生物においてのみ差示的に発現するｓＲＮＡである必要はなく、前記特定の生物を含む特定の生物の群においてのみ差示的に発現するｓＲＮＡといった、前記特定の生物にのみに完全に差示的であるわけではないｓＲＮＡをも含む概念を意味する。
ここで、「差示的な発現状態」とは、前記特定の生物においてのみ差示的に発現するｓＲＮＡである必要はなく、前記特定の生物を含む特定の生物の群においてのみ差示的に発現するｓＲＮＡといった、前記特定の生物にのみに完全に差示的であるわけではないｓＲＮＡをも含む概念を意味する。
本開示に係る抽出方法においても、抽出する対象となるｓＲＮＡは、生物に応じて差示的な発現状態を示すものであることが好ましい。
上述したとおり、第二の液体が水性溶媒であり前記生物が細胞壁を有する生物である場合、本開示に係る抽出方法及び本開示に係る判定方法においては、強アルカリ処理、グアニジン処理、フェノール、１価又は２価の直鎖、分枝鎖又は脂環式のＣ２～Ｃ８アルコール以外のアルコール、イオン性界面活性剤などによる細胞膜の変性を行わずに細胞壁を有する細胞の外部の第二の液体にｓＲＮＡを漏出させることができる。このため、変性剤の使用が必要無く、変性剤による処理時間も不要になり、また、ｓＲＮＡを漏出させた第二の液体はそのままでもその後の処理（例えば、ｓＲＮＡ検出のための核酸増幅処理等）に供することができる。
＜存在状態＞
本開示に係る判定方法において、「存在状態」とは、単に存在の有無を指してもよく、また、存在量を指していてもよい。つまり、「存在状態を検出すること」とは、存在するというバイナリーな情報を得ることであってもよいが、存在という情報に加えて存在量の情報までも得るものであってもよい。存在量の情報には、存在の有無についての情報も内在している。同様に、「存在状態を判定すること」とは、存在するというバイナリーな判定を行うことであってもよいが、存在するという情報に加えて存在量の判定までも行うものであってもよい。ここで、存在量は、絶対的な存在量には限定されず、ネガティブコントロール又はポジティブコントロール等の比較対象に対する相対存在量であってもよい。
本開示に係る判定方法において、「存在状態」とは、単に存在の有無を指してもよく、また、存在量を指していてもよい。つまり、「存在状態を検出すること」とは、存在するというバイナリーな情報を得ることであってもよいが、存在という情報に加えて存在量の情報までも得るものであってもよい。存在量の情報には、存在の有無についての情報も内在している。同様に、「存在状態を判定すること」とは、存在するというバイナリーな判定を行うことであってもよいが、存在するという情報に加えて存在量の判定までも行うものであってもよい。ここで、存在量は、絶対的な存在量には限定されず、ネガティブコントロール又はポジティブコントロール等の比較対象に対する相対存在量であってもよい。
＜存在状態の検出＞
本開示に係る判定方法においてｓＲＮＡの存在状態を検出する手法については特に制限されない。ｓＲＮＡの存在状態を検出する手法としては、標識された核酸プローブとのハイブリダイゼーション（ノーザンブロッティングを含む）、核酸増幅などの方法がある。核酸増幅はＤＮＡ又はＲＮＡを増幅させる方法であればよく、その例としては、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＲＴ－ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－ＰＣＲ）法、ＬＣＲ（Ｌｉｇａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＲＣ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｒｅｖｅｒｓｅ－ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＲＴ－ＬＡＭＰ（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－ＬＡＭＰ）法、ＩＣＡＮ（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｎｄ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ｐｒｉｍｅｒ－ｉｎｉｔｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ）法、ＲＣＡ（Ｒｏｌｌｉｎｇ Ｃｙｃｌｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、Ｓｍａｒｔ Ａｍｐ（Ｓｍａｒｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｓｓ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－ｍｅｄｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＡＳ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）法、３ＳＲ（Ｓｅｌｆ－ｓｕｓｔａｉｎｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）法等の各増幅方法が挙げられる。ＲＮＡを直接増幅できない方法の場合には、一旦ｓＲＮＡを逆転写酵素で逆転写してＤＮＡに変換してから核酸増幅すればよい。ある実施形態においては、ｓＲＮＡの存在状態の検出は等温遺伝子増幅又はＰＣＲによって行われる。
本開示に係る判定方法においてｓＲＮＡの存在状態を検出する手法については特に制限されない。ｓＲＮＡの存在状態を検出する手法としては、標識された核酸プローブとのハイブリダイゼーション（ノーザンブロッティングを含む）、核酸増幅などの方法がある。核酸増幅はＤＮＡ又はＲＮＡを増幅させる方法であればよく、その例としては、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＲＴ－ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－ＰＣＲ）法、ＬＣＲ（Ｌｉｇａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＲＣ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｒｅｖｅｒｓｅ－ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＲＴ－ＬＡＭＰ（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－ＬＡＭＰ）法、ＩＣＡＮ（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｎｄ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ｐｒｉｍｅｒ－ｉｎｉｔｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ）法、ＲＣＡ（Ｒｏｌｌｉｎｇ Ｃｙｃｌｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、Ｓｍａｒｔ Ａｍｐ（Ｓｍａｒｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｓｓ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－ｍｅｄｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＡＳ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）法、３ＳＲ（Ｓｅｌｆ－ｓｕｓｔａｉｎｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）法等の各増幅方法が挙げられる。ＲＮＡを直接増幅できない方法の場合には、一旦ｓＲＮＡを逆転写酵素で逆転写してＤＮＡに変換してから核酸増幅すればよい。ある実施形態においては、ｓＲＮＡの存在状態の検出は等温遺伝子増幅又はＰＣＲによって行われる。
ｓＲＮＡの存在状態を検出するために用いられる核酸増幅は、温度サイクルのための設備を必要としないという点では、好ましくは等温遺伝子増幅法であるＬＡＭＰ法又はＲＣＡ法である。ＲＣＡ法としては、特にＳＡＴＩＣ（ｔｅｒｍｅｄ ｓｉｇｎａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｅｒｎａｒｙ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）法が挙げられる。等温遺伝子増幅は、増幅のための機器（温度サイクルに合わせて温度を変動させる機器）を用意する必要が無い点で好ましい。等温遺伝子増幅は例えば１０℃～４０℃の温度範囲内の温度でも可能であるため、室温で行うことができる。なお、本開示において、実施例等で特に定める場合を除き、室温とは２０℃～４０℃の範囲内の温度であってもよい。
また、前述のＰＣＲは、ｑＰＣＲ（定量ＰＣＲ）であってもよく、ｑＰＣＲはリアルタイムＰＣＲであってもよい。リアルタイムＰＣＲとしては、特に、Ｔａｑｍａｎ（登録商標） ｍｉＲＮＡ ａｓｓａｙ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いる方法が挙げられる。ｑＰＣＲを用いることで、ｓＲＮＡの存在状態について定量的な解析を行うことが容易となる。
