JP7668013B2 - Ａｌｋ２／ａｃｖｒ１の細胞外領域を認識する抗体 - Google Patents

Description

本発明は、ＡＬＫ２／ＡＣＶＲ１（以下、特に断らない限り「ＡＬＫ２」と称する。）の細胞外領域を認識する抗体、具体的にはさらにＡＬＫ２キナーゼ活性を阻害する抗体、又はＢＭＰシグナル伝達を阻害する抗体に関する。

本発明はまた、上記抗体を用いて、ＡＬＫ２を発現する細胞においてＡＬＫ２キナーゼ活性を阻害する方法、又はＢＭＰシグナル伝達を阻害する方法に関する。

ＡＬＫ２は、Ａｃｔｉｖｉｎ Ｌｉｋｅ Ｋｉｎａｓｅ ２（アクチビン様キナーゼ２）の略称であり、別称Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ ｔｙｐｅ Ｉ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ １（ＡＣＶＲ１）とも呼ばれるタンパク質であり、骨形成蛋白質（Ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＢＭＰ））の受容体の一種である。

ヒト及びマウスＡＬＫ２は、５０９アミノ酸からなるシグナルペプチドを持つ１回膜貫通型タンパク質で、ＢＭＰと結合する膜貫通型のセリン・スレオニン・キナーゼ受容体として機能する（非特許文献１～３）。Ｎ末端側の細胞外領域でＢＭＰを結合し、細胞内のセリン・スレオニン・キナーゼによって下流の細胞内情報伝達系を活性化する。

異所性に軟骨組織や骨組織が形成される遺伝性疾患である家族性及び孤発性ＦＯＰ（進行性骨化性線維異形成症（Ｆｉｂｒｏｄｙｓｐｌａｓｉａ ｏｓｓｉｆｉｃａｎｓ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖａ））症例から、アミノ酸置換を伴った活性化型ＡＬＫ２が見出されており、ＦＯＰの責任因子として注目されている（非特許文献４）。

ＡＬＫ２に特異的に結合しＢＭＰシグナル伝達を阻害する抗体に関して、例えば特許文献１には、抗ＡＬＫ２抗体、並びに異所性骨化及び／又は骨形成異常の治療への使用などが開示されている。

国際公開ＷＯ２０１６／１２１９０８号

Ｔ．Ｋａｔａｇｉｒｉ，Ｊ．Ｏｒａｌ Ｂｉｏｓｃｉ．，５２，３３－４１（２０１０） Ｔ．Ｋａｔａｇｉｒｉ，Ｊ．Ｏｒａｌ Ｂｉｏｓｃｉ．，５４，１１９－１２３（２０１２） Ｔ．Ｋａｔａｇｉｒｉ ａｎｄ Ｓ．Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３９４，７０３－７１４（２０１３） Ｅ．Ｍ．Ｓｈｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，３８，５２５－５２７（２００６）

本発明者らは、これまで抗ＡＬＫ２抗体を開発してきた。それらはヒト及びマウスＡＬＫ２を認識し、リガンド依存的な細胞内シグナルを用量依存的に阻害するが、組織切片を用いた免疫組織学的な解析、還元した変性ＡＬＫ２を用いたウェスタンブロット解析ではＡＬＫ２を認識できないことが分かった。

したがって本発明の目的は、治療薬としてのみならず、免疫学的かつ免疫組織学的な解析ツールとして有用である抗ＡＬＫ２抗体を提供することである。

上記目的を達成するために、ヒトＡＬＫ２に対する多数のラットモノクローナル抗体産生クローンを作製し、そのなかから免疫学的かつ免疫組織学的な解析ツールとして有用である抗ＡＬＫ２抗体を見出した。これらの抗体のなかには、ヒト、マウス及びラットＡＬＫ２を認識する抗体も含まれていた。さらに、このような抗体はまた、ＢＭＰ受容体（ＡＬＫ２及びＴｙｐｅＩＩ受容体からなる四量体）に対して不完全な又は緩い（ｌｏｏｓｅ）立体的構造変化をもたらすことによりＡＬＫ２／ＡＣＶＲ１（ＴｙｐｅＩ受容体）とＴｙｐｅＩＩ受容体の相互作用が阻害され、それにより受容体の活性化抑制効果を発揮することも今回見出された。

したがって、本発明は、以下の特徴を包含する。
[１]以下の（ａ）乃至（ｃ）に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを特異的に認識し、ＢＭＰシグナル伝達を抑制する抗体又は該抗体の抗原結合断片：
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号３に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列。
[２]配列番号３に示されるアミノ酸配列中の６４番目のアルギニンを含むエピトープに結合することを特徴とする、上記[１]に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
[３]重鎖配列が、配列番号１３（ＣＤＲＨ１）、配列番号１４（ＣＤＲＨ２）及び配列番号１５（ＣＤＲＨ３）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ配列を含む可変領域を含み、並びに、軽鎖配列が、配列番号１６（ＣＤＲＬ１）、配列番号１７（ＣＤＲＬ２）及び配列番号１８（ＣＤＲＬ３）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ配列を含む可変領域を含むことを特徴とする、上記[１]又は[２]に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
[４]配列番号９に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域配列及び配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域配列を含むことを特徴とする上記[３]に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
[５]上記[３]又は[４]に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片と、ＡＬＫ２タンパク質の細胞外領域への結合に対し交差競合することを特徴とする、上記[１]又は[２]に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
[６]モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ラット抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、ダイアボディ、多特異性抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’、Ｆｖ、又はｓｃＦｖである、上記[１]乃至[５]のいずれかに記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
[７]重鎖定常領域のアイソタイプがＩｇＧ２ｂであることを特徴とする、上記[１]乃至[５]のいずれかに記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
[８]上記[１]乃至[７]のいずれかに記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片の少なくともいずれか一つを含むことを特徴とする、医薬組成物。
[９]異所性骨化及び／又はびまん性橋膠腫（ＤＩＰＧ）の治療及び／又は予防剤であることを特徴とする、上記[８]に記載の医薬組成物。
[１０]異所性骨化が、進行性骨化性線維形成異常症（ＦＯＰ）である、上記[９]に記載の医薬組成物。
[１１]ＡＬＫ２タンパク質に対する結合活性を有する抗体又は該抗体の抗原結合断片であって、重鎖配列が、配列番号１３（ＣＤＲＨ１）、配列番号１４（ＣＤＲＨ２）及び配列番号１５（ＣＤＲＨ３）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ配列を含む可変領域を含み、並びに、軽鎖配列が、配列番号１６（ＣＤＲＬ１）、配列番号１７（ＣＤＲＬ２）及び配列番号１８（ＣＤＲＬ３）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ配列を含む可変領域を含むことを特徴とする抗体又は該抗体の抗原結合断片、或いは、前記ＡＬＫ２タンパク質への結合に対し前記抗体又は抗原結合断片と交差競合する抗体又は該抗体の抗原結合断片。
[１２]ＡＬＫ２タンパク質に対する結合活性を有する抗体又は該抗体の抗原結合断片であって、重鎖配列が、配列番号２３（ＣＤＲＨ１）、配列番号２４（ＣＤＲＨ２）及び配列番号２５（ＣＤＲＨ３）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ配列を含む可変領域を含み、並びに、軽鎖配列が、配列番号２６（ＣＤＲＬ１）、配列番号２７（ＣＤＲＬ２）及び配列番号２８（ＣＤＲＬ３）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ配列を含む可変領域を含むことを特徴とする抗体又は該抗体の抗原結合断片、或いは、前記ＡＬＫ２タンパク質への結合に対し前記抗体又は抗原結合断片と交差競合する抗体又は該抗体の抗原結合断片。
[１３]配列番号９に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域配列を含む重鎖及び配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域配列を含む軽鎖からなる抗体又は該抗体の抗原結合断片、或いは、前記ＡＬＫ２タンパク質への結合に対し前記抗体又は抗原結合断片と交差競合する抗体又は該抗体の抗原結合断片。
[１４]配列番号１９に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域配列を含む重鎖及び配列番号２１に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域配列を含む軽鎖からなる抗体又は該抗体の抗原結合断片、或いは、前記ＡＬＫ２タンパク質への結合に対し前記抗体又は抗原結合断片と交差競合する抗体又は該抗体の抗原結合断片。
[１５]上記[１]乃至[７]、[１１]、[１３]のいずれかに記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片の、免疫染色への使用。
[１６]免疫染色が、組織の凍結切片又はパラフィン切片を用いることを特徴とする、上記[１５]に記載の使用。
[１７]上記[１２]又は[１４]に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片の、免疫染色又はウェスタンブロッティングへの使用。
[１８]上記[１]乃至[７]、[１１]、[１３]のいずれかに記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片の、異所性骨化及び／又はびまん性橋膠腫（ＤＩＰＧ）の治療及び／又は予防剤としての使用。
[１９]上記[１]乃至[７]、[１１]、[１３]のいずれかに記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片の、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ５及び／又はＳＭＡＤ８のリン酸化阻害剤としての使用。
[２０]上記[１]乃至[７]、[１１]乃至[１４]のいずれかに記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド。
[２１]上記[２０]に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
[２２]細胞表面にＡＬＫ２タンパク質を発現する細胞において、ＡＬＫ２の細胞外領域に特異的に結合し、ＡＬＫ２ホモ二量体を形成する性質、及びＡＬＫ２－ＴｙｐｅＩＩ受容体ヘテロ二量体の形成を阻害する性質を有する抗体を作用してＡＬＫ２キナーゼの活性化を阻害することを特徴とする、ＡＬＫ２キナーゼの活性化を阻害する方法。
[２３]細胞表面にＡＬＫ２タンパク質を発現する細胞において、ＡＬＫ２の細胞外領域に特異的に結合し、ＡＬＫ２ホモ二量体を形成する性質、及びＡＬＫ２－ＴｙｐｅＩＩ受容体ヘテロ二量体の形成を阻害する性質を有する抗体を作用してＢＭＰシグナル伝達を阻害することを特徴とする、ＢＭＰシグナル伝達を阻害する方法。
[２４]ＡＬＫ２の３３０番目のアミノ酸残基がプロリンである、上記[２２]又は[２３]に記載の方法。
[２５]ＡＬＫ２が活性化型変異を有する、上記[２２]又は[２３]に記載の方法。
[２６]ＡＬＫ２の活性化型変異が、Ｌ１９６Ｐ、ｄｅｌＰ１９７＿Ｆ１９８ｉｎｓＬ、Ｒ２０２Ｉ、Ｒ２０６Ｈ、Ｑ２０７Ｅ、Ｒ２５８Ｓ、Ｒ２５８Ｇ、Ｇ３２５Ａ、Ｇ３２８Ｅ、Ｇ３２８Ｒ、Ｇ３２８Ｗ、Ｇ３５６Ｄ、Ｒ３７５Ｐ、及びＫ４００Ｅから選択される少なくとも一つである、上記[２５]に記載の方法。
[２７]ＡＬＫ２の活性化型変異が、Ｒ２０６Ｈ変異である、上記[２５]に記載の方法。
[２８]抗体が、モノクローナル抗体又は該抗体の抗原結合断片である、上記[２２]乃至[２７]のいずれかに記載の方法。
[２９]モノクローナル抗体又は該抗体の抗原結合断片が、下記の（１）乃至（５）に記載の少なくとも１つの抗体又は該抗体の抗原結合断片：
（１）配列番号１３（ＣＤＲＨ１）、配列番号１４（ＣＤＲＨ２）及び配列番号１５（ＣＤＲＨ３）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲを含む重鎖可変領域、並びに、配列番号１６（ＣＤＲＬ１）、配列番号１７（ＣＤＲＬ２）及び配列番号１８（ＣＤＲＬ３）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合断片、或いは、前記抗体又は該抗体の抗原結合断片と、ＡＬＫ２タンパク質の細胞外領域への結合に対し交差競合する抗体又は該抗体の抗原結合断片；
（２）配列番号２９（ＣＤＲＨ１）、配列番号３０（ＣＤＲＨ２）及び配列番号３１（ＣＤＲＨ３）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲを含む重鎖可変領域、並びに、配列番号３２（ＣＤＲＬ１）、配列番号３３（ＣＤＲＬ２）及び配列番号３４（ＣＤＲＬ３）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合断片、或いは、前記抗体又は該抗体の抗原結合断片と、ＡＬＫ２タンパク質の細胞外領域への結合に対し交差競合する抗体又は該抗体の抗原結合断片；
（３）配列番号３５（ＣＤＲＨ１）、配列番号３６（ＣＤＲＨ２）及び配列番号３７（ＣＤＲＨ３）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲを含む重鎖可変領域、並びに、配列番号３８（ＣＤＲＬ１）、配列番号３９（ＣＤＲＬ２）及び配列番号４０（ＣＤＲＬ３）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合断片、或いは、前記抗体又は該抗体の抗原結合断片と、ＡＬＫ２タンパク質の細胞外領域への結合に対し交差競合する抗体又は該抗体の抗原結合断片；
（４）配列番号４１（ＣＤＲＨ１）、配列番号４２（ＣＤＲＨ２）及び配列番号４３（ＣＤＲＨ３）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲを含む重鎖可変領域、並びに、配列番号４４（ＣＤＲＬ１）、配列番号４５（ＣＤＲＬ２）及び配列番号４６（ＣＤＲＬ３）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合断片、或いは、前記抗体又は該抗体の抗原結合断片と、ＡＬＫ２タンパク質の細胞外領域への結合に対し交差競合する抗体又は該抗体の抗原結合断片；或いは
（５）配列番号４７（ＣＤＲＨ１）、配列番号４８（ＣＤＲＨ２）及び配列番号４９（ＣＤＲＨ３）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲを含む重鎖可変領域、並びに、配列番号５０（ＣＤＲＬ１）、配列番号５１（ＣＤＲＬ２）及び配列番号５２（ＣＤＲＬ３）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合断片、或いは、前記抗体又は該抗体の抗原結合断片と、ＡＬＫ２タンパク質の細胞外領域への結合に対し交差競合する抗体又は該抗体の抗原結合断片、
であることを特徴とする、上記[２２]乃至[２８]のいずれかに記載の方法。
或いは、本発明は、以下の特徴を有する。

[１']以下の（ａ）～（ｃ）に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを特異的に認識し、ＢＭＰシグナル伝達を抑制する抗体又は該抗体の抗原結合断片：
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の２１～１２３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の２１～１２３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号３に示されるアミノ酸配列の２１～１２３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列。
[２']配列番号３に示されるアミノ酸配列中の６４番目のアルギニンを含むエピトープに結合することを特徴とする、上記[１']に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
[３']重鎖配列が、配列番号１３（ＣＤＲＨ１）、配列番号１４（ＣＤＲＨ２）及び配列番号１５（ＣＤＲＨ３）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ配列を含む可変領域を含み、並びに、軽鎖配列が、配列番号１６（ＣＤＲＬ１）、配列番号１７（ＣＤＲＬ２）及び配列番号１８（ＣＤＲＬ３）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ配列を含む可変領域を含むことを特徴とする、上記[１']又は[２']に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
[４']配列番号９に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域配列及び配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域配列を含むことを特徴とする上記[３']に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
[５']上記[３']又は[４']に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片と、ＡＬＫ２タンパク質の細胞外領域への結合に対し交差競合することを特徴とする、上記[１']又は[２']に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
[６']モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ラット抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、ダイアボディ、多特異性抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’、Ｆｖ、又はｓｃＦｖである、上記[１']～[５']のいずれかに記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
[７']重鎖定常領域のアイソタイプがＩｇＧ２ｂであることを特徴とする、上記[１']～[５']のいずれかに記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
[８']上記[１']～[７']のいずれかに記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片の少なくともいずれか一つを含むことを特徴とする、医薬組成物。
[９']異所性骨化及び／又はびまん性橋膠腫（ＤＩＰＧ）の治療及び／又は予防剤であることを特徴とする、上記[８']に記載の医薬組成物。
[１０']異所性骨化が、進行性骨化性線維形成異常症（ＦＯＰ）である、上記[９']に記載の医薬組成物。
[１１']ＡＬＫ２タンパク質に対する結合活性を有する抗体又は該抗体の抗原結合断片であって、重鎖配列が、配列番号１３（ＣＤＲＨ１）、配列番号１４（ＣＤＲＨ２）及び配列番号１５（ＣＤＲＨ３）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ配列を含む可変領域を含み、並びに、軽鎖配列が、配列番号１６（ＣＤＲＬ１）、配列番号１７（ＣＤＲＬ２）及び配列番号１８（ＣＤＲＬ３）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ配列を含む可変領域を含むことを特徴とする抗体又は該抗体の抗原結合断片、或いは、上記ＡＬＫ２タンパク質への結合に対し上記抗体又は抗原結合断片と交差競合する抗体又は該抗体の抗原結合断片。
[１２']ＡＬＫ２タンパク質に対する結合活性を有する抗体又は該抗体の抗原結合断片であって、重鎖配列が、配列番号２３（ＣＤＲＨ１）、配列番号２４（ＣＤＲＨ２）及び配列番号２５（ＣＤＲＨ３）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ配列を含む可変領域を含み、並びに、軽鎖配列が、配列番号２６（ＣＤＲＬ１）、配列番号２７（ＣＤＲＬ２）及び配列番号２８（ＣＤＲＬ３）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ配列を含む可変領域を含むことを特徴とする抗体又は該抗体の抗原結合断片、或いは、上記ＡＬＫ２タンパク質への結合に対し上記抗体又は抗原結合断片と交差競合する抗体又は該抗体の抗原結合断片。
[１３']配列番号９に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域配列を含む重鎖及び配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域配列を含む軽鎖からなる抗体又は該抗体の抗原結合断片、或いは、上記ＡＬＫ２タンパク質への結合に対し上記抗体又は抗原結合断片と交差競合する抗体又は該抗体の抗原結合断片。
[１４']配列番号１９に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域配列を含む重鎖及び配列番号２１に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域配列を含む軽鎖からなる抗体又は該抗体の抗原結合断片、或いは、上記ＡＬＫ２タンパク質への結合に対し上記抗体又は抗原結合断片と交差競合する抗体又は該抗体の抗原結合断片。
[１５']上記[１']～[７']、[１１']、[１３']のいずれかに記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片の、免疫染色への使用。
[１６']上記[１２']又は[１４']に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片の、免疫染色又はウェスタンブロッティングへの使用。
[１７']免疫染色が、組織の凍結切片又はパラフィン切片を用いることを特徴とする、上記[１５']又は[１６']に記載の使用。
[１８']上記[１']～[７']、[１１']、[１３']のいずれかに記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片の、異所性骨化及び／又はびまん性橋膠腫（ＤＩＰＧ）の治療及び／又は予防剤としての使用。
[１９']上記[１']～[７']、[１１']、[１３']のいずれかに記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片の、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ５及び／又はＳＭＡＤ８のリン酸化阻害剤としての使用。
[２０']上記[１']～[７']、[１１']～[１４']のいずれかに記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド。
[２１']上記[２０']に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
[２２']細胞表面にＡＬＫ２タンパク質を発現する細胞において、ＡＬＫ２の細胞外領域に特異的に結合し、ＡＬＫ２ホモ二量体を形成する性質、及びＡＬＫ２－ＴｙｐｅＩＩ受容体ヘテロ二量体の形成を阻害する性質を有する抗体を作用してＡＬＫ２キナーゼの活性化を阻害することを特徴とする、ＡＬＫ２キナーゼの活性化を阻害する方法。
[２３']細胞表面にＡＬＫ２タンパク質を発現する細胞において、ＡＬＫ２の細胞外領域に特異的に結合し、ＡＬＫ２ホモ二量体を形成する性質、及びＡＬＫ２－ＴｙｐｅＩＩ受容体ヘテロ二量体の形成を阻害する性質を有する抗体を作用してＢＭＰシグナル伝達を阻害することを特徴とする、ＢＭＰシグナル伝達を阻害する方法。
[２４']ＡＬＫ２の３３０番目のアミノ酸残基がプロリンである、上記[２２']又は[２３']に記載の方法。
[２５']ＡＬＫ２が活性化型変異を有する、上記[２２']又は[２３']に記載の方法。
[２６']ＡＬＫ２の活性化型変異が、Ｌ１９６Ｐ、ｄｅｌＰ１９７＿Ｆ１９８ｉｎｓＬ、Ｒ２０２Ｉ、Ｒ２０６Ｈ、Ｑ２０７Ｅ、Ｒ２５８Ｓ、Ｒ２５８Ｇ、Ｇ３２５Ａ、Ｇ３２８Ｅ、Ｇ３２８Ｒ、Ｇ３２８Ｗ、Ｇ３５６Ｄ、Ｒ３７５Ｐ、及びＫ４００Ｅから選択される少なくとも一つである、上記[２５']に記載の方法。
[２７']ＡＬＫ２の活性化型変異が、Ｒ２０６Ｈ変異である、上記[２５']に記載の方法。
[２８']抗体が、モノクローナル抗体又は該抗体の抗原結合断片である、上記[２２']～[２７']のいずれかに記載の方法。
[２９']抗体又は該抗体の抗原結合断片が、下記の（１）～（５）に記載の少なくとも１つの抗体又は該抗体の抗原結合断片：
（１）配列番号１３（ＣＤＲＨ１）、配列番号１４（ＣＤＲＨ２）及び配列番号１５（ＣＤＲＨ３）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲを含む重鎖可変領域、並びに、配列番号１６（ＣＤＲＬ１）、配列番号１７（ＣＤＲＬ２）及び配列番号１８（ＣＤＲＬ３）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合断片、或いは、上記抗体又は該抗体の抗原結合断片と、ＡＬＫ２タンパク質の細胞外領域への結合に対し交差競合する抗体又は該抗体の抗原結合断片；
（２）配列番号２９（ＣＤＲＨ１）、配列番号３０（ＣＤＲＨ２）及び配列番号３１（ＣＤＲＨ３）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲを含む重鎖可変領域、並びに、配列番号３２（ＣＤＲＬ１）、配列番号３３（ＣＤＲＬ２）及び配列番号３４（ＣＤＲＬ３）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合断片、或いは、上記抗体又は該抗体の抗原結合断片と、ＡＬＫ２タンパク質の細胞外領域への結合に対し交差競合する抗体又は該抗体の抗原結合断片；
（３）配列番号３５（ＣＤＲＨ１）、配列番号３６（ＣＤＲＨ２）及び配列番号３７（ＣＤＲＨ３）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲを含む重鎖可変領域、並びに、配列番号３８（ＣＤＲＬ１）、配列番号３９（ＣＤＲＬ２）及び配列番号４０（ＣＤＲＬ３）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合断片、或いは、上記抗体又は該抗体の抗原結合断片と、ＡＬＫ２タンパク質の細胞外領域への結合に対し交差競合する抗体又は該抗体の抗原結合断片；
（４）配列番号４１（ＣＤＲＨ１）、配列番号４２（ＣＤＲＨ２）及び配列番号４３（ＣＤＲＨ３）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲを含む重鎖可変領域、並びに、配列番号４４（ＣＤＲＬ１）、配列番号４５（ＣＤＲＬ２）及び配列番号４６（ＣＤＲＬ３）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合断片、或いは、上記抗体又は該抗体の抗原結合断片と、ＡＬＫ２タンパク質の細胞外領域への結合に対し交差競合する抗体又は該抗体の抗原結合断片；或いは
（５）配列番号４７（ＣＤＲＨ１）、配列番号４８（ＣＤＲＨ２）及び配列番号４９（ＣＤＲＨ３）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲを含む重鎖可変領域、並びに、配列番号５０（ＣＤＲＬ１）、配列番号５１（ＣＤＲＬ２）及び配列番号５２（ＣＤＲＬ３）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合断片、或いは、上記抗体又は該抗体の抗原結合断片と、ＡＬＫ２タンパク質の細胞外領域への結合に対し交差競合する抗体又は該抗体の抗原結合断片、
であることを特徴とする、上記[２２']～[２８']のいずれかに記載の方法。
[３０']以下の工程を含む、ＡＬＫ２キナーゼの活性化を阻害する抗体を取得する方法：
（ａ）細胞表面にＡＬＫ２タンパク質を発現する細胞を用いて該ＡＬＫ２タンパク質の細胞外領域に特異的に結合する抗体を取得する工程；
（ｂ）上記工程（ａ）で選択された抗ＡＬＫ２抗体について、上記ＡＬＫ２タンパク質がホモ二量体を形成する能力を測定する工程；
（ｃ）上記工程（ａ）で選択された抗ＡＬＫ２抗体について、ＡＬＫ２－ＴｙｐｅＩＩ受容体へテロ二量体の形成を阻害する能力を測定する工程；及び
（ｄ）ＡＬＫ２ホモ二量体が形成され、かつ、ＡＬＫ２－ＴｙｐｅＩＩ受容体へテロ二量体の形成が阻害される場合に、上記抗ＡＬＫ２抗体がＡＬＫ２キナーゼの活性化を阻害する性質を有すると決定し、該抗体を選抜する工程。
[３１']以下の工程を含む、ＡＬＫ２を介したＢＭＰシグナル伝達を阻害する抗体を取得する方法：
（ａ）細胞表面にＡＬＫ２タンパク質を発現する細胞を用いて該ＡＬＫ２タンパク質の細胞外領域に特異的に結合する抗体を取得する工程；
（ｂ）上記工程（ａ）で選択された抗ＡＬＫ２抗体について、上記ＡＬＫ２タンパク質がホモ二量体を形成する能力を測定する工程；
（ｃ）上記工程（ａ）で選択された抗ＡＬＫ２抗体について、ＡＬＫ２－ＴｙｐｅＩＩ受容体へテロ二量体の形成を阻害する能力を測定する工程；及び
（ｄ）ＡＬＫ２ホモ二量体が形成され、かつ、ＡＬＫ２－ＴｙｐｅＩＩ受容体へテロ二量体の形成が阻害される場合に、上記抗ＡＬＫ２抗体がＡＬＫ２を介したＢＭＰシグナル伝達を阻害する性質を有すると決定し、該抗体を選抜する工程。

