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JP7664848B2 - リソソーム障害のための遺伝子療法 - Google Patents

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JP7664848B2 JP2021559877A JP2021559877A JP7664848B2 JP 7664848 B2 JP7664848 B2 JP 7664848B2 JP 2021559877 A JP2021559877 A JP 2021559877A JP 2021559877 A JP2021559877 A JP 2021559877A JP 7664848 B2 JP7664848 B2 JP 7664848B2
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Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年３月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／９９０，２４６号及び２０１９年４月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／８３１，８４０号の優先権を主張する。これらの出願の各々の開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
電子的に提出されたテキストファイルの説明
本明細書とともに電子的に提出されたテキストファイルの内容は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる：配列表のコンピュータ可読フォーマットコピー（ファイル名：ＰＲＶＬ＿００９＿０２ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ．ｔｘｔ、記録日：２０２０年４月１０日、ファイルサイズ約３６１，１５４バイト）。
リソソーム酸性β－グルコセレブロシダーゼ（Ｇｃａｓｅ）及びα－シヌクレインなどのタンパク質の異常発現は、多くの中枢神経系障害に関与する。ゴーシェ病は、Ｇｃａｓｅの欠乏によるスフィンゴ糖脂質代謝の稀な先天性異常である。患者は、肝脾腫大、汎血球減少症につながる骨髄不全、肺障害及び線維症、ならびに骨欠損を含む非ＣＮＳ症状及び所見に苦しむ。さらに、かなりの数の患者は、衝動性眼球運動及び視線の欠陥、発作、認知障害、発達遅延、及びパーキンソン病を含む運動障害を含む神経学的症状に苦しむ。
造血骨髄及び内臓における末梢疾患及び主な臨床症状に対処するいくつかの治療法が存在し、それは、酵素補充療法、欠陥のあるＧｃａｓｅと結合して安定性を向上させるシャペロン様小分子薬剤、ならびにゴーシェ病において蓄積して症状及び病理に至る基質の産生を遮断する基質減少療法を含む。しかしながら、ゴーシェ病の他の側面は、治療に対して難治性であるようである。
ゴーシェ病患者（ＧＢＡ１遺伝子の両方の染色体対立遺伝子に変異を有する）に加えて、ＧＢＡ１の１つの対立遺伝子のみにおいて変異を有する患者は、パーキンソン病（ＰＤ）のリスクが非常に増加する。α－シヌクレインレベルの上昇もまた、ＰＤなどのシヌクレイン病の土台となる。歩行困難、安静時の振戦、硬直、及び頻繁な抑うつ、睡眠障害、及び認知機能低下を含むＰＤ症状の重症度は、酵素活性の低下の程度と相関する。したがって、ゴーシェ病患者は最も重度の経過を有するが、一方で、ＧＢＡ１における単一の軽度の変異を有する患者は、典型的にはより穏やかな経過を有する。変異保有者はまた、実行機能不全、精神病、及びＰＤ様運動障害を特徴とするレビー小体型認知症、ならびに特徴的な運動障害及び認知機能障害を有する多系統萎縮症を含む、他のＰＤ関連障害のリスクが高い。これらの障害及び他のシヌクレイン病の不可避な経過を変える療法は存在しない。
本開示は、遺伝子療法の分野及びそれを使用する方法に関する。
本明細書では、２型ゴーシェ病または３型ゴーシェ病を有する対象を治療するための方法が提供され、方法は、対象に以下を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を投与することを含む。（ｉ）グルコセレブロシダーゼ（Ｇｃａｓｅ）タンパク質をコードする導入遺伝子挿入物に作動可能に連結したプロモーターを含む発現構築物を含む核酸を含むｒＡＡＶベクターであって、導入遺伝子挿入物は配列番号１５のヌクレオチド配列を含む、ｒＡＡＶベクター、及び（ｉｉ）ＡＡＶ９キャプシドタンパク質。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、約５×１０１０ｖｇ／ｇ脳～約５×１０１１ｖｇ／ｇ脳の範囲の用量で対象に投与される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、約１．３×１０１１ｖｇ／ｇ脳の用量で対象に投与される。
本明細書では、グルコセレブロシダーゼ１（ＧＢＡ１）変異を有するパーキンソン病を有する対象を治療するための方法が提供され、方法は、対象に以下を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を投与することを含む。（ｉ）Ｇｃａｓｅタンパク質をコードする導入遺伝子挿入物に作動可能に連結したプロモーターを含む発現構築物を含む核酸を含むｒＡＡＶベクターであって、導入遺伝子挿入物は配列番号１５のヌクレオチド配列を含む、ｒＡＡＶベクター、及び（ｉｉ）ＡＡＶ９キャプシドタンパク質。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、約５×１０１３ｖｇ～約５×１０１４ｖｇの範囲の用量で対象に投与される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、約１×１０１４ｖｇまたは約２×１０１４ｖｇの用量で対象に投与される。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、大槽への後頭下注射を介して投与される。
本明細書では、１型ゴーシェ病を有する対象を治療するための方法が提供され、方法は、対象に以下を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を投与することを含む。（ｉ）Ｇｃａｓｅタンパク質をコードする導入遺伝子挿入物に作動可能に連結したプロモーターを含む発現構築物を含む核酸を含むｒＡＡＶベクターであって、導入遺伝子挿入物は配列番号１５のヌクレオチド配列を含む、ｒＡＡＶベクター、及び（ｉｉ）ＡＡＶ９キャプシドタンパク質。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、約５×１０１３ｖｇ～約５×１０１４ｖｇの範囲の用量で対象に投与される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、静脈内に投与される。
本明細書では、シヌクレイン病またはパーキンソニズムを有する対象を治療するための方法が提供され、方法は、対象に以下を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を投与することを含む。（ｉ）（ａ）配列番号１５のヌクレオチド配列を含むＧｃａｓｅタンパク質コード配列、及び（ｂ）配列番号２０のヌクレオチド配列を含む阻害性核酸コード配列、を含む導入遺伝子を含む発現構築物を含む核酸を含むｒＡＡＶベクター、ならびに（ｉｉ）ＡＡＶ９キャプシドタンパク質。
本明細書では、シヌクレイン病またはパーキンソニズムを有する対象を治療するための方法が提供され、方法は、対象に以下を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を投与することを含む。（ｉ）配列番号２０のヌクレオチド配列を含む阻害性核酸コード配列を含む導入遺伝子を含む発現構築物を含む核酸を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター、ならびに（ｉｉ）ＡＡＶ９キャプシドタンパク質。
いくつかの実施形態において、シヌクレイン病またはパーキンソニズムは、多系統萎縮、パーキンソン病、ＧＢＡ１変異を有するパーキンソン病、レビー小体病、レビー小体型認知症、ＧＢＡ１変異を有するレビー小体型認知症、進行性核上性麻痺、または皮質基底核症候群である。
いくつかの実施形態において、プロモーターは、ニワトリベータアクチン（ＣＢＡ）プロモーターである。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーをさらに含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素（ＷＰＲＥ）をさらに含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、ウシ成長ホルモンポリＡシグナル尾部をさらに含む。いくつかの実施形態において、核酸は、発現構築物に隣接する２つのアデノ随伴ウイルス逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を含む。いくつかの実施形態において、各ＩＴＲ配列は、野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、５’ＩＴＲ及び発現構築物の間のＴＲＹ領域をさらに含み、ＴＲＹ領域は、配列番号２８を含む。
本明細書では、２型ゴーシェ病または３型ゴーシェ病を有する対象を治療するための方法が提供され、方法は、対象に以下を含むｒＡＡＶを投与することを含む。
（ｉ）５’から３’の順に、
（ａ）ＡＡＶ２ ＩＴＲ、
（ｂ）ＣＭＶエンハンサー、
（ｃ）ＣＢＡプロモーター、
（ｄ）Ｇｃａｓｅタンパク質をコードする導入遺伝子挿入物であって、導入遺伝子挿入物が配列番号１５のヌクレオチド配列を含む、導入遺伝子挿入物、
（ｅ）ＷＰＲＥ、
（ｆ）ウシ成長ホルモンポリＡシグナル尾部、及び
（ｇ）ＡＡＶ２ ＩＴＲを含む核酸を含む、ｒＡＡＶベクター、ならびに
（ｉｉ）ＡＡＶ９キャプシドタンパク質。
ｒＡＡＶは、約５×１０１０ｖｇ／ｇ脳～約５×１０１１ｖｇ／ｇ脳の範囲の用量で対象に投与される。
本明細書では、ＧＢＡ１変異を有するパーキンソン病を有する対象を治療するための方法が提供され、方法は、対象に以下を含むｒＡＡＶを投与することを含む。
（ｉ）５’から３’の順に、
（ａ）ＡＡＶ２ ＩＴＲ、
（ｂ）ＣＭＶエンハンサー、
（ｃ）ＣＢＡプロモーター、
（ｄ）Ｇｃａｓｅタンパク質をコードする導入遺伝子挿入物であって、導入遺伝子挿入物が配列番号１５のヌクレオチド配列を含む、導入遺伝子挿入物、
（ｅ）ＷＰＲＥ、
（ｆ）ウシ成長ホルモンポリＡシグナル尾部、及び
（ｇ）ＡＡＶ２ ＩＴＲを含む核酸を含む、ｒＡＡＶベクター、ならびに
（ｉｉ）ＡＡＶ９キャプシドタンパク質。
ｒＡＡＶは、約５×１０１３ｖｇ～約５×１０１４ｖｇの範囲の用量で対象に投与される。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、大槽への後頭下注射を介して投与される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、約２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、約１ｍＭのＭｇＣｌ２、約２００ｍＭのＮａＣｌ、及び約０．００１％ｗ／ｖのポロキサマー１８８を含む製剤で投与される。
本明細書では、以下を含む医薬組成物が提供される。
（ｉ）
（ａ）導入遺伝子挿入物Ｇｃａｓｅタンパク質に作動可能に連結したプロモーターを含む発現構築物を含む核酸を含むｒＡＡＶベクターであって、導入遺伝子挿入物が配列番号１５のヌクレオチド配列を含む、ｒＡＡＶベクター、及び
（ｂ）ＡＡＶ９キャプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ、
（ｉｉ）約２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、
（ｉｉｉ）約１ｍＭのＭｇＣｌ２、
（ｉｖ）約２００ｍＭのＮａＣｌ、ならびに
（ｖ）約０．００１％ｗ／ｖのポロキサマー１８８。
本明細書では、
（ａ）Ｇｃａｓｅタンパク質をコードする導入遺伝子挿入物に作動可能に連結したプロモーターを含む発現構築物を含む核酸を含むｒＡＡＶベクターであって、導入遺伝子挿入物が配列番号１５のヌクレオチド配列を含む、前記ｒＡＡＶベクターと、
（ｂ）ＡＡＶ９キャプシドタンパク質と、を含む、
対象において１型ゴーシェ病、２型ゴーシェ病、３型ゴーシェ病またはＧＢＡ１変異を有するパーキンソン病を治療する方法において使用するための、ｒＡＡＶが提供される。
本明細書では、
（ｉ）
（ａ）配列番号１５のヌクレオチド配列を含むＧｃａｓｅタンパク質コード配列、及び
（ｂ）配列番号２０のヌクレオチド配列を含む阻害性核酸コード配列、を含む導入遺伝子挿入物に作動可能に連結したプロモーターを含む発現構築物を含む核酸を含むｒＡＡＶベクターと、
（ｉｉ）ＡＡＶ９キャプシドタンパク質と、を含む、
対象においてシヌクレイン病またはパーキンソニズムを治療する方法において使用するための、ｒＡＡＶが提供される。
本明細書では、
（ｉ）配列番号２０のヌクレオチド配列を含む阻害性核酸コード配列を含む導入遺伝子挿入物に作動可能に連結したプロモーターを含む発現構築物を含む核酸を含むｒＡＡＶベクターと、
（ｉｉ）ＡＡＶ９キャプシドタンパク質と、を含む、
対象においてシヌクレイン病またはパーキンソニズムを治療する方法において使用するための、ｒＡＡＶが提供される。
Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部分）をコードする発現構築物を含むｒＡＡＶベクターを含むプラスミドの一実施形態を示す概略図である。 Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部分）及びＬＩＭＰ２（ＳＣＡＲＢ２）またはその一部分をコードする発現構築物を含むｒＡＡＶベクターを含むプラスミドの一実施形態を示す概略図である。Ｇｃａｓｅ及びＬＩＭＰ２のコード配列は、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）によって分離される。 Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部分）及びＬＩＭＰ２（ＳＣＡＲＢ２）またはその一部分をコードする発現構築物を含むｒＡＡＶベクターを含むプラスミドの一実施形態を示す概略図である。Ｇｃａｓｅ及びＬＩＭＰ２のコード配列の発現は、別個のプロモーターによってそれぞれ駆動される。 Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部分）、ＬＩＭＰ２（ＳＣＡＲＢ２）またはその一部分、及びα－Ｓｙｎについての干渉ＲＮＡをコードする発現構築物を含むｒＡＡＶベクターを含むプラスミドの一実施形態を示す概略図である。 Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部分）、プロサポシン（例えば、ＰＳＡＰまたはその一部分）、及びα－Ｓｙｎについての干渉ＲＮＡをコードする発現構築物を含むｒＡＡＶベクターを含むプラスミドの一実施形態を示す概略図である。 Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部分）及びプロサポシン（例えば、ＰＳＡＰまたはその一部分）をコードする発現構築物を含むｒＡＡＶベクターを含むプラスミドの一実施形態を示す概略図である。Ｇｃａｓｅ及びプロサポシンのコード配列は、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）によって分離される。 Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部分）をコードする発現構築物を含むｒＡＡＶベクターを含むプラスミドの一実施形態を示す概略図である。本実施形態において、ベクターは、以下の４つの部分からなるＣＢＡプロモーター要素（ＣＢＡ）を含む。ヒトＧＢＡ１のコドン最適化コード配列を構成的に発現するための、ＣＭＶエンハンサー（ＣＭＶｅ）、ＣＢＡプロモーター（ＣＢＡｐ）、エクソン１、及びイントロン（ｉｎｔ）。３’領域はまた、ＷＰＲＥ調節エレメント、続いてｂＧＨポリＡ尾部を含む。以下の３つの転写調節活性化部位が、プロモーター領域の５’末端に含まれる：ＴＡＴＡ、ＲＢＳ、及びＹＹ１を含む配列を指す。隣接ＩＴＲは、介在配列の正しいパッケージングを可能にする。５’ＩＴＲ配列の２つのバリアント（挿入ボックス）を評価し、これらは、野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲの２０ヌクレオチド「Ｄ」領域内にいくつかのヌクレオチド差を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、上段の並びに示される「Ｄ」ドメインヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、変異体「Ｄ」ドメイン（例えば、下段の並びに示されるヌクレオチド変化を有する「Ｓ」ドメイン）を含む。 図７に記載のｒＡＡＶベクターをコードするプラスミドの一実施形態を示す概略図である。 ＣＢＥマウスモデル検証についての代表的なデータを示す。生存率（Ａ）を１日２回チェックし、体重（Ｂ）を毎日記録し、Ｐ２７で分析した（Ｃ）。すべての群は、ｎ＝８で開始した。Ｐ２４でロータロッドでの落下までの潜時（Ｄ）、及びオープンフィールドにおける移動距離の合計（Ｆ）によって、行動を評価した。早期の致死性のため、各群についての動物の数は異なり、ＰＢＳ及び２５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥについてはｎ＝８、３７．５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥではｎ＝４であった。Ｐ２４までの完全な致死性のため、５０ｍｇ／ｋｇのＣＢＥ処置群をロータロッドにおいて評価しなかった。ＡＮＯＶＡ、続いてＴｕｋｅｙ ＨＳＤ検定を使用して、ＰＢＳ群に対する比較について、統計結果を示す。ＰＢＳ及び２５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥ処置群におけるマウスの大脳皮質において、ＧＣａｓｅ基質のレベルを分析した。凝集体ＧｌｕＳｐｈ及びＧａｌＳｐｈレベル（Ｅ）を、組織のｍｇ湿潤重量当たりのｐｍｏｌとして示す。統計結果を、スチューデントのｔ検定を使用して示す。平均が示されている。エラーバーは平均値の標準誤差（ＳＥＭ）である。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。 ＣＢＥマウスモデル検証についての代表的なデータを示す。生存率（Ａ）を１日２回チェックし、体重（Ｂ）を毎日記録し、Ｐ２７で分析した（Ｃ）。すべての群は、ｎ＝８で開始した。Ｐ２４でロータロッドでの落下までの潜時（Ｄ）、及びオープンフィールドにおける移動距離の合計（Ｆ）によって、行動を評価した。早期の致死性のため、各群についての動物の数は異なり、ＰＢＳ及び２５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥについてはｎ＝８、３７．５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥではｎ＝４であった。Ｐ２４までの完全な致死性のため、５０ｍｇ／ｋｇのＣＢＥ処置群をロータロッドにおいて評価しなかった。ＡＮＯＶＡ、続いてＴｕｋｅｙ ＨＳＤ検定を使用して、ＰＢＳ群に対する比較について、統計結果を示す。ＰＢＳ及び２５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥ処置群におけるマウスの大脳皮質において、ＧＣａｓｅ基質のレベルを分析した。凝集体ＧｌｕＳｐｈ及びＧａｌＳｐｈレベル（Ｅ）を、組織のｍｇ湿潤重量当たりのｐｍｏｌとして示す。統計結果を、スチューデントのｔ検定を使用して示す。平均が示されている。エラーバーは平均値の標準誤差（ＳＥＭ）である。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。 ＣＢＥマウスモデルにおけるＧＣａｓｅをコードするｒＡＡＶの最大用量についての試験設計の一実施形態を示す概略図である。４μＬのＰＲ００１ＢまたはｄＰＢＳが、Ｐ３でのＩＣＶ注射によって送達され、毎日の２５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥ処置は、Ｐ８で開始された。行動をＰ２４でロータロッドアッセイにおいて評価した。半数の動物を、Ｐ３５での最終ＣＢＥ用量の１日後であるＰ３６で屠殺し、残りの半数を、Ｐ３５での最終ＣＢＥ用量の３日後であるＰ３８で屠殺した。「ｖｇ」は、ベクターゲノムを指す。 ＣＢＥマウスモデルにおける最大ＰＲ００１Ｂ ｒＡＡＶ用量の生存中評価についての代表的なデータを示す。Ｐ３で、マウスを、ＩＣＶ送達を介して賦形剤または８．８ｅ９ｖｇのｒＡＡＶのいずれかで処置した。ＰＢＳまたは２５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥのいずれかの毎日のＩＰ送達を、Ｐ８で開始した。試験の終了時に、半数のマウスを、Ｐ３６（１日目）での最終ＣＢＥ用量の１日後に屠殺し、残りの半数を、３日間のＣＢＥ離脱を経てＰ３８（３日目）で屠殺した。すべての処置群（賦形剤＋ＰＢＳ（ｎ＝８）、ｒＡＡＶ＋ＰＢＳ（ｎ＝７）、賦形剤＋ＣＢＥ（ｎ＝８）、及びｒＡＡＶ＋ＣＢＥ（ｎ＝９））を毎日計量し（Ａ）、Ｐ３３で重量を分析した（Ｂ）。行動を、Ｐ２３でのオープンフィールドにおける総移動距離（Ｄ）及びＰ２４でのロータロッドでの落下までの潜時（Ｃ）によって評価し、３つの試験にわたる中央値として各動物について評価した。致死性により、行動アッセイについての賦形剤＋ＣＢＥ群については、ｎ＝７であり、他のすべての群についてはｎ＝８であった。動物全体の平均が示されている。エラーバーはＳＥＭである。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、ＣＢＥ処置の動物における線形回帰による処置群についての名目上のｐ値。 Ａ～Ｂは、ＣＢＥマウスモデルにおける最大ＰＲ００１Ｂ ｒＡＡＶ用量の生化学的評価についての代表的なデータを示す。すべての処置群の大脳皮質を使用して、ベクターゲノム（Ａ）及びＧＣａｓｅ活性（Ｂ）を測定した。生体内分布は、１μｇのゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）当たりのベクターゲノムとして示される。破線（１００ベクターゲノム／μｇ ｇＤＮＡで）は、ベクターの存在の陽性についての検出閾値を表す。Ａｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；＃Ａ２２１８９）を使用して、ＧＣａｓｅによるグルコース産生の速度を測定し、次いで、組換えＧＣａｓｅ参照標準曲線を使用して、有効なＧＣａｓｅ活性レベルに変換することによって、酵素活性を評価した。１単位を、総タンパク質のｍｇに対して正規化された組換え精製ＧＣａｓｅの１ｎｇ／ｍＬの活性として定義した。ｎ＝６～９／群。平均が示されている。エラーバーはＳＥＭである。＊Ｐ＜０．０５、収集日数及び性別が共変量として補正された、ＣＢＥ処置の動物における処置群の名目上のｐ値。 Ｃ～Ｄは、ＣＢＥマウスモデルにおける最大ＰＲ００１Ｂ ｒＡＡＶ用量の糖脂質分析についての代表的なデータを示す。すべての処置群（ＰＢＳ＋ｄＰＢＳ［各グラフの左のバー］（ｎ＝４）、ＣＢＥ＋ｄＰＢＳ［各グラフの中央のバー］（ｎ＝６）、及びＣＢＥ＋ＰＲ００１Ｂ［各グラフの右のバー］（ｎ＝９））の大脳皮質を使用して、ＣＢＥ離脱前（１日目）または離脱後（３日目）の群におけるＧｌｕＳｐｈレベル（Ｃ）及びＧｌｕＣｅｒレベル（Ｄ）を測定した。ＧｌｕＳｐｈ及びＧｌｕＣｅｒレベルは、リン酸塩のｎｍｏｌ当たりのｐｍｏｌとして示される。平均が示されている。エラーバーはＳＥＭである。＊ｐ＜０．１、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、収集日数及び性別が共変量として補正された、多重線形回帰からのＣＢＥ処置の動物における処置群の名目上のｐ値。 賦形剤＋ＰＢＳ、賦形剤＋ＣＢＥ、及びＰＲ００１Ｂ ｒＡＡＶ＋ＣＢＥ処置群の投与後のＣＢＥマウスモデルにおける行動及び生化学的相関についての代表的なデータを示す。処置群にわたって、ロータロッドでの性能は、ＧｌｕＣｅｒ蓄積と負の相関があり（Ａ、線形回帰によりｐ＝０．００１２）、ＧｌｕＳｐｈ蓄積は、ＧＣａｓｅ活性の増加と負の相関があった（Ｂ、線形回帰によりｐ＝０．００８６）。 ＣＢＥマウスモデルにおけるＰＲ００１Ｂ ｒＡＡＶの生体内分布についての代表的なデータを示す。ベクターゲノムの存在を、ベクター参照標準曲線を使用した定量的ＰＣＲによって定量し、ゲノムＤＮＡ濃度を、Ａ２６０光学密度測定によって評価した。破線（１００ベクターゲノム／μｇ ｇＤＮＡで）は、ベクターの存在の陽性についての検出閾値を表す。平均が示されている。エラーバーはＳＥＭである。群当たり、ｎ＝７～９。 Ａは、ＣＢＥマウスモデルにおけるＧＣａｓｅをコードするｒＡＡＶの用量範囲についての試験設計の一実施形態を示す概略図である。ＰＲ００１Ａは、Ｐ３でのＩＣＶ注射によって送達され、毎日の２５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥ処置は、Ｐ８で開始された。行動を、Ｐ２１～Ｐ２２でのオープンフィールド及びロータロッドアッセイにおいて、及びＰ２８でのテーパービームによって評価した。最終ＣＢＥ用量の１日後である、Ｐ３８～Ｐ４０で動物を屠殺した。ＧｌｕＳｐｈ及びＧｌｕＣｅｒ基質レベルならびにＧＣａｓｅ活性について皮質を分析した。各処置群においては１０頭のマウス（５頭雄、５頭雌）であった。Ｂ～Ｅは、ＣＢＥマウスモデルにおけるＰＲ００１ ｒＡＡＶ用量範囲の生存中評価についての代表的なデータを示す。マウスは、Ｐ３で４μＬのＩＣＶ送達によって、賦形剤または低用量（中央のバー）、中程度用量（右から２番目のバー）、もしくは高用量（右端のバー）の３つの異なる用量のうちの１つのＰＲ００１Ａを受けた。Ｐ８で、２５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥの毎日のＩＰ処置を開始した。賦形剤及びＣＢＥ（左から２番目のバー）または賦形剤及びＰＢＳ（左端のバー）を受けたマウスを対照とした。すべての処置群は、群あたりｎ＝１０（５頭雄／５頭雌）で開始した。最終ＣＢＥ用量の１日後（Ｐ３８～Ｐ４０）にすべてのマウスを屠殺した。すべての処置群を毎日計量し（Ｂ）、それらの体重をＰ３７で分析した（Ｃ）。Ｐ２４でロータロッドでの落下までの潜時（Ｄ）、及びＰ３０でテーパービームを横断するまでの潜時（Ｅ）によって、運動性能を評価した。早期の致死性のため、行動アッセイに参加したマウスの数は、賦形剤＋ＰＢＳ（左端のバー）のｎ＝１０、賦形剤＋ＣＢＥ（左から２番目のバー）のｎ＝９、低用量ＰＲ００１Ａ＋ＣＢＥ（中央のバー）のｎ＝６、中程度用量ＰＲ００１Ａ＋ＣＢＥ（右から２番目のバー）のｎ＝１０、高用量ＰＲ００１Ａ＋ＣＢＥ（右端のバー）のｎ＝７であった。平均が示されている。エラーバーはＳＥＭである。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１はＣＢＥ処置群における名目上のｐ値についてであり、性別は共変量として補正される。 ＰＲ００１Ａの用量範囲ＣＢＥモデル試験における生体内分布についての代表的なデータを示す。マウスは、Ｐ３でのＩＣＶ送達によって、低用量（中央のバー）、中程度用量（右から２番目のバー）、または高用量（右端のバー）の３つの異なる用量のうちの１つのＰＲ００１Ａを受けた。Ｐ８で、２５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥの毎日のＩＰ処置を開始した。賦形剤及びＣＢＥ（左から２番目のバー）または賦形剤及びＰＢＳ（左端のバー）を受けたマウスを対照とした。最終ＣＢＥ用量の１日後である、Ｐ３８～Ｐ４０ですべてのマウスを屠殺した。ベクターゲノムの存在を、各組織及びすべての処置群において評価し、１μｇのゲノムＤＮＡ当たりのベクターコピーの数として示した。ベクターゲノムの存在を、ベクター参照標準曲線を使用して、ｑＰＣＲによって定量化した。それぞれ、群当たりＮ＝１０、９、６、１０、７。破線は、陽性のベクターの存在の検出閾値を表す。平均が示されている。エラーバーはＳＥＭである。 ＰＲ００１Ａの用量範囲ＣＢＥモデル試験におけるＧＣａｓｅ酵素活性についての代表的なデータを示す。有効な酵素ＧＣａｓｅ活性が、各組織及びすべての処置群について示される。活性は、組換え精製ＧＣａｓｅの１ｎｇ／ｍＬの活性として定義される１単位で総タンパク質のｍｇ当たりの単位として示される。平均が示されている。エラーバーはＳＥＭである。賦形剤＋ＣＢＥ群（左から２番目のバー）に対する比較について、統計結果を示す。それぞれ、群当たりＮ＝１０、９、６、１０、７。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ＡＮＯＶＡ、続いてＴｕｋｅｙ ＨＳＤ多重検定補正による。 ＰＲ００１Ａの用量範囲ＣＢＥモデル試験における糖脂質分析についての代表的なデータを示す。ＧｌｕＳｐｈレベルが、リン酸塩のｎｍｏｌ当たりのｐｍｏｌとして示される。平均が示されている。エラーバーはＳＥＭである。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ＡＮＯＶＡ、続いてＴｕｋｅｙ ＨＳＤ多重検定補正による。 ＰＲ００１Ａの用量範囲ＣＢＥモデル試験における糖脂質分析についての代表的なデータを示す。ＧｌｕＣｅｒレベルが、リン酸塩のｎｍｏｌ当たりのｐｍｏｌとして示される。平均が示されている。エラーバーはＳＥＭである。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ＡＮＯＶＡ、続いてＴｕｋｅｙ ＨＳＤ多重検定補正による。 ＰＲ００１Ａの用量範囲ＣＢＥモデル試験におけるヘマトキシリン及びエオシン染色分析についての代表的なデータを示す。脳組織をヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色するために処理し、組織切片を、病理学的変化について評価した。神経炎症の徴候である大脳皮質グリア瘢痕について陽性の動物のパーセンテージを示す。ＣＢＥ処置は、賦形剤処置対照と比較して、グリア瘢痕において有意な増加をもたらした。ＰＲ００１Ａは、用量依存的に、ＣＢＥ誘発性グリア瘢痕を有意に減少させた。ＣＢＥ＋賦形剤群（左のバー）に対する比較について、統計結果を示す。それぞれ、群当たりＮ＝１０、９、６、１０、７。＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１、フィッシャーの正確検定について。 ＰＲ００１Ａの用量範囲ＣＢＥモデル試験における大脳皮質免疫組織化学分析についての代表的なデータを示す。グラフは、大脳皮質内で測定された免疫反応面積の平均値を示す（群当たりｎ＝５～１０）。Ｉｂａ１（イオン化カルシウム結合アダプター分子１）免疫反応面積は、調査した他のすべての群のマウスよりもＣＢＥ＋賦形剤処置動物（左から２番目のバー）において有意に高かった。平均値を示し、エラーバーはＳＥＭである。データを、一元配置ＡＮＯＶＡ及び多重比較のためのＳｉｄａｋの事後検定によって分析した。＊＊：Ｐ＜０．０１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１。 遺伝子マウスモデルにおける最大用量ＧＢＡ１ ｒＡＡＶにおけるテーパービーム分析についての代表的なデータを示す。処置群（ＷＴ＋賦形剤（ｎ＝５）、４Ｌ／ＰＳ－ＮＡ＋賦形剤（ｎ＝６）、及び４Ｌ／ＰＳ－ＮＡ＋ｒＡＡＶ（ｎ＝５））の運動性能を、ｒＡＡＶ投与の４週間後のビームウォークによってアッセイした。合計スリップ及び活動時間は、異なるビームでの５回にわたる試験の合計として示される。速度ごとの速度及びスリップは、異なるビームでの５回にわたる試験の平均として示される。平均が示されている。エラーバーはＳＥＭである。 遺伝子マウスモデルにおける最大用量ＧＢＡ１ ｒＡＡＶにおけるテーパービーム分析についての代表的なデータを示す。