JP7565089B2 - ミクロバクテリウム・エステルアロマティクム株、これを含む組成物、およびそれらの使用 - Google Patents

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CECT CECT 9167

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１２月１８日出願の欧州特許出願第１８３８２９３７．３号の利益を主張する。

本発明は、植物の健康状態に関する製品の分野に関する。本発明は、微生物ミクロバクテリウム・エステルアロマティクム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｓｔｅｒａｒｏｍａｔｉｃｕｍ）の新たな単離株、該単離株を含む組成物、ならびに植物での寄生線虫によって引き起こされる疾患の生物学的防除における該単離株および該組成物の使用を提供する。

寄生線虫は、圃場およびプランテーション作物生産における主要な律速因子のうちである、世界中で経済的に重要性の高い重要な植物の損失を引き起こす。寄生線虫には、ネコブセンチュウ、例えば、メロイドギネ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ）属、シストセンチュウ、例えば、グロボデラ（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ）属、およびネグサレセンチュウ、例えば、プラティレンクス（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ）属がある。

最も一般的に使用される線虫管理戦略は化学的防除であるが、有効ではあるものの、土壌汚染の問題につながり、生物多様性に影響を及ぼし、ヒトの健康に負の影響を有することがある。ここ数十年にわたって、研究者らは、非化学的かつ環境に優しいアプローチを開発するよう試みてきた。いくつかの研究では、根圏細菌株を含む植物抽出物が寄生線虫を阻害する可能性が評価されており、殺線虫効果は植物によって放出される殺生物性物質によっても行われることが示唆されてきた。非特許文献１では、マリーゴールド抽出物中で植物寄生線虫の根圏細菌拮抗物質が同定されたが、その有効性は土壌中に存在する線虫に限定されており、根組織内での寄生線虫に対しては有効ではなかった。

環境条件および宿主条件が細菌株の生物学的活性に影響を及ぼし、該細菌株の有効性を一般的には変動させ、参照化学製品よりも有意に低くすることを指摘することが重要である。

Ｓｔｕｒｚ ＡＶ ａｎｄ Ｋｉｍｐｉｎｓｋｉ Ｊ ２００４ Ｐｌａｎ ａｎｄ Ｓｏｉｌ２６２：２４１－２４９

尽力が施されたにもかかわらず、寄生性植物線虫を防除することにおいて当技術分野で既知の細菌株によって示される制限の全部または一部を克服し、特に根組織内に存在する寄生線虫に対して有効である殺線虫特性を有する細菌株についての必要性がある。

本発明者らは、驚くべきことに、ネコブセンチュウおよびシストセンチュウなどの植物寄生線虫に対して拮抗物質活性を示し、植物（すなわち、根）内に存在する線虫においてその活性を発揮し、広範囲の土壌ｐＨにおいて該活性を発揮するミクロバクテリウム・エステルアロマティクム種の１つの株（以後、「細菌株Ｂ２４」または「Ｂ２４」とも称される）を発見した。

以下に示すように、本発明の株は、成長チャンバおよび温室試験で試験されており、卵および幼若ネコブセンチュウ（ＲＫＮ）メロイドギネ・インコグニタ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｉｎｃｏｇｎｉｔａ）およびメロイドギネ・ヤバニカ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｊａｖａｎｉｃａ）を防除する上で、ならびにジャガイモシストセンチュウ（ＰＣＮ）グロボデラ・ロストキエンシス（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ ｒｏｓｔｏｃｈｉｅｎｓｉｓ）およびグロボデラ・パリダ（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ ｐａｌｌｉｄａ）に対して効率的であることが実証されている。

卵の孵化阻害に関して、試験した線虫に対する本発明の株のインビトロでの有効性が、ＲＫＮ線虫において参照殺線虫化学物質を使用して達成されたものと同様であったことは注目に値する（参照化学物質はフェナミホスとした）（図１および図２）。驚くべきことに、ＰＣＮのシストに対するインビトロでの本発明の株の殺線虫効果は、参照化学物質（オキサミル）の殺線虫効果よりも良好であった（例５、図７および図８）。この抗線虫効果は、線虫防除に関して、植物１個体当たりおよび新鮮な根１グラム当たりのＲＫＮ卵の最終集団を測定すると、インビボでも検出された（ＲＫＮ生殖）。このインビボでの効果は、本発明の細菌をいくつかの形態で、すなわちペレット（例６．１）として、技術等級の有効成分（ＴＧＡＩ）（例６．２）として、および製剤されたプロトタイプ（油分散物）（例６．３）として使用して達成された。驚くべきことに、キュウリ植物において、最終集団および生殖に対するインビボでの有効性は、参照化学物質よりも良好であった（例６．４を参照されたい）。

これらの実験データから、本発明の細菌株は、広範囲の線虫を、該線虫の発生段階および植物の部分とは無関係に、防除する驚くべき効果を有すると結論付けることができた。このような特定の効果を有するＭ．エステルアロマティクム株が報告されたのはこれが初めてである。

加えて、このような顕著な抗線虫活性プロファイルに対して、本発明者らはまた、ＴＧＡＩ病原性が認められなかったので、マウスに本発明の株を供給したとき、例７に示されるように、本発明の株が安全であることも発見した。

いかなる理論にも束縛されるものではないが、このような殺線虫効果は、本発明の株が宿主と接触し、ある特定の酵素を放出し（上清で殺線虫効果が観察された例１を参照されたい）、植物の誘導された全体抵抗性（ＩＳＲ）に関与するという事実に起因する、と、本発明者らは考えている。

さらに、本発明の株は、５～１０の範囲のｐＨを有する土壌中に定着して生存する能力を有する。

土壌のｐＨ範囲は、３．５より低いｐＨを有する土壌である超酸性から、９より高いｐＨを有する非常に強アルカリ性の土壌までの範囲であることができる。土壌ｐＨは、植物栄養素の利用可能度に明確な影響を与える。このことが、一部の土壌中で成長することができる植物種も存在すれば、成長の必要条件によっては該土壌中で成長することができない他の植物種も存在する理由である。一方、ｐＨなどの環境条件が特定の微生物の生存度／活性に負に影響を及ぼす可能性があることは、当業者によって十分に認識されている。本発明者らは、驚くべきことに、本発明の株が５～１０の極端なｐＨ値で生存することができることを発見した。このことは、本発明の株が広範囲の植物作物においてその機能を発揮することができることを意味するので、さらに有益な利点である。

その上、本発明者らはさらに、本発明の株（実施例１を参照されたい）が、（ａ）シデロホアを産生することができたこと、（ｂ）ロイシンアリールアミダーゼ、α－グルコシダーゼ、およびα－マンノシダーゼなどの酵素を産生したこと、（ｃ）バイオフィルム産生細胞であったこと、かつ（ｄ）環境に優しいことを発見した。

シデロホアならびに酵素ロイシンアリールアミダーゼ、α－グルコシダーゼおよびα－マンノシダーゼの活性の産生は、植物の成長、発達および生殖に有益な影響を及ぼす。

シデロホアは、可溶性Ｆｅ３＋結合剤であり、植物の鉄の利用可能度および取り込みを上昇させることもできる。ロイシンアリールアミダーゼは、高分子量化合物ポリマーからアミノ酸を遊離させ、植物にとって必須栄養素である溶存有機窒素の供給源を提供する。α－グルコシダーゼおよびα－マンノシダーゼは、炭水化物複合体をそれらのモノマーへと分解するよう作用し、植物に糖の供給源を提供する。バイオフィルムは、土壌品質、植物栄養および植物保護にとって重要であると報告されている表面結合性多糖を含むポリマーマトリックスによって結合された微生物細胞のコミュニティである。

それゆえ、本発明の株は、細菌行動易感受性植物（ｂａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｐｌａｎｔ）の成長に有益である。

全体として、本発明の株は、バイオ農薬の分野における大きな進歩を意味する。

したがって、本発明の第１の態様は、受託番号ＣＥＣＴ９１６７の下で「Ｃｏｐｅｃｃｉｏｎ Ｅｓｐａｎｏｌａ ｄｅ Ｃｕｌｔｉｖｏｓ Ｔｉｐｏ」（ＣＥＣＴ）に寄託されたミクロバクテリウム・エステルアロマティクムの株、またはその突然変異体を指し、該突然変異体は、ミクロバクテリウム・エステルアロマティクムのＣＥＣＴ９１６７を出発材料として使用して得られ、ＣＥＣＴ９１６７の殺線虫効果を維持する。

本発明では、本発明の株を指す「Ｂ２４」および「ＣＥＣＴ９１６７」という用語は相互互換可能に使用される。

本発明の株は、アルメリア市（スペイン南部）の農業土壌から分離され、ブダペスト条約により、受託番号ＣＥＣＴ９１６７の下でＵｎｉｖｅｒｓｉｄａｄ ｄｅ Ｖａｌｅｎｃｉａ Ｃ．Ｐ ４６９８０ Ｃａｔｅｄｒａｔｉｃｏ Ａｇｕｓｔｉｎ Ｅｓｃａｒｄｉｎｏ Ｎｏ９ Ｐａｔｅｒｎａ，Ｖａｌｅｎｃｉａ（スペイン）のＣＥＣＴに寄託された。該株は、寄託者Ｆｕｔｕｒｅｃｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｓ．Ａ．，Ａｖ．Ｄｅｌ Ｃａｄｉ １９－２３ Ｐ．Ｉ．Ｓａｎｔ Ｐｅｒｅ Ｍｏｌａｎｔａ０８７９９ Ｏｌｅｒｄｏｌａ Ｂａｒｃｅｌｏｎａによって２０１６年７月１３日に寄託された。該株は、該寄託者によって参照Ｂ２４で同定され、受託番号ＣＥＣＴ９１６７を受けた。該株は、加えて、生存可能であると宣言された。

本発明の第２の態様は、本発明の第１の態様で定義された株またはその突然変異体を含む細菌培養物を指す。

本発明の株の殺虫効果により、該株は、植物の健康状態に関する製品として使用することができる。後の実施例に示すように、本発明の第１の態様の株は、国際連合食糧農業機関によって発行されたガイドラインであるＦＡＯガイドラインによって植物の健康状態に関する製品として使用することができる。本発明の第１の態様で定義されたような単離された細菌は、植物の健康状態に関する組成物の成分として使用することができる。

それゆえ、本発明の第３の態様は、有効量の本発明の第１の態様で定義されたような株、または本発明の第２の態様で定義されたような細菌培養物と、１つ以上の農業上許容され得る化合物とを含む組成物を指す。

本発明の第４の態様は、ミクロバクテリウム・エステルアロマティクムのＣＥＣＴ９１６７の株の突然変異体を得る方法であって、寄託された株を出発材料として使用することと、遺伝子工学技術、例えばＤＮＡ組換え技術、例えば突然変異誘発を適用することとを含み、得られた突然変異体が、植物における植物線虫および感染を防除する親寄託株の活性を維持する、方法を指す。

本発明の第５の態様は、本発明の第１の態様のＭ．エステルアロマティクムのＣＥＣＴ９１６７株またはその突然変異体に由来する生細胞懸濁液を得るためのプロセスを指し、該プロセスは、（ｉ）該株を適切な培養培地中に接種することと、（ｉｉ）ステップ（ｉ）の該接種した培養培地を該株の成長に適した条件に供することと、（ｉｉｉ）場合により、ステップ（ｉｉ）から結果として得られた該培地を濃縮ステップに供することと、を含む。

先に示したように、殺線虫効果は、本発明の株が少なくともある特定の酵素を放出し、植物のＩＳＲに関与するという事実に起因する。それゆえ、本発明の第６の態様は、本発明の第１の態様で定義されるＭ．エステルアロマティクムのＣＥＣＴ９１６７株またはその突然変異体に由来する上清を指し、該上清は、（ｉ）該株を適切な培養培地中に接種することと、（ｉｉ）該接種した培養培地を適切な成長条件に供することと、（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）の培養培地から細胞を分離することと、（ｉｖ）上清を回収することと、（ｖ）場合により、上清を濃縮ステップに供することと、を含むプロセスによって得ることができる。

本発明の第７の態様は、有効量の本発明の第１の態様のミクロバクテリウム・エステルアロマティクムのＣＥＣＴ９１６７株もしくはその突然変異体、または本発明の第２の態様の細菌培養物、または本発明の第３の態様の組成物または本発明の第６の態様の上清、を含むキットを指す。

本発明の第８の態様は、植物における線虫感染を防除するための、本発明の第１の態様のミクロバクテリウム・エステルアロマティクムのＣＥＣＴ９１６７株もしくはその突然変異体、または本発明の第６の態様の上清、または本発明の第７の態様のキットの使用を指す。

本発明の第９の態様は、植物の一部か、または該植物を成長させるために使用される基材へ、本発明の第１の態様のミクロバクテリウム・エステルアロマティクムのＣＥＣＴ９１６７株、もしくはその突然変異体、または本発明の第２の態様の細菌培養物、または本発明の第３の態様の組成物、または本発明の第６の態様の上清、または本発明の第７の態様のキットを適用することを含む、該植物における線虫によって引き起こされる感染症を防除するための方法を指す。

Ｍ．エステルアロマティクムＢ２４株（８．０×１０^８ＣＦＵ／ｍｌ）およびＮｅｍａｃｕｒ（登録商標）（「化学物質」）または陰性対照を使用したインビトロでの処理後のＭ．ヤバニカおよびＭ．インコグニタの卵の孵化（各種の５０％）を表す。 Ｍ．エステルアロマティクムＢ２４株（３×１０^７ＣＦＵ／ｍｌ）およびＮｅｍａｃｕｒ（登録商標）（「化学物質」）または陰性対照を使用したインビトロでの処理後のＭ．ヤバニカおよびＭ．インコグニタの卵の孵化（各種の５０％）を表す。 Ｍ．エステルアロマティクムＢ２４株（５．２０×１０^７ＣＦＵ／ｍｌ）、Ｂ２５３８（６．２×１０^７ＣＦＵ／ｍＬ）株またはＤＳＭＺ（ＤＳＭＺ８６０９）（２．０３×１０^７ＣＦＵ／ｍＬ）株または陰性対照を使用したインビトロでの処理後のＭ．ヤバニカおよびＭ．インコグニタの卵の孵化（各種の５０％）を表す。 ２つの濃度（三角形、１．４×１０^７ＣＦＵ／ｍＬ、正方形、２．１×１０^６ＣＦＵ／ｍＬ）のＭ．エステルアロマティクムＢ２４株を使用したインビトロでの処理後のＭ．ヤバニカおよびＭ．インコグニタの幼若体（Ｊ２）の生存率（各種の５０％）を示す。 Ｍ．エステルアロマティクムＢ２４（５．２×１０^７ＣＦＵ／ｍｌ）株、Ｂ２５３８（６．２×１０^７ＣＦＵ／ｍＬ）株またはＤＳＭＺ（ＤＳＭＺ８６０９）（２．０３×１０^７ＣＦＵ／ｍＬ）株を使用したインビトロでの処理後のＭ．ヤバニカおよびＭ．インコグニタの幼若体（Ｊ２）の生存率（各種の５０％）を示す。 対照および化学製品（Ｖｙｄａｔｅ（登録商標））に関する、Ｍ．エステルアロマティクムＢ２４（７．０×１０^７ＣＦＵ／ｍＬ）株のＧ．ロストキエンシスおよびジャガイモシロシストセンチュウの卵孵化阻害に対するインビトロでの有効性の百分率の比較を表す。 対照および化学製品（Ｖｙｄａｔｅ（登録商標））に関する、ＴＧＡＩとして適用されるＭ．エステルアロマティクムＢ２４（７．０×１０^７ＣＦＵ／ｍＬ）株のＧ．ロストキエンシスおよびジャガイモシロシストセンチュウのシストからの卵孵化に対するインビトロでの有効性の百分率の比較を表す。 対照および化学製品（Ｖｙｄａｔｅ（登録商標））に関する、１％（２．２×１０^８ＣＦＵ／ｍＬ）でＯＤ製剤として適用されるＭ．エステルアロマティクムＢ２４株のＧ．ロストキエンシスおよびジャガイモシロシストセンチュウのシストからの卵孵化に対するインビトロでの有効性の百分率の比較を表す。 Ｂ２４フラスコのＣＳ（破線）、ＤＳＭ８６０９フラスコのＣＳ（点線）の２５４ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムを、微生物接種なしの培養培地（実線）と比較して表す。関連する異なるピークを矢印で標識した。

