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JP7393328B2 - マイクロ流体を使用した治療的に活性な細胞を調製する方法 - Google Patents

マイクロ流体を使用した治療的に活性な細胞を調製する方法 Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
この出願は、２０１７年９月１日に出願された米国仮特許出願第６２／５５３，７２３号の恩典；２０１７年１０月３日に出願された米国仮特許出願第６２／５６７，５５３号の恩典；２０１８年２月２６日に出願された仮特許出願第６２／６３５，３０４号の恩典；および２０１８年４月１２日に出願された仮特許出願第６２／６５６，９３９号の恩典を主張し、加えて、本願は、２０１７年１０月２３日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０５７８７６の一部継続出願である。これらの先行出願は全て、全体として参照により本明細書に組み入れられている。
連邦支援研究に関する言明
この発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈにより授与された認可番号ＣＡ１７４１２１および番号ＨＬ１１０５７４による政府支援でなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
本発明は、治療用の細胞および組成物を調製する方法に、主として向けられる。その方法は、サイズに基づいて細胞を分離するマイクロ流体デバイスを使用する。
細胞治療、特にＣＡＲ－Ｔ細胞治療は、Ｂ細胞急性リンパ性白血病（B-ALL）およびＢ細胞リンパ腫などのＢ細胞疾患を処置することにおいて並外れた効力を示している。結果として、自己治療の需要が劇的に増加しており、開発の努力は、神経膠芽腫などの固形腫瘍により特徴づけられる癌に焦点を合わせるように広げられている（Vonderheide, et al., Immunol. Rev. 257:7-13 (2014); Fousek, et al., Clin. Cancer Res. 21:3384-3392 (2015); Wang, et al., Mol. Ther. Oncolytics 3:16015 (2016); Sadelain, et al., Nature 545:423-431 (2017)）。焦点を向けられた、幹細胞などの自己細胞の集団におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ－９を用いての標的化遺伝子編集は、さらに需要を喚起し得る（Johnson, et al., Cancer Cell Res. 27:38-58 (2017)）。
個別治療のための細胞の調製は、通常、血液バンキングから適合させた手順、または治療適用にはあまり適していないタンパク質バイオプロセス手順に頼る労働集約的なプロセスである。部分的に、細胞特異的分離（Powell, et al., Cytotherapy 11:923-935 (2009); TerumoBCT. ELUTRA Cell Separation System. Manufacturer recommendations for the Enrichment of Lymphocytes from Apheresis Residues）を達成するが、それを細胞生存率および収率を犠牲にして行う（Chiche-Lapierre, Cytotherapy 18(6):S47 (2016)）調製を用いるプロセスのために、処理工程に関連した細胞損失は、典型的にはかなりある（Hokland, et al., Scand. J. Immunol. 11:353-356 (1980); Stroncek, et al., J. Transl. Med. 12:241 (2014)）。したがって、より効率的なプロセスの必要性がある。
本発明は、とりわけ、細胞、特に、治療的用途がある細胞を収集し、かつ迅速に処理する方法に向けられる。その方法の多くは、流体フローの方向からわずかな角度で傾斜している、特別にデザインされた、マイクロポストアレイを含有するマイクロ流体デバイスを通して試料を流すことを含むプロセスである、決定論的横置換（ＤＬＤ）に頼る（Davis, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:14779-14784 (2006); Inglis, et al., Lab Chip 6:655-658 (2006); Chen, et al., Biomicrofluidics. 9(5):054105 (2015)）。マイクロポストアレイの標的サイズより大きい細胞は、マイクロポストによりクリーンバッファー流へ優しく偏向され（「バンピング」され）、より小さい、偏向されなかった細胞および粒子から効果的に分離され得、その上、傷つけることがないプロセスにおいて、細胞を同時に洗浄し得る。細胞処理に関してのＤＬＤの有利な特徴は表１に記載されている。
標的細胞を操作するための方法
それの第１の態様において、本発明は、標的細胞集団を遺伝子操作する方法に向けられる。これは、マイクロ流体デバイス上で決定論的横置換（ＤＬＤ）を実施することにより、標的細胞を粗流体組成物から単離することにより行われる。そのデバイスは、試料注入口から１つまたは複数の流体出口へ延び、かつ第１の壁およびその第１の壁と反対側の第２の壁によって囲まれている、少なくとも１つのチャネルの存在により特徴づけられる。障害物のアレイは、チャネルにおいて、いくつもの行（row）をなして配列され、障害物のそれぞれの次の行が、前の行に対して横方向へシフトしている。その障害物は、粗流体組成物がデバイスの注入口にアプライされ、チャネルを通過する時、標的細胞が、濃縮された産物が収集される１つまたは複数の収集出口へ流れ、混入細胞または粒子は、収集出口から切り離されているもう１つの廃棄物出口へ流れるような様式で配置されている。いったん標的細胞が、デバイスを用いて精製されたならば、それらは、その細胞に所望の表現型を付与するように、例えば、キメラ分子（好ましくは、治療上の価値のある細胞にするタンパク質）を発現するように設計された核酸をトランスフェクションまたは形質導入される。その後、細胞集団は、インビトロ（in vitro）での培養により増殖され得る。培養および増殖された時、所望の表現型を示す組換え的に操作された標的細胞の収率は、ＤＬＤに供されていない同一の細胞（特に、Ｆｉｃｏｌｌ遠心分離に曝されたが、ＤＬＤには曝されなかった細胞）より、好ましくは、少なくとも１０％高く、より好ましくは、少なくとも２０％、３０％、４０％、または５０％高い。
好ましい実施形態において、粗流体組成物は、血液、より好ましくは、患者の血液にアフェレーシスまたは白血球アフェレーシスを実施することにより取得されている白血球の調製物である。好ましい標的細胞には、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単球、および前駆細胞が挙げられ、Ｔ細胞（特に、ナチュラルキラーＴ細胞）が最も好ましい。白血球はさておき、他の細胞型、例えば、樹状細胞または幹細胞もまた、標的細胞としての役割を果たし得る。
一般的に、標的細胞を含有する粗流体組成物は、凍結することなしに（少なくとも、それらが遺伝子操作される時点まで）、かつ収集される現地で処理される。粗流体組成物は、好ましくは、患者の血液であり、より好ましくは、そのような血液にアフェレーシスまたは白血球アフェレーシスを実施した結果として得られた白血球を含有する組成物である。しかしながら、用語「粗流体組成物」はまた、リンパ液または滑液などの体液、加えて、骨髄または他の組織から調製された流体組成物も含む。粗流体組成物はまた、腫瘍または他の異常組織に由来し得る。
標的細胞が、遺伝子操作される前に、担体に結合していることは必須ではないが、ＤＬＤが初めて実施される前かまたは後のいずれかに（好ましくは、前に）、それらに、１つまたは複数の担体を結合させることは好ましい。これが生じる正確な手段は本発明にとって重要ではないが、結合は、「ＤＬＤ分離を促進するように」行われるべきである。本関連において用いられる場合、この用語は、その方法が、特定の標的細胞型に対する特異性を示し、結合していない細胞に対してその複合体のサイズの少なくとも２μｍ（およびあるいは、パーセンテージとして表現される場合、少なくとも２０％、５０％、１００％、２００％、５００％、または１０００％）の増加を提供し、治療または他の用途が遊離型標的細胞を必要とする場合、標的細胞が、複合体から、化学的または酵素的切断、化学的溶解、消化により、他の結合剤との競合により、例えばピペットを用いて、ずり応力を生じる、物理的剪断により、または他の手段により、放出されることを可能にする、結合を最終的に生じなければならないことを意味する。
好ましい実施形態において、担体は、担体が特異性を以て、標的細胞と直接、結合することを可能にする親和性物質（例えば、抗体、アクチベーター、ハプテン、アプタマー、核酸配列、または他の化合物）を表面上に有する。あるいは、標的細胞と担体の両方と、特異性を以て結合する中間のタンパク質、細胞、または他の作用物質が存在し得る。例えば、標的細胞上の表面抗原を認識し、しかも、担体とも特異性を以て（例えば、担体表面上の第２の抗体のその存在、アビジン／ビオチン結合、またはいくつかの他の類似した相互作用により）結合する抗体が、用いられ得る。加えて、標的細胞は、他の細胞と特異性を以て相互作用して、複合体を形成する場合もあり、そのように行うことにおいて、その他の細胞は、生物学的担体としての役割を果たし得、すなわち、それらは、標的細胞の有効サイズを増加させ得、それにより、複合体化していない細胞からのそれの分離を容易にし得る。例えば、ヒトＴ細胞は、ヒツジ赤血球または自己ヒト赤血球と相互作用して、細胞のロゼットを形成し得、それは、その後、複合体として精製することができる。あるいは、他の担体が、そのようなロゼットにおける細胞と、特異性を以て結合して、サイズに基づいた分離をさらに促進し得る。
この関連において用いられる場合、語「特異性」は、粗流体組成物において、結合した非標的細胞の１個に対して、少なくとも１００個（好ましくは、少なくとも１０００個）の標的細胞が担体により結合するだろうことを意味する。担体がＤＬＤ後に結合する場合、その結合は、標的細胞が遺伝子操作される前または後に生じ得る。
担体の結合は、細胞を安定化し、それらを活性化する（例えば、分裂するために）のに役立ち得、または１つの型の細胞の別の型の細胞からの単離を促進するのに役立ち得る。上記で示唆されているように、担体の細胞との結合は、本方法において様々な時点で起こり得、その時点には、細胞が取得されている最中の時間の間が挙げられる。分離を向上させるために、担体は、単一担体の１個の細胞との結合が細胞単独のサイズより実質的に大きい担体－細胞の複合体を生じるように選択され得る。あるいは、標的細胞より小さい担体が、用いられ得る。この場合、数個の担体が、１個の細胞と特異性を以て結合し、それにより、１個の細胞および複数の担体を有する複合体を形成することが好ましい。ＤＬＤ中、複合体化標的細胞は、類似したサイズを有する非複合体化細胞から分離されて、さもなければ起こらなかっただろう精製を提供し得る。
そのような分離を達成するために、その複合体の直径は、好ましくは、非複合体化標的細胞より少なくとも２０％長く、より好ましくは、少なくとも５０％長く、少なくとも２倍の長さ、または少なくとも１０倍の長さであるべきである。上記で言及されているように、このサイズの増加は、単一の大きい担体の標的細胞との結合によるか、または数個のより小さい担体の結合によるかのいずれかであり得る。これは、ａ）標的細胞の直径と少なくとも同じ（または他の実施形態において、少なくとも２倍もしくは少なくとも１０倍の）長さの直径を有する担体のみ；ｂ）標的細胞の直径の５０％以下（または他の実施形態において、２５％以下もしくは１５％以下）の長さの直径を有する担体のみ；またはｃ）これらのサイズ特徴を有する大きい担体および小さい担体の混合物（例えば、標的細胞と少なくとも同じ（または少なくとも２倍もしくは１０倍の）長さの直径を有する担体の１つの群および標的細胞の直径の５０％以下（または２５％以下もしくは１５％以下）の長さの直径を有する担体の第２の群が存在し得る）を用いて、達成され得る。典型的には、担体は、１～１０００μｍ（多くの場合、５～６００μｍまたは５～４００μｍの範囲）の直径を有する。理想的には、複合体は、複合体のサイズより低いが、非複合体化非標的細胞または混入物のサイズより高い臨界サイズを有する障害物のアレイを有するマイクロ流体デバイス上でのＤＬＤにより、他の細胞または混入物から分離されるだろう。
加えて、担体は、この技術によりＤＬＤによる分離を直接的に促進するというよりむしろ、「ＤＬＤ分離を補完する」ように働き得る。例えば、担体（例えば、ヤヌスまたはイチゴ様粒子）は、化学的、電気化学的、または磁気的性質などのすぐに使用可能な示差的な、サイズに関係しない二次的性質を支援し、かつそれらが結合する細胞へ与える２つ以上の異なる化学的性質を含み得、これらの性質は下流プロセスにおいて用いられ得る。したがって、その粒子は、磁気分離、エレクトロポレーション、または遺伝子移入を容易にするように用いられ得る。それらはまた、例えば代謝または再生に関する、細胞の性質の有利な変化を与え得る。
特に重要な実施形態において、担体の結合は、特定の白血球、特に、ナチュラルキラーＴ細胞を含むＴ細胞を他の白血球、例えば、顆粒球および単球から、ならびに／または他の細胞から、分離する手段として用いられ得る。これは、例えば、ＤＬＤが、担体に結合していない標的細胞に、標的細胞より小さい臨界サイズを有する障害物のアレイを用いて、実施され、ならびにまた、標的細胞および担体を含む複合体に、その複合体より小さいが、非複合体化細胞より大きい臨界サイズを有する障害物のアレイを用いて、実施される、２段階プロセスで、行われ得る。ＤＬＤ工程は、いずれの順序でも実施することができ、すなわち、ＤＬＤは、非複合体化標的細胞に実施される前または後に、複合体に実施され得る。
粗流体組成物の取得が完了した時点から、標的細胞が初めて担体に結合するまで、４時間より長く（好ましくは、３時間より長く、２時間より長く、または１時間より長く）経過するべきではない。加えて、粗流体組成物の取得が完了した時点から、初めて標的細胞がトランスフェクションまたは形質導入される時点まで、５時間より長く（好ましくは、４時間より長く、３時間より長く、または２時間より長く）経過するべきではない。
特に好ましい実施形態において、上記の方法における標的細胞は、Ｔ細胞（特に、ナチュラルキラーＴ細胞およびメモリーＴ細胞）であり、これらは、表面上にキメラ抗原受容体を発現するように操作される。これらのＣＡＲ Ｔ細胞を作製するための手順は、下記でより具体的に記載されている。
ＣＡＲ Ｔ細胞を作製するための方法
本発明は、Ｔ細胞（特に、ナチュラルキラーＴ細胞およびメモリーＴ細胞）を含む粗流体組成物を取得し、マイクロ流体デバイスを用いて、前記組成物にＤＬＤを実施することにより、ＣＡＲ Ｔ細胞を作製する方法を含む。一般的に、Ｔ細胞を含む粗流体組成物は、患者の血液に由来し、かつ白血球を含有するアフェレーシスまたは白血球アフェレーシス産物である。
マイクロ流体デバイスは、試料注入口から１つまたは複数の流体出口へ延びる少なくとも１つのチャネルを有しなければならず、そのチャネルは、第１の壁およびその第１の壁と反対側の第２の壁によって囲まれている。障害物のアレイは、チャネルにおいて、いくつもの行をなして配列され、障害物のそれぞれの次の行が、前の行に対して横方向へシフトしている。これらの障害物は、Ｔ細胞を含む粗流体組成物がデバイスの注入口にアプライされ、流体的にチャネルを通過する時、Ｔ細胞が、濃縮された産物が収集される１つまたは複数の収集出口へ流れ、Ｔ細胞とは異なる（一般的には、より小さい）サイズの他の細胞（例えば、赤血球および血小板）または他の粒子は、収集出口から切り離されているもう１つの廃棄物出口へ流れるような様式で配置されている。いったん取得されたならば、そのＴ細胞は、当技術分野において十分、確立された手順を用いて、表面上にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を産生するように遺伝子操作される。これらの受容体は、一般的に、疾患または異常な状態に関連した細胞の表面上にある抗原を結合するはずである。例えば、その受容体は、癌細胞の表面に固有であり、またはそこに過剰発現している抗原を結合し得る。この点において、ＣＤ１９は、そのような抗原である場合がある。
ＣＡＲ発現Ｔ細胞の遺伝子操作は、一般的に、Ｔ細胞に核酸をトランスフェクションまたは形質導入することを含み、いったん作製されたならば、ＣＡＲ Ｔ細胞は、その細胞をインビトロで成長させることにより、数が増加し得る。アクチベーターまたは他の因子が、このプロセス中に加えられて、成長を促進し得、用いられ得るその作用物質の中には、ＩＬ－２およびＩＬ－１５がある。ＤＬＤ、組換え操作、および増殖後の、表面上にキメラ受容体を発現するＴ細胞の収率は、いくつかの実施形態において、ＤＬＤに供されていないこと以外は同じ様式で調製されたＴ細胞より少なくとも１０％高いはずであり、好ましくは、少なくとも２０％、３０％、４０％、または５０％高い。同様に、いくつかの実施形態において、表面上にキメラ受容体を発現するＴ細胞の収率は、Ｆｉｃｏｌｌ遠心分離により単離され、かつＤＬＤに供されていないＴ細胞より少なくとも１０％高いはずであり、好ましくは、少なくとも２０％、３０％、４０％、または５０％高い。
キメラ受容体は、典型的には、ａ）抗原結合ドメインを有する細胞外領域、ｂ）膜貫通領域、およびｃ）細胞内領域を有する。その細胞はまた、トリガーされた時、ＣＡＲ Ｔ細胞の数または活性を低下させる分子スイッチをその細胞に提供する配列で組換え的に操作され得る。好ましい実施形態において、抗原結合ドメインは、モノクローナル抗体の重鎖と軽鎖の両方の抗原結合領域由来の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。好ましくは、細胞外領域と膜貫通領域を接続する２～２０個のアミノ酸のヒンジ領域もまた存在する。膜貫通領域は、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８、またはＣＤ２８タンパク質配列を有し得、細胞内領域は、典型的にはＣＤ３ζ、ＣＤ１３７、またはＣＤ２８に由来した、シグナル伝達ドメインを有するべきである。活性を制御または刺激するように働く他のシグナル伝達配列もまた含まれ得る。
Ｔ細胞を含む粗流体組成物を取得した後、またはそれらが収集されている最中の時間の間、Ｔ細胞に、上記で論じられた理由により、ＤＬＤ分離を促進するように、１つまたは複数の担体を結合させ得る。これは、好ましくは、ＤＬＤを実施する前に行われる。しかしながら、それはまた、ＤＬＤを実施した後で、かつ細胞が初めてトランスフェクションまたは形質導入される前または後のいずれかで、起こってもよい。好ましい実施形態において、担体は、Ｔ細胞、好ましくは、ナチュラルキラーＴ細胞と特異性を以て結合する親和性物質（例えば、抗体、アクチベーター、ハプテン、またはアプタマー）を表面上に含むべきである。この関連において用いられ場合、用語「特異性」は、担体が、組成物中のいかなる他の細胞と比較しても、所望のＴ細胞と優先的に結合することを意味する。例えば、担体は、それが異なる型の細胞を結合する事例ごとに、１００個または１０００個のＣＤ８＋ Ｔ細胞と結合し得る。
いくつかの実施形態において、担体は、球状の形をとり得、コラーゲン、ポリスチレンを含む多糖、アクリルアミド、アルギン酸塩、および磁性材料を含む、生物学的かまたは合成的かのいずれかの材料で作られ得る。加えて、担体は、ＤＬＤ分離を補完するように、働き得る。
分離を達成することを助けるために、Ｔ細胞と担体の間で形成された複合体の直径は、好ましくは、非複合体化Ｔ細胞より少なくとも２０％長く、好ましくは、少なくとも５０％長く、少なくとも２倍の長さ、または少なくとも１０倍の長さであるべきである。このサイズの増加は、単一の大きい担体の標的細胞との結合によるか、または数個のより小さい担体の結合によるかのいずれかであり得る。結合は、ａ）Ｔ細胞の直径と少なくとも同じ（または他の実施形態において、少なくとも２倍、もしくは少なくとも１０倍の）長さの直径を有する担体のみ；ｂ）Ｔ細胞の直径の５０％以下（または他の実施形態において、２５％以下もしくは１５％以下）の長さの直径を有する担体のみ；またはｃ）これらのサイズ特徴を有する大きい担体および小さい担体の混合物（例えば、Ｔ細胞と少なくとも同じ（または少なくとも２倍もしくは１０倍の）長さの直径を有する担体の１つの群およびＴ細胞の直径の５０％以下（または２５％以下もしくは１５％以下）の長さの直径を有する担体の第２の群が存在し得る）を用いることを含み得る。典型的には、担体は、１～１０００μｍ（多くの場合、５～６００μｍまたは５～４００μｍの範囲）の直径を有する。理想的には、複合体は、複合体のサイズより低いが、非複合体化非標的細胞または混入物のサイズより高い臨界サイズを有する障害物のアレイを有するマイクロ流体デバイス上でのＤＬＤにより、非複合体化細胞または混入物から分離されるだろう。
標的細胞に関して上記で論じられているように、Ｔ細胞の精製は、２段階プロセスを含み得る。例えば、ＤＬＤは、Ｔ細胞より小さい臨界サイズを有する障害物のアレイを用いて、担体と結合していないＴ細胞に実施され得る。その後、他の細胞または粒子と一緒に、その分離されたＴ細胞を含有する組成物を回収し、ＤＬＤ分離を促進するように、１つまたは複数の担体と結合させ得、その場合、Ｔ細胞は特異性を以て結合する。その後、それにより形成された複合体は、複合体より小さいが、非複合体化細胞より大きい臨界サイズを有する障害物のアレイにおいて分離され得る。原理的には、ＤＬＤ工程は、いずれの順序でも実施することができ、すなわち、それは、最初に複合体に、または最初に非複合体化Ｔ細胞に、実施され得る。
好ましくは、Ｔ細胞を含む粗流体組成物の取得が完了した時点から（例えば、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシスが完了した時点から）、Ｔ細胞に担体を結合させるまで、４時間より長く（より好ましくは、３時間より長く、２時間より長く、または１時間より長く）経過するべきではない。加えて、Ｔ細胞の取得が完了した時点から、初めてＴ細胞がトランスフェクションまたは形質導入される時点まで、５時間より長く（好ましくは、４時間より長く、３時間より長く、または２時間より長く）経過するべきではない。理想的には、ＣＡＲ Ｔ細胞を作製することにおける全工程は、そのＴ細胞を含む粗流体組成物が取得される同じ施設で実施され、全工程は、４時間以内（好ましくは、３時間以内）で、かつその細胞を凍結することなく、完了する。
ＣＡＲ Ｔ細胞を用いる、癌、自己免疫疾患、または感染性疾患の処置
別の態様において、本発明は、癌細胞抗原、または自己免疫疾患もしくは感染性疾患の原因であり、またはそれに寄与する細胞上の抗原を認識するキメラ抗原受容体を発現するように操作されたＣＡＲ Ｔ細胞を投与することにより、患者を癌、自己免疫疾患、または感染性疾患について処置する方法に向けられる。ＣＡＲ Ｔ細胞は、上記のセクションで論じられた方法を用いて、すなわち、Ｔ細胞を含む粗流体組成物（好ましくは、患者から引き出された白血球含有アフェレーシスまたは白血球アフェレーシス産物）を取得し、その後、マイクロ流体デバイスを用いてその組成物にＤＬＤを実施することにより、作製され得る。その後、この様式で回収されたＣＡＲ Ｔ細胞（好ましくは、ナチュラルキラーＴ細胞およびメモリーＴ細胞）は、その細胞をインビトロで成長させることにより、増殖される。最後に、その細胞は、患者に投与され、その患者は、一般的に、そのＴ細胞が単離された血液を提供した同じ患者であるべきである。
好ましくは、ＤＬＤ、組換え操作、および増殖後の、表面上にキメラ受容体を発現するＴ細胞の収率は、ＤＬＤに供されていないこと以外は同じ様式で調製されたＴ細胞より少なくとも１０％高く、より好ましくは、少なくとも２０％、３０％、４０％、または５０％高い。例えば、表面上にキメラ受容体を発現するＴ細胞の収率は、Ｆｉｃｏｌｌ遠心分離により単離され、かつＤＬＤに供されていないＴ細胞より少なくとも１０％高くてもよい、好ましくは、少なくとも２０％、３０％、４０％、または５０％高くてもよい。
キメラ受容体は、典型的には、少なくとも、ａ）抗原結合ドメインを有する細胞外領域、ｂ）膜貫通領域、およびｃ）細胞内領域を有する。その細胞はまた、トリガーされた時、ＣＡＲ Ｔ細胞の数または活性を低下させる分子スイッチをその細胞に提供する配列で組換え的に操作され得る。好ましい実施形態において、抗原結合ドメインは、モノクローナル抗体の重鎖と軽鎖の両方の抗原結合領域由来の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。細胞外領域と膜貫通領域を接続する２～２０個のアミノ酸のヒンジ領域もまた存在する。膜貫通領域自体は、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８、またはＣＤ２８タンパク質配列を有し得、細胞内領域は、典型的にはＣＤ３ζおよび／またはＣＤ２８細胞内ドメインに由来した、シグナル伝達ドメインを有する。活性を制御または刺激するように働く他のシグナル伝達配列もまた含まれ得る。
粗流体組成物を取得した後、または粗流体組成物が収集されている最中の時間の間、その組成物に存在するＴ細胞に、ＤＬＤ分離を促進または補完するように、１つまたは複数の担体を結合させ得る。これは、好ましくは、ＤＬＤを実施する前に行われる。しかしながら、それはまた、ＤＬＤを実施した後で、かつ細胞が遺伝子操作される前または後のいずれかで、起こってもよい。好ましくは、その結合は、ＤＬＤ分離を促進し、担体は、その表面上に、Ｔ細胞、特にナチュラルキラーＴ細胞と特異性を以て結合する抗体、アクチベーター、または他の作用物質を含む。この関連において用いられ場合、用語「特異性」は、担体が、組成物中のいかなる他の細胞と比較しても、所望のＴ細胞と優先的に結合することを意味する。例えば、担体は、他の型の細胞と結合する担体あたり、１００個または１０００個のＣＤ８＋ Ｔ細胞と結合し得る。
Ｔ細胞と担体の間で形成された複合体の直径は、好ましくは、非複合体化Ｔ細胞より少なくとも２０％長く、より好ましくは、少なくとも５０％長く、少なくとも２倍の長さ、または少なくとも１０倍の長さであるべきである。このサイズの増加は、単一の大きい担体の細胞との結合によるか、または数個のより小さい担体の結合によるかのいずれかであり得る。結合は、ａ）Ｔ細胞の直径と少なくとも同じ（または他の実施形態において、少なくとも２倍、もしくは少なくとも１０倍の）長さの直径を有する担体のみ；ｂ）Ｔ細胞の直径の５０％以下（または他の実施形態において、２５％以下もしくは１５％以下）の長さの直径を有する担体のみ；またはｃ）これらのサイズ特徴を有する大きい担体および小さい担体の混合物（例えば、Ｔ細胞と少なくとも同じ（または少なくとも２倍もしくは１０倍の）長さの直径を有する担体の１つの群およびＴ細胞の直径の５０％以下（または２５％以下もしくは１５％以下）の長さの直径を有する担体の第２の群が存在し得る）を用いることを含み得る。典型的には、担体は、１～１０００μｍ（多くの場合、５～６００μｍまたは５～４００μｍの範囲）の直径を有する。理想的には、複合体は、複合体のサイズより低いが、非複合体化非標的細胞または混入物のサイズより高い臨界サイズを有する障害物のアレイを有するマイクロ流体デバイス上でのＤＬＤにより、非複合体化細胞または混入物から分離されるだろう。
Ｔ細胞の精製は、２段階プロセスを含み得る。例えば、ＤＬＤは、Ｔ細胞より小さい臨界サイズを有する障害物のアレイを用いて、担体と結合していないＴ細胞に実施され得る。その後、他の細胞または粒子と一緒に、その分離されたＴ細胞を含有する組成物を回収し、ＤＬＤ分離を促進するように、１つまたは複数の担体と結合させ得、その場合、Ｔ細胞は特異性を以て結合する。その後、それにより形成された複合体は、複合体より小さいが、非複合体化細胞より大きい臨界サイズを有する障害物のアレイにおいて分離され得る。原理的には、ＤＬＤ工程は、いずれの順序でも実施することができ、すなわち、それは、最初に複合体に、または最初に非複合体化Ｔ細胞に、実施され得る。
好ましくは、Ｔ細胞の取得が完了した時点から（例えば、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシスが完了した時点から）、Ｔ細胞に担体を結合させるまで、４時間より長く（より好ましくは、３時間より長く、２時間より長く、または１時間より長く）経過するべきではない。加えて、Ｔ細胞の取得が完了した時点から、初めてＴ細胞がトランスフェクションまたは形質導入される時点まで、５時間より長く（好ましくは、４時間より長く、３時間より長く、または２時間より長く）経過するべきではない。理想的には、ＣＡＲ Ｔ細胞を作製することにおける全工程は、Ｔ細胞を含む粗流体組成物が取得される同じ施設で実施され、全工程は、４時間以内（好ましくは、３時間以内）で完了する。
このようにして作製されたＣＡＲ Ｔ細胞は、臨床医学の分野において十分、確立された手順を用いて、白血病、例えば、急性リンパ芽球性白血病について患者を処置することに用いられ得、これらの場合において、ＣＡＲは、腫瘍抗原としてＣＤ１９またはＣＤ２０を認識し得る。方法はまた固形腫瘍について用いられ得、その場合において、認識される抗原には、ＣＤ２２；ＲＯＲＩ；メゾテリン；ＣＤ３３／ＩＬ３Ｒａ；ｃ－Ｍｅｔ；ＰＳＭＡ；糖脂質Ｆ７７；ＥＧＦＲｖＩＩＩ；ＧＤ－２；ＮＹ－ＥＳＯ－ｌ；ＭＡＧＥ Ａ３；およびそれらの組合せが挙げられ得る。自己免疫疾患に関して、ＣＡＲ Ｔ細胞は、関節リウマチ、ループス、多発性硬化症、強直性脊椎炎、１型糖尿病、または血管炎を処置するために用いられ得る。
いくつかの実施形態において、上記の方法により作製された標的細胞は、その細胞が、ＤＬＤを含まない方法を用いて作製された場合より早く、患者への投与に利用可能であろう。 これらの細胞は、１日またはそれ以上早く、好ましくは、２日、３日、４日、５日、またはそれ以上早く、投与され得る。細胞は、粗流体組成物の取得が完了した時点から８～１０日以内に投与され得る。
細胞の収集および処理
本発明はまた、細胞を迅速に処理するように設計され、かつ一般的に、その細胞が収集される現地で実施することができる、患者由来の細胞を収集および処理するためのプロトコールに向けられる。プロトコールは、上記の標的細胞およびＣＡＲ Ｔ細胞を調製するための方法の一部分として用いられ得る。これらのプロトコールの一部の態様は、図１３および図１４に図示され、図１２に示されたプロトコールと対比され得る。図示された特定の手順において、全血のアフェレーシスにより取得された組成物が得られ、その後、その組成物におけるＴ細胞が選択される。この関連における用語「選択される」は、Ｔ細胞が、Ｔ細胞を特異性（上記で定義されているような）を以て認識する作用物質により結合されることを意味する。その後、ＤＬＤを用いて、選択されたＴ細胞を単離し、これらの細胞を、選ばれた流体培地へ移す。
より一般的には、本発明は、ａ）標的細胞を含む粗流体組成物を患者から取得する工程；およびｂ）前記流体組成物に決定論的横置換（ＤＬＤ）を実施して、標的細胞が濃縮された組成物を得る工程であって、ＤＬＤの前かまたは後のいずれかに、標的細胞に、ＤＬＤ分離を促進するように、担体を結合させる、工程により、標的細胞を収集する方法に関する。例えば、標的細胞と特異性（上記で定義されているような）を以て結合する親和性物質（例えば、抗体、アクチベーター、ハプテン、またはアプタマー）を表面上に有する担体が、用いられ得る。
