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JP7466875B2 - Ｓｐａｒｃを発現する癌の治療用組成物 - Google Patents

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Description

特許法第３０条第２項適用 （１） 行為時の権利者であり、発明者であるコン ウク カン、ミュン グン ソンおよびチョ ロン パクは、令和２（２０２０）年１０月２６日に、本発明のＳＰＡＲＣを発現する癌の治療用組成物をＩｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．２０２０，２１，７９３２にて公開した。
本発明は、ＳＰＡＲＣを発現する癌の治療用組成物に関する。
現在、神経膠腫の標準的な治療法は外科的切除術である。しかし、全ての神経膠腫は時々機能的な脳領域に位置するので、完全に除去することは困難である。
抗がん化学療法は、一般的に人体に毒性副作用を誘発し、経済的負担も大きい高コストの治療法である。そのため、副作用を減らして薬効を最大化する製剤を設計するための開発が進められており、薬物－タンパク質複合体がその代表的な形態に該当する。
シスプラチンは白金素材の薬物であり、抗がんに有効であることが知られている。しかし、細胞毒性による問題や、血液－脳関門を通過できず、脳腫瘍の治療用途には使用できない問題があった。また、ＨＳＡに結合したＣＤＤＰ（ＨＳＡ－ＣＤＤＰ）は、治療的に不活性であることが知られている。
さらに、アルブミン結合タンパク質である神経膠腫におけるＳＰＡＲＣの高い発現にもかかわらず、神経膠腫の治療薬としての薬物送達ＨＳＡの妥当性は十分に研究されていない。
韓国公開特許第２０１６－００５１９９５号
本発明は、ＳＰＡＲＣ（Secreted Protein Acidic and Rich in Cysteine）を発現する癌の治療用組成物を提供する。
１．アルブミンおよびそれに結合した１つ以上のシスプラチンを含むＳＰＡＲＣ（Secreted Protein Acidic and Rich in Cysteine）を発現する癌の治療用組成物。
２．前記項目１において、前記アルブミンに１～５つの前記シスプラチンが結合したものである、癌の治療用組成物。
３．前記項目１において、前記アルブミンに４つの前記シスプラチンが結合したものである、癌の治療用組成物。
４．前記項目３において、前記アルブミンに４つの前記シスプラチンが結合した結合体の分子量は６５，０００～７０，０００Ｄａである、癌の治療用組成物。
５．前記項目３において、前記アルブミンに４つの前記シスプラチンが結合した結合体の大きさは５ｎｍ～１００ｎｍである、癌の治療用組成物。
６．前記項目１において、前記シスプラチンは、前記アルブミン表面のＨｉｓ側鎖残基またはＭｅｔ側鎖残基に結合したものである、癌の治療用組成物。
７．前記項目６において、前記シスプラチンに前記アルブミン表面のＨｉｓ１０５またはＨｉｓ２８８が結合したものである、癌の治療用組成物。
８．前記項目６において、前記シスプラチンに前記アルブミン表面のＭｅｔ２９８、Ｍｅｔ３２９またはＭｅｔ５４８が結合したものである、癌の治療用組成物。
９．前記項目６において、前記結合は配位結合によるものである、癌の治療用組成物。
１０．前記項目１において、前記ＳＰＡＲＣを発現する癌は、脳腫瘍、黒色腫、乳癌、大腸癌および胃癌からなる群より選択される１つ以上である、癌の治療用組成物。
１１．前記項目１０において、前記癌は前記脳腫瘍である、癌の治療用組成物。
１２．前記項目１１において、前記脳腫瘍は神経膠腫である、癌の治療用組成物。
１３．前記項目１２において、前記神経膠腫は、星状細胞腫、膠芽細胞腫、および乏突起膠腫からなる群より選択される１つ以上である、癌の治療用組成物。
本発明の組成物を用いることにより、抗癌治療薬の血液循環時間を向上させることができる。
本発明の組成物を用いることにより、抗癌治療薬の細胞毒性および腎毒性を減少させることができる。
本発明の組成物は、ＳＰＡＲＣを発現する癌の標的化に優れ、抗癌治療薬の癌細胞蓄積効果に優れる。
図１は、ＨＳＡ－ＣＤＤＰ（ヒト血清アルブミン－シスプラチン）の細胞取り込み（cellular uptake）の結果を示す。図１（ａ）は、細胞における細胞取り込みの代表的な画像である。ＨＳＡ－ＣＤＤＰ取り込みにおけるＳＰＡＲＣ依存性を観察するために、ＳＰＡＲＣ（exogenous secreted protein acidic and rich in cysteine）を処理した（スケールバー、５０μｍ）。図１（ｂ）は、細胞におけるＦＮＲ６４８－ＨＳＡの細胞取り込み定量化を示す。図１（ｃ）は、ＦＮＲ６４８－ＨＳＡ－ＣＤＤＰ細胞における細胞取り込み定量化を示す。データは平均ＳＤ（ｎ＝５）で示す。＊＊＊ｐ＜０．００１。 