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JP7335001B2 - 新規ｃｄ１６＋ナチュラルキラーおよびｃｄ１６＋ナチュラルキラー細胞の培養方法 - Google Patents

新規ｃｄ１６＋ナチュラルキラーおよびｃｄ１６＋ナチュラルキラー細胞の培養方法 Download PDF

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JP7335001B2 JP2021541069A JP2021541069A JP7335001B2 JP 7335001 B2 JP7335001 B2 JP 7335001B2 JP 2021541069 A JP2021541069 A JP 2021541069A JP 2021541069 A JP2021541069 A JP 2021541069A JP 7335001 B2 JP7335001 B2 JP 7335001B2
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Description

NPMD NITE BP-03017
本発明はＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞およびＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞を培養する方法に関する。より具体的には、非トランスジェニックおよび非腫瘍形成性のＣＤ１６＋キラー細胞株、ならびにＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞を大量増殖させてＣＤ１６発現を維持することができる培養方法に関する。
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は自然免疫系の重要な構成要素を構成するリンパ球であり、ウイルス感染に対する自然免疫および腫瘍細胞の監視に最も適する。ヒトでは、ＮＫ細胞はＴ細胞受容体複合体（ＣＤ３－）の欠如と神経細胞接着分子（ＣＤ５６ ＋）の存在によって典型的に識別される。ヒト末梢血には主に２つのＮＫ細胞サブセットがあり、末梢血ＮＫ細胞の大多数（＞ ９０％）はＣＤ３－ＣＤ５６ｄｉｍＣＤ１６＋ ＮＫ細胞および末梢血ＮＫ細胞の少数（１０％）はＣＤ３－ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔＣＤ１６－ ＮＫ細胞である（Ｏｒａｎｇｅ ＪＳ、２０１３）。
ＣＤ１６受容体（ＦｃγＲＩＩＩはＩｇＧのＦｃ領域の受容体であり、ＩｇＧ抗体のＦｃ部分に結合できる）はヒトＮＫ細胞によって実行される抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）プロセスに必要である。ヒトでは、ＣＤ１６受容体をコードするポリヌクレオチドは、染色体１のｑアームの位置１ｑ２３．３にある。ＣＤ１６受容体を発現するヒトＮＫ細胞は、ＡＤＣＣプロセスを介して、癌細胞、腫瘍細胞、ＨＩＶ感染細胞などのさまざまな種類の標的細胞を殺すことができる（Ｒｅｚｖａｎｉ Ｋ ａｎｄ Ｒｏｕｃｅ ＲＨ， ２０１５； Ｌｉｔｔｗｉｔｚ－Ｓａｌｏｍｏｎ ｅｔ ａｌ， ２０１６； Ｅｉｌｅｅｎ Ｓｃｕｌｌｙ ａｎｄ Ｇａｌｉｔ Ａｌｔｅｒ， ２０１６）。腫瘍細胞を例に取ると、腫瘍関連抗原を発現する腫瘍細胞（ＨＥＲ２と呼ばれるヒト上皮成長因子受容体２など）は、内因性ＩｇＧ抗体又は腫瘍関連抗原を標的とする臨床的に承認された治療用ＩｇＧ抗体（トラスツズマブ、リツキシマブ、又はセツキシマブなど）に結合することができる。ＮＫ細胞によって発現されるＣＤ１６受容体（ＩｇＧ Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩＩ）が内因性ＩｇＧ抗体又は臨床的に承認された治療用ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に結合すると、ＮＫ細胞を介したＡＤＣＣがトリガーされ、ＮＫ細胞は細胞傷害因子を放出して腫瘍細胞の死を引き起こす（Ｒｅｚｖａｎｉ Ｋ ａｎｄ Ｒｏｕｃｅ ＲＨ、２０１５）。
ＣＤ１６＋ ＮＫ細胞を使用した２つの主要な癌治療法がある。最初の方法には、次の手順が含まれる。（ａ） 自家又は同種血液を入手し、（ｂ） 自家又は同種の血液から自家又は同種の初代ＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞（初代ＣＤ１６＋ ＮＫ細胞）を分離し、（ｃ） 自家又は同種の初代ＣＤ１６＋ ＮＫ細胞を生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で増殖させ、そして （ｄ） 増殖した自家又は同種の初代ＣＤ１６＋ ＮＫ細胞を癌患者の静脈に注入し、ＡＤＣＣプロセスを介して癌細胞の死を引き起こす細胞毒性因子を放出する為に十分なＣＤ１６＋ＮＫ細胞が癌患者にあるようにする。しかしながら、初代ＣＤ１６＋ＮＫ細胞は数週間の短期培養後に老化し、更には死滅するという事実のせいで、長期治療の為に自己血又は同種血液から初代ＣＤ１６＋ ＮＫ細胞を継続的に取得する必要がある。更に研究により、高純度ＣＤ１６＋ ＮＫ細胞集団（即ち、数によるＣＤ１６＋ ＮＫ細胞の量は９９％以上である）を従来法で４日間培養して得られたすべての培養細胞において、ＣＤ１６を発現している細胞は僅か１０％であることが示される。言い換えると、ＣＤ１６＋ ＮＫ細胞を生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で培養する現行法は増殖後にＮＫ細胞にＣＤ１６を安定発現させることができない。従って、前述の方法は、初代ＣＤ１６＋ ＮＫ細胞の供給源を保持することが困難であるだけでなく、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）でＣＤ１６＋ ＮＫ細胞を安定して増殖させることができる方法にもならない。これらの問題は癌患者が十分な数のＣＤ１６＋ ＮＫ細胞を獲得することを困難にすることが多く、毎回癌治療を円滑に行うことも困難にする。更に前述の方法はまた、個々の細胞の違いによって引き起こされる有効性を制御することが困難であるという問題に直面することもある。
二つ目の方法は、ＮＫ－９２細胞株（寄託番号ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２４０７）に関する。ＮＫ－９２細胞株は悪性非ホジキンリンパ腫を患っている５０歳の白人男性の血液から分離されたＣＤ１６－ナチュラルキラー細胞株である。ＮＫ－９２細胞株は老化や死滅の問題なしに継続的に継代培養することができ、このＮＫ－９２細胞株は免疫力が低下したマウスに対して腫瘍形成性がない。ガンマ線 （γ－ｒａｙ）を照射した後に、同種異系の人間被験者に対しても発癌性がない為、ある程度の適用性がある。しかしながら、ＮＫ－９２細胞株はＣＤ１６受容体を発現しない為、ＡＤＣＣプロセスによって癌細胞を破壊することはできない。従って、ＣＤ１６受容体を発現し、ＡＤＣＣを発揮することができるトランスジェニックＣＤ１６ＮＫ－９２細胞株を得るために、前述の二つ目の方法はトランスジェニック技術を介したＮＫ－９２細胞株へのＣＤ１６受容体遺伝子の遺伝子導入を必要とする。次に、ＣＤ１６でトランスフェクトされたＮＫ－９２細胞株が癌患者の静脈に注入される。従って、癌患者には、ＡＤＣＣプロセスを通じて癌細胞の死を引き起こす細胞傷害性因子を放出するのに十分なＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞がある。残念ながら、医学界と一般大衆には、ヒトの循環器系におけるトランスジェニック免疫細胞の長期的な安全性に関する懸念がある。したがって、前述した方法の開発はかなりの程度に制限されている。
その結果、継続的に継代培養できる非トランスジェニックと非腫瘍形成性の細胞株、およびＣＤ１６の発現を維持しながらＣＤ１６＋ ＮＫの大量増殖させることが可能な培養法が至急に必要とされる。
本発明は老化又は死滅の問題なしに継続的に継代培養することができるナチュラルキラー細胞株を提供する。
本発明の第２の目的は、継代培養後、少なくとも３ヶ月ＣＤ１６＋受容体の安定発現ができるナチュラルキラー細胞を提供することである。
本発明のもう一つの目的は非トランスジェニックＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株を提供することである。
本発明のもう一つの目的は免疫力が低下したマウスに対して腫瘍形成性がないＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株を提供することである。
本発明のもう一つの目的はγ線を照射した後に同種異系の人間被験者に対して発癌性がないＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株を提供することである。
本発明のもう一つの目的はＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞を大量増殖させる為の培養方法を提供することである。
本発明のもう一つの目的はＣＤ１６＋ナチュラルキラーが増殖した後にＣＤ１６受容体の安定発現ができる培養方法を提供することである。
本発明のもう一つの目的はヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞が実質的に濃縮された組成物を提供することである。この組成物におけるヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞数は少なくとも５×１０５であり、ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞は組成物における細胞の総数を１００％として、数で５％以上の量である。ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞は次の特徴を有する：細胞は、継代培養後、少なくとも３ヶ月間増殖能力を保持することである。
本発明は以下の特徴を有するヒトナチュラルキラー細胞を提供する：（ｉ） ＣＤ１６受容体を発現すること、（ｉｉ） 継代培養後、少なくとも３か月増殖能力を保持することと、（ｉｉｉ） ＣＤ１６受容体をコードする発現されたポリヌクレオチド配列を含有することであり、このＣＤ１６受容体をコードする発現されたポリヌクレオチド配列は合成されておらず、遺伝子改変されておらず、および／又は意図的に細胞に導入されていないことである。
好ましくは、ヒトナチュラルキラー細胞は、継代培養後、少なくとも１週間、２週間、３週間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、７ヶ月間、８ヶ月間、９ヶ月間、１０ヶ月間、又は１１ヶ月間増殖することができる。
好ましくは、ヒトナチュラルキラー細胞は、継代培養後、少なくとも１年、２年、又は３年増殖することができる。
好ましくは、ヒトナチュラルキラー細胞が免疫力が低下したマウスにおいて非腫瘍形成性である。
好ましくは、免疫力が低下したマウスがＳＣＩＤ／ｂｅｉｇｅ、 ＮＯＤ／ＳＣＩＤ， ＮＳＧ，又はヌードマウスである。
本発明は更にヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞が実質的に濃縮された組成物を提供する。この組成物におけるヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞数は少なくとも５×１０５であり、ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞は組成物における細胞の総数を１００％として、数として５％以上の量である。ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞は以下の特徴を有する： （ｉ） ＣＤ１６受容体を発現すること、（ｉｉ） 継代培養後、少なくとも３ヶ月間増殖能力を保持することと、（ｉｉｉ） ＣＤ１６受容体をコードする発現されたポリヌクレオチド配列を含有することであり、このＣＤ１６受容体をコードする発現されたポリヌクレオチド配列は合成されておらず、遺伝子改変されておらず、および／又は意図的に細胞に導入されていないことである。
好ましくは、組成物におけるヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞数が５×１０５～５×１０９である。
好ましくは、組成物におけるヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞数が１×１０６、１．１×１０６、５×１０６、５．１×１０６、１×１０７、１．１×１０７、５×１０７、５．１×１０７、１×１０８、１．１×１０８、５×１０８、５．１×１０８、１×１０９ 、１．１×１０９、又は５×１０９である。
好ましくは、ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞の総量が、組成物における細胞の総数を１００％として、５％～１００％である。
好ましくは、ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞が、組成物における細胞の総数を１００％として、数で５％、７％、９％、１０％、１２％、１５％、１９％、２０％、２２％、２５％、２９％、３０％、３２％、３５％、３９％、４０％、４２％、４５％、４９％、５０％、５２％、５５％、５９％、６０％、６２％、６５％、６９％、７０％、７２％、７５％、７９％、８０％、８２％、８５％、８９％、又は９５％以上の量である。
好ましくは、ＣＤ１６受容体がＣＤ１６ａ受容体又はＣＤ１６ｂ受容体である。
好ましくは、ＣＤ１６ａ受容体又はＣＤ１６ｂ受容体をコードする発現されたポリヌクレオチド配列が合成されておらず、遺伝子改変されておらず、および／又は意図的に細胞に導入されていない。
ヒトＣＤ１６＋チュラルキラー細胞が実質的に濃縮された組成物を得る方法であり以下の方法を含有する： （ａ） 寄託番号ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２４０７を有するヒト末梢血ナチュラルキラー細胞の集団を取得し、 （ｂ） ヒト末梢血ナチュラルキラー細胞の集団をＣＤ１６受容体に特異的な抗体と接触させ、および（ｃ） 抗体によって特異的に結合される細胞を分離する。それによって、ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞が実質的に濃縮された組成物を得る。
このヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞はＣＤ１６受容体をコードする発現されたポリヌクレオチドを含有し、ＣＤ１６受容体をコードする発現されたポリヌクレオチド配列は合成されておらず、遺伝子改変されておらず、および／又は意図的に細胞に導入されていない。
好ましくは、ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞は、継代培養後、少なくとも３か月増殖能力を保持する。
好ましくは、ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞は、継代培養後、少なくとも１週間、２週間、３週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、又は１１か月増殖能力を保持することができる。
好ましくは、ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞は、継代培養後、少なくとも１年、２年、又は３年増殖能力を保持することができる。
好ましくは、ＣＤ１６受容体をコードする発現されたポリヌクレオチド配列が合成されておらず、遺伝子改変されておらず、および／又は意図的に細胞に導入されていない。
好ましくは、組成物におけるヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞が、組成物における細胞の総数を１００％として、数で８０％以上の量である。
好ましくは、ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞が、組成物における細胞の総数を１００％として、数で５％以上の量である。
好ましくは、ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞が、組成物における細胞の総数を１００％として、数で５０％以上の量である。
好ましくは、培養培地における溶解グルコースの濃度が１５００ｍｇ／Ｌよりも高い。
好ましくは、培地が完全に通気され、培地における溶解酸素の濃度も安定範囲に維持され、又は培地における溶解グルコースの濃度が１５００～５０００ ｍｇ／Ｌである。
好ましくは、培養培地における溶解グルコースの濃度が２５００、２５０１、３５００、３５０１、４０００、又は４５００ｍｇ／Ｌである。
好ましくは、組成物中のヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞数が少なくとも５×１０５であり、ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞が組成物における細胞の総数を１００％として、数で５％以上の量である。
好ましくは、組成物中のヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞の数は５×１０５～５×１０９である。
好ましくは、組成物中のヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞の数は １×１０６、 １．１×１０６、 ５×１０６、 １×１０７、 １．１×１０７、５×１０７、５．１×１０７、 １×１０８、１．１×１０８、５×１０８、５．１×１０８、１×１０９、１．１×１０９、５×１０９、 １×１０１０、１．１×１０１０、 ５×１０１０、 １×１０１１、 １．１×１０１１、５×１０１１、 ５．１×１０１１、 １×１０１２、 １．１×１０１２、５×１０１２、 ５．１×１０１２、 １×１０１３、 １．１×１０１４、 ５×１０１４、 １×１０１５、 １．１×１０１５、 ５×１０１５、１×１０１６、 １．１×１０１６、 ５×１０１６、５．１×１０１６、１×１０１７、 １．１×１０１７、 ５×１０１７、５．１×１０１７、 １×１０１８、 １．１×１０１８、５×１０１８、 １×１０１９、１．１×１０１９， ５×１０１９、 １×１０２０、 １．１×１０２０、 ５×１０２０、 ５．１×１０２０、 １×１０２１、 １．１×１０２１、５×１０２１、５．１×１０２１、 １×１０２２、 １．１×１０２２、 ５× １０２２、１×１０２３、 １．１×１０２３、 ５×１０２３、 １×１０２４、 １．１×１０２４、 ５×１０２４、 ５．１×１０２４、 １×１０２５、 １．１×１０２５、 ５×１０２５、５．１×１０２５、 １×１０２６、 １．１×１０２６、 ５×１０２６、 １×１０２７、 １．１×１０２７、 ５×１０２７、 １×１０２８、１．１×１０２８、 ５×１０２８、 ５．１ ×１０２８、 １×１０２９、１．１×１０２９、 ５×１０２９、５．１×１０２９、１×１０３０、１．１×１０３０、 ５×１０３０、 １×１０３１、 １．１×１０３１、 ５×１０３１、 １ ×１０３２、１．１×１０３２、５×１０３２、５．１×１０３２、１×１０３３、 １．１×１０３３、 ５×１０３３、５．１×１０３３、 １×１０３４、 １．１×１０３４、５×１０３４、 １×１０３５、 １．１×１０３５、 ５×１０３５、１×１０３６、 １．１×１０３６、 ５×１０３６、５．１×１０３６、１×１０３７、 １．１×１０３７、 ５×１０３７、 ５．１×１０３７、１×１０３８、 １．１×１０３８、 ５×１０３８、 １×１０３９、 １．１×１０３９、 ５×１０３９、 ５．１×１０３９、 １×１０４０、 １．１×１０４０、 ５×１０４０である。
好ましくは、組成物中のヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞の数は１×１０６ － １×１０４１である。
好ましくは、ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞の総数は、組成物における細胞の総数を１００％として、５％～１００％である。
好ましくは、ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞が、組成物における細胞の総数を１００％として、５％、７％、９％、１０％、１２％、１５％、１９％、２０％、２２％、２５％、２９％、３０％、３２％、３５％、３９％、４０％、４２％、４５％、４９％、５０％、５２％、５５％、５９％、６０％、６２％、６５％、６９％、７０％、７２％、７５％、７９％、８０％、８２％、８５％、８９％、又は９５％以上の量である。
本発明は更にヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞を培養および増殖させる方法を提供する。方法は以下を含有する：（ｘ） 容器内でヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞をヒト血小板溶解物およびＩＬ－２を含有する培地と接触させ、および（ｙ） 細胞を複数日間培養し、ここでヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞はＣＤ１６受容体をコードする発現されたポリヌクレオチドを含有し、ＣＤ１６受容体をコードする発現されたポリヌクレオチド配列は合成されておらず、遺伝子改変されておらず、および／又は細胞に意図的に導入されていない。
好ましくは、培養培地における溶解グルコースの濃度が１５００ｍｇ／Ｌよりも高い。
好ましくは、ステップ（ｙ）がサブステップを含有する：（ｙ１） 細胞を少なくとも１日間培養し、（ｙ２） 細胞を少なくとも３ヶ月継代培養する。
好ましくは、ステップ（ｙ２）では、細胞を少なくとも１週間、２週間、３週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月 、９ヶ月、１０ヶ月、又は１１ヶ月継代培養する。
好ましくは、ステップ（ｙ２）では、細胞を少なくとも１年、２年、又は３年継代培養する。
好ましくは、ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞が少なくとも３ヶ月継代培養した後に増殖能力を保持することができる。
好ましくは、ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞が少なくとも１週間、２週間、３週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、又は１１ヶ月継代培養した後に増殖能力を保持することができる。
好ましくは、ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞が少なくとも１年、２年、又は３年継代培養した後に増殖能力を保持することができる。
好ましくは、ＣＤ１６受容体をコードする発現されたポリヌクレオチド配列は合成されておらず、遺伝子改変されておらず、および／又は細胞内に意図的に導入されていない。
好ましくは、ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞がＣＤ２分子（ＣＤ２＋）を発現する。
好ましくは、ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞がＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、又はＣＤ１０７ａを発現する。
本発明は以下の特徴を有するヒトナチュラルキラー細胞を提供する：（ｉ）ＣＤ１６受容体を発現する、（ｉｉ）少なくとも３ヶ月間継代培養した後に増殖能力を保持する、および（ｉｉｉ）ＣＤ１６受容体をコードする発現されたＣＤ１６Ａ遺伝子を含有し、発現されたＣＤ１６Ａ遺伝子は染色体１のｑアームにある。
好ましくは、発現されたＣＤ１６Ａ遺伝子が染色体１のｑアームの位置１ｑ２３．３にある。
本発明は以下の特徴を有するヒトナチュラルキラー細胞を提供する：（ｉ）ＣＤ１６受容体を発現する、（ｉｉ）少なくとも３ヶ月間継代培養した後に増殖能力を保持する、および（ｉｉｉ）ＣＤ１６受容体をコードする発現されたＣＤ１６Ａ遺伝子を含有し、発現されたＣＤ１６Ａ遺伝子ポリヌクレオチド配列は合成されておらず、遺伝子改変されておらず、および／又は細胞内に意図的に導入されていない。
好ましくは、発現されたＣＤ１６Ａ遺伝子ポリヌクレオチド配列は合成されておらず、遺伝子改変されておらず、および／又は細胞内に意図的に導入されていない。
本発明は（Ａ）寄託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０３０１７を有するＮＰＭＤに寄託されたヒトナチュラルキラー細胞を提供し、又は（Ｂ）以下の特徴を有する：
ｉ）ＣＤ１６受容体を発現する、
ｉｉ）少なくとも３ヶ月間継代培養した後に増殖能力を保持している、および
ｉｉｉ）ｘ）合成、遺伝子改変、および／又は意図的に導入された、ＣＤ１６受容体をコードするポリヌクレオチドを含まない、又はｙ）ｄｄＰＣＲシステムを使用して細胞のゲノムＤＮＡを分析することにより、ＣＤ１６ Ｆ１７６Ｆプローブで検出可能なＤＮＡ分子とＣＤ１６ Ｆ１７６Ｖプローブで検出可能なＤＮＡ分子の比率は１以上であり、ＣＤ１６ Ｆ１７６Ｆプローブの配列は配列番号：１１であり、ＣＤ１６ Ｆ１７６Ｖプローブは配列番号：１２である。
好ましくは、ＣＤ１６受容体がＣＤ１６ａ受容体又はＣＤ１６ｂ受容体である。
好ましくは、ＣＤ１６受容体をコードする発現されたポリヌクレオチドが染色体１のｑアームの位置１ｑ２３．３にある。
好ましくは、細胞が免疫力が低下したマウスにおいて非腫瘍形成性である。
好ましくは、細胞がγ線を照射した後に同種異系の人間被験者において非腫瘍形成性である。
好ましくは、ＣＤ１６受容体をコードするポリヌクレオチドが配列番号：１、配列番号：２、 又は配列番号：１９のヌクレオチド配列を含有する。
好ましくは、ＣＤ１６受容体が配列番号：３、配列番号：４、 又は配列番号：２０のアミノ酸配列を含有する。
好ましくは、細胞は不活性な腫瘍抑制遺伝子又は変異し高度発現された癌遺伝子を更に含有する。
好ましくは、細胞が抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）応答を媒介することができ、そして、細胞が雄細胞である。
