JP7660998B2 - アシル中性アミノ酸エステル - Google Patents
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Description
本発明は、アシル中性アミノ酸エステルなどに関する。
角層は、内部で水分を保持する保湿能と、外界からの外来物（例、異物、ウイルスおよび細菌）の侵入を抑制するバリア能を角層機能として備えている。このような角層機能に作用する物質として、皮脂、細胞間脂質、天然保湿因子等が知られている。
皮膚組織の顆粒層内に貯蔵されているプロフィラグリンは、角化の際に脱リン酸化を経てフィラグリンに分解される。フィラグリンは、顆粒層から角層に移動して、ケラチン繊維と結合及び凝集し、ケラチンパターンを形成する。その後、フィラグリンは、ウロカニン酸等の低分子に分解されて、保水、紫外線吸収に関与する天然保湿因子となる。そのため、フィラグリンの産生が促進されるほど、その分解物である天然保湿因子の量が増えて、肌の保湿能が向上すると考えられる。
角層を構成する角質細胞と角質細胞間に存在する細胞間脂質等により、外界からの外来物の侵入が抑制されている。そのため、角質細胞の数や大きさ等が不十分であると、角層に隙間が生じ、バリア能が低下する。
ケラチン１０等のケラチンとフィラグリンとが凝集した構造体を包含する角質細胞の周辺には、角質細胞の細胞膜を裏打ちするきわめて強靭で巨大な不溶性構造物である周辺帯が存在している。周辺帯の主な構造要素は、有棘細胞で産生されるインボルクリン、顆粒細胞で産生されるロリクリン等のタンパク質であり、これらがトランスグルタミナーゼ（ＴＧ）１等の酵素により架橋されている。そのため、フィラグリン、インボルクリン、トランスグルタミナーゼ１、ケラチン１０、ロリクリンは、角質細胞の形成に強く影響し、肌のバリア能と関連すると考えられる。
フィラグリン、インボルクリン、トランスグルタミナーゼ１、ケラチン１０、及びロリクリンの発現は、グリシルプロリン等の特定のペプチドにより促進されることが報告されている（特許文献１）。
しかし、グリシルプロリン等の特定のペプチドは、フィラグリン等の保湿関連タンパク質の発現促進作用が弱く、角層内部で水分を保持する保湿能の改善には不十分であると考えられる。このような特定のペプチドはまた、肌のバリア能と関連するタンパク質の発現促進作用も弱く、外来物の侵入を抑制するバリア能の改善にも不十分であると考えられる。すなわち、このような特定のペプチドは、角質機能の改善に不十分であると考えられる。
また、角層における水分量の保持は、肌の健康に非常に重要であり、角層内部での水分保持による保湿のみならず、角層外部からの作用により実現することができれば、より効果的に各層における水分量の保持が可能になると考えられる。角層のカサカサな状態を改善して角層を整える機能、および保湿性を向上させる機能（角層外部での作用）はエモリエント性と呼称されるが、上述した特定のペプチドについてはエモリエント性を有することも知られてない。
本発明は、角層機能を改善でき、かつエモリエント性に優れる化合物を提供することを目的とする。
本発明者らは、鋭意検討した結果、特定のアシル中性アミノ酸エステルが角層機能を改善でき、かつエモリエント性に優れる成分として有望であることなどを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕下記式（１）：
〔式中、
Ａは、炭素原子数２～１０の直鎖もしくは分岐鎖の炭化水素基であり、
Ｂは、炭素原子数２～１８の直鎖もしくは分岐鎖の炭化水素基であり、
Ｘは、炭素原子数１～５の直鎖もしくは分岐鎖の炭化水素基である。〕で表される化合物。
〔２〕前記式（１）で表される化合物が、下記式（２）：
〔式中、
ＡおよびＢはそれぞれ、前記式（１）のものと同じである。〕、
下記式（３）：
〔式中、
ＡおよびＢはそれぞれ、前記式（１）のものと同じである。〕、
下記式（４）：
〔式中、
ＡおよびＢはそれぞれ、前記式（１）のものと同じである。〕、あるいは
下記式（５）：
〔式中、
ＡおよびＢはそれぞれ、前記式（１）のものと同じである。〕のいずれか一つで表される化合物である、〔１〕の化合物。
〔３〕Ｂが、炭素原子数２～８の直鎖もしくは分岐鎖の炭化水素基である、〔１〕または〔２〕の化合物。
〔４〕Ｂが、炭素原子数２もしくは３の直鎖もしくは分岐鎖の炭化水素基である、〔３〕の化合物。
〔５〕Ａが、炭素原子数７～１０の直鎖もしくは分岐鎖の炭化水素基である、〔１〕～〔４〕のいずれかの化合物。
〔６〕Ａが、炭素原子数２～６の直鎖もしくは分岐鎖の炭化水素基である、〔１〕～〔４〕のいずれかの化合物。
〔７〕Ａ、ＢおよびＸにおける炭化水素基がアルキルである、〔１〕～〔６〕のいずれかの化合物。
〔８〕〔１〕～〔７〕のいずれかの化合物、および担体を含む、組成物。
〔９〕〔１〕～〔７〕のいずれかの化合物を含む、皮膚外用剤。
〔１０〕〔１〕～〔７〕のいずれかの化合物を含む、化粧料。
〔１〕下記式（１）：
Ａは、炭素原子数２～１０の直鎖もしくは分岐鎖の炭化水素基であり、
Ｂは、炭素原子数２～１８の直鎖もしくは分岐鎖の炭化水素基であり、
Ｘは、炭素原子数１～５の直鎖もしくは分岐鎖の炭化水素基である。〕で表される化合物。
〔２〕前記式（１）で表される化合物が、下記式（２）：
ＡおよびＢはそれぞれ、前記式（１）のものと同じである。〕、
下記式（３）：
ＡおよびＢはそれぞれ、前記式（１）のものと同じである。〕、
下記式（４）：
ＡおよびＢはそれぞれ、前記式（１）のものと同じである。〕、あるいは
下記式（５）：
ＡおよびＢはそれぞれ、前記式（１）のものと同じである。〕のいずれか一つで表される化合物である、〔１〕の化合物。
〔３〕Ｂが、炭素原子数２～８の直鎖もしくは分岐鎖の炭化水素基である、〔１〕または〔２〕の化合物。
〔４〕Ｂが、炭素原子数２もしくは３の直鎖もしくは分岐鎖の炭化水素基である、〔３〕の化合物。
〔５〕Ａが、炭素原子数７～１０の直鎖もしくは分岐鎖の炭化水素基である、〔１〕～〔４〕のいずれかの化合物。
〔６〕Ａが、炭素原子数２～６の直鎖もしくは分岐鎖の炭化水素基である、〔１〕～〔４〕のいずれかの化合物。
〔７〕Ａ、ＢおよびＸにおける炭化水素基がアルキルである、〔１〕～〔６〕のいずれかの化合物。
〔８〕〔１〕～〔７〕のいずれかの化合物、および担体を含む、組成物。
〔９〕〔１〕～〔７〕のいずれかの化合物を含む、皮膚外用剤。
〔１０〕〔１〕～〔７〕のいずれかの化合物を含む、化粧料。
本発明の化合物は、角層機能（例、角層内部で水分を保持する保湿能、および角層における外界からの外来物の侵入を抑制するバリア能）の改善に関連する各種タンパク質の産生を向上させることができる。
本発明の化合物はまた、優れたエモリエント性を発揮することができる。
したがって、本発明の化合物によれば、角層における水分量の保持を改善することができる。例えば、角層における水分量の保持の改善は、角層の内部もしくは外部から、またはその双方により、実現することができる。
本発明の化合物はまた、有効量の濃度範囲内において、親水性有機溶媒および疎水性有機溶媒（油）と安定的に配合することができる。
本発明の化合物はさらに、本発明の化合物と疎水性有機溶媒（油）との混合液、および本発明の化合物と親水性有機溶媒との混合液において透明の性状を呈することができるため、外観的に高級感を付与することができ、更に肌への視覚上の影響を回避できる。したがって、本発明の化合物は、例えば、塗布による白残りを軽減できるという利点がある。
本発明の化合物はまた、優れたエモリエント性を発揮することができる。
したがって、本発明の化合物によれば、角層における水分量の保持を改善することができる。例えば、角層における水分量の保持の改善は、角層の内部もしくは外部から、またはその双方により、実現することができる。
本発明の化合物はまた、有効量の濃度範囲内において、親水性有機溶媒および疎水性有機溶媒（油）と安定的に配合することができる。
本発明の化合物はさらに、本発明の化合物と疎水性有機溶媒（油）との混合液、および本発明の化合物と親水性有機溶媒との混合液において透明の性状を呈することができるため、外観的に高級感を付与することができ、更に肌への視覚上の影響を回避できる。したがって、本発明の化合物は、例えば、塗布による白残りを軽減できるという利点がある。
本発明は、上記式（１）で表される化合物を提供する。
Ａは、炭素原子数２～１０の直鎖もしくは分岐鎖の炭化水素基である。Ａにおける炭化水素基の炭素原子数は、例えば５～１０であってもよい。Ａにおける炭化水素基は、飽和もしくは不飽和である。このような炭化水素基としては、例えば、アルキル、アルケニル、およびアルキニルが挙げられる。
