JP7656635B2 - 抗ｐｄｌ１×ｅｇｆｒの二重特異性抗体 - Google Patents

Description

本発明は、抗体の分野に関し、より具体的には、本発明は、抗ＰＤＬ１×ＥＧＦＲの二重特異性抗体を開示する。

ヒトプログラム細胞死受容体－１（ＰＤ－１）は、２８８個のアミノ酸を有するＩ型膜タンパク質であり、既知の主な免疫チェックポイント（Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ）の一つである（Ｂｌａｎｋ ｅｔ ａｌ、２００５、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ、５４：３０７～３１４）。ＰＤ－１は、活性化されたＴリンパ球で発現し、それは、リガンドＰＤ－Ｌ１（プログラム細胞死受容体－リガンド１、ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ－Ｌｉｇａｎｄ １）およびＰＤ－Ｌ２（プログラム細胞死受容体－リガンド２、ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ－Ｌｉｇａｎｄ ２）に結合して、Ｔリンパ球の活性および関連するインビボ細胞性免疫応答を阻害することができる。ＰＤ－Ｌ２は、主にマクロファージおよび樹状細胞で発現するが、ＰＤ－Ｌ１は、Ｂリンパ球およびＴリンパ球ならびに微小血管上皮細胞、肺、肝臓、心臓などの組織細胞等の末梢細胞で広く発現する。多数の研究によると、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との相互作用は、生体内で免疫系の平衡を維持するために必要だけでなく、ＰＤ－Ｌ１発現陽性の腫瘍細胞が免疫監視を回避する主なメカニズムおよび原因でもあることが示される。ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１シグナル伝達経路上の癌細胞の負の調節を遮断することにより、免疫系を活性化し、Ｔ細胞に関連する腫瘍特異的な細胞性免疫応答を促進することができるため、新しい腫瘍治療法である腫瘍免疫療法への扉が開かれる。

ＰＤ－１（遺伝子Ｐｄｃｄ１によってコードされる）は、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ－４に関連する免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。研究結果は、ＰＤ－１がそのリガンド（ＰＤ－Ｌ１および／またはＰＤ－Ｌ２）に結合すると、抗原受容体シグナル伝達を負に調節することを示す。現在、マウスＰＤ－１の構造、およびマウスＰＤ－１とヒトＰＤ－Ｌ１との共結晶構造をすでに解明した（Ｚｈａｎｇ、Ｘ．ら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、２０：３３７～３４７（２００４）、Ｌｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０５：３０１１～６（２００８））。ＰＤ－１および類似のファミリーのメンバーは、リガンド結合に関与するＩｇ可変型（Ｖ－型）ドメインおよびシグナル伝達分子の結合に関与する細胞質テール領域を含む、Ｉ型膜貫通糖タンパク質である。ＰＤ－１細胞質テール領域は、二つのチロシンに基づくシグナル伝達モチーフＩＴＩＭ（免疫受容体チロシン阻害効果モチーフ）およびＩＴＳＭ（免疫受容体チロシン転換作用モチーフ）を含む。

ＰＤ－１は、腫瘍の免疫回避メカニズムにおいて重要な役割を果たす。体自身の免疫系を使用して癌を抵抗する腫瘍免疫療法は、画期的な腫瘍治療法であるが、腫瘍微小環境は、効果的な免疫破壊から腫瘍細胞を保護できるため、腫瘍微小環境を破壊する方法は、抗腫瘍研究の焦点となる。既存の研究結果によると、腫瘍の微小環境におけるＰＤ－１の役割が特定され、ＰＤ－Ｌ１は、多くのマウスおよびヒト腫瘍で発現し（ほとんどのＰＤ－Ｌ１陰性腫瘍細胞株でＩＦＮ－γによって誘導されることができる）、腫瘍免疫回避を媒介する重要な標的であると推定される（Ｉｗａｉ Ｙ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９９：１２２９３～１２２９７（２００２）、Ｓｔｒｏｍｅ Ｓ．Ｅ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、６３：６５０１～６５０５（２００３））。生検の免疫組織化学的評価により、ヒトの多くの原発性腫瘍で腫瘍細胞上のＰＤ－１（腫瘍浸潤リンパ球について）および／またはＰＤ－Ｌ１の発現が発見された。このような組織は、肺がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮頸がん、皮膚がん、結腸がん、神経膠腫、膀胱がん、乳がん、腎臓がん、食道がん、胃がん、口腔扁平上皮がん、尿路上皮がんおよび膵臓がんならびに頭頸部腫瘍等を含む。これから分かるように、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１の相互作用を遮断すると、腫瘍特異的Ｔ細胞の免疫活性を向上させ、免疫系の腫瘍細胞の除去を助けることができるため、ＰＤ－Ｌ１は、腫瘍免疫療法薬の開発の人気な標的となる。

ＥＧＦＲ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）は、ＥｒｂＢ受容体ファミリーに属する、表皮成長因子（ＥＧＦ）の受容体である。ＥＧＦＲは、受容体型チロシンキナーゼに属する、分子量１７０ＫＤａの膜貫通糖タンパク質であり、ＥＧＦおよびトランスフォーミング増殖因子－α（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ α、ＴＧＦα）等の関連するリガンドの作用下で、ＥＧＦＲは、単量体を二量体に変換することによって活性化されることにより、下流シグナル伝達経路をさらに活化下し、細胞の増殖を調節する。多数の研究によると、グリア細胞がん、腎臓がん、肺がん、前立腺がん、膵臓がん、乳がん等のほとんどの腫瘍の組織には、ＥＧＦＲの高発現または異常発現が存在することが示される。ＥＧＦＲ機能の異常は、腫瘍細胞の増殖、血管新生、腫瘍浸潤、転移およびアポトーシスの阻害に関連する。その機能異常は、主に二つの側面で現れ、一つは、腫瘍組織における過剰な異常発現であり、二つは、腫瘍細胞におけるＥＧＦＲ突然変異体の継続的な活性化である（リガンド刺激または自己循環刺激経路の形成を必要としない）。結腸がん患者の組織において、ＥＧＦＲの発現率は、約２５～７７％である。関連する臨床データは、ＥＧＦＲ発現量の多少が腫瘍の悪性度および腫瘍患者の予後に密接に関連することを示す。

Ｅｒｂｉｔｕｘ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ、セツキシマブ、ＩＭＣ－Ｃ２２５）は、ＥＧＦＲに対するヒトマウスキメラモノクローナル抗体であり、ＥＧＦＲに特異的に結合し、ＥＦＧＲとそのリガンドとの結合を競合的に遮断することにより、ＥＧＦＲシグナル伝達を阻害する。Ｅｒｂｉｔｕｘは、２００４年２月に販売が承認され、イリノテカンと併用してＥＧＦＲ陽性、イリノテカンによる化学療法が無効な転移性結腸直腸がんの治療および放射線療法と併用して局所領域性早期頭頸部扁平上皮がんの治療に使用される（ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ、ＳＣＣＨＮ）。

二重特異性抗体は、様々な炎症性疾患、癌、および他の疾患の治療に使用できる新しいクラスの治療用抗体になっている。

当技術分野では、癌等の疾患を治療するための優れた特性を有する二重特異性抗体を開発することが緊急に必要とされる。

Ｂｌａｎｋ ｅｔ ａｌ、２００５、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ、５４：３０７～３１４ Ｚｈａｎｇ、Ｘ．ら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、２０：３３７～３４７（２００４） Ｌｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０５：３０１１～６（２００８） Ｉｗａｉ Ｙ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９９：１２２９３～１２２９７（２００２） ＳｔｒｏｍｅＳ．Ｅ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、６３：６５０１～６５０５（２００３）

本発明は、抗ＰＤＬ１×ＥＧＦＲの二重特異性抗体およびその適用を提供する。

従って、本発明の第１の目的は、抗ＰＤＬ１×ＥＧＦＲの二重特異性抗体を提供することである。

本発明の第２の目的は、前記二重特異性抗体をコードする単離されたヌクレオチドを提供することである。

本発明の第３の目的は、前記ヌクレオチドを含む発現ベクターを提供することである。

本発明の第４の目的は、前記発現ベクターを含む宿主細胞を提供することである。

本発明の第５の目的は、前記二重特異性抗体の調製方法を提供することである。

本発明の第６の目的は、前記二重特異性抗体を含む医薬組成物を提供することである。

本発明の第７の目的は、前記二重特異性抗体または前記医薬組成物癌を治療するための薬物の調製における用途を提供することである。

本発明の第８の目的は、前記二重特異性抗体または前記医薬組成物を用いて癌を治療するための方法を提供することである。

上記の目的を達成するために、本発明は、次のような技術的解決策を提供する。

本発明の第１の態様は、以下からなる群から選択される二つのポリペプチド鎖および二つの軽鎖を含む、抗ＰＤＬ１×ＥＧＦＲの二重特異性抗体を提供し、
（ａ）前記ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端までＶＬ－ＰＤＬ１－リンカー１－ＶＨ－ＰＤＬ１－リンカー２－ＶＨ－ＥＧＦＲ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３またはＶＨ－ＰＤＬ１－リンカー１－ＶＬ－ＰＤＬ１－リンカー２－ＶＨ－ＥＧＦＲ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３またはＥＧＦＲ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３－リンカー２－ＶＬ－ＰＤＬ１－リンカー１－ＶＨ－ＰＤＬ１またはＥＧＦＲ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３－リンカー２－ＶＨ－ＰＤＬ１－リンカー１－ＶＬ－ＰＤＬ１を含み、
前記軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端までＶＬ－ＥＧＦＲ－ＣＬを含み、または
（ｂ）前記ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端までＶＬ－ＥＧＦＲ－リンカー１－ＶＨ－ＥＧＦＲ－リンカー２－ＶＨ－ＰＤＬ１－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３またはＶＨ－ＥＧＦＲ－リンカー１－ＶＬ－ＥＧＦＲ－リンカー２－ＶＨ－ＰＤＬ１－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３またはＰＤＬ１－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３－リンカー２－ＶＬ－ＥＧＦＲ－リンカー１－ＶＨ－ＥＧＦＲまたはＰＤＬ１－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３－リンカー２－ＶＨ－ＥＧＦＲ－リンカー１－ＶＬ－ＥＧＦＲを含み、
前記軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端までＶＬ－ＰＤＬ１－ＣＬを含み、
ここで、前記ＶＬ－ＰＤＬ１は、ＰＤ－Ｌ１に結合する軽鎖可変領域であり、
前記ＶＨ－ＰＤＬ１は、ＰＤ－Ｌ１に結合する重鎖可変領域であり、
前記ＶＬ－ＥＧＦＲは、ＥＧＦＲに結合する軽鎖可変領域であり、
前記ＶＨ－ＥＧＦＲは、ＥＧＦＲに結合する重鎖可変領域であり、
前記ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３は、重鎖定常領域であり、前記ＣＬは、軽鎖定常領域であり、
前記リンカー１およびリンカー２は、それぞれ独立して、柔軟なペプチドリンカーであり、
前記ＶＬ－ＰＤＬ１と前記ＶＨ－ＰＤＬ１とは、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、
前記ＶＨ－ＥＧＦＲと前記ＶＬ－ＥＧＦＲとは、ＥＧＦＲに特異的に結合する抗原結合部位を形成する。

