JP7398366B2 - 対称性ジメチルアルギニンの検出 - Google Patents

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関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年１０月１９日に出願された米国特許仮出願第６２／５７４，５９２号および２０１７年１２月１５に出願された米国特許仮出願第６２／５９９，１１７号の優先権を主張し、これらはそれぞれ、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする。

本開示は、対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）の検出に全般的に関する。より詳細には、本開示は、固相を使用したＳＤＭＡの検出に関する。

動物からの生物学的試料において遊離ＳＤＭＡを検出すると、動物における腎機能の指標を得ることができる。腎疾患および障害（例えば、腎機能障害、腎臓不全、慢性腎疾患、糸球体腎炎、糖尿病性腎症、間質性腎炎、多発性嚢胞腎疾患、および高血圧性腎疾患）は、ＧＦＲ（糸球体ろ過率）を含む全体的な腎機能を低下させる傾向があり、一般的な腎臓のマーカーであるクレアチニンおよびＢＵＮの使用を含む多数の方法で診断することができる。健常および疾患動物におけるＳＤＭＡ、ＢＵＮおよびクレアチニンのレベルを比較することによって、試料中のＳＤＭＡレベルを動物の病態と関連付けることができる。したがって、正常な（基準範囲の）クレアチニンおよびＢＵＮを示す「健常」動物は、ＳＤＭＡレベルが疾患動物のものよりも低いはずである。一般的に、腎障害／疾患に罹患した動物は、血清ＳＤＭＡレベルが正常な腎機能を呈する動物よりも高いはずである。健常ヒトでは、血漿ＳＤＭＡレベルは典型的には、０．３～０．７μｍｏｌ／ｌの範囲である（Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ（２００６年）１７巻：１１２８～１１３４頁；Ｅｕｒ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２００７年６月；３７巻（５号）：３６４～３７１頁；Ｎｅｐｈｒｏｌ Ｄｉａｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ（２００３年）１８巻：２５４２～２５５０頁；Ｎｅｐｈｒｏｌ Ｄｉａｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ（２００６年）２１巻：２４４６～２４５１頁；Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、（２００１年）５９巻（７８号）：Ｓ１４～Ｓ１８頁）。

同様に、生物学的試料における遊離ＳＤＭＡレベルは、動物における心疾患のマーカーとして使用することができる。試料中のＳＤＭＡレベルによって、心疾患に関する既知のマーカーのレベルと比較し、心疾患を診断するためのカットオフ範囲を決定することができる（Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ（２００６年）１７巻：１１２８～１１３４頁）。

したがって、発明者らは、ヒトおよび他の動物からの試料におけるＳＤＭＡを正確にかつ効率的に決定する必要性を当技術分野において確認している。

１つの態様において、本開示は、固体マトリックスであって、それに非拡散的に結合している粒子を有する固体マトリックス、例えば多孔質マトリックスを含むデバイスであって、粒子が、粒子に結合しているタンパク質に共有結合している分析物または分析物誘導体の類似体を含む捕捉試薬を含む、デバイスを対象とする。さまざまな実施形態において、タンパク質は、粒子に共有結合または非共有結合していてもよい。タンパク質は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、オボアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、およびグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）のうちの１つまたは複数であってもよい。タンパク質の粒子への非共有結合は、ＢＳＡ、オボアルブミンまたはＫＬＨの非共有結合よりも、界面活性剤または高塩濃度に耐性を示し得る。誘導体は、アルギニン誘導体、例えばメチル化アルギニン誘導体、例えば、非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）、Ｌ－アルギニン、Ｎ－メチルアルギニン（ＭＭＡ）、アシル化ＡＤＭＡ、アシル化Ｌ－アルギニン、およびアシル化ＭＭＡであってもよい。マトリックスは、カートリッジまたはハウジングに配置されていてもよい。

別の態様において、本開示は、粒子に結合しているＮ－メチルアルギニン（ＭＭＡ）またはアシル化ＭＭＡの類似体を含む捕捉試薬を対象とする。さまざまな実施形態において、類似体は、リンカーを介して粒子に結合していてもよい。類似体は、粒子に結合しているタンパク質に共有結合していてもよく、タンパク質は、粒子に共有結合または非共有結合していてもよい。タンパク質は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、オボアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、およびグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）のうちの少なくとも１つであってもよい。リンカーとしては以下の構造

が挙げられ、捕捉試薬は、

であってもよい。

更なる態様において本開示は、試料中の対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）を決定する方法を対象とする。方法は、（ａ）試料と、標識にコンジュゲートされた抗ＳＤＭＡ抗体を含む標識コンジュゲートとを含む混合物を形成することと；（ｂ）混合物を、メチル化アルギニン誘導体の類似体および固体支持体または固体マトリックスを含むデバイスと接触させることと、（ｃ）固体支持体またはマトリックスを洗浄し、固体マトリックスに未結合のコンジュゲートを除去することと；固体支持体またはマトリックスと会合した標識の量を測定し、試料中のＳＤＭＡの存在または量を決定することとを含む。

さまざまな実施形態において、混合物は、捕捉試薬の一部としてのＳＤＭＡを有するデバイスおよびＳＤＭＡに対する親和性よりもアルギニン誘導体に対する親和性が低い抗ＳＤＭＡ抗体と接触させてもよい。例えば、アルギニン誘導体に対する抗ＳＤＭＡ抗体の親和性は、ＳＤＭＡに対する抗体の親和性の約２５％未満、約１０％未満、約５％未満、約１％未満、約０．１％未満、約０．０１％未満、または約０．００１％未満であってもよい。

更に別の態様において、本開示は、試料中の対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）を決定する方法を対象とする。方法は、（ａ）試料と、標識にコンジュゲートされた抗ＳＤＭＡ抗体を含む標識コンジュゲートとを含む混合物を形成することと；混合物を、本明細書に記載のメチル化アルギニン誘導体を含む捕捉試薬を含む固体マトリックスと接触させることと；（ｃ）固体マトリックスを洗浄し、固体マトリックスに未結合のコンジュゲートを除去することと；固体マトリックスと会合した標識の量を測定し、試料中のＳＤＭＡの存在または量を決定することとを含む。

更に、本開示は、本開示のデバイスと標識にコンジュゲートされた抗ＳＤＭＡ抗体を含むコンジュゲートとを含む、試料中のＳＤＭＡを決定するためのキットであって、捕捉試薬に対する抗ＳＤＭＡ抗体の親和性が、ＳＤＭＡに対する抗体の親和性の約２５％未満（例えば、約１０％、約５％、約１％、約０．１％、約０．０１％または約０．００１％）であるキットを対象とする。

更に別の態様において、本開示は、試料中のＳＤＭＡを決定するためのキットであって、メチル化アルギニン誘導体を含む捕捉試薬を含む固体マトリックスと標識にコンジュゲートされた抗ＳＤＭＡ抗体を含むコンジュゲートとを含み、捕捉試薬に対する抗ＳＤＭＡ抗体の親和性が、ＳＤＭＡに対する抗体の親和性の約２５％未満（例えば、約１０％、約５％、約１％、約０．１％、約０．０１％または約０．００１％）である、キットを対象とする。

更に、本開示は、血清試料または血漿試料中の対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）に対する免疫測定法における血清－血漿バイアスを減少させるかまたは除去する方法を対象とする。方法は、（ａ）試料と、標識にコンジュゲートされた抗ＳＤＭＡ抗体を含む標識コンジュゲートとを含む混合物を形成することと；（ｂ）混合物を、本明細書に記載のアルギニン誘導体を含む固相を含む固体マトリックスと接触させることであって、タンパク質が粒子に非共有結合しており、アルギニン誘導体に対する抗ＳＤＭＡ抗体の親和性が、ＳＤＭＡに対する抗体の親和性の約２５％未満（例えば、約１０％、約５％、約１％、約０．１％、約０．０１％または約０．００１％）であることと；（ｃ）固体マトリックスを洗浄し、固体マトリックスに未結合のコンジュゲートを除去することと；（ｄ）固体マトリックスと会合した標識の量を測定し、試料中のＳＤＭＡの存在または量を決定することとを含む。

別の態様において、本開示は、粒子に非共有結合しているＧ６ＰＤＨに共有結合しているメチル化アルギニン誘導体の類似体、例えばＮ－メチルアルギニン（ＭＭＡ）またはアシル化ＭＭＡを含む固相を対象とする。固相としては、多孔質マトリックスがあり得、それはハウジングに取り付けられていてもよい。抗ＳＤＭＡ抗体は、類似体に結合し得、抗体の類似体に対する親和性は、ＳＤＭＡに対するものよりも低い。例えば、類似体に対する抗ＳＤＭＡ抗体の親和性は、ＳＤＭＡに対する抗体の親和性の約２５％未満（例えば、約１０％、約５％、約１％、約０．１％、約０．０１％または約０．００１％）である。抗ＳＤＭＡ抗体は、標識されていてもよい。

別の態様において、本開示は、固体マトリックスに固相化されたメチル化アルギニン誘導体の類似体、例えばＮ－メチルアルギニン（ＭＭＡ）またはアシル化ＭＭＡを含む組成物であって、類似体が抗ＳＤＭＡ抗体と複合体を形成している組成物を対象とする。抗体は、溶液中のＳＤＭＡに対する親和性よりも、固相化類似体に対する親和性を有していてもよい。例えば、固相化類似体に対する抗ＳＤＭＡ抗体の親和性は、溶液中のＳＤＭＡに対する抗体の親和性の約２５％未満（例えば、約１０％、約５％、約１％、約０．１％、約０．０１％または約０．００１％）であってもよい。抗ＳＤＭＡ抗体は標識されていてもよい。類似体はタンパク質に共有結合していてもよい。タンパク質は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、オボアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、およびグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）のうちの１つまたは複数であってもよい。タンパク質は、固体マトリックスに非共有結合していてもよく、タンパク質は、粒子に非共有結合していてもよく、その粒子は固体マトリックスに非拡散的に結合している。

更なる態様において、本開示は、血清または血漿試料中の分析物に対する免疫測定法における血清－血漿バイアスを減少させるかまたは除去する方法を対象とする。方法は、（ａ）試料と、標識にコンジュゲートされた抗分析物抗体を含む標識コンジュゲートとを含む混合物を形成することと；（ｂ）混合物を、固体マトリックスであって、それに非拡散的に結合している粒子を含む固体マトリックスを含むデバイスと接触させることであって、粒子が、粒子に結合しているタンパク質に共有結合している分析物類似体を含む捕捉試薬を含み、分析物捕捉試薬に対する抗分析物抗体の親和性が、分析物に対する抗体の親和性の約２５％未満（例えば、約１０％、約５％、約１％、約０．１％、約０．０１％または約０．００１％）であることと；（ｃ）固相を洗浄し、未結合のコンジュゲートを除去することと；（ｄ）固相に会合した標識の量を測定し、試料中の分析物の存在または量を決定することとを含む。

更に別の態様において、本開示は、抗Ｔ４抗体および抗ＳＤＭＡ抗体を含む組成物を対象とする。抗Ｔ４抗体および抗ＳＤＭＡ抗体のうちの少なくとも１つは、ビオチン、ストレプトアビジン、アビジン、または検出可能な標識に結合していてもよい。抗体は凍結乾燥されていてもよい。組成物は、組成物を収容する容器を含むキットの一部であってもよい。キットは、洗浄液を更に含んでいてもよく、酵素基質を更に含んでいてもよい。

本開示を更に理解するために含まれる添付の図面は、本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を構成し、開示の実施形態を例示し、詳細な説明とともに本開示の原理を説明するために役立つ。本開示およびそれを行うことができるさまざまな方法を基本的に理解するために必要とされ得るよりも詳細に本開示の構造の詳細を示すための試みは行っていない。

固相としてのタンパク質Ｇ６ＰＤＨ－ＭＭＡ受動被覆ラテックス粒子および抗ＳＤＭＡ ＳＰＤＰ ＨＲＰコンジュゲートを使用して本開示の方法に従って用意されたＳＤＭＡ検量曲線を示す。 同上。 固相としてのＫＬＨ－ＭＭＡ被覆粒子および抗ＳＤＭＡ ＳＰＤＰ ＨＲＰコンジュゲートを使用して本開示の方法に従って用意されたＳＤＭＡ検量曲線を示す。 固相としてのＭＭＡ化学修飾粒子および抗ＳＤＭＡ ＳＰＤＰ ＨＲＰコンジュゲートを使用して本開示の方法に従って用意されたＳＤＭＡ検量曲線を示す。 Ｇ６ＰＤＨ－ＭＭＡ粒子固相および液体ＳＰＤＰコンジュゲートを使用して本開示の方法に従って用意された試料分析を示す。 ２０７匹のイヌ血清試料に対する本開示の方法によるＣａｔａｌｙｓｔ ＤＸ（商標）ＳＤＭＡアッセイとＬＣ－ＭＳアッセイとの相関を示す。 ８６匹のネコ血清試料に対する本開示の方法によるＣａｔａｌｙｓｔ ＤＸ（商標）ＳＤＭＡアッセイとＬＣ－ＭＳアッセイとの相関を示す。 ２０７匹のイヌ血清試料に対する本開示の方法によるＣａｔａｌｙｓｔ ＤＸ（商標）ＳＤＭＡアッセイとＥＭＩＴ（商標）アッセイとの相関を示す。 ８６匹のネコ血清試料に対する本開示の方法によるＣａｔａｌｙｓｔ ＤＸ（登録商標）ＳＤＭＡアッセイとＥＭＩＴアッセイとの相関を示す。 同一のイヌ血清および血漿試料に対する共有結合アミン－ＭＭＡ粒子または受動被覆Ｇ６ＰＤＨ－ＭＭＡ粒子のいずれかを用いた本開示の方法によるＣａｔａｌｙｓｔ ＤＸ（商標）ＳＤＭＡアッセイの結果を示す。 同一のネコ血清および血漿試料に対する共有結合アミン－ＭＭＡ粒子または受動被覆Ｇ６ＰＤＨ－ＭＭＡ粒子のいずれかを用いた本開示の方法によるＣａｔａｌｙｓｔ ＤＸ（商標）ＳＤＭＡアッセイの結果を示す。 ２０対の血清および血漿試料に関して行われた、Ｇ６ＰＤＨ－ＭＭＡ粒子またはオボアルブミン－ＭＭＡ粒子を用いた本開示の方法によるＣａｔａｌｙｓｔ ＤＸ（商標）ＳＤＭＡアッセイの結果を示す。 ２０対の血清および血漿試料に関して行われた、オボアルブミン－ＭＭＡ粒子を用いた本開示の方法によるＣａｔａｌｙｓｔ ＤＸ（商標）ＳＤＭＡアッセイの結果を示す。 受動被覆粒子（Ｇ６ＰＤＨ－ＭＭＡ、Ｇ６ＰＤＨ－ＭＭＡまたはオボアルブミン－ＭＭＡで被覆された）の安定性を評価するための本開示によるアッセイの結果を示す。 １Ｍ ＮａＣｌを伴ってまたは伴わずにインキュベートした後のＧ６ＰＤＨ－ＭＭＡ受動被覆粒子を使用したＣＡＴＡＬＹＳＴ ＤＸ（商標）ＳＤＭＡ検量曲線を示す。 ＴＷＥＥＮ（商標）２０界面活性剤を伴ってまたは伴わずにインキュベートした後のＧ６ＰＤＨ－ＭＭＡ受動被覆粒子を使用したＳＤＭＡ検量曲線を示す。 スライド膜上に直接被覆されたタンパク質ＫＬＨ－ＭＭＡコンジュゲート（実施例２）を使用したＳＤＭＡ検量プロットを示す。

さまざまな態様において、本開示は、試料、例えば動物からの生物学的試料中の対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）を検出するためのデバイス、試薬、キットおよび方法を提供する。方法は、免疫測定法形式、例えば競合免疫測定法を使用することによって試料中のＳＤＭＡの存在または量を検出することを含む。アッセイは、ＳＤＭＡに対して特異的であり、非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）、Ｌ－アルギニンおよびＮ－メチルアルギニンを含む他のアルギニン誘導体に対する親和性が低い、ＳＤＭＡに対する抗体の使用を含む。

