JP7578245B2

JP7578245B2 - 皮膚再生および皮膚創傷の治療または改善のための竜眼肉含有混合生薬抽出物を含む局所用組成物およびその使用

Info

Publication number: JP7578245B2
Application number: JP2022555654A
Authority: JP
Inventors: ナムパク，オク
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2020-03-13
Filing date: 2021-03-10
Publication date: 2024-11-06
Anticipated expiration: 2041-03-10
Also published as: JP2023518224A; WO2021182873A1; EP4117698A4; CN115297879A; EP4117698A1; US20230103514A1

Description

本発明は、皮膚再生および皮膚創傷の治療または改善のための竜眼肉（ＬｏｎｇａｎａｅＡｒｉｌｌｕｓ）を含む混合生薬抽出物を含む局所用組成物および皮膚再生および皮膚創傷の治療または改善用途、並びにその使用に関する。

皮膚創傷は、外傷、打撲創、擦傷などにより誘発され、創傷治癒は、皮膚の完全性のために損傷した組織を修復する過程である（ＰａｚｙａｒＮ，ＹａｇｈｏｏｂｉＲ，ＲａｆｉｅｅＥ，ＭｅｈｒａｂｉａｎＡ，ＦｅｉｌｙＡ（２０１４）ＳｋｉｎＷｏｕｎｄＨｅａｌｉｎｇａｎｄＰｈｙｔｏｍｅｄｉｃｉｎｅ：ＡＲｅｖｉｅｗ．ＳｋｉｎＰｈａｒｍａｃｏｌＰｈｙｓｉｏｌ．２７：ｐｐ．３０３－３１０．）。

創傷治癒は、止血、炎症、増殖および再構築の４段階の順次かつ連続とした過程で起こる（Ｄｅｍｉｄｏｖａ－ＲｉｃｅＴＮ，ＨａｍｂｌｉｎＭＲ，ＨｅｒｍａｎＩＭ（２０１２）ＡｃｕｔｅａｎｄＩｍｐａｉｒｅｄＷｏｕｎｄＨｅａｌｉｎｇ：ＰａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙａｎｄＣｕｒｒｅｎｔＭｅｔｈｏｄｓｆｏｒＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙ，Ｐａｒｔ１：ＮｏｒｍａｌａｎｄＣｈｒｏｎｉｃＷｏｕｎｄｓ：Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃａｕｓｅｓ，ａｎｄＡｐｐｒｏａｃｈｅｓｔｏＣａｒｅ．ＡｄｖａｎｃｅｓｉｎＳｋｉｎ＆ＷｏｕｎｄＣａｒｅ．２５：３０４－３１４）。

この過程は、多様な細胞、タンパク質、サイトカイン間の効率的な相互作用により非常に複雑であるが、精巧しており、慢性創傷が形成されるのはさまざまな原因によって創傷治癒過程が正しく行われないときである。

例えば、慢性創傷は、炎症段階で停滞し、過剰な炎症反応を引き起こし、プロ炎症性サイトカインおよびＭＭＰの異常な増加をもたらすことが知られている（ＥｍｉｎｇＳＡ，ＫｒｉｅｇＴ，ＤａｖｉｄｓｏｎＪＭ（２００７）Ｉｎ－ｆｌａｍｍａｔｉｏｎｉｎＷｏｕｎｄＲｅｐａｉｒ：ＭｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄＣｅｌｌｕｌａｒＭｅｃｈａｎｉｓｍｓ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅＤｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ．１２７：５１４－５２５．）。

また、成長因子の発現が減少し、血管新生過程と肉芽組織の形成が正しく行われない（ＦｒａｎｋＳ，ＨｕｂｎｅｒＧ，ＢｒｅｉｅｒＧ，ＬｏｎｇａｋｅｒＭＴ，ＧｒｅｅｎｈａｌｇｈＤＧ，ＷｅｒｎｅｒＳ（１９９５）ＲｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆＶａｓｃｕｌａｒＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＣｕｌｔｕｒｅｄＫｅｒ－ａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ．２７０：ｐｐ．１２６０７－１２６１３．；ＧｏｌｄｍａｎＲ（２００４）ＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒｓａｎｄＣｈｒｏｎｉｃＷｏｕｎｄＨｅａｌｉｎｇ：Ｐａｓｔ，Ｐｒｅｓｅｎｔ，ａｎｄＦｕｔｕｒｅ．ＡｄｖａｎｃｅｓｉｎＳｋｉｎ＆ＷｏｕｎｄＣａｒｅ．１７：ｐｐ．２４－３５．）。

慢性創傷は、創傷が３ヶ月以内に自然に治癒しない創傷を特徴とし、糖尿病および血管疾患患者から発生する（ＮｕｎａｎＲ，ＨａｒｄｉｎｇＫＧ，ＭａｒｔｉｎＰ（２０１４）Ｃｌｉｎｉｃａｌｃｈａｌｌｅｎｇｅｓｏｆｃｈｒｏｎｉｃｗｏｕｎｄｓ：ｓｅａｒｃｈｉｎｇｆｏｒａｎｏｐｔｉｍａｌａｎｉｍａｌｍｏｄｅｌｔｏｒｅｃａｐｉｔｕｌａｔｅｔｈｅｉｒｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ．ＤｉｓｅａｓｅＭｏｄｅｌｓ＆Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．７：１２０５－１２１３．）。

慢性創傷の内、糖尿病性足潰瘍を患う患者の数が最も多く、その数は全世界で約４億人にのぼり、そのうちの２０～３０％が糖尿病性足潰瘍へと発展する生涯リスクがある（ＡｒｍｓｔｒｏｎｇＤＧ，ＢｏｕｌｔｏｎＡＪＭ，ＢｕｓＳＡ（２０１７）ＤｉａｂｅｔｉｃＦｏｏｔＵｌｃｅｒｓａｎｄＴｈｅｉｒＲｅｃｕｒｒｅｎｃｅ．ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ．３７６：ｐｐ．２３６７－２３７５．）。

慢性創傷は、分子生物学的に炎症段階に停滞し、さらなる増殖段階へと進行されないことにより形成され、このような理由によりそれ以後、異常な遺伝子発現および相互作用が起こる（ＢａｎｎｏｎＰ，ＷｏｏｄＳ，ＲｅｓｔｉｖｏＴ，ＣａｍｐｂｅｌｌＬ，ＨａｒｄｍａｎＭＪ，ＭａｃｅＫＡ（２０１３）Ｄｉａｂｅｔｅｓｉｎｄｕｃｅｓｓｔａｂｌｅｉｎｔｒｉｎｓｉｃｃｈａｎｇｅｓｔｏｍｙｅｌｏｉｄｃｅｌｌｓｔｈａｔｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｔｏｃｈｒｏｎｉｃｉｎ－ｆｌａｍｍａｔｉｏｎｄｕｒｉｎｇｗｏｕｎｄｈｅａｌｉｎｇｉｎｍｉｃｅ．ＤｉｓｅａｓｅＭｏｄｅｌｓ＆Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．６：１４３４－１４４７．）。

炎症段階が持続するにつれて、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＩＬ－６などのようなプロ炎症性サイトカインとＭＭＰ（ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ）が発現する一方、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ、およびＩＧＦなどの様々な成長因子の発現が減少すると報告されている（ＴｒｅｎｇｏｖｅＮＪ，Ｂｉｅｌｅｆｅｌｄｔ－ＯｈｍａｎｎＨ，ＳｔａｃｅｙＭＣ（２００１）Ｍｉｔｏｇｅｎｉｃａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｃｙｔｏｋｉｎｅｌｅｖｅｌｓｉｎｎｏｎ－ｈｅａｌｉｎｇａｎｄｈｅａｌｉｎｇｃｈｒｏｎｉｃｌｅｇｕｌｃｅｒｓ．ＷｏｕｎｄＲｅｐａｉｒａｎｄＲｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．８：ｐｐ．，１３－２５．；ＡｒｍｓｔｒｏｎｇＤＧ，ＪｕｄｅＥＢ（２００２）ＴｈｅＲｏｌｅｏｆＭａｔｒｉｘＭｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓｉｎＷｏｕｎｄＨｅａｌｉｎｇ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＰｏｄｉａｔｒｉｃＭｅｄｉｃａｌＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ．９２：ｐｐ．１２－１８．）。ＴＩＭＰ（組織メタロプロテアーゼ抑制物質）によって調節されるＭＭＰ（マトリックスメタロプロテアーゼ）は、細胞外基質を分解し、再上皮化（ｒｅ－ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｉｚａｔｉｏｎ）を可能にする（ＭａｒｔｉｎｓＶＬ，ＣａｌｅｙＭ，Ｏ’ＴｏｏｌｅＥＡ（２０１３）Ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌ－ｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓａｎｄｅｐｉｄｅｒｍａｌｗｏｕｎｄｒｅｐａｉｒ．ＣｅｌｌａｎｄＴｉｓｓｕｅＲｅｓｅａｒｃｈ．３５１：２５５－２６８）。

特に、ＭＭＰの内、ＭＭＰ－９に対する研究が最も活発であり、慢性創傷に最も有害な影響を及ぼすことが知られている（ＪｏｎｅｓＪＩ，ＮｇｕｙｅｎＴＴ，ＰｅｎｇＺ，ＣｈａｎｇＭ（２０１９）ＴａｒｇｅｔｉｎｇＭＭＰ－９ｉｎＤｉａｂｅｔｉｃＦｏｏｔＵｌｃｅｒｓ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ．１２：７９．；ＲｅｉｓｓＭＪ，ＨａｎＹＰ，ＧａｒｃｉａＥ，ＧｏｌｄｂｅｒｇＭ，ＹｕＨ，ＧａｒｎｅｒＷＬ（２０１０）Ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－９ｄｅｌａｙｓｗｏｕｎｄｈｅａｌｉｎｇｉｎａｍｕｒｉｎｅｗｏｕｎｄｍｏｄｅｌ．Ｓｕｒｇｅｒｙ．１４７：２９５－３０２）。

最近、糖尿病性皮膚潰瘍、褥瘡、放射線潰瘍、静脈性潰瘍、過度なステロイド使用、老化などのさまざまな病因による慢性創傷は、効果的な治療が難しいため、正常な皮膚損傷回復過程で問題が生じている。皮膚損傷の回復過程は、様々な原因によって抑制され、創傷回復の初期段階である炎症段階での異常炎症は、増殖段階への進行を遅延させる。マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）活性とＴＩＭＰｓ（組織メタロプロテアーゼ抑制物質）とのバランスが崩れると、創傷損傷が続き、過活性化された免疫細胞によりＴＮＦ－αなどの炎症性サイトカインの合成／放出が増加し、ＴＧＦ－βのような成長因子の発現が減少し、増殖段階への進行が抑制される。

特に、糖尿病性皮膚潰瘍の創傷回復の遅れは、血液供給障害、神経障害、感染症、仮骨形成（ｃａｌｌｕｓ）などに起因するものであり、その病因は、新血管産生、マクロファージ機能、コラーゲン増殖、肉芽組織の特性、ケラチノサイト細胞／線維芽細胞の移動／活性化、細胞外基質の成分、ＭＭＰ酵素の活性などに起因し得る。

糖尿病性足潰瘍の場合、患者の約１５％が末梢血管の損傷、障害、閉塞を経験し、感染症まで進行してしまい、結局のところ創傷部位だけでなく、足を切断するまでになる。

基本的な治療法として、血糖調節、傷除去、死んだ組織除去、抗生物質治療などの様々な治療方法や多様な形態のドレッシングなども開発され、現在まで実際に使われている。

現在、糖尿病性足潰瘍を始めとする慢性創傷を治療するための有効な治療法や薬が報告されており、皮膚創傷に対する生理学的、生化学的、分子生物学的への理解が深まるにつれて数々の治療法が開発されており、例えば、創傷周辺に発生する虚血を改善するための高圧酸素療法、皮膚移植、減圧療法、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦなどの処理、遺伝子療法、幹細胞療法などが開発されている（ＫｌｅｏｐａｔｒａＡｌｅｘｉａｄｏｕ，ＪｏｈｎＤｏｕｐｉｓ（２０１２）ＭａｎａｇｅｍｅｎｔｏｆＤｉａｂｅｔｉｃＦｏｏｔＵｌｃｅｒｓ．ＤｉａｂｅｔｅｓＴｈｅｒ．Ｄｅｃ；３（１）：４；ＡｕｒｅｌｉｏＰｅｒｅｚ－Ｆａｖｉｌａ，ＭａｒｇａｒｉｔａＬＭａｒｔｉｎｅｚ－Ｆｉｅｒｒｏ，ＪｅｓｓｉｃａＧＲｏｄｒｉｇｕｅｚ－Ｌａｚａｌｄｅ（２０１９ＣｕｒｒｅｎｔＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＳｔｒａｔｅｇｉｅｓｉｎＤｉａｂｅｔｉｃＦｏｏｔｕｌｃｅｒｓ．Ｍｅｄｉｃｉｎａ，５５（１１），７１４）。

特に、ＩＧＦ（インスリン－様成長因子）、ＴＧＦ－α、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＰＤＧＦ（血小板－由来成長因子）、ＮＧＦ（神経成長因子）、ＧＭ－ＣＳＦ（顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子）、ＥＧＦ（内皮成長因子）、ＨＧＦ（肝細胞成長因子）などを含む、糖尿病性皮膚潰瘍を回復させる成長因子についての多くの研究が行われている（Ｇｒａｚｕｌ－ＢｉｌｓｋａＡＴ（２００３）Ｗｏｕｎｄｈｅａｌｉｎｇ：ｔｈｅｒｏｌｅｏｆｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｓ．ＤｒｕｇｓＴｏｄａｙ（Ｂａｒｃ）２００３Ｏｃｔ；３９（１０）：７８７－８００）。