好ましくは、細胞が細胞と複合体を形成した少なくとも一つの外因性標的化ユニットを更に含有し、この外因性標的化ユニットが以下の特徴を有する標的化部分を含有する：（ａ）標的細胞上に生物学的マーカーへの特異的結合を示す、（ｂ）核酸ではない、および（ｃ）細胞によって生成されない。
好ましくは、外因性標的化ユニットが標的化部分に接合した第１のリンカーと細胞に接合した第２のリンカーとの間の相互作用を介して細胞と複合体を形成する。
好ましくは、第１のリンカーが第１のポリヌクレオチドであり、又は第２のリンカーが第２のポリヌクレオチドである。
好ましくは、標的化部分が抗原結合ユニットを含有する。
好ましくは、第１のポリヌクレオチドが一本鎖領域を含有する。
好ましくは、第１のリンカーが第１のポリヌクレオチドであり、第２のリンカーが第２のポリヌクレオチドである。
好ましくは、第１のリンカーおよび第２のリンカーは、以下からなる群から選択される：ＤＮＡ結合ドメインと標的ＤＮＡ、ロイシンジッパーと標的ＤＮＡ、ビオチンとアビジン、ビオチンとストレプトアビジン、カルモジュリン結合タンパク質とカルモジュリン、ホルモンとホルモン受容体、レクチンと炭水化物、細胞膜受容体と受容体リガンド、酵素と基質、抗原と抗体、アゴニストとアンタゴニスト、ポリヌクレオチドハイブリダイズ配列、アプタマーとターゲット、およびジンクフィンガーと標的ＤＮＡ。
好ましくは、第１のリンカーは第１の反応性基を含有し、第２のリンカーは第２の反応性基を含有し、細胞は、第２の反応性基と第１の反応性基との間の反応によって形成される共有結合を介して、標的化部分と複合体を形成する。
好ましくは、標的化部分が抗原結合ユニットを含有する。
好ましくは、第２のリンカーがＰＥＧ領域を含有する。
好ましくは、標的化部分と細胞が１ｎｍから４００ｎｍの長さで分離され、又は標的化部分と細胞が２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１３０、１７０、２００、２３０、２７０、３００、３３０、又は３７０ｎｍの長さで分離される。
好ましくは、外因性標的化ユニットが抗原結合ユニットを含有し、抗原結合ユニットが癌抗原、糖脂質、糖タンパク質、造血系統の細胞に存在する分化抗原のクラスター、ガンマ－グルタミルトランスペプチダーゼ、接着タンパク質、ホルモン、成長因子、サイトカイン、リガンド受容体、イオンチャネル、免疫グロブリンμ．鎖の膜結合型、アルファ－フェトプロテイン、Ｃ反応性タンパク質、クロモグラニンＡ、上皮ムチン抗原、ヒト上皮特異的抗原、ルイス（ａ）抗原、多剤耐性関連タンパク質、Ｎｅｕ癌遺伝子タンパク質、ニューロン特異的エノラーゼ、Ｐ糖タンパク質、多剤耐性関連抗原、ｐ１７０、多剤耐性関連抗原、前立腺特異抗原、ＮＣＡＭ、ガングリオシド分子、ＭＡＲＴ－１、熱ショックタンパク質、シアリルＴｎ、チロシナーゼ、ＭＵＣ－１、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ、ＫＳＡ、ＰＳＭＡ、ｐ５３、ＲＡＳ、ＥＧＦ－Ｒ、ＶＥＧＦ、又はＭＡＧＥに結合する。
好ましくは、抗原結合ユニットがＨＥＲ２／ｎｅｕ（ＥＲＢＢ２）、ＨＥＲ３（ＥＲＢＢ３）、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ２、ＧＤ２、ＣＴＬＡ４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３（Ｓｉｇｌｅｃ－３）、ＣＤ５２（ＣＡＭＰＡＴＨ－１抗原）、ＣＤ３２６（ＥｐＣＡＭ）、ＣＡ－１２５（ＭＵＣ１６）、ＭＭＰ９、ＤＬＬ３、ＣＤ２７４（ＰＤ－Ｌ１）、ＣＥＡ、ＭＳＬＮ（メソテリン）、ＣＡ１９－９、ＣＤ７３、ＣＤ２０５（ＤＥＣ２０５）、ＣＤ５１、ｃ－ＭＥＴ、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、ＩＧＦ－１Ｒ、ＣＤ３、ＭＩＦ、葉酸受容体アルファ（ＦＯＬＲ１）、ＣＳＦ１、ＯＸ－４０、ＣＤ１３７、ＴｆＲ、ＭＵＣ１、ＣＤ２５（ＩＬ－２Ｒ）、ＣＤ１１５（ＣＳＦ１Ｒ）、ＩＬ１Ｂ、ＣＤ１０５（エンドグリン）、ＫＩＲ、ＣＤ４７、ＣＥＡ、ＩＬ－１７Ａ、ＤＬＬ４、ＣＤ５１、アンジオポエチン２、ニューロピリン－１、ＣＤ３７、ＣＤ２２３（ＬＡＧ－３）、ＣＤ４０、ＬＩＶ－１（ＳＬＣ３９Ａ６）、ＣＤ２７（ＴＮＦＲＳＦ７）、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、Ｔｒｏｐ２、クローディン１（ＣＬＤＮ１）、ＰＳＭＡ、ＴＩＭ－１（ＨＡＶｃｒ－１）、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＤ７０、ＬＹ６Ｅ、ＢＣＭＡ、ＣＤ１３５（ＦＬＴ３）、ＡＰＲＩＬ、ＴＦ（Ｆ３）、ネクチン－４、ＦＡＰ、ＧＰＣ３、ＦＧＦＲ３、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリンタンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、活性化ＮＫ細胞受容体およびそれらの組み合わせから選ばれる癌抗原に対する抗体である。
好ましくは、標的部分がカップリング基を使用して第１のポリヌクレオチドに接合され、このカップリング基がＮＨＳエステル、他の活性化エステル、ハロゲン化アルキル又はハロゲン化アシル、二官能性架橋剤、又はマレイミド基である。
好ましくは、第１のポリヌクレオチド又は第２のポリヌクレオチドが、２０量体のポリＣＡ、２０量体のポリＧＧＴＴ、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、 ２３量体の配列番号：７，および配列番号：１０から選択される配列を含有する。
好ましくは、生物学的マーカーに対する標的化部分の結合親和性が２５０ｎＭ未満であり、又は生物学的マーカーに対する標的化部分の結合親和性が５ｎＭ、１０ｎＭ、４０ｎＭ、９０ｎＭ、１３０ｎＭ、又は１７０ｎＭである。
好ましくは、第１のポリヌクレオチドの長さ又は第２のポリヌクレオチドの長さは４ｎｔから５００ｎｔである。好ましくは、第１のポリヌクレオチドの長さ又は第２のポリヌクレオチドの長さは４、 ５、 ６、 ７、 ８、 ９、 １０、 １１、 １２、 １３、 １４、１５、 １６、 １７、 １８、 １９、 ２０、 ２１、 ２２、 ２３、 ２４、 ２５、 ２６、 ２７、 ２８、 ２９、３０、 ３２、 ３４、 ３６、 ３８、 ４０、 ４２、 ４４、 ４６、 ４８、 ５０、 ５５、 ６０、 ６５、 ７０、 ７５、 ８０、 ８５、 ９０、 ９５、 １００、 １２０、 １６０、 ２２０、 ３００、 ４００、 又は４８０ ｎｔである。
好ましくは、第１のリンカーと第２のリンカーとの間の結合親和性が２５０ｎＭ未満である。好ましくは、第１のリンカーと第２のリンカーとの間の結合親和性が５ｎＭ、１０ｎＭ、４０ｎＭ、９０ｎＭ、１３０ｎＭ、又は１７０ｎＭである。
好ましくは、第１のリンカー又は第２のリンカーが標的化ユニットの天然官能基又は細胞の表面に接合され、この天然官能基はアミノ酸、糖、又はアミンである。
好ましくは、標的化部分がペプチド、タンパク質、又はアプタマーである。
本発明はヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞が実質的に濃縮された組成物を提供し、この組成物におけるヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞数が少なくとも５×１０５であり、ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞が組成物における細胞の総数を１００％として、数として５％以上の量である。ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞は（Ａ）ＮＰＭＤに寄託され、寄託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０３０１７を有する、又は（Ｂ）以下の特徴を有する：
ｉ）ＣＤ１６受容体を発現していること、
ｉｉ） 少なくとも３ヶ月間継代培養した後に増殖能力を保持していること、および
ｉｉｉ）ｘ）合成、遺伝子改変、および／又は意図的に導入されたＣＤ１６受容体をコードするポリヌクレオチドを含まない、又はｙ）ｄｄＰＣＲ システムを使用して細胞のゲノムＤＮＡを分析することにより、ＣＤ１６ Ｆ１７６Ｆプローブで検出可能なＤＮＡ分子とＣＤ１６ Ｆ１７６Ｖプローブで検出可能なＤＮＡ分子の比率は１以上であり、ＣＤ１６ Ｆ１７６Ｆプローブの配列は配列番号：１１であり、ＣＤ１６ Ｆ１７６Ｖプローブは配列番号：１２である。
好ましくは、ＣＤ１６受容体がＣＤ１６ａ受容体又はＣＤ１６ｂ受容体である。
好ましくは、ＣＤ１６受容体をコードするポリヌクレオチドが染色体１のｑアームの位置１ｑ２３．３にある。
好ましくは、ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞が免疫力が低下したマウスにおいて非腫瘍形成性である。
好ましくは、ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞がγ線を照射した後に同種異系の人間被験者において非腫瘍形成性がある。
好ましくは、ＣＤ１６受容体をコードするポリヌクレオチドが配列番号：１、配列番号：２、 又は配列番号：１９のヌクレオチド配列を含有する。
好ましくは、ＣＤ１６受容体が配列番号：３、配列番号：４、又は配列番号：２０のアミノ酸配列を含有する。
好ましくは、ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞は不活性な腫瘍抑制遺伝子又は変異し高度発現された癌遺伝子を更に含有する。
好ましくは、ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞が抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）応答を媒介することができ、そして、細胞が雄細胞である。
好ましくは、ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞がヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞と複合体を形成した少なくとも一つの外因性標的化ユニットを更に含有し、この外因性標的化ユニットが以下の特徴を有する標的化部分を含有する：（ａ）標的細胞上に生物学的マーカーへの特異的結合を示す、（ｂ）核酸ではない、および（ｃ）ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞によって生成されない。
好ましくは、外因性標的化ユニットが標的化部分に接合した第１のリンカーとヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞に接合した第２のリンカーとの間の相互作用を介してヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞と複合体を形成する。
好ましくは、第１のリンカーが第１のポリヌクレオチド、又は第２のリンカーが第２のポリヌクレオチドである。
好ましくは、標的化部分が抗原結合ユニットを含有する。
好ましくは、第１のポリヌクレオチドは一本鎖領域を含有する。
好ましくは、第１のリンカーが第１のポリヌクレオチドであり、第２のリンカーが第２のポリヌクレオチドである。
好ましくは、第１のリンカーおよび第２のリンカーは、以下からなる群から選択される：ＤＮＡ結合ドメインと標的ＤＮＡ、ロイシンジッパーと標的ＤＮＡ、ビオチンとアビジン、ビオチンとストレプトアビジン、カルモジュリン結合タンパク質とカルモジュリン、ホルモンとホルモン受容体、レクチンと炭水化物、細胞膜受容体と受容体リガンド、酵素と基質、抗原と抗体、アゴニストとアンタゴニスト、ポリヌクレオチドハイブリダイズ配列、アプタマーとターゲット、およびジンクフィンガーと標的ＤＮＡ。
好ましくは、第１のリンカーは第１の反応性基を含有し、第２のリンカーは第２の反応性基を含有し、ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞は、第２の反応性基と第１の反応性基との間の反応によって形成される共有結合を介して、標的化部分と複合体を形成する。
好ましくは、標的化部分が抗原結合ユニットを含有する。
好ましくは、第２のリンカーがＰＥＧ領域を含有する。
好ましくは、標的化部分とヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞が１ｎｍから４００ｎｍの長さで分離される。
好ましくは、外因性標的化ユニットが抗原結合ユニットを含有し、抗原結合ユニットが癌抗原、糖脂質、糖タンパク質、造血系統の細胞に存在する分化抗原のクラスター、ガンマ－グルタミルトランスペプチダーゼ、接着タンパク質、ホルモン、成長因子、サイトカイン、リガンド受容体、イオンチャネル、免疫グロブリンμ．鎖の膜結合型、アルファ－フェトプロテイン、Ｃ反応性タンパク質、クロモグラニンＡ、上皮ムチン抗原、ヒト上皮特異的抗原、ルイス（ａ）抗原、多剤耐性関連タンパク質、Ｎｅｕ癌遺伝子タンパク質、ニューロン特異的エノラーゼ、Ｐ糖タンパク質、多剤耐性関連抗原、ｐ１７０、多剤耐性関連抗原、前立腺特異抗原、ＮＣＡＭ、ガングリオシド分子、ＭＡＲＴ－１、熱ショックタンパク質、シアリルＴｎ、チロシナーゼ、ＭＵＣ－１、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ、ＫＳＡ、ＰＳＭＡ、ｐ５３、ＲＡＳ、ＥＧＦ－Ｒ、ＶＥＧＦ、又はＭＡＧＥに結合する。
好ましくは、抗原結合ユニットがＨＥＲ２／ｎｅｕ（ＥＲＢＢ２）、ＨＥＲ３（ＥＲＢＢ３）、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ２、ＧＤ２、ＣＴＬＡ４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３（Ｓｉｇｌｅｃ－３）、ＣＤ５２（ＣＡＭＰＡＴＨ－１抗原）、ＣＤ３２６（ＥｐＣＡＭ）、ＣＡ－１２５（ＭＵＣ１６）、ＭＭＰ９、ＤＬＬ３、ＣＤ２７４（ＰＤ－Ｌ１）、ＣＥＡ、ＭＳＬＮ（メソテリン）、ＣＡ１９－９、ＣＤ７３、ＣＤ２０５（ＤＥＣ２０５）、ＣＤ５１、ｃ－ＭＥＴ、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、ＩＧＦ－１Ｒ、ＣＤ３、ＭＩＦ、葉酸受容体アルファ（ＦＯＬＲ１）、ＣＳＦ１、ＯＸ－４０、ＣＤ１３７、ＴｆＲ、ＭＵＣ１、ＣＤ２５（ＩＬ－２Ｒ）、ＣＤ１１５（ＣＳＦ１Ｒ）、ＩＬ１Ｂ、ＣＤ１０５（エンドグリン）、ＫＩＲ、ＣＤ４７、ＣＥＡ、ＩＬ－１７Ａ、ＤＬＬ４、ＣＤ５１、アンジオポエチン２、ニューロピリン－１、ＣＤ３７、ＣＤ２２３（ＬＡＧ－３）、ＣＤ４０、ＬＩＶ－１（ＳＬＣ３９Ａ６）、ＣＤ２７（ＴＮＦＲＳＦ７）、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、Ｔｒｏｐ２、クローディン１（ＣＬＤＮ１）、ＰＳＭＡ、ＴＩＭ－１（ＨＡＶｃｒ－１）、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＤ７０、ＬＹ６Ｅ、ＢＣＭＡ、ＣＤ１３５（ＦＬＴ３）、ＡＰＲＩＬ、ＴＦ（Ｆ３）、ネクチン－４、ＦＡＰ、ＧＰＣ３、ＦＧＦＲ３、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリンタンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、活性化ＮＫ細胞受容体およびそれらの組み合わせから選ばれる癌抗原に対する抗体である。
好ましくは、標的化部分がカップリング基を使用して第１のポリヌクレオチドに接合され、ここでこのカップリング基はＮＨＳエステル、他の活性化エステル、ハロゲン化アルキル又はハロゲン化アシル、二官能性架橋剤、又はマレイミド基である。
好ましくは、第１のポリヌクレオチド又は第２のポリヌクレオチドが、２０量体のポリＣＡ、２０量体のポリＧＧＴＴ、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、２３量体の配列番号：７，および配列番号：１０から選択された配列を含有する。
好ましくは、生物学的マーカーに対する標的化部分の結合親和性は、２５０ｎＭ未満である。
好ましくは、第１のポリヌクレオチドの長さ又は第２のポリヌクレオチドの長さが４ｎｔから５００ｎｔである。
好ましくは、第１のリンカーと第２のリンカーとの間の結合親和性が２５０ｎＭ未満である。
好ましくは、第１のリンカー又は第２のリンカーが標的化ユニットの天然官能基又はヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞の表面に接合され、この天然官能基はアミノ酸、糖、又はアミンである。
好ましくは、標的化部分がペプチド、タンパク質、又はアプタマーである。
本発明はヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞が実質的に濃縮された組成物を得る方法を提供し、以下の方法を含有する：（ａ） 寄託番号ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２４０７を有するヒト末梢血ナチュラルキラー細胞の集団を取得し、（ｂ） ヒト末梢血ナチュラルキラー細胞の集団をＣＤ１６受容体に特異的な抗体と接触させ、および（ｃ） 抗体によって特異的に結合される細胞を分離し、それによってヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞が実質的に濃縮された組成物を得、ここで、このヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞は（Ａ）ＮＰＭＤに寄託され、寄託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０３０１７を有する、又は（Ｂ）以下の特徴を有する：
ｉ）ＣＤ１６受容体を発現していること、
ｉｉ）ｘ）合成、遺伝子改変、および／又は意図的に導入されたポリヌクレオチドを含まない、又はｙ）ｄｄＰＣＲ システムを使用して細胞のゲノムＤＮＡを分析することにより、ＣＤ１６ Ｆ１７６Ｆプローブで検出可能なＤＮＡ分子とＣＤ１６ Ｆ１７６Ｖプローブで検出可能なＤＮＡ分子の比率は１以上であり、ＣＤ１６ Ｆ１７６Ｆプローブの配列は配列番号：１１であり、ＣＤ１６ Ｆ１７６Ｖプローブは配列番号：１２である。
好ましくは、抗体がＣＤ１６ａ受容体とＣＤ１６ｂ受容体の少なくとも一つに特異的である。
好ましくは、ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞が少なくとも１週間継代培養した後に増殖能力を保持することができる。
好ましくは、ＣＤ１６受容体をコードする発現されたポリヌクレオチドが染色体１のｑアームの位置１ｑ２３．３にある。
好ましくは、ヒトＣＤ１６＋ヒトナチュラルキラー細胞が、免疫力が低下したマウスにおいて非腫瘍形成性である。
好ましくは、ヒトＣＤ１６＋ヒトナチュラルキラー細胞がγ線を照射した後に同種異系の人間被験者において非腫瘍形成性である。
好ましくは、ＣＤ１６受容体をコードするポリヌクレオチドが配列番号：１、配列番号：２、 又は配列番号：１９のヌクレオチド配列を含有する。
好ましくは、ＣＤ１６受容体が配列番号：３、配列番号：４、 又は配列番号：２０のアミノ酸配列を含有する。
好ましくは、ヒトＣＤ１６＋ヒトナチュラルキラー細胞は不活性な腫瘍抑制遺伝子又は変異し高度発現された癌遺伝子を更に含有する。
好ましくは、ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞が組成物における細胞の総数を１００％として、数として５％以上の量である。
好ましくは、ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞が抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）応答を媒介することができ、そして、細胞が雄細胞である。
好ましくは、ステップ（ｃ）がサブステップを含有する：（ｃ１）抗体によって特異的に結合される細胞を分離し、（ｃ２）容器内で抗体が特異的に結合している細胞をヒト血小板溶解物およびＩＬ－２を含有する培地と接触させ、そして（ｃ３）細胞を数日間培養することにより、ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞が実質的に濃縮された組成物が得られる。
好ましくは、容器がＧ－Ｒｅｘ培養装置である。
好ましくは、容器が細胞を播種するための底部を含有し、この底部が空気透過性および水不透過性である。
好ましくは、培地中の溶解グルコースの濃度が１５００～５０００ｍｇ／Ｌである。
好ましくは、組成物におけるヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞数が少なくとも５×１０５であり、ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞が組成物における細胞の総数を１００％として、数として５％以上の量である。
本発明はヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞を培養および増殖させる方法を提供し、以下の方法を含有する：（ｘ） 容器内でヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞を０．５－１０ ｖｏｌ％ヒト血小板溶解物および１００－３０００ ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２を含有する培地と接触させ、そして（ｙ） 細胞を数日間培養する。好ましくは、培地が１ ｖｏｌ％、 ２ ｖｏｌ％、 ３ ｖｏｌ％、 ４ ｖｏｌ％、 ５ ｖｏｌ％、 ６ ｖｏｌ％、 ７ ｖｏｌ％、 ８ ｖｏｌ％、 ９ ｖｏｌ％、 １０ ｖｏｌ％、１１ ｖｏｌ％、 １２ ｖｏｌ％、 １３ ｖｏｌ％、 １４ ｖｏｌ％、 又は１５ ｖｏｌ％のヒト血小板溶解物を含有する。好ましくは、培地が０．５～２０ ｖｏｌ％のヒト血小板溶解物を含有することは好ましい。培地が１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、又は３０００ ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２を含有する。
好ましくは、容器がＧ－Ｒｅｘ培養装置である。
好ましくは、容器が細胞を播種するための底部を含有し、この底部が空気透過性および水不透過性である。
好ましくは、培地中の溶解グルコースの濃度が１５００～５０００ｍｇ／Ｌである。
好ましくは、ステップ（ｙ）がサブステップを含有する：（ｙ１）細胞を少なくとも１日間培養し、および（ｙ２）細胞を少なくとも１ヶ月継代培養する。
好ましくは、ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞が少なくとも３ヶ月継代培養した後に増殖能力を保持することができる。
好ましくは、このヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞が（Ａ）ＮＰＭＤに寄託され、寄託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０３０１７を有する、又は（Ｂ）以下の特徴を有する：
ｉ）ＣＤ１６受容体を発現していること、
ｉｉ）ｘ）合成、遺伝子改変、および／又は意図的に導入されたＣＤ１６受容体をコードするポリヌクレオチドを含まない、又はｙ）ｄｄＰＣＲシステムを使用して細胞のゲノムＤＮＡを分析することにより、ＣＤ１６ Ｆ１７６Ｆプローブで検出可能なＤＮＡ分子とＣＤ１６ Ｆ１７６Ｖプローブで検出可能なＤＮＡ分子の比率は１以上であり、ＣＤ１６ Ｆ１７６Ｆプローブの配列は配列番号：１１であり、ＣＤ１６ Ｆ１７６Ｖプローブの配列は配列番号：１２である。
好ましくは、ヒトＣＤ１６＋ヒトナチュラルキラー細胞が、免疫力が低下したマウスにおいて非腫瘍形成性である。
好ましくは、ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞がγ線を照射した後に同種異系の人間被験者において非腫瘍形成性である。
好ましくは、ＣＤ１６受容体をコードするポリヌクレオチドが配列番号：１、配列番号：２、 又は配列番号：１９のヌクレオチド配列を含有する。
好ましくは、ＣＤ１６受容体が配列番号：３、配列番号：４、 又は配列番号：２０のアミノ酸配列を含有する。
好ましくは、ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞は不活性な腫瘍抑制遺伝子又は変異し高度発現された癌遺伝子を更に含有する。
本発明は癌、自己免疫疾患、神経疾患、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症、造血細胞関連疾患、メタボリックシンドローム、病原性疾患、ウイルス感染、又は細菌感染を治療する為に、それを必要とする対象に対する有効量のヒトナチュラルキラー細胞を含有する組成物の投与を含有する方法を提供する。ヒトナチュラルキラー細胞は（Ａ）ＮＰＭＤに寄託され、寄託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０３０１７を有する、又は（Ｂ）以下の特徴を有する：
ｉ）ＣＤ１６受容体を発現していること、
ｉｉ）少なくとも３ヶ月間継代培養した後に増殖能力を保持していること、および
ｉｉｉ）ｘ）合成、遺伝子改変、および／又は意図的に導入されたＣＤ１６受容体をコードするポリヌクレオチドを含まない、又はｙ）ｄｄＰＣＲ システムを使用して細胞のゲノムＤＮＡを分析することにより、ＣＤ１６ Ｆ１７６Ｆプローブで検出可能なＤＮＡ分子とＣＤ１６ Ｆ１７６Ｖプローブで検出可能なＤＮＡ分子の比率は１以上であり、ＣＤ１６ Ｆ１７６Ｆプローブの配列は配列番号：１１であり、ＣＤ１６ Ｆ１７６Ｖプローブの配列は配列番号：１２である。
好ましくは、ヒトナチュラルキラー細胞がヒトナチュラルキラー細胞と複合体を形成した少なくとも一つの外因性標的化ユニットを更に含有し、この外因性標的化ユニットが以下の特徴を有する標的化部分を含有する：（ａ）標的細胞上に生物学的マーカーへの特異的結合を示し、（ｂ）核酸ではない、および（ｃ）ヒトナチュラルキラー細胞によって生成されない。