本開示を更に詳細に説明する前に、いくつかの用語を定義する。

Ａｂは抗体である。

アルギニンの構造は

である。

Ｌ－アルギニンはアルギニンのＬ－異性体である。

アルギニン誘導体としては、これらに限定されるものではないが、メチル化アルギニン誘導体、アシル化アルギニンおよび誘導体、ならびに以下の構造を有する化合物

（式中、ｎは、整数０、２、または３である）が挙げられる。いくつかの実施形態において、アルギニン誘導体には、定義上の目的で、ＳＤＭＡ、ＡＤＭＡおよびＮ－ＭＭＡのうちの１つまたは複数を含まないあるクラスのアルギニン誘導体を提供するために、ＳＤＭＡ、ＡＤＭＡ、および／またはＮ－ＭＭＡが含まれない。

ＡＤＭＡは非対称性ジメチルアルギニンである。ＡＤＭＡの構造は

である。

Ｎ－ＭＭＡはＮ－モノメチルアルギニン、または単にＮ－メチルアルギニンであり、これは本明細書において単に「ＭＭＡ」とも称する。Ｎ－モノメチルアルギニンの構造は

である。

ＳＤＭＡは対称性ジメチルアルギニンである。ＳＤＭＡの構造は

である。
遊離ＳＤＭＡは、ポリペプチド鎖の一部ではないＳＤＭＡおよびＳＤＭＡ塩を指す。１つまたは複数のＳＤＭＡのアミノ酸残基はポリペプチドに存在していてもよい。

本明細書において使用する「メチル化アルギニン誘導体」という用語は、以下の構造を有する化合物

（式中、ｎは、整数０、１、２または３であり；Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、およびＲ_６はそれぞれ独立して、水素またはメチルであり、ただし、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、およびＲ_６のうちの少なくとも１つはメチルである）を指す。メチル化アルギニン誘導体の例としては、ＭＭＡ、ＳＤＭＡ、およびＡＤＭＡがあるが、メチル化誘導体のある特定のサブセットは、定義上の目的で、これらの化合物のうちの１つまたは複数を含まない。

本明細書において使用する「塩」という用語は、酸と化合物の塩基官能基との間に形成される塩を意味する。例示の塩としては、これらに限定されるものではないが、硫酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、塩化物塩、臭化物塩、ヨウ化物塩、硝酸塩、リン酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルカロン酸塩、サッカリン酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、および塩が挙げられる。「塩」という用語は、酸性官能基、例えばカルボン酸官能基を有する化合物と無機または有機塩基との間に形成される塩も指す。好適な塩基としては、これらに限定されるものではないが、アルカリ金属、例えばナトリウム、カリウム、およびリチウムの水酸化物；アルカリ土類金属、例えばカルシウムおよびマグネシウムの水酸化物；他の金属、例えばアルミニウムおよび亜鉛の水酸化物；アンモニア、および有機アミンが挙げられる。

本明細書において使用する「類似体」という用語は、１つまたは複数の個々の原子が、分析物を、別の部分、例えば標識または固体マトリックスに結合させる手段を与える異なる原子でまたは異なる官能基で置き換えられている化合物を一般的に指す。例えば、分析物を別の部分に結合させるための手段は、リンカーであってもよい。類似体は、分析物と受容体に関して競合してもよい。特に、分析物類似体は、抗体に分析物と類似する様式で結合することができる。分析物のマトリックスまたは別の分子への共有結合は、分析物類似体の使用を介して達成されることが多いため、マトリックスまたは別の分子に結合したまたはコンジュゲートした単なる「分析物」の本明細書における開示は、免疫測定法の技術分野における当業者によって容易に理解されるであろうような、共有結合またはコンジュゲートを達成するための分析物類似体の使用を含む。例えば、ＭＭＡのさまざまな類似体は、以下の例で開示する。

分析物の「誘導体」は、受容体に関して分析物と競合することができる分析物の修飾形態であって、修飾が、分析物を別の部分、例えば標識または固体マトリックスに結合させるための手段を与えない官能基を付加または修飾している修飾形態を指す。２つの分子は、互いの誘導体であってもよく、その結果、分子のいずれかは、場合に応じて分析物または分析物誘導体であってもよい。例えば、アルギニン、ＳＤＭＡ、ＭＭＡおよびＬ－アルギニンは全て互いの誘導体であり、分子間の違いは、異性、または１つもしくは２つのメチル基の存在もしくは位置である。

本明細書において使用する「抗体」という用語は、抗原への曝露に応答してＢリンパ球細胞によって産生され、その抗原に特異的に結合する糖タンパク質を一般的に指す。「抗体」という用語は、その広範な意味で使用され、所望の生物学的活性を示す限りは、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特性抗体（例えば二重特異性抗体）、および抗体断片を特に含む。

本明細書において使用する「抗体断片」という用語は、完全長抗体の一部、一般的にその抗原結合ドメインまたは可変ドメインを指す。特に、例えば、抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、およびＦｖ断片；ダイアボディ；直鎖状抗体（ｌｉｎｅａｒ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）；単鎖抗体分子、および抗体断片からの多重特性抗体が挙げられる。

本明細書において使用する「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体を一般的に指し、すなわち、集団を含め、個々の抗体は同一である。モノクローナル抗体は非常に特異的であり、単一の抗原部位を対象とする。異なるエピトープを対象とする異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一のエピトープを対象とする。「モノクローナル」という修飾語句は、抗体の特徴を指すにすぎず、任意の特定の方法による抗体産生を必要とするとは解釈されない。特に、例えば、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ方法論によって作製されてもよく、または組換えＤＮＡ法によって作製されてもよく、または既知の技術を使用してファージ抗体ライブラリから単離してもよい。

本明細書において使用する「抗ＳＤＭＡ抗体」、「抗ＳＤＭＡ抗体部分」または「抗ＳＤＭＡ抗体断片」および／または「抗ＳＤＭＡ抗体バリアント」などは、免疫グロブリン分子のうちの少なくとも一部を含む分子を含む任意のタンパク質またはペプチドを含み、例えば、これらに限定されないが、重鎖または軽鎖定常領域、フレームワーク領域、またはこれらの任意の部分の１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。本明細書において使用する抗ＳＤＭＡ抗体は、米国特許第８，４８１，６９０号に従って調製してもよく、その出願は、その内容全体が本明細書に組み込まれるものとする。

本明細書において使用する「抗原」という用語は、適切な条件下で、抗原に特異的な抗体と反応することが可能である物質を一般的に指す。

本明細書において使用する「分析物」という用語は、検出されるおよび／または測定される試料中の物質または一連の物質を一般的に指す。本開示の例示の態様によれば、ＳＤＭＡまたはＳＤＭＡの塩は、分析物の例と考えられる。

本明細書において使用する「生物学的試料」という用語は、ヒトまたは動物からの組織または流体の試料を一般的に指し、これらに限定されないが、全血、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、腹部液（腹水）、外表皮膚、気道、腸管、尿生殖路、涙液、唾液、尿、血液細胞、腫瘍、臓器、組織、およびｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞培養物構成成分の試料を含む。多くのそのような試料は、分析の前に処理を必要とする。試料には、未加工の試料および／または処理された試料の両方が含まれる。

本明細書において使用する「免疫測定法」という用語は、測定可能な応答を生成するための抗体および抗原複合体を用いる試験を一般的に指す。「抗体：抗原複合体」は、「免疫複合体」という用語と相互互換的に使用してもよい。免疫測定法としては、一般的に、非競合免疫測定法、競合免疫測定法、均一系免疫測定法、および不均一系免疫測定法がある。「競合免疫測定法」では、被検試料中の非標識の分析物（または抗原）を、免疫測定法において標識抗原と競合するその能力によって測定する。抗体上の結合部位がすでに占有されているために、非標識抗原は、標識抗原の結合能力をブロックする。「競合免疫測定法」では、被検試料に存在する抗原の量は、標識から生成されるシグナルの量に逆相関する。反対に、「サンドイッチ」免疫測定法としても知られる「非競合免疫測定法」では、分析物は、２つの高度に特異的な抗体試薬の間に結合させて複合体を形成し、抗原の量は、複合体と関連付くシグナルの量と直接的に比例する。結合した抗体：抗原複合体の分離を必要とする免疫測定法は、「不均一系免疫測定法」と一般的に称され、抗体：抗原複合体の分離を必要としない免疫測定法は、「均一系免疫測定法」と一般的に称される。当業者であれば、さまざまな免疫測定法形式を容易に理解するであろう。

本明細書において使用する「免疫複合体」という用語は、補体結合の有無にかかわらず抗原および抗体分子の結合によって形成される複合体を一般的に指す。抗体または抗原のいずれかが標識された場合、標識は、抗原と抗体との間の結合の結果として免疫複合体と会合する。その結果、抗体が標識された場合、標識は結合の結果として抗原と会合するようになる。同様に、抗原が標識された場合（例えば、標識を有する分析物類似体）、標識は、抗原と抗体との間の結合の結果として抗体と会合するようになる。

本明細書において使用する「標識」という用語は、本開示の抗体または類似体に直接的にまたは間接的に（例えば、共有または非共有手段を介して、単独でまたはカプセル化され）コンジュゲートすることができる検出可能な化合物を指す。標識は、それ自体（例えば、放射性同位体標識、化学発光色素、電気化学標識、金属キレート、ラテックス粒子、または蛍光標識）によって検出可能であってもよいか、または酵素標識の場合、検出可能な基質化合物または組成物の化学変化を触媒してもよい（例えば、酵素、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど）。現在の開示で用いられる標識は、これらに限定されるものではないが：アルカリホスファターゼ；グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ（「Ｇ６ＰＤＨ」）；ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）；化学発光剤（Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｒ）、例えばイソルミノール、蛍光剤、例えばフルオロセインおよびローダミン化合物；リボザイム；および色素であってもよい。標識は、それ自体が検出可能であってもよい（例えば、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、ジゴキシゲニン、マルトース、オリゴヒスチジン、２，４－ジニトロベンゼン、ヒ酸フェニル（ｐｈｅｎｙｌａｒｓｅｎａｔｅ）、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡなど）特異的結合分子でもあり得る。標識を利用すると、シグナルが産生され、これは、手段、例えば電磁放射の検出または直接可視化によって検出することができるし、測定してもよい。

本明細書において使用する「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸配列を有する分子を一般的に指す。この用語は、タンパク質、融合タンパク質、オリゴペプチド、環式ペプチド、およびポリペプチド誘導体を含む。抗体および抗体誘導体は上記の個別の項で検討しているが、抗体および抗体誘導体は、開示のために、ポリペプチドおよびポリペプチド誘導体のサブクラスとして扱われる。

本明細書において使用する「固体支持体」、「固相」および「固体マトリックス」という用語は、本開示の結合相手が付着することができる非水性マトリックスを指す。固体支持体、固相、および固体マトリックスの例としては、ガラス（例えば、制御多孔ガラス）、合成および天然ポリマー、多糖（例えばアガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコールおよびシリコーンで部分的もしくは全体的に形成された支持体、クロマトグラフィーストリップ、マイクロタイターポリスチレンプレート、または結合した結合相手を未結合の材料から洗浄またはもしくは分離できるようにするであろう任意の他の物質がある。いくつかの実施形態において、固体支持体、相およびマトリックスは多孔質とすることができる。ある特定の実施形態において、用途によっては、固体支持体、固相および固体マトリックスはアッセイプレートのウェルとすることができる。固体支持体、固相および固体マトリックスとしては、米国特許出願公開第２０１４／０３１５２１６号に記載されているような分析試験用スライドがあり得、この出願は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする。

本開示に関連する「粒子（ｐａｒｔｉｃｌｅ）」または「粒子（ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）」という用語は、例えば、ラテックス、ポリスチレンの粒子、または他の支持体材料、例えばシリカ、アガロース、セラミック、ガラス、ポリアクリルアミド、ポリメタクリル酸メチル、カルボキシレート修飾ラテックス、メラミン、およびセファロースの粒子を含む。粒子は約０．１ミクロンから約１００ミクロンまでサイズが異なり、例えば、約０．１、０．５、１．０、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００ミクロンであろう。特に、有用な市販の材料としては、カルボキシレート修飾ラテックス、臭化シアン活性化セファロースビーズ、溶融シリカ粒子、イソチオシアネートガラス、ポリスチレン、およびカルボキシレート単分散マイクロスフェアがある。粒子は、磁性または常磁性体であってもよい。本発明に使用するために好適な粒子は、他の物質、例えば誘導体、リンカー分子またはタンパク質に付着することができる。他の物質に付着するための粒子の能力は、粒子材料ならびに任意の表面修飾または粒子に付加される官能基に起因する場合がある。粒子は、本明細書に記載のタンパク質、リンカー分子または誘導体を共有結合または非共有結合するために官能基化することができるかまたは官能基化されるようにすることができる。好適な官能基としては、例えば、アミン、ビオチン、ストレプトアビジン、アビジン、タンパク質Ａ、スルフヒドリル、ヒドロキシルおよびカルボキシルがある。

「受容体」は、分子の特定の空間性および極性の構成、例えばエピトープまたは決定部位を認識することができる任意の化合物または組成物を指す。例示の受容体としては、抗体、Ｆａｂ断片などがある。

本明細書において使用する「交差反応性」という用語は、抗体の個々の抗原結合部位が１つを超える抗原決定基と反応するための能力、または抗体分子の集団が１つを超える抗原と反応するための能力を一般的に指す。一般的に、交差反応は、（ｉ）交差反応抗原が、免疫抗原と共通のエピトープを共有するか、または（ｉｉ）免疫抗原上のものと構造的に類似しているエピトープを有する（多重特異性）ために生じる。

「結合特異性」または「特異的結合」は、第２の分子、例えば、ポリペプチド、およびポリクローナルもしくはモノクローナル抗体、または抗体断片（例えばＦｖ、一本鎖Ｆｖ、Ｆａｂ’、またはＦ（ａｂ’）２断片）に対する、ポリペプチドに特異的な第１の分子の実質的な認識を指す。例えば、本明細書において使用する「特異性」は、一般的に個々の抗体結合部位が１つの抗原決定基のみと反応するための能力、または抗体分子の集団が１つの抗原のみと反応するための能力を指す。一般的に、抗原－抗体反応では、高度の特異性が存在する。抗体は、（ｉ）抗原の一次構造、（ｉｉ）抗原の異性体形態、および（ｉｉｉ）抗原の二次および三次構造における違いを識別することができる。高特異性を示す抗体－抗原反応は交差反応性が低い。

「実質的に結合している」または「実質的な結合」は、特定のアッセイ条件下でのアッセイ混合物における分子間の特異的結合または認識の量を指す。その最も広範な態様において、実質的な結合は、第１の分子が第２の分子に結合できないかまたはそれを認識できないことと、第１の分子が第３の分子に結合できるかまたはそれを認識できることとの間の差であって、意味があるアッセイを可能にし、分子の相対濃度、ならびにインキュベート時間および温度を含む一連の特定のアッセイ条件下で特異的結合を区別するのに十分であるような差に関連する。

別の態様において、第１の分子が、一連の特定のアッセイ条件で第３の分子に対して示す反応性の２５％未満、１０％未満、５％未満または１％未満の第２の分子に対する反応性を示す場合、１つの分子は、交差反応性の意味においては、別の分子を実質的に結合または認識できない。特異的結合は、多数の広範囲に既知の方法、例えば免疫組織化学的アッセイ、酸素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、またはウエスタンブロットアッセイを使用して試験することができる。