担体を、望ましい場合には、標的細胞が患者から収集されている最中の時間の間、標的細胞に結合させ得、標的細胞を含む粗流体組成物の取得が完了した時点から、その標的細胞に担体を結合させるまで、５時間より長く（好ましくは、４時間より長く、３時間より長く、２時間より長く、または１時間より長く）経過するべきではない。
標的細胞と１つまたは複数の担体との間で形成された複合体の直径は、好ましくは、非複合体化細胞より少なくとも２０％長く、好ましくは、少なくとも５０％長く、少なくとも２倍の長さ、または少なくとも１０倍の長さであるべきである。このサイズの増加は、単一の大きい担体の標的細胞との結合によるか、または数個のより小さい担体の結合によるかのいずれかであり得る。結合は、ｉ）標的細胞の直径と少なくとも同じ（または他の実施形態において、少なくとも２倍、もしくは少なくとも１０倍の）長さの直径を有する担体のみ；ｉｉ）標的細胞の直径の５０％以下（または他の実施形態において、２５％以下もしくは１５％以下）の長さの直径を有する担体のみ；またはｉｉｉ）これらのサイズ特徴を有する大きい担体および小さい担体の混合物（例えば、標的細胞と少なくとも同じ（または少なくとも２倍もしくは１０倍の）長さの直径を有する担体の１つの群および標的細胞の直径の５０％以下（または２５％以下もしくは１５％以下）の長さの直径を有する担体の第２の群が存在し得る）を用いることを含み得る。典型的には、担体は、１～１０００μｍ（多くの場合、５～６００μｍまたは５～４００μｍの範囲）の直径を有する。理想的には、複合体は、複合体のサイズより低いが、非複合体化細胞または混入物のサイズより高い臨界サイズを有する障害物のアレイを有するマイクロ流体デバイス上でのＤＬＤにより、他の細胞または混入物から分離されるだろう。
好ましい実施形態において、標的細胞を含む粗流体組成物は、患者由来の血液にアフェレーシスまたは白血球アフェレーシスを実施することにより取得される。この組成物は、抗凝固剤として働き、または血小板の活性化を防ぐ１つまたは複数の添加物を含み得る。そのような添加物の例には、単独または組合せでの、チクロピジン、イノシン、プロトカテキュ酸、アセチルサリチル酸、およびチロフィバンが挙げられる。
マイクロ流体デバイスは、試料注入口から１つまたは複数の流体出口へ延びる少なくとも１つのチャネルを有しなければならず、そのチャネルは、第１の壁およびその第１の壁と反対側の第２の壁によって囲まれている。チャネルにおいて、いくつもの行をなして配列された障害物のアレイもまた存在しなければならず、障害物のそれぞれの次の行が、前の行に対して横方向へシフトしており、その結果、前記標的細胞を含む粗流体組成物がデバイスの注入口にアプライされ、流体的にチャネルを通過する時、標的細胞が、濃縮された産物が収集される１つまたは複数の収集出口へ流れ、粗流体組成物中にあり、かつ標的細胞とは異なるサイズである混入細胞または粒子は、収集出口から切り離されているもう１つの廃棄物出口へ流れる。
特に好ましい実施形態において、標的細胞は、ナチュラルキラーＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、ヘルパーＴ細胞、および制御性Ｔ細胞からなる群から選択されるＴ細胞であり、ナチュラルキラーＴ細胞が最も好ましい。代替の好ましい実施形態において、標的細胞は、幹細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、または前駆細胞である。
工程ａ）およびｂ）に加えて、本発明の方法は、ｃ）ウイルスベクターを用いて細胞に形質導入することにより、細胞を遺伝子操作する工程（あるいは、細胞は、電気的に、化学的に、もしくはナノ粒子を用いて、トランスフェクションされ、および／または数を増加され得る）、および／またはｄ）その標的細胞が取得された同じ患者を、収集された標的細胞で処置する工程を含み得る。加えて、前記収集された細胞は、培養および／または凍結保存され得る。標的細胞がＴ細胞である場合、培養は、一般的に、アクチベーター、好ましくは、担体に結合しているアクチベーターの存在下で行われるべきである。Ｔ細胞培養に含まれ得る因子の中には、ＩＬ－２およびＩＬ－１５がある。
いくつかの実施形態において、上記の方法により作製された標的細胞は、その細胞が、ＤＬＤを含まない方法を用いて作製された場合より早く、患者への投与に利用可能であろう。 これらの細胞は、１日またはそれ以上早く、好ましくは、２日、３日、４日、５日、またはそれ以上早く、投与され得る。細胞は、粗流体組成物の取得が完了した時点から８～１０日以内に投与され得る。
上記で論じられた方法に加えて、本発明は、その方法により作製された標的細胞、およびその標的細胞が患者に投与される処置方法を含む。
ＤＬＤを使用して白血球の特性を変えること
白血球調製物中の血小板のレベルを減少させることは、ＣＡＲ Ｔ細胞の作製に関して、および他の治療的使用のための白血球の調製の両方において利点を有する。この点で、本発明は、部分的には、ＤＬＤがアフェレーシス試料中の血小板の総数を、一般的にフィコール分離を使用する場合（図１９－２１を参照）、特に血小板凝集を促進しないバッファーを使用する場合（図２２－２３参照）よりも効果的に減少させるという概念に基づく。Ｔ細胞に特異的に結合する磁気ビーズに基づく分離と組み合わせて使用すると、ＤＬＤは、かかるビーズを単独またはＦｉｃｏｌｌ遠心分離と組み合わせてのどちらかで使用する場合よりも迅速に増殖できる細胞の調製物をもたらす（図２４を参照）。この効果は、部分的に、血小板数の減少、および存在する血小板の数とは無関係の要因による（図２４を参照）。さらに、ＤＬＤ／磁気ビーズ手順を使用して取得される結果はより一貫性があり（図２５を参照）、この手順からの増殖されたＴ細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ／磁気ビーズアプローチを使用して調製される集団と比較した場合、セントラルメモリー表現型を有するＴ細胞のパーセンテージが高い（図２６を参照）。ａ）より早いＴ細胞の増殖およびｂ）セントラルメモリー細胞のより高いパーセンテージと組み合わされる、ＤＬＤからの高い初期の細胞回収率は、治療的に有効なレベルのＴ細胞がより迅速に患者に利用可能にされることができることを意味する。
１つの態様において、本発明は、遠心分離またはエルトリエーションの非存在下で試料に決定論的側方変位を行い、白血球に対する血小板の比が、ＤＬＤの代わりに遠心分離（勾配遠心分離または向流遠心分離を含む）またはエルトリエーションを使用して同じ手順が行われる時に取得される比よりも少なくとも２０％（好ましくは５０％または７０％）低い産物を取得することにより、アフェレーシス試料中の白血球に対する血小板の比を減少させる方法に向けられる。好ましくは、この手順は、ＤＬＤの前にアフェレーシス試料上で行われる分離工程を含まず、ＤＬＤは、インターカレーターまたは血小板のサイズを変更し、血小板凝集を促進しない他の手段を含まないバッファー中で行われる。避けるべき薬剤は、デキストランおよびその他の高電荷ポリマーを含む。白血球に対する血小板の比を下げることに加えて、ＤＬＤ由来の産物中の血小板の総数は、アフェレーシス試料中より少なくとも７０％低い、好ましくは少なくとも９０％低いはずである。
別の態様において、本発明は、試料上でＤＬＤを実施し、続いて親和性分離工程およびアクチベーターの存在下で培養することによるＴ細胞の増殖を行うことにより、アフェレーシス試料からＴ細胞を精製する方法に向けられる。このプロセスは、ＤＬＤの代わりにＦｉｃｏｌｌ遠心分離を使用して実行される同じ手順で作製される数の少なくとも２倍の数のＴ細胞をもたらすはずである。好ましい親和性方法は、少なくともＣＤ３を認識する抗体によってＴ細胞に特異的に結合する磁気ビーズの使用を含み、ＣＤ３をＣＤ２８または他の共刺激分子と一緒に含んでもよい。培養において１４日後に取得されるＴ細胞の数は、ＤＬＤの代わりにＦｉｃｏｌｌ遠心分離を使用して実行される同じ手順によって作製される数よりも少なくとも２倍（好ましくは少なくとも４倍または６倍）高いはずである。この方法で作製される産物中のメモリーＴ細胞のパーセンテージは、ＤＬＤの代わりにＦｉｃｏｌｌ遠心分離を使用する同じ手順を使用して作製されるパーセンテージよりも少なくとも１０％（好ましくは少なくとも２０％）高いはずである。
該方法は、ＣＡＲ Ｔ細胞療法のためのＴ細胞の生成に特に適する。患者を処理するのに十分な数の細胞を生成するのに必要な時間は、Ｆｉｃｏｌｌ遠心分離の代わりにＤＬＤを使用して、少なくとも５％（好ましくは少なくとも１０％または少なくとも２０％）減少し、ＣＡＲ Ｔ細胞は凍結することなく調製することができる。好ましい方法において、細胞が患者から収集され、ＤＬＤ、所望により同じ場所での親和性方法によって処理される。遺伝的形質転換もその場所で起こってもよく、好ましくは、アフェレーシスが完了されてからＤＬＤが開始されるまで１時間以内が経過する。
本発明はまた、試料上で決定論的側方変位（ＤＬＤ）を実行することにより、アフェレーシス試料中の白血球に対する血小板の比を減少させる方法を包含する。ＤＬＤは、遠心分離またはエルトリエーションを行わずに、血小板の総数がアフェレーシス試料中よりも少なくとも７０％（好ましくは少なくとも９０％）低い産物を取得するために行われる。好ましくは、ＤＬＤは、インターカレーターを含まず、血小板凝集を促進しないバッファー中で行われるべきである。好ましくは、バッファーはデキストランまたは他の高電荷ポリマーを含まない。
本発明は、白血球に限定されず、他の治療的に価値のある細胞、特に循環幹細胞を含むアフェレーシス調製物中に存在してもよい細胞も含む。不要な血小板の除去による利益を含むＤＬＤの利益は、さまざまなプロセスに適用するべきである。
大容量の白血球アフェレーシス材料についてＤＬＤを用いる方法
ＤＬＤの一つの利点は、それが、相対的に大量の材料だけでなく、少量の材料も、ほとんど容量を増加せずに処理するために用いられ得ることである。その手順は、大容量の材料を処理することにおいてだけでなく、遠心分離による白血球の濃縮により小容量である白血球アフェレーシス産物にも用いられ得る。
したがって、別の態様において、本発明は、大容量白血球アフェレーシスプロセスから細胞を精製するためのシステムであって、そのシステムにおいて、材料をＤＬＤにより分離する少なくとも１つのマイクロ流体デバイスが用いられる、システムに向けられる。その目的は、治療的に用いられ得、または治療的に用いられ得る作用物質を分泌する白血球を得ることである。特に重要なことには、本発明は、ＤＬＤ分離を促進し、およびまた、適宜、補完するように、特定の型の白血球に１つまたは複数の担体を結合させ、その後、その複合体にＤＬＤを実施することを含む。このようにして、特定の型の白血球は、およそ同じサイズであり、かつ、複合体形成の非存在下では、ＤＬＤにより分割することができなかった細胞から、分離され得る。この点において、一つのＤＬＤ手順が、結合していない白血球をより小さい材料から分離し、もう一つのＤＬＤ手順が、担体－白血球複合体を非複合体化細胞から分離する、上記で論じられているような２段階手順が有利である場合がある。本質的に同じ技術が、細胞特異的担体が利用可能であるという条件で、他の関連において同様に、例えば培養細胞に、用いられ得る。全ての場合において、細胞は、それらの遺伝子の１つまたは複数の発現を変化させるように組換え的に遺伝子操作され得る。
白血球アフェレーシス材料について、マイクロ流体デバイスは、試料注入口から、白血球（ＷＢＣ）または特定の白血球－担体複合体を回収するための「収集出口」と、ＷＢＣとは異なるサイズ（一般的には、より小さい）の材料または非複合体化白血球が流れる「廃棄物出口」の両方へと延びる少なくとも１つのチャネルを有しなければならない。チャネルは、第１の壁およびその第１の壁と反対側の第２の壁によって囲まれており、いくつもの行をなして配列された障害物のアレイを含み、各連続する行が前の行に対して横方向へシフトしている。障害物は、白血球アフェレーシス材料がデバイスの注入口にアプライされ、流体的にチャネルを通過する時、細胞または細胞複合体が、濃縮された産物が収集される収集出口（または複数の出口）へ偏向され、異なる（一般的には、より小さい）サイズの材料は、１つまたは複数の切り離された廃棄物出口へ流れるような様式で配置されている。
大容量の出発材料の迅速な処理を促すために、マイクロ流体デバイスにおける障害物は、菱形または三角形の形にデザインされ得、各デバイスは６～４０個のチャネルを有し得る。加えて、マイクロ流体デバイスは、２～２０個のマイクロ流体デバイスを含むシステムの一部であり得る（図７参照）。個々のデバイスは、１４ｍｌ／時の流速で作動され得るが、少なくとも２５ｍｌ／時（好ましくは、少なくとも４０ｍｌ／時、６０ｍｌ／時、８０ｍｌ／時、または１００ｍｌ／時）の流速が好ましく、大きい試料容量（少なくとも２００ｍｌ、好ましくは４００～６００ｍｌ）が、１時間以内に処理されることを可能にする。
生存細胞の分離
別の態様において、本発明は、以下の工程を含む、生存細胞を非生存細胞から分離する方法に向けられる：（ａ）生存細胞および非生存細胞を含む試料を取得する工程であって、前記生存細胞が第１の既定のサイズを有し得、かつ前記非生存細胞が第２の既定サイズを有し得、および前記第１の既定サイズが臨界サイズ以上であり得、かつ前記第２の既定サイズが前記臨界サイズより小さくてもよい、工程；（ｂ）前記試料をデバイスにアプライする工程であって、前記デバイスが、いくつもの行をなして配列された障害物のアレイを含み得、前記行が、お互いに対して横方向へシフトされ得、前記行が、前記臨界サイズ以上の粒子を第１の方向へ、および前記臨界サイズより小さい粒子を第２の方向へ偏向させるように構成され得る、工程；ならびに（ｃ）前記試料を前記デバイスに流す工程であって、前記生存細胞が前記障害物により前記第１の方向に偏向され得、前記非生存細胞が前記第２の方向に偏向され得、それにより、前記生存細胞を前記非生存細胞から分離する、工程。臨界サイズは、第２の既定サイズの約１．１倍であり得、いくつかの実施形態において、生存細胞は、活発に分裂する細胞であり得る。いくつかの実施形態において、デバイスは、徐々により小さい障害物および間隙を有する少なくとも３つのゾーンを含み得る。
接着細胞の分離
本発明はまた、以下により、接着性標的細胞、好ましくは治療上価値のある細胞、例えば、接着性幹細胞を取得する方法を含む：ａ）接着性標的細胞を含む粗流体組成物を患者から取得する工程、およびｂ）決定論的横置換（ＤＬＤ）を実施して、接着性標的細胞が濃縮された組成物を得る工程。このプロセスの間、接着性標的細胞に、ＤＬＤ分離を促進または補完するように、１つまたは複数の担体を結合させ得る。例えば、担体は、接着性標的細胞と特異性（上記で定義されているような）を以て結合する親和性物質（例えば、抗体、アクチベーター、ハプテン、またはアプタマー）を表面上に有し得、所望の表現型をその細胞に付与するように、例えば、キメラ分子（好ましくは、より高い治療上の価値がある細胞にするタンパク質）を発現するように、設計された核酸をトランスフェクションまたは形質導入され得る。
担体は、粗流体組成物が収集されている最中の時点で、または代替として、収集が完了した後だが、ＤＬＤが初めて実施される前に、添加され得る。第２の代替において、ＤＬＤは、担体が添加される前に、初めて実施され得る。例えば、接着細胞が臨界サイズ未満のサイズを有する場合には、粗流体組成物が、担体が添加される前に、デバイスにアプライされ得、接着細胞が回収され得、その後、その細胞を１つまたは複数の担体に付着させて、デバイスの臨界サイズより大きい複合体を形成し得、その後、第２のＤＬＤ段階が実施され得、担体接着細胞の複合体が収集され得る。
好ましくは、患者からの粗流体組成物の取得が完了した時点から、接着細胞に担体を初めて結合させるまで、３時間より長く（より好ましくは、２時間より長く、または１時間より長く）経過しない。別の好ましい実施形態において、患者からの粗流体組成物の取得が完了した時点から、接着細胞または担体接着細胞複合体がデバイスから初めて回収される時点まで、４時間より長く（好ましくは、３時間より長く、または２時間より長く）経過しない。
上記の方法論は、接着性標的細胞、例えば、接着性幹細胞を複数の他の細胞から分離するために用いられ得る。その方法は以下を含む：ａ）接着性標的細胞および複数の他の細胞を含む粗流体組成物を接触させる工程であって、前記接着性標的細胞が、ＤＬＤ分離を促進するように、１つまたは複数の担体と少なくとも部分的に会合し、担体会合化接着性標的細胞複合体を形成し、前記複合体が、前記複数の他の細胞に対して増加したサイズを含み、前記担体会合化接着細胞複合体のサイズが、好ましくは、臨界サイズより少なくとも５０％大きく、かつ他の非複合体化細胞が前記臨界サイズ未満のサイズを含む、工程；ｂ）前記担体会合化接着細胞複合体を含有する粗流体組成物をデバイスにアプライする工程であって、前記デバイスが、行をなして配列された障害物のアレイを含み、前記行が、お互いに対して横方向へシフトされ、前記行が、臨界サイズ以上の細胞または複合体を第１の方向へ、および前記臨界サイズ未満の細胞または複合体を第２の方向へ偏向させるように構成される、工程；ｃ）前記担体会合化接着性標的細胞複合体を含む前記粗流体組成物を前記デバイスに流す工程であって、前記複合体が前記障害物により前記第１の方向に偏向され、かつ非複合体化細胞が前記第２の方向に偏向され、それにより、前記担体会合化接着細胞複合体を前記他の非複合体化細胞から分離する、工程；ｄ）分離された担体会合化接着性標的細胞複合体を含む流体組成物を収集する工程。
接着性標的細胞と１つまたは複数の担体との間に形成された複合体の直径は、好ましくは、非複合体化細胞より少なくとも２０％長く、好ましくは、少なくとも５０％長く、少なくとも２倍の長さ、または少なくとも１０倍の長さであるべきである。このサイズの増加は、単一の大きい担体の接着性標的細胞との結合によるか、または数個のより小さい担体の結合によるかのいずれかであり得る。結合は、ａ）接着性標的細胞の直径と少なくとも同じ（または他の実施形態において、少なくとも２倍、もしくは少なくとも１０倍の）長さの直径を有する担体のみ；ｂ）接着性標的細胞の直径の５０％以下（または他の実施形態において、２５％以下もしくは１５％以下）の長さの直径を有する担体のみ；またはｃ）これらのサイズ特徴を有する大きい担体および小さい担体の混合物（例えば、接着性標的細胞と少なくとも同じ（または少なくとも２倍もしくは１０倍の）長さの直径を有する担体の１つの群および接着性標的細胞の直径の５０％以下（または２５％以下もしくは１５％以下）の長さの直径を有する担体の第２の群が存在し得る）を用いることを含み得る。典型的には、担体は、１～１０００μｍ（多くの場合、５～６００μｍまたは５～４００μｍの範囲）の直径を有する。
担体は、ポリプロピレン、ポリスチレン、ガラス、ゼラチン、コラーゲン、多糖、プラスチック、アクリルアミド、およびアルギン酸塩を含む、接着細胞の培養のための、当技術分野において知られている材料のいずれかで作られ得る。それらは、コーティングされなくてもよいし、接着および成長を促進する材料（例えば、血清、コラーゲン、タンパク質、またはポリマー）でコーティングされてもよく、表面に付着した作用物質（例えば、抗体、抗体断片、基質、アクチベーター、または他の材料）を有し得る。いくつかの実施形態において、希釈剤は、成長培地であり得、前記工程は逐次的に実施され得、工程（ｄ）の後に、バッファー交換を実施することができる。
上記の方法において単離され得る特定の接着細胞の例には以下が挙げられる：ＭＲＣ－５細胞；ＨｅＬａ細胞；Ｖｅｒｏ細胞；ＮＩＨ ３Ｔ３細胞；Ｌ９２９細胞；Ｓｆ２１細胞；Ｓｆ９細胞；Ａ５４９細胞；Ａ９細胞；ＡｔＴ－２０細胞；ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞；ＢＨＫ－２１細胞；ＢＨＬ－１００細胞；ＢＴ細胞；Ｃａｃｏ－２細胞；Ｃｈａｎｇ細胞；Ｃｌｏｎｅ ９細胞；Ｃｌｏｎｅ Ｍ－３細胞；ＣＯＳ－１細胞；ＣＯＳ－３細胞；ＣＯＳ－７細胞；ＣＲＦＫ細胞；ＣＶ－１細胞；Ｄ－１７細胞；Ｄａｕｄｉ細胞；ＧＨ１細胞；ＧＨ３細胞；ＨａＫ細胞；ＨＣＴ－１５細胞；ＨＬ－６０細胞；ＨＴ－１０８０細胞；ＨＥＫ細胞、ＨＴ－２９細胞；ＨＵＶＥＣ細胞；Ｉ－１０細胞；ＩＭ－９細胞；ＪＥＧ－２細胞；Ｊｅｎｓｅｎ細胞；Ｊｕｒｋａｔ細胞；Ｋ－５６２細胞；ＫＢ細胞；ＫＧ－１細胞；Ｌ２細胞；ＬＬＣ－ＷＲＣ ２５６細胞；ＭｃＣｏｙ細胞；ＭＣＦ７細胞；ＷＩ－３８細胞；ＷＩＳＨ細胞；ＸＣ細胞；Ｙ－１細胞；ＣＨＯ細胞；Ｒａｗ ２６４．７細胞；ＨＥＰ Ｇ２細胞；ＢＡＥ－１細胞；ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞、およびそれらの任意の誘導体。
アクチベーターと結合した細胞の分離
本発明はまた、上記の手順を用いて、活性化の能力がある細胞を精製する方法を含む。好ましい実施形態において、本発明は、以下により、活性化細胞を複数の他の細胞から分離する方法に向けられる：ａ）活性化の能力がある細胞および複数の他の細胞を含む粗流体組成物を、ＤＬＤ分離を促進するように、１つまたは複数の担体と接触させる工程であって、前記担体の１つまたは複数が、細胞アクチベーターを含み、１つまたは複数の担体が、接触により、または接触後、細胞アクチベーターによる活性化の能力がある細胞に少なくとも部分的に会合して、担体会合化細胞を生成し、少なくとも部分的な、前記細胞アクチベーターの前記活性化の能力がある細胞との会合が、前記活性化の能力がある細胞を活性化し、前記担体会合化細胞複合体が、他の細胞に対して増加したサイズを含み、前記担体会合化細胞複合体のサイズが、臨界サイズ以上であり、かつ前記複数の他の細胞における細胞が、前記臨界サイズ未満のサイズを含む、工程；ｂ）前記粗流体組成物をデバイスにアプライする工程であって、前記デバイスが、行をなして配列された障害物のアレイを含み、前記行が、お互いに対して横方向へシフトされ、前記行が、臨界サイズ以上の粒子を第１の方向へ、および臨界サイズ未満の粒子を第２の方向へ偏向させるように構成される、工程；ｃ）前記試料を前記デバイスに流す工程であって、前記担体会合化細胞複合体が前記障害物により前記第１の方向に偏向され、前記複数の他の細胞における細胞が前記第２の方向に偏向され、それにより、前記活性化細胞を前記複数の他の細胞から分離する、工程。その後、分離された担体会合化細胞複合体を含む流体組成物が収集され得る。このプロセスの間、その細胞は、適宜、その細胞に所望の表現型を付与するように、例えば、キメラ分子（好ましくは、より高い治療上の価値がある細胞にするタンパク質）を発現するように、設計された核酸をトランスフェクションまたは形質導入され得る。
活性化の能力がある細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞、顆粒球、自然リンパ球系細胞（innate lymphoid cell）、巨核球、ナチュラルキラー細胞、栓球、滑膜細胞、β細胞、肝臓細胞、膵臓細胞、ＤＥ３溶原化細胞、酵母細胞、植物細胞、および幹細胞からなる群から選択され得る。
細胞アクチベーターは、抗体または抗体断片、ＣＤ３、ＣＤ２８、抗原、ヘルパーＴ細胞、受容体、サイトカイン、糖タンパク質、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択され得る。他の実施形態において、アクチベーターは、低分子化合物であり得、インスリン、ＩＰＴＧ、ラクトース、アロラクトース、脂質、グリコシド、テルペン、ステロイド、アルカロイド、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択され得る。
好ましい実施形態において、活性化の能力がある細胞は、活性化の能力がある細胞および複数の他の細胞を含む粗流体組成物の一部として患者から収集され、患者からの粗流体組成物の取得が完了した時点から、前記活性化の能力がある細胞に担体を結合させるまで、４時間より長く（好ましくは、３時間より長く、２時間より長く、または１時間より長く）経過しない。患者からの粗流体組成物の取得が完了した時点から、工程ｃ）が完了するまで、４時間より長く経過しないこともまた好ましい。あるいは、方法は、細胞の収集が始まる前にアクチベーターを結合させることにより、変更され得る。
好ましくは、活性化の能力がある細胞と１つまたは複数の担体との間で形成された複合体の直径は、非複合体化細胞より少なくとも２０％長く、より好ましくは、少なくとも５０％長く、少なくとも２倍の長さ、または少なくとも１０倍の長さであるべきである。このサイズの増加は、単一の大きい担体の活性化の能力がある細胞との結合によるか、または数個のより小さい担体の結合によるかのいずれかであり得る。結合は、ａ）活性化の能力がある細胞の直径と少なくとも同じ（または他の実施形態において、少なくとも２倍、もしくは少なくとも１０倍の）長さの直径を有する担体のみ；ｂ）活性化の能力がある細胞の直径の５０％以下（または他の実施形態において、２５％以下もしくは１５％以下）の長さの直径を有する担体のみ；またはｃ）これらのサイズ特徴を有する大きい担体および小さい担体の混合物（例えば、活性化の能力がある細胞と少なくとも同じ（または少なくとも２倍もしくは１０倍の）長さの直径を有する担体の１つの群および活性化の能力がある細胞の直径の５０％以下（または２５％以下もしくは１５％以下）の長さの直径を有する担体の第２の群が存在し得る）を用いることを含み得る。典型的には、担体は、１～１０００μｍ（多くの場合、５～６００μｍまたは５～４００μｍの範囲）の直径を有する。
化合物の細胞からの分離
別の実施形態において、本発明は、以下を含む、化合物を細胞から除去する方法を含む：（ａ）細胞および化合物を含む流体組成物を取得する工程であって、前記細胞が、前記化合物の既定サイズより大きい既定サイズを有し、および前記細胞の既定サイズが臨界サイズ以上であり、かつ前記化合物の既定サイズが前記臨界サイズ未満である、工程；（ｂ）前記試料をデバイスにアプライする工程であって、前記デバイスが、いくつもの行をなして配列された障害物のアレイを含み、前記行が、お互いに対して横方向へシフトされ、前記行が、前記臨界サイズ以上の粒子を第１の方向へ、および前記臨界サイズ未満の粒子を第２の方向へ偏向させるように構成される、工程；ならびに（ｃ）前記試料を前記デバイスに流す工程であって、その間、前記細胞が前記障害物により前記第１の方向に偏向され、前記化合物が前記第２の方向に偏向され得、それにより、前記細胞から前記化合物を除去する、工程。いくつかの実施形態において、方法はさらに、工程（ｃ）後に細胞を培養すること、または工程（ａ）の流体組成物が取得された培養物へ前記細胞をリサイクルすることを含み得る。
前記化合物は、毒性化合物であり得、抗生物質、抗真菌剤、毒性代謝産物、アジ化ナトリウム、金属イオン、内毒素、可塑剤、殺虫剤、およびそれらの組合せからなる群から選択され得る。他の実施形態において、前記化合物は、使用済の化学成分であり得る。
分泌性細胞産物の連続的精製
本発明はまた、以下を含む、細胞から分泌性産物を連続的に精製する方法を含む：（ａ）細胞を含む流体組成物（細胞培養組成物であり得る）を取得する工程であって、前記細胞が、前記流体組成物中に懸濁しており（または前記細胞に、ＤＬＤ分離を促進し、かつ担体－細胞の複合体を形成するように、１つまたは複数の担体を結合させ）、前記細胞が、分泌性産物を前記流体組成物へ分泌し、前記細胞（または前記担体－細胞複合体）が、前記分泌性産物の既定サイズより大きい既定サイズを有し、前記細胞（または前記担体－細胞複合体）の既定サイズが、臨界サイズ以上であり、かつ前記分泌性産物の既定サイズが前記臨界サイズ未満である、工程；（ｂ）前記細胞（または前記担体－細胞複合体）を含む流体組成物を、ＤＬＤ用デバイスにアプライする工程であって、前記デバイスが、いくつもの行をなして配列された障害物のアレイを含み、前記行が、お互いに対して横方向へシフトされ、前記行が、前記臨界サイズ以上の粒子を第１の方向へ、および前記臨界サイズ未満の粒子を第２の方向へ偏向させるように構成される、工程；ならびに（ｃ）前記細胞または前記担体－細胞複合体を含む流体組成物を前記デバイスに流す工程であって、前記細胞または担体－細胞複合体が前記障害物により前記第１の方向に偏向され、前記分泌性産物が前記第２の方向に偏向され、それにより、前記分泌性産物を前記細胞から分離する、工程；（ｄ）前記分泌性産物を収集する工程であって、それにより、精製されている前記分泌性産物の流体組成物を生じる、工程；（ｅ）分離された細胞または担体－細胞複合体を含む回収された流体組成物を収集する工程；（ｆ）前記細胞（または前記担体－細胞複合体）を前記流体組成物に再びアプライする工程；ならびに工程（ａ）～（ｅ）を繰り返す工程であって、それにより、分泌性産物を細胞から連続的に精製する、工程。
分泌性産物は、タンパク質、抗体、バイオ燃料、ポリマー、小分子、およびそれらの任意の組合せであり得、細胞は、細菌細胞、藻類細胞、哺乳類細胞、および腫瘍細胞であり得る。一つの好ましい実施形態において、分泌性産物は、治療上価値の高いタンパク質、抗体、ポリマー、または小分子である。加えて、工程（ａ）の流体組成物は、細胞が、担体において成長している培養物から取得され得る。
マイクロ流体サイジングデバイスの使用
より広義には、本発明は、任意のサイズに基づいたマイクロ流体分離方法によって調製される標的細胞の集団を操作する方法に向けられる。サイズに基づく細胞の並べ替えの違いは、本明細書中で議論されるバンプアレイを使用した結果、または分離中の流量を制御することによって生成された慣性力の結果、またはマイクロ流体デバイス自体の設計によるものである（全体が参照により本明細書中に組み込まれるＵＳ ９，８９５，６９４およびＵＳ ９，６１０，５８２を参照）。使用される分離手順は１つだけでも、複数でもよい。たとえば、標的細胞は、１つのマイクロ流体手順を使用して小さな粒子および細胞から、第２の手順を使用して大きな粒子および細胞から分離される。
標的細胞が単離されると、それらは所望の表現型を有するように遺伝子操作される。これは、細胞をトランスフェクトまたは形質転換するための標準的な組換え方法論を使用して達成することができる。例えば、細胞をベクターでトランスフェクトして、組換え表現型を発現させることができる。遺伝子操作の前の遠心分離を回避することにより、所望の特性を有する細胞が少なくとも２０％増加するはずである。
好ましい標的細胞は、白血球（特にＴ細胞）または幹細胞であり、好ましい粗液組成物は、患者から取得される血液またはアフェレーシス調製物である。中心的な目的は、これらの調製物中の標的細胞に対する血小板の比を少なくとも５０％、好ましくは少なくとも８０％または９０％減少させることである。標的細胞の単離は、産物が取得されるように血小板の総数が開始アフェレーシス調製物より少なくとも７０％（好ましくは少なくとも９０％）少ない条件で行われるべきである。
遺伝子操作中または遺伝子操作後、細胞は細胞培養中で増殖される。上記の手順を使用すると、培養において１４日後に取得されるＴ細胞の数は、遠心分離を使用して細胞が単離される手順より少なくとも２倍（好ましくは少なくとも５または１０倍）高いはずである。さらに、Ｔ細胞の総数に対する培養におけるメモリーＴ細胞のパーセンテージは、遠心分離によりＴ細胞が単離される手順よりも少なくとも１０％（好ましくは２０％または３０％）高いはずである。
アフェレーシス収集が完了される時点からＤＬＤが実行されるまで１時間以内、アフェレーシス試料の取得が完了される時点から標的細胞が単離され、遺伝子操作されるまで４時間以内が経過するべきである。