また、前述のＰＣＲは、ｑＰＣＲ（定量ＰＣＲ）であってもよく、ｑＰＣＲはリアルタイムＰＣＲであってもよい。リアルタイムＰＣＲとしては、特に、Ｔａｑｍａｎ（登録商標） ｍｉＲＮＡ ａｓｓａｙ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いる方法が挙げられる。ｑＰＣＲを用いることで、ｓＲＮＡの存在状態について定量的な解析を行うことが容易となる。
ｓＲＮＡの検出に用いられるプローブ又はプライマー等の試薬（以下ｓＲＮＡ検出用試薬とも称する）については、浸漬完了後に第二の液体中に添加してもよいし、浸漬前の第二の液体にあらかじめ含ませておいてもよい。浸漬前の第二の液体にあらかじめｓＲＮＡ検出用試薬を含ませておいた場合は、浸漬完了後の添加操作が不要となる点で好ましい。また、水性溶媒である試料において溶媒交換せずに該水性溶媒を第二の液体として用いる場合には、該第二の液体にｓＲＮＡ検出用試薬を添加してもよいし、第二の液体を調製する過程が存在する場合には当該調製過程でｓＲＮＡ検出用試薬を添加してもよい。
増幅した核酸は、例えば、プライマーに蛍光色素を付着しておく、沈殿物を目視で確認する、核酸染色色素を用いる、蛍光プローブとハイブリダイゼーションさせる、核酸クロマトグラフィーに供する等の既存の増幅核酸検出方法を用いることにより検出することができる。前記蛍光プローブは、マイクロアレイ上に配置されていてもよい。マイクロアレイを用いることで、複数種のｓＲＮＡの存在情報を一度に得ることができる。
例えば、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）プローブ、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ色素などを用いることで、核酸増幅量を蛍光シグナルにより測定でき、その情報を基にｓＲＮＡの存在状態を知ることができ、この手法は特にｑＰＣＲにおいて有効である。
例えば、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）プローブ、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ色素などを用いることで、核酸増幅量を蛍光シグナルにより測定でき、その情報を基にｓＲＮＡの存在状態を知ることができ、この手法は特にｑＰＣＲにおいて有効である。
上述のように、ｓＲＮＡの検出において核酸増幅は必須ではなく、核酸増幅無しに蛍光プローブとｓＲＮＡとをハイブリダイゼーションさせること等により直接検出してもよい。
上記の核酸増幅又はプローブとのハイブリダイゼーション等の検出操作においては、ｓＲＮＡの全長を増幅してもよく、及び／又はｓＲＮＡの全長とハイブリダイゼーションするプローブを用いてもよい。ただし、ｓＲＮＡの全長を増幅すること、及び／又はｓＲＮＡの全長とハイブリダイゼーションするプローブを用いることは必須ではない。ｓＲＮＡの一部の領域、例えばｓＲＮＡの３’末端側領域の１０塩基～３０塩基程度を対象として、核酸増幅又はハイブリダイゼーションを行ってもよい。
上記の核酸増幅又はプローブとのハイブリダイゼーション等の検出操作においては、ｓＲＮＡの全長を増幅してもよく、及び／又はｓＲＮＡの全長とハイブリダイゼーションするプローブを用いてもよい。ただし、ｓＲＮＡの全長を増幅すること、及び／又はｓＲＮＡの全長とハイブリダイゼーションするプローブを用いることは必須ではない。ｓＲＮＡの一部の領域、例えばｓＲＮＡの３’末端側領域の１０塩基～３０塩基程度を対象として、核酸増幅又はハイブリダイゼーションを行ってもよい。
前記ｓＲＮＡの存在状態の検出は、細胞からのｓＲＮＡの抽出と同時並行で行ってもよい。例えば、ＰＣＲ法、又はＳＡＴＩＣ法等の等温遺伝子増幅法の反応液中に、前記生物を吸着した前記コーティングされた担体を直接浸漬又は添加して、ｓＲＮＡの漏出と検出を同時に行ってもよい。等温遺伝子増幅法の場合、温度サイクルが無いため、核酸増幅に必要な試薬が第二の液体中に揃っているのであれば、いつでも核酸増幅を開始できる状態にある。
なお本開示に係る前記ｓＲＮＡの存在状態を検出することは、前記ｓＲＮＡの存在量を検出することを含んでいてもよい。
＜生物の存在状態の判定＞
試料中に生物に差示的なｓＲＮＡが検出されることは、試料中における当該生物の存在を示唆する。試料中における生物に差示的なｓＲＮＡの存在量の情報からは、試料中における当該生物の存在量についての情報を得ることもできる。
試料中に生物に差示的なｓＲＮＡが検出されることは、試料中における当該生物の存在を示唆する。試料中における生物に差示的なｓＲＮＡの存在量の情報からは、試料中における当該生物の存在量についての情報を得ることもできる。
生物の検出方法の中で、培養法は非常に感度が高く、信頼性も高い方法である。ただし、培養法には問題点もある。例えば、培養に１日～数日を要するため結果を得るまでに時間がかかること、培養が困難な細菌には適用が困難であること、培養後の細菌の同定には特殊な技術が必要であること、培養した細菌の廃棄にはオートクレーブ等の滅菌操作が必要で、廃棄物の体積もかさばることから、廃棄の手間とコストがかかること、などが培養法の問題点として挙げられる。
また、抗体法の場合、例えばイムノクロマト法及びラテックス凝集法は、サンプルを接触させるだけで微生物を検出できるので、操作が簡便という利点がある。しかし、イムノクロマト法及びラテックス凝集法は、検出感度が低く、高濃度の微生物菌体が存在しないと検出ができないという問題点がある。ＥＬＩＳＡ法は、イムノクロマト法等よりも高感度な方法であるが、洗浄及び発色操作が必要なため手間がかかる。
ｓＲＮＡの検出に基づく生物の存在状態の判定方法によれば、培養法とは異なり、測定試料に含まれる可能性のある生物を培養する必要が無い。このため、短時間での判定又は同定が可能である。
ｓＲＮＡがどの生物で発現するかについては、例えば以下のようにして知ることができる。前記ｓＲＮＡの核酸配列を基準配列として、National Center for Biotechnology Information (NCBI)のデータベースから、基準配列と類似する核酸配列をNucleotide BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)を用いて比較する。得られた比較結果の中から、基準配列としたｓＲＮＡと核酸配列が１００％一致するｓＲＮＡを含む生物が、前記ｓＲＮＡを発現する生物ということになる。
ｓＲＮＡの存在状態を検出する前においては、細胞外に抽出されているｓＲＮＡの種類は定かではないが、特定のｓＲＮＡが細胞外で検出されれば、その特定のｓＲＮＡを持つことが知られている生物が存在すると判断できる。
本開示に係る判定方法における生物とは、検出対象となる生物を指し、検出しようとする任意の生物であってよい。当該生物において、他の生物と比較して差示的に発現するｓＲＮＡの存在状態を検出することにより、前記生物の存在状態を判定することができる。前記生物において差示的に発現するｓＲＮＡが検出されることは、前記生物が存在することを示唆し、該ｓＲＮＡが検出されないことは前記生物が存在しないことを示唆する。本開示に係る判定方法においては、試料中における存在状態を検出したい生物の種類に応じて、当該生物に差示的な発現状態を示すｓＲＮＡを、存在状態の検出を行うｓＲＮＡとして選択することが好ましい。ｓＲＮＡの差示的な発現状態とは、存在状態を検出したい生物において差示的に多く発現することであっても、存在状態を検出したい生物において差示的に少なく発現することであってもよい。ただし、存在状態を検出する１種又は複数種のｓＲＮＡのうち少なくとも１種は、存在状態を検出したい生物において差示的に発現するｓＲＮＡであることが好ましい。
なお、１種類のｓＲＮＡが１種類の生物に完全に差示的であるとは限らず、同じｓＲＮＡを発現する生物が複数種存在する場合もある。しかし、１種類の生物におけるｓＲＮＡの発現プロファイルはｓＲＮＡ毎に異なるため、複数種のｓＲＮＡそれぞれの存在状態を基にすれば、存在する可能性のある生物の種類をより絞り込むことができる。このため、本開示に係る判定方法においては、複数種のｓＲＮＡそれぞれの存在状態に基づいて、生物の存在状態を判定してもよい。この判定においては、前記生物において差示的に少なく発現するｓＲＮＡの発現状態も用いることができる。前記生物において差示的に少なく発現するｓＲＮＡが検出されること又はされないことは、単独では、前記生物の存在状態を示唆するものではないが、前記生物において差示的に発現するｓＲＮＡの存在状態についての情報と組み合わせることで、それらｓＲＮＡの発現プロファイルを示す生物の候補をより絞り込むことができる。
本開示に係る判定方法において存在状態を検出するｓＲＮＡとして、その発現プロファイルを基に関心のある特定の生物が、他の生物からよりよく判別されるようなｓＲＮＡを選択することが好ましい。
とはいえ、存在する生物の候補を１種類に限定することは本開示に係る判定方法においては必須ではなく、複数種の生物からなる候補群を同定するだけでも十分である。このため、本開示に係る判定方法は、複数種の生物の存在状態を判定するものであってもよく、その場合、前記判定方法は複数種の生物それぞれの存在状態を個別に判定するものではなく、複数種の生物の存在状態を総体的に判定するものである。つまり、前記判定方法は、複数種の生物のうちどれが実際に存在しているかまでは判定できないにしても、候補群（グループ）を構成する複数種の生物のうち少なくとも１種が存在していることを判定できれば十分である。
