JP7566045B2 - 栽培条件を決定する方法、及び目的タンパク質又は目的ペプチドの製造方法 - Google Patents
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Description
本発明は、栽培条件を決定する方法、及び目的タンパク質又は目的ペプチドの製造方法に関する。
遺伝子組換え技術等により植物体に目的タンパク質又は目的ペプチドを異種発現させて目的タンパク質又は目的ペプチドを製造する様々な方法が開発されている。植物体に目的タンパク質又は目的ペプチドを異種発現させるためには、例えば、目的タンパク質又は目的ペプチドをコードするポリヌクレオチドを有する細菌又はウイルスを植物体に感染させることがよく行われる（非特許文献１）。植物体において目的タンパク質又は目的ペプチドを異種発現させた後の目的タンパク質又は目的ペプチドの回収方法に関する報告は多いものの、異種発現のために細菌又はウイルスを植物体に感染させた後の植物体の栽培条件の検討はあまり行われていない。
Marillonnetet al. "In planta engineering of viral RNA replicons: efficient assembly by recombination of DNA modules delivered by Agrobacterium.", Proc Natl Acad Sci US A., 2004 Oct 26;101(43):15546
本発明は、目的タンパク質又は目的ペプチドを植物体において発現させる際の植物体の栽培条件を決定するための新規な方法、及び決定された栽培条件での植物体の栽培による目的タンパク質又は目的ペプチドの製造方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、栽培時の葉温に基づいて、好適な栽培条件を決定することができることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、例えば以下の発明を含む。
［１］
目的タンパク質又は目的ペプチドを発現する植物体を、暗期及び明期を交互に繰り返す２４時間サイクル下で栽培するための条件を決定する方法であって、
目的タンパク質又は目的ペプチドの発現能に基づき、最適葉温を決定する工程と、
目的タンパク質又は目的ペプチドをコードするポリヌクレオチドを有する細菌又はウイルスを植物体に感染させた後の明暗期の葉温並びに明暗期の時間を、
暗期の葉温（℃）×暗期の時間（時間）＋明期の葉温（℃）×明期の時間（時間）＝最適葉温（℃）×２４（時間）±２４を満たすように設定する工程とを含む、方法。
［２］
最適葉温を決定する工程が、目的タンパク質又は目的ペプチドの発現量に基づき、最適葉温を決定することを含む、［１］に記載の方法。
［３］
明期における葉温を暗期における葉温よりも高く設定することを含む、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］
２４時間サイクルの内訳として、暗期が３～２１時間の間の時間に設定され、明期が３～２１時間の間の時間に設定され、暗期と明期の合計時間が２４時間である、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］
最適葉温が２２℃～２７℃間の温度である、［１］～［４］のいずれかに記載の方法。
［６］
暗期の葉温が１６℃～２７℃間の温度であり、明期の葉温が１６℃～２７℃間の温度である、［１］～［５］のいずれかに記載の方法。
［７］
植物体がタバコ属植物である、［１］～［６］のいずれかに記載の方法。
［８］
目的タンパク質又は目的ペプチドが、抗体、酵素、ホルモン又は抗原である、［１］～［７］のいずれかに記載の方法。
［９］
［１］～［８］のいずれかに記載の方法により、栽培するための条件を決定すること、決定した栽培条件で目的タンパク質又は目的ペプチドを発現する植物体を栽培すること、及び栽培した植物体から目的タンパク質又は目的ペプチドを抽出することを含む、目的タンパク質又は目的ペプチドの製造方法。
［１０］
目的タンパク質又は目的ペプチドを発現する植物体を、暗期及び明期を交互に繰り返すサイクル下で栽培するための条件を決定する方法であって、
目的タンパク質又は目的ペプチドの発現能に基づき、最適葉温を決定する工程と、
目的タンパク質又は目的ペプチドをコードするポリヌクレオチドを有する細菌又はウイルスを植物体に感染させた後の明暗期の葉温並びに明暗期の時間を、
暗期の葉温（℃）×１サイクルあたりの暗期の時間（時間）＋明期の葉温（℃）×１サイクルあたりの明期の時間（時間）＝最適葉温（℃）×１サイクルの総時間±２４を満たすように、設定する工程とを含む、方法。
［１１］
最適葉温を決定する工程が、目的タンパク質又は目的ペプチドの発現量に基づき、最適葉温を決定することを含む、［１０］に記載の方法。
［１２］
明期における葉温を暗期における葉温よりも高く設定することを含む、［１０］又は［１１］に記載の方法。
［１３］
暗期が３～２１時間の間の時間に設定され、明期が３～２１時間の間の時間に設定される、［１０］～［１２］のいずれかに記載の方法。
［１４］
最適葉温が２２℃～２７℃間の温度である、［１０］～［１３］のいずれかに記載の方法。
［１５］
暗期の葉温が１６℃～２７℃間の温度であり、明期の葉温が１６℃～２７℃間の温度である、［１０］～［１４］のいずれかに記載の方法。
［１６］
植物体がタバコ属植物である、［１０］～［１５］のいずれかに記載の方法。
［１７］
目的タンパク質又は目的ペプチドが、抗体、酵素、ホルモン又は抗原である、［１０］～［１６］のいずれかに記載の方法。
［１８］
１サイクルが２０時間～３６時間の間の時間に設定される、［１０］～［１７］のいずれかに記載の方法。
［１９］
目的タンパク質又は目的ペプチドを発現する植物体を、複数の温度帯を含む２４時間サイクル下で栽培するための条件を決定する方法であって、
目的タンパク質又は目的ペプチドの発現能に基づき、最適葉温を決定する工程と、
目的タンパク質又は目的ペプチドをコードするポリヌクレオチドを有する細菌又はウイルスを植物体に感染させた後の、一定の間隔で測定した葉温の積算値が下記の関係を満たすように、葉温及び測定回数を設定する工程を含む、方法。
（Ｔ－１）×（Ｃ１＋・・・＋Ｃｎ）≦（Ｔ１×Ｃ１）＋・・・＋（Ｔｎ×Ｃｎ）≦（Ｔ＋１）×（Ｃ１＋・・・＋Ｃｎ）
ｎ×測定間隔（時間）＝２４（時間）
Ｃ１＋・・・＋Ｃｎ＝２４（時間）
ここで、Ｔは最適葉温（℃）であり、Ｔ１～Ｔｎは葉温（℃）であり、ｎは測定回数（回）であり、ｎは２以上１０以下の整数である。
［２０］
ｎが２又は３である、［１９］に記載の方法。
［２１］
［１９］又は［２０］に記載の方法により、栽培するための条件を決定すること、決定した栽培条件で目的タンパク質又は目的ペプチドを発現する植物体を栽培すること、及び栽培した植物体から目的タンパク質又は目的ペプチドを抽出することを含む、目的タンパク質又は目的ペプチドの製造方法。
［２２］
目的タンパク質又は目的ペプチドを発現する植物体を、複数の温度帯を含む一定時間（Ｃ（時間））のサイクル下で栽培するための条件を決定する方法であって、
目的タンパク質又は目的ペプチドの発現能に基づき、最適葉温を決定する工程と、
目的タンパク質又は目的ペプチドをコードするポリヌクレオチドを有する細菌又はウイルスを植物体に感染させた後の、一定の間隔で測定した葉温の積算値が下記の関係を満たすように、葉温及び測定回数を設定する工程とを含む、方法。
（Ｔ－１）×（Ｃ１＋・・・＋Ｃｎ）≦（Ｔ１×Ｃ１）＋・・・＋（Ｔｎ×Ｃｎ）≦（Ｔ＋１）×（Ｃ１＋・・・＋Ｃｎ）
ｎ×測定間隔（時間）＝Ｃ（時間）
Ｃ１＋・・・＋Ｃｎ＝Ｃ（時間）
ここで、Ｔは最適葉温（℃）であり、Ｔ１～Ｔｎは葉温（℃）であり、ｎは測定回数（回）であり、ｎは２以上１０以下の整数である。
［２３］
ｎが２又は３である、［２２］に記載の方法。
［２４］
［２２］又は［２３］に記載の方法により、栽培するための条件を決定すること、決定した栽培条件で目的タンパク質又は目的ペプチドを発現する植物体を栽培すること、及び栽培した植物体から目的タンパク質又は目的ペプチドを抽出することを含む、目的タンパク質又は目的ペプチドの製造方法。
［１］
目的タンパク質又は目的ペプチドを発現する植物体を、暗期及び明期を交互に繰り返す２４時間サイクル下で栽培するための条件を決定する方法であって、
目的タンパク質又は目的ペプチドの発現能に基づき、最適葉温を決定する工程と、
目的タンパク質又は目的ペプチドをコードするポリヌクレオチドを有する細菌又はウイルスを植物体に感染させた後の明暗期の葉温並びに明暗期の時間を、
暗期の葉温（℃）×暗期の時間（時間）＋明期の葉温（℃）×明期の時間（時間）＝最適葉温（℃）×２４（時間）±２４を満たすように設定する工程とを含む、方法。
［２］
最適葉温を決定する工程が、目的タンパク質又は目的ペプチドの発現量に基づき、最適葉温を決定することを含む、［１］に記載の方法。
［３］