好ましくは、外因性標的化ユニットが標的部分に接合した第１のリンカーとヒトナチュラルキラー細胞に接合した第２のリンカーとの間の相互作用を介してヒトナチュラルキラー細胞と複合体を形成する。
好ましくは、第１のリンカーが第１のポリヌクレオチド、又は第２のリンカーが第２のポリヌクレオチドである。
好ましくは、標的化部分が抗原結合ユニットを含有する。
好ましくは、第１のポリヌクレオチドは一本鎖領域を含有する。
好ましくは、第１のリンカーが第１のポリヌクレオチドであり、第２のリンカーが第２のポリヌクレオチドである。
好ましくは、第１のリンカーおよび第２のリンカーは、以下からなる群から選択される：ＤＮＡ結合ドメインと標的ＤＮＡ、ロイシンジッパーと標的ＤＮＡ、ビオチンとアビジン、ビオチンとストレプトアビジン、カルモジュリン結合タンパク質とカルモジュリン、ホルモンとホルモン受容体、レクチンと炭水化物、細胞膜受容体と受容体リガンド、酵素と基質、抗原と抗体、アゴニストとアンタゴニスト、ポリヌクレオチドハイブリダイズ配列、アプタマーとターゲット、およびジンクフィンガーと標的ＤＮＡ。
好ましくは、第１のリンカーは第１の反応性基を含有し、第２のリンカーは第２の反応性基を含有し、ヒトナチュラルキラー細胞は、第２の反応性基と第１の反応性基との間の反応によって形成される共有結合を介して、標的化部分と複合体を形成する。
好ましくは、標的化部分が抗原結合ユニットを含有する。
好ましくは、第２のリンカーがＰＥＧ領域を含有する。
好ましくは、標的化部分とヒトナチュラルキラー細胞が１ｎｍから４００ｎｍの長さで分離される。
好ましくは、外因性標的化ユニットが抗原結合ユニットを含有し、抗原結合ユニットが癌抗原、糖脂質、糖タンパク質、造血系統の細胞に存在する分化抗原のクラスター、ガンマ－グルタミルトランスペプチダーゼ、接着タンパク質、ホルモン、成長因子、サイトカイン、リガンド受容体、イオンチャネル、免疫グロブリンμ．鎖の膜結合型、アルファ－フェトプロテイン、Ｃ反応性タンパク質、クロモグラニンＡ、上皮ムチン抗原、ヒト上皮特異的抗原、ルイス（ａ）抗原、多剤耐性関連タンパク質、Ｎｅｕ癌遺伝子タンパク質、ニューロン特異的エノラーゼ、Ｐ糖タンパク質、多剤耐性関連抗原、ｐ１７０、多剤耐性関連抗原、前立腺特異抗原、ＮＣＡＭ、ガングリオシド分子、ＭＡＲＴ－１、熱ショックタンパク質、シアリルＴｎ、チロシナーゼ、ＭＵＣ－１、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ、ＫＳＡ、ＰＳＭＡ、ｐ５３、ＲＡＳ、ＥＧＦ－Ｒ、ＶＥＧＦ、又はＭＡＧＥに結合する。
好ましくは、抗原結合ユニットがＨＥＲ２／ｎｅｕ（ＥＲＢＢ２）、ＨＥＲ３（ＥＲＢＢ３）、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ２、ＧＤ２、ＣＴＬＡ４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３（Ｓｉｇｌｅｃ－３）、ＣＤ５２（ＣＡＭＰＡＴＨ－１抗原）、ＣＤ３２６（ＥｐＣＡＭ）、ＣＡ－１２５（ＭＵＣ１６）、ＭＭＰ９、ＤＬＬ３、ＣＤ２７４（ＰＤ－Ｌ１）、ＣＥＡ、ＭＳＬＮ（メソテリン）、ＣＡ１９－９、ＣＤ７３、ＣＤ２０５（ＤＥＣ２０５）、ＣＤ５１、ｃ－ＭＥＴ、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、ＩＧＦ－１Ｒ、ＣＤ３、ＭＩＦ、葉酸受容体アルファ（ＦＯＬＲ１）、ＣＳＦ１、ＯＸ－４０、ＣＤ１３７、ＴｆＲ、ＭＵＣ１、ＣＤ２５（ＩＬ－２Ｒ）、ＣＤ１１５（ＣＳＦ１Ｒ）、ＩＬ１Ｂ、ＣＤ１０５（エンドグリン）、ＫＩＲ、ＣＤ４７、ＣＥＡ、ＩＬ－１７Ａ、ＤＬＬ４、ＣＤ５１、アンジオポエチン２、ニューロピリン－１、ＣＤ３７、ＣＤ２２３（ＬＡＧ－３）、ＣＤ４０、ＬＩＶ－１（ＳＬＣ３９Ａ６）、ＣＤ２７（ＴＮＦＲＳＦ７）、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、Ｔｒｏｐ２、クローディン１（ＣＬＤＮ１）、ＰＳＭＡ、ＴＩＭ－１（ＨＡＶｃｒ－１）、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＤ７０、ＬＹ６Ｅ、ＢＣＭＡ、ＣＤ１３５（ＦＬＴ３）、ＡＰＲＩＬ、ＴＦ（Ｆ３）、ネクチン－４、ＦＡＰ、ＧＰＣ３、ＦＧＦＲ３、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリンタンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、活性化ＮＫ細胞受容体およびそれらの組み合わせからから選ばれる癌抗原に対する抗体である。
好ましくは、標的化部分がカップリング基を使用して第１のポリヌクレオチドに接合され、このカップリング基がＮＨＳエステル、他の活性化エステル、ハロゲン化アルキル又はハロゲン化アシル、二官能性架橋剤、又はマレイミド基である。好ましくは、第１のポリヌクレオチド又は第２のポリヌクレオチドが、２０量体のポリＣＡ、２０量体のポリＧＧＴＴ、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、 ２３量体の配列番号：７， および配列番号：１０から選択された配列を含有する。
好ましくは、生物学的マーカーに対する標的化部分の結合親和性が２５０ｎＭ未満であり、又は生物学的マーカーに対する標的化部分の結合親和性が５ｎＭ、１０ｎＭ、４０ｎＭ、９０ｎＭ、１３０ｎＭ、又は１７０ｎＭである。
好ましくは、第１のポリヌクレオチドの長さ又は第２のポリヌクレオチドの長さは４ｎｔから５００ｎｔである。好ましくは、第１のポリヌクレオチドの長さ又は第２のポリヌクレオチドの長さは４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２０、１６０、２２０、３００、４００、又は４８０ｎｔである。
好ましくは、第１のリンカーと第２のリンカーとの間の結合親和性が２５０ｎＭ未満である。好ましくは、第１のリンカーと第２のリンカーとの間の結合親和性が２、１０、２５、５０、６２、７０、８５、１００、１０２、１１０、１２５、１５０、１６２、１７０、１８５、２００、２０２、２１０、２２５、又は２５０ｎＭである。
好ましくは、第１のリンカー又は第２のリンカーが標的化ユニットの天然官能基又は細胞の表面に接合され、ここで、この天然官能基はアミノ酸、糖、又はアミンである。
好ましくは、標的化部分がペプチド、タンパク質、又はアプタマーである。
好ましくは、ＣＤ１６受容体がＣＤ１６ａ受容体又はＣＤ１６ｂ受容体である。
好ましくは、ＣＤ１６受容体をコードする発現されたポリヌクレオチドが染色体１のｑアームの位置１ｑ２３．３にある。
好ましくは、細胞が、免疫力が低下したマウスにおいて非腫瘍形成性である。
好ましくは、細胞がγ線を照射した後に同種異系の人間被験者において非腫瘍形成性である。
好ましくは、ＣＤ１６受容体をコードするポリヌクレオチドが配列番号：１、配列番号：２、 又は配列番号：１９のヌクレオチド配列を含有する。
好ましくは、ＣＤ１６受容体が配列番号：３、配列番号：４、又は配列番号：２０のアミノ酸配列を含有する。
好ましくは、ヒトナチュラルキラー細胞は不活性な腫瘍抑制遺伝子又は変異し高度発現された癌遺伝子を更に含有する。
好ましくは、ヒトナチュラルキラー細胞が抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）応答を媒介することができ、そして、細胞が雄細胞である。
好ましくは、組成物におけるヒトナチュラルキラー細胞数が少なくとも５×１０５であり、ヒトナチュラルキラー細胞が組成物における細胞の総数を１００％として、５％以上の量である。
好ましくは、被験者がヒトである。
好ましくは、アカントーマ、腺房細胞癌、音響神経腫、末端黒子型黒色腫、アクロスピロマ、急性好酸球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性巨核芽球性白血病、急性単球性白血病、成熟を伴う急性骨髄芽球性白血病、急性骨髄性樹状細胞白血病、急性骨髄性白血病、急性前骨髄球性白血病、アダマンチノーマ、腺癌、腺様嚢胞癌、腺腫、腺様歯原性腫瘍、副腎皮質癌、成人Ｔ細胞白血病、アグレッシブＮＫ細胞白血病、エイズ関連がん、エイズ関連リンパ腫、胞巣状軟部肉腫、骨髄芽球性線維腫、肛門がん、未分化大細胞リンパ腫、未分化甲状腺がん、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、血管筋脂肪腫、血管肉腫、虫垂がん、星状細胞腫、異型奇形腫瘍、基底細胞癌、基底様癌、Ｂ細胞白血病、Ｂ細胞リンパ腫、ベリーニ管癌、胆道癌、膀胱癌、芽細胞腫、骨癌、骨腫瘍、脳幹神経膠腫、脳腫瘍、乳がん、ブレンナー腫瘍、気管支腫瘍、気管支肺胞がん、褐色腫瘍、バーキットリンパ腫、原発部位不明のがん、カルチノイド腫瘍、がん、上皮内がん、陰茎癌腫、原発部位不明のがん、癌肉腫、キャッスルマン病、中枢神経系胚性腫瘍、小脳星状細胞腫、脳星状細胞腫、子宮頸癌、胆管癌、軟骨肉腫、軟骨肉腫、脊索腫、絨毛癌、脈絡叢乳頭腫、慢性リンパ性白血病、慢性単球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性疾患、慢性好中球性白血病、明細胞腫瘍、結腸がん、結腸直腸がん、頭蓋咽頭腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、デゴス病、隆起性皮膚線維肉腫、類皮嚢胞、線維形成性小円形細胞腫瘍、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、胚芽異形成性神経上皮腫瘍、胚性癌、子宮内膜洞腫瘍、子宮内膜癌、子宮内膜子宮癌、子宮内膜腫瘍、腸管症関連Ｔ細胞リンパ腫、上衣腫、上衣腫、類上皮肉腫、赤白血病、食道癌、食道神経芽細胞腫、ユーイング腫瘍ファミリー、ユーイングファミリー肉腫、ユーイング肉腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管癌、乳房外パジェット病、ファロピウス管癌、胎児の胎児、線維腫、線維肉腫、濾胞性リンパ腫、濾胞性甲状腺癌、胆嚢癌、胆嚢癌、神経節膠腫、神経節神経腫、胃癌、胃リンパ腫、胃腸癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、消化管間質腫瘍、生殖細胞腫瘍、胚細胞腫、妊娠性絨毛癌、妊娠性絨毛腫瘍、骨の巨大細胞腫瘍、多形性膠芽腫、神経膠腫、大脳神経膠腫症、グロムス腫瘍、グルカゴノーマ、性腺芽細胞腫、顆粒膜細胞腫瘍、有毛細胞白血病、有毛細胞白血病、頭頸部がん、心臓がん、血管芽腫、血管周囲細胞腫、血管肉腫、血液悪性腫瘍、肝細胞癌、肝脾Ｔ細胞リンパ腫、遺伝性乳房卵巣癌症候群、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、視床下部神経膠腫、炎症性乳がん、眼内黒色腫、膵島細胞がん、膵島細胞腫瘍、若年性骨髄単球性白血病、カポジ肉腫、カポジ肉腫、腎臓がん、クラトスキン腫瘍、クルーケンベルク腫瘍、喉頭がん、悪性黒子黒色腫、白血病、白血病、唇および口腔がん、脂肪肉腫、肺がん、黄体腫、リンパ管腫、リンパ管肉腫、リンパ上皮腫、リンパ性白血病、リンパ腫、マクログロブリン血症、悪性線維性組織球腫、骨の悪性線維性組織球腫、悪性神経膠腫、悪性中皮腫、悪性末梢神経鞘腫瘍、悪性ラブドイド腫瘍、悪性トリトン腫瘍、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、肥満細胞白血病、縦隔胚細胞腫瘍、縦隔腫瘍、甲状腺髄様がん、髄芽腫、黒色腫、髄膜腫、メルケル細胞癌、中皮腫、潜在性原発性扁平上皮癌、転移性尿路上皮癌、混合ミュラー腫瘍、単球性白血病、口癌、粘液性腫瘍、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫、多発性骨髄腫、菌状息肉腫、骨髄異形成症、骨髄異形成症候群、骨髄性白血病、骨髄性肉腫、骨髄増殖性疾患、粘液腫、鼻腔がん、鼻咽頭がん、上咽頭がん、新生物、神経鞘腫、神経芽細胞腫、神経線維腫、神経腫瘍、結節性黒色腫、非ホジキンリンパ腫、非黒色腫皮膚がん、非小細胞肺がん、眼腫瘍学、乏突起星細胞腫、乏突起膠腫、オンコサイトーマ、視神経鞘髄膜腫、口腔がん、中咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、卵巣上皮がん、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性腫瘍、乳房のパジェット病、パンコースト腫瘍、膵臓癌、甲状腺乳頭癌、乳頭腫症、傍神経節腫、鼻傍洞癌、副甲状腺がん、陰茎がん、血管周囲類上皮細胞腫瘍、咽頭がん、褐色細胞腫、中間型松果体実質腫瘍、松果体芽細胞腫、下垂体細胞腫、下垂体腺腫、下垂体腫瘍、形質細胞新生物、胸膜肺芽腫、多胚腫、前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性滲出液リンパ腫、原発性肝細胞癌、原発性肝癌、原発性腹膜癌、原始神経外胚葉性腫瘍、前立腺癌、腹膜偽粘液腫、直腸癌、腎細胞癌、染色体１５におけるＮＵＴ遺伝子が関与する気道癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、横紋筋肉腫、リヒター形質転換、仙尾骨奇形腫、唾液腺癌、肉腫、シュワン腫症、脂腺癌、続発性新生物、セミノーマ、漿液性腫瘍、セルトリ・ライディッヒ細胞腫瘍、性索間質腫瘍、セザリー症候群、印環細胞癌、皮膚がん、小青色円形細胞腫瘍、小細胞がん、小細胞肺がん、小細胞リンパ腫、小腸がん、軟部肉腫、ソマトスタチノーマ、煤疣贅、脊髄腫瘍、脊椎腫瘍、脾辺縁帯リンパ腫、扁平上皮がん、胃がん、表在拡大型黒色腫、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、表面上皮間質腫瘍、滑膜肉腫、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病、Ｔ細胞大顆粒リンパ球性白血病、Ｔ細胞白血病、Ｔ細胞リンパ腫、Ｔ細胞前リンパ球性白血病、奇形腫、末期リンパ腫、精巣癌、莢膜細胞癌、胸腺癌、胸腺癌、胸腺腫、甲状腺癌、腎盂および尿路上皮の移行上皮癌、移行上皮癌、尿膜管癌、尿道がん、尿生殖器腫瘍、子宮肉腫、ブドウ膜黒色腫、膣がん、バーナーモリソン症候群、疣贅がん、視覚経路神経膠腫、外陰がん、ワルデンストレームマクログロブリン血症、ワーシン腫瘍、ウィルムス腫瘍、他の癌、およびそれらの組み合わせから選ばれる癌を治療する方法である。
好ましくは、生物学的マーカーが炭水化物、糖脂質、糖タンパク質、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２１等の造血系統の細胞に存在するＣＤ（分化クラスター）抗原、ガンマ－グルタミルトランスペプチダーゼ； 接着タンパク質（例：ＩＣＡＭ－１、ＩＣＡＭ－２、ＥＬＡＭ－１、ＶＣＡＭ－１）； ホルモン、成長因子、サイトカイン、および他のリガンド受容体、イオンチャネル； と免疫グロブリンμ．鎖の膜結合型から選らばれる。
好ましくは、造血系統の細胞に存在するＣＤ（分化のクラスター）抗原がＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２１、又は他のＣＤ（分化のクラスター）抗原である。
好ましくは、接着タンパク質は、ＩＣＡＭ－１、ＩＣＡＭ－２、ＥＬＡＭ－１、ＶＣＡＭ－１、又は他の接着タンパク質である。
好ましくは、細胞が、ＣＤ２、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ８ａ、ＣＤ８、ＣＤ１ １ａ（ＩＴＧＡＬ）、ＣＤ１ １ｂ（ＩＴＧＡＭ）、ＣＤ１ １ｃ（ＩＴＧＡＸ）、ＣＤ１ １ｄ（ＩＴＧＡＤ）、ＣＤ １８（ＩＴＧＢ２）、ＣＤ １９（Ｂ４）、ＣＤ２７（ＴＮＦＲＳＦ７）、ＣＤ２８、ＣＤ２９（ＩＴＧＢ１）、ＣＤ３０（ＴＮＦＲＳＦ８）、ＣＤ４０（ＴＮＦＲＳＦ５）、ＣＤ４８（ＳＬＡＭＦ２）、ＣＤ４９ａ（ＩＴＧＡ１）、ＣＤ４９ｄ（ＩＴＧＡ４）、ＣＤ４９ｆ（ＩＴＧＡ６）、ＣＤ６６ａ（ＣＥＡＣＡＭ１）、ＣＤ６６ｂ（ＣＥＡＣＡＭ８）、ＣＤ６６ｃ（ＣＥＡＣＡＭ６）、ＣＤ６６ｄ（ＣＥＡＣＡＭ３）、ＣＤ６６ｅ（ＣＥＡＣＡＭ５）、ＣＤ６９（ＣＬＥＣ２）、ＣＤ７９Ａ（Ｂ細胞抗原受容体複合体関連アルファ鎖）、ＣＤ７９Ｂ（Ｂ細胞抗原受容体複合体関連ベータ鎖）、ＣＤ８４（ＳＬＡＭＦ５）、ＣＤ９６（触覚）、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ１０３（ＩＴＧＡＥ）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭＦ１）、ＣＤ１５８Ａ（ＫＩＲ２ＤＬ１）、ＣＤ１５８Ｂ１（ＫＩＲ２ＤＬ２）、ＣＤ１５８Ｂ２（ＫＩＲ２ＤＬ３）、ＣＤ１５８Ｃ（ＫＩＲ３ＤＰ１）、ＣＤ１５８Ｄ（ＫＩＲＤＬ４）、ＣＤ１５８Ｆ１（ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ）、ＣＤ１５８Ｆ２（ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ）、ＣＤ１５８Ｋ（ＫＩＲ３ＤＬ２）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＣＤ１６２（ＳＥＬＰＬＧ）、ＣＤ２２６（ＤＮＡＭ１）、ＣＤ２２９（ＳＬＡＭＦ３）、ＣＤ２４４（ＳＬＡＭＦ４）、ＣＤ２４７（ＣＤ３－ゼータ）、ＣＤ２５８（ＬＩＧＨＴ）、ＣＤ２６８（ＢＡＦＦＲ）、ＣＤ２７０（ＴＮＦＳＦ１４）、ＣＤ２７２（ＢＴＬＡ）、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、ＣＤ２７９（ＰＤ－１）、ＣＤ３１４（ＮＫＧ２Ｄ）、ＣＤ３１９（ＳＬＡＭＦ７）、ＣＤ３３５（ＮＫ－ｐ４６）、ＣＤ３３６（ＮＫ－ｐ４４）、ＣＤ３３７（ ＮＫ－ｐ３０）、ＣＤ３５２（ＳＬＡＭＦ６）、ＣＤ３５３（ＳＬＡＭＦ８）、ＣＤ３５５（ＣＲＴＡＭ）、ＣＤ３５７（ＴＮＦＲＳＦ１８）、誘導性Ｔ細胞共刺激因子（ＩＣＯＳ）、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＮＫＧ２Ｃ、ＤＡＰ－１０、ＩＣＡＭ－１、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＩＬ－２Ｒベータ、ＩＬ－２Ｒガンマ、ＩＬ－７Ｒアルファ、ＬＦＡ－１、ＳＬＡＭＦ９、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ（ＧｒｐＬ）、ＳＬＰ－７６（ＬＣＰ２）、ＰＡＧ１／ＣＢＰ、ＣＤ８３リガンド、Ｆｃガンマ受容体、ＭＨＣクラス１分子、ＭＨＣクラス２分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリンタンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、活性化ＮＫ細胞受容体、Ｔｏｌｌ様受容体、ＨＥＲ２、ＢＣＭＡ、ＰＤ－Ｌ１およびそれらの組み合わせから選ばれる抗原に対する標的結合一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含有したキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする合成、遺伝子改変および／又は意図的に導入されたポリヌクレオチドを更に含有する。
好ましくは、細胞が抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）応答を媒介することができる。
本発明は癌、自己免疫疾患、神経疾患、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症、造血細胞関連疾患、メタボリックシンドローム、病原性疾患、ウイルス感染、又は細菌感染を治療する方法で、それを必要とする対象に対する有効量のヒトナチュラルキラー細胞を含有する組成物の投与を含有する方法を提供する。ヒトナチュラルキラー細胞が、ＣＤ２、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ８ａ、ＣＤ８、ＣＤ１ １ａ（ＩＴＧＡＬ）、ＣＤ１ １ｂ（ＩＴＧＡＭ）、ＣＤ１ １ｃ（ＩＴＧＡＸ）、ＣＤ１ １ｄ（ＩＴＧＡＤ）、ＣＤ １８（ＩＴＧＢ２）、ＣＤ １９（Ｂ４）、ＣＤ２７（ＴＮＦＲＳＦ７）、ＣＤ２８、ＣＤ２９（ＩＴＧＢ１）、ＣＤ３０（ＴＮＦＲＳＦ８）、ＣＤ４０（ＴＮＦＲＳＦ５）、ＣＤ４８（ＳＬＡＭＦ２）、ＣＤ４９ａ（ＩＴＧＡ１）、ＣＤ４９ｄ（ＩＴＧＡ４）、ＣＤ４９ｆ（ＩＴＧＡ６）、ＣＤ６６ａ（ＣＥＡＣＡＭ１）、ＣＤ６６ｂ（ＣＥＡＣＡＭ８）、ＣＤ６６ｃ（ＣＥＡＣＡＭ６）、ＣＤ６６ｄ（ＣＥＡＣＡＭ３）、ＣＤ６６ｅ（ＣＥＡＣＡＭ５）、ＣＤ６９（ＣＬＥＣ２）、ＣＤ７９Ａ（Ｂ細胞抗原受容体複合体関連アルファ鎖）、ＣＤ７９Ｂ（Ｂ細胞抗原受容体複合体関連ベータ鎖）、ＣＤ８４（ＳＬＡＭＦ５）、ＣＤ９６（触覚）、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ１０３（ＩＴＧＡＥ）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭＦ１）、ＣＤ１５８Ａ（ＫＩＲ２ＤＬ１）、ＣＤ１５８Ｂ１（ＫＩＲ２ＤＬ２）、ＣＤ１５８Ｂ２（ＫＩＲ２ＤＬ３）、ＣＤ１５８Ｃ（ＫＩＲ３ＤＰ１）、ＣＤ１５８Ｄ（ＫＩＲＤＬ４）、ＣＤ１５８Ｆ１（ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ）、ＣＤ１５８Ｆ２（ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ）、ＣＤ１５８Ｋ（ＫＩＲ３ＤＬ２）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＣＤ１６２（ＳＥＬＰＬＧ）、ＣＤ２２６（ＤＮＡＭ１）、ＣＤ２２９（ＳＬＡＭＦ３）、ＣＤ２４４（ＳＬＡＭＦ４）、ＣＤ２４７（ＣＤ３－ゼータ）、ＣＤ２５８（ＬＩＧＨＴ）、ＣＤ２６８（ＢＡＦＦＲ）、ＣＤ２７０（ＴＮＦＳＦ１４）、ＣＤ２７２（ＢＴＬＡ）、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、ＣＤ２７９（ＰＤ－１）、ＣＤ３１４（ＮＫＧ２Ｄ）、ＣＤ３１９（ＳＬＡＭＦ７）、ＣＤ３３５（ＮＫ－ｐ４６）、ＣＤ３３６（ＮＫ－ｐ４４）、ＣＤ３３７（ ＮＫ－ｐ３０）、ＣＤ３５２（ＳＬＡＭＦ６）、ＣＤ３５３（ＳＬＡＭＦ８）、ＣＤ３５５（ＣＲＴＡＭ）、ＣＤ３５７（ＴＮＦＲＳＦ１８）、誘導性Ｔ細胞共刺激因子（ＩＣＯＳ）、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＮＫＧ２Ｃ、ＤＡＰ－１０、ＩＣＡＭ－１、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＩＬ－２Ｒベータ、ＩＬ－２Ｒガンマ、ＩＬ－７Ｒアルファ、ＬＦＡ－１、ＳＬＡＭＦ９、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ（ＧｒｐＬ）、ＳＬＰ－７６（ＬＣＰ２）、ＰＡＧ１／ＣＢＰ、ＣＤ８３リガンド、Ｆｃガンマ受容体、ＭＨＣクラス１分子、ＭＨＣクラス２分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリンタンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、活性化ＮＫ細胞受容体、Ｔｏｌｌ様受容体、ＨＥＲ２、ＢＣＭＡ、ＰＤ－Ｌ１およびそれらの組み合わせから選ばれる抗原に対する標的結合一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含有したキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする合成、遺伝子改変および／又は意図的に導入されたポリヌクレオチドを更に含有し、ヒトナチュラルキラー細胞は（Ａ）ＮＰＭＤに寄託され、寄託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０３０１７を有する、又は（Ｂ）以下の特徴を有する：
ｉ）ＣＤ１６受容体を発現していること、
ｉｉ）少なくとも３ヶ月間継代培養した後に増殖能力を保持していること、および
ｉｉｉ）ｘ）合成、遺伝子改変、および／又は意図的に導入されたＣＤ１６受容体をコードするポリヌクレオチドを含まない、又はｙ）ｄｄＰＣＲ システムを使用して細胞のゲノムＤＮＡを分析することにより、ＣＤ１６ Ｆ１７６Ｆプローブで検出可能なＤＮＡ分子とＣＤ１６ Ｆ１７６Ｖプローブで検出可能なＤＮＡ分子の比率は１以上であり、ＣＤ１６ Ｆ１７６Ｆプローブの配列は配列番号：１１であり、ＣＤ１６ Ｆ１７６Ｖプローブの配列は配列番号：１２である。
好ましくは、組成物におけるヒトナチュラルキラー細胞数が少なくとも５×１０５であり、ヒトナチュラルキラー細胞が組成物における細胞の総数を１００％として、５％以上の量である。
好ましくは、被験者がヒトである。