すなわち、本開示に係る判定方法において、生物の存在状態を判定することが、２種以上の生物の総体的な存在状態を判定することを含んでいてもよい。本開示に係る判定方法が２種以上の生物の総体的な存在状態を判定することを含む場合、２種以上の生物の総体的な存在状態を判定することが、２種以上の生物のいずれもが存在しないか、２種以上の生物のうち少なくとも１種が存在するかを判定することを含んでいてもよく、２種以上の生物のうち少なくとも１種が存在すると判定した場合には、さらに、２種以上の生物のうち存在する少なくとも１種の存在量を判定することを含んでいてもよい。
この場合、２種以上の生物のうち関心のある１種類の生物についての存在状態が完全に判定できるわけではないが、当該関心のある１種類の生物についての存在の可能性については判定することが可能であり、この判定結果を基にしてさらなる試験を行ってもよく、あるいはこの判定結果に基づいて試料を得た対象物の清浄化などの作業を行うようにしてもよい。つまり、２種以上の生物の総体的な存在状態を判定することは、当該２種以上の生物に含まれる特定の生物の存在の可能性を判定することを含んでいてもよく、さらに当該特定の生物の推定存在量を判定することを含んでいてもよい。
ｓＲＮＡの存在状態の検出の際に、ｓＲＮＡの存在量についても測定することで、上記に記載の生物の存在量の判定が可能となる。ｓＲＮＡの存在量の検出は、当業界で一般的に用いられている手法により行うことができ、例えば、ｓＲＮＡにハイブリダイズする蛍光標識プローブからの蛍光発光量を測定する、ｓＲＮＡからの核酸増幅時に蛍光標識プライマーを用い当該プライマーからの蛍光発光量を測定する、ｑＰＣＲを用いる等の手法により測定することができる。
＜試料中に存在する生物の同定＞
本開示に係る判定方法では、ｓＲＮＡの存在状態から、当該ｓＲＮＡの存在状態と合致するｓＲＮＡ発現プロファイルを有する１種又は複数種の生物を特定する同定方法も提供される。前記ｓＲＮＡは、生物に応じて差示的な発現状態を示すｓＲＮＡであることが好ましい。第二の液体中におけるｓＲＮＡの存在状態を検出することは、第二の液体中に存在するｓＲＮＡを網羅的に検出することを含んでいてもよいが、試料中に存在する可能性のある生物の種類を考慮してあらかじめ選択した１種又は複数種のｓＲＮＡの存在状態を測定することを含んでいてもよい。
本開示に係る判定方法では、ｓＲＮＡの存在状態から、当該ｓＲＮＡの存在状態と合致するｓＲＮＡ発現プロファイルを有する１種又は複数種の生物を特定する同定方法も提供される。前記ｓＲＮＡは、生物に応じて差示的な発現状態を示すｓＲＮＡであることが好ましい。第二の液体中におけるｓＲＮＡの存在状態を検出することは、第二の液体中に存在するｓＲＮＡを網羅的に検出することを含んでいてもよいが、試料中に存在する可能性のある生物の種類を考慮してあらかじめ選択した１種又は複数種のｓＲＮＡの存在状態を測定することを含んでいてもよい。
１種類のｓＲＮＡの特定の存在状態が、１種類の生物のｓＲＮＡ発現プロファイルに完全に差示的であるとは限らず、ｓＲＮＡの特定の存在状態に合致するｓＲＮＡ発現プロファイルを有する生物が複数種存在する場合もある。しかし、生物毎のｓＲＮＡ発現プロファイルはｓＲＮＡ毎に異なるため、複数種のｓＲＮＡそれぞれの存在状態の情報を基にすれば、存在する生物の種類をより絞り込むことができる。このため、同定方法においては、複数種のｓＲＮＡそれぞれの存在状態に基づいて、試料中に存在する生物を同定してもよい。とはいえ、存在する生物種の候補を１種類に絞り込むことは同定方法においては必須ではなく、複数種の生物からなる候補群を同定するだけでも十分である。
このため、同定方法は、複数種の生物を同定するものであってもよく、その場合、前記同定方法は複数種の生物のそれぞれが存在していると個別に検出するものではなく、複数種の生物の存在を総体的に検出するものであってもよい。つまり、前記同定方法は、複数種の生物のうちどれが実際に存在しているかは検出できないまでも、複数種の生物のうち少なくとも１種が存在していると検出できれば十分である。
すなわち、同定方法において、前記試料中に存在する生物を同定することが、２種以上の候補生物のうち１種以上が存在していると同定していることを含んでいてもよい。２種以上の生物のうち少なくとも１種が存在していると同定した場合には、さらに、２種以上の候補となる生物のうち存在する少なくとも１種の存在量を同定することを含んでいてもよい。つまり同定方法において、前記試料中に存在する生物を同定することが、２種以上の候補となる生物のうち１種以上が存在していると同定していることを含む場合には、２種以上の候補となる生物のうちどれが存在しているかを正確に特定できるわけではないが、この同定結果を基にしてさらなる試験を行ってもよく、あるいはこの同定結果に基づいて試料を得た対象物の清浄化（候補生物の種類に応じた適切な清浄化）などの作業を行うようにしてもよい。
すなわち、２種以上の候補となる生物のうち１種以上が存在していると同定することは、当該２種以上の候補となる生物に含まれる特定の生物を存在の可能性がある生物として同定することを含んでいてもよく、さらに当該特定の生物の推定存在量を同定することを含んでいてもよい。
ｓＲＮＡの存在状態の検出の際に、ｓＲＮＡの存在量についても測定することで、上記に記載の生物の存在量の同定が可能となる。第二の液体中におけるｓＲＮＡの存在量は、当該ｓＲＮＡを発現する生物の量を反映（最も単純な場合は当該ｓＲＮＡを発現する生物の量に比例）すると考えられるためである。ｓＲＮＡの存在量の検出は、当業界で一般的に用いられている手法により行うことができ、例えば、ｓＲＮＡにハイブリダイズする蛍光標識プローブからの蛍光発光量を測定する、ｓＲＮＡからの核酸増幅時に蛍光標識プライマーを用い当該プライマーからの蛍光発光量を測定する、ｑＰＣＲを用いる（例えばリアルタイムＰＣＲにおけるＣｔ値を求める）等の手法により測定することができる。
本開示に係る判定方法に含まれてもよい同定方法における、第二の液体中における１種又は複数種のｓＲＮＡの存在状態に基づく生物の同定の一例について説明する。ｓＲＮＡであるＥＣ－５ｐ－３６（配列番号１；５’－ＵＧＵＧＧＧＣＡＣＵＣＧＡＡＧＡＵＡＣＧＧＡＵ－３’、Ｃｕｒｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１３ Ｎｏｖ；６７（５）：６０９－１３参照）は、Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＢＬＡＳＴ検索によれば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属細菌、Ｓｈｉｇｅｌｌａ属細菌、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属細菌、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌において共通して発現している。このことから、第二の液体中にＥＣ－５ｐ－３６が存在すると検出された場合、存在している生物は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属細菌、Ｓｈｉｇｅｌｌａ属細菌、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属細菌、及びＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌のうち１種以上であると同定できる。また、ｓＲＮＡであるＥＣ－３ｐ－４０は、Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＢＬＡＳＴ検索によれば、Ｓｈｉｇｅｌｌａ属細菌、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属細菌、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属細菌、及びＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌に加えて、Ｋｌｅｂｓｉｌｌａ属細菌にも共通して発現する。このため、ＥＣ－３ｐ－４０（配列番号２；５’－ＧＵＵＧＵＧＡＧＧＵＵＡＡＧＣＧＡＣＵ－３’）が第二の液体中に存在すると検出された場合、存在する生物はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属細菌、Ｓｈｉｇｅｌｌａ属細菌、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属細菌、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌、及びＫｌｅｂｓｉｌｌａ属細菌のうち１種以上であると同定できる。また、これらの結果を組み合わせて同定を行ってもよい。たとえば、ＥＣ－５ｐ－３６はＫｌｅｂｓｉｌｌａ属細菌では発現しないが、ＥＣ－３ｐ－４０はＫｌｅｂｓｉｌｌａ属細菌で発現するので、第二の液体中にＥＣ－３ｐ－４０は存在するがＥＣ－５ｐ－３６は存在しないと検出された場合は、存在する生物はＫｌｅｂｓｉｌｌａ属細菌であると同定できる。
また、生物の同定は、特定の機能を有するｓＲＮＡの存在状態に基づいて同定してもよい。たとえば、腸管出血性大腸菌（Ｏ－１５７等）の毒素（ベロ毒素。シガトキシンとも呼ばれる）に関与するｓＲＮＡである２４Ｂ＿１（配列番号８；５’－ＵＡＡＣＧＵＵＡＡＧＵＵＧＡＣＵＣＧＧＧ－３’、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ｖｏｌｕｍｅ ５， Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ： １００８０ （２０１５）参照）は、Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｂｌａｓｔ検索によればベロ毒素（シガトキシン）生産菌に共通して発現する。このため、第二の液体中に２４Ｂ＿１が存在すると検出された場合は、存在する生物はベロ毒素保有菌であると同定できる。