組換えＰＤＧＦ（局所拡散剤、ｂｅｃａｐｌｅｒｍｉｎ、Ｒｅｇｒａｎｅｘ）、ＶＥＧＦ（局所拡散剤、ｔｅｌｂｅｒｍｉｎ、ＧｅｎｅｎｔｅｃｈＩｎｃ．）などのような創傷治療剤の一つとして、成長因子が治療効果を示すことが報告されている。しかし、高額で、がん発生リスクなどの安全性といった問題によりそれらの使用が制限されており、最近大幅に減少している（ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎＰＪ，ＣａｉｎＪＤ，ＴｉｔｕｎｉｃｋＭＢ，ＳａｓｓａｎｉＪＷ，ＺａｇｏｎＩＳ．ＴｏｐｉｃａｌＮａｌｔｒｅｘｏｎｅＩｓａＳａｆｅａｎｄＥｆｆｅｃｔｉｖｅＡｌ－ｔｅｒｎａｔｉｖｅｔｏＳｔａｎｄａｒｄＴｒｅａｔｍｅｎｔｏｆＤｉａｂｅｔｉｃＷｏｕｎｄｓ．ＡｄｖＷｏｕｎｄＣａｒｅ．２０１７；６：２７９－２８８．）。

さらに、このような成長因子治療は、創傷部位にＭＭＰが効果的に送達されないので、高濃度の治療を頻繁にしなければならず、その実際の効果が一様ではない。また、組換え成長因子の場合、皮膚組織の透過能が低下し、実際の組織での回復に必要な量の約５０倍が必要なため、高価格になる問題がある。損傷治療剤の一つとして、最近脚光を浴びている幹細胞治療も同様に臨床適用するには多くの研究が必要である（ＬａｒａＬｏｐｅｓ，ＯｃｅａｎＳｅｔｉａ，ＡｆｓｈａＡｕｒｓｈｉｎａ，ＳｈｉｒｌｅｙＬｉｕ，ＨａｉｄｉＨｕ（２０１８）Ｓｔｅｍｃｅｌｌｔｈｅｒａｐｙｆｏｒｄｉａｂｅｔｉｃｆｏｏｔｕｌｃｅｒｓ：ａｒｅｖｉｅｗｏｆｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌａｎｄｃｌｉｎｉｃａｌｒｅｓｅａｒｃｈ．ＳｔｅｍＣｅｌｌＲｅｓＴｈｅｒ：９：１８８）。

創傷治療薬の一つとして、セファレキシン（ｃｅｐｈａｌｅｘｉｎ）およびクリンダマイシン（ｃｌｉｎｄａｍｙｃｉｎ）が一般に抗生物質として使用されており、中等度または慢性感染症にはアンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）およびイミペネム（ｉｍｉｐｅｎｅｍ）が使用されている。

したがって、糖尿病性足潰瘍などの皮膚損傷や潰瘍を治療し改善する上で、天然由来原料からこれまで従来使用されていた薬物よりも副作用が少なく、低コストでより効果的な薬物および化粧品を開発することが依然として求められている。

ムクロジ科（Ｓａｐｉｎｄａｃｅａｅ）に属するラムヤイ（Ｄｉｍｏｃａｒｐｕｓｌｏｎｇａｎ）、リュウガン（Ｅｕｐｈｏｒｉａｌｏｎｇａｎ）または同種の種皮である、竜眼肉（ＬｏｎｇａｎａｅＡｒｉｌｌｕｓ）は、グルコース、フルクトース、タンパク質などを含有し、心筋保護効果、食欲増進効果などを示すことが報告されている（ＣｈｕｎｇＢ．Ｓｅｔａｌ，Ｄｏｈａｅｈｙａｎｇｙａｋｄａｅｓａｊｅｏｎ，ｙｏｕｎｇｒｉｍｓａ，２ｎｄＥｄ．ｐ１９７－１９８，１９９８）。

セリ科（Ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒａｅ）に属するＬｉｇｕｓｔｉｃｕｍｔｅｎｕｉｓｓｉｍｕｍＫｉｔａｇａｗａ、ＬｉｇｕｓｔｉｃｕｍｓｉｎｅｎｓｅＯｌｉｖ、ＬｉｇｕｓｔｉｃｕｍｊｅｈｏｌｅｎｓｅＮａｋａｉｅｔＫｉｔａｇａｗａまたは同種の根茎または根である藁本（ＬｉｇｕｓｔｉｃｉＴｅｎｕｉｓｓｉｍｉＲｈｉｚｏｍａ）は、クニジリド（ｃｎｉｄｉｌｉｄｅ）、３－ブチルフタリド（ｐｈｔｈａｌｉｄｅ）などを含有し、抗菌効果などを示すことが報告されている（ＣｈｕｎｇＢ．Ｓｅｔａｌ，Ｄｏｈａｅ－ｈｙａｎｇｙａｋｄａｅｓａｊｅｏｎ，ｙｏｕｎｇｒｉｍｓａ，２ｎｄＥｄ．Ｐ４２８－４２９，１９９８）。

ヒメハギ科（Ｐｏｌｙｇａｌａｃｅａｅ）に属するイトヒメハギ（ＰｏｌｙｇａｌａｔｅｎｕｉｆｏｌｉａＷｉｌｌｄ）または同種の根であるオンジ（Ｐｏｌｙｇａｌａｅｒａｄｉｘ）は、様々なサポニンを含有し、去痰作用、抗菌作用などを示すことが報告されている（ＣｈｕｎｇＢ．Ｓｅｔａｌ，Ｄｏｈａｅｈｙａｎｇｙａｋｄａｅｓａｊｅｏｎ，ｙｏｕｎｇｒｉｍｓａ，２ｎｄＥｄ．Ｐ７９８－７９９，１９９８）。

しかし、その開示内容が本願に引用され含まれた上記引用文献のどこにも、糖尿病性足潰瘍のような皮膚創傷や潰瘍に対する強力な治療効果を示す竜眼肉、藁本およびオンジが局所的に適用される混合生薬抽出物の予防または改善活性についての報告または開示がされていない。

ＰａｚｙａｒＮ，ＹａｇｈｏｏｂｉＲ，ＲａｆｉｅｅＥ，ＭｅｈｒａｂｉａｎＡ，ＦｅｉｌｙＡ（２０１４）ＳｋｉｎＷｏｕｎｄＨｅａｌｉｎｇａｎｄＰｈｙｔｏｍｅｄｉｃｉｎｅ：ＡＲｅｖｉｅｗ．ＳｋｉｎＰｈａｒｍａｃｏｌＰｈｙｓｉｏｌ．２７：ｐｐ．３０３－３１０。Ｄｅｍｉｄｏｖａ－ＲｉｃｅＴＮ，ＨａｍｂｌｉｎＭＲ，ＨｅｒｍａｎＩＭ（２０１２）ＡｃｕｔｅａｎｄＩｍｐａｉｒｅｄＷｏｕｎｄＨｅａｌｉｎｇ：ＰａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙａｎｄＣｕｒｒｅｎｔＭｅｔｈｏｄｓｆｏｒＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙ，Ｐａｒｔ１：ＮｏｒｍａｌａｎｄＣｈｒｏｎｉｃＷｏｕｎｄｓ：Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃａｕｓｅｓ，ａｎｄＡｐｐｒｏａｃｈｅｓｔｏＣａｒｅ．ＡｄｖａｎｃｅｓｉｎＳｋｉｎ＆ＷｏｕｎｄＣａｒｅ．２５：３０４－３１４。ＥｍｉｎｇＳＡ，ＫｒｉｅｇＴ，ＤａｖｉｄｓｏｎＪＭ（２００７）Ｉｎ－ｆｌａｍｍａｔｉｏｎｉｎＷｏｕｎｄＲｅｐａｉｒ：ＭｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄＣｅｌｌｕｌａｒＭｅｃｈａｎｉｓｍｓ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅＤｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ．１２７：５１４－５２５。ＦｒａｎｋＳ，ＨｕｂｎｅｒＧ，ＢｒｅｉｅｒＧ，ＬｏｎｇａｋｅｒＭＴ，ＧｒｅｅｎｈａｌｇｈＤＧ，ＷｅｒｎｅｒＳ（１９９５）ＲｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆＶａｓｃｕｌａｒＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＣｕｌｔｕｒｅｄＫｅｒ－ａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ．２７０：ｐｐ．１２６０７－１２６１３。ＧｏｌｄｍａｎＲ（２００４）ＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒｓａｎｄＣｈｒｏｎｉｃＷｏｕｎｄＨｅａｌｉｎｇ：Ｐａｓｔ，Ｐｒｅｓｅｎｔ，ａｎｄＦｕｔｕｒｅ．ＡｄｖａｎｃｅｓｉｎＳｋｉｎ＆ＷｏｕｎｄＣａｒｅ．１７：ｐｐ．２４－３５。ＮｕｎａｎＲ，ＨａｒｄｉｎｇＫＧ，ＭａｒｔｉｎＰ（２０１４）Ｃｌｉｎｉｃａｌｃｈａｌｌｅｎｇｅｓｏｆｃｈｒｏｎｉｃｗｏｕｎｄｓ：ｓｅａｒｃｈｉｎｇｆｏｒａｎｏｐｔｉｍａｌａｎｉｍａｌｍｏｄｅｌｔｏｒｅｃａｐｉｔｕｌａｔｅｔｈｅｉｒｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ．ＤｉｓｅａｓｅＭｏｄｅｌｓ＆Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．７：１２０５－１２１３。ＡｒｍｓｔｒｏｎｇＤＧ，ＢｏｕｌｔｏｎＡＪＭ，ＢｕｓＳＡ（２０１７）ＤｉａｂｅｔｉｃＦｏｏｔＵｌｃｅｒｓａｎｄＴｈｅｉｒＲｅｃｕｒｒｅｎｃｅ．ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ．３７６：ｐｐ．２３６７－２３７５。ＢａｎｎｏｎＰ，ＷｏｏｄＳ，ＲｅｓｔｉｖｏＴ，ＣａｍｐｂｅｌｌＬ，ＨａｒｄｍａｎＭＪ，ＭａｃｅＫＡ（２０１３）Ｄｉａｂｅｔｅｓｉｎｄｕｃｅｓｓｔａｂｌｅｉｎｔｒｉｎｓｉｃｃｈａｎｇｅｓｔｏｍｙｅｌｏｉｄｃｅｌｌｓｔｈａｔｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｔｏｃｈｒｏｎｉｃｉｎ－ｆｌａｍｍａｔｉｏｎｄｕｒｉｎｇｗｏｕｎｄｈｅａｌｉｎｇｉｎｍｉｃｅ．ＤｉｓｅａｓｅＭｏｄｅｌｓ＆Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．６：１４３４－１４４７。ＴｒｅｎｇｏｖｅＮＪ，Ｂｉｅｌｅｆｅｌｄｔ－ＯｈｍａｎｎＨ，ＳｔａｃｅｙＭＣ（２００１）Ｍｉｔｏｇｅｎｉｃａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｃｙｔｏｋｉｎｅｌｅｖｅｌｓｉｎｎｏｎ－ｈｅａｌｉｎｇａｎｄｈｅａｌｉｎｇｃｈｒｏｎｉｃｌｅｇｕｌｃｅｒｓ．ＷｏｕｎｄＲｅｐａｉｒａｎｄＲｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．８：ｐｐ．，１３－２５。ＡｒｍｓｔｒｏｎｇＤＧ，ＪｕｄｅＥＢ（２００２）ＴｈｅＲｏｌｅｏｆＭａｔｒｉｘＭｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓｉｎＷｏｕｎｄＨｅａｌｉｎｇ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＰｏｄｉａｔｒｉｃＭｅｄｉｃａｌＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ．９２：ｐｐ．１２－１８。ＭａｒｔｉｎｓＶＬ，ＣａｌｅｙＭ，Ｏ’ＴｏｏｌｅＥＡ（２０１３）Ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌ－ｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓａｎｄｅｐｉｄｅｒｍａｌｗｏｕｎｄｒｅｐａｉｒ．ＣｅｌｌａｎｄＴｉｓｓｕｅＲｅｓｅａｒｃｈ．３５１：２５５－２６８。ＪｏｎｅｓＪＩ，ＮｇｕｙｅｎＴＴ，ＰｅｎｇＺ，ＣｈａｎｇＭ（２０１９）ＴａｒｇｅｔｉｎｇＭＭＰ－９ｉｎＤｉａｂｅｔｉｃＦｏｏｔＵｌｃｅｒｓ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ．１２：７９。ＲｅｉｓｓＭＪ，ＨａｎＹＰ，ＧａｒｃｉａＥ，ＧｏｌｄｂｅｒｇＭ，ＹｕＨ，ＧａｒｎｅｒＷＬ（２０１０）Ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－９ｄｅｌａｙｓｗｏｕｎｄｈｅａｌｉｎｇｉｎａｍｕｒｉｎｅｗｏｕｎｄｍｏｄｅｌ．Ｓｕｒｇｅｒｙ．１４７：２９５－３０２。ＫｌｅｏｐａｔｒａＡｌｅｘｉａｄｏｕ，ＪｏｈｎＤｏｕｐｉｓ（２０１２）ＭａｎａｇｅｍｅｎｔｏｆＤｉａｂｅｔｉｃＦｏｏｔＵｌｃｅｒｓ．ＤｉａｂｅｔｅｓＴｈｅｒ．Ｄｅｃ；３（１）：４。ＡｕｒｅｌｉｏＰｅｒｅｚ－Ｆａｖｉｌａ，ＭａｒｇａｒｉｔａＬＭａｒｔｉｎｅｚ－Ｆｉｅｒｒｏ，ＪｅｓｓｉｃａＧＲｏｄｒｉｇｕｅｚ－Ｌａｚａｌｄｅ（２０１９ＣｕｒｒｅｎｔＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＳｔｒａｔｅｇｉｅｓｉｎＤｉａｂｅｔｉｃＦｏｏｔｕｌｃｅｒｓ．Ｍｅｄｉｃｉｎａ，５５（１１），７１４。Ｇｒａｚｕｌ－ＢｉｌｓｋａＡＴ（２００３）Ｗｏｕｎｄｈｅａｌｉｎｇ：ｔｈｅｒｏｌｅｏｆｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｓ．ＤｒｕｇｓＴｏｄａｙ（Ｂａｒｃ）２００３Ｏｃｔ；３９（１０）：７８７－８００。ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎＰＪ，ＣａｉｎＪＤ，ＴｉｔｕｎｉｃｋＭＢ，ＳａｓｓａｎｉＪＷ，ＺａｇｏｎＩＳ．ＴｏｐｉｃａｌＮａｌｔｒｅｘｏｎｅＩｓａＳａｆｅａｎｄＥｆｆｅｃｔｉｖｅＡｌ－ｔｅｒｎａｔｉｖｅｔｏＳｔａｎｄａｒｄＴｒｅａｔｍｅｎｔｏｆＤｉａｂｅｔｉｃＷｏｕｎｄｓ．ＡｄｖＷｏｕｎｄＣａｒｅ．２０１７；６：２７９－２８８。ＬａｒａＬｏｐｅｓ，ＯｃｅａｎＳｅｔｉａ，ＡｆｓｈａＡｕｒｓｈｉｎａ，ＳｈｉｒｌｅｙＬｉｕ，ＨａｉｄｉＨｕ（２０１８）Ｓｔｅｍｃｅｌｌｔｈｅｒａｐｙｆｏｒｄｉａｂｅｔｉｃｆｏｏｔｕｌｃｅｒｓ：ａｒｅｖｉｅｗｏｆｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌａｎｄｃｌｉｎｉｃａｌｒｅｓｅａｒｃｈ．ＳｔｅｍＣｅｌｌＲｅｓＴｈｅｒ：９：１８８ＣｈｕｎｇＢ．Ｓｅｔａｌ，Ｄｏｈａｅｈｙａｎｇｙａｋｄａｅｓａｊｅｏｎ，ｙｏｕｎｇｒｉｍｓａ，２ｎｄＥｄ．ｐ１９７－１９８，１９９８。ＣｈｕｎｇＢ．Ｓｅｔａｌ，Ｄｏｈａｅ－ｈｙａｎｇｙａｋｄａｅｓａｊｅｏｎ，ｙｏｕｎｇｒｉｍｓａ，２ｎｄＥｄ．Ｐ４２８－４２９，１９９８．。ＣｈｕｎｇＢ．Ｓｅｔａｌ，Ｄｏｈａｅｈｙａｎｇｙａｋｄａｅｓａｊｅｏｎ，ｙｏｕｎｇｒｉｍｓａ，２ｎｄＥｄ．Ｐ７９８－７９９，１９９８。ＭａｔｓｕｍｏｔｏＭｉｔｈｉｏ；Ｍａｎｕａｌｆｏｒｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌａｐｐｌｉｅｄｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ．ＳｅｉｓｉＰｒｅｓｓ，１ｓｔＥｄ．，１９８５。Ｊｅｏｎｇｅｔａｌ．，２０１９，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，Ｍａｙ；１３９（５）：ｐｐ１０９８－１１０９。Ｌｅｅｅｔａｌ．，２０２０，ＩｎｔＪＭｏｌＳｃｉ．２０２０Ｊａｎ５；２１（１）：３４３。Ｎａｅｔａｌ．，２０１６，ＪＩｎｖｅｓｔＤｅｒｍａｔｏｌ．２０１６Ａｐｒ；１３６（４）：８４７－８５８。ＬｏｎｇＭ，ＲｏｊｏｄｅｌａＶｅｇａＭ，ＷｅｎＱ，ＢｈａｒａｒａＭ，ＪｉａｎｇＴ，ＺｈａｎｇＲ，ＺｈｏｕＳ，ＷｏｎｇＰＫ，ＷｏｎｄｒａｋＧＴ，ＺｈｅｎｇＨ，ＺｈａｎｇＤＤ（２０１６）ＡｎＥｓｓｅｎｔｉａｌＲｏｌｅｏｆＮＲＦ２ｉｎＤｉａｂｅｔｉｃＷｏｕｎｄＨｅａｌｉｎｇ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ．６５：７８０－７９３。ＧｒｏｔｅｎｄｏｒｓｔＧＲ，ＭａｒｔｉｎＧＲ，ＰｅｎｃｅｖＤ，ＳｏｄｅｋＪ，ＨａｒｖｅｙＡＫ（１９８５）Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎｏｆｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎｔｉｓｓｕｅｆｏｒｍａｔｉｏｎｂｙｐｌａｔｅｌｅｔ－ｄｅｒｉｖｅｄｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｉｎｎｏｒｍａｌａｎｄｄｉａｂｅｔｉｃｒａｔｓ．Ｔｈｅｊｏｕｒｎａｌｏｆｃｌｉｎｉｃａｌｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ．７６：２３２３－２３。ＴｒｅｎｇｏｖｅＮＪ，Ｂｉｅｌｅｆｅｌｄｔ－ＯｈｍａｎｎＨ，ＳｔａｃｅｙＭＣ（２００１）Ｍｉｔｏｇｅｎｉｃａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｃｙｔｏｋｉｎｅｌｅｖｅｌｓｉｎｎｏｎ－ｈｅａｌｉｎｇａｎｄｈｅａｌｉｎｇｃｈｒｏｎｉｃｌｅｇｕｌｃｅｒｓ．ＷｏｕｎｄＲｅｐａｉｒａｎｄＲｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．８：１３－２５．；ＡｒｍｓｔｒｏｎｇＤＧ，ＪｕｄｅＥＢ（２００２）ＴｈｅＲｏｌｅｏｆＭａｔｒｉｘＭｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓｉｎＷｏｕｎｄＨｅａｌｉｎｇ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＰｏｄｉａｔｒｉｃＭｅｄｉｃａｌＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ．９２：１２－１８。ＬｅｏｎｉＧ，ＮｅｕｍａｎｎＰＡ，ＳｕｍａｇｉｎＲ，ＤｅｎｎｉｎｇＴＬ，ＮｕｓｒａｔＡ（２０１５）Ｗｏｕｎｄｒｅｐａｉｒ：ｒｏｌｅｏｆｉｍｍｕｎｅ－ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．ＭｕｃｏｓａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．８：９５９－９６８。ＤｉＧｉｏｖａｎｎｉＣＷ，ＰｅｔｒｉｃｅｋＪＭ．ＴｈｅｅｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆｒｈＰＤＧＦ－ＢＢｉｎｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌｅｔａｌｒｅｐａｉｒａｎｄｉｔｓｒｏｌｅｉｎｆｏｏｔａｎｄａｎｋｌｅｆｕｓｉｏｎｓｕｒｇｅｒｙ．ＦｏｏｔＡｎｋｌｅＣｌｉｎ．２０１０；１５：６２１－６４０。ＤｉＧｉｏｖａｎｎｉａｎｄＰｅｔｒｉｃｋｅｒ，２０１０；ＳｈｉＲ，ＬｉａｎＷ，ＨａｎＳ，ＣａｏＣ，ＪｉｎＹ，ＹｕａｎＹ，ＺｈａｏＨ，ＬｉＭ．Ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄｃｏ－ｄｅｌｉｖｅｒｙｏｆＶＥＧＦ－ＡａｎｄＰＤＧＦ－Ｂｇｅｎｅｓｆｏｒａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇｄｉａｂｅｔｉｃｆｏｏｔｕｌｃｅｒｓｈｅａｌｉｎｇｉｎｒａｔｓ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．２０１８；２５：４２５－４３８。