本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号２０１９－１３８３１２号の開示内容を包含する。

本発明の抗ＡＬＫ２抗体は、ヒト、マウス及びラットＡＬＫ２を認識する抗体を含み、治療薬としてのみならず、免疫学的かつ免疫組織学的な解析ツールとして有用である。

この図は、各種ラット抗ヒトＡＬＫ２抗体のＢＭＰシグナル阻害活性を示す。ＡＬＫ２は、ヒト、マウス及びラットのＡＬＫ２である。抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、Ａ２－１１Ｅ、Ａ２－１５Ａ、Ａ２－２５Ｃ、Ａ２－２７Ｄ、＃１０９、及び＃２００であり、ＰＢＳ（リン酸緩衝塩水）はコントロールである。ＢＭＰシグナル活性は、ＢＭＰ特異的なルシフエラーゼ・レポーターを用いて測定された。各ＡＬＫ２のルシフェラーゼ活性は、ＢＭＰ７非存在下での活性（白色カラム）、ＢＭＰ７存在下での活性（黒色カラム）として示す。 この図は、ヒト、サル、イヌ、ラット及びマウスのＡＬＫ２のアミノ酸番号１－１４０の配列比較（それぞれ配列番号４～８；（Ａ））、並びに、ＡＬＫ２の６４番目アミノ酸置換が抗体Ａ２－２７ＤによるＢＭＰシグナル阻害活性に及ぼす影響（Ｂ）を示す。コントロール抗体は、ＩｇＧ２ａである。ＢＭＰシグナル活性は、ＢＭＰ特異的なルシフェラーゼ・レポーターを用いて測定された。 この図は、抗体Ａ２－２７Ｄのエピトープに対する、各種ラット抗ヒトＡＬＫ２抗体のエピトープの重複解析結果を示す。抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、Ａ２－１１Ｅ、Ａ２－１５Ａ、Ａ２－２５Ｃ、Ａ２－２７Ｄ、＃１０９、及び＃２００である。図は、ハイブリドーマＡ２－１１Ｅ、Ａ２－１５Ａ、Ａ２－２５Ｃの産生する抗体のＡＬＫ２細胞外領域に結合する部位が、ハイブリドーマＡ２－２７Ｄの結合部位と重複していることを示すが、ハイブリドーマ＃１０９と＃２００の産生する抗体は、Ａ２－２７Ｄとは異なるＡＬＫ２の細胞外領域に結合することを示している。 この図は、各種ラット抗ＡＬＫ２抗体によるＡＬＫ２のウェスタンブロット解析結果を示す。抗体は、Ａ２－１５Ａ、Ａ２－２５Ｃ、Ａ２－２７Ｄ、Ａ２－１１Ｅ、及び＃１０９である。ハイブリドーマ＃１０９の産生する抗ＡＬＫ２モノクローナル抗体は、約６５ｋＤａのヒトＡＬＫ２とマウスＡＬＫ２を検出するが、その他の抗体はいずれのＡＬＫ２も検出しなかった。 この図は、各種ラット抗ヒトＡＬＫ２抗体によるマウス新生児臓器凍結切片を用いた免疫組織染色の結果を示す。抗体は、ＩｇＧ、Ａ２－１１Ｅ、Ａ２－１５Ａ、Ａ２－２５Ｃ、Ａ２－２７Ｄ、＃１０９、及び＃２００である。ハイブリドーマＡ２－１１Ｅ、Ａ２－１５Ａ、Ａ２－２５Ｃ、Ａ２－２７Ｄの産生するラット抗ＡＬＫ２抗体は、コントロールＩｇＧと同様に、凍結切片のマウス新生児のいずれの臓器にも免疫染色陰性であったが、ハイブリドーマ＃１０９と＃２００の産生する抗体は、マウス新生児の複数の臓器に免疫染色陽性像を示した。 この図は、各種ラット抗ヒトＡＬＫ２抗体によるマウス新生児臓器パラフィン切片を用いた免疫組織染色の結果を示す。抗体は、ＩｇＧ、Ａ２－１１Ｅ、Ａ２－１５Ａ、Ａ２－２５Ｃ、Ａ２－２７Ｄ、＃１０９、及び＃２００である。ハイブリドーマＡ２－１１Ｅ、Ａ２－１５Ａ、Ａ２－２５Ｃ、Ａ２－２７Ｄの産生するラット抗ＡＬＫ２抗体は、コントロールＩｇＧと同様に、パラフィン切片のマウス新生児のいずれの臓器にも免疫染色陰性であったが、ハイブリドーマ＃１０９と＃２００の産生する抗体は、マウス新生児の複数の臓器に免疫染色陽性像を示した。 この図は、各種ラット抗ヒトＡＬＫ２抗体によるＡＬＫ２ホモ二量体の形成を調べた結果を示す。ハイブリドーマ＃１０９、＃２００、およびＡ２－１１Ｅ、Ａ２－１５Ａ、Ａ２－２５Ｃ、Ａ２－２７Ｄの産生するラット抗ＡＬＫ２抗体は、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼの活性を促進したことから、ヒトＡＬＫ２のホモ二量体形成を誘導することが示された（Ａ，Ｂ）。コントロール抗体は、ＩｇＧ１である。Ａ２－ＳｍはＡＬＫ２とＳｍＢｉＴとの融合体を、Ａ２－ＬｇはＡＬＫ２とＬｇＢｉＴとの融合体を示している。 この図は、ＢＭＰ７の存在下で各種ラット抗ヒトＡＬＫ２抗体によるＡＬＫ２－ｔｙｐｅＩＩ受容体ヘテロ二量体の形成阻害を調べた結果を示す。ハイブリドーマ＃２００、並びにＡ２－１１Ｅ、Ａ２－１５Ａ、Ａ２－２５Ｃ、Ａ２－２７Ｄの産生するラット抗ＡＬＫ２抗体は、ＢＭＰ７によって誘導されるＡＬＫ２とＡｃｔＲ－ＩＩＢ受容体のヘテロ二量体形成を抑制することが示された（Ａ，Ｂ）。コントロール抗体は、ＩｇＧ１である。Ａ２－ＳｍはＡＬＫ２とＳｍＢｉＴとの融合体を、ＩＩ－ＬｇはｔｙｐｅＩＩ受容体とＬｇＢｉＴとの融合体を、２ａ．ａ．は２アミノ酸を示している。

本発明をさらに詳細に説明する。
１．定義
本明細書中において、「遺伝子」という語には、ＤＮＡのみならずｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ及びｃＲＮＡも含まれるものとする。

本明細書中において、「ポリヌクレオチド」という語は核酸と同じ意味で用いており、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、プローブ、オリゴヌクレオチド、及びプライマーなども含まれている。

本明細書中において、「ポリペプチド」と「蛋白質」（「タンパク質」とも称する）は区別せずに用いている。

本明細書中において、「ＲＮＡ画分」とは、ＲＮＡを含んでいる画分をいう。

本明細書中において、「細胞」には、動物個体内の細胞、培養細胞も含んでいる。

本明細書中において、「ＡＬＫ２」は、ＡＬＫ２タンパク質と同じ意味で用いており、野生型及び変異体（「変異型」ともいう。）を含む。

本明細書中における「抗体の抗原結合断片」とは、「抗体の機能性断片」とも呼ばれ、抗原との結合性を有する抗体の部分断片を意味しており、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、線状抗体もしくは一本鎖抗体、及び抗体断片より形成された多特異性抗体等を含む。但し、抗ＡＬＫ２抗体と同様に、ＡＬＫ２との結合能（もしくは、ＡＬＫ２と結合する性質）を有している限りこれらの分子に限定されない。また、好ましくは、上記抗体の抗原結合断片はさらに、抗ＡＬＫ２抗体と同様に、ＢＭＰシグナル伝達抑制能（もしくは、ＢＭＰシグナル伝達を抑制（「阻害」ともいう。）する性質）を有する。さらにまた、これらの抗原結合断片には、抗体蛋白質の全長分子を適当な酵素で処理したもののみならず、遺伝子工学的に改変された抗体遺伝子を用いて適当な宿主細胞において産生された蛋白質も含まれる。

本明細書における、「エピトープ」とは、抗体の「抗原結合部位」とも呼ばれ、一般に抗原の少なくとも７アミノ酸、少なくとも８アミノ酸、少なくとも９アミノ酸、又は少なくとも１０アミノ酸からなる、抗体が結合する抗原部位を指し、本明細書では特定の抗ＡＬＫ２抗体が結合するＡＬＫ２の部分ペプチド又は部分立体構造を意味する。上記のＡＬＫ２の部分ペプチドであるエピトープは、例えば免疫アッセイ法等の当業者によく知られている方法によって決定することができるが、例えば以下の方法によって行うことができる。ＡＬＫ２の様々な部分構造を作製する。部分構造の作製にあたっては、公知のオリゴペプチド合成技術を用いることができる。例えば、ＡＬＫ２のＣ末端或いはＮ末端から適当な長さで順次短くした一連のポリペプチドを当業者に周知の遺伝子組み換え技術を用いて作製した後、それらに対する抗体の反応性を検討し、大まかな認識部位を決定した後に、さらに短いペプチドを合成してそれらのペプチドとの反応性を検討することによって、エピトープを決定することができる。又、特定のＡＬＫ２抗体が結合するＡＬＫ２の部分立体構造であるエピトープは、Ｘ線結晶構造解析によって上記の抗体と隣接するＡＬＫ２のアミノ酸残基を特定することによって決定することができる。第一の抗ＡＬＫ２抗体の結合する部分ペプチド又は部分立体構造に第二の抗ＡＬＫ２抗体が結合すれば、第一の抗体と第二の抗体が共通のエピトープを有すると判定することができる。また、第一の抗ＡＬＫ２抗体のＡＬＫ２に対する結合に対して第二の抗ＡＬＫ２抗体が競合する（すなわち、第二の抗体が第一の抗体とＡＬＫ２との結合を妨げる）ことを確認することによって、具体的なエピトープの配列又は構造が決定されていなくても、第一の抗体と第二の抗体が共通のエピトープを有すると判定することができる。さらに、第一の抗体と第二の抗体が共通のエピトープに結合し、かつ第一の抗体がＡＬＫ２を介するＢＭＰシグナル伝達の阻害活性等の活性を有する場合、第二の抗体も同様な活性を有することが期待できる。

本明細書における、「競合する」又は「交差競合する」とは、標準的な結合アッセイにおいて、ＡＬＫ２タンパク質の細胞外領域と結合性を有する特定の抗体又はその抗原結合断片と、他の抗体とが、ＡＬＫ２タンパク質との結合に対し互いに干渉し合うことを指し、このアッセイによってこれら２つの抗体のエピトープの類似性を決定することができる。

本明細書における、「認識する」とは、例えば特定の抗体が、それが結合する抗原部位を識別して相互作用する又は結合することを指す。

抗体分子の重鎖及び軽鎖にはそれぞれ３箇所の相補性決定領域（ＣＤＲ：Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｒｅｇｉｏｎ）があることが知られている。相補性決定領域は、超可変領域（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ）とも呼ばれ、抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域内にあって、一次構造の変異性が特に高い部位であり、重鎖及び軽鎖のポリペプチド鎖の一次構造上において、それぞれ３箇所に分離している。本明細書中においては、抗体の相補性決定領域について、重鎖の相補性決定領域を重鎖アミノ酸配列のアミノ末端側からＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３と表記し、軽鎖の相補性決定領域を軽鎖アミノ酸配列のアミノ末端側からＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３と表記する。これらの部位は立体構造の上で相互に近接し、結合する抗原に対する特異性を決定している。

本明細書において、「１もしくは数個」なる記載がある場合の「数個」とは、２～１０個を示している。好ましくは、１０個以下、より好ましくは、５もしくは６個以下、さらにより好ましくは、２もしくは３個である。

本発明において「クロスリンク能」とは、１つの抗体又は抗原結合断片が２分子のＡＬＫ２タンパク質のそれぞれの細胞外領域に結合して架橋（すなわち、クロスリンク）する能力をいう。通常、ＢＭＰリガンド存在下でＡＬＫ２（Ｉ型受容体）は複合体（ホモ二量体）を形成し、さらにはＩＩ型受容体（ホモ二量体）との四量体の形成を介して下流のＳＭＡＤ１／５／８を活性化するが、抗ＡＬＫ２抗体により２分子のＡＬＫ２のクロスリンクが誘導され、リガンド非存在下においても複合体様の形成が生じる可能性がある。

「ＢＭＰシグナル伝達の促進」とは、ＡＬＫ２受容体分子を介して下流の細胞内情報伝達系を活性化することをいう。

本発明において「患者」とは、疾患に罹患しているヒトのみならず、疾患に罹患している疑いのあるヒトであってもよいし、或いはヒトを除く哺乳動物（例えば、イヌ、ネコ、マウス、ラットなど）であってもよい。

本発明において用いられる「試料」としては、ＡＬＫ２を発現する細胞、該細胞を含む、例えば体液（例、血液、血清、血漿、尿、リンパ液、滲出液、脳脊髄液）、組織（正常組織、疾患組織（例、腫瘍、器官））などが挙げられる。或いは、これらの試料から得られるタンパク質抽出物や核酸抽出物（例えばｍＲＮＡ抽出物、ｍＲＮＡ抽出物から調製されたｃＤＮＡ調製物やｃＲＮＡ調製物等）であってもよい。

本発明において「免疫組織化学（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：ＩＨＣ）」とは、組織標本中の抗原を検出する組織学的（組織化学的）手法を意味し、「免疫抗体法」と同義であり、「免疫染色（ｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎｉｎｇ）」も同じ意味に用いられる。

２．ＡＬＫ２
ＡＬＫ２は、Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－β（ＴＧＦ－β）ファミリーのリガンドを結合し、細胞内シグナルを活性化する膜貫通型セリン・スレオニンキナーゼ受容体の一種である。ＡＬＫ２は、Ｎ末端側の細胞外領域で骨形成蛋白質（ＢＭＰ）を結合し、細胞内のセリン・スレオニン・キナーゼによって下流の細胞内情報伝達系を活性化する。このとき、ＩＩ型受容体が、ＡＬＫ２（Ｉ型受容体）のＧＳ（グリシンとセリンに富む）ドメインをリン酸化することによってＡＬＫ２を活性化することが知られている（Ｔ．Ｋａｔａｇｉｒｉ，Ｊ． Ｏｒａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ５４（２０１２）：１１９－１２３）。