処置群（ＷＴ＋賦形剤（ｎ＝５）、４Ｌ／ＰＳ－ＮＡ＋賦形剤（ｎ＝６）、及び４Ｌ／ＰＳ－ＮＡ＋ｒＡＡＶ（ｎ＝５））の運動性能を、ｒＡＡＶ投与の４週間後のビームウォークによってアッセイした。合計スリップ及び活動時間は、異なるビームでの５回にわたる試験の合計として示される。速度ごとの速度及びスリップは、異なるビームでの５回にわたる試験の平均として示される。平均が示されている。エラーバーはＳＥＭである。 プロサポシン（ＰＳＡＰ）、ＳＣＡＲＢ２、及び／または１つ以上の阻害性核酸と組み合わせた、ＧＢＡ１をコードするｒＡＡＶ構築物のインビトロ発現についての代表的なデータを示す。データは、各構築物でのＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクションが、ＧＦＰトランスフェクション細胞に対して目的の導入遺伝子の過剰発現をもたらしたことを示す。 プロサポシン（ＰＳＡＰ）、ＳＣＡＲＢ２、及び／または１つ以上の阻害性核酸と組み合わせた、ＧＢＡ１をコードするｒＡＡＶ構築物のインビトロ発現についての代表的なデータを示す。データは、各構築物でのＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクションが、ＧＦＰトランスフェクション細胞に対して目的の導入遺伝子の過剰発現をもたらしたことを示す。 ＩＴＲの「外側」に位置する「Ｄ」領域を（例えば、導入遺伝子挿入物または発現構築物に対してＩＴＲの末端に近位に）含むｒＡＡＶベクター（上段）、及びベクターの「内側」にＩＴＲを（例えば、ベクターの導入遺伝子挿入物に近位に）有する野生型ｒＡＡＶベクターを示す概略図である。 「Ｄ」配列の野生型（円）または代替的（例えば、「外側」、正方形）配置を有するＩＴＲを有するｒＡＡＶを使用したＨＥＫ２９３細胞の形質導入についてのデータを示す。「外側」に配置されたＩＴＲを有するｒＡＡＶは、野生型ＩＴＲを有するｒＡＡＶと同様に効率的に細胞に形質導入することができた。 Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部分）をコードする発現構築物を含むｒＡＡＶベクターを含むプラスミドの一実施形態を示す概略図である。 Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部分）をコードする発現構築物を含むｒＡＡＶベクターを含むプラスミドの一実施形態を示す概略図である。 Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部分））またはその一部分、及びα－Ｓｙｎについての干渉ＲＮＡをコードする発現構築物を含むｒＡＡＶベクターを含むプラスミドの一実施形態を示す概略図である。 Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部分））またはその一部分、及びα－Ｓｙｎについての干渉ＲＮＡをコードする発現構築物を含むｒＡＡＶベクターを含むプラスミドの一実施形態を示す概略図である。 プロサポシン（例えば、ＰＳＡＰまたはその一部分）をコードする発現構築物を含むｒＡＡＶベクターを含むプラスミドの一実施形態を示す概略図である。 Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部分）をコードする発現構築物を含むｒＡＡＶベクターを含むプラスミドの一実施形態を示す概略図である。 Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部分）、プロサポシン（例えば、ＰＳＡＰまたはその一部分）、及びα－Ｓｙｎについての干渉ＲＮＡをコードする発現構築物を含むｒＡＡＶベクターを含むプラスミドの一実施形態を示す概略図である。 ＧｃａｓｅをコードするｒＡＡＶベクターの投与がインビボでグリア瘢痕を減少させることを示す代表的なデータを示す。組織をヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色するために処理し、スライドを、病理学的変化について評価した。各群におけるアストログリオーシスを反映したグリア瘢痕について陽性の動物のパーセンテージは、薄い陰影で示され、グリア瘢痕につい陰性の動物は黒色で示される。ＣＢＥ処置は、賦形剤処置対照と比較して、グリア瘢痕において有意な増加をもたらした。ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１は、用量依存的にＣＢＥ誘発性グリア瘢痕を有意に減少させた。統計結果は、賦形剤＋ＣＢＥ群（赤色）に対する比較について、統計結果を示す。それぞれ、群当たりＮ＝１０、９、６、１０、７。＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１、フィッシャーの正確検定について。 ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１または賦形剤を投与されたマウスの皮質内で測定された免疫蛍光シグナルの平均値（１群当たりｎ＝６～１０）についての代表的なデータを示す。ＧＣａｓｅ（Ａ）免疫標識の定量化は、高用量ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１処置動物において最も強力な免疫蛍光標識を明らかにし、中程度用量及び低用量ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１処置動物と続いた。Ｉｂａ１（Ｂ）免疫反応面積は、調査したすべての他の群のマウスよりもＣＢＥ／賦形剤処置動物において有意に高かった。データを、一元配置ＡＮＯＶＡ及び多重比較のためのＳｉｄａｋの事後検定で分析した。棒グラフは、群平均＋ＳＥＭを表す。 １８３日目の試験ＰＲＶ－２０１８－０１６におけるＰＲ００１Ａ導入遺伝子の生体内分布についての代表的なデータを示す棒グラフである。この試験は、実施例１２に記載されている。導入遺伝子レベルは、賦形剤、低用量のＰＲ００１Ａ（６．２×１０１０ｖｇ／ｇ脳）、または高用量のＰＲ００１Ａ（２．３×１０１１ｖｇ／ｇ脳）のいずれかの大槽内（ＩＣＭ）注射の１８３日後のＮＨＰ（非ヒト霊長類）におけるｑＰＣＲ法を使用して分析した。各バーは、群当たり３頭の動物の平均±ＳＥＭを表し、定量の限界を下回った値をゼロとしてプロットした。賦形剤処置動物についてのｑＰＣＲ値は、領域についてゼロであったため、賦形剤のバーは、このスケールのグラフには示されない。 試験ＰＲＶ－２０１８－０１６における１８３日目のヒトＧＣａｓｅ発現についての代表的なデータを示すグラフである。この試験は、実施例１２に記載されている。ＧＣａｓｅ発現レベルを、Ｓｉｍｐｌｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ（商標）（Ｊｅｓｓ）分析によって、１８３日目に収集したＮＨＰ（非ヒト霊長類）皮質、海馬及び中脳試料において決定した。賦形剤（各パネルにおいて左）、低用量のＰＲ００１Ａ（６．２×１０１０ｖｇ／ｇ脳重量、各パネルにおいて中央）、または高用量のＰＲ００１Ａ（２．３×１０１１ｖｇ／ｇ脳重量、各パネルにおいて右）で処置したＮＨＰ由来のＧＣａｓｅ発現レベルを示す。Ａは、個々の皮質、海馬、及び中脳領域由来のデータを示す。Ｂは、賦形剤処置群（左）、低用量（中央）、及び高用量（右）群からの変化パーセントを示す。このプロットについてのデータは、組織内で平均正規化され、皮質、海馬、及び中脳について組み合わされた。各バーは、平均正規化データの各用量についての賦形剤群の中央値のパーセントを表す。有意性を計算するために、一元配置ＡＮＯＶＡを行い、低用量及び高用量処置動物の両方を賦形剤群に含めた併用処置群の有意性を検討した。Ｐ値＝０．０１４（＊＜０．０５）。 試験ＰＲＶ－２０１９－００５におけるｑＰＣＲによって定量化されたＰＲ００１Ａ導入遺伝子の生体内分布の代表的なデータを示す一連のプロットである。この試験は、実施例１２に記載されている。導入遺伝子レベルは、賦形剤またはＰＲ００１Ａ（７．０×１０１１ｖｇ／ｇ脳）のいずれかの大槽内（ＩＣＭ）注射の３０日後及び９０日後のＮＨＰ（非ヒト霊長類）におけるｑＰＣＲ法を使用して分析した。各プロットは、平均±ＳＥＭで各個々の動物（ｎ＝３／群）を表す。 ＰＲ００１ＡでのＨＥＫ２９３Ｔ細胞のインビトロ形質導入後のＧＣａｓｅ活性についての代表的なデータを示す線グラフである。異なる感染の多重度（ＭＯＩ）にてＰＲ００１Ａで形質導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＧＣａｓｅ活性についてアッセイした。活性を、プロ蛍光基質レゾルフィンβ－Ｄ－グルコピラノシドの加水分解によって測定した。５７３ｎｍの励起及び６１０ｎｍの発光でプレートリーダーを使用して、切断基質の蛍光を決定した。値は平均±ＳＥＭ、ｎ＝２であり、単位は、組換え精製ＧＣａｓｅの１ｎｇ／ｍＬの活性に相当する。 ＰＲ００１ＡでのＨｅＬａ細胞のインビトロ形質導入後のＧＣａｓｅ活性（Ａ）及びα－シヌクレインレベル（Ｂ）についての代表的なデータを示す棒グラフである。賦形剤（左のバー）で処理したか、または２×１０５ｖｇ／細胞のＰＲ００１Ａ（中央のバー）または２×１０６ｖｇ／細胞のＰＲ００１Ａ（右のバー）で形質導入したＨｅＬａ細胞を、処理７２時間後に収集し、蛍光測定酵素アッセイによってＧＣａｓｅ活性レベル（Ａ）について分析し、またはＥＬＩＳＡによってα－シヌクレインレベル（Ｂ）について分析した。有効な酵素ＧＣａｓｅ活性は、組換え精製ＧＣａｓｅの１ｎｇ／ｍＬの活性として定義される１単位で総タンパク質のｍｇ当たりの単位として示される。α－シヌクレイン濃度は、総タンパク質のｍｇ当たりのｎｇ／ｍＬとして示される。試験は、生物学的三重で実施した。平均が示されている。エラーバーはＳＥＭである。一元配置ＡＮＯＶＡ、続いてＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定を使用した。 ＰＲ００１Ａでのマウス海馬ニューロンのインビトロ形質導入後のＧＣａｓｅ活性（Ａ）及びα－シヌクレインレベル（Ｂ）についての代表的なデータを示す棒グラフである。マウス海馬ニューロンの初代培養物を、インビトロ日数（ＤＩＶ）２日目に、賦形剤で処理したか（左のバー）、または１．３×１０５ｖｇ／細胞のＰＲ００１Ａ（中央のバー）もしくは１．３×１０６ｖｇ／細胞のＰＲ００１Ａ（右のバー）で形質導入した。ＤＩＶ９で、細胞を収集し、蛍光測定酵素アッセイによってＧＣａｓｅ活性レベル（Ａ）について分析し、またはＥＬＩＳＡによってα－シヌクレインレベル（Ｂ）について分析した。ＧＣａｓｅ活性は、総タンパク質のｍｇ当たりの時間当たりの相対蛍光単位（ＲＦＵ）として示される。α－シヌクレイン濃度は、総タンパク質のｍｇ当たりのｎｇ／ｍＬとして示される。試験は、生物学的二重で実施した。平均が示されている。エラーバーはＳＥＭである。一元配置ＡＮＯＶＡ、続いてＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定を使用した。 ＣＢＥマウスモデルにおけるＧＣａｓｅをコードするｒＡＡＶでの長期処置についての試験設計の一実施形態を示す概略図である。ＰＲ００１Ａは、Ｐ３でのＩＣＶ注射によって送達され、毎日のＣＢＥ処置は、Ｐ８で開始された。行動を、３週目、６週目、及び１５週目のロータロッドアッセイ、ならびに４週目、７週目、１３週目のテーパービームアッセイにおいて評価した。最終ＣＢＥ用量の１日後である２６週目頃に動物を屠殺した。ＧｌｕＳｐｈ及びＧｌｕＣｅｒ基質レベルならびにＧＣａｓｅ活性について大脳皮質を分析した。処置群当たり１０～１１頭の動物であり、それぞれ雄及び雌のマウスを含んだ。 ＣＢＥモデルにおける長期ＰＲ００１Ａ処置の評価についての代表的なデータを示す。すべての処置群（ＰＢＳ＋賦形剤：左のバー、ＣＢＥ＋賦形剤：中央のバー、ＣＢＥ＋２．０×１０１０ｖｇのＰＲ００１Ａ：右のバー）の皮質を使用して、ベクターゲノム（Ａ）、ＧＣａｓｅ活性（Ｂ）、ＧｌｕＳｐｈレベル（Ｃ）、及びＧｌｕＣｅｒレベル（Ｄ）を測定した。ベクターゲノムの存在を、各組織及びすべての処置群において評価し、１μｇのゲノムＤＮＡ当たりのベクターコピーの数として示した。ベクターゲノムの存在を、ベクター参照標準曲線を使用して、ｑＰＣＲによって定量化した。有効な酵素ＧＣａｓｅ活性は、組換え精製ＧＣａｓｅの１ｎｇ／ｍＬの活性として定義される１単位で総タンパク質のｍｇ当たりの単位として示される。ＧｌｕＳｐｈ及びＧｌｕＣｅｒレベルは、リン酸塩のｎｍｏｌ当たりのｐｍｏｌとして示される。平均が示されている。エラーバーはＳＥＭである。それぞれ、群当たりＮ＝１０、１１、１０。（＊）Ｐ＜０．１、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ＡＮＯＶＡ、続いてＴｕｋｅｙ ＨＳＤ多重検定補正による。 ＣＢＥモデルにおける追加の用量範囲ＰＲ００１Ａの生存中評価についての代表的なデータを示す。すべての処置群を毎日計量し（Ａ）、それらの体重をＰ４５で分析した（Ｂ）。３週目（Ｃ）及び５週目（Ｄ）でロータロッドでの落下までの潜時、及び４週目でテーパービームを横断するまでの潜時（Ｅ）によって、運動性能を評価した。群当たりｎ＝８～１１。平均が示されている。エラーバーはＳＥＭである。ＣＢＥ＋賦形剤群（左から２番目のバー）に対する比較について、統計結果を示す。＊＊＊Ｐ＜０．００１、ＡＮＯＶＡ、続いてＴｕｋｅｙ ＨＳＤ検定による。 追加の用量範囲ＣＢＥモデル試験における生体内分布についての代表的なデータを示す。ベクターゲノムの存在を、各組織及びすべての処置群において評価し、１μｇのｇＤＮＡ当たりのベクターコピーの数として示した。ベクターゲノムの存在を、ベクター参照標準曲線を使用して、ｑＰＣＲによって定量化した。群当たりｎ＝９～１１。黒い破線（１００ベクターゲノム／μｇ ｇＤＮＡで）は、ベクターの存在の陽性についての検出閾値を表す。平均が示されている。エラーバーはＳＥＭである。 追加の用量範囲ＣＢＥモデル試験におけるＧＣａｓｅ酵素活性についての代表的なデータを示す。有効な酵素ＧＣａｓｅ活性を測定し、すべての処置群の大脳皮質について示す。活性は、組換え精製ＧＣａｓｅの１ｎｇ／ｍＬの活性として定義される１単位で総タンパク質のｍｇ当たりの単位として示される。平均が示されている。エラーバーはＳＥＭである。ＣＢＥ＋賦形剤群（左から２番目のバー）に対する比較について、統計結果を示す。群当たりｎ＝９～１１。（＊）Ｐ＜０．１、ＡＮＯＶＡ、続いてＴｕｋｅｙ ＨＳＤ検定による。 追加の用量決定ＣＢＥモデル試験における糖脂質分析についての代表的なデータを示す。ＧｌｕＳｐｈ（Ａ）及びＧｌｕＣｅｒ（Ｂ）レベルが、リン酸塩のｎｍｏｌ当たりのｐｍｏｌとして示される。平均が示されている。エラーバーはＳＥＭである。ＣＢＥ＋賦形剤群（左から２番目のバー）に対する比較について、統計結果を示す。群当たりｎ＝９～１１。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ＡＮＯＶＡ、続いてＴｕｋｅｙ ＨＳＤ検定による。 ＣＢＥモデル試験におけるさらなる用量範囲ＰＲ００１Ａの生存中評価についての代表的なデータを示す。すべての処置群を毎日計量し（Ａ）、それらの体重をＰ３７で分析した（Ｂ）。３週目（Ｃ）でロータロッドでの落下までの潜時、及び４週目でテーパービームを横断するまでの潜時（Ｄ）によって、運動性能を評価した。群当たりｎ＝９～１０。平均が示されている。エラーバーはＳＥＭである。ＣＢＥ＋賦形剤群（左から２番目のバー）に対する比較について、統計結果を示す。＊＊＊Ｐ＜０．００１、ＡＮＯＶＡ、続いてＴｕｋｅｙ ＨＳＤ検定による。 ＣＢＥモデル試験におけるさらなる用量範囲ＰＲ００１Ａにおける生体内分布及びＧＣａｓｅ酵素活性についての代表的なデータを示す。ベクターゲノムを、すべての処置群の大脳皮質（Ａ）で測定し、１μｇのゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）当たりのベクターコピー数として示す。ベクターゲノムの存在を、ベクター参照標準曲線を使用して、ｑＰＣＲによって定量化した。黒い破線は、（１００ベクターゲノム／μｇ ｇＤＮＡでの）陽性ベクターの存在の検出閾値を表す。有効な酵素ＧＣａｓｅ活性は、大脳皮質において測定され（Ｂ）、組換え精製ＧＣａｓｅの１ｎｇ／ｍＬの活性として定義される１単位で総タンパク質のｍｇ当たりの単位として示される。平均が示されている。エラーバーはＳＥＭである。群当たりＮ＝９～１０。＊＊＊Ｐ＜０．００１、ＡＮＯＶＡ、続いてＴｕｋｅｙ ＨＳＤ検定による。 ＣＢＥモデル試験におけるさらなる用量範囲ＰＲ００１Ａにおける糖脂質分析についての代表的なデータを示す。ＧｌｕＳｐｈ（Ａ）及びＧｌｕＣｅｒ（Ｂ）レベルが、リン酸塩のｎｍｏｌ当たりのｐｍｏｌとして示される。平均が示されている。エラーバーはＳＥＭである。ＣＢＥ＋賦形剤群（左から２番目のバー）に対する比較について、統計結果を示す。群当たりｎ＝９～１０。＊＊＊Ｐ＜０．００１、ＡＮＯＶＡ、続いてＴｕｋｅｙ ＨＳＤ検定による。 ４Ｌ／ＰＳ－ＮＡ遺伝子マウスモデルにおけるＧＣａｓｅをコードするｒＡＡＶでの処置についての試験設計の一実施形態を示す概略図である。ＰＲ００１Ａを、３～４週齢の４Ｌ／ＰＳ－ＮＡマウスにＩＣＶ注射により送達した。ビームウォークを、生後８週目、１２週目及び１８週目（ＩＣＶ処置後５週目、９週目及び１５週目）で試験し、ロータロッドを、生後１２週目及び１８週目（ＩＣＶ処置後９週目及び１５週目）で試験した。１８週目にマウスを屠殺した。大脳皮質をＧＣａｓｅ酵素活性について分析し、小脳をＧｌｕＳｐｈ及びＧｌｕＣｅｒ基質レベルについて分析した。各処置群においては３頭の雄及び３頭の雌のマウスであった。 ４Ｌ／ＰＳ－ＮＡ遺伝子マウスモデルにおける最大用量ＰＲ００１Ａにおける生体内分布についての代表的なデータを示す。ベクターゲノムの存在を、各組織及びすべての処置群において評価し、１μｇのゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）当たりのベクターコピーの数として示した。ベクターゲノムの存在を、ベクター参照標準曲線を使用して、ｑＰＣＲによって定量化した。平均が示されている。エラーバーはＳＥＭである。群当たりｎ＝４～５。破線は、（１００ベクターゲノム／μｇ ｇＤＮＡでの）陽性ベクターの存在の検出閾値を表す。 ４Ｌ／ＰＳ－ＮＡ遺伝子マウスモデルにおける最大用量ＰＲ００１ＡにおけるＧＣａｓｅ酵素活性についての代表的なデータを示す。有効な酵素ＧＣａｓｅ活性を測定し、各組織及びすべての処置群について示す。活性は、組換え精製ＧＣａｓｅの１ｎｇ／ｍＬの活性として定義される１単位で総タンパク質のｍｇ当たりの単位として示される。平均が示されている。エラーバーはＳＥＭである。群当たりＮ＝４～５。＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１、ＡＮＯＶＡ、続いてＴｕｋｅｙ ＨＳＤ多重検定補正による。 ４Ｌ／ＰＳ－ＮＡ遺伝子マウスモデルにおけるＰＲ００１Ａの糖脂質分析についての代表的なデータを示す。４Ｌ／ＰＳ－ＮＡマウスは、賦形剤（中央のバー）または１．５×１０１０ｖｇのＰＲ００１Ａ（右のバー）を受け、対照マウスは、生後Ｐ２３日目でＩＣＶ送達によって賦形剤（左のバー）を受けた。小脳を使用して、ＧｌｕＳｐｈ（Ａ）及びＧｌｕＣｅｒ（Ｂ）レベルを測定した。レベルは、リン酸塩のｎｍｏｌ当たりのｐｍｏｌとして示される。平均が示されている。エラーバーはＳＥＭである。それぞれ、群当たりｎ＝４、５、５。＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１、ＡＮＯＶＡ、続いてＴｕｋｅｙ ＨＳＤ多重検定補正による。 ４Ｌ／ＰＳ－ＮＡ遺伝子マウスモデルにおける大脳皮質α－シヌクレイン蓄積の生化学的評価についての代表的なデータを示す。４Ｌ／ＰＳ－ＮＡマウスは、ＩＣＶ賦形剤（中央のバー）または１．５×１０１０ｖｇのＰＲ００１Ａ（右バー）を受け、対照マウスは、生後２３日目にＩＣＶ賦形剤（左のバー）を受けた。大脳皮質由来の脳溶解物のＴｒｉｔｏｎ Ｘ溶解性及びＴｒｉｔｏｎ Ｘ不溶性画分を、カスタマイズされた免疫吸着アッセイを使用して、α－シヌクレインタンパク質レベルについて分析した。不溶性α－シヌクレイン（Ａ）及び不溶性対可溶性α－シヌクレインの比率（Ｂ）を示す。平均が示されている。エラーバーはＳＥＭである。群当たりＮ＝３～５。（＊）： Ｐ＜０．２０、ＡＮＯＶＡ、続いてＴｕｋｅｙ ＨＳＤ多重検定補正。 ４Ｌ／ＰＳ－ＮＡ遺伝子マウスモデルにおける用量範囲ＰＲ００１Ａ ｒＡＡＶについての試験設計の一実施形態を示す概略図である。ＰＲ００１Ａを、３～４週間で４Ｌ／ＰＳ－ＮＡマウスにＩＣＶ注射により送達した。ビームウォークを、生後８週目、１２週目及び１８週目（ＩＣＶ処置後５週目、９週目及び１５週目）で評価し、ロータロッドを、生後１２週目及び１８週目（ＩＣＶ処置後９週目及び１５週目）で評価した。１８週目にマウスを屠殺した。大脳皮質をＧＣａｓｅ酵素活性について分析し、小脳をＧｌｕＳｐｈ及びＧｌｕＣｅｒ基質レベルについて分析した。処置群当たり１０～１１頭のマウスであった。 ４Ｌ／ＰＳ－ＮＡ遺伝子マウスモデルにおける用量血清ＰＲ００１Ａにおける１８週目の行動分析についての代表的なデータを示す。ビームウォークにおける運動性能を評価し、速度ごとの平均総スリップを異なるビームで２回の試験にわたって示した。それぞれ、群当たりＮ＝１０、６、５、７、４、８。平均が示されている。エラーバーはＳＥＭであり、＊：Ｐ＜０．０５、＊＊＊：Ｐ＜０．００１、ＡＮＯＶＡ、続いてＴｕｋｅｙ ＨＳＤ多重検定補正による。 ４Ｌ／ＰＳ－ＮＡ遺伝子マウスモデルにおける用量範囲ＰＲ００１Ａにおける生体内分布及びＧＣａｓｅ酵素活性についての代表的なデータを示す。ベクターゲノムを、すべての処置群の大脳皮質（Ａ）で測定し、１μｇのゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）当たりのベクターコピー数として示す。ベクターゲノムの存在を、ベクター参照標準曲線を使用して、ｑＰＣＲによって定量化した。破線は、（１００ベクターゲノム／μｇ ｇＤＮＡでの）陽性ベクターゲノムの存在の検出閾値を表す。有効な酵素ＧＣａｓｅ活性は、大脳皮質において測定され（Ｂ）、組換え精製ＧＣａｓｅの１ｎｇ／ｍＬの活性として定義される１単位で総タンパク質のｍｇ当たりの単位として示される。平均が示されている。エラーバーはＳＥＭである。それぞれ、群当たりｎ＝１０、１０、１０、１０、７、８。＊＊＊Ｐ＜０．００１、ＡＮＯＶＡ、続いてＴｕｋｅｙ ＨＳＤ多重検定補正による。 ４Ｌ／ＰＳ－ＮＡ遺伝子マウスモデルにおける用量範囲ＰＲ００１Ａにおける糖脂質分析についての代表的なデータを示す。小脳を使用して、ＧｌｕＳｐｈ（Ａ）及びＧｌｕＣｅｒ（Ｂ）レベルを測定した。レベルは、リン酸塩のｎｍｏｌ当たりのｐｍｏｌとして示される。平均が示されている。エラーバーはＳＥＭである。それぞれ、群当たりｎ＝１０、１０、１０、１０、７、８。＊＊＊： Ｐ＜０．００１、ＡＮＯＶＡ、続いてＴｕｋｅｙ ＨＳＤ多重検定補正による。（＃）： Ｐ＜０．１、＃：Ｐ＜０．０５、すべての動物にわたる遺伝子型及び用量についての多重線形回帰による。 ＣＢＥ処置α－シヌクレイントランスジェニックマウスにおけるα－シヌクレインタンパク質レベルの生化学的評価についての代表的なデータを示す。海馬脳溶解物を、Ｓｉｍｐｌｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ（商標）（Ｊｅｓｓ）自動キャピラリーウエスタンブロットシステム及びＭＪＦＲ－１４－６－４－２α－シヌクレイン抗体を使用して、α－シヌクレイン濃度について分析した。４８ｋＤａ～２３０ｋＤａで複数のバンドが観察され、「高分子量」（ＨＭＷ）としてグループ化された。単一のバンドが、α－シヌクレインモノマーの予測される分子量と一致して、１８ｋＤａで存在した。Ａ５３Ｔ＋賦形剤群の正規化平均に対する平均倍率変化を示す。エラーバーはＳＥＭである。群当たりＮ＝３～５。＊：Ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡ、続いてＴｕｋｅｙ ＨＳＤ多重検定補正による。 ヒトＧｃａｓｅをコードする発現構築物を含む組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ＰＲ００１Ａ）をコードするプラスミドの一実施形態を示す概略図である。「ｂｐ」は、「塩基対」を指す。「ｋａｎ」は、カナマイシンに対する耐性を付与する遺伝子を指す。「ＯＲＦ１」は、Ｇｃａｓｅについてのオープンリーディングフレームを指す。「ＩＴＲ」は、アデノ随伴ウイルス逆位末端反復配列を指す。「ＴＲＹ」は、３つの転写制御活性化部位、すなわちＴＡＴＡ、ＲＢＳ、及びＹＹ１を含む配列を指す。「ＣＢＡｐ」は、ニワトリβ－アクチンプロモーターを指す。「ＣＭＶｅ」は、サイトメガロウイルスエンハンサーを指す。「ＷＰＲＥ」は、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素を指す。「ｂＧＨ」は、ウシ成長ホルモンポリＡシグナル尾部を指す。「ｉｎｔ」は、イントロンを指す。ＰＲ００１Ａの２本鎖のヌクレオチド配列は、配列番号３９及び４０に提供される。 ヒトＧｃａｓｅ及びα－シヌクレインを標的とするｓｈＲＮＡをコードする発現構築物を含む組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ＰＲ００４Ｘ）をコードするプラスミドの一実施形態を示す概略図である。「ｂｐ」は、「塩基対」を指す。「ｋａｎ」は、カナマイシンに対する耐性を付与する遺伝子を指す。「ａＳｙｎ＿ＭｓｈＲＮＡ」は、α－シヌクレインを阻害するｓｈＲＮＡをコードする領域を指す。「ＧＢＡ＿ＣＤＳｏｐｔ」は、Ｇｃａｓｅについてのオープンリーディングフレームを指す。「ＩＴＲ」は、アデノ随伴ウイルス逆位末端反復配列を指す。「ＴＲＹ」は、３つの転写制御活性化部位、すなわちＴＡＴＡ、ＲＢＳ、及びＹＹ１を含む配列を指す。「ＣＢＡｐ」は、ニワトリβ－アクチンプロモーターを指す。「ＣＭＶｅ」は、サイトメガロウイルスエンハンサーを指す。「ＷＰＲＥ」は、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素を指す。「ｂＧＨ」は、ウシ成長ホルモンポリＡシグナル尾部を指す。「ｉｎｔ」は、イントロンを指す。ＰＲ００４Ｘの２本鎖のヌクレオチド配列（配列検証済み）は、配列番号４１及び４２に提供される。 ヒトＧｃａｓｅ及びα－シヌクレインを標的とするｓｈＲＮＡをコードする発現構築物を含む組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ＰＲ００４Ｙ）をコードするプラスミドの一実施形態を示す概略図である。「ｂｐ」は、「塩基対」を指す。「ｋａｎ」は、カナマイシンに対する耐性を付与する遺伝子を指す。「ｓｈＳＮＣＡ」は、α－シヌクレインを阻害するｓｈＲＮＡをコードする領域を指す。「ＧＢＡ＿ＣＤＳｏｐｔ」は、Ｇｃａｓｅについてのオープンリーディングフレームを指す。「ＩＴＲ」は、アデノ随伴ウイルス逆位末端反復配列を指す。「ＴＲＹ」は、３つの転写制御活性化部位、すなわちＴＡＴＡ、ＲＢＳ、及びＹＹ１を含む配列を指す。「ＣＢＡｐ」は、ニワトリβ－アクチンプロモーターを指す。「ＣＭＶｅ」は、サイトメガロウイルスエンハンサーを指す。「ＷＰＲＥ」は、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素を指す。「ｂＧＨ」は、ウシ成長ホルモンポリＡシグナル尾部を指す。「ｉｎｔ」は、イントロンを指す。ＰＲ００４Ｙの２本鎖のヌクレオチド配列（理論上）は、配列番号４３及び４４に提供される。 α－シヌクレインを標的とするｓｈＲＮＡをコードする発現構築物を含む組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ＰＲ０１４Ｘ）をコードするプラスミドの一実施形態を示す概略図である。「ｂｐ」は、「塩基対」を指す。「ｋａｎ」は、カナマイシンに対する耐性を付与する遺伝子を指す。「ａＳｙｎ＿ＭｓｈＲＮＡ」は、α－シヌクレインを阻害するｓｈＲＮＡをコードする領域を指す。「ＩＴＲ」は、アデノ随伴ウイルス逆位末端反復配列を指す。「ＴＲＹ」は、３つの転写制御活性化部位、すなわちＴＡＴＡ、ＲＢＳ、及びＹＹ１を含む配列を指す。「ＣＢＡｐ」は、ニワトリβ－アクチンプロモーターを指す。「ＣＭＶｅ」は、サイトメガロウイルスエンハンサーを指す。「ＷＰＲＥ」は、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素を指す。「ｂＧＨ」は、ウシ成長ホルモンポリＡシグナル尾部を指す。「ｉｎｔ」は、イントロンを指す。ＰＲ０１４Ｘの２本鎖のヌクレオチド配列（理論上）は、配列番号４５及び４６に提供される。ｓｈＲＮＡをコードする領域の２本鎖のヌクレオチド配列（理論上）は、配列番号４７及び４８に提供される。 Ｄ４０９Ｖ Ｈｏｍ遺伝子マウスモデルにおける用量範囲ＰＲ００１ ｒＡＡＶについての試験設計の一実施形態を示す概略図である。ＰＲ００１を、Ｄ４０９Ｖ Ｈｏｍマウスに静脈内（ＩＶ）注射によって送達した。図に記載のパラメータを５週間後に評価した。 Ｄ４０９Ｖ Ｈｏｍ遺伝子マウスモデルにおけるＰＲ００１静脈内（ＩＶ）投与の肝臓生化学についての代表的なデータを示す。ＩＶ注射の５週間後に、マウスを屠殺した。サイトカインレベル（Ａ）及び糖脂質レベル（Ｂ、Ｃ）を定量化した。Ｄ４０９Ｖ ＡＮＯＶＡ、続いてＨｏｍ＋賦形剤群と比較したＤｕｎｎｅｔｔ検定を使用して、統計を決定した。平均が、±ＳＥＭ（ｎ＝８～１０／群）として示されている。＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１、＊＊＊：ｐ＜０．００１、＊＊：ｐ＜０．０１、＊：ｐ＜０．０５、（＊）：ｐ＝０．１０。ＧｌｕＣｅｒ＝グルコシルセラミド。ＧｌｕＳｐｈ＝グルコシルスフィンゴシン。ＷＴ＝野生型。 Ｄ４０９Ｖ Ｈｏｍ遺伝子マウスモデルにおけるＰＲ００１静脈内（ＩＶ）投与の脳生化学についての代表的なデータを示す。ＩＶ注射の５週間後に、マウスを屠殺した。糖脂質レベルを定量化した。ＡＮＯＶＡ、続いてＤ４０９Ｖ Ｈｏｍ＋賦形剤群と比較したＤｕｎｎｅｔｔ検定を使用して、統計を決定した。平均が、±ＳＥＭ（ｎ＝８～１０／群）として示されている。＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１、＊：ｐ＜０．０５。ＧｌｕＣｅｒ＝グルコシルセラミド。ＧｌｕＳｐｈ＝グルコシルスフィンゴシン。ＷＴ＝野生型。 Ｄ４０９Ｖ Ｈｏｍ遺伝子マウスモデルにおけるＰＲ００１静脈内（ＩＶ）投与の肺生化学についての代表的なデータを示す。ＩＶ注射の５週間後に、マウスを屠殺した。サイトカインレベルを定量化した。ＡＮＯＶＡ、続いてＤ４０９Ｖ Ｈｏｍ＋賦形剤群と比較したＤｕｎｎｅｔｔ検定を使用して、統計を決定した。平均が、±ＳＥＭ（ｎ＝８～１０／群）として示されている。＊：Ｐ＜０．０５。ＷＴ＝野生型。 ４Ｌ／ＰＳ－ＮＡ遺伝子マウスモデルにおける用量範囲ＰＲ００１ ｒＡＡＶについての試験設計の一実施形態を示す概略図である。ＰＲ００１を、４Ｌ／ＰＳ－ＮＡマウスに静脈内（ＩＶ）注射によって送達した。図に記載のパラメータを、示された時点で評価した。 ４Ｌ／ＰＳ－ＮＡ遺伝子マウスモデルにおけるＰＲ００１静脈内（ＩＶ）投与の肝臓生化学についての代表的なデータを示す。ＩＶ注射の１５週間後に、マウスを屠殺した。糖脂質レベルを定量化した。ＡＮＯＶＡ、続いて４Ｌ／ＰＳ－ＮＡ＋賦形剤群と比較したＤｕｎｎｅｔｔ検定を使用して、統計を決定した。平均が、±ＳＥＭ（ｎ＝１０／群）として示されている。＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１、＊＊＊：ｐ＜０．００１、＊：ｐ＜０．０５。ＧｌｕＣｅｒ＝グルコシルセラミド。ＧｌｕＳｐｈ＝グルコシルスフィンゴシン。 ４Ｌ／ＰＳ－ＮＡ遺伝子マウスモデルにおけるＰＲ００１静脈内（ＩＶ）投与の脳生化学についての代表的なデータを示す。ＩＶ注射の１５週間後に、マウスを屠殺した。糖脂質レベルを定量化した。ＡＮＯＶＡ、続いて４Ｌ／ＰＳ－ＮＡ＋賦形剤群と比較したＤｕｎｎｅｔｔ検定を使用して、統計を決定した。平均が、±ＳＥＭ（ｎ＝１０／群）として示されている。＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１、＊＊：ｐ＜０．０１、＊：ｐ＜０．０５。ＧｌｕＣｅｒ＝グルコシルセラミド。ＧｌｕＳｐｈ＝グルコシルスフィンゴシン。 ＰＲ００４またはＰＲ０１４による形質導入後のＨｅＬａ細胞におけるα－シヌクレインタンパク質レベル及びＧｃａｓｅ活性についての代表的なデータを示す。ＨｅＬａ細胞をＰＲ００４、ＰＲ０１４または賦形剤で処理し、細胞溶解物におけるα－シヌクレインレベル（Ａ）及びＧＣａｓｅ活性（Ｂ）を７２時間後に測定した。データを、平均±ＳＥＭ（ｎ＝３／条件）として示す。 パーキンソン病患者由来の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来のニューロン培養におけるＰＲ００４有効性についての代表的なデータを示す。ＳＮＣＡ三重を有するパーキンソン病患者に由来する人工多能性幹細胞をニューロンに分化させた（Ａ）。ｉＰＳＣ由来ニューロンをＰＲ００４または賦形剤で処理し、２週間後に細胞溶解物におけるＧＣａｓｅ活性（Ｂ）及びα－シヌクレインレベル（Ｃ）を測定した。統計を、対応のないｔ検定、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１を使用して決定した。データを、平均±ＳＥＭ（ｎ＝２～３／群）として示す。 ｑＲＴ－ＰＣＲによりＨＥＫ２９３細胞におけるＰＲ００４ベクター由来のＳＮＣＡを標的とするｓｈＲＮＡを評価する試験についての代表的なデータを示す。ＨＥＫ２９３細胞をＰＲ００４または対照でトランスフェクションし、７２時間後にＲＮＡを抽出した。様々な遺伝子についてｑＲＴ－ＰＣＲを実施し、ＧＡＰＤＨ発現に対して正規化した。データを、対照条件に対して正規化し、平均±ＳＥＭ（ｎ＝３／群）として示す。 ｑＲＴ－ＰＣＲによりＨＥＫ２９３細胞におけるＰＲ００４ベクター由来のＳＮＣＡを標的とするｓｈＲＮＡを評価する試験についての代表的なデータを示す。ＨＥＫ２９３細胞をＰＲ００４または対照でトランスフェクションし、７２時間後にＲＮＡを抽出した。様々な遺伝子についてｑＲＴ－ＰＣＲを実施し、ＧＡＰＤＨ発現に対して正規化した。データを、対照条件に対して正規化し、平均±ＳＥＭ（ｎ＝３／群）として示す。 ＰＲ００４の投与後のＳＮＣＡ－Ａ５３Ｔ ＰＡＣマウスモデルにおける胃腸の、運動挙動、及び生化学的エンドポイントを調査する試験設計の一実施形態を示す概略図である。ＩＣＶ＝脳室内。 ＰＲ００４の投与後のＡＡＶ２－ＳＮＣＡ－Ａ５３Ｔ ＩＰａ注射マウスモデルにおける運動挙動及び生化学分析を調査する試験設計の一実施形態を示す概略図である。ＩＰａ＝実質内。ＳＮ＝黒質。ＩＣＶ＝脳室内。 ＡＡＶ２－ＳＮＣＡ－Ａ５３ＴマウスモデルにおけるＰＲ００４投与後の運動表現型を評価する試験についての代表的なデータを示す。１０週齢のマウスに、（１）ＳＮへのＩＰａ注射によるＡＡＶ－ヌルまたはＡＡＶ－ＳＮＣＡ－Ａ５３Ｔ、及び（２）ＩＣＶ注射による賦形剤またはＰＲ００４を投薬した。処置の４週間後（Ａ）及び９週間後（Ｂ）に微細運動学的歩行分析（ＭｏｔｏＲａｔｅｒ）を実施した。統計は、ＡＮＯＶＡ、続いてＤｕｎｎｅｔｔの複数の試験補正、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１によって決定された。データを、平均±ＳＥＭ（ｎ＝１０／群）として示す。ＩＰａ＝実質内。ＳＮ＝黒質。ＩＣＶ＝脳室内。