好ましくは、アカントーマ、腺房細胞癌、音響神経腫、末端黒子型黒色腫、アクロスピロマ、急性好酸球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性巨核芽球性白血病、急性単球性白血病、成熟を伴う急性骨髄芽球性白血病、急性骨髄性樹状細胞白血病、急性骨髄性白血病、急性前骨髄球性白血病、アダマンチノーマ、腺癌、腺様嚢胞癌、腺腫、腺様歯原性腫瘍、副腎皮質癌、成人Ｔ細胞白血病、アグレッシブＮＫ細胞白血病、エイズ関連がん、エイズ関連リンパ腫、胞巣状軟部肉腫、骨髄芽球性線維腫、肛門がん、未分化大細胞リンパ腫、未分化甲状腺がん、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、血管筋脂肪腫、血管肉腫、虫垂がん、星状細胞腫、異型奇形腫瘍、基底細胞癌、基底様癌、Ｂ細胞白血病、Ｂ細胞リンパ腫、ベリーニ管癌、胆道癌、膀胱癌、芽細胞腫、骨癌、骨腫瘍、脳幹神経膠腫、脳腫瘍、乳がん、ブレンナー腫瘍、気管支腫瘍、気管支肺胞がん、褐色腫瘍、バーキットリンパ腫、原発部位不明のがん、カルチノイド腫瘍、がん、上皮内がん、陰茎癌腫、原発部位不明のがん、癌肉腫、キャッスルマン病、中枢神経系胚性腫瘍、小脳星状細胞腫、脳星状細胞腫、子宮頸癌、胆管癌、軟骨肉腫、脊索腫、絨毛癌、脈絡叢乳頭腫、慢性リンパ性白血病、慢性単球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性疾患、慢性好中球性白血病、明細胞腫瘍、結腸がん、結腸直腸がん、頭蓋咽頭腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、デゴス病、隆起性皮膚線維肉腫、類皮嚢胞、線維形成性小円形細胞腫瘍、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、胚芽異形成性神経上皮腫瘍、胚性癌、子宮内膜洞腫瘍、子宮内膜癌、子宮内膜子宮癌、子宮内膜腫瘍、腸管症関連Ｔ細胞リンパ腫、上衣芽細胞腫、上衣腫、類上皮肉腫、赤白血病、食道癌、食道神経芽細胞腫、ユーイング腫瘍ファミリー、ユーイングファミリー肉腫、ユーイング肉腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管癌、乳房外パジェット病、ファロピウス管癌、胎児の胎児、線維腫、線維肉腫、濾胞性リンパ腫、濾胞性甲状腺癌、胆嚢癌、胆嚢癌、神経節膠腫、神経節神経腫、胃癌、胃リンパ腫、胃腸癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、消化管間質腫瘍、生殖細胞腫瘍、胚細胞腫、妊娠性絨毛癌、妊娠性絨毛腫瘍、骨の巨大細胞腫瘍、多形性膠芽腫、神経膠腫、大脳神経膠腫症、グロムス腫瘍、グルカゴノーマ、性腺芽細胞腫、顆粒膜細胞腫瘍、有毛細胞白血病、有毛細胞白血病、頭頸部がん、心臓がん、血管芽腫、血管周囲細胞腫、血管肉腫、血液悪性腫瘍、肝細胞癌、肝脾Ｔ細胞リンパ腫、遺伝性乳房卵巣癌症候群、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、視床下部神経膠腫、炎症性乳がん、眼内黒色腫、膵島細胞がん、膵島細胞腫瘍、若年性骨髄単球性白血病、カポジ肉腫、カポジ肉腫、腎臓がん、クラトスキン腫瘍、クルーケンベルク腫瘍、喉頭がん、悪性黒子黒色腫、白血病、唇および口腔がん、脂肪肉腫、肺がん、黄体腫、リンパ管腫、リンパ管肉腫、リンパ上皮腫、リンパ性白血病、リンパ腫、マクログロブリン血症、悪性線維性組織球腫、骨の悪性線維性組織球腫、悪性神経膠腫、悪性中皮腫、悪性末梢神経鞘腫瘍、悪性ラブドイド腫瘍、悪性トリトン腫瘍、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、肥満細胞白血病、縦隔胚細胞腫瘍、縦隔腫瘍、甲状腺髄様がん、髄芽腫、黒色腫、髄膜腫、メルケル細胞癌、中皮腫、潜在性原発性扁平上皮癌、転移性尿路上皮癌、混合ミュラー腫瘍、単球性白血病、口癌、粘液性腫瘍、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫、多発性骨髄腫、菌状息肉腫、骨髄異形成症、骨髄異形成症候群、骨髄性白血病、骨髄性肉腫、骨髄増殖性疾患、粘液腫、鼻腔がん、鼻咽頭がん、上咽頭がん、新生物、神経鞘腫、神経芽細胞腫、神経線維腫、神経腫瘍、結節性黒色腫、非ホジキンリンパ腫、非黒色腫皮膚がん、非小細胞肺がん、眼腫瘍学、乏突起星細胞腫、乏突起膠腫、オンコサイトーマ、視神経鞘髄膜腫、口腔がん、中咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、卵巣上皮がん、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性腫瘍、乳房のパジェット病、パンコースト腫瘍、膵臓癌、甲状腺乳頭癌、乳頭腫症、傍神経節腫、鼻傍洞癌、副甲状腺がん、陰茎がん、血管周囲類上皮細胞腫瘍、咽頭がん、褐色細胞腫、中間型松果体実質腫瘍、松果体芽細胞腫、下垂体細胞腫、下垂体腺腫、下垂体腫瘍、形質細胞新生物、胸膜肺芽腫、多胚腫、前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性滲出液リンパ腫、原発性肝細胞癌、原発性肝癌、原発性腹膜癌、原始神経外胚葉性腫瘍、前立腺癌、腹膜偽粘液腫、直腸癌、腎細胞癌、染色体１５におけるＮＵＴ遺伝子が関与する気道癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、横紋筋肉腫、リヒター形質転換、仙尾骨奇形腫、唾液腺癌、肉腫、シュワン腫症、脂腺癌、続発性新生物、セミノーマ、漿液性腫瘍、セルトリ・ライディッヒ細胞腫瘍、性索間質腫瘍、セザリー症候群、印環細胞癌、皮膚がん、小青色円形細胞腫瘍、小細胞がん、小細胞肺がん、小細胞リンパ腫、小腸がん、軟部肉腫、ソマトスタチノーマ、煤疣贅、脊髄腫瘍、脊椎腫瘍、脾辺縁帯リンパ腫、扁平上皮がん、胃がん、表在拡大型黒色腫、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、表面上皮間質腫瘍、滑膜肉腫、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病、Ｔ細胞大顆粒リンパ球性白血病、Ｔ細胞白血病、Ｔ細胞リンパ腫、Ｔ細胞前リンパ球性白血病、奇形腫、末期リンパ腫、精巣癌、莢膜細胞癌、咽喉癌、胸腺癌、胸腺腫、甲状腺癌、腎盂および尿路上皮の移行上皮癌、移行上皮癌、尿膜管癌、尿道がん、尿生殖器腫瘍、子宮肉腫、ブドウ膜黒色腫、膣がん、バーナーモリソン症候群、疣贅がん、視覚経路神経膠腫、外陰がん、ワルデンストレームマクログロブリン血症、ワーシン腫瘍、ウィルムス腫瘍、他の癌およびそれらの組み合わせから選ばれる癌を治療する方法である。
“ｏＮＫ”という用語は、（ａ）寄託番号ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２４０７を有するヒト末梢血ナチュラルキラー細胞の集団に由来した、単離された非トランスジェニックヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株を示し、（ｂ）実施形態２．１に開示された培養方法で（ａ）の細胞を複数日間培養することによって得られた非トランスジェニックヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株を示し、（ｃ）寄託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０３０１７を有するＮＰＭＤに寄託された細胞を示し、又は（ｄ）以下の特徴を有するヒトナチュラルキラー細胞を示す：
ｉ）ＣＤ１６受容体を発現していること、
ｉｉ）少なくとも３ヶ月間継代培養した後に増殖能力を保持していること、および
ｉｉｉ）ｘ）合成、遺伝子改変、および／又は意図的に導入されたＣＤ１６受容体をコードするポリヌクレオチドを含まれない、又はｙ）ｄｄＰＣＲ システムを使用して細胞のゲノムＤＮＡを分析することにより、ＣＤ１６ Ｆ１７６Ｆプローブで検出可能なＤＮＡ分子とＣＤ１６ Ｆ１７６Ｖプローブで検出可能なＤＮＡ分子の比率は１以上であり、ＣＤ１６ Ｆ１７６Ｆプローブの配列は配列番号：１１であり、ＣＤ１６ Ｆ１７６Ｖプローブの配列は配列番号：１２である。
非トランスジェニックヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株を取得するためのフローチャートである。 ＣＤ１６蛍光標識抗体で標識されないヒト末梢血ナチュラルキラー細胞の集団を示す２次元ドットプロットであり、このヒト末梢血ナチュラルキラー細胞の集団は寄託番号ＡＴＣＣＣＲＬ－２４０７を有する細胞集団に由来する。 ＣＤ１６蛍光標識抗体で標識されたヒト末梢血ナチュラルキラー細胞の集団を示す２次元ドットプロットであり、このヒト末梢血ナチュラルキラー細胞の集団は寄託番号ＡＴＣＣＣＲＬ－２４０７を有する細胞集団に由来する。 ＣＤ１６蛍光標識抗体の標識によってヒト末梢血ナチュラルキラー細胞の集団から単離されたＣＤ１６受容体発現細胞を示す２次元ドットプロットである。 ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞を培養するフローチャートである。 異なる培養日数後の非トランスジェニックヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株の細胞生存率を示す折れ線グラフである。 培養された非トランスジェニックヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株と癌細胞を殺すためのＮＫ－９２細胞株との間の細胞毒性機能比較を示す棒グラフである。 癌細胞を殺すための異なる非トランスジェニックヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株間の細胞毒性活性の比較を示す棒グラフである。 ＡＤＣＣプロセスを介して癌細胞を殺すための、異なる抗ＨＥＲ２抗体結合非トランスジェニックヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株間の細胞毒性活性の比較を示す棒グラフである。 ＡＤＣＣプロセスを介して癌細胞を殺すための抗ＨＥＲ２抗体結合非トランスジェニックヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株と抗ＨＥＲ２抗体共培養された非トランスジェニックヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株との間の細胞毒性機能の比較を示す棒グラフである。 非トランスジェニックヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株とＣＤ１６トランスジェニックＮＫ－９２細胞株の遺伝子型の比較を示す棒グラフである。 ヒトナチュラルキラー細胞におけるＣＤ１６ａ受容体をコードするトランスジェニック、合成、遺伝子改変、又は意図的に導入されたＤＮＡ配列を検出するために、一つの色でラベル付けされたＣＤ１６ａ受容体遺伝子特異的テストプローブと別の色でラベル付けされた参照プローブを利用した２色ＦＩＳＨ分析の原理を適用できることを示す。 ヒトナチュラルキラー細胞におけるＣＤ１６ａ受容体をコードするトランスジェニック、合成、遺伝子改変、又は意図的に導入されたＤＮＡ配列を検出するために、一つの色でラベル付けされたＣＤ１６ａ受容体遺伝子特異的テストプローブと別の色でラベル付けされた参照プローブを利用した２色ＦＩＳＨ分析の原理を適用できることを示す。 ヒトナチュラルキラー細胞におけるＣＤ１６ａ受容体をコードするトランスジェニック、合成、遺伝子改変、又は意図的に導入されたＤＮＡ配列を検出するために、一つの色でラベル付けされたＣＤ１６ａ受容体遺伝子特異的テストプローブと別の色でラベル付けされた参照プローブを利用した２色ＦＩＳＨ分析の原理を適用できることを示す。 ヒトナチュラルキラー細胞におけるＣＤ１６ａ受容体をコードするトランスジェニック、合成、遺伝子改変、又は意図的に導入されたＤＮＡ配列を検出するために、一つの色でラベル付けされたＣＤ１６ａ受容体遺伝子特異的テストプローブと別の色でラベル付けされた参照プローブを利用した２色ＦＩＳＨ分析の原理を適用できることを示す。 ヒトナチュラルキラー細胞におけるＣＤ１６ａ受容体をコードするトランスジェニック、合成、遺伝子改変、又は意図的に導入されたＤＮＡ配列を検出するために、一つの色でラベル付けされたＣＤ１６ａ受容体遺伝子特異的テストプローブと別の色でラベル付けされた参照プローブを利用した２色ＦＩＳＨ分析の原理を適用できることを示す。 ＡＤＣＣプロセスを介して癌細胞を殺すための非トランスジェニックヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株の細胞毒性機能を示す棒グラフである。 異なるエフェクター（Ｅ）対ターゲット（Ｔ）比で癌細胞を殺すための非トランスジェニックヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株とＣＤ１６トランスジェニックＮＫ－９２細胞株との間の細胞毒性機能の比較を示す棒グラフである。 異なるエフェクター（Ｅ）対ターゲット（Ｔ）比でＡＤＣＣプロセスを介して癌細胞を殺すための非トランスジェニックヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株とＣＤ１６トランスジェニックＮＫ－９２細胞株との間の細胞毒性機能の比較を示す棒グラフである。 ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株を培養した異なる日後の総細胞数に対するヒト血小板溶解物の効果を示す折れ線グラフである。 ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株を培養した異なる日後の細胞生存率に対するヒト血小板溶解物の効果を示す折れ線グラフである。 ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株を培養した異なる日後のＣＤ１６の発現を維持することに対するヒト血小板溶解物の効果を示す折れ線グラフである。 ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株を培養した異なる日後の総細胞数に対する低濃度のＩＬ－２の効果を示す折れ線グラフである。 ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株を培養した異なる日後の総細胞数に対する高濃度のＩＬ－２の効果を示す折れ線グラフである。 ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株を培養した異なる日後の細胞生存率に対する低濃度のＩＬ－２の効果を示す折れ線グラフである。 ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株を培養した異なる日後の細胞生存率に対する高濃度のＩＬ－２の効果を示す折れ線グラフである。 ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株を培養した異なる日後のＣＤ１６の発現を維持することに対する低濃度のＩＬ－２の効果を示す折れ線グラフである。 ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株を培養した異なる日後のＣＤ１６の発現を維持することに対する高濃度のＩＬ－２の効果を示す折れ線グラフである。 ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株を培養した異なる日後の総細胞数に対する通気性容器の効果を示す折れ線グラフである。 ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株を培養した異なる日後の細胞生存率に対する通気性容器の効果を示す折れ線グラフである。 ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株を培養した異なる日後のＣＤ１６の発現を維持することに対する通気性容器の効果を示す折れ線グラフである。
以下は本発明の実施形態、ならびに本発明の技術、および特徴を使用する詳細な説明である。しかしながら、これらの実施形態は本発明を限定することを意図するものではなく、この技術に精通する人によって本発明の精神および範囲から逸脱することなく行われる変更および修正は、本発明の範囲に含まれることを意図する。
実施形態１：非トランスジェニックヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株の取得。
図１を参照すると、図１は非トランスジェニックヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株を取得するためのフローチャートである。本発明において、非トランスジェニックヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株を取得するための方法が少なくとも以下のステップを含有する：
ステップＳ１１：寄託番号ＡＴＣＣＣＲＬ－２４０７を有する細胞集団に由来するヒト末梢血ナチュラルキラー細胞集団の取得。ステップＳ１２：ヒト末梢血ナチュラルキラー細胞の集団をＣＤ１６受容体に特異的な抗体と接触させる。ステップＳ１３：抗体が特異的に結合している細胞を分離し、それによって非トランスジェニックヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株を取得する。
好ましくは、ステップＳ１２において、ＣＤ１６受容体がＣＤ１６ａ受容体である。
好ましくは、フローサイトメトリー、ビーズ、又は抗体で修飾された表面を有する任意の材料を使用して、ステップＳ１３で抗体によって特異的に結合される細胞を分離する。
好ましくは、「非トランスジェニックヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株」という用語は、非遺伝子改変されたヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株および／又は合成又は外因性ポリヌクレオチド配列を持たないヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株を指す。
好ましい実施形態の詳細な説明を以下に詳述する。
実施形態１．１：非トランスジェニックヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株の標識と選別。
この実施形態は実験群および対照群から成る。寄託番号ＡＴＣＣＣＲＬ－２４０７を有するヒト末梢血ナチュラルキラー細胞の集団を１００～１０００ｘｇの速度で３～５分間遠心分離した。上清を除去し、ヒト末梢血ナチュラルキラー細胞の集団をバッファーで再懸濁した。ヒト末梢血ナチュラルキラー細胞の集団は、対照群と実験群の細胞培養皿に均等に分配された。実験群のヒト末梢血ナチュラルキラー細胞の集団を前記細胞培養皿で培養し、次にＣＤ１６蛍光標識抗体（ＣＤ１６－ＰＥ－Ｃｙ７、ＣＤ１６ａ受容体およびＣＤ１６ｂ受容体に対する抗体）と混合して、ヒト末梢血ナチュラルキラー細胞の集団におけるＣＤ１６受容体を発現する細胞を標識した。一方、対照群のヒト末梢血ナチュラルキラー細胞の集団は、等量のバッファーと混合された。実験群と対照群の細胞を別々に遠心分離し、上清を除去し、そして、ソーティングバッファーを加えて細胞濃度を１ｍＬあたり１×１０７細胞に調整した。最後に、実験と対照群の細胞集団はセルソーターを使用して分析された。
バッファーは、プレソートバッファー、フローサイトメトリーサンプル調製バッファー、又はダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）であった。ソーティングバッファーは、プレソートバッファー、フローサイトメトリーサンプル調製バッファー、又はウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）であった。セルソーターは、例えば、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ－ＦＡＣＳＡｒｉａｌｌｌｕモデルのフローサイトメーターであった。
好ましくは、ソーティングバッファーは、０．１から１０％（体積パーセント、ｖｏｌ％、ｖ／ｖ）のウシ胎児血清（ウシ胎児血清、ＦＢＳ）を含有する。
ソート時間は１時間であり、ソート速度は５０～７０００イベント／秒である。
セルソーターの前方散乱（ＦＳＣ）と側方散乱（ＳＳＣ）を使用して、対照群と実験群のそれぞれ１０，０００個の粒子を分析した後、対照群の１０，０００個の粒子のうち６７７１個の粒子は細胞であり（粒子数が１００％の場合、細胞数は６７．７％であった）、そして、実験群の１０，０００個の粒子のうち６９４４個の粒子は細胞であった（粒子数が１００％の場合、細胞数は６９．４％であった）。
対照群細胞の蛍光分析の結果を図２Ａに示す。図２Ａは、ＣＤ１６蛍光標識抗体で標識されないヒト末梢血ナチュラルキラー細胞の集団を表す２次元ドットプロットであり、このヒト末梢血ナチュラルキラー細胞の集団は寄託番号ＡＴＣＣＣＲＬ－２４０７を有する細胞集団に由来する。実験群細胞の蛍光分析の結果を図２Ｂに示す。図２Ｂは、ＣＤ１６蛍光標識抗体で標識されたヒト末梢血ナチュラルキラー細胞の集団を表す２次元ドットプロットであり、このヒト末梢血ナチュラルキラー細胞の集団は寄託番号ＡＴＣＣＣＲＬ－２４０７を有する細胞集団に由来する。
図２Ａおよび図２Ｂでは、横軸はＰＥ－Ｃｙ７蛍光強度の相対値であり（本実験で使用したＣＤ１６蛍光標識抗体はＰＥ－Ｃｙ７蛍光を発する）、縦軸は前方散乱（ＦＳＣ）強度の相対値である。
図２Ａに示す結果は対照群で分析された６７７１細胞のすべてがＰＥ－Ｃｙ７蛍光を発しなかった（長方形領域に０細胞がある）。従って、ＣＤ１６－ＰＥ－ｃｙ７蛍光標識抗体標識がない場合、対照群細胞の実験結果を妨げるＰＥ－Ｃｙ７蛍光色素と同様な波長を持つ他の放射光はなかった。
図２Ｂに示す結果は、実験群で分析された６９４４個の細胞のほとんどがＰＥ－Ｃｙ７蛍光を持たず、ＰＥ－Ｃｙ７蛍光を発した細胞はごくわずかであった（長方形の領域には１７４個の細胞しかない）。従って、実験群の１０，０００個の粒子のうち６９４４個は、１７４個の細胞がＣＤ１６受容体を発現する細胞であることがわかった。即ち、粒子の１．７％のみがＣＤ１６受容体を発現する細胞であり（１７４÷１００００＝１．７％）、細胞の２．５％～２．６％のみがＣＤ１６受容体を発現する細胞である（１７４÷６９４４≒２．６％）ことを意味する。実験群では、細胞濃度の条件に基づいて、１ｍＬあたり１×１０７個細胞であり、実験群の細胞溶液の各ｍＬは、ＣＤ１６受容体を発現するおよそ２．６×１０５個の細胞を含んだ。
高純度のＣＤ１６＋細胞を得るために、ＣＤ１６受容体を発現する細胞を実験群の細胞から選別した（以下、”精製ＣＤ１６＋細胞集団”、”単離されたｏＮＫ”、又は”単離された非トランスジェニックヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株”と呼ぶ）。
図２Ｃを参照すると、図２ＣはＣＤ１６蛍光標識抗体の標識によってヒト末梢血ナチュラルキラー細胞の集団から単離されたＣＤ１６受容体発現する細胞を示す２次元ドットプロットである。図２Ｃに示す結果は精製ＣＤ１６＋細胞集団のほとんどの細胞がＰＥ－Ｃｙ蛍光を発し、ＣＤ１６受容体を発現する細胞の純度は９９％にも達す。
精製ＣＤ１６＋細胞集団におけるＣＤ１６受容体を発現する前述の細胞は非トランスジェニック細胞である。精製ＣＤ１６＋細胞集団におけるＣＤ１６受容体を発現する前述の細胞はすべて、分析後にＣＤ３－ＣＤ５６ ＋の特徴を持ち、それらは継続的に継代培養することができ、非腫瘍形成性である。従って、精製ＣＤ１６＋細胞集団におけるＣＤ１６受容体を発現する前述の細胞は、新規の非トランスジェニックヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株である。
実施形態２：ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞の培養。
図３を参照すると、図３はヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞の培養フローチャートである。ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞を培養する方法は少なくとも以下のステップを含有する：
ステップＳ２１’：ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞を取得し、
ステップＳ２２’：容器内で、ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞をヒト血小板溶解物とＩＬ－２を含有する培地と接触させ、そして、
ステップＳ２３：ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞を複数日間培養して、ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞を増殖させる。
以下は本発明による非トランスジェニックヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株を培養する特定の実施形態を記載するが、本発明の適用はそれに限定されないことを意味し、本発明が他のヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞の培養にも使用できることを意味する。例えば、自己血又は同種異系血液から単離された初代ＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞、ＣＤ１６トランスジェニックＮＫ－９２細胞株、又はその他のヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞である。
実施形態２．１：非トランスジェニックヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株の培養。
ステップＳ２１’：実施形態１によって分類された精製ＣＤ１６＋細胞集団（ＣＤ１６受容体を発現する細胞の割合は９９％くらい高かった）を遠心分離し、そして上清を除去した。
ステップＳ２２’：１ ｍＬの細胞培養培地で細胞を再懸濁した後、細胞懸濁液を最初の容器に入れ、４０ｍＬの細胞培養培地に６．５４×１０５の非トランスジェニックヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株を含むようにした。細胞培養培地は以下を含有する： ０．５％－３０％ （体積パーセント、ｖｏｌ％、ｖ／ｖ）ヒト血小板溶解物、 １００～３０００ ＩＵ／ｍＬインターロイキン２ （ＩＬ－２）、およびＤＭＥＭ培地（ダルベッコ改変イーグル培地）、イーグル最小必須培地のアルファ改変、又はＸＶＩＶＯ１０培地。
ステップＳ２３’：複数日間の培養後、ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞が実質的に濃縮された組成物が取得られた。ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞が実質的に濃縮された組成物において、非トランスジェニックヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株の数は少なくとも５×１０５である。複数日と言うのは、例えば、１日から３年である。
好ましくは、複数日が１週間、２週間、３週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１年、２年、又は３年である。
好ましくは、細胞培養培地が０．５％、１％、１．５％、１．６％、２％、２．５％、２．６％、３％、３．５％、３．６％、４％、４．５％、４．６％、５．０％、５．１％、５．５％、５．６％、６％、６．１％、６．５％、６．６％、７％、７．１％、７．５％、７．６％、８％、８．１％、８．５％、８．６％、９％、９．１％、９．５％、９．６％、又は１０％（体積パーセント、ｖｏｌ％、ｖ／ｖ）のヒト血小板溶解物を含有する。