ＢＭＰは、ＴＧＦ－βスーパーファミリーに属する多機能成長因子であり、約２０のＢＭＰファミリーメンバーが同定されている。ＢＭＰは骨格筋組織を含む軟組織において異所性骨形成を誘導することが確認されていることから、異常な骨形成を促進する疾患に関与していると考えられている。ＢＭＰ２やＢＭＰ４は、ＡＬＫ２に比べてＡＬＫ３に親和性が高いと考えられている。ＡＬＫ３は、ＡＬＫ２に比べてユビキタスに発現していることから、さまざまな部位で異所性骨化を誘導する実験ではＢＭＰ２やＢＭＰ４が一般的によく用いられていると考えられる。一方、ＢＭＰ７は比較的ＡＬＫ２に対する親和性が高く、またＢＭＰ９は一般的にＡＬＫ１に親和性が高いとが考えられているが、ＡＬＫ２に対しても比較的高い親和性をもっていることが分かっている。ＦＯＰではＡＬＫ２を介した異所性骨化が起こっていることから、ＢＭＰ７及びＢＭＰ９によるＡＬＫ２を介したシグナルの活性化による異所性骨誘導に対する薬効を検証することで、ＦＯＰに対する治療及び／又は予防効果の有無を確認することができると考えられる。

近年、ＡＬＫ２遺伝子のアミノ酸置換を伴う変異により細胞内シグナルが充進する遺伝性疾患として、骨格筋などの軟組織の中に異所性骨化を生じる進行性骨化性線維異形成症（ＦＯＰ）、腱靭帯付着部の骨化を伴う広汎性特発性骨増殖症（ＤＩＳＨ)、及び小児脳幹部グリオーマ（ＤＩＰＧ）が明らかとなっている。従来、生体内のＡＬＫ２を特異的に認識できる抗体が樹立されていなかったために、これらの発症に関与する細胞群や生化学的シグナルは依然として不明な点が残されおり、また有効な治療法は確立されていない。

ＡＬＫ２遺伝子は、骨格筋組織を含む軟組織において異所性骨形成を誘導するＢＭＰの受容体の一種をコードするＦＯＰの責任遺伝子である。家族性、及び孤発性ＦＯＰ症例からは、アミノ酸置換を伴った変異型ＡＬＫ２が見出されている。ヒトＡＬＫ２の活性化型変異としては、配列番号１のアミノ酸配列中、Ｌ１９６Ｐ（１９６番目のロイシンがプロリンに置換された変異）、ｄｅｌＰ１９７＿Ｆ１９８ｉｎｓＬ（「ＰＦ１９７－８Ｌ」とも称する）（１９７番目のプロリン及び１９８番目のフェニルアラニンが欠失し、ロイシンが挿入された変異）、Ｒ２０２Ｉ（２０２番目のアルギニンがイソロイシンに置換された変異）、Ｒ２０６Ｈ（２０６番目のアルギニンがヒスチジンに置換された変異）、Ｑ２０７Ｅ（２０７番目のグルタミンがグルタミン酸に置換された変異）、Ｒ２５８Ｓ（２５８番目のアルギニンがセリンに置換された変異）、Ｒ２５８Ｇ（２５８番目のアルギニンがグリシンに置換された変異）、Ｇ３２５Ａ（３２５番目のグリシンがアラニンに置換された変異）、Ｇ３２８Ｅ（３２８番目のグリシンがグルタミン酸に置換された変異）、Ｇ３２８Ｒ（３２８番目のグリシンがアルギニンに置換された変異）、Ｇ３２８Ｗ（３２８番目のグリシンがトリプトファンに置換された変異）、Ｇ３５６Ｄ（３５６番目のグリシンがアスパラギン酸に置換された変異）、Ｒ３７５Ｐ（３７５番目のアルギニンがプロリンに置換された変異）等が知られている。ＤＩＳＨ症例からは、Ｋ４００Ｅ（４００番目のリシンがグルタミン酸に置換された変異）が知られている。

また、ＤＩＰＧ症例からもアミノ酸置換を伴った変異型ＡＬＫ２が見出されている。ヒトＡＬＫ２の活性化型変異としては、配列番号１のアミノ酸配列中、Ｒ２０６Ｈ、Ｒ２５８Ｇ、Ｇ３２８Ｅ、Ｇ３２８Ｖ（３２８番目のグリシンがバリンに置換された変異）、Ｇ３２８Ｗ、Ｇ３５６Ｄ等が知られている。

ＡＬＫ２は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにて合成する、或いは遺伝子操作により宿主細胞に産生させることによって得ることができる。具体的には、ＡＬＫ２ ｃＤＮＡを発現可能なベクターに組み込んだ後、転写と翻訳に必要な酵素、基質及びエネルギー物質を含む溶液中で合成する、或いは他の原核生物、又は真核生物の宿主細胞を形質転換させることによってＡＬＫ２を発現させることにより、該蛋白質を得ることができる。

本明細書で用いるＡＬＫ２はヒト、マウスを含む哺乳動物由来のＡＬＫ２であり、例えばヒトＡＬＫ２のアミノ酸配列及びヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ－００１１０５を参照することにより入手可能であり、アミノ酸配列は配列番号１として本明細書中にも開示されている。マウスＡＬＫ２のアミノ酸配列及びヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ－００１１０３６７４を参照することにより入手可能であり、アミノ酸配列は配列番号２として本明細書中にも開示されている。さらにまた、サル、ラット及びイヌのＡＬＫ２のアミノ酸配列は、それぞれＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ－００１２６０７６１、ＮＰ＿０７７８１２（配列番号３）、ＸＭ＿５４９６１５．５を参照することにより入手可能である。なお、ＡＬＫ２は、前述のとおり、ＡＣＶＲ１（Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ ｔｙｐｅ Ｉ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ １）又はＡＣＴＲ１（Ａｃｔｉｖｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔｙｐｅ １）と呼ばれることがあり、これらは全て同じ分子を示している。

ＡＬＫ２のｃＤＮＡは、例えば、ＡＬＫ２のｃＤＮＡを発現しているｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、ＡＬＫ２のｃＤＮＡを特異的に増幅するプライマーを用いて、例えばポリメラーゼ連鎖反応（以下「ＰＣＲ」という）（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，（１９８８）２３９，４８７－４９）を行なう、いわゆるＰＣＲ法により取得することができる。

３．抗ＡＬＫ２抗体及びその製造
本発明の抗ＡＬＫ２抗体は、ＡＬＫ２の細胞外領域を認識するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを樹立し、多数のハイブリドーマクローンの中から、従来得られたことがなかった特徴のあるクローン、例えば、ヒトやマウスに加えてラットＡＬＫ２の活性を強力に阻害するクローン、マウスの組織を用いた凍結切片やパラフィン切片などを用いる免疫染色法でＡＬＫ２の局在等について陽性像を示すクローン、ウェスタンブロット法でＡＬＫ２を認識できるクローンなどを選択することによって得ることができる。

また、本発明の抗ＡＬＫ２抗体は、例えば、ＷＯ２００９／０９１０４８、ＷＯ２０１１／０２７８０８、又はＷＯ２０１２／１３３５７２に記載の方法で得ることができる。すなわち、非ヒト動物を目的抗原で免疫し、免疫成立後の動物からリンパ液、リンパ組織、血球試料又は骨髄由来の細胞を採取し、目的抗原に特異的に結合する非ヒト動物の形質細胞及び／又は形質芽細胞を選択する。得られた形質細胞及び／又は形質芽細胞から目的抗原に対する抗体遺伝子を採取し、その塩基配列を同定し、同定した遺伝子の塩基配列に基づいて上記抗体又は抗体の断片を得ることができる。また、ヒト感染患者の血液から同様に形質細胞及び／又は形質芽細胞を得ることにより、抗体又は抗体断片を得ることができる。

本発明の抗ＡＬＫ２抗体は、例えば以下の抗体又はその抗原結合断片を包含する。

以下の（ａ）～（ｃ）に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを特異的に認識し、ＢＭＰシグナル伝達を抑制する抗体又は該抗体の抗原結合断片：
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の２１～１２３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の２１～１２３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号３に示されるアミノ酸配列の２１～１２３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列。

配列番号１、２、３のアミノ酸配列はそれぞれヒトＡＬＫ２、マウスＡＬＫ２、ラットＡＬＫ２を表し、それらの２１～１２３番目のアミノ酸配列は、ＡＬＫ２の細胞外領域に相当する。図２Ａに示される当該領域のアミノ酸配列を比較すると、マウスとヒトでは非常に高い配列同一性（約９８％）を有するが、ヒトとラットでは、約９４％の配列同一性を有する。

従来、上記（ａ）と（ｂ）のアミノ酸配列を認識する抗体は得られていたが、上記（ｃ）のアミノ酸配列をも認識することができる抗体は得られていなかった。また、従来の抗体は、免疫染色法による組織染色や、ＡＬＫ２の存在や量を測定するためのウェスタンブロット法での使用が難しかった。一方、上記の性質をもつ抗ＡＬＫ２抗体は、ヒト、マウス及びラットのＡＬＫ２を認識できるうえに、免疫染色法での使用を可能にする。

図２Ｂの結果が示すように、ＡＬＫ２のアミノ酸配列中の６４番目のアミノ酸残基が、抗体のＢＭＰシグナル伝達阻害活性に影響する。図２Ｂでは、抗体としてＡ２－２７Ｄが使用されたため、それが認識する、ＡＬＫ２のアミノ酸配列中の６４番目のアミノ酸残基はヒスチジンであるが、本発明の上記抗体は、配列番号３に示されるアミノ酸配列中の６４番目のアルギニンを含むエピトープに結合することが可能であり、かつＢＭＰシグナル伝達阻害活性を有している。

本発明の抗体は、例えば以下の少なくとも１つを包含する。
（１）重鎖配列が、配列番号１３（ＣＤＲＨ１）、配列番号１４（ＣＤＲＨ２）及び配列番号１５（ＣＤＲＨ３）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ配列を含む可変領域を含み、並びに、軽鎖配列が、配列番号１６（ＣＤＲＬ１）、配列番号１７（ＣＤＲＬ２）及び配列番号１８（ＣＤＲＬ３）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ配列を含む可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合断片。
（２）配列番号９に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域配列及び配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域配列を含む抗体又は該抗体の抗原結合断片。
（３）上記（１）又は（２）に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片と、ＡＬＫ２タンパク質の細胞外領域への結合に対し交差競合する抗体又は該抗体の抗原結合断片。
（４）上記（１）～（３）のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む抗体又は該抗体の抗原結合断片。
（５）上記（１）～（３）のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む抗体又は該抗体の抗原結合断片。
（６）上記（１）～（３）のいずれかのアミノ酸配列に１もしくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列を含む抗体又は該抗体の抗原結合断片。

本発明において免疫染色法やウェスタンブロット法で利用可能な他の抗ＡＬＫ２抗体は、例えば以下の抗体又はその抗原結合断片の少なくとも１つを包含する。
（７）ＡＬＫ２タンパク質に対する結合活性を有する抗体又は該抗体の抗原結合断片であって、重鎖配列が、配列番号２３（ＣＤＲＨ１）、配列番号２４（ＣＤＲＨ２）及び配列番号２５（ＣＤＲＨ３）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ配列を含む可変領域を含み、並びに、軽鎖配列が、配列番号２６（ＣＤＲＬ１）、配列番号２７（ＣＤＲＬ２）及び配列番号２８（ＣＤＲＬ３）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ配列を含む可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合断片、或いは、上記ＡＬＫ２タンパク質の細胞外領域への結合に対し上記抗体又は抗原結合断片と交差競合する抗体又は該抗体の抗原結合断片。
（８）配列番号１９に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域配列を含む重鎖及び配列番号２１に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域配列を含む軽鎖からなる抗体又は該抗体の抗原結合断片、或いは、上記ＡＬＫ２タンパク質の細胞外領域への結合に対し上記抗体又は抗原結合断片と交差競合する抗体又は該抗体の抗原結合断片。
（９）上記（７）又は（８）のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む抗体又は該抗体の抗原結合断片。
（１０）上記（７）又は（８）のアミノ酸配列と少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む抗体又は該抗体の抗原結合断片。
（１１）上記（７）又は（８）のアミノ酸配列に１もしくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列を含む抗体又は該抗体の抗原結合断片。

本発明の実施形態において、上記抗体及びその抗原結合断片は、例えば、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体、好ましくはモノクローナル抗体、或いは、ラット抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、ダイアボディ、多特異性抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’、Ｆｖ、又はｓｃＦｖ（一本鎖抗体）であることができる。

さらに、本発明の別の実施形態において、重鎖定常領域のアイソタイプが、例えばＩｇＧ２ｂであることができる。

本発明において利用可能な他の抗ＡＬＫ２抗体は、以下の性質を有する。

ＡＬＫ２の細胞外領域に特異的に結合し、ＡＬＫ２ホモ二量体を形成する性質、ＡＬＫ２－ＴｙｐｅＩＩ受容体ヘテロ二量体の形成を阻害する性質、並びに、ＡＬＫ２キナーゼの活性化を阻害する性質を有する抗体又は該抗体の抗原結合断片。

或いは、ＡＬＫ２の細胞外領域に特異的に結合し、ＡＬＫ２ホモ二量体を形成する性質、ＡＬＫ２－ＴｙｐｅＩＩ受容体ヘテロ二量体の形成を阻害する性質、並びに、ＢＭＰシグナル伝達を阻害する性質を有する抗体又は該抗体の抗原結合断片。

これらの性質を有する抗体は、以下の工程（ａ）～（ｄ）を含む方法によって取得してもよい（例えば、後述の実施例９及び１０）：
（ａ）細胞表面にＡＬＫ２タンパク質を発現する細胞を用いて該ＡＬＫ２タンパク質の細胞外領域に特異的に結合する抗体を取得する工程；
（ｂ）上記工程（ａ）で選択された抗ＡＬＫ２抗体について、上記ＡＬＫ２タンパク質がホモ二量体を形成する能力を測定する工程；
（ｃ）上記工程（ａ）で選択された抗ＡＬＫ２抗体について、ＡＬＫ２－ＴｙｐｅＩＩ受容体へテロ二量体の形成を阻害する能力を測定する工程；及び
（ｄ）ＡＬＫ２ホモ二量体が形成され、かつ、ＡＬＫ２－ＴｙｐｅＩＩ受容体へテロ二量体の形成が阻害される場合に、上記抗ＡＬＫ２抗体がＡＬＫ２キナーゼの活性化を阻害する性質を有する、又はＡＬＫ２を介したＢＭＰシグナル伝達を阻害する性質を有すると決定し、該抗体を選抜する工程。

具体的には、以下の抗体が例示される。

ａ１）上述の、ＡＬＫ２タンパク質の細胞外領域に対する結合活性を有する抗体又は該抗体の抗原結合断片であって、重鎖配列が、配列番号１３（ＣＤＲＨ１）、配列番号１４（ＣＤＲＨ２）及び配列番号１５（ＣＤＲＨ３）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ配列を含む可変領域を含み、並びに、軽鎖配列が、配列番号１６（ＣＤＲＬ１）、配列番号１７（ＣＤＲＬ２）及び配列番号１８（ＣＤＲＬ３）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ配列を含む可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合断片、或いは、上記ＡＬＫ２タンパク質の細胞外領域への結合に対し上記抗体又は抗原結合断片と交差競合する抗体又は該抗体の抗原結合断片。

ａ２）上述の、配列番号９に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域配列を含む重鎖及び配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域配列を含む軽鎖からなる抗体又は該抗体の抗原結合断片、或いは、上記ＡＬＫ２タンパク質の細胞外領域への結合に対し上記抗体又は抗原結合断片と交差競合する抗体又は該抗体の抗原結合断片。

ａ３）ＡＬＫ２タンパク質の細胞外領域に対する結合活性を有する抗体又は該抗体の抗原結合断片であって、重鎖配列が、配列番号２９（ＣＤＲＨ１）、配列番号３０（ＣＤＲＨ２）及び配列番号３１（ＣＤＲＨ３）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ配列を含む可変領域を含み、並びに、軽鎖配列が、配列番号３２（ＣＤＲＬ１）、配列番号３３（ＣＤＲＬ２）及び配列番号３４（ＣＤＲＬ３）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ配列を含む可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合断片、或いは、上記ＡＬＫ２タンパク質の細胞外領域への結合に対し上記抗体又は抗原結合断片と交差競合する抗体又は該抗体の抗原結合断片。

ａ４）ＡＬＫ２タンパク質の細胞外領域に対する結合活性を有する抗体又は該抗体の抗原結合断片であって、重鎖配列が、配列番号３５（ＣＤＲＨ１）、配列番号３６（ＣＤＲＨ２）及び配列番号３７（ＣＤＲＨ３）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ配列を含む可変領域を含み、並びに、軽鎖配列が、配列番号３８（ＣＤＲＬ１）、配列番号３９（ＣＤＲＬ２）及び配列番号４０（ＣＤＲＬ３）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ配列を含む可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合断片、或いは、上記ＡＬＫ２タンパク質の細胞外領域への結合に対し上記抗体又は抗原結合断片と交差競合する抗体又は該抗体の抗原結合断片。

ａ５）ＡＬＫ２タンパク質の細胞外領域に対する結合活性を有する抗体又は該抗体の抗原結合断片であって、重鎖配列が、配列番号４１（ＣＤＲＨ１）、配列番号４２（ＣＤＲＨ２）及び配列番号４３（ＣＤＲＨ３）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ配列を含む可変領域を含み、並びに、軽鎖配列が、配列番号４４（ＣＤＲＬ１）、配列番号４５（ＣＤＲＬ２）及び配列番号４６（ＣＤＲＬ３）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ配列を含む可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合断片、或いは、上記ＡＬＫ２タンパク質の細胞外領域への結合に対し上記抗体又は抗原結合断片と交差競合する抗体又は該抗体の抗原結合断片。

ａ６）ＡＬＫ２タンパク質の細胞外領域に対する結合活性を有する抗体又は該抗体の抗原結合断片であって、重鎖配列が、配列番号４７（ＣＤＲＨ１）、配列番号４８（ＣＤＲＨ２）及び配列番号４９（ＣＤＲＨ３）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ配列を含む可変領域を含み、並びに、軽鎖配列が、配列番号５０（ＣＤＲＬ１）、配列番号５１（ＣＤＲＬ２）及び配列番号５２（ＣＤＲＬ３）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ配列を含む可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合断片、或いは、上記ＡＬＫ２タンパク質の細胞外領域への結合に対し上記抗体又は抗原結合断片と交差競合する抗体又は該抗体の抗原結合断片。

ａ７）上記ａ１）からａ６）のアミノ酸配列から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む抗体又は該抗体の抗原結合断片。

ａ８）上記ａ１）からａ６）のアミノ酸配列から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む抗体又は該抗体の抗原結合断片。

ａ９）上記ａ１）からａ６）のアミノ酸配列から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列に１もしくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列を含む抗体又は該抗体の抗原結合断片。

本発明において用いられるＡＬＫ２の細胞外領域に対する抗体は、公知の方法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６，ｐ．４９５－４９７、Ｋｅｎｎｅｔ，Ｒ．ｅｄ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｐ．３６５－３６７，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８０））に従って得ることができる。すなわち、ＡＬＫ２の細胞外領域に対する抗体を産生する抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることによりハイブリドーマを樹立し、モノクローナル抗体を得ることができる。取得された抗体はＡＬＫ２に対する結合性及び／又はクロスリンク能などを試験することによって、好適な抗体を選別できる。

なお、ＣＤＲ配列の決定には、数種の方法が知られており、例えば、Ａｂｍの定義、Ｃｈｏｔｈｉａの定義、Ｋａｂａｔの定義、及びＩｍｇｔ（登録商標）（Ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（登録商標））の定義を挙げることができる。本発明の抗体のＣＤＲ配列はいずれの方法によって定義されたものでもよい。

本発明に用いられる抗体には、上記ＡＬＫ２の細胞外領域に対するモノクローナル抗体に加え、例えばポリクローナル抗体や、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ）抗体、ヒト化（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体、ヒト抗体なども含まれる。これらの抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。

キメラ抗体としては、抗体の可変領域と定常領域（Ｆｃ）が互いに異種である抗体、例えばマウス又はラット由来抗体の可変領域をヒト由来の定常領域に接合したキメラ抗体を挙げることができる（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１，６８５１－６８５５（１９８４）参照）。

ヒト化抗体としては、ＣＤＲのみをヒト由来の抗体に組み込んだ抗体（Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）３２１，ｐ．５２２－５２５参照）、ＣＤＲ移植法によって、ＣＤＲの配列に加え一部のフレームワークのアミノ酸残基もヒト抗体に移植した抗体（国際公開第ＷＯ９０／０７８６１号）を挙げることができる。