図２は、Ｕ８７ＭＧおよびＵ８７ＭＧ－ｓｈＳＰＡＲＣ細胞におけるＣＤＤＰおよびＨＳＡ－ＣＤＤＰの細胞毒性を示す。図２（ａ）は、Ｕ８７ＭＧおよびＵ８７ＭＧ－ｓｈＳＰＡＲＣ細胞におけるＣＤＤＰの細胞毒性を示す。図２（ｂ）は、Ｕ８７ＭＧおよびＵ８７ＭＧ－ｓｈＳＰＡＲＣ細胞におけるＨＳＡ－ＣＤＤＰの細胞毒性を示す（各濃度に対してｎ＝５）。各化合物は７２時間処理された。 図３は、ＨＳＡ－ＣＤＤＰの細胞毒性を確認した結果である。ＣＤＤＰおよびＨＳＡ－ＣＤＤＰの細胞死を分析した。ＣＤＤＰまたはＨＳＡ－ＣＤＤＰは、細胞で７２時間処理された。各濃度は、図２のｃｃｋ－８の結果において生きている細胞の３０～４０％に基づく。赤い数字は、各図のより小さいフォント数の合計である各グループの総細胞死の細胞の割合を意味する。 図４は、Ｕ８７ＭＧおよびＵ８７ＭＧ－ｓｈＳＰＡＲＣ細胞におけるＣＤＤＰおよびＨＳＡ－ＣＤＤＰの細胞死を分析した結果である。図４（ａ）はＣＤＤＰ、図４（ｂ）はＨＳＡ－ＣＤＤＰを、各濃度が異なるようにして細胞に７２時間処理した結果を示す。 図５は、異種移植腫瘍モデルにおけるＨＳＡ－ＣＤＤＰの抗腫瘍効果を示す。図５（ａ）はＵ８７ＭＧ、図５（ｂ）はＵ８７ＭＧ－ｓｈＳＰＡＲＣの腫瘍体積を示す。異種移植腫瘍マウスにおいて、図５（ｃ）はＵ８７ＭＧ、図５（ｄ）はＵ８７ＭＧ－ｓｈＳＰＡＲＣのマウスの重量を示す。腫瘍モデルにおいて、図５（ｅ）はＵ８７ＭＧ、図５（ｆ）はＵ８７ＭＧ－ｓｈＳＰＡＲＣに対するカプラン・マイヤー（Kaplan－Meier）生存曲線を示す。データは平均ＳＤで示す。＊＊＊ｐ＜０．００１。 図６は、ＩＣＰ－ＭＳを用いて、マウスにおけるＨＳＡ－ＣＤＤＰの生体分布を分析した結果である。ＣＤＤＰまたはＨＳＡ－ＣＤＤＰは、治療と同様な方法に（隔日、７回）治療した。図６（ａ）は、臓器及び血液におけるＣＤＤＰの蓄積を示す。図６（ｂ）は、腫瘍におけるＣＤＤＰの蓄積を示す（％ＩＤ；Percent injected dose、注射された容量の割合）。全ての臓器および腫瘍は、最後の薬物処理７２時間後に収集された。データは平均ＳＤ（ｎ＝４）で示す。＊ｐ＜０．０５。 図７は、マウスにおけるＨＳＡ－ＣＤＤＰの生物学的な安全性の分析結果を示す。図７（ａ）は、アスパラギン酸アミノ基転移酵素（Aspratate tranaminase、AST）、アラニンアミノ基転移酵素（alanine aminotransferase、ALAN）、血中尿素窒素（blood urea nitrogen、BUN）及びクレアチニンの体重および血清濃度を示す。図７（ｂ）は、腎臓、肝臓および脾臓におけるヘマトキシリン・エオジン（hematoxylin-eosin、Ｈ＆Ｅ）を用いた臓器染色の画像である。ＣＤＤＰで処理されたマウスの腎臓では、腎臓の尿細管変性（黒矢印）および上皮空泡化（黄矢印）が観察された（スケールバー、腎臓および肝臓用１００μｍ、脾臓用２００μｍ）。 図８は、腎組織のＴＵＮＥＬ分析画像を示す。図８（ａ）は２００倍の画像（スケールバー、１００μｍ）である。図８（ｂ）は、４００倍の画像（スケールバー、５０μｍ）である。黒矢印はＴＵＮＥＬ陽性領域を示す。 図９は、ＨＳＡ－ＣＤＤＰの血清安定性および生体分布画像である。図９（ａ）は、インビトロＨＳＡ－ＣＤＤＰの血清安定性を示す。図９（ｂ）は、腫瘍異種移植モデルにおいて、［１７７Ｌｕ］標識されたＨＳＡ－ＣＤＤＰのＳＰＥＣＴ画像を示す。
本発明は、アルブミン及びそれに結合した１つ以上のシスプラチンを含むＳＰＡＲＣ（Secreted Protein Acidic and Rich in Cysteine）を発現する癌の治療用組成物に関するものである。
アルブミンは血漿などに多くある球状の単純タンパク質であり、血漿に存在するアルブミンを血漿アルブミン（plasma albumin）という。アルブミンは生体細胞や体液中に広く分布しているが、血漿アルブミンは血漿のグロブリンとともに細胞と血漿の基礎物質を構成する。人体を構成するタンパク質の５０～６０％程度がアルブミンであり、浸透調節によって血液と体内の水分量を調節するなどの重要な役割を果たすことができる。
前記アルブミンのうちのヒト血清アルブミン（human serum albumin、ＨＳＡ）は、血液中に存在する内因性および外因性リガンドの送達および配置に重要な役割を果たすことができる。
本発明において、アルブミンはＳＰＡＲＣ結合部位とシスプラチン結合部位を含むので、ＳＰＡＲＣおよびシスプラチンと結合することができる。この場合、前記ＳＰＡＲＣまたは前記シスプラチンの結合により、他の結合部位の結合に影響を及ぼさない。
シスプラチン（Cisplatin、cis－diamminedichloroplatinum（II）、CDDP）は、固形がんに広く使用されている化学療法薬の１つである。シスプラチンは、血清中で最も豊富な血漿タンパク質であるヒト血清アルブミン（human serum albumin、HSA）に結合することができる。