別の好ましい例において、前記二重特異性抗体は、ＥＧＦＲへの結合およびＰＤ－Ｌ１への結合を同時に行う活性を有する。

別の好ましい例において、前記柔軟なペプチドリンカーは、６～３０個のアミノ酸、好ましくは１０～２５個のアミノ酸を含む。

別の好ましい例において、前記柔軟なペプチドリンカーは、２～６個のＧ４Ｓおよび／またはＧ３Ｓを含む。

別の好ましい例において、前記リンカー１は、３～５個のＧ４Ｓである。

別の好ましい例において、前記リンカー２は、２～４個のＧ４Ｓである。

別の好ましい例において、前記抗ＰＤＬ１×ＥＧＦＲの二重特異性抗体は、
（ａ）Ｎ末端からＣ末端までＶＬ－ＰＤＬ１－リンカー１－ＶＨ－ＰＤＬ１－リンカー２－ＶＨ－ＥＧＦＲ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３を含む二つのポリペプチド鎖と、（ｂ）Ｎ末端からＣ末端までＶＬ－ＥＧＦＲ－ＣＬを含む二つの軽鎖とを含み、
（ａ）Ｎ末端からＣ末端までＶＬ－ＰＤＬ１－リンカー１－ＶＨ－ＰＤＬ１－リンカー２－ＶＨ－ＥＧＦＲ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３を含む二つのポリペプチド鎖において、
前記ＶＬ－ＰＤＬ１は、ＰＤ－Ｌ１に結合する軽鎖可変領域であり、
前記リンカー１およびリンカー２は、それぞれ独立して、柔軟なペプチドリンカーであり、
前記ＶＨ－ＥＧＦＲは、ＥＧＦＲに結合する重鎖可変領域であり、
前記ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３は、重鎖定常領域であり、および
（ｂ）Ｎ末端からＣ末端までＶＬ－ＥＧＦＲ－ＣＬを含む二つの軽鎖において
前記ＶＬ－ＥＧＦＲは、ＥＧＦＲに結合する軽鎖可変領域であり、前記ＣＬは、軽鎖定常領域であり、
ここで、前記ＶＬ－ＰＤＬ１と前記ＶＨ－ＰＤＬ１とは、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、前記ＶＨ－ＥＧＦＲと前記ＶＬ－ＥＧＦＲとは、ＥＧＦＲに特異的に結合する抗原結合部位を形成する。

別の好ましい例において、前記抗ＰＤＬ１×ＥＧＦＲの二重特異性抗体は、（ａ）Ｎ末端からＣ末端までＶＬ－ＰＤＬ１－リンカー１－ＶＨ－ＰＤＬ１－リンカー２－ＶＨ－ＥＧＦＲ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３を含む二つのポリペプチド鎖と、（ｂ）Ｎ末端からＣ末端までＶＬ－ＥＧＦＲ－ＣＬを含む二つの軽鎖とを含み、
（ａ）Ｎ末端からＣ末端までＶＬ－ＰＤＬ１－リンカー１－ＶＨ－ＰＤＬ１－リンカー２－ＶＨ－ＥＧＦＲ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３を含む二つのポリペプチド鎖において、前記ＶＬ－ＰＤＬ１は、ＰＤ－Ｌ１に結合する軽鎖可変領域であり、前記リンカー１は、４個または５個のＧＧＧＧＳであり、前記ＶＨ－ＰＤＬ１は、ＰＤ－Ｌ１に結合する重鎖可変領域であり、前記リンカー２は、３個または４個のＧＧＧＧＳであり、前記ＶＨ－ＥＧＦＲは、ＥＧＦＲに結合する重鎖可変領域であり、前記ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３は、重鎖定常領域であり、および
（ｂ）Ｎ末端からＣ末端までＶＬ－ＥＧＦＲ－ＣＬを含む二つの軽鎖において、前記ＶＬ－ＥＧＦＲは、ＥＧＦＲに結合する軽鎖可変領域であり、前記ＣＬは、軽鎖定常領域であり、
ここで、前記ＶＬ－ＰＤＬ１と前記ＶＨ－ＰＤＬ１とは、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、前記ＶＨ－ＥＧＦＲと前記ＶＬ－ＥＧＦＲとは、ＥＧＦＲに特異的に結合する抗原結合部位を形成する。

本発明の好ましい実施例によれば、前記ＶＬ－ＰＤＬ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１－３に示されるようなアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲを含み、前記ＶＨ－ＰＤＬ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４－６に示されるようなアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲを含み、前記ＶＨ－ＥＧＦＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７－９に示されるようなアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲを含み、前記ＶＬ－ＥＧＦＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０－１２に示されるようなアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲを含む。

本発明の好ましい実施例によれば、前記ＶＬ－ＰＤＬ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示されるようなアミノ酸配列を有し、前記ＶＨ－ＰＤＬ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示されるようなアミノ酸配列を有し、前記ＶＨ－ＥＧＦＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示されるようなアミノ酸配列を有し、前記ＶＬ－ＥＧＦＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に示されるようなアミノ酸配列を有する。

本発明の好ましい実施例によれば、前記ポリペプチド鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５に示されるようなアミノ酸配列を有し、前記軽鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９に示されるようなアミノ酸配列を有し、
または前記ポリペプチド鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９に示されるようなアミノ酸配列を有し、前記軽鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に示されるようなアミノ酸配列を有する。

本発明によれば、前記重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４重鎖定常領域を含み、前記軽鎖定常領域は、κまたはλ軽鎖定常領域を含む。

本発明の第２の態様は、単離されたヌクレオチドを含み、前記ヌクレオチドは、前記二重特異性抗体をコードする。

本発明の第３の態様は、発現ベクターを提供し、前記発現ベクターは、上記のようなヌクレオチドを含む。

本発明の第４の態様は、宿主細胞を提供し、前記宿主細胞は、上記のような発現ベクターを含む。

本発明の第５の態様は、前記二重特異性抗体の調製方法を提供し、前記方法は、
（ａ）発現条件下で、上記のような宿主細胞を培養することにより、前記二重特異性抗体を発現する段階と、
（ｂ）（ａ）に記載の二重特異性抗体を分離および精製する段階とを含む。

本発明の第６の態様は、医薬組成物を提供し、前記医薬組成物は、上記のような二重特異性抗体および薬学的に許容されるベクターを含む。

別の好ましい例において、前記医薬組成物には、抗腫瘍剤が含まれる。

別の好ましい例において、前記医薬組成物は、単位剤形である。

別の好ましい例において、前記抗腫瘍剤は、前記二重特異性抗体単独とは別個のパッケージに存在することができ、または前記抗腫瘍剤は、前記二重特異性抗体にカップリングすることができる。

別の好ましい例において、前記医薬組成物の剤形は、胃腸投与剤形または非経口投与剤形を含む。

別の好ましい例において、前記非経口投与剤形は、静脈内注射、点滴注射、皮下注射、局所注射、筋肉内注射、腫瘍内注射、腹腔内注射、頭蓋内注射、または腔内注射を含む。

本発明の第７の態様は、癌を治療するための薬物の調製における、上記のような二重特異性抗体、またはその免疫コンジュゲート、または上記のような医薬組成物の用途を提供する。

本発明によれば、前記癌は、結腸直腸がん、非小細胞肺がん、扁平上皮がん、頭頸部がん、腎臓がん、膀胱がん、卵巣がん、乳がん、黒色腫、肺がん、肝臓がん、胃がん、リンパ腫、白血病、前立腺がん、骨髄がん及他の腫瘍性悪性疾患等からなる群から選択される。

本発明の第８の態様は、必要とする被験者に上記のような二重特異性抗体、またはその免疫コンジュゲート、または上記のような医薬組成物を投与する段階を含む、癌の治療法を提供する。

本発明によれば、前記癌は、結腸直腸がん、非小細胞肺がん、扁平上皮がん、頭頸部がん、腎臓がん、膀胱がん、卵巣がん、乳がん、黒色腫、肺がん、肝臓がん、胃がん、リンパ腫、白血病、前立腺がん、骨髄がん及他の腫瘍性悪性疾患等からなる群から選択される。

本発明の第９の態様は、免疫コンジュゲートを提供し、前記免疫コンジュゲートは、
（ａ）本発明の第１の態様に記載の二重特異性抗体と、および
（ｂ）検出可能なマーカー、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、または酵素からなる群から選択されるカップリング部分とを含む。

別の好ましい例において、前記コンジュゲート部分は、蛍光または発光マーカー、放射性マーカー、ＭＲＩ（磁気共鳴画像）またはＣＴ（コンピューター断層撮影）造影剤、または検出可能な生成物を生成できる酵素、放射性核種、生物毒素、サイトカイン（例えば、ＩＬ－２等）から選択される。

別の好ましい例において、前記免疫コンジュゲートは、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を含む。

別の好ましい例において、前記免疫コンジュゲートは、腫瘍を治療するための医薬組成物の調製に使用される。

有益な効果：本発明は、抗ＰＤＬ１×ＥＧＦＲの二重特異性抗体を提供し、実験結果は、当該二重抗体が抗ＥＧＦＲおよび抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体の活性をより良好に維持できることを示し、ＰＤ－Ｌ１およびＥＧＦＲの二つの標的に同時に特異的に結合することができ、明らかな細胞レベルでの相乗効果を有する。