特に好ましい実施形態において、上記の方法はＣＡＲ Ｔ細胞の産生に使用される。これは、最初にアフェレーシスによってＴ細胞を含有する粗液組成物を取得し、次いでサイズの違いに基づいてＴ細胞を血小板から分離する１つ以上の手順を使用して、マイクロ流体デバイス上で細胞を単離することを含む。結果として、Ｔ細胞中で濃縮され、血小板が枯渇する産物が、取得されるはずである。次の工程において、単離されるＴ細胞は、遺伝子操作され、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を表面上に発現する。これらの細胞は、それらの数を増やすために培養され、次いで収集される。Ｔ細胞は、遺伝子操作される前のどの段階でも遠心分離または水処理されるべきでなく、好ましい実施形態において、遺伝子操作に使用される試薬は、マイクロ流体デバイスを使用してサイズによって細胞から分離される。追加の好ましい実施形態において、Ｔ細胞は、患者に投与するための医薬組成物中に移すことによって収集される。
Ｔ細胞は、収集または医薬組成物中に移される前に凍結されるべきでなく、好ましくは、血小板の少なくとも９０％は除去される。培養前または培養中に、細胞は、Ｔ細胞アクチベーターまたは担体にさらされてもよい。これは、細胞の安定化に役立ち、サイズに基づいたマイクロ流体分離を促進してもよい。しかしながら、アクチベーターも担体も必ずしも磁気ビーズまたは粒子に結合される必要はないことに注意すべきである。
細胞が遠心分離により単離されるかまたは濃縮される手順と比較して、マイクロ流体分離によって取得されるＣＡＲ Ｔ細胞は、少なくとも１日（好ましくは、少なくとも３日、５日または１０日）早く、患者による使用のために利用可能であるべきである。全体として、処理のために十分な数のＣＡＲ Ｔ細胞を生成するのに必要な時間は、Ｆｉｃｏｌｌ遠心分離を使用して同じ方法で細胞を分離する場合よりも少なくとも１０％（好ましくは少なくとも２０％または３０％）短いべきである。これは、部分的に、サイズに基づいたマイクロ流体分離を使用することにより、培養において１４日後に取得されるＣＡＲ Ｔ細胞の数は典型的に、Ｆｉｃｏｌｌ遠心分離により取得される細胞を使用する培養における数より少なくとも２倍（好ましくは４倍または８倍）高くなるためである。さらに、本方法で調製される細胞が患者に投与される場合、それらは、遠心分離によりアフェレーシス組成物から単離される細胞よりも少なくとも１０％少ない老化を示すはずである。
本発明はまた、上記の議論される方法によって調製される治療的に有効な量の細胞を投与することにより疾患または状態について患者を処理することを包含する。これは、操作される白血球または幹細胞に反応する任意の疾患または状態を含み、少なくともＣＡＲ Ｔ細胞の場合、癌は処理されてもよい疾患のうちにある。
図１Ａ～１Ｇ：図１Ａ～１Ｃは、ＤＬＤの異なる動作モードを示す。これは、ｉ）分離（図１Ａ）、ｉｉ）バッファー交換（図１Ｂ）、およびｉｉｉ）濃縮（図１Ｃ）を含む。各モードにおいて、臨界直径より大きい本質的に全部の粒子が、流入の地点からアレイの方向に偏向され、結果として、デバイスの幾何学的配置の機能としてのサイズ選択、バッファー交換、または濃縮を生じる。全ての場合において、臨界直径より小さい粒子は、層流条件下でデバイスを真っ直ぐに通過し、その後、デバイスを出て行く。図１Ｄは、分離モードに用いられる１４レーンのＤＬＤデザインを示す。描かれたアレイおよびマイクロチャネルの全長は、７５ｍｍであり、幅は４０ｍｍであり、それぞれの個々のレーンは、幅１．８ｍｍである。図１Ｅ～１Ｆは、プラスチック菱形ポストアレイ、および出口についての統合収集ポートの拡大図である。図１Ｇは、１０ＰＳＩにおける、プロトタイプデバイスを用いて処理中の白血球アフェレーシス産物の写真を描く。
図２Ａ～２Ｈ：図２Ａは、この研究に用いられた正常なドナーの血小板細胞カウント数およびＷＢＣ細胞カウント数の範囲を示す散布図である。それぞれ、ＷＢＣの平均カウント数：１６２．４×１０６／ｍＬおよび血小板の平均カウント数：２７１８×１０３／μＬ（＋）。異常値試料（▲）は、２０μｍプレフィルターを詰まらせ、データセットから排除された。入力試料が示されている（図２Ｃおよび２Ｄ）。代表的な２４時間経過した正常ドナーの白血球アフェレーシス入力物（図２Ｂ）および１０ＰＳＩにおける１４レーンの菱形ポストアレイＤＬＤ（図２Ｅ）かまたはＦｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ（図２Ｆ）のいずれかにより処理されたＰＢＭＣ産物。同じ白血球アフェレーシスドナー（＃３７）由来の代表的なＤＬＤ産物（図２Ｇ）およびＦｉｃｏｌｌ（図２Ｈ）。入力物（図２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ）および産物画分（図２Ｅおよび２Ｆ）を固定し、ＣＤ４１－ＦＩＴＣ（血小板）およびＣＤ４５－Ａｌｅｘａ６４７（ＷＢＣ）を用いてスライド上で染色し、ＤＡＰＩ（核ＤＮＡ）で対比染色した。
図３：この図は、ＤＬＤ対Ｆｉｃｏｌｌおよび直接的磁石アプローチにおける細胞活性化の一貫性に関する（８日目におけるＣＤ４、ＣＤ８対ＣＤ２５）。細胞活性化および表現型プロフィールは、古典的セントラルメモリーＴ細胞関連表現型への増殖中のシフト（８日目）を示す。細胞を、前に記載されているように、カウントし、脱ビーズした。各時点において、約１００，０００個の細胞を、ＣＤ３－ＢＶ４２１、ＣＤ４５ＲＡ－ＢＶ６０５、ＣＤ９５－ＦＩＴＣ、ＣＤ２７９－ＰＥ、ＣＤ２５－ＡＰＣ、ＣＤ４－Ａｌｅｘａ ７００、およびＣＤ８－ＡＰＣ－Ｃｙ７で染色し、暗所中、室温で３０分間、インキュベートし、１０容量のＰＢＳで洗浄し、その後、遠心分離し、ＰＢＳ中１．０％パラ－ホルムアルデヒド中で固定した。試料をＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａにおいて獲得し、ＣＤ３、ならびに前方散乱および側方散乱のゲートを用い、ＦｌｏｗＬｏｇｉｃソフトウェアを用いて分析した。
図４：図４は、Ｆｉｃｏｌｌおよび直接的磁石と比較した、ＤＬＤによる試料の、メモリー細胞表現型の迅速な獲得、および一貫した活性化を描くグラフである。Ｔ細胞活性化への変換およびＣＤ４５ ＲＯ状態を介した変換を測定するＣＤ４５ＲＡ－、ＣＤ２５＋細胞の％のプロットが示されている。実験は、増殖する初期能力に向けるように設計されたため、細胞に、３日目、および再び、８日目においてのみ、２００ユニットＩＬ－２／ｍＬ培養物を与えた。
図５Ａ～５Ｃ：これらの図は、ＤＬＤ、Ｆｉｃｏｌｌ、および直接的磁石からのＣＤ３細胞の増殖倍率（×１０６）に関する。ＤＬＤ産物およびＦｉｃｏｌｌ細胞のアリコートを、１×１０７個のＴ細胞／ｍＬのＴ細胞密度を用いて、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ ＣＴＳプロトコールに従って、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズとインキュベートした。約２．５個のビーズ／Ｔ細胞、および直接的磁石については、約５．０個のビーズ／Ｔ細胞の比を用いて、細胞およびビーズを、磁気分離の前に、回転式ミキサー上で６０分間、インキュベートした。刺激されたか、または刺激されていない（分離されていないＰＭＢＣ）かのいずれかの細胞を、完全培地（ＩＬ－２を含まない、ＲＰＭＩ－１６４０ ＋ １０％ＦＢＳ ＋ 抗生物質）中に０．５×１０６個／ｍＬに希釈し、中間時点での培養物のいかなる妨害をも避けるために、時点を特定した反応においてプレーティングした。３日目において、２００ＩＵのＩＬ－２／ｍＬを、製造会社の推奨通り、刺激され、かつ分離されるアームに加えた。製造会社のプロトコール（ピペッティング）を用いて脱ビーズした後、３日目、８日目、１５日目に、コールターカウンター（Ｓｃｅｐｔｅｒ）により細胞カウント数を決定し、ＣＤ４５に関する蛍光閾値およびＣＤ３－ＦＩＴＣ、ＣＤ４５－ＰｅｒＣＰでの染色を用いる非洗浄アプローチを用いるＢＤ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒにおけるフローサイトメトリを用いてビーズに基づいた絶対的カウンティングにより、ならびにダブレットおよびビーズがまだ付着した任意の細胞の効果的な識別を保証するためにＤＮＡ染色ＤＲＡＱ５を用いて、検証した。カウンティング方法間の相関は、０．９５の傾き、Ｒ２＝０．９４４で、許容できた。許容範囲（＜３．０×１０６個／ｍＬ）で細胞密度を維持するように、６日目および９日目に培地を培養物に加えた。ドナー２１についての１５日目のデータ点は、汚染により喪失した。指示されているように、平均または％ＣＶが水平的なバーで示されている（図５Ａ）。図５Ｂは、セントラルメモリーＴ細胞のパーセンテージ（１５日目）を示し、図５Ｃは、セントラルメモリーＴ細胞の数（１５日目）を示す。
図６Ａ～６Ｂ：図６Ａ～６Ｂは、セントラルメモリーＴ細胞の細胞数測定分析および産生されたセントラルメモリー細胞の数に関する。図６Ａ：セントラルメモリーＴ細胞：ＣＤ３＋ Ｔ細胞を、シングレットゲート、続いてＣＤ３対側方散乱においてゲーティングし、セントラルメモリー集団を定義するＣＤ４５ＲＯ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、およびＣＤ９５の４パラメータゲートを用いてセントラルメモリー表現型分類をした。その集団をバックゲーティングして、セントラルメモリー細胞を、Ｔ細胞の画分としてカラーの図面中で赤色でディスプレイした。カラーの図面中の非赤色細胞は、全て非セントラルメモリーＴ細胞を表す。図６Ｂ：表現型変換および重要な測定基準（１５日目）：重要な測定基準は、セントラルメモリー細胞の数が＞５０％であるドナーの数を、セントラルメモリー増殖に関連した平均および％ＣＶと共に示す。
図７：図７は、この個々のチップがどのようにして、確立された製造アプローチを用いて、任意の特定の適用による要求通り、スループットを達成するように層に積み重ね可能であるように設計されているかを示す概略図である。射出成形層は、システムが開発された時に計画される。
図８Ａ～８Ｃ：これらは、ＤＬＤによるＷＢＣの濃縮を示す補足図である。図８Ａ：全血から引き出されたＤＬＤ産物：全血を、第１のＤＬＤを通過させて、赤血球を除去した。１２の濃縮係数を達成するように設計された第２の直列の濃縮ＤＬＤを、分離ＤＬＤの産物出力に接続した。等容量の産物および廃棄物を、同数の絶対カウントビーズと共にチューブに加え、フローサイトメトリにより分析した。廃棄物（図８Ｂ）および濃縮物（図８Ｃ）についての生じた相対的細胞：ビーズ比を、入力材料と比較して計算して、濃縮倍率を決定した。白血球を、ＣＤ４５ ＰｅｒＣＰおよび１ｍＭ ＤＲＡＱ５で染色して（それは蛍光閾値として用いられた）、ビーズと白血球の両方を獲得した。５０００個のビーズ事象が獲得された。（全ての試薬はｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）。設計された濃縮係数：１２．０×；観察された相対的濃縮：１５．７１４／１．３０２＝１２．０７×。
図９：図９は、ＤＬＤ法かＦｉｃｏｌｌ法かのいずれかにより精製された非刺激ＣＤ３＋ Ｔ細胞（８日目）におけるＣＤ２５およびＣＤ４の発現に関する補足図である。細胞を記載されているように調製し、図３においてのように分析した。平均ＣＤ４＋ ２５＋：Ｆｉｃｏｌｌ：２０．２５％；ＤＬＤ：８％。
図１０：これは、主要なサブセットによるＩＬ－２により増殖したセントラルメモリーＴ細胞の割当に関する補足図である。最初の図：ＣＤ８（緑色）、ＣＤ４（青色）において、ＣＤ４＋ＣＤ８＋（赤色）セントラルメモリー細胞を、逐次的に、以下に関してゲーティングした：ＣＤ３＋、ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７＋、ＣＤ２８＋ＣＤ９５＋。ＩＬ２により作動したＣＤ４サブセットの相対量は明らかである。
図１１：図１１は、この研究における収率、および５０×１０６個のＷＢＣ細胞／ｍＬを有し、かつ２５０ｍＬ中５０％ＣＤ３リンパ球を含有するドナー由来の典型的な白血球アフェレーシス採取物を仮定する、ＩＬ－２での増殖後のセントラルメモリーＴ細胞の数の推定値を描く補足図である。
図１２：図１２は、ＣＡＲ Ｔ細胞を作製し、その細胞を患者に投与するために、原理的に用いられ得るプロトコールを示す。それは、本明細書で論じられた他の手順を対比させるために含まれており、実際に実施される作業を表していない。
図１３：図１３は、手順の最初の工程において図１２のプロトコールと異なるＣＡＲ Ｔ細胞を作製するための提案されたプロトコールを示す。図の中央部分における工程は、比較のために含まれる。その略図は、発明概念を図解することを意図され、実際に実施される作業を表していない。
図１４：図１４は、手順の最初の工程において図１２のプロトコールと異なるＣＡＲ Ｔ細胞を作製するための第２の提案されたプロトコールを示す。図の中央部分における工程は、比較のために含まれる。図１２および１３と同様に、その略図は、発明概念を図解することを意図され、実際に実施される作業を表していない。
図１５：図１５は、使用済み細胞から分泌性産物を取り出すためのデバイスの概略図を示す。
図１６：図１６は、活発に成長する細胞からの毒性化合物の連続的除去のためのデバイスの概略図を示す。
図１７：図１７は、各繰り返しの間に担体を添加するという選択肢を含む、活発に成長する細胞からの毒性化合物の連続的除去のためのデバイスの概略図を示す。
図１８Ａおよび１８Ｂ：図１８Ａは、ダウンシフトを有する、障害物の鏡映型アレイの例を示す。中心チャネルは、左側の障害物のアレイと右側の障害物のアレイとの間にある。中心チャネルは、少なくとも臨界サイズの粒子についての収集チャネルであり得る（すなわち、少なくとも臨界サイズの粒子は、アレイにより中心チャネルへ偏向させられ得、一方、臨界サイズ未満の粒子は、バルクフローと共にチャネルを通過することができる）。行をダウンシフトすることにより、ダウンシフトを有する鏡映型アレイに対してチャネルの幅の変化を達成することができる。ダウンシフトの量は、障害物のサイズおよび／または断面形状に基づいて変動し得る。図１８Ｂは、ダウンシフトを有しない、障害物の鏡映型アレイを示す。左側のアレイおよび右側のアレイは、少なくとも臨界サイズの粒子を中心チャネルへ偏向させることができる。
図１９Ａおよび１９Ｂ：これらの図は、ＤＬＤを使用して処理されるアフェレーシス試料中に残っている血小板（図１９Ａ）および、Ｆｉｃｏｌｌ遠心分離を使用して処理されるアフェレーシス試料中に残っている血小板（図１９Ｂ）を示す。血小板はより小さくて明るい細胞（一部は矢印で示される）であり、白血球はより大きくて暗い細胞である。血小板の相対数は、ＤＬＤによって処理される細胞中で実質的に低いことが分かる。
図２０：図２０は、３つの異なるバッファーを使用して、Ｆｉｃｏｌｌ遠心分離により処理されるアフェレーシス試料（白い棒）およびＤＬＤにより処理されるアフェレーシス試料（ストライプの棒）中に残される血小板のパーセンテージをグラフを使って示す。Ｘ軸は残っている血小板のパーセンテージである。１％ＢＳＡ／ＰＢＳバッファーについての結果は、図の左端に示され；Ｆ１２７ポロキサマーインターカレーターを含有するバッファーについてのパーセンテージは中央にあり、エルトリエーションバッファーについてのパーセンテージは右端にある。
図２１：図２１は、図２２の結果を示すが、Ｙ軸は白血球あたりの血小板の数、つまり白血球に対する血小板の比を表す。三重ストライプの棒は、最初のアフェレーシス試料中に存在する比を表し、白い棒はＦｉｃｏｌｌ遠心分離による処理後の比であり、広い間隔の単一のストライプの棒は、ＤＬＤによる処理後の比である。
図２２：図２２は、Ｆｉｃｏｌｌ遠心分離（無地の白い棒）およびＤＬＤ（白い棒に隣接する単一のストライプを有する棒）によるアフェレーシス試料の処理の結果として発生するＴ細胞の増殖を示す棒グラフである。棒は、左から右に移動して、アフェレーシス出発材料中に元々存在している血小板の１０％（二重ストライプの棒）、５０％（小さな斑点で覆われた棒）および１００％（小さな斑点で覆われた棒に隣接する暗く広い間隔の棒を有する棒）を、増殖の前にＤＬＤにより処理される細胞に添加して戻すことの効果を示す。図の左側は、ＥＤＴＡなしでＤＬＤを介して処理され、次いで０日目にＣＤ３／ＣＤ２８で刺激され、３、７および１４日目にＣＤ３陽性細胞がカウントされる細胞を示す。図の右側は、２ｍＭ ＥＤＴＡで処理され、次いで０日目にＣＤ３／ＣＤ２８で刺激され、３、７および１４日目にＣＤ３陽性細胞がカウントされる細胞を示す。
図２３：図２３は、処理の３つの方法：磁気ビーズのみを使用した分離（図の左端の棒）、Ｆｉｃｏｌｌ遠心分離に続いて磁気ビーズを使用した分離（中央の棒）、およびＤＬＤに続く磁気ビーズによる分離（右端の棒）を使用して取得されるＴ細胞の増殖における可変性の比較である。
図２４：図２４は、図２３の増殖されるＴ細胞集団中に存在する、セントラルメモリーＴ細胞である細胞のパーセンテージを示す。
ワークフロー図の概要：図２５－３２はすべて概念を図解するように含まれ、実際に実施される実験には関係ない。図は、次いで処理され、治療的に使用される患者からの細胞を取得し、典型的に細胞が取得されたのと同じ患者を処理することに典型的に関与する基本的なワークフローを図解する。図は、ほとんどの部分について、ＣＡＲ Ｔ細胞の作製に特異的に言及しているが、プロセスは、治療的目的のための白血球および他の細胞の作製に一般的に適用できることが理解される。ＣＡＲ Ｔ細胞などを含む多くのかかるプロセスの場合、患者から収集される細胞は、治療的な目的の遺伝子を発現するように組換え的に操作される。かかる操作のいかなる型も、図解されるプロセスの一部であってもよい。図は、工程を診療所で実施される工程および、図解の目的で「製造現場」と呼ばれている別の場所で実施される工程に分ける。図２５は、例えばＣＡＲ Ｔ細胞の作製において使用される典型的なプロセスに期待されるワークフローを示す。凍結保存された試料が解凍され、洗浄され、デバルキングされ、濃縮された後、細胞の形質転換は典型的には製造現場で生じる。図２６は、同じ基本的なワークフローを維持しながらＤＬＤが使用されてもよいプロトタイプＣＡＲ Ｔ細胞プロセスにおけるいくつかの場所（小さな斑点で覆われた箱）を示す。次いで、図２７－３２は、ワークフローを変更してプロトタイププロセスを改善するためにＤＬＤが使用されてもよい方法の多数の例示的な例を示す。主な目的は、全体的な質がより良い細胞を産生すること、患者を処理するのに十分な数の細胞を取得するために必要な時間を短縮すること、および現在より労働集約的な工程を自動化することである。
図２５：図２５は、患者からの細胞を治療的な使用のために処理する現方法に一般的に関与する基本的なワークフローを図解する。図解されるように、プロセスは、診療所で細胞の収集（「アフェレーシス収集」）から始まり、細胞が増殖され、操作されてもよい製造現場に進み、診療所で患者への細胞の投与（「再注入」）で終了する。
図２６：図２６は、ＤＬＤを使用できるＣＡＲ Ｔワークフローにおけるいくつかの工程（小さな斑点で覆われた箱）を示す。この例において、基本的なワークフローは基本的に変更されないままである。
図２７：図２７は、凍結する前に細胞をクリーンアップするためにアフェレーシスの直後にＤＬＤが使用されてもよいことを図解する（小さな斑点で覆われた箱）。この時点でＤＬＤを使用する利点は、それが、輸送前に細胞から血小板を除去し、それによって血小板の活性化、血餅形成、保管関連の任意の脱顆粒、および細胞の全体的な損失による有害な影響を排除することである。このようにして、ＤＬＤは輸送されている細胞組成物の質を改善し、プロセスにおける実践的労働工程の１つを自動化された対応物に置き換える。
図２８：このシナリオにおいて、細胞がクリーンアップ、活性化、ＤＬＤ分離され、成長培地などの所望の培地中に移される初期の工程の間に、ＤＬＤが使用される（小さな斑点で覆われた箱）。重要なのは、プロセスを完了させるのに必要な時間を例えば約２－３日減少させるはずである診療所での凍結および凍結保存、および製造現場でのその後の解凍が回避される。好まれないが、必要に応じて、凍結保存工程は依然として実施されることができる。回避されてもよい他の工程は、線を引かれたテキストで示される。
図２９：このシナリオにおいて、ＤＬＤは、Ｔ細胞上の細胞表面ＣＤ３に結合する磁気ビーズと組み合わせて使用される。このシナリオは、上記の血小板を減少させるという同じ利点を有するが、プロトタイプ手順よりもはるかに早く細胞を活性化して成長を開始するために使用されてもよい。細胞はまた、成長と互換性のある暖かい温度で輸送されてもよい。その結果、製造現場で実施されていた対応工程が排除され、全体の処理時間が対応して減少される。
図３０：図２９のシナリオと比較した図３０に示されるシナリオにおける最も重要な違いは、アクチベーターに曝された直後に、細胞がウイルスで遺伝的に形質転換されることである（小さな斑点で覆われた箱を参照）。活性化および形質転換の前に数日経過するのではなく、細胞は、アフェレーシス収集が完了してから２４時間以内に、培地中で精製、活性化、形質転換され、成長する。好ましくは、アフェレーシスの完了からベクターに曝されることまでの時間は、１２時間以内、より好ましくは６時間または３時間以内であるはずである。最も好ましくは、曝されることは、アフェレーシスが完了してから２時間以内、すべての場合において、細胞が凍結する前に生じる。図は、排除されてもよい製造現場での多くの処理工程を示しており、患者を処理するために十分な細胞を取得するのに必要とされる時間は、少なくとも３または４日減少されると予想される。
図３１：図３１に示されるシナリオは、図３０のシナリオと同様であるが、Ｔ細胞の単離を支援するために、親和性手順による分離（ＣＤ３含有細胞を認識する磁気ビーズによって例示される）が初期の工程に追加される。ＤＬＤは、細胞を精製および／または濃縮するためにも使用される。
図３２：図３２に示されるシナリオにおいて、アフェレーシスにより収集されるＴ細胞は、精製され、操作され、増殖され、そして凍結される工程を経ることなく再注入のために濃縮される。すべての工程は、必要に応じて、輸送の必要なしに細胞が収集される場所で実施されることができる。
定義
アフェレーシス：本明細書で用いられる場合、この用語は、患者またはドナー由来の血液がそれの成分、例えば、血漿、白血球、および赤血球へ分離される手順を指す。より具体的な用語は、「血小板アフェレーシス」（血小板の分離を指す）および「白血球アフェレーシス」（白血球の分離を指す）である。この関連において、用語「分離」は、全血と比較して、特定の成分が濃縮されている産物の取得を指し、絶対的純粋が達成されていることを意味しない。
ＣＡＲ Ｔ細胞：用語「ＣＡＲ」は、「キメラ抗原受容体」の頭字語である。したがって、「ＣＡＲ Ｔ細胞」は、キメラ受容体を発現するように遺伝子操作されているＴ細胞である。
ＣＡＲ Ｔ細胞治療：この用語は、疾患がＣＡＲ Ｔ細胞で処置される任意の手順を指す。処置され得る疾患には、血液学的および固形腫瘍癌、自己免疫疾患、ならびに感染性疾患が挙げられる。
担体：本明細書で用いられる場合、用語「担体」は、存在する化合物または細胞の一部または全部と直接的に、または間接的に（すなわち、１つまたは複数の中間の細胞、粒子、または化合物を通して）結合することを目的として調製物に加えられる、生物学的かまたは合成的かのいずれかの材料で作られた作用物質、例えば、ビーズまたは粒子を指す。担体は、ＤＥＡＥ－デキストラン、ガラス、ポリスチレン、プラスチック、アクリルアミド、コラーゲン、およびアルギン酸塩を含む、様々な異なる材料から作製され得、典型的には、１～１０００μｍのサイズを有する。それらは、コーティングされている場合もされていない場合もあり、細胞の表面上の抗原または他の分子を認識する親和性物質（例えば、抗体、アクチベーター、ハプテン、アプタマー、粒子、または他の化合物）を含むように改変されている表面を有し得る。担体はまた、磁化され得、これは、ＤＬＤを補完するための精製の追加の手段を提供し得、それらは、細胞または細胞複合体に、サイズに関係しない二次的性質を与える粒子（例えば、ヤヌスまたはイチゴ様粒子）を含み得る。例えば、その粒子は、結果として、磁気分離、エレクトロポレーション、遺伝子移入、および／または特定の分析化学プロセスなどの下流プロセスに用いることができる化学的、電気化学的、または磁気的性質を生じ得る。粒子はまた、細胞における代謝変化を引き起こし、細胞を活性化し、または細胞分裂を促進し得る。
「ＤＬＤ分離を促進するように」結合する担体：この用語は、状況に依存して、細胞、タンパク質、または粒子がＤＬＤ中に挙動する仕方に影響する、担体、および担体を結合する方法を指す。具体的には、「ＤＬＤ分離を促進するように結合すること」とは、ａ）その結合することが、特定の標的細胞型、タンパク質、または粒子に対する特異性を示さなければならず、かつｂ）結合していない細胞、タンパク質、または粒子と比べて、複合体のサイズの増加を提供する複合体を生じなければならないことを意味する。標的細胞との結合の場合、少なくとも２μｍ（あるいは、パーセンテージとして表現された場合、少なくとも２０％、５０％、１００％、２００％、５００％、または１０００％）の増加がなければならない。治療または他の用途が、標的細胞、タンパク質、または他の粒子が、それらの意図された用途を満たすために複合体から放出されることを必要とする場合、用語「ＤＬＤ分離を促進するように」はまた、その複合体が、そのような放出を、例えば、化学的もしくは酵素的切断、化学的溶解、消化により、他の結合剤との競合により、または物理的剪断（例えばピペットを用いて、ずり応力を生じること）により可能にし、かつその解放された標的細胞、タンパク質、または他の粒子が、活性を維持しなければならない；例えば、複合体からの放出後の治療用細胞は、それらを治療的に有用にさせる生物学的活性をなお維持しなければならないことを必要とする。
担体はまた「ＤＬＤ分離を補完するように」結合し得る：この用語は、ＤＬＤ分離を促進するのに十分にサイズを増加させるかどうかに関わらず、細胞もしくは細胞複合体の化学的、電気化学的、もしくは磁気的性質を変化させ、または細胞の１つもしくは複数の生物学的活性を変化させる、担体、および担体を結合する方法を指す。ＤＬＤ分離を補完する担体はまた、必ずしも標的細胞と特異性を以て結合するとは限らない、すなわち、それらは、それらを特異性にさせる何かの他の作用物質と組み合わされなければならない場合もあるし、またはそれらは単に、細胞調製物に加えられて、非特異的に結合してもよい。用語「ＤＬＤ分離を補完するように」および「ＤＬＤ分離を促進するように」は、お互いに排他的ではない。結合は、ＤＬＤ分離を補完すること、およびまたＤＬＤ分離を促進することの両方であり得る。例えば、多糖担体は、それの表面上に、細胞成長速度を増加させるアクチベーターを有し得、これらの担体の１つまたは複数の結合はまた、ＤＬＤ分離を促進し得る。あるいは、結合は、ＤＬＤ分離をただ促進するだけ、またはＤＬＤ分離をただ補完するだけであり得る。
標的細胞：本明細書で用いられる場合、「標的細胞」は、本明細書に記載された様々な手順が必要とする細胞、または精製し、収集し、操作するなどのために設計される細胞である。その特定の細胞が何であるかは、その用語が用いられる文脈に依存する。例えば、手順の目的が特定の種類の幹細胞を単離することである場合には、その細胞は、その手順の標的細胞である。
単離する、精製する：他の指示がない限り、これらの用語は、本明細書で用いられる場合、同意語であり、望まれない材料に対しての所望の産物の濃縮を指す。その用語は必ずしも、その産物が完全に単離され、または完全に純粋であることを意味するわけではない。例えば、出発試料が、試料中細胞の２％を構成する標的細胞を有し、そして、手順が実施され、結果として、その標的細胞が、存在する細胞の６０％である組成を生じたならば、その手順は、標的細胞を単離または精製することに成功しただろう。
バンプ（bump）アレイ：用語「バンプアレイ」および「障害物アレイ」は、本明細書では同意語として用いられ、細胞または粒子を有する流体を通過させることができるフローチャネルに配置されている障害物の規則正しいアレイを記載する。
決定論的横置換：本明細書で用いられる場合、用語「決定論的横置換」または「ＤＬＤ」は、粒子が、アレイのパラメータの一部に関係したそれらのサイズに基づいて、決定論的に、アレイを通る経路において偏向されるプロセスを指す。このプロセスは、細胞を分離するため用いることができ、そのことが、このプロセスが本明細書で論じられる一般的な背景にある。しかしながら、ＤＬＤがまた、細胞を濃縮するために、およびバッファー交換のために用いられ得ることを認識することは重要である。プロセスは、一般的に、連続フロー（ＤＣ状態、すなわち、単一の方向のみでのバルク流体フロー）に関して本明細書で記載されている。しかしながら、ＤＬＤはまた、振動フロー（ＡＣ状態、すなわち、２つの方向の間を交互に変換するバルク流体フロー）で機能することもできる。
臨界サイズ：障害物アレイを通過する粒子の「臨界サイズ」または「既定サイズ」は、流体の層流に従うことができる粒子のサイズ限界を記載する。臨界サイズより大きい粒子は、流体のフロー経路から「バンピング」され得、一方、臨界サイズ（または既定サイズ）より小さいサイズを有する粒子は、必ずしもそのように外されるとは限らない。間隙を通る流体フローのプロフィールが、バルク流体フローの方向にその間隙を二等分する平面に関して対称である場合、臨界サイズは、間隙の両側について同一であり得る；しかしながら、そのプロフィールが非対称である場合、間隙の２つの側面の臨界サイズは異なり得る。
流体フロー：ＤＬＤとの関連において本明細書で用いられる場合、用語「流体フロー」および「バルク流体フロー」は、障害物アレイに渡る全般的な方向における巨視的な動きを指す。これらの用語は、流体が全般的な方向で移動し続けるために流体が障害物の周りを動く、流体の流れの一時的変位を考慮しない。
傾斜角ε：バンプアレイデバイスにおいて、傾斜角は、バルク流体フローの方向と、アレイにおける連続的（バルク流体フローの方向における）障害物の行の整列により定義される方向との間の角度である。
アレイ方向：バンプアレイデバイスにおいて、「アレイ方向」は、アレイにおける連続的障害物の行の整列により定義される方向である。粒子は、間隙を通過し、かつ下流の障害物に遭遇した時、粒子の全体的な軌道が、バンプアレイのアレイ方向に従う（すなわち、バルク流体フローに対して傾斜角εで動く）場合には、バンプアレイにおいて「バンピング」されている。粒子は、それの全体的な軌道が、それらの状況下で、バルク流体フローの方向に従う場合には、バンピングされていない。
本発明は、主として、治療上、価値のある細胞を調製することにおけるＤＬＤの使用に関係している。下記の本文は、本明細書に開示された方法に関するガイダンス、ならびにそれらの方法を行うことに関与するデバイスの作製および使用に役立ち得る情報を提供する。
１．マイクロ流体プレートの設計
細胞、特に、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシスにより調製された組成物における細胞は、流体が、デバイスの１つの端における注入口から反対側の端の出口へ流れるチャネルを含有するマイクロ流体デバイスを用いてＤＬＤを実施することにより単離され得る。サイズに基づいたマイクロ流体分離の基本原理、および細胞を分離するための障害物アレイの設計は、他の所（ＵＳ ２０１４／０３４２３７５；ＵＳ ２０１６／０１３９０１２；７，３１８，９０２、およびＵＳ ７，１５０，８１２参照。それらは、全体として参照により本明細書に組み入れられている）で提供されており、また、下記のセクションで要約されている。