ＳＰＡＲＣ（Secreted Protein Acidic and Rich in Cysteine）は、いくつかの癌において高度に発現されるアルブミンと結合できるタンパク質であり、細胞－マトリックス相互作用、増殖、生存および移動を調節する機能を果たすことができる。
本発明において、前記アルブミンと薬物が結合した結合体は、アルブミン－シスプラチン結合体であってもよい。例えば、ＨＳＡ－ＣＤＤＰ（ヒト血清アルブミン－シスプラチン）結合体であってもよい。
本発明において、アルブミン、またはアルブミンと薬物が結合した結合体は、血液－脳関門（ＢＢＢ）の表面に存在するタンパク質（例えば、グリコプロテイン６０（ＧＰ６０）など）と結合することができる。
本発明において、アルブミンにシスプラチンが結合した結合体は、血液－脳関門（ＢＢＢ）を通過することができる。
本発明において、アルブミン、またはアルブミンと薬物が結合した結合体は、ＢＢＢを通過した後、内部の脳腫瘍細胞が過剰発現するＳＰＡＲＣタンパク質をターゲットにして結合することができる。
本発明において、アルブミン、またはアルブミンと薬物が結合した結合体は、ＳＰＡＲＣによって媒介される受動的標的化および能動的標的化によって腫瘍に蓄積することができる。例えば、アルブミン、またはアルブミンと薬物が結合した結合体は、ＥＰＲ（Enhanced Permeability and Retention）効果によって腫瘍に蓄積することができる。
本発明において、アルブミン、またはアルブミンと薬物が結合した結合体を含む組成物は、ＳＰＡＲＣを発現する癌の標的治療に使用することができる。例えば、ＨＳＡ－ＣＤＤＰ結合体は、脳の残存神経膠腫の除去に使用することができる。
本発明において、ＨＳＡ－ＣＤＤＰ結合体は細胞内移入によって細胞に取り込まれ、細胞内でＨＳＡ－ＣＤＤＰ結合体が分解され、ＨＳＡから遊離ＣＤＤＰ状態に放出できる。
本発明において、ＨＳＡ－ＣＤＤＰ結合体を形成する場合には、排泄およびＯＣＴ２によって媒介されるＣＤＤＰの腎臓蓄積が減少し得る。
本発明において、アルブミンにはシスプラチンが１つ以上結合することができる。例えば、前記アルブミンに１～１０個、１～５個、または１～４個のシスプラチンが結合することができるが、これらに限定されるものではない。
本発明において、１つのアルブミンに４つのシスプラチンが結合することができ、前記アルブミンはヒト血清アルブミンであってもよい。
本発明において、アルブミンにシスプラチンが結合した結合体の分子量は、６５，０００～７０，０００Ｄａであってもよく、例えば６６，５００～６８，０００Ｄａであってもよい。
本発明において、アルブミンにシスプラチンが結合した結合体の大きさは、５ｎｍ～１００ｎｍであってもよく、例えば７ｎｍ～１０ｎｍであってもよい。
シスプラチンのアルブミンへの結合位置は特に限定されず、例えば、アルブミン表面のＨｉｓ側鎖残基またはＭｅｔ側鎖残基などであってもよい。
本発明において、前記シスプラチンは、前記アルブミン表面のＨｉｓ１０５、Ｈｉｓ２８８、Ｍｅｔ２９８、Ｍｅｔ３２９、またはＭｅｔ５４８側鎖残基と結合することができる。
本発明において、ＨＳＡへのＣＤＤＰの結合は不可逆的であってもよく、例えば、前記シスプラチンと前記アルブミンは配位結合によって結合体を形成することができる。
本発明の組成物は、従来、抗癌効果が公知のシスプラチンを含んでいるので、シスプラチンが薬効を示すことが知られている癌は、いずれも治療対象に該当し得る。
本発明の組成物において、シスプラチンはアルブミンに結合し、その結合体が癌細胞または組織が発現するＳＰＡＲＣに結合してその癌をターゲットにすることができる。そのため、ＳＰＡＲＣを発現する癌に使用する場合、より有用な効果を示すことができる。
その適用対象であるＳＰＡＲＣを発現する癌は、脳腫瘍、黒色腫、乳癌、大腸癌または胃癌であってもよく、他にもＳＰＡＲＣを発現することが知られている癌種はいずれも適用対象になり得る。本発明において、ＳＰＡＲＣを発現する癌は脳腫瘍であってもよい。本発明において、ＳＰＡＲＣは神経膠腫、黒色腫または乳癌において高濃度で発現され得る。
本発明において、前記脳腫瘍は神経膠腫であってもよく、例えば、星状細胞腫、膠芽細胞腫、または乏突起膠腫であってもよいが、これらに限定されるものではない。
本発明において、星状細胞腫（Astrocytic Tumor）は、星状細胞から発生し、周囲の正常組織との境界が明確ではない浸潤性腫瘍である。前記星状細胞腫は、発生位置、年齢、成長速度、浸潤性、形態学的形状、臨床経過などが非常に多様である。
前記星状細胞腫は、その悪性度によって、以下のように陽性のグレード１から最も悪性のグレード４に分類することができる。
グレード１：毛様細胞性星状細胞腫（pilocytic astrocytoma）
グレード２：びまん性星状細胞腫
グレード３：退形成性星状細胞腫（anaplastic astrocytoma）
グレード４：膠芽細胞腫（glioblastoma）