また、本開示に係る判定方法において、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属細菌、Ｓｈｉｇｅｌｌａ属細菌、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属細菌、及びＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌の総体的な存在状態（いずれも存在しないか、１種以上が存在するか等）を判定したい場合には、ＥＣ－５ｐ－３６の存在状態を検出するようにすればよい。本開示に係る判定方法において、Ｋｌｅｂｓｉｌｌａ属細菌の存在状態を判定したい場合には、ＥＣ－３ｐ－４０及びＥＣ－５ｐ－３６の存在状態を検出するようにすればよい。
そのほか、ｓＲＮＡであるＥＣ－５ｐ－７９（配列番号３；５’－ＵＵＵＧＣＵＣＵＵＵＡＡＡＡＡＵＣ－３’）及びＥＣ－３ｐ－３９３（配列番号４；５’－ＣＵＣＧＡＡＧＡＵＡＣＧＧＡＵＵＣＵＵＡＡＣ－３’）は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ、及びＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍにおいて発現している。以上のことから、ｓＲＮＡと生物種の対応関係として、ＥＣ－５ｐ－３６、ＥＣ－３ｐ－４０、ＥＣ－５ｐ－７９、及びＥＣ－３ｐ－３９３からなる群より選択される少なくとも１種と、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ、及びＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍからなる群より選択される少なくとも１種との組み合わせ、配列番号５で表されるヌクレオチド配列を有するｆｏｘ＿ｍｉｌＲＮＡ＿５（配列番号５；５’－ＵＣＣＧＧＵＡＵＧＧＵＧＵＡＧＵＧＧＣ－３’、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ． ２０１４ Ａｕｇ ２０；９（８）：ｅ１０４９５６．参照）とＦｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍとの組み合わせ、配列番号６で表されるヌクレオチド配列を有するｍｉＲ１５６（配列番号６；５’－ＣＡＧＡＡＧＡＵＡＧＡＧＡＧＣＡＣＡＵＣ－３’；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ／；ｐｔａ－ｍｉＲ１５６ａを参照）とクロマツとの組み合わせ、ならびに配列番号７で表されるヌクレオチド配列を有するｍｉＲ７１６ｂ（配列番号７；５’－ＧＡＧＡＵＣＵＵＧＧＵＧＧＵＡＧＵＡＧＣＡＡＡＵＡ－３’；Ｓｃｉ． Ｒｅｐ．， ２０１５，５，７７６３参照）とＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅとの組み合わせが挙げられる。
その他、以下の表１及び表２に記載したｓＲＮＡは、腸内細菌科の細菌、例えば大腸菌において発現することが判明している。特に、ｓＲＮＡ１３～ｓＲＮＡ３２は、ｔＲＮＡの配列である。本開示に係る抽出方法によって抽出されるｓＲＮＡはこれらのｓＲＮＡから選択されてもよい。また、本開示に係る抽出方法及び本開示に係る判定方法においては、これらのｓＲＮＡから選択されるｓＲＮＡの存在量を測定してもよい。
また、ｓＲＮＡ９、１０、１３～１５、１７～１９、２１～２４、２６、及び２７について、その発現が確認されている生物をその属名（カンジダ属については種名）により以下の表３及び表４に示す。表３及び表４中「Ｙｅｓ」はその生物においてｓＲＮＡが発現することを表す。
表１及び表２に記載されたｓＲＮＡも、本開示に係る抽出方法において抽出の対象とすることができ、また、本開示に係る抽出方法及び本開示に係る判定方法において用いることができる。本開示に係る抽出方法において抽出するｓＲＮＡは、配列番号１～４８で表されるｓＲＮＡのうちの少なくとも１種類を含むことが好ましく、配列番号１～８、１３～１５及び３４で表されるｓＲＮＡのうちの少なくとも１種類を含むことがより好ましい。本開示に係る抽出方法及び本開示に係る判定方法においては、ｓＲＮＡは、配列番号１～４８で表されるｓＲＮＡのうちの少なくとも１種類を含むことが好ましく、配列番号１～８、１３～１５及び３４で表されるｓＲＮＡのうちの少なくとも１種類を含むことがより好ましく、配列番号１～８で表されるｓＲＮＡのうちの少なくとも１種類を含むことがさらに好ましい。
例えば、抽出の対象となるｓＲＮＡは、配列番号９～４８で表されるｓＲＮＡのうちの少なくとも１種類（つまりｓＲＮＡ９～ｓＲＮＡ４８のうちの少なくとも１種類）を含んでいてもよい。
また、例えば、抽出の対象となるｓＲＮＡは、配列番号９～４８で表されるｓＲＮＡのうちの少なくとも１種類（好ましくは配列番号１３～１５及び３４で表されるｓＲＮＡのうちの少なくとも１種類）と、配列番号１～８のｓＲＮＡのうちの少なくとも１種類とを含んでいてもよい。
検出するｓＲＮＡは、実施例に記載の試験において用いているＥＣ－５ｐ－３６、ＥＣ－３ｐ－４０、ＥＣ－５ｐ－７９、ＥＣ－３ｐ－３９３、ｆｏｘ＿ｍｉｌＲＮＡ＿５、ｍｉＲ１５６、及びｍｉＲ７１６ｂからなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましい。
なお、上記では数例のｓＲＮＡに言及したが、本開示に係る抽出方法及び判定方法は他のｓＲＮＡを検出する場合でも同様にして行うことができる。抽出又は判定に必要なｓＲＮＡと生物との対応関係は、上述のデータベースから容易に入手することができる。
本開示に係る抽出方法によれば、特定コーティング材でコーティングされていない担体に生物を吸着させる場合と比べて、生物から効率的にｓＲＮＡを抽出することができる。さらには本開示に係る判定方法によれば、培養法とは異なり、短時間での判定が可能でありながら、核酸増幅等を用いれば高い感度を実現することも可能である。さらに、培養が困難な細菌等にも本開示に係る抽出方法及び本開示に係る判定方法を適用することができる。また、培養法とは異なり、本開示に係る判定方法は、迅速な判定を可能とし、必要なサンプル量が少なく、処理に用いた資材の廃棄も容易である。本開示に係る判定方法では、遺伝子法の利点を維持しつつ、さらに従来の遺伝子法よりも迅速で簡便な操作で生物の存在状態の判定をすることができる。
本開示に係る抽出方法は、例えば、生物が有するｓＲＮＡの研究、生物が有するｓＲＮＡの生産のために用いることができる。その例としては、生物種特異的なｓＲＮＡの基礎研究、ｓＲＮＡの核酸医薬としての製造、及びｓＲＮＡの検出剤としての製造等が挙げられる。さらには、本開示に係る抽出方法は、本開示に係る判定方法にも用いることができる。
本開示に係る判定方法は、例えば、衛生管理の必要とされる現場（食品製造、医療、福祉、家庭等）での迅速で簡便な微生物検査のために用いることができる。その例としては、食品製造工程における腐敗変敗菌検査による製品の衛生管理、食中毒事故時のすみやかな原因特定、医療施設のベッドや待合室における食中毒菌検出による二次感染予防、児童福祉施設や老人福祉施設における食中毒菌の二次感染予防、家庭に食中毒患者がいる場合における食中毒菌の検出による二次感染予防等が挙げられる。
本開示に係る判定方法は、例えば、衛生管理の必要とされる現場（食品製造、医療、福祉、家庭等）での迅速で簡便な微生物検査のために用いることができる。その例としては、食品製造工程における腐敗変敗菌検査による製品の衛生管理、食中毒事故時のすみやかな原因特定、医療施設のベッドや待合室における食中毒菌検出による二次感染予防、児童福祉施設や老人福祉施設における食中毒菌の二次感染予防、家庭に食中毒患者がいる場合における食中毒菌の検出による二次感染予防等が挙げられる。
以下の実施例により実施形態を更に説明するが、本開示は以下の実施例によって何ら限定されるものではない。また、実施例の組成物における含有成分量を示す「％」は、特に断らない限り質量基準である。以下の実施例において、「室温」は約３０℃であった。
＜リアルタイムＰＣＲ法によるｓＲＮＡの定量方法＞
実施例１～実施例２４、比較例１～比較例５、及び参考例１～参考例１３において、抽出する対象又は存在状態を検出する対象となるｓＲＮＡは、以下に記載の方法により定量した。
実施例１～実施例２４、比較例１～比較例５、及び参考例１～参考例１３のそれぞれにおける反応液中のｓＲＮＡを、リアルタイムＰＣＲ法により定量した。定量の対象となるｓＲＮＡに合わせてカスタム合成した定量試薬（Ｔａｑｍａｎ（登録商標） ｍｉｃｒｏＲＮＡ Ａｓｓａｙｓ、アプライドバイオシステムズ社製）及び逆転写酵素（Ｔａｑｍａｎ（登録商標） ｍｉｃｒｏＲＮＡ ＲＴ ｋｉｔ、アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、製造業者の指示に従って逆転写反応を行い、逆転写により形成されたＤＮＡを含む逆転写反応溶液を得た。逆転写反応において、具体的には、１反応あたり、１μＬのＲＮＡサンプル、１．５μの１０× ＲＴ ｂｕｆｆｅｒ、０．１５μＬのｄＮＴＰ ｍｉｘ、０．１９μＬのＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、終濃度が1×になる量のカスタム合成Ｔａｑｍａｎ ａｓｓａｙｓ（例：２０×のＴａｑｍａｎ ａｓｓａｙｓであれば０．７５μＬ）の第一液、１μＬのＭｕｌｔｉｓｃｒｉｂｅ ＲＴ ｅｎｚｙｍｅ、を用い、純水で液量が１５μＬになるよう調整した。逆転写反応の温度プロファイルは、（１）１６℃で３０分、続いて（２）４２℃で３０分、及び（３）８５℃で５分からなるステップを含んでいた。
