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JP7569091B2 - インターロイキン６（ｉｌ－６）調節異常による影響を受ける疾患の免疫療法のための、ｉｌ－６を標的とするペプチド免疫原及びその製剤 - Google Patents

インターロイキン６（ｉｌ－６）調節異常による影響を受ける疾患の免疫療法のための、ｉｌ－６を標的とするペプチド免疫原及びその製剤 Download PDF

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Description

本出願は、２０１８年１２月２８日出願の米国仮出願第６２／７８６，１９２号の利益を主張するＰＣＴ国際出願であり、当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
本開示は、インターロイキン６（ＩＬ－６）調節異常による影響を受ける疾患の免疫療法のための、ＩＬ－６を標的とするペプチド免疫原コンストラクト及びその製剤に関する。
ＩＬ－６は、１８４個のアミノ酸から構成される小さな（約２５ｋＤ）の分泌糖タンパク質であり（表１）、この糖タンパク質は、４本のヘリックスが束になった構造によって特徴付けられる。ＩＬ－６は、さまざまな刺激（リポ多糖及び他の細菌産物、ウイルス、サイトカイン（ＴＮＦ－α、ＩＬ－１、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）－β）、アデノシン三リン酸、パラトルモン、ビタミンＤ３、ホモシステイン、ならびにアンジオテンシンＩＩなど）に応答して、いくつかの細胞型（白血球（Ｔリンパ球及びＢリンパ球、単球、マクロファージ）、線維芽細胞、骨芽細胞、ケラチノサイト、内皮細胞、メサンギウム細胞、脂肪細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、脳細胞（アストログリア、ミクログリア、ニューロン）を含む）ならびにいくつかの腫瘍細胞によって産生される（Sebba, 2008）。
健康なヒトの血中には低濃度（≦１ｐｇ／ｍＬ）の循環ＩＬ－６が見られる。循環ＩＬ－６は、炎症性の応答が生じている間は著しく増加し、敗血症の間にはｎｇ／ｍＬの範囲の濃度に到達する。ＩＬ－６は、急性期免疫応答及び造血を刺激することによって、感染及び組織損傷に対する宿主防御に決定的に寄与する。さらに、ＩＬ－６は、生理学的条件下での代謝プロセス、再生プロセス、及び神経プロセスも調節する。ＩＬ－６は、放出されると、ＩＬ－６受容体（ＩＬ－６Ｒ）及び下流シグナル伝達分子を含む特有のＩＬ－６Ｒシグナル伝達系を活性化することによってその多面的な生物学的作用を発揮する。
ＩＬ－６Ｒは、（１）ＩＬ－６結合鎖、すなわちＩＬ－６Ｒα（２つの形態（すなわち、（ａ）８０ｋＤの膜貫通型ＩＬ－６Ｒα（ｍＩＬ－６Ｒα）及び（ｂ）５０～５５ｋＤの可溶性ＩＬ－６Ｒα（ｓＩＬ－６Ｒα））で存在する）、ならびに（２）１３０ｋＤのシグナル伝達鎖（ＩＬ－６Ｒβ（すなわち、ｇｐ１３０）と呼ばれる）という２つの鎖によって構成される。
膜ＩＬ－６Ｒα（すなわち、ｍＩＬ－６Ｒα）は、限られた数の細胞型の表面上に発現する。こうした細胞型は、すなわち、肝細胞、巨核球、ならびに白血球（単球、マクロファージ、好中球、ならびにＴリンパ球及びＢリンパ球を含む）である。可溶性ＩＬ－６Ｒα（すなわち、ｓＩＬ－６Ｒα）は、ヒト血漿（２５～７５ｎｇ／ｍＬ）及び組織液中に存在し、ｍＩＬ－６Ｒαがメタロプロテアーゼ（ディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼ（すなわち、ＡＤＡＭ））によるタンパク質切断（シェディング）を受けることによって生成されるか、または生成量は少ないが、膜貫通ドメインが除外されることによる選択的スプライシングを介して生成され得る。膜ＩＬ－６Ｒβは、すべてのヒト細胞上に遍在性に発現する（Sebba, 2008）。
ＩＬ－６は、ＩＬ－６Ｒα（ｍＩＬ－６ＲαまたはｓＩＬ－６Ｒαのいずれか）に結合すると、ＩＬ－６Ｒα鎖／ＩＬ－６Ｒβ鎖のホモダイマー化を誘導することでヘキサマー（２つのＩＬ－６タンパク質、２つのＩＬ－６Ｒαタンパク質、及び２つのＩＬ－６Ｒβタンパク質を含む）を形成させ、これによってその後に下流シグナル伝達カスケードを引き起こす（Rose-John, et al., 2017）。
ＩＬ－６がｍＩＬ－６Ｒαに結合することによる細胞活性化は、「古典的シグナル伝達」と呼ばれる。ｍＩＬ－６Ｒαを発現しない他の細胞はすべて、「トランスシグナル伝達」によってＩＬ－６シグナルを得る。トランスシグナル伝達では、ＩＬ－６は、循環ｓＩＬ－６Ｒαに結合し、この複合体は、細胞表面上のＩＬ－６Ｒβとシグナル伝達複合体を形成する。トランスシグナル伝達は、幅広い範囲のヒト細胞に生じ得るものであることから、ＩＬ－６の活性が多面的であると説明される一因となっている。現在では、ＩＬ－６のホメオスタシス活性及び再生活性は古典的シグナル伝達によって媒介される一方で、炎症促進性作用は、主に、トランスシグナル伝達経路の活性化に起因するものと理解されている。疾患の発症に特に関与するのはＩＬ－６トランスシグナル伝達であることを示す証拠が積み上がってきている。循環中には、可溶性形態であるｓＩＬ－６Ｒβ（すなわち、ｓｇｐ１３０）も比較的高濃度で検出されており、この可溶性形態は、主に、選択的スプライシングによって生じたものであった。ｓＩＬ－６ＲβはＩＬ－６／ｓＩＬ－６Ｒα複合体に結合し得ることから、ＩＬ－６介在性のトランスシグナル伝達の天然の特異的阻害剤として働く一方で、古典的シグナル伝達は、ｓＩＬ－６Ｒβによる影響を受けない。
ＩＬ－６Ｒαは、ＩＬ－６に対する特有の結合受容体である一方で、ＩＬ－６Ｒβ（すなわち、ｇｐ１３０）シグナル伝達鎖は、白血病抑制因子、オンコスタチンＭ、毛様体神経栄養因子、ＩＬ－１１、カルジオトロフィン－１、ニューロポエチン－１、ＩＬ－２７、及びＩＬ－３５を含む、ＩＬ－６ファミリーのメンバーによって共有されている。
ＩＬ－６が結合した後、受容体がホモダイマー化することで、ＩＬ－６Ｒβ（すなわち、ｇｐ１３０）鎖とチロシンキナーゼＪＡＫ（ヤヌスキナーゼ）との間の相互作用が促進され、その結果、それらの相互トランス活性化が生じる。次に、ＪＡＫが活性化すると２つの重要タンパク質（すなわち、１）Ｓｒｃホモロジードメイン含有タンパク質チロシンホスファターゼ－２（ＳＨＰ－２）、及び２）シグナル伝達兼転写活性化因子タンパク質（ＳＴＡＴ１～ＳＴＡＴ３））がリン酸化されることで、３つの主要な細胞内シグナル伝達経路が発動される。ＳＨＰ－２は、リン酸化されるとＧｒｂ２（増殖因子受容体結合タンパク質２）と相互作用してＲａｓ／ＥＲＫ／ＭＡＰＫ（ラット肉腫タンパク質／細胞外シグナル制御キナーゼ／分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ）カスケードを活性化し、及び／またはＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ（ホスホイノシトール－３キナーゼ／タンパク質キナーゼＢ）経路を活性化し得る。一方、ＳＴＡＴタンパク質がリン酸化されると、ヘテロダイマー（ＳＴＡＴ１／ＳＴＡＴ３）あるいはホモダイマー（ＳＴＡＴ１／ＳＴＡＴ１及び／またはＳＴＡＴ３／ＳＴＡＴ３）の形成が誘導され、これらのダイマーは、その後に核に移動する。すべての場合で、こうした細胞内経路が活性化されると複数の標的遺伝子の転写が誘導され、このことが、ＩＬ－６の生物学的活性が多面的である所以である（Lazzerini, et al., 2016)。
ＩＬ－６は、幅広い範囲の生物学的活性を発揮し、こうした生物学的活性は、急性炎症応答の活性化ならびに自然免疫から獲得免疫への移行に決定的に関与するものである。ＩＬ－６は、代謝、認知機能、及び胚発生を含めて、さまざまな他のプロセスにおいてもいくつかの付加的な役割を有する。
急性炎症応答の活性化に対するＩＬ－６の作用については研究が行われている。さまざまな起源の感染または組織損傷が生じると、全身性の急性期応答が急速に誘導されることで、病原体が中和され、そのさらなる侵入が阻止され、組織損傷が最小化され、創傷治癒が促進される。この急性期応答は、発熱及び肝細胞による急性期タンパク質の産生からなるものであり、ＩＬ－６によって主導される。
ＩＬ－６が、体温調節に関与する視床下部の視索前野のニューロンに作用することによって体温を上昇させ、肝臓を刺激して急性期タンパク質（Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、フィブリノゲン、補体成分Ｃ３、血清アミロイドＡ、ヘプシジン、ハプトグロビン、α１－酸性糖タンパク質、α１－アンチトリプシン、α１－アンチキモトリプシン、及びセルロプラスミンなど）を合成させるという事実に対して、一方ではアルブミン、トランスフェリン、フィブロネクチン、トランスサイレチン、及びレチノール結合タンパク質（「負の」急性期タンパク質）の産生は抑制される。
さらに、ＩＬ－６は、単球からマクロファージへの分化を促進し、骨髄系前駆細胞及び巨核球の成熟を刺激して好中球及び血小板を増加させ、血管内皮増殖因子を産生させて血管新生を誘導し、内皮細胞上の接着分子（具体的には、細胞内接着分子－１（ＩＣＡＭ－１）及び血管細胞接着分子（ＶＣＡＭ－１））の発現を上方制御することによってリンパ球及び好中球の輸送を増進し、Ｂリンパ球による抗体産生を増加させ、ヘルパーＴ（ＴＨ）リンパ球の増殖を増強してそれがＴＨ２細胞またはＴＨ１７細胞に分化するように促す。すべての場合で、こうした変化は、異なるが相乗的な機構を介して、最終的に宿主防御が得られる統合応答の実現に寄与する。
免疫炎症応答におけるその重要な関与の他に、ＩＬ－６は、複数の臓器系が関与する機能を多く調節することによって生理学的条件下でも重要な役割を担う。こうした機能は、胚形成、糖及び脂質の代謝、骨再形成、肝再生、神経組織ホメオスタシス、認知機能、睡眠、記憶、痛み、ならびに情動行動などである。
こうした追加の免疫炎症作用に関する知見は、関節リウマチ（ＲＡ）及びＩＬ－６レベルの上昇が持続することによって特徴付けられる他の慢性炎症性疾患において観察されるいくつかの全身徴候の原因説明に役立ち得るものである。
ＲＡ患者では、このサイトカインが代謝及び骨ホメオスタシスに与える影響に対して、特に病態生理学的及び臨床的に関心が寄せられている。
脂肪組織は、生理学的条件下ではＩＬ－６産生にかなり寄与しており、その寄与率は、循環ＩＬ－６レベルの約３５％に相当する。運動が継続される間は、収縮する骨格筋が主なＩＬ－６供給源となり、その血漿中レベルは約１００倍に増加する。ＩＬ－６は、脂肪細胞中の脂肪分解を刺激し（脂肪生成は抑制する）、超低密度リポタンパク質受容体の発現を増進させることで末梢組織によるコレステロール及びトリグリセリドの取り込みを増加させ、体重の減少及び血清中脂質レベルの減少を促進する。さらに、ＩＬ－６は、肝細胞及び筋細胞におけるインスリン感度を増進し、糖利用及び耐糖能を改善する。こうした作用は、このサイトカインが、インスリン活性を運動誘導性に増加させて耐久性を向上させることの根底をなす生理学的機構の一部であり得ることを示唆するものであるが、ＩＬ－６の慢性的な上昇（部分的には、例えば、過度の運動が長期的に行われることに起因する）は、肝細胞及び脂肪細胞においてインスリン抵抗性を生じさせる可能性がある。
骨組織に対する影響に関して、ＩＬ－６は、骨芽細胞、破骨細胞、及び軟骨細胞の分化及び活性を調節することによって、骨格の発達、成長、及び維持に必要な骨吸収及び骨形成に影響を与える。間質／骨芽細胞の表面上の核内因子ｋＢ活性化受容体リガンド（ＲＡＮＫＬ）の発現（次いで破骨細胞分化及び骨吸収が刺激される）を増進することおいてＩＬ－６が役割を担うことで、生理学的条件下での骨ホメオスタシスに対して潜在的に正の作用を伴って骨再形成が促進され得る。ＲＡでは、それが過度かつ長期的に活性化されることで、異常な破骨細胞形成が誘導され、これによって骨粗鬆症及び骨破壊が引き起こされる。
ＩＬ－６、ＩＬ－６受容体、ＩＬ－６シグナル伝達、ＩＬ－６の多面的な生物学的作用、免疫炎症応答に対する作用、追加の免疫炎症作用、ならびに関節リウマチ、自己免疫プロセスの発生、関節損傷、追加の関節徴候を含む、さまざまな病的状態におけるＩＬ－６の役割に関する最新の総説（Lazzerini, P., et al., 2016）は、参照によって本明細書に組み込まれ、この文献では、上記の背景セクションにおける記載を裏付ける文書を見つけることができる。
ＩＬ－６は、事実上あらゆる臓器系の生理学に関与する多面的なサイトカインであり、損傷または感染に対する応答において主要な役割を担うため、ＩＬ－６の発現異常は、多様なヒト疾病と関連付けられており、こうしたヒト疾病の中で最も注目すべきは、炎症障害及び自己免疫障害、冠動脈及び神経の疾患、妊娠性の問題、ならびに新生物である。
こうした疾患の多くに対する治療として、ＩＬ－６がＩＬ６Ｒ（すなわち、ＩＬ－６Ｒα及びＩＬ－６Ｒβ／すなわちｇｐ１３０）複合体に結合することを阻害するための抗体を開発することについて関心が寄せられている。そのような抗体で最初に開発されたものはトシリズマブであり、その後にサリルマブが開発された。これらの抗体は両方共、ＩＬ－６Ｒを標的とするものであり、関節リウマチ、キャッスルマン病、及び全身型若年性特発性関節炎の治療の認可が下りている。シルツキシマブは、ＩＬ－６を標的とするモノクローナル抗体であり、現在のところ、特発性多中心性キャッスルマン病（ＭＣＤ）を対象として米国ＦＤＡが認可した唯一の治療剤である。シルクマブは、中程度～重度の関節リウマチを患う成人を対象としてＩＬ－６経路を遮断するように設計された別の高親和性抗ＩＬ－６モノクローナル抗体であるが、この薬物を摂取した患者の死亡率が高かったため、認可のためのＦＤＡのＡｒｔｈｒｉｔｉｓ Ａｄｖｉｓｏｒｙ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって推奨されることはなかった。そのような目的のために、他にも多くの抗ＩＬ－６モノクローナル抗体または抗ＩＬ－６Ｒモノクローナル抗体（Rose-John, et al., 2017において論じられている）が活発に探求されている。モノクローナル抗ＩＬ－６抗体またはモノクローナル抗ＩＬ－６受容体抗体の多くが、ある特定の疾患の免疫療法において有効であることが判明し得るものの、そうした抗体は高価である上、血清中ＩＬ－６を十分に抑制し、そこから臨床的利点が得られるように維持するためには、そうした抗体を頻繁かつ長期的に投与しなくてはならない。
ＩＬ－６関連の免疫障害に対抗するためのワクチン接種方法についてもいくつか報告されている。１つの手法は、７つのアミノ酸置換を有するヒトＩＬ－６バリアント（Ｓａｎｔ１）を免疫原として使用するものである（De Benedetti, et al., 2001；米国特許第６，７０６，２６１号）。しかしながら、この研究は、それが約２０年前に最初に開示されて以来、いずれの臨床開発にも至っていない。別のグループ（Desallais, L., et al., 2014）からは、長さ１８４残基のＩＬ－６タンパク質の４０％超をカバーする無作為に選択された５つのＩＬ－６ペプチドが、それぞれのペプチドの免疫原性を増進するために、複雑な化学的カップリング手順を使用して大きな担体タンパク質（ＫＬＨ）に付加されたものを使用することが報告された。この方法の下で調製されたワクチンで生成された抗体は、そのほとんどが、望ましくない担体タンパク質（ＫＬＨ）に指向化されたものであり、ＩＬ－６を標的とするものはごく少量であった。さらに、このワクチンは、臨床的及び産業的な適用に最適なものからは程遠い完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）及び不完全フロイントアジュバント（ＩＣＦＡ）を製剤に含めることが必要なものであった。
上記のように、現在のＩＬ－６ワクチン設計には多くの制限及び問題（例えば、免疫原を調製するための化学的カップリング手順が複雑であること、ＫＬＨを担体タンパク質として使用した場合、誘導される抗体のほとんどが、当該担体タンパク質に指向化されたものになること、ワクチン接種において免疫原性を増強するために、臨床的に認められない完全フロイントアジュバントが使用されること、最も挑戦的な免疫化プロトコールを使用したとしても、ワクチン接種を受けた動物での標的ＩＬ－６に対する免疫原性が弱いこと、作用機構が不明であることなど）が存在する。したがって、ＩＬ－６に対する高度に特異的な免疫応答を誘発する能力を有し、患者への投与が容易であり、厳密な医薬品及び医薬部外品の製造管理及び品質管理の基準（ＧＭＰ）の下で製造することが可能であり、ＩＬ－６調節異常による影響を受ける疾患に罹患している患者の治療に世界的に適用する上でコスト効率の高い有効な免疫療法ワクチンを開発することに対するアンメットニーズが存在することは明らかである。
本開示の主要目的は、ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクト及びそのワクチン製剤を創出／開発することであり、設計されるペプチド免疫原コンストラクトのＢ細胞エピトープは、ＩＬ－６上のＩＬ－６Ｒ結合部位を厳密に模倣しており、そのようなペプチド免疫原コンストラクト及びその製剤は、ワクチン接種される宿主において強力な免疫応答を生じさせて、自己タンパク質であるＩＬ－６に対する免疫寛容を打ち破り、ＩＬ－６調節異常による影響を受ける疾患を治療するための、ＩＬ－６Ｒ結合部位を標的とする有効な抗体を生成させることを可能にする能力を有する。
本開示は、インターロイキン６（ＩＬ－６）調節異常による影響を受ける疾患の免疫療法のための、ＩＬ－６を標的とする個々のペプチド免疫原コンストラクト及びその製剤を対象とする。
こうした個々のＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトは、アミノ酸数３０以上の長さを有し、ＩＬ－６受容体結合領域（Ｅ４２～Ｃ８３（配列番号１６）もしくはＮ１４４～Ｉ１６６（配列番号１９））またはその断片に由来する機能性Ｂ細胞エピトープを含み、この機能性Ｂ細胞エピトープは、病原体タンパク質に由来する異種ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）エピトープにスペーサー残基（複数可）を介して連結される。こうしたＩＬ－６ペプチドコンストラクトは、設計されたＢ細胞エピトープ及びＴｈ細胞エピトープの両方を含み、これらのエピトープは、一緒に働くことで、ＩＬ－６Ｒ結合領域に対して指向化された高度に特異的な抗体の生成を刺激し、これによって、ＩＬ－６調節異常による影響を受ける疾患に罹患しやすいか、または罹患している対象に治療的な免疫応答を与える。
いくつかの実施形態では、開示のＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトは、ＩＬ－６Ｒ結合領域またはその断片に由来するＢ細胞抗原部位（表１に示される配列番号５～２０、配列番号７２～７４）が、病原性タンパク質に由来する異種Ｔｈエピトープ（表２に示される配列番号７８～１０６及び配列番号２１６～２２６）に連結されたハイブリッドペプチドを含み、このＢ細胞抗原部位及び異種Ｔｈエピトープは、一緒に働くことで、組換えヒトＩＬ－６（配列番号１）または他の種のＩＬ－６（マカクのＩＬ－６（配列番号２）、マウスのＩＬ－６（配列番号３）、及びラットのＩＬ－６（配列番号４）など）と交差反応する高度に特異的な抗体の生成を刺激する。
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図１は、ヒト種由来のＩＬ－６配列（配列番号２２７）、マカク種由来のＩＬ－６配列（配列番号２２８）、マウス種由来のＩＬ－６配列（配列番号２２９）、及びラット種由来のＩＬ－６配列（配列番号２３０）の配列アライメントを示す。アミノ酸位置４４～５０から生じる分子内ループ構造及びアミノ酸位置７３～８３から生じる分子内ループ構造は、影付きのシステイン及び角括弧で示される。 図２は、本明細書に開示の特定の実施形態に従って選択標的に対して指向化された医薬組成物の商業化（産業化）に繋がる開発プロセスを示す流れ図である。本開示は、ＩＬ－６ペプチド免疫原設計、ＩＬ－６ペプチド組成物設計、ＩＬ－６医薬製剤設計、インビトロでのＩＬ－６機能的抗原性試験設計、インビボでのＩＬ－６免疫原性及び効力の試験設計、ならびにＩＬ－６治療臨床プロトコール設計を含む。ステップのそれぞれを詳細に評価及び分析することで、安全かつ有効なＩＬ－６医薬組成物の商業化に最終的に繋がることになる一連の実験を行うに至った。 図３Ａ－Ｄは、異なるＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトで免疫化したモルモットにおける１２週間にわたる抗体応答の動態を示すグラフである。具体的には、図３Ａには、配列番号１０７、配列番号１１２～１１４、及び配列番号１１６～１１８のペプチド免疫原コンストラクトに対する抗体応答が示される。図３Ｂには、配列番号１２４～１３０のペプチド免疫原コンストラクトに対する抗体応答が示される。図３Ｃには、配列番号１３１～１３７のペプチド免疫原コンストラクトに対する抗体応答が示される。図３Ｄには、配列番号１３８～１４５のペプチド免疫原コンストラクトに対する抗体応答が示される。組換えヒトＩＬ－６を用いてＥＬＩＳＡプレートをコートした。４倍の段階希釈によって血清を１：１００～１：４．１９×１０８に希釈した。試験した血清の力価（Ｌｏｇ１０（ＥＣ５０）として表される）は、４パラメーターロジスティック曲線を当てはめる非線形回帰によって計算した。 図４Ａ－Ｂは、異なるＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトに対して指向化されたさまざまな精製ポリクローナル抗ＩＬ－６抗体の交差反応性を示す。具体的には、図４Ａに、配列番号１０７、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２４～１２８の結果を示し、図４Ｂに、配列番号１２９～１３３の結果を示す。組換えヒトＩＬ－６タンパク質、組換えサルＩＬ－６タンパク質、組換えマウスＩＬ－６タンパク質、または組換えラットＩＬ－６タンパク質を用いてＥＬＩＳＡプレートをコートした。プロテインＡクロマトグラフィーによってモルモット血清から精製したポリクローナル抗ＩＬ－６ ＩｇＧ抗体を、４倍の段階希釈によって１０μｇ／ｍＬ～０．００２３８ｎｇ／ｍＬに希釈した。４パラメーターロジスティック曲線を当てはめる非線形回帰によってＥＣ５０を計算した。 図４Ａ－Ｂは、異なるＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトに対して指向化されたさまざまな精製ポリクローナル抗ＩＬ－６抗体の交差反応性を示す。具体的には、図４Ａに、配列番号１０７、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２４～１２８の結果を示し、図４Ｂに、配列番号１２９～１３３の結果を示す。組換えヒトＩＬ－６タンパク質、組換えサルＩＬ－６タンパク質、組換えマウスＩＬ－６タンパク質、または組換えラットＩＬ－６タンパク質を用いてＥＬＩＳＡプレートをコートした。プロテインＡクロマトグラフィーによってモルモット血清から精製したポリクローナル抗ＩＬ－６ ＩｇＧ抗体を、４倍の段階希釈によって１０μｇ／ｍＬ～０．００２３８ｎｇ／ｍＬに希釈した。４パラメーターロジスティック曲線を当てはめる非線形回帰によってＥＣ５０を計算した。 図５Ａは、異なるＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクト（配列番号１０７、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２４、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１２４、及び配列番号１３７、ならびにＧＰ ＩｇＧ）によって産生されたさまざまな精製ポリクローナル抗ＩＬ－６抗体がＥＬＩＳＡベースのアッセイにおいてＩＬ－６とＩＬ－６Ｒとの相互作用を中和する活性を示す。組換えヒトＩＬ－６Ｒタンパク質を用いてＥＬＩＳＡプレートをコートした。１０ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ－６と、３倍の段階希釈によって１００～０．４１２μｇ／ｍＬとした漸減濃度のさまざまなポリクローナル抗ＩＬ－６ ＩｇＧ抗体と、を事前に混合した後、ＩＬ－６Ｒコートウェルに添加した。捕捉されたＩＬ－６を、ビオチン標識型ウサギ抗ＩＬ－６抗体、次いでストレプトアビジンポリＨＲＰを使用することによって検出した。４パラメーターロジスティック曲線を当てはめる非線形回帰によってＩＣ５０を計算した。 図５Ｂは、異なるＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクト（配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３４、及び配列番号１３５、ならびにＧＰ ＩｇＧ）によって産生されたさまざまな精製ポリクローナル抗ＩＬ－６抗体がＥＬＩＳＡベースのアッセイにおいてＩＬ－６／ＩＬ－６Ｒとｇｐ１３０との相互作用を中和する活性を示す。組換えｇｐ１３０－Ｆｃ融合タンパク質を用いてＥＬＩＳＡプレートをコートした。所定の比で事前に形成させたＩＬ－６／ＩＬ－６Ｒ複合体と、３倍の段階希釈によって１００～０．４１２μｇ／ｍＬとした漸減濃度のさまざまなポリクローナル抗ＩＬ－６ ＩｇＧ抗体と、を事前に混合した後、ｇｐ１３０－Ｆｃコートウェルに添加した。捕捉されたＩＬ－６／ＩＬ－６Ｒ複合体を、ビオチン標識型ウサギ抗ＩＬ－６抗体、次いでストレプトアビジンポリＨＲＰを使用することによって検出した。４パラメーターロジスティック曲線を当てはめる非線形回帰によってＩＣ５０を計算した。 図６は、異なるＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクト（配列番号１１６、配列番号１２４、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３４、配列番号１３５、及び配列番号１３７、ならびにＧＰ ＩｇＧ）によって産生されたさまざまな精製ポリクローナル抗ＩＬ－６抗体がＥＬＩＳＡベースのアッセイにおいてＩＬ－６依存性のＳＴＡＴ３リン酸化を中和する活性を示す。１０ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ－６及び１００μｇ／ｍＬ濃度のさまざまなポリクローナル抗ＩＬ－６ ＩｇＧ抗体と共に、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃でＲＭＰＩ８２２６細胞を３０分間インキュベートした後、溶解させることで、ＥＬＩＳＡベースのアッセイにおいてリン酸化ＳＴＡＴ３のレベルを決定した。 図７Ａ－Ｂは、異なるＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトによって産生されたさまざまな精製ポリクローナル抗ＩＬ－６抗体がＩＬ－６依存性の細胞増殖を中和する活性を示す。図７Ａに、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２４～１２９、配列番号１３１、配列番号１３２、及び配列番号１３３の中和活性を示し、図７Ｂに、配列番号１３４～１４５の中和活性を示す。１０ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ－６及び指定濃度のさまざまなポリクローナル抗ＩＬ－６ ＩｇＧ抗体と共に、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃でＴＦ－１細胞を７２時間インキュベートした。代謝的に活性な細胞中のＡＴＰ量を測定することによって細胞生存度を監視した。 図７Ａ－Ｂは、異なるＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトによって産生されたさまざまな精製ポリクローナル抗ＩＬ－６抗体がＩＬ－６依存性の細胞増殖を中和する活性を示す。図７Ａに、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２４～１２９、配列番号１３１、配列番号１３２、及び配列番号１３３の中和活性を示し、図７Ｂに、配列番号１３４～１４５の中和活性を示す。１０ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ－６及び指定濃度のさまざまなポリクローナル抗ＩＬ－６ ＩｇＧ抗体と共に、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃でＴＦ－１細胞を７２時間インキュベートした。代謝的に活性な細胞中のＡＴＰ量を測定することによって細胞生存度を監視した。 図８Ａ－Ｂは、異なるＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトによって産生されたさまざまな精製ポリクローナル抗ＩＬ－６抗体がＩＬ－６誘導性のＭＣＰ－１分泌を中和する活性を示す。図８Ａに、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２４～１３４、及び配列番号１３６の中和活性を示し、図８Ｂに、配列番号１３８～１４５の中和活性を示す。１０ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ－６及び指定濃度のさまざまなポリクローナル抗ＩＬ－６ ＩｇＧ抗体と共に、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃でＵ９３７細胞を２４時間インキュベートした。培養上清を採取してＭＣＰ－１レベルを決定した。 図８Ａ－Ｂは、異なるＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトによって産生されたさまざまな精製ポリクローナル抗ＩＬ－６抗体がＩＬ－６誘導性のＭＣＰ－１分泌を中和する活性を示す。図８Ａに、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２４～１３４、及び配列番号１３６の中和活性を示し、図８Ｂに、配列番号１３８～１４５の中和活性を示す。１０ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ－６及び指定濃度のさまざまなポリクローナル抗ＩＬ－６ ＩｇＧ抗体と共に、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃でＵ９３７細胞を２４時間インキュベートした。培養上清を採取してＭＣＰ－１レベルを決定した。 図９は、予防モデルを用いてラットコラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）におけるラットＩＬ－６ペプチドコンストラクトの効力を評価するための実験設計を示す。－３１日目、－１０日目、及び４日目に配列番号１４８または配列番号１５７のペプチド免疫原コンストラクトを４５μｇ用量で雌性ルイスラット（群当たりｎ＝７）に筋肉内投与して免疫化した。関節炎を誘導するために、０日目及び７日目にウシＩＩ型コラーゲン／ＩＦＡエマルションを動物の皮内に負荷した。 図１０は、異なるＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクト（配列番号１４８及び配列番号１５７）を用いて免疫化したラットにおける２８日間にわたる抗体応答の動態を示す。組換えラットＩＬ－６を用いてＥＬＩＳＡプレートをコートした。４倍の段階希釈によって血清を１：１００～１：４．１９×１０８に希釈した。試験した血清の力価（Ｌｏｇ１０（ＥＣ５０）として表される）は、４パラメーターロジスティック曲線を当てはめる非線形回帰によって計算した。 図１１は、異なるＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクト（配列番号１４８及び配列番号１５７）を用いて事前に免疫化したコラーゲン負荷ラットにおける関節炎スコアの減少を示す。 