JP7667985B2 - 腸炎抑制用組成物 - Google Patents
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Description
本開示は、腸炎抑制用組成物等に関する。
腸炎は、十二指腸、小腸、大腸等の腸粘膜の炎症の総称である。大腸炎は、結腸と直腸の粘膜炎症の総称である。大腸炎は、例えば、細菌やウイルス等への感染、近年ではアルコールの摂取等のような原因で引き起こされ得ることが報告されている。併せて、慢性化した大腸炎は、大腸がん発症のリスクファクターとなると報告されている。
潰瘍性大腸炎を治療するための現在の推奨手段は重症度によって異なるが、厚生労働省による科学研究事業報告 (久松班) による「潰瘍性大腸炎・クローン病診断基準・治療指針」（非特許文献1）によれば、軽症、寛解維持治療には5-アミノサリチル酸、重症時にはステロイド薬、外科手術、劇症期にはステロイド大量静注、免疫抑制薬の使用が挙げられる。
潰瘍性大腸炎の発症原因は未だ不明であり、「厚生労働省 難病対策事業の対象疾患（（指定難病97）令和3年8月時点）」として継続指定されている（非特許文献2）。但し、潰瘍性大腸炎を含む、多くの大腸炎は、日々の食事、保健機能食品の有効利用により、発症予防・進展改善への可能性を持っており、子どもから高齢者まで全ての国民が健康増進の推進を図るための重要な手法となり得る（非特許文献3）。
炎症性腸疾患（inflammatory bowel disease, IBD）の発症、進展において、腸内細菌叢は重要な役割を果たしていることが広く知られている（非特許文献4）。そのため、大腸炎予防に「腸内環境を正常に戻す手法」が多数試みられ、その１つとして、腸内細菌叢の構成の乱れを整えるビフィズス菌を含む保健機能食品が挙げられる（非特許文献5、特許文献1）。また、シイタケ（Lentinula edodes）に含まれるβ－グルカンであるレンチナンは、インターロイキン－8（Interleukin-8, IL8）の発現の阻害を介して大腸炎を抑制する効果を示すことが報告されており（非特許文献6）、機能性食品素材として注目されている。
セサミノールは、ゴマ種子中に含有されることが知られている。また、セサミノールは、抗酸化機能を有することが報告されている（非特許文献7）。近年では、抗酸化機能のみならず、パーキンソン病予防作用や認知障害予防作用等の多岐に渡る生理作用を持つことが示唆されている（非特許文献8、非特許文献9、及び非特許文献10）。しかしながら、これまでにセサミノールの腸炎抑制作用についての報告は無い。
厚生労働科学研究費補助金 難治性疾患政策研究事業「難治性炎症性腸管障害に関する調査研究」(久松班), 令和2年度分担研究報告書 潰瘍性大腸炎・クローン病診断基準・治療指針, 令和3年3月31日.
平成27年1月1日施行の指定難病 (告示番号1～110), 告示番号97「潰瘍性大腸炎」(https://www.mhlw.go.jp/stf/seisakunitsuite/bunya/0000062437.html)
厚生労働省告示第四百三十号 健康増進法 (平成十四年法律第百三号) 第七条第一項 国民の健康の増進の総合的な推進を図るための基本的な方針 二 生活習慣病の発症予防と重症化予防の徹底 (NCDの予防)
「II. 炎症性腸疾患の病理・病態生理、3. 腸内細菌叢の役割」日本内科学会雑誌、第98巻、第1号・平成21年1月10日
「ビフィズス菌含有大腸崩壊性カプセルの臨床的有用性」腸内細菌学雑誌、17:67-79, 2003
Nishitani Y, Zhang L, Yoshida M, Azuma T, Kanazawa K, Hashimoto T, et al. (2013) Intestinal Anti-Inflammatory Activity of Lentinan: Influence on IL-8 and TNFR1 Expression in Intestinal Epithelial Cells. PLoS ONE 8(4):e62441.https://doi.org/10.1371/journal.pone.0062441
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本発明は、新規な腸炎抑制用組成物を提供することを課題とする。
本発明者らは、鋭意研究を進めた結果、セサミノールが腸炎抑制作用を有することを見出した。本発明者らは、この知見に基づいてさらに研究を進めた結果、セサミノール及びその代謝物からなる群より選択される少なくとも一種を含有する、新規な腸炎抑制用組成物を完成させた。
すなわち、本発明は、下記の態様を包含する。
項1．
セサミノール及びその代謝物からなる群より選択される少なくとも一種を含有する、腸炎抑制用組成物。
項2．
前記腸炎が、慢性腸炎である、項1に記載の腸炎抑制用組成物。
項3．
リーキーガット症候群の抑制に用いるための、項1又は2に記載の腸炎抑制用組成物。
項4．
経口組成物である、項1～3のいずれかに記載の腸炎抑制用組成物。
項5．
食品組成物である、項1～4のいずれかに記載の腸炎抑制用組成物。
項6．
前記代謝物がセサミノールの消化管内代謝物である、項1～5のいずれかに記載の腸炎抑制用組成物。
項7．
セサミノール及びその代謝物からなる群より選択される少なくとも一種を含有する、腸組織傷害抑制用組成物。
項8．
セサミノール及びその代謝物からなる群より選択される少なくとも一種を含有する、腸粘膜保護用組成物。
項9．
セサミノール及びその代謝物からなる群より選択される少なくとも一種を含有する、腸組織内酸化ストレス抑制用組成物。
項10．
セサミノール及びその代謝物からなる群より選択される少なくとも一種を含有する、リーキーガット症候群抑制用組成物。
項11．
セサミノール及びその代謝物からなる群より選択される少なくとも一種を含有する、腸内細菌叢改善用組成物。
また、本発明は、下記の態様も包含する。
項1A．
セサミノール及びその代謝物からなる群より選択される少なくとも一種を、腸炎の抑制が必要な対象に投与する又は摂取させることを含む、腸炎を抑制する方法。
項1B．
腸炎抑制用組成物としての使用のための、セサミノール及びその代謝物からなる群より選択される少なくとも一種を含有する組成物。
項1C．
セサミノール及びその代謝物からなる群より選択される少なくとも一種を含有する組成物の、腸炎抑制用組成物の製造のための使用。
項1D．
セサミノール及びその代謝物からなる群より選択される少なくとも一種を含有する組成物の、腸炎抑制用組成物としての使用。
項7A．
セサミノール及びその代謝物からなる群より選択される少なくとも一種を、腸組織傷害の抑制が必要な対象に投与する又は摂取させることを含む、腸組織傷害を抑制する方法。
項7B．
腸組織傷害抑制用組成物としての使用のための、セサミノール及びその代謝物からなる群より選択される少なくとも一種を含有する組成物。
項7C．
セサミノール及びその代謝物からなる群より選択される少なくとも一種を含有する組成物の、腸組織傷害抑制用組成物の製造のための使用。
項7D．
セサミノール及びその代謝物からなる群より選択される少なくとも一種を含有する組成物の、腸組織傷害抑制用組成物としての使用。
項8A．
セサミノール及びその代謝物からなる群より選択される少なくとも一種を、腸粘膜の保護が必要な対象に投与する又は摂取させることを含む、腸粘膜を保護する方法。
項8B．
腸粘膜保護用組成物としての使用のための、セサミノール及びその代謝物からなる群より選択される少なくとも一種を含有する組成物。
項8C．
セサミノール及びその代謝物からなる群より選択される少なくとも一種を含有する組成物の、腸粘膜保護用組成物の製造のための使用。
項8D．
セサミノール及びその代謝物からなる群より選択される少なくとも一種を含有する組成物の、腸粘膜保護用組成物としての使用。
項9A．
セサミノール及びその代謝物からなる群より選択される少なくとも一種を、腸組織内酸化ストレスの抑制が必要な対象に投与する又は摂取させることを含む、腸組織内酸化ストレスを抑制する方法。
項9B．
腸組織内酸化ストレス抑制用組成物としての使用のための、セサミノール及びその代謝物からなる群より選択される少なくとも一種を含有する組成物。
項9C．
セサミノール及びその代謝物からなる群より選択される少なくとも一種を含有する組成物の、腸組織内酸化ストレス抑制用組成物の製造のための使用。
項9D．
セサミノール及びその代謝物からなる群より選択される少なくとも一種を含有する組成物の、腸組織内酸化ストレス抑制用組成物としての使用。
項10A．
セサミノール及びその代謝物からなる群より選択される少なくとも一種を、リーキーガット症候群の抑制が必要な対象に投与する又は摂取させることを含む、リーキーガット症候群を抑制する方法。
項10B．
リーキーガット症候群抑制用組成物としての使用のための、セサミノール及びその代謝物からなる群より選択される少なくとも一種を含有する組成物。
項10C．
セサミノール及びその代謝物からなる群より選択される少なくとも一種を含有する組成物の、リーキーガット症候群抑制用組成物の製造のための使用。
項10D．
セサミノール及びその代謝物からなる群より選択される少なくとも一種を含有する組成物の、リーキーガット症候群抑制用組成物としての使用。
項11A．
セサミノール及びその代謝物からなる群より選択される少なくとも一種を、腸内細菌叢の改善が必要な対象に投与する又は摂取させることを含む、腸内細菌叢を改善する方法。
項11B．
腸内細菌叢改善用組成物としての使用のための、セサミノール及びその代謝物からなる群より選択される少なくとも一種を含有する組成物。
項11C．
セサミノール及びその代謝物からなる群より選択される少なくとも一種を含有する組成物の、腸内細菌叢改善用組成物の製造のための使用。
項11D．
セサミノール及びその代謝物からなる群より選択される少なくとも一種を含有する組成物の、腸内細菌叢改善用組成物としての使用。
項1．
セサミノール及びその代謝物からなる群より選択される少なくとも一種を含有する、腸炎抑制用組成物。
項2．
前記腸炎が、慢性腸炎である、項1に記載の腸炎抑制用組成物。
項3．
リーキーガット症候群の抑制に用いるための、項1又は2に記載の腸炎抑制用組成物。
項4．
経口組成物である、項1～3のいずれかに記載の腸炎抑制用組成物。
項5．
食品組成物である、項1～4のいずれかに記載の腸炎抑制用組成物。
項6．
前記代謝物がセサミノールの消化管内代謝物である、項1～5のいずれかに記載の腸炎抑制用組成物。
項7．
セサミノール及びその代謝物からなる群より選択される少なくとも一種を含有する、腸組織傷害抑制用組成物。
項8．
セサミノール及びその代謝物からなる群より選択される少なくとも一種を含有する、腸粘膜保護用組成物。