図面全部において、異なる文字（「ａ」、「ｂ」または「ａｂ」）で表されたデータは、それらの間に統計学的な有意差があったことを示す（データは、Ｒプログラムを用いて分散分析（ＡＮＯＶＡ）に供され、処理の平均を、Ｆｉｓｈｅｒの保護最小有意差検定（ＬＳＤ）をＰ＝０．０５で用いて比較した）。「対照」：陰性対照。「卵孵化（％）」：：卵孵化率。

発明を実施するための態様

発明の詳細な説明
本出願において本明細書で使用されるすべての用語は、特に明記しない限り、当技術分野で公知の通常の意味で理解されるものとする。本出願で使用されるある特定の用語についての他のより具体的な定義は、以下に明らかにされる通りであり、特に明示して提示された定義がより広い定義を提供しない限り、本明細書および特許請求の範囲全体にわたって均一に適用されることを意図している。本明細書で与えられる定義は、理解の目的のために含まれ、発明を実施するための形態、特許請求の範囲および図面全体を通して適用されることが期待される。

本発明の第１の態様は、受託番号ＣＥＣＴ９１６７の下でスペイン微生物株保護機関（Ｃｏｐｅｃｃｉｏｎ Ｅｓｐａｎｏｌａ ｄｅ Ｃｕｌｔｉｖｏｓ Ｔｉｐｏ；ＣＥＣＴ）に寄託されたミクロバクテリウム・エステルアロマティクムの単離株、またはその突然変異体を指し、該突然変異体株は、ミクロバクテリウム・エステルアロマティクムのＣＥＣＴ９１６７を使用して得られ、ＣＥＣＴ９１６７の殺線虫効果を維持する。

本発明の第１の態様の特定の実施形態では、場合により以下に提供される実施形態のうちのいずれかと組み合わせて、ミクロバクテリウム・エステルアロマティクムの単離株は、受託番号ＣＥＣＴ９１６７の下でスペイン微生物株保護機関（ＣＥＣＴ）に寄託されたＭ．エステルアロマティクムＢ２４株である。

本発明の第１の態様の別の実施形態では、場合により先にまたは後に提供される実施形態のうちのいずれかと組み合わせて、該株は、出発株の殺線虫効果を維持するＣＥＣＴ９１６７株の突然変異体である。

ＣＥＣＴ９１６７株の「突然変異体」という用語はまた、本発明によればＣＥＣＴ９１６７株の「変異株」としても理解される。

寄託した株を出発材料として使用することにより、当業者は、突然変異誘発または細菌組換え技術などの遺伝子工学技術によって、本発明の株の本明細書に説明する関連の特徴および利点を維持する突然変異体を定番で得ることができる。本発明の一実施形態では、突然変異体は、ランダム突然変異誘発（すなわち、化学的または物理的な作用因子を使用すること）または部位特異的突然変異誘発、コンビナトリアル突然変異誘発もしくは挿入突然変異誘発によって得られた遺伝子改変突然変異体である。本発明の第１の態様の別の実施形態では、突然変異体は、組換え技術を使用することによって、例えば形質転換技術（例えば、電気穿孔法、熱ショックによるか、または塩化カルシウムなどの二価カチオン溶液を使用することによる）、形質導入技術または接合技術を使用することによって得られる。組換え技術を使用することにより、プラスミドを細菌株に含めることができ、該プラスミドは、抗生物質耐性遺伝子または突然変異体の選別に機能する遺伝子を含むことができる。遺伝子工学技術の例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．およびＲｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｗ．「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」，第１３章，「Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，第３版，２００１において認めることができる。

上述のように、本発明によって提供される突然変異体は、ＣＥＣＴ９１６７株によって示される効果、すなわち抗線虫活性を維持しなければならない。本発明では、「維持する」という用語は、突然変異体に言及するとき、抗線虫活性を提示しなければならないことを意味する。もちろん、該株における突然変異の結果として、本発明によって包含される、結果として得られた突然変異体は、ミクロバクテリウム・エステルアロマティクムのＣＥＣＴ９１６７株よりも効率的に活性を提示することができる。

突然変異体が広範な抗線虫プロファイルを維持しているかどうかを決定するために、いくつかの周知のプロトコルに従うことができる。これらの方法は、一般に、該株と接触している病原体の成長能力の分析、または該株への曝露後の病原体感染によって引き起こされる疾患の重症度の評価に基づいている。活性を決定するために本明細書の例に含まれているプロトコルは、例示的かつ非限定的な例である。簡潔にいえば、該プロトコルは、インビトロでの線虫の孵卵および線虫の生存、ならびにインビボでの線虫の繁殖分析に基づいている。

本発明の第１の態様の別の実施形態では、場合により、先にまたは後に提供される実施形態のうちのいずれかと組み合わせて、殺線虫効果は、少なくともメロイドギネ属、グロボデラ属、および／またはプラティレンクス属の線虫に対するものである。別の実施形態では、場合により、先にまたは後に提供される実施形態のうちのいずれかと組み合わせて、殺線虫効果は、少なくともメロイドギネ属およびグロボデラ属の線虫に対するものである。別の実施形態では、場合により、先にまたは後に提供される実施形態のうちのいずれかと組み合わせて、殺線虫効果は、メロイドギネ・インコグニタ、メロイドギネ・ヤバニカ、グロボデラ・ロストキエンシスおよびグロボデラ・パリダのうちの１つ以上に対するものである。別の実施形態では、本発明の第１の態様で定義される株は、メロイドギネ・インコグニタ、メロイドギネ・ヤバニカ、グロボデラ・ロストキエンシスおよびグロボデラ・パリダに対する殺線虫効果を有する。別の実施形態では、場合により、先にまたは後に提供される実施形態のうちのいずれかと組み合わせて、殺線虫効果は、プラティレンクス・ペネトランス（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｐｅｎｅｔｒａｎｓ）、プラティレンクス・ファラックス（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｆａｌｌａｘ）、プラティレンクス・コフェアエ（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｃｏｆｆｅａｅ）、プラティレンクス・ルージ（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｌｏｏｓｉ）、およびプラティレンクス・ヴルヌス（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｖｕｌｎｕｓ）のうちの１つ以上に対するものである。

本発明の第１の態様の別の実施形態では、場合により、先にまたは後に提供される実施形態のうちのいずれかと組み合わせて、本発明の第１の態様において定義される株は、メロイドギネ・インコグニタ、メロイドギネ・ヤバニカ、グロボデラ・ロストキエンシスおよびグロボデラ・パリダに対する殺線虫効果を有する。

本発明の第１の態様の別の実施形態では、場合により、先にまたは後に提供される実施形態のうちのいずれかと組み合わせて、ミクロバクテリウム・エステルアロマティクムのＣＥＣＴ９１６７株の突然変異体は、ミクロバクテリウム・エステルアロマティクムのＣＥＣＴ９１６７株と少なくとも９９．８％または９９．９％のゲノム配列同一性を有する。

本発明では、「同一性」という用語は、２つの配列が最適に整列させられているときに該配列において同一である残基の百分率を指す。最適なアラインメントにおいて、第１の配列における位置が、第２の配列における対応する位置と同じアミノ酸残基によって占められている場合、該配列は、その位置に関して同一性を呈する。２つの配列（または「配列同一率」）間の同一性のレベルは、配列の大きさに関して配列が共有する同一の位置の数の比として測定される（すなわち、配列同一率＝（同一の位置の数／位置の総数）×１００）。

最適なアラインメントを迅速に得て、２つ以上の配列間の同一性を計算するためのいくつかの数学的アルゴリズムは公知であり、いくつかの利用可能なソフトウェアプログラムへと組み込まれている。このようなプログラムの例としては、とりわけ、アミノ酸配列分析のためのＭＡＴＣＨ－ＢＯＸ、ＭＵＬＴＡＩＮ、ＧＣＧ、ＦＡＳＴＡおよびＲＯＢＵＳＴといったプログラムがある。好ましいソフトウェア解析プログラムには、ＡＬＩＧＮ、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ、およびＢＬＡＳＴといったプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ２．１、ＢＬ２ＳＥＱ，およびそれらの新版）がある。

アミノ酸配列分析のために、ＢＬＯＳＵＭ行列（例えば、ＢＬＯＳＵＭ４５行列、ＢＬＯＳＵＭ５０行列、ＢＬＯＳＵＭ６２行列、およびＢＬＯＳＵＭ８０行列）、Ｇｏｎｎｅｔ行列、またはＰＡＭ行列（例えば、ＰＡＭ３０行列、ＰＡＭ７０行列、ＰＡＭ１２０行列、ＰＡＭ１６０行列、ＰＡＭ２５０行列、およびＰＡＭ３５０行列）などの重み付け行列が、同一性を求める上で使用することができる。

ＢＬＡＳＴプログラムは、選択された配列をデータベース（例えば、ＧｅｎＳｅｑ）内の複数の配列に対して、またはＢＬ２ＳＥＱを用いて２つの選択された配列間で整列させることによって、少なくとも２つの配列の分析を提供する。ＢＬＡＳＴプログラムは、好ましくはＢＬＡＳＴプログラム演算へと組み込まれたＤＵＳＴプログラムまたはＳＥＧプログラムなどの低複雑度フィルタリングプログラムによって修正変更される。ギャップ存在コスト（またはギャップスコア）が使用される場合、ギャップ存在コストは好ましくは、約－５から－１５の間に設定される。同様のギャップパラメータは、適宜、他のプログラムとともに使用することができる。ＢＬＡＳＴプログラムおよびその基礎となる原理は、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，「Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ」，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，第２１５巻，４０３～４１０ページにおいてさらに説明されている。

多重配列解析については、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗプログラムを使用することができる。ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗプログラムは望ましくは、「動的」（対「高速」）設定を使用して実行される。配列は、配列間の同一性のレベルに応じてＢＬＯＳＵＭ行列の変数セットを使用して評価される。ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗプログラムおよび基本的な演算原理は、例えば、Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，「ＣＬＵＳＴＡＬ Ｖ：ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ」，１９９２，ＣＡＢＩＯＳ，８（２），１８９～１９１ページにおいてさらに説明されている。

本発明の第１の態様の別の実施形態では、場合により、先にまたは後に提供される実施形態のうちのいずれかと組み合わせて、ミクロバクテリウム・エステルアロマティクムのＣＥＣＴ９１６７株の突然変異体は、ミクロバクテリウム・エステルアロマティクムのＣＥＣＴ９１６７株と少なくとも９９．８％または９９．９％の平均ヌクレオチド同一性（ＡＮＩ）を有する。

本発明の第１の態様の別の実施形態では、場合により、先にまたは後に提供される実施形態のうちのいずれかと組み合わせて、本発明の突然変異体のＡＮＩを求める方法は、Ｒｉｃｈｔｅｒ Ｍ，ｅｔ ａｌ．２０１５ ＪＳｐｅｃｉｅｓＷＳ：ａ ｗｅｂ ｓｅｒｖｅｒ ｆｏｒ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｓｐｅｃｉｅｓ ｃｉｒｃｕｍｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｐａｉｒｗｉｓｅ ｇｅｎｏｍｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ．Ｂｉｏｉｎｆｏｍａｔｉｃｓ．２０１５ Ｎｏｖ１６．ｐｉｉ：ｂｔｖ６８１において説明される「ＡＮＩｍ」法である。

本発明の第１の態様の別の実施形態では、場合により、先にまたは後に提供される実施形態のうちのいずれかと組み合わせて、例えば、ミクロバクテリウム・エステルアロマティクムのＣＥＣＴ９１６７株と少なくとも９９．８％または９９．９％のゲノム配列同一性を有する本発明の株の突然変異体を得る方法は、Ａｕｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，「Ａ Ｍａｒｋｅｒｌｅｓｓ Ｄｅｌｅｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ－Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｇｒａｍ－Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ」 Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２０１４；１１９７：３１１－２７において説明される変異原性法である。

本発明の第２の態様は、本発明の第１の態様において定義された株を含む細菌培養物を指す。

本発明の第２の態様の一実施形態では、場合により、先にまたは後に提供される実施形態のうちのいずれかと組み合わせて、細菌培養物は、本発明の第１の態様において定義される生存可能な株を含む。

本発明の第２の態様の一実施形態では、場合により、先にまたは後に提供される実施形態のうちのいずれかと組み合わせて、細菌培養物は、接種産物である。

「接種産物」とは、株を適切な培養培地中に接種し、接種した培養培地を適切な成長条件に供した後に得られる産物と理解される。

本発明の第２の態様の別の実施形態では、場合により、先にまたは後に提供される実施形態のうちのいずれかと組み合わせて、細菌培養物は、不活性化した本発明の株を含む。

「不活性化した」という用語は、微生物がコロニーを形成することができないことを意味する。一実施形態では、不活性化した微生物は、細胞膜が無傷であるかまたは破壊されている。

本発明の第２の態様の別の実施形態では、場合により、先にまたは後に提供される実施形態のうちのいずれかと組み合わせて、接種産物は、不活性化した本発明の株を含む。

「不活性化された本発明の株を含む接種産物」とは、株を適切な培養培地中に接種し、接種した培養培地を適切な成長条件に供し、次いで株を不活性化した後に得られる産物を指す。

有害生物防除における実用的な使用を目的として、農薬剤は通常、農業上許容され得る化合物もはじめとする組成物へと製剤される。それゆえ、本発明の第３の態様は、有効量の本発明の第１の態様で定義されたような株、または本発明の第２の態様で定義されたような細菌培養物と、１つ以上の農業上許容され得る化合物とを含む組成物を指す。

本明細書で使用される「有効量」という用語は、植物病害の処置または予防のいずれかの所望の利益を提供するのに十分高いが、重篤な副作用を回避するのに十分低い、本発明の第１の態様で定義されるＭ．エステルアロマティクムＣＥＣＴ９１６７株の量を意味する。本発明により投与される化合物の特定の用量は、当然のことながら、投与される化合物、投与経路、処置される特定の容態、および同様の配慮事項をはじめとする、症例を取り巻く特定の状況によって判断される。

本発明の第３の態様の一実施形態では、場合により、先にまたは後に提供される実施形態のうちのいずれかと組み合わせて、該株は、１．０×１０^５ＣＦＵ／ｍＬ～１．０×１０^１２ＣＦＵ／ｍＬの濃度で存在する。本発明の第３の態様の別の実施形態では、該株は、１．０×１０^５ＣＦＵ／ｍＬ、１．０×１０^６ＣＦＵ／ｍＬ、１．０×１０^７ＣＦＵ／ｍＬ、１．０×１０^８ＣＦＵ／ｍＬ、１．０×１０^９ＣＦＵ／ｍＬ、１．０×１０^１０ＣＦＵ／ｍＬ、１．０×１０^１１ＣＦＵ／ｍＬまたは１．０×１０^１２ＣＦＵ／ｍＬの濃度で存在する。

本発明の目的のために、与えられた何らかの範囲には、該範囲の下限終点および上限終点をいずれも含む。

ＣＦＵ／ｍＬとして示される量は、組成物１ミリリットルまたは１グラム当たりの本発明の株のコロニー形成単位（ＣＦＵ）に関する。

本発明の第３の態様の別の実施形態では、場合により、先にまたは後に提供される実施形態のうちのいずれかと組み合わせて、組成物は、植物の健康状態に関する組成物である。

本発明の第３の態様の別の実施形態では、場合により、先にまたは後に提供される実施形態のうちのいずれかと組み合わせて、組成物は、少なくとも１つの追加の農薬を含む。

本発明の第３の態様の別の実施形態では、場合により、先にまたは後に提供される実施形態のうちのいずれかと組み合わせて、追加の農薬は、農薬特性を有する別の菌株、殺真菌剤、殺菌剤、除草剤、殺虫剤または化学殺線虫剤からなる群から選択される。該追加の農薬は、組成物中に含まれる本発明の株の活性／生存率に負に影響を及ぼすに及ばない。

本発明では、「農薬」という用語は、有害生物と見なされる生物を死滅、忌避、調節またはその成長の妨害することを意図した製品としての農学の分野におけるその通常の意味によって理解される。明らかに、Ｍ．エステルアロマティクムのＣＥＣＴ９１６７株またはその突然変異体の性質により、本明細書では、「農薬」とは生物農薬とも呼ばれる生物学的または生態学的（有機）農薬であると理解される。本発明の範囲では、「農薬」という用語は、「植物の健康状態に関する」という用語と同じ意味を有するであろう。