図１２は、異なるＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクト（配列番号１４８及び配列番号１５７）を用いて事前に免疫化したコラーゲン負荷ラットにおける後足の腫脹の減少を示す。 図１３は、異なるＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクト（配列番号１４８及び配列番号１５７）を用いて事前に免疫化したコラーゲン負荷ラットにおける血中好中球数増加の軽減を示す。 図１４は、治療モデルを用いてラットコラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）におけるラットＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトの効力を評価するための実験設計を示す。－７日目、７日目、１４日目、２１日目、及び２８日目に配列番号１４８を４５μｇ用量で雌性ルイスラット（群当たりｎ＝６または７）に筋肉内投与して免疫化した。関節炎を誘導するために、０日目及び７日目にウシＩＩ型コラーゲン／ＩＦＡエマルションを動物の皮内に負荷した。 図１５は、ＩＳＡ５１またはＩＳＡ５１／ＣｐＧのいずれかと共に製剤化した配列番号１４８で免疫化したラットにおける４３日間にわたる抗体応答の動態を示す。組換えラットＩＬ－６を用いてＥＬＩＳＡプレートをコートした。４倍の段階希釈によって血清を１：１００～１：４．１９×１０８に希釈した。試験した血清の力価（Ｌｏｇ１０（ＥＣ５０）として表される）は、４パラメーターロジスティック曲線を当てはめる非線形回帰によって計算した。 図１６は、ＩＳＡ５１またはＩＳＡ５１／ＣｐＧのいずれかと共に製剤化した配列番号１４８で事前に免疫化したコラーゲン負荷ラットにおける関節炎スコア及び後足の腫脹の減少を示す。 図１７は、ＩＳＡ５１またはＩＳＡ５１／ＣｐＧのいずれかと共に製剤化した配列番号１４８で事前に免疫化したコラーゲン負荷ラットにおける肝臓Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）の減少を示す。 図１８は、ＩＳＡ５１またはＩＳＡ５１／ＣｐＧのいずれかと共に製剤化した配列番号１４８で事前に免疫化したコラーゲン負荷ラットにおける足首関節の破壊の緩和を示す。 図１９は、ＩＳＡ５１またはＩＳＡ５１／ＣｐＧのいずれかと共に製剤化した配列番号１４８で事前に免疫化したコラーゲン負荷ラットにおける組織の炎症性サイトカイン（ＴＮＦ－α、ＩＬ－１７、及びＭＣＰ－１）の産生の減少を示す。 図２０は、ＩＳＡ５１／ＣｐＧまたはＡＤＪＵ－ＰＨＯＳ／ＣｐＧのいずれかと共に製剤化した配列番号１４８を異なる用量で用いて免疫化したラットにおける４３日間にわたる抗体応答の動態を示す。この試験は、図１７と同じ実験設計に従って実施した。組換えラットＩＬ－６を用いてＥＬＩＳＡプレートをコートした。４倍の段階希釈によって血清を１：１００～１：４．１９×１０８に希釈した。試験した血清の力価（Ｌｏｇ１０として表される）は、非線形回帰で得た各血清試料の４パラメーターロジスティック曲線に０．４５のカットオフ値を組み込むことによって計算した。 図２１は、ＩＳＡ５１／ＣｐＧまたはＡＤＪＵ－ＰＨＯＳ／ＣｐＧのいずれかと共に製剤化した配列番号１４８を漸増用量で用いて免疫化したコラーゲン負荷ラットにおける体重減少の緩和を示す。 図２２は、ＩＳＡ５１／ＣｐＧまたはＡＤＪＵ－ＰＨＯＳ／ＣｐＧのいずれかと共に製剤化した配列番号１４８を漸増用量で用いて免疫化したコラーゲン負荷ラットにおける後足の腫脹の減少を示す。 図２３は、ＩＳＡ５１／ＣｐＧまたはＡＤＪＵ－ＰＨＯＳ／ＣｐＧのいずれかと共に製剤化した配列番号１４８を漸増用量で用いて免疫化したコラーゲン負荷ラットの後足を２４日目に巨視的に観察したものを示す。 図２４は、ＩＳＡ５１／ＣｐＧまたはＡＤＪＵ－ＰＨＯＳ／ＣｐＧのいずれかと共に製剤化した配列番号１４８を漸増用量で用いて免疫化したコラーゲン負荷ラットにおける関節炎スコアの減少を示す。 図２５は、ＩＳＡ５１／ＣｐＧまたはＡＤＪＵ－ＰＨＯＳ／ＣｐＧのいずれかと共に製剤化した配列番号１４８を漸増用量で用いて免疫化したコラーゲン負荷ラットにおける血中好中球数増加の軽減を示す。 図２６は、ＩＳＡ５１／ＣｐＧまたはＡＤＪＵ－ＰＨＯＳ／ＣｐＧのいずれかと共に製剤化した配列番号１４８を漸増用量で用いて免疫化したコラーゲン負荷ラットにおける血小板放出の軽減を示す。 図２７は、ＩＳＡ５１／ＣｐＧまたはＡＤＪＵ－ＰＨＯＳ／ＣｐＧのいずれかと共に製剤化した配列番号１４８を漸増用量で用いて免疫化したコラーゲン負荷ラットにおける血中ＡＳＴ増加の減少を示す。 図２８は、指定のアジュバントと共に製剤化した異なるＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクト（配列番号１０２、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１７、及び配列番号１１８）で免疫化したモルモットにおける１２週間にわたる抗体応答の動態を示す。組換えヒトＩＬ－６を用いてＥＬＩＳＡプレートをコートした。４倍の段階希釈によって血清を１：１００～１：４．１９×１０８に希釈した。試験した血清の力価（Ｌｏｇ１０（ＥＣ５０）として表される）は、４パラメーターロジスティック曲線を当てはめる非線形回帰によって計算した。
本開示は、インターロイキン６（ＩＬ－６）調節異常による影響を受ける疾患の免疫療法のための、ＩＬ－６を標的とする個々のペプチド免疫原コンストラクト及びその製剤を対象とする。
開示のＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトは、３０個以上のアミノ酸を有し、ＩＬ－６受容体（ＩＬ－６Ｒ）結合領域（Ｅ４２～Ｃ８３（配列番号１６）もしくはＮ１４４～Ｉ１６６（配列番号１９））またはその断片（配列番号５～１９）に由来する機能性Ｂ細胞エピトープを含み、この機能性Ｂ細胞エピトープは、病原体タンパク質に由来する異種ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）エピトープ（配列番号７８～１０６及び配列番号２１６～２２６）に対して、任意選択の異種スペーサーを介して連結される。こうしたＩＬ－６ペプチドコンストラクトは、設計されたＢ細胞エピトープ及びＴｈ細胞エピトープの両方を含み、これらのエピトープは、一緒に働くことで、ＩＬ－６Ｒ結合領域に対して指向化された高度に特異的な抗体の生成を刺激し、これによって、ＩＬ－６調節異常による影響を受ける疾患に罹患しているか、または罹患しやすい患者に予防的及び／または治療的な免疫応答を与える。開示のＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトは、ＩＬ－６Ｒ結合領域またはその断片に由来するＢ細胞抗原部位（配列番号５～２０、配列番号７２～７５）が、病原性タンパク質に由来する異種Ｔｈエピトープ（例えば、表２の配列番号７８～１０６及び配列番号２１６～２２６）に連結されたハイブリッドペプチドを含み得、このＢ細胞抗原部位及び異種Ｔｈエピトープは、一緒に働くことで、組換えヒトＩＬ－６（配列番号１）または他の種のＩＬ－６（マカクのＩＬ－６（配列番号２）、マウスのＩＬ－６（配列番号３）、及びラットのＩＬ－６（配列番号４）など）と交差反応する高度に特異的な抗体の生成を刺激する。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクト（例えば、表３の配列番号１０７～１８６）は、さまざまな病原性タンパク質に由来する異種Ｔｈエピトープ（配列番号７８～１０６及び配列番号２１６～２２６）にＢ細胞抗原部位（例えば、Ｃ７３～Ｃ８３（配列番号５））が連結されたハイブリッドペプチドを含み、このハイブリッドペプチドは、組換えヒトＩＬ－６（配列番号１）と交差反応し、かつ他の種のＩＬ－６（配列番号２、配列番号３、配列番号４）との交差反応性を有する抗体を誘導する能力を有する。Ｂ細胞抗原部位の増強に用いられる異種Ｔｈエピトープの中で、天然の病原体に由来するＴｈエピトープ（ＥＢＶ ＢＰＬＦ１（配列番号１０５）、ＥＢＶ ＣＰ（配列番号１０２）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ Ｔｅｔａｎｉ１、２、４（配列番号７８、配列番号９９～１０１）、コレラ毒素（配列番号８５）、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｍａｎｓｏｎｉ（配列番号８４））、ならびに麻疹ウイルス融合タンパク質（ＭＶＦ１～５）及びＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ１～３）に由来する理想化された人工Ｔｈエピトープ（単一配列または組み合わせ配列（例えば、配列番号７９、配列番号８６～９２）のいずれかの形態をとる）が、そのようなＢ細胞抗原性増強において特に有用であることが、免疫原性スクリーニング試験によって明らかになっている。
本開示は、異なる病原体に由来する異種Ｔｈエピトープを含むＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトの混合物を含むペプチド組成物も対象とする。ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトの混合物を含む組成物を使用することで、患者の幅広い遺伝的背景をカバーすることが可能になり、これによって、ＩＬ－６調節異常による影響を受ける疾患の予防及び／または治療のための免疫化を行ったときのレスポンダー率のパーセントが高まり得る。ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトを複数含むペプチド組成物を使用すると、免疫応答の相乗的な増強が観察され得る。
そのようなペプチド免疫原コンストラクトから得られる抗体応答は、そのほとんど（＞９０％）が、ＩＬ－６Ｒ結合領域ペプチド（配列番号５～１９）に対する所望の交差反応性に集中しており、免疫原性増強に用いた異種Ｔｈエピトープに指向化されたものは、仮に伴うとしても多くはなかった。このことは、そのようなペプチド抗原性増強に使用される従来の担体タンパク質（ＫＬＨ、トキソイドなど）または他の生物学的担体を使用する標準的な方法とは際立って対照的である。
本開示は、ＩＬ－６調節異常による影響を受ける疾患の予防及び／または治療ための製剤を含めて、医薬組成物も対象とする。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、全長ヒトＩＬ－６（配列番号１）または他の種のＩＬ－６（マカクのＩＬ－６（配列番号２）、マウスのＩＬ－６（配列番号３）、及びラットのＩＬ－６（配列番号４）など）との所望の交差反応性が得られるようにＩＬ－６ペプチドの免疫原性をさらに増強するための安定化された免疫刺激性複合体（ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトの混合物を含むペプチド組成物とＣｐＧオリゴマーとを混合することによって静電気的な結合を介して形成される）を含む。
他の実施形態では、ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトの混合物を含むペプチド組成物を、アジュバントとしての無機塩（アラムゲル（ＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ）もしくはリン酸アルミニウム（ＡＤＪＵ－ＰＨＯＳ）を含む）と接触させて懸濁液を形成させるか、またはアジュバントとしてのＭＯＮＴＡＮＩＤＥ ＩＳＡ５１もしくはＭＯＮＴＡＮＩＤＥ ＩＳＡ７２０と接触させて油中水型エマルションを形成させたものを含む医薬組成物を、ＩＬ－６調節異常による影響を受ける疾患の予防及び／または治療のための患者への投与に使用した。
さらに、本開示は、ＩＬ－６調節異常による影響を受ける疾患に罹患している動物及び患者の予防及び／または治療に使用するためのＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクト及びその製剤を低コストで製造及び品質管理するための方法も提供する。
本開示は、開示のＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトに対して指向化された抗体も対象とする。具体的には、本開示のＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトは、ＩＬ－６分子上のＩＬ－６Ｒ結合部位と交差反応する高度に特異的な抗体の生成を刺激することができる。開示の抗体は、ＩＬ－６Ｒ結合部位に対して高度に特異的に結合し、免疫原性の増強に用いられる異種Ｔｈエピトープに対して指向化された抗体は、仮に伴うとしても多くはなく、このことは、そのようなペプチド免疫原性増強に使用される従来のタンパク質または他の生物学的担体を使用して生成される抗体とは際立って対照的である。したがって、開示のＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトは、自己ＩＬ－６タンパク質に対する免疫寛容を打ち破る能力を有し、他のペプチド免疫原またはタンパク質免疫原と比較して、得られるレスポンダー率が高い。
ある特定の実施形態では、抗体は、ヒトＩＬ－６分子（配列番号１）上のＩＬ－６Ｒ結合部位に対して指向化され、それに特異的に結合する。ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトに誘導される高度に特異的な抗体は、ＩＬ－６とＩＬ－６Ｒとの結合を阻害すると共に、下流の事象（ＩＬ－６誘導性のＳＴＡＴ３リン酸化、ＩＬ－６依存性の細胞増殖、ＩＬ－６誘導性のＭＣＰ産生、及び他のＩＬ－６関連の病的状態など）を抑制し、これによって、ＩＬ－６調節異常による影響を受ける疾患に罹患している患者を有効に治療すること可能である。
別の態様では、本開示は、開示のＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトを含む組成物を投与した患者において誘導されるＩＬ－６に対するヒト抗体（ポリクローナル及びモノクローナル）を提供する。ヒト患者の血液から単離されたＢ細胞からのヒトモノクローナル抗体の調製に有効な方法は、Traggiai, et al. (2004)によって記載されており、当該文献の開示内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトによって誘導される開示の抗体は、その特有の特徴及び特性に基づいて、ＩＬ－６調節異常による影響を受ける疾患に罹患している患者を治療するための免疫療法手法を提供する能力を有する。
本開示は、開示のＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクト、組成物、及び抗体を調製する方法も対象とする。開示の方法によれば、ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクト及び当該コンストラクトを含む組成物が低コストで製造及び品質管理され、このＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクト及び組成物は、ＩＬ－６調節異常による影響を受ける疾患に罹患している患者を治療するための方法において使用され得る。
本開示は、開示のＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクト及び／またはＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトに対して指向化された抗体を使用して対象におけるＩＬ－６調節異常による影響を受ける疾患を予防及び／または治療するための方法も含む。開示の方法は、開示のＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトを含む組成物を対象に投与するステップを含む。いくつかの実施形態では、方法において利用される組成物は、静電気的な結合を介して生じる負荷電オリゴヌクレオチド（ＣｐＧオリゴマーなど）との安定な免疫刺激性複合体（アジュバントがさらに追加され得る）の形態で、ＩＬ－６調節異常による影響を受ける疾患に罹患しやすいか、または罹患している対象に投与するための開示のＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトを含む。
開示の方法は、ＩＬ－６調節異常による影響を受ける疾患を予防及び／または治療するためにペプチド免疫原コンストラクトを投与するための投薬レジメン、剤形、及び経路も含む。
一般
本明細書で使用されるセクションの見出しは、構成を目的とするものにすぎず、記載対象を限定するものと解釈してはならない。本出願において引用される参考文献または参考文献の一部はすべて、それらの全体が、あらゆる目的のために参照によって本明細書に明確に組み込まれる。
別段の説明がない限り、本明細書で使用される専門用語及び科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」という単数の用語は、別に文脈上明確に示されない限り、複数の指示対象を含む。同様に、「または」という言葉は、別に文脈上明確に示されない限り、「及び」を含むことを意図する。したがって、「ＡまたはＢを含む」という語句は、Ａ、もしくはＢ、またはＡ及びＢを含むことを意味する。ポリペプチドに対して与えられるすべてのアミノ酸サイズ、及びすべての分子量値または分子質量値はおよそのものであり、説明のために提供されるものであることがさらに理解されよう。開示の方法の実施または試験においては、本明細書記載のものと同様または同等の方法及び材料を使用することができるが、以下には適切な方法及び材料が記載される。本明細書で言及される刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献はすべて、それらの全体が参照によって組み込まれる。矛盾が生じる場合は、用語の説明を含めて、本明細書が優先されることになる。さらに、本明細書に開示の材料、方法、及び実施例は、例示にすぎず、限定を意図するものではない。
ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクト
本開示は、ＩＬ－６受容体（ＩＬ－６Ｒ）結合領域（Ｅ４２～Ｃ８３（配列番号１６）もしくはＮ１４４～Ｉ１６６（配列番号１９））またはその断片（例えば、配列番号５～１９）に由来するアミノ酸配列を有するＢ細胞エピトープを含むペプチド免疫原コンストラクトを提供する。Ｂ細胞エピトープは、病原体タンパク質に由来する異種ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）エピトープに対して、直接的に共有結合で連結されるか、または任意選択の異種スペーサーを介して共有結合で連結される。こうしたコンストラクトは、設計されたＢ細胞エピトープ及びＴｈ細胞エピトープの両方を含み、これらのエピトープは、一緒に働くことで、ＩＬ－６上のＩＬ－６Ｒ結合領域に対して指向化された高度に特異的な抗体の生成を刺激し、これによって、ＩＬ－６調節異常による影響を受ける疾患に罹患しやすいか、または罹患している患者に治療的な免疫応答を与える。
本明細書で使用される「ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクト」または「ペプチド免疫原コンストラクト」という語句は、（ａ）全長ヒトＩＬ－６（配列番号１）のペプチドＥ４２～Ｃ８３（配列番号１６）もしくはペプチドＮ１４４～Ｉ１６６（配列番号１９）によって表されるＩＬ－６Ｒ結合領域またはその断片（例えば、配列番号５～１９）に由来する約１０個超の連続アミノ酸残基を有するＢ細胞エピトープと、（ｂ）異種Ｔｈエピトープと、（ｃ）任意選択の異種スペーサーと、を含むアミノ酸数３０超の長さを有するペプチドを指す。
ある特定の実施形態では、ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトは、下記の式：
（Ｔｈ）ｍ－（Ａ）ｎ－（ＩＬ－６のＩＬ－６Ｒ結合領域もしくはその断片）－Ｘ
または
（ＩＬ－６のＩＬ－６Ｒ結合領域もしくはその断片）－（Ａ）ｎ－（Ｔｈ）ｍ－Ｘ
または
（Ｔｈ）ｍ－（Ａ）ｎ－（ＩＬ－６のＩＬ－６Ｒ結合領域もしくはその断片）－（Ａ）ｎ－（Ｔｈ）ｍ－Ｘ
によって表すことができ、
式中、
Ｔｈは、異種ヘルパーＴ細胞エピトープであり、
Ａは、異種スペーサーであり、
（ＩＬ－６のＩＬ－６Ｒ結合領域またはその断片）は、ＩＬ－６（配列番号１）のＩＬ－６Ｒ結合領域に由来する７～４２個のアミノ酸残基を有するＢ細胞エピトープペプチドであり、
Ｘは、アミノ酸のα－ＣＯＯＨまたはα－ＣＯＮＨ２であり、
ｍは、１～約４であり、
ｎは、０～約１０である。
本開示のＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトは、多くの理論的根拠に基づいて設計及び選択されたものであり、こうした理論的根拠には、下記のものが含まれる：
ｉ．ＩＬ－６ Ｂ細胞エピトープペプチドは、それ単独では非免疫原性であることで、自己Ｔ細胞を活性化することを回避する。
ｉｉ．ＩＬ－６ Ｂ細胞エピトープペプチドは、タンパク質担体または強力なヘルパーＴ細胞エピトープ（複数可）を使用することによって免疫原性にされ得る。
ｉｉｉ．ＩＬ－６ Ｂ細胞エピトープペプチドが免疫原性にされ、宿主に投与されると、ペプチド免疫原コンストラクトは、
ａ．ＩＬ－６ペプチド配列（Ｂ細胞エピトープ）に対して選択的に指向化されており、タンパク質担体またはヘルパーＴ細胞エピトープ（複数可）に対しては指向化されていない高力価抗体を誘導し、
ｂ．免疫化された宿主における免疫寛容を壊し、ＩＬ－６（配列番号１）との交差反応性を有する高度に特異的な抗体を生成させ、
ｃ．ＩＬ－６とＩＬ－６Ｒとの結合を阻害すると共に、下流の事象（ＩＬ－６誘導性のＳＴＡＴ３リン酸化、ＩＬ－６依存性の細胞増殖、ＩＬ－６誘導性のＭＣＰ産生など）を抑制する能力を有する高度に特異的な抗体を生成させ、
ｄ．他のＩＬ－６関連の病的状態をインビボで低減する能力を有する高度に特異的な抗体を生成させる。
開示のＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクト及びその製剤は、医薬組成物として有効に機能することで、ＩＬ－６調節異常による影響を受ける疾患に罹患しやすいか、または罹患している対象の予防及び／または治療を行うことができる。
以下には、開示のＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトのさまざまな構成要素についてさらに詳細に記載される。
ａ．ＩＬ－６Ｒ結合領域に由来するＢ細胞エピトープペプチド
本開示は、ヒト組換えＩＬ－６タンパク質に対する特異性を有すると共に、マカク種、マウス種、及びラット種に由来するＩＬ－６タンパク質に対する交差反応性を有する高力価抗体を生成させるための新規のペプチド組成物を対象とする。ペプチド組成物の部位特異性によって、ＩＬ－６上の他の領域の不適切部位または担体タンパク質上の不適切部位に指向化された抗体が生成することが最小化され、それによって高い安全係数が得られる。
本明細書で使用される「ＩＬ－６」という用語は、ヒト由来の全長ＩＬ－６タンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｐ０５２３１；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿０００５９１．１）及び交差反応性を有する他の種に由来する全長ＩＬ－６タンパク質（マカク（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ａ０Ａ１Ｄ５ＱＭ０２－１；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿００１２７４２４５．１）、マウス（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｐ０８５０５；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿１１２４４５．１）、及びラット（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｐ２０６０７；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿０３６７２１．１）を含む）を指す。図１には、ヒトの全長ＩＬ－６配列（配列番号２２７）、マカクの全長ＩＬ－６配列（配列番号２２８）、マウスの全長ＩＬ－６配列（配列番号２２９）、及びラットの全長ＩＬ－６配列（配列番号２３０）のアミノ酸配列アライメントが示される。
より具体的には、本明細書で使用される「ＩＬ－６」という用語は、Ｎ末端シグナルペプチド（種によって約２４～２８個のアミノ酸を含む）が切断された全長成熟ＩＬ－６タンパク質のアミノ酸配列を指す。ヒト由来の全長成熟ＩＬ－６タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１）、マカク由来の全長成熟ＩＬ－６タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）、マウス由来の全長成熟ＩＬ－６タンパク質のアミノ酸配列（配列番号３）、及びラット由来の全長成熟ＩＬ－６タンパク質のアミノ酸配列（配列番号４）は、表１に示される。本出願を通じて、ＩＬ－６タンパク質内のアミノ酸位置の番号付けは、表１に示されるように、ＩＬ－６の全長成熟配列（Ｎ末端シグナル配列が切断されているもの）に基づいており、こうした全長成熟配列は、配列番号１～４によって示される。
ＩＬ－６Ｒは、（１）ＩＬ－６結合鎖、すなわちＩＬ－６Ｒα（２つの形態（すなわち、（ａ）８０ｋＤの膜貫通型ＩＬ－６Ｒα（ｍＩＬ－６Ｒα）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ０８８８７；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿０００５５６．１）、及び（ｂ）５０～５５ｋＤの可溶性ＩＬ－６Ｒα（ｓＩＬ－６Ｒα）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ０８８８７またはＰ０８８８７－２））で存在する）、ならびに（２）１３０ｋＤのシグナル伝達鎖（ＩＬ－６Ｒβまたはｇｐ１３０と呼ばれる）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ４０１８９；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿００２１７５．２）という２つの鎖によって構成される。
膜ＩＬ－６Ｒα（すなわち、ｍＩＬ－６Ｒα）は、限られた数の細胞型の表面上に発現する。こうした細胞型は、すなわち、肝細胞、巨核球、ならびに白血球（単球、マクロファージ、好中球、ならびにＴリンパ球及びＢリンパ球を含む）である。可溶性ＩＬ－６Ｒα（すなわち、ｓＩＬ－６Ｒα）は、ヒト血漿（２５～７５ｎｇ／ｍＬ）及び組織液中に存在し、ｍＩＬ－６Ｒαがメタロプロテアーゼ（ディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼ（すなわち、ＡＤＡＭ））によるタンパク質切断（シェディング）を受けることによって生成されるか、または生成量は少ないが、膜貫通ドメインが除外されることによる選択的スプライシングを介して生成され得る。
膜ＩＬ－６Ｒβ、すなわちｇｐ１３０は、すべてのヒト細胞上に遍在性に発現する（Sabba, 2008)。
古典的シグナル伝達では、ＩＬ－６は、膜結合型ＩＬ－６受容体（ｍＩＬ－６Ｒα）に結合し、ＩＬ－６－ｍＩＬ－６Ｒα複合体がＩＬ－６Ｒβ－サブユニット（ｇｐ１３０）と結び付くことで、ｇｐ１３０のダイマー化及び細胞内シグナル伝達が誘導される。代替的に、ＩＬ－６は、可溶性ＩＬ－６Ｒα（ｓＩＬ－６Ｒα）（ディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼドメイン含有タンパク質１７（ＡＤＡＭ１７）によってｍＩＬ－６Ｒαが切断されることによって生成される）に結合し得る。次に、ＩＬ－６－ｓＩＬ－６Ｒα複合体は、膜結合型ＩＬ－６Ｒβ－サブユニット（ｇｐ１３０）（ＩＬ－６Ｒを発現しない細胞上にさえ存在する）に結合し、トランスシグナル伝達を誘導する。したがって、ＩＬ－６は、ｍＩＬ－６Ｒα（またはｓＩＬ－６Ｒα）のいずれに結合しても、ヘキサマー（２つのＩＬ－６、２つのＩＬ－６Ｒα、及び２つのＩＬ－６Ｒβ（ｇｐ１３０）を含む）タンパク質の形成を誘導し、これによってその後に下流シグナル伝達カスケードを引き起こす（Rose-John, et al., 2017）。
ＩＬ－６がｍＩＬ－６Ｒαに結合することによる細胞活性化は、「古典的シグナル伝達」と呼ばれる。ｍＩＬ－６Ｒαを発現しない他の細胞はすべて、「トランスシグナル伝達」によってＩＬ－６シグナルを得る。トランスシグナル伝達では、ＩＬ－６は、循環ｓＩＬ－６Ｒαに結合し、この複合体は、細胞表面上のＩＬ－６Ｒβ（すなわち、ｇｐ１３０）とシグナル伝達複合体を形成する。トランスシグナル伝達は、幅広い範囲のヒト細胞に生じ得るものであることから、ＩＬ－６の活性が多面的となる一因となっている。現在では、ＩＬ－６のホメオスタシス活性及び再生活性は古典的シグナル伝達によって媒介される一方で、炎症促進性作用は、主に、トランスシグナル伝達経路の活性化に起因するものと理解されている。疾患の発症に特に関与するのはＩＬ－６トランスシグナル伝達であることを示す証拠が積み上がってきている。循環中には、ＩＬ－６Ｒβの可溶性形態（ｓＩＬ－６Ｒβ）（すなわち、ｇｐ１３０の可溶性形態（ｓｇｐ１３０））も比較的高濃度で検出されており、この可溶性形態は、主に、選択的スプライシングによって生じたものであった。ｓｇｐ１３０はＩＬ－６／ｓＩＬ－６Ｒα複合体に結合し得ることから、ＩＬ－６介在性のトランスシグナル伝達の天然の特異的阻害剤として働く一方で、古典的シグナル伝達は、ｓｇｐ１３０による影響を受けない。
ＩＬ－６Ｒαは、ＩＬ－６に対する特有の結合受容体である一方で、ＩＬ－６Ｒβ（すなわち、ｇｐ１３０）シグナル伝達鎖は、白血病抑制因子、オンコスタチンＭ、毛様体神経栄養因子、ＩＬ－１１、カルジオトロフィン－１、ニューロポエチン－１、ＩＬ－２７、及びＩＬ－３５を含む、ＩＬ－６ファミリーのメンバーによって共有されている。
ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトのＩＬ－６ Ｂ細胞エピトープ部分は、ＩＬ－６分子上のＩＬ－６Ｒ結合領域を標的とする。Ｂ細胞エピトープペプチドは、全長成熟ＩＬ－６タンパク質（配列番号１～４）のＥ４２～Ｃ８３（配列番号１６）またはＮ１４４～Ｉ１６６（配列番号１９）のいずれかに由来する約７～約４２個のアミノ酸残基を含む。ＩＬ－６ Ｂ細胞エピトープは、ＩＬ－６タンパク質の断片を使用して広範な血清学的スクリーニングを経て選択されたものであり、使用した断片のいくつかは、当該タンパク質内に天然に存在する分子内ループを含むものであり、当該分子内ループは、図１に影付きのシステイン残基によって示される。
ある特定の実施形態では、Ｂ細胞エピトープペプチドは、設計根拠に基づいてスクリーニング及び選択され、内在性システインによって形成されるＩＬ－６の内部分子内ループ（例えば、Ｃ７３～Ｃ８３（配列番号５）もしくはＣ４４～Ｃ５０（配列番号１５））（全長成熟ＩＬ－６タンパク質配列（配列番号１）の番号付けに従う）に由来するアミノ酸配列を含むか、またはＩＬ－６分子のＣ末端側に由来するアミノ酸配列（Ｎ１４４～Ｉ１６６（配列番号１９）に由来するアミノ酸配列を含む）を含む。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞エピトープは、表１に示される配列番号５～１９のアミノ酸配列を有する。