また、さらに各ＣＤＲ中の１～３個のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換したＣＤＲ改変ヒト化抗体も、ＡＬＫ２に対する結合性を有する限り、本発明に用いられる抗体に含まれる。

本発明に用いられる抗体としては、さらに、ヒト抗体を挙げることができる。抗ＡＬＫ２ヒト抗体とは、ヒト染色体由来の抗体の遺伝子配列のみを有するヒト抗体を意味する。抗ＡＬＫ２ヒト抗体は、ヒト抗体の重鎖と軽鎖の遺伝子を含むヒト染色体断片を有するヒト抗体産生マウスを用いた方法（Ｔｏｍｉｚｕｋａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９７）１６，ｐ．１３３－１４３，；Ｋｕｒｏｉｗａ，Ｙ．ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９８）２６，ｐ．３４４７－３４４８；Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｈ．ｅｔ．ａｌ．，Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ａｓｐｅｃｔｓ ｖｏｌ．１０，ｐ．６９－７３（Ｋｉｔａｇａｗａ，Ｙ．，Ｍａｔｓｕｄａ，Ｔ．ａｎｄ Ｉｉｊｉｍａ，Ｓ．ｅｄｓ．），Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９９．；Ｔｏｍｉｚｕｋａ，Ｋ．ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２０００）９７，ｐ．７２２－７２７等を参照。）によって取得することができる。

このようなヒト抗体産生マウスは、具体的には、内在性免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の遺伝子座が破壊され、代わりに例えばヒト人工染色体（Ｈｕｍａｎ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ，ＨＡＣ）ベクターやマウス人工染色体（Ｍｏｕｓｅ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ，ＭＡＣ）ベクターなどのベクターを介してヒト免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の遺伝子座が導入された遺伝子組み換え動物を、ノックアウト動物及びトランスジェニック動物の作製、及びこれらの動物同士を掛け合わせることにより作り出すことができる。

また、遺伝子組換え技術により、そのようなヒト抗体の重鎖及び軽鎖の各々をコードするｃＤＮＡ、好ましくは該ｃＤＮＡを含むベクターにより真核細胞を形質転換し、遺伝子組換えヒトモノクローナル抗体を産生する形質転換細胞を培養することにより、この抗体を培養上清中から得ることもできる。ここで、宿主としては例えば真核細胞、好ましくはＣＨＯ細胞、リンパ球やミエローマ等の哺乳動物細胞を用いることができる。

また、ヒト抗体ライブラリーより選別したファージディスプレイ由来のヒト抗体を取得する方法（Ｗｏｒｍｓｔｏｎｅ，Ｉ．Ｍ．ｅｔ．ａｌ，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ＆Ｖｉｓｕａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ．（２００２）４３（７），ｐ．２３０１－２３０８；Ｃａｒｍｅｎ，Ｓ．ｅｔ．ａｌ．，Ｂｒｉｅｆｉｎｇｓ ｉｎ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ（２００２），１（２），ｐ．１８９－２０３；Ｓｉｒｉｗａｒｄｅｎａ，Ｄ．ｅｔ．ａｌ．，Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ（２００２）１０９（３），ｐ．４２７－４３１等参照。）も知られている。

例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）としてファージ表面に発現させて、抗原に結合するファージを選択するファージディスプレイ法（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５），２３，（９），ｐ．１１０５－１１１６）を用いることができる。抗原に結合することで選択されたファージの遺伝子を解析することによって、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を決定することができる。抗原に結合するｓｃＦｖのＤＮＡ配列が明らかになれば、当該配列を有する発現ベクターを作製し、適当な宿主に導入して発現させることによりヒト抗体を取得することができる（ＷＯ９２／０１０４７、ＷＯ９２／２０７９１、ＷＯ９３／０６２１３、ＷＯ９３／１１２３６、ＷＯ９３／１９１７２、ＷＯ９５／０１４３８、ＷＯ９５／１５３８８、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９４）１２，ｐ．４３３－４５５、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５）２３（９），ｐ．１１０５－１１１６）。

抗体が抗原の部分高次構造に結合又は認識している場合、かかる抗体のエピトープは、Ｘ線構造解析を用いて、当該抗体に隣接する抗原上のアミノ酸残基を特定することにより決定することができる。例えば、抗体又はその断片及び抗原又はその断片を結合させて結晶化し、構造解析を行うことにより、抗体と相互作用距離を有する抗原上のアミノ酸残基を特定することができる。相互作用距離は８オングストローム（Å）以下であり、好適には６オングストローム以下であり、より好適には４オングストローム以下である。そのような抗体との相互作用距離を有するアミノ酸残基は１つ又はそれ以上で抗体のエピトープ（抗原結合部位）を構成し得る。かかるアミノ酸残基が２つ以上の場合、各アミノ酸は一次配列上で互いに隣接していなくてもよい。

上記の抗体は、ＷＯ２０１６／１２１９０８の実施例２、実施例６、実施例９又は実施例１０に示された方法等によって抗原に対する結合性を評価し、好適な抗体を選抜することができる。抗体の解離定数（Ｋ_Ｄ）は、例えば１×１０^－６～１×１０^－１２Ｍ、又はそれ以下であるが、目的の治療又は予防効果が得られる限り、この範囲に限定されない。抗体と抗原（ＡＬＫ２）との解離定数は表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を検出原理とするビアコアＴ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を使用して測定することができる。例えば、リガンドとして固相化した抗原に対し、適当な濃度に設定した抗体をアナライトと反応させ、その結合及び解離を測定することにより、結合速度定数ｋ_ａ１、解離速度定数ｋ_ｄ１及び解離定数（Ｋ_Ｄ；Ｋ_Ｄ＝ｋ_ｄ１／ｋ_ａ１）を得ることができる。ＡＬＫ２に対する結合性評価は、ビアコアＴ２００の使用に限定されず、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を検出原理とする機器、結合平衡除外法（Ｋｉｎｅｔｉｃ Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ）を検出原理とするＫｉｎＥｘＡ（Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）、バイオレイヤー干渉法（Ｂｉｏ－Ｌａｙｅｒ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ）を検出原理とするＢＬＩｔｚシステム（Ｐａｌｌ社）或いはＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）法等によっても可能である。

上記の抗体は、例えば、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標） Ｂｉｎａｒｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ＮａｎｏＢｉＴ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて、ＡＬＫ２とＬｇＢｉＴ又はＳｍＢｉＴとの融合体をｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞内で発現させ、抗体によるＡＬＫ２タンパク質の相互作用を、ＬｇＢｉＴ及びＳｍＢｉＴの構造的相補性による発光により検出することが可能である（例えば、ＡＣＳ Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． ２０１２， ７， １８４８－１８５７、ＡＣＳ Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． ２０１６， １１， ４００－４０８）。

抗体の性質を比較する際の別の指標の一例としては、抗体の安定性を挙げることができる。示差走査カロリメトリー（ＤＳＣ）は、蛋白の相対的構造安定性の良い指標となる熱変性中点（Ｔｍ）を素早く、また正確に測定することができる方法である。ＤＳＣを用いてＴｍ値を測定し、その値を比較することによって、熱安定性の違いを比較することができる。抗体の保存安定性は、抗体の熱安定性とある程度の相関を示すことが知られており（Ｌｏｒｉ Ｂｕｒｔｏｎ，ｅｔ．ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００７）１２，ｐ．２６５－２７３）、熱安定性を指標に、好適な抗体を選抜することができる。抗体を選抜するための他の指標としては、適切な宿主細胞における収量が高いこと、及び水溶液中での凝集性が低いことを挙げることができる。例えば収量の最も高い抗体が最も高い熱安定性を示すとは限らないので、以上に述べた指標に基づいて総合的に判断して、ヒトへの投与に最も適した抗体を選抜する必要がある。

また、抗体の重鎖及び軽鎖の全長配列を適切なリンカーを用いて連結し、一本鎖イムノグロブリン（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）を取得する方法も知られている（Ｌｅｅ，Ｈ－Ｓ，ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９９）３６，ｐ．６１－７１；Ｓｈｉｒｒｍａｎｎ，Ｔ．ｅｔ．ａｌ．，ｍＡｂｓ（２０１０），２，（１）ｐ．１－４）。このような一本鎖イムノグロブリンは二量体化することによって、本来は四量体である抗体と類似した構造と活性を保持することが可能である。また、本発明に用いられる抗体は、単一の重鎖可変領域を有し、軽鎖配列を有さない抗体であっても良い。このような抗体は、単一ドメイン抗体（ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ：ｓｄＡｂ）又はナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）又はラクダ科抗体（重鎖抗体）と呼ばれており、実際にラクダ又はラマで観察され、抗原結合能が保持されていることが報告されている（Ｍｕｙｌｄｅｍａｎｓ Ｓ．ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．（１９９４）７（９），１１２９－３５，Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎ Ｃ．ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９９３）３６３（６４２８）４４６－８）。上記の抗体は、本発明における抗体の抗原結合断片の一種と解釈することも可能である。

また、本発明に用いられる抗体は、結合している糖鎖修飾を調節することによって、抗体依存性細胞障害活性を増強することが可能である。抗体の糖鎖修飾の調節技術としては、ＷＯ９９／５４３４２、ＷＯ２０００／６１７３９、ＷＯ２００２／３１１４０等が知られているが、これらに限定されるものではない。

抗体遺伝子の具体例としては、上に記載された抗体の重鎖配列をコードする遺伝子（もしくはポリヌクレオチド）、軽鎖配列をコードする遺伝子（もしくはポリヌクレオチド）、或いは、それら遺伝子（もしくはポリヌクレオチド）を組み合わせたものを挙げることができる。

抗体遺伝子を一旦単離した後、適当な宿主に導入して抗体を作製する場合には、適当な宿主と上記遺伝子（もしくはポリヌクレオチド）を含む発現ベクターを使用することができる。

宿主細胞を形質転換する際には、重鎖配列遺伝子（もしくはポリヌクレオチド）と軽鎖配列遺伝子（もしくはポリヌクレオチド）は、同一の発現ベクターに挿入されていることが可能であり、又別々の発現ベクターに挿入されていることも可能である。真核細胞を宿主として使用する場合、動物細胞、植物細胞、真核微生物を用いることができる。動物細胞としては、哺乳類細胞、例えば、サルの細胞であるＣＯＳ細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｙ．Ｃｅｌｌ（１９８１）２３，ｐ．１７５－１８２、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６５０）、マウス線維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ－１６５８）やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞、ＡＴＣＣ ＣＣＬ－６１）のジヒドロ葉酸還元酵素欠損株（Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ，Ｌ．Ａ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８０）７７，ｐ．４１２６－４２２０）などを挙げることができる。また、原核細胞を使用する場合は、例えば、大腸菌、枯草菌などを挙げることができる。これらの細胞に目的とする抗体遺伝子を形質転換により導入し、形質転換された細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養することにより抗体が得られる。以上の培養法においては抗体の配列によって収量が異なる場合があり、同等な結合性を持つ抗体の中から収量を指標に医薬としての生産が容易なものを選別することが可能である。

本発明に用いられる抗体のアイソタイプとしては、ＡＬＫ２に対する結合能を有するものであればよく、例えばＩｇＧ（ＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３，ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ（ＩｇＡ１，ＩｇＡ２）、ＩｇＤ或いはＩｇＥ等を挙げることができるが、好ましくはＩｇＧ又はＩｇＭ、さらに好ましくはＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４を挙げることができる。

本発明に用いられる抗体のアイソタイプとしてＩｇＧ１を用いる場合は、定常領域のアミノ酸残基の一部を置換することによって、エフェクター機能を調整することが可能である（ＷＯ８８／０７０８９、ＷＯ９４／２８０２７、ＷＯ９４／２９３５１参照）。ＩｇＧ１の変異体としては、ＩｇＧ１ ＬＡＬＡ（ＩｇＧ１－Ｌ２３４Ａ，Ｌ２３５Ａ）、ＩｇＧ１ ＬＡＧＡ（ＩｇＧ１－Ｌ２３５Ａ，Ｇ２３７Ａ）等が挙げられ、好ましくはＩｇＧ１ ＬＡＬＡである。

本発明に用いられる抗体のアイソタイプとしてＩｇＧ４を用いる場合は、定常領域のアミノ酸残基の一部を置換することによって、ＩｇＧ４特有の分割が抑制され、半減期を延長することが可能である（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３０（１）：１０５－１０８（１９９３）参照）。ＩｇＧ４の変異体としては、ＩｇＧ４ ｐｒｏ（ＩｇＧ４－Ｓ２４１Ｐ）等が挙げられる。

また本発明に用いられる抗体は、抗体の抗原結合部を有する抗体の抗原結合断片又はその修飾物であってもよい。抗体をパパイン、ペプシン等の蛋白質分解酵素で処理するか、或いは抗体遺伝子を遺伝子工学的手法によって改変し適当な培養細胞において発現させることによって、該抗体の断片を得ることができる。このような抗体断片のうちで、抗体全長分子の持つ機能の全て又は一部を保持している断片を抗体の抗原結合断片と呼ぶことができる。抗体の機能としては、一般的には抗原結合性、抗原の活性を阻害する活性、抗原の活性を増強する活性、抗体依存性細胞障害活性、補体依存性細胞障害活性、及び補体依存性細胞性細胞障害活性を挙げることができる。本発明における抗体の抗原結合断片が保持する機能は、ＡＬＫ２に対する結合性、ＡＬＫ２ホモ二量体を形成する性質（例、クロスリンク能）、及び／又はＡＬＫ２－ＴｙｐｅＩＩ受容体ヘテロ二量体の形成を阻害する性質である。ＡＬＫ２に対する結合性とは、抗体又は抗原結合断片がＡＬＫ２分子に（好ましくは、特異的に）結合する性質であり、好ましくはＡＬＫ２のキナーゼ活性を阻害する、より好ましくはＡＬＫ２を介したＢＭＰシグナル伝達を抑制する活性である。

本発明に用いられる抗体は、多量化して抗原に対する親和性を高めたものであってもよい。多量化する抗体としては、１種類の抗体であっても、同一の抗原の複数のエピトープを認識する複数の抗体であってもよい。抗体を多量化する方法としては、ＩｇＧ ＣＨ３ドメインと２つのｓｃＦｖとの結合、ストレプトアビジンとの結合、へリックス－ターン－へリックスモチーフの導入等を挙げることができる。

本発明に用いられる抗体は、アミノ酸配列が異なる複数種類の抗ＡＬＫ２抗体の混合物である、ポリクローナル抗体であってもよい。ポリクローナル抗体の一例としては、ＣＤＲが異なる複数種類の抗体の混合物を挙げることができる。そのようなポリクローナル抗体としては、異なる抗体を産生する細胞の混合物を培養し、該培養物から精製された抗体を用いることができる（ＷＯ２００４／０６１１０４参照）。

本発明に用いられる抗体は、上記の抗体の重鎖及び／又は軽鎖と比較して８０％～９９％又はそれ以上の同一性を有する抗体であってもよい。ここで「同一性」なる用語は、当分野で使用される一般的な定義を有するものとする。同一性の％は、２つのアミノ酸配列をアミノ酸の一致度が最大となるように整列（アラインメント）させたとき総アミノ酸数（ギャップを含む。）あたりの同一アミノ酸数のパーセンテージを指す。上記の重鎖アミノ酸配列及び軽鎖アミノ酸配列と高い同一性を示す配列を組み合わせることによって、上記の各抗体と同等の抗原結合能、ＡＬＫ２ホモ二量体を形成する性質（例、クロスリンク能）、ＡＬＫ２－ＴｙｐｅＩＩ受容体ヘテロ二量体の形成を阻害する性質、ＡＬＫ２キナーゼの活性化阻害作用及び／又はＢＭＰシグナル伝達の抑制作用を有する抗体を選択することが可能である。このような同一性は、一般的には８０％以上もしくは８５％以上の同一性であり、好ましくは９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上もしくは９４％以上の同一性であり、より好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上もしくは９８％以上の同一性であり、最も好ましくは９９％以上の同一性である。また、重鎖及び／又は軽鎖のアミノ酸配列に１もしくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列を組み合わせることによっても、上記の各抗体と同等の各種作用を有する抗体を選択することが可能である。置換、欠失及び／又は付加されるアミノ酸残基数は、一般的には１０アミノ酸残基以下であり、好ましくは５～６アミノ酸残基以下であり、より好ましくは２～３アミノ酸残基以下であり、最も好ましくは１アミノ酸残基である。

なお、哺乳類培養細胞で生産される抗体の重鎖のカルボキシル末端のリジン残基が欠失することが知られており（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ，７０５：１２９－１３４（１９９５））、また、同じく重鎖カルボキシル末端のグリシン、リジンの２アミノ酸残基が欠失し、新たにカルボキシル末端に位置するプロリン残基がアミド化されることが知られている（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３６０：７５－８３（２００７））。

さらにまた、抗体の作製時に、抗体の重鎖又は軽鎖のＮ末端のグルタミン又はグルタミン酸残基がピログルタミル化修飾されることが知られており、本発明に用いられる抗体はそのような修飾を有していてもよい（ＷＯ２０１３／１４７１５３）。

しかし、これらの重鎖配列の欠失、或いは、重鎖又は軽鎖配列の修飾は、抗体の抗原結合能及びエフェクター機能（補体の活性化や抗体依存性細胞障害作用など）には影響を及ぼさない。

従って、本発明に用いられる抗体には当該欠失又は修飾を受けた抗体も含まれ、重鎖カルボキシル末端において１又は２つのアミノ酸が欠失した欠失体、及びアミド化された当該欠失体（例えば、カルボキシル末端部位のプロリン残基がアミド化された重鎖）、重鎖又は軽鎖のＮ末端アミノ酸残基がピログルタミル化された抗体、等を挙げることができる。但し、抗原結合能及びエフェクター機能が保たれている限り、本発明に用いられる抗体の重鎖のカルボキシル末端の欠失体は上記の種類に限定されない。本発明に用いられる抗体を構成する２本の重鎖は、完全長及び上記の欠失体からなる群から選択される重鎖のいずれか一種であっても良いし、いずれか二種を組み合わせたものであっても良い。各欠失体の量比は本発明に用いられる抗体を産生する哺乳類培養細胞の種類及び培養条件に影響を受け得るが、抗体の主成分としては２本の重鎖の双方でカルボキシル末端の１つのアミノ酸残基が欠失している場合を挙げることができる。

二種類のアミノ酸配列間の同一性は、Ｂｌａｓｔ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．２．２（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｆ．，Ｔｈｏｍａｓ Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，Ａｌｅｊａｎｄｒｏ Ａ．Ｓｃｈａｆｆｅｒ，Ｊｉｎｇｈｕｉ Ｚｈａｎｇ，Ｚｈｅｎｇ Ｚｈａｎｇ，Ｗｅｂｂ Ｍｉｌｌｅｒ，ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ（１９９７），「Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ：ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ」，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２）のデフォルトパラメーターを使用することによって決定することができる。Ｂｌａｓｔ ａｌｇｏｒｉｔｈｍは、インターネットでｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔにアクセスすることによっても使用することができる。なお、上記のＢｌａｓｔ ａｌｇｏｒｉｔｈｍによってＩｄｅｎｔｉｔｙ（又はＩｄｅｎｔｉｔｉｅｓ）及びＰｏｓｉｔｉｖｉｔｙ（又はＰｏｓｉｔｉｖｉｔｉｅｓ）の２種類のパーセンテージの値が計算される。前者は同一性を求めるべき二種類のアミノ酸配列の間でアミノ酸残基が一致した場合の値であり、後者は化学構造の類似したアミノ酸残基も考慮した数値である。本明細書においては、アミノ酸残基が一致している場合のＩｄｅｎｔｉｔｙ（同一性）の値を持って同一性の値とする。

抗体の修飾物として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる。

本発明に用いられる抗体は、更にこれらの抗体と他の薬剤がコンジュゲートを形成しているもの（Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）でもよい。このような抗体の例としては、該抗体が放射性物質や薬理作用を有する化合物と結合している物を挙げることができる（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５）２３，ｐ．１１３７－１１４６）。

得られた抗体は、均一にまで精製することができる。抗体の分離、精製は通常の蛋白質で使用されている分離、精製方法を使用すればよい。例えばカラムクロマトグラフィー、フィルター濾過、限外濾過、塩析、透析、調製用ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動等を適宜選択、組み合わせれば、抗体を分離、精製することができる（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ，Ｄａｎｉｅｌ Ｒ．Ｍａｒｓｈａｋ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８））が、これらに限定されるものではない。