本発明の第３の態様の別の実施形態では、場合により、先にまたは後に提供される実施形態のうちのいずれかと組み合わせて、組成物は、溶液、ペレット、懸濁液、凍結乾燥組成物または他の乾燥組成物（例えば、凍結乾燥組成物）の形態であり得る。凍結乾燥または乾燥させた組成物は、その使用前に液状担体で再構成することができるか、または直接使用することができる。該組成物は、植物の健康状態に関する使用に適したさまざまな配合によって調製することができ、例えば、以下の種類の製剤からなる群から選択することができる：希釈なしでの使用を企図した液剤（ＡＬ）、希釈なしでの使用を企図した散剤（ＡＰ）、カプセルに封入された顆粒剤（ＣＧ）、接触液剤または接触ゲル剤（ＣＬ）、接触散剤（ＣＰ）、粉状散剤（ＤＰ）、乳化性濃縮物（ＥＣ）、乳化性顆粒剤（ＥＧ）、油型エマルション剤（ＥＯ）、水型エマルション剤（ＥＷ）、微粒子剤（ＦＧ）、マクロ顆粒剤（ＧＧ）、乳化性ゲル剤（ＧＬ）、噴霧用散剤（ＧＰ）、顆粒剤（ＧＲ）、グリース剤（ＧＳ）、水溶性ゲル剤（ＧＷ）、マイクロエマルション剤（ＭＥ）、マイクロ顆粒剤（ＭＧ）、水希釈性濃縮懸濁剤（ＯＦ）、油分散剤（ＯＤ）、水混和性懸濁剤（ＯＬ）、油中分散用散剤（ＯＰ）、ゲル状またはペースト状濃縮物（ＰＣ）、スティック剤（農業上の使用向け）（ＰＲ）、濃縮懸濁剤（ＳＣ）、懸濁エマルション剤（ＳＥ）、水溶性顆粒剤（ＤＧ）、可溶性濃縮物（ＳＬ）、フィルム形成油（ＳＯ）、水溶性散剤（ＳＰ）、水溶性錠剤（ＳＴ）、錠剤（ＴＢ）、水分散性顆粒剤（ＷＧ）、湿潤性散剤（ＷＰ）、水分散性錠剤（ＷＴ）（コードは、植物の健康状態に関する製品のための国際コードに相当する２つの大文字からなる）。

本発明の第３の態様の別の実施形態では、場合により、先にまたは後に提供される実施形態のうちのいずれかと組み合わせて、組成物は、ＯＤ組成物である。

本発明の第３の態様の別の実施形態では、場合により、先にまたは後に提供される実施形態のうちのいずれかと組み合わせて、組成物は、ＯＤ組成物であり、１．０×１０^５～１．０×１０^１２ＣＦＵ／ｍＬ（１．０×１０^５ＣＦＵ／ｍＬ、１．０×１０^６ＣＦＵ／ｍＬ、１．０×１０^７ＣＦＵ／ｍＬ、１．０×１０^８ＣＦＵ／ｍＬ、１．０×１０^９ＣＦＵ／ｍＬ、１．０×１０^１０ＣＦＵ／ｍＬ、１．０×１０^１１ＣＦＵ／ｍＬまたは１．０×１０^１２ＣＦＵ／ｍＬ）の範囲の、本発明の第１の態様で定義される株の濃度を含む。

本発明の第３の態様の一実施形態では、場合により、先にまたは後に提供される実施形態のうちのいずれかと組み合わせて、組成物は、ＯＤ製剤であり、１０^１０ＣＦＵ／ｍＬの本発明の第１の態様において定義される株の濃度を含む。

本発明の第３の態様の一実施形態では、場合により、先にまたは後に提供される実施形態のうちのいずれかと組み合わせて、組成物は、ＯＤ製剤であり、１．０×１０^５～１．０×１０^１２ＣＦＵ／ｍＬの範囲の、本発明の第１の態様で定義される株の濃度を含み、また、植物油、有機エステル、シリカ、および高分子量コポリマーも含む。

本発明の第３の態様の一実施形態では、場合により、先にまたは後に提供される実施形態のうちのいずれかと組み合わせて、組成物は、油性成分を含む。別の実施形態では、油性成分は植物油である。別の実施形態では、植物油はダイズ油である。

本発明の第３の態様の一実施形態では、場合により、先にまたは後に提供される実施形態のうちのいずれかと組み合わせて、組成物は、ダイズ油、Ｃ１８エトキシ化脂肪酸、シリカおよびポリアクリラートクロスポリマーを含む。

本発明の第３の態様の一実施形態では、場合により、先にまたは後に提供される実施形態のうちのいずれかと組み合わせて、組成物は、ＯＤ組成物であり、ダイズ油、Ｃ１８エトキシ化脂肪酸、シリカ、ポリアクリラートクロスポリマーを含み、１．０×１０^５～１．０×１０^１２ＣＦＵ／ｍＬの範囲の、本発明の第１の態様で定義される株の濃度を含む。

本発明の第３の態様の別の実施形態では、場合により、先にまたは後に提供される実施形態のうちのいずれかと組み合わせて、組成物は、ＯＤ組成物であり、７０％のダイズ油、２０％のＣ１８エトキシ化脂肪酸、１％のシリカ、ポリアクリラートクロスポリマーおよび８％の本発明の細菌株を含み、別の実施形態では、細菌の終濃度は、１．０×１０^１０ＣＦＵ／ｍＬである。

「農業上許容され得る化合物」は、農業における使用に適した該化合物および／または材料を指す。一般に、該化合物は、ヒトに対して非毒性であるべきであり、好ましくは環境に優しくあるべきである。

本発明の第３の態様の特定の実施形態では、場合により、先にまたは後に提供される実施形態のうちのいずれかと組み合わせて、本発明の組成物は、処置される植物における株の接着を改善するための化合物、ならびに植物強化剤化合物、栄養素、湿潤剤、安定剤、浸透圧保護剤、酸化防止剤、日焼け止め剤、緩衝化合物またはそれらの組み合わせを含有することができる。

接着製品の例は、ゼラチン、デンプン、ペクチン、アルギナート、およびキサンタンなどのさまざまな種類のガムである。これらの化合物の多くはまた、湿潤剤でもある。日焼け止め剤の場合、コンゴーレッド、炭酸カルシウムおよび蝋エマルションを使用することができる。植物強化剤は、作物に対して病原体または有害な環境条件に対する堅牢性または耐性を発達させるのを容易にすることができる化合物であり、例えば、ジャスモン酸類似体ならびにハルピン、キトサン、およびラミナリンなどのいくつかの植物防御刺激剤である。加えて、浸透圧保護剤の例は、トレハロース、ベタインおよびアミノ酸である。最後に、アスコルビン酸およびグルタチオンが酸化防止剤の中に含まれる。

本発明の第３の態様の組成物は、異なる成分を混合することによるなどの通常のプロトコルによって調製することができる。

本発明の第４の態様は、ミクロバクテリウム・エステルアロマティクムのＣＥＣＴ９１６７株の突然変異体を得る方法であって、ＣＥＣＴ９１６７株を遺伝子工学技術に供するステップを含む、ＣＥＣＴ９１６７の殺線虫効果を維持する方法を指す。

本発明の第４の態様の一実施形態では、場合により、先にまたは後に提供される実施形態のうちのいずれかと組み合わせて、遺伝子工学技術は、部位特異的突然変異誘発、コンビナトリアル突然変異誘発もしくは挿入突然変異誘発によるランダム突然変異誘発（すなわち、化学的または物理的な薬剤を使用すること）などの突然変異誘発、または形質転換（例えば、電気穿孔法、熱ショックによるか、または塩化カルシウムなどの二価カチオン溶液を使用することによる）、形質導入もしくは接合の技術などの組換え技術である。本発明の第４の態様の別の実施形態では、遺伝子工学技術は突然変異誘発である。

本発明の第４の態様の一実施形態では、場合により、先にまたは後に提供される実施形態のうちのいずれかと組み合わせて、突然変異体は、シデロホア、ロイシンアリールアミダーゼ、α－グルコシダーゼおよび／もしくはマンノシダーゼなどの酵素の産生、ならびに／またはバイオフィルムの産生を維持する。

本発明の第４の態様の一実施形態では、場合により、先にまたは後に提供される実施形態のうちのいずれかと組み合わせて、ミクロバクテリウム・エステルアロマティクムのＣＥＣＴ９１６７株の突然変異体は、ミクロバクテリウム・エステルアロマティクムのＣＥＣＴ９１６７株と少なくとも９９．８％または９９．９％のゲノム配列同一性を有する。

本発明の第５の態様は、本発明の第１の態様のＭ．エステルアロマティクムのＣＥＣＴ９１６７株またはその突然変異体に由来する生細胞懸濁液を得るためのプロセスを指し、該プロセスは、（ｉ）該株を適切な培養培地中に接種することと、（ｉｉ）ステップ（ｉ）の該接種した培養培地を該株の成長に適した条件に供することと、（ｉｉｉ）場合により、ステップ（ｉｉ）から結果として得られた該培地を濃縮ステップに供することと、を含む。

「ＣＥＣＴ９１６７株に由来する」という用語は、懸濁液が本発明の第１の態様で定義される株から得られることを意味する。

本発明の株は、３～７％（ｖ／ｖ）、例えば５～７％（ｖ／ｖ）、例えば５％（ｖ／ｖ）を含む終濃度で培養培地中に接種することができる。好ましくは、接種された培養物は指数関数的成長期にある。本発明の株の成長に適した培養培地は、ＬＢ（溶原性ブロス）およびＰＭ（塩類溶液産生培地）などの合成培地、または糖蜜（例えば、サトウキビ、テンサイなどに由来する）などの植物起源の培地である。株の成長に適した条件は、６～４２℃が含まれる温度、４～１０（例えば、７～１０）が含まれるｐＨ、および１０～１００％が含まれる酸素濃度である。特定の実施形態では、株の成長のための条件は、２８～３０℃の温度、７～８のｐＨ、および５０％の酸素濃度である。本発明の株の成長中、撹拌を使用することができる。

本発明の第５の態様の別の実施形態では、場合により、先にまたは後に提供される実施形態のうちのいずれかと組み合わせて、細胞を培地から分離して、濃縮された懸濁液を得る。適切な分離技術には、培養物の遠心分離または濾過がある。培養物の遠心分離を、例えば、最低５０００ｒｐｍで行うと、細胞がペレットで得られ、該細胞を培養培地の一部にまたは適切な緩衝培地に、株濃度がおおよそ１×１０^５～１×１０^１２ＣＦＵ／ｍＬ（１０^５ＣＦＵ／ｍＬ、１０^６ＣＦＵ／ｍＬ、１０^７ＣＦＵ／ｍＬ、１０^８ＣＦＵ／ｍＬ、１０^９ＣＦＵ／ｍＬ、１０^１０ＣＦＵ／ｍＬ、１０^１１ＣＦＵ／ｍＬ、または１０^１２ＣＦＵ／ｍＬ）となるように再懸濁する。

懸濁液がいったん得られると、該懸濁液は、脱水ステップに供することができる。脱水は、凍結乾燥プロセスを経て行うことができる。あるいは、懸濁液を流動床乾燥によって脱水することができる。別の選択肢は、噴霧乾燥または真空下のオーブン内での乾燥によって懸濁液を脱水することである。これに関して、本発明の株の別の有利な特徴は、工業規模で微生物を得る際に定番である脱水プロセスに対して高い耐性を呈することである。細胞生存率を改善するために、脱水プロセスを実施する前に不活性浸透圧保護成分を懸濁液に添加することができる。

本発明の第５の態様の別の特定の実施形態では、場合により、先にまたは後に提供される実施形態のうちのいずれかと組み合わせて、本プロセスは、分離ステップから結果として得られた細胞を適切な緩衝液中に再懸濁して、細胞濃縮懸濁液を得ることを含む。

次いで、本発明の第５の態様で得られた細胞を直接使用し、所望の密度に再懸濁し、脱水に供し、または破壊して無細胞抽出物を得ることができる。

本発明の第６の態様は、本発明の第１の態様で定義されるＭ．エステルアロマティクムのＣＥＣＴ９１６７株またはその突然変異体に由来する上清を指し、該上清は、（ｉ）該株を適切な培養培地中に接種することと、（ｉｉ）該接種した培養培地を適切な成長条件に供することと、（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）の培養培地から細胞を分離することと、（ｉｖ）上清を回収することと、（ｖ）場合により、上清を濃縮ステップに供することと、を含むプロセスによって得ることができる。

本発明の第６の態様の特定の実施形態では、場合により、先にまたは後に提供される実施形態のうちのいずれかと組み合わせて、上清は、本発明の第１の態様において定義されるＭ．エステルアロマティクムのＣＥＣＴ９１６７株またはその突然変異体に由来する。

本発明の第６の態様の特定の実施形態では、場合により、先にまたは後に提供される実施形態のうちのいずれかと組み合わせて、上清が、本発明の第１の態様で定義されるＭ．エステルアロマティクムのＣＥＣＴ９１６７株またはその突然変異体によって産生され、例えば、培養培地が液体培地であり、例えばトリプシン分解ダイズブロス（ＴＳＢ）であるとき、Ｎ－アセチル－β－グルコサミニダーゼ、ロイシンアリールアミダーゼ、α－グルコシダーゼおよびα－マンノシダーゼを含む。

本発明の第６の態様は、本発明の第１の態様で定義されるＭ．エステルアロマティクムのＣＥＣＴ９１６７株またはその突然変異体に由来する細胞抽出物を指し、該細胞抽出物は、（ｉ）該株を適切な培養培地中に接種することと、（ｉｉ）該接種した培養培地を適切な成長条件に供することと、（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）の培養培地から細胞を分離することと、（ｉｖ）細胞を回収することと、（ｖ）細胞を破壊することと、（ｖｉ）細胞を細胞デブリから分離することと、（ｖｉｉ）細胞抽出物を回収することと、（ｖｉｉｉ）場合により、細胞抽出物を濃縮プロセスに供することと、を含むプロセスによって得ることができる。

適切な破壊手段は、当業者に公知であり、物理的破壊、例えば、凍結融解もしくはフレンチプレス、または化学的破壊、例えば、リゾチームの添加によるものを含み得る。適切な分離手段は、先に説明されている。無細胞抽出物はまた、好ましくは代謝産物含有上清を含有する、先に定義した細胞懸濁液から得られてもよい。

本発明の第６の態様の上清または先に説明する方法によって得られた細胞抽出物は、適切な組成物に直接使用および／もしくは含めることができ、またはより適切な組成物に到達するための濃縮ステップに供することができる。したがって、本発明の該態様の一実施形態では、上清またはそれに代わるものとして細胞抽出物の濃縮ステップは、脱水、濾過、限外濾過、遠心分離、超遠心分離、沈殿またはクロマトグラフィーによって行うことができる。

本発明の第７の態様は、有効量の本発明の第１の態様で定義される株もしくはその突然変異体、または本発明の第２の態様の細菌培養物、または本発明の第３の態様の組成物または本発明の第６の態様の上清、を含むキットに関する。

本発明の第１の態様の株、本発明の第２の態様の細菌培養物および本発明の第３の態様の組成物について先に提供されるすべての実施形態はまた、本発明の第７の態様のキットの実施形態でもある。

本発明の第７の態様の一実施形態では、場合により、先にまたは後に提供される実施形態のうちのいずれかと組み合わせて、キットは、本発明の第１の態様の株の毎週の用量、毎月の用量、または他の周期的な用量を含み得る。例示的な例として、毎週の用量を含むキットは、該株を含む７つの個別の組成物（７つの日用量）を含み得る。別の例として、毎月の用量を含むキットは、本発明の第１の態様の株を含む３０の組成物を含み得る。

本発明の第１の態様の株が凍結乾燥される場合、本発明の第８の態様のキットは、水などの再懸濁剤を含むことができる。

本発明の第７の態様の別の実施形態では、場合により、先にまたは後に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、キットは、投薬遵守を促進する手段を含む。例えば、キットは、それを使用した人が、適切に処方されたスケジュールで植物への有効量の本発明の株の正確な投与を行うことを確保する目的で特に有利であり得る。ブリスターカードまたは適切に構成された他の収容装置は、さまざまな構成要素の投与の順序またはタイミングを明確に示すのに特に適切であり得る。キットは、１枚のカードとして、または４枚、６枚、７枚（例えば、毎週の供給）、または８枚のカードが一緒に同梱されたケースとして入手することができる。加えて、毎月のまたは他の種類のキットを入手することができる。