実施例１～実施例２４、比較例１～比較例５、及び参考例１～参考例１３において、抽出する対象又は存在状態を検出する対象となるｓＲＮＡは、以下に記載の方法により定量した。
実施例１～実施例２４、比較例１～比較例５、及び参考例１～参考例１３のそれぞれにおける反応液中のｓＲＮＡを、リアルタイムＰＣＲ法により定量した。定量の対象となるｓＲＮＡに合わせてカスタム合成した定量試薬（Ｔａｑｍａｎ（登録商標） ｍｉｃｒｏＲＮＡ Ａｓｓａｙｓ、アプライドバイオシステムズ社製）及び逆転写酵素（Ｔａｑｍａｎ（登録商標） ｍｉｃｒｏＲＮＡ ＲＴ ｋｉｔ、アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、製造業者の指示に従って逆転写反応を行い、逆転写により形成されたＤＮＡを含む逆転写反応溶液を得た。逆転写反応において、具体的には、１反応あたり、１μＬのＲＮＡサンプル、１．５μの１０× ＲＴ ｂｕｆｆｅｒ、０．１５μＬのｄＮＴＰ ｍｉｘ、０．１９μＬのＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、終濃度が1×になる量のカスタム合成Ｔａｑｍａｎ ａｓｓａｙｓ（例：２０×のＴａｑｍａｎ ａｓｓａｙｓであれば０．７５μＬ）の第一液、１μＬのＭｕｌｔｉｓｃｒｉｂｅ ＲＴ ｅｎｚｙｍｅ、を用い、純水で液量が１５μＬになるよう調整した。逆転写反応の温度プロファイルは、（１）１６℃で３０分、続いて（２）４２℃で３０分、及び（３）８５℃で５分からなるステップを含んでいた。
次に、得られた逆転写反応溶液を用い、リアルタイムＰＣＲ反応を行った。定量の対象となるｓＲＮＡに合わせてカスタム合成した定量試薬（Ｔａｑｍａｎ（登録商標）、ｍｉｃｒｏＲＮＡ Ａｓｓａｙｓ、アプライドバイオシステムズ社製、及びリアルタイムＰＣＲ用マスターミックス（ＴａｑＭａｎ（登録商標） Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ＩＩ ｗｉｔｈ ＵＮＧ、アプライドバイオシステムズ社製）を用い、製造業者の指示に従って反応液を調製した。具体的には、２μＬの逆転写反応溶液、１０μＬのＵｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ＩＩ ｗｉｔｈ ＵＮＧ、終濃度が1×になる量のカスタム合成Ｔａｑｍａｎ ａｓｓａｙｓ（例：２０×のＴａｑｍａｎ ａｓｓａｙｓであれば１μＬ）の第二液を用い、純水で液量が２０μＬになるよう調整して反応液を調製した。調製した反応液をＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（登録商標）リアルタイムＰＣＲシステム（アプライドバイオシステムズ社製）を用い、９５℃で１０分のステップの後、９５℃で１５秒及び６０℃で１分からなるサイクルを４０サイクル含む温度プロファイルでリアルタイムＰＣＲを行った。その際、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（登録商標）リアルタイムＰＣＲシステム（アプライドバイオシステムズ社製）を用い、ｒｅａｇｅｎｔｓ ＝“Ｔａｑｍａｎ ｒｅａｇｅｎｔｓ”、ｒａｍｐ ｓｐｅｅｄ ＝“Ｓｔａｎｄａｒｄ”の条件で、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓソフトウェアの自動計算（上記の設定以外はデフォールトの設定）によりＣｔ値を算出した。標品と比較して定量する場合、定量の対象となるｓＲＮＡ配列を合成（ユーロフィンジェノミクス社によるＲＮＡプライマー合成、ＨＰＬＣ精製グレード）し、１０－１０Ｍ～１０－１５Ｍの範囲で希釈系列を調製して、サンプルの測定と同時並行して前記希釈系列についてもリアルタイムＰＣＲを行い、Ｃｔ値を比較することでｓＲＮＡ量を定量した。
（実施例１）
－ノニオン性界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ ２０）による担体のコーティング－
ヤシガラ活性炭５０ｍｇ（１０－３２ ｍｅｓｈ；ナカライテスク社製）を１．５ｍＬ容量のチューブに量り取った。量り取ったヤシガラ活性炭に、Ｔｗｅｅｎ ２０（ナカライテスク社製）の２％溶液（Ｔｗｅｅｎ ２０のストック濃度が２％）を１００μＬずつ添加し、室温で１０分以上静置した。その後、静置した前記ヤシガラ活性炭を１４０００ｒｐｍ（回転／分）で２分間遠心分離し、上清を除去し、３００μＬの滅菌水を添加して洗浄し、１４０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、上清を除去することで、Ｔｗｅｅｎ ２０でコーティングされた水洗済みの活性炭を得た。
－ノニオン性界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ ２０）による担体のコーティング－
ヤシガラ活性炭５０ｍｇ（１０－３２ ｍｅｓｈ；ナカライテスク社製）を１．５ｍＬ容量のチューブに量り取った。量り取ったヤシガラ活性炭に、Ｔｗｅｅｎ ２０（ナカライテスク社製）の２％溶液（Ｔｗｅｅｎ ２０のストック濃度が２％）を１００μＬずつ添加し、室温で１０分以上静置した。その後、静置した前記ヤシガラ活性炭を１４０００ｒｐｍ（回転／分）で２分間遠心分離し、上清を除去し、３００μＬの滅菌水を添加して洗浄し、１４０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、上清を除去することで、Ｔｗｅｅｎ ２０でコーティングされた水洗済みの活性炭を得た。
－生物－
細胞壁を有する生物である、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（以下、単に「大腸菌Ｗ３１１０」と称する）を用いた。
大腸菌Ｗ３１１０をＬＢプレートに塗布して培養し、そのコロニーを２ｍＬのＬＢ培地に懸濁して、３７℃、１８０ｒｐｍで２４時間振とう培養を行った。その後、培養液を４０μＬ採取して、４ｍＬのＬＢ培地に植菌し、３７℃、１８０ｒｐｍで５時間振とう培養を行った。その後、培養液を３０００ｇ（遠心加速度）で３分間遠心分離し、上清を吸引除去した後、滅菌水を添加して大腸菌懸濁液を得た。懸濁後、ＯＤ６００（６００ｎｍの波長で測定されたサンプルの光学濃度（ＯＤ））を測定し、ＯＤ６００＝１．０となるように滅菌水で大腸菌懸濁液の濃度を調製した。
細胞壁を有する生物である、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（以下、単に「大腸菌Ｗ３１１０」と称する）を用いた。
大腸菌Ｗ３１１０をＬＢプレートに塗布して培養し、そのコロニーを２ｍＬのＬＢ培地に懸濁して、３７℃、１８０ｒｐｍで２４時間振とう培養を行った。その後、培養液を４０μＬ採取して、４ｍＬのＬＢ培地に植菌し、３７℃、１８０ｒｐｍで５時間振とう培養を行った。その後、培養液を３０００ｇ（遠心加速度）で３分間遠心分離し、上清を吸引除去した後、滅菌水を添加して大腸菌懸濁液を得た。懸濁後、ＯＤ６００（６００ｎｍの波長で測定されたサンプルの光学濃度（ＯＤ））を測定し、ＯＤ６００＝１．０となるように滅菌水で大腸菌懸濁液の濃度を調製した。
－大腸菌Ｗ３１１０の吸着及びｓＲＮＡの抽出－
前記ノニオン性界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ ２０）によりコーティングされた水洗済みの活性炭に対して、ＯＤ６００＝１．０になるように濃度を調製した大腸菌Ｗ３１１０の懸濁液を３０μＬ添加し、室温で１０分間静置することで、コーティングされた活性炭に大腸菌Ｗ３１１０を吸着させた。次いで、前記大腸菌Ｗ３１１０を吸着させた活性炭を含む懸濁液をスピンダウンして上清を除去した後、１ｍＬの滅菌水を添加して、再度スピンダウンして上清を除去することで、大腸菌Ｗ３１１０を吸着させた水洗済みの活性炭を得た。
前記大腸菌Ｗ３１１０を吸着させた水洗済みの活性炭に、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を１％含む滅菌水を５０μＬ添加して、３７℃で１時間静置することで、前記大腸菌Ｗ３１１０からｓＲＮＡを含むサンプルを抽出した。
前記ノニオン性界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ ２０）によりコーティングされた水洗済みの活性炭に対して、ＯＤ６００＝１．０になるように濃度を調製した大腸菌Ｗ３１１０の懸濁液を３０μＬ添加し、室温で１０分間静置することで、コーティングされた活性炭に大腸菌Ｗ３１１０を吸着させた。次いで、前記大腸菌Ｗ３１１０を吸着させた活性炭を含む懸濁液をスピンダウンして上清を除去した後、１ｍＬの滅菌水を添加して、再度スピンダウンして上清を除去することで、大腸菌Ｗ３１１０を吸着させた水洗済みの活性炭を得た。
前記大腸菌Ｗ３１１０を吸着させた水洗済みの活性炭に、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を１％含む滅菌水を５０μＬ添加して、３７℃で１時間静置することで、前記大腸菌Ｗ３１１０からｓＲＮＡを含むサンプルを抽出した。
－ｓＲＮＡの定量－
大腸菌Ｗ３１１０に含まれるｓＲＮＡの一種であるＥＣ－５ｐ－３６を対象として、大腸菌Ｗ３１１０からのｓＲＮＡの定量を試みた。