クロマトグラフィーとしては、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等を挙げることができる。

これらのクロマトグラフィーは、ＨＰＬＣやＦＰＬＣ等の液体クロマトグラフィーを用いて行うことができる。

アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムを挙げることができる。

例えばプロテインＡカラムを用いたカラムとして、Ｈｙｐｅｒ Ｄ，ＰＯＲＯＳ，Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．（ＧＥヘルスケア）等を挙げることができる。

また抗原を固定化した担体を用いて、抗原への結合性を利用して抗体を精製することも可能である。

本発明における抗ＡＬＫ２抗体のＡＬＫ２との結合親和性を示すＫ_Ｄ値は、好ましくは１０^－６Ｍ以下、例えば１０^－７Ｍ以下、１０^－８Ｍ以下、１０^－９Ｍ以下、１０^－１０Ｍ以下、１０^－１１Ｍ以下、１０^－１２Ｍ以下などである。

４．医薬組成物
本発明は、抗ＡＬＫ２抗体又は該抗体の抗原結合断片の少なくともいずれか１つを含有することを特徴とする、医薬組成物を提供する。

本発明の抗ＡＬＫ２抗体は、例えば以下の抗体又はその抗原結合断片を包含する。
以下の（ａ）～（ｃ）に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを特異的に認識し、ＢＭＰシグナル伝達を抑制する抗体又は該抗体の抗原結合断片：
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の２１～１２３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の２１～１２３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号３に示されるアミノ酸配列の２１～１２３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列。

上記抗ＡＬＫ２抗体は、例えば以下の（１）～（７）の少なくとも１つである。
（１）重鎖配列が、配列番号１３（ＣＤＲＨ１）、配列番号１４（ＣＤＲＨ２）及び配列番号１５（ＣＤＲＨ３）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ配列を含む可変領域を含み、並びに、軽鎖配列が、配列番号１６（ＣＤＲＬ１）、配列番号１７（ＣＤＲＬ２）及び配列番号１８（ＣＤＲＬ３）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ配列を含む可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合断片。
（２）配列番号９に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域配列及び配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域配列を含む抗体又は該抗体の抗原結合断片。
（３）上記（１）又は（２）に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片と、ＡＬＫ２タンパク質の細胞外領域への結合に対し交差競合する抗体又は該抗体の抗原結合断片。
（４）上記（１）～（３）のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む抗体又は該抗体の抗原結合断片。
（５）上記（１）～（３）のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む抗体又は該抗体の抗原結合断片。
（６）上記（１）～（３）のいずれかのアミノ酸配列に１もしくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列を含む抗体又は該抗体の抗原結合断片。
（７）修飾を含む、上記（１）～（６）のいずれかの抗体又は該抗体の抗原結合断片。

上記（７）における「修飾」は、上記３．の「抗ＡＬＫ２抗体及びその製造」の項に例示されている。

ＡＬＫ２の活性化型変異に起因する疾患としては、例えば、進行性骨化性線維形成異常症（ＦＯＰ）、進行性骨異形成（ＰＯＨ）、広汎性特発性骨増殖症（ＤＩＳＨ)、外傷性の異所性骨化、人工関節置換術後の異所性骨化、びまん性橋膠腫（ＤＩＰＧ）、脊椎関節炎（ＳｐＡ）、強直性脊椎炎（ＡＳ）、貧血、薄毛等を挙げることができ、好ましくは進行性骨化性線維形成異常症（ＦＯＰ）、進行性骨異形成（ＰＯＨ）、外傷性の異所性骨化、又は人工関節置換術後の異所性骨化であり、より好ましくは進行性骨化性線維形成異常症（ＦＯＰ）であるが、ＡＬＫ２の活性化型変異に起因する疾患であれば、これらに限定されない。ＦＯＰの患者には手足の指の癒合又は変形、頚椎の癒合又は変形なども見られ、難聴も認められるが、これらもＡＬＫ２の活性化型変異に起因する疾患に含まれる。

このような疾患では、ＡＬＫ２を介したＢＭＰシグナル伝達により、異所性骨化及び／又は腱靭帯の骨化及び／又は脳腫瘍が惹起される。

本発明の医薬組成物は、例えば、異所性骨化及び／又は腱靭帯の骨化及び／又は脳腫瘍（例、びまん性橋膠腫（ＤＩＰＧ））の治療及び／又は予防剤である。

「異所性骨化」とは、本来骨がない部位に骨ができることを意味する。異所性骨化は、好ましくは進行性骨化性線維形成異常症（ＦＯＰ）である。

ＦＯＰの患者ではＡＬＫ２に活性化型変異が認められており、これまでに１０種類以上の変異の種類が報告されている。それら変異は全てＡＬＫ２タンパク質の細胞内領域に存在するアミノ酸変異（ミスセンス変異）であることが分かっており、細胞外領域のアミノ酸配列には変化がない。したがって、ＡＬＫ２の細胞外領域に結合する抗ＡＬＫ２抗体を用いることにより、変異の種類に寄らず、ＦＯＰに対する治療及び／又は予防効果が得られる。

ＦＯＰの治療とは、ＦＯＰの症状の治癒、症状の改善、症状の軽減、又は症状の進行の抑制を意味する。

ＦＯＰの予防とは、フレアアップ又は異所性骨化が発症することを回避又は抑制することを意味する。

本明細書における「脳腫瘍」としては、例えば、びまん性橋膠腫（ＤＩＰＧ）、脳幹グリオーマ、膠芽腫、多形性膠芽腫（ＧＢＭ）、非膠芽腫脳腫瘍、髄膜腫、中枢神経系リンパ腫、神経膠腫、星細胞腫、未分化星細胞腫、乏突起膠腫、乏突起星細胞腫、髄芽腫、上衣腫等を挙げることができ、好ましくはびまん性橋膠腫（ＤＩＰＧ）である。

ＤＩＰＧの患者でもＡＬＫ２に活性化型変異が認められている。ヒトＡＬＫ２の変異型としては、Ｒ２０６Ｈ、Ｒ２５８Ｇ、Ｇ３２８Ｅ、Ｇ３２８Ｖ、Ｇ３２８Ｗ、及びＧ３５６Ｄが知られており、Ｇ３２８Ｖ変異以外はＦＯＰの患者で認められている変異と共通している。Ｇ３２８Ｖ変異が存在する場合を除き、抗ＡＬＫ２抗体はＡＬＫ２阻害活性を示すことから、本発明に用いられる抗ＡＬＫ２抗体は、Ｇ３２８Ｖ変異以外のＡＬＫ２活性化型変異を有する患者おいて、ＤＩＰＧに対する治療及び／又は予防効果を有する。

本発明はまた、上記抗体又は該抗体の抗原結合断片の、異所性骨化及び／又はびまん性橋膠腫（ＤＩＰＧ）の治療及び／又は予防剤としての使用を提供する。

Ｉｎ ｖｉｔｒｏでの抗ＡＬＫ２抗体によるＡＬＫ２の生物活性（ＢＭＰシグナル阻害活性）は、例えば、ＢＭＰ応答配列を挿入したレポータープラスミドを用いたルシフェラーゼアッセイ、ＳＭＡＤ１／５／８のリン酸化、ＢＭＰ標的遺伝子の発現解析、又はＢＭＰリガンドによる刺激によって骨芽細胞への分化を誘導させたマウス筋芽細胞Ｃ２Ｃ１２におけるアルカリフォスファターゼ活性を測定することで確認できる。

筋芽細胞（Ｃ２Ｃ１２細胞）をＢＭＰ存在下で培養すると、ＢＭＰに特異的な細胞内シグナル伝達機構により成熟筋細胞への分化が抑制され、代わりに骨芽細胞への分化が誘導される。したがって、Ｃ２Ｃ１２細胞を用いたＢＭＰによる骨芽細胞への分化誘導モデルにより、ＡＬＫ２を介したＢＭＰシグナル伝達を解析することができる。

Ｉｎ ｖｉｖｏでの実験動物を利用した抗ＡＬＫ２抗体の異所性骨化に対する治療又は予防効果は、例えば、マウスの筋肉にＢＭＰリガンド含有ペレットを移植した異所性骨化誘導モデル、又は変異ＡＬＫ２を導入したＦＯＰモデルマウスに対して抗ＡＬＫ２抗体を皮下又は静脈投与し、異所性骨の形成を解析することで確認することができる。或いは、脳腫瘍に対する治療又は予防効果は、例えば、免疫不全マウスに患者由来の腫瘍細胞を脳又は皮下等に移植したモデルに対して抗ＡＬＫ２抗体を皮下又は静脈投与し、腫瘍の増殖やマウスの生存日数を解析することで確認することができる。

本発明において用いられる抗ＡＬＫ２抗体は、異所性骨化の治療又は予防に対しては該抗体単独で、或いは少なくとも一つの他の異所性骨化治療剤と併用して投与することができ、脳腫瘍の治療又は予防に対しては該抗体単独で、或いは少なくとも一つの他の脳腫瘍治療剤、放射線治療、免疫療法、又は化学療法などと併用して投与することができる。

抗ＡＬＫ２抗体と併用して投与できる他の異所性骨化治療剤としては、抗炎症剤、ステロイド剤、ビスフォスフォネート、筋弛緩剤、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）γアゴニスト等を挙げることができるがこれらに限定されない。

抗炎症剤としては、アスピリン、ジクロフェナク、インドメタシン、イブプロフェン、ケトプロフェン、ナプロキセン、ピロキシカム、ロフェコキシブ、セレコキシブ、アザチオプリン、ペニシラミン、メトトレキセート、スルファサラジン、レフルノミド、インフリキシマブ、エタネルセプト等を挙げることができ、好ましくはインドメタシン、イブプロフェン、ピロキシカム、又はセレコキシブである。

ステロイド剤としては、プレドニゾロン、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、フルチカゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン等を挙げることができ、好ましくはプレドニゾロンである。

ビスフォスフォネートとしては、アレンドロネート、シマドロネート、クロドロネート、エチドロネート、イバンドロネート、インカドロネート、ミノドロネート、ネリドロネート、オルパドロネート、パミドロネート、ピリドロネート、リセドロネート、チルドロネート、ゾレドロネート等を挙げることができ、好ましくはパミドロネート、又はゾレドロネートである。

筋弛緩剤としては、シクロベンザプリン、メタキサロン、バクロフェン等を挙げることができ、好ましくはバクロフェンである。

レチノイン酸受容体γアゴニストとしては、Ｐａｌｏｖａｒｏｔｅｎｅ等を挙げることができる。

抗ＡＬＫ２抗体と併用して投与できる他の脳腫瘍治療剤としては、例えば、テモゾロミド、ベバシズマブ、カルムスチン、ロムスチン、塩酸プロカルバジン、ビンクリスチン等を挙げることができる。

異所性骨化又は脳腫瘍の状態やどの程度の治療及び／又は予防を目指すかによって、２、３或いはそれ以上の他の治療剤を投与することもできるし、それらの他の治療剤は同じ製剤の中に封入することによって同時に投与することができる。他の治療剤と抗ＡＬＫ２抗体は同じ製剤の中に封入することによって同時に投与することもできる。また、抗ＡＬＫ２抗体と他の治療剤を別々の製剤に封入して同時に投与することもできる。さらに、他の薬剤と抗ＡＬＫ２抗体を相前後して別々に投与することもできる。すなわち、他の治療剤を投与した後に抗ＡＬＫ２抗体又は該抗体の抗原結合断片を有効成分として含有する治療剤を投与するか、或いは抗ＡＬＫ２抗体又は該抗体の抗原結合断片を有効成分として含有する治療剤を投与した後に他の治療剤を投与しても良い。遺伝子治療において投与する場合には、蛋白質性の異所性骨化又は脳腫瘍治療剤の遺伝子と抗ＡＬＫ２抗体の遺伝子は、別々の或いは同じプロモーター領域の下流に挿入することができ、別々の或いは、同じベクターに導入することができる。

抗ＡＬＫ２抗体、或いはそのフラグメントに対し異所性骨化又は脳腫瘍治療剤を結合させることにより、Ｍ．Ｃ．Ｇａｒｎｅｔ「Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｇｒｅｓｓ」，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ，（２００１）５３，１７１－２１６記載の標的型薬物複合体を製造することができる。この目的には、抗体分子のほか、ＡＬＫ２との結合能（もしくは、認識性）を完全消失していない限り、いずれの抗体フラグメントも適用可能であるが、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２等のフラグメントを例として挙げることができる。抗ＡＬＫ２抗体又は該抗体のフラグメントとＦＯＰ治療剤との結合様式は、Ｍ．Ｃ．Ｇａｒｎｅｔ「Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｇｒｅｓｓ」，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ，（２００１）５３，１７１－２１６、Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（１９９６）、Ｐｕｔｎａｍ ａｎｄ Ｊ．Ｋｏｐｅｃｅｋ「Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｗｉｔｈ Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ａｃｔｉｖｉｔｙ」Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９５）１２２，５５－１２３等に記載される種々の形態があり得る。すなわち、抗ＡＬＫ２抗体と異所性骨化又は脳腫瘍治療剤が化学的に直接或いはオリゴペプチド等のスペーサーを介在して結合される様式や、適当な薬物担体を介在して結合される様式を挙げることができる。薬物担体の例としては、リポソーム、ナノ粒子、ナノミセル、水溶性高分子等のドラッグデリバリーシステム（例えばＸ．Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎａｎｏｍａｔｅｒ．２０１６；２０１６：ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１６／１０８７２５０、Ｊ． Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，２５：１，１３１９－１３２７，ＤＯＩ：１０．１０８０／１０７１７５４４．２０１８．１４７７８５７）を挙げることができる。これら薬物担体が介在される様式としては、より具体的には、異所性骨化又は脳腫瘍治療剤がリポソームに包含され、該リポソームと抗体とが結合した様式、及び、異所性骨化又は脳腫瘍治療剤が水溶性高分子（分子量１０００～１０万程度の化合物）に化学的に直接或いはオリゴペプチド等のスペーサーを介在させて結合され、該水溶性高分子に抗体が結合した様式、を例として挙げることができる。抗体（又は該フラグメント）と異所性骨化又は脳腫瘍治療剤、リポソーム及び水溶性高分子等の薬物担体との結合は、Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（１９９６）、Ｐｕｔｎａｍ ａｎｄ Ｊ．Ｋｏｐｅｃｅｋ「Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｗｉｔｈ Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ａｃｔｉｖｉｔｙ」Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９５）１２２，５５－１２３に記載の方法等の当業者周知の方法により実施することができる。異所性骨化又は脳腫瘍治療剤のリポソームへの包含は、Ｄ．Ｄ．Ｌａｓｉｃ「Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：Ｆｒｏｍ Ｐｈｙｓｉｃｓ ｔｏ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｂ．Ｖ．，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９９３）等に記載の方法等の当業者周知の方法により実施することができる。異所性骨化又は脳腫瘍治療剤の水溶性高分子への結合は、Ｄ．Ｐｕｔｎａｍ ａｎｄ Ｊ Ｋｏｐｅｃｅｋ「Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｗｉｔｈ Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ａｃｔｉｖｉｔｙ」Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９５）１２２，５５－１２３記載の方法等の当業者周知の方法により、実施することができる。抗体（又はそのフラグメント）と蛋白質性の異所性骨化又は脳腫瘍治療剤（例えば抗体又はそのフラグメント）との複合体は、上記の方法のほか、遺伝子工学的に、当業者周知の方法により作製することができる。

本発明に用いられる抗ＡＬＫ２抗体の投与量は、ヒト型抗ＡＬＫ２抗体を患者に対して投与する際には、例えば約０．１～１００ｍｇ／ｋｇ体重を１～１８０日間に１回又は複数回投与すればよい。しかし、投与量や投与回数は、一般に、患者の性別、体重、年齢、症状、重篤度、副作用などを考慮して決定されるべきものであるので、上記の用量や用法には限定されないものとする。

本発明に用いられる抗ＡＬＫ２抗体は、非限定的に、例えば点滴を含む注射剤、坐剤、経鼻剤、舌下剤、経皮吸収剤などを挙げることができる。投与経路は、経口経路又は非経口経路であり、非経口経路には、非限定的に、例えば静脈内、動脈内、筋肉内、直腸内、経粘膜内、皮内、腹腔内、脳室内などの経路が挙げられる。

５．ＡＬＫ２キナーゼの活性化又はＢＭＰシグナル伝達を阻害する方法
本発明の抗体は、ＡＬＫ２の細胞外領域に特異的に結合し、ＡＬＫ２ホモ二量体を形成する性質、ＡＬＫ２－ＴｙｐｅＩＩ受容体ヘテロ二量体の形成を阻害する性質、並びに、ＡＬＫ２キナーゼの活性化を阻害する性質を有する抗体又は該抗体の抗原結合断片、或いは、ＡＬＫ２の細胞外領域に特異的に結合し、ＡＬＫ２ホモ二量体を形成する性質、ＡＬＫ２－ＴｙｐｅＩＩ受容体ヘテロ二量体の形成を阻害する性質、並びに、ＢＭＰシグナル伝達を阻害する性質を有する抗体又は該抗体の抗原結合断片、を含む。

このような抗体は、ＢＭＰ受容体（ＡＬＫ２及びＴｙｐｅＩＩ受容体からなる四量体）に対して構造的な変化をもたらすことによりＡＬＫ２／ＡＣＶＲ１（ＴｙｐｅＩ受容体）とＴｙｐｅＩＩ受容体の相互作用が阻害され、それにより受容体の活性化抑制効果が発揮されるという、新しい知見に基づく。上記相互作用とは、ＴｙｐｅＩＩ受容体がＴｙｐｅＩ受容体のＧＳドメインをリン酸化してＴｙｐｅＩ受容体を活性化することを指す。したがって、上記構造的な変化は、上記ＧＳドメインのリン酸化を起こすことができない程度の不完全な（緩めの（loose））上記四量体の立体的な構造変化である。

したがって、本発明は、細胞表面にＡＬＫ２を発現する細胞において、ＡＬＫ２の細胞外領域に特異的に結合し、ＡＬＫ２ホモ二量体を形成する性質、ＡＬＫ２－ＴｙｐｅＩＩ受容体ヘテロ二量体の形成を阻害する性質を有する抗体を用いてＡＬＫ２キナーゼの活性化を阻害することを特徴とする、ＡＬＫ２キナーゼの活性化を阻害する方法を提供する。

本発明はまた、細胞表面にＡＬＫ２を発現する細胞において、ＡＬＫ２の細胞外領域に特異的に結合し、ＡＬＫ２ホモ二量体を形成する性質、ＡＬＫ２－ＴｙｐｅＩＩ受容体ヘテロ二量体の形成を阻害する性質を有する抗体を用いてＢＭＰシグナル伝達を阻害することを特徴とする、ＢＭＰシグナル伝達を阻害する方法を提供する。

ＡＬＫ２の３３０番目のアミノ酸残基は、ヒトの場合の天然型のプロリンであることが望ましい。また、ＡＬＫ２が活性化型変異を有していてもよい。ＡＬＫ２の活性化型変異としては、Ｌ１９６Ｐ、ｄｅｌＰ１９７＿Ｆ１９８ｉｎｓＬ、Ｒ２０２Ｉ、Ｒ２０６Ｈ、Ｑ２０７Ｅ、Ｒ２５８Ｓ、Ｒ２５８Ｇ、Ｇ３２５Ａ、Ｇ３２８Ｅ、Ｇ３２８Ｒ、Ｇ３２８Ｗ、Ｇ３５６Ｄ、及びＲ３７５Ｐから選択される少なくとも一つを挙げることができ、好ましくは、Ｒ２０６Ｈ、Ｒ２５８Ｇ、Ｇ３２８Ｅ、Ｇ３２８Ｗ、Ｇ３５６Ｄ、及びＫ４００Ｅから選択される少なくとも一つであり、より好ましくは、Ｒ２０６Ｈである。言い換えれば、ＡＬＫ２は天然型又は活性型変異のいずれであったとしても、本発明の抗体は、ＡＬＫ２キナーゼの活性化を阻害する、或いはＢＭＰシグナル伝達を阻害することができる。