本開示のＩＬ－６ Ｂ細胞エピトープペプチドには、ＩＬ－６ペプチド（配列番号５～１９）の免疫学的に機能性の類似体または相同体も含まれる。ＩＬ－６ Ｂ細胞エピトープペプチドの機能性の免疫学的類似体または免疫学的相同体には、元のペプチドと実質的に同じ免疫原性を保持するバリアントが含まれる。免疫学的に機能性の類似体は、あるアミノ酸位置での保存的置換、全体電荷の変更、別の部分への共有結合での付加、またはアミノ酸の追加、挿入、もしくは欠失、及び／またはそれらの任意の組み合わせを有し得る（例えば、配列番号７２～７６のＩＬ－６ペプチド）。
ｂ．異種ヘルパーＴ細胞エピトープ（Ｔｈエピトープ）
本開示は、ＩＬ－６由来のＢ細胞エピトープが異種ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）エピトープに対して直接的に共有結合で連結されたもの、または任意選択の異種スペーサーを介して共有結合で連結されたものを含むペプチド免疫原コンストラクトを提供する。
ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクト中の異種Ｔｈエピトープは、ＩＬ－６断片の免疫原性を増強し、これによって、設計根拠に基づいてスクリーニング及び選択された最適化標的Ｂ細胞エピトープペプチド（すなわち、ＩＬ－６断片）に対して指向化された特異的な高力価抗体の産生が促進される。
本明細書で使用される「異種」という用語は、アミノ酸配列が、ＩＬ－６の野生型配列の一部ではないアミノ酸配列に由来するものであること指すか、またはアミノ酸配列が、ＩＬ－６の野生型配列と相同的ではないアミノ酸配列に由来するものであることを指す。したがって、異種Ｔｈエピトープは、ＩＬ－６中に天然には見られないアミノ酸配列に由来するＴｈエピトープである（すなわち、Ｔｈエピトープは、ＩＬ－６に由来するものではない）。こうしたＴｈエピトープは、ＩＬ－６に対して異種のものであるため、ＩＬ－６断片に対してこうした異種Ｔｈエピトープが共有結合で連結されても、ＩＬ－６の天然のアミノ酸配列は、Ｎ末端方向またはＣ末端方向のいずれにも延長されない。
本開示の異種Ｔｈエピトープは、ＩＬ－６中に天然に見られるアミノ酸配列を有さない任意のＴｈエピトープであり得る。Ｔｈエピトープは、複数の種のＭＨＣクラスＩＩ分子に非選択的に結合するモチーフも有し得る。ある特定の実施形態では、Ｔｈエピトープは、ＭＨＣクラスＩＩ分子に非選択的に結合するモチーフを複数含むことで、ヘルパーＴ細胞を最大限に活性化することを可能にし、これによって免疫応答の開始及び調節を引き起こす。Ｔｈエピトープは、好ましくは、それ単独では免疫学的に静的であり、すなわち、ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトによって生成される抗体のうちでＴｈエピトープに対して指向化されることになるものは、仮に存在するとしても極めて少なく、それによって、ＩＬ－６の標的Ｂ細胞エピトープペプチドに指向化された非常に集中的な免疫応答を引き起こすことを可能にする。
本開示のＴｈエピトープには、限定されないが、外来病原体に由来するアミノ酸配列（表２に例示されるもの（配列番号７８～１０６及び配列番号２１６～２２６））が含まれる。さらに、Ｔｈエピトープには、理想化された人工Ｔｈエピトープ及び理想化された人工Ｔｈエピトープの組み合わせ（例えば、配列番号７９、配列番号８６、配列番号９１、配列番号９２、及び配列番号７９、配列番号８６～９２）が含まれる。組み合わせ配列（例えば、配列番号８７～９０）として示される異種Ｔｈエピトープペプチドは、その特定のペプチドに対する相同体の可変残基に基づくペプチドフレームワーク内の特定の位置に示されるアミノ酸残基の混合物を含む。組み合わせペプチドの集合物は、合成プロセスの間に、指定の保護アミノ酸の混合物を１つの特定のアミノ酸の代わりに特定の位置に付加することによって１つのプロセスにおいて合成され得る。そのような組み合わせ異種Ｔｈエピトープペプチド集合物は、多様な遺伝的背景を有する動物に対するＴｈエピトープ適用範囲を広げることを可能にし得る。異種Ｔｈエピトープペプチドの代表的な組み合わせ配列には、表２に示される配列番号８７～９０が含まれる。本開示のＴｈエピトープペプチドは、遺伝的に多様な集団に由来する動物及び患者に対して幅広い反応性及び免疫原性を与える。
ｃ．異種スペーサー
開示のＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトは、ＩＬ－６ Ｂ細胞エピトープペプチドを異種ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）エピトープに共有結合で連結する異種スペーサーを任意選択で含む。
上に議論されるように、「異種」という用語は、アミノ酸配列が、ＩＬ－６の天然型配列の一部ではないアミノ酸配列に由来するものであること指すか、またはアミノ酸配列が、ＩＬ－６の天然型配列と相同的ではないアミノ酸配列に由来するものであることを指す。したがって、ＩＬ－６ Ｂ細胞エピトープペプチドに対して異種スペーサーが共有結合で連結されても、このスペーサーは、ＩＬ－６配列に対して異種のものであるため、ＩＬ－６の天然のアミノ酸配列は、Ｎ末端方向またはＣ末端方向のいずれにも延長されない。
スペーサーは、２つのアミノ酸及び／またはペプチドを一緒に連結する能力を有する任意の分子または化学構造である。スペーサーの長さまたは極性は、用途に応じて異なり得る。スペーサーの付加は、アミド結合またはカルボキシル結合を介して行われ得るが、他の官能性を利用することも可能である。スペーサーは、化合物、天然起源のアミノ酸、または非天然起源のアミノ酸を含み得る。
スペーサーは、ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトに対して構造特徴を付与し得る。構造的には、スペーサーは、ＩＬ－６断片のＢ細胞エピトープからＴｈエピトープを物理的に分離する。スペーサーによる物理的な分離は、ＴｈエピトープをＢ細胞エピトープに連結することによって創出される任意の人工二次構造を破壊し得る。さらに、スペーサーによってエピトープを物理的に分離すると、Ｔｈ細胞応答及び／またはＢ細胞応答の間の干渉が除去され得る。さらに、スペーサーは、ペプチド免疫原コンストラクトの二次構造を創出または改変するように設計され得る。例えば、スペーサーは、Ｔｈエピトープ及びＢ細胞エピトープの分離を増進させるための可動性ヒンジとして働くように設計され得る。可動性ヒンジスペーサーは、提示されるペプチド免疫原と、適切なＴｈ細胞及びＢ細胞との間の相互作用の効率性を促進してＴｈエピトープ及びＢ細胞エピトープに対する免疫応答を増強することも可能にし得る。可動性ヒンジをコードする配列の例は、免疫グロブリン重鎖ヒンジ領域に見られ、こうした配列はプロリンを多く含むことが多い。スペーサーとして使用され得る特に有用な可動性ヒンジの１つは、Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｘａａ－Ｐｒｏ－Ｘａａ－Ｐｒｏという配列（配列番号７６）によって提供され、配列中、Ｘａａは、任意のアミノ酸であり、好ましくは、アスパラギン酸である。
スペーサーは、ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトに対して機能特徴も付与し得る。例えば、ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトの全体電荷が変化するようにスペーサーを設計することができ、これによって、ペプチド免疫原コンストラクトの溶解性に影響を与えることができる。さらに、ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトの全体電荷を変化させると、ペプチド免疫原コンストラクトが他の化合物及び試薬と結び付く能力に影響を与えることができる。以下にさらに詳述されるように、ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトは、高度に荷電したオリゴヌクレオチド（ＣｐＧオリゴマーなど）と静電気的な結合を介して安定な免疫刺激性複合体を形成するようになり得る。ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトの全体電荷は、こうした安定な免疫刺激性複合体の形成に重要である。
スペーサーとして使用され得る化合物には、限定されないが、（２－アミノエトキシ）酢酸（ＡＥＡ）、５－アミノ吉草酸（ＡＶＡ）、６－アミノカプロン酸（Ａｈｘ）、８－アミノ－３，６－ジオキサオクタン酸（ＡＥＥＡ、ミニＰＥＧ１）、１２－アミノ－４，７，１０－トリオキサドデカン酸（ミニＰＥＧ２）、１５－アミノ－４，７，１０，１３－テトラオキサペンタ－デカン酸（ミニＰＥＧ３）、トリオキサトリデカン－コハク酸（Ｔｔｄｓ）、１２－アミノ－ドデカン酸、Ｆｍｏｃ－５－アミノ－３－オキサペンタン酸（Ｏ１Ｐｅｎ）、及び同様のものが含まれる。
天然起源のアミノ酸には、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、及びバリンが含まれる。
非天然起源のアミノ酸には、限定されないが、ε－Ｎリジン、β－アラニン、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、チロキシン、γ－アミノ酪酸、ホモセリン、シトルリン、アミノ安息香酸、６－アミノカプロン酸（Ａｃａ；６－アミノヘキサン酸）、ヒドロキシプロリン、メルカプトプロピオン酸（ＭＰＡ）、３－ニトロ－チロシン、ピログルタミン酸、及び同様のものが含まれる。
ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクト中に含めるスペーサーは、Ｔｈエピトープ及びＩＬ－６ Ｂ細胞エピトープペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかに共有結合で連結され得る。いくつかの実施形態では、スペーサーは、ＴｈエピトープのＣ末端及びＩＬ－６ Ｂ細胞エピトープペプチドのＮ末端に共有結合で連結される。他の実施形態では、スペーサーは、ＩＬ－６ Ｂ細胞エピトープペプチドのＣ末端及びＴｈエピトープのＮ末端に共有結合で連結される。ある特定の実施形態では、複数のスペーサーを使用することができ、この使用は、例えば、ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクト中に複数のＴｈエピトープが存在する場合に行われる。複数のスペーサーが使用される場合、各スペーサーは互いに同じか、または異なり得る。さらに、ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクト中に複数のＴｈエピトープが存在する場合、これらのＴｈエピトープは、スペーサー分離されることがあり得、このスペーサーは、ＴｈエピトープをＩＬ－６ Ｂ細胞エピトープペプチドから分離するために使用されるスペーサーと同じであるか、または異なり得る。ＴｈエピトープまたはＩＬ－６ Ｂ細胞エピトープペプチドとの関係においてスペーサーの配置に制限は存在しない。
ある特定の実施形態では、異種スペーサーは、天然起源のアミノ酸または非天然起源のアミノ酸である。他の実施形態では、スペーサーは、天然起源のアミノ酸または非天然起源のアミノ酸を複数含む。特定の実施形態では、スペーサーは、Ｌｙｓ－、Ｇｌｙ－、Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－、（α，ε－Ｎ）Ｌｙｓ、ε－Ｎ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ（配列番号７７）、またはＬｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－ε－Ｎ－Ｌｙｓ（配列番号２３１）である。
ｄ．ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトの特定の実施形態
ある特定の実施形態では、ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトは、下記の式によって表すことができる：
アミノ酸数約３０超の長さを有するＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトは、下記の式：
（Ｔｈ）ｍ－（Ａ）ｎ－（ＩＬ－６のＩＬ－６Ｒ結合領域もしくはその断片）－Ｘ
または
（ＩＬ－６のＩＬ－６Ｒ結合領域もしくはその断片）－（Ａ）ｎ－（Ｔｈ）ｍ－Ｘ
または
（Ｔｈ）ｍ－（Ａ）ｎ－（ＩＬ－６のＩＬ－６Ｒ結合領域もしくはその断片）－（Ａ）ｎ－（Ｔｈ）ｍ－Ｘ
によって表され、
式中、
Ｔｈは、異種ヘルパーＴ細胞エピトープであり、
Ａは、異種スペーサーであり、
（ＩＬ－６のＩＬ－６Ｒ結合領域またはその断片）は、ＩＬ－６（配列番号１）のＩＬ－６Ｒ結合領域に由来する約７～約４２個のアミノ酸残基を有するＢ細胞エピトープペプチドであり、
Ｘは、アミノ酸のα－ＣＯＯＨまたはα－ＣＯＮＨ２であり、
ｍは、１～約４であり、
ｎは、０～約１０である。
いくつかの実施形態では、（ＩＬ－６のＩＬ－６Ｒ結合領域またはその断片）は、配列番号５～１９のいずれかから選択されるアミノ酸配列を有するＢ細胞エピトープペプチドである。ある特定の実施形態では、Ｂ細胞エピトープは、ＩＬ－６（配列番号１～４）のＥ４２～Ｃ８３（配列番号１６）もしくはＮ１４４～Ｉ１６６（配列番号１９）またはその断片に由来するアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、（ＩＬ－６のＩＬ－６Ｒ結合領域またはその断片）は、図１に示されるＣ７３～Ｃ８３（配列番号５）及び／またはＣ４４～Ｃ５０（配列番号１５）に由来する天然に存在する分子内ループを少なくとも１つ含むＢ細胞エピトープである。
ある特定の実施形態では、ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクト中の異種Ｔｈエピトープは、表２に示される配列番号７８～１０６、配列番号２１６～２２６、またはそれらの組み合わせ、のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトは、複数のＴｈエピトープを含む
ある特定の実施形態では、任意選択の異種スペーサーは、Ｌｙｓ－、Ｇｌｙ－、Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－、（α，ε－Ｎ）Ｌｙｓ、Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｘａａ－Ｐｒｏ－Ｘａａ－Ｐｒｏ（配列番号７６）、ε－Ｎ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ（配列番号７７）、Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－ε－Ｎ－Ｌｙｓ（配列番号２３１）、及びそれらの任意の組み合わせ、のうちのいずれかから選択され、配列中、Ｘａａは、任意のアミノ酸であるが、好ましくは、アスパラギン酸である。特定の実施形態では、異種スペーサーは、ε－Ｎ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ（配列番号７７）またはＬｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－ε－Ｎ－Ｌｙｓ（配列番号２３１）である。
ある特定の実施形態では、ＩＬ－６ Ｂ細胞エピトープペプチドは、配列番号１の全長成熟ＩＬ－６タンパク質に由来する約７～約４２個のアミノ酸残基を有する。特定の実施形態では、ＩＬ－６ Ｂ細胞エピトープペプチドは、（Ｅ４２～Ｃ８３、配列番号１６）内に含まれるＩＬ－６の分子内ループに由来するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、ＩＬ－６ Ｂ細胞エピトープペプチドは、表１に示されるアミノ酸Ｃ７３～Ｃ８３（配列番号５）またはＩＬ－６ Ｃ４４～Ｃ５０（配列番号１５）に由来するＩＬ－６の内部ループを含む（例えば、配列番号５～８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１５～１７）。
ある特定の実施形態では、ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトは、表３に示される配列番号１０７～２１５のいずれかから選択されるアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトは、配列番号１０７～１６０のいずれかから選択されるアミノ酸配列を有する。
ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトを構成するＴｈエピトープは、ＩＬ－６断片との直列配置で単回の固相ペプチド合成において同時に生成され得る。Ｔｈエピトープには、Ｔｈエピトープの免疫学的類似体も含まれ得る。免疫学的Ｔｈ類似体には、免疫増強性類似体、交差反応性類似体、及びこうしたＴｈエピトープのいずれかのセグメントであって、ＩＬ－６ Ｂ細胞エピトープペプチドに対する免疫応答を増強または刺激する上で十分なものが含まれる。
ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクト中に含めるＴｈエピトープは、ＩＬ－６ Ｂ細胞エピトープペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかに共有結合で連結され得る。いくつかの実施形態では、Ｔｈエピトープは、ＩＬ－６ Ｂ細胞エピトープペプチドのＮ末端に共有結合で連結される。他の実施形態では、Ｔｈエピトープは、ＩＬ－６ Ｂ細胞エピトープペプチドのＣ末端に共有結合で連結される。ある特定の実施形態では、複数のＴｈエピトープが、ＩＬ－６ Ｂ細胞エピトープペプチドに共有結合で連結される。複数のＴｈエピトープがＩＬ－６ Ｂ細胞エピトープペプチドに連結される場合、各Ｔｈエピトープは、同じアミノ酸配列または異なるアミノ酸配列を有し得る。さらに、複数のＴｈエピトープがＩＬ－６ Ｂ細胞エピトープペプチドに連結される場合、これらのＴｈエピトープは任意の順序で配置され得る。例えば、これらのＴｈエピトープは、ＩＬ－６ Ｂ細胞エピトープペプチドのＮ末端に連続して連結されるか、もしくはＩＬ－６ Ｂ細胞エピトープペプチドのＣ末端に連続して連結され得る。または、ＩＬ－６ Ｂ細胞エピトープペプチドのＮ末端にＴｈエピトープが共有結合で連結され得る一方で、ＩＬ－６ Ｂ細胞エピトープペプチドのＣ末端には別のＴｈエピトープが共有結合で連結される。ＩＬ－６ Ｂ細胞エピトープペプチドとの関係においてＴｈエピトープの配置に制限は存在しない。
いくつかの実施形態では、Ｔｈエピトープは、ＩＬ－６ Ｂ細胞エピトープペプチドに対して直接的に共有結合で連結される。他の実施形態では、Ｔｈエピトープは、異種スペーサーを介してＩＬ－６断片に共有結合で連結される。
ｅ．バリアント、相同体、及び機能性類似体
好ましいＩＬ－６ Ｂ細胞エピトープペプチドに対する抗体を誘導し、及び／または当該抗体と交差反応する、上記の免疫原性ペプチドコンストラクトのバリアント及び類似体も使用され得る。類似体（アレルバリアント、種バリアント、及び誘導バリアントを含む）は、典型的には、１つ、２つ、または少数の位置が天然の起源のペプチドと異なり、この差異は、保存的置換によるものであることが多い。類似体は、典型的には、天然のペプチドとの配列同一性が少なくとも８０％または少なくとも９０％である。類似体によっては、非天然アミノ酸、またはＮ末端側アミノ酸もしくはＣ末端側アミノ酸の修飾を１つ、２つ、または少数の位置に含むこともあり得る。
機能性類似体であるバリアントは、あるアミノ酸位置での保存的置換、全体電荷の変更、別の部分への共有結合での付加、またはアミノ酸の追加、挿入、もしくは欠失、及び／またはそれらの任意の組み合わせを有し得る。
保存的置換は、あるアミノ酸残基が、類似の化学特性を有する別のアミノ酸残基に置換されるものである。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びメチオニンが含まれ、極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミンが含まれ、正荷電（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リジン、及びヒスチジンが含まれ、負荷電（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれる。
特定の実施形態では、機能性類似体は、元のアミノ酸配列との同一性が少なくとも５０％である。別の実施形態では、機能性類似体は、元のアミノ酸配列との同一性が少なくとも８０％である。さらに別の実施形態では、機能性類似体は、元のアミノ酸配列との同一性が少なくとも８５％である。さらに別の実施形態では、機能性類似体は、元のアミノ酸配列との同一性が少なくとも９０％である。
バリアントには、リン酸化残基のバリエーションも含まれ得る。例えば、バリアントには、ペプチド内の異なる残基がリン酸化されたものが含まれ得る。バリアント免疫原性ＩＬ－６ペプチドには、偽リン酸化ペプチドも含まれ得る。偽リン酸化ペプチドは、ＩＬ－６ペプチドのリン酸化セリン残基、リン酸化スレオニン残基、及びリン酸化チロシン残基のうちの１つ以上を、酸性アミノ酸残基（グルタミン酸及びアスパラギン酸など）で置き換えることによって生成される。
Ｔｈエピトープペプチドの機能性の免疫学的類似体も有効であり、本開示の一部として含まれる。機能性の免疫学的Ｔｈ類似体は、ＴｈエピトープのＴｈ刺激機能を本質的に改変しない１～約５つのアミノ酸残基の保存的な置換、追加、欠失、及び挿入をＴｈエピトープ中に含み得る。保存的な置換、追加、及び挿入は、ＩＬ－６ Ｂ細胞エピトープペプチドについて上に記載されるように、天然アミノ酸または非天然アミノ酸を用いて達成され得る。表２には、Ｔｈエピトープペプチドの機能性類似体の別のバリエーションが示される。具体的には、ＭｖＦ１ Ｔｈ及びＭｖＦ２ Ｔｈの配列番号７９及び配列番号８６は、ＭｖＦ４及びＭｖＦ５の配列番号８９及び配列番号９１の機能性類似体であり、これは、これらの配列のアミノ酸フレームが、Ｎ末端及びＣ末端のそれぞれから２つのアミノ酸が欠失することによって異なるか（配列番号７９及び配列番号８６）、またはＮ末端及びＣ末端のそれぞれに２つのアミノ酸が含められることによって異なる（配列番号８９及び９１配列番号）という観点によるものである。こうした２つの一連の類似配列の間の差異は、こうした配列中に含まれるＴｈエピトープの機能に影響を与えないと想定される。したがって、機能性の免疫学的Ｔｈ類似体には、麻疹ウイルス融合タンパク質に由来するＴｈエピトープ（ＭｖＦ１～４ Ｔｈ）のいくつかのバージョン（配列番号７９、配列番号８６、配列番号８７、及び配列番号８９）、ならびに肝炎表面タンパク質に由来するＴｈエピトープ（ＨＢｓＡｇ１～３ Ｔｈ）のいくつかのバージョン（配列番号８８、配列番号９０、及び配列番号９２）が含まれる。
組成物
本開示は、開示のＩＬ－６免疫原ペプチドコンストラクトを含む組成物も提供する。
ａ．ペプチド組成物
開示のＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトを含む組成物は、液体形態または固体／凍結乾燥形態のものであり得る。液体組成物は、水、緩衝液、溶媒、塩、及び／またはＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトの構造特性もしくは機能特性を変化させない任意の他の許容可能な試薬を含み得る。ペプチド組成物は、開示のＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトのうちの１つ以上を含み得る。
ｂ．医薬組成物
本開示は、開示のＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトを含む医薬組成物も対象とする。
医薬組成物は、医薬的に許容可能な送達系において担体及び／または他の添加剤を含み得る。したがって、医薬組成物は、医薬的に許容可能な担体、アジュバント、及び／または他の医薬品添加物（希釈剤、添加剤、安定化剤、保存剤、可溶化剤、緩衝剤、及び同様のものなど）と一緒に医薬的に有効な量のＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトを含み得る。
医薬組成物は、ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトに対する免疫応答を、それ自体はいずれの特定の抗原性作用も有することなく促進、延長、または増強するように働く１つ以上のアジュバントを含み得る。医薬組成物において使用されるアジュバントには、油、油エマルション、アルミニウム塩、カルシウム塩、免疫刺激性複合体、細菌系物質及びウイルス系物質、ビロソーム、糖質、サイトカイン、ポリマー微粒子が含まれ得る。ある特定の実施形態では、アジュバントは、アラム（リン酸カリウムアルミニウム）、リン酸アルミニウム（例えば、ＡＤＪＵ－ＰＨＯＳ（登録商標））、水酸化アルミニウム（例えば、ＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ（登録商標））、リン酸カルシウム、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）、完全フロイントアジュバント、ＭＦ５９、アジュバント６５、Ｌｉｐｏｖａｎｔ、ＩＳＣＯＭ、リポシン（ｌｉｐｏｓｙｎ）、サポニン、スクアレン、Ｌ１２１、ＥｍｕｌｓＩＬ－６ｎ（登録商標）、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、ＱｕｉｌＡ、ＱＳ２１、ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ（登録商標）ＩＳＡ３５、ＩＳＡ５０Ｖ、ＩＳＡ５０Ｖ２、ＩＳＡ５１、ＩＳＡ２０６、ＩＳＡ７２０、リポソーム、リン脂質、ペプチドグリカン、リポ多糖（ＬＰＳ）、ＡＳＯ１、ＡＳＯ２、ＡＳＯ３、ＡＳＯ４、ＡＦ０３、親油性リン脂質（リピドＡ）、ガンマイヌリン、アルガムリン（ａｌｇａｍｍｕｌｉｎ）、グルカン、デキストラン、グルコマンナン、ガラクトマンナン、レバン、キシラン、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡ）、ならびに他のアジュバント及び乳化剤から選択され得る。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ（商標）ＩＳＡ５１（油中水型エマルション生成用の植物油及びオレイン酸マンニドから構成される油アジュバント組成物）、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０（ポリソルベート８０もしくはポリオキシエチレン（２０）ソルビタンオレイン酸モノエステルとしても知られる）、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、及び／またはそれらの任意の組み合わせを含む。他の実施形態では、医薬組成物は、アジュバントとしてＥｍｕｌｓＩＬ－６ｎまたはＥｍｕｌｓＩＬ－６ｎ Ｄを含む水中油中水型（すなわち、ｗ／ｏ／ｗ型）エマルションである。
医薬組成物は、医薬的に許容可能な添加剤または医薬品添加物も含み得る。例えば、医薬組成物は、抗酸化剤、結合剤、緩衝剤、増量剤、担体、キレート剤、着色剤、希釈剤、崩壊剤、乳化剤、賦形剤、ゲル化剤、ｐＨ緩衝剤、保存剤、可溶化剤、安定化剤、及び同様のものを含み得る。
医薬組成物は、即放型製剤または徐放型製剤として製剤化され得る。さらに、医薬組成物は、微粒子を用いる免疫原の封入及び同時投与を介して全身免疫または局所粘膜免疫が誘導されるように製剤化され得る。そのような送達系は、当業者によって容易に決定される。
医薬組成物は、注射剤（溶液または懸濁液としてのもの）として調製され得る。ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトを含む液体媒体は、注射前に調製されるものでもあり得る。医薬組成物は、任意の適切な適用様式（例えば、皮内、静脈内、腹腔内、筋肉内、鼻腔内、経口、皮下など）によって投与されることも、任意の適切な送達機器において投与されることもあり得る。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、静脈内投与、皮下投与、皮内投与、または筋肉内投与向けに製剤化される。経口適用及び鼻腔内適用を含めて、他の投与様式に適した医薬組成物も調製され得る。
医薬組成物は、適切な単位剤形でも製剤化され得る。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、体重ｋｇ当たり約０．１μｇ～約１ｍｇのＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトを含む。医薬組成物の有効用量は、多くの異なる因子に応じて異なり得、こうした因子には、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトまたは動物であるかどうか、他の投与薬剤、及び治療が予防的または治療的であるかどうかが含まれる。通常、患者はヒトであるが、トランスジェニック哺乳類を含めて、非ヒト哺乳類も治療され得る。医薬組成物は、複数回用量で送達される場合、単位剤形当たり適切な量へと好都合に分割され得る。投与量は、対象の年齢、体重、及び総体的な健康に依存することになり、こうしたことは、治療分野でよく知られている。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、複数のＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトを含む。複数のＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトの混合物を医薬組成物に含めることで、コンストラクトの免疫効力を相乗的に増強することが可能となる。複数のＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトを含む医薬組成物は、ＭＨＣクラスＩＩ適用範囲が広いことで、より大きな遺伝的集団において有効性が向上し得るため、ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトに対する免疫応答を改善させる。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、配列番号１０７～２１５（表３）から選択されるＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクト、ならびにその相同体、類似体、及び／または組み合わせを含む。
ある特定の実施形態では、ＭＶＦ及びＨＢｓＡｇに由来する異種Ｔｈエピトープを組み合わせ形態（配列番号８７～９０）で含むＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクト（配列番号１７０～１７２）を等モル比で混合して製剤に使用することで、多様な遺伝的背景を有する宿主集団を最大限にカバーすることが可能であった。ＩＬ－６ ７３～８３免疫原コンストラクト（配列番号１７０、配列番号１７２）では、本開示のペプチド組成物において相乗的な増強が生じることが観察された。
さらに、ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクト（例えば、配列番号９１のＵＢＩＴｈ（登録商標）１）によって誘導される抗体応答は、そのほとんど（＞９０％）が、ＩＬ－６のＢ細胞エピトープペプチド（配列番号５）に対する所望の交差反応性に集中しており、免疫原性増強に用いた異種Ｔｈエピトープに指向化されたものは、仮に伴うとしても多くはなかった（実施例６、表８）。このことは、そのようなＩＬ－６ペプチド免疫原性増強に使用される従来のタンパク質（ＫＬＨなど）または他の生物学的タンパク質担体とは際立って対照的である。