好ましくは、細胞培養培地が１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、又は３０００ ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２を含有する。
好ましくは、ステップＳ２３は更にサブステップを含有する：
ステップＳ２３１：複数日間の培養後、細胞培養液中の細胞数は最初の細胞数に達し、最初の細胞数は１．２５×１０６～５×１０６であった。
ステップＳ２３２：細胞懸濁液を第２の容器に入れて、第２の容器内の細胞の数を第１の細胞数にする。複数日間の培養後、細胞数は第２の細胞数に達し、第２の細胞数は５×１０７～１×１０９であった。そして、
ステップＳ２３３：細胞懸濁液を第３の容器に入れて、第３の容器内の細胞の数を第２の細胞数にする。複数日間の培養後、ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞が実質的に濃縮された組成物を取得するために、細胞数は第３の細胞数に達した。第３の細胞数は、例えば、５×１０９又は１×１０４０であった。
最初の容器は、例えば、Ｔ２５細胞培養フラスコ（Ｔ２５フラスコ）、又はＧ－Ｒｅｘ６ウェル細胞培養プレートであった。第２と第３の容器はガス透過性であるが水不透過性の膜を含有し、又は、第２と第３の容器は、溶存酸素の濃度を完全に通気するか、培地中の溶存グルコースの濃度を１５００～５０００ ｍｇ／Ｌに維持することができる。好ましくは、第２の容器は、例えば、Ｇ－Ｒｅｘ １００Ｍボトル（製品番号８１１００、ＷＩＬＳＯＮ ＷＯＬＦ、ＵＳＡ）であり、第３の容器は、例えば、Ｇ－Ｒｅｘ－５００Ｍ（製品番号８５５００Ｓ、ＷＩＬＳＯＮ ＷＯＬＦ、ＵＳＡ）であった。Ｇ－Ｒｅｘ ６Ｍ ６ウェル細胞培養プレート、Ｇ－Ｒｅｘ １００Ｍボトル、Ｇ－Ｒｅｘ－５００Ｍの使用方法については、これらの容器の製品マニュアルを参照する。
ステップＳ２３ およびＳ２３１～Ｓ２３３では、細胞を培養するため、０．５％～３０％（体積パーセント、ｖｏｌ％、ｖ／ｖ）のヒト血小板溶解物および１００～３０００ ＩＵ／ｍＬのインターロイキン２（ＩＬ－２）を培地に添加した。又、培地は、例えば、ＤＭＥＭ培地（ダルベッコ改変イーグル培地）、イーグル最小必須培地のアルファ改変、ＸＶＩＶＯ １０培地、又はＸ－ＶＩＶＯ１０無血清造血細胞培地である。
ステップＳ２３’およびＳ２３１’～Ｓ２３３’では、細胞を３７℃と５％二酸化炭素の条件下で培養した。
実施形態２．２： 実施形態２．１から取得された培養細胞の細胞生存率の検出。
実施形態２．１に開示された培養方法で異なる日数培養することによって取得された細胞懸濁液の各サンプルを、等量のトリパンブルーと混合し、細胞数および細胞生存率を観察した。
実験結果は７、１６、２１、２８、３７、４２、４９、６５、９２、９７、１０３、１３４、１６６、１８４、および２０２日間の培養後、細胞数がそれぞれ１．６１×１０６、 １．０１×１０９、２．５３×１０９、５．０６×１０９、１．０１×１０１０、１．６２×１０１０、３．２４×１０１０、１．１３×１０１１、１．８１×１０１５、３．２５×１０１６、６．５０×１０１７、１．３５×１０２２、３．２４×１０２７、１．３０×１０３３、および１．０４×１０３９に達することを示した。図４を参照すると、図４は、非トランスジェニックヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株を７、１６、２１、２８、３７、４２、４９、６５、９２、９７、１０３、１３４、１６６、１８４、および２０２日間培養した後、細胞生存率が８４～９７％に維持されたことを示す。従って、非トランスジェニックヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株を本発明の培養方法で培養することにより、増殖後の細胞生存率を効果的に維持しながら、細胞数を少なくとも１．５９×１０３３倍〔（１．０４×１０３９）÷（６．５４×１０５）≒１．５９×１０３３〕に拡大させることができる。
実施形態３： 細胞の状態と細胞表面マーカーの検出
実施形態３．１： 本発明の培養法による非トランスジェニックヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株の長期培養
この実施形態には２つの実験的試行がある。精製ＣＤ１６＋細胞集団の最初のバッチと精製ＣＤ１６＋細胞集団の２番目のバッチ（両方のバッチでＣＤ１６受容体を発現する細胞の割合は９９％くらい高かった）は、実施形態１．１の方法で分類された。次に、精製ＣＤ１６＋細胞集団の第１のバッチおよび精製ＣＤ１６＋細胞集団の第２のバッチを、実験２．１の培養方法によってそれぞれ培養して、第１の実験試行の細胞懸濁液および第２の実験試行の細胞懸濁液を取得した。精製ＣＤ１６＋細胞集団の最初のバッチは合計３５日間培養され、精製ＣＤ１６＋細胞集団の２番目のバッチは少くとも２０２日目まで長期間培養された。
実施形態３．２： 培養細胞の状態の検出
実施形態３．１において異なる時点で取得された細胞懸濁液の各サンプルを遠心分離した。上清を除去し、細胞をバッファーに再懸濁する。次に、１μＬのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）と混合する。セルソーター又はフローサイトメーターを使用して、細胞がヨウ化プロピジウムで染色されているかどうかを検出し、アポトーシスを起こしている、又は死んだ細胞の割合を決定した。
実施形態３．３： 培養細胞のＣＤ５６、ＣＤ３、およびＣＤ２表面マーカーの検出
実施形態３．１において異なる時点で取得された細胞懸濁液の各サンプルを遠心分離した。上清を除去し、細胞をバッファーに再懸濁する。次に、１μＬのＣＤ５６蛍光標識抗体 （Ｃａｔ． Ｎｏ． ３１８３０４， Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ， ＵＳＡ）、１μＬのＣＤ３蛍光標識抗体 （Ｃａｔ． Ｎｏ． ３００４１０， Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ， ＵＳＡ）、および１μＬのＣＤ２蛍光標識抗体（Ｃａｔ． Ｎｏ． ３００２２２， Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ， ＵＳＡ）と混合して、ＣＤ５６分子、ＣＤ３分子、および／又はＣＤ２分子を発現する細胞を同時に標識する。最後に、セルソーター又はフローサイトメーターを使用して、細胞がＣＤ５６分子、ＣＤ３分子、および／又はＣＤ２分子を示すかどうかを分析し、さまざまな細胞表面メーカーを持つ細胞の割合を計算した。
実施形態３．４： 培養細胞のＣＤ１６表面マーカーの検出。
実施形態３．１において異なる時点で取得された細胞懸濁液の各サンプルを遠心分離した。上清を除去し、細胞をバッファーに再懸濁する。次に、１μＬのＣＤ１６蛍光標識抗体（Ｃａｔ． Ｎｏ． ３０２０１６， Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ， ＵＳＡ）と混合して、ＣＤ１６受容体を発現する細胞を標識する。最後に、セルソーターを使用して、細胞がＣＤ１６受容体を表すかどうかを分析し、ＣＤ１６受容体を持つ細胞の割合を計算した。
実施形態３．５： 培養細胞の細胞毒性機能の検出。
ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅリアルタイム細胞分析システム（ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡ ｓｙｓｔｅｍ， ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．， ＵＳＡ）をこの実施形態で使用して、標的細胞に対する培養細胞の細胞毒性能力を検出した。この実施形態は細胞毒性試験を実施するための９６ウェルｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ Ｅ－プレートを一枚含有し、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ Ｅ－プレートのウェルは、コントロールウェル、実験ウェル、および標的細胞の最大溶解コントロールウェルに分けられた。この実施形態で使用されたエフェクター細胞は実施形態３．１において異なる時点で培養することによって取得された細胞懸濁液であり、標的細胞は、付着性卵巣癌細胞株であるＳＫ－ＯＶ－３細胞株（ＨＴＢ－７７、ＡＴＣＣから購入）であった。ＳＫ－ＯＶ－３細胞をコントロールウェル、実験ウェル、および標的細胞の最大溶解コントロールウェルに播種し、各ウェルに２００００ ＳＫ－ＯＶ－３細胞が含まれるようにしてから、３０分間静置した。
実施形態３．１で取得された細胞懸濁液のサンプルを実験ウェルに加え、ＳＫ－ＯＶ－３細胞（標的細胞）の数に対するエフェクター細胞数の比は２、５、および１０であり、細胞懸濁液のサンプルに対する１０分の１の等量溶解バッファーを標的細胞の最大溶解コントロールウェルに加えた。サンプル又は溶解バッファーをコントロールウェルに添加しなかった。ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ Ｅ－プレートをｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅリアルタイムセル分析システムに配置し、３７℃および５％二酸化炭素の条件下でセルインデックス（ＣＩ）のリアルタイム変化を検出した。
ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ Ｅ－プレートの底部に付着している標的細胞数が多いほど、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅリアルタイム細胞分析システムによって検出される細胞指数が高くなる。従って、細胞指数を使用して、実験ウェルで溶解された標的細胞の割合に換算することができる。細胞指数を実験ウェルで溶解された標的細胞の割合に換算するために使用される式は次のとおりである：
溶解された標的細胞の割合（％）＝１－［（実験ウェルの細胞指数-標的細胞の最大溶解コントロールウェルの細胞指数）÷（対照ウェルの細胞指数－標的細胞の最大溶解コントロールウェルの細胞指数）］×１００ ％
表１および表２を参照すると、表１は最初の実験的試行で取得された細胞懸濁液の結果を示し、表２は２番目の実験的試行で取得された細胞懸濁液の結果を示す。
表１の最初の列「日数」は、培養日数を示す。２番目の列「ＰＩ＋」は、細胞懸濁液中における細胞の総数を１００％として、アポトーシスを起こしている、又は死んだ細胞の割合を示す。ナチュラルキラー細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、およびＣＤ８＋Ｔ細胞はすべてＣＤ５６＋（Ｐｅｒｎｉｃｋ， Ｎ， ２０１８）を発現するため、３番目の列「ＣＤ５６＋」は、細胞懸濁液中における細胞の総数を１００％として、ナチュラルキラー細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、およびＣＤ８＋Ｔ細胞の総数の割合を示す。Ｔ細胞はすべてＣＤ３＋を発現するため（Ｐｅｒｎｉｃｋ， Ｎ， ２０１８）、４番目の列「ＣＤ３－」は、細胞懸濁液中における細胞の総数を１００％として、Ｔ細胞ではない細胞の割合を示す。ナチュラルキラー細胞、末梢血Ｔ細胞、およびほとんどの胸腺細胞はすべてＣＤ２＋（Ｐｅｒｎｉｃｋ， Ｎ， ２０１８）を発現し、実験３で最適化される細胞は末梢血に由来するため、５番目の列「ＣＤ２＋」は、細胞懸濁液中における細胞の総数を１００％として、ナチュラルキラー細胞とＴ細胞の総数の割合を示す。６番目の列「ＣＤ５６＋ＣＤ３－」は、細胞懸濁液中における細胞の総数を１００％として、ナチュラルキラー細胞の割合を示す。７番目の列「ＣＤ５６＋ＣＤ２＋」は、細胞懸濁液中における細胞の総数を１００％として、ナチュラルキラー細胞とＴ細胞の総数の割合を示す。ナチュラルキラー細胞とマクロファージはＣＤ１６＋（Ｐｅｒｎｉｃｋ， Ｎ， ２０１８）を発現し、ＣＤ１６は抗体依存性細胞傷害性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に関与するため、８番目の列「ＣＤ１６＋」は、細胞懸濁液中における細胞の総数を１００％として、ＡＤＣＣ機能を備えたナチュラルキラー細胞とマクロファージの総数の割合を示す。９番目の列「ＣＤ５６＋ＣＤ１６＋」は、ナチュラルキラー細胞（ＣＤ５６＋ＣＤ３－細胞）の総数を１００％として、ＡＤＣＣ機能を備えたナチュラルキラー細胞の割合を示す。
表２の１列目から８列目の表示は表１と同じである。９列目の「キリングテスト」に「レ」の記号が付いている場合は、特定の時点での細胞懸濁液中における細胞の細胞毒性機能が同時に試験され、細胞が細胞毒性機能を有することを確認したことを示す。
表１は、（１）精製ＣＤ１６＋細胞集団の最初のバッチ（ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株の割合は９９％くらい高かった）を７～３５日間培養した後に取得された細胞懸濁液において、アポトーシスを起こしている、又は死んだ細胞の割合が５．６５％～７．３４％であることを示す。従って、培養中の細胞生存率が９２．６６％～９４．３５％である。（２）精製ＣＤ１６＋細胞集団の最初のバッチを７～３５日間培養した後に取得された細胞懸濁液では、細胞懸濁液中における細胞の総数を１００％として、ナチュラルキラー細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、およびＣＤ８＋Ｔ細胞の総数の割合は９９．０８～９９．５６％である。（３）精製ＣＤ１６＋細胞集団の最初のバッチを７～３５日間培養した後に取得された細胞懸濁液では、細胞懸濁液中における細胞の総数を１００％として、Ｔ細胞ではない細胞の割合は９９．８８～１００％である。（４）精製ＣＤ１６＋細胞集団の最初のバッチを７～３５日間培養した後に取得された細胞懸濁液では、細胞懸濁液中における細胞の総数を１００％として、ナチュラルキラー細胞とＴ細胞の総数の割合は９８．０８～９９．２２％である。（５）精製ＣＤ１６＋細胞集団の最初のバッチを７～３５日間培養した後に取得された細胞懸濁液では、細胞懸濁液中における細胞の総数を１００％として、ナチュラルキラー細胞の割合は９８．２１～９８．７６％である。（６）精製ＣＤ１６＋細胞集団の最初のバッチを７～３５日間培養した後に取得された細胞懸濁液では、細胞懸濁液中における細胞の総数を１００％として、ナチュラルキラー細胞とＴ細胞の総数の割合は９８．７８～９９．３３％である。（７）精製ＣＤ１６＋細胞集団の最初のバッチを７～３５日間培養した後に取得された細胞懸濁液では、細胞懸濁液中における細胞の総数を１００％として、ＡＤＣＣ機能を持ちナチュラルキラー細胞とマクロファージの総数の割合は９０．１７～９２．３６％である。（８）精製ＣＤ１６＋細胞集団の最初のバッチを７～３５日間培養した後に得られた細胞懸濁液では、ナチュラルキラー細胞（すなわち、ＣＤ５６ ＋ ＣＤ３－細胞）の総数を１００％として、ＡＤＣＣ機能を有するナチュラルキラー細胞の割合は８８．７９～９２．１１％である。
表２は、（１）精製ＣＤ１６＋細胞集団の２番目のバッチ（ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株の割合は９９％くらい高かった）を７～２０２日間培養した後に取得された細胞懸濁液において、アポトーシスを起こしている、又は死んだ細胞の割合が２．７％－１０．５％である。従って、培養中の細胞生存率は８９．５％～９７．３％である。（２）精製ＣＤ１６＋細胞集団の２番目のバッチを７～２０２日間培養した後に得られた細胞懸濁液では、細胞懸濁液中における細胞の総数を１００％として、ナチュラルキラー細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、およびＣＤ８＋Ｔ細胞の総数の割合は９８．８５％～９９．６５％である。（３）精製ＣＤ１６＋細胞集団の２番目のバッチを７～２０２日間培養した後に取得された細胞懸濁液では、細胞懸濁液中における細胞の総数を１００％として、Ｔ細胞ではない細胞の割合は９９．８２％～１００％である。（４）精製ＣＤ１６＋細胞集団の２番目のバッチを７～２０２日間培養した後に取得された細胞懸濁液では、細胞懸濁液中における細胞の総数を１００％として、ナチュラルキラー細胞とＴ細胞の総数の割合は９４．５％～９９．６８％である。（５）精製ＣＤ１６＋細胞集団の２番目のバッチを７～２０２日間培養した後に取得された細胞懸濁液では、細胞懸濁液中における細胞の総数を１００％として、ナチュラルキラー細胞の割合９７．６５％～９９．０５％である。（６）精製ＣＤ１６＋細胞集団の２番目のバッチを７～２０２日間培養した後に取得された細胞懸濁液では、細胞懸濁液中における細胞の総数を１００％として、ナチュラルキラー細胞とＴ細胞の総数の割合は９７．８３％～９９．６１％である。（７）精製ＣＤ１６＋細胞集団の２番目のバッチを７～２０２日間培養した後に取得された細胞懸濁液では、細胞懸濁液中における細胞の総数を１００％として、ＡＤＣＣ機能を持つナチュラルキラー細胞とマクロファージの総数の割合は８３．８８％～９４．０４％である。（８）精製ＣＤ１６＋細胞集団の２回目のバッチを７～２０２日間培養した後に取得された細胞懸濁液中の細胞は、細胞毒性機能を有することが確認された。
実施形態２．１に開示されている培養方法で２８日間培養して得られた細胞懸濁液を、ＮＰＭＤに寄託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０３０１７で寄託した。本発明に開示された結果は、ｏＮＫ細胞株が少なくとも３ヶ月継代培養後に増殖する能力を保持できることを示し、従って、細胞増殖制御に関与する調節解除した遺伝子を含有する可能性がある（例えば、ｏＮＫ細胞株は不活性な腫瘍抑制遺伝子、又は変異して高度発現された癌遺伝子を含有する）。
実施形態４：非トランスジェニックヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株の非腫瘍形成性。
この実施形態では、６～８週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌｂｏｒａｔｏｒｙ 又はＢｉｏＬａｓｃｏ、Ｔａｉｗａｎから購入）を使用した。３０匹のマウスをランダムにＳＫ－ＯＶ－３群、ラジ群、ダウディ群、ｏＮＫ群、γ線照射ＡＣＥ－ｏＮＫ群、ＤＰＢＳ群である６群に割り当てた。
ヒト卵巣癌細胞株「ＳＫ－ＯＶ－３」（ＡＴＣＣから購入；寄託番号はＡＴＣＣ ＨＴＢ－７７）、ヒトＢリンパ芽球様細胞株「ラジ」（ＡＴＣＣから購入、寄託番号はＡＴＣＣＣＣＬ－８６）、および「ダウディ」（ＡＴＣＣから購入、寄託番号はＡＴＣＣ ＣＣＬ－２１３）、実施形態２．１に開示されている培養方法で８８日間培養して得られた細胞懸濁液（本発明の８８日培養ｏＮＫ懸濁液、８８日培養ｏＮＫ懸濁液と呼ばれる）とγ線照射ＡＣＥ－ｏＮＫ細胞懸濁液がこの実施形態において使用された。γ線照射ＡＣＥ－ｏＮＫ細胞懸濁液の調製方法を以下に説明した。
γ線照射ＡＣＥ－ｏＮＫ細胞懸濁液： 実施形態２．１に開示された培養方法で８４日間培養することによって取得された細胞懸濁液（本発明の８４日培養ｏＮＫ懸濁液、８４日培養ｏＮＫ懸濁液と呼ばれる）に１０Ｇｙの線量でγ線を照射した。相補的な細胞リンカーとトラスツズマブリンカーを使用して、γ線照射８４日培養ｏＮＫ懸濁液中の細胞にトラスツズマブを結合させた後、γ線照射ＡＣＥ－ｏＮＫ細胞懸濁液が得られた。
トラスツズマブを細胞（例えば、ナチュラルキラー細胞、６０日培養ｏＮＫ懸濁液中の細胞、γ線照射６０日培養ｏＮＫ懸濁液中の細胞）に結合する手順は次のとおりであった：（Ａ）細胞リンカーを調製し、細胞－ｓｓＤＮＡ接合を調製するために細胞リンカーを細胞に結合するステップ（Ｂ）トラスツズマブ－ｓｓＤＮＡ接合を調製するために、トラスツズマブリンカーを調製し、トラスツズマブリンカーをトラスツズマブに結合するステップ（Ｃ）トラスツズマブ接合細胞を調製するために、細胞リンカーおよびトラスツズマブリンカー上の相補配列を介し、細胞－ｓｓＤＮＡ接合およびトラスツズマブ－ｓｓＤＮＡ接合を混合して細胞－ｓｓＤＮＡ接合とトラスツズマブ－ｓｓＤＮＡ接合を組み合わせる。
細胞リンカーを調製し、細胞リンカーを細胞に結合するステップ（Ａ）は、以下のステップ（ａ１） ～ （ａ４） を含有する：
ステップ（ａ１） 第１の一本鎖ＤＮＡが得られ、第１の一本鎖ＤＮＡの配列は配列番号：５、配列番号：６、又は配列番号：７であった。
ステップ（ａ２） 最初の一本鎖ＤＮＡの５’末端は５’末端チオール修飾された最初の一本鎖ＤＮＡとして修飾され、細胞リンカーストックを得た。細胞リンカーストックもＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから市販されている。実際の修正方法は、当業者に知られているか、又は明らかである（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ、Ｊ、２０１０）。
ステップ（ａ３） １０～５００μＬの細胞リンカーストックと０．１～１０μＬのＮＨＳ－マレイミド（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから市販されている）を混合し、１～６０分間培養した。
ステップ（ａ４） ステップ（ａ３）で取得された混合物を１×１０６～１×１０８細胞と混合し、１～６０分間培養して細胞－ｓｓＤＮＡ接合を得た。
トラスツズマブリンカーを調製し、トラスツズマブリンカーをトラスツズマブに結合するステップ（Ｂ）は以下のステップ（ｂ１）～（ｂ４）を含有する：
ステップ（ｂ１）第２の一本鎖ＤＮＡが得られ、第２の一本鎖ＤＮＡの配列は配列番号：８、配列番号：９、又は配列番号：１０であり、第２の一本鎖ＤＮＡの配列は第１の一本鎖ＤＮＡの相補鎖である。
ステップ（ｂ２）第２の一本鎖ＤＮＡの５ ’末端を５’末端チオール修飾された第２の一本鎖ＤＮＡとして修飾され、トラスツズマブリンカーストックを得た。トラスツズマブリンカーストックはＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからも市販されている。実際の修正方法は、当業者に知られているか、又は明らかである（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ、Ｊ、２０１０）。
ステップ（ｂ３）１０～５００μＬのトラスツズマブリンカーストックと０．１～１０μＬのＮＨＳ－マレイミド（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから市販されている）を混合し、１～６０分間培養した。
ステップ（ｂ４）ステップ（ｂ３）で取得された混合物を、１０～１００μＬのトラスツズマブストック（Ｒｏｃｈｅから市販されている）と混合し、１０分から３時間培養してトラスツズマブ－ｓｓＤＮＡ接合を得た。
細胞－ｓｓＤＮＡ接合とトラスツズマブ－ｓｓＤＮＡ接合を混合して、γ線照射ＡＣＥ－ｏＮＫ細胞懸濁液中の細胞などのトラスツズマブ接合細胞を得た。
１×１０７ＳＫ－ＯＶ－３細胞、１×１０７ラジ細胞、１×１０７ダウディ細胞、６０日培養ｏＮＫ懸濁液中の１×１０７細胞、およびγ線照射ＡＣＥ－ｏＮＫ細胞懸濁液中の１×１０７細胞を異なる細胞懸濁液を得るために、それぞれ１００μＬのダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）に懸濁した。細胞懸濁液と１００μＬのＤＰＢＳをＳＫ－ＯＶ－３群、ラジ群、ダウディ群、ｏＮＫ群、γ線照射ＡＣＥ－ｏＮＫ群、ＤＰＢＳ群の雌ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスにそれぞれ０日目に皮下移植した。各マウスの腫瘍増殖は１４日目、２１日目、２４日目、４２日目、および５９日目に観察され、マウスは５９日目に安楽死させられた。
表３を参照すると、表３はさまざまな細胞株を異種移植したヌードマウスにおける腫瘍形成の結果を示す。
表３は、研究期間を通じてＤＰＢＳ群（陰性対照群）のマウスに腫瘍形成がなかったこと（０ ／ ５、０％）を示しているが、ＳＫ－ＯＶ－３群（陽性対照群）の５匹のマウスすべてに腫瘍が発生した（５ ／ ５，１００％）。リンパ腫細胞株ダウディを異種移植したマウスでは、ダウディ群の５匹中４匹のマウスが腫瘍を発症し（４ ／ ５、８０％）、研究の終わり（５９日目）まで続いた。リンパ腫細胞株ラジを異種移植したマウスでは５匹中１匹（１／５）のマウスが４２日目までに検出可能な腫瘍を持っていたが、その後、研究の終わりまでに測定不可能なサイズに戻った。
本発明のｏＮＫ細胞又はγ線照射ＡＣＥ－ｏＮＫ細胞を異種移植したマウスでは、調査期間中にｏＮＫ群およびγ線照射ＡＣＥ－ｏＮＫ群のマウスに（０ ／ ５、０％）腫瘍形成は見られなかった。これらの研究結果は、非照射ｏＮＫ細胞およびトラスツズマブ接合照射ＡＣＥ－ｏＮＫ細胞が非腫瘍形成性であり、将来の臨床応用および疾患治療に安全であるという証拠を提供する。
実施形態５：培養された非トランスジェニックヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株とＮＫ－９２細胞株との間の細胞毒性活性の比較。
この実施形態の実験方法は、以下の点を除いて、実施形態３．５の実験方法とほぼ同じである： （１） 本実施形態で使用するエフェクター細胞は、＜ｉ＞実施形態２．１に開示する培養方法で３３日間培養して取得された細胞懸濁液（本発明の３３日培養ｏＮＫ懸濁液が、ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株の割合が９１．７４％である３３日培養ｏＮＫ懸濁液と呼ばれる）であり、又は＜ｉｉ＞寄託番号ＡＴＣＣＣＲＬ－２４０７を有するヒト末梢血ナチュラルキラー細胞の集団（図２Ｂに示されるように、ＮＫ－９２細胞株の割合が少なくとも９８％であり、ＮＫ－９２細胞株がＣＤ１６－ナチュラルキラー細胞株であるＮＫ－９２懸濁液と呼ばれる）である。そして、（２）ＳＫ－ＯＶ－３細胞（標的細胞）の数に対するエフェクター細胞（３３日培養されたｏＮＫ懸濁液の総細胞又はＮＫ－９２懸濁液の総細胞）の数の比率は２：１（ＥＴ２）である。