本発明の抗ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ二重抗体分子の構造概略図である。 抗ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ二重抗体のＨＰＬＣ検出スペクトルおよびＳＤＳ－ＰＡＧＥ検出結果であり、ここで、図２Ａは、ＨＰＬＣ検出スペクトルであり、図２Ｂは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ検出結果である。 抗ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ二重抗体のＨＰＬＣ検出スペクトルおよびＳＤＳ－ＰＡＧＥ検出結果であり、ここで、図２Ａは、ＨＰＬＣ検出スペクトルであり、図２Ｂは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ検出結果である。 抗ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ二重抗体のＰＤ－Ｌ１およびＥＧＦＲそれぞれへの結合へのＥＬＩＳＡ検出の結果であり、ここで、図３Ａは、ＰＤ－Ｌ１への結合の結果であり、図３Ｂは、ＥＧＦＲへの結合の結果である。 抗ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ二重抗体のＰＤ－Ｌ１およびＥＧＦＲそれぞれへの結合へのＥＬＩＳＡ検出の結果であり、ここで、図３Ａは、ＰＤ－Ｌ１への結合の結果であり、図３Ｂは、ＥＧＦＲへの結合の結果である。 抗ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ二重抗体のＰＤ－Ｌ１およびＥＧＦＲに同時に結合する二重特異性ＥＬＩＳＡ検出の結果である。 抗ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ二重抗体のＡ４３１およびＮ８７－ＰＤＬ１細胞それぞれへの結合のＦＡＣＳ検出の結果であり、ここで、図５Ａは、Ａ４３１細胞への結合の結果であり、図５Ｂは、Ｎ８７－ＰＤＬ１細胞への結合の結果である。 抗ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ二重抗体のＡ４３１およびＮ８７－ＰＤＬ１細胞それぞれへの結合のＦＡＣＳ検出の結果であり、ここで、図５Ａは、Ａ４３１細胞への結合の結果であり、図５Ｂは、Ｎ８７－ＰＤＬ１細胞への結合の結果である。 抗ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ二重抗体によるＡ４３１細胞の増殖を阻害する活性結果である。 細胞上のＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１の活性を遮断する抗ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ二重抗体の結果である。 抗ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ二重特異性抗体とＥＧＦＲ抗原とのアフィニティー検出のフィッティング図である。 抗ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ二重特異性抗体とＰＤ－Ｌ１抗原とのアフィニティー検出のフィッティング図である。 抗ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ二重特異性抗体の細胞レベルでの相乗効果である。 ＳＷ４８異種移植腫瘍モデルにおける抗ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ二重特異性抗体の抗腫瘍効果である。 Ｂ－ｈＰＤ－Ｌ１ヒト化マウスＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１異種移植腫瘍モデルにおける抗ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ二重特異性抗体の抗腫瘍効果である。 比較例の抗ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ二重抗体のＡ４３１細胞のインビトロでの増殖阻害効果の活性結果である。 比較例の抗ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ二重抗体の細胞上ＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１阻害の活性結果であり、ここで、図１４Ａは、ａｎｔｉ－ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ ＢｓＡｂ ｒｅｖ１、ｒｅｖ２、ｒｅｖ３と陽性対照抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体との活性比較であり、図１４Ｂは、抗ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ ＢｓＡｂ ｒｅｖ５、ｒｅｖ６、ｒｅｖ７、ｒｅｖ８と陽性対照抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体との活性比較である。 比較例の抗ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ二重抗体の細胞上ＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１阻害の活性結果であり、ここで、図１４Ａは、ａｎｔｉ－ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ ＢｓＡｂ ｒｅｖ１、ｒｅｖ２、ｒｅｖ３と陽性対照抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体との活性比較であり、図１４Ｂは、抗ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ ＢｓＡｂ ｒｅｖ５、ｒｅｖ６、ｒｅｖ７、ｒｅｖ８と陽性対照抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体との活性比較である。

本発明者らは、広範囲かつ綿密な研究および大量のスクリーニングにより、抗ＥＧＦＲ抗体および抗ＰＤ－Ｌ１抗体からなる二重特異性抗体を得、本発明の二重特異性抗体は、ホモ二量体に属する。本発明の二重特異性抗体は、抗ＥＧＦＲ抗体および抗ＰＤＬ１抗体の活性を維持するだけでなく、ＥＧＦＲおよびＰＤ－Ｌ１に同時に結合することができ、さらに重要なことに、細胞レベルの実験は、この二重特異性抗体が腫瘍細胞を殺傷する相乗効果を果たすことができることを示し、抗ＥＧＦＲ抗体よりも有意に高く、抗ＰＤ－Ｌ１抗体よりも高い殺傷活性を示す。従って、本発明の二重特異性抗体は、優れた治療効果を有する抗腫瘍薬物として開発することができる。これに基づいて、本発明者らは本発明を完成させた。

用語
本発明において、「抗体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ、略してＡｂ）」および「免疫グロブリンＧ（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ、略してＩｇＧ）」という用語は、二つの同一の軽鎖（Ｌ）および二つの同一の重鎖（Ｈ）からなる同一の構造的特徴を有するヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は、共有ジスルフィド結合によって重鎖に結合され、異なる免疫グロブリンアイソタイプ（ｉｓｏｔｙｐｅ）の重鎖間でのジスルフィド結合の数は異なる。各重鎖および軽鎖は、規則的な感覚で配置された鎖内ジスルフィド結合も有する。各重鎖の一端には、可変領域（ＶＨ）があり、その後に定常領域が続き、重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３の三つのドメインからなる。各軽鎖の一端には、可変領域（ＶＬ）があり、他端には定常領域があり、軽鎖定常領域は、一つのドメインＣＬを含み、軽鎖の定常領域は、重鎖の定常領域のＣＨ１ドメインと対になり、軽鎖の可変領域は、重鎖の可変領域と対になる。定常領域は、抗体と抗原との結合に直接関与しないが、それらは、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性作用（ＡＤＣＣ、ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）に関与する等の、様々なエフェクター機能を示す。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４サブタイプを含み、軽鎖定常領域は、κ（Ｋａｐｐａ）またはλ（Ｌａｍｂｄａ）を含む。抗体の重鎖および軽鎖は、重鎖のＣＨ１ドメインと軽鎖のＣＬドメインとの間のジスルフィド結合によって共有結合され、抗体の二つの重鎖は、ヒンジ領域簡易形成されたポリペプチド間のジスルフィド結合によって共有結合される。

本発明において、「二重特異性抗体（または二重抗体）」という用語は、同時に二つの抗原（標的）または二つのエピトープに特異的に結合できる抗体分子を指す。対称性に基づいて、二重特異性抗体は、構造的に対称な分子および非対称な分子に分けることができる。結合部位の数に応じて、二重特異性抗体は、二価、三価、四価および多価分子に分けることができる。

本発明において、「モノクローナル抗体（ｍＡｂ）」という用語は、実質的に均一な集団から得られる抗体を指し、即ち、当該集団に含まれる個々の抗体は、存在し得る天然に発生する少数の変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、単一の抗原部位に対して非常に特異的である。また、従来のポリクローナル抗体製剤（通常は、異なる抗原決定基を有する異なる抗体の混合物）とは異なり、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基にを向けられる。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体の利点は、他の免疫ブロブリンによる汚染なしにハイブリドーマ培養によって合成できることである。「モノクローナル」という修飾語は、抗体の実質的に均質な集団から得られる抗体の特性を示し、これは、抗体産生に特定の方法が必要であると解釈されるべきではない。

本発明において、「Ｆａｂ」および「Ｆｃ」という用語は、パパインが抗体を二つの同一のＦａｂセグメントおよび一つのＦｃセグメントに切断できることを指す。Ｆａｂセグメントは、抗体の重鎖のＶＨおよびＣＨ１ならびに軽鎖のＶＬおよびＣＬドメインからなる。Ｆｃセグメントは、抗体のＣＨ２およびＣＨ３ドメインからなる結晶化可能なフラグメント（ｆｒａｇｍｅｎｔ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅ、Ｆｃ）である。Ｆｃセグメントは、抗原結合活性を有さず、抗体とエフェクター分子または細胞と相互作用する部位である。

本発明において、「ｓｃＦｖ」という用語は、抗体の重鎖の可変領域および軽鎖の可変領域とが一般に１５～２５個のアミノ酸のリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を介して結合されることによって形成される、一本鎖抗体（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔ、ｓｃＦｖ）である。

本発明において、「可変」という用語は、抗体の可変領域の特定の部分の配列が異なることを指し、それは、特定の抗原に対する様々な特定の結合および特異性を形成する。しかしながら、可変性は、抗体可変領域全体に均等に分されていない。それは、重鎖可変領域および軽鎖可変領域で相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ）または超可変領域と呼ばれる三つのフラグメントに集中する。可変領域のより保存された部分は、フレームワーク領域（ｆｒａｍｅ ｒｅｇｉｏｎ、ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖および軽鎖の可変領域は、それぞれ、四つのＦＲ領域を含み、それらは、接続環を形成する三つのＣＤＲによって接続された大抵β－フォールディング構成にあり、場合によっては部分的なβフォールディング構造を形成することができる。各鎖のＣＤＲは、ＦＲ領域によって緊密に近接され、かつ別の鎖のＣＤＲとともに抗体の抗原結合部位を形成する（Ｋａｂａｔら、ＮＩＨ Ｐｕｂｌ．Ｎｏ．９１－３２４２、巻Ｉ、６４７～６６９ページ（１９９１）を参照する）。

本明細書で使用されるように、「フレームワーク領域」（ＦＲ）という用語は、ＣＤＲ間に挿入されるアミノ酸配列、即ち、単一種の異なる免疫グロブリン間で比較的保存された免疫グロブリンの軽鎖および重鎖可変領域の部分を指す。免疫グロブリンの軽鎖および重鎖は、それぞれＦＲ１－Ｌ、ＦＲ２－Ｌ、ＦＲ３－Ｌ、ＦＲ４－ＬおよびＦＲ１－Ｈ、ＦＲ２－Ｈ、ＦＲ３－Ｈ、ＦＲ４－Ｈと呼ばれる四つのＦＲを有する。対応的に、軽鎖可変ドメインは、（ＦＲ１－Ｌ）－（ＣＤＲ１－Ｌ）－（ＦＲ２－Ｌ）－（ＣＤＲ２－Ｌ）－（ＦＲ３－Ｌ）－（ＣＤＲ３－Ｌ）－（ＦＲ４－Ｌ）と呼ばれることができ、かつ重鎖可変ドメインは、（ＦＲ１－Ｈ）－（ＣＤＲ１－Ｈ）－（ＦＲ２－Ｈ）－（ＣＤＲ２－Ｈ）－（ＦＲ３－Ｈ）－（ＣＤＲ３－Ｈ）－（ＦＲ４－Ｈ）として表されることができる。好ましくは、本発明のＦＲは、ヒト抗体ＦＲまたはその誘導物であり、前記ヒト抗体ＦＲの誘導物は、天然に存在するヒト抗体ＦＲと実質的に同一であり、即ち、配列の同一性は、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％に達する。

ＣＤＲのアミノ酸配列を知っている当業者は、フレームワーク領域ＦＲ１－Ｌ、ＦＲ２－Ｌ、ＦＲ３－Ｌ、ＦＲ４－Ｌおよび／またはＦＲ１－Ｈ、ＦＲ２－Ｈ、ＦＲ３－Ｈ、ＦＲ４－Ｈを容易に決定することができる。

本明細書で使用されるように、「ヒトフレームワーク領域」という用語は、天然に存在するヒト抗体のフレームワーク領域と実質的に同一（約８５％またはそれ以上、具体的には９０％、９５％、９７％、９９％または１００％）であるフレームワーク領域である。

本明細書で使用されるように、「リンカー」という用語は、軽鎖および重鎖のドメインが交換された二重可変領域免疫グロブリンにフォールディングされるのに十分な可動性を提供するために、免疫グロブリンドメインに挿入された一つまたは複数のアミノ酸基を指す。本発明において、好ましいリンカーとは、リンカー１およびリンカー２を指し、ここで、リンカー１は、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）のＶＨおよびＶＬに結合し、リンカー２は、ｓｃＦｖを別の抗体の重鎖に結合するために使用される。

