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JP7588150B2 - 観察装置および観察方法 - Google Patents

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Description

本開示は、観察装置および観察方法に関するものである。
近年、スフェロイドやオルガノイドと呼ばれる３次元の細胞組織を作製する技術が進歩している。また、これらの３次元細胞組織を創薬や再生医療などに応用する研究が進んでいる。これらの３次元細胞組織は光学的に透明な多重散乱体である。このような光学的に透明な散乱体をイメージングする技術として、これまでに多種多様な手法が提案されている。そのうち蛍光プローブを用いるイメージング技術としては、共焦点顕微鏡、多光子顕微鏡、ライトシート顕微鏡が挙げられる。一方、蛍光プローブを用いない非染色・非侵襲のイメージング技術としては、光コヒーレンス・トモグラフィ（Optical Coherence Tomography、ＯＣＴ）などが知られている。
スフェロイドやオルガノイドなどのような観察対象物については非染色・非侵襲のイメージングが望まれる場合が多いものの、これらの観察対象物のイメージングにＯＣＴが適用されたという報告例は多くない。その理由としては、ＯＣＴによるイメージングの分解能が低いこと、および、ＯＣＴによるイメージングにより得られた信号の解釈が難しいこと、が考えられる。したがって、現時点では、ゴールドスタンダードとなりうる非染色の３次元細胞組織のイメージング技術は確立されていないと言ってよい。
観察対象物の光路長を非染色・非侵襲でイメージングすることができる技術として、定量位相イメージング（Quantitative Phase Imaging、ＱＰＩ）も知られている。ＱＰＩは、観察対象物（例えば細胞）の光路長という物理的な情報を取得することができることから、生物分野で応用が進んでいる。ＱＰＩにより取得した画像を用いて、微分干渉画像や位相差顕微鏡画像などの他の種類の画像を生成することができる。ＱＰＩは、情報量が比較的多い画像を取得することができる技術であり、従来の明視野画像を用いた解析よりハイコンテントな解析にも適用することができると期待されている。また、近年の機械学習による画像認識精度の向上により非染色のイメージング技術を使ったハイコンテントな解析が盛んに研究されており、今後、多重散乱体の非染色イメージングは重要な役割を担うことが期待される。しかし、ＱＰＩは、取得される画像があくまで光路長の２次元への投影であるので、真の３次元の構造を把握できない。
また、観察対象物の光路長を非染色・非侵襲でイメージングすることができる技術として、特許文献１に記載されている光回折トモグラフィ（Optical Diffraction Tomography、ＯＤＴ）も知られている。ＯＤＴは、ＱＰＩを３次元イメージング可能な技術に発展させたものであり、観察対象物の３次元屈折率トモグラフィを実現することができる。ＯＤＴを用いて細胞観察を行うことにより、細胞核やミトコンドリアなどの細胞小器官の同定が可能になり、また、３次元的な形態変化の追跡が可能になって、ＱＰＩより更にハイコンテントな解析ができることが期待されている。
特開２０１７－２１９８２６号公報
Sungsam Kang, et al, "Imaging deep within a scattering medium using collective accumulation of single-scattered waves," NATURE PHOTONICS, Vol.9, pp.253-258 (2015).
しかしながら、従来のＯＤＴは、数個からなる細胞の観察に適用され得るものの、上記のような３次元細胞組織などの多重散乱体の観察には適用が困難である。何故なら、従来のＯＤＴでは、観察対象物で生じる多重散乱光が多い場合に、取得される画像に多重散乱光の影響が大きく現れるからである。
光の散乱とは、光が対象物と相互作用することによって光の進行方向が変えられる現象をいう。特に対象物の屈折率の空間的な不均一さが増大すると、光は対象物を通過する間に対象物と多数回相互作用するようになる。このように対象物と多数回相互作用した光は多重散乱光と呼ばれる。これに対して、対象物と一回のみ相互作用した光は単一散乱光と呼ばれる。多重散乱光は、スペックルの増大および単一散乱-多重散乱比（Single-scattering to Multi-scattering Ratio、ＳＭＲ）の悪化の原因となり、測定の障壁となることが知られている。
スペックルは、光が時間的かつ空間的にコヒーレントである場合に、多重散乱光の干渉によって空間的に強度または位相の大きな変化が引き起こされることにより生じる。スペックル発生を抑制するには、時間的または空間的にインコヒーレントである光を出力する光源を用いればよい。例えば、位相差顕微鏡などの通常の明視野顕微鏡は、ハロゲンランプや発光ダイオードなどの空間的かつ時間的にインコヒーレントな光源を用いることで、スペックルのない画像を取得している。
ＳＭＲの悪化は、単一散乱光よりも多重散乱光が支配的になって、単一散乱光が多重散乱光の中に埋もれてしまうことにより生じる。観察対象物が大きくなって観察深度が深いほど、単一散乱光の成分は指数関数的に減少する一方で、これと対照的に多重散乱光の成分が増大する。単一散乱光は、その散乱方向が対象物の構造と直接的な対応関係を持っていることから、対象物の構造の測定に用いやすい。一方で、多重散乱光は、対象物の構造との関係が複雑であり、対象物の構造の情報を抽出することが難しい。それ故、単一散乱光を利用したイメージング技術では、多重散乱光の中に単一散乱光が埋もれると（すなわち、ＳＭＲが悪化すると）測定が失敗することが知られている。
ＳＭＲ悪化の抑制は、単一散乱光および多重散乱光のうち単一散乱光を選択的に検出するゲーティングと呼ばれる技術により可能である。ゲーティングにより多重散乱光が抑制されるので、ＳＭＲ悪化の抑制と同時にスペックルの抑制も可能である。ゲーティングは、空間、時間および偏光などの自由度を用いて実現される。共焦点顕微鏡は、空間的ゲーティングの一例である。ＯＣＴは、時間的および空間的なゲーティングの一例である。
従来のＯＤＴは、多重散乱光の影響を除去していないことから、観察対象物で生じる多重散乱光が多い場合に、取得される画像においてスペックルが増大し、また、ＳＭＲが悪化する。それ故、従来のＯＤＴは、多重散乱光の発生が少ない数個からなる細胞の観察に適用され得るものの、多重散乱光の発生が多い３次元細胞組織などの多重散乱体の観察には適用が困難である。
本発明は、上記問題点を解消する為になされたものであり、観察対象物が多重散乱体である場合であっても、多重散乱光の影響が低減された３次元屈折率トモグラフィを実現することができる観察装置および観察方法を提供することを目的とする。
本発明の第１態様は観察装置である。観察装置は、(1) 複数の光照射方向それぞれに沿って観察対象物に照射されて観察対象物を経た光と参照光との干渉による基準位置の干渉強度画像を、複数の光照射方向それぞれについて取得する干渉強度画像取得部と、(2) 複数の光照射方向それぞれについて、基準位置の干渉強度画像に基づいて基準位置の複素振幅画像を生成する第１複素振幅画像生成部と、(3) 複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像に基づいて２次元位相画像を生成する２次元位相画像生成部と、を備える。
本発明の第２態様は観察方法である。観察方法は、(1) 複数の光照射方向それぞれに沿って観察対象物に照射されて観察対象物を経た光と参照光との干渉による基準位置の干渉強度画像を、複数の光照射方向それぞれについて取得する干渉強度画像取得ステップと、(2) 複数の光照射方向それぞれについて、基準位置の干渉強度画像に基づいて基準位置の複素振幅画像を生成する第１複素振幅画像生成ステップと、(3) 複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像に基づいて２次元位相画像を生成する２次元位相画像生成ステップと、を備える。
