JP7520367B2 - 化学合成独立栄養微生物を用いた豊富な細胞培養培地の製造方法 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は平成３０年６月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／６８６，５０８号の利益を主張する、令和１年６月１７日に出願された米国特許出願第１６／４４３，６５８号の利益を主張し、平成２９年７月３日に出願された米国特許出願第１５／６４１，１１４号の一部継続出願であり、その３つすべてが参照により本明細書に組み込まれる。

発明の分野
本発明は一般に、微生物発酵及び工業的バイオテクノロジーの分野に関し、より詳細には、従属栄養生物の培養のための栄養豊富な増殖培地の製造に関する。

細胞培養は、細胞を液体中で、又は寒天などの固体もしくは半固体基質上で成長させ、増殖させ、維持する方法である。細胞培養の実施において、細胞が培養される液体又は物質は培地と呼ばれる。すべての従属栄養細胞、すなわち独立栄養細胞以外のすべての細胞は何らかの形態の化学エネルギー及び炭素を含む培地を必要とし、これらは、ギ酸塩、酢酸塩、及びメタノールなどの小分子、又は糖及びデンプンなどのより複雑でより大きな分子、及び場合によってはタンパク質などの非常に複雑で大きな化学物質によって提供され得る。

細胞培養培地は、無機塩、糖、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、多糖、ホルモン、成長因子、ならびにウシ血清、トリプトン及び酵母抽出物などの複合成分を含む、様々な成分を含む多くの異なる組成物を有することができる。水とミネラル塩のみを含む培地組成物は「最小培地」と呼ばれ、化学エネルギーと炭素の何らかの形態を欠くため、本質的に従属栄養細胞にとっては最小培地は不十分である。最小培地は有機化合物を含まない。糖、酵母エキス、酵素的に消化されたタンパク質及びその他のエネルギー源及び複合化合物のような有機化合物を含有する培地は「リッチ培地」又は「複合培地」と呼ばれ、複合培地又はリッチ培地は微生物が増殖するために必要とされるすべてのエネルギー、炭素及びその他の因子を本質的に含有する培地である。タンパク質は、脊椎動物、軟体動物、節足動物などの多細胞生物の細胞株を培養する際に特に重要である。

以下のさらなる定義が本明細書に適用される：

「従属栄養」とは、「代謝合成のために窒素及び炭素（酵母、植物又は動物物質から得られるものなど）の複雑な有機化合物を必要とすること」を意味すると定義される。

「独立栄養性」とは、「炭素源として二酸化炭素又は炭酸塩（Ｃ_１化合物）のみを必要とし、有機分子（グルコースなど）の代謝的合成に単純な無機窒素化合物を必要とする」ことを意味する。

「化学合成独立栄養性」とは、「独立栄養性であり、エネルギー源としての無機化合物を酸化すること」と定義されており、水素酸化細菌の場合、エネルギー源としての無機化合物にはＨ_２が含まれ、ＣＯ_２、Ｈ_２、Ｏ_２の組み合わせを消費することができる。たとえば、炭素にはＣＯ_２を、エネルギーにはＨ_２を消費する嫌気性アセトゲンがある。化学合成独立栄養生物の他の無機エネルギー源としては、還元型小分子、例えば、Ｈ_２Ｓ、アンモニウム、又は第一鉄が挙げられる。ある場合には、化学合成独立栄養生物への炭素と
エネルギーの入力は、単一のＣ_１分子に結合される。たとえば、カルボキシドトロフ（ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｏｒｏｐｈｓ：一酸化炭素資化性）とカルボキシド食性（ｃａｒｂｏｘｙｄｏｖｏｒｅｓ）は炭素とエネルギーの両方でＣＯ（一酸化炭素）を消費し、メタノトローフ（ｍｅｔｈａｎｏｔｏｒｏｐｈｓ）はＯ_２（酸素分子）や他の酸素供与性化合物とともにＣＨ_４（メタン）を消費する。化学合成独立栄養的代謝は細菌や古細菌で知られており、未発見の形質として、あるいは遺伝子組み換えによって与えられる能力として、他の生物にも存在することがある。化学合成独立栄養生物の例は、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ、Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｎｉｔｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｔｈｅｒｍｕｓ、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｖｉｂｒｉｏ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ａｌｃａｌｉｇｉｎｅｓ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、及びＴｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓのような多数の細菌属、並びにメタン生成菌を含む古細菌の多くの属に見られる。化学合成独立栄養生物の具体例としては、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｂａｓｉｌｅｎｓｉｓ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｏｐａｃｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｔｈｅｒｍｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｉｕｍ ｒｕｂｒｕｍ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｕｓ、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ、及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍが含まれる。

「発酵」とは、「酵素の作用により有機基質に化学変化を起こす代謝過程」と定義され、生化学では、酸素が存在しないときに炭水化物からエネルギーを抽出することと狭義に定義される。食品製造の関連では、微生物の活性が食品又は飲料に望ましい変化をもたらす任意のプロセスと、より広く言及される。さらにより広い意味で、本発明の目的のために、「発酵」とは、それらの増殖を最適化し、効率を最大化するために、制御されたプロセス条件下で、特殊な容器（ガラス、金属又はプラスチックで作られ、発酵器又はバイオリアクターとして知られる）中の細胞を培養するためのプロセスである。制御されたプロセス条件は、無菌性、温度、撹拌速度、ｐＨ、投入ガス組成及び流量、栄養成分、細胞密度、溶存ガス濃度、バイオマス除去速度（連続的又は半連続的収穫のため）などを含む。後者の場合、発酵は好気的又は嫌気的である。