項9．
セサミノール及びその代謝物からなる群より選択される少なくとも一種を含有する、腸組織内酸化ストレス抑制用組成物。
項10．
セサミノール及びその代謝物からなる群より選択される少なくとも一種を含有する、リーキーガット症候群抑制用組成物。
項11．
セサミノール及びその代謝物からなる群より選択される少なくとも一種を含有する、腸内細菌叢改善用組成物。
また、本発明は、下記の態様も包含する。
項1A．
セサミノール及びその代謝物からなる群より選択される少なくとも一種を、腸炎の抑制が必要な対象に投与する又は摂取させることを含む、腸炎を抑制する方法。
項1B．
腸炎抑制用組成物としての使用のための、セサミノール及びその代謝物からなる群より選択される少なくとも一種を含有する組成物。
項1C．
セサミノール及びその代謝物からなる群より選択される少なくとも一種を含有する組成物の、腸炎抑制用組成物の製造のための使用。
項1D．
セサミノール及びその代謝物からなる群より選択される少なくとも一種を含有する組成物の、腸炎抑制用組成物としての使用。
項7A．
セサミノール及びその代謝物からなる群より選択される少なくとも一種を、腸組織傷害の抑制が必要な対象に投与する又は摂取させることを含む、腸組織傷害を抑制する方法。
項7B．
腸組織傷害抑制用組成物としての使用のための、セサミノール及びその代謝物からなる群より選択される少なくとも一種を含有する組成物。
項7C．
セサミノール及びその代謝物からなる群より選択される少なくとも一種を含有する組成物の、腸組織傷害抑制用組成物の製造のための使用。
項7D．
セサミノール及びその代謝物からなる群より選択される少なくとも一種を含有する組成物の、腸組織傷害抑制用組成物としての使用。
項8A．
セサミノール及びその代謝物からなる群より選択される少なくとも一種を、腸粘膜の保護が必要な対象に投与する又は摂取させることを含む、腸粘膜を保護する方法。
項8B．
腸粘膜保護用組成物としての使用のための、セサミノール及びその代謝物からなる群より選択される少なくとも一種を含有する組成物。
項8C．
セサミノール及びその代謝物からなる群より選択される少なくとも一種を含有する組成物の、腸粘膜保護用組成物の製造のための使用。
項8D．
セサミノール及びその代謝物からなる群より選択される少なくとも一種を含有する組成物の、腸粘膜保護用組成物としての使用。
項9A．
セサミノール及びその代謝物からなる群より選択される少なくとも一種を、腸組織内酸化ストレスの抑制が必要な対象に投与する又は摂取させることを含む、腸組織内酸化ストレスを抑制する方法。
項9B．
腸組織内酸化ストレス抑制用組成物としての使用のための、セサミノール及びその代謝物からなる群より選択される少なくとも一種を含有する組成物。
項9C．
セサミノール及びその代謝物からなる群より選択される少なくとも一種を含有する組成物の、腸組織内酸化ストレス抑制用組成物の製造のための使用。
項9D．
セサミノール及びその代謝物からなる群より選択される少なくとも一種を含有する組成物の、腸組織内酸化ストレス抑制用組成物としての使用。
項10A．
セサミノール及びその代謝物からなる群より選択される少なくとも一種を、リーキーガット症候群の抑制が必要な対象に投与する又は摂取させることを含む、リーキーガット症候群を抑制する方法。
項10B．
リーキーガット症候群抑制用組成物としての使用のための、セサミノール及びその代謝物からなる群より選択される少なくとも一種を含有する組成物。
項10C．
セサミノール及びその代謝物からなる群より選択される少なくとも一種を含有する組成物の、リーキーガット症候群抑制用組成物の製造のための使用。
項10D．
セサミノール及びその代謝物からなる群より選択される少なくとも一種を含有する組成物の、リーキーガット症候群抑制用組成物としての使用。
項11A．
セサミノール及びその代謝物からなる群より選択される少なくとも一種を、腸内細菌叢の改善が必要な対象に投与する又は摂取させることを含む、腸内細菌叢を改善する方法。
項11B．
腸内細菌叢改善用組成物としての使用のための、セサミノール及びその代謝物からなる群より選択される少なくとも一種を含有する組成物。
項11C．
セサミノール及びその代謝物からなる群より選択される少なくとも一種を含有する組成物の、腸内細菌叢改善用組成物の製造のための使用。
項11D．
セサミノール及びその代謝物からなる群より選択される少なくとも一種を含有する組成物の、腸内細菌叢改善用組成物としての使用。
本発明によれば、セサミノール及びその代謝物からなる群より選択される少なくとも一種を含む、腸炎抑制用組成物を提供することができる。該組成物を利用することにより、腸炎の予防又は治療等が可能になり得る。
本明細書中において、「含有」及び「含む」なる表現については、「含有」、「含む」、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。
本発明は、その一態様において、セサミノール及びその代謝物からなる群より選択される少なくとも一種を含有する、腸炎抑制用組成物（本明細書において、「本発明の腸炎抑制用組成物」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。
本発明の腸炎抑制用組成物は、セサミノール又はその代謝物を含有する。
セサミノールは、以下の構造式を有する公知の化合物であり、例えばゴマ種子中に含有されることが知られている。
また、セサミノールを効率よく生産する方法についても研究がなされており（例えば特開2006－61115号公報、特開2008－167712号公報参照）、容易に入手又は製造することができる。
セサミノールの代謝物としては、例えばセサミノールの血中代謝物、消化管内代謝物の両方が挙げられる。中でも、消化管内代謝物が好ましい。
ラットを用いた報告では、経口投与により、小腸で吸収されたセサミノールは、肝臓にて [5´´-methylated sesamin-6-catechol] と [sesaminol-6-catechol] へ代謝され、短時間ではあるが、その血中代謝物は、セサミノールに比べ、約1.6倍の抗酸化活性を持つことが報告されている（非特許文献11）。
また、セサミノールの消化管内代謝物とは、経口摂取されたセサミノールが口腔、食道、胃、小腸（十二指腸、空腸、回腸を含む）、大腸（盲腸、結腸、直腸を含む）等の消化管において代謝されたものを意味する。セサミノールの消化管内代謝物として、具体的に、[tetrahydrofuranoid] が挙げられる（非特許文献12）。
本発明の腸炎抑制用組成物は、セサミノール及びその代謝物からなる群より選択される少なくとも一種からなるものであってもよいし、本発明の効果を損なわない限りセサミノール及びその代謝物以外の成分を含有してもよい。つまり、本発明の腸炎抑制用組成物は、セサミノール及びその代謝物からなる群より選択される少なくとも一種が100重量％からなるものであってもよいし、また本発明の効果を損なわない限り他の成分を含有するものであってもよい。他の成分の含有量は、本発明の効果を損なわない限り特に制限されず、例えば0.01～99.99重量％、好ましくは0.1～99.9重量％が例示できる。“他の成分”としては、薬学的又は食品衛生学的に許容される基剤、担体、添加剤等が例示でき、さらに詳細には後述する成分が例示できる。なお、本発明の腸炎抑制用組成物のセサミノール及びその代謝物からなる群より選択される少なくとも一種の含有量は、特に、好ましくは0.00001重量％以上、より好ましくは0.0001重量％以上、さらに好ましくは0.001重量％以上、より更に好ましくは0.005重量％以上である。また、本発明の一態様において、本発明の腸炎抑制用組成物のセサミノール及びその代謝物からなる群より選択される少なくとも一種の含有量の上限は例えば100重量％であり、その下限は例えば0.01重量％、0.1重量％、1重量％、2重量％、5重量％、10重量％、20重量％、40重量％、60重量％、又は80重量％である。本発明の腸炎抑制用組成物における腸炎抑制の有効成分100重量％に対する、セサミノール及びその代謝物からなる群より選択される少なくとも一種の含有量の割合は、例えば50重量％以上、好ましくは60重量％以上、70重量％以上、80重量％以上、90重量％以上、95重量％以上、又は99重量％以上である。
本発明の組成物の形態は、特に限定されず、本発明の組成物の用途に応じて、各用途において通常利用される形態をとることができる。
本発明の腸炎抑制用組成物を投与する又は摂取させる対象としては、特に制限されず、健常人及び腸炎患者が例示される。健常人には腸炎予防のため、腸炎患者には腸炎悪化の防止又は腸炎治療のため、本発明の腸炎抑制用組成物を投与する又は摂取させることができる。健常人の中でも、アルコール摂取量が多い人など、腸炎リスクが高い人には、より好ましく予防のために投与する又は摂取させることができる。また、腸炎患者に投与する又は摂取させるにあたっては、腸炎の原因は特に制限されない。腸炎としては、慢性腸炎、急性腸炎、及び薬剤性腸炎等が挙げられる。慢性腸炎としては、感染性腸炎、アルコール性腸炎、難治性炎症性腸疾患、膠原病による腸炎などが挙げられる。感染性腸炎としては、細菌性腸炎、寄生虫性腸炎、ウイルス性腸炎などが挙げられる。難治性炎症性腸疾患としては、潰瘍性大腸炎、クローン病などが挙げられる。急性腸炎としては、感染性腸炎、虚血性腸炎などが挙げられる。虚血性大腸炎は生活習慣病患者、及び高齢者に多く見られる。薬剤性腸炎としては、偽膜性腸炎、薬剤耐性菌腸炎（MRSAなど）、抗生物質起因性急性出血性腸炎などが挙げられ、抗生物質による菌交代現象、耐性菌、非ステロイド性抗炎症薬による出血がひき起こされる。中でも、慢性腸炎が好ましい。
また、本発明の腸炎抑制用組成物は、人のみならず、健常な動物、又は腸炎の症状を呈する動物（特にペット及び家畜）も投与／摂取対象に含まれる。動物としては、例えばイヌ、ネコ、サル、マウス、ラット、ハムスター、牛、馬、豚、羊等が例示できる。
本発明の腸炎抑制用組成物の投与形態としては、特に経口投与又は注射投与（例えば皮下投与、筋肉内投与、経静脈投与、経動脈投与）が好適である。
本発明の腸炎予防又は治療剤の投与又は摂取量は、適宜設定することができる。当該剤中のセサミノール量は、好ましくは成人一日あたり1～1,000mg、より好ましくは10～500mg、の範囲となる量を目安とすることができる。なお、1日1回又は複数回（例えば、好ましくは2～3回）に分けて投与又は摂取することができる。
本発明の特徴の一つは、セサミノール及びその代謝物からなる群より選択される少なくとも一種を投与する又は摂取させることにより、腸組織における傷害が抑制される点にある。腸組織における傷害の抑制とは、例えば腸粘膜や腸粘膜下組織などを構成する細胞において死、もしくは機能障害、又は増殖阻害などが引き起こされることを抑制することを意味する。よって、本発明は、セサミノール及びその代謝物からなる群から選択される一種を含む腸組織傷害抑制用組成物を包含する。