前記サンプルについて、リアルタイムＰＣＲ法によりＥＣ－５ｐ－３６を定量した。具体的には、スピンダウン後、１μＬの上清を採取し、上記＜リアルタイムＰＣＲ法によるｓＲＮＡの定量方法＞に従ってリアルタイムＰＣＲを行った。なおプライマーは、ＥＣ－５ｐ－３６に対応したヌクレオチド配列を有するＴａｑｍａｎ（登録商標）Ａｓｓａｙプライマーを用いた。ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（登録商標）リアルタイムＰＣＲシステム（アプライドバイオシステムズ社製）により得られたＣｔ値の結果を表５に示す。
大腸菌Ｗ３１１０に含まれるｓＲＮＡの一種であるＥＣ－５ｐ－３６を対象として、大腸菌Ｗ３１１０からのｓＲＮＡの定量を試みた。
前記サンプルについて、リアルタイムＰＣＲ法によりＥＣ－５ｐ－３６を定量した。具体的には、スピンダウン後、１μＬの上清を採取し、上記＜リアルタイムＰＣＲ法によるｓＲＮＡの定量方法＞に従ってリアルタイムＰＣＲを行った。なおプライマーは、ＥＣ－５ｐ－３６に対応したヌクレオチド配列を有するＴａｑｍａｎ（登録商標）Ａｓｓａｙプライマーを用いた。ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（登録商標）リアルタイムＰＣＲシステム（アプライドバイオシステムズ社製）により得られたＣｔ値の結果を表５に示す。
（実施例２～実施例１６及び比較例１～比較例３）
コーティング材の種類及びコーティング材のストック濃度を、以下及び表５に示すとおりに変更したこと以外は、実施例１と同様に、Ｃｔ値を求めた（表５）。表５中、ストック濃度とは、担体をコーティングするのに用いたコーティング材溶液の濃度をいう。なお比較例３は、活性炭をそのまま使用、つまり、コーティングしない活性炭を用いた。
コーティング材の種類及びコーティング材のストック濃度を、以下及び表５に示すとおりに変更したこと以外は、実施例１と同様に、Ｃｔ値を求めた（表５）。表５中、ストック濃度とは、担体をコーティングするのに用いたコーティング材溶液の濃度をいう。なお比較例３は、活性炭をそのまま使用、つまり、コーティングしない活性炭を用いた。
使用したコーティング材の詳細は以下のとおりである。
ポリソルベート２０（ナカライテスク社製、商品名：Ｔｗｅｅｎ ２０）
ポリソルベート８０（ナカライテスク社製、商品名：Ｔｗｅｅｎ ８０）
オクチルフェノールエトキシレート（ナカライテスク社製、商品名：Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）
ベンザルコニウム塩化物液（和光純薬社製、商品名：オスバン）
臭化セチルトリメチルアンモニウム（和光純薬社製、略称：ＣＴＡＢ）
ドデシル硫酸ナトリウム（和光純薬社製、略称：ＳＤＳ）
１－オクタンスルホン酸ナトリウム（和光純薬社製）
グリシン（和光純薬社製）
脱脂粉乳（和光純薬社製、商品名：スキムミルク）
ウシ血清アルブミン（和光純薬社製、略称：ＢＳＡ）
ポリエチレングリコール６０００（ナカライテスク社製、略称：ＰＥＧ－６０００）
ポリエチレングリコール４０００（ナカライテスク社製、略称：ＰＥＧ－４０００）
ポリソルベート２０（ナカライテスク社製、商品名：Ｔｗｅｅｎ ２０）
ポリソルベート８０（ナカライテスク社製、商品名：Ｔｗｅｅｎ ８０）
オクチルフェノールエトキシレート（ナカライテスク社製、商品名：Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）
ベンザルコニウム塩化物液（和光純薬社製、商品名：オスバン）
臭化セチルトリメチルアンモニウム（和光純薬社製、略称：ＣＴＡＢ）
ドデシル硫酸ナトリウム（和光純薬社製、略称：ＳＤＳ）
１－オクタンスルホン酸ナトリウム（和光純薬社製）
グリシン（和光純薬社製）
脱脂粉乳（和光純薬社製、商品名：スキムミルク）
ウシ血清アルブミン（和光純薬社製、略称：ＢＳＡ）
ポリエチレングリコール６０００（ナカライテスク社製、略称：ＰＥＧ－６０００）
ポリエチレングリコール４０００（ナカライテスク社製、略称：ＰＥＧ－４０００）
コーティング材でコーティングしない担体を用いてＣｔ値を測定したときのＣｔ値が３６．２５であった（比較例３）。そのため、Ｃｔ値が３６．２５よりも小さいとき、担体を該コーティング材でコーティングするとｓＲＮＡ抽出効率が向上したといえる。一方で、Ｃｔ値が３６．２５よりも大きい又は測定限界以上であるとき、担体を該コーティング材でコーティングするとｓＲＮＡ抽出効率が低下したといえる。なおＣｔ値が測定限界以上とは、Ｃｔ値が大きすぎることによりＣｔ値を得られなかったことを表し、生物からｓＲＮＡをほとんど抽出できなかったことを意味する。
なお、大腸菌を添加しなかった場合には、Ｃｔ値は測定限界以上となるため、表中でＣｔ値が得られたサンプルは、生物の存在状態を迅速に判定できている。
なお、大腸菌を添加しなかった場合には、Ｃｔ値は測定限界以上となるため、表中でＣｔ値が得られたサンプルは、生物の存在状態を迅速に判定できている。
実施例１～実施例１６の結果から、特定コーティング材、例えば、ノニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、又はタンパク質で担体をコーティングすると、担体をコーティング材でコーティングしないときよりも、ｓＲＮＡの抽出効率が向上した。一方で、比較例１～比較例２の結果から、親水性高分子で担体をコーティングすると、担体をコーティング材でコーティングしないとき又は前記特定のコーティング材でコーティングしたときよりも、ｓＲＮＡの抽出効率は低下した。
なおコーティング材のストック濃度によるＣｔ値の変化が見られなかったため、いずれの実施例においても、十分に活性炭をコーティングできていたことが分かった。
なお実施例１～実施例１６では、ノイズとは区別可能なＣｔ値が得られたため、各サンプルは大腸菌を含んでいると判定できた。
なおコーティング材のストック濃度によるＣｔ値の変化が見られなかったため、いずれの実施例においても、十分に活性炭をコーティングできていたことが分かった。
なお実施例１～実施例１６では、ノイズとは区別可能なＣｔ値が得られたため、各サンプルは大腸菌を含んでいると判定できた。
（実施例１７）
－ノニオン性界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ ２０）による担体のコーティング－
ヤシガラ活性炭１００ｍｇ（１０－３２ ｍｅｓｈ；ナカライテスク社製）を１．５ｍＬ容量のチューブに量り取った。量り取ったヤシガラ活性炭に、１ｍＬの滅菌水を添加した後、１０μＬずつ別のチューブに分注してヤシガラ活性炭懸濁液を得た。前記分注した１０μＬのヤシガラ活性炭懸濁液に、Ｔｗｅｅｎ ２０の２％溶液（Ｔｗｅｅｎ ２０のストック濃度が２％）を１００μＬずつ添加し、４℃で１０分間静置した。その後、静置した前記ヤシガラ活性炭を１４０００ｒｐｍ（回転／分）で２分間遠心分離し、上清を除去し、３００μＬの滅菌水を添加して洗浄し、１４０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、上清を除去することで、Ｔｗｅｅｎ ２０でコーティングされた水洗済みの活性炭を得た。
－ノニオン性界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ ２０）による担体のコーティング－
ヤシガラ活性炭１００ｍｇ（１０－３２ ｍｅｓｈ；ナカライテスク社製）を１．５ｍＬ容量のチューブに量り取った。量り取ったヤシガラ活性炭に、１ｍＬの滅菌水を添加した後、１０μＬずつ別のチューブに分注してヤシガラ活性炭懸濁液を得た。前記分注した１０μＬのヤシガラ活性炭懸濁液に、Ｔｗｅｅｎ ２０の２％溶液（Ｔｗｅｅｎ ２０のストック濃度が２％）を１００μＬずつ添加し、４℃で１０分間静置した。その後、静置した前記ヤシガラ活性炭を１４０００ｒｐｍ（回転／分）で２分間遠心分離し、上清を除去し、３００μＬの滅菌水を添加して洗浄し、１４０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、上清を除去することで、Ｔｗｅｅｎ ２０でコーティングされた水洗済みの活性炭を得た。
－生物－
細胞壁を有する生物である、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（以下、単に「大腸菌Ｗ３１１０」と称する）を用いた。
大腸菌Ｗ３１１０をＬＢプレートに塗布して培養し、そのコロニーを２ｍＬのＬＢ培地に懸濁して、３７℃、１８０ｒｐｍで２４時間振とう培養を行った。その後、培養液を４０μＬ採取して、４ｍＬのＬＢ培地に植菌し、３７℃、１８０ｒｐｍで５時間振とう培養を行った。その後、培養液を３０００ｇ（遠心加速度）で３分間遠心分離し、上清を吸引除去した後、滅菌水を添加して大腸菌懸濁液を得た。懸濁後、ＯＤ６００（６００ｎｍの波長で測定されたサンプルの光学濃度（ＯＤ））を測定し、ＯＤ６００＝１．０となるように滅菌水で大腸菌懸濁液の濃度を調製した。
細胞壁を有する生物である、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（以下、単に「大腸菌Ｗ３１１０」と称する）を用いた。
大腸菌Ｗ３１１０をＬＢプレートに塗布して培養し、そのコロニーを２ｍＬのＬＢ培地に懸濁して、３７℃、１８０ｒｐｍで２４時間振とう培養を行った。その後、培養液を４０μＬ採取して、４ｍＬのＬＢ培地に植菌し、３７℃、１８０ｒｐｍで５時間振とう培養を行った。その後、培養液を３０００ｇ（遠心加速度）で３分間遠心分離し、上清を吸引除去した後、滅菌水を添加して大腸菌懸濁液を得た。懸濁後、ＯＤ６００（６００ｎｍの波長で測定されたサンプルの光学濃度（ＯＤ））を測定し、ＯＤ６００＝１．０となるように滅菌水で大腸菌懸濁液の濃度を調製した。
－大腸菌Ｗ３１１０の吸着及びｓＲＮＡの抽出－