その標的に対する抗体に対する親和性は、抗体および／または標的の環境によって影響を受ける場合がある。例えば、どちらかが固相に結合するかまたは別の分子にコンジュゲートする場合、分子間の親和性は、溶液中の２つの分子間のものとは異なっていることがある。ある特定の実施形態において、本明細書における本開示の方法は、分析物が溶液中にある場合の分析物に対する抗分析物抗体の親和性と、分析物が固相に結合した場合の親和性との違いを利用する。更に、さまざまな実施形態において、本開示の方法は、分析物に対する抗体の親和性と分析物誘導体に対する抗体の親和性との違いを利用する。例えば、抗分析物抗体は分析物誘導体に実質的に結合することはできないが、抗体は、十分な反応性で誘導体に結合する場合があり、その結果、抗体のおよび誘導体の結合親和性が低くても、本開示の方法において有用であり得る。例えば、低結合親和性（例えば、抗分析物抗体が、分析物に対する抗体の結合反応性の２５％未満で分析物誘導体に結合する）は、抗体および分析物が溶液中にあり、誘導体が固相に結合している場合に有用に使用することができる。

次に本開示のさまざまな態様に注目すると、本開示は、生物学的試料中のある量の遊離ＳＤＭＡの存在を検出するための免疫学的方法、デバイス、試薬、およびキットを対象とする。方法には、ＳＤＭＡまたはＳＤＭＡ類似体のうちの１つまたは複数を含む対照、キャリブレーターまたは標準が含まれる場合がある。特に方法は、当業者に周知の免疫測定法技術を使用して達成してもよく、方法としては、これらに限定されないが、マイクロプレート、多孔質マトリックス、フロースルー固相マトリックス、およびラテラルフローデバイスの使用がある。ＳＤＭＡを検出するために試料を得る動物対象としては、ヒトおよび非ヒト動物対象（例えばコンパニオンアニマル、家畜など）がある。ＳＤＭＡの存在または量と関連する病態の決定は、ヒトと非ヒト対象の両方に対して行うことができる。

特定の態様において、開示の例示のデバイスには、固体マトリックスであって、それに非拡散的に結合している粒子を有する固体マトリックスが含まれ、粒子は、それに共有または受動（非共有）結合している捕捉試薬を含む。捕捉試薬には、粒子に結合しているタンパク質に共有結合している分析物または分析物誘導体が含まれる。マトリックスは、多孔質マトリックスであってもよく、取り扱いを容易にするためにかつ自動分析装置で使用するためにカートリッジまたはハウジングに配置されていてもよい。米国特許出願公開第２０１４／０３１５２１６号を参照されたい。

分析物がＳＤＭＡである場合、誘導体としては、アルギニン誘導体、例えば非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）、Ｌ－アルギニン、Ｎ－メチルアルギニン（ＭＭＡ）、アシル化ＡＤＭＡ、アシル化Ｌ－アルギニン、アシル化ＭＭＡ、および以下の式

（式中、ｎは、整数０、１、２、または３である）を有する化合物がある。非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）、Ｌ－アルギニン、Ｎ－メチルアルギニン（ＭＭＡ）、アシル化ＡＤＭＡ、アシル化Ｌ－アルギニン、およびアシル化ＭＭＡは、更に誘導体化してもよい。１つの態様において、アルギニン誘導体は、誘導体が固体支持体に固相化された場合に、抗ＳＤＭＡ抗体または抗アシル－ＳＤＭＡ抗体に対する親和性を有する。アルギニン誘導体は、それ自体がＳＤＭＡまたはアシル－ＳＤＭＡであってもよい。またはいくつかの実施形態において、ＳＤＭＡ、ＡＤＭＡ、Ｎ－ＭＭＡおよびこれらのアシル化形態のうちの１つまたは複数はアルギニン誘導体のグループから特に除外する。

さまざまなタンパク質を、分析物または分析物誘導体を固相に結合するために使用することができる。特定の例としては、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、オボアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、およびグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）がある。Ｇ６ＰＤＨは酵素標識として周知であるが、この文脈では、分析物または誘導体を固相に結合させるために機能する。それは適切な基質を使用しない限りは標識として機能せず、本明細書において更に述べるアッセイでは標識としてＧ６ＰＤＨ（ＨＲＰなど）以外の分子を使用することによって、本開示の方法において回避することができる。Ｇ６ＰＤＨは、真核生物、原核生物、酵母または組換え発現由来であってもよい。

分析物誘導体または類似体が結合するタンパク質の全ての列挙、例えばＢＳＡ、ＫＬＨ、オボアルブミン、またはＧ６ＰＤＨは、タンパク質のバリアント、アイソフォーム、断片および変異体も含む。バリアント、アイソフォーム、断片および変異体は、分析物、類似体または誘導体に結合するかまたはコンジュゲートするためのおよび／または固体支持体に結合するための能力を保持する。タンパク質が酵素である場合、タンパク質のバリアント、アイソフォーム、断片または変異体は、酵素活性を保持していてもしていなくてもよい。例えば、さまざまなアミノ酸置換基を有するＧ６ＰＤＨの突然変異形態は、米国特許第６，４５５，２８８号に記載されており、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする。

タンパク質が粒子に共有結合していない場合、タンパク質の粒子への非共有結合は、ＢＳＡ、オボアルブミンまたはＫＬＨの非共有結合よりも、界面活性剤または高塩濃度に耐性を示し得る。例えば、Ｇ６ＰＤＨのポリスチレン粒子に対する非共有結合は、ＢＳＡ、オボアルブミンまたはＫＬＨの結合よりも、界面活性剤および高塩濃度に耐性を示す。さまざまな反応条件下でのタンパク質の粒子への結合の耐性は、当業者に周知の方法に従って試験してもよい。固相アッセイ形式は、通常使用される結合アッセイ技術である。多数のアッセイデバイスおよび手順が存在し、分析物の存在は、分析物がコンジュゲートおよび／または固相化された相補的結合部材に結合することによって示される。１つの特定の態様において、固相化結合部材（例えば、アルギニン誘導体またはその類似体）は、固相、例えば反応ウェル、ディップスティック、テストストリップ、フロースルーパッド、紙、ファイバーマトリックスまたは他の好適な固相材料にアッセイ中に結合しているかまたは結合するようになる。試料中の遊離ＳＤＭＡと抗ＳＤＭＡ抗体結合との間の反応は、試料と、ある量の、標識にコンジュゲートした抗体とを合わせることによって決定する。試料およびコンジュゲートの混合物を固相と接触させた後、混合物および固相をインキュベートし、固相化アルギニン誘導体またはその類似体と抗ＳＤＭＡ抗体との間に結合させる。インキュベート後、未結合の反応物を固相から除去する。抗体と誘導体または類似体との結合を介して固相に会合するようになる標識の量を測定する。固相に会合した標識の量は、試料中の遊離ＳＤＭＡの量に反比例する。

アルギニン誘導体またはその類似体のデバイスまたは固体支持体上での固相化は、誘導体または類似体が、試料、希釈剤および／または洗浄手順によって洗い流されることがないように行う。

別の態様において、本開示は、混合物を固体支持体に適用する前に被検試料と混合することができる１つまたは複数の標識された抗体を含む。この場合、アルギニン誘導体またはその類似体は、類似体が試料、希釈剤および／または洗浄手順によって洗い流されることがないように固体支持体に結合することができる。試料中の標識された抗体は、試料中のＳＤＭＡに結合し、その結果、固体支持体上の類似体と結合することはできない。混合物を固体支持体に適用し、適切にインキュベートした後、混合物を固体支持体から洗浄する。試料ＳＤＭＡに未結合の抗体は、固体支持体上のアルギニン誘導体またはその類似体に結合するようになるであろう。試料中のＳＤＭＡの存在または量は、ＳＤＭＡ類似体に結合するようになった抗体の量に反比例する。抗体上の標識と関連付くシグナルは適切な方法によって測定することができる。標識の測定において使用するための例示的なアナライザーは、ＣＡＴＡＬＹＳＴ ＤＸ（商標）システム（ＩＤＥＸＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）であり、これは、米国特許出願公開第２０１４／０３１５２１６号に記載のアナライザーに取り付けられるカートリッジまたはハウジングにおいて単層固相と組み合わせることができる。

より詳細には、本開示の方法の例には、試料と、標識にコンジュゲートされた抗ＳＤＭＡ抗体を含む標識コンジュゲートとを含む混合物を形成することが含まれる。抗ＳＤＭＡ抗体および標識の抗体へのコンジュゲートは、例えば米国特許第８，４８１，６９０号に記載されている。混合物は、固体マトリックスであって、それに非拡散的に結合している粒子を有する固体マトリックスを含む開示のデバイスであって、粒子が、それに共有または受動（非共有）結合している捕捉試薬を含むデバイスと接触させる。本明細書に記載のように、捕捉試薬は、粒子に結合しているタンパク質に共有結合しているＳＤＭＡまたは誘導体（例えばアルギニン誘導体）を含む。固体支持体を洗浄し、固体支持体に未結合のコンジュゲートを除去する。固体支持体と会合した標識の量を測定し、試料中のＳＤＭＡの存在または量を決定する。

本明細書に記載のＳＤＭＡ自体は、タンパク質へのコンジュゲートおよびタンパク質の粒子への結合を介して固相に結合していてもよい。ＳＤＭＡのタンパク質へのコンジュゲートの例は、米国特許出願公開第２０１６／０２４５８０１号に示されており、この出願は、その内容全体が本明細書に組み込まれるものとする。他の実施形態において、ＳＤＭＡの誘導体（例えばアルギニン誘導体、メチル化アルギニン誘導体）をＳＤＭＡの代わりに使用することができ、抗ＳＤＭＡ抗体の誘導体に対する親和性はＳＤＭＡに対する親和性よりも低い。特定の例では、抗ＳＤＭＡ抗体の誘導体に対する親和性は、ＳＤＭＡに対する抗体の親和性の約２５％未満、１０％未満、５％未満、１％未満、０．１％未満、０．０１％未満または０．００１％未満である。

マトリックス材料としては、合成または天然繊維（例えば、ガラスまたはセルロース系材料または熱可塑性ポリマー、例えばポリエチレン、ポリプロピレン、またはポリエステル）から構成される繊維状マット；微粒子材料から構成される焼結構造（例えば、ガラスまたはさまざまな熱可塑性ポリマー）；またはニトロセルロース、ナイロン、ポリスルホンなど（多くの場合、実際は合成物質）から構成されるキャスト膜フィルムがある。マトリックスは、焼結した、多孔質ポリエチレンとして通常既知のポリエチレン微粒子、例えば焼結ポリエチレンビーズからも構成される場合がある。そのような材料の密度は、０．３５から０．５５グラム毎立方センチメートルの間、孔径は５から４０ミクロンの間、空隙容量は４０から６０パーセントの間とすることができる。架橋または超高分子量ポリエチレンから構成される微粒子ポリエチレンも、使用してもよい。例示的なマトリックスとしては、１０～１５ミクロンの多孔質ポリエチレンであるＣｈｒｏｍｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製ＦＮ＃３８－２４４－１（Ｂｒｏｏｋｌｙｎ、Ｎ．Ｙ．）およびＷｈａｔｍａｎ，Ｉｎｃ．、ＵＳＡから入手可能なＦＵＳＩＯＮ ５（商標）マトリックスがある。

特異的結合アッセイにおける試薬含浸テストストリップの使用も周知である。そのような手順では、被検試料をテストストリップの一部に適用し、ストリップ材料を介して移動または吸い上げる。したがって、検出または測定されることになる分析物が材料を介してまたはそれに沿って通過し、場合により被検試料自体であっても個別に添加された溶液であってもよい溶出溶媒が用いられる。分析物は、テストストリップの捕捉または検出ゾーンに移動するが、そこには抗分析物抗体に結合することができる分析物類似体または他の化合物は固相化されている。抗体が検出ゾーンで結合するようになる程度は、抗体にコンジュゲートされた標識を用いて決定することができ、その場所でコンジュゲートは試料と混合される。１つの実施形態において、抗体に結合することができる類似体は、異なる位置で固体支持体に固相化される。試料コンジュゲート混合物を添加した後、当技術分野において既知の任意の手段によって固体支持体上のＳＤＭＡ－抗体複合体を検出することができる。例えば、米国特許第５，７２６，０１０号では、ラテラルフローデバイスであるＳＮＡＰ（商標）ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｄｅｖｉｃｅ（ＩＤＥＸＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の例が記載されており、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれるものとし、本開示において有用である。

他の検出技術では、本明細書に記載の捕捉試薬用に使用する粒子とは無関係な磁性粒子またはマイクロビーズが用いられる。例えば、超常磁性酸化鉄含有ポリマービーズは、例えば捕捉試薬の一部として粒子を使用することによって、分析物または分析物に対する誘導体に会合させることができる。固相用に使用するビーズは、溶液から磁気的に単離するかまたは分離することができる。一度単離を行うと、光学的に直接かカメラを用いるかを問わず標識を観察することを含む他の試験を行うことができる。

更なる態様において、本開示は、本明細書における開示によるＳＤＭＡを決定するための方法に使用するためのアルギニン誘導体およびその類似体を使用した捕捉試薬に関する。特に本開示は、チオール基、ヒドロキシル基、アミノ基、またはカルボキシレート基が誘導体を別の分子（コンジュゲート標的）、例えば活性化タンパク質に連結できるようにし、コンジュゲートを形成する、アルギニン誘導体のチオール含有、ヒドロキシル含有、アミノ含有、およびカルボキシレート含有類似体に関する。本開示の類似体は、誘導体をコンジュゲート標的、例えばタンパク質、ポリペプチド、検出可能な標識、固体支持体などに連結できるようにする。

本開示の１つの態様は、粒子に結合しているメチル化アルギニン誘導体、例えばＮ－メチルアルギニン（ＭＭＡ）またはアシル化ＭＭＡを含むアルギニン誘導体の類似体を含む捕捉試薬に関する。１つの実施形態において、類似体は、類似体が粒子に結合しているタンパク質に共有結合するようにリンカーを介して粒子に結合している。タンパク質は、粒子に共有結合していても非共有（受動）結合していてもよい。タンパク質は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、オボアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、およびグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）のうちの少なくとも１つであってもよい。類似体の粒子への結合は、受動的かまたは共有結合的であり、粒子を使用して類似体を固相に固定すると、類似体が直接結合している固相の使用と比較して、アッセイの直線範囲が増加する。この実施形態は、本明細書において更に記載し、例示するような試料バイアスの減少または消失ももたらす。

開示の捕捉試薬の１つの例において、リンカーには、以下の構造

が含まれる。

ＭＭＡがこのリンカーを用いて粒子に結合している場合、捕捉試薬は以下の構造

を有する。

更に、以下のＭＭＡ類似体は、例えば捕捉試薬において使用するためにタンパク質にリンクおよび結合を与えるような以下の構造

（式中、ｘおよびｙは、１から５の範囲の整数である）を有していてもよい。

１つの実施形態によれば、本開示のＭＭＡ類似体は、以下の一般式

（式中、Ｒ_１は、チオール（または保護されたチオール）、ヒドロキシル（または保護されたヒドロキシル）、アミノ（または保護されたアミノ）基、またはカルボキシレート（カルボン酸を含む）もしくは保護されたカルボキシレート基であってもよい）を有する。

好適なチオール、ヒドロキシル、アミノ、およびカルボキシレート保護基は当業者に既知であり、例えばＴ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅら、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第３版（１９９９年）に記載されているものである。

１つの特定の実施形態において、本開示は、式（１）のＭＭＡ類似体

またはその塩を対象とする。式（１）の化合物は、適切な「チオール反応性部位」、すなわちチオール基と反応する部位を含むコンジュゲート標的と反応することができる利用可能なチオールを提供する。例えば、マレイミド、ハロゲン化アルキルおよびアリール、ならびにアルファ－ハロアシルは、チオールと反応し、チオ－エーテルを形成することができる例示のチオール反応性部位である。同様に、ピリジルジスルフィドはチオールと反応し、混合ジスルフィドを形成することができる。

別の実施形態において、Ｒ_１はＸ－Ｒ_２であり、Ｘは－Ｓ－、－Ｏ－、－Ｎ－、または－ＣＯＯ－であり、Ｒ_２は、チオール、ヒドロキシル、アミノ、またはカルボキシレート反応性基を有する標識である。

１つの実施形態において、Ｒ_１はＸ－Ｒ_２であり、Ｘは、－Ｓ－、－Ｏ－、－Ｎ－、または－ＣＯＯ－であり、およびＲ_２は、チオール、ヒドロキシル、アミノ、またはカルボキシレート反応性基を含むように官能基化されているタンパク質である。