図５を参照すると、図５は培養された非トランスジェニックヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株とＮＫ－９２細胞株の癌細胞を殺す細胞毒性機能を比較するグラフである。図５は、ＮＫ－９２細胞株（ＣＤ１６－ナチュラルキラー細胞株であるため、ＡＤＣＣプロセスによって癌細胞を破壊できない）が癌細胞の２．４０±５．５２％しか殺すことができず、一方、ｏＮＫ細胞（腫瘍関連抗原を標的とするＩｇＧ抗体にリンク又は共培養されておらず、ＡＤＣＣ反応を誘導するために活性化されていない非トランスジェニックヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞）は４９．６８±１．１９％のがん細胞を殺したことを示す。
従って、結果は次のことを示している：ＮＫ－９２細胞と比較すると（ＮＫ－９２はＣＤ１６－ナチュラルキラー細胞株であるため、ＡＤＣＣプロセスによって癌細胞を破壊することはできない）、ＡＤＣＣ反応を誘発するために活性化されなかったｏＮＫ細胞は細胞毒性の約２１倍の増加を引き起こす可能性がある（４９．６８÷２．４ ＝ ２１）。これは予想外の結果である。
更に、この結果に基づいて、出願人は３３日培養ｏＮＫ懸濁液（培養ｏＮＫ）からヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株を単離し、ＮＫ－９２懸濁液からのＣＤ１６－ナチュラルキラー細胞株（ＮＫ－９２）を単離した後に同様の予想外の結果が観察される可能性があると考えている。
実施形態６：異なる量の非トランスジェニックヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株間の細胞毒性活性の比較。
この実施形態の実験方法は、以下の点を除いて、実施形態３．５の実験方法とほぼ同じである：（１） 本実施形態で使用するエフェクター細胞は、＜ｉ＞実施形態２．１に開示する培養方法でＸ日間培養して取得された細胞懸濁液（本発明のＸ日培養ｏＮＫ懸濁液が、ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株の割合が８．９１％で、少数ｏＮＫ懸濁液と呼ばれる）であり、＜ｉｉ＞実施形態２．１に開示する培養方法でＹ日間培養して取得された細胞懸濁液（本発明のＹ日培養ｏＮＫ懸濁液が、ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株の割合が６４．１５％で、中数ｏＮＫ懸濁液と呼ばれる）であり、＜ｉｉｉ＞実施形態２．１に開示する培養方法でＺ日間培養して取得された細胞懸濁液（本発明のＺ日培養ｏＮＫ懸濁液が、ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株の割合が９１．７４％で、多数ｏＮＫ懸濁液と呼ばれる）であり、＜ｉｖ＞寄託番号ＡＴＣＣＣＲＬ－２４０７を有するヒト末梢血ナチュラルキラー細胞の集団（図２Ｂに示されるように、ＮＫ－９２細胞株の割合が少なくとも９８％であり、ＮＫ－９２細胞株がＣＤ１６－ナチュラルキラー細胞株であるＮＫ－９２懸濁液と呼ばれる）であり、＜ｖ＞少数ＡＣＥ－ｏＮＫ－ＨＥＲ２細胞懸濁液であり、＜ｖｉ＞中数ＡＣＥ－ｏＮＫ－ＨＥＲ２細胞懸濁液であり、又は＜ｖｉｉ＞多数ＡＣＥ－ｏＮＫ－ＨＥＲ２細胞懸濁液である。そして、（２）ＳＫ－ＯＶ－３細胞（標的細胞）の数に対するエフェクター細胞（少数ｏＮＫ細胞懸濁液、中数ｏＮＫ細胞懸濁液、多数ｏＮＫ細胞懸濁液、ＮＫ－９２懸濁液、少数ＡＣＥ－ｏＮＫ－ＨＥＲ２懸濁液、中数ＡＣＥ－ｏＮＫ－ＨＥＲ２懸濁液、又は多数ＡＣＥ－ｏＮＫ－ＨＥＲ２細胞懸濁液における総細胞数）の数の比率は２：１（ＥＴ２）である。
少数ＡＣＥ－ｏＮＫ－ＨＥＲ２ 細胞懸濁液、中数ＡＣＥ－ｏＮＫ－ＨＥＲ２ 細胞懸濁液、および多数ＡＣＥ－ｏＮＫ－ＨＥＲ２ 細胞懸濁液の調製方法を以下に記載した。
少数ＡＣＥ－ｏＮＫ－ＨＥＲ２ 細胞懸濁液： 「少数ｏＮＫ細胞懸濁液」の総細胞は、相補的な細胞リンカーとトラスツズマブリンカーを使用してトラスツズマブと連結され、従って、ＡＣＥ－ｏＮＫ－ＨＥＲ２細胞の割合が約８．９１％である少数ＡＣＥ－ｏＮＫ－ＨＥＲ２細胞懸濁液が取得された。
中数ＡＣＥ－ｏＮＫ－ＨＥＲ２ 細胞懸濁液： 「中数ｏＮＫ細胞懸濁液」の総細胞は、相補的な細胞リンカーとトラスツズマブリンカーを使用してトラスツズマブと連結され、従って、ＡＣＥ－ｏＮＫ－ＨＥＲ２細胞の割合が約６４．１５％である中数ＡＣＥ－ｏＮＫ－ＨＥＲ２細胞懸濁液が取得された。
多数ＡＣＥ－ｏＮＫ－ＨＥＲ２ 細胞懸濁液： 「多数ｏＮＫ細胞懸濁液」の総細胞は、相補的な細胞リンカーとトラスツズマブリンカーを使用してトラスツズマブと連結され、従って、ＡＣＥ－ｏＮＫ－ＨＥＲ２細胞の割合が約９１．７４％である多数ＡＣＥ－ｏＮＫ－ＨＥＲ２細胞懸濁液が取得された。
トラスツズマブを細胞（少数ｏＮＫ細胞懸濁液、中数ｏＮＫ細胞懸濁液、又は多数ｏＮＫ細胞懸濁液における細胞）に結合させる手順は、実施形態４の手順と同じである。
図６Ａおよび図６Ｂを参照すると、図６Ａは癌細胞を殺すための異なる数の非トランスジェニックヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株間の細胞毒性活性の比較を示す棒グラフである。図６ＢはＡＤＣＣプロセスを通じて癌細胞を殺すための異なる数の抗ＨＥＲ２抗体接合非トランスジェニックヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株間の細胞毒性活性の比較を示す棒グラフである。
図６Ａは、ＮＫ－９２細胞株（ＣＤ１６－ナチュラルキラー細胞株であり、ゆえにＡＤＣＣプロセスによって癌細胞を破壊することができない）が癌細胞の２．４０±５．５２％しか殺すことができず、少数ｏＮＫ細胞（腫瘍関連抗原を標的とするＩｇＧ抗体にリンク又は共培養されておらず、ＡＤＣＣ反応を誘導するために活性化されていない非トランスジェニックヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞）が癌細胞の２５．００±３．６０％を殺し、中数ｏＮＫ細胞（腫瘍関連抗原を標的とするＩｇＧ抗体にリンク又は共培養されておらず、ＡＤＣＣ反応を誘導するために活性化されていない非トランスジェニックヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞）が癌細胞の４７．６０±６．８０％を殺し、多数ｏＮＫ細胞（腫瘍関連抗原を標的とするＩｇＧ抗体にリンク又は共培養されておらず、ＡＤＣＣ反応を誘導するために活性化されていない非トランスジェニックヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞）が癌細胞の４９．６８±１．１９％を殺したことを示す。
従って、結果は次のことを示している： ＮＫ－９２細胞（ＮＫ－９２はＣＤ１６－ナチュラルキラー細胞株であるため、ＡＤＣＣプロセスを通じて癌細胞を破壊することはできない）と比較して、少数ｏＮＫ細胞（ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株の割合は８．９１％である）懸濁液は細胞毒性の約１０倍（２５ ÷ ２．４ ＝ １０）の増加を引き起こすのに十分である。これは予想外の結果である。従って、癌細胞を殺すには、組成物中における細胞の総数を１００％として、５％以上の量のヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株で十分であることが示された。この結果に基づいて、出願人は、同様の予想外の結果が臨床試験で観察される可能性があると考えている。
この結果は、中数ｏＮＫ細胞又は多数ｏＮＫ細胞（ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株の割合が６４．１５％又は９１．７４％）懸濁液が細胞傷害性の約２０～２１倍（４７．６０÷２．４ ＝ ２０； ４９．６８÷２．４ ＝ ２１）の増加を引き起こす可能性があることも示している。従って、ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株は多いほど癌細胞が死滅し、組成物中における細胞の総数を１００％として、ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株として約６０％～６５％の量でプラトーに達することを示してる。この結果に基づいて、出願人は同様の結果が臨床試験で観察される可能性があると考えている。
図６Ｂは少数ｏＮＫ細胞が癌細胞の２５．００±３．６０％を殺し、中数ｏＮＫ細胞が癌細胞の４７．６０±６．８０％を殺し、多数ｏＮＫ細胞が癌細胞の４９．６８±１．１９％を殺し、少数ＡＣＥ－ｏＮＫ－ＨＥＲ２細胞が６３．７０±５．００％の癌細胞を殺し、中数ＡＣＥ－ｏＮＫ－ＨＥＲ２細胞が癌細胞の６２．００±４．００％を殺し、多数ＡＣＥ－ｏＮＫ－ＨＥＲ２細胞が癌細胞の７３．９±１１．８０％を殺したことを示している。
従って、結果は次のことを示している： 本発明の培養によって取得された非トランスジェニックヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株が腫瘍関連抗原（トラスツズマブなど）を標的とする抗体と結合した場合、相補的である細胞リンカーと抗体ライナー（トラスツズマブリンカーなど）を使用することによって活性化されてＡＤＣＣ反応を誘発する可能性があり、細胞毒性効果は１４．４％～３８．７％（６２．００％－４７．６０％＝ １４．４％； ６３．７０％－２５．００％＝ ３８．７％）有意に増加した。
この結果は又、５％以上の量の外因性標的化ユニット複合ｏＮＫ細胞（抗ＨＥＲ２抗体接合ｏＮＫ細胞など）がＡＤＣＣプロセスを介して癌細胞を殺すのに十分であることを示している。外因性標的化ユニット複合ｏＮＫ細胞が多いほど、ＡＤＣＣプロセスによって多くの癌細胞が殺され、組成物中における細胞の総数を１００％として、外因性標的化ユニット複合ｏＮ細胞として約５％－１０％に等しい量でプラトーに達することも示してる。この結果に基づいて、出願人は同様の結果が臨床試験で観察される可能性があると考えている。
実施形態７：抗ＨＥＲ２抗体接合非トランスジェニックヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株と抗ＨＥＲ２抗体共培養非トランスジェニックヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株の細胞毒性活性の比較
この実施形態の実験方法は、以下の点を除いて、実施形態３．５の実験方法とほぼ同じである：（１） 本実施形態で使用するエフェクター細胞は、＜ｉ＞実施形態２．１に開示する培養方法で５５日間培養して取得された細胞懸濁液（５５日培養ｏＮＫ懸濁液と呼ばれる）であり、又は、＜ｉｉ＞ＡＣＥ－ｏＮＫ－ＨＥＲ２細胞を用いた細胞懸濁液（「５５日培養ｏＮＫ懸濁液」の総細胞を、実施形態４に記載のように相補的な細胞リンカーおよびトラスツズマブリンカーを使用してトラスツズマブと連結させた）である。そして、（２）ＳＫ－ＯＶ－３細胞（標的細胞）の数に対するエフェクター細胞（５５日培養ｏＮＫ懸濁液又はＡＣＥ－ｏＮＫ－ＨＥＲ２細胞懸濁液における総細胞）の数の比率は１：１ （ＥＴ１）， ２：１ （ＥＴ２）， 又は５：１ （ＥＴ５）であり、（３）５５日間培養ｏＮＫ懸濁液の実験用ウェルにおいて、Ｅ：Ｔ比が１（０．５５ ｎｇ）、２（１．１０ ｎｇ）、および５（２．７５ ｎｇ）のＡＣＥ－ｏＮＫ－ＨＥＲ２細胞懸濁液中の細胞に結合したトラスツズマブの総量と同等のトラスツズマブが添加された。詳細な手順は以下のとおりである。
ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ Ｅ－プレートのウェルは、コントロールウェル、ＡＣＥ－ｏＮＫ－ＨＥＲ２ ＥＴ１実験ウェル、ＡＣＥ－ｏＮＫ－ＨＥＲ２ ＥＴ２実験ウェル、ＡＣＥ－ｏＮＫ－ＨＥＲ２ ＥＴ５実験ウェル、ｏＮＫとハーセプチンＥＴ１実験ウェル、ｏＮＫとハーセプチンＥＴ２実験ウェル、ｏＮＫとハーセプチンＥＴ５実験ウェル、および標的細胞の最大溶解コントロールウェルに分けられた。ＳＫ－ＯＶ－３細胞をコントロールウェル、ＡＣＥ－ｏＮＫ－ＨＥＲ２ ＥＴ１実験ウェル、ＡＣＥ－ｏＮＫ－ＨＥＲ２ ＥＴ２実験ウェル、ＡＣＥ－ｏＮＫ－ＨＥＲ２ ＥＴ５実験ウェル、ｏＮＫとハーセプチンＥＴ１実験ウェル、ｏＮＫとハーセプチンＥＴ２実験ウェル、ｏＮＫとハーセプチンＥＴ５実験ウェル、および標的細胞の最大溶解コントロールウェルに播種し、各ウェルには２００００ ＳＫ－ＯＶ－３細胞が含まれて、そして、３０分間置いた。
ＡＣＥ－ｏＮＫ－ＨＥＲ２細胞懸濁液中の２００００、４００００、又は１０００００細胞をＡＣＥ－ｏＮＫ－ＨＥＲ２ ＥＴ１実験ウェル、ＡＣＥ－ｏＮＫ－ＨＥＲ２ ＥＴ２実験ウェル、およびＡＣＥ－ｏＮＫ－ＨＥＲ２ＥＴ５実験ウェルにそれぞれ添加した。従って、ＳＫＯＶ－３細胞（標的細胞）の数に対するエフェクター細胞（ＡＣＥ－ｏＮＫ－ＨＥＲ２細胞懸濁液中の総細胞）の数の比率は、１、２、および５であった。
５５日培養ｏＮＫ懸濁液中の２００００、４００００、又は１０００００細胞と０．５５、１．１０、又は２．７５ ｎｇのトラスツズマブ（製品名がハーセプチンであるＨＥＲ２タンパク質に対する抗体はＲｏｃｈｅ、Ｓｗｉｓｓから購入した）の両方を「ｏＮＫとハーセプチンＥＴ１実験ウェル」、「ｏＮＫとハーセプチンＥＴ２実験ウェル」、「ｏＮＫとハーセプチンＥＴ５実験的ウェル」にそれぞれ添加した。 従って、ＳＫ－ＯＶ－３細胞（標的細胞）の数に対するエフェクター細胞（５５日培養ｏＮＫ懸濁液中の総細胞）の数の比率は１、２、および５であった。「ｏＮＫとハーセプチンＥＴ１実験ウェル」、「ｏＮＫとハーセプチンＥＴ２実験ウェル」、又は「ｏＮＫとハーセプチンＥＴ５実験ウェル」におけるトラスツズマブの量は、ＡＣＥ－ｏＮＫ－ＨＥＲ２ＥＴ１実験ウェル、ＡＣＥ－ｏＮＫ－ＨＥＲ２ ＥＴ２実験ウェル、およびＡＣＥ－ｏＮＫ－ＨＥＲ２ＥＴ５実験ウェルの細胞に結合したトラスツズマブの総量とそれぞれ同じであった。
図７を参照すると、図７は、ＡＤＣＣプロセスを介して癌細胞を殺すために抗ＨＥＲ２抗体結合非トランスジェニックヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株と抗ＨＥＲ２抗体共培養された非トランスジェニックヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株との間の細胞毒性機能の比較を示す棒グラフである。図７は、腫瘍関連抗原を標的とするＩｇＧ抗体と共培養した（従って、ＡＤＣＣ反応を誘発するように活性化された）ｏＮＫ細胞がＥ：Ｔ比１、２又は５でそれぞれ癌細胞の０．００±２．１０％、７．３０±１．４０％、又は７１．８±２．１０％しか殺すことができず、一方、腫瘍関連抗原を標的とするＩｇＧ抗体と結合（接合）した（従って、ＡＤＣＣ反応を誘導するために活性化された）ＡＣＥ－ｏＮＫ－ＨＥＲ２細胞がＥ：Ｔ比１、２、又は５でそれぞれ癌細胞の３１．４０±１．１０％、６５．６０±１．００％、又は９９．１０±１．３０％を殺したことを示す。
従って、結果は次のことを示している：腫瘍関連抗原を標的とするＩｇＧ抗体と共培養されたｏＮＫ細胞と比較すると、腫瘍関連抗原を標的とするＩｇＧ抗体と結合（接合）したＡＣＥ－ｏＮＫ－ＨＥＲ２細胞は低用量で細胞毒性の９～∞倍（ＥＴ１と０．５５ ｎｇトラスツズマブ、又はＥＴ２と１．１０ｎｇトラスツズマブ、 ６５．６０÷７．３０ ＝ ９、３１．４０÷０．００ ＝∞、∞は無限大の数を表す記号である）の増加を引き起こすことができる。つまり、「ＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞を抗腫瘍抗原抗体とリンクさせる」（たとえば、培養されたｏＮＫをトラスツズマブとリンクさせる）と予想外の結果が生じ、ＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞を抗腫瘍抗原抗体とリンクさせることで、低用量治療に基づく効果的かつ安全な治療を実現できる。
更に、この結果に基づいて、出願人は５５日間の培養ｏＮＫ懸濁液（培養ｏＮＫ）からヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株を単離し、ＡＣＥ－ｏＮＫ－ＨＥＲ２細胞懸濁液からトラスツズマブ結合ＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞（ＡＣＥ－ｏＮＫ－ＨＥＲ２細胞）を分離すると、同様の予想外の結果が観察される可能性があると考えている。
実施形態８：非トランスジェニックヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株のゲノムＤＮＡの検出
実施形態８．１ 液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）によるＣＤ１６受容体をコードするＤＮＡ配列の検出。
この実施形態では、液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を使用して、本発明の培養された非トランスジェニックヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株（ｏＮＫ）、又はＣＤ１６トランスジェニックＮＫ－９２細胞株（ｙＮＫ）のＣＤ１６受容体をコードするＤＮＡ配列を検出した。
この実施形態では、実施形態２．１に開示された培養方法でＭ日間培養することによって取得された細胞懸濁液（Ｍ日培養ｏＮＫ懸濁液と呼ばれる）、およびＣＤ１６トランスジェニックＮＫ－９２細胞株（ＡＴＣＣから購入、寄託番号がＡＴＣＣＰＴＡ－６９６７。ｙＮＫと呼ばれる）が使用された。Ｍ日培養ｏＮＫ懸濁液中におけるｙＮＫと細胞のゲノムＤＮＡは、Ｂｌｏｏｄ＆Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎから購入）によって分離された。
ｙＮＫサンプル又はｏＮＫサンプル：ｙＮＫ又はＭ日培養ｏＮＫ懸濁液から単離された５０ｎｇのゲノムＤＮＡを、１０μＬのｄｄＰＣＲＴＭＳｕｐｅｒｍｉｘ ｆｏｒ Ｐｒｏｂｅｓ（２Ｘ）（カタログ番号＃１８６３０２６； Ｂｉｏ－Ｒａｄから購入）、１μＬのＢｓｔＸＩ制限酵素（製品名ＢｓｔＸＩ；カタログ番号Ｒ０１１３Ｓ； ＢｉｏＬａｂｓから購入）、および１μＬのＣＤ１６ Ｆ１７６Ｆ加水分解プローブとＣＤ１６ Ｆ１７６Ｖ加水分解プローブの混合物（アッセイＩＤ：Ｃ＿２５８１５６６６＿１０； ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒから購入、コンテキストシーケンス［ＶＩＣ／ＦＡＭ］：
ＴＣＴＧＡＡＧＡＣＡＣＡＴＴＴＴＴＡＣＴＣＣＣＡＡ［Ｃ／Ａ］ＡＡＧＣＣＣＣＣＴＧＣＡＧＡＡＧＴＡＧＧＡＧＣＣＧ（配列番号：４１）、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ／ｏｒｄｅｒ／ｇｅｎｏｍｅ－ｄａｔａｂａｓｅ／ｄｅｔａｉｌｓ／ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ／Ｃ＿２５８１５６６６＿１０？ＣＩＤ＝＆ＩＣＩＤ＝＆ｓｕｂｔｙｐｅ＝）と混合し、最終容量は２０μＬである。
テンプレートなしのコントロールサンプル：水、１０μＬのｄｄＰＣＲＴＭＳｕｐｅｒｍｉｘ ｆｏｒ Ｐｒｏｂｅｓ（２Ｘ）、１μＬのＢｓｔＸＩ制限酵素、および１μＬのＣＤ１６ Ｆ１７６Ｆ加水分解プローブとＣＤ１６ Ｆ１７６Ｖ加水分解プローブの混合物を混合し、最終容量は２０μＬである。
ｄｄＰＣＲの実験は、ＱＸ１００／ＱＸ２００ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄから購入）を使用して実施した。先ず、サンプルをＱＸ１００又はＱＸ２００ドロップレットジェネレーター（ＱＸ１００／ＱＸ２００ドロップレットデジタルＰＣＲシステムのマシン）に入れて、各サンプルを１５０００～２００００の液滴（ナノリットルサイズの液滴）に分割する。
次に、９６ウェルプレート（製品名：ＤＧ８カートリッジ、Ｂｉｏ－Ｒａｄから購入）のウェルをテンプレートなしのコントロールウェル、ｙＮＫウェル、ｏＮＫウェルに分け、これらのウェルはそれぞれテンプレートなしのコントロール群（ＮＴＣ群）、ｙＮＫ群、およびｏＮＫ群用である。ナノ化されたテンプレートなしのコントロールサンプル、ｙＮＫサンプル、およびｏＮＫサンプルは、それぞれテンプレートなしのコントロールウェル、ｙＮＫウェル、およびｏＮＫウェルに移された。
次に、ＰＣＲ増幅プロセスの場合、サーモサイクリング条件は、９５°Ｃで１０分間、９５°Ｃで１５秒間を４５サイクル、６０°Ｃで１分間、続いて９８°Ｃで１０分間、その後４°Ｃで保持した。各ステップのランプ速度は２°Ｃ／ｓに設定された。
ＣＤ１６ Ｆ１７６Ｆ加水分解プローブは、ＦＡＭレポーターフルオロフォアで標識されたプローブであり、ＣＤ１６ Ｆ１７６Ｖ加水分解プローブは、ＶＩＣレポーターフルオロフォアで標識されたプローブである。ＰＣＲ増幅プロセスの主なステップは、変性、アニーリング、および伸長である。アニーリング中に加水分解プローブ（ＣＤ１６ Ｆ１７６Ｆ加水分解プローブやＣＤ１６ Ｆ１７６Ｖ加水分解プローブなど）はターゲット配列に結合する。次に、伸長中にプローブの５’末端にラベルが付けられたレポーターが切断され、遊離のレポーターが蛍光を発する。ＣＤ１６ Ｆ１７６Ｆ加水分解プローブの配列は配列番号：１１であり、従って、染色体１のｑアームの位置１ｑ２３．３にあるＣＤ１６受容体をコードするＤＮＡ配列を検出できることが期待された。ＣＤ１６ Ｆ１７６Ｖ加水分解プローブの配列は配列番号：１２であり、ｙＮＫの合成ＤＮＡ配列を検出できると期待されている。
染色体１のｑアームの位置１ｑ２３．３にあるＣＤ１６受容体をコードするＤＮＡ配列はＣＤ１６ Ｆ１７６Ｆ ｍＲＮＡに転写され、次にＣＤ１６ Ｆ１７６Ｆタンパク質に翻訳され、ｏＮＫにおける染色体１のｑアームの位置１ｑ２３．３にあるＣＤ１６受容体をコードするＤＮＡの配列は配列番号：１、配列番号：２、又は配列番号：１９を含有することに注意する。ＣＤ１６ Ｆ１７６Ｆ ｍＲＮＡの配列は配列番号：１３を含有し、 ＣＤ１６ Ｆ１７６Ｆタンパク質の配列は配列番号：３、配列番号：４、配列番号：１４、又は配列番号：２０を含有する。ｙＮＫにおけるＣＤ１６受容体をコードする合成ＤＮＡ配列はＣＤ１６ Ｆ１７６Ｖ ｍＲＮＡに転写され、次にＣＤ１６ Ｆ１７６Ｖタンパク質に翻訳され、ＣＤ１６ Ｆ１７６Ｖ ｍＲＮＡの配列は配列番号：１５である。 ＣＤ１６ Ｆ１７６ＶＦタンパク質の配列は配列番号：１６である。
次に、液滴読み取りプロセスでは、ＱＸ１００／ＱＸ２００液滴リーダー（ＱＸ１００／ＱＸ２００液滴デジタルＰＣＲシステムのマシン）を使用して液滴を読み取り、蛍光を読み取るために液滴を個別に配置し、従って、各液滴を２色検出システム（ＦＡＭおよびＶＩＣを検出するように設定した）を使用して個別に分析した。ターゲットＤＮＡ分子（ＣＤ１６ Ｆ１７６Ｆ加水分解プローブで検出されたＤＮＡ分子又はＣＤ１６ Ｆ１７６Ｖ加水分解プローブで検出された分子など）のコピーを少なくとも１つ
含む陽性液滴は陰性液滴と比較して蛍光の増加を示す。
図８を参照すると、図８は非トランスジェニックヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株とＣＤ１６トランスジェニックＮＫ－９２細胞株の遺伝子型の比較を示す棒グラフである。
ＮＴＣ群では、収集された合計１４５６８個液滴（イベント）の中にＣＤ１６ Ｆ１７６Ｆ加水分解プローブで検出可能なＤＮＡ分子を含む陽性液滴が１個とＣＤ１６ Ｆ１７６Ｖ加水分解プローブで検出可能なＤＮＡ分子を含む陽性液滴が４個しかない。ｙＮＫ群では、収集された合計１４２３０個液滴（イベント）の中にＣＤ１６ Ｆ１７６Ｆ加水分解プローブで検出可能なＤＮＡ分子を含む陽性液滴が６７３７個とＣＤ１６ Ｆ１７６Ｖ加水分解プローブで検出可能なＤＮＡ分子を含む陽性液滴が８１５２個ある。ｏＮＫ群では、収集された合計１４２３０個液滴（イベント）の中にＣＤ１６ Ｆ１７６Ｆ加水分解プローブで検出可能なＤＮＡ分子を含む陽性液滴が７６３７個と、ＣＤ１６ Ｆ１７６Ｖ加水分解プローブで検出可能なＤＮＡ分子を含む陽性液滴が５３３３個ある。
従って、結果は、ｄｄＰＣＲシステムを使用してｙＮＫ細胞のゲノムＤＮＡを分析した場合、ＣＤ１６ Ｆ１７６Ｆ加水分解プローブ検出可能ＤＮＡ分子とＣＤ１６ Ｆ１７６Ｖ加水分解プローブ検出可能ＤＮＡ分子の比率は０．８３ （６７３７ ÷ ８１５２ ＝ ０．８３） であったことを示す。一方で、ｄｄＰＣＲシステムを使用してｏＮＫ細胞のゲノムＤＮＡを分析したところ、ＣＤ１６ Ｆ１７６Ｆ加水分解プローブで検出可能なＤＮＡ分子とＣＤ１６ Ｆ１７６Ｖ加水分解プローブで検出可能なＤＮＡ分子の比率は１．４３（７６３７ ÷ ５３３３ ＝ １．４３）であった。
すなわち、本発明においてヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株 （ｏＮＫ） のゲノムＤＮＡを分析するためにｄｄＰＣＲシステムを使用することにより、ＣＤ１６ Ｆ１７６Ｆ加水分解プローブで検出可能なＤＮＡ分子とＣＤ１６ Ｆ１７６Ｖ加水分解プローブで検出可能なＤＮＡ分子の比率は１以上（ＣＤ１６ Ｆ１７６Ｆ プローブで検出可能なＤＮＡ分子の数÷ＣＤ１６ Ｆ１７６Ｖ プローブで検出可能なＤＮＡ分子の数≧１）であった。
又、この結果に基づいて、出願人は、Ｍ日培養ｏＮＫ懸濁液（培養ｏＮＫ）からヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株を単離した後、同様の結果が観察される可能性があると考えている。
出願人の経験に基づいて、配列番号：１７又は配列番号：１８の配列を持つ別の加水分解プローブは、他のＣＤ１６トランスジェニックＮＫ細胞のＣＤ１６受容体をコードするＤＮＡ配列を検出することができる。
実施形態８．２ 蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）によるＣＤ１６受容体をコードするＤＮＡ配列の検出。
この実施形態では、２色蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を使用して、ヒトナチュラルキラー細胞のＣＤ１６ａ受容体をコードするトランスジェニック、合成、遺伝子改変、又は意図的に導入されたＤＮＡ配列を検出する。
本発明における培養された非トランスジェニックヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株（ｏＮＫ）が例として使用され、ＣＤ １６受容体をコードするトランスジェニック、合成、遺伝子改変、又は意図的に導入されたＤＮＡ配列を持たないヒト細胞の結果を示している。一方で、ＣＤ１６トランスジェニックＮＫ－９２細胞株（ｙＮＫ）が例として使用され、ＣＤ １６受容体をコードするトランスジェニック、合成、遺伝子改変、又は意図的に導入されたＤＮＡ配列を持つヒト細胞の結果を示している。