ＤＬＤの間、細胞を含有する流体試料は、デバイスへ注入口において導入され、デバイスを通って出口へ流れる流体と共に運ばれる。試料中の細胞がデバイスを横切る時、それらは、いくつもの行をなして位置づけられており、かつ、細胞が通過しなければならない間隙または細孔を形成するポストまたは他の障害物に遭遇する。障害物のそれぞれの連続する行は、フローチャネルにおいて流体フローの方向とは異なるアレイ方向を形成するように前の行に対してずらされる。障害物間の間隙の幅、障害物の形、および間隙を形成する障害物の配向と共に、これらの２つの方向により定義される「傾斜角」は、アレイについての「臨界サイズ」を決定することにおける主要な因子である。臨界サイズより大きいサイズを有する細胞は、バルク流体フローの方向よりむしろ、アレイ方向に動き、臨界サイズより小さいサイズを有する粒子は、バルク流体フローの方向に動く。白血球アフェレーシスにより引き出された組成物に用いられるデバイスにおいて、結果として、白血球がアレイ方向にそらされることを生じ、一方、赤血球および血小板がバルク流体フローの方向を保ち続ける、アレイ特徴が選択され得る。白血球の選択された型を、類似したサイズを有する他のものから分離するために、その時、ＤＬＤ分離を促進するように、その細胞と結合し、それにより、非複合体化白血球より大きい複合体を生じる、担体が用いられ得る。その時、複合体より小さいが、非複合体化細胞より大きい臨界サイズを有するデバイス上で分離を行うことが可能であり得る。
デバイスに用いられる障害物は、円柱の形状をとり得、または三角形、四角形、長方形、菱形、台形、六角形、もしくは涙滴形であり得る。加えて、隣接障害物は、間隙を定義する障害物の部分が、バルク流体フローの方向に延びる間隙の軸に関して対称または非対称のいずれかであるような幾何学的配置を有し得る。
ＩＩ．マイクロ流体デバイスの作製および操作
サイズに基づいて細胞を分離する能力があるマイクロ流体デバイスを作製および使用するための一般的な手順は、当技術分野において周知されている。そのようなデバイスには、ＵＳ ５，８３７，１１５；ＵＳ ７，１５０，８１２；ＵＳ ６，６８５，８４１；ＵＳ ７，３１８，９０２；７，４７２，７９４；およびＵＳ ７，７３５，６５２（それらの全ては、全体として参照により本明細書に組み入れられている）に記載されたものが挙げられる。本発明のためのデバイスの作製および使用に役立ち得るガイダンスを提供する他の参考文献には以下が挙げられる：ＵＳ ５，４２７，６６３；ＵＳ ７，２７６，１７０；ＵＳ ６，９１３，６９７；ＵＳ ７，９８８，８４０；ＵＳ ８，０２１，６１４；ＵＳ ８，２８２，７９９；ＵＳ８，３０４，２３０；ＵＳ ８，５７９，１１７；ＵＳ ２００６／０１３４５９９；ＵＳ ２００７／０１６０５０３；ＵＳ ２００５０２８２２９３；ＵＳ ２００６／０１２１６２４；ＵＳ ２００５／０２６６４３３；ＵＳ ２００７／００２６３８１；ＵＳ ２００７／００２６４１４；ＵＳ ２００７／００２６４１７；ＵＳ ２００７／００２６４１５；ＵＳ ２００７／００２６４１３；ＵＳ ２００７／００９９２０７；ＵＳ ２００７／０１９６８２０；ＵＳ ２００７／００５９６８０；ＵＳ ２００７／００５９７１８；ＵＳ ２００７／００５９１６；ＵＳ ２００７／００５９７７４；ＵＳ ２００７／００５９７８１；ＵＳ ２００７／００５９７１９；ＵＳ ２００６／０２２３１７８；ＵＳ ２００８／０１２４７２１；ＵＳ ２００８／００９０２３９；ＵＳ ２００８／０１１３３５８；およびＷＯ２０１２０９４６４２（それらの全ては全体として参照により本明細書に組み入れられている）。デバイスの作製および使用を記載する様々な参考文献のうちで、ＵＳ ７，１５０，８１２は、特に良いガイダンスを提供し、７，７３５，６５２は、血液中に見出される細胞を含む試料に実施される分離のためのマイクロ流体デバイス（この点において、ＵＳ ２００７／０１６０５０３も参照されたい）に関して、特に興味深い。
デバイスは、マイクロスケールおよびナノスケールの流体ハンドリングデバイスが典型的に製作される材料のいずれかを用いて作製することができ、その材料には、シリコン、ガラス、プラスチック、およびハイブリッド材料が挙げられる。マイクロ流体製作に適した様々な熱可塑性材料が、利用可能であり、強化し、かつさらに特定の適用に合わせて調整することができる、機械的および化学的性質の幅広い選択を提供する。
デバイスを作製するための技術には、レプリカ成形、ＰＤＭＳを用いたソフトリソグラフィ、熱硬化性ポリエステル、エンボス加工、射出成形、レーザー切断、およびそれらの組合せが挙げられる。さらなる詳細は、「Disposable microfluidic devises: fabrication, function and application」、Fiorini, et al. (BioTechniques 38:429-446 (March 2005))（それは、全体として参照により本明細書に組み入れられている）に見出すことができる。書籍「Lab on a Chip Technology」Keith E.編 Herold and Avraham Rasooly, Caister Academic Press Norfolk UK (2009)は、製作の方法についてのもう一つのリソースであり、全体として参照により本明細書に組み入れられている。
熱可塑性プラスチックのオープンリール式処理などのハイスループットエンボス加工方法は、工業用マイクロ流体チップ製造についての魅力的な方法である。単一チップ熱エンボス加工の使用は、プロトタイプ製造段階中に高品質マイクロ流体デバイスを実現するための費用効果の高い技術であり得る。２つの熱可塑性プラスチックである、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）および／またはポリカーボネート（ＰＣ）におけるマイクロスケールのフィーチャーの複製のための方法は、「Microfluidic device fabrication by thermoplastic hot-embossing」、Yang, et al. (Methods Mol. Biol. 949: 115-23 (2013))（それは、全体として参照により本明細書に組み入れられている）に記載されている。
フローチャネルは、組み立てられた時、それの内に配置された障害物を有する、閉キャビティ（好ましくは、流体を加え、または抜き取るための開口部を有するもの）を形成する２つ以上の部品を用いて構築することができる。障害物は、組み立てられてフローチャネルを形成する１つ以上の部品において製作することができ、またはそれらは、フローチャネルの境界を定義する２つ以上の部品の間に挟まれている挿入物の形をとって製作することができる。
障害物は、フローチャネルに渡って、場合によっては、フローチャネルの１つの面からフローチャネルの反対側の面へ、延びる固形物であり得る。障害物が、その障害物の一端でフローチャネルの面の１つと一体になっている（またはそれの延長部である）場合、その障害物の他方の端は、フローチャネルの反対側の面に対して、塞がれ、または押しつけられ得る。小さい（好ましくは、意図された用途についての目的の任意の粒子を収容するには小さすぎる）空間が、その空間が、障害物の構造的安定性またはデバイスの関連したフロー性質に悪影響を及ぼさないという条件で、障害物の一端とフローチャネルの面との間で許容される。
存在する障害物の数は、アレイの粒子を分離する性質を実現するのに十分であるべきである。障害物は、一般的に、行および列（注：用語「行および列」の使用は、行および列がお互いに垂直であることを意味または含意しない）へ組織化することができる。全般的にフローチャネルにおいて流体フローに対して横切る方向に整列する障害物は、列における障害物と呼ぶことができる。列においてお互いに隣接した障害物は、流体が流れる間隙を定義し得る。
隣接した列における障害物は、ε（イプシロン）と名付けられた傾斜角により特徴づけられる角度だけ、お互いから斜めであり得る。したがって、お互いに隣接した数個の列について（すなわち、一般的にその列に対して横切る単一の方向に流体フローにより連続的に通過される障害物の数個の列）、列における対応する障害物は、その対応する障害物が、その列を通過する流体フローの方向に対して角度εで延びる障害物の行を形成するように、お互いから斜めであり得る。傾斜角が選択され得、１／ε（ラジアンで表示された場合）が整数であるように、列はお互いから相隔たることができ、障害物の列は周期的に繰り返す。単一の列における障害物もまた、同じ、または異なる傾斜角だけ、お互いから斜めであり得る。例として、行および列を、お互いに対して９０度の角度で配列することができ、行と列の両方が、εの同じ角度で、フローチャネルを通るバルク流体フローの方向に対して傾斜している。
表面は、それらの性質、およびデバイスを製作するために使用されるポリマー材料を改変するためにコーティングすることができ、多くの方法で改変することができる。ある場合では、天然のポリマー中にあるか、または湿式化学またはプラズマ処理を用いて付加されるかのいずれかであるアミンまたはカルボン酸などの官能基が、タンパク質または他の分子を架橋するために用いられる。ＤＮＡを、表面アミン基を用いて、ＣＯＣおよびＰＭＭＡ基質へ付着させることができる。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）などの界面活性剤は、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）をＰＤＭＳ製剤へ加えることにより、表面を親水性およびタンパク質忌避性にするために用いることができる。場合によっては、ＰＭＭＡの層が、デバイス上でスピンコーティングされ、例えば、マイクロ流体チップおよびＰＭＭＡが、それの接触角度を変化させるために、ヒドロキシプロピルセルロースで「ドープ」される。
例えば溶解した細胞により放出された、または生物学的試料に見出される、細胞または化合物のチャネル壁への非特異的吸着を低下させるために、１つまたは複数の壁は、非接着性または反発性であるように化学的に改変され得る。壁は、ヒドロゲルを形成するために用いられるものなどの市販の汚れ防止試薬の薄膜コーティング（例えば、単層）でコーティングされ得る。チャネル壁を改変するために用いられ得る化学種の追加の例には、オリゴエチレングリコール、フッ素化ポリマー、オルガノシラン、チオール、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、ウシ血清アルブミン、ポリビニルアルコール、ムチン、ポリ－ＨＥＭＡ、メタクリル化ＰＥＧ、およびアガロースが挙げられる。荷電ポリマーもまた、逆荷電種を反発させるために使用され得る。反発させるために用いられる化学種の型、およびチャネル壁への付着の方法は、反発させることになっている種の性質、ならびに壁および付着されることになっている種の性質に依存し得る。そのような表面改変技術は、当技術分野において周知されている。壁は、デバイスが組み立てられる前または後に機能性付与され得る。
ＩＩＩ．ＣＡＲ Ｔ細胞
ＣＡＲ Ｔ細胞を作製および使用するための方法は、当技術分野において周知されている。手順は、例えば、ＵＳ ９，６２９，８７７；ＵＳ ９，３２８，１５６；ＵＳ ８，９０６，６８２；ＵＳ ２０１７／０２２４７８９；ＵＳ ２０１７／０１６６８６６；ＵＳ ２０１７／０１３７５１５；ＵＳ ２０１６／０３６１３６０；ＵＳ ２０１６／００８１３１４；ＵＳ ２０１５／０２９９３１７；およびＵＳ ２０１５／００２４４８２（それぞれ、全体として参照により本明細書に組み入れられている）に記載されている。
ＩＶ．ＤＬＤを用いる分離プロセス
本明細書に記載されたＤＬＤデバイスは、細胞、細胞断片、細胞付加体、または核酸を精製するために用いることができる。本明細書で論じられているように、これらのデバイスはまた、目的の細胞集団を複数の他の細胞から分離するために用いることができる。デバイスを用いる血液成分の分離および精製は、例えば、米国特許出願公開第２０１６／０１３９０１２号に見出すことができ、それの教示は、全体として参照により本明細書に組み入れられている。少数の実例となる分離の簡単な議論は下記に提供されている。
Ａ．生存細胞
一実施形態において、デバイスは、生存細胞を非生存細胞から分離するように設計された手順に用いられる。用語「生存細胞」は、成長の能力があり、活発に分裂しており、再生の能力があるなどの細胞を指す。生存細胞が、非生存細胞より大きいサイズを有する場合、ＤＬＤデバイスは、非生存細胞の既定サイズより大きく、かつ生存細胞の既定サイズより小さい臨界サイズを含むように設計することができる。臨界サイズは、非生存細胞の既定サイズの１．１倍大きい（または小さい）などの小規模であり得るが、一般的に、より大きい（またはより小さい）程度が好ましく、例えば、約１．２倍～２倍、好ましくは３～１０倍である。
Ｂ．接着細胞
別の実施形態において、ＤＬＤデバイスは、接着細胞を分離するための手順に用いることができる。本明細書で用いられる場合、用語「接着細胞」は、表面に接着する能力がある細胞を指す。接着細胞には、細胞培養に用いられる不死化細胞が挙げられ、哺乳類宿主に由来し得る。場合によっては、接着細胞は、精製の前にトリプシン処理され得る。接着細胞の例には、ＭＲＣ－５細胞；ＨｅＬａ細胞；Ｖｅｒｏ細胞；ＮＩＨ ３Ｔ３細胞；Ｌ９２９細胞；Ｓｆ２１細胞；Ｓｆ９細胞；Ａ５４９細胞；Ａ９細胞；ＡｔＴ－２０細胞；ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞；ＢＨＫ－２１細胞；ＢＨＬ－１００細胞；ＢＴ細胞；Ｃａｃｏ－２細胞；Ｃｈａｎｇ細胞；Ｃｌｏｎｅ ９細胞；Ｃｌｏｎｅ Ｍ－３細胞；ＣＯＳ－１細胞；ＣＯＳ－３細胞；ＣＯＳ－７細胞；ＣＲＦＫ細胞；ＣＶ－１細胞；Ｄ－１７細胞；Ｄａｕｄｉ細胞；ＧＨ１細胞；ＧＨ３細胞；ＨａＫ細胞；ＨＣＴ－１５細胞；ＨＬ－６０細胞；ＨＴ－１０８０細胞；ＨＴ－２９細胞；ＨＵＶＥＣ細胞；Ｉ－１０細胞；ＩＭ－９細胞；ＪＥＧ－２細胞；Ｊｅｎｓｅｎ細胞；Ｊｕｒｋａｔ細胞；Ｋ－５６２細胞；ＫＢ細胞；ＫＧ－１細胞；Ｌ２細胞；ＬＬＣ－ＷＲＣ ２５６細胞；ＭｃＣｏｙ細胞；ＭＣＦ７細胞；ＷＩ－３８細胞；ＷＩＳＨ細胞；ＸＣ細胞；Ｙ－１細胞； ＣＨＯ細胞；Ｒａｗ ２６４．７；ＢＨＫ－２１細胞；２９３Ａ、２９３Ｔなどを含むＨＥＫ ２９３細胞；ＨＥＰ Ｇ２細胞；ＢＡＥ－１細胞；ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞；ならびに、操作された株および組換え株を含む、それらの任意の誘導体が挙げられる。
いくつかの実施形態において、手順は、成長培地などの希釈剤から細胞を分離することを含み得、その分離することは、接着細胞の培養物の効率的な維持を提供し得る。例えば、成長培地における接着細胞の培養物は、トランスフェクション試薬を含むトランスフェクション培地へ、幹細胞の分化などの接着細胞内の変化を誘発するように設計された第２の成長培地へ、またはその培養物から化合物を除去するように設計された連続洗浄バッファーへ交換することができる。
特に好ましい手順において、接着細胞は、ＤＬＤ分離を促進するように結合する１つまたは複数の担体との会合を通して精製される。担体は、本明細書に記載された型であり得、結合は、細胞を安定化および／または活性化し得る。担体は、典型的には、１～１０００μｍの範囲であるが、この範囲外である場合もあり得る。
担体と細胞の間の会合は、担体と会合していない他の材料に対して増加したサイズの複合体を生じるはずである。細胞および担体の特定のサイズ、ならびに存在する細胞および担体の数に依存して、複合体は、非複合体化細胞より数パーセント大きくから、非複合体化細胞のサイズの多数倍までの範囲であり得る。分離を容易にするために、少なくとも２０％の増加が望ましく、より高いパーセンテージ（５０；１００；１０００またはそれ以上）が好ましい。
Ｃ．活性化細胞
ＤＬＤデバイスはまた、活性化細胞または活性化の能力がある細胞を、複数の他の細胞から分離するための手順に用いることができる。活性化を受けた細胞は、ラージスケールで成長し得るが、好ましい実施形態において、その細胞は、単一の患者に由来し、ＤＬＤが、収集から少なくとも数時間以内に実施される。用語「活性化細胞」または「活性化の能力がある細胞」は、細胞アクチベーターとの会合、インキュベーション、または接触を通して、それぞれ、活性化されている、または活性化され得る細胞を指す。活性化の能力がある細胞の例には、免疫または炎症応答において役割を果たす細胞、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞；制御性Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞、顆粒球、自然リンパ球系細胞、巨核球、ナチュラルキラー細胞、栓球、滑膜細胞など；代謝において役割を果たす細胞、例えば、β細胞、肝臓細胞、および膵臓細胞；ならびに誘導性タンパク質発現の能力がある組換え細胞、例えば、ＤＥ３溶原化Ｅ．コリ（E. coli）細胞、酵母細胞、植物細胞などが挙げられ得る。
典型的には、１つまたは複数の担体は、表面上にアクチベーターを有する。細胞アクチベーターの例には、タンパク質、抗体、サイトカイン、ＣＤ３、ＣＤ２８、特定のタンパク質に対する抗原、ヘルパーＴ細胞、受容体、および糖タンパク質；ホルモン、例えば、インスリン、グルカゴンなど；ＩＰＴＧ、ラクトース、アロラクトース、脂質、グリコシド、テルペン、ステロイド、およびアルカロイドが挙げられる。活性化可能細胞は、活性化可能細胞と担体の表面上の細胞アクチベーターとの間の相互作用を通して、担体と少なくとも部分的に会合するべきである。形成された複合体は、非複合体化細胞よりほんの数パーセントだけ大きい場合もあるし、または非複合体化細胞のサイズの多数倍である場合もある。分離を容易にするために、少なくとも２０％の増加が望ましく、より高いパーセンテージ（４０、５０、１００、１０００、またはそれ以上）が好ましい。
Ｄ．細胞の毒性材料からの分離
ＤＬＤはまた、細胞にとって毒性であり得る化合物を除去するように、または細胞を毒性化合物による汚染を含まないようにしておくように設計された精製に用いることができる。例には、抗生物質、凍結保存剤、抗真菌剤、毒性代謝産物、アジ化ナトリウム、金属イオン、金属イオンキレート化剤、内毒素、可塑剤、殺虫剤、およびそれらの組合せが挙げられる。デバイスは、細胞から毒性化合物を除去して、細胞から材料の一貫した生産を保証するために用いることができる。場合によっては、細胞は、対数期細胞であり得る。用語「対数期細胞」は、指数関数的対数成長により特徴づけられる成長の時期における活発に分裂する細胞を指す。対数期において、細胞集団は、時間に対して細胞数の自然対数をプロットすることにより直線が生じるような、一定速度で倍増することができる。
毒性材料を分離する能力は、幅広い種類の細胞にとって重要であり得、その細胞には、細菌株、例えば、ＢＬ２１、Ｔｕｎｅｒ、Ｏｒｉｇａｍｉ、Ｏｒｉｇａｍｉ Ｂ、Ｒｏｓｅｔｔａ、Ｃ４１、Ｃ４３、ＤＨ５α、ＤＨ１０β、またはＸＬ１Ｂｌｕｅ；酵母株、例えば、サッカロミセス属（Saccharomyces）、ピキア属（Pichia）、クリベロマイセス属（Kluyveromyces）、ハンゼヌラ属（Hansenula）、およびヤロウイア属（Yarrowia）の株；藻類；ならびにＭＲＣ－５細胞；ＨｅＬａ細胞；Ｖｅｒｏ細胞；ＮＩＨ ３Ｔ３細胞；Ｌ９２９細胞；Ｓｆ２１細胞；Ｓｆ９細胞；Ａ５４９細胞；Ａ９細胞；ＡｔＴ－２０細胞；ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞；ＢＨＫ－２１細胞；ＢＨＬ－１００細胞；ＢＴ細胞；Ｃａｃｏ－２細胞；Ｃｈａｎｇ細胞；Ｃｌｏｎｅ ９細胞；Ｃｌｏｎｅ Ｍ－３細胞；ＣＯＳ－１細胞；ＣＯＳ－３細胞；ＣＯＳ－７細胞；ＣＲＦＫ細胞；ＣＶ－１細胞；Ｄ－１７細胞；Ｄａｕｄｉ細胞；ＧＨ１細胞；ＧＨ３細胞；ＨａＫ細胞；ＨＣＴ－１５細胞；ＨＬ－６０細胞；ＨＴ－１０８０細胞；ＨＴ－２９細胞；ＨＵＶＥＣ細胞；Ｉ－１０細胞；ＩＭ－９細胞；ＪＥＧ－２細胞；Ｊｅｎｓｅｎ細胞；Ｊｕｒｋａｔ細胞；Ｋ－５６２細胞；ＫＢ細胞；ＫＧ－１細胞；Ｌ２細胞；ＬＬＣ－ＷＲＣ ２５６細胞；ＭｃＣｏｙ細胞；ＭＣＦ７細胞；ＷＩ－３８細胞；ＷＩＳＨ細胞；ＸＣ細胞；Ｙ－１細胞； ＣＨＯ細胞；Ｒａｗ ２６４．７；ＢＨＫ－２１細胞；２９３Ａ、２９３Ｔなどを含むＨＥＫ ２９３細胞；ＨＥＰ Ｇ２細胞；ＢＡＥ－１細胞；ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞の培養物を含む、哺乳類細胞培養物；幹細胞、ならびに操作された株および組換え株を含むそれらの任意の誘導体が挙げられる。
Ｅ．細胞から分泌された材料の精製
ＤＬＤ分離はまた、細胞から分泌された材料の精製に用いられ得る。そのような分泌性材料の例には、タンパク質、ペプチド、酵素、抗体、燃料、藻類に由来したものなどのバイオ燃料、ポリマー、単純な有機分子などの小分子、複雑な有機分子、薬物およびプロドラッグ、糖質、ならびにそれらの組合せが挙げられる。分泌性産物には、インスリン、イマチニブ、Ｔ細胞、Ｔ細胞受容体、Ｆｃ融合タンパク質、抗凝固剤、血液因子、骨形成タンパク質、操作されたタンパク質スキャフォールド、酵素、成長因子、ホルモン、インターフェロン、インターロイキン、および血栓溶解剤などの治療上有用なタンパク質が挙げられ得る。
図１５は、分泌性産物の精製におけるＤＬＤの使用を描く概略図である。場合によっては、細胞は、細胞が産物を懸濁液へ分泌するように、バッファー、成長培地などの水性懸濁液中にあり得る。そのような分泌性産物の例には、タンパク質、ペプチド、酵素、抗体、燃料、藻類に由来したものなどのバイオ燃料、ポリマー、単純な有機分子などの小分子、複雑な有機分子、薬物およびプロドラッグ、糖質、ならびにそれらの組合せが挙げられる。分泌性産物には、インスリン、イマチニブ、Ｔ細胞、Ｔ細胞受容体、Ｆｃ融合タンパク質、抗凝固剤、血液因子、骨形成タンパク質、操作されたタンパク質スキャフォールド、酵素、成長因子、ホルモン、インターフェロン、インターロイキン、および血栓溶解剤などの治療上有用なタンパク質が挙げられ得る。
精製は、例えば、細胞が、分泌性化合物の既定サイズより大きい既定サイズを有する状況において、行われ得、前記細胞の既定サイズが、臨界サイズ以上であり、かつ前記分泌性産物の既定サイズが臨界サイズ未満である。そのような構成において、ＤＬＤデバイスにアプライされた時、細胞は、第１の方向に偏向され得、一方、分泌性化合物は第２の方向に偏向され得、それにより、分泌性化合物を細胞から分離する。また、分泌性タンパク質は、ＤＬＤ分離を促進するように結合する大きな担体により捕獲され得る。その後、ＤＬＤが実施され得、その後、担体－タンパク質複合体は、そのタンパク質をさらに精製し、または放出するために処理され得る。
そのようなプロセスは、分離された粒子の集団が、さらなる分離のために、連続的にデバイスへループバックされ得るように反復様式で行われ得る。この点において、図１６および１７は、分離された細胞が、分離後、ＤＬＤデバイスへループバックされる、反復プロセスの概略図である。場合によっては、細胞は、第１のデバイスから、異なる臨界サイズを含む障害物を有する第２の異なるデバイスへループされ得る。そのようなシステムは、臨界サイズの範囲を操作することにより、複数のサイズ範囲の系統的分離を可能にすることができる。他の場合では、細胞は、その分離された粒子を分離するのに前に用いられた同じデバイスへループバックされ得る。このシステムは、活発に分裂する細胞、または活発に発現している最中の化合物の連続的精製について有利であり得る。例えば、そのような方法は、１つのフロー流由来の分泌性産物と、別のフロー流由来の分泌性産物を産生する細胞の両方を収集する分泌性産物を精製する方法と組み合わせることができた。細胞は分泌性産物を連続的に産生することができるため、精製された細胞は、その細胞からの分泌性産物を連続的に収集するためにデバイスへ再アプライされ得る。
Ｆ．純度および収率
本明細書で論じられたＤＬＤ方法により産生された細胞の純度、収率、および生存率は、出発材料の性質、使用される厳密な手順、およびＤＬＤデバイスの特徴を含むいくつかの因子に基づいて変動する。好ましくは、少なくとも６０％の精製、収率、および生存率が、得られるべきであり、より高いパーセンテージの、少なくとも７０％、８０％、または９０％がより好ましい。好ましい実施形態において、方法は、全血、アフェレーシス産物、または白血球アフェレーシス産物から白血球を少なくとも７０％の純度、収率、および生存率で単離するために用いられ得、より高いパーセンテージ（少なくとも８０％、８５％、または９０％）が好ましい。
Ｖ．技術的背景
いかなる特定の理論にも捕らわれずに、マイクロ流体のいくつかの技術的側面の一般的な議論は、この分野において行われる分離に影響する因子を理解することにおいて助けとなり得る。様々な微細加工ふるいマトリックスが、粒子を分離するために開示されている（Chou, et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. 96:13762 (1999); Han, et al., Science 288:1026 (2000); Huang, et al., Nat. Biotechnol. 20:1048 (2002); Turner et al., Phys. Rev. Lett. 88(12):128103 (2002); Huang, et al., Phys. Rev. Lett. 89:178301 (2002); 米国特許第５，４２７，６６３号；米国特許第７，１５０，８１２号；米国特許第６，８８１，３１７号）。バンプアレイ（別名「障害物アレイ」）デバイスが記載されており、それらの基本的な動作は、例えば、米国特許第７，１５０，８１２号（全体として参照により本明細書に組み入れられている）に説明されている。バンプアレイは、本質的に、障害物のアレイ（一般的に、周期的に順序づけられたアレイ）を通過する粒子を分離する（segregate）ことにより、動作し、分離は、バルク流体フローの方向から、または印加電場の方向から斜めである「アレイ方向」に従う粒子間で起こる（Ｕ．Ｓ． ７，１５０，８１２）。
Ａ．バンプアレイ
いくつかのアレイにおいて、隣接障害物の幾何学的配置は、間隙を定義する障害物の部分が、バルク流体フローの方向に延びる間隙の軸に関して対称であるような配置である。そのような間隙を通る流体フローの速度または容量プロフィールは、間隙に渡って、およそ放物線であり、流体速度および流量は、間隙を定義する各障害物の表面においてゼロであり（すべり流なしの状態を仮定した場合）、間隙の中心点で最大値に達する。プロフィールが放物線である場合、間隙を定義する障害物の１つに隣接する所定の幅の流体層が、間隙を定義するその他の障害物に隣接した同じ幅の流体層と等しい割合の流体流量を含有し、間隙の通過中に「バンピング」される粒子の臨界サイズが、粒子がどの障害物の近くを移動するかに関わらず、等しいことを意味する。
場合によっては、障害物アレイの粒子サイズによる分離性能は、障害物間の間隙へ流体フローを偏向させる隣接障害物の部分が、バルク流体フローの方向に延びる間隙の軸に関して対称ではないように、障害物を形作り、かつ配置することにより向上することができる。そのような、間隙へのフロー対称性の欠如は、間隙内の非対称流体フロープロフィールをもたらし得る。間隙の一方の側への流体フローの濃縮（すなわち、間隙を通る非対称流体フロープロフィールの結果）は、バルク流体フローの方向よりむしろ、アレイ方向に移動するように誘導される粒子の臨界サイズを低下させ得る。これは、フロープロフィールの非対称性が、間隙を通る選択された割合の流体流量を含有する１つの障害物に隣接したフロー層の幅と、同じ割合の流体流量を含有し、かつ間隙を定義する他の障害物に隣接するフロー層の幅との差を引き起こすからである。障害物に隣接した流体層の異なる幅が、２つの異なる臨界粒子サイズを示す間隙を定義する。間隙を横切る粒子は、それが運ばれる流体層の臨界サイズをそれが超える場合には、バンピングされ得る（すなわち、バルク流体フロー方向よりむしろ、アレイ方向に移動し得る）。したがって、非対称フロープロフィールを有する間隙を横切る粒子が、その粒子が、１つの障害物に隣接した流体層で移動する場合には、バンピングされるが、それが間隙を定義する他の障害物に隣接した流体層で移動する場合には、バンピングされないことが可能である。
別の態様において、間隙を定義する障害物のエッジの丸みを減少させることは、障害物アレイの粒子サイズによる分離性能を向上させ得る。例として、とがった頂点がある三角形の横断面を有する障害物のアレイは、丸みのある頂点を有する同一のサイズおよび同一の間隔の三角形障害物のアレイが示すより低い臨界粒子サイズを示し得る。
したがって、障害物アレイにおいて間隙を定義する障害物のエッジをとがらせることにより、バルク流体フローの影響下でアレイ方向に偏向した粒子の臨界サイズは、障害物のサイズを必ずしも低下させなくても、減少させることができる。逆に、よりとがったエッジを有する障害物は、よりとがりが少ないエッジを有する同一サイズの障害物より、より離れた間隔を置くことができるが、それでもなお、よりとがりが少ないエッジを有する障害物と等価の粒子分離性質を生じ得る。
Ｂ．分画範囲
マイクロ流体デバイスにおいてサイズにより分離される物体には、細胞、生体分子、無機ビーズ、および他の物体が挙げられる。分画される典型的なサイズは、１００ナノメートルから５０マイクロメートルまでの範囲である。しかしながら、より大きい、およびより小さい粒子もまた、分画され得る場合もあり得る。
Ｃ．容量
デザインに依存して、デバイス、またはデバイスの組合せは、試料の約１０μｌから少なくとも５００μｌの間、試料の約５００μｌから約４０ｍＬの間、試料の約５００μｌから約２０ｍＬの間、試料の約２０ｍＬから約２００ｍＬの間、試料の約４０ｍＬから約２００ｍＬの間、または少なくとも試料の２００ｍＬを処理するために用いられ得る。
Ｄ．チャネル
デバイスは、１つまたは複数の注入口および１つまたは複数の出口を有する１つまたは複数のチャネルを含み得る。注入口は、試料または粗（すなわち、非精製）流体組成物用に、バッファー用に、または試薬を導入するために、用いられ得る。出口は、産物を収集するために用いられ得、または廃棄物用の出口として用いられ得る。チャネルは、幅が約０．５～１００ｍｍ、長さが約２～２００ｍｍであり得るが、異なる幅および長さもまた可能である。深さは、１～１０００μｍであり得、１個から１００個までの範囲、またはそれ以上のチャネルが存在し得る。容量は、数μｌから何ｍｌまでもの非常に幅広い範囲に渡って変動し得、デバイスは、障害物の異なる立体配置での複数のゾーン（ステージまたはセクション）を有し得る。
Ｅ．間隙サイズ（ポスト間または障害物間のエッジからエッジまでの距離）
障害物のアレイにおける間隙サイズ（ポスト間または障害物間のエッジからエッジまでの距離）は、約数（例えば、１～５００）マイクロメートルから変動し得、または１ミリメートルより大きくてもよい。いくつかの実施形態において、障害物は、１～３０００マイクロメートルの直径を有し、様々な形（球形、三角形、涙滴形、菱形、四角形、長方形など）を有し得る。ポストの第１行は、注入口の近くに（例えば、５μｍ以内に）位置し得、または１ｍｍより遠く離れてあり得る。
Ｆ.積み重ね可能なチップ
デバイスは、複数の積み重ね可能なチップを含み得る。デバイスは、約１～５０個のチップを含み得る。場合によっては、デバイスは、直列に、または並列に、または両方で置かれた複数のチップを有し得る。
ＶＩ．発明の概念