また、本発明の特徴の一つは、セサミノール又はその代謝物を投与する又は摂取させることにより、腸粘膜が保護される点にある。腸粘膜の保護とは、例えば腸組織の粘膜への傷害の抑制、粘液分泌性の杯細胞の細胞数減少の抑制を介した粘液の減少抑制などを意味する。よって、本発明は、セサミノール及びその代謝物からなる群から選択される一種を含む腸粘膜保護用組成物を包含する。
また、本発明の特徴の一つは、セサミノール又はその代謝物を投与する又は摂取させることにより、腸組織内酸化ストレスが抑制される点にある。腸組織内酸化ストレスの抑制とは、例えば腸組織内における酸化ストレス関連遺伝子又は当該遺伝子にコードされるタンパク質の発現量の増加を抑制、又は正常な腸組織内におけるこれらの発現量と同程度に維持することを意味する。よって、本発明は、セサミノール及びその代謝物からなる群から選択される一種を含む腸組織内酸化ストレス抑制用組成物を包含する。
さらに、本発明の特徴の一つは、セサミノール又はその代謝物を投与する又は摂取させることにより、リーキーガット症候群の症状が抑制される点にある。リーキーガット症候群の症状の抑制とは、例えば腸組織の上皮細胞に局在する細胞間接着構造であるタイトジャンクションを構成する膜タンパク質の発現量の減少を抑制、又は正常な腸組織内におけるこれらの発現量と同程度に維持することを意味する。よって、本発明は、セサミノール及びその代謝物からなる群から選択される一種を含むリーキーガット症候群抑制用組成物を包含する。
また、本発明の特徴の一つは、セサミノール又はその代謝物を投与する又は摂取させることにより、腸内細菌叢が改善される点にある。腸内細菌叢の改善とは、例えば腸内細菌叢における短鎖脂肪酸産生菌の相対存在量を正常な腸内細菌叢におけるこれらの相対存在量に比べて、増加させ、減少を抑制し、若しくはより近い状態を維持すること、又は、腸内細菌叢のバランス異常、すなわちディスバイオシスを正常な腸内細菌叢により近い状態に改善することを意味する。よって、本発明は、セサミノール及びその代謝物からなる群から選択される一種を含む腸内細菌叢改善用組成物を包含する。
短鎖脂肪酸としては、炭素数が6未満の脂肪酸であれば、特に制限されないが、例えば酢酸、プロピオン酸、酪酸等が例示できる。短鎖脂肪酸産生菌としては、炭素数が6未満の脂肪酸を産生する細菌であれば、特に限定されない。好ましくは、短鎖脂肪酸産生菌はBacteroidetes門及びFirmicutes門に属する細菌である。このため、より具体的には、腸内細菌叢の改善とは、腸内細菌叢における、例えばBacteroidetes門及びFirmicutes門からなる群より選択される少なくとも一種の短鎖脂肪酸産生菌の相対存在量を正常な腸内細菌叢におけるこれらの相対存在量に比べて、増加させ、減少を抑制し、若しくはより近い状態を維持することを意味する。Bacteroidetes門に属する細菌としては、Tannerellaceae科等が例示できる。中でもTannerellaceae科が好ましい。Firmicutes門に属する細菌としては、Streptococcaceae科や、Blautia属、Roseburia属等を含むLachnospiraceae科、Butyricicoccus属、Negativibacillus属、Oscillibacter属、Ruminiclostridium属を含むRuminococcaceae科等が例示できる。中でもLachnospiraceae科、及びRuminococcaceae科が好ましい。
腸内細菌叢のバランス異常は、例えば、アルコールの摂取等により引き起こされる。このため、腸内細菌叢の改善とは、より具体的には、例えば、腸内細菌叢におけるアルコールの摂取に伴い増加する腸内細菌の相対存在量の増加を抑制、若しくは正常な腸内細菌叢におけるこれらの相対存在量により近い状態に維持すること、又は、腸内細菌叢におけるアルコールの摂取に伴い減少する腸内細菌の相対存在量の減少を抑制、若しくは正常な腸内細菌叢におけるこれらの相対存在量により近い状態に維持することを意味する。
アルコールの摂取に伴い増加する腸内細菌としては、例えばTenericutes門、Verrucomicrobia門、Proteobacteria門、Actinobacteria門、Firmicutes門等に属する腸内細菌が挙げられる。好ましくは、アルコールの摂取に伴い増加する腸内細菌は、Tenericutes門、Verrucomicrobia門、Proteobacteria門、Actinobacteria門、及びFirmicutes門に属する腸内細菌である。このため、さらに具体的には、腸内細菌叢の改善とは、例えば、アルコールの摂取に伴い増加する、Tenericutes門、Verrucomicrobia門、Proteobacteria門、Actinobacteria門、及びFirmicutes門からなる群より選択される少なくとも一種の腸内細菌の、腸内細菌叢における相対存在量を抑制、又は正常な腸内細菌叢におけるこれらの相対存在量により近い状態に維持することを意味する。Proteobacteria門の腸内細菌としては、Enterobacteriaceae科が好ましい。Firmicutes門の腸内細菌としては、Streptococcaceae科が好ましい。
アルコールの摂取に伴い減少する腸内細菌としては、例えば、Bacteroidetes門、Firmicutes門等に属する腸内細菌が挙げられる。好ましくは、アルコールの摂取に伴い減少する腸内細菌は、Bacteroidetes門及びFirmicutes門に属する腸内細菌である。このため、さらに具体的には、腸内細菌叢の改善とは、例えばBacteroidetes門及びFirmicutes門からなる群より選択される少なくとも一種の腸内細菌の、アルコールの摂取に伴う腸内細菌叢における相対存在量の減少を抑制、又は正常な腸内細菌叢におけるこれらの相対存在量により近い状態に維持することを意味する。Bacteroidetes門の腸内細菌としては、Tannerellaceae科が好ましく、Firmicutes門の腸内細菌としては、Lachnospiraceae科及びRuminococcaceae科が好ましい。
上記の特徴（腸組織傷害抑制、腸粘膜保護、腸組織内酸化ストレス抑制、リーキーガット症候群抑制、及び腸内細菌叢改善）は、腸炎抑制に直接的に又は間接的に働く。また、腸炎抑制は、上記の特徴（腸組織傷害抑制、腸粘膜保護、腸組織内酸化ストレス抑制、リーキーガット症候群抑制、及び腸内細菌叢改善）に直接的に又は間接的に働く。
上記腸組織傷害抑制用組成物、上記腸組織内酸化ストレス抑制用組成物、上記腸組織内酸化ストレス抑制用組成物、上記リーキーガット症候群抑制用組成物、及び上記腸内細菌叢改善用組成物の成分構成については、本発明の腸炎抑制用組成物と同様である。
本発明の腸炎抑制用組成物、上記腸組織傷害抑制用組成物、上記腸組織内酸化ストレス抑制用組成物、上記腸組織内酸化ストレス抑制用組成物、上記リーキーガット症候群抑制用組成物、及び上記腸内細菌叢改善用組成物（以下、これらをまとめて、「本発明の組成物」と示すこともある。）は、医薬分野及び食品分野で好ましく用いることができる。
本発明の組成物を医薬分野にて用いる場合、本発明の組成物は、セサミノールそのものであってもよいし、これと他の薬理活性成分、薬学的に許容される基剤、担体、添加剤（例えば溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤等）等が必要に応じて配合され、例えば錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、注射剤、点滴剤等の医薬製剤に調製されたものでもよい。当該調製は、常法に従って行うことが出来る。このような本発明の組成物は、上述したように、特に経口投与により、腸炎の症状の予防又は治療のために好ましく用いることができる。つまり、例えば、経口剤等として好ましく用いることができる。なお、本発明の組成物のセサミノールの一日摂取量、摂取対象、セサミノール及び他の成分の含有量等の条件は、上述したのと同様であることが好ましい。
本発明の組成物を食品添加剤として用いる場合、本発明の組成物は、セサミノールそのものであってもよいし、これと食品衛生学上許容される基剤、担体、添加剤や、その他食品添加剤として利用され得る成分・材料が適宜配合されたものでもよい。また、このような食品添加剤の形態としては、例えば液状、粉末状、フレーク状、顆粒状、ペースト状のものが挙げられるがこれらに限定されない。具体的には、調味料（醤油、ソース、ケチャップ、ドレッシング等）、フレーク（ふりかけ）、焼き肉のたれ、スパイス、ルーペースト（カレールーペースト等）等が例示できる。このような食品添加剤は、常法に従って適宜調製することができる。
このような本発明に係る食品添加剤は、該食品添加剤が添加された食品を食べることにより摂取される。なお、当該添加は食品調理中又は製造中に行ってもよいし、調理済みの食品を食べる直前又は食べながら行ってもよい。当該食品添加剤はこのようにして経口摂取することにより、腸炎の予防効果を発揮する。なお、本発明に係る食品添加剤のセサミノールの一日摂取量、摂取対象、セサミノール及び他の成分の含有量等の条件は、上述したのと同様であることが好ましい。
本発明の組成物を腸炎予防用の飲食品として用いる場合、当該剤（以下「本発明に係る飲食品」と記載することがある）は、セサミノールと、食品衛生学上許容される基剤、担体、添加剤や、その他食品として利用され得る成分・材料等が適宜配合されたものである。セサミノールが配合されてなる腸炎予防用飲食品ということもできる。例えば、セサミノールを含む、腸炎予防用の加工食品、飲料、健康食品（栄養機能食品、特定保健用食品等）、サプリメント、病者用食品（病院食、病人食又は介護食等）等が例示できる。具体的な形態としては、タブレット剤、カプセル剤、ドリンク剤等が例示される。
健康食品（栄養機能食品、特定保健用食品等）、又はサプリメントとして、本発明に係る飲食品を調製する場合は、継続的な摂取が行いやすいように、例えば顆粒、カプセル、錠剤（チュアブル剤等を含む）、飲料（ドリンク剤）等の形態で調製することが好ましく、なかでもカプセル、タブレット、錠剤の形態が摂取の簡便さの点からは好ましい。ただし、特にこれらに限定されるものではない。顆粒、カプセル、錠剤等の形態の当該飲食品からなる腸炎予防剤は、薬学的及び／又は食品衛生学的に許容される担体等を用いて、常法に従って適宜調製することができる。また、他の形態に調製する場合であっても、従来の方法に従えばよい。