「ガス発酵」とは、化学合成独立栄養細胞の代謝プロセスが、それらに供給されるガス入力からエネルギー及び炭素を抽出するバイオリアクター中の発酵をいう。ガス発酵は、ガス上で微生物を培養する嫌気的又は好気的プロセスを指す。これらのガス入力を培地中の単純な無機塩と組み合わせることによって、化学合成独立栄養細胞はこれらの基本的な入力をより複雑なバイオマスや他の細胞産物に変換する。ガス発酵は、使用する微生物及び発酵に利用できる原料ガスに応じて、好気性又は嫌気性のいずれかである。ガス発酵は、化学合成独立栄養発酵の中でも特に有利な形態である。なぜなら、主要なインプットは、広く利用可能で低コストのガスによって提供されるからである。

「培養」とは、「調製した栄養培地中で生物（細菌、ウイルス等）を培養する行為又は方法」、「栄養」とは、「成長を促進し、エネルギーを供給し、生命を維持する物質又は成分」、「培地」とは、「細胞又は生物、特に細菌を人工的に培養するための栄養体系」をいい、培地は、液体、半固体又は固体（例えば、寒天、ビーズ又はその他の足場）とすることができる。固体又は半固体培地は、細胞の増殖支持体を提供することができる。

典型的な従属栄養発酵において、細胞は、糖、アミノ酸、ペプチド、有機酸などの複雑な有機分子を含む培地中で増殖されることに留意されたい。従属栄養細胞は一般に「高エネルギー」型の炭素の大部分を培地から抽出し、細胞のバイオマスを増加させ、異化された炭素を二酸化炭素、酢酸炭素、又は他の単純で低価値の老廃物として放出するので、従属栄養発酵プロセス後にバイオリアクターからバイオマスを回収した後に残る培地は、一般に従属栄養生物をさらに培養するための栄養価が非常に低いので、通常「使用済み培地」と呼ばれる。従属栄養生物が高価値産物を培地中に排泄するように選択又は設計される場合でさえ、それにもかかわらず、それらはかなり高コストの培地（糖又はタンパク質のような複雑な分子を含む）上で培養されなければならず、したがって、生産プロセスの利益率を制限する。

化学合成独立栄養発酵では、細胞は同様に成長し、バイオマスを生産する。しかし、化学合成独立栄養生物の高度な同化代謝によって栄養的に価値のある産物が過剰に生成され、その一部が培地から漏出したり、培地中に排出されたりする。

「高等生命体」又は「高等生物」とは、酵母、真菌、微細藻類、植物及び動物などの真核生物を意味する。

細胞の商業的培養及び維持、特に植物、魚、軟体動物及び節足動物のような多細胞生物から単離された細胞の培養におけるかなりの費用は、増殖培地の費用である。このような培地はしばしば、水及び種々の無機塩に加えて、多くの異なるペプチド成長因子、アミノ酸、糖、酵母抽出物、動物又は植物起源のタンパク質消化物、動物起源の血清、タンパク質（例えば、トリプトン及びペプトン、又はウシ血清アルブミンのようなアルブミン）、ならびに細胞の成長に重要な他の代謝産物を含む。これらの媒体の高い製造コストの重要な部分は、動物材料、例えば血液及び他の流体及び組織から加工される材料の使用である。

例えば、基礎培地イーグル（ＢＭＥ）は、多くの異なる哺乳動物細胞の増殖を支持するために広く使用されている合成基礎培地である。ＢＭＥは、８つのＢ－ビタミン及び１０の必須アミノ酸＋シスチン、チロシン、及びグルタミンを含む。

図１は、本発明の様々な実施形態による、システムの例示的な実施形態の概略図である。 図２は、本発明の様々な実施形態による、例示的なバイオリアクターの概略図である。 図３は、本発明の様々な実施形態による方法のフローチャート表現である。 図４は、本発明の例示的な方法により製造された培地におけるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓの培養を示す実験結果のグラフである。

本発明は、従属栄養細胞を培養するのに適した栄養豊富な培地の、排ガスからの産生を記載する。本明細書に記載の方法は、産業廃棄物中の炭素を、光合成独立栄養微生物又は化学合成独立栄養微生物を、化学合成独立栄養条件下で、その炭素上で、及び最初は有機栄養素を含まない培地中でガス発酵することによって開始する食物連鎖の底部として使用する。微生物はこの炭素をより大きなバイオマスに変換するために増殖し、適切な条件下で、炭素の一部を廃棄副産物として有機栄養素に変換することもでき、これは、従属栄養細胞を食物連鎖のさらに上方で培養するのに適したものとなるように培地を濃縮することができる。

本発明の例示的な方法はバイオリアクターに最小培地を提供する工程と、化学合成独立
栄養細胞及び／又は光合成独立栄養細胞を含む接種材料をバイオリアクター中の最小培地に接種する工程と、培地中のバイオマスの細胞密度が閾値を満たすまでバイオリアクター中にガス入力を提供することによってバイオリアクター中のバイオマスを増殖させるために、接種材料を培養し、化学合成独立栄養的に培養する工程とを含み、それによって、培養中に最小培地が濃縮培地になるように富化される。様々な実施形態では、本方法が最小培地に接種する前に接種物を調製することをさらに含む。種々の方法は、最小培地を調製することをさらに含み得る。さらなる実施形態は最小培地に接種材料を接種する前に、最小培地及びバイオリアクターを滅菌することを含む。なおさらなる実施形態では、最小培地はゲルを含む。種々の実施形態において、最小培地は、細胞の増殖支持体と共にバイオリアクターに添加される。