明期における葉温を暗期における葉温よりも高く設定することを含む、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］
２４時間サイクルの内訳として、暗期が３～２１時間の間の時間に設定され、明期が３～２１時間の間の時間に設定され、暗期と明期の合計時間が２４時間である、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］
最適葉温が２２℃～２７℃間の温度である、［１］～［４］のいずれかに記載の方法。
［６］
暗期の葉温が１６℃～２７℃間の温度であり、明期の葉温が１６℃～２７℃間の温度である、［１］～［５］のいずれかに記載の方法。
［７］
植物体がタバコ属植物である、［１］～［６］のいずれかに記載の方法。
［８］
目的タンパク質又は目的ペプチドが、抗体、酵素、ホルモン又は抗原である、［１］～［７］のいずれかに記載の方法。
［９］
［１］～［８］のいずれかに記載の方法により、栽培するための条件を決定すること、決定した栽培条件で目的タンパク質又は目的ペプチドを発現する植物体を栽培すること、及び栽培した植物体から目的タンパク質又は目的ペプチドを抽出することを含む、目的タンパク質又は目的ペプチドの製造方法。
［１０］
目的タンパク質又は目的ペプチドを発現する植物体を、暗期及び明期を交互に繰り返すサイクル下で栽培するための条件を決定する方法であって、
目的タンパク質又は目的ペプチドの発現能に基づき、最適葉温を決定する工程と、
目的タンパク質又は目的ペプチドをコードするポリヌクレオチドを有する細菌又はウイルスを植物体に感染させた後の明暗期の葉温並びに明暗期の時間を、
暗期の葉温（℃）×１サイクルあたりの暗期の時間（時間）＋明期の葉温（℃）×１サイクルあたりの明期の時間（時間）＝最適葉温（℃）×１サイクルの総時間±２４を満たすように、設定する工程とを含む、方法。
［１１］
最適葉温を決定する工程が、目的タンパク質又は目的ペプチドの発現量に基づき、最適葉温を決定することを含む、［１０］に記載の方法。
［１２］
明期における葉温を暗期における葉温よりも高く設定することを含む、［１０］又は［１１］に記載の方法。
［１３］
暗期が３～２１時間の間の時間に設定され、明期が３～２１時間の間の時間に設定される、［１０］～［１２］のいずれかに記載の方法。
［１４］
最適葉温が２２℃～２７℃間の温度である、［１０］～［１３］のいずれかに記載の方法。
［１５］
暗期の葉温が１６℃～２７℃間の温度であり、明期の葉温が１６℃～２７℃間の温度である、［１０］～［１４］のいずれかに記載の方法。
［１６］
植物体がタバコ属植物である、［１０］～［１５］のいずれかに記載の方法。
［１７］
目的タンパク質又は目的ペプチドが、抗体、酵素、ホルモン又は抗原である、［１０］～［１６］のいずれかに記載の方法。
［１８］
１サイクルが２０時間～３６時間の間の時間に設定される、［１０］～［１７］のいずれかに記載の方法。
［１９］
目的タンパク質又は目的ペプチドを発現する植物体を、複数の温度帯を含む２４時間サイクル下で栽培するための条件を決定する方法であって、
目的タンパク質又は目的ペプチドの発現能に基づき、最適葉温を決定する工程と、
目的タンパク質又は目的ペプチドをコードするポリヌクレオチドを有する細菌又はウイルスを植物体に感染させた後の、一定の間隔で測定した葉温の積算値が下記の関係を満たすように、葉温及び測定回数を設定する工程を含む、方法。
（Ｔ－１）×（Ｃ１＋・・・＋Ｃｎ）≦（Ｔ１×Ｃ１）＋・・・＋（Ｔｎ×Ｃｎ）≦（Ｔ＋１）×（Ｃ１＋・・・＋Ｃｎ）
ｎ×測定間隔（時間）＝２４（時間）
Ｃ１＋・・・＋Ｃｎ＝２４（時間）
ここで、Ｔは最適葉温（℃）であり、Ｔ１～Ｔｎは葉温（℃）であり、ｎは測定回数（回）であり、ｎは２以上１０以下の整数である。
［２０］
ｎが２又は３である、［１９］に記載の方法。
［２１］
［１９］又は［２０］に記載の方法により、栽培するための条件を決定すること、決定した栽培条件で目的タンパク質又は目的ペプチドを発現する植物体を栽培すること、及び栽培した植物体から目的タンパク質又は目的ペプチドを抽出することを含む、目的タンパク質又は目的ペプチドの製造方法。
［２２］
目的タンパク質又は目的ペプチドを発現する植物体を、複数の温度帯を含む一定時間（Ｃ（時間））のサイクル下で栽培するための条件を決定する方法であって、
目的タンパク質又は目的ペプチドの発現能に基づき、最適葉温を決定する工程と、
目的タンパク質又は目的ペプチドをコードするポリヌクレオチドを有する細菌又はウイルスを植物体に感染させた後の、一定の間隔で測定した葉温の積算値が下記の関係を満たすように、葉温及び測定回数を設定する工程とを含む、方法。
（Ｔ－１）×（Ｃ１＋・・・＋Ｃｎ）≦（Ｔ１×Ｃ１）＋・・・＋（Ｔｎ×Ｃｎ）≦（Ｔ＋１）×（Ｃ１＋・・・＋Ｃｎ）
ｎ×測定間隔（時間）＝Ｃ（時間）
Ｃ１＋・・・＋Ｃｎ＝Ｃ（時間）
ここで、Ｔは最適葉温（℃）であり、Ｔ１～Ｔｎは葉温（℃）であり、ｎは測定回数（回）であり、ｎは２以上１０以下の整数である。
［２３］
ｎが２又は３である、［２２］に記載の方法。
［２４］
［２２］又は［２３］に記載の方法により、栽培するための条件を決定すること、決定した栽培条件で目的タンパク質又は目的ペプチドを発現する植物体を栽培すること、及び栽培した植物体から目的タンパク質又は目的ペプチドを抽出することを含む、目的タンパク質又は目的ペプチドの製造方法。
本発明によれば、目的タンパク質又は目的ペプチドを植物体において発現させる際の植物体の栽培条件を決定するための新規な方法、及び決定された栽培条件での植物体の栽培による目的タンパク質又は目的ペプチドの製造方法を提供することができる。
本発明によれば、明暗期の葉温及び明暗期の時間を一定に維持する必要はなく、本発明の条件を満たす限り、明暗期の葉温及び明暗期の時間をフレキシブルに設定することができ、栽培条件設定の自由度が増す。明暗期の葉温及び明暗期の時間を調節し、例えば、明期における葉温を暗期における葉温よりも高く設定することで、明期の栽培時の空調電力コスト削減が望める。
本発明は、一実施形態として、目的タンパク質又は目的ペプチドを発現する植物体を、暗期及び明期を交互に繰り返す２４時間サイクル下で栽培するための条件を決定する方法であって、
目的タンパク質又は目的ペプチドの発現能に基づき、最適葉温を決定する工程と、
目的タンパク質又は目的ペプチドをコードするポリヌクレオチドを有する細菌又はウイルスを植物体に感染させた後の明暗期の葉温並びに明暗期の時間を、
暗期の葉温（℃）×暗期の時間（時間）＋明期の葉温（℃）×明期の時間（時間）＝最適葉温（℃）×２４（時間）±２４を満たすように設定する工程とを含む、方法を提供する。
目的タンパク質又は目的ペプチドの発現能に基づき、最適葉温を決定する工程と、
目的タンパク質又は目的ペプチドをコードするポリヌクレオチドを有する細菌又はウイルスを植物体に感染させた後の明暗期の葉温並びに明暗期の時間を、
暗期の葉温（℃）×暗期の時間（時間）＋明期の葉温（℃）×明期の時間（時間）＝最適葉温（℃）×２４（時間）±２４を満たすように設定する工程とを含む、方法を提供する。
また、本発明は、一実施形態として、目的タンパク質又は目的ペプチドを発現する植物体を、暗期及び明期を交互に繰り返すサイクル下で栽培するための条件を決定する方法であって、
目的タンパク質又は目的ペプチドの発現能に基づき、最適葉温を決定する工程と、
目的タンパク質又は目的ペプチドをコードするポリヌクレオチドを有する細菌又はウイルスを植物体に感染させた後の明暗期の葉温並びに明暗期の時間を、
暗期の葉温（℃）×１サイクルあたりの暗期の時間（時間）＋明期の葉温（℃）×１サイクルあたりの明期の時間（時間）＝最適葉温（℃）×１サイクルの総時間±２４を満たすように、設定する工程とを含む、方法も提供する。
目的タンパク質又は目的ペプチドの発現能に基づき、最適葉温を決定する工程と、
目的タンパク質又は目的ペプチドをコードするポリヌクレオチドを有する細菌又はウイルスを植物体に感染させた後の明暗期の葉温並びに明暗期の時間を、
暗期の葉温（℃）×１サイクルあたりの暗期の時間（時間）＋明期の葉温（℃）×１サイクルあたりの明期の時間（時間）＝最適葉温（℃）×１サイクルの総時間±２４を満たすように、設定する工程とを含む、方法も提供する。
目的タンパク質又は目的ペプチドは、植物体において発現が可能である限り制限されず、例えば、自然界に存在するタンパク質又はペプチド、自然界に存在するタンパク質又はペプチドに由来するタンパク質又はペプチド、又は人工的に設計したタンパク質又はペプチドであってもよい。目的タンパク質又は目的ペプチドとしては、例えば、酵素、抗体、ホルモン等の生理活性タンパク質、抗原、エピトープ、成長因子、サイトカイン、転写因子、受容体又はそれらの部分ペプチド等が挙げられる。例えば、目的タンパク質又は目的ペプチドは、酵素、抗原、ホルモン及び抗体からなる群から選択されるものであってもよく、酵素であってもよい。目的タンパク質又は目的ペプチドの由来も制限されず、例えば、動物（ヒト等の哺乳動物を含む）、植物、糸状菌、細菌又は酵母由来であってよい。