本発明に係る飲食品のセサミノールの摂取量、摂取対象、セサミノール及び他の成分の含有量等は、例えば上述したのと同様であることが好ましい。
本発明は、腸炎患者に対し、本発明の組成物を投与する又は摂取させることを特徴とする腸炎の抑制、改善、又は治療方法をも提供する。また、本発明は、非腸炎患者（腸炎患者でない者の意味；健常者及び腸炎境界型の者を含む）に対し、本発明の組成物を投与する又は摂取させることを特徴とする腸炎の予防方法をも提供する。これらの方法は、具体的には、前述の本発明の組成物を投与する又は摂取させることで実施される。なお、当該方法における、本発明の組成物に含まれるセサミノールの摂取量等の各条件は前述の通りである。
さらに、本発明は、対象者（腸炎患者及び非腸炎患者を含む）に対し、セサミノール又はセサミノールを含む組成物を経口投与し又は経口摂取させ、当該対象者の腸細胞が傷害されるのを抑制する方法（但し治療方法を除く）をも包含する。さらにまた、本発明は、当該対象者に対し、セサミノール又はセサミノールを含む組成物を経口投与し又は経口摂取させ、何らかの要因（例えば上述した要因）により当該対象者の腸細胞が死滅する場合において、腸細胞生存率を向上させる方法（但し治療方法を除く）をも包含する。
なお、これらの方法における“但し治療方法を除く”との記載には、医療従事者（特に医師）の監督、指導、手技等に基づいて行われる行為を除くとの意味合いがあり、ひいては、医療従事者が自ら行おうとしていることが特許侵害になり責任追及されるのではないかと恐れながら医療行為に当たらなければならない状況が発生することを除くとの意味合いがある。
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。なお、以下特に断らない限り、％は質量％を示す。
以下の例で用いたセサミノールは、特開2008-167712号公報に記載の方法に準じて調製したものである。より、具体的には、次の調製例のようにして調製した。
調製例
Paenibacillus sp. KB0549株（寄託番号：FERM P-21057）をゴマ脱脂粕（竹本油脂製）で培養させることにより、ゴマ脱脂粕中に含まれるセサミノール配糖体からセサミノールを製造した。具体的には、次のようにして行った。
調製例
Paenibacillus sp. KB0549株（寄託番号：FERM P-21057）をゴマ脱脂粕（竹本油脂製）で培養させることにより、ゴマ脱脂粕中に含まれるセサミノール配糖体からセサミノールを製造した。具体的には、次のようにして行った。
まず、トリプトン1.0％、酵母エキス0.5%、及びNaCl0.89％を加えたゴマ脱脂粕の温水抽出液でKB0549を増殖させ、KB0549培養液を得た。当該培養液を、ゴマ脱脂粕10.0 kg（加熱殺菌し水分70%、ｐＨ6.0に調整済み）に加え、固体発酵機（37℃）で間歇撹拌とエアレーションを6日間継続して発酵処理を行った。
次に、こうして得られた、発酵させたゴマ脱脂粕を水分8.5％へと乾燥させた後、乾燥物重量に対して10倍容量の95%エタノールを加えて、50℃に加熱、撹拌させ、セサミノールの抽出を行った。得られた抽出液をフィルタープレスにより珪藻土ろ過を行い、固形分を除去して濾液82 Lを得た。当該濾液82Lを真空濃縮機で4.1 Lに濃縮した。得られた濃縮液に99.5％エタノールを4倍量以上加えて濾紙濾過で不溶物を除去後、エバポレーターで濃縮し、高濃縮液4.05 Lを得た。
当該高濃縮液中のセサミノール及びセサミノール関連化合物は高速液体クロマトグラフィー（HPLC）に供して同定した結果、濃縮液中にセサミノールが18.4 g含まれていた。当該HPLC分析条件は次の通りである：
HPLC：HITACHI LaChrom
カラム：Wakosil-II 5C18HG（φ4.6＊250mm、和光純薬）
展開溶媒：A；10％アセトニトリル＋0.1%トリフルオロ酢酸、B；80％アセトニトリル＋0.1%トリフルオロ酢酸、Bを10%～100％の直線勾配（40分間）で展開。
流速：0.8 ml／min
分析波長：280 nm
セサミノール及びセサミノール関連化合物の標準試料によって検量線を作成することで、当該高濃縮液中のセサミノール及びセサミノール関連化合物の同定や含量算出を行った。 なお、さらに溶媒抽出やシリカゲルによるカラム精製、ゲル濾過精製などの手法を用いることで、さらにセサミノール含有割合を高めることもできる。
HPLC：HITACHI LaChrom
カラム：Wakosil-II 5C18HG（φ4.6＊250mm、和光純薬）
展開溶媒：A；10％アセトニトリル＋0.1%トリフルオロ酢酸、B；80％アセトニトリル＋0.1%トリフルオロ酢酸、Bを10%～100％の直線勾配（40分間）で展開。
流速：0.8 ml／min
分析波長：280 nm
セサミノール及びセサミノール関連化合物の標準試料によって検量線を作成することで、当該高濃縮液中のセサミノール及びセサミノール関連化合物の同定や含量算出を行った。 なお、さらに溶媒抽出やシリカゲルによるカラム精製、ゲル濾過精製などの手法を用いることで、さらにセサミノール含有割合を高めることもできる。
実施例1. セサミノール投与による体重の変化及び一般観察
10週齢のC57BL/6NCr雄マウスをC群、S群、E群、及びES群の4群(各群8匹) に分け、次のように2週間毎日給餌した。コントロール群としてのC群のマウスにはエタノール及びセサミノールのいずれも含まない流動食 (デキストロースコントロール流動食) を与えた。S群のマウスには1日あたり2.5 mgのセサミノールを含む流動食 (100 mg kg-1 d-1に相当) を強制経口投与した。E群、ES群のマウスには、エネルギーをコントロール群と同量調整したエタノール含有流動食 (2.0% v/vエタノール) を自由摂取させた。ES群には、1日あたり2.5 mgのセサミノールを含む流動食を強制経口投与した。
10週齢のC57BL/6NCr雄マウスをC群、S群、E群、及びES群の4群(各群8匹) に分け、次のように2週間毎日給餌した。コントロール群としてのC群のマウスにはエタノール及びセサミノールのいずれも含まない流動食 (デキストロースコントロール流動食) を与えた。S群のマウスには1日あたり2.5 mgのセサミノールを含む流動食 (100 mg kg-1 d-1に相当) を強制経口投与した。E群、ES群のマウスには、エネルギーをコントロール群と同量調整したエタノール含有流動食 (2.0% v/vエタノール) を自由摂取させた。ES群には、1日あたり2.5 mgのセサミノールを含む流動食を強制経口投与した。
上記4群 (C群、S群、E群、及びES群) のマウスの体重を、一週ごとに測定した。各群間で試験期間中の体重の変化に顕著な違いは見られなかった (図1)。なお、実験に使用した全てのマウスは試験期間中に突然死することはなく、食欲不振、及び不動状態に陥ることもなかった。
実施例2. マウス結腸におけるエタノール誘導性病変に対するセサミノールの経口投与効果
C群、E群、S群、及びES群のマウスの結腸上皮を、ヘマトキシリン・エオジン (Hematoxylin Eosin: HE) 染色及びトルイジンブルー (Toluidine Blue: TB) 染色して顕微鏡観察した (図2A及びB) 後、ウサギ抗腸ムチン2 (MUC2) ポリクローナル抗体を用いた免疫染色を行った(図2C)。
C群、E群、S群、及びES群のマウスの結腸上皮を、ヘマトキシリン・エオジン (Hematoxylin Eosin: HE) 染色及びトルイジンブルー (Toluidine Blue: TB) 染色して顕微鏡観察した (図2A及びB) 後、ウサギ抗腸ムチン2 (MUC2) ポリクローナル抗体を用いた免疫染色を行った(図2C)。
＜組織標本のHE染色及びTB染色＞
HE染色及びTB染色した組織標本は、結腸組織の一部を採取し、10%v/v中性ホルムアルデヒド溶液で固定し、パラフィン包埋した後、パラフィン切片 (厚さ4 μm) を作製してHE染色及びTB染色を行って、作製した。
HE染色及びTB染色した組織標本は、結腸組織の一部を採取し、10%v/v中性ホルムアルデヒド溶液で固定し、パラフィン包埋した後、パラフィン切片 (厚さ4 μm) を作製してHE染色及びTB染色を行って、作製した。
＜組織標本の免疫染色＞
免疫染色した組織標本は、以下の手順で作製した。
上記パラフィン切片をスライドガラス上に置き、60℃で2時間加熱して乾燥させ、キシレンで5分間、3回洗浄して脱パラフィンした後、エタノールで脱水した。熱誘導性抗原回復のため、スライドガラスを10 mMクエン酸ナトリウム緩衝液 (pH6.0) 中、100℃で20分間加熱し、同じ緩衝液で20分間室温まで冷却した後、0.1% Tween 20を含む1xTris緩衝生理食塩水で洗浄した。切片を3% H2O2で5分間インキュベートし、内因性ペルオキシダーゼ活性を阻害した。切片をリン酸緩衝生理食塩水中の2%ウシ血清アルブミンを室温で30分間インキュベートした後、ウサギ抗MUC2ポリクローナル抗体を用いて4℃で一晩インキュベートした。続いて、切片にビオチン化ヤギ抗ウサギIgG抗体を用いて室温で20分間インキュベートした後、ペルオキシダーゼが触媒するジアミノベンゼンの酸化により視覚化し、ヘマトキシリンで対比染色した。
免疫染色した組織標本は、以下の手順で作製した。
上記パラフィン切片をスライドガラス上に置き、60℃で2時間加熱して乾燥させ、キシレンで5分間、3回洗浄して脱パラフィンした後、エタノールで脱水した。熱誘導性抗原回復のため、スライドガラスを10 mMクエン酸ナトリウム緩衝液 (pH6.0) 中、100℃で20分間加熱し、同じ緩衝液で20分間室温まで冷却した後、0.1% Tween 20を含む1xTris緩衝生理食塩水で洗浄した。切片を3% H2O2で5分間インキュベートし、内因性ペルオキシダーゼ活性を阻害した。切片をリン酸緩衝生理食塩水中の2%ウシ血清アルブミンを室温で30分間インキュベートした後、ウサギ抗MUC2ポリクローナル抗体を用いて4℃で一晩インキュベートした。続いて、切片にビオチン化ヤギ抗ウサギIgG抗体を用いて室温で20分間インキュベートした後、ペルオキシダーゼが触媒するジアミノベンゼンの酸化により視覚化し、ヘマトキシリンで対比染色した。
結果を図2に示す。C群及びS群では明らかな病変は観察されなかった。E群のマウスの結腸上皮では、C群の結腸上皮と比べて粘膜層が薄いという構造変化が観察された (図2A及びB)。また、E群のマウスの結腸組織では、杯細胞の数の減少に起因する粘液分泌量の減少が観察された (図2B及びC)。一方で、ES群のマウスの結腸上皮ではE群で観察された病変に比べて病変の程度が減少した (図2A～C)。各群間で結腸組織 (結腸上皮、結腸陰窩、粘膜下層、及び粘膜) における顕微鏡観察スコアを比較した結果、E群で最もスコアが高かった (図2D)。ES群のスコアは、全く病変を示さなかったC群及びS群のスコアよりは高かったものの、E群のスコアに比べて顕著に低かった (図2D)。