脳腫瘍の重症度が高いほど、ＳＰＡＲＣの発現程度が増加することが知られているので（例えば、脳腫瘍細胞の近くでＳＰＡＲＣの濃度が増加する。）、本発明の組成物は、重症度の高い脳腫瘍に適用した場合に、より高いターゲット能を示すことができる。
本発明において、乏突起膠腫（Oligodendroglial Tumor）は、中枢神経系の髄鞘を形成し維持する乏突起膠細胞（希突起膠細胞）で発生する腫瘍である。本発明において、前記乏突起膠腫は星状細胞腫と混合された混合膠腫の形態であってもよい。
本発明において、脳腫瘍が形成された細胞は神経膠細胞であってもよい。前記神経膠細胞は星状膠細胞（Astrocyte）、ミクログリア（microglia）、乏突起膠細胞（希突起膠細胞、Oligodendroglia）、上衣細胞（ependymal cell）、シュワン細胞（Schwann's cell）、または神経節膠細胞（Capsular cell）であってもよいが、これらに限定されるものではない。
以下、実施例及び実験例を挙げて本発明を具体的に説明することとする。
１．材料および方法
１．１．細胞株（cell lines）
ヒト神経膠腫細胞（Ｕ８７ＭＧ）としては、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection、ATCC；Manassas、VA、USA）および低ＳＰＡＲＣ発現Ｕ８７ＭＧ細胞であるＵ８７ＭＧ－ｓｈＳＰＡＲＣを用いた。
細胞を１０％熱不活性化ウシ胎児血清（FBS、Fetal bovine serum；Gibco、Grand Island、NY、USA）及びペニシリン／ストレプトマイシンを含む１％抗生物質（米国ニューヨーク州グランドアイランドのＧｉｂｃｏ）が補充された最少必須培地（MEM、Minimum essential medium；Invitrogen、Grand Island、NY、USA）で育成した。全ての細胞は、５％ＣＯ２で加湿された大気（atmosphere）中で３７℃に維持した。
１．２．ＣＤＤＰ結合ＨＳＡの製造
ヒト血清アルブミン（MP biomedicals、Irvine、CA、USA）を２２ｍｇ／ｍＬの濃度でＰＢＳに溶解した。ＣＤＤＰ（Sigma－Aldrich、St.Louis、MO、USA）をＰＢＳに１ｍｇ／ｍＬの濃度に溶解した。
ＨＳＡおよびＣＤＤＰ溶液を新しいボトルに１：１０（体積比１：１）のモル比で添加し、３７℃で２４時間撹拌した。
非結合ＣＤＤＰおよび濃縮ＨＳＡ－ＣＤＤＰを除去するために、アミコン・ウルトラ（Amicon Ultra）遠心分離フィルター装置（公称分子量制限３０ｋＤａ；Millipore、Burlington、MA、USA）を用いて遠心分離濾過を行った。
ＨＳＡ－ＣＤＤＰの濃度は、ＢＣＡ（bicinchoninic acid）タンパク質分析キット（Pierce Endogen、Rockford、IL、USA）により測定した。ＨＳＡ－ＣＤＤＰにおけるＨＳＡあたりのＣＤＤＰの量を確認するために、分子量はＴＯＦ－ＴＯＦ５８００システム（AB SCIEX、米国マサチューセッツ州フレイミングハム）を用いて、マトリックス支援レーザー脱離イオン化－飛行時間型（matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight、MALDI－TOF）によって分析した。
１．３．ＨＳＡ及びＨＳＡ－ＣＤＤＰの蛍光染料の結合
ＨＳＡ及びＨＳＡ－ＣＤＤＰをＦＮＲ６４８蛍光染料と結合した。ＨＳＡ－ＣＤＤＰは、ジベンゾシクロオクチン（DBCO、Dibenzocyclooctyne）－ＮＨＳを用いて修飾した。ＤＢＣＯ－ＨＳＡ－ＣＤＤＰは、３７℃で３０分間１：１のモル比でＦＲＮ６４８染料と反応させた。蛍光標識されたＨＳＡ－ＣＤＤＰは、ＰＤ－１０カラム（GE Healthcare、Buckinghamshire、イギリス）を用いて精製し、ＰＢＳで溶出させた。
１．４．ＦＮＲ６４８－ＨＳＡ－ＣＤＤＰの細胞取り込み（for Cellular Uptake）の共焦点顕微鏡の画像（Confocal Microscopy Imaging）
蛍光標識されたＨＳＡまたはＨＳＡ－ＣＤＤＰを細胞取り込みさせた。３７℃で２時間、ＦＮＲ６４８－ＨＳＡまたはＦＮＲ６４８－ＨＳＡ－ＣＤＤＰで細胞を培養した。外因性ＳＰＡＲＣ処理群では、ヒトＳＰＡＲＣ（５μｇ／ｍＬ）および各化合物（ＦＮＲ６４８－ＨＳＡまたはＦＮＲ６４８－ＨＳＡ－ＣＤＤＰ）を３７℃で２時間共同培養した。細胞によるＦＮＲ６４８－ＨＳＡまたはＦＮＲ６４８－ＨＳＡ－ＣＤＤＰの取り込みを定量化するために、全てのテストにおいて５つのランダム画像を得た。各群におけるＦＮＲ６４８－ＨＳＡまたはＦＮＲ６４８－ＨＳＡ－ＣＤＤＰの平均シグナル強度をＤＡＰＩ陽性細胞の数で割った。これは画像における生存可能な細胞の数を示す。この割合は、各群の細胞取り込みと見なされ、各物質の細胞取り込みを定量化するのに使用した。
１．５．細胞毒性の実験（Cellular Cytotoxicity Studies）