酵素としては、例えば、酸化酵素、還元酵素、リパーゼ（例えば、ホスホリパーゼ）、プロテアーゼ、キナーゼ、フォスファターゼ、セルラーゼ、ステロイド合成酵素、メチラーゼ、デメチラーゼ、コラゲナーゼ、トランスグルタミナーゼ、グリコシダーゼ及びキチナーゼが挙げられる。例えば、酵素は、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、及びオキシダーゼからなる群から選択されるものであってもよく、エステラーゼであってよく、ホスホジエステラーゼであってもよい。
抗体としては、例えば、完全抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃ、Ｆｃ融合タンパク質、重鎖（Ｈ鎖）、軽鎖（Ｌ鎖）、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃ（Ｆｖ）２、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、Ｄｉａｂｏｄｙが挙げられる。
抗原及びエピトープとしては、例えば、糸状菌由来のタンパク質、細菌由来のタンパク質及びウイルス由来のタンパク質が挙げられる。また、抗原には、例えば、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の様な自己組織化したタンパク質多量体も含まれる。ワクチンとして使用される抗原タンパク質又はエピトープである場合には、免疫原性を有するものであれば特に制限されないが、例えば、病原性である糸状菌由来のタンパク質、病原性である細菌由来のタンパク質及び病原性であるウイルス由来のタンパク質が挙げられる。
成長因子としては、例えば、上皮成長因子（ＥＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）が挙げられる。
ホルモンとしては、例えば、ペプチド・タンパク質系ホルモンが挙げられる。
サイトカインとしては、例えば、インターロイキン（ＩＬ）、造血因子（ＣＳＦ、ＥＰＯ、ＴＰＯ）、インターフェロン（ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、増殖因子（ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ）及びケモカイン（ＩＬ－８）が挙げられる。
転写因子としては、例えば、基本転写因子、上流転写因子及び誘導型転写因子が挙げられる。
受容体としては、例えば、Ｇタンパク質結合型受容体、イオンチャネル型受容体及びサイトカイン受容体スーパーファミリーが挙げられる。
また、目的タンパク質又は目的ペプチドは、２つ以上のタンパク質が結合した融合タンパク質であってもよい。２つ以上のタンパク質の融合タンパク質としては、２つ以上の異種タンパク質の融合タンパク質でもよいし、２つ以上の同種タンパク質の融合タンパク質でもよい。
目的タンパク質又は目的ペプチドの分子量は、特に制限されないが、例えば、１ｋＤａ～３００ｋＤａ、１ｋＤａ～２００ｋＤａ、１ｋＤａ～１００ｋＤａ、１ｋＤａ～７５ｋＤａ、１ｋＤａ～５０ｋＤａ、１ｋＤａ～１０ｋＤａ、２０ｋＤａ～５００ｋＤａ、５０ｋＤａ～３００ｋＤａ、１００ｋＤａ～２００ｋＤａであってよい。また、目的タンパク質又は目的ペプチドの分子量は、例えば、１０ｋＤａ以上、２０ｋＤａ以上、５０ｋＤａ以上、８０ｋＤａ以上、１００ｋＤａ以上、５００ｋＤａ以下、３００ｋＤａ以下、２００ｋＤａ以下、１００ｋＤａ以下、７５ｋＤａ以下、又は５０ｋＤａ以下であってもよい。
目的タンパク質又は目的ペプチドは、モノマー、ダイマー、トリマー又はマルチマーであってもよい。
目的タンパク質又は目的ペプチドには、目的タンパク質又は目的ペプチドの検出及び／又は精製しやすくするためのタグが付加されていてもよい。
目的タンパク質又は目的ペプチドを発現する植物体は、目的タンパク質又は目的ペプチドをコードするポリヌクレオチドを有する細菌又はウイルスを植物体に感染させることにより作製される。そのような方法としては、例えば、アグロインフィルトレーション法、植物ウイルスベクター法、Ｇｅｎｅｗａｒｅシステム、及びｍａｇｎＩＣＯＮ（登録商標）システムが挙げられる。
目的タンパク質又は目的ペプチドをコードするポリヌクレオチドを有する細菌又はウイルスは、例えば、目的タンパク質又は目的ペプチドをコードするポリヌクレオチドを細菌又はウイルスに形質転換することにより作製することができる。形質転換は公知の方法により行うことができるが、例えば、目的タンパク質又は目的ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを使用することができる。ベクターとしては、例えば、プラスミド、ウイルス、コスミド、ラムダファージ及び人工染色体等が挙げられる。ベクターは、プロモーター配列等を含む発現ベクターであることが好ましい。目的タンパク質又は目的ペプチドをコードするポリヌクレオチドを有するベクターを細菌又はウイルスに形質転換することで、目的タンパク質又は目的ペプチドをコードするポリヌクレオチドを有する細菌又はウイルスを作製できる。
目的タンパク質又は目的ペプチドをコードするポリヌクレオチドを形質転換する細菌としては、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、シノリゾビウム（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、メソリゾビウム（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、フィロバクテリウム（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種及びブラディリゾビウム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種の細菌が挙げられ、アグロバクテリウムであることが好ましい。
目的タンパク質又は目的ペプチドをコードするポリヌクレオチドを形質転換するウイルスには、ウイルスベクターとして使用するものも含まれる。そのようなウイルスとしては、例えば、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）、プラムポックスウイルス（ＰＰＶ）、ジャガイモＸウイルス（ＰＶＸ）、アルファルファモザイクウイルス（ＡＩＭＶ）、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）、カウピーモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）、及びズッキーニイエローモザイクウイルス（ＺＹＭＶ）等が挙げられる。
アグロインフィルトレーション法を使用する場合、目的タンパク質又は目的ペプチドをコードするポリヌクレオチドを挿入したＴ－ＤＮＡでアグロバクテリウムを形質転換し、そのアグロバクテリウムを植物体に感染させることで目的タンパク質又は目的ペプチドを発現する植物体を得ることができる。
植物ウイルスベクター法を使用する場合、目的タンパク質又は目的ペプチドをコードするポリヌクレオチドを挿入した植物ウイルスゲノムのｃＤＮＡから得られたＲＮＡをベクターとして植物体に接種して感染させることで目的タンパク質又は目的ペプチドを発現する植物体を得ることができる。このようなウイルスベクターとしては、例えば、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）ベクター、プラムポックスウイルス（ＰＰＶ）ベクター、ジャガイモＸウイルス（ＰＶＸ）ベクター、アルファルファモザイクウイルス（ＡＩＭＶ）ベクター、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）ベクター、カウピーモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）ベクター、及びズッキーニイエローモザイクウイルス（ＺＹＭＶ）ベクター等が挙げられる。
ｍａｇｎＩＣＯＮ（登録商標）システムを使用する場合、目的タンパク質又は目的ペプチドをコードするポリヌクレオチドを挿入したＴＭＶ又はＰＶＸゲノムのｃＤＮＡをＴ－ＤＮＡベクター内に導入し、得られたＴ－ＤＮＡベクターで形質転換したアグロバクテリウムを植物体に感染させることで目的タンパク質又は目的ペプチドを発現する植物体を得ることができる。
植物体としては特に制限されないが、例えば、ナス科（例えば、タバコ、ナス、トマト、ピーマン、トウガラシ）、バラ科（例えば、バラ、イチゴ）、アブラナ科（例えば、シロイヌナズナ、アブラナ、ハクサイ、キャベツ、ダイコン、ナタネ）、キク科（例えば、キク、シュンギク、レタス）、アカザ科（例えば、ホウレンソウ、テンサイ）、イネ科（例えば、コムギ、イネ、オオムギ、トウモロコシ）及びマメ科（例えば、ダイズ、アズキ、インゲン、ソラマメ）等に属する植物が挙げられる。例えば、植物体は、ナス科又アブラナ科の植物であってよく、タバコ属又はシロイヌナズナ属の植物であってよく、ニコチアナ・ベンサミアーナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎ））、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）又はシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）であってもよい。
