JP7660563B2

JP7660563B2 - 改善された熱安定性ウイルス逆転写酵素

Info

Publication number: JP7660563B2
Application number: JP2022516609A
Authority: JP
Inventors: スーマンチュン，; デイビッドマークシュスター，; トーマスウィリアムショーンフェルド，
Original assignee: キアゲンビバリー，エルエルシー
Priority date: 2019-09-18
Filing date: 2020-09-18
Publication date: 2025-04-11
Anticipated expiration: 2040-09-18
Also published as: CN114641566A; EP3805380A1; EP3997218A1; CN114641566B; AU2020348400A1; US20220348891A1; JP2022548118A; CA3150778A1; EP3997218A4; US12398381B2; EP3805380B1; WO2021055729A1

Description

発明の分野
本発明は、ＲＮＡの検出および分析を改善するための新規に操作された逆転写酵素を提供する。本発明はまた、そのような逆転写酵素を使用して鋳型核酸を増幅するための方法および前記酵素を産生する方法を提供する。本発明は、ＲＮＡの検出および分析における現在の技術水準の逆転写酵素の欠陥に対処し、それには、特に長さ、二次構造およびヌクレオチド含有量がさまざまである鋳型核酸を使用した場合の検出感度、特異性、副酵素活性、酵素安定性および合成能力の欠陥が含まれる。

技術的背景
ＲＮＡの検出および分析は、遺伝子発現、遺伝子サイレンシング、重要な病原体、特にＲＮＡウイルスの存在または不在、およびその他の医学的に重要な状態などの重要な生物学的現象への洞察をもたらすことができる。メッセンジャーＲＮＡ、ノンコーディングＲＮＡおよびウイルスＲＮＡの存在もしくは不在または量の変化をモニターすることができれば、癌またはウイルス感染などの重要な病状の診断が可能になり、一般に生物学的プロセスの研究が容易になる。これらの理由から、これらの分析における技術水準の改善が強く求められている。

ＲＮＡ分析の最も一般的な方法は、いくつかの関連する分析および調製方法の重要な段階である、ＲＮＡ鋳型を使用して相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の合成を触媒する逆転写酵素に依存している（Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎ１９７１、Ｔｅｌｅｓｎｉｔｓｋｙ１９９７）。例えば、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）（Ｌｅｅ１９８９）およびその変形である定量的ＲＴ－ＰＣＲ（ＲＴｑＰＣＲ）、リアルタイム定量的ＲＴ－ＰＣＲ（ＲＴＲＴ－ＰＣＲ）（Ｏｗａｒｚｅｋ１９９２、Ｐａｒｉａ１９９３、Ｇｉｂｓｏｎ１９９６）およびデジタルＲＴ－ＰＣＲ（ＲＴｄＰＣＲ）（Ｗａｒｒｅｎ２００６、Ｓａｎｄｅｒｓ２０１８）は、基本的に、ｃＤＮＡが逆転写によって合成され、ＰＣＲによって増幅される２段階プロセスである。一般に、これら２つの機能は、逆転写酵素（ＲＴ）、多くの場合モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）ＲＴ誘導体と、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｏｌ）、通常はＴａｑＰｏｌという別個の酵素によって提供される。これらの方法の性能は両方の活性に依存するが、ＰＣＲ段階は一般によく確立されて堅牢であるため、ＲＴ酵素に着目して改善点を求めることが最も一般的である。

ＲＴ－ＰＣＲに加えて、転写物、ノンコーディングＲＮＡ、およびウイルスゲノミクスおよびメタゲノミクスに焦点を当てたＲＮＡ中心のゲノミクスの分野は、集合的にＲＮＡ－Ｓｅｑと呼ばれる分析アプローチの変形に依存している（Ｈｒｄｌｉｃｋｏｖａ２０１７、Ｂｏｏｎｅら、２０１８で概説されている）。さまざまなＲＮＡ－Ｓｅｑ戦略は、遺伝子発現および転写物の相対的存在量の変動、ウイルスゲノム配列とその進化の多様性、イントロンプロセシングとスプライシングなどの現象およびその他の関連する現象に関連するさまざまな生物学的問題に対処するために使用される。いずれの場合も、酵素成分は、配列解析に使用されるライブラリーの生成に重要であり、解析の全体的な品質と信頼性に大きな影響を及ぼす。ＲＴ－ＰＣＲおよびＲＮＡ－Ｓｅｑに加えて、ｃＤＮＡ合成は、転写物と翻訳タンパク質に関するより集中的な解析のためのｃＤＮＡのクローニングに関連する調製方法として、伝統的に多く使用されている（Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎ１９７１、Ｂｕｒｒｅｌｌ１９９６）。これらの解析の各々において最適な性能を発揮するために酵素に独特の要求が課され、ＲＴの選択は方法の有効性および信頼性に大きな影響を与える（Ｏｋｅｌｌｏ２０１０、Ｂｕｓｔｉｎ２０１５）。

エンジニアリングは、特定の用途におけるＲＴの性能を向上させた。多くのＲＴは、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ成分を消化する固有のＲＮアーゼＨ活性を有する（Ｇｅｒａｒｄ１９７５）。これは特定の用途にとってプラスの特性であるが、他の一般的な使用を妨げる（Ｇａｒｃｅｓ１９９１）。ＲＮアーゼＨ活性を無効にすることには二次的な効果がある。ヌクレアーゼとしての標準的な機能を除去するだけでなく、突然変異誘発によってＲＮアーゼＨ活性を除去することによって熱安定性も向上する。このことにより、高温での合成が可能になり、それにより高度に構造化されたＲＮＡ標的の分析が容易になる。ＭＭＬＶＲＴに関するさらなる研究により、特定のドメイン、特に副溝結合トラック（ＭＧＢＴ）と接続ドメイン（ＣＤ）が、鋳型との相互作用に役割を果たすことが示されている（Ｂｅａｒｄ１９９４）。ＲＮアーゼＨ活性、ＭＧＢＴまたはＣＤあるいはその組合せのいずれかを修飾することにより、鋳型スイッチング（Ｇａｒｃｅｓ１９９１、Ｓｖａｒｏｖｓｋａｉａ２０００）、鋳型に対する親和性、さらに、伸長により、産物の長さを増加させることができる。これらの改善は、ＲＴ－ＰＣＲ、ＲＮＡ－Ｓｅｑライブラリーの調製、ｃＤＮＡクローニングにおいて、さまざまな程度で有益である。

これらのさまざまな用途の特殊なニーズに対処するために、多数の天然および操作されたＲＴが検討されてきた。最も一般的なのは、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）ＲＴ（Ｇｅｒａｒｄ１９７５）、またはあまり一般的ではないが、トリ骨髄芽球症（ＡＭＶ）ＲＴ（Ｋａｃｉａｎ１９７１）の誘導体である。他のＲＴ酵素は、代替レトロウイルス酵素（例えば、ＵＳ７５６０１１７号）、ファージ（Ｍｏｓｅｒ２０１２）および細菌（Ｇｒａｂｃｏ１９９６）に由来しているが、いずれも長さ、二次構造およびヌクレオチド含有量がさまざまである標的の高感度で高度に特異的で堅牢なｃＤＮＡの合成のニーズに完全に対処していない。したがって、最先端技術におけるこれらの欠点は、継続的に改善される必要がある。

参考文献

米国特許第７５６０１１７号明細書

発明の要旨
本発明は、熱安定性、ＲＮＡ鋳型を使用して合成されるｃＤＮＡの長さ、および二次酵素活性の除去において有益な改善をもたらす、新規に操作された逆転写酵素を提供する。これらの改善は、サム（ｔｈｕｍｂ）ドメイン、接続ドメイン、およびＲＮアーゼＨドメインに存在するアミノ酸残基の定方向突然変異誘発によって、親のウマ伝染性貧血ウイルス逆転写酵素（ＥＩＡＶＲＴ）分子に組み込まれた。これらの変異は、ＲＮアーゼＨ活性を集合的に除去し、高温でＲＴ活性を増加させるものであり、合理的設計とランダム変異誘発／スクリーニングの両方から特定された。これらの変異を組み合わせることにより、６５℃までの温度で１２ｋｂを超える長さのｃＤＮＡを合成する能力などの成績を大幅に改善することが可能になる。

第１の態様において、本発明は、２つのサブユニットを含む逆転写酵素（ＲＴ）に関し、ここで、２つのサブユニットは、各々、配列番号１のポリヌクレオチド配列のバリアントにコードされており、ここで、バリアントにコードされたアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸配列またはその断片と少なくとも９０％同一であり、ここで、バリアントは、ＲＴのサムドメインおよび／またはＲＴの接続ドメイン（ＣＤ）の副溝結合トラック（ＭＧＢＴ）の配列番号２のアミノ酸配列に対して１または複数のアミノ酸交換を引き起こす、１または複数の変異を配列番号１のポリヌクレオチド配列中に含む。

本発明のこの態様による１または複数のアミノ酸交換は、配列番号２の２６３、２６５、２６７、２６９、および２７１位に対応するアミノ酸位置のコードされたアミノ酸配列内で引き起こされ得、ここで、アミノ酸交換は、Ｍ２６３Ｖ、Ｎ２６５Ｋ、Ｔ２６７Ｎ、Ｍ２６９Ａ、およびＳ２７１Ｑである。

さらにまたは代替的に、１または複数のアミノ酸交換は、配列番号２の３５６、３６０、３６２、および３６３位に対応するアミノ酸位置のコードされたアミノ酸配列内で引き起こされ得、ここで、アミノ酸交換は、Ｉ３５６ＧまたはＩ３５６ＤまたはＩ３５６Ｎ、Ｎ３６０Ａ、Ｇ３６２ＴまたはＧ３６２Ｎ、およびＷ３６３ＫまたはＷ３６３ＮまたはＷ３６３Ｉ、好ましくはＩ３５６Ｇ、Ｎ３６０Ａ、Ｇ３６２ＴおよびＷ３６３Ｋである。

一実施形態によれば、配列番号１のバリアントは、ＲＴのＲＮアーゼＨドメインの配列番号２に対して１または複数のアミノ酸交換を引き起こす、１または複数の変異を配列番号１のポリヌクレオチド配列中にさらに含む。本発明のこの態様による１または複数のアミノ酸交換は、配列番号２の４４３、４７０、４７６、４９１、５２６および５５３位に対応するアミノ酸位置のコードされたアミノ酸配列内で引き起こされ得、ここで、アミノ酸交換は、Ｄ４４３Ｇ、Ｖ４７０Ｆ、Ｅ４７６Ｑ、Ｑ４９１Ｒ、Ｒ５２６ＨおよびＫ５５３Ｒである。好ましい実施形態では、アミノ酸交換は、Ｄ４４３Ｇおよび／またはＥ４７６Ｑである。非常に好ましい実施形態では、アミノ酸交換は、Ｄ４４３Ｇである。

別の実施形態によれば、配列番号１のポリヌクレオチド配列中における１または複数の変異は、配列番号２の２６３、２６５、２６７、２６９、２７１および４４３位に対応するアミノ酸位置のコードされたアミノ酸配列内で１または複数のアミノ酸交換を引き起こし、ここで、アミノ酸交換は、Ｍ２６３Ｖ、Ｎ２６５Ｋ、Ｔ２６７Ｎ、Ｍ２６９Ａ、Ｓ２７１ＱおよびＤ４４３Ｇである。好ましい実施形態では、配列番号１のポリヌクレオチド配列内の変異は、配列番号２の２６３、２６５、２６７、２６９、２７１および４４３位に対応するすべてのアミノ酸位置のコードされたアミノ酸配列内でアミノ酸交換を引き起こし、ここで、アミノ酸交換は、Ｍ２６３Ｖ、Ｎ２６５Ｋ、Ｔ２６７Ｎ、Ｍ２６９Ａ、Ｓ２７１ＱおよびＤ４４３Ｇである。