糖尿病性足潰瘍のような皮膚創傷または潰瘍に対する竜眼肉（ＬｏｎｇａｎａｅＡｒｉｌｌｕｓ）、藁本（ＬｉｇｕｓｔｉｃｉＴｅｎｕｉｓｓｉｍｉＲｈｉｚｏｍａ）およびオンジ（Ｐｏｌｙｇａｌａｅｒａｄｉｘ）の混合生薬抽出物の治療または改善効果を調べるために、本発明者らは、サイトカイン発現に対する抑制効果（ｉｎｖｉｔｒｏ）（実験例１）；細胞増殖促進効果（ｉｎｖｉｔｒｏ）（実験例２）；細胞創傷回復効果（ｉｎｖｉｔｒｏ）（実験例３）のようなｉｎｖｉｔｒｏ実験；だけでなく、慢性潰瘍に対する治療効果（ｉｎｖｉｖｏ）（実験例４）；皮膚創傷回復効果（ｉｎｖｉｖｏ）（実験例５）；成長因子に関与するプロ炎症性サイトカインの発現抑制効果（ｉｎｖｉｖｏ）（実験例６）のようなｉｎｖｉｖｏ実験を含む多様な実験を集中的に行った。これらの調査の結果、本発明者らは、本発明の混合生薬抽出物が皮膚再生を強力に促進させ、皮膚創傷を抑制および改善することを確認することにより最終的に本発明を完成した。

背景技術の問題を解決するための技術的解決策は、皮膚創傷を治療および予防するための新規生薬製剤を開発することである。

したがって、本発明の目的は、皮膚再生を促進させ、皮膚創傷を治療および改善するための、龍眼肉（ＬｏｎｇａｎａｅＡｒｉｌｌｕｓ）、藁本（ＬｉｇｕｓｔｉｃｉＴｅｎｕｉｓｓｉｍｉＲｈｉｚｏｍａ）およびオンジ（Ｐｏｌｙｇａｌａｅｒａｄｉｘ）の混合生薬抽出物を有効成分として含む局所用医薬組成物を提供することである。

上述したように、本発明者らは、サイトカイン発現抑制効果（ｉｎｖｉｔｒｏ）（実験例１）；細胞増殖促進効果（ｉｎｖｉｔｒｏ）（実験例２）；細胞創傷回復効果（ｉｎｖｉｔｒｏ）（実験例３）のようなｉｎｖｉｔｒｏ実験；だけでなく、慢性潰瘍に対する治療効果（ｉｎｖｉｖｏ）（実験例４）；皮膚創傷回復効果（ｉｎｖｉｖｏ）（実験例５）；成長因子に関与するプロ炎症性サイトカインの発現抑制効果（ｉｎｖｉｖｏ）（実験例６）のようなｉｎｖｉｖｏ実験を行うことにより、本発明の混合組成物の皮膚創傷治療効果が強力であることが立証された。したがって、本発明の混合抽出物は、局所用医薬品または化粧料組成物の形態として、皮膚創傷の改善または治療に非常に有用であることを確認した。

皮膚上皮細胞（ＨａＣａＴ）にスクラッチを作った後、本発明の混合抽出物で処理した試験群の細胞写真を示す（ＤＩＷ：蒸留水；ＮＰ：本発明の混合抽出物）；ストレプトゾトシン（ＳＴＺ：ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ）－誘発性糖尿病マウスモデルの確立を示す（ＳＴＺ：ストレプトゾトシン、ＤＩＷ：蒸留水；ＮＰ：本発明の混合抽出物）。本発明の混合抽出物（ＮＰ）が糖尿病性皮膚創傷治癒に及ぼす治癒効果を損傷後の経過日別に示す（Ｃｏｎ：対照群；ＳＴＺ：ストレプトゾトシン、ＤＩＷ：蒸留水；ＮＰ：本発明の混合抽出物）。糖尿病性皮膚創傷の組織学的解析、並びに本発明の混合抽出物（ＮＰ）が肉芽組織増殖に及ぼす促進効果を示す（スケールバー＝２００μｍ、ＳＴＺ：ストレプトゾトシン、ＤＩＷ：蒸留水；ＮＰ：本発明の混合抽出物）。

本願で定義される用語「混合生薬抽出物」は、混合生薬抽出物、すなわち、（ａ）竜眼肉、藁本およびオンジの乾燥重量（ｗ／ｗ）を基準とした混合比が０．０１－１００：０．０１－１００：０．０１－１００重量部（ｗ／ｗ）、好ましくは、０．１－５０：０．１－５０：０．１－５０重量部（ｗ／ｗ）、より好ましくは、０．１－１０：０．１－１０：０．１－１０重量部（ｗ／ｗ）、さらに好ましくは、１－５：１－５：１－５重量部（ｗ／ｗ）、最も好ましくは、１－３：１－３：１－３重量部（ｗ／ｗ）である、竜眼肉、藁本およびオンジの混合生薬抽出物；又は（ｂ）竜眼肉、藁本およびオンジの乾燥重量（ｗ／ｗ）を基準とした混合比が０．０１－１００：０．０１－１００：０．０１－１００重量部（ｗ／ｗ）、好ましくは、０．１－５０：０．１－５０：０．１－５０重量部（ｗ／ｗ）、より好ましくは、０．１－１０：０．１－１０：０．１－１０重量部（ｗ／ｗ）、さらに好ましくは、１－５：１－５：１－５重量部（ｗ／ｗ）、最も好ましくは、１－３：１－３：１－３重量部（ｗ／ｗ）である、竜眼肉、藁本およびオンジの各抽出物の混合物を含む。

本発明の別の目的は、ＴＬＳＰ（胸腺間質リンホポエチン）サイトカインを抑制する量の竜眼肉、藁本およびオンジの混合生薬抽出物を有効成分として含むＴＬＳＰ発現抑制剤を提供することである。

本願に開示する用語「抽出物」は、水、Ｃ_１－Ｃ_４低級アルキルアルコール、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、など、アセトン、酢酸エチル、クロロホルム、ヘキサン、ブチレングリコール、プロピレングリコールまたはグリセリン、好ましくは、水、メタノール、エタノール、より好ましくは、水または水中１０～９０％（ｖ／ｖ）エタノール、最も好ましくは、水または水中２０～８０％（ｖ／ｖ）エタノールから選択される１つ以上の溶媒で抽出することができる抽出物を含むが、これらに限定されるものではない。