本開示は、部分的に、対象におけるある特定の遺伝子産物（例えば、ＣＮＳ疾患に関連する遺伝子産物）の組み合わせの発現のための組成物及び方法に基づく。遺伝子産物は、タンパク質、タンパク質の断片（例えば、部分）、ＣＮＳ疾患関連遺伝子を阻害する干渉核酸などであり得る。いくつかの実施形態において、遺伝子産物は、ＣＮＳ疾患関連遺伝子によってコードされるタンパク質またはタンパク質断片である。いくつかの実施形態において、遺伝子産物は、ＣＮＳ疾患関連遺伝子を阻害する干渉核酸（例えば、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ａｍｉＲＮＡなど）である。
ＣＮＳ疾患関連遺伝子は、パーキンソン病（ＰＤ）、ゴーシェ病（ＧＤ）、またはシヌクレイン病などの中枢神経系（ＣＮＳ）疾患に遺伝的、生化学的、または機能的に関連する遺伝子産物をコードする遺伝子を指す。例えば、ＧＢＡ１遺伝子（タンパク質Ｇｃａｓｅをコードする）において変異を有する個体は、ＧＢＡ１において変異を有さない個体と比較して、ＰＤを発症するリスクが増加することが観察されている。別の例では、ＰＤは、α－シヌクレイン（α－Ｓｙｎ）タンパク質を含むタンパク質凝集体の蓄積に関連しており、したがって、ＳＮＣＡ（α－Ｓｙｎをコードする）は、ＣＮＳ疾患関連遺伝子である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の発現カセットは、野生型または非変異体形態のＣＮＳ疾患関連遺伝子（またはそのコード配列）をコードする。ＣＮＳ疾患関連遺伝子の例を表１に記載する。
リソソーム酸性β－グルコセレブロシダーゼ（例えば、ＧＢＡ１遺伝子の遺伝子産物、ＧＣａｓｅとも称される）などの酵素の欠損だけでなく、リソソーム機能またはリソソームへの巨大分子の輸送に関与する多くの遺伝子における一般的なバリアント（例えば、リソソーム膜タンパク質１（ＬＩＭＰ）、ＳＣＡＲＢ２とも称される）は、ＰＤリスクの増加及び／またはゴーシェ病（例えば、２型ゴーシェ病または３型ゴーシェ病などの神経障害性ゴーシェ病）のリスクの増加と関連している。本開示は、部分的に、Ｇｃａｓｅ（またはその一部分）、プロサポシン（またはその一部分）、ＬＩＭＰ２（またはその一部分）、またはＧｃａｓｅ（またはその一部分）と、例えば、ＰＤ、ゴーシェ病など中枢神経系（ＣＮＳ）疾患に関連する遺伝子（例えば、ＬＩＭＰ２、プロサポシン、及び／またはα－シヌクレイン（α－Ｓｙｎ））からの１つ以上の追加の遺伝子産物との組み合わせをコードする発現構築物（例えば、ベクター）に基づく。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の遺伝子産物の組み合わせは、対象において発現される場合、一緒に作用して（例えば、相乗的に）、ＣＮＳ疾患の１つ以上の徴候及び症状を減少させる。
したがって、いくつかの態様において、本開示は、Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む単離核酸を提供する。いくつかの実施形態において、単離核酸は、コドン最適化された（例えば、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞における発現のためにコドン最適化された）Ｇｃａｓｅコード配列を含む。いくつかの実施形態において、Ｇｃａｓｅをコードする核酸配列は、配列番号１４に記載（例えば、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０００１４８．２に記載）のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、単離核酸は、配列番号１５に記載の配列を含む。いくつかの実施形態において、発現構築物は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）、例えば、Ｇｃａｓｅをコードする核酸配列に隣接するＡＡＶ ＩＴＲを含む。
いくつかの態様において、本開示は、プロサポシン（例えば、ＰＳＡＰ遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む単離核酸を提供する。いくつかの実施形態において、単離核酸は、コドン最適化された（例えば、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞における発現のためにコドン最適化された）プロサポシンコード配列を含む。いくつかの実施形態において、プロサポシンをコードする核酸配列は、配列番号１６に記載（例えば、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００２７６９．１に記載）のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、単離核酸は、配列番号１７に記載の配列を含む。いくつかの実施形態において、発現構築物は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）、例えば、プロサポシンをコードする核酸配列に隣接するＡＡＶ ＩＴＲを含む。
いくつかの態様において、本開示は、ＬＩＭＰ２／ＳＣＡＲＢ２（例えば、ＳＣＡＲＢ２遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む単離核酸を提供する。いくつかの実施形態において、単離核酸は、コドン最適化された（例えば、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞における発現のためにコドン最適化された）ＳＣＡＲＢ２コード配列を含む。いくつかの実施形態において、ＬＩＭＰ２／ＳＣＡＲＢ２をコードする核酸配列は、配列番号１８に記載（例えば、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００５４９７．１に記載）のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、単離核酸は、配列番号２９に記載の配列を含む。いくつかの実施形態において、発現構築物は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）、例えば、ＳＣＡＲＢ２をコードする核酸配列に隣接するＡＡＶ ＩＴＲを含む。
いくつかの態様において、本開示は、第１の遺伝子産物及び第２の遺伝子産物をコードする発現構築物を含む単離核酸を提供し、各遺伝子産物は、独立して、表１に記載の遺伝子産物またはその一部から選択される。
いくつかの実施形態において、第１の遺伝子産物または第２の遺伝子産物は、Ｇｃａｓｅタンパク質、またはその一部分である。いくつかの実施形態において、第１の遺伝子産物または第２の遺伝子産物は、ＬＩＭＰ２もしくはその一部分、またはプロサポシンもしくはその一部分である。いくつかの実施形態において、第１の遺伝子産物は、Ｇｃａｓｅタンパク質であり、第２の遺伝子産物は、ＬＩＭＰ２もしくはその一部分、またはプロサポシンもしくはその一部分である。
いくつかの実施形態において、発現構築物は、（例えば、単独でまたは別の遺伝子産物に加えて）干渉核酸（例えば、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡなど）をコードする。いくつかの実施形態において、干渉核酸は、α－シヌクレイン（α－シヌクレイン）の発現を阻害する。いくつかの実施形態において、α－シヌクレインを標的とする干渉核酸は、配列番号２０～２５のうちのいずれか１つに記載の配列を含む。いくつかの実施形態において、α－シヌクレインを標的とする干渉核酸は、配列番号２０に記載の配列を含む。いくつかの実施形態において、α－シヌクレインを標的とする干渉核酸は、配列番号２０～２５のうちのいずれか１つに記載の配列に結合する（例えば、ハイブリダイゼーションする）。いくつかの実施形態において、α－シヌクレインを標的とする干渉核酸は、配列番号２０に記載の配列に結合する（例えば、ハイブリダイゼーションする）。
いくつかの実施形態において、発現構築物は１つ以上のプロモーターをさらに含む。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ニワトリベータアクチン（ＣＢＡ）プロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＣＤ６８プロモーター、またはＪｅＴプロモーターである。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩプロモーター、またはＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター（例えば、Ｕ６など）である。
いくつかの実施形態において、発現構築物は、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）をさらに含む。いくつかの実施形態において、ＩＲＥＳは、第１の遺伝子産物及び第２の遺伝子産物の間に位置する。
いくつかの実施形態において、発現構築物は、自己切断ペプチドコード配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、自己切断ペプチドは、Ｔ２Ａペプチドである。
いくつかの実施形態において、発現構築物は、２つのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を含む。いくつかの実施形態において、ＩＴＲ配列は、第１の遺伝子産物及び第２の遺伝子産物に隣接する（例えば、５’末端から３’末端までに以下のように配置される：ＩＴＲ－第１遺伝子産物－第２遺伝子産物－ＩＴＲ）。いくつかの実施形態において、単離核酸のＩＴＲ配列のうちの１つは、機能的な末端解離部位（ｔｒｓ）を欠く。例えば、いくつかの実施形態において、ＩＴＲのうちの１つは、ΔＩＴＲである。
本開示は、いくつかの態様において、修飾「Ｄ」領域（例えば、野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲに対して修飾されたＤ配列、配列番号２９）を有するＩＴＲを含むｒＡＡＶベクターに関する。いくつかの実施形態において、修飾Ｄ領域を有するＩＴＲは、ｒＡＡＶベクターの５’ＩＴＲである。いくつかの実施形態において、修飾「Ｄ」領域は、例えば、配列番号２６に記載の「Ｓ」配列を含む。いくつかの実施形態において、修飾「Ｄ」領域を有するＩＴＲは、ｒＡＡＶベクターの３’ＩＴＲである。いくつかの実施形態において、修飾「Ｄ」領域は、「Ｄ」領域がＩＴＲの３’末端（例えば、ベクターの導入遺伝子挿入物に対してＩＴＲの外側または末端）に配置される３’ＩＴＲを含む。いくつかの実施形態において、修飾「Ｄ」領域は、配列番号２６または２７に記載の配列を含む。
いくつかの実施形態において、単離核酸（例えば、ｒＡＡＶベクター）は、ＴＲＹ領域を含む。いくつかの実施形態において、ＴＲＹ領域は、配列番号２８に記載の配列を含む。
いくつかの実施形態において、本開示による記載の単離核酸は、配列番号１～１３、１５、１７、１９及び３２～４８のうちのいずれか１つに記載の配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態において、本開示による記載の単離核酸は、配列番号１４、１６及び１８のうちのいずれか１つに記載の配列を含むか、またはそれからなるペプチドをコードする。
いくつかの態様において、本開示は、本開示による記載の単離核酸を含むベクターを提供する。いくつかの実施形態において、ベクターは、プラスミド、またはウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターである。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、一本鎖（例えば、一本鎖ＤＮＡ）である。
いくつかの態様において、本開示は、本開示による記載の単離核酸または本開示による記載のベクターを含む宿主細胞を提供する。
いくつかの態様において、本開示は、キャプシドタンパク質及び本開示による記載の単離核酸またはベクターを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を提供する。
いくつかの実施形態において、キャプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質またはＡＡＶｒｈ．１０キャプシドタンパク質は、血液脳関門を通過することができる。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、中枢神経系（ＣＮＳ）の神経細胞及び非神経細胞を形質導入する。
いくつかの態様において、本開示は、中枢神経系（ＣＮＳ）疾患を有するか、または有する疑いのある対象を治療するための方法を提供し、方法は、本開示による記載の組成物（例えば、単離核酸またはベクターまたはｒＡＡＶを含む組成物）を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、ＣＮＳ疾患は、表４に記載の神経変性疾患などの神経変性疾患である。いくつかの実施形態において、ＣＮＳ疾患は、表５に記載のシヌクレイン病などのシヌクレイン病である。いくつかの実施形態において、ＣＮＳ疾患は、表６に記載のタウオパチーなどのタウオパチーである。いくつかの実施形態において、ＣＮＳ疾患は、表７に記載のリソソーム蓄積症などのリソソーム蓄積症である。いくつかの実施形態において、リソソーム蓄積症は、１型ゴーシェ病、２型ゴーシェ病または３型ゴーシェ病などの神経障害性ゴーシェ病である。
いくつかの態様において、本開示は、パーキンソン病を有するか、または有する疑いのある対象を治療するための方法を提供し、方法は、本開示による記載の組成物（例えば、単離核酸またはベクターまたはｒＡＡＶを含む組成物）を対象に投与することを含む。
いくつかの実施形態において、本開示は、２型ゴーシェ病または３型ゴーシェ病を有する対象を治療するための方法を提供し、方法は、Ｇｃａｓｅタンパク質をコードする配列に作動可能に連結したプロモーターを含む発現構築物を含む核酸を含むｒＡＡＶを対象に投与することを含み、Ｇｃａｓｅタンパク質をコードする配列は、配列番号１５を含み、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ９血清型を有するキャプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、２型ゴーシェ病または３型ゴーシェ病を有する対象に、約１．３×１０１１ベクターゲノム（ｖｇ）／ｇ脳の用量で投与される。
いくつかの実施形態において、本開示は、グルコセレブロシダーゼ－１（ＧＢＡ１）変異を有する、パーキンソン病を有する対象を治療するための方法を提供し、方法は、Ｇｃａｓｅタンパク質をコードする配列に作動可能に連結したプロモーターを含む発現構築物を含む核酸を含むｒＡＡＶを対象に投与することを含み、Ｇｃａｓｅタンパク質をコードする配列は、配列番号１５を含み、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ９血清型を有するキャプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、約１×１０１４ベクターゲノム（ｖｇ）または約２×１０１４ｖｇの用量でパーキンソン病を有する対象に投与される。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、大槽への後頭下注射を介して投与される。
いくつかの実施形態において、組成物は、２つ以上の遺伝子産物（例えば、ＣＮＳ疾患関連遺伝子産物）、例えば、本出願に記載の２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上の遺伝子産物をコードする核酸（例えば、ＡＡＶキャプシドタンパク質によって封入される、ｒＡＡＶゲノム）を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、２つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上）の異なる核酸（例えば、ＡＡＶキャプシドタンパク質によって別々に封入される２つ以上のｒＡＡＶゲノム）を含み、それぞれが１つ以上の異なる遺伝子産物をコードする。いくつかの実施形態において、２つ以上の異なる組成物が対象に投与され、それぞれの組成物は、異なる遺伝子産物をコードする１つ以上の核酸を含む。いくつかの実施形態において、異なる遺伝子産物が、同じプロモーター型（例えば、同じプロモーター）に作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、異なる遺伝子産物が、異なるプロモーターに作動可能に連結されている。
単離核酸及びベクター
単離核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。いくつかの態様において、本開示は、Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１遺伝子の遺伝子産物）またはその一部をコードする発現構築物を含む単離核酸を提供する。Ｇｃａｓｅは、ベータ－グルコセレブロシダーゼまたはＧＢＡとも称され、化学的グルコセレブロシド、糖脂質代謝における中間体のβ－グルコシド結合を切断するリソソームタンパク質を指す。糖脂質の正常な代謝に必要な主要なリソソーム酵素であるＧｃａｓｅの欠乏は、Ｇｃａｓｅ糖脂質基質グルコシルセラミド（ＧｌｕＣｅｒ）及びグルコシルスフィンゴシン（ＧｌｕＳｐｈ）の蓄積をもたらす。ヒトにおいて、Ｇｃａｓｅは、１番染色体上に位置するＧＢＡ１遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態において、ＧＢＡ１は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０００１４８．２（配列番号１４）によって表されるペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、単離核酸は、配列番号１５に記載の配列などの、コドン最適化された（例えば、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化された）Ｇｃａｓｅコード配列を含む。
いくつかの態様において、本開示は、プロサポシン（例えば、ＰＳＡＰ遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む単離核酸を提供する。プロサポシンは、スフィンゴ脂質活性化タンパク質（サポシン）Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤの前駆体糖タンパク質であり、短いオリゴ糖基を有するスフィンゴ糖脂質の異化を促進する。ヒトにおいて、ＰＳＡＰ遺伝子は、１０番染色体上に位置する。いくつかの実施形態において、ＰＳＡＰは、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００２７６９．１（例えば、配列番号１６）によって表されるペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、単離核酸は、配列番号１７に記載の配列などの、コドン最適化された（例えば、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化された）プロサポシンをコードする配列を含む。
本開示の態様は、ＬＩＭＰ２／ＳＣＡＲＢ２（例えば、ＳＣＡＲＢ２遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む単離核酸に関する。ＳＣＡＲＢ２は、細胞内のリソソーム及びエンドソーム輸送を調節する膜タンパク質を指す。ヒトにおいて、ＳＣＡＲＢ２遺伝子は、４番染色体上に位置する。いくつかの実施形態において、ＳＣＡＲＢ２遺伝子は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００５４９７．１（配列番号１８）によって表されるペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、単離核酸は、配列番号１９に記載の配列を含む。いくつかの実施形態において、単離核酸は、コドン最適化されたＳＣＡＲＢ２コード配列を含む。
いくつかの態様において、本開示は、第１の遺伝子産物及び第２の遺伝子産物をコードする発現構築物を含む単離核酸を提供し、各遺伝子産物は、独立して、表１に記載の遺伝子産物またはその一部から選択される。
いくつかの実施形態において、本開示による記載の単離核酸またはベクター（例えば、ｒＡＡＶベクター）は、配列番号１～４８のうちのいずれか１つに記載の配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態において、本開示による記載の単離核酸またはベクター（例えば、ｒＡＡＶベクター）は、配列番号１～４８のうちのいずれか１つに記載の配列と相補的である（例えば、その相補鎖である）配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態において、本開示による記載の単離核酸またはベクター（例えば、ｒＡＡＶベクター）は、配列番号１～４８のうちのいずれか１つに記載の配列の逆相補鎖である配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態において、本開示による記載の単離核酸またはベクター（例えば、ｒＡＡＶベクター）は、配列番号１～４８のうちのいずれか１つに記載の配列の一部分を含むか、またはそれからなる。一部分は、配列番号１～４８のうちのいずれか１つに記載の配列の少なくとも２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％を含み得る。いくつかの実施形態において、本開示による記載の核酸配列は、核酸センス鎖（例えば、５’から３’鎖）であるか、またはウイルス配列の文脈において、プラス（＋）鎖である。いくつかの実施形態において、本開示による記載の核酸配列は、核酸アンチセンス鎖（例えば、３’から５’鎖）であるか、またはウイルス配列の文脈において、マイナス（－）鎖である。
いくつかの実施形態において、遺伝子産物は、天然に存在する遺伝子のコード部分（例えば、ｃＤＮＡ）によってコードされる。いくつかの実施形態において、第１の遺伝子産物は、ＧＢＡ１遺伝子によってコードされるタンパク質（またはその断片）である。いくつかの実施形態において、遺伝子産物は、ＳＣＡＲＢ２／ＬＩＭＰ２遺伝子及び／またはＰＳＡＰ遺伝子によってコードされるタンパク質（またはその断片）である。しかしながら、当業者は、第１の遺伝子産物（例えば、Ｇｃａｓｅ）及び第２の遺伝子産物（例えば、ＬＩＭＰ２）の発現順序が概して逆転し得ること（例えば、ＬＩＭＰ２は第１の遺伝子産物であり、Ｇｃａｓｅは第２の遺伝子産物である）を認識する。いくつかの実施形態において、遺伝子産物は、表１に記載の遺伝子の断片（例えば、部分）である。タンパク質断片は、表１に記載の遺伝子によってコードされるタンパク質の約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％または約９９％を含み得る。いくつかの実施形態において、タンパク質断片は、表１に記載の遺伝子によってコードされるタンパク質の５０％～９９．９％（例えば、５０％～９９．９％の任意の値）を含む。
いくつかの実施形態において、発現構築物は、モノシストロン性である（例えば、発現構築物は、第１の遺伝子産物及び第２の遺伝子産物を含む単一の融合タンパク質をコードする）。いくつかの実施形態において、発現構築物は、ポリシストロン性である（例えば、発現構築物は、２つの異なる遺伝子産物、例えば、２つの異なるタンパク質またはタンパク質断片をコードする）。
ポリシストロン発現ベクターは、１つ以上（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上）のプロモーターを含み得る。任意の好適なプロモーター、例えば、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、内因性プロモーター、組織特異的プロモーター（例えば、ＣＮＳ特異的プロモーター）などを使用し得る。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ニワトリベータアクチンプロモーター（ＣＢＡプロモーター）、ＣＡＧプロモーター（例えば、Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｕ ｅｔ ａｌ．（２００８）ＢＭＣ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．９：２；ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７１－２１２１－９－２によって記載される）、ＣＤ６８プロモーター、またはＪｅＴプロモーター（例えば、Ｔｏｒｎｏｅ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｇｅｎｅ ２９７（１－２）：２１－３２によって記載される）である。いくつかの実施形態において、プロモーターは、第１の遺伝子産物、第２の遺伝子産物、または第１の遺伝子産物及び第２の遺伝子産物をコードする核酸配列に作動可能に連結される。いくつかの実施形態において、発現カセットは、転写因子結合配列、イントロンスプライス部位、ポリ（Ａ）付加部位、エンハンサー配列、リプレッサー結合部位、または前述の任意の組み合わせを含むがこれらに限定されない１つ以上の追加の調節配列を含む。
いくつかの実施形態において、第１の遺伝子産物をコードする核酸配列及び第２の遺伝子産物をコードする核酸配列は、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）をコードする核酸配列によって分離される。ＩＲＥＳ部位の例は、例えば、Ｍｏｋｒｅｊｓ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３４（Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ）：Ｄ１２５－３０によって記載されている。いくつかの実施形態において、第１の遺伝子産物をコードする核酸配列及び第２の遺伝子産物をコードする核酸配列は、自己切断ペプチドをコードする核酸配列によって分離される。自己切断ペプチドの例として、限定されないが、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、Ｆ２Ａ、ＢｍＣＰＶ ２Ａ、及びＢｍＩＦＶ ２Ａが挙げられ、それらはＬｉｕ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｓｃｉ Ｒｅｐ．７：２１９３に記載される。いくつかの実施形態において、自己切断ペプチドは、Ｔ２Ａペプチドである。
病理学的には、ＰＤ及びゴーシェ病などの障害は、α－シヌクレイン（α－Ｓｙｎ）タンパク質を主に含むタンパク質凝集体の蓄積と関連している。したがって、いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離核酸は、α－Ｓｙｎタンパク質の発現を減少または防止する阻害性核酸を含む。阻害性核酸をコードする配列は、発現ベクターの非翻訳領域（例えば、イントロン、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲなど）に配置され得る。
いくつかの実施形態において、阻害性核酸は、発現構築物のイントロンにおいて、例えば、第１の遺伝子産物をコードする配列の上流のイントロンにおいて配置される。阻害性核酸は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、人工ｍｉＲＮＡ（ａｍｉＲＮＡ）、またはＲＮＡアプタマーであり得る。一般に、阻害性核酸は、標的ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の約６個～約３０個（例えば、６個及び３０個を含めたその間の任意の整数）の連続したヌクレオチドに結合する（例えば、ハイブリダイゼーションする）。いくつかの実施形態において、阻害性核酸分子は、ｍｉＲＮＡまたはａｍｉＲＮＡ、例えば、ＳＮＣＡ（α－Ｓｙｎタンパク質をコードする遺伝子）を標的とするｍｉＲＮＡである。いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡは、それがハイブリダイゼーションするＳＮＣＡ ｍＲＮＡの領域とのミスマッチを一切含まない（例えば、ｍｉＲＮＡは「完全」である）。いくつかの実施形態において、阻害性核酸は、ｓｈＲＮＡ（例えば、ＳＮＣＡを標的とするｓｈＲＮＡ）である。いくつかの実施形態において、ＳＮＣＡを標的とするｓｈＲＮＡは、配列番号４７によってコードされる。いくつかの実施形態において、ＳＮＣＡを標的とするｓｈＲＮＡは、配列番号２０を含む配列によってコードされる。
当業者は、阻害性核酸（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ａｍｉＲＮＡなど）を含むかまたはコードする核酸配列に言及する場合、本明細書で提供される配列において任意の１つ以上のチミジン（Ｔ）ヌクレオチドまたはウリジン（Ｕ）ヌクレオチドを、アデノシンヌクレオチドとの塩基対形成（例えば、ワトソン－クリック塩基対を介して）に適切な任意の他のヌクレオチドと置き換えてもよいことを認識する。例えば、ＴをＵに置き換え得、ＵをＴに置き換え得る。