抗体は、構造的にも生物学的にも特性化し易いという点で、好ましくは、モノクローナル抗体又は該抗体の抗原結合断片である。

上記の方法で使用しうるモノクローナル抗体又は該抗体の抗原結合断片は、例えば下記の（１）～（８）に記載の少なくとも１つの抗体又は該抗体の抗原結合断片である。
（１）配列番号１３（ＣＤＲＨ１）、配列番号１４（ＣＤＲＨ２）及び配列番号１５（ＣＤＲＨ３）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲを含む重鎖可変領域、並びに、配列番号１６（ＣＤＲＬ１）、配列番号１７（ＣＤＲＬ２）及び配列番号１８（ＣＤＲＬ３）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合断片、或いは、上記抗体又は該抗体の抗原結合断片と、ＡＬＫ２タンパク質の細胞外領域への結合に対し交差競合する抗体又は該抗体の抗原結合断片。
（２）配列番号２９（ＣＤＲＨ１）、配列番号３０（ＣＤＲＨ２）及び配列番号３１（ＣＤＲＨ３）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲを含む重鎖可変領域、並びに、配列番号３２（ＣＤＲＬ１）、配列番号３３（ＣＤＲＬ２）及び配列番号３４（ＣＤＲＬ３）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合断片、或いは、上記抗体又は該抗体の抗原結合断片と、ＡＬＫ２タンパク質の細胞外領域への結合に対し交差競合する抗体又は該抗体の抗原結合断片。
（３）配列番号３５（ＣＤＲＨ１）、配列番号３６（ＣＤＲＨ２）及び配列番号３７（ＣＤＲＨ３）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲを含む重鎖可変領域、並びに、配列番号３８（ＣＤＲＬ１）、配列番号３９（ＣＤＲＬ２）及び配列番号４０（ＣＤＲＬ３）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合断片、或いは、上記抗体又は該抗体の抗原結合断片と、ＡＬＫ２タンパク質の細胞外領域への結合に対し交差競合する抗体又は該抗体の抗原結合断片。
（４）配列番号４１（ＣＤＲＨ１）、配列番号４２（ＣＤＲＨ２）及び配列番号４３（ＣＤＲＨ３）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲを含む重鎖可変領域、並びに、配列番号４４（ＣＤＲＬ１）、配列番号４５（ＣＤＲＬ２）及び配列番号４６（ＣＤＲＬ３）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合断片、或いは、上記抗体又は該抗体の抗原結合断片と、ＡＬＫ２タンパク質の細胞外領域への結合に対し交差競合する抗体又は該抗体の抗原結合断片。
（５）配列番号４７（ＣＤＲＨ１）、配列番号４８（ＣＤＲＨ２）及び配列番号４９（ＣＤＲＨ３）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲを含む重鎖可変領域、並びに、配列番号５０（ＣＤＲＬ１）、配列番号５１（ＣＤＲＬ２）及び配列番号５２（ＣＤＲＬ３）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合断片、或いは、上記抗体又は該抗体の抗原結合断片と、ＡＬＫ２タンパク質の細胞外領域への結合に対し交差競合する抗体又は該抗体の抗原結合断片。
（６）上記（１）～（５）のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む抗体又は該抗体の抗原結合断片。
（７）上記（１）～（５）のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む抗体又は該抗体の抗原結合断片。
（８）上記（１）～（５）のいずれかのアミノ酸配列に１もしくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列を含む抗体又は該抗体の抗原結合断片。

上記（２）～（５）の特定の抗体は、ＷＯ２０１６／１２１９０８で本発明者らが記載したＡ２－１１Ｅ、Ａ２－１５Ａ、Ａ２－２５Ｃ、Ａ２－２７Ｄである。これらの抗体は、上記（１）の抗体と同様に、ＡＬＫ２ホモ二量体を形成する性質（図７Ｂ）、並びに、ＡＬＫ２－ＴｙｐｅＩＩ受容体ヘテロ二量体の形成を阻害する性質（図８Ｂ）を有する。

Ａ２－１５Ａ抗体由来のヒト化抗体としては、Ａ２－１５Ａの６種全てのＣＤＲ配列を含み、ＡＬＫ２に対する結合性及びクロスリンク能、並びにＡＬＫ２及び－ＴｙｐｅＩＩ受容体ヘテロ二量体の形成阻害能を持つ限り、本発明に用いられる抗体に含まれる。なお、Ａ２－１５Ａ抗体の重鎖可変領域は、配列番号２９に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１（GFTFSHYYMA）、配列番号３０に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２（SITNSGGSINYRDSVKG）、及び配列番号３１に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３（EGGENYGGYPPFAY）を含む。また、Ａ２－１５Ａ抗体の軽鎖可変領域は、配列番号３２に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１（RANQGVSLSRYNLMH）、配列番号３３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２（RSSNLAS）、及び配列番号３４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３（QQSRESPFT）を含む。ＣＤＲＬ２は、配列番号３３に示されるアミノ酸配列において、１個のアミノ酸を置換した配列番号５５に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２（RSSNLAQ）を含む。さらにまた、上記ＡＬＫ２への結合に対して上記Ａ２－１５Ａ抗体と競合する抗体を含む。

Ａ２－１５Ａ抗体由来のヒト化抗体の実例としては、配列番号５６に示されるアミノ酸配列の２０～４６８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号５７に示されるアミノ酸配列の２１～２３８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体を挙げることができる。

Ａ２－２７Ｄ抗体由来のヒト化抗体としては、Ａ２－２７Ｄの６種全てのＣＤＲ配列を含み、ＡＬＫ２に対する結合性及びクロスリンク能、並びにＡＬＫ２及び－ＴｙｐｅＩＩ受容体ヘテロ二量体の形成阻害能を持つ限り、本発明に用いられる抗体に含まれる。なお、Ａ２－２７Ｄ抗体の重鎖可変領域は、配列番号３５に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１（GSTFSNYGMK）、配列番号３６に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２（SISRSSTYIYYADTVKG）、及び配列番号３７に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３（AISTPFYWYFDF）を含む。また、Ａ２－２７Ｄ抗体の軽鎖可変領域は、配列番号３８に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１（LASSSVSYMT）、配列番号３９に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２（GTSNLAS）、及び配列番号４０に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３（LHLTSYPPYT）を含む。さらにまた、上記ＡＬＫ２への結合に対して上記Ａ２－２７Ｄ抗体と競合する抗体を含む。

Ａ２－２７Ｄ抗体由来のヒト化抗体の実例としては、配列番号５８に示されるアミノ酸配列の２０～４７０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号５９に示されるアミノ酸配列の２１～２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体、又は配列番号６０に示されるアミノ酸配列の２０～４７０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号６１に示されるアミノ酸配列の２１～２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体を挙げることができる。

Ａ２－１１Ｅ抗体由来のヒト化抗体としては、Ａ２－１１Ｅの６種全てのＣＤＲ配列を含み、ＡＬＫ２に対する結合性及びクロスリンク能、並びにＡＬＫ２及び－ＴｙｐｅＩＩ受容体ヘテロ二量体の形成阻害能を持つ限り、本発明に用いられる抗体に含まれる。なお、Ａ２－１１Ｅ抗体の重鎖可変領域は、配列番号４１に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１（GFTFSNYYMY）、配列番号４２に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２（SINTDGGSTYYPDSVKG）、及び配列番号４３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３（STPNIPLAY）を含む。また、Ａ２－１１Ｅ抗体の軽鎖可変領域は、配列番号４４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１（KASQNIYKYLN）、配列番号４５に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２（YSNSLQT）、及び配列番号４６に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３（FQYSSGPT）を含む。さらにまた、上記ＡＬＫ２への結合に対して上記Ａ２－１１Ｅ抗体と競合する抗体を含む。

Ａ２－２５Ｃ抗体由来のヒト化抗体としては、Ａ２－２５Ｃの６種全てのＣＤＲ配列を含み、ＡＬＫ２に対する結合性及びクロスリンク能、並びにＡＬＫ２及び－ＴｙｐｅＩＩ受容体ヘテロ二量体の形成阻害能を持つ限り、本発明に用いられる抗体に含まれる。なお、Ａ２－２５Ｃ抗体の重鎖可変領域は、配列番号４７に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１（GFTFSYYAMS）、配列番号４８に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２（SISRGGDNTYYRDTVKG）、及び配列番号４９に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３（LNYNNYFDY）を含む。また、Ａ２－２５Ｃ抗体の軽鎖可変領域は、配列番号５０に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１（QASQDIGNWLS）、配列番号５１に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２（GATSLAD）、及び配列番号５２に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３（LQAYSAPFT）を含む。さらにまた、上記ＡＬＫ２への結合に対して上記Ａ２－２５Ｃ抗体と競合する抗体を含む。

６．診断用組成物
本発明は、抗ＡＬＫ２抗体又は該抗体の抗原結合断片を含む検査用又は診断用組成物（以下、まとめて「診断用組成物」という）を提供する。

本発明の診断用組成物は、ＦＯＰなどＡＬＫ２に関わる疾患、ＡＬＫ２発現の検査又は診断に有用である。本発明において検査又は診断には、例えば、罹患リスクの判定又は測定、罹患の有無の判定、進行や増悪化の程度の測定、抗ＡＬＫ２抗体等の医薬組成物による薬物治療の効果の測定又は判定、薬物治療以外の治療の効果の測定又は判定、再発リスクの測定、再発の有無の判定等が含まれるが、検査又は診断であればそれらに限定されるものではない。

本発明の診断用組成物は、本発明の抗体又は該抗体の抗原結合断片、それらを含む組成物、それらを含む医薬組成物を投与する個体の同定に有用である。

かかる診断用組成物には、ｐＨ緩衝剤、浸透圧調節剤、塩類、安定化剤、防腐剤、顕色剤、増感剤、凝集防止剤等を含有せしめることができる。

本発明はＦＯＰなどＡＬＫ２に関わる疾患の検査方法又は診断方法、該疾患の診断用組成物を調製するための本発明の抗体の使用、該疾患の検査又は診断のための本発明の抗体の使用、をも提供する。本発明の抗体を含む検査又は診断用キットも本発明に含まれる。

本発明の抗体を含む検査又は診断の方法としてはサンドウィッチＥＬＩＳＡが望ましいが、通常のＥＬＩＳＡ法やＲＩＡ法、ＥＬＩＳＰＯＴ（Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ）法、ドットブロット法、オクタロニー法、ＣＩＥ（Ｃｏｕｎｔｅｒｉｍｍｕｎｏｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）法、ＣＬＩＡ（Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、ＦＣＭ（Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）などの抗体を利用した検出方法が利用可能である。抗体の標識法としてはビオチンのほか、ＨＲＰ、アルカリフォスファターゼ、ＦＩＴＣやＡＬＥＸＡなどの発蛍光団、放射性同位元素などのラベルなど生化学的解析に実施可能な標識法が利用できる。酵素標識を利用した検出にはＴＭＢ（３，３’，５，５’－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）、ＢＣＩＰ（５－ｂｒｏｍｏ－４－ｃｈｌｏｒｏ－３－ｉｎｄｏｌｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ρ－Ｎ ＰＰ（ρ－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ＯＰＤ（ｏ－Ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）、ＡＢＴＳ（３－Ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ－６－ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ ＥＬＩＳＡ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）などの発色基質やＱｕａｎｔａＢｌｕ^ＴＭＦｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ Ｐｅｒｏｘ ｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）蛍光基質のほか、化学発光基質を用いることができる。本測定には、ヒト又は非ヒト動物由来の試料に加え、組換え蛋白質等の人工的な処理を加えた試料をも供することができる。生物個体由来の被検試料としては、例えば、血液、関節液、腹水、リンパ液、脳脊髄液、組織ホモジネート上清、組織切片等をあげることができるが、それらに限定されるものではない。

本発明の抗体を含む検査又は診断用のサンドウィッチＥＬＩＳＡキットには、ＡＬＫ２蛋白質標準液、発色試薬、希釈用緩衝液、固相用抗体、検出用抗体、ならびに洗浄液等が含まれてよい。抗原に結合した抗体量を測定する方法としては、吸光法、蛍光法、発光法、ＲＩ（Ｒａｄｉｏｉｓｏｔｏｐｅ）法等が好適に適用され、測定には、吸光プレートリーダー、蛍光プレートリーダー、発光プレートリーダー、ＲＩ液体シンチレーションカウンター等が好適に使用される。

上記の免疫組織学的試験だけでなく、試料中の細胞、組織又は臓器もしくはその一部から、常法に従って可溶性蛋白を調製し、当該可溶性蛋白に標識化抗体を反応させることにより可溶性蛋白中のＡＬＫ２の存否を確認するウェスタンブロッティング法やドットブロット法においても用いることができる。

本発明は免疫組織化学（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：ＩＨＣ）の分析に有用な抗体、該抗体の抗原結合断片、ならびにそれらを含む組成物を提供する。かかる組成物も本発明の「診断用組成物」に包含される。

免疫組織化学は、組織切片を抗原に結合する抗体（一次抗体）を反応させ、抗原に結合した一次抗体を検出する手法であれば特に限定されない。

組織切片は、好適にはホルマリン固定後にパラフィン包埋処理する。パラフィン包埋後、薄切した組織切片を脱パラフィン処理した後、抗原賦活処理および非特異的反応抑制処理を行う。抗原賦活処理の方法としては、加熱処理、プロテアーゼ等による酵素処理を例示することができ、好適には加熱処理である。加熱処理の条件としては、通常、温度９０～１１０℃、ｐＨ８～１０、処理時間２０～６０分の範囲が好適である。ｐＨの調整にはＴｒｉｓ－ＥＤＴＡ緩衝液（例えば、１ｍＭのＥＤＴＡを含有する１０ｍＭトリス緩衝液）等を使用することができる。非特異的反応抑制処理としては、発色に使用する酵素と同様又は類似の触媒活性を有する内因性の酵素を不活性化する方法が通常用いられる。ペルオキシダーゼ反応により発色させる場合、予め組織中に存在する内因性のペルオキシダーゼをＨ_２Ｏ_２等で阻害することが好ましい。Ｈ_２Ｏ_２の溶媒は水、メタノール等を使用することができ、Ｈ_２Ｏ_２の濃度は０．１～３％、好適には０．３～３％である。Ｈ_２Ｏ_２溶液にはアジ化ナトリウムを添加することができる。また、血清やカゼインによりブロッキングする方法も非特異的反応抑制処理として使用することができる。血清やカゼインは、一次抗体反応の前に組織を処理することができるが、１次抗体を希釈する溶媒に含有せしめることもできる。

一次抗体の反応条件は特に限定されないが、温度４～５０℃、好適には２０～３７℃、より好適には２４℃である。反応時間は５分～一昼夜、好適には１０分～４時間、より好適には３０分～１時間である。

一次抗体の検出には、好適には、可視化することができ且つ一次抗体に結合する抗体（二次抗体）を用いることができる。二次抗体自体に結合する抗体（三次抗体）を用いて３回以上の反応を行う場合もある。二次抗体又は三次抗体の可視化法としては、ペルオキシダーゼやアルカリフォスファターゼ等の酵素をそれらの抗体に結合させるか、又はそれらの抗体にビオチン等を付加して上記酵素を結合させたストレプトアビジン等と結合させ、それらの酵素に対応する発色基質を反応させる方法を好適に使用することができる。酵素を二次抗体又は三次抗体に結合させる方法としては、デキストリンポリマーやアミノ酸ポリマーに上記酵素と二次抗体を多数結合させた試薬を用いる方法（ポリマー法）を例示することができる。ビオチン化二次抗体およびペルオキシダーゼ標識したストレプトアビジンを反応させる方法（ＬＳＡＢ法）では、発色基質としてＤＡＢ等を用いることができる。また、蛍光色素などで標識された二次抗体を使用することもできる。蛍光標識二次抗体で処理した場合、処理後に蛍光顕微鏡を用いて陽性細胞を検出する。

スメア法では、摘出細胞をガラスに塗布又は遠心分離機で分離し、細胞成分と液性成分に分け、細胞成分について免疫染色を行う。すなわち、細胞成分をスライドガラス上に塗布し、エタノール液又は１０％ホルマリン液などで固定した後、組織切片と同様の免疫染色を行うことができる。

凍結包埋法では、摘出組織をＯＣＴコンパウンド等での包埋後に液体窒素等で急速凍結し、クリオスタットで薄切することでスライド標本を作製する。この標本を１０％ホルマリンやエタノール液などで固定した後、組織切片と同様の免疫染色を行うことができる。

免疫組織化学に係る操作は、反応液、反応条件、洗浄回数等をプログラムして免疫装置に組み込み、自動化して行なうことができる。

画像診断の場合は、薬学的に許容可能な放射性核種や発光体を抗体にラベルし、被験者に該抗体を投与し、ＰＥＴ/ＣＴなどの画像診断技術を使用して画像を取り、ＡＬＫ２の存在を判定又は検査することができる。

本発明の診断用組成物に含まれる抗体又は該抗体の抗原結合断片は、好適にはＡＬＫ２に結合又は認識する抗体、すなわちＡＬＫ２選択性を有する抗体又は該抗体の抗原結合断片である。

ＡＬＫ２選択性を有する抗体は、例えば以下の少なくとも１つである。
（１）重鎖配列が、配列番号１３（ＣＤＲＨ１）、配列番号１４（ＣＤＲＨ２）及び配列番号１５（ＣＤＲＨ３）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ配列を含む可変領域を含み、並びに、軽鎖配列が、配列番号１６（ＣＤＲＬ１）、配列番号１７（ＣＤＲＬ２）及び配列番号１８（ＣＤＲＬ３）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ配列を含む可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合断片。
（２）配列番号９に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域配列及び配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域配列を含む抗体又は該抗体の抗原結合断片。
（３）上記（１）又は（２）に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片と、ＡＬＫ２タンパク質の細胞外領域への結合に対し交差競合する抗体又は該抗体の抗原結合断片。
（４）ＡＬＫ２タンパク質に対する結合活性を有する抗体又は該抗体の抗原結合断片であって、重鎖配列が、配列番号２３（ＣＤＲＨ１）、配列番号２４（ＣＤＲＨ２）及び配列番号２５（ＣＤＲＨ３）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ配列を含む可変領域を含み、並びに、軽鎖配列が、配列番号２６（ＣＤＲＬ１）、配列番号２７（ＣＤＲＬ２）及び配列番号２８（ＣＤＲＬ３）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ配列を含む可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合断片、或いは、上記ＡＬＫ２タンパク質の細胞外領域への結合に対し上記抗体又は抗原結合断片と交差競合する抗体又は該抗体の抗原結合断片。
（５）配列番号１９に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域配列を含む重鎖及び配列番号２１に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域配列を含む軽鎖からなる抗体又は該抗体の抗原結合断片、或いは、上記ＡＬＫ２タンパク質の細胞外領域への結合に対し上記抗体又は抗原結合断片と交差競合する抗体又は該抗体の抗原結合断片。
（６）上記（１）～（５）のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む抗体又は該抗体の抗原結合断片。
（７）上記（１）～（５）のアミノ酸配列と少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む抗体又は該抗体の抗原結合断片。
（８）上記（１）～（５）のアミノ酸配列に１もしくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列を含む抗体又は該抗体の抗原結合断片。

本発明の一つの好適な態様において、診断用組成物は、ＡＬＫ２検出用または測定用である。

７．抗体のその他の用途
本発明におけるその他の用途は、本発明の抗ＡＬＫ２抗体又は該抗体の抗原結合断片の、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ５及び／又はＳＭＡＤ８のリン酸化阻害剤としての使用である。

転写因子である上記ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ５及び／又はＳＭＡＤ８のリン酸化は、細胞内へのＢＭＰシグナル伝達を活性化する。ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ５及び／又はＳＭＡＤ８のリン酸化阻害剤は、例えば、多能性細胞からの再生医療に有用な分化誘導細胞（例、網膜色素上皮細胞）を作製するために使用することができる（ＷＯ２０１５／０８７２３１）。