本発明の第１の態様の単離された株または突然変異体を含むキットは、培養培地、サプリメントまたは抗生物質、ならびに正しい調製および／または植物への正しい適用のような、本発明の株の正しい培養を可能にする任意の手段を含むことができる。

本発明の第８の態様は、植物における線虫感染を防除するための、本発明の第１の態様のミクロバクテリウム・エステルアロマティクムのＣＥＣＴ９１６７株もしくはその突然変異体、または本発明の第６の態様の上清、または本発明の第７の態様のキットの使用を指す。

本発明の第９の態様は、植物の一部か、または植物を成長させるために使用される基材へ、第１の態様のミクロバクテリウム・エステルアロマティクムのＣＥＣＴ９１６７株もしくはその突然変異体、または本発明の第６の態様の上清、または本発明の第７の態様のキットを適用することを含む、該植物における線虫によって引き起こされる感染症を防除するための方法を指す。

本発明の第８および第９の態様の株は、細菌培養物または組成物として使用することができる。

本発明の第１の態様の株、本発明の第２の態様の細菌培養物および本発明の第３の態様の組成物について先に提供されるすべての実施形態はまた、本発明の第８および第９の態様の実施形態でもある。

本発明の第９の態様の一実施形態では、場合により、先にまたは後に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、本発明の第１の態様で定義されるＭ．エステルアロマティクムのＣＥＣＴ９１６７株、またはその突然変異体を、１日当たり１０^６～１０^８ＣＦＵ／ｇまたは１０^６～１０^８ＣＦＵ／ｍＬの薬用量投与計画で数週間に１回、例えば、１０^６～１０^８ＣＦＵ／ｇまたは１０^６～１０^８ＣＦＵ／ｍＬを数週間に１～６回、または例えば、１０^６～１０^８ＣＦＵ／ｇまたはＣＦＵ／ｍＬを１回の処理当たり１～４回、植物に投与する。

用量は、本発明の第３の態様の組成物および使用される組成物の配合によって、また気象条件、何らかの抵抗現象または他の自然因子、処理の性質または外部寄生の程度によっても、および処理される植物または部位によって適合させることができる。

本発明の第９の態様の一実施形態では、場合により、先にまたは後に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、該株、細菌培養物または組成物は、種子の処理、種子の粉衣、種子の消毒、苗根の浸漬処理、植え付けピットの処理、植物の足処理、植え付け行処理、表面噴霧、土壌混和、点滴灌漑の間に、または水耕栽培における水培地への適用によって、植物の苗トレイに適用される。

「植物の一部」という用語は、根、茎、葉および種子などの植物の何らかのセグメントを含む。

本発明の第９の態様の一実施形態では、場合により、先にまたは後に提供される実施形態のうちのいずれかと組み合わせて、処理される植物の一部は、根の系（根）である。

本発明の第９の態様の一実施形態では、場合により、先にまたは後に提供される実施形態のうちのいずれかと組み合わせて、処理される植物の一部は、種子である。この処理は、通常の方法、例えば、種子を本発明の第３の態様の組成物中に浸漬し、種子をコーティングする方法によって達成することができる。

「種子」という用語には、いわゆる種子の他、球根、塊茎および種芋などの栄養繁殖用の植物体も含まれる。

植物、すなわち、根および／または種子の処理は、根線虫に対する本発明の株の殺線虫作用を可能にする。

「植物」という用語は、ヒトによって栽培される全ての植物種、特に穀類、飼料、野菜、果実作物、蔓植物などの食用もしくは動物飼料用、および／またはあらゆる目的の木材の供給用（暖房、住宅建築用家具、および／または装飾品など）を企図する植物種を含む。植物の例としては、穀類（例えば、コメ、オオムギ、コムギ、ライムギ、エンバクおよびトウモロコシ）、豆類（例えば、ダイズ、アズキ、ソラマメ、エンドウマメおよびラッカセイ）、果樹／果物（例えば、リンゴ、セイヨウナシ、柑橘類、ブドウ、モモ、アンズ、サクランボ、オリーブ、ナッツ、アーモンド、バナナ、ベリー類、およびイチゴ）、野菜（例えば、トマト、キャベツ、ホウレンソウ、ブロッコリー、レタス、タマネギ、ニンニク、ニラ、コショウ）、根作物（例えば、ジャガイモ、ニンジン、サツマイモ、ダイコン、レンコンおよびカブ）、産業用作物（例えば、ワタ、アサ、カジキ、ミツマタ、セイヨウアブラナ、テンサイ、ホップ、サトウキビ、サトウダイコン、ゴム、コーヒー、タバコ、チャ）、瓠果（例えば、カボチャ、キュウリ、スイカ、メロン）、牧草（例えば、カモガヤ、モロコシ、チモシーグラス（Ｔｈｉｍｏｔｈｙ－ｇｒａｓｓ）、クローバ、アルファルファ）、芝草（例えば、コウライシバ、ベントグラス）、香料用作物（例えば、ラベンダー、ローズマリー、タイム、パセリ、バシリカ（ｂａｓｉｌｉｃａ）、ミント、コリアンダー、コショウ、ショウガ）、および花卉植物（例えば、キク、バラ、ラン）がある。

本発明の第８または第９の態様の一実施形態では、場合により、先にまたは後に提供される実施形態のうちのいずれかと組み合わせて、該植物は、トマト植物、キュウリ植物またはジャガイモ植物である。

「基材」という用語は、植物を栽培するための何らかの支持体を含み、そのための材料は、植物がその中で成長することができる限り、特に限定されず、例えば、苗床マット、水、砂、土壌、バーミキュライト、綿、紙、珪藻土、寒天、ゲル物質、高分子物質、ロックウール、グラスウール、ウッドチップ、樹皮および軽石である。

本発明の第９の態様の一実施形態では、場合により、先にまたは後に提供される実施形態のうちのいずれかと組み合わせて、適用方法は、植物の近傍または苗を育成するための苗床内で行われる。

本発明の第９の態様の一実施形態では、場合により、先にまたは後に提供される実施形態のうちのいずれかと組み合わせて、適用方法は、植物において直接行われる。一実施形態では、適用方法は、根系および／または種子の上で行われる。

以下の例は、線虫感染の処置におけるバイオ農薬としてのＭ．エステルアロマティクム株の使用を実証する。

本発明の第８および第９の態様の一実施形態では、場合により、先にまたは後に提供される実施形態のうちのいずれかと組み合わせて、第８の態様の使用および第９の態様の方法は、有害線虫のコロニー形成の防除用、または外部寄生された植物の処理用である。特に、本発明は、植物の該有害生物を防除するための使用に関する。それゆえ、「処理すること」という用語は、外部寄生性植物を指す。「防除」という用語は、該有害生物による植物の外部寄生の防止、該有害生物の忌避または排除を含む。

本発明の第８および第９の態様の一実施形態では、場合により、先にまたは後に提供される実施形態のうちのいずれかと組み合わせて、第８の態様の使用および第９の態様の方法は、有害線虫に感染した植物の処理用である。

本発明の第８または第９の態様の一実施形態では、場合により、先にまたは後に提供される実施形態のうちのいずれかと組み合わせて、該線虫は、ネコブセンチュウまたはシストセンチュウである。

本発明の第８および第９の態様の一実施形態では、場合により、先にまたは後に提供される実施形態のうちのいずれかと組み合わせて、線虫は、メロイドギネ・インコグニタ（サツマイモネコブセンチュウ）、メロイドギネ・ヤバニカ（ジャワネコブセンチュウ）、メロイドキネ・ハプラ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｈａｐｌａ）（キタネコブセンチュウ）およびメロイドギネ・アレナリア（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ａｒｅｎａｒｉａ）（ラッカセイネコブセンチュウ）などのメロイドギネ属、グロボデラ・ロストキエンシス（ゴールデンセンチュウ（ｇｏｌｄｅｎ ｎｅｍａｔｏｄｅ））およびグロボデラ・パリダ（ジャガイモシストセンチュウ）などのグロボデラ属の線虫、ディチレレンクス・デストラクタ（Ｄｉｔｙｌｅｌｅｎｃｈｕｓ ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ）（イモグサレセンチュウ）およびディチレレンクス・ディプサシ（Ｄｉｔｙｌｅｌｅｎｃｈｕｓ ｄｉｐｓａｃｉ）（ナミクキセンチュウ）などのディチレレンクス（Ｄｉｔｙｌｅｌｅｎｃｈｕｓ）属の線虫、プラティレンクス・ペネトランス（キタネグサレセンチュウ）、プラティレンクス・ファラックス（キクネグサレセンチュウ）、プラティレンクス・コフェアエ（ミナミネグサレセンチュウ）、およびプラティレンクス・ヴルヌス（クルミネグサレセンチュウ）などのプラティレンクス属の線虫、ヘテロデラ・グリシネス（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ ｇｌｙｃｉｎｅｓ）（ダイズシストセンチュウ）およびヘテロデラ・シャクトイイ（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ ｓｈａｃｈｔｏｉｉ））（サトウダイコンシストセンチュウ）などのヘテロデラ属の線虫、アフェレンコイデス・ベッシィ（Ａｐｈｅｌｅｎｃｈｏｉｄｅｓ ｂｅｓｓｅｙｉ）（イネシンガレセンチュウ）、アフェレンコイデス・リツェマボシ（Ａｐｈｅｌｅｎｃｈｏｉｄｅｓ ｒｉｔｚｅｍａｂｏｓｉ）（ハガレセンチュウ）、およびアフェレンコイデス・フラガリエアエ（Ａｐｈｅｌｅｎｃｈｏｉｄｅｓ ｆｒａｇａｒｉｅａｅ）（イチゴセンチュウ）などのアフェレンコイデス属の線虫、アフェレンチュス・アヴェナエ（Ａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓ ａｖｅｎａｅ）（菌食性線虫）などのアフェレンチュス属の線虫、ラドフォルス・シミリス（Ｒａｄｏｐｈｏｌｕｓ ｓｉｍｉｌｉｓ）（ネモグリセンチュウ）などのラドフォルス属の線虫、タイレンチュルス・セミペネトランス（Ｔｙｌｅｎｃｈｕｌｕｓ ｓｅｍｉｐｅｎｅｔｒａｎｓ）（ミカンネセンチュウ）などのタイレンチュルス属、ロティレンチュルス・レニフォルミス（Ｒｏｔｙｌｅｎｃｈｕｌｕｓ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（ニセフクロセンチュウ）などのロティレンチュルス属、またはブルサフェレンチュス・ザイロフィルス（Ｂｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓ ｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓ）（マツノザイセンチュウ）などの樹木に生じる線虫である。

本発明の第８および第９の態様の一実施形態では、場合により、先にまたは後に提供される実施形態のうちのいずれかと組み合わせて、該線虫は、メロイドギネ属から選択されるか、またはそれに代わるものとして、該線虫は、グロボデラ属である。

本発明の第８および第９の態様の実施形態では、場合により、先にまたは後に提供される実施形態のうちのいずれかと組み合わせて、該線虫は、メロイドギネ・インコグニタ、メロイドギネ・ヤバニカ、グロボデラ・ロストキエンシスおよびグロボデラ・パリダからなる群から選択されるか、またはそれに代わるものとして、該線虫は、メロイドギネ・インコグニタであるか、またはそれに代わるものとして、該線虫は、メロイドギネ・ヤバニカであるか、またはそれに代わるものとして、該線虫は、グロボデラ・ロストキエンシスであるか、またはそれに代わるものとして、該線虫は、グロボデラ・パリダである。

本発明では、「感染」という用語は、線虫によって引き起こされる植物の無症候性感染または症候性感染を含む。

本発明の第８または第９の態様の一実施形態では、場合により、先にまたは後に提供される実施形態のうちのいずれかと組み合わせて、防除は、いかなる植物においても行うことができる。

本明細書および特許請求の範囲を通して、「含む」という語および該語の変形は、他の技術的特徴、添加物、構成要素、またはステップを排除することを意図するものではない。さらに、「含む」という語は、「からなる」の場合を包含する。本発明の追加の目的、利点および特徴は、本明細書を検討する際に当業者に明らかとなるか、または本発明の実施によって習得され得る。以下の実施例および図面は、例示として提供されており、該実施例および図面は、本発明を制限することを意図するものではない。図面に関する、および特許請求の範囲内の括弧内にある参照符号は単に、特許請求の範囲の明瞭性を高めることを試みるためのものであり、特許請求の範囲を制限するものとは解釈されないものとする。さらに、本発明は、本明細書に説明する特定の好ましい実施形態のすべての可能な組み合わせを網羅する。

実施例１：Ｍ．エステルアロマティクムＢ２４株の特性評価

１．１ 種の識別：

材料および方法
Ｍ．エステルアロマティクムのＢ２４株を、アルメリア市（スペイン南部）からの有機農法体制下の農業土壌で分離した。細菌分離株の同定は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列分析を使用して達成した。

１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列決定を次に説明するとおり行った。１０μＬのＰｈｉｒｅ Ｇｒｒｅｅｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、０．８μＬのプライマー８ｆ １０μＭ（配列番号１）、０．８μＬのプライマー１４９２ｒ １０μＭ（配列番号２）、２μＬのテンプレート（栄養寒天プレートから採取し、５０μＬの滅菌蒸留水中に再懸濁し、９８℃で１０分間煮沸し、４℃に冷却した単一のコロニー）および６．４μＬのナノ純水からなるＰＣＲ反応ミックスを、以下のプログラム（直接ＰＣＲ）、すなわち９８℃５分、９８℃５秒と、５８．５℃５秒と、７２℃２０秒とを３５サイクル、および７２℃２０秒によって増幅した。ＰＣＲ産物を、ＥＺＮＡ Ｃｙｃｌｅ Ｐｕｒｅ Ｋｉｔ（Ｏｍｅｇａ Ｂｉｏ－Ｔｅｋ）を製造元の説明書によって使用して精製した。精製されたＰＣＲ産物を、プライマー１４９２ｒ（配列番号２）を使用する外部配列決定サービス（Ｓｅｃｕｇｅｎ）と、製造元の説明書によるＢｉｇＤｙｅ（登録商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ第３．１版（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用するＳａｎｇｅｒ法とによって配列決定した。配列決定により、いくつかのＭ．エステルアロマティクム株（ＮＣＢＩ受託番号ＭＧ７０５６７９．１、ＪＦ４９６４１６．１、ＪＦ４９６２６２．１、ＡＢ３５５７００．１、ＡＢ０９９６５８．１、ＡＢ０９９６５６．１；データベース受託日２０１８年１月１０日）の配列と１００％同一である配列（配列番号３）が明らかになった。

１．２ 酵素活性の特性評価

材料および方法
酵素活性は、ＡＰＩ（登録商標）ＺＹＭ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、スペイン国マドリッド市）を使用して、製造元の説明書に従って決定した。以下の酵素の活性を試験した（括弧内は該酵素の相応する基質）。すなわち、アルカリホスファターゼ（２－ナフチルホスファート）、エステラーゼＣ４（２－ナフチルブチラート）、エステラーゼリパーゼＣ８（２－ナフチルカプリラート）、リパーゼＣ１４（２－ナフチルミリスタート）、ロイシンアリールアミダーゼ（Ｌ－ロイシル－２－ナフチルアミド）、バリンアリールアミダーゼ（Ｌ－バリル－２－ナフチルアミド）、シスチンアリールアミダーゼ（Ｌ－シスチル－２－ナフチルアミド）、トリプシン（Ｎ－ベンゾイル－ＤＬ－アルギニン－２－ナフチルアミド）、α－キモトリプシン（Ｎ－グルタリル－フェニルアラニン－２－ナフチルアミド）、酸性ホスファターゼ（２－ナフチルホスファート）、ナフトール－ＡＳ－ＢＩ－ホスホヒドロラーゼ（ナフトール－ＡＳ－ＢＩ－ホスファート）、α－ガラクトシダーゼ（６－Ｂｒ－２－ナフチル－αＤ－グルコピラノシド）、βガラクトシダーゼ（２－ナフチル－βＤ－グルコピラノシド）、β－グルクロニダーゼ（ナフトール－ＡＳ－ＢＩ－βＤ－グルクロニド）、α－グルコシダーゼ（２－ナフチル－αＤ－グルコピラノシド）、β－グルコシダーゼ（６－Ｂｒ－２－ナフチル－βＤ－グルコピラノシド）、Ｎ－アセチル－β－グルコサミニダーゼ（１－ナフチル－Ｎ－アセチル－βＤ－グルコサミニド）、α－マンノシダーゼ（６－Ｂｒ－２－ナフチル－αＤ－マンノピラノシド）およびα－フコシダーゼ（２－ナフチル－αＬ－フコピラノシド）とした。