目的タンパク質又は目的ペプチドをコードするポリヌクレオチドを有する細菌又はウイルスを植物体に感染させる方法は、公知の方法により行うことが出来る。細菌がアグロバクテリウムである場合は、例えば、インフィルトレーション（例えば、バキュームインフィルトレーション）により感染させることができる。ウイルスである場合には、例えば、機械的接種により感染させることができる。植物体全体を感染させてもよいし、植物体の一部分（例えば、葉）のみを感染させてもよい。
例えば、目的タンパク質又は目的ペプチドをコードするポリヌクレオチドを有するアグロバクテリウムを含む培養液を緩衝液で希釈した液をインフィルトレーションバッファーとし、バキュームインフィルトレーションにより植物体にインフィルトレーションバッファーを浸潤させることにより感染することができる。
植物体を感染させるタイミングは、植物体の種類等によって適宜設定できるが、植物体がタバコ属植物である場合には、例えば、４週齢～７週齢、５週齢～６週齢、又は５週齢の植物体に感染させてもよい。
暗期及び明期を交互に繰り返すサイクル下での栽培における１サイクルは、例えば、１２時間、１２時間～４８時間の間の時間、１６時間～４０時間の間の時間、２０時間～３６時間の間の時間、２４時間～３０時間の間の時間、又は２４時間に設定されてもよい。
全体の栽培期間は、播種後３５日～５６日、４２日～４９日、又は４２日であってよく、感染後の栽培期間は、感染後４日～１４日、６日～９日、又は７日であってよい。
植物体の栽培環境は、植物体の種類、目的タンパク質又は目的ペプチドの種類、使用する細菌又はウイルスの種類等により決定することができる。植物体は培土に植えられていても、水耕栽培されていてもよい。ただし、栽培環境は、栽培時の明るさ（照度）及び温度を制御できる環境であることが好ましく、明るさ（照度）、温度及び湿度を制御できる環境であることがより好ましい。そのような栽培環境としては、例えば、人工照明を備えた植物育成キャビネットが挙げられ、具体例としては、グロースチャンバー（ＦＣ―７００Ｚ３、エスペックミック株式会社）が挙げられる。
栽培における温度は、植物の生育や目的タンパク質の製造が可能な限り特に限定されず、全期間を通じて常に一定でもよく、植物の成長に応じて、あるいは昼夜（明期・暗期）、感染前後等で変更してもよい。栽培における温度は、例えば、１０℃～３５℃、１５℃～４０℃、１３℃～２８℃、又は１５℃～２５℃であってよい。
栽培における相対湿度は、植物の生育や目的タンパク質の製造が可能な限り特に限定されず、全期間を通じて常に一定でもいいし、植物の成長に応じて、あるいは昼夜（明期・暗期）、感染前後等で変更してもよい。例えば、４５%～９０％、６０％～８５％であってよい。
栽培におけるＣＯ２濃度は、植物の生育や目的タンパク質の製造が可能な限り特に限定されず、全期間を通じて常に一定でもいいし、植物の成長に応じて、あるいは昼夜（明期・暗期）、感染前後等で変更してもよい。例えば、３００ｐｐｍ～１０００ｐｐｍ、４００ｐｐｍ～７００ｐｐｍ、であってよい。
栽培における光合成有効量子束密度は、植物の生育や目的タンパク質の製造が可能な限り特に限定されず、全期間を通じて常に一定でもいいし、植物の成長に応じて、あるいは感染前後等で変更してもよい。例えば、３０μｍｏｌ・ｍ－２・ｓ－１以上、３０μｍｏｌ・ｍ－２・ｓ－１～１０００μｍｏｌ・ｍ－２・ｓ－１、又は２００μｍｏｌ・ｍ－２・ｓ－１～５００μｍｏｌ・ｍ－２・ｓ－１であってよい。
本実施形態における方法は、目的タンパク質又は目的ペプチドの発現能に基づき、最適葉温を決定する工程を含む。例えば、目的タンパク質又は目的ペプチドの発現能が最も高くなる葉温、及び／又は目的タンパク質又は目的ペプチドの発現能が最も安定する葉温を最適葉温として決定することができる。最適葉温を決定することで、目的タンパク質又は目的ペプチドを効率よく発現させることができる。目的タンパク質又は目的ペプチドの発現能は、例えば、目的タンパク質又は目的ペプチドの発現量、目的タンパク質又は目的ペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現量、及び目的タンパク質又は目的ペプチドの翻訳効率等を指標として判断することができる。例えば、目的タンパク質又は目的ペプチドを発現させる植物体と同じ種類の複数の植物体に、目的タンパク質又は目的ペプチドをコードするポリヌクレオチドを有する細菌又はウイルスを感染させ、異なる葉温になる温度下でそれぞれ栽培した後、目的タンパク質又は目的ペプチドの発現量又は目的タンパク質又は目的ペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現量を測定し、最も高い発現量を示した際の葉温を最適葉温とすることができる。
目的タンパク質又は目的ペプチドの発現量の測定は、例えば、以下のように行うことができる。
（１）感染後の植物体又は植物体の部分（例えば、葉）を収穫する。
（２）収穫物を磨砕し、抽出緩衝液を添加して遠心した後、上清を採取し抽出液とする。
（３）上清を用いて、イムノアッセイにより目的タンパク質又は目的ペプチドの発現量を測定する。
イムノアッセイとしては、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロッティング等が挙げられる。
ここで、収穫した感染後の植物体又は植物体の部分（収穫物）を乾熱した後、以下の式から乾燥重率（％）を算出することができる。
乾物重率（％）＝乾燥後の収穫物の重量／乾燥前の収穫物の重量×１００
さらに、目的タンパク質又は目的ペプチドの発現量を測定した後、以下の式から乾燥後の収穫物あたりのタンパク質量（ｍｇ／ｇ 乾燥収穫物）を算出することができる。
乾燥後の収穫物あたりのタンパク質量（ｍｇ／ｇ 乾燥収穫物）＝抽出液中のタンパク質濃度（測定値）×抽出液量（磨砕物重量の２倍と定義）／磨砕物重量×乾物重率（％）／１００
（１）感染後の植物体又は植物体の部分（例えば、葉）を収穫する。
（２）収穫物を磨砕し、抽出緩衝液を添加して遠心した後、上清を採取し抽出液とする。
（３）上清を用いて、イムノアッセイにより目的タンパク質又は目的ペプチドの発現量を測定する。
イムノアッセイとしては、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロッティング等が挙げられる。
ここで、収穫した感染後の植物体又は植物体の部分（収穫物）を乾熱した後、以下の式から乾燥重率（％）を算出することができる。
乾物重率（％）＝乾燥後の収穫物の重量／乾燥前の収穫物の重量×１００
さらに、目的タンパク質又は目的ペプチドの発現量を測定した後、以下の式から乾燥後の収穫物あたりのタンパク質量（ｍｇ／ｇ 乾燥収穫物）を算出することができる。
乾燥後の収穫物あたりのタンパク質量（ｍｇ／ｇ 乾燥収穫物）＝抽出液中のタンパク質濃度（測定値）×抽出液量（磨砕物重量の２倍と定義）／磨砕物重量×乾物重率（％）／１００
目的タンパク質又は目的ペプチドの発現量は、例えば、乾燥後の収穫物あたりのタンパク質量（ｍｇ／ｇ 乾燥収穫物）として算出してよく、乾燥後のＤＬ（乾燥葉）あたりのタンパク質量（ｍｇ／ｇ ＤＬ）として算出してもよい。目的タンパク質又は目的ペプチドの発現量は、使用する植物体、細菌又はウイルス等により異なるが、目的タンパク質又は目的ペプチドをコードするポリヌクレオチドを挿入したＴＭＶ又はＰＶＸゲノムのｃＤＮＡをＴ－ＤＮＡベクター内に導入し、得られたＴ－ＤＮＡベクターで形質転換したアグロバクテリウムをタバコ属植物に感染させることで目的タンパク質又は目的ペプチドを発現させる場合には、乾燥後のＤＬ（乾燥葉）あたりのタンパク質量（ｍｇ／ｇ ＤＬ）が、例えば、８（ｍｇ／ｇ ＤＬ）以上、１０（ｍｇ／ｇ ＤＬ）以上、１０（ｍｇ／ｇ ＤＬ）～２０（ｍｇ／ｇ ＤＬ）、又は１０（ｍｇ／ｇ ＤＬ）～１５（ｍｇ／ｇ ＤＬ）であってもよい。
葉温は、放射温度計及びサーモグラフィ装置のような非接触式の温度測定手段、熱電対温度計等の接触式温度測定手段により測定することができる。熱電対温度計としては、例えば、温度ロガーが挙げられ、具体例としては、温度ロガー（おんどとりＴＲ－５２i、株式会社ティアンドデイ）が挙げられる。植物体がタバコ属植物である場合には、例えば、温度ロガーのプローブをタバコ属植物の葉の表面から刺し、裏面でプローブと葉を接触させることで測定することができる。複数の葉及び／又は複数の植物において葉温を測定する場合には、葉温の合計値を測定した葉の枚数及び／又は植物の個体数で除した平均値を葉温（平均葉温）として用いることができる。