本発明の第３態様はプログラムであり、このプログラムは、上記の観察方法の各ステップをコンピュータに実行させるためのものである。本発明の第４態様は記録媒体であり、この記録媒体は、上記のプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能なものである。
本発明の各態様によれば、観察対象物が多重散乱体である場合であっても、多重散乱光の影響が低減された３次元屈折率トモグラフィを実現することができる。
図１は、観察装置１Ａの構成を示す図である。 図２は、観察装置１Ｂの構成を示す図である。 図３は、観察方法のフローチャートである。 図４（ａ）～（ｃ）は、干渉強度画像取得ステップＳ１における観察対象物Ｓへの光照射方向の走査の例を示す図である。 図５は、カーネル関数ｇを説明する図である。 図６は、２次元位相画像生成ステップＳ４の第１態様のフローチャートである。 図７は、干渉強度画像取得ステップＳ１で取得された干渉強度画像（垂直照射時）である。 図８は、第１複素振幅画像生成ステップＳ２で干渉強度画像（図７）に基づいて生成された複素振幅画像（実部、ｚ＝０）である。 図９は、第２複素振幅画像生成ステップＳ３で複素振幅画像（図８）に基づいて生成された複素振幅画像（実部、ｚ＝１０μｍ）である。 図１０は、２次元位相画像生成ステップＳ４中のステップＳ１１で複素振幅画像（図９）に基づいて生成された複素振幅総和画像（実部）である。 図１１は、２次元位相画像生成ステップＳ４中のステップＳ１２で複素振幅総和画像（図１０）に基づいて生成された２次元位相画像である。 図１２は、屈折率分布算出ステップＳ６で得られた３次元屈折率分布の或るｚ位置での画像である。 図１３は、２次元位相画像生成ステップＳ４の第２態様のフローチャートである。 図１４は、干渉強度画像取得ステップＳ１で取得された干渉強度画像（垂直照射時）である。 図１５は、第１複素振幅画像生成ステップＳ２で干渉強度画像（図１４）に基づいて生成された複素振幅画像（実部、ｚ＝０）である。 図１６は、第２複素振幅画像生成ステップＳ３で複素振幅画像（図１５）に基づいて生成された複素振幅画像（実部、ｚ＝２０μｍ）である。 図１７は、２次元位相画像生成ステップＳ４中のステップＳ２１で複素振幅画像（図１６）に基づいて生成された複素微分干渉画像（上下方向シアー及び左右方向シアーそれぞれについて実部および虚部）である。 図１８は、２次元位相画像生成ステップＳ４中のステップＳ２１で生成された複素微分干渉画像（図１７）の総和を表す画像（上下方向シアー及び左右方向シアーそれぞれについて実部および虚部）である。 図１９は、２次元位相画像生成ステップＳ４中のステップＳ２２で複素微分干渉画像の総和を表す画像（図１８）に基づいて生成された位相微分画像（上下方向シアー及び左右方向シアー）である。 図２０は、２次元位相画像生成ステップＳ４中のステップＳ２３で位相微分画像（図１９）に基づいて生成された２次元位相画像である。 図２１は、屈折率分布算出ステップＳ６で得られた３次元屈折率分布の或るｚ位置での画像である。 図２２は、２次元位相画像生成ステップＳ４の第３態様のフローチャートである。 図２３は、干渉強度画像取得ステップＳ１で取得された干渉強度画像（垂直照射時）である。 図２４は、第１複素振幅画像生成ステップＳ２で干渉強度画像（図２３）に基づいて生成された複素振幅画像（実部、ｚ＝０）である。 図２５は、第２複素振幅画像生成ステップＳ３で複素振幅画像（図２４）に基づいて生成された複素振幅画像（実部、ｚ＝２０μｍ）である。 図２６は、２次元位相画像生成ステップＳ４中のステップＳ３１で複素振幅画像（図２５）に基づいて生成された複素振幅総和画像である。 図２７は、２次元位相画像生成ステップＳ４中のステップＳ３４で生成された２次元位相画像である。 図２８は、屈折率分布算出ステップＳ６で得られた３次元屈折率分布の或るｚ位置での画像である。 図２９は、カーネル関数を説明する図である。 図３０は、観察装置１Ｃの構成を示す図である。 図３１（ａ），（ｂ）は、干渉強度画像取得ステップＳ１における観察対象物Ｓへの光照射方向の走査の例を示す図である。 図３２（ａ）～（ｃ）は、干渉強度画像取得ステップＳ１における観察対象物Ｓへの光照射方向の走査の例を示す図である。
以下、添付図面を参照して、本発明を実施するための形態を詳細に説明する。なお、図面の説明において同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省略する。本発明は、これらの例示に限定されるものではなく、特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。
図１は、観察装置１Ａの構成を示す図である。この観察装置１Ａは、光源１１、レンズ１２、レンズ２１、ミラー２２、レンズ２３、コンデンサレンズ２４、対物レンズ２５、ビームスプリッタ４１、レンズ４２、撮像部４３および解析部５０などを備える。
光源１１は、空間的・時間的にコヒーレントな光を出力するものであり、好適にはレーザ光源である。レンズ１２は、光源１１と光学的に接続されており、光源１１から出力された光を光ファイバ１４の光入射端１３に集光して、その光を光入射端１３に入射させる。光ファイバ１４は、レンズ１２により光入射端１３に入射された光をファイバカプラ１５へ導光する。ファイバカプラ１５は、光ファイバ１４と光ファイバ１６，１７との間で光を結合するものであり、光ファイバ１４により導光されて到達した光を２分岐して、一方の分岐光を光ファイバ１６により導光させ、他方の分岐光を光ファイバ１７によりさせる。光ファイバ１６により導光された光は光出射端１８から発散光として出射される。光ファイバ１７により導光された光は光出射端１９から発散光として出射される。
レンズ２１は、光出射端１８と光学的に接続されており、光出射端１８から発散光として出力された光をコリメートする。ミラー２２は、レンズ２１と光学的に接続されており、レンズ２１から到達した光をレンズ２３へ反射させる。ミラー２２の反射面の方位は可変である。レンズ２３は、ミラー２２と光学的に接続されている。コンデンサレンズ２４は、レンズ２３と光学的に接続されている。レンズ２３およびコンデンサレンズ２４は、好適には４ｆ光学系を構成している。レンズ２３およびコンデンサレンズ２４は、ミラー２２の反射面の方位に応じた光照射方向から観察対象物Ｓに対して光を照射する。対物レンズ２５は、コンデンサレンズ２４と光学的に接続されている。対物レンズ２５とコンデンサレンズ２４との間に観察対象物Ｓが配置される。対物レンズ２５は、コンデンサレンズ２４から出力されて観察対象物Ｓを経た光（物体光）を入力し、その光をビームスプリッタ４１へ出力する。
ビームスプリッタ４１は、対物レンズ２５と光学的に接続され、また、光出射端１９とも光学的に接続されている。ビームスプリッタ４１は、対物レンズ２５から出力されて到達した光（物体光）と、光出射端１９から出力されて到達した光（参照光）とを合波して、両光をレンズ４２へ出力する。レンズ４２は、ビームスプリッタ４１と光学的に接続されており、ビームスプリッタ４１から到達した物体光および参照光それぞれをコリメートして撮像部４３へ出力する。撮像部４３は、レンズ４２と光学的に接続されており、レンズ４２から到達した物体光と参照光との干渉による干渉縞像（干渉強度画像）を撮像する。撮像部４３の撮像面への物体光の入射方向に対して参照光の入射方向は傾斜している。ビームスプリッタ４１により物体光と参照光とが合波される位置は、結像レンズより後段であってもよいが、収差の影響を考慮すると、図に示されるように対物レンズ２５とレンズ４２との間であるのが望ましい。
解析部５０は、撮像部４３と電気的に接続されており、撮像部４３により撮像された干渉強度画像を入力する。解析部５０は、その入力した干渉強度画像を処理することにより、観察対象物Ｓの３次元屈折率分布を算出する。解析部５０は、コンピュータであってよい。解析部５０は、干渉強度画像取得部５１、第１複素振幅画像生成部５２、第２複素振幅画像生成部５３、２次元位相画像生成部５４、３次元位相画像生成部５５、屈折率分布算出部５６、表示部５７および記憶部５８を備える。