種々の実施形態において、化学合成独立栄養細胞又は光合成独立栄養細胞は、成長因子、ホルモン、抗生物質、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ビタミン、着色剤、カロチノイド、脂肪酸、又は油を産生する。様々な実施形態では、接種材料は従属栄養細胞も含む。接種物はまた、光合成独立栄養細胞を含むことができ、これらの実施形態において、培養は、バイオリアクター内の光の非存在下で行われる。

様々な実施形態では、接種材料を培養することは、有益な分子を濃縮培地に添加することを含み、これらの実施形態のいくつかでは、有益な分子はグルコースを含む。接種材料の培養は、いくつかの態様において、豊富化された培地のｐＨを調節することを含む。場合によっては、接種材料は化学合成独立栄養細胞を含み、ガス流入はＣＨ_４とＯ_２を含む。これらの実施態様のいくつかにおいて、化学合成独立栄養細胞は、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓの細胞を含む。様々な実施形態では、ガス投入はＣＯを含み、ガス投入はＣＯ_２及びＨ_２Ｓを含み、ガス投入はＣＯ_２、Ｈ_２及びＯ_２を含む。なお他の実施形態では、接種材料は、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒの細胞、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓの細胞、又は両方の細胞を含む。接種材料は、種々の実施形態において、カルボキシドトロフ（ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｒｏｐｈｓ：一酸化炭素資化性）の細胞又はＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｏｐａｃｕｓの細胞を含むことができる。

本発明の様々な実施形態は濃縮培地中にそれらの内容物を放出するように、濃縮培地中の細胞を破壊することをさらに含む。細胞を破壊することは、場合によっては細胞を溶解することを含むことができる。様々な実施形態では、濃縮培地が成長因子、ホルモン、抗生物質、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ビタミン、着色剤、カロチノイド、脂肪酸、又は油のうちの１つ以上を含む。

様々な実施形態では、遠心分離、濾過、又は重力に基づく分離などの方法によって、濃縮媒体から不溶性バイオマスを分離することをさらに含む。これらの態様のいくつかにおいて、分離後の濃縮培地は、１リットル当たり少なくとも１グラムのＤ－グルコースを含む。いくつかの実施形態では、方法が分離後、濃縮培地に鉱物塩を添加すること、濃縮培地のｐＨを調整すること、濾過すること、濃縮培地に酵素処理を提供すること、濃縮培地にクロマトグラフィー分離を行うこと、又は濃縮培地から選択的沈殿を行うことのうちの１つ以上をさらに含む。濃縮培地から不溶性バイオマスを分離する方法において、いくつかの方法は、濃縮培地からアンモニウムイオンを除去することをさらに含む。

種々の態様において、本方法は、さらに、バイオマスから分離された濃縮培地中で従属栄養生物の細胞を培養することを含み、それによって、濃縮培地を枯渇させる。これらの方法のいくつかでは、従属栄養生物は酵母、菌類、藻類、古細菌、細菌、又は哺乳類を含む。従属栄養細胞は、さらなる態様において、多細胞水生生物の細胞系に由来する。

さらに、本発明は、本明細書中に記載される方法によって産生される種々の濃縮培地を対象とする。

本発明は、従属栄養細胞を培養するのに適した栄養豊富培地の、廃ガスからの生産を記載する。このような培地の製造には、当初は最小の培地でガス発酵を介して化学合成独立栄養的に化学合成独立栄養細胞及び／又は光合成独立栄養細胞を培養し、その後、十分な培養を行った後に、そのような培地を豊富に収穫することが含まれる。次いで、濃縮培地を酵母、真菌、微細藻類、植物及び動物のような従属栄養生物の培養に用いることができる。バイオリアクター中で培養された細胞は、化学合成独立栄養微生物又は光合成独立栄養微生物の単一種又は単一株を含んでもよく、又はそれらは複数の株又は種を含んでもよい。さらに、これらの細胞は、種々の選択された従属栄養微生物の１つ又は複数の種又は株と共培養され得、その目的は、化学合成独立栄養細胞又は光合成独立栄養細胞のみによっては産生されない培地に、さらなる所望の栄養成分（プロバイオティクスなど）を供給することである。従属栄養細胞との共培養又は共同体は、従属栄養細胞が消費するよりも最終産物に付加価値を提供するように設計することができる。いくつかの態様において、得られたバイオマスの細胞内内容物を、濃縮培地に添加することができる。

ここで、「第１の培地」とは最初の発酵のための基本的な栄養素を供給するために使用される最初の培地である。ここで使用される「第２の培地」が第１の培地の富化から得られる上清濃縮培地であり、バイオマスの全部又は大部分から分離された後に残る。したがって、化学合成独立栄養発酵の間に、細胞は増殖し、高度に同化する産物も生成する。化学合成独立栄養発酵からの富化後に残る培地は従属栄養発酵から得られる栄養的に劣る「使用済み培地」と区別するために、「第２の培地」と呼ばれる。バイオマスの大部分又は全体が除去された後に、第２の培地は従属栄養細胞の増殖を支持するのに適した多くの複合物質を含む。したがって、この第２の培地は発酵中又は発酵後に収集され、（所望であれば）任意の残存する細胞又は細胞残屑を除去するために処理され、従属栄養細胞の培養のための栄養的に有利な増殖培地又は添加剤として再使用され得る。本明細書で使用される「濃縮培地」はガス発酵が始まった後の第１の培地を指し、培養中の培地及び分離プロセス後の第２の培地の両方を広く包含する。