本願に開示される用語「皮膚創傷」は、皮膚に発生した怪我、擦過傷、損傷、切り傷、打撲傷、挫創、掻き傷などを含むが、これらに限定されるものではない。

炎症は、病原体、損傷した細胞、または刺激物質などの有害な刺激に対する身体組織の複雑な生物学的反応の一部であり、熱、痛み、発赤、腫れなどの非特異的免疫応答を「炎症反応」と呼ぶ。

炎症は、（ａ）有害な刺激に対する身体の初期反応である急性炎症であって、血液からの血漿および白血球（特に顆粒球）の損傷した組織への移動の増加によって達成され、その後、一連の生化学的事像が伝播され、そして局所血管系、免疫系、および損傷した組織内の様々な細胞に関連する炎症反応成熟によって達成される、炎症、および（ｂ）慢性炎症として知られる炎症の長期化により、炎症部位に存在する細胞の種類、例えば、単核細胞の漸進的な変化をもたらし、炎症過程における組織の同時破壊および治癒を特徴とする、炎症として分類することができる。

一般に、損傷した細胞のマクロファージは、様々なサイトカインを放出し、Ｔリンパ球を活性化し、リンパ球である肥満細胞は様々なヒスタミンを放出し、内部障壁反応を起こし、感染した細胞の炎症を誘導する。したがって、細胞サイトカインの発現レベルは、炎症反応の活性化（他の様態ら、抗炎症活性）の指標として用いることができる。本願に開示される「抗炎症活性」は、様々な皮膚炎症に対する抑制活性を意味する。

サイトカインは、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンホカイン、およびマクロファージ、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、および肥満細胞などの免疫細胞だけでなく、内皮細胞を含む広範囲の細胞によって産生される腫瘍壊死因子、線維芽細胞、および様々な病原体、例えば、ウイルスなどの侵入によって引き起こされる免疫学的な進行を通じて放出される、多様な基質細胞を含むすべての免疫学的物質を意味する。

一般に、サイトカインは感染初期に放出されるが、免疫システムが異常に活性化されると、持続的に放出される。一週間以上などの長期間にわたって高レベルのサイトカインが放出された場合を、本発明者らは「サイトカインストーム（ｓｔｏｒｍ）」と呼んでいる。これは自然免疫系がサイトカインと呼ばれるプロ炎症性シグナル送達分子が抑制不能となり、過剰な放出を惹起する、また、免疫細胞が感染部位に極度に大量にホーミングすることで炎症を悪化させ、血管を弛緩させて血管外漏出を起こし、最悪の場合、死に至らしめる、生理的反応である。本願に開示する用語「サイトカイン発現の抑制活性」は、サイトカインストームの予防、治療または改善として解釈することができる。

本願に開示する用語「サイトカイン」は、アトピー性皮膚炎などの皮膚炎に関与する様々なサイトカイン、具体的には、ＴＬＳＰ（胸腺間質リンホポエチン）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば、ＧＭ－ＣＳＦ（顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子）、Ｍ－ＣＳＦ（マクロファージコロニー刺激因子）、Ｇ－ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）など、インターロイキン、例えばインターロイキン－１（ＩＬ－１）、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－３１、ＩＬ－３３など、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）などの群から選択されたサイトカインを含むが、これらに限定されるものではない。

本発明の抽出物は、以下の好ましい実施形態に従って調製することができる。

本発明の場合、前記抽出物は、以下のように調製することができる。

本願で定義されている用語「竜眼肉、藁本、およびオンジの混合生薬抽出物」は；「竜眼肉、藁本、およびオンジ」をスライスして洗浄し、第１段階の基本抽出物質として使用する段階；０．０１－１００：０．０１－１００：０．０１－１００重量部（ｗ／ｗ）、好ましくは、０．１－５０：０．１－５０：０．１－５０重量部（ｗ／ｗ）、より好ましくは、０．１－１０：０．１－１０：０．１－１０重量部（ｗ／ｗ）、さらに好ましくは、１－５：１－５：１－５重量部（ｗ／ｗ）、最も好ましくは、１－３：１－３：１－３重量部（ｗ／ｗ）範囲の竜眼肉、藁本およびオンジの乾燥重量（ｗ／ｗ）を基準とした混合比でよく混ぜ合わせ、第２段階の混合物質を得る段階；第３段階において、水、Ｃ_１－Ｃ_４低級アルキルアルコール、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、アセトン、酢酸エチル、クロロホルム、ヘキサン、ブチレングリコール、プロピレングリコールまたはグリセリン、好ましくは、水、メタノール、エタノール、より好ましくは、水または水中１０～９０％（ｖ／ｖ）エタノール、最も好ましくは、水または水中２０～８０％（ｖ／ｖ）エタノールからなる群から選択される抽出溶媒１～２０倍体積（ｖ／ｗ）、好ましくは４～８倍体積（ｖ／ｗ）を混合物質に添加する段階；第４段階において、５０℃～１２０℃、好ましくは、約８０℃～１００℃の温度範囲で１～２４時間、好ましくは、２～１２時間の範囲の間、熱水抽出、冷水抽出、還流抽出または超音波抽出、好ましくは、熱水抽出による抽出法で各溶液を抽出する段階；前記抽出過程を繰り返し、各濾液を濾過、凍結乾燥、自然乾燥または熱風乾燥過程を介した乾燥、好ましくは凍結乾燥過程により収集し、本発明の竜眼肉、藁本およびオンジの混合生薬抽出物を得る段階を含む手順によって調製することができる。

本発明の別の目的は、上述のように、本発明の竜眼肉、藁本およびオンジの混合生薬抽出物を調製する方法を提供することである。

本発明の他の目的は、皮膚の再生を促進させ、皮膚創傷を治療および改善するための上記のような方法で調製された竜眼肉、藁本およびオンジの混合生薬抽出物を有効成分として含む局所用医薬組成物を提供する。

本発明のまた別の態様によれば、有効量の竜眼肉、藁本およびオンジの混合生薬抽出物、およびその薬学的に許容される担体を哺乳動物に局所投与する段階を含む、哺乳動物の皮膚再生を促進させ、皮膚創傷を治療および改善する方法が提供される。

本発明の別の態様によれば、ヒトを含む哺乳動物の皮膚再生を促進させ、皮膚創傷を治療および改善するために使用される局所製剤を調製するための竜眼肉、藁本およびオンジの混合生薬抽出物の有効成分としての使用もまた提供される。

本発明の組成物は、使用方法によって従来の担体、アジュバントまたは希釈剤をさらに含むことができる。前記担体は、用途および適用方法によって適切な物質として用いられることが好ましいが、これに限定されるものではない。適切な希釈剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅ（ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇｃｏ、ＥａｓｔｏｎＰＡ）の書面テキストに挙げられている。

以下、下記の剤形化方法および賦形剤は、単なる例示に過ぎないものであって、いずれの方法でも本発明を制限するものではない。

本発明による本発明の組成物は、薬学的に許容される担体、アジュバントまたは希釈剤、例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アカシアゴム、アルギン酸、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウムおよび鉱物油を含む局所用医薬組成物として提供することができる。剤形は、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、保湿剤、香味剤、乳化剤、防腐剤などをさらに含むことができる。本発明の組成物は、当業界で周知の任意の手順を介して患者に投与した後、有効成分の迅速、持続放出または遅延放出を提供できるように剤形化することができる。

局所投与のために、本発明の抽出物は、クリーム、ゲル、パッチ、スプレー溶液、エマルジョン、軟膏、ローション、リニメント（ｌｉｎｉｍｅｎｔ）、バーム、溶液、懸濁液、パック、ペースト、エアロゾル、カタプラズマなどの局所用製剤を含む軟膏およびクリームの形態で剤形化することができる。

医薬投与形態の本発明の組成物は、その薬学的に許容される塩の形態で使用することができ、単独でまたは適切な組み合わせにより使用することができるだけでなく、他の薬学的に活性な化合物と組み合わせて使用することもできる。

本発明の抽出物または組成物の好ましい用量は、対象体の状態および体重、重症度、薬物形態、投与経路および投与期間によって異なり、当業者によって選択され得る。しかし、好ましい効果を得るためには、一般に本発明の抽出物を０．０１－１０ｇ／ｋｇ、好ましくは１－５ｇ／ｋｇ（重量／日）の範囲の量で局所投与することが推奨される。用量は一日に単一または多重用量で投与することができる。組成物の観点から、本抽出物は、組成物の総重量基準０．０１－８０重量％、好ましくは０．５－５０重量％存在すべきである。

本発明者らは、本組成物の抗炎症効果がサイトカイン発現に対する抑制効果（ｉｎｖｉｔｒｏ）（実験例１）；細胞増殖促進効果（ｉｎｖｉｔｒｏ）（実験例２）；細胞創傷回復効果（ｉｎｖｉｔｒｏ）（実験例３）のようなｉｎｖｉｔｒｏ実験；だけでなく、慢性潰瘍に対する治療効果（ｉｎｖｉｖｏ）（実験例４）；皮膚創傷回復効果（ｉｎｖｉｖｏ）（実験例５）；成長因子に関与するプロ炎症性サイトカインの発現抑制効果（ｉｎｖｉｖｏ）（実験例６）のようなｉｎｖｉｖｏ実験を行うことにより、強力であることが立証され、本発明の混合抽出物が、局所薬剤または化粧料組成物の形態で皮膚創傷の改善または治療に非常に有用であることを確認した。

本発明のまた別の目的は、皮膚再生を促進させ、皮膚創傷を治療または改善するのに有効な量で、竜眼肉、藁本およびオンジの混合生薬抽出物を有効成分として含む化粧料組成物を提供することである。

本発明の化粧料組成物は、組成物の総重量を基準に０．００１－４０重量％、より好ましくは、０．０１－１０重量％の本発明の組成物を含有することが好ましい。他の成分は、当業界で周知の従来の化粧料組成物の成分の混合物であってもよい。

前記組成を含有する化粧料剤形は、例えば、化粧水、スキンソフナー、スキントナー、収斂剤、ローション、ミルクローション、モイスチャーローション、栄養ローション、マッサージクリーム、栄養クリーム、水分クリーム、ハンドクリーム、ファンデーション、エッセンス、栄養エッセンス、パック、クレンジングフォーム、クレンジングローション、クレンジングクリーム、ボディローション、ボディクレンザー、トリートメント、美容液などの任意の形態で調製することができる。

以下、下記の剤形化方法および賦形剤は、単なる例示に過ぎないものであり、いかなる方法でも本発明を制限するものではない。

本発明の化粧料組成物は、水溶性ビタミン、脂溶性ビタミン、ペプチドポリマー、多糖類ポリマー、スフィンゴ脂質および海藻抽出物からなる群から選択される添加剤をさらに含むことができる。

好ましい水溶性ビタミンは、化粧料に配合できるものはであるが、様々なビタミン、例えば、ビタミンＢ_１、Ｂ_２、Ｂ_６、ピリドキシン、ピリドキシンＨＣｌ、ビタミンＢ_１２、パントテン酸、ニコチン酸、ニコチンアミド、葉酸、ビタミンＣ、ビタミンＨなど、それらの塩、例えば、チアミンＨＣｌ塩、アスコルビン酸Ｎａ塩等またはそれらの誘導体、例えば、アスコルビン酸－２－ホスホン酸Ｎａ塩、アスコルビン酸－２－ホスホン酸Ｍｇ塩が好ましく、これらは、微生物変換法、微生物培養物からの精製法、酵素法または化学合成法のような従来の方法により得ることができる。

好ましい脂溶性ビタミンは、化粧料に配合できるものではあるが、本発明の実施例で使用される脂溶性ビタミンを含む、様々なビタミン、例えば、ビタミンＡ、Ｄ_２、Ｄ_３、Ｅ（ｄｌ－ａ－トコフェロール、ｄ－ａ－トコフェロール、ｄ－ｄ－トコフェロール）、およびこれらの誘導体、例えば、パルミチン酸アスコルビン酸、ステアリン酸アスコルビン酸、ジパルミチン酸アスコルビン酸、酢酸－ｄｌ－ａ－トコフェロール、ニコチン酸ｄｌ－ａ－トコフェロールビタミンＥ、ｄｌ－パントテニルアルコール、Ｄ－パントテニルアルコール、パントテニルエチルエーテルなどが好ましく、これらは微生物変換法、微生物培養物からの精製法、酵素的方法または化学合成法などのような従来の方法によって得ることができる。

好ましいペプチドポリマーは、化粧料に配合できるものではあるが、本発明の実施例で使用されるペプチドポリマーを含む、コラーゲン、加水分解性コラーゲン、ゼラチン、エラスチン、加水分解性ゼラチン、ケラチンなどが好ましい。

好ましい多糖類ポリマーは、化粧料に配合できるものではあるが、ヒドロキシエチルセルロース、キサンタンガム、ヒアルロン酸Ｎａ、コンドロイチン硫酸またはそれらの塩（Ｎａ塩など）などが好ましい。例えば、コンドロイチン硫酸またはその塩などは、通常、哺乳動物または魚類から精製して使用することができる。

好ましいスフィンゴ脂質は、化粧料に配合できるものではあるが、セラミド、フィトスフィンゴシン、スフィンゴ－リポポリサッカライドなどが好ましい。スフィンゴ脂質は、哺乳動物、魚類、貝類、酵母または植物などから従来の方法により精製して得ることができる。

好ましい海藻抽出物（ｓｅａｗｅｅｄｅｘｔｒａｃｔ）は、化粧料に配合できるものではあるが、褐藻類、紅藻類、緑藻類などの抽出物またはこれらより単離した精製カラギーナン、アルギン酸、アルギン酸Ｎａ、Ｋが好ましい。アルゲエキス（ａｌｇａｅｅｘｔｒａｃｔ）は、海藻から従来の方法により精製して得ることができる。