さらなる実施形態によれば、配列番号１のポリヌクレオチド配列中における１または複数の変異は、配列番号２の２６３、２６５、２６７、２６９、２７１、３５６、３６０、３６２、３６３および４４３位に対応するアミノ酸位置のコードされたアミノ酸配列内で１または複数のアミノ酸交換を引き起こし、ここで、アミノ酸交換は、Ｍ２６３Ｖ、Ｎ２６５Ｋ、Ｔ２６７Ｎ、Ｍ２６９Ａ、Ｓ２７１Ｑ、Ｉ３５６Ｇ、Ｎ３６０Ａ、Ｇ３６２Ｔ、Ｗ３６３ＫおよびＤ４４３Ｇである。好ましい実施形態では、配列番号１のポリヌクレオチド配列内の変異は、配列番号２の２６３、２６５、２６７、２６９、２７１、３５６、３６０、３６２、３６３および４４３位に対応するすべてのアミノ酸位置のコードされたアミノ酸配列内でアミノ酸交換を引き起こし、ここで、アミノ酸交換は、Ｍ２６３Ｖ、Ｎ２６５Ｋ、Ｔ２６７Ｎ、Ｍ２６９Ａ、Ｓ２７１Ｑ、Ｉ３５６Ｇ、Ｎ３６０Ａ、Ｇ３６２Ｔ、Ｗ３６３ＫおよびＤ４４３Ｇである。あるいは、配列番号１のポリヌクレオチド配列内の変異は、配列番号２の２６３、２６５、２６７、２６９、２７１、３５６、３６０、３６２、３６３および４４３位に対応するすべてのアミノ酸位置のコードされたアミノ酸配列内でアミノ酸交換を引き起こし、ここで、アミノ酸交換は、Ｍ２６３Ｖ、Ｎ２６５Ｋ、Ｔ２６７Ｎ、Ｍ２６９Ａ、Ｓ２７１Ｑ、Ｉ３５６Ｇ、Ｎ３６０Ａ、Ｇ３６２Ｔ、Ｗ３６３ＮおよびＤ４４３Ｇである。さらにあるいは、配列番号１のポリヌクレオチド配列内の変異は、配列番号２の２６３、２６５、２６７、２６９、２７１、３５６、３６０、３６２、３６３および４４３位に対応するすべてのアミノ酸位置のコードされたアミノ酸配列内でアミノ酸交換を引き起こし、ここで、アミノ酸交換は、Ｍ２６３Ｖ、Ｎ２６５Ｋ、Ｔ２６７Ｎ、Ｍ２６９Ａ、Ｓ２７１Ｑ、Ｉ３５６Ｄ、Ｎ３６０Ａ、Ｇ３６２Ｔ、Ｗ３６３ＫおよびＤ４４３Ｇである。さらにあるいは、配列番号１のポリヌクレオチド配列内の変異は、配列番号２の２６３、２６５、２６７、２６９、２７１、３５６、３６０、３６２、３６３および４４３位に対応するすべてのアミノ酸位置のコードされたアミノ酸配列内でアミノ酸交換を引き起こし、ここで、アミノ酸交換は、Ｍ２６３Ｖ、Ｎ２６５Ｋ、Ｔ２６７Ｎ、Ｍ２６９Ａ、Ｓ２７１Ｑ、Ｉ３５６Ｎ、Ｎ３６０Ａ、Ｇ３６２Ｎ、Ｗ３６３ＩおよびＤ４４３Ｇである。

さらなる実施形態によれば、配列番号１のポリヌクレオチド配列中における１または複数の変異は、配列番号２の２６３、２６５、２６７、２６９、２７１、４９１、５２６および４４３位に対応するアミノ酸位置のコードされたアミノ酸配列内で１または複数のアミノ酸交換を引き起こし、ここで、アミノ酸交換は、Ｍ２６３Ｖ、Ｎ２６５Ｋ、Ｔ２６７Ｎ、Ｍ２６９Ａ、Ｓ２７１Ｑ、Ｑ４９１Ｒ、Ｒ５２６ＨおよびＤ４４３Ｇである。好ましい実施形態では、配列番号１のポリヌクレオチド配列内の変異は、配列番号２の２６３、２６５、２６７、２６９、２７１、４９１、５２６および４４３位に対応するすべてのアミノ酸位置のコードされたアミノ酸配列内でアミノ酸交換を引き起こし、ここで、アミノ酸交換は、Ｍ２６３Ｖ、Ｎ２６５Ｋ、Ｔ２６７Ｎ、Ｍ２６９Ａ、Ｓ２７１Ｑ、Ｑ４９１Ｒ、Ｒ５２６ＨおよびＤ４４３Ｇである。あるいは、配列番号１のポリヌクレオチド配列内の変異は、配列番号２の２６３、２６５、２６７、２６９、２７１、４９１、５２６および４４３位に対応するすべてのアミノ酸位置のコードされたアミノ酸配列内でアミノ酸交換を引き起こし、ここで、アミノ酸交換は、Ｍ２６３Ｖ、Ｎ２６５Ｋ、Ｔ２６７Ｎ、Ｍ２６９Ａ、Ｓ２７１Ｑ、Ｑ４９１Ｒ、Ｋ５５３ＲおよびＤ４４３Ｇである。さらにあるいは、配列番号１のポリヌクレオチド配列内の変異は、配列番号２の２６３、２６５、２６７、２６９、２７１、４９１、５２６および４４３位に対応するすべてのアミノ酸位置のコードされたアミノ酸配列内でアミノ酸交換を引き起こし、ここで、アミノ酸交換は、Ｍ２６３Ｖ、Ｎ２６５Ｋ、Ｔ２６７Ｎ、Ｍ２６９Ａ、Ｓ２７１Ｑ、Ｑ４９１Ｒ、Ｒ５２６Ｈ、Ｋ５５３ＲおよびＤ４４３Ｇである。

さらなる実施形態によれば、配列番号１のポリヌクレオチド配列中における１または複数の変異は、配列番号２の２６３、２６５、２６７、２６９、２７１、３５６、３６０、３６２、３６３、４９１、５２６および４４３位に対応するアミノ酸位置のコードされたアミノ酸配列内で１または複数のアミノ酸交換を引き起こし、ここで、アミノ酸交換は、Ｍ２６３Ｖ、Ｎ２６５Ｋ、Ｔ２６７Ｎ、Ｍ２６９Ａ、Ｓ２７１Ｑ、Ｉ３５６Ｇ、Ｎ３６０Ａ、Ｇ３６２Ｔ、Ｗ３６３Ｋ、Ｑ４９１Ｒ、Ｒ５２６ＨおよびＤ４４３Ｇである。好ましい実施形態では、配列番号１のポリヌクレオチド配列内の変異は、配列番号２の２６３、２６５、２６７、２６９、２７１、３５６、３６０、３６２、３６３、４９１、５２６および４４３位に対応するすべてのアミノ酸位置のコードされたアミノ酸配列内でアミノ酸交換を引き起こし、ここで、アミノ酸交換は、Ｍ２６３Ｖ、Ｎ２６５Ｋ、Ｔ２６７Ｎ、Ｍ２６９Ａ、Ｓ２７１Ｑ、Ｉ３５６Ｇ、Ｎ３６０Ａ、Ｇ３６２Ｔ、Ｗ３６３Ｋ、Ｑ４９１Ｒ、Ｒ５２６ＨおよびＤ４４３Ｇである。

好ましい実施形態によれば、２つのサブユニットのうちの第１のサブユニットは、配列番号１のバリアントによってコードされる完全なアミノ酸配列を含み、２つのサブユニットのうちの第２のサブユニットは、配列番号１のバリアントによってコードされる完全なアミノ酸配列のタンパク質分解断片を含む。

別の態様では、本発明は、鋳型核酸と本発明のＲＴを接触させることを含む鋳型核酸を増幅させるための方法を指す。一実施形態では、この方法は、逆転写（ＲＴ）ＰＣＲである。

さらなる態様では、本発明は、本発明のＲＴおよび緩衝液を含むキットを提供する。

本発明の別の態様は、本発明のＲＴをコードするポリヌクレオチドに関する。本発明のさらなる態様は、本発明によるポリヌクレオチドを含むベクターに関する。別の態様では、本発明は、前記ベクターを含む形質転換宿主細胞に関する。

別の態様では、本発明は、本発明によるポリヌクレオチドまたはベクターを宿主細胞において発現させることにより得られるＲＴを提供する。好ましい実施形態では、宿主細胞はＥ．ｃｏｌｉである。

さらに別の実施形態では、本発明は、形質転換宿主細胞からＲＴを単離することを含む、本発明のＲＴを生成する方法に関する。

図面の簡単な説明
本開示は、以下の添付の図面に関連して検討される際に、以下の詳細な説明を参照することにより、より容易に理解されるであろう。

図１は、４２℃でのＲＴ反応の前に、示された温度でプレインキュベーションステップを行ったさまざまなＲＴを使用した熱安定性アッセイの結果を示す。

図２は、さまざまなＲＴを使用して高温下でのｃＤＮＡ合成を測定する熱安定性アッセイの結果を表す。パネル（ａ）は、５０℃でのｃＤＮＡ合成反応の結果を示す。パネル（ｂ）は、ｃＤＮＡを５０℃（上のパネル）および６０℃（下のパネル）で生成した２段階ＲＴ－ＰＣＲ反応の結果を示す。

図３は、ＲＮアーゼＨ活性を低下させた最先端のＭＭＬＶＲＴ（ＥｎｚＳｃｒｉｐｔ）と、本発明によるＲＮアーゼＨ^ｎｅｇＥＩＡＶＲＴバリアントを用いる１段階ＲＴ－ｑＰＣＲアッセイにおけるｃＤＮＡ収率への温度の影響を示し、ここで、ＥＩＡＶＲＴＶ３は、ＭＧＢＴ内に点変異をさらに含む。

図４は、最先端のＭＭＬＶＲＴ（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＶ）および本発明によるＥＩＡＶＲＴバリアントを用いる２段階ＲＴ－ｑＰＣＲアッセイにおけるさまざまな長さのｃＤＮＡの収率への温度の影響を示す。

図５は、ＥＩＡＶＲＴＶ３および最先端のＭＭＬＶＲＴＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＶによる５５℃で９ｋｂのｃＤＮＡ合成の時間経過を示す。

図６は、本発明によるさまざまなＥＩＡＶＲＴバリアントを用いる２段階ＲＴ－ｑＰＣＲアッセイにおけるｃＤＮＡの収率への温度の影響を示す。

図７は、本発明によるさまざまなＥＩＡＶＲＴバリアントを用いる長期エンドポイントＰＣＲアッセイにおけるｃＤＮＡの収率への温度の影響を示す。

発明の詳細な説明
定義
別に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、当技術分野の（例えば細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリダイゼーション技術および生化学の）当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。

本発明を実践する際には、分子生物学、微生物学、および組換えＤＮＡにおける多くの従来技術が使用されてよい。これらの技術は周知であり、例えば、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＶｏｌｕｍｅｓＩ，ＩＩ，ａｎｄＩＩＩ，１９９７（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌｅｄ．）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＳｅｃｏｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，ＶｏｌｕｍｅｓＩａｎｄＩＩ，１９８５（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒｅｄ．）；ＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ，１９８４（Ｍ．Ｌ．Ｇａｉｔｅｄ．）；ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，１９８５（ＨａｍｅｓａｎｄＨｉｇｇｉｎｓ）；ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｎｄＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎ，１９８４（ＨａｍｅｓａｎｄＨｉｇｇｉｎｓｅｄｓ．）；ＡｎｉｍａｌＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅ，１９８６（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙｅｄ．）；ＩｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄＣｅｌｌｓａｎｄＥｎｚｙｍｅｓ，１９８６（ＩＲＬＰｒｅｓｓ）；Ｐｅｒｂａｌ，１９８４，ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＧｕｉｄｅｔｏＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ；ｔｈｅｓｅｒｉｅｓ，ＭｅｔｈｏｄｓＩｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；ＧｅｎｅＴｒａｎｓｆｅｒＶｅｃｔｏｒｓｆｏｒＭａｍｍａｌｉａｎＣｅｌｌｓ，１９８７（Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒａｎｄＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓｅｄｓ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）；およびＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙＶｏｌ．１５４ａｎｄＶｏｌ．１５５（それぞれ、ＷｕａｎｄＧｒｏｓｓｍａｎ，ａｎｄＷｕ，ｅｄｓ．）に説明されている。