本明細書に記載の単離核酸は、それ自体として、またはベクターの一部として存在し得る。一般に、ベクターは、プラスミド、コスミド、ファージミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、またはウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レトロウイルスベクター、バキュロウイルスベクターなど）であり得る。いくつかの実施形態において、ベクターは、プラスミド（例えば、本明細書に記載の単離核酸を含むプラスミド）である。いくつかの実施形態において、ベクターは組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターである。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、一本鎖（例えば、一本鎖ＤＮＡ）である。いくつかの実施形態において、ベクターは、バキュロウイルスベクター（例えば、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病（ＡｃＮＰＶ）ベクター）である。
典型的には、ｒＡＡＶベクター（例えば、ｒＡＡＶゲノム）は、２つのＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）配列に隣接する導入遺伝子（例えば、以下のプロモーター、イントロン、エンハンサー配列、タンパク質コード配列、阻害性ＲＮＡコード配列、ポリＡ尾部配列などの各々のうちの１つ以上を含む発現構築物）を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶベクターの導入遺伝子は、本開示による記載の単離核酸を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶベクターの２つのＩＴＲ配列の各々は、全長ＩＴＲ（例えば、長さが約１４５ｂｐであり、機能的なＲｅｐ結合部位（ＲＢＳ）及び末端解離部位（ｔｒｓ）を含む）である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶベクターのＩＴＲのうちの１つは、切断されている（例えば、短縮されるか、または完全長ではない）。いくつかの実施形態において、切断されたＩＴＲは、機能的な末端解離部位（ｔｒｓ）を欠き、自己相補的ＡＡＶベクター（ｓｃＡＡＶベクター）の産生のために使用される。いくつかの実施形態において、切断されたＩＴＲは、例えば、ＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１０（２６）：２１１２－８によって記載されるΔＩＴＲである。
本開示の態様は、野生型ＡＡＶ ＩＴＲに対して、例えば野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲ（例えば、配列番号２９）に対して、１つ以上の修飾（例えば、核酸付加、欠失、置換など）を有するＩＴＲを含む単離核酸（例えば、ｒＡＡＶベクター）に関する。野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲの構造を図１９に示す。概して、野生型ＩＴＲは、自己アニールして、２つのクロスアーム（それぞれＢ／Ｂ’及びＣ／Ｃ’と称される配列によって形成される）、より長いステム領域（配列Ａ／Ａ’と称される配列によって形成される）、及び「Ｄ」領域と称される一本鎖末端領域からなる回文二本鎖Ｔ字形ヘアピン構造を形成する１２５ヌクレオチド領域を含む。（図１９）。概して、ＩＴＲの「Ｄ」領域は、Ａ／Ａ’配列によって形成されるステム領域と、ｒＡＡＶベクターの導入遺伝子を含む挿入物との間に配置される（例えば、ＩＴＲの末端に対してＩＴＲの「内側」に配置されるか、またはｒＡＡＶベクターの導入遺伝子挿入物もしくは発現構築物の近位に配置される）。いくつかの実施形態において、「Ｄ」領域は、配列番号２７に記載の配列を含む。「Ｄ」領域は、例えば、Ｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｊ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｄ ９（３）によって開示されるように、キャプシドタンパク質によるｒＡＡＶベクターのキャプシド化において重要な役割を果たすことが観察されている。
本開示は、部分的に、ＩＴＲの「外側」（例えば、導入遺伝子挿入物または発現構築物に対してＩＴＲの末端に近位）に位置する「Ｄ」領域を含むｒＡＡＶベクターが、未修飾（例えば、野生型）ＩＴＲを有するＩＴＲを有するｒＡＡＶベクターよりもＡＡＶキャプシドタンパク質によって効率的にキャプシド化されるという驚くべき発見に基づいている。いくつかの実施形態において、修飾「Ｄ」配列（例えば、「外側」位置における「Ｄ」配列）を有するｒＡＡＶベクターは、野生型ＩＴＲ配列を有するｒＡＡＶベクターに対して毒性が低下している。
いくつかの実施形態において、修飾「Ｄ」配列は、野生型「Ｄ」配列（例えば、配列番号２７）に対して少なくとも１つのヌクレオチド置換を含む。修飾「Ｄ」配列は、野生型「Ｄ」配列（例えば、配列番号２７）に対して、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、または１０個超のヌクレオチド置換を有し得る。いくつかの実施形態において、修飾「Ｄ」配列は、野生型「Ｄ」配列（例えば、配列番号２７）に対して、少なくとも１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、または１９個の核酸置換を含む。いくつかの実施形態において、修飾「Ｄ」配列は、野生型「Ｄ」配列（例えば、配列番号２７）と、約１０％～約９９％（例えば、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％）同一である。いくつかの実施形態において、修飾「Ｄ」配列は、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２５０（５）：５７３－８０に記載の「Ｓ」配列とも称される、配列番号２６に記載の配列を含む。
本開示による記載の単離核酸またはｒＡＡＶベクターは、例えば、配列番号２８に記載の、またはＦｒａｎｃｏｉｓ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９（１７）：１１０８２－１１０９４に記載される「ＴＲＹ」配列をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、ＴＲＹ配列は、単離核酸またはｒＡＡＶベクターのＩＴＲ（例えば、５’ＩＴＲ）と発現構築物（例えば、導入遺伝子コード挿入物）との間に位置付けられる。
いくつかの態様において、本開示は、本開示による記載の単離核酸またはｒＡＡＶベクターを含むバキュロウイルスベクターに関する。いくつかの実施形態において、バキュロウイルスベクターは、例えば、Ｕｒａｂｅ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １３（１６）：１９３５－４３及びＳｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １７（１１）：１８８８－１８９６によって記載される、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病（ＡｃＮＰＶ）ベクターである。
いくつかの態様において、本開示は、本明細書に記載の単離核酸またはベクターを含む宿主細胞を提供する。宿主細胞は、原核細胞または真核細胞であり得る。例えば、宿主細胞は哺乳動物細胞、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞などであり得る。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、哺乳動物細胞、例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、細菌細胞、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞である。
ｒＡＡＶ
いくつかの態様において、本開示は、本明細書に記載の核酸（例えば、本明細書に記載のｒＡＡＶベクター）をコードする導入遺伝子を含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）に関する。「ｒＡＡＶ」という用語は、概して、１つ以上のＡＡＶキャプシドタンパク質によって封入されたｒＡＡＶベクターを含むウイルス粒子を指す。本開示による記載のｒＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、及びＡＡＶ１０から選択される血清型を有するキャプシドタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、非ヒト宿主由来のキャプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｒｈ．３９などのアカゲザルＡＡＶキャプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、本開示による記載のｒＡＡＶは、それが由来する野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質に対して、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、または１０個超（例えば、１５個、２０個、２５個、５０個、１００個など）のアミノ酸置換（例えば、変異）を含むキャプシドタンパク質バリアントなどの野生型キャプシドタンパク質のバリアントであるキャプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶキャプシドタンパク質バリアントは、例えば、Ａｌｂｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１８ Ｆｅｂ ７；２６（２）：５１０－５２３によって記載される、ＡＡＶ１ＲＸキャプシドタンパク質である。いくつかの実施形態において、キャプシドタンパク質バリアントは、例えば、Ｒｏｓａｒｉｏ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ．２０１６；３：１６０２６によって記載される、ＡＡＶ ＴＭ６キャプシドタンパク質である。
いくつかの実施形態において、本開示による記載のｒＡＡＶは、特にＣＳＦ空間に、または脳実質に直接導入されるときに、ＣＮＳを通して容易に拡散する。したがって、いくつかの実施形態において、本開示による記載のｒＡＡＶは、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過することができるキャプシドタンパク質を含む。例えば、いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ９またはＡＡＶｒｈ．１０血清型を有するキャプシドタンパク質を含む。ｒＡＡＶの産生は、例えば、Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｊ Ｖｉｒｏｌ．６３（９）：３８２２－８及びＷｒｉｇｈｔ（２００９）Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０（７）：６９８－７０６によって記載される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、骨髄性細胞、例えば、小膠細胞を特異的または優先的に標的とするキャプシドタンパク質を含む。
いくつかの実施形態において、本開示は、「ＰＲ００１」と称されるｒＡＡＶを提供する。このｒＡＡＶは、ヒトＧＢＡ１のコドン最適化コード配列（配列番号１５）を発現する。いくつかの実施形態において、本開示は、「ＰＲ００１Ａ」と称されるｒＡＡＶを提供する。ＰＲ００１Ａ（ＡＡＶ９．ＣＢＡ．ＧＢＡ１．Ａ）は、機能的なヒトＧＢＡ１遺伝子を送達し、機能的なヒトＧｃａｓｅの発現の増加をもたらすｒＡＡＶである。ＰＲ００１Ａベクター挿入物は、ヒトＧＢＡ１のコドン最適化コード配列（配列番号１５）を構成的に発現するために、４つの部分、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー、ＣＢＡプロモーター、エクソン１、及びイントロン（ｉｎｔ）を含む、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーター要素を含む。３’領域はまた、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素（ＷＰＲＥ）、それに続くウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル尾部を含む。よく説明された３つの転写調節活性化部位が、プロモーター領域の５’末端に含まれる：ＴＡＴＡ、ＲＢＳ、及びＹＹ１（例えば、Ｆｒａｎｃｏｉｓ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９（１７）：１１０８２－１１０９４を参照）。隣接する逆位末端反復（ＩＴＲ）は、介在配列の正しいパッケージングを可能にする。５’ＩＴＲ配列の２つの変異型（図７、挿入ボックス、下部配列）が提供され、これらの変異型は、ＩＴＲの２０ヌクレオチド「Ｄ」領域内にいくつかのヌクレオチドの差異を有し、これはパッケージング及び発現の効率に影響を与えると考えられる。ＰＲ００１Ａは、図７（挿入ボックス、上部配列、配列番号３０）に示される「Ｄ」ドメインヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本開示は、変異体「Ｄ」ドメイン（本明細書において「Ｓ」ドメインと呼ばれ、図７の配列番号３１においてヌクレオチド変化が陰影によって示される）を保有する、「ＰＲ００１Ｂ」と称されるバリアントベクターを提供する。異なる５’ＩＴＲ配列を除き、ＰＲ００１ＢはＰＲ００１Ａと同一である。骨格は、カナマイシンに対する耐性を付与する遺伝子、及び逆パッケージングを防止するためのスタッファー配列を含む。ｒＡＡＶベクターをコードするプラスミドを示す概略図を図５５に示す。配列番号３９は、図５５に示されるＰＲ００１Ａベクターをコードするプラスミドの第１の鎖のヌクレオチド配列（５’から３’の順に）を提供する。配列番号４０は、図５５に示されるＰＲ００１Ａベクターをコードするプラスミドの第２の鎖のヌクレオチド配列（５’から３’の順に）を提供する。ＰＲ００１Ａは、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質を含む。
いくつかの実施形態において、本開示は、「ＰＲ００４」と称されるｒＡＡＶを提供する。このｒＡＡＶは、ヒトＧＢＡ１のコドン最適化コード配列（配列番号１５）及びα－シヌクレインを標的とし減少させ、配列番号２０のヌクレオチド配列を含む阻害性核酸コード配列を発現する。いくつかの実施形態において、本開示は、「ＰＲ００４Ｘ」と称されるｒＡＡＶを提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、「ＰＲ００４Ｙ」と称されるｒＡＡＶを提供する。ＰＲ００４Ｘ及びＰＲ００４Ｙのそれぞれは、（ｉ）機能的なヒトＧＢＡ１遺伝子を送達し、機能的なヒトＧｃａｓｅの発現の増加をもたらし、（ｉｉ）ＲＮＡ干渉を介してα－シヌクレインレベルを減少させるｓｈＲＮＡをコードするｒＡＡＶである。ＰＲ００４ベクター挿入物は、ヒトＧＢＡ１のコドン最適化コード配列（配列番号１５）及び配列番号２０のヌクレオチド配列を含む阻害性核酸コード配列を構成的に発現するために、４つの部分、すなわちサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー、ＣＢＡプロモーター、エクソン１、及びイントロン（ｉｎｔ）を含む、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーター要素を含む。３’領域はまた、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素（ＷＰＲＥ）、それに続くウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル尾部を含む。ＴＡＴＡ、ＲＢＳ、及びＹＹ１という、よく説明された３つの転写調節活性化部位が、プロモーター領域の５’末端に含まれる（例えば、Ｆｒａｎｃｏｉｓ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９（１７）：１１０８２－１１０９４を参照）。隣接する逆位末端反復（ＩＴＲ）は、介在配列の正しいパッケージングを可能にする。骨格は、カナマイシンに対する耐性を付与する遺伝子、及び逆パッケージングを防止するためのスタッファー配列を含む。ｒＡＡＶ ＰＲ００４Ｘベクターを示す概略図を図５６に示す。配列番号４１は、図５６に示されるＰＲ００４Ｘベクターをコードするプラスミドの第１の鎖のヌクレオチド配列（５’から３’の順に）を提供する。配列番号４２は、図５６に示されるＰＲ００４Ｘベクターをコードするプラスミドの第２の鎖のヌクレオチド配列（５’から３’の順に）を提供する。ｒＡＡＶ ＰＲ００４Ｙベクターを示す概略図を図５７に示す。配列番号４３は、図５７に示されるＰＲ００４Ｙベクターをコードするプラスミドの第１の鎖のヌクレオチド配列（５’から３’の順に）を提供する。配列番号４４は、図５７に示されるＰＲ００４Ｙベクターをコードするプラスミドの第２の鎖のヌクレオチド配列（５’から３’の順に）を提供する。ＰＲ００４Ｘ及びＰＲ００４Ｙは、それぞれ、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質を含む。ＰＲ００４Ｘ及びＰＲ００４Ｙベクターは、凝集形態及び細胞外形態を含むすべての形態のα－シヌクレインの蓄積を減少させるように設計されている。
いくつかの実施形態において、本開示は、「ＰＲ０１４」と称されるｒＡＡＶを提供する。このｒＡＡＶは、α－シヌクレインを標的とし減少させ、配列番号２０のヌクレオチド配列を含む阻害性核酸コード配列を発現する。いくつかの実施形態において、本開示は、「ＰＲ０１４Ｘ」と称されるｒＡＡＶを提供する。ＰＲ０１４Ｘは、ＲＮＡ干渉を介してα－シヌクレインレベルを減少させるｓｈＲＮＡをコードするｒＡＡＶである。ＰＲ０１４Ｘベクター挿入物は、配列番号２０のヌクレオチド配列を含む阻害性核酸コード配列を構成的に発現するために、４つの部分、すなわちサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー、ＣＢＡプロモーター、エクソン１、及びイントロン（ｉｎｔ）を含む、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーター要素を含む。３’領域はまた、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素（ＷＰＲＥ）、それに続くウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル尾部を含む。ＴＡＴＡ、ＲＢＳ、及びＹＹ１という、よく説明された３つの転写調節活性化部位が、プロモーター領域の５’末端に含まれる（例えば、Ｆｒａｎｃｏｉｓ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９（１７）：１１０８２－１１０９４を参照）。隣接する逆位末端反復（ＩＴＲ）は、介在配列の正しいパッケージングを可能にする。骨格は、カナマイシンに対する耐性を付与する遺伝子、及び逆パッケージングを防止するためのスタッファー配列を含む。ｒＡＡＶベクターを示す概略図を図５８に示す。配列番号４５は、図６０に示されるＰＲ０１４Ｘベクターをコードするプラスミドの第１の鎖のヌクレオチド配列（５’から３’の順に）を提供する。配列番号４６は、図６０に示されるＰＲ０１４Ｘベクターをコードするプラスミドの第２の鎖のヌクレオチド配列（５’から３’の順に）を提供する。配列番号４７は、図５８に示されるＰＲ０１４ＸベクターをコードするプラスミドにおけるｓｈＲＮＡの第１の鎖のヌクレオチド配列（５’から３’の順に）を提供する。配列番号４８は、図５８に示されるＰＲ０１４ＸベクターをコードするプラスミドにおけるｓｈＲＮＡの第２の鎖のヌクレオチド配列（５’から３’の順に）を提供する。ＰＲ０１４Ｘは、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質を含む。ＰＲ０１４Ｘベクターは、凝集形態及び細胞外形態を含むすべての形態のα－シヌクレインの蓄積を減少させるように設計されている。
いくつかの実施形態において、本開示による記載のｒＡＡＶ（例えば、ｒＡＡＶキャプシド粒子を形成するようにＡＡＶキャプシドタンパク質によってキャプシド化された組換えｒＡＡＶゲノムを含む）は、バキュロウイルスベクター発現系（ＢＥＶＳ）において産生される。ＢＥＶＳを使用したｒＡＡＶの産生は、例えば、Ｕｒａｂｅ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １３（１６）：１９３５－４３、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １７（１１）：１８８８－１８９６、米国特許第８，９４５，９１８号、米国特許第９，８７９，２８２号、及び国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１７／１８４８７９号によって記載される。しかしながら、ｒＡＡＶは、任意の適切な方法を用いて（例えば、組換えｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を用いて）産生され得る。いくつかの実施形態において、本明細書に開示のｒＡＡＶは、ＨＥＫ２９３（ヒト胚性腎臓）細胞において産生される。
医薬組成物
いくつかの態様において、本開示は、本明細書に記載の単離核酸またはｒＡＡＶ及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される」という用語は、化合物の生物学的活性または特性を無効にせず、比較的無毒である担体または希釈剤などの材料を指し、例えば、材料は、望ましくない生物学的作用を引き起こすことなく、またはそれが含まれている組成物の構成要素のうちのいずれかと有害な様式で相互作用することなく、個体に投与され得る。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、本発明内で有用な化合物をその意図された機能を実行し得るように患者内で、または患者に運搬または輸送することに関与する、液体もしくは固体充填剤、安定剤、分散剤、懸濁剤、希釈剤、賦形剤、増粘剤、溶媒、または封入材料などの薬学的に許容される材料、組成物、または担体を意味する。本発明の実施において使用される医薬組成物に含まれ得る追加の成分は、当該技術分野で既知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｇｅｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，１９８５，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）に記載され、それは参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で提供される組成物（例えば、医薬組成物）は、経腸（例えば、経口）、非経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、くも膜下腔内、皮下、脳室内、経皮、皮膚間、直腸、膣内、腹腔内、局所（粉末、軟膏、クリーム、及び／または液滴による）、粘膜、鼻腔、口腔、舌下を含む任意の経路によって；気管内注入、気管支注入、及び／または吸入によって；及び／または経口スプレー、鼻腔スプレー、及び／またはエアロゾルとして投与され得る。具体的に企図される経路は、経口投与、静脈内投与（例えば、全身静脈内注射）、血液及び／またはリンパ供給を介した局所投与、及び／または患部への直接投与である。概して、最も適切な投与経路は、薬剤の性質（例えば、胃腸管の環境におけるその安定性）、及び／または対象の状態（例えば、対象が経口投与に耐えることができるかどうか）を含む様々な因子に依存する。ある特定の実施形態において、本明細書に記載の化合物または医薬組成物は、対象の眼への局所投与に適切である。
いくつかの実施形態において、本開示は、水溶液中に存在する上述のＰＲ００１ ｒＡＡＶを含むＰＲ００１（例えば、ＰＲ００１Ａ）完成薬品を提供する。いくつかの実施形態において、最終製剤緩衝液は、約２０ｍＭのＴｒｉｓ［ｐＨ８．０］、約１ｍＭのＭｇＣｌ２、約２００ｍＭのＮａＣｌ、及び約０．００１％［ｗ／ｖ］のポロキサマー１８８を含む。いくつかの実施形態において、完成した薬剤製品及び最終製剤緩衝液は、大槽内（ＩＣＭ）注射または静脈内投与に適切である。
方法
本開示の態様は、ＣＮＳ疾患関連遺伝子産物を発現するように操作された組成物（例えば、単離核酸、ｒＡＡＶなど）の細胞（例えば、対象の細胞（複数可））への送達に関する。
実施例のセクションにおいてさらに説明されるように、本開示の態様は、グリア瘢痕形成（例えば、神経膠症）を阻害または防止する遺伝子産物を発現する組成物に関する。したがって、いくつかの態様において、本開示は、対象におけるグリア瘢痕形成を阻害するための方法を提供し、方法は、本明細書に記載の組成物（例えば、単離核酸またはｒＡＡＶ）を対象に投与することを含む。
いくつかの実施形態において、対象は、中枢神経系（ＣＮＳ）疾患を有するか、または有すると疑われる。いくつかの実施形態において、対象は、ゴーシェ病（ＧＤ）を有する。いくつかの実施形態において、対象は、神経障害性ＧＤ（ｎＧＤ）（例えば、２型ＧＤまたは３型ＧＤ）を有する。いくつかの実施形態において、対象は、１型ＧＤを有する。いくつかの実施形態において、ＧＤを有する対象は、ＰＤまたはＰＤ症状を有しない。いくつかの実施形態において、対象は、パーキンソニズムを有する。いくつかの実施形態において、対象は、パーキンソン病（ＰＤ）を有する。いくつかの実施形態において、対象は、非定型パーキンソン病を有する。いくつかの実施形態において、非定型パーキンソン病は、レビー小体型認知症、進行性核上性麻痺、多系統萎縮または皮質基底核症候群である。
本開示は、部分的に、ＣＮＳ関連疾患を治療するための対象における１つ以上のＣＮＳ疾患関連遺伝子産物の発現のための組成物に基づく。１つ以上のＣＮＳ疾患関連遺伝子産物は、１つ以上の単離核酸またはｒＡＡＶベクターによってコードされ得る。いくつかの実施形態において、対象は、１つ以上（１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上）の遺伝子産物をコードする単一のベクター（例えば、単離核酸、ｒＡＡＶなど）を投与される。いくつかの実施形態において、対象は、複数の（例えば、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上の）ベクター（例えば、単離核酸、ｒＡＡＶなど）を投与され、各ベクターは、異なるＣＮＳ疾患関連遺伝子産物をコードする。いくつかの実施形態において、組成物は、ＧＢＡまたはその一部分を発現する。いくつかの実施形態において、組成物は、α－シヌクレインを標的とする干渉ＲＮＡを発現する。いくつかの実施形態において、組成物は、ＧＢＡまたはその一部分、及びα－シヌクレインを標的とする干渉ＲＮＡを発現する。
ＣＮＳ関連疾患は、神経変性疾患、シヌクレイン病、タウオパチー、またはリソソーム蓄積症であり得る。神経変性疾患及びその関連遺伝子の例を表４に記載する。
「シヌクレイン病」は、（例えば、健康な対象、例えば、シヌクレイン病を有しない対象に対して）対象におけるアルファ－シヌクレイン（ＳＮＣＡの遺伝子産物）の蓄積によって特徴付けられる疾患または障害を指す。シヌクレイン病及びその関連遺伝子の例を表５に記載する。
「タウオパチー」は、（例えば、タウオパチーを有しない健康な対象に対して）対象における異常なＴａｕタンパク質の蓄積によって特徴付けられる疾患または障害を指す。タウオパチー及びその関連遺伝子の例を表６に記載する。
「リソソーム蓄積症」は、対象のリソソームにおける有毒な細胞産物の異常な蓄積によって特徴付けられる疾患を指す。リソソーム蓄積症及びそれらに関連する遺伝子の例を表７に記載する。
本明細書で使用される場合、「治療する」または「治療すること」は、（ａ）ＣＮＳ疾患の発症の予防または遅延、（ｂ）ＣＮＳ疾患の重症度の減少、（ｃ）ＣＮＳ疾患の特徴的な症状の発症の減少または予防、（ｄ）及び／またはＣＮＳ疾患の特徴的な症状の悪化の予防を指す。ＣＮＳ疾患の症状は、例えば、運動機能障害（例えば、震え、硬直、動きの遅さ、歩行困難、麻痺）、認知機能障害（例えば、認知症、うつ病、不安、精神病）、記憶の障害、ならびに感情及び行動機能障害を含み得る。
本開示は、部分的に、パーキンソン病を治療するために一緒に（例えば、相乗的に）作用する対象における１つ以上のＰＤ関連遺伝子産物の発現のための組成物に基づく。
したがって、いくつかの態様において、本開示は、パーキンソン病を有するか、または有する疑いのある対象を治療するための方法を提供し、方法は、本開示による記載の組成物（例えば、単離核酸またはベクターまたはｒＡＡＶを含む組成物）を対象に投与することを含む。
本開示は、部分的に、ゴーシェ病（ＧＤ）を治療するための対象における１つ以上のＣＮＳ疾患関連遺伝子産物の発現のための組成物に基づく。ＧＤの診断は、ＧＢＡ１における二対立遺伝子病原性変異の存在、または末梢血白血球における正常なＧＣａｓｅ活性の１５％未満の所見によって確立されている。より深刻な酵素欠損を引き起こすＧＢＡ１変異は、疾患の早期発症、症状のより速い進行、及び神経症状を発症する可能性の高さと関連する（Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｇｅｎｅｔ．１９８６；３０（２）：１３１－５、Ｃｏｘ，Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ．２０１０；４：２９９－３１３）。ＧＤは、伝統的に、神経学的症状の存在によって区別される３つのより広い表現型（神経障害性［２型ＧＤ及び３型ＧＤ、ｎＧＤ］または非神経障害性［１型ＧＤ］）に細分化されている。
ｎＧＤ内で、２型ＧＤと３型ＧＤとの間の区別は、ＣＮＳ及び内臓症状の提示の急性から慢性への表現型の連続を表し得る。急性神経障害性形態として知られる２型ＧＤを有する乳児は、古典的に、早期の球状徴候（斜視及び／または嚥下困難など）、後弓反張または痙縮、核上性注視麻痺、ならびに運動、行動、及び認知のマイルストーンの達成の失敗を伴って存在する。ほとんどの子供は２歳までに死ぬ。（Ｇｏｋｅｒ－Ａｌｐａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｅｄｉａｔｒ．２００３；１４３（２）：２７３－６、Ｒｏｓｈａｎ ａｎｄ Ｓｉｄｒａｎｓｋｙ，Ｄｉｓｅａｓｅｓ．２０１７；５（１）：ｐｉｉ：Ｅ１０）。３型ＧＤにおいて、特徴的な臨床徴候は、緩徐な水平核上性注視麻痺であり、認知障害から運動失調、発作、小児期または青年期初期の死亡までに至る他の神経学的症状を伴う（Ｇｏｋｅｒ－Ａｌｐａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｅｄｉａｔｒ．２００３；１４３（２）：２７３－６、Ｔｙｌｋｉ－Ｓｚｙｍａｎｓｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｎｈｅｒｉｔ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓ．２０１０；３３（４）：３３９－４６）。
したがって、いくつかの態様において、本開示は、神経障害性ゴーシェ病を有するか、または有する疑いのある対象を治療するための方法を提供し、方法は、本開示による記載の組成物（例えば、単離核酸またはベクターまたはｒＡＡＶを含む組成物）を対象に投与することを含む。