産業廃ガス上で培養された化学合成栄養性微生物及び光合成独立栄養性微生物は、それらの微生物が単純で一般に安価な投入物（例えば、水素、二酸化炭素、酸素、水及び無機塩）から、それらの細胞構成成分（糖、脂肪酸、カロテノイド、補因子、ビタミン、ペプチド及びタンパク質を含む）のすべてを新たに産生しなければならないので、特に豊富で有益な栄養源であり得る。この化学合成独立栄養様式の産生はまた、ビタミン及びタンパク質が例えば、糖上での従属栄養微生物の発酵によるよりも低いコストで合成され得るという利点を有する。

本発明に従って製造された第２の培地は、先行技術のリッチ培地と比較して類似又は同一の成分を含有することができ、同等の栄養価を提供することができ、したがって、様々な細胞培養用途のための動物由来及び他の高価な成分を補うか、又は完全に置き換えることができる。いくつかの場合において、これは、生産コストを低減するだけでなく、動物を殺すこと又は害することを必要としない培養培地の供給源を提供する。他の場合には培地中で利用可能な成分が公知のリッチ培地には見られない利点を提供し得、したがって、この方法の生成物はそれ自体、先行技術に対して新規である。培地は、完全に液体であってもよく、あるいは、細胞の増殖支持体として使用するために、ゲル（例えば、寒天を使用）に処方してもよく、あるいは、固体又は半固体の物質（例えば、ビーズ）を含有してもよい。

従属栄養生物のための典型的な先行技術の増殖培地は、増殖細胞が培養されるにつれて枯渇するように設計された初期組成を有することに留意することが重要である。本発明によれば、化学合成独立栄養細胞の発酵は、最小培地中で開始する。ミネラル塩及び供給原料ガスを供給する細胞の化学合成独立栄養増殖、ならびにコンソーシアムの一部として含まれ得る任意のさらなる従属栄養細胞の増殖及び化学合成独立栄養増殖からの産物の供給と組み合わされた供給原料ガスの投入は、培養が進行するにつれて、実際に豊富化された培地の栄養的な質を蓄積する。

図１は、本発明の例示的なシステム１００の概略図を示す。システム１００は、光合成独立栄養細胞及び／又は化学合成独立栄養細胞１２０を含むバイオリアクター１１０を含む。システム１００はまた、１つ以上の酸化炭素、一酸化炭素及び二酸化炭素を含む廃棄流１４０を生成する工業的供給源のような炭素源１３０を含む。炭素源１３０の例には、セメント製造設備、化石燃料を燃焼させる発電所、鉄金属製品製造（例えば、鋳造及び鍛造）、非鉄製品製造、食品製造、エタノール又は他のバイオ生産を生産する発酵プラント、バイオマスのガス化、石炭のガス化、ならびに石油精製、カーボンブラック生産、アンモニア生産、メタノール生産及びコークス製造などの化学製造が含まれる。

システム１００は、水素貯蔵タンク、水素パイプライン、水蒸気メタン改質装置、ガス化装置、又は電解システムなどの任意の分子水素源１５０をさらに備える。水素源１５０は化学合成独立栄養的に、すなわち光の不在下で成長させた化学合成独立栄養細胞又は光合成独立栄養細胞のためのエネルギー源として分子状水素を含む水素流１６０を生成する。本発明の種々の実施形態では化学合成独立栄養的に増殖されるバイオリアクター中の細胞がメタン又は一酸化炭素などの１つの廃棄流１４０から炭素及びエネルギーの両方を誘導し、これらの実施形態では水素分子源１５０は必要ではない。さらなる実施形態では、廃棄流１４０が炭素源と、ガス化装置によって生成され得るような水素源とを含む。図１はまた、システム１００の２つの産出流が、バイオリアクター１１０からの除去及び分離後に、蓄積されたバイオマス１７０及び濃縮された又は「第２の」培地１８０であることを概略的に示す。いくつかの実施形態では、バイオマス１７０はガス化され（図示せず）、産生物は第２の炭素源１３０として使用される。

図２は、本発明の方法のための適切なバイオリアクターの一例としてのバイオリアクター２００の概略図を示す。バイオリアクター２００は第１の培地に接種するための細胞の産生のための合成容器、及び濃縮培地におけるバイオマスの産生のための別個の増殖容器と併せて使用するための合成容器のいずれかを含むことができ、又はバイオリアクター２００は、合成及び増殖段階の両方に適した容器を含むことができる。図２において、バイオリアクター２００は、操作中に化学合成独立栄養細胞又は光合成独立栄養細胞及び任意に他の従属栄養細胞を含む一定量の液体培地２１０を培養物中に保持する容器２０５を含む。バイオリアクター２００はまた、培地２１０に導入するためにガス２２０を容器２０５に導入することができる流入口２１５と、新鮮な培地２３０を容器２０５に導入することができる培地注入口２２５と、培地２１０を除去して、例えば、濃縮培地を不溶性バイオマスから分離することができる培地排出口２３５とを含む。バイオリアクター２００はまた、ヘッドスペース２４０と、ヘッドスペース２４０からガスを排出するためのガス放出弁２４５とを含むことができる。いくつかの実施形態では、ガス放出弁２４５がベントされたガスを入力ポート２１５に戻すために再循環システムに取り付けられ、ガス組成を最適化するための添加を行うためのマニホールド（図示せず）を含むことができる。

種々の実施形態において、バイオリアクター２００は、連続撹拌タンクリアクター、ループバイオリアクター、又はガス発酵に適切な任意の他の設計であり得る。バイオリアクター２００は、混合のための制御された撹拌、ｐＨ、溶解ガス、及び培養密度を測定するための様々なプローブ、ならびにガス、温度調節などのための制御をさらに含むことがで
きる。発泡を制御するための薬剤をバイオリアクター２００に添加することもできる。