本明細書において使用される、「含む」という用語は、「含んでいる」と「からなる」の両方を包含するものと解釈されるべきであり、両方の意味は特に意図され、そのため、本発明に従って個別に開示される実施形態を含む。

本明細書において使用される「核酸配列、ヌクレオチド配列」または「ポリヌクレオチド配列」という用語は、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドおよびその断片および部分、そしてゲノムまたは合成起源のＤＮＡまたはＲＮＡを指し、これは一本鎖または二本鎖であってよく、センス鎖またはアンチセンス鎖を表し得る。配列は、非コード配列、コード配列または両方の混合物であってよい。

ポリヌクレオチド配列（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）の「バリアント」は、１または複数の核酸残基が核酸配列に挿入、削除および／または置換されている別のポリヌクレオチド配列に対して、ポリヌクレオチド配列内に１または複数の変異を含む。前記１または複数の変異は、別のアミノ酸配列と比較して、バリアントがコードするアミノ酸配列内で１または複数のアミノ酸交換を引き起こし得る（すなわち、「非サイレント変異」）。バリアントには、１または複数のコドンがアミノ酸交換を引き起こさないシノニム（ｓｙｎｏｎｙｍｓ）で置き換えられており、そのため「サイレント変異」と呼ばれる核酸配列も含まれる。

「同一性」という用語は、配列を整列および比較することによって決定される、２またはそれを超えるポリペプチド分子または２またはそれを超える核酸分子の配列間の関係を指す。「同一性パーセント」とは、比較される分子中のアミノ酸またはヌクレオチド間の同一の残基のパーセントを意味し、比較される分子の最小のサイズに基づいて計算される。これらの計算では、アラインメントのギャップ（存在する場合）は、特定の数学モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち、「アルゴリズム」）によって対処されることが好ましい。整列した核酸またはポリペプチドの同一性を計算するために使用することができる方法としては、ＣｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．），１９８８，ＮｅｗＹｏｒｋ：ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ；ＢｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇＩｎｆｏｒｍａｔｉｃｓａｎｄＧｅｎｏｍｅＰｒｏｊｅｃｔｓ，（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．），１９９３，ＮｅｗＹｏｒｋ：ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ；ＣｏｍｐｕｔｅｒＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＳｅｑｕｅｎｃｅＤａｔａ，ＰａｒｔＩ，（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．），１９９４，ＮｅｗＪｅｒｓｅｙ：ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ；ｖｏｎＨｅｉｎｊｅ，Ｇ．，１９８７，ＳｅｑｕｅｎｃｅＡｎａｌｙｓｉｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＮｅｗＹｏｒｋ：ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ；ＳｅｑｕｅｎｃｅＡｎａｌｙｓｉｓＰｒｉｍｅｒ，（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．），１９９１，ＮｅｗＹｏｒｋ：Ｍ．ＳｔｏｃｋｔｏｎＰｒｅｓｓ；およびＣａｒｉｌｌｏら、１９８８，ＳＩＡＭＪ．ＡｐｐｌｉｅｄＭａｔｈ．４８：１０７３に記載されるものが挙げられる。

同一性パーセントを計算する際、比較される配列は通常、配列間で最大一致をもたらすような方法で整列される。同一性パーセントを決定するために使用することができるコンピュータプログラムは、例えば、Ｐｅａｒｓｏｎによって考察されている（Ｐｅａｒｓｏｎ、２０１３、Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ．４２：３．１．１－３．１．８）。このようなコンピュータアルゴリズムは、配列同一性パーセントを決定する２つのポリペプチドまたはポリヌクレオチドを整列させるために使用される。配列は、そのそれぞれのアミノ酸またはヌクレオチドの最適な一致（アルゴリズムによって決定される「一致したスパン」）を目指して整列される。

２つの配列を整列させるための特定のアラインメントスキームは、２つの配列の短い領域のみの一致をもたらすことがあり、この小さな整列領域は、２つの全長配列間に有意な関係がないにもかかわらず、非常に高い配列同一性を示すことがある。したがって、選択したアラインメント方法を必要に応じて調整して、少なくとも５０個または他の数の連続したヌクレオチドまたはアミノ酸にまたがるアラインメントをもたらすことができる。

本発明の核酸配列は、当業者に周知の標準的な技術を使用して作製することができる。「コード化」または「コーディング」という用語は、定義された配列のヌクレオチド（すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、他のＲＮＡ分子）またはアミノ酸を有する生物学的プロセスにおいて、他のポリマーおよび高分子の合成用の鋳型として機能する、染色体またはｍＲＮＡ中の遺伝子などの核酸中のヌクレオチドの特定の配列の固有の特性、およびそれらから生じる生物学的特性を指す。したがって、遺伝子は、その遺伝子によって生成されたｍＲＮＡの転写および翻訳が細胞または他の生物学的系においてタンパク質を生成する場合に、タンパク質をコードする。そのヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列と同一であり、通常は配列リストに記載されているコード鎖と、遺伝子またはｃＤＮＡの転写の鋳型として使用される非コード鎖の両方のコード鎖は、その遺伝子またはｃＤＮＡのタンパク質または他の産物をコードしていると呼ぶことができる。タンパク質をコードする核酸には、さまざまなヌクレオチド配列を有するが、遺伝暗号の縮重のために同じタンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸が含まれる。タンパク質をコードする核酸およびヌクレオチド配列には、イントロンが含まれることがある。

「ポリペプチド」という用語は、「アミノ酸配列」または「タンパク質」と同義的に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。これらの用語には、限定されるものではないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、またはタンパク質プロセシングを含む反応によって翻訳後修飾されるタンパク質も含まれる。修飾および変化、例えば他のタンパク質への融合、アミノ酸配列の置換、欠失または挿入は、分子がその生物学的機能活性を維持したまま、ポリペプチドの構造内で行うことができる。例えば、特定のアミノ酸配列置換を、ポリペプチドまたはその基礎となる核酸コード配列において行い、同様の特性をもつタンパク質を得ることができる。アミノ酸修飾は、例えば、部位特異的変異誘発またはポリメラーゼ連鎖反応を介した変異誘発をその基礎となる核酸配列に実施することによって作製することができる。

本明細書で使用される「発現した」という用語は、宿主細胞内の異種核酸配列の転写および／または翻訳を指す。「産生」には、転写と翻訳の両方が含まれる。宿主細胞における発現量は、その細胞に存在する対応するｍＲＮＡの量のいずれかに基づいて決定されてよく、産生は所望のポリペプチドの量に基づくことになる。例えば、選択された配列から転写されたｍＲＮＡは、ノーザンブロットハイブリダイゼーション、リボヌクレアーゼＲＮＡ保護、細胞のＲＮＡへのインサイツハイブリダイゼーションまたはＰＣＲによって定量することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年）、前掲；Ａｕｓｕｂｅｌら（１９９４年更新）、前掲を参照）。選択された配列にコードされるタンパク質は、さまざまな方法、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット法、ラジオイムノアッセイ、免疫沈降、タンパク質生物活性のアッセイ、またはタンパク質の免疫染色とそれに続くＦＡＣＳ分析ＰＣＲによって定量することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年）、前掲；Ａｕｓｕｂｅｌら（１９９４年更新）、前掲を参照）。

「ＰＣＲ」という用語は、ＤＮＡ増幅のための分子生物学の標準的な方法であるポリメラーゼ連鎖反応を指す。

「ＲＴ－ＰＣＲ」は、ＲＮＡの検出および定量化に一般に使用されるＰＣＲの変形である逆転写ポリメラーゼ連鎖反応に関する。ＲＴ－ＰＣＲは、ＲＮＡからの逆転写による相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の合成と、生成されたｃＤＮＡのＰＣＲによる増幅の２つのステップを含む。ＲＴ－ＰＣＲの変形には、定量的ＲＴ－ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ、デジタルＲＴ－ＰＣＲ（ｄＲＴ－ＰＣＲ）またはデジタル液滴ＲＴ－ＰＣＲ（ｄｄＲＴ－ＰＣＲ）が含まれる。

以下では、添付の図面を参照して、本発明をより詳細に説明する。これらの実施形態および項目が複数の可能性の一例を示しているに過ぎないことは、当業者には明らかであろう。したがって、ここに示す実施形態は、これらの特徴および構成の限定をなすものと理解されるべきではない。記載された特徴の任意の可能な組合せおよび構成は、本発明の範囲に従って選択することができる。

ポリメラーゼ／酵素
ウマ伝染性貧血ウイルス逆転写酵素（ＥＩＡＶＲＴ）は、単一のオープンリーディングフレームに由来する６６ｋＤａおよび５１ｋＤａのサブユニットを含むヘテロ二量体として生体内で活性である。小さい方の５１ｋＤａのサブユニットは、大きい方の６６ｋＤａのサブユニットのタンパク質分解断片である。Ｅ．ｃｏｌｉにおける配列番号１のオープンリーディングフレームの発現は、ホモ二量体（すなわち、ｐ６６／ｐ６６およびｐ５１／ｐ５１）とヘテロ二量体（すなわち、ｐ６６／ｐ５１）を形成することのできる６６ｋＤａと５１ｋＤａのサブユニットの両方を生じさせる。ＲＴのいくつかの市販の調製物は、ホモ二量体とヘテロ二量体の混合物である。どちらの種類の二量体もＤＮＡ合成に活性を示すが、ヘテロ二量体はホモ二量体よりも高い安定性とプロセシビティ（ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｉｔｙ）を示す。

したがって、本発明によるＲＴの好ましい実施形態は、ヘテロ二量体が濃縮されている酵素調製物である。濃縮は、当業者に公知の任意の方法、例えば、ヘパリンを含むクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、およびイオン交換などを用いて行うことができる。ヘテロ二量体の含有量が、酵素調製物中のヘテロ二量体の濃縮前の含有量と比較して少なくとも２５％高い場合、酵素調製物はヘテロ二量体が濃縮されている。本発明のこの態様の一部の実施形態では、ヘテロ二量体の含有量は、酵素調製物中のヘテロ二量体の濃縮前の含有量と比較して少なくとも３０％濃縮されている。もう一つの実施形態では、ヘテロ二量体の含有量は、酵素調製物中のヘテロ二量体の濃縮前の含有量と比較して少なくとも５０％濃縮されている。本発明のこの態様の好ましい実施形態では、ヘテロ二量体の含有量は、酵素調製物中のヘテロ二量体の濃縮前の含有量と比較して少なくとも７５％濃縮されている。本発明のこの態様のより好ましい実施形態では、ヘテロ二量体の含有量は、酵素調製物中のヘテロ二量体の濃縮前の含有量と比較して少なくとも１００％濃縮されている。本発明のこの態様の特に好ましい実施形態では、ヘテロ二量体は、明らかに均質になるまで精製されている。