１つの実施形態において、ＭＭＡ類似体は、マレイミド活性化タンパク質、例えばマレイミド活性化キーホールリンペットタンパク質（ＫＬＨ）またはマレイミド活性化ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）にコンジュゲートしている。

１つの実施形態において、式（１）の化合物は、マレイミド活性化タンパク質、例えばマレイミド活性化キーホールリンペットタンパク質（ＫＬＨ）またはマレイミド活性化ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）にコンジュゲートしている。

したがって、特定の実施形態において、本開示は、式（１）の化合物および式

を有するマレイミド活性化タンパク質のコンジュゲートに関する。

典型的には、ｍは５より大きい。しかし、ｍに関する値は変数である。例えば、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから市販されているマレイミド活性化ＢＳＡでは、ｍはタンパク質毎に約１５個のマレイミド基であり；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから市販されているマレイミド活性化ＫＬＨでは、ｍはタンパク質毎に約８０個のマレイミド基であり；Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｅｒｃｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬから市販されているマレイミド活性化ＢＳＡでは、ｍは、タンパク質毎に約１５から約２５個の範囲のマレイミド基であり；Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｅｒｃｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓから市販されているマレイミド活性化ＫＬＨでは、ｍは、タンパク質毎に約４００個を超えるマレイミド基であり；Ａ．Ｇ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｏｆ Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから市販されているマレイミド活性化ＫＬＨでは、ｍは、タンパク質毎に約１５０から約３００個の範囲のマレイミド基である。一般的に、ｍは、免疫原性タンパク質に存在する利用可能なアミン基の数によって制限される。利用可能なアミンの数は、免疫原性タンパク質のポリアミンへのコンジュゲートによって増加させることができる。

１つの実施形態において、タンパク質はＢＳＡであり、ｍは約５を超える。１つの実施形態において、タンパク質はＢＳＡであり、ｍは約１０を超える。１つの実施形態において、タンパク質はＢＳＡであり、ｍは約２５を超える。１つの実施形態において、タンパク質はＢＳＡであり、ｍは約５０を超える。１つの実施形態において、タンパク質はＢＳＡであり、ｍは約７５を超える。１つの実施形態において、タンパク質はＢＳＡであり、ｍは約５から約８０の範囲である。１つの実施形態において、タンパク質はＢＳＡであり、ｍは約７５を超える。１つの実施形態において、タンパク質はＢＳＡであり、ｍは約１０から約８０の範囲である。１つの実施形態において、タンパク質はＢＳＡであり、ｍは約７５を超える。１つの実施形態において、タンパク質はＢＳＡであり、ｍは約２０から約８０の範囲である。１つの実施形態において、タンパク質はＢＳＡであり、ｍは約７５を超える。１つの実施形態において、タンパク質はＢＳＡであり、ｍは約３０から約８０の範囲である。

１つの実施形態において、タンパク質はＫＬＨであり、ｍは約５を超える。１つの実施形態において、タンパク質はＫＬＨであり、ｍは約５０を超える。１つの実施形態において、タンパク質はＫＬＨであり、ｍは約１００を超える。１つの実施形態において、タンパク質はＫＬＨであり、ｍは約２００を超える。１つの実施形態において、タンパク質はＫＬＨであり、ｍは約３００を超える。１つの実施形態において、タンパク質はＫＬＨであり、ｍは約４００を超える。１つの実施形態において、タンパク質はＫＬＨであり、ｍは約５００を超える。１つの実施形態において、タンパク質はＫＬＨであり、ｍは約６００を超える。１つの実施形態において、タンパク質はＫＬＨであり、ｍは約７００を超える。１つの実施形態において、タンパク質はＫＬＨであり、ｍは約８００を超える。１つの実施形態において、タンパク質はＫＬＨであり、ｍは約５から約８００の範囲である。１つの実施形態において、タンパク質はＫＬＨであり、ｍは約５から約６００の範囲である。１つの実施形態において、タンパク質はＫＬＨであり、ｍは約５から約４００の範囲である。１つの実施形態において、タンパク質はＫＬＨであり、ｍは約５から約２００の範囲である。１つの実施形態において、タンパク質はＫＬＨであり、ｍは約５から約１００の範囲である。１つの実施形態において、タンパク質はＫＬＨであり、ｍは約１００から約２００の範囲である。１つの実施形態において、タンパク質はＫＬＨであり、ｍは１００から約３００の範囲である。１つの実施形態において、タンパク質はＫＬＨであり、ｍは約１００から約４００の範囲である。さまざまな態様において、タンパク質はＫＬＨであり、ｍは約１００から約５００、約１００から約６００、約１００から約７００、約１００から約８００、または約１００から約１，０００の範囲である。

式（１）の化合物のコンジュゲートおよびマレイミド活性化タンパク質は、当業者に周知の方法を使用して特徴づけることができる（例えば、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ｆｏｒ Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＢＳＡ，ＫＬＨ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（カタログ番号ＭＢＫ１）を参照のこと）。

代替の実施形態において、ＭＭＡ類似体は、チオール、ヒドロキシル、アミノ、またはカルボキシレート基を介して固体支持体に直接連結している。

標識は、それ自体（例えば、放射性同位体標識、化学発光色素、電気化学標識、金属キレート、ラテックス粒子、または蛍光標識）によって検出可能な場合があるか、酵素標識の場合、検出可能な基質化合物または組成物の化学変化を触媒する場合がある（例えば酵素、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど）。標識は、それ自体が検出可能な場合がある特異的結合分子であってもよい（例えば、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、ジゴキシゲニン、マルトース、オリゴヒスチジン、２，４－ジニトロベンゼン、ヒ酸フェニル、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡなど）。ＭＭＡは、当業者に周知の方法を使用して検出可能な標識に連結することができる。例示の例として、ＭＭＡ類似体は、ホースラディッシュ凍結乾燥粉末からマレイミド活性化ペルオキシダーゼに連結することができる（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ（カタログ番号Ｐ１７０９）から市販されている、製品マニュアルの指示に従う）。

式（１）の類似体は、以下の手順に従ってＭＭＡ（ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．、Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ＮＪから市販されている）から調製してもよい。ＭＭＡの第１級および第２級アミノ基を、ＭＭＡを二炭酸ジ－ｔｅｒｔ－ブチル（Ｂｏｃ_２Ｏ）と反応させることによって保護する。次いで、得られたｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）保護ＭＭＡ（（Ｂｏｃ_３）－ＭＭＡを樹脂に連結する。例えば、（Ｂｏｃ_３）－ＭＭＡを、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の２－（１Ｈ－７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルウラニウムヘキサフルオロフォスフェートメタンアミニウム（ＨＡＴＵ）およびＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）の存在下で樹脂と接触させ、樹脂結合（Ｂｏｃ_３）－ＭＭＡシステアミドを得ることによって、（Ｂｏｃ_３）－ＭＭＡをシステアミン－４－メトキシトリチル樹脂（ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．、Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ＮＪから市販されている）に連結することができる。樹脂結合（Ｂｏｃ_３）－ＭＭＡシステアミド上のＢＯＣ保護基を除去し、得られたＭＭＡシスタミド結合樹脂を、例えばトリフルオロ酢酸を使用してジクロロメタン中で樹脂から開裂させ、ＭＭＡシステアミドを得、これを、塩酸を用いた反応によって塩酸塩へ変換した。

上述の式Ａ～Ｄの類似体は、同様の方法論を使用して作製することができる。

ＭＭＡコンジュゲートおよび本明細書に記載の他のメチル化アルギニン誘導体のコンジュゲートを使用して、デバイスの固相構成成分を構築することができる。例えば、固相としては、固相、例えば多孔質マトリックスに非拡散的に結合している粒子に非共有結合しているＧ６ＰＤＨに共有結合しているＭＭＡまたはアシル化ＭＭＡ類似体があり得る。本明細書に記載の固相は、自動分析装置またはラテラルフローデバイスにおいてその使用を促進するためにハウジングまたはブランケットに取り付けることができる。

１つの態様において、非拡散的に結合している粒子を含む固相は、固相上に粒子を含む粒子スポッティング希釈剤をスポッティングすることによって調製することができる。例えば、粒子スポッティング希釈剤には、さまざまな緩衝剤、界面活性剤、および／または粒子の固相への接着を促進する他の化合物（例えば糖）が含まれる場合がある。固相に適用する希釈剤の容積および希釈剤中の粒子の濃度は、希釈剤を適用した後の固相に結合するようになる粒子数に影響を与えるであろう。さまざまな実施形態において、希釈剤の粒子濃度は約０．００１％および１．０％、例えば０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、および１．０％であり、本明細書において網羅的に列挙されていたかのように０．００１％から１．０％の間の全ての値を含む。

使用において、固相はまた、類似体に結合した抗ＳＤＭＡ抗体であって、抗体の類似体に対する親和性がＳＤＭＡに対するものよりも低い抗ＳＤＭＡ抗体を含む。例えば、類似体に対する抗ＳＤＭＡ抗体の親和性は、ＳＤＭＡに対する抗体の親和性の約２５％未満、約１０％未満、約５％未満、１％未満、約０．１％未満、０．０１％未満、または０．００１％未満であってもよい。実施形態において、ＳＤＭＡ抗体は標識されている。

同様に、本開示は、Ｎ－メチルアルギニン（ＭＭＡ）、アシル化ＭＭＡ、ＡＤＭＡ、アシル化ＡＤＭＡ、または別のメチル化アルギニン誘導体の類似体を含む組成物であって、類似体が抗ＳＤＭＡ抗体と複合体を形成している、組成物を対象とする。さまざまな実施形態において、抗体の固相化類似体に対する親和性は、溶液中のＳＤＭＡに対するものよりも低い。例えば、固相化類似体に対する抗ＳＤＭＡ抗体の親和性は、溶液中のＳＤＭＡに対する抗体の親和性の約２５％未満である。実施形態において、ＳＤＭＡ抗体は標識されている。類似体は、タンパク質、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、オボアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、およびグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）に共有結合していてもよく、タンパク質は、固体支持体に非共有結合していてもよい。１つの実施形態において、タンパク質は、固体支持体に非拡散的に結合している粒子に非共有結合している。別の実施形態において、タンパク質は、例えば当業者に周知の技術の使用を介して粒子に共有結合している。

抗ＳＤＭＡ抗体を標識に連結し、受容体結合アッセイ、例えばＳＤＭＡに対する免疫測定法に使用するための検出可能な抗ＳＤＭＡ抗体を得ることができる。抗ＳＤＭＡ－抗体は、当業者に周知の方法を使用して標識に連結することができる（例えば、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２９５巻、Ｒ．Ｂｕｒｎｓ編（２００５年））。検出可能な抗ＳＤＭＡ抗体は、さまざまな均一系、サンドイッチ、競合的、または非競合的アッセイ形式として使用し、被検試料中のＳＤＭＡの存在または量と関連したシグナルを生成してもよい。１つの実施形態において、本開示の方法は、遊離ＳＤＭＡ（すなわち、ポリペプチド鎖の一部ではないＳＤＭＡ）に特異的に結合する抗ＳＤＭＡ抗体の能力を使用し、同時にＳＤＭＡ誘導体、例えばＡＤＭＡ、Ｌ－アルギニンおよび／またはＮ－メチルアルギニンとの交差反応も使用する。本開示の方法のさまざまな実施形態において、誘導体に対する抗ＳＤＭＡ抗体の親和性は、ＳＤＭＡに対する抗体の親和性の約２５％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満、０．１％未満、０．０１％未満、または０．００１％未満である。

本開示は、本明細書に記載のＳＤＭＡの検出に使用するためのデバイスおよび試薬を含む診断キットを更に提供する。典型的には、そのようなキットは、固相と会合したＳＤＭＡ以外の少なくとも１つのアルギニン誘導体、例えばＳＤＭＡ誘導体、およびＳＤＭＡに実質的に結合する１つの試薬、例えば抗ＳＤＭＡ抗体を含む。キットは、典型的には、上述の診断アッセイをどのように行うか、および／またはそれによって得られた結果をどのように判断するかを記載した説明書または取扱説明書も含む。したがって、さまざまな実施形態において、本開示は、試料中のＳＤＭＡを決定するためのキットを対象とする。キットは、捕捉試薬がそこに固相化されている固相を含む本明細書に記載のデバイスを含み、標識にコンジュゲートされた抗ＳＤＭＡ抗体を含むコンジュゲートも含み、捕捉試薬に対する抗ＳＤＭＡ抗体の親和性は、ＳＤＭＡに対する抗体の親和性の約２５％未満である。１つの実施形態において、キットは、ＭＭＡまたはアシルＭＭＡの類似体を含む捕捉試薬を有する固体支持体、および標識にコンジュゲートされた抗ＳＤＭＡ抗体のコンジュゲートを含み、捕捉試薬に対する抗ＳＤＭＡ抗体の親和性は、ＳＤＭＡに対する抗体の親和性の約２５％未満である。

１つの特定の例において、そのようなキットは、特異的結合試薬（例えば、非固相化標識された特異的結合試薬および固相化分析物捕捉試薬）を備えたデバイスおよび洗浄試薬、ならびに必要に応じてまたは適切な場合、検出試薬および陽性および陰性対照試薬を含むであろう。更に他の添加剤としては、例えば安定化剤、緩衝剤などがあり得る。さまざまな試薬の相対量を変更し、アッセイの感受性を実質的に最適化する試薬の溶液中での濃度を得ることができる。特に、試薬は、通常凍結乾燥されており、乾燥粉末として提供することができ、前記乾燥粉末は、溶解時に試料と組み合わせるための適切な濃度を有する試薬溶液を提供するであろう。

デバイスは、反応ゾーン（固相）から非結合材料（例えば、未反応流体試料および未結合の特異的結合試薬）を運び去る液体試薬も含んでいてもよい。液体試薬は、洗浄試薬とし、反応ゾーンから非結合材料を除去するのみの役割を果たすことができるか、または検出試薬を含み、非結合材料を除去することと分析物の検出を促進することの両方の役割を果たすことができる。例えば、酵素にコンジュゲートする特異的結合試薬の場合、検出試薬は、反応ゾーンにおける酵素－抗体コンジュゲートとの反応時に検出可能なシグナルを産生する基質を含む。放射性、蛍光、または光吸収分子にコンジュゲートする標識特異的結合試薬の場合、検出試薬は、未結合の標識試薬を洗い流すことによって反応ゾーンにおける複合体形成の検出を促進する洗浄液として単に作用する。

２つ以上の液体試薬がデバイスに存在していてもよく、例えばデバイスは、洗浄試薬として作用する液体試薬および検出試薬として作用し、分析物の検出を促進する液体試薬を含んでいてもよい。

本開示のキットおよびデバイスは、血清試料と血漿試料との間のアッセイバイアスを減少させるための方法において使用することができる。以下の例で記載するように、分析物または分析物誘導体の類似体を粒子に結合させ、次いで固相に固相化するためにタンパク質を使用すると、試料間のバイアスが、固相に直接連結した（例えばリンカーを介して）類似体と比較した場合に減少する。したがって、１つの実施形態において、本開示は、血清または血漿試料中の分析物に対する免疫測定法における血清－血漿バイアスを減少させるかまたは除去する方法を目的とする。方法は、試料と、標識にコンジュゲートされた抗分析物抗体の標識コンジュゲートとの混合物を形成することを含む。混合物は、固体指示体であって、それに非拡散的に結合している粒子を有する固体支持体を含み、粒子が、粒子に結合しているタンパク質に共有結合している分析物または分析物誘導体の類似体を含む捕捉試薬を含む、デバイスと接触させる。分析物捕捉試薬に対する抗分析物抗体の親和性は、分析物に対する抗体の親和性の約２５％未満（例えば、約１０％、約５％、約１％、約０．１％、約０．０１％または約０．００１％）である。方法は、固相を洗浄し、未結合のコンジュゲートを除去することと、固相に会合した標識の量を測定し、試料中の分析物の存在または量を決定することとを更に含む。