結果：
Ｂ２４は、ロイシンアリールアミダーゼ、α－グルコシダーゼおよびα－マンノシダーゼを産生した。１３個の陰性酵素反応があり、それゆえ、Ｂ２４は、アッセイ条件において他の試験酵素を産生しなかった。

１．３：シデロホア産生

材料および方法
いくつかの改変を加えたクロムアズロールＳ色素（ＣＡＳ）方法論（Ｓｃｈｗｙｎ Ｂ ａｎｄ Ｎｅｉｌａｎｄｓ Ｊ Ｂ 「Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｄｅｒｏｐｈｏｒｅｓ」 １９８７ Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ １６０（１）：４７－５６）を使用して、第二鉄イオンキレートの産生を検出した。ＣＡＳ溶液は、６０．５ｍｇのＣＡＳ粉末（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を５０ｍｌの蒸留水中に溶解することによって作製し、１０ｍｌのＦｅ（ＩＩＩ）溶液（１ｍＭのＦｅＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ、１０Ｍｍ ＨＣｌ）を添加した。撹拌下で、この溶液を７２．９ｍｇのヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＨＤＴＭＡ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）と緩徐に混合し、４０ｍｌの水中に溶解し、結果として得られた濃青色の溶液をオートクレーブ処理して滅菌し、暗所で保存した。

液体培地中でのＣＡＳアッセイを、以下の方法を実施して行った：９００μｌの一晩細菌培養物（ルリア・ベルターニ（ＬＢ）培地中、２８℃および２００ｒｐｍで生育）を、ガラス管内の１００μｌのＣＡＳアッセイ溶液と混合した。混合物を室温で３０分間インキュベートさせておき、非接種培地対照と比較した。

ＣＡＳ寒天アッセイを、以下の方法を実施して行った。一晩細菌培養物を、ＣＡＳ溶液の１／１０を含有するＫｉｎｇ Ｂプレート（２０ｇ／Ｌのカゼインペプトン、１．５ｇ／ＬのＫ_２ＨＰＯ_４、１．５ｇ／ＬのＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、１０ｍｌのグリセロール、および１５ｇ／Ｌの寒天）上で、２８℃で２４時間生育させた。

結果：
寒天培地および液体培地中でのＣＡＳアッセイの後、Ｂ２４がシデロホアを産生することができると判断された。両アッセイは、細菌株Ｂ２４とのインキュベーション後に濃青色から橙色への変化を示した（ＣＡＳ寒天アッセイでは、微生物コロニーの周りに形成された橙色のハローはシデロホア排出を示した）のに対し、シデロホアを産生しなかった他の細菌とのインキュベーション後には変化は観察されなかった。

１．４：バイオフィルム形成

材料および方法
この試験で使用した株は、Ｆｕｔｕｒｅｃｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ収集物由来の２つのＭ．エステルアロマティクム分離株、すなわち、本発明の株（Ｂ２４）およびＢ２５３８株と、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ）収集から購入した参照株であるＭ．エステロアロマティクムＤＳＭ８６０９株とからなった。

バイオフィルム形成を判定するために、各分離株の一晩培養物を回転式振盪器上で２８℃でＬＢ中で生育させた。翌日、培養物を新鮮なＬＢ中へと希釈して、０．１のＯＤ_６００を得た。滅菌した未処理９６ウェルマイクロタイタープレートに２００μＬの細菌懸濁液を接種し、２８℃で４８時間インキュベートした。バイオフィルムの定量前に、プレートリーダー（Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｐｌａｔｅｒ Ｒｅａｄｅｒ ＨＡＬＯ ＬＥＤ９６，Ｄｙｎａｍｉｃａ）を使用して、６２０ｎｍでの光学密度（ＯＤ_６２０）を測定することによって、各ウェルの細胞成長を概算した。バイオフィルムバイオマスの定量は、クリスタルバイオレット（ＣＶ）染色によって行った。簡単に説明すると、接着した細胞を含有するウェルを水で３回洗浄し、６０℃で１時間固定し、１５分間、２００μＬの０．１％ＣＶで染色した。染色したバイオフィルムを蒸留水ですすぎ、３７℃で３０分間乾燥させておき、次いで２００μＬの９５％エタノールで抽出した。バイオフィルムの量は、プレートリーダーを使用して、溶解したＣＶのＯＤ_６２０を測定することによって定量した。バイオフィルム形成（ＣＶのＯＤ_６２０）を細胞成長（ＯＤ_６２０）によって正規化し、相対的なバイオフィルム形成（培養物のＣＶ／ＯＤ_６２０のＯＤ_６２０）として報告した。

結果：
０．１％のＣＶによるバイオフィルム染色によって、Ｂ２４における高強度の死滅が明らかとなったが、Ｂ２５３８およびＤＳＭ８６０９は非常に低い強度を示し、いずれも陰性対照（微生物を含有していない培地）と同様であった。相対的なバイオフィルム形成は、次の通り、すなわち、Ｂ２４が０．３６、Ｂ２５３８が０．０５、およびＤＳＭ８６０９が０．００であった。それゆえ、Ｂ２４は、試験した他の細菌株よりも高いバイオフィルム形成を有していた。

１．５：成長のｐＨ条件

材料および方法
Ｂ２４株の２８℃での生育のｐＨ範囲を、異なるｐＨの栄養寒天（ＮＡ）（Ｓｃｈａｒｌａｂ－ＵＮＥ－ＥＮ１２７８０，ＥＮ ＩＳＯ１６２６６）プレートにおいて決定した。実験のために、Ｂ２４をまずＬＢ（５ｇ／Ｌの酵母エキス、１０ｇ／Ｌのトリプトン、１０ｇ／ＬのＮａＣｌ）中で一晩生育させた。その後、Ｂ２４を異なるｐＨ、すなわち、４、５、６、７、８、９および１０でＮＡプレート上に線条接種した。該プレートを２８℃で２４時間および４日間のインキュベーション後に読み取り、細菌細胞の成長を視覚的に評価した。

結果：
Ｍ．エステルアロマティクムＢ２４株は、ｐＨ５、６、７、８、９および１０において生育した。

１．６：Ｂ２４株の上清

材料および方法
培養条件：
Ｍ．エステルアロマティクムＢ２４株を、１４Ｌのバイオリアクタ内の液体培養培地ＴＳＢ中で、３０℃、２００～４５０ｒｐｍで１８時間生育させた。比較目的のために、Ｍ．エステルアロマティクム収集ＤＳＭ８６０９株を使用した。Ｂ２４株およびＤＳＭ８６０９株を、２５０ｍｌフラスコ内の１２５ｍｌの半強度ＴＳＢ培地中で生育させた。培養条件は、２８℃、２００ｒｐｍで２日間とした。インキュベーション後、遠心分離および０．２２μｍ孔径フィルタによる濾過によって、無細胞培養上清（ＣＳ）を得た。上清が細菌細胞を含んでいないことを確認するために、１００μｌの一定分量を栄養寒天（ＡＮ）上に播種し、２６℃で２日間インキュベートした後、生育がないことを確認した。

ネコブセンチュウであるメロイドギネに対するインビトロでの殺線虫活性；
線虫卵に対するＣＳ試料のインビトロでの殺線虫活性を、２ｇの予め滅菌した砂を入れた孵化チャンバ（Ｎｕｎｃｌｏｎ（商標）Ｓｕｒｆａｃｅ多重壁プレート，Ｎｕｎｃ，デンマーク）内で評価した。次いで、基材に、ウェルあたり５５０個の卵を含有する水性懸濁液（スペイン国ビラダカンス原産の５０％のＭ．ヤバニカと５０％のＭ．インコグニタとの混合物）を接種した。孵化チャンバを２６℃で２週間インキュベートし、ＣＳ試料を適用して７日後および１４日後に読み取りを行い、孵化率を決定した。（結果を通常の孵化率と比較するための参照を確立するために）各処理および滅菌蒸留水を用いた対照の４回の繰り返しを含めた。線虫卵の孵化の経過観察を７日目および１４日目に行った。

ＨＰＬＣ分析による無細胞培養上清（ＣＳ）の特性評価：
ＴＳＢ培地中で生育させたＢ２４およびＤＳＭ８６０９由来のＣＳ試料をＨＰＬＣ（ｅＡｌｌｉａｎｃｅシステム，Ｗａｔｅｒｓ，マサチューセッツ州ミルフォード町）によって分析した。クロマトグラムは、溶媒Ａ［Ｈ_２Ｏ＋０．０５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ］と溶媒Ｂ（ＣＨ_３ＣＮ＋０．０５％ＴＦＡ）との移動相混合物を用いて１ｍｌ／分で溶離するＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８逆相カラム（５μｍ４．６×１５０ｍｍ，Ｗａｔｅｒｓ）を用いて行った。溶離勾配は、０～１０％のＢで１０分、１０～４０％のＢで１０分、４０～１００％のＢで３分、１００％のＢで２分、０％のＢで５分とした。生成された代謝産物をホトダイオードアレー検出器を用いたＵＶ分光法によって検出し、クロマトグラムを２５４ｎｍでの処理によって得た。

無細胞培養上清の酵素活性と他のＭ．エステルアロマティクム株上清との比較：
Ｂ２４のＭ．エステルアロマティクム株およびＤＳＭ８６０９型の株に由来の無細胞培養上清からの酵素活性を、ポイント１．２で先に説明したとおり、ＡＰＩ－ＺＹＭ（登録商標）法を使用して評価した。株の培養および無細胞培養上清の取得は、本明細書で先に説明したとおり行った。

結果：
異なる処理を適用した２週間後、未処理卵（対照）の４０．９３％およびＴＳＢで処理した卵の３９．２２％が孵化した。対照的に、バイオリアクタおよびフラスコ内でそれぞれ生育させたＢ２４のＣＳで処理した後、卵の２９．７４％および２７．２５％のみが孵化した。それゆえ、対照に関して孵化を低減させるＢ２４のＣＳの有効性は、インビトロでの条件下で約３０％であった。

Ｂ２４によって産生されたＣＳで処理したネコブセンチュウ卵は、蒸留水またはＴＳＢ培地を用いた対照に関して卵孵化に対する有意な低減を示した。対照（蒸留水）に関して補正した、処理１４日後の有効性の百分率は、次の通りであった。すなわち、ＴＢＳ培地の４．１７％の有効性と比較して、バイオリアクタ内で得られたＢ２４由来のＣＳの２７．３４％の有効性、およびＤＳＭ８６０９（フラスコ）由来のＣＳの３．４６％の有効性と比較して、Ｂ２４（フラスコ）由来のＣＳの３３．４２％の有効性であった。それゆえ、Ｂ２４の同じ条件で生育させた収集株ＤＳＭ８６０９のＣＳの有効性はより低かった。それゆえ、Ｍ．エステルアロマティクムＢ２４株の上清は、殺線虫効果を有していた。

Ｂ２４およびＤＳＭ８６０９の異なるクロマトグラフィープロファイルは、各株が異なる代謝産物を産生することを示唆した（図９を参照されたい）。

ＡＰＩ－ＺＹＭ（登録商標）によれば、Ｂ２４によって産生されたＣＳは、Ｎ－アセチル－β－グルコサミニダーゼ、ロイシンアリールアミダーゼ、α－グルコシダーゼおよびα－マンノシダーゼを含有していた。Ｂ２４によって産生されたＣＳは、アルカリホスファターゼ、エステラーゼ（Ｃ４）、エステラーゼリパーゼ（Ｃ８）、リパーゼ（Ｃ１４）、バリンアリールアミダーゼ、シスチンアリールアミダーゼ、トリプシン、α－キモトリプシン、酸性ホスファターゼ、ナフトール－ＡＳ－ＢＩ－ホスホヒドロラーゼ、α－ガラクトシダーゼ、βガラクトシダーゼ、β－グルクロニダーゼ、β－グルコシダーゼおよびα－フコシダーゼを含有していなかった。

Ｂ２４は、ＴＳＢ培地中で生育させたとき、Ｎ－アセチル－β－グルコサミニダーゼを産生したのに対し、固体培地（ＡＮ）中では、（ポイント１．２に見られるように）この酵素を産生しなかった。

一方、ＤＳＭ８６０９によって産生されるＣＳは、ロイシンアリールアミダーゼ活性のみを示した。ＤＳＭ８６０９によって産生されたＣＳは、Ｎ－アセチル－β－グルコサミニダーゼ、α－グルコシダーゼおよびα－マンノシダーゼ、アルカリホスファターゼ、エステラーゼ（Ｃ４）、エステラーゼリパーゼ（Ｃ８）、リパーゼ（Ｃ１４）、バリンアリールアミダーゼ、シスチンアリールアミダーゼ、トリプシン、α－キモトリプシン、酸性ホスファターゼ、ナフトール－ＡＳ－ＢＩ－ホスホヒドロラーゼ、α－ガラクトシダーゼ、βガラクトシダーゼ、β－グルクロニダーゼ、β－グルコシダーゼ、およびα－フコシダーゼを含有していなかった。

これらの結果によれば、Ｂ２４およびＤＳＭ８６０９は、培地へ異なる代謝産物を産生しおよび遊離させることが実証された。いずれの株の上清も異なることが実証された。

１．７：他のミクロバクテリウム株との遺伝子比較

材料および方法
本発明のＢ２４株のゲノムを、Ｒｉｃｈｔｅｒ Ｍ，ｅｔ ａｌ．ＪＳｐｅｃｉｅｓＷＳ：ａ ｗｅｂ ｓｅｒｖｅｒ ｆｏｒ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｓｐｅｃｉｅｓ ｃｉｒｃｕｍｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｐａｉｒｗｉｓｅ ｇｅｎｏｍｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ．Ｂｉｏｉｎｆｏｍａｔｉｃｓ．２０１５ Ｎｏｖ １６．ｐｉｉ：ｂｔｖ６８１において説明されるＡＮＩｍを用いて、他のミクロバクテリウム種およびＭ．エステルアロマティクム株と比較した。ミクロバクテリウム種のうち、Ｍ．アルボレセンス（Ｍ．ａｒｂｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＤＳＭ２０７５４［Ｔ］、Ｍ．アザジラクタエ（Ｍ．ａｚａｄｉｒａｃｈｔａｅ）ＤＳＭ２３８４８［Ｔ］、Ｍ．フォリオルム（Ｍ．ｆｏｌｉｏｒｕｍ）ＤＳＭ１２９６６［Ｔ］、およびＭ．ジンセンジソリ（Ｍ．ｇｉｎｓｅｎｇｉｓｏｌｉ）ＤＳＭ１８６５９［Ｔ］などのＤＭＳＺ Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓのある特定の株を使用して比較を行った。他のＭ．エステルアロマティクム株との比較は、ＭＭ１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＰＤＶＯ０２）およびＢ Ｍｂ ０５．０１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＦＵＫＯ０１）のＭ．エステルアロマティクム株を用いて行った。

結果
ミクロバクテリウム属内で得られたＡＮＩｍ値は、Ｒｉｃｈｔｅｒら（２０１５）によると、約８４と、同じ属内で比較的低い値であった。

Ｍ．エステルアロマティクム株に関して、Ｂ２４およびＭＭ１のＡＮＩｍ値は８７．７１であり、Ｂ２４およびＢ Ｍｂ ０５．０１のＡＮＩｍ値は８４．７２であり、ＭＭ１およびＢ Ｍｂ ０５．０１のＡＮＩｍ値は８４．８０であった。

実施例２：ＲＫＮの卵に対するミクロバクテリウム・エステルアロマティクムＢ２４株のインビトロでの殺線虫活性

ＲＫＮ卵の混合物に対する細菌Ｍ．エステルアロマティクムＢ２４株のインビトロでの殺線虫能力を、参照化学物質（実施例２．１および実施例２．２）と比較して、または他のＭ．エステルアロマティクム株（実施例２．３）（１つはＤＳＭＺ収集物から、もう１つはＦｕｔｕｒｅｃｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＳＡの収集物から）と比較して評価した。

材料および方法
試験は、インキュベータ（ＩＮＣＵＢＩＧ ２８８Ｌ ２０００２３７，ＪＰ Ｓｅｌｅｃｔａ，スペイン）内の土壌条件を模倣するために暗所で行った。インキュベーション温度は、２６℃とした。