Ａがアルキルである場合、アルキルは、炭素原子数２～１０の直鎖もしくは分岐鎖のアルキルである。Ａにおけるアルキルの炭素原子数の例および好ましい例は、Ａにおける上述した炭化水素基の炭素原子数と同様である。Ａにおけるアルキルとしては、例えば、エチル、プロピル（例、ｎ－プロピル、イソプロピル）、ブチル（例、ｎ－ブチル、ｉｓｏ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル）、ペンチル（例、ｎ－ペンチル、ｉｓｏ－ペンチル、ｎｅｏ－ペンチル、１－エチルプロピル）、ヘキシル（例、ｎ－ヘキシル、ｉｓｏ－ヘキシル、１，１－ジメチルブチル、２，２－ジメチルブチル、３，３－ジメチルブチル、２－エチルブチル）、ヘプチル（例、ｎ－ヘプチル、１－メチルヘキシル、２－メチルヘキシル、３－メチルヘキシル、１，１－ジメチルペンチル、２，２－ジメチルペンチル、３，３－ジメチルペンチル、２－エチルペンチル）、オクチル（例、ｎ－オクチル、１－メチルヘプチル、２－メチルヘプチル、３－メチルヘプチル、１，１－ジメチルヘキシル、２，２－ジメチルヘキシル、３，３－ジメチルヘキシル、２－エチルヘキシル）、ノニル（例、ｎ－ノニル、３，５，５－トリメチルヘキシル）、およびデカニル（例、ｎ－デカニル）が挙げられる。
Ａがアルケニルである場合、アルケニルは、炭素原子数２～１０の直鎖もしくは分岐鎖のアルケニルである。Ａにおけるアルケニルの炭素原子数の例および好ましい例は、Ａにおける上述した炭化水素基の炭素原子数と同様である。Ａにおけるアルケニルとしては、例えば、エテニル、プロペニル、ブテニル、ペンテニル、へキセニル、ヘプテニル、オクテニル、ノネニル、およびデセニルが挙げられる。
Ａがアルキニルである場合、アルキニルは、炭素原子数２～１０の直鎖もしくは分岐鎖のアルキニルである。Ａにおけるアルキニルの炭素原子数の例および好ましい例は、Ａにおける上述した炭化水素基の炭素原子数と同様である。Ａにおけるアルキニルとしては、例えば、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、へキシニル、ヘプチニル、オクチニル、ノニニル、およびデシニルが挙げられる。
好ましくは、Ａは、炭素原子数２～１０の直鎖もしくは分岐鎖のアルキルである。Ａにおけるアルキルの炭素原子数の例および好ましい例は、Ａにおける上述した炭化水素基の炭素原子数と同様である。このようなアルキルの具体例は、上述したとおりである。
特定の実施形態では、Ａにおける基の炭素原子数は、７～１０（好ましくは８～１０）であってもよい。Ａにおける基の炭素原子数が７～１０である場合、上記式（１）で表される化合物は、角層機能の改善に関連する各種タンパク質をコードする遺伝子の発現を顕著に誘導できるという利点がある。このようなタンパク質としては、例えば、皮膚組織内で天然保湿因子を生成し得るタンパク質（例、フィラグリン、プロフィラグリン）、および皮膚バリア能に関与し得るタンパク質（例、フィラグリン、インボルクリン、トランスグルタミナーゼ１、ケラチン１０、ロリクリン）が挙げられる。
別の特定の実施形態では、Ａにおける基の炭素原子数は、６以下（すなわち、２～６）であってもよい。Ａにおける基の炭素原子数が６以下であっても、上記式（１）で表される化合物は、分配係数（ＬｏｇＰ）が１～４の範囲内にあり、更に分子量が５００Ｄａ以下であるため、経費吸収性に優れ、角層中に高濃度で提供することができるという利点がある。
Ｂは、炭素原子数２～１８の直鎖もしくは分岐鎖の炭化水素基である。Ｂにおける炭化水素基の炭素原子数は、好ましくは２～１５であり、より好ましくは２～１２であり、さらにより好ましくは２～８であり、なおさらにより好ましくは２～６であり、特に好ましくは２または３であってもよい。Ｂにおける炭化水素基は、飽和もしくは不飽和である。このような炭化水素基としては、例えば、アルキル、アルケニル、およびアルキニルが挙げられる。
Ｂがアルキルである場合、アルキルは、炭素原子数２～１８の直鎖もしくは分岐鎖のアルキルである。Ｂにおけるアルキルの炭素原子数の例および好ましい例は、Ｂにおける上述した炭化水素基の炭素原子数と同様である。Ｂにおけるアルキルとしては、例えば、エチル、プロピル（例、ｎ－プロピル、イソプロピル）、ブチル（例、ｎ－ブチル、ｉｓｏ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル）、ペンチル（例、ｎ－ペンチル、ｉｓｏ－ペンチル、ｎｅｏ－ペンチル、１－エチルプロピル）、ヘキシル（例、ｎ－ヘキシル、ｉｓｏ－ヘキシル、１，１－ジメチルブチル、２，２－ジメチルブチル、３，３－ジメチルブチル、２－エチルブチル）、ヘプチル（例、ｎ－ヘプチル、１－メチルヘキシル、２－メチルヘキシル、３－メチルヘキシル、１，１－ジメチルペンチル、２，２－ジメチルペンチル、３，３－ジメチルペンチル、２－エチルペンチル）、オクチル（例、ｎ－オクチル、１－メチルヘプチル、２－メチルヘプチル、３－メチルヘプチル、１，１－ジメチルヘキシル、２，２－ジメチルヘキシル、３，３－ジメチルヘキシル、２－エチルヘキシル）、ノニル（例、ｎ－ノニル、３，５，５－トリメチルヘキシル）、デカニル（例、ｎ－デカニル）、ウンデカニル（例、ｎ－ウンデカニル）、ドデカニル（例、ｎ－ドデカニル）、トリデカニル（例、ｎ－トリデカニル）、テトラデカニル（例、ｎ－テトラデカニル）、ペンタデカニル（例、ｎ－ペンタデカニル）、ヘキサデカニル（例、ｎ－ヘキサデカニル）、ヘプタデカニル（例、ｎ－ヘプタデカニル）、およびオクタデカニル（例、ｎ－オクタデカニル）が挙げられる。
Ｂがアルケニルである場合、アルケニルは、炭素原子数２～１８の直鎖もしくは分岐鎖のアルケニルである。Ｂにおけるアルケニルの炭素原子数の例および好ましい例は、Ｂにおける上述した炭化水素基の炭素原子数と同様である。Ｂにおけるアルケニルとしては、例えば、エテニル、プロペニル、ブテニル、ペンテニル、へキセニル、ヘプテニル、オクテニル、ノネニル、デセニル、ウンデセニル、ドデセニル、トリデセニル、テトラデセニル、ペンタデセニル、ヘキサデセニル、ヘプタデセニル、およびオクタデセニルが挙げられる。
Ｂがアルキニルである場合、アルキニルは、炭素原子数２～１８の直鎖もしくは分岐鎖のアルキニルである。Ｂにおけるアルキニルの炭素原子数の例および好ましい例は、Ｂにおける上述した炭化水素基の炭素原子数と同様である。Ｂにおけるアルキニルとしては、例えば、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、へキシニル、ヘプチニル、オクチニル、ノニニル、デシニル、ウンデシニル、ドデシニル、トリデシニル、テトラデシニル、ペンタデシニル、ヘキサデシニル、ヘプタデシニル、およびオクタデシニルが挙げられる。
好ましくは、Ｂは、炭素原子数２～１８の直鎖もしくは分岐鎖のアルキルである。Ｂにおけるアルキルの炭素原子数の例および好ましい例は、Ｂにおける上述した炭化水素基の炭素原子数と同様である。このようなアルキルの具体例は、上述したとおりである。
Ｘは、炭素原子数１～５の直鎖もしくは分岐鎖の炭化水素基である。Ｘにおける炭化水素基の炭素原子数は、例えば１～４であってもよい。Ｘにおける炭化水素基は、飽和もしくは不飽和である。このような炭化水素基としては、例えば、アルキル、アルケニル、およびアルキニルが挙げられる。
Ｘがアルキルである場合、アルキルは、炭素原子数１～５の直鎖もしくは分岐鎖のアルキルである。Ｘにおけるアルキルの炭素原子数の例および好ましい例は、Ｘにおける上述した炭化水素基の炭素原子数と同様である。Ｘにおけるアルキルとしては、例えば、メチル、エチル、プロピル（例、ｎ－プロピル、イソプロピル）、ブチル（例、ｎ－ブチル、ｉｓｏ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル）、およびペンチル（例、ｎ－ペンチル、ｉｓｏ－ペンチル、ｎｅｏ－ペンチル、１－エチルプロピル）が挙げられる。
Ｘがアルケニルである場合、アルケニルは、炭素原子数２～５の直鎖もしくは分岐鎖のアルケニルである。Ｘにおけるアルケニルの炭素原子数の例および好ましい例は、Ｘにおける上述した炭化水素基の炭素原子数と同様である。Ｘにおけるアルケニルとしては、例えば、エテニル、プロペニル、ブテニル、およびペンテニルが挙げられる。
Ｘがアルキニルである場合、アルキニルは、炭素原子数２～５の直鎖もしくは分岐鎖のアルキニルである。Ｘにおけるアルキニルの炭素原子数の例および好ましい例は、Ｘにおける上述した炭化水素基の炭素原子数と同様である。Ｘにおけるアルキニルとしては、例えば、エチニル、プロピニル、ブチニル、およびペンチニルが挙げられる。
好ましくは、Ｘは、炭素原子１～５の直鎖もしくは分岐鎖のアルキルである。Ｘにおけるアルキルの炭素原子数の例および好ましい例は、Ｘにおける上述した炭化水素基の炭素原子数と同様である。このようなアルキルの具体例は、上述したとおりである。
好ましくは、上記式（１）で表される化合物は、上記式（２）～（５）のいずれか一つで表される化合物である。上記式（２）～（５）で表される化合物におけるＡおよびＢについて、炭化水素基（例、アルキル、アルケニル、アルキニル）および炭素原子数の定義、例、好ましい例および具体例は、式（１）において上述したものと同様である。