特定の例において、本開示には、血清試料または血漿試料中の対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）に対する免疫測定法における血清－血漿バイアスを減少させるかまたは除去する方法が含まれる。方法は、試料と、標識にコンジュゲートされた抗ＳＤＭＡ抗体を含む標識コンジュゲートとを含む混合物を形成することを含む。混合物は、タンパク質に付随している類似体を有する固相を含む固体支持体であって、タンパク質が、固相に非拡散的に結合している粒子に非共有結合している、固体支持体と接触させる。本明細書においてより十分に記載しているように、アルギニン誘導体に対する抗ＳＤＭＡ抗体の親和性は、ＳＤＭＡに対する抗体の親和性の約２５％未満（例えば、約１０％、約５％、約１％、約０．１％、約０．０１％または約０．００１％）である。方法は、固体支持体を洗浄し、固体支持体に未結合のコンジュゲートを除去することと、固体支持体と会合した標識の量を測定し、試料中のＳＤＭＡの存在または量を決定することとを含む。

すでに説明しているように、動物からの生物学的試料において遊離ＳＤＭＡを検出すると、動物における腎機能の指標を得ることができる。更に、動物は、甲状腺機能亢進症と腎疾患の両方に罹患している場合がある。甲状腺機能亢進症は、筋肉量の低下をもたらすことがある。筋肉量の減少がクレアチニン値の低下につながるために、クレアチニンは、甲状腺機能亢進患者における腎疾患の貧弱なマーカーである。クレアチニンは、甲状腺機能亢進症における代謝状態の増加と関連する過剰ろ過によっても低下する（Ｊｅｐｓｏｎ Ｒ．Ｆｅｌｉｎｅ ｈｙｐｅｒｔｈｙｒｏｉｄｉｓｍ ａｎｄ ｃｈｒｏｎｉｃ ｋｉｄｎｅｙ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｉｎ：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ＢＳＡＶＡ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ；２０１５年４月、９～１２頁；Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＵＫを参照されたい）。したがって、クレアチニンレベルが腎臓機能をモニタリングするために使用される場合に、甲状腺機能亢進症は、腎疾患の存在をマスクする場合がある（Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｔ．Ｃｈｒｏｎｉｃ ｋｉｄｎｅｙ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ｃａｔｓ ｗｉｔｈ ｈｙｐｅｒｔｈｙｒｏｉｄｉｓｍ．Ｃｌｉｎ Ｂｒｉｅｆ．２０１５年９月：１０～１２頁）。ＳＤＭＡ値は筋肉量による影響を受けないために、ＳＤＭＡは、甲状腺機能亢進患者における腎疾患を検出するための優れたマーカーである。このような理由で、甲状腺マーカー、例えばチロキシン（Ｔ４）に関するアッセイとＳＤＭＡに関するアッセイとを組み合わせることは診断目的で有利である。本明細書において使用するＴ４に関するアッセイとしては、遊離Ｔ４、結合Ｔ４または総Ｔ４に関するアッセイがあり得る。ある特定のアッセイ形態において、単一の容器中でＴ４およびＳＤＭＡアッセイに必須の試薬を合わせることは有利である。このようにして試薬を合わせると、複雑性、費用が低下し、アッセイワークフローが単純化する。

したがって、１つの実施形態において、本開示は、患者からの生物学的試料におけるＳＤＭＡの組合せを決定する方法を対象とする。方法は、試料と抗Ｔ４抗体および抗ＳＤＭＡ抗体とを接触させることと、Ｔ４と抗Ｔ４抗体との間の結合を決定することと、ＳＤＭＡと抗ＳＤＭＡ抗体との間の結合を決定することとを含む。ある特定の実施形態において、抗Ｔ４抗体もしくは抗ＳＤＭＡ抗体のいずれか、または両方は、検出可能な標識に結合している。方法を容易にするために、本開示の態様には、抗Ｔ４と抗ＳＤＭＡ抗体の両方を含む試薬組成物が含まれる。本開示は、貯蔵するためか、またはＴ４およびＳＤＭＡに関するアッセイを組み合わせて行うために、試薬組成物を収容する容器を含むキットも対象とする。別の実施形態において、試薬組成物およびその構成成分は、凍結乾燥されていてもよく、それは容器中にあってもよい。キットは、Ｔ４アッセイとＳＤＭＡアッセイの両方に好適な洗浄液を収容する容器を更に含んでいてもよい。キットは、酵素標識に対する基質を含んでいてもよく、標識は、抗体に結合していてもよいか、またはアッセイ形式に応じてＴ４アッセイおよびＳＤＭＡアッセイのいずれかに好適なＳＤＭＡまたはＴ４類似体にコンジュゲートしていてもよい。

前述の説明を使用する当業者は、更に工夫することなく本開示を最大限に利用することができると考えられる。本開示の他の特徴および利点は、以下の実施例から明らかになるであろう。以下のものは例示目的のためのみに提供されており、上記の広義の用語で記載した本開示の範囲を限定することを意図するものではない。本開示で挙げる全ての参考文献は参照により本明細書に組み込まれるものとする。

実施例１：Ｇ６ＰＤＨを含むＭＭＡ、ＡＤＭＡおよびＳＤＭＡコンジュゲートの調製
ＭＭＡ、ＡＤＭＡまたはＳＤＭＡとＧ６ＰＤＨとのコンジュゲートを、ＭＭＡ－ＳＨ、ＡＤＭＡ－ＳＨまたはＳＤＭＡ－ＳＨを、スクシンイミジルヨードアセテート（ＳＩＡ）によって活性化したＧ６ＰＤＨとコンジュゲートすることによって調製した。ＳＩＡ架橋剤は、アミン反応性Ｎ－ヒドロキシスクシミド（ＮＨＳ）エステルおよびスルフヒドリル反応性ヨードアセチル基を含む。ＮＨＳエステルは、側鎖リシン（Ｋ）残基に存在する第１級アミノ基（－ＮＨ２）およびグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）のＮ末端と反応する。透析による精製後、ヨードアセチル基を、活性化ＭＭＡ（ＭＭＡ－ＳＨ）、ＡＤＭＡ（ＡＤＭＡ－ＳＨ）またはＳＤＭＡ（ＳＤＭＡ－ＳＨ）のスルフヒドリル基と反応させ、安定なチオエーテル連結したＧ６ＰＤＨ－ＭＭＡまたはＧ６ＰＤＨ－ＳＤＭＡコンジュゲートを得る。コンジュゲート手順の更なる詳細を以下に示す。

Ｇ６ＰＤＨ－ＭＭＡコンジュゲートの合成
Ｇ６ＰＤＨ－ＭＭＡコンジュゲートは以下の構造

を有する。

コンジュゲートを以下の手順に従って調製した。最初に、Ｇ６ＰＤＨ粉末１０８ｍｇを、ＭＥＳ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ６．５）３３ｍｌ中に溶解し、２５℃で１０分インキュベートし、２．１１ｍｇ／ｍｌ Ｇ６ＰＤＨ原液を調製した（ＢＣＡキットによって測定する）。Ｇ６ＰＤＨ原液２８．４ｍｌをＭＥＳ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ６．５）９．１ｍｌへ添加し、Ｇ６ＰＤＨ反応溶液を形成した。ＳＩＡ５０ｍｇを、ＤＭＳＯ １ｍｌ中に溶解し、５０ｍｇ／ｍｌの濃度のＳＩＡ原液を調製した。８４．９μｌの量のＳＩＡ原液（５０ｍｇ／ｍｌ、ＤＭＳＯ中）を、前述のＧ６ＰＤＨ反応溶液（３７．５ｍｌ）へ添加し、素早く混合し、２５℃で２．０時間回転させた。反応混合物を、ＰＢＳ（４Ｌ）に対して４℃で２回、ＭＥＳ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）に対して４℃で１回透析した。次いでＥＤＴＡ（０．５Ｍ、ｐＨ８．０）を反応混合物に添加し、５ｍＭの最終ＥＤＴＡ濃度とした。

ＭＭＡ－ＳＨ．２ＨＣｌ化合物２５ｍｇを、５ｍＭ ＥＤＴＡ溶液８．４ｍｌ中に溶解し、十分に混合した。次いでＭＭＡ－ＳＨ溶液５．７６ｍｌを上記ＳＩＡ活性化Ｇ６ＰＤＨ溶液に添加し、４℃で２４時間回転させた。次いでＧ６ＰＤＨ－ＭＭＡコンジュゲートをＰＢＳに対して４℃で３回、ＭＥＳ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ５．０）に対して１回透析した。Ｇ６ＰＤＨ－ＭＭＡコンジュゲートの濃度を、ＢＣＡキットによって測定し、次いで－８０℃で貯蔵して、更に使用した。

Ｇ６ＰＤＨ－ＡＤＭＡコンジュゲートの合成
Ｇ６ＰＤＨ－ＡＤＭＡコンジュゲートは、以下の構造

を有する。

コンジュゲートを以下の手順に従って調製した。最初に、Ｇ６ＰＤＨ粉末３２．３ｍｇを、ＭＥＳ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ６．５）１０ｍｌ中に溶解し、２５℃で１０分インキュベートし、２．２ｍｇ／ｍｌ Ｇ６ＰＤＨ原液を調製した（ＢＣＡキットによって測定する）。ＳＩＡ５０ｍｇを、ＤＭＳＯ １ｍｌ中に溶解し、５０ｍｇ／ｍｌの濃度のＳＩＡ原液を調製した。１８．１μｌの量のＳＩＡ原液（５０ｍｇ／ｍｌ、ＤＭＳＯ中）を、前述のＧ６ＰＤＨ反応溶液（８ｍｌ）へ添加し、素早く混合し、２５℃で２．０時間回転させた。反応混合物を、ＰＢＳ（４Ｌ）に対して４℃で２回、ＭＥＳ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）に対して４℃で１回透析した。次いでＥＤＴＡ（０．５Ｍ、ｐＨ８．０）を反応混合物に添加し、５ｍＭの最終ＥＤＴＡ濃度とした。ＡＤＭＡ－ＳＨ２．７ｍｌを以下の通りに合成し、５ｍＭ ＥＤＴＡ溶液（３．８ｍＭ）中に溶解し、次いで上記ＳＩＡ－活性化Ｇ６ＰＤＨ溶液に添加し、４℃で２４時間回転させた。次いでＧ６ＰＤＨ－ＡＤＭＡコンジュゲートを、ＰＢＳに対して４℃で３回、ＭＥＳ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ５．０）に対して１回透析した。Ｇ６ＰＤＨ－ＡＤＭＡコンジュゲートの濃度を、ＢＣＡキットによって測定し、次いで－８０℃で貯蔵して、更に使用した。

以下の手順に従ってＡＤＭＡ－ＳＨ．２ＴＦＡを合成した。２０ｍｌのバイアルに、システアミン４－メトキシトリチル樹脂（０．９ｇ、０．７４ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ－ＡＤＭＡ（ｐｄｂ）－ＯＨ（１．０ｇ、１．５ｍｍｏｌ、２．０当量）、ＨＡＴＵ（０．７ｇ、１．８ｍｍｏｌ、２．５当量）、ジイソプロピルエチルアミン（０．６ｍＬ、３．７ｍｍｏｌ、５．０当量）および無水ＤＭＦ（２０ｍＬ）を添加した。混合物に蓋をし、２５℃で１６時間回転させた。次いで液体をろ過除去し、樹脂を、ＤＭＦ（２０ｍＬ、４回）、メタノール（２０ｍＬ、４回）で洗浄した。次いで樹脂を、ＤＭＦ中の２０％ピペリジン２０ｍｌで３回処置し、それぞれの回に対して３０分インキュベートした。樹脂を、ＤＭＦ（２０ｍＬ、４回）、メタノール（２０ｍＬ、４回）で洗浄し、真空下で乾燥した。ＡＤＭＡ－ＳＨを樹脂から開裂させるために、ＴＦＡ３ｍｌを前述の樹脂へ添加し、２５℃で３時間回転させた。樹脂をろ過除去後、ＴＦＡ液を蒸発させ、真空下で乾燥し、ＡＤＭＡ－ＳＨ．２ＴＦＡのシロップ様生成物を得た。ＡＤＭＡ－ＳＨ．２ＴＦＡ生成物を、エルマン試薬によって測定した３．８ｍＭ ＡＤＭＡ－ＳＨ原液のまま５ｍＭ ＥＤＴＡ溶液中に溶解した。

Ｇ６ＰＤＨ－ＳＤＭＡコンジュゲートの合成
Ｇ６ＰＤＨ－ＳＤＭＡコンジュゲートは、以下の構造

を有する。

コンジュゲートを以下の手順に従って調製した。グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）（１２ｍｇ）の１つのバイアルを、ＭＥＳ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）３ｍｌ中に溶解し、１時間回転させ、酵素が緩衝液中に完全に溶解することを確実にした。調製した酵素溶液を、必要になるまで氷上で維持した。ＭＥＳ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）の追加の４．５ｍｌを酵素溶液へ添加し、ボルテックスによって十分に混合し（５秒）、氷上で１０分間維持した。Ｇ６Ｐ１００ｍｇを、脱イオン水ｌｍＬ中に溶解し、氷上で１０分間維持した。ＮＡＤＨ２００ｍｇを、脱イオン水１ｍｌ中に溶解し、氷上で１０分間維持した。Ｇ６Ｐ溶液０．６８ｍｌおよびＮＡＤＨ溶液０．３４ｍｌを酵素溶液に添加し、ボルテックスによって十分に混合し（５秒）、また氷上で１０分間維持した。ＳＩＡ（５０ｍｇ）の１つのバイアルを、ＤＭＳＯ（１００ｍｇ／ｍｌ）０．５ｍｌ中に溶解し、形成したＳＩＡ溶液０．１４ｍｌを酵素溶液へ添加し、ボルテックスによって十分に混合し（５秒）、アルミホイルで覆い、室温で２時間回転させた。次いで溶液をＧ２スライド－Ａ－Ｌｙｚｅｒ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｃａｓｓｅｔｔｅに移し、ＰＢＳ緩衝液（４Ｌ）に対して暗室中４℃で５時間透析した。透析緩衝液を新鮮なＰＢＳ（４Ｌ）に交換後、溶液を暗室中、４℃で一晩再び透析した。次いで透析緩衝液をＭＥＳ（４Ｌ、２５ｍＭ、ｐＨ８．０）に交換し、溶液を４℃で３時間透析した。酵素溶液１２．５ｍｌをＤｉａｌｙｓｉｓ Ｃａｓｓｅｔｔｅから除去し、ＭＥＳ緩衝液（１Ｍ、ｐＨ８．０）０．３２ｍｌおよびＥＤＴＡ（０．２Ｍ、ｐＨ８．０）０．３２ｍｌを添加し、溶液の最終濃度を５０ｍＭ ＭＥＳおよび５ｍＭ ＥＤＴＡとした。必要であれば、例えば、酵素溶液が１２．５ｍｌ未満の場合、ＭＥＳおよびＥＤＴＡの容積は、それに応じて調整してもよい。溶液をアルゴンで５分間脱気した。

実施例２：ＫＬＨ－ＭＭＡコンジュゲートの合成
ＫＬＨ－ＭＭＡコンジュゲートは、以下の構造

を有する。

コンジュゲートを以下の手順に従って調製した。マレイミド活性化ＫＬＨタンパク質の５ｍｇを、５ｍＭ ＥＤＴＡを含むＭＥＳ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＫ８．０）２．０ｍｌ中に溶解し、次いでＭＭＡ－ＳＨ（５ｍｇ／ｍｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ溶液中）２．５ｍｌと混合した。反応混合物を４℃で３６時間を超えて回転させ、カップリング効率を測定した。次いで反応混合物を更に２４時間回転させ、カップリング効率を再度測定した。次いで調製したＫＬＨ－ＭＭＡコンジュゲートを、１０Ｋ分子量カットオフでＰＢＳ（４Ｌ）に対して４℃で３回透析した。ＫＬＨ－ＭＭＡコンジュゲートをＭＥＳ緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ５．０）に対して更に透析した。