干渉強度画像取得部５１は、ミラー２２の反射面の方位を変化させることにより、観察対象物Ｓに対して複数の光照射方向それぞれに沿って光を照射させる。また、干渉強度画像取得部５１は、複数の光照射方向それぞれについて基準位置における干渉強度画像を撮像部４３から取得する。干渉強度画像取得部５１は、ＣＰＵを含み、ミラー２２の反射面の方位を変化させる為の制御信号を出力する出力ポートを有し、また、撮像部４３から干渉強度画像を入力する入力ポートを有する。対物レンズ２５を光軸方向に移動させる必要はない。基準位置は、撮像部４３の撮像面に対して共役関係にある像面位置である。
第１複素振幅画像生成部５２、第２複素振幅画像生成部５３、２次元位相画像生成部５４、３次元位相画像生成部５５および屈折率分布算出部５６は、干渉強度画像に基づいて処理を行うものであり、ＣＰＵ、ＤＳＰまたはＦＰＧＡ等の処理装置を含む。表示部５７は、処理すべき画像、処理途中の画像および処理後の画像などを表示するものであり、例えば液晶ディスプレイを含む。記憶部５８は、各種の画像のデータを記憶するものであり、ハードディスクドライブ、フラッシュメモリ、ＲＡＭおよびＲＯＭ等を含む。第１複素振幅画像生成部５２、第２複素振幅画像生成部５３、２次元位相画像生成部５４、３次元位相画像生成部５５、屈折率分布算出部５６および記憶部５８は、クラウドコンピューティングによって構成されてもよい。
記憶部５８は、干渉強度画像取得部５１、第１複素振幅画像生成部５２、第２複素振幅画像生成部５３、２次元位相画像生成部５４、３次元位相画像生成部５５および屈折率分布算出部５６に各処理を実行させるためのプログラムをも記憶する。このプログラムは、観察装置１Ａの製造時または出荷時に記憶部５８に記憶されていてもよいし、出荷後に通信回線を経由して取得されたものが記憶部５８に記憶されてもよいし、コンピュータ読み取り可能な記録媒体２に記録されていたものが記憶部５８に記憶されてもよい。記録媒体２は、フレキシブルディスク、ＣＤ-ＲＯＭ、ＤＶＤ-ＲＯＭ、ＢＤ-ＲＯＭ、ＵＳＢメモリなど任意である。
干渉強度画像取得部５１、第１複素振幅画像生成部５２、第２複素振幅画像生成部５３、２次元位相画像生成部５４、３次元位相画像生成部５５および屈折率分布算出部５６それぞれの処理の詳細については後述する。
図２は、観察装置１Ｂの構成を示す図である。この図２に示される観察装置１Ｂは、図１に示された観察装置１Ａの構成に加えて、レンズ３１、ミラー３２およびレンズ３４などを備える。
レンズ３１は、光出射端１９と光学的に接続されており、光出射端１９から発散光として出力された光（参照光）をコリメートする。ミラー３２は、レンズ３１と光学的に接続されており、レンズ３１から到達した光をレンズ３４へ反射させる。レンズ３４は、ミラー３２と光学的に接続されており、ミラー３２から到達した光をビームスプリッタ４１へ出力する。レンズ３４から出力された光は、ビームスプリッタ４１の手前で一旦集光された後、発散光としてビームスプリッタ４１に入力される。ビームスプリッタ４１は、対物レンズ２５から出力されて到達した光（物体光）と、レンズ３４から出力されて到達した光（参照光）とを合波して、両光を同軸にしてレンズ４２へ出力する。撮像部４３は、レンズ４２から到達した物体光と参照光との干渉による干渉縞像（干渉強度画像）を撮像する。撮像部４３の撮像面への物体光の入射方向に対して参照光の入射方向は平行である。
駆動部３３は、ミラー３２の反射面に垂直な方向にミラー３２を移動させる。駆動部３３は例えばピエゾアクチュエータである。このミラー３２の移動により、ファイバカプラ１５における光分岐からビームスプリッタ４１における合波に至るまでの物体光および参照光それぞれの光路長の差（位相差）を変化させる。この光路長差が異なると、撮像部４３により撮像される干渉強度画像も異なる。
図３は、観察方法のフローチャートである。この観察方法は、観察装置１Ａ（図１）および観察装置１Ｂ（図２）の何れを用いた場合においても可能なものである。この観察方法は、干渉強度画像取得ステップＳ１、第１複素振幅画像生成ステップＳ２、第２複素振幅画像生成ステップＳ３、２次元位相画像生成ステップＳ４、３次元位相画像生成ステップＳ５および屈折率分布算出ステップＳ６を備える。
干渉強度画像取得ステップＳ１の処理は干渉強度画像取得部５１により行われる。第１複素振幅画像生成ステップＳ２の処理は第１複素振幅画像生成部５２により行われる。第２複素振幅画像生成ステップＳ３の処理は第２複素振幅画像生成部５３により行われる。２次元位相画像生成ステップＳ４の処理は２次元位相画像生成部５４により行われる。３次元位相画像生成ステップＳ５の処理は３次元位相画像生成部５５により行われる。屈折率分布算出ステップＳ６の処理は屈折率分布算出部５６により行われる。
干渉強度画像取得ステップＳ１において、干渉強度画像取得部５１は、ミラー２２の反射面の方位を変化させることにより、観察対象物Ｓに対して複数の光照射方向それぞれに沿って光を照射させる。そして、干渉強度画像取得部５１は、複数の光照射方向それぞれについて基準位置における干渉強度画像を撮像部４３から取得する。
図１中および図２中に説明の便宜のためにｘｙｚ直交座標系が示されている。ｚ軸は対物レンズ２５の光軸に対し平行である。基準位置は、撮像部４３の撮像面に対して共役関係にある像面位置である。この位置をｚ＝０とする。観察対象物Ｓへの光照射方向は、その照射光の波数ベクトル（ｋｘ，ｋｙ，ｋｚ）のうちのｋｘ及びｋｙにより表すことができる。
図４（ａ）～（ｃ）は、干渉強度画像取得ステップＳ１における観察対象物Ｓへの光照射方向の走査の例を示す図である。この図では、横軸をｋｘとし縦軸をｋｙとしたｋｘｋｙ平面において各々の丸印の位置が光照射方向を表している。光照射方向の走査は、図４（ａ）に示されるようにｋｘｋｙ平面において矩形格子状に配置されるようなものであってもよいし、図４（ｂ）に示されるようにｋｘｋｙ平面において同心の複数の円それぞれの周上に配置されるようなものであってもよいし、また、図４（ｃ）に示されるようにｋｘｋｙ平面において螺旋状に配置されるようなものであってもよい。何れの場合にも、コンデンサレンズ２４のＮＡの許す限りで光照射方向の走査が可能である。ラスタスキャンおよびランダムスキャンの何れであってもよい。ラスタスキャンの場合には、戻りスキャンが有ってもよいし無くてもよい。
第１複素振幅画像生成ステップＳ２において、第１複素振幅画像生成部５２は、複数の光照射方向それぞれについて、干渉強度画像取得部５１により取得された基準位置の干渉強度画像に基づいて、基準位置の複素振幅画像を生成する。観察装置１Ａ（図１）の場合には、第１複素振幅画像生成部５２は、フーリエ縞解析法により、１枚の干渉強度画像に基づいて複素振幅画像を生成することができる。観察装置１Ｂ（図２）の場合には、第１複素振幅画像生成部５２は、位相シフト法により、物体光と参照光との間の光路長差（位相差）が互いに異なる３枚以上の干渉強度画像に基づいて複素振幅画像を生成することができる。
第２複素振幅画像生成ステップＳ３において、第２複素振幅画像生成部５３は、複数の光照射方向それぞれについて、第１複素振幅画像生成部５２により生成された基準位置（ｚ＝０）の複素振幅画像に基づいて、複数のｚ方向位置それぞれの複素振幅画像を生成する。基準位置の複素振幅画像ｕ（ｘ，ｙ，０）の２次元フーリエ変換をＵ（ｋｘ，ｋｙ，０）とすると、ｚ＝ｄの位置の複素振幅画像ｕ（ｘ，ｙ，ｄ）、および、この複素振幅画像ｕ（ｘ，ｙ，ｄ）の２次元フーリエ変換Ｕ（ｋｘ，ｋｙ，ｄ）は、下記式で表される。ｉは虚数単位であり、ｋ０は観察対象物中における光の波数である。
Figure 0007588150000001
Figure 0007588150000002
２次元位相画像生成ステップＳ４において、２次元位相画像生成部５４は、複数の位置それぞれについて、第２複素振幅画像生成部５３により生成された複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像に基づいて２次元位相画像を生成する。ここで生成される２次元位相画像は、フォーカスを合わせたｚ方向位置を中心とする位相画像に相当する。２次元位相画像生成ステップＳ４の詳細については後述する。