特定の実施形態では、上記式（２）～（５）で表される化合物におけるＡおよびＢは、それぞれ独立して、異なる炭素原子数および異なる炭化水素基を有していてもよい。例えば、上記（２）～（４）で表される化合物におけるＡが、炭素原子数２～１０の直鎖もしくは分岐鎖の炭化水素基であり、上記（５）で表される化合物におけるＡが、炭素原子数６以下、または７～１０（好ましくは８～１０）の直鎖もしくは分岐鎖の炭化水素基であってもよい。また、上記（２）～（４）で表される化合物におけるＡが、炭素原子数２～１０の直鎖もしくは分岐鎖の炭化水素基であり、上記（５）で表される化合物におけるＡが、炭素原子数７～１０（好ましくは８～１０）の直鎖もしくは分岐鎖の炭化水素基であってもよい。さらに、上記（２）～（４）で表される化合物におけるＡが、炭素原子数５～１０の直鎖もしくは分岐鎖の炭化水素基であり、上記（５）で表される化合物におけるＡが、炭素原子数７～１０（好ましくは８～１０）の直鎖もしくは分岐鎖の炭化水素基であってもよい。
式（１）～（５）で表される化合物は、Ｎ－アシル中性アミノ酸エステル（中性アミノ酸誘導体）に対応する。式（１）～（５）で表される化合物は、窒素原子、カルボニル基の炭素原子およびＸのいずれもが結合する炭素原子について光学異性体（Ｌ体もしくはＤ体）であってもよく、またはそれらの混合物であってもよい。好ましくは、式（１）～（５）で表される化合物は、Ｌ体である。
本発明の化合物の調製は、Ｎ－アシル中性アミノ酸およびアルコールを反応させることにより適宜行うことができる。Ｎ－アシル中性アミノ酸およびアルコールの反応は、カルボン酸化合物およびアルコールからのエステルの生成のための一般的な方法により行うことができる。このような反応は、当該分野において周知である。例えば、反応は、触媒を適宜添加することにより行うことができる。反応はまた、適温（例、１５～２００℃）で数時間（例、０．５～８時間）行うことができる。より具体的には、本発明の化合物の調製は、後述する製造例Ａの方法により行うことができる。本発明の化合物の調製はまた、特開平１１－２４０８２８号に記載される方法においてＮ－アシル中性アミノ酸およびアルコールの種類を変更することを除き、特開平１１－２４０８２８号に記載される方法と同様にして行われてもよい。本発明の化合物は、有機合成分野で用いられる任意の精製方法（例、抽出）により適宜精製することができる。
本発明の化合物は、角質機能改善剤および保湿剤等の剤として、ならびに化粧料、医薬品および医薬部外品等の製品の開発に有用である。本発明の化合物は、本発明の化合物および担体（例、化粧料、医薬または医薬部外品として許容され得る担体）を含む組成物の形態で提供されてもよい。このような担体としては、例えば、増粘剤、安定化剤、ｐＨ調整剤、保存剤、紫外線防止剤、香料、色素が挙げられる。これらの成分の具体的な種類および量は、適宜設定することができる。このような組成物は、任意の状態の組成物として調製することができる。このような組成物としては、例えば、液状組成物、クリーム状組成物、乳化状組成物、粉状組成物、スティック状組成物、シート含浸型組成物が挙げられる。
例えば、本発明の化合物は、被験体（例、ヒト等の哺乳動物、鳥類、爬虫類等の動物）の所望の部位（例、皮膚、毛髪、体毛、頭皮）に有効量（例、０．００１ｍｇ～１０ｇ）を適用（例、塗布、投与）することにより、用いることができる。好ましくは、本発明の化合物は、ヒトに適用される。本発明の化合物が適用される被験体の状態は、健常な状態、または異常な状態（例、疾患）である。このような異常な状態としては、例えば、肌荒れ、皮膚の乾燥、鱗屑、ターンオーバーの乱れ、皮膚疾患（例、アトピー性皮膚炎等の皮膚炎）が挙げられる。
本発明の化合物はまた、化粧料または外用剤であってもよい。本発明の化粧料または外用剤は、常法に従って、例えば所望の部位（例、皮膚、毛髪、頭皮）に適用可能な任意の形態の製剤とすることができる。
本発明の化合物は、好ましくは、皮膚、毛髪、または頭皮に対する化粧料または外用剤として用いることができる。皮膚に対する化粧料または外用剤としては、例えば、乳液、化粧水、クリーム、ジェル、美容液、フェイスマスクが挙げられる。毛髪に対する化粧料または外用剤としては、例えば、毛髪用乳液、ヘアトリートメント、ヘアコンディショナー、シャンプー、ヘアローションが挙げられる。頭皮に対する化粧料または外用剤としては、例えば、育毛剤が挙げられる。好ましい化粧料としては、例えば、リーブオン化粧料、乳液、化粧水、クリーム、ジェル、美容液、フェイスマスクが挙げられる。好ましい外用剤としては、例えば、軟膏剤、クリーム剤、ムース剤、ゲルが挙げられる。
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。以下の製造例において原料として用いたＮ－アシル中性アミノ酸は全てＬ体である。
製造例Ａ：アルコールおよびＮ－アシル中性アミノ酸からのＮ－アシル中性アミノ酸エステルの合成
エタノール（３２０ｍＬ、５．４８ｍｏｌ）またはイソプロピルアルコール（４１８ｍＬ、５．４８ｍｏｌ）にＮ－アシル中性アミノ酸（０．１４ｍｏｌ）を添加し、混合した。混合物にｐ－トルエンスルホン酸一水和物（５．３ｇ、０．０３ｍｏｌ）を添加し、アルコールが蒸発されないように還流管を付け、バス温１２５℃で３時間撹拌した。生成物を真空減圧により濃縮した後、生成物を酢酸エチル（６００ｍＬ）で希釈し、飽和重曹水（２４０ｍＬ）で４回洗浄した。有機相をさらに超純水（４８０ｍＬ）で２回洗浄した。硫酸ナトリウムによって有機層から水を除去した。更に、酸ナトリウムをろ過して除去した後、有機層を真空減圧により濃縮して生成物（アシル中性アミノ酸エステル）を得た。
エタノール（３２０ｍＬ、５．４８ｍｏｌ）またはイソプロピルアルコール（４１８ｍＬ、５．４８ｍｏｌ）にＮ－アシル中性アミノ酸（０．１４ｍｏｌ）を添加し、混合した。混合物にｐ－トルエンスルホン酸一水和物（５．３ｇ、０．０３ｍｏｌ）を添加し、アルコールが蒸発されないように還流管を付け、バス温１２５℃で３時間撹拌した。生成物を真空減圧により濃縮した後、生成物を酢酸エチル（６００ｍＬ）で希釈し、飽和重曹水（２４０ｍＬ）で４回洗浄した。有機相をさらに超純水（４８０ｍＬ）で２回洗浄した。硫酸ナトリウムによって有機層から水を除去した。更に、酸ナトリウムをろ過して除去した後、有機層を真空減圧により濃縮して生成物（アシル中性アミノ酸エステル）を得た。
製造例１：Ｎ－オクタノイルアラニンイソプロピルエステル（Ｃ８Ａｌａ－ｉＰＡ）の製造
Ｎ－アシルアミノ酸としてＮ－オクタノイルアラニン（Ｃ８Ａｌａ、３０．００ｇ、０．１４ｍｏｌ）、アルコールとしてはイソプロピルアルコール（４１８ｍＬ、５．４８ｍｏｌ）を使用し、製造例Ａの合成法に従って反応させることによりＣ８Ｖａｌ－ｉＰＡを得た（収率９７％）。
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，ｒ．ｔ．）：δ６．０７７－６．０９３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），５．０１５－５．０７８（１Ｈ，ｓｅｐ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），４．５１１－４．５８３（１Ｈ，ｑｕｉｎｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），２．１８４－２．２２２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），１．５９９－１．６６９（２Ｈ，ｑｕｉｎｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），１．３７２－１．３９０（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）１．２４４－１．２９８（１４Ｈ，ｍ），０．８５９－０．８９２（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）ｐｐｍ．
ＥＳＩ－ＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｚ ２５８．２［Ｍ＋Ｈ］＋，２８０．１［Ｍ＋Ｎａ］＋
製造例２：Ｎ－オクタノイルバリンイソプロピルエステル（Ｃ８Ｖａｌ－ｉＰＡ）の製造
Ｎ－アシルアミノ酸としてＮ－オクタノイルバリン（Ｃ８Ｖａｌ、３４．０６ｇ、０．１４ｍｏｌ）、アルコールとしてはイソプロピルアルコール（４１８ｍＬ、５．４８ｍｏｌ）を使用し、製造例Ａの合成法に従って８時間反応されることによりＣ８Ｖａｌ－ｉＰＡを得た（収率９３％）。