他の実施形態では、ペプチド組成物（例えば、ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトの混合物を含むもの）を、アジュバントとしての無機塩（アラムゲル（ＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ）またはリン酸アルミニウム（ＡＤＪＵＰＨＯＳ）を含む）と接触させて懸濁液製剤を形成させたものを含む医薬組成物を、宿主への投与に使用した。
ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトを含む医薬組成物を使用することで、投与時に宿主において免疫応答が誘発され、抗体が産生され得る。
ｃ．免疫刺激性複合体
本開示は、ＣｐＧオリゴヌクレオチドとの免疫刺激性複合体の形態でＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトを含む医薬組成物も対象とする。そのような免疫刺激性複合体は、具体的には、アジュバントかつペプチド免疫原安定化剤として働くことに適したものである。免疫刺激性複合体は、微粒子の形態をとり、この微粒子は、ＩＬ－６ペプチド免疫原を免疫系の細胞に効率的に提示して免疫応答を生じさせ得る。免疫刺激性複合体は、非経口投与用の懸濁液として製剤化され得る。免疫刺激性複合体は、油中水型（ｗ／ｏ型）エマルションの形態で製剤化されるか、無機塩と組み合わさった懸濁液として製剤化されるか、または非経口投与後に宿主の免疫系の細胞にＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトを効率的に送達するためのインサイチュゲル化ポリマーと共に製剤化されることもあり得る。
ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトを、アニオン性分子、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、またはそれらの組み合わせと静電気的な結合を介して複合体化させることによって、安定化された免疫刺激性複合体が形成され得る。安定化された免疫刺激性複合体は、免疫原送達系として医薬組成物に組み込まれ得る。
ある特定の実施形態では、ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトは、５．０～８．０のｐＨ範囲で正に荷電するカチオン性部分を含むように設計される。ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトのカチオン性部分上の正味の電荷またはコンストラクトの混合物のカチオン性部分上の正味の電荷は、それぞれのリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）については＋１の電荷、それぞれのアスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）については－１の電荷、当該配列内の他のアミノ酸については０の電荷を割り当てることによって計算される。電荷は、ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトのカチオン性部分内で合計され、正味の平均電荷として表される。適切なペプチド免疫原は、正味の平均正電荷が＋１であるカチオン性部分を有する。好ましくは、ペプチド免疫原は、＋２を超える範囲の正味の正電荷を有する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトのカチオン性部分は異種スペーサーである。ある特定の実施形態では、ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトのカチオン性部分は、スペーサー配列が（α，ε－Ｎ）Ｌｙｓ、ε－Ｎ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ（配列番号７７）である場合、＋４の電荷を有する。
本明細書に記載の「アニオン性分子」は、５．０～８．０のｐＨ範囲で負に荷電する任意の分子を指す。ある特定の実施形態では、アニオン性分子は、オリゴマーまたはポリマーである。オリゴマー上またはポリマー上の正味の負電荷は、オリゴマー中のそれぞれのホスホジエステル基またはホスホロチオエート基について－１の電荷を割り当てることによって計算される。適切なアニオン性オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド塩基数が８～６４であり、ＣｐＧモチーフのリピート数の範囲が１～１０の一本鎖ＤＮＡ分子である。好ましくは、ＣｐＧ免疫刺激性一本鎖ＤＮＡ分子は、含有ヌクレオチド塩基数が１８～４８であり、ＣｐＧモチーフのリピート数の範囲が３～８のものであり得る。
より好ましくは、アニオン性オリゴヌクレオチドは、５’Ｘ１ＣＧＸ２３’という式によって表され、式中、Ｃ及びＧは、メチル化されておらず、Ｘ１は、Ａ（アデニン）、Ｇ（グアニン）、及びＴ（チミン）からなる群から選択され、Ｘ２は、Ｃ（シトシン）またはＴ（チミン）である。あるいは、アニオン性オリゴヌクレオチドは、５’（Ｘ３）２ＣＧ（Ｘ４）２３’という式によって表され、Ｃ及びＧは、メチル化されておらず、Ｘ３は、Ａ、Ｔ、またはＧからなる群から選択され、Ｘ４は、ＣまたはＴである。特定の実施形態では、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、ＣｐＧ１：５’ＴＣｇ ＴＣｇ ＴＴＴ ＴｇＴ ＣｇＴ ＴＴＴ ｇＴＣ ｇＴＴ ＴＴｇ ＴＣｇ ＴＴ ３’（完全にホスホロチオエート化されたもの）（配列番号２３２）、ＣｐＧ２：５’リン酸ＴＣｇ ＴＣｇ ＴＴＴ ＴｇＴ ＣｇＴ ＴＴＴ ｇＴＣ ｇＴＴ ３’（完全にホスホロチオエート化されたもの）（配列番号２３３）、またはＣｐＧ３ ５’ＴＣｇ ＴＣｇ ＴＴＴ ＴｇＴ ＣｇＴ ＴＴＴ ｇＴＣ ｇＴＴ ３’（完全にホスホロチオエート化されたもの）（配列番号２３４）という配列を有する。
得られる免疫刺激性複合体は、サイズが典型的には１～５０ミクロンの範囲の粒子の形態をとり、相互作用種の相対的電荷化学量論及び分子量を含めて、多くの因子の影響を受けるものである。微粒子状の免疫刺激性複合体は、インビボで特定の免疫応答のアジュバント作用及び上方制御を与えるという利点を有する。さらに、安定化された免疫刺激性複合体は、油中水型エマルション、無機塩懸濁液、及びポリマーゲルを含めて、さまざまなプロセスによる医薬組成物の調製に適する。
本開示は、ＩＬ－６調節異常による影響を受ける疾患を予防及び／または治療するための医薬組成物（製剤を含む）も対象とする。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトの免疫原性をさらに増強すると共に、配列番号１～４のＩＬ－６タンパク質と交差反応し、ＩＬ－６Ｒ結合領域に指向化された抗体を誘導するための安定化された免疫刺激性複合体（ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクト（例えば、配列番号１０７～２１５）の混合物を含むペプチド組成物とＣｐＧオリゴマーとを混合することで、静電気的な結合を介して形成される）を含む（実施例６）。
さらに他の実施形態では、医薬組成物は、ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトの混合物（例えば、配列番号１０７～２１５の任意の組み合わせ）を、ＣｐＧオリゴマー（高い安全係数を有するアジュバントとしての無機塩（アラムゲル（ＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ）またはリン酸アルミニウム（ＡＤＪＵＰＨＯＳ）を含む）と任意選択で混合される）との安定化された免疫刺激性複合体の形態で含むことで、宿主に投与するための懸濁液製剤を形成する。
抗体
本開示は、開示のＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトによって誘導される抗体も提供する。
本開示は、製造でのコスト効率が高く、自体の設計が最適であり、ＩＬ－６分子のＩＬ－６Ｒ結合領域を標的とする高力価抗体を誘導する能力を有し、自己タンパク質であるＩＬ－６に対する免疫寛容を壊す能力を有し、免疫化される宿主でのレスポンダー率が高いＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクト及びその製剤を提供する。ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトによって生成される抗体は、ＩＬ－６Ｒ結合領域に対して高い親和性を有する。
いくつかの実施形態では、抗体を誘導するためのＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトは、ＩＬ－６Ｒα及びＩＬ－６Ｒβとの結合領域をカバーする約７～約４２個のアミノ酸を含むＢ細胞エピトープ（任意選択で、ＩＬ－６（表１、図１、ならびに配列番号１及び配列番号２２７を参照のこと）内のＩＬ－６ペプチド（Ｃ７３～Ｃ８３（配列番号５）またはＣ４４～Ｃ５０（配列番号１５））に由来する分子内ループ構造を含む）を有するＩＬ－６ペプチドが、任意選択のスペーサーを介して、病原性タンパク質（麻疹ウイルス融合（ＭＶＦ）タンパク質など）に由来する異種Ｔｈエピトープ及び他のもの（配列番号７８～１０６及び配列番号２１６～２２６）に連結されたハイブリッド物を含む。ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトのＢ細胞エピトープ及びＴｈエピトープは、一緒に働くことで、ＩＬ－６タンパク質（配列番号１）のＩＬ－６Ｒ結合領域と交差反応する高度に特異的な抗体の生成を刺激する。
ペプチドに対する免疫応答を増強するための伝統的な方法（担体タンパク質（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）または他の担体タンパク質（ジフテリアトキソイド（ＤＴ）タンパク質及び破傷風トキソイド（ＴＴ）タンパク質など））への化学的カップリングを行うものなど）では、典型的には、そうした担体タンパク質に対して指向化された抗体が大量に生成してしまうという結果を招く。したがって、そのようなペプチド－担体タンパク質組成物の主な欠点は、当該免疫原によって生成される抗体のほとんど（＞９０％）が、担体タンパク質（ＫＬＨ、ＤＴ、またはＴＴ）に対して指向化された非機能性抗体であることであり、こうした担体タンパク質は、エピトープ抑制（ｅｐｉｔｏｐｉｃ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）を招き得るものである。
ペプチドに対する免疫応答を増強するための伝統的な方法とは異なり、開示のＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクト（例えば、配列番号１４２）によって生成される抗体は、ＩＬ－６ Ｂ細胞エピトープペプチド（例えば、配列番号５～１９）に対して高度に特異的に結合し、異種Ｔｈエピトープ（例えば、表８の配列番号９１）または任意選択の異種スペーサーに対して指向化された抗体は、仮に伴うとしても極めて少ない。具体的には、免疫化された動物において誘導されるポリクローナル抗体は、中央のＩＬ－６Ｒ結合領域（配列番号１０７）に高度に特異的に結合し、その結果、図５Ａに示されるように、シスシグナル伝達を介するＩＬ－６とＩＬ－６Ｒとの相互作用が阻害される。
方法
本開示は、ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクト、組成物、及び医薬組成物の調製方法及び使用方法も対象とする。
ａ．ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトを製造するための方法
本開示のＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトは、当業者によく知られる化学合成法によって調製され得る（例えば、Fields et al., Chapter 3 in Synthetic Peptides: A User’s Guide, ed. Grant, W. H. Freeman & Co., New York, NY, 1992, p.77を参照のこと）。ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトは、自動化メリフィールド固相合成手法を使用して合成することができ、この手法は、側鎖保護アミノ酸を使用してｔ－Ｂｏｃ化学またはＦ－ｍｏｃ化学のいずれかによってα－ＮＨ２を保護することによって行われ、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒのモデル４３０Ａまたはモデル４３１で行われる。Ｔｈエピトープの組み合わせライブラリーペプチドを含むＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトの調製は、所与の可変位置の時点でのカップリングに代替アミノ酸の混合物を使用することによって達成され得る。
所望のＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトが完全に構築された後、標準的な手順に従って樹脂を処理することで、樹脂からペプチドを切断し得、アミノ酸側鎖上の官能基を脱保護し得る。遊離のペプチドは、ＨＰＬＣによって精製され、生化学的に特徴付けられ得る。この特徴付けは、例えば、アミノ酸分析または配列決定によって行われる。ペプチドの精製方法及び特徴付け方法は、当業者によく知られている。
この化学プロセスによって生成されるペプチドの品質は、制御及び規定することができるものであり、結果として、ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクト、免疫原性、及び収率の再現性が保証され得る。固相ペプチド合成を介するＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトの製造についての詳細説明は実施例１に示される。
意図する免疫学的活性の保持を可能にする構造可変性範囲は、小分子薬物による特定の薬物活性の保持を可能にする構造可変性範囲、または生物学的に得られる薬物と共に生じる大分子に見られる所望の活性及び望ましくない毒性の保持を可能にする構造可変性範囲と比較してはるかに柔軟なものであることが明らかになっている。
したがって、ペプチド類似体は、意図的に設計されるものにしても、意図するペプチドと同様のクロマトグラフィー特性及び免疫学的特性を有する欠損配列副生成物の混合物として合成プロセスのエラーによって不可避的に生じるものにしても、所望のペプチドの精製調製物と同じくらい有効であることが多い。設計される類似体及び意図しない類似体混合物は、製造プロセス及び製品評価プロセスの両方を監視するために識別ＱＣ手順が開発されて、こうしたペプチドを用いる最終製品の再現性及び効力が保証される限りにおいては、有効である。
ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトは、核酸分子、ベクター、及び／または宿主細胞を含めて、組換えＤＮＡ技術を使用しても調製され得る。したがって、ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトをコードする核酸分子、及びペプチド免疫原コンストラクトの免疫学的に機能性の類似体をコードする核酸分子もまた、本開示の一部として本開示によって包含される。同様に、核酸分子を含むベクター（発現ベクターを含む）ならびにそうしたベクターを含む宿主細胞もまた、本開示の一部として本開示によって包含される。
さまざまな例示の実施形態は、ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクト及びその免疫学的に機能性の類似体の生成方法も包含する。例えば、方法は、ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクト及び／またはその免疫学的に機能性の類似体をコードする核酸分子を含む発現ベクターを含む宿主細胞を、そうしたペプチド及び／または類似体が発現する条件の下でインキュベートするステップを含み得る。よく知られる組換えＤＮＡ手法によって、より長い合成ペプチド免疫原が合成され得る。そのような手法は、詳細なプロトコールと共に、よく知られるマニュアルにおいて提供されている。本開示のペプチドをコードする遺伝子を構築するには、アミノ酸配列をコードする核酸配列が、アミノ酸配列を逆翻訳して取得され、こうした核酸配列では、好ましくは、遺伝子が発現することになる生物に最適なコドンが用いられる。次に、典型的には、ペプチド及び必要に応じて任意の制御エレメントをコードするオリゴヌクレオチドを合成することによって合成遺伝子が調製される。合成遺伝子は、適切なクローニングベクターに挿入され、宿主細胞にトランスフェクトされる。その後、ペプチドは、選択される発現系及び宿主に適した適切な条件の下で発現される。ペプチドは、標準的な方法によって精製され、特徴付けられる。
ｂ．免疫刺激性複合体を製造するための方法
さまざまな例示の実施形態は、ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクト及びＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）分子を含む免疫刺激性複合体の生成方法も包含する。安定化された免疫刺激性複合体（ＩＳＣ）は、ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトのカチオン性部分及びポリアニオン性ＣｐＧ ＯＤＮ分子から得られる。この自己集合系は、電荷の静電気的な中和によって促進される。アニオン性オリゴマーに対するＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトのカチオン性部分のモル電荷比の化学量論によって集合の程度が決まる。ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトとＣｐＧ ＯＤＮとの非共有結合性の静電気的な結合は、完全に再現性のあるプロセスである。ペプチド／ＣｐＧ ＯＤＮ免疫刺激性複合集合体は、免疫系の「プロフェッショナル」抗原提示細胞（ＡＰＣ）に対する提示を促進し、それによって自体の免疫原性をさらに増強する。こうした複合体は、製造の間の品質制御のための特徴付けが容易なものである。ペプチド／ＣｐＧ ＩＳＣのインビボでの忍容性は良好である。ＣｐＧ ＯＤＮ及びＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトを含むこの新規の微粒子系は、ＣｐＧ ＯＤＮの使用と関連する全般的なＢ細胞分裂促進性を利用し、さらにはＴｈ－１／Ｔｈ－２型応答のバランス取りを促進するように設計した。
開示の医薬組成物中のＣｐＧ ＯＤＮは、反対電荷の静電気的な中和によって媒介されるプロセスにおいて免疫原に１００％結合し、その結果、ミクロンサイズの微粒子を形成する。この微粒子形態は、ＣｐＧアジュバントの従来の使用と比較してＣｐＧの投与量を顕著に減らし、有害な自然免疫応答が生じる可能を下げることが可能であり、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む代替の免疫原プロセシング経路を促進する。したがって、そのような製剤は概念的に新規のものであり、代替の機構による免疫応答の刺激を促進することによって利益をもたらすことが見込まれる。
ｃ．医薬組成物を製造するための方法
さまざまな例示の実施形態は、ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトを含む医薬組成物も包含する。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、油中水型エマルションを用いるものであることもあり、無機塩を含む懸濁液に含められることもある。
大きな集団が医薬組成物を使用することを目的とする場合、安全性は、別の重要考慮因子となる。多くの臨床試験において油中水型エマルションが使用されているものの、製剤において使用するための主要なアジュバントは依然としてアラムであり、これはアラムが安全性を有するが故のことである。したがって、臨床適用のための調製物におけるアジュバントとしてアラムまたはその無機塩（リン酸アルミニウム（ＡＤＪＵＰＨＯＳ））が使用されることが多い。
他のアジュバント及び免疫刺激剤には、３－Ｏ－脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）または３－ＤＭＰ、ポリマーアミノ酸またはモノマーアミノ酸（ポリグルタミン酸またはポリリジンなど）が含まれる。そのようなアジュバントは、他の特定の免疫刺激剤と併用されるか、または他の特定の免疫刺激剤を併用せずに使用され得る。こうした他の特定の免疫刺激剤は、ムラミルペプチド（例えば、Ｎ－アセチルムラミル－Ｌ－スレオニル－Ｄ－イソグルタミン（ｔｈｒ－ＭＤＰ）、Ｎ－アセチル－ノルムラミル－Ｌ－アラニル－Ｄ－イソグルタミン（ｎｏｒ－ＭＤＰ）、Ｎ－アセチルムラミル－Ｌ－アラニル－Ｄ－イソグルタミニル－Ｌ－アラニン－２－（１’－２’ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ヒドロキシホスホリルオキシ）－エチルアミン（ＭＴＰ－ＰＥ）、Ｎ－アセチルグルコサミニル－Ｎ－アセチルムラミル－Ｌ－Ａｌ－Ｄ－イソグル－Ｌ－Ａｌａ－ジパルミトキシプロピルアミド（ＤＴＰ－ＤＰＰ）ＴＨＥＲＡＭＩＤＥ（商標））、または他の細菌細胞壁成分などである。水中油型エマルションには、ＭＦ５９（Van Nest et al.に付与されたＷＯ９０／１４８３７を参照のこと。当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）（５％のスクアレン、０．５％のＴＷＥＥＮ８０、及び０．５％のＳｐａｎ８５（さらに、任意選択で、さまざまな量のＭＴＰ－ＰＥ）を含み、マイクロフルイダイザーを使用してサブミクロン粒子に製剤化されたもの）、ＳＡＦ（１０％のスクアレン、０．４％のＴＷＥＥＮ８０、５％のｐｌｕｒｏｎｉｃブロックポリマーＬ１２１、及びｔｈｒ－ＭＤＰを含み、マイクロフルイダイザーによってサブミクロンエマルションにされるか、またはボルテックスしてより大きな粒子サイズのエマルションを生成させたもの）、ならびにＲＩＢＩ（商標）アジュバント系（ＲＡＳ）（Ribi Immuno Chem, Hamilton, Mont.）（２％のスクアレンと、０．２％のＴＷＥＥＮ８０と、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、及び細胞壁骨格（ＣＷＳ）からなる群から選択される１つ以上の細菌細胞壁成分（好ましくは、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ（商標）））と、を含む）が含まれる。他のアジュバントには、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）、ならびにサイトカイン（インターロイキン（ＩＬ－１、ＩＬ－２、及びＩＬ－１２）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、ならびに腫瘍壊死因子（ＴＮＦ－α）など）が含まれる。
アジュバントの選択は、アジュバントを含む免疫原性製剤の安定性、投与経路、投薬スケジュール、免疫化される種に対するアジュバントの効力に依存し、ヒトでは、医薬的に許容可能なアジュバントは、関連規制機関によってヒトへの投与の認可を受けているか、または受けることが可能なものである。例えば、アラム、ＭＰＬ、または不完全フロイントアジュバント（（Chang, et al., 1998）、当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）は、単独でもヒトへの投与に適し、任意選択でそれらを組み合わせたものもすべて、ヒトへの投与に適する。
組成物は、医薬的に許容可能な無毒な担体または希釈剤を含み得、こうした担体または希釈剤は、動物またはヒトへの投与向けの医薬組成物の製剤化に一般に使用される媒体として定義される。希釈剤は、組み合わせるものの生物学的活性に影響を与えないように選択される。そのような希釈剤の例は、蒸留水、生理学的リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、及びハンクス液である。さらに、医薬組成物または製剤は、他の担体、アジュバント、または無毒かつ非治療的な非免疫原性の安定化剤、及び同様のものも含み得る。
医薬組成物は、大型で代謝が緩徐な巨大分子も含み得、こうした巨大分子は、タンパク質、キトサンのような多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、及びコポリマー（例えば、ラテックス官能化ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、アガロース、セルロース、及び同様のもの）、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、ならびに脂質集合体（例えば、油滴またはリポソーム）などである。さらに、こうした担体は、免疫刺激剤（すなわち、アジュバント）として機能し得る。
本開示の医薬組成物は、適切な送達媒体をさらに含み得る。適切な送達媒体には、限定されないが、ウイルス、細菌、生分解性マイクロスフェア、微粒子、ナノ粒子、リポソーム、コラーゲンミニペレット、及び渦巻型ベシクルが含まれる。
ｄ．医薬組成物の使用方法
本開示は、ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトを含む医薬組成物の使用方法も含む。
ある特定の実施形態では、ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトを含む医薬組成物は、ＩＬ－６の調節異常による影響を受ける疾患の治療に使用され得る。
いくつかの実施形態では、方法は、薬理学的に有効な量のＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトを含む医薬組成物を、それを必要とする宿主に投与することを含む。ある特定の実施形態では、方法は、薬理学的に有効な量のＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトを含む医薬組成物を温血動物（例えば、ヒト、カニクイザル、マウス）に投与することで、ヒトＩＬ－６タンパク質（配列番号１）または他の種に由来するＩＬ－６タンパク質（配列番号２～４）と交差反応する高度に特異的な抗体を誘導することを含む。
ある特定の実施形態では、インビトロアッセイ及びインビボ疾患モデルの両方において示されるように、ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトを含む医薬組成物を使用することで、ＩＬ－６調節の機能障害による影響を受ける疾患が治療され得る。
ｅ．インビトロの機能アッセイ及びインビボの概念実証試験
ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトによって免疫化した宿主において誘導される抗体は、インビトロの機能アッセイにおいて使用され得る。こうした機能アッセイには、限定されないが、下記のものが含まれる。
（１）組換えタンパク質としてのＩＬ－６タンパク質（配列番号１）に対するインビトロでの結合
（２）ＩＬ－６Ｒαに対するＩＬ－６のシス結合のインビトロでの阻害
（３）ＩＬ－６Ｒβに対するＩＬ－６／ＩＬ－６Ｒαのトランス結合のインビトロでの阻害（実施例３）
（４）ＩＬ－６誘導性のＴＦ－１増殖のインビトロでの阻害（実施例３及び実施例７）
（５）ＩＬ－６誘導性のＳＴＡＴ３リン酸化のインビトロでの阻害（実施例３及び実施例７）
（６）ＩＬ－６誘導性のヒトＵ９３７細胞によるＭＣＰ－１産生のインビトロでの阻害（実施例３及び実施例７）
（７）ラットのコラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）モデルのインビボでの抑制
（８）ラットにおける骨髄から循環への好中球の放出のインビボでの抑制／軽減
（９）下記の（ｉ）～（ｖｉｉ）によって測定される関節炎スコアによるラットが示す関節炎症状のインビボでの抑制
（ｉ）炎症誘導性の肝臓分泌タンパク質
（ｉｉ）足首関節の破壊
（ｉｉｉ）組織でのＴＮＦ－α、ＩＬ－１７、及びＭＣＰの産生
（ｉｖ）体重減少の好転
（ｖ）後足の腫脹
（ｖｉ）好中球数増加の軽減
（ｖｉｉ）血小板放出の軽減
特定の実施形態
（１）約３０個以上のアミノ酸を有するＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトであって、前記ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトが、下記の式：
（Ｔｈ）ｍ－（Ａ）ｎ－（ＩＬ－６のＩＬ－６Ｒ結合領域もしくはその断片）－Ｘ
または
（ＩＬ－６のＩＬ－６Ｒ結合領域もしくはその断片）－（Ａ）ｎ－（Ｔｈ）ｍ－Ｘ
または
（Ｔｈ）ｍ－（Ａ）ｎ－（ＩＬ－６のＩＬ－６Ｒ結合領域もしくはその断片）－（Ａ）ｎ－（Ｔｈ）ｍ－Ｘ
によって表され、
式中、
Ｔｈが、異種ヘルパーＴ細胞エピトープであり、
Ａが、異種スペーサーであり、
（ＩＬ－６のＩＬ－６Ｒ結合領域またはその断片）が、ＩＬ－６（配列番号１）のＩＬ－６Ｒ結合領域に由来する約７～約４２個のアミノ酸残基を有するＢ細胞エピトープペプチドであり、
Ｘが、アミノ酸のα－ＣＯＯＨまたはα－ＣＯＮＨ２であり、
ｍが、１～約４であり、
ｎが、０～約１０である、前記ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクト。
（２）前記ＩＬ－６Ｒ結合領域またはその断片が、配列番号５～１９からなる群から選択される、（１）に記載のＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクト。
（３）前記Ｔｈエピトープが、配列番号７８～１０６及び配列番号２１６～２２６からなる群から選択される、（１）または（２）のいずれかに記載のＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクト。
（４）前記ペプチド免疫原コンストラクトが、配列番号１０７～２１５からなる群から選択される、（１）に記載のＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクト。
（５）ａ．配列番号１～４のＩＬ－６配列に由来する約７～約４２個のアミノ酸残基を含むＢ細胞エピトープと、
ｂ．配列番号７８～１０６、配列番号２１６～２２６、及びそれらの任意の組み合わせ、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むヘルパーＴ細胞エピトープと、
ｃ．アミノ酸、Ｌｙｓ－、Ｇｌｙ－、Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－、（α，ε－Ｎ）Ｌｙｓ、ε－Ｎ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ（配列番号７７）、Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－ε－Ｎ－Ｌｙｓ（配列番号２３１）、及びＰｒｏ－Ｐｒｏ－Ｘａａ－Ｐｒｏ－Ｘａａ－Ｐｒｏ（配列番号７６）、ならびにそれらの任意の組み合わせ、からなる群から選択される任意選択の異種スペーサーと、