以下の番号付きの段落は、本願の一部である発明の概念を提示する。これらの概念は、段落例Ｅ１～Ｅ２７３の形式で表される。
Ｅ１． 以下の工程を含む、標的細胞の集団を操作する方法：
ａ）標的細胞を粗流体組成物から単離する工程であって、単離手順が、マイクロ流体デバイス上で決定論的横置換（ＤＬＤ）を実施することを含み、前記デバイスが、
ｉ）試料注入口から１つまたは複数の流体出口へ延びる少なくとも１個のチャネルであって、前記チャネルが第１の壁および前記第１の壁と反対側の第２の壁によって囲まれている、チャネル；
ｉｉ）前記チャネルにおいて、いくつもの行（row）をなして配列された障害物のアレイであって、障害物のそれぞれの次の行が、前の行に対して横方向へシフトしており、前記障害物が、前記粗流体組成物が前記デバイスの注入口にアプライされ、前記チャネルを流体的に通過する時、標的細胞が、濃縮された産物が収集される１つまたは複数の収集出口へ流れ、前記標的細胞とは異なるサイズである混入細胞または粒子が、前記収集出口から切り離されている１つまたは複数の廃棄物出口へ流れるような様式で配置されている、障害物のアレイ
を含む、工程；
ｂ）前記収集出口から得られた標的細胞を、所望の表現型を有するように遺伝子操作する工程。
Ｅ２． 前記遺伝子操作する工程が、標的細胞をトランスフェクションまたは形質導入することを含み、遺伝子操作された標的細胞が、それらをインビトロで（in vitro）培養することにより増殖される、Ｅ１に記載の方法。
Ｅ３． 前記所望の表現型を示す標的細胞の収率が、Ｆｉｃｏｌｌ遠心分離により単離され、かつＤＬＤに供されていない同一の細胞より少なくとも１０％高い、Ｅ２に記載の方法。
Ｅ４． 前記粗流体組成物が、血液、または血液にアフェレーシスもしくは白血球アフェレーシスを実施することにより取得されている組成物である、Ｅ１に記載の方法。
Ｅ５． 前記標的細胞が白血球である、Ｅ１～４のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ６． 前記標的細胞が、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、単球、または前駆細胞である、Ｅ１～４のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ７． 前記標的細胞が樹状細胞である、Ｅ１～４のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ８． 前記粗流体組成物が患者から取得される、Ｅ１～７のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ９． 前記粗流体組成物における標的細胞が、形質導入またはトランスフェクションされる前に担体と結合していない、Ｅ８に記載の方法。
Ｅ１０． 標的細胞に、ＤＬＤを実施する前に、ＤＬＤ分離を促進または補完するように、１つまたは複数の担体を結合させる、Ｅ８に記載の方法。
Ｅ１１． 標的細胞に、ＤＬＤを実施した後で、かつそれらを形質導入またはトランスフェクションする前かまたは後のいずれかで、ＤＬＤ分離を促進または補完するように、１つまたは複数の担体を結合させる、Ｅ９に記載の方法。
Ｅ１２． 前記１つまたは複数の担体が、前記標的細胞と特異的に結合する親和性物質を表面上に含む、Ｅ１０またはＥ１１に記載の方法。
Ｅ１３． 前記物質が、抗体、アクチベーター、ハプテン、またはアプタマーである、Ｅ１２に記載の方法。
Ｅ１４． 前記担体の直径が、標的細胞の直径と少なくとも同じ長さである、Ｅ１０～１３のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ１５． 前記担体の全部の直径が、標的細胞の直径の５０％以下の長さである、Ｅ１０～１３のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ１６． 前記担体の全部の直径が、標的細胞の直径の少なくとも２倍の長さである、Ｅ１０～１３のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ１７． 前記担体の全部の直径が、標的細胞の直径の２５％以下の長さである、Ｅ１０～１３のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ１８． 担体の１つの群が、標的細胞と少なくとも同じ長さの直径を有し、担体の第２の群が、標的細胞の直径の５０％以下の長さの直径を有する、Ｅ１０～１３のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ１９． 担体の１つの群が、標的細胞の少なくとも２倍の長さの直径を有し、担体の第２の群が、標的細胞の２５％以下の長さの直径を有する、Ｅ１０～１３のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ２０． 前記担体が、コラーゲンまたは多糖でできている、Ｅ１０～１９のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ２１． 前記担体が、ゼラチンまたはアルギン酸塩でできている、Ｅ１０～２０のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ２２． 粗流体組成物が患者から取得され、前記粗流体組成物の取得が完了した時点から、標的細胞に初めて担体を結合させるまで、４時間より長く経過していない、Ｅ１０～２１のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ２３． 粗流体組成物が、患者の血液から引き出されたアフェレーシスまたは白血球アフェレーシス産物であり、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシスが完了した時点から標的細胞に初めて担体を結合させるまで、４時間より長く経過していない、Ｅ１０～２１のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ２４． 粗流体組成物が患者から取得され、前記粗流体組成物の取得が完了した時点から、初めて標的細胞がトランスフェクションまたは形質導入される時まで、５時間より長く経過していない、Ｅ１～２３のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ２５． 粗流体組成物が、患者の血液から引き出されたアフェレーシスまたは白血球アフェレーシス産物であり、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシスが完了した時点から、初めて標的細胞がトランスフェクションまたは形質導入される時まで、５時間より長く経過していない、Ｅ１～２３のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ２６． 初めて標的細胞がトランスフェクションまたは形質導入される時まで、４時間より長く経過していない、Ｅ２４またはＥ２５に記載の方法。
Ｅ２７． 以下の工程を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞を作製する方法：
ａ）Ｔ細胞を含む粗流体組成物を取得する工程；
ｂ）ｉ）試料注入口から１つまたは複数の流体出口へ延びる少なくとも１個のチャネルであって、前記チャネルが第１の壁および前記第１の壁と反対側の第２の壁によって囲まれている、チャネル；
ｉｉ）前記チャネルにおいて、いくつもの行をなして配列された障害物のアレイであって、障害物のそれぞれの次の行が、前の行に対して横方向へシフトしており、前記障害物が、前記粗流体組成物がデバイスの注入口にアプライされ、前記チャネルを流体的に通過する時、前記組成物中のＴ細胞が、濃縮された産物が収集される１つまたは複数の収集出口へ流れ、前記粗流体組成物中にあり、かつ前記Ｔ細胞とは異なるサイズである細胞または粒子が、前記収集出口から切り離されている１つまたは複数の廃棄物出口へ流れるような様式で配置されている、障害物のアレイ
を含むマイクロ流体デバイスを用いて、前記粗流体組成物に決定論的横置換（ＤＬＤ）を実施する工程；
ｃ）工程ｂ）において取得された濃縮産物中のＴ細胞を、それらの表面上にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を産生するように遺伝子操作する工程。
Ｅ２８． 前記粗流体組成物が、患者由来の血液から取得されたアフェレーシス産物または白血球アフェレーシス産物であり、前記粗流体組成物が前記デバイスの注入口にアプライされ、前記チャネルを流体的に通過する時、前記組成物中のＴ細胞が、濃縮された産物が収集される１つまたは複数の収集出口へ流れ、前記粗流体組成物中にあり、かつ異なるサイズである赤血球、血小板、または他の粒子が、前記収集出口から切り離されている１つまたは複数の廃棄物出口へ流れる、Ｅ２７に記載の方法。
Ｅ２９． 前記遺伝子操作が、標的細胞をトランスフェクションまたは形質導入することを含み、遺伝子操作された標的細胞が、インビトロで前記細胞を成長させることにより、さらに増殖される、Ｅ２７またはＥ２８に記載の方法。
Ｅ３０． 表面上にキメラ受容体を発現するＴ細胞の収率が、粗流体組成物からＦｉｃｏｌｌ遠心分離により単離され、かつＤＬＤに供されていないＴ細胞より少なくとも１０％高い、Ｅ２７～２９のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ３１． 表面上にキメラ受容体を発現するＴ細胞の収率が、粗流体組成物からＦｉｃｏｌｌ遠心分離により単離され、かつＤＬＤに供されていないＴ細胞より少なくとも２０％高い、Ｅ３０に記載の方法。
Ｅ３２． 表面上にキメラ受容体を発現するＴ細胞の収率が、粗流体組成物からＦｉｃｏｌｌ遠心分離により単離され、かつＤＬＤに供されていないＴ細胞より少なくとも５０％高い、Ｅ３０に記載の方法。
Ｅ３３． 前記ＣＡＲが、ａ）抗原結合ドメインを含む細胞外領域；ｂ）膜貫通領域；ｃ）細胞内領域を含み、前記ＣＡＲ Ｔ細胞が、トリガーされた時、ＣＡＲ Ｔ細胞の数または活性を低下させる分子スイッチを前記細胞に提供する１つまたは複数の組換え配列を含んでもよい、Ｅ２７～３２のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ３４． 前記抗原結合ドメインが、モノクローナル抗体の重鎖と軽鎖の両方の抗原結合領域由来の、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、Ｅ３３に記載の方法。
Ｅ３５． 前記ＣＡＲが、細胞外領域と膜貫通領域を接続する２～２０個のアミノ酸のヒンジ領域を含む、Ｅ３３またはＥ３４に記載の方法。
Ｅ３６． 前記膜貫通領域が、ＣＤ８またはＣＤ２８タンパク質配列を含む、Ｅ３５に記載の方法。
Ｅ３７． 前記細胞内領域が、ＣＤ３ζ、ＣＤ１３７、またはＣＤ２８細胞内ドメインに由来したシグナル伝達ドメインを含む、Ｅ３３～３６のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ３８． 前記Ｔ細胞を含む粗流体組成物が、癌、自己免疫疾患、または感染性疾患を有する患者から取得される、Ｅ２７～３７のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ３９． Ｔ細胞を含む粗流体組成物を取得した後、前記流体組成物中のＴ細胞に、ＤＬＤ分離を促進するように、１つまたは複数の担体を結合させる、Ｅ３８に記載の方法。
Ｅ４０． Ｔ細胞に、ＤＬＤを実施する前に、ＤＬＤ分離を促進するように、１つまたは複数の担体を結合させる、Ｅ３９に記載の方法。
Ｅ４１． Ｔ細胞に、ＤＬＤを実施した後で、かつそれらが遺伝子操作される前かまたは後のいずれかで、ＤＬＤ分離を促進するように、１つまたは複数の担体を結合させる、Ｅ３９に記載の方法。
Ｅ４２． 前記１つまたは複数の担体が、前記Ｔ細胞と特異的に結合する抗体またはアクチベーターを表面上に含む、Ｅ３９～４１のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ４３． 前記担体の全部の直径が、Ｔ細胞の直径と少なくとも同じ長さである、Ｅ３９～４２のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ４４． 前記担体の全部の直径が、Ｔ細胞の直径の５０％以下の長さである、Ｅ３９～４２のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ４５． 前記担体の全部の直径が、Ｔ細胞の直径の少なくとも２倍の長さである、Ｅ３９～４２のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ４６． 前記担体の全部の直径が、Ｔ細胞の直径の２５％以下の長さである、Ｅ３９～４２のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ４７． 担体の１つの群が、Ｔ細胞と少なくとも同じ長さの直径を有し、担体の第２の群が、Ｔ細胞の直径の５０％以下の長さの直径を有する、Ｅ３９～４２のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ４８． 担体の１つの群が、Ｔ細胞の少なくとも２倍の長さの直径を有し、担体の第２の群が、Ｔ細胞の２５％以下の長さの直径を有する、Ｅ３９～４２のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ４９． 前記担体が、コラーゲンまたは多糖でできている、Ｅ３９～４８のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ５０． 前記担体が、ゼラチンまたはアルギン酸塩でできている、Ｅ３９～４９のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ５１． Ｔ細胞を含む粗流体組成物の取得が完了した時点から、前記Ｔ細胞に担体を結合させるまで、４時間より長く経過していない、Ｅ３９～５０のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ５２． 粗流体組成物が、患者の血液から引き出されたアフェレーシスまたは白血球アフェレーシス産物であり、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシスが完了した時点から、標的細胞に担体を結合させるまで、４時間より長く経過していない、Ｅ３９～５０のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ５３． Ｔ細胞を含む粗流体組成物の取得が完了した時点から、初めてＴ細胞がトランスフェクションまたは形質導入される時まで、５時間より長く経過していない、Ｅ２７～５０のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ５４． 粗流体組成物が、患者の血液から引き出されたアフェレーシスまたは白血球アフェレーシス産物であり、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシスが完了した時点から、初めてＴ細胞がトランスフェクションまたは形質導入される時まで、５時間より長く経過していない、Ｅ２７～５０のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ５５． 初めてＴ細胞がトランスフェクションまたは形質導入される時まで、４時間より長く経過していない、Ｅ５３またはＥ５４に記載の方法。
Ｅ５６． ＣＡＲ Ｔ細胞を作製することにおける全工程が、Ｔ細胞を含む粗流体組成物が取得される同じ施設で実施され、全工程が、合計４時間以内に完了する、Ｅ２７～５５のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ５７． Ｅ２７～５５のいずれか一つに記載の方法により作製されたＣＡＲ Ｔ細胞。
Ｅ５８． 癌、自己免疫疾患、または感染性疾患について患者を処置する方法であって、前記患者由来の癌細胞、自己免疫細胞、または感染細胞上の抗原を認識するキメラ抗原受容体を発現するように操作されたＣＡＲ Ｔ細胞を前記患者に投与することを含み、前記ＣＡＲ Ｔ細胞が、以下の工程を含むプロセスにより作製されている、方法：
ａ）Ｔ細胞を含む粗流体組成物を患者から取得する工程；
ｂ）ｉ）試料注入口から１つまたは複数の流体出口へ延びる少なくとも１個のチャネルであって、前記チャネルが第１の壁および前記第１の壁と反対側の第２の壁によって囲まれている、チャネル；
ｉｉ）前記チャネルにおいて、いくつもの行をなして配列された障害物のアレイであって、障害物のそれぞれの次の行が、前の行に対して横方向へシフトしており、前記障害物が、前記粗流体組成物がデバイスの注入口にアプライされ、前記チャネルを流体的に通過する時、前記組成物中のＴ細胞が、濃縮された産物が収集される１つまたは複数の収集出口へ流れ、前記粗流体組成物中にあり、かつ前記Ｔ細胞とは異なるサイズである細胞または粒子が、前記収集出口から切り離されている１つまたは複数の廃棄物出口へ流れるような様式で配置されている、障害物のアレイ
を含むマイクロ流体デバイスを用いて、前記粗流体組成物に決定論的横置換（ＤＬＤ）を実施する工程；
ｃ）工程ｂ）において取得された前記Ｔ細胞を、それらの表面上にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子操作する工程；
ｄ）操作されたＴ細胞の数を、前記細胞をインビトロで成長させることにより増加させる工程；ならびに
ｅ）前記粗流体組成物が取得された患者へ前記操作されたＴ細胞を投与する工程。
Ｅ５９． 前記粗流体組成物が、前記患者由来の血液から取得されたアフェレーシス産物または白血球アフェレーシス産物であり、前記粗流体組成物がデバイスの注入口にアプライされ、前記チャネルを流体的に通過する時、前記組成物中のＴ細胞が、濃縮された産物が収集される１つまたは複数の収集出口へ流れ、前記粗流体組成物中にあり、かつ異なるサイズである赤血球、血小板、または他の粒子が、前記収集出口から切り離されているもう１つの廃棄物出口へ流れる、Ｅ５８に記載の方法。
Ｅ６０． 遺伝子操作が、標的細胞をトランスフェクションまたは形質導入することを含む、Ｅ５８またはＥ５９に記載の方法。
Ｅ６１． 表面上にキメラ受容体を発現する細胞の収率が、粗流体組成物からＦｉｃｏｌｌ遠心分離により単離され、かつＤＬＤに供されていないＴ細胞より少なくとも１０％高い、Ｅ６０に記載の方法。
Ｅ６２． 表面上にキメラ受容体を発現する標的細胞の収率が、粗流体組成物からＦｉｃｏｌｌ遠心分離により単離され、かつＤＬＤに供されていないＴ細胞より少なくとも５０％高い、Ｅ６０に記載の方法。
Ｅ６３． 前記ＣＡＲが、ａ）抗原結合ドメインを含む細胞外領域；ｂ）膜貫通領域；およびｃ）細胞内領域を含み、前記ＣＡＲ Ｔ細胞が、トリガーされた時、ＣＡＲ Ｔ細胞の数または活性を低下させる分子スイッチを前記細胞に提供する１つまたは複数の組換え配列を含んでもよい、Ｅ５８～６２のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ６４． 前記抗原結合ドメインが、モノクローナル抗体の重鎖と軽鎖の両方の抗原結合領域由来の、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、Ｅ６３に記載の方法。
Ｅ６５． 前記ＣＡＲが、細胞外領域と膜貫通領域を接続する２～２０個のアミノ酸のヒンジ領域を含む、Ｅ６３またはＥ６４に記載の方法。
Ｅ６６． 前記膜貫通領域が、ＣＤ８またはＣＤ２８タンパク質配列を含む、Ｅ６３～６５のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ６７． 前記細胞内領域が、ＣＤ３ζ、ＣＤ１３７、またはＣＤ２８細胞内ドメインに由来したシグナル伝達ドメインを含む、Ｅ６３～６６のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ６８． 前記患者が白血病を有する、Ｅ５８～６７のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ６９． 前記白血病が急性リンパ芽球性白血病である、Ｅ６８に記載の方法。
Ｅ７０． 前記ＣＡＲが抗原ＣＤ１９またはＣＤ２０を認識する、Ｅ６８またはＥ６９に記載の方法。
Ｅ７１． 前記患者が固形腫瘍を有する、Ｅ５８～６７のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ７２． 前記ＣＡＲが、ＣＤ２２；ＲＯＲＩ；メゾテリン；ＣＤ３３／ＩＬ３Ｒａ；ｃ－Ｍｅｔ；ＰＳＭＡ；糖脂質Ｆ７７；ＥＧＦＲｖＩＩＩ；ＧＤ－２；ＮＹ－ＥＳＯ－ｌ ＴＣＲ；ＭＡＧＥ Ａ３ ＴＣＲ；およびそれらの組合せからなる群から選択される抗原を認識する、Ｅ７１に記載の方法。
Ｅ７３． Ｔ細胞を含む粗流体組成物を取得した後に、前記流体中のＴ細胞に、ＤＬＤ分離を促進するように、担体を結合させる、Ｅ５８～７２のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ７４． ＤＬＤを実施する前に、Ｔ細胞に、ＤＬＤ分離を促進するように、１つまたは複数の担体を結合させる、Ｅ７３に記載の方法。
Ｅ７５． ＤＬＤを実施した後で、かつＴ細胞が、キメラ受容体を発現するように遺伝子操作される前かまたは後のいずれかで、Ｔ細胞に、ＤＬＤ分離を促進するように、１つまたは複数の担体を結合させる、Ｅ７３に記載の方法。
Ｅ７６． 前記１つまたは複数の担体が、前記Ｔ細胞と特異的に結合する抗体またはアクチベーターを表面上に含む、Ｅ７３～７５のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ７７． 前記担体の全部の直径が、Ｔ細胞の直径と少なくとも同じ長さである、Ｅ７３～７６のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ７８． 前記担体の全部の直径が、Ｔ細胞の直径の５０％以下の長さである、Ｅ７３～７６のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ７９． 前記担体の全部の直径が、Ｔ細胞の直径の少なくとも２倍の長さである、Ｅ７３～７６のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ８０． 前記担体の全部の直径が、Ｔ細胞の直径の２５％以下の長さである、Ｅ７３～７６のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ８１． 担体の１つの群が、Ｔ細胞と少なくとも同じ長さの直径を有し、担体の第２の群が、Ｔ細胞の直径の５０％以下の長さの直径を有する、Ｅ８０に記載の方法。
Ｅ８２． 担体の１つの群が、Ｔ細胞の少なくとも２倍の長さの直径を有し、担体の第２の群が、Ｔ細胞の２５％以下の長さの直径を有する、Ｅ７３～８１のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ８３． 前記担体が、コラーゲンまたは多糖でできている、Ｅ７３～８２のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ８４． 前記担体が、ゼラチンまたはアルギン酸塩でできている、Ｅ７３～８３のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ８５． Ｔ細胞を含む粗流体組成物の取得が完了した時点から、前記Ｔ細胞に担体を結合させるまで、４時間より長く経過していない、Ｅ７３～８４のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ８６． 粗流体組成物が、患者の血液から引き出されたアフェレーシスまたは白血球アフェレーシス産物であり、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシスが完了した時点から、標的細胞に担体を結合させるまで、４時間より長く経過していない、Ｅ７３～８４のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ８７． Ｔ細胞を含む粗流体組成物の取得が完了した時点から、初めてＴ細胞がトランスフェクションまたは形質導入される時まで、５時間より長く経過していない、Ｅ７３～８４のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ８８． 粗流体組成物が、患者の血液から引き出されたアフェレーシスまたは白血球アフェレーシス産物であり、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシスが完了した時点から、初めてＴ細胞がトランスフェクションまたは形質導入される時まで、５時間より長く経過していない、Ｅ７３～８４のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ８９． 初めてＴ細胞がトランスフェクションまたは形質導入される時まで、４時間より長く経過していない、Ｅ８７または８８に記載の方法。
Ｅ９０． Ｔ細胞が、ＤＬＤを含まない方法により処理された細胞についてより少なくとも１日早く、患者への投与に利用可能である、Ｅ５８～８９のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ９１． 標的細胞が、ＤＬＤを含まない方法により処理された細胞についてより少なくとも３日早く、患者への投与に利用可能である、Ｅ５８～８９のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ９２． ａ）標的細胞を含む粗流体組成物を患者から取得する工程；
ｂ）マイクロ流体デバイスを用いて、前記標的細胞を含む粗流体組成物に決定論的横置換（ＤＬＤ）を実施して、標的細胞が濃縮された組成物を得る工程；
を含み、ＤＬＤの前かまたは後のいずれかに、標的細胞に、ＤＬＤ分離を促進するように、１つまたは複数の担体を結合させ、前記標的細胞を含む粗流体組成物の患者からの取得が完了した時点から、前記標的細胞に担体を結合させるまで、５時間より長く経過していない、患者から標的細胞を収集する方法。
Ｅ９３． 前記１つまたは複数の担体が、前記標的細胞と特異的に結合する抗体またはアクチベーターを表面上に含む、Ｅ９２に記載の方法。
Ｅ９４． 前記担体の全部の直径が、標的細胞の直径と少なくとも同じ長さである、Ｅ９２またはＥ９３に記載の方法。
Ｅ９５． 前記担体の全部の直径が、標的細胞の直径の５０％以下の長さである、Ｅ９２または９３に記載の方法。
Ｅ９６． 前記担体の全部の直径が、標的細胞の直径の少なくとも２倍の長さである、Ｅ９２またはＥ９３に記載の方法。
Ｅ９７． 前記担体の全部の直径が、標的細胞の直径の２５％以下の長さである、Ｅ９２またはＥ９３に記載の方法。
Ｅ９８． 担体の１つの群が、標的細胞と少なくとも同じ長さの直径を有し、担体の第２の群が、標的細胞の直径の５０％以下の長さの直径を有する、Ｅ９２またはＥ９３に記載の方法。
Ｅ９９． 担体の１つの群が、Ｔ細胞の少なくとも２倍の長さの直径を有し、担体の第２の群が、Ｔ細胞の２５％以下の長さの直径を有する、Ｅ９２またはＥ９３に記載の方法。
Ｅ１００． 前記担体が、コラーゲンまたは多糖でできている、Ｅ９２～９９のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ１０１． 前記担体が、ゼラチンまたはアルギン酸塩でできている、Ｅ９２～１００のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ１０２． 標的細胞を含む粗流体組成物の取得が完了した時点から、前記標的細胞に担体を結合させるまで、４時間より長く経過していない、Ｅ９２～１０１のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ１０３． 標的細胞を含む粗流体組成物の取得が完了した時点から、前記標的細胞に担体を結合させるまで、３時間より長く経過していない、Ｅ９２～１０１のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ１０４． 前記標的細胞を含む粗流体組成物が、患者由来の血液にアフェレーシスまたは白血球アフェレーシスを実施することにより、取得される、Ｅ９２～１０３のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ１０５． ＤＬＤにより標的細胞が濃縮された組成物中の標的細胞が、ウイルスベクターを用いて形質導入される、Ｅ９２～１０４のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ１０６． 標的細胞が、電気的に、化学的に、またはナノ粒子を用いて、トランスフェクションされる、Ｅ１０５に記載の方法。
Ｅ１０７． 前記マイクロ流体デバイスが
ａ）試料注入口から１つまたは複数の流体出口へ延びる少なくとも１個のチャネルであって、前記チャネルが第１の壁および前記第１の壁と反対側の第２の壁によって囲まれている、チャネル；
ｂ）前記チャネルにおいて、いくつもの行をなして配列された障害物のアレイであって、障害物のそれぞれの次の行が、前の行に対して横方向へシフトしており、前記障害物が、前記標的細胞を含む粗流体組成物が前記デバイスの注入口にアプライされ、前記チャネルを流体的に通過する時、標的細胞が、濃縮された産物が収集される１つまたは複数の収集出口へ流れ、前記粗流体組成物中にあり、かつ前記標的細胞とは異なるサイズである混入細胞または粒子が、前記収集出口から切り離されている１つまたは複数の廃棄物出口へ流れるような様式で配置されている、障害物のアレイ
を含む、Ｅ９２～１０６のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ１０８． 前記標的細胞がＴ細胞である、Ｅ９２～１０７のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ１０９． 前記Ｔ細胞が、ナチュラルキラーＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、ヘルパーＴ細胞、および制御性Ｔ細胞からなる群から選択される、Ｅ１０８に記載の方法。
Ｅ１１０． 前記標的細胞が幹細胞である、Ｅ９２～１０７のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ１１１． 前記標的細胞が、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞、または顆粒球である、Ｅ９２～１０７のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ１１２． 前記標的細胞を含む粗流体組成物が、抗凝固剤として働き、または血小板の活性化を防ぐ１つまたは複数の添加物を含む、Ｅ９２～１１１のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ１１３． 前記添加物が、チクロピジン、イノシン、プロトカテキュ酸、アセチルサリチル酸、およびチロフィバンからなる群から選択される、Ｅ１１２に記載の方法。