実施例3. マウス結腸におけるエタノール誘導性酸化ストレスに対するセサミノールの経口投与効果
本発明者らは、以前、マウスへのエタノールの慢性的経口投与が結腸組織において酸化ストレスを増加させることを報告している (非特許文献13)。そこで、エタノールの慢性的経口摂取により誘導される、結腸における酸化ストレスに対する、セサミノールの経口投与効果を検証するために、C群、S群、E群、及びES群のマウスの結腸組織における酸化ストレスマーカー (8-hydroxy-2’-deoxyguanosine (8-OHdG)、並びに、malondialdehyde (MDA) 及び4-hydroxyalkenals (HAE)) のレベルを調べた。
本発明者らは、以前、マウスへのエタノールの慢性的経口投与が結腸組織において酸化ストレスを増加させることを報告している (非特許文献13)。そこで、エタノールの慢性的経口摂取により誘導される、結腸における酸化ストレスに対する、セサミノールの経口投与効果を検証するために、C群、S群、E群、及びES群のマウスの結腸組織における酸化ストレスマーカー (8-hydroxy-2’-deoxyguanosine (8-OHdG)、並びに、malondialdehyde (MDA) 及び4-hydroxyalkenals (HAE)) のレベルを調べた。
組織中の酸化ストレスマーカーである8-OHdGレベルを免疫組織化学染色及びELISAにより調べた。
＜免疫組織化学染色＞
免疫染色した組織標本の作製は、一次抗体をウサギ抗8-OHdGとする点を除いて上記方法と同様である。
免疫染色した組織標本の作製は、一次抗体をウサギ抗8-OHdGとする点を除いて上記方法と同様である。
＜ELISA＞
結腸組織サンプル (50 mg) を1 mLのDNAzol試薬でホモジナイズし、得られたホモジネートを20,000 x g、4℃で、3時間遠心分離した後、DNAをエタノール沈殿により上清から単離し、8-OHdG測定前処理試薬セット (富士フィルム和光純薬) で処理した。OxiSelect酸化DNA損傷ELISAキット(Cell Biolabs) を使用した8-OHdGレベル分析には等量の抽出DNAを使用した。
結腸組織サンプル (50 mg) を1 mLのDNAzol試薬でホモジナイズし、得られたホモジネートを20,000 x g、4℃で、3時間遠心分離した後、DNAをエタノール沈殿により上清から単離し、8-OHdG測定前処理試薬セット (富士フィルム和光純薬) で処理した。OxiSelect酸化DNA損傷ELISAキット(Cell Biolabs) を使用した8-OHdGレベル分析には等量の抽出DNAを使用した。
結果を図3Aに示す。免疫組織化学染色の結果、C群及びS群のマウスでは感知できるレベルの8-OHdGは検出されなかった (図3A)。一方で、結腸組織における8-OHdGレベルはE群のマウスにおいて最も高く、次にES群のマウスにおいて高かった (図3A)。ELISA法を用いた、定量測定の結果を図3Bに示す。
脂質過酸化は、細胞及び組織における酸化ストレスの指標として使用され、過酸化脂質は分解時にMDA及びHAEを生成する。そこで、脂質過酸化反応のマーカーとしてMDA+HAEの結腸組織中のレベルを調べた。
＜過酸化脂質測定＞
結腸組織サンプル (100 mg) をホモジナイザーにより、1 mLの20 mMリン酸緩衝生理食塩水 (pH 7.4) でホモジナイズし、3,000 x gで10分間、4℃で遠心分離した。得られた沈殿物を過酸化脂質測定キット (Oxford Biomedical Research, Inc.) を用いてmalondialdehyde (MDA) 及び4-hydroxyalkenals (HAE) について調べた。
結腸組織サンプル (100 mg) をホモジナイザーにより、1 mLの20 mMリン酸緩衝生理食塩水 (pH 7.4) でホモジナイズし、3,000 x gで10分間、4℃で遠心分離した。得られた沈殿物を過酸化脂質測定キット (Oxford Biomedical Research, Inc.) を用いてmalondialdehyde (MDA) 及び4-hydroxyalkenals (HAE) について調べた。
結果を図3Cに示す。結腸組織におけるMDA+HAEのレベルはE群で最も高く、次いでES群で高かった (図3C)。ES群の値はC群及びS群の値に比べて僅かに高かった (図3C)。
実施例4. マウス結腸におけるエタノール誘導性の酸化ストレスタンパク質及び転写因子タンパク質の発現に対するセサミノールの経口投与効果
過剰量のエタノールを慢性的に摂取すると、CYP2E1及びiNOS量が上昇し、肝臓及び他の組織においてエタノール誘発性の酸化ストレスを引き起こすことが報告されている。また、nuclear factor erythroid 2-related factor 2/heme oxygenase-1 (Nrf2/HO-1) 系は、酸化損傷からの細胞の保護に広く関与していることが報告されている。そこで、4群(C群、S群、E群、及びES群) のマウス結腸組織におけるこれらタンパク質 (CYP2E1、iNOS、及びHO-1) 発現量をWestern blotting (WB) により調べた。
過剰量のエタノールを慢性的に摂取すると、CYP2E1及びiNOS量が上昇し、肝臓及び他の組織においてエタノール誘発性の酸化ストレスを引き起こすことが報告されている。また、nuclear factor erythroid 2-related factor 2/heme oxygenase-1 (Nrf2/HO-1) 系は、酸化損傷からの細胞の保護に広く関与していることが報告されている。そこで、4群(C群、S群、E群、及びES群) のマウス結腸組織におけるこれらタンパク質 (CYP2E1、iNOS、及びHO-1) 発現量をWestern blotting (WB) により調べた。
＜Western blotting＞
結腸組織サンプル(100 mg) をプロテアーゼ阻害カクテル (ナカライテスク) 希釈液を添加した1 mLのM-PER Mammalian Protein Extraction Reagent (Pierce) でホモジナイズし、得られたホモジネートを20,000 x gで15分間、4℃で遠心分離した。上清のタンパク質濃度をProtein assay reagent (Bio-Rad Laboratories) により測定、等量のタンパク質量をSDS-PAGEに供した。ゲル中の電気泳動したタンパク質をPVDFメンブレンに転写し、メンブレンをブロッキング試薬に浸漬させた (室温、一晩)。その後、一次抗体 (ウサギポリクローナル抗体) を反応させた。用いた一次抗体は、次の通りである。
anti-mouse CYP2E1
anti-mouse inducible nitric oxide synthase (iNOS)
anti-mouse heme oxygenase-1 (HO-1)
anti-mouse β-Actin
一次抗体反応後、0.1%のTween20を含む1xTris緩衝生理食塩水で10分間、3回洗浄し、HRP結合抗ウサギIgGを反応させ、ECL Western blotting kit (Cytiva) を用いてペルオキシダーゼが触媒する化学発光反応により可視化した。バンドの強度は、ImageJを用いて定量化した。
結腸組織サンプル(100 mg) をプロテアーゼ阻害カクテル (ナカライテスク) 希釈液を添加した1 mLのM-PER Mammalian Protein Extraction Reagent (Pierce) でホモジナイズし、得られたホモジネートを20,000 x gで15分間、4℃で遠心分離した。上清のタンパク質濃度をProtein assay reagent (Bio-Rad Laboratories) により測定、等量のタンパク質量をSDS-PAGEに供した。ゲル中の電気泳動したタンパク質をPVDFメンブレンに転写し、メンブレンをブロッキング試薬に浸漬させた (室温、一晩)。その後、一次抗体 (ウサギポリクローナル抗体) を反応させた。用いた一次抗体は、次の通りである。
anti-mouse CYP2E1
anti-mouse inducible nitric oxide synthase (iNOS)
anti-mouse heme oxygenase-1 (HO-1)
anti-mouse β-Actin
一次抗体反応後、0.1%のTween20を含む1xTris緩衝生理食塩水で10分間、3回洗浄し、HRP結合抗ウサギIgGを反応させ、ECL Western blotting kit (Cytiva) を用いてペルオキシダーゼが触媒する化学発光反応により可視化した。バンドの強度は、ImageJを用いて定量化した。
結果を図4に示す。E群におけるCYP2E1発現量はC群及びその他の群に比べて顕著に高かった。ES群におけるCYP2E1発現量は、E群における発現量に比べて著しく低かった (図4A及びB)。これらの結果は、iNOS発現量についても同様であった (図4A及びB)。また、E群のHO-1発現量はC群に比べて著しく低かった一方で、ES群では発現量が回復した (図4A及びB)。
Nrf2転写因子は、細胞保護に働く主要な制御因子であり、酸化ストレスに対する細胞内応答におけるHO-1遺伝子の発現を促進する。そこで、E群においてHO-1発現量が減少したことについてNrf2転写因子の活性化レベルを調べた。各群間で結腸組織抽出物のタンパク質量を揃えて、結腸組織抽出物におけるNrf2活性化レベルをELISAにより決定した。
結果を図5Cに示す。E群ではNrf2の活性化レベルがC群に比べて著しく減少した一方で、ES群ではC群と同程度に回復した (図4C)。
実施例5. マウスの大腸におけるエタノール誘導性大腸炎に対するセサミノールの経口投与効果
過剰エタノール量の慢性的な摂取は、結腸組織において、腫瘍形成に関与する炎症を誘導し得ることが報告されている。そこで、セサミノールの経口投与が、エタノールに誘導される大腸炎の予防効果を有するかどうかを検証するために、4群(C群、S群、E群、及びES群) のマウスの大腸粘膜固有層における炎症性サイトカイン (TNF-α及びIL-6) 及びケモカイン (MCP-1) の発現量を、qRT-PCR及びELISAを用いて調べた。また、上記4群のマウスにおいてNF-kB活性についても調べた。NF-kBは、炎症を制御する遺伝子発現に関与し、炎症促進因子に免疫細胞が暴露されることにより活性化される転写因子である。