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，ｒ．ｔ．）：δ５．９５５－５．９７６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），５．０２４－５．０８７（１Ｈ，ｓｅｐ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），４．５２８－４．５６１（１Ｈ，ｄｄ），２．２１６－２．２５４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），２．１３５－２．１８２（１Ｈ，ｓｅｘ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），１．６１０－１．７６５（２Ｈ，ｑｕｉｎｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），１．２５６－１．３１４（１４Ｈ，ｍ），０．８６０－０．９４９（９Ｈ，ｍ）ｐｐｍ．
ＥＳＩ－ＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｚ ２８６．２［Ｍ＋Ｈ］＋，３０８．１［Ｍ＋Ｎａ］＋
製造例３：Ｎ－オクタノイルグリシンイソプロピルエステル（Ｃ８Ｇｌｙ－ｉＰＡ）の製造
Ｎ－アシルアミノ酸としてＮ－オクタノイルグリシン（Ｃ８Ｇｌｙ、２８．１８ｇ、０．１４ｍｏｌ）、アルコールとしてはイソプロピルアルコール（４１８ｍＬ、５．４８ｍｏｌ）を使用し、製造例Ａの合成法に従って反応させることによりＣ８Ｇｌｙ－ｉＰＡを得た（収率９７％）。
ＥＳＩ－ＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｚ ２４４．１［Ｍ＋Ｈ］＋，２６６．１［Ｍ＋Ｎａ］＋
製造例４：Ｎ－オクタノイルイソロイシンイソプロピルエステル（Ｃ８Ｉｌｅ－ｉＰＡ）の製造
Ｎ－アシルアミノ酸としてＮ－オクタノイルイソロイシン（Ｃ８Ｉｌｅ、３６．０３ｇ、０．１４ｍｏｌ）、アルコールとしてはイソプロピルアルコール（４１８ｍＬ、５．４８ｍｏｌ）を使用し、製造例Ａの合成法に従って反応させることによりＣ８Ｉｌｅ－ｉＰＡを得た（収率７１％）。
ＥＳＩ－ＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｚ ３００．２［Ｍ＋Ｈ］＋，３２２．２［Ｍ＋Ｎａ］＋
製造例５：Ｎ－オクタノイルロイシンイソプロピルエステル（Ｃ８Ｌｅｕ－ｉＰＡ）の製造
Ｎ－アシルアミノ酸としてＮ－オクタノイルロイシン（Ｃ８Ｌｅｕ、３６．０３ｇ、０．１４ｍｏｌ）、アルコールとしてはイソプロピルアルコール（４１８ｍＬ、５．４８ｍｏｌ）を使用し、製造例Ａの合成法に従って反応させることによりＣ８Ｌｅｕ－ｉＰＡを得た（収率９７％）。
ＥＳＩ－ＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｚ ３００．２［Ｍ＋Ｈ］＋，３２２．２［Ｍ＋Ｎａ］＋
製造例６：Ｎ－ラウロイルイソロイシンイソプロピルエステル（Ｃ１２Ｉｌｅ－ｉＰＡ）の製造
Ｎ－アシルアミノ酸としてＮ－ラウロイルイソロイシン（Ｃ１２Ｉｌｅ、４３．８９ｇ、０．１４ｍｏｌ）、アルコールとしてはイソプロピルアルコール（４１８ｍＬ、５．４８ｍｏｌ）を使用し、製造例Ａの合成法に従って反応させることによりＣ１２Ｉｌｅ－ｉＰＡを得た（収率８５％）。
ＥＳＩ－ＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｚ ３５６．３［Ｍ＋Ｈ］＋，３７８．２［Ｍ＋Ｎａ］＋
製造例７：Ｎ－オクタノイルアラニンエチルエステル（Ｃ８Ａｌａ－Ｅｔ）の製造
Ｎ－アシルアミノ酸としてＮ－オクタノイルアラニン（Ｃ８Ａｌａ、３０．００ｇ、０．１４ｍｏｌ）、アルコールとしてはエタノール（３２０ｍＬ、５．４８ｍｏｌ）を使用し、製造例Ａの合成法に従って反応させることによりＣ８Ｖａｌ－Ｅｔを得た（収率９０％）。
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，ｒ．ｔ．）：δ６．０６３－６．０７８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），４．５５２－４．６２４（１Ｈ，ｑｕｉｎｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），４．１７６－４．２３０（２Ｈ，ｑ, Ｊ＝７．２Ｈｚ），２．１８６－２．２２４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），１．５９９－１．６７０（２Ｈ，ｑｕｉｎｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），１．３８９－１．４０７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）１．２６７－１．３０２（１１Ｈ，ｍ），０．８６０－０．８９２（３Ｈ，ｍ）ｐｐｍ．
ＥＳＩ－ＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｚ ２４４．２［Ｍ＋Ｈ］＋，２６６．１［Ｍ＋Ｎａ］＋
製造例８：Ｎ－オクタノイルバリンエチルエステル（Ｃ８Ｖａｌ－Ｅｔ）の製造
Ｎ－アシルアミノ酸としてＮ－オクタノイルバリン（Ｃ８Ｖａｌ、３４．０６ｇ、０．１４ｍｏｌ）、アルコールとしてはエタノール（３２０ｍＬ、５．４８ｍｏｌ）を使用し、製造例Ａの合成法に従って８時間反応させることによりＣ８Ｖａｌ－Ｅｔを得た（収率９３％）。
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，ｒ．ｔ．）：δ５．９５２－５．９７３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），４．５５７－４．５９１（１Ｈ，ｄｄ），４．１５９－４．２４１（２Ｈ，ｍ），２．２１７－２．２５５（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），２．１２１－２．２０２（１Ｈ，ｓｅｘ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），１．６１０－１．６８１（２Ｈ，ｑｕｉｎｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），１．２６８－１．３０３（１１Ｈ，ｍ），０．８６０－０．９５２（９Ｈ，ｍ）ｐｐｍ．
ＥＳＩ－ＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｚ ２７２．２［Ｍ＋Ｈ］＋，２９４．１［Ｍ＋Ｎａ］＋
製造例９：Ｎ－オクタノイルグリシンエチルエステル（Ｃ８Ｇｌｙ－Ｅｔ）の製造
Ｎ－アシルアミノ酸としてＮ－オクタノイルグリシン（Ｃ８Ｇｌｙ、２８．１８ｇ、０．１４ｍｏｌ）、アルコールとしてはエタノール（３２０ｍＬ、５．４８ｍｏｌ）を使用し、製造例Ａの合成法に従って反応させることによりＣ８Ｇｌｙ－Ｅｔを得た（収率９６％）。
ＥＳＩ－ＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｚ ２３０．２［Ｍ＋Ｈ］＋，２５２．１［Ｍ＋Ｎａ］＋
製造例１０：Ｎ－オクタノイルイソロイシンエチルエステル（Ｃ８Ｉｌｅ－Ｅｔ）の製造
Ｎ－アシルアミノ酸としてＮ－オクタノイルイソロイシン（Ｃ８Ｉｌｅ、３６．０３ｇ、０．１４ｍｏｌ）、アルコールとしてはエタノール（３２０ｍＬ、５．４８ｍｏｌ）を使用し、製造例Ａの合成法に従って反応させることによりＣ８Ｉｌｅ－Ｅｔを得た（収率９７％）。
ＥＳＩ－ＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｚ ２８６．２［Ｍ＋Ｈ］＋，３０８．２［Ｍ＋Ｎａ］＋
製造例１１：Ｎ－オクタノイルロイシンエチルエステル（Ｃ８Ｌｅｕ－Ｅｔ）の製造
Ｎ－アシルアミノ酸としてＮ－オクタノイルロイシン（Ｃ８Ｌｅｕ、３６．０３ｇ、０．１４ｍｏｌ）、アルコールとしてはエタノール（３２０ｍＬ、５．４８ｍｏｌ）を使用し、製造例Ａの合成法に従って反応させることによりＣ８Ｇｌｙ－Ｅｔを得た（収率９８％）。
ＥＳＩ－ＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｚ ２８６．２［Ｍ＋Ｈ］＋，３０８．２［Ｍ＋Ｎａ］＋
製造例１２：Ｎ－ラウロイルイソロイシンエチルエステル（Ｃ１２Ｉｌｅ－Ｅｔ）の製造
Ｎ－アシルアミノ酸としてＮ－ラウロイルイソロイシン（Ｃ１２Ｉｌｅ、４３．８９ｇ、０．１４ｍｏｌ）、アルコールとしてはエタノール（３２０ｍＬ、５．４８ｍｏｌ）を使用し、製造例Ａの合成法に従って反応させることによりＣ１２Ｉｌｅ－Ｅｔを得た（収率９１％）。
ＥＳＩ－ＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｚ ３４２．３［Ｍ＋Ｈ］＋，３６４．３［Ｍ＋Ｎａ］＋