いくつかの態様において、本開示は、２型ゴーシェ病または３型ゴーシェ病を有する対象を治療するための方法を提供し、方法は、Ｇｃａｓｅタンパク質をコードする配列に作動可能に連結したプロモーターを含む発現構築物を含む核酸を含むｒＡＡＶを対象に投与することを含み、Ｇｃａｓｅタンパク質をコードする配列は、配列番号１５を含み、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ９血清型を有するキャプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、本開示は、２型ゴーシェ病または３型ゴーシェ病を有する対象の神経学的症状を治療するための方法を提供し、方法は、Ｇｃａｓｅタンパク質をコードする配列に作動可能に連結したプロモーターを含む発現構築物を含む核酸を含むｒＡＡＶを対象に投与することを含み、Ｇｃａｓｅタンパク質をコードする配列は、配列番号１５を含み、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ９血清型を有するキャプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、２型ゴーシェ病または３型ゴーシェ病の神経症状は、核上性注視麻痺、低血圧、発作、痙縮、運動機能低下、運動もしくは行動発達遅延もしくは障害、認知遅延もしくは障害、運動失調、企図振戦、または硬直である。
いくつかの実施形態において、ある特定の形態のゴーシェ病を有する患者は、例えば、Ｂｉｅｇｓｔｒａａｔｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｂｒａｉｎ １３３（１０）：２９０９－２９１９に記載されているように、末梢神経障害の症状を呈する。いくつかの実施形態において、本開示は、ゴーシェ病（例えば、１型ゴーシェ病）を有する対象における末梢神経障害を治療するための方法を提供し、方法は、Ｇｃａｓｅタンパク質をコードする配列に作動可能に連結したプロモーターを含む発現構築物を含む核酸を含むｒＡＡＶを対象に投与することを含み、Ｇｃａｓｅタンパク質をコードする配列は、配列番号１５を含み、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ９血清型を有するキャプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、本開示は、対象における１型ゴーシェ病の治療方法を提供し、方法は、Ｇｃａｓｅタンパク質をコードする配列に作動可能に連結したプロモーターを含む発現構築物を含む核酸を含むｒＡＡＶを対象に投与することを含み、Ｇｃａｓｅタンパク質をコードする配列は、配列番号１５を含み、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ９血清型を有するキャプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、１型ゴーシェ病を治療するために対象に静脈内投与される。
いくつかの実施形態において、本開示は、グルコセレブロシダーゼ－１（ＧＢＡ１）変異（例えば、病原性ＧＢＡ１変異）を有する、パーキンソン病（ＰＤ）を有する対象を治療するための方法を提供し、方法は、Ｇｃａｓｅタンパク質をコードする配列に作動可能に連結したプロモーターを含む発現構築物を含む核酸を含むｒＡＡＶを対象に投与することを含み、Ｇｃａｓｅタンパク質をコードする配列は、配列番号１５を含み、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ９血清型を有するキャプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、本開示は、ＧＢＡ１変異を有するＰＤを有する対象の症状を治療するための方法を提供し、方法は、Ｇｃａｓｅタンパク質をコードする配列に作動可能に連結したプロモーターを含む発現構築物を含む核酸を含むｒＡＡＶを対象に投与することを含み、Ｇｃａｓｅタンパク質をコードする配列は、配列番号１５を含み、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ９血清型を有するキャプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ＰＤの運動症状は、安静時振戦、動作緩慢、硬直、または歩行困難である。いくつかの実施形態において、ＰＤの非運動症状は、認知障害／認知症、うつ病、妄想／幻覚、精神病、睡眠障害、便秘、泌尿器症状、疼痛、臭覚障害、嚥下困難、または低血圧である。いくつかの実施形態において、ＰＤを有する対象は、１つのＧＢＡ１変異を有する。いくつかの実施形態において、ＰＤを有する対象は、２つのＧＢＡ１変異を有する。
いくつかの実施形態において、１型ゴーシェ病、２型ゴーシェ病、３型ゴーシェ病またはＧＢＡ１変異を有するパーキンソン病を治療するためのＧｃａｓｅタンパク質をコードするｒＡＡＶは、対象に、約１×１０１２ベクターゲノム（ｖｇ）～約１×１０１５ｖｇ、または約１×１０１３ｖｇ～約５×１０１４ｖｇ、または約５×１０１３ｖｇ～約５×１０１４ｖｇ、または約３．４×１０１３ｖｇ～約１×１０１４ｖｇ、または約１×１０１４ｖｇ～約５×１０１４ｖｇ、または約１×１０１４ｖｇ～約３×１０１４ｖｇ、または約１×１０１４～約２×１０１４ｖｇの範囲の用量で投与される。総用量は、１．３ｋｇの成人の脳質量を想定している（Ｈａｋｉｍ ａｎｄ Ｍａｔｈｉｅｓｏｎ，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，１９７９；２９（９ Ｐｔ １）：１２０９－１４）。小児対象の場合、用量はそれに応じて調整され得る。いくつかの実施形態において、小児対象についての用量は、例えば、２１の解剖及び神経画像の出版物（Ｖａｎｎｕｃｃｉ ａｎｄ Ｖａｎｎｕｃｃｉ，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓ Ａｎｔｈｒｏｐｏｌ．２０１９；１６８（２）：２４７－６１）から得られた脳重量を含む複合データセットに基づいて、年齢による脳重量の推定値を使用して、調整され得る。
いくつかの実施形態において、ＧＢＡ１変異を有するパーキンソン病を治療するためのＧｃａｓｅタンパク質をコードするｒＡＡＶは、約１×１０１４ｖｇ、約２×１０１４ｖｇ、約３×１０１４ｖｇ、約４×１０１４ｖｇ、または約５×１０１４ｖｇの用量で対象（例えば、ヒト成人対象）に投与される。いくつかの実施形態において、ＧＢＡ１変異を有するパーキンソン病を治療するためのｒＡＡＶは、約１×１０１４ｖｇ（約７．７×１０１０ｖｇ／ｇ脳）、約２×１０１４ｖｇ（約１．５×１０１１ｖｇ／ｇ脳）、または約３×１０１４ｖｇ（約１．９×１０１１ｖｇ／ｇ脳）の用量で対象（例えば、ヒト成人対象）に投与される。
いくつかの実施形態において、２型または３型ゴーシェ病を治療するためのＧｃａｓｅタンパク質をコードするｒＡＡＶは、約５×１０１０ｖｇ／ｇ脳～約５×１０１１ｖｇ／ｇ脳の範囲の用量で対象（例えば、ヒト小児対象）に投与される。いくつかの実施形態において、２型ゴーシェ病または３型ゴーシェ病を治療するためのｒＡＡＶは、約１．３×１０１１ｖｇ／ｇ脳（約５．９×１０１３ｖｇ～約１．７×１０１４ｖｇ）の用量で対象（例えば、ヒト小児対象）に投与される。いくつかの実施形態において、２型ゴーシェ病または３型ゴーシェ病を治療するためのｒＡＡＶは、約１．９×１０１１ｖｇ／ｇ脳（約８．６×１０１３ｖｇ～約２．５×１０１４ｖｇ）の用量で対象（例えば、ヒト小児対象）に投与される。いくつかの実施形態において、２型ゴーシェ病または３型ゴーシェ病を治療するためのｒＡＡＶは、約７．７×１０１０ｖｇ／ｇ脳（約３．４×１０１３ｖｇ～約１×１０１４ｖｇ）または約２．３×１０１１ｖｇ／ｇ脳（約１×１０１４ｖｇ～約３×１０１４ｖｇ）の用量で対象（例えば、ヒト小児対象）に投与される。
いくつかの実施形態において、１型、２型もしくは３型ゴーシェ病またはＧＢＡ１変異を有するパーキンソン病を治療するためのＧｃａｓｅタンパク質をコードするｒＡＡＶは、単回用量として対象に投与され、ｒＡＡＶは、その後対象に投与されない。
いくつかの実施形態において、Ｇｃａｓｅタンパク質をコードするｒＡＡＶは、大槽への単回の後頭下注射を介して送達される。いくつかの実施形態において、大槽への注射は、放射線誘導下で行われる。
いくつかの実施形態において、本開示は、シヌクレイン病またはパーキンソニズムを有する対象を治療するための方法を提供し、方法は、（ａ）配列番号１５のヌクレオチド配列を含むＧｃａｓｅタンパク質コード配列、及び（ｂ）配列番号２０または配列番号４７のヌクレオチド配列を含む阻害性核酸コード配列を含む導入遺伝子を含む発現構築物を含む核酸を含むｒＡＡＶを対象に投与することを含み、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ９血清型を有するキャプシドタンパク質を含む。
いくつかの実施形態において、本開示は、多系統萎縮、パーキンソン病、ＧＢＡ１変異を有するパーキンソン病、レビー小体病、レビー小体型認知症、ＧＢＡ１変異を有するレビー小体型認知症、進行性核上性麻痺、または皮質基底核症候群を有する対象を治療するための方法を提供し、方法は、（ａ）配列番号１５のヌクレオチド配列を含むＧｃａｓｅタンパク質コード配列、及び（ｂ）配列番号２０または配列番号４７のヌクレオチド配列を含む阻害性核酸コード配列を含む導入遺伝子を含む発現構築物を含む核酸を含むｒＡＡＶを対象に投与することを含み、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ９血清型を有するキャプシドタンパク質を含む。
いくつかの実施形態において、本開示は、シヌクレイン病またはパーキンソニズムを有する対象を治療するための方法を提供し、方法は、配列番号２０または配列番号４７のヌクレオチド配列を含む阻害性核酸コード配列を含む導入遺伝子を含む発現構築物を含む核酸を含むｒＡＡＶを対象に投与することを含み、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ９血清型を有するキャプシドタンパク質を含む。
いくつかの実施形態において、本開示は、多系統萎縮、パーキンソン病、ＧＢＡ１変異を有するパーキンソン病、レビー小体病、レビー小体型認知症、ＧＢＡ１変異を有するレビー小体型認知症、進行性核上性麻痺、または皮質基底核症候群を有する対象を治療するための方法を提供し、方法は、配列番号２０または配列番号４７のヌクレオチド配列を含む阻害性核酸コード配列を含む導入遺伝子を含む発現構築物を含む核酸を含むｒＡＡＶを対象に投与することを含み、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ９血清型を有するキャプシドタンパク質を含む。
対象は、典型的には、哺乳動物、好ましくはヒトである。いくつかの実施形態において、対象は、１か月齢～１０歳齢（例えば、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、１３か月、１４か月、１５か月、１６か月、１７か月、１８か月、１９か月、２０か月、２１か月、２２か月、２３か月、２４か月、３年、４年、５年、６年、７年、８年、９年、１０年、またはこれらの間の任意の齢）である。いくつかの実施形態において、対象は、２歳～２０歳である。いくつかの実施形態において、対象は、３０歳～１００歳である。実施形態によっては、対象は、年齢５５歳より高齢である。
いくつかの実施形態において、組成物は、例えば、対象の脳、及び／または脊髄への直接注射によって、対象のＣＮＳに直接投与される。ＣＮＳ直接投与様式の例としては、脳内注射、脳室内注射、大槽内注射、実質内注射、くも膜下腔内注射、及び前述の任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、組成物は、大槽内（ＩＣＭ）注射によって対象に投与される。いくつかの実施形態において、対象のＣＮＳへの直接注射は、対象の中脳、線条体、及び／または大脳皮質における導入遺伝子発現（例えば、第１の遺伝子産物、第２の遺伝子産物、及び該当する場合、第３の遺伝子産物の発現）をもたらす。いくつかの実施形態において、ＣＮＳへの直接注射は、対象の脊髄、及び／またはＣＳＦにおける導入遺伝子発現（例えば、第１の遺伝子産物、第２の遺伝子産物、及び該当する場合、第３の遺伝子産物の発現）をもたらす。
いくつかの実施形態において、対象のＣＮＳへの直接注射は、対流増強送達（ＣＥＤ）を含む。対流増強送達は、脳の外科的露出及び脳の標的領域への小径カテーテルの直接的な配置、続いて治療薬（例えば、本明細書に記載の組成物またはｒＡＡＶ）の対象の脳への直接的な注入を含む治療戦略である。ＣＥＤは、例えば、Ｄｅｂｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｔｈｅｒ．９（１０）：１５１９－２７によって記載されている。
いくつかの実施形態において、組成物は、例えば、末梢注射によって、対象に末梢投与される。末梢注射の例としては、皮下注射、静脈内注射、動脈内注射、腹腔内注射、または前述の任意の組み合わせが挙げられる。いくつかの実施形態において、末梢注射は、動脈内注射、例えば対象の頸動脈への注射である。
いくつかの実施形態において、本開示による記載の組成物（例えば、単離核酸またはベクターまたはｒＡＡＶを含む組成物）は、対象のＣＮＳに末梢及び直接の両方で投与される。例えば、いくつかの実施形態において、対象は、動脈内注射（例えば、頸動脈への注射）及び実質内注射（例えば、ＣＥＤによる実質内注射）によって組成物を投与される。いくつかの実施形態において、ＣＮＳへの直接注射及び末梢注射は、同時に行われる（例えば、同時に行われる）。いくつかの実施形態において、直接注射は、末梢注射の前（例えば、１分～１週間、またはそれ以上前）に行われる。いくつかの実施形態において、直接注射は、末梢注射の後（例えば、１分～１週間、またはそれ以上後）に行われる。
いくつかの実施形態において、対象は、本明細書に記載の組成物の前（例えば、１か月～１分前）または同時に免疫抑制剤を投与される。いくつかの実施形態において、免疫抑制剤は、コルチコステロイド（例えば、プレドニゾン、ブデソニドなど）、ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、シロリムス、エベロリムスなど）、抗体（例えば、アダリムマブ、エタネルセプト、ナタリズマブなど）、またはメトトレキサートである。
対象に投与される本開示による記載の組成物（例えば、単離核酸またはベクターまたはｒＡＡＶを含む組成物）の量は、投与方法に応じて変化するであろう。例えば、いくつかの実施形態において、本明細書に記載のｒＡＡＶは、約１０９ゲノムコピー（ＧＣ）／ｋｇ～約１０１４ＧＣ／ｋｇ（例えば、約１０９ＧＣ／ｋｇ、約１０１０ＧＣ／ｋｇ、約１０１１ＧＣ／ｋｇ、約１０１２ＧＣ／ｋｇ、約１０１２ＧＣ／ｋｇ、または約１０１４ＧＣ／ｋｇ）の力価で対象に投与される。いくつかの実施形態において、対象は、ＣＳＦ空間への注射によって、または実質内注射によって、高い力価（例えば、１０１２ゲノムコピーＧＣ／ｋｇ超のｒＡＡＶ）を投与される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のｒＡＡＶは、静脈内注射によって約１×１０１０ベクターゲノム（ｖｇ）～約１×１０１７ｖｇの範囲の用量で対象に投与される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のｒＡＡＶは、大槽への注射によって、約１×１０１０ｖｇ～約１×１０１６ｖｇの範囲の用量で対象に投与される。
本開示による記載の組成物（例えば、単離核酸またはベクターまたはｒＡＡＶを含む組成物）は、対象に、１回または複数回（例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、２０回、またはそれ以上）投与され得る。いくつかの実施形態において、組成物は、例えば、注入ポンプを介して、対象に連続的に（例えば、慢性的に）投与される。
実施例１：ｒＡＡＶベクター
ＨＥＫ２９３細胞などの細胞を使用して、トリプルプラスミドトランスフェクションのためのＡＡＶベクターを生成する。ＩＴＲ配列は、各目的の導入遺伝子についてのプロモーター／エンハンサー要素、３’ポリＡシグナル、及びＷＰＲＥ要素などの翻訳後シグナルを含む発現構築物に隣接している。ＧＢＡ１及びＬＩＭＰ２、及び／またはプロサポシンなどの複数の遺伝子産物が、タンパク質配列の融合によって、またはペプチド結合の生成の防止によりアミノ酸が付加された２つのペプチド断片を導くＴ２ＡもしくはＰ２Ａなどの２Ａペプチドリンカーを使用して、またはＩＲＥＳ要素を使用して、または２つの別々の発現カセットでの発現によって、同時に発現され得る。発現された遺伝子の上流で効率的にスプライシングされる短いイントロン配列の存在は、発現レベルを改善し得る。ｓｈＲＮＡ及び他の調節ＲＮＡは、潜在的にこれらの配列内に含まれ得る。本開示による記載のｒＡＡＶベクターを含むプラスミドの例は、図１～６、図２１～２７、及び図５５～５８、ならびに下記の表２に示される。
実施例２：ＧＢＡ欠損細胞へのウイルス形質導入の細胞ベースアッセイ
ＧＢＡ１が欠損した細胞は、例えば、ＧＤ患者、単球もしくはｈＥＳ細胞由来の線維芽細胞、または患者由来人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）として得られる。これらの細胞は、グルコシルセラミド及びグルコシルスフィンゴシン（ＧｌｕＣｅｒ及びＧｌｕＳｐｈ）などの基質を蓄積する。野生型または変異体培養細胞株でのＣＢＥなどのＧｃａｓｅ阻害剤での処置もまた、ＧＢＡ欠損細胞を得るために使用される。
そのような細胞モデルを使用して、リソソーム欠損は、このタンパク質またはホスホαＳｙｎについての抗体、続いて蛍光顕微鏡法を使用した画像化でα－シヌクレインなどのタンパク質凝集体の蓄積の観点で定量化される。ＬＡＭＰ１、ＬＡＭＰ２、ＬＩＭＰ１、ＬＩＭＰ２などのタンパク質マーカーについてのＩＣＣによる、またはライソトラッカーなどの染料を使用した、または蛍光デキストランもしくは他のマーカーのエンドサイトーシス区画を介した取り込みによる、リソソーム異常についての画像化も実施される。ＬＣ３についてなどのリソソームとの欠陥のある融合による自食作用マーカー蓄積についての画像化も実施され得る。ウェスタンブロッティング及び／またはＥＬＩＳＡを使用して、これらのマーカーの異常蓄積を定量する。また、ＧＢＡ１の糖脂質基質及び生成物の蓄積を標準的な手法を用いて測定する。
治療的エンドポイント（例えば、ＰＤ関連病理の減少）を、ＡＡＶベクターの形質導入の発現という観点で測定し、活性及び機能を確認し、定量化する。Ｇｃａｓｅはまた、タンパク質ＥＬＩＳＡ測定を使用して、または標準的なＧｃａｓｅ活性アッセイによって定量化され得る。
実施例２．１：ＧｃａｓｅをコードするｒＡＡＶでのインビトロ薬理学試験
形質導入及び効力
ヒトＧＢＡ１のコドン最適化コード配列（配列番号１５）を含む、ＰＲ００１Ａ（ＡＡＶ９．ＣＢＡ．ＧＢＡ１．Ａ）（図５５に提供されるベクターをコードするプラスミドの概略図）の、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてＧＢＡ１導入遺伝子を発現する能力を評価するためのインビトロ試験は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＰＲ００１Ａの形質導入後のＧＣａｓｅ活性の用量依存的増加を示した（図３３）。
有効性測定（α－シヌクレイン）
ヒト細胞株であるＨｅＬａ細胞、及び初代マウス海馬ニューロンにおいてもインビトロ試験を行った。２×１０６ｖｇ／細胞のＰＲ００１Ａで処理したＨｅＬａ細胞において、賦形剤処理した対照細胞と比較して、ＧＣａｓｅ活性レベルの約２倍の増加、及び総α－シヌクレインレベルの低下が観察された（図３４Ａ及び図３４Ｂ）。同様の効果は、低用量のＰＲ００１Ａでは観察されなかった。
１．３×１０５ｖｇ／細胞または１．３×１０６ｖｇ／細胞のＰＲ００１Ａで形質導入されたマウス海馬ニューロンは、ＧＣａｓｅ活性レベルの増加を示し、総α－シヌクレインレベルが減少傾向であった（図３５Ａ及び図３５Ｂ）。
要約すると、細胞株及び初代ニューロン培養におけるＰＲ００１Ａの形質導入は、ＧＣａｓｅ活性の増加をもたらした。ＨｅＬａ細胞及びマウス海馬ニューロンにおいて、ＰＲ００１Ａ形質導入はまた、α－シヌクレインレベルの低下をもたらし、ＧＣａｓｅ活性とα－シヌクレインレベルとの間の連結を支持した（Ｍａｚｚｕｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２０１１；１４６（１）：３７－５２）。
実施例３：変異体マウスを用いたインビボアッセイ
本実施例は、変異体マウスを使用したＡＡＶベクターのインビボアッセイを記載する。変異体マウスにおける上述のＡＡＶベクターのインビボ試験は、例えば、Ｌｉｏｕ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１（７）：４２４２－４２５３、Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．４６：２１０２－２１１３、及びＦａｒｆｅｌ－Ｂｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｄｉｓ．Ｍｏｄｅｌ Ｍｅｃｈ．４（６）：７４６－７５２によって記載されるアッセイを使用して実施される。
ビヒクル対照及びＡＡＶベクターのくも膜下腔内または脳室内送達（例えば、２×１０１１ｖｇ／マウスの用量）は、濃縮ＡＡＶストックを使用して、例えば、５～１０μＬの注射体積で実行される。対流増強送達による実質内送達を実施する。
処置は、症状の発症の前、または発症の後のいずれかで開始される。測定されるエンドポイントは、ＣＮＳ及びＣＳＦにおける基質の蓄積、ＥＬＩＳＡによるＧｃａｓｅ酵素の蓄積及び酵素活性の蓄積、運動及び認知エンドポイント、リソソーム機能障害、ならびにα－シヌクレインモノマー、プロトフィブリルまたは原線維の蓄積である。
実施例４：疾患の化学モデル
本実施例は、ゴーシェ病の化学的誘導マウスモデル（例えば、ＣＢＥマウスモデル）を使用したＡＡＶベクターのインビボアッセイを記載する。これらのＡＡＶベクターのインビボ試験は、例えば、Ｖａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．２３９（４）：４９６－５０９によって記載されているように、ゴーシェ病の化学的誘導マウスモデルにおいて実施される。
ビヒクル対照及びＡＡＶベクターのくも膜下腔内または脳室内送達（例えば、２×１０１１ｖｇ／マウスの用量で）は、濃縮されたＡＡＶストックを使用して、例えば、５～１０μＬの注射体積で実施される。対流増強送達による実質内送達を実施する。末梢送達を尾静脈注射によって達成する。
処置は、症状の発症の前、または発症の後のいずれかで開始される。測定されるエンドポイントは、ＣＮＳ及びＣＳＦにおける基質の蓄積、ＥＬＩＳＡによるＧｃａｓｅ酵素の蓄積及び酵素活性の蓄積、運動及び認知エンドポイント、リソソーム機能障害、ならびにα－シヌクレインモノマー、プロトフィブリルまたは原線維の蓄積である。
実施例５：ＰＤ、ＬＢＤ、ゴーシェ病患者における臨床試験
いくつかの実施形態において、ある特定の形態のゴーシェ病（例えば、ＧＤ１）を有する患者は、パーキンソン病（ＰＤ）またはレビー小体型認知症（ＬＢＤ）を発症するリスクが増加する。本実施例は、ゴーシェ病、ＰＤ及び／またはＬＢＤを有する患者における、本開示による記載のｒＡＡＶの安全性及び有効性を評価するための臨床試験を記載する。
ゴーシェ病、ＰＤ及び／またはＬＢＤの治療のためのそのようなベクターの臨床試験は、Ｇｒａｂｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１２２（１）：３３－３９に記載されているものと同様の試験設計を使用して実施される。
実施例６：末梢疾患の治療
いくつかの実施形態において、ある特定の形態のゴーシェ病を有する患者は、例えば、Ｂｉｅｇｓｔｒａａｔｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｂｒａｉｎ １３３（１０）：２９０９－２９１９に記載されているように、末梢神経障害の症状を呈する。
本実施例は、ゴーシェ病（例えば、１型ゴーシェ病）に関連する末梢神経障害の治療のための本明細書に記載のＡＡＶベクターのインビボアッセイを記載する。簡潔に述べると、末梢神経障害の徴候または症状を有すると特定された１型ゴーシェ病患者は、本開示による記載のｒＡＡＶを投与される。いくつかの実施形態において、対象の末梢神経障害の徴候及び症状は、ｒＡＡＶの投与後に、例えば、Ｂｉｅｇｓｔｒａａｔｅｎ ｅｔ ａｌ．に記載の方法を使用して監視される。
患者の患者において存在する（例えば、患者の血清における、末梢組織（例えば、肝臓組織、脾臓組織など）における）本開示による記載の形質導入遺伝子産物のレベルを、例えば、ウエスタンブロット分析、酵素機能アッセイ、または画像化研究によってアッセイする。
実施例７：ＣＮＳ形態の治療
本実施例は、ゴーシェ病のＣＮＳ形態の治療のための本明細書に記載のｒＡＡＶのインビボアッセイを記載する。簡潔に述べると、ＣＮＳ形態のゴーシェ病（例えば、２型または３型ゴーシェ病）を有すると特定されたゴーシェ病患者は、本開示による記載のｒＡＡＶを投与される。患者のＣＮＳにおいて（例えば、患者のＣＮＳの血清において、患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）において、または患者のＣＮＳ組織において）存在する本開示による記載の形質導入遺伝子産物のレベルを、例えば、ウエスタンブロット分析、酵素機能アッセイ、または画像化研究によってアッセイする。
実施例８：ＧＢＡ１において変異を有する対象におけるパーキンソン病の遺伝子療法
本実施例は、ＧＢＡ１遺伝子における変異によって特徴付けられるパーキンソン病を有する対象への、ＧＢＡ１をコードする組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の投与を記載する。
ｒＡＡＶベクター挿入物は、ヒトＧＢＡ１（栗色）のコドン最適化コード配列（ＣＤＳ）を構成的に発現するために、４つの部分、ＣＭＶエンハンサー（ＣＭＶｅ）、ＣＢＡプロモーター（ＣＢＡｐ）、エクソン１、及びイントロン（ｉｎｔ）からなるＣＢＡプロモーター要素（ＣＢＡ）を含む。３’領域はまた、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素（ＷＰＲＥ）、それに続くウシ成長ホルモンポリＡシグナル（ｂＧＨポリＡ）尾部を含む。隣接ＩＴＲは、介在配列の正しいパッケージングを可能にする。５’ＩＴＲ配列の２つの変異型（図７、挿入ボックス、下部配列）を評価し、これらの変異型は、ＩＴＲの２０ヌクレオチド「Ｄ」領域内にいくつかのヌクレオチドの差異を有し、これはパッケージング及び発現の効率に影響を与えると考えられる。ｒＡＡＶベクター生成物は、図７（挿入ボックス、上部配列）に示される「Ｄ」ドメインヌクレオチド配列を含む。変異体「Ｄ」ドメイン（本明細書では「Ｓ」ドメインと称され、ヌクレオチド変化が陰影によって示される）を有する変異型ベクターについても、前臨床研究において同様に実施された。骨格は、カナマイシンに対する耐性を付与する遺伝子、及び逆パッケージングを防止するためのスタッファー配列を含む。ｒＡＡＶベクターを示す概略図を図８に示す。ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ９血清型キャプシドタンパク質を使用してｒＡＡＶにパッケージ化される。
ＧＢＡ１－ｒＡＡＶは、大槽（大槽内、ＩＣＭ）への蛍光透視誘導後頭下注射を介して単回用量として対象に投与される。投与レジメン試験の一実施形態は以下のとおりである。
実施例８．１：ＧｃａｓｅをコードするｒＡＡＶでのインビボ薬理学試験
初期試験は、ヒトＧＢＡ１のコドン最適化されたコード配列（配列番号１５）、及びＰＲ００１Ｂ ｒＡＡＶ Ｓ－バリアント構築物（以下にさらに記載）を含むＰＲ００１Ａ ｒＡＡＶベクター（ＡＡＶ９．ＣＢＡ．ＧＢＡ１．Ａ）（図５５に提供されるベクターをコードするプラスミドの概略図）の有効性及び安全性を評価するために、ＧＣａｓｅの阻害剤であるコンズリトール－β－エポキシド（ＣＢＥ）の日次送達にて、化学マウスモデルにおいて実施された。さらに、初期試験は、ホモ接合性ＧＢＡ１変異を保有し、サポシンが部分的に欠損している（４Ｌ／ＰＳ－ＮＡ）遺伝子マウスモデルにおいて行われた。マウス及び非ヒト霊長類（ＮＨＰ）における追加の用量範囲試験を実施して、ベクターの安全性及び有効性をさらに評価する。
これらのマウスモデルは、ＧＣａｓｅ活性の低下、ＧＣａｓｅの糖脂質基質の蓄積、運動挙動の欠損、及び炎症を反映するアストログリオーシス及び小膠細胞症を含む神経病理学的変化を含む、ｎＧＤ（神経障害性ゴーシェ病）及びＰＤ－ＧＢＡ（ＧＢＡ１遺伝子における変異によって特徴付けられるパーキンソン病を有する）の特徴的な表現型を示す。ＰＲ００１Ａの脳室内注射は、これらの疾患関連表現型のすべてを抑制した。さらに、４Ｌ／ＰＳ－ＮＡモデルはα－シヌクレインの蓄積を示し、４Ｌ／ＰＳ－ＮＡモデルにおけるＰＲ００１ＡのＩＣＶ投与は、α－シヌクレインの蓄積を減少させた。
ＡＡＶ骨格における５’逆位末端反復（ＩＴＲ）の２つのわずかに異なるバージョンを試験して、製造可能性及び導入遺伝子発現を評価した（図７）。１４５ｂｐの５’ＩＴＲ内の２０ｂｐの「Ｄ」ドメインは、最適なウイルスベクター産生に必要であると考えられているが、「Ｄ」ドメイン内の変異が、場合によっては導入遺伝子発現を増加させることも報告されている。したがって、完全なままの「Ｄ」ドメインを保有するＰＲ００１Ａウイルスベクターに加えて、変異体Ｄドメイン（本明細書において「Ｓ」ドメインと称される）を有する第２のベクター形態（ＰＲ００１Ｂ）も評価した。ＰＲ００１Ａ ｒＡＡＶ及びバリアントＰＲ００１Ｂ ｒＡＡＶの両方が同じ導入遺伝子を発現する。両方のベクターが、以下に詳述するようにインビボで有効なウイルスを産生したが、野生型「Ｄ」ドメインを含むＰＲ００１Ａ ｒＡＡＶをさらなる開発のために選択した。
非臨床インビボ薬理学（有効性）試験を表１４に要約する。合計１０件の試験が完了した。４件の主要試験は、後続のセクションで詳細に考察される。
実施例８．１．１：ＣＢＥマウスモデル試験
ＣＢＥモデルの概要
ＣＢＥ化学マウスモデルにおいて、ＧＣａｓｅの選択的かつ不可逆的な共有結合競合阻害剤を使用して、ＧＣａｓｅ活性の薬理学的阻害が達成され、糖脂質（ＧｌｕＣｅｒ及びＧｌｕＳｐｈ）の蓄積、アストログリオーシス及び小膠細胞症を含む神経病理学的変化、ならびに運動行動欠損をもたらす（Ｍａｎｎｉｎｇ－Ｂｏｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ．２００９；３０（６）：１１２７－３２、Ｆａｒｆｅｌ－Ｂｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｓ Ｍｏｄｅｌ Ｍｅｃｈ．２０１１；４（６）：７４６－５２、Ｒｏｃｈａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｏｘｉｄ Ｒｅｄｏｘ Ｓｉｇｎａｌ．２０１５；２３（６）：５５０－６４）。
ＣＢＥは、ＧＣａｓｅの薬理学的阻害剤であり、ＣＢＥで処置したマウスは、ＧＣａｓｅの機能喪失と一致する表現型を示す。ＣＢＥの投薬量を変化させ、したがって、インビボでのＧＣａｓｅ阻害の程度を変化させることにより、異なるＧＢＡ１関連障害において見られる様々な程度の酵素欠損を再現し、それによって得られる表現型の重症度を調節することが可能である。このため、ＣＢＥマウスモデルは、ＧＣａｓｅ欠損の遺伝子モデルよりも有意な技術的利点を有し、ＰＤ－ＧＢＡに対して魅力的なモデルとなる。ＣＢＥモデルにおけるＧＣａｓｅ活性の全身的な減少は、ＣＮＳ及び末梢器官全体にわたってＧＣａｓｅ活性の減少を伴って存在するＰＤ－ＧＢＡを有する患者のように、ヒト疾患を再現する。ＣＢＥは、内因性ＧＣａｓｅ活性及びＰＲ００１Ａ処置から生じる外因性ＧＣａｓｅ活性の両方を阻害するため、このモデルはＰＲ００１Ａの効果を過小評価すると予想される。
試験ＰＲＶ－２０１７－００１：ＣＢＥ用量範囲試験