を含むＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトであって、
前記Ｂ細胞エピトープが、前記ヘルパーＴ細胞エピトープに対して、直接的に共有結合で連結されるか、または前記任意選択の異種スペーサーを介して共有結合で連結される、前記ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクト。
（６）前記Ｂ細胞エピトープが、配列番号５～１９からなる群から選択される、（５）に記載のＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクト。
（７）前記ヘルパーＴ細胞エピトープが、配列番号７８～１０６からなる群から選択される、（５）に記載のＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクト。
（８）前記任意選択の異種スペーサーが、（α，ε－Ｎ）Ｌｙｓ、ε－Ｎ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ（配列番号７７）、Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－ε－Ｎ－Ｌｙｓ（配列番号２３１）、またはＰｒｏ－Ｐｒｏ－Ｘａａ－Ｐｒｏ－Ｘａａ－Ｐｒｏ（配列番号７６）であり、配列中、Ｘａａが、任意のアミノ酸であり、好ましくはアスパラギン酸である、（５）に記載のＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクト。
（９）前記ヘルパーＴ細胞エピトープが、前記Ｂ細胞エピトープのアミノ末端に共有結合で連結される、（５）に記載のＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクト。
（１０）前記ヘルパーＴ細胞エピトープが、前記Ｂ細胞エピトープのアミノ末端に対して、前記任意選択の異種スペーサーを介して共有結合で連結される、（５）に記載のＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクト。
（１１）（１）に記載のＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトを含む組成物。
（１２）ａ．（１）に記載のペプチド免疫原コンストラクトと、
ｂ．医薬的に許容可能な送達媒体及び／またはアジュバントと、
を含む医薬組成物。
（１３）ａ．前記ＩＬ－６Ｒ結合領域またはその断片が、配列番号５～１９からなる群から選択され、
ｂ．前記Ｔｈエピトープが、配列番号７８～１０６及び配列番号２１６～２２６からなる群から選択され、
ｃ．前記異種スペーサーが、アミノ酸、Ｌｙｓ－、Ｇｌｙ－、Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－、（α，ε－Ｎ）Ｌｙｓ、ε－Ｎ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ（配列番号７７）、Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－ε－Ｎ－Ｌｙｓ（配列番号２３１）、及びＰｒｏ－Ｐｒｏ－Ｘａａ－Ｐｒｏ－Ｘａａ－Ｐｒｏ（配列番号７６）、ならびにそれらの任意の組み合わせ、からなる群から選択され、
前記ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトが、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）と混合されることで、安定化された免疫刺激性複合体を形成する、（１２）に記載の医薬組成物。
（１４）ａ．前記ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトが、配列番号１０７～２１５からなる群から選択され、
前記ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトが、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）と混合されることで、安定化された免疫刺激性複合体を形成する、（１２）に記載の医薬組成物。
（１５）動物においてＩＬ－６に対する抗体を生成させるための方法であって、前記方法が、（１２）に記載の医薬組成物を前記動物に投与することを含む、前記方法。
（１６）（１）に記載のＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクト中の前記ＩＬ－６のＩＬ－６Ｒ結合領域またはその断片に特異的に結合する、単離された抗体またはそのエピトープ結合断片。
（１７）前記ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトに結合した、（１６）に記載の単離された抗体またはそのエピトープ結合断片。
（１）～（１０）のいずれかに記載のＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトの前記Ｂ細胞エピトープペプチドに特異的に結合する、単離された抗体またはそのエピトープ結合断片。
（１８）（１６）に記載の単離された抗体またはそのエピトープ結合断片を含む組成物。
（１９）動物におけるＩＬ－６調節異常による影響を受ける疾患を予防及び／または治療する方法であって、前記方法が、（１２）に記載の医薬組成物を前記動物に投与することを含む、前記方法。
実施例１
ＩＬ－６関連ペプチドの合成及びその製剤の調製
ａ．ＩＬ－６関連ペプチドの合成
ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトの開発労力に含まれたＩＬ－６関連ペプチドの合成方法について記載される。これらのペプチドは、血清学的アッセイ、実験室パイロット試験、及びフィールド試験に有用な小スケール量で合成すると共に、医薬組成物の産業的／商業的な生産に有用な大スケール（キログラム）量でも合成した。エピトープマッピング、ならびに有効なＩＬ－６標的指向型治療組成物における使用に最も適したペプチド免疫原コンストラクトのスクリーニング及び選択を目的として、アミノ酸数約７～７０の長さの配列を有するＩＬ－６関連抗原性ペプチドの大きなレパートリーを設計した。
表１には、ヒト種、マウス種、ラット種、及びマカク種の代表的な全長ＩＬ－６（配列番号１～４）、ＩＬ－６ペプチド断片、及びさまざまな血清学的アッセイにおけるエピトープマッピングに用いた１０マーペプチドが示される（配列番号５～７５）。
病原体タンパク質を元にして慎重に設計したヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）エピトープペプチドに対して合成的に連結することによって、選択ＩＬ－６ Ｂ細胞エピトープペプチドをＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトにした。元にした病原体タンパク質には、表２に示される麻疹ウイルス融合タンパク質（ＭＶＦ）、Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質（ＨＢｓＡｇ）、ペプチドインフルエンザ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｕｍ ｔｅｔａｎｉ、及びエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）（配列番号７８～１０６及び配列番号２１６～２２６）が含まれる。Ｔｈエピトープペプチドを、単一配列（配列番号７８～８６及び配列番号９１～１０６）または組み合わせライブラリー（配列番号８７～９０）のいずれかとして使用することで、そのそれぞれのＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトの免疫原性を増強した。
表３には、数百のペプチドコンストラクトから選択した代表的なＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトが示される（配列番号１０７～２１５）。
抗ＩＬ－６抗体を検出及び／または測定するための免疫原性試験または関連血清学的試験に使用したペプチドはすべて、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓのモデル４３０Ａペプチド合成機、モデル４３１ペプチド合成機、及び／またはモデル４３３ペプチド合成機によってＦ－ｍｏｃ化学を使用して小スケールで合成した。Ｎ末端をＦ－ｍｏｃで保護し、三官能性アミノ酸には側鎖保護基も用いて固相担体上での独立した合成によって各ペプチドを生成させた。合成が完了したペプチドを固相担体から切り離し、９０％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）によって側鎖保護基を除去した。マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）質量分析によって合成ペプチド調製物を評価してアミノ酸内容が正しいことを確かめた。逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）によっても各合成ペプチドを評価して調製物の合成プロファイル及び濃度を確認した。合成プロセスの厳格な制御（カップリング効率のステップワイズ監視を含む）を行ったものの、アミノ酸の挿入、欠損、置換、及び中途終結を含めて、伸長サイクルの間に意図しない事象が生じたことに起因してペプチド類似体も生成された。したがって、合成した調製物には、典型的には、狙ったペプチドに加えて複数のペプチド類似体も一緒に含まれていた。
そのような意図しないペプチド類似体は含まれていたものの、それでもなお、得られた合成ペプチド調製物は、免疫学的診断（抗体捕捉抗原として）及び医薬組成物（ペプチド免疫原として）を含めて、免疫学的応用における使用に適したものであった。典型的には、そのようなペプチド類似体は、意図的に設計したものにしても、副生成物の混合物として合成プロセスを介して生じたものにしても、製造プロセス及び製品評価プロセスの両方を監視するために識別ＱＣ手順が開発されて、こうしたペプチドを用いる最終製品の再現性及び効力が保証される限りにおいては、所望のペプチドの精製調製物と同じくらい有効であることが多い。数百～キログラム量での大スケールのペプチド合成は、カスタマイズされた自動化ペプチド合成機ＵＢＩ２００３または同様のもので、１５ミリモル～１５０ミリモルスケールで実施した。
臨床試験のための最終的な医薬組成物において使用した活性成分については、ＩＬ－６関連ペプチド免疫原コンストラクトを、緩やかな濃度勾配でグラジエント溶出する分取ＲＰ－ＨＰＬＣによって精製し、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析、アミノ酸分析、及びＲＰ－ＨＰＬＣによってその純度及び独自性を特徴付けた。
ｂ．ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトを含む組成物の調製
油中水型エマルションを用いる製剤、及び無機塩を含む懸濁液における製剤を調製した。大きな集団によって使用されるように医薬組成物を設計するには、安全性は、別の重要考慮因子となる。多くの臨床試験では油中水型エマルションが医薬組成物としてヒトに使用されているという事実はあるものの、医薬組成物において使用するための主要なアジュバントは依然としてアラムであり、これはアラムが安全性を有するが故のことである。したがって、臨床適用のための調製物におけるアジュバントとしてアラムまたはその無機塩（ＡＤＪＵＰＨＯＳ（リン酸アルミニウム））が使用されることが多い。
簡潔に記載すると、以下に記載の試験群のそれぞれに具体的に記載される製剤には、一般に、すべての型のＩＬ－６デザイナーペプチド免疫原コンストラクトを含めた。２００を超えるデザイナーＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトを、それらの相対的な免疫原性について、そうした免疫原のＢ細胞エピトープペプチドを代表する対応ＩＬ－６ペプチドを用いてモルモットにおいて慎重に評価した。異なる相同ペプチドに対するエピトープマッピング及び血清学的交差反応性の分析を、配列番号１～７５のリストから選択されるペプチドでコートされたプレートを使用するＥＬＩＳＡアッセイによって行った。
異なる量のＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトを、ヒトでの使用が認可された油としてＳｅｐｐｉｃ ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ（商標）ＩＳＡ５１を用いて油中水型エマルションで調製するか、または無機塩ＡＤＪＵＰＨＯＳ（リン酸アルミニウム）もしくはＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ（アラム）と混合した（明記されるように行った）。典型的には、ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトを約２０～８００μｇ／ｍＬで水に溶解することによって組成物を調製し、ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ（商標）ＩＳＡ５１を用いて油中水型エマルションにして製剤化（体積で１：１）するか、または無機塩ＡＤＪＵＰＨＯＳもしくはＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ（アラム）を用いて製剤化（体積で１：１）した。組成物を室温で約３０分間保持し、約１０～１５秒間ボルテックスによって混合してから免疫化に使用した。特定の組成物の２～３回用量を用いて動物を免疫化し、これらの投与は、初回免疫化後経過週数（ｗｐｉ）が０の時点（プライム）及び３の時点（ブースト）で実施し、２回目のブーストについては任意選択で５ｗｐｉまたは６ｗｐｉの時点で実施し、これらの投与は、筋肉内経路によって実施した。その後、免疫化動物から得られた血清を、選択したＢ細胞エピトープペプチド（複数可）を用いて試験することで、製剤中に存在するさまざまなＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトの免疫原性、及びＩＬ－６タンパク質との対応血清の交差反応性について評価した。モルモットにおける最初のスクリーニングにおいて強力な免疫原性を有することが明らかになったＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトについては、その対応血清の機能特性をインビトロアッセイにおいてさらに試験した。次に、選択した候補ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトを、免疫化プロトコールによって示される特定期間にわたる投薬レジメン用として、油中水型エマルションベースの製剤、無機塩ベースの製剤、及びアラムベースの製剤として調製した。
新薬臨床試験開始届の提出に備えて行うＧＬＰ指針に沿う前臨床試験における免疫原性試験、持続期間試験、毒性試験、及び効力試験、ならびにＩＬ－６調節異常による影響を受けている患者でのその後の臨床試験のための最終的な製剤に組み込む前に、最も有望なＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトのみ、さらなる評価を広範に実施した。
下記の実施例は、本開示を例示するためのものであり、本開示の限定に使用されるものではない。
実施例２
血清学的アッセイ及び試薬
以下では、ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクト及びその製剤の機能的免疫原性を評価するための血清学的アッセイ及び試薬について詳述される。
ａ．抗体特異性分析のためのＩＬ－６またはＩＬ－６ペプチド断片ベースのＥＬＩＳＡ試験
以下の実施例に記載の免疫血清試料を評価するためのＥＬＩＳＡアッセイを開発し、このアッセイについて以下に記載した。ＩＬ－６またはＩＬ－６断片ペプチド（配列番号１～２０、配列番号７２～７５）を２μｇ／ｍＬ（別段の記載がない限り）で含めた１０ｍＭのＮａＨＣＯ３緩衝液（ｐＨ９．５）（別段の記載がない限り）を１００μＬ用いて９６ウェルプレートのウェルを３７℃で１時間、それぞれコートした。
ＩＬ－６またはＩＬ－６断片ペプチドでコートしたウェルを、ゼラチン含量３重量％のＰＢＳ（２５０μＬ）と共に３７℃で１時間インキュベートして非特異的なタンパク質結合部位をブロッキングした後、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０含量０．０５体積％のＰＢＳを用いて当該ウェルを３回洗浄し、乾燥させた。正常ヤギ血清含量２０体積％、ゼラチン含量１重量％、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０含量０．０５体積％のＰＢＳを用いて、分析対象の血清を（別段の記載がない限り）１：２０希釈した。希釈した検体（例えば、血清、血漿）のうちの１００マイクロリットル（１００μＬ）を各ウェルに添加し、３７℃で６０分間反応させた。次に、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０含量０．０５体積％のＰＢＳを用いてウェルを６回洗浄して非結合抗体を除去した。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合型の種（例えば、モルモットまたはラット）特異的ヤギポリクローナル抗ＩｇＧ抗体またはプロテインＡ／Ｇを標識型トレーサーとして使用することで、陽性ウェルにおいて形成された抗体／ペプチド抗原複合体と結合させた。正常ヤギ血清含量１体積％、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０含量０．０５体積％のＰＢＳ中に、あらかじめ力価測定して決定した最適な希釈率でＨＲＰ標識型検出試薬を含めたものを、各ウェルに１００マイクロリットル添加し、３７℃でさらに３０分間インキュベートした。ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０含量０．０５体積％のＰＢＳを用いてウェルを６回洗浄して非結合抗体を除去し、クエン酸ナトリウム緩衝液中に３’，３’，５’，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を０．０４重量％、過酸化水素を０．１２体積％含む基質混合物１００μＬとウェルをさらに１５分間反応させた。この基質混合物を使用して、着色生成物を形成させることによってペルオキシダーゼ標識を検出した。１．０ＭのＨ２ＳＯ４を１００μＬ添加することによって反応を停止し、４５０ｎｍでの吸光度（Ａ４５０）を決定した。さまざまなペプチド製剤を投与した免疫化動物の抗体力価の決定には、１０倍の段階希釈を行って１：１００～１：１０，０００とした血清を試験するか、または４倍の段階希釈を行って１：１００～１：４．１９×１０８とした血清を試験した。試験した血清の力価（Ｌｏｇ１０として表される）は、Ａ４５０のカットオフ値を０．５としてＡ４５０の線形回帰分析によって計算した。
ｂ．ＴｈペプチドベースのＥＬＩＳＡによるＴｈペプチドに対する抗体反応性の評価
Ｔｈペプチドを２μｇ／ｍＬ（別段の記載がない限り）で含めた１０ｍＭのＮａＨＣＯ３緩衝液（ｐＨ９．５）（別段の記載がない限り）を１００μＬ用いて９６ウェルプレートのウェルを３７℃で１時間、それぞれコートし、同様のＥＬＩＳＡ法（上記のように実施した）に供した。さまざまなＩＬ－６ペプチド製剤を投与した免疫化動物の抗体力価の決定には、１０倍の段階希釈を行って１：１００～１：１０，０００とした血清を試験した。試験した血清の力価（Ｌｏｇ１０として表される）は、Ａ４５０のカットオフ値を０．５としてＡ４５０の線形回帰分析によって計算した。
ｃ．Ｂ細胞エピトープクラスター１０マーペプチドベースのＥＬＩＳＡ試験によるエピトープマッピングによって決定した標的ＩＬ－６ Ｂ細胞エピトープペプチドの詳細な特異性分析
ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトで免疫化した宿主から得られた抗ＩＬ－６抗体の詳細な特異性分析を、Ｂ細胞エピトープクラスター１０マーペプチドベースのＥＬＩＳＡ試験を使用するエピトープマッピングによって実施した。簡潔に記載すると、個々のＩＬ－６ １０マーペプチド（配列番号２１～７１）をウェル当たり０．５μｇ／０．１ｍＬで用いて９６ウェルプレートのウェルをコートした。その後、上記の抗体ＥＬＩＳＡ法のステップに従って１０マープレートウェル中で１００μＬの血清試料（ＰＢＳ中１：１００希釈）を２連でインキュベートした。免疫化した宿主から得られた抗ＩＬ－６抗体の標的Ｂ細胞エピトープ関連の詳細な特異性分析を、対応するＩＬ－６ペプチド、または特異性を確認するための無関係な対照ペプチドを用いて実施した。
ｄ．免疫原性の評価
実験プロトコールに従って免疫前血清試料及び免疫血清試料を動物またはヒト対象から収集し、５６℃で３０分間加熱して血清中補体因子を不活化した。製剤の投与後、プロトコールに従って血液試料を取得し、特定の標的部位（複数可）に対するその免疫原性を、対応ＩＬ－６ Ｂ細胞エピトープペプチドベースのＥＬＩＳＡ試験によって評価した。段階希釈した血清を試験し、希釈率の逆数のＬｏｇ１０として陽性力価を表した。所望のＢ細胞応答を増強するために用いた「ヘルパーＴ細胞エピトープ」への抗体反応性を低いもの～無視できる程度のものに維持しながら、標的抗原内の所望のエピトープに対して特異的に指向化された高力価抗体応答を誘発する能力、及びＩＬ－６タンパク質との高い交差反応性について、特定の製剤の免疫原性が評価される。
ｅ．ラット血清におけるＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）レベルを評価するための免疫アッセイ
捕捉抗体としてポリクローナルウサギ抗ラットＣＲＰ抗体（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、検出抗体としてビオチン標識型ウサギ抗ラットＣＲＰ抗体（Ａｓｓａｙｐｒｏ ＬＬＣ）を使用して、ラットＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）レベルをサンドイッチＥＬＩＳＡによって測定した。簡潔に記載すると、ポリクローナルウサギ抗ラットＣＲＰ抗体をコート用緩衝液（１５ｍＭのＮａ２ＣＯ３、３５ｍＭのＮａＨＣＯ３（ｐＨ９．６））中に含めて５０ｎｇ／ウェルで９６ウェルプレート上に固定化し、４℃で一晩インキュベートした。コートしたウェルを、２００μＬ／ウェルのアッセイ希釈液（ＢＳＡ含量１％、ＴＷＥＥＮ（登録商標）－２０含量０．０５％、ＰｒｏＣｌｉｎ３００含量０．０１％のＰＢＳ）によって室温で１時間ブロッキングした。洗浄緩衝液（ＴＷＥＥＮ（登録商標）－２０含量０．０５％、ＰｒｏＣｌｉｎ ３００含量０．０１％のＰＢＳ）を２００μＬ／ウェルで用いてプレートを３回洗浄した。組換えラットＣＲＰ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）を使用してアッセイ希釈剤における標準曲線（２．５倍の段階希釈によって調製した４５０～１．８４ｎｇ／ｍＬ範囲のもの）を作成した。コートしたウェルに対して希釈血清（１：３０，０００）及び標準物質を１００μＬ添加した。室温で２時間、インキュベートを実施した。すべてのウェルの吸引処理を行い、洗浄緩衝液を２００μＬ／ウェルで用いてすべてのウェルを５回洗浄した。捕捉されたＣＲＰを１００μＬの検出抗体溶液（１００ｎｇ／ｍｌのビオチン標識型ウサギ抗ラットＣＲＰ抗体を含むアッセイ希釈液）と共に室温で１時間インキュベートした。次に、結合したビオチン標識型抗体を、ストレプトアビジンポリ－ＨＲＰ（１：１０，０００希釈、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（１００μＬ／ウェル）を使用して１時間検出した。すべてのウェルの吸引処理を行い、洗浄緩衝液を２００μＬ／ウェルで用いてすべてのウェルを６回洗浄した。最終的に、１００μＬ／ウェルのＮｅＡ－Ｂｌｕｅ ＴＭＢ基質（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）によってウェルの発色処理を行い、１ＭのＨ２ＳＯ４を１００μＬ／ウェルで添加することによって反応を停止した。ＶｅｒｓａＭａｘ ＥＬＩＳＡ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）によって比色吸光度を測定し、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して４パラメーターロジスティック曲線を当てはめることによって標準曲線を作成し、すべての試験試料中のＣＲＰの濃度計算に使用した。Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用することによってスチューデントｔ検定を使用するデータ比較を行った。
実施例３
動物においてＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトによって誘導される抗体及びその製剤の機能特性評価
（１）ＩＬ－６とその受容体ＩＬ－６Ｒ（ＩＬ－６α及びＩＬ－６Ｒβ／ｇｐ１３０）との間の相互作用を遮断する能力、及び（２）ＲＰＭＩ８２２６細胞におけるＩＬ－６誘導性のＳＴＡＴ３リン酸化を抑制する能力、及び（３）ＩＬ－６依存性のＴＦ－１細胞増殖を抑制する能力、ならびに（４）Ｕ９３７細胞株における単球走化性タンパク質－１（ＭＣＰ－１）の産生を抑制する能力について、免疫化した動物の免疫血清または精製抗ＩＬ－６抗体をさらに試験した。
ａ．細胞
（１）ＲＰＭＩ８２２６細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から購入し、５％ＣＯ２雰囲気の加湿された３７℃のインキュベーターにおいて、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、４．５ｇ／ＬのＬ－グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、及び１％のペニシリン／ストレプトマイシンが添加されたＲＰＭＩ１６４０培地中で維持した。
（２）ＴＦ－１細胞株は、５％ＣＯ２雰囲気の加湿された３７℃のインキュベーターにおいて、２ｍＭのグルタミン、１％のピルビン酸ナトリウム（ＮａＰ）、２ｎｇ／ｍｌのヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ヒトＧＭ－ＣＳＦ）、ならびに１０％のＦＢＳ及び１％のペニシリン／ストレプトマイシンが添加されたＲＰＭＩ１６４０培地中で維持した。
（３）Ｕ９３７細胞株は、５％ＣＯ２雰囲気の加湿された３７℃のインキュベーターにおいて、２ｍＭのグルタミン、１％のＮａＰ、ならびに１０％のＦＢＳ及び１％のペニシリン／ストレプトマイシンが添加されたＲＰＭＩ１６４０培地中で維持した。
ｂ．ＩＬ－６Ｒα鎖に対するＩＬ－６の結合（シス結合）
異なるＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトで事前に免疫化したモルモットの免疫血清をプールし、そこから精製したＩｇＧポリクローナル抗体がＩＬ－６Ｒαに対するＩＬ－６の結合を阻害する相対能力をＥＬＩＳＡによって調べた。組換えＨｉｓタグ付きヒトＩＬ－６Ｒα（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）を４μｇ／ｍＬで含めたコート用緩衝液（１５ｍＭのＮａ２ＣＯ３、３５ｍＭのＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６）を５０μＬ用いて９６ウェルプレートのウェルをそれぞれコートし、４℃で一晩インキュベートした。コートしたウェルを、２００μＬ／ウェルのアッセイ希釈液（ＢＳＡ含量１％、ＴＷＥＥＮ（登録商標）－２０含量０．０５％、ＰｒｏＣｌｉｎ３００含量０．０１％のＰＢＳ）によって室温で１時間ブロッキングした。洗浄緩衝液（ＴＷＥＥＮ－２０含量０．０５％、ＰｒｏＣｌｉｎ ３００含量０．０１％のＰＢＳ）を２００μＬ／ウェルで用いてプレートを３回洗浄した。１０ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ－６（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）混合物１００μＬと、異なる濃度の精製モルモットＩｇＧポリクローナル抗体とを、事前に室温で１時間インキュベートした後、コート済のウェルに添加した。室温で１時間、インキュベートを実施した。すべてのウェルの吸引処理を行い、洗浄緩衝液を２００μＬ／ウェルで用いてすべてのウェルを３回洗浄した。捕捉されたＩＬ－６を、１００μＬ／ウェルのビオチン標識型ウサギ抗ＩＬ－６抗体（１：１，０００希釈、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）によって室温で１時間検出した。次に、結合したビオチン標識型抗体を、ストレプトアビジンポリＨＲＰ（１：４０，０００希釈、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（１００μＬ／ウェル）を使用して１時間検出した。すべてのウェルの吸引処理を行い、洗浄緩衝液を２００μＬ／ウェルで用いてすべてのウェルを３回洗浄した。最終的に、１００μＬ／ウェルのＯｐｔＥＩＡ ＴＭＢ基質（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によってウェルの発色処理を行い、１ＭのＨ２ＳＯ４を１００μＬ／ウェルで添加することによって反応を停止した。ＶｅｒｓａＭａｘ ＥＬＩＳＡ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）によって比色吸光度を測定し、Ｐｒｉｓｍ６ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）において５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を計算するために、４パラメーターロジスティック曲線を当てはめることによって反応性曲線を作成した。
ｃ．ＩＬ－６Ｒβ鎖／ｇｐ１３０に対するＩＬ－６／ＩＬ－６Ｒα鎖複合体の結合（トランス結合）