過剰エタノール量の慢性的な摂取は、結腸組織において、腫瘍形成に関与する炎症を誘導し得ることが報告されている。そこで、セサミノールの経口投与が、エタノールに誘導される大腸炎の予防効果を有するかどうかを検証するために、4群(C群、S群、E群、及びES群) のマウスの大腸粘膜固有層における炎症性サイトカイン (TNF-α及びIL-6) 及びケモカイン (MCP-1) の発現量を、qRT-PCR及びELISAを用いて調べた。また、上記4群のマウスにおいてNF-kB活性についても調べた。NF-kBは、炎症を制御する遺伝子発現に関与し、炎症促進因子に免疫細胞が暴露されることにより活性化される転写因子である。
＜qRT-PCR＞
全RNAは、結腸組織サンプルから抽出した。qRT-PCR条件は次の通りである。
95℃ 10秒間
60℃ 10秒間
72℃ 10-20秒間
45サイクル
全RNAは、結腸組織サンプルから抽出した。qRT-PCR条件は次の通りである。
95℃ 10秒間
60℃ 10秒間
72℃ 10-20秒間
45サイクル
＜ELISA＞
結腸組織サンプル (100 mg) をプロテアーゼ阻害カクテル (ナカライテスク) 希釈液を添加した1 mLのM-PER Mammalian Protein Extraction Reagent (Pierce) でホモジナイズし、得られたホモジネートを20,000 x gで15分間、4℃で遠心分離した。上清のタンパク質濃度をProtein assay reagent (Bio-Rad Laboratories) より測定、等量のタンパク質量をELISAによるTNF-α、IL-6、及びMCP-1の発現量解析に供した。
結腸組織サンプル (100 mg) をプロテアーゼ阻害カクテル (ナカライテスク) 希釈液を添加した1 mLのM-PER Mammalian Protein Extraction Reagent (Pierce) でホモジナイズし、得られたホモジネートを20,000 x gで15分間、4℃で遠心分離した。上清のタンパク質濃度をProtein assay reagent (Bio-Rad Laboratories) より測定、等量のタンパク質量をELISAによるTNF-α、IL-6、及びMCP-1の発現量解析に供した。
結果を図5に示す。マウスの結腸組織におけるTNF-α、IL-6、及びMCP-1遺伝子の発現をqRT-PCR (図5A～C)、及びタンパク質の発現をELISA (図5D～F) により調べた結果、E群におけるこれら遺伝子の発現量はC群に比べて全て著しく高かった。ES群におけるTNF-α、IL-6、及びMCP-1遺伝子の発現量はC群に比べて高かった一方で、E群に比べて著しく低かった (図5A～F)。同様に、E群におけるNF-kB p65の活性化レベルはC群に比べて著しく高かった一方で、ES群におけるNF-kB p65の活性化レベルはE群に比べて著しく低かった (図5G)。
実施例6. エタノール誘導性の腸タイトジャンクション障害及び腸管壁侵漏に対するセサミノールの経口投与効果
エタノール代謝中に蓄積するアセトアルデヒドは、細胞骨格からの結腸上皮タイトジャンクション (TJ) タンパク質 (ZO-1、occludin、及びclaudin-1) の解離を介して腸のTJを破壊することが知られている。これにより、細胞間接着が失われ、結腸内腔から体循環への細菌毒素（lipopolysaccharides, LPS）の透過性が高まり、内毒素血症を引き起こす可能性がある。そこで、セサミノールの経口投与がエタノール誘発性腸管バリア機能障害に影響を与えるかどうかを、4群 (C群、S群、E群、及びES群) のマウスにおける結腸上皮TJタンパク質の発現量及び血漿LPSレベルを分析することによって調べた。
エタノール代謝中に蓄積するアセトアルデヒドは、細胞骨格からの結腸上皮タイトジャンクション (TJ) タンパク質 (ZO-1、occludin、及びclaudin-1) の解離を介して腸のTJを破壊することが知られている。これにより、細胞間接着が失われ、結腸内腔から体循環への細菌毒素（lipopolysaccharides, LPS）の透過性が高まり、内毒素血症を引き起こす可能性がある。そこで、セサミノールの経口投与がエタノール誘発性腸管バリア機能障害に影響を与えるかどうかを、4群 (C群、S群、E群、及びES群) のマウスにおける結腸上皮TJタンパク質の発現量及び血漿LPSレベルを分析することによって調べた。
＜Western blotting＞
WBは上記実施例4と同様の方法で行った。用いた一次抗体は、次の通りである。
anti-mouse zonula occludens-1 protein (ZO-1)
anti-mouse occludin
anti-mouse claudin-1
WBは上記実施例4と同様の方法で行った。用いた一次抗体は、次の通りである。
anti-mouse zonula occludens-1 protein (ZO-1)
anti-mouse occludin
anti-mouse claudin-1
＜血漿LPSレベルの測定＞
血漿LPS濃度は、limulus amebocyte lysate (LAL) アッセイにより測定した。
血漿LPS濃度は、limulus amebocyte lysate (LAL) アッセイにより測定した。
結果を図6に示す。E群のマウスの結腸組織では、ZO-1、occludin、及びclaudin-1の発現量は、C群に比べて著しく減少した (図6A及びB)。ES群では、ZO-1、occludin、及びclaudin-1の発現量はC群に比べて低かった一方で、E群における発現量に比べて著しく高かった。また、E群のマウスの血漿中のLPSレベルは、C群に比べて著しく高かった。ES群のLPSレベルもC群より高かったが、E群に比べ著しく低かった (図6C)。
以上の結果から、セサミノールの経口投与により、エタノールにより誘発される症状 (組織病変、酸化ストレス産生、炎症、及び腸TJ障害による腸管壁侵漏) が抑制されることが確認された (図7)。
実施例7. セサミノール投与による体重の変化及び一般観察
10週齢のC57BL/6NCr雄マウスをC群、S群、E群、及びES群の4群 (各群8匹) に分け、実施例1と同様の方法で4週間毎日給餌した。
10週齢のC57BL/6NCr雄マウスをC群、S群、E群、及びES群の4群 (各群8匹) に分け、実施例1と同様の方法で4週間毎日給餌した。
上記4群 (C群、S群、E群、及びES群) のマウスの体重を、一週ごとに測定した。各群間で試験期間中の体重の変化に顕著な違いは見られなかった (図8)。なお、実験に使用した全てのマウスは試験期間中に突然死することはなく、食欲不振、及び不動状態に陥ることもなかった。
実施例8. マウス肝臓におけるエタノール誘導性病変に対するセサミノールの経口投与効果
各群のマウスにおける、体重に対する肝臓の重量割合や、肝臓中のトリアシルグリセロール (Triglyceride, TG) 濃度、血漿中のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ (Aspartate Aminotransferase, AST) 活性、アラニンアミノトランスフェラーゼ (Alanine aminotransferase, ALT) 活性、及びTG濃度を測定することにより、各群のマウスの肝機能及び血漿脂質レベルを調べた。
各群のマウスにおける、体重に対する肝臓の重量割合や、肝臓中のトリアシルグリセロール (Triglyceride, TG) 濃度、血漿中のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ (Aspartate Aminotransferase, AST) 活性、アラニンアミノトランスフェラーゼ (Alanine aminotransferase, ALT) 活性、及びTG濃度を測定することにより、各群のマウスの肝機能及び血漿脂質レベルを調べた。
＜体重に対する肝臓の重量割合の測定＞
4週間給餌したマウスの体重を計量し、麻酔下解剖を実施した。肝臓を摘出し、肝臓重量を計量した。個体ごとの体重と肝臓の各重量比率を評価した。
＜肝臓中のTG量の測定＞
各肝臓を4℃下にてホモジナイズし、組織TG抽出試薬キット (Lipid Droplet Isolation kit、Cell Biolabs社製) の製品プロトコールに従ってTGを抽出した。抽出した各検体は、TG量と蛋白質量については各測定試薬の製品プロトコールに従い定量を行い、蛋白質 (g) あたりのTG量 (mg) へ換算、評価を行った。
＜血漿中のAST、ALT活性、及びTG濃度の測定＞
血漿中のAST、ALT活性、及びTG濃度については、各検査項目に応じた専用試薬キット(L-Type Wako AST、L-Type Wako ALT、L-Type Wako TG M、富士フイルム和光純薬株式会社製) を用い、製品プロトコールに従い測定を行った。
4週間給餌したマウスの体重を計量し、麻酔下解剖を実施した。肝臓を摘出し、肝臓重量を計量した。個体ごとの体重と肝臓の各重量比率を評価した。
＜肝臓中のTG量の測定＞
各肝臓を4℃下にてホモジナイズし、組織TG抽出試薬キット (Lipid Droplet Isolation kit、Cell Biolabs社製) の製品プロトコールに従ってTGを抽出した。抽出した各検体は、TG量と蛋白質量については各測定試薬の製品プロトコールに従い定量を行い、蛋白質 (g) あたりのTG量 (mg) へ換算、評価を行った。
＜血漿中のAST、ALT活性、及びTG濃度の測定＞
血漿中のAST、ALT活性、及びTG濃度については、各検査項目に応じた専用試薬キット(L-Type Wako AST、L-Type Wako ALT、L-Type Wako TG M、富士フイルム和光純薬株式会社製) を用い、製品プロトコールに従い測定を行った。
結果を表1に示す。
ALT；Alanine aminotransferase (アラニンアミノトランスフェラーゼ)、TG、トリグリセリド。 AST、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ。 ALT、アラニンアミノトランスフェラーゼ。
各値は、平均値±SDで示す。 各群の比較は、ANOVA と Tukey-Kramer 検定を用い評価した。 *;p<0.05、***p<0.001: 対 Con(C)群、†;p<0.05、††;p<0.01、及び†††;p<0.001: 対 Sesaminol(S)群、#;p<0.05 、##;p<0.01, ###；p<0.001:対 EtOH(E)群。EtOH+Sesaminol(ES)群。