図３は、本発明の例示的な方法３００を示す。一部の手順はオプションとして記載されているが、オプションとして記載されていない手順は必ずしも必須ではない。方法３００は、接種材料を調製する任意の工程３０５と、最小培地を調製する任意の工程３１０とを含む。次いで、方法３００は、バイオリアクターに最小培地を添加する工程３１５と、最小培地及びバイオリアクターを滅菌する任意の工程３２０とを含む。次いで、方法３００は、ガスをバイオリアクターに供給することによって、滅菌最小培地に接種材料を接種する工程３２５、細胞密度が閾値を満たすまで発酵する工程３３０を含む。次いで、方法３００は、細胞の内容物を濃縮培地に放出する任意の工程３３５、次いで、バイオマスを第２の培地から分離する任意の工程３４０を含む。任意選択の工程３４５では、第２の培地に、第２の培地が支持するように設計されたタイプの従属栄養細胞を接種する。

工程３０５において、バイオリアクター２００のようなバイオリアクターに接種するのに十分な接種材料が調製される。この工程は、方法３００の特定の実施形態が予め作製された接種材料から開始することができる限り、任意である。接種材料は光合成独立栄養微生物又は化学合成独立栄養微生物の少なくとも１つの種の細胞を含み、ガス供給原料と共にリッチ培地又は最小培地のいずれかを使用して調製することができる。接種材料のために選択された微生物の特定の種、及びその中に含まれる任意の他の従属栄養微生物は、細菌、古細菌、微細藻類、真菌、カビ、又は酵母のような、第２の培地中で後に特定の高等生物を培養する利益のために調整された適切な第２の培地を産生するように選択される。接種材料を調製することは、化学合成独立栄養細胞、光合成独立栄養細胞、及び／又は従属栄養細胞を、同じ培地中で一緒に、又は別々の培地中の１つ以上の株で共培養することを含み得る。後者の場合、接種材料を調製することは、化学合成独立栄養細胞、光合成独立栄養細胞、及び／又は従属栄養細胞の量を異なる時点で調製すること、及びそれらの量をすべての使用の準備ができるまで保存することを含むことができる。

いくつかの実施形態において、化学的独立栄養微生物は、有益な異種性産物を産生するように遺伝子的に改変されている、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｓｔｏｒ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ、若しくはＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｏｐａｃｕｓ、又は化学的独立栄養生物のような単一の化学的独立栄養細胞株を含む。化学合成独立栄養株は、天然であっても、突然変異を含んでいても、遺伝的に改変されていても、又はＣＲＩＳＰＲを介して編集された１つ以上の遺伝子を含んでいてもよく、貴重な小分子、成長因子、ホルモン、抗生物質、アミノ酸、ペプチド、糖、多糖、タンパク質、ビタミン、着色剤、カロチノイド、脂肪酸、有機酸、核酸、油、グリコール酸、炭化水素、ポリヒドロキシアルカン酸、ファシン、遺伝子導入剤（ＧＴＡ）又は非独立栄養微生物及び他の従属栄養細胞によって成長基質及び成長調節因子として利用され得る他の生体分子を産生するためであってもよい。このように使用することができる光合成独立栄養微生物の例には、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｉｕｍ ｒｕｂｒｕｍ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｕｓ、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ、ｓｐｉｒｕｌｉｎａ及びａｎａｂａｅｎａなどのシアノバクテリアが含まれる。

生物材料の寄託
以下の微生物は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， １０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ， Ｍａｎａｓｓａｓ，
ＶＡ ２０１１０－２２０９， ＵＳＡ （ＡＴＣＣ）に寄託されている：
表１：
微生物の指定：Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ ＯＢ－２１３
ＡＴＣＣ番号：ＰＴＡ－１２０４９
寄託日：２０１１年８月２５日

この寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約及びその下の規則（ブダペスト条約）の規定に基づいて行われた。これは、寄託の日から３０年間、生存可能な培養物の維持を保証する。生物はブダペスト条約の条件の下でＡＴＣＣによって利用可能にされ、Ｏａｋｂｉｏ、Ｉｎｃ．とＡＴＣＣとの間の合意に従う。これは、関連する米国特許の発行時に、又は米国特許もしくは外国特許出願のいずれかの公開時に、培養物の子孫の永続的かつ無制限の入手可能性を保証し、３５ ＵＳＣ §１２２及びそれに従う局長の規則（８８６ ＯＧ ６３８を特に参照して３７ ＣＦＲ §１．１２を含む）に従い、米国特許商標局長によって決定されたものに対する子孫の入手可能性を保証する、Ｏａｋｂｉｏ、Ｉｎｃ．とＡＴＣＣとの間の合意に従う。

本出願の譲受人は、寄託培養物が、適切な条件下で培養されたときに、死滅又は滅失又は破壊される場合、それらは、同一培養物の生存可能な標本と通知され次第、速やかに交換されることに合意した。寄託された菌株の利用可能性は、特許法に従って政府の権限に基づいて付与された権利に違反して発明を実施するためのライセンスと解釈されるべきではない。

工程３１０では、水中にミネラル塩を含む最小培地が調製される。また、この工程は方法３００の特定の実施形態が予め作製された最小培地で始まることができる限り、任意である。化学合成独立栄養生物のための最小培地の例としては、水素栄養生物のためのＲｅｐａｓｋｅ培地及びメタノトロフのためのＮＭＳ培地が挙げられる。これらの例示的なミニマルメディアのレシピは、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）を通じて一般に入手可能である。

工程３１５において、最小培地をバイオリアクターに添加し、工程３２０において、最小培地及びバイオリアクターを滅菌する。最小培地は、例えば、熱、放射線によって、又は最小培地を無菌フィルター（例えば、０．２μｍフィルター装置）に通すことによって、滅菌され得る。工程３１５において、最小培地はゲルを含むことができる。また、工程３１５において、最小培地は、ビーズのような増殖支持体と一緒にバイオリアクターに添加され得る。