詳細については、実施形態２．１に開示された培養方法でＮ日間培養することによって取得された細胞懸濁液（Ｎ日間培養ｏＮＫ懸濁液と呼ばれる）から単離されたＣＤ１６＋ ＮＫ細胞（ｏＮＫ 細胞）およびＣＤ１６トランスジェニックＮＫ－９２細胞株（ＡＴＣＣから購入、寄託番号はＡＴＣＣ ＰＴＡ－６９６７。ｙＮＫと呼ばれる）がこの実施形態で使用された。
Ｋａｌｌｉｏｎｉｅｍｉは１９９６年に２色蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）法の詳細を開示し、簡単な抜粋を以下に示す。
先ず、Ｎ日培養ｏＮＫ懸濁液から単離された１×１０７ ｙＮＫ細胞又はｏＮＫ細胞（ＣＤ１６＋ ＮＫ細胞）からの核を、ＤＮＡフローサイトメトリーで使用されるプロトコル（Ｋａｌｌｉｏｎｉｅｍｉ ｅｔ ａｌ．， １９９６； Ｖｉｎｄｅｌｏｖ ｅｔ ａｌ．， １９８３）に従って調製する。 詳細については、細胞ペレットを低張界面活性剤溶液に培養し、短時間のトリプシンで消化する。
次に、核を顕微鏡のスライドに落とし、風乾し、メタノール酢酸で固定する。
次に、ハイブリダイゼーションの前に、標的細胞をプロテイナーゼＫ又は他のタンパク質分解酵素で処理し、プローブの浸透を改善する。
次に、標的細胞の変性は通常、スライドを変性溶液（７０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ）に７０℃で２～４分間浸漬し、続いてエタノールで固定および脱水することによって達成される。変性の時間と温度は標的細胞の特性に応じて最適化する必要がある。
次に、ハイブリダイゼーションの前に、２０～６０ ｎｇの最初の蛍光色素標識ＦＣＧＲ３ＡＦＩＳＨプローブ（ＣＤ１６ａ受容体をコードするすべてのヒトＤＮＡ配列を検出できるテストプローブ、Ｅｍｐｉｒｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓから購入）、２０～６０ ｎｇの２番目の蛍光色素標識染色体１コントロールプローブ（参照プローブ、Ｅｍｐｉｒｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓから購入）、およびブロッキングＤＮＡ（非標識Ｃｏｔ－１又は胎盤ＤＮＡ）をホルムアミドベースのハイブリダイゼーションバッファーに添加する。プローブにゲノム内の複数の場所にハイブリダイズする反復配列が含まれている場合はブロッキングＤＮＡを使用する必要がある。ハイブリダイゼーション混合物を７０℃で５分間加熱してプローブフラグメントを変性させ、ターゲットスライドにアプライし、カバースリップが適用され、ゴムセメントで密封される。ハイブリダイゼーションは湿ったチャンバー内で、３７℃で一晩行う。
次に、結合していないプローブが洗浄される。
次に、標的核はＤＮＡ染色、通常はヨウ化プロピジウムとＤＡＰＩで対比染色される。
ハイブリダイゼーションは通常の高品質落射蛍光顕微鏡で調べらる。主要メーカー（Ｚｅｉｓｓ、 Ｌｅｉｔｚ、Ｏｌｙｍｐｕｓ、およびＮｉｋｏｎ）からの最近のほぼすべての顕微鏡モデルは遺伝子特異的なＦＩＳＨ分析に適している。テストおよび参照プローブシグナルの数は、スライド全体でランダムに選択された最低１００個の核から調べられる。形態学的に無傷で重複しない核のみがカウントされる。核は３次元であるため、正しい信号数を取得するには、核の深さ全体に焦点を移動する必要がある。
遺伝子特異的ＦＩＳＨの結果を報告するために、通常いくつかの形式が使用され、例えば：（１）細胞当たりのテストプローブ信号数、（２）テストプローブからの細胞当たりの信号数を参照プローブからの信号数で割ったもの、又は（３）テストプローブの信号数が参照プローブよりも高い又は低いコピー数で存在する細胞の割合である。
図９Ａ～９Ｅを参照すると、図９Ａ～９Ｅは、ヒトナチュラルキラー細胞においてＣＤ１６ａ受容体をコードするトランスジェニック、合成、遺伝子改変、又は意図的に導入されたＤＮＡ配列を検出するために、一つの色で標識されたＣＤ１６ａ受容体遺伝子特異的テストプローブと別の色で標識された参照プローブを使用した２色ＦＩＳＨ分析の原理を適用できることを示している。
出願人の経験に基づくと、ｏＮＫ細胞当たりのＦＣＧＲ３Ａ ＦＩＳＨプローブ（ＣＤ１６ａ受容体をコードするすべてのヒトＤＮＡ配列を検出できるテストプローブ）信号数は２（細胞当たりの実際遺伝子コピー数）であり、ｏＮＫの２色のＦＩＳＨパターンは図９Ａ（ＣＤ１６ａ受容体をコードするトランスジェニック、合成、遺伝子改変、又は意図的に導入されたＤＮＡ配列を持たないヒト細胞の結果を示す通常のパターン）のようになる。ｙＮＫ細胞当たりの染色体１コントロールプローブ（参照プローブ； Ｅｍｐｉｒｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓから購入）信号数は２より大きい場合があり、ｙＮＫの２色ＦＩＳＨパターンは図９Ｂ～９Ｅ（ＣＤ１６ａ受容体をコードするトランスジェニック、合成、遺伝子改変、又は意図的に導入されたＤＮＡ配列を持つヒト細胞の結果を示すＣＤ１６トランスジェニックパターン）のようになる。
実施形態９：非トランスジェニックヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株の生存率に対する凍結および解凍の効果。
精製ＣＤ１６＋細胞集団（ＣＤ１６受容体を発現する細胞の割合は９９％くらい高かった）は実施形態１．１の方法によって分類され、次に、精製ＣＤ１６＋細胞集団は実施形態２．１の培養方法によって２１日間培養された（精製ＣＤＣＤ１６＋細胞集団は８回継代培養された）。細胞溶液のサンプルを等量のトリパンブルーと混合し、細胞数を数えると、細胞の生存率が９５％であることがわかった。２×１０７個の生細胞を含む十分な量の細胞溶液を取り、以下の凍結融解手順を実行する。
凍結手順：２×１０７個の生細胞を含む細胞溶液を遠心分離し、上清を除去してから、１ｍＬの凍結培地（ＣｒｙｏＳｔｏｒ （登録商標） ＣＳ１０ ＦｒｅｅｚｅＭｅｄｉａ、１０ ｖｏｌ％ＤＭＳＯを含む、ＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、ＵＳＡ）を使用して細胞を再懸濁した。細胞懸濁液をクライオチューブに入れ、クライオチューブをＣｏｏｌＣｅｌｌ 細胞凍結容器（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＵＳＡ）に入れた。次に、ＣｏｏｌＣｅｌｌ Ｃｅｌｌ冷凍容器を－８０°Ｃの冷蔵庫に一晩保管した（１分あたり１°Ｃ低下した）。クライオチューブを移し、液体窒素で１７日間保存した。
解凍手順：クライオチューブを３７℃の水浴に入れて細胞懸濁液を迅速に解凍し、１ｍＬの細胞懸濁液を９ｍＬの実施形態２．１における細胞培養培地と混合する。細胞混合物のサンプルを等量のトリパンブルーと混合した後、細胞数と細胞生存率を観察した。
実験結果は、１．９５×１０７個の細胞が解凍後に生存し、回収率が９７．５％［（１．９５×１０７） ÷ （２×１０７）×１００％ ＝ ９７．５％］と高く、細胞の生存率が凍結前の生存率（９５％）と有意差がない９６％であることを示した。
実施形態１０：非トランスジェニックヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株の細胞毒性活性
この実施形態の実験方法は、以下の点を除いて、実施形態３．５の実験方法とほぼ同じである：（１）この実施形態で使用されるエフェクター細胞はＣｔｒｌ ｏＮＫ細胞、Ｃｔｒｌ ｙＮＫ細胞、ＡＣＥ－ｏＮＫ細胞、又はＡＣＥ－ｙＮＫ細胞であり、（２）ＳＫ－ＯＶ－３細胞（標的細胞）の数に対するエフェクター細胞の数の比率は２：１（ＥＴ２），又は５：１（ＥＴ５）である。
Ｃｔｒｌ ｏＮＫ細胞： Ｃｔｒｌ ｏＮＫ細胞は精製ＣＤ１６＋細胞集団（非トランスジェニックヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株の割合が９９％くらい高かった）が実施形態２．１の方法を使用して２６日間培養された後の培養細胞集団である。
Ｃｔｒｌ ｙＮＫ 細胞： Ｃｔｒｌ ｙＮＫ細胞はＣＤ１６トランスジェニックＮＫ－９２細胞株（ＡＴＣＣから購入、寄託番号はＡＴＣＣ ＰＴＡ－６９６７）である。
ＡＣＥ－ｏＮＫ 細胞： ＡＣＥ－ｏＮＫ細胞は、相補的な細胞リンカーとトラスツズマブリンカーを使用してトラスツズマブをＣｔｒｌ ｏＮＫ細胞に結合することによって取得される細胞である。
ＡＣＥ－ｙＮＫ 細胞： ＡＣＥ－ｙＮＫ細胞は、相補的な細胞リンカーとトラスツズマブリンカーを使用してトラスツズマブ（ＨＥＲ２タンパク質に対する抗体、製品名はＨｅｒｃｅｐｔｉｎ、Ｒｏｃｈｅ、Ｓｗｉｓｓから購入）をＣｔｒｌｙ ＮＫ細胞に結合することによって取得される細胞である。
トラスツズマブをナチュラルキラー細胞（例えば、Ｃｔｒｌ ｏＮＫ細胞又はＣｔｒｌ ｙＮＫ細胞）に結合させる手順は次のとおりである。（Ａ）ＮＫ－ｓｓＤＮＡ接合を調製するために、細胞リンカーを調製し、細胞リンカーをナチュラルキラー細胞に結合させるステップであり、（Ｂ）トラスツズマブ－ｓｓＤＮＡ接合を調製するために、トラスツズマブリンカーを調製し、トラスツズマブリンカーをトラスツズマブに結合するステップであり、（Ｃ）トラスツズマブ接合ナチュラルキラー細胞（例えば、ＡＣＥ－ｏＮＫ細胞又はＡＣＥ－ｙＮＫ細胞）を調製するために、ＮＫ－ｓｓＤＮＡ接合とトラスツズマブ－ｓｓＤＮＡ接合を混合して、細胞リンカーとトラスツズマブリンカーの相補配列を介してＮＫ－ｓｓＤＮＡ接合とトラスツズマブ－ｓｓＤＮＡ接合を結合させる。
細胞リンカーを調製し、細胞リンカーをナチュラルキラー細胞に結合するステップ（Ａ）は、以下のステップ（ａ１）～（ａ４）を含有する：
ステップ（ａ１）第１の一本鎖ＤＮＡが取得され、第１の一本鎖ＤＮＡの配列は、配列番号：５、配列番号：６、又は配列番号：７であった。
ステップ（ａ２）第１の一本鎖ＤＮＡの５’末端は５’末端チオール修飾された第１の一本鎖ＤＮＡとして修飾され、細胞リンカーストックを得た。細胞リンカーストックもＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから市販されている。実際の修飾方法は、当業者に知られているか、又は明らかである（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ、Ｊ、２０１０）。
ステップ（ａ３）１０～５００μＬの細胞リンカーストックと０．１～１０μＬのＮＨＳ－マレイミド（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから市販されている）を混合し、１～６０分間培養した。
ステップ（ａ４）ステップ（ａ３）で取得された混合物を１×１０６～１×１０８ナチュラルキラー細胞と混合し、１～６０分間培養してＮＫ－ｓｓＤＮＡ接合を得た。
トラスツズマブリンカーを調製し、トラスツズマブリンカーをトラスツズマブに結合するステップ（Ｂ）は以下のステップ（ｂ１）～（ｂ４）を含有する：
ステップ（ｂ１）第２の一本鎖ＤＮＡが得られ、第２の一本鎖ＤＮＡの配列は配列番号：８、配列番号：９、又は配列番号：１０であり、第２の一本鎖ＤＮＡの配列は第１の一本鎖ＤＮＡの相補鎖である。
ステップ（ｂ２）第２の一本鎖ＤＮＡの５’末端は５’末端チオール修飾された第２の一本鎖ＤＮＡとして修飾され、トラスツズマブリンカーストックを得る。トラスツズマブリンカーストックもＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからも市販されている。実際の修飾方法は、当業者に知られているか、又は明らかである（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ、Ｊ、２０１０）。
ステップ（ｂ３）１０～５００μＬのトラスツズマブリンカーストックと０．１～１０μＬのＮＨＳ－マレイミド（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから市販されている）を混合し、１～６０分間培養した。
ステップ（ｂ４）ステップ（ｂ３）で取得された混合物を、１０～１００μＬのトラスツズマブストック（Ｒｏｃｈｅから市販されている）と混合し、１０分から３時間培養してトラスツズマブ－ｓｓＤＮＡ接合を得た。
図１０を参照すると、図１０は、ＡＤＣＣプロセスを介して癌細胞を殺すための非トランスジェニックヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株の細胞毒性機能を示す棒グラフである。図１０は、エフェクター細胞の数とＳＫＯＶ－３細胞（標的細胞）の数の比率が２：１（ＥＴ２）又は５：１（ＥＴ５）であることに関係なく、トラスツズマブによって活性化されなかった非トランスジェニックヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株（Ｃｔｒｌ ｏＮＫ 細胞）は癌細胞の６０％～６５％を殺したが、トラスツズマブ活性化非トランスジェニックヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株（ＡＣＥ－ｏＮＫ 細胞）が癌細胞の９５％～１００％を殺したことを示している。従って、本発明の培養によって取得された非トランスジェニックヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株は実際に癌細胞を殺す細胞毒性機能を有する。そして、本発明の培養によって取得された非トランスジェニックヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株が活性化されてＡＤＣＣ反応を誘導した場合、細胞毒性効果は少なくとも３０％（９５％－６５％＝３０％； ｐ＜０．０５）有意に増加した。
図１１Ａおよび１１Ｂを参照すると、図１１Ａは異なるエフェトール（Ｅ）対標的（Ｔ）比率で癌細胞を殺すための、非トランスジェニックヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株とＣＤ１６＋トランスジェニックＮＫ－９２細胞株との間の細胞毒性機能の比較を示す棒グラフである。図１１Ｂは異なるエフェトール（Ｅ）対標的（Ｔ）比率でＡＤＣＣプロセスを介して癌細胞を殺すための非トランスジェニックヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株とＣＤ１６＋トランスジェニックＮＫ－９２細胞株との間の細胞毒性機能の比較を示す棒グラフである。
図１１Ａの結果は、エフェクター細胞の数とＳＫ－ＯＶ－３細胞（標的細胞）の数の比率が５：１ （ＥＴ５） およびトラスツズマブによって活性化されていない場合、非トランスジェニックヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株（Ｃｔｒｌ ｏＮＫ 細胞）は癌細胞の７０％を殺したが、ＣＤ１６トランスジェニックＮＫ－９２細胞株（Ｃｔｒｌ ｙＮＫ）は癌細胞の７２％を殺したことを示し、２つの群間に有意差はなかった（ｐ＞ ０．０５）。従って、エフェクター細胞の数とＳＫ－ＯＶ－３細胞（標的細胞）の数の比率が５：１（ＥＴ５）の場合、本発明の培養方法によって取得された非トランスジェニックヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株の細胞毒性機能は、ＣＤ１６トランスジェニックＮＫ－９２細胞株より劣っていなかった。即ち、ＣＤ１６トランスジェニックＮＫ－９２細胞株と比較して、本発明の方法によって取得された非トランスジェニックヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株は安全であるだけでなく、同じ細胞毒性効果も有する。
図１１Ｂの結果は、エフェクター細胞の数とＳＫＯＶ－３細胞（標的細胞）の数の比率が２：１（ＥＴ２）又は５：１（ＥＴ５）であることに関係なく、トラスツズマブ活性化非トランスジェニックヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株（ＡＣＥ－ｏＮＫ細胞）は癌細胞の９５％を殺したが、トラスツズマブ活性化ＣＤ１６トランスジェニックＮＫ－９２細胞株（ＡＣＥ－ｙＮＫ）も癌細胞の９５％を殺したことを示し、 ２つの群間に有意差はなかった（ｐ＞ ０．０５）。従って、本発明の培養法によって取得された非トランスジェニックヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株のＡＤＣＣプロセスによる細胞毒性機能は、ＣＤ１６トランスジェニックＮＫ－９２細胞株より劣っていなかった。即ち、ＣＤ１６トランスジェニックＮＫ－９２細胞株と比較して、本発明の方法によって取得された非トランスジェニックヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株は安全であるだけでなく、ＡＤＣＣプロセスを介して癌細胞を殺すのに同じ細胞毒性効果を有していた。
実施形態１１：異なる濃度のヒト血小板溶解物を用いた非トランスジェニックヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株の培養
この実施形態の実験方法は、以下の点を除いて、実施形態２．１の実験方法とほぼ同じである：（１）ステップＳ２２’において、実施形態２．１に開示された培養方法で９日間培養（９日間培養ｏＮＫ懸濁液と呼ばれる）することによって取得された細胞懸濁液中のすべての細胞がこの実施形態において培養され、ステップＳ２２’の最初容器の細胞数は５×１０６であった。そして、（２）細胞培地は、５００ ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２と＜ｉ＞２．５％のヒト血小板溶解物、＜ｉｉ＞５．０％ヒト血小板溶解物、＜ｉｉｉ＞１０．０％ヒト血小板溶解物、又は＜ｉｖ＞５．０％ヒト血清（ヒト血小板溶解物を含有しない）を含有する。
本実施形態における培養細胞の細胞数、細胞生存率、およびＣＤ１６表面マーカーを検出する実験方法は、実施形態２．２および３．４の方法と同じである。
図１２Ａ～１２Ｃを参照すると、図１２Ａ～１２Ｃは、ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株を培養した異なる日後のそれぞれ総細胞数、細胞生存率、又はＣＤ１６の発現の維持に対するヒト血小板溶解物の効果を示す線グラフである。
図１２Ａは、１４日間培養した後、ヒト血小板溶解物を含有しない（但し、５．０％のヒト血清を含有する）、２．５％ヒト血小板溶解物、５．０％ヒト血小板溶解物、および１０．０％ヒト血小板溶解物を含有する細胞培地で培養された非トランスジェニックヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞の数はそれぞれ４．７×１０８、６．４９×１０８、１．０１×１０９、および１．７４×１０９であったことを示した。従って、結果は、ヒト血小板溶解物を含有しない（但し、５．０％のヒト血清を含有する）細胞培養培地と比較して、ヒト血小板溶解物は３．７倍の増加を引き起こす可能性がある（１７．４÷４．７ ＝ ３．７）ことを示す。つまり、ヒト血小板溶解物は予想外な結果をもたらし、ヒト血小板溶解物は非トランスジェニックヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞を大幅に増殖させる。更に、これらの結果はフォーミュラ３（１０．０％のヒト血小板溶解物を含有する）がヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞増殖の残りのフォーミュラよりも優れていることを示唆した。
図１２Ｂは、７日間培養した後、ヒト血小板溶解物を含有しない（但し、５．０％のヒト血清を含有する）、２．５％ヒト血小板溶解物、５．０％ヒト血小板溶解物、および１０．０％ヒト血小板溶解物を含有する細胞培地で培養された非トランスジェニックヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞の細胞生存率はそれぞれ９２％、８８％、９２％、および９２％に維持された。１４日間培養した後、ヒト血小板溶解物を含有しない（但し、５．０％のヒト血清を含有する）、２．５％ヒト血小板溶解物、５．０％ヒト血小板溶解物、および１０．０％ヒト血小板溶解物を含有する細胞培地で培養された非トランスジェニックヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞の細胞生存率はそれぞれ９４％、９０％、９２％、および９３％に維持された。従って、結果は次のことを示す。ヒト血小板溶解物で処理されなかったヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞は、２．５％～１０．０％のヒト血小板溶解物で処理されたヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞と同様の生存率である。
図１２Ｃは、ヒト血小板溶解物を含有しない（但し、５．０％のヒト血清を含有する）、２．５％ヒト血小板溶解物、５．０％ヒト血小板溶解物、又は１０．０％ヒト血小板溶解物を含有する細胞培養培地で７日間培養した後、ＣＤ１６＋細胞の割合がそれぞれ８３．５５％、８４．１５％、８２．８１％、８３．９５％に維持されたことを示した。ヒト血小板溶解物を含有しない（但し、５．０％のヒト血清を含有する）、２．５％ヒト血小板溶解物、５．０％ヒト血小板溶解物、又は１０．０％ヒト血小板溶解物を含有する細胞培養培地で１４日間培養した後、ＣＤ１６＋細胞の割合がそれぞれ８０．７２％、８０．７４％、７８．０７％、８０．７６％に維持されたことを示した。従って、結果は次のことを示す。２．５％－１０％ヒト血小板溶解物はヒト血小板溶解物なし（５．０％ヒト血清を含有する）と同様のＣＤ１６＋集団を維持する。
更に、この結果に基づいて、出願人は９日間の培養ｏＮＫ懸濁液（培養ｏＮＫ）からヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株を単離した後、同様の結果が観察されると考えている。
実施形態１２：異なる濃度のＩＬ－２を用いた非トランスジェニックヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株の培養。
この実施形態の実験方法は、以下の点を除いて、実施形態２．１の実験方法とほぼ同じである：（１）ステップＳ２２’において、実施形態２．１に開示された培養方法で９日間培養することによって取得された細胞懸濁液（９日間培養ｏＮＫ懸濁液と呼ばれる）中のすべての細胞がこの実施形態において培養され、ステップＳ２２’の最初の容器の細胞数は５×１０６であった。そして、（２）細胞培地は、５．０％のヒト血小板溶解物と＜ｉ＞１００ＩＵ／ ｍＬ ＩＬ－２、＜ｉｉ＞２００ＩＵ／ ｍＬ ＩＬ－２、＜ｉｉｉ＞５００ＩＵ／ ｍＬ ＩＬ－２、＜ｉｖ＞７５０ＩＵ／ ｍＬ ＩＬ－２、又は＜ｖ＞１０００ＩＵ／ ｍＬ ＩＬ－２を含有する。
ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞の増殖にはＩＬ－２とヒト血小板溶解物の両方が必要であることに注意が必要である。この実施形態では、１．８×１０７ ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２は１．１ｍｇ／ｍＬ ＩＬ－２に等しかった。従って、１００ ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２は０．０６１２μｇ／ ｍＬ ＩＬ－２に相当し、２００ ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２は０．１２２４μｇ／ ｍＬ ＩＬ－２に相当し、５００ ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２は０．３０６μｇ／ ｍＬ ＩＬ－２に相当し、７５０ ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２は０．４５９μｇ／ ｍＬ ＩＬ－２に相当し、そして、１０００ ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２は０．６１２μｇ／ ｍＬ ＩＬ－２に相当する。
本実施形態における培養細胞の細胞数、細胞生存率、およびＣＤ１６表面マーカーを検出する実験方法は、実施形態２．２および３．４の方法と同じである。
図１３Ａ～１３Ｆを参照すると、図１３Ａ～１３Ｆは、ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株を培養した異なる日後の、総細胞数、細胞生存率、又はＣＤ１６の発現の維持に対するＩＬ－２の効果をそれぞれ示す線グラフである。
図１３Ａ～１３ＢはＩＬ－２レベルが非トランスジェニックヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞の増殖に影響を及ぼさなかったことを示した。細胞は７日目に再播種され、その後１１日目まで増やし続けし、増殖プロセスは１１日ごとに繰り返されたことに注意が必要である。
図１３Ｃ～１３Ｄは、ＩＬ－２レベルが非トランスジェニックヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞の細胞生存率に影響を与えなかったことを示している。
図１３Ｅ－１３Ｆは、１００～２００ ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含有する細胞培養培地で４０日間培養した後、ＣＤ１６＋細胞の割合が２０％未満に低下したことを示している。一方で、５００～１０００ ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含有する細胞培養培地で４０日間培養した後、ＣＤ１６＋細胞の割合は８０％に増加した。つまり、５００～１０００ ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２は予想外な結果をもたらし、５００～１０００ ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２はＣＤ１６＋集団を大幅に維持する。
更に、この結果に基づいて、出願人は９日間の培養ｏＮＫ懸濁液（培養ｏＮＫ）からヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株を単離した後、同様の結果が観察されると考えている。