（１）上記抗体又はその抗原結合断片は、例えば以下の少なくとも１つである。
以下の（ａ）～（ｃ）に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを特異的に認識し、ＢＭＰシグナル伝達を抑制する抗体又は該抗体の抗原結合断片：
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の２１～１２３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の２１～１２３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号３に示されるアミノ酸配列の２１～１２３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列。
（２）重鎖配列が、配列番号１３（ＣＤＲＨ１）、配列番号１４（ＣＤＲＨ２）及び配列番号１５（ＣＤＲＨ３）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ配列を含む可変領域を含み、並びに、軽鎖配列が、配列番号１６（ＣＤＲＬ１）、配列番号１７（ＣＤＲＬ２）及び配列番号１８（ＣＤＲＬ３）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ配列を含む可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合断片、或いは、上記抗体又は該抗体の抗原結合断片と、ＡＬＫ２タンパク質の細胞外領域への結合に対し交差競合する抗体又は該抗体の抗原結合断片。
（３）配列番号９に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域配列及び配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域配列を含む抗体又は該抗体の抗原結合断片、或いは、上記抗体又は該抗体の抗原結合断片と、ＡＬＫ２タンパク質の細胞外領域への結合に対し交差競合する抗体又は該抗体の抗原結合断片。
（４）配列番号２９（ＣＤＲＨ１）、配列番号３０（ＣＤＲＨ２）及び配列番号３１（ＣＤＲＨ３）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲを含む重鎖可変領域、並びに、配列番号３２（ＣＤＲＬ１）、配列番号３３（ＣＤＲＬ２）及び配列番号３４（ＣＤＲＬ３）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合断片、或いは、上記抗体又は該抗体の抗原結合断片と、ＡＬＫ２タンパク質の細胞外領域への結合に対し交差競合する抗体又は該抗体の抗原結合断片。
（５）配列番号３５（ＣＤＲＨ１）、配列番号３６（ＣＤＲＨ２）及び配列番号３７（ＣＤＲＨ３）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲを含む重鎖可変領域、並びに、配列番号３８（ＣＤＲＬ１）、配列番号３９（ＣＤＲＬ２）及び配列番号４０（ＣＤＲＬ３）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合断片、或いは、上記抗体又は該抗体の抗原結合断片と、ＡＬＫ２タンパク質の細胞外領域への結合に対し交差競合する抗体又は該抗体の抗原結合断片。
（６）配列番号４１（ＣＤＲＨ１）、配列番号４２（ＣＤＲＨ２）及び配列番号４３（ＣＤＲＨ３）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲを含む重鎖可変領域、並びに、配列番号４４（ＣＤＲＬ１）、配列番号４５（ＣＤＲＬ２）及び配列番号４６（ＣＤＲＬ３）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合断片、或いは、上記抗体又は該抗体の抗原結合断片と、ＡＬＫ２タンパク質の細胞外領域への結合に対し交差競合する抗体又は該抗体の抗原結合断片。
（７）配列番号４７（ＣＤＲＨ１）、配列番号４８（ＣＤＲＨ２）及び配列番号４９（ＣＤＲＨ３）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲを含む重鎖可変領域、並びに、配列番号５０（ＣＤＲＬ１）、配列番号５１（ＣＤＲＬ２）及び配列番号５２（ＣＤＲＬ３）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合断片、或いは、上記抗体又は該抗体の抗原結合断片と、ＡＬＫ２タンパク質の細胞外領域への結合に対し交差競合する抗体又は該抗体の抗原結合断片。
（８）上記（１）～（７）のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む抗体又は該抗体の抗原結合断片。
（９）上記（１）～（７）のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む抗体又は該抗体の抗原結合断片。
（１０）上記（１）～（７）のいずれかのアミノ酸配列に１もしくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列を含む抗体又は該抗体の抗原結合断片。

以下に実施例を参照しながら、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は、それらの実施例によって制限されないものとする。

［実施例１］ラット抗ヒトＡＬＫ２抗体（＃１０９、＃２００）の作製
１）－１ 抗原の調製
抗原となるヒトＡＬＫ２－Ｈｉｓは、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ社製のヒトＡＬＫ２－Ｈｉｓ（Ｃａｔ．＃１０２２７－Ｈ０８８）を用いた。

１）－２ 動物の免疫
１ｍｇ／ｍＬのヒトＡＬＫ２－ＨｉｓとＴｉｔｅｒＭａｘＧｏｌｄ（ＴｉｔｅｒＭａｘ、ＵＳＡ）を等量混合しエマルジョンを作製した。６週齢のＷｉｓｔｅｒ雌ラット、２匹に、１匹あたり１００μｇの抗原をアジュバントと共に、２回に分けて皮下投与した。１－２週間後に抗原溶液のみを４０μｇ皮下投与し、３日後に抗体産生細胞として牌臓細胞と各種リンパ節を無菌的に摘出し、以下の細胞融合に供した。

１）－３ 骨髄腫細胞との細胞融合
上記の抗体産生細胞を、ＢＡＬＢ／ｃマウスから得られた株化骨髄腫細胞（Ｐ３Ｕ１細胞）と５：１～１０：１の割合に調整し、５０％ポリエチレングリコール１５００を用いて３分間融合させ、その後、６分間かけて希釈した。融合した細胞は、ラット１匹あたり１０枚の９６穴プレートを用いて、フィーダー細胞（胸腺細胞）と共に播種した。培地として、ＨＡＴサプリメントを含む１５％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（グルタミン、ピルビン酸、ペニシリン、ストレプトマイシン含有）で培養した。

１）－４ ハイブリドーマの選択
細胞融合から１週間後、それぞれの培養上清を用いて、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）で、抗原として用いたヒトＡＬＫ２－Ｈｉｓを認識するクローンを選択し、さらに、ヒ卜ＡＬＫ１－Ｈｉｓ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．社製）を認識するクローンを除外した。ＥＬＩＳＡは以下のように行った。

まず、９６ウェルのＥＬＩＳＡ用プレート（ＮＵＮＣ社製、Ｃａｔ．＃４ ４２４０４）に、１μｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳで希釈した抗原を、室温で２時間または４℃で一晩、固相化した。固相化液を取り除き、ＰＢＳに溶解した０．５％スキムミルク液で、室温で３０分間のブロッキングを行った。次に、上記ハイブリドーマの培養上清を添加し、室温で１時間静置した。プレートを洗浄後、０．５％スキムミルク液で１：２５００に希釈したＡＬＰ標識抗ラットＩｇＧ抗体（ＳＡＢ社製）を加え、さらに、室温で１時間静置した。プレートを洗浄後、フェニルリン酸系基質を室温で反応させた後、波長４９２ｎｍの吸光度を測定した。

選択したハイブリドーマについて、限界希釈法で２回以上のクローニングを行った。以上の操作により、モノクローナル抗体＃１０９と＃２００を産生するハイブリドーマ株を単離した。

［実施例２］ラット抗ヒトＡＬＫ２抗体（＃１０９、＃２００）の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列の決定
１）－１ クローン＃１０９、＃２００の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列の決定
１）－１－１ クローン＃１０９、＃２００産生ハイブリドーマからのＴｏｔａｌ ＲＮＡの調製
クローン＃１０９、＃２００の可変領域を含むｃＤＮＡを増幅するため、クローン＃１０９、＃２００抗体産生ハイブリドーマよりＤｉｒｅｃｔ－ｚｏｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（ＺＹＭＯ ＲＥＳＥＡＲＣＨ社）を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを調製した。

１）－１－２ ５’－ＲＡＣＥ ＰＣＲによるクローン＃１０９、＃２００の軽鎖の可変領域を含むｃＤＮＡの増幅と配列の決定
以下の反応はＳＭＡＲＴｅｒ ＲＡＣＥ ５’／３’ Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＥＴＥＣＨ社）を用いて実施した。
ｔｏｔａｌ ＲＮＡからＳＭＡＲＴｅｒ法を用いて１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを合成した後、以下のプライマーの組み合わせと合成したｃＤＮＡを鋳型とした５’－ＲＡＣＥ ＰＣＲによりクローン＃１０９、＃２００の軽鎖の可変領域を含むＰＣＲ産物を取得した。プライマーとして、ＵＰＭ(１０Ｘ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｉｍｅｒ Ａ Ｍｉｘ、ＳＭＡＲＴｅｒ ＲＡＣＥ ５’／３’ Ｋｉｔに付属)及び５’－GATTACGCCAAGCTTTCAGTAACACTGTCCAGGACACCATCTC－３’（Ｉｎｆ－ＲＫＲ５）（配列番号５３）の配列を有するオリゴヌクレオチドを用いた。Ｉｎｆ－ＲＫＲ５はデータベースのラット軽鎖の定常領域の配列から設計した。得られた各ＰＣＲ産物のシークエンス解析を実施した。シークエンスプライマーとして、Ｉｎｆ－ＲＫＲ５を用いた。

５'ＲＡＣＥ ＰＣＲによって得られたＰＣＲ産物を用いて、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎクローニング（ＳＭＡＲＴｅｒ ＲＡＣＥ ５’／３’ Ｋｉｔ付属）を実施した。クローニングした軽鎖の可変領域を含むｃＤＮＡのヌクレオチド配列のシークエンス解析を実施した。シークエンスプライマーとして、Ｍ１３－ＦｏｒｗａｒｄとＩｎｆ－ＲＫＲ５を用いた。その結果、５´ＲＡＣＥ ＰＣＲによって得られた可変領域と同一の配列を確認することができた。

決定された＃１０９、＃２００の軽鎖の可変領域のヌクレオチド配列をそれぞれ配列表の配列番号２２、１２、アミノ酸配列を配列表の配列番号２１、１１に示した。

１）－１－３ ５’－ＲＡＣＥ ＰＣＲによるクローン＃１０９、＃２００の重鎖可変領域を含むｃＤＮＡの増幅と配列の決定
以下の反応はＳＭＡＲＴｅｒ ＲＡＣＥ ５’／３’ Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＥＴＥＣＨ社）を用いて実施した。

ｔｏｔａｌ ＲＮＡからＳＭＡＲＴｅｒ法を用いて１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを合成した後、以下のプライマーの組み合わせと合成したｃＤＮＡを鋳型とした５’－ＲＡＣＥ ＰＣＲによりクローン＃１０９、＃２００の重鎖の可変領域を含むＰＣＲ産物を取得した。プライマーとして、ＵＰＭ(１０Ｘ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｉｍｅｒ Ａ Ｍｉｘ、ＳＭＡＲＴｅｒ ＲＡＣＥ ５’／３’ Ｋｉｔに付属)及び５’－GATTACGCCAAGCTTCTCCAGAGTTCCAGGTCACGGTGACTGGC－３’（Ｉｎｆ－ＲＧ２ＡＲ３）（配列番号５４）の配列を有するオリゴヌクレオチドを用いた。Ｉｎｆ－ＲＫＲ５はデータベースのラット重鎖の定常領域の配列から設計した。得られた各ＰＣＲ産物のシークエンス解析を実施した。シークエンスプライマーとして、Ｉｎｆ－ＲＧ２ＡＲ３を用いた。

５'ＲＡＣＥ ＰＣＲによって得られたＰＣＲ産物を用いて、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎクローニング（ＳＭＡＲＴｅｒ ＲＡＣＥ ５’／３’ Ｋｉｔ付属）を実施した。クローニングした軽鎖の可変領域を含むｃＤＮＡのヌクレオチド配列のシークエンス解析を実施した。シークエンスプライマーとして、Ｍ１３－ＦｏｒｗａｒｄとＩｎｆ－ＲＧ２ＡＲ３を用いた。その結果、５'ＲＡＣＥ ＰＣＲによって得られた可変領域と同一の配列を確認することができた。

決定された＃１０９、＃２００の重鎖の可変領域のヌクレオチド配列をそれぞれ配列表の配列番号２０、１０、アミノ酸配列を配列表の配列番号１９、９に示した。

ラット抗ヒトＡＬＫ２抗体＃１０９、＃２００の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は以下のとおりである。下線部は、各配列においてＮ末端側から順番にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を表している。ＣＤＲ配列の決定には、Ａｂｍの定義を用いた。

クローン＃１０９重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１９）：

クローン＃１０９軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号２１）：

クローン＃１０９重鎖可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号２０）：

クローン＃１０９軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号２２）：

クローン＃２００重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号９）：

クローン＃２００軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１１）：

クローン＃２００重鎖可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１０）：

クローン＃２００軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１２）：

［実施例３］ラット抗ヒトＡＬＫ２抗体（＃１０９、＃２００）のＢＭＰシグナルの阻害活性（Ｈｕｍａｎ，Ｍｏｕｓｅ，ＲａｔのＡＬＫ２）
モノク口一ナル抗体の、ＡＬＫ２を介した細胞内シグナルの阻害活性は、ＢＭＰ特異的なルシフエラーゼ・レポーターを用いて解析した。ＨＥＫ２９３Ａ細胞を、１×１０^４細胞／穴となるように、ルシフェラーゼ・アッセイ用９６穴白色プレート（グライナ一社製）に播種し、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地中で、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で一晩培養した。翌日、ｐｃＤＥＦ３／ヒ卜ＡＬＫ２（ＷＴ）－Ｖ５－Ｈｉｓ、ｐｃＤＥＦ３／マウスＡＬＫ２（ＷＴ）－Ｖ５－Ｈｉｓ、またはｐｃＤＥＦ３／ラットＡＬＫ２（ＷＴ）－Ｖ５－Ｈｉｓ、ｐＧＬ４．２６／１ｄｌＷＴ４Ｆ－１ｕｃ（Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ，７，９４９（２００２）；Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ，４０７，２１３（２０１１））、ｐｈＲＬ－ＳＶ４０（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて導入した。２．５時間後、培地をモノクローナル抗体と１０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ７ （Ｍｉ１ｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製）を含むＯＰＴＩ－ＭＥＭ Ｉ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に交換し、さらに一晩培養した。翌日、Ｄｕａｌ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、Ｆｉｒｅｆｌｙ、およびＲｅｎｉｌｌａのルシフェラーゼ活性をプレートリーダーＧＥＮｉｏｓ（ＴＥＣＡＮ社製）で測定した。

結果を図１に記載する。各抗体は、ＢＭＰ７非存在下のルシフェラーゼ活性（白色カラム）にはほぼ影響せず、１０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ７依存的に誘導されるルシフェラーゼ活性（黒色カラム）を以下のように抑制した。ハイブリドーマ＃２００の産生するモノクローナル抗体は、ハイブリドーマＡ２－１１Ｅ，Ａ２－１５Ａ，Ａ２－２５Ｃ，Ａ２－２７Ｄの産生するモノクローナル抗体と同様に、ヒトＡＬＫ２とマウスＡＬＫ２を過剰発現させたＨＥＫ２９３Ａ細胞のＢＭＰ特異的ルシフェラーゼ活性を抑制した。さらに、ハイブリドーマ＃２００の産生するモノクローナル抗体は、ハイブリドーマＡ２－１１Ｅ，Ａ２－１５Ａ，Ａ２－２５Ｃ，Ａ２－２７Ｄの産生するモノクローナル抗体とは異なり、ラットＡＬＫ２のＢＭＰ特異的ルシフェラーゼ活性も抑制した。一方、ハイブリドーマ＃１０９の産生するモノクローナル抗体は、ヒト、マウス、およびラットＡＬＫ２をほとんど阻害しなかった。これらの結果より、ハイブリドーマ＃２００の産生するモノクローナル抗体は、ヒト、マウス、およびラットＡＬＫ２に結合して、ＢＭＰによる細胞内シグナルを阻害する抗体であることが示された。

［実施例４］６４番目のアミノ酸置換が与える影響の検証（ヒト、サル、イヌ、ラット、マウスの配列比較）
ハイブリドーマＡ２－２７Ｄの産生するモノクローナル抗体がＢＭＰシグナルを阻害するのに重要なアミノ酸残基を解析した。ヒトＡＬＫ２（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ＿００１１０４５３７）、サルＡＬＫ２（ＧｅｎＢａｎｋ ＸＰ＿０１４９６５６３０）、イヌＡＬＫ２（ＧｅｎＢａｎｋ ＸＭ＿５４９６１５）、ラットＡＬＫ２（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿０７７８１２）、およびマウスＡＬＫ２（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿００１１０３６７４）の細胞外領域を含むアミノ酸配列（アミノ酸残基１番から１４０番まで）を図３に示す。シグナルペプチド（アミノ酸残基１番から２０番まで）切断後のこれらのＡＬＫ２において、ラットＡＬＫ２に特異的なアミノ酸残基として、Ｅ２５、Ｖ５９、Ｒ６４、Ｖ１０３、Ｒ１０６、およびＳ１１７が同定された。ラットＡＬＫ２に特異的なＫ２５Ｅ、Ｉ５９Ｖ、Ｈ６４Ｒ、Ｉ１０３Ｖ、Ｑ１０６Ｒ、およびＴ１１７Ｓのアミノ酸置換を、それぞれｐｃＤＥＦ３／ヒ卜ＡＬＫ２－Ｖ５－Ｈｉｓを鋳型として、１残基ずつ導入した発現ベクターと、ｐｃＤＥＦ３／ラットＡＬＫ２－Ｖ５－Ｈｉｓを鋳型として、ヒト、サル、イヌ、マウスのＡＬＫ２に相当するＲ６４Ｈ変異を導入した発現ベクターを構築した。実施例３と同様に、これらのＡＬＫ２発現ベクターとルシフェラーゼレポータープラスミドを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を用いて前日に播種したＨＥＫ２９３Ａ細胞に遺伝子導入し、ＢＭＰ７が誘導するＢＭＰ特異的ルシフェラーゼ活性に対する各抗体の作用を測定した。

結果を図２に示す。各ＡＬＫ２のルシフェラーゼ活性は、コントロールＩｇＧ２ａ添加時の活性（白色カラム）に対するハイブリドーマＡ２－Ｄ２７の産生するモノクローナル抗体添加時の相対的活性（黒色カラム）として示す。ハイブリドーマＡ２－Ｄ２７の産生するモノクローナル抗体は、Ｋ２５Ｅ、Ｉ５９Ｖ、Ｉ１０３Ｖ、Ｑ１０６Ｒ、およびＴ１１７Ｓ変異を導入した各ヒトＡＬＫ２が活性化するＢＭＰ細胞内シグナルを抑制した。一方、ラット野生型ＡＬＫ２とＨ６４Ｒ変異を導入したヒトＡＬＫ２が活性化するＢＭＰシグナルは、抗体によって抑制されなかった。しかし、ラットＡＬＫ２にＲ６４Ｈ変異を導入すると、抗体によってＢＭＰシグナルが抑制された。これらの結果より、ハイブリドーマＡ２－２７Ｄの産生するモノクローナル抗体がＡＬＫ２の細胞内シグナルを抑制するためには、細胞外領域の６４番目のヒスチジン残基（Ｈ６４）が重要なことが示された。

［実施例５］ラット抗ヒトＡＬＫ２抗体（＃１０９、＃２００）のエピトープの重複解析
ＨＥＫ２９３Ａ細胞に、実施例３と同様にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて一過性にｐｃＤＥＦ３／ヒ卜ＡＬＫ２－ＥＧＦＰを遺伝子導入し、２．５時間後に新鮮な１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地に交換して一晩培養した。翌日、１×１０^６細胞／ｍＬとなるように調整した細胞懸濁液を、１００μＬずつ１．５ｍＬ微量遠心管に分注し、５００ｇで５分間遠心した後に上清を除去した。細胞に、１μｇ／ｍＬに希釈したＡｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ６４７でラベルしたＡ２－２７Ｄと１０μｇ／ｍＬの精製ＩｇＧの混合液１００μＬを加え、４℃で３０分間静置した。細胞をＰＢＳで３回洗浄後、フローサイトメータ－（ＢＤ Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６：ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）で蛍光を検出した。細胞の発現するＥＧＦＰの強度と、染色されたＡｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ６４７の蛍光強度をプロットした。

結果を図３に記載する。コントロールの精製ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａは、蛍光ラベルしたＡ２－２７ＤのＡＬＫ２への結合を阻害しないが、ハイブリドーマＡ２－１１Ｅ、Ａ２－１５Ａ、Ａ２－２５Ｃ、Ａ２－２７Ｄの産生するラット抗ＡＬＫ２抗体は、それぞれ、蛍光ラベルしたＡ２－２７ＤのＡＬＫ２への結合を阻害した。一方、ハイブリドーマ＃１０９と＃２００の産生する抗体は、蛍光ラベルしたＡ２－２７ＤのＡＬＫ２への結合を阻害しなかった。これらの結果は、ハイブリドーマＡ２－１１Ｅ、Ａ２－１５Ａ、Ａ２－２５Ｃの産生する抗体のＡＬＫ２細胞外領域に結合する部位が、ハイブリドーマＡ２－２７Ｄの結合部位と重複していることを示す。一方、ハイブリドーマ＃１０９と＃２００の産生する抗体は、Ａ２－２７Ｄとは異なるＡＬＫ２の細胞外領域に結合することが示された。