前記ノニオン性界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ ２０）によりコーティングされた水洗済みの活性炭に対して、ＯＤ６００＝１．０になるように濃度を調製した大腸菌Ｗ３１１０の懸濁液を３０μＬ添加し、４℃で１０分間静置することで、コーティングされた活性炭に大腸菌Ｗ３１１０を吸着させた。次いで、前記大腸菌Ｗ３１１０を吸着させた活性炭を含む溶液を５００ｒｐｍで３分間遠心分離して上清を除去した後、３０μＬの滅菌水を添加した。
前記大腸菌Ｗ３１１０を吸着させた活性炭を含む懸濁液を、９５℃で５分間熱処理することで、前記大腸菌Ｗ３１１０からｓＲＮＡを含むサンプルを抽出した。
前記ノニオン性界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ ２０）によりコーティングされた水洗済みの活性炭に対して、ＯＤ６００＝１．０になるように濃度を調製した大腸菌Ｗ３１１０の懸濁液を３０μＬ添加し、４℃で１０分間静置することで、コーティングされた活性炭に大腸菌Ｗ３１１０を吸着させた。次いで、前記大腸菌Ｗ３１１０を吸着させた活性炭を含む溶液を５００ｒｐｍで３分間遠心分離して上清を除去した後、３０μＬの滅菌水を添加した。
前記大腸菌Ｗ３１１０を吸着させた活性炭を含む懸濁液を、９５℃で５分間熱処理することで、前記大腸菌Ｗ３１１０からｓＲＮＡを含むサンプルを抽出した。
－ｓＲＮＡの定量－
大腸菌Ｗ３１１０に含まれるｓＲＮＡの一種であるＥＣ－５ｐ－３６を対象として、大腸菌Ｗ３１１０からのｓＲＮＡの定量を試みた。
前記サンプルについて、リアルタイムＰＣＲ法によりＥＣ－５ｐ－３６を定量した。具体的には、スピンダウン後、１μＬの上清を採取し、上記＜リアルタイムＰＣＲ法によるｓＲＮＡの定量方法＞に従ってリアルタイムＰＣＲを行った。なおプライマーは、ＥＣ－５ｐ－３６に対応したヌクレオチド配列を有するＴａｑｍａｎ（登録商標）Ａｓｓａｙプライマーを用いた。ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（登録商標）リアルタイムＰＣＲシステム（アプライドバイオシステムズ社製）により得られたＣｔ値の結果を表６に示す。
大腸菌Ｗ３１１０に含まれるｓＲＮＡの一種であるＥＣ－５ｐ－３６を対象として、大腸菌Ｗ３１１０からのｓＲＮＡの定量を試みた。
前記サンプルについて、リアルタイムＰＣＲ法によりＥＣ－５ｐ－３６を定量した。具体的には、スピンダウン後、１μＬの上清を採取し、上記＜リアルタイムＰＣＲ法によるｓＲＮＡの定量方法＞に従ってリアルタイムＰＣＲを行った。なおプライマーは、ＥＣ－５ｐ－３６に対応したヌクレオチド配列を有するＴａｑｍａｎ（登録商標）Ａｓｓａｙプライマーを用いた。ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（登録商標）リアルタイムＰＣＲシステム（アプライドバイオシステムズ社製）により得られたＣｔ値の結果を表６に示す。
（実施例１８～実施例２４及び比較例４～比較例５）
実施例１８～実施例２４及び比較例４～比較例５においては、コーティング材の種類及を、表６に示すとおりに変更したこと以外は、実施例１７と同様に、Ｃｔ値を求めた（表６）。使用したコーティング材の詳細は、前述したコーティング材の詳細と同様である。
実施例１８～実施例２４及び比較例４～比較例５においては、コーティング材の種類及を、表６に示すとおりに変更したこと以外は、実施例１７と同様に、Ｃｔ値を求めた（表６）。使用したコーティング材の詳細は、前述したコーティング材の詳細と同様である。
コーティング材でコーティングしない担体を用いて、さらに前記担体に吸着した生物を９５℃で５分間熱処理してＣｔ値を測定したときのＣｔ値が３０．８であった（比較例５）。そのため、担体に吸着した生物を加熱したとしても、Ｃｔ値が３０．８よりも小さいとき、担体を該コーティング材でコーティングするとｓＲＮＡ抽出効率が向上したといえる。一方で、Ｃｔ値が３０．８よりも大きいとき、担体を該コーティング材でコーティングするとｓＲＮＡ抽出効率が低下したといえる。
なお、大腸菌を添加しなかった場合には、Ｃｔ値は測定限界以上となるため、表中でＣｔ値が得られたサンプルは、生物の存在状態を判定できたサンプルである。
なお、大腸菌を添加しなかった場合には、Ｃｔ値は測定限界以上となるため、表中でＣｔ値が得られたサンプルは、生物の存在状態を判定できたサンプルである。
実施例１７～実施例２４の結果から、特定コーティング材、例えば、ノニオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、タンパク質、又はアミノ酸で担体をコーティングすると、担体をコーティング材でコーティングしないときよりも、ｓＲＮＡの抽出効率が向上した。一方で、比較例４の結果から、親水性高分子で担体をコーティングすると、担体をコーティング材でコーティングしないとき又は前記特定コーティング材でコーティングしたときよりも、ｓＲＮＡの抽出効率は低下した。
また、大腸菌Ｗ３１１０を吸着させた活性炭を、水性溶媒に浸漬することでｓＲＮＡを抽出したサンプルのＣｔ値は３６．２５であった（比較例３）。一方で、前記大腸菌Ｗ３１１０を吸着させた活性炭を含む懸濁液を、９５℃で５分間熱処理することでｓＲＮＡを抽出したサンプルのＣｔ値は３０．８であった（比較例５）。このことから、水性溶媒への浸漬よりも、熱処理のほうが、ｓＲＮＡ抽出効率が向上したことが分かった。
実施例１～実施例１６の結果及び実施例１７～実施例２４の結果の比較からも、水性溶媒への浸漬よりも、熱処理のほうが、ｓＲＮＡ抽出効率が向上し、さらには水性溶媒への浸漬又は熱処理のいずれであっても、特定コーティング材でコーティングすることによりｓＲＮＡ抽出効率が向上したことが分かった。
なお実施例１７～実施例２４では、ノイズと区別可能なＣｔ値が得られたため、各サンプルは大腸菌を含んでいると判定できた。
また、大腸菌Ｗ３１１０を吸着させた活性炭を、水性溶媒に浸漬することでｓＲＮＡを抽出したサンプルのＣｔ値は３６．２５であった（比較例３）。一方で、前記大腸菌Ｗ３１１０を吸着させた活性炭を含む懸濁液を、９５℃で５分間熱処理することでｓＲＮＡを抽出したサンプルのＣｔ値は３０．８であった（比較例５）。このことから、水性溶媒への浸漬よりも、熱処理のほうが、ｓＲＮＡ抽出効率が向上したことが分かった。
実施例１～実施例１６の結果及び実施例１７～実施例２４の結果の比較からも、水性溶媒への浸漬よりも、熱処理のほうが、ｓＲＮＡ抽出効率が向上し、さらには水性溶媒への浸漬又は熱処理のいずれであっても、特定コーティング材でコーティングすることによりｓＲＮＡ抽出効率が向上したことが分かった。
なお実施例１７～実施例２４では、ノイズと区別可能なＣｔ値が得られたため、各サンプルは大腸菌を含んでいると判定できた。
以上のことから、実施例１～実施例２４では、生物から効率的にｓＲＮＡを抽出する方法、又は生物の存在状態を迅速に判定する方法を提供することができた。
（参考例１）ｓＲＮＡ１３、１４、１５及び３４による腸内細菌科に属する菌の検出
腸内細菌科に属する菌であるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ、及びＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍの各菌をＬＢプレートに播種して培養し、生じたコロニーを２ｍＬのＬＢ培地に懸濁して、３７℃、１８０ｒｐｍで２４時間振とう培養を行った。その後、培養液４０μＬを採取して、４ｍＬのＬＢ培地に植菌し、３７℃、１８０ｒｐｍで２４時間振とう培養を行った。その後、培養液を３０００Ｇで５分間遠心し、上清を吸引除去した後、滅菌水を添加した。この際、ＯＤ６００を測定し、滅菌水でＯＤ＝１に調整して菌懸濁液を調製した。調製した菌懸濁液から５００μＬの試料を３個用意し、それぞれ５℃、２５℃、又は３７℃で１時間静置した。
腸内細菌科に属する菌であるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ、及びＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍの各菌をＬＢプレートに播種して培養し、生じたコロニーを２ｍＬのＬＢ培地に懸濁して、３７℃、１８０ｒｐｍで２４時間振とう培養を行った。その後、培養液４０μＬを採取して、４ｍＬのＬＢ培地に植菌し、３７℃、１８０ｒｐｍで２４時間振とう培養を行った。その後、培養液を３０００Ｇで５分間遠心し、上清を吸引除去した後、滅菌水を添加した。この際、ＯＤ６００を測定し、滅菌水でＯＤ＝１に調整して菌懸濁液を調製した。調製した菌懸濁液から５００μＬの試料を３個用意し、それぞれ５℃、２５℃、又は３７℃で１時間静置した。
次いで、静置後の菌懸濁液中のｓＲＮＡ（ｓＲＮＡ１３、ｓＲＮＡ１４、ｓＲＮＡ１５及びｓＲＮＡ３４）を対象として、逆転写反応及びリアルタイムＰＣＲを行った。静置後の菌懸濁液各１μＬのサンプルを用い、上記＜リアルタイムＰＣＲ法によるｓＲＮＡの定量方法＞に従ってリアルタイムＰＣＲを行った。リアルタイムＰＣＲシステム（アプライドバイオシステムズ社製）により得られたＣｔ値の結果を表７に示す。いずれの場合においても、Ｃｔ値が３０以下を示し、調査対象である腸内細菌科の菌の存在が検出された。したがって、腸内細菌科のｔＲＮＡ及びその他のｓＲＮＡを用いても、腸内細菌科の微生物の検出が可能であることが示された。
（参考例２）Ｅ． ｃｏｌｉからのｓＲＮＡ抽出時の添加剤による影響の検討