ＲＫＮ卵（Ｍ．ヤバニカおよびＭ．インコグニタ）の混合物（トマト植物培養物から得られたもの）に対する細菌Ｍ．エステルアロマティクムＢ２４株のインビトロでの殺線虫能力を、予め滅菌した砂２ｇを入れた孵化チャンバ（Ｎｕｎｃｌｏｎ（商標）Ｓｕｒｆａｃｅ多重ウェルプレート，Ｎｕｎｃ，デンマーク）内で評価した。次いで、基材に、上述のＲＫＮの卵を含有する水性懸濁液を接種した。すなわち、実施例２．１で１２０個の卵、実施例２．２で１２５個の卵、実施例２．３で４００個の卵とした。直後に、２００μｌの生物学的防除剤Ｍ．エステルアロマティクムＢ２４株を、実施例２．１では８．０×１０^８ＣＦＵ／ｍＬ、実施例２．２では３×１０^７ＣＦＵ／ｍＬ、および実施例２．３では５．２０×１０^７ＣＦＵ／ｍＬで施用した。

実施例２．１および実施例２．２では、商業上推奨される用量の参照化学物質を含有する対照（Ｎｅｍａｃｕｒ（登録商標）０．０１２５％、有効成分：フェナミホス２４％，Ｂａｙｅｒ）および滅菌蒸留水を含有する（結果を通常の孵化率と比較するための参照を確立するための）対照を含めた。

実施例２．３では、他の２つのＭ．エステルアロマティクム株と比較した。すなわち、Ｍ．エステルアロマティクムＤＳＭＺ８６０９（２．０３×１０^７ＣＦＵ／ｍＬで施用）およびＭ．エステルアロマティクムＢ２５３８株（Ｆｕｔｕｒｅｃｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（６．２０×１０^７ＣＦＵ／ｍＬで施用）とした。

孵化チャンバを２６℃で３週間インキュベートし、生物学的防除剤を適用した７、１４、および２１日後に（実施例２．１および実施例２．２で）または７日後および１４日後に（実施例２．３で）定期的な読み取りを行って、孵化率（計数は、Ｈａｗｋｓｌｅｙ（登録商標）チャンバ、顕微鏡ＯＰＴＥＣＨ ＢＩＯＳＴＡＲ Ｂ４，Ｏｐｔｅｃｈ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ドイツによって行った）を決定した。各処理を６回繰り返した。

結果：
実施例２．１：
Ｍ．エステルアロマティクムＢ２４株を用いて処理したＭ．ヤバニカおよびＭ．インコグニタの卵は、対照に関して卵孵化に対する有意な低減を示した（図１）。

異なる処理を適用した３週間後、未処理卵（対照）の２７．３８％が孵化したのに対し、Ｍ．エステルアロマティクムＢ２４株で処理したものの５．３７％が孵化し、Ｎｅｍａｃｕｒ（登録商標）（参照化学物質）で処理したものの２．５０％が孵化した。処理後２１日目に、Ｍ．エステルアロマティクムＢ２４株は、インビトロでの条件下で対照に関して孵化を低減させる上で８０．３６％の有効性に達した。孵化を低減させる上での有効性は、９０．８６％の孵化を低減させる上での有効性を有した参照化学物質（Ｎｅｍａｃｕｒ（登録商標））と類似していた（統計学的有意差はなかった）。

実施例２．２：
Ｍ．エステルアロマティクムＢ２４株を用いて処理したＭ．ヤバニカおよびＭ．インコグニタの卵は、対照に関して孵化に対する有意な低減を示した（図２）。

異なる処理を適用した３週間後、未処理卵（対照）の３５．８９％が孵化したのに対し、Ｍ．エステルアロマティクムＢ２４株で処理したものの１４．５７％が孵化し、Ｎｅｍａｃｕｒ（登録商標）（参照化学物質）で処理したものの３．９９％が孵化した。それゆえ、Ｍ．エステルアロマティクムＢ２４株は、インビトロでの条件下で対照に関して孵化を低減させる上で５９．４０％の有効性に達したのに対し、参照化学物質では、孵化を低減させる上での有効性は８８．８９％であり、すなわち、本発明の微生物物体（Ｍ．エステルアロマティクムＢ２４株）によって達成される低減よりも高かったが、Ｎｅｍａｃｕｒ（登録商標）処理とＭ．エステルアロマティクムＢ２４株処理との間で統計的な差は観察されなかった。

実施例２．３：
Ｍ．エステルアロマティクムＢ２４株を用いて処理したＭ．ヤバニカおよびＭ．インコグニタの卵は、対照、Ｂ２５３８株および参照株ＤＳＭＺ８６０９に関して孵化に対する有意な低減を示した（図３）。

異なる処理を適用した２週間後、未処理卵（対照）の３８．４６％が孵化したのに対し、Ｍ．エステルアロマティクムＢ２４株で処理したものの２０．８９％、Ｍ．エステルアロマティクムＤＳＭＺ８６０９株で処理したものの３５．２６％、およびＭ．エステルアロマティクムＢ２５３８株で処理したものの３２．２３％が孵化した。それゆえ、Ｍ．エステルアロマティクムＢ２４株は、インビトロでの条件下で対照に関して孵化を低減させる上で４５．６９％の有効性に達したのに対し、参照株（ＤＳＭＺ８６０９）は、８．３２％の有効性を表し、Ｂ２５３８株は１６．２０％の有効性を示した。

実施例３：ＲＫＮの幼虫（Ｊ２）に対するミクロバクテリウム・エステルアロマティクムＢ２４株のインビトロでの殺線虫活性

細菌Ｍ．エステルアロマティクムＢ２４株のインビトロでの殺線虫能力を、ＲＫＮ Ｍ．ヤバニカおよびＭ．インコグニタの幼虫（Ｊ２）の混合物に対して評価した。

材料および方法：
試験は、インキュベータ（ＩＮＣＵＢＩＧ ２８８Ｌ ２０００２３７，ＪＰ Ｓｅｌｅｃｔａ，スペイン）内の土壌条件を模倣するために暗所で行った。インキュベーション温度は、２６℃とした。ＲＫＮのＭ．ヤバニカおよびＭ．インコグニタ幼虫（感染性幼虫期（Ｊ２））の混合物をトマト植物において培養を促進し形成し、これらを孵化チャンバ（Ｎｕｎｃｌｏｎ（商標）Ｓｕｒｆａｃｅ多重ウェルプレート，Ｎｕｎｃ，デンマーク）に入れ、その中に予め滅菌した土壌２ｇを入れた。２つの実験を行った。

実施例３．１：
Ｍ．ヤバニカ＋Ｍ．インコグニタの２２５個の幼虫形態の混合物を含有する水性懸濁液を供給し、次いで、２００μＬの生物学的防除剤であるＭ．エステルアロマティクムＢ２４株を１．４０×１０^７ＣＦＵ／ｍＬまたは２．１０×１０^６ＣＦＵ／ｍＬで施用した。各処理を６回繰り返した。

実施例３．２：
言及された線虫種の２７５個の幼虫形態（それらの混合物）を含有する水性懸濁液を供給し、次いで、Ｍ．エステルアロマティクムの３つの異なる株を異なる用量で施用した。すなわち、Ｍ．エステルアロマティクムＢ２４株を５．２０×１０^７ＣＦＵ／ｍＬで施用し、Ｍ．エステルアロマティクムＤＳＭＺ８６０９を２．０３×１０^７ＣＦＵ／ｍＬで施用し、Ｍ．エステルアロマティクムＢ２５３８株を６．２０×１０^７ＣＦＵ／ｍＬで施用した。実験計画は、１回の処理あたり３回の繰り返しからなった。

いずれの場合（実施例３．１および実施例３．２）でも、孵化チャンバを２６℃で１４日間インキュベートし、７日後および１４日後にＨａｗｋｓｌｅｙ（登録商標）チャンバによって計数を行い、生幼虫数（％生存）を決定した（顕微鏡ＯＰＴＥＣＨ ＢＩＯＳＴＡＲ Ｂ４、Ｏｐｔｅｃｈ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ドイツ）。滅菌蒸留水を用いた陰性対照を含めた。

結果：
実施例３．１：
Ｍ．エステルアロマティクムＢ２４株で処理したＲＫＮ幼虫は、最大用量（１．４０×１０^７ｃｆｕ／ｍＬ）で施用したとき、対照に関して幼虫の生存率に対する有意な低減を示した（図４）。

異なる処理を適用した２週間後、幼虫（陰性対照）の８６．７５％が生存していたのに対し、２．１０×１０^６ＣＦＵ／ｍＬで施用されたＭ．エステルアロマティクムＢ２４株で処理したものの７０．４６％が生存しており、１．４０×１０^７でＭ．エステルアロマティクムＢ２４株で処理したものの２１．３９％が生存していた。それゆえ、Ｍ．エステルアロマティクムＢ２４株は、１．４０×１０^７ＣＦＵ／ｍＬの濃度で施用したとき、インビトロでの条件下で対照に関して幼虫の生存率を低減させる上で７５．３４％の有効性に達したのに対し、２．１０×１０^６ＣＦＵ／ｍＬの用量で施用したとき、幼虫を低減させる上での有効性は約１８．７８％であった。それゆえ、最大用量（１．４０×１０^７ＣＦＵ／ｍＬ）で施用したとき、本発明の微生物物体（Ｍ．エステルアロマティクムＢ２４株）によって達成される有効性の間に統計学的な差があった。

実施例３．２：
Ｍ．エステルアロマティクムＢ２４株を用いて処理した幼虫は、Ｂ２５３８株および参照株ＤＳＭＺ８６０９に関して幼虫の生存に対する有意な低減を示した（図５）。

異なる処理を適用した２週間後、未処理の幼虫（対照）の８７．９７％が生存していたのに対し、Ｍ．エステルアロマティクムＢ２４株で処理したものの６１．４２％が生存しており、Ｍ．エステルアロマティクムＤＳＭＺ８６０９株で処理したものの７８．７５％およびＭ．エステルアロマティクムＢ２５３８株で処理したものの８１．１７％が生存していた。それゆえ、Ｍ．エステルアロマティクムＢ２４株は、インビトロでの条件下で対照に関して幼虫の生存を低減させる上で３０．１９％の有効性に達したのに対し、参照株（ＤＳＭＺ８６０９）は、１０．４９％の有効性を表し、Ｂ２５３８株は７．７３％の有効性を示した。

実施例４：ジャガイモシストセンチュウの卵に対するミクロバクテリウム・エステルアロマティクムＢ２４株のインビトロでの殺線虫活性

ジャガイモシストセンチュウ（ＰＣＮ）のグロボデラ・ロストキエンシスおよびグロボデラ・パリダの卵に対する細菌Ｍ．エステルアロマティクムＢ２４株のインビトロでの殺線虫能力を評価した。

材料および方法
試験は、インキュベータ（ＩＮＣＵＢＩＧ ２８８Ｌ ２０００２３７，ＪＰ Ｓｅｌｅｃｔａ，スペイン）内の土壌条件を模倣するために暗所で行った。インキュベーション温度は、２６℃とした。予め滅菌した砂２ｇを入れた孵化チャンバ（Ｎｕｎｃｌｏｎ（商標）Ｓｕｒｆａｃｅ多重ウェルプレート，Ｎｕｎｃ，デンマーク）を用いた。

グロボデラのシストは、Ｆｅｎｗｉｃｋ Ｃａｎ（浮選法）を使用して外部寄生土壌から得た。シストを２％漂白剤で２分間消毒し、滅菌蒸留水ですすいだ。次いで、内側からグロボデラ卵を放出するために、シストを機械的に破砕した。インビトロでの試験は、各４回の繰り返しによる３種類の処理からなっていた。すなわち、１）対照卵、２）Ｍ．エステルアロマティクムＢ２４株（７×１０^７ＣＦＵ／ｍＬ）で処理した卵、３）市販用量の０．２％で適用した化学物質対照（Ｖｙｄａｔｅ（登録商標），オキサミル２４％，ＤｕＰｏｎｔ）。

３２５個の卵を各ウェルに入れた。次いで、卵を孵化させるために、ウェルあたり１０％ジャガイモ根拡散液（ＰＲＤ）溶液４．５ｍＬを添加した。

ＰＲＤを調製するために、Ｋｅｎｎｅｂｅｃ品種のジャガイモの芽を、滅菌基材（泥炭／バーミキュライト、１／１（ｖ／ｖ））を含有するトレイ内に播種した。発芽したジャガイモを気候室内に３週間放置した。次いで、３週齢の植物の根を２５℃で２４時間、滅菌蒸留水中に浸漬した。２４時間後、根に接触させた蒸留水を遠心分離し（４０００ｒｐｍ、１５分）、濾過し（２２μｍ）、必要になるまで冷凍庫内で保存した。

ＰＲＤを添加したら、７．７０×１０^７ＣＦＵ／ｍＬの濃度のＭ．エステルアロマティクムＢ２４株の溶液を添加した（２００μＬ／ウェル）。孵化チャンバは、評価期間を通して２６℃に維持した。試験読み取りを１４、２８および３５日目に（Ｈａｗｋｓｌｅｙ（登録商標）カンバ（ｃａｍｂｅｒ）を使用して）行い、新たな１０％ＰＲＤ１ｍＬを毎週添加した。

結果
Ｍ．エステルアロマティクムＢ２４株を用いて処理した卵は、対照に関して孵化に対する有意な低減を示した（図６）。

Ｍ．エステルアロマティクムＢ２４株で処理して３５日後の有効性の百分率は、参照として使用した対照に関して補正して６０．１８％であったのに対し、化学物質対照では有効性の百分率は３１．９０％であった。

実施例５：ＰＣＮのシストに対するミクロバクテリウム・エステルアロマティクムＢ２４株のインビトロでの殺線虫活性

材料および方法
ＰＣＮであるグロボデラ・ロストキエンシスおよびグロボデラ・パリダのシスト（両種各５０％の混合物）に対する細菌Ｍ．エステルアロマティクムＢ２４株のインビトロでの殺線虫活性を、孵化チャンバ（Ｎｕｎｃｌｏｎ（商標）Ｓｕｒｆａｃｅ多重ウェルプレート，Ｎｕｎｃ，デンマーク）内で評価した。試験は、インキュベータ（ＩＮＣＵＢＩＧ ２８８Ｌ ２０００２３７，ＪＰ Ｓｅｌｅｃｔａ，スペイン）内で暗所で行った。

グロボデラシストを、Ｆｅｎｗｉｃｋ缶を使用して外部寄生土壌から得（浮選法）、次いで、実施例４において説明されるように消毒したが、機械的に破砕しなかった。ＰＲＤは、先のバイオアッセイ（実施例４）において説明した通りに得た。

実施例５．１：第１のインビトロでの試験は、各４回の繰り返しによる３種類の処理からなっていた。

すなわち、１）対照シスト（未処理）、
２）化学標準物質（Ｖｙｄａｔｅ（登録商標）、市販用量０．２％、オキサミル２４％で適用，ＤｕＰｏｎｔ）で処理した対照シスト、および
３）技術等級の有効成分（７×１０^７ＣＦＵ／ｍＬのＴＧＡＩ）としてのＭ．エステルアロマティクムＢ２４株で処理したシスト（ＴＧＡＩを水で希釈）とした。

実施例５．２：第２のインビトロでの試験は、各４回の繰り返しによる３種類の処理からなっていた。

すなわち、１）対照シスト（未処理）、
２）化学標準物質（Ｖｙｄａｔｅ（登録商標）、オキサミル２４％，市販用量０．２％で適用、ＤｕＰｏｎｔ）で処理した対照シスト、および
３）１％で適用されたＭ．エステルアロマティクムＢ２４株製剤ＯＤで処理したシストであり、フォミュレーション（Ｆｏｍｕｌａｔｉｏｎ）は、ダイズ植物油（Ｇｕｓｔａｖｅ Ｈｅｓｓ，ドイツ）７００ｇ／Ｌ＋シリカ（Ｓｉｌｙｓｉａｍｏｎｔ，イタリア）（１０ｇ／Ｌ）＋Ｃ１８エトキシ化脂肪酸（Ｌａｍｂｅｒｔｉ－Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｐｅｃｉａｌｉｓｔ，イタリア）（２００ｇ／Ｌ）＋ポリアクリラートクロスポリマー６（Ｃｒｏｄａ Ｅｕｒｏｐｅ Ｌｔｄ．英国）（１０ｇ／Ｌ）＋ＴＧＡＩ（本発明の株）（８０ｇ／Ｌ）の混合物からなっていた。材料を、油用に設計された高速撹拌器を使用して、実験用反応器内で混合した。