Ｅ１１４． 工程ａ）およびｂ）がどちらも、標的細胞を含む粗流体組成物が患者から取得される現地で行われる、Ｅ９２～１１３のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ１１５． 標的細胞を含む粗流体組成物の患者からの取得が完了した時点から、前記標的細胞に担体を結合させるまで、４時間より長く経過していない、Ｅ９２～１１４のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ１１６． 粗流体組成物が、患者の血液から引き出されたアフェレーシスまたは白血球アフェレーシス産物であり、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシスが完了した時点から、標的細胞に担体を結合させるまで、４時間より長く経過していない、Ｅ９２～１１４のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ１１７． ｃ）細胞を遺伝子操作し、および／もしくは数を増加させる工程；ならびに／または
ｄ）前記標的細胞が取得された同じ患者を、収集された標的細胞で処置する工程
をさらに含む、Ｅ９２～１１６のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ１１８． 工程ｄ）後に、前記標的細胞が凍結保存される、Ｅ１１７に記載の方法。
Ｅ１１９． 工程ｃ）において培養される標的細胞が、アクチベーターの存在下で培養されるＴ細胞である、Ｅ１１７またはＥ１１８に記載の方法。
Ｅ１２０． 前記アクチベーターが担体に結合している、Ｅ１１９に記載の方法。
Ｅ１２１． 標的細胞が、ＤＬＤを含まない方法により処理された細胞についてより少なくとも１日早く、患者への投与に利用可能である、Ｅ５８～８９のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ１２２． 標的細胞が、ＤＬＤを含まない方法により処理された細胞についてより少なくとも３日早く、患者への投与に利用可能である、Ｅ５８～８９のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ１２３． Ｅ９２～１２２のいずれか一つに記載の方法により作製された標的細胞。
Ｅ１２４． Ｅ１２３に記載の標的細胞を前記患者に投与することを含む、疾患または状態について患者を処置する方法。
Ｅ１２５． 以下の工程を含む、接着細胞を複数の他の細胞から分離する方法：
ａ）複数の他の細胞および接着細胞を含む粗流体組成物を、ＤＬＤ分離を促進するように結合する１つまたは複数の担体と接触させる工程であって、前記接着細胞が、接触により、または接触後に担体と少なくとも部分的に会合して、担体会合化接着細胞複合体を生成し、前記担体会合化接着細胞複合体が、前記複数の他の細胞における細胞に対して増加したサイズを含み、前記担体会合化接着細胞複合体のサイズが、臨界サイズ以上であり、かつ前記複数の他の細胞における細胞が前記臨界サイズ未満のサイズを含む、工程；
ｂ）前記粗流体組成物をデバイスにアプライする工程であって、前記デバイスが、行をなして配列された障害物のアレイを含み、前記行が、お互いに対して横方向へシフトされ、前記行が、前記臨界サイズ以上の粒子を第１の方向へ、および前記臨界サイズ未満の粒子を第２の方向へ偏向させるように構成される、工程；ならびに
ｃ）前記担体会合化接着細胞複合体を含む前記試料を前記デバイスに流す工程であって、前記担体会合化接着細胞複合体が前記障害物により前記第１の方向に偏向され、かつ前記複数の他の細胞における細胞が前記第２の方向に偏向され、それにより、前記担体会合化接着細胞複合体を前記複数の他の細胞から分離する、工程；
ｄ）分離された担体会合化接着細胞複合体を含む流体組成物を収集する工程。
Ｅ１２６． 前記接着細胞が、前記接着細胞および複数の他の細胞を含む粗流体組成物の一部として患者から収集され、前記粗流体組成物の患者からの取得が完了した時点から、前記接着細胞に初めて担体を結合させるまで、３時間より長く経過していない、Ｅ１２５に記載の方法。
Ｅ１２７． 前記粗流体組成物の患者からの取得が完了した時点から、前記接着細胞に初めて担体を結合させるまで、２時間より長く経過していない、Ｅ１２５に記載の方法。
Ｅ１２８． 前記粗流体組成物の患者からの取得が完了した時点から、前記接着細胞に初めて担体を結合させるまで、１時間より長く経過していない、Ｅ１２５に記載の方法。
Ｅ１２９． 前記粗流体組成物の患者からの取得が完了した時点から、前記接着細胞または前記担体接着細胞複合体が初めて前記デバイスから収集されるまで、４時間より長く経過していない、Ｅ１２５に記載の方法。
Ｅ１３０． 前記粗流体組成物の患者からの取得が完了した時点から、前記接着細胞または前記担体接着細胞複合体が初めて前記デバイスから収集されるまで、４時間より長く経過していない、Ｅ１２５に記載の方法。
Ｅ１３１． 前記担体が、前記接着細胞と特異的に結合する抗体またはアクチベーターを表面上に含む、Ｅ１２５～１３０のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ１３２． 前記担体の直径が、前記接着細胞の直径と少なくとも同じ長さである、Ｅ１２５～１３１のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ１３３． 前記担体の全部の直径が、前記接着細胞の直径の少なくとも２倍の長さである、Ｅ１２５～１３１のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ１３４． 前記担体の全部の直径が、前記接着細胞の直径の少なくとも１０倍の長さである、Ｅ１２５～１３１のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ１３５． 前記担体の全部の直径が、１０～６００μｍである、Ｅ１２５～１３１のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ１３６． 前記接着細胞が、ＭＲＣ－５細胞；ＨｅＬａ細胞；Ｖｅｒｏ細胞；ＮＩＨ ３Ｔ３細胞；Ｌ９２９細胞；Ｓｆ２１細胞；Ｓｆ９細胞；Ａ５４９細胞；Ａ９細胞；ＡｔＴ－２０細胞；ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞；ＢＨＫ－２１細胞；ＢＨＬ－１００細胞；ＢＴ細胞；Ｃａｃｏ－２細胞；Ｃｈａｎｇ細胞；Ｃｌｏｎｅ ９細胞；Ｃｌｏｎｅ Ｍ－３細胞；ＣＯＳ－１細胞；ＣＯＳ－３細胞；ＣＯＳ－７細胞；ＣＲＦＫ細胞；ＣＶ－１細胞；Ｄ－１７細胞；Ｄａｕｄｉ細胞；ＧＨ１細胞；ＧＨ３細胞；ＨａＫ細胞；ＨＣＴ－１５細胞；ＨＬ－６０細胞；ＨＴ－１０８０細胞；ＨＥＫ細胞、ＨＴ－２９細胞；ＨＵＶＥＣ細胞；Ｉ－１０細胞；ＩＭ－９細胞；ＪＥＧ－２細胞；Ｊｅｎｓｅｎ細胞；Ｊｕｒｋａｔ細胞；Ｋ－５６２細胞；ＫＢ細胞；ＫＧ－１細胞；Ｌ２細胞；ＬＬＣ－ＷＲＣ ２５６細胞；ＭｃＣｏｙ細胞；ＭＣＦ７細胞；ＷＩ－３８細胞；ＷＩＳＨ細胞；ＸＣ細胞；Ｙ－１細胞；ＣＨＯ細胞；Ｒａｗ ２６４．７細胞；ＨＥＰ Ｇ２細胞；ＢＡＥ－１細胞；ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞、およびそれらの任意の誘導体からなる群から選択される、Ｅ１２５～１３５のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ１３７． 前記接着細胞が幹細胞である、Ｅ１２５～１３５のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ１３８． 以下の工程を含む、活性化細胞を複数の他の細胞から分離する方法：
ａ）活性化の能力がある細胞および複数の他の細胞を含む粗流体組成物を、１つまたは複数の担体と接触させる工程であって、少なくとも１つの担体が細胞アクチベーターを含み、前記細胞アクチベーターが、接触により、または接触後に、前記細胞アクチベーターによる活性化の能力がある細胞と少なくとも部分的に会合して、担体会合化細胞複合体を生成し、前記細胞アクチベーターによる活性化の能力がある細胞との前記細胞アクチベーターの会合が、前記活性化の能力がある細胞を少なくとも部分的に活性化し、前記担体会合化細胞複合体が、前記複数の他の細胞における細胞に対して増加したサイズを含み、前記担体会合化細胞複合体のサイズが臨界サイズ以上であり、かつ前記複数の他の細胞における細胞が前記臨界サイズ未満のサイズを含む、工程；
ｂ）前記試料をデバイスにアプライする工程であって、前記デバイスが、行をなして配列された障害物のアレイを含み、前記行が、お互いに対して横方向へシフトされ、前記行が、前記臨界サイズ以上の粒子を第１の方向へ、および前記臨界サイズ未満の粒子を第２の方向へ偏向させるように構成される、工程；ならびに
ｃ）前記試料を前記デバイスに流す工程であって、前記担体会合化細胞複合体が前記障害物により前記第１の方向に偏向され、かつ前記複数の他の細胞における細胞が前記第２の方向に偏向され、それにより、前記活性化細胞を前記複数の他の細胞から分離する、工程；
ｄ）分離された担体会合化細胞複合体を含む流体組成物を収集する工程。
Ｅ１３９． 前記活性化の能力がある細胞が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、制御性Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞、顆粒球、自然リンパ球系細胞、巨核球、ナチュラルキラー細胞、栓球、滑膜細胞、β細胞、肝臓細胞、膵臓細胞、ＤＥ３溶原化細胞、酵母細胞、植物細胞、および幹細胞からなる群から選択される、Ｅ１３８に記載の方法。
Ｅ１４０． 細胞アクチベーターがタンパク質である、Ｅ１３８またはＥ１３９に記載の方法。
Ｅ１４１． 前記タンパク質が抗体である、Ｅ１４０に記載の方法。
Ｅ１４２． 前記タンパク質が、ＣＤ３、ＣＤ２８、抗原、ヘルパーＴ細胞、受容体、サイトカイン、糖タンパク質、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される、Ｅ１４０に記載の方法。
Ｅ１４３． 前記細胞アクチベーターが、インスリン、ＩＰＴＧ、ラクトース、アロラクトース、脂質、グリコシド、テルペン、ステロイド、アルカロイド、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される、Ｅ１３８に記載の方法。
Ｅ１４４． 前記活性化の能力がある細胞が、前記活性化の能力がある細胞および複数の他の細胞を含む粗流体組成物の一部として患者から収集され、前記粗流体組成物の患者からの取得が完了した時点から、前記活性化の能力がある細胞に担体を結合させるまで、４時間より長く経過していない、Ｅ１３８～１４３のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ１４５． 前記粗流体組成物の患者からの取得が完了した時点から、前記活性化の能力がある細胞に担体を結合させるまで、３時間より長く経過していない、Ｅ１３８～１４３のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ１４６． 前記粗流体組成物の患者からの取得が完了した時点から、前記活性化の能力がある細胞に担体を結合させるまで、２時間より長く経過していない、Ｅ１３８～１４３のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ１４７． 前記粗流体組成物の患者からの取得が完了した時点から、工程ｃ）が完了するまで、４時間より長く経過していない、Ｅ１３８～１４３のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ１４８． 前記粗流体組成物の患者からの取得が完了した時点から、工程ｃ）が完了するまで、３時間より長く経過していない、Ｅ１３８～１４３のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ１４９． 前記担体の全部の直径が、前記活性化の能力がある細胞と少なくとも同じ長さである、Ｅ１３８～１４８のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ１５０． 前記担体の全部の直径が、前記活性化の能力がある細胞の直径の少なくとも２倍の長さである、Ｅ１３８～１４８のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ１５１． 前記担体の全部の直径が、前記活性化の能力がある細胞の直径の少なくとも１０倍の長さである、Ｅ１３８～１４８のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ１５２． 前記担体の直径が、１０～６００μｍである、Ｅ１３８～１４８のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ１５３． 以下の工程を含む、細胞から分泌性産物を連続的に精製する方法：
ａ）細胞を含む流体組成物を取得する工程であって、前記細胞が、前記流体組成物中に懸濁しており、前記細胞が分泌性産物を前記懸濁液へ分泌し、前記細胞が前記分泌性産物の既定サイズより大きい既定サイズを有し、前記細胞の既定サイズが臨界サイズ以上であり、かつ前記分泌性産物の既定サイズが、前記臨界サイズ未満である、工程；
ｂ）前記細胞を含む流体組成物をデバイスにアプライする工程であって、前記デバイスが、行をなして配列された障害物のアレイを含み、前記行が、お互いに対して横方向へシフトされ、前記行が、前記臨界サイズ以上の粒子を第１の方向へ、および前記臨界サイズ未満の粒子を第２の方向へ偏向させるように構成される、工程；
ｃ）前記試料を前記デバイスに流す工程であって、前記細胞が前記障害物により前記第１の方向に偏向され、かつ前記分泌性産物が前記第２の方向に偏向され、それにより、前記分泌性産物を前記細胞から分離する、工程；
ｄ）前記分泌性産物を収集する工程であって、それにより、実質的に純粋である前記分泌性産物の試料を生じる、工程；
ｅ）分離された細胞を含む回収された流体組成物を収集する工程；ならびに
ｆ）分離された細胞を含む回収された流体組成物を、前記デバイスに再アプライし、工程（ａ）～（ｅ）を繰り返す工程であって、それにより、分泌性産物を細胞から連続的に精製する、工程。
Ｅ１５４． 前記分泌性産物が、タンパク質、抗体、バイオ燃料、ポリマー、小分子、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される、Ｅ１５３に記載の方法。
Ｅ１５５． 前記細胞が、細菌細胞、藻類細胞、哺乳類細胞、および腫瘍細胞からなる群から選択される、Ｅ１５３に記載の方法。
Ｅ１５６． 遠心分離または水簸の非存在下で、試料上で決定論的横置換（ＤＬＤ）を実施することを含む、アフェレーシス試料中の血小板と白血球の比率を減少させる方法であって、産物が、血小板と白血球の比率がＤＬＤの代わりに遠心分離または水簸を使用して実施される同じ手順で得られる比率よりも少なくとも２０％低くで得られる、方法。
Ｅ１５７． 産物が、血小板と白血球の比率が密度勾配遠心分離または向流遠心分離を使用して実施される同じ手順で得られる比率よりも少なくとも２０％低くで得られる、Ｅ１５６に記載の方法。
Ｅ１５８． 産物が、血小板と白血球の比率が水簸を使用して実施される同じ手順で得られる比率よりも少なくとも２０％低くで得られる、Ｅ１５６に記載の方法。
Ｅ１５９． 産物が、血小板と白血球の比率がＤＬＤの代わりに遠心分離または水簸を使用して得られる比率よりも少なくとも５０％低くで得られる、Ｅ１５６に記載の方法。
Ｅ１６０． ＤＬＤの前に、アフェレーシス試料に対して実施される分離工程がない、Ｅ１５６～１５９のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ１６１． ＤＬＤが、血小板のサイズを変えるインターカレーションを含まず、血小板凝集を促進しないバッファーにおいて実施される、Ｅ１５６～１６０のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ１６２． ＤＬＤが、デキストランまたは他の高電荷ポリマーを含まないバッファーにおいて実施される、Ｅ１５６～１５９のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ１６３． 産物中の血小板の総数が、アフェレーシス試料中よりも少なくとも７０％低い、Ｅ１５６～１６２のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ１６４． 産物中の血小板の総数が、アフェレーシス試料中よりも少なくとも９０％低い、Ｅ１５６～１６３のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ１６５． 試料上でＤＬＤ、次にアフィニティー分離工程およびアクチベーターの存在下で培養することによるＴ細胞の拡張を実施することを含む、アフェレーシス試料からＴ細胞を精製するための方法であって、得られるＴ細胞の数が、ＤＬＤの代わりにＦｉｃｏｌｌ遠心分離を使用して実施される同じ手順によって産生される数の少なくとも２倍である、方法。
Ｅ１６６． アフィニティー分離工程が、ＣＤ３に結合する抗体を含む磁気ビーズまたは粒子の使用を含む、Ｅ１６５に記載の方法。
Ｅ１６７． 培養１４日後に得られるＴ細胞の数が、ＤＬＤの代わりにＦｉｃｏｌｌ遠心分離を使用して実施される同じ手順によって産生される数の少なくとも２倍である、Ｅ１６５に記載の方法。
Ｅ１６８． 培養１４日後に得られるＴ細胞の数が、ＤＬＤの代わりにＦｉｃｏｌｌ遠心分離を使用して実施される同じ手順によって産生される数の少なくとも４倍である、Ｅ１６５に記載の方法。
Ｅ１６９． ＤＬＤ産物中の細胞が組換え表現型を発現するようにベクターで形質転換されているとき、所望の表現型を示す細胞の収量は、Ｆｉｃｏｌｌ遠心分離により単離され、ＤＬＤに付されない同一の細胞よりも少なくとも１０％高い、Ｅ１５６～１６８のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ１７０． ＤＬＤ産物中の細胞が組換え表現型を発現するようにベクターで形質転換されているとき、所望の表現型を示すＴ細胞の収量は、Ｆｉｃｏｌｌ遠心分離により単離され、ＤＬＤに付されない同一の細胞よりも少なくとも２０％高い、Ｅ１５６～１６９のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ１７１． Ｔ細胞の総数に対するＤＬＤ産物中のメモリーＴ細胞の割合が、ＤＬＤの代わりにＦｉｃｏｌｌ遠心分離で同じ手順を使用して産生される割合よりも少なくとも１０％高い、Ｅ１６３～１６５のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ１７２． 方法が、ＣＡＲ Ｔ細胞療法のためのＴ細胞を産生するために使用され、患者を処置するために十分な数の細胞を産生するために必要な時間がＦｉｃｏｌｌ遠心分離の代わりにＤＬＤを使用して少なくとも２０％減少される、Ｅ１５６～１７１のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ１７３． ＣＡＲ Ｔ細胞を産生するためのプロセスが、細胞が凍結される工程を含まない、Ｅ１７２に記載の方法。
Ｅ１７４． Ｔ細胞の処理が、アフェレーシスが実施されるのと同じ部位で実施される、Ｅ１７２またはＥ１７３のいずれかに記載の方法。
Ｅ１７５． Ｔ細胞が、アフェレーシスが実施されるのと同じ部位で遺伝的に形質転換される、Ｅ１７２～１７４のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ１７６． １時間未満が、アフェレーシス試料収集が完了される時間からＤＬＤが実施される時間までで経過する、Ｅ１５６～１６９のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ１７７． 遠心分離または水簸の非存在下で、試料上で決定論的横置換（ＤＬＤ）を実施することを含む、アフェレーシス試料中の白血球に対する血小板の比率を減少させる方法であって、産物が、産物中の血小板の総数がアフェレーシス試料中よりも少なくとも９０％低くで得られる、方法。
Ｅ１７８． ＤＬＤが、血小板のサイズを変えるインターカレーションを含まず、血小板凝集を促進しないバッファーにおいて実施される、Ｅ１７７に記載の方法。
Ｅ１７９． ＤＬＤが、デキストランまたは他の高電荷ポリマーを含まないバッファーにおいて実施される、Ｅ１７７に記載の方法。
Ｅ１８０． 以下の工程を含む、ＣＡＲ Ｔ細胞を操作する方法：
ａ）アフェレーシスにより患者から試料組成物を取得する工程であって、前記試料組成物がＴ細胞を含む、工程；
ｂ）存在する血小板の総数を少なくとも７０％減少させるように試料組成物上でＤＬＤを実施する工程であって、ＤＬＤは、
ｉ）試料注入口から１つまたは複数の流体出口へ延びる少なくとも１個のチャネルであって、前記チャネルが第１の壁および前記第１の壁と反対側の第２の壁によって囲まれている、チャネル；
ｉｉ）前記チャネルにおいて、いくつもの行（ｒｏｗ）をなして配列された障害物のアレイであって、障害物のそれぞれの次の行が、前の行に対して横方向へシフトしており、前記障害物が、粗流体組成物が前記デバイスの注入口にアプライされ、前記チャネルを流体的に通過する時、組成物中のＴ細胞が、濃縮産物が収集される１つまたは複数の収集出口へ流れ、血小板およびＴ細胞より小さい他の物質が、収集出口から切り離されている１つまたは複数の廃棄物出口へ流れる様式で配置されている、障害物のアレイ
を含むマイクロ流体デバイス上で実施される、工程；
ｃ）工程ｂ）において取得された濃縮産物中のＴ細胞を、それらの表面上にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を産生するように遺伝子操作する工程；
ｄ）それらの数を拡張するようにＴ細胞を培養する工程；
ｅ）患者への投与のための医薬組成物にＴ細胞を移す工程。
Ｅ１８１． 血小板の少なくとも９０％が工程ｂ）において除去される、Ｅ１８０に記載の方法。
Ｅ１８２． 全ての単離工程および濃縮工程がＤＬＤを使用して実施される、Ｅ１８０またはＥ１８１のいずれかに記載の方法。
Ｅ１８３． 培養前または培養中に、細胞がＴ細胞アクチベーターに曝露される、Ｅ１８０～１８２のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ１８４． 工程ｂ）中および工程ｃ）の前に、細胞が、Ｔ細胞アクチベーターが存在または添加されている培地に移される、Ｅ１８０～１８３のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ１８５． アクチベーターを含む培地をＤＬＤにより処理し、アクチベーターを細胞から分離し、細胞が、細胞を組み換え的に操作するためのベクターが存在または添加されている培地に移される、Ｅ１８４に記載の方法。
Ｅ１８６． 細胞が、患者への投与のために医薬組成物に移されるまで細胞が凍結されない、Ｅ１８０～１８５のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ１８７． 細胞があらゆる工程で凍結されない、Ｅ１８０～１８５のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ１８８． 細胞がＤＬＤ以外の方法によって単離または濃縮される手順と比較して、プロセスが少なくとも１日早く完了する、Ｅ１８０～１８７のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ１８９． 細胞がＤＬＤ以外の方法によって単離または濃縮される手順と比較して、プロセスが少なくとも３日早く完了する、Ｅ１８０～１８７のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ１９０． 細胞がＤＬＤ以外の方法によって単離または濃縮される手順と比較して、プロセスが少なくとも５日早く完了する、Ｅ１８０～１８７のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ１９１． 細胞がＤＬＤ以外の方法によって単離または濃縮される手順と比較して、プロセスが少なくとも１０日早く完了する、Ｅ１８０～１８７のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ１９２． 工程ｄ）において、培養１４日後に取得されるＴ細胞の数が、ＤＬＤの代わりにＦｉｃｏｌｌ遠心分離を使用して行われる同じ手順によって産生される数よりも少なくとも２倍高い、Ｅ１８０～１９１のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ１９３． 工程ｄ）において、培養１４日後に取得されるＴ細胞の数が、ＤＬＤの代わりにＦｉｃｏｌｌ遠心分離を使用して行われる同じ手順によって産生される数よりも少なくとも４倍高い、Ｅ１８０～１９１のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ１９４． 以下の工程を含む、ＣＡＲ Ｔ細胞を調製する方法：
ａ）アフェレーシスにより患者から細胞を収集する；
ｂ）工程ａ）で得られた細胞にＤＬＤを実施して、白血球を他の細胞および粒子から分離し、白血球を、それらの増殖をサポートし、Ｔ細胞活性化因子を含むかまたは補充した培地に移す；
ｃ）ＤＬＤを実施して、工程ｂ）の培地から、その表面にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように組換え操作されたＴ細胞を分離し、培地に移す；
ｄ）ＤＬＤを実施してＴ細胞を試薬から分離し、増殖培地に移す；
ｅ）細胞を培養して細胞数を増やす；
ｆ）ＤＬＤを実施して、増やしたＴ細胞を患者に投与するための培地に移す。
Ｅ１９５． 細胞が、患者への投与のために医薬組成物に移されるまで凍結されない、Ｅ１９４に記載の方法。
Ｅ１９６． 細胞がいかなる段階においても凍結されていない、Ｅ１９４に記載の方法。
Ｅ１９７． 細胞がＤＬＤ以外の方法によって単離または濃縮される手順と比較して、プロセスが少なくとも３日早く完了する、Ｅ１９４～１９６のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ１９８． 細胞がＤＬＤ以外の方法によって単離または濃縮される手順と比較して、プロセスが少なくとも５日早く完了する、Ｅ１９４～１９６のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ１９９． 細胞がＤＬＤ以外の方法によって単離または濃縮される手順と比較して、プロセスが少なくとも１０日早く完了する、Ｅ１９４～１９６のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ２００． 以下の工程を含む、患者の処置のためのＣＡＲ Ｔ細胞を調製する方法：
ａ）アフェレーシスによって患者から細胞を収集すること；
ｂ）工程ａ）で得られた細胞にＤＬＤを実施して、白血球を他の細胞および粒子から分離し、白血球を、それらの増殖をサポートし、Ｔ細胞活性化因子を含むかまたは補充した培地に移す；
ｃ）工程ｂ）の培地からＴ細胞を、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を表面に生成するようにＴ細胞を遺伝子操作するためのベクターを含む培地に分離する；
ｄ）ＤＬＤを実施して、Ｔ細胞を試薬から分離し、患者に投与するための培地に移す。
Ｅ２０１． 細胞が、患者への投与のために医薬組成物に移されるまで凍結されない、Ｅ２００に記載の方法。
Ｅ２０２． 細胞がいかなる段階においても凍結されていない、Ｅ２００に記載の方法。
Ｅ２０３． 細胞がＤＬＤ以外の方法によって単離または濃縮される手順と比較して、プロセスが少なくとも３日早く完了する、Ｅ２００～２０２のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ２０４． 細胞がＤＬＤ以外の方法によって単離または濃縮される手順と比較して、プロセスが少なくとも５日早く完了する、Ｅ２００～２０２のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ２０５． 細胞がＤＬＤ以外の方法によって単離または濃縮される手順と比較して、プロセスが少なくとも１０日早く完了する、Ｅ２００～２０２のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ２０６． 工程ｂ）において、白血球に対する血小板の比が、ＤＬＤの代わりに遠心分離またはエルトリエーション（ｅｌｕｔｒｉａｔｉｏｎ）を用いて得られる比よりも少なくとも５０％低い生成物が得られる、Ｅ１８０～２０５のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ２０７． 所望のＣＡＲ Ｔ表現型を示すＴ細胞の収量が、Ｆｉｃｏｌｌ遠心分離によって単離され、ＤＬＤに供されていない同一の細胞よりも少なくとも１０％高い、Ｅ１８０～２０５のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ２０８． 所望のＣＡＲ Ｔ表現型を示すＴ細胞の収量が、Ｆｉｃｏｌｌ遠心分離によって単離され、ＤＬＤに供されていない同一の細胞よりも少なくとも２０％高い、Ｅ１８０～２０５のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ２０９． 患者の処置のために十分な数のＴ細胞を製造するのに必要な時間が、同じ方法がアフェレーシス開始材料から細胞を単離するためにＤＬＤではなくＦｉｃｏｌｌ遠心分離を使用して実施された場合よりも少なくとも５％短い、Ｅ１８０～２０８のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ２１０． 患者の処置のために十分な数のＴ細胞を製造するのに必要な時間が、同じ方法がアフェレーシス開始材料から細胞を単離するためにＤＬＤではなくＦｉｃｏｌｌ遠心分離を使用して実施された場合よりも少なくとも１０％短い、Ｅ１８０～２０９のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ２１１． 前記方法によって調製された細胞が患者に投与される場合に、細胞が、ＤＬＤの代わりに遠心分離またはエルトリエーション法を使用してアフェレーシス組成物から処理された細胞よりも少なくとも１０％少ない老化を示す、Ｅ１８０～２０９のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ２１２． 前記方法によって調製された細胞が患者に投与される場合に、細胞が、ＤＬＤの代わりに遠心分離またはエルトリエーション法を使用してアフェレーシス組成物から処理された細胞よりも増大した効力を示す、Ｅ１８０～２０９のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ２１３． Ｅ１８０～２０９のいずれか一つに記載の方法によって調製された治療有効量の細胞を前記患者に投与することを含む、疾患または症状について患者を処置する方法。
Ｅ２１４． 前記疾患または症状ががんである、Ｅ２１３に記載の方法。
Ｅ２１５． 以下の工程を含む、治療的に活性な細胞を製造する方法：
ａ）前記細胞を含む患者から試料組成物を得る；
ｂ）試料に対してＤＬＤを実施して、治療的に活性な細胞が濃縮された組成物を製造する、ここで、ＤＬＤは、以下を含むマイクロ流体デバイスで実施される：
ｉ）試料入口から１つまたは複数の流体出口まで延びる少なくとも１つのチャネルであって、第１の壁および第１の壁の反対側の第２の壁によって境界付けられている、チャネル；