なお、第２複素振幅画像生成ステップＳ３において複数の光照射方向それぞれについて複数の位置それぞれの複素振幅画像を全て生成した後に、２次元位相画像生成ステップＳ４以降の処理を行ってもよい。また、第２複素振幅画像生成ステップＳ３において複数の光照射方向それぞれについて或る１つのｚ方向位置の複素振幅画像を生成し、該位置の２次元位相画像を２次元位相画像生成ステップＳ４において生成する処理を単位として、ｚ方向位置を走査しながら当該単位処理を繰り返し行ってもよい。後者の場合には、記憶部５８が記憶しておくべき画像データの容量を小さくすることができる点で好ましい。
３次元位相画像生成ステップＳ５において、３次元位相画像生成部５５は、２次元位相画像生成部５４により生成された複数の位置それぞれの２次元位相画像に基づいて３次元位相画像を生成する。ここで生成される３次元位相画像は、２次元位相画像中での位置ｘ，ｙおよび該２次元位相画像の位置ｚを変数とする画像である。
屈折率分布算出ステップＳ６において、屈折率分布算出部５６は、３次元位相画像生成部５５により生成された３次元位相画像に基づいて、デコンボリューションにより観察対象物の３次元屈折率分布を求める。観察対象物の屈折率分布をｎ（ｘ，ｙ，ｚ）とし、電気感受率分布をｆ（ｘ，ｙ，ｚ）とし、背景の媒質の屈折率をｎｍとすると、両者の間には下記（３）式の関係がある。３次元位相画像生成部５５により生成された３次元位相画像Φ（ｘ，ｙ，ｚ）は、下記（４）式のとおり、カーネル関数ｇ（ｘ，ｙ，ｚ）と電気感受率分布ｆ（ｘ，ｙ，ｚ）とのコンボリューションで表される。したがって、観察対象物の３次元屈折率分布ｎ（ｘ，ｙ，ｚ）は、３次元位相画像Φ（ｘ，ｙ，ｚ）に基づいてデコンボリューションにより求めることができる。
Figure 0007588150000003
Figure 0007588150000004
なお、カーネル関数ｇは、波動方程式の解に対応するグリーン関数に基づくものである。図５は、カーネル関数ｇを説明する図である。この図において、カーネル関数ｇの値が最も大きい中心位置が原点であり、縦方向がｚ軸であり、横方向がｚ軸に垂直な方向である。
次に、２次元位相画像生成ステップＳ４の詳細について説明する。２次元位相画像生成ステップＳ４において、２次元位相画像生成部５４は、複数の位置それぞれについて、第２複素振幅画像生成部５３により生成された複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像に基づいて２次元位相画像を生成する。２次元位相画像生成ステップＳ４は、以下に説明する３つの態様が可能である。
図６は、２次元位相画像生成ステップＳ４の第１態様のフローチャートである。この第１態様では、２次元位相画像生成ステップＳ４は、複数の位置それぞれについて、ステップＳ１１において、複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像の位相を光照射方向に基づいて補正した後、これら補正後の複素振幅画像の総和を表す複素振幅総和画像を生成し、ステップＳ１２において、この複素振幅総和画像に基づいて２次元位相画像を生成する。
ステップＳ１１の処理は、非特許文献１に記載されているＣＡＳＳ（Collective Accumulation of Single Scattering）技術によるものである。或る光照射方向に沿って対象物に照射されて該対象物を経た光のうち、対象物と一回のみ相互作用した単一散乱光の空間周波数分布は光照射方向に応じてシフトしているのに対して、対象物と複数回相互作用した多重散乱光の空間周波数分布は光照射方向によってランダムに変化する。ＣＡＳＳ技術は、このような単一散乱光および多重散乱光それぞれの空間周波数分布の光照射方向依存性の相違を利用する。
すなわち、ステップＳ１１では、複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像の位相を光照射方向に基づいて補正する（つまり、空間周波数領域において複素振幅画像の空間周波数分布を光照射方向に応じて平行移動する）ことにより、複素振幅画像のうちの単一散乱光成分の空間周波数分布を光照射方向に依存しない形状および配置とし、その一方で、複素振幅画像のうちの多重散乱光成分の空間周波数分布をランダムな形状および配置とする。そして、ステップＳ１１では、これら補正後の複数の複素振幅画像の総和を表す複素振幅総和画像を生成する（つまり、合成開口処理をする）ことにより、複素振幅画像のうちの単一散乱光成分をコヒーレントに足し合わせ、その一方で、複素振幅画像のうちの多重散乱光成分を互いに相殺させる。
したがって、ステップＳ１１で生成される複素振幅総和画像は、多重散乱光の影響が低減されたものとなる。そして、最終的に屈折率分布算出ステップＳ６で得られる３次元屈折率分布も、多重散乱光の影響が低減されて、スペックルが抑制されＳＭＲが改善されたものとなる。
図７～図１２は、２次元位相画像生成ステップＳ４の第１態様の場合に各ステップで得られた画像の例を示す図である。これらの画像は、観察装置１Ａ（図１）を用いたフーリエ縞解析法に基づくものである。図７は、干渉強度画像取得ステップＳ１で取得された干渉強度画像（垂直照射時）である。図８は、第１複素振幅画像生成ステップＳ２で干渉強度画像（図７）に基づいて生成された複素振幅画像（実部、ｚ＝０）である。図９は、第２複素振幅画像生成ステップＳ３で複素振幅画像（図８）に基づいて生成された複素振幅画像（実部、ｚ＝１０μｍ）である。
図１０は、２次元位相画像生成ステップＳ４中のステップＳ１１で複素振幅画像（図９）に基づいて生成された複素振幅総和画像（実部）である。図１１は、２次元位相画像生成ステップＳ４中のステップＳ１２で複素振幅総和画像（図１０）に基づいて生成された２次元位相画像である。図１２は、屈折率分布算出ステップＳ６で得られた３次元屈折率分布の或るｚ位置での画像である。このように、得られた３次元屈折率分布は、多重散乱光の影響が低減されて、スペックルが抑制されＳＭＲが改善されている。
図１３は、２次元位相画像生成ステップＳ４の第２態様のフローチャートである。この第２態様では、２次元位相画像生成ステップＳ４は、複数の位置それぞれについて、ステップＳ２１において、複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像に基づいて複数の光照射方向それぞれの複素微分干渉画像を生成し、ステップＳ２２において、複数の光照射方向それぞれの複素微分干渉画像の総和に基づいて位相微分画像を生成し、ステップＳ２３において、位相微分画像に基づいて２次元位相画像を生成する。
ｚ＝ｄの位置の複素振幅画像をｕ（ｘ，ｙ，ｄ）とすると、ステップＳ２１で生成される複素微分干渉画像ｑ（ｘ，ｙ，ｄ）は下記（５）式で表される。δｘおよびδｙのうち少なくとも一方は非０である。δｘ≠０，δｙ＝０であれば、ｘ方向をシアー方向とする複素微分干渉画像ｑが得られる。δｘ＝０，δｙ≠０であれば、ｙ方向をシアー方向とする複素微分干渉画像ｑが得られる。δｘ≠０，δｙ≠０であれば、ｘ方向およびｙ方向の何れとも異なる方向をシアー方向とする複素微分干渉画像ｑが得られる。
Figure 0007588150000005
複数の光照射方向それぞれの複素微分干渉画像qの総和をｑsum（ｘ，ｙ，ｄ）とすると、ステップＳ２２で生成される位相微分画像φ（ｘ，ｙ，ｚ）は、ｑsum（ｘ，ｙ，ｄ）の位相として下記（６）式で表される。ステップＳ２３では、この位相微分画像φ（ｘ，ｙ，ｚ）を積分またはデコンボリューションすることにより、２次元位相画像を生成することができる。
Figure 0007588150000006