製造例１３：Ｎ－ラウロイルロイシンエチルエステル（Ｃ１２Ｌｅｕ－Ｅｔ）の製造
Ｎ－アシルアミノ酸としてＮ－ラウロイルロイシン（Ｃ１２Ｌｅｕ、４３．８９ｇ、０．１４ｍｏｌ）、アルコールとしてはエタノール（３２０ｍＬ、５．４８ｍｏｌ）を使用し、製造例Ａの合成法に従って反応させることによりＣ１２Ｌｅｕ－Ｅｔを得た（収率８８％）。
ＥＳＩ－ＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｚ ３４２．３［Ｍ＋Ｈ］＋，３６４．３［Ｍ＋Ｎａ］＋
製造例１４：Ｎ－ラウロイルバリンエチルエステル（Ｃ１２Ｖａｌ－Ｅｔ）の製造
Ｎ－アシルアミノ酸としてＮ－ラウロイルバリン（Ｃ１２Ｖａｌ、４１．９２ｇ、０．１４ｍｏｌ）、アルコールとしてはエタノール（３２０ｍＬ、５．４８ｍｏｌ）を使用し、製造例Ａの合成法に従って８時間反応させることによりＣ１２Ｖａｌ－Ｅｔを得た（収率８７％）。
ＥＳＩ－ＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｚ ３２８．３［Ｍ＋Ｈ］＋，３５０．２［Ｍ＋Ｎａ］＋
製造例１５：Ｎ－デカノイルバリンイソプロピルエステル（Ｃ１０Ｖａｌ－ｉＰＡ）の製造
Ｎ－アシルアミノ酸としてＮ－デカノイルバリン（Ｃ１０Ｖａｌ、３８ｇ、０．１４ｍｏｌ）、アルコールとしてはイソプロピルアルコール（４１８ｍＬ、５．４８ｍｏｌ）を使用し、製造例Ａの合成法に従って反応させることによりＣ１０Ｖａｌ－ｉＰＡを得た（収率９８％）。
ＥＳＩ－ＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）ｍ／ｚ ３１４．５［Ｍ＋Ｈ］＋，３３６．４［Ｍ＋Ｎａ］＋
製造例１６：Ｎ－デカノイルアラニンイソプロピルエステル（Ｃ１０Ａｌａ－ｉＰＡ）の製造
Ｎ－アシルアミノ酸としてＮ－デカノイルアラニン（Ｃ１０Ａｌａ、３４．６ｇ、０．１４ｍｏｌ）、アルコールとしてはイソプロピルアルコール（４１８ｍＬ、５．４８ｍｏｌ）を使用し、製造例Ａの合成法に従って反応させることによりＣ１０Ａｌａ－ｉＰＡを得た（収率９７％）。
ＥＳＩ－ＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）ｍ／ｚ ２８５．４［Ｍ＋Ｈ］＋，３０７．４［Ｍ＋Ｎａ］＋
製造例１７：Ｎ－デカノイルロイシンイソプロピルエステル（Ｃ１０Ｌｅｕ－ｉＰＡ）の製造
Ｎ－アシルアミノ酸としてＮ－デカノイルロイシン（Ｃ１０Ｌｅｕ、３９．９ｇ、０．１４ｍｏｌ）、アルコールとしてはイソプロピルアルコール（４１８ｍＬ、５．４８ｍｏｌ）を使用し、製造例Ａの合成法に従って反応させることによりＣ１０Ｌｅｕ－ｉＰＡを得た（収率９７％）。
ＥＳＩ－ＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）ｍ／ｚ ３２８．５［Ｍ＋Ｈ］＋，３５０．３［Ｍ＋Ｎａ］＋
製造例１８：Ｎ－ヘキサノイルバリンエチルエステル（Ｃ６Ｖａｌ－Ｅｔ）の製造
Ｎ－アシルアミノ酸としてＮ－ヘキサノイルバリン（Ｃ６Ｖａｌ、３０．１４ｇ、０．１４ｍｏｌ）、アルコールとしてはエタノール（３２０ｍＬ、５．４８ｍｏｌ）を使用し、製造例Ａの合成法に従って８時間反応させることによりＣ６Ｖａｌ－Ｅｔを得た（収率８２％）。
ＥＳＩ－ＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ） ｍ／ｚ ２４４．３［Ｍ＋Ｈ］＋，２６６．２［Ｍ＋Ｎａ］＋
参考製造例１～３：Ｎ－ラウリルバリンイソプロピルエステル（Ｃ１２Ｖａｌ－ｉＰＡ）、Ｎ－ラウリルアラニンイソプロピルエステル（Ｃ１２Ａｌａ－ｉＰＡ）、およびＮ－ラウリルアラニンエチルエステル（Ｃ１２Ａｌａ－Ｅｔ）の製造
Ｎ－ラウリルバリンイソプロピルエステル（Ｃ１２Ｖａｌ－ｉＰＡ）、Ｎ－ラウリルアラニンイソプロピルエステル（Ｃ１２Ａｌａ－ｉＰＡ）、およびＮ－ラウリルアラニンエチルエステル（Ｃ１２Ａｌａ－Ｅｔ）の製造は、特開平１１－２４０８２８号公報の記載に従って行った。
Ｎ－ラウリルバリンイソプロピルエステル（Ｃ１２Ｖａｌ－ｉＰＡ）、Ｎ－ラウリルアラニンイソプロピルエステル（Ｃ１２Ａｌａ－ｉＰＡ）、およびＮ－ラウリルアラニンエチルエステル（Ｃ１２Ａｌａ－Ｅｔ）の製造は、特開平１１－２４０８２８号公報の記載に従って行った。
実施例１：アシル中性アミノ酸エステルの評価
（１）疎水性有機溶媒（油）との相溶性の評価
１ｇの各種サンプルを測り取り、５ｇの流動パラフィンに添加し、２５℃で１０分間撹拌して混合した。撹拌停止後、２５℃で１０分静置し、目視により各種サンプルおよび流動パラフィンの分離状態を確認し、下記の基準によって評価を行った。
とても好ましい（Ａ）：全く分離が確認されず透明な溶液
好ましい（Ｂ）：ほとんど分離が確認されず透明な溶液
あまり好ましくない（Ｃ）：局所的に分離し濁りが生じた
全く好ましくない：（Ｄ）：明確に分離が起きた
（１）疎水性有機溶媒（油）との相溶性の評価
１ｇの各種サンプルを測り取り、５ｇの流動パラフィンに添加し、２５℃で１０分間撹拌して混合した。撹拌停止後、２５℃で１０分静置し、目視により各種サンプルおよび流動パラフィンの分離状態を確認し、下記の基準によって評価を行った。
とても好ましい（Ａ）：全く分離が確認されず透明な溶液
好ましい（Ｂ）：ほとんど分離が確認されず透明な溶液
あまり好ましくない（Ｃ）：局所的に分離し濁りが生じた
全く好ましくない：（Ｄ）：明確に分離が起きた
（２）親水性有機溶媒との相溶性の評価
０．５ｇの各種サンプルを測り取り、１０ｇの１，３－ブチレングリコールに添加し、２５℃で１０分間撹拌して混合した。撹拌停止後、２５℃で１０分静置し、目視により各種サンプルおよび１，３－ブチレングリコールの分離状態を確認し、下記の基準によって評価を行った。
とても好ましい（Ａ）：全く分離が確認されず透明な溶液
好ましい（Ｂ）：ほとんど分離が確認されず透明な溶液
あまり好ましくない（Ｃ）：局所的に分離し濁りが生じた
全く好ましくない：（Ｄ）：明確に分離が起きた
０．５ｇの各種サンプルを測り取り、１０ｇの１，３－ブチレングリコールに添加し、２５℃で１０分間撹拌して混合した。撹拌停止後、２５℃で１０分静置し、目視により各種サンプルおよび１，３－ブチレングリコールの分離状態を確認し、下記の基準によって評価を行った。
とても好ましい（Ａ）：全く分離が確認されず透明な溶液
好ましい（Ｂ）：ほとんど分離が確認されず透明な溶液
あまり好ましくない（Ｃ）：局所的に分離し濁りが生じた
全く好ましくない：（Ｄ）：明確に分離が起きた
（３）性状評価
各化合物を４℃に一日冷却した後、室温（２５℃）で３日間放置した。３日後、各化合物の性状を室温（２５℃）で確認した。
好ましい（Ａ）：性状が室温（２５℃）で液状である。したがって、加熱せずに他の液状成分と室温で混ぜるだけで処方を作製することが容易である。
好ましくない（Ｂ）：性状が室温（２５℃）で固形または結晶形であり、加熱せずに他の液状成分と室温で混ぜるだけで処方を作製することが困難である。
各化合物を４℃に一日冷却した後、室温（２５℃）で３日間放置した。３日後、各化合物の性状を室温（２５℃）で確認した。
好ましい（Ａ）：性状が室温（２５℃）で液状である。したがって、加熱せずに他の液状成分と室温で混ぜるだけで処方を作製することが容易である。
好ましくない（Ｂ）：性状が室温（２５℃）で固形または結晶形であり、加熱せずに他の液状成分と室温で混ぜるだけで処方を作製することが困難である。
（４）エモリエント性の評価
つぎに、エモリエント性を評価した。専門パネラー５名の手の甲を石鹸で洗浄後乾燥させ、そこに２００ｍｇずつの評価サンプルを添加し、均一皮膚展開してもらった。２５℃で１５分間乾燥後に各サンプルの添加によって、肌のカサカサな状態を改善して肌が整ったか、および保湿性が向上されたかの評価を下記の基準によって行った。パネラーの平均評価点数に基づき、使用時のエモリエント性を下記のように評価した。
つぎに、エモリエント性を評価した。専門パネラー５名の手の甲を石鹸で洗浄後乾燥させ、そこに２００ｍｇずつの評価サンプルを添加し、均一皮膚展開してもらった。２５℃で１５分間乾燥後に各サンプルの添加によって、肌のカサカサな状態を改善して肌が整ったか、および保湿性が向上されたかの評価を下記の基準によって行った。パネラーの平均評価点数に基づき、使用時のエモリエント性を下記のように評価した。
＜使用時のエモリエント性の評価＞
３点：肌が非常に整い、保湿性の向上がとても堅調であった
２点：肌が整い、保湿性の向上が堅調であった
１点：肌があまり整わず、保湿性の向上があまり感じられなかった
０点：肌が全く整わず、保湿性の向上が全く感じられなかった
３点：肌が非常に整い、保湿性の向上がとても堅調であった
２点：肌が整い、保湿性の向上が堅調であった
１点：肌があまり整わず、保湿性の向上があまり感じられなかった
０点：肌が全く整わず、保湿性の向上が全く感じられなかった
専門パネラーの評価の平均点が
２．４以上をＡ、