本発明の化粧料組成物は、前記必須成分と共に必要に応じて従来の化粧料組成物に使用される他の成分と組み合わせることができる。

上記に記載された好ましい他の成分は、油成分、保湿剤、軟化剤、界面活性剤、有機または無機染料、有機粉体、紫外線吸収剤、保存剤、防腐剤、酸化防止剤、植物抽出物、ｐＨ調整剤、アルコール、顔料、香水、冷媒、血液循環剤（ｃｉｒｃｕｌａｔｏｒ）、制汗剤（ａｎｔｉｈｉｄｒｏｔｉｃ）、蒸留水などを含んでもよい。

好ましい油成分は、エステル油、炭化水素油、シリコーンオイル、フッ素油、動物性油、植物性油などを含んでもよい。

上記に記載の好ましいエステル油は、トリ－２－エチルヘキサン酸グリセリル、２－エチルヘキサン酸セチル、ミリスチン酸イソプロピル、ミリスチン酸ブチル、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸エチル、パルミチン酸オクチル、イソステアリン酸イソセチル、ステアリン酸ブチル、リノール酸エチル、リノール酸イソプロピル、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソセチル、ミリスチン酸イソステアリル、パルミチン酸イソステアリル、ミリスチン酸オクチルドデシル、イソステアリン酸イソセチル、セバシン酸ジエチル、アジピン酸イソプロピル、ネオペンタン酸イソアルキル、グリセリルトリ（カプリル、カプリン酸）、トリ２－エチルヘキサン酸トリメチロールプロパン、トリイソステアリン酸トリメチロールプロパン、テトラ２－エチルヘキサン酸ペンタエリトリトール、カプリル酸セチル、ラウリン酸デシル、ラウリン酸ヘキシル、ミリスチン酸デシル、ミリスチン酸ミリスチル、ミリスチン酸セチル、ステアリン酸ステアリル、オレイン酸デシル、リシノール酸セチル、ラウリン酸イソステアリル、ミリスチン酸イソトリデシル、パルミチン酸イソセチル、ステアリン酸オクチル、ステアリン酸イソセチル、オレイン酸イソデシル、オレイン酸オクチルドデシル、リノール酸オクチルドデシル、イソステアリン酸イソプロピル、２－エチルヘキサン酸セトステアリル、２－エチルヘキサン酸ステアリル、イソステアリン酸ヘキシル、ジオクタン酸エチレングリコール、ジオレイン酸エチレングリコール、ジカプリン酸プロピレングリコール、ジ（カプリル、カプル酸）プロピレングリコール、ジカプリル酸プロピレングリコール、ジカプリン酸ネオペンチルグリコール、ジオクタン酸ネオペンチルグリコール、トリカプリル酸グリセリル、トリウンデシル酸グリセリル、トリパルミチン酸グリセリル、トリイソステアリン酸グリセリル、ネオペンタン酸オクチルドデシル、オクタン酸イソステアリル、イソノナン酸オクチル、ネオデカン酸ヘキシルデシル、ネオデカン酸オクチルドデシル、イソステアリン酸イソセチル、イソステアリン酸イソステアリル、イソステアリン酸オクチルドデシル、ポリグリセリンオレアノール酸エステル、イソステアリン酸ポリグリセリンエステル、クエン酸トリイソセチル、クエン酸トリイソアルキル、クエン酸トリイソオクチル、乳酸ラウリル、乳酸ミリスチル、乳酸セチル、乳酸オクチルデシル、クエン酸トリエチル、クエン酸アセチルトリエチル、クエン酸アセチルトリブチル、クエン酸トリオクチル、マレイン酸ジイソステアリル、ジ２－エチルヘキシルヒドロキシステアリン酸、コハク酸２－エチルヘキシル、アジピン酸ジイソブチル、セバシン酸ジイソプロピル、セバシン酸ジオクチル、ステアリン酸コレステリル、イソステアリン酸コレステリル、ヒドロキシステアリン酸コレステリル、ヒドロキシステアリン酸コレステリル、オレイン酸コレステリル、オレイン酸ジヒドロコレステリル、イソステアリン酸フィトステリル、オレイン酸フィトステリル、１２－ステアロイルヒドロキシステアリン酸イソセチル、１２－ステアロイルヒドロキシステアリン酸ステアリル、１２－ステアロイルヒドロキシステアリン酸イソステアリルを含んでもよい。

上記に記載の好ましい炭化水素油は、スクアレン、流動パラフィン、α－オレフィンオリゴマー、イソパラフィン、セレシン、パラフィン、流動イソパラフィン、ポリブデン、微細結晶質ワックス、ワセリンなどを含んでもよい。
上記に記載の好ましいシリコーンオイルは、ポリメチルシリコーン、メチルフェニルシリコーン、メチルシクロポリシロキサン、オクタメチルポリシロキサン、デカメチルポリシロキサン、ドデカメチルシクロシロキサン、ジメチルシロキサン－メチルセチルオキシシロキサン共重合体、ジメチルシロキサン－メチルステアロキシシロキサン共重合体、アルキル変性シリコーンオイル、アミノ変性シリコーンオイルなどを含んでもよい。

上記に記載の好ましいフッ素油は、パーフルオロポリエーテルなどを含んでもよい。

好ましい動物性油または植物性油は、アボカド油、アーモンド油、オリーブ油、ごま油、米糊油、紅花油、大豆油、トウモロコシ油、菜種油、アミグダリンオイル、パーム核油、パーム油、ヒマシ油、ヒマワリ油、フルーツ油、綿実油、ヤシ油（ｃｏｃｏｎｕｔｐａｌｍｏｉｌ）、ククイナッツ油（ｃｕｃｕｉｎｕｔｏｉｌ）、小麦胚芽油（ｗｈｅａｔｅｍｂｒｙｏｂｕｄｏｉｌ）、米胚芽油、シア脂、月見草油、マカデイミアナッツ油（ｍａｒｋｅｒｄａｙｍｉａｎｕｔｏｉｌ）、メドフォーム油（ｍｅｄｏｈｏｍｅｏｉｌ）、卵黄油、ラノリン、ハンプシード油、ミンク油、オレンジラフィー油（ｏｒａｎｇｅｒｕｐｐｙｏｉｌ）、ホホバ油、カナワワックス、液体ラノリン、固形ヒマシワックスなどを含んでもよい。

好ましい保湿剤は、水溶性低分子保湿剤、親油性低分子保湿剤、水溶性重合体および脂溶性重合体を含むことができる。

具体的に、好ましい水溶性低分子保湿剤は、セリン、グルタミン、ソルビトール、マンニトール、ピロリドン－カルボン酸Ｎａ、グリセリン、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール、エチレングリコール、ポリエチレングリコール（重合度＞２）、ポリプロピレングリコール（重合度＞２）、乳酸、乳酸塩などを含んでもよい。

好ましい脂溶性低分子保湿剤としては、コレステロール、コレステリルエステルなどを含んでもよい。

好ましい水溶性重合体は、カルボキシビニルポリマー、ポリアスパラギン酸塩、トラガカント、キサンタンガム、ＨＭＣ（ヒドロキシメチルセルロース）、ＨＥＣ（ヒドロキシエチルセルロース）、ＨＰＣ（ヒドロキシプロピルセルロース）、カルボキシメチルセルロース、水溶性キチン、キトサン、デキストリンなどを含んでもよい。

好ましい脂溶性重合体は、ポリビニルピロリドン－エイコセン共重合体、ポリビニルピロリドン－ヘキサデセン共重合体、ニトロセルロース、デキストリン脂肪酸エステル、シリコーンポリマーなどを含んでもよい。

好ましい軟化剤は、長鎖アシルグルタミン酸コレステリルエステル、ヒドロキシステアリン酸コレステリル、１２－ヒドロキシステアリン酸、ロジン酸（ｒｏｇｉｃａｃｉｄ）、ラノリン脂肪酸コレステリルエステルなどを含んでもよい。

好ましい界面活性剤は、非イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、両性界面活性剤などを含んでもよい。

具体的には、好ましい非イオン性界面活性剤は、自己乳化型モノステアリン酸グリセリン、プロピレングリコール脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）ソルビタン脂肪酸エステル、ＰＯＥソルビタン脂肪酸エステル、ＰＯＥグリセリン脂肪酸エステル、ＰＯＥアルキルエーテル、ＰＯＥ脂肪酸エステル、ＰＯＥ硬化ヒマシ油、ＰＯＥヒマシ油、ＰＯＥ－ＰＯＰ共重合体、ＰＯＥ－ＰＯＰアルキルエーテル、ポリエーテル変性シリコーン、ラウリン酸アルカノールアミド、アルキルアミンオキシド、水素添加大豆リン脂質などを含んでもよい。

好ましいアニオン性界面活性剤は、脂肪酸石鹸、アルファ－アシルスルホン酸、スルホン酸アルキル、スルホン酸アルキルアリ、アルキルナフタレンスルホン酸、アルキルスルホン酸、ＰＯＥアルキルエーテル硫酸塩、アルキルアミド硫酸塩、アルキルリン酸塩、ＰＯＥアルキルリン酸塩、アルキルアミドリン酸塩、アルキルロイルアルキルタウリン塩、Ｎ－アシルアミノ酸塩、ＰＯＥアルキルエーテルカルボン酸塩、アルキルスルホコハク酸塩、アルキルスルホ酢酸塩、アシル化加水分解性コラーゲンペプチド塩、パーフルオロアルキルリン酸エステルなどを含んでもよい。

好ましいカチオン性界面活性剤は、塩化アルキルトリメチルアンモニウム、塩化ステアリルトリメチルアンモニウム、臭化ステアリルトリメチルアンモニウム、塩化セトステアリルトリメチルアンモニウム、塩化ジステアリルジメチルアンモニウム、塩化ステアリルジメチルベンジルアンモニウム、臭化ベヘニルトリメチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウム、ステアリン酸ジエチルアミノエチルアミド、ステアリン酸ジメチルアミノプロピルアミド、ラノリン誘導体第四級アンモニウムなどを含んでもよい。

好ましい両性界面活性剤は、カルボキシベタイン型、アミドベタイン型、ヒドロキシスルホベタイン型、ホスホベタイン型、アミノカルボン酸、イミダゾリン誘導体型、アミドアミン型などを含んでもよい。

好ましい有機および無機染料は、無機染料として、ケイ酸、無水ケイ酸、ケイ酸マグネシウム、タルク、セリサイト、マイカ、カオリン、ベンガラ、クレイ、ベントナイト、チタンフィルムマイカ（ｔｉｔａｎｆｉｌｍｍｉｃａ）、オキシ塩化ビスマス、酸化ジルコニウム、酸化マグネシウム、酸化亜鉛、酸化チタン、酸化アルミニウム、硫酸カルシウム、硫酸バリウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、酸化第一鉄、酸化クロム、水酸化クロム、カラミン、カーボンブラックおよびこれらの複合体；有機染料として、ポリアミド、ポリエステル、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリウレタン、ビニル樹脂、尿素樹脂、フェノール樹脂、フッ素樹脂、ケイ素樹脂（ｓｉｌｉｃｏｎｅｒｅｓｉｎ）、アクリル樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、ポリカーボネート樹脂、スチレン共－ジビニルベンゼン共重合体、シルクパウダー、セルロース、ＣＩ顔料イエロー、ＣＩ顔料オレンジ；およびこれらの複合体などを含んでもよい。

好ましい有機粉体は、金属石鹸、例えば、ステアリン酸カルシウム；アルキルリン酸金属塩（ａｌｋｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｍｅｔａｌｓａｌｔ）、例えば、セチルリン酸亜鉛ナトリウム、ラウリル酸亜鉛、ラウリル酸カルシウム；アシルアミノ酸多価金属塩、例えば、Ｎ－ラウロイル－ｂ－アラニンカルシウム、Ｎ－ラウロイル－ｂ－アラニン亜鉛、Ｎ－ラウロイル－グリシンカルシウムなど；アミドスルホン酸多価金属塩、例えば、Ｎ－ラウロイル－タウリンカルシウム、Ｎ－パルミトイル－タウリンカルシウム；Ｎ－アシル塩基性アミノ酸、例えば、Ｎε－ラウロイル－Ｌ－リジン、Ｎε－パルミトイル－リジン、Ｎα－パルミトイルオルニチン、Ｎα－ラウロリアルギニン、硬化ラノリン脂肪酸アシルアルギニンなど；Ｎ－アシルポリペプチド、例えば、Ｎ－ラウロイルグリシルグリシン；α－アミノ脂肪酸、例えば、α－アミノカプリル酸、α－アミノラウリン酸など；ポリエチレン、ポリプロピレン、ナイロン、ポリメチルメタクリレート、ポリスチレン、スチレン－ジビニルベンゼン共重合体、四フッ化エチレンなどを含んでもよい。

好ましい紫外線吸収剤は、パラアミノ安息香酸、パラアミノ安息香酸エチル、パラアミノ安息香酸アミル、パラアミノ安息香酸オクチル、サリチル酸エチレングリコール、サリチル酸フェニル、サリチル酸オクチル、サリチル酸ベンジル、サリチル酸ブチルフェニル、サリチル酸ホモメンチル、けい皮酸ベンジル、パラメトキシけい皮酸２－エトキシエチル、パラメトキシけい皮酸オクチル、ジパラメトキシけい皮酸モノ－２－エチルヘキサングリセリル、パラメトキシけい皮酸イソプロピル、ジイソプロピル－ジイソプロピルけい皮酸エステル混合物、ウロカニン酸、ウロカニン酸エチル、ヒドロキシメトキシベンゾフェノン、ヒドロキシメトキシベンゾフェノンスルホン酸およびその塩、ジヒドロキシメトキシベンゾフェノン、ジヒドロキシメトキシベンゾフェノンジスルホン酸ナトリウム（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚｏｐｈｅｎｏｎｅｄｉｓｕｌｆｏｎａｔｅＮａ）、ジヒドロキシベンゾフェノン、テトラヒドロキシベンゾフェノン、４－ｔｅｒｔ－ブチル－４’－メトキシジベンゾイルメタン、２，４，６－トリアニリノ－ｐ－（カルボ－２’－エチルヘキシル－１’－オキシ）－１，３，５－トリアジン、２－（２－ヒドロキシ－５－メチルフェニル）ベンゾトリアゾールなどを含んでもよい。