Ｕ８７ＭＧおよびＵ８７ＭＧ－ｓｈＳＰＡＲＣ細胞を９６ウェルプレート（４０００細胞／ウェル）に添加した。一晩培養した後、細胞をＣＤＤＰまたはＨＳＡ－ＣＤＤＰと共に互いに異なる濃度で７２時間培養した。細胞生存率は、メーカーのプロトコルに従って細胞計数キット－８（CCK－8、Dojindo Molecular Technologies、Tokyo、Japan）を用いて分析した。
１．６．細胞死の研究（Cell Apoptosis Study）
Ｕ８７ＭＧおよびＵ８７ＭＧ－ｓｈＳＰＡＲＣ細胞を６ウェルプレート（１．２×１０５細胞／ウェル）に配置した。一晩培養した後、細胞をＣＤＤＰまたはＨＳＡ－ＣＤＤＰで７２時間処理した。次に、細胞を回収し、アネキシン（Annexin）Ｖ－ＦＩＴＣ細胞死検出キット（BD、San Jose、CA、USA）を用いてＰＩおよびアネキシンＶで共同染色した。細胞の細胞死は、フローサイトメトリーで分析した。
１．７．動物異種移植腫瘍モデル及びインビボ抗腫瘍の効果（Animal Xenografts Tumor Model and Anti－Tumor Effect In Vivo）
すべての動物研究は、ソウル大学の動物実験および使用委員会（ＩＡＣＵＣ Ｎｏ．１８－０２３１、２０１８．１１．０１）の承認を得て行った。ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（５週齢、オス）はオリエントバイオ社（Ｏｒｉｅｎｔ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．（韓国、ソンナム））から購入した。Ｕ８７ＭＧまたはＵ８７ＭＧ－ｓｈＳＰＡＲＣ細胞（２×１０６個の細胞／部位）を右下脇腹に皮下注射した。
腫瘍体積が５０ｍｍ３に近づくと、各細胞株のマウスをランダムに３つの群に分けた（Ｕ８７ＭＧ：ＰＢＳ群はｎ＝１２、ＣＤＤＰ群はｎ＝９、ＨＳＡ－ＣＤＤＰ群はｎ＝１１；Ｕ８７ＭＧ－ｓｈＳＰＡＲＣ：ＰＢＳ群はｎ＝７、ＣＤＤＰ群はｎ＝６、ＨＳＡ－ＣＤＤＰ群はｎ＝９）。
マウスにＰＢＳ、ＣＤＤＰまたはＨＳＡ－ＣＤＤＰをＩＶ投与した（隔日７回）。ＣＤＤＰの薬物容量は３ｍｇ／ｋｇであり、ＨＳＡ－ＣＤＤＰの容量はＣＤＤＰの等価量であった（ＨＳＡ－ＣＤＤＰのＣＤＤＰ３ｍｇ／ｋｇ）。
各マウスの腫瘍サイズおよび体重は隔日で記録した。腫瘍体積は、方程式Ｖ＝０．５×Ｌ×Ｗ２を用いて計算した（Ｌ：腫瘍の長さ、Ｗ：腫瘍の幅）。
腫瘍モデルにおけるＣＤＤＰおよびＨＳＡ－ＣＤＤＰの生存率を評価するために、人道的エンドポイントのガイドライン（humane endpoints guideline）に従ってマウスをモニターし、安楽死させた（特に、数日内に１５～２０％の急速な体重減少がある場合、または腫瘍体積が２０００ｍｍ３以上である場合）。
１．８．ＩＣＰ－ＭＳを用いたＣＤＤＰの生体分布（Biodistribution of CDDP Using ICP-MS）
正常マウスを２つの群に分けて（各群に対してｎ＝４）、抗腫瘍効果の検査と同じ容量および時間スケジュールでＣＤＤＰまたはＨＳＡ－ＣＤＤＰをＩＶ投与した（３ｍｇ／ｋｇのＣＤＤＰおよびＨＳＡ－ＣＤＤＰのＣＤＤＰ等価容量、隔日、７回）。最後のＩＶ投与７２時間後（初回のＩＶ投与１５日後）にマウスを安楽死させ、臓器（脳、心臓、肝臓、腎臓、脾臓及び肺）および血液を取得して重量を測定した。
腫瘍ＣＤＤＰ分布のために、Ｕ８７ＭＧまたはＵ８７ＭＧ－ｓｈＳＰＡＲＣ細胞（２×１０６細胞／部位）を右下脇腹に皮下注射した。腫瘍体積が５０ｍｍ３に近づくと、各細胞株を注射したマウスをランダムに２つの群に分けて（各群に対してｎ＝５）、ＩＶ投与ＣＤＤＰまたはＨＳＡ－ＣＤＤＰ（隔日、７回）を投与した。最後のＩＶ投与７２時間後（初回投与１５日後）にマウスを安楽死させ、腫瘍を取得した。
すべてのサンプル（臓器、血液および腫瘍）を凍結乾燥し、ソウル大学のＮＣＩＲＦ（The National Center for Inter－university Research Facilities）に設置されたＩＣＰ－ＭＳ（NexION 350；Perkin－Elmer、Waltham、MA、USA）を用いて、ＣＤＤＰの量を分析した。
１．９．血液分析（Hematology Analysis）
マウスに対して、ＰＢＳ、ＣＤＤＰまたはＨＳＡ－ＣＤＤＰ（各群に対してｎ＝４）を療法治療（ｔｈｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）（隔日、７回）で処理し、マウスの血液サンプル（murine blood samples）を最終投与７２時間後（初回のtreatmentから１５日後）に採取した。４℃で２０分間遠心分離した後、血液生化学分析のために血漿を収集した。ＡＳＴ、ＡＬＴ、ＢＵＮ及びクレアチニンの濃度は、ＤＫＫｏｒｅａ（ソウル、韓国）で分析された。
１．１０．組織病理検査（Histopathology Examination）