１．５以上２．４未満をＢ、
０．５以上１．５未満をＣ、
０．５未満をＤ
とした。
２．４以上をＡ、
１．５以上２．４未満をＢ、
０．５以上１．５未満をＣ、
０．５未満をＤ
とした。
その結果、アシル中性アミノ酸エステルは、疎水性有機溶媒（油）および親水性有機溶媒と安定的に配合することができた（表１）。したがって、アシル中性アミノ酸エステルは、油剤として優れることが示された。
アシル中性アミノ酸エステルはまた、処方の作製を容易にした（表１）。したがって、アシル中性アミノ酸エステルは、ハンドリング性に優れることが示された。
アシル中性アミノ酸エステルはさらに、エモリエント性が優れていた（表１）。したがって、アシル中性アミノ酸エステルは、エモリエント作用により角層の外から角層における水分量の保持を改善できることが示された（表１）。
アシル中性アミノ酸エステルはまた、処方の作製を容易にした（表１）。したがって、アシル中性アミノ酸エステルは、ハンドリング性に優れることが示された。
アシル中性アミノ酸エステルはさらに、エモリエント性が優れていた（表１）。したがって、アシル中性アミノ酸エステルは、エモリエント作用により角層の外から角層における水分量の保持を改善できることが示された（表１）。
実施例２：アシル中性アミノ酸エステルのエステラーゼによる加水分解の評価
５ｍｇのアシル中性アミノ酸エステルを１ｘＰＢＳバッファーに添加し、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００（Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を２．１５μｌ（０．２ｗｔ％）添加した後超音波照射によって均一に混合した。混合物にエステラーゼ（Ｅｓｔｅｒａｓｅ ｆｒｏｍ ｐｏｒｃｉｎｅ ｌｉｖｅｒ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）のバッファー溶液をアシルアミノ酸１分子対してエステラーゼが５Ｕｎｉｔになるように添加し、撹拌して混合した。この混合物を３０℃に加温した振とう機において２４時間振とう・撹拌し反応させた。反応物を１２０００ｘｇの遠心分離器によって遠心し、上澄みを高速液体クロマトグラフィー（島津社製）に分析した。コントロールとしてはエステラーゼ溶液の代わりにバッファーのみを添加した。使用したエステラーゼ（Ｅｓｔｅｒａｓｅ ｆｒｏｍ ｐｏｒｃｉｎｅ ｌｉｖｅｒ）は、ヒト皮膚中に存在するエステラーゼ酵素のモデルとして使用した〔Ｂｏｎｉｎａ，Ｆ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１４，１２３－１３４（２００１）；Ｗｏｎｇ，Ｏ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．，５２，１９１－２０２（１９８９）；Ｖａｖｒｏｖａ Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ．１０４，４１－４９（２００５）〕。
５ｍｇのアシル中性アミノ酸エステルを１ｘＰＢＳバッファーに添加し、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００（Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を２．１５μｌ（０．２ｗｔ％）添加した後超音波照射によって均一に混合した。混合物にエステラーゼ（Ｅｓｔｅｒａｓｅ ｆｒｏｍ ｐｏｒｃｉｎｅ ｌｉｖｅｒ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）のバッファー溶液をアシルアミノ酸１分子対してエステラーゼが５Ｕｎｉｔになるように添加し、撹拌して混合した。この混合物を３０℃に加温した振とう機において２４時間振とう・撹拌し反応させた。反応物を１２０００ｘｇの遠心分離器によって遠心し、上澄みを高速液体クロマトグラフィー（島津社製）に分析した。コントロールとしてはエステラーゼ溶液の代わりにバッファーのみを添加した。使用したエステラーゼ（Ｅｓｔｅｒａｓｅ ｆｒｏｍ ｐｏｒｃｉｎｅ ｌｉｖｅｒ）は、ヒト皮膚中に存在するエステラーゼ酵素のモデルとして使用した〔Ｂｏｎｉｎａ，Ｆ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１４，１２３－１３４（２００１）；Ｗｏｎｇ，Ｏ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．，５２，１９１－２０２（１９８９）；Ｖａｖｒｏｖａ Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ．１０４，４１－４９（２００５）〕。
アシル中性アミノ酸エステルのエステル結合がエステラーゼによって加水分解されると、ＨＰＬＣクロマトグラム上では、アシル中性アミノ酸エステルのピーク面積が減少し、アシル中性アミノ酸と同一溶出時間に新しいピークが確認される。このピークの出現によってアシル中性アミノ酸エステルがエステラーゼによって加水分解され、アシル中性アミノ酸が生成されたと結論付けることができる。
試験物質としては、製造例１～１８、および参考製造例１～３により製造した化合物を用いた。
エステラーゼの存在下では、Ｃ６Ｖａｌ－Ｅｔ、Ｃ８Ａｌａ－ｉＰＡ、Ｃ８Ｖａｌ－ｉＰＡ、Ｃ８Ｇｌｙ－ｉＰＡ、Ｃ８Ｉｌｅ－ｉＰＡ、Ｃ８Ｌｅｕ－ｉＰＡ、Ｃ８Ａｌａ－Ｅｔ、Ｃ８Ｖａｌ－Ｅｔ、Ｃ８Ｇｌｙ－Ｅｔ、Ｃ８Ｉｌｅ－Ｅｔ、Ｃ８Ｌｅｕ－Ｅｔ、Ｃ１２Ｉｌｅ－Ｅｔ、Ｃ１０Ａｌａ－ｉＰＡ、Ｃ１０Ｖａｌ－ｉＰＡ、Ｃ１０Ｌｅｕ－ｉＰＡ、Ｃ１２Ａｌａ－Ｅｔ、Ｃ１２Ａｌａ－ｉＰＡ、Ｃ１２Ｖａｌ－Ｅｔ、Ｃ１２Ｖａｌ－ｉＰＡ、Ｃ１２Ｉｌｅ－ｉＰＡ、Ｃ１２Ｌｅｕ－Ｅｔのすべてが加水分解され、Ｃ６Ｖａｌ、Ｃ８Ａｌａ、Ｃ８Ｖａｌ、Ｃ８Ｇｌｙ、Ｃ８Ｉｌｅ、Ｃ８Ｌｅｕ、Ｃ１０Ａｌａ、Ｃ１０Ｖａｌ、Ｃ１０Ｌｅｕ、Ｃ１２Ａｌａ、Ｃ１２Ｖａｌ、Ｃ１２Ｉｌｅ、Ｃ１２Ｌｅｕが生成された。
実施例３～７および比較例２～３：オクタノイル中性アミノ酸による保湿関連タンパク質等の遺伝子の増幅量の比較
ヒト正常表皮角化細胞ＮＨＥＫ（ＮＢ）（クラボウ社製）をＨｕＭｅｄｉａ－ＫＧ２（クラボウ社製）で前培養し、３０ｘ１０４細胞／ｍＬの濃度となるよう調整し、調整後の培養液２ｍＬ（すなわち、６０ｘ１０４細胞／ｗｅｌｌ）を６ｗｅｌｌプレートに添加して３７℃で１日培養した。サンプル（オクタノイルバリン（実施例３：Ｃ８Ｖａｌ）、オクタノイルアラニン（実施例４：Ｃ８Ａｌａ）、オクタノイルロイシン（実施例５：Ｃ８Ｌｅｕ）、オクタノイルイソロイシン（実施例６：Ｃ８Ｉｌｅ）、オクタノイルグリシン（実施例７：Ｃ８Ｇｌｙ）、グリシルプロリン（比較例２：Ｇｌｙ－Ｐｒｏ）、およびバリン（比較例３：Ｖａｌ））を各図に示す濃度となるように添加し、４８時間反応させた。反応後、細胞より全ＲＮＡを抽出し、逆転写を行い、リアルタイムＰＣＲにて標的遺伝子（フィラグリン、インボルクリン、卜ランスグルタミナーゼ（ＴＧ）１、ケラチン１０、およびロリクリン）の増幅量を測定し（ｎ＝２）、コントロール（無添加）の増幅量と比較した。補正遺伝子としてＧＡＰＤＨを用いた。計算は比較ＣＴ法を用い、プライマーおよびプロ一ブはＴａｑＭａｎ（登録商標） Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎを用い、蛍光色素はＦＡＭを用いた。結果を図１～２に示す。
ヒト正常表皮角化細胞ＮＨＥＫ（ＮＢ）（クラボウ社製）をＨｕＭｅｄｉａ－ＫＧ２（クラボウ社製）で前培養し、３０ｘ１０４細胞／ｍＬの濃度となるよう調整し、調整後の培養液２ｍＬ（すなわち、６０ｘ１０４細胞／ｗｅｌｌ）を６ｗｅｌｌプレートに添加して３７℃で１日培養した。サンプル（オクタノイルバリン（実施例３：Ｃ８Ｖａｌ）、オクタノイルアラニン（実施例４：Ｃ８Ａｌａ）、オクタノイルロイシン（実施例５：Ｃ８Ｌｅｕ）、オクタノイルイソロイシン（実施例６：Ｃ８Ｉｌｅ）、オクタノイルグリシン（実施例７：Ｃ８Ｇｌｙ）、グリシルプロリン（比較例２：Ｇｌｙ－Ｐｒｏ）、およびバリン（比較例３：Ｖａｌ））を各図に示す濃度となるように添加し、４８時間反応させた。反応後、細胞より全ＲＮＡを抽出し、逆転写を行い、リアルタイムＰＣＲにて標的遺伝子（フィラグリン、インボルクリン、卜ランスグルタミナーゼ（ＴＧ）１、ケラチン１０、およびロリクリン）の増幅量を測定し（ｎ＝２）、コントロール（無添加）の増幅量と比較した。補正遺伝子としてＧＡＰＤＨを用いた。計算は比較ＣＴ法を用い、プライマーおよびプロ一ブはＴａｑＭａｎ（登録商標） Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎを用い、蛍光色素はＦＡＭを用いた。結果を図１～２に示す。
図１～２から明らかなとおり、実施例３～７の各標的遺伝子の増幅量は、比較例２および３と比べて高かった。これらの結果は、アシル中性アミノ酸が保湿関連タンパク質の産生を促進できることを示している。