実施例３：ＫＬＨ－ＳＤＭＡコンジュゲートの合成
ＫＬＨ－ＳＤＭＡコンジュゲートは、以下の構造

を有する。

コンジュゲートを以下の手順に従って調製した。マレイミド活性化ＫＬＨタンパク質５ｍｇを、５ｍＭ ＥＤＴＡを含むＭＥＳ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）２．０ｍｌ中に溶解し、次いでＳＤＭＡ－ＳＨ溶液（３．６ｍＭ、５ｍＭ ＥＤＴＡ中）２．５ｍｌと混合した。調製した反応混合物を４℃で３６時間を超えて回転させ、カップリング効率を測定し、次いで混合物を更に２４時間回転させ、カップリング効率を再び測定した。次いで調製したＫＬＨ－ＭＭＡコンジュゲートを１０Ｋ分子量カットオフでＰＢＳ（４Ｌ）に対して４℃で３回透析した。次いでコンジュゲートをＭＥＳ緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ５．０）に対して透析した。

実施例４：ＢＳＡ－ＭＭＡコンジュゲートの合成
ＢＳＡ－ＭＭＡコンジュゲートは、以下の構造

を有する。

コンジュゲートを以下の手順に従って調製した。２５ｍｇＭＭＡ－ＳＨを、ＤＭＳＯ中に溶解し、５０ｍＭ ＭＭＡ－ＳＨ原液を作製し、濃度をエルマン試薬によって決定した。ＭＭＡ－ＳＨ原液をＭＥＳ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．０、および５ｍＭ ＥＤＴＡ）で希釈し、最終濃度を３．６ｍＭとした。３．６ｍＭ ＭＭＡ－ＳＨ溶液２．５ｍｌをマレイミド活性化ＢＳＡ５ｍｇに添加し、十分に混合し、次いで４℃で３６時間回転させた。次いで調製したＢＳＡ－ＭＭＡコンジュゲートをＰＢＳ（４Ｌ）に対して４℃で３回、ＭＥＳ緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ５．０）に対して４℃で１回透析した。

実施例５：ＢＳＡ－ＳＤＭＡコンジュゲートの合成
ＢＳＡ－ＳＤＭＡコンジュゲートは、以下の構造

を有する。

コンジュゲートを以下の手順に従って調製した。ＳＤＭＡ－チオール樹脂から開裂したばかりのＳＤＭＡ－ＳＨ（１００ｍｇ）を、ＭＥＳ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．０、５ｍＭ ＥＤＴＡを含む）中に溶解し、正味のＳＤＭＡ－ＳＨの濃度をエルマン試薬キットによって決定し、３．６ｍＭとした。ＳＤＭＡ－ＳＨ溶液２．５ｍｌをマレイミド活性化ＢＳＡ５ｍｇに添加し、十分に混合し、次いで４℃で３６時間回転させた。調製したＢＳＡ－ＳＤＭＡコンジュゲートを、ＰＢＳに対して４℃で３回透析した（４Ｌ）。次いでコンジュゲートをＭＥＳ緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ５．０）に対して１回透析した。

実施例６：ラテックス粒子上の受動コーティングＧ６ＰＤＨ－ＭＭＡおよびＧ６ＰＤＨ－ＡＤＭＡコンジュゲート
以下の手順を使用し、受動コーティングＧ６ＰＤＨ－ＭＭＡコンジュゲートを有するラテックス粒子を調製した。同様の手順を使用し、受動コーティングＧ６ＰＤＨ－ＡＤＭＡコンジュゲートを有するラテックス粒子を調製した。同様の手順を使用し、Ｇ６ＰＤＨおよび他のアルギニン誘導体のコンジュゲートで粒子を受動被覆することができる。更に、同様の手順を使用し、他のタンパク質を含むコンジュゲートで粒子を被覆することができる。

ラテックス粒子懸濁剤（５％ｗ／ｖ％；粒子サイズ０．５２μｍ）５００μｌを２ｍｌのプラスチック管に添加し、１０Ｋ ｒｐｍで５分間遠心分離し、上澄み液を除去し、廃棄した。コーティング緩衝液５００μｌを粒子ペレットに添加し、ピペッティングによって十分に混合した。次いで混合物を遠心分離し、上澄みを除去した。

Ｇ６ＰＤＨ－ＭＭＡ（０．６３８ｍｇ／ｍＬ、コーティング緩衝液（ＭＥＳ２５ｍＭ、ｐＨ５．０）中）１．４８ｍＬを粒子ペレットへ添加し、粒子を再懸濁し、十分に混合した。０．５μＭラテックス粒子にコンジュゲートの単層を被覆するために、３４．３μｇ／ｍｇビーズのコンジュゲート（３４．３μｇコンジュゲート毎ｍｇビーズ）を使用した。粒子懸濁剤およびコンジュゲート混合物を４℃で１６時間回転させた。次いで粒子懸濁剤を１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上澄み液を除去し、０．２μｍフィルターでろ過した。コンジュゲート残渣を、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ）を使用して測定し、被覆効率を決定した。粒子を、コーティング緩衝液で２回洗浄し、次いでコーティング緩衝液中で再懸濁し、４℃で貯蔵した。被覆粒子の濃度を、上記粒子懸濁液５μＬを水９９５μＬで希釈し（×２００希釈）、６５０ｎｍで読み取ることによって決定した。Ａ_６５０は０．３４８であり、固体粒子１．８％（ｗ／ｖ）に匹敵する。

実施例７：化学的修飾ＭＭＡ－アミノ粒子の合成
化学的修飾ＭＭＡ－アミノ粒子の調製を、以下の概略図

および以下の手順で示す。この手順は、他のアルギニン誘導体を用いて一般的に使用することができる。

アミノ粒子のＳＭ（ＰＥＧ）１２－活性化
アミン修飾ポリスチレン粒子（５％ｗ／ｖ；粒子サイズ０．５５μｍ）の懸濁液１０ｍｌを、５０ｍｌのＦａｌｃｏｎチューブに添加し、７０００ｒｐｍで２５分間遠心分離し、次いで上澄みを廃棄した。粒子ペレットを、リン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．４）２０ｍｌで２回洗浄し、次いでｐＨ７．４のリン酸緩衝液２０ｍｌ中で再懸濁した。ＳＭ（ＰＥＧ）１２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｐｉｅｒｃｅ）１００ｍｇをＤＭＳＯ１ｍｌ中に溶解し、最終濃度を１００ｍｇ／ｍｌとした。シェイカー中で、ＳＭ（ＰＥＧ）１２溶液を、アミン粒子懸濁液へ一滴ずつ添加し、次いで２５℃で４時間回転させた。粒子混合物を、７０００ｒｐｍ、２０分間の遠心分離によって４回洗浄し、１分間の超音波処置および２０分のインキュベートによってリン酸緩衝液（４０ｍｌ）中に再懸濁した。４回洗浄後、粒子を、５ｍＭ ＥＤＴＡを含むリン酸緩衝液２０ｍｌ中で再懸濁した。

ＳＭ（ＰＥＧ）１２粒子にコンジュゲートしたＭＭＡ－ＳＨ
ＭＭＡ－ＳＨ－２ＴＦＡ２５ｍｇを、５ｍ ＭＥＤＴＡ溶液４．２ｍｌ中に溶解し、１２．５ｍＭ ＭＭＡ－ＳＨ原液を調製した。ＭＭＡ－ＳＨ原液（１２．５ｍＭ）を１．２５ｍＭに希釈し、中間ＭＭＡ－ＳＨ溶液を調製し、次いで０．０５ｍＭに再び希釈し、ＭＭＡ－ＳＨ作業溶液を調製した。上記ＳＭ（ＰＥＧ）１２－活性化粒子溶液（１０ｍｌ）を振とうし、ＭＭＡ－ＳＨ作業溶液（０．０５ｍＭ）の対応する容積を粒子溶液に滴加した。粒子を、超音波処置によって十分に混合し、次いで２５℃で１５時間回転させた。５ｍＭシステアミンを添加し、粒子とともに更に１時間インキュベートした。次いで粒子を６０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、超音波処置によってリン酸緩衝液１２ｍｌで５回洗浄し、再懸濁した。次いで粒子をリン酸緩衝液１０ｍｌ中に再懸濁した。粒子の濃度を測定するために、懸濁液を脱イオン水中で２００倍に希釈し、６５０ｎｍにおけるＯＤを読み取った。

実施例８：粒子スポッティング希釈剤の調製
５００ｍｌスケールに関しては、以下の材料を混合し、液体の最終ｐＨを７．４に調整した。
１Ｍリン酸緩衝液 ５０ｍｌ
スクロース ５０グラム
ＴＷＥＥＮ（商標）２０界面活性剤 ２０μｌ
脱イオン水 ４５０ｍｌ

実施例９：抗ＳＤＭＡ抗体－ＨＲＰコンジュゲートの合成
４ステップ反応スキームを使用し、抗体のスルホ活性化および酵素ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）のＴｒａｕｔ試薬またはＳＰＤＰ試薬活性化を介して、抗ＳＤＭＡ抗体およびＨＲＰコンジュゲートを調製した。ステップ１では、マレイミドを使用し、抗体溶液中の任意の遊離チオール断片をキャップし、ＳＭＣＣ活性化プロセス中の抗体の架橋を回避した。ステップ２では、ＳＭＣＣ架橋剤を抗体と反応させ、マレイミド活性化抗体（ＳＭＣＣ－Ｍａｂ）を生成した。ステップ３では、過剰な未反応の架橋剤を透析によって除去後、ＳＭＣＣ活性化抗体を、Ｔｒａｕｔ試薬を用いてまたはＳＰＤＰによりＨＲＰを活性化することによって調製した、スルフヒドリル活性化ＨＲＰと反応させた。ＳＭＣＣ活性化抗体をスルフヒドリル基によってＨＲＰ酵素と反応させた。Ｍａｂ－ＨＲＰ合成の化学的経路を以下の概略図（Ｔｒａｕｔ試薬を用いてまたはＳＰＤＰによりＨＲＰを活性化することで示されるステップ３および４）に示す。

あるいは、ステップ３および４は以下の通りに達成することができる。

ステップ１～４に関する手順を以下により詳細に示す。

ステップ１：不純物不含チオールのマレイミドキャッピング
ＰＢＳ中の５．６ｍｇ／ｍＬ抗ＳＤＭＡ Ｍａｂ（米国特許第８，４８１，６９０号と同様に調製した）（合計２２．４ｍｇ）４ｍｌに、ＤＭＳＯ中の０．５Ｍマレイミド１５μｌを添加し、次いで室温で４５分間回転させた。キャップした抗体溶液を、ＰＢＳ（４Ｌ）に対して４℃で３回透析した。ＰＢＳで抗体を１０倍希釈することによって、抗体濃度を決定し、ＯＤ２８０ｎｍ（ＯＤ_２８０＝１．３７は１ｍｇ／ｍｌに等しい）を５．２ｍｇ／ｍｌとして読み取った。

ステップ２：抗ＳＤＭＡ ＭａｂのＳＭＣＣ活性化
次いでスルホ－ＳＭＣＣ（秤量不要品、バイアルを室温と平衡化してから開封し、結露を回避する、２ｍｇをＤＭＳＯ１００μｌに添加して１０．０ｍｇ／ｍｌ溶液を作製した）５０μｌをＰＢＳ中の５．２ｍｇ／ｍｌマレイミドキャップＭａｂ ３．３ｍｌに添加し、これを徐々に混合し、室温で１時間回転させた（徐々に低速にしながら）。ＳＭＣＣ活性化抗体を、ＰＢＳ（４Ｌ）に対して４℃で３回透析した。抗体をＰＢＳで１０倍希釈することによって、ＳＭＣＣ活性化抗体（ＳＭＣＣ－Ａｂ）の濃度を決定し、次いで２８０ｎｍにおけるＯＤを４．９ｍｇ／ｍｌとして読み取った。

ステップ３（代替１）：ＨＲＰのＴｒａｕｔ試薬活性化
ＨＲＰ４０ｍｇを、５ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ３ｍｌ中に溶解し、ＨＲＰの最終濃度を１３．３ｍｇ／ｍｌとした。水（１０ｍｇ／ｍｌ）中のＴｒａｕｔ試薬（２０ｅｑ）０．２７５ｍｌを上記ＨＲＰ溶液へ添加し、次いで２５℃で１時間回転させた。次いで溶液をＰＤ－１０カラムで脱塩し、５ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ緩衝液で洗浄した。茶色の分画を収集し、４０５ｎｍにおけるＯＤを測定し、ＨＲＰ濃度を７．８ｍｇ／ｍｌと決定した。

ステップ３（代替１）：抗体－ＨＲＰ Ｔｒａｕｔコンジュゲートの調製
ＰＢＳ中のＳＭＣＣ－Ｍａｂ（２．２３ｍｇ／ｍｌ）０．７ｍｌをＥＤＴＡ溶液（０．５Ｍ、ｐＨ８．０）へ添加し、最終ＥＤＴＡ濃度を５ｍＭにした。上記で精製したＴｒａｕｔ－ＨＲＰ（１２Ｅｑ、７．８ｍｇ／ｍｌ）０．６４ｍｌを添加し、次いで混合物を４℃で２４時間回転させた。システイン（０．５Ｍ）を混合物へ添加し、０．５ｍＭの最終濃度で反応をクエンチし、混合物を室温で２時間静置した。次いで調製したコンジュゲート溶液を０．２μｍスピンフィルターでろ過した。コンジュゲートを４℃で貯蔵し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびＳＥＣを使用し、溶液に存在するコンジュゲートを特徴分析した。

ステップ３（代替２）：ＨＲＰのＳＰＤＰ活性化
ＨＲＰ２５０ｍｇを、ＰＢＳ１２．５ｍｌ中に溶解し、２０ｍｇ／ｍｌ溶液を作製した。ＰＥＧ４－ＳＰＤＰ（ペグ化長鎖ＳＰＤＰ架橋剤；ＳＰＤＰはスクシンイミジル３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）１００ｍｇを室温に冷却し、次いでＤＭＳＯ１ｍｌ中に溶解し、１００ｍｇ／ｍｌ ＰＥＧ４－ＳＰＤＰ溶液を作製した。次いでＳＰＤＰ溶液０．７ｍｌをＨＲＰ溶液１２．５ｍｌに添加し、室温で１時間回転させた。ＳＰＤＰ－ＨＲＰコンジュゲートをＰＢＳ（４Ｌ）に対して４℃で３回透析した。ＳＰＤＰ－ＨＲＰ溶液を２０倍に希釈し、４０５ｎｍにおけるＯＤを読み取ることによってＨＲＰ濃度を１５．２ｍｇ／ｍｌと決定した。

ＴＣＥＰ樹脂によるＳＰＤＰ－ＨＲＰの脱キャッピング
ＴＣＥＰ樹脂スラリー６ｍｌを遠心分離し（３０００ｒｐｍ、２分間）、上澄みを廃棄した。次いで樹脂ペレットを５ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ緩衝液６ｍｌで２回洗浄した。次いで０．５Ｍ ＥＤＴＡ溶液４０μｌをＳＰＤＰ－ＨＲＰ溶液（１５．２ｍｇ／ｍｌ）４ｍｌに添加し、十分に混合し、次いでＴＣＥＰ樹脂に添加した。次いでこの溶液を十分に混合し、室温で２時間回転させた。樹脂をろ過除去後、２０倍に希釈し、４０５ｎｍにおけるＯＤを読み取ることによって、ＨＲＰの濃度を決定し、濃度は１０．５ｍｇ／ｍｌであった。

ステップ４（代替２）：抗体－ＨＲＰ ＳＰＤＰコンジュゲート
ＰＢＳ（４．９ｍｇ／ｍｌ）中のＳＭＣＣ－ｍＡｂ２．２ｍｌをＥＤＴＡへ添加し、５ｍＭ混合物を調製した。この混合物に、脱キャップしたＳＰＤＰ－ＨＲＰ（１０．５ｍｇ／ｍｌ、ＨＲＰ／Ａｂ８Ｅｑ）２．２ｍｌを添加し、十分に混合し、次いで４℃で１５時間回転させた。ＳＭＣＣ反応をクエンチするために、水中の０．５Ｍシステイン４．４μｌを０．５ｍＭで添加し、４℃で２時間インキュベートした。遊離チオールをブロックするために、ＤＭＳＯ中の０．５Ｍシステイン４．４μｌを１ｍＭで添加し、次いで４℃で１時間インキュベートした。次いで調製したコンジュゲート溶液を、０．２μｍスピンフィルターでろ過し、－８０℃で貯蔵した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびＳＥＣを使用し、コンジュゲートを分析した。