薬物処理されたマウスの腎臓、肝臓および脾臓を取得し、４％パラホルムアルデヒドで固定した。組織をパラフィン(paraffin)に包埋し、ヘマトキシリン＆エオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。Ｈ＆Ｅ染色画像は、光学顕微鏡（Olympus BX43、Tokyo、Japan）を用いて撮影した。
１．１１．ＨＳＡ－ＣＤＤＰの血清安定性（Serum Stability of HSA-CDDP）
血清中のＨＳＡ－ＣＤＤＰのＣＤＤＰ安定性を測定した。血清アルブミン／ＨＳＡ－ＣＤＤＰ溶液を３７℃で培養し、血清中の遊離ＣＤＤＰは、培養０．５、１、２、４、８、１６、２４、４８、７２及び１２０時間後に測定した。血清から遊離ＣＤＤＰを得るために、アミコン・ウルトラ遠心分離フィルター装置（公称分子量の制限３０ｋＤａ； Millipore、Burlington、MA、USA）を用いた。上清液（チューブの底部、３０ＫＤａ未満）で測定されたＣＤＤＰ濃度は遊離ＣＤＤＰのレベルに相当する。上清液のＣＤＤＰ濃度は、ＮＣＩＲＦに設置された誘導結合プラズマ質量分析計（Inductively coupled plasma-mass spectrometry、ICP－MS；NexION 350；PerkinElmer、米国マサチューセッツ州ウォルサム）を用いて分析した。
１．１２．ＳＰＥＣＴ画像
Ｎａｎｏ ＳＰＥＣＴ／ＣＴ ｐｌｕｓ（Mediso medical imaging system、Budapest、Hungary）を用いて、腫瘍を有するマウスの小動物用ＳＰＥＣＴ画像を撮影した。マウスに尾静脈を介して１８．５ＭＢｑの１７７Ｌｕ－ＨＳＡまたは１７７Ｌｕ－ＨＳＡ－ＣＤＤＰを注入した。ＳＰＥＣＴ画像は、注入１０分、４時間、２４時間、４８時間および７２時間後に撮影した。ＳＰＥＣＴ画像を得るために、マウスを２％イソフルランで麻酔した。ＳＰＥＣＴスキャンは、フレーム当たり３０秒、１８゜角度ステップ（angular step）の４０個のプロジェクション（フレーム）から収集した。１７７Ｌｕのエネルギーピークは５６．１ｋｅＶ １０％、１１２．９ｋｅＶ １０％、および２０８．４ｋｅＶ １０％に設定した。ＳＰＥＣＴで再構成されたデータは、ＩｎＶｉｖｏＳｃｏｐｅ（Bioscan、Washington、DC、USA）を用いて可視化した。
１．１３．免疫組織化学およびＴＵＮＥＬ分析（Immunohistochemistry and TUNEL Assay）
腫瘍および腎臓を４％パラホルムアルデヒドで固定してパラフィンに挿入し、４μｍの切片に切った。腎臓における細胞死を評価するために、メーカーのプロトコルに従ってＴＵＮＥＬアッセイキット－ＨＲＰ－ＤＡＢ（ab206386；abcam、イギリスのケンブリッジ）を用いて腎臓切片を染色した。
１．１４．統計学的分析（Statistical Analysis）
全ての統計分析は、グラフパッド・プリズム（GraphPad Prism）を用いて行った。スチューデントのｔ検定（Student's t-test）を用いて、ＨＳＡ－ＣＤＤＰの細胞取り込み、異種移植の腫瘍モデルにおけるＨＳＡ－ＣＤＤＰの抗腫瘍効果、およびマウスにおけるＨＳＡ－ＣＤＤＰの生体分布の統計的有意性を決定した。０．０５未満のＰの値は統計的有意性を有するものとみなした。
２．結果
２．１．ＨＳＡ－ＣＤＤＰの特性
ＨＳＡ－ＣＤＤＰの分子量は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化－飛行時間型（matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight、MALDI－TOF）で分析した。測定されたＨＳＡ－ＣＤＤＰの分子量は６７，５２２±１２９Ｄａであった。ＨＳＡの１モル当たりのＣＤＤＰの割合は、ＨＳＡ－ＣＤＤＰとＨＳＡとの間の分子量の差から計算した。ＨＳＡの１モルに結合したＣＤＤＰの平均分子数は４．０７であった。ＣＤＤＰをＨＳＡに結合した後、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦを用いてＨＳＡ－ＣＤＤＰの分子量を測定した。
ＨＳＡ－ＣＤＤＰがＳＰＡＲＣ媒介ＨＳＡ依存的方法で膠芽細胞腫細胞（glioblastoma cells）によって取り込みされるかどうかを観察するために、共焦点顕微鏡を用いて細胞取り込み画像を撮影した。
ＳＰＡＲＣタンパク質を高度に発現するＵ８７ＭＧ細胞およびＳＰＡＲＣタンパク質の低い発現を示すＵ８７ＭＧ－ｓｈＳＰＡＲＣ細胞の２種類のＵ８７ＭＧ細胞株を使用した。
客観的な比較のために、細胞の共焦点顕微鏡画像を取得して定量化した（各群に対してｎ＝５）。その結果、Ｕ８７ＭＧ－ｓｈＳＰＡＲＣ細胞よりもＵ８７ＭＧ細胞においてより高いＨＳＡ－ＣＤＤＰの取り込みを示した（図１（ａ）及び（ｃ）、ＦＮＲ６４８－ＨＳＡ－ＣＤＤＰ、ｐ＜０．００１）。