最適葉温は、用いる植物体及び目的タンパク質又は目的ペプチドの種類等で異なるが、例えば、１５℃～４０℃間の温度、１８℃～３７℃間の温度、２０℃～３０℃間の温度、２２℃～２７℃間の温度、２２℃～２５℃間の温度、２３℃～２５℃間の温度又は２３℃であってもよい。植物体がタバコ属植物である場合には、例えば、２２℃～２７℃間の温度、２２℃～２５℃間の温度、２３℃～２５℃間の温度又は２３℃であってもよい。
本実施形態における方法において、目的タンパク質又は目的ペプチドをコードするポリヌクレオチドを有する細菌又はウイルスを植物体に感染させた後の明暗期の葉温並びに明暗期の時間は、下記の式（条件）を満たすように設定される。
暗期の葉温（℃）×１サイクルあたりの暗期の時間（時間）＋明期の葉温（℃）×１サイクルあたりの明期の時間（時間）＝最適葉温（℃）×１サイクルの総時間±２４
暗期の葉温（℃）×１サイクルあたりの暗期の時間（時間）＋明期の葉温（℃）×１サイクルあたりの明期の時間（時間）＝最適葉温（℃）×１サイクルの総時間±２４
例えば、１サイクルが２４時間である場合には、目的タンパク質又は目的ペプチドをコードするポリヌクレオチドを有する細菌又はウイルスを植物体に感染させた後の明暗期の葉温並びに明暗期の時間は、下記の式を満たすように設定される。
暗期の葉温（℃）×暗期の時間（時間）＋明期の葉温（℃）×明期の時間（時間）＝最適葉温（℃）×２４（時間）±２４
暗期の葉温（℃）×暗期の時間（時間）＋明期の葉温（℃）×明期の時間（時間）＝最適葉温（℃）×２４（時間）±２４
上述した式における「±２４」は、例えば、「±２０」、「±１７」、「±１５」、「±１０」、「±８」又は「±５」とすることもできる。
上述した条件を満たすように設定した明暗期の葉温になるように、感染後の植物体を栽培する温度を決定することができる。連続する暗期の間及び連続する明期の間、植物の栽培温度は一定若しくは変更してもよい。
上述した条件を満たす限り、明暗期の葉温及び明暗期の時間を調節して、例えば、明期における葉温を暗期における葉温よりも高く設定することができる。明期における葉温を暗期における葉温よりも高く設定することで、明期の栽培時の空調電力コスト削減が望める。
暗期の葉温は、例えば、１０℃～３５℃間の温度、１３℃～２８℃間の温度、又は１５℃～２５℃間の温度であってよい。明期の葉温は、例えば、１０℃～３５℃間の温度、１３℃～２８℃間の温度、又は１５℃～２５℃間の温度であってよい。例えば、暗期の葉温が１６℃～２７℃間の温度であり、明期の葉温が１６℃～２７℃間の温度であってよく、暗期の葉温が１６℃～２７℃間の温度であり、明期の葉温が２０℃～２７℃間の温度であってもよく、暗期の葉温が１６℃～２６℃間の温度であり、明期の葉温が２２℃～２７℃間の温度であってもよい。本発明の効果を顕著に奏する観点から、暗期の葉温と明期の葉温は異なる温度に設定されることが好ましい。
１サイクル（暗期と明期の合計時間）は、例えば、１２時間～４８時間の間の時間、１６時間～４０時間の間の時間、２０時間～３６時間の間の時間又は２４時間に設定されてもよい。例えば、１サイクルの内訳として、暗期が３～２１時間の間の時間に設定され、明期が３～２１時間の間の時間に設定され、暗期と明期の合計時間が２０時間～２６時間の間の時間に設定されてもよい。また、例えば、２４時間サイクルの内訳として、暗期が３～２１時間の間の時間に設定され、明期が３～２１時間の間の時間に設定され、暗期と明期の合計時間が２４時間であってもよい。
本発明は、一実施形態として、上述した方法により、栽培するための条件を決定すること、決定した栽培条件で目的タンパク質又は目的ペプチドを発現する植物体を栽培すること、及び栽培した植物体から目的タンパク質又は目的ペプチドを抽出することを含む、目的タンパク質又は目的ペプチドの製造方法も提供する。
栽培した植物体から目的タンパク質又は目的ペプチドを抽出することは、例えば、感染後３日後～２１日後、５日後～１４日後、又は７日後～１０日後の植物体から目的タンパク質又は目的ペプチドを抽出することであってもよい。また、抽出した目的タンパク質又は目的ペプチドを精製することをさらに含んでもよい。植物体の栽培、目的タンパク質又は目的ペプチドの抽出及び目的タンパク質又は目的ペプチドの精製は、公知の方法により実施することができる。
本実施形態に係る方法における具体的な態様等は、上述した具体的な態様等を制限なく適用できる。
本発明は、一実施形態として、目的タンパク質又は目的ペプチドを発現する植物体を、複数の温度帯を含む２４時間サイクル下で栽培するための条件を決定する方法であって、
目的タンパク質又は目的ペプチドの発現能に基づき、最適葉温を決定する工程と、
目的タンパク質又は目的ペプチドをコードするポリヌクレオチドを有する細菌又はウイルスを植物体に感染させた後の、一定の間隔で測定した葉温の積算値が下記の関係を満たすように、葉温及び測定回数を設定する工程を含む、方法。
（Ｔ－１）×（Ｃ１＋・・・＋Ｃｎ）≦（Ｔ１×Ｃ１）＋・・・＋（Ｔｎ×Ｃｎ）≦（Ｔ＋１）×（Ｃ１＋・・・＋Ｃｎ）
ｎ×測定間隔（時間）＝２４（時間）
Ｃ１＋・・・＋Ｃｎ＝２４（時間）
ここで、Ｔは最適葉温（℃）であり、Ｔ１～Ｔｎは葉温（℃）であり、ｎは測定回数（回）であり、ｎは２以上１０以下の整数である、も提供する。
目的タンパク質又は目的ペプチドの発現能に基づき、最適葉温を決定する工程と、
目的タンパク質又は目的ペプチドをコードするポリヌクレオチドを有する細菌又はウイルスを植物体に感染させた後の、一定の間隔で測定した葉温の積算値が下記の関係を満たすように、葉温及び測定回数を設定する工程を含む、方法。
（Ｔ－１）×（Ｃ１＋・・・＋Ｃｎ）≦（Ｔ１×Ｃ１）＋・・・＋（Ｔｎ×Ｃｎ）≦（Ｔ＋１）×（Ｃ１＋・・・＋Ｃｎ）
ｎ×測定間隔（時間）＝２４（時間）
Ｃ１＋・・・＋Ｃｎ＝２４（時間）
ここで、Ｔは最適葉温（℃）であり、Ｔ１～Ｔｎは葉温（℃）であり、ｎは測定回数（回）であり、ｎは２以上１０以下の整数である、も提供する。
また、本発明は、一実施形態として、目的タンパク質又は目的ペプチドを発現する植物体を、複数の温度帯を含む一定時間（Ｃ（時間））のサイクル下で栽培するための条件を決定する方法であって、
目的タンパク質又は目的ペプチドの発現能に基づき、最適葉温を決定する工程と、
目的タンパク質又は目的ペプチドをコードするポリヌクレオチドを有する細菌又はウイルスを植物体に感染させた後の、一定の間隔で測定した葉温の積算値が下記の関係を満たすように、葉温及び測定回数を設定する工程とを含む、方法。
（Ｔ－１）×（Ｃ１＋・・・＋Ｃｎ）≦（Ｔ１×Ｃ１）＋・・・＋（Ｔｎ×Ｃｎ）≦（Ｔ＋１）×（Ｃ１＋・・・＋Ｃｎ）
ｎ×測定間隔（時間）＝Ｃ（時間）
Ｃ１＋・・・＋Ｃｎ＝Ｃ（時間）
ここで、Ｔは最適葉温（℃）であり、Ｔ１～Ｔｎは葉温（℃）であり、ｎは測定回数（回）であり、ｎは２以上１０以下の整数である、も提供する。
目的タンパク質又は目的ペプチドの発現能に基づき、最適葉温を決定する工程と、
目的タンパク質又は目的ペプチドをコードするポリヌクレオチドを有する細菌又はウイルスを植物体に感染させた後の、一定の間隔で測定した葉温の積算値が下記の関係を満たすように、葉温及び測定回数を設定する工程とを含む、方法。
（Ｔ－１）×（Ｃ１＋・・・＋Ｃｎ）≦（Ｔ１×Ｃ１）＋・・・＋（Ｔｎ×Ｃｎ）≦（Ｔ＋１）×（Ｃ１＋・・・＋Ｃｎ）
ｎ×測定間隔（時間）＝Ｃ（時間）
Ｃ１＋・・・＋Ｃｎ＝Ｃ（時間）
ここで、Ｔは最適葉温（℃）であり、Ｔ１～Ｔｎは葉温（℃）であり、ｎは測定回数（回）であり、ｎは２以上１０以下の整数である、も提供する。
目的タンパク質又は目的ペプチドを発現する植物体、及び植物体の目的タンパク質又は目的ペプチドをコードするポリヌクレオチドを有する細菌又はウイルスの感染等については上述したとおりである。
本実施形態に係る方法は、複数の温度帯を含む一定時間（Ｃ（時間））サイクル下で栽培するための条件を決定する方法である。
複数の温度帯は、２以上の温度帯を意味し、例えば、１サイクルが、２～５の温度帯、２～４の温度帯、２～３の温度帯、３又は２の温度帯を含んでいてもよい。
栽培する温度は、植物の生育や目的タンパク質の製造が可能な限り特に限定されず、全期間を通じて常に一定でもいいし、植物の成長に応じて、あるいは昼夜（明期・暗期）、感染前後等で変更してもよい。例えば、１０℃～３５℃、１３℃～２８℃、又は１５℃～２５℃であってよい。１サイクルが葉温の３の温度帯（Ｔ１～Ｔ３）を含む場合には、例えば、Ｔ１は１０℃～３５℃間の温度の温度帯、Ｔ２は１０℃～３５℃間の温度の温度帯、Ｔ３は１０℃～３５℃間の温度の温度帯を含んでいてもよい。
栽培する相対湿度については、上述したとおりである。
一定時間（Ｃ（時間））は、例えば、１２時間～４８時間の間の時間、１６時間～４０時間の間の時間、２０時間～３６時間の間の時間又は２４時間であってもよい。
感染後の栽培において、栽培期間を通して栽培する照度は一定であっても、複数の異なる照度であってもよい。複数の異なる照度である場合には、複数の温度帯の各温度帯にあわせて設定されていてもよく、温度帯の切り替わりとは関係なく設定されていてもよい。