組換えヒトｇｐ１３０－Ｆｃキメラタンパク質（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を３００ｎｇ／ｍＬで含めたコート用緩衝液（１５ｍＭのＮａ２ＣＯ３、３５ｍＭのＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６）を５０μＬ用いて９６ウェルプレートのウェルをそれぞれコートし、４℃で一晩インキュベートした。コートしたウェルを、２００μＬ／ウェルのアッセイ希釈液（ＢＳＡ含量１％、ＴＷＥＥＮ－２０含量０．０５％、ＰｒｏＣｌｉｎ３００含量０．０１％のＰＢＳ）によって室温で１時間ブロッキングした。洗浄緩衝液（ＴＷＥＥＮ－２０含量０．０５％、ＰｒｏＣｌｉｎ ３００含量０．０１％のＰＢＳ）を２００μＬ／ウェルで用いてプレートを３回洗浄した。アッセイ前に、Ｈｉｓタグ付きヒトＩＬ－６Ｒα（４μｇ／ｍＬ、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）とＩＬ－６（１００ｎｇ／ｍＬ、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）とを室温で１時間インキュベートすることによって、ＩＬ－６：ｓＩＬ－６Ｒαのモル比１：２０でｓＩＬ－６Ｒα／ＩＬ－６複合体を形成させた。１０μＬの事前形成複合体溶液を、異なる濃度の精製モルモットＩｇＧポリクローナル抗体と共に、総体積１００μＬ、室温で１時間インキュベートした後、当該混合物をｇｐ１３０－Ｆｃコートウェルに添加した。室温で１時間、インキュベートを実施した。すべてのウェルの吸引処理を行い、洗浄緩衝液を２００μＬ／ウェルで用いてすべてのウェルを３回洗浄した。捕捉されたＩＬ－６を、１００μＬ／ウェルのビオチン標識型ウサギ抗ＩＬ－６抗体（１：１，０００希釈、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）によって室温で１時間検出した。次に、結合したビオチン標識型抗体を、ストレプトアビジンポリＨＲＰ（１：４０，０００希釈、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（１００μＬ／ウェル）を使用して１時間検出した。すべてのウェルの吸引処理を行い、洗浄緩衝液を２００μＬ／ウェルで用いてすべてのウェルを３回洗浄した。最終的に、１００μＬ／ウェルのＯｐｔＥＩＡ ＴＭＢ基質（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によってウェルの発色処理を行い、１ＭのＨ２ＳＯ４を１００μＬ／ウェルで添加することによって反応を停止した。ＶｅｒｓａＭａｘ ＥＬＩＳＡ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）によって比色吸光度を測定し、Ｐｒｉｓｍ６ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）において５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を計算するために、４パラメーターロジスティック曲線を当てはめることによって反応性曲線を作成した。
ｄ．ＩＬ－６依存性のＴＦ－１細胞増殖アッセイ
ヒト赤白血病ＴＦ－１細胞は、ヒトＩＬ－６に応答して増殖することができる。２．５％のＦＢＳが添加されたＲＰＭＩ１６４０培地中、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で、ウェル当たりの総体積を１００μＬとして、異なる濃度の精製モルモットＩｇＧポリクローナル抗体の存在下で最終濃度１０ｎｇ／ｍＬのヒト組換えＩＬ－６と共に５×１０３個の細胞を７２時間同時インキュベートすることによってアッセイを実施した。試験対照としてトシリズマブ（抗ＩＬ－６受容体抗体）も含めた。ウェル当たり４０μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加した後、当該反応液を室温で１０分間インキュベートすることによって細胞の増殖及び生存度を決定した。得られた発光をＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉ３ｘ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）によって測定し、Ｐｒｉｓｍ６ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）において５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を計算するために、４パラメーターロジスティック曲線を当てはめることによって反応性曲線を作成した。
ｅ．ＩＬ－６誘導性のＳＴＡＴ３リン酸化アッセイ
ＳＴＡＴ３のリン酸化が構成的に活性ではないヒト骨髄腫細胞株ＲＰＭＩ８２２６は、ＳＴＡＴ３の活性化にＩＬ－６への曝露を必要とする。精製ＩｇＧがＲＰＭＩ８２２６細胞におけるＩＬ－６誘導性のＳＴＡＴ３リン酸化を抑制し得るかどうかを調べるために、総体積５００μＬのＲＭＰＩ８２２６培養培地中、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃、１００μｇ／ｍＬ濃度のモルモットポリクローナル抗体の存在下で、最終濃度１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－６と共に８×１０５個の細胞を３０分間同時インキュベートした。試験対照としてトシリズマブ（抗ＩＬ－６受容体抗体）を含めた。ＰａｔｈＳｃａｎ ｐ－Ｓｔａｔ３ ＥＬＩＳＡキット（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）によってリン酸化ＳＴＡＴ３レベルを測定した。簡潔に記載すると、１％のホスファターゼ阻害剤カクテル３（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）が添加された細胞溶解緩衝液（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）３０μＬ中に細胞を懸濁することによって細胞溶解液を調製し、１２，０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離することによって細胞片を除去した。１０μｇの清澄な細胞溶解液を使用して、供給業者の説明パンフレットに従ってリン酸化ＳＴＡＴ３の含量を測定した。ＶｅｒｓａＭａｘ ＥＬＩＳＡ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）によって比色吸光度を測定した。
ｆ．ＩＬ－６誘導性のＭＣＰ－１産生
Ｕ９３７は、いくつかの物質によって成熟マクロファージに分化誘導可能な前単球細胞株である。ＩＬ－６は、単球系細胞におけるＭＣＰ－１産生を誘導することができる。ＩＬ－６ペプチドコンストラクト免疫原によって誘導される抗ＩＬ－６抗体は、Ｕ９３７細胞株におけるＩＬ－６依存性のＭＣＰ－１分泌を調節する可能性がある。ウェル当たり総体積１００μＬのＵ９３７培養培地中、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で、８×１０３個の細胞、最終濃度１０ｎｇ／ｍＬのヒト組換えＩＬ－６、及び異なる濃度の精製モルモットＩｇＧポリクローナル抗体を２４時間インキュベートすることによってアッセイを実施した。抗ＩＬ－６受容体抗体として、トシリズマブも試験対照として含めた。培養培地を３００×ｇで１０分間遠心分離することによって清澄な上清を調製し、－３０℃で保管した。供給業者の説明に従って希釈上清（１：１００希釈）１００μＬをヒトＭＣＰ－１定量化ＥＬＩＳＡキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）に供した。ＶｅｒｓａＭａｘ ＥＬＩＳＡ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）によって比色吸光度を測定し、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して４パラメーターロジスティック曲線を当てはめることによって標準曲線を作成し、すべての試験試料中のＭＣＰ－１濃度の計算に使用した。Ｐｒｉｓｍ６ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）において５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を計算するために、４パラメーターロジスティック曲線を当てはめることによって反応性曲線を作成した。
実施例４
安全性試験、免疫原性試験、毒性試験、及び効力試験において使用した動物
モルモット：
免疫原性試験は、成熟、ナイーブ、かつ成体の雄性及び雌性のＤｕｎｃａｎ－Ｈａｒｔｌｅｙモルモット（３００～３５０ｇ／ＢＷ）において実施した。実験では、群当たり少なくとも３匹のモルモットを利用した。Ｄｕｎｃａｎ－Ｈａｒｔｌｅｙモルモット（８～１２週齢、Ｃｏｖａｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｎｖｅｒ，ＰＡ，ＵＳＡ）と関連するプロトコールは、ＵＢＩスポンサーの契約動物施設において、認可されたＩＡＣＵＣ申請内容で実施した。
ラット：
コラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）の誘導にはルイスラットを用いた。Ｂｉｏｌａｓｃｏから８～１２週齢の雌性ルイスラットを購入し、体重を約１８０ｇに揃えた。ＵＢＩ Ａｓｉａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｆａｃｉｌｉｔｙにて動物を飼育し、一定の温度（２２℃）、湿度（７２％）、１２時間明期／１２時間暗期サイクルの下で１週間順応させた。ラットがラット固形飼料及び水を自由に摂取できるようにした。すべてのプロトコールにおいてＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅに従った。コラーゲン負荷注射は、皮内経路によって０日目及び７日目に尾の付け根に対して実施した。血液採取は、プロトコールに示されるように実施した。臨床的観察は、ＣＩＡげっ歯類モデルにおける関節炎重症度評価のためのスコア付けシステムを使用して３５日目まで１週間に３回実施した。抗ＩＬ－６（ラット）の抗体力価は、ＥＬＩＳＡアッセイによって試験した。関連炎症バイオマーカー（ＣＲＰ）及び血液学的アッセイでの血中ＷＢＣ数を評価した。
実施例５
モルモットにおけるＩＬ－６ペプチドコンストラクトの免疫原性評価のための製剤
以下には、各実験に使用した医薬組成物及び製剤について、より詳細に記載される。簡潔に記載すると、各試験群に明記した製剤には、一般に、異なる型のスペーサー（例えば、ペプチドコンストラクトの溶解性を増進させるためのεＬｙｓ（εＫ）またはリジン－リジン－リジン（ＫＫＫ））を介してＩＬ－６ Ｂ細胞エピトープペプチドが連結されたセグメントと、非選択的ヘルパーＴ細胞エピトープ（麻疹ウイルス融合タンパク質及びＢ型肝炎表面抗原に由来する２つの人工ヘルパーＴ細胞エピトープセットを含む）と、を含むすべての型のデザイナーＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトを含めた。ＩＬ－６ Ｂ細胞エピトープペプチドは、デザイナーペプチドコンストラクトのＮ末端またはＣ末端に連結されている。数百のデザイナーＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトを、それらの相対的な免疫原性について、対応するＩＬ－６ Ｂ細胞エピトープペプチドを用いてモルモットにおいて最初に評価した。異なる量のＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトを、ヒトでのワクチン使用が認可された油としてＳｅｐｐｉｃ ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ ＩＳＡ５１を用いて油中水型エマルションで調製するか、または無機塩（ＡＤＪＵＰＨＯＳ）もしくはＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ（アラム）を用いて懸濁液として調製した（明記されるように行った）。製剤は、通常、ＩＬ－６ペプチドコンストラクトを約２０～８００μｇ／ｍＬで水に溶解することによって調製し、ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ ＩＳＡ５１を用いて油中水型エマルションにして製剤化（体積で１：１）するか、または無機塩（ＡＤＪＵＰＨＯＳ）もしくはＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ（アラム）を用いて製剤化（体積で１：１）した。製剤を室温で約３０分間保持し、約１０～１５秒間ボルテックスによって混合してから免疫化に使用した。
特定の組成物の２～３回用量を用いて何匹かの動物を免疫化し、これらの投与は、初回免疫化後経過週数（ｗｐｉ）が０の時点（プライム）及び３の時点（ブースト）で実施し、２回目のブーストについては任意選択で５ｗｐｉまたは６ｗｐｉの時点で実施し、これらの投与は、筋肉内経路によって実施した。その後、こうした免疫化動物において、それぞれの製剤において使用した対応ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトの免疫原性を、組換えＩＬ－６との交差反応性について評価した。モルモットにおける最初のスクリーニングにおいて強力な免疫原性を有したＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトについては、免疫化プロトコールによって示される特定期間にわたる投薬レジメン用として、油中水型エマルションベースの製剤と無機塩ベースの製剤及びアラムベースの製剤との両方で、マカクにおいてさらに試験した。
最も有望なＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクト候補のみ、マウスまたはラットにおいて免疫寛容を壊すその能力について、対応するマウスまたはラットのＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトを使用してさらなる評価を広範に実施した。最良の免疫原性を有したＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトは、内在性ＩＬ－６に対して抗ＩＬ－６抗体力価を誘発し、特に、ラットにおいて血中炎症因子を抑制し、ＣＩＡ誘導型ルイスラットモデルの関節リウマチ臨床症状を緩和する能力について最良の免疫原性を有するか、またはカニクイザルにおいて外来性ＩＬ－６の皮下投与によって引き起こされる血中好中球数増加を抑制する能力について最良の免疫原性を有していた。こうした最適化されたＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトを、新薬臨床試験開始届の提出に備えて行うＧＬＰ指針に沿う免疫原性試験、持続期間試験、毒性試験、及び効力証明試験、ならびに自己免疫性関節リウマチ患者における臨床試験のための最終的な製剤に組み込んだ。
実施例６
自己免疫性関節リウマチの治療のためのＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトを組み込んだ複数成分製剤の設計根拠、スクリーニング、同定、機能特性評価、及び最適化
ＩＬ－６（サイトカイン）は、設計の標的分子としても、本開示の内容としても選択されている。図１は、ヒト種由来のＩＬ－６配列（配列番号２２７）、マカク種由来のＩＬ－６配列（配列番号２２８）、マウス種由来のＩＬ－６配列（配列番号２２９）、及びラット種由来のＩＬ－６配列（配列番号２３０）のアライメントを示す。本発明の一般概要及び開発ステップは、ＩＬ－６製剤の商業化（産業化）に繋がる開発プロセスを示す流れ図を用いて図２に示される。こうしたステップのそれぞれの詳細な評価及び分析には、喜ばしい驚きもそうでないものも伴ったが、そうした評価及び分析を行うことで、安全かつ有効なＩＬ－６製剤の商業化を最終的にもたらすことになる無数の実験をこれまでに行うに至った。
ａ．設計履歴
それぞれのペプチド免疫原コンストラクトまたは免疫療法製品には、その特定の疾患機序及び介入を要する標的タンパク質（複数可）に基づく独自の設計着目及び手法が必要である。標的ＩＬ－６分子はサイトカインであり、その設計が後にモデル化されるものである。研究から商業化へのプロセスは、典型的には、達成に十年または数十年を要するものである。免疫原コンストラクトを設計するには、介入対象の機能性部位（複数可）と相関するＩＬ－６ Ｂ細胞エピトープペプチドを同定することが重要である。さまざまなヘルパーＴ細胞支援物（担体タンパク質または適切なヘルパーＴ細胞ペプチド）をさまざまな製剤に組み込んでモルモットにおいてパイロット免疫原性試験を連続的に実施することで、誘導される抗体の機能特性を評価する。次に、広範な血清学的検証を行って、標的種または非ヒト霊長類において候補ＩＬ－６ Ｂ細胞エピトープペプチド免疫原コンストラクトをさらに試験することで、免疫原性、及びＩＬ－６ペプチド免疫原の設計方向をさらに検証する。次に、選択したＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトを、異なる混合物として調製することで、組み合わせて使用した場合のペプチドコンストラクト間のそれぞれの相互作用と関連する機能特性の微妙な差異を評価する。追加評価を行って、最終的なペプチドコンストラクト、ペプチド組成物、及びその製剤を、そうした製剤のそれぞれの物理的パラメーターと併せて確立することで、最終的な製品開発プロセスに繋げる。
ｂ．ＩＬ－６調節異常による影響を受ける疾患（自己免疫性関節リウマチを含む）に罹患している患者を治療する潜在力を有する医薬組成物のためのＩＬ－６由来のペプチド免疫原コンストラクトの設計及び検証
医薬組成物に組み込む上で最も強力なペプチドコンストラクトを生成させるために、ヒトＩＬ－６ Ｂ細胞エピトープペプチド（配列番号５～１９）のレパートリー、及びさまざまな病原体に由来する非選択的なヘルパーＴ細胞エピトープまたは人工的なヘルパーＴ細胞エピトープ（配列番号７８～１０６及び配列番号２１６～２２６）をさらに設計し、モルモットにおいて最初に免疫原性試験を行うためのＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクト（配列番号１０７～２１５）にした。
ｉ）設計のための、２つの分子内ループを含む領域に由来するＩＬ－６ Ｂ細胞エピトープペプチド配列の選択
さらなるＢ細胞エピトープペプチド設計のために、多くの試験領域の中でも特に、２つの分子内ループの間に位置する領域及び２つの分子内ループを含む領域が選択される。こうした領域は、ＩＬ－６Ｒのα鎖及びβ鎖（すなわち、ｇｐ１３０鎖）に接近することが明らかになっている。ＩＬ－６がＩＬ－６Ｒに結合すると、ＩＬ－６Ｒは、細胞内で活性化シグナルを伝達し、その後の主要な細胞事象を引き起こすことになる。２つのループは、表１の配列番号１または図１の配列番号２２７の中に示されるＣ７３～Ｃ８３（配列番号５）及びＣ４４～Ｃ５０（配列番号１５）であり、これら２つのループの間には、３～４つのアルファヘリックス束が位置する。
最初に、ＩＬ－６ Ｃ７３～Ｃ８３（配列番号５）に対するマウス及びラットのカウンターパートループ構造（例えば、配列番号２０及び配列番号７４）をＢ細胞エピトープとして選択することで、ＵＢＩＴｈ（登録商標）３ヘルパーＴ細胞ペプチド（配列番号８９）及びリンカー（配列番号７７）と連結されたＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトを設計した。これら２つのＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトをＩＳＡ５１及びＣｐＧと共に製剤化して、モルモットにおける４００μｇ／１ｍＬでのプライム免疫化及び１００μｇ／０．２５ｍＬでのブースト（３ｗｐｉ、６ｗｐｉ、及び９ｗｐｉ）用とした。モルモットにおける免疫原性を試験するために、１０倍の段階希釈によって１：１００～１：１００００に希釈したモルモット免疫血清を用いるＥＬＩＳＡアッセイを使用した。ヒトＩＬ－６ペプチド（配列番号５）、マウスペプチド、またはラットペプチド（配列番号２０及び配列番号７４）を用いて、ウェル当たりのペプチド量０．５μｇでＥＬＩＳＡプレートをコートした。試験した血清の力価（Ｌｏｇ１０として表される）は、Ａ４５０のカットオフ値を０．５としてＡ４５０ｎｍの線形回帰分析によって計算した。ＥＬＩＳＡの結果から、ヒトＩＬ－６ ７３～８３に由来するペプチド免疫原コンストラクト（配列番号１０７）及びマウスＩＬ－６ ７２～８２に由来するペプチド免疫原コンストラクト（配列番号１４６）の２つは、それら自体のＢ細胞エピトープペプチドヒトＩＬ－６ Ｃ７３～Ｃ８３（配列番号５）及びマウスＢ細胞エピトープペプチド（配列番号２０）に対して高い免疫原性力価を誘導しただけなく、これら２つの抗血清は、表４に示されるようにヒトＩＬ－６及びマウスＩＬ－６に由来するそれらの相同Ｂ細胞エピトープペプチドに対しても中程度の交差反応性を有することも示された。この試験では、設計した２つのペプチド免疫原が、ヒトＩＬ－６ Ｃ７３～Ｃ８３ペプチド及びそのマウスカウンターパートペプチドに対する交差反応性を有する特異的な抗体を誘導可能であることが示された。さらに、ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクト１２４、ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクト１２５、ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクト１２６、及びＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクト１３２（環状）、ならびにＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクト１３３（非環状）（これらは、ＩＬ－６ ７３～８３を超えてループのＮ末端部分へと延長された配列を有する）についても、免疫原性ならびにヒトＩＬ－６タンパク質とのそれらの交差反応性を試験し、これによって、高い免疫原性及び中程度の交差反応性の両方を有することが示された（表５Ａに示される）。
次に、ＩＬ－６ Ｃ４４～Ｃ５０に由来するもう一方のループ構造を設計に組み込んだ。Ｃ４４～Ｃ５０ループをカバーする異なるサイズのＢ細胞エピトープペプチドをＩＬ－６ペプチド免疫原の構築に選択した。ＵＢＩＴｈ（登録商標）１ヘルパーＴ細胞エピトープペプチド（配列番号９１）及び短いリンカーεＫまたは長いリンカーＫＫＫ－εＫ（配列番号７７）を使用して新たなヒトＩＬ－６免疫原コンストラクトを構築した。ＵＢＩＴｈ（登録商標）１ヘルパーＴ細胞エピトープペプチドを、リンカー配列と共に、標的Ｂ細胞エピトープペプチドに対してコンストラクトのＮ末端もしくはＣ末端または両末端に配置した。３つの異なるサイズのＢ細胞エピトープ（ＩＬ－６ ４４～５０（配列番号１５）、ＩＬ－６ ４２～５７（配列番号１２）、ＩＬ－６ ４２～７２（配列番号１０））に由来する７つのヒトＩＬ－６免疫原コンストラクト（配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３１、及び配列番号１３４～１３７）を設計し、免疫原性試験に用いた。各ペプチド免疫原をＩＳＡ５１及びＣｐＧと共に製剤化してモルモットを免疫化した。この免疫化は、プライム免疫化の用量を４００μｇ／ｍｌ、ｗｐｉが３、６、９の時点でのブーストの用量を１００μｇ／ｍｌとして、群当たりの３匹のモルモットに対して実施した。ＥＬＩＳＡアッセイを実施することで、設計したＩＬ－６ペプチド免疫原の免疫原性を評価した。ＩＬ－６ Ｂ細胞エピトープペプチド及びヒトＩＬ－６タンパク質（配列番号１）を使用してプレートウェルをコートすることで、標的ペプチドとした。１０倍の段階希釈によってモルモット免疫血清を１：１００～１：１０００００に希釈した。試験した血清の力価（Ｌｏｇ１０として表される）は、Ａ４５０のカットオフ値を０．５としてＡ４５０ｎｍの線形回帰分析によって計算した。８つすべてのペプチド免疫原が、プレートウェルにコートされたＢ細胞エピトープペプチドに対する強力な免疫原性力価を誘導した。ＥＬＩＳＡの結果から、これら７つのペプチド免疫原コンストラクトが、対応するＩＬ－６ Ｂ細胞エピトープペプチドに対して高い免疫原性力価を誘導するだけでなく、これらの抗血清が、ヒトＩＬ－６タンパク質（配列番号１）に対して中程度の交差反応性を有することも示された（表５Ｂに示される）。
さらに、２つのループの間から取得した配列（配列番号１３及び配列番号９（すなわちＩＬ－６ ６１～７５及びＩＬ－６ ５２～７２））を有する２つの他のＢ細胞エピトープペプチドを設計に組み込んだ。ＵＢＩＴｈ（登録商標）１ヘルパーＴ細胞エピトープペプチド（配列番号９１）及び短いリンカーεＫまたは長いリンカーＫＫＫ－εＫ（配列番号７７）を使用して新たなヒトＩＬ－６免疫原コンストラクト（配列番号１２７、配列番号１３８～１４５）を構築した。ＵＢＩＴｈ（登録商標）１ヘルパーＴ細胞エピトープペプチドを、リンカー配列と共に、標的Ｂ細胞エピトープペプチドに対してコンストラクトのＮ末端またはＣ末端のいずれかに配置した。３つの異なるサイズのＢ細胞エピトープ（ＩＬ－６ ５２～７２（配列番号９）、ＩＬ－６ ６１～７５（配列番号１３）、ＩＬ－６ ６１～７２（配列番号１４））に由来する９つのヒトＩＬ－６免疫原コンストラクト（配列番号１２７、配列番号１３８～１４５）を設計し、免疫原性試験に用いた。各ペプチド免疫原をＩＳＡ５１及びＣｐＧと共に製剤化してモルモットを免疫化した。この免疫化は、プライム免疫化の用量を４００μｇ／ｍｌ、ｗｐｉが３、６、９の時点でのブーストの用量を１００μｇ／ｍｌとして、群当たりの３匹のモルモットに対して実施した。ＥＬＩＳＡアッセイを実施することで、設計したＩＬ－６ペプチド免疫原の免疫原性を評価した。ＩＬ－６ Ｂ細胞エピトープペプチド及びヒトＩＬ－６タンパク質（配列番号１）を使用してプレートウェルをコートすることで、標的ペプチドとした。１０倍の段階希釈によってモルモット免疫血清を１：１００～１：１０００００に希釈した。試験した血清の力価（Ｌｏｇ１０として表される）は、Ａ４５０のカットオフ値を０．５としてＡ４５０ｎｍの線形回帰分析によって計算した。９つすべてのペプチド免疫原が、プレートウェルにコートされたＢ細胞エピトープペプチドに対する強力な免疫原性力価を誘導した。ＥＬＩＳＡの結果から、これら８つのペプチド免疫原コンストラクトが、対応するＩＬ－６ Ｂ細胞エピトープペプチドに対して高い免疫原性力価を誘導するだけでなく、これらの抗血清が、ヒトＩＬ－６タンパク質（配列番号１）に対して中程度の交差反応性を有することも示された（表５Ｃに示される）。
上記の内在性の内部ループを含むペプチドコンストラクトに加えて、モノクローナル抗体オロキズマブと関連するヒトＩＬ－６上のエピトープに対してもＩＬ－６ Ｂ細胞エピトープペプチド設計を行った。オロキズマブは、ｇｐ１３０に対するＩＬ－６／ｓＩＬ－６Ｒの結合を阻害することが知られている。オロキズマブと関連する立体構造エピトープの部分をカバーする２つの異なる配列サイズのペプチドを設計してＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトを構築した。ＵＢＩＴｈ（登録商標）１ヘルパーＴ細胞エピトープペプチド（配列番号９１）及び長いリンカーεＫ－ＫＫＫ（配列番号７７）を選択して新たなヒトＩＬ－６免疫原コンストラクトを構築した。ＵＢＩＴｈ（登録商標）１ヘルパーＴ細胞エピトープ及びリンカー配列をＢ細胞エピトープペプチドのＮ末端もしくはＣ末端または両末端に配置した。２つの異なるサイズのＢ細胞エピトープ（配列番号１８及び配列番号１９）に由来する５つのヒトＩＬ－６免疫原コンストラクト（配列番号１１２～１１７）を設計し、免疫原性試験に用いた。Ｎ末端及びＣ末端の両方にＵＢＩＴｈ（登録商標）１を有するＩＬ－６ ７３～８３コンストラクト（配列番号１１８）（群６）を１つ追加し、これを、免疫原性及び免疫特異性の比較のための対照とした。各ペプチド免疫原をＩＳＡ５１及びＣｐＧと共に製剤化してモルモットを免疫化した。この免疫化は、プライム免疫化の用量を４００μｇ／ｍｌ、ｗｐｉが３、６、９の時点でのブーストの用量を１００μｇ／ｍｌとして、群当たりの３匹のモルモットに対して実施した。ＥＬＩＳＡアッセイを実施してこれらの設計ペプチド免疫原の免疫原性を評価した。３つのＢ細胞エピトープペプチド（ＩＬ－６ Ｃ７３～Ｃ８３（配列番号５）、ＩＬ－６ １５０～１６２（配列番号１８）、及びＩＬ－６ １４４～１６６（配列番号１９））を使用してプレートウェルをコートすることで、標的ペプチドとした。１０倍の段階希釈によってモルモット免疫血清を１：１００～１：１０００００に希釈した。試験した血清の力価（Ｌｏｇ１０として表される）は、Ａ４５０のカットオフ値を０．５としてＡ４５０ｎｍの線形回帰分析によって計算した。６つすべてのペプチド免疫原が、プレートウェルにコートされたそれら自体のＢ細胞エピトープペプチドに対する強力な免疫原性力価を誘導した。ＥＬＩＳＡデータから、５つの免疫原コンストラクト（配列番号１１２～１１７）の間には交差反応性が存在することが示され、これは、それらの免疫原コンストラクトが、アミノ酸配列１４４～１６６に由来する同じヘリックス・ターン・ヘリックス構造を共有することによるものである（表５Ｄに示される）。表５Ｅには、こうしたコンストラクトから得られた免疫血清が、ヒトＩＬ－６タンパク質に対する交差反応性を有することが示され、このことは、他のＩＬ－６誘導性の機能アッセイにおいて試験されることになるＩＬ－６結合介入にこの部位が有望であることを示している。
ｉｉ）病原体に由来する異種ヘルパーＴ細胞エピトープの順位付け、及び選択したＩＬ－６ Ｂ細胞エピトープペプチドの免疫原性を増強するための、ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクト設計へのその組み込み
表２は、Ｂ細胞エピトープの免疫原性を増強する相対的な能力について複数の種（マウス、ラット、モルモット、ヒヒ、及びマカクなど）において試験した全部で２９種類の異種Ｔｈエピトープ（配列番号７８～１０６及び配列番号２１６～２２６）を示す。
εＫスペーサーを介して個々の非選択的なヘルパーＴ細胞エピトープと連結されたＩＬ－６ Ｃ７３～Ｃ８３ Ｂ細胞エピトープペプチド（配列番号５）を含むＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトの代表的な試験としてモルモットにおける免疫原性試験を実施することで、それぞれの異種ヘルパーＴ細胞エピトープの相対的な有効性を順位付けした（表６に示される）。初回免疫化後経過週数６（６ｗｐｉ）の時点で得られた結果を使用して、異なるＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトを順位付けした。選択したすべてのＴｈエピトープがＩＬ－６ Ｂ細胞エピトープペプチドの免疫原性を増強する能力を有していたが、最も強力なコンストラクトは、配列番号１１９のコンストラクトであることが明らかとなった。
霊長類を含めて、異なる種においてそれぞれ及びすべてのＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトの免疫原性を慎重に調整することで、最終的なＴｈペプチドの選択、及び最終製剤の開発の成功が保証されることになる。
ｉｉｉ）組換えＩＬ－６との抗体反応性についてのＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトの免疫原性の評価
図３は、２５種類の異なるＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクト（配列番号１０７、配列番号１１２～１１４、配列番号１１６～１１８、及び配列番号１２４～１４５）で免疫化したモルモットにおける１２週間にわたる抗血清の動態をさらに示す。Ｗｐｉが０、３、６、８／９、及び１２の時点で得られたモルモット抗血清を４倍の段階希釈によって１：１００～１：４．１９×１０８に希釈した。ウェル当たり５０ｎｇのヒトＩＬ－６（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）でＥＬＩＳＡプレートをコートした。試験した血清の力価（Ｌｏｇ（ＥＣ５０）として表される）は、４パラメーターロジスティック曲線に当てはめて５０％効果濃度（ＥＣ５０）をＬｏｇで得ることによって計算した。２５種類の免疫原コンストラクトのすべてが、天然のヒトＩＬ－６に対するある特定の程度の交差反応性を誘発することができた。このことは、それらの産生抗ＩＬ－６抗体がＩＬ－６活性を中和する潜在力を有し得ることを示唆している。