実施例８～１３：アシルバリンによる保湿関連タンパク質等の遺伝子の増幅量の比較
サンプルとして、ブタノイルバリン（実施例８：Ｃ４Ｖａｌ）、ヘキサノイルバリン（実施例９：Ｃ６Ｖａｌ）、オクタノイルバリン（実施例１０：Ｃ８Ｖａｌ）、デカノイルバリン（実施例１１：Ｃ１０Ｖａｌ）、ラウロイルバリン（実施例１２：Ｃ１２Ｖａｌ）およびアセチルバリン（実施例１３：Ｃ２Ｖａｌ）を用いたこと、および、標的遺伝子をフィラグリン、インボルクリン、および卜ランスグルタミナーゼ（ＴＧ）１としたことのほかは、実施例３と同様に行った。結果を図３に示す。
サンプルとして、ブタノイルバリン（実施例８：Ｃ４Ｖａｌ）、ヘキサノイルバリン（実施例９：Ｃ６Ｖａｌ）、オクタノイルバリン（実施例１０：Ｃ８Ｖａｌ）、デカノイルバリン（実施例１１：Ｃ１０Ｖａｌ）、ラウロイルバリン（実施例１２：Ｃ１２Ｖａｌ）およびアセチルバリン（実施例１３：Ｃ２Ｖａｌ）を用いたこと、および、標的遺伝子をフィラグリン、インボルクリン、および卜ランスグルタミナーゼ（ＴＧ）１としたことのほかは、実施例３と同様に行った。結果を図３に示す。
図３から明らかなとおり、実施例８～１３のいずれにおいても、各標的遺伝子の増幅量がコントロールと比較して高かった。これらの結果は、炭素原子数２～１２のアシル基を有するアシル中性アミノ酸またはその塩は、アシル基の種類に拘らず保湿関連タンパク質の産生を促進できることを示している。
実施例１４～２４：アシルバリンまたはアシルアラニンによるフィラグリン遺伝子増幅量の比較
ヒト正常表皮角化細胞ＮＨＥＫ（ＮＢ）（クラボウ社製）をＨｕＭｅｄｉａ－ＫＧ２（クラボウ社製）で前培養し、１５ｘ１０４細胞／ｍＬの濃度となるよう調整し、調整後の培養液２ｍＬ（すなわち、３０ｘ１０４細胞／ｗｅｌｌ）を６ｗｅｌｌプレートに添加して３７℃で１日培養した。サンプル（ラウロイルバリン（実施例１４：Ｃ１２Ｖａｌ）、デカノイルバリン（実施例１５：Ｃ１０Ｖａｌ）、オクタノイルバリン（実施例１６：Ｃ８Ｖａｌ）、ヘキサノイルバリン（実施例１７：Ｃ６Ｖａｌ）、ブタノイルバリン（実施例１８：Ｃ４Ｖａｌ）、アセチルバリン（実施例１９：Ｃ２Ｖａｌ）、ラウロイルアラニン（実施例２０：Ｃ１２Ａｌａ）、デカノイルアラニン（実施例２１：Ｃ１０Ａｌａ）、オクタノイルアラニン（実施例２２：Ｃ８Ａｌａ）、ヘキサノイルアラニン（実施例２３：Ｃ６Ａｌａ）、ブタノイルアラニン（実施例２４：Ｃ４Ａｌａ））を各図に示す濃度となるように添加し、２４時間反応させた。反応後、細胞より全ＲＮＡを抽出し、逆転写を行い、リアルタイムＰＣＲにて標的遺伝子（フィラグリン）の増幅量を測定し（ｎ＝２）、コントロール（無添加）の増幅量を１００％とし、この値と比較した。補正遺伝子としてＧＡＰＤＨを用いた。計算は比較ＣＴ法を用い、プライマーおよびプロ一ブはＴａｑＭａｎ（登録商標） Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎを用い、蛍光色素はＦＡＭを用いた。
ヒト正常表皮角化細胞ＮＨＥＫ（ＮＢ）（クラボウ社製）をＨｕＭｅｄｉａ－ＫＧ２（クラボウ社製）で前培養し、１５ｘ１０４細胞／ｍＬの濃度となるよう調整し、調整後の培養液２ｍＬ（すなわち、３０ｘ１０４細胞／ｗｅｌｌ）を６ｗｅｌｌプレートに添加して３７℃で１日培養した。サンプル（ラウロイルバリン（実施例１４：Ｃ１２Ｖａｌ）、デカノイルバリン（実施例１５：Ｃ１０Ｖａｌ）、オクタノイルバリン（実施例１６：Ｃ８Ｖａｌ）、ヘキサノイルバリン（実施例１７：Ｃ６Ｖａｌ）、ブタノイルバリン（実施例１８：Ｃ４Ｖａｌ）、アセチルバリン（実施例１９：Ｃ２Ｖａｌ）、ラウロイルアラニン（実施例２０：Ｃ１２Ａｌａ）、デカノイルアラニン（実施例２１：Ｃ１０Ａｌａ）、オクタノイルアラニン（実施例２２：Ｃ８Ａｌａ）、ヘキサノイルアラニン（実施例２３：Ｃ６Ａｌａ）、ブタノイルアラニン（実施例２４：Ｃ４Ａｌａ））を各図に示す濃度となるように添加し、２４時間反応させた。反応後、細胞より全ＲＮＡを抽出し、逆転写を行い、リアルタイムＰＣＲにて標的遺伝子（フィラグリン）の増幅量を測定し（ｎ＝２）、コントロール（無添加）の増幅量を１００％とし、この値と比較した。補正遺伝子としてＧＡＰＤＨを用いた。計算は比較ＣＴ法を用い、プライマーおよびプロ一ブはＴａｑＭａｎ（登録商標） Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎを用い、蛍光色素はＦＡＭを用いた。
増幅量に応じて、以下の評価を行った。結果を表２～３および図４～５に示す。
とても好ましい（Ａ）：２００％以上
好ましい（Ｂ）：１００％以上２００％未満
あまり好ましくない（Ｃ）：５０％以上１００％未満
全く好ましくない（Ｄ）：５０％未満
とても好ましい（Ａ）：２００％以上
好ましい（Ｂ）：１００％以上２００％未満
あまり好ましくない（Ｃ）：５０％以上１００％未満
全く好ましくない（Ｄ）：５０％未満
以上の実施例２～２４の結果（表２、３、図１～５及び７、８）を考慮すると、アシル中性アミノ酸エステルは、フィラグリン等の保湿関連タンパク質の発現促進作用を向上させることができたことから、角層内部で水分を保持する保湿能を改善することができると考えられる。また、アシル中性アミノ酸エステルは肌のバリア能と関連するタンパク質の発現促進作用を向上させることができたことから、外来物の侵入を抑制するバリア能の改善することができると考えられる。また、これらの結果に加えて実施例１（表１）の結果も考慮すると、アシル中性アミノ酸エステルは、ハンドリング性に優れ、角層内部での作用、および角層外部からのエモリエント作用の双方により十分に角質機能改善能を示すことができると考えられる。
実施例２５～２９：細胞毒性の評価
ヒト正常表皮角化細胞ＮＨＥＫ（ＮＢ）（クラボウ社製）をＨｕＭｅｄｉａ－ＫＧ２（クラボウ社製）で前培養し、１５ｘ１０４細胞／ｍＬの濃度となるよう調整し、調整後の培養液２ｍＬ（すなわち、３０ｘ１０４細胞／ｗｅｌｌ）を６ｗｅｌｌプレートに添加して３７℃で１日培養した。サンプル（ラウロイルバリン（比較例４：Ｃ１２Ｖａｌ）、デカノイルバリン（実施例２５：Ｃ１０Ｖａｌ）、オクタノイルバリン（実施例２６：Ｃ８Ｖａｌ）、ヘキサノイルバリン（実施例２７：Ｃ６Ｖａｌ）、ブタノイルバリン（実施例２８：Ｃ４Ｖａｌ）、アセチルバリン（実施例２９：Ｃ２Ｖａｌ）を各図に示す濃度となるように添加し、２４時間反応させた。その後、培地を捨ててＮｅｕｔｒａｌ Ｒｅｄ溶液２ｍＬ／ｗｅｌｌに置換し、さらに２時間培養した。Ｎｅｕｔｒａｌ Ｒｅｄ溶液はＮｅｕｔｒａｌ Ｒｅｄ（クラボウ社）をＨｕＭｅｄｉａ－ＫＧ２培地／生理食塩水（２：１）混合溶液で１／１００に希釈したものを使用した。Ｎｅｕｔｒａｌ Ｒｅｄ溶液で染色した細胞は、ＰＢＳ（－）で一回洗浄した後、１％ＣａＣｌ２／１％ホルマリン溶液１．５ｍＬ／ｗｅｌｌで１分固定し、１％酢酸／５０％エタノール溶液１．５ｍＬ／ｗｅｌｌを添加して室温で２０分抽出を行い、プレートリーダーで吸光度５４０／６３０ｎｍを測定した。
ヒト正常表皮角化細胞ＮＨＥＫ（ＮＢ）（クラボウ社製）をＨｕＭｅｄｉａ－ＫＧ２（クラボウ社製）で前培養し、１５ｘ１０４細胞／ｍＬの濃度となるよう調整し、調整後の培養液２ｍＬ（すなわち、３０ｘ１０４細胞／ｗｅｌｌ）を６ｗｅｌｌプレートに添加して３７℃で１日培養した。サンプル（ラウロイルバリン（比較例４：Ｃ１２Ｖａｌ）、デカノイルバリン（実施例２５：Ｃ１０Ｖａｌ）、オクタノイルバリン（実施例２６：Ｃ８Ｖａｌ）、ヘキサノイルバリン（実施例２７：Ｃ６Ｖａｌ）、ブタノイルバリン（実施例２８：Ｃ４Ｖａｌ）、アセチルバリン（実施例２９：Ｃ２Ｖａｌ）を各図に示す濃度となるように添加し、２４時間反応させた。その後、培地を捨ててＮｅｕｔｒａｌ Ｒｅｄ溶液２ｍＬ／ｗｅｌｌに置換し、さらに２時間培養した。Ｎｅｕｔｒａｌ Ｒｅｄ溶液はＮｅｕｔｒａｌ Ｒｅｄ（クラボウ社）をＨｕＭｅｄｉａ－ＫＧ２培地／生理食塩水（２：１）混合溶液で１／１００に希釈したものを使用した。Ｎｅｕｔｒａｌ Ｒｅｄ溶液で染色した細胞は、ＰＢＳ（－）で一回洗浄した後、１％ＣａＣｌ２／１％ホルマリン溶液１．５ｍＬ／ｗｅｌｌで１分固定し、１％酢酸／５０％エタノール溶液１．５ｍＬ／ｗｅｌｌを添加して室温で２０分抽出を行い、プレートリーダーで吸光度５４０／６３０ｎｍを測定した。
細胞生存率に応じて、以下の評価を行った。結果を表４および図６に示す。
とても好ましい（Ａ）：９５％以上
好ましい（Ｂ）：７５％以上９５％未満
あまり好ましくない（Ｃ）：５０％以上７５％未満
全く好ましくない（Ｄ）：５０％未満
とても好ましい（Ａ）：９５％以上
好ましい（Ｂ）：７５％以上９５％未満
あまり好ましくない（Ｃ）：５０％以上７５％未満
全く好ましくない（Ｄ）：５０％未満