実施例１０：抗ＳＤＭＡ液体コンジュゲート試薬の調製
抗ＳＤＭＡバルクコンジュゲート溶液を、実施例１１で記載するコンジュゲート希釈剤中で調製した。抗ＳＤＭＡ抗体コンジュゲートを、コンジュゲート希釈剤を使用して５０μｇ／ｍＬに予め希釈した。作業溶液を調製するために、バルクコンジュゲート溶液（５０μｇ／ｍｌ）をコンジュゲート希釈剤へ添加し、最終濃度を０．３または０．８μｇ／ｍｌとした。次いで溶液を２５℃で３０分間回転させることによって、作業溶液を十分に混合した。次いで作業溶液をアルミホイルで覆い、使用するまで４℃で貯蔵した。

実施例１１：コンジュゲート試薬希釈剤の調製
以下の材料をＳＴＡＢＬＺＹＭＥ ＳＥＬＥＣＴ（商標）安定化剤１５０ｍＬに列挙する順序で添加した。次いで混合物を２５℃で２時間回転することによって混合し、ｐＨを７．０に調整した。
ＡＮＳ １８０ｍｇ
サリチル酸 ２．６２５ｇ
スクロース １７．５ｇ
ヘパリン １６．５ｍｇ
不活性化ＨＲＰ ５０ｍｇ
青色色素 ０．５ｍＬ

上記材料を、ＳＴＡＢＬＺＹＭＥ ＳＥＬＥＣＴ（商標）安定化剤２５０ｍＬに添加し、回転させ数分間徐々に混合した。希釈剤を０．２μｍフィルターに通してろ過し、次いでアルミニウムで覆い、４℃で貯蔵した。

実施例１２：ＣＡＴＡＬＹＳＴ ＤＸ（商標）アナライザー用のＳＤＭＡアッセイスライドの調製
貯蔵したＧ６ＰＤＨ－ＭＭＡまたはＧ６ＰＤＨ－ＡＤＭＡ受動被覆ラテックス粒子は、スポッティング希釈剤（実施例８）中で０．１％の最終粒子濃度で混合した。希釈した粒子溶液３５μＬを、Ｆｕｓｉｏｎ５単層マトリックス膜（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を有する予め組み立てた各スライド上に添加した（米国特許出願公開第２０１４／０３１５２１６号を参照のこと）。次いでスライドを、乾燥トンネル中、４９℃、流速７４５で３０分間乾燥した。乾燥したスライドを、乾燥剤を含むアルミホイルバッグに入れ、スライドを含むバッグを密閉し、４℃で貯蔵した。

ＭＭＡ－アミノ粒子を使用してスライドを調製するために、実施例６および７で記載した粒子を、スポッティング希釈剤で０．１％の最終粒子濃度に希釈し、次いでスライド上にスポットし、上記乾燥手順を使用して乾燥した。

実施例１３：ＣＡＴＡＬＹＳＴ ＤＸ（商標）アナライザーでのＳＤＭＡアッセイ
ＣＡＴＡＬＹＳＴ ＤＸ（商標）アッセイを、以下の一般手順および製造業者（ＩＤＥＸＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）の取扱説明書に従って行った。試料および抗ＳＤＭＡ－ＨＲＰコンジュゲートを、室温で２分間インキュベートした。混合物の２つのアリコート１１μＬを、実施例１２で記載したように調製したＣＡＴＡＬＹＳＴ ＤＸ（商標）固相に適用した。固相を洗浄緩衝液９μＬで３回洗浄した。ＴＭＢ基質の２つのアリコート１１．５μＬを添加した。次いでスライドのＯＤを、６４５ｎＭにおいて０．５秒間隔で２分間読み取った。

図１は、固相としてのタンパク質Ｇ６ＰＤＨ－ＭＭＡ受動被覆ラテックス粒子および抗ＳＤＭＡ ＳＰＤＰ ＨＲＰコンジュゲートを使用したＳＤＭＡ検量線を示す。ＳＤＭＡキャリブレーターは、ストリッピングしていない（ｕｎ－ｓｔｒｉｐｐｅｄ）イヌ血清中で調製した。固相：粒子の濃度（０．１％）；液体コンジュゲート＝０．３μｇ／ｍｌ。

図１Ｂは、固相としてのタンパク質Ｇ６ＰＤＨ－ＭＭＡ受動被覆ラテックス粒子および抗ＳＤＭＡ ＳＰＤＰ ＨＲＰコンジュゲートを使用したＳＤＭＡ検量プロットを示す。ＳＤＭＡキャリブレーターは、ストリッピングしていないイヌ血清中で調製した。固相：粒子の濃度（０．０２５％）；液体コンジュゲート＝０．０２７μｇ／ｍｌ。表示されるデータは６回繰り返した実験を示す。

図２は、固相としてのＫＬＨ－ＭＭＡ受動被覆粒子および抗ＳＤＭＡ ＳＰＤＰ ＨＲＰコンジュゲートを使用したＳＤＭＡ検量線を示す。ＳＤＭＡキャリブレーターは、ストリッピングしていないイヌ血清中で調製した。固相：粒子の濃度（０．１％）；液体コンジュゲート＝０．８μｇ／ｍｌ。

図３は、固相としてのＭＭＡ化学修飾粒子および抗ＳＤＭＡ ＳＰＤＰ ＨＲＰコンジュゲートを使用したＳＤＭＡ検量線を示す。ＳＤＭＡキャリブレーターは、ストリッピングしていないイヌ血清中で調製した。固相：粒子の濃度（０．１％）；液体コンジュゲート＝０．８μｇ／ｍｌ。

図４は、Ｇ６ＰＤＨ－ＭＭＡ受動被覆粒子固相および液体ＳＰＤＰコンジュゲートを使用したキャリブレーターおよび患者試料のＣＡＴＡＬＹＳＴ ＤＸ（商標）ＳＤＭＡ試料分析を示す。

実施例１４：ＳＤＭＡ、ＡＤＭＡおよびＭＭＡ被覆粒子の固相特性の比較
触媒アナライザーベースのＳＤＭＡアッセイを開発するために、実施例１および１２で記載したタンパク質ベースのＭＭＡ、ＡＤＭＡおよびＳＤＭＡコンジュゲートで受動被覆された固相化粒子を有する固相を含む異なるバージョンの固相を開発した。実施例７で記載したＭＭＡおよびＳＤＭＡを用いて化学修飾された固相化粒子も研究した。

１つの発見は、アッセイ性能は、固相上でＭＭＡを固相化し、使用することで改善される点である。タンパク質ベースの受動被覆ラテックス粒子または化学修飾粒子のいずれかによって固相に固相化されたＳＤＭＡを使用すると、ＳＤＭＡキャリブレーターパネル間の限定された分離のみが生じた。ＭＭＡ化学修飾ラテックス粒子は、アッセイ精度および正確性を含む改善されたアッセイ性能を有する検量線をもたらしたが、２つの試料タイプである血清と血漿との間に大きなバイアスが生じた。最良の触媒ＳＤＭＡアッセイ性能は、固相に固相化された粒子上のＧ６ＰＤＨ－ＭＭＡコンジュゲート受動コーティングによって得られた。粒子は、優良な精度、正確性、および安定性を有するアッセイをもたらした。

抗ＳＤＭＡ－酵素コンジュゲートも、実施例９で記載したＴｒａｕｔ試薬またはＳＰＤＰを使用して研究した。形成されたコンジュゲートは、ＳＤＭＡアッセイにおける広範なダイナミックレンジと改善されたアッセイ性能とを与えることが示された。

表１で示すように、ラテックス粒子上でのＢＳＡ－ＭＭＡ／ＢＳＡ－ＳＤＭＡの被覆効率（約２５％）は、ＫＬＨ－ＭＭＡ／ＫＬＨ－ＳＤＭＡおよびＧ６ＰＤＨ－ＭＭＡ／Ｇ６ＰＤＨ－ＳＤＭＡに関する被覆効率（約９５％）よりもはるかに低かった。ＫＬＨ－ＭＭＡおよびＫＬＨ－ＳＤＭＡ被覆ラテックス粒子は、スライド上にスポットする前に貯蔵条件下で凝集し、スポッティングする前に粒子を十分に超音波処置しない限りは、アッセイの大きな変動につながった。ＫＬＨ－ＭＭＡは、Ｆｕｓｉｏｎ５スライド上に直接スポットし、スライドを３７℃で１週間インキュベートした場合、安定であったが、２週間インキュベートした場合、安定ではなかった。Ｇ６ＰＤＨ－ＭＭＡは、ラテックス粒子上での被覆効率が高く、３７℃で２週間インキュベートした場合でさえ、乾燥スライド上で非常に頑強であり、したがってＳＤＭＡ触媒アッセイに関して最良の固相を提供した。

表２は、受動被覆ＫＬＨ－ＭＭＡおよびＫＬＨ－ＳＤＭＡ粒子を含む固相を使用したアッセイ性能の比較を示す。

表３は、受動コーティングＧ６ＰＤＨ－ＭＭＡ、Ｇ６ＰＤＨ－ＡＤＭＡおよびＧ６ＰＤＨ－ＳＤＭＡを有する固相化粒子を含む固相を使用したアッセイ性能の比較を示す。

表３で示すように、受動コーティングＧ６ＰＤＨ－ＭＭＡ、Ｇ６ＰＤＨ－ＡＤＭＡまたはＧ６ＰＤＨ－ＳＤＭＡを有する固相化粒子は、触媒ＳＤＭＡアッセイにおいてそれぞれ使用することができる。

表４は、受動コーティングＢＳＡ－ＭＭＡおよびＢＳＡ－ＳＤＭＡを有する固相化粒子を含む固相を使用したアッセイ性能の比較を示す。

実施例１５：アッセイ性能の分析
イヌ試料とネコ試料の両方に関して、ＣＡＴＡＬＹＳＴ ＤＸ（商標）ＳＤＭＡ試験性能をＬＣ－ＭＳおよびＥＭＩＴ（商標）アッセイと比較した（米国特許出願公開第２０１６／２４５８０１号を参照のこと）。

図５Ａは、イヌ血清試料（２０７個の試料）に対する、ＣＡＴＡＬＹＳＴ ＤＸ（商標）ＳＤＭＡ試験のＬＣ－ＭＳアッセイとの相関を示す。触媒［ＳＤＭＡ］（μｇ／ｄＬ）＝１．２２０６５＋０．９３３５３ＬＣ－ＭＳ［ＳＤＭＡ］（μｇ／ｄＬ）、Ｒ^２＝０．９４５。Ｒ２乗値は、試験結果が強く相関していたことを示す。

図５Ｂは、ネコ血清試料（８６個の試料）に対する、ＣＡＴＡＬＹＳＴ ＤＸ（商標）ＳＤＭＡ試験のＬＣ－ＭＳアッセイとの相関を示す。触媒［ＳＤＭＡ］（μｇ／ｄＬ）＝１．２２０６５＋０．９３３５３ＬＣ－ＭＳ［ＳＤＭＡ］（μｇ／ｄＬ）、Ｒ^２＝０．９４５。Ｒ２乗値は、試験結果が強く相関していたことを示す。

図６Ａは、イヌ血清試料（２０７個の試料）に対する、ＣＡＴＡＬＹＳＴ ＤＸ（商標）ＳＤＭＡ試験のＥＭＩＴアッセイとの相関を示す。触媒［ＳＤＭＡ］（μｇ／ｄＬ）＝０．５６４３８＋０．９３９８０ＥＭＩＴ［ＳＤＭＡ］（μｇ／ｄＬ）、Ｒ^２＝０．９３９。Ｒ２乗値は、試験結果が強く相関していたことを示す。

図６Ｂは、ネコ血清試料（８６個の試料）に対する、ＣＡＴＡＬＹＳＴ ＤＸ（商標）ＳＤＭＡ試験のＥＭＩＴアッセイとの相関を示す。触媒［ＳＤＭＡ］（μｇ／ｄＬ）＝０．５６４３８＋０．９３９８０ＥＭＩＴ［ＳＤＭＡ］（μｇ／ｄＬ）、Ｒ^２＝０．９３９。Ｒ２乗値は、試験結果が強く相関していたことを示す。

実施例１６：共有結合アミン－ＭＭＡ粒子および受動被覆Ｇ６ＰＤＨ－ＭＭＡ粒子における血清／血漿バイアスの比較
ＣＡＴＡＬＹＳＴ ＤＸ（商標）ＳＤＭＡアッセイを、共有結合アミン－ＭＭＡ粒子または受動被覆Ｇ６ＰＤＨ－ＭＭＡ粒子のいずれかを用いて、同一の血清および血漿試料で行った。実験は２回繰り返して行った。試料バイアスを次の通りに計算し：（血清ＳＤＭＡ（μｇ／ｄＬ）－血漿ＳＤＭＡ（μｇ／ｄＬ）／（（血清ＳＤＭＡ（μｇ／ｄＬ）＋血漿ＳＤＭＡ（μｇ／ｄＬ））／２）、これは血清値と血漿値との間の差を血清および血漿値の平均で割った値を反映する。

表５および図７Ａで示すように、イヌ試料では、６４～８２％の血清／血漿バイアスが、アミン－ＭＭＡ共有結合粒子で観察された。対照的に、０％から１１％の血清／血漿バイアスが、受動被覆Ｇ６ＰＤＨ－ＭＭＡ粒子で観察された。その結果、受動被覆Ｇ６ＤＰＨ－ＭＭＡ粒子は、共有結合アミン－ＭＭＡ粒子を用いたイヌ試料において観察された血漿／血清バイアスを大きく減少させた。

表６および図７Ｂで示すように、ネコ試料では、－３６％から３５％の血清／血漿バイアスが、アミン－ＭＭＡ共有結合粒子で観察された。対照的に、－３％から６％の血清／血漿バイアスが、受動被覆Ｇ６ＰＤＨ－ＭＭＡ粒子で観察された。その結果、受動被覆Ｇ６ＤＰＨ－ＭＭＡ粒子は、共有結合アミン－ＭＭＡ粒子を用いたネコ試料において観察された血漿／血清バイアスを大きく減少させた。

実施例１７：受動被覆Ｇ６ＰＤＨ－ＭＭＡ粒子および受動被覆オボアルブミン－ＭＭＡ粒子における血清／血漿バイアス
ＣＡＴＡＬＹＳＴ ＤＸ（商標）ＳＤＭＡアッセイを、Ｇ６ＰＤＨ－ＭＭＡ粒子（図８）またはオボアルブミン－ＭＭＡ粒子（図９）のいずれかを用いて、２０対のイヌ血清および血漿試料に関して行った。図８および９におけるグラフのＹ軸は、真のＳＤＭＡ濃度と測定されたＳＤＭＡ濃度との間の差をμｇ／ｄＬで図示する。この差を「バイアス」と称する。実験は２回繰り返して行った。Ｇ６ＰＤＨコーティングとオボアルブミンコーティングの両方が、血清または血漿で測定されたＳＤＭＡ値間に最小のバイアスをもたらした。更に、血清試料における真のＳＤＭＡ値と測定されたＳＤＭＡ値との間に最小バイアスが、かつ血漿試料における真のＳＤＭＡ値と測定されたＳＤＭＡ値との間に最小バイアスが存在した。