細胞におけるＳＰＡＲＣ媒介ＨＳＡ－ＣＤＤＰの取り込みを評価するために、外因性のＳＰＡＲＣタンパク質を細胞内で共同処理した。この処理により、ＨＳＡ－ＣＤＤＰはＵ８７ＭＧ－ｓｈＳＰＡＲＣ細胞に高度に蓄積された（図１（ａ）、Ｕ８７ＭＧ－ｓｈＳＰＡＲＣのＦＮＲ６４８－ＨＳＡ－ＣＤＤＰおよび図１（ｃ）、＋ＳＰＡＲＣ）。
ＳＰＡＲＣ依存的な取り込みパターンは、細胞におけるＨＳＡ取り込み方式と類似していた（図１（ａ）、ＦＮＲ６４８－ＨＳＡおよびＦＮＲ６４８－ＨＳＡ－ＣＤＤＰ）。この結果は、細胞に対するＨＳＡ－ＣＤＤＰの取り込みがＨＳＡに依存的なことを意味する。
２．２．ＨＳＡ－ＣＤＤＰインビトロの細胞毒性効果（Cytotoxic Effect of HSA-CDDP In Vitro）
癌細胞の生存力に対するＨＳＡ－ＣＤＤＰの効果を調査した。
ＨＳＡ－ＣＤＤＰの細胞毒性は、細胞計数キット（cell counting kit－8、CCK－8）アッセイを用いて、Ｕ８７ＭＧおよびＵ８７ＭＧ－ｓｈＳＰＡＲ細胞を用いて研究した。
ＨＳＡ－ＣＤＤＰは、細胞に対して容量依存的な毒性を示した（図２（ｂ）、ＨＳＡ－ＣＤＤＰ）。特に、ＨＳＡ－ＣＤＤＰの毒性は、Ｕ８７ＭＧ－ｓｈＳＰＡＲＣ細胞よりもＵ８７ＭＧ細胞においてより高かった（図２（ｂ）および表１）。
Ｕ８７ＭＧおよびＵ８７ＭＧ－ｓｈＳＰＡＲＣは、ＣＤＤＰと類似した細胞毒性を示した（図２（ａ）および表１）。これはＨＳＡ－ＣＤＤＰのＵ８７ＭＧおよびＵ８７ＭＧ－ｓｈＳＰＡＲＣに対する細胞毒性がＨＳＡ－ＣＤＤＰのＳＰＡＲＣ媒介細胞取り込みに依存することを示す。
下記表１は、細胞におけるＣＤＤＰおよびＨＳＡ－ＣＤＤＰに対するＩＣ５０の値を示す。データは平均ＳＤ（ｎ＝５）で示す。
ＨＳＡ－ＣＤＤＰによって誘発された細胞死（Apoptosis）は、アネキシンＶ－ＦＩＴＣ／ＰＩ共同染色（co-staining）を用いたフローサイトメトリー分析（flow cytometry analysis）で観察した（図３及び図４）。その結果、ＨＳＡ－ＣＤＤＰが容量依存的な方法に細胞死を誘導することが示された（図４（ｂ））。
細胞死細胞の割合をＣＤＤＰの４．９μＭおよびＨＳＡ－ＣＤＤＰの１９．３μＭの濃度で比較し、ＣＣＫ－８の結果から、薬物治療後、細胞の３０～４０％が生きていることを確認した。
Ｕ８７ＭＧは、Ｕ８７ＭＧ－ｓｈＳＰＡＲＣ細胞よりも高い細胞死率を示した（図３、ＨＳＡ－ＣＤＤＰ、１９．３μＭ；Ｕ８７ＭＧ、２３．２％；Ｕ８７ＭＧ－ｓｈＳＰＡＲＣ、８．８％）。Ｕ８７ＭＧ細胞におけるＣＤＤＰの４．９μＭとＨＳＡ－ＣＤＤＰの１９．３μＭを比較したとき、ＨＳＡ－ＣＤＤＰはＣＤＤＰよりも高い細胞死率を示したが、両方ともＣＣＫ－８で類似した細胞毒性を示した（図３）。
この結果は、ＨＳＡ－ＣＤＤＰの細胞毒性がＳＰＡＲＣ媒介であり、ＨＳＡが細胞取り込みおよび細胞死を増強することを示す。
２．３．インビボでのＨＳＡ－ＣＤＤＰの抗がん効果（Antitumor Effect of HAS-CDDP In Vivo）
ＨＳＡ－ＣＤＤＰの治療効果は、Ｕ８７ＭＧおよびＵ８７ＭＧ－ｓｈＳＰＡＲＣ細胞を使用する異種移植腫瘍マウスモデルで調べた。薬物投与は、腫瘍サイズが５０ｍｍ３に達したときに開始し、腫瘍体積が２０００ｍｍ３に達するまで腫瘍成長を観察した。マウスにＰＢＳ（Phosphate buffered saline）、ＣＤＤＰまたはＨＳＡ－ＣＤＤＰを隔日で合計７回静脈注射で投与した。
Ｕ８７ＭＧ腫瘍モデルにおいて、初回の薬物治療１２日後、ＣＤＤＰ－およびＨＳＡ－ＣＤＤＰ処理されたマウスは、ＰＢＳ群よりも腫瘍の成長が顕著に減少した（図５（ａ）、ｐ＜０．００１）。
Ｕ８７ＭＧ－ｓｈＳＰＡＲＣ腫瘍モデルにおいて、初回の薬物処理２６日後にＣＤＤＰ処理されたマウスは、ＰＢＳ群よりも腫瘍の成長が顕著に減少したが(図５（ｂ）、ｐ＜０．００１)、ＨＳＡ－ＣＤＤＰ処理されたマウスは、ＰＢＳ群と比較して腫瘍成長に差がなかった。マウスの重量はＣＤＤＰ処理群では顕著に減少したが(図５（ｃ）、（ｄ）)、ＨＳＡ－ＣＤＤＰ処理群では減少しなかった。これはＣＤＤＰがインビボ・システムでネガティブな影響を及ぼす可能性があることを意味するが、ＨＳＡ－ＣＤＤＰ治療では、このようなネガティブな効果が示されなかった。
Ｕ８７ＭＧ腫瘍モデルの生存率に対して、ＣＤＤＰおよびＨＳＡ－ＣＤＤＰ処理マウスは、ＰＢＳ群よりも長い生存時間を示した（図５（ｅ）および表２）。Ｕ８７ＭＧ－ｓｈＳＰＡＲＣ腫瘍モデルにおいて、ＨＳＡ－ＣＤＤＰ処理マウスはＰＢＳ群と近似した生存率を示したのに対して、ＣＤＤＰ処理マウスは延長された生存率を示した（図５（ｆ）および表２）。この結果は、ＨＳＡ－ＣＤＤＰの抗腫瘍効果が腫瘍においてＳＰＡＲＣ媒介ＨＳＡ依存性取り込みに基づいており、ＣＤＤＰと類似していることを示す。
下記表２は、Ｕ８７ＭＧおよびＵ８７ＭＧ－ｓｈＳＰＡＲＣ異種移植腫瘍モデルの中央生存日数（Median survival（days））を示す。
２．４．インビボでのＨＳＡ－ＣＤＤＰの生体分布（Biodistribution of HSA-CDDP In Vivo）