実施例１４～２４の結果は、各アシル中性アミノ酸がフィラグリン遺伝子を増幅することができることを示す。また、実施例２５～２９、比較例４の結果は、実施例２５～２９の各アシル中性アミノ酸およびアシル中性アミノ酸エステルの細胞毒性が低いのに対し、比較例４のアシル中性アミノ酸の細胞毒性が高いことを示す。
実施例３０：オクタノイルバリン（Ｃ８Ｖａｌ）によるプロフィラグリン産生率の向上
まず、ヒト正常表皮角化細胞ＮＨＥＫ（ＮＢ）（クラボウ社製）をＨｕＭｅｄｉａ－ＫＧ２（クラボウ社製）にて３７℃、５％ＣＯ２、飽和水蒸気下で培養した。コンフルエント状態になった細胞を、６ウェルプレートに１５×１０４（細胞／ウェル）で播種した。３７℃で１日培養後、１００μＭのオクタイノイルバリン（Ｃ８Ｖａｌ）と１．３ｍＭのＣａＣｌ２を添加したＨｕＭｅｄｉａ－ＫＧ２培地に交換し、１～２日毎に同様の培地交換を行い、６日間培養した。培養後、培地を取り除き、冷ＰＢＳ（－）にて２回洗浄し、プロテアーゼインヒビターとフォスファターゼインヒビター(ＥｚＲＩＰＡ Ｌｙｓｉｓ（ＡＴＴＯ社製）)を添加した抽出液（Ｍ－ＰＥＲ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製））を２００μＬ／ウェルで各ウェルに添加し、振とう機（ＴＡＩＴＥＣ社製）にて２００ｒｐｍで５分間振とうさせた。スクレーパーで細胞をかき集め、沈殿物を含めた液体全量に２００μＬの変性剤（ＥｚＡｐｐｌｙ（ＡＴＴＯ社製））を添加後、振とう機（Ｂｉｏｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）にて１１００ｒｐｍ、１００℃で５分間、加熱振とうした。得られた溶液を遠心分離機（トミー精工社製）１００００Ｇにて４℃で１０分間遠心処理し、上澄みをウェスタンブロット用サンプルとした。
まず、ヒト正常表皮角化細胞ＮＨＥＫ（ＮＢ）（クラボウ社製）をＨｕＭｅｄｉａ－ＫＧ２（クラボウ社製）にて３７℃、５％ＣＯ２、飽和水蒸気下で培養した。コンフルエント状態になった細胞を、６ウェルプレートに１５×１０４（細胞／ウェル）で播種した。３７℃で１日培養後、１００μＭのオクタイノイルバリン（Ｃ８Ｖａｌ）と１．３ｍＭのＣａＣｌ２を添加したＨｕＭｅｄｉａ－ＫＧ２培地に交換し、１～２日毎に同様の培地交換を行い、６日間培養した。培養後、培地を取り除き、冷ＰＢＳ（－）にて２回洗浄し、プロテアーゼインヒビターとフォスファターゼインヒビター(ＥｚＲＩＰＡ Ｌｙｓｉｓ（ＡＴＴＯ社製）)を添加した抽出液（Ｍ－ＰＥＲ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製））を２００μＬ／ウェルで各ウェルに添加し、振とう機（ＴＡＩＴＥＣ社製）にて２００ｒｐｍで５分間振とうさせた。スクレーパーで細胞をかき集め、沈殿物を含めた液体全量に２００μＬの変性剤（ＥｚＡｐｐｌｙ（ＡＴＴＯ社製））を添加後、振とう機（Ｂｉｏｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）にて１１００ｒｐｍ、１００℃で５分間、加熱振とうした。得られた溶液を遠心分離機（トミー精工社製）１００００Ｇにて４℃で１０分間遠心処理し、上澄みをウェスタンブロット用サンプルとした。
つぎに、ゲル１レーンあたり各ウェスタンブロット用サンプル２０μＬ（プロフィラグリン）、または（１）で調製したウェスタンブロット用サンプルを５０倍希釈した溶液５μＬ（ＧＡＰＤＨ）をｅ－ＰＡＧＥＬ ７．５％（ＡＴＴＯ社製）にアプライし、電気泳動装置（ＡＴＴＯ社製）にて２１ｍＡの定電流で１時間泳動した。電気泳動後のゲルからＰＶＤＦ膜に転写し、ＴＢＳ－Ｔ（ＡＴＴＯ社製）にて洗浄後、ＥｚＢｌｏｃｋ ＢＳＡ（ＡＴＴＯ社製）を用いてブロッキングした。次に、１次抗体液（Ａｎｔｉ Ｆｉｌａｇｇｒｉｎ （ＡＫＨ１）抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）（プロフィラグリン）、Ａｎｔｉ ＧＡＰＤＨ（６Ｃ５）抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）（ＧＡＰＤＨ））にて抗原抗体反応を行った。２次抗体（Ａｎｔｉ－ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ），Ｍｏｕｓｅ，Ｇｏａｔ－ｐｏｌｙ，ＨＲＰ（ＫＰＬ社製））にて標識化し、化学発光法によりイメージアナライザー（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）でバンド強度(２５０－４００ｋＤａ（プロフィラグリン），３７ｋＤａ（ＧＡＰＤＨ）)を数値化した（ｎ＝２）。プロフィラグリンの発現量はＧＡＰＤＨの発現量にて規格化し、コントロール（オクタイノイルバリン（Ｃ８Ｖａｌ）無添加）の産生量を１００％として比較した。
得られた結果を以下のとおり評価した。結果を表５に示す。
とても好ましい（Ａ）：２５０％以上
好ましい（Ｂ）：１５０％以上２５０％未満
あまり好ましくない（Ｃ）：１００％以上１５０％未満
全く好ましくない（Ｄ）：１００％未満
とても好ましい（Ａ）：２５０％以上
好ましい（Ｂ）：１５０％以上２５０％未満
あまり好ましくない（Ｃ）：１００％以上１５０％未満
全く好ましくない（Ｄ）：１００％未満
以上より、オクタノイルバリン（Ｃ８Ｖａｌ）がプロフィラグリンタンパク質の産生を向上させることが明らかとなった。
実施例３１：アシル中性アミノ酸エステルの分配係数の評価
アシル中性アミノ酸エステルの分配係数（ＬｏｇＰ）の値をＣｈｅｍＳｋｅｔｃｈ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｉｎｃ．，（ＡＣＤ／Ｌａｂｓ）社製）という化学構造式用計算ソフトを用いて計算した。
アシル中性アミノ酸エステルの分配係数（ＬｏｇＰ）の値をＣｈｅｍＳｋｅｔｃｈ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｉｎｃ．，（ＡＣＤ／Ｌａｂｓ）社製）という化学構造式用計算ソフトを用いて計算した。
表６からはＣ６Ａｌａ－iＰＡ、Ｃ６Ｖａｌ－Ｅｔ、Ｃ６Ｉｌｅ－Ｅｔ等のアシル中性アミノ酸エステルのＬｏｇＰ値が１～4の範囲内であり、より経皮吸収性に優れている性質を持っていることが理解できる（Ｍａｒｃ Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｒｍａｔｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，１，１９７－２０６（２００９））。
本発明の化合物は、角質機能改善剤および保湿剤等の剤として、ならびに化粧料、医薬品および医薬部外品等の製品の開発に有用である。
Claims (10)
- 下記（Ｉ）～（ＩＶ）から選ばれる化合物および有機溶媒を含む、皮膚外用剤：
（Ｉ）Ｎ－オクタノイルイソロイシンイソプロピルエステル、およびＮ－オクタノイルイソロイシンエチルエステル；
（ＩＩ）Ｎ－オクタノイルロイシンエチルエステル；
（ＩＩＩ）Ｎ－オクタノイルアラニンイソプロピルエステル（ただし、Ｎ－ココイルアラニンイソプロピルエステルに含まれるものを除く）、およびＮ－デカノイルアラニンイソプロピルエステル（ただし、Ｎ－ココイルアラニンイソプロピルエステルに含まれるものを除く）；ならびに
（ＩＶ）Ｎ－ヘキサノイルバリンエチルエステル、Ｎ－オクタノイルバリンエチルエステル、およびＮ－デカノイルバリンイソプロピルエステル。 - 前記化合物が前記（Ｉ）から選ばれる化合物である、請求項１記載の皮膚外用剤。
- 前記化合物が前記（ＩＩ）の化合物である、請求項１記載の皮膚外用剤。
- 前記化合物が前記（ＩＩＩ）から選ばれる化合物である、請求項１記載の皮膚外用剤。
- 前記化合物が前記（ＩＶ）から選ばれる化合物である、請求項１記載の皮膚外用剤。
- 下記（Ｉ）～（ＩＶ）から選ばれる化合物および有機溶媒を含む、化粧料：
（Ｉ）Ｎ－オクタノイルイソロイシンイソプロピルエステル、およびＮ－オクタノイルイソロイシンエチルエステル；
（ＩＩ）Ｎ－オクタノイルロイシンエチルエステル；
（ＩＩＩ）Ｎ－オクタノイルアラニンイソプロピルエステル（ただし、Ｎ－ココイルアラニンイソプロピルエステルに含まれるものを除く）、およびＮ－デカノイルアラニンイソプロピルエステル（ただし、Ｎ－ココイルアラニンイソプロピルエステルに含まれるものを除く）；ならびに
（ＩＶ）Ｎ－ヘキサノイルバリンエチルエステル、Ｎ－オクタノイルバリンエチルエステル、およびＮ－デカノイルバリンイソプロピルエステル。 - 前記化合物が前記（Ｉ）から選ばれる化合物である、請求項６記載の化粧料。
- 前記化合物が前記（ＩＩ）の化合物である、請求項６記載の化粧料。
- 前記化合物が前記（ＩＩＩ）から選ばれる化合物である、請求項６記載の化粧料。
- 前記化合物が前記（ＩＶ）から選ばれる化合物である、請求項６記載の化粧料。
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