実施例１８：受動被覆タンパク質－ＭＭＡ粒子の安定性
粒子上のタンパク質－ＭＭＡ受動コーティングの安定性を評価した。

水溶液中の安定性
受動被覆粒子（Ｇ６ＰＤＨ－ＭＭＡ；Ｇ６ＰＤＨ－ＭＭＡとその基質Ｇ６ＰおよびＮＡＤ；またはオボアルブミン－ＭＭＡで被覆）を、ｐＨ６．４の５０ｍＭリン酸ナトリウムおよび２．５％スクロース中、５時間から８日までのさまざまな期間、４℃でインキュベートした。５時間インキュベートした粒子のアリコートを超音波処置した。更に、新しい被覆粒子を、１回の凍結－解凍サイクルを－２０℃で行った被覆粒子と比較した。インキュベート後、粒子をＳＤＭＡアッセイにおいて使用し、結果を図１０に示す。これらのプレインキュベートは、オボアルブミン－ＭＭＡ被覆粒子を使用した場合、Ｇ６ＰＤＨ－ＭＭＡ被覆粒子と比較してＳＤＭＡ値に大きな影響を与えた。これらの結果は、Ｇ６ＰＤＨ－ＭＭＡ被覆粒子は、水溶液中でインキュベートした場合、オボアルブミン－ＭＭＡ被覆粒子よりも安定であったことを示す。

高濃度の塩を含む水溶液中での安定性
高濃度の塩に対する受動コーティングの耐性を評価するために、１Ｍ ＮａＣｌを４℃で一晩前処置したＧ６ＰＤＨ－ＭＭＡ受動被覆粒子と未処置のＧ６ＰＤＨ－ＭＭＡ受動被覆粒子とを用いてＳＤＭＡアッセイを行った。アッセイは、ＳＤＭＡ標準を用いて、０、６．２５、１２．５、２５、５０および１００μｇ／ｄＬ ＳＤＭＡで行った。

図１１は、１Ｍ ＮａＣｌと予めインキュベートしたＧ６ＰＤＨ－ＭＭＡ受動被覆粒子および予めインキュベートしなかったＧ６ＰＤＨ－ＭＭＡ受動被覆粒子を使用したＣＡＴＡＬＹＳＴ ＤＸ（商標）ＳＤＭＡ検量線を示す。実験は３回繰り返して行った。ＳＤＭＡ検量線は、１Ｍ塩化ナトリウム（「ストリッピング」と標識）に曝露された粒子または対照粒子（「非ストリッピング」と標識）間で識別できなかった。これは、Ｇ６ＰＤＨ－ＭＭＡ受動被覆粒子は、１Ｍ塩化ナトリウム中、４℃で一晩、安定であることを示す。

界面活性剤中での安定性
Ｇ６ＰＤＨ－ＭＭＡ受動被覆粒子を、０．１％界面活性剤ＴＷＥＥＮ（商標）２０（ポリエチレングリコールソルビタンモノラウレート）を含むかまたは含まない緩衝液中、４℃で一晩（１２時間を超えて）インキュベートした。一晩インキュベート後、粒子をＣＡＴＡＬＹＳＴ ＤＸ（商標）ＳＤＭＡアッセイにおいて使用した。ＳＤＭＡキャリブレーターを、ＳＤＭＡと混合したイヌ血清で調製し、最終濃度を０、２０、４０、６０、８０または１００μｇ／ｄＬとした。得られた検量線を図１２に示す。データは、アッセイにおいて界面活性剤とプレインキュベートすると、Ｇ６ＰＤＨ－ＭＭＡ受動被覆粒子の性能に影響を与えなかったことを示す。

Ｇ６ＰＤＨ－ＭＭＡ、ＢＳＡ－ＭＭＡおよびＫＬＨ－ＭＭＡ受動被覆ラテックス粒子の界面活性剤耐性を比較するための別の実験を行った。各タイプのコンジュゲート被覆ラテックス粒子を、貯蔵緩衝液中、一晩、４℃で０．１％または１％Ｔｗｅｅｎ２０を用いて処置した。貯蔵緩衝液中に放出されたタンパク質を、マイクロＢＣＡキットによって測定し、粒子上に残存するコンジュゲートの百分率を決定した。表７で示すように、３つのタイプのコンジュゲートのうち、ＢＳＡ－ＭＭＡ被覆ラテックス粒子がＴｗｅｅｎ２０の存在下最も安定性が低かった。対照的に、Ｇ６ＰＤＨ－ＭＭＡ被覆ラテックス粒子は、１％Ｔｗｅｅｎ２０とインキュベートした場合でさえも、最も高い耐性を示した。ＫＬＨ－ＭＭＡ被覆粒子は界面活性剤処置に対して比較的耐性を有していたが、粒子は貯蔵中容易に凝集し、低いアッセイ精度につながった。

要約すると、詳細なさまざまな実験によって、Ｇ６ＰＤＨ－ＭＭＡ被覆ラテックス粒子が最も高い被覆効率および安定性を示したことが示される。Ｇ６ＰＤＨ－ＭＭＡ粒子も、貯蔵およびスポッティング緩衝液中で単分散のままであり、他のコンジュゲート、例えばＢＳＡ－ＭＭＡおよびＫＬＨ－ＭＭＡで被覆された粒子と比較して、最良のアッセイ性能をもたらした。

実施例１９：アッセイスライド上でのＫＬＨ－ＭＭＡの直接被覆
図１３は、スライド膜上に直接被覆されたタンパク質ＫＬＨ－ＭＭＡコンジュゲート（実施例２）を使用したＳＤＭＡ検量プロットを示す。ＫＬＨ－ＭＭＡコンジュゲート（１４．３μｇ／ｍｌ、リン酸緩衝液中、２％スクロースおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む）のアリコート３５μｌを、Ｆｕｓｉｏｎ５単層マトリックス膜（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を有する予め組み立てたスライド上に置いた（米国特許出願公開第２０１４／０３１５２１６号を参照のこと）。次いでスライドを、乾燥トンネル中、４９℃、流速７４５で３０分間乾燥した。ＳＤＭＡキャリブレーターをストリッピングしていないイヌ血清中で調製した。０．６μｇ／ｍｌでキャリブレーターを、抗ＳＤＭＡ－ＨＲＰコンジュゲートとともに、室温で２分間インキュベートした。２つの混合物のアリコート１１μＬをスライドに適用した。固相を洗浄緩衝液９μＬで３回洗浄した。２つのＴＭＢ基質のアリコート１１．５μＬを添加した。次いでスライドのＯＤを、６４５ｎＭにおいて０．５秒間隔で２分間読み取った。プロット上の各点は、３回繰り返した実験の結果の平均を表す。

上記の例は、例示にすぎず、本開示の全ての可能な実施形態、適用または改良の網羅的な列挙を意味するものではない。したがって、本開示の記載の方法およびシステムの開示の範囲および趣旨から逸脱することのないさまざまな改良および変形は、当業者であれば明らかであろう。本開示は、具体的な実施形態に関して記載してきたが、特許請求する開示は、そのような具体的な実施形態に過度に限定されるべきではないことを理解されたい。実際に、分子生物学、免疫学、化学、生化学または関連分野における当業者であれば自明である本開示を行うために記載する様式のさまざまな改良は、添付の特許請求の範囲の範囲内であることを意図する。

本開示は、当業者であれば理解するはずであるが、変更される場合があるため、本明細書に記載の特定の方法論、プロトコール、および試薬などに限定されるものではないことを理解されたい。本明細書において使用する専門用語は、特定の実施形態を説明する目的のみで使用し、本開示の範囲を限定することを意図しないことも理解されたい。本明細書および添付の特許請求の範囲において使用する単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに別段の指示がない限り、複数の指示対象を含むことも留意されたい。したがって、例えば「ａ ｌｉｎｋｅｒ」は、１つまたは複数のリンカーおよび当業者であれば既知の等価物への言及である。

別段の定義がない限り、本明細書において使用する全ての技術および科学用語は、本開示が関連する当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。本開示の実施形態ならびにそのさまざまな特徴および有利な詳細は、非限定的な実施形態を参照しながらより十分に説明し、および／または添付の図面で示し、以下の説明で詳細に示す。図面に示す特徴は、必ずしも一定のスケールで描かれているわけではなく、１つの実施形態の特徴は、本明細書において明確に規定されていなかったとしても、当業者であれば理解するであろう通りに他の実施形態とともに用いてもよい点に留意されたい。

本明細書において挙げられる任意の数値は、１単位の増加で、下限値から上限値まで全ての値を含み、ただし任意の下限値と任意の上限値との間に少なくとも２単位の間隔が存在するものとする。例として、本明細書において構成成分の濃度またはプロセス変数の値、例えばサイズ、角度サイズ、圧力、時間などが、例えば１から９０、特に２０から８０、より具体的には３０から７０であると規定される場合、値、例えば１５から８５、２２から６８、４３から５１、３０から３２などが明示的に列挙されることを意図する。１未満の値に関しては、１単位は０．０００１、０．００１、０．０１または０．１であると必要に応じて考えられる。これらは特に意図するものの例にすぎず、列挙される下限値と上限値との間の全ての可能な数値の組合せは、同様の様式で本出願において明示的に規定されると考えられたい。

特定の方法、デバイス、および材料が記載されているが、本明細書に記載のものと同様のまたは同等の任意の方法および材料を本開示の実施または試験において使用することができる。前述の全ての参考文献および刊行物の開示は、それぞれが参照により個々に込まれたかのように、その全体が参照により同程度に明示的に組み込まれるものとする。

Claims (28)

1. 試料中の対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）を決定する方法であって、
   （ａ）試料と、標識にコンジュゲートされた抗ＳＤＭＡ抗体を含む標識コンジュゲートとを含む混合物を形成することと；
   （ｂ）混合物を、固体マトリックスであって、それに非拡散的に結合している捕捉試薬を含む固体マトリックスを含むデバイスと接触させることであって、捕捉試薬が、粒子に結合しているタンパク質に結合したアルギニン誘導体を含み、アルギニン誘導体が、非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）、Ｌ－アルギニン、Ｎ－メチルアルギニン（ＭＭＡ）、アシル化ＳＤＭＡ、アシル化ＡＤＭＡ、アシル化Ｌ－アルギニン、およびアシル化ＭＭＡからなる群から選択されること、ここで、抗ＳＤＭＡ抗体がＳＤＭＡに対する親和性よりも低いアルギニン誘導体に対する親和性を有する、と；
   （ｃ）固体マトリックスを洗浄し、固体マトリックスに未結合のコンジュゲートを除去することと；
   （ｄ）固体マトリックスと結合した標識の量を測定し、試料中のＳＤＭＡの存在または量を決定することと
   を含む方法。
2. 抗ＳＤＭＡ抗体がＳＤＭＡに対する親和性よりも２５％より低いアルギニン誘導体に対する親和性を有する、請求項１に記載の方法。
3. 試料と標識にコンジュゲートされた抗ＳＤＭＡ抗体を含む標識コンジュゲートとを含む混合物を接触させることによって試料中の対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）を決定するための固体マトリックスであって、それに非拡散的に結合している捕捉試薬を含む固体マトリックスを含むデバイスであって、捕捉試薬が、粒子に結合しているタンパク質に結合したアルギニン誘導体を含み、ここでアルギニン誘導体は非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）、Ｌ－アルギニン、Ｎ－メチルアルギニン（ＭＭＡ）、アシル化ＳＤＭＡ、アシル化ＡＤＭＡ、アシル化Ｌ－アルギニン、およびアシル化ＭＭＡからなる群から選択され、ここで、抗ＳＤＭＡ抗体がＳＤＭＡに対する親和性よりも低いアルギニン誘導体に対する親和性を有する、デバイス。
4. タンパク質が粒子に共有結合している、請求項３に記載のデバイス。
5. タンパク質が粒子に非共有結合している、請求項３に記載のデバイス。
6. タンパク質が、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、オボアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、およびグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）のうちの少なくとも１つである、請求項３に記載のデバイス。
7. 固体マトリックスが多孔質マトリックスである、請求項３に記載のデバイス。
8. 固体マトリックスが、カートリッジまたはハウジングに配置されている、請求項３に記載のデバイス。
9. 粒子に結合しているタンパク質に結合しているＮ－メチルアルギニン（ＭＭＡ）またはアシル化ＭＭＡを含む、補足試薬を含むデバイスを用いて、試料と標識にコンジュゲートされた抗ＳＤＭＡ抗体を含む標識コンジュゲートとを含む混合物を接触させることによって試料中の対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）を決定するための捕捉試薬。
10. タンパク質が、粒子に共有結合している、請求項９に記載の捕捉試薬。
11. タンパク質が粒子に非共有結合している、請求項９に記載の捕捉試薬。
12. タンパク質が、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、オボアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、およびグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）のうちの少なくとも１つである、請求項９～１１のいずれか一項に記載の捕捉試薬。
13. 試料中のＳＤＭＡを決定するためのキットであって、請求項３～８のいずれか一項に記載のデバイスと標識にコンジュゲートされた抗ＳＤＭＡ抗体を含むコンジュゲートとを含み、捕捉試薬に対する抗ＳＤＭＡ抗体の親和性が、ＳＤＭＡに対する抗体の親和性の２５％未満である、キット。
14. 試料中のＳＤＭＡを決定するためのキットであって、請求項９～１２のいずれか一項に記載の捕捉試薬を含む固体マトリックスと標識にコンジュゲートされた抗ＳＤＭＡ抗体を含むコンジュゲートとを含み、捕捉試薬に対する抗ＳＤＭＡ抗体の親和性が、ＳＤＭＡに対する抗体の親和性の約２５％未満である、キット。
15. Ｎ－メチルアルギニン（ＭＭＡ）、アシル化ＭＭＡ、非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）およびアシル化ＡＤＭＡからなる群から選択されるアルギニン誘導体を含む、試料と標識にコンジュゲートされた抗ＳＤＭＡ抗体を含む標識コンジュゲートとを含む混合物を接触させることによって試料中の対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）を決定するための固相であって、アルギニン誘導体がＧ６ＰＤＨに共有結合しており、Ｇ６ＰＤＨが粒子に非共有結合している、固相。
16. 多孔質マトリックスを更に含む、請求項１５に記載の固相。
17. 多孔質マトリックスがハウジングに取り付けられている、請求項１６に記載の固相。
18. アルギニン誘導体に結合した抗ＳＤＭＡ抗体を更に含み、抗体のアルギニン誘導体に対する親和性がＳＤＭＡに対するものよりも低い、請求項１７に記載の固相。
19. アルギニン誘導体に対する抗ＳＤＭＡ抗体の親和性が、ＳＤＭＡに対する抗体の親和性の約２５％未満である、請求項１８に記載の固相。
20. 抗ＳＤＭＡ抗体が標識されている、請求項１５に記載の固相。
21. 固体マトリックスに固相化されたＮ－メチルアルギニン（ＭＭＡ）、アシル化ＭＭＡ、非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）、またはアシル化ＡＤＭＡからなる群から選択されるメチル化アルギニン誘導体を含む、試料と標識にコンジュゲートされた抗ＳＤＭＡ抗体を含む標識コンジュゲートとを含む混合物を固体マトリックスと接触させることによって試料中の対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）を決定するための組成物であって、メチル化アルギニン誘導体が粒子に非共有結合しているタンパク質に共有結合しており、それは固体マトリックスに非拡散的に結合している、メチル化アルギニン誘導体が抗ＳＤＭＡ抗体と複合体を形成しており、ここで、抗体のアルギニン誘導体に対する親和性が溶液中のＳＤＭＡに対するものよりも低い、組成物。
22. アルギニン誘導体に対する抗ＳＤＭＡ抗体の親和性が、溶液中のＳＤＭＡに対する抗体の親和性の約２５％未満である、請求項２１に記載の組成物。
23. 抗ＳＤＭＡ抗体が標識されている、請求項２１に記載の組成物。
24. タンパク質が、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、オボアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、およびグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）からなる群から選択される、請求項２１に記載の組成物。
25. タンパク質がウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、オボアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、およびグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）のうちの少なくとも１つである、請求項１または２に記載の方法。
26. 固体マトリックスが多孔質マトリックスである、請求項１または２に記載の方法。
27. 固体マトリックスがカートリッジまたはハウジングに配置されている、請求項１または２に記載の方法。
28. アルギニン誘導体が粒子に結合したＮ－メチルアルギニン（ＭＭＡ）、アシル化ＭＭＡである、請求項１または２に記載の方法。