なお、ステップＳ２１において、複素振幅画像上の互いに異なる複数のシアー方向それぞれについて複素微分干渉画像を生成してもよい。この場合、２次元位相画像生成ステップＳ４は、複数の位置それぞれについて、ステップＳ２１において、複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像に基づいて該画像上の互いに異なる複数のシアー方向それぞれについて複数の光照射方向それぞれの複素微分干渉画像を生成し、ステップＳ２２において、複数のシアー方向それぞれについて、複数の光照射方向それぞれの複素微分干渉画像の総和に基づいて位相微分画像を生成し、ステップＳ２３において、複数のシアー方向それぞれの位相微分画像に基づいて２次元位相画像を生成する。
ステップＳ２２で複数の光照射方向それぞれの複素微分干渉画像の総和に基づいて生成される位相微分画像は、多重散乱光の影響が低減されたものとなる。そして、最終的に屈折率分布算出ステップＳ６で得られる３次元屈折率分布も、多重散乱光の影響が低減されて、スペックルが抑制されたものとなる。また、ステップＳ２１において複素振幅画像上の互いに異なる複数のシアー方向それぞれについて複素微分干渉画像を生成する場合には、ステップＳ２３で得られる２次元位相画像にライン状のノイズが現れるのを抑制することができる。
図１４～図２１は、２次元位相画像生成ステップＳ４の第２態様の場合に各ステップで得られた画像の例を示す図である。これらの画像は、観察装置１Ａ（図１）を用いたフーリエ縞解析法に基づくものである。また、ステップＳ２１において、複素振幅画像上の互いに異なる２つのシアー方向（上下方向シアー及び左右方向シアー）それぞれについて複素微分干渉画像を生成した。図１４は、干渉強度画像取得ステップＳ１で取得された干渉強度画像（垂直照射時）である。図１５は、第１複素振幅画像生成ステップＳ２で干渉強度画像（図１４）に基づいて生成された複素振幅画像（実部、ｚ＝０）である。図１６は、第２複素振幅画像生成ステップＳ３で複素振幅画像（図１５）に基づいて生成された複素振幅画像（実部、ｚ＝２０μｍ）である。
図１７は、２次元位相画像生成ステップＳ４中のステップＳ２１で複素振幅画像（図１６）に基づいて生成された複素微分干渉画像（上下方向シアー及び左右方向シアーそれぞれについて実部および虚部）である。図１８は、２次元位相画像生成ステップＳ４中のステップＳ２１で生成された複素微分干渉画像（図１７）の総和を表す画像（上下方向シアー及び左右方向シアーそれぞれについて実部および虚部）である。図１９は、２次元位相画像生成ステップＳ４中のステップＳ２２で複素微分干渉画像の総和を表す画像（図１８）に基づいて生成された位相微分画像（上下方向シアー及び左右方向シアー）である。図２０は、２次元位相画像生成ステップＳ４中のステップＳ２３で位相微分画像（図１９）に基づいて生成された２次元位相画像である。図２１は、屈折率分布算出ステップＳ６で得られた３次元屈折率分布の或るｚ位置での画像である。このように、得られた３次元屈折率分布は、多重散乱光の影響が低減されて、スペックルが抑制されている。
なお、ここでは、ステップＳ２３において位相微分画像を積分またはデコンボリューションすることにより２次元位相画像を生成する場合を説明した。しかし、位相微分画像を２次元位相画像として扱うこともできる。この場合、ステップＳ２３を行うことなく、屈折率分布算出ステップＳ６のデコンボリューションにおいて、ステップＳ２３のデコンボリューションで用いたカーネルを含むカーネル（図２９）を用いることにより、ステップＳ２２で生成された位相微分画像（２次元位相画像）から観察対象物の３次元屈折率分布を求めることができる。図２９に示されるカーネルは、図５に示したカーネルとステップＳ２３のデコンボリューションで用いるカーネルとを畳み込み積分することにより得られる。
図２２は、２次元位相画像生成ステップＳ４の第３態様のフローチャートである。この第３態様では、２次元位相画像生成ステップＳ４は、複数の位置それぞれについて、ステップＳ３１において、複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像を複数のバッチに区分し、複数のバッチそれぞれについて、該バッチに含まれる複素振幅画像の位相を光照射方向に基づいて補正した後、これら補正後の複素振幅画像の総和を表す複素振幅総和画像を生成し、ステップＳ３２において、複数のバッチそれぞれの複素振幅総和画像に基づいて複数のバッチそれぞれの複素微分干渉画像を生成し、ステップＳ３３において、複数のバッチそれぞれの複素微分干渉画像の総和に基づいて位相微分画像を生成し、ステップＳ３４において、位相微分画像に基づいて２次元位相画像を生成する。
第３態様のステップＳ３１の処理は、複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像を複数のバッチに区分した上で、複数のバッチそれぞれについて第１態様のステップＳ１１の処理を行うことに相当する。第３態様のステップＳ３２，Ｓ３３の処理は、複数のバッチそれぞれについて第２態様のステップＳ２１，Ｓ２２の処理を行うことに相当する。第３態様のステップＳ３４の処理は、第２態様のステップＳ２３の処理を行うことに相当する。
なお、ステップＳ３２において、複素振幅画像上の互いに異なる複数のシアー方向それぞれについて複素微分干渉画像を生成してもよい。この場合、２次元位相画像生成ステップＳ４は、ステップＳ３２において、複数のバッチそれぞれの複素振幅総和画像に基づいて該画像上の互いに異なる複数のシアー方向それぞれについて複数のバッチそれぞれの複素微分干渉画像を生成し、ステップＳ３３において、複数のシアー方向それぞれについて、複数のバッチそれぞれの複素微分干渉画像の総和に基づいて位相微分画像を生成し、ステップＳ３４において、複数のシアー方向それぞれの位相微分画像に基づいて２次元位相画像を生成する。
第３態様におけるスペックルの抑制は、第１態様および第２態様と同程度である。第３態様におけるＳＭＲの改善は、第１態様と第２態様との中間の程度である。
図２３～図２８は、２次元位相画像生成ステップＳ４の第３態様の場合に各ステップで得られた画像の例を示す図である。これらの画像は、観察装置１Ａ（図１）を用いたフーリエ縞解析法に基づくものである。また、ステップＳ３２において、複素振幅画像上の互いに異なる２つのシアー方向（上下方向シアー及び左右方向シアー）それぞれについて複素微分干渉画像を生成した。図２３は、干渉強度画像取得ステップＳ１で取得された干渉強度画像（垂直照射時）である。図２４は、第１複素振幅画像生成ステップＳ２で干渉強度画像（図２３）に基づいて生成された複素振幅画像（実部、ｚ＝０）である。
図２５は、第２複素振幅画像生成ステップＳ３で複素振幅画像（図２４）に基づいて生成された複素振幅画像（実部、ｚ＝２０μｍ）である。図２６は、２次元位相画像生成ステップＳ４中のステップＳ３１で複素振幅画像（図２５）に基づいて生成された複素振幅総和画像である。図２７は、２次元位相画像生成ステップＳ４中のステップＳ３４で生成された２次元位相画像である。図２８は、屈折率分布算出ステップＳ６で得られた３次元屈折率分布の或るｚ位置での画像である。このように、得られた３次元屈折率分布は、多重散乱光の影響が低減されて、スペックルが抑制されＳＭＲが改善されている。
なお、ここでは、ステップＳ３４において位相微分画像を積分またはデコンボリューションすることにより２次元位相画像を生成する場合を説明した。しかし、位相微分画像を２次元位相画像として扱うこともできる。この場合、ステップＳ３４を行うことなく、屈折率分布算出ステップＳ６のデコンボリューションにおいて、ステップＳ３４のデコンボリューションで用いたカーネルを含むカーネルを用いることにより、ステップＳ３３で生成された位相微分画像（２次元位相画像）から観察対象物の３次元屈折率分布を求めることができる。
第１態様の場合に得られた３次元屈折率分布の或るｚ位置での画像（図１２）と、第２態様の場合に得られた３次元屈折率分布の或るｚ位置での画像（図２１）と、第３態様の場合に得られた３次元屈折率分布の或るｚ位置での画像（図２８）とを比較すると、スペックル抑制の効果は同程度であるものの、第２態様より第３態様の方がＳＭＲ改善の効果が大きく、第３態様より第１態様の方がＳＭＲ改善の効果が大きい。