適切なリンカーの例としては、モノグリシン（Ｇｌｙ）、またはセリン（Ｓｅｒ）残基を含み、リンカー中のアミノ酸残基の標識および配列は、リンカー中で達成する必要がある二次構造要素のタイプによって異なる。

二重特異性抗体
本発明の二重特異性抗体は、抗ＰＤＬ１抗体部分および抗ＥＧＦＲ抗体部分を含む、抗ＰＤＬ１×ＥＧＦＲの二重特異性抗体である。

好ましくは、本発明の抗ＰＤ－Ｌ１抗体の配列は、特許出願ＰＣＴ／ＣＮ２０２０／０９０４４２に記載されたとおりであり、当業者は、本発明の抗ＰＤ－Ｌ１抗体を一つまたはいくつかのアミノ酸残基の付加、欠失および／または置換等の当技術分野で周知の技術によって修飾または形質転換されることができることにより、抗ＰＤ－Ｌ１のアフィニティーまたは構造安定性をさらに増加させ、従来の測定方法によって修飾または改変された結果を得ることができる。

本発明において、「本発明の二重特異性抗体の保存的変異体」とは、本発明の二重特異性抗体のアミノ酸配列と比較して、最大１０個、好ましくは最大８個、より好ましくは最大５個、最も好ましくは最大３個のアミノ酸が同様または類似の性質を有するアミノ酸によって置き換えられてポリペプチドを形成することを指す。これらの保存的変種ポリペプチドは、好ましくは、表Ａによるアミノ酸の置き換えによって産生される。

本発明において、「抗」、「結合」、「特異的結合」という用語は、抗体とその対応する抗原との間の反応等、二つの分子間のランダムでない結合反応を指す。通常、抗体は、約１０^－７Ｍ、例えば、約１０^－８Ｍ未満、１０^－９Ｍ未満、１０^－１０Ｍ未満、１０^－１１Ｍ未満またはそれ以下の平衡解離定数（ＫＤ）で抗原に結合する。本発明において、「ＫＤ」という用語は、特定の抗体－抗原相互作用の平衡解離定数を指し、抗体と抗原との間の結合アフィニティーを説明するために使用される。平衡解離定数が小さいほど、抗体－抗原の結合が強くなり、抗体と抗原との間のアフィニティーが高くなる。例えば、表面プラズモン共鳴（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ、略してＳＰＲ）を使用してＢＩＡＣＯＲＥ機器で抗体と抗原との結合アフィニティーを測定するか、またはＥＬＩＳＡを使用して抗体と抗原結合との相対的アフィニティーを測定する。

本発明において、「エピトープ」という用語は、抗体に特異的に結合するポリペプチド決定基を言う。本発明のエピトープは、抗体が結合する抗原の領域である。

本発明の二重特異性抗体は、単独で使用することができるか、検出可能なマーカー（診断目的で）、治療剤、または任意のこれらの物質の組み合わせと結合またはカップリングされることができる。

核酸および発現ベクターのコード化
本発明は、上記の抗体またはそのフラグメントまたはその融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子をさらに提供する。本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ形態またはＲＮＡ形態であり得る。ＤＮＡ形態は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは人口構成ＤＮＡを含む。ＤＮＡは、一本鎖または二本鎖であり得る。ＤＮＡは、コード鎖または非コード鎖であり得る。

本発明において、「発現ベクター」という用語は、プラスミド、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス）、ファージ、酵母プラスミド、または他のベクター等、特定の標的タンパク質または他の物質を発現されるための発現カセットを担持するベクターを指す。代表的な例としては、ｐＴＴ５、ｐＳＥＣｔａｇシリーズ、ｐＣＧＳ３シリーズ、ｐｃＤＮＡシリーズのベクター等、ならびに哺乳動物の発現系で使用される他のベクター等を含むが、これらに限定されない。発現ベクターには、適切な転写および翻訳調節配列に結合された結合ＤＮＡ配列が含まれる。

関連する配列を得られたら、組換え法を使用して、関連する配列を大領に得ることができる。通常、これは、それをベクターにクローニングし、次に細胞に形質転換し、次に従来の方法によって増殖した宿主細胞から関連する配列を単離することによって得られる。

本発明は、前記適切なＤＮＡ配列および適切なプロモーターまたは制御配列を含むベクターにさらに関する。これらのベクターは、タンパク質を発現できるように適切な宿主細胞に形質転換するために使用されることができる。

本発明において、「宿主細胞」という用語は、上記の発現ベクターを発現するのに適した細胞を指し、本発明の融合タンパク質の発現のために使用できる哺乳動物または昆虫の宿主細胞培養系等の真核細胞であり得、ＣＨＯ（中国ハムスター卵巣、Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ）、ＨＥＫ２９３、ＣＯＳ、ＢＨＫおよび上記の細胞の派生細胞は、本発明に適用されることができる。

医薬組成物および適用
本発明は、組成物をさらに提供する。好ましくは、前記組成物は、上記の抗体またはその活性フラグメントまたはその融合タンパク質、ならびに薬学的に許容されるベクターを含む医薬組成物である。一般に、これらの物質を、毒性がなく、不活性で、薬学的に許容される水性ベクター媒体で処方することができ、ここで、ｐＨは、通常、約５～８、好ましくは、約６～８であり、ｐＨ値は、処方される物質の性質および治療される病症によって異なる。処方された医薬組成物は、従来の経路で投与されることができ、ここで、静脈内注射、静脈内点滴、皮下注射、局所注射、筋肉内注射、腫瘍内注射、腹腔内注射（腹膜内等）、頭蓋内注射、または腔内注射をふくむ（これらに限定されない）。

本発明において、「医薬組成物」という用語は、本発明の二重特異性抗体を薬学的に許容されるベクターと共に医薬製剤組成物を形成することによりより安定した治療効果を発揮できることを指し、これらの製剤は、本発明で開示された二重特異性抗体のアミノ酸コア配列のコンフォメーションの完全性を確保し、同時にタンパク質の多官能基を分解から保護することができる（凝縮、脱アミノ化または酸化を含むがこれらに限定されない）。

本発明の医薬組成物は、安全かつ有効な量（例えば、０．００１～９９ｗｔ％、好ましくは、０．０１～９０ｗｔ％、より好ましくは、０．１～８０ｗｔ％）の本発明の上記の二重特異性抗体（またはそのコンジュゲート）および薬学的に許容されるベクターまたは賦形剤を含む。このようなベクターは、生理食塩水、緩衝液、グルコース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。薬物製剤は、投与方法と一致する必要がある。本発明の医薬組成物は、例えば、生理食塩水またはグルコースと他のアジュバントとを含む水溶液を使用して、従来の方法によって注射の形態で調製することができる。注射剤および溶液等の医薬組成物は、無菌条件下で調製する必要がある。有効成分の投与量は、治療有效量であり、例えば、毎日の約１０μｇ／ｋｇ体重～約５０ｍｇ／ｋｇ体重である。さらに、本発明の二重特異性抗体は、他の治療剤とともに使用することもできる。

医薬組成物を使用する場合、安全かつ有効な量の二重特異性抗体またはその免疫コンジュゲートが哺乳動物に陽よされ、ここで、当該安全かつ有効な量は、通常、少なくとも約１０μｇ／ｋｇ体重であり、ほとんどの場合、約５０ｍｇ／ｋｇ体重を超えなく、好ましくは、当該投与量は、約１０μｇ／ｋｇ体重～約１０ｍｇ／ｋｇ体重である。もちろん，具体的な投与量は、投与経路および患者の健康状態等の要因を考慮する必要があり、これらは、すべて熟練した医師のスキル範囲内にある。

以下の実施例で使用される実験材料の説明は、次のように記載されたとおりである。

ｐｃＤＮＡ^TM ３．４ ＴＯＰＯ（登録商標） ｖｅｃｔｏｒ ：Ｔｈｅｒｍｏ ｆｉｓｈｅｒ会社から購入され、カタログ番号Ａ１４６９７、
ＣＨＯ細胞：Ｔｈｅｒｍｏ ｆｉｓｈｅｒ会社から購入され、カタログ番号Ａ２９１３３、
２９３Ｅ細胞：ＮＲＣ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから購入され、
ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１ Ｂｌｏｃｋａｄｅ Ｂｉｏａｓｓａｙ，Ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ ｍｏｄｅｌ：Ｐｒｏｍｅｇａ会社から購入され、カタログ番号Ｊ１２５２、
ヒト胃がん細胞株ＮＣＩ－Ｎ８７：アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から購入され、
ヒト表皮がん細胞Ａ４３１：ＡＴＣＣから購入され、
ＳＤラット：上海霊暢生物科学技術株式会社から購入され、
ＳＷ４８細胞：中国科学院上海生物化学研究院から購入され、
ＭＣ３８細胞：広州ジェネオバイオテクノロジー株式会社から購入され、
Ｂ－ｈＰＤ－Ｌ１ヒト化マウス：Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ江蘇遺伝子バイオテクノロジー株式会社から購入される。

以下の実施例で使用される実験試薬の説明は、次のように記載されたとおりである。

抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体：ＰＣＴ／ＣＮ２０２０／０９０４４２中の配列に従って調製され、
抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体：セツキシマブの配列に従って調製され、
ＨＲＰ標識羊抗ヒトＦｃ抗体：ｓｉｇｍａから購入され、カタログ番号Ａ０１７０、
ＨＲＰ標識マウス抗ヒトＦａｂ抗体：ｓｉｇｍａから購入され、カタログ番号Ａ０２９３、
ＨＲＰ標識ａｎｔｉ－６×Ｈｉｓ抗体：ａｂｃａｍから購入され、カタログ番号ａｂ１７８５６３、
ヤギ抗ヒトＩｇＧ－ＦＩＴＣ：ｓｉｇｍａから購入され、カタログ番号Ｆ４１４３、
ＰＢＳ：Ｓａｎｇｏｎバイオエンジニアリング（上海）株式会社から購入され、カタログ番号Ｂ５４８１１７、
ＰＢＳＴ：ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０、
ＢＳＡ：Ｓａｎｇｏｎバイオエンジニアリング（上海）株式会社から購入され、カタログ番号Ａ６０３３２、
ＦＢＳ：Ｇｉｂｃｏから購入され、カタログ番号１００９９、
ＴＭＢ：ＢＤ会社から購入され、カタログ番号５５５２１４；
ＲＰＭＩ １６４０培地：Ｇｉｂｃｏから購入され、カタログ番号２２４００－０８９、
Ｂｉｏ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ：Ｐｒｏｍｅｇａから購入され、カタログ番号Ｇ７９４０、
Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８：日本同仁化学研究所（Ｄｏｊｉｎｄｏ）から購入され、カタログ番号ＣＫ０４、
ＤＭＥＭ培地：Ｃｅｌｌｇｒｏから購入され、カタログ番号１０－０１３－ＣＶ。