ＧＣａｓｅ欠損のＣＢＥモデルを確立するために、若齢マウスに、ＣＢＥ、ＧＣａｓｅの特異的阻害剤を投薬した。生後８日目（Ｐ８）で開始して、毎日のＩＰ注射によって、マウスにＣＢＥを与えた。３つの異なるＣＢＥ用量（２５ｍｇ／ｋｇ、３７．５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ）または毎日の腹腔内（ＩＰ）ビヒクル（ＰＢＳ）を試験し、行動表現型を呈するモデルを確立した（図９Ａ～図９Ｆ）。ＣＢＥの高用量は、用量依存的に致死性をもたらした。５０ｍｇ／ｋｇのＣＢＥで処置したすべてのマウスは、Ｐ２３までに死亡し、３７．５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥで処置した８頭のマウスのうち５頭は、Ｐ２７までに死亡した（図９Ａ）。２５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥで処置したマウスに致死性はなかった。ＣＢＥで処置したマウスは、ＣＢＥ用量と相関した体重増加不能を示した。本試験の生存中部分の終わりであるＰ２７では、重量差は、対照動物と、２５または３７．５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥのいずれかで処置したものとの間で統計的に有意であり、５０ｍｇ／ｋｇのＣＢＥで処置したマウスはいずれも、Ｐ２７まで生存しなかった（図９Ｂ、図９Ｃ）。ＣＢＥ注射のマウスがオープンフィールドアッセイで全般的な運動欠損を示さなかった（ＰＢＳを与えられたマウスと同じ距離を、同じ速度で移動した、図９Ｆ）のに対し、ＣＢＥ処置のマウスは、ロータロッドアッセイによって測定されるように運動協調性及びバランスの欠損を呈した（図９Ｄ）。
試験終了まで生存したマウスを、最後のＣＢＥ投与の翌日（Ｐ２７、「１日目」）またはＣＢＥ離脱の３日後（Ｐ２９、「３日目」）に屠殺した。２５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥを与えたマウスの皮質に対して脂質分析を行い、１日目及び３日目の両方のコホートにおけるＧＣａｓｅ基質の蓄積を評価した。ＧｌｕＳｐｈ及びＧａｌＳｐｈレベル（本実施例において、凝集体で測定した）は、ＧＣａｓｅ不全と一致して、ＰＢＳ処置の対照と比較して、ＣＢＥ処置のマウスにおいて顕著に蓄積された（図９Ｅ）。
要約すると、毎日の２５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥ注射ＩＰの用量は、ＧＣａｓｅ活性の阻害と一致する、運動行動の欠損及びＧＣａｓｅ基質の蓄積（ＧｌｕＳｐｈ及びＧａｌＳｐｈレベルの凝集物）をもたらした。したがって、２５ｍｇ／ｋｇの用量を、ベクターの持続性を評価するためのより長い試験を可能にしながら、ヒト疾患の核心的特徴を再現したので、後続の研究のために選択した。
試験ＰＲＶ－２０１８－００２：ＣＢＥモデルにおけるＰＲ００１Ｂの有効性
上述の試験に基づいて、生存に影響を与えることなく行動欠損を生じさせたため、２５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥ用量を選択した。すべての非臨床マウス試験において、脳室内（ＩＣＶ）注射を投与経路（ＲＯＡ）として選択した。大槽内（ＩＣＭ）注射（意図された臨床ＲＯＡ）はマウスにおいて技術的に困難であるため、ＩＣＶ注射が、脳脊髄液（ＣＳＦ）への治療薬のＩＣＭ送達を再現するのに最も適切な代替アプローチとみなされた。ＣＢＥ処置中に脳全体にわたる広いＧＢＡ１分布及び導入遺伝子発現を達成するために、４μＬのビヒクル（ｄＰＢＳ＋０．００１％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８、「ｄＰＢＳ」）または８．８×１０９ｖｇ（１５０ｍｇの脳重量に基づいて、５．９×１０１０ｖｇ／ｇ脳）のＰＲ００１Ｂを、Ｐ３でＩＣＶ注射によって送達し、ＰＢＳまたは２５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥ処置の毎日のＩＰ注射を、Ｐ８で開始した（図１０）。ＣＢＥ処置がＰＲ００１Ｂの効果を完全に隠すかどうかを判定するために、最終ＣＢＥ注射の１日後であるＰ３６に半数の動物を屠殺し、残りの半数はＣＢＥ離脱を行い、最終ＣＢＥ注射の３日後であるＰ３８に屠殺した。すべての測定値について、各群を組み合わせて分析し、収集日を共変量として補正した。
ＣＢＥ処置マウスは、ＰＲ００１Ｂ処置で減衰した体重の進展の減少を示した（図１１Ａ、図１１Ｂ）。ｒＡＡＶを受けたＣＢＥ処置のマウスは、賦形剤を受けたマウスよりも、ロータロッド上で統計学的に有意に良好に行動した（図１１Ｃ）。バリアントベクター処置群のマウスは、試験中に移動した総距離に関して、賦形剤処置のマウスと差異はなかった（図１１Ｄ）。
生存中試験の完了時に、生化学分析のために、半数のマウスは、最後のＣＢＥ投与の翌日に（Ｐ３６、「１日目」）、またはＣＢＥ離脱の３日後（Ｐ３８、「３日目」）に屠殺された（図１２Ｂ～図１２Ｄ）。生物学的三重で実施した蛍光測定酵素アッセイを使用して、皮質におけるＧＣａｓｅ活性を評価した。ＧＣａｓｅ活性は、ＰＲ００１Ｂ ｒＡＡＶで処置したマウスにおいて増加したが、ＣＢＥ処置はＧＣａｓｅ活性を低下させた（図１２Ｂ）。加えて、ＣＢＥ及びＰＲ００１Ｂ ｒＡＡＶの両方を受けたマウスは、ＰＢＳ処置群と同様のＧＣａｓｅ活性レベルを有し、これは、ｒＡＡＶの送達が、ＣＢＥ処置によって誘導されるＧＣａｓｅ活性の阻害を克服することができることを示す。マウスの運動皮質に対して脂質分析を行い、基質ＧｌｕＣｅｒ及びＧｌｕＳｐｈのレベルを調査した。ＣＢＥ及びｒＡＡＶ処置を与えられたマウスの脳において蓄積した両方の脂質は、ＧｌｕＣｅｒ蓄積を有意に減少させ、ＧｌｕＳｐｈ蓄積を減少させる傾向があった（図１２Ｃ、図１２Ｄ）。
脂質レベルは、処置群にわたってＧＣａｓｅ活性及びロータロッド上の性能の両方と負の相関があった。ｒＡＡＶ投与後のＧＣａｓｅ活性の増加は、基質の減少及び運動機能の増強と関連した（図１３）。
図１４に示されるように、予備的な生体内分布は、ｑＰＣＲによって測定して、ベクターゲノムの存在によって評価した（１μｇのゲノムＤＮＡあたり１００超のベクターゲノムを陽性として定義した）。ＰＲ００１Ｂ ｒＡＡＶを受けたマウスは、ＣＢＥの有無の両方で、皮質におけるｒＡＡＶベクターゲノムについて陽性であり（図１２Ａ）、これは、ＩＣＶ送達が、皮質へのｒＡＡＶ送達をもたらすことを示す。さらに、ベクターゲノムは、肝臓、脾臓、心臓、及び肺において検出され、腎臓においてはレベルが低く、生殖腺においては検出されなかった（図１４）。すべての測定値について、１日目群及び３日目群の間に統計学的有意差はなかった（データは示していない）。
要約すると、８．８×１０９ｖｇ（５．９×１０１０ｖｇ／ｇ脳）の用量でＩＣＶ注射したＰＲ００１Ｂは、脳及び末梢組織に分布し、酵素的に活性なＧＣａｓｅが脳において発現した。ＰＲ００１Ｂは、ロータロッドでの生化学的（すなわち、糖脂質レベル）欠損及び性能を改善した。ＰＲ００１Ｂの効果を見るためにＣＢＥ離脱は必要ではなかったため、それ以降のすべての試験においては、最終ＣＢＥ用量の１日後にマウスを屠殺した。
試験ＰＲＶ－２０１８－００５：ＣＢＥモデルにおける用量範囲ＰＲ００１Ａ
例示的な用量範囲の試験の設計を示す概略図を図１５Ａに示す。
ＣＢＥモデルにおけるより大規模な試験により、ＣＢＥモデルにおけるＰＲ００１ ｒＡＡＶの有効用量をさらに探索した。２５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥ用量モデルを用いて、賦形剤またはＰＲ００１ ｒＡＡＶを、Ｐ３でＩＣＶを介して送達し、Ｐ８で毎日のＩＰ ＰＢＳまたはＣＢＥ処置を開始した。以前の試験で観察されたＣＢＥ離脱有無の群間の類似性を考慮して、すべてのマウスを最終ＣＢＥ用量の１日後に屠殺した（Ｐ３８～４０）。３つの異なるｒＡＡＶ用量の効果を評価し、群当たり１０頭のマウス（５Ｍ／５Ｆ）での以下の５つの群の結果をもたらした。
賦形剤ＩＣＶ＋ＰＢＳ ＩＰ
賦形剤ＩＣＶ＋２５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥ ＩＰ
２．０ｅ９ｖｇ（１．３ｅ１０ｖｇ／ｇ脳）のｒＡＡＶ ＩＣＶ＋２５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥ ＩＰ。
６．２ｅ１０ｖｇ（４．２ｅ１０ｖｇ／ｇ脳）のｒＡＡＶ ＩＣＶ＋２５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥ ＩＰ。
２．０ｅ１０ｖｇ（１．３ｅ１１ｖｇ／ｇ脳）のｒＡＡＶ ＩＣＶ＋２５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥ ＩＰ。
ＣＢＥ処置動物は、対照動物よりも低い速度で体重が増加し、この動物モデルにおける典型的な観察である。最高用量では、ＰＲ００１ＡはＣＢＥ処置に関連する体重増加の失敗を補正した。さらに、この用量は、ＰＲ００１Ａを受けなかったＣＢＥ処置群と比較して、ロータロッド及びテーパービームのタスクにおいて統計学的に有意な改善をもたらした（図１５Ｂ～図１５Ｅ）。脳ＧＣａｓｅ活性は、ロータロッド上の性能と正の相関があった。致死性が、賦形剤処置群及びｒＡＡＶ処置群の両方を含むいくつかの群において観察された。
生存中試験の完了時に、生体内分布及び生化学分析のためにマウスを屠殺した（図１６Ａ～図１６Ｄ）。調査した組織のうち、脳、脊髄、肝臓、脾臓、心臓、腎臓、及び肺は、中程度用量及び最高用量でベクターゲノムについて陽性であった。脳、脊髄、肺、及び心臓は、低用量でも陽性であった（図１６Ａ）。生殖腺はどの用量でも陽性ではなかった。蛍光測定アッセイを使用して、すべての組織における酵素活性を測定することによって評価した有効なＧＣａｓｅ活性は、ＣＢＥでの処理後、最大６０％減少した（図１６Ｂ）。ＰＲ００１Ａの最高用量で、ＧＣａｓｅ活性は、脳、脊髄、及び心臓において有意に増加した。ＣＢＥ処置は、内因性ＧＣａｓｅと同じ程度にＰＲ００１ＡにコードされたＧＣａｓｅの活性を約５０％阻害するため、ＣＢＥモデル試験は、ＧＣａｓｅ活性によって測定されるＰＲ００１Ａの効力を約２倍過小評価する可能性が高いことに留意されたい。ＣＢＥ処置マウスは、脳皮質においてＧｌｕＣｅｒ及びＧｌｕＳｐｈの蓄積を示した。高用量のＰＲ００１Ａは、それらの蓄積を減少させた（図１６Ｃ、図１６Ｄ）。
反応性アストログリオーシス及び小膠細胞活性化は、神経障害性ＧＤ及びＰＤ－ＧＢＡ患者において説明されるＣＮＳ病理の顕著な炎症性側面である（Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ ２００４、Ｇｉｎｎｓ ｅｔ ａｌ ２０１４）。この試験において、ＣＢＥ処置マウスは、ＣＢＥの状況においてＣＮＳ活性化を示す以前の試験と一致して、大脳皮質において、反応性アストログリオーシスの症状であるグリア瘢痕形成を示した（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ ２０１１）。ＰＲ００１Ａ処置は、グリア瘢痕表現型の統計的に有意な用量依存的減少をもたらした（図１６Ｅ）。したがって、ＰＲ００１処置は、ＣＮＳにおけるＧＣａｓｅ欠損に関連する神経病理を抑制する。この試験からの組織病理学的所見の完全な説明は、毒性のセクションで考察されている。
ＧＣａｓｅ及びイオン化カルシウム結合アダプター分子１（Ｉｂａ１、小膠細胞症のマーカー）発現について、皮質において免疫組織化学検査を行った（図１６Ｆ）（Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ ２００４、Ｖｉｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ ２０１６）。ＧＣａｓｅの発現は、ＣＢＥ＋賦形剤処置動物と比較して、ＰＲ００１Ａで処置したすべてのマウスにおいて有意に増加し、送達された用量と相関した。Ｉｂａ１染色は、ＰＢＳを受けたマウスと比較してＩｂａ１染色が有意に増加したＣＢＥ＋賦形剤を受けたマウスと比較して、ＰＲ００１Ａで処置されたマウスにおいて、用量依存的に有意に減少した。
要約すると、ＰＲＶ－２０１８－００５試験の結果は、３用量レベルでのＰＲ００１ＡのＩＣＶ投与が、広範なベクターゲノム生体内分布、ＧＣａｓｅ活性の増加、運動行動エンドポイントの改善、及び糖脂質蓄積の減少につながったことを示している。神経炎症の２つの異なる尺度（小膠細胞症及びアストログリオーシス）は、ＰＲ００１Ａで処置したマウスにおいて用量依存的に、統計的に有意な減少を示した。ＣＢＥモデルは、ＣＢＥがＰＲ００１Ａ処理による酵素活性も阻害するため、ＰＲ００１Ａの効力を本質的に過小評価する。まとめると、これらの結果は、ＣＢＥマウスモデルにおいて、２．０×１０１０ｖｇ（１．３×１０１１ｖｇ／ｇ脳）でのＰＲ００１ＡのＩＣＶ投与が有効であったことを示す。有効性への傾向は、エンドポイントのサブセットにおいて低用量のＰＲ００１Ａで観察された。
試験ＰＲＶ－２０１８－００７：ＣＢＥモデルにおけるＰＲ００１Ａの長期の影響
本試験は、ＣＢＥマウスモデルにおけるＰＲ００１Ａベクターコピー数生体内分布の持続性及びＰＲ００１Ａ媒介ＧＣａｓｅ発現の耐久性を評価した。単回用量の賦形剤またはＰＲ００１Ａを、Ｐ３でＩＣＶを介して送達し、毎日のＩＰ ＰＢＳまたはＣＢＥ処置を、Ｐ８で開始し、Ｐ１８３～Ｐ１８５まで続けた（図３６）。最終ＣＢＥ用量の１日後にすべてのマウスを屠殺した。いずれの群においても致死性は観察されなかった。
ＣＢＥ処置マウスにおけるＰＲ００１Ａの単回ＩＣＶ用量は、ＩＣＶ投薬の約１か月後に見られたレベルと同等のレベル（試験ＰＲＶ－２０１８－００５を参照）で投薬の６か月後にベクターゲノムコピーの存在をもたらした（図３７Ａ）。慢性ＣＢＥ処置は、ＧＣａｓｅ活性レベルの低下をもたらし、ＧＣａｓｅ活性は、ＰＲ００１Ａを受けたマウスにおいてほぼ正常化され、ＰＲ００１Ａの単回用量がＧＣａｓｅの耐久性のある発現をもたらすことを示す（図３７Ｂ）。６か月ＣＢＥで処置されたマウスは、１か月のＣＢＥ処置を受けたマウスと比較して、大脳皮質における糖脂質基質ＧｌｕＣｅｒ及びＧｌｕＳｐｈの顕著な蓄積を示した。Ｐ３でのＰＲ００１Ａの単回投与は、ほぼ野生型レベルへのＧｌｕＣｅｒ及びＧｌｕＳｐｈレベルの有意な低下をもたらした（図３７Ｃ、図３７Ｄ）。
試験ＰＲＶ－２０１８－００８：ＣＢＥモデルにおける追加の用量範囲ＰＲ００１Ａ
この試験は、ＰＲ００１Ａの追加用量を評価して、最小有効用量を決定し、より高い用量の耐容性を調査することを意図していた。しかしながら、予期しない投薬逸脱があったため、この試験はＰＲＶ－２０１８－００５からの用量を再現した。ＰＲＶ－２０１８－００５（図１５Ａ）と同様の設計に従い、４μＬの賦形剤またはＰＲ００１Ａを、Ｐ３でＩＣＶを介して送達し、毎日のＩＰ ＰＢＳまたはＣＢＥ処置を、Ｐ８で開始し、Ｐ５１～Ｐ５３まで続けた。
先の試験とは異なり、ＣＢＥ処置は、体重の顕著な変化をもたらさなかった。ＣＢＥ処置は、ロータロッド及びテーパービームでの成績において著しく低下した結果をもたらしたが、ＰＲ００１Ａによる処置は、この成績を著しく変化させなかった（図３８Ａ～図３８Ｅ）。
調査した組織のうち、脳、脊髄、肝臓、心臓、及び肺は、すべての用量レベルでＰＲ００１Ａについて陽性であった。腎臓も中程度及び最高用量では陽性であったが、脾臓は最高用量でのみ陽性であった。生殖腺も調査したが、いずれの用量レベルでも陽性ではなかった（図３９）。ＧＣａｓｅ活性を、選択した臓器においてのみ評価した。大脳皮質において、低用量及び中程度用量のＰＲ００１Ａは、ＧＣａｓｅ活性レベルをＰＢＳ＋賦形剤レベル以上に回復させたが、これは統計的有意性には達しなかった。高用量のＰＲ００１Ａは、ＣＢＥ＋賦形剤処置動物のレベルと比較して、ＧＣａｓｅ活性を顕著に増加させる傾向であった（図４０）。
このモデルにおける他の試験と一致して、ＣＢＥ処置マウスは、脳におけるＧｌｕＳｐｈ及びＧｌｕＣｅｒの蓄積を示し、ＰＲ００１Ａを投与することによって減少した（図４１、図４１Ｂ）。用量依存的に、すべての用量のＰＲ００１Ａは、ＧｌｕＳｐｈレベルを顕著に低下させ、一方で、中程度及び高用量は、ＧｌｕＣｅｒレベルを顕著に低下させた。
この試験は、ＰＲＶ－２０１８－００５からの所見を確認し、ＰＲ００１Ａ処置は、広範な生物分布と、ＣＢＥ処置によって引き起こされる糖脂質基質の蓄積を顕著に減少させるＧＣａｓｅ活性の堅牢な上昇をもたらすことを示した。この試験は、ＰＲＶ－２０１８－００５で観察された行動表現型を再現しなかったが、これらの表現型はマウスにおいては可変であり、信頼性が低いことが知られている。
ＰＲＶ－２０１８－０２５：ＣＢＥモデルにおけるさらなる用量範囲ＰＲ００１Ａ
ＰＲＶ－２０１８－００８における試験偏差を考慮して、先の用量範囲試験を拡張するために、ＣＢＥモデルで追加試験を実施した。ＰＲ００１ＡのＩＣＶ投与及びＰＢＳまたはＣＢＥのＩＰ注射は、ＰＲＶ－２０１８－００５と同じプロトコルに従った。しかしながら、この試験は、最小有効用量を調査するためのより低いＰＲ００１Ａ用量、及び耐容性を調査するためのより高い用量を含んだ。
この試験において、ＣＢＥ処置は、経時的な体重増加不能には至らなかったが、ロータロッド及びテーパービームの両方において、ＣＢＥ＋賦形剤動物において、運動性能の統計学的に有意な減少が観察された。５．２×１０１０ｖｇのＰＲ００１Ａで処置すると、ＰＢＳ＋賦形剤動物とほぼ同じレベルまで運動性能が有意に改善した。１．７×１０１０ｖｇのＰＲ００１Ａで処置した動物においても改善が観察されたが、これは有意性には達しなかった（図４２Ａ～図４２Ｄ）。
ＰＲ００１Ａで処置した動物の大脳皮質は、すべての用量でベクターゲノムについて陽性であり、５．２×１０１０ｖｇのＰＲ００１Ａでの処置は、ＧＣａｓｅ活性の有意な増加をもたらした。１．７×１０１０ｖｇのＰＲ００１Ａでの処置は、活性をほぼ野生型レベルに回復した（図４３Ａ～図４３Ｂ）が、これは統計的有意性には達しなかった。
このモデルにおける他の試験と一致して、ＣＢＥ処置マウスは、脳におけるＧｌｕＳｐｈ及びＧｌｕＣｅｒの蓄積を示し、これは、１．７×１０１０ｖｇまたは５．２×１０１０ｖｇのいずれかでＰＲ００１Ａを投与することによって有意に減少した（図４４Ａ～図４４Ｂ）。
本試験は、ＣＢＥモデルにおける先の試験からの所見を確認し、拡張した。本試験は、ＰＲＶ－２０１８－００５において観察された行動表現型を完全に再現しなかったが、１．７×１０１０ｖｇのＰＲ００１Ａでロータロッドとテーパービームの両方において、非有意な改善が見られ、５．２×１０１０ｖｇのＰＲ００１Ａの処置は、両方のタスクにおける性能を有意に向上させた。さらに、いずれの用量の処置でも、糖脂質基質の蓄積を減少させ、他のＣＢＥ試験からの結果を確認した。
ＣＢＥモデル試験の要約
ＣＢＥモデル試験の結果は、ＰＲ００１Ａが、ＩＣＶ注射によってＣＮＳ及び末梢組織にも効果的に送達され得ることを示す。ＣＮＳ内で、ＰＲ００１ＡのＩＣＶ送達は、ＧＣａｓｅ活性の一貫した増加、糖脂質基質ＧｌｕＣｅｒ及びＧｌｕＳｐｈの減少、グリア瘢痕形成の減少、ならびにいくつかの運動欠損の改善をもたらした。評価したこれらの効果は、処置後６か月まで持続した。
実施例８．１．２：４Ｌ／ＰＳ－ＮＡ遺伝子マウスモデル試験
４Ｌ／ＰＳ－ＮＡモデルの概要
４Ｌ／ＰＳ－ＮＡマウスは、ＧＤ及びＰＤ－ＧＢＡの確立された遺伝子モデルである（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．２００５；４６（１０）：２１０２－１３、Ｍａｚｚｕｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２０１１；１４６（１）：３７－５２、Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ．２０１１；１０２（４）：４３６－４７）。これらのマウスは、ＧＢＡ１のＶ３９４Ｌ変異についてホモ接合性であり、さらに、ＧＣａｓｅの活性化因子であるサポシンＣをコードするＰＳＡＰの変異を有し、変異体ＧＣａｓｅ酵素の存在及び低レベルのＧＣａｓｅ活性化因子サポシンＣは、一緒になって、重度のＧＣａｓｅ活性の減少、糖脂質基質の蓄積、及び運動行動欠損をもたらす。これらのマウスは、ビームウォーク、ロータロッド、及びワイヤハングアッセイにおけるそれらの性能によって証明されるように、運動強度、協調性、及びバランスの欠損を呈する。典型的には、これらのマウスの寿命は２２週未満である。本試験における「対照」マウスは、Ｇｂａ１におけるＶ３９４Ｌ変異についてホモ接合性であるが、内因性プロサポシン遺伝子については野生型であり、したがって、ＧＣａｓｅ活性のより穏やかな低下を有する。ＰＲ００１Ａでの処置はサポシンＣに影響を及ぼさないため、４Ｌ／ＰＳ－ＮＡマウスにおいて得られた結果は、ヒトにおける予測される効果を過小評価している可能性が高いことに留意されたい。これらのマウスにおいて、ＰＲ００１Ａで２つの試験が実施された。
試験ＰＲＶ－２０１８－００６：４Ｌ／ＰＳ－ＮＡ遺伝モデルにおけるＰＲ００１Ａ
試験ＰＲＶ－２０１８－００６において、ＰＲ００１Ａまたは賦形剤を３～４週齢の４Ｌ／ＰＳ－ＮＡマウスにＩＣＶに送達し、ＰＲ００１Ａの投与から１５週間後に動物を屠殺した。３μＬの未希釈ベクターの用量（合計１．５×１０１０ｖｇ、３．７×１０１０ｖｇ／ｇ脳）を投与した（図４５）。
４Ｌ／ＰＳ－ＮＡマウスにおいて進行性運動障害が観察され、ＰＲ００１Ａでの処置は、処置の５週間後及び９週間後のビームウォークに有意ではない改善をもたらした。処置の１５週後、群間に統計学的有意差はなかった。４Ｌ／ＰＳ－ＮＡマウスにおけるＰＲ００１Ａベクターゲノムの生体内分布を、投薬の約１５週間後で定量化した。大脳皮質、脊髄、肝臓、腎臓、心臓、肺、脾臓、及び生殖腺を含む、調査したすべての組織は、ベクターゲノムについて陽性であった。（図４６）。蛍光測定アッセイを使用して評価した、組織溶解物におけるＧＣａｓｅ活性の分析は、皮質及び肝臓において有効なＧＣａｓｅ活性の有意な増加を明らかにした（図４７）。
対照動物由来の溶解物と比較して、４Ｌ／ＰＳ－ＮＡマウス由来の脳溶解物においてＧｌｕＳｐｈ及びＧｌｕＣｅｒの統計的に有意な蓄積があった。４Ｌ／ＰＳ－ＮＡマウスにおいて、ＰＲ００１Ａでの処置は、ＧｌｕＳｐｈの蓄積の統計的に有意な減少、及びＧｌｕＣｅｒの減少への傾向（Ｐ＝０．１６）をもたらした（図４８Ａ、図４８Ｂ）。
先の研究は、α－シヌクレイン病理学におけるＧＣａｓｅの提案された役割と一致して、４Ｌ／ＰＳ－ＮＡマウスモデルの皮質におけるα－シヌクレインタンパク質の蓄積の増加を実証している（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．２００５；４６（１０）：２１０２－１３、Ｍａｚｚｕｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２０１１；１４６（１）：３７－５２、Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ．２０１１；１０２（４）：４３６－４７）。可溶性及び不溶性α－シヌクレインの大脳皮質レベルを生化学的に調査した。賦形剤で処置した４Ｌ／ＰＳ－ＮＡマウスにおいて、大脳皮質における不溶性α－シヌクレイン及び可溶性α－シヌクレインに対する不溶性の比率の非有意な増加があり、ＩＣＶ ＰＲ００１Ａでの処置は、これらの効果を逆転させた（それぞれ、Ｐ＝０．１９、Ｐ＝０．８７）（図４９Ａ、図４９Ｂ）。これらのデータは、α－シヌクレインの蓄積の減少を実証する実施例２．１に記載のインビトロ試験と一致する。
ビームウォーク試験による運動性能を、ｒＡＡＶの送達の４週間後に評価した。ＰＲ００１Ａ ｒＡＡＶを受けた変異体マウスの群は、賦形剤で処置した変異体マウスと比較して、総スリップが少なく、速度当たりのスリップが少ない傾向を示し、運動機能を野生型レベル近くまで回復させた（図１７）。
試験ＰＲＶ－２０１８－０１１：４Ｌ／ＰＳ－ＮＡ遺伝モデルにおける用量範囲ＰＲ００１Ａ
４Ｌ／ＰＳ－ＮＡマウスを用いた第２の試験は、試験ＰＲＶ－２０１８－００６において使用されたものと同様の設計を使用して、ＰＲ００１Ａ用量の範囲を探索した（図５０）。
ビームウォーク試験で、４Ｌ／ＰＳ－ＮＡマウスは、対照マウスよりも有意に悪く振舞った。２．９×１０１１ｖｇ、９．３×１０１０ｖｇ、または２．９×１０１０ｖｇのＰＲ００１Ａで処置した４Ｌ／ＰＳ－ＮＡマウスは、１８週目に賦形剤で処置した４Ｌ／ＰＳ－ＮＡマウスと比較して有意な改善を示した（図５１）。前の時点では、ＰＲ００１Ａの影響はなかった。４Ｌ／ＰＳ－ＮＡマウスと対照マウスとの間にロータロッド試験結果に差はなく、ＰＲ００１Ａ処置はこの転帰に影響を及ぼさなかったようである。
すべてのＰＲ００１Ａ処置群は、皮質におけるベクターゲノムについて陽性であった。蛍光測定アッセイを使用して評価した有効なＧＣａｓｅ活性を皮質において測定し、２．９×１０１１ｖｇのＰＲ００１Ａで処置したマウスにおいて有意に増加したことが見出された（図５２Ａ、図５２Ｂ）。
可溶性及び不溶性α－シヌクレインの大脳皮質及び海馬レベルを生化学的に調査した。４Ｌ／ＰＳ－ＮＡマウスと対照動物との間にこれらのレベルに差はなく、文献に発表された報告は、可変のα－シヌクレイン表現型を示している。
賦形剤で処置した４Ｌ／ＰＳ－ＮＡマウスの小脳において、ＧｌｕＳｐｈ及びＧｌｕＣｅｒの統計的に有意な蓄積があった。ＰＲ００１Ａによる処置は、ＧｌｕＳｐｈのレベルの用量依存的な減少への傾向、及びＧｌｕＣｅｒの統計的に有意な用量依存的な減少をもたらした（図５３Ａ、図５３Ｂ）。
４Ｌ／ＰＳ－ＮＡ遺伝子マウスモデルの要約
４Ｌ／ＰＳ－ＮＡマウスは、２つの試験にわたって測定された表現型に対して変動性を示したが、全体的なデータは、ＣＢＥモデルの所見及び発表されたデータと一致した：ＧＣａｓｅ欠損は、糖脂質基質のレベルの増加及び運動行動欠損と関連した。ＩＣＶ ＰＲ００１Ａでの処置は、これらの表現型を強く減弱させた。試験ＰＲＶ－２０１８－００６において、大脳皮質における不溶性α－シヌクレインレベルは、公開された研究において報告されているように、対照マウスと比較して、４Ｌ／ＰＳ－ＮＡにおいて非有意に増加した（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．２００５；４６（１０）：２１０２－１３、Ｍａｚｚｕｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２０１１；１４６（１）：３７－５２、Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ．２０１１；１０２（４）：４３６－４７）。ＩＣＶ ＰＲ００１Ａでの処置は、本明細書に開示されるインビトロ分析と一致して、そのような蓄積を逆転させた。総合すると、これらの試験はＰＲ００１Ａの臨床開発を支持する。
実施例８．１．３：インビボα－シヌクレインモデル試験
試験ＰＲＶ－２０１８－０１９及びＰＲＶ－２０１９－００１：ＣＢＥで処置したα－シヌクレイントランスジェニックマウスにおけるＰＲ００１Ａ
ＰＲ００１Ａがα－シヌクレイン病理に及ぼす影響をさらに調査するために、２つの試験を、ＳｎｃａノックアウトバックグラウンドでヒトＰＤ関連α－シヌクレインＡ５３Ｔ変異導入遺伝子についてホモ接合性であるｄｂｌ－ＰＡＣ－Ｔｇ（ＳＮＣＡＡ５３Ｔ）、Ｓｎｃａ－／－マウスにおいて行った（Ｓｎｃａはマウスα－シヌクレインタンパク質をコードする）。これらのマウスは、生後６～１２か月の間に消化管表現型及び微妙な運動異常を示すが、脳におけるα－シヌクレイン病理を広範囲に示さないことが報告されている（Ｋｕｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．２０１０；１９（９）：１６３３－５０）。ヒトα－シヌクレインＡ５３Ｔトランスジェニックマウスモデルにおける先の研究は、ＣＢＥによるかかるマウスの処置が、α－シヌクレインレベルの上昇をもたらすことを報告している（Ｒｏｃｋｅｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．２０１６；２５（１３）：２６４５－６０、Ｐａｐａｄｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．２０１８；２７（１０）：１６９６－１７１０）。これらの公表された所見のために、及びこのモデルにおけるＧＣａｓｅ欠損の効果を検証するために、これらのマウスをＣＢＥで処置した。９～１０週齢で、ＩＣＶ注射により、マウスを１０μＬの賦形剤または２．９×１０１１ｖｇ（７．４×１０１１ｖｇ／ｇ脳、４００ｍｇの脳重量に基づく）のＰＲ００１Ａで処置した。ＩＣＶ処置の２週間後、ＩＰ ＰＢＳまたは１００ｍｇ／ｋｇのＣＢＥを１週間毎日与えた。
大脳皮質におけるベクターゲノムの存在及びＧＣａｓｅ活性を評価した。ＰＲＶ－２０１８－０１９について、ＣＢＥ処置での皮質糖脂質基質の増加を確認し、Ｊｅｓｓ機器での自動キャピラリーＳｉｍｐｌｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ（商標）免疫ブロットシステムを使用して、海馬溶解物由来のα－シヌクレインレベルを評価した。モノマー及び高分子量（ＨＭＷ）種の存在と一致する、複数のα－シヌクレイン免疫反応バンドが観察された。ＨＭＷα－シヌクレイン種の単量体α－シヌクレインレベルに対する比率の統計的に有意な減少が、ＣＢＥ投与されたα－シヌクレイントランスジェニックマウスのＰＲ００１Ａ処置で観察された（図５４Ａ、図５４Ｂ）。
非臨床的有効性試験の要約
上記の試験は、ＰＲ００１Ａの単回ＩＣＶ注射が、ＧＢＡ１をマウスのＣＮＳ及び末梢組織に効果的に送達することを示す。ＰＤ－ＧＢＡ及びｎＧＤの２つの動物モデルにおいて、ＰＲ００１Ａは、ＣＮＳにおけるＧＣａｓｅ活性を上昇させた。ＧＣａｓｅ活性の増加は、脳における糖脂質基質の蓄積を減少させた。これらの糖脂質基質は、意図された臨床試験についてのバイオマーカー転帰尺度として提案される。重要なことに、これらの利点は、ＰＲ００１Ａによる単回処置後、少なくとも６か月間継続する。ＣＢＥモデルは、ＰＤ－ＧＢＡ、ｎＧＤを有する患者、及びこれらの障害の動物モデルにおける典型的な組織病理学的所見である、反応性アストログリオーシス及び小膠細胞症を提示する（Ｈａｍｂｙ ａｎｄ Ｓｏｆｒｏｎｉｅｗ，Ｎｅｕｒｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．２０１０；７（４）：４９４－５０６、Ｆａｒｆｅｌ－Ｂｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｓ．Ｍｏｄｅｌ Ｍｅｃｈ．２０１１；４（６）：７４６－７５２、Ｆａｒｆｅｌ－Ｂｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．２０１１；２０（７）：１３７５－８６、Ｂｏｏｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１７；４０（６）：３５８－７０、ＭｃＭａｈｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ．２０１８；１２３（２）：Ｓ９３）。ＰＲ００１Ａは、ＣＢＥ誘導反応性神経膠症及び小膠細胞症を予防または逆転させることができる。両方のモデルは運動欠損を表示し、ＰＲ００１Ａでの処置は両方のモデルにおいてこれらの欠損のいくつかを改善する。これらの２つのモデルとともに、追加のマウスモデルを使用して、α－シヌクレイン病理を調査した。α－シヌクレイン表現型は、マウスモデルでは可変であるが、ＰＲ００１Ａは、それらが観察された場合に表現型を抑制または逆転させることができ、追加のインビトロ試験は、α－シヌクレインレベルを減少させるＰＲ００１Ａの有効性を支持する。総合すると、これらの試験は、ＰＤ－ＧＢＡ及びｎＧＤのモデルにおけるＰＲ００１Ａの有効性を支持する。
実施例８．１．４：毒性
単回投与マウス試験
マウスモデルにおいてＰＲ００１Ａで実施した安全性及び毒性試験を表１５に要約する。マウスモデル有効性試験のうちの２つ（ＰＲＶ－２０１８－００５及びＰＲＶ－２０１８－００６）には、疾患モデルにおけるＰＲ００１Ａの安全性を評価するための組織病理学などの選択された安全性エンドポイントも含まれていた。
試験ＰＲＶ－２０１８－００５：ＣＢＥモデルにおける用量範囲ＰＲ００１Ａ
組織病理学的分析を、脳、胸髄、心臓、肝臓、脾臓、肺、及び腎臓のヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色によって実施し、結果を理事会認定の獣医病理学者によって評価した。ＣＢＥで処置したマウスにおいて、ＣＮＳにおける所見は、大脳皮質、脳幹、及び胸髄におけるグリア瘢痕及びニューロン壊死を含む。最大１．３×１０１１ｖｇ／ｇの用量での脳室内ＰＲ００１Ａは、これらのマウスにおいて良好な忍容性を有し、この最高用量は、これらのＣＮＳ所見の発現の顕著な減少をもたらし、低用量及び中程度用量のＰＲ００１Ａは、大脳皮質においてグリア瘢痕を有する動物の数の用量依存的な減少を有し、ニューロン壊死などの他のＣＮＳ所見への曖昧な影響を有した。末梢組織において、ＣＢＥまたはＰＲ００１Ａのいずれの副作用も観察されなかった。要約すると、ＣＢＥマウスモデルでの試験において、ＰＲ００１Ａでの処置に起因する有害な組織病理学的所見または毒性の証拠はなかった。