ｉｉ）チャネル内の列に配置された障害物の配列、後続の各列の障害物は前の列に対して横方向にシフトされ、前記障害物は、粗流体組成物が装置の入口にアプライされ、流体的にチャネルを通過するときに、組成物中の治療的に活性な細胞は、濃縮生成物が収集される１つまたは複数の収集出口に流れ、ここで治療的に活性な細胞よりも小さい細胞および材料は、収集出口から分離されるもう１つの廃棄出口に流れる；
ｃ）任意に、工程ｂ）で得られた濃縮生成物中の治療活性細胞を遺伝子操作する；
ｄ）任意に、治療的に活性な細胞を培養してその数を増やす；
ｅ）治療的に活性な細胞を患者への投与のための医薬組成物に移す。
Ｅ２１６． 治療的に活性な細胞が幹細胞である、Ｅ２１５に記載の方法。
Ｅ２１７． 幹細胞が循環中に見出され、試料組成物がアフェレーシスによって調製される、Ｅ２１６に記載の方法
Ｅ２１８． 血小板の少なくとも７０％が工程ｂ）の濃縮生成物から除去される、Ｅ２１７に記載の方法。
Ｅ２１９． 血小板の少なくとも９０％が工程ｂ）の濃縮生成物から除去される、Ｅ２１７に記載の方法。
Ｅ２２０． すべての単離工程および濃縮工程がＤＬＤを使用して実施される、Ｅ２１５～２１９のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ２２１． 細胞が、患者への投与のために医薬組成物に移されるまで凍結されない、Ｅ２１５～２２０のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ２２２． 細胞がいかなる段階においても凍結されていない、Ｅ２１５～２２０のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ２２３． 細胞がＤＬＤ以外の方法によって単離または濃縮される手順と比較して、プロセスが少なくとも１日早く完了する、Ｅ２１５～２２２のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ２２４． 細胞がＤＬＤ以外の方法によって単離または濃縮される手順と比較して、プロセスが少なくとも３日早く完了する、Ｅ２１５～２２２のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ２２５． 細胞がＤＬＤ以外の方法によって単離または濃縮される手順と比較して、プロセスが少なくとも５日早く完了する、Ｅ２１５～２２２のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ２２６． 試料組成物から得られる治療的に活性な細胞の収量が、細胞がＤＬＤ以外の方法によって単離または濃縮される手順によって得られる場合よりも少なくとも２５％高い、Ｅ２１５～２２２のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ２２７． 細胞がＤＬＤ以外の方法によって単離または濃縮される手順と比較して、プロセスが少なくとも３日早く完了する、Ｅ２１５～２２２のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ２２８． 細胞がＤＬＤ以外の方法によって単離または濃縮される手順と比較して、プロセスが少なくとも５日早く完了する、Ｅ２１５～２２２のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ２２９． 患者の処置のために十分な数の治療的に活性な細胞を製造するのに必要な時間が、同じ方法が試料組成物から細胞を単離するためにＤＬＤではなくＦｉｃｏｌｌ遠心分離を使用して実施された場合よりも少なくとも５％短い、Ｅ２１５～２２２のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ２３０． 患者の処置のために十分な数の治療的に活性な細胞を製造するのに必要な時間が、同じ方法が試料組成物から細胞を単離するためにＤＬＤではなくＦｉｃｏｌｌ遠心分離を使用して実施された場合よりも少なくとも１０％短い、Ｅ２１５～２２２のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ２３１． 前記方法によって調製された治療的に活性な細胞が患者に投与される場合に、細胞が、ＤＬＤの代わりに遠心分離またはエルトリエーション法を使用してアフェレーシス組成物から処理された細胞よりも少なくとも１０％少ない老化を示す、Ｅ２１５～２３０のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ２３２． 前記方法によって調製された治療的に活性な細胞が患者に投与される場合に、細胞が、ＤＬＤの代わりに遠心分離またはエルトリエーション法を使用して試料組成物から処理された細胞よりも増大した効力を示す、Ｅ２１５～２３０のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ２３３． Ｅ２１５～２３０のいずれか一つに記載の方法によって調製された治療有効量の治療的に活性な細胞を前記患者に投与することを含む、疾患または症状について患者を処置する方法。
Ｅ２３４． 前記治療的に活性な細胞が幹細胞であり、前記疾患または症状が遺伝性疾患である、Ｅ２３３に記載の方法。
Ｅ２３５． 標的細胞の集団を操作する方法であって、
ａ）粗液体組成物から標的細胞を単離すること、ここに単離は、細胞のサイズの相違に基づいて粗液体組成物中の他の細胞から標的細胞を分離する１つまたは複数の手段を用いて、マイクロ流体デバイス上で行われ、該単離プロセスにより標的細胞豊富な組成物が得られるものであり、
ｂ）工程ａ）から得られた標的細胞を、所望の表現形を有するように遺伝子操作すること
を含み、
標的細胞が遺伝子操作される前に遠心分離されないか、あるいは溶出処理されない、方法。
Ｅ２３６． 該標的細胞が白血球または幹細胞である、Ｅ２３５記載の方法。
Ｅ２３７． 該標的細胞がＴ細胞である、Ｅ２３５記載の方法。
Ｅ２３８． 該粗液体組成物が患者から得られた血液またはアフェレーシス調製物である、Ｅ２３５～２３７のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ２３９． 標的細胞の単離が、標的細胞に富む組成物がアフェレーシス調製物よりも少なくとも７０％少ない血小板の総数を有するような条件下で行われる、Ｅ２３８記載の方法。
Ｅ２４０． 標的細胞に富む組成物中の血小板の総数がアフェレーシス調製物よりも少なくとも９０％少ない、Ｅ２３９記載の方法。
Ｅ２４１． 標的細胞に対する血小板の割合が、成分除去製剤よりも少なくとも５０％低い、Ｅ２４０記載の方法。
Ｅ２４２． 該標的細胞が、単離後に再簿培養にて拡大されるＴ細胞である、Ｅ２３８記載の方法。
Ｅ２４３． 培養１４日後に得られるＴ細胞の数が、遠心分離工程を含むプロセスによってＴ細胞が単離される手順よりも少なくとも２倍多い、Ｅ２４２記載の方法。
Ｅ２４４． 培養１４日後に得られるＴ細胞の数が、遠心分離工程を含むプロセスによってＴ細胞が単離される手順よりも少なくとも４倍多い、Ｅ２４２記載の方法。
Ｅ２４５． 培養中のＴ細胞の総数に対するメモリーＴ細胞のパーセンテージが、遠心分離工程を含むプロセスによってＴ細胞が単離される手順よりも少なくとも１０％高い、Ｅ２４４記載の方法。
Ｅ２４６． 培養中のＴ細胞の総数に対するメモリーＴ細胞のパーセンテージが、遠心分離工程を含むプロセスによってＴ細胞が単離される手順よりも少なくとも２０％高い、Ｅ２４４記載の方法。
Ｅ２４７． 標的細胞が富化された組成物中の細胞がベクターにて形質転換されて組換え表現形を示す場合、所望の表現形を示す標的細胞の収量が、遠心分離により単離された同じ細胞よりも少なくとも２０％高い、Ｅ２３５～２４６のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ２４８． アフェレーシス試料の収集が完了した時から、マイクロ流体デバイスを用いる分離が行われるまでに１時間以内が経過する、Ｅ２３８～２４７のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ２４９． 患者からのアフェレーシス試料の取得が完了してから標的細胞の単離が完了するまでの経過時間が４時間以内である、Ｅ２３８～２４７のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ２５０． 患者からのアフェレーシス試料の取得が完了してから細胞が遺伝子操作されるまでの経過時間が４時間以内である、Ｅ２３８～２４７のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ２５１． ＣＡＲ Ｔ細胞の調製方法であって、
ａ）アフェレーシスにより患者から粗液体組成物を得ること、ここに該試料はＴ細胞を含むものであり、
ｂ）該粗液体組成部物からＴ細胞を単離すること、ここに該単離は、サイズの相違に基づいてＴ細胞を粗液体組成物中の血小板および他の細胞から分子する１つ以上の手順を用いて、マイクロ流体デバイス上で行われ、該単離によりＴ細胞が豊富化され血小板が減少した組成物が得られるものであり、
ｃ）工程ａ）で得られた標的細胞を遺伝子操作して、それらの表面上にキメラ抗原受容体（ＣＡＲｓ）を生成させること、ここに遺伝子操作前のいかなる工程においてもＴ細胞が遠心分離されないか、あるいは溶出処理されず、
ｄ）遺伝子操作されたＴ細胞の数を増大させること、
ｅ）工程ｄ）で得られた培養細胞を収集すること
を含む方法。
Ｅ２５２． 工程ｃ）において、患者に投与するための医薬組成物中に移されることによりＴ細胞が収集される、Ｅ２５１記載の方法。
Ｅ２５３． 収集前に細胞が凍結されない、Ｅ２５１またはＥ２５２記載の方法。
Ｅ２５４． 血小板の少なくとも９０％が工程ｂ）で除去される、Ｅ２５１～２５３のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ２５５． 培養前または培養中に細胞がＴ細胞活性化因子または担体に曝露される、Ｅ２５１～２５４のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ２５６． 該活性化剤も該担体も、磁気ビーズにまたは粒子に結合されていない、Ｅ２５５記載の方法。
Ｅ２５７． マイクロ流体デバイスの使用を含まない方法によって細胞が単離または濃縮される手順と比較して、少なくとも１日前にＣＡＲ Ｔ細胞が患者への投与に利用可能である、Ｅ２５１～２５６のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ２５８． マイクロ流体デバイスの使用を含まない方法によって細胞が単離または濃縮される手順と比較して、少なくとも３日前にＣＡＲ Ｔ細胞が患者への投与に利用可能である、Ｅ２５１～２５６のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ２５９． 工程ｄ）において、培養１４日後に得られるＣＡＲ Ｔ細胞の数が、Ｆｉｃｏｌｌ遠心分離を用いて得られる数よりも少なくとも２倍多い、Ｅ２５１～２５８のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ２６０． 工程ｄ）において、培養１４日後に得られるＣＡＲ Ｔ細胞の数が、Ｆｉｃｏｌｌ遠心分離を用いて得られる数よりも少なくとも４倍多い、Ｅ２５１～２５８のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ２６１． Ｔ細胞およびＣＡＲ Ｔ細胞が、患者に投与される前に決して凍結されない、Ｅ２５１～２６０のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ２６２． 患者の処置のためのＣＡＲ Ｔ細胞を調製する方法であって、
ａ）アフェレーシスにより患者から粗液体組成物を得ること、ここに該試料はＴ細胞を含むものであり、
ｂ）該粗液体組成部物からＴ細胞を単離すること、ここに該単離は、サイズの相違に基づいてＴ細胞を粗液体組成物中の血小板および他の細胞から分子する１つ以上の手順を用いて、マイクロ流体デバイス上で行われ、該単離によりＴ細胞が豊富化され血小板が減少した組成物が得られるものであり、
ｃ）工程ａ）で得られた標的細胞を遺伝子操作して、それらの表面上にキメラ抗原受容体（ＣＡＲｓ）を生成させること、ここに遺伝子操作前のいかなる工程においてもＴ細胞が遠心分離されないか、あるいは溶出処理されず、
ｄ）遺伝子操作されたＴ細胞の数を増大させること、
ｅ）サイズの相違に基づいてＴ細胞を試薬から分離する１つ以上の手順を用いて、マイクロ流体デバイス上でＴ細胞を分離すること
を含む方法。
Ｅ２６３． 細胞が、患者への投与のために医薬組成物中に移されるまで凍結されない、Ｅ２６２記載の方法。
Ｅ２６４． 細胞がいかなる工程においても凍結されない、Ｅ２６２記載の方法。
Ｅ２６５． マイクロ流体デバイスの使用を含まない方法によって細胞が単離または濃縮される手順と比較して、プロセスが少なくとも３日早く完了する、Ｅ２６２～２６４のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ２６６． マイクロ流体デバイスの使用を含まない方法によって細胞が単離または濃縮される手順と比較して、少なくとも１日前にＣＡＲ Ｔ細胞が患者への投与に利用可能である、Ｅ２６２～２６５のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ２６７． マイクロ流体デバイスの使用を含まない方法によって細胞が単離または濃縮される手順と比較して、少なくとも３日前にＣＡＲ Ｔ細胞が患者への投与に利用可能である、Ｅ２６２～２６５のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ２６８． 工程ｂ）において、白血球に対する血小板の割合が、遠心分離または溶出処理を用いて得られる割合よりも少なくとも５０％低い生成物組成物が得られる、Ｅ２６２～２６７のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ２６９． 患者の処置のための十分な数のＣＡＲ Ｔ細胞を産生するのに必要な時間が、Ｆｉｃｏｌｌ遠心分離により単離された細胞を用いて同じ方法が行われる場合よりも少なくとも５％短い、Ｅ２６２～２６８のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ２７０． 患者の処置のための十分な数のＣＡＲ Ｔ細胞を産生するのに必要な時間が、アフェレーシス出発材料から細胞を単離するためにＦｉｃｏｌｌ遠心分離を用いて同じ方法が行われる場合よりも少なくとも１０％短い、Ｅ２６２～２６９のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ２７１． 該方法によって調製された細胞が患者に投与されるとき、それらの細胞が、遠心分離または溶出処理を用いてアフェレーシス組成物から処理された細胞よりも少なくとも１０％少ない老化を示す、Ｅ２６２～２７０のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ２７２． Ｅ２３５～２７１のいずれか一つに記載の方法によって調製された治療上有効量の細胞を患者に投与することを含む、疾病または症状について患者を処置する方法。
Ｅ２７３． 該疾病または症状ががんである、Ｅ２７２記載の方法。
以下の実施例は、本発明を例証することを意図されるが、本発明を限定することを意図するものではない。
実施例１
この研究は、ＣＡＲ－Ｔ細胞製造に欠かせないアフェレーシス試料に焦点を合わせている。ドナーの健康、疾患状態、および過去の化学療法に関連した固有の可変性は全て、白血球アフェレーシス収集の品質、およびおそらく、製造プロトコールにおける様々な工程の効率に影響を及ぼす（Levine, et al., Mol. Therapy: Meth. Clin. Dev. 4:92-101 (2017)）。自動化ＤＬＤ白血球濃縮をストレス試験するために、残留白血球（ＬＲＳチャンバー画分）を、血小板アフェレーシス献血から収集し、その血小板アフェレーシスは、一般的に、正常に近い赤血球カウント数、１０～２０倍のリンパ球および単球を有し、顆粒球をほとんど有しない。それらはまた、正常な末梢血と比較して、約１０倍の血小板カウント数を有する。
１２個のドナーを処理し、ＤＬＤ対Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離（「ゴールドスタンダード」）による主要な血液細胞型および処理能力について、収率を比較した。これらのドナーのうちの４個をまた、「Ｔ細胞増殖能力」について１５日間にわたって評価した。各ドナー試料を、ＤＬＤとＦｉｃｏｌｌの両方により処理し、Ｔ細胞増殖能力について研究された４個のドナーについて、試料を、直接的磁気抽出を用いて処理した。
材料および方法
マイクロチップデザインおよび製作：この研究に用いられるＤＬＤアレイは、単一ゾーンの鏡映型菱形ポストのデザインからなった（D'Silva, J., 「Throughout Microfluidic Capture of Rare Cells from Large Volumes of Blood」; A Dissertation Presented to the Faculty of Princeton University in Candidacy for the Degree of Doctor of Philosophy (2016)参照）。１４レーンのＤＬＤデバイスを生じる、チップあたり１４個の並列アレイがあった（図１Ｄ）。デバイスは、ポスト間の１６μｍの間隙、および１／４２傾斜を有するようにデザインされ、結果として、約４μｍの臨界直径を生じた。プラスチックＤＬＤデバイスを、ソフトエンボス加工と呼ばれるプロセスを用いて作製した。まず、プラスチックＤＬＤマイクロチップについてのシリコン（Ｓｉ）マスターを、標準フォトリソグラフィの深掘り反応性イオンエッチング技術を用いて作製した（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、ＰＲＩＳＭ）。その後、シリコンマスター上のフィーチャーを、Ｓｉフィーチャーの上にエラストマーを流し込み、硬化させることにより、ソフト弾性鋳型（Ｅｄｇｅ Ｅｍｂｏｓｓｉｎｇ、Ｍｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）へ転写した。エラストマーを剥がして、シリコンマスターの再利用可能なネガティブインプリントが生じた。プラスチックブランクシートをエラストマー鋳型の間に置き、その後、圧力と温度の組合せを用いて、そのプラスチックを、ソフトエラストマーネガティブ鋳型のフィーチャー（ウェル）へ押し出し成形して、オリジナルのシリコンマスターのポジティブフィーチャーおよび深さを複製した。その後、そのソフトツールを、プラスチックデバイスから剥がして、マイクロポストのアレイの周りのフローチャネルおよび溝のパターンを有する、深さ約１００μｍまで表面エンボス加工されたプラスチックの平らな一片を生成した（図１Ｄ、挿入図）。マイクロチップの注入口末端および出口末端への流体アクセスのためにポートを作製した。超音波処理によるクリーニング後、デバイスを、感熱性で親水性の接着材（ＡＲＦｌｏｗ Ａｄｈｅｓｉｖｅｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｇｌｅｎ Ｒｏｃｋ、ＰＡ）で覆った。チップ全体は４０×７５ｍｍ、厚さ１ｍｍであり、クレジットカードのサイズより小さかった。
ＤＬＤマイクロチップ動作：マイクロ流体デバイスを、流体接続部を有する、光学的に透明で耐圧性のマニフォールドの内側に組み立てた。流体を、一定空気圧制御装置（ＭＦＣＳ－ＥＺ、Ｆｌｕｉｇｅｎｔ、Ｌｏｗｅｌｌ、ＭＡ）を用いて、ＤＬＤマイクロチップへ流した。１つはバッファーについて、１つは試料について、２つの異なる圧力制御を用いた。バッファーラインについてのフロー経路は、バッファーリザーバ（６０ｍＬシリンジ）、インラインデガッサー（Ｂｉｏｔｅｃｈ ＤＥＧＡＳｉ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）、およびマニフォールドのバッファー注入口ポートを接続する管を含んだ。試料についてのフロー経路は、試料リザーバ（２０ｍＬシリンジ）、マイクロチップ公称間隙サイズ（１６μｍ）より大きい凝集物を保持するための直径２５ｍｍの２０μｍ ＰｕｒｅＦｌｏｗナイロンフィルター、およびマニフォールドの試料注入口ポートを接続する管を含んだ。マニフォールドの出口ポートを、廃棄物画分および産物画分についての収集リザーバに配管することにより接続した。
マイクロチップ、フィルター、および管の準備をし、試料を負荷する前にランニングバッファーで１５分間、ブロッキングした。ＤＬＤ設定を、ランニングバッファーをバッファーリザーバ（６０ｍＬシリンジ）へ負荷し、その後、加圧することにより準備した；その時、流体は、管を通って、マニフォールド「バッファーイン」ポートへと通過した（図１）。マニフォールドポートにおける空気を、その注入口における別のポートを介してベントし、その後、そのポートを密閉した。その後、バッファーをマイクロチップへ流し、産物出口と廃棄物出口の両方から排出して、マイクロポストアレイにおける全ての空気を抜いた。同時に、バッファーを、マニフォールドの「試料イン」ポート、およびインラインフィルターを通して、逆流させ、少しの空気も追い出した。この準備工程は、実際に手を動かす時間が約５分かかり、マイクロチップ、マニフォールド、および管から全空気を除去した。準備工程後、全ての内部表面をブロッキングするためにさらに１５分間、バッファーで、装備を洗い流し続けた；この工程は自動化されており、実際に手を動かす必要はなかった。
ブロッキング工程後、システムを減圧し、試料を試料容器（２０ｍＬシリンジ）へ負荷した。試料（下記参照）を、ＤＬＤへの負荷前に、ランニングバッファー（０．２×）４部あたり試料１部の割合で希釈した。最初にバッファー供給源、その後、試料供給源を、再び加圧し、その結果、バッファーと試料の両方が、マニフォールド上のそれらのそれぞれのポートおよびマイクロチップに入り、並列したマイクロチップの中へ流れた（分離モード、図１Ａｉ）参照）。いったん試料が負荷され、ランニング圧力下に置かれたならば、システムは自動的に、試料容量全体を処理した。産物画分と廃棄物画分の両方を、あらかじめ重量測定された滅菌コニカル５０ｍＬチューブに収集し、収集後、重量を測定して、収集された容量を決定した。
バッファー系。以下の３つの異なるＥＤＴＡフリーのバッファー製剤をＤＬＤにおいて試験した：リン酸緩衝食塩水［Ｃａ＋＋／Ｍｇ＋＋フリー］（Ｑｕａｌｉｔｙ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）中０．５％Ｆ１２７（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－１２７、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、リン酸緩衝食塩水［Ｃａ＋＋／Ｍｇ＋＋フリー］中１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）、ならびにＰｌａｓｍａｌｙｔｅ Ａ（Ｂａｘｔｅｒ、Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬ）の５０％と、１．０％ＢＳＡ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）、１．０ｍＭ Ｎ－アセチル－システイン、２％デキストロース、および０．４５％ＮａＣｌ（全てＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ社製）を含有する混合物の５０％とで構成される等張性エラトリエーションバッファー（ＥＢ）。バッファーを、毎日、新鮮に調製し、ＤＬＤでの使用の前に、０．２μｍフィルターフラスコに通して、滅菌濾過した。より良いＤＬＤ性能はポロキサマーの添加により確立されているが（Johnson, et al., Cancer Cell Res. 27:38-58 (2017)）、増殖群における全ての試料を、等張性エラトリエーションバッファーを用いて処理して、本ＣＡＲ－Ｔ細胞製造アプローチを用いて最良に調整した。
生物学的試料。Ｔｒｉｍａシステム（Ｔｅｒｕｍｏ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を用いての、スクリーニングされた正常なドナーの血小板アフェレーシス献血由来の白血球除去システム（ＬＲＳ）チャンバー試料を、地方血液バンクから入手した。血液バンクによる収集の時点で、細胞カウントが行われた。カウントは、本発明者らの実験室において、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＡｃＴ２ Ｄｉｆｆ２臨床血液アナライザを用いて検証され、７６～３１３．３×１０３ＷＢＣ／μＬの間、および０．８～４．８７×１０６血小板／μＬの間の範囲であった。全試料を、一晩の輸送を模倣するために、オービタル振盪機（Ｂｉｏｃｏｔｅｋ、Ｃｈｉｎａ）上に、室温で一晩、保ち、その後、次の日に（約２４時間後）処理した。各ドナー試料を、ＤＬＤとＦｉｃｏｌｌの両方により処理し、Ｔ細胞増殖および免疫表現型研究に用いられる４個のドナーについては、試料をまた、直接的磁気抽出を用いて処理した。
Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、ＬＲＳ試料を、ＲＰＭＩ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ．Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）中０．５×に希釈することにより取得し、５０ｍＬコニカルチューブにおいて等容量のＦｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ（ＧＥ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）の上に層状に重ね、フリースウィングローターを用いて、ブレーキなし、４００ｘｇで、３５分間、遠心分離した。遠心分離後、最上層を捨て、界面ＰＢＭＣ画分を、新しい５０ｍＬチューブに移し、合計を２０ｍＬのＲＰＭＩに合わせた。ＰＢＭＣを、４００ｘｇで１０分間の遠心分離により洗浄し、上清を捨て、ペレットを２０ｍＬのＲＰＭＩで再懸濁し、２００ｘｇで１０分間、再び洗浄した。上清を除去し、ペレットを、ＲＰＭＩ－１６４０ ＋ １０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、加えて、ペニシリン１００ユニット／ｍＬおよびストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬの抗生物質（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を含有する完全培地中に再懸濁した。
細胞単離、カウント、および免疫蛍光染色。上記の方法を用いての単離の前および後に、生じた産物の細胞カウント数を、血液細胞アナライザ（Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ ＡｃＴ２ Ｄｉｆｆ２）を用いて決定した。培養中に１回、および活性化後、細胞カウント数を、Ｓｃｅｐｔｅｒ（商標）２．０手動細胞カウンター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を用いて、およびフローサイトメトリを用いる絶対的カウンティングにより、決定した。その後、入力物画分、産物画分、および廃棄物画分由来の細胞を、ポリリジンコーティング化スライド上に１０分間、載せ、その後、遠心分離によるＰＢＳ中での３回の洗浄前に、ＰＢＳ中４％ｐ－ホルムアルデヒド ＋ ０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００中で１５分間、固定した。スライドを、コンジュゲート型一次抗体ＣＤ４１－Ａ６４７およびＣＤ４１－ＦＩＴＣ（どちらもＢｉｏＬｅｇｅｎｄ Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ社製）と暗所中、６０分間、インキュベートし、ＰＢＳで３回、洗浄し、その後、ＤＮＡ染色ＤＡＰＩ（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を含有するＳｌｏｗＦａｄｅ封入剤中に封入した。スライドを、Ｅｔａｌｕｍａ（商標）Ｌｕｍａｓｃｏｐｅ ６２０蛍光倒立顕微鏡（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて観察した。以下の蛍光色素にコンジュゲートした抗体（ｍＡｂ）は、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から入手した：ＣＤ２５－ＰＥ、ＣＤ２５－ＡＰＣ、ＣＤ９５－ＦＩＴＣ、ＣＤ４５ＲＡ－ＢＶ６０５、ＣＤ４５ＲＯ－ＰＥＣｙ７、ＣＤ１９７／ＣＣＲ７ ＰＥ、ＣＤ２７９－ＰＥ、ＣＤ２８ ＰＥ－Ｃｙ５、ＣＤ４５－ＰｅｒＣＰ、ＣＤ３－ＦＩＴＣ、ＣＤ３－ＢＶ４２１、ＣＤ４－ＡＦ７００、ＣＤ８－ＡＰＣ－ＡＦ７８０、ＣＤ６１－ＦＩＴＣ、ＣＤ４１－ＦＩＴＣ、ＣＤ４５－Ａｌｅｘａ６４７。ＤＬＤにより取得されたＷＢＣおよびＦｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅにより精製されたＰＢＭＣの生存率を、トリパンブルー排除法により決定した。
活性化および磁気分離。増殖群におけるＴ細胞刺激について、ＤＬＤ産物、Ｆｉｃｏｌｌ産物、およびＬＲＳ産物を、１×１０７個のＴ細胞／ｍＬに希釈し、その後、洗浄し、平衡化した抗ＣＤ３／ＣＤ２８コンジュゲート化磁気ビーズ（５．０μｍ）（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）と３．２：１のビーズ：細胞の比で６０分間、活性化し、その後、活性化Ｔ細胞を、５分間、磁気デプレションにより分離した。結合していない細胞を除去し、ビーズに結合した細胞を、完全培地（下記）中でさらに培養した。直接的磁石プロトコールにおいて、０．５ｍＬのＬＲＳ試料（ＤＬＤまたはＦｉｃｏｌｌにより処理されたのと同じドナー）を、免疫磁気ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズと１時間、インキュベートした。その後、その混合物を、磁石につけて５分間、置いて、Ｔ細胞を捕獲した。磁気ビーズに結合した細胞（活性化細胞）を取り出し、その後、完全培地中での培養のために、上記のように０．５×１０６個／ｍＬに希釈した。
培養における３日間後、組換えヒトＩＬ－２（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を２００ＩＵ／ｍＬでウェルに加えた。最長１５日間の細胞培養後、ビーズを細胞から除去し、細胞を各時点においてカウントした。ビーズを除去するために、ウェル中の細胞を、その細胞を５ｍＬピペットの中へ１０回、通過させることにより、再懸濁した。次に、細胞懸濁液を、１ｍＬピペットに４０回、通過させ、続いて、２００μＬチップを用いる激しいピペッティングを１分間、行った。その後、細胞懸濁液を、磁石の側に５分間、置き、非磁性画分を、新鮮なチューブに移し、カウントした。培養ウェルにおける細胞の数を、Ｓｃｅｐｔｅｒ手動細胞カウンターを用いて、およびフローサイトメトリにより、決定した。