E群では、体重に対する肝臓の重量割合がC群に比べて増加したのに対して、ES群ではE群に比べて減少した。また、E群では、肝臓及び血漿中のTG濃度がC群に比べて増加したのに対して、ES群ではE群に比べて減少した。さらに、E群では、血漿中のAST及びALT活性がC群に比べて増加したのに対して、ES群ではE群に比べて減少した。
各値は、平均値±SDで示す。 各群の比較は、ANOVA と Tukey-Kramer 検定を用い評価した。 *;p<0.05、***p<0.001: 対 Con(C)群、†;p<0.05、††;p<0.01、及び†††;p<0.001: 対 Sesaminol(S)群、#;p<0.05 、##;p<0.01, ###；p<0.001:対 EtOH(E)群。EtOH+Sesaminol(ES)群。
E群では、体重に対する肝臓の重量割合がC群に比べて増加したのに対して、ES群ではE群に比べて減少した。また、E群では、肝臓及び血漿中のTG濃度がC群に比べて増加したのに対して、ES群ではE群に比べて減少した。さらに、E群では、血漿中のAST及びALT活性がC群に比べて増加したのに対して、ES群ではE群に比べて減少した。
さらに、各群 (C群、E群、S群、及びES群) のマウスの肝臓切片を、HE染色又はOil Red O染色して顕微鏡観察した。
＜肝臓切片のHE染色又はOil Red O染色＞
肝臓組織サンプルは 10% v/v 中性ホルムアルデヒド溶液にて、室温一晩固定し、パラフィン包埋処理後、肝臓組織切片をHE試薬、凍結組織切片をOil Red O試薬を用い、それぞれ染色を行った。 各染色標本は、顕微鏡より観察、画像解析を行った。
肝臓組織サンプルは 10% v/v 中性ホルムアルデヒド溶液にて、室温一晩固定し、パラフィン包埋処理後、肝臓組織切片をHE試薬、凍結組織切片をOil Red O試薬を用い、それぞれ染色を行った。 各染色標本は、顕微鏡より観察、画像解析を行った。
結果を図9に示す。肝臓組織Oil Red O染色の顕微鏡像より、E群にて赤く染まった脂肪滴の顕著な増加が認められる一方、ES群では、脂肪滴の減少を認めた。本結果から、セサミノールの経口投与によりアルコール性脂肪肝炎が改善されることが観察された (図9B)。
実施例9. マウス結腸におけるエタノール誘導性酸化ストレスに対するセサミノールの経口投与効果
マウス結腸におけるエタノール誘導性酸化ストレスに対するセサミノール経口投与のより長期的な効果を検証するため、実施例7に示す各群 (C群、E群、S群、及びES群) のマウスの結腸上皮を、HE染色、TB染色、並びに過ヨウ素酸シッフ (Periodic Acid Schiff: PAS) 染色して顕微鏡観察した (図10A、B、及びC) 後、MUC2ポリクローナル抗体を用いた免疫染色を行った (図10D)。HE染色、TB染色、及びMUC2ポリクローナル抗体を用いた免疫染色は、実施例2に記載する方法と同様の方法で行った。
マウス結腸におけるエタノール誘導性酸化ストレスに対するセサミノール経口投与のより長期的な効果を検証するため、実施例7に示す各群 (C群、E群、S群、及びES群) のマウスの結腸上皮を、HE染色、TB染色、並びに過ヨウ素酸シッフ (Periodic Acid Schiff: PAS) 染色して顕微鏡観察した (図10A、B、及びC) 後、MUC2ポリクローナル抗体を用いた免疫染色を行った (図10D)。HE染色、TB染色、及びMUC2ポリクローナル抗体を用いた免疫染色は、実施例2に記載する方法と同様の方法で行った。
＜結腸組織標本のPAS染色＞
結腸組織サンプルは 10% v/v 中性ホルムアルデヒド溶液にて、室温一晩固定し、パラフィン包埋処理後、結腸組織切片をPAS染色試薬より杯細胞検出を目的とした染色を行った。各染色標本は、顕微鏡より観察、画像解析を行った。
結腸組織サンプルは 10% v/v 中性ホルムアルデヒド溶液にて、室温一晩固定し、パラフィン包埋処理後、結腸組織切片をPAS染色試薬より杯細胞検出を目的とした染色を行った。各染色標本は、顕微鏡より観察、画像解析を行った。
結果を図10に示す。HE染色、TB染色、PAS染色、又はMUC2免疫染色した各結腸組織を観察した結果、C群に比べ、E群では結腸上皮組織の萎縮、並びに杯細胞、粘液分泌細胞の著明な減少が観察された一方、ES群では、エタノール継続投与にて障害された結腸組織が、C群の組織像へ戻る傾向を観察することができた。
これらの結果から、セサミノールの経口投与によりアルコールの継続投与による結腸の炎症が改善されることが分かった。
これらの結果から、セサミノールの経口投与によりアルコールの継続投与による結腸の炎症が改善されることが分かった。
実施例10. マウス結腸における粘液分泌量に対するセサミノールの経口投与効果
各群 (C群、E群、S群、及びES群) のマウスの糞便中のムチン量の測定、並びにマウスの結腸組織中の分泌型免疫グロブリンA (Immunoglobulin A: IgA) 量の測定により、マウス結腸における粘液分泌量に対するセサミノールの経口投与効果を調べた。
各群 (C群、E群、S群、及びES群) のマウスの糞便中のムチン量の測定、並びにマウスの結腸組織中の分泌型免疫グロブリンA (Immunoglobulin A: IgA) 量の測定により、マウス結腸における粘液分泌量に対するセサミノールの経口投与効果を調べた。
＜マウスの糞便中のムチン量の測定＞
糞便サンプルは凍結乾燥装置にて、一晩凍結乾燥化後、粉末化処理を行った。乾燥粉末化した各糞便の重量測定後、糞便ムチン測定キット (Fecal Mucin Assay Kit、コスモ・バイオ株式会社製) 試薬の製品プロトコールに従い、糞便ムチン定量と乾燥糞便量(g)あたりのムチン量 (μg) へ換算、評価を行った。
＜マウスの結腸組織中の分泌型IgA量の測定＞
液体窒素処理後、-80℃にて保管した各結腸組織より、分泌型IgA測定キット (QuickDetect (商標) Secretory IgA (Mouse) ELISA kit、BioVision社製) 試薬の製品プロトコールに従い、組織中分泌型IgA量を定量した。組織100 mgあたりの分泌型IgA濃度 (ng/mL) へ換算、評価を行った。
糞便サンプルは凍結乾燥装置にて、一晩凍結乾燥化後、粉末化処理を行った。乾燥粉末化した各糞便の重量測定後、糞便ムチン測定キット (Fecal Mucin Assay Kit、コスモ・バイオ株式会社製) 試薬の製品プロトコールに従い、糞便ムチン定量と乾燥糞便量(g)あたりのムチン量 (μg) へ換算、評価を行った。
＜マウスの結腸組織中の分泌型IgA量の測定＞
液体窒素処理後、-80℃にて保管した各結腸組織より、分泌型IgA測定キット (QuickDetect (商標) Secretory IgA (Mouse) ELISA kit、BioVision社製) 試薬の製品プロトコールに従い、組織中分泌型IgA量を定量した。組織100 mgあたりの分泌型IgA濃度 (ng/mL) へ換算、評価を行った。
結果を図11に示す。E群のマウス糞便中ムチン量は、C群に比べ、有意かつ著しく減少を示した。一方、ES群のマウス糞便中ムチン量は、E群に比べて有意に高く、かつC群と同程度まで増加した (図11A)。また、E群のマウス結腸組織中の分泌型IgA量は、C群に比べて有意かつ著しい減少を示した。一方、ES軍のマウス結腸組織中の分泌型IgA量は、E群に比べて有意に高く、かつC群と同程度まで増加した (図11B)。これらの結果から、セサミノールの経口投与により、エタノールの継続投与による結腸粘液分泌量と分泌型IgA量減少の両方が改善されることが分かった。
実施例11. エタノール誘導性の腸タイトジャンクション障害及び腸管壁侵漏に対するセサミノールの予防効果
次に、エタノール誘導性の腸タイトジャンクション (TJ) 機能障害及び腸管壁侵漏に対するセサミノール経口投与のより長期的な効果を検証するため、実施例7に示す各群 (C群、S群、E群、及びES群) のマウスを用いて、結腸上皮TJタンパク質 (ZO-1、Occludin、及びClaudin-1) の組織学的解析及び血漿LPSレベルの分析を行った。組織学的解析は、抗ZO-1抗体、抗Occludin抗体、及び抗Claudin-1抗体を用いた蛍光免疫染色を行い、蛍光顕微鏡を用いて観察することにより行った。血漿LPSレベルの測定は、実施例6に示す方法と同様の方法で行った。
次に、エタノール誘導性の腸タイトジャンクション (TJ) 機能障害及び腸管壁侵漏に対するセサミノール経口投与のより長期的な効果を検証するため、実施例7に示す各群 (C群、S群、E群、及びES群) のマウスを用いて、結腸上皮TJタンパク質 (ZO-1、Occludin、及びClaudin-1) の組織学的解析及び血漿LPSレベルの分析を行った。組織学的解析は、抗ZO-1抗体、抗Occludin抗体、及び抗Claudin-1抗体を用いた蛍光免疫染色を行い、蛍光顕微鏡を用いて観察することにより行った。血漿LPSレベルの測定は、実施例6に示す方法と同様の方法で行った。
蛍光顕微鏡観察の結果を図12に、血漿LPSレベル測定の結果を図13にそれぞれ示す。
図12(A)～(C)において、タイトジャンクション（細胞間結合）マーカーである、ZO-1、Occludin、Claudin-1の結腸組織中での各蛋白質量は、蛍光顕微鏡観察より、C群、S群に比べ、E群では、ZO-1、Occludin、及びClaudin-1の著明な減少を観察した。一方、ES群では、全て改善することが観察された。
図13において、血漿中LPS濃度は、E群では、C群に比べて有意かつ顕著な増加を示したのに対し、ES群ではE群に比べて有意かつ顕著に減少し、C群及びS群の血漿中LPS濃度と同程度まで改善を示した。これら結果から、エタノール誘導性の結腸TJ機能障害及び腸管壁侵漏（腸管バリア機能低下）に対しセサミノール経口投与が長期的に、これら機能障害予防への効果を奏することが示された。
図12(A)～(C)において、タイトジャンクション（細胞間結合）マーカーである、ZO-1、Occludin、Claudin-1の結腸組織中での各蛋白質量は、蛍光顕微鏡観察より、C群、S群に比べ、E群では、ZO-1、Occludin、及びClaudin-1の著明な減少を観察した。一方、ES群では、全て改善することが観察された。
図13において、血漿中LPS濃度は、E群では、C群に比べて有意かつ顕著な増加を示したのに対し、ES群ではE群に比べて有意かつ顕著に減少し、C群及びS群の血漿中LPS濃度と同程度まで改善を示した。これら結果から、エタノール誘導性の結腸TJ機能障害及び腸管壁侵漏（腸管バリア機能低下）に対しセサミノール経口投与が長期的に、これら機能障害予防への効果を奏することが示された。
実施例12. マウスにおける腸内細菌叢構造に対するセサミノールの経口投与効果