ＴＧＡＩ中の本発明の株は、１．２～１．３×１０^１１ＣＦＵ／ｇの濃度であり、そこで、ＯＤ製剤中で８％で使用する場合、該製剤内では２．１９×１０^１０ＣＦＵ／ｍＬであった。

いずれの実施例でも、各ウェル内に５個のシストを入れた。次いで、卵を孵化させるために、ウェルあたり１０％ＰＲＤ溶液４．５ｍＬを添加した。ＰＲＤを添加したら、７．７０×１０^７ＣＦＵ／ｍＬの濃度のＭ．エステルアロマティクムＢ２４株の溶液をウェルあたり２００μＬで実施例５．１に注ぎ、Ｍ．エステルアロマティクムＢ２４株製剤ＯＤを１％で適用した溶液をウェルあたり２００μＬで注入し、実施例５．２に注いだ。孵化チャンバは、評価期間を通して２６℃に維持した。試験読み取りを１４、２８および３５日目に（Ｈａｗｋｓｌｅｙ（登録商標）チャンバを使用して）行い、新たな１０％ＰＲＤ１ｍＬを毎週添加した。

結果
ＴＧＡＩ Ｍ．エステルアロマティクムＢ２４株（実施例５．１．）またはＭ．エステルアロマティクムＢ２４株の製剤ＯＤ１％（実施例５．２．）で処理した卵は、対照に関して孵化に対する有意な低減を示した（それぞれ図７および図８）。

ＴＧＡＩ Ｍ．エステルアロマティクムＢ２４株で処理して３５日後の有効性の百分率は、参照として使用した対照に関して補正して７７．９２％であったのに対し、化学物質対照では有効性の百分率は３５．７２％であった。

Ｍ．エステルアロマティクムＢ２４株の製剤ＯＤ１％で処理して３５日後の有効性の百分率は、参照として使用した対照に関して補正して７５．７２％であったのに対し、化学物質対照では有効性の百分率は２６．０４％であった。

実施例６：ＲＫＮに対するミクロバクテリウム・エステルアロマティクムＢ２４株のインビトロでの殺線虫活性

トマト植物においてＭ．エステルアロマティクムＢ２４株を「ペレットとして（実施例６．１）、ＴＧＡＩとして（実施例６．２）および製剤されたプロトタイプとして（実施例６．３）使用して、３つの実施例を実施した。これらのすべてについての結果をこの節の最後に表す。キュウリ植物においてＭ．エステルアロマティクムＢ２４株を使用する実施例は、実施例６．４において開示されている。

材料および方法
６．１ ミクロバクテリウム・エステルアロマティクムＢ２４株の「ペレット」のインビボでの殺線虫活性

細菌Ｍ．エステルアロマティクムＢ２４株のインビボでの殺線虫能力を、Ｍ．ヤバニカ＋Ｍ．インコグニタに対して気候室内での２つの実験において評価した。実験計画は、２つの異なる処理によって構成されていた。すなわち、１）未処理の植物を用いた対照、２）「ペレット」として施用されたＭ．エステルアロマティクムＢ２４株の懸濁液で処理された植物である。各処理は、１回の複製物につき３つの植物を用いた３回の複製物からなっていた。

ペレットを以下のようにして得た。Ｂ２４株の凍結試料１ｍＬ（凍結バイアル、－８０℃）を融解させ、１００ｍＬフラスコ内のトリプシン分解ダイズブロス（ＴＳＢ）中で３日間、おおよそ３０℃で生育させた。これを遠心分離し、残ったペレット（微生物自体）を本アッセイにおいて試験した。

実施例６．１．１
３～４週齢の１８個のトマト苗（「マルマンデ」品種）を、砂とパーライトとの混合物（３：１（ｖ：ｖ））からなる基材を充填した１０００ｃｍ３の鉢へと植え替えた。植え替えの翌日、すべてのトマト植物に、ネコブセンチュウＭ．ヤバニカ＋Ｍ．インコグニタを含有する水懸濁液（１００ｃｍ３の基材につき、１００匹の外部寄生幼虫の用量）を接種した（１０００匹の幼虫／植物は、両方の線虫の添加の合計であり、該幼虫はトマト植物から得た）。植物の半分を、Ｍ．エステルアロマティクムＢ２４株を含有する２０ｍＬの水溶液で２回処理し、第１に、１．００×１０^７ＣＦＵ／ｍＬの用量で７ＤＡＩ（線虫接種後の日数）、第２に、１．０３×１０^７ＣＦＵ／ｍＬの用量で２１ＤＡＩとした（後の表３にあり、それぞれ処理Ａおよび処理Ｂと称する）。

実施例６．１．２
３～４週齢の１８個のトマト苗（「マルマンデ」品種）を、砂とパーライトとの混合物（３：１（ｖ：ｖ））からなる基材を充填した１０００ｃｍ３の鉢へと植え替えた。植え替え（予防的処置）の３日前に、該植物の１／３を、２．１３×１０^８ＣＦＵ／ｍＬの用量でＭ．エステルアロマティクムＢ２４を含有する１０ｍＬの水溶液で処理した。植え替えの翌日、すべてのトマト植物に、ネコブセンチュウＭ．ヤバニカ（１００ｃｍ３の基材あたり１００匹の外部寄生幼虫の用量）を含有する水懸濁液を接種した。次に、線虫（７ＤＡＩ）を接種した７日後に、Ｍ．エステルアロマティクムＢ２４株を含有する水溶液２０ｍＬを該植物の１／３に、４．９×１０^７ＣＦＵ／ｍＬの用量で施用した。後の表３では、それぞれ処理Ａおよび処理Ｂと称する。

いずれの実験でも（６．１．１および６．１．２）、該植物を気候室（温度２２±２℃、相対湿度（ＲＨ）：５０±１０内に、苗を植え替えしてから１０週間設置した。

実施例６．２：ＲＫＮに対するミクロバクテリウム・エステルアロマティクムＢ２４株「ＴＧＡＩ」のインビボでの殺線虫活性

細菌Ｍ．エステルアロマティクムＢ２４株のインビボでの殺線虫能力を、両方ともＭ．ヤバニカおよびＭ．インコグニタの混合物（トマト植物から入手）に対する温室試験における２つの実験、すなわち実施例６．２．１および実施例６．２．２で評価した。

実験計画は、２つの異なる処理によって構成されていた。すなわち、１）未処理の植物を用いた対照、２）実施例６．２．１では平均７．８８×１０^７ｃｆｕ／ｍＬ、実施例６．２．２では平均１．５５×１０^８の用量で、ＴＧＡＩ（バイオリアクタ内での発酵から入手）としてのＭ．エステルアロマティクムＢ２４株の懸濁液で処理した植物とした。３つの処理は、１回の複製物につき３つの植物を用いた３回の複製物からなっていた。

３～４週齢の１８個のトマト苗（「ドゥリンタ」品種）を、砂と（３：１（体積：体積））との混合物からなる基材を充填した３０００ｃｍ^３の鉢へと植え替えた。植え替えの翌日、すべてのトマト植物に、ＲＫＮメロイドギネ・ヤバニカ＋メロイドギネ・インコグニタ（１００ｃｍ^３の基材あたり１００匹の外部寄生幼虫の用量）（該線虫の混合物とし、５０％のメロイドギネ・ヤバニカ（Ｆｕｔｕｒｅｃｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製のコード「ＡＬ０５」の集団）＋５０％のメロイドギネ・インコグニタ（Ｆｕｔｕｒｅｃｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製のコード「ＡＬ０９」の集団）とし、これら２つの集団は、スペイン国アルメリア市で分離した）。

植え替えの３日前に、植物の半数を、後の表１に示される特定の用量のＭ．エステルアロマティクムＢ２４株を含有する１０ｍＬの水溶液で１回処理した（予防処理）。次に、線虫（７ＤＡＩ）を接種した７日後に、２１ＤＡＩに、および３５ＤＡＩに、Ｍ．エステルアロマティクムＢ２４株を含有する水溶液２０ｍＬを同じ植物に、表１に示される用量で施用した。実験６．２．１および実験６．２．２は、異なる用量を受けた。

いずれの実験でも（６．２．１および６．２．２）、該植物を温室（温度２５±２℃、相対湿度（ＲＨ：５０±１０）内に、苗を植え替えしてから９週間設置した。

実施例６．３：ＲＫＮに対するミクロバクテリウム・エステルアロマティクムＢ２４株「製剤されたプロトタイプ」のインビボでの殺線虫活性

細菌Ｍ．エステルアロマティクムＢ２４株に基づく殺線虫製剤のインビボでの殺線虫能力を、トマト植物における温室試験での２つの実験（実施例６．３．１および実施例６．３．２において評価し、いずれもＭ．ヤバニカとＭ．インコグニタとの混合物（トマト植物から入手）に対するものとした。

実験計画は、２つの異なる処理によって構成されていた。すなわち、１）未処理の植物を用いた対照、２）実施例６．３．１では平均６．４３×１０^７ｃｆｕ／ｍＬの用量の「製剤」（製剤－１０^７）または実施例６．３．２では平均２．３０×１０^７ＣＦＵ／ｍＬの用量の「製剤」（製剤－１０^７）として施用された細菌Ｍ．エステルアロマティクムＢ２４株の懸濁液で処理した植物とした。いずれの処理も、１回の複製物につき３つの植物を用いた３回の複製物からなっていた。フォミュレーションは、ダイズ植物油（Ｇｕｓｔａｖｅ Ｈｅｓｓ，ドイツ）７００ｇ／Ｌ＋シリカ（Ｓｉｌｙｓｉａｍｏｎｔ，イタリア）（１０ｇ／Ｌ）＋Ｃ１８エトキシ化脂肪酸（Ｌａｍｂｅｒｔｉ－Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｐｅｃｉａｌｉｓｔ，イタリア）（２００ｇ／Ｌ）＋ポリアクリラートクロスポリマー６（Ｃｒｏｄａ Ｅｕｒｏｐｅ Ｌｔｄ．英国）（１０ｇ／Ｌ）＋ＴＧＡＩ（本発明の株）（８０ｇ／Ｌ）の混合物からなっていた（ＴＧＡＩ中の本発明の株は、１．２～１．３×１０^１１ＣＦＵ／ｇの濃度であり、そこで、ＯＤ製剤で８％で使用される場合、該製剤では１×１０^１０ＣＦＵ／ｍＬであった）。材料を、油用に設計された高速撹拌器を使用して、実験用反応器内で混合した。

３～４週齢の１８個のトマト苗（「ドゥリンタ」品種）を、砂とパーライトとの混合物（３：１（体積：体積））との混合物からなる基材を充填した３０００ｃｍ^３の鉢へと植え替えた。植え替えの翌日、すべてのトマト植物に、ネコブセンチュウであるメロイドギネ・ヤバニカ（１００ｃｍ^３の基材あたりおおよそ１００匹の外部寄生幼虫（２種類の線虫の混合物とした）の用量）を含有する水懸濁液を接種した。植物の２つの異なるセットが存在した。植物の半分は未処理（対照植物）とした。植物のもう半数を、植え替え当日に後の表２に示される用量のＭ．エステルアロマティクムＢ２４株に基づく製剤の１％を含有する２０ｍＬの水溶液で１回処理した（予防処理）。次に、線虫（７ＤＡＩ）を接種した７日後に、２１ＤＡＩに、および３５ＤＡＩに、Ｍ．エステルアロマティクムＢ２４株に基づく製剤の１％を含有する水溶液２０ｍＬを植物の同じ半数に、各実験について後の表２に示される用量で施用した。

いずれの実験でも（６．３．１および６．３．２）、該植物を温室（温度２５±２℃、相対湿度（ＲＨ：５０±１０）内に、苗を植え替えしてから９週間設置した。

すべての実験（実験６．１、実験６．２および実験６．３）について、バイオアッセイの終了時に、植物あたりの卵の総数および根１グラムあたりの卵を各処理において決定した。これらを機械的破壊によって根性系から抽出し、２００メッシュ（７５μｍ）～５００メッシュ（２５μｍ）の異なるふるいに通した。卵をＨａｗｋｓｌｅｙ（登録商標）チャンバ内の顕微鏡ＯＰＴＥＣＨ ＢＩＯＳＴＡＲ Ｂ４（Ｏｐｔｅｃｈ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ドイツ）で可視化した。

植え替えの１０週間後または９週間のすべての処理において、卵／植物の数の平均におけるＰｆおよび線虫の生殖（卵の個数／新鮮な根のグラム）を評価した（「ペレット」の場合、１０週間とし、ＴＧＡＩおよびＯＤ製剤の場合は９週間とした）。

処理を行った後のすべての場合で、データを、Ｒソフトウェア（Ｒ Ｃｏｒｅ Ｔｅａｍ，２０１３，オーストリア）を使用して分散分析（ＡＮＯＶＡ）に供した。処理間の有意差を、Ｐ≦０．０５での最小有意差（ＬＳＤ）検定によって決定した。

実施例６．１（「ペレット」）、実施例６．２（ＴＧＡＩ）および実施例６．３（製剤されたプロトタイプ）の結果

３つの製剤中のＭ．エステルアロマティクムＢ２４株で処理したＲＫＮは、すべての場合において対照に関して両パラメータで有意な低減を示した（後の表３を参照されたい）。生殖に対する有効性は、該株が根１グラムあたりのいずれの場合でも与えられたので、処理間でより類似していたのに対し、最終集団に対する有効性は植物によって測定された（ここで、根性系の発達間の差が繰り返し間の差をもたらし得る）。本アッセイで得られた結果は、ペレットとして、ＴＧＡＩとして、または１％ＯＤ用量で適用されたＭ．エステルアロマティクムＢ２４株に基づく製剤が、ＲＫＮに対して殺線虫活性を有することを示した。

実施例６．４：キュウリ植物におけるＲＫＮに対するミクロバクテリウム・エステルアロマティクムＢ２４株のインビボでの殺線虫活性

材料および方法
キュウリ植物における細菌Ｍ．エステルアロマティクムに基づく殺線虫製剤のインビボでの殺線虫能力を評価した。実施例６．３で使用したものと同様の材料および方法を使用したが、実施例外は、「ダッシャー」品種のキュウリを使用し、処理あたり６本の植物（ブロックあたり２本および３つの複製物）を後の表４に示す用量で使用したことであった。化学標準物質ＳＯＮＤＡＥ（有効成分オキサミル１０％，ＳＡＰＥＣ ＡＧＲＯ）を使用した（後の表５を参照されたい）。

結果
キュウリ植物で行われたインビボでの実験は、最終集団に対する良好な有効性および生殖に対する有効性を示し、Ｍ．エステルアロマティクムＢ２４株で処理したＲＫＮは、対照に関して両パラメータで有意な低減を示した（後の表５を参照されたい）。

実施例７：Ｍ．エステルアロマティクムＢ２４株の経口毒性の評価

Ｍ．エステルアロマティクムＢ２４株が安全であるかどうかを決定するために、マウスにおけるその経口毒性を試験した。

材料および方法：
４～５週齢の３匹の雄および３匹の雌のＢａｌｂ／Ｃマウス（ＱＣ’ｄ ａｌｂｉｎｏ病原体非含有マウス，Ｅｎｖｉｇｏ）を使用した。動物は、投与前に一晩絶食させた。実験の前日に、動物の体重を記録し、個々の動物から糞便試料を収集した。各動物は、Ｍ．エステルアロマティクムＢ２４株：１０^９ＣＦＵ Ｂ２４ ＴＧＡＩ（ビヒクルは２００μｌの滅菌Ｈ_２Ｏ）（実施例５．１ですでに説明した通り調製）の経口単回用量を１回受けた。滅菌水（ビヒクル対照）を受けたマウスはまた、試験全体を通して維持された。マウスを、制御された環境下に収容し、２１日間監視し、観察を記録した。毎日１回、各動物について以下を観察した。すなわち、皮膚および体毛、眼および粘膜、呼吸器系、循環器系、自律神経系および中枢神経系、身体運動活動、行動パターン、振戦、痙攣、下痢、嗜眠、唾液分泌、ならびにもしあれば昏睡の観察とした。個々の動物の体重を、週１回、強制飼養の前後で調べた。組織中の細菌株の有無を評価するために、経口強制飼養後２１日目の終了時に剖検を行った。いかなる交差汚染も回避するために、組織収集および血液培養を無菌的に行った。