好ましい保存剤は、ヒノキチオール、三塩素酸（ｔｒｉｃｈｌｏｒｉｃａｃｉｄ）、トリクロロヒドロキシジフェニルエーテル、クロロヘキシジングルクロネート、フェノキシエタノール、レゾルシン、イソプロピルメチルフェノール、アズレン、サリチル酸、ピリチオン亜鉛、ベザルコニウムＨＣｌ、感光素３０１、モノニトログアヤコールＮａ、ウンデシレン酸などを含んでもよい。

好ましい酸化防止剤は、ブチルヒドロキシアニソール、没食子酸プロピル、エリソルベートなどを含んでもよい。

好ましいｐＨ調整剤は、クエン酸、クエン酸ナトリウム、リンゴ酸、リンゴ酸ナトリウム、フマル酸、フマル酸ナトリウム、コハク酸、コハク酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、リン酸水素ナトリウムなどを含んでもよい。

好ましいアルコールは、セチルアルコールなどを含んでもよい。

また、上記成分に添加できる他の成分およびその量は、本発明の目的および効果の範囲内に限定されないが、その他の成分の含有量は、全組成物の含有量のうち０．０１－５％であることが好ましく、より好ましくは、０．０１－３％の範囲である。

本発明の化粧料組成物は、溶液、エマルジョン、粘着性混合物などに変形されることができる。

水溶性ビタミン、脂溶性ビタミン、ペプチドポリマー、多糖類ポリマー、スフィンゴ脂質、海藻抽出物などのような上記成分および必要に応じて上記成分の他に添加することができる添加成分は、文献（ＭａｔｓｕｍｏｔｏＭｉｔｈｉｏ；Ｍａｎｕａｌｆｏｒｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌａｐｐｌｉｅｄｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ．ＳｅｉｓｉＰｒｅｓｓ，１ｓｔＥｄ．，１９８５）に記載された従来の方法により得ることができる。

本発明の化合物は、毒性および副作用がないので、安全に使用することができる。

本発明の精神または範囲から逸脱することなく、本発明の組成物、使用および製剤に様々な変更および変形を行うことができることは、当業者にとって明らかであろう。

本発明は、以下の実施例によってより具体的に説明される。しかし、本発明はいかなる方法であってもこれらの実施形態に限定されないことを理解すべきである。

以下の実施例および実験例は、本発明の範囲を限定することなく本発明をさらに例示するためのものである。

実施例１．本発明の混合抽出物（１）の調製
乾燥竜眼肉（ＬｏｎｇａｎａｅＡｒｉｌｌｕｓ）（ＢｕｙｏｕｎｇＹａｋｕｐＣｏ．Ｌｔｄ．）２０ｇ、乾燥藁本（ＬｉｇｕｓｔｉｃｉＴｅｎｕｉｓｓｉｍｉＲｈｉｚｏｍａ）（ＢｕｙｏｕｎｇＹａｋｕｐＣｏ．Ｌｔｄ．）２０ｇおよび乾燥オンジ（Ｐｏｌｙｇａｌａｅｒａｄｉｘ）（ＢｕｙｏｕｎｇＹａｋｕｐＣｏ．Ｌｔｄ．）２０ｇを小片に切断した後、６倍体積（ｖ／ｗ）の２０％エタノール水溶液と混合し、その混合物を９０±５℃で３日間還流抽出した。抽出物をろ紙（孔径１０μｍ未満）を通して濾過させ、残渣を除去した後、残りの残渣を４倍体積（ｖ／ｗ）の２０％エタノール水溶液でさらに２回抽出し、抽出物をろ紙（孔径、１０μｍ未満）を通して濾過した。

収集した抽出物を一緒に混合し、真空下で濃縮し（１６－２１ブリックス）濃縮抽出物を得た。濃縮した抽出物を凍結乾燥過程により乾燥させ、粉砕し（５０メッシュ未満）、本発明の混合抽出物（１）（以下、「ＷＩＮ－１００１Ｘ」と表す）２０．５ｇを得た（乾燥基準粉末、収率３３．４％）。

実施例２－６．本発明の混合抽出物（２）－（６）の調製
実施例１に開示されたものとは異なる混合比および異なる溶媒を用いたことを除いては、全ての手順が実施例１と同様であり、竜眼肉（ＬＡ）、藁本（ＬＴ）およびオンジ（ＰＲ）の様々な本発明の混合抽出物、すなわち、本発明の混合抽出物（２）ないし本発明の混合抽出物（６）を得た。これを以下の実験にて試験試料として使用する。

実験例１．サイトカイン発現に対する抑制効果（ｉｎｖｉｔｒｏ）
本発明の抽出物の抗炎症活性を決定するために、文献（Ｊｅｏｎｇｅｔａｌ．，２０１９，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，Ｍａｙ；１３９（５）：ｐｐ１０９８－１１０９）に記載された手順に従って、ＨａＣａＴ細胞を用いた以下のサイトカイン発現抑制試験を行った。

１０％ウシ胎児血清、１００単位／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｄ６４２９、Ｓｉｇｍａ－ＡｌｄｒｉｃｈＣｏ．Ｌｔｄ）を含有するＤＭＥＭ培地にＨａＣａＴ細胞（ヒト表皮角化細胞、３００４９３、ＣＬＳ）を接種し、最適湿度（８５～９５％）および５％のＣＯ_２雰囲気を維持しながらインキュベーター（ＨＥＲＡｃｅｌｌ１５０ｉ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＣｏ．Ｌｔｄ．）でインキュベートした。

遺伝子発現試験を行うために、インキュベートした細胞を１２ウェルに移し、５０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦアルファ（ＲＣ２１４－１２，ＢｉｏｂａｓｉｃＣｏ．Ｌｔｄ）をそれと共に１時間処理し、炎症反応を誘導した。デキサメタゾン（２００ｎＭ、陽性対照群、「ＤＥＸ」、Ｄ４９０２,Ｓｉｇｍａ－ＡｌｄｒｉｃｈＣｏ．Ｌｔｄ．）および蒸留水（陰性対照群、「ＤＩＷ」）を比較対照群として使用した。

炎症誘発１時間後、実施例で調製した本発明の抽出物１μｇ／ｍｌを同じ培地で処理し、１時間インキュベートした。インキュベーションした後、細胞からＲＮＡ（ＦＡＴＲＲ－００１、Ｆａｖｏｒｇｅｎ）を抽出し、ｃＤＮＡ合成キット（ＲＲＯ３６Ａ、ＴＡＫＡＲＡ）を用いてＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。合成されたｃＤＮＡとＳｙｂｒｇｒｅｅｎキット（ＲＴ５００Ｍ、Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ）を用いて重合反応を行った後、表２に示すような皮膚炎症に関与する様々なサイトカインに対するプライマー（ＲＰＬＰＯ、ＴＳＬＰ、ＧＭ－ＣＳＦ、およびＩＬ－１β）を用いてリアルタイムＰＣＲを行った。

ＲＴ－ＰＣＲの定量的結果を示す表３から分かるように、本発明の抽出物で処理された試験試料群は、蒸留水（ＤＩＷ）で処理した陰性対照群に比べて皮膚炎症に関与する様々なサイトカインの発現レベルが大幅に抑制されており、皮膚炎症に関与する様々なサイトカインの発現に対する試験試料の抑制活性は、デキサメタゾン（ＤＥＸ）で処理した陽性対照群と同等であることが確認された。

したがって、実施例１～６で調製された各種の本発明の混合抽出物は、皮膚炎症に対する強力な抑制効果があることが確認された。

実験例２．細胞増殖促進効果（ｉｎｖｉｔｒｏ）。
本発明の抽出物の促進活性を決定するために、文献（Ｌｅｅｅｔａｌ．，２０２０，ＩｎｔＪＭｏｌＳｃｉ．２０２０Ｊａｎ５；２１（１）：３４３）に記載された手順に従って、ＨａＣａＴ細胞を用いた以下の細胞増殖試験を行った。

１０％ウシ胎児血清、１００単位／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ培地（Ｄ６４２９、Ｓｉｇｍａ－ＡｌｄｒｉｃｈＣｏ．Ｌｔｄ）にＨａＣａＴ細胞（ヒト表皮角化細胞、３００４９３、ＣＬＳ）、脳微小血管内皮細胞（ｂＥＮＤ．３、ＣＲＬ－２２９９ＡＴＣＣ）および線維芽細胞（ＮＩＨ３Ｔ３、ＣＲＬ－１６５８、ＡＴＣＣ）を接種し、最適湿度（８５～９５％）および５％のＣＯ_２雰囲気を維持しながらインキュベーター（ＨＥＲＡｃｅｌｌ１５０ｉ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＣｏ．Ｌｔｄ．）でインキュベートした。
本発明の抽出物の細胞増殖促進効果を決定するために、インキュベートした細胞を４８ウェルに移し、実施例で調製した本発明の抽出物１μｇ／ｍｌと蒸留水（陰性対照群、「ＤＩＷ」）を処理した。

１０μＬ／ｍｌのＱｕａｎｔｉ－Ｍａｘ^ＴＭ（ＱＭ１０００、ＢＩＯＭＡＸ）をそれぞれ０時間、２４時間、４８時間、および７２時間間隔で繰り返し細胞に処理し、３０分間インキュベートした。インキュベーションした後、マイクロプレートリーダー（ＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ２５０、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ）を用いて各群の４５０ｎｍでの吸光度を測定し、その試験結果を下記表４に示す。

下記表４に示すように、実施例１～６で調製された本発明の多様な混合抽出物が強力な細胞増殖促進効果を有することが確認された。

実験例３．細胞創傷回復効果（ｉｎｖｉｔｒｏ）
本発明の抽出物の回復活性を決定するために、文献（Ｎａｅｔａｌ．，２０１６，ＪＩｎｖｅｓｔＤｅｒｍａｔｏｌ．２０１６Ａｐｒ；１３６（４）：８４７－８５８）に記載された手順に従って、ＨａＣａＴ細胞を用いた以下の細胞創傷試験を行った。

１０％小胎児血清、１００単位／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地（Ｄ６４２９、Ｓｉｇｍａ－ＡｌｄｒｉｃｈＣｏ．Ｌｔｄ）にＨａＣａＴ細胞（ヒト上皮角質細胞、３００４９３、ＣＬＳ）を接種し、最適湿度（８５～９５％）および５％のＣＯ_２の雰囲気を維持しながらインキュベーター（ＨＥＲＡｃｅｌｌ１５０ｉ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＣｏ．Ｌｔｄ．）でインキュベートした。

本発明の抽出物の細胞創傷回復効果を決定するために、インキュベートした細胞を６ウェルに移し、培地の細胞コンフルエントが約９０％に達するまでインキュベートした。インキュベートした培地を無血清培地（Ｄ６４２９、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で２４時間さらにインキュベートした。培養細胞を２００μｌのチップ（ＫＧ１２１２－Ｌ、Ｋｉｒｇｅｎ）でスクラッチした後、培地を実施例で調製した１μｇ／ｍｌの本発明の抽出物を含有する新しい２％ＦＢＳ培地（Ｄ６４２９、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）に移した。顕微鏡（ＡＭＥＸ１０００、ＥＶＯＳＸＬＣｏｒｅ）を用いて回復様子を写真で撮影し、時間別に比較し、陰性対照群としては蒸留水（陰性対照群、「ＤＩＷ」）を使用した。

下記表５に示すように、実施例１～６で調製した本発明の多様な混合抽出物が細胞創傷に強力な回復効果を有することが確認された。

実験例４．慢性潰瘍に対する治療効果（ｉｎｖｉｖｏ）
本発明の抽出物の慢性潰瘍に対する治療効果を確認するために、参考文献（ＬｏｎｇＭ、ＲｏｊｏｄｅｌａＶｅｇａＭ、ＷｅｎＱ、ＢｈａｒａｒａＭ、ＪｉａｎｇＴ、ＺｈａｎｇＲ、ＺｈｏｕＳ、ＷｏｎｇＰＫ、ＷｏｎｄｒａｋＧＴ、ＺｈｅｎｇＨ、ＺｈａｎｇＤＤ（２０１６）ＡｎＥｓｓｅｎｔｉａｌＲｏｌｅｏｆＮＲＦ２ｉｎＤｉａｂｅｔｉｃＷｏｕｎｄＨｅａｌｉｎｇ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ．６５：７８０－７９３）に開示された方法に従ってマウスを用いた動物モデル試験を行った。

４－１．糖尿病性マウスモデルの作製
８週齢のＣ５７ＢＬ雄マウス（２３０ｇ、ＤａｅｈａｎｂｉｏｌｉｎｋＣｏ．Ｌｔｄ）を、温度および湿度が２２±１℃および５０±５％に維持され、１２時間および夜間毎に光を調節するケージで飼育した。

１週間環境に順応させた後、マウスを試験試料群と対照群（ケージ当たりマウス１匹）に分類した。５０ｍｇ／ｋｇのストレプトゾトシン（Ｓ０１３０，ＳＴＺ，Ｓｉｇｍａ－ＡｌｄｒｉｃｈＵＳＡ）を５日連続試験試料群に腹腔内に投与し、０．０５Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５，ＩＢＳ－ＢＣ００３６，Ｉｎｔｒｏｎ，Ｋｏｒｅａ）を５日間連続陰性対照群に腹腔内投与した。