感染後の栽培における栽培する光合成有効量子束密度は、例えば、０．１μｍｏｌ・ｍ－２・ｓ－１以上、０．１μｍｏｌ・ｍ－２・ｓ－１～１０００μｍｏｌ・ｍ－２・ｓ－１、又は２００μｍｏｌ・ｍ－２・ｓ－１～５００μｍｏｌ・ｍ－２・ｓ－１であってよい。複数の異なる光合成有効量子束密度である場合には、例えば、上述したように、暗期及び明期のように分かれていてもよい。例えば、１サイクルが含む複数の温度帯のうち、より高い温度帯により高い照度を設定してもよい。
目的タンパク質又は目的ペプチドをコードするポリヌクレオチドを有する細菌又はウイルスを植物体に感染させた後の、一定の間隔で測定した葉温の積算値が下記の関係を満たすように、葉温及び測定回数を設定する。
（Ｔ－１）×（Ｃ１＋・・・＋Ｃｎ）≦（Ｔ１×Ｃ１）＋・・・＋（Ｔｎ×Ｃｎ）≦（Ｔ＋１）×（Ｃ１＋・・・＋Ｃｎ）
ｎ×測定間隔（時間）＝Ｃ（時間）
Ｃ１＋・・・＋Ｃｎ＝Ｃ（時間）
ここで、Ｔは最適葉温（℃）であり、Ｔ１～Ｔｎは葉温（℃）であり、ｎは測定回数（回）であり、ｎは２以上１０以下の整数である。
（Ｔ－１）×（Ｃ１＋・・・＋Ｃｎ）≦（Ｔ１×Ｃ１）＋・・・＋（Ｔｎ×Ｃｎ）≦（Ｔ＋１）×（Ｃ１＋・・・＋Ｃｎ）
ｎ×測定間隔（時間）＝Ｃ（時間）
Ｃ１＋・・・＋Ｃｎ＝Ｃ（時間）
ここで、Ｔは最適葉温（℃）であり、Ｔ１～Ｔｎは葉温（℃）であり、ｎは測定回数（回）であり、ｎは２以上１０以下の整数である。
目的タンパク質又は目的ペプチドを発現する植物体を、複数の温度帯を含む２４時間サイクル下で栽培する場合には、目的タンパク質又は目的ペプチドをコードするポリヌクレオチドを有する細菌又はウイルスを植物体に感染させた後の、一定の間隔で測定した葉温の積算値が下記の関係を満たすように、葉温及び測定回数を設定する。
（Ｔ－１）×（Ｃ１＋・・・＋Ｃｎ）≦（Ｔ１×Ｃ１）＋・・・＋（Ｔｎ×Ｃｎ）≦（Ｔ＋１）×（Ｃ１＋・・・＋Ｃｎ）
ｎ×測定間隔（時間）＝２４（時間）
Ｃ１＋・・・＋Ｃｎ＝２４（時間）
ここで、Ｔは最適葉温（℃）であり、Ｔ１～Ｔｎは葉温（℃）であり、ｎは測定回数（回）であり、ｎは２以上１０以下の整数である
（Ｔ－１）×（Ｃ１＋・・・＋Ｃｎ）≦（Ｔ１×Ｃ１）＋・・・＋（Ｔｎ×Ｃｎ）≦（Ｔ＋１）×（Ｃ１＋・・・＋Ｃｎ）
ｎ×測定間隔（時間）＝２４（時間）
Ｃ１＋・・・＋Ｃｎ＝２４（時間）
ここで、Ｔは最適葉温（℃）であり、Ｔ１～Ｔｎは葉温（℃）であり、ｎは測定回数（回）であり、ｎは２以上１０以下の整数である
最適葉温は、用いる植物体及び目的タンパク質又は目的ペプチドの種類等で異なるが、例えば、１８℃～３７℃間の温度、２０℃～３０℃間の温度、２２℃～２７℃間の温度、２２℃～２５℃間の温度、２３℃～２５℃間の温度又は２３℃であってもよい。植物体がタバコ属植物である場合には、例えば、２２℃～２７℃間の温度、２２℃～２５℃間の温度、２３℃～２５℃間の温度又は２３℃であってもよい。
目的タンパク質又は目的ペプチドの発現能に基づき、最適葉温を決定する工程については、上述したとおりである。
測定間隔は一定であり、例えば、１．２時間～２４時間の間の時間、２時間～１２時間の間の時間、又は４時間～８時間の間の時間に設定されてもよい。
Ｃ１～Ｃｎ（時間）は、葉温Ｔ１～Ｔｎ（℃）が維持される時間を示す。測定間隔は一定であるため、例えば、Ｃが２４（時間）で、測定回数ｎが３の場合には、Ｃ１、Ｃ２及びＣ３はそれぞれ８（時間）となる。
葉温の積算値とは、（Ｔ１×Ｃ１）＋・・・＋（Ｔｎ×Ｃｎ）を意味する。
葉温の測定については、上述したとおりである。
上述した式における測定回数ｎは、２以上、３以上、２～１０、２～８、２～６、２～５、２～４、又は２～３であってよく、２又は３であってもよい。
本実施形態に係る方法における具体的な態様等は、上述した具体的な態様等を制限なく適用できる。
本発明は、一実施形態として、上述した方法により、栽培するための条件を決定すること、決定した栽培条件で目的タンパク質又は目的ペプチドを発現する植物体を栽培すること、及び栽培した植物体から目的タンパク質又は目的ペプチドを抽出することを含む、目的タンパク質又は目的ペプチドの製造方法も提供する。
目的タンパク質又は目的ペプチドを製造する方法は、例えば、感染後４日～１４日、６日～９日、又は７日の植物体から目的タンパク質又は目的ペプチドを抽出する工程をさらに含んでもよい。また、抽出した目的タンパク質又は目的ペプチドを精製する工程をさらに含んでもよい。目的タンパク質又は目的ペプチドを抽出する工程及び目的タンパク質又は目的ペプチドを精製する工程は、公知の方法により実施することができる。
本実施形態に係る方法における具体的な態様等は、上述した具体的な態様等を制限なく適用できる。
１．植物バイオマスの調製
（１）播種
育苗ポット（ＴＳ－１０．５、株式会社 東海化成）にすり切りいっぱいになるよう培土を充填させ、ベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）種子を２～３粒播種した。その後、中苗用育苗箱（ＡＺ－０３２、安全興業株式会社）に前記育苗ポットを複数個並べ、３０分底面潅水し、農業用べたがけ資材（パオパオ９０、三菱ケミカルアグリドリーム株式会社）を被覆した。前記農業用べたがけ資材は５～７日目に取り外した。
（１）播種
育苗ポット（ＴＳ－１０．５、株式会社 東海化成）にすり切りいっぱいになるよう培土を充填させ、ベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）種子を２～３粒播種した。その後、中苗用育苗箱（ＡＺ－０３２、安全興業株式会社）に前記育苗ポットを複数個並べ、３０分底面潅水し、農業用べたがけ資材（パオパオ９０、三菱ケミカルアグリドリーム株式会社）を被覆した。前記農業用べたがけ資材は５～７日目に取り外した。
（２）生育
播種後の植物を冷房下室温２２℃、１６時間昼／８時間夜の光サイクルにて１４日間生育させた。生育させた植物が発芽した後、１ポットあたり１株になるよう間引きした。間引き後、２週齢時に、前記中苗用育苗箱を栽培箱に設置した。この際、栽培棚１段あたり３２ポットとなるよう配置した。環境条件及び溶媒条件は以下の通り調整した。
播種後の植物を冷房下室温２２℃、１６時間昼／８時間夜の光サイクルにて１４日間生育させた。生育させた植物が発芽した後、１ポットあたり１株になるよう間引きした。間引き後、２週齢時に、前記中苗用育苗箱を栽培箱に設置した。この際、栽培棚１段あたり３２ポットとなるよう配置した。環境条件及び溶媒条件は以下の通り調整した。
＜環境条件＞
－温度：２２℃
－相対湿度：３０～８０％
－ＣＯ２濃度：４００～７００ｐｐｍ
－光源：高出力４９５０ｌｍ、ＨＦ蛍光ランプ、ＦＨＦ３２ＥＸ－Ｎ－Ｈ（東芝ライテック株式会社）
－温度：２２℃
－相対湿度：３０～８０％
－ＣＯ２濃度：４００～７００ｐｐｍ
－光源：高出力４９５０ｌｍ、ＨＦ蛍光ランプ、ＦＨＦ３２ＥＸ－Ｎ－Ｈ（東芝ライテック株式会社）
＜養液条件＞
栽培棚に供給される養液は、肥料Ａ液（ＯＡＴハウス１号（ＯＡＴアグリオ株式会社）１５０ｇ／Ｌ）、肥料Ｂ液（ＯＡＴハウス２号（ＯＡＴアグリオ株式会社）１００ｇ／Ｌ）を混合比１：１、電気伝導度（ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ；ＥＣ）：１．８ｍＳ／ｃｍ、ｐＨ（６．０）となるように混合したものを使用した。
栽培棚に供給される養液は、肥料Ａ液（ＯＡＴハウス１号（ＯＡＴアグリオ株式会社）１５０ｇ／Ｌ）、肥料Ｂ液（ＯＡＴハウス２号（ＯＡＴアグリオ株式会社）１００ｇ／Ｌ）を混合比１：１、電気伝導度（ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ；ＥＣ）：１．８ｍＳ／ｃｍ、ｐＨ（６．０）となるように混合したものを使用した。
２．ウイルスの浸潤（インフィルトレーション）
（１）アグロバクテリウム形質転換体の作製
イムノグロブリンＧをコードするポリヌクレオチドを挿入したＴＭＶ及びＰＶＸゲノムのｃＤＮＡをＴ－ＤＮＡベクター内に導入し、得られたＴ－ＤＮＡベクターで形質転換したアグロバクテリウムを作製した。
（１）アグロバクテリウム形質転換体の作製
イムノグロブリンＧをコードするポリヌクレオチドを挿入したＴＭＶ及びＰＶＸゲノムのｃＤＮＡをＴ－ＤＮＡベクター内に導入し、得られたＴ－ＤＮＡベクターで形質転換したアグロバクテリウムを作製した。
（２）アグロバクテリウムの培養
インフィルトレーションを行う前日にＬＢ液体培地を５ｍＬずつ試験管に入れ、２０ｍｇ／ｍＬリファンピシン溶液を終濃度５０μｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬカナマイシン溶液を終濃度２５μｇ／ｍＬになるように添加した。アグロバクテリウム形質転換体のグリセロールストックを１００μＬ添加し、２８℃で約２４時間振とう培養（２３０ｒｐｍ）して培養液を得た。
インフィルトレーションを行う前日にＬＢ液体培地を５ｍＬずつ試験管に入れ、２０ｍｇ／ｍＬリファンピシン溶液を終濃度５０μｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬカナマイシン溶液を終濃度２５μｇ／ｍＬになるように添加した。アグロバクテリウム形質転換体のグリセロールストックを１００μＬ添加し、２８℃で約２４時間振とう培養（２３０ｒｐｍ）して培養液を得た。