以下の実施例で使用される実験機器の説明は、次のように記載されたとおりである。

ＰＣＲ装置：ＢｉｏＲａｄから購入され、カタログ番号Ｃ１０００ Ｔｏｕｃｈ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ、
ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅカラム：ＧＥ会社から購入され、カタログ番号１１－００３４－９５、
Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメーター：Ｂｅｃｋｍａｎ会社から購入され、
ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉ３ｘマイクロプレートリーダー：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ会社から購入され、
ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＭ５マイクロプレートリーダー：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ会社から購入される。

以下の実施例、実験例は、本発明をさらに説明するためのものであり、本発明を限定するものと解釈されるべきではない。実施例は、ベクターおよびプラスミドを構築するそれらの方法、タンパク質をコードする遺伝子をそのようなベクターおよびプラスミドに挿入する方法またはプラスミドに宿主細胞を導入する方法等の、従来の方法の詳細な説明を含まない。そのような方法は、当業者に周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｅ．Ｆ．ａｎｄ Ｍａｎｉａｉｓ、Ｔ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ等の、多くの出版物に記載されている。以下の実施例で具体的な条件が示されていない実験方法については、通常、従来の条件または製造業者によって提案された条件に従う。特に明記しない限り、パーセンテージおよび部数は、重量パーセンテージおよび重量部数である。

実施例１．抗ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ二重抗体分子の構築
本発明は、抗ヒトＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体Ｍ８（配列は、ＰＣＴ／ＣＮ２０２０／０９０４４２に由来する）のｓｃＦｖ（ＶＬ－リンカー１－ＶＨ、リンカー１は、４個または５個のＧＧＧＧＳである）を、リンカー２（３個または４個のＧＧＧＧＳである）を介して、抗ヒトＥＧＦＲモノクローナル抗体（セツキシマブの配列に従って調製され、配列は、Ｍａｇｄｅｌａｉｎｅ－Ｂｅｕｚｅｌｉｎ Ｃ、Ｋａａｓ Ｑ、Ｗｅｈｂｉ Ｖ、ｅｔ ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｏｆ ｔｈｅ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｐｐｒｏｖｅｄ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ［Ｊ］．Ｃｒｉｔｉｃａｌ ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ ｏｎｃｏｌｏｇｙ／ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ、２００７、６４（３）：２１０－２２５に由来する）の重鎖のＮ－末端に直列に接続して、抗ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ二重特異性抗体を構築する。ここで、リンカー１が４個のＧＧＧＧＳであり且つリンカー２が３個のＧＧＧＧＳである二重抗体は、ａｎｔｉ－ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ ＢｓＡｂ１と命名され、リンカー１が５個のＧＧＧＧＳであり且つリンカー２が３個のＧＧＧＧＳである二重抗体は、ａｎｔｉ－ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ ＢｓＡｂ２と命名される。構造は、図１に示されたとおりである。

本発明は、抗ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ二重抗体分子を構築するためにいくつかの他の結合方法を使用し、以下に示されたとおりである。

ａｎｔｉ－ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ ＢｓＡｂ ｒｅｖ１：抗ヒトＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体のｓｃＦｖ（Ｎ末端からＣ末端までＶＬ－リンカー１－ＶＨであり、リンカー１は、４個のＧＧＧＧＳである）を使用し、ｓｃＦｖのＶＬをリンカー２（３個のＧＧＧＧＳである）を介して、抗ヒトＥＧＦＲモノクローナル抗体の重鎖Ｃ－末端に直列に構築され、
ａｎｔｉ－ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ ＢｓＡｂ ｒｅｖ２：抗ヒトＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体のｓｃＦｖ（Ｎ末端からＣ末端までＶＨ－リンカー１－ＶＬであり、リンカー１は、４個のＧＧＧＧＳである）を使用し、ｓｃＦｖのＶＨをリンカー２（３個のＧＧＧＧＳである）を介して、抗ヒトＥＧＦＲモノクローナル抗体の重鎖Ｃ－末端に直列に構築され、
ａｎｔｉ－ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ ＢｓＡｂ ｒｅｖ３：抗ヒトＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体のｓｃＦｖ（Ｎ末端からＣ末端までＶＨ－リンカー１－ＶＬであり、リンカー１は、４個のＧＧＧＧＳである）を使用し、ｓｃＦｖのＶＬをリンカー２（３個のＧＧＧＧＳである）を介して、抗ヒトＥＧＦＲモノクローナル抗体の重鎖Ｎ－末端に直列に構築され、
ａｎｔｉ－ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ ＢｓＡｂ ｒｅｖ５：抗ヒトＥＧＦＲモノクローナル抗体のｓｃＦｖ（Ｎ末端からＣ末端までＶＬ－リンカー１－ＶＨであり、リンカー１は、４個のＧＧＧＧＳである）を使用し、ｓｃＦｖのＶＬをリンカー２（３個のＧＧＧＧＳである）を介して、抗ヒトＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体の重鎖Ｃ－末端に直列に構築され、
ａｎｔｉ－ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ ＢｓＡｂ ｒｅｖ６：抗ヒトＥＧＦＲモノクローナル抗体のｓｃＦｖ（Ｎ末端からＣ末端までＶＨ－リンカー１－ＶＬであり、リンカー１は、４個のＧＧＧＧＳである）を使用し、ｓｃＦｖのＶＨをリンカー２（３個のＧＧＧＧＳである）を介して、抗ヒトＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体の重鎖Ｃ－末端に直列に構築され、
ａｎｔｉ－ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ ＢｓＡｂ ｒｅｖ７：抗ヒトＥＧＦＲモノクローナル抗体のｓｃＦｖ（Ｎ末端からＣ末端までＶＨ－リンカー１－ＶＬであり、リンカー１は、４個のＧＧＧＧＳである）を使用し、ｓｃＦｖのＶＬをリンカー２（３個のＧＧＧＧＳである）を介して、抗ヒトＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体の重鎖Ｎ－末端に直列に構築され、
ａｎｔｉ－ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ ＢｓＡｂ ｒｅｖ８：抗ヒトＥＧＦＲモノクローナル抗体のｓｃＦｖ（Ｎ末端からＣ末端までＶＬ－リンカー１－ＶＨであり、リンカー１は、４個のＧＧＧＧＳである）を使用し、ｓｃＦｖのＶＨをリンカー２（３個のＧＧＧＧＳである）を介して、抗ヒトＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体の重鎖Ｎ－末端に直列に構築される。

遺伝子合成および従来の分子クローニング法によって、二重特異性抗体およびその対応するモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖発現ベクターを得、その対応するアミノ酸配列は、表１に示されたとおりであり、ここで、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔの規則に従ってコードされる。

実施例２．抗ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ二重抗体の発現および精製
抗ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ二重抗体の重鎖および軽鎖のＤＮＡフラグメントを、それぞれｐｃＤＮＡ３．４ベクターにサブクローニングし、組換えプラスミドを抽出し、ＣＨＯ細胞および／または２９３Ｅ細胞にコトランスフェクトし、細胞を５～７日培養した後、培養液を高速遠心分離および、微多ウェル膜で吸引ろ過した後、サンプルをＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅカラムにロードし、１００ｍＭのクエン酸、ｐＨ３．５を含む溶離液でタンパク質を溶出し、ｐＨ７．４のＰＢＳに透析する。

精製後のタンパク質をＨＰＬＣで検出し、抗ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ二重抗体のＨＰＬＣ－ＳＥＣ検出スペクトルは、図２Ａに示されたとおりである。ａｎｔｉ－ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ ＢｓＡｂ１およびａｎｔｉ－ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ ＢｓＡｂ２の二つの二重抗体の単量体の純度は、９２％以上に達し、ここで、ａｎｔｉ－ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ ＢｓＡｂ２の単量体の純度は、ａｎｔｉ－ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ ＢｓＡｂ１よりわずかに高い。

ＳＤＳ－ＰＡＧＥの検出結果は、図２Ｂに示されたとおりであり、レーン１および２は、抗ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ二重抗体の非還元および還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥであり、レーン３および４は、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体の非還元および還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥである。二重抗体の理論上の分子量は、１９８ＫＤである。

実施例３．抗原に対する抗ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ二重抗体のアフィニティーを検出するための酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）
３．１．ＰＤ－Ｌ１抗原によるアフィニティー検出
抗ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ二重抗体およびＰＤ－Ｌ１抗原のアフィニティーを検出するために、ｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液で、ＰＤＬ１－ＥＣＤ－Ｈｉｓタンパク質（ＮＣＢＩによって提供された配列（ＮＣＢＩ登録番号は、ＮＰ＿０５４８６２．１である）に従って、ＰＤ－Ｌ１細胞外ドメイン遺伝子を合成し、且つそのＮ末端にシグナルペプチド配列を付加し、Ｃ末端に６×Ｈｉｓタグを付加し、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩの二つの制限部位によってそれぞれ発現ベクターに構築され、ＨＥＫ－２９３Ｅ細胞にトランスフェクトされ、発現および精製されて得られる）を１０００ｎｇ／ｍｌに希釈し、次いで１００μｌ／ウェルをＥＬＩＳＡプレートに加え、４℃下で一晩インキュベートし、翌日、ＰＢＳＴでプレートを２回洗浄し、各ウェルにＰＢＳＴ＋１％ＢＳＡを加えてブロックし、３７℃下で１時間ブロックし、ＰＢＳＴでプレートを２回洗浄し、次いでＰＢＳ＋１％ＢＳＡの勾配で希釈した検出する抗体を加え、抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体は、陽性対照として使用され、初期濃度は、１００ｎＭであり、１２個の勾配を３倍に段階希釈する。３７℃下で１時間インキュベートし、ＰＢＳＴでプレートを２回洗浄し、二次抗体ＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＦｃ抗体を加え、３７℃下で４０分間さらにインキュベートし、ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄し、且つ軽くたたいて乾かし、各ウェルに１００μｌのＴＭＢを加え、室温（２０±５℃）の暗所で５分間置き、各ウェルに５０μｌの２Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４停止液を加えて基質反応を停止させ、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍでのＯＤ値を読み取り、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍでデータを分析し、プロットし、ＥＣ_５０を計算する。

実験結果は、図３Ａに示されたとおりであり、抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体、ａｎｔｉ－ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ ＢｓＡｂ１およびａｎｔｉ－ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ ＢｓＡｂ２のＥＣ_５０は、すべて０．１１ｎＭであり、三つのアフィニティーは、類似する。