なお、本実施形態において位相を計算するに際しては、必要に応じて位相アンラップを行うのが好ましい。
観察装置は、上記実施形態および構成例に限定されるものではなく、様々な変形が可能である。観察装置１Ａ（図１）および観察装置１Ｂ（図２）の構成では観察対象物Ｓを透過した光を物体光としたが、以下に説明する観察装置１Ｃ（図３０）の構成のように観察対象物Ｓで反射された光を物体光としてもよい。
図３０は、観察装置１Ｃの構成を示す図である。観察装置１Ｃは、光源１１、レンズ１２、レンズ２１、ミラー２２、レンズ２３、対物レンズ２５、ビームスプリッタ４１、レンズ４２、撮像部４３および解析部５０などを備える。以下では、観察装置１Ａ（図１）と相違する点について主に説明する。
レンズ２１は、光ファイバ１６の光出射端１８と光学的に接続されており、光出射端１８から発散光として出力された光をコリメートする。ミラー２２は、レンズ２１と光学的に接続されており、レンズ２１から到達した光をレンズ２３へ反射させる。ミラー２２の反射面の方位は可変である。レンズ２３は、ミラー２２と光学的に接続されている。対物レンズ２５は、レンズ２３と光学的に接続されている。レンズ２３と対物レンズ２５との間にビームスプリッタ４１が配置されている。レンズ２３および対物レンズ２５は、好適には４ｆ光学系を構成している。レンズ２３および対物レンズ２５は、ミラー２２の反射面の方位に応じた光照射方向から観察対象物Ｓに対して光を照射する。対物レンズ２５は、観察対象物Ｓで反射された光（物体光）を入力し、その光をビームスプリッタ４１へ出力する。
ビームスプリッタ４１は、対物レンズ２５と光学的に接続され、また、光ファイバ１７の光出射端１９とも光学的に接続されている。ビームスプリッタ４１は、対物レンズ２５から出力されて到達した光（物体光）と、光出射端１９から出力されて到達した光（参照光）とを合波して、両光をレンズ４２へ出力する。レンズ４２は、ビームスプリッタ４１と光学的に接続されており、ビームスプリッタ４１から到達した物体光および参照光それぞれをコリメートして撮像部４３へ出力する。撮像部４３は、レンズ４２と光学的に接続されており、レンズ４２から到達した物体光と参照光との干渉による干渉縞像（干渉強度画像）を撮像する。撮像部４３の撮像面への物体光の入射方向に対して参照光の入射方向は傾斜している。ビームスプリッタ４１により物体光と参照光とが合波される位置は、結像レンズより後段であってもよいが、収差の影響を考慮すると、図に示されるように対物レンズ２５とレンズ４２との間であるのが望ましい。
観察装置１Ｃ（図３０）の構成において、観察装置１Ｂ（図２）と同様に参照光の光路長を変化させる機構（図２中のレンズ３１、ミラー３２、駆動部３３およびレンズ３４）を設けて、ファイバカプラ１５における光分岐からビームスプリッタ４１における合波に至るまでの物体光および参照光それぞれの光路長の差（位相差）を変化させてもよい。この場合、撮像部４３の撮像面への物体光の入射方向に対して参照光の入射方向は平行であってよい。
また、第１複素振幅画像生成ステップＳ２、第２複素振幅画像生成ステップＳ３、２次元位相画像生成ステップＳ４、３次元位相画像生成ステップＳ５および屈折率分布算出ステップＳ６の各処理は、所定の数の光照射方向それぞれの干渉強度画像が干渉強度画像取得ステップＳ１において取得される度に行われてもよいし（図３１）、１つの光照射方向の干渉強度画像が干渉強度画像取得ステップＳ１において取得される度に行われてもよい（図３２）。
図３１および図３２は、干渉強度画像取得ステップＳ１における観察対象物Ｓへの光照射方向の走査の例を示す図である。これらの図では、横軸をｋｘとし縦軸をｋｙとしたｋｘｋｙ平面において各々の丸印の位置が光照射方向を表している。これらの図に示される光照射方向の走査の例では、光照射方向を順次変更していき、第(Ｎ＋ｎ)の干渉強度画像取得時の光照射方向を第ｎの干渉強度画像取得時の光照射方向と一致させている。ｎは正の整数であり、Ｎは２以上の整数である。
図３１に示される例では、第１～第Ｎの干渉強度画像が干渉強度画像取得ステップＳ１において取得されると、これら第１～第Ｎの干渉強度画像に基づいてステップＳ２～Ｓ６の各処理が行われる（図３１（ａ））。次に、第(Ｎ＋１)～第２Ｎの干渉強度画像が干渉強度画像取得ステップＳ１において取得されると、これら第(Ｎ＋１)～第２Ｎの干渉強度画像に基づいてステップＳ２～Ｓ６の各処理が行われる（図３１（ｂ））。次に、第(２Ｎ＋１)～第３Ｎの干渉強度画像が干渉強度画像取得ステップＳ１において取得されると、これら第(２Ｎ＋１)～第３Ｎの干渉強度画像に基づいてステップＳ２～Ｓ６の各処理が行われる。以降も同様である。
図３２に示される例では、第１～第Ｎの干渉強度画像が干渉強度画像取得ステップＳ１において取得されると、これら第１～第Ｎの干渉強度画像に基づいてステップＳ２～Ｓ６の各処理が行われる（図３２（ａ））。次に、第(Ｎ＋１)の干渉強度画像が干渉強度画像取得ステップＳ１において取得されると、この第(Ｎ＋１)の干渉強度画像を含む直近のＮ枚の干渉強度画像（第２～第(Ｎ＋１)の干渉強度画像）に基づいてステップＳ２～Ｓ６の各処理が行われる（図３２（ｂ））。次に、第(Ｎ＋２)の干渉強度画像が干渉強度画像取得ステップＳ１において取得されると、この第(Ｎ＋２)の干渉強度画像を含む直近のＮ枚の干渉強度画像（第３～第(Ｎ＋２)の干渉強度画像）に基づいてステップＳ２～Ｓ６の各処理が行われる（図３２（ｃ））。以降も同様にして、第(Ｎ＋ｎ)の干渉強度画像が干渉強度画像取得ステップＳ１において取得されると、この第(Ｎ＋ｎ)の干渉強度画像を含む直近のＮ枚の干渉強度画像（第(１＋ｎ)～第(Ｎ＋ｎ)の干渉強度画像）に基づいてステップＳ２～Ｓ６の各処理が行われる。
図３１に示された例と比較すると、図３２に示された例では、１つの光照射方向の干渉強度画像が干渉強度画像取得ステップＳ１において取得される度に、その干渉強度画像を含む直近の複数の干渉強度画像に基づいてステップＳ２～Ｓ６の各処理が行われるので、ステップＳ２～Ｓ６の各処理により単位時間当たりに得られる各画像の数が多い。
上記実施形態の観察装置は、(1) 複数の光照射方向それぞれに沿って観察対象物に照射されて観察対象物を経た光と参照光との干渉による基準位置の干渉強度画像を、複数の光照射方向それぞれについて取得する干渉強度画像取得部と、(2) 複数の光照射方向それぞれについて、基準位置の干渉強度画像に基づいて基準位置の複素振幅画像を生成する第１複素振幅画像生成部と、(3) 複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像に基づいて２次元位相画像を生成する２次元位相画像生成部と、を備える。
一側面において、２次元位相画像生成部は、(a) 複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像の位相を光照射方向に基づいて補正した後、これら補正後の複素振幅画像の総和を表す複素振幅総和画像を生成し、(b) 複素振幅総和画像に基づいて２次元位相画像を生成する。
他の一側面において、２次元位相画像生成部は、(a) 複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像に基づいて複数の光照射方向それぞれの複素微分干渉画像を生成し、(b) 複数の光照射方向それぞれの複素微分干渉画像に基づいて２次元位相画像を生成する。また、２次元位相画像生成部は、(a) 複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像に基づいて該画像上の互いに異なる複数のシアー方向それぞれについて複数の光照射方向それぞれの複素微分干渉画像を生成し、(b) 複数のシアー方向および複数の光照射方向それぞれの複素微分干渉画像に基づいて２次元位相画像を生成するのが好適である。