第１の態様において、本発明は、２つのサブユニットを含む逆転写酵素（ＲＴ）を提供し、ここで、２つのサブユニットは、各々、配列番号１のポリヌクレオチド配列のバリアントにコードされており、ここで、バリアントにコードされたアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸配列またはその断片と少なくとも９０％同一であり、ここで、バリアントは、ＲＴのサムドメインおよび／またはＲＴの接続ドメイン（ＣＤ）の副溝結合トラック（ＭＧＢＴ）の配列番号２のアミノ酸配列に対して１または複数のアミノ酸交換を引き起こす、１または複数の変異を配列番号１のポリヌクレオチド配列中に含む。

配列番号１のバリアントは、配列番号２に対してアミノ酸配列内でアミノ酸交換を引き起こさないそれらのシノニム（表１参照）によって置き換えられている任意の数のコドンを含むことができる。さらに、このバリアントは、配列番号２のアミノ酸配列に対してアミノ酸交換を引き起こす少なくとも１つの変異を含む。一部の実施形態では、このバリアントは、配列番号２のアミノ酸配列に対してアミノ酸交換を引き起こす少なくとも２つの変異を含む。もう一つの実施形態では、このバリアントは、配列番号２のアミノ酸配列に対してアミノ酸交換を引き起こす少なくとも３つの変異を含む。もう一つの実施形態では、このバリアントは、配列番号２のアミノ酸配列に対してアミノ酸交換を引き起こす少なくとも４つの変異を含む。もう一つの実施形態では、このバリアントは、配列番号２のアミノ酸配列に対してアミノ酸交換を引き起こす少なくとも５つの変異を含む。もう一つの実施形態では、このバリアントは、配列番号２のアミノ酸配列に対してアミノ酸交換を引き起こす少なくとも６つの変異を含む。もう一つの実施形態では、このバリアントは、配列番号２のアミノ酸配列に対してアミノ酸交換を引き起こす少なくとも８つの変異を含む。もう一つの実施形態では、このバリアントは、配列番号２のアミノ酸配列に対してアミノ酸交換を引き起こす少なくとも１０の変異を含む。
表１：遺伝暗号

本発明のこの態様による一部の実施形態では、配列番号１のバリアントは、配列番号２のアミノ酸配列に対してアミノ酸交換を引き起こす１つの変異を含む。もう一つの実施形態では、このバリアントは、配列番号２のアミノ酸配列に対してアミノ酸交換を引き起こす２つの変異を含む。もう一つの実施形態では、このバリアントは、配列番号２のアミノ酸配列に対してアミノ酸交換を引き起こす３つの変異を含む。もう一つの実施形態では、このバリアントは、配列番号２のアミノ酸配列に対してアミノ酸交換を引き起こす４つの変異を含む。もう一つの実施形態では、このバリアントは、配列番号２のアミノ酸配列に対してアミノ酸交換を引き起こす５つの変異を含む。もう一つの実施形態では、このバリアントは、配列番号２のアミノ酸配列に対してアミノ酸交換を引き起こす６つの変異を含む。もう一つの実施形態では、このバリアントは、配列番号２のアミノ酸配列に対してアミノ酸交換を引き起こす８つの変異を含む。もう一つの実施形態では、このバリアントは、配列番号２のアミノ酸配列に対してアミノ酸交換を引き起こす１０の変異を含む。もう一つの実施形態では、このバリアントは、配列番号２のアミノ酸配列に対してアミノ酸交換を引き起こす１２の変異を含む。

配列番号２のアミノ酸配列に対する１または複数のアミノ酸交換は、配列番号２のアミノ酸残基２５５～２９８に及ぶＲＴのサムドメインの副溝結合トラック（ＭＧＢＴ）、配列番号２のアミノ酸残基３２０～４１４に及ぶＲＴの接続ドメイン（ＣＤ）、および／または配列番号２のアミノ酸残基４３８～５５３に及ぶＲＴのＲＮアーゼＨドメインに位置することができる。本発明のこの態様による一部の実施形態では、配列番号２のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸交換は、ＲＴのサムドメインのＭＧＢＴに位置する。本発明のこの態様による他の実施形態では、配列番号２のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸交換は、ＲＴのＣＤに位置する。本発明のこの態様によるさらなる実施形態では、配列番号２のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸交換は、ＲＴのＲＮアーゼＨドメインに位置する。好ましい実施形態では、配列番号２のアミノ酸配列に対する少なくとも２つのアミノ酸交換は、ＲＴのサムドメインおよびＲＴのＣＤのＭＧＢＴに位置する。もう一つの好ましい実施形態では、配列番号２のアミノ酸配列に対する少なくとも２つのアミノ酸交換は、ＲＴのサムドメインおよびＲＴのＲＮアーゼＨドメインのＭＧＢＴに位置する。特に好ましい実施形態では、配列番号２のアミノ酸配列に対する少なくとも３つのアミノ酸交換は、ＲＴのサムドメイン、ＲＴのＲＮアーゼＨドメインおよびＲＴのＣＤのＭＧＢＴに位置する。

本発明のこの態様による一部の実施形態では、配列番号１のバリアントは、配列番号２のアミノ酸配列に対して１つのアミノ酸交換を引き起こす１または複数の変異を含む。この配列番号２のアミノ酸配列に対する１つのアミノ酸交換は、配列番号２のアミノ酸残基２５５～２９８に及ぶＲＴのサムドメインの副溝結合トラック（ＭＧＢＴ）、配列番号２のアミノ酸残基３２０～４１４に及ぶＲＴの接続ドメイン（ＣＤ）、および／または配列番号２のアミノ酸残基４３８～５５３に及ぶＲＴのＲＮアーゼＨドメインに位置することができる。特定の実施形態では、配列番号２のアミノ酸配列に対するこの１つのアミノ酸交換は、ＲＴのサムドメインのＭＧＢＴに位置する。他の実施形態では、配列番号２のアミノ酸配列に対するこの１つのアミノ酸交換は、ＲＴのＣＤに位置する。さらなる実施形態では、配列番号２のアミノ酸配列に対するこの１つのアミノ酸交換は、ＲＴのＲＮアーゼＨドメインに位置する。好ましい実施形態では、このバリアントは、配列番号２のアミノ酸配列に対して２つのアミノ酸交換を引き起こす変異を含む。配列番号２のアミノ酸配列に対するこれらの２つのアミノ酸交換は、ＲＴのサムドメインおよびＲＴのＣＤのＭＧＢＴに位置する。もう一つの好ましい実施形態では、配列番号２のアミノ酸配列に対するこれらの２つのアミノ酸交換は、ＲＴのサムドメインおよびＲＴのＲＮアーゼＨドメインのＭＧＢＴに位置する。特に好ましい実施形態では、バリアントは、配列番号２のアミノ酸配列に対して３つのアミノ酸交換を引き起こす変異を含む。配列番号２のアミノ酸配列に対するこれらの３つのアミノ酸交換は、ＲＴのサムドメイン、ＲＴのＲＮアーゼＨドメインおよびＲＴのＣＤのＭＧＢＴに位置する。

本発明のこの態様による一部の実施形態では、配列番号１のバリアントにコードされたアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸配列またはその断片と少なくとも９０％同一である。他の実施形態では、バリアントにコードされたアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸配列またはその断片と少なくとも９５％同一である。本発明のこの態様による好ましい実施形態では、バリアントにコードされたアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸配列またはその断片と少なくとも９７％同一である。配列番号２のアミノ酸配列またはその断片と少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸配列またはその断片の生物学的機能を保持する。より具体的には、配列番号２のアミノ酸配列またはその断片と少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列は、ＥＩＡＶ－ＲＴの逆転写酵素活性を保持する。

一実施形態によれば、本発明のこの態様による１または複数のアミノ酸交換は、配列番号２の２６３、２６５、２６７、２６９、および２７１位に対応するアミノ酸位置のコードされたアミノ酸配列内で引き起こされ得、ここで、アミノ酸交換は、Ｍ２６３Ｖ、Ｎ２６５Ｋ、Ｔ２６７Ｎ、Ｍ２６９Ａ、およびＳ２７１Ｑである。好ましくは、ＥＩＡＶＲＴは、そのＭＧＢＴ内の前記アミノ酸交換のうちの少なくとも２つを含む。より好ましくは、ＥＩＡＶＲＴは、そのＭＧＢＴ内の前記アミノ酸交換のうちの少なくとも３つを含む。一部のさらなる実施形態では、ＥＩＡＶＲＴは、そのＭＧＢＴ内の前記アミノ酸交換のうちの２つを含む。より好ましくは、ＥＩＡＶＲＴは、そのＭＧＢＴ内の前記アミノ酸交換のうちの３つを含む。特に好ましくは、ＥＩＡＶＲＴは、そのＭＧＢＴ内の前記アミノ酸交換のうちのすべてを含む。

ＲＴのＭＧＢＴ内の少なくとも１つのアミノ酸交換に加えてまたはその代わりに、１または複数のアミノ酸交換は、配列番号２の３５６、３６０、３６２、および３６３位に対応するアミノ酸位置のコードされたアミノ酸配列内で引き起こされ得、ここで、アミノ酸交換は、Ｉ３５６ＧまたはＩ３５６ＤまたはＩ３５６Ｎ、Ｎ３６０Ａ、Ｇ３６２ＴまたはＧ３６２Ｎ、およびＷ３６３ＫまたはＷ３６３ＮまたはＷ３６３Ｉ、好ましくはＩ３５６Ｇ、Ｎ３６０Ａ、Ｇ３６２ＴおよびＷ３６３Ｋである。好ましくは、ＥＩＡＶＲＴは、そのＣＤ内の前記アミノ酸交換のうちの少なくとも２つを含む。より好ましくは、ＥＩＡＶＲＴは、そのＣＤ内の前記アミノ酸交換のうちの少なくとも３つを含む。一部のさらなる実施形態では、ＥＩＡＶＲＴは、そのＣＤ内の前記アミノ酸交換のうちの２つを含む。より好ましくは、ＥＩＡＶＲＴは、そのＣＤ内の前記アミノ酸交換のうちの３つを含む。特に好ましくは、ＥＩＡＶＲＴは、そのＣＤ内の前記アミノ酸交換のうちのすべてを含む。

ＲＴのＭＧＢＴ内の少なくとも１つのアミノ酸交換に加えてまたはその代わりに、１または複数のアミノ酸交換は、配列番号２の４４３、４７０、４７６、４９１、５２６および５５３位に対応するアミノ酸位置のコードされたアミノ酸配列内で引き起こされ得、ここで、アミノ酸交換は、Ｄ４４３Ｇ、Ｖ４７０Ｆ、Ｅ４７６Ｑ、Ｑ４９１Ｒ、Ｒ５２６ＨおよびＫ５５３Ｒである。一実施形態によれば、ＥＩＡＶＲＴは、配列番号２のＤ４４３Ｇおよび／またはＥ４７６Ｑの位置に対応するアミノ酸交換を含む。一実施形態によれば、ＥＩＡＶＲＴは、配列番号２のＤ４４３Ｇの位置に対応する１つのアミノ酸交換を含む。このＥＩＡＶＲＴは、配列番号３の核酸配列またはその同義バリアントにコードされる配列番号４のアミノ酸配列を有する。別の実施形態によれば、ＥＩＡＶＲＴは、配列番号２のＤ４４３ＧおよびＥ４７６Ｑの位置に対応する２つのアミノ酸交換を含む。前記ＥＩＡＶＲＴは、配列番号５の核酸配列またはその同義バリアントにコードされる配列番号６のアミノ酸配列を有する。好ましい実施形態では、アミノ酸交換の１つは、Ｄ４４３Ｇである。他の実施形態では、ＥＩＡＶＲＴは、少なくとも２つの前述のアミノ酸交換をそのＲＮアーゼＨドメイン内に含む。さらなる実施形態によれば、ＥＩＡＶＲＴは、少なくとも３つの前記アミノ酸交換をそのＲＮアーゼＨドメイン内に含む。一部のさらなる実施形態では、ＥＩＡＶＲＴは、２つの前述のアミノ酸交換をそのＲＮアーゼＨドメイン内に含む。さらなる実施形態によれば、ＥＩＡＶＲＴは、３つの前記アミノ酸交換をそのＲＮアーゼＨドメイン内に含む。特に好ましくは、ＥＩＡＶＲＴは、アミノ酸交換Ｄ４４３Ｇ、Ｑ４９１Ｒ、およびＲ５２６Ｈを含む。