大腸菌Ｗ３１１０をＬＢプレートに塗布して培養し、生じたコロニーを２ｍＬのＬＢ培地に懸濁して、３７℃、１８０ｒｐｍで２４時間振とう培養を行った。得られた培養液を４０μＬ採取して、４ｍＬのＬＢ培地に植菌し、３７℃、１８０ｒｐｍで５時間振とう培養を行った。その後、培養液を３０００Ｇで３分間遠心し、上清を吸引除去した後、滅菌水を添加した。ＯＤ６００を測定し、ＯＤ６００の値が１．０となるように滅菌水で希釈し、ＯＤ１．０大腸菌Ｗ３１１０懸濁液とした。
大腸菌Ｗ３１１０をＬＢプレートに塗布して培養し、生じたコロニーを２ｍＬのＬＢ培地に懸濁して、３７℃、１８０ｒｐｍで２４時間振とう培養を行った。得られた培養液を４０μＬ採取して、４ｍＬのＬＢ培地に植菌し、３７℃、１８０ｒｐｍで５時間振とう培養を行った。その後、培養液を３０００Ｇで３分間遠心し、上清を吸引除去した後、滅菌水を添加した。ＯＤ６００を測定し、ＯＤ６００の値が１．０となるように滅菌水で希釈し、ＯＤ１．０大腸菌Ｗ３１１０懸濁液とした。
ＯＤ１．０大腸菌Ｗ３１１０懸濁液を１０μＬ採取し、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を終濃度が１質量％になるように１０μＬ添加して、ＯＤ６００の値が０．５となるように滅菌水で希釈したのち、３７℃で１時間放置した。１時間放置後の液体試料を用いて、リアルタイムＰＣＲ法によりＥＣ－５ｐ－３６の定量を行った。具体的には、１μＬの液体試料を採取し、上記＜リアルタイムＰＣＲ法によるｓＲＮＡの定量方法＞に従ってリアルタイムＰＣＲを行い、Ｃｔ値を求めた。別途、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を添加しない以外は上記と同様に作製した対照（添加剤なしの参考例１３）についてもリアルタイムＰＣＲ法によりＣｔ値を得た。参考例１３のＣｔ値から参考例２のＣｔ値を引き、得られた値（つまり、添加剤無しの対照と比較してのＣｔ値の減少）を「スコア」とした。スコアが正の値であれば、Ｃｔ値が減少したことを示し、すなわちｓＲＮＡの抽出量が増大したことを示す。逆にスコアが負の値の場合は、Ｃｔ値が増加したことを示し、すなわちｓＲＮＡの抽出量が減少したことを示す。また、スコアが「検出限界未満」と記載されている参考例については、ｓＲＮＡの増幅は観察されず、Ｃｔ値が得られなかった（つまり、ｓＲＮＡの抽出量は、検出限界未満にまで減少した）。各添加剤に関する結果を表８に示す。
（参考例３～１２）
大腸菌Ｗ３１１０懸濁液の濃度が参考例２と同様になるように、表８に示す添加剤を用い、その終濃度を表８に示す通りとしたこと以外は参考例２と同様にして、スコアを測定した。例えば、参考例３のＳｙｎｐｅｒｏｉｎｃ Ｆ１０８の場合、Ｓｙｎｐｅｒｏｉｎｃ Ｆ１０８の２質量％水溶液を用いて、ＯＤ１．０大腸菌Ｗ３１１０懸濁液１０μＬに対して１０μＬを添加し、ＯＤ６００の値が０．５となり、かつＳｙｎｐｅｒｏｉｎｃ Ｆ１０８の終濃度（得られた液体試料中における濃度）が１質量％となるようにした。参考例３～１２についても、結果を表８に示す。
大腸菌Ｗ３１１０懸濁液の濃度が参考例２と同様になるように、表８に示す添加剤を用い、その終濃度を表８に示す通りとしたこと以外は参考例２と同様にして、スコアを測定した。例えば、参考例３のＳｙｎｐｅｒｏｉｎｃ Ｆ１０８の場合、Ｓｙｎｐｅｒｏｉｎｃ Ｆ１０８の２質量％水溶液を用いて、ＯＤ１．０大腸菌Ｗ３１１０懸濁液１０μＬに対して１０μＬを添加し、ＯＤ６００の値が０．５となり、かつＳｙｎｐｅｒｏｉｎｃ Ｆ１０８の終濃度（得られた液体試料中における濃度）が１質量％となるようにした。参考例３～１２についても、結果を表８に示す。
表８に示された結果から分かるように、ノニオン性界面活性剤、抗菌ペプチド、１価又は２価の直鎖、分枝鎖又は脂環式のＣ２～Ｃ８アルコール、アセトン、及び還元剤を、本開示に規定の含有量範囲内で用いた場合、これら添加剤の含有によりｓＲＮＡの抽出効率が向上するという効果が確認された。一方、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、及び酸化剤を添加剤として用いた場合には、ｓＲＮＡの抽出効率は逆に低下することが確認された。
本明細書に記載された全ての文献、特許出願、および技術規格は、個々の文献、特許出願、および技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。
Claims (22)
- 細胞壁を有する生物と、ノニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、アミノ酸、オリゴペプチド、及びタンパク質からなる群より選択されるコーティング材でコーティングされた担体とを、第一の液体中で共存させることにより、前記生物を前記コーティングされた担体に吸着させること、及び
前記生物を吸着した前記コーティングされた担体を、前記第一の液体と同じであっても異なっていてもよい第二の液体中に浸漬することにより、前記生物由来のｓＲＮＡを前記第二の液体中に抽出すること、
を含み、前記第二の液体は水性溶媒であり、
前記コーティング材は前記生物を吸着させるがｓＲＮＡの吸着を低減させる、
生物からのｓＲＮＡの抽出方法。 - 前記浸漬は加熱下で行われる、請求項１に記載の抽出方法。
- 細胞壁を有する生物と、ノニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、アミノ酸、オリゴペプチド、及びタンパク質からなる群より選択されるコーティング材でコーティングされた担体とを、第一の液体中で共存させることにより、前記生物を前記コーティングされた担体に吸着させること、
前記生物を吸着した前記コーティングされた担体を、前記第一の液体と同じであっても異なっていてもよい第二の液体中に浸漬することにより、前記生物由来のｓＲＮＡを前記第二の液体中に抽出すること、
前記抽出されたｓＲＮＡの存在状態を検出すること、及び
得られたｓＲＮＡの存在状態を基に、前記生物の存在状態を判定すること、
を含み、前記第二の液体は水性溶媒であり、
前記コーティング材は前記生物を吸着させるがｓＲＮＡの吸着を低減させる、
生物の存在状態の判定方法。 - 前記ｓＲＮＡは１種又は複数種のｓＲＮＡである、請求項３に記載の判定方法。
- 前記浸漬は加熱下で行われる、請求項３又は請求項４に記載の判定方法。
- 前記水性溶媒が核酸増幅用試薬を含む、請求項３に記載の判定方法。
- 前記浸漬が０℃～５０℃の温度範囲内の温度で行われる、請求項３～請求項６のうちいずれか一項に記載の判定方法。
- 前記担体は、活性炭、シリカ、ゼオライト、多孔性セラミックス、炭素繊維、砂、及びガラスビーズからなる群より選択される少なくとも一種である、請求項３～請求項７のうちいずれか一項に記載の判定方法。
- 前記ノニオン性界面活性剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、及びオクチルフェノールエトキシレートからなる群より選択される少なくとも一種である、請求項３～請求項８のうちいずれか一項に記載の判定方法。
- 前記カチオン性界面活性剤は、ベンザルコニウム塩化物及び臭化セチルトリメチルアンモニウムからなる群より選択される少なくとも一種である、請求項３～請求項８のうちいずれか一項に記載の判定方法。
- 前記アニオン性界面活性剤は、ドデシル硫酸ナトリウム及び１－オクタンスルホン酸ナトリウムからなる群より選択される少なくとも一種である、請求項３～請求項８のうちいずれか一項に記載の判定方法。
- 前記アミノ酸は、グリシンである、請求項３～請求項８のうちいずれか一項に記載の判定方法。
- 前記タンパク質は、脱脂粉乳、及びウシ血清アルブミンからなる群より選択される少なくとも一種である、請求項３～請求項８のうちいずれか一項に記載の判定方法。
- 前記ｓＲＮＡは、前記生物中に存在する、請求項３～請求項１３のうちいずれか一項に記載の判定方法。
- 前記生物の存在状態を判定することが、２種以上の生物の総体的な存在状態を判定することを含む、請求項３～請求項１４のうちいずれか一項に記載の判定方法。
- 前記ｓＲＮＡの存在状態を検出することが、前記ｓＲＮＡの存在量を判定することを含む、請求項３～請求項１５のうちいずれか一項に記載の判定方法。
- 前記生物が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ、及びＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍからなる群より選ばれる少なくとも一種の細胞壁を有する生物を含む、請求項３～請求項１６のうちいずれか一項に記載の判定方法。
- 前記生物が植物を含む、請求項３～請求項１７のうちいずれか一項に記載の判定方法。
- 前記生物がベロ毒素生産菌を含む、請求項３～請求項１８のうちいずれか一項に記載の判定方法。
- 前記ｓＲＮＡそれぞれの塩基数が、５～５００の範囲内である、請求項３～請求項１９のうちいずれか一項に記載の判定方法。
- 前記ｓＲＮＡは、配列番号１で表されるヌクレオチド配列を有するＥＣ－５ｐ－３６、配列番号２で表されるヌクレオチド配列を有するＥＣ－３ｐ－４０、配列番号３で表されるヌクレオチド配列を有するＥＣ－５ｐ－７９、配列番号４で表されるヌクレオチド配列を有するＥＣ－３ｐ－３９３、配列番号５で表されるヌクレオチド配列を有するｆｏｘ＿ｍｉｌＲＮＡ＿５、配列番号６で表されるヌクレオチド配列を有するｍｉＲ１５６、及び配列番号７で表されるヌクレオチド配列を有するｍｉＲ７１６ｂからなる群より選択される少なくとも１種を含む、請求項３～請求項２０のうちいずれか一項に記載の判定方法。
- 前記ｓＲＮＡの存在状態を検出することがＰＣＲにより行われる、請求項３～請求項２１のうちいずれか一項に記載の判定方法。
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