設計したヒトＩＬ－６ペプチド免疫原が、異なる動物種から交差反応性を有する抗体を誘導するかどうか（こうしたデータからは、さらなる動物試験に有用な情報が得られる可能性がある）を調べるために、２９種類の異なる免疫原コンストラクト（配列番号１０７、配列番号１１２～１１４、配列番号１１６～１１８、及び配列番号１２４～１４５）によって誘導された８ｗｐｉまたは９ｗｐｉの時点の血清を選択して、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーによるＩｇＧ精製に供した。図４には、配列番号１０７、配列番号１１６、配列番号１１８、及び配列番号１２４～１３３によって誘導された精製ポリクローナルモルモットＩｇＧが、ヒト、サル、及びラットの組換えＩＬ－６タンパク質（すべてＧｅｎＳｃｒｉｐｔから購入した）と交差反応することを示した。これらの中で、（配列番号１０７、配列番号１１８、及び配列番号１２４～１２６）のペプチドは、異なるペプチド構成でＩＬ－６ ７３～８３ループを含み、ペプチド（配列番号１２８、配列番号１２９、及び配列番号１３１）は、ＩＬ－６ ４４～５０ループを含み、配列番号１３２は、両方のループを含む。
ｉｖ）ＩＬ－６ Ｂ細胞エピトープペプチド設計の除外対象となる内在性／自己Ｔｈエピトープの同定
ペプチド免疫原コンストラクト中にヘルパーＴ細胞エピトープ（複数可）構造特徴が存在すると、アルツハイマー病ワクチンとしてのＡＮ１７９２で以前に生じたように、ブースト免疫化時に自己Ｔ細胞が活性化されることに起因して望ましくない炎症が生じる可能性があり得ることから、標的タンパク質中に存在する潜在的な内在性／自己Ｔｈエピトープを同定すれば、免疫療法介入のための組成物を設計する上で利点が得られるものと想定される。表７に示されるように、遊離のＩＬ－６ Ｂ細胞エピトープペプチド（ＩＬ－６ ６２～８３（配列番号６）、ＩＬ－６ ５８～８３（配列番号７）、ＩＬ－６ ５２～８３（配列番号８）、ＩＬ－６ ５２～７２（配列番号９）、及びＩＬ－６ ４２～７２（配列番号１０））を強力な油中水型エマルション製剤として製剤化しても、免疫原性試験において得られたバックグラウンドは綺麗であった。このことは、そうしたＩＬ－６ Ｂ細胞エピトープペプチドが、ＩＬ－６製剤に使用するためのＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトの構築に使用するＩＬ－６ Ｂ細胞エピトープペプチドの候補として相応しいものであることを示している。
ｖ）ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトによって誘発される集中的な抗体応答は、ＩＬ－６ Ｂ細胞エピトープのみを標的とする
担体タンパク質（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）または他の担体タンパク質（ジフテリアトキソイド（ＤＴ）タンパク質及び破傷風トキソイド（ＴＴ）タンパク質など））はすべて、それぞれの担体タンパク質に標的Ｂ細胞エピトープペプチドを化学的に結合させることによってそのようなＢ細胞エピトープペプチドに対して指向化された免疫応答を増強するために使用されるが、そうした担体タンパク質が免疫化宿主において誘導する抗体は、その９０％超が、そうした増強用の担体タンパク質に対して指向化されることになり、標的Ｂ細胞エピトープに対して指向化された抗体は１０％にも満たないことがよく知られている。それ故に、本開示のＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトの特異性を評価することは興味深いことである。長さが異なるＢ細胞エピトープがスペーサー配列を介して異種Ｔ細胞エピトープＵＢＩＴｈ（登録商標）１（配列番号９１）に連結された一連の８つのＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクト（表３の配列番号１３８～１４５）を免疫原性評価のために調製した。ＵＢＩＴｈ（登録商標）１（Ｂ細胞エピトープ免疫増強に使用したヘルパーＴ細胞ペプチド）をプレートにコートし、モルモット免疫血清を用いることで、免疫増強に使用したＵＢＩＴｈ（登録商標）１ペプチドとの交差反応性を試験した。こうしたコンストラクトの免疫原性が、対応する標的ＩＬ－６ Ｂ細胞エピトープペプチドに対しては高いものであった（ＩＬ－６ Ｂ細胞エピトープ（複数可）に対して生成された抗体の力価が高いことによって示された）こととは対照的に、すべてではないにせよ、免疫血清のほとんどが、ＵＢＩＴｈ（登録商標）１ペプチドに対しては反応しないことが明らかとなった（表８に示される）。
めとめると、慎重に選択したヘルパーＴ細胞エピトープに標的ＩＬ－６ Ｂ細胞エピトープペプチドを連結して組み込むという単純な免疫原設計を行うことで、対応するＩＬ－６ Ｂ細胞エピトープペプチドのみを標的とする集中的かつ綺麗な免疫応答を生成させることが可能になる。医薬組成物の設計については、それが生成させる免疫応答が特異的になればなるほど、それによって組成物に備われる安全性プロファイルが向上する。したがって、本開示のＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトは、その標的に対して高度に特異的である上に強力なものである。
ｖｉ）ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトによって得られる抗体がＩＬ－６とＩＬ－６Ｒとの相互作用を阻害するかについてのその免疫原性の評価
ＩＬ－６は、ヘテロトリマーＩＬ－６Ｒ／ｇｐ１３０複合体を介してシグナルを伝達し、この複合体が会合することによって下流のシグナル伝達が活性化される。ＩＬ－６またはＩＬ－６Ｒはいずれも、単独では下流のシグナル伝達を活性化できない。候補ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトが、モルモットにおいて抗体を誘導し得るかどうか、及び誘導される抗体が、ＩＬ－６とＩＬ－６受容体（ＩＬ－６Ｒ）との間の相互作用を遮断するようにＩＬ－６を中和し得るかを、さらに試験を実施して調べた（Rose-John, et al., 2017）。
２５種類のそれぞれ候補ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクト（配列番号１０７、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２４～１４５）によって免疫化したモルモットの免疫血清から精製したモルモットＩｇＧをＥＬＩＳＡアッセイに用いることで、（ａ）実施例３に記載のように固相抗原コーティングとして対応ＩＬ－６ Ｂ細胞エピトープペプチドを使用するＥＬＩＳＡによる相対的な免疫原性、（ｂ）ヒト種、サル種、及びげっ歯類種に由来するＩＬ－６タンパク質と交差反応する相対的な能力、これらに加えて、（ａ）及び（ｂ）の両方が存在する場合、こうした精製抗体が、ＩＬ－６タンパク質を中和し得、それによって、ＩＬ－６とＩＬ－６Ｒａとの間の相互作用（すなわち、シスシグナル伝達）またはＩＬ－６／ＩＬ－６ＲａとＩＬ－６Ｒｂ／すなわちｇｐ１３０との間の相互作用（すなわち、トランスシグナル伝達）を阻害し得るかどうか、を評価した。
図３に示されるように、慎重に設計したそれぞれの候補ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトで免疫化したモルモットの精製抗体はすべて、免疫化スケジュールに沿って顕著な抗体力価を経時的に示した。さらに、こうしたＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトでの免疫化から得られた免疫血清から精製した抗体はすべて、ヒトＩＬ－６タンパク質との高い反応性を示すと共に、サル（マカク）及びげっ歯類のＩＬ－６タンパク質との中程度の交差反応も示した（図４Ａ及び図４Ｂに示される）。
さらに、図５Ａに示されるように、それぞれの候補ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクト（例えば、配列番号１０７、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２４、配列番号１３２～１３４、及び配列番号１３７を有するもの）で免疫化したモルモットの免疫血清から精製した代表的な抗体は、シスシグナル伝達様式を介するＩＬ－６とＩＬ－６Ｒａとの相互作用を用量依存的な様式で競合的に阻害した。
図５Ｂに示されるように、それぞれの候補ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクト（例えば、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３４、及び配列番号１３５を有するもの）で免疫化したモルモットの免疫血清から精製した代表的な抗体は、トランスシグナル伝達様式を介するＩＬ－６－ＩＬ－６Ｒａ複合体とＩＬ－６Ｒｂ／ｇｐ１３０との相互作用を用量依存的な様式で競合的に阻害した。
対照的に、先行技術のＢ細胞エピトープペプチド配列（配列番号１１）を含むペプチド免疫原コンストラクト（配列番号１３０）から得られた免疫血清から精製した抗体は、シス経路もトランス経路も抑制することができなかった。
ｖｉｉ）さまざまなＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトによって誘導された免疫血清（９ｗｐｉ）による、詳細な特異性分析のためのエピトープマッピング
ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトを含むＩＬ－６組成物の設計を、ＩＬ－６Ｒ結合部位に近い２つの分子内ループ（Ｃ４４～Ｃ５０（配列番号１５）及びＣ７３～Ｃ８３（配列番号５））を含む領域に絞って行った。この構造ベースの設計の目的は、これら天然の分子内ループのうちの少なくとも１つを免疫原性標的として保持することである。
６２～８３（配列番号１２４）、５８～８３（配列番号１２５）、５２～８３（配列番号１２６）、５２～７２（配列番号１２７）、４２～７２（配列番号１２８）（当該Ｂ細胞エピトープに対してＮ末端側にＴｈが位置する）、４２～７２（配列番号１２９）（当該Ｂ細胞エピトープに対してＣ末端側にＴｈが位置する）、５０～６７（配列番号１３０）、及び７３～８３（配列番号１０７）の８つを、ＩＬ－６ Ｂ細胞エピトープペプチドを代表するものとした。
ＩＬ－６ ６２～８３（配列番号６）、ＩＬ－６ ５８～８３（配列番号７）、ＩＬ－６ ５２～８３（配列番号８）、ＩＬ－６ ５２～７２（配列番号９）、ＩＬ－６ ４２～７２（配列番号１０）、ＩＬ－６ ５０～６７（配列番号１１）、及びＩＬ－６ ７３～８３（配列番号５）をＢ細胞エピトープペプチドの設計に使用し、これらのＢ細胞エピトープペプチドを、そのＮ末端またはＣ末端でＵＢＩＴｈ（登録商標）１（配列番号９１）と連結してプロトタイプペプチド免疫原を形成させた。Ｂ細胞とＴｈエピトープとの間にεＫリンカーまたはεＫ－ＫＫＫ（配列番号７７）スペーサーを使用して、表３に示されるペプチド免疫原コンストラクト（配列番号１２４～１３０、配列番号１０７）を形成させた。アミノ酸（ａａ）４２～８３、アミノ酸（ａａ）４２～７２、及びアミノ酸（ａａ）７３～８３に含まれるＢ細胞エピトープペプチドはすべて、環化によるＣ４４～Ｃ５０拘束ループ構造またはＣ７３～Ｃ８３拘束ループ構造を含むように設計した。
プレートのコートに個々のＩＬ－６ Ｂ細胞エピトープペプチド（Ｃ７３～Ｃ８３（配列番号５）及びＥ４２～Ｇ７２（配列番号１０））を使用するＥＬＩＳＡ試験によって、ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクト（配列番号１２４～１３０、配列番号１０７）で免疫化したモルモットから得られた過免疫血清の抗体反応性を評価した。Ｃ７３～Ｃ８３ループ構造を含むコンストラクト（配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、及び配列番号１０７）はＩＬ－６ Ｂ細胞エピトープペプチドＣ７３～Ｃ８３（配列番号５）に対する高力価抗体を誘導した一方で、Ｃ４４～Ｃ５０ループ構造を含むＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクト（配列番号１２７～１３０）によって誘導されたモルモット抗血清は、Ｂ細胞エピトープペプチドＥ４２～Ｃ７２（配列番号１０）との抗体反応性を有するが、Ｃ７３～Ｃ８３ループ（配列番号５）との交差反応性はほとんどまたは全く有さないことが、結果から示された。このことは、免疫原性の特異性が高く、すなわち、設計した免疫原コンストラクトが、ＩＬ－６の対応Ｂ細胞エピトープドメインと反応する特異的な抗体を誘導できることを示している（表９）。
抗体結合部位（複数可）を標的領域中の特定残基に帰属させるための詳細なエピトープマッピング（表９）では、ＩＬ－６のアミノ酸３２～アミノ酸９１の配列領域をカバーする５１種類のオーバーラップする１０マーペプチド（配列番号２１～７１）を合成した。これらの１０マーペプチドを、固相免疫吸着物質として９６ウェルマイクロタイタープレートのウェル上に個々にコートした。２．０μｇ／ｍＬの１０マーペプチドでコートしたこれらのプレートウェルに対して、プールしたモルモット抗血清を検体希釈緩衝液での１：１００希釈液として添加した後、３７℃で１時間インキュベートした。プレートウェルを洗浄緩衝液で洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合型ｒプロテインＡ／Ｇを添加し、３０分間インキュベートした。ＰＢＳで再び洗浄した後、基質をウェルに添加してＥＬＩＳＡプレートリーダーによって４５０ｎｍで吸光度を測定した。その際、２連の試料で分析を行った。ＩＬ－６ペプチド免疫原によって誘導された免疫血清が、対応するＩＬ－６ Ｂ細胞エピトープペプチドでコートしたウェルに結合すると、抗体結合シグナルが最大となる。
Ｃ７３～Ｃ８３ループ構造を含む配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、及び配列番号１０７のＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトから得られたモルモット血清プール中に誘導されていた高力価抗体が、アミノ酸６９～７８（配列番号５８）～アミノ酸７６～８５（配列番号６５）の１０マーペプチドクラスターを主に標的とするものであり、アミノ酸３５～４４（配列番号２４）のペプチドとの高い交差反応性を有し、当該ループのＮ末端を超えて少し伸びた領域に幾分か不規則な中程度の活性を有することが、詳細なエピトープマッピングの結果から示された。
驚くべきことに、Ｃ４４～Ｃ５０ループ構造を含む配列番号１２７～１２９のＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトから得られたモルモット血清プール中に誘導されていた高力価抗体は、Ｃ４４～Ｃ５０ループの外側のアミノ酸６１～７０（配列番号５０）～アミノ酸６７～７６（配列番号５６）の１０マーペプチドクラスターを主に標的とするものであり、ＩＬ－６ペプチドコンストラクト１２９は、当該Ｂ細胞エピトープペプチドのＮ末端側部分（４１～５０（配列番号３０）、４５～５４（配列番号３４）、５７～６６（配列番号４６）、５８～６７（配列番号４７））にまで伸びたより広い散在性の抗体反応性を有していた。ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクト１２８及びＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクト１２９によって生成された免疫血清が、ＩＬ－６／ＩＬ－６Ｒαシス競合結合阻害試験及び（ＩＬ－６／ＩＬ－６Ｒα複合体）／ＩＬ－６Ｒβトランス競合結合阻害試験（それぞれ、ＥＬＩＳＡによるもの）においてトランス阻害に選択性を示すことが認められたことは興味深いことである。
まとめると、ＩＬ－６に含まれるループ構造（Ｃ４４～Ｃ５０及びＣ７３～Ｃ８３）がＵＢＩＴｈ（登録商標）１エピトープペプチドに連結されたものによって表される設計した合成ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトは、ＩＬ－６Ｒ結合領域に近い異なる１０マーペプチドクラスターを標的とするポリクローナル抗体を生成させる強固な免疫応答を誘導することで、ＩＬ－６／ＩＬ－６Ｒα介在性のシス競合結合阻害による結合阻害または重要な医学的意義を有することになる（ＩＬ－６／ＩＬ－６Ｒα複合体）／ＩＬ－６Ｒβ（すなわち、Ｇｐ１３０）介在性のトランス競合結合阻害による結合阻害を可能にした（図５Ａ及び図５Ｂを参照のこと）。
実施例７
ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトによって誘導される抗体及びその製剤のエクスビボ様式での機能特性評価
慎重に選択したそれぞれの候補ＩＬ－６免疫原コンストラクトで免疫化したモルモットの免疫血清から精製した抗体が高免疫原性であり、交差反応性を有することが実証された後、次の試験を設計することで、こうした免疫血清から得られる代表的な精製ＩｇＧが、（ａ）ＩＬ－６誘導性のＳＴＡＴ３リン酸化を抑制し、（ｂ）ＴＦ－１細胞株の細胞増殖を抑制し、（ｃ）Ｕ９３７細胞におけるＩＬ－６誘導性のＭＣＰ－１産生を抑制し得るかどうかを、すべてエクスビボ様式で評価した。
抗ＩＬ－６抗体によるＩＬ－６誘導性のＳＴＡＴ３リン酸化の抑制
ＩＬ－６シグナル伝達経路では、ＩＬ－６／ＩＬ－６Ｒａ／ＩＬ６Ｒｂ（すなわち、Ｇｐ１３０）複合体が最初に細胞膜上で形成され、その後に下流でＳＴＡＴ３タンパク質のリン酸化が細胞質内で生じる。慎重に選択した候補ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトで免疫化したモルモットの免疫血清から精製した抗ＩＬ－６抗体がＩＬ－６誘導性のＳＴＡＴ３リン酸化を抑制する能力についてＲＰＭＩ８２２６細胞株を使用して評価した。この細胞株を使用したのは、この８２２６細胞株がリン酸化ＳＴＡＴ３を構成的に発現しないためである。
最初に、ＩＬ－６（１０ｎｇ／ｍｌ）と異なる濃度の精製ＩｇＧとで培養細胞を同時処理した。抗ＩＬ－６Ｒモノクローナル抗体、図６に見られるように、代表的な免疫原（配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３４、配列番号１３５、及び配列番号１３７）によって誘導された抗ＩＬ－６ ＩｇＧは、ＩｇＧ濃度１００μｇ／ｍＬでＳＴＡＴ３のリン酸化を低減することが可能であった。先行技術のＢ細胞エピトープ配列（配列番号１１）を含むペプチドコンストラクト（配列番号１３０）によって誘導された免疫血清から得られたＩｇＧは、ＳＴＡＴ３のリン酸化を阻害することは不可能であった。
ＴＦ－１細胞のＩＬ－６依存性の細胞増殖の抑制
ヒト赤白血病ＴＦ－１細胞は、ヒトＩＬ－６に応答して増殖することができる。慎重に選択した候補ＩＬ－６ペプチドコンストラクト（配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２４～１２９、配列番号１３１～１４５）で免疫化したモルモットの免疫血清から精製したＩｇＧが、ＴＦ－１細胞株のＩＬ－６依存性の細胞増殖を抑制できるかどうかを調べるために、すべてのＴＦ－１細胞培養物をＩＬ－６（１０ｎｇ／ｍｌ）と精製モルモットＩｇＧとで同時処理した。ＩＬ－６処理を行わないＴＦ－１細胞、ならびにＩＬ－６処理のみを行い、抗体処理は行わないＴＦ－１細胞を対照として用意した。図７Ａ及び図７Ｂに示されるように、ＩＬ－６のみの存在下では、他のすべての群と比較してＴＦ－１細胞の増殖性は高く、ＴＦ－１細胞の増殖は、ＩＬ－６の非存在下の細胞の２倍であった。代表的な候補ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクト（配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２４～２４５、配列番号１２７～１２９、配列番号１３１～１４５）によって誘導された抗ＩＬ－６ ＩｇＧ抗体の存在下でのＴＦ－１細胞の増殖を、ある特定の程度に抑制することが可能であった（図７Ａ及び図７Ｂ）。先行技術のＢ細胞エピトープ配列（配列番号１１）を含むペプチドコンストラクト（配列番号１３０）によって誘導された免疫血清から得られたＩｇＧは、ＩＬ－６誘導性の細胞増殖を抑制することは不可能であった。
ＩＬ－６誘導性のＭＣＰ－１産生の抑制
ＭＣＰ－１は、急性炎症プロセス及び慢性炎症プロセスにおいて中心的な役割を担っている。ＭＣＰ－１は、疾患の病態形成において単球及び好塩基球を誘引する走化性因子である。ＩＬ－６は、前単球細胞株Ｕ９３７においてＭＣＰ－１の発現を誘導し得る。ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトによってモルモットにおいて誘導される抗ＩＬ－６抗体が、Ｕ９３７細胞株においてＩＬ－６依存性のＭＣＰ－１分泌を抑制し得るかどうかを調べるために、ＭＣＰ－１産生を誘導するための１０ｎｇ／ｍｌ濃度のＩＬ－６サイトカインで、すべての細胞培養群を処理した。候補ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクト（配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２４～１３４、配列番号１３６、配列番号１３８～１４５）によって誘導されたモルモットの免疫血清から得られた代表的な精製ＩｇＧ調製物を、異なる濃度の試験群に添加した。陽性対照としてトシリズマブも含めた。抗体を添加せずにＩＬ－６のみを存在させたＵ９３７細胞培養物を陰性対照として用意した。図８Ａ及び図８Ｂに示されるように、代表的な候補ペプチドコンストラクトによって誘導された精製ＩｇＧ抗体で処理した群では、抗体濃度依存的にＭＣＰ－１産生が異なる程度に抑制されることが用量依存的な様式で観察されたが、先行技術のＢ細胞エピトープ配列（配列番号１１）を含むペプチドコンストラクト（配列番号１３０）によって誘導された免疫血清から得られたＩｇＧについては例外であった（図８Ａを参照のこと）。
上記のエクスビボでの機能試験は、これらの代表的なＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトが、ＩＬ－６誘導性の炎症プロセス及び病態形成を抑制したことを示し、このことは、これらのＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトが、自己免疫性リウマチ性疾患を含めて、ＩＬ－６調節異常による影響を受ける疾患を治療するための潜在力を有することを示している。
実施例８
ルイスラットのコラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）モデルでの予防様式でのラットＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクト候補の評価
関節リウマチのラットコラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）モデルでのＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトの効果を、以下に記載のように、予防試験において評価した。
ヒトＩＬ－６は、ラットＩＬ－６と約４０％のアミノ酸配列同一性を共有する。ラットＩＬ－６タンパク質配列に基づいて、ＩＬ－６ ７３～８３及びＩＬ－６ １４４～１６６のヒトＩＬ－６ Ｂ細胞エピトープペプチドの相同体としてラットペプチド免疫原コンストラクト（配列番号１４８及び配列番号１５７）を設計した。これら２つのラットペプチド免疫原コンストラクト（配列番号１４８及び配列番号１５７）は、Ｂ細胞エピトープペプチドを増強するヘルパーＴ細胞エピトープとしてのＵＢＩＴｈ（登録商標）３（配列番号８９）と、リンカーとしてのεＫ－ＫＫＫ（配列番号７７）とが、それぞれＩＬ－６ Ｂ細胞エピトープペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかに連結されたものである。
この試験にはルイスラットを使用し、そのプロトコールは図９に簡潔に示される。全部で２１匹のラットを３群に割り付け、プラセボ群にはアジュバントのみを注射した。実験群のラットには、ＩＳＡ５１及びＣｐＧと共に製剤化したＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトを、４５μｇ／０．５ｍＬ用量で、プライム免疫化用及びブースト免疫化用として注射した。全部で３回用量を－３１日目、－１０日目、及び４日目に投与した。３回目の投与の４日前（０日目）に皮内経路によってウシＩＩ型コラーゲン／ＩＦＡエマルション（ラット当たり１００μＬ中１００μｇ）をすべてのラットの尾の付け根に注射し、この注射を、３回目の投与から３日後（７日目）に追加で実施した。－３１日目、－１０日目、０日目、７日目、１４日目、２１日目、２６日目、２８日目、及び３５日目にラットの採血を行った。ＥＬＩＳＡアッセイを用いることで、ラット組換えＩＬ－６タンパク質に対する免疫原性力価を測定した。
ＥＬＩＳＡの結果から、－３１日目の免疫化の前には検出可能な抗体力価が各群で観察されないことが示された。３回の免疫化後、プラセボ処理ラットはいずれも、抗ラット組換えＩＬ－６に対する検出可能な抗体力価を示さなかった。ＩＬ－６ ７３～８３Ｂ細胞エピトープを標的とするペプチド免疫原（配列番号１４８）は、ＣＩＡの期間中、もう一方の群（配列番号１５７）のものと比較してより強力な抗ＩＬ－６抗体力価（Ｌｏｇ（ＥＣ５０）が約３．０）を誘発することが可能であった（図１０）。
ラットＣＩＡモデルで、予防様式で評価したＩＬ－６免疫療法の効果
ラットＩＬ－６ペプチドコンストラクト（配列番号１４８または配列番号１５７）で免疫化した後、ＣＩＡ関節炎を誘発させたラットの関節炎の臨床徴候及び症状を慎重に調べた。コラーゲン（ウシＩＩ型コラーゲン、Ｃｈｏｎｄｒｅｘ Ｉｎｃ．）を注射したラットでは、ＣＩＡ誘導関節炎が急速に生じた。紅斑及び関節腫脹を含めて、急性関節炎の臨床炎症徴候を、各足について０～４の尺度で段階分けし（総スコア範囲０～１６）、コラーゲン負荷から約２週間経った辺りで、そうした臨床炎症徴候が後足に見られた。各群においてＣＩＡ負荷後約３週間で関節炎重症度スコアが最大となり、足の腫脹が最も重症化した（図１１及び図１２）。異なるＩＬ－６免疫原コンストラクトの治療効力を関節炎重症度スコアによって評価した。このインビボ免疫療法試験中、（配列番号１４８）によって免疫化した群では、試験したもう一方の免疫原コンストラクト（配列番号１５７）と比較して関節炎重症度スコアが下がって緩和されると共に、足の腫脹が低減され、プラセボ群と比較して統計的に有意な差が存在した（図１１及び図１２ならびに表１０及び表１１）。
ラットＣＩＡ負荷試験中に骨髄から循環への好中球の放出をＩＬ－６免疫原が軽減できるかどうかを観察したところ、骨髄からの好中球の放出数が０日目から徐々に増加し、１４日目にピークに達することが結果から示された。ラットＩＬ－６免疫原（配列番号１４８）は、骨髄から循環への好中球の放出を効果的に軽減した（図１３及び表１２）。これらの設計したＩＬ－６免疫原コンストラクトの両方が、炎症プロセスの低減において重要な役割を果たすことが示された。
この試験の結果から、ＩＬ－６ラットＢ細胞エピトープペプチドＩＬ－６ ７２～８２が、ＩＬ－６調節異常による影響を受ける疾患を予防様式で治療するためのＢ細胞エピトープペプチドとしてＩＬ－６ ７３～８３をヒトＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトに組み込むことの良好な候補になることが示され、この予防様式では、当該ＩＬ－６分子に対して誘導されるポリクローナル抗体が、血中循環サイトカインＩＬ－６を中和してそのシグナル伝達を遮断／抑制し、それによって臨床的な炎症病理プロセスが低減されるものと想定される。
ＣＩＡラットには、ラットＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトまたはアジュバントのみを筋肉内経路によって３回注射した。当該動物は、４５μｇ／０．５ｍＬ用量の候補ラットＩＬ－６製剤に対して良好な全体的忍容性を示した。配列番号１４８の候補ラットＩＬ－６ペプチド免疫原は、配列番号１５７のものと比較して抗体応答の効力が高く、関節炎重症度を軽減した。
実施例９
ルイスラットのＣＩＡモデルにおいて治療様式での実証される、関節リウマチ治療のためのＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクト及びその製剤の効果
ルイスラットコラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）モデルにおけるＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトの概念実証（ＰＯＣ）試験
ＩＬ－６免疫原コンストラクト（配列番号１４８）の効力を確認するために、ルイスラットＣＩＡモデルにおいてＰＯＣ試験を実施し、この効力試験では、図１４に示されるように２つの異なるアジュバント製剤を評価した。２つの治療群のそれぞれに７匹の動物を割り付け、プラセボ群には６匹の動物を割り付けた。２つの治療群の動物には、ＩＳＡ５１のみと共に製剤化したペプチド免疫原コンストラクト（配列番号１４８）またはＩＳＡ５１／ＣｐＧと共に製剤化したペプチド免疫原コンストラクト（配列番号１４８）を－７日目、７日目、１４日目、２１日目、及び２８日目にプライム用にもブースト用にも４５μｇ／０．５ｍＬ／用量で注射した。プラセボ群には、治療群と同じ注射時点で、ペプチド免疫原コンストラクトを含まないアジュバント媒体のみを注射した。０日目及び７日目にすべての群の尾の付け根に皮内経路によってウシＩＩ型コラーゲン／ＩＦＡエマルション（ラット当たり１００μＬ中１００μｇ）を注射して関節炎を誘導した。この試験は、３５日目に終了した。
ラットＩＬ－６組換えタンパク質に対する免疫化ラット血清由来の免疫原性力価をＥＬＩＳＡによって評価した。異なるアジュバントによって製剤化した同じＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトで治療した両方の群においてラットＩＬ－６に対する高い抗体力価が得られ、この抗体力価は、免疫化後に着実に上昇することが、結果から示された。２１日目に両方の治療群でＬｏｇ（ＥＣ５０）が３のレベルで力価がピークに達し、３５日目の試験終了時点までプラトーに留まった（図１５）。この結果から、このペプチド免疫原コンストラクト（配列番号１４８）がかなり免疫原性であり、免疫寛容を壊してラットＩＬ－６に対して特異的なポリクローナル抗体を誘導できるものであり、両方のアジュバント製剤が、抗体産生を効果的に増強することがさらに確認された。
ＩＬ－６免疫原コンストラクトによる免疫化ならびにＣＩＡ関節炎誘導による免疫化の前後に、ルイスラットにおけるＣＩＡ誘導関節炎の臨床的評価を治療群とプラセボ群とを比較して行った。試験中、関節炎重症度の臨床徴候に基づいて各足について０～４の尺度で関節炎重症度を段階分け（総スコア範囲０～１６）した。コラーゲンの負荷後にラットにおいてＣＩＡ誘導関節炎が急速に生じることが結果から示された。アジュバントプラセボ群では、１４日目に関節炎スコアが９となり最大となった。対照的に、２つの治療群の両方において、１４日目の同じ時点で統計的有意性（ｐ＜０．０１）を伴って両スコアが６未満となり、関節炎の重症度がはるかに軽度化した。その後、試験終了まで全部で９つの評価を行って１４日目から３５日目まで２～３日ごとに監視を行うと、監視したすべての群において関節炎スコアの減少が観察された。各評価の結果から、２つの治療群では、１４～３５日目に、プラセボ群と比較して統計的有意性（ほとんどがｐ＜０．０１またはＰ＜０．００１）を伴って関節炎重症度スコアがはるかに低下することが示された。図１６に示されるように、３５日目の試験終了時点までに、プラセボ群のスコアは約６であった一方で、治療群は両方共、約３のスコアを有していた。後足のＣＩＡの臨床徴候も評価し、関節炎症の結果に起因して１４日目からすべての関節炎ラットの後足の大きさが増加することが結果から示された。２つの治療群についても同様の結果が観察されたが、これら２つの治療群の後足の大きさは、それぞれ１４日目、２１日目、２８日目、及び３５日目の時点で、プラセボ群と比較して統計的有意性（ほとんどがｐ＜０．０１～Ｐ＜０．００１）を伴ってはるかに小さかった。図１６に示されるように、３５日目の試験終了時点までに、これら２つの治療群の後足の大きさは正常な大きさに近づいた一方で、プラセボ群の後足の大きさは大きいままであった。こうした知見はすべて、この試験で２つのアジュバントが示した臨床効力は同様のものであったが、ＩＳＡ５１とＣｐＧとの組み合わせが、ＩＳＡ５１と比較してわずかに良好であることを示すものであった。