細胞培養および細胞活性化。細胞培養へ入れられるＴ細胞調製物のそれぞれについて、上記の刺激された細胞に加えて、非刺激細胞（対照）を、完全培地（ＲＰＭＩ ＋ １０％ＦＢＳ ＋ 抗生物質）中に０．５×１０６個／ｍＬに調整し、６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）に置き、加湿インキュベータにおいて３７℃、５％ＣＯ２で培養した。サンプリング、および特に３日目における、信頼できるカウント数のために必要とされる脱ビーズ行動のせいでの増殖中の破壊の可能性を少しでも排除するために、刺激されなかった、ならびにＩＬ２で刺激された、およびＩＬ２なしで刺激された、各条件についての個々のウェルを、各時点における各ドナーに特化させた。
フローサイトメトリ。フローサイトメトリによる洗浄なしの絶対的カウンティングを、全ての時点におけるＣＤ３＋細胞カウント数に用いた。最初の０日目のカウント数は、ＴｒｕＣｏｕｎｔチューブ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を用いて、回収され、かつカウントされた細胞の数を正確に決定した。その後の日は、内部対照としてのＴｒｕＣｏｕｎｔチューブにインデックスを付けた２５，０００個の１２３ビーズ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を用いた。ＴｒｕＣｏｕｎｔチューブにおいてか、または２５，０００個の１２３ビーズ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）の添加によるかのいずれかで、１００μＬの細胞懸濁液を、ＣＤ３ ＦＩＴＣ、ＣＤ２５ ＰＥ、およびＣＤ４５ ＰｅｒＣＰのコンジュゲート型抗体で暗所中、３０分間、染色した。その後、細胞を、１．０ｍＭの最終ＤＲＡＱ５（商標）ＤＮＡ色素（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）濃度を含む２５０μＬのＰＢＳへ希釈した。次に、染色された細胞を、獲得前に、ＰＢＳ中１．２％ｐ－ホルムアルデヒドの追加の２５０μＬで、一晩、固定した。絶対カウント数サイトメトリについて、最低限の２５，０００個の事象または２５００個のビーズ事象が、蛍光閾値（ＣＤ４５ ＰｅｒＣＰ）を用いて、ＢＤ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）において獲得された。表現型分析もまた、全時点において、ＣＤ３、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ９５、ＣＤ２７９、ＣＤ２５、ＣＤ４、およびＣＤ８からなる７色の活性化／アネルギーパネルを用いて、実施した。１５日目において、パネルを改変して、ＣＤ４５ＲＯ ＰＥ－Ｃｙ７、ＣＤ２８ ＰＥ－Ｃｙ５を加え、かつＣＤ２７９／ＰＤ１ ＰＥの代わりにＣＤ１９７／ＣＣＲ７ ＰＥを用いる、セントラルメモリーＴ細胞に焦点を合わせた９色パネルを作製した。多色染色について、１００μｌの細胞懸濁液を上記のように染色し、７５０μＬ ＰＢＳ中に再懸濁し、４００ｘｇでの遠心分離により洗浄し、その後、２５０μＬ １．２％ｐ－ホルムアルデヒド中に再懸濁し、一晩固定し、その後、４レーザーＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）において前方散乱閾値を用いて２０，０００個の事象を獲得した。全てのデータ分析は、Ｆｌｏｗｌｏｇｉｃソフトウェア（Ｉｎｉｖａｉ、Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を用いて実施された。
結果
アフェレーシス産物のＤＬＤマイクロチップおよびＦｉｃｏｌｌ処理
ＤＬＤおよびＦｉｃｏｌｌ分離方法を用いて、１２人の異なる正常なドナーから得られた１２個のＬＲＳ試料を処理した。受け取られ、かつ処理されたそれらの１２個の試料のうち、１１個の試料は、それぞれ、およそ１４８．７×１０３個／μＬのＷＢＣカウント数および２．５２×１０６個／μＬの血小板カウント数の平均値に密集した（図２Ａ、２Ｂ）。３１３．３×１０３個／μＬのＷＢＣカウント数および４．８７×１０６個／μＬの血小板カウント数を有する１２番目の試料は、散布図において赤色三角形として見ることができる（図２Ａ）。この試料は、処理の時点で、十分凝集しており、急速に２０μｍプレフィルターを詰まらせ、したがって、ＤＬＤに十分には流入しなかった。入力試料の顕微鏡検査により、この試料が、２５～５０μｍのサイズの範囲である血小板－ＷＢＣ凝集体が充満していることが示され、２５０μｍ直径の規模の大きさの多数の凝集体が観察された（図２Ｃ、２Ｄ）。さらに、ＷＢＣカウント数と血小板カウント数の両方は、平均ＷＢＣカウント数および平均血小板カウント数より３標準偏差、高かった。四分位方法を用いて、この試料を、軽度の異常値として分類した；異常値についてのＧｒｕｂｂｓ検定および０．０５のαレベルを用いて、この試料をまた、異常値として分類した２０。結果として、このドナーを、極めて高いＷＢＣカウント数および血小板カウント数、ならびに凝集が過度にひどく、かつ損傷していることに基づいて、本研究から排除した。
入力材料（０．２×に希釈されたＬＲＳ産物）の代表的な画像が図２Ａに示されている。同じ入力物ドナー由来のＤＬＤ細胞産物（図２Ｅ）およびＦｉｃｏｌｌ細胞産物（図２Ｃ）の典型的な顕微鏡写真より、Ｆｉｃｏｌｌと比較してＤＬＤにおいて、バックグラウンドの血小板レベル（緑色のＣＤ４１－ＦＩＴＣ）が有意により低いことが見出された。チューブに収集された時のそれぞれの細胞産物もまた示されている（図２Ｇ、Ｈ）。ＤＬＤ処理は、ＷＢＣをＲＢＣおよび血小板から取り出すプロセスを自動化し、産物についての１つのチューブおよび廃棄物についての１つのチューブを生じるが、一方、Ｆｉｃｏｌｌ試料はまだ、上方の血漿層と下方のＦｉｃｏｌｌ層の操作上規定された界面におけるＰＭＢＣ層をピペッティングするさらなる手作業での処理を必要とする（図２Ｈ）；加えて、追加の最低限２回の遠心洗浄が、混入血小板の大部分を除去するために必要とされる。
１１個の試料のＷＢＣの回収、ならびにＲＢＣデプレションおよび血小板デプレションは、表２に要約されている。ＤＬＤからのＰＢＭＣの平均細胞回収率は約８０％であり、Ｆｉｃｏｌｌ（６３％）より１７％高く、ＤＬＤ試料と磁気試料の両方におけるＣＤ３細胞の数を計上すると、ＤＬＤ産物は、直接的磁石（４４％）より３６％高かった。ＤＬＤによる平均血小板デプレション（８３％）は、Ｆｉｃｏｌｌ（５６．５％）と直接的磁石（７７％）のどちらよりも優れていた。これらの２４時間経過した試料における平均赤血球デプレションは、ＤＬＤとＦｉｃｏｌｌの両方について９７％、直接的磁石アプローチについて９４％であった。ＤＬＤにより取得された細胞の平均生存率は、９７％であったＦｉｃｏｌｌと比較して、９６％であった。
Ｆｉｃｏｌｌ技術による５０ｍＬコニカルチューブにおける単一試料の等価アリコートを処理するのにかかる平均の合計時間は、約９０分の所要時間であり、およそ３０分間の熟練者が実際に手を動かす時間が必要とされた。本発明者らの単一マイクロチップ層ブレッドボードシステムを用いる時限実行（timed run）は、はるかに短い時間、５０分間で処理し、２５分間の実際に手を動かす時間を必要とし、およそ２０分間は単に流体工学部品の組立によるものであり、その理由は、デバイスが、プロトタイプの性質をもつからであり、そうでなければ、介入する必要はない。
細胞増殖および特徴づけ
ＤＬＤまたはＦｉｃｏｌｌ濃縮後、細胞を、ＣＤ３／ＣＤ２８磁気ビーズを用いて、ＣＤ３＋細胞あたり３．２個のビーズの目安で、６０分間、活性化し、分離し、その後、プレーティングの前にカウントした。フローサイトメーターへのアクセスの制限および産物細胞カウント数における潜在的ビーズ干渉に関する懸念により、本発明者らは、入力物画分と非磁気画分の両方をカウントし、９０％の効率での磁気分離（製造会社が報告した効率に基づいた）の仮定を用いて、引き算により磁石に結合したＴ細胞の数を得ることにより、Ｔ細胞カウント数を推定した。正確なＴ細胞カウント数を、培養へのプレーティング後に、フローサイトメトリにより、およびコールターカウンターによる絶対カウント数×％ＣＤ３陽性細胞を用いて、決定した；これらのカウント数は、最初の磁気ＣＤ３＋細胞デプレションプロセスがたった４４％効率であったことを確立した（表２）。これは、ＣＤ３＋細胞あたり３．２個のビーズという目安に関係する最初の計算が、実際、ＤＬＤ画分とＦｉｃｏｌｌ画分の両方について平均して２．３個であり（目安とされた数よりＴ細胞あたり少ないビーズ）、直接的磁石画分においては５：１比（目安とされた数よりＴ細胞あたり有意に多いビーズ）であることを意味し、ＤＬＤアームとＦｉｃｏｌｌアームの両方と比較して、直接的磁石画分に、さらにより高い増殖倍率を生じさせた可能性がある。
培養物のフローサイトメトリ特徴づけを各時点において実施して、細胞活性化の一貫性を評価した。Ｆｉｃｏｌｌ、ＤＬＤ、および直接的磁石についての、８日目に測定された場合の、ＣＤ３＋細胞のＣＤ２５発現の変化（図３）。ＩＬ－２受容体陽性（ＣＤ２５）ＣＤ３細胞は、青色（ＣＤ４＋プロット）および赤色（ＣＤ８＋プロット）で示されている。ＤＬＤ調製細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ調製物および直接的磁石調製物のどちらと比較しても、ＣＤ２５（ＣＤ３／ＣＤ２８刺激に対する応答の指標）について、４個のドナーに渡って、より一貫した表現型発現を示す。ＤＬＤ調製ＣＤ３＋細胞は、５１％におけるＦｉｃｏｌｌと比較して、共刺激に対して平均７３％応答を生じ（どちらも、２．３個のビーズ／細胞において刺激された）、一方、より高い５：１比で刺激された、直接的磁石画分は、５４％応答だけ生じた。
ＦｉｃｏｌｌおよびＤＬＤについての非刺激対照は、顕著な差を示し、ＤＬＤ調製細胞は、Ｆｉｃｏｌｌと比較して、ＣＤ２５陰性のままであった（図９）。興味深いことに、直接的磁石画分におけるドナー３７は、８日目まで応答しなかったが、より後の時点において増殖し（図５Ａにも示された）、直接的磁気アプローチに対するいくつかの試料の応答の潜在的遅延を示している。
ＣＤ２５を評価することに加えて、メモリー細胞表現型への変換を、ＣＤ４５ＲＡ－およびＣＤ２５＋であるＣＤ３＋細胞のパーセンテージを用いて、追跡した。図４において示される結果は、ＤＬＤにより生成された場合、培養細胞のより高いパーセンテージが、Ｆｉｃｏｌｌおよび直接的磁石により処理された細胞と比較して、共刺激に対して応答性であったことを示す。さらに、ＣＤ２５－ ＣＤ４５ＲＡ－であったＣＤ３細胞のパーセントは、Ｆｉｃｏｌｌおよび直接的磁石、それぞれについての３３％および２９％と比較してＤＬＤ画分において１２％と最も低く、ＤＬＤ ＣＤ３細胞に関して、ＣＤ２５＋ ＣＤ４５ＲＡ－集団へのより完全な変換を示している。ＤＬＤについての８日目におけるＣＤ４５ＲＡ－ ＣＤ２５＋集団の標準偏差は、Ｆｉｃｏｌｌについての２４．８％および直接的磁石についての５３．４％と比較して１０．１％であった。
個々の培養物の増殖倍率を、３日目、８日目、および１５日目において決定した；そのデータは図５Ａに示されている。そのプロットは、各方法に渡る、各ドナー試料の増殖を示す。直接的磁石アプローチは、より高い増殖を示すように思われるが、そのカウント数は、異なるビーズ対細胞比（および対応するプレーティング密度の差）により有意に影響された可能性が高い。とにかく、４個のドナーは、増殖倍率において有意な生存率を示している。加えて、直接的磁石アームのドナー＃２１についての１５日目の培養物は、抗生物質を存在させていたにも関わらず、汚染され、廃棄されなければならなかった。ドナー＃２１についての８日目の増殖データがその汚染により影響されたかどうかを知ることは可能ではない。
ＦｉｃｏｌｌとＤＬＤの比較は、妥当であり、かつはるかに直接的であった：これらの細胞を、同じ密度でプレーティングし、同じビーズ：細胞比で刺激した。ＤＬＤ細胞の平均増殖倍率はＦｉｃｏｌｌ細胞のそれより有意には高くはないが、４個のドナーのセットに渡っての、および調査された全ての日における、増殖の一貫性は顕著である。さらに、セントラルメモリー表現型である培養中の細胞のパーセントは、ＤＬＤアームについて平均７４％であり、Ｆｉｃｏｌｌアームおよび直接的磁石アームについて、それぞれ、４７％および４８％と対照をなす。図５Ａにおける増殖倍率にパーセント収率（表１）およびパーセントメモリー（図５Ｂ）を掛けることにより、ビーズ：細胞比での準最適比較にも関わらず、Ｆｉｃｏｌｌアームまたは直接的磁石アームのいずれと比較しても、平均して２倍のメモリー細胞がＤＬＤアームから産生されたことが示される。
図６は、この研究に用いられたメモリー細胞を同定することへの表現型アプローチを示し、そのアプローチは、ＣＤ６２Ｌなどの抗原が脱落するいかなる問題も排除するように設計されている（Mahnke, et al., Eur. J. of Immunol. 43:2797-2809 (2013)）。セントラルメモリー細胞は、逐次的にゲーティングされ、その後、ＣＤ３＋ Ｔ細胞が、その培養物中の全ての他のＣＤ３＋細胞に対して、ＣＤ４５Ｒ０＋、ＣＤ９５＋、ＣＤ２８＋、およびＣＤ１９７／ＣＣＲ７＋について陽性であることを示すためにバックゲーティングされる。培養物の任意の５０％より高くがセントラルメモリー表現型であることを変換測定基準として用いて、ＤＬＤアームは、１００％（４／４）のドナーがセントラルメモリー変換を達成したことを示し、細胞の平均７４％がメモリー表現型であり、１３％のドナーに渡る変動係数であった。対照的に、Ｆｉｃｏｌｌアームは、５０％（２／４）変換を示し、平均４７％のメモリー細胞、および２９％の変動係数であった。直接的磁石アームは、３３％（１／３）変換を達成し、平均４８％のメモリー細胞および関連した７９％変動係数であった。
実施例２：血小板付加バック(Back)実験
原理
以前に、ＤＬＤ単離および精製に由来するＷＢＣは、健常であり、ＣＤ３／ＣＤ２８抗体による活性化に応答し、それらのＴｃｍ（Ｔセントラルメモリー）表現型に分化することが見いだされている（doi.org/10.1177/2472630317751214にオンライン公開された、Campos-Gonzalez, et al., SLAS, January 23, 2018）。さらに、ＩＬ－２の存在下で、Ｔｃｍ細胞は、Ｆｉｃｏｌｌのように、他の方法に由来する細胞にしたがっておよび同様に、拡張および増殖する。
ＤＬＤ細胞精製の重要な特徴は、高度に精製された白血球（ＷＢＣ）産物を提供するための、赤血球および血小板の十分な除去である。比較すると、Ｆｉｃｏｌｌ由来白血球（ＰＢＭＣ）は、試料の質に依存して、より汚染された赤血球および血小板を示す。平均して、Ｆｉｃｏｌｌ由来細胞中の血小板「汚染」は約２２％の変動範囲を有する４４％であるが、ＤＬＤ細胞は＋／－１２％の変動で１７％のみの血小板汚染を示す。
Ｆｉｃｏｌｌ分離アフェレーシス血液と比較したとき、ＤＬＤ処理アフェレーシス血液における血小板枯渇の顕著な違いのため、ＤＬＤ精製白血球への自己血小板の添加が期間にわたって増殖およびＴｃｍ産生に影響するか否かについて調査が行われた。
実験の詳細
２つの異なる白血球除去システムアフェレーシス（「ＬＲＳ－アフェレーシス」）試料は、コントロールとして、または２．０ｍＭ ＥＤＴＡ中のいずれかでローカルの血液バンクから収集された。全４つの試料を、ＤＬＤ処理およびＦｉｃｏｌｌ勾配遠心分離という２つの異なる方法で並行して同じように処理した。血液バンクによって提供された元の血小板：ＷＢＣ比に注釈が付けられ、コールターカウンター測定によって確認された。
３．０ｍｌの各ＬＲＳ血液を、ＰＢＳ中の１．０％ ＢＳＡ／５．０ｍＭ ＥＤＴＡで０．２Ｘに血液を希釈することによって、我々の前述のプロトコールにしたがってＤＬＤにより処理した。試料を、各試料について個々のＤＬＤ－１４レーンチップを使用して標準圧力および条件下で、１．０％ ＢＳＡ／ＰＢＳバッファーで実施した。産物および廃棄物を回収し、細胞充実性をコールターカウンターを使用して測定した。
（２．０ｍＭ ＥＤＴＡまたはコントロールにおいて回収された）２つの異なるドナーおよび条件からの３．０ｍｌの各ＬＲＳ血液産物を、３．０ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（カルシウムとマグネシウムを差し引いたもの）で１：１に希釈し、５０ｍｌコニカルチューブ中で６．０ｍｌのＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ上に層状にした。ＰＢＭＣの末梢単核細胞を、ブレーキをかけずに３５分間４００ｘｇでの遠心分離によって得た。上層または血漿富画分を取り出し、別のチューブに移し、ＰＢＳ／１．０％ＢＳＡで１：１に希釈した。１回目は４００ｘｇ１０分間および２回目は２００ｘｇ１０分間の遠心分離により、ＰＢＭＣを過剰なＰＢＳで洗浄した。両方の上清を新しい５０ｍｌコニカルチューブに移し、ＰＢＳ／１．０％ ＢＳＡで１：１に希釈した。希釈された血漿富画分および２つの上清を１５分間１，２００ｘｇで遠心し、上清を廃棄し、ペレットをＰＢＳ／１．０％ ＢＳＡに再懸濁し、混合し、１５分間１，２００ｘｇでもう一度遠心した。上清を廃棄し、ペレットまたは血小板画分を穏やかなピペッティングにより１．０ｍｌのＰＢＳ／１．０％ ＢＳＡに再懸濁した。血小板をコールターカウンターを使用して測定した。対応する血小板を、所望の比率（０、０．１、０．５および１．０ｘ 元の血小板数）でＤＬＤ由来のＷＢＣにバック付加し、ＣＤ３／ＣＤ２８磁気ビーズでの活性化の前に１時間インキュベートした（Thermo Fisher）。
活性化後、細胞を完全なＲＰＭＩ培地＋１０％ ＦＢＳ＋抗生物質に置き、３７℃および５％ ＣＯ２で加湿インキュベーターで一定時間培養した。図に示されている抗体の組み合わせを使用して、マルチカラーフローサイトメトリーによって、細胞アリコートを３、７および１４日に分析した。細胞培養アリコットを異なる日に得て、フローサイトメトリーの調製前に、前述のように細胞のビーズを外した。また、細胞増殖を、セプター手動細胞カウンターを使用することによって測定した。
我々は、次に、Ｆｉｃｏｌｌ由来の細胞とコントロール条件下でおよび異なる比率で血小板をＤＬＤ細胞にバック付加したときのＤＬＤ処理から得られたものとの違いを比較した。我々が使用したパラメーターは、異なる時点での細胞数およびフローサイトメトリーによる表現型に応じたＴｃｍ細胞数であった。
以下のスキームは、上から下に進むステップでこの実験中に続く全体的な実験計画を説明する。
Figure 0007393328000003
結果および結論
ＤＬＤを使用して得た白血球は、Ｆｉｃｏｌｌを使用して得た白血球よりも一貫して少ない血小板を示した（図１９－２１参照）。結果はまた、Ｆｉｃｏｌｌからの対応物と比較して、ＤＬＤに由来するＴ細胞の明らかに優れた増殖を証明する（図２２）。さらに、ＤＬＤ単離細胞への血小板のバック付加は、血小板を含まないＤＬＤ細胞と同じレベルまで拡大する能力が低下した（図２２）。これらの結果は、血液産物のＤＬＤ処理中のより効率的な血小板減少が、ＣＤ３／ＣＤ２８による活性化およびＩＬ－２による拡大により応答する白血球を生産するという仮説をサポートする。
参考文献
本明細書に引用された全ての参考文献は、参照により完全に組み入れられている。今、本発明を完全に記載したが、本発明が、本発明またはその任意の実施形態の精神または範囲に影響することなく、条件、パラメータなどの幅広くかつ等価の範囲内で実施され得ることは当業者により理解されているだろう。

Claims (28)

  1. 以下の工程を含む、標的細胞の集団を操作するインビトロ方法：
    ａ）標的細胞を粗流体組成物から単離する工程であって、単離手順が、マイクロ流体デバイス上で決定論的横置換（ＤＬＤ）を実施することを含み、前記デバイスが、
    ｉ）試料注入口から１つまたは複数の流体出口へ延びる少なくとも１個のチャネルであって、前記チャネルが第１の壁および前記第１の壁と反対側の第２の壁によって囲まれている、チャネル；
    ｉｉ）前記チャネルにおいて、いくつもの行（row）をなして配列された障害物のアレイであって、障害物のそれぞれの次の行が、前の行に対して横方向へシフトしており、前記障害物が、前記粗流体組成物が前記デバイスの注入口にアプライされ、前記チャネルを流体的に通過する時、標的細胞が、濃縮された産物が収集される１つまたは複数の収集出口へ流れ、前記標的細胞とは異なるサイズである混入細胞または粒子が、前記収集出口から切り離されているもう１つの廃棄物出口へ流れるような様式で配置されている、障害物のアレイ
    を含む、工程；
    ｂ）前記収集出口から得られた標的細胞を、所望の表現型を有するように遺伝子操作する工程；および
    ｃ）該標的細胞をそれらの数を増加させるように培養する工程；
    ここでセントラルメモリーＴ細胞である遺伝子操作されかつ増殖させた標的細胞のＣＤ３陽性Ｔ細胞のパーセンテージが、Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配遠心分離または直接的磁石によって同じ粗流体組成物から単離される遺伝子操作されかつ増殖させた細胞集団中のセントラルメモリーＴ細胞であるＣＤ３陽性Ｔ細胞のパーセンテージより高い。
  2. 以下の工程を含む、標的細胞の集団を操作するインビトロ方法：
    ａ）標的細胞を粗流体組成物から単離する工程であって、単離手順が、マイクロ流体デバイス上で決定論的横置換（ＤＬＤ）を実施することを含み、前記デバイスが、
    ｉ）試料注入口から１つまたは複数の流体出口へ延びる少なくとも１個のチャネルであって、前記チャネルが第１の壁および前記第１の壁と反対側の第２の壁によって囲まれている、チャネル；
    ｉｉ）前記チャネルにおいて、いくつもの行（row）をなして配列された障害物のアレイであって、障害物のそれぞれの次の行が、前の行に対して横方向へシフトしており、前記障害物が、前記粗流体組成物が前記デバイスの注入口にアプライされ、前記チャネルを流体的に通過する時、標的細胞が、濃縮された産物が収集される１つまたは複数の収集出口へ流れ、前記標的細胞とは異なるサイズである混入細胞または粒子が、前記収集出口から切り離されているもう１つの廃棄物出口へ流れるような様式で配置されている、障害物のアレイ
    を含む、工程；
    ｂ）前記収集出口から得られた標的細胞を、所望の表現型を有するように遺伝子操作する工程；および
    ｃ）該標的細胞をそれらの数を増加させるように培養する工程；
    ここで遺伝子操作されかつ増殖させた標的細胞のＣＤ３陽性細胞の４８％より多くが、セントラルメモリーＴ細胞である。
  3. 以下の工程を含む、標的細胞の集団を操作するインビトロ方法：
    ａ）標的細胞を粗流体組成物から単離する工程であって、単離手順が、マイクロ流体デバイス上で決定論的横置換（ＤＬＤ）を実施することを含み、前記デバイスが、
    ｉ）試料注入口から１つまたは複数の流体出口へ延びる少なくとも１個のチャネルであって、前記チャネルが第１の壁および前記第１の壁と反対側の第２の壁によって囲まれている、チャネル；
    ｉｉ）前記チャネルにおいて、いくつもの行（row）をなして配列された障害物のアレイであって、障害物のそれぞれの次の行が、前の行に対して横方向へシフトしており、前記障害物が、前記粗流体組成物が前記デバイスの注入口にアプライされ、前記チャネルを流体的に通過する時、標的細胞が、濃縮された産物が収集される１つまたは複数の収集出口へ流れ、前記標的細胞とは異なるサイズである混入細胞または粒子が、前記収集出口から切り離されているもう１つの廃棄物出口へ流れるような様式で配置されている、障害物のアレイ
    を含む、工程；
    ｂ）前記収集出口から得られた標的細胞を、所望の表現型を有するように遺伝子操作する工程；および
    ｃ）該標的細胞をそれらの数を増加させるように培養する工程；
    ここでセントラルメモリーＴ細胞である遺伝子操作されかつ増殖させた標的細胞のＣＤ３陽性Ｔ細胞のパーセンテージが、Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配遠心分離によって同じ粗流体組成物から単離される遺伝子操作されかつ増殖させた細胞集団中のセントラルメモリーＴ細胞であるＣＤ３陽性Ｔ細胞のパーセンテージの２倍高い。
  4. 以下の工程を含む、標的細胞の集団を操作するインビトロ方法：
    ａ）標的細胞を粗流体組成物から単離する工程であって、単離手順が、マイクロ流体デバイス上で決定論的横置換（ＤＬＤ）を実施することを含み、前記デバイスが、
    ｉ）試料注入口から１つまたは複数の流体出口へ延びる少なくとも１個のチャネルであって、前記チャネルが第１の壁および前記第１の壁と反対側の第２の壁によって囲まれている、チャネル；
    ｉｉ）前記チャネルにおいて、いくつもの行（row）をなして配列された障害物のアレイであって、障害物のそれぞれの次の行が、前の行に対して横方向へシフトしており、前記障害物が、前記粗流体組成物が前記デバイスの注入口にアプライされ、前記チャネルを流体的に通過する時、標的細胞が、濃縮された産物が収集される１つまたは複数の収集出口へ流れ、前記標的細胞とは異なるサイズである混入細胞または粒子が、前記収集出口から切り離されているもう１つの廃棄物出口へ流れるような様式で配置されている、障害物のアレイ
    を含む、工程；
    ｂ）前記収集出口から得られた標的細胞を、所望の表現型を有するように遺伝子操作する工程；および
    ｃ）該標的細胞をそれらの数を増加させるように培養する工程；
    ここでセントラルメモリーＴ細胞である遺伝子操作されかつ増殖させた標的細胞のＣＤ３陽性Ｔ細胞のパーセンテージが、Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配遠心分離によって同じ粗流体組成から単離される遺伝子操作されかつ増殖させた細胞集団中のセントラルメモリーＴ細胞であるＣＤ３陽性Ｔ細胞のパーセンテージの少なくとも１．５倍高い。
  5. 前記所望の表現型を示す標的細胞の収率が、Ｆｉｃｏｌｌ遠心分離により単離され、かつＤＬＤに供されていない同一の細胞より少なくとも１０％高い、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記粗流体組成物が、血液、または血液にアフェレーシスもしくは白血球アフェレーシスを実施することにより取得されている組成物である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記標的細胞が白血球である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記標的細胞が、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、単球、または前駆細胞を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記標的細胞が樹状細胞を含む、請求項１～６のいずれか一項記載の方法。
  10. 前記粗流体組成物が患者から取得されている、請求項１～９のいずれか一項記載の方法。
  11. 前記粗流体組成物における標的細胞が、形質導入またはトランスフェクションされる前に担体と結合していない、請求項１０に記載の方法。
  12. 標的細胞に、ＤＬＤを実施する前に、ＤＬＤ分離を促進または補完するように、１つまたは複数の担体を結合させる、請求項１０に記載の方法。
  13. 標的細胞に、ＤＬＤを実施した後で、かつそれらを形質導入またはトランスフェクションする前かまたは後のいずれかで、ＤＬＤ分離を促進または補完するように、１つまたは複数の担体を結合させる、請求項１１に記載の方法。
  14. 前記１つまたは複数の担体が、前記標的細胞と特異的に結合する親和性物質を表面上に含む、請求項１２または１３に記載の方法。
  15. 前記物質が、抗体、アクチベーター、ハプテン、またはアプタマーである、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記担体の直径が、標的細胞の直径と少なくとも同じ長さである、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記担体の全部の直径が、標的細胞の直径の５０％以下の長さである、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記担体の全部の直径が、標的細胞の直径の少なくとも２倍の長さである、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記担体の全部の直径が、標的細胞の直径の２５％以下の長さである、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の方法。
  20. 担体の１つの群が、標的細胞と少なくとも同じ長さの直径を有し、担体の第２の群が、標的細胞の直径の５０％以下の長さの直径を有する、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の方法。
  21. 担体の１つの群が、標的細胞の少なくとも２倍の長さの直径を有し、担体の第２の群が、標的細胞の２５％以下の長さの直径を有する、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記担体が、コラーゲンまたは多糖でできている、請求項１２～２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. 前記担体が、ゼラチンまたはアルギン酸塩でできている、請求項１２～２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. 粗流体組成物が患者から取得され、前記粗流体組成物の取得が完了した時点から、標的細胞に初めて担体を結合させるまで、４時間より長く経過していない、請求項１２～２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 粗流体組成物が、患者の血液から引き出されたアフェレーシスまたは白血球アフェレーシス産物であり、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシスが完了した時点から標的細胞に初めて担体を結合させるまで、４時間より長く経過していない、請求項１２～２３のいずれか一項に記載の方法。
  26. 粗流体組成物が患者から取得され、前記粗流体組成物の取得が完了した時点から、初めて標的細胞がトランスフェクションまたは形質導入される時まで、５時間より長く経過していない、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 粗流体組成物が、患者の血液から引き出されたアフェレーシスまたは白血球アフェレーシス産物であり、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシスが完了した時点から、初めて標的細胞がトランスフェクションまたは形質導入される時まで、５時間より長く経過していない、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。
  28. 初めて標的細胞がトランスフェクションまたは形質導入される時まで、４時間より長く経過していない、請求項２６または２７に記載の方法。
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