ＨＳＡ－ＣＤＤＰの生体分布は、最後のＨＳＡ－ＣＤＤＰ処理７２時間後、正常マウスおよび腫瘍保持マウスにおける抗腫瘍効果（２日に１回ずつ７回投与、最初のＨＳＡ－ＣＤＤＰ処理１５日後に開始）を分析した。
各々の臓器（脳、心臓、肝臓、腎臓、脾臓、肺および血液）でのＣＤＤＰ量は誘導結合血漿質量分析法（inductively coupled plasma mass spectrometry、ICP－MS）を用いて測定した。
ＨＳＡ－ＣＤＤＰは、ＣＤＤＰよりも血液分布が高かった（図６（Ａ））。長期間の血液分布により、脳を除く全ての機関において、ＨＳＡ－ＣＤＤＰ群でＣＤＤＰがより多く蓄積されることが示された。特に、ＨＳＡ－ＣＤＤＰは肝臓で多く蓄積された（図６（ａ））。
ＣＤＤＰデータのＵ８７ＭＧ腫瘍蓄積において、ＨＳＡ－ＣＤＤＰ群のＣＤＤＰ量はＣＤＤＰ群よりも有意に高かった（図６（ｂ）、ｐ＜０．０５）。ＨＳＡ－ＣＤＤＰ群において、Ｕ８７ＭＧ腫瘍は、Ｕ８７ＭＧ－ｓｈＳＰＡＲＣ腫瘍よりもＣＤＤＰがより多く蓄積されることが示された（図６（ｂ）、ＨＳＡ－ＣＤＤＰ、ｐ＜０．０５）。
ＣＤＤＰ治療群では、Ｕ８７ＭＧとＵ８７ＭＧ－ｓｈＳＰＡＲＣとの間でＣＤＤＰ蓄積量に差がなかった（図６（ｂ））。Ｕ８７ＭＧ腫瘍では、ＨＳＡ－ＣＤＤＰ群はＣＤＤＰ群よりもＣＤＤＰの蓄積が大幅に増加した（図６（ｂ））。
この結果は、ＨＳＡ－ＣＤＤＰがＨＳＡ依存的な方法で腫瘍に取り込みされることを示す。
２．５．インビボでのＨＳＡ－ＣＤＤＰの生物学的な安定性（Biosafety of HSA-CDDP In Vivo）
抗腫瘍効果に関する結果から、ＣＣＤＰで処理したマウスは、ＰＢＳで処理したマウスと比較して相当な体重減少を示した。この結果は、インビボ・システムのＣＤＤＰにネガティブな影響を及ぼす可能性があることを示す。
生物学的分布の研究では、ＨＳＡ－ＣＤＤＰは肝臓に多く蓄積し、抗腫瘍効果計画で最後のＨＳＡ－ＣＤＤＰ治療７２時間後に肝臓、腎臓の機能および体重の血液マーカーをモニターし、マウスにおけるＨＳＡ－ＣＤＤＰの毒性を評価した（隔日、７回、最初のＨＳＡ－ＣＤＤＰ処理１５日後）。
ＣＤＤＰ処理群では、体重に対する抗腫瘍効果に関する結果と同様に、ＰＢＳおよびＨＳＡ－ＣＤＤＰ群と比較して相当な体重減少を示した（図７（ａ））。
肝機能の観点から、アスパラギン酸アミノ基転移酵素（Aspartate transaminase、AST）、アラニンアミノ基転移酵素（alanine aminotransferase、ALT）は、群間に有意な差を示さなかった（図７（ａ））。
腎機能の場合には、ＣＤＤＰ群で血中尿素窒素（blood urea nitrogen、BUN）が増加した（図７（ａ））。ヘマトキシリン＆エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色画像でＣＤＤＰ処理された腎臓組織は、尿細管変性（図７（ｂ）、黒矢印）と広範囲の上皮空泡形成（図７（ｂ）、黄矢印）を示した。
ＴＵＮＥＬ（terminal deoxynucleotidyl transferase）アッセイでは、ＴＵＮＥＬ陽性細胞はＣＤＤＰ処理されたマウスの腎臓のみで確認された（図８）。
前記結果は、ＨＳＡ－ＣＤＤＰがインビボでのＣＤＤＰの腎毒性を減少させることを示す。

Claims (7)

  1. アルブミン及びそれに結合した１つ以上のシスプラチンを含むＳＰＡＲＣ（Secreted Protein Acidic and Rich in Cysteine）を発現する癌の治療用組成物であって、
    前記シスプラチンは、前記アルブミンの表面に配位結合しており、前記アルブミン１分子当たりに前記シスプラチンが１～５個結合し、前記癌は神経膠腫であり、前記シスプラチンの腎毒性を減少させた、癌の治療用組成物。
  2. 前記アルブミンに４つの前記シスプラチンが結合して結合体を形成した場合、前記結合体の分子量は６５，０００～７０，０００Ｄａである、請求項１に記載の癌の治療用組成物。
  3. 前記アルブミンに４つの前記シスプラチンが結合して結合体を形成した場合、前記結合体の大きさは５ｎｍ～１００ｎｍである、請求項１に記載の癌の治療用組成物。
  4. 前記シスプラチンは、前記アルブミン表面のＨｉｓ側鎖残基またはＭｅｔ側鎖残基に結合したものである、請求項１に記載の癌の治療用組成物。
  5. 前記シスプラチンに前記アルブミン表面のＨｉｓ１０５またはＨｉｓ２８８が結合したものである、請求項４に記載の癌の治療用組成物。
  6. 前記シスプラチンに前記アルブミン表面のＭｅｔ２９８、Ｍｅｔ３２９またはＭｅｔ５４８が結合したものである、請求項４に記載の癌の治療用組成物。
  7. 前記神経膠腫は、星状細胞腫、膠芽細胞腫、および乏突起膠腫からなる群より選択される１つ以上である、請求項１に記載の癌の治療用組成物。
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