血清中ＩＬ－６レベルは、関節障害の程度及び重症度と正に相関する一方で、他のいくつかの下流血清中炎症バイオマーカー（Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）など）も、炎症重症度を評価するための指標となる。ＣＲＰの血清中レベルの決定にはＥＬＩＳＡを使用した。プラセボ群（アジュバント媒体でＣＩＡを処理した群）のラットでは、２つの治療群と比較して血清中ＣＲＰレベルが有意（ｐ＜０．０５）に高かった（図１７）。２１日目の時点で、免疫原（配列番号１４８）で治療したＣＩＡラットの血清中ＣＲＰの平均値は正常値に近く、プラセボ群のものと比較して有意に低かった。
足首関節の組織学的破壊変化に対するＩＬ－６ペプチド免疫原の効果を評価するために、組織病理学的検査試験を実施した。ＣＩＡラット（７匹／治療群、６匹／プラセボ群）を３５日目に屠殺し、組織切片の固定化、脱灰、及びパラフィン包埋を行うために足首関節組織を取り出した。組織切片を調製し、Ｈ＆Ｅで染色した。この組織病理学的検査は図１８に示され、正常な対照群では、健康な関節窩及び正常な組織が見られた。対照的に、プラセボ群では、典型的な関節炎特徴が見られ、こうした関節炎特徴は、著しい滑膜炎症及び関節周囲炎症、滑膜の過形成、ならびに骨侵食によって特徴付けられた。（配列番号１４８）で免疫化したＣＩＡラットでは、細胞浸潤の軽度化、滑膜の過形成及び骨侵食の軽症化を伴って炎症がはるかに軽度化していることが、当該ＣＩＡラットの関節病状から明らかとなり、このことは、ペプチド免疫原コンストラクト（配列番号１４８）によって足首関節の破壊が緩和されたことを示している。図１８には、３つの異なる群の病理学的スコアの比較も示され、ここでは、改変Ｍａｎｋｉｎスコア付けシステムを適用して、軟骨構造には０～６、細胞形態には０～３、サフラニンＯ染色には０～４、滑膜の炎症及び過形成には０～４の段階分けを行うことによって関節軟骨を評価した（Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２４：２４４－２５７）。ペプチド免疫原コンストラクト（配列番号１４８）治療群では、プラセボ群のスコアである１１と比較して病理学的スコアが６に有意に低下した。
炎症性サイトカインは、ＲＡ病態形成において重要な役割を有することが示唆されている。炎症足関節組織を評価するために免疫組織化学染色法を適用した。簡潔に記載すると、ホルマリン固定化パラフィン包埋組織切片をキシレン中での脱パラフィン処理に供し、漸減濃度のエタノール中に浸漬し、水中で再び水和させた。マイクロ波照射での抗原賦活化処理にすべての切片を供した。スライドにマウントした切片を抗原賦活化クエン酸溶液（Ｓｃｙｔｅｋ）中に浸漬し、最大出力でマイクロ波オーブン中で沸騰するまで加熱し、３０分間室温に冷却した。３％の過酸化水素／ＰＢＳを用いて、内在性のペルオキシダーゼ活性の遮断処理を１０分間行った。Ｕｌｔｒａｖｉｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｌｏｃｋ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）と共に切片を室温で１時間プレインキュベートした。次に、一次ウサギ抗ラットＩＬ－１７（Ａｂｂｉｏｔｅｃ、ＰＢＳＴでの１：１００希釈液）、抗ラットＴＮＦ－α（Ａｂｃａｍ、ＰＢＳＴでの１：１００希釈液）、または抗ラットＭＣＰ－１（Ａｂｃａｍ、ＰＢＳＴでの１：２００希釈液）と共に切片を４℃で一晩インキュベートし、ＴＢＳＴ（Ｓｃｙｔｅｋ）で洗浄し、ＤＡＢ ＫｉｔのＰｏｌｉｎｋ－２ Ｐｌｕｓ ＨＲＰ Ｒａｂｂｉｔ（ＧＢＩ Ｌａｂｓ）によって発色させた。ヘマトキシリン（Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて切片を対比染色し、脱水し、Ｓｕｒｇｉｐａｔｈ Ｍｉｃｒｏｍｏｕｎｔマウント媒体（Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にマウントした。図１９に示されるように、プラセボ群では、組織のＴＮＦ－α、ＩＬ－１７、及びＭＣＰ－１が実質的に増加した。一方で、ＩＬ－６免疫原で治療したＣＩＡラットでは、これらのサイトカインの産生は大幅に抑制された。
この試験では、ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトで免疫化を行うことで、炎症性関節炎の発生が劇的に低減され、骨及び軟骨が破壊から保護されることが示された。こうした知見は、関節リウマチ及び他の自己免疫疾患を治療または予防するためにインビボでＩＬ－６ペプチド免疫原による免疫化を行うことの臨床適用を強力に支持するものである。
ＣＩＡモデルにおいてＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトによって誘発される免疫応答に対する投薬及びアジュバントの効果の評価
設計したペプチド免疫原コンストラクトが高い免疫原性を有することに加えて、ＩＬ－６誘導性の病態形成に対する治療効力を有することが、ＣＩＡラットにおけるＰＯＣ試験によって実証され、この治療効力は、関節リウマチ及び他の自己免疫疾患における免疫療法的な応用の可能性を暗示するものである。下記の試験は、ペプチド免疫原コンストラクトの最適化及びアジュバントの選択、ならびにＣＩＡ ルイスラットにおける用量決定に焦点を当てたものとなる。
異なるアジュバントとしてのＭＯＮＴＡＮＩＤＥ ＩＳＡ５１及びＡＤＪＵ－ＰＨＯＳを、それぞれ同じペプチド免疫原（配列番号１４８）＋ＣｐＧと共に製剤化したものを、ラットＣＩＡ免疫化試験において評価した。５つの群のそれぞれに割り付けられた５匹のラットに対して、２つのアジュバント製剤のうちの一方を投与し、これら２つの異なるアジュバントについて全部で１０個の群とした。プライム（－７日目）、ならびにブースト（７日目、１４日目、２１日目、及び２８日目）として、異なる用量（０．５ｍｌ中５μｇ、１５μｇ、４５μｇ、１５０μｇ）を、治療群のすべての動物に対して筋肉内経路を介して注射し、３５日目まで臨床的な観察を行った。ペプチド免疫原を投与しない２つの異なるアジュバントプラセボ群には、アジュバント媒体のみを含む製剤を注射した。下記の試験では、抗ＩＬ－６力価、体重、後足の腫脹検査、関節炎重症度スコア、血中の好中球数、血小板数、及び肝機能をすべて評価した。
プレートウェルにコートしたラットＩＬ－６組換えタンパク質に対するＥＬＩＳＡによって抗ＩＬ－６力価を測定した。２つの異なるアジュバント媒体を注射した２つのプラセボ群のいずれにおいても、検出可能な抗ＩＬ－６抗体力価は見られないが、ＩＬ－６免疫原コンストラクト（配列番号１４８）で免疫化した治療群では、そのすべてにおいて、両方のアジュバント製剤で、ラットＩＬ－６に対する抗体が生成されることが、ＥＬＩＳＡの結果から示された。総じて述べれば、この結果から、用量依存的な様式が観察され、ＩＳＡ５１製剤を用いた群では特にそうであることが示された（図２０）。ＩＳＡ５１製剤は、免疫化ラットにおいてＡＤＪＵＰＨＯＳ製剤と比較して強い免疫応答を誘導し、免疫原性のＬｏｇ１０値は、それぞれすべての用量で３を超えた。
３５日の試験プロセスの間、体重を７日ごとに監視した。図２１には、免疫化したラットの体重変化パターンを正常なラットと比較したものが示され、実験的ＣＩＡラットにおける体重の減少は、各群において１４日目に始まって、２１日目に最低点に到達し、その後は徐々に体重が増加した。試験終了時点（３５日目）では、すべてのＣＩＡラットにおいて、正常な対照と比較して約１０％の体重減少が見られた。体重変化は用量依存的様式で生じ、用量が高い群ほど体重減少の緩和が観測されることも、データから示された。使用したアジュバントにかかわらず、１５０μｇ用量群では、他の用量群と比較して体重が大きく増加した。比較すると、ＡＤＪＵＰＨＯＳを用いた１５０μｇ用量群では、２８日目及び３５日目の時点で、他のいずれの群と比較しても体重が大きく増加しており、２００ｇレベルを超えていた（表１３）。
足の大きさの変化を定量化することによって、ラットにおけるＣＩＡ誘導性の炎症及び破壊の臨床的重症度も評価した。ＩＳＡ５１またはＡＤＪＵＰＨＯＳのいずれかと共に製剤化したＩＬ－６免疫原コンストラクト（配列番号１４８）が、ラットモデルにおいてＣＩＡが発症しないように保護し得ることが巨視的観察によって示された。コラーゲンの負荷後、試験中は、ラットにおける足の腫脹及び発赤の急性臨床徴候を記録した。図２２及び表１４に示されるように、免疫化したラットのすべてにおいて、７～２１日目に足の腫脹が進行し、その後は炎症の減少と共に徐々に回復が生じた。２４日目の時点で正常群と比較すると、プラセボ群では、巨視的観察において著しい腫脹変化及び発赤変化が生じていた（図２３）。ペプチド免疫原コンストラクト（配列番号１４８）は、用量依存的な様式で足の発赤及び腫脹を低減した。２４日目に１５０μｇ用量群において炎症の減少が最大となることが、定量的分析によって明らかとなった。ＡＤＪＵ－ＰＨＯＳは、ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ ＩＳＡ５１と比較してわずかに良好に機能した。
紅斑及び腫脹の徴候（スコア基準）の炎症性変化に従って、各足の関節炎の臨床的重症度を尺度（０～４）に基づいて段階分けした。２日または３日ごとに動物を検査し、平均値±標準偏差として測定することで、関節炎重症度を評価した（図２４及び表１５）。コラーゲン負荷によって誘導される関節炎発症の初期徴候は、１４日目に視認可能となった。ＣＩＡ群の関節炎スコアは急速に増加し、２０日目に約５～９のスコアに到達し、最大となった。その後、２１～３５日目にかけて、治療群及びプラセボ群の両方において炎症徴候は徐々に弱まった。しかしながら、試験中、免疫原コンストラクト（配列番号１４８）を用いた治療群では、そのすべてにおいて、臨床徴候スコアによる関節炎がプラセボ群と比較して大幅に軽減された。アジュバントＩＳＡ５１またはアジュバントＡＤＪＵＰＨＯＳのいずれを治療群に用いても、そのすべてにおいて、投与用量が高い群ほど関節炎スコアが低いというペプチド免疫原用量依存的な様式も観察された。２つの異なるアジュバント媒体を用いた２つのプラセボ群では、すべての治療群のものと比較して臨床徴候スコアが高いことによって、臨床的関節炎徴候の重症度の進行が見られた。最良の用量レベルは４５μｇ及び１５０μｇであることが分かり、これらの用量では、ＩＳＡ５１製剤及びＡＤＪＵＰＨＯＳ製剤の両方の５μｇ用量及び１５μｇ用量と比較して関節炎徴候及び症状が有意に減少した。３３日目及び３５日目には、１５０μｇ用量レベルのＡＤＪＵＰＨＯＳ製剤群の関節炎スコア（それぞれ６１％及び６３％）は、ＩＳＡ５１群の関節炎スコア（それぞれ３１％及び４５％）と比較して、より有意に減少した。
好中球数は、最初のコラーゲン注射の０～７日後にかけて急速に増加し、その後、２回目の負荷後からは１４日目まで徐々に上昇した。好中球数の上昇は、免疫化によって用量依存的な様式で急速におさまった（図２５及び表１６）。すべての免疫原治療群において、各時点のプラセボ群と比較して好中球数の大きな減少が見られた。ＩＬ－６免疫原治療群では、２つの高用量によって好中球数増加が有意に減少したが、ＡＤＪＵＰＨＯＳ製剤の４５μｇ用量及び１５０μｇ用量では、好中球数が、それぞれ１．５５±０．２３×１０３個／μＬ及び１．３６±０．２５×１０３個／μＬに有意（ｐ＜０．００１）に減少し、この結果は、同じ用量レベルでＩＳＡ５１を用いた製剤と比較して良好なものであった。
コラーゲン誘導関節炎は、血小板数の顕著な増加とも関連する。試験したＣＩＡラットでは、最初のコラーゲン注射後にすべての群において平均血小板数が着実に増加し、その後は徐々に減少した（図２６及び表１７）。用量依存性も確認され、用量が高いほど血小板数が低下した。特に、４５μｇ用量及び１５０μｇ用量でＡＤＪＵＰＨＯＳと共に製剤化したＩＬ－６組成物は、正常値近くにまで血小板レベルを有意に低減した一方で、プラセボ群では、各時点で血中血小板数が高まっていた。
Ｈｉｔａｃｈｉ７０８０化学分析装置（Ｈｉｔａｃｈｉ）での通例のヒトアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）試験を使用して血清中ＡＳＴレベルを測定することによって肝臓損傷を定量化した（図２７及び表１８）。ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクト製剤及びコラーゲンでラットを処理すると、０日目～７日目に正常ラット群と比較して血清中ＡＳＴレベルが中程度に増加した。ＡＳＴ濃度は２１日目まで一定であり、その後は試験終了までゆっくりと減少した。ＡＳＴレベルについても用量依存性が観察された。１５０μｇ用量を投与したラットでは、両方の製剤でＡＳＴレベルが有意に低下した。４５μｇ用量では、ＡＳＴレベルの有意な低下はＡＤＪＵＰＨＯＳ製剤でのみ見られ、ＩＳＡ５１では見られなかった。
まとめると、アジュバントと共に製剤化したＩｌ－６ペプチド免疫原コンストラクト（配列番号１４８）は、ＩＬ－６抗体を誘導して過剰なＩＬ－６を中和することで、関節炎重症度の軽減ならびに炎症因子（血中の好中球数及び血小板数など）の抑制、ならびに肝機能の保護を行うことができる。ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクト治療群のそれぞれにおいて、組成物に対する同様の用量依存的応答パターンが観察された。用量当たり１５０μｇを投与した動物で生じる免疫応答が最も強く、その次に強い免疫応答は、４５μｇを投与した動物で生じるものであることが、結果から明らかとなった。さらに、両方のアジュバント送達系（ＩＳＡ５１及びＡＤＪＵＰＨＯＳ）が、ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトとの併用時に関節炎症状を軽減する能力を示した。一方で、アジュバントＡＤＪＵ－ＰＨＯＳは、すべての関節炎関連病理学的パラメーターにおいて、ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ ＩＳＡ５１と比較してわずかに良好に機能した。したがって、０．５ｍＬのＡＤＪＵＰＨＯＳ当たり１５０μｇの最高用量が、ラットを免疫化する上では最適な用量であると考えられ、異なる種における免疫原性の探求指針として使用されることになる。
実施例１０
ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクト及びその製剤での免疫化による慢性炎症性疾患の治療
ＩＬ－６は、幅広いスペクトルの生物学的事象（免疫応答、造血、及び急性期反応など）に関与する。一方で、ＩＬ－６の過剰産生は、いくつかの慢性炎症性疾患及びがんを含めて、さまざまな疾患の病態形成と関連している。ＩＬ－６シグナル伝達に対する阻害剤を使用すれば、ＩＬ－６調節異常による影響を受ける疾患の分子機序の理解を深めるための臨床情報が得られることになり、これによって、こうした疾患に対する新たな治療介入の開発が促進されることになる。実施例１１～１５には、本開示のＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクト及びその製剤を、疾患を予防及び／または治療するための医薬組成物として臨床適用することについて記載される。本明細書では、疾患におけるＩＬ－６シグナル伝達に対するＩＬ－６阻害剤を臨床適用する可能性に関する総説論文が参照文献として提供される（Mihara, et al., 2012)。
慢性炎症性疾患に伴う貧血（ＡＣＤ）
慢性炎症性疾患（ＲＡ、炎症性腸疾患、及びがんなど）を有する患者では、貧血が観察されることが多く、こうした貧血は、ＡＣＤ（慢性疾患に伴う貧血）と呼ばれる。ＡＣＤは、適切な鉄貯蔵の存在下でも低鉄血症が生じることによって特徴付けられる。ＡＣＤでは、炎症性サイトカインが重要な役割を担うと考えられる。
サルのコラーゲン誘導関節炎で観察される貧血は、血清中鉄及びトランスフェリン飽和度の低下ならびに血清中フェリチンの上昇によって特徴付けられる。貧血の重症度は、血清中ＩＬ－６レベルと相関する。ヘプシジンは、ヒト及び他の哺乳類における鉄ホメオスタシスの主要調節因子である。ヘプシジンは、小腸における鉄吸収及びマクロファージからの再利用鉄の放出を抑制することで、骨髄中で成熟していく赤血球への鉄の送達を効果的に低減する。ヘプシジンを過剰産生するように遺伝子操作したマウスは、出生後すぐに重度の鉄欠乏によって死亡する。
ＩＬ－６は、肝細胞においてヘプシジン産生を誘導する。コラーゲン誘導関節炎を患うサルにＴＣＺ（ＩＬ－６受容体に対するモノクローナル抗体）を投与すると、貧血が急速に改善され、一過性ではあるが、血清中ヘプシジンの減少が急速に誘導された。関節炎サル由来の血清によって誘導されるヘプシジンのｍＲＮＡ発現は、健康な動物由来の血清によって誘導されるものと比較して強力なものであり、この強力なｍＲＮＡ発現は、ＴＣＺの投与によって抑制された。こうした一連の証拠は、ＴＣＺが、ＩＬ－６誘導性のヘプシジン産生の抑制を介してサル関節炎における貧血を改善することを示している。
高価な抗体治療の代わりに、ＩＬ－６Ｒ結合部位に対する抗体を患者において誘導するための本開示のＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクト及びその製剤を投与してＩＬ－６とＩＬ－６Ｒと結合に介入することで、疾患が治療される。
実施例１１
ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクト及びその製剤での免疫化によるがんの治療
ヒトの発がんにおける慢性炎症
ヒトの発がんでは、慢性炎症が重要な役割を担っている。がん患者における血清中ＩＬ－６レベルの上昇について述べている報告は多く存在しており、血清中ＩＬ－６レベルは、疾患の重症度及び転帰と関連する。ＩＬ－６は、多くのがんの増殖及び分化の調節に関与している。ＩＬ－６の上昇は、腎細胞癌、卵巣癌、リンパ腫、メラノーマ、及び前立腺癌の予後不良とも関連することが明らかになっている。ＩＬ－６は、ＥＲＫ１／２を活性化することによって腫瘍細胞増殖を刺激する。ＩＬ－６は、重要な細胞生存調節因子となることで、ストレス及び細胞傷害性薬物によって誘導される細胞死を回避するための機構を腫瘍細胞に与える。さらに、ＩＬ－６は、腫瘍増殖を促進するだけなく、転移及び悪液質症状も促進する生理学的役割を有することも示されている。
多発性骨髄腫（ＭＭ）
ＭＭは、形質細胞の悪性腫瘍であり、成人では最も一般的な悪性リンパ腫である。ＭＭは、腫瘍細胞が骨髄に局在化し、そこでこうした細胞が広がり、骨疾患を誘導することによって特徴付けられる。骨髄微小環境においてＭＭ細胞と間質細胞との間で相互作用が生じると、サイトカイン、増殖因子、及び接着分子の産生が刺激される。そうしたものは、一緒に、骨髄におけるＭＭ細胞の増殖及び局在化において重要な役割を担っている。ＭＭ細胞は、骨溶解を誘発することで骨痛及び高カルシウム血症を引き起こす。ＩＬ－６は、ＭＭ細胞の主要な増殖因子である。すべてのＭＭ患者の約半数では、オートクリンループによって培養ＭＭ細胞の増殖が媒介されることが観察され、今日では、ＭＭ細胞の増殖及び生存に関与する主要なサイトカインは、骨髄環境によって産生されるＩＬ－６であることがよく知られている。さらに、さまざまな刺激（デキサメタゾン、Ｆａｓ、及び血清枯渇など）によって誘導されるＭＭ細胞のアポトーシスはＩＬ－６によって阻止されるため、ＩＬ－６は、ＭＭ細胞の生存に必須の因子であることもよく知られている。ＩＬ－６－ｓＩＬ－６Ｒ複合体は、自然ＭＭ細胞（細胞表面上にＩＬ－６Ｒを発現しない）におけるＢｃｌ－ｘＬ及びＭｃｌ－ｌの両方の上方制御において単独のＩＬ－６よりも強力である。したがって、トランスシグナル伝達を妨害する（すなわち、ＩＬ－６／ＩＬ－６Ｒα複合体のレベルでＩＬ－６Ｒβ／すなわちｇｐ１３０を妨害する）と想定される部位に指向化された抗体を誘導し得るＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトを含む組成物を有することが重要である。したがって、本開示のＩＬ－６組成物は、ＭＭの治療に適用可能であり得る。
前立腺癌
前立腺癌におけるＩＬ－６及びＩＬ－６Ｒの発現ならびに増殖因子としてのＩＬ－６の役割についてはよく報告されている。ＩＬ－６は、アポトーシスに対する抵抗性を生じさせ、進行性前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰにおけるＢｃｌ－２ファミリーの抗アポトーシスメンバーのレベルを上昇させる役割を果たす。前立腺癌細胞の増殖はアンドロゲンの存在に依存するため、進行性前立腺癌患者のほとんどすべてにおいて、アンドロゲン枯渇及び抗アンドロゲン療法が初期には奏功する。ＩＬ－６は、アンドロゲンの合成及び前立腺癌細胞上でのＡＲ（アンドロゲン受容体）の発現を刺激するため、前立腺癌における抗アンドロゲン治療の治療効果はＩＬ－６によって弱められる可能性がある。一方で、ＡＲ陰性前立腺癌細胞では、ＩＬ－６は、アポトーシスの阻害物質として知られている。本開示のＩＬ－６組成物は、免疫化される患者において抗ＩＬ－６抗体を生成させることで、こうしたがん患者においてＩＬ－６によってもたらされる負の影響を中和することが可能であると想定される。
がんと関連する食欲不振及び悪液質
がんと関連する食欲不振及び悪液質は、悪性疾患と関連する重篤な合併症である。悪液質の特徴は、貧血、肝機能異常、疲労、及び嘔吐である。膵癌患者では血清中ＩＬ－６が上昇しており、悪液質との関連が観察されている。上記のように、ＩＬ－６は、鉄代謝と関連する。さらに、ＩＬ－６は、過剰糖代謝及び筋力低下と関連する調節的な役割も有する。ＩＬ－６は、同系マウスモデルにおけるがん悪液質に必須のものであることも知られており、この同系マウスモデルを抗ＩＬ－６抗体で処理すると、がん悪液質の誘導が阻止される。さらに、ＩＬ－６のｃＤＮＡがトランスフェクトされたルイス肺癌細胞を同系マウスに注射すると、正味の腫瘍増殖速度は変わらないが、体重が減少し、生存期間が短くなる。抗ヒトＩＬ－６抗体（ＡＬＤ５１８）は、進行性非小細胞肺癌患者において疲労を回復させ、除脂肪体重の減少を低減する（ＡＬＤ５１８を摂取している患者では－０．１９ｋｇであるのに対し、プラセボを摂取している患者では－１．５０ｋｇ）ことが報告された。こうした患者では、ＡＬＤ５１８によって、ヘモグロビン量、ヘマトクリット値、平均赤血球ヘモグロビン量、及びアルブミン量が増加し、ベースラインのヘモグロビンレベルが≦１１ｇ／ｄｌである患者の５８％においてヘモグロビンレベルが≧１２ｇ／ｄｌに上昇した。したがって、抗ＩＬ－６抗体は、モノクローナル抗体としても、ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトを含む組成物で患者を免疫化することによって誘導される抗体としても、がん関連貧血のための非赤血球生成刺激剤となり得る。
長期にわたって潰瘍性大腸炎を有する患者では、結腸癌を発症するリスクがはるかに高まっており、このことは、免疫系が、結腸における腫瘍プロモーターとしての役割を担っていることを示唆している。腸管損傷に応答して粘膜固有層内の自然免疫細胞においてＩＬ－６が産生され、このＩＬ－６が、腫瘍始原細胞の増殖を増進させると共に、急性結腸炎症及びＣＡＣ（大腸炎関連癌）が誘導される間、正常な腸上皮細胞及び前悪性の腸上皮細胞をアポトーシスから保護することが研究によって示されている。さらに、潰瘍性大腸炎モデルにおけるアゾキシメタン誘導性の結腸腫瘍では、腫瘍の出現には、Ｆ４／８０＋ＣＤ１１ｂ高Ｇｒ１低（Ｍ２）マクロファージサブセットの同時出現が伴っており、このＭ２サブセットが、ＩＬ－６を含む腫瘍促進因子の供給源となる。こうした結果は、ＩＬ－６を遮断することが、大腸炎関連癌を治療するための手法となり得ることを示唆してる。
ＩＬ－６とＩＬ－６受容体との相互作用に介入するための高価な抗体治療を行い、ＩＬ－６の血清中レベルを低減して、がん（多発性骨髄腫（ＭＭ）、アンドロゲン依存性またはアンドロゲン非依存性の前立腺癌、非小細胞肺癌、がんと関連する食欲不振及び悪液質、がん関連貧血、ならびに大腸炎関連癌を含む）の治療及び寛解に繋げる代わりに、ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクト及びその製剤での免疫化は、こうした深刻な疾患の治療に適するものと想定される。
実施例１２
ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクト及びその製剤での免疫化による関節リウマチの治療
関節リウマチ（ＲＡ）
関節リウマチ（ＲＡ）は、特に手足の関節を冒す慢性かつ進行性の自己免疫性炎症性疾患であり、その病因は不明である。患部関節の滑膜組織が炎症性細胞（マクロファージ及びリンパ球など）による浸潤を受けることで、血管新生を伴う過形成が生じ、これがひいては関節腫脹、こわばり、及び疼痛を誘発する。このプロセスは、最終的に関節の軟骨破壊及び骨吸収を引き起こし、患者によっては恒久的な障害に苦しむ。ＩＬ－６の生物学的活性、ならびにＲＡ患者の血清及び滑液中のＩＬ－６の上昇は、ＩＬ－６が、ＲＡ発症に関与する主要なサイトカインの１つであることを示している。抗ＩＬ－６Ｒモノクローナル抗体ＴＣＺ（トシリズマブ）を用いる第ＩＩＩ相臨床試験が日本及び世界中で７回実施されており、これらの臨床試験では、中程度～重度のＲＡを患う成人患者の治療において単剤療法またはＤＭＡＲＤ（疾患修飾性抗リウマチ薬）との併用療法のいずれにおいても、トシリズマブが効力を有することが明らかになっている。さらに、ＳＡＭＵＲＡＩ（関節リウマチに使用される単剤（ＩＬ－６阻害剤）療法の実薬対照試験）試験及びＬＩＴＨＥ（トシリズマブの安全性及び構造的関節損傷予防試験）試験では、放射線学的に評価した関節損傷がＴＣＺ治療によって有意に抑制されることが証明された。結果として、今日ではＴＣＺは、ＲＡ治療剤として多くの国で承認されている。
全身型若年性特発性関節炎（ｓＪＩＡ）
全身型若年性特発性関節炎（ｓＪＩＡ）は、全身性の炎症を伴って関節破壊及び機能障害を引き起こす亜型の慢性小児関節炎である。この持続性の炎症は、弛張熱、貧血、及び成長障害も引き起こす。マクロファージ活性化症候群として知られるｓＪＩＡの急性合併症は、重篤な病的状態と関連する。患者の血液及び滑液中ではＩＬ－６が著しく上昇していることが報告されており、ＩＬ－６レベルは、疾患活性と相関することが示されている。従来の治療レジメンに抵抗性であった５６人のｓＪＩＡ患者を対象とする無作為化二重盲検プラセボ対照治療中止期ありの第ＩＩＩ相試験では、ＴＣＺは極めて優れた効力を示した。ＴＣＺは、ｓＪＩＡに対する最初の生物学的製剤として２００８年に日本で承認された。
ＩＬ－６の血清中レベルを低減し、ｓＪＩＡ疾患を寛解させるためにＩＬ－６とＩＬ－６受容体との相互作用のレベルでの介入を行うための上記の高価な抗体治療の代わりに、本開示のＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクト及びその製剤での免疫化は、ｓＪＩＡ疾患の治療に適するものと想定される。
実施例１３
ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクト及びその製剤での免疫化によるキャッスルマン病の治療
キャッスルマン病は、濾胞性過形成、及び内皮過形成を伴う毛細血管増生によって特徴付けられる良性のリンパ節腫大を伴うリンパ増殖性疾患である。腫大リンパ節ではＩＬ－６が高レベルで産生され、ＩＬ－６は、さまざまな臨床症状の原因となる重要な要素である。２回の非盲検臨床試験では、８ｍｇ／体重ｋｇで２週間ごとに投与される抗ＩＬ－６Ｒ抗体ＴＣＺが、臨床症状、検査所見、ならびに組織学的に決定される寛解に対して著しい効果を有することが示されている。さらに、ＴＣＺ治療の結果、キャッスルマン病患者の血清中ヘプシジン－２５が急速に減少した。ＴＣＺ治療の開始後は、鉄関連パラメーターの正常化の進行及び症状の改善を伴う長期的な減少が観察され、このことは、キャッスルマン病におけるヘプシジンの誘導においてＩＬ－６が本質的な役割を担っていることを示している。ＴＣＺは、日本で２００５年にキャッスルマン病のオーファンドラッグとして承認された。
ＩＬ－６とＩＬ－６受容体との相互作用のレベルでの介入を行ってＩＬ－６の血清中レベルを低減し、キャッスルマン病を寛解させる高価な抗体治療の代わりに、ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクト及びその製剤での免疫化は、キャッスルマン病の治療に適するものと想定される。
実施例１４
ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクト及びその製剤での免疫化による鬱病の治療
免疫系と脳との間の関連性からは、鬱病の機序についての理解及び鬱病治療に対する洞察が新たに得られる可能性がある。免疫系と脳との間のサイトカイン介在性のコミュニケーションは、鬱病の病態形成と関連付けられている。Ｃ型肝炎ウイルスに罹患している患者では、インターフェロン（強力なサイトカイン誘導因子）での治療後に大鬱病が生じることが多い（４人に１人）。健康なボランティアの免疫を実験的に活性化すると、鬱症状が生じ、認識能力が低下する。鬱患者では循環炎症性サイトカインのレベルが上昇していることが、横断的研究のメタ解析によって確認されている。縦断的研究では、血清中サイトカインレベルが先行して上昇し、それによって鬱症状が潜在的に誘発されることが実証されている。さらに、炎症系の活性化が抗鬱治療抵抗性の根底をなすと考えられており、このことは、治療応答に炎症が関与していることを強く示している。こうした知見に基づくと、本開示のＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクト及びその製剤を用いて炎症性サイトカイン、特にＩＬ－６を標的とすることで、鬱病及び疼痛を有する患者、具体的には慢性炎症状態を有する患者に治療効果を与えることは最も有意義であると想定される。
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Claims (7)

  1. 配列番号１０７～１２９及び配列番号１３１～２１５からなる群から選択されるＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクト。
  2. 請求項１に記載のＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトを含む組成物。
  3. ａ．請求項１に記載のＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトと、
    ｂ．医薬的に許容可能な送達媒体及び／またはアジュバントと、
    を含む医薬組成物。
  4. 前記ＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトが、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）と混合されることで、安定化された免疫刺激性複合体を形成する請求項３に記載の医薬組成物。
  5. 動物においてＩＬ－６に対する抗体を生成させる請求項３又は４に記載の医薬組成物。
  6. 動物におけるＩＬ－６調節異常による影響を受ける疾患を予防及び／または治療する請求項３又は４に記載の医薬組成物。
  7. 動物におけるＩＬ－６調節異常による影響を受ける疾患を予防及び／または治療する医薬の製造における請求項１に記載のＩＬ－６ペプチド免疫原コンストラクトの使用。
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