工程３２５では、バイオリアクタ内の滅菌培地に、工程３０５で調製されたような接種材料を接種する。いくつかの実施形態において、バイオリアクターに接種材料を接種することは、別々に調製された量の異なる細胞を連続的に導入することを含む。

工程３３０では、ＣＯ_２、ＣＯ、ＣＨ_４、Ｈ_２、Ｈ_２Ｓ、Ｏ_２、Ｎ_２、又はＮＨ_３のうちの１つ以上を含むガス供給原料をバイオリアクターに供給することによって、接種材料を発酵させ、バイオマスに培養する。２つ以上のガスが供給原料中に含まれる場合、いくつかのガスは、培養される細胞の種に適切な組み合わせ及び割合で供給される。具体的な例としてはＣＯ_２、Ｈ_２、及びＯ_２の混合、ＣＨ_４とＯ_２の混合、ならびにＣＯ_２とＨ_２Ｓの混合が挙げられ、バイオマスのセルが通常、リットル当たり０．５グラムのセルドライウェイト（ＣＤＷ／Ｌ）を超える、好ましくは約２グラムのＣＤＷ／Ｌを超える、しきい値密度が達成されるまで、発酵が維持される。工程３３０の間に、有益な分子は、増殖するバイオマスの細胞によって最小培地中に分泌され、濃縮培地を作製する。さらなる態様において、工程３３０の間に、さらなる有益な分子を濃縮培地に添加して、その栄養品質をさらに増加させることができる。例えば、哺乳動物細胞に適切な培養培地を作製するために、グルコースを添加して、グルコースの濃度を、迅速な増殖のための許容可能なレベルまで増加させ得る。他の場合には、鉄又は他のミネラルの添加が必要となることがあ
る。同様に、ｐＨは酸又は塩基を添加することによって調整することができ、追加の無機塩、酵母エキス、トリプトン、フェノールレッド又は他の成分を含めることができる。

任意の工程３３５において、培地は濃縮培地が細胞内アミノ酸、タンパク質、核酸、ポリヒドロキシアルカノエート、有機酸、及び高等生物の細胞を培養するために培地をより有用にする他の因子をさらに含むように、それらの内容物を放出するような様式で、濃縮培地中の細胞を殺菌、溶解、又は不活化もしくは破壊するために滅菌又は処理され得る。

工程３４０では、第２の培地を採取する。いくつかの実施形態では、これは例えば、バイオマスを除去するための遠心分離、濾過、又は重力に基づく分離などの分離プロセスによって達成される。いくつかの実施形態ではこの処理が０．２μｍフィルター膜を通した滅菌濾過を含み得、その結果、得られる液体は任意の微生物細胞を含まない。いくつかの実施形態において、工程３４０で回収された第２の培地は、無機塩の添加、ｐＨの調整、濾過、酵素処理、クロマトグラフィー分離、選択的沈殿、及び／又は他の操作によって改変されて、第２の培地を高等生物の細胞の培養により有用にすることができる。例えば、従属栄養発酵がこの成分の高濃度によって阻害される場合、洗浄工程などを用いて、第２の培地からアンモニウムイオンを選択的に除去することが有利であり得る。乳酸塩についても同様である。いくつかの実施形態では、第２の培地が元の接種物由来の化学合成独立栄養生物又は他の細胞を含む。

本明細書中に記載される化学合成独立栄養法によって産生される第２の培地は、１リットルあたり１グラムを超えるＤ－グルコース、ならびに有意量のビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ１２、ビオチン、パントテン酸塩、グルタミン酸塩、メチオニン、及びグルコース、ビタミン、アミノ酸又はタンパク質を全く含有しない第１の培地から出発するペプチドを含有する。従属栄養細菌、酵母（Ｐｈａｆｆｉａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、真菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、細菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）は、化学合成独立栄養細菌を培養することによって生産される改良されていない第２の培地で培養することができる。本発明の第２の培地はまた、高等生物のためのより複雑な培地調製物のための基礎として、又はそれに対する補足として使用され得る。

任意の工程３４５において、第２の培地に、より高い生命形態の細胞を接種する。細胞は細胞が回収されるまで、又は培養物全体が回収されるまで、又はそのいくつかの成分（例えば、組換えタンパク質）が得られる培地から単離されるまで、第２の培地中で培養される。これらの微生物には、細菌、古細菌、微細藻類、真菌、カビ、酵母又はその他が含まれ得る。そのような微生物の例には、以下が含まれる：
Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ａｍｙｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｃａｐｉｌｌｏｓｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｒｕｍｉｎｏｃｏｌａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｕｉｓ、Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｉｍａｌｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｂｌａｋｅｓｌｅａ ｔｒｉｓｐｏｒａ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒ
ｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｈｅｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｆａｒｒａｇｉｎｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｈｅｒｍａｎｉｉ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂｏｕｌａｒｄｉｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｅｍｏｒｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｉａｃｅｔｙｌａｃｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ。

例１：化学合成独立栄養細菌のガス発酵を用いた第２の培地の製造

この最初の例では、ガス発酵のために改良されたＮｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ ＢｉｏＦｌｏ ４５００ ３０Ｌ連続攪拌タンクバイオリアクターを用いてガス発酵を行った。化学合成独立栄養種としてＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ、従属栄養（プロバイオティック）種としてＢａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ 亜種 ｃａｓｅｉを用いて、化学合成独立栄養及び従属栄養種の接種材料を調製した。