剖検：腎臓、脳、肝臓、肺、脾臓、血液および腸リンパ節を各動物から収集し、直ちにドライアイス中で保持し、さらなる処理まで－２０℃で保存した。先の組織からＲＮＡを抽出し、ＲＴ－ＰＣＲを行って、特異的プライマー：「Ｍ ｅｓｔｅｒａ Ｆ１」，（配列番号４）、「Ｍ ｅｓｔｅｒａ Ｒ１」，（配列番号５）、「Ｍ ｅｓｔｅｒａ Ｆ２」，（配列番号６）、および「Ｍ ｅｓｔｅｒａ Ｒ２」（配列番号７）を用いて、Ｂ２４ ＴＧＡＩ（１６Ｓ ｒＲＮＡ）の存在を決定した（増幅の特異性を確保するために２つのプライマー対を使用し、Ｒ：逆方向プライマー、Ｆ：順方向プライマーとした）。

血液処理：剖検時に、無菌全血試料を各動物から収集した。収集直後に、各血液試料１００μｌを寒天プレート上に置いて延展し、２８℃で１２０時間維持した。細菌のいかなる成長も評価するために、プレートを定期的に分析した。

微生物性有害生物防除剤（ＭＰＣＡ）のクリアランス：投与時ならびに７、１４および２１日目の糞便収集物を、さらなるＲＮＡ抽出およびＲＴ－ＰＣＲ分析のために４℃に保持した。

血液／細菌培養培地：食肉抽出物１ｇ、酵母抽出物２ｇ、ペプトン５ｇ、ＮａＣｌ５ｇおよび寒天１５ｇを入れ（１０００ｍｌ用）、１２１℃で２０分間滅菌し、その後、プレートへと注ぎ、血液培養およびＢ２４ＴＧＡＩ ＣＦＵ／ｇの測定のために使用した。ＲＮＡ抽出プロトコル：５０ｍｇの組織を製造元の説明書に従ってＲＮＡ抽出に使用した（ＲＮＡ単離キットＺｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，カタログ番号Ｒ１０５０）。

スパイク対照：１００μｌの１０９ＣＦＵのＢ２４ＴＧＡＩを、５０ｍｇの脳および肝臓組織でスパイクし、製造元の説明書（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）によってＱｕｉｃｋ ＲＮＡキット全ＲＮＡ抽出キットを使用することによって全ＲＮＡを抽出し、細菌ＲＮＡをはじめとする全ＲＮＡを単離するために、上述のキットに含まれるプロテイナーゼＫおよびリゾチーム消化ステップを加えた。

陽性対照：０．２ｇのＢ２４ ＴＧＡＩを滅菌水中で７回連続希釈し、播種し（１００μｌ）、ＣＦＵ／ｇ試料を再確認した。寒天プレート上で生育した細菌コロニーを収集し、全ＲＮＡ抽出のためにおよび試験の陽性対照として直接使用した。

ｃＤＮＡ合成：組織および糞便からの全ＲＮＡをマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ）において測定した。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＶ 第１の鎖合成キット（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カタログ番号１８０９１０５０）を用いることによって、全ＲＮＡ２μｇ（糞便試料の場合は１μｇ）をｃＤＮＡ合成に使用した。適切な陽性（Ｂ２４ ＴＧＡＩ）および陰性対照（Ｈ_２Ｏ）も維持した。

ＲＴ－ＰＣＲアッセイ：合計２０μｌのｃＤＮＡ混合物を１：１０倍希釈（組織試料）および１：５倍希釈（糞便試料ｃＤＮＡ）し、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＳｔｅｐＯｎｅ（商標）リアルタイムＰＣＲ装置を備えた製造元の説明書（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カタログ番号Ａ２５７７６）により、ＰｏｗｅｒＵｐ ＳＹＢＲ（商標）Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを用いて、ＲＴ－ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、５μＬのＰｏｗｅｒＵｐ（商標）ＳＹＢＲ（商標）Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、０．５μＬの各特異的プライマー（Ｆ１およびＲ１、またはＦ２およびＲ２）、およびテンプレートとしての１０ｎｇのｃＤＮＡからなり、総反応体積は２０μＬとした。熱サイクル条件は以下の通りであった。すなわち、５０℃で２分、９５℃で２分、および９５℃で１５秒と、６０℃で１５秒と、７２℃で１分とを４０サイクルとした。

結果：
対照およびＭ．エステルアロマティクムＢ２４強制飼養動物からの体重は有意に異ならなかった。２８度で１２０時間インキュベートした血液培養プレートは、目に見える成長がなく、陰性と結論付けられた。監視された臨床症状は、有害な変化を明らかにしなかった。ＲＴ－ＰＣＲデータにより、１６ｓｒＤＮＡ特異的プライマーは、Ｍ．エステルアロマティクムＢ２４強制飼養動物由来の組織試料および糞便試料のいずれにおいても増幅されないことが明らかになった（平均Ｃｔ値３３）。Ｍ．エステルアロマティクム特異的プライマーを陽性対照とともに使用して、Ｍ．エステルアロマティクムＢ２４ＴＧＡＩでスパイクした組織試料を増幅した（脳については平均スパイクＣｔ値１２、および肝臓については１７）。陰性対照（水を強制飼養）は、ＲＴ－ＰＣＲにおいて増幅しなかった（平均Ｃｔ値３０）。陽性対照の１６ｓ ｒＤＮＡプライマーは、サイクル６で増幅した（Ｃｔ値６）。本データにより、特異的ＲＴ－ＰＣＲプライマーを使用してスクリーニングした試料のいずれにおいても、Ｍ エステルアロマティクムＢ２４が存在しないことが明らかになった。

動物は目に見える臨床的有害作用を有さず、感染性または病原性は見られなかった。Ｍ．エステルアロマティクムＢ２４株の強制飼養動物は目に見える臨床的有害作用を有さず、細菌株は、検査した血液、糞便または他の器官で検出されなかった。

本願で引用された参照文献

Sturz AV and Kimpinski J “Endoroot bacteria derived from marigolds (Tagetes spp.) can decrease soil population densities of root-lesion nematodes in the potato root zone” 2004 Plan and Soil 262:241-249.
Sambrook J and Russell DW "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" Chapter 13 "Mutagenesis" Cold Spring Harbor, 3rd Ed, 2001.
Schwyn B and Neilands J B "Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores." 1987 Anal Biochem 160(1): 47-56.
Altschul et al., “Basic local alignment search tool”, 1990, J. Mol. Biol, v. 215, pages 403-410.
Higgins et al., “CLUSTAL V: improved software for multiple sequence alignment”, 1992, CABIOS, 8(2), pages 189-191.
Richter M, et al. JSpeciesWS: a web server for prokaryotic species circumscription based on pairwise genome comparison. Bioinformatics. 2015 Nov 16. pii: btv681.
Aubert et al., “A Markerless Deletion Method for Genetic Manipulation of Burkholderia cenocepacia and Other Multidrug-Resistant Gram-Negative Bacteria” Methods Mol Biol 2014;1197:311-27.

完全を期すために、本願発明の種々の面を以下の番号の項に提示する。

第１項．スペイン微生物株保護機関（ＣＥＣＴ）に寄託された受託番号ＣＥＣＴ９１６７のミクロバクテリウム・エステルアロマティクム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｓｔｅｒａｒｏｍａｔｉｃｕｍ）の株、またはその突然変異体であって、該突然変異体が、ミクロバクテリウム・エステルアロマティクムのＣＥＣＴ９１６７を出発材料として使用して得られ、ＣＥＣＴ９１６７の殺線虫効果を維持する、ミクロバクテリウム・エステルアロマティクムの株、またはその突然変異体。
第２項．第１項に記載の株またはその突然変異体を含む細菌培養物であって、好ましくは前記細菌培養物が接種製品である、細菌培養物。
第３項．有効量の第１項に記載のミクロバクテリウム・エステルアロマティクムのＣＥＣＴ９１６７株もしくはその突然変異体、または第２項に記載の細菌培養物と、１つ以上の農業上許容され得る化合物と、を含む、組成物。
第４項．前記株が、１０^５ＣＦＵ／ｍｌ～１０^１２ＣＦＵ／ｍｌの濃度で存在する、第３項に記載の組成物。
第５項．前記農業上許容され得る化合物が、植物強化剤、栄養素、湿潤剤、付着を改善する化合物、緩衝化合物、安定剤、酸化防止剤、浸透圧保護剤および日焼け止め剤からなる群から選択される、第３または４項に記載の組成物。
第６項．少なくとも１つの追加の農薬を含む、第３～５項のいずれか一項に記載の組成物。
第７項．油性成分、好ましくは植物油、好ましくはダイズ油を含む、第３～６項のいずれか一項に記載の組成物。
第８項．ダイズ油、Ｃ１８エトキシ化脂肪酸、シリカおよびポリアクリラートクロスポリマーを含む、第３～７項のいずれか一項に記載の組成物。
第９項．ＣＥＣＴ９１６７株をＤＮＡ組換え技術、好ましくは突然変異誘発に供するステップを含む、ＣＥＣＴ９１６７の殺線虫効果を維持するＭ．エステルアロマティクムのＣＥＣＴ９１６７株の突然変異体を得る方法。
第１０項．（ｉ）前記株を適切な培養培地中に接種することと、（ｉｉ）ステップ（ｉ）の前記接種した培養培地を前記株の成長に適した条件に供することと、（ｉｉｉ）場合により、ステップ（ｉｉ）から結果として得られた前記培地を濃縮ステップに供することと、を含む、第１項に記載のミクロバクテリウム・エステルアロマティクムのＣＥＣＴ９１６７株またはその突然変異体に由来する生細胞懸濁液を得るためのプロセス。
第１１項．（ｉ）前記株を適切な培養培地中に接種することと、（ｉｉ）該接種した培養培地を適切な成長条件に供することと、（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）の培養培地から細胞を分離することと、（ｉｖ）上清を回収することと、（ｖ）場合により、上清を濃縮ステップに供することと、を含むプロセスによって得ることができる、定義された第１項としてのＭ．エステルアロマティクムのＣＥＣＴ９１６７株またはその突然変異体に由来する、上清。
第１２項．有効量の第１項に記載のＭ．エステルアロマティクムのＣＥＣＴ９１６７株もしくはその突然変異体、または第２項に記載の細菌培養物、第３～８項のいずれか一項に記載の組成物、または第１１項に記載の上清を含む、キット。
第１３項．植物における線虫感染を防除するための、第１項に記載のミクロバクテリウム・エステルアロマティクムのＣＥＣＴ９１６７株もしくはその突然変異体、または第２項に記載の細菌培養物、または第３～８項のいずれか一項に記載の組成物、または第１１項に記載の上清、または第１２項に記載のキットの、使用。
第１４項．植物の一部か、または前記植物を成長させるために使用される基材に、請求項１もしくは２に記載のミクロバクテリウム・エステルアロマティクムのＣＥＣＴ９１６７株もしくはその突然変異体、または請求項３に記載の細菌培養物、または第３～８項のいずれか一項に記載の組成物、または第１１項に記載の上清、または第１２項に記載のキットを適用することを含む、植物における線虫によって発生する感染症を防除するための方法。
第１５項．前記線虫が、メロイドギネ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ）属およびグロボデラ（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ）属から選択され、またはそれに代わるものとして、前記線虫が、メロイドギネ・インコグニタ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｉｎｃｏｇｎｉｔａ）、メロイドギネ・ヤバニカ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｊａｖａｎｉｃａ）、グロボデラ・ロストキエンシス（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ ｒｏｓｔｏｃｈｉｅｎｓｉｓ）およびジャガイモシロシストセンチュウ（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ ｐａｌｌｉｄａ）からなる群から選択される、第１３項に記載の使用または請求項１４項に記載の方法。

Claims (20)

1. スペイン微生物株保護機関（ＣＥＣＴ）に寄託された受託番号ＣＥＣＴ９１６７のミクロバクテリウム・エステルアロマティクム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｓｔｅｒａｒｏｍａｔｉｃｕｍ）の株。
2. ミクロバクテリウム・エステルアロマティクムのＣＥＣＴ９１６７株の殺線虫効果を維持し、且つミクロバクテリウム・エステルアロマティクムのＣＥＣＴ９１６７株と少なくとも９９．８％のゲノム配列同一性を有する、ミクロバクテリウム・エステルアロマティクムのＣＥＣＴ９１６７株の突然変異体。
3. 請求項１に記載の株または請求項２に記載の突然変異体を含む、細菌培養物。
4. 植物における線虫によって引き起こされる感染を防除するのに有効量の、請求項１に記載のミクロバクテリウム・エステルアロマティクムのＣＥＣＴ９１６７株もしくは請求項２に記載の突然変異体、または請求項３に記載の細菌培養物と、１つ以上の農業上許容され得る化合物と、を含む、植物における線虫によって引き起こされる感染を防除するための組成物。
5. 前記株又は突然変異体が、１０^５ＣＦＵ／ｍｌ～１０^１２ＣＦＵ／ｍｌの濃度で存在する、請求項４に記載の組成物。
6. 前記農業上許容され得る化合物が、植物強化剤、栄養素、湿潤剤、付着を改善する化合物、緩衝化合物、安定剤、酸化防止剤、および浸透圧保護剤からなる群から選択される、請求項４または５のいずれか一項に記載の組成物。
7. 少なくとも１つの追加の農薬を含む、請求項４～６のいずれか一項に記載の組成物。
8. 油性成分を含む、請求項４～７のいずれか一項に記載の組成物。
9. 前記油性成分が植物油である、請求項８に記載の組成物。
10. 前記植物油がダイズ油である、請求項９に記載の組成物。
11. ダイズ油、Ｃ１８エトキシ化脂肪酸、シリカおよびポリアクリラートクロスポリマーを含む、請求項４～１０のいずれか一項に記載の組成物。
12. （ｉ）前記株又は突然変異体を適切な培養培地中に接種することと、（ｉｉ）ステップ（ｉ）の前記接種した培養培地を前記株又は突然変異体の成長に適した条件に供することと、を含む、請求項１に記載のミクロバクテリウム・エステルアロマティクムのＣＥＣＴ９１６７株または請求項２に記載の突然変異体に由来する生細胞懸濁液を得るためのプロセス。
13. 更に、（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）から結果として得られた前記培地を濃縮ステップに供することを含む、請求項１２に記載のプロセス。
14. （ｉ）前記株又は突然変異体を適切な培養培地中に接種することと、（ｉｉ）該接種した培養培地を適切な成長条件に供することと、（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）の培養培地から細胞を分離することと、（ｉｖ）上清を回収することと、を含むプロセスによって得ることができ、殺線虫活性を有する、請求項１に記載のＭ．エステルアロマティクムのＣＥＣＴ９１６７株または請求項２に記載の突然変異体の上清。
15. 前記プロセスが更に、（ｖ）上清を濃縮ステップに供することを含む、請求項１４に記載の上清。
16. 植物における線虫によって引き起こされる感染を防除するのに有効量の、請求項１に記載のＭ．エステルアロマティクムのＣＥＣＴ９１６７株もしくは請求項２に記載の突然変異体、請求項３に記載の細菌培養物、請求項４～１１のいずれか一項に記載の組成物、または請求項１４若しくは１５に記載の上清を含む、植物における線虫によって引き起こされる感染を防除するためのキット。
17. 植物における線虫感染を防除するための、請求項１に記載のミクロバクテリウム・エステルアロマティクムのＣＥＣＴ９１６７株もしくは請求項２に記載の突然変異体、請求項３に記載の細菌培養物、請求項４～１１のいずれか一項に記載の組成物、請求項１４若しくは１５に記載の上清、または請求項１６に記載のキットの、使用。
18. 植物の一部か、または前記植物を成長させるために使用される基材に、請求項１に記載のミクロバクテリウム・エステルアロマティクムのＣＥＣＴ９１６７株もしくは請求項２に記載の突然変異体、請求項３に記載の細菌培養物、請求項４～１１のいずれか一項に記載の組成物、請求項１４若しくは１５に記載の上清、または請求項１６に記載のキットを適用することを含む、植物における線虫によって発生する感染症を防除するための方法。
19. 前記線虫が、メロイドギネ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ）属およびグロボデラ（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ）属から選択される、請求項１７に記載の使用または請求項１８に記載の方法。
20. 前記線虫が、メロイドギネ・インコグニタ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｉｎｃｏｇｎｉｔａ）、メロイドギネ・ヤバニカ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｊａｖａｎｉｃａ）、グロボデラ・ロストキエンシス（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ ｒｏｓｔｏｃｈｉｅｎｓｉｓ）およびジャガイモシロシストセンチュウ（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ ｐａｌｌｉｄａ）からなる群から選択される、請求項１７に記載の使用または請求項１８に記載の方法。