実施例９：ｒＡＡＶベクターのインビトロ分析
単独でまたはＧＢＡ１及び／または１つ以上の阻害性ＲＮＡと組み合わせて、プロサポシン（ＰＳＡＰ）及びＳＣＡＲＢ２をコードするｒＡＡＶベクターのインビトロ活性を評価するためにパイロット試験を行った。ＰＳＡＰ及びプログラニュリン（ＰＧＲＮ）をコードする１つの構築物も試験した。試験したベクターは、表３に示されるものを含む。「Ｏｐｔ」は、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）における発現のためにコドン最適化された核酸配列を指す。図１８は、構築物の各々でのＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクションが、モックトランスフェクション細胞と比較して対応する遺伝子産物の過剰発現をもたらしたことを示す代表的なデータを示す。
実施例１０：ＩＴＲ「Ｄ」配列の配置及び細胞形質導入
ｒＡＡＶベクターの細胞形質導入に対するＩＴＲ「Ｄ」配列の配置の効果を調査した。図１９に示すように、ＨＥＫ２９３細胞を、１）野生型ＩＴＲ（例えば、導入遺伝子挿入物の近位にあり、ＩＴＲの末端の遠位にある「Ｄ」配列）または２）ベクターの「外側」に位置する「Ｄ」配列を有するＩＴＲ（例えば、ＩＴＲの末端に近位であり、導入遺伝子挿入物の遠位にある「Ｄ」配列）を有するＧｃａｓｅコード化ｒＡＡＶで形質導入した。驚くべきことに、データは、「外側」位置に位置する「Ｄ」配列を有するｒＡＡＶが、パッケージ化され、細胞を効率的に形質導入する能力を保持することを示す（図２０）。
実施例１１：インビボ毒性試験
５０頭のマウスに、生後３日目に４μＬの脳室内（ＩＣＶ）注射を介してＧＢＡ１をコードするｒＡＡＶを投与した。すべてのマウスは、生後８日目から試験終了まで、処置群に応じて、コンズリトール－Ｂ－エポキシド（ＣＢＥ）またはＰＢＳの腹腔内（ＩＰ）注射を毎日受けた。動物を、最後のＩＰ投与の２４時間後に安楽死させた。安楽死の後、標的組織を採取し、冷却された４％パラホルムアルデヒド中に落として固定し、４℃で保管し、次いで、組織病理学的処理及び評価のために送付された。
３８～４０日に安楽死させた４２頭の動物由来の組織の不要部分を切り落とし、処理し、パラフィンブロックに包埋した。次いで、これらを、約５μｍに切片化し、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色し、評価のためにスライドへ貼り付けた。
ｒＡＡＶでの処置に起因する組織病理学的所見または毒性の証拠はなかった。コンズリトールＢ－エポキシド（ＣＢＥ）で処置したマウスにおいて、大脳皮質におけるグリア瘢痕及びニューロン壊死、ならびに脳幹及び胸髄におけるニューロン壊死を含む中枢神経系（ＣＮＳ）における所見があった。高用量ｒＡＡＶ処置は、これらのＣＮＳ所見の発現の顕著な減少をもたらし、一方、低用量及び中程度用量ウイルスは、大脳皮質におけるグリア瘢痕の発現の用量依存的な減少を有し、他のＣＮＳ所見については曖昧な効果を有した（図２８）。
皮質におけるＧＣａｓｅ及びＩｂａ１の発現を評価するために、免疫組織化学を行った（図２９Ａ～２９Ｂ）。ＧＣａｓｅ発現は、ＣＢＥ／賦形剤処置動物と比較して、ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１で処置したすべての動物において有意に増加した。ＧＣａｓｅ発現の増加は、送達された用量と相関し、高用量処置動物において最も高いＧＣａｓｅ発現が観察され、中程度及び低用量処置動物と続いた。小膠細胞症のマーカーであるＩｂａ１は、ＣＢＥ／賦形剤で処置した動物において有意に増加した。すべての用量のｒＡＡＶ－ＧＢＡ１は、Ｉｂａ１染色を減少させ、ＣＢＥモデルにおける小膠細胞症を緩和した。小膠細胞症は、神経障害性ＧＤ及びこの障害のモデルにおいてよく説明されたエンドポイントである。
実施例１２：ＧｃａｓｅをコードするｒＡＡＶでの非ヒト霊長類試験
ヒトＧＢＡ１のコドン最適化コード配列（配列番号１５）を含むＰＲ００１Ａ（ＡＡＶ９．ＣＢＡ．ＧＢＡ１．Ａ）の安全性を、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）においてインビボで評価した。ＰＲ００１Ａ構成要素の追加の詳細は、上記に提供される。ＮＨＰの脳は、ヒトのものと最も類似しており、ＮＨＰ脊髄及びＣＳＦの体積ならびに流量の解剖学的特徴は、ＩＣＭ（大槽内）注射を可能にする。ヒトとの解剖学的類似性のため、ＮＨＰ試験は、ＰＲ００１Ａの臨床投与を支持する信頼できる生体内分布データを提供することが期待された。
ＰＲ００１Ａの安全性及び生体内分布を、カニクイザルマカクを対象とした３つの毒性試験（表８）、２つの非ＧＬＰ（優良試験所基準）試験（ＰＲＶ－２０１８－０１５及びＰＲＶ－２０１９－００５）及びより大規模な２１ＣＦＲ５８ ＧＬＰ準拠試験（ＰＲＶ－２０１８－０１６）で評価した。
ＰＲ００１Ａ最終製品がＩＣＭ投与後にＮＨＰ脳に送達されることを確認するために、ＮＨＰにおいてパイロット非ＧＬＰ試験（ＰＲＶ－２０１８－０１５）を実施した。ＮＨＰにおけるＧＬＰ毒性及び生体内分布試験（ＰＲＶ－２０１８－０１６）は、ＰＲ００１Ａの安全性及び生体内分布を評価した。
ＮＨＰにおいて試験した用量は、投与される体積及び試験品力価によって決定される最大実行可能用量を含む。さらに、ＧＬＰ試験において、より低い用量も評価された。ＧＬＰ試験の時点は、処置後であるが、ピーク発現前（７日目）、ピーク発現の開始（３０日目）、及びピーク後の長期発現（１８３日目）を選択して、安全性を評価した。
試験ＰＲＶ－２０１８－０１５：ＰＲ００１Ａの非ＧＬＰ ＮＨＰ試験
ＰＲ００１Ａの非ＧＬＰパイロット耐性及び生体内分布試験が、雄のカニクイザルにおいて実施された。この試験の目的は、ＩＣＭ送達後の様々な脳領域及び主要な末梢臓器へのＰＲ００１Ａの生体内分布を検証することであった。潜在的な早期毒性の有意義な測定を可能にすることが予測されたため、最も顕著に機能的観察バッテリー（ＦＯＢ）によって測定された早期生存中観察を伴って、計画されたＧＬＰ ＮＨＰ毒性試験に情報を提供するために、屠殺のための時点を選択した。くも膜下腔内ＡＡＶ送達の試験は、導入遺伝子発現が注射の２～３週間後でピークに達することを実証している（Ｈｉｎｄｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１４；２２（１２）：２０１８－２７、Ｈｉｎｄｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ．２０１４；１：１４０５１、Ｈｉｎｄｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１５；２３（８）１２９８－３０７、Ｈｉｎｄｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ．２０１６；１１９（１－２）：１２４－３０）。したがって、１８日目の評価は、注射手順または試験品に対する先天的な炎症反応に起因する即時の毒性を検出するとともに、初期のピーク発現に対応する時点での導入遺伝子の生体内分布及び発現に関する情報を提供するはずである。試験設計は、免疫抑制が潜在的な毒性の緩和において有益かどうかを判断するために、ＰＲ００１Ａと組み合わせたラパマイシン処置（０．３ｍｇ／ｋｇの経口、－３日目～１８日目）の群を含んだ。脳における導入遺伝子発現を増加させるために、試験における１つの群は、ＩＣＭ送達と組み合わせて両側の黒質緻密部を標的とする中脳への直接のＰＲ００１Ａの実質内（ＩＰａ）投与を含んだ。ＩＣＭ投与体積は、０．５ｍＬであり、投与の経験がある最大体積であり、ＩＰａ用量は、両側で１０μＬであり、ＩＣＭ単独の場合は１．４７×１０１３ｖｇ、ＩＣＭ及びＩＰａの両方での処置の場合は１．５３×１０１３ｖｇの用量となる。７４ｇの推定脳重量で、これは、ＩＰａと組み合わせてＩＣＭ投与を受ける群の場合、ＩＣＭの２．０×１０１１ｖｇ／ｇ脳の用量及び２．１×１０１１ｖｇ／ｇ脳の用量となる。この試験の設計の表形式の要約を表９に示す。
略語：ＦＯＢ、機能的観察バッテリー；ＧＬＰ、優良試験所基準；Ｈ＆Ｅ、ヘマトキシリン及びエオシン；ＩＣＭ、大槽内；Ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐ、免疫抑制；ＩＰａ、実質内；ＭｇＣｌ２、塩化マグネシウム；ＮａＣｌ、塩化ナトリウム；ＮＨＰ、非ヒト霊長類；ｑＰＣＲ、定量的ポリメラーゼ連鎖反応；ＲＯＡ、投与経路；ｖｇ、ベクターゲノム（複数可）。
Ｈ＆Ｅ分析は、２人の独立した理事会認定の獣医病理学者によって実施され、両者はＰＲ００１Ａ関連の毒性所見はなかったと結論付けた。観察された脊髄の変化は、ＩＣＭ注射時の外傷の結果である可能性が高く、ＰＲ００１Ａに関連するものではないと考えられた。非神経系組織におけるすべての組織病理学的所見は、対照サルにおいて一般的に見られる自発的または偶発的な変化とみなされた。全体的に、脳または脊髄において確定的な有害なＰＲ００１Ａ効果はなかった。
レビューした病理学者は、髄膜、脳または脊髄実質、及び／または注射部位（これらの組織における）の非特異的変化（主に単核細胞の可変浸潤）が、試験品と関連している可能性が高いことを指摘したが、病理学者はこれらの変化が有害であるとは考えなかった。記載される重症度で、同様の浸潤は、髄膜及び／または血液脳関門を破壊する実験手順を有する任意のサルにおいて観察されることが合理的に予想され得る。さらに、いくつかの浸潤（特に、脈絡叢内及び時折実質におけるのもの）は、対照サルにおいて概して観察される（Ｂｕｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｐａｔｈｏｌ．２０１５；４３：５１３－８）。観察された他のすべての組織病理学的所見は、賦形剤及びＰＲ００１Ａ処置の動物において偶発的及び／または同様の発生率及び重症度であるとみなされ、したがって、ＰＲ００１Ａの投与とは無関係であるとみなされた。同じ組織試料をレビューした第２の独立した理事会認定の獣医病理学者は、すべての所見は、賦形剤のみを受けた対照群を含むすべての群にわたって非特異的であるため、注射処置中に生じた偶発的所見または外傷と区別できないことを指摘した。さらに、別の理事会認定の獣医病理学者が非ＧＬＰ組織をレビューし、ＰＲ００１Ａ関連の影響はないと結論付けた。
全体的に、群にかかわらず、及び時点にわたって、試験過程中のＦＯＢスコア、体重増加、または食物消費量に変化はなかった。中脳における小膠細胞の形態は、（Ｉｂａ１染色で決定したように）処置群間で異なるようには思われなかった。中脳のチロシンヒドロキシラーゼ陽性ニューロンの発現及び形態は、処置群にわたって異なっていなかった。１８日目までに、ＡＡＶ９－ｎＡｂ力価が、すべてのＰＲ００１Ａ処置動物において増加したが、賦形剤処置対照動物は、ベースラインと比較してわずかな変化しか示さなかった。経口ラパマイシンを受けた群におけるサルのうちの１頭は、ＰＲ００１Ａ処置を受けた他の動物（１：２５６超）と比較して、１８日目のＡＡＶ９ ｎＡｂ力価が低く（１：６４）、力価の差は、生体内分布に影響を及ぼさなかったように見えるが、試料サイズが小さすぎて、決定的ではない。
定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）を使用して収集したすべての試験試料における生体内分布を評価した。組織は、少なくとも１００ｖｇ／μｇのＤＮＡで陽性とみなされた（これらの基準は、マウス有効性試験における陽性組織の評価にも使用された）。試験したすべての組織は、ＰＲ００１Ａで処置したすべての群において陽性であり、ＣＮＳ及び末梢にわたって広範囲に分布していることを示した。さらに、中脳への両側ＩＰａ投与と組み合わせてＰＲ００１ＡのＩＣＭ投与を受けた動物は、局所的発現を増加させた。ラパマイシンによる処置は、安全性または生体内分布に何ら影響を及ぼさなかったようである（図３０に示される選択された代表的な領域）。注目すべきは、対照動物のいくつかの組織（脳橋、脊髄、室傍、後根神経節、及び肺）も、ｑＰＣＲによって決定されるように陽性であったことである。異なる処置群における動物にわたって、及び各動物内の異なる臓器間の交差汚染のリスクが増加することを示す剖検手順について、いくつかの問題が指摘された。今後の試験のために汚染を最小限に抑えるために、剖検手順に変更を実施した。しかしながら、ｑＰＣＲに陽性であったいずれの動物にも有害な毒性所見はなかった。導入遺伝子発現（ＧＣａｓｅ活性）の分析は、対照と比較して、ＰＲ００１Ａ処置動物におけるＧＣａｓｅ活性の有意な増加を示さなかった。ＧＣａｓｅ活性は、ＧＬＰ ＮＨＰ毒性試験ＰＲＶ－２０１８－０１６においてより詳細に探索された。
総合すると、非ＧＬＰ ＮＨＰ臨床試験ＰＲＶ－２０１８－０１５の結果は、生存中または死後の評価のいずれにおいても、安全性または毒性の懸念はないことを示した。すべての動物は、予定された剖検日まで生存し、死後の病理学的分析は、有害な毒性の懸念は示さなかった。試験はまた、脳におけるＰＲ００１Ａの均一な生物学的分布を示した。
試験ＰＲＶ－２０１８－０１６：ＰＲ００１ＡのＧＬＰ ＮＨＰ試験
試験設計
このＧＬＰ試験の目的は、投与の７日後、３０日後、または１８３日後の観察期間で、カニクイザルにＩＣＭ注射を介して１回投与した場合のＰＲ００１Ａの毒性及び生体内分布を評価することであった。この試験は、２つの用量レベルを評価するように設計されており、最高用量は、１．２ｍＬ体積（投与の経験があった最高体積）の未希釈の試験品で達成可能な最大実行可能用量であり、低用量は、高用量よりも１／２対数単位低い用量である。用量は、４．６×１０１２ｖｇの低用量、及び１．７×１０１３ｖｇの高用量に等しく、カニクイザルにおける脳重量推定値は７４ｇであり、これは、約６．２×１０１０ｖｇ／ｇ脳及び２．３×１０１１ｖｇ／ｇ脳と変換される。この試験は、動物が１．２ｍＬの賦形剤のみ（２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、２００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２及び０．００１％［ｗ／ｖ］のポロキサマー１８８）を受ける対照群も含んだ。この試験は、雄及び雌のカニクイザルマカクの両方を利用した。７日目の群は、最高用量での１頭の雄を含み、早期毒性のためのセンチネルとして設計され、残りの２つの時点（３０日目及び１８３日目）には、各用量での２頭の雄と１頭の雌を含んだ。複数の脳領域由来の試料に加えて、ｑＰＣＲ分析のために末梢組織試料を収集した。ｑＰＣＲで陽性であったすべての試料を、導入遺伝子発現について分析した。この試験の設計の表形式の要約を表１０に示す。
略語：ＣＳＦ、脳脊髄液；ＤＲＧ、後根神経節；Ｆ、雌；ＧＡＬＴ、腸関連リンパ組織；ＧＬＰ、優良試験所基準；ＩＣＭ、大槽内；Ｍ、雄；ＭｇＣｌ２、塩化マグネシウム；ＮａＣｌ、塩化ナトリウム；ＮＨＰ、非ヒト霊長類；ｑＰＣＲ、定量的ポリメラーゼ連鎖反応；ｖｇ、ベクターゲノム（複数可）。ａ２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、２００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、及び０．００１％（ｗ／ｖ）のポロキサマー１８８。
カニクイザルＮＨＰを、死亡率／罹患率（毎日）、臨床観察（毎日）、体重（ベースライン及びその後毎週）、食物消費の目視検査（毎日）、神経学的観察（ベースライン及び２週目及び２６週目の間）、間接眼底検査（ベースライン及び２週目及び２６週目の間）、及び心電図（ＥＣＧ）測定（ベースライン及び２週目及び２６週目の間）を含む複数の生存中観察及び測定によって評価した。
ＡＡＶ９キャプシドに対するｎＡｂの分析を、ベースライン時及び７日目、３０日目、または１８３日目の屠殺時に実施した。血液学、凝固、臨床化学、及び尿検査からなる臨床病理検査を、ベースライン時に２回（血液検査、尿検査について１回）、及び投与段階の１週目及び１３週目の間に１回行った。
動物を安楽死させ、７日目、３０日目、または１８３日目に組織を回収した。組織を、すべての動物から収集し、重量を測定し（該当する場合）、複製に分割した。組織病理学的評価のために、１０％中性緩衝ホルマリン（最適な固定のために特別な固定剤が必要な場合を除く）中に１個の複製物を保存した（すべての動物）。ｑＰＣＲ及び導入遺伝子発現分析のためにさらなる複製物を収集した。
安全性及び毒性
すべての動物は、予定された剖検日まで生存し、予期しない死亡はなかった。いずれの群についても、生存中評価に懸念または問題は存在せず、剖検時の肉眼的検査では、いずれのコホートにおいてもＰＲ００１Ａ関連の異常は見られなかった。
いかなるＰＲ００１Ａ関連の臓器重量の差、または肉眼的もしくは顕微鏡的所見も、７日目もしくは３０日目の中間屠殺時、または１８３日目の終末屠殺時のいずれの群にも存在しなかった。主に脳幹の領域における血管周囲出血の局所領域によって特徴付けられる出血が、対照を含むすべての群にわたって存在し、したがって、手順に関連し（剖検前のＣＳＦ収集）、ＰＲ００１Ａとは関連しないとみなされた。脳または脊髄における最小限の単核浸潤を含む他のすべての顕微鏡所見は、低発症率で発生したために自発的及び／または偶発的であるとみなされ、群間（同時対照を含む）にランダムに分布し、及び／またはその重症度は、この年齢のサルに対して予想されるとおりであり、したがって、それらはＰＲ００１Ａに関連しないとみなされた。
臨床病理学的試験結果において、ＰＲ００１Ａ関連所見は観察されず、ベクターに対する免疫応答と一致する最も高い抗ＡＡＶ９力価を示す動物において、フィブリノーゲンの増加が見られた。抗ＡＡＶ９抗体についての陽性力価は、ＰＲ００１Ａを投与されたすべての動物において７日目までに観察された。ＰＲ００１Ａ関連の臨床観察、体重変化、眼科的観察、または身体的もしくは神経学的検査所見は見られなかった。平均ＰＲ間隔、ＱＲＳ期間、ＱＴ間隔、補正ＱＴ（ＱＴｃ）間隔、または心拍数においてＰＲ００１Ａ関連の差異は、いずれかの用量のＰＲ００１Ａを投与された雄のみまたは雌雄の組み合わせにおいて観測されなかった。ＰＲ００１Ａ関連の不整脈または異常な波形は観察されなかった。
０、６．２×１０１０、または２．３×１０１１ｖｇ／ｇ脳のＰＲ００１Ａの用量レベルは、雄及び雌のサルに大槽での単回注射を介して投与した場合に良好な耐容性があった。ＰＲ００１Ａにおいて、遺伝子産物に関連すると考えられる生存中、臨床病理学的、または解剖病理学的観察は観察されなかった。
生体内分布及び免疫応答
ベクターゲノムコピーの生体内分布分析を、ｑＰＣＲベースのアッセイを使用して実施し（ベクター存在）、導入遺伝子（ＧＢＡ１）の発現を、ベクターゲノム存在について陽性であった試料において測定した。３０日目及び１８３日目に、調査したすべての組織（ＣＮＳ及び末梢を含む）は、高用量（２．３×１０１１ｖｇ／ｇ脳）での処置後に、ｑＰＣＲ分析によって陽性であった（図３０に示される１８３日目から代表的な領域を選択した）。３０日目に、精巣及び卵巣から採取した組織試料は、高用量のＰＲ００１Ａ（２．３×１０１１ｖｇ／ｇ脳）で処置したすべてのＮＨＰにおいて形質導入について陽性であった。加えて、低用量のＰＲ００１Ａ（６．２×１０１０ｖｇ／ｇ脳）で処置した１頭の雄のＮＨＰは、３０日目の精巣において陽性であった。１８３日目において、１頭の雄及び１頭の雌は、高用量での処置後の生殖腺におけるＰＲ００１Ａ形質導入について陽性であり、低用量で処置した２頭の雄は精巣において陽性であった。
処置されたＮＨＰにおいてヒトＧＣａｓｅが産生されたことを確認するために、タンパク質レベルを、Ｊｅｓｓ機器でのＳｉｍｐｌｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ（商標）免疫ブロットシステムで評価した。ＰＲ００１Ａを投薬したＮＨＰから得られた皮質、海馬、及び中脳試料からの結果は、賦形剤のみを受けた正常なＮＨＰ由来の試料と比較して、凝集体で分析した場合のＧＣａｓｅ発現のレベルの上昇を示し、対照群との統計的比較のために低用量及び高用量群の両方を組み合わせた（図３１Ａ及び図３１Ｂ）。これらの結果は、ＩＣＭ投与後のＮＨＰにおけるＰＲ００１Ａの効果的で広範な形質導入が、ＧＣａｓｅレベルの増加につながることを示す。
結論として、生体内分布所見は、ＮＨＰにおけるＰＲ００１ＡのＩＣＭ投与が、脳及び末梢臓器におけるヒトＧＢＡ１導入遺伝子の堅牢かつ広範な形質導入をもたらすことを示す。ＮＨＰ生体内分布データの要約において、ＰＲ００１ＡのＩＣＭ投与は、マウスモデルにおいて有効であることが示されているレベルと同等の脳全体の広範な生体内分布をもたらし、この形質導入は、脳におけるＧＣａｓｅタンパク質レベルの上昇につながる。
試験ＰＲＶ－２０１９－００５：ＰＲ００１Ａの非ＧＬＰ ＮＨＰ試験
試験設計
非ＧＬＰ試験を、１２頭の雄のカニクイザルマカクで実施し、投与後３０日及び９０日の観察期間でＩＣＭ注射を介して１回投与した場合のＰＲ００１Ａの毒性及び生体内分布を評価した。この試験は、単回用量レベルを評価するように設計されている：カニクイザルマカクの平均脳重量を７４ｇと仮定した場合、５．２×１０１３ｖｇ、または７．０×１０１１ｖｇ／ｇ脳である。投与される用量は、１．２ｍＬ体積（投与の経験があった最高体積）の未希釈のＰＲ００１Ａ製品で達成可能な最大実行可能用量である。この試験は、動物が１．２ｍＬの賦形剤のみ（２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、２００ｍＭのＮａＣｌ、及び１ｍＭのＭｇＣｌ２＋０．００１％［ｗ／ｖ］のプルロニックＦ６８）を受ける対照群も含んだ。生体内分布を測定するためにｑＰＣＲ分析のための複数の脳領域及び末梢臓器由来の試料を収集し、安全性を評価するために臨床病理学的測定及び組織病理学を実施した。この試験の設計の表形式の要約を表１１に示す。
略語：ＣＳＦ、脳脊髄液；ＦＯＢ、機能的観察バッテリー；ＧＬＰ、優良試験所基準；Ｈ＆Ｅ、ヘマトキシリン及びエオシン；ＮＨＰ、非ヒト霊長類；ｑＰＣＲ、定量的ポリメラーゼ連鎖反応；ｖｇ、ベクターゲノム（複数可）。
この試験の一部として、組織を１０％ホルマリン中に固定し、パラフィン中に包埋し、Ｈ＆Ｅ染色スライドを生成するように処理した。デジタルスライドを作成し、独立した理事会認定の獣医病理学者によって調査した。処置の３０日後及び９０日後の両方で、ＰＲ００１Ａ処置動物における所見は、カニクイザルマカクにおいて一般的に観察される所見といずれか一致するか（Ｃｈａｍａｎｚａ ｅｔ ａｌ．，Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｐａｔｈｏｌ．２０１０；３８（４）：６４２－５７）、及び／またはビヒクル対照動物及びＰＲ００１Ａで処置された動物の両方において観察されるかであり、したがって、偶発的であるとみなされたため、ＰＲ００１Ａによる処置に起因する所見はなかった。
試験過程中、治療群と対照群との間に統計学的差異はなかったため、大槽に投与されたＰＲ００１Ａは、体重増加または食物消費に影響を及ぼさなかった。さらに、群にかかわらず、及び時点にわたってＦＯＢスコアの変化はなく、試験の生存中段階で問題または懸念がなかったことを示した。ＡＡＶ９に対するｎＡｂの血漿レベルを、インビトロアッセイを使用して測定した。試料を、ベースライン時（ＩＣＭ投与前）及び屠殺時（３０日目または９０日目のいずれか）に、試験中の動物から調製した。ＰＲ００１Ａによる処置は、ベースラインと剖検の時との間の３０日目及び９０日目の両方で、ＡＡＶ９ ｎＡｂ力価の増加をもたらしたが、一方で、ビヒクル処置動物の力価は全体的に安定したままか、または低下した。
ＰＲ００１Ａの生体内分布及び発現
収集したすべての試験試料において、ｑＰＣＲを使用してＰＲ００１Ａ導入遺伝子の生体内分布を評価し、組織は、アッセイの定量の下限である少なくとも５０ｖｇ／μｇのＤＮＡで陽性とみなされた。試験したすべての組織は、ＰＲ００１Ａで処置したすべての群において陽性であり、ＣＮＳ及び末梢にわたって広範囲に分布していることを示した。３０日目及び９０日目のコホートの両方からの選択された代表的な領域からのデータを図３２に示す。
総合すると、非ＧＬＰ ＮＨＰ臨床試験ＰＲＶ－２０１９－００５の結果は、生存中または死後の評価のいずれにおいても、安全性または毒性の懸念はないことを示した。すべての動物は、予定された剖検日まで生存し、死後の病理学的分析は、有害な毒性の懸念はなかった。
ＮＨＰにおけるＰＲ００１Ａで実施した安全性及び毒性試験を表１６に要約する。
実施例１３：ヒト対象における第１／２相試験
ＧＢＡ１変異を有するパーキンソン病
ヒト対象が、ＰＲ００１Ａ ｒＡＡＶの無作為化二重盲検偽手順対照試験に登録される。対象の包含基準は、単一または二対立遺伝子のＧＢＡ１変異、中等度から重度のパーキンソン病、及び治験薬の投薬前にバックグラウンドのパーキンソン病の薬の安定した使用を含む。対象は、以下の２つのグループに分けられる。（１）ＰＲ００１低用量（１×１０１４ｖｇ）対プラセボ（Ｎ＝８、６：２）、及び（２）ＰＲ００１高用量（２×１０１４ｖｇ）対プラセボ（Ｎ＝８、６：２）。各被験者は、単回ＩＣＭ（大槽内）注射として治験薬を受ける。試験は、３か月間のバイオマーカー読み出し、１２か月間の臨床読み出し、５年間の安全性及び臨床フォローアップを含む。試験では、以下を分析する。（１）安全性及び耐容性、（２）以下を含む主要なバイオマーカー、すなわちＧｃａｓｅ、ＧｌｕＣｅｒ、及びＧｌｕＳｐｈ（ＣＳＦ及び血液）、（３）以下を含む追加のバイオマーカー：α－シヌクレイン、ＮｆＬ（ニューロフィラメント軽鎖）、ＤＡＴ（ドーパミントランスポーター）ＳＰＥＣＴ（単一光子放射型コンピュータ断層撮影）、及びＭＲＩ（磁気共鳴画像法）、ならびに（４）有効性：ＭＤＳ－ＵＰＤＲＳ（Ｍｏｖｅｍｅｎｔ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｕｎｉｆｉｅｄ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ Ｒａｔｉｎｇ Ｓｃａｌｅ）、認知、及びＡＤＬ（日常生活活動）。
２型ゴーシェ病
ヒト対象（ｎ＝１５）が、ＰＲ００１Ａ ｒＡＡＶの非盲検試験に登録される。対象の包含基準は、０～２４か月齢の乳児、二対立遺伝子ＧＢＡ１変異、２型ゴーシェ病と一致する神経学的徴候及び症状、ならびに安定した標準のケアの背景薬を含む。各被験者は、単回ＩＣＭ（大槽内）注射として治験薬を受ける。試験は、３か月間のバイオマーカー読み出し、１２か月間の臨床読み出し、５年間の安全性及び臨床フォローアップを含む。試験では、以下を分析する。（１）安全性及び耐容性、（２）以下を含む主要なバイオマーカー：Ｇｃａｓｅ、ＧｌｕＣｅｒ、及びＧｌｕＳｐｈ（ＣＳＦ及び血液）、（３）臨床事象（例えば、気管切開、ＰＥＧ（経皮内視鏡的胃瘻造設術）の配置、死亡）までの時間、及び（４）有効性：行動、認知、総運動、機能、ＱｏＬ（生活の質）。
実施例１４：ＧｃａｓｅをコードするｒＡＡＶの静脈内投与の試験
Ｄ４０９Ｖ Ｈｏｍマウスモデルにおいて、ＰＲ００１静脈内用量範囲の試験が実施された。ホモ接合型Ｇｂａ１Ｄ４０９Ｖ／Ｄ４０９Ｖ（Ｄ４０９Ｖ Ｈｏｍ）マウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ， ＭＥ）は、減少したＧＣａｓｅ活性を含むゴーシェ病関連表現型を示す（例えば、Ｓａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１１；１０８（２９）：１２１０１－６を参照）。試験設計を図５９に提供する。群及び用量を表１２に提供する。
†Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から購入した野生型動物であり、同腹子ではない。
ＰＲ００１の静脈内投与は、肝臓における炎症を減少させた（図６０Ａ）。Ｄ４０９Ｖ Ｈｏｍマウスは、肝臓における糖脂質蓄積を示し、これはＰＲ００１処置によって用量依存的に抑制された（図６０Ｂ、図６０Ｃ）。Ｄ４０９Ｖ Ｈｏｍマウスは、脳におけるＧｌｕＳｐｈの蓄積を示し、これはＰＲ００１処理によって減少した（図６１Ｂ）。ＰＲ００１の静脈内投与は、肺における炎症を減少させた（図６２）。
４Ｌ／ＰＳ－ＮＡマウスモデルにおいても、ＰＲ００１静脈内用量範囲試験が実施された。試験設計を図６３に提供する。群及び用量を表１３に提供する。
４Ｌ／ＰＳ－ＮＡマウスは、肝臓における糖脂質の蓄積を示し、これはＰＲ００１処置によって減少した（図６４Ａ、図６４Ｂ）。４Ｌ／ＰＳ－ＮＡマウスは、脳における糖脂質の蓄積を示し、これはＰＲ００１処置によって減少した（図６５Ａ、図６５Ｂ）。
実施例１５：α－シヌクレインを標的とする阻害性ＲＮＡをコードするｒＡＡＶの試験
ＨｅＬａ細胞に、いくつかの感染の多重度（ＭＯＩ）でＰＲ００４またはＰＲ０１４で形質導入した。ＰＲ００４及びＰＲ０１４の両方とも、用量依存的にα－シヌクレインタンパク質レベルを減少させた（図６６Ａ）。ＰＲ００４は、用量依存的にＧＣａｓｅ活性を増加させた（図６６Ｂ）。
ＰＲ００４の有効性を、パーキンソン病患者由来人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来のニューロン培養物において評価した。ＳＮＣＡ三重を有するパーキンソン病患者に由来する人工多能性幹細胞をニューロンに分化させた（図６７Ａ）。ＰＲ００４で形質導入されたニューロンは、ＧＣａｓｅ活性の増加（図６７Ｂ）及びα－シヌクレインタンパク質レベルの減少（図６７Ｃ）を有した。
ＰＲ００４ ｒＡＡＶベクターのオフターゲット効果は観察されなかった。ＰＲ００４ベクターからのＳＮＣＡを標的とするｓｈＲＮＡのオフターゲット効果を、ｑＲＴ－ＰＣＲによってＨＥＫ２９３細胞において評価した。ＳＮＣＡの標的領域と最も配列が類似している１５個の遺伝子の発現を評価した（図６８Ａ）。ＳＮＣＡファミリーメンバーβ及びγシヌクレイン（それぞれ、ＳＮＣＢ及びＳＮＣＧ）の発現も評価した（図６８Ｂ）。これらの遺伝子のｍＲＮＡレベルは、ＰＲ００４によって影響を受けなかった。
ＰＲ００４有効性を、パーキンソン病のＡＡＶ２－ＳＮＣＡ－Ａ５３Ｔ ＡＡＶマウスモデルにおいて評価した（図６９、図７０）。Ａ５３Ｔ変異を有するヒトＳＮＣＡをコードするＡＡＶ２を、成体野生型マウスの黒質に直接注射する。注射の４週間後から、動物は、歩行異常、ドーパミン代謝の変化、ドーパミン作動性ニューロンの喪失、神経炎症、及びリン酸化α－シヌクレイン発現を示す。ＰＲ００４脳室内注射の４週間後（図７１Ａ）及び９週間後（図７１Ｂ）に、自動運動歩行分析（ＭｏｔｏＲａｔｅｒ）を実施した。ＰＲ００４処置効果の傾向が、両方の時点で観察された。
本出願は、参照により、以下の文書の内容全体を組み込む。国際ＰＣＴ出願公開第ＷＯ２０１９／０７０８９４号、国際ＰＣＴ出願公開第ＷＯ２０１９／０７０８９１号、２０１７年１０月３日に出願され、「ＧＥＮＥ ＴＨＥＲＡＰＩＥＳ ＦＯＲ ＬＹＳＯＳＯＭＡＬ ＤＩＳＯＲＤＥＲＳ」と題された米国仮特許出願第６２／５６７，３１１号、２０１７年１０月３日に出願され、「ＧＥＮＥ ＴＨＥＲＡＰＩＥＳ ＦＯＲ ＬＹＳＯＳＯＭＡＬ ＤＩＳＯＲＤＥＲＳ」と題された同第６２／５６７，３１９号、２０１８年１０月３日に出願され、「ＧＥＮＥ ＴＨＥＲＡＰＩＥＳ ＦＯＲ ＬＹＳＯＳＯＭＡＬ ＤＩＳＯＲＤＥＲＳ」と題された同第６２／５６７，３０１号、２０１７年１０月３日に出願され、「ＧＥＮＥ ＴＨＥＲＡＰＩＥＳ ＦＯＲ ＬＹＳＯＳＯＭＡＬ ＤＩＳＯＲＤＥＲＳ」と題された同第６２／５６７，３１０号、２０１７年１０月３日に出願され、「ＧＥＮＥ ＴＨＥＲＡＰＩＥＳ ＦＯＲ ＬＹＳＯＳＯＭＡＬ ＤＩＳＯＲＤＥＲＳ」と題された同第６２／５６７，３０３号、及び２０１７年１０月３日に出願され、「ＧＥＮＥ ＴＨＥＲＡＰＩＥＳ ＦＯＲ ＬＹＳＯＳＯＭＡＬ ＤＩＳＯＲＤＥＲＳ」と題された同第６２／５６７，３０５号。
このように本発明の少なくとも１つの実施形態のいくつかの態様を説明したが、当業者は、様々な変更、修正、及び改善を容易に考えつくことが理解されるであろう。そのような変更、修正、及び改善は、本開示の一部であることが意図され、本発明の趣旨及び範囲内であることが意図されている。したがって、前述の説明及び図面は単なる例にすぎない。