接種材料を調製するために、細菌培養物を、１５ｍｌの滅菌Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ培地に接種した凍結ストックから培養し、２００ｒｐｍ及び３０℃で一晩振盪する温度制御インキュベーター中で、又は培養物が６２０ｎｍでの０．６吸光度単位（ａｕ）の吸光度に達するまで増殖させた。これらを、１リットル当たり以下を含有する化学合成独立栄養増殖培地中でさらに培養した：
１０倍溶液からのリン酸塩（ＰＯ_４） １００ｍＬ
１０倍溶液からの塩化アンモニウム（ＮＨ_４Ｃｌ） ２００ｍｌ
２０ｇ／２００ｍＬ溶液からの炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ_３） ２ｍｌ
１００ｍＭ （ＮＨ_４）_２Ｎｉ（ＳＯ_４）_２・６Ｈ_２Ｏ溶液４からのニッケル ０．１６６ｍｌ
蒸留水（ｄｉＨ_２Ｏ） ６７４ ｍｌ

培地を滅菌した後、以下の無菌の無機塩を添加した：
ＳｃｈｌｅｇｅｌＳｏｌｕｔｉｏｎ ‘Ｅ’からの微量元素 ２ｍＬ
２００ｇ／Ｌの溶液５からのＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ ０．１ ｍｌ
１００倍の溶液６からのＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ １０ ｍｌ
０．１ｇ／１００ｍＬの溶液からのＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ １２ ｍｌ

上記の成分の多くは、はるかに高濃度のストック溶液から添加された。リン酸塩１０倍のストックは、１ＬのｄｉＨ_２Ｏ中に混合したリン酸二塩基性ナトリウム（Ｎａ_２ＨＰＯ_４）無水物４０ｇ及びリン酸一塩基性カリウム（ＫＨ_２ＰＯ_４）無水物６６．７ｇから調製した。１０倍量の塩化アンモニウムストックを、１ＬのｄｉＨ_２Ｏ中に混合した１８ｇのＮＨ_４Ｃｌから調製した。炭酸水素ナトリウムストック溶液を、２００ｍＬのｄｉＨ_２Ｏ中に混合された２０ｇのＮａＨＣＯ_３から調製した。ニッケルは、１００ｍＭのＮｉＣｌ_２を１００μＬ加えてもよい。塩化カルシウムは、２００ｇのＣａＣｌ_２・Ｈ_２Ｏ；１ＬのｄｉＨ_２Ｏ；１０，０００倍濃縮ストック溶液から得ることができる。最後に、１１３．０５ｇのＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏを含む溶液から適量を加えて、硫酸マグネシウム（１００倍に濃縮されたストック溶液）を調製することができる。

バイオリアクターを～２０Ｌの培地で満たし、次いでバイオリアクターのオンボード滅菌サイクルを使用して３０分間滅菌し、室温に冷却し、次いで残りの無機塩を添加した。次いで、コンソーシアル接種物の種々の成分を、滅菌ポートを通して添加した。

超純水を供給した９ｋＷプロトンＳ４０電解槽により、バイオリアクターに水素ガスを供給した。Ｏ_２及びＣＯ_２を、ガスレギュレーターを備えた圧縮ガスボンベから供給して、約２０ｐｓｉに減圧した。ガス混合は、８０：１０：１０（Ｈ_２：ＣＯ_２：Ｏ_２）の比率に従って、３つのマスフローコントローラーのセットによって制御した。バイオリアクターへのガス流量は、発酵が進行することにつれて１～８ＳＬＰＭから増加した。バイオリアクター内のガスヘッド圧力は１０ｐｓｉであった。３０℃の温度、６．８のｐＨ、及び３００ｒｐｍのインペラー撹拌速度を維持した。

バイオリアクターを、半連続採取モードで３２日間運転した。２４時間毎に、１０Ｌの反応器内容物を無菌ポートを介して取り出し、同じ容量の無菌新鮮培地をバイオリアクターに戻した。細菌バイオマスを、遠心分離によって濃縮培地から分離し、次いで、後の使用のために凍結乾燥した。残りの上清培地のアリコートを、滅菌済みの使い捨て０．２μｍ濾過装置を通して濾過することによって滅菌し、－２０℃で凍結し、「第２の培地」を得た。

発酵の１１日目及び２３日目からの第２の培地の凍結サンプルを使用済み培地分析に供し、以下の結果を得た：

ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）は、１１日目のサンプルも０．８３ｇ／Ｌのタンパク質を含むことを示した。クーマシーブルー染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によるＳＤＳ－ＰＡＧＥによるタンパク質分子量の分析は、タンパク質の大部分が約１０ｋＤ未満の小分子量ペプチドからなることを示した（図示せず。）。

各試料からの細菌バイオマスを、遠心分離によって第２の培地から分離し、後の使用のために凍結乾燥した（収穫された各リットルについて約８ｇのＣＤＷ）。すでに細胞を含まない第２の培地を収集し、４℃で保存した。

例２：ガス発酵１１日目からの第２の培地でのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓの従属栄養培養

従属栄養Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓの凍結ストックの細胞を、例１に記載の発酵の１１日目からの３０ｍｌの無菌第２培地に１：５０比で接種した。この接種物を、２５０ｍｌのバッフル付き培養フラスコ中で、温度制御インキュベーター中で回転振盪機上で２８℃にて１００ｒｐｍで振盪した。一方のフラスコには添加物を加えず（「グルコースなし」）、他方の２つのフラスコは第１のフラスコと同じ第２の培地を含有したが、追加の０．５％（ｗ／ｖ）グルコース及び１．０％（ｗ／ｖ）グルコースをそれぞれ含有した（第２の培地中に既に存在した０．１４％のレベルを超える）。サンプルを様々な時点で取り出し、２００μＬアリコートの６２０ｎｍ（Ａ６２０）での光学密度をマイクロプレートリーダーで測定した。成長曲線を図４に示す。