［実施例６］ラット抗ヒトＡＬＫ２抗体（＃１０９）によるウェスタンブロット解析
ＨＥＫ２９３Ａ細胞に、実施例３と同様にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を用いて一過性にｐｃＤＥＦ３、ｐｃＤＥＦ３／ヒトＡＬＫ２（ＷＴ）－Ｖ５－Ｈｉｓ、ｐｃＤＥＦ３／マウスＡＬＫ２（ＷＴ）－Ｖ５－Ｈｉｓ、およびｐｃＤＥＦ３／ラットＡＬＫ２（ＷＴ）－Ｖ５－Ｈｉｓを遺伝子導入し、２．５時間後に新鮮な１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地に交換して一晩培養した。翌日、細胞抽出液を調整し、還元・変性させた後に７％ポリアクリルアミドゲルを用いて分画した後、ＰＶＤＦ膜に転写してウェスタンブロットを行った（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２８５，１５５７７（２０１０）；Ｓｃｉ Ｒｅｐ，４，７５９６（２０１４））。一次抗体として、抗Ｖ５タグ抗体（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製、Ｃａｔ．＃１３２０２）、抗Ｔｕｂｕｌｉｎ抗体（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製、Ｃａｔ．＃２１４４）、およびハイブリドーマ＃１０９、Ａ２－１１Ｅ、Ａ２－１５Ａ、Ａ２－２５Ｃ、Ａ２－２７Ｄの産生するラット抗ＡＬＫ２抗体（１０μｇ／ｍｌ）を用いた。二次抗体として、抗Ｖ５タグ抗体及び抗Ｔｕｂｕｌｉｎ抗体に対しては、ＨＲＰ結合抗ラビットＩｇＧ抗体（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製、Ｃａｔ． ＃７０７４）、ラット抗ＡＬＫ２抗体に対しては、ＨＲＰ結合抗ラットＩｇＧ抗体（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製、Ｃａｔ．＃７０７７）を用いた。

結果を図４に示す。ヒト、マウス、ラットＡＬＫ２は、抗Ｖ５抗体で約６５ｋＤａに検出された。しかし、ハイブリドーマＡ２－１１Ｅ、Ａ２－１５Ａ、Ａ２－２５Ｃ、Ａ２－２７Ｄの産生するラット抗ＡＬＫ２抗体は、ヒト、マウス、ラットＡＬＫ２のいずれも検出しなかった。一方、ハイブリドーマ＃１０９の産生する抗ＡＬＫ２モノクローナル抗体は、約６５ｋＤａのヒトＡＬＫ２とマウスＡＬＫ２を検出し、ラットＡＬＫ２は検出しなかったことから、還元・変性状態のヒトＡＬＫ２とマウスＡＬＫ２を認識することが示された。

［実施例７］ラット抗ヒトＡＬＫ２抗体（＃１０９、＃２００など）による凍結切片を用いた免疫組織染色
Ｃ５７ＢＬ／６マウスの新生児を４％パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液で２日間固定後、Ｏ．Ｃ．Ｔコンパウンド（サクラファインテックジャパン社製）で凍結包埋し、クリオスタット（Ｌｅｉｃａ社製、Ｃａｔ．＃ＣＭ３０５０Ｓ）を用いて、５μｍの厚みで凍結切片を作製した。切片をＰＢＳで３回洗浄し、内在性酵素活性ブロッキング溶液（ＶＥＣＴＯＲ社製、Ｃａｔ．＃ＳＰ－６０００）を１０分間反応させた。その後、ＰＢＳ－Ｔ（０．２％ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）で３回洗浄し、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ Ｈｉｓｔｏ（ナカライテスク社製、Ｃａｔ．＃０６３４９－６４）を５分間反応させ、一次抗体として、ハイブリドーマＡ２－１１Ｅ、Ａ２－１５Ａ、Ａ２－２５Ｃ、Ａ２－２７Ｄ、＃１０９、＃２００の産生するラット抗ＡＬＫ２抗体（１０μｇ／ｍｌ）を４℃で一晩反応させた。翌日、ＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、二次抗体として、ＨＲＰ結合抗ラットＩｇＧ抗体のＩｍｍＰＲＥＳＳ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＶＥＣＴＯＲ社製、Ｃａｔ．＃ＭＰ－７４４４）を３７℃で３０分間反応させた。その後、ＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、ＤＡＢ発色（ＶＥＣＴＯＲ社製、Ｃａｔ．＃ＳＫ－４１００）を行い、蒸留水で洗浄した後、ヘマトキシリンでカウンター染色を行い、定法に従い、カバーガラスで封入し、ＢＺ－９０００（Ｋｅｙｅｎｃｅ社製）により観察した。

結果を図５に示す。ハイブリドーマＡ２－１１Ｅ、Ａ２－１５Ａ、Ａ２－２５Ｃ、Ａ２－２７Ｄの産生するラット抗ＡＬＫ２抗体は、コントロールＩｇＧと同様に、凍結切片のマウス新生児のいずれの臓器にも免疫染色陰性であった。一方、ハイブリドーマ＃１０９と＃２００の産生する抗体は、マウス新生児の複数の臓器に免疫染色陽性像を示したことから、マウスが発現するＡＬＫ２を凍結切片上で認識する抗体で発現することが示された。

［実施例８］ラット抗ヒトＡＬＫ２抗体（＃１０９、＃２００など）によるパラフィン切片を用いた免疫組織染色
Ｃ５７ＢＬ／６マウスの新生児を４％パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液で２日間固定後、定法に従い、脱水及び置換を行い、パラフィンで包埋した。回転式ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ社製、Ｃａｔ．＃ＲＭ２１２５ＲＴ）を用いて、４μｍの厚みでパラフィン切片を作製した後、３７℃で一晩乾燥させた。切片をＰＢＳで３回洗浄し、内在性酵素活性ブロッキング溶液（ＶＥＣＴＯＲ社製、Ｃａｔ．＃ ＳＰ－６０００）を１０分間反応させた。その後、ＰＢＳ－Ｔ（０．２％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）で３回洗浄し、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ Ｈｉｓｔｏ（ナカライテスク社製、Ｃａｔ．＃０６３４９－６４）を５分間反応させ、一次抗体として、ハイブリドーマＡ２－１１Ｅ、Ａ２－１５Ａ、Ａ２－２５Ｃ、Ａ２－２７Ｄ、＃１０９、＃２００の産生するラット抗ＡＬＫ２抗体（１０μｇ／ｍｌ）を４℃で一晩反応させた。翌日、ＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、二次抗体として、ＨＲＰ結合抗ラットＩｇＧ抗体であるＩｍｍＰＲＥＳＳ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＶＥＣＴＯＲ社製、Ｃａｔ．＃ＭＰ－７４４４）を３７℃で３０分間反応させた。その後、ＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、ＤＡＢ発色（ＶＥＣＴＯＲ社製、Ｃａｔ．＃ＳＫ－４１００）を行い、蒸留水で洗浄した後、ヘマトキシリンでカウンター染色を行い、定法に従い、カバーガラスで封入し、ＢＺ－９０００（Ｋｅｙｅｎｃｅ社製）により観察した。

結果を図６に示す。ハイブリドーマＡ２－１１Ｅ、Ａ２－１５Ａ、Ａ２－２５Ｃ、Ａ２－２７Ｄの産生するラット抗ＡＬＫ２抗体は、コントロールＩｇＧと同様に、パラフィン切片のマウス新生児のいずれの臓器にも免疫染色陰性であった。一方、ハイブリドーマ＃１０９と＃２００の産生する抗体は、マウス新生児の複数の臓器に免疫染色陽性像を示したことから、マウスが発現するＡＬＫ２をパラフィン切片上で認識する抗体で発現することが示された。

［実施例９］ラット抗ヒトＡＬＫ２抗体（＃１０９、＃２００など）によるＡＬＫ２ホモ二量体の形成
モノクローナル抗体によるヒトＡＬＫ２のホモ二量体形成は、ＮａｎｏＢＩＴ（登録商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ：Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて測定した。ヒトＡＬＫ２ ｃＤＮＡをｐＢＩＴ１．１－Ｃ［ＴＫ／ＬｇＢＩＴ］ｖｅｃｔｏｒ、および、ｐＢＩＴ２．１－Ｃ［ＴＫ／ＳｍＢＩＴ］ｖｅｃｔｏｒにそれぞれクローニングした。実施例３と同様に、前日にルシフェラーゼ・アッセイ用９６穴白色プレート（グライナ一社製）に播種したＨＥＫ２９３Ａ細胞に、ヒトＡＬＫ２を発現するｐＢＩＴ１．１－Ｃ［ＴＫ／ＬｇＢＩＴ］とｐＢＩＴ２．１－Ｃ［ＴＫ／ＳｍＢＩＴ］を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて導入した。２．５時間後に培地を新鮮なＯＰＴＩ－ＭＥＭ Ｉに交換し、さらに一晩培養した。翌日、Ｎａｎｏ－ＧＬＯ（登録商標） Ｌｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、１００ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ７ （Ｍｉ１ｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製）、または１０μｇ／ｍｌモノクローナル抗体の添加後１４分に誘導されるＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼ活性を、プレートリーダー ＦＬＵＯｓｔａｒ Ｏｍｅｇａ（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ社製）で測定した。

結果を図７に示す。ハイブリドーマ＃１０９、＃２００、およびＡ２－１１Ｅ、Ａ２－１５Ａ、Ａ２－２５Ｃ、Ａ２－２７Ｄの産生するラット抗ＡＬＫ２抗体は、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼの活性を促進したことから、ヒトＡＬＫ２のホモ二量体形成を誘導することが示された。

［実施例１０］ラット抗ヒトＡＬＫ２抗体（＃１０９、＃２００など）によるＡＬＫ２－ｔｙｐｅ ＩＩ受容体ヘテロ二量体の形成阻害
モノクローナル抗体によるヒトＡＬＫ２とマウスＡｃｔＲ－ＩＩＢのヘテロ二量体形成は、ＮａｎｏＢＩＴ（登録商標） Ｐｒｏｔｅｉｎ：Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて測定した。マウスＡｃｔＲ－ＩＩＢ ｃＤＮＡをｐＢＩＴ１．１－Ｃ［ＴＫ／ＬｇＢＩＴ］ ｖｅｃｔｏｒ、および、ヒトＡＬＫ２ ｃＤＮＡをｐＢＩＴ２．１－Ｃ［ＴＫ／ＳｍＢＩＴ］ｖｅｃｔｏｒにそれぞれクローニングした。実施例９と同様に、ＨＥＫ２９３Ａ細胞に、ヒトＡＬＫ２とマウスＡｃｔＲ－ＩＩＢを発現するベクターを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて遺伝子導入した。２．５時間後に培地を新鮮なＯＰＴＩ－ＭＥＭ Ｉに交換し、さらに一晩培養した。翌日、Ｎａｎｏ－ＧＬＯ（登録商標） Ｌｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、１００ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ７（Ｍｉ１ｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製）によって誘導されるＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼ活性に対する、モノクローナル抗体の作用をプレートリーダー ＦＬＵＯｓｔａｒ Ｏｍｅｇａ（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ社製）で測定した。

結果を図８に示す。ハイブリドーマ＃２００、およびＡ２－１１Ｅ、Ａ２－１５Ａ、Ａ２－２５Ｃ、Ａ２－２７Ｄの産生するラット抗ＡＬＫ２抗体は、ＢＭＰ７が誘導するＡＬＫ２とマウスＡｃｔＲ－ＩＩＢヘテロ二量体のＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼ活性を抑制した。一方、ハイブリドーマ＃１０９の産生するモノクローナル抗体は、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼ活性を阻害しなかった。これらの結果より、ハイブリドーマ＃２００、およびＡ２－１１Ｅ、Ａ２－１５Ａ、Ａ２－２５Ｃ、Ａ２－２７Ｄの産生するラット抗ＡＬＫ２抗体は、ＢＭＰ７によって誘導されるＡＬＫ２とＡｃｔＲ－ＩＩＢ受容体のヘテロ二量体形成を抑制することが示された。

本発明の抗体は、ＢＭＰ関連疾患であるＦＯＰ、ＤＩＳＨ、ＤＩＰＧの疾患の治療剤や予防剤としての利用だけでなく、組織等の生物材料の免疫染色やウェスタンブロットなどの免疫学的かつ免疫組織学的な解析ツールとして利用することができる。

配列番号１：ヒトＡＬＫ２タンパク質のアミノ酸配列
配列番号２：マウスＡＬＫ２タンパク質のアミノ酸配列
配列番号３：ラットＡＬＫ２タンパク質のアミノ酸配列
配列番号４：ヒトＡＬＫ２のアミノ酸番号１－１４０のアミノ酸配列
配列番号５：サルＡＬＫ２のアミノ酸番号１－１４０のアミノ酸配列
配列番号６：イヌＡＬＫ２のアミノ酸番号１－１４０のアミノ酸配列
配列番号７：ラットＡＬＫ２のアミノ酸番号１－１４０のアミノ酸配列
配列番号８：マウスＡＬＫ２のアミノ酸番号１－１４０のアミノ酸配列
配列番号９：ＡＬＫ２＿＃２００＿ＶＨのアミノ酸配列
配列番号１０：ＡＬＫ２＿＃２００＿ＶＨのｃＤＮＡ配列
配列番号１１：ＡＬＬ２＿＃２００＿ＶＬのアミノ酸配列
配列番号１２：ＡＬＫ２＿＃２００＿ＶＬのｃＤＮＡ配列
配列番号１３：ＡＬＫ２＿＃２００＿ＶＨ＿ＣＤＲＨ１のアミノ酸配列
配列番号１４：ＡＬＫ２＿＃２００＿ＶＨ＿ＣＤＲＨ２のアミノ酸配列
配列番号１５：ＡＬＫ２＿＃２００＿ＶＨ＿ＣＤＲＨ３のアミノ酸配列
配列番号１６：ＡＬＫ２＿＃２００＿ＶＬ＿ＣＤＲＬ１のアミノ酸配列
配列番号１７：ＡＬＫ２＿＃２００＿ＶＬ＿ＣＤＲＬ２のアミノ酸配列
配列番号１８：ＡＬＫ２＿＃２００＿ＶＬ＿ＣＤＲＬ３のアミノ酸配列
配列番号１９：ＡＬＫ２＿＃１０９＿ＶＨのアミノ酸配列
配列番号２０：ＡＬＫ２＿＃１０９＿ＶＨのｃＤＮＡ配列
配列番号２１：ＡＬＫ２＿＃１０９＿ＶＬのアミノ酸配列
配列番号２２：ＡＬＫ２＿＃１０９＿ＶＬのｃＤＮＡ配列
配列番号２３：ＡＬＫ２＿＃１０９＿ＶＨ＿ＣＤＲＨ１のアミノ酸配列
配列番号２４：ＡＬＫ２＿＃１０９＿ＶＨ＿ＣＤＲＨ２のアミノ酸配列
配列番号２５：ＡＬＫ２＿＃１０９＿ＶＨ＿ＣＤＲＨ３のアミノ酸配列
配列番号２６：ＡＬＫ２＿＃１０９＿ＶＬ＿ＣＤＲＬ１のアミノ酸配列
配列番号２７：ＡＬＫ２＿＃１０９＿ＶＬ＿ＣＤＲＬ２のアミノ酸配列
配列番号２８：ＡＬＫ２＿＃１０９＿ＶＬ＿ＣＤＲＬ３のアミノ酸配列
配列番号２９：ＡＬＫ２＿Ａ２－１５Ａ＿ＶＨ＿ＣＤＲＨ１のアミノ酸配列
配列番号３０：ＡＬＫ２＿Ａ２－１５Ａ＿ＶＨ＿ＣＤＲＨ２のアミノ酸配列
配列番号３１：ＡＬＫ２＿Ａ２－１５Ａ＿ＶＨ＿ＣＤＲＨ３のアミノ酸配列
配列番号３２：ＡＬＫ２＿Ａ２－１５Ａ＿ＶＬ＿ＣＤＲＬ１のアミノ酸配列
配列番号３３：ＡＬＫ２＿Ａ２－１５Ａ＿ＶＬ＿ＣＤＲＬ２のアミノ酸配列
配列番号３４：ＡＬＫ２＿Ａ２－１５Ａ＿ＶＬ＿ＣＤＲＬ３のアミノ酸配列
配列番号３５：ＡＬＫ２＿Ａ２－２７Ｄ＿ＶＨ＿ＣＤＲＨ１のアミノ酸配列
配列番号３６：ＡＬＫ２＿Ａ２－２７Ｄ＿ＶＨ＿ＣＤＲＨ２のアミノ酸配列
配列番号３７：ＡＬＫ２＿Ａ２－２７Ｄ＿ＶＨ＿ＣＤＲＨ３のアミノ酸配列
配列番号３８：ＡＬＫ２＿Ａ２－２７Ｄ＿ＶＬ＿ＣＤＲＬ１のアミノ酸配列
配列番号３９：ＡＬＫ２＿Ａ２－２７Ｄ＿ＶＬ＿ＣＤＲＬ２のアミノ酸配列
配列番号４０：ＡＬＫ２＿Ａ２－２７Ｄ＿ＶＬ＿ＣＤＲＬ３のアミノ酸配列
配列番号４１：ＡＬＫ２＿Ａ２－１１Ｅ＿ＶＨ＿ＣＤＲＨ１のアミノ酸配列
配列番号４２：ＡＬＫ２＿Ａ２－１１Ｅ＿ＶＨ＿ＣＤＲＨ２のアミノ酸配列
配列番号４３：ＡＬＫ２＿Ａ２－１１Ｅ＿ＶＨ＿ＣＤＲＨ３のアミノ酸配列
配列番号４４：ＡＬＫ２＿Ａ２－１１Ｅ＿ＶＬ＿ＣＤＲＬ１のアミノ酸配列
配列番号４５：ＡＬＫ２＿Ａ２－１１Ｅ＿ＶＬ＿ＣＤＲＬ２のアミノ酸配列
配列番号４６：ＡＬＫ２＿Ａ２－１１Ｅ＿ＶＬ＿ＣＤＲＬ３のアミノ酸配列
配列番号４７：ＡＬＫ２＿Ａ２－２５Ｃ＿ＶＨ＿ＣＤＲＨ１のアミノ酸配列
配列番号４８：ＡＬＫ２＿Ａ２－２５Ｃ＿ＶＨ＿ＣＤＲＨ２のアミノ酸配列
配列番号４９：ＡＬＫ２＿Ａ２－２５Ｃ＿ＶＨ＿ＣＤＲＨ３のアミノ酸配列
配列番号５０：ＡＬＫ２＿Ａ２－２５Ｃ＿ＶＬ＿ＣＤＲＬ１のアミノ酸配列
配列番号５１：ＡＬＫ２＿Ａ２－２５Ｃ＿ＶＬ＿ＣＤＲＬ２のアミノ酸配列
配列番号５２：ＡＬＫ２＿Ａ２－２５Ｃ＿ＶＬ＿ＣＤＲＬ３のアミノ酸配列
配列番号５３：プライマー（Ｉｎｆ－ＲＫＲ５）のヌクレオチド配列
配列番号５４：プライマー（Ｉｎｆ－ＲＧ２ＡＲ３）のヌクレオチド配列
配列番号５５：Ａ２－１５Ａ抗体の改変ＣＤＲＬ２のアミノ酸配列
配列番号５６：ヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｈ４（ＩｇＧ２）のアミノ酸配列
配列番号５７：ヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｌ６のアミノ酸配列
配列番号５８：ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ２－ＬＡＬＡ（ＩｇＧ１）のアミノ酸配列
配列番号５９：ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｌ２のアミノ酸配列
配列番号６０：ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ３－ＬＡＬＡ（ＩｇＧ１）のアミノ酸配列
配列番号６１：ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｌ４のアミノ酸配列

本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (6)

1. ＡＬＫ２タンパク質に対する結合活性を有する抗体又は該抗体の抗原結合断片であって、重鎖配列が、配列番号１３（ＣＤＲＨ１）、配列番号１４（ＣＤＲＨ２）及び配列番号１５（ＣＤＲＨ３）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ配列を含む可変領域を含み、並びに、軽鎖配列が、配列番号１６（ＣＤＲＬ１）、配列番号１７（ＣＤＲＬ２）及び配列番号１８（ＣＤＲＬ３）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ配列を含む可変領域を含むことを特徴とする抗体又は該抗体の抗原結合断片。
2. 配列番号９に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域配列を含む重鎖及び配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域配列を含む軽鎖からなる抗体又は該抗体の抗原結合断片。
3. 請求項１又は２に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片の、免疫染色への使用。
4. 免疫染色が、組織の凍結切片又はパラフィン切片を用いることを特徴とする、請求項３に記載の使用。
5. 請求項１又は２に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド。
6. 請求項５に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。

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