（３）インフィルトレーションバッファー調整
上記（２）の培養液を採取しリン酸緩衝生理食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｔｓ；ＰＢＳ）（１０×ＰＢＳ Ｌｉｑｕｉｄｅ Ｃｏｎｃｅｎｔｒｅ， ＯｍｎｉＰｕｒ （登録商標）を精製水で１０倍希釈し冷蔵保存したもの）で１０倍希釈した。簡易光学密度、光学濃度（Ｏｐｔｉｃａｌ Ｄｅｎｓｉｔｙ；ＯＤ）モニター（ｍｉｎｉ ｐｈｏｔｏ ５１８Ｒ、タイテック株式会社）で、希釈液に対して、６６０ｍｍの吸光度下で測定した光密度の値であるＯＤ値を測定し、ＯＤ値が２．０以上であること確認した。広口バケツに精製水５．３Ｌ、０．５Ｍ ２－モルホリノエタンスルホン酸（２－（Ｎ－ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ；ＭＥＳ）（ｐＨ５．４）１３０ｍＬ、１Ｍ ＭｇＳＯ４ ６５ｍＬを加え、真空デシケーター（３００Ｇ、アズワン株式会社）に広口バケツを設置し、攪拌した。終濃度が１０ｍＭ ＭＥＳ、１０ｍＭ ＭｇＳＯ４、ｐＨ５．４、ＯＤ６６０が０．００２となるように調整したものをインフィルトレーションバッファーとして使用した。
上記（２）の培養液を採取しリン酸緩衝生理食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｔｓ；ＰＢＳ）（１０×ＰＢＳ Ｌｉｑｕｉｄｅ Ｃｏｎｃｅｎｔｒｅ， ＯｍｎｉＰｕｒ （登録商標）を精製水で１０倍希釈し冷蔵保存したもの）で１０倍希釈した。簡易光学密度、光学濃度（Ｏｐｔｉｃａｌ Ｄｅｎｓｉｔｙ；ＯＤ）モニター（ｍｉｎｉ ｐｈｏｔｏ ５１８Ｒ、タイテック株式会社）で、希釈液に対して、６６０ｍｍの吸光度下で測定した光密度の値であるＯＤ値を測定し、ＯＤ値が２．０以上であること確認した。広口バケツに精製水５．３Ｌ、０．５Ｍ ２－モルホリノエタンスルホン酸（２－（Ｎ－ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ；ＭＥＳ）（ｐＨ５．４）１３０ｍＬ、１Ｍ ＭｇＳＯ４ ６５ｍＬを加え、真空デシケーター（３００Ｇ、アズワン株式会社）に広口バケツを設置し、攪拌した。終濃度が１０ｍＭ ＭＥＳ、１０ｍＭ ＭｇＳＯ４、ｐＨ５．４、ＯＤ６６０が０．００２となるように調整したものをインフィルトレーションバッファーとして使用した。
（４）ウイルスの浸潤（インフィルトレーション）
５週齢となった植物に対して、以下に示す操作でインフィルトレーションを行った。植物の根部を上方向にし、植物の地上部を上記（３）のインフィルトレーションバッファーに浸けた。培土部分がインフィルトレーションバッファーに浸からないように棒をバケツの口に渡してストッパーとした。真空ポンプと真空デシケーターをホースで接続し、排気コックを全開にした状態で真空ポンプを稼動させ、－０．０９２ＭＰａＧまで吸引した。排気コックを閉じ、真空デシケーターから真空ポンプを外し、排気コックを一気に開放した。復圧した後、植物をインフィルトレーションバッファーから出し、葉の表面の水気をやさしくふき取った。グロースチャンバー（ＦＣ－７００Ｚ３、エスペックミック株式会社）のＬＥＤ出力を調節し、チャンバー内の光合成有効量子束密度を４００μｍｏｌ・ｍ－２・ｓ－１に調節した。このチャンバーに植物を配置し、明期１６時間、暗期８時間を交互に繰り返す光周期とした。植物の葉に温度ロガー（おんどとりＴＲ－５２i、株式会社ティアンドデイ）のプローブを表面から刺し、裏面でプローブと葉を接触させることで葉温を測定した。任意の葉温となるようグロースチャンバーの室温を設定し、植物を栽培した。各植物を感染後７日間栽培した後、適宜各測定を行った。なお、感染後の栽培における相対湿度、ＣＯ２濃度及び光合成有効量子束密度は感染前と同条件で行った。
５週齢となった植物に対して、以下に示す操作でインフィルトレーションを行った。植物の根部を上方向にし、植物の地上部を上記（３）のインフィルトレーションバッファーに浸けた。培土部分がインフィルトレーションバッファーに浸からないように棒をバケツの口に渡してストッパーとした。真空ポンプと真空デシケーターをホースで接続し、排気コックを全開にした状態で真空ポンプを稼動させ、－０．０９２ＭＰａＧまで吸引した。排気コックを閉じ、真空デシケーターから真空ポンプを外し、排気コックを一気に開放した。復圧した後、植物をインフィルトレーションバッファーから出し、葉の表面の水気をやさしくふき取った。グロースチャンバー（ＦＣ－７００Ｚ３、エスペックミック株式会社）のＬＥＤ出力を調節し、チャンバー内の光合成有効量子束密度を４００μｍｏｌ・ｍ－２・ｓ－１に調節した。このチャンバーに植物を配置し、明期１６時間、暗期８時間を交互に繰り返す光周期とした。植物の葉に温度ロガー（おんどとりＴＲ－５２i、株式会社ティアンドデイ）のプローブを表面から刺し、裏面でプローブと葉を接触させることで葉温を測定した。任意の葉温となるようグロースチャンバーの室温を設定し、植物を栽培した。各植物を感染後７日間栽培した後、適宜各測定を行った。なお、感染後の栽培における相対湿度、ＣＯ２濃度及び光合成有効量子束密度は感染前と同条件で行った。
３．イムノグロブリンＧの発現量の測定
（１）生育状態の計測
（ｉ）葉重量の測定
感染後の植物に対して、収穫した葉を－８０℃で保管したものを感染葉とした。全ての植物の茎を培土面、又は定植板際でカットし、株数をカウント後、植物の重量をデジタルはかりで測定した（総地上部重量（ｇ））。植物の本葉をカットし全ての葉の重量をデジタルはかりで測定した（本葉重量（ｇ））。
（１）生育状態の計測
（ｉ）葉重量の測定
感染後の植物に対して、収穫した葉を－８０℃で保管したものを感染葉とした。全ての植物の茎を培土面、又は定植板際でカットし、株数をカウント後、植物の重量をデジタルはかりで測定した（総地上部重量（ｇ））。植物の本葉をカットし全ての葉の重量をデジタルはかりで測定した（本葉重量（ｇ））。
（ｉｉ）乾物重率の測定
カットした滅菌ロールの重量を電子天秤で測定した（重量１）。乾燥重量測定用の感染葉を、重量測定した滅菌ロールに詰め、シーリングした。電子天秤で重量（重量２）を測定後、１２１℃，２０分でオートクレーブにかけた。オートクレーブ後、１００℃に設定した乾熱滅菌器（ＳＩ６０１、ヤマト科学株式会社）に入れた。次日に、９５℃に設定した乾熱滅菌器（ＥＹＥＬＡ）に入れた。次日に、乾熱機より取出し、１０分ほど室温で静置した後、電子天秤で重量（重量３）を測定した。以下の式から乾物重率を算出した。
乾物重率（％）＝（重量３－重量１）／（重量２－重量１）×１００
カットした滅菌ロールの重量を電子天秤で測定した（重量１）。乾燥重量測定用の感染葉を、重量測定した滅菌ロールに詰め、シーリングした。電子天秤で重量（重量２）を測定後、１２１℃，２０分でオートクレーブにかけた。オートクレーブ後、１００℃に設定した乾熱滅菌器（ＳＩ６０１、ヤマト科学株式会社）に入れた。次日に、９５℃に設定した乾熱滅菌器（ＥＹＥＬＡ）に入れた。次日に、乾熱機より取出し、１０分ほど室温で静置した後、電子天秤で重量（重量３）を測定した。以下の式から乾物重率を算出した。
乾物重率（％）＝（重量３－重量１）／（重量２－重量１）×１００
（２）イムノグロブリンＧの発現量の定量分析
（ｉ）粗抽出液の調製
乳鉢及び乳棒をあらかじめ液体窒素で冷却し、－８０℃で保管している感染葉を入れ、紛体状になるまで感染葉を磨砕した。１．５ｍＬチューブの重量（重量４）を計りで測定した。薬さじを液体窒素で冷却し、磨砕物を１．５ｍＬチューブに適量入れ、重量（重量５）を測定した。磨砕物重量（重量５－重量４）の等倍重量の抽出バッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、４０ｍＭ アスコルビン酸ナトリウム）を添加し、冷蔵（約４℃）で３０分静置した後、卓上遠心機（株式会社トミー精工、Ｍｕｌｔｉ Ｓｐｉｎ）で５分間遠心した。１．５ｍＬチューブに上清液１００μＬを入れて、－３０℃で保存した（抽出液）。
（ｉ）粗抽出液の調製
乳鉢及び乳棒をあらかじめ液体窒素で冷却し、－８０℃で保管している感染葉を入れ、紛体状になるまで感染葉を磨砕した。１．５ｍＬチューブの重量（重量４）を計りで測定した。薬さじを液体窒素で冷却し、磨砕物を１．５ｍＬチューブに適量入れ、重量（重量５）を測定した。磨砕物重量（重量５－重量４）の等倍重量の抽出バッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、４０ｍＭ アスコルビン酸ナトリウム）を添加し、冷蔵（約４℃）で３０分静置した後、卓上遠心機（株式会社トミー精工、Ｍｕｌｔｉ Ｓｐｉｎ）で５分間遠心した。１．５ｍＬチューブに上清液１００μＬを入れて、－３０℃で保存した（抽出液）。
（ｉｉ）イムノグロブリンＧ量の測定
イムノグロブリンＧ量の測定にＡｌｐｈａＬＩＳＡイムノアッセイキットを用いた。抽出液はキット付属のバッファーで２０００倍に希釈し、キットの説明書に従い測定を行った。以下の式から、ＤＬ（乾燥葉）あたりのイムノグロブリンＧ量（ｍｇ／ｇ ＤＬ）を算出した。