３．２．ＥＧＦＲ抗原によるアフィニティー検出
抗ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ二重抗体およびＥＧＦＲ抗原のアフィニティーを検出するために、ｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液でＥＧＦＲ－ＥＣＤ－ｈＦｃタンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔによって提供された配列（シリアル番号Ｐ００５３３）に従って、細胞外ドメイン遺伝子を合成し、且つそのＮ末端にシグナルペプチド配列を付加し、Ｃ末端にｈＦｃタグを付加し、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩの二つの制限部位によってそれぞれ発現ベクターに構築され、ＨＥＫ－２９３Ｅ細胞にトランスフェクトされ、発現および精製されて得られる）を１０００ｎｇ／ｍｌに希釈し、次いで１００μｌ／ウェルをＥＬＩＳＡプレートに加え、４℃下で一晩インキュベートし、翌日ＰＢＳＴでプレートを２回洗浄し、各ウェルにＰＢＳＴ＋１％ＢＳＡを加えてブロックし、３７℃下で１時間ブロックし、ＰＢＳＴでプレートを２回洗浄し、次いでＰＢＳ＋１％ＢＳＡの勾配で希釈した検出する抗体を加え、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体を陽性対照として使用され、初期濃度は、１００ｎＭであり、１２個の勾配を３倍に段階希釈する。３７℃下で１時間インキュベートし、ＰＢＳＴでプレートを２回洗浄し、二次抗体ＨＲＰ－ａｎｔｉ－Ｆａｂ抗体を加え、３７℃下で４０分間さらにインキュベートし、ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄し、且つ軽くたたいて乾かし、各ウェルに１００μｌのＴＭＢを加え、室温（２０±５℃）の暗所で５分間置き、各ウェルに５０μｌの２Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４停止液を加えて基質反応を停止させ、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍでのＯＤ値を読み取り、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６でデータを分析し、プロットし、ＥＣ_５０を計算する。

実験結果は、図３Ｂに示されたとおりであり、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体のＥＣ_５０は、０．１５ｎＭであり、ａｎｔｉ－ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ ＢｓＡｂ１のＥＣ_５０は、０．１５ｎＭであり、ａｎｔｉ－ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ ＢｓＡｂ２のＥＣ_５０は、０．２１ｎＭであり、三つのアフィニティーは、類似する。

実施例４．抗ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ二重抗体が二つの抗原に同時に結合する能力を検出するための二重特異性ＥＬＩＳＡ
抗ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ二重抗体がＥＧＦＲ抗原およびＰＤ－Ｌ１抗原に同時に結合する能力を検出するために、ｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液でＰＤＬ１－ＥＣＤ－ｈＦｃタンパク質（ＰＤＬ１－ＥＣＤ－Ｈｉｓタンパク質のＣ末端をｈＦｃタグに置き換える）を１μｇ／ｍｌに希釈し、次いで１００μｌ／ウェルをＥＬＩＳＡプレートに加え、４℃下で一晩インキュベートし、翌日ＰＢＳＴでプレートを２回洗浄し、各ウェルにＰＢＳＴ＋１％ＢＳＡを加えてブロックし、３７℃下で１時間ブロックし、ＰＢＳＴでプレートを２回洗浄し、次いでＰＢＳ＋１％ＢＳＡの勾配で希釈した検出する抗体を加え、初期濃度は、３００ｎＭであり、１２個の勾配を３倍に段階希釈する。３７℃下で１時間インキュベートし、ＰＢＳＴでプレートを２回洗浄し、ｐＨ７．４のＰＢＳで希釈した１μｇ／ｍｌのＥＧＦＲ－ＥＣＤ－Ｈｉｓ抗原（ＥＧＦＲ－ＥＣＤ－ｈＦｃタンパク質のＣ末端を６×Ｈｉｓタグに置き換える）をさらに加え、１００μｌ／ウェルをＥＬＩＳＡプレートに加える。３７℃下で１時間インキュベートし、ＰＢＳＴでプレートを２回洗浄し、二次抗体ＨＲＰ－ａｎｔｉ－Ｈｉｓを加え、３７℃下で４０分間さらにインキュベートし、ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄し、且つ軽くたたいて乾かし、各ウェルに１００μｌのＴＭＢを加え、室温（２０±５℃）の暗所で５分間置き、各ウェルに５０μｌの２Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４停止液を加えて基質反応を停止させ、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍでのＯＤ値を読み取り、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍでデータを分析し、プロットし、ＥＣ_５０を計算する。

実験結果は、図４に示されたとおりであり、ａｎｔｉ－ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ ＢｓＡｂ１およびａｎｔｉ－ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ ＢｓＡｂ２のＥＣ_５０は、それぞれ０．６６ｎＭおよび０．６３ｎＭであり、モノクローナル抗体は、両方の抗原に同時に結合する能力はない。

実施例５．標的細胞に対する抗ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ二重抗体の結合アフィニティーのＦＡＣＳ検出
本実験では、細胞表面にＥＧＦＲを高発現するヒト表皮がん細胞Ａ４３１を標的細胞として使用し、０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳで３回洗浄し、毎回３００ｇで５分間遠心分離し、上清を廃棄する。０．５％ＢＳＡのＰＢＳで細胞を再懸濁し、細胞密度は、１×１０^６細胞／ｍＬであり、１００μＬ／ウェルを９６ウェルプレートに加える。抗ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ二重抗体および陽性対照抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体を６００ｎＭに希釈し、１１個の勾配を段階希釈し、１００μＬ／ウェルを９６ウェルプレートに加え、Ａ４３１細胞と均等に混合する。４℃下で１時間インキュベートする。ＰＢＳで細胞を２回洗浄して、結合しない検出する抗体を除去する。１００μＬ／ウェルのヤギ抗ヒトＩｇＧ－ＦＩＴＣを皿に加えて、４℃下で３０分間インキュベートする。３００ｇで５分間遠心分離し、ＰＢＳで細胞を２回洗浄して、結合しない二次抗体を除去する。最後に、細胞を２００μｌのＰＢＳに再懸濁し、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメーターによって当該細胞に対する二重抗体の結合アフィニティーを測定する。得られたデータは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ７ソフトウェアによってフィッティングおよび分析される。

実験結果は、図５Ａに示されたとおりであり、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体、ａｎｔｉ－ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ ＢｓＡｂ１およびａｎｔｉ－ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ ＢｓＡｂ２の三者のＥＣ_５０は、すべて１．５６ｎＭであり、三つのアフィニティーは、類似する。

Ｎ８７－ＰＤＬ１は、本実験室でレンチウイルストランスフェクション法を用いてＮＣＩ－Ｎ８７にＰＤ－Ｌ１をトランスフェクトすることによって構築された安定細胞株である。対数増殖期のＮ８７－ＰＤＬ１をトリプシンで消化した後、０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳで３回洗浄し、毎回３００ｇで５分間遠心分離し、上清を廃棄する。０．５％ＢＳＡのＰＢＳで細胞を再懸濁し、細胞密度は、１×１０６細胞／ｍＬであり、１００μＬ／ウェルを９６ウェルプレートに加える。抗ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ二重抗体および陽性対照抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体を１２０ｎＭに希釈し、１１個の勾配を段階希釈し、１００μＬ／ウェルを９６ウェルプレートに加え、Ｎ８７－ＰＤＬ１細胞と均等に混合する。残りの方法は、上記と同じである。

実験結果は、図５Ｂに示されたとおりであり、抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体のＥＣ_５０は、０．１１ｎＭであり、ａｎｔｉ－ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ ＢｓＡｂ１のＥＣ_５０は、０．１６ｎＭであり、ａｎｔｉ－ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ ＢｓＡｂ２のＥＣ_５０は、０．２２ｎＭであり、三つのアフィニティーは、類似する。

実施例６．インビトロでのＡ４３１細胞増殖に対する抗ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ二重抗体の阻害効果
ヒト表皮がん細胞Ａ４３１の表面にＥＧＦＲを高発現し、抗ＥＧＦＲ抗体は、インビトロでＡ４３１細胞の増殖を効果的に阻害することができる。対数増殖期のＡ４３１細胞を、１％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で５×１０^４／ｍＬに希釈し、１００μＬ／ウェルで９６ウェル培養プレートに接種し、２４時間接着成長した後、１％ＦＢＳのＲＰＭＩ１６４０培地で希釈した異なる濃度の検出する抗体を加える。検出する抗体の初期作業濃度は、５０ｎＭであり、合計１０個の異なる濃度を３倍に段階希釈し、濃度ごとに二重デュープリケートウェルを設定する。３７℃下で、５％ＣＯ_２条件下で細胞を７２時間培養した後、２０μｌ／ウェルのＣＣＫ－８発色液を加え、室温下で１．５時間インキュベートする。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＭ５マイクロプレートリーダーで、検出波長として４５０ｎｍ、参照波長として６５０ｎｍを使用して読み取り、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍでデータを分析し、プロットし、ＩＣ_５０を計算する。

実験結果は、図６に示されたとおりであり、Ａ４３１の増殖を阻害するａｎｔｉ－ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ ＢｓＡｂ１、ａｎｔｉ－ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ ＢｓＡｂ２、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体のＩＣ_５０は、それぞれ６．６３ｎＭ、７．１７ｎＭ、５．２３ｎＭである。三つの阻害活性は、相当である。

ａｎｔｉ－ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ ＢｓＡｂ ｒｅｖ１、ｒｅｖ２、ｒｅｖ３、ｒｅｖ５、ｒｅｖ６、ｒｅｖ７およびｒｅｖ８等の七つの二重特異性抗体は、インビトロでＡ４３１細胞の増殖に対する阻害効果実験において、結果は、図１３に示されたとおりである。ａｎｔｉ－ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ ＢｓＡｂ ｒｅｖ２、ｒｅｖ７およびｒｅｖ８の三つの二重特異性抗体の活性は、陽性対照抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体より有意に悪く、ａｎｔｉ－ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ ｒｅｖ５は、陽性対照よりわずかに弱く、ａｎｔｉ－ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ ｒｅｖ３の活性は、陽性対照抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体と有意な差はない。

さらに、ａｎｔｉ－ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ ｒｅｖ６の発現量は、低い。

実施例７．細胞上のＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１の活性を遮断する抗ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ二重抗体
本実験では、ＰｒｏｍｅｇａのＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１ Ｂｌｏｃｋａｄｅ Ｂｉｏａｓｓａｙ、Ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ ｍｏｄｅｌおよび方法を使用する。

対数増殖期のＰＤ－Ｌ１ ａＡＰＣ／ＣＨＯ－Ｋ１を取り、トリプシンで単一の細胞に消化した後に白色底透明９６ウェルプレートに転移し、１００μＬ／ウェル、４００００細胞／ウェル、３７℃、５％ＣＯ_２に置き、一晩インキュベートする。抗ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ二重抗体および抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体を取り、２×作業液濃度に希釈し、初期濃度は、２４ｎＭであり、３倍に段階希釈する。密度が１．４～２×１０^６細胞／ｍＬで、細胞生存率が９５％以上であるＰＤ１エフェクター細胞を取り、トリプシンで１．２５×１０^６細胞／ｍＬの単一細胞懸濁液に消化する。前日にプレーティングしたＰＤ－Ｌ１ ａＡＰＣ／ＣＨＯ－Ｋ１細胞を取り、上清を廃棄し、段階希釈した４０μｌの二重抗体／ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体作業液を加え、等量のＰＤ１エフェクター細胞を加える。３７℃、５％ＣＯ_２に置き、６時間インキュベートする。各ウェルに８０μｌの検出試薬Ｂｉｏ－Ｇｌｏを加え、室温下で１０分間インキュベートした後、ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ ｉ３でｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅを読み取る。プレートを読み取る前に、遮光膜でプレートの底をシールする。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍでデータを分析し、プロットし、ＩＣ_５０を計算する。