本発明のこの態様による一部の実施形態では、配列番号１のポリヌクレオチド配列内の１または複数の変異は、配列番号２の２６３、２６５、２６７、２６９、２７１および４４３位に対応するアミノ酸位置のコードされたアミノ酸配列内で１または複数のアミノ酸交換を引き起こし、ここで、アミノ酸交換は、Ｍ２６３Ｖ、Ｎ２６５Ｋ、Ｔ２６７Ｎ、Ｍ２６９Ａ、Ｓ２７１ＱおよびＤ４４３Ｇである。好ましくは、ＥＩＡＶＲＴは、少なくとも２つの前述のアミノ酸交換を含み、ここで、少なくとも１つの前記アミノ酸交換はＲＮアーゼＨドメインに位置し、少なくとも１つの前記アミノ酸交換はＭＧＢＴに位置する。より好ましくは、ＥＩＡＶＲＴは、少なくとも３つの前述のアミノ酸交換を含み、ここで、少なくとも１つの前記アミノ酸交換はＲＮアーゼＨドメインに位置し、前記アミノ酸交換の少なくとも２つはＭＧＢＴに位置する。別の好ましい実施形態によれば、ＥＩＡＶＲＴは、少なくとも４つの前述のアミノ酸交換を含み、ここで、少なくとも１つの前記アミノ酸交換はＲＮアーゼＨドメインに位置し、前記アミノ酸交換の少なくとも３つはＭＧＢＴに位置する。さらに好ましい実施形態によれば、ＥＩＡＶＲＴは、少なくとも５つの前述のアミノ酸交換を含み、ここで、少なくとも１つの前記アミノ酸交換はＲＮアーゼＨドメインに位置し、前記アミノ酸交換の少なくとも４つはＭＧＢＴに位置する。一部のさらなる実施形態では、ＥＩＡＶＲＴは、２つの前述のアミノ酸交換を含み、ここで、前記アミノ酸交換の１つはＲＮアーゼＨドメインに位置し、前記アミノ酸交換の１つはＭＧＢＴに位置する。好ましくは、ＥＩＡＶＲＴは、３つの前述のアミノ酸交換を含み、ここで、前記アミノ酸交換の１つはＲＮアーゼＨドメインに位置し、前記アミノ酸交換の２つはＭＧＢＴに位置する。別の好ましい実施形態によれば、ＥＩＡＶＲＴは、４つの前述のアミノ酸交換を含み、ここで、前記アミノ酸交換の１つはＲＮアーゼＨドメインに位置し、前記アミノ酸交換の３つはＭＧＢＴに位置する。さらに好ましい実施形態によれば、ＥＩＡＶＲＴは、５つの前述のアミノ酸交換を含み、ここで、前記アミノ酸交換の１つはＲＮアーゼＨドメインに位置し、前記アミノ酸交換の４つはＭＧＢＴに位置する。特に好ましくは、ＥＩＡＶＲＴは、前述のアミノ酸交換をすべて含む。後者のＥＩＡＶＲＴは、配列番号７の核酸配列またはその同義バリアントにコードされる配列番号８のアミノ酸配列を有する。

本発明のこの態様によるさらなる実施形態では、配列番号１のポリヌクレオチド配列内の１または複数の変異は、配列番号２の２６３、２６５、２６７、２６９、２７１、３５６、３６０、３６２、３６３および４４３位に対応するアミノ酸位置のコードされたアミノ酸配列内で１または複数のアミノ酸交換を引き起こし、ここで、アミノ酸交換は、Ｍ２６３Ｖ、Ｎ２６５Ｋ、Ｔ２６７Ｎ、Ｍ２６９Ａ、Ｓ２７１Ｑ、Ｉ３５６Ｇ、Ｎ３６０Ａ、Ｇ３６２Ｔ、Ｗ３６３ＫおよびＤ４４３Ｇである。好ましくは、ＥＩＡＶＲＴは、少なくとも３つの前述のアミノ酸交換を含み、ここで、少なくとも１つの前記アミノ酸交換はＲＮアーゼＨドメインに位置し、少なくとも１つの前記アミノ酸交換はＭＧＢＴに位置し、少なくとも１つの前記アミノ酸交換はＣＤに位置する。別の好ましい実施形態によれば、ＥＩＡＶＲＴは、少なくとも４つの前述のアミノ酸交換を含み、ここで、少なくとも１つの前記アミノ酸交換はＲＮアーゼＨドメインに位置し、少なくとも１つの前記アミノ酸交換はＭＧＢＴに位置し、少なくとも１つの前記アミノ酸交換はＣＤに位置する。さらに好ましい実施形態によれば、ＥＩＡＶＲＴは、少なくとも５つの前述のアミノ酸交換を含み、ここで、少なくとも１つの前記アミノ酸交換はＲＮアーゼＨドメインに位置し、少なくとも２つの前記アミノ酸交換はＭＧＢＴに位置し、前記アミノ酸交換の少なくとも２つはＣＤに位置する。他の好ましい実施形態によれば、ＥＩＡＶＲＴは、少なくとも６つの前述のアミノ酸交換を含み、ここで、少なくとも１つの前記アミノ酸交換はＲＮアーゼＨドメインに位置し、少なくとも２つの前記アミノ酸交換はＭＧＢＴに位置し、前記アミノ酸交換の少なくとも２つはＣＤに位置する。より好ましい実施形態によれば、ＥＩＡＶＲＴは、少なくとも７つの前述のアミノ酸交換を含み、ここで、少なくとも１つの前記アミノ酸交換はＲＮアーゼＨドメインに位置し、少なくとも３つの前記アミノ酸交換はＭＧＢＴに位置し、前記アミノ酸交換の少なくとも３つはＣＤに位置する。さらにより好ましい実施形態によれば、ＥＩＡＶＲＴは、少なくとも８つの前述のアミノ酸交換を含み、ここで、少なくとも１つの前記アミノ酸交換はＲＮアーゼＨドメインに位置し、少なくとも３つの前記アミノ酸交換はＭＧＢＴに位置し、少なくとも３つの前記アミノ酸交換はＣＤに位置する。他のより好ましい実施形態によれば、ＥＩＡＶＲＴは、少なくとも９つの前述のアミノ酸交換を含み、ここで、少なくとも１つの前記アミノ酸交換はＲＮアーゼＨドメインに位置し、少なくとも４つの前記アミノ酸交換はＭＧＢＴに位置し、前記アミノ酸交換の少なくとも４つはＣＤに位置する。一部のさらなる実施形態では、ＥＩＡＶＲＴは、３つの前述のアミノ酸交換を含み、ここで、前記アミノ酸交換の１つはＲＮアーゼＨドメインに位置し、前記アミノ酸交換の１つはＭＧＢＴに位置し、前記アミノ酸交換の１つはＣＤに位置する。別の実施形態によれば、ＥＩＡＶＲＴは、４つの前述のアミノ酸交換を含み、ここで、前記アミノ酸交換の１つはＲＮアーゼＨドメインに位置し、前記アミノ酸交換の１つまたは２つはそれぞれＭＧＢＴとＣＤに位置する。さらなる実施形態によれば、ＥＩＡＶＲＴは、５つの前述のアミノ酸交換を含み、ここで、前記アミノ酸交換の１つはＲＮアーゼＨドメインに位置し、前記アミノ酸交換の２つはＭＧＢＴに位置し、前記アミノ酸交換の２つはＣＤに位置する。他の実施形態によれば、ＥＩＡＶＲＴは、６つの前述のアミノ酸交換を含み、ここで、前記アミノ酸交換の１つはＲＮアーゼＨドメインに位置し、前記アミノ酸交換の２つまたは３つはそれぞれＭＧＢＴとＣＤに位置する。より好ましい実施形態によれば、ＥＩＡＶＲＴは、７つの前述のアミノ酸交換を含み、ここで、前記アミノ酸交換の１つはＲＮアーゼＨドメインに位置し、前記アミノ酸交換の３つはＭＧＢＴに位置し、前記アミノ酸交換の３つはＣＤに位置する。さらにより好ましい実施形態によれば、ＥＩＡＶＲＴは、８つの前述のアミノ酸交換を含み、ここで、前記アミノ酸交換の１つはＲＮアーゼＨドメインに位置し、前記アミノ酸交換の３つまたは４つはそれぞれＭＧＢＴとＣＤに位置する。他のより好ましい実施形態によれば、ＥＩＡＶＲＴは、９つの前述のアミノ酸交換を含み、ここで、前記アミノ酸交換の１つはＲＮアーゼＨドメインに位置し、前記アミノ酸交換の４つはＭＧＢＴに位置し、前記アミノ酸交換の４つはＣＤに位置する。特に好ましくは、ＥＩＡＶＲＴは、前述のアミノ酸交換をすべて含む。後者のＥＩＡＶＲＴは、配列番号９の核酸配列またはその同義バリアントにコードされる配列番号１０のアミノ酸配列を有する。

別の実施形態によれば、配列番号１のポリヌクレオチド配列内の変異は、配列番号２の２６３、２６５、２６７、２６９、２７１、３５６、３６０、３６２、３６３および４４３位に対応するすべてのアミノ酸位置のコードされたアミノ酸配列内でアミノ酸交換を引き起こし、ここで、アミノ酸交換は、Ｍ２６３Ｖ、Ｎ２６５Ｋ、Ｔ２６７Ｎ、Ｍ２６９Ａ、Ｓ２７１Ｑ、Ｉ３５６Ｇ、Ｎ３６０Ａ、Ｇ３６２Ｔ、Ｗ３６３ＮおよびＤ４４３Ｇである。

別の実施形態によれば、配列番号１のポリヌクレオチド配列内の変異は、配列番号２の２６３、２６５、２６７、２６９、２７１、３５６、３６０、３６２、３６３および４４３位に対応するすべてのアミノ酸位置のコードされたアミノ酸配列内でアミノ酸交換を引き起こし、ここで、アミノ酸交換は、Ｍ２６３Ｖ、Ｎ２６５Ｋ、Ｔ２６７Ｎ、Ｍ２６９Ａ、Ｓ２７１Ｑ、Ｉ３５６Ｄ、Ｎ３６０Ａ、Ｇ３６２Ｔ、Ｗ３６３ＫおよびＤ４４３Ｇである。

別の実施形態によれば、配列番号１のポリヌクレオチド配列内の変異は、配列番号２の２６３、２６５、２６７、２６９、２７１、３５６、３６０、３６２、３６３および４４３位に対応するすべてのアミノ酸位置のコードされたアミノ酸配列内でアミノ酸交換を引き起こし、ここで、アミノ酸交換は、Ｍ２６３Ｖ、Ｎ２６５Ｋ、Ｔ２６７Ｎ、Ｍ２６９Ａ、Ｓ２７１Ｑ、Ｉ３５６Ｎ、Ｎ３６０Ａ、Ｇ３６２Ｎ、Ｗ３６３ＩおよびＤ４４３Ｇである。

別の実施形態によれば、配列番号１のポリヌクレオチド配列内の変異は、配列番号２の２６３、２６５、２６７、２６９、２７１、４４３、４９１および５２６位に対応するすべてのアミノ酸位置のコードされたアミノ酸配列内でアミノ酸交換を引き起こし、ここで、アミノ酸交換は、Ｍ２６３Ｖ、Ｎ２６５Ｋ、Ｔ２６７Ｎ、Ｍ２６９Ａ、Ｓ２７１Ｑ、Ｄ４４３Ｇ、Ｑ４９１ＲおよびＲ５２６Ｈである。前記ＥＩＡＶＲＴは、配列番号１１の核酸配列またはその同義バリアントにコードされる配列番号１２のアミノ酸配列を有する。