ＤＬ（乾燥葉）あたりのイムノグロブリンＧ量（ｍｇ／ｇ ＤＬ）＝抽出液中のタンパク質濃度（ＡｌｐｈａＬＩＳＡ測定値）×抽出液量（磨砕物重量の２倍と定義）／磨砕物重量（重量５－重量４）×乾物重率（％）／１００
イムノグロブリンＧ量の測定にＡｌｐｈａＬＩＳＡイムノアッセイキットを用いた。抽出液はキット付属のバッファーで２０００倍に希釈し、キットの説明書に従い測定を行った。以下の式から、ＤＬ（乾燥葉）あたりのイムノグロブリンＧ量（ｍｇ／ｇ ＤＬ）を算出した。
ＤＬ（乾燥葉）あたりのイムノグロブリンＧ量（ｍｇ／ｇ ＤＬ）＝抽出液中のタンパク質濃度（ＡｌｐｈａＬＩＳＡ測定値）×抽出液量（磨砕物重量の２倍と定義）／磨砕物重量（重量５－重量４）×乾物重率（％）／１００
下記表１の条件で感染後の栽培を行った。
イムノグロブリンＧの発現量を比較した結果を図１に示す。図１の結果から、葉温１９℃（試験例１）及び葉温２８℃（試験例３）と比較して、葉温２３℃（試験例２）のＤＬ（乾燥葉）あたりのイムノグロブリンＧ量が高いことがわかる。この結果から、最適葉温を２３℃と設定した。設定した最適温度から下記式に当てはまるように暗期の葉温、明期の葉温を設定し、表２の条件で栽培した（実施例１、２、３）。
暗期の葉温（℃）×暗期の時間（時間）＋明期の葉温（℃）×明期の時間（時間）＝最適葉温（℃）×２４（時間）±２４
暗期の葉温（℃）×暗期の時間（時間）＋明期の葉温（℃）×明期の時間（時間）＝最適葉温（℃）×２４（時間）±２４
また、１サイクルが１２時間である栽培条件において、設定した最適温度から下記式に当てはまるように暗期の葉温、明期の葉温を設定し、表２の条件で栽培した（実施例４）。
暗期の葉温（℃）×１サイクルあたりの暗期の時間（時間）＋明期の葉温（℃）×１サイクルあたりの明期の時間（時間）＝最適葉温（℃）×１サイクルの総時間±２４
暗期の葉温（℃）×１サイクルあたりの暗期の時間（時間）＋明期の葉温（℃）×１サイクルあたりの明期の時間（時間）＝最適葉温（℃）×１サイクルの総時間±２４
イムノグロブリンＧの発現量を比較した結果を図２に示す。図２に示したＤＬ（乾燥葉）あたりのイムノグロブリンＧ量からわかる通り、上記式に当てはまる実施例１、２、３及び４はそれぞれ高いイムノグロブリンＧ量を示しており、上記式に当てはまらない比較例１及び２は低いイムノグロブリンＧ量を示していることが分かる。この結果より、設定した式によって高いイムノグロブリンＧ発現量を示す栽培条件を設定することができることが示された。
Claims (24)
- 目的タンパク質又は目的ペプチドを発現する植物体を、暗期及び明期を交互に繰り返す２４時間サイクル下で栽培するための条件を決定する方法であって、
目的タンパク質又は目的ペプチドの発現能に基づき、最適葉温を決定する工程と、
目的タンパク質又は目的ペプチドをコードするポリヌクレオチドを有する細菌又はウイルスを植物体に感染させた後の明暗期の葉温並びに明暗期の時間を、
暗期の葉温（℃）×暗期の時間（時間）＋明期の葉温（℃）×明期の時間（時間）＝最適葉温（℃）×２４（時間）±２４を満たすように設定する工程とを含む、方法。 - 最適葉温を決定する工程が、目的タンパク質又は目的ペプチドの発現量に基づき、最適葉温を決定することを含む、請求項１に記載の方法。
- 明期における葉温を暗期における葉温よりも高く設定することを含む、請求項１又は２に記載の方法。
- ２４時間サイクルの内訳として、暗期が３～２１時間の間の時間に設定され、明期が３～２１時間の間の時間に設定され、暗期と明期の合計時間が２４時間である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
- 最適葉温が２２℃～２７℃間の温度である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
- 暗期の葉温が１６℃～２７℃間の温度であり、明期の葉温が１６℃～２７℃間の温度である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
- 植物体がタバコ属植物である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
- 目的タンパク質又は目的ペプチドが、抗体、酵素、ホルモン又は抗原である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項１～８のいずれか一項に記載の方法により、栽培するための条件を決定すること、決定した栽培条件で目的タンパク質又は目的ペプチドを発現する植物体を栽培すること、及び栽培した植物体から目的タンパク質又は目的ペプチドを抽出することを含む、目的タンパク質又は目的ペプチドの製造方法。
- 目的タンパク質又は目的ペプチドを発現する植物体を、暗期及び明期を交互に繰り返すサイクル下で栽培するための条件を決定する方法であって、
目的タンパク質又は目的ペプチドの発現能に基づき、最適葉温を決定する工程と、
目的タンパク質又は目的ペプチドをコードするポリヌクレオチドを有する細菌又はウイルスを植物体に感染させた後の明暗期の葉温並びに明暗期の時間を、
暗期の葉温（℃）×１サイクルあたりの暗期の時間（時間）＋明期の葉温（℃）×１サイクルあたりの明期の時間（時間）＝最適葉温（℃）×１サイクルの総時間±２４を満たすように、設定する工程とを含む、方法。 - 最適葉温を決定する工程が、目的タンパク質又は目的ペプチドの発現量に基づき、最適葉温を決定することを含む、請求項１０に記載の方法。
- 明期における葉温を暗期における葉温よりも高く設定することを含む、請求項１０又は１１に記載の方法。
- 暗期が３～２１時間の間の時間に設定され、明期が３～２１時間の間の時間に設定される、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の方法。
- 最適葉温が２２℃～２７℃間の温度である、請求項１０～１３のいずれか一項に記載の方法。
- 暗期の葉温が１６℃～２７℃間の温度であり、明期の葉温が１６℃～２７℃間の温度である、請求項１０～１４のいずれか一項に記載の方法。
- 植物体がタバコ属植物である、請求項１０～１５のいずれか一項に記載の方法。
- 目的タンパク質又は目的ペプチドが、抗体、酵素、ホルモン又は抗原である、請求項１０～１６のいずれか一項に記載の方法。
- １サイクルが２０時間～３６時間である、請求項１０～１７のいずれか一項に記載の方法。
- 目的タンパク質又は目的ペプチドを発現する植物体を、複数の温度帯を含む２４時間サイクル下で栽培するための条件を決定する方法であって、
目的タンパク質又は目的ペプチドの発現能に基づき、最適葉温を決定する工程と、
目的タンパク質又は目的ペプチドをコードするポリヌクレオチドを有する細菌又はウイルスを植物体に感染させた後の、一定の間隔で測定した葉温の積算値が下記の関係を満たすように、葉温及び測定回数を設定する工程を含む、方法。
（Ｔ－１）×（Ｃ１＋・・・＋Ｃｎ）≦（Ｔ１×Ｃ１）＋・・・＋（Ｔｎ×Ｃｎ）≦（Ｔ＋１）×（Ｃ１＋・・・＋Ｃｎ）
ｎ×測定間隔（時間）＝２４（時間）
Ｃ１＋・・・＋Ｃｎ＝２４（時間）
ここで、Ｔは最適葉温（℃）であり、Ｔ１～Ｔｎは葉温（℃）であり、ｎは測定回数（回）であり、ｎは２以上１０以下の整数である。 - ｎが２又は３である、請求項１９に記載の方法。
- 請求項１９又は２０に記載の方法により、栽培するための条件を決定すること、決定した栽培条件で目的タンパク質又は目的ペプチドを発現する植物体を栽培すること、及び栽培した植物体から目的タンパク質又は目的ペプチドを抽出することを含む、目的タンパク質又は目的ペプチドの製造方法。
- 目的タンパク質又は目的ペプチドを発現する植物体を、複数の温度帯を含む一定時間（Ｃ（時間））のサイクル下で栽培するための条件を決定する方法であって、
目的タンパク質又は目的ペプチドの発現能に基づき、最適葉温を決定する工程と、
目的タンパク質又は目的ペプチドをコードするポリヌクレオチドを有する細菌又はウイルスを植物体に感染させた後の、一定の間隔で測定した葉温の積算値が下記の関係を満たすように、葉温及び測定回数を設定する工程とを含む、方法。
（Ｔ－１）×（Ｃ１＋・・・＋Ｃｎ）≦（Ｔ１×Ｃ１）＋・・・＋（Ｔｎ×Ｃｎ）≦（Ｔ＋１）×（Ｃ１＋・・・＋Ｃｎ）
ｎ×測定間隔（時間）＝Ｃ（時間）
Ｃ１＋・・・＋Ｃｎ＝Ｃ（時間）
ここで、Ｔは最適葉温（℃）であり、Ｔ１～Ｔｎは葉温（℃）であり、ｎは測定回数（回）であり、ｎは２以上１０以下の整数である。 - ｎが２又は３である、請求項２２に記載の方法。
- 請求項２２又は２３に記載の方法により、栽培するための条件を決定すること、決定した栽培条件で目的タンパク質又は目的ペプチドを発現する植物体を栽培すること、及び栽培した植物体から目的タンパク質又は目的ペプチドを抽出することを含む、目的タンパク質又は目的ペプチドの製造方法。
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