短鎖脂肪酸は腸内細菌の代謝産物である。各群 (C群、E群、S群、及びES群) のマウスの糞便中の短鎖脂肪酸 (酢酸、プロピオン酸、酪酸) 量の測定を行った。
短鎖脂肪酸は腸内細菌の代謝産物である。各群 (C群、E群、S群、及びES群) のマウスの糞便中の短鎖脂肪酸 (酢酸、プロピオン酸、酪酸) 量の測定を行った。
＜マウスの糞便中の短鎖脂肪酸量の測定＞
マウス糞便中の短鎖脂肪酸量については、株式会社テクノスルガ・ラボ (TechnoSuruga Laboratory Co., ltd) への外部委託により測定依頼を行った。
各マウス糞便は、摘便後、即座に液体窒素処理し、-80℃にて保管した。糞便サンプルは、凍結したまま100 mgをビーズにて破砕・粉末化、酢酸エチル処理より抽出した成分を検出サンプルとした。測定は、水素炎イオン化型検出器ガスクロマトグラフィーシステム（Agilent 7890B GC、Agilent technologies社製）を用い、標準物質量との比較にて、各短鎖脂肪酸濃度の算出を行った。
マウス糞便中の短鎖脂肪酸量については、株式会社テクノスルガ・ラボ (TechnoSuruga Laboratory Co., ltd) への外部委託により測定依頼を行った。
各マウス糞便は、摘便後、即座に液体窒素処理し、-80℃にて保管した。糞便サンプルは、凍結したまま100 mgをビーズにて破砕・粉末化、酢酸エチル処理より抽出した成分を検出サンプルとした。測定は、水素炎イオン化型検出器ガスクロマトグラフィーシステム（Agilent 7890B GC、Agilent technologies社製）を用い、標準物質量との比較にて、各短鎖脂肪酸濃度の算出を行った。
結果を図14に示す。4週間の各群へのエタノール、セサミノール継続投与により、E群の糞便中酪酸量は、全ての群と比較し、有意かつ顕著な低下を示した。ES群では有意な改善を示し、C群レベルまで酪酸量の増加を認めた。一方、糞便中酢酸、プロピオン酸量に関しては、C群とE群間に差は認められなかった。
特徴的な傾向として、S群では、C群を含む全ての群と比較して、糞便中短鎖脂肪酸量の有意な増加を示し、ES群でも糞便中酢酸、プロピオン酸の有意な増加が認められた。
これら結果より、セサミノール経口投与が長期的に、エタノール誘発性の糞便中酪酸減少への改善を示した。併せて、セサミノール単独投与において、糞便中の3種の短鎖脂肪酸（酢酸、プロピオン酸、酪酸）が増加することを認めた。
特徴的な傾向として、S群では、C群を含む全ての群と比較して、糞便中短鎖脂肪酸量の有意な増加を示し、ES群でも糞便中酢酸、プロピオン酸の有意な増加が認められた。
これら結果より、セサミノール経口投与が長期的に、エタノール誘発性の糞便中酪酸減少への改善を示した。併せて、セサミノール単独投与において、糞便中の3種の短鎖脂肪酸（酢酸、プロピオン酸、酪酸）が増加することを認めた。
また、各群 (C群、E群、S群、及びES群) のマウスの腸内細菌叢の構造解析を行った。
＜マウスの腸内細菌叢の構造解析＞
マウス腸内細菌叢16S rRNA シーケンス配列解析については、マイメタゲノム株式会社 (MyMetagenome Co., ltd) への外部委託により測定依頼を行った。
各マウス糞便は、摘便後、即座に液体窒素処理し、-80℃にて保管した。糞便サンプルは、凍結したまま、処理より抽出した核酸を配列解析サンプルとした。測定は、次世代型シークエンサー（NGS）（MiniSeq, Illumina, KK）を用い、抽出核酸より、16S rRNA 遺伝子 (The V1-V2 領域)、配列5,000リード以上の結果を解析に用いた。菌叢構造解析については、生配列データ処理と既知配列データ解析により行い、分析は、16S リード 96% のペアワイズ アイデンティティ カットオフでクラスター化した。類似性値は、門と属への分類にそれぞれ割当てた。
マウス腸内細菌叢16S rRNA シーケンス配列解析については、マイメタゲノム株式会社 (MyMetagenome Co., ltd) への外部委託により測定依頼を行った。
各マウス糞便は、摘便後、即座に液体窒素処理し、-80℃にて保管した。糞便サンプルは、凍結したまま、処理より抽出した核酸を配列解析サンプルとした。測定は、次世代型シークエンサー（NGS）（MiniSeq, Illumina, KK）を用い、抽出核酸より、16S rRNA 遺伝子 (The V1-V2 領域)、配列5,000リード以上の結果を解析に用いた。菌叢構造解析については、生配列データ処理と既知配列データ解析により行い、分析は、16S リード 96% のペアワイズ アイデンティティ カットオフでクラスター化した。類似性値は、門と属への分類にそれぞれ割当てた。
結果を図15に示す。
図15(A)において、Phylum (門) レベルにおける腸内細菌叢構造解析の結果、C群とE群の比較では、E群で、健常時には殆ど検出されない2門の菌叢「Tenericutes門」及び、「Verrucomicrobia門」増加が観察された。また、C群と比べE群では、一般的に通性嫌気性菌に分類される「Proteobacteria門」の著明増加を認め、併せて、E群では、「Actinobacteria門」の増加を認めた。エタノールとセサミノールを共に継続投与したES群では、E群で見られた著しい菌叢構造異常は、C群レベルにまで戻し、菌叢構造の改善効果を示した。特徴的な事象として、C群と比較してS群単独において、偏性嫌気性菌に属し、短鎖脂肪酸産生菌である「Bacteroidetes門」及び「Firmicutes門」増加を認めた。
図15(B)に示すFamily (科) レベルにおける腸内細菌叢構造解析の結果、C群とE群の比較では、通性嫌気性菌である「Enterobacteriaceae科」及び「Streptococcaceae科」の相対存在比は、E群では著しい異常を認め、有意な増加を示した (図15(C)、及び 図15(D))。一方、ES群では、E群で見られた、腸内細菌叢における「Enterobacteriaceae科」、「Streptococcaceae科」相対存在比はC群と同レベルにまで戻り、有意な改善を示した。また、C群とE群を比較した結果、E群では酪酸産生菌として知られる「Lachnospiraceae科」、「Ruminococcaceae科」、「Tannerellaceae科」の相対的存在比は、E群では著しい異常を認め、有意な低下を示した。一方、ES群では、E群で見られた、これら4つの科は、C群と同レベルにまで戻り、有意な改善を示した。特徴的な事象として、C群と比較してS群単独において、短鎖脂肪酸産生菌である「Lachnospiraceae科」、「Ruminococcaceae科」、「Tannerellaceae科」増加を認めた。
図15(A)において、Phylum (門) レベルにおける腸内細菌叢構造解析の結果、C群とE群の比較では、E群で、健常時には殆ど検出されない2門の菌叢「Tenericutes門」及び、「Verrucomicrobia門」増加が観察された。また、C群と比べE群では、一般的に通性嫌気性菌に分類される「Proteobacteria門」の著明増加を認め、併せて、E群では、「Actinobacteria門」の増加を認めた。エタノールとセサミノールを共に継続投与したES群では、E群で見られた著しい菌叢構造異常は、C群レベルにまで戻し、菌叢構造の改善効果を示した。特徴的な事象として、C群と比較してS群単独において、偏性嫌気性菌に属し、短鎖脂肪酸産生菌である「Bacteroidetes門」及び「Firmicutes門」増加を認めた。
図15(B)に示すFamily (科) レベルにおける腸内細菌叢構造解析の結果、C群とE群の比較では、通性嫌気性菌である「Enterobacteriaceae科」及び「Streptococcaceae科」の相対存在比は、E群では著しい異常を認め、有意な増加を示した (図15(C)、及び 図15(D))。一方、ES群では、E群で見られた、腸内細菌叢における「Enterobacteriaceae科」、「Streptococcaceae科」相対存在比はC群と同レベルにまで戻り、有意な改善を示した。また、C群とE群を比較した結果、E群では酪酸産生菌として知られる「Lachnospiraceae科」、「Ruminococcaceae科」、「Tannerellaceae科」の相対的存在比は、E群では著しい異常を認め、有意な低下を示した。一方、ES群では、E群で見られた、これら4つの科は、C群と同レベルにまで戻り、有意な改善を示した。特徴的な事象として、C群と比較してS群単独において、短鎖脂肪酸産生菌である「Lachnospiraceae科」、「Ruminococcaceae科」、「Tannerellaceae科」増加を認めた。
以上の結果から、エタノール継続摂取条件での、セサミノールの継続的な経口摂取により、腸内細菌叢構造異常予防と改善を認めた。これは、糞便中の短鎖脂肪酸量の結果と併せて、酪酸産生菌の相対存在量の増加と深い関連性を持つ。併せて、セサミノール単独投与において、偏性嫌気性菌に属し、短鎖脂肪酸産生菌である「Bacteroidetes門」、「Firmicutes門」増加、並びに「Lachnospiraceae科」、「Ruminococcaceae科」、及び「Tannerellaceae科」増加を認めた。
Claims (10)
- セサミノールを含有する、腸炎抑制用組成物。
- 前記腸炎が、慢性腸炎である、請求項1に記載の腸炎抑制用組成物。
- リーキーガット症候群の抑制に用いるための、請求項1に記載の腸炎抑制用組成物。
- 経口組成物である、請求項1～3のいずれかに記載の腸炎抑制用組成物。
- 食品組成物である、請求項1～3のいずれかに記載の腸炎抑制用組成物。
- セサミノールを含有する、腸組織傷害抑制用組成物。
- セサミノールを含有する、腸粘膜保護用組成物。
- セサミノールを含有する、腸組織内酸化ストレス抑制用組成物。
- セサミノールを含有する、リーキーガット症候群抑制用組成物。
- セサミノールを含有する、腸内細菌叢改善用組成物。
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| OHIRA, Hideo et al.，Suppression of colonic oxidative stress caused by chronic ethanol administration and attenuation of，Food & Function，2022年08月08日，13，9285-9298 |
| Oxidative Medicine and Cellular Longevity，2019年，Volume 2019，Article ID 2432416 |
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