本明細書では本発明のいくつかの実施形態を記載及び例示説明したが、当業者は、本明細書に記載の機能を実行するために、及び／または、結果及び／または利点のうちの１つ以上を得るために様々な他の手段及び／または構造を容易に想起するであろうし、そのような変形及び／または修正の各々は本発明の範囲内であるとみなされる。より一般的には、当業者は、本明細書に記載のすべてのパラメータ、寸法、材料、及び構成が例示であることを意図しており、実際のパラメータ、寸法、材料、及び／または構成は、本発明の教示が使用される特定の用途または複数の用途に依存することを容易に理解するであろう。当業者は、通常の実験のみを使用して本明細書に記載の本発明の特定の実施形態の多くの同等物を認識するか、または通確認することができるであろう。したがって、前述の実施形態は、単なる例として提示され、添付の特許請求の範囲及びその同等の範囲内で、本発明は、具体的に記載され特許請求される以外の方法で実施され得ることを理解されたい。本発明は、本明細書に記載される各個々の特徴、システム、物品、材料、及び／または方法を対象とする。さらに、２つ以上のそのような特徴、システム、物品、材料、及び／または方法の任意の組み合わせが、そのような特徴、システム、物品、材料、及び／または方法が相互に矛盾しない場合、本発明の範囲内に含まれる。
本明細書及び特許請求の範囲において本願で使用される場合、不定冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、反対に明確に示されない限り、「少なくとも１つ」を意味すると理解される必要がある。
本明細書及び特許請求の範囲において本明細書で使用される場合、「及び／または」という表現は、そのように結合された要素の「いずれかまたは両方」、すなわち、ある場合には結合して存在し、他の場合には分離して存在する要素を意味すると理解される必要がある。「及び／または」節によって具体的に特定される要素以外の他の要素は、反対に明確に示されない限り、具体的に特定される要素に関連するかどうかにかかわらず、任意に存在し得る。したがって、非限定的な例として、「含む」などの制限のない言語と組み合わせて使用される場合、「Ａ及び／またはＢ」への言及は、一実施形態において、ＢのないＡ（任意にＢ以外の要素を含む）、別の実施形態において、ＡのないＢ（任意にＡ以外の要素を含む）、さらに別の実施形態において、Ａ及びＢの両方（任意に他の要素を含む）などを指し得る。
本明細書及び特許請求の範囲において本明細書で使用される場合、「または」は、上記で定義された「及び／または」と同じ意味を有すると理解される必要がある。例えば、リストにおいて項目を区切る場合、「または」または「及び／または」は包括的である、すなわち、多数の、またはリストの要素のうちの少なくとも１つを含むが、それのうちの１つより多く、及び任意に、追加のリストされていない項目を含むと解釈されるものとする。「のうちの１つのみ」または「のうちの正確に１つ」などの反対に明確に示される用語のみ、または特許請求の範囲で使用される場合の「からなる」は、多数の、またはリストの要素のうちの正確に１つの要素を含むことを指す。概して、本明細書で使用されるとき、「または」という用語は、「いずれか」、「のうちの１つ」、「のうちの１つのみ」、または「のうちの正確に１つ」などの排他性の用語が先行する場合にのみ、排他的代替（すなわち、「１つまたは他の、しかし両方ではない」）を示すものとして解釈されるべきである。
本明細書及び特許請求の範囲において本明細書で使用される場合、１つ以上の要素のリストに関連する「少なくとも１つ」という表現は、要素のリストの要素の任意の１つ以上から選択される少なくとも１つの要素を意味するが、必ずしも要素のリスト内に具体的に記載される各及びすべての要素のうちの少なくとも１つを含む必要はなく、要素のリストにおける要素の任意の組み合わせを除外しないことが理解される必要がある。この定義はまた、「少なくとも１つ」という表現が指す要素のリスト内で具体的に特定される要素以外の要素が、具体的に特定される要素に関連するかどうかにかかわらず、任意に存在し得ることを可能にする。したがって、非限定的な例として、「Ａ及びＢのうちの少なくとも１つ」（または同等に、「ＡまたはＢのうちの少なくとも１つ」、または同等に、「Ａ及び／またはＢのうちの少なくとも１つ」）は、１つの実施形態において、少なくとも１つ、任意に１つ以上のＡを含み、Ｂが存在しない（及び任意にＢ以外の要素を含む）、別の実施形態において、少なくとも１つ、任意に１つより多いＢを含み、Ａが存在しない（及び任意選択的にＡ以外の要素を含む）、さらに別の実施形態において、少なくとも１つ、任意に１つより多いＡ、及び少なくとも１つ、任意に１つ以上のＢを含むこと（及び任意に他の要素を含む）を指し得る。
特許請求の範囲の要素を修飾するための特許請求の範囲における「第１の」、「第２の」、「第３の」などの順序用語の使用は、それ自体が、ある特許請求の範囲の要素の他の要素に対する重要度、優先度、もしくは順序、または方法の行為が実行される時間的順序を意味するものではなく、特許請求の範囲の要素を区別するために、特定の名前を有する１つの特許請求の範囲の要素を（順序用語の使用について以外で）同じ名前を有する別の要素から区別するためのラベルとしてのみ使用される。
また、反対に明確に示されない限り、１つより多いステップまたは行為を含む本明細書で請求される任意の方法において、方法のステップまたは行為の順序は、必ずしも、方法のステップまたは行為が列挙される順序に限定されないことも理解される必要がある。
本出願において参照されている米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、及び非特許刊行物の各々は、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。
配列
いくつかの実施形態において、１つ以上の遺伝子産物（例えば、第１、第２及び／または第３の遺伝子産物）をコードする発現カセットは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、または４８のうちのいずれか１つに記載の配列を含むか、またはそれからなる（またはそれを有するペプチドをコードする）。いくつかの実施形態において、遺伝子産物は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、または４８のうちのいずれか１つの一部分（例えば、断片）によってコードされる。
番号付けされた実施形態
添付の特許請求の範囲にかかわらず、本開示は、以下の番号付けされた本開示の実施形態を記載する。
１．２つのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）に隣接するＧｃａｓｅタンパク質をコードする発現構築物を含む単離核酸であって、
（ｉ）前記ＩＴＲのうちの少なくとも１つが、野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲ（配列番号２９）に対して修飾「Ｄ」領域を含み、及び／または
（ｉｉ）前記Ｇｃａｓｅが、コドン最適化核酸配列によってコードされる、前記単離核酸。
２．前記Ｇｃａｓｅタンパク質が、配列番号１４に記載のアミノ酸配列またはその一部分を含む、実施形態１に記載の単離核酸。
３．前記Ｇｃａｓｅタンパク質が、コドン最適化核酸配列、任意に配列番号１５に記載の核酸配列によってコードされる、実施形態１または２に記載の単離核酸。
４．前記修飾「Ｄ」領域が、前記発現構築物に対して前記ＩＴＲの外側に位置する「Ｄ」配列である、実施形態１～３のいずれか１つに記載の単離核酸。
５．前記修飾「Ｄ」配列を含む前記ＩＴＲが、３’ＩＴＲである、実施形態１～４のいずれか１つに記載の単離核酸。
６．ＴＲＹ配列をさらに含み、任意に、前記ＴＲＹ配列が、配列番号２８に記載されている、実施形態１～５のいずれか１つに記載の単離核酸。
７．２つのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）に隣接するプロサポシンタンパク質をコードする発現構築物を含む単離核酸であって、
（ｉ）前記ＩＴＲのうちの少なくとも１つが、野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲ（配列番号２９）に対して修飾「Ｄ」領域を含み、及び／または
（ｉｉ）前記プロサポシンが、コドン最適化核酸配列によってコードされる、前記単離核酸。
８．前記プロサポシンタンパク質が、配列番号１６に記載のアミノ酸配列またはその一部分を含む、実施形態７に記載の単離核酸。
９．前記プロサポシンタンパク質が、コドン最適化核酸配列、任意に配列番号１７に記載の核酸配列によってコードされる、実施形態７または８に記載の単離核酸。
１０．前記修飾「Ｄ」領域が、前記発現構築物に対して前記ＩＴＲの外側に位置する「Ｄ」配列である、実施形態７～９のいずれか１つに記載の単離核酸。
１１．前記修飾「Ｄ」配列を含む前記ＩＴＲが、３’ＩＴＲである、実施形態７～１０のいずれか１つに記載の単離核酸。
１２．ＴＲＹ配列をさらに含み、任意に、前記ＴＲＹ配列が、配列番号２８に記載されている、実施形態７～１１のいずれか１つに記載の単離核酸。
１３．２つのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）に隣接するＳＣＡＲＢ２タンパク質をコードする発現構築物を含む単離核酸であって、
（ｉ）前記ＩＴＲのうちの少なくとも１つが、野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲ（配列番号２９）に対して修飾「Ｄ」領域を含み、及び／または
（ｉｉ）前記ＳＣＡＲＢ２が、コドン最適化核酸配列によってコードされる、前記単離核酸。
１４．前記ＳＣＡＲＢ２タンパク質が、配列番号１８に記載のアミノ酸配列またはその一部分を含む、実施形態１３に記載の単離核酸。
１５．前記ＳＣＡＲＢ２タンパク質が、コドン最適化核酸配列、または配列番号１９に記載の核酸配列によってコードされる、実施形態１３または１４に記載の単離核酸。
１６．前記修飾「Ｄ」領域が、前記発現構築物に対して前記ＩＴＲの外側に位置する「Ｄ」配列である、実施形態１３～１５のいずれか１つに記載の単離核酸。
１７．前記修飾「Ｄ」配列を含む前記ＩＴＲが、３’ＩＴＲである、実施形態１３～１６のいずれか１つに記載の単離核酸。
１８．ＴＲＹ配列をさらに含み、任意に、前記ＴＲＹ配列が、配列番号２８に記載されている、実施形態１３～１７のいずれか１つに記載の単離核酸。
１９．第１の遺伝子産物及び第２の遺伝子産物をコードする発現構築物を含む単離核酸であって、各遺伝子産物が、独立して、表１に記載の遺伝子産物またはその一部から選択される、前記単離核酸。
２０．前記第１の遺伝子産物が、Ｇｃａｓｅタンパク質またはその一部分である、実施形態１９に記載の単離核酸。
２１．前記第２の遺伝子産物が、ＬＩＭＰ２もしくはその一部分、またはプロサポシンもしくはその一部分である、実施形態１９または実施形態２０に記載の単離核酸。
２２．干渉核酸（例えば、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡなど）をさらにコードし、任意に、前記干渉核酸が、α－Ｓｙｎの発現を阻害する、実施形態１９～２１のいずれか１つに記載の単離核酸。
２３．１つ以上のプロモーターをさらに含み、任意に、前記１つ以上のプロモーターの各々が、独立して、ニワトリベータアクチン（ＣＢＡ）プロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＣＤ６８プロモーター、またはＪｅＴプロモーターである、実施形態１９～２２のいずれか１つに記載の単離核酸。
２４．内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）をさらに含み、任意に、前記ＩＲＥＳが、前記第１の遺伝子産物及び前記第２の遺伝子産物の間に位置する、実施形態１９～２３のいずれか１つに記載の単離核酸。
２５．自己切断ペプチドコーディング配列をさらに含み、任意に、前記自己切断ペプチドがＴ２Ａである、実施形態１９～２３のいずれか１つに記載の単離核酸。
２６．前記発現構築物が、前記第１の遺伝子産物及び前記第２の遺伝子産物に隣接する２つのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を含み、任意に、前記ＩＴＲ配列のうちの１つが、機能的な末端解離部位を欠く、実施形態１９～２４のいずれか１つに記載の単離核酸。
２７．前記ＩＴＲのうちの少なくとも１つが、野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲ（配列番号２９）に対して修飾「Ｄ」領域を含む、実施形態２６に記載の単離核酸。
２８．前記修飾「Ｄ」領域が、前記発現構築物に対して前記ＩＴＲの外側に位置する「Ｄ」配列である、実施形態２７に記載の単離核酸。
２９．前記修飾「Ｄ」配列を含む前記ＩＴＲが、３’ＩＴＲである、実施形態２７または２８に記載の単離核酸。
３０．ＴＲＹ配列をさらに含み、任意に、前記ＴＲＹ配列が、配列番号２８に記載されている、実施形態２７～２９のいずれか１つに記載の単離核酸。
３１．配列番号１～１２、１４、１６、及び１８のうちのいずれか１つに記載の配列を有する、実施形態１～３０のいずれか１つに記載の単離核酸。
３２．実施形態１～３１のいずれか１つに記載の単離核酸を含む、ベクター。
３３．前記ベクターがプラスミドである、実施形態３２に記載のベクター。
３４．前記ベクターが、ウイルスベクターであり、任意に、前記ウイルスベクターが、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターまたはバキュロウイルスベクターである、実施形態３２に記載のベクター。
３５．実施形態１～３１のいずれか１つに記載の単離核酸、または実施形態３２～３４のいずれか１つに記載のベクターを含む、組成物。
３６．実施形態１～３１のいずれか１つに記載の単離核酸または実施形態３２～３４のいずれか１つに記載のベクターを含む、宿主細胞。
３７．
（ｉ）キャプシドタンパク質、及び
（ｉｉ）実施形態１～３１のいずれか１つに記載の単離核酸、または実施形態３２～３４のいずれか１つに記載のベクターを含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）。
３８．前記キャプシドタンパク質が、血液脳関門を通過することができ、任意に、前記キャプシドタンパク質が、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質またはＡＡＶｒｈ．１０キャプシドタンパク質である、実施形態３７に記載のｒＡＡＶ。
３９．前記ｒＡＡＶが、中枢神経系（ＣＮＳ）の神経細胞及び非神経細胞を形質導入する、実施形態３７または実施形態３８に記載のｒＡＡＶ。
４０．パーキンソン病を有するか，または有する疑いのある対象を治療するための方法であって、前記対象に、実施形態１～３１のいずれか１つに記載の単離核酸、実施形態３２～３４のいずれか１つに記載のベクター、実施形態３５に記載の組成物、または実施形態３７～３９のいずれか１つに記載のｒＡＡＶを投与することを含む、前記方法。
４１．前記投与が、前記対象の前記ＣＮＳへの直接注射を含み、任意に、前記直接注射が、脳内注射、実質内注射、くも膜下腔内注射、大槽内注射、またはそれらの任意の組み合わせである、実施形態４０に記載の方法。
４２．前記対象の前記ＣＮＳへの前記直接注射が、対流増強送達（ＣＥＤ）を含む、実施形態４１に記載の方法。
４３．前記投与が、末梢注射を含み、任意に、前記末梢注射が、静脈内注射である、実施形態４０～４２のいずれか１つに記載の方法。
４４．２型ゴーシェ病または３型ゴーシェ病を有する対象を治療するための方法であって、
（ｉ）グルコセレブロシダーゼ（Ｇｃａｓｅ）タンパク質をコードする導入遺伝子挿入物に作動可能に連結したプロモーターを含む発現構築物を含む核酸を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターであって、前記導入遺伝子挿入物が配列番号１５のヌクレオチド配列を含む、前記ｒＡＡＶベクターと、
（ｉｉ）ＡＡＶ９キャプシドタンパク質と、を含むｒＡＡＶを、前記対象に投与することを含む、前記方法。
４５．前記ｒＡＡＶが、約５×１０１０ｖｇ／ｇ脳～約５×１０１１ｖｇ／ｇ脳の範囲の用量で前記対象に投与される、実施形態４４に記載の方法。
４６．前記ｒＡＡＶが、約１．３×１０１１ｖｇ／ｇ脳の用量で前記対象に投与される、実施形態４４に記載の方法。
４７．グルコセレブロシダーゼ１（ＧＢＡ１）変異を有するパーキンソン病を有する対象を治療するための方法であって、
（ｉ）Ｇｃａｓｅタンパク質をコードする導入遺伝子挿入物に作動可能に連結したプロモーターを含む発現構築物を含む核酸を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターであって、前記導入遺伝子挿入物が配列番号１５のヌクレオチド配列を含む、前記ｒＡＡＶベクターと、
（ｉｉ）ＡＡＶ９キャプシドタンパク質と、を含むｒＡＡＶを、前記対象に投与することを含む、前記方法。
４７．前記ｒＡＡＶが、約５×１０１３ｖｇ～約５×１０１４ｖｇの範囲の用量で前記対象に投与される、実施形態４６に記載の方法。
４８．前記ｒＡＡＶが、約１×１０１４ｖｇまたは約２×１０１４ｖｇの用量で前記対象に投与される、実施形態４６に記載の方法。
４９．前記ｒＡＡＶが、大槽への後頭下注射を介して投与される、実施形態４４～４８のいずれか１つに記載の方法。
５０．１型ゴーシェ病を有する対象を治療するための方法であって、
（ｉ）Ｇｃａｓｅタンパク質をコードする導入遺伝子挿入物に作動可能に連結したプロモーターを含む発現構築物を含む核酸を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターであって、前記導入遺伝子挿入物が配列番号１５のヌクレオチド配列を含む、前記ｒＡＡＶベクターと、
（ｉｉ）ＡＡＶ９キャプシドタンパク質と、を含むｒＡＡＶを、前記対象に投与することを含む、前記方法。
５１．前記ｒＡＡＶが、約５×１０１３ｖｇ～約５×１０１４ｖｇの範囲の用量で前記対象に投与される、実施形態５０に記載の方法。
５２．前記ｒＡＡＶが、静脈内投与される、実施形態５０または５１に記載の方法。
５３．シヌクレイン病またはパーキンソニズムを有する対象を治療するための方法であって、
（ｉ）
（ａ）配列番号１５のヌクレオチド配列を含むＧｃａｓｅタンパク質コード配列、及び
（ｂ）配列番号２０のヌクレオチド配列を含む阻害性核酸コード配列、を含む導入遺伝子を含む発現構築物を含む核酸を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターと、
（ｉｉ）ＡＡＶ９キャプシドタンパク質と、を含むｒＡＡＶを、前記対象に投与することを含む、前記方法。
５４．シヌクレイン病またはパーキンソニズムを有する対象を治療するための方法であって、
（ｉ）配列番号２０のヌクレオチド配列を含む阻害性核酸コード配列を含む導入遺伝子を含む発現構築物を含む核酸を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターと、
（ｉｉ）ＡＡＶ９キャプシドタンパク質と、を含むｒＡＡＶを、前記対象に投与することを含む、前記方法。
５５．前記シヌクレイン病またはパーキンソニズムが、多系統萎縮、パーキンソン病、ＧＢＡ１変異を有するパーキンソン病、レビー小体病、レビー小体型認知症、ＧＢＡ１変異を有するレビー小体型認知症、進行性核上性麻痺、または皮質基底核症候群である、実施形態５３または５４に記載の方法。
５６．前記プロモーターが、ニワトリベータアクチン（ＣＢＡ）プロモーターである、実施形態４４～５５のいずれか１つに記載の方法。
５７．前記ｒＡＡＶベクターが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーをさらに含む、実施形態４４～５６のいずれか１つに記載の方法。
５８．前記ｒＡＡＶベクターが、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素（ＷＰＲＥ）をさらに含む、実施形態４４～５７のいずれか１つに記載の方法。
５９．前記ｒＡＡＶベクターが、ウシ成長ホルモンポリＡシグナル尾部をさらに含む、実施形態４４～５８のいずれか１つに記載の方法。
６０．前記核酸が、前記発現構築物に隣接する２つのアデノ随伴ウイルス逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を含む、実施形態４４～５９のいずれか１つに記載の方法。
６１．各ＩＴＲ配列が、野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列である、実施形態６０に記載の方法。
６２．前記ｒＡＡＶベクターが、５’ＩＴＲ及び前記発現構築物の間のＴＲＹ領域をさらに含み、前記ＴＲＹ領域が、配列番号２８を含む、実施形態４４～６１のいずれか１つに記載の方法。
６３．２型ゴーシェ病または３型ゴーシェ病を有する対象を治療するための方法であって、前記方法が、
（ｉ）５’から３’の順に、
（ａ）ＡＡＶ２ ＩＴＲ、
（ｂ）ＣＭＶエンハンサー、
（ｃ）ＣＢＡプロモーター、
（ｄ）Ｇｃａｓｅタンパク質をコードする導入遺伝子挿入物であって、前記導入遺伝子挿入物が配列番号１５のヌクレオチド配列を含む、前記導入遺伝子挿入物、
（ｅ）ＷＰＲＥ、
（ｆ）ウシ成長ホルモンポリＡシグナル尾部、及び
（ｇ）ＡＡＶ２ ＩＴＲを含む核酸を含む、ｒＡＡＶベクターと、
（ｉｉ）ＡＡＶ９キャプシドタンパク質と、を含むｒＡＡＶを、対象に投与することを含み、
前記ｒＡＡＶが、約５×１０１０ｖｇ／ｇ脳～約５×１０１１ｖｇ／ｇ脳の範囲の用量で前記対象に投与される、前記方法。
６４．ＧＢＡ１変異を有するパーキンソン病を有する対象を治療するための方法であって、前記方法が、
（ｉ）５’から３’の順に、
（ａ）ＡＡＶ２ ＩＴＲ、
（ｂ）ＣＭＶエンハンサー、
（ｃ）ＣＢＡプロモーター、
（ｄ）Ｇｃａｓｅタンパク質をコードする導入遺伝子挿入物であって、前記導入遺伝子挿入物が配列番号１５のヌクレオチド配列を含む、前記導入遺伝子挿入物、
（ｅ）ＷＰＲＥ、
（ｆ）ウシ成長ホルモンポリＡシグナル尾部、及び
（ｇ）ＡＡＶ２ ＩＴＲを含む核酸を含む、ｒＡＡＶベクターと、
（ｉｉ）ＡＡＶ９キャプシドタンパク質と、を含むｒＡＡＶを、対象に投与することを含み、
前記ｒＡＡＶが、約５×１０１３ｖｇ～約５×１０１４ｖｇの範囲の用量で対象に投与される、前記方法。
６５．前記ｒＡＡＶが、大槽への後頭下注射を介して投与される、実施形態６３または６４に記載の方法。
６６．前記ｒＡＡＶが、約２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、約１ｍＭのＭｇＣｌ２、約２００ｍＭのＮａＣｌ、及び約０．００１％ｗ／ｖのポロキサマー１８８を含む製剤で投与される、実施形態４４～５２及び６３～６５のいずれか１つに記載の方法。
６７．
（ｉ）
（ａ）導入遺伝子挿入物Ｇｃａｓｅタンパク質に作動可能に連結したプロモーターを含む発現構築物を含む核酸を含むｒＡＡＶベクターであって、導入遺伝子挿入物が配列番号１５のヌクレオチド配列を含む、前記ｒＡＡＶベクター、及び
（ｂ）ＡＡＶ９キャプシドタンパク質を含むｒＡＡＶと、
（ｉｉ）約２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）と、
（ｉｉｉ）約１ｍＭのＭｇＣｌ２と、
（ｉｖ）約２００ｍＭのＮａＣｌと、
（ｖ）約０．００１％ｗ／ｖのポロキサマー１８８と、を含む、医薬組成物。
６８．
（ｉ）Ｇｃａｓｅタンパク質をコードする導入遺伝子挿入物に作動可能に連結したプロモーターを含む発現構築物を含む核酸を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターであって、前記導入遺伝子挿入物が配列番号１５のヌクレオチド配列を含む、前記ｒＡＡＶベクターと、
（ｉｉ）ＡＡＶ９キャプシドタンパク質と、を含む、
対象において１型ゴーシェ病、２型ゴーシェ病、３型ゴーシェ病またはＧＢＡ１変異を有するパーキンソン病を治療する方法において使用するための、ｒＡＡＶ。
６９．
（ｉ）
（ａ）配列番号１５のヌクレオチド配列を含むＧｃａｓｅタンパク質コード配列、及び
（ｂ）配列番号２０のヌクレオチド配列を含む阻害性核酸コード配列、を含む導入遺伝子挿入物に作動可能に連結したプロモーターを含む発現構築物を含む核酸を含むｒＡＡＶベクターと、
（ｉｉ）ＡＡＶ９キャプシドタンパク質と、を含む、
対象においてシヌクレイン病またはパーキンソニズムを治療する方法において使用するための、ｒＡＡＶ。
７０．
（ｉ）配列番号２０のヌクレオチド配列を含む阻害性核酸コード配列を含む導入遺伝子挿入物に作動可能に連結したプロモーターを含む発現構築物を含む核酸を含むｒＡＡＶベクターと、
（ｉｉ）ＡＡＶ９キャプシドタンパク質と、を含む、
対象においてシヌクレイン病またはパーキンソニズムを治療する方法において使用するための、ｒＡＡＶ。

Claims (15)

  1. ２型ゴーシェ病または３型ゴーシェ病を有する対象を治療するための医薬組成物であって、
    （ｉ）グルコセレブロシダーゼ（Ｇｃａｓｅ）タンパク質をコードする導入遺伝子挿入物に作動可能に連結したプロモーターを含む発現構築物を含む核酸を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター、ここで前記導入遺伝子挿入物が配列番号１５のヌクレオチド配列を含む、と、
    （ｉｉ）ＡＡＶ９キャプシドタンパク質と、
    を含み；
    （ａ）約５×１０１０ｖｇ／ｇ脳～約５×１０１１ｖｇ／ｇ脳の範囲をとるか、または
    （ｂ）約１．３×１０１１ｖｇ／ｇ脳の
    前記ｒＡＡＶの用量を含む、前記医薬組成物。
  2. グルコセレブロシダーゼ１（ＧＢＡ１）変異を有するパーキンソン病を有する対象を治療するための医薬組成物であって、
    （ｉ）Ｇｃａｓｅタンパク質をコードする導入遺伝子挿入物に作動可能に連結したプロモーターを含む発現構築物を含む核酸を含むｒＡＡＶベクター、ここで前記導入遺伝子挿入物が配列番号１５のヌクレオチド配列を含む、と、
    （ｉｉ）ＡＡＶ９キャプシドタンパク質と、
    を含み；
    （ａ）約１×１０１３ｖｇ～約５×１０１４ｖｇの範囲をとるか、
    （ｂ）約５×１０１３ｖｇ～約５×１０１４ｖｇの範囲をとるか、または
    （ｃ）約１×１０１４ｖｇまたは約２×１０１４ｖｇの
    前記ｒＡＡＶの用量を含む、前記医薬組成物。
  3. １型ゴーシェ病を有する対象を治療するための医薬組成物であって、
    （ｉ）Ｇｃａｓｅタンパク質をコードする導入遺伝子挿入物に作動可能に連結したプロモーターを含む発現構築物を含む核酸を含むｒＡＡＶベクター、ここで前記導入遺伝子挿入物が配列番号１５のヌクレオチド配列を含む、と、
    （ｉｉ）ＡＡＶ９キャプシドタンパク質と、
    を含み；
    （ａ）約５×１０１３ｖｇ～約５×１０１４ｖｇの範囲をとるか、または
    （ｂ）約１×１０１３ｖｇ～約５×１０１４ｖｇの範囲をとる
    前記ｒＡＡＶの用量を含む、前記医薬組成物。
  4. 前記プロモーターが、ニワトリベータアクチン（ＣＢＡ）プロモーターである、請求項１～３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  5. 前記ｒＡＡＶベクターが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーをさらに含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  6. 前記ｒＡＡＶベクターが、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素（ＷＰＲＥ）をさらに含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  7. 前記ｒＡＡＶベクターが、ウシ成長ホルモンポリＡシグナル尾部をさらに含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  8. 前記核酸が、前記発現構築物に隣接する２つのアデノ随伴ウイルス逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を含み、ここで第１のＩＴＲ配列が、５’ＩＴＲであり、かつ第２のＩＴＲが、３’ＩＴＲである、請求項１～７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  9. ２つのＩＴＲ配列の各々が、野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列である、請求項８に記載の医薬組成物。
  10. 前記ｒＡＡＶベクターが、５’ＩＴＲと前記発現構築物との間にＴＲＹ領域をさらに含み、ここで前記ＴＲＹ領域が、配列番号２８を含む、請求項８または９に記載の医薬組成物。
  11. ２型ゴーシェ病または３型ゴーシェ病を有する対象を治療するための医薬組成物であって、
    （ｉ）５’から３’の順に、
    （ａ）ＡＡＶ２ ＩＴＲ、
    （ｂ）ＣＭＶエンハンサー、
    （ｃ）ＣＢＡプロモーター、
    （ｄ）Ｇｃａｓｅタンパク質をコードする導入遺伝子挿入物、ここで前記導入遺伝子挿入物が配列番号１５のヌクレオチド配列を含む、
    （ｅ）ＷＰＲＥ、
    （ｆ）ウシ成長ホルモンポリＡシグナル尾部、及び
    （ｇ）ＡＡＶ２ ＩＴＲ
    を含む核酸を含む、ｒＡＡＶベクターと、
    （ｉｉ）ＡＡＶ９キャプシドタンパク質と、
    を含み、
    前記ｒＡＡＶが、約５×１０１０ｖｇ／ｇ脳～約５×１０１１ｖｇ／ｇ脳の範囲の用量である、前記医薬組成物。
  12. グルコセレブロシダーゼ１（ＧＢＡ１）変異を有するパーキンソン病を有する対象を治療するための医薬組成物であって、
    （ｉ）５’から３’の順に、
    （ａ）ＡＡＶ２ ＩＴＲ、
    （ｂ）ＣＭＶエンハンサー、
    （ｃ）ＣＢＡプロモーター、
    （ｄ）Ｇｃａｓｅタンパク質をコードする導入遺伝子挿入物、ここで前記導入遺伝子挿入物が配列番号１５のヌクレオチド配列を含む、
    （ｅ）ＷＰＲＥ、
    （ｆ）ウシ成長ホルモンポリＡシグナル尾部、及び
    （ｇ）ＡＡＶ２ ＩＴＲ
    を含む核酸を含む、ｒＡＡＶベクターと、
    （ｉｉ）ＡＡＶ９キャプシドタンパク質と、
    を含み、
    前記ｒＡＡＶが、約１×１０１３ｖｇ～約５×１０１４ｖｇの範囲の用量であるか、または約５×１０１３ｖｇ～約５×１０１４ｖｇの範囲の用量である、前記医薬組成物。
  13. １型ゴーシェ病を有する対象を治療するための医薬組成物であって、
    （ｉ）５’から３’の順に、
    （ａ）ＡＡＶ２ ＩＴＲ、
    （ｂ）ＣＭＶエンハンサー、
    （ｃ）ＣＢＡプロモーター、
    （ｄ）Ｇｃａｓｅタンパク質をコードする導入遺伝子挿入物、ここで前記導入遺伝子挿入物が配列番号１５のヌクレオチド配列を含む、
    （ｅ）ＷＰＲＥ、
    （ｆ）ウシ成長ホルモンポリＡシグナル尾部、及び
    （ｇ）ＡＡＶ２ ＩＴＲ
    を含む核酸を含む、ｒＡＡＶベクターと、
    （ｉｉ）ＡＡＶ９キャプシドタンパク質と、
    を含み、
    前記ｒＡＡＶが、約１×１０１３ｖｇ～約５×１０１４ｖｇの範囲の用量であるか、または約５×１０１３ｖｇ～約５×１０１４ｖｇの範囲の用量である、前記医薬組成物。
  14. 前記ｒＡＡＶが、約２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、約１ｍＭのＭｇＣｌ２、約２００ｍＭのＮａＣｌ、及び約０．００１％ｗ／ｖのポロキサマー１８８を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  15. （ｉ）
    （ａ）導入遺伝子挿入物Ｇｃａｓｅタンパク質に作動可能に連結したプロモーターを含む発現構築物を含む核酸を含むｒＡＡＶベクターであって、前記導入遺伝子挿入物が配列番号１５のヌクレオチド配列を含む、前記ｒＡＡＶベクター、及び
    （ｂ）ＡＡＶ９キャプシドタンパク質を含むｒＡＡＶと、
    （ｉｉ）約２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）と、
    （ｉｉｉ）約１ｍＭのＭｇＣｌ２と、
    （ｉｖ）約２００ｍＭのＮａＣｌと、
    （ｖ）約０．００１％ｗ／ｖのポロキサマー１８８と、
    を含む、２型ゴーシェ病、３型ゴーシェ病、グルコセレブロシダーゼ１（ＧＢＡ１）変異を有するパーキンソン病、および／または１型ゴーシェ病を有する対象を治療するための医薬組成物。
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