実験結果は、図７に示されたとおりであり、ａｎｔｉ－ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ ＢｓＡｂ１、ａｎｔｉ－ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ ＢｓＡｂ２、抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体のＩＣ_５０は、それぞれ１．０６ｎＭ、１．２１ｎＭ、０．７８ｎＭであり、三つの効果は相当である。

ａｎｔｉ－ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ ＢｓＡｂ ｒｅｖ１、ｒｅｖ２、ｒｅｖ３、ｒｅｖ５、ｒｅｖ６、ｒｅｖ７、およびｒｅｖ８等の七つの二重特異性抗体は、細胞上のＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１シグナル伝達経路の活性を遮断し、結果は、図１４に示されたとおりである。ａｎｔｉ－ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ ＢｓＡｂ ｒｅｖ１、ｒｅｖ２、ｒｅｖ３、ｒｅｖ７の四つの二重特異性抗体は、陽性対照抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体より有意に悪く（図１４Ａ）、ａｎｔｉ－ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ ＢｓＡｂ ｒｅｖ５、ｒｅｖ６およびｒｅｖ８の活性は、陽性対照抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体と有意な差はない（図１４Ｂ）。

実施例６および７の実験結果に基づいて、総合的な性能の順序は、ａｎｔｉ－ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ ＢｓＡｂ１≧ａｎｔｉ－ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ ＢｓＡｂ２＞他の二重特異性抗体である。

実施例８．抗ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ二重抗体の薬物動態学研究
体重約２００ｇの各群に５匹のＳＤラットを取り、各ラットに尾静脈から３ｍｇの抗体ａｎｔｉ－ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ ＢｓＡｂ２を注射する。投与後の採決の時点は、０時間、３時間、２４時間、４８時間、９６時間、１６８時間、３３６時間である。眼窩より採血し、自然凝固後、８０００ｒｐｍ／ｍｉｎで遠心分離し、血清を得る。

ａｎｔｉ－ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ ＢｓＡｂ２の血清中の薬物濃度は、以下の方法で検出する。

１）プロテインＡをＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、抗体Ｆａｂセグメントを検出する。プロテインＡでコーティングし、コーティング量は、１００ｎｇ／ウェルであり、４℃下で一晩コーティングし、翌日ＰＢＳＴでプレートを２回洗浄し、次いでＰＢＳ＋２％ＢＳＡで３７℃下で２時間ブロッキングする。ＰＢＳＴでプレートを２回洗浄する。ａｎｔｉ－ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ ＢｓＡｂ２の標準品は、１０００ｎｇ／ｍＬから開始し、１２個の勾配で２倍に段階希釈する。ラット血清サンプルを１０００～４０００倍に希釈する。上記の二つのグループのサンプルを密封したＥＬＩＳＡプレートに加え、１時間インキュベートし、ＰＢＳＴでプレートを２回洗浄した後にＨＲＰ標識マウス抗ヒトＦａｂ抗体を加え、３７℃下で３０分間静置し、ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄した後、吸収紙に残った液滴をできるだけパッティングして乾かし、各ウェルに１００μｌのＴＭＢを加え、室温（２０±５℃）の暗所で５分間置き、各ウェルに５０μｌの２ＭＨ_２ＳＯ_４停止液を加えて基質反応を停止させ、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍでのＯＤ値を読み取る。計算して得られた半減期は、３０４時間である。

２）ＥＧＦＲ－ＥＣＤ－ｈＦｃコーティングＥＬＩＳＡプレート、５０ｎｇ／ウェル。残りの方法は、上記と同じである。計算して得られた半減期は、２７５時間である。

３）ＰＤＬ１－ＥＣＤ－ｈＦｃコーティングＥＬＩＳＡプレート、１００ｎｇ／ウェル。残りの方法は、上記と同じである。計算して得られた半減期は、２３２時間である。

表１～３に示されたとおりであり、上記の三つのグループのＥＬＩＳＡ結果から、計算された半減期の結果は、類似しており、分析データが信頼できることを示す。

実施例９．抗原に対する抗ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ二重特異性抗体のアフィニティーのＢｉａｃｏｒｅ８Ｋ測定
プロテインＡ捕捉法を用いて抗ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ二重特異性抗体および抗原ＰＤＬ１－ＥＣＤ－ｈｉｓに結合する動態学パラメーターを測定する。濃度が２μｇ／ｍｌである二重特異性抗体をプロテインＡチップに結合し、抗原ＰＤＬ１－ＥＣＤ－ｈｉｓを１×ＨＢＳ－ＥＰ作業液で５０ｎＭから２倍に段階希釈し、抗体に結合する七つの濃度勾配を設定し、ＨＢＳ－ＥＰ作業液で解離する（図９に示されたとおりである）。

プロテインＡ捕捉法を用いて抗ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ二重特異性抗体および抗原ＥＧＦＲ－ＥＣＤ－ｈｉｓに結合する動態学パラメーターを測定する。濃度が２μｇ／ｍｌである二重抗体をプロテインＡチップに結合し、抗原ＥＧＦＲ－ＥＣＤ－ｈｉｓを１×ＨＢＳ－ＥＰ作業液で２５ｎＭから２倍に段階希釈し、抗体に結合する七つの濃度勾配を設定し、ＨＢＳ－ＥＰ作業液で解離する（例えば、図８に示されたとおりである）。

抗ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ ＢｓＡｂ１および対照モノクローナル抗体、ならびにＥＧＦＲ－ｈｉｓ、ＰＤＬ１－ＥＣＤ－ｈｉｓに結合する動態学パラメーターは、以下の表（表４、表５）に示される。

データ結果は、陽性対照と比較して、抗ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ二重特異性抗体の親和性解離定数には有意差がないことを示す。

実施例１０．細胞レベルでの抗ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ二重特異性抗体の相乗効果
９６ウェルプレートでの細胞プレーティング：対数増殖期に培養したＳＷ４８細胞を、問プシンで消化した後、５％ＦＢＳを加えたＲＰＭＩ１６４０培地に交換し、細胞密度を１０００００個／ｍＬに調整する。１００μＬ／ウェルを使用して９６ウェルプレート、即ち１００００個／ウェルにプレーティングする。３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで一晩インキュベートする。

翌日投与：各抗体の濃度は、２００ｎＭであり、ヒトＰＢＭＣは、５００００個／ウェルであり、最終体積は、２００μＬ／ウェルである。３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで７日間培養し続ける。

プレートの読み取り：７日間投与した後、ピペットで１５０μＬの上清を取り出した後、残りを５０μＬ／ウェルのｃｅｌｌ ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏに加え、１０分間インキュベートした後にＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅを読み取り、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ７でデータを分析し、ブロットする。

実験結果は、図１０に示されたとおりであり、抗ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ ＢｓＡｂ１の殺傷活性は、抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体よりも有意に大きく、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体よりも有意に大きい。抗ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ ＢｓＡｂ１が相乗的な殺傷効果を発揮したことを示す。

実施例１１．マウス異種移植腫瘍モデルにおける抗ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ二重特異性抗体の抗腫瘍効果
１．ＳＷ４８異種移植腫瘍モデルにおける抗ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ二重特異性抗体の抗腫瘍効果
本実験は、動物モデルにおける抗ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ二重特異性抗体の抗ＥＧＦＲ活性を評価するために使用される。ＳＷ４８結腸がん細胞の表面にＥＧＦＲを発現し、抗ＥＧＦＲ抗体は、ＳＷ４８細胞の増殖を効果的に阻害することができる。

インビトロで培養した結腸がんＳＷ４８細胞を収集し、無血清培地で細胞濃度を３×１０^７細胞／ｍＬに調整する。無菌条件下で、１００μＬの細胞懸濁液をＢＡＬＢ／Ｃヌードマウスの脇腹に皮下接種する。ノギスで異種移植腫瘍の長さおよび幅を測定し、腫瘍の体積を計算し、腫瘍が１００～２００ｍｍ^３に成長した後、動物をランダムにグループに分ける。

被験サンプルの抗ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ ＢｓＡｂ１の投与量は、１３．３ｍｇ／ｋｇであり、陽性対照薬の抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体の投与量は、１０ｍｇ／ｋｇである。対照群には、同量のＰＢＳを投与する。投与方法は、腹腔内投与であり、投与体積は、０．２ｍＬ／マウス（２０ｇ）であり、週２回、３週間連続投与する。

異種移植腫瘍の体積を週２回測定し、同時にマウスの体重を測定し、記録する。腫瘍体積（ｔｕｍｏｒ ｖｏｌｕｍｅ、ＴＶ）の計算式は、ＴＶ＝１／２×長さ×幅^２である。測定した結果に基づいて、相対腫瘍体積（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｔｕｍｏｒ ｖｏｌｕｍｅ、ＲＴＶ）を計算し、計算式は、ＲＴＶ＝Ｖｔ／Ｖ０である。ここで、Ｖ０は、グループ分けて投与時（即ち、ｄ０）に測定された腫瘍体積であり、Ｖｔは、各測定時の腫瘍体積である。抗腫瘍活性の評価指標は、相対腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ（％）であり、計算式は、Ｔ／Ｃ（％）＝（ＴＲＴＶ／ＣＲＴＶ）×１００（ＴＲＴＶ：治療群ＲＴＶ、ＣＲＴＶ：陰性対照群ＲＴＶ）であり、腫瘍阻害率＝１－Ｔ／Ｃ（％）である。有効性評価標準：Ｔ／Ｃ（％）＞４０％は、無効であり、Ｔ／Ｃ（％）≦４０、且つ統計処理後のｐ≦０．０５は、有効である。

実験結果は、図１１に示されたとおりであり、抗ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ ＢｓＡｂ１と陽性対照抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体との間には有意差はない。

２．Ｂ－ｈＰＤ－Ｌ１ヒト化マウスＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１異種移植腫瘍モデルにおける抗ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ二重特異性抗体の抗腫瘍効果
本実験は、動物モデルにおける抗ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ二重特異性抗体の抗ＰＤ－Ｌ１活性を評価するために使用される。

マウス結腸がんＭＣ３８細胞を３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーターで培養し、培地成分は、１０％不活性化ウシ胎児血清を含むＤｕＬｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ（ＤＭＥＭ）培地を使用する。ＭＣ３８－ｈＰＤＬ１細胞（Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎによって遺伝子改変される）は、ヒトＰＤ－Ｌ１を過剰発現し、同時にマウスＰＤ－Ｌ１をノックアウトする。ＰＢＳに懸濁したＭＣ３８－ｈＰＤＬ１結腸がん細胞を、５×１０^５個／０．１ｍＬの濃度、０．１ｍＬ／匹の体積で、Ｂ－ｈＰＤ－Ｌ１ヒト化マウス（Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ、種類Ｃ５７ＢＬ／６）の右側に皮下接種する。平均腫瘍体積が約１３８ｍｍ^３に達する場合、実験のために適切な個体の腫瘍体積を有する８匹のマウスを選択する。