投与から３週間後、４時間おきに血液試料を採取し、マウス尾の空腹時の血糖値を測定し、実験では空腹時の血糖が３５０ｍｇ／ｄｌ超のマウスのみを選別した。

５０ｍｇ／ｋｇのストレプトゾトシン（Ｓ０１３０、ＳＴＺ、Ｓｉｇｍａ－ＡｌｄｒｉｃｈＵＳＡ）を５日連続試験試料群に腹腔内に投与し（図２参照）、０．０５Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５、ＩＢＳ－ＢＣ００３６、Ｉｎｔｒｏｎ、Ｋｏｒｅａ）を５日連続陰性対照群に腹腔内投与した。４時間の空腹時の血糖値とマウスの体重を３週間と５週間毎に測定した。

表６および表７に示すように、ＳＴＺ－誘発糖尿病マウスの体重が減少し、空腹時の血糖値が上昇することが確認された。空腹時の血糖値が３５０ｍｇ／ｄｌ超の選択されたマウスを糖尿病モデル群とみなした（ＬｏｎｇＭ，ＲｏｊｏｄｅｌａＶｅｇａＭ，ＷｅｎＱ，ＢｈａｒａｒａＭ，ＪｉａｎｇＴ，ＺｈａｎｇＲ，ＺｈｏｕＳ，ＷｏｎｇＰＫ，ＷｏｎｄｒａｋＧＴ，ＺｈｅｎｇＨ，ＺｈａｎｇＤＤ（２０１６）ＡｎＥｓｓｅｎｔｉａｌＲｏｌｅｏｆＮＲＦ２ｉｎＤｉａｂｅｔｉｃＷｏｕｎｄＨｅａｌｉｎｇ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ．６５：７８０－７９３）。

４－２．実験方法（慢性潰瘍に対する治療効果）
慢性潰瘍に対する本発明の抽出物の治療効果を確認するために、上記４－１段階で調製した糖尿病誘発マウスを使用した動物モデル試験を参考文献（ＬｏｎｇＭ，ＲｏｊｏｄｅｌａＶｅｇａＭ，ＷｅｎＱ，ＢｈａｒａｒａＭ，ＪｉａｎｇＴ，ＺｈａｎｇＲ，ＺｈｏｕＳＷｏｎｇＰＫ，ＷｏｎｄｒａｋＧＴ，ＺｈｅｎｇＨ，ＺｈａｎｇＤＤ（２０１６）ＡｎＥｓｓｅｎｔｉａｌＲｏｌｅｏｆＮＲＦ２ｉｎＤｉａｂｅｔｉｃＷｏｕｎｄＨｅａｌｉｎｇ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ．６５：７８０－７９３）に記載の方法に従って行った。

８週齢のＣ５７ＢＬ雄マウス（２３０ｇ、ＤａｅｈａｎｂｉｏｌｉｎｋＣｏ．Ｌｔｄ）を上記４－１段階で調製した（ａ）対照群と（ｂ）糖尿病誘発マウス群に分類し、３００μｌのＡｖｅｒｔｉｎ（２５ｍｇ／ｍＬＴ４８４０２、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）を腹腔内注射してマウスを麻酔させた。

麻酔になったことを確認した後、電気シェーバー（３２７／８０８、ＲＩＫＥＩ、Ｔａｉｗａｎ）を使用してマウスの背部の毛を取り除き、５ｍｍ生検トレパン（ＢＰ－５０Ｆ、ＫａｉＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、ＵＳＡ）および外科用はさみ（ＰＦ）－２４．１０、Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ，Ｐａｋｉｓｔａｎ）を用いて５ｍｍ円形の背部皮膚の全層を切り取った。ＤＩＷ（１０ｍｇ／ｍＬ）に溶解させた本発明の抽出物３５μｌを試験試料群の皮膚創傷に毎日塗布し、３５μｌのＤＩＷを陰性対照群の皮膚創傷に毎日塗布した。

皮膚創傷をデジタルカメラ（ＬＤＶ２０デジタルカメラ）で１４日間撮影および画像化し、皮膚創傷の大きさをＰｈｏｔｏｓｈｏｐＣＳ５プログラム（Ａｄｏｂｅ）で定量的に測定した。

皮膚創傷の治癒率は、下記式１に従って各試料を第１創傷の大きさで除して計算した。

［数式１］
皮膚創傷の治癒率＝（Ｎ日／０日）×１００

４－３．試験結果（皮膚潰瘍）
図３に示すように、陰性対照群がＤＩＷで治療を受けた場合に比べて糖尿病誘導群の治癒率が減少したのに対し、試験試料群の治癒率は、糖尿病誘導群および陰性対照群に比べて大幅に増加した。

創傷部位をカメラ（ＬＧＶ２０携帯電話カメラ）で撮影し、創傷面積を計算した後、ピクセル数を計算し、定量的に比較した。表８に示すように、本発明の混合抽出物は、皮膚創傷損傷後６日目から陰性対照群に比べて糖尿病マウスの皮膚潰瘍部位に対してより速い治癒効果を示すことが確認された。

実験例５．皮膚創傷回復効果（ｉｎｖｉｖｏ）
本発明の抽出物の皮膚創傷の回復効果を確認するために、上記４－１段階で調製した糖尿病誘発マウスを対象とした試験試料群と対照群との組織学的差異を、参考文献（ＬｏｎｇＭ，ＲｏｊｏｄｅｌａＶｅｇａＭ，ＷｅｎＱ，ＢｈａｒａｒａＭ，ＪｉａｎｇＴ，ＺｈａｎｇＲ，ＺｈｏｕＳ，ＷｏｎｇＰＫ，ＷｏｎｄｒａｋＧＴ，ＺｈｅｎｇＨ，ＺｈａｎｇＤＤ（２０１６）ＡｎＥｓｓｅｎｔｉａｌＲｏｌｅｏｆＮＲＦ２ｉｎＤｉａｂｅｔｉｃＷｏｕｎｄＨｅａｌｉｎｇ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ．６５：７８０－７９３）に開示された方法に従って４－３段階の試験結果に基づいて行った。

５－１．実験方法（皮膚傷回復効果）
８週齢のＣ５７ＢＬ雄マウス（２３０ｇ、ＤａｅｈａｎｂｉｏｌｉｎｋＣｏ．Ｌｔｄ）を上記実験例４－１段階にて調製した（ａ）対照群と（ｂ）糖尿病誘発マウス群に分類し、３００μｌのＡｖｅｒｔｉｎ（２５ｍｇ／ｍＬＴ４８４０２、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）を腹腔内注射してマウスを麻酔させた。

麻酔になったことを確認した後、電気シェーバー（３２７／８０８、ＲＩＫＥＩ、Ｔａｉｗａｎ）を用いてマウスの背部の毛を取り除き、５ｍｍ生検パンチ（ＢＰ－５０Ｆ、ＫａｉＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、ＵＳＡ）および手術用はさみ（ＰＦ－２４．１０，Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ，Ｐａｋｉｓｔａｎ）を使用して５ｍｍ円の背部皮膚の全層を切り取った。ＤＩＷ（１０ｍｇ／ｍＬ）に溶解させた本発明の抽出物３５μｌ試験試料群の皮膚創傷に毎日塗布し、３５μｌのＤＩＷを陰性対照群の皮膚創傷に毎日塗布した。

皮膚損傷７日目に、創傷組織を外科的に分離し、分離した創傷組織を４％パラホルムアルデヒド溶液（１５８１２７、Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）に浸し、振とう機（４℃）で一晩撹拌しながら固定した。

翌日、創傷組織をＰＢＳが入ったバイアルに室温（ＲＴ）入れ、１５分おきに５回洗浄した。

その後、創傷組織を２５％、５０％、７５％、９５％、および１００％の順でエタノール溶液に入れ、振とう機（ＳＨＫ０３９、ＪｅｏｎＢｉｏｔｅｃｈ、Ｋｏｒｅａ）上で３０分間かけて脱水させた。

脱水した皮膚組織をキシレン溶液（１３３０－２０－７、ＤＵＫＳＡＮ、Ｋｏｒｅａ）に移し、真空クリーナーに２時間放置し、キシレンを組織に浸透するようにした。

組織の透明性を確認した後、キシレンに含有された組織を５５℃のオーブン（ｏｖｅｎ、３００、ＣＨＩＣＡＧＯＳＵＲＧＩＣＡＬ＆ＥＬＥＣＴＲＩＣＡＬＣＯ．，ＵＳＡ）に移し、パラフィン溶液（８０４２－４７－５、ＭｅｒｃｋＭｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で５回洗浄した。ここに最後のパラフィン溶液を加え、オーブンで一晩５５℃を維持した。翌日、組織をパラフィンに包埋し、室温（ＲＴ）で１時間硬化させた後、４℃で１日放置した。ミクロトーム（８２０、ＡＯＡＭＥＲＩＣＡＮＯＰＴＩＣＡＬ、ＵＳＡ）を用いて、パラフィン包埋組織を５μｍ厚に切片化し、このパラフィン切片をスライドガラス上に載せた。残りのパラフィンはキシレンで除去し、１００％、９５％、７５％、５０％、および２５％エタノール溶液の順に組織を水和させた。その後、組織をヘマトキシリンとエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色し、ＥＶＯＳＸＬＣｏｒｅ顕微鏡（ＵＳＡ，４０倍の大きさ）を用いて撮影し、解析した。

４－３．試験結果（皮膚創傷）
図４に示すように、興味深いことに、本発明の混合抽出物で処理した試験試料群では、対照群からは観察されなかった肉芽組織が観察された。肉芽組織は、創傷治癒の増殖中に形成された多数の新しい血管、線維芽細胞および成長因子などの細胞からなる（ＧｒｏｔｅｎｄｏｒｓｔＧＲ、ＭａｒｔｉｎＧＲ、ＰｅｎｃｅｖＤ、ＳｏｄｅｋＪ、ＨａｒｖｅｙＡＫ（１９８５）Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎｏｆｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎｔｉｓｓｕｅｆｏｒｍａｔｉｏｎｂｙｐｌａｔｅｌｅｔ－ｄｅｒｉｖｅｄｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｉｎｎｏｒｍａｌａｎｄｄｉａｂｅｔｉｃｒａｔｓ．Ｔｈｅｊｏｕｒｎａｌｏｆｃｌｉｎｉｃａｌｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ．７６：２３２３－２３２９．）。

試験試料群は、対照群に比べて肉芽組織の観察頻度が５倍以上高かった（表９参照）。

実験例６．成長因子に関与するプロ炎症性サイトカインの発現抑制効果（ｉｎｖｉｖｏ）
成長因子に関与するプロ炎症誘発性サイトカインの発現に本発明の抽出物が及ぼす抑制効果を確認するために、試験動物を用いたサイトカイン発現に対する以下の阻害試験を、文献（ＬｏｎｇＭ、ＲｏｊｏｄｅｌａＶｅｇａＭ、ＷｅｎＱ、ＢｈａｒａｒａＭ、ＪｉａｎｇＴ、ＺｈａｎｇＲ、ＺｈｏｕＳ、ＷｏｎｇＰＫ、ＷｏｎｄｒａｋＧＴ，ＺｈｅｎｇＨ，ＺｈａｎｇＤＤ（２０１６）ＡｎＥｓｓｅｎｔｉａｌＲｏｌｅｏｆＮＲＦ２ｉｎＤｉａｂｅｔｉｃＷｏｕｎｄＨｅａｌｉｎｇ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ．６５：７８０－７９３．）に開示された手順に従って行った。

慢性創傷におけるＭＭＰ－９の異常発現の増加と成長因子（ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦなど）の発現の減少が発見されたと報告がされている（ＴｒｅｎｇｏｖｅＮＪ、Ｂｉｅｌｅｆｅｌｄｔ－ＯｈｍａｎｎＨ、ＳｔａｃｅｙＭＣ（２００１）Ｍｉｔｏｇｅｎｉｃａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｃｙｔｏｋｉｎｅｌｅｖｅｌｓｉｎｎｏｎ－ｈｅａｌｉｎｇａｎｄｈｅａｌｉｎｇｃｈｒｏｎｉｃｌｅｇｕｌｃｅｒｓ．ＷｏｕｎｄＲｅｐａｉｒａｎｄＲｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．８：１３－２５．；ＡｒｍｓｔｒｏｎｇＤＧ，ＪｕｄｅＥＢ（２００２）ＴｈｅＲｏｌｅｏｆＭａｔｒｉｘＭｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓｉｎＷｏｕｎｄＨｅａｌｉｎｇ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＰｏｄｉａｔｒｉｃＭｅｄｉｃａｌＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ．９２：１２－１８）。

特に、成長因子は、創傷治癒を媒介する肉芽組織の形成を促進する（ＬｅｏｎｉＧ、ＮｅｕｍａｎｎＰＡ、ＳｕｍａｇｉｎＲ、ＤｅｎｎｉｎｇＴＬ、ＮｕｓｒａｔＡ（２０１５）Ｗｏｕｎｄｒｅｐａｉｒ：ｒｏｌｅｏｆｉｍｍｕｎｅ－ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．ＭｕｃｏｓａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ９５９－９６８．）。

したがって、本発明の混合抽出物の遺伝子発現抑制効果は、定量的ＲＴ－ＰＣＲおよびウェスタンブロット解析によって決定した。

６－１．ＲＮＡ抽出および定量的ＲＴ－ＰＣＲ
７日目に、外科用はさみ（ＰＦ－２４．１０、Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ、Ｐａｒｋｉｓｔａｎ）を用いて創傷の両側で３ｍｍだけ間隔をおいて、マウスの創傷皮膚組織を得た。皮膚組織を液体窒素（Ｄｏｎｇａｓ、Ｋｏｒｅａ）で凍結させ、全ＲＮＡを抽出した。トリＲＮＡ試薬（ＦＡＴＲ００１、Ｆａｖｏｒｇｅｎ、Ｔａｉｗａｎ）を凍結皮膚組織に添加し、ビーズ（Ｄ１０３１－０５、Ｂｅｄｂｕｇ、ＵＳＡ）を用いて破砕した。