更に他の一側面において、２次元位相画像生成部は、(a) 複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像を複数のバッチに区分し、複数のバッチそれぞれについて、該バッチに含まれる複素振幅画像の位相を光照射方向に基づいて補正した後、これら補正後の複素振幅画像の総和を表す複素振幅総和画像を生成し、(b) 複数のバッチそれぞれの複素振幅総和画像に基づいて複数のバッチそれぞれの複素微分干渉画像を生成し、(c) 複数のバッチそれぞれの複素微分干渉画像に基づいて２次元位相画像を生成する。また、２次元位相画像生成部は、(a) 複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像を複数のバッチに区分し、複数のバッチそれぞれについて、該バッチに含まれる複素振幅画像の位相を光照射方向に基づいて補正した後、これら補正後の複素振幅画像の総和を表す複素振幅総和画像を生成し、(b) 複数のバッチそれぞれの複素振幅総和画像に基づいて該画像上の互いに異なる複数のシアー方向それぞれについて複数のバッチそれぞれの複素微分干渉画像を生成し、(c) 複数のシアー方向および複数のバッチそれぞれの複素微分干渉画像に基づいて２次元位相画像を生成するのが好適である。
また、一側面において、観察装置は、(4) 複数の光照射方向それぞれについて、第１複素振幅画像生成部により生成された基準位置の複素振幅画像に基づいて複数の位置それぞれの複素振幅画像を生成する第２複素振幅画像生成部と、(5) ２次元位相画像生成部により生成された複数の位置それぞれの２次元位相画像に基づいて３次元位相画像を生成する３次元位相画像生成部と、(6) ３次元位相画像に基づいて観察対象物の３次元屈折率分布を求める屈折率分布算出部と、を更に備えるのが好適である。
上記実施形態の観察方法は、(1) 複数の光照射方向それぞれに沿って観察対象物に照射されて観察対象物を経た光と参照光との干渉による基準位置の干渉強度画像を、複数の光照射方向それぞれについて取得する干渉強度画像取得ステップと、(2) 複数の光照射方向それぞれについて、基準位置の干渉強度画像に基づいて基準位置の複素振幅画像を生成する第１複素振幅画像生成ステップと、(3) 複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像に基づいて２次元位相画像を生成する２次元位相画像生成ステップと、を備える。
一側面において、２次元位相画像生成ステップでは、(a) 複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像の位相を光照射方向に基づいて補正した後、これら補正後の複素振幅画像の総和を表す複素振幅総和画像を生成し、(b) 複素振幅総和画像に基づいて２次元位相画像を生成する。
他の一側面において、２次元位相画像生成ステップでは、(a) 複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像に基づいて複数の光照射方向それぞれの複素微分干渉画像を生成し、(b) 複数の光照射方向それぞれの複素微分干渉画像に基づいて２次元位相画像を生成する。また、２次元位相画像生成ステップでは、(a) 複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像に基づいて該画像上の互いに異なる複数のシアー方向それぞれについて複数の光照射方向それぞれの複素微分干渉画像を生成し、(b) 複数のシアー方向および複数の光照射方向それぞれの複素微分干渉画像に基づいて２次元位相画像を生成するのが好適である。
更に他の一側面において、２次元位相画像生成ステップでは、(a) 複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像を複数のバッチに区分し、複数のバッチそれぞれについて、該バッチに含まれる複素振幅画像の位相を光照射方向に基づいて補正した後、これら補正後の複素振幅画像の総和を表す複素振幅総和画像を生成し、(b) 複数のバッチそれぞれの複素振幅総和画像に基づいて複数のバッチそれぞれの複素微分干渉画像を生成し、(c) 複数のバッチそれぞれの複素微分干渉画像に基づいて２次元位相画像を生成する。また、２次元位相画像生成ステップでは、(a) 複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像を複数のバッチに区分し、複数のバッチそれぞれについて、該バッチに含まれる複素振幅画像の位相を光照射方向に基づいて補正した後、これら補正後の複素振幅画像の総和を表す複素振幅総和画像を生成し、(b) 複数のバッチそれぞれの複素振幅総和画像に基づいて該画像上の互いに異なる複数のシアー方向それぞれについて複数のバッチそれぞれの複素微分干渉画像を生成し、(c) 複数のシアー方向および複数のバッチそれぞれの複素微分干渉画像に基づいて２次元位相画像を生成するのが好適である。
また、一側面において、観察方法は、(4) 複数の光照射方向それぞれについて、第１複素振幅画像生成ステップにおいて生成された基準位置の複素振幅画像に基づいて複数の位置それぞれの複素振幅画像を生成する第２複素振幅画像生成ステップと、(5) ２次元位相画像生成ステップにおいて生成された複数の位置それぞれの２次元位相画像に基づいて３次元位相画像を生成する３次元位相画像生成ステップと、(6) ３次元位相画像に基づいて観察対象物の３次元屈折率分布を求める屈折率分布算出ステップ、を更に備えるのが好適である。
上記実施形態のプログラムは、上記の観察方法の各ステップをコンピュータに実行させるためのものである。上記実施形態の記録媒体は、上記のプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能なものである。
本発明は、観察対象物が多重散乱体である場合であっても、多重散乱光の影響が低減された３次元屈折率トモグラフィを実現することができる装置および方法として利用可能である。
１Ａ，１Ｂ…観察装置、２…記録媒体、１１…光源、１２…レンズ、１３…光入射端、１４…光ファイバ、１５…ファイバカプラ、１６，１７…光ファイバ、１８，１９…光出射端、２１…レンズ、２２…ミラー、２３…レンズ、２４…コンデンサレンズ、２５…対物レンズ、３１…レンズ、３２…ミラー、３３…駆動部、３４…レンズ、４１…ビームスプリッタ、４２…レンズ、４３…撮像部、５０…解析部、５１…干渉強度画像取得部、５２…第１複素振幅画像生成部、５３…第２複素振幅画像生成部、５４…２次元位相画像生成部、５５…３次元位相画像生成部、５６…屈折率分布算出部、５７…表示部、５８…記憶部。

Claims (14)

  1. 複数の光照射方向それぞれに沿って観察対象物に照射されて前記観察対象物を経た光と参照光との干渉による基準位置の干渉強度画像を、前記複数の光照射方向それぞれについて取得する干渉強度画像取得部と、
    前記複数の光照射方向それぞれについて、前記基準位置の前記干渉強度画像に基づいて前記基準位置の複素振幅画像を生成する第１複素振幅画像生成部と、
    前記複数の光照射方向それぞれの前記複素振幅画像に基づいて２次元位相画像を生成する２次元位相画像生成部と、
    を備え、
    前記２次元位相画像生成部は、
    前記複数の光照射方向それぞれの前記複素振幅画像の位相を光照射方向に基づいて補正した後、これら補正後の複素振幅画像の総和を表す複素振幅総和画像を生成し、
    前記複素振幅総和画像に基づいて前記２次元位相画像を生成する、
    観察装置。
  2. 複数の光照射方向それぞれに沿って観察対象物に照射されて前記観察対象物を経た光と参照光との干渉による基準位置の干渉強度画像を、前記複数の光照射方向それぞれについて取得する干渉強度画像取得部と、
    前記複数の光照射方向それぞれについて、前記基準位置の前記干渉強度画像に基づいて前記基準位置の複素振幅画像を生成する第１複素振幅画像生成部と、
    前記複数の光照射方向それぞれの前記複素振幅画像に基づいて２次元位相画像を生成する２次元位相画像生成部と、
    を備え、
    前記２次元位相画像生成部は、
    前記複数の光照射方向それぞれの前記複素振幅画像に基づいて前記複数の光照射方向それぞれの複素微分干渉画像を生成し、
    前記複数の光照射方向それぞれの前記複素微分干渉画像に基づいて前記２次元位相画像を生成する、