実施形態１３：異なる容器での非トランスジェニックヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株の培養。
この実施形態の実験方法は、以下の点を除いて、実施形態２．１の実験方法とほぼ同じである：（１）ステップＳ２２’において、実施形態２．１に開示された培養方法で９日間培養することによって取得された細胞懸濁液（９日間培養ｏＮＫ懸濁液と呼ばれる）中のすべての細胞がこの実施形態において培養され、ステップＳ２２’の最初容器の細胞数は５×１０６であり、（２）細胞培養培地は、５００ ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２と５．０％のヒト血小板溶解物を含有する。そして、（３）この実施形態で使用される容器は、＜ｉ＞Ｇ－Ｒｅｘ６ウェル培養プレートなどの通気性容器であり、又は＜ｉｉ＞Ｔ２５細胞培養フラスコなどの非通気性容器である。
本実施形態における培養細胞の細胞数、細胞生存率、およびＣＤ１６表面マーカーを検出する実験方法は、実施形態２．２および３．４の方法と同じである。
図１４Ａ～１４Ｃを参照すると、図１４Ａ～１４Ｃは、ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株を培養した異なる日後の、それぞれ、総細胞数、細胞生存率、又はＣＤ１６の発現の維持に対する通気性容器の効果を示す線グラフである。
図１４Ａは、１４日間培養した後、非通気性容器および通気性容器で培養された非トランスジェニックヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞の数がそれぞれ３．１×１０８および１．０１×１０９であることを示した。従って、結果は次のことを示す。非通気性の容器で培養された細胞と比較して、通気性の容器は３．２６倍（１０．１ ÷ ３．１ ＝ ３．２６）の増加を引き起こす可能性がある。つまり、通気性のある容器は予想外な結果をもたらし、通気性のある容器は非トランスジェニックヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞を大幅に増殖させる。
図１４Ｂは、７日間培養した後、非通気性容器および空気透過性容器で培養された非トランスジェニックヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞の細胞生存率がそれぞれ８７％および９２％に維持されたことを示した。１４日間培養した後、非通気性容器および空気透過性容器で培養された非トランスジェニックヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞の細胞生存率がそれぞれ８８％および９２％に維持されたことを示した。従って、結果は次のことを示す。通気性のある容器で培養されたヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞は、非通気性の容器で培養されたヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞よりも生存率が高い。
図１４Ｃは、非通気性容器と通気性容器で７日間培養した後、ＣＤ１６＋細胞の割合がそれぞれ８２．６３％と８２．８１％に維持されたことを示している。非通気性容器と通気性容器で１４日間培養した後、ＣＤ１６＋細胞の割合がそれぞれ８３．７９％と８８．０７％に維持されたことを示している。従って、結果は次のことを示す。通気性容器は非通気性容器と同様のＣＤ１６＋集団を維持する。
更に、この結果に基づいて、出願人は９日間の培養ｏＮＫ懸濁液（培養ｏＮＫ）からヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株を単離した後、同様の結果が観察されると考えている。
実施形態１４：外因性標的化ユニット複合ｏＮＫ細胞を調製する
この実施形態では、出願者は少なくとも外因性標的化ユニットが複合体を形成した外因性標的化ユニット複合ｏＮＫ細胞を調製する。外因性標的化ユニットは標的細胞上の生物学的マーカーへの特異的結合を発現する標的化部分を含有する。そして、標的化部分は、癌抗原、糖脂質、糖タンパク質、造血系統の細胞に存在する分化抗原のクラスター、ガンマ－グルタミルトランスペプチダーゼ、接着タンパク質、ホルモン、成長因子、サイトカイン、リガンド受容体、イオンチャネル、免疫グロブリンμ．鎖の膜結合型、アルファ－フェトプロテイン、Ｃ反応性タンパク質、クロモグラニンＡ、上皮ムチン抗原、ヒト上皮特異的抗原、ルイス（ａ）抗原、多剤耐性関連タンパク質、Ｎｅｕ癌遺伝子タンパク質、ニューロン特異的エノラーゼ、Ｐ糖タンパク質、多剤耐性関連抗原、ｐ１７０、多剤耐性関連抗原、前立腺特異抗原、ＮＣＡＭ、ガングリオシド分子、ＭＡＲＴ－１、熱ショックタンパク質、シアリルＴｎ、チロシナーゼ、ＭＵＣ－１、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ、ＫＳＡ、ＰＳＭＡ、ｐ５３、ＲＡＳ、ＥＧＦ－Ｒ、ＶＥＧＦ、又はＭＡＧＥから選択された生物学的マーカーに結合する可能性がある。標的化部分は核酸ではなく、外因性標的化ユニット複合ｏＮＫ細胞によって生成されない。
標的化部分（ＨＥＲ２タンパク質に対抗するトラスツズマブなど）をｏＮＫ細胞に結合させる手順は次のとおりである。（Ａ）ＮＫ－ｓｓＤＮＡ接合を調製するために、細胞リンカーを調製し、細胞リンカーをナチュラルキラー細胞に結合させるステップであり、（Ｂ）標的化部分－ｓｓＤＮＡ接合を調製するために、標的化部分リンカー（トラスツズマブリンカーなど）を調製し、標的化部分リンカーを標的化部分に結合させるステップであり、Ｃ）外因性標的化ユニット複合接合ナチュラルキラー細胞（例えば、ＡＣＥ－ｏＮＫ細胞又はＡＣＥ－ｙＮＫ細胞）を調製するために、ＮＫ－ｓｓＤＮＡ接合と標的化部分－ｓｓＤＮＡ接合を混合して、細胞リンカーと標的化部分リンカー上のその相補配列を介してＮＫ－ｓｓＤＮＡ接合と標的化部分－ｓｓＤＮＡ接合を結合させる。
細胞リンカーを調製し、細胞リンカーをナチュラルキラー細胞に結合するステップ（Ａ）は、以下のステップ（ａ１）～（ａ４）を含有する：
ステップ（ａ１）第１の一本鎖ＤＮＡが取得され、第１の一本鎖ＤＮＡの配列は、配列番号：５、配列番号：６、又は配列番号：７であった。
ステップ（ａ２）第１の一本鎖ＤＮＡの５ ’末端は５’末端チオール修飾された第１の一本鎖ＤＮＡとして修飾され、細胞リンカーストックを得た。細胞リンカーストックもＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから市販されている。実際の修飾方法は、当業者に知られているか、又は明らかである（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ、Ｊ、２０１０）。
ステップ（ａ３）１０～５００μＬの細胞リンカーストックと０．１～１０μＬのＮＨＳ－マレイミド（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから市販されている）を混合し、１～６０分間培養した。
ステップ（ａ４）ステップ（ａ３）で取得された混合物を１×１０６～１×１０８ナチュラルキラー細胞と混合し、１～６０分間培養してＮＫ－ｓｓＤＮＡ接合を得た。
標的化部分リンカーを調製し、標的化部分リンカーを標的化部分に結合するステップ（Ｂ）は以下のステップ（ｂ１）～（ｂ４）を含有する：
ステップ（ｂ１）第２の一本鎖ＤＮＡが得られ、第２の一本鎖ＤＮＡの配列は配列番号：８、配列番号：９、又は配列番号：１０であり、第２の一本鎖ＤＮＡの配列は第１の一本鎖ＤＮＡの相補鎖である。
ステップ（ｂ２）第２の一本鎖ＤＮＡの５’末端は５’末端チオール修飾された第２の一本鎖ＤＮＡとして修飾され、標的化部分リンカーストックを得た。標的化部分リンカーストックもＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから市販されている。実際の修飾方法は、当業者に知られているか、又は明らかである（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ、Ｊ、２０１０）。
ステップ（ｂ３）１０～５００μＬの標的化部分リンカーストックと０．１～１０μＬのＮＨＳ－マレイミド（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから市販されている）を混合し、１～６０分間培養した。ステップ（ｂ４）ステップ（ｂ３）で取得された混合物を、１０～１００μＬの標的化部分リンカーストック（Ｒｏｃｈｅから市販されている）と混合し、１０分から３時間培養して標的化部分－ｓｓＤＮＡ接合を得た。
標的化部分がペプチド、タンパク質、又はアプタマーであり得、タンパク質がＨＥＲ２／ｎｅｕ（ＥＲＢＢ２）、ＨＥＲ３（ＥＲＢＢ３）、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ２、ＧＤ２、ＣＴＬＡ４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３（Ｓｉｇｌｅｃ－３）、ＣＤ５２（ＣＡＭＰＡＴＨ－１抗原）、ＣＤ３２６（ＥｐＣＡＭ）、ＣＡ－１２５（ＭＵＣ１６）、ＭＭＰ９、ＤＬＬ３、ＣＤ２７４（ＰＤ－Ｌ１）、ＣＥＡ、ＭＳＬＮ（メソテリン）、ＣＡ１９－９、ＣＤ７３、ＣＤ２０５（ＤＥＣ２０５）、ＣＤ５１、ｃ－ＭＥＴ、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、ＩＧＦ－１Ｒ、ＣＤ３、ＭＩＦ、葉酸受容体アルファ（ＦＯＬＲ１）、ＣＳＦ１、ＯＸ－４０、ＣＤ１３７、ＴｆＲ、ＭＵＣ１、ＣＤ２５（ＩＬ－２Ｒ）、ＣＤ１１５（ＣＳＦ１Ｒ）、ＩＬ１Ｂ、ＣＤ１０５（エンドグリン）、ＫＩＲ、ＣＤ４７、ＣＥＡ、ＩＬ－１７Ａ、ＤＬＬ４、ＣＤ５１、アンジオポエチン２、ニューロピリン－１、ＣＤ３７、ＣＤ２２３（ＬＡＧ－３）、ＣＤ４０、ＬＩＶ－１（ＳＬＣ３９Ａ６）、ＣＤ２７（ＴＮＦＲＳＦ７）、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、Ｔｒｏｐ２、クローディン１（ＣＬＤＮ１）、ＰＳＭＡ、ＴＩＭ－１（ＨＡＶｃｒ－１）、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＤ７０、ＬＹ６Ｅ、ＢＣＭＡ、ＣＤ１３５（ＦＬＴ３）、ＡＰＲＩＬ、ＴＦ（Ｆ３）、ネクチン－４、ＦＡＰ、ＧＰＣ３、ＦＧＦＲ３、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリンタンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、活性化ＮＫ細胞受容体、およびその組み合わせから選択された癌抗原に対する抗体の可能性がある。
実施形態１５：キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現ｏＮＫ細胞を調製する
標的抗原に対する標的結合一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする合成、遺伝子改変および／又は意図的に導入されたポリヌクレオチドを含有するｏＮＫ細胞を調製するための方法がこの実施形態において開示され、キメラ抗原受容体は、ＣＤ２、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ８ａ、ＣＤ８、ＣＤ１ １ａ（ＩＴＧＡＬ）、ＣＤ１ １ｂ（ＩＴＧＡＭ）、ＣＤ１ １ｃ（ＩＴＧＡＸ）、ＣＤ１ １ｄ（ＩＴＧＡＤ）、ＣＤ １８（ＩＴＧＢ２）、ＣＤ １９（Ｂ４）、ＣＤ２７（ＴＮＦＲＳＦ７）、ＣＤ２８、ＣＤ２９（ＩＴＧＢ１）、ＣＤ３０（ＴＮＦＲＳＦ８）、ＣＤ４０（ＴＮＦＲＳＦ５）、ＣＤ４８（ＳＬＡＭＦ２）、ＣＤ４９ａ（ＩＴＧＡ１）、ＣＤ４９ｄ（ＩＴＧＡ４）、ＣＤ４９ｆ（ＩＴＧＡ６）、ＣＤ６６ａ（ＣＥＡＣＡＭ１）、ＣＤ６６ｂ（ＣＥＡＣＡＭ８）、ＣＤ６６ｃ（ＣＥＡＣＡＭ６）、ＣＤ６６ｄ（ＣＥＡＣＡＭ３）、ＣＤ６６ｅ（ＣＥＡＣＡＭ５）、ＣＤ６９（ＣＬＥＣ２）、ＣＤ７９Ａ（Ｂ細胞抗原受容体複合体関連アルファ鎖）、ＣＤ７９Ｂ（Ｂ細胞抗原受容体複合体関連ベータ鎖）、ＣＤ８４（ＳＬＡＭＦ５）、ＣＤ９６（触覚）、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ１０３（ＩＴＧＡＥ）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭＦ１）、ＣＤ１５８Ａ（ＫＩＲ２ＤＬ１）、ＣＤ１５８Ｂ１（ＫＩＲ２ＤＬ２）、ＣＤ１５８Ｂ２（ＫＩＲ２ＤＬ３）、ＣＤ１５８Ｃ（ＫＩＲ３ＤＰ１）、ＣＤ１５８Ｄ（ＫＩＲＤＬ４）、ＣＤ１５８Ｆ１（ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ）、ＣＤ１５８Ｆ２（ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ）、ＣＤ１５８Ｋ（ＫＩＲ３ＤＬ２）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＣＤ１６２（ＳＥＬＰＬＧ）、ＣＤ２２６（ＤＮＡＭ１）、ＣＤ２２９（ＳＬＡＭＦ３）、ＣＤ２４４（ＳＬＡＭＦ４）、ＣＤ２４７（ＣＤ３－ゼータ）、ＣＤ２５８（ＬＩＧＨＴ）、ＣＤ２６８（ＢＡＦＦＲ）、ＣＤ２７０（ＴＮＦＳＦ１４）、ＣＤ２７２（ＢＴＬＡ）、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、ＣＤ２７９（ＰＤ－１）、ＣＤ３１４（ＮＫＧ２Ｄ）、ＣＤ３１９（ＳＬＡＭＦ７）、ＣＤ３３５（ＮＫ－ｐ４６）、ＣＤ３３６（ＮＫ－ｐ４４）、ＣＤ３３７（ ＮＫ－ｐ３０）、ＣＤ３５２（ＳＬＡＭＦ６）、ＣＤ３５３（ＳＬＡＭＦ８）、ＣＤ３５５（ＣＲＴＡＭ）、ＣＤ３５７（ＴＮＦＲＳＦ１８）、誘導性Ｔ細胞共刺激因子（ＩＣＯＳ）、ＬＦＡ－１（ＣＤ１ １ａ／ＣＤ１８）、ＮＫＧ２Ｃ、ＤＡＰ－１０、ＩＣＡＭ－１、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＩＬ－２Ｒベータ、ＩＬ－２Ｒガンマ、ＩＬ－７Ｒアルファ、ＬＦＡ－１、ＳＬＡＭＦ９、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ（ＧｒｐＬ）、ＳＬＰ－７６（ＬＣＰ２）、ＰＡＧ１／ＣＢＰ、ＣＤ８３リガンド、Ｆｃガンマ受容体、ＭＨＣクラス１分子、ＭＨＣクラス２分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリンタンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、活性化ＮＫ細胞受容体、Ｔｏｌｌ様受容体、ＨＥＲ２、ＢＣＭＡ、ＰＤ－Ｌ１、およびその組み合わせからから選ばれる。
例えばＣＤ１９を取り上げ、以下のようにＣＤ１９に対する標的結合一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする合成、遺伝子改変、および／又は意図的に導入されたポリヌクレオチドを含有するｏＮＫの調製方法を説明する。ｏＮＫ細胞を回収し、６ μＭの５Ｚ－７ オキソゼアエノール（ＴＡＫ１阻害剤）で３０分間処理した。５Ｚ－７－オキソゼアエノールで処理した細胞がＴｒａｓｄｕｘ（形質導入エンハンサー）で処理され、ＣＤ８１０Ａ－１ベクターの抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖＣＡＲ発現コンストラクトによって生成されたレンチウイルス粒子を ９のｍ．ｏ．ｉで感染させた。細胞を１０００ｘｇで７０分間遠心分離し、３７℃で４時間培養した。細胞を更に２００ｘｇで５分間遠心分離し、上清を除去した。感染した細胞を新鮮な増殖培地に再懸濁し、Ｇ－Ｒｅｘプレートで、３７℃で培養した。
ＣＡＲを発現する集団を濃縮するために、細胞を４００ ｘｇで５分間遠心分離し、ＭＡＣＳバッファーで洗浄した。細胞を更に抗Ｍｙｃ Ａｂ－ＡＰＣおよびＤＡＰＩで染色した。ＤＰＢＳで洗浄した後、ＡＰＣ＋ ＤＡＰＩ－細胞をセルソーターで選別し、Ｇ－Ｒｅｘで新鮮な増殖培地で増殖させた。

本発明の実施形態から、本発明の方法によって取得されたすべての非トランスジェニックヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株、本発明の外因性標的化ユニット複合ナチュラルキラー細胞、および本発明のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現ｏＮＫ細胞はＡＤＣＣ様プロセスを介して実際に標的細胞（例えば、癌細胞）を殺すことができることを示す。従って、本発明の培養法によって得られる非トランスジェニックヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞株の適用可能な分野には、これらに限定されないが、癌治療、自己免疫疾患治療、神経疾患治療、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）根絶 、造血細胞関連疾患、代謝症候群治療、病原性疾患治療、ウイルス感染症の治療、および細菌感染症の治療が含まれる。
参考文献１： Ｅｉｌｅｅｎ ＳｃｕｌｌｙとＧａｌｉｔ Ａｌｔｅｒ、２０１６年。ＨＩＶ疾患のＮＫ細胞。Ｃｕｒｒ ＨＩＶ／ＡＩＤＳ Ｒｅｐ． １３（２）：８５－９４。
参考文献２： Ｊｏｒｄａｎ Ｓ． Ｏｒａｎｇｅ、２０１３年。ナチュラルキラー細胞の欠損。 Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３２（３）：５１５－５２５。
参考文献３： Ｋａｌｌｉｏｎｉｅｍｉ Ａ、Ｖｉｓａｋｏｒｐｉ Ｔ、Ｋａｒｈｕ Ｒ、Ｐｉｎｋｅｌ Ｄ、およびＫａｌｌｉｏｎｉｅｍｉ ＯＰ、１９９６年。蛍光インサイチュハイブリダイゼーションおよび比較ゲノムハイブリダイゼーションによる遺伝子コピー数分析。Ｍｅｔｈｏｄｓ． ９（１）：１１３－１２１。
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参考文献５： Ｐｅｒｎｉｃｋ、Ｎ、２０１８年。
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参考文献６： Ｒｅｚｖａｎｉ ＫおよびＲｏｕｃｅ ＲＨ、２０１５年。癌治療のためのナチュラルキラー細胞免疫療法の適用。Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ６：５７８。
参考文献７： Ｖｉｎｄｅｌoｖ、 Ｌ． Ｌ．、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ、Ｉ． Ｊ．、およびＮｉｓｓｅｎ、Ｎ． Ｉ．、１９８３年。フローサイトメトリーＤＮＡ分析用の核を調製するための界面活性剤－トリプシン法。Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ． ３（５）， ３２３-３２７。
参考文献８： Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ、Ｊ．、Ｎｉｃｏｌａｕｓ、Ｔ．、Ｎｅｕｅｒｔ、Ｇ． およびＢｌａｎｋ、Ｋ．、２０１０年。単一分子実験のための生体分子のチオールベースの部位特異的および共有結合固定化。Ｎａｔ． Ｐｒｏｔｏｃ． ５（６）：９７５－９８５。
前述の説明は、本発明の好ましい実施形態に過ぎず、本発明の特許出願の範囲を限定することを意図するものではない。従って、本明細書に開示された精神から逸脱しない変更又は修正は本発明の特許出願の範囲内に含まれるべきである。

Claims (11)

  1. ＮＰＭＤに寄託され、寄託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０３０１７を有する、ヒトナチュラルキラー細胞。
  2. ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞が実質的に濃縮された組成物を得る方法であり、
    （ａ）寄託番号ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２４０７を有するヒト末梢血ナチュラルキラー細胞の集団を取得し、
    （ｂ）ヒト末梢血ナチュラルキラー細胞の集団をＣＤ１６受容体に特異的な抗体と接触させ、そして
    （ｃ）抗体によって特異的に結合される細胞を分離し、それによってヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞が実質的に濃縮された組成物を得、
    前記ステップ（ｃ）が以下のサブステップを含有し：
    （ｃ１）前記抗体によって特異的に結合される細胞を分離し、
    （ｃ２）容器内で、前記抗体が特異的に結合している細胞をヒト血小板溶解物およびＩＬ－２を含有する培地と接触させ、および
    （ｃ３）前記細胞を複数日間培養することにより、ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞が実質的に濃縮された組成物が得られ、
    前記ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞は、
    （Ａ）ＮＰＭＤに寄託され、寄託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０３０１７を有する、又は
    （Ｂ）以下の特徴を有する：
    ｉ）ＣＤ１６受容体を発現していること、および
    ｉｉ）ｘ）合成、遺伝子改変、および／又は意図的に導入されたＣＤ１６受容体をコードするポリヌクレオチドを含まない、又はｙ）ｄｄＰＣＲシステムを使用して細胞のゲノムＤＮＡを分析し、ＣＤ１６ Ｆ１７６Ｆプローブで検出可能なＤＮＡ分子とＣＤ１６ Ｆ１７６Ｖプローブで検出可能なＤＮＡ分子との比率は１以上であり、前記ＣＤ１６ Ｆ１７６Ｆプローブの配列は配列番号：１１であり、前記ＣＤ１６ Ｆ１７６Ｖプローブは配列番号：１２である、方法。
  3. 前記容器が細胞を播種するための底部を含有し、前記底部が空気透過性および水不透過性である、請求項２に記載の方法。
  4. 前記培地中の溶解グルコースの濃度が１５００～５０００ｍｇ／Ｌである、請求項２に記載の方法。
  5. 前記組成物におけるヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞数が少なくとも５×１０５であり、前記ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞が組成物における細胞の総数を１００％として、数で５％以上の量である、請求項２に記載の方法。
  6. ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞を培養および増殖させる方法であり、以下を含有する：
    （ｘ）容器内で前記ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞を０．５－１０ｖｏｌ％ヒト血小板溶解物および１００－３０００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２を含有する培地と接触させ、および
    （ｙ）前記細胞を複数日間培養し、
    前記ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞が、ＣＤ１６＋細胞の集団を培養するステップおよび分離するステップを含むプロセスを通して、寄託番号ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２４０７を有する細胞集団から得られたものであり、
    前記培養するステップが、ヒト血小板溶解物およびインターロイキン２（ＩＬ－２）を
    含む培養培地において実施され、
    さらに以下の特徴を有する、方法：
    ａ）合成、遺伝子改変、および／又は意図的に導入されたＣＤ１６受容体をコードするポリヌクレオチドを含まない、又はｂ）ｄｄＰＣＲシステムを使用して細胞のゲノムＤＮＡを分析することにより、ＣＤ１６ Ｆ１７６Ｆプローブで検出可能なＤＮＡ分子とＣＤ１６ Ｆ１７６Ｖプローブで検出可能なＤＮＡ分子の比率は１以上であり、ＣＤ１６ Ｆ１７６Ｆプローブの配列は配列番号：１１であり、ＣＤ１６ Ｆ１７６Ｖプローブは配列番号：１２である。
  7. 前記容器が細胞を播種するための底部を含有し、前記底部が空気透過性および水不透過性である、請求項６に記載の方法。
  8. 前記ステップ（ｙ）が以下のサブステップを含有する：
    （ｙ１）前記細胞を少なくとも１日間培養し、および
    （ｙ２）前記細胞を少なくとも１ヶ月継代培養する、請求項６に記載の方法。
  9. 前記ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞が少なくとも３ヶ月継代培養した後に増殖能力を保持することができる、請求項６に記載の方法。
  10. 前記ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞が
    （Ａ）ＮＰＭＤに寄託され、寄託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０３０１７を有する、又は
    （Ｂ）ＮＰＭＤに寄託され、寄託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０３０１７である細胞から得られた、請求項６に記載の方法。
  11. ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞が実質的に濃縮された組成物であって、前記組成物中の前記ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞の数が少なくとも５×１０５であり、前記ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞が、前記組成物中の細胞の総数を１００％として、数で５％以上の量であり、前記ヒトＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞がＮＰＭＤに寄託され、寄託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０３０１７を有する、組成物。
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