図４の結果は、従属栄養細菌がグルコース補給なしの第２の培地上でそれらの密度を３
倍以上に増加させたことを示す。追加のグルコースは特に０．５％添加の後期段階で、このレベルを超えるそれらの増殖を刺激したが、１％グルコースは培養期間が長くなるにつれて効果が低くなる可能性がある。これは、第２の培地が完全培地又は有意な培地成分のいずれかとして従属栄養細胞を培養するために使用され得ることを実証する。この方法はまた、従属栄養細胞をガス上で間接的に効果的に培養することを可能にし、それによって、それらが代謝的に適していない供給原料及び培養条件を利用する。また、本発明は、元の抽出されたバイオマスを超えて、ガス発酵の生成物から付加的な価値を抽出することを可能にする。

前述の明細書において、本発明は、その特定の実施形態を参照して説明されているが、当業者は、本発明がそれに限定されないことを認識するであろう。上述の発明の様々な特徴及び態様は、個別に又は共同で使用され得る。さらに、本発明は、本明細書のより広い精神及び範囲から逸脱することなく、本明細書に記載されている環境及び用途を超える任意の数の環境及び用途において利用することができる。したがって、明細書及び図面は、限定的ではなく例示的であるとみなす。本明細書で使用される「含む」、「含む」、「有する」という用語は、特に、オープンエンドの技術用語として読まれることが意図されていることが認識されよう。

Claims (22)

1. バイオリアクターへ有機化合物を含まない培地を提供することと、
   化学合成独立栄養細胞を含む接種材料を前記バイオリアクター中の前記培地に接種することと、
   前記培地中のバイオマスの細胞密度が閾値を満たすまで、前記バイオリアクターへのガス投入を提供することによって、前記バイオリアクター中でバイオマスを増殖させるために、化学合成独立栄養的に、接種材料を培養し、それによって、培養中に前記培地が濃縮され、濃縮培地となることと、
   を含み、
   前記接種材料が従属栄養細胞も含み、
   前記ガス投入がＣＨ_４及びＯ_２を含み、
   前記化学合成独立栄養細胞がＭｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓの細胞、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒの細胞、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓの細胞、及びＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｏｐａｃｕｓの細胞を含む、前記濃縮培地を得る方法。
2. 前記化学合成独立栄養細胞が、成長因子、ホルモン、抗生物質、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ビタミン、着色剤、カロチノイド、脂肪酸、又は油を産生する、請求項１に記載の方法。
3. 前記接種材料を培養することが、有益な分子を前記濃縮培地に添加することを含む、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記有益な分子がグルコースを含む、請求項３に記載の方法。
5. 前記バイオリアクター中でバイオマスを増殖させることが、前記培地のｐＨを調節することを含む、請求項１～３又は４に記載の方法。
6. 前記接種材料が一酸化炭素資化性（カルボキシドトロフ）の細胞を含む、請求項１～４
   又は５に記載の方法。
7. 前記培地に接種する前に、前記接種材料を調製することをさらに含む、請求項１～５又は６に記載の方法。
8. 前記培地を調製することをさらに含む、請求項１～６又は７に記載の方法。
9. 前記培地に前記接種材料を接種する前に、前記培地及び前記バイオリアクターを滅菌することをさらに含む、請求項１～７又は８に記載の方法。
10. 細胞の内容物を前記濃縮培地中に放出するように、前記濃縮培地中の細胞を破壊することをさらに含む、請求項１～８又は９に記載の方法。
11. 前記細胞を破壊することが、前記細胞を溶解することを含む、請求項１０に記載の方法。
12. 前記濃縮培地が、成長因子、ホルモン、抗生物質、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ビタミン、着色剤、カロテノイド、脂肪酸、又は油の１つ以上を含む、請求項１～１０又は１１に記載の方法。
13. 不溶性バイオマスを前記濃縮培地から分離することをさらに含む、請求項１～１１又は１２に記載の方法。
14. 前記濃縮培地が、分離後、リットル当たり少なくとも１グラムのＤ－グルコースを含む、請求項１３に記載の方法。
15. 分離後、無機塩を前記濃縮培地に添加すること、前記濃縮培地のｐＨを調節すること、前記濃縮培地を濾過すること、前記濃縮培地に酵素処理を施すこと、前記濃縮培地上でクロマトグラフィーによる分離を行うこと、又は前記濃縮培地から選択的に沈殿させることのうちの１つ以上をさらに含む、請求項１３又は１４に記載の方法。
16. 前記バイオマスを前記濃縮培地から分離することが、遠心分離、濾過、又は重力に基づく分離を含む、請求項１３、１４又は１５に記載の方法。
17. 前記濃縮培地からアンモニウムイオンを除去することをさらに含む、請求項１３～１５又は１６に記載の方法。
18. 前記バイオマスから分離された前記濃縮培地中で従属栄養細胞の細胞を培養し、それによって前記濃縮培地を枯渇させることをさらに含む、請求項１３～１６又は１７に記載の方法。
19. 前記従属栄養細胞が酵母、真菌、藻類、古細菌、細菌、又は哺乳動物を含む、請求項１８に記載の方法。
20. 前記従属栄養細胞が多細胞水生生物の細胞系に由来する、請求項１８に記載の方法。
21. 前記培地がゲルを含む、請求項１～１９又は２０に記載の方法。
22. 前記培地が、前記細胞の成長支持体と共に前記バイオリアクターに添加される、請求項１～２０又は２１に記載の方法。

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