０．２ｍＬのクロロホルム（６７－６６－３、ＪＵＮＳＥＩ、Ｊａｐａｎ）を十分に添加して混合した後、遠心分離機（５４１５Ｒ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて１２，０００ｒｐｍおよび４℃で１０分間遠心分離を行った。

上清液のみを新しい微量遠心管（Ｓ０４４３７８、ＳＡＲＳＴＥＤＴＡＧ５ＣＯ．ＫＧ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に移した後、０．４ｍＬのイソプロパノールを加えて混合し、遠心分離機（５４１５Ｒ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて１２，０００ｒｐｍおよび４℃で２０分間遠心分離し、ＲＮＡ生成物を沈殿させた。

ＲＮＡ沈殿物を７５％エタノールで洗浄した後、１２，０００ｒｐｍおよび４℃で１０分間遠心分離を行った。ＲＮＡをヌクレアーゼフリー水（Ｓ００２、Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ、Ｋｏｒｅａ）に溶解させた。

これに組換えＤＮａｓｅＩ（Ｍ０５９５、Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ、Ｋｏｒｅａ）を加え、３７℃のインキュベーター（ｉｎｃｕｂａｔｏｒ、ＢＦ－１５０Ｎ、Ｂｉｏｆｒｅｅ、Ｋｏｒｅａ）に３０分間放置した。これに８Ｍ塩化リチウム（Ｌ９６５０、Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）を加え、－２０℃で一晩単独で静置した。

翌日、１２，０００ｒｐｍおよび４℃で２０分間遠心分離した後、ＲＮＡ沈殿物を７５％エタノールで洗浄し、次いで１２，０００ｒｐｍおよび４℃で１０分間遠心分離した。ＲＮＡをヌクレアーゼフリー水（Ｓ００２、Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ、Ｋｏｒｅａ）に溶解させ、定量した。

ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ^ＴＭＲＴＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＲＲ０３６Ａ，Ｔａｋａｒａ，Ｊａｐａｎ）を用いて全ＲＮＡ鋳型からｃＤＮＡを合成し、ＳＹＢＲグリーンキット（ＲＴ５００Ｍ，Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ，Ｋｏｒｅａ）およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅＭｘ３０００ｐ（ＭＸ３０００ｐ，Ａｇｉｌｅｎｔ，ＵＳＡ）により、上記合成されたｃＤＮＡを用いてｑＲＴ－ＰＣＲを行った。

結果として得られた解析は、所望の遺伝子のサイクル閾値（Ｃｔ）値からＣｔ値を差し引いて１８ＳのＣｔ値および（１／２）＾補正されたｃｔ値を得るために、下記数式２によって行われた。用いられたプライマーの配列リストを表１０に開示する。

［数式２］
相対的定量＝（１／２）＾（所望の遺伝子Ｃｔ－１８ＳＣｔ）

６－２．ウェスタンブロット解析
７日目に外科用はさみ（ＰＦ－２４．１０、Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ、Ｐａｒｋｉｓｔａｎ）を用いて創傷の両側から３ｍｍだけ間隔をおいてマウスの創傷皮膚組織を採取した。皮膚組織をＰＢＳ溶液に添加し、４℃の振とう機で一晩洗浄した。皮膚組織をＲＩＰＡ緩衝液（自己製造、０．１％ＳＤＳ、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、２ｍＭＥＤＴＡ、５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭＮａＣｌ）に入れ、氷冷で３０分間インキュベートした。

皮膚組織をはさみ（ＰＦ－２４．１０、Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ、Ｐａｒｋｉｓｔａｎ）を用いて小片に切断し、微小管ホモジナイザー（９８５３７０、ＤＲＥＭＥＬ、およびＭｅｘｉｃｏ）で破砕した。スライスした皮膚組織を遠心分離機（５４１５Ｒ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で１３，０００ｒｐｍおよび４℃で１０分間遠心分離し、上清液を移した。

ここに５Ｘサンプル緩衝液（自己製造、１ＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、５０％グリセロール、１０％ＳＤＳ、２－メルカプトエタノール、および１％ブロモフェノールブルー）を添加した後、組織を１００℃で７分間煮沸し、氷で３分間冷却させ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルからタンパク質を単離した。ＭＭＰ－９（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＵＳＡ，ＡＢ１９０１６）、ＶＥＧＦ－Ａ（ａｂｃａｍ，ＵＫ，ａｂ４６１５４）、ＰＤＧＦ－Ａ（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ，ＵＳＡ，ｓｃ－９９７４）、β－チューブリン（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ，ＵＳＡ，ｓｃ－１６６７２９）に対する一次抗体を実験に使用した。

本発明の混合抽出物のＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルでのＭＭＰ発現減少効果および成長因子増加効果を示す表１１に示すように、本発明の抽出物で処理した試験試料群がＳＴＺ－誘発糖尿病マウスの皮膚創傷（ＭＭＰ－９）および皮膚潰瘍に関与した様々なサイトカインの発現レベルを大幅に抑制したことはもちろん、蒸留水（ＤＩＷ）で処理した陰性対照群に比べて、成長因子（ＰＤＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ａ）に対する促進効果を確認した。

したがって、実施例で調製した本発明の混合抽出物は、皮膚潰瘍および皮膚創傷に対する強力な抑制効果および皮膚増殖段階において重要な役割を果たす成長因子に対する促進効果を有することが確認された。

特に、ＰＤＧＦは、最近慢性潰瘍のタンパク質治療薬として開発されており、ＶＥＧＦは、血管成長因子である（ＤｉＧｉｏｖａｎｎｉＣＷ、ＰｅｔｒｉｃｅｋＪＭ．ＴｈｅｅｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆｒｈＰＤＧＦ－ＢＢｉｎｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌｅｔａｌｒｅｐａｉｒａｎｄｉｔｓｒｏｌｅｉｎｆｏｏｔａｎｄａｎｋｌｅｆｕｓｉｏｎｓｕｒｇｅｒｙ．ＦｏｏｔＡｎｋｌｅ２０１０；１５：６２１－６４０．ＤｉＧｉｏｖａｎｎｉａｎｄＰｅｔｒｉｃｋｅｒ，２０１０；ＳｈｉＲ，ＬｉａｎＷ，ＨａｎＳ，ＣａｏＣ，ＪｉｎＹ，ＹｕａｎＹ，ＺｈａｏＨ，ＬｉＭ．Ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄｃｏ－ｄｅｌｉｖｅｒｙｏｆＶＥＧＦ－ＡａｎｄＰＤＧＦ－Ｂｇｅｎｅｓｆｏｒａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇｄｉａｂｅｔｉｃｆｏｏｔｕｌｃｅｒｓｈｅａｌｉｎｇｉｎｒａｔｓ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．２０１８；２５：４２５－４３８）。

統計分析
平均および標準誤差は、実験で得られた試験結果から計算した。有意差検定はｔ検定を用いて分析し、有意水準（Ｐ－値）は、Ｐ≦０．０５＝＊、Ｐ≦０．０１＝＊＊、およびＰ≦０．００１＝＊＊＊で表した。

本発明の方法
以下、賦形剤の剤形化方法および種類について説明するが、本発明がこれに限定されるものではない。代表的な調製例は、以下の通り説明する。

化粧水の調製
実施例の抽出物（ＷＩＮ－１００１Ｘ）１．００％
グリセロール３．００％
エタノール１．００％
プロピレングリコール０．１０％
香料微量
蒸留水１００％以下

皮膚製剤は、従来のローションの調製方法に従って有効成分を溶解させて調製した。

ローションの調製
実施例の抽出物（ＷＩＮ－１００２Ｘ）３．００％
Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸マグネシウム１．００％
可溶性コラーゲン（１％溶液）１．００％
クエン酸ナトリウム０．１０％
１，３－ブチレングリコール３．００％
蒸留水１００％以下

ローション製剤は、従来のローションの調製方法に従って有効成分を溶解させて調製した。

クリームの調製
実施例の抽出物（ＷＩＮ－１００３Ｘ）３．００％
ポリエチレングリコモノステアレート２．００％
モノステアリン酸グリセリン１．００％
セチルアルコール４．００％
スクアレン６．００％
トリ２－グリセリルエチルヘキサノエート６．００％
スフィンゴ－糖脂質１．００％
１，３－ブチレングリコール３．００％
蒸留水１００％以下

クリーム製剤は、従来のクリームの調製方法に従って有効成分を溶解させて調製した。

パックの調製
実施例の抽出物（ＷＩＮ－１００４Ｘ）５．００％
ポリビニルアルコール１３．００％
Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸マグネシウム１．００％
ラウロイルヒドロキシプロリン１．００％
可溶性コラーゲン（１％溶液）２．００％
１，３－ブチレングリコール３．００％
エタノール５．００％
蒸留水１００％以下
糖２０ｇ
フルクトース２０ｇ
レモン風味最適量
蒸留水１００ｍｌ

パック製剤は、従来のパックの調製方法に従って有効成分を溶解させて調製した。

美容液の調製
実施例の抽出物（ＷＩＮ－１００５Ｘ）２．００％
ヒドロキシエチレンセルロース（２％溶液）１２．００％
キサンタンガム（２％溶液）２．００％
１，３－ブチレングリコール３．００％
グリセリン濃度４．００％
ヒアルロン酸ナトリウム５．００％
蒸留水１００ｍｌ

美容液の製剤は、従来の美容液の調製方法に従って有効成分を溶解させて調製した。

したがって、説明されている本発明は、多様な方法で変形することができることは明らかである。このような変形は、本発明の精神および範囲から逸脱するものとみなされるべきではなく、当業者にとって自明であるようなあらゆる全ての変形は、以下の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。
このように本発明を記述したが、同一のものが多様な方法に変形できることは明らかである。このような変形は、本発明の精神および範囲から逸脱するものとみなされるべきではなく、当業者にとって自明であるようなあらゆる全ての変形は、以下の特許請求の範囲内に含まれることが意図されている。

本発明に記述するように、本発明は、竜眼肉、藁本、およびオンジの混合生薬抽出物を含む局所用組成物および化粧料組成物を提供し、本発明者らは、本発明の混合組成物の皮膚創傷治療効果がサイトカイン発現に対する抑制効果（ｉｎｖｉｔｒｏ）（実験例１）；細胞増殖促進効果（ｉｎｖｉｔｒｏ）（実験例２）；細胞創傷回復効果（ｉｎｖｉｔｒｏ）（実験例３）などのｉｎｖｉｔｒｏ実験；だけでなく、慢性潰瘍に対する治療効果（ｉｎｖｉｖｏ）（実験例４）；皮膚創傷回復効果（ｉｎｖｉｖｏ）（実験例５）；成長因子に関与するプロ炎症誘発性サイトカインの発現抑制効果（ｉｎｖｉｖｏ）（実験例６）のようなｉｎｖｉｖｏ実験を行うことにより強力であることが立証された。したがって、本発明の混合抽出物は、局所用医薬剤または化粧品組成物の形態で皮膚創傷の改善または治療に非常に有用であることを確認した。

Claims

竜眼肉（ＬｏｎｇａｎａｅＡｒｉｌｌｕｓ）、藁本（ＬｉｇｕｓｔｉｃｉＴｅｎｕｉｓｓｉｍｉＲｈｉｚｏｍａ）およびオンジ（Ｐｏｌｙｇａｌａｅｒａｄｉｘ）の混合生薬が；水、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、アセトン、酢酸エチル、クロロホルム、ヘキサン、ブチレングリコール、プロピレングリコールまたはグリセリンから選択される１つ以上の溶媒で抽出される混合生薬抽出物を有効成分として含む、皮膚再生を促進させ、皮膚創傷を治療および改善するための局所用医薬組成物の製造方法。
前記混合生薬抽出物は、（ａ）０．０１－１００：０．０１－１００：０．０１－１００重量部（ｗ／ｗ）の範囲の竜眼肉、藁本およびオンジの乾燥重量（ｗ／ｗ）を基準とした混合比を有する竜眼肉、藁本およびオンジの混合生薬抽出物、または（ｂ）０．０１－１００：０．０１－１００：０．０１－１００重量部（ｗ／ｗ）の範囲の竜眼肉、藁本およびオンジの乾燥重量（ｗ／ｗ）を基準とした混合比を有する竜眼肉、藁本およびオンジの各抽出物の混合物であることを特徴とする、請求項１に記載の局所用医薬組成物の製造方法。
前記皮膚創傷が、皮膚に発生した怪我、擦過傷、損傷、切り傷、打撲傷、挫創、掻き傷から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の局所用医薬組成物の製造方法。
ヒトを含む哺乳動物の皮膚再生を促進させ、皮膚創傷を治療および改善するために使用される局所用製剤を調製するための竜眼肉、藁本およびオンジの混合生薬抽出物の有効成分としての使用。
皮膚再生を促進させ、皮膚創傷を治療および改善するのに有効な量で竜眼肉、藁本およびオンジの混合生薬が；水、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、アセトン、酢酸エチル、クロロホルム、ヘキサン、ブチレングリコール、プロピレングリコールまたはグリセリンから選択される１つ以上の溶媒で抽出される成分を有効成分として含む、化粧料組成物の製造方法。
前記皮膚創傷が、皮膚に発生した怪我、擦過傷、損傷、切り傷、打撲傷、挫創、掻き傷から選択されることを特徴とする、請求項５に記載の化粧料組成物の製造方法。
前記組成物は、化粧水、スキンソフナー、スキントナー、収斂剤、ローション、ミルクローション、モイスチャーローション、栄養ローション、マッサージクリーム、栄養クリーム、水分クリーム、ハンドクリーム、ファンデーション、エッセンス、栄養エッセンス、パック、クレンジングフォーム、クレンジングローション、クレンジングクリーム、ボディローション、ボディクレンザー、トリートメント、美容液から選択された形態であることを特徴とする、請求項５に記載の化粧料組成物の製造方法。