    観察装置。
  3. 前記２次元位相画像生成部は、
    前記複数の光照射方向それぞれの前記複素振幅画像に基づいて該画像上の互いに異なる複数のシアー方向それぞれについて前記複数の光照射方向それぞれの複素微分干渉画像を生成し、
    前記複数のシアー方向および前記複数の光照射方向それぞれの前記複素微分干渉画像に基づいて前記２次元位相画像を生成する、
    請求項２に記載の観察装置。
  4. 複数の光照射方向それぞれに沿って観察対象物に照射されて前記観察対象物を経た光と参照光との干渉による基準位置の干渉強度画像を、前記複数の光照射方向それぞれについて取得する干渉強度画像取得部と、
    前記複数の光照射方向それぞれについて、前記基準位置の前記干渉強度画像に基づいて前記基準位置の複素振幅画像を生成する第１複素振幅画像生成部と、
    前記複数の光照射方向それぞれの前記複素振幅画像に基づいて２次元位相画像を生成する２次元位相画像生成部と、
    を備え、
    前記２次元位相画像生成部は、
    前記複数の光照射方向それぞれの前記複素振幅画像を複数のバッチに区分し、前記複数のバッチそれぞれについて、該バッチに含まれる前記複素振幅画像の位相を光照射方向に基づいて補正した後、これら補正後の複素振幅画像の総和を表す複素振幅総和画像を生成し、
    前記複数のバッチそれぞれの前記複素振幅総和画像に基づいて前記複数のバッチそれぞれの複素微分干渉画像を生成し、
    前記複数のバッチそれぞれの前記複素微分干渉画像に基づいて前記２次元位相画像を生成する、
    観察装置。
  5. 前記２次元位相画像生成部は、
    前記複数の光照射方向それぞれの前記複素振幅画像を複数のバッチに区分し、前記複数のバッチそれぞれについて、該バッチに含まれる前記複素振幅画像の位相を光照射方向に基づいて補正した後、これら補正後の複素振幅画像の総和を表す複素振幅総和画像を生成し、
    前記複数のバッチそれぞれの前記複素振幅総和画像に基づいて該画像上の互いに異なる複数のシアー方向それぞれについて前記複数のバッチそれぞれの複素微分干渉画像を生成し、
    前記複数のシアー方向および前記複数のバッチそれぞれの前記複素微分干渉画像に基づいて前記２次元位相画像を生成する、
    請求項４に記載の観察装置。
  6. 前記複数の光照射方向それぞれについて、前記第１複素振幅画像生成部により生成された前記基準位置の前記複素振幅画像に基づいて複数の位置それぞれの複素振幅画像を生成する第２複素振幅画像生成部と、
    前記２次元位相画像生成部により生成された前記複数の位置それぞれの前記２次元位相画像に基づいて３次元位相画像を生成する３次元位相画像生成部と、
    前記３次元位相画像に基づいて前記観察対象物の３次元屈折率分布を求める屈折率分布算出部と、
    を更に備える請求項１～５の何れか１項に記載の観察装置。
  7. 複数の光照射方向それぞれに沿って観察対象物に照射されて前記観察対象物を経た光と参照光との干渉による基準位置の干渉強度画像を、前記複数の光照射方向それぞれについて取得する干渉強度画像取得ステップと、
    前記複数の光照射方向それぞれについて、前記基準位置の前記干渉強度画像に基づいて前記基準位置の複素振幅画像を生成する第１複素振幅画像生成ステップと、
    前記複数の光照射方向それぞれの前記複素振幅画像に基づいて２次元位相画像を生成する２次元位相画像生成ステップと、
    を備え、
    前記２次元位相画像生成ステップでは、
    前記複数の光照射方向それぞれの前記複素振幅画像の位相を光照射方向に基づいて補正した後、これら補正後の複素振幅画像の総和を表す複素振幅総和画像を生成し、
    前記複素振幅総和画像に基づいて前記２次元位相画像を生成する、
    観察方法。
  8. 複数の光照射方向それぞれに沿って観察対象物に照射されて前記観察対象物を経た光と参照光との干渉による基準位置の干渉強度画像を、前記複数の光照射方向それぞれについて取得する干渉強度画像取得ステップと、
    前記複数の光照射方向それぞれについて、前記基準位置の前記干渉強度画像に基づいて前記基準位置の複素振幅画像を生成する第１複素振幅画像生成ステップと、
    前記複数の光照射方向それぞれの前記複素振幅画像に基づいて２次元位相画像を生成する２次元位相画像生成ステップと、
    を備え、
    前記２次元位相画像生成ステップでは、
    前記複数の光照射方向それぞれの前記複素振幅画像に基づいて前記複数の光照射方向それぞれの複素微分干渉画像を生成し、
    前記複数の光照射方向それぞれの前記複素微分干渉画像に基づいて前記２次元位相画像を生成する、
    観察方法。
  9. 前記２次元位相画像生成ステップでは、
    前記複数の光照射方向それぞれの前記複素振幅画像に基づいて該画像上の互いに異なる複数のシアー方向それぞれについて前記複数の光照射方向それぞれの複素微分干渉画像を生成し、
    前記複数のシアー方向および前記複数の光照射方向それぞれの前記複素微分干渉画像に基づいて前記２次元位相画像を生成する、
    請求項８に記載の観察方法。
  10. 複数の光照射方向それぞれに沿って観察対象物に照射されて前記観察対象物を経た光と参照光との干渉による基準位置の干渉強度画像を、前記複数の光照射方向それぞれについて取得する干渉強度画像取得ステップと、
    前記複数の光照射方向それぞれについて、前記基準位置の前記干渉強度画像に基づいて前記基準位置の複素振幅画像を生成する第１複素振幅画像生成ステップと、
    前記複数の光照射方向それぞれの前記複素振幅画像に基づいて２次元位相画像を生成する２次元位相画像生成ステップと、
    を備え、
    前記２次元位相画像生成ステップでは、
    前記複数の光照射方向それぞれの前記複素振幅画像を複数のバッチに区分し、前記複数のバッチそれぞれについて、該バッチに含まれる前記複素振幅画像の位相を光照射方向に基づいて補正した後、これら補正後の複素振幅画像の総和を表す複素振幅総和画像を生成し、
    前記複数のバッチそれぞれの前記複素振幅総和画像に基づいて前記複数のバッチそれぞれの複素微分干渉画像を生成し、
    前記複数のバッチそれぞれの前記複素微分干渉画像に基づいて前記２次元位相画像を生成する、
    観察方法。
  11. 前記２次元位相画像生成ステップでは、
    前記複数の光照射方向それぞれの前記複素振幅画像を複数のバッチに区分し、前記複数のバッチそれぞれについて、該バッチに含まれる前記複素振幅画像の位相を光照射方向に基づいて補正した後、これら補正後の複素振幅画像の総和を表す複素振幅総和画像を生成し、
    前記複数のバッチそれぞれの前記複素振幅総和画像に基づいて該画像上の互いに異なる複数のシアー方向それぞれについて前記複数のバッチそれぞれの複素微分干渉画像を生成し、
    前記複数のシアー方向および前記複数のバッチそれぞれの前記複素微分干渉画像に基づいて前記２次元位相画像を生成する、
    請求項１０に記載の観察方法。
  12. 前記複数の光照射方向それぞれについて、前記第１複素振幅画像生成ステップにおいて生成された前記基準位置の前記複素振幅画像に基づいて複数の位置それぞれの複素振幅画像を生成する第２複素振幅画像生成ステップと、
    前記２次元位相画像生成ステップにおいて生成された前記複数の位置それぞれの前記２次元位相画像に基づいて３次元位相画像を生成する３次元位相画像生成ステップと、
    前記３次元位相画像に基づいて前記観察対象物の３次元屈折率分布を求める屈折率分布算出ステップと、
    を更に備える請求項７～１１の何れか１項に記載の観察方法。
  13. 請求項７～１２の何れか１項に記載の観察方法の各ステップをコンピュータに実行させるためのプログラム。
  14. 請求項１３に記載のプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体。
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