抗ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ ＢｓＡｂ１の投与量は、２７ｍｇ／ｋｇであり、陽性対照薬抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体の投与量は、２０ｍｇ／ｋｇである。対照群には、同量のＰＢＳを投与する。投与方法は、腹腔内投与であり、週２回、３週間連続投与する。異種移植腫瘍の体積を週２回測定し、同時にマウスの体重を測定し、記録する。

実験結果は、図１２に示されたとおりであり、本実験の薬効モデルにおいて、対照群（ＰＢＳ）と比較して、被験品の抗ＰＤＬ１×ＥＧＦＲ ＢｓＡｂ１は、測定投与量下で、ＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１細胞移植Ｂ－ｈＰＤ－Ｌ１ヒト化マウスの皮下腫瘍の増殖に対して有意な阻害効果を有し、陽性対照抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体と比較して、有意差はない。

本発明で言及されたすべての文書は、あたかも各文書が個別に参照として引用されたかのように、本出願における参照として引用される。さらに、本発明の上記の教示内容を読んだ後、当業者は本発明に様々な変更または修正を加えることができ、これらの同等の形態も、本出願の添付の請求範囲によって定義される範囲に含まれる。

Claims (17)

1. 抗ＰＤＬ１×ＥＧＦＲの二重特異性抗体であって、
   以下の（ａ）群又は（ｂ）群の二つのポリペプチド鎖および二つの軽鎖を含み、
   （ａ）前記ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端まで
   （ＶＬ－ＰＤＬ１）－リンカー１－（ＶＨ－ＰＤＬ１）－リンカー２－（ＶＨ－ＥＧＦＲ）－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３、または
   （ＶＨ－ＰＤＬ１）－リンカー１－（ＶＬ－ＰＤＬ１）－リンカー２－（ＶＨ－ＥＧＦＲ）－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３、または
   （ＶＨ－ＥＧＦＲ）－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３－リンカー２－（ＶＬ－ＰＤＬ１）－リンカー１－（ＶＨ－ＰＤＬ１）、または
   （ＶＨ－ＥＧＦＲ）－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３－リンカー２－（ＶＨ－ＰＤＬ１）－リンカー１－（ＶＬ－ＰＤＬ１）を含み、
   前記軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端まで（ＶＬ－ＥＧＦＲ）－ＣＬを含み、または
   （ｂ）前記ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端まで
   （ＶＬ－ＥＧＦＲ）－リンカー１－（ＶＨ－ＥＧＦＲ）－リンカー２－（ＶＨ－ＰＤＬ１）－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３、または
   （ＶＨ－ＥＧＦＲ）－リンカー１－（ＶＬ－ＥＧＦＲ）－リンカー２－（ＶＨ－ＰＤＬ１）－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３、または
   （ＶＨ－ＰＤＬ１）－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３－リンカー２－（ＶＬ－ＥＧＦＲ）－リンカー１－（ＶＨ－ＥＧＦＲ）、または
   （ＶＨ－ＰＤＬ１）－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３－リンカー２－（ＶＨ－ＥＧＦＲ）－リンカー１－（ＶＬ－ＥＧＦＲ）を含み、
   前記軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端まで（ＶＬ－ＰＤＬ１）－ＣＬを含み、
   ここで、前記ＶＬ－ＰＤＬ１は、ＰＤ－Ｌ１に結合する軽鎖可変領域であり、
   前記ＶＨ－ＰＤＬ１は、ＰＤ－Ｌ１に結合する重鎖可変領域であり、
   前記ＶＬ－ＥＧＦＲは、ＥＧＦＲに結合する軽鎖可変領域であり、
   前記ＶＨ－ＥＧＦＲは、ＥＧＦＲに結合する重鎖可変領域であり、
   前記ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３は、重鎖定常領域であり、前記ＣＬは、軽鎖定常領域であり、
   前記リンカー１およびリンカー２は、それぞれ独立して、柔軟なペプチドリンカーであり、
   前記ＶＬ－ＰＤＬ１と前記ＶＨ－ＰＤＬ１とは、抗ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、
   前記ＶＨ－ＥＧＦＲと前記ＶＬ－ＥＧＦＲとは、ＥＧＦＲに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、
   前記ＶＬ－ＰＤＬ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１－３に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲを含み、前記ＶＨ－ＰＤＬ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４－６に示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲを含み、前記ＶＨ－ＥＧＦＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７－９に示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲを含み、前記ＶＬ－ＥＧＦＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０－１２に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲを含む
   ことを特徴とする、前記ＰＤＬ１×ＥＧＦＲの二重特異性抗体。
2. （ａ）Ｎ末端からＣ末端まで（ＶＬ－ＰＤＬ１）－リンカー１－（ＶＨ－ＰＤＬ１）－リンカー２－（ＶＨ－ＥＧＦＲ）－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３を含む二つのポリペプチド鎖と、（ｂ）Ｎ末端からＣ末端まで（ＶＬ－ＥＧＦＲ）－ＣＬを含む二つの軽鎖とを含み
   前記（ａ）の前記二つのポリペプチド鎖において、
   前記ＶＬ－ＰＤＬ１は、ＰＤ－Ｌ１に結合する軽鎖可変領域であり、
   前記リンカー１およびリンカー２は、それぞれ独立して、柔軟なペプチドリンカーであり、
   前記ＶＨ－ＥＧＦＲは、ＥＧＦＲに結合する重鎖可変領域であり、
   前記ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３は、重鎖定常領域であり、および
   前記（ｂ）の前記二つの軽鎖において、前記ＶＬ－ＥＧＦＲは、ＥＧＦＲに結合する軽鎖可変領域であり、前記ＣＬは、軽鎖定常領域であり、
   ここで、前記ＶＬ－ＰＤＬ１と前記ＶＨ－ＰＤＬ１とは、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、前記ＶＨ－ＥＧＦＲと前記ＶＬ－ＥＧＦＲとは、ＥＧＦＲに特異的に結合する抗原結合部位を形成することを特徴とする
   請求項１に記載の抗ＰＤＬ１×ＥＧＦＲの二重特異性抗体。
3. （ａ）Ｎ末端からＣ末端まで（ＶＬ－ＰＤＬ１）－リンカー１－（ＶＨ－ＰＤＬ１）－リンカー２－（ＶＨ－ＥＧＦＲ）－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３を含む二つのポリペプチド鎖と、（ｂ）Ｎ末端からＣ末端まで（ＶＬ－ＥＧＦＲ）－ＣＬを含む二つの軽鎖とを含み、
   前記（ａ）の前記二つのポリペプチド鎖において、前記ＶＬ－ＰＤＬ１は、ＰＤ－Ｌ１に結合する軽鎖可変領域であり、前記リンカー１は、４個または５個のＧＧＧＧＳであり、前記ＶＨ－ＰＤＬ１は、ＰＤ－Ｌ１に結合する重鎖可変領域であり、前記リンカー２は、３個または４個のＧＧＧＧＳであり、前記ＶＨ－ＥＧＦＲは、ＥＧＦＲに結合する重鎖可変領域であり、前記ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３は、重鎖定常領域であり、および
   前記（ｂ）の前記二つの軽鎖において、前記ＶＬ－ＥＧＦＲは、ＥＧＦＲに結合する軽鎖可変領域であり、前記ＣＬは、軽鎖定常領域であり、
   ここで、前記ＶＬ－ＰＤＬ１と前記ＶＨ－ＰＤＬ１とは、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、前記ＶＨ－ＥＧＦＲと前記ＶＬ－ＥＧＦＲとは、ＥＧＦＲに特異的に結合する抗原結合部位を形成することを特徴とする
   請求項２に記載の抗ＰＤＬ１×ＥＧＦＲの二重特異性抗体。
4. 前記ＶＬ－ＰＤＬ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示されるアミノ酸配列を有し、前記ＶＨ－ＰＤＬ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示されるアミノ酸配列を有し、前記ＶＨ－ＥＧＦＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示されるアミノ酸配列を有し、前記ＶＬ－ＥＧＦＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする
   請求項１に記載の抗ＰＤＬ１×ＥＧＦＲの二重特異性抗体。
5. 前記ポリペプチド鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５に示されるアミノ酸配列を有し、前記軽鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９に示されるアミノ酸配列を有し、
   または前記ポリペプチド鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９に示されるアミノ酸配列を有し、前記軽鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする
   請求項１～４のいずれか１項に記載の抗ＰＤＬ１×ＥＧＦＲの二重特異性抗体。
6. 前記重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４重鎖定常領域を含み、前記軽鎖定常領域は、κまたはλ軽鎖定常領域を含むことを特徴とする
   請求項１～５のいずれか１項に記載の抗ＰＤＬ１×ＥＧＦＲの二重特異性抗体。
7. 請求項１～６のいずれか１項に記載の二重特異性抗体をコードすることを特徴とする、単離されたヌクレオチド。
8. 請求項７に記載のヌクレオチドを含むことを特徴とする、発現ベクター。
9. 請求項８に記載の発現ベクターを含むことを特徴とする、宿主細胞。
10. 請求項１～６のいずれか１項に記載の二重特異性抗体の調製方法であって、
    （ａ）発現条件下で、請求項９に記載の宿主細胞を培養することにより、前記二重特異性抗体を発現する段階と、
    （ｂ）（ａ）に記載の二重特異性抗体を分離および精製する段階とを含むことを特徴とする、二重特異性抗体の調製方法。
11. 請求項１～６のいずれか１項に記載の二重特異性抗体および薬学的に許容されるベクターを含むことを特徴とする、医薬組成物。
12. 癌を治療するための薬物の調製における、請求項１～６のいずれか１項に記載の二重特異性抗体または請求項１１に記載の医薬組成物の使用。
13. 前記癌は、結腸直腸がん、非小細胞肺がん、扁平上皮がん、頭頸部がん、腎臓がん、膀胱がん、卵巣がん、乳がん、黒色腫、肺がん、肝臓がん、胃がん、リンパ腫、白血病、前立腺がん、骨髄がんおよび他の腫瘍性悪性疾患からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１２に記載の使用。
14. 癌の治療法において用いるための、請求項１～６のいずれか１項に記載の二重特異性抗体、またはその免疫コンジュゲート、または請求項１１に記載の医薬組成物。
15. 前記癌は、結腸直腸がん、非小細胞肺がん、扁平上皮がん、頭頸部がん、腎臓がん、膀胱がん、卵巣がん、乳がん、黒色腫、肺がん、肝臓がん、胃がん、リンパ腫、白血病、前立腺がん、骨髄がんおよび他の腫瘍性悪性疾患からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１４に記載の二重特異性抗体、またはその免疫コンジュゲート、または医薬組成物。
16. 免疫コンジュゲートであって、
    （ａ）請求項１～６のいずれか１項に記載の二重特異性抗体と、および
    （ｂ）検出可能なマーカー、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、または酵素からなる群から選択されるカップリング部分とを含むことを特徴とする、前記免疫コンジュゲート。
17. 腫瘍を治療するための医薬組成物の調製に使用されることを特徴とする、前記請求項１６に記載の免疫コンジュゲートの使用。

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