別の実施形態によれば、配列番号１のポリヌクレオチド配列内の変異は、配列番号２の２６３、２６５、２６７、２６９、２７１、４４３、４９１および５２６位に対応するすべてのアミノ酸位置のコードされたアミノ酸配列内でアミノ酸交換を引き起こし、ここで、アミノ酸交換は、Ｍ２６３Ｖ、Ｎ２６５Ｋ、Ｔ２６７Ｎ、Ｍ２６９Ａ、Ｓ２７１Ｑ、Ｄ４４３Ｇ、Ｑ４９１ＲおよびＫ５５３Ｒである。

別の実施形態によれば、配列番号１のポリヌクレオチド配列内の変異は、配列番号２の２６３、２６５、２６７、２６９、２７１、４４３、４７０、４９１、５２６および５５３位に対応するすべてのアミノ酸位置のコードされたアミノ酸配列内でアミノ酸交換を引き起こし、ここで、アミノ酸交換は、Ｍ２６３Ｖ、Ｎ２６５Ｋ、Ｔ２６７Ｎ、Ｍ２６９Ａ、Ｓ２７１Ｑ、Ｄ４４３Ｇ、Ｖ４７０Ｆ、Ｑ４９１Ｒ、Ｒ５２６ＨおよびＫ５５３Ｒである。

さらなる実施形態によれば、配列番号１のポリヌクレオチド配列内の変異は、配列番号２の２６３、２６５、２６７、２６９、２７１、３５６、３６０、３６２、３６３、４４３、４９１および５２６位に対応するすべてのアミノ酸位置のコードされたアミノ酸配列内でアミノ酸交換を引き起こし、ここで、アミノ酸交換は、Ｍ２６３Ｖ、Ｎ２６５Ｋ、Ｔ２６７Ｎ、Ｍ２６９Ａ、Ｓ２７１Ｑ、Ｉ３５６Ｇ、Ｎ３６０Ａ、Ｇ３６２Ｔ、Ｗ３６３Ｋ、Ｄ４４３Ｇ、Ｑ４９１ＲおよびＲ５２６Ｈである。前記ＥＩＡＶＲＴは、配列番号１３の核酸配列またはその同義バリアントにコードされる配列番号１４のアミノ酸配列を有する。

以下の表２は、本発明による好ましい実施形態のアミノ酸配列を要約し、それをコードする１つの核酸配列を示している。当業者は、列挙されたアミノ酸配列が、表２に示されたものと同義の核酸配列によってもコードされ得ることを知っている。本発明はまた、前記同義の核酸配列のいずれかを包含する。
表２：好ましい実施形態とそれらの核酸／アミノ酸配列

本発明によるＥＩＡＶＲＴは、配列番号１のポリヌクレオチド配列のバリアントによってともにコードされる２つのサブユニットを含む。本発明によるバリアントは、本明細書の上文でより詳細に記載されている。好ましくは、ＲＴはヘテロ二量体である。一部の実施形態によれば、２つのサブユニットのうちの第１のサブユニットは、バリアントによってコードされる完全なアミノ酸配列を含み、２つのサブユニットのうちの第２のサブユニットは、バリアントによってコードされる完全なアミノ酸配列のタンパク質分解断片、すなわち、第１のサブユニットのタンパク質分解断片を含む。第１のサブユニットの分子量は６６ｋＤａであり、第２のサブユニットの分子量は５１ｋＤａである。Ｅ．ｃｏｌｉなどの宿主細胞における配列番号１のオープンリーディングフレームの発現は、ホモ二量体（すなわち、ｐ６６／ｐ６６およびｐ５１／ｐ５１）とヘテロ二量体（すなわち、ｐ６６／ｐ５１）を形成することのできる６６ｋＤと５１ｋＤのサブユニットの両方を生じさせる。ＲＴのいくつかの市販の調製物は、ホモ二量体とヘテロ二量体の混合物である。どちらの種類の二量体もＤＮＡ合成に活性を示すが、ヘテロ二量体はホモ二量体よりも高い安定性とプロセシビティ（ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｉｔｙ）を示す。したがって、好ましい実施形態では、ＥＩＡＶＲＴのヘテロ二量体形態は、均質になるまで精製される。

別の態様では、本発明は、配列番号１のポリヌクレオチド配列のバリアントまたは前記バリアントを含むベクターを宿主細胞で発現させることによって得られるＲＴを提供する。本発明によるＥＩＡＶＲＴの生成に使用することができる宿主細胞は、哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞または細菌細胞である。好ましい実施形態では、宿主細胞は、ＨＥＫ２９３またはＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞、またはＥ．ｃｏｌｉなどの細菌細胞である。好ましい宿主細胞はＥ．ｃｏｌｉである。

本発明の別の態様は、本発明のＲＴをコードするポリヌクレオチドに関する。前記ポリヌクレオチドは、本明細書の上文でより詳細に記載されるように、配列番号１のポリヌクレオチド配列のバリアントである。本発明のさらなる態様は、本発明によるポリヌクレオチドを含むベクターに関する。前記ポリヌクレオチドは、本明細書の上文でより詳細に記載されるように、配列番号１のポリヌクレオチド配列のバリアントである。別の態様では、本発明は、前記ベクターを含む形質転換宿主細胞に関する。

したがって、本発明は、熱安定性、プロセシビティ、したがってＲＮＡ鋳型を使用して合成されるｃＤＮＡの長さ、ｃＤＮＡ収量、および二次酵素活性、すなわち、ＲＮアーゼＨ活性の除去において有益な改善をもたらす、新規に操作された逆転写酵素を提供する。これらの改善は、サムドメイン、接続ドメイン、および／またはＲＮアーゼＨドメインに存在するアミノ酸残基の定方向突然変異誘発によって、親（ＥＩＡＶＲＴ）分子に組み込まれた。これらの変異は、ＲＮアーゼＨ活性を集合的に除去し、高温でＲＴ活性を増加させるものであり、合理的設計とランダム変異誘発とそれに続くスクリーニングの両方から特定された。これらの変異を組み合わせることにより、６５℃までの温度で１２ｋｂを超える長さのｃＤＮＡを合成する能力をはじめとする性能を大幅に改善することが可能になり、最も困難なＲＮＡサンプルでも優れた成績を得ることができる。

方法
別の態様では、本発明は、鋳型核酸と本発明によるＲＴを接触させることを含む鋳型核酸を増幅させるための方法を指す。

本発明による鋳型核酸は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドなどの任意の種類の核酸であってよい。鋳型核酸は、人工的に生成されたもの（例えば分子もしくは酵素の操作によるか、または合成によるもの）であってもよいし、天然に存在するＤＮＡまたはＲＮＡであってもよい。一部の好ましい実施形態では、鋳型核酸は、転写生成物、ＲＮＡウイルス、またはｒＲＮＡなどのＲＮＡ配列である。

一部の実施形態では、本明細書で言及される方法は、ＲＴ－ＰＣＲである。ＲＴ－ＰＣＲは、定量的ＲＴ－ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ、デジタルＲＴ－ＰＣＲ（ｄＲＴ－ＰＣＲ）またはデジタル液滴ＲＴ－ＰＣＲ（ｄｄＲＴ－ＰＣＲ）であってよい。

一部の好ましい実施形態では、本発明の方法は、以下の
ａ）本発明のＲＴを使用してｃＤＮＡを生成するステップ；および
ｂ）ＴａｑＤＮＡポリメラーゼなどのＤＮＡポリメラーゼを使用してｃＤＮＡを増幅するステップ
を含む。

一部の実施形態では、血清アルブミンが増幅中に添加され、好ましくは組換えヒト型が１ｍｇ／ｍｌの濃度で添加される。

一部の実施形態では、本発明の方法は、増幅した核酸を検出および／または定量化することをさらに含む。増幅した核酸の定量化／検出は、例えば、配列非特異的な方法で二本鎖ＤＮＡ分子にインターカレートされる非配列特異的蛍光色素（例えば、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ、ＥｖａＧｒｅｅｎ（登録商標））、あるいはＤＮＡ標的とのハイブリダイゼーションの後、合成に依存する加水分解の後、またはＰＣＲ産物への組み込みの後にのみ検出が可能である配列特異的ＤＮＡプローブ（例えば、蛍光レポーターで標識したオリゴヌクレオチド）を使用して実施されてよい。

キット
本発明の方法を実施するために必要な試薬は、キットに含めることができる。

一部の実施形態では、本発明は、鋳型核酸を増幅するためのキットに関し、ここで、キットは、本発明のＲＴと緩衝液を含む。必要に応じて、キットは、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼおよび／または血清アルブミンをさらに含む。キットに含められる緩衝液は、マグネシウムを含有する従来の緩衝液であってよい。

本発明を以下の実施例で説明する。

実施例１：ＥＩＡＶＲＴの発現および精製
配列番号１のオープンリーディングフレームまたはそのバリアントをＥ．ｃｏｌｉで発現させ、６６ｋＤａのポリペプチドおよびそのタンパク質分解処理断片、すなわち、５１ｋＤａのポリペプチドが生じた。６６ｋＤａのポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する。６６ｋＤａおよび５１ｋＤａのポリペプチドは、ホモ二量体（すなわち、ｐ６６／ｐ６６およびｐ５１／ｐ５１）およびヘテロ二量体（すなわち、ｐ６６／ｐ５１）を形成する。「均質な」調製物と呼ばれる１つの調製物では、ヘテロ二量体形態（ｐ６６／ｐ５１）は、ヘパリン、疎水性相互作用、およびイオン交換クロマトグラフィーをはじめとする複数回のクロマトグラフィーステップによってホモ二量体形態（ｐ６６／ｐ６６およびｐ５１／ｐ５１）のいずれかから分離された；「不均質な」調製物と呼ばれる第２の調製物では、ホモ二量体とヘテロ二量体はほぼ等しい量で存在していた。ホモ二量体もヘテロ二量体もＤＮＡ合成において活性であったが、ヘテロ二量体の均質な調製物は、ホモ二量体とヘテロ二量体の不均質混合物よりも高い安定性およびプロセシビティと、性能の向上をもたらす（図１および２）。特に明記されていない限り、以下の実施例のすべてのＲＴバリアントを、ヘテロ二量体の均質な調製物として試験した。

実施例２：ＥＩＡＶＲＴ変異体の生成
ＲＮアーゼＨ^ｎｅｇ変異
一般的に研究されているＲＴのＲＮアーゼＨ活性を除去した相同変異、すなわち、ＭＭＬＶおよびＨＩＶ－１ＲＴ（Ｍｉｚｕｎｏ２０１０、Ｇｅｒａｒｄ２００２）に基づいて、ＥＩＡＶＲＴＲＮアーゼＨドメインの変異は熱安定性を高めると予想された。したがって、ＥＩＡＶＲＴのＲＮアーゼＨ^ｎｅｇバリアント（ＥＩＡＶＲＴＶ１およびＶ２；下の表３参照）は、部位特異的変異誘発によって生成された。２５０ｎｇまでのサンプルを試験したところ、ＥＩＡＶＲＴＶ１もＥＩＡＶＲＴＶ２も検出可能なＲＮアーゼＨ活性を示さなかった（データは示していない）。

サムドメイン変異
サムドメインの副溝結合トラック（ＭＧＢＴ）は、レトロウイルスＲＴの中で高度に保存された構造要素である（Ｂｅａｒｄ１９９８、Ｂｅｂｅｎｅｋ１９９７）。ＨＩＶ－１ＲＴの生化学的および分子モデリング研究により、この要素は、鋳型－プライマー結合親和性を高めることによってリーディングフレーム、忠実度およびプロセシビティを維持するために重要であることが明らかになった（Ｂｅａｒｄ１９９４、Ｂｅｂｅｎｅｋ１９９５）。他のレンチウイルスＲＴのサムドメインの配列アラインメントに基づいて、ＭＧＢＴ（ＥＩＡＶＲＴＶ３）内の５つの点変異（Ｍ２６３Ｖ／Ｎ２６５Ｋ／Ｔ２６７Ｎ／Ｍ２６９Ａ／Ｓ２７１Ｑ）を部位特異的変異誘発によってＥＩＡＶＲＴＶ１に導入した。

接続およびＲＮアーゼＨドメインでのランダム変異およびスクリーニング。

ＲＴの熱安定性を改善する重要な変異は、接続ドメインとＲＮアーゼＨドメインにおいて特定されている（Ｍａｔａｍｏｒｏｓ２０１３）。熱安定性とプロセシビティをさらに改善するために、接続ドメインとＲＮアーゼＨドメインのランダム変異ライブラリーを構築してスクリーニングした。鋳型／プライマーと複合体を形成したＨＩＶ－１ＲＴの結晶構造とモデリング研究（Ｈｕａｎｇ１９９８）に基づいて、接続ドメイン（ＣＤ）内の１０アミノ酸（３５５～３６４）を含有する領域をランダム化のために選択した。ＣＤライブラリーは、各位置に１つのランダムなアミノ酸を含む１０個のｓｓＤＮＡオリゴの混合物でｄｓＤＮＡを架橋することによって生成された。ＲＮアーゼＨドメインバリアントのランダムライブラリーは、エラープローンＰＣＲによって生成された。ライブラリーのスクリーニングアッセイは、熱処理（５０℃で１０分間）した６０℃の粗細胞溶解物のＲＴ活性を測定することによって実施された。これらの結果により、ＣＤライブラリーから４つのバリアント、ＲＮアーゼＨドメインライブラリーから３つのバリアントが、親ＥＩＡＶＲＴＶ３よりも高いＲＴ活性を示すことが特定された（データは示していない）。最も成績の良いＣＤバリアントはＥＩＡＶＲＴＶ４であり、最も成績の良いＲＮアーゼＨドメインバリアントはＥＩＡＶＲＴＶ５であった。ＥＩＡＶＲＴＶ４とＥＩＡＶＲＴＶ５の変異を組み合わせて、バリアントＥＩＡＶＲＴＶ６を生成した。
表３：ＥＩＡＶの最適な形態の構築物

実施例３：ＲＮアーゼＨ^ｎｅｇバリアントの熱安定性および熱活性の評価
ＲＮアーゼＨバリアントＥＩＡＶＲＴＶ１およびＶ２の熱安定性および熱活性は、熱不活性化アッセイ（図１）および第１鎖ｃＤＮＡ合成（図２）によって評価した。熱不活性化アッセイでは、ＲＴを基質（オリゴ（ｄＴ）２０でプライムしたポリ（Ａ）鋳型）とともに４２～６０℃で１０分間プレインキュベートした。プレインキュベーションに続いて、ＭｇＣｌ_２を添加することによりＲＴ反応を開始させ、４２℃でのｄＴ取り込みの相対速度をモニターすることにより活性を測定した。すべてのＲＮアーゼＨ^ｎｅｇバリアント（ＥＩＡＶＲＴＶ１およびＶ２）は、５０℃でのプレインキュベーション後も完全に活性を維持したが、不均質なＥＩＡＶＲＴＷＴおよび均質なＥＩＡＶＲＴＷＴは、それぞれ５０％および３０％の活性低下を示した（図１）。特に、二重のＨ^ｎｅｇ変異体であるＥＩＡＶＲＴＶ２は、５５℃のプレインキュベーションでもその活性の８０％を保持していた。

これらのバリアントの熱安定性は、高温下でｃＤＮＡ合成を測定することによって、より厳密に評価された。第１鎖ｃＤＮＡ合成反応は、０．５～９ｋｂの長さのＲＮＡの混合物を鋳型（ポリ（Ａ）テールＲＮＡラダー）として使用して５０℃で実施された。一本鎖ｃＤＮＡをアルカリ電気泳動で分離し、ＳＹＢＲゴールドで染色して可視化した。図２（ａ）に示されるように、すべてのＲＮアーゼＨ^ｎｅｇバリアントは、９ｋｂまでの全長ｃＤＮＡを効率的に合成したが、ＥＩＡＶＲＴＷＴは、ＲＮアーゼＨ^ｎｅｇバリアントよりも低いｃＤＮＡ収量を示した（レーン１：不均質なＥＩＡＶＲＴ、レーン２：均質なＥＩＡＶＲＴＷＴ、レーン３：ＥＩＡＶＲＴＶ１、レーン４：ＥＩＡＶＲＴＶ２）。対照的に、不均質なＥＩＡＶＲＴＷＴからの全長生成物はどのサイズも視覚的検出の限界に近い。一方、均質なＥＩＡＶＲＴＷＴの収量は、ＲＮアーゼＨ^ｎｅｇバリアントよりもわずかに低かった。

２段階ＲＴ－ＰＣＲアッセイでは、最初のｃＤＮＡ合成反応は、１０ｎｇのヒト全ＲＮＡを鋳型として使用して、５０℃（図２（ｂ）、上のパネル）または６０℃（図２（ｂ）、下のパネル）で３０分間行った。次に、ＡＰＣ遺伝子の２ｋｂの断片を増幅した。すべてのＲＮアーゼＨ^ｎｅｇバリアントは、５０℃と６０℃の両方で増幅可能なｃＤＮＡを生成したが、均質および不均質なＥＩＡＶＲＴは、両方とも５０℃または６０℃のいずれかでｃＤＮＡを生成できなかった（図２（ｂ））。

総合すると、これらの結果は、ＲＴのＲＮアーゼＨ活性を消失させるとその熱安定性が高まるという解釈をトータルで裏付ける。

実施例４：サムドメインのＭＧＢＴ内に追加の変異を有するＲＮアーゼＨ^ｎｅｇＥＩＡＶＲＴバリアント（ＥＩＡＶＲＴＶ３）の熱安定性および熱活性の評価
追加の変異が熱安定性および熱活性に及ぼす影響を、ＦＡＭプローブに基づく１段階ＲＴ－ｑＰＣＲを使用して評価したまず、ＡＣＴＢ遺伝子の１領域を、示されるようにＥＩＡＶＲＴＶ１、ＥＩＡＶＲＴＶ３またはＥｎｚＳｃｒｉｐｔＲＴを使用してヒト全ＲＮＡ（２ｐｇ）から逆転写し、次に増幅および定量した。結果は、ＥＩＡＶＲＴＶ１とＥＩＡＶＲＴＶ３が、ともに７０℃付近でその活性の大部分を保持し、５５℃前後の温度で最適な活性を示すことを示す。しかし、ＥＩＡＶＲＴＶ１の活性の低下は６５℃よりも高い温度で顕著になる。対照的に、温度が上昇するにつれて、ｃＤＮＡ収量の低下を示すＣｔ値の大幅な増加が、広く使用されている典型的なコンパレータである、ＥｎｚＳｃｒｉｐｔ（ＲＮアーゼＨ活性が低下したモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）ＲＴ）で観察された（図３）。

さらに、ＥＩＡＶＲＴＶ１、ＥＩＡＶＲＴＶ３およびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＶを使用して２段階ＲＴ－ｑＰＣＲアッセイを実施した。ヒト全ＲＮＡ（５０ｎｇ）および遺伝子特異的プライマー（ＭＡＰ４）を使用して、ｃＤＮＡを示された温度で逆転写し、ＭＡＰ４遺伝子を標的とするｑＰＣＲによって、さまざまな長さのｃＤＮＡを定量した。結果は、ＥＩＡＶＲＴＶ１よりも低いＣｔ値で示されるように、ＥＩＡＶＲＴＶ３が、より高いｃＤＮＡ収量を生成することを示している。これらの酵素間の収量の差は、高温またはより長いｃＤＮＡ合成で劇的に増加し、ＥＩＡＶＲＴＶ１と比較してＥＩＡＶＲＴＶ３の熱安定性およびプロセシビティの改善が示される（図４）。

ＥＩＡＶＲＴＶ３により生成されたｃＤＮＡの合成速度および生成物の長さを、最先端とみなされている、広く使用されている市販のＲＴであるＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＶと比較した。この反応は、５５℃で５０ｎｇのヒト全ＲＮＡを入力として、オリゴ（ｄＴ）２０をプライマーとして使用して実施した。ＲＴを示された時に８５℃で５分間熱失活させた後、９ｋｂＡＰＣ遺伝子を増幅することによって反応をクエンチした。両方の酵素は、増幅可能な９ｋｂの生成物を１０分以内に生成した。しかし、収量はＥＩＡＶＲＴＶ３で大幅に増加した（図５）。

実施例５：接続ドメインおよび／またはＲＮアーゼＨドメイン内に追加の変異を有するＲＮアーゼＨ^ｎｅｇ／ＭＧＢＴ^ｍｕｔＥＩＡＶＲＴバリアントの熱安定性および熱活性の評価
ＣＤおよび／またはＲＮアーゼＨドメイン内の追加の変異が熱安定性および熱活性に及ぼす影響を、２段階ＲＴ－ｑＰＣＲ（図６）および長期エンドポイントＰＣＲ（図７）で試験した。

２段階ＲＴ－ｑＰＣＲでは、ヒト全ＲＮＡ（５０ｎｇ）および遺伝子特異的プライマー（ＭＡＰ４）を使用するｃＤＮＡ合成が示された温度で実施された。次に、遺伝子の特定の領域のために設計されたプライマーセットを使用してＭＡＰ４遺伝子を増幅することにより、さまざまな長さのｃＤＮＡを定量した。長距離２段階ＲＴ－ＰＣＲ（１２．３ｋｂ）では、ラット脳全ＲＮＡ（５０ｎｇ）およびラットダイニンのための遺伝子特異的プライマーを、さまざまな温度でのｃＤＮＡ合成使用した（図７；レーン１：ＥＩＡＶＲＴＶ３、レーン２：ＥＩＡＶＲＴＶ４、レーン３：ＥＩＡＶＲＴＶ５、レーン４：ＥＩＡＶＲＴＶ６）。

さまざまな温度での２段階ＲＴ－ｑＰＣＲ（図６）および長期エンドポイントＰＣＲ（図７）の両アッセイにより、これらのバリアント（ＥＩＡＶＲＴＶ４、ＥＩＡＶＲＴＶ５およびＥＩＡＶＲＴＶ６）のすべてが、元のＥＩＡＶＲＴＶ３と比較して熱安定性およびプロセシビティの向上を示したことが確認された。構築物の１つであるＥＩＡＶＲＴＶ４は、６５℃の高温で１２．３ｋｂのｃＤＮＡを合成することができ（図７）、このバリアントがほとんどの用途で最適な形態と考えられる。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
２つのサブユニットを含む逆転写酵素（ＲＴ）であって、前記２つのサブユニットは、各々、配列番号１のポリヌクレオチド配列のバリアントにコードされており、
前記バリアントにコードされたアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸配列またはその断片と少なくとも９０％同一であり、
前記バリアントは、前記ＲＴのサムドメインの副溝結合トラック（ＭＧＢＴ）において前記配列番号２のアミノ酸配列に対してアミノ酸交換を引き起こす変異を前記配列番号１のポリヌクレオチド配列中に含み、
前記配列番号１のポリヌクレオチド配列中の前記変異は、配列番号２の２６３、２６５、２６７、２６９、および２７１位に対応するすべてのアミノ酸位置の前記コードされたアミノ酸配列内でアミノ酸交換を引き起こし、ここで、前記アミノ酸交換は、Ｍ２６３Ｖ、Ｎ２６５Ｋ、Ｔ２６７Ｎ、Ｍ２６９Ａ、およびＳ２７１Ｑである、逆転写酵素（ＲＴ）。
（項目２）
前記バリアントが、前記ＲＴの接続ドメイン（ＣＤ）内の配列番号２に対して１または複数のさらなるアミノ酸交換を引き起こす、１または複数のさらなる変異を前記配列番号１のポリヌクレオチド配列中に含む、項目１に記載のＲＴ。
（項目３）
前記配列番号１のポリヌクレオチド配列中の前記１または複数のさらなる変異が、配列番号２の３５６、３６０、３６２、および３６３位に対応するアミノ酸位置の前記コードされたアミノ酸配列内で１または複数のさらなるアミノ酸交換を引き起こし、前記アミノ酸交換が、Ｉ３５６Ｇ／Ｉ３５６Ｄ／Ｉ３５６Ｎおよび／またはＮ３６０Ａおよび／またはＧ３６２Ｔ／Ｇ３６２Ｎおよび／またはＷ３６３Ｋ／Ｗ３６３Ｎ／Ｗ３６３Ｉ、好ましくはＩ３５６Ｇおよび／またはＮ３６０Ａおよび／またはＧ３６２Ｔおよび／またはＷ３６３Ｋ、より好ましくはＩ３５６Ｇ、Ｎ３６０Ａ、Ｇ３６２ＴおよびＷ３６３Ｋである、項目２に記載のＲＴ。
（項目４）
前記バリアントが、前記ＲＴのＲＮアーゼＨドメインの配列番号２に対して１または複数のさらなるアミノ酸交換を引き起こす、１または複数のさらなる変異を前記配列番号１のポリヌクレオチド配列中に含む、先行する項目のいずれか１項に記載のＲＴ。
（項目５）
前記配列番号１のポリヌクレオチド配列中の前記さらなる変異が、配列番号２の４４３および４７６位に対応するアミノ酸位置の前記コードされたアミノ酸配列内で１または複数のさらなるアミノ酸交換を引き起こし、前記アミノ酸交換が、Ｄ４４３Ｇおよび／またはＥ４７６Ｑ、好ましくはＤ４４３Ｇである、項目４に記載のＲＴ。
（項目６）
前記バリアントが、配列番号２に対してさらなるアミノ酸交換を引き起こす、さらなる変異を前記配列番号１のポリヌクレオチド配列中に含み、前記配列番号１のポリヌクレオチド配列中の前記さらなる変異が、配列番号２の４９１位に対応するアミノ酸位置の前記コードされたアミノ酸配列内でさらなるアミノ酸交換を引き起こし、前記アミノ酸交換がＱ４９１Ｒである、先行する項目のいずれか１項に記載のＲＴ。
（項目７）
前記バリアントが、配列番号２に対して１または複数のさらなるアミノ酸交換を引き起こす、１または複数のさらなる変異を前記配列番号１のポリヌクレオチド配列中に含み、前記配列番号１のポリヌクレオチド配列中の前記さらなる変異が、配列番号２の４７０、５２６および５５３位に対応するアミノ酸位置の前記コードされたアミノ酸配列内で１または複数のさらなるアミノ酸交換を引き起こし、前記アミノ酸交換が、Ｖ４７０Ｆおよび／またはＲ５２６Ｈおよび／またはＫ５３３Ｒ、好ましくはＲ５２６Ｈおよび／またはＫ５５３Ｒ、より好ましくはＲ５２６Ｈである、項目６に記載のＲＴ。
（項目８）
前記配列番号１のポリヌクレオチド配列中の前記変異が、配列番号２の２６３、２６５、２６７、２６９、２７１、３５６、３６０、３６２、３６３および４４３位に対応するすべてのアミノ酸位置の前記コードされたアミノ酸配列内でアミノ酸交換を引き起こし、前記アミノ酸交換が、Ｍ２６３Ｖ、Ｎ２６５Ｋ、Ｔ２６７Ｎ、Ｍ２６９Ａ、Ｓ２７１Ｑ、Ｉ３５６Ｇ、Ｎ３６０Ａ、Ｇ３６２Ｔ、Ｗ３６３ＫおよびＤ４４３Ｇである、先行する項目のいずれか１項に記載のＲＴ。
（項目９）
前記２つのサブユニットのうちの第１のサブユニットが、前記バリアントによってコードされる完全なアミノ酸配列を含み、前記２つのサブユニットのうちの第２のサブユニットが、前記バリアントによってコードされる完全なアミノ酸配列のタンパク質分解断片を含む、先行する項目のいずれか１項に記載のＲＴ。
（項目１０）
鋳型核酸と、先行する項目のいずれか１項に記載のＲＴとを接触させることを含む、前記鋳型核酸を増幅させるための方法であって、好ましくは、前記方法は逆転写（ＲＴ）ＰＣＲである、方法。
（項目１１）
ａ）項目１から９のいずれか１項に記載のＲＴ；および
ｂ）緩衝液
を含むキット。
（項目１２）
項目１から９のいずれか１項に記載のＲＴをコードする、ポリヌクレオチド。
（項目１３）
項目１２に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
（項目１４）
項目１３に記載のベクターを含む、形質転換宿主細胞。
（項目１５）
項目１２に記載のポリヌクレオチドまたは項目１３に記載のベクターを宿主細胞、好ましくはＥ．ｃｏｌｉで発現させることによって得られる、ＲＴ。

Claims

２つのサブユニットを含む逆転写酵素（ＲＴ）であって、前記２つのサブユニットは、各々、配列番号１のポリヌクレオチド配列のバリアントにコードされており、
前記バリアントにコードされたアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であり、
前記バリアントは、前記ＲＴのサムドメインの副溝結合トラック（ＭＧＢＴ）において前記配列番号２のアミノ酸配列に対してアミノ酸交換を引き起こす変異を前記配列番号１のポリヌクレオチド配列中に含み、
前記配列番号１のポリヌクレオチド配列中の前記変異は、配列番号２の２６３、２６５、２６７、２６９、および２７１位に対応するすべてのアミノ酸位置の前記コードされたアミノ酸配列内でアミノ酸交換を引き起こし、ここで、前記アミノ酸交換は、Ｍ２６３Ｖ、Ｎ２６５Ｋ、Ｔ２６７Ｎ、Ｍ２６９Ａ、およびＳ２７１Ｑである、逆転写酵素（ＲＴ）。
前記バリアントが、前記ＲＴの接続ドメイン（ＣＤ）内の配列番号２に対して１または複数のさらなるアミノ酸交換を引き起こす、１または複数のさらなる変異を前記配列番号１のポリヌクレオチド配列中に含む、請求項１に記載のＲＴ。
前記配列番号１のポリヌクレオチド配列中の前記１または複数のさらなる変異が、配列番号２の３５６、３６０、３６２、および３６３位に対応するアミノ酸位置の前記コードされたアミノ酸配列内で１または複数のさらなるアミノ酸交換を引き起こし、前記アミノ酸交換が、Ｉ３５６Ｇ／Ｉ３５６Ｄ／Ｉ３５６Ｎおよび／またはＮ３６０Ａおよび／またはＧ３６２Ｔ／Ｇ３６２Ｎおよび／またはＷ３６３Ｋ／Ｗ３６３Ｎ／Ｗ３６３Ｉである、請求項２に記載のＲＴ。
前記アミノ酸交換が、Ｉ３５６Ｇおよび／またはＮ３６０Ａおよび／またはＧ３６２Ｔおよび／またはＷ３６３Ｋである、請求項３に記載のＲＴ。
前記アミノ酸交換が、Ｉ３５６Ｇ、Ｎ３６０Ａ、Ｇ３６２ＴおよびＷ３６３Ｋである、請求項４に記載のＲＴ。
前記バリアントが、前記ＲＴのＲＮアーゼＨドメインの配列番号２に対して１または複数のさらなるアミノ酸交換を引き起こす、１または複数のさらなる変異を前記配列番号１のポリヌクレオチド配列中に含む、請求項１から５のいずれか１項に記載のＲＴ。
前記配列番号１のポリヌクレオチド配列中の前記さらなる変異が、配列番号２の４４３および４７６位に対応するアミノ酸位置の前記コードされたアミノ酸配列内で１または複数のさらなるアミノ酸交換を引き起こし、前記アミノ酸交換が、Ｄ４４３Ｇおよび／またはＥ４７６Ｑである、請求項６に記載のＲＴ。
前記アミノ酸交換が、Ｄ４４３Ｇである、請求項７に記載のＲＴ。
前記バリアントが、配列番号２に対してさらなるアミノ酸交換を引き起こす、さらなる変異を前記配列番号１のポリヌクレオチド配列中に含み、前記配列番号１のポリヌクレオチド配列中の前記さらなる変異が、配列番号２の４９１位に対応するアミノ酸位置の前記コードされたアミノ酸配列内でさらなるアミノ酸交換を引き起こし、前記アミノ酸交換がＱ４９１Ｒである、請求項１から８のいずれか１項に記載のＲＴ。
前記バリアントが、配列番号２に対して１または複数のさらなるアミノ酸交換を引き起こす、１または複数のさらなる変異を前記配列番号１のポリヌクレオチド配列中に含み、前記配列番号１のポリヌクレオチド配列中の前記さらなる変異が、配列番号２の４７０、５２６および５５３位に対応するアミノ酸位置の前記コードされたアミノ酸配列内で１または複数のさらなるアミノ酸交換を引き起こし、前記アミノ酸交換が、Ｖ４７０Ｆおよび／またはＲ５２６Ｈおよび／またはＫ５３３Ｒである、請求項９に記載のＲＴ。
前記アミノ酸交換が、Ｒ５２６Ｈおよび／またはＫ５５３Ｒである、請求項１０に記載のＲＴ。
前記アミノ酸交換が、Ｒ５２６Ｈである、請求項１１に記載のＲＴ。
前記配列番号１のポリヌクレオチド配列中の前記変異が、配列番号２の２６３、２６５、２６７、２６９、２７１、３５６、３６０、３６２、３６３および４４３位に対応するすべてのアミノ酸位置の前記コードされたアミノ酸配列内でアミノ酸交換を引き起こし、前記アミノ酸交換が、Ｍ２６３Ｖ、Ｎ２６５Ｋ、Ｔ２６７Ｎ、Ｍ２６９Ａ、Ｓ２７１Ｑ、Ｉ３５６Ｇ、Ｎ３６０Ａ、Ｇ３６２Ｔ、Ｗ３６３ＫおよびＤ４４３Ｇである、請求項１から１２のいずれか１項に記載のＲＴ。
前記２つのサブユニットのうちの第１のサブユニットが、前記バリアントによってコードされる完全なアミノ酸配列を含む、請求項１から１３のいずれか１項に記載のＲＴ。
鋳型核酸と、請求項１から１４のいずれか１項に記載のＲＴとを接触させることを含む、前記鋳型核酸を増幅させるための方法。
前記方法は逆転写（ＲＴ）ＰＣＲである、請求項１５に記載の方法。
ａ）請求項１から１４のいずれか１項に記載のＲＴ；および
ｂ）緩衝液
を含む、鋳型核酸を増幅するためのキット。
請求項１から１４のいずれか１項に記載のＲＴをコードする、ポリヌクレオチド。
請求項１８に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
請求項１９に記載のベクターを含む、形質転換宿主細胞。
請求項１８に記載のポリヌクレオチドまたは請求項１９に記載のベクターを宿主細胞で発現させることによって得られる、ＲＴ。
前記宿主細胞が、Ｅ．ｃｏｌｉである